(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定しようとする抗原に対する抗体を用いる免疫学的測定法において、試料中に存在する前記測定しようとする抗原に対する抗体に反応するヒトIgM型自然抗体に対する抗体を免疫測定系に添加することにより、該ヒトIgM型自然抗体による非特異反応を抑制し、正確な測定値を得ることを特徴とする免疫学的測定法であって、ヒトIgM型自然抗体に対する抗体が、前記測定しようとする抗原に対する抗体を作製した動物と同種動物で作製した抗ヒトIgM抗体である免疫学的測定法。
【請求項２】
ヒトIgM型自然抗体に対する抗体の添加量が、0.1〜10mg/mLである請求項１記載の免疫学的測定法。
【請求項３】
免疫学的測定法が、ラテックス凝集光学的測定法である請求項１または２に記載の免疫学的測定法。
【請求項４】
測定しようとする抗原に対する抗体を用いる免疫学的測定用キットであって、試料中に存在する前記測定しようとする抗原に対する抗体に反応するヒトIgM型自然抗体に対する抗体を含み、ヒトIgM型自然抗体に対する抗体が、前記測定しようとする抗原に対する抗体を作製した動物と同種動物で作製した抗ヒトIgM抗体であり、ヒトIgM型自然抗体による非特異反応を抑制し、正確な測定値を得ることができる免疫学的測定キット。
【請求項５】
ヒトIgM型自然抗体に対する抗体の添加量が、0.1〜10mg/mLである請求項４記載の免疫学的測定キット。
【請求項６】
免疫学的測定法が、ラテックス凝集光学的測定法である請求項４または５に記載の免疫学的測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定法に関し、より詳細には、試料中に存在する非特異因子により生じる非特異反応を抑制する免疫学的測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫学的測定法は抗原抗体反応を利用した測定法で、特異性が非常に高い測定法であることが知られている。免疫学的測定法としては、蛍光抗体法、間接血球凝集法、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法などが知られている。最近は、より高感度な化学発光免疫測定法、一般の生化学用分析装置で測定可能な免疫比濁法、ラテックス凝集光学的測定法などが開発され、特に医学分野においては頻繁に利用されている。
【０００３】
しかし、このような特異性の高い免疫学的測定法であっても、試料によっては測定しようとする抗原が存在しなくても陽性の測定値を示したり、真値とは異なった測定値を示したりする問題があった。すなわち、非特異反応と呼ばれる現象である。たとえば、測定しようとする抗原に対する抗体を固相化するような免疫学的測定法であるエンザイムイムノアッセイ法やラテックス凝集光学的測定法などでは、固相化抗体を認識してこれと反応する因子（非特異因子）が試料中に存在する場合があり、このような場合には試料中に測定しようとする抗原が存在しなくても陽性の測定値になったり、真値とは異なった測定値を示してしまうという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、試料中に存在する非特異因子による影響を受けることなく、抗原を正確に測定することができる免疫学的測定法およびそれに用いることができるキットを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、免疫学的測定法において、試料中に存在する非特異因子に対する抗体を免疫測定系に添加することにより、該非特異因子による非特異反応を抑制し、その結果として、抗原を正確に測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、試料中に存在する非特異因子に対する抗体を免疫測定系に添加することにより、該非特異因子による非特異反応を抑制することを特徴とする免疫学的測定法を提供する。試料中に存在する非特異因子としては、測定しようとする抗原に対する抗体を認識して、この抗体と反応するものであれば、特に限定されないが、ＩｇＭ型またはＩｇＧ型の自然抗体を挙げることができる。非特異因子に対する抗体としては、非特異因子を認識して、これと反応するものであれば、特に限定されないが、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体を挙げることができる。免疫学的測定法としては、蛍光抗体法、間接血球凝集法、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法、化学発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集光学的測定法などが挙げられるが、ラテックス凝集光学的測定法が効果的である。
【０００６】
また、本発明は、試料中に存在しうる非特異因子に対する抗体を含む免疫学的測定用キットを提供する。試料中に存在しうる非特異因子およびそれに対する抗体としては、上記のものが挙げられる。本発明のキットは、さらに、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する薬剤、たとえば、グリシン、Tris、Hepes などを含んでもよい。
本発明の方法およびキットは、臨床検査分野を始めとする医学分野、特に免疫学的手法に関係する分野に有用なものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
免疫学的測定にかける試料としては、種々の生体試料、例えば、被験者の血液、血清、血漿、尿、唾液などの体液、各種の細胞、組織を挙げることができる。
試料中に存在する非特異因子は、測定しようとする抗原に対する抗体を認識して、この抗体と反応するものである。たとえば、ラテックス凝集光学的測定法において、ラテックス粒子に結合させた測定しようとする抗原に対する抗体がウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である場合には、ラテックス粒子表面上に結合したウサギＩｇＧを非特異因子が認識してこれと反応する。この非特異因子は、測定しようとする抗原で全く免疫されていない正常ウサギのＩｇＧも認識してこれと反応する。試料中に存在するこのような非特異因子は免疫などによって産生されたものでないため、自然抗体と呼ばれている。このような自然抗体は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）であったり、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であったりする。すなわち、非特異因子は、試料がヒト体液、たとえば血清や血漿の場合には、測定しようとする抗原に対する抗体を作製した動物のＩｇＧに対する抗動物ＩｇＧ抗体ヒトＩｇＭ型あるいは抗動物ＩｇＧ抗体ヒトＩｇＧ型である。この他にも、非特異因子としては、リウマチ因子、異好抗体などが知られている。
【０００８】
非特異因子に対する抗体は、非特異因子を認識して、これと反応するものであり、ＩｇＭ型の非特異因子の場合には、抗ヒトＩｇＭ抗体であり、ＩｇＧ型の非特異因子の場合には、抗ヒトＩｇＧ抗体であるが、これは一例である。非特異因子に対する抗体は、いずれの動物に免疫して作製されたものでも良いが、好ましくは測定しようとする抗原に対する抗体と同種の動物により作製されたものである。
【０００９】
本発明の方法において、非特異因子に対する抗体は、免疫測定系に添加される。具体的には、非特異因子に対する抗体の溶液を用意して、測定しようとする抗原に対する抗体を抗原と反応させる前に、あらかじめ試料に前記の溶液を添加して、非特異因子とそれに対する抗体を反応させることによって、非特異因子による非特異反応を抑制してもよいし、測定しようとする抗原に対する抗体の溶液中に非特異因子に対する抗体を含ませ、この溶液を試料に添加して、非特異因子とそれに対する抗体を反応させることによって、非特異因子による非特異反応を抑制してもよい。前者の方法において、非特異因子に対する抗体の溶液中の該抗体の量は、特に限定されないが、好ましくは抗体蛋白量0.1mg/mLから10mg/mLである。この溶液の組成は、特に限定されることはなく、抗体活性に安定なもので（すなわち、抗体の活性を失活させない）しかも測定しようとする抗原の測定系に影響を与えないものであればよい。また、後者の方法において、測定しようとする抗原に対する抗体の溶液中に含ませる非特異因子に対する抗体の量は、特に限定されないが、好ましくは抗体蛋白量0.1mg/mLから10mg/mLである。
【００１０】
本発明の免疫学的測定用キットは、試料中に存在しうる非特異因子に対する抗体をひとつの要素として含むが、その他にも、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する薬剤、たとえば、グリシン、Tris、Hepes などの要素を含んでもよい。これらの要素は、バイアル、チューブなどのような容器に収納され、区画化された担持手段中にこれらの容器をひとまとめにして納められるとよい。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
参考例１
試料として、数名の急性心筋梗塞患者からの血清を用意し、これらの試料における非特異反応の有無を以下のようにして確認した。
【００１２】
血清試料を生理食塩液にて５段階希釈し、各々の試料10μLに第１試薬である0.17Mグリシン緩衝液、pH7.0を160μＬ添加したのち、Massonらの方法（Methods in enzymology, vol.74, 106-140）により抗ミオグロビン抗体ウサギＩｇＧを結合させたラテックス試薬である第２試薬を100μL添加して反応させ、各々の試料中のミオグロビン濃度を測定した。結果を図１に示す。図１に示されるように、希釈系列とミオグロビン濃度に比例関係があるものは非特異反応の無い試料であり、このような試料では、正確にミオグロビン濃度が定量できる。これに対して、希釈系列とミオグロビン濃度に比例関係が無いものは非特異反応のある試料であり、このような試料では、非特異因子が測定に影響を及ぼすために、正確なミオグロビン濃度の定量ができないことは明らかである。
【００１３】
実施例１
参考例１の非特異反応のある試料または非特異反応の無い試料を生理食塩液にて５段階希釈し、各々の試料10μLに、抗ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）1.0 mg/mLを含む第１試薬（0.17Mグリシン緩衝液、pH7.0）を160μＬ添加したのち、第２試薬（Massonらの方法により抗ミオグロビン抗体ウサギＩｇＧを結合させたラテックス試薬）を100μL添加して反応させ、各々の試料中のミオグロビン濃度を測定した。結果を図２に示す。図２に示されるように、非特異反応の無い試料では、第１試薬に抗ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）が含まれていても希釈系列とミオグロビン濃度には比例関係があり、正確にミオグロビン濃度を定量していることがわかる。また、非特異反応のある試料でも、第１試薬に抗ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）を含ませれば、参考例１の場合とは異なり希釈系列とミオグロビン濃度には比例関係があり、正確にミオグロビン濃度を定量していることがわかる。
【００１４】
参考例１および実施例１の結果から、次のことが言える。非特異因子による非特異反応が無い試料中のミオグロビン濃度は正確に定量できるが、参考例１では非特異反応のある試料では希釈系列とミオグロビン濃度には比例関係が無く、明らかに非特異因子による測定への影響があり、正確にミオグロビン濃度を定量できなかった。しかし、非特異因子に対する抗体、この実施例では抗ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）を第１試薬に含ませて試料に添加すれば、試料中の非特異因子の非特異反応を抑制することにより非特異反応のある試料でも希釈系列とミオグロビン濃度には比例関係が成立し、正確にミオグロビン濃度を定量できる。
【００１５】
実施例２
非特異因子の分画
参考例１の非特異反応のある試料200μLをSuperose 6にチャージし、ゲル濾過分画を行った。次に、各画分のミオグロビン濃度を参考例１の第１試薬（抗ＩｇＭ抗体を含まない）及び第２試薬のラテックス試薬を用いて参考例１と同様に測定した。ピークはミオグロビンの分子量的に分画される位置とそれより高分子側の分画位置とに確認された。この高分子側の分画を非特異因子分画とした。
【００１６】
非特異因子と抗ＩｇＭ抗体添加の効果
非特異反応のない試料として、健常人の血清を用意した。この非特異反応のない試料の少量をとり、これを試料Ａとした。また、同じ試料から別に少量とり、これに非特異因子分画を約１mg/mL（最終蛋白質量）添加して、試料Ｂとした。
【００１７】
試料ＡおよびＢの各10μLに、第１試薬（0.17Mグリシン緩衝液、pH7.0）を160μＬ、または抗ヒトＩｇＭ抗体（ウサギＩｇＧ）1.0 mg/mLを含む第１試薬を160μＬ添加したのち、第２試薬（Massonらの方法により抗ミオグロビン抗体ウサギＩｇＧを結合させたラテックス試薬）を100μL添加して反応させ、各々の試料中のミオグロビン濃度を測定した。その結果、表１に示すように試料Ａのミオグロビン濃度は抗ＩｇＭ抗体を含まない第１試薬を用いた場合と抗ＩｇＭ抗体を含んだ第１試薬を用いた場合とでほぼ同様の測定値であったが、試料Ｂのミオグロビン濃度は抗ＩｇＭ抗体を含まない第１試薬を用いた場合、試料Ａに比較して非常に高い値を示した。しかし、抗ＩｇＭ抗体を含んだ第１試薬を用いた場合の試料Ｂのミオグロビン濃度は試料Ａと同様の測定値であった。抗ＩｇＭ抗体を含まない第１試薬を用いた場合の試料Ｂのミオグロビン濃度が試料Ａに比較して非常に高い値を示したのは、非特異因子の添加によるものであり、抗ＩｇＭ抗体を含んだ第１試薬を用いた場合の試料Ｂのミオグロビン濃度が試料Ａと同様の測定値であったのは、第１試薬に抗ＩｇＭ抗体を添加することにより非特異因子の非特異反応を抑制したためである。このことは、抗ＩｇＭ抗体の添加により非特異因子による非特異反応を抑制し、その結果、ミオグロビンの正確な定量測定ができることを意味している。
【００１８】
【表１】
0004065600.tif 000002
【００１９】
【発明の効果】
本発明の免疫学的測定法によれば、非特異因子を含む試料についても、該非特異因子により生じる非特異反応を抑制して、抗原を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  参考例１で得られた非特異反応のある試料または非特異反応の無い試料の希釈系列とミオグロビン濃度の測定値との関係を示した図である。
【図２】  非特異因子に対する抗体を添加した場合の非特異反応のある試料または非特異反応の無い試料の希釈系列とミオグロビン濃度の測定値との関係を示した図である。
【図１】
0004065600.tif 000003
【図２】
0004065600.tif 000004