(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードしている単離されたＤＮＡであって、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｂ６１から入手可能である単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
そのなかにＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼをエンコードしているＤＮＡ断片が挿入されたベクターを含む組換えＤＮＡベクター。
【請求項３】
ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓｍＢＩメチラーゼをコードしている単離されたＤＮＡであって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７３９から入手可能な単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載の単離されたＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項２又は４に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
組換えＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法であって、請求項２又は４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を前記エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に好適な条件下で培養することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ）及びＢｓｍＢＩメチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ）をエンコードする組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼは、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＢ６１株（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（New England Biolabs）の株コレクションＮｏ．８５７）で発見されている。それは、２本鎖ＤＮＡ配列５’ＣＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を認識し、認識配列の下流Ｎ１（上の鎖）及びＮ５（下の鎖）で切断して４−塩基５’側にオーバーハングを生じる（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ；／はリン酸ジエステル結合を示す）。ＢｓｍＢＩメチラーゼ（Ｍ．ＢｓｍＢＩ）もバチルス・ステアロサーモフィラスのＢ６１株で発見されている。それは、２本鎖ＤＮＡ配列、５’ＣＧＴＣＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２）（上の鎖）及び５’ＧＡＧＡＣＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（下の鎖）を認識し、認識配列の中で、おそらくは、上の鎖ではシトシン（５ｍＣ）を、また下の鎖ではアデノシン（Ｎ６ｍＡ）を修飾する。
【０００３】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、細菌及び一部のウイルスに天然に存在する一種の酵素である。細菌／ウイルスのタンパク質から精製して取り出すと、制限エンドヌクレアーゼは、分子クローニングや遺伝子の特性決定のためにＤＮＡ分子を小さな断片に切断するのに実験室で用いることができる。
【０００４】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿って核酸の特定の配列（「認識配列」）を認識して結合する。いったん結合すると、それらは認識配列の中で（例えば、ＢａｍＨＩ）、一方の端で（例えば、ＳａｐＩ）又は両端で（例えば、ＴｓｐＲＩ）分子を切断する。別の制限エンドヌクレアーゼは、別の認識配列に対して親和性を有する。今日までに調べられた何百という細菌種の間で、独特の特異性をもつ２１１に及ぶ制限エンドヌクレアーゼが同定されてきた（Roberts and Macelis, Nucl. Acids Res., 27:312-313, 1999）。
【０００５】
制限エンドヌクレアーゼは通常、それが発見された細菌に基づいて命名される。従って、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、例えば、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ及びＤｒａＩＩＩと命名された３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを産生する。このような酵素はそれぞれ、配列、５’ＴＴＴ／ＡＡＡ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、５’ＰｕＧ／ＧＮＣＣＰｙ３’（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：５）及び５’ＣＡＣＮＮＮ／ＧＴＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を切断する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＹ１３はたった１つの酵素、ＥｃｏＲＩを産生し、それは、配列５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を認識する。
【０００６】
細菌／ウイルスの制限−修飾（Ｒ−Ｍ）システムの第２の成分はメチラーゼである。このような酵素は制限エンドヌクレアーゼと共存し、細菌が自らのＤＮＡを保護し、それを外来のＤＮＡから区別する手段を提供している。修飾メチラーゼは、相当する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、それに結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基（Ｃ５メチルシトシン、Ｎ４メチルシトシン、又はＮ６メチルアデニン）を付加することによって配列内の特定の核酸の１つを修飾する。メチル化された後、認識配列はもはや同族の制限エンドヌクレアーゼによって切断されることはない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性によって常に完全に修飾されている。従って、それは内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在には完全に非感受性である。修飾されていない識別可能な外来のＤＮＡだけが制限エンドヌクレアーゼの認識及び切断に感受性である。ＤＮＡ複製の最中に及びその後に、通常、半メチル化されたＤＮＡ（一方の鎖でメチル化されたＤＮＡ）も同族の制限消化に対しては抵抗性である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
組換えＤＮＡ技術の進歩と共に、今や、遺伝子をクローニングし、酵素を大量生産することが可能になっている。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵となるのは、それらが１０−３〜１０−４という低い頻度で生じる場合、ゲノムＤＮＡライブラリの中でこのようなクローン、例えば、「ショットガン」法で引き出されるクローン集団を識別する効率的な方法を開発することである。好ましくは、該方法は、望ましい稀なクローンが生き残る一方で、メチラーゼでない挿入物を伴った望ましくないクローンが破壊されるように選択的であるべきである。
【０００８】
今までにも、多数のＩＩ型制限−修飾システムがクローニングされてきた。最初のクローニング法は、制限エンドヌクレアーゼのクローンを識別し、選抜する手段としてバクテリオファージの感染を用いた（ＥｃｏＲＩＩ：Kosykh et al., Mol. Gen. Genet., 178:717-719, 1980; ＨｈａＩＩ：Mann et al., Gene 3:97-112, 1978; ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78:1503-1507, 1981）。細菌における制限−修飾システムの発現によってそれらをバクテリオファージによる感染に抵抗性にすることができるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を持つ細胞は、原則としてファージにさらされているゲノムＤＮＡライブラリの生き残りとして選択的に単離することができる。しかしながら、この方法は、ごく限られた成功率しか有さないことが判った。具体的には、クローニングされた制限−修飾遺伝子が常に選択的生き残りを達成するのに十分なファージ抵抗性を与えるとは限らないことが判った。
【０００９】
もう１つのクローニング法には、プラスミド由来で大腸菌でクローニングするベクターとして、当初、特徴づけられた転移システムがある（ＥｃｏＲＶ：Bougueleret et al., Nucl. Acids Res., 12:3659-3676, 1984; ＰａｅＲ７：Gingeras and Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406, 1983; Theriault and Roy, Gene 19:355-359, 1982; ＰｖｕＩＩ：Blumenthal et al., J. Bacteriol., 164:501-509, 1985; Ｔｓｐ４５Ｉ：Wayne et al., Gene 202:83-88, 1997)。
【００１０】
第３の方法は、メチラーゼ遺伝子の活性発現について選抜することである（メチラーゼ選抜）（米国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：Kiss et al., Nucl. Acids Res., 13:6403-6421, 1985)。制限−修飾遺伝子は、しばしば、密接に連繋しているので、双方の遺伝子が同時にクローニングされることがしばしば起こり得る。しかしながら、この選抜によって常に完全な制限システムが得られるとは限らず、代わりにメチラーゼ遺伝子のみが得られることがある（ＢｓｐＲＩ：Szomolanyi et al., Gene 10:219-225, 1980; ＢｃｎＩ：Janulaitis et al., Gene 20:197-204, 1982; ＢｓｕＲＩ：Kiss and Bladauf, Gene 21:111-119, 1983;及びＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem.,258:1235-1241, 1983)。
【００１１】
つい最近の方法である「エンドブルー法」は、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺの融合を含有する大腸菌の指示菌に基づいた、熱安定性の制限エンドヌクレアーゼを大腸菌に直接クローニングすることについて記載されている（米国特許第５，４９８，５３５号（１９９６年）；Fomenkov et al., Nucl. Acids Res., 22: 2399-2403, 1994)。この方法は、制限エンドヌクレアーゼ又は非特異的ヌクレアーゼにより生じたＤＮＡの損傷から起こる大腸菌のＳＯＳ応答シグナルを利用する。この方法によって多数の熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（ＴａｑＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＢｓｏＢＩ、Ｔｆヌクレアーゼ）がクローニングされている（米国特許第５，４９８，５３５号、１９９６年）。この方法の欠点は、同族のメチラーゼ遺伝子が欠如するために、制限エンドヌクレアーゼを含有する陽性の青色クローンは培養するのが難しい、ということである。
【００１２】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼには、位置及び修飾される塩基に基づいた３つの主なグループがある（Ｃ５シトシンメチラーゼ、Ｎ４シトシンメチラーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼ）。Ｎ４シトシンメチラーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼはアミノ−メチルトランスフェラーゼである（Malone et al., J. Mol. Biol. , 253:618-632, 1995）。ＤＮＡの制限部位がメチラーゼによって修飾されると（メチル化されると）、それは同族の制限エンドヌクレアーゼによる消化に対して抵抗性となる。時々、同族ではないメチラーゼによるメチル化が、ＤＮＡ部位に制限酵素に対する抵抗性を付与し得る。例えば、５’ＣＣＷＧＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）（Ｗ＝Ａ又はＴ）のＤｃｍメチラーゼによる修飾は、ＤＮＡをＰｓｐＧＩの制限消化に対して抵抗性にすることもできる。もう１つの例は、ＣｐＭメチラーゼがＣＧジヌクレオチドを修飾し、ＮｏｔＩ部位（５’ＧＣＧＧＣＣＧＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））をＮｏｔＩ消化に不応性にすることができる（ニュー・イングランド・バイオラブズ社のカタログ２０００〜０１年の２２０ページ）。従って、特定のＤＮＡ配列を修飾し、制限酵素によってそれが切断されないようにするツールとしてメチラーゼを用いることができる。
【００１３】
精製した制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組換え分子を創製するのに有用なツールなので、組換えＤＮＡ技術を介して大量に制限酵素を生産する細菌株を入手しようという強い商業的関心がある。かかる過剰発現株もまた酵素精製の作業を簡略化するはずである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、メチラーゼ選抜及びインバースＰＣＲによってバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）Ｂ６１のＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼを大腸菌にクローニングする方法に関する。メチラーゼ選抜の後、ＤＮＡライブラリの中にＣ５メチラーゼに高い相同性を持つメチラーゼ遺伝子が見い出された。第１のメチラーゼ遺伝子の近傍のゲノムＤＮＡを配列決定した後、アミノ−メチラーゼ（Ｎ６−アデノシンメチラーゼ）に高い相同性を持つ第２のメチラーゼ遺伝子を見い出した。後になって、これら２つの遺伝子が一緒に融合して単一の融合タンパク質をコードしていることが検証された。この融合遺伝子をＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ）と命名した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現には、予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を用いた。
【００１５】
中程度のコピー数の発現ベクターではＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを発現するのは困難であることが判っている。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を含有するＰＣＲのＤＮＡをｐＡＩＩ１７又はｐＥＴ２１ａｔに連結した場合、正しい挿入で活性のあるクローンは見い出せなかったが、それは、大腸菌ゲノム又はベクターにおけるＢｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化による可能性がある。
【００１６】
安定な発現クローンを構築するために、ｂｓｍＢＩＭ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐＢＲ３２２にクローニングして、予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子をＰＣＲで増幅し、適合する末端を持ったｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに挿入した。高いＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ活性が検出された。しかしながら、さらに大規模に増幅した培養ではさらに低いＢｓｍＢＩ活性が検出されたので、発現クローンＥＲ２７４４「ｐＢＲ−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］は極めて不安定であった。発現クローンをさらに安定化するために、以下の２つの戦略を用いた：
ａ）  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロモータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコードしているＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラスミドを導入すること。
ｂ）  発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること（ＢｓｍＡＩメチラーゼの認識配列、５’ＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７））。
【００１７】
２つの産生株を構築した。１番目は、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］である。２番目の株は、同族でないメチラーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼにより予め修飾したＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］である。この第２の株は、増幅した大規模培養で最高のＢｓｍＢＩ産物収量を生じた。
【００１８】
先ず、メチラーゼ選抜によってｂｓｍＢＩＭ遺伝子をクローニングした。遺伝子全体を配列決定した後、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによる消化に続いて、ＰＣＲのＤＮＡをｐＡＣＹＣ１８４に連結した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＢｓｍＢＩＭを含有する５つのクローンがＢｓｍＢＩの切断に完全な抵抗性を示した。コンピテント細胞ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を調製し、ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現に用いた。
【００１９】
中程度のコピー数の発現ベクターではＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを発現するのは困難であることが判っている。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩消化した。ＤＮＡを精製した後、ＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＡ１１１７に連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。多数の形質転換体のミニプレップでは正しいサイズの挿入物を持った陽性クローンは同定されなかった。ＣｏｌＥＩ起源を持った中程度のコピー数のプラスミドｐＡＩＩ１７ではｂｓｍＢＩＲ遺伝子をクローニングし、発現させるのは困難であると結論付けた。
【００２０】
ｂｓｍＢＩＲ遺伝子の残りの精製ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。精製した後、ＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＥＴ２１ａｔに連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。挿入物について多数の形質転換体をスクリーニングした。所望の挿入物を組み込んだクローンは見つからなかった。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子は中程度のコピー数のプラスミド（ｐＡＩＩ１７又はｐＥＴ２１ａｔのいずれか）から発現されると、毒性があると思われたが、それは、大腸菌ゲノム又はベクターにおけるＢｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化による可能性がある。
【００２１】
成功率の高いもう１つの発現戦略には、ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現が含まれており、その際、メチラーゼ遺伝子はｐＢＲ３２２で発現され、エンドヌクレアーゼ遺伝子はｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒで発現された。プラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒは、Ｔ７プロモータ、ｐ１５Ａ複製開始点（低いコピー数、細胞当り５〜８コピー）、及びＴ７プロモータの上流に４コピーの転写ターミネータを含有していた。
【００２２】
【発明の実施の形態】
大腸菌においてＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子及びＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が好ましくクローニングされ、発現される本明細書に記載される方法は、以下の工程を用いた：
【００２３】
１．  ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩ部分ゲノムＤＮＡライブラリの構築
ベクターｐＵＣ１９を用いてＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩゲノムライブラリを構築した。ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩゲノムライブラリをＢｓｍＢＩに曝し、抵抗性の環状ＤＮＡを用いてＥＲ２５０２コンピテント細胞を形質転換した。  形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｓｍＢＩの消化に抵抗性のものをスクリーニングした。３つのクローンがＢｓｍＢＩの消化に抵抗性であると同定された。クローンの１つにおける挿入物を配列決定し、融合されたメチラーゼ遺伝子を見い出し、ｂｓｍＢＩＭ遺伝子と命名した。部分ＯＲＦはメチラーゼ遺伝子の下流に位置していた。
【００２４】
２．  ｂｓｍＢＩＲ遺伝子配列を増幅するためのインバースＰＣＲの使用
ｂｓｍＢＩＭ遺伝子を越えて隣接するＤＮＡ配列を得るために、ゲノムＤＮＡをＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｒＧＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｙｐ９４Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＰｓｉＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、ＴｓｅＩ、及びＸｂａＩで消化した。消化したＤＮＡを連結し、次いでｂｓｍＢＩＲ遺伝子のインバースＰＣＲ増幅に用いた。ＡａｔＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｉＩ及びＸｂａＩ鋳型のインバースＰＣＲ産物を低融点アガロースからゲル精製し、直接配列を決定した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の下流に１５９３ｂｐのＯＲＦが見い出された。このＯＲＦをｂｓｍＢＩＲと命名した。それは６２ｋＤａの予想分子量を持つ５３０個のアミノ酸のタンパク質をエンコードしている。
【００２５】
３．  予め修飾した宿主を構築するためのｐＢＲ３２２へのｂｓｍＢＩＭのクローニング
発現宿主においてＢｓｍＢＩメチラーゼの発現を高めるために、ｂｓｍＢＩＭのＰＣＲのＤＮＡをＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して、適合する末端を持つｐＢＲ３２２に連結した。連結したＤＮＡでＥＲ２５６６コンピテント細胞を形質転換した。３つのクローンがＢｓｍＢＩの切断に完全に抵抗性であると同定され、正しい挿入サイズを有していた。次いでＣａＣｌ２処理によって細胞に応答能を持たせ、予め修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。
【００２６】
４．  Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにおけるｂｓｍＢＩＲの発現
ＰＣＲによりｂｓｍＢＩＲを増幅し、ＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、ＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに連結した。予め修飾したＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。ＥＲ２７４４は、染色体上にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを持つ大腸菌Ｋ株に由来する（ＮＥＢ株コレクション）。所望の挿入物を持つ９つのクローンが見い出された。９つのクローンで細胞抽出物を調製し、ＢｓｍＢＩ活性を測定した。２つのクローン、Ｎｏ．２４及びＮｏ．２６が高いＢｓｍＢＩ活性を示した。さらに大規模に増幅した培養ではさらに低いＢｓｍＢＩ活性が検出されたので、発現クローンＥＲ２７４４「ｐＢＲ−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］は極めて不安定であった。発現クローンをさらに安定化するために、以下の２つの戦略を用いた：
ａ）  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロモータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコードするＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラスミドを導入すること。
ｂ）  発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること。
【００２７】
５．  ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、  ｐＣＥＦ８］予め修飾した宿主の構築
コンピテント細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］をｐＣＥＦ８（ＫｍＲ）で形質転換した。プラスミドｐＣＥＦ８は、ｐＳＣ１０１複製開始点及びＴ７リゾチームをコードするｌｙｓＳ遺伝子を持つ。ＡｐＲＫｍＲ形質転換体を増幅し、冷却ＣａＣｌ２で洗浄することにより応答能を持たせた。ＥＲ２５６６は、大腸菌Ｂ株に由来するＴ７発現宿主である。ＥＲ２５６６は、また、染色体上にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子も持つ（ＮＥＢ株コレクション）。ＰＣＲの突然変異率を減らすために、ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を１３回のＰＣＲサイクルによってゲノムＤＮＡから再び増幅し、発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにクローニングし直した。予め修飾した宿主はＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、  ｐＣＥＦ８］だった。プラスミドのミニスクリーニングにおいて、ｂｓｍＢＩＲエンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲを見い出した。挿入物を持つクローンからＩＰＴＧ誘導した細胞抽出物を調製し、ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ活性について測定した。
【００２８】
６．  ＢｓｍＡＩメチラーゼで予め修飾した宿主におけるＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現
ＢｓｍＡＩ及びＢｓｍＢＩの認識配列は、それぞれ、５’ＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）及び５’ＣＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。ＢｓｍＡＩ部位は、ＢｓｍＢＩ部位のサブセットである。ＢｓｍＡＩメチラーゼ及びＢｓｍＢＩメチラーゼは双方共２つのメチラーゼ（Ｃ５メチラーゼと融合したＮ６Ａメチラーゼ）の融合物である。ＢｓｍＡＩメチラーゼとＢｓｍＢＩメチラーゼとの間のアミノ酸配列の相同性及びＤＮＡ認識配列における類似性に基づいて、ＢｓｍＡＩメチラーゼがＢｓｍＢＩの切断に対して大腸菌のゲノムＤＮＡを保護することが予測された。ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ］（ＢｓｍＡＩ、米国特許出願番号０９／９５７，００５）を発現プラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲで形質転換した。ＢｓｍＢＩ活性について、誘導していない、誘導した、及び誘導し／加熱した（５５℃及び６５℃にて）細胞抽出物を測定した。最も高い活性は、ＩＰＴＧ誘導した培養からの抽出物及び誘導した培養を５５℃に加熱したものから検出された。収量はおよそ＞１０６単位／細胞の湿重量であると割り出された。
【００２９】
誘導していない、誘導した、及び誘導し／加熱した（５５℃及び６５℃にて）もののタンパク質の発現の特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約６０ｋＤａのタンパク質バンドが誘導した培養の抽出物において検出されたが、誘導しなかった培養の抽出物には存在しなかった。
【００３０】
７．  ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの均質になるまでの精製
７５ｇのＩＰＴＧ誘導した細胞、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を超音波破砕によって溶解した。透明化した細胞抽出物を５９〜６１℃で２０分間加熱した。熱変性したタンパク質を遠心で取り除いた。アクタ（Akta：登録商標）ＦＰＬＣシステムを用い、ヘパリンハイパー(Heparin hyper)Ｄ、ソース(Source)Ｑ１５ＨＲカラム及びヘパリン５ＰＷカラムによってほとんど均質になるまでＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを精製した。精製したＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼは６２ｋＤａの予想サイズに比べ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約６０ｋＤａの見かけの分子量を有する。
【００３１】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。実施例は、本発明の理解を助けるために提供されるのであって、その限定として解釈されるものではない。
【００３２】
上記及び以下で引用される引用文献は参考として本明細書に組み入れられる。
【００３３】
【実施例】
大腸菌におけるＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
１．  ゲノムＤＮＡの調製
５０ｍｌの２５％スクロース、５０ｍＭのトリス塩酸中で１０分間穏やかに振盪して９．２ｇの細胞ペーストを再浮遊することにより、バチルス・ステアロサーモフィラスＢ６１（ニュー・イングランド・バイオラブズ・コレクション  ＮＥＢ  Ｎｏ．８５７）からゲノムＤＮＡを調製した。新しく調製した０．２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８．０）中に１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを添加することにより細胞溶解を完了し、室温にて１時間インキュベートした。次いで５ｍｌの０．２５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を懸濁液に加え、続いて清潔なピペットで懸濁液をゆっくり混合した。ＥＤＴＡは二価の陽イオンをキレートし、非特異的エンドヌクレアーゼ／エクソヌクレアーゼを不活化した。１％の最終濃度でＳＤＳを添加することにより細胞溶解物をさらに改良した。３６ｍｌの溶解緩衝液（１％のトリトン−Ｘ１００、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．６２ＭのＥＤＴＡ）を加え、穏かに回転して混合した。粘性の溶解細胞懸濁液を平衡化した１２０ｍｌのフェノールで抽出し、水性相を回収し、この工程を繰り返した。上清に１００ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加えて希釈し、粘性を軽減した。これに２２０ｍｌのフェノールによる抽出が一回、及び２００ｍｌのクロロホルムによる抽出が一回続き、その際、クロロホルムから分離するための遠心の後、ＤＮＡを回収した。次いで、４℃にて２〜４ＬのＴＥ緩衝液で上清を４回透析した。得られた１５０ｍｌの溶液にＲＮＡ分解酵素Ａ（１０ｍｇ／ｍｌストックの１５０μｌ）を加え、溶液を３７℃にて１時間インキュベートした。１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃ及び１容量のイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、次いで、遠心により回収した。ＤＮＡ沈殿物を３０分間風乾し、次いで３０分間穏かに振盪することにより２０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、最終濃度をおよそ２５０μｇ／ｍｌとした。
【００３４】
２．  ゲノムＤＮＡの部分消化
精製したＤＮＡをＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩで切断して以下のように部分消化を達成した：３つの５００μｌ溶液を１００μｇ／ｍｌでバチルス・ステアロサーモフィラスのＤＮＡから作製し；１つは、ＮＥ緩衝液３＋ＢＳＡ（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２５℃にてｐＨ７．９）中で、１つはＮＥ緩衝液４＋ＢＳＡ（５０ｍＭのＫ−アセテート、２０ｍＭのトリスアセテート、１０ｍＭのＭｇ−アセテート、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２５℃にてｐＨ７．９）中で、及び１つは、ＮＥ緩衝液  Ｓａｕ３ＡＩ＋ＢＳＡ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのビストリスプロパン塩酸、１０ｍＭのＭｇＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２５℃にてｐＨ７．０）中で溶液とした。各溶液を２００μｌを１つ、１００μｌを３つに分割した。２００μｌのチューブそれぞれに、２μｌのそれぞれの酵素（８単位のＡｐｏＩ、２０単位のＮｌａＩＩＩ及び８単位のＳａｕ３ＡＩ）を加え、ＡｐｏＩ及びＳａｕ３ＡＩとの反応の双方についてＤＮＡ２．５μｇ当り１単位の酵素を達成し、ＮｌａＩＩＩとの反応についてはＤＮＡのμｇ当り１単位の酵素を達成した。分取した２００μｌそれぞれから１００μｌを取って同一緩衝液の第二の分取試料に加え、ＡｐｏＩ及びＳａｕ３ＡＩとの反応について５μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素、及びＮｌａＩＩＩとの反応について２μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素を達成し、このようにして、適切な酵素の先の量の半分を次のチューブが受け取るようにした。ＡｐｏＩのチューブを５０℃にてインキュベートし、ＮｌａＩＩＩとＳａｕ３ＡＩのチューブを３７℃にて１時間インキュベートし、各チューブの５μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。この方法をＮｌａＩＩＩについても繰り返したが、反応混合物への添加に先立ってＮｌａＩＩＩを４倍に希釈することを例外とした結果、最初のチューブでは４μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素となり、２番目のチューブでは８μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素というようになった。限られた消化及び中程度の、しかし不完全な消化を示すチューブの内容物を１％の低融点アガロースゲルで２時間泳動した。およそ１ｋｂ〜８ｋｂの間のＤＮＡ断片をゲルから切り出し、計量した。各バンドに１／１０容量のβ−アガラーゼ緩衝液（１０ｍＭのビストリス塩酸ｐＨ６．８、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）を加えた後、６５℃にて１０分間インキュベートした。４２℃にて９０分間インキュベートすることにより１／１００のβ−アガラーゼでアガロースを消化した。氷上に置くと、溶液はゼリー状になると考えられた。従って、６５℃にて１０分間、次いで４２℃にて５分間、チューブをさらにインキュベートし、続いて１／１００容量のβ−アガラーゼを加えて４２℃にて９０分間インキュベートした。１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃを加えて氷上で１５分間インキュベートし、２容量のエタノールを一晩添加することによりＤＮＡを沈殿させた。次いで溶液を遠心し、上清を捨てて、ＤＮＡ沈殿物を２０μｌのＴＥに再懸濁し、その各１μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
【００３５】
３．  ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＳａｕ３ＡＩの部分消化及び完全消化したゲノムＤＮＡライブラリの構築
ベクターｐＵＣ１９を用いてＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＳａｕ３ＡＩのゲノムＤＮＡライブラリを構築した。上述のように、ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＳａｕ３ＡＩで部分的に消化したバチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡの約０．５μｇ（３μｌ）を、それぞれＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化した並びにＣＩＰ処理した約０．１μｇのｐＵＣ１９と混合した。各チューブに合計５０μｌ容量で５μｌの１０ｘ連結緩衝液及び１μｌ（４００単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えた。反応物を１６℃にて一晩インキュベートした。６５℃にて３０分間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを熱で不活化し、次いで、ＶＳ型０．０２５μｍの濾紙を用いて２ＬのｄＨ２Ｏ中で４時間、各チューブの内容物を微量透析し、塩濃度を減らした結果、それぞれおよそ７５μｌの最終容量が得られた。
【００３６】
４．  メチラーゼ選抜法によるＭ．ＢｓｍＢＩの選抜
形質転換実験については、電気容量２５μＦ、電圧２．５ｋＶ及び抵抗２００オームに設定したバイオラッド（BioRad）のジーンパルサー（Gene Pulser）を用いたエレクトロポレーションによってＥＲ２５０２を、上記のような透析したＤＮＡライブラリ各２μｌで形質転換した。各チューブにＬＢ培地（０．５ｍｌ）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした。各チューブの内容物をＡｐプレート上に播き、ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩのゲノム断片挿入物を持つｐＵＣ１９の形質転換体を選抜するために３７℃にて一晩インキュベートした。
【００３７】
およそ１，０００の形質転換体がＮｌａＩＩＩライブラリについて得られ、およそ９００の形質転換体がＳａｕ３ＡＩライブラリについて得られた。ＡｐｏＩライブラリの形質転換からはＡｐＲ形質転換体は得られなかった。ＮｌａＩＩＩライブラリ及びＳａｕ３ＡＩライブラリからの形質転換体をプールし、それぞれ３７℃にて一晩のＬＢ＋Ａｐの培養で増やした。キアゲンマキシ（Qiagen（登録商標） Maxi）カラム法によって一晩培養の細胞からプラスミドＤＮＡを調製した。各プラスミドライブラリから１、２、５及び１０μｌ（約０．２μｇ、０．４μｇ、１μｇ、２μｇのＤＮＡ）を５５℃にて一晩ＢｓｍＢＩに曝した。ＢｓｍＢＩの消化に続いて、常法により、消化物のそれぞれ５μｌでＥＲ２５０２及びＥＲ２６８３コンピテント細胞の各１００μｌを形質転換した（１００μｌのコンピテント細胞とプラスミドＤＮＡを混合し、氷上で３０分間、３７℃で５分間、室温で５分間、１００μｌのＳＯＢを加えて３７℃にて１時間インキュベートする）。形質転換産物をＡｐプレートにて３７℃で一晩増殖させる。個々のＡｐＲコロニー（ＥＲ２６８３細胞からは３３個、ＥＲ２５０２細胞からは３個）に２ｍｌのＬＢ＋Ａｐを接種した。３０単位（３μｌ）のＢｓｍＢＩと５５℃にて１時間インキュベートすることによって、各プラスミドのミニプレップから１μｇ（５μｌ）を抵抗性についてスクリーニングし、アガロースゲル電気泳動によって分析した。３つのコロニーがＢｓｍＢＩの消化に抵抗性であると同定された。これら３つのうち２つが挿入物を有することが判った。完全に抵抗性のクローン（ＢｓｍＢＩＭ陽性）はＮｌａＩＩＩ部分ライブラリに由来していた。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子を含有する断片又はｐＵＣ１９のいずれかがＢｓｍＢＩＭ部位を喪失したと結論付けた。（後になって、挿入物を配列決定した際、それがＢｓｍＢＩメチラーゼをコードしており、ベクターのＢｓｍＢＩ部位は無傷であることが確認された）。
【００３８】
５．  ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定
ＧＰＳ（登録商標）−１ゲノムのプライミングシステム（ニューイングランドバイオラブズ（登録商標））のプライミング部位の挿入及びプライマーウォーキングによってｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定を行った。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子は、予想分子量１２２．４ｋＤａを持つ１０６８個のアミノ酸の融合タンパク質をコードする３２０７ｂｐである。ジェンバンク（GenBank）におけるその他のメチラーゼとの配列の比較は、Ｍ．ＢｓｍＢＩが、アミノメチラーゼ（Ｎ６Ａメチラーゼ）とＣ５−メチラーゼの融合の結果である融合タンパク質であること示した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定の間に、部分ＯＲＦ（後に１５８７ｂｐであると決定された）がそこにあるので、制限遺伝子（ｂｓｍＢＩＲ）はおそらくｂｓｍＢＩＭ遺伝子の下流に位置するらしいことが判った。ほとんどの制限−修飾システムにおける制限遺伝子と修飾遺伝子は今日まで、互いに数百塩基対の範囲内で同定されることが判っているので、これを仮説立てた。
【００３９】
６．  予め修飾した宿主を構築するためのｂｓｍＢＩＭ遺伝子のｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３９へのクローニング
以下の配列で３つのプライマーを合成した：
５’ｔａａｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔｇａａｃｔｃｃｔｔａｔｃａｃｔａａａａｇａｔｇａａ３’
（２４９−１６４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
５’ａｔｇａａａｇｔｃｇａｃｃｃｃｇｔａａｔｔｔｔａｃｇｇｇｃｔｔｔｔｔｔａａａａ３’
（２４９−１６５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
５’ｔａｔｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔｇａａａｇｔａａｔａｃｔｇａａｔｇａｔｔｔａｇａａ３’
（２４９−２５５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
【００４０】
プライマー２４６−１６４及び２４９−１６５を用い、９５℃で５分間を１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で５分間を、２５サイクルの条件下で、ベント（Vent）ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲによってゲノムＤＮＡからｂｓｍＢＩＭ遺伝子を上手く増幅した。キアゲンスピンカラムによりＰＣＲのＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、テトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子の真ん中をＰＣＲのＤＮＡの挿入目的位置として適合する末端を持つ、ＣＩＰ処理したｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３９に連結した。
【００４１】
常法を用いて、連結したｂｓｍＢＩＭ遺伝子を持つベクターｐＡＣＹＣ１８４で大腸菌ＥＲ２６８３を形質転換し、クロラムフェニコール（Ｃｍ）プレートに播いた。常法を用いて、連結したｂｓｍＢＩＭ遺伝子を持つｐＬＧ３３９で大腸菌ＥＲ２５０２を形質転換し、カナマイシン（Ｋｍ）プレートで増殖させた。それぞれ、Ｃｍ＋Ｔｃプレート及びＫｍ＋ＴｃプレートにおいてＴｃの感受性について形質転換体を調べた。Ｔｃ耐性遺伝子に挿入物を持つクローンは、Ｔｃ耐性遺伝子の真ん中における挿入物の挿入のためにＴｃに感受性を示すはずである。
【００４２】
精製したｂｓｍＢＩＭのＰＣＲＤＮＡをＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、適合する末端を持つ、ＣＩＰ処理したｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３９に連結した。常法を用いて、連結したｐＬＧ３３９−ＢｓｍＢＩＭでＥＲ２５０２を形質転換し、Ｋｍプレートで増殖させた。常法を用いて、連結したｐＡＣＹＣ１８４−ＢｓｍＢＩＭでＥＲ２５０２を形質転換し、Ｃｍプレートで増殖させた。次いで、Ｋｍプレート及びＣｍプレート双方からのコロニーをそれぞれＫｍ＋Ｔｃプレート及びＣｍ＋Ｔｃプレートに接種した。Ｔｃ感受性を示したＫｍ＋Ｔｃプレートからの１８コロニー及びＣｍ＋Ｔｃプレートからの１８コロニーをそれぞれ、ＬＢ＋Ｋｍプレート及びＬＢ＋Ｃｍプレートに接種した。このような培養のそれぞれからのミニプレップＤＮＡをＢｓｍＢＩで消化して切断への抵抗性を調べた。  プラスミドｐＬＧ３３９を含有する１８コロニー（Ｋｍ含有プレートからの）のうち、４つは切断への完全な抵抗性を示し、３つは切断への部分的な抵抗性を示し、１１は切断への抵抗性を示さなかった。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を含有する１８コロニー（Ｃｍ含有プレートからの）のうち、６つは切断への完全な抵抗性を示し、４つは切断への部分的な抵抗性を示し、８つは切断への抵抗性を示さなかった。
【００４３】
切断への完全な抵抗性を示した６つのｐＡＣＹＣ１８４クローンのうち５つからのプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断して挿入物のサイズをチェックした。５つのクローンはすべて、ｂｓｍＢＩＭ遺伝子のサイズである、およそ３．２ｋｂの挿入物を有していた。ＢｓｍＢＩによる切断に完全な抵抗性を示し、ＢｓｍＢＩＭ遺伝子のサイズの挿入物を示したので、このようなクローンはＭ．ＢｓｍＢＩ陽性であると結論付けた。このような５つのＭ．ＢｓｍＢＩ陽性クローンのうちの４つからのミニプレップＤＮＡで常法を用いてＥＲ２７４４を形質転換し、Ｃｍプレートで増殖させた。得られた形質転換体をＬＢ培地＋Ｃｍで増殖させ、遠心し、冷却ＣａＣｌ２により受容能を持たせ、予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。
【００４４】
７．  インバースＰＣＲによるｂｓｍＢＩＲのクローニング及びｂｓｍＢＩＲ遺伝子の配列決定
以下の配列で７つのプライマーを合成した：
５’ｃｃｃａｔａａａｇｃｃｃｇｃａｃｔｔｇｃｃａｔｇ３’（２４９−３３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
５’ｔｇａｃｇａｔｇａｔｔｃｃａａａｔｔａｃｔｔａｇ３’（２４９−３４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
５’ｃｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｃｔａｃｔｔａａｔｔｇａａｃｔ３’（２４９−２５６）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
５’ｔｔａｔａａｃａａｃａａｔａｃａｃａａｇｃｔｔｔｃｃｃ３’（２４９−２５７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
５’ｔｃｔｔａｃｃｃｃａｔｃｃｔｔｃａｇａｃａａａｃ３’（２５０−５５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
５’ａａｇａｃｃｃａｇｇｇｃｇａｃａｔｇａｃｇａｔａａ３’（２５０−５６）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
５’ｔｇｔａｔａｔｇｇａｃａｔａｔｔｇｇａａａｇａｔ３’（２５０−５７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
【００４５】
ゲノムＤＮＡをＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｒＧＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｙｐ９４Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＰｓｉＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、ＴｓｅＩ、及びＸｂａＩで消化した。  消化したＤＮＡを２μｇ／ｍｌにて低いＤＮＡ濃度で連結し、次いで、プライマー２４９−３３と２４９−３４を用いたｂｓｍＢＩＲ遺伝子のインバースＰＣＲ増幅に用いた。インバースＰＣＲの条件は、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を３５サイクルであった。インバースＰＣＲ産物は、ＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓｒＧＩ、ＤｒａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｉＩ、ＴａｑＩ及びＸｂａＩの鋳型に由来していた。ＡａｔＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｉＩ及びＸｂａＩの鋳型に由来するインバースＰＣＲ産物を低融点アガロースからゲル精製し、プライマー２４９−３３及び２４９−３４を用いて配列決定した。プライマー２４９−２３３及び２２９−２２４を用いてさらにＰｓｉＩ及びＸｂａＩ断片の配列決定を行った。次いで、ゲノムＤＮＡ及びプライマー２４９−３３及び２４９−２５６並びにプライマー２４９−３３及び２４９−２５７を用い、９４℃で５分間を１サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を２５サイクルの条件下で、ＰＣＲを行った。低融点アガロースからＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマー２４９−３３、２５０−５５、２５０−５６及び２５０−５７を用いて配列決定した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の下流に１５４７ｂｐのＯＲＦが見い出された。このＯＲＦをｂｓｍＢＩＲ遺伝子と命名した。それは６２ｋＤａの予想分子量を持つ５３０個のアミノ酸のタンパク質をコードしている。
【００４６】
８．  Ｔ７発現ベクターｐＡＩＩ１７におけるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の発現
以下の配列で２つのプライマーを合成した：
５’ｇｇｇｔａｇａｔｔｃａｔａｔｇｇｃｔａａａｔａｃｇｇａｃｇｔｇｇａａａｇｔｔｔ３’（２５０−８８）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）
５’ｇｃｔｇｇａｔｃｃｔｃａｔａｔａａｔｃｔｔｔａｇｃａａｔｃｔｇｃｔｃｃｃ３’（２５０−８９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）
【００４７】
ベントＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー２５０−８８と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによってｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。キアゲンスピンカラムによりＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を持ったｐＡＩＩ１７にＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。５４のプラスミドのミニプレップの中には、所望の挿入物を持つクローンはなかった。中程度のコピー数のプラスミドではｂｓｍＢＩＲ遺伝子をクローニングし、発現させるのは困難であると結論付けた。
【００４８】
９．  Ｔ７発現ベクターｐＥＴ２１ａｔにおけるｂｓｍＢＩＲの発現
ｂｓｍＢＩＲ遺伝子の残りの精製したＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を持つｐＥＴ２１ａｔにＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。スクリーニングした３６プラスミドの中に所望の挿入物を持つクローンはなかった。
【００４９】
ベントＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー２５０−８８と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の増幅を反復した。ＰＣＲ産物をフェノール−ＣＨＣｌ３抽出により精製し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を持つｐＥＴ２１ａｔにＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。２２のプラスミドのミニプレップの中には、所望の挿入物を持つクローンはなかった。おそらく大腸菌ゲノム又はベクターにおけるＢｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化の結果として、ｐＥＴベクターではｂｓｍＢＩＲ遺伝子のクローニングを行うことは困難であると結論付けた。
【００５０】
１０．  予め修飾された宿主を構築するためのｂｓｍＢＩＭのｐＢＲ３２２へのクローニング
次の発現戦略は、中程度のコピー数のプラスミドでｂｓｍＢＩＭ遺伝子を発現させ、低いコピー数のプラスミドでｂｓｍＢＩＲ遺伝子を発現させることである。発現宿主においてＢｓｍＢＩメチラーゼの発現を高めるためにＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したｂｓｍＢＩＭのＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＢＲ３２２に連結した。コンピテントＥＲ２５６６及びコンピテントＥＲ２６８３を連結したＤＮＡで形質転換し、アンピシリンプレートで増殖させた。１８のプラスミドのミニプレップのうち、３つのクローンがＢｓｍＢＩの切断に完全に抵抗性であり、正しい挿入物サイズを有していた。次いで冷却ＣａＣｌ２処理により細胞に受容能を持たせ、予め修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。
【００５１】
１１．  Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにおけるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の発現
以下の配列でプライマーを１つ合成した：
５’ａａｇｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔｇｇｃｔａａａｔａｃｇｇａａａｇｔｔｔ３’（２５２−２７０）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）
【００５２】
ベントＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー２５２−７０と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによってｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。フェノール−ＣＨＣｌ３抽出によってＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を持つｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。７２のプラスミドのミニプレップのうちで９つのクローンが所望の挿入物を持っていた。９つのクローンすべてを１０ｍｌのＬＢにＡｐとＣｍを加えたもので培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導した。細胞抽出物を調製し、ＢｓｍＢＩ活性を測定した。２つのクローン、Ｎｏ．２４及びＮｏ．２６が高いＢｓｍＢＩ活性を示した。このような２つのクローンを５００ｍｌのＬＢにＡｐとＣｍを加えたもので培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導した。クローンＮｏ．２４とＮｏ．２６は双方共高いＢｓｍＢＩ活性を示した。湿った細胞のグラム当り１０６単位を上回って見い出された。ＢｓｍＢＩはＩＩ型制限酵素の中でも最も高い比活性を示す。クローンＮｏ．２４及びＮｏ．２６はそれぞれ２０ｍｌのＬＢプラスＡｐ及びＣｍで増殖させ、それぞれ１０ｍｌはＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導した。誘導した培養からそれぞれ１ｍｌずつ取って、均等に３つに分け、１つは加熱しないまま放置し、１つは５５℃にて４５分間加熱し、１つは６５℃にて４５分間加熱した。クローンは双方共、３つの誘導した培養及び誘導しない培養のすべてが活性を示した。双方のクローンの４試料からそれぞれ、５、１０及び１５μｌをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。誘導した試料にはＢｓｍＢＩ（約６０ｋＤａ）のおよそのサイズのタンパク質が存在することがゲルから判明した。
【００５３】
クローンＮｏ．２４を５００ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３７℃にて一晩増殖させた。一晩培養した細胞１０ｍｌを用いて新鮮な５００ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３７℃にて４時間培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導した。細胞を回収し、ＢｓｍＢＩ活性を測定した。細胞抽出物は、ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの切断に特徴的な活性を示したが、その収量は、新鮮な形質転換体から増殖された小規模１０ｍｌの培養よりもはるかに少なかった。発現クローンＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］はさほど安定なクローンではないと結論付けた。発現クローンをさらに安定化するために２つの戦略を用いた：
ａ）  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロモータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコードするＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラスミドを導入すること。
ｂ）  発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること。
【００５４】
１２．  ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８］予め修飾した宿主の構築
プラスミドｐＣＥＦ８は、ｐＳＣ１０１複製開始点及びＴ７リゾチームをコードするｌｙｓＳ遺伝子を持っている。プラスミドｐＣＥＦ８は、ｐＢＲ３２２及びｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒと適合性があるので、同じ発現宿主を形質転換することができる。１０μｌのｐＣＥＦ８（ＫｍＲ）でコンピテント細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ」（１００μｌ）を常法で形質転換し、Ａｐ＋Ｋｍプレートで３７℃にて一晩増殖させた。８つの１０ｍｌＬＢとＡｐ＋ＫｍのチューブにＡｐＲＫｍＲ形質転換体を接種し、３７℃で２．５時間増殖させ、冷却ＣａＣｌ２で洗浄することにより受容能を持たせた。
【００５５】
１３．  Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにおける及びｌｙｓＳの存在下におけるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の発現
プライマー２５２−２７０と２４９−８９を用い、９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を１３サイクルという条件下でＰＣＲを行い、ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。少ないＰＣＲサイクル（１３サイクル）はＰＣＲにおける突然変異率を減らすことを意図していた。ＰＣＲのＤＮＡを等容量のフェノール−クロロホルムで２回抽出し、等容量のクロロホルムで１回抽出し、ＮａＯＡｃ、９５％の冷却エタノールで沈殿させ、７０％の冷却エタノールで洗浄した。次いで、精製したＰＣＲのＤＮＡを３７℃にて一晩ＢａｍＨＩで消化し、その０．５μｇを連結緩衝液中での１６℃にて一晩の０．１μｇのｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒとの連結に用いた。
【００５６】
連結したプラスミドＤＮＡ（５μｌ）で１００μｌのＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８］を形質転換し、３７℃にて一晩、ＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍ＋Ｋｍプレートで増殖させた。３６のＡｐＲＣｍＲＫｍＲ形質転換体をそれぞれ２ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍ＋Ｋｍに接種し、３７℃にて一晩増殖させた。３６クローンのミニプレップＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物は、２４クローンが正しいサイズ（およそ１．５ｋｂ）の挿入物を含有していることを示した。２４クローンのミニプレップＤＮＡのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物は、このようなクローンのうち１５が正しい方向でｂｓｍＢＩＲ遺伝子を有することを示した。このような１５のクローンの培養の残りを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍ＋Ｋｍに接種し、３７℃にて４時間増殖させ、６ｋｒｐｍで１０分間遠心し、１ｍｌの超音波破砕用緩衝液に再懸濁し、３０秒間で２回、超音波破砕し、１４ｋｒｐｍで１０分間遠心した。活性について得られた上清を測定し、１３のクローンでＢｓｍＢＩ様活性が見られた。この新しい発現株は、３つのプラスミド、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を含有していた。ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲにおけるｂｓｍＢＩＲ遺伝子にサイレント突然変異が１つ見い出された。遺伝子全体を配列決定して、それが野生型アミノ酸配列をコードすることを確認した。
【００５７】
１４．  ＢｓｍＡＩで予め修飾した宿主におけるＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現
２つのクローン（Ｎｏ．１及びＮｏ．１０）のミニプレップＤＮＡでＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ］（ＢｓｍＡＩ、米国特許係属（Z. Y .Zhu, J. Zhou, S. Y. Xu））を形質転換し、３０℃にて一晩、ＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍプレートで増殖させた。このようなクローンからのコロニーを２．５ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３０℃にて一晩増殖させた。次いで、これをそれぞれ１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３０℃にて４時間増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃にてさらに３時間増殖させた。１２ｋｒｐｍで１０分間、細胞を遠心し、１ｍｌの超音波破砕用緩衝液に再懸濁し、ＢｓｍＢＩ活性について測定した。  最も高い活性は、クローンＮｏ．１０（１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃ）を伴った３つの培養からＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］で検出された。クローンＮｏ．１０ＢのＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を２本の５００ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３０℃にて７時間増殖させたが、うち１本は４時間後に０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞を６ｋｒｐｍで１０分間遠心し、計量した（１．６３ｇ）。各培養からの細胞を１６ｍｌの超音波破砕用緩衝液に再懸濁し、１０分間超音波破砕を行い、４℃にて１４ｋｒｐｍで１２分間遠心した。誘導した培養からの１ｍｌを５５℃にて４０分間加熱し、１ｍｌを６５℃にて４０分間加熱し、双方共４℃にて１４ｋｒｐｍで１０分間遠心した。誘導しなかった、誘導した、及び誘導して加熱した（５５℃及び６５℃の両方）細胞の抽出物をＢｓｍＢＩ活性について測定し、結果をアガロースゲル電気泳動で分析した。最も高い活性は、誘導した培養及び誘導し、５５℃に加熱した培養からの抽出物に見られた。誘導したクローン及び誘導して５５℃に加熱したクローンの活性から、細胞は、細胞のｇ当りおよそ＞１０６単位を含有することが割り出された。
【００５８】
誘導しなかった、誘導した、及び誘導して加熱した（５５℃及び６５℃の両方）タンパク質発現の特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約６０ｋＤａのタンパク質バンド（ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼのサイズ）が誘導した培養の抽出物で検出されたが、誘導しなかった培養の抽出物では存在しなかった。
【００５９】
１５．  ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの均質になるまでの精製
穏かにピペッティングし、回すことによって７５ｇのＩＰＴＧ誘導した細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を、２６０ｍｌの緩衝液Ａ（０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＫＰＯ４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）に再浮遊させた。細胞浮遊液を２分間隔で超音波破砕し、各間隔後、ブラッドフォード（Bradford）アッセイを用いてタンパク質濃度を推定した。６回の超音波破砕の間隔の後、細胞を１２ｋｒｐｍにて１時間遠心した。次いで、得られた上清を５９〜６１℃にて２０分間加熱した。次いで、加熱処理した溶液を１２ｋｒｐｍにて３０分間遠心して変性したタンパク質を除いた。２５５ｍｌのヘパリンハイパーＤカラムを４カラム容量の緩衝液Ａにて平衡化した。アクタ（登録商標）ＦＰＬＣを用いてＮａＣｌの０．１Ｍ〜１．０Ｍの濃度勾配で２５ｍｌ分画を溶出した。アクタ（登録商標）で記録した分画のＵＶ分光分析は、それぞれおよそ０．７３Ｍと０．８５ＭのＮａＣｌで溶出された２つのピークを示した。分画の内容物の活性測定は活性がクロマトグラムの２番目のピークに一致することを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したタンパク組成は、第１と第２のクロマトグラムのピークのタンパク質における明瞭な差異を示した。高い塩濃度のために、８つの分画（２００ｍｌ）をプールして１．１Ｌの緩衝液Ｃ（２０ｍＭのトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ７．８）で希釈した。
【００６０】
７．１ｍｌのソースＱ１５ＨＲカラムを３カラム容量の緩衝液Ａ２（０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で平衡化した。アクタ（登録商標）ＦＰＬＣを用い、０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾配で１ｍｌの分画を溶出した。ＵＶクロマトグラムは勾配分画には主なピークを示さなかった。ブラッドフォードアッセイ及びアガロースゲル電気泳動によって分析した活性測定は酵素がカラムの流出部分にあることを示した。洗浄溶液及び流出溶液をプールした。
【００６１】
７．１ｍｌのヘパリン５ＰＷカラムを３カラム容量の緩衝液Ａで平衡化した。アクタ（登録商標）ＦＰＬＣを用い、０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾配で１ｍｌの分画を溶出した。クロマトグラム、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びアガロースゲル電気泳動で分析した活性測定から得られたデータは、クロマトグラム上に認められる１本の主要なピークがＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼに相当することを示した。８本の１ｍｌ分画をプールし、１Ｌの透析緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０％のグリセロール、ｐＨ７．５）によって透析した。最終的な精製したＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを図９に示した。
【００６２】
２００１年９月２８日、ブタペスト協定の諸条件のもと、ＥＴ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］株をアメリカンティッシュカルチャーコレクションに供託し、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３７３９を受領した。
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＢｓｍＢＩ制限−修飾システムの遺伝子構成を示す。ｂｓｍＢＩＲ、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子；ｂｓｍＢＩＭ、ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子。
【図２】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１１）を示す。
【図３】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１１）を示す。
【図４】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１１）を示す。
【図５】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１１）を示す。
【図６】ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＲ、１５９３ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を示す。
【図７】ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＲ、１５９３ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を示す。
【図８】細胞抽出物における組換えＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ活性を示す。レーン１〜７、組換えＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する細胞抽出物で処理したλＤＮＡ。レーン１〜７における希釈係数：１ｘ、１：１０、１：１００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００。  レーン８、λＤＮＡ；レーン９、精製した天然のＢｓｍＢＩで消化したλＤＮＡ。
【図９】精製した組換えＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを示す。レーン１〜４、ヘパリン５ＰＷカラムを通した後の１μｌ、３μｌ、５μｌ及び１０μｌの精製したＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ；レーン５、タンパク質のサイズマーカー。ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの予想サイズは６２ｋＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの見かけのサイズは約６０ｋＤａである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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