(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
処理対象物中に存在するまたは存在が疑われる原虫類の、紫外線照射による感染能力の不活性化の程度を指標として紫外線照射条件を設定して、前記処理対象物に紫外線を照射する原虫類の不活性化方法であって、
前記紫外線照射条件の設定が、紫外線未照射の処理対象物の試料、および処理対象物に波長２５４ｎｍ付近の紫外線の照射量が１〜１００ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 となるように紫外線を照射した後の試料の、それぞれの試料を培養細胞に接触させ、前記試料中の感染能力のある原虫類が培養細胞に寄生して培養細胞内で増殖した原虫類を、酸素抗体法又は免疫染色法を用いて定量検出して、前記それぞれの試料における前記感染能力のある原虫類の濃度を算出し、下式（１）：
不活性化率＝１−（処理対象物に紫外線を照射した後の試料における原虫類の濃度
÷紫外線未照射の処理対象物の試料における原虫類の濃度）(式１)
で定義される不活性化率を算出し、前記紫外線照射量と前記不活性化率との、紫外線照射量の特定の一定増加量毎に感染能力のある原虫類の９０％が不活性化するという連関から、不活性化率の目標値に応じて処理対象物への紫外線照射条件を設定することであることを特徴とする原虫類の不活性化方法。
【請求項２】
処理対象物の試料と接触し、かつ、紫外線を受光可能な位置に、光触媒機能を有する薄膜を配置することによって、紫外線による直接作用とともに光触媒が紫外線を受光することで生じる酸化還元反応を利用する、請求項１に記載の原虫類の不活性化方法。
【請求項３】
光触媒機能を有する薄膜が酸化チタンを主成分とする薄膜である、請求項２に記載の原虫類の不活性化方法。
【請求項４】
処理対象物が水である、請求項１から３のいずれか１項に記載の原虫類の不活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）やジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）等の原虫類の汚染が懸念される浄水、飲用水、下水、排水、河川水、湖沼水、修景水、プール用水および食品または食品製造設備等を処理対象物とした消毒方法に関する。
【０００２】
本発明は、感染力のある原虫類を短時間でしかも簡便に不活性化して当該微生物の病原性を低減もしくは消失せしめる消毒方法にも関する。
【０００３】
【従来の技術】
最近、クリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫による水系感染症の発生が上・下水道分野をはじめとして世界的に大きな問題となっている（総説として例えば、保坂三継（１９９８）「水系原虫感染症−原因生物と流行発生−」，用水と廃水，第４０巻，第２号，１１頁；金子光美（１９９８）「原虫類やその他の病原性微生物の検出とその除去技術」，用水と廃水，第１０巻，第４号，３２頁など）。当該原虫は極めて少数個の飲用によって疾病を起こしうる危険な病原体であり、飲用水や食品の汚染に由来した甚大な流行感染をも懸念されている。甚大な流行感染の発生を未然に防ぐために原虫類を確実に駆除できる消毒技術の開発が強く求められている。
【０００４】
上・下水道分野では、水の消毒方法として塩素処理法が汎用されている。しかしながら、クリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類は、塩素に対する抵抗性が高く、塩素処理法では原虫類の殺滅が困難とされている（例えば、I. S. Campbell et al. (1982) Effect of disinfectants on survival of Cryptosporidium oocysts, Weterinary Record, Vol.111, p414など）。
【０００５】
塩素消毒に代わる対策技術として、下記のような処理技術が検討されている。ろ過法は、砂ろ過や膜ろ過によって原虫類のシストまたはオーシストを被処理水中から物理的に除去する処理技術である。
加熱処理は、被処理水を加熱することによって原虫類のシストまたはオーシストを殺滅する処理技術である。
【０００６】
オゾン処理は、被処理水にオゾンガスを吹き込み、オゾンの酸化力によって原虫類のシストまたはオーシストを不活性化または殺滅する処理技術である。紫外線照射と併用することによって処理効率がさらに高まるといわれている。
また、細菌やウイルスを殺滅する処理技術として紫外線処理があるが、ジアルジアやクリプトスポリジウム等の原虫類への適用は困難とされている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
原虫類は、環境中においてクリプトスポリジウムではオーシスト、ジアルジアではシストと呼ばれる胞子状の殻に包まれた形態で存在しているため、化学薬剤に対する耐性があり、従来の水処理法で汎用される塩素消毒では防除できない。
膜ろ過法は、原虫類の確実な除去が期待できるが、透過水量に限界があり、大容量の水処理においては設備の巨大化や膜の更新等に多大なコスト負担が必要である。
【０００８】
砂ろ過法では、ろ床内での短絡水流や破過によって原虫類が処理水中に漏出する恐れがある。
原虫類は、加熱や乾燥に極めて弱いため加熱処理によって不活性化できるが、大容量の水処理においては大型の加温設備の設置や加温に必要なエネルギーの大量投入等に多大なコスト負担が必要である。
【０００９】
紫外線処理によってジアルジアやクリプトスポリジウム等の原虫類を殺滅するためには出力１５Ｗの紫外線を１５０分間照射し続ける必要があり、概ね７００〜１０００ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 程度の紫外線を照射する必要があるとされている。この紫外線照射量は通常の紫外線消毒装置の設計値の概ね１０倍から２０倍に相当するため、原虫類の紫外線処理は実用上の適用が困難である（例えば、E. L.Jaroll (1988) Effect of disinfectants on Giardia cysts, CRC Critical Reviews in Environmental Control, Vol.18, p1；M. J. Lorenzo-Lorenzo et al.(1993) Effect of ultraviolet disinfection of drinking water on the viability Cryptosporidium parvum oocysts, J. Parasitol., Vol.79, No.1, p67）。
【００１０】
上述の如く、処理対象物中の原虫類を除去もしくは殺滅することを目的とした従来の防除技術は、処理効果の安定性やコストの点で課題がある。
一方、原虫類の生育活性あるいは感染能力を評価する方法としてはバイタル染色法、脱嚢試験法、動物実験法が提案されている。しかしながら、バイタル染色法と脱嚢試験法は顕微鏡観察によらねば定量評価ができないため、操作の煩雑さ、効率の悪さ、データ精度の悪さ等の欠点があり、不活性化条件の決定には不適である。また、動物実験法はマウス等の小動物へ被検試料を経口的に接種し、１週間から１ヶ月程度の間にわたって継続的に飼育し、排泄された糞便から原虫類のオーシストもしくはシストを精製して顕微鏡観察等でオーシストもしくはシストの数を計測し、この結果に基づいて被検試料中の原虫類濃度を推定する。もしくは該小動物の消化器官を摘出し、病理学的な観察によって発症の有無を判定し、この結果に基づいて被検試料中の原虫類濃度を推定する。このように動物実験法については、判定に長時間を要することや小動物の個体差が結果に大きく影響することに加え、動物保護の観点からも好ましい方法とはいえない。
【００１１】
動物実験法に代わる原虫類の検査方法として培養細胞法が提案されている。例えば、公開特許公報、特開２０００−２１４１６８において、培養細胞を用いれば感染能力のある原虫類を簡便にかつ感度良く検出できると記載されている。
本発明者は、処理対象物中の個々の原虫類もしくはそのシストまたはオーシストをたとえ完全に殺滅できなくとも、原虫類の生育活性または感染能力を消失せしめること（すなわち“不活性化”）ができれば、人畜に対する病原性の有無を問題とする衛生学の面では対策技術になりえることを見い出し、原虫類の不活性化の程度の正確な判定結果に基づいて処理条件を最適化することによって、従来技術の問題点を克服した効率的かつ効果的な原虫類の不活性方法を提供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
原虫類のシストまたはオーシストの感染能力の程度を指標とすれば不活性化に必要な処理条件を絞り込むことができ、処理コストを最小限に抑えた原虫類の不活性化方法を提供することができる。すなわち、前記した課題は下記の（１）〜（４）によって解決できる。
【００１３】
（１）処理対象物中に存在するまたは存在が疑われる原虫類の、紫外線照射による感染能力の不活性化の程度を指標として紫外線照射条件を設定して、前記処理対象物に紫外線を照射する原虫類の不活性化方法であって、前記紫外線照射条件の設定が、紫外線未照射の処理対象物の試料、および処理対象物に波長２５４ｎｍ付近の紫外線の照射量が１〜１００ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 となるように紫外線を照射した後の試料の、それぞれの試料を培養細胞に接触させ、前記試料中の感染能力のある原虫類が培養細胞に寄生して培養細胞内で増殖した原虫類を、酸素抗体法又は免疫染色法を用いて定量検出して、前記それぞれの試料における前記感染能力のある原虫類の濃度を算出し、酸素抗体法で吸光度を測定して定量検出し、下式（１）で定義される不活性化率を算出し、前記紫外線照射量と前記不活性化率との、紫外線照射量の特定の一定増加量毎に感染能力のある原虫類の９０％が不活性化するという連関から、不活性化率の目標値に応じて処理対象物への紫外線照射条件を設定することであることを特徴とする原虫類の不活性化方法。
【００１４】
不活性化率＝１ − （処理対象物に紫外線を照射した後の試料における原虫類の濃度 ÷ 紫外線未照射の処理対象物の試料における原虫類の濃度）（式１）
【００１５】
（２）処理対象物の試料と接触し、かつ、紫外線を受光可能な位置に、光触媒機能を有する薄膜を配置することによって、紫外線による直接作用とともに光触媒が紫外線を受光することで生じる酸化還元反応を利用する前記（１）に記載の原虫類の不活性化方法。
（３）光触媒機能を有する薄膜が酸化チタンを主成分とする薄膜である前記（２）に記載の原虫類の不活性化方法。
【００１６】
（４）処理対象物が水である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の原虫類の不活性化方法。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下に述べるクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類が動物の体内に寄生して疾病を引き起こす過程において、原虫類が細胞に寄生して増殖する能力が消失することを“不活性化”と定義し、完全に殺滅せずとも疾病発現のリスクを回避できる効果的な原虫類の不活性化方法を提供することができる。なお、クリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類が動物の体内に寄生して疾病を引き起こす過程を該述すると、以下のようになる。
【００１８】
１）シストまたはオーシストが経口的に体内へ摂取される。
２）消化管内での脱嚢して感染性虫体が発露する。
３）感染性虫体が腸管の表皮細胞へ付着する。
４）感染性虫体が腸管の表皮細胞内へ侵入する。
５）感染性虫体が腸管の表皮細胞内で増殖する。
【００１９】
６）増殖した感染性虫体がシストまたはオーシストを形成する。
７）細胞内で形成されたシストまたはオーシストが細胞外へ放出される。
８）細胞外へ放出されたシストまたはオーシストが腸管内で脱嚢し、再び別の細胞へ侵入し、増殖する。
９）前記２から８を繰り返して、消化管の機能障害を引き起こし、疾病に至る。
【００２０】
上記の疾病に至る過程を鑑み、経口的に摂取される以前に混入が懸念される原虫類を完全に殺滅しなけれればならないという観点で、消毒技術の開発が検討され、結果的に多大なエネルギーやコストを投じた消毒技術に頼らねばならなかった。しかしながら、発明者らが鋭意検討したところ、殺滅しなくても遺伝子の本体であるＤＮＡを損傷させれば、寄生した細胞内での増殖を阻止でき、前記した５以降の疾病に至る過程を抑制できることを見い出した。例えば、紫外線を照射した原虫類は培養細胞へ感染できず、培養細胞内で増殖できないことを知見した。これは紫外線照射によって原虫のＤＮＡが損傷した結果、ＤＮＡ複製および細胞分裂が不能になり、増殖できないためである。なお、かかる知見は培養細胞を用いた評価法を利用することで詳細に解明できる。
【００２１】
本発明は、原虫類の不活性化に必要な紫外線照射強度や照射時間等の処理条件を最適化でき、最適化した処理条件を満たした処理装置の設計もしくは既存設備の運転条件変更によって原虫類の不活性化技術を提供することができる。
まず、原虫類の不活性化方法について詳述する。原虫類（もしくはそのオーシストまたはシスト）は１〜１００ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 （波長２５４ｎｍ）程度の低照射量の紫外線照射処理によって容易に不活性化できる。紫外線光源としては、紫外線を発光するランプであれば特に限定はないが、不活性化処理として紫外線照射単独法を採用する場合と光触媒併用法とで相違がある。前者の場合、波長２５４ｎｍ付近の紫外線を発光するランプとして、例えば、低圧水銀ランプ、中・高圧水銀ランプ、キセノンランプを用いることができ、後者の場合は、これらに加えてブラックランプのような波長３６５ｎｍ付近の紫外線を発光するランプも用いることができるが、波長２５４ｎｍ付近と波長３６５ｎｍ付近の紫外線を発光する中・高圧水銀ランプが好ましい。原虫類の不活性化のために最適化された装置として製造することもできるが、既設の紫外線消毒装置について、紫外線照射強度や照射時間等の運転条件を変更することによっても対応することができる。
【００２２】
ところで、多くの生物は紫外線照射によって損傷したＤＮＡを自己修復するための機構を備えているといわれ、この修復機構は近紫外光や可視光によって誘導されることから光回復と呼ばれており、紫外線消毒が抱える克服すべき課題のひとつといわれている（例えば、鹿島田ら（１９９５）『紫外線照射水処理における光回復の評価』水環境学会誌、第１８巻、第１号、４４頁）。光触媒併用法を用いれば、前記した光回復を抑制することができる（例えば、公開特許公報、特開平１１−１５６３５２）。光触媒併用法においては、処理対象物と接触し、かつ、紫外線を受光可能な位置に、光触媒機能を有する薄膜を配置すればよい。光触媒機能を有する薄膜としてはコスト、触媒活性、耐久性などの点で酸化チタンを主成分とする薄膜が好ましい。また、酸化チタン単独組成の薄膜のみならず、光触媒活性を高めるためにＡｇ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｂ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｎ、Ｖ、Ｚｎ等の金属またはその酸化物を添加した酸化チタン薄膜を用いることもできる。
【００２３】
次いで、原虫類の不活性化の程度を評価する方法について詳述する。前記したように従来の評価技術では操作性や信頼性の点で問題があったことから、これら原虫類の不活性化の程度を評価すべき従来法が抱える課題を克服した方法を採用することが好ましい。本発明においては原虫類の不活性化の程度を評価する方法として、培養細胞を用いた検査方法を用いることができる。例えば、培養細胞に被検試料を３０分から３時間接触させ、被検試料を新鮮な培養培地に置換し、１日から１週間、好ましくは１〜３日間培養した後に、培養細胞内で増殖した原虫類もしくは原虫類のオーシストまたはシストを酵素抗体法もしくは免疫染色法によって定量検出する方法を用いることができる。検査に供する培養細胞は検出しようとする原虫類が感染しうる細胞株であればよく、例えば、マウス由来のＢＡＬＢ／３Ｔ３、ヒト由来のＢＴ−５４９、Ｃａｃｏ−２、ＨＣＴ−８、ＨＴ−２９、Ｈｓ−７００Ｔ、ＨＴ−１０８０、ＬＳ−１７４Ｔ、ＲＬ５９−２、ウシ由来のＭＤＢＫ、イヌ由来のＭＤＣＫなどを用いることができるが、ヒトに対して感染性があるクリプトスポリジウム（パルバム（ｐａｒｖｕｍ）種）を検出しようとした場合には、例えばヒト腸管内皮細胞由来のＨＣＴ−８を用いればヒトへの感染性を正しく評価できる。細胞を培養する培地組成、培養温度、湿度、炭酸ガス濃度、培養時間等の培養条件は、用いようとする細胞株に応じて選定することができる。
【００２４】
培養細胞内で増殖した原虫類もしくは原虫類のオーシストまたはシストを定量検出するための酵素抗体法としては、例えば、ホルマリン溶液やアルコール溶液で細胞を固定した後に、必要に応じてウシ血清アルブミン添加リン酸緩衝液や培養培地等でブロッキング処理をしてからＥＬＩＳＡ法［Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ］（例えば、加藤ら（２０００）培養細胞へのクリプトスポリジウム・パルバムの感染とELISAによる検出，水環境学会誌，第23巻，第7号，p427）によって原虫類（もしくはそのオーシストまたはシスト）の濃度に応じた吸光度の変化として定量検出することができる。
【００２５】
また、培養細胞内で増殖した原虫類もしくは原虫類のオーシストまたはシストを定量検出するための免疫染色法としては、例えば、ホルマリン溶液やアルコール溶液で細胞を固定した後に、必要に応じてウシ血清アルブミン添加リン酸緩衝液や培養培地等でブロッキング処理をしてから、細胞を蛍光標識抗体で染色し、蛍光顕微鏡観察またはレーザー顕微鏡観察によって培養細胞群におけるｆｏｃｉ（病原体の感染部位）を計数し、その結果から被検試料中の感染性を有した原虫類のオーシストまたはシストの濃度を判断することができる。
【００２６】
ところで、原虫類の不活性化の程度を評価するには、感染性を有した原虫類が不活性化処理の前後でどの程度低減したかを数値化する必要がある。前記した定量検出方法のうち免疫染色法においては、原虫類のオーシストまたはシストの数を直接計数するために直ちに不活性化率を判断できる。一方、前記した定量検出方法のうち酵素抗体法においては、原虫類（もしくはそのオーシストまたはシスト）の濃度と吸光度は必ずしも一次関数で表現できない、つまり正比例の関係ではないことから、原虫類（もしくはそのオーシストまたはシスト）の濃度と吸光度に関する検量線が必要である。そこで、既知の濃度で原虫類（もしくはそのオーシストまたはシスト）を含有している標準試料を複数の濃度段階に希釈した試料を被検試料とし、同様の検査手順を実施することで原虫類（もしくはそのオーシストまたはシスト）の濃度と吸光度に関する検量線を得ることができる。標準試料に関する原虫類の濃度と吸光度との相関関係の数式化は、試験結果に応じてふさわしい近似方法を選定すればよいが、例えば、一次線形近似、多項式近似、対数近似、指数近似、累乗近似あるいは両逆数プロット解析などが挙げ上げられる。当該検量線に基づけば、感染性を有した原虫類が不活性化処理の前後でのどの程度低減したかを数値化することができる。被検試料中の原虫類（もしくはそのオーシストまたはシスト）の濃度を正確に判定するためには、前記した検量線の濃度範囲で判断することが望ましく、検査したい試料を必要に応じて希釈または濃縮した試料を被検試料としても良い。
【００２７】
紫外線未照射の試料および種々の照射量で紫外線照射した複数水準の試料を被検試料として、前記した評価方法を用いてそれぞれの被検試料中の原虫類の濃度を測定し、下式（１）で定義される不活性化率を算出し、
不活性化率＝１  −  （紫外線を照射した被検試料における原虫類の濃    度  ÷  紫外線未照射の被検試料における原虫類の濃度）    （式１）
さらに、紫外線照射量と前記不活性化率との連関から、所望の不活性化率を得るに必要な紫外線照射量を決定することができる。決定した紫外線照射量を紫外線照射装置の設計条件としてもよいが、かかる紫外線照射量を基礎データとし更に安全率を考慮して算定される紫外線照射量を設計条件として採用してもよい。
【００２８】
【実施例】
実施例１
クリプトスポリジウムのオーシスト懸濁液に紫外線を照射し、生存オーシストの量を感染試験によって定量評価して紫外線照射によるオーシスト不活性化の程度を検査した。
【００２９】
米国Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ  Ｉｎｃ．より購入したクリプトスポリジウム（パルバム種）のオーシスト懸濁液（１×１０6 個／ｍＬ−リン酸緩衝液）を７０μＬずつ９６穴マルチプレートに分注した。１５Ｗ低圧水銀ランプ点灯下で紫外線照射強度が０．１ｍＷ／ｃｍ2 の位置に当該マルチプレートを置き、３０秒から１０分の範囲で紫外線を照射した。紫外線を照射した後のウェルにオーシスト希釈液（０．２％重炭酸ナトリウム、１０％ウマ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｇ／Ｌカナマイシン、１ｍｇ／Ｌ葉酸、４ｍｇ／Ｌｐ−アミノ安息香酸、２ｍｇ／Ｌパントテン酸、３５ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地からなる溶液）をそれぞれ６３０μＬずつ注入して、オーシスト濃度を１０倍に希釈した（オーシスト濃度は１×１０5 個／ｍＬ）。希釈後のオーシスト懸濁液中に生存しているオーシストの濃度は、ヒト由来培養細胞ＨＣＴ−８株（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ  ２４４）を宿主細胞とした感染試験によって定量評価した。
【００３０】
すなわち、０．２％重炭酸ナトリウム、１０％ウマ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｇ／Ｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地からなる維持培地にて培養したＨＣＴ−８細胞をトリプシン処理で培養容器から回収し、細胞濃度が２．５×１０5 個／ｍＬとなるように新鮮な増殖培地に懸濁して、予めゼラチンでコートした９６穴マルチプレートに２００μＬずつ分注し、炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後のマルチプレートの培地を除去し、検水を各々１００μｌずつ分注し、炭酸ガス培養器内で９０分間培養して、感染させた。感染後の各ウェルより培地を除去し、リン酸緩衝液で２回洗浄した後、オーシストを含まない増殖培地を１００μｌずつ分注し、炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養後の各ウェルより培地を除去し、４％ホルマリンを添加したリン酸緩衝液からなる固定液を１００μｌずつ分注して、室温で２時間反応させて固定した。固定液を除去し、リン酸緩衝液で３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミンと０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したリン酸緩衝液からなるブロッキング液を１００μｌずつ分注して、室温で１時間反応させてブロッキングした。ブロッキング液を除去し、一次処理溶液を３３μｌずつ分注して、室温で１時間反応させた。一次処理溶液は、米国Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ  Ｉｎｃ．より購入したビオチン化抗体（商品名Ａｑｕａ−Ｇｌｏ  Ｇ／Ｃ  Ｉｎｄｉｒｅｃｔ）を前記したブロッキング液で２０倍に希釈した溶液を用いた。反応後の各ウェルから一次処理溶液を除去し、リン酸緩衝液で３回洗浄した後、二次処理溶液を３３μｌずつ分注して、室温で１時間反応させた。二次処理溶液は、アマシャム株式会社より購入したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（商品名Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を前記したブロッキング液で４００倍に希釈した溶液を用いた。反応後の各ウェルから二次処理溶液を除去し、リン酸緩衝液で３回洗浄し、過ホウ酸ナトリウム添加リン酸クエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で１回洗浄した後、発色溶液を１００μｌずつ分注して、室温で１時間反応させて発色させた。発色溶液は、ＯＰＤ［o-phenylenediamine dihydrochloride］（Ｓｉｇｍａ）を発色試薬として０．４ｍｇ／ｍｌとなるように過ホウ酸ナトリウム添加リン酸クエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に溶解したものを用いた。発色反応後のマルチプレートは、マイクロプレートリーダー（バイオラド社製  モデル５５０）を用いて、波長５９５ｎｍをリファレンスとして波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定した吸光度の大小は、検水中の生存オーシスト濃度の高低に依存していることが知られている（加藤ら（２０００）培養細胞へのクリプトスポリジウム・パルバムの感染とELISAによる検出，水環境学会誌，第23巻，第7号，p427）。
【００３１】
また、オーシスト濃度算定のための検量線は、米国Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ  Ｉｎｃ．より購入したクリプトスポリジウム（パルバム種）のオーシストを前記したオーシスト希釈液で０〜１０万個／ｍｌの範囲で種々の濃度に希釈したオーシスト懸濁液（以下、標準液という）を検水として前記した感染試験に基づいて定量評価し、作成した。
【００３２】
まず、オーシスト濃度算定のための検量線を図１に示した。図１では、ウェルに添加したクリプトスポリジウムのオーシスト濃度の対数を横軸として、各ウェルについての発色強度を示す吸光度を縦軸にプロットした。回帰式を計算した結果、相関係数０．９８で下式（２）が得られた。
ｙ  ＝  ０．０２３５Ｌｎ（ｘ）  ＋  ０．０２１９        （式２）
式（２）を変形した下式（３）によれば吸光度（ｙ）から生存オーシスト濃度（ｘ）を算出することができる。
【００３３】
ｘ  ＝  Ｅｘｐ｛（ｙ−０．０２１９）÷０．０２３５｝    （式３）
ついで、種々の時間で紫外線照射した実施例の検水に関する感染試験の結果を図２に示した。図２では、紫外線照射強度（本実施例においては０.１ｍＷ／ｃｍ2 ）と照射時間［秒］の積から紫外線照射量［ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 ］を算定し、その数値を横軸上に標記した。それぞれの照射量の紫外線を照射して得た検水に関する感染試験の結果を吸光度の値として縦軸にプロットした。なお、紫外線未照射のオーシスト懸濁液に関して同様の感染試験で評価した結果を最左列に併記した。本図より明らかなように、紫外線照射量を高めると吸光度が顕著に低下しており、紫外線照射によって生存オーシスト濃度が減少、すなわち不活性化が可能であることが容易に推定される。
【００３４】
さらに、図１に示した感染試験の検量線に基づいて、図２に示した実施例の感染試験における吸光度測定値から検水中の生存オーシスト濃度を算出した。具体的には、式（２）中のｙに図２の吸光度を代入することによって生存オーシスト濃度を算出した。紫外線照射後の検水の生存オーシスト濃度を紫外線未照射時のそれと比較することによって、紫外線照射によるクリプトスポリジウムのオーシストの不活性化率を算出した。すなわち、不活性化率は下式（４）で算出した。
【００３５】
不活性化率［％］  ＝  ｛１−（紫外線照射後の生存オーシスト濃度÷    紫外線未照射時の生存オーシスト濃度）｝  ×  １００      （式４）
結果を図３に示した。図３では、紫外線照射量を横軸とし、それぞれの照射量における不活性化率を縦軸にプロットした。本図より明らかなように紫外線照射量が高まると指数関数的に不活性化が可能であることは明らかである。本実施例の結果では、紫外線照射量にして２０ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 毎に９０％のクリプトスポリジウムのオーシストが不活性化することが可能であった。つまり、２０、４０、６０ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 の紫外線を照射した場合、それぞれ、９０、９９、９９．９％が不活性化することができる。
【００３６】
実施例２
内側を二酸化チタン光触媒被膜したガラスシャーレにクリプトスポリジウムのオーシスト懸濁液を入れ、液面上部から紫外線を照射し、生存オーシストの量を感染試験によって定量評価して紫外線照射によるオーシスト不活性化の程度を検査した。
【００３７】
内側を二酸化チタン光触媒被膜した外径６０ｍｍのガラスシャーレに、米国Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ  Ｉｎｃ．より購入したクリプトスポリジウム（パルバム種）のオーシスト懸濁液（１×１０6 個／ｍＬ−リン酸緩衝液）を５ｍＬを注ぎ、４００Ｗ高圧水銀ランプ点灯下で紫外線照射強度が０．１ｍＷ／ｃｍ2 の位置に当該マルチプレートを置き、液面上部から紫外線を照射した。３０秒から１０分の範囲で経時的にオーシスト懸濁液を１００μＬずつ採取し、実施例１に記したオーシスト希釈液を用いて１０倍に希釈した後の試料を検水とした。当該検水実施例１に記した手順に従って、培養細胞に感染させ、酵素抗体法で吸光度を測定し、さらに図１に示した検量線に基づいて検水中の生存オーシスト濃度を算出した。
【００３８】
結果を図４に示した。図４では、紫外線照射量を横軸とし、それぞれの照射量における不活性化率を縦軸にプロットした。本図より明らかなように紫外線照射量が高まると指数関数的に不活性化が可能であることは明らかである。本実施例の結果では、紫外線照射量にして１５ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 毎に９０％のクリプトスポリジウムのオーシストが不活性化することが可能であった。つまり、１５、３０、４５ｍＷ・ｓ／ｃｍ2 の紫外線を照射した場合、それぞれ、９０、９９、９９．９％が不活性化することができる。本実施例で得られた光触媒併用法を用いれば、実施例１に記した紫外線照射単独法に比べて２割程度少ない紫外線照射量で不活性化が可能であった。
【００３９】
以上の２例の実施例の結果より、紫外線照射することでクリプトスポリジウムを効果的に不活性化できることは明らかである。また、光触媒併用法によれば紫外線単独法に比べてより少ない紫外線照射量で原虫類を不活性化できる。さらに、実際の不活性化処理へ適用に際しては所望の不活性化目標値に応じて紫外線照射量の最適値を決定することができる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、従来、紫外線による不活性化が困難とされた原虫類のシストやオーシストを容易に不活性化できる。さらに、所望の不活性化目標値に応じて紫外線照射量の最適値を決定することができる。
実際の処理への適用に際しては、濁度、色度、紫外線吸収率等による不活性化効果の阻害因子が存在するが、その場合にはそれぞれの処理対象物の水質を考慮して不活性条件を見極めて、最適化すればよい。また、前記した紫外線照射量の最適値に安全率を乗じて照射条件を算定してもよい。
【００４１】
また、一般に微生物を紫外線照射した後に可視光や近紫外光を受光すると紫外線照射によって損傷したＤＮＡが修復され、再び活性化するいわゆる光回復現象が存在することが知られているが、紫外線とはことなる機構で不活性化する光触媒法を併用することによって光回復現象を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および２において検水中の生存オーシスト濃度の算定根拠とした、感染試験における検量線例を示す図である。
【図２】クリプトスポリジウム原虫に関して本願の不活性化方法の実施例１における感染試験結果例を示す図である。
【図３】クリプトスポリジウム・パルバムに関して本願の不活性化方法の実施例１における紫外線照射量と不活性率との相関性を示す例図である。
【図４】クリプトスポリジウム・パルバムに関して本願の不活性化方法の実施例２における紫外線照射量と不活性率との相関性を示す例図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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