(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
１）タンパク質分子のアミノ酸配列上、予め定めた個数のアミノ酸からなる移動フレームを該配列のＮ末端に設定する；
２）移動フレームのアミノ酸配列を、該タンパク質分子のアミノ酸配列とＮ末端から順に比較し、該タンパク質分子のアミノ酸配列上で規定個数以上のアミノ酸が該移動フレームと表：
【表１】
0004053616.tif 000003
に記載の関係にある部分を抽出してアンチセンスフレームとする；
３）全アミノ酸配列と比較の後、移動フレームをＣ末端から逆向きの配列と順に比較し、２）と同様にしてアンチセンスフレームを抽出する；
４）移動フレームをアミノ酸一つ移動させて２）および３）を繰り返す；
５）移動フレームがＣ末端に達するまで４）を繰り返す；
６）相対するアンチセンスフレームを複数集積して持つ部分をアンチセンスホモロジーボックスとすることを含む、タンパク質分子内アンチセンスホモロジーボックスの検索方法。
【請求項２】
以下の工程：
１）タンパク質分子のアミノ酸配列上、予め定めた個数のアミノ酸からなる移動フレームを該配列のＮ末端に設定する；
２）移動フレームのアミノ酸配列を、該タンパク質分子のアミノ酸配列とＮ末端から順に比較し、該タンパク質分子のアミノ酸配列上で規定個数以上のアミノ酸が該移動フレームと表：
【表２】
0004053616.tif 000004
に記載の関係にある部分を抽出してアンチセンスフレームとする；
３）全アミノ酸配列と比較の後、移動フレームをＣ末端から逆向きの配列と順に比較し、２）と同様にしてアンチセンスフレームを抽出する；
４）移動フレームをアミノ酸一つ移動させて２）および３）を繰り返す；
５）移動フレームがＣ末端に達するまで４）を繰り返す；
６）相対するアンチセンスフレームを複数集積して持つ部分をアンチセンスホモロジーボックスとする、
７）アンチセンスホモロジーボックスのアミノ酸配列に基づいて、該タンパク質の活性に何らかの変化を及ぼす生理活性ペプチドを設計する
工程を含む、生理活性ペプチドの設計方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はタンパク質分子内において相互にアンチセンスの関係にある領域を検索する方法および、該方法に基づく生理活性ペプチドの設計方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパクの活性には、アミノ酸の一次配列のみならず、非共有結合による相互作用に依存する三次元構造が大きく寄与している。この三次元構造には水素結合、疎水性相互作用、イオン結合、ファンデルワールス引力等が関与していることが知られている。これらに加えてタンパク質分子内においてセンス−アンチセンスの関係にあるペプチドが相互に認識し合い、結合する相互作用が、タンパク質の三次元構造に寄与している可能性が報告されている。ここでセンス−アンチセンスの関係にあるペプチドとは、あるペプチド（センスペプチド）をコードするＤＮＡの対合鎖によってコードされるアミノ酸からなるペプチド（アンチセンスペプチド）の関係を意味する（図１参照）。
【０００３】
センス−アンチセンスの関係にあるペプチドの認識機構の詳細は未だ明らかにはされていない。親水性アミノ酸をコードするコドンのアンチセンスコドンがコードするアミノ酸（アンチセンスアミノ酸）が疎水性アミノ酸であること、およびその逆の関係が報告されており（ブラロックら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 121, 203-207(1984)および同、Trends.Biotech. 6,140-144(1991))、また、親水性の低いアミノ酸を示すコドンの場合にも同様の相補性が認められている。このように対合ＤＮＡによりコードされるアミノ酸間のハイドロパシーには有意な相関関係がある(ｒ＝０.７４)ことが報告されており、かかるハイドロパシーの相補性がセンス−アンチセンスペプチド間の親和性にかかわっていると考えられている。さらに、ペプチド間のハイドロパシーの平均値の相補性が高いほど、該ペプチド間の親和性が高いという報告もある。この、ハイドロパシー理論に基づくタンパク質に親和性を有するペプチドを設計する方法が提案されている（特表昭６２−５０２５１３号）。
【０００４】
近年、タンパク質の活性の解析等のために、タンパク質分子内や、リガンドとそのレセプターのごとき対応関係にあるタンパク質間においてかかるセンス−アンチセンスの関係にあるＤＮＡ配列を検索することが行われている。
しかしながら周知のようにアミノ酸をコードするＤＮＡのコドンは３つの核酸から構成されるが、ひとつのアミノ酸をコードするコドンが複数あるため、アンチセンスアミノ酸としては複数のアミノ酸があることになる。従って検索の際、アミノ酸のレベルで比較すればアンチセンスアミノ酸に該当する場合でも核酸レベルで比較した場合にはアンチセンス部分であると判断されない場合が多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アミノ酸レベルにおける検索によりタンパク質分子内でセンス−アンチセンスの関係を有する領域を検索する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、あるタンパク質に対して特異的に作用する、生理活性ペプチドを設計する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明においては相補的なアミノ酸を核酸レベルではなく、アミノ酸レベルで検索するところに特徴がある。これは、遺伝子コードの変異に基づくものであり、例えばバリンをコードするコドンとしてはＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＧおよびＧＵＡがあり、これに対する相補的コドンはそれぞれＡＡＣ、ＧＡＣ、ＣＡＣおよびＵＡＣであり、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＨｉｓおよびＴｙｒをコードする。すなわちアミノ酸レベルにおいてＶａｌとアンチセンスの関係にあるアミノ酸は、この４つのアミノ酸なのである。かかる核酸コードの変異によりセンス−アンチセンスの関係となるアミノ酸の対応関係を以下に示す：
【０００７】
【表４】
0004053616.tif 000002
上記表および本明細書においては、アミノ酸は一文字標記にて表す。また、各数値はアミノ酸のハイドロパシーを示す。
【０００８】
本発明はタンパク質分子内において、アミノ酸配列がセンス−アンチセンスの関係にある部分を上記表に記載した対応関係に基づき、アミノ酸レベルで検索する、タンパク質分子内アンチセンスホモロジーボックスの検索方法を提供する。
【０００９】
便宜上移動フレームを設定するタンパク質をタンパク質１と、移動フレームと比較するタンパク質をタンパク質２として説明すれば、本発明はより詳細には以下の工程：
【００１０】
１）タンパク質１のアミノ酸配列上、予め定めた個数のアミノ酸からなる移動フレームを該配列のＮ末端に設定する；
２）移動フレームのアミノ酸配列を、タンパク質分子２のアミノ酸配列とＮ末端から順に比較し、タンパク質分子２のアミノ酸配列上で設定個数以上のアミノ酸が該移動フレームと上記表に記載の関係にある部分を抽出してアンチセンスフレームとする；
３）タンパク質分子２のアミノ酸配列のＮ末端まで比較した後、移動フレームをタンパク質分子２のＣ末端から逆向きの配列と順に比較し、２）と同様にしてアンチセンスフレームを抽出する；
４）移動フレームをタンパク質分子１上アミノ酸一つ移動させて２）および３）を繰り返す；
５）移動フレームがタンパク質分子１のアミノ酸配列のＣ末端に達するまで４）を繰り返す；
６）相対するアンチセンスフレームの複数集積して持つ部分をアンチセンスホモロジーボックスとする
を含む方法である。工程の概念図を図２に示した。本発明のごとくタンパク質内のアンチセンスホモロジーボックスを検索する場合にはタンパク質２はタンパク質１の同一コピーである。
【００１１】
得られるアンチセンスフレームを持つペプチドフレームは単独で存在するものも、アミノ酸数個分フレームが移動して重複しているものもある（図３参照）。本明細書において、これらのフレーム単独あるいは重複部分を「アンチセンスホモロジーボックス」という。アンチセンスホモロジーボックスは原型タンパク質分子内でペプチドの読み取り方向にかかわりなくお互いにアンチセンスの関係にある部分であるが、１個だけでなく複数のアンチセンスホモロジーボックスとアンチセンスであっても、当該アンチセンスホモロジーボックス自身とアンチセンスであってもよい（図４参照）。
【００１２】
本発明の方法によって得られるアンチセンスホモロジーボックスは相互に親和性を有し、タンパク質分子の三次元構造に深くかかわっていることが予測される。従って、本発明の方法により得られるアンチセンスホモロジーボックスのアミノ酸配列を有するペプチドを原型としたタンパク質と同一系内に存在させれば、該タンパク質の三次元構造に影響を及ぼし、その結果として該タンパク質本来の生理活性が変化すると考えられる。従って、本発明はさらに分子内アンチセンスホモロジーボックスを検索することを含むに基づいた生理活性ペプチドの設計方法も提供する。
【００１３】
すなわち本発明はタンパク質分子内において、アミノ酸配列がセンス−アンチセンスの関係にある部分を上記表に基づきアミノ酸レベルで検索することを含む、生理活性ペプチドの設計方法も提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法においては表１の関係に基づき、タンパク質分子内におけるアンチセンスアミノ酸の検索を行う。検索のためには、目的とするタンパク質のアミノ酸配列をあらかじめ決定しておくことが必要である。アミノ酸配列は、データーベースとして当業者の利用に供されているアミノ酸配列や、ｃＤＮＡから得られるアミノ酸配列を用いる他、従来から当業者に知られているいずれの方法を用いて決定したものであってもよい。
【００１５】
検索時に設定する移動フレームのアミノ酸の個数としては、６個から１５個程度の範囲で定める。６〜１５個としたのは、例えば抗原ペプチドとしてＴ細胞レセプター等に提示されるペプチドが１０個程度のアミノ酸であり、アミノ酸１０個程度のペプチドが構造情報を十分保持しているという知見に基づく。移動フレームのアミノ酸数を１０個とするのが最も好ましい。移動フレームのアミノ酸数を１０アミノ酸とするとき、これに対しアンチセンスの関係にあるアミノ酸の数が８個以上の場合にアンチセンスフレームと規定すれば、８０％以上の相補性を有するアンチセンスフレームが得られる。複数のアンチセンスフレームを持つ部分は特に分子内での相互作用にかかわっている可能性が高いと考えられ、かかる部分をアンチセンスホモロジーボックスとする。
【００１６】
実際の検索は、上記手順に基づいたコンピュータープログラムを作成し、必要なデータを読み込んで行えばよい。本発明者らは、ＩＢＭ社のパーソナルコンピューター上で稼働するプログラムであるＡＮＴＩＳを作成し、さまざまな解析を行った。本発明者らが移動フレームのアミノ酸を１０、移動フレームとアンチセンスの関係にあるアミノ酸が８個以上の場合をアンチセンスフレームであるととして、様々なタンパク質を用いて行った予備試験によれば、タンパク質の長さに関係なく、平均１４アミノ酸からなるアンチセンスホモロジーボックスが分子内に平均５０アミノ酸からなる非アンチセンス部分を挟んで存在していることがわかった。
【００１７】
本発明のタンパク質分子内のアンチセンスホモロジーボックスを検索することを含む、生理活性ペプチドの設計方法において、目的とする生理活性は原型タンパク質の活性に対して何らかの変化を及ぼす活性である。本発明において、原型として用いるタンパク質としては何らかの生理活性を示すタンパク質例えば、酵素、受容体、抗体、リンホカイン、サイトカイン、増殖因子、細胞内情報伝達物質、遺伝子発現制御タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。期待される生理活性としては、かかる原型として用いるタンパク質の三次元構造を変化させることによる活性の阻害、あるいは活性部位の露出による活性の増強や改変等が挙げられる。
【００１８】
本発明の生理活性ペプチドの設計方法においては、ペプチドの設計はアンチセンスホモロジーボックスのアミノ酸配列そのものからなるペプチドを用いる場合のみならず、該ペプチドを改変させる場合も含む。
【００１９】
本発明の設計方法において用いるペプチドの改変方法としては、アンチセンスホモロジーボックスが繰り返される配列のペプチドを作成するような方法の他に、上記表に示したごときアンチセンスアミノ酸の関係にあるアミノ酸はハイドロパシーについても相補的であるという関係から、ハイドロパシーの平均値を維持して実際の分子内の環境に近づけるため、アンチセンスホモロジーボックスに隣接する部分のアミノ酸配列を付け加えた配列としてもよい。さらに、アンチセンスホモロジーボックス内のアミノ酸を同様のハイドロパシーを示すアミノ酸で置換してもよい。
【００２０】
更に同様の目的を達するためにアミノ酸等を化学修飾してもよい。また、タンパク質分解酵素の作用によりペプチドが分解されるのを防ぐために、Ｄ体のアミノ酸を用いてペプチドを合成したり、アミノ酸の化学修飾をすることも有用な手段となる。
【００２１】
本発明の設計方法によってなされた設計に基づいて、ペプチドを合成する。ペプチドの合成は、化学合成、遺伝子組換法で遺伝子導入した微生物による合成、遺伝子導入した培養細胞により産生させる等々の従来知られているかあるいは将来的に開発されるいかなる方法を用いてもよい。得られたペプチドについては、各タンパク質の活性に及ぼす効果を検出する。本願発明の方法によって、原型としたタンパク質に親和性が高く、タンパク質の生理活性に対して何らかの作用を及ぼすペプチドが得られることが予想される。この作用を検出するためには、原型タンパク質への親和性を評価する他に、原型タンパク質の活性に応じて試験すればよい。例えばエンドセリンレセプター分子内アンチセンスホモロジーボックスから誘導されたペプチドについては、エンドセリンとの結合、エンドセリンにより収縮させた血管平滑筋細胞に対する弛緩作用等を調べればよい。また、Ｃ５ａレセプター由来のペプチドには、Ｃ５ａへの親和性やＣ５ａの活性である細胞内カルシウム濃度の増大、細胞の脱顆粒化等を制御する効力について調べるればよい。もちろん、本願発明の生理活性を有するペプチドはこれらの活性の変化に限定されるべきではなく、現在知られており、または将来明らかにされるすべてのタンパク質に及ぶ。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２２】
【実施例１】
１）Ａ型ヒトエンドセリンレセプター内のアンチセンスホモロジーボックスの検索
ヒトＡ型エンドセリンレセプターのアミノ酸配列に対し、本発明の方法により移動フレームのアミノ酸数を１０とし、アミノ酸レベルで８０％以上の相補性を示すアンチセンスホモロジーボックスを検索した。検索にはＡ型ヒトエンドセリンレセプターをコードするｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列（Biochem. Biophys. Res. Commun., 180, 1265-1272(1991)参照)を用いて行った。
【００２３】
７つのアンチセンスホモロジーボックスが得られたが、アミノ末端領域（アミノ酸１２から２４）にある第１のアンチセンスホモロジーボックスはタンパク質の合成の後に除かれるため、天然のレセプター内に存在するのは６つのボックスである。第２及び第３のボックスはアミノ酸５５から６４および７４から８０であり、細胞外に位置していた。第４のアンチセンスホモロジーボックスはアミノ酸１１７〜１９１を含む。第４のアンチセンスホモロジーボックスは自分自身を含むほとんどすべてのアンチセンスホモロジーボックスに対して相補的であった。第５番目及び６番目のボックスは細胞膜透過領域に存在すると考えられる。カルボキシ末端側のボックスは３８６位のアミノ酸から始まり、最後の２つを除く残りの配列を含んでいた。
【００２４】
上記のうち、最も活性が強いと考えられる第４のアンチセンスホモロジーボックスから誘導されたペプチド、すなわちＮＨ2−ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＣＯＯＨを選んだ。
【００２５】
２）ペプチドの改変
得られたＮＨ2−ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＣＯＯＨペプチド（ＥＴＲ−Ｐ１と名付ける）に基づき２つのペプチドをデザインした。第１はＥＴＲ−Ｐ１の両端に、エンドセリンレセプターＡのアミノ酸配列においてＥＴＲ−Ｐ１に隣接するアミノ酸を４個ずつ付加したペプチド（ただし、アミノ酸の性質を考慮してＣ末端のＱをＩに置換した）（ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１）および第２はＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１のアミノ酸配列を逆向きとした配列（ＥＴＲ−Ｐ１／ｒｅ）である。以下に改変ペプチドのアミノ酸配列を示す：
ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１：ＮＨ2−ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＣＯＯＨ
ＥＴＲ−Ｐ１／ｒｅ：ＮＨ2−ＩＶＲＳＷＳＡＶＡＲＹＲＤＶＳＬＡＣＬＮＬＶ−ＣＯＯＨ
【００２６】
上記３つのアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成した。ペプチドの合成はぺプチドシンセサイザー（ＰＥＰＴＩＣＯＵＰＬＥＲ  ２２００：ベガ社製）を用いて固相法により行った。得られたペプチド樹脂を無水弗化水素により処理して樹脂よりペプチドの切り出しおよび脱保護を行った後、酢酸−アセトニトリル−水（１：２：２）で抽出、高速液体クロマトグラフィーによる精製を行い、アミノ酸分析によって確認した。
【００２７】
３）エンドセリンによるラット血管平滑筋収縮に対するペプチドの効果
オスWistarラット(２２０〜３５０ｇ，７〜９週令)の大腿動脈を採取し、螺旋状に切り取って長さ２０ｍｍ幅１.４ｍｍの標本を作成した。得られた標本を張力測定器にセットし、Krebs-Henseleit Bicarbonate緩衝液２０ｍｌ中に浸漬し、静止張力として５００ｍｇを負荷した。
【００２８】
エンドセリン−１を最終濃度が１０-9Ｍとなるように緩衝液へ添加し、標本の収縮が一定となったところで各ペプチドを累積的に添加して血管の弛緩を調べた。最終的に平滑筋弛緩剤であるパパベリンを最終濃度１０-4Ｍとなるよう添加して標本を完全に弛緩させ、これを弛緩率１００％としてペプチドによる弛緩率を求めた。結果を図５に示した。この結果から、ＥＴＲ−Ｐ１がエンドセリンの平滑筋収縮作用を阻害すること、およびＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１およびＥＴＲ−Ｐ１／ｒｅがそれぞれＥＴＲ−Ｐ１より強い活性を示すことがわかる。
【００２９】
４）細胞内Ａ型エンドセリンレセプターへのエンドセリン結合促進作用
Ａ型エンドセリンレセプター（ＥＴＲ−Ａ）を発現している細胞である３Ｔ３細胞に、125Ｉを標識したエンドセリンー１（ＥＴ−１）を作用させれば、ＥＴ−１の結合を125Ｉの放射性活性で測定し得る。この系に非標識のＥＴ−１を添加すればその量に応じて競合阻害が起こり、125Ｉ−ＥＴ−１が細胞に吸着しなくなる。ＥＴ−１の競合阻害物質として知られるＢＱ１２３を系に添加しても同様の効果が認められる。
【００３０】
この系に上記で得たＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１を添加したところ、測定された125Ｉの活性は上昇し、125Ｉ−ＥＴ−１の細胞への結合の促進が認められた。
この結果より、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１はＡ型エンドセリンレセプターに作用させると立体構造を変化させ、ＥＴＲ−Ａのシグナル伝達機能を失わせる一方、ＥＴ−１の結合性を高めるものであると考えられる。
【００３１】
５）インビボにおける効果
ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１の生体内における作用を調べた。
ラットに細菌の菌体内毒素であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を投与すると、エンドトキシンショックとして致死的血圧低下が誘導される。これに対してＬＰＳ投与の前に予めＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１を５０μｇ／ｋｇ血管内投与した群においては血圧低下を顕著に防止した。
同様の実験をイヌを用いて行った。ＬＰＳの持続投与を開始した１５分後にＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１を投与した場合にも血圧低下に対する抑制効果が認められた。
【００３２】
【実施例２】
１）Ｃ５ａレセプターのアンチセンスホモロジーボックスの検索
補体の活性フラグメントであるＣ５ａはアナフィラトキシンとも呼ばれる。このＣ５ａに対する細胞膜上のレセプターであるＣ５ａレセプター（Ｃ５ａＲ）の分子内アンチセンスホモロジーボックスを、実施例１と同様にして検索した。得られたアンチセンスホモロジーボックスから分子内の複数部分と相互にアンチセンスの関係にあることから分子内で中心的役割を果たしていると考えられるアンチセンスホモロジーボックスとしてＮＨ2−ＬＲＴＷＳＲＲＡＴＲＳＴＫＬＫＶＶ−ＣＯＯＨ（ＰＲ２２７と名付ける）を選択し、実施例１と同様にして合成した。
【００３３】
２）細胞のカルシウムインフラックスに及ぼす影響
培養細胞株であるＵ９３７細胞にジブチルｃＡＭＰを添加して培養すると貪食細胞へと分化し、Ｃ５ａＲを細胞膜上に発現するようになる。この細胞にＣ５ａを作用させると細胞が活性化され、カルシウムインフラックスを生じることが知られている。
【００３４】
Ｃ５ａＲを発現させた細胞へ、１０-11Ｍ以下の濃度のＣ５ａを単独で添加してもカルシウムインフラックスはほとんど生じなかった。この系に対してＰＲ２２７を添加するとＣ５ａに対する感受性が増強され、顕著なカルシウムインフラックスが認められた（図６参照）。一方、Ｃ５ａを添加せずＰＲ２２７のみを添加した場合にはカルシウムインフラックスの変化は全く認められなかった。
この結果より、ＰＲ２２７はＣ５ａＲに作用してその分子立体構造に変化を及ぼし、Ｃ５ａとの反応性を高めるような分子変換を生じさせたものと考えられる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の方法により、アミノ酸レベルにおける検索によりタンパク質分子内でセンス−アンチセンスの関係を有する領域を検索することが可能となった。本発明の方法で検索されたタンパク質の分子内センスーアンチセンスの関係を有する領域であるアンチセンスホモロジーボックスは、当該タンパク質に対して特異的に作用する、生理活性ペプチドの設計に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  センスペプチドとアンチセンスペプチドの関係を示す図である。
【図２】  本発明の検索方法の概念図である。
【図３】  本発明のアンチセンスホモロジーボックスの概念図である。
【図４】  本発明のタンパク質分子内アンチセンスホモロジーボックスの相互関係を示す図である。
【図５】  実施例１（４）の結果を示す図である。
【図６】  実施例２（２）の結果を示す図である。
【図１】
0004053616.tif 000005
【図２】
0004053616.tif 000006
【図３】
0004053616.tif 000007
【図４】
0004053616.tif 000008
【図５】
0004053616.tif 000009
【図６】
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