(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性蛋白質の分離、検出及び定量のための方法において、検査すべきサンプルを有機媒体中に溶かし、これを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、かつＴＬＣプレート上で直接免疫学的方法を用いて疎水性蛋白質を検出し、蛋白質を定量することからなることを特徴とする、疎水性蛋白質の分離、検出及び定量法。
【請求項２】
有機媒体がクロロホルムとメタノールとの混合物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
定量を免疫学的方法により実施する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
免疫学的方法が疎水性蛋白質を標識した抗体に結合することからなる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
免疫反応性複合体を可視化し、かつ定量することからなる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
可視化および定量を化学ルミネッセンスを用いて実施する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
薄層クロマトグラフィーを変性シリカマトリックスを有する被覆されたプレート上で実施することからなる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
有機媒体が疎水性蛋白質を溶かすことができる溶媒混合物である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は著しく疎水性の蛋白質、蛋白質フラグメント及び修飾体の、及び著しく疎水性のペプチドの検出及び定量法に関する。
従来技術
疎水性蛋白質の定量は、従来慣用の技術を用いる場合、可能でないか、又は不十分にのみ可能である。疎水性蛋白質は、一方ではＳＤＳゲル上での分離が不十分であり、かつ他方では常用の膜への該蛋白質の転移はせいぜいでセミ定量的であるために、親水性蛋白質の分離のための常法、例えばウェスタン・ブロット法はしばしば疎水性蛋白質に限定された範囲でのみ適用可能である。僅かに修飾した蛋白質（例えば、メチルエステル）の分離はゲル電気泳動を用いて達成することはできない。免疫学的方法、例えばＥＬＩＳＡ法の使用は、これが一般的に水性系中でのみ実施することができるので、問題が多い。有機溶剤はマイクロタイタープレートの材料と反応し、これを使用不可能にする傾向がある。定量されるべき分析物は通常非常に僅かな量でのみ存在する。しばしば、直鎖の疎水性蛋白質は付加的に他の親油性物質（例えば、リピド）と会合しており、このことは従来の方法による定量を不可能にする。ＥＬＩＳＡ法においては、これらの成分は相互に分離しない。
発明の詳細な説明
本発明の目的は、疎水性蛋白質、蛋白質フラグメント及び修飾体及び同様に著しく疎水性のペプチドを分離すること及び定量することを可能にする方法の提供である。
更なる目的は、例えばアセチル化又は酸化により僅かに修飾された蛋白質の測定を可能にする方法を提供することである。
更なる目的は、疎水性蛋白質、例えば著しく疎水性の肺界面活性作用蛋白質（ＳＰ−Ｃ）のバイオテクノロジーによる生産における疎水性宿主細胞蛋白質不純物（ＨＣＰ）の検出に、特に好適である方法を示唆することである。
これらの目的は有機媒体中に溶解した蛋白質混合物の薄層クロマトグラフィーによる分離及び分離した蛋白質の免疫学的検出により達成することができることが見いだされた。
従って、本発明の課題は著しく疎水性の蛋白質、蛋白質フラグメント及び修飾体の、及び著しく疎水性のペプチドの分離及び定量法であり、この方法は検査すべきサンプルを有機媒体中に溶かし、これを薄層クロマトグラフィーにかけ、かつ疎水性蛋白質を免疫学的に可視にすることからなる。
更なる課題はサブクレームから明らかである。
この薄層クロマトグラフィーによる分離工程のために、分離すべき蛋白質の疎水特性に適合された、公知の方法及び材料がこの課題に導くことが意外にも見いだされた。可能なクロマトグラフィープレートはそのコーティングが有機媒体中の疎水性混合物を分離するために好適である全てのプレートである。これらのうちでも、特に好適であることが立証されているものはジオール（Diol）という商品名でメルク・ダルムシュタット社によって市販されているＨＰＴＬＣプレートであり、これは変性シリカマトリックスを有する。疎水性蛋白質に関して、薄層クロマトグラフィーのために好適な移動相は有機溶剤及び有機溶剤混合物、例えばクロロホルム及びメタノールの混合物である。非極性及び極性溶剤の混合物は、特に好適であり、可能な非極性溶剤は、特にクロロホルム、塩化メチレン及びトルエンであり、かつ極性溶剤は短鎖アルコールであり、特にメタノール、エタノール及びイソプロパノールである。
プレートへのサンプルの適用及び分離法は常法で、例えば市販の入手可能な自動装置で実施される。
免疫学的検出のための製造のためには、このプレートを薄層クロマトグラフィー分離の後に乾燥する。非特異的結合部位の飽和のためには、このプレートを好適な遮蔽溶液、例えばゼラチン又は蛋白質溶液とインキュベートする。次いでこのプレートを第一の抗体とインキュベートする。もしこの抗体が、標識を有していないのであれば、検出は標識された第二の抗体の助けを借りて実施することができる。検出のためには、全ての市販の検出法を使用することができる。過剰の第一の抗体を洗浄により除去した後、インキュベーションを標識した第二の抗体と共に実施する。洗浄後、標識した抗体を検出する。標識した抗体を常法で、例えばルミノール及び過酸化水素の添加により、例えば非常に感度の高い、アメルスハム・ブフラー（Amersham Buchler）のＥＣＬ（強化化学ルミネッセンス）検出法により、可視にする。僅かな化学的修飾が期待される純度分析においては、物質を分離した後、直接ＴＬＣプレート上で同様に常用の蛋白質染色試薬を用いて検出することができる。
次に、大腸菌を用いるｒ−ＳＰ−Ｃのバイオテクノロジーによる製法において、宿主細胞蛋白質不純物の測定法を用いて、本発明を実施例により記載する。
実施例
１．  免疫のためのＨＣＰの獲得
文献公知の方法との及び関連公式規則との一致において、ダウンストリーム法の最終相から抗原フラクションを探した。従って、免疫のためには、ＨＣＰをｒ−ＳＰ−Ｃが８０〜９０％まで純粋である発酵相から取り出した。ＨＣＰ抗原フラクションの除去のためには、１０ｌ空発酵から濾過により及び／又は遠心分離により単離された含有体６０ｇを、約９６時間の凍結乾燥の後に使用した。
２．抗血清の製造
ｐＨ２の９５％濃度のイソプロパノール中に溶かしたＨＣＰ１ｍｇを真空濃縮器（speedvac（R））中で乾燥し、リン酸塩緩衝した塩水０．５ｍｌ中に再懸濁させ、アジュバント（ベース免疫のためにＡＢＭ−Ｓ及びブースター注射のためにＡＢＭ−Ｎ）０．５ｍｌと混合し、かつそれぞれの場合に１ｍｇ／ウサギの量で皮下に注射した。免疫法は標準法に従って実施した：最初の免疫の後、ブースター注射を４週間ごとに６回まで実施した。血液の採取をそれぞれの場合において、タイターの展開を監視するために最後の注射の１０日後に実施した。タイターが十分になるとすぐに、血液５０ｍｌを採取し標準法に従って、血清を製造した。
３．  タイターの測定
タイターの測定のために、個々の血清を種々の希釈で免疫薄層クロマトグラフィー（immuno-TLC）として記載されている新規方法を用いて分析した。１：５０００、１：１００００、１：２００００及び１：５００００の希釈をＨＣＰの４、１６、６２．５及び２５０ｎｇを分析するために使用した。１：１００００の希釈で、調査した全てのウサギ抗体は全蛋白質の量に比例してＨＣＰ成分を認めた。同様のタイターを有する抗血清をプールし、再分析した。この血清を標準法に基づき、かつ分割して−２０℃で貯蔵した。
４．  サンプル製造及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
分析すべきサンプルを真空濃縮器中で乾燥し、かつＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ２０〜２００μｌ中に溶かした。薄層クロマトグラフィーのために、ジオール（Diol）という商品名でメルク・ダルムシュタット社によって市販されている変性シリカマトリックスを有するＨＰＴＬＣプレートを使用した。ＨＰＴＬＣプレートへのサンプルの適用はリンゴマート（Lingomat）ＩＶ（Camag,Berlin）を用いて自動的に実施した。サンプル適用後、このプレートを空気乾燥し、かつＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ混合物［ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／２５％濃度のＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ＝３２．５／１５／１／２（容量比）］を液相として使用してクロマトグラフィーを実施した。クロマトグラフィーの後、このプレートを乾燥した。
５．  抗−ＨＣＰ抗体でのＨＣＰの免疫ステイン
非特異的結合部位を飽和するために、乾燥ＨＰＴＬＣプレートをＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4１２ｍＭ及びＮａＨ2ＰＯ4３ｍＭを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３％濃度の魚ゼラチンと４時間インキュベートした。次いで、このプレートを第一の抗体の、通常１：１００００の希釈での存在下に、僅かに振盪して一夜インキュベートした。未結合の抗体をトリスＨＣｌ  ４ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ツウィン２０  ０．０５％からなるＴＢＳ／Ｔ（ｐＨ７．４）で数回洗浄することにより除去した。第一の抗体とのハイブリダイゼーションのために、このプレートを西洋わさびペルオキシドと複合した第二の抗体と、ＴＢＳ／Ｔ中の１：８００００の希釈で、２時間インキュベートした。未結合の抗体を前記のように、ＴＢＳ／Ｔで数回このプレートを洗浄することにより除去した。免疫反応性複合体をアメルスハム・ブフラー（Amersham Buchler）のＥＣＬ検出システムを用いて可視にした。このプレートをＸ線フィルム（Hyperfilm Amersham）を用いて２０〜６０秒間インキュベートした。
６．  ＳＰ−Ｃのステイン及び免疫ステイン
ＳＰ−Ｃの修飾（例えば、Ｃ−末端でのメチルエステル、及びメチオニンスルホキシド）を検出するために、ＴＬＣを用いて分離したこの蛋白質型をポンソー（Ponceau）Ｓでのステインで検出することができる。より感度の高い可能性は、ＳＰ−Ｃ抗体の使用及び前記のＨＣＰ測定に類似した方法の使用である。
７．  Ｘ線フィルムのビデオイメージング及びコンピューター分析
免疫複合体の定量のために、Ｘ線フィルムをビデオイメージャー（Cybertech,Berlin,Germany）を用いてデジタル化した。このＸ線フィルム上のシグナル強度をヴィンカム  ソフトウェア（Wincam software：Cybertech）を用いてコンピューター分析により分析した。
８．  ＨＣＰの定量
ｒ−ＳＰ−Ｃサンプル中のＨＣＰの測定のために、分割量を純粋のままで、又はＨＣＰ２．５、５．０、又は１０．０ｎｇを添加の後、分析した。個々のサンプル中のＨＣＰの量は線形回帰計算により決定した。パーセンテージは式％＝（ＨＣＰのｎｇ×１００）／ｒ−ＳＰ−Ｃのｎｇにより決定した。
ｒ−ＳＰ−Ｃ中の少量のＨＣＰを定量するために、僅かな量のＨＣＰから標的蛋白質の大部分を分離することが必要である。このことは薄層クロマトグラフィーにより達成された。ＨＣＰの検出限界は高度に純粋なｒ−ＳＰ−Ｃの５μｇをＨＣＰのｎｇ量と混合することにより分析された。これらの条件下に、ＨＣＰの０．１２５ｎｇはｒ−ＳＰ−Ｃの内生ＨＣＰ含有量から識別することが可能である最も低い量である。免疫−ＴＬＣにより分析することのできるサンプルの量はＨＣＰ含有量に依存する。ＨＣＰを０．１％より少量で含有するｒ−ＳＰ−Ｃサンプルに関しては、ｒ−ＳＰ−Ｃ１〜５μｇが分析される。薄層クロマトグラフィーにより２０μｇまでのｒ−ＳＰ−Ｃの量を分離することが可能であり、かつ定量限界がルミノグラフィーにおいて１ｎｇであるので（添加したｒ−ＳＰ−Ｃ５μｇを使用した場合）、ＨＣＰを検出することを理論的に０．００５％まで下げることができる。ＨＣＰ０．００２％を検出することは、標準条件下に信頼できる定量限界であると思われる。