(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物、電子の授受により色調が変化する電子授受色調変化物質、および酸化還元酵素を混合し、前記分析対象物から前記電子授受色調変化物質への電子伝達の結果生じる前記電子授受色調変化物質の色調変化を測定することにより、前記分析対象物の定性若しくは定量を行う比色分析方法であって、
前記分析対象物が、グルコースまたはピルビン酸であり、
前記酸化還元酵素が、グルコースまたはピルビン酸の脱水素酵素または酸化酵素であり、
前記電子授受色調変化物質が、銅錯体、鉄錯体、ルテニウム錯体、およびオスミウム錯体からなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属錯体である比色分析方法。
【請求項２】
前記遷移金属錯体の配位子における配位原子が、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１記載の比色分析方法。
【請求項３】
前記遷移金属錯体の配位子が、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、およびシュウ酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２に記載の比色分析方法。
【請求項４】
前記配位子の配位座以外における水素原子の少なくとも一つが、置換基により置換された配位子である請求項３記載の比色分析方法。
【請求項５】
前記置換基が、アルキル基、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基、およびハロゲン基からなる群から選択された少なくとも一つである請求項４記載の比色分析方法。
【請求項６】
前記遷移金属錯体が、２種類以上の配位子を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の比色分析方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の比色分析方法に使用する試薬であって、酸化還元酵素と、電子の授受により色調が変化する電子授受色調変化物質とを含み、
前記酸化還元酵素が、グルコースまたはピルビン酸の脱水素酵素または酸化酵素であり、
前記電子授受色調変化物質が、銅錯体、鉄錯体、ルテニウム錯体、およびオスミウム錯体からなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属錯体である試薬。
【請求項８】
前記遷移金属錯体の配位子における配位原子が、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される少なくとも一つである請求項７記載の試薬。
【請求項９】
前記遷移金属錯体の配位子が、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、およびシュウ酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項７または８記載の試薬。
【請求項１０】
前記配位子の配位座以外における水素原子の少なくとも一つが、置換基により置換された配位子である請求項９記載の試薬。
【請求項１１】
前記置換基が、アルキル基、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基、およびハロゲン基からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１０記載の試薬。
【請求項１２】
前記遷移金属錯体が、２種類以上の配位子を有する請求項７〜１１のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の試薬を含む試験片。
【請求項１４】
さらに、無機ゲルを含む請求項１３記載の試験片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、比色分析方法およびそれに使用する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査や生化学検査等の分野において、グルコース、コレステロール等の成分分析が行われており、その一手法として、比色分析がある。例えば、グルコースの比色分析では、まずグルコースオキシダーゼをグルコース（基質）に作用させて、グルコノラクトンおよび過酸化水素を発生させ、過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下、トリンダー試薬等の発色剤により検出するのが一般的である。このように、過酸化水素を介して間接的に基質濃度を測定するという手法は、グルコースに限らず、コレステロール等の他の成分分析にも適用されている。
【０００３】
しかし、従来の比色分析では、つぎのような問題がある。まず、分析対象物を直接測定するのではなく、過酸化水素を介して、間接的に測定するため、測定に時間がかかり、例えば、グルコースの測定の場合、３０〜６０秒かかる。また、従来の比色分析法では、２種類の酵素反応系を同時に安定化する必要があり、条件設定が難しい。そして、酸素を必要とするため、従来の比色分析法では、酸素が不十分であると、反応が十分におこらないという問題もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、反応系が一段階であり、分析時間が短時間であり、分析値に信頼性がある比色分析方法の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の比色分析法は、分析対象物および電子の授受により色調を変化させる電子授受色調変化物質に酸化還元酵素を作用させ、前記分析対象物から前記電子授受色調変化物質への電子伝達の結果生じる前記電子授受色調変化物質の色調変化を測定することにより、前記分析対象物の定性若しくは定量を行う方法である。
【発明の効果】
【０００６】
この方法によれば、１段階の反応であるため、反応系が簡単で安定性が良く、かつ測定時間も短くなり（例えば、グルコースを基質とした場合、約５秒以下での測定が可能）、また過酸化水素を介さず、かつ原理的に酸素の量に影響されないようにすることもできることから、分析値の信頼性も高い。
【０００７】
つぎに、本発明の試薬は、前記本発明の比色分析方法に使用される試薬であり、酸化還元酵素および電子の授受により色調を変化させる電子授受色調変化物質を含む試薬である。また、本発明の試験片は、前記本発明の試薬を含む試験片である。この試験片は、従来の過酸化水素を介する比色分析の試験片に比べ、極めて短時間で分析が可能であり、分析値の信頼性も高い。
【０００８】
なお、ビピリジル金属錯体を発光物質として使用する分析方法があるが（特開平１０−２５３６３３号公報等）、本発明は比色分析方法に関するものであり、本発明と技術分野が全く異なる。同様に、ビピリジル金属錯体に、電極により直接印加して発消色反応を起こさせる技術もあるが（例えば、特開昭５７−１９２４８３号広報）、本発明は、酸化還元酵素による電子の授受を利用するため、これも本発明と技術分野が全く異なる。
【０００９】
（図面の簡単な説明）
図１は、本発明の一実施例における反射率のグルコース濃度依存特性を示すグラフである。
【００１０】
図２は、本発明のその他の実施例における反射率のグルコース濃度依存特性を示すグラフである。
【００１１】
図３は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００１２】
図４は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００１３】
図５は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００１４】
図６は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００１５】
図７は、本発明のさらにその他の実施例における反射率のグルコース濃度依存特性を示すグラフである。
【００１６】
図８Ａ〜図８Ｆは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００１７】
図９Ａ〜図９Ｄは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００１８】
図１０Ａ〜図１０Ｃは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００１９】
図１１は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００２０】
図１２は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００２１】
図１３Ａ〜図１３Ｃは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００２２】
図１４は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００２３】
図１５は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００２４】
図１６Ａ〜図１６Ｅは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００２５】
図１７Ａと図１７Ｂは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【００２６】
図１８Ａ〜図１８Ｃは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の比色分析方法、試薬および試験片において、前記電子授受色調変化物質は、遷移金属錯体が好ましい。遷移金属錯体としては、銅錯体、鉄錯体、ルテニウム錯体若しくはオスミウム錯体またはこれらの２種類以上の混合物が好ましい。また、前記遷移金属錯体の配位子の配位原子は、窒素、酸素および硫黄の少なくとも一つであることが好ましい。前記配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体が好ましい。前記配位子の配位座以外における水素原子の少なくとも一つは、置換基により置換されていてもよい。前記置換基としては、例えば、アルキル基、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基がある。前記遷移金属錯体は、２種類以上の配位子を持っていてもよい。すなわち、前記錯体は、混合配位子錯体でもよい。
【００２８】
本発明の比色分析方法、試薬および試験片において、酸化還元酵素は、脱水素酵素若しくは酸化酵素が好ましい。酵素量を多くすれば、反応が速くなるので好ましい。また、分析対象物は、例えば、グルコース、コレステロール、尿酸、乳酸、ピルビン酸、クレアチン、クレアチニン等であり、この場合の酸化還元酵素は、前記各物質に対応する脱水素酵素若しくは酸化酵素である。
【００２９】
本発明の比色分析方法、試薬および試験片において、電子授受色調変化物質に加え、さらにメディエータを使用することが好ましい。前記電子授受色調変化物質もメディエータであるが、これは電子の授受という機能だけではなく、これにより色調が変化するという機能も併せ持つ。したがって、追加的に使用するメディエータは、前記電子授受色調変化物質とは別のメディエータである。メディエータを用いると、電子の授受スピードが向上し、このため前記電子授受色調変化物質の色調変化のスピードも向上する。この結果、酸化還元酵素の使用量を少なくすることができ、コスト的に有利となる。前記メディエータとしては、例えば、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等があり、具体例は、後述のとおりである。電子授受色調変化物質とメディエータの組み合わせとしては、電子授受色調変化物質が銅錯体で、メディエータがオスミウム錯体若しくはルテニウム錯体の組み合わせが好ましい。
【００３０】
本発明の試験片において、前記試薬に加え、さらに無機ゲルを含むことが好ましい。前記色調変化物質は、電子伝達の結果、還元されて色調変化を起こすが、周囲に酸素があると、再酸化されて退色するおそれがあるが、無機ゲルを含んでいれば、この退色を防止できる。
【００３１】
以下、本発明について、具体例を挙げてさらに詳しく説明する。
【００３２】
前述のように、本発明において、電子授受色調変化物質は、遷移金属錯体が好ましく、遷移金属錯体のなかでも、銅錯体、鉄錯体、ルテニウム錯体およびオスミウム錯体が好ましい。
【００３３】
（銅錯体）
銅錯体は、酵素からの電子伝達により、例えば、青色（Ｃｕ2+）から赤褐色（Ｃｕ+）に色調が変化する。銅錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体等の配位子があげられる。これらを２種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
【００３４】
ビピリジルの場合、配位数は、４若しくは６であるが、安定性の見地から、ビピリジルは２個配位させることが好ましい。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
【００３５】
ビピリジル銅錯体の例としては、例えば、[Cu(bipyridyl)2]、[Cu(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(4,4'-diamino-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(4,4'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(4,4'-dibromo-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(5,5'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(5,5'-diamino-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(5,5'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(5,5'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(5,5'-dibromo-2,2'-bipyridyl)2]、[Cu(bipyridyl)3]、[Cu(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(4,4'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(4,4'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(4,4'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(5,5'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(5,5'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(5,5'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(5,5'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Cu(5,5'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]等がある。
【００３６】
イミダゾールの場合、配位数は、４である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
【００３７】
イミダゾール銅錯体の例としては、例えば、[Cu(imidazole)4]、[Cu(4-metyl-imidazole)4]、[Cu(4-phenyl-imidazole)4]、[Cu(4-amino-imidazole)4]、[Cu(4-hydroxy-imidazole)4]、[Cu(4-carboxy-imidazole)4]、[Cu(4-bromo-imidazole)4]等がある。
【００３８】
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニン銅錯体は、溶解性が高いという利点を持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、[Cu(imidazole)2(bipyridyl)]、[Cu(L-Arg)2(bipyridyl)]がある。混合配位子を用いると銅錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
【００３９】
（鉄錯体）
鉄錯体は、酵素からの電子伝達により、例えば、黄色系（Ｆｅ3+）から赤色系（Ｆｅ2+）に色調が変化する。鉄錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体の配位子があげられる。これらを２種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
【００４０】
ビピリジルの場合、配位数は、６である。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
【００４１】
ビピリジル鉄錯体の例としては、例えば、[Fe(bipyridyl)3]、[Fe(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(4,4'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(4,4'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(4,4'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(5,5'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(5,5'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(5,5'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(5,5'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Fe(5,5'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]等がある。
【００４２】
イミダゾールの場合、配位数は、６である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
【００４３】
イミダゾール鉄錯体の例としては、例えば、[Fe(imidazole)6]、[Fe(4-metyl-imidazole)6]、[Fe(4-phenyl-imidazole)6]、[Fe(4-amino-imidazole)6]、[Fe(4-hydroxy-imidazole)6]、[Fe(4-carboxy-imidazole)6]、[Fe(4-bromo-imidazole)6]等がある。
【００４４】
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニン鉄錯体は、溶解性が高いという利点を一般的に持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、[Fe(imidazole)2(bipyridyl)2]、[Fe(L-Arg)2(bipyridyl)2]がある。混合配位子を用いると錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
【００４５】
（ルテニウム錯体）
ルテニウム錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体の配位子があげられる。これらを２種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
【００４６】
ビピリジルの場合、配位数は、６である。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
【００４７】
ビピリジルルテニウム錯体の例としては、例えば、[Ru(bipyridyl)3]、[Ru(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(4,4'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(4,4'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(4,4'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(5,5'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(5,5'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(5,5'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(5,5'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Ru(5,5'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]等がある。
【００４８】
イミダゾールの場合、配位数は、６である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
【００４９】
イミダゾールルテニウム錯体の例としては、例えば、[Ru(imidazole)6]、[Ru(4-metyl-imidazole)6]、[Ru(4-phenyl-imidazole)6]、[Ru(4-amino-imidazole)6]、[Ru(4-hydroxy-imidazole)6]、[Ru(4-carboxy-imidazole)6]、[Ru(4-bromo-imidazole)6]等がある。
【００５０】
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニンルテニウム錯体は、溶解性が高いという利点を持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、[Ru(imidazole)2(bipyridyl)2]、[Ru(L-Arg)2(bipyridyl)2]がある。混合配位子を用いると錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
【００５１】
（オスミウム錯体）
オスミウム錯体は、酵素からの電子伝達により、例えば、橙色系（Ｏｓ3+）から茶褐色系色（Ｏｓ2+）に色調が変化する。オスミウム錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体の配位子があげられる。これらを２種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
【００５２】
ビピリジルの場合、配位数は、６である。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
【００５３】
ビピリジルオスミウム錯体の例としては、例えば、[Os(bipyridyl)3]、[Os(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(4,4'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(4,4'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(4,4'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(5,5'-diphenyl-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(5,5'-diamino-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(5,5'-dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(5,5'-dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3]、[Os(5,5'-dibromo-2,2'-bipyridyl)3]等がある。
【００５４】
イミダゾールの場合、配位数は、６である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）などのハロゲン基がある。
【００５５】
イミダゾールオスミウム錯体の例としては、例えば、[Os(imidazole)6]、[Os(4-metyl-imidazole)6]、[Os(4-phenyl-imidazole)6]、[Os(4-amino-imidazole)6]、[Os(4-hydroxy-imidazole)6]、[Os(4-carboxy-imidazole)6]、[Os(4-bromo-imidazole)6]等がある。
【００５６】
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニンオスミウム錯体は、溶解性が高いという利点を持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、[Os(imidazole)2(bipyridyl)2]、[Os(L-Arg)2(bipyridyl)2]がある。混合配位子を用いると錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
【００５７】
以上の遷移金属錯体の説明は、遷移金属の種類に着目して例を挙げたものであり、本発明は、これらに限定されない。以下、遷移金属錯体について、配位子に着目して説明する。
【００５８】
Ｎ、Ｏ、Ｓの配位原子をもつ配位子とは、分子内に、例えば、=N-OH、-COOH、-OH、-SH、>C=Oなどの基を持っているものをいう。このような配位子を持つ金属錯体としては、例えば、NNキレート、NOキレート、NSキレート、OOキレート、OSキレート、SSキレート(二座配位)、Nキレート（単座）、NNNキレート（三座）等があり、組み合わせは多種に及ぶ。配位子に二重結合を有しているものを選べば、Cu、Fe、Ru、Osの金属は電子伝達/授受機能がつきやすい。配位子としては、好ましくは芳香環を有しているものが良い。前述のように、配位子に、様々な置換基を導入してもよい。例えば、スルホン基などを導入すれば、金属錯体の溶解度の上昇につながる。金属錯体を形成させる際に、配位子を二種以上混在させ、混合配位子錯体としても使用しても良い。例えば、配位子の一つとして、アミノ酸を混在させておけば酵素との親和性が良くなったりする場合がある。また、中心金属の一部のサイトに各種ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）を付けるなどしても良い。以下に、配位のタイプ別の分類した遷移金属錯体の一例を示す。
【００５９】
（ＮＮ配位型）
フェナントロリン誘導体
Cu + 1,10-Phenanthoroline
Fe + 1,10-Phenanthoroline
Cu + Bathophenanthroline
Fe + Bathophenanthroline
Cu + Bathophenanthroline sulfonic acid
Fe + Bathophenanthroline sulfonic acid
ビピリジル誘導体
Cu + 2,2'-Bipyridyl
Fe + 2,2'-Bipyridyl
Fe + 4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl
Ru + 4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl
トリアジン誘導体
Cu + TPTZ (2,4,6-Tripyridyl-S-triazine)
Fe + TPTZ (2,4,6-Tripyridyl-S-triazine)
Fe + PDTS (3-(2-Pyridyl)-5,6-bis(4-sulfophenyl)-1,2,4-triazine)
ビキノリン誘導体
Cu + Cuproin (2,2'-Biquinoline)
ピリジルアゾ誘導体
Fe + Nitro-PAPS (2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol)
（NO配位型）
Fe + Nitroso-PSAP                  (2-Nitroso-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol)
Fe + Nitroso-ESAP                  (2-Nitroso-5-[N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol)
Fe + 1-Nitroso-2-Naphthol
（NS配位型）
Fe + 2-Amino-4-thiazole acetic acid
（OO配位型）
Fe + 1,2-Naphthoquinone-4-Sulfonic acid
（混合配位子型）
Os + Cl, Imidazole, 4,4'-Dimethyl-2,2'-Bipyridyl
Os + Imidazole, 4,4'-Dimethyl-2,2'-Bipyridyl
Cu + L-Arginine, 2,2'-Bipyridyl
Cu + Ethylenediamine, 2,2'-Bipyridyl
Cu + Imidazole, 2,2'-Bipyridyl
つぎに、本発明の比色分析方法を試験片に適用した例について、電子授受色調変化物質として銅錯体を使用し、かつグルコースを分析対象とした場合を例にとり説明する。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて酸化還元酵素を変える以外は、基本的に同様である。
【００６０】
まず、ビピリジル銅錯体を準備する。これは、市販品を使用してもよいが、自家調製でもよい。例えば、ＣｕＣｌ2と２，２’−ビピリジル（ｂｐｙ）を、約６０〜９０℃の温浴中で混合し、[Ｃｕ（ｂｐｙ）2]Ｃｌ2を合成する。ＣｕＣｌ2と２，２’−ビピリジル（ｂｐｙ）のモル比は、例えば、１：２である。また、ビピリジル銅錯体水溶液の濃度は、例えば、１〜１０質量％である。このビピリジル銅錯体水溶液にバインダーを溶解し、さらに、このバインダー液に、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を溶解して、試薬液とする。バインダーとしては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリルアミド、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等があり、このなかで、ＨＰＣが好ましい。また、バインダーの濃度は、例えば、０．５〜５質量％の範囲である。ＧＤＨの濃度は、例えば、１０００〜５００００Ｕ／ｍｌである。そして、前記試薬液をろ紙等の多孔質シートに含浸させ、その後乾燥させることにより、グルコース分析用の試験片が作成できる。なお、前記試薬液の含浸に先立ち、無機ゲル溶液を前記多孔質シートに含浸させ、乾燥させることが好ましい。無機ゲルとしては、例えば、スメクタイト等がある。前記無機ゲル溶液の無機ゲル濃度は、例えば、１〜５質量％、好ましくは１〜３質量％、より好ましくは１．５〜２質量％である。前記無機ゲル溶液には、ＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤を含有させてもよい。前記無機ゲル溶液全体に対する前記両性界面活性剤の濃度は、例えば、０．１〜２質量％、好ましくは０．１〜１質量％、より好ましくは０．２〜０．４質量％である。前記無機ゲルの前記多孔質シートに対する含浸量は、多孔質シート空隙体積基準で、例えば、１〜５０ｍｇ／ｃｍ3、好ましくは、１０〜３０ｍｇ／ｃｍ3、より好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｃｍ3である。前記多孔質シートは、孔径が厚み方向若しくはシート面方向にしたがい変化する非対称多孔質膜でもよい。この試験片は、当初青色であるが、血液等のグルコースを含む試料を点着すると、その濃度に応じ、赤褐色に変化する。この色調変化により、グルコースの定性若しくは定量分析が可能である。また、分析に必要な時間は、試料点着後、約２〜３秒である。この試験片に無機ゲルが含浸させてあれば、色調変化後の再酸化による退色が防止され、測定に供する時間を幅広くとることが可能となる。
【００６１】
前記無機ゲルは、例えば、膨潤性粘土鉱物を使用することが好ましい。膨潤性粘土鉱物のうち、更に好ましいものはベントナイト、スメクタイト、バーミキュライトまたは合成フッ素雲母であり、特に好ましくは合成ヘクトライトもしくは合成サポナイト等の合成スメクタイト、または合成フッ素雲母で代表される膨潤性合成雲母（又はＮａ型雲母）等の合成雲母（天然の雲母は通常非膨潤性の粘土鉱物である）である。
【００６２】
つぎに、本発明の比色分析方法を、液系分析に適用した例を、電子授受色調変化物質として銅錯体を使用し、かつグルコースを分析対象とした場合を例にとり説明する。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて酸化還元酵素を変える以外は、基本的に同様である。
【００６３】
すなわち、前述のようにして、銅錯体［Ｃｕ（ｂｐｙ）2］Ｃｌ2を合成する。この銅錯体とＧＤＨとを、緩衝液に溶解して試薬液を調製する。なお、水に溶解してもよいが、緩衝液に溶解するのが好ましい。緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８の範囲であり、好ましくはｐＨ６．５〜７の範囲である。また、銅錯体の濃度は、例えば、０．１〜６０ｍＭであり、好ましくは０．２〜１０ｍＭであり、より好ましくは０．３〜０．６ｍＭである。ＧＤＨの濃度は、例えば、１０〜１０００Ｕ／ｍｌであり、好ましくは、５０〜５００Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは、１００〜２００Ｕ／ｍｌである。この試薬液に血液等のグルコースを含む検体を添加すると、例えば、５秒以内の短時間に、前記試薬液の色が、検体のグルコース濃度に応じ、青色から赤褐色に変化する。この変化は目視で確認しても良いし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定してもよい。前記検体の添加量は、前記試薬液１ｍｌに対し、例えば、１〜１００μｌの範囲であり、好ましくは３〜１０μｌの範囲であり、より好ましくは５〜１０μｌの範囲である。
【００６４】
前述のように、本発明の比色分析方法において、電子授受色調変化物質に加え、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等のメディエータを使用することが好ましい。このメディエータの使用量は、試験片の場合、前記試薬液全体に対し、例えば、０．１〜５０ｍＭであり、好ましくは０．５〜１０ｍＭであり、より好ましくは１〜３ｍＭであり、液系分析の場合、前記試薬液全体に対し、例えば、０．１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．１〜１ｍＭであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍＭである。これらの至適濃度は、用いられるメディエータの種類によって変わる。
【００６５】
（実施例）
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、以下においてＰＱＱは、ピロロキノリンキノンを示し、その他の試薬の詳細は以下のとおりである。
【００６６】
【表１】
0004090435.tif 000002
【実施例１】
【００６７】
ＣｕＣｌ2と２，２’−ビピリジルをモル比１：２で約８０℃の温浴中で混合し、［Ｃｕ（ｂｐｙ）2］Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏ水溶液（濃度８０ｍＭ）を調製した。他方、ＨＰＣ−Ｍをビピリジル銅錯体水溶液に溶解し（濃度２質量％）、一度５０℃まで加熱した後、２５℃まで冷却した。この水溶液に、さらにＧＤＨを５００００Ｕ／ｍｌの濃度で溶解し、試薬液を調製した。つぎに、孔径が厚み方向に変化している非対称性多孔質膜（製品番号ＢＴＳ−２５、ＵＳフィルター社製）を準備し、予め、前記多孔質膜の目が細かい方の面から無機ゲル（製品番号ラポナイトＸＬＧ、ＲＯＯＫＷＯＯＤ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ社製）の水溶液（２質量％）を含浸させた後、乾燥させた。次に、前記多孔質膜の目が粗い方の面から、試薬液を２μｌ点着し、送風乾燥させ、円形のスポット（薄青色）を形成した。このスポット部分を切り抜き、これを孔つきのＰＥＴフィルムで挟んで、目的とするグルコース分析用試験片を作製した。
【００６８】
この試験片に対し、４種類のグルコース濃度の血清（０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ）を点着し、点着５秒後に反射率測定装置で色調変化を測定した（波長４７０ｎｍ）。この結果を、図１のグラフに示す。図示のように、この試験片では、点着５秒以内に、グルコース濃度に応じて発色した。このグルコース濃度に応じた発色（赤褐色）は、目視によっても観察することができた。また、発色に要した時間は２〜３秒であった。なお、前記グルコース添加血清は、解糖しきったヒト全血の血漿を凍結融解し、得られた血清に対して、前記種々濃度でグルコースを添加して調製した。
【実施例２】
【００６９】
塩化銅(II)0.01molを30mlの熱水に溶解させ、これに２，２’−ビピリジル0.02molを加えて攪拌した。その後、冷却して六水和物を結晶として析出し、［Ｃｕ（ｂｐｙ）2］Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏを得た。この銅錯体を含む下記の反応試薬1mlを光路長10mmのマイクロセルに入れ、分光光度計（日本分光社製V-550型）にて波長300nm〜900nmの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に500mMグルコース水溶液を10μl添加して攪拌し、直ちにスペクトルを測定した。この結果を図２のグラフに示す。図示のように、酵素反応により銅錯体は還元され、短波長側で発色が確認できた。
【００７０】
（反応試薬組成）
[Cu(bpy)2]Cl2                              0.4mM
PIPES(pH7.0)                               50mM
PQQGDH                                     200U/ml
【実施例３】
【００７１】
塩化銅(II)0.01molおよび２，２’−ビピリジル0.033molを少量の水に加え、完全に溶解するまで加熱したのち、冷却すると、［Ｃｕ（ｂｐｙ）3］Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏが結晶として析出した。この銅錯体を含む下記の反応試薬1mlを光路長10mmのマイクロセルに入れ、分光光度計（日本分光社製V-550型）にて波長300nm〜900nmの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に500mMグルコース水溶液を10μl添加して攪拌し、直ちにスペクトルを測定した。この結果を図３のグラフに示す。図示のように、酵素反応により銅錯体は還元され、短波長側で発色が確認できた。
【００７２】
（反応試薬組成）
[Cu(bpy)3]Cl2                              0.4mM
PIPES(pH7.0)                               50mM
PQQGDH                                     200U/ml
【実施例４】
【００７３】
塩化銅(II)0.01molを10mlの熱水に、エチレンジアミン（ｅｎ）0.01molを10mlの熱水に、２，２’−ビピリジル0.01molを10mlの熱エタノールに、それぞれ溶解し、これら３液を混合し、青色の溶液を得た。この溶液を冷却濃縮して、[Cu(en)(bpy)]Cl2の針状結晶を得た。この銅錯体を含む下記の反応試薬1mlを光路長10mmのマイクロセルに入れ、分光光度計（日本分光社製V-550型）にて波長300nm〜900nmの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に500mMグルコース水溶液を10μl添加して攪拌し、直ちにスペクトルを測定した。この結果を図４のグラフに示す。図示のように、酵素反応により銅錯体は還元され、短波長側で発色が確認できた。
【００７４】
（反応試薬）
[Cu(en)(bpy)]Cl2                           0.4mM
PIPES(pH7.0)                               50mM
PQQGDH                                     200U/ml
【実施例５】
【００７５】
511mg（3.0mmol、1.0eq.）の塩化銅(II)二水和物ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏを10mLの熱水に溶解し塩化銅水溶液を調製した。これとは別に、408mg（6.0mmol、2.0eq.）のイミダゾールを10mLの水に溶かしたものと、69mg（3.0mmol、1.0eq.）の２，２’−ビピリジルを10mLのエタノールに溶かしたものとを混合した溶液を調製した。この混合溶液を、塩化銅水溶液に加え、[Cu(Him)2(bpy)]Cl2の濃青色溶液を調製した。この銅錯体を含む下記の反応試薬1mlを光路長10mmのマイクロセルに入れ、分光光度計（日本分光社製V-550型）にて波長300nm〜900nmの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に500mMグルコース水溶液を10μl添加して攪拌し、直ちにスペクトルを測定した。この結果を図５のグラフに示す。図示のように、酵素反応により銅錯体は還元され、短波長側で発色が確認できた。
【００７６】
（反応試薬）
[Cu(Him)2(bpy)]Cl2                         1mM
PIPES(pH7.0)                               50mM
PQQGDH                                     1000U/ml
【実施例６】
【００７７】
塩化銅(II)0.01molを10mlの熱水に、L-アルギニン0.01molを10mlの熱水に、２，２’−ビピリジル0.01molを10mlの熱エタノール、それぞれ溶解し、これら３液を混合して濃青色の溶液を得た。この溶液を冷却濃縮して、[Cu(L-Arg)(bpy)]Cl2の針状結晶を得た。この銅錯体を含む下記の反応試薬1mlを光路長10mmのマイクロセルに入れ、分光光度計（日本分光社製V-550型）にて波長300nm〜900nmの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に500mMグルコース水溶液を10μl添加して攪拌し、直ちにスペクトルを測定した。この結果を図６のグラフに示す。図示のように、酵素反応により銅錯体は還元され、短波長側で発色が確認できた。
【００７８】
（反応試薬）
[Cu(L-Arg)(bpy)]Cl2                        1mM
PIPES(pH7.0)                               50mM
PQQGDH                                     1000U/ml
【実施例７】
【００７９】
孔径が厚み方向に変化している非対称性多孔質膜（製品番号ＢＴＳ−２５、ＵＳフィルター社製）を準備し、予め、前記多孔質膜の目が細かい方の面から下記組成の無機ゲル水溶液（２質量％）を含浸させた後、乾燥させた。次に、前記多孔質膜の目が粗い方の面から、下記組成の試薬液を２μｌ点着し、送風乾燥させ、円形のスポット（薄青色）を形成した。このスポット部分を切り抜き、これを孔つきのＰＥＴフィルムで挟んで、目的とするグルコース分析用試験片を作製した。
【００８０】
（無機ゲル水溶液組成）
スメクタイト(実施例１と同一製品)          1.8質量%
CHAPS(界面活性剤)                         0.4質量%
（試薬液）
[Cu(bpy)2]Cl2                              80mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl3                     3mM
PQQ-GDH                                    1000U/ml
BSA                                        5%
CHAPS                                      0.4%
この試験片に対し、４種類のグルコース濃度の血清（０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ）を点着し、点着５秒後に反射率測定装置で色調変化を測定した（波長４７０ｎｍ）。この結果を、図７のグラフに示す。図示のように、この試験片では、点着後直ちに、グルコース濃度に応じて発色した。このグルコース濃度に応じた発色（赤褐色）は、目視によっても観察することができた。また、発色は瞬時に起こった。なお、前記グルコース添加血清は、解糖しきったヒト全血の血漿を凍結融解し、得られた血清に対して、前記種々濃度でグルコースを添加して調製した。
【実施例８】
【００８１】
下記組成の試薬液100μlに対して、グルコース水溶液500mMを10μl添加した。すると、１分以内に、前記試薬液の当初の色調である緑色が、赤褐色に変化するのを、目視で確認できた。なお、前記試薬液の当初の色調が緑色なのは、GODに含まれる補酵素FADの黄色と、銅の青色とが混ざって緑色となるためである。
【００８２】
（試薬液組成）
GOD(Sigma社製、比活性209U/mg)            50mg/ml
[Cu(bpy)2]Cl2                              40mM
PIPES(pH7)                                 50mM
CHAPS                                      0.1質量%
【実施例９】
【００８３】
下記組成の試薬液100μlに対して、グルコース水溶液500mMを10μl添加した。すると、５秒以内に、前記試薬液の当初の色調である緑色が、赤褐色に変化するのを、目視で確認できた。なお、前記試薬液の当初の色調が緑色なのは、GODに含まれる補酵素FADの黄色と、銅の青色とが混ざって緑色となるためである。
【００８４】
（試薬液組成）
GOD(Sigma社製、比活性209U/mg)              50mg/ml
[Cu(bpy)2]Cl2                              40mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2                     0.3mM
PIPES(pH7)                                 50mM
CHAPS                                      0.1質量%
【実施例１０】
【００８５】
種々の配位子を有する銅錯体を作製した。すなわち、塩化銅(II)と、以下の配位子をモル比１：２で混合、精製水で溶かし、約80℃の温浴中で10分間インキュベートして配位させ、錯溶液を得た。
【００８６】
【表２】
0004090435.tif 000003
【実施例１１】
【００８７】
配位子として、以下に示す配位子とビピリジルを用い、銅の混合配位子錯体を作製した。すなわち、銅：以下の配位子：ビピリジルをモル比１：２：１で混合し、精製水で溶かし、約80℃の温浴中で10分間インキュベートして配位させ、以下の配位子を得た。
【００８８】
【表３】
0004090435.tif 000004
【実施例１２】
【００８９】
種々の配位子を用いて鉄錯体を作製した。塩化鉄(III)と以下の配位子をモル比１：３で混合、精製水で溶かし、約80℃の温浴中で10分間インキュベートして配位させ、錯溶液を得た。
【００９０】
【表４】
0004090435.tif 000005
【実施例１３】
【００９１】
以下のようにして、２種類のルテニウム錯体を作製した。
【００９２】
[Ru(NH3)6]
まず、市販のルテニウム錯体（Aldrich社 Hexaammineruthenium(III) chloride）を水溶して、[Ru(NH3)6]の錯溶液を得た。
【００９３】
[Ru(4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl)3]
＜配位子＞  11.8g(63.0mmol)の2,2'-Bipyridil-N,N'-dioxide（Aldrich社製）を氷浴で冷やした濃硫酸120mlにゆっくり溶かし、反応液を100℃に加熱した。次に硝酸カリウム64.0g(630mmol)の100ml濃硫酸溶液をゆっくりと滴下し、その後１時間加熱攪拌した。反応後、溶液を室温まで放冷し、砕氷へ注ぎ、4,4'-Dinitro-2,2'-bipyridyl-N,N'-oxide の固体を濾過して得た。アルゴン気流下、4,4'-Dinitro-2,2'-bipyridyl-N,N'-oxide 7.0g(25mM)、10%パラジウム炭素6.0gをエタノール23mlに懸濁させた。この溶液にヒドラジン一水和物6.3g(126mmol)の47mlエタノール溶液を滴下し、8時間還流した。反応液を放冷後、濾過し、濾液を濃縮した。精製はシリカゲルカラムで行い、4,4'-Diamino-2,2'-bipyridylを得た。
【００９４】
＜合成＞  50mLの2つ首フラスコにエチレングリコール(10mL)を入れ、DA-bpy(0.2g)、RuCl3(0.1g)を順次、撹拌溶解させ、N2気流下で強撹拌しながらマントルヒーターで加熱し、約４時間還流した。
【００９５】
＜精製＞  N2気流下で撹拌・放冷した後100mLのナス型フラスコに移し、反応液をアセトン(5mL)＋ジエチルエーテル(20mL)で洗浄した。溶媒のエチレングリコールが十分に除かれるまで、反応液をアセトン(5mL)＋ジエチルエーテル(20mL)で繰り返し洗浄した。十分に洗浄した目的物をエタノールで溶解させ、ジエチルエーテルを加えることによって目的物を沈殿させた。ジエチルエーテルで洗浄しながら濾別し、減圧乾燥させて、[Ru(4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl)3]の固体を得た。これを水溶して、錯溶液を得た。
【実施例１４】
【００９６】
以下のようにして、2種類のオスミウム錯体を作製した。
【００９７】
[OsCl(Him)(dmbpy)2]
<合成>  (NH4)2[OsCl6]2.00g(4.56mmol、Aldrich)と4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl（dmbpy 和光純約薬）1.68g(9.11mmol)を窒素気流下、エチレングリコール60ml中で1h還流した。室温まで冷却した後、1M亜二チオン酸ナトリウム水溶液120mlを30minかけて加え、氷浴中で30min冷却した。得られた沈澱を減圧ろ過し、十分に水で洗浄した(500〜1000ml使用)。さらにジエチルエーテルで２度洗浄した後、減圧乾燥した。これで[OsCl2(dmbpy)2]を1.5〜1.7g得る。得られた[OsCl2(dmbpy)2]1.56g(2.60mmol)とImidazole（Him）0.36g(5.2mmol)を窒素気流下、水/メタノール混合溶媒50ml中で2h還流した。室温まで冷却した後、飽和NaCl水溶液300mlを加えた。得られた沈澱を減圧ろ過し、飽和NaCl水溶液で洗浄した後、減圧乾燥し、[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2を得た。
【００９８】
<精製>  [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2をできるだけ少量のアセトニトリル/メタノール(1:1v/v)で溶かし、カラムクロマトグラフィー（吸着剤：活性アルミナ，展開溶媒：アセトニトリル/メタノール）で精製した。溶媒をエバポレートした後、少量のアセトンに溶かし、ジエチルエーテルで再沈澱させた。得られた沈澱を減圧ろ過した後、減圧乾燥した。これを水溶して錯溶液を得た。
【００９９】
[Os(Him)2(dmbpy)2]
<合成>  (NH4)2[OsCl6]2.00g(4.56mmol)とdmbpy1.68g(9.11mmol)を窒素気流下、エチレングリコール60ml中で1h還流した。室温まで冷却した後、1M亜二チオン酸ナトリウム水溶液120mlを30minかけて加え、氷浴中で30min冷却した。得られた沈澱を減圧ろ過し、十分に水で洗浄した(500〜1000ml使用)。さらにジエチルエーテルで２度洗浄した後、減圧乾燥した。これで[OsCl2(dmbpy)2]を1.5〜1.7g得る。得られた[OsCl2(dmbpy)2]1.56g(2.60mmol)とHim0.36g(5.2mmol)を窒素気流下、１，２−エタンジオール溶媒50ml中で2h還流した。室温まで冷却した後、飽和NaCl水溶液300mlを加えた。得られた沈澱を減圧ろ過し、飽和NaCl水溶液で洗浄した後、減圧乾燥し、[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2を得た。
【０１００】
<精製>  [Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2をできるだけ少量のアセトニトリル/メタノール(1:1v/v)で溶かし、カラムクロマトグラフィー（吸着剤：活性アルミナ，展開溶媒：アセトニトリル/メタノール）で精製した。溶媒をエバポレートした後、少量のアセトンに溶かし、ジエチルエーテルで再沈澱させた。得られた沈澱を減圧ろ過した後、減圧乾燥した。これを水溶して錯溶液を得た。
【実施例１５】
【０１０１】
以下の試薬液組成１〜６で、ＮＮ配位型フェナントロリン配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図８Ａ〜図８Ｆに示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１０２】
(試薬液組成１：図８Ａ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(1,10-Phenanthroline)2]                 1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成２：図８Ｂ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(1,10-Phenanthroline)3]                 0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成３：図８Ｃ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(Bathophenanthroline)2]                 1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Bathophenanthroline＝4,7-Diphenyl phenanthoroline）
(試薬液組成４：図８Ｄ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(Bathophenanthroline)3]                 1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Bathophenanthroline＝4,7-Diphenyl phenanthoroline）
(試薬液組成５：図８Ｅ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(Bathophenanthroline Sulfonic Acid)2]   1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成６：図８Ｆ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(Bathophenanthroline sulfonic acid)3]   0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
【実施例１６】
【０１０３】
以下の試薬液組成１〜４で、ＮＮ配位型ビピリジル配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図９Ａ〜図９Ｄに示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１０４】
(試薬液組成１：図９Ａ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(2,2'-Bipyridyl)2]                      1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成２：図９Ｂ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(2,2'-Bipyridyl)3]                      1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成３：図９Ｃ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl)3]         0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成４：図９Ｄ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Ru(4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl)3]         10mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
【実施例１７】
【０１０５】
以下の試薬液組成１〜３で、ＮＮ配位型トリアジン配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１０Ａ〜図１０Ｃに示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１０６】
(試薬液組成１：図１０Ａ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(TPTZ)2]                                1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（TPTZ＝2,4,6-Tripyridyl-s-triazine）
(試薬液組成２：図１０Ｂ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(TPTZ)3]                                0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（TPTZ＝2,4,6-Tripyridyl-s-triazine）
(試薬液組成３：図１０Ｃ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(PDTS)3]                                1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（PDTS＝3-(2-Pyridyl)-5,6-bis(4-sulfophenyl)-1,2,4-triazine）
【実施例１８】
【０１０７】
以下の試薬液組成で、ＮＮ配位型ビキノリン配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１１に示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１０８】
(試薬液組成)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(Cuproin)2]                             1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Cuproin＝2,2'-Biquinoline）
【実施例１９】
【０１０９】
以下の試薬液組成で、ＮＮ配位型ピリジルアゾ配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１２に示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１１０】
(試薬液組成)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(Nitro-PAPS)3]                          0.02mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Nitro-PAPS＝2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol）
【実施例２０】
【０１１１】
以下に示す組成で、錯体・酵素（ピルビン酸オキシダーゼ）・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図１５に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
【０１１２】
(試薬液組成)
Pyruvate Oxidase                           100U/mL
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                        0.1mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Him＝Imidazole）
（dmbpy＝4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl）
【実施例２１】
【０１１３】
以下の試薬液組成１〜３で、ＮO配位型配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１３Ａ〜図１３Ｃに示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１１４】
(試薬液組成１：図１３Ａ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(Nitroso-PSAP)3]                        0.05mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Nitroso-PSAP＝2-Nitroso-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol）
(試薬液組成２：図１３Ｂ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(Nitroso-ESAP)3]                        0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Nitroso-ESAP＝2-Nitroso-5-[N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol）
(試薬液組成３：図１３Ｃ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(1-Nitroso-2-Naphthol)3]                0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
【実施例２１】
【０１１５】
以下の試薬液組成で、ＮＳ配位型配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１４に示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１１６】
(試薬液組成)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(2-Amino-4-thiazoleacetic acid)3]       1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
【実施例２２】
【０１１７】
以下の試薬液組成で、ＯＯ配位型配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１５に示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１１８】
(試薬液組成)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Fe(1,2-Naphthoquinone-4-Sulfonic acid)3]  1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
【実施例２３】
【０１１９】
以下の試薬液組成１〜５で、混合配位子の錯体、酵素、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１６Ａ〜図１６Ｅに示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１２０】
(試薬液組成１：図１６Ａ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                        0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Him＝Imidazole）
（dmbpy＝4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl）
(試薬液組成２：図１６Ｂ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Os(Him)2(dmbpy)2]                          0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成３：図１６Ｃ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(L-Arg)2(bpy)]                          1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（L-Arg＝L-Arginine）
（bpy＝2,2'-Bipyridyl）
(試薬液組成４：図１６Ｄ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(en)2(bpy)]                             1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（en＝Ethylenediamine）
（bpy＝2,2'-Bipyridyl）
(試薬液組成５：図１６Ｅ)
PQQ-GDH                                    50U/mL
[Cu(Him)2(bpy)]                            1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
【実施例２４】
【０１２１】
以下の試薬液組成１、２で、錯体、酵素（グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピルビン酸オキシダーゼ）、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。このスペクトルを測定し、ブランクとし、さらに錯体に対し当量のGlucose若しくはピルビン酸を添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を、図１７Ａ、図１７Ｂに示す。なお、錯体は、前述の実施例により調製したものを使用した。
【０１２２】
(試薬液組成１：図１７Ａ)
GOD                                        100U/mL
[Cu(2,2'-Bipyridyl)2]                      1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
(試薬液組成２：図１７Ｂ)
Pyruvate Oxidase                           100U/mL
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                         0.1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（Him＝Imidazole）
（dmbpy＝4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl）
【実施例２５】
【０１２３】
以下の試薬液組成で、緩衝液を混合し、試薬液を調製した。また、下記の酵素液１、２、３を調製した。そして、10mm長のディスポセルに0、10、20、30mMグルコース水溶液を10μL（終濃度0、0.1、0.2、0.3mM）添加し、ついで、前記試薬液500μLを添加し、最後に、酵素液500μL添加して反応を開始し、分光光度計（波長600nm）にて50sec間の吸光度変化を観察した。その結果を、図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃに示す。図示のように、酵素量を増やすほど、反応速度が向上し、酵素活性1000U/mLの場合は、5秒程度で反応の終局に達した。反応が終局に達した５秒間付近のシグナルをサンプリングすれば、グルコースの定量が可能である。また、反応が終局に達するタイムコースの傾きからもグルコースの定量が可能である。
【０１２４】
（試薬組成）
Cu(PDTS)2                                  1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5%
（酵素液１：図１８Ａ）
PQQ-GDH                                    111U/mL
（酵素液２：図１８Ｂ）
PQQ-GDH                                    333U/mL
（酵素液３：図１８Ｃ）
PQQ-GDH                                    1000U/mL
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
以上のように、本発明の比色分析方法によれば、短時間かつ簡単に信頼性のある分析を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】  図１は、本発明の一実施例における反射率のグルコース濃度依存特性を示すグラフである。
【図２】  図２は、本発明のその他の実施例における反射率のグルコース濃度依存特性を示すグラフである。
【図３】  図３は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図４】  図４は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図５】  図５は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図６】  図６は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図７】  図７は、本発明のさらにその他の実施例における反射率のグルコース濃度依存特性を示すグラフである。
【図８】  図８Ａ〜図８Ｆは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１】  図９Ａ〜図９Ｄは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１０】  図１０Ａ〜図１０Ｃは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１１】  図１１は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１２】  図１２は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１３】  図１３Ａ〜図１３Ｃは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１４】  図１４は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１５】  図１５は、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１６】  図１６Ａ〜図１６Ｅは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１７】  図１７Ａと図１７Ｂは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１８】  図１８Ａ〜図１８Ｃは、本発明のさらにその他の実施例における色調変化を示すグラフである。
【図１】
0004090435.tif 000006
【図２】
0004090435.tif 000007
【図３】
0004090435.tif 000008
【図４】
0004090435.tif 000009
【図５】
0004090435.tif 000010
【図６】
0004090435.tif 000011
【図７】
0004090435.tif 000012
【図８Ａ】
0004090435.tif 000013
【図８Ｂ】
0004090435.tif 000014
【図８Ｃ】
0004090435.tif 000015
【図８Ｄ】
0004090435.tif 000016
【図８Ｅ】
0004090435.tif 000017
【図８Ｆ】
0004090435.tif 000018
【図９Ａ】
0004090435.tif 000019
【図９Ｂ】
0004090435.tif 000020
【図９Ｃ】
0004090435.tif 000021
【図９Ｄ】
0004090435.tif 000022
【図１０Ａ】
0004090435.tif 000023
【図１０Ｂ】
0004090435.tif 000024
【図１０Ｃ】
0004090435.tif 000025
【図１１】
0004090435.tif 000026
【図１２】
0004090435.tif 000027
【図１３Ａ】
0004090435.tif 000028
【図１３Ｂ】
0004090435.tif 000029
【図１３Ｃ】
0004090435.tif 000030
【図１４】
0004090435.tif 000031
【図１５】
0004090435.tif 000032
【図１６Ａ】
0004090435.tif 000033
【図１６Ｂ】
0004090435.tif 000034
【図１６Ｃ】
0004090435.tif 000035
【図１６Ｄ】
0004090435.tif 000036
【図１６Ｅ】
0004090435.tif 000037
【図１７Ａ】
0004090435.tif 000038
【図１７Ｂ】
0004090435.tif 000039
【図１８Ａ】
0004090435.tif 000040
【図１８Ｂ】
0004090435.tif 000041
【図１８Ｃ】
0004090435.tif 000042