(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中の加水分解酵素を定量する方法において、インドキシル化合物を含浸させた吸収性担体を試料で湿らし、酸化剤を含む溶液に浸して反応させた後、反射光測定法により分析することを特徴とする加水分解酵素の定量方法。
【請求項２】
請求項１に記載の定量方法により加水分解酵素を定量するためのキットであって、インドキシル化合物が含浸により吸着している吸収性担体と、酸化剤の溶液とを有することを特徴とする加水分解酵素の定量用キット。
【請求項３】
前記インドキシル化合物が、インドキシル酢酸エステル、インドキシル酪酸エステル、インドキシルカプリル酸エステル、インドキシルパルミチン酸エステル、インドキシルグルクロン酸エステル、インドキシルガラクトシド、インドキシルマルトトリオース、インドキシルリン酸エステルまたはインドキシル硫酸エステルである請求項２に記載のキット。
【請求項４】
インドキシル化合物がハロゲン置換インドキルエステルである請求項２または３に記載のキット。
【請求項５】
酸化剤がテトラゾリウム化合物である請求項２〜４のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固体試薬担体及び反射光測定法を利用して、例えば、食品や生物学的溶液のような液体試料に含まれる加水分解酵素を定量するための方法及びそれに用いるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品に含まれる加水分解酵素は、その食品そのもの、またはその食品に混入している微生物に由来する。酵素が殺菌により完全に不活性化されてない場合には、これらの酵素が食品の腐敗の原因となることが多い。このような加水分解酵素として、例えば、リパーゼ、アリエステラーゼ、アリールエステラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、アミラーゼ、プロテイナーゼがある。血液、血漿、血清、尿などのような生物学的溶液に含まれる加水分解酵素には、例えば、リパーゼ、アミラーゼ、プロテイナーゼ、コリンエステラーゼ、ホスファターゼがある。これらの濃度の変化は、ヒトの病気の状態や身体の生理学的状態を示す。これらの変化が示す病状の診断には、迅速で感度の高い測定が重要となる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＧＢ１１２８３７１及びＥＰ１２９５７には、インドキシルエステルと酸化剤の両方を含む吸着担体を使う加水分解酵素の定量法が開示されている。
動物及び植物の組織内や微生物内のエステラーゼの検出のための、インドキシル酢酸エステルを含む試験紙はNahrung 9, 445, 1965により知られている。この試験紙では、大気中の酸素が酸化剤として作用する。色反応が出るまでの時間によりエステラーゼの濃度が定量される。しかし、これらの公知の方法の欠点は、特に、脂肪、タンパク質、塩、異物を多く含む試料においては、その測定感度に限界があることであり、さらに、その酵素活性について、目視による色の判定でしか評価ができないということである。
【０００４】
本発明の目的は、従来技術よりも高い感度が得られ、かつ定量も可能である加水分解酵素の測定法及びそのためのキットが利用できるようにすることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
驚いたことに、酸化剤を独立した溶液内に存在させ、かつインドキシル化合物を含む吸着担体をこの酸化剤溶液に浸すという本発明の方法を採ることで、従来技術に比較して３〜１２倍高い感度での測定が達成されることが判明した。本発明の他の特長は、試薬を別々に構成したことに関連して試薬の高保存性が確保され、更に、基質の必要量が少ないことである。
【０００６】
本発明の加水分解酵素の定量用キットは、インドキシル化合物と酸化剤の助けによって液体試料中の加水分解酵素を定量するためのキットであって、インドキシル化合物が吸着している担体と、酸化剤の溶液とを有することを特徴とする。
【０００７】
本発明の加水分解酵素の定量方法は、液体中の加水分解酵素を定量する方法において、インドキシル化合物を含浸させた吸収性担体を試料で湿らし、酸化剤を含む溶液に浸してインキュベートして反応させた後、反射光測定法により分析することを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この吸着担体に含浸させたインドキシル化合物は、加水分解酵素に対する特異的酵素基質である。
【０００９】
使用できる適当なインドキシル化合物としては、例えば、インドキシル酢酸エステル、インドキシル酪酸エステル、インドキシルカプリル酸エステル、インドキシルパルミチン酸エステル、インドキシルグルクロン酸エステル（indoxyl glucuronide）、インドキシルガラクトシド（indoxyl galactoside）、インドキシルマルトリオース（indoxyl maltotriose）、インドキシルリン酸エステル、インドキシル硫酸エステルのようなエステル化の部分に炭素原子を２〜２０個含むインドキシルエステル、好ましくは、５−ブロモインドキシルエステル、６−クロロインドキシルエステル、５−ブロモ−６−クロロインドキシルエステル、５−ブロモ−４−クロロインドキシルエステルのようなハロゲン置換インドキシルエステル、さらに好ましくは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸エステル、５−ブロモ−４−クロロインドキシルリン酸エステル、５−ブロモ−４−クロロインドキシル酢酸エステルがある。
【００１０】
使用する吸着担体は、この種類のテストで一般に使用されているものでかまわない。濾紙は一般に広く使用されているものでよいが、セルロース製またはプラスチック製のものでもかまわない。吸着担体としては濾紙が好ましい。この濾紙に公知の方法でインドキシル化合物を含浸させる。
【００１１】
インドキシル化合物を含浸させて乾燥させた担体濾紙を加工して、プラスチックフィルム、紙、金属ストリップの上に公知の方法で張り付けるか密閉し、濾紙担体からなる四方形や直角の部分を有する領域を形成する。あるいは、含浸をさせる前に、吸着担体をストリップ状のプラスチックに張り付けておいて、含浸をさせた後にそのストリップ方向に対して直角の方向に切り取ってもよい。
【００１２】
含浸させるための含浸用溶液は、０．００５〜２ｇ程度、好ましくは０．０５ｇのインドキシルを、１００ｍｌの有機溶剤、例えば、エタノール、メタノール、アセトンに溶かして調製する。場合によっては、この含浸用溶液の中に、水、緩衝物質、錯化剤、触媒を加えてもよい。得られた試験紙は、温度４〜８℃で、光と湿気のない場所で好適に保管することができる。
【００１３】
溶液に入れる酸化剤としては、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド、テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＴＮＢＴ）、ジメチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、テトラゾリウムブルークロリド、トリフェニルテトラゾリムクロリド、ヨードフェニルニトロフェニルフェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、ネオテオラゾリウムクロリド、フェニルアミノカルボキシルテトラゾリウムビスメトキシニトロベンゼンスルフォン酸ナトリウム塩（ＸＴＴ）、好ましくは、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）のようなテトラゾリウム（tetrazolium）塩がある。これらのテトラゾリウム塩は、適当な溶媒、好ましくは、エタノールに溶解させる。濃度は水を使って０．０２〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｍｇ／ｍｌになるように調製する。この溶液に界面活性剤のような安定剤を添加してもよい。
【００１４】
酵素定量を実施するにあたっては、試料はそのままで使用してもよいし、緩衝液で希釈しても、抽出処理してもかまわない。緩衝物質によるｐＨ範囲は、６〜１１、好ましくは約８に維持することができる。緩衝液の濃度は、試料溶液のｐＨにより決定する。
【００１５】
適当な緩衝液としては、トリス／ＨＣＬ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、水酸化ナトリウム溶液／酒石酸塩緩衝液、水酸化ナトリウム溶液／ホウ酸緩衝液、炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液、好ましくは、トリス／ＨＣＬ緩衝液が使用できる。
【００１６】
吸着担体を試料溶液に約２秒間浸し、強く振とうした後、反応箇所が完全に濡れるように、テトラゾリウム塩溶液に浸す。浸す時間は１〜６０分、好ましくは約１５分である。担体を試料溶液から取り除き、強く振とうすると、試料が発色するので、反射率計（３４０〜７００ｎｍ）または色比較計を用いて色分析する。本発明による方法により、特に、リパーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼを迅速・正確で高い感度で酵素定量をすることが可能となる。
【実施例】
実施例１
（リパーゼの定量）
ａ）試験紙の作製
濾紙(Schoeller & Hoesch 300A)に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸エステルの５６ｍｇを１１２ｍｌのエタノール（９６％）に溶解させた溶液を含浸させて乾燥させた。得られた濾紙を、ポリエステルフィルムなどの担体に公知の方法で張り付けた。
【００１７】
b）酸化剤溶液の調製
酸化剤は、６０ｍｇのニトロブルーテトラゾリウムクロリド（Nitro Blue Tetrazolium Chloride）をエタノール（９６％）の１２．５ｍｌ中に含むものである。この溶液を１．５ｇの界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む４９．３ｍｌの水に添加した。
【００１８】
ｃ）リパーゼ標準溶液の調製
シュードモナス菌由来のリポタンパク・リパーゼを用い、５００ｍｍｏｌ／ｌのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に、４ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、２ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび２％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液で希釈することで、それぞれ１０、２０、６０、１２０、２００、３００、４５０及び６００μｇ／ｌの濃度のリパーゼ標準溶液を調製した。
【００１９】
ｄ）リパーゼの定量
テストストリップ（テスト片）を、酵素を含む溶液に約２秒間浸して振とうした後、約１ｍｌの酸化剤溶液に１５分間浸した。この後、反射率計（５７６ｎｍ）で測定される青色の発色が得られた。
【００２０】
【表１】
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この測定結果を図１のＡとして図表で示す。ここで測定された反射率の値を、酵素濃度に対する直線関係を見るために、クベルカ及びムンク(Kubelka and Munk)(Z. Tech. Physik 12, 593, 1931)による等式：Ｆ＝（１−Ｒ）2／２Ｒ（クベルカ−ムンク関数式）(Kubelka-Munk function)を適用して換算し直線化した。ここで得られた直線：ｙ＝０．００１１ｘは、標準カーブを直線化したものに相当する。
【００２１】
ｅ）比較実験
従来技術に従って、基質と酸化剤の両方を吸着担体に吸着させた。すなわち、５６ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸エステルと１１２ｍｇのニトロブルーテトラゾリウムクロリドを１１２ｍｌのエタノールに溶解させ、それを濾紙に含浸させ、乾燥させた。得られた試験紙を上記のｃ）に従って標準溶液に約２秒間浸し、浸とう後、１５分間静置してインキュベートし、更に上記ｄ）の方法で分析した。
【００２２】
【表２】
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結果を図１のＢとして図表で示しているが、ここで得られた直線はｙ＝０．０００１ｘ（傾き：０．０００１）であった。つまり、本発明による方法では、従来技術に較べて、勾配の係数で１１倍感度がよいということになる。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸エステルの代わりに、５−ブロモ−３−インドキシルカプリル酸エステル、６−クロロ−３−インドキシルカプリル酸エステル、５−ブロモ−６−クロロ−３インドキシルカプリル酸、または、これらの脂肪酸部分をパルミチン酸または酢酸に変換したエステルを使用しても同様の結果が得られる。
実施例２
（乳中のリパーゼの定量）
緩衝液の代わりに、加熱殺菌した全乳（脂肪含有率３．５％）を用いてリパーゼ溶液の希釈を行う以外は、実施例１と同様にして定量を実施した。下表は、反射率計を用いて測定した結果を示したものである。
【００２３】
【表３】
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結果は図２に図表で示されているが、直線Ａは本発明による方法により得られた結果であり、直線Ｂは従来技術により得られた結果である。これらの２つの直線の勾配の係数比較から明かなであるように（ｙ＝０．００１２ｘとｙ＝０．０００２ｘ）、本発明による方法が従来技術の方法に較べて、６倍感度がよい。
実施例３
（血清中のリパーゼの定量）
濃度が０、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００μｇ／ｌであるリパーゼを含む標準溶液を、緩衝液の代わりに、６５℃で１０分間加熱処理したヒト血清で希釈する以外は実施例１と同様にして定量を行った。結果は下表の通りである。この表からリパーゼの濃度が２μｇ／ｌである場合にも確実に検出できることが分かる。
【００２４】
【表４】
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本発明による方法で得られた結果（表中第３欄：Ｒ0−Ｒ）を、市販されている光化学・湿式リパーゼテストを用いて得られた結果（表中４欄：湿式化学テスト）と比較した。リパーゼ活性は臨床化学分析器で測定した。表から、ゼロ以外の値が出るのは、リパーゼ濃度が５０μｇ／ｌ以上からである。本発明による方法により、市販のリパーゼテストによる方法の約２５倍の感度が得られることを示している。
実施例４
（アルカリ性ファスファターゼの定量）
ａ）試験紙の作製
濾紙(Schoeller & Hoesch 300A)に、５６ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸エステルの１１２ｍｌエタノール（９６％）溶液を含浸させ、乾燥させた。得られた濾紙を、ポリエステルフィルムなどの担体に公知の方法で張り付けた。
【００２５】
ｂ）酸化剤溶液の調製
酸化剤は、９．９ｇのエタノール（９６％）に溶解させたニトロブルーテトラゾリウムクロリド６０ｍｇを含むものである。この溶液を、２％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む水に添加した。
【００２６】
ｃ）アルカリ性ホスファターゼ標準液の調製
１ｍｏｌ／ｌのジエタノールアミン（ｐＨ９．８）と０．５ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウムから成る緩衝液で希釈した子ウシ腸由来のアルカリ性ホスファターゼを使用した。濃度がそれぞれ０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０μｇ／ｌであるアルカリ性ホスファターゼ標準液を調製した。
【００２７】
ｄ）アルカリ性ホスファターゼの定量
テストストリップを酵素溶液中に約２秒間浸し、振とうさせ、約１ｍｌの酸化剤溶液に１５分間浸した。反射率計（５７６ｎｍ）で測定される青色の発色が得られた。
【００２８】
【表５】
0004077914.tif 000006
ｅ）比較試験
従来技術に従って、基質と酸化剤の両方を吸収体に吸収させた。すなわち、濾紙を５６ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸エステル及び１１２ｍｇのニトロブルーテトラゾリウムクロリドを含むエタノール溶液（１１２ｍｌ）に含浸させた後、乾燥させた。得られた試験紙を、上記ｃ）によって作製された標準溶液に浸し、振とうさせ、室温にて１５分間静置した。青色の発色を反射率計で測定した。
【００２９】
【表６】
0004077914.tif 000007
上記のｄ）及びｅ）の結果が図３に図表で示されている。この図は、クベルカ及びムンクによる等式：Ｆ＝（１−Ｒ）2／２Ｒを使用して反射率を換算し、酵素含有量を直線化して表したものである。直線Ａは、本発明の方法により得られた結果を示し、直線Ｂは、従来技術により得られた結果である。これらの直線の勾配（ｙ＝０．０５７４ｘ、ｙ＝０．０１５７ｘ）から、本発明による方法では、従来技術の３．６倍の感度が得られることが分かる。
実施例５
（エステラーゼの定量）
実施例４と同じように、５６ｍｇのＮ−メチルインドキシル酢酸エステルのエタノール（９６％）溶液（１１２ｍｌ）を含浸させ、試験紙を作製した。酸化剤は実施例４のｄ）と同じとした。ブタ肝臓由来のエステラーゼを、２０ｍｍｏｌ／ｌのトリス／ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．６）中に、４ｍｍｏｌ／ｌの塩化マグネシウム、２ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む緩衝液で希釈することにより、濃度が１、２、５、１０、２０、５０及び１００μｇ／ｌのエステラーゼ標準液を調製した。
【００３０】
この試験紙を酵素溶液中に約２分間浸し、振とうさせ、約１ｍｌの酸化剤溶液に約１５分間浸した。この後、反射率計（５７６ｎｍ）で測定される青色の発色が得られた。
【００３１】
【表７】
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比較結果を得るために、５６ｍｇのＮ−メチルインドキシル酢酸エステル及び１１２ｍｇのニトロブルーテトラゾリウムクロリドのエタノール溶液（１１２ｍｌ）を含浸させた試験紙を作製して試験をした。結果は下記の通りであった。
【００３２】
【表８】
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試験の結果は図４に図表で示されている。本発明による手順から得られた直線Ａ：ｙ＝０．００６８ｘ（傾き：０．００６８）であり、比較試験から得られた直線ｙ：０．００１２ｘ（傾き：０．００１２）である。このことは、本発明による方法が、従来の技術の方法よりも係数で５．７倍感度がよいことを示している。
【００３３】
【発明の効果】
酸化剤とインドキシル化合物の存在下で加水分解酵素の定量を行う方法において、酸化剤を独立した溶液内に存在させ、かつインドキシル化合物を予め吸着させた担体を用意し、この担体を酵素試料液に浸してから、酸化剤溶液と反応させることで、従来技術に比較して３〜１２倍高い感度での測定を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】定量曲線をクベルカ−ムンクの手法によって直線化した図であり、Ａは本発明の方法で得られた結果を、Ｂは従来法で得られた結果を示す。
【図２】定量曲線をクベルカ−ムンクの手法によって直線化した図であり、Ａは本発明の方法で得られた結果を、Ｂは従来法で得られた結果を示す。
【図３】定量曲線をクベルカ−ムンクの手法によって直線化した図であり、Ａは本発明の方法で得られた結果を、Ｂは従来法で得られた結果を示す。
【図４】定量曲線をクベルカ−ムンクの手法によって直線化した図であり、Ａは本発明の方法で得られた結果を、Ｂは従来法で得られた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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