(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドを有効成分として含有する、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦによる血管新生の抑制剤。
（ａ）Hepatocyte growth factor（ＨＧＦ）のPyrGlu３２〜Val４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記の（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドを有効成分として含有する、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦによる血管新生の抑制剤。
（ａ）Hepatocyte growth factor（ＨＧＦ）のPyrGlu３２〜Val４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性、並びにｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド。
【請求項３】
上記ポリペプチドが、少なくとも一つのヘアピンドメイン及び４つのクリングルドメインを有するものである請求項１又は２記載の血管新生の抑制剤。
【請求項４】
上記ポリペプチドがHepatocyte growth factorをエラスターゼで消化して得られるものである請求項１又は２記載の血管新生の抑制剤。
【請求項５】
配列番号１記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦによる血管新生の抑制剤。
【請求項６】
配列番号２記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦによる血管新生の抑制剤。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦによる血管異常増殖に起因する疾患の予防又は治療剤。
【請求項８】
ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦによる血管新生の抑制剤の製造のための、下記の（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドの使用：
（ａ）Hepatocyte growth factor（ＨＧＦ）のPyrGlu３２〜Val４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド。
【請求項９】
ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦによる血管新生の抑制剤の製造のための、下記の（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドの使用：
（ａ）Hepatocyte growth factor（ＨＧＦ）のPyrGlu３２〜Val４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性、並びにｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血管新生抑制剤に関する。より詳細には、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（以下、単にＨＧＦとも称する。）のα鎖の特定領域を含む蛋白質を有効成分とする血管新生抑制剤に関する。
本発明の血管新生抑制剤は、その血管新生抑制作用に基づいて、血管異常増殖に起因する種々の疾患、例えばリウマチ性関節炎，糖尿病性網膜症，未熟児網膜症，老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の予防又は治療剤として有用である。
背景技術
血管新生とは、何らかの刺激に応じて、主に細静脈の血管内皮細胞が反応して新しい血管網を形成する現象である。この現象は、生体の正常な状況下においては、組織の代謝を維持し、生体の機能的恒常性を保持するために不可欠であり、一般に損傷の治癒過程、胎児における肺の発育、黄体形成の進展形成等で観察される。
その一方、従来から異常な血管新生が炎症性疾患を含む種々の疾患に関係していることが知られている。例えば、増殖性糖尿病、尋常性乾癬、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の疾患及び固形腫瘍の転移や再発は、血管、特に末梢毛細血管の異常増殖に起因することが報告されている（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．，１９９５，６（３），ｐｐ．２３０−２４７，Ｒｅｖｉｅｗ：Ｆｏｒｋｍａｎ  Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１９９５，１（１），ｐｐ．２７−３１）。
このため、これらの疾患に対する予防又は治療剤として、血管新生阻害作用を有する物質を有効成分とする種々の血管新生抑制剤が開発されている。
本発明は、新規な血管新生抑制因子を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は上述するように血管の異常増殖に起因して生じる種々の疾患の予防及び治療に役立つ血管新生抑制剤を提供することを目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、上記目的に基づいて新規な血管新生抑制因子を求めて日夜研究を重ねていたところ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のα鎖の特定領域を含む蛋白質に血管の新生を有意に抑制する作用があることを見いだして本発明を開発するに至った。
ＨＧＦは、そもそも本発明者によって１９８４年に肝実質細胞の新規増殖因子として見いだされたポリペプチドである（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８４，１２２，ｐｐ．１４５０−１４５９）。本発明者のその後の研究によって、ＨＧＦは分子量約６９ｋＤａのα鎖と約３４ｋＤａのβ鎖からなるヘテロダイマーであり、しかもその構造は、α鎖にＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインを有し、またβ鎖にセリンプロテアーゼ様ドメインを有するユニークなドメイン構造であることがわかった（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４２，ｐｐ．４４０−４４３）。ＨＧＦの発見当初は肝再生因子の本体として肝細胞に特異性の高い増殖因子であると考えられていたが、リコンビナントＨＧＦが使用できるようになった１９８９年以降の研究により、ＨＧＦは肝細胞以外にも多くの上皮細胞に対して強力なマイトゲンとして働くことが明らかになった（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．，Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｓｙｍｐ．，１９９４，２４，ｐｐ．１９５−２１３．Ｒｅｖｉｅｗ）。また、更なる研究によってＨＧＦはかかる細胞増殖制御に加えて、細胞運動（ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を促進するモートゲン（ｍｏｔｏｇｅｎ）としての機能（Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｐｒｏｇ．ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．，３，ｐｐ．６７−８５，１９９１）や、多くの癌細胞の増殖を抑制するｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ作用などの新しい生物活性を有することがわかった（Ｈｉｇａｓｈｉｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９０，Ｊｕｌｙ  １６，１７０（１），ｐｐ．３９７−４０４）。
さらに１９９１年には、ＨＧＦの高親和性で機能的なレセプターが、プロトオンコジーン産物（ｃ−ｍｅｔ産物：ｃ−Ｍｅｔ）であることが明らかとなり（Ｂｏｔｔａｒｏ  ＤＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，Ｆｅｂ．，１５，２５１（４９９５），ｐｐ．８０２−８０４：Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１  Ａｐｒ，６（４），ｐｐ．５０１−５０４）、本発明者は、α鎖内のＮ末端ヘアピンならびに第１、第２クリングルドメインが該ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターに結合する最小ドメインであることを見いだした（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９１  Ｄｅｃ．，１６，１８１（２），ｐｐ．６９１−６９９）。
本発明者はかかるＨＧＦに関する一連の研究成果をさらに追究すべく研究を行っていたところ、本発明に先だちα鎖内のＮ末端ヘアピンならびに第１から第４の４つのクリングルドメインを有するポリペプチドが、上記ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対してアンタゴニスト活性を有していることを新たに見いだし、かかるポリペプチドがＨＧＦの血管新生作用を有意に抑制する作用を有することを確認した。
本発明は、このような年余にわたるＨＧＦの研究を基礎として上記新規な知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は下記１〜６に掲げる血管新生抑制剤である。
１．下記の（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドを有効成分として含有する血管新生抑制剤。
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセブプーを介するＨＧＦの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド。
２．下記の（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドを有効成分として含有する血管新生抑制剤。
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性、並びにｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド。
３．上記ポリペプチドが、少なくとも一つのヘアピンドメイン及び４つのクリングルドメインを有するものである１又は２記載の血管新生抑制剤。
４．上記ポリペプチドがＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒをエラスターゼで消化して得られるものである１又は２記載の血管新生抑制剤。
５．配列番号１記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する血管新生抑制剤。
６．配列番号２記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する血管新生抑制剤。
また本発明は、下記７〜１１に掲げる、医学的若しくは薬理学的に有用な医薬品である。
７．１又は２に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、血管異常増殖に起因する疾患の予防又は治療剤。
８．血管異常増殖に起因する疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー−ウェバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患、血管線維腫、良性腫瘍及び創傷肉芽形成よりなる群から選択されるいずれかである７記載の予防又は治療剤。
９．１又は２に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、内皮細胞の過度な刺激によって生じる疾患の予防又は治療剤。
１０．内皮細胞の過度な刺激によって生じる疾患が、腸管癒着、クローン病、アテローム硬化症、強皮症及び過剰瘢痕形成よりなる群から選択されるいずれかである９記載の予防又は治療剤。
１１．１又は２に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する受胎調節剤。
更にまた本発明は、下記１２〜１６に掲げる、医学的若しくは薬理学的に有用な処置方法である。
１２．下記（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチド：
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド、
及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を被験者に投与することからなる、血管新生抑制方法。
１３．下記（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチド：
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性、並びにｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド、
及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を被験者に投与することからなる、血管新生抑制方法。
１４．下記（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチド：
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド、
及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を血管異常増殖に起因する疾患の予防または治療をうける被験者に投与することからなる、該疾患の予防または治療方法。
１５．下記（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチド：
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性、並びにｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド、
及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を血管異常増殖に起因する疾患の予防または治療をうける被験者に投与することからなる、該疾患の予防または治療方法。
１６．上記疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー−ウェバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患、血管線維腫、良性腫瘍、創傷肉芽形成、腸管癒着、クローン病、アテローム硬化症、強皮症及び過剰瘢痕形成よりなる群から選択されるいずれかである１４又は１５に記載の予防又は治療方法。
また、本発明は下記１７及び１８に記載するポリペプチドの使用に関する：
１７．血管新生抑制剤の製造のための下記（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドの使用：
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド。
１８．血管新生抑制剤の製造のための、下記（ａ）又は（ｂ）に記載されるポリペプチドの使用：
（ａ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）のＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性、並びにｂＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド。
なお、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、塩基配列その他に関する略号による表示は、基本的にはＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法又はその規定、及び「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成９年３月、特許庁調整課審査基準室）に従うものとする。
また、本発明において、アミノ酸番号やアミノ酸の位置は、プレプロＨＧＦのアミノ酸配列を基準として表記する（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４２，ｐｐ．４４０−４４３）。本発明で、ＰｙｒＧｌｕとは、修飾アミノ酸であるピログルタメート（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ）を意味し、ＰｙｒＧｌｕ３２とは、プレプロＨＧＦのアミノ酸配列を基準としてＮ末端から３２番目のアミノ酸残基が、ピログルタメートになっていることを示す。
本発明の血管新生抑制剤は、ＨＧＦのα鎖に起因するものであって血管新生抑制作用を有するポリペプチドを有効成分として含有するものである。
ここで「ＨＧＦのα鎖に起因する」とは、ＨＧＦのα鎖の全領域又はその断片を連続的もしくは非連続的に有するという意味で用いられる。
血管新生抑制作用とは、血管の新生作用を抑制する作用であればその機序の別を問うものではないが、ＨＧＦが有する血管新生作用を抑制する作用、好適にはＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦが有する血管新生作用を抑制する作用を意味する。
かかる作用を有するポリペプチドとしては、ＨＧＦのレセプターであるｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターに親和性を有し、該レセプターへのＨＧＦの結合を競合的に阻害する作用を有するものを挙げることができる。好適には、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターに結合して、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドである。
ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用としては、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターのチロシンリン酸化作用、モートゲン活性（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、マイトゲン活性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びモルフォゲン活性（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を挙げることができる（実験医学，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．９（１９９３）参照）。
従って、本発明で用いられるポリペプチドとしては、これらの作用のいずれかを抑制・阻害するもの、具体的にはＨＧＦ誘導によるｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターのチロシンリン酸化を抑制・阻害する作用、ＨＧＦが有するモートゲン活性を抑制・阻害する作用、ＨＧＦが有するマイトゲン活性を抑制・阻害する作用、またはＨＧＦが有するモルフォゲン活性を抑制・阻害する作用のいずれか少なくとも１種を有するものが挙げられる。好ましくは、上記すべての作用を有するポリペプチドを挙げることができる。
このようなポリペプチドとしては、好適にはＨＧＦのＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。尚、配列番号１中、「Ｘａａ」とは「ＰｙｒＧｌｕ」を意味する。
当該ポリペプチドは、基本的にはＨＧＦをエラスターゼ処理することによって得られ、ＨＧＦのα鎖のＮ末端領域の４４７アミノ酸から構成される。このため、当該ポリペプチドは、ＨＧＦのα鎖と同様にＮ末端アミノ酸として修飾アミノ酸残基：ピログルタメートを有し、一つのＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインを有している。なお、本発明において当該ポリペプチドをＨＧＦ／ＮＫ４とも称する。
後述する実施例で示すように、当該ポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターにＨＧＦと競合的に結合するアンタゴニスト活性をもち、ＨＧＦが誘導するｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターの自動チロシンリン酸化を抑制・阻害する作用を有している。また当該ポリペプチドは、それ自身はマイトゲン活性、モートゲン活性及びモルフォゲン活性を殆ど有しておらず、ＨＧＦが有するマイトゲン活性、モートゲン活性及びモルフォゲン活性を阻害する性質を有している。
しかしながら、前述するように本発明の血管新生抑制剤の有効成分として用いられるポリペプチドは、ＨＧＦのα鎖に起因するものであって、ＨＧＦが有する血管新生作用を抑制する作用を有するものであれば、上記配列番号１で示される特定のポリペプチドに限定されることはない。
かかるポリペプチドとしては、具体的には，、ＨＧＦのＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８からなるアミノ酸配列において、その一部若しくは数個乃至は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、かつｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを介するＨＧＦの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
より好適には前述するＨＧＦ／ＮＫ４と同じか若しくは同程度の生理活性（チロシンリン酸化抑制作用、モートゲン活性抑制作用、マイトゲン活性抑制作用、モルフォゲン活性抑制作用）を有するポリペプチドを挙げることができる。
ここでアミノ酸の「欠失、置換若しくは付加」の程度およびそれらの位置等は、改変されたポリペプチドが上記生理活性を有するものであれば特に制限されない。例えば、上記ＨＧＦ／ＮＫ４のＮ末端及び／又はＣ末端において１若しくは複数（又は数個）のアミノ酸が欠失又は付加したポリペプチド、ＨＧＦ／ＮＫ４の中央領域において１若しくは複数（又は数個）のアミノ酸が欠失又は付加したポリペプチドを挙げることができるが、ＨＧＦ／ＮＫ４の特徴的な構造である少なくとも一つのヘアピンドメイン及び４つのクリングルドメインが実質上保持されるような改変であることが望ましい。
ゆえに改変ペプチドとして、好適にはヘアピンドメイン及び４つのクリングルドメイン以外の領域において１若しくは複数（又は数個）のアミノ酸が置換、欠失又は付加したポリペプチドを例示することができる。かかるポリペプチドとして、具体的には、ＨＧＦ／ＮＫ４のポリペプチドのうちアミノ酸番号１６２〜１６６（配列番号１において、アミノ酸番号１３１〜１３５）の５つのアミノ酸が欠失したポリペプチド（ＨＧＦ／ＮＫ４（ｄｅｌ５））、具体的には配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。
本発明で用いられるＨＧＦ／ＮＫ４又はＨＧＦ／ＮＫ４（ｄｅｌ５）は、それぞれ配列番号１又は２に示すアミノ酸配列又は既に公知のＨＧＦの遺伝子配列等に基づいて、慣用のペプチド合成に準じて化学的に製造するか又は遺伝子工学的に製造することができる。
好適にはＨＧＦを酵素的に分解することによって得ることができる。
ＨＧＦの酵素分解は、例えばエラスターゼ等の酵素を用いてＨＧＦを消化することにより行うことができる。次いで、高速液体クロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の慣用の蛋白精製法を用いて酵素消化物を精製し、所定の分子量を有するポリペプチドを単離することにより、ＨＧＦ／ＮＫ４を取得することができる。ここで分子量としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元条件下で約６５〜６９ｋＤ、好ましくは約６７ｋＤを挙げることができ、またＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約４８〜５２ｋＤ、好ましくは約５０ｋＤの分子量を挙げることができる。
なお、酵素分解に用いられるＨＧＦは、その取得の由来及び調製法等によって特に制限されるものではない。
例えば、ヒトを含む哺乳動物の肝臓などの組織、血小板や白血球などの血液細胞又は血漿や血清などから抽出、精製することによって得ることができるし（ＦＥＢＳ，２２４，３１２，（１９８７）；Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，５８４４，（１９８９））、またＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物から分離、精製することによって得ることができる。また、遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞（例えば、動物細胞）に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることもできる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０，１９８９；特開平５−１１１３８３号公報；特開平３−２５５０９６号公報；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３，９６７，１９８９等）。ＨＧＦをコードする遺伝子としては、通常ヒトを含む哺乳動物に由来するＨＧＦ遺伝子、好ましくはヒトに由来するＨＧＦ遺伝子、より好ましくはヒトに由来する組換えＨＧＦ遺伝子（特開平５−１１１３８３号公報）を用いることができる。
またＨＧＦ／ＮＫ４（ｄｅｌ５）のように、ＨＧＦ／ＮＫ４のアミノ酸配列に基づいて改変されてなるいわゆる改変体は、ペプチド合成法により化学的に調製してもよく、またＨＧＦの遺伝子に基づいて遺伝子工学的改変法で調製することもできる。
遺伝子工学的改変法としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：３５０，ｐｐ．３６７−３８２（１９８７）；同  １００：４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９：４８０１（１９６７）；同９１：３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０：１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９（１９８１）；同２４：２４５（１９８３）〕及びそれらの組合せ方法等が例示できる。
本発明の血管新生抑制剤は、その投与剤形を特に制限するものではなく、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤又はシロップ剤等の経口剤；軟膏、クリーム、貼付剤、坐剤等の外用剤；点眼剤、眼軟膏等の眼用剤；注射剤、点滴などの種々の製剤形態をとり得る。これらの投与剤は、この分野で通常知られた慣用的な製剤方法により製剤化される。
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤等を使用できる。
カプセル剤は常法に従い、上記ペプチドを上記で例示した各種の担体と混合して硬化ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等が使用できる。
注射剤は常法に従って調製することができ、例えば上記ポリペプチドを適切な溶媒に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによって調製することができる。なお、注射液は血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば滅菌水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
軟膏剤を調製する場合は、上記ペプチドに通常使用される基剤、安定化剤、潤滑剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、パラフィン等が挙げられる。保存剤としてはパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
貼付剤を製造する場合には、通常の支持体に前記軟膏、ペースト、クリーム、ゲル等を常法により塗布すればよい。支持体としては綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
更に上記各製剤には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等の薬学的に許容される添加剤や他の医薬品を含有させてもよい。
製剤化に際しては、安定化剤を配合することが好ましい。安定化剤としては例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等を挙げることができる。
また、注射剤等の液剤とする場合は、凍結保存するか、または予め凍結乾燥品として調製することが好ましい。凍結乾燥品は、用時に注射用蒸留水等により再溶解して使用される。
本発明の製剤中に含有されるべきポリペプチドの量としては、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常製剤中０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％）程度、好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）程度とするのがよい。
上記医薬製剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度等に応じて適宜決定される。例えば、注射剤は単独であるいはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。
本発明の血管新生抑制剤の１日当りの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概に決定できないが、本発明のポリペプチド（ＨＧＦ／ＮＫ４またはその改変体）として通常成人１日当り約０．０１〜１００ｍｇとすればよく、これを１回又は数回に分けて投与するのが好ましい。
本発明の血管新生抑制剤は、血管異常増殖に起因する疾患の予防又は治療に広く適用することができる。かかる疾患としては、特に制限はないが、具体的には、例えばリウマチ性関節炎、乾癬、オスラー−ウェバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患（例えば、糖尿病性網膜症，未熟児網膜症，老人黄班部変性，角膜移植拒絶，血管新生緑内障，水晶体後線維増殖症又はルペオーシス等）、血管線維腫、良性腫瘍（例えば、血管種，聴神経腫，神経線維種，トラコーマ，化膿性肉芽腫等）、白血病を含む造血器腫瘍、固形腫瘍、腫瘍転移、創傷肉芽形成等を挙げることができる。
本発明の血管新生抑制剤は、また内皮細胞の過度若しくは異常な刺激によって生じる疾患の予防又は治療に広く適用することができる。かかる疾患としては、特に制限はないが、具体的には、例えば腸管癒着、クローン病、アテローム硬化症、強皮症、例えばケロイド等の過剰瘢痕形成等を挙げることができる。
本発明の血管新生抑制剤は、さらに胚着床に必要な血管新生を妨げることに基づく受胎調節剤として有用であり、また病的な結果としてネコのひっかき疾患（ｃａｔ  ｓｃｒａｔｃｈ  ｄｉｓｅａｓｅ）や潰瘍といった脈管形成を伴う疾患の予防剤又は治療剤として有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の説明のために実施例を記載するが、当該実施例はなんら本発明の技術的範囲を制限するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１  ＨＧＦ／ＮＫ４の単離精製
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡで形質転換したＣＨＯ細胞を培養して、該培養物からヒト遺伝子組換えＨＧＦを精製単離した（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，ｐｐ．４４０−４４３（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２，ｐｐ．３２１−３２７（１９９０））。次いで該組換えＨＧＦ（９００ｍｇ）を０．２Ｍ  トリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で３７℃、２０分間、膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ社製）（酵素：基質＝１：１００）で消化し、該消化物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：μＢｏｎｄａｐａｃｋ  Ｃ４カラム使用、日本ウォーターズ社製）に付して、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルのグラジェントによって溶出し、精製した。図１Ａに示すように、ＨＰＬＣにより３つのピークが得られた。
次いで、これらの各ピーク画分をＳＡＳ−ＰＡＧＥにかけて、タンパク染色を行った（図１Ｂ）。それにより、第一のピークが非還元条件下で５０ｋＤ、還元条件下で６７ｋＤの分子量を有するポリペプチドのフラグメントであり、第二のピークが６９ｋＤのα鎖及び３４／３２ｋＤのβ鎖からなる未消化のヘテロダイマーＨＧＦに相当し、第三のピークが非還元条件下で３３／３１ｋＤ，及び還元条件下で３４／３２ｋＤ分子量を有するフラグメントであることがわかった。
なお上記において、 ／ ｋＤとは、アミノ酸配列は同一であるが、付加している糖鎖の違いに基づいて、分子量の異なる蛋白質が存在することを示す。
このことは、ＨＧＦをエラスターゼ処理することによって、α鎖の大部分を有するがα鎖全体よりもわずかに小さいフラグメント（第一ピーク）と、α鎖のＣ末端側の一部と完全なβ鎖とからなるフラグメント（第三ピーク）との２つに消化されることが分かった。
精製フラグメントについてアミノ酸配列を分析するために、まず各溶出画分から溶媒を蒸発して、残渣を０．０５％ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ社製）及び１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解した。
アミノ酸分析は、自動プロテインシークエンサー  モデル４９２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．社製）を用いて行った。
まず第一ピークのフラグメントのＮ末端アミノ酸分析を行ったが、うまくいなかったため、ＨＧＦのＮ末端と同様に該フラグメントのＮ末端はピログルタメートになっている可能性が示唆された。そこで、該フラグメントをピログルタメートアミノペプチダーゼで処理してＮ末端アミノ酸分析を行ったところ、その配列は一文字表記でＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦであり、α鎖の２〜１１番目のＮ末端アミノ酸配列と一致した。このことから、該フラグメントのＮ末端アミノ酸はピログルタメートに修飾されたグルタミンであり、Ｎ末端領域の構造は未消化のＨＧＦと同じであることが判明した。
次に、当該フラグメントのＣ末端を分析するために、エラスターゼ消化によって生じた他のフラグメント（第三ピーク）について、それが有する部分α鎖のＮ末端をアミノ酸分析した。その結果、該部分α鎖のＮ末端領域のアミノ酸配列はＨＧＦのＡｓｎ４７９−Ａｌａ４８８に相当することがわかった。これから、第一ピークフラグメントのＣ末端はＶａｌ４７８であることが判明した。
以上の結果から、ＨＧＦをエラスターゼ処理することによって、２つのフラグメントに消化され、その一つはＨＧＦのヘアピンドメインと４つのクリングルドメインを有するＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８の領域からなるフラグメント（ＨＧＦ／ＮＫ４）であり、他の一つはα鎖の一部（Ａｓｎ４７９から始まる１６アミノ酸）とβ鎖とからなるフラグメントであることが明らかになった（図２）。
実施例２−ＨＧＦ／ＮＫ４の細胞表面レセプターとの結合性
実施例１で調製したＨＧＦ／ＮＫ４について、細胞表面レセプターとの結合性を調べた。また比較実験として、ＨＧＦを用いて同様に細胞表面レセプターとの結合性を調べた。なお、ＨＧＦ／ＮＫ４及びＨＧＦはクロラミン−Ｔ法によって放射性標識し（１２５Ｉ−ＨＧＦ／ＮＫ４、１２５Ｉ−ＨＧＦ）、また細胞表面レセプター標品としてラット肝臓から調製した原形質膜を用いた。
スキャッチャード分析により、ＨＧＦ及びＨＧＦ／ＮＫ４はいずれも８０ｐＭまで、濃度依存的に細胞表面レセプターと結合することがわかり（図３Ａ及びＢ）、ＨＧＦレセプターのＫｄ及び数はそれぞれ６４．５ｐＭ及び５４７８部位／ｎｇであり、またＨＧＦ／ＮＫ４レセプターのＫｄ及び数はそれぞれ４８６ｐＭ及び６４２７部位／ｎｇであった。
次いでＨＧＦ／ＮＫ４がＨＧＦに対する競合的なアンタゴニストであるか否かを調べるために、肝臓の原形質膜（５０μｇ）を１２５Ｉ−ＨＧＦ単独（６０ｐＭ）、または１２５Ｉ−ＨＧＦに種々の濃度の非標識ＨＧＦ若しくは非標識ＨＧＦ／ＮＫ４を加えて、それらの存在下でインキュベーションを行った。１２５Ｉ−ＨＧＦの膜結合は、非標識ＨＧＦの添加によって完全に阻害され、非標識ＨＧＦによる５０％阻害濃度は６０ｐＭであった。非標識ＨＧＦ／ＮＫ４もまた同様に１２５Ｉ−ＨＧＦの膜結合を阻害し、ＨＧＦ／ＮＫ４による５０％阻害濃度は６００ｐＭであり、６０ｎＭで完全に１２５Ｉ−ＨＧＦの膜結合を阻害した（図３Ｃ）。
このことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターに対して、ＨＧＦより８〜１０倍低いものの親和性を有しており、ＨＧＦのアンタゴニストであることが示唆された。
実施例３−ＨＧＦ／ＮＫ４のマイトゲン活性及びＨＧＦのマイトゲン活性に対する阻害作用
ラット初代培養肝細胞のＤＮＡ合成を測定することにより、ＨＧＦ／ＮＫ４のマイトゲン活性を調べた。また、比較対象実験として、同様にＨＧＦのマイトゲン活性を測定した（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，４４０−４４３（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１，６９１−６９９（１９９１））。
結果を図４Ａに示す。該図から分かるように、ＨＧＦは用量依存的に肝細胞のＤＮＡ合成を促進するのに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４には１００ｎＭという高濃度でもＤＮＡ合成を促進する効果はみられなかった。
一方、ＨＧＦを含有する培養液中にＨＧＦ／ＮＫ４を入れ、ＨＧＦとＨＧＦ／ＮＫ４を共存させた場合、ＨＧＦ／ＮＫ４は用量依存的にＨＧＦによって促進されるＤＮＡ合成を抑制し、６０ｎＭでほぼ完全に阻害した（図４Ｂ）。それに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４は表皮成長因子（ＥＧＦ）によって促進されるＤＮＡ合成に対しては阻害作用を示さなかった（図４Ｂ）。
これらのことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、それ自身マイトゲン活性を有しないが、ＨＧＦのマイトゲン活性を特異的に阻害する作用を有していることがわかる。実施例４−ＨＧＦ／ＮＫ４のモートゲン活性及びＨＧＦのモートゲン活性に対する阻害作用
腎尿細管由来の正常上皮細胞であるＭＤＣＫ細胞を用いてＨＧＦ／ＮＫ４のモートゲン活性を調べた。
ＭＤＣＫ細胞は、ＨＧＦを含まないコントロール培地中では隙間なくコロニーを形成したが、ＨＧＦ（２２ｐＭ）を培地に添加するとＭＤＣＫ細胞の運動性を亢進し、該細胞を分散させた。それに対してＨＧＦ／ＮＫ４は細胞を全く分散させず、細胞と細胞の接触性はよく維持されていた。また、ＭＤＣＫ細胞をＨＧＦ及びＨＧＦ／ＮＫ４の共存下で培養したところ、ＨＧＦ／ＮＫ４はＨＧＦによって誘導される細胞分散を阻害した。
これらのことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、それ自身モートゲン活性を有しないが、ＨＧＦのモートゲン活性を阻害する作用を有していることがわかる。
実施例５−ＨＧＦ／ＮＫ４のモルフォゲン活性及びＨＧＦのモルフォゲン活性に対する阻害作用
ＨＧＦ／ＮＫ４が、ＨＧＦの有するモルフォゲン活性を阻害するか否かを調べるために、腎尿細管由来の正常上皮細胞であるＭＤＣＫ細胞をＨＧＦ及び／又はＨＧＦ／ＮＫ４の存在下、コラーゲンゲル中で生育させた。
ＭＤＣＫ細胞は、ＨＧＦを含まないコントロール培地中では球状の細胞塊を形成したが、ＨＧＦ（５５ｐＭ）を培地に添加すると枝分かれした管腔構造が誘導された。それに対してＨＧＦ／ＮＫ４（５５ｎＭ）を添加しても管腔構造は誘導されなかった。また、ＭＤＣＫ細胞をＨＧＦ及びＨＧＦ／ＮＫ４の共存下で培養すると、細胞は細胞塊の状態を維持し、管腔構造は誘導されなかった。
これらのことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、それ自身モルフォゲン活性を有しないが、ＨＧＦのモルフォゲン活性を阻害する作用を有していることがわかる。
実施例６−ＨＧＦ／ＮＫ４の、ＨＧＦが誘導するｃ−Ｍｅｔチロシンリン酸化の阻害作用
肺癌細胞Ａ５４９は、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターを発現しており、ＨＧＦ刺激によってｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化が亢進することが知られている。そこで、ＨＧＦ／ＮＫ４が該ＨＧＦのｃ−Ｍｅｔに対するチロシンリン酸化作用を阻害するかどうかを調べた。
具体的には、Ａ５４９細胞をＨＧＦ及び／又はＨＧＦ／ＮＫ４で刺激して、細胞を可溶化させて、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体で免疫沈降させ、ウエスタンブロッティングを行って、抗ホスホチロシン抗体でｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化を観察した。
その結果、ＨＧＦ（１１０ｐＭ）による刺激によってｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化が誘導されたのに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４（１１０ｎＭ）による刺激では殆どリン酸化されなかった。また、ＨＧＦ／ＮＫ４は、ＨＧＦ誘導によるｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化を用量依存的に阻害した。
これらのことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、ＨＧＦが誘導するｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターのチロシンリン酸化を抑制することが分かる。また、この阻害作用に基づいてＨＧＦ／ＮＫ４はＨＧＦの生物学上の活性に対してアンタゴニストとして作用すると考えられた。
実施例７−ＨＧＦ／ＮＫ４の血管内皮細胞の増殖抑制作用
血管内皮細胞として、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｄ：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）を用いて、ＨＧＦ／ＮＫ４の内皮細胞に対する増殖抑制作用をみた。
具体的には、Ｐａｓｓａｇｅ−５〜８の対数増殖期のヒト肺微小血管内皮細胞またはヒト皮膚微小血管内皮細胞の細胞浮遊液を作成し、ゼラチンコートした２４ウエルのプレートディッシュに１ウエルあたり８０００個の細胞を播きこんだ。２４時間後、新しい培養液（ＥＧＭ（Ｅａｇｌｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）とＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）とを１：１で混合し、それに５％となるように血清を混合したもの）に交換し、３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）および何も添加しないもの（５％血清含有溶液、図中Ｎｏｎｅで示す）の４つの群を設定し、それに０〜４５０ｎＭ範囲の各濃度のＨＧＦ／ＮＫ４を添加して３７℃、５％ＣＯ２で培養した。７２時間後、トリプシンで細胞を剥がし、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒで細胞数を計測した。
ヒト肺微小血管内皮細胞についての結果を図５に、ヒト皮膚微小血管内皮細胞についての結果を図６に示す。
図から分かるように、ＨＧＦ／ＮＫ４は３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ及び５％血清の刺激により促進された血管内皮細胞の増殖を、濃度依存的に顕著に抑制した。このことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、ＨＧＦ刺激で促進される血管内皮細胞の増殖のみならず、ｂＦＧＦやＶＥＧＦなどの他の血管内皮増殖促進因子による増殖に対しても、抑制的に作用することが示唆された。
実施例８−ヒト毛細血管内皮細胞に対する抗ＨＧＦ抗体及びＨＧＦ／ＮＫ４の作用
Ａ．増殖に対する影響
抗ＨＧＦ抗体及びＨＧＦ／ＮＫ４のヒト毛細血管内皮細胞の増殖に対する影響を調べた。
［方法］
培養したヒト皮膚毛細血管内皮細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））を用いて剥がした。得られた内皮細胞を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）にて懸濁後、ゼラチンコートした２４ウエルプレートに５×１０３細胞／ｃｍ２となるように播き、２４時間培養した。
培養物を、５％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２培地をベースとする下記１０種類の培地に応じて１０群に分けて、培地をそれぞれ下記培地で交換した。なお、下記α−ＨＧＦ  Ａｂは抗ＨＧＦウサギポリクローナル抗体を示す。
１．  ５％  ＦＢＳ
２．  ５％  ＦＢＳ＋  ３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ
３．  ５％  ＦＢＳ＋  ３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ        ４
４．  ５％  ＦＢＳ＋  ３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＨＧ        Ｆ  Ａｂ
５．  ５％  ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ
６．  ５％  ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ        ４
７．  ５％  ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＨＧ        Ｆ  Ａｂ
８．  ５％  ＦＢＳ＋  ３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ
９．  ５％  ＦＢＳ＋  ３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ＋３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ４
１０．５％  ＦＢＳ＋３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＨＧＦ          Ａｂ
これらの培地を３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間培養し、次いでトリプシンで細胞を剥がし、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒで細胞数を計測した。
［結果］
結果を図７に示す。図から分かるように、３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ４は、３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦの刺激で促進された血管内皮細胞の増殖を顕著に抑制した。一方、１０μｇ／ｍｌの抗ＨＧＦウサギポリクローナル抗体は、ＨＧＦ刺激による血管内皮細胞の増殖を特異的に抑制したが、ｂＦＧＦやＶＥＧＦ刺激による血管内皮細胞の増殖は抑制しなかった。このことから、ＨＧＦ／ＮＫ４がＨＧＦアンタゴニスト作用に加えて、更に別の異なる新規な作用によって血管内皮細胞の増殖を抑制することが示唆された。
Ｂ．細胞遊走に対する影響
抗ＨＧＦ抗体及びＨＧＦ／ＮＫ４のヒト毛細血管内皮細胞の遊走に対する影響を調べた。
［方法］
細胞遊走に対する影響は改良したボイデンチャンバー法（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ，；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．１９９６；１３（１−２）：５７−６４）を用いて調べた。具体的には、１３．４μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングしたポアサイズ５μｍのポリカーボネートフィルターを用いてボイデンチャンバー法を行った。
まずヒト皮膚毛細血管内皮細胞を、血清を含まないＥＢＭ−２培地にて１２時間培養した後、１％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２で懸濁し、上記フィルターに１２×１０４細胞／ｃｍ２となるように播いた。
該培養物を１０群に分け、各培養物のフィルターカップ外液に下記のようにｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦまたはＨＧＦ／ＮＫ４、抗ＨＧＦウサギポリクローナル抗体（α−ＨＧＦ  Ａｂ）が含まれるように、各溶液を添加した。
１．  無添加（１％  ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２培地）
２．  ３ｎｇ／ｍｌ    ｂＦＧＦ
３．  ３ｎｇ／ｍｌ    ｂＦＧＦ＋３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ４
４．  ３ｎｇ／ｍｌ    ｂＦＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＨＧＦ  Ａｂ
５．  １０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ
６．  １０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ４
７．  １０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＨＧＦ  Ａｂ
８．    ３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ
９．    ３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ＋３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ４
１０．  ３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＨＧＦ  Ａｂ
これらを５時間培養し、顕微鏡下（×２００）で各フィルターの下面に遊走した細胞数（１視野内）を計測した。なお精度向上を図るため、細胞数の計測は、５視野をランダムに選択して各視野において行った。
［結果］
結果を図８に示す。図から分かるように、３００ｎＭ  ＨＧＦ／ＮＫ４は、３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、３ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦの刺激で促進された血管内皮細胞の遊走を顕著に抑制した。一方、１０μｇ／ｍｌの抗ＨＧＦウサギポリクローナル抗体は、ＨＧＦ刺激による血管内皮細胞の遊走を特異的に抑制したが、ｂＦＧＦやＶＥＧＦ刺激による血管内皮細胞の遊走は抑制しなかった。このことから、ＨＧＦ／ＮＫ４がＨＧＦアンタゴニスト作用に加えて、更に別の異なる新規な作用によって血管内皮細胞の遊走を抑制することが示唆された。
実施例９−ＨＧＦ／ＮＫ４の鶏胚漿尿膜（ＣＡＭ）の血管新生抑制作用
鶏受精卵を４日間培養し、気室上部と鶏卵側部の２カ所の卵殻に穴をあけ、側部の穴から３ｍｌ卵白を吸引し、テープでシールした。気室上部の卵殻と卵殻膜を除去した、胚漿尿膜（ＣＡＭ）上にシリコンリングの中心をあわせるように置き、シリコンリング内にＨＧＦ／ＮＫ４または牛血清アルブミン（コントロール）を含むメチルセルロースディスクを置いた。３７℃で２日間培養した後、ＣＡＭ上の血管網を実体顕微鏡下で観察した。結果を表１に示す。
0004094814.tif 000002
なおディスク中への新生血管の進入度は次の基準に基づいて評価した
0004094814.tif 000003
また、実体顕微鏡で観察した結果を図面に代わる写真（図９）として提出する。
これらからわかるように、コントロールのディスクでは、新生血管の進入を著しく認めたのに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４のディスクでは新生血管の進入が殆どなかった。このことから、ＨＧＦ／ＮＫ４に血管新生抑制作用があることが認められた。
実施例１０−ＨＧＦ／ＮＫ４による腫瘍血管新生の抑制作用
６〜８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）背部皮下に５×１０６個のＧＢ−ｄ１ヒト胆のう癌細胞を移植した。７日後、ＨＧＦ／ＮＫ４またはコントロールとして生理食塩水を含む浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社製）を背部皮下に埋め、１３日間ＨＧＦ／ＮＫ４または生理食塩水を持続的に移植癌近傍に注入した。癌移植４週間後、癌を摘出し、固定後通常の組織切片を作成した。腫瘍内の血管新生を調べるため、微小血管を抗ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ抗体（Ｄａｋｏ社）を用いた免疫組織化学法により染色した。結果を表２に示す。
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なお腫瘍内の血管新生度は次の基準に基づいて評価した
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また、顕微鏡で観察した結果を図面に代わる写真（図１０）として提示する。
これらの結果からわかるように、生理食塩水を注入したコントロールの移植癌組織内にはｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ陽性の微小血管が多数形成され、腫瘍組織内での癌細胞のアポトーシスは認められなかった。これに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４を注入した移植癌組織では腫瘍血管新生は著しく抑制され、癌中心部では癌細胞のアポトーシスが広範囲に認められた。このことから、ＨＧＦ／ＮＫ４はｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍血管新生を抑制することが判明した。
参考例１−ＨＧＦ／ＮＫ４による癌の成長・転移抑制効果（１）
６〜８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）背部皮下に５×１０６個のＬｅｗｉｓ肺癌細胞を移植した。５日後、ＨＧＦ／ＮＫ４又は生理食塩水（コントロール）を含む浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社製）を背部皮下に埋め、２週間ＨＧＦ／ＮＫ４又は生理食塩水を持続的に移植癌近傍に注入した。癌移植後２８日後に移植癌の重量及び肺転移を調べた。癌の体積は（短径）２×（長径）２×０．５で算出した。
移植癌の体積を経時的に追跡した結果を図１１Ａに、図１１Ｂに移植癌の２８日目の重量を示す。図からわかるように、生理食塩水を注入したコントロールの移植癌は移植後１０日以降急速に成長したが、ＨＧＦ／ＮＫ４は癌の成長を用量依存的に強く抑制した。
また、Ｌｅｗｉｓ肺癌の肺転移に関しては、コントロールの生理食塩水注入群では多数の肺転移巣が観察されたのに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４を注入した個体では肺転移は用量依存的に強く阻害された（図１２Ａ、Ｂ）。
これらのことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、ｉｎ  ｖｉｖｏで肺癌の成長及び転移を有意に抑制する作用を有していることがわかる。
参考例２−ＨＧＦ／ＮＫ４による癌の成長・転移抑制効果（２）
６〜８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）背部皮下に５×１０６個のＪｙｇ乳癌細胞を移植した。５日後、ＨＧＦ／ＮＫ４又は生理食塩水（コントロール）を含む浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社製）を背部皮下に埋め、２週間ＨＧＦ／ＮＫ４又は生理食塩水を持続的に移植癌近傍に注入した。移植癌の体積を経時的に測定し、癌移植後２８日目に肺表面の転移性腫瘍の数を計測した。
移植癌の体積を経時的に追跡した結果を図１３Ａに、図１３Ｂに癌移植後２８日目に肺表面の転移性腫瘍の数を示す。図からわかるように、生理食塩水を注入したコントロールの移植癌は移植後１０日以降急速に成長したが、ＨＧＦ／ＮＫ４は癌の成長を抑制した。また、肺転移に関しては、コントロールの生理食塩水注入群では多数の肺転移巣が観察されたのに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４を注入した個体では肺転移の抑制が認められた。
これらのことから、ＨＧＦ／ＮＫ４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｊｙｇ乳癌の成長及び転移を有意に抑制する作用を有していることがわかる。
製剤例１
生理食塩水１００ｍｌ中に実施例１で調製したＨＧＦ／ＮＫ４（１ｍｇ）、マンニトール（１ｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含有する溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の血管新生抑制剤を凍結乾燥製剤として調製した。
製剤例２
０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中に、実施例１で調製したＨＧＦ／ＮＫ４  １ｍｇ及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に配合して、１ｍｌずつバイアルに分注した。次いで、各バイアル中の液剤を凍結乾燥して密封して、本発明の血管新生抑制剤を凍結乾燥製剤として調製した。
製剤例３
注射用蒸留水１００ｍｌ中に、実施例１で調製したＨＧＦ／ＮＫ４（１ｍｇ）、ソルビトール（２ｇ）、グリシン（２ｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の血管新生抑制剤を凍結乾燥製剤として調製した。
産業上の利用可能性
本発明の血管新生抑制剤は、その血管新生抑制作用に基づいて、血管異常増殖に起因する種々の疾患、例えばリウマチ性関節炎，糖尿病性網膜症，未熟児網膜症，老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の予防又は治療剤として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１において、ＡはＨＧＦのエラスターゼ処理物を逆相高速液体カラムクロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）（Ｃ４）にかけて得られたクロマトグラムであり、Ｂは逆相ＨＰＬＣの各ピーク画分を電気泳動（還元条件、非還元条件）に付した結果を示す図である。
図２は、ＨＧＦのα鎖及びβ鎖の構造、並びにエラスターゼ処理により切り出される本発明のＨＧＦのＰｙｒＧｌｕ３２〜Ｖａｌ４７８領域（ＨＧＦ／ＮＫ４）の構造を模式的に示す図である。
図３において、Ａ及びＢは、それぞれラット肝臓の原形質膜に対する１２５Ｉ−ＨＧＦ及び１２５Ｉ−ＨＧＦ／ＮＫ４の用量依存的な結合を示す図である。なお、図Ａ及びＢ中の挿入図は、上記ラット肝臓の原形質膜に対する１２５Ｉ−ＨＧＦ及び１２１Ｉ−ＨＧＦ／ＮＫ４の結合をそれぞれスキャッチャードプロットで示した図である。Ｃは、１２５Ｉ−ＨＧＦ存在下で、ラット肝臓原形質膜に対する非標識ＨＧＦ又は非標識ＨＧＦ／ＮＫ４の結合を調べた結果を示す図である（実施例２参照）。
図４は、ＨＧＦ及びＨＧＦ／ＮＫ４のマイトゲン活性の有無（Ａ）、並びにＨＧＦのマイトゲン活性に対するＨＧＦ／ＮＫ４のアンタゴニスト作用を示す図である（Ｂ）。マイトゲン活性はラット初代培養肝細胞のＤＮＡ合成を測定することによって調べた。具体的には、図Ａは、ＨＧＦまたはＨＧＦ／ＮＫ４の存在下での肝細胞のＤＮＡ合成を示し、図Ｂは６０ｐＭのＨＧＦ又は１．５ｎＭの表皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下における肝細胞のＤＮＡ合成に対するＨＧＦ／ＮＫ４の影響を見た図である（実施例３参照）。
図５は、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ若しくはＶＥＧＦの存在下又は非存在下（Ｎｏｎｅ）におけるＨＧＦ／ＮＫ４によるヒト肺微小血管内皮細胞の増殖抑制作用を調べた結果を示す図である（実施例７参照）。
図６は、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ若しくはＶＥＧＦの存在下又は非存在下（Ｎｏｎｅ）におけるＨＧＦ／ＮＫ４によるヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖抑制作用を調べた結果を示す図である（実施例７参照）。
図７は、ＨＧＦ／ＮＫ４（図中、ＮＫ４として表示）及び抗ＨＧＦ抗体（図中、α−ＨＧＦ  Ａｂとして表示）のヒト毛細血管内皮細胞の増殖に対する影響を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ＦＢＳ＋ｂＦＧＦ１５％ＦＢＳ＋ＶＥＧＦまたは５％ＦＢＳ＋ＨＧＦの存在下で調べた結果を示す図である（実施例９Ａ参照）。
図８は、ＨＧＦ／ＮＫ４（図中、ＮＫ４として表示）及び抗ＨＧＦ抗体（図中、α−ＨＧＦ  Ａｂとして表示）のヒト毛細血管内皮細胞の遊走に対する影響を１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ＦＢＳ＋ｂＦＧＦ、１％ＦＢＳ＋ＶＥＧＦまたは１％ＦＢＳ＋ＨＧＦの存在下で調べた結果を示す図である（実施例９Ｂ参照）。
図９は、ＨＧＦ／ＮＫ４による鶏胚漿尿膜の血管新生抑制作用を実体顕微鏡による観察により調べた結果を示す、図面にかわる写真である。
図１０は、ＨＧＦ／ＮＫ４による腫瘍血管新生抑制作用を免疫組織化学法によって調べた結果を示す、図面にかわる写真である。
図１１は、ＨＧＦ／ＮＫ４がＬｅｗｉｓ肺癌細胞の成長を抑制する作用を有することを示す図面である。Ａは移植癌の体積を経時的に追跡した図であり、Ｂは移植癌の２８日目の重量を示す図である。
図１２中、ＡはＨＧＦ／ＮＫ４がＬｅｗｉｓ肺癌細胞の転移を抑制する作用を有することを示す図面である（参考例１参照）。Ｂは肺に転移した癌組織を示す図面に代わる写真であり、生理食塩水を注入したコントロール群は明らかに複数の肺転移巣があるのに対して、ＨＧＦ／ＮＫ４投与群は肺転移巣がほとんどないことを示す。
図１３は、ＨＧＦ／ＮＫ４がＪｙｇ乳癌細胞の成長（Ａ）及び転移（Ｂ）を抑制する作用を有することを示す図面である。Ａは移植癌の体積を経時的に追跡した図であり、Ｂは転移巣の数を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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