(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
0004194690.tif 000004
［式中、Ｒ１は式ＯＲまたはＮＲＲ’（ここでＲおよびＲ’はＣ１−８のアルキル基を表すか、またはＲとＲ’がそれらの結合する窒素原子と一緒になって５−７員の異項環を形成する基である）またはＣ１〜Ｃ８のアルコキシ基または環状アミノ基を表し、Ｒ２はシアノ基またはニトロ基を表し、Ｒ３は水素原子またはＣ１〜Ｃ４のアルキル基を表す。］
で表されるフェニルチアゾール誘導体および／またはその塩を有効成分として含有する、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの生体細胞内への取り込みを阻害するための薬剤（ただし、抗炎症剤は除く）。
【請求項２】
上記式（１）で表されるフェニルチアゾール誘導体および／またはその塩を有効成分として含有する、細胞増殖阻害剤の作用増強剤。
【請求項３】
上記式（１）で表されるフェニルチアゾール誘導体および／またはその塩を有効成分として含有する、低酸素状態により引き起こされる、組織または臓器の傷害を予防または治療するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェニルチアゾール骨格を有する、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの生体細胞内への取り込みを阻害する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プリンおよびピリミジン体の生合成経路は、低分子アミノ酸、葉酸、二酸化炭素などの非核酸性の前駆体から新たに合成するデノボ生合成経路と、食事やプリンおよびピリミジン体の分解により供給されるプリンおよびピリミジン塩基やヌクレオシドを再利用するサルベージ経路の二種からなる。
【０００３】
血中にあるヌクレオシドの再利用は、細胞膜のヌクレオシドトランスポーターを介して行われるが、このトランスポーターは、細胞の種類や状態によって発現量が著しく異なる。例えば、急性白血病やリンパ腫などの癌において、急速に増殖をしている腫瘍細胞は、正常な白血球の１０〜５０倍のトランスポーターを発現しており（ネイチャー・メディスン（Nature Medicine）１９９７、３、ｐｐ２５−２６）、積極的にヌクレオシドを取り込んで増殖に必要な核酸合成を行っている。
【０００４】
このような腫瘍細胞においては、細胞膜のヌクレオシドトランスポートを阻害することにより、ヌクレオシドの再利用が妨げられ、代謝拮抗剤の抗腫瘍活性が高まることが明らかにされている（薬学雑誌、１９９６、１１６、ｐｐ２１７−２２７）。
【０００５】
したがって、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの細胞内取り込みを抑制する物質は、細胞増殖阻害剤の作用増強、たとえば代謝拮抗剤との併用で抗腫瘍活性を高めるのに有用と考えられる。
【０００６】
ところで、アデノシン三リン酸やアデノシンといったヌクレオチドやヌクレオシドには、核酸としての役割のみならず、それぞれの受容体を介した生理活性があることが知られている。ヌクレオシドであるアデノシンは、アデノシン受容体を介して種々の作用を引き起こす。例えば、心筋虚血においては、低酸素状態で心筋組織中のＡＴＰが分解し、アデノシンが遊離する。アデノシンは近傍の冠血管平滑筋上のアデノシン受容体を介して血管拡張作用をもたらし、心筋への血液を供給する働きがある（カレント・オピニオン・イン・カルディオロジー（Current Opinion in Cardiology）、１９９５、１０、ｐｐ５７７−５８３）。アデノシンはまた、心拍数低下、心筋収縮力低下、交感神経緊張低下などの抑制性の作用を示し、さらに、好中球や単球からの細胞傷害性物質の遊離を抑制し（バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）、１９９４、４８、ｐｐ２０２５−２０３２；ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology）、１９９４、１５３、ｐｐ４１５９−４１６８）、抗炎症性サイトカインの遊離を促進することが知られている（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology）、１９９６、１５６、ｐｐ４４０８−４４１４）。しかし、アデノシンはトランスポーターを介して急速に細胞内に取り込まれるため、その作用は一過性のものである。ヌクレオシドトランスポーターの阻害剤は、アデノシンの急速な消失を防ぎ、受容体近傍での濃度を高め、その作用を増強することが知られる（カレント・オピニオン・イン・カルディオロジー（Current Opinion in Cardiology）、１９９５、１０、ｐｐ５７７−５８３）。
【０００７】
したがって、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの細胞内取り込みを抑制する物質は、たとえば低酸素下における組織または臓器傷害の予防や治療にも有用といえる。
なお、下記式（１）
【０００８】
【化２】
0004194690.tif 000002
【０００９】
［式中、Ｒ1は式ＯＲまたはＮＲＲ’（ここでＲおよびＲ’は無置換もしくは置換されたＣ1-8のアルキル基を表すか、またはＲとＲ’がそれらの結合する窒素原子と一緒になって無置換もしくは置換された５−７員の異項環を形成する基である）またはＣ1〜Ｃ8のアルコキシ基または環状アミノ基を表し、Ｒ2はシアノ基またはニトロ基を表し、Ｒ3は水素原子またはＣ1〜Ｃ4のアルキル基を表す。］
で表されるフェニルチアゾール誘導体は、強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す化合物群であり、高尿酸血症および痛風の治療薬として用いられる（国際公開ＷＯ９２／０９２７９号パンフレット）。しかし、上記式（１）で表される化合物が、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの取り込みに対してどのような影響を及ぼすかについては知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの生体細胞内への取り込みを抑制する薬剤を提供することである。本発明が解決しようとする課題は、また、細胞増殖阻害剤の作用を増強する薬剤を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる目的の下、上記式（１）で表される化合物が、プリンおよびピリミジンヌクレオシドの取り込みに対していかなる影響を及ぼすかについて研究を行ったところ、所期の作用を有することを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は下記式（１）
【００１２】
【化３】
0004194690.tif 000003
【００１３】
［式中、Ｒ１は式ＯＲまたはＮＲＲ’（ここでＲおよびＲ’はＣ１−８のアルキル基を表すか、またはＲとＲ’がそれらの結合する窒素原子と一緒になって５−７員の異項環を形成する基である）またはＣ１〜Ｃ８のアルコキシ基または環状アミノ基を表し、Ｒ２はシアノ基またはニトロ基を表し、Ｒ３は水素原子またはＣ１〜Ｃ４のアルキル基を表す。］
で表されるフェニルチアゾール誘導体および／またはその塩を有効成分として含有する、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの生体細胞内への取り込みを阻害するための薬剤である。
【００１４】
本発明はまた、上記フェニルチアゾール誘導体および／またはその塩を有効成分として含有する、細胞増殖阻害剤の作用増強剤、ならびに低酸素状態により引き起こされる、組織または臓器の傷害を予防または治療するための薬剤に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
上記式（１）において、Ｒ1は式ＯＲまたはＮＲＲ’（ここでＲおよびＲ’は無置換もしくは置換されたＣ1-8のアルキル基を表すか、またはＲとＲ’がそれらの結合する窒素原子と一緒になって無置換もしくは置換された５−７員の異項環を形成する基である）またはＣ1〜Ｃ8のアルコキシ基または環状アミノ基を表す。かかるＣ1〜Ｃ8の式ＯＲの例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、オクチルオキシ基等が挙げられる。また、かかる式ＮＲＲ’の例としては、ピロリジノ、ピペリジノ、モルフォリノ、ピペラジニル基等が挙げられる。なかでもＲ1としては、Ｃ2〜Ｃ6のアルコキシ基が好ましく、特にイソブトキシ基が好ましい。
【００１６】
また、Ｒ2はシアノ基またはニトロ基を表すが、特にシアノ基が好ましい。
【００１７】
さらに、Ｒ3は水素原子またはＣ1〜Ｃ4のアルキル基を表す。かかるＣ1〜Ｃ4のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル基等が挙げられるが、特に水素原子が好ましい。
【００１８】
これらの有効成分は、公知の方法で適当な賦形剤等を用いて、軟カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤、シロップ剤などの経口剤、注射剤、または外用剤とすることにより使用できる。
【００１９】
かかる賦形剤としては、植物油（例えばトウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、落花生油など）、中鎖脂肪酸グリセリドなどの油状エステル、鉱物油、ワセリン、動物油脂、セルロース誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、デキストリン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、デンプンなどが挙げられる。
【００２０】
有効成分の投与量は、通常０．０１−３００ｍｇ／ｋｇ／日  程度で、好ましくは０．０５−５０ｍｇ／ｋｇ／日  程度であり、投与回数は通常１−３回／日であるので、このような条件を満たすように製剤を調整するのが好ましい。
【００２１】
また、本発明薬剤の安全性については、有効成分として２−（３−シアノ−４−イソブチルオキシフェニル）−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸についてのラットを用いた急性毒性試験を行ったところ、３００ｍｇ／ｋｇまで単回で経口投与しても死亡は全く認められなかった。
【００２２】
本発明薬剤の有効成分である前記式（１）で表される化合物は、例えば国際公開ＷＯ９２／０９２７９号パンフレット記載の方法により合成することができる。
【００２３】
【実施例】
［実施例１］
以下の組成の錠剤を調製した。
２−（３−シアノ−４−イソブチルオキシフェニル）−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸                                      ５０  ｍｇ
ラクトース                                        ２３０  ｍｇ
ポテトスターチ                                      ８０  ｍｇ
ポリビニルピロリドン                                １１  ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                              ５  ｍｇ
全量                                              ３７６  ｍｇ
上記のフェニルチアゾール誘導体、ラクトース、およびポテトスターチをよく混合し、それにポリビニルピロリドンの２０％エタノール溶液を一様に浸透させた。その後、２０のメッシュでろ過し、４５℃で乾燥させ、さらに１５のメッシュでろ過した。このようにしてできた顆粒を、ステアリン酸マグネシウムと混合し、これを打錠して錠剤化した。
【００２４】
［実施例２］
プリンまたはピリミジンヌクレオシドの細胞内取り込みに対する作用を検討するために、肺癌由来細胞株を用いて以下のように、本発明薬剤の有効成分の効果を検討した。
【００２５】
ヒト肺癌由来細胞株、Ａ５４９（ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（The Journal of National Cancer Institute）、１９７３、５１，  ｐｐ１４１７−１４２３）を１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むミニマム・エッセンシャル・メディウム（Minimum Essential Medium （ＭＥＭ））にて、５×１０5cells／ｍＬ  の密度で２４穴のマイクロプレートに１ｍＬを播種し、５％ＣＯ2存在下で一晩培養した。その後上清を除去し、１４５ｍＭ  ＫＣｌ、４．２ｍＭ  ＫＨＣＯ3、０．３６ｍＭ  Ｋ2ＨＣＯ4、  １．３ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．４４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含むメディウムで洗浄し、実験に用いた。
【００２６】
一晩培養した後、メディウムを吸引し、細胞を血清不含メディウムにて２回洗浄した。その後、プリンヌクレオシドのイノシン（８０μＭ）またはピリミジンヌクレオシドのウリジン（８０μＭ）を含むメディウム１ｍＬを加え、有効成分の２−（３−シアノ−４−イソブチルオキシフェニル）−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸（１６μＭ）または、他のキサンチンオキシダーゼ阻害剤であり、高尿酸血症および痛風の治療薬であるアロプリノール（１５０μＭ）の存在下、非存在下にて培養し、１．５、５、および８時間後に５０μＬの上清を得、イノシンを添加した場合は、上清中のヒポキサンチンおよびイノシン濃度を、ウリジンを添加した場合は、上清中のウラシルおよびウリジン濃度を、それぞれＨＰＬＣにて測定した。
【００２７】
ウリジンの取り込みについては、さらにＫｉ値を求めるため、以下の検討をした。試験は室温（２４〜２６℃）にて行った。ウリジンの取り込みは、上記メディウムの、１４５ｍＭ  ＫＣｌ、４．２ｍＭ  ＫＨＣＯ3を１４０ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＨＣｌ）および５ｍＭ  ＫＣｌに変更し、［3Ｈ］ウリジン（１０μＣｉ／ｍＬ）を最終濃度１５、２０、または２５μＭとなるよう加えたものそれぞれ０．２ｍＬを、有効成分の２−（３−シアノ−４−イソブチルオキシフェニル）−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸を最終濃度２、４、６、８、または１０μＭを添加した培養液中に加えて開始した。１．５、５、８時間後にメディウムを吸引し、氷冷した１ｍＬのＮａ不含メディウムにて細胞を３回洗浄し、取り込みを終了させた。その後、０．２  ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨを添加して細胞を融解し、放射活性を測定した。
【００２８】
図１に、イノシンを加えた場合の上清中イノシン濃度の測定結果を示した。これによると、培養液中にイノシンのみを加えた場合、上清中のイノシン濃度は経時的に低下した。これは、ヌクレオシドトランスポーターを介してＡ５４９細胞にイノシンが取り込まれたことを示す。これに対して、本発明薬剤の有効成分を添加したものは、上清中のイノシン濃度の低下は抑制された。このことは、本発明薬剤の有効成分によって、プリンヌクレオシドであるイノシンの細胞内取り込みが阻害されたことを示す。ウリジンを加えた場合にも同様であり、ピリミジンヌクレオシドであるウリジンによって、競合的にイノシンの取り込みが阻害されたことが示された。しかし、アロプリノールは、イノシン濃度の低下に影響を与えず、プリンヌクレオシドの取り込みに影響のないことが示された。
【００２９】
図２に、イノシンを加えた場合の上清中ヒポキサンチン濃度の測定結果を示した。これによると、培養液中にイノシンのみを加えた場合、上清中のヒポキサンチン濃度は経時的に増加した。これは、ヌクレオシドトランスポーターを介してＡ５４９細胞に取り込まれたイノシンが、細胞内でプリンヌクレオシドホスホリラーゼによってヒポキサンチンに変換し、それが細胞外培養液中に漏出したことを示す。これに対して、本発明薬剤の有効成分を添加したものは、上清中のヒポキサンチン濃度の増加は抑制された。ウリジンを加えた場合にも、同様にヒポキサンチン濃度の増加の抑制が見られた。しかし、アロプリノールは、ヒポキサンチン濃度の増加に影響を与えなかった。
【００３０】
図３に、ウリジンを加えた場合の上清中ウリジン濃度の測定結果を示した。これによると、培養液中にウリジンのみを加えた場合、上清中のウリジン濃度は経時的に低下した。これは、ヌクレオシドトランスポーターを介してＡ５４９細胞にウリジンが取り込まれたことを示す。これに対して、本発明薬剤の有効成分を添加したものは、上清中のウリジン濃度の低下は抑制された。このことは、本発明薬剤の有効成分によって、ピリミジンヌクレオシドであるウリジンの細胞内取り込みが阻害されたことを示す。イノシンを加えた場合にも同様であり、プリンヌクレオシドであるイノシンによって、競合的にウリジンの取り込みが阻害されたことが示された。しかし、アロプリノールは、ウリジン濃度の低下に影響を与えず、ピリミジンヌクレオシドの取り込みに影響のないことが示された。
【００３１】
図４に、ウリジンを加えた場合の上清中ウラシル濃度の測定結果を示した。培養液中にウリジンのみを加えた場合、上清中のウラシル濃度は経時的に増加した。これは、ヌクレオシドトランスポーターを介してＡ５４９細胞に取り込まれたウリジンが、細胞内でウリジンホスホリラーゼによってウラシルに変換し、それが細胞外培養液中に漏出したことを示す。これに対して、本発明薬剤の有効成分を添加したものは、上清中のウラシル濃度の増加は抑制された。イノシンを加えた場合にも、同様にウラシル濃度の増加の抑制が見られた。しかし、アロプリノールは、ウラシル濃度の増加に影響を与えなかった。
【００３２】
図５にウリジンの取り込み阻害に関してディクソンプロットを行った結果を示す。本発明薬剤は、非拮抗型の阻害を示し、Ｋｉ値は４．１μＭであった。
【００３３】
［実施例３］
プリンヌクレオシドであるアデノシンは、アデノシン受容体を介して単球からの炎症性物質の遊離を抑制し（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology）、１９９４、１５３、ｐｐ４１５９−４１６８）、抗炎症性サイトカインの遊離を促進することが知られ（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology）、１９９６、１５６、ｐｐ４４０８−４４１４）、ヌクレオシドトランスポーターの阻害剤は、アデノシンの急速な消失を防ぎ、受容体近傍での濃度を高め、それらの作用を増強することが期待される。
【００３４】
そこで、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）と、抗炎症性サイトカインであるインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生に対する作用を検討するために、ラットを用いて以下のようにサイトカイン産生モデルを作製し、本発明薬剤の有効成分の効果を検討した。
【００３５】
ウィスター系ラット（オス、８週齢）にリポポリサッカライド（ＬＰＳ、１０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈より投与し、その１時間後、エーテル麻酔下にて眼窩静脈叢より採血を行った。
【００３６】
採取した血液から血清を遠心分離した後、血清中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０を酵素免疫測定法にて測定した。
【００３７】
有効成分の２−（３−シアノ−４−イソブチルオキシフェニル）−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸を０．５％メチルセルロース水溶液に懸濁し、ＬＰＳ投与の１時間前に、１、１０、および１００ｍｇ／ｋｇ／５ｍｌの用量で経口投与した。対照群には溶媒である０．５％メチルセルロース水溶液を５ｍｌ／ｋｇの容量で経口投与した。また、陽性対照群として既知のヌクレオシド取り込み阻害剤であるジピリダモールを０．５％メチルセルロース水溶液に懸濁し、３００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。
【００３８】
各群の例数は、対照群が７、薬物投与群が８、また正常動物である無処置群は４であった。得られた結果を各群につき平均値±標準偏差で表した。ここで、対照群との有意差検定は、Dunnettの多重比較検定またはStudentのｔ−検定により行った。
【００３９】
図６に血清ＴＮＦ−αの測定結果を示した。これによると、対照群のラットの血清ＴＮＦ−αは１６．７±４．３ｎｇ／ｍｌと、無処置群（６．４±１２．７ｐｇ／ｍｌ）と比較して明らかに高値を示した。これに対して、本発明薬剤の有効成分を投与したものは、血清ＴＮＦ−αの増加が有意に抑制されていた（１０ｍｇ／ｋｇ：７．５±４．０ｎｇ／ｍｌ；１００ｍｇ／ｋｇ：６．６±３．４ｎｇ／ｍｌ）。また、陽性対照のジピリダモール群も、血清ＴＮＦ−αの増加が有意に抑制された（６．４±４．７ｎｇ／ｍｌ）。
【００４０】
図７に血清ＩＬ−１０の測定結果を示した。これによると、対照群のラットの血清ＩＬ−１０は２．６±０．４ｎｇ／ｍｌと、無処置群（検出されず）と比較して明らかに高値を示した。これに対して、本発明薬剤の有効成分を投与したものの血清ＩＬ−１０は、更に有意に増加していた（１００ｍｇ／ｋｇ：３．２±０．２ｎｇ／ｍｌ）。また、陽性対照のジピリダモール群も、血清ＩＬ−１０の増加が有意に増強された（３．６±０．４ｎｇ／ｍｌ）。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、プリンまたはピリミジンヌクレオシドの生体細胞内への取り込みを抑制する薬剤が提供される。また、本発明によれば、細胞増殖阻害剤の作用を増強する薬剤が提供される。さらに本発明によれば、血清ＴＮＦ−α産生を抑制し、血清ＩＬ−１０産生を増強する薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】イノシンを加えた場合の上清中イノシン濃度の測定結果。
【図２】イノシンを加えた場合の上清中ヒポキサンチン濃度の測定結果。
【図３】ウリジンを加えた場合の上清中ウリジン濃度の測定結果
【図４】ウリジンを加えた場合の上清中ウラシル濃度の測定結果
【図５】ウリジンの取り込み阻害に関してディクソンプロットを行った結果
【図６】ラット血清中ＴＮＦ−α濃度の測定結果
【図７】ラット血清中ＩＬ−１０濃度の測定結果
【図１】
0004194690.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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