(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１においてＳｅｒ１２９がリン酸化された蛋白質と特異的に結合する抗体。
【請求項２】
配列番号２においてＳｅｒ６がリン酸化されたペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項３】
さらに配列番号１においてＳｅｒ１２９がリン酸化されていない蛋白質とは結合しない請求の範囲第１項又は第２項に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
ポリクローナル抗体である請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の抗体を含有することを特徴とするシヌクレイノパチー病変検出薬。
【請求項７】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の抗体を使用することを特徴とする配列番号１においてＳｅｒ１２９がリン酸化されたα−シヌクレインの検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、レビー小体等のα−シヌクレイン凝集物に特異的に結合する抗体、該抗体を含有するレビー小体及びシヌクレイノパチー（シヌクレイン症）病変の検出薬ならびにレビー小体及びシヌクレイノパチー（シヌクレイン症）病変の検出方法に関する。
背景技術
パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型痴呆症（ＤＬＢ）等の変性神経細胞にはレビー小体（ＬＢ）などの形でα−シヌクレインが凝集・蓄積する［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５２  ８７９（１９９８）］。α−シヌクレインはＰＤ、ＤＬＢ以外にも脊髄小脳変性症の一種である多系統萎縮症のグリア細胞やＨａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ病におけるＬＢ、変性神経突起などに蓄積することが知られ、これらの疾患はシヌクレイノパチー（シヌクレイン症）と総称される。さらに家族性ＰＤ家系でα−シヌクレインの変異が見出されたこと［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：２０４５（１９９７）］からα−シヌクレインのＰＤならびにシヌクレイノパチー発症における役割が注目されている。
しかし、α−シヌクレインを細胞内で過剰発現させるのみではＬＢは形成されないという事実、α−シヌクレイン変異が家族性ＰＤ以外では認められないことなど、ＰＤ及びＤＬＢとα−シヌクレインとの関係には未だ不明な点が多く、分子レベルでの解明が待たれている。
これまでα−シヌクレインの研究にあたり種々の抗α−シヌクレイン抗体が調製されてきたが、これら抗体はレビー小体等と結合するとともに正常脳に存在するα−シヌクレインとも結合することが知られていた。
一方、α−シヌクレインのＳｅｒはＧ蛋白結合型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）、カゼインキナーゼ（ＣＫ１、ＣＫ２）などによりリン酸化されうる［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２６５１５（２０００），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，３９０（２０００）］が、生理的条件下において、あるいは上記レビー小体などＰＤあるいは他のシヌクレイノパチーなどの病的条件下においてリン酸化されているという報告はない。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究した結果、レビー小体等の凝集物を構成するα−シヌクレインにおいて構成アミノ酸の１部がリン酸化されていることを発見した。さらにこのリン酸化アミノ酸を有する合成ペプチドを抗原として調製した抗体が、α−シヌクレイン凝集物と特異的に結合することを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は配列番号１において１又は２以上のＳｅｒがリン酸化された蛋白質と特異的に結合する抗体である。
また、本発明は配列番号１においてＳｅｒ９、Ｓｅｒ４２、Ｓｅｒ８７又はＳｅｒ１２９のいずれか１つがリン酸化された蛋白質と特異的に結合する抗体である。
また、本発明は配列番号１においてＳｅｒ１２９がリン酸化された蛋白質と特異的に結合する抗体である。
また、本発明は配列番号２においてＳｅｒ６がリン酸化されたペプチドと特異的に結合する抗体である。
また、本発明は配列番号１においてＳｅｒ８７がリン酸化された蛋白質と特異的に結合する抗体である。
また、本発明は配列番号３においてＳｅｒ６がリン酸化されたペプチドと特異的に結合する抗体である。
また、本発明は上記抗体のいずれかを含有することを特徴とするシヌクレイノパチー病変検出薬である。
また、本発明は上記抗体のいずれかを使用することを特徴とする配列番号１においてＳｅｒ１２９又はＳｅｒ８７がリン酸化されたα−シヌクレインの検出方法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、「配列番号１において１又は２以上のＳｅｒがリン酸化された蛋白質」とは、配列番号１の９、４２、８７又は１２９番目のいずれかのＳｅｒがリン酸化された蛋白質であり、リン酸化されるＳｅｒは１箇所であっても複数箇所であってもよい。
Ｓｅｒ１２９とはアミノ酸配列においてＮ末端から１２９番目に位置するアミノ酸であるＳｅｒを意味し、Ｓｅｒ６とはアミノ酸配列においてＮ末端から６番目に位置するアミノ酸であるＳｅｒを意味し、Ｓｅｒ８７とはアミノ酸配列においてＮ末端から８７番目に位置するアミノ酸であるＳｅｒを意味する。
「特異的に結合する」とは、配列番号１のＳｅｒがリン酸化されたα−シヌクレインには結合（又は反応）するが、リン酸化されていないα−シヌクレインには結合（又は反応）しないことを意味する。例えば、配列番号１においてＳｅｒ１２９がリン酸化された蛋白質とは結合するが、Ｓｅｒ１２９がリン酸化されていない蛋白質とは結合しないことである。
具体的には、Ｓｅｒがリン酸化されたペプチドあるいは全長α−シヌクレインとＥＬＩＳＡ法あるいはウェスタンブロット法で陽性反応を呈するが、Ｓｅｒがリン酸化されていないペプチドあるいは全長α−シヌクレインとは反応を示さないことを意味する。
「抗体」とは、完全な全長分子からなるシヌクレイン及びリン酸化されたＳｅｒを含むフラグメントと特異的に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、又はこれらの抗体の部分フラグメント（例えばパパインまたはペプシンで分解して得られる断片（ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’））を意味し、後述するように公知の製造方法に従って製造することができる。
「シヌクレイノパチー病変検出薬」とは、ＬＢあるいはその他のα−シヌクレイン陽性病変（例えば、ＧＣＩやＬｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅなどの変性神経突起）を呈するシヌクレイノパチーの脳組織の免疫組織化学的検索において陽性反応を呈し、あるいは脳組織のウェスタンブロット解析により不溶化・蓄積したα−シヌクレインと特異的に反応する抗体、試薬又は薬剤を意味する。
シヌクレイノパチー病変の検出には、検出感度の点から、配列番号１においてＳｅｒ１２９がリン酸化された蛋白質とは結合するが、Ｓｅｒ１２９がリン酸化されていない蛋白質とは結合しない抗体を用いることが好ましい。
本発明に係る抗体は以下のような製造法に従って製造することが可能である。
（１）抗原の調製
ＤＬＢ脳を各種界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに、不溶画分を尿素に溶解し、陰イオン交換カラム、例えば、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにより精製を行う。精製物を臭化シアンで消化後、ＨＰＬＣでペプチド断片を分離したところ、Ｓｅｒのリン酸化された目的物を得ることができる。また、リン酸化Ｓｅｒを含む合成ペプチド、例えば、
▲１▼  ＣＡＹＥＭＰＳ（ＰＯ３Ｈ２）ＥＥＧＹＱ（配列番号２のＮ末端にシステインを付加したもの）
▲２▼  ＣＶＥＧＡＧＳ（ＰＯ３Ｈ２）ＩＡＡＡＴ（配列番号３のＮ末端にシステインを付加したもの）
は、固相法により合成することができる。合成したペプチドはＮ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを縮合試薬として用い、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｙｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎと結合させ、抗原として用いる。なお、▲１▼及び▲２▼はアミノ酸は１文字表記により表されたペプチドであり、特に  Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）はリン酸化セリンを表す。
（２）抗体の調製
抗原ペプチド溶液を、温血動物に対してそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに計２〜１０回程度投与することにより免疫する。用いられる温血動物は、例えば、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラットがあげられる。４回ないし６回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、抗原として用いたペプチドを９６穴のマイクロタイタープレートに固定し、ＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。精製方法は、例えばゲル濾過法、プロテインＡなどの活性吸着剤による精製法をあげることができ、さらにリン酸化されていないリコンビナントα−シヌクレイン蛋白を結合したカラムの素通し画分を採取することによりリン酸化α−シヌクレインに対する特異性を向上させることができる。
（３）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体産生細胞の作製は、抗原を免疫された温血動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を調製することができる。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒ等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５））に従い実施できる。骨髄腫細胞としては例えばＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１などがあげられる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルス（ＨＶＪ）をあげることができるが、好ましくは分子量１０００〜６０００のＰＥＧである。１０〜８０％程度の濃度で添加し、２０〜４０℃でインキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体の選別は、公知の方法に準じて行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別及び育種用培地としては、例えば、１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地などを用いることができる。培養は、通常５％炭酸ガス下、培養温度２０〜４０℃にて５日〜３週間行なわれる。
ハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し，ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によって抗原ペプチドと反応がある抗体を選択する。まず９６穴プレートに抗原ペプチドをしき、一晩底面に吸着させた後、仔牛血清でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の上清を３７℃、１時間反応させた後、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を３７℃、１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質に用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定して３程度の値がでた抗体を選択し，限界希釈法によるクローニングを行う。
かくして得られる目的とするハイブリドーマ細胞を培養してその培養上清よりモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマ細胞を例えばマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に腹腔内投与し、その腹水中からモノクローナル抗体を得ることもできる。
モノクロナール抗体の精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。
産業上の利用可能性
本発明により、レビー小体等の生体内で検出されるα−シヌクレイン凝集物に特異的に結合する抗体の提供が可能となり、レビー小体検出、ＰＤ、ＤＬＢを含むシヌクレイノパチーの病理診断等に有用である。
実施例１  ＤＬＢ脳より抽出したα−シヌクレインのウェスタンブロット解析
ＤＬＢ脳及び正常脳の大脳皮質より灰白質を切り出し、各種界面活性剤を用いて次のように段階的に可溶化した。まず、大脳皮質はＴｒｉｓ  Ａ溶液ｐＨ７．５［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ），１ｍＭ  ＥＧＴＡ（和光純薬），０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉｐａｉｎ（ＳＩＧＭＡ社），１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社），１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（和光純薬），５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（関東化学），２５ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（関東化学），２０ｍＭ  ＮａＦ（関東化学），１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７（関東化学）］中でホモジナイズし、遠心機（日立工機）で４℃、５分、１，０００×ｇで遠心分離した。得られた上清を１０００ｇ  ｓｕｐ、得られた沈殿物を１０００ｇ  ｐｐｔとする。１０００ｇ  ｓｕｐは遠心機で４℃、１５分、３５０，０００×ｇで遠心分離した。この上清をＴｒｉｓ可溶画分とする。
１０００ｇ  ｐｐｔはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液［Ｔｒｉｓ  Ａ溶液，１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（和光純薬），１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ（関東化学），０．５Ｍ  ＮａＣｌ（関東化学）］中でホモジナイズ後、遠心機で４℃、１５分、３５０，０００×ｇで遠心分離した。上清はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ可溶画分とした。
得られた沈殿物Ｓａｒｋｏｓｙｌ溶液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ（和光純薬）］中でホモジナイズ後、遠心機で２５℃、１５分、３５０，０００×ｇで遠心分離した。上清はＳａｒｋｏｓｙｌ可溶画分とした。
こうして得られた沈殿物を再びＳａｒｋｏｓｙｌ溶液中でホモジナイズ後、遠心機で２５℃、１５分、３５０，０００×ｇで遠心分離した。ここで得られるＳａｒｋｏｓｙｌ不溶性の沈殿物をＴｒｉｓ  Ａ  溶液ｐＨ７．５中でホモジナイズ後、遠心機で２５℃、１５分、３５０，０００×ｇで遠心分離した。得られた沈殿物を尿素溶液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＧＴＡ、８Ｍ尿素（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）］中で超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ社）により超音波処理後、３７℃の湯浴に３０分間静置した。その後、２５℃、１５分、３５０，０００×ｇで遠心分離した。この上清を尿素可溶画分とする。
こうして得られた、Ｔｒｉｓ可溶画分、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ可溶画分、Ｓａｒｋｏｓｙｌ可溶画分、尿素可溶画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いて電気泳動し、イモビロン膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写した後、ヒトα−シヌクレインを特異的に認識するモノクローナル抗体ＬＢ５０９［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５２  ８７９（１９９８）］でイムノブロッティング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４  ２０２５（１９９７）］により解析した結果、正常な可溶性α−シヌクレインはＤＬＢ脳、正常脳のＴｒｉｓ可溶画分及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ可溶画分に回収された。一方、尿素可溶画分においては、ＤＬＢ脳に特異的にウエスタンブロット上１５キロダルトン（ｋＤａ）の位置に正常α−シヌクレインとほぼ同じ泳動パターンを示す不溶性α−シヌクレインが検出された（図１）。
正常なα−シヌクレインは以下のように精製した。ＤＬＢ脳及び正常脳の大脳皮質から得られたＴｒｉｓ可溶画分に硫酸アンモニウム（関東化学）を最終濃度５０％となるように加え、氷上で３０分以上静置した後、遠心機で４℃、１５分、３５０，０００×ｇで遠心分離した。上清を取り除き、沈殿物をＴｒｉｓ  Ｂ溶液ｐＨ７．５［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１％  ２−メルカプトエタノール（関東化学），０．５Ｍ  ＮａＣｌ］に懸濁後、熱処理［１００℃，５分］し、遠心操作により上清を回収した。上清に含まれた塩をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で取り除いた後、ＤＥＡＥ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて精製すると可溶性α−シヌクレインは約０．１Ｍ  ＮａＣｌ画分に溶出された。凍結乾燥機（Ｔｏｍｙ社）で濃縮した後、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６×６００ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社）により分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたウエスタンブロッティング法によりα−シヌクレインが含まれていることを確認した分子量約１５ｋＤａの画分をＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ３００カラム（２．１×３０ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分画したところ、α−シヌクレインはアセトニトリル（関東化学）濃度約６０％の画分に分画された。
ＤＬＢ脳由来の尿素可溶画分に含まれるα−シヌクレインは次のように精製した。まず尿素可溶画分に含まれる蛋白をＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に吸着させ、０Ｍ，０．１Ｍ，０．２Ｍ，０．３Ｍ，０．５ＭのＮａＣｌを含む尿素溶液で段階的に吸着した蛋白質を溶出すると、α−シヌクレインは０．３Ｍ  ＮａＣｌ画分に溶出された。この画分を逆相ＨＰＬＣでＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ３００カラムを用いて分画したところ、α−シヌクレインはアセトニトリル濃度約６０％の画分に回収された。
このようにＨＰＬＣを用いて精製したＴｒｉｓ可溶画分及び尿素可溶画分に含まれるα−シヌクレインを凍結乾燥機で乾固後、７０％ギ酸（和光純薬）溶液に懸濁し、０．２％臭化シアン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）で化学的にペプチド結合を切断した。反応後、溶液を約１０倍に希釈し、凍結乾燥機で乾固後、８Ｍグアニジン塩酸（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）水溶液に懸濁した。こうして得られたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣでＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂカラム（２．１×１２５ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ社）を用いて分離、分画した。
分離した各画分をＴＯＦ（ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ）型質量分析機（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）及びアミノ酸配列解析機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析［Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７  １７０４７（１９９２）］した。その結果、Ｔｒｉｓ可溶画分由来からはアセトニトリル濃度約３１％の画分にα−シヌクレインのＣ末端部分１１７〜１２７に相当する質量数１２３２のシグナル、アセトニトリル濃度約３３％の画分に最Ｃ末端部分１２８〜１４０に相当する質量数１５１５のシグナルが検出された。尿素可溶画分由来からはこれらのシグナルに加え、アセトニトリル濃度約３１％の画分にα−シヌクレインの最Ｃ末端部分に１個のリン酸が付加した質量数１５９５のシグナルが検出された。さらに質量数１５９５のピークをナノ・エレクトロスプレー法によるＭＳ／ＭＳ解析［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７１  ２４６５（１９９８）］に供し、Ｓｅｒ１２９のリン酸化を確認した。
実施例２  抗体（ａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９）の調製
α−シヌクレインの１２４−１３４の配列を含み、且つリン酸化したＳｅｒ１２９を含むペプチド、ＣＡＹＥＭＰＳ（ＰＯ３Ｈ２）ＥＥＧＹＱを固相法により合成し（ペプチド研究所）、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｙｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とコンジュゲートし、抗原とした。ＫＬＨとのコンジュゲーションは常法に従った。１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩水溶液と１ｍｌのフロイント完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ社）を超音波処理によってエマルジョン化し、ウサギ（日本白色、体重２．７ｋｇ、雌）の背中１０箇所以上に分けて免疫した。１ヶ月後に０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ社）を超音波処理によってエマルジョン化したものを同様に追加免疫し、以降１週間毎に０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫した。採血は免疫した１週間後に行い、採取した血液はパスツールピペットでよく撹拌し室温で１時間おいた後、４℃で一晩静置し、５，０００×ｇ、１０分間遠心して抗血清を得た。
抗体を精製するため、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ  １０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）約２ｍｌに対し、リコンビナントα−シヌクレイン（［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４３６  ３０９（１９９８）］によって作製した。）約７．５ｍｇを反応させたカラムを作製した。抗血清を５６℃、１０分間処理することにより非働化した後、ＰＢＳ（８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬）、２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（和光純薬），１３１ｍＭ  ＮａＣｌ）で５倍希釈し、５μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に通してから、このカラムに１０時間以上循環し、カラムに吸着されなかった抗体をＳｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体とした。
実施例３  病理組織の染色ならびにウェスタンブロット解析
実施例２において調製したＳｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体（ａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９）を用いてＰＤ、ＤＬＢ脳を染色した。
ＤＬＢ脳大脳皮質をホルマリン固定後、５０ミクロン厚に薄切し、抗ヒトα−シヌクレイン抗体ＬＢ５０９（Ａ）及びＳｅｒ１２９リン酸化特異α−シヌクレイン抗体（Ｂ）を用いてアビジン・ビオチン複合体法により免疫染色し、ジアミノベンチジンで褐色に発色した。すると、中脳黒質や大脳皮質においてＬＢ及びＬｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅなどの関連病変が強い陽性反応を示したが、従来の抗α−シヌクレイン抗体によって認識されるニューロピルに細顆粒状に分布する正常α−シヌクレイン［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５２  ８７９（１９９８）］（図２Ａ）は、本抗体には陰性であった（図２Ｂ）。また、多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者脳に出現する細胞内封入体ＧＣＩ（ｇｌｉａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）も従来の抗α−シヌクレイン抗体と同様に本抗体に対しても強い陽性反応を示した。
実施例１においてＤＬＢ脳及び正常脳の大脳皮質を各種界面活性剤を用いて段階的に可溶化した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたウエスタンブロッティング法にて解析した結果、Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体はＴｒｉｓ可溶画分、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ可溶画分に含まれる正常のα−シヌクレインとは反応せず、尿素可溶画分に含まれるα−シヌクレインのみと特異的に反応した（図３）。
実施例４  抗体（ａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９）の特異性
実施例２において調製したα−シヌクレイン抗体がＳｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体であることはＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）にて確認した。
常法に従って９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、５μｇ／ｗｅｌｌのリコンビナントα−シヌクレインあるいは抗原ペプチドを底面に吸着させた後、実施例２で調製したα−シヌクレイン抗体を１００倍希釈して反応させ、常法を用いて発色させると、リコンビナントα−シヌクレインとは結合を示さなかったが、抗原ペプチドとは強い反応性を示した（図４）。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたウエスタンブロッティング法において、この抗体はＤＬＢ脳由来の尿素可溶画分のα−シヌクレインと強く反応したが、この画分とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）を１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、６５℃、２時間反応させる［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７  １７０４７（１９９２）］ことにより反応性が消失した。
さらに、免疫組織化学的検討においては、この抗体と抗原ペプチドを混和することにって抗原に対する抗体の反応性を吸収したところ［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５２  ８７９（１９９８）］、吸収抗体に対するＬＢ及びＬｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅなどの関連病変の反応性が消失した。
実施例５    抗体（ｍＡｂ  ＰＳｅｒ１２９）の作製
α−シヌクレインの１２４−１３４の配列を含み、且つリン酸化したＳｅｒ１２９を含むペプチド、ＣＡＹＥＭＰＳ（ＰＯ３Ｈ２）ＥＥＧＹＱをＫＬＨとコンジュゲートし、抗原とした。１００μｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩水溶液に０．５％  ＳＤＳを加え、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ，６週齢）背中に免疫した。２週間後に５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩水溶液、０．５％  ＳＤＳ、フロイント不完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫し、以降１週間毎に追加免疫を行った。免疫後４０日目に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ペニシリン，ストレプトマイシン入り）中でリンパ球を取り出し、０．１７Ｍの塩化アンモニウムで赤血球処理をおこなった。取り出したリンパ球をポリエチレングリコール法（ＰＥＧ４０００）によりマウス骨髄腫由来のミエローマ細胞ＰＡＩ株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。ハイブリドーマ細胞をフィーダー細胞入りのＨＡＴ培地に懸濁し９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に分注し１５日間培養した。
実施例６  モノクローナル抗体（ｍＡｂ  ＰＳｅｒ１２９）のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し，ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によって抗原ペプチドと反応があるｍＡｂ  ＰＳｅｒ１２９を選択した。まず９６穴プレートに４０μｌの１０μｇ／ｍｌ抗原ペプチドをしき、４℃、一晩底面に吸着させた後、１００μｌの１０％仔牛血清で３７℃、３０分間ブロッキングさせた。ハイブリドーマ細胞の上清５０μｌを３７℃、１時間反応させた後、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を１０００倍に希釈して３７℃、１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質に用いて発色させた。２５μｌの８Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定して３程度の値がでたｍＡｂ  ＰＳｅｒ１２９を選択し，限界希釈法によるクローニングを行った。
７日前、３日前にそれぞれ０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に、選択したｍＡｂ  ＰＳｅｒ１２９のハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、約１０日後に腹水を採取した。採取した腹水は室温で３０分おいた後、４℃で一晩静置し，１５Ｋｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。
実施例７  モノクローナル抗体（ｍＡｂ  ＰＳｅｒ１２９）の特異性
９６穴プレートに抗原ペプチドあるいはリコンビナントα−シヌクレインを底面に吸着させた後、α―シヌクレイン抗体（腹水）を１０００倍希釈して反応させ発色させるとリコンビナントα−シヌクレインとは結合しなかったが、抗原ペプチドとは特異的に強く反応した（図５）。
ＤＬＢ脳の大脳皮質を各種界面活性剤を用いて段階的に可溶化した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたウエスタンブロッティング法にて解析した結果、Ｓｅｒ１２９リン酸化α―シヌクレイン抗体はＴｒｉｓ可溶画分、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ可溶画分に含まれる正常のα―シヌクレインとは反応せず、尿素可溶画分に含まれるα―シヌクレインと特異的に反応した（図６）。
実施例８  抗体（ａｎｔｉ−ＰＳｅｒ８７）の調製
α−シヌクレインの８２−９２の配列を含み、且つリン酸化したＳｅｒ８７を含むポリペプチド［ＫＬＨ］−ＣＶＥＧＡＧＳ（ＰＯ３Ｈ２）ＩＡＡＡＴを合成し（ペプチド研究所）、抗原とした。
１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩溶液と１ｍｌのフロイント完全アジュバント  （ＳＩＧＭＡ社）を超音波処理によってエマルジョン化し、ウサギ（日本白色、体重２．７ｋｇ、雌）の背中１０箇所以上に分けて免疫した。１ヶ月後に０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ社）を超音波処理によってエマルジョン化したものを同様に２次免疫し、以降１週間毎に０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫した。採血は免疫した１週間後に行い、採取した血液はパスツールピペットでよく撹拌し室温で１時間おいた後、４℃で一晩静置し、５，０００×ｇ、１０分間遠心して抗血清を得た。
抗体を精製するため、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ  １０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）約２ｍｌに対し、リコンビナントα−シヌクレイン（［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４３６  ３０９（１９９８）］によって作製した。）約７．５ｍｇを反応させたカラムを作製した。抗血清を５６℃、１０分間処理することにより非働化した後、ＰＢＳ（８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬），２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（和光純薬），１３１ｍＭ  ＮａＣｌ）で５倍希釈し、５μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に通してから、このカラムに１０時間以上循環し、カラムに吸着されなかった抗体をＳｅｒ８７リン酸化α−シヌクレイン特異抗体とした。
実施例９  抗体（ａｎｔｉ−ＰＳｅｒ８７）の特異性
実施例８において調製したα−シヌクレイン抗体がＳｅｒ８７リン酸化α−シヌクレイン特異抗体であることをＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）にて確認した。
９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、１．２５μｇ／ｗｅｌｌのリコンビナントα−シヌクレインあるいは抗原ペプチド（抗体作成に使用したもの）を底面に吸着させた後、実施例８で調製したα−シヌクレイン抗体を１００倍希釈して反応させると、リコンビナントα−シヌクレインとは結合を示さなかったが、抗原ペプチドとは強い反応性を示した。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はＤＬＢ脳より抽出したα−シヌクレインのウェスタンブロット解析の結果を表す。ＤＬＢ脳を５０ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、８Ｍ尿素（Ｕｒｅａ）で可溶化することにより得られた画分を抗ヒトα−シヌクレイン抗体ＬＢ５０９を用いてウェスタンブロット解析した。Ｃは正常対照人脳、ＤはＤＬＢ患者脳を表す。分子量マーカー位置（キロダルトン表示）を左側に示す。１５キロダルトンの位置にα−シヌクレイン蛋白のバンドが陽性を示す。
図２はＤＬＢ脳組織の抗α−シヌクレイン抗体ならびにリン酸化特異抗α−シヌクレイン抗体による染色の結果を表す。ＤＬＢ脳大脳皮質をホルマリン固定後、５０ミクロン厚に薄切し、抗ヒトα−シヌクレイン抗体ＬＢ５０９（Ａ）及びＳｅｒ１２９リン酸化特異α−シヌクレイン抗体（Ｂ）を用いてアビジン・ビオチン複合体法により免疫染色し、ジアミノベンチジンで褐色に発色した。ＡではＬＢが円形に陽性を示す（矢印）ほか、正常なα−シヌクレインがニューロピルの全域にびまん性に微細顆粒状の陽性染色を示しているが、神経細胞体は陰性である（＊）。ＢではＬＢ（矢印）の他に、短く縮れたＬｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅ（矢頭）が明瞭に描出されている。
図３はＤＬＢ脳より抽出したα−シヌクレインのリン酸化特異抗α−シヌクレイン抗体によるウェスタンブロット解析の結果を表す。ＤＬＢ脳を５０ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、８Ｍ尿素（Ｕｒｅａ）で可溶化することにより得られた画分をＳｅｒ１２９リン酸化特異α−シヌクレイン抗体を用いてウェスタンブロット解析した。Ｃは正常対照人脳、ＤはＤＬＢ患者脳を表す。分子量マーカー位置（キロダルトン表示）を左側に示す。１５キロダルトンの位置に尿素可溶画分特異的にリン酸化α−シヌクレイン蛋白のバンドが陽性を示す。
図４はアフィニティ精製後のＳｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体の特異性のＥＬＩＳＡによる検討を表す。横軸に表示された量のＳｅｒ１２９リン酸化ペプチド（配列は実施例２の通り）あるいはリコンビナント全長α−シヌクレインをマイクロウェルプレートに固着させ、Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体と反応後ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（フナコシ）を用いて発色させた。Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体はＳｅｒ１２９リン酸化ペプチドと特異的に反応するが、リン酸化されていないリコンビナントα−シヌクレインとは反応しない。
図５はの特異性のＥＬＩＳＡによる検討を表す。横軸に表示された量のＳｅｒ１２９リン酸化ペプチド（配列は実施例５の通り）あるいはリコンビナント全長α−シヌクレインをマイクロウェルプレートに固着させ、Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体と反応後ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（フナコシ）を用いて発色させた。Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体はＳｅｒ１２９リン酸化ペプチドと特異的に反応するが、リン酸化されていないリコンビナントα−シヌクレインとは反応しない。
図６はＤＬＢ脳より抽出したα−シヌクレインのウェスタンブロット解析の結果を表す。ＤＬＢ脳を５０ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、８Ｍ尿素（Ｕｒｅａ）、ＳＤＳで可溶化することにより得られた画分をを用いてウェスタンブロット解析した。分子量マーカー位置（キロダルトン表示）を左側に示す。１５キロダルトンの位置にα−シヌクレイン蛋白のバンドが陽性を示す。
図７はアフィニティ精製後のＳｅｒ８７リン酸化α−シヌクレイン特異抗体の特異性のＥＬＩＳＡによる検討を表す。横軸に表示された量のＳｅｒ８７リン酸化ペプチド（配列は実施例８の通り）あるいはリコンビナント全長α−シヌクレインをマイクロウェルプレートに固着させ、Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン特異抗体と反応後ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（フナコシ）を用いて発色させた。Ｓｅｒ８７リン酸化α−シヌクレイン特異抗体はＳｅｒ８７リン酸化ペプチドと特異的に反応するが、リン酸化されていないリコンビナントα−シヌクレインとは反応しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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