(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体ストレスにより誘導され、Ｓｅｃ６１と結合する小胞体膜タンパク質ヒトＳＥＲＰ１をコードする、配列番号３に示される塩基配列のうち、２１５番目から４１２番目までの塩基配列を含むＤＮＡを含有する、ヒトＳＥＲＰ１を発現することができるベクターからなる、小胞体内に変性したタンパク質が蓄積するストレス下における、小胞体内の細胞膜表面タンパク質又は分泌系タンパク質の分解阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、小胞体ストレスにより誘導される新規な小胞体膜タンパク質であるヒトＳＥＲＰ１（Stress associated Endoplasmic Reticulum Protein 1）及びヒトＳＥＲＰ１をコードするｃＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
虚血はヒトが老化する段階で最も頻回に遭遇するストレスの一つであり、虚血により中枢神経系における神経活性及び神経生存性が低下する理由の一つに、細胞外スペース内でのグルタミン酸等の刺激性アミノ酸の蓄積や、カルシウムホメオスタシスの低下が挙げられ、また反応酸素種（ＲＯＳ）を生成することによって、虚血にひきつづいて発生する再灌流も神経細胞を損傷することが報告されている（Fed. Proc. 85, 46, 2402-2406, 1987）。また、脳虚血において細胞内の遺伝子発現に変化が認められ、これまでに８０を超える異なった遺伝子が脳虚血中に誘導されることが報告されている（Neuroreport 8, 1-8, 1997）。これらは、即時型遺伝子、アポトーシス遺伝子、ストレスタンパク質、サイトカイン及び成長因子を含み、神経死を引き起こすものがある一方で、ストレス条件に対してより抵抗力のある神経細胞へと導くものもある。
【０００３】
アストログリア（星状膠細胞）は、虚血ストレス条件においても耐性があり、さらに増殖もすることができ、ストレスを受けた後損傷した脳細胞を再構成することができるという独特の能力を有している（1,2nd edit. Lajitha A., ed., pp603-661, 1982）。本発明者らは、ラット培養アストログリアを低酸素（Ｈ）下、続いて再酸素添加（Ｒ）下に暴露するインビトロ系を用いて、基礎となるメカニズムの研究を行い（J. Neurochem. 62, 1489-1495、1994）、一連のストレスタンパク質（ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＨＳＰ７２及びヘムオキシゲナーゼ）を発現することによって、アストログリアは環境変化に適応でき、また、ストレスを受けた後に神経保護因子ＩＬ−６を放出することを既に明らかにしている（J. Exp. Med. 180, 2297-2308、1994；J. Neurochem. 66, 973-979、1996）。
【０００４】
さらに、本発明者らは、低酸素（Ｈ）下及びそれに続く再酸素添加（Ｒ）下における虚血後のラット脳内に誘導される３種の新規ｃＤＮＡ、すなわち１）新規のストレスタンパク質である酸素調節タンパク質（Oxygen Regulated Protein ）１５０（ＯＲＰ１５０）、２）ショウジョウバエのスプライシング因子のラット相同体（ＲＡ３０１）、３）新規の小胞体輸送体ＲＡ４１０（J. Biol. Chem. 27, 5025-5032、1996；J. Biol. Chem. 270, 28216-28222 1995；J. Biol. Chem. 272, 16438-16444、、1997）をクローニングした。
【０００５】
また、低酸素（Ｈ）及び梗塞条件下において、タンパク質の折りたたみ(folding)に関与しその高次構造の形成を補助する小胞体タンパク質である分子シャペロン（ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、及び新規分子ＯＲＰ１５０）が誘導されることは、本発明者らをはじめ他の研究者らによって報告されている（Mol. Brain Res. 22, 299-308, 1994; J. Neurosci. Res. 40, 807-819, 1995; J. Biol. Chem. 27, 5025-5032、1996）。そしてまた、アンチセンスベクターを培養細胞にトランスフェクションすることによって小胞体シャペロンを欠失させることにより、該細胞が低酸素に対し影響を受けやすくなることも報告されている（J. Biol. Chem. In press、1999）。
【０００６】
細胞内のおいて小胞体膜透過チャネルを形成するタンパク質であるＳｅｃ６１はアルファ、ベータ、及びガンマサブユニットからなる複合体であり、形成途中のタンパク質が小胞体に運び込まれるチャンネルを形成すること（Cell 71, 489-503. 1992; EMBO J. 16, 4549-4559, 1997; J. cell Biol. 141, 887-894, 1998）や、小胞体膜を透過するタンパク質の輸送は、タンパク質の変異と変性とに密接に結びついていること（J. cell Biol. 141, 887-894, 1998）も知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、小胞体ストレスにより誘導される小胞体膜タンパク質であり、虚血後の細胞の機能保持及び機能改善に関与している可能性やウイルス抗原の提示を促進するという可能性を有し、虚血後の細胞の機能を解析をする上で、また虚血のみならず様々な病態をタンパク質分解という観点から解明する上で有用である新規なヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１及びヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１ｃＤＮＡを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ラット胎児の大脳皮質から単離されるアストログリア（星状膠細胞）を、低酸素雰囲気下に暴露した後、通常酸素雰囲気下に細胞を戻し、このストレス条件を与えた細胞から得られる全ＲＮＡと、かかるストレス条件を与えない細胞から得られる全ＲＮＡとをそれぞれｃＤＮＡに逆転写した後にディファレンシャルディスプレー（differential display）を行い、32ＰラベルのｃＤＮＡをプローブとして用いるノーザンブロット法によって、低酸素及び通常酸素雰囲気下において候補遺伝子の発現の変化を確かめた後、新規小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１のｃＤＮＡをクローニングし、完全長のラットＳＥＲＰ１ｃＤＮＡを得て、かかるラットＳＥＲＰ１ｃＤＮＡの情報に基づき、ヒトＳＥＲＰ１ｃＤＮＡをＥＳＴクローン上に発見し、ヒトＳＥＲＰ１ｃＤＮＡをクローニングし、このヒトＳＥＲＰ１ｃＤＮＡを発現させ、その作用を確認することにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、小胞体ストレスにより誘導され、Ｓｅｃ６１と結合する小胞体膜タンパク質ヒトＳＥＲＰ１をコードする、配列番号３に示される塩基配列のうち、２１５番目から４１２番目までの塩基配列を含むＤＮＡを含有する、ヒトＳＥＲＰ１を発現することができるベクターからなる、小胞体内に変性したタンパク質が蓄積するストレス下における、小胞体内の細胞膜表面タンパク質又は分泌系タンパク質の分解阻害剤に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の新規ヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１（Stress associated Endoplasmic Reticulum Protein 1）は、図１及び配列表の配列番号４に示されるように、ＳＥＲＰ１タンパク質はアミノ酸６６残基からなる。本発明のヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１や、本発明のヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１活性を有するポリペプチドは、化学合成やヒトＳＥＲＰ１のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを宿主細胞で発現させることにより得ることができる。
【００１２】
本発明の新規ヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１は、Ｃ末端に膜透過領域をもつ小タンパク質であり、ＳＥＲＰ１タンパク質自体をエンドグリコシダーゼＨでの処理からは、グリコシレーションは発生しないが、ＳＥＲＰ１は、そのＮ末端に推定のＮグリコシレーションサイトを有している。また、ヒトＳＥＲＰ１は、アミノ酸レベルでラットＳＥＲＰ１と１００％一致する他、相同性検索により、Ｓｅｃ６１に関連する酵母のタンパク質ＹＳＹ６と約３０％の相同性を示す。
【００１３】
ＳＥＲＰ１のｍＲＮＡは、成体の全組織で低レベルかつ広範囲に発現し、脳、肝臓及び精巣で高レベルで発現する。ＳＥＲＰ１は、培養細胞においては低酸素やＣａイオン透過担体、ツニカマイシン処理など、小胞体内に変性したタンパク質が蓄積するストレス（小胞体ストレス）により誘導され、また、インビボにおいては脳梗塞モデル（rat MCA occlusion model）において梗塞巣周囲の神経細胞及びアストロサイトに強く誘導される。このように、ＳＥＲＰ１産生細胞に低酸素雰囲気下処理、Ｃａイオン透過担体処理、ツニカマイシン処理等の小胞体ストレスを加え、ＳＥＲＰ１産生が誘発された細胞を用いることが、ＳＥＲＰ１ｃＤＮＡを効率よくクローニングする上で好ましい。ヒトＳＥＲＰ１ｃＤＮＡのＤＮＡ配列は配列表の配列番号３において示されている。
【００１４】
上記のようにヒトＳＥＲＰ１は、小胞体ストレスにより誘導される小胞体膜タンパク質であり、またＳＥＲＰ１は、小胞体内に蓄積する変性したタンパク質の分解あるいは安定性に関与し、より具体的には、ＳＥＲＰ１がＳｅｃ６１（粗面小胞体膜にタンパク質透過チャネルタンパク質として存在し、通常は翻訳されたばかりの分泌系タンパク質を小胞体内に運ぶチャンネルとして機能し、ストレス時には小胞体内に蓄積する変性したタンパク質をサイトゾルへ運び出し、ユビキチン−プロテアソーム系により分解するための、タンパク質逆輸送チャンネルとして機能する。）に結合し、このことより細胞膜表面のマーカータンパク質とＳｅｃ６１との結合を阻害し、細胞膜表面のマ−カータンパク質の分解を阻害するという作用を有する。また、本発明において「ヒト小胞体タンパク質膜ＳＥＲＰ１活性を有する」とは、当該ヒト小胞体膜タンパク質を発現するＤＮＡとＲＡＧＥタンパク質を発現するＤＮＡをコトランスフェクションし、さらに前記細胞にＡ２３１８７刺激を行う系において、Ａ２３１８７刺激によって誘導されるＲＡＧＥタンパク質の分解を当該ヒト小胞体膜タンパク質が抑制する活性を意味する。
【００１５】
また、ヒトＳＥＲＰ１のｃＤＮＡクローニングに用いられたラットＳＥＲＰ１の完全長のｃＤＮＡは配列表の配列番号１で示され、配列番号２にはその翻訳領域であるラットＳＥＲＰ１の推定されるアミノ酸配列が示されている。なお、ラットＳＥＲＰ１ｃＤＮＡの部分ＤＮＡ配列は、Dr. Rapoport及びDr. Hartmannのグループとシークエンス情報について意見交換をした際、リボゾームアソーシエーテッド膜タンパク質（ribosome associated membrane proteins）の一つとして博士らがクローンしたＲａｍｐ４のラットｃＤＮＡ（未公開データ）と事実上同一であることが偶然にも明らかになった。
【００１６】
本発明のヒトＥＲタンパク質ＳＥＲＰ１に特異的に結合する抗体や、ヒトＥＲタンパク質ＳＥＲＰ１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリモノクローナル抗体であってもよく、これらは細胞融合など常法により作製することができる。
【００１７】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、かかる実施例に限定されるものではない。
（各種ストレスに対する細胞培養及び条件）
低酸素／再酸素添加（Ｈ／Ｒ）によるストレスの付与は、ラットＥ１８胎児の大脳皮質からラット１次アストログリアを単離し、文献（J. cell Biol. 85, 890-902, 1980）記載の方法をわずかに改変して次のように行った。Ｅ１８脳より得られた大脳半球から髄膜を注意深く取り除いた脳組織を、３７℃で１５分間パパイン溶液（Worthington Biochemical Corporation; NJ, USA）で消化し、１７５ｃｍ2の培養フラスコ（脳２個／フラスコ）で培養した。１０％子牛胎児血清（ＦＣＳ）を用いた最小培地（ＭＥＭ）で１０日間細胞を増殖させた後、小神経膠細胞及び乏突起神経細胞からアストログリアを分離するために強く撹拌し、次いで直径１５０ｍｍの皿に細胞を移し、さらに７日間増殖させた。
【００１８】
次に、形態学的基準（繊維芽細胞様の石畳様細胞層の形成）及び免疫組織化学的基準（抗グリア繊維様酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体（Sigma; St. Louis, MO）を用いたＧＦＡＰの検出）に基づいて、９５％以上がアストログリアである培養物を実験に使用した。細胞が凝集した時点で、血清フリーの培地に替えて、文献（J. Clin. Invest. 69, 1090-1098、1990）記載のように、低酸素チェンバー（Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI）内のインキュベーターを用いて、２２時間低酸素（Ｈ）雰囲気下に曝らした。その後、通常雰囲気（再酸素添加；Ｒ）に細胞を戻し、４時間インキュベートした。
【００１９】
また、上記の低酸素／再酸素添加（Ｈ／Ｒ）以外の他のストレスにも細胞を曝した。カルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７（Sigma; MO, USA）、ツニカマイシン（Sigma; MO, USA）、及び過酸化水素（和光純薬、大阪、日本）を、それぞれ１μＭ、１μｇ／ｍｌ、及び８０μＭ添加し、細胞を８時間（Ａ２３１８７及びツニカマイシン）又は４時間（過酸化水素）インキュベートした。また、熱ショックの場合には、４２℃で２時間細胞を培養して３７℃に戻し、さらに２時間インキュベートした。
【００２０】
（ディファレンシャルディスプレー）
通常酸素雰囲気下及び低酸素雰囲気下における培養アストログリアから、キアゲン  アールエヌイージー  キット（「Quiagen RNeasy Kit」Quiagen; GmbH, Germany）を用いて全ＲＮＡを抽出し、文献（Sience 257, 967-971, 1992）記載のようにディファレンシャルディスプレーを行った。オリゴｄＴプライマーの存在下、上記ＲＮＡにＡＭＶ逆転写酵素（Pharmacia Biotech; Sweeden）を作用させｃＤＮＡを合成し、ほぼ３００種のランダムプライマー（１２〜２１オリゴヌクレオチド）を用いてＰＣＲを実施した。次に、ＰＣＲ産物は６％アクリルアミドゲルによって分離され、非ストレス下におけるよりもストレス下において生成量が多い目的とするｃＤＮＡバンドをそのゲルから切断した。
【００２１】
（ラットＳＥＲＰ１ｃＤＮＡクローニング）
ディファレンシャルディスプレー法によって、低酸素雰囲気下に暴露されたラット培養アストログリアにおいて、４００ｂｐのＳＥＲＰ１のｃＤＮＡフラグメントが大幅に増幅された。プローブとして32ＰラベルＳＥＲＰ１のｃＤＮＡを用いたノーザンブロット法によって、低酸素雰囲気及び通常酸素雰囲気下における候補遺伝子の発現の変化を確認し、次に、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、ＳＥＲＰ１のｃＤＮＡクローニングを行い、３７７ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems, 日本）を用いて両鎖のＤＮＡの配列を決定した。得られたｃＤＮＡは唯一可能性のあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及びポリＡ（アデニン）シグナルを含有する２．３ｋｂｐのｃＤＮＡクローンであった。
【００２２】
この決定されたラットＳＥＲＰ１ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に、また推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号２にそれぞれ示す。ラットＳＥＲＰ１は、Ｃ末端の推定の膜透過領域を１つ含むアミノ酸６６残基からなっていた。
【００２３】
（ノーザンブロット分析）
上記ノーザンブロット分析は以下のように行われた。培養アストログリア、即ちラット組織から、全ＲＮＡのうち１０から１５μｇを１．０％アガロース／ホルムアルデヒドゲルの上に分離して、イモロビンＮ膜（Milipore; MA, USA）に移した。ランダム６量体処理（特異活性は５×１０8及び３×１０9ｃｐｍ／μｇＤＮＡの間）によって、32Ｐを用いてｃＤＮＡフラグメントをラベルして、膜ハイブリダイゼーションに使用した。２×ＳＳＣ及び０．５×ＳＤＳで１時間洗浄した後、膜をオートラジオグラフに付した。
【００２４】
（ヒトＳＥＲＰ１のｃＤＮＡクローニング）
ディファレンシャルディスプレーによって得られた上記ラットＳＥＲＰ１ｃＤＮＡフラグメントを、ヒトｃＤＮＡライブラリー（lambda ZapＩ ｃＤＮＡ library: Stratagene; CA, USA）をスクリーニングするために用いた。このラットＳＥＲＰ１ｃＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列情報に基づき、ナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（NCBI）Ｅ−メールサーバー、ゲノムネットのファスタ（FASTA）とブラスト（BLAST）のＥ−メールサーバー、及びＤＮＡデータバンク・オブ・ジャパン（DDBJ）分子分析システムを利用して、シークエンスサーチと比較を行った。ヒト発現シークエンスタグ（ＥＳＴ）クローンから、ラットＳＥＲＰ１の完全オープンリーディングフレームを含むヒトＳＥＲＰ１のｃＤＮＡを得て、それぞれのクローンにおける両鎖に対しＤＮＡ配列を決定した。
【００２５】
この決定されたヒトＳＥＲＰ１ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列表の配列番号３に、また推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号４及び図１にそれぞれ示す。ヒトＳＥＲＰ１は、アミノ酸レベルでラットＳＥＲＰ１と１００％一致し、Ｃ末端の推定の膜透過領域（図１の下線部）を１つ含むアミノ酸６６残基からなっていた。また、図１に示されるように、ヒトＳＥＲＰ１は、ＳｅｃＹ／Ｓｅｃ６１関連の酵母タンパク質ＹＳＹ６とタンパク質レベルで２９％の相同性を有していることが、最新のシークエンスデータベースを用いた相同性サーチから明らかになった。
【００２６】
（通常条件下におけるＳＥＲＰ１の組織分布）
ノーマルな条件下でのＳＥＲＰ１の組織分布を調べるために、雄の成体ラットの種々の組織から抽出した全ＲＮＡを用いて、ノーザンブロット分析を行った。結果を図２に示す。図２（レーン１は脳、レーン２は心臓、レーン３は肺、レーン４は肝臓、レーン５は腎臓、レーン６は脾臓、レーン７は筋肉、レーン８は精巣、各レーン１２ｕｇＲＮＡ）から、ＳＥＲＰ１のｍＲＮＡは、低レベルで広範囲に発現し、脳、肝臓及び精巣で高レベルで発現していることがわかる。
【００２７】
（ストレス条件におけるＳＥＲＰ１の誘導）
また、ストレス条件においてＳＥＲＰ１がどのように誘導されるのか知るために、培養アストログリアからのＲＮＡを用いて、ノーザンブロット法を実施した。低酸素（Ｈ）雰囲気下において比較的長い時間暴露して（Ｈ暴露１２時間後）、次ぎに再酸素添加（Ｒ）雰囲気に戻すことにより、ＳＥＲＰ１の誘導を行った。また、化学的なストレス条件、すなわちツニカマイシン処理、Ｃａイオン透過担体Ａ２３１８７処理及び過酸化水素処理と、熱ショックに暴露した条件とによってもＳＥＲＰ１の誘導を行った。結果を図３に示す。
【００２８】
ラット培養アストログリアからの全ＲＮＡ（１５ｕｇ／lane）で示される図３中の、レーン１は２２時間の通常酸素雰囲気、レーン２は１２時間の低酸素（Ｈ）雰囲気、レーン３は２２時間の低酸素（Ｈ）雰囲気、レーン４は２２時間の低酸素（Ｈ）雰囲気後の４時間の通常酸素雰囲気を示す。また、ラット培養アストログリアからの全ＲＮＡ（１０ｕｇ／lane）で示される図３中の、レーン５はコントロール、レーン６はツニカマイシン処理、レーン７はＡ２３１８７処理、レーン８は過酸化水素処理、レーン９は熱ショックを示す。図３からわかるように、低酸素（Ｈ）雰囲気下（レーン２、３、４）や、ツニカマイシン処理（レーン６）、Ａ２３１８７処理（レーン７）ではＳＥＲＰ１の誘導がみられたが、通常酸素暴露（レーン１）、コントロール（５）、過酸化水素処理（レーン８）、熱ショック（レーン９）ではＳＥＲＰ１の誘導がみられなかった。
【００２９】
（虚血脳におけるＳＥＲＰ１の発現）
文献（Am. J. Path. 142, 623-635, 1993）に記載されている方法により、雄スプラーグ−ダーレイ（Sprague-Dawley）ラット（２５０ｇ）にラットの片側の中大脳動脈（ＭＣＡ）梗塞を行った。１２時間の虚血の後、ラットを犠牲にして、−８０℃で脳を凍結した。連続したコロナルセクションを得て、文献（J. Biol. Chem. 270, 28216-28222、1995）記載の方法で、インサイチュウ（in situ）ハイブリダイゼーション技術により、ラットＳＥＲＰ１のｍＲＮＡを以下のようにして検出した。
【００３０】
ｐＧＥＭＴベクターに挿入したラットＳＥＲＰ１のｃＤＮＡから、ＳＥＲＰ１のセンス及びアンチセンスリボプローブをインビトロで転写し、ＮｃｏII（センスプローブ）及びＳｐｅII（アンチセンスプローブ）を用いて線状とした後、35Ｓ−ＵＴＰ（ＮＥＧ−０３９Ｈ、Dupon NEN; USA）と、ＳＰ６又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Primega; WI, USA）とを含む試薬混合物を用いて、ｃＤＮＡをインキュベートした。次に、センスプローブ又はアンチセンスプローブのいずれかを用いて脳セクションをハイブリダイズして、洗浄、乾燥し、Ｘ線フィルムに曝した。２日後、このフィルムを現像して、脳の画像を調べた。いくつかのセクションに対し、２週間写真乳剤（Kodak; NY, USA）でスライドをカバーして現像し、暗視野照明を用いた顕微鏡下で調べ、ラットＳＥＲＰ１のｍＲＮＡが存在することを確認した。特に、梗塞巣周囲（penumbra）でのＭＣＡ梗塞が発生した後のｍＲＮＡにＳＥＲＰ１が誘導されることが、インビボでのインサイチュウ（in situ）ハイブリダイゼーションにより示された。また、神経細胞及び梗塞が発生した半球のアストログリアの両方にＳＥＲＰ１の誘導が見られたことが、マイクロオートグラフィーを用いた詳細な分析から示唆された。このように、ラットＭＣＡ梗塞後のタンパク質レベルで神経細胞、及びアストログリア内にＳＥＲＰ１が実際に誘導されることが、免疫組織学的にも確認された。
【００３１】
（プラズミド構築及び抗体の入手）
Ｎ末端のＦＬＡＧエピトープのタグをもつプライマーを用いたＰＣＲによって、完全オープンリーディングフレームを含むＳＥＲＰ１のｃＤＮＡを増幅して、ｐｃＤＮＡ3（＋）にクローンした。Dr. Enno Hartmann から提供されたヒトＳｅｃ６１ベータのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＨＡタグＳｅｃ６１ベータ構築物を得て、そのシークエンスを確認するために、両方向に対しＤＮＡ配列を決定した。抗ヒトＳｅｃ６１抗体は、ハーバード大学Dr. Tom A. Hartmann から提供されたものを用いた。また、細胞表面タンパク質である最終糖化産物レセプター（ＲＡＧＥ）（J. Biol. Chem. 267, 14998-15004, 1992）に対するｃＤＮＡ及びこの分子に対する抗体は、ニューヨーク州コロンビア大学Dr. Ann Marie Schmidtから提供されたものを用いた。
【００３２】
（ヒトＳＥＲＰ１の作製、抗ヒトＳＥＲＰ１抗体の作製）
ヒトＳＥＲＰ１の作製は常法によりペプチド合成により行った。次ぎに、ヒトＳＥＲＰ１と反応する抗体を得るために、Ｎ末端に余分なシステイン残基をもつ配列を有するペプチドを合成してＫＬＨに結合した。次に、常法によりウサギを免疫し、抗血清力価が最大に達した後、上記合成ペプチドを結合したカラム（Proton Kit 1; Multiple Peptide System, CA, USA）を用いて、抗体をアフニティー精製処理した。
【００３３】
（ヒトＳＥＲＰ１と他分子に対するウェスタンブロット）
ＳＥＲＰ１タンパク質を検出するウェスタンブロットを行うため、培養アストログリア又はＦＬＡＧタグＳＥＲＰ１のｃＤＮＡでトランスフェクションされた２９３細胞を、１％ＮＰ−４０及び１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有するバッファー中に溶解して、抗ＳＥＲＰ１抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体を用いて通常の方法でウェスタンブロットを行い、続いてアルカリフォスファターゼが結合した抗ウサギ抗体又は抗マウス抗体をそれぞれ用いたインキュベーションを行った。タンパク質レベルでの他の分子を検出するために、同様の方法で細胞を溶解して、Ｓｅｃ６１ベータ、ＲＡＧＥ、ＣＤ８、ＨＡ又はＦＬＡＧに対する抗体を用いてウェスタンブロット法を実施した。また、抗ＳＥＲＰ１抗体を用いた免疫組織学技術によって、ＳＥＲＰ１タンパク質も検出された。
【００３４】
（ＢＨＫ細胞を用いたＳＥＲＰ１の細胞内局在）
ＳＥＲＰ１の細胞内局在を分析するために、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）抗体を用いて、ＦＬＡＧタグＳＥＲＰ１のｃＤＮＡがトランジェントにトランスフェクションされたＢＨＫ細胞を二重に染色し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗マウス抗体及びＴＲＩＴＣ結合抗ウサギ抗体を用いて視覚化した。図４は、ＴＲＩＴＣ結合抗マウス抗体で視覚化した抗ＦＬＡＧ抗体（ａ）及びＦＩＴＣ結合抗ラビット抗体で視覚化した抗ＰＤＩ抗体（ｂ）の結合サイトを示す。
【００３５】
（ストレス条件下における細胞表面マーカータンパク質分解に対するＳＥＲＰ１の作用）
細胞表面マーカータンパク質ＲＡＧＥ（Advanced Glycation Productsの受容体）（J. Biol. Chem. 267, 14998-15004, 1992）又はＣＤ８のｃＤＮＡをリポフェクタミン（Life Technologies; MD, USA）を単独又はＳＥＲＰ１のｃＤＮＡ（２μｇｃＤＮＡ／ｍｌ）と共に用いて、２９３細胞又はＢＨＫ細胞（２μｇｃＤＮＡ／ｍｌ）に、トランジェントにトランスフェクトし、小胞体ストレスを起こさせ、小胞体内にマーカータンパク質の蓄積をさせるために、Ｃａイオン透過担体Ａ２３１８７（１μｇ／ｍｌ）又はツニカマイシン（１μＭ）で細胞を処理した。一晩インキュベーションした後、通常のウェスタンブロット法及び35Ｓメチオニン（American Radiolabeled Chemicals; MO, USA）を用いて代謝ラベリングを行った後の免疫沈降反応によってマーカータンパク質の分解について分析した。代謝ラベリングは、０．２５ｍＣｉ／ｍｌの濃度で35Ｓを培地に添加して、35Ｓフリー培地を用いずに１時間の追跡の実施に続いて、メチオニンフリーのＤＭＥＭ中で３０分間細胞をインキュベートすることにより行った。結果を図５〜７に示す。
【００３６】
図５は、ＲＡＧＥトランスフェクトＢＨＫ細胞を、抗ＲＡＧＥ抗体を用いて免疫染色して、ＦＩＴＣ結合抗ラビット抗体を用いて視覚化したものであり、コントロールとしてのノーマル条件(１)及びツニカマイシン処理(２)によるストレス条件におけるＢＨＫ細胞でのＲＡＧＥの細胞内局在を示しており、図５より、ストレス条件下(２)において、核周辺領域にＲＡＧＥが主に局在していることがわかる。
【００３７】
図６は、ＲＡＧＥとＳＥＲＰ１とのｃＤＮＡをコトランスフェクションした２９３細胞及びＲＡＧＥｃＤＮＡを単独トランスフェクションした２９３細胞からのそれぞれの抽出物に対して、抗ＲＡＧＥ抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示している。図６中、レーン１はコントロール、レーン２はＡ２３１８７処理、レーン３はＳＥＲＰ１をコトランスフェクションしたコントロール、レーン４はＳＥＲＰ１をコトランスフェクションしたＡ３２１８７処理の場合をそれぞれ示している。この抗ＲＡＧＥ抗体を用いたウェスタンブロットにおいては、Ａ２３１８７で処理した細胞内にＲＡＧＥの分解及びわずかな凝集が検出されたが、ＳＥＲＰ１の共通のトランスフェクションはこれらを阻害した。
【００３８】
図７は、抗ＲＡＧＥ抗体と抗ＣＤ８抗体のそれぞれについての免疫沈降反応の結果を表しており、レーン１はコントロール、レーン２はツニカマイシン処理、レーン３はＡ２３１８７処理、レーン４はＳＥＲＰ１をコトランスフェクションしたツニカマイシン処理、レーン５はＳＥＲＰ１をコトランスフェクションしたＡ２３１８７処理を示している。このメタボリックラベル後の抗ＲＡＧＥ又は抗ＣＤ８を用いた免疫沈降反応から、ツニカマイシン処理条件又はＡ２３１８７処理条件における１時間の追跡でマーカータンパク質は分解されるが、ＳＥＲＰ１をコトランスフェクションした場合はストレス条件においてさえも、これらの分解をブロックすることが明らかになった。
【００３９】
（Ｓｅｃ６１及びマーカータンパク質とのＳＥＲＰ１の相互作用）
ストレス条件において膜タンパク質の分解をＳＥＲＰ１がどのようにブロックするかそのメカニズムを調べるために、ノーマル条件及びストレス条件（ツニカマイシン処理）におけるＦＬＡＧタグＳＥＲＰ１ｃＤＮＡ及びＲＡＧＥｃＤＮＡをトランジェントにトランスフェクションした２９３細胞からのタンパク質抽出物を用いて、共免疫沈降反応及びクロスリンキングを行った。２９３細胞に、ＦＬＡＧタグＳＥＲＰ１ｃＤＮＡを単独又はマーカータンパク質ＲＡＧＥｃＤＮＡとコトランスフェクションして、１％ＮＰ−４０及び１ｍＭＰＭＳＦ中に細胞を溶解した。抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＲＡＧＥ抗体を用いて、ＳＥＲＰ１又はＲＡＧＥを免疫沈降反応させた後、抗Ｓｅｃ６１ベータサブユニット抗体、抗ＫＤＥＬ抗体（Stressgen, Canada）、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＲＡＧＥ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロットは、アルカリフォスファターゼ結合二次抗体を用いて、一次抗体の結合を検出した。
【００４０】
前述のように（J. Biol. Chem. 269, 9882-9888, 1994）、ジサクシニミディール基質（ＤＳＳ）（Pierce; IL, USA）を用いて、ＳＥＲＰ１とトランスフェクトした２９３細胞及びＨＡタグＳｅｃ６１のｃＤＮＡの膜分画を用いたクロスリンキングを行った。抗ＦＬＡＧ抗体を用いた共免疫沈降反応を行い、続いてＳＥＲＰ１とＳｅｃ６１ベータとの相互作用を確認するため、抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。結果を図８に示す。図８中、ＩＰは免疫沈降反応を、ＴＭはツニカマイシンをそれぞれ表す。
【００４１】
共免疫沈降反応実験から、ストレス条件及びノーマル条件の両方で、Ｓｅｃ６１ベータサブユニットとＳＥＲＰ１は相互作用した可能性がある（図８ａ）が、一方、マーカータンパク質（ＲＡＧＥ）とＳｅｃ６１ベータサブユニット及び分子シャペロン（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４）はストレス条件においてのみ相互作用した（図８ｂ、８ｃ）ことから、Ｓｅｃ６１ベータに対する２種類の結合があること、そしてＳＥＲＰ１とＳｅｃ６１ベータの相互作用は、ＳＥＲＰ１自体の分解のよるものではないことがわかる。また、ＳＥＲＰ１は、マーカータンパク質と直接相互作用していないので、分子シャペロンとして機能している可能性が低い（図８ｄ）。
【００４２】
ＦＬＡＧタグＳＥＲＰ１及びＨＡタグＳｅｃ６１ベータサブユニットを過剰に発現する２９３細胞から膜機能をクロスリンキングした後、共免疫沈降反応を行ってＳＥＲＰ１とＳｅｃ６１ベータの相互作用を確認した（図８ｅ）。抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降反応した後、抗ＨＡ抗体との２つの異なった免疫反応バンドが検出された。分子量に基づき、低位置のバンドはＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１のヘテロダイマーを表している可能性があり、一方、高位置のバンドは、他の分子を伴うかあるいは伴わない、ＳＥＲＰ１とＳｅｃ６１ベータのヘテロトリマー又はオリゴマーを示している可能性がある。
【００４３】
また、図９は、Ｓｅｃ６１ベータサブユニットとマーカータンパク質との相互作用をまとめたもので、相互作用に対するＳＥＲＰ１の影響を示している。ＲＡＧＥ及び異なる量のＳＥＲＰ１のｃＤＮＡとをコトランスフェクションした２９３細胞を用いて、ストレス条件におけるＳｅｃ６１ベータサブユニットとマーカータンパク質との相互作用に対するＳＥＲＰ１の影響を共免疫沈降反応により検討した。ＳＥＲＰ１が過剰に発現することによって、ストレス条件におけるＲＡＧＥとＳｅｃ６１ベータサブユニットとの結合は、投与量に応じて阻害され、Ｓｅｃ６１ベータサブユニットを用いたコトランスフェクションによって復元する。このことは、ＳＥＲＰ１とＳｅｃ６１ベータサブユニットとの複合体がマーカータンパク質とＳｅｃ６１ベータサブユニットとの結合の相互作用をブロックすることを示している。そしてまた図１０は、ストレス条件下におけるＳＥＲＰ１の推定の機能を表す図であり、Ｓｅｃ６１ベータサブユニットに対するＳＥＲＰ１の結合が、変性した膜タンパク質とＳｅｃ６１複合体との相互作用を阻害することを示している。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の小胞体ストレスにより誘導される新規なヒト小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１は、虚血後の細胞の機能保持及び機能改善に関与している可能性やウイルス抗原の提示を促進するという可能性を有し、虚血後の細胞の機能を解析をする上で、また虚血のみならず様々な病態をタンパク質分解という観点から解明する上で有用である。
【００４５】
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のヒトＳＥＲＰ１のアミノ酸配列並びにアミノ酸レベルでのラットＳＥＲＰ１及び酵母タンパク質ＹＳＹ６との相同性を示す図である。
【図２】  通常条件下におけるＳＥＲＰ１の組織分布を示すノーザンブロットの図である。
【図３】  各種ストレス条件下におけるＳＥＲＰ１の誘導を示すノーザンブロットの図である。
【図４】  ＴＲＩＴＣ結合抗マウス抗体で視覚化した抗ＦＬＡＧ抗体（ａ）及びＦＩＴＣ結合抗ラビット抗体で視覚化した抗ＰＤＩ抗体（ｂ）の結合サイトを示す図である。
【図５】  ノーマル条件下(１)及びストレス条件下(２)におけるＢＨＫ細胞でのＲＡＧＥの細胞内局在を示す図である。
【図６】  ＲＡＧＥｃＤＮＡの単独又はＳＥＲＰ１とのコトランスフェクションの場合における抗ＲＡＧＥ抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図７】  ストレス条件下における細胞表面マーカータンパク質分解に対するＳＥＲＰ１の作用を示すための免疫沈降反応の結果を示す図である。
【図８】  Ｓｅｃ６１及びマーカータンパク質とのＳＥＲＰ１の相互作用を示す図である。
【図９】  Ｓｅｃ６１とマーカータンパク質との相互作用をまとめたもので、相互作用に対するＳＥＲＰ１の影響を示す図である。
【図１０】  ストレス条件下におけるＳＥＲＰ１の推定の機能を表す図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Japan Science and Technology Corporation
<120> A Novel ER Protein SERP1
<130> A081P02
<160> 4
<210> 1
<211> 2335
<212> DNA
<213> rat
<220>
<221> CDS
<222> (253..450)
<400> 1
cggcacgagg ccggcaccag ctgtcggcac gaggttggac tctttcctcc cggtcctgcg    60
gccctctttc tccggcgcgc cgcccctcgg ttgctcagac cgctgtgatc ggaggttgcc   120
ggtgctccag cgcttggcgt cccggcccag tggccgtagg cggcgtaggc accgcgagcc   180
gagcctcccg gtggccgggg aacggcaagc gagcgagtcc gagaggttct tggggcaggt   240
ggcgccgcga ag atg gtc gcc aag cag agg atc cgt atg gcc aac gag aag   291
Met Val Ala Lys Gln Arg Ile Arg Met Ala Asn Glu Lys
1               5                  10
cac agc aag aac ata act cag cgc ggc aac gtc gct aag acc tcg aga     339
His Ser Lys Asn Ile Thr Gln Arg Gly Asn Val Ala Lys Thr Ser Arg
15                 20                  25
aat gcc ccc gaa gaa aag gcg tcg gta gga ccc tgg tta ttg gcc ctc     387
Asn Ala Pro Glu Glu Lys Ala Ser Val Gly Pro Trp Leu Leu Ala Leu
30                  35                  40                  45
ttc att ttt gtc gtt tgt gga tct gca att ttc cag att att caa agt     435
Phe Ile Phe Val Val Cys Gly Ser Ala Ile Phe Gln Ile Ile Gln Ser
50                  55                  60
atc agg atg ggc atg tgaagtgact gaccttgaga tgtttccatt ctcctgtgaa     490
Ile Arg Met Gly Met
65
ttttaacttg aactcattcc tgatgttcga tgccctggtt aaaaacaatt cagtaaatca   550
ccctgcctca gaatgacttt ttcatatcaa ccttcatgtg tcattccaag gtttcttcaa   610
gagtcattcc aggtttgcta gtccatgcca cagtgccttg caaaagcacc acatgaataa   670
agcaataaaa tttgattatt aagttccagt agtagaccat acttattcag tacagaatga   730
gttttatgtg gttattaaaa cttatgacta attagattaa atctgtgtag acagggtata   790
gattttgtta accctaatgt gtaaatgcaa ttagctaatt taaattttgg aaacttaagg   850
ttttatatag ctaggcactt tactactctt ggattgaaaa agcacactcc attataggga   910
catgtaacta tcctataatc aggtgcttat aaatggacaa ctacacggcc tagttttacc   970
acaatcattg tcacctaaat ttttttaaaa actcctaggg catatgtaag tggagatgct  1030
cactgctgca tctgtttcta atgataatgt ttctgttaca cagccttgag tttcgcatga  1090
gtaagtatag tcacctaggg atcccatttg agactgggtt gagcattttg gtaacttgaa  1150
tccaaagtga ctgcagtttc actaaaaagc tatcatggtg agatgaaatt aggggatgga  1210
ttgctgaagg tcatacagat cagaattaac atatcaaggg gtttaccggt ggaggaaaaa  1270
agttaagggg gaaaagtcta ccaagaggga aatgccttga aaaaataggg gggaaacctg  1330
tgtgccatat gatatcttag catgtgaatt gcacttttaa taccaaaaag gcacatcaac  1390
taaaaagtta tgattgaaat gcccttaggg ttctaggtat gtcaacctaa actagcattt  1450
ggagttaaat gaatttactg ataaggatca gtctagtctt cctctgtatg acttagtagg  1510
ttgtgattgg tcagatttcc ttttttaact aacggtaagg gtgagagtga tgaggcaggg  1570
tttgaggttt tctggtacta ttgaaaactg caagtcctga ctatgcactt agccagaact  1630
tggtgtagac caccaagcaa tatctgtgta tggaattgga agaaacctgc ttatgtttgc  1690
tttgttattt gcctcaggag atctcttttt gaaataagct gttttccaaa ggaacagaag  1750
ggaaacttgc tacctgttct gagagcagtg taaacctcac aggactttgg accccctcag  1810
atgtagagga gaatgaagga aaggaatagt tagggatgca caggaattta tctgtctctg  1870
atcaggaaag aaagctggct atgggtctgc aggggcatga ctgatggttg tctgcctctt  1930
ttcaccctgt aagtgaatcc ctgaactgga ttcactgaag caagtcttgg ttaactaatt  1990
ctattttact ataactttaa aagtgaaaaa tattctctaa atttatagca ggtgccttat  2050
ttcctttgaa tcaaatcatt ccataccaga atttcccttg gtttactatt agataattgg  2110
ctttaagata cttttgtttt gaaacataca gtgttttaat tgatttgtta aattgctgta  2170
gccatcaatc atttcacatt tgtaaaatac attccctttg tatcatgtaa tttgcctatt  2230
cagtgcattt tatattcagg ttgggttatg catatttggg tcaatgaaag ttgtgtctgt  2290
ttgatttatg ctttaaaaat aaagttccct ggatatttaa aaaaa                  2335
<210> 2
<211> 66
<212> PRT
<213> rat
<400> 2
Met Val Ala Lys Gln Arg Ile Arg Met Ala Asn Glu Lys His Ser Lys
1               5                  10                  15
Asn Ile Thr Gln Arg Gly Asn Val Ala Lys Thr Ser Arg Asn Ala Pro
20                  25                  30
Glu Glu Lys Ala Ser Val Gly Pro Trp Leu Leu Ala Leu Phe Ile Phe
35                  40                  45
Val Val Cys Gly Ser Ala Ile Phe Gln Ile Ile Gln Ser Ile Arg Met
50                  55                  60
Gly Met
65
<210> 3
<211> 655
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> CDS
<222> (215..412)
<400> 3
tgctcggtca gtcagtcggc ggccggcgcc cggcttgtgc tcagacctcg cgcttgcggc      60
gcccaggccc agcggccgta gctagcgtct ggcctgagaa cctcggcgct ccggcggcgc     120
gggcaccacg agcggagctt cgcagcggct ccagaggagg caggcgagtg agcgagtccg     180
aggggtggcc ggggcaggtg gtggcgccgc gaag atg gtc gcc aag caa agg atc    235
Met Val Ala Lys Gln Arg Ile
1               5
cgt atg gcc aac gag aag cac agc aag aac atc acc cag cgc ggc aac      283
Arg Met Ala Asn Glu Lys His Ser Lys Asn Ile Thr Gln Arg Gly Asn
10                  15                  20
gtc gcc aag acc tcg aga aat gcc ccc gaa gag aag gcg tct gta gga      331
Val Ala Lys Thr Ser Arg Asn Ala Pro Glu Glu Lys Ala Ser Val Gly
25                  30                  35
ccc tgg tta ttg gct ctc ttc att ttt gtt gtc tgt ggt tct gca att      379
Pro Trp Leu Leu Ala Leu Phe Ile Phe Val Val Cys Gly Ser Ala Ile
40                  45                  50                  55
ttc cag att att caa agt atc agg atg ggc atg tgaagtga ctgaccttaa      430
Phe Gln Ile Ile Gln Ser Ile Arg Met Gly Met
60                  65
gatgtttcca ttctcctgtg aatttttaac ttgaactcat tcctgatgtt tgataccctg    490
gttgaaaaca attcagtaaa gcatcctgcc tcagaatgac tttcctatca tgcttcatgt    550
gtcattccaa ggtttcttca tgagtcattc caagttttct agtccatacc acagtgcctt    610
gcaaaaaaca ccacatgaat aaagcaataa aatttgattg ttaag                    655
<210> 4
<211> 66
<212> PRT
<213> human
<400> 4
Met Val Ala Lys Gln Arg Ile Arg Met Ala Asn Glu Lys His Ser Lys
1               5                  10                  15
Asn Ile Thr Gln Arg Gly Asn Val Ala Lys Thr Ser Arg Asn Ala Pro
20                  25                  30
Glu Glu Lys Ala Ser Val Gly Pro Trp Leu Leu Ala Leu Phe Ile Phe
35                  40                  45
Val Val Cys Gly Ser Ala Ile Phe Gln Ile Ile Gln Ser Ile Arg Met
50                  55                  60
Gly Met
65
【図１】
0004031138.tif 000002
【図２】
0004031138.tif 000003
【図３】
0004031138.tif 000004
【図４】
0004031138.tif 000005
【図５】
0004031138.tif 000006
【図６】
0004031138.tif 000007
【図７】
0004031138.tif 000008
【図８】
0004031138.tif 000009
【図９】
0004031138.tif 000010
【図１０】
0004031138.tif 000011