(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールエステラーゼと、
コレステロール脱水素酵素と、
ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン二酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸、ジアミノプロパノール四酢酸及びニトリロトリスメチレンホスホン酸から選ばれる少なくとも一つのキレート剤と、
を含有するコレステロール測定試薬。
【請求項２】
キレート剤がニトリロ三酢酸及び／又はエチレンジアミン二酢酸である請求項１に記載のコレステロール測定試薬。
【請求項３】
前記キレート剤のキレート安定度定数（ｌｏｇＫＭＬ）が１０以下である請求項１又は２に記載のコレステロール測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素などの生理活性物質を用いる測定方法および測定試薬の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、酵素を用いる測定方法は、反応の特異性および再現性に優れ、操作が簡便であることなどから、数多く開発されてきた。特に臨床検査の分野では血液試料の成分の測定に関して多くの方法が知られている。しかし、一般に酵素は安定性が悪いので、測定試薬として調製するために種々の工夫がなされている。
【０００３】
例えば、酵素修飾によるα−グルコシダーゼの安定化方法、グリセリンの添加による乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の安定化方法、アセトンの添加によるベンジルアルコール脱水素酵素の安定化方法、ジチオスレイトールなどの還元剤を用いるウレアーゼの安定化方法、カルシウムイオンの添加によるリパーゼの安定化方法などが報告されている。また、配糖体を用いたコレステロール脱水素酵素の安定化方法も特開平９−３１３１７８号公報に開示されている。
【０００４】
これらの方法は多くの場合、酵素が異なると効果が得られないため、酵素により個々に安定化方法が検討されていた。特に近年、臨床検査の日常業務の効率化を図るため、検査に使用する試薬を従来の凍結乾燥品から液状品に変えることが多くなり、試薬中の酵素の安定化が一層重要な課題となってきた。そのような中で各種の酵素を全般的に安定化するクリスタリンが開発された（特開平７−２３６４８３号公報）。
【０００５】
一般的に酵素を用いる測定方法では、通常複数の酵素を用いて、反応指示物質を生成させて被測定物質を測定する。このとき、用いる酵素の組み合わせにより該酵素が不安定になったり、その酵素活性が阻害されることがある。例えば一つの酵素が酵素活性の発現および／または安定化のため金属イオンを必要とし、他の酵素が該金属イオンにより不安定化および／または酵素活性が阻害される場合がある。
【０００６】
現在このような場合、酵素を安定化するために、酵素を大量に使用する、安定性に係る性質が相反する酵素を別々に保存する、などの方法が採られている。しかし、酵素を大量に使用する方法は、コストが高くなるなどの問題がある。また、酵素を別々に保存する方法は、保存する試薬数が多くなり、その上、例えば臨床検査の分野で汎用されている自動分析装置で使用できる試薬数は多くの場合２試薬までなので、使用時に複数の試薬を２試薬に調製する必要があり、調製の手間がかかる上に調製ミスの原因となる。また、２試薬に調製しようとしても、例えば正確な測定のために測定に影響する干渉物質を消去する必要上、安定性に係る性質が相反する酵素であっても、別々の試薬として保存できない場合もある。
【０００７】
また、金属イオンにより酵素が不安定化および／または活性阻害される場合、上記のグリセリン、有機溶媒、還元剤、配糖体、クリスタリンなどの安定化剤では効果が見られなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題の一は、金属イオンの存在下で、該金属イオンにより不安定化されるおよび／または活性阻害される酵素などの生理活性物質の、安定化および／または活性阻害の防止である。
【０００９】
別の課題は、金属イオンにより安定性を増すおよび／または活性を増す酵素などの生理活性物質と、該金属イオンにより不安定化されるおよび／または活性阻害される酵素などの生理活性物質とを同一試薬中に保存する場合、両方の生理活性物質を安定化および／または活性阻害防止もしくは活性化することである。
【００１０】
別の課題は、反応指示物質のシグナルの安定化である。また、金属イオンと血清検体とを混合したときに生じることのある濁りの防止であり、金属イオンを含む試薬の保存中に生じることのある金属塩の沈殿を防止することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、溶液中で酵素などの生理活性物質を安定化する効率的且つ汎用的方法を求め鋭意検討した。そして、酵素などの生理活性物質を不安定化および／または活性阻害する金属イオン、または、酵素などの生理活性物質を不安定化および／または活性阻害しかつ共存する酵素などの生理活性物質の安定性を増すおよび／または活性を増す金属イオン、に対する特定のキレート剤を添加すれば効率的且つ汎用的に上記課題を解決できることを見い出し本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち本発明は、生理活性物質を用いて行う測定法に使用する測定試薬であって、少なくとも以下から選ばれる１または２以上の効果が得られる機能を有するキレート剤が含まれていることを特徴とする測定試薬である；
１）生理活性物質の安定化効果および／または活性阻害防止効果、
２）反応指示物質のシグナルの安定化効果、
３）被測定物質と金属イオンを含有する測定試薬との混合時の濁り防止効果、
４）金属塩の沈殿防止効果。
【００１３】
本発明において測定試薬とは、物質の測定に使用する、１以上の化合物からなる試薬である。ここで化合物は、酵素、蛋白質、ペプチドなども含む。
【００１４】
本発明の測定試薬は、生理活性物質として少なくとも金属イオンにより不安定化および／または活性阻害されるものを含有していればよく、その他の生理活性物質を含んでいても含んでいなくてもよい。その他の生理活性物質としては、金属イオンが安定性を増すおよび／または活性を増すものを例示することができる。金属イオンにより活性を増す生理活性物質としては、金属イオンが活性の発現に必須なものだけでなく、金属イオンがなくても活性はあるが金属イオンを添加することにより活性が上昇するものも含む。
【００１５】
本発明の測定試薬において、キレート剤の添加により安定化される生理活性物質としては、酵素、生理活性ポリペプチドなどが挙げられるが、とくに酵素の安定化に有効である。
【００１６】
金属イオンにより不安定化されるおよび／または活性阻害される生理活性物質としては、酵素ではコレステロール脱水素酵素が例示される。
【００１７】
また、金属イオンが安定性を増すおよび／または活性を増す生理活性物質としては、酵素ではコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホスホリパーゼが例示される。
【００１８】
本発明の測定試薬を用いることにより安定化されるシグナルを発する反応指示物質は特に限定されず、金属イオンにより不安定化および／または活性阻害される反応指示物質であれば本発明を適用できるが、好適な例としてはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまたはｔｈｉｏ−ＮＡＤＨまたはｔｈｉｏ−ＮＡＤＰＨが例示される。反応指示物質のシグナルの安定化とは、金属イオンが直接反応指示物質に作用することにより、または測定反応に係わる生理活性物質が金属イオンで不活性化されることにより、反応指示物質のシグナルが変化したり不安定になることを阻止することを意味する。例えば、金属イオンがＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ等の反応指示物質を酸化還元反応により変化させ、その吸光度を上昇させたり減少させたりするのを阻止することを意味する。
【００１９】
被測定物質と金属イオンを含有する測定試薬との混合時の濁り防止効果とは、測定試薬中の金属イオンと被測定物質中の物質とが結合して生じることがある沈殿物の生成を防止する効果をいう。本発明の測定試薬を用いれば、測定試薬中のキレート剤が金属イオンと結合することにより、測定試薬中の金属イオンと被測定物質中の物質との結合が阻止され、混合時の沈殿による濁りが防止される。
【００２０】
金属塩の沈殿防止効果とは、金属イオンを含有する測定試薬の保存中に生じることがある金属イオンと測定試薬中の物質との結合による金属塩の沈殿を防止する効果をいう。本発明の測定試薬を用いれば、測定試薬中のキレート剤に金属イオンが結合し、測定試薬の保存中に生じることのある金属塩の沈殿防止を計ることができる。
【００２１】
本発明の測定試薬に添加するキレート剤は、上記１）〜４）記載の効果が１または２以上得られる機能をもつものを要時選択して用いるが、好ましくは生理活性物質の安定性および／または活性に関与する金属イオンに対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫＭＬ）が１０以下のものである。キレート安定度定数の下限値は生理活性物質を安定化できる数値であればよく、当業者は個々の生理活性物質の安定化条件により適宜選択できる。好ましくは、０．１以上のものを用いる。キレート安定度定数（ｌｏｇＫＭＬ）が１０以下の弱いキレート剤であれば、金属イオンにより不安定化されるおよび／または活性阻害される生理活性物質と、該金属イオンにより安定性を増すおよび／または活性を増す生理活性物質が共存している場合、金属イオンにより不安定化されるおよび／または活性阻害される生理活性物質を安定化させ、該金属イオンが安定性を増すおよび／または活性を増す生理活性物質の作用を消失させない程度に、金属イオンをキレートすることができるので、本発明の測定試薬に好適に用いることができる。
【００２２】
具体的なキレート剤としては、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ハイドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、ハイドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＰＯ）、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）などが例示される。
【００２３】
本発明の測定試薬には、キレート剤を少なくとも一添加すればよいが、所望により二以上を組合せて添加してもよい。使用濃度は、用いる生理活性物質と金属イオンの種類や濃度などを考慮し、簡単な実験的繰り返しにより求められるが、金属イオンの濃度が０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌの場合、キレート剤は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いるのが好ましい。
【００２４】
さらに、本発明の測定試薬を使用することにより、金属イオンにより不安定化および／または活性阻害される生理活性物を、単独で、または該金属イオンにより安定性を増すおよび／または活性を増す生理活性物の共存下で用いる測定を簡便かつ正確に行うことが可能になる。すなわち、本発明は、本発明の測定試薬を用いる測定方法をも提供する。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
ヒト正常血清４検体について、その総コレステロールを測定するため、以下に示す試薬Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３およびＢを調製した。
【００２６】
試薬Ａ−１
ＨＥＰＥＳ緩衝液                    １００ ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
二塩化ヒドラジニウム                １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム                      ０．３ ％
トリトンＸ−１００                      ０．３ ％
コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）      ８ Ｕ／ｍＬ
（シュードモナス属）
塩化カルシウム（無水）                  ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ
【００２７】
試薬Ａ−２
ＨＥＰＥＳ緩衝液                    １００ ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
二塩化ヒドラジニウム                １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム                      ０．３ ％
トリトンＸ−１００                      ０．３ ％
コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）      ８ Ｕ／ｍＬ
（シュードモナス属）
塩化カルシウム（無水）                  ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ                                ５．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
【００２８】
試薬Ａ−３
ＨＥＰＥＳ緩衝液                    １００ ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
二塩化ヒドラジニウム                １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム                      ０．３ ％
トリトンＸ−１００                      ０．３ ％
コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）      ８ Ｕ／ｍＬ
（シュードモナス属）
塩化カルシウム（無水）                  ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＤＡ                              １０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
【００２９】
試薬Ｂ
ＨＥＰＥＳ緩衝液                    １００ ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
コール酸ナトリウム                      ０．３ ％
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）    ２０ Ｕ／ｍＬ
（ノカルヂア属）
【００３０】
検体０．１ｍＬと試薬Ａ−１の３．０ｍＬとを混和し、３７℃で３４０ｎｍにおける吸光度を５分間測定する（第一反応）。この溶液に試薬Ｂを加え更に３７℃で３４０ｎｍにおける吸光度を１５分間測定する（第二反応）。測定には日立ＵＶ−３２１０型分光光度計を用いた。さらに、同一検体を用いて試薬Ａ−１の代わりに試薬Ａ−２または試薬Ａ−３を用いて同様に測定を行った。
【００３１】
結果を図１に示す。図１のＡは試薬Ａ−１を、Ｂは試薬Ａ−２を、Ｃは試薬Ａ−３を用いて測定した結果である。キレート剤が添加されていない試薬Ａ−１では吸光度が一定にならないが、キレート剤としてＥＤＴＡ（カルシウムに対するｌｏｇＫＭＬ＝１０．９６）を添加した試薬Ａ−２と、ＥＤＤＡを添加したＡ−３では第一反応および第二反応共に吸光度が一定となった。
【００３２】
次ぎに、試薬Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３を１０℃以下の冷蔵庫と３０℃の恒温器に３日間保管し、酵素としてこれらに添加されているコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）の残存活性を測定した。その結果を表１に示す。キレート剤を添加していない試薬Ａ−１とキレート剤としてＥＤＤＡを添加した試薬Ａ−３では、３０℃で３日間保存後の残存活性は、調製時の酵素活性を１００％とすると、１００％だったが、ＥＤＴＡを用いた試薬Ａ−２では、１０％以下であった。
【００３３】
したがって、酵素の安定性および活性阻害の防止に効果が有り、臨床検査薬として使用に耐えうるものは試薬Ａ−３の組成である。
【００３４】
【表１】
３０℃負荷後のＣＥの残存活性
0004130724.tif 000002
【００３５】
【実施例２】
以下に示す組成の試薬Ｃを調製した。試薬Ｃに様々なキレート剤を１．０、５．０、１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ添加した。これらの溶液を１０℃以下の冷蔵庫と３０℃の恒温器に３日間保管し、酵素として添加されているＣＥとＣＤＨの残存活性を測定した。残存活性は、調製時を１００％として表現し、表２に示した。ｌｏｇＫＭＬが１０以上のＥＤＴＡ、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）を１ｍｍｏｌ／Ｌ添加しても、ＣＥの３０℃３日間保存後の残存活性は１０％以下であった。また、キレート剤無添加ではＣＤＨが完全に活性を失った。一方、ｌｏｇＫＭＬが１０以下のその他のキレート剤では使用濃度により差があるものの、ＣＥとＣＤＨの残存活性が９０％以上となった。
【００３６】
試薬Ｃ
ＨＥＰＥＳ緩衝液                    １００ ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
塩化カルシウム（無水）                  ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム                      ０．１ ％
コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）      ６ Ｕ／ｍＬ
（シュードモナス属）
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）    ２０ Ｕ／ｍＬ
（ノカルヂア属）
【００３７】
【表２】
３０℃負荷後のＣＥとＣＤＨの残存活性      単位：相対値（％）
0004130724.tif 000003
【００３８】
【発明の効果】
本発明は生理活性物質を用いて行う測定法に使用する、弱いキレート剤を含む測定試薬および該測定試薬を用いる測定方法を提供する。本発明は、酵素や生理活性ペプチドなどの生理活性物質をその種類を問わず安定化することができる。すなわち本発明は、安定性の悪い生理活性物質を効率的且つ汎用的に安定化でき、その保存期間の延長、測定コストの低減、簡便かつ正確な測定などの効果が得られ、臨床検査の分野などにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】キレート剤添加による効果を示す図である。縦軸は吸光度（Ａｂｓ．×１０４）、横軸は試薬添加後の経過時間（分）を示す。（実施例１）図Ａはキレート剤無添加、図ＢはＥＤＴＡ添加、図ＣはＥＤＤＡ添加、の結果である。
【図１】
0004130724.tif 000004