(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−リベチン溶液を６０℃〜７０℃で、１０〜３０分加熱する反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを主構成成分とする水溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【請求項２】
γ−リベチン溶液濃度が１〜５０ｍｇ／ｍｌ未満であり、且つ反応生成物から水不溶成分を取り除くことを特徴とする請求項１記載の水溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【請求項３】
加熱反応の後、γ−リベチンの活性が９０％以上残存することを特徴とする請求項１又は２記載の水溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶性γ−リベチン複合体の製造法に関する。更に詳しくは、従来の免疫反応性を高めた可溶性γ−リベチン複合体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のγ−リベチンは抗原結合部位が１箇所しか存在しないため分子間架橋が作りにくく、検査薬として使用する際、測定する抗原の種類によっては満足する沈降反応が得られない欠点があった。
架橋を作りやすくする方法として、１．５Ｍの塩化ナトリウムを添加する事が開示されている（大谷、日本畜産学会北陸支部会報、57、p16-25(1988)）。この方法は、１．５Ｍの塩化ナトリウム存在下ではγ−リベチンは２量体として存在することにより４価となり格子を作りやすく、沈降反応の判定が行いやすくなる性質を利用したものであるが、大量の塩化ナトリウムを必要とする為、測定する抗原の種類によっては沈降反応判定を困難とする欠点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明は、高い凝集反応性を有する可溶性γ−リベチン複合体の製造法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、γ−リベチンに不可逆な反応を施すことにより高い凝集反応性を有する可溶性複合体が得られることを見い出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、不可逆反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを主構成成分とする可溶性γ−リベチン複合体の製造法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明における不可逆な反応とは、γ−リベチン間もしくはγ−リベチンと夾雑する蛋白質との間における共有結合を形成する反応のことをいい、少なくともγ−リベチンが２分子以上共有結合する反応のことをいう。特に限定するものではないが、共有結合を判定する方法として例えばSDS-PAGE法が挙げられる。本発明の可溶性γ−リベチン複合体はこの方法において測定される分子量が360kDa以上の蛋白質複合体である。高塩濃度下で生じるγ−リベチン同士の二量体や塩析物である多重合体は疎水結合又はイオン結合でありSDS-PAGEでは単量体として存在するものであり、本発明の可溶性γ−リベチン複合体とは異なる。
本発明における不可逆反応法は、特に限定するものではないが加熱反応法、超高圧反応法、還元剤を用いた反応法が挙げられ、好ましくは加熱反応法である。
加熱反応法における加熱条件は、γ−リベチンの活性が９０％以上残存する条件が選ばれる。具体的にはγ−リベチン含有溶液を６０〜８０℃、１０〜１２０分間加熱することが好ましく、その際のγ−リベチン含有溶液の濃度は、１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度が好ましい。更に好ましくは、５ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌの濃度が好ましい。濃度が１ｍｇ／ｍｌより低いと可溶性複合体を形成しにくくなり、又５０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度ではγ−リベチンが不溶性の凝集体の割合が多くなってしまう。
【０００６】
本発明における加熱処理前のγ−リベチン含有溶液のpHは、ｐＨ５．０からｐＨ１１．０が好ましく、さらに好ましくは、ｐＨ７．０からｐＨ９．０である。ｐＨがｐＨ５．０より酸性側、又はｐＨ１１．０よりアルカリ性側に傾くとγ−リベチンの持つ活性が失活する恐れがある。
本発明において主構成成分とは、γ−リベチン複合体中に占めるγ−リベチンの割合が５０％以上を占める事を言う。
本発明において可溶性とは、水に対する溶解性を言う。
本発明の可溶性のγ−リベチン複合体はさらに精製して使用してもよく、その精製法としては、特に限定するものではないが膜分離法、塩析法、クロマトグラフィー法、超遠心法等が挙げられ、特に、膜分離法、塩析法は好適に使用できる。
【０００７】
膜分離法とは、特に限定するものではないが限外濾過膜、精密濾過膜、逆浸透膜もしくは濾紙、濾板、ガラスフィルターより選ばれた１種類以上の膜を使用して分離する方法が挙げられ、特に限外濾過膜は好適に使用できる。
また塩析法に使用する塩とはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2 、ＭｇＣｌ2 、ＮａＨ2 ＰＯ4 、Ｎａ2 ＨＰＯ4 、Ｎａ2 ＳＯ4 、（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、ＭｇＳＯ4 より選ばれる１種又は２種以上の塩であり、濃度はそれぞれの塩の種類によっても異なるが２〜１２％が好ましく、更に好ましくは５〜１０％、最も好ましくは８〜１０％である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、これらによって発明を制限するものではない。
【０００８】
【実施例】
実施例１
抗S.mutans  γ−リベチン含有卵黄水溶性蛋白質溶液の調製
特定抗原として、ストレプトコッカス・ミュータンス  MT8148（以下S.mutansという）菌体を含む菌溶液(CFU 108）を調製し、産卵鶏を免疫した。得られた卵より卵黄を分離し均質化した溶液を卵黄液とした。
得られた卵黄液１ｋｇに対し１ｋｇの水を加え均質化し、そこに０．１５％のλ−カラギーナン水溶液を４ｋｇ加え撹拌した。静置後、吸引濾過を行い濾液を分取した。このとき得られた濾液を卵黄水溶性蛋白質溶液とした。
【０００９】
実施例２
抗S.mutans  γ−リベチン含有粉末の調製
実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１Ｌに硫酸ナトリウム  １５０ｇを少しずつ加え溶解した後、３０分間静置し遠心（常温、8000rpm ×15分間）する。上清を捨て、沈殿物に１０ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー２００ｍｌを加え溶解する。得られた溶液を用い上記同様の方法にて再度塩析法を行った。本溶液を１０ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファーを用い一晩透析を行う。得られた溶液を凍結乾燥し、特異的γ−リベチン含有粉末を得た。
得られた粉末は、ゲル濾過法（”蛋白質Ｉ”、日本生化学会編、第11章、東京化学同人(1990)）により全蛋白質に対するγ−リベチンの割合が９０％以上であることを確認した。
【００１０】
実施例３
可溶性抗S.mutans  γ−リベチン複合体の調製
実施例２で得られた抗S.mutansγ−リベチン含有粉末を純水を用い１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。調製した溶液２００ｍｌを耐熱性の容器に封入し７０℃の恒温層にて３０分間加熱し可溶性の複合体とγ−リベチン単体の混合溶液を得た。この混合溶液を膜分離法（日本ポール：500kDa cut off）によるダイアフィルトレーション法を用いてγ−リベチン単量体を分離し、可溶性γ−リベチン複合体を凍結乾燥機にて乾燥させ粉末を得た。
【００１１】
試験例１
特異的γ−リベチン複合体の不可逆反応の確認
実施例３で得られた粉末を用いSDS-PAGEにて泳動させ、本複合体の結合様式を確認した。
使用したポリアクリルアミドゲルはパジェル（ AE-6000 NPG-310L ：アトー株式会社)(分画分子量40〜500kDa）を用い泳動を行った。泳動サンプルは実施例３又は４で得られた粉末を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かし本溶液５μｌをゲルにアプライした。
その結果実施例３又は４で得られたサンプルは、ほとんど泳動されず上端部分で止っていた。このことより本サンプルは共有的な結合を有し、もとの単量体には戻ることのない５００ｋＤａ以上の蛋白質であることが確認された。
【００１２】
試験例２
特異抗体活性回収率の比較
実施例３により得られた特異的γ−リベチン複合体粉末のS.mutansに対する特異的抗体力価を、酵素免疫測定法（以下 ELISA法という）により測定し特異抗体活性回収率の比較を行った。各試料液を１００μｌ／ウエルの割合で、抗原として用いたS.mutansを固相へコーティングした ELISAプレート（９６穴, ヌンク社製）へ添加し、２５℃、２時間静置することにより、抗原と特異的抗体の反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、抗ニワトリＩｇＧウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ザイメット社）のPBS-Tween 希釈液（2000倍）を１００μｌ／ウエルの割合で添加した。２５℃で１時間放置することにより、抗原と反応した特異的抗体と上記コンジュゲートの反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、０．１％  Ｐ−フェニルジソジウムホスフェート溶液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６に溶解）を基質として１００μｌ／ウエルの割合で添加し、２５℃、１５分間酵素反応を行った。反応の停止は２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を50μl ／ウエル添加することにより行い、４０５ｎｍにおける各ウエルの吸光度をプレートリーダーにより測定した。
なお、対照としては試料の代わりにPBS-Tween を用いた。各試料につき、４ウエルを用いた。各試料の示す吸光度の平均値から対照の示す吸光度を引き、それぞれの試料重量を乗じた値（総吸光度）を各試料の総抗体活性とした。
総抗体活性を測定した結果、実施例２により得られた特異的γ−リベチン粉末と実施例３により得られた特異的γ−リベチン複合体粉末を比較すると、特異的γ−リベチン粉末を１００％として特異的γ−リベチン複合体粉末は約９０％抗体活性回収率が得られた。
【００１３】
実施例４
可溶性特異的γ−リベチン複合体のSRID法への応用
ヒト口腔内に存在するS.mutans菌量を定量する手段としてSRID（一元放射免疫拡散）法（G.Mancini et al., Immunochemistry , 2 , 235 （1965) ）を用いた。
人ボランティアを募り純水にて口腔内を洗浄した。この口腔内の洗浄液を測定サンプルとした。測定用のプレートとして、実施例２で得られた抗S.mutans  γ−リベチンを１％加えた２％寒天プレート（プレートＡ）、プレートＡに１．５Ｍになるように塩化ナトリウムを添加したプレート（プレートＢ）及び実施例４で得られた可溶性の抗S.mutans  γ−リベチン複合体を用いプレートＡと同様に調製した（プレートＣ）上にできる沈降輪の大きさから菌量を求めることを試みた。
その結果、プレートＡ，Ｂ上にできた沈降輪は不明瞭であり、菌量を求めることはできなかったのに対しプレートＣ上にできた沈降輪は明瞭であり、この大きさよりγ−リベチン濃度を求め、その値に溶液の体積量を乗じてS.mutans菌量を求めることができた。
このことより、従来SRID法では沈降輪がはっきりしないことから測定することが困難であった抗原も測定が可能になった。
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
【００１４】
（１）不可逆な反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを主構成成分とする可溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（２）不可逆な反応が加熱処理である前記１記載の可溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（３）加熱反応が６０〜８０℃、１０〜１２０分、γ−リベチン溶液濃度が１〜５０ｍｇ／ｍｌ未満であり、且つ反応生成物から不溶成分を取り除くことを特徴とする前記１記載の可溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（４）不可逆な反応が超高圧処理である前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
【００１５】
（５）不可逆な反応が還元剤を用いることを特徴とする前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
（６）２量体以上の可溶性γ−リベチン複合体を膜を使って精製することを特徴とする前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
（７）膜が限外濾過膜、精密濾過膜、逆浸透膜であることを特徴とする前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
（８）２量体以上の可溶性γ−リベチン複合体を塩を使って精製することを特徴とする前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
【００１６】
（９）塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2 、ＭｇＣｌ2 、ＮａＨ2 ＰＯ4 、Ｎａ2 ＨＰＯ4 、Ｎａ2 ＳＯ4 、（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、ＭｇＳＯ4 より選ばれる１種又は２種以上を１０％以下添加して精製することを特徴とする請求項４記載の分子量が５００ｋＤａより大きいγ−リベチン複合体ならびにその分離法。
（１０）２量体以上の可溶性γ−リベチン複合体をクロマトグラフィー法を使って精製することを特徴とする前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
【００１７】
【発明の効果】
本発明は、γ−リベチンを不可逆な反応を使って可溶性の複合体にすることにより、従来のγ−リベチンが持つ機能を飛躍的に高める効果があり、更にγ−リベチンの応用範囲を広げ産業上への貢献も大である。