(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-15214）から得ることのできる以下の（１）〜（６）の条件を充たすアルカリプロテアーゼ：
（１）至適ｐＨ
カゼインを基質とし３０℃にて１０分間反応させたとき至適ｐＨは１２付近にある。
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）の条件を充たす。
（ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存活性を有する。
（ｂ）緩衝液（５０ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分後に４０％以上の残存活性を有する。
（ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存活性を有する。
（３）安定ｐＨ域
３０℃で２４時間インキュベートしたとき、ｐＨ５〜１１で安定である。
（４）至適温度
カゼインを基質とし、ｐＨ１０で１０分間反応させたとき、至適温度が６０℃付近にある。
（５）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子量は29000±2000である。
（６）等電点
等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点は10.1±0.5である。
【請求項２】
以下の工程を含む請求項１に記載のアルカリプロテアーゼの製造方法：
（ｉ）前記プロテアーゼを発現する微生物を、前記プロテアーゼを発現するのに適した条件下で培養する工程；および
（ｉｉ）前記培養物から前記プロテアーゼを回収する工程。
【請求項３】
前記微生物がバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-15214）である請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-15214）を含む単離された微生物培養物。
【請求項５】
請求項１に記載のプロテアーゼを含む洗剤。
【請求項６】
自動食器洗浄機用である請求項５に記載の洗剤。
【請求項７】
請求項１に記載のプロテアーゼを蛋白質に作用させることを特徴とするペプチドまたはアミノ酸の加水分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアルカリプロテアーゼに関する。さらに詳しく言えば、界面活性剤と熱に対する安定性に優れたアルカリプロテアーゼ、その製造方法、その洗浄剤等への用途、及びそのアルカリプロテアーゼを生産する微生物に関する。
【０００２】
【従来技術】
近年、環境汚染が問題となり、洗剤成分としてのリン酸塩の使用が規制されるに伴って、酵素を洗剤に配合して、洗浄力を高めることが行なわれている。現在では、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ等を配合した酵素入り洗剤が上市されている。中でもプロテアーゼは、衣類に付着する有機汚垢の１０〜４０％を占め、従来の洗剤成分だけでは除去しきれないタンパク質汚れを効率よく分解し、洗浄力を高めるための洗浄成分として不可欠になっている。
洗剤用プロテアーゼとしては、アルカリ域で活性を示す微生物由来の酵素が、従来数多く知られており、カズサーゼ（昭和電工（株））、サビナーゼ（ノヴォ(NOVO)社製）、マキサカル（ギスト(GIST)社製）、アルカラーゼ（ノヴォ(NOVO)社製）、バイオサム（昭和電工（株））等が用いられている。また、自動食器洗浄機の普及に伴って、自動食器洗浄機用洗剤に配合可能な酵素が求められている。卵黄、乳製品等のタンパク質性の食器汚れに対して、プロテアーゼが有効である。ただし、一般に酵素は高温水中で使用すると失活が促進されるので優れた安定性が要求される。現在この目的にはエスペラーゼ（ノヴォ(NOVO)社製）等が用いられているが、十分な活性、安定性を兼ね備えているとは言えない。これまでに知られているプロテアーゼで界面活性剤に対して最も安定性の高いのは、バチルスＳＤ５２１株の産するプロテアーゼ（特開平3-191781号）であるが、更に安定性の高いプロテアーゼが望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、界面活性剤存在下においてより安定性の高いアルカリプロテアーゼ、そのアルカリプロテアーゼの製造方法、そのプロテアーゼを含む洗剤組成物等の用途、及びそのようなプロテアーゼを生産する微生物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、バチルス属の１菌株である、バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株が生産するプロテアーゼＡＰＩ−２６が優れた安定性を有し、また洗浄性にも優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下のアルカリプロテアーゼ、その製造方法、洗剤等を提供する。
１）  バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-15214）から得ることのできる以下の（１）〜（６）の条件を充たすアルカリプロテアーゼ：
（１）至適ｐＨ
カゼインを基質とし３０℃にて１０分間反応させたとき至適ｐＨは１２付近にある。
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）の条件を充たす。
（ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存活性を有する。
（ｂ）緩衝液（５０ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分後に４０％以上の残存活性を有する。
（ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存活性を有する。
（３）安定ｐＨ域
３０℃で２４時間インキュベートしたとき、ｐＨ５〜１１で安定である。
（４）至適温度
カゼインを基質とし、ｐＨ１０で１０分間反応させたとき、至適温度が６０℃付近にある。
（５）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子量は29000±2000である。
（６）等電点
等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点は10.1±0.5である。
【０００６】
２）以下の工程を含む前記１に記載のアルカリプロテアーゼの製造方法：
（ｉ）前記プロテアーゼを発現する微生物を、前記プロテアーゼを発現するのに適した条件下で培養する工程；および
（ｉｉ）前記培養物から前記プロテアーゼを回収する工程。
３）前記微生物がバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-15214）である前記２に記載の製造方法。
【０００７】
４）バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-15214）を含む単離された微生物培養物。
【０００８】
５）前記１に記載のプロテアーゼを含む洗剤。
６）自動食器洗浄機用である前記５に記載の洗剤。
７）前記１に記載のプロテアーゼを蛋白質に作用させることを特徴とするペプチドまたはアミノ酸の加水分解方法。
【０００９】
［酵素生産菌］
本発明の酵素を生産する菌株の１つであるバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株は以下に述べる如く、菌学的性質からはBacillus firmusに近縁の菌株と判断されるが、いくつかの性質において他の公知の菌株と明らかに相違し、新規な菌と認定された。
【００１０】
菌学的性質：
本発明に係るバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株は、以下に示す菌学的性質を示す。
(a)形態：桿菌、
(b)グラム染色性：＋、
(c)胞子形成能：＋、
(d)胞子形態：楕円形、
(e)運動性：＋、
(f)酸素に対する態度：好気性、
(g)カタラーゼ生産：＋、
(h)嫌気下での生育：−、
(i)ＶＰ反応：−、
(j)ＶＰブロスのｐＨ：6.2 、
(k)酸の生成：
グルコース        −
アラビノース      −
キシロース        −
マンニトール      −
(l)グルコースからのガスの生成：−、
(m)ゼラチンの液化：＋、
(n)デンプンの分解：＋、
(o)クエン酸塩類の利用：−、
(p)プロピオン酸塩の利用：−、
(q)フェニルアラニンデアミネーション：−、
(r)卵黄反応：−、
(s)硝酸塩の還元：−、
(t)ｐＨ6.8 での生育：＋、
(u)ｐＨ5.7 での生育：＋、
(v)５％塩化ナトリウム存在下での生育：＋、
(w)７％塩化ナトリウム存在下での生育：＋、
(x)１０℃での生育：＋、
(y)３０℃での生育：＋、
(z)５５℃での生育：＋、
(aa)菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：４５％。
【００１１】
上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上の性質を“バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー”VOL.2(1986) William ＆ Wilkinsを参考にして他の菌株と比較すると以下の通りである。
本発明に係るバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株は糖からの酸の生成や、５０℃での生育においてバチルス・ファーマス（Bacillus firmus）の典型的な性状を示さなかった。一方、公知の菌株であるＳＤ５２１株はグルコースから酸を生成し、硝酸塩を還元し、ｐＨ6.8で生育せず、５０℃で生育しない。ＮＣＩＢ１０３０９はグルコース、アラビノース、マンニトールから酸を生成する。ＰＢ９２はグルコース、キシロースから酸を生成し、プロピオン酸塩を利用出来る。以上の菌学的性質から明らかなように本菌株ＳＤ１１４株は中温菌であり、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）と近縁のバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)と判断され、他の公知菌株とも相違する。従って、本菌株はバチルス（Bacillus）属に属する新菌株と認められた。本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-15214として寄託されている。
【００１２】
また、上記ＳＤ１１４株を元菌株として自然または誘発突然変異により、上記菌株が生産する性質を有するプロテアーゼを生産する変異株を得て、本発明によるプロテアーゼ生産菌として用いることが出来る。これらの変異株を調製する方法としては、従来知られている慣用の方法、例えば元菌株を紫外線照射あるいはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の薬剤による人工突然変異処理を施して、スキムミルク等を含む寒天培地に広げ、生育してくる菌株の中からコロニーのまわりに形成されるクリアゾーンが、より大きいコロニーを選抜し、生産性の優れた菌株を選別する方法を用いることが出来る。また本発明の酵素を生産する性質を有するプロテアーゼ遺伝子を適当な自己複製するＤＮＡと連結し、これを用いて適当な宿主細胞を形質転換し、遺伝子増幅効果によって生産性を向上させることもできる。
【００１３】
［プロテアーゼの製造方法］
本発明のプロテアーゼを製造するに際して使用される培地は、本発明のプロテアーゼ生産菌が増殖し、プロテアーゼを生産し得るものならば任意のものでよい。
例えば、炭素源としてはグルコース、マルトース、シュークロース、可溶性デンプン等が用いられ、窒素源としては、大豆かす、ごまかす、ふすまかす、コーンスティープリカー等の有機窒素源が用いられる。また、この他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の無機塩類が添加される。本発明においては、培養は好気的条件下で、例えば通気撹拌法や振とう培養法で行う。培養温度は２０〜４０℃の範囲で良いが、生育の最も良好な３０〜３７℃が望ましい。初発ｐＨは９〜１０、培養中のｐＨは 8.5〜１０がそれぞれ好ましい。培養時間は１６〜６０時間程度であり、プロテアーゼ活性が最高に達した時に培養を終了するのが望ましい。このように得られる培養液から目的とするプロテアーゼの精製は一般の酵素の分離精製に準じて行うことが出来る。遠心分離、またはろ過等によって菌体、培地固形物を除去し、上清またはろ液を得ることが出来る。これらの分離液に可溶性塩類、親水性有機溶媒を添加し、蛋白質を沈殿させる塩析法、溶媒沈殿法、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等により本発明のプロテアーゼを得る。さらにイオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィー等の精製法を組み合わせ、精製することが出来る。かくして得られる本発明のプロテアーゼをＡＰＩ−２６と命名した。ＡＰＩ−２６の活性は以下に示す方法にて測定される。
【００１４】
［酵素活性測定法］
ｐＨ１０の５０ｍＭ  Atkins-Pantinのほう酸緩衝液５００μｌに、適当に希釈した酵素液５０μｌを加え、３０℃で３〜５分プレインキュベートする。この溶液にｐＨ１０の２％ハマーステインカゼイン溶液５００μｌを加え、１０分後トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液（0.132Ｍ  ＴＣＡ：酢酸緩衝液でｐＨ４に調整）２ｍｌを加えて反応を停止させる。３０℃１０分以上放置後、No.2のフィルターペーパー（東洋ろ紙）を用いてろ過する。ろ液１ｍｌに0.4 Ｍ炭酸ソーダ５ｍｌ、水で６倍希釈のフェノール試薬１ｍｌを添加し、３０℃で２０分間放置して発色させた後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素単位は３０℃、ｐＨ１０でカゼインを基質として反応させたとき、ＴＣＡ画分中に１秒間にチロシン１モル相当の６６０ｎｍの発色を示す分解物を生成するプロテアーゼ活性を１カタール（１katal）とする。
【００１５】
［プロテアーゼの性質］
次に本発明で得られるプロテアーゼ（ＡＰＩ−２６）の理化学的性質について述べる。
(1)作用及び基質特異性
タンパク質及びペプチド、例えばカゼイン、ヘモグロビン、アルブミン、肉タンパク、魚肉タンパク、大豆タンパクなどを分解する。
【００１６】
(2)至適ｐＨ
至適ｐＨの測定法：
緩衝液としてBritton-Robinsonの広域緩衝液を使用した。また至適ｐＨを調べるに当たっては、１％カゼインを含む各ｐＨ緩衝液中に、酵素を約２０nkatal／ｍｌとるように加え、３０℃で１０分間反応させ活性を測定し、ｐＨ11.7での活性を１００とし表１及び図１に示した。本酵素はｐＨ１２付近に至適ｐＨを有することが分かる。
【００１７】
(3)安定ｐＨ域
安定ｐＨ域の測定法：
各ｐＨの緩衝液に酵素を約２０nkatal／ｍｌとなるように加え、３０℃で２４時間インキュベートした後の活性を測定した。インキュベート前の活性を１００として、各ｐＨでの残存活性を表２及び図２に示した。本酵素の安定ｐＨ域は３０℃で５〜１１であることが分かる。
【００１８】
【表１】
表１

ｐＨ     7.1  7.9  9.0  9.9 10.6 11.2 11.7 12.1 
活性      19 35 46 64 79 86  100 94 
【００１９】
【表２】
表２

ｐＨ         4  5  6  7  8  9 10 11 12 
残存活性     0  100  100  100  100  100  100  100  0 
【００２０】
(4)至適温度
至適温度の測定法：
基質として１％のカゼイン及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid、エチレンジアミン四酢酸) を含むｐＨ１０の２５ｍＭ Atkins-Pantinほう酸緩衝液を５分間各温度でプレインキュベートした後、酵素を添加し１０分間各温度で反応させた。６０℃での活性を１００として各温度での相対活性を表３及び図３に示す。本酵素は６０℃付近に至適温度を有することが分かる。
【００２１】
【表３】
表３

温度（℃）      30 40 50 60 70 
活性            13 25 49  100 35 
【００２２】
(5)阻害剤の影響
以下の条件及び方法により本酵素に対する各種阻害剤の影響を調べた。
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）で、本酵素を約２０nkatal／ｍｌになるように調製し、ＥＤＴＡ、ＰＣＭＶ（ｐ−メルクリ安息香酸）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）を表４に示した濃度で添加し、３０℃３０分間インキュベート後活性を測定した。阻害剤無添加のものを１００％とした相対活性で表した結果を表４に示す。表４から明らかなように本酵素はＰＭＳＦにより著しく阻害されることから、セリンプロテアーゼであることがわかる。
【００２３】
【表４】
表４

阻害剤        濃  度      活  性
無添加                    １００
ＰＣＭＶ      １ｍＭ      １００
ＰＭＳＦ    １０ｍＭ         0.7
ＥＤＴＡ      ５ｍＭ        ９９  
【００２４】
(6)分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、本酵素の分子量は、29000±2000と算出された。
(7)等電点
等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られた等電点は10.1±0.5である。
【００２５】
(8)安定性
以下に示す条件のうち少なくとも１つを充たす。
(a) 界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ  ＥＤＴＡ、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）５００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存活性を有する。
(b) 緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分後に４０％以上の残存活性を有する。
(c) 界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存活性を有する。
【００２６】
［抗ＡＰＩ２６抗体との交差性］
本発明のプロテアーゼは、以下の測定条件で好ましくは抗ＡＰＩ−２６抗体と交差反応を示す。
交差反応測定条件：
抗原であるＡＰＩ−２６を２ｍｇ／ｍｌに調製し、等量のフロイント完全アジュバンド（Freund's complete adjuvant）と混合し、完全に油中水滴状（Water in oil）にする。２羽の雌ウサギにこの試料１ｍｌを０日目、２１日目、４２日目、６３日目の間隔で注射する。７０日目に全採血し、抗体を含む血清を調製する。
交差反応はオークタロニー（Ouchterlony）法（Acta.Med.Scan.133, 76-79(1950)）によって評価する。すなわち、中央の穴に１ｍｇ／ｍｌのＡＰＩ２６または同濃度の他プロテアーゼ１０μｌ添加し、周りの穴に２のｎ乗系列（ｎ＝１，２，３，４，５，６，７）で希釈した抗血清を添加し、湿潤箱に入れて３７℃で一晩放置し沈降線を観察する。ＡＰＩ２６に対して沈降線を形成する限界の濃度の少なくとも４倍以上の濃度で沈降線を形成する場合、抗ＡＰＩ−２６抗体と交差性を有すると判断する。
【００２７】
［プロテアーゼ作用方法］
本発明のプロテアーゼをタンパク質やペプチドに作用させることによりペプチドやアミノ酸を製造することが出来る。また、タンパク質やペプチドを成分に含む目的物質に作用させることにより目的物質の加工に使用することが出来る。その方法としては、従来用いられてきた方法において、従来酵素の代わりに本発明のプロテアーゼを使用する形態をとることが出来る。さらに従来酵素が失活してしまうような過酷な条件においても、本発明のプロテアーゼが活性を保持する限りは使用可能である。例えば５０ｐｐｍ以上５００ｐｐｍ以下のＬＡＳ存在下は勿論のこと、５００ｐｐｍ以上のＬＡＳ存在下においても使用可能である。ただし、好ましくは３０００ｐｐｍ以下、より好ましくは３００ｐｐｍ以下で使用する。また、温度に関しては４８℃以上の高温においても使用可能である。ただし、好ましくは７５℃以下、より好ましくは７０℃以下にて使用する。
【００２８】
［用途］
本発明のアルカリプロテアーゼは既存のアルカリプロテアーゼに比べて各種市販洗浄剤溶液中や界面活性剤存在下で高い安定性を有する。また熱に対しても安定であり、洗濯や食器洗浄で使用される温水中においてタンパク質の汚れを効率的に分解するので、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることが出来る。
その他の用途としては、例えば、飼料加工、食品加工（魚油加工、食肉加工等）、繊維加工、羊毛加工、皮革加工、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄等があり、また入浴剤や脱毛剤に配合することも出来る。
【００２９】
［洗浄剤組成物］
本発明により、前記の性質を有するアルカリプロテアーゼを配合した洗浄剤組成物が提供される。本発明の洗浄剤組成物に配合されるアルカリプロテアーゼの量には特に限定はないが、洗浄液１リットル当たり、１０〜１０００nkatalに相当する量を配合するのが適当である。この配合量が少なすぎると十分な洗浄効果の向上が得られず、また逆に多過ぎた場合には酵素配合量に比して洗浄効果の向上が大きくなく、経済性の点で好ましくない。
【００３０】
本発明に従えば、前記アルカリプロテアーゼは従来公知の任意の洗浄剤組成物に洗剤組成物の組成を何等変更することなく配合することができ、本発明の洗浄剤組成物の成分については特に限定はない。そのような洗浄剤組成物の代表例をあげれば、洗浄剤組成物重量当たり１０〜５０重量％の界面活性剤、０〜５０重量％のビルダー、１〜５０重量％のアルカリ剤あるいは無機電解質、0.1〜５重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング防止剤及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の配合成分からなる洗浄剤組成物があげられる。
【００３１】
界面活性剤としては石鹸、例えば直鎖または分岐アルキルあるいはアルケニル硫酸塩、アミド硫酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩のような脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミドスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、α−オレフィン、ビニリデン型オレフィン及び内部オレフィンの各スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキルベンゼンスルホン酸塩のような芳香族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩またはアミド、α−スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたはアルケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケニルリン酸塩の如きリン酸エステル系界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテルあるいはアルコール、直鎖または分岐鎖のアルキル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアルキレンオキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンモノエステル、アルキルまたはアルケニルアミンオキサイド、テトラアルキルアンモニウム塩型カチオン界面活性剤など洗剤組成物として通常配合される界面活性剤であればいずれも使用可能であり、陰イオン性界面活性剤の場合の対イオンとしてはナトリウムイオンまたはカリウムイオンであることが好ましい。これらの界面活性剤は、単独または２種以上の混合物として使用される。
【００３２】
ビルダー及びアルカリ剤あるいは無機電解質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩などのリン酸塩、エタン−１，１−ジホスホン酸、エタン−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸及びその誘導体、エタンヒドロキシ−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１，２−ジカルボキシ−１，２−ジホスホン酸、メタンヒドロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、２−ホスホノブタン−１，２−ジカルボン酸、１−ホスホノブタン−２，３，４−トリカルボン酸、α−メチルホスホノコハク酸などのホスホノカルボン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩などのアミノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離高分子、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、ショ糖、ラクトースなどのカルボキシメチル化物、ペンタエリスリトールのカルボキシメチル化物、グルコン酸のカルボキシメチル化物、ベンゼンポリカルボン酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸などの有機酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸塩などの無機塩をアルカリ金属塩として用いることができ、またデンプン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリウム、ベントナイトなどの無機化合物を用いることができ、更には有機アルカリ剤としてトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリイソプロパノールアミンなどを用いることができる。
【００３３】
本発明の洗浄剤組成物は、前述の如く、界面活性剤、本発明のアルカリプロテアーゼ、アルカリ剤または無機電解質を必須の構成成分として含むが、その他必要に応じて両性界面活性剤、例えば過炭酸ソーダ、過ホウ酸ソーダなどの漂白剤、漂白活性剤、色素、ビルダー、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどの再汚染防止剤、ケーキング防止剤、酸化防止剤、耐食剤、蛍光増白剤、起泡増進剤、リパーゼなどのその他の酵素を必要に応じて含ませることができる。
【００３４】
本発明の洗浄剤組成物に酵素を配合するには如何なる方法をもって行ってもよいが、微粉末状で配合することは、洗剤取扱い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業における作業者の安全衛生上好ましいことではなく、溶液状態あるいはあらかじめ発塵性をおさえた形状に賦形しておくことが好ましい。この賦形は通常良く用いられるマルメ造粒、押し出し造粒、流動造粒、遠心流動造粒やその他の方法のいずれによるものであっても良く、本発明の洗浄剤組成物に配合する酵素の形状は特にこれらの方法によって賦形されたものに限定されるものではない。なお、本発明のアルカリプロテアーゼは安定性が高いため、通常、酵素の製剤（賦形）が行われる温度以上の温度、例えば５０℃以上での賦形も可能である。
【００３５】
本発明の洗浄剤組成物の具体例としては、本発明のアルカリプロテアーゼを含む洗濯用洗剤や自動食器洗浄機用洗剤等の洗剤が挙げられるが、その一例として市販の洗剤に本発明のアルカリプロテアーゼを添加したものが挙げられる。
【００３６】
【実施例】
次に実施例を挙げて説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
なお、実施例に記載の市販洗剤はすべて、予めそれに含まれる酵素粒剤を選別除去する等して実質的に酵素を含まないものを調製して使用した。
実施例１：バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株の培養法
カゼイン１％、肉エキス１％及びポリペプトン１％を含有し、かつ炭酸ナトリウムでｐＨ 7.5に調整した培地３００ｍｌ中で３５℃、６６時間振とう培養し、培養液中に酵素を分泌生産させた。この培養液を、４℃、1000Ｇで遠心分離し、上清をとり、活性を測定したところ、約５０nkatal／ｍｌであった。
【００３７】
実施例２：ＡＰＩ−２６酵素精製法
実施例１で得られた微生物培養液の上清を除菌膜処理し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した。この濃縮液を３０〜６０％飽和の硫安塩析を行った。さらに得られた沈殿を１ｍＭ  ＣａＣｌ2 を含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ 7.5に溶解し、同緩衝液で透析した。続いて該溶液をｐＨ 7.5でＣＭセルロファイン（ＣＭ-cellulofine）Ｃ−５００カラム（生化学工業製）吸着させ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2 を含む０〜１Ｍ  ＫＣｌ濃度勾配法により溶出し、比活性がイオン交換クロマトグラフィー前の約８倍に上昇した酵素画分を回収した。このサンプルを用いてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ単一バンドとして検出された。
【００３８】
実施例３：温度安定性
0.1ｍＭ  ＥＤＴＡを含むｐＨ１０の５０ｍＭ  Atkins-Pantin ほう酸緩衝液に約２０nkatal/ml度になるように本発明の酵素（ＡＰＩ２６）、Subtilisin10309 （NCIB10309 株の産する酵素）、ＰＢ９２（バチルスＰＢ９２株の産する酵素）、ＳＤ５２１（バチルスＳＤ５２１株の産する酵素）を加え、５５℃でインキュベートする。経時的にサンプリングし、残存活性を３０℃で測定した。熱処理なしの活性を１００としたときの各時間での残存活性を表５示す。但しSubtilisin 10309、ＰＢ９２、ＳＤ５２１はそれぞれ特公昭51-8401号、特開昭51-125407号、特開平3-191781号に記載の方法で調製した。表５及び図４から分かるようにＡＰＩ２６は優れた温度安定性を有する。
【００３９】
【表５】
表５：温度安定性（５５℃）

時間（分）            0  7.5  15  22.5  30 
ＡＰＩ２６          100     70      43      25      30
Subtilisin 10309    100      4       3       3       3
ＰＢ９２            100      5       3       4       3
ＳＤ５２１          100  20 13 10  8 
【００４０】
実施例４：界面活性剤安定性
本酵素の界面活性剤に対する安定性を調べた。
測定法：
0.１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Atkins-Pantinほう酸緩衝液ｐＨ１０にＬＡＳを５００ｐｐｍとなるように溶解する。この溶液に約２０nkatal／ｍｌ濃度になるように酵素（ＡＰＩ２６、Subtilisin 10309、ＰＢ９２、ＳＤ５２１）を加え、４０℃及び５５℃でインキュベートし残存活性を３０℃で経時的に測定した。時間０での活性を１００とした時の各時間での残存活性を表６（４０℃）及び表７（５５℃）に示す。ＡＰＩ２６は従来の酵素に比べて格段に優れた界面活性剤安定性を有することが分かる。
【００４１】
【表６】
表６：界面活性剤存在下での安定性（４０℃）

時間（分）            0  7.5  15  22.5  30 
ＡＰＩ２６          100     100    100      99      97
Subtilisin 10309    100       0      0       0       0
ＰＢ９２            100       0      0       0       0
ＳＤ５２１          100  7   5  0  0 
【００４２】
【表７】
表７：界面活性剤存在下での安定性（５５℃）

時間（分）            0  7.5  15  22.5  30 
ＡＰＩ２６          100      65     40      20      15
Subtilisin 10309    100       0      0       0       0
ＰＢ９２            100       0      0       0       0
ＳＤ５２１          100  3   0  0  0 
【００４３】
実施例５：ＡＰＩ−２６酵素の洗剤溶液中での安定性
以下の条件及び方法により市販洗剤ウルトラアリエル（Ultra Ariel）（Ｐ＆Ｇ社製）、スーパーチアー（Super Cheer）（Ｐ＆Ｇ社製）、タイド・グリィース・リリーシング（Tide Grease Releasing）（Ｐ＆Ｇ社製）溶液中での本酵素の安定性を調べた。５０ｍＭ Atkins-Pantinほう酸緩衝液ｐＨ１０  ５０ｐｐｍＣａ2+洗剤濃度1000ｐｐｍの溶液で本酵素ＡＰＩ２６及び他酵素Subtilisin 10309、ＰＢ９２、ＳＤＩ５２１を約２０nkatal／ｍｌになるように加え、５５℃または４０℃でインキュベートし、残存活性を３０℃で経時的に測定した。時間０での活性を１００とした時の各時間での残存活性を表８〜１０及び図５〜図７に示す。この結果からＡＰＩ２６は他の酵素と比較して著しく洗剤溶液中で安定性が高いことが分かる。
【００４４】
【表８】
表８：ウルトラアリエル（Ultra Ariel）（５５℃）

時間（分）            0  7.5  15  22.5  30 
ＡＰＩ２６          100      90     82      75      65
Subtilisin 10309    100      75     48      35      22
ＰＢ９２            100      73     46      33      21
ＳＤ５２１          100   81  53 44 31 
【００４５】
【表９】
表９：スーパーチアー（Super Cheer）（５５℃）

時間（分）            0  7.5  15  22.5  30 
ＡＰＩ２６          100      90     80      71      63
Subtilisin 10309    100      25      7       5       3
ＰＢ９２            100      26      8       5       4
ＳＤ５２１          100   41  25 10  9 
【００４６】
【表１０】
表１０：タイド・グリィース・リリーシング（Tide Grease Releasing）（４０℃）

時間（分）            0  7.5  15  22.5  30 
ＡＰＩ２６          100      98     92      84      81
Subtilisin 10309    100      65     40      30      21
ＰＢ９２            100      66     41      28      20
ＳＤ５２１          100   72  66 52 39 
【００４７】
実施例６：ＡＰＩ−２６酵素含有液体洗剤洗浄性試験
実施例１と同様にして得られた培養液の上清を除菌膜処理し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した後、噴霧乾燥法により粗酵素を調製した。これを用いて、市販の液体洗剤タイド（Tide）（Ｐ＆Ｇ）に添加した際の洗浄効果を調べた。タイドに粗酵素を１００nkatal／ｍｌとなるように加え、本酵素を配合した洗剤を調製し、それを４０℃で４週間保存した。カルシウムイオン（Ｃａ2+）濃度が４０ｐｐｍの水１リットルに対し、この４週間保存した洗剤を２ｇ添加し汚染布を洗浄後、白度を測定し、洗浄効率を求めた。なお、汚染布はＥＭＰＡ−１１６５ｃｍ×５ｃｍのものを各１０枚用いた。また、洗浄効率は以下の式によって定義する。
【００４８】
洗浄効率（％）＝（洗濯後の布の白度−汚染布の白度）／（非汚染布の白度−汚
染布の白度）×１００
【００４９】
対照としてＳＤ５２１も同時に試験した。結果を表１１に示す。この結果から液体洗剤中にＡＰＩ２６を添加することは有効であることが分かる。
【００５０】
【表１１】
表１１

酵素                洗浄効率（％）  
ＡＰＩ２６              ６２
Subtilisin 10309        ５５
ＰＢ９２                ５４
ＳＤ５２１              ５８
無添加                  ５２        
【００５１】
実施例７：ＡＰＩ−２６酵素含有自動食器洗浄機用洗剤洗浄性試験
実施例６に記載のＡＰＩ−２６粗酵素を用いて、自動食器洗浄機での洗浄効果を調べた。
まず、市販洗剤（商品名ハイウォッシュＳ；株式会社エヌシーシー；成分はポリエチレンアルキレンエーテル、過炭酸ナトリウム、炭酸塩、硫酸塩、有機酸塩）とＡＰＩ−２６粗酵素を重量比２０：１の割合で混合して酵素含有自動食器洗浄機用洗剤を調製し、これを洗浄時0.21％となるように使用して以下の条件により洗浄性を試験した。
【００５２】
洗浄条件
使用機種：松下電器（株）製自動食器洗い機ＮＰ−６００洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、その噴射軌道上面に設置された食器類を洗浄する形式のもの。
洗浄温度：５℃〜５５℃まで徐々に上昇する。
使用水：硬度 3.5°ＤＨの水、
酵素濃度：0.01％、
洗浄時の循環水量： 2.5リットル、
汚染皿の調製：卵黄１ｇを直径２５ｃｍの磁性の皿に塗布し、一昼夜風乾したもの２枚試験に供する。
【００５３】
［洗浄力評価法］
洗浄後の皿にアミドシュニッツ液反応により、皿上の紫色面積（Ｐ1 ）を写真判定によって測り、汚染面積から下記の式によって洗浄率を求めた。
【００５４】
洗浄率（％）＝｛（Ｐ0 −Ｐ1 ）／Ｐ0 ｝×１００
但し、Ｐ0 ：皿の面積
【００５５】
求めた洗浄率は表１２に示した。対照としてＳＤ５２１も同時に試験した。この結果より、本酵素を含むサンプルは洗浄作用が強く、今回特別に設定した強固な汚れに対しても効果的に作用して１００％の洗浄率を示し、自動洗浄機用洗剤の洗浄力の改善に大きく寄与していることことが分かる。
【００５６】
【表１２】
0004030603.tif 000002
【００５７】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは既存のアルカリプロテアーゼに比べて各種市販洗剤溶液中や界面活性剤存在下で高い安定性を有し、また熱に対しても安定であり、洗濯や食器洗浄においてタンパク質の汚れを効率的に分解するので、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることが出来る。
また、蛋白質やペプチドに作用させて他のペプチドやアミノ酸を製造する際にその安定性を利用して経済的なプロセスが可能となる。
本発明のバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株及びその変異株は、取扱い易い中温菌であり、本発明のアルカリプロテアーゼの生産等において有用である。
また、バチルス（Bacillus）属に属する微生物またはその変異株を培養する本発明のプロテアーゼの製造方法により本発明のアルカリプロテアーゼを効率良く生産することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明酵素の至適ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図２】  本発明酵素の安定ｐＨ域範囲を示すグラフである。
【図３】  本発明酵素の至適温度範囲を示すグラフである。
【図４】  本発明酵素及び公知酵素の５５℃の温度における安定性を示すグラフである。
【図５】  本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤ウルトラアリエル中５５℃における安定性を示すグラフである。
【図６】  本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤スーパーチアー中５５℃における安定性を示すグラフである。
【図７】  本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤タイド・グリィース・リリーシング中４０℃における安定性を示すグラフである。
【図１】
0004030603.tif 000003
【図２】
0004030603.tif 000004
【図３】
0004030603.tif 000005
【図４】
0004030603.tif 000006
【図５】
0004030603.tif 000007
【図６】
0004030603.tif 000008
【図７】
0004030603.tif 000009