(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略してヒアルロン酸（塩）という）の水溶液に、ヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素を添加して温度５℃〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解した後、分画分子量１万以下の限外ろ過膜を用いて分解酵素と分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩を分離し、該オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液に、０．３モル／リットル以上になるように塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加し、その後オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液の５〜１０倍容量の、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール及びアセトンのなかから選ばれる少なくとも一種以上に、該オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液を添加して晶析し、分画分子量１万以下の限外ろ過膜で分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩より分離したヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素を繰り返し使用することを特徴とする高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【請求項２】
ヒアルロン酸（塩）が微生物が産出したヒアルロン酸（塩）もしくは動物の生体より抽出したヒアルロン酸（塩）である請求項１記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【請求項３】
ヒアルロン酸（塩）を産出する微生物がストレプトコッカス属のストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ (Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae)もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)である請求項２記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【請求項４】
ヒアルロン酸分解能を有する酵素が、ヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）およびヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）から選ばれる１種以上である請求項１記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【０００１】
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、化粧品、食品等に広範囲に利用されるオリゴヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略称してオリゴヒアルロン酸（塩）という）をヒアルロン酸分解能を有する酵素を用いることでより簡便に、かつ迅速に製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略称してヒアルロン酸（塩）という）の製造は工業的には、主ににわとりのとさかから抽出する方法（抽出法）もしくはヒアルロン酸生産能を有する微生物を培地に培養して該培養液より採取する方法（発酵法）により行われている。得られるヒアルロン酸（塩）の分子量は数百万から１万以下に至るまで種々のヒアルロン酸（塩）が製造されている。
近年、低分子量ヒアルロン酸（塩）については従来の分子量の物に比べ高濃度で使用でき、ベトツキ感がないなどの特性を有することが明らかとなり、また、糖の重合度で１０〜１４糖の低分子量ヒアルロン酸（塩）に血管形成促進作用があることが報告されている。このため低分子量ヒアルロン酸（塩）特にここでいう平均分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）の需要の増大が期待されている。
【０００３】
該低分子量ヒアルロン酸（塩）の製造法としては、ヒアルロン酸分解酵素を用いる方法（特開昭６２−７９７９０公報）、酸、アルカリを用いる方法（特開昭６３−５７６０２公報、特開平１−２６６１０２公報）や次亜塩素酸などの酸化剤を用いる方法（特開平２−２４５１９３公報）が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヒアルロン酸分解酵素を用いる場合、その酵素が高価格のため製造コストが高くなり、また、生成物より該分解酵素を除去する操作が煩雑であり、さらに反応制御が大変難しい。酸、アルカリを使用する方法では、工業的には安価に処理できるものの平均分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）を製造する場合、過激な条件で尚かつ長時間の処理が必要であり、変色も発生する。また、次亜塩素酸などの酸化剤を用いる方法ではヒアルロン酸（塩）を酸化的に分解するためにヒアルロン酸（塩）の還元末端及び非還元末端に加水分解反応では発生しない新たな化学構造の末端が生成し、医薬、化粧品、食品に使用する場合、問題となる。
【０００５】
本発明者らはかかる従来法の問題点を解決すべく鋭意研究した。その結果、ヒアルロン酸（塩）の水溶液に、ヒアルロン酸（塩）分解能を有する分解酵素を添加し、５〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解したのち、分画分子量１万以下の限外ろ過膜に供することにより、該分解酵素と該分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）水溶液とを分離したのち、該オリゴヒアルロン酸水溶液を、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール及びアセトンのなかから選ばれる少なくとも一種以上の貧溶媒を用いて晶析することにより高純度のオリゴヒアルロン酸（塩）が得られることを見い出し、この知見に基づき、本発明を完成した。  以上の記述から、明かなように、本発明の目的は、簡単かつ安価に分子量１万以下の高純度オリゴヒアルロン酸（塩）を製造する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
（１）ヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略してヒアルロン酸（塩）という）の水溶液に、該ヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素を添加して温度５℃〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解した後、分画分子量１万以下の限外ろ過膜を用いて分解酵素と分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩を分離し、該オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液に、０．３モル／リットル以上になるように塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加し、その後オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液の５〜１０倍容量の、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール及びアセトンのなかから選ばれる少なくとも一種以上に、該オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液を添加して晶析し、分画分子量１万以下の限外ろ過膜で分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩より分離したヒアルロン酸（塩）の分解能を有する酵素を繰り返し使用することを特徴とする高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（２）ヒアルロン酸（塩）が微生物が産出したヒアルロン酸（塩）もしくは動物の生体より抽出したヒアルロン酸（塩）である前記第１項記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（３）ヒアルロン酸（塩）を産出する微生物がストレプトコッカス属のストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ (Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae）もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)である前記第２項記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（４）ヒアルロン酸分解能を有する酵素が、ヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）およびヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）から選ばれる１種以上である前記第１項記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【０００７】
本発明でオリゴヒアルロン酸（塩）とはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析による平均分子量が１万以下のヒアルロン酸（塩）をいう。
該ＨＰＬＣによる平均分子量の測定はカラム（Shodx Ionpak KS806およびIonpak KS-G）を用いた。溶出液として０．２モル／リットルの塩化ナトリウム水溶液を用い、流速１．０ミリリットル／分で流した。検出は２０６ｎｍで行った。平均分子量は分子量既知のヒアルロン酸ナトリウムで作製した検量線より計算した。
【０００８】
本発明に使用するヒアルロン酸（塩）は、ヒアルロン酸生産菌により発酵生産され、精製されたヒアルロン酸（塩）もしくはニワトリの鶏冠などの動物組織より抽出、精製されたヒアルロン酸（塩）の水溶液を用いる。もちろん一度粉末としたヒアルロン酸（塩）を用いても差し支えない。水溶液としたヒアルロン酸（塩）にヒアルロン酸分解能を有する酵素、たとえばヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）およびヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）の少なくとも１種以上を、ヒアルロン酸ナトリウム量に対して１／５００〜１倍量添加後、温度５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で３０分以上、好ましくは６時間以上分解した後、分画分子量１万以下の限外ろ過膜を用いて平均分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）とヒアルロン酸分解能を有する酵素を分離する。分離されたオリゴヒアルロン酸（塩）へ塩濃度が０．１モル／リットル以上に好ましくは０．２〜０．４モル／リットルになるように塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加後、１０℃以下まで冷却し、その５〜１０倍容量、好ましくは７倍容量の１０℃以下に冷却したエタノール、メタノール、イソプロピルアルコールもしくはアセトンの少なくとも一種以上の貧溶媒に添加して晶析することにより、高純度のオリゴヒアルロン酸が得られる。 一方、分離されたヒアルロン酸分解能を有する酵素は溶液の状態で低温で冷蔵保存し、繰り返し使用することができる。
【０００９】
本発明に使用するヒアルロン酸生産菌としてはストレプトコッカス属、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Strepto-   coccus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcuszooepidemicus)等を挙げることができる。
【００１０】
以下の説明で％は重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％をいう。
本発明に用いる培地はヒアルロン酸生産菌を培養するのに通常、用いられる培地を用いればよく、例えばグルコース３．０％、酵母エキス１．０％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分でｐＨ６．０〜８．５に調整されたものを用いることができる。
【００１１】
本発明の培養では通気撹拌培養でも振トウ培養のいずれを用いてもよく培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３８℃にて培養する。培養は２０〜７０時間を要し、培養液の粘度上昇がみられなくなった時点で停止する。
【００１２】
本発明の精製では培養液から遠心分離もしくは加圧ろ過にて菌体をろ過し、限外ろ過膜にてろ過液より不純物を透析除去したものも用いることができる。
【００１３】
【実施例】
以下にその実施例を示す。
なお、ヒアルロン酸（塩）の純度測定は化粧品種別配合規格（ヒアルロン酸ナトリウム（２））記載のグルクロン酸定量法に従った。また、ここでいう高純度とはグルクロン酸含有量で４０．０〜５０．０重量％のものをいう。
なお、実施例および比較例で用いた％とは、断らない限り重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％を意味する。
【００１４】
実施例１
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０リットルに溶解し、３７℃でヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３５）１０ｇを添加、溶解し、攪拌を続ける。６時間後、分画分子量６０００の限外ろ過膜（旭化成製、SIP1013）に通し、ヒアルロン酸分解酵素よりオリゴヒアルロン酸を分離する。分離されたオリゴヒアルロン酸水溶液に、塩化ナトリウムを０．３モル／リットルになるように添加、溶解後、１０℃まで冷却し、その溶液をその７倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加して晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、９２ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウムを得た。
この操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で５３００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５％以上であった。使用した酵素を２ヶ月冷蔵保存した後同様な操作で処理し得られたオリゴヒアルロン酸（塩）の平均分子量は６３００であった。純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。
【００１５】
比較例１
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０リットルに溶解し３７℃でヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３５）１０ｇ添加溶解し、攪拌を続ける。６時間後１００℃で６分間煮沸する。室温まで冷却後、発生したヒアルロノグルコサミニダーゼの変成物をろ過除去し、ろ過液に塩化ナトリウムを０．３モル／リットルになるように添加溶解後、活性炭白鷺A50W(武田薬品工業製）１５０ｇを添加し１時間撹拌する。活性炭をろ過除去し、１０℃まで冷却する。その水溶液をその７倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、８７ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウムを得た。
この操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で７８００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。反応に使用したあとのヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素はその分解能を喪失してしまい、繰り返し使用することはできなかった。
【００１６】
比較例２
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．１規定塩酸水溶液２０リットルに溶解し４５℃で２４時間撹拌する。その後、６規定の苛性ソーダ水にて中和した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルになるように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液をその３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、６５ｇヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作で得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で６３０００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。
【００１７】
比較例３
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．１規定苛性ソーダ水溶液２０リットルに溶解し４５℃で２４時間撹拌する。その後、６規定の塩酸にて中和した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルになるように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液をその３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、６０ｇのヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作で得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で５５０００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、ヒアルロン酸（塩）水溶液をヒアルロン酸分解能を有する酵素で分解し、限外ろ過膜でその酵素とオリゴヒアルロン酸（塩）を分離することにより、従来に比べ遥かに単純な工程でかつ安価に純度の高いオリゴヒアルロン酸（塩）を容易に製造することができる。