(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロンまたはグリア特性を有する精製前駆細胞の産出方法であって、
（ａ）ＥＳ細胞を増殖させること、
（ｂ）（ａ）からのＥＳ細胞を培養して神経前駆細胞にすること、
（ｃ）増殖因子含有無血清培地で該神経前駆細胞を増殖させること（ここで、増殖因子含有無血清培地はｂＦＧＦを含む）、
（ｄ）（ｃ）からの神経前駆細胞を他の増殖因子含有無血清培地で増殖させること（ここで、他の増殖因子含有無血清培地はｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む）、および精製神経前駆細胞を単離すること、ならびに
（ｅ）（ｄ）からの神経前駆細胞を他の増殖因子含有無血清培地で増殖させること（ここで、他の増殖因子含有無血清培地はｂＦＧＦおよびＰＤＧＦを含む）、およびニューロンまたはグリア特性を有する精製前駆細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）におけるＥＳ細胞を細胞集合体、特に胚様体へ増殖させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
ニューロンまたはグリア特性を有する精製前駆細胞の産出方法であって、
（ａ’）ＥＳ細胞を増殖させること、
（ｂ’）（ａ’）からのＥＳ細胞を培養して神経前駆細胞にすること、
（ｃ’）増殖因子含有無血清培地で該神経前駆細胞を増殖させること（ここで、増殖因子含有無血清培地はｂＦＧＦを含む）、
（ｄ’）（ｃ’）からの神経前駆細胞を他の増殖因子含有無血清培地でニューロンおよびグリア分化能を有する神経球へ増殖させること（ここで、他の増殖因子含有無血清培地はｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む）、および該神経球を単離すること、ならびに
（ｅ’）（ｄ’）からの神経球がグリア前駆細胞の単層を生ずるまで該神経球を増殖因子含有無血清培地で増殖させること（ここで、増殖因子含有無血清培地はｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む）、およびグリア特性を有する該精製前駆細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項４】
工程（ａ’）におけるＥＳ細胞を細胞集合体、特に胚様体へ増殖させる請求項３記載の方法。
【請求項５】
さらに、以下の工程：
（ｆ’）工程（ｅ’）からのグリア前駆細胞をｂＦＧＦおよび／またはＥＧＦ含有無血清培地中にて星状細胞またはオリゴデンドログリアとなる方向に向けて分化操作すること、および星状細胞またはオリゴデンドログリア特性を有する前駆細胞を単離すること
を含む請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
工程（ｆ’）における培地がさらにＣＮＴＦまたはＴ３を含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
操作を細胞分離およびセル・ソーティング技術と組み合わせる請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
精製前駆細胞を注射に適した培地に懸濁させる請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、単離され精製された胚性幹細胞由来の神経前駆細胞、無制限な量のかかる前駆細胞の生成、ならびにＩ）特に哺乳動物における、好ましくはヒトにおける神経性欠陥の治療、およびＩＩ）ポリペプチドの生成、のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
哺乳動物神経系中への神経細胞の移植は、多くの神経学的疾患の治療に対する将来性のある方法である。動物を用いた研究において、種々の細胞集団が脳および脊髄中に移植されている（Molecular and Cellular Approaches to the Treatment of Neurological Disease, Raven Press, New York, 1993中Bjorklund執筆部分; Brustle & McKay, Curr. Opinion Neurobiol. 6: 688-695, 1996）。最近、神経移植が選択された疾病の臨床的治療、例えば、パーキンソン病患者の治療に適用されている（Neural transplantation in Parkinson's disease, Raven Press, New York, 1984中Lindvall執筆部分; Olanow et al., TINS 19: 102-109, 1996）。
【０００３】
多くの他の器官とは対照的に、成熟した哺乳動物神経系は非常に限定された再性能しか示さない。このことは、数少ない例外はあるが、神経組織の発生に必要とされる前駆細胞が神経系の発達に限定されているという事実による。前駆細胞の利用可能性は、成熟神経系における欠陥の移植による修復にとり重要不可欠である。よって、神経移植のためのドナー細胞は、胚の脳由来のものが大部分である。例えば、パーキンソン病個体に対する移植に十分量のドナー組織を得るためには７個までの胚に由来する脳組織が必要である。このことは大きな道徳上の問題を生じ、多くの患者の治療にかかるアプローチを使用できるかどうかについては疑問がある。
【０００４】
最近、移植前の前駆細胞のインビトロでの増殖により、哺乳動物胚性脳細胞の限られた利用可能性に側道をつけるための多くの研究がなされている。２つの主要な方法が用いられた。１の方法は、腫瘍遺伝子を用いる前駆細胞の不死化である。このアプローチに用いられる遺伝子の大部分は起源的に腫瘍組織から単離されたものである。これらの「腫瘍遺伝子」は細胞ゲノム中に挿入され、連続的で誤制御される増殖を誘発する（Lendahl & McKay, TINS 13: 132-137, 1990）。
【０００５】
より最近のうまく制御されるこの方法の変法には温度感受性腫瘍遺伝子が使用される。このアプローチは「許容」温度におけるインビトロでの細胞増殖を可能にする。体温と等しい非許容温度を選択し、遺伝子産物を不安定化させ、移植後の増殖を停止させる（Renfranz et al., Cell 66: 713-729, 1991）。しかしながら、腫瘍遺伝子は移植された細胞中に残存しており、その後の低い活性または再活性化を完全になくすことはできない。より新しい方法は、分子生物学的道具を用いて増殖フェーズの完了後に腫瘍遺伝子を除去することを目的としている（Westerman & Leboulch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8971-8976, 1996）。すべての細胞系と同様に、腫瘍遺伝子−不死化前駆細胞は染色体異常に対して高い感受性を示す。
【０００６】
移植前に前駆細胞をインビトロで増殖させるためのもう１つの方法は、成長因子を用いる増殖の刺激である（Cattano & McKay, Nature 347: 762-765, 1990; Reynolds & Weiss, Science 255: 1707-1710, 1992; Richards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8591-8595, 1992; Ray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3602-3606, 1993; Kilpatrick & Bartlett, Neuron 10: 255-265, 1993; Ray & Gage, J. Neurosci. 6: 3548-3564, 1994; Davis & Temple, Nature 372: 263-266, 1994; Vicario-Abejon et al., Neuron 15: 105-114, 1995; Gosh & Greenberg, Neuron 15: 89-103, 1995; Gritti et al., J. Neurosci. 16: 1091-1100, 1996）。どの程度まで成長因子が神経前駆細胞の増殖を可能にするのかは現在不明である。成長因子で処理した細胞を用いた最初の移植の研究は議論の余地のある結果を示した。幾人かの科学者は、これらの細胞が宿主組織中に取り込まれる能力が低下していることを観察しているが（Svendsen et al., Exp. Neurol. 137: 376-388, 1996）、成長因子で処理された細胞はレシピエントの脳中に取り込まれうることを示唆する研究がある（Gage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11879-11883, 1995）。
【０００７】
要約すれば、宿主神経系中に移植された後の、成長因子により媒介される神経前駆細胞の増殖およびこれらの増殖した細胞の生物学的挙動の増加オーダーは現在不明である。腫瘍遺伝子により媒介される細胞増殖法は、染色体異常および潜在的な腫瘍誘発の危険性が高い。これらの方法の最も重大な欠点は、脳組織の利用可能性に依存しており、その大部分が胚ドナー由来のものであるということである。
【０００８】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は移植用ドナー細胞の生成について全く新しい見通しを有するものである。ＥＳ細胞はマウスのものが１９８１年に初めて記載された（Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638, 1981; Evans & Kaufman, Nature 292: 154-156, 1981）。それらは、例えば、３．５日目の胚の内部細胞塊由来である。ＥＳ細胞は多分化能を有し、すべての組織および細胞タイプを発生させうる。このことは、別の胚盤胞中に注入されたＥＳ細胞が、生殖系を包含するすべての組織の発生に関与でき、そのことによりキメラ動物が得られるという事実により、最もよく示されている（Bradley et al., Nature 309: 255-256, 1984）。ＥＳ細胞のユニークな特徴は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下においてそれらが多分化能のある段階で維持され、増殖できるという事実である（Smith et al., Nature 336: 688-690, 1998）。今日、このことは、ＥＳ細胞の遺伝学的修飾に頻繁に利用されている。その後、これらの処理されたＥＳ細胞の胚盤胞への注入を用いてトランスジェニック動物が得られている（Robertson et al., Nature 323: 445-448, 1986）。あまり頻繁ではないが、ＥＳ細胞はインビトロでの分化の研究に使用されている。この方法は、インビトロにおける制御された条件下での初期組織の発達に関する研究および実験的処理を可能にする。ラット（Iannaconns et al., Dev. Biol. 163: 288-292, 1994）、ハムスター（Doetschman et al., Dev. Biol. 127: 224-227, 1988）、鳥類（Pain et al., Development 122: 2339-2348, 1996）、魚類（Sun et al., Mol. Mar. Biol. Biotechno. 4: 193-199, 1995）、ブタ（Wheeler, Reprod. Fertil. Dev. 6: 563-568, 1994）、ウシ（First et al., Reprod. Fertil. Dev. 6: 553-562）、ならびに霊長類（Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848,1995）を包含する多種多様な種から多分化能胚性幹細胞が単離されている。ドイツ特許出願第１９７ ５６ ８６４．５号の出願から数カ月後に、２つの研究チームが、胚性ヒト組織からのＥＳ細胞およびＥＳ細胞様幹細胞の単離に成功した（Thompson et al., Science 282: 1145-1147, 1988; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-13731, 1998）。他の最近の研究は、胚および成熟哺乳動物細胞由来の核を脱核卵母細胞中に移植することにより胚および胚性細胞を得ることが可能であることを示している（Campbell et al., Nature 380: 64-66, 1996; Wilmut et al., Nature 385: 810-813, 1997）。
【０００９】
最近２〜３年の間に、いくつかの研究グループがインビトロにおけるＥＳ細胞の神経細胞への分化に成功している。多くの場合、凝集したＥＳ細胞をレチノイン酸で処理することにより神経分化が開始された（Bain et al., Dev. Biol. 168: 342-357, 1995; Strubing et al., Mech. Dev. 53: 275-287, 1995; Fraichard et al., J. Cell Sci. 108: 3181-3188, 1995; Finley et al., J. Neurosci. 16: 1056-1065, 1996）。このようにして分化した細胞のいくつかはニューロンの特性（Bain et al., Dev. Biol. 168: 342-357, 1995; Strubing et al., Mech. Dev. 53: 275-287, 1995; Fairchild et al., J. Cell Sci. 108-3181-3188, 1995; Finley et al., J. Neurosci. 16: 1056-1065, 1996）およびグリア細胞の特性（Fairchild et al., J. Cell Sci. 108-3181-3188, 1995）を示した。レチノイン酸により媒介される神経分化の誘導は２つの大きな欠点を有する。まず第１に、ニューロン分化は細胞の１つのフラグメントのみにおいて起こる。これらの神経細胞の十分な精製はいままでのところ可能ではない。第２に、レチノイン酸はＥＳ細胞分化の強力なインデューサーである。レチノイン酸存在下で分化したニューロンおよびグリア細胞は前駆細胞の段階をほとんど通り越して発達しており、分裂終了段階に入っている。それゆえ、それらは細胞豊富化戦略および移植にとっては限られた価値しか有しない。
【００１０】
ＥＳ細胞から神経前駆細胞を得るための別法が最近報告された（Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996）。凝集して胚様体となったＥＳ細胞を無血清培地に撒き、数日間培養する。この期間中に、特に非神経細胞の大量の死が観察される。この段階の終わりに、８０％以上の細胞がネストリン（典型的には神経前駆細胞に見出される中間体フィラメント）を発現する（Frederiksen & McKay, J. Neurosci. 8: 1144-1151, 1988; Lendahl et al., Cell 60: 585-595, 1990）。塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の存在下においてこれらの前駆体細胞はさらに増殖して単層培養となることができ、ｂＦＧＦを添加しなくなるとニューロンおよび星状細胞へと分化する（Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996）。しかしながら、ｂＦＧＦ存在下でのこれらの細胞の増殖能は限られており、わずか２〜３代の継代後に星状細胞への分化の増加が観察される（Current Protocols in Neuroscience, John Wiley, New York, 1997中Okabe執筆部分）。かかる短い増殖期間の後においても、やはり培養物は多くの未分化胚性細胞ならびに分化した非神経細胞を含んでいる。かかる混入細胞を含む細胞集団は再構築的な移植（reconstructive transplants）には適さない。未分化ＥＳ細胞は腫瘍（テトラトカルシノーマ）を生じさせる可能性があり、非神経ドナー細胞は非神経組織を移植物中に生じさせる可能性がある。現在に至るまで、神経系において腫瘍原性のない移植物となるのに必要な純度であり、神経消失により誘発される異常な挙動からの回復を伴うミエリン形成または消失ニューロンの置換のごときインビボでの機能活性を発揮するのに必要とされる純度である、ニューロン的またはグリア的特性を有するＥＳ細胞由来の細胞を得ることを可能にする方法は知られていない。
【００１１】
はっきりと性質のわかっている十分な数の神経前駆体細胞を得ることは、神経移植における重要な問題である。現在、前駆細胞は胚性哺乳動物脳から単離されている。例えば、７個までのヒト胚由来の材料が１人のパーキンソン病患者の移植に必要である。かかる方法は重大な問題に関連しており、かかる方法を用いて多くのパーキンソン病患者を治療することはできない。移植前にＥＳ細胞をインビトロで増殖させるための努力は、いままでのところ、有意な改良にはつながっていない。腫瘍遺伝子により媒介される不死化は、ドナー細胞中に腫瘍遺伝子が導入されるために、かなりの危険性がある。成長因子により媒介される前駆細胞の増殖の規模のオーダーは有効な臨床的応答には十分でない。さらに、増殖した細胞が宿主組織中に取り込まれる能力についても現在不明である。
【００１２】
ＥＳ細胞は、神経移植のための興味深い代わりのドナー源である。それらの重要な利点は、それらが長時間にわたり未分化の多分化能段階で増殖しうることである（From Egg to Embryo, Cambridge University Press, Cambridge, 1991中Slack執筆部分）。増殖中にそれらは神経組織を包含するすべての組織に分化する能力を維持している。しかしながら、今まで、それらを選択的に神経細胞に分化させることはできなかった。レチノイン酸を用いて神経分化を誘導する試みは、常に、細胞の１フラクションのみを代表する神経細胞との細胞集団混合物を生じさせた（Bain et al., Dev. Biol. 168: 342-357, 1995; Strubing et al., Mech. Dev. 53: 275-287, 1995; Fairchild et al., J. Cell Sci. 108: 3181-3188, 1995; Finley et al., J. Neurosci. 16: 1056-1065, 1996）。さらに、レチノイン酸誘導によるＥＳ細胞由来のニューロンの生成についての報告があるが、レチノイン酸により誘導された神経前駆細胞に関する報告はない。Dinsmoreらによる研究において、かかる混合集団が、キノリン酸により障害を受けたラットの脳中に移植された。キノリン酸は神経毒であり、ニューロンにダメージを与え、破壊する。移植後、移植細胞のいくぶんかはそのニューロン的表現型を維持した。しかしながら、宿主脳の機能的神経支配または消失した脳機能の再構築はこれらの実験においては観察されなかった（Dinsmore et al., Cell Transplant. 5: 131-143, 1996）。Okabeらにより記載された培養法は、ＩＴＳＦｎ培地に胚様体を撒くことを特徴とするが、レチノイン酸に依存しない。この方法は、神経前駆細胞マーカーであるネスチンを発現する８５％までの細胞を生じさせる（Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996）。しかしながら、これらの細胞集団の純度は再構築目的に使用するにはやはり十分でない。例えば、ＩＴＳＦｎ培地で培養された、移植ＥＳ細胞由来の前駆細胞は原始的な神経上皮構造ならびに軟骨およびアデノイド組織のごとき非神経組織を形成することが示された。ＩＴＳＦｎ中で培養された細胞をｂＦＧＦ存在下でさらに分化させることが可能である。しかしながら、細胞はその多分化能を急激に失い、２〜３第の継代のうちに分化して主として星状細胞となる。この短時間のうちに、神経前駆細胞から非神経細胞を分離することが可能である。この例のもう１つの欠点はオリゴデンドロサイトの有効な生成を欠くことである。例えば、Okabeらは、植物成長因子を添加しないようにして誘導した分化の後に、オリゴデンドログリアへの分化を観察しなかった。甲状腺ホルモンＴ３の添加後でさえも、オリゴデンドログリア抗原は細胞の１〜２％において検出されたに過ぎなかった（Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996）。ニューロンの分化に関する限り、Okabeらにより報告された研究は、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはセロトニン（それらは個々のニューロン間のシグナルトランスダクションにとり非常に重要な化合物である）を発現するニューロンの発生に関する証拠を示すものではない。さらに、これらの研究はペリフェリンを発現するニューロンに関する証拠を示すものでもない。典型的には、ペリフェリンは、末梢ニューロンならびに脳幹および脊髄のニューロンにおいて発現される。
【００１３】
よって、本発明の目的は、単離され、精製された、非腫瘍原性の、ニューロン的およびグリア的特性を有するＥＳ細胞由来の前駆体細胞、特に、精製されたニューロンおよびグリア細胞、ならびに実質的に無制限な数のこれらの前駆細胞を製造する方法を提供することである。かかる精製前駆細胞は、腫瘍を形成せずに神経系中への移植を可能にし、またインビボにおける機能活性、例えば、神経損失から生じる異常な挙動の改善を伴うミエリン形成または消失ニューロンの置換を可能にし、さらに神経性欠陥の治療の改良を可能にする。これらの目的は、特許請求の範囲、本発明の説明および開示された図面により明らかである。
【００１４】
定義
本明細書で使用する以下の用語および略号は、以下に示す意味を有する。
アストログリア（アストロサイト）
神経系のグリア細胞。アストログリア・プロセスは、脳内の液体から血液系を分離する血液脳関門の部分である。この細胞型の他の機能についてはほとんど知られていない。
自家
同じ個体からの（例、同じ個体からの細胞）。
ｂＦＧＦ
塩基性線維芽細増殖因子、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子２）と同じ。神経前駆細胞の増殖を刺激する増殖因子。
ＣＮＴＦ
毛様体神経栄養因子。
ＤＭＥＭ／Ｆ２
ダルベッコ修正イーグル培地／栄養ミックスＦ１２（１：１）。血清不含培養に使用できる商業的に入手可能な細胞培養培地（例、Life TechnologiesからのNo. 11320）。
ＥＧＦ
上皮増殖因子。神経前駆細胞の増殖を刺激する増殖因子。
胚様体
懸濁して増殖する細胞集合体。ＥＳ細胞を細菌培養皿で増殖させて胚様体を発生させることができる。これらは初期胚と類似性を示し、種々の異なった組織を発生するので、胚様体と称される。
ＥＳ細胞
胚幹細胞。これらの細胞は、胚盤胞期の初期胚から単離できる。これらは全ての組織および細胞型を発生できる多分化性細胞を代表する。細胞培養において、これらは、多くの継代にわたって多分化性期に維持できる。ＥＳ細胞はまた、核移植、すなわち、細胞核の脱核された卵母細胞への移植およびその後の胚盤胞期への培養によっても得ることができる。ＥＳ細胞の定義には、胚芽細胞から得られたＥＳ細胞様細胞も包含する。
【００１５】
支持細胞（feeder cells）
他の細胞集団の増殖を支持する細胞集団。例えば、ＥＳ細胞は胚線維芽細胞の支持層（feeder layer）上でしばしば培養される。
ＩＴＳＦおよびＮ３ＦＬ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地から由来する細胞培養培地（Okabe et al., Mech. Dev., 59:89-102, 1996）。
ＬＩＦ
白血病阻害因子。ＥＳ細胞の分化を阻害する因子。
神経前駆細胞
ニューロンやグリア（アストログリアおよびオリゴデンドログリア（オリゴデンドロサイト））のような成熟神経系細胞に発達する能力を有する神経系の未成熟細胞。
神経球
非被覆細胞培養皿中、増殖因子含有細胞培養培地で神経前駆細胞を増殖させて得られる細胞集合体。
オリゴデンドログリア
神経系のグリア細胞。これらの細胞の最も重要な公知の機能は、神経細胞プロセス（軸索）の遮断である。軸索は、オリゴデンドログリアによって生じるミエリンの鞘により遮断される。ミエリン形成の欠陥は脱ミエリン化疾患をもたらす。最も頻発する脱ミエリン化疾患の一つは多発性硬化症（ＭＳ）である。
ＰＤＧＦ
血小板由来増殖因子。例えば、他の増殖因子との組み合わせで、神経前駆細胞の増殖を刺激できる増殖因子。ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂサブユニットは、ＰＤＦＧ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢとして知られる二量体を形成する。
多、複および二性能（pluri-、multi-およびbipotent）細胞
多くの異なる（pluri-およびmultipotent）または二つの異なる（bipotent）成熟細胞型に分化する能力を有する前駆細胞。神経生物学においては、二性能細胞は、しばしば、アストログリアおよびオリゴデンドログリアを発生できる前駆細胞についての用語として使用される。
ＲＴ
室温。
【００１６】
かくして、本発明は、単離された、非腫瘍形成性の、胚幹細胞由来の、ニューロンおよびグリア特性を有する前駆細胞、好ましくは初期胚および非神経細胞を１５％以下しか含まない前駆細胞に関する。好ましい具体例において、細胞は単層または球体として増殖する。特に好ましい具体例において、細胞は、ニューロン、アスロトグリアおよび／またはオリゴデンドログリア特性を示す。もう一つ別の好ましい具体例において、前駆細胞は、卵母細胞への核移植によって発生した胚盤胞から単離したＥＳ細胞から由来する。もう一つ別の好ましい具体例において、前駆細胞は胚芽細胞から発生した胚幹細胞から由来する。もう一つ別の好ましい具体例において、前駆細胞は、哺乳動物ＥＳ細胞または哺乳動物卵母細胞から由来する。もう一つ別の好ましい具体例において、前駆細胞は、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシ、非ヒト類人猿およびヒトから由来する。特に好ましい具体例において、前駆細胞は遺伝子的に修飾されている。もう一つ別のの特に好ましい具体例において、前駆細胞は凍結状態で維持される。もう一つ別の特に好ましい具体例において、前駆細胞は、自家および非自家前駆細胞からなる細胞ライブラリーの産出に使用される。
【００１７】
本発明は、さらに、
（ａ）ＥＳ細胞の増殖、
（ｂ）（ａ）からのＥＳ細胞の神経前駆細胞期への培養、
（ｃ）増殖因子含有、血清不含培地での該神経前駆細胞の増殖、
（ｄ）（ｃ）からの神経前駆細胞の、他の増殖因子含有、血清不含培地での増殖および精製された該神経前駆細胞の単離、
（ｅ）（ｄ）からの前駆細胞の、他の増殖因子含有、血清不含培地での増殖および精製された、ニューロンおよびグリア特性を有する該前駆細胞の単離からなる工程を含むことを特徴とする精製された、ニューロンおよびグリア特性を有する前駆細胞の産出方法に関する。
本発明の好ましい具体例において、（ａ）からのＥＳ細胞を集合体、特に胚様体に増殖させる。本発明のもう一つ別の好ましい具体例において、（ｃ）における増殖因子含有、血清不含培地がｂＦＧＦを含有する。もう一つ別の好ましい具体例において、（ｄ）および（ｅ）における増殖因子含有、血清不含培地が、各々、ｂＦＧＦ−ＥＧＦおよびｂＦＧＦ−ＰＤＧＦの増殖因子の組み合わせを含有する。もう一つ別の具体例において、精製神経前駆細胞は、注射に適して培地に導入される。
【００１８】
本発明はまた、
（ａ’）ＥＳ細胞の増殖、
（ｂ’）（ａ’）からのＥＳ細胞の神経前駆細胞期への培養、
（ｃ’）増殖因子含有、血清不含培地での該神経前駆細胞の増殖、
（ｄ’）（ｃ’）からの神経前駆細胞の、他の増殖因子含有、血清不含培地での神経球への増殖および該神経球の単離、
（ｅ’）（ｄ’）からの神経球の、それらがグリア前駆細胞の成長形成を生ずるまでの増殖因子含有、血清不含培地での増殖および精製された該前駆細胞の単離の工程を含むことを特徴とするニューロンおよびグリア特性を有する前駆細胞の産出方法にも関する。
本発明の好ましい具体例において、（ａ’）からのＥＳ細胞を細胞集合体、特に胚様体に増殖させる。追加の工程（ｆ’）において、（ｅ’）で得られたグリア前駆細胞は、培地に単一の因子を加えることにより、アストログリアまたはオリゴデンドログリアへの分化に導かれ、ついで、アストログリアまたはオリゴデンドログリア細胞が単離される。本発明の好ましい具体例において、（ｃ’）の増殖因子含有、血清不含培地はｂＦＧＦを含む。もう一つ別の好ましい具体例において、（ｄ’）、（ｅ’）および（ｆ’）の増殖因子含有、血清不含培地は増殖因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦのいずれかを、単独で、または組み合わせて含有する。もう一つ別の好ましい具体例において、工程（ｆ’）で、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および甲状腺ホルモン（Ｔ３）を使用し、アストログリアおよびオリゴデンドログリアへの分化を促進する。もう一つ別の好ましい具体例において、精製神経前駆細胞は、注射に適した培地に導入される。
【００１９】
本発明で得られた神経前駆細胞は、医療処置における治療手段（tool）として使用できる。該神経前駆細胞の好ましい適用は、神経性欠陥の処置のための治療手段の産出である。特に好ましい適用は、神経細胞の再構成または脱ミエリン化神経細胞の再ミエリン化、特に、神経系への細胞移植による脱ミエリン化領域における脱ミエリン化神経細胞の再ミエリン化である。
好ましい適用には、神経系の外傷性、虚血性、退行性、遺伝性、低酸素性、打代謝性、感染性、腫瘍形成性または毒性障害に基づく神経細胞の損傷または喪失の再構成が包含される。特に好ましくは、脳および脊髄の外傷性病変、虚血性および出血性梗塞、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、小脳および大脳系の遺伝性萎縮性障害、運動ニューロン病ならびに脊椎筋萎縮における神経細胞の再構成である。好ましい適用には、さらに、年齢に関係した変化による神経細胞の喪失または損傷の再構成が包含される。特に好ましい適用は、神経系の脱ミエリン化領域、とりわけ、多発性硬化症（ＭＳ）、アドレノロイコジストロフィーおよびペリツェウス−メルツバッフェル病における脱ミエリン化領域の再ミエリン化である。
ＥＳ細胞由来神経前駆細胞のもう一つ別の好ましい適用は、神経系への細胞性（cell-mediated）遺伝子導入である。細胞性遺伝子導入の好ましい適用には、神経系の酵素欠損および腫瘍性疾患による遺伝性代謝障害が包含される。本発明で得られたＥＳ細胞由来前駆細胞は、因子、例えば、ポリペプチドの臨床および商業的適用のためのin vitro生産にも使用できる。
【００２０】
図面の説明
図１は、ＥＳ細胞由来神経前駆体の生成の模式図である。（Ａ）胚線維芽細胞（四角）の支持細胞層上で増殖するＥＳ細胞（丸）。増殖後、ＥＳ細胞をさらに増殖させてもよく、または液体窒素中で凍結してもよい。（Ｂ）支持細胞層なしでゼラチンコートした細胞培養ディッシュ中で増殖するＥＳ細胞。（Ｃ）神経細胞中の初発分化した胚様体（黒丸）。（Ｄ）ＩＴＳＦｎ培地中で増殖するプレーティングした胚様体。この培地は、神経細胞（黒丸）の生存に有利である。（Ｅ）ｂＦＧＦ存在下、増殖因子含有無血清培地（Ｎ３ＦＬ培地）中で増殖するＥＳ細胞由来神経前駆細胞。（Ｆ）ｂＦＧＦおよびＥＧＦの存在下、増殖因子含有無血清培地（Ｎ３ＥＦＬ培地）中で増殖するＥＳ細胞由来神経前駆細胞。（Ｇ）ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦの存在下、増殖因子含有無血清培地（Ｎ２ＦＰ培地）中で増殖するＥＳ細胞由来神経前駆細胞。Ｎ２ＦＰ培地中での２回の継代の後、細胞を再ミエリン化移植片のために使用してもよい。あるいは、細胞を後の使用のために無血清凍結培地中で凍結してもよい。
【００２１】
図２は、ＥＳ細胞からの神経球および球由来細胞集団の生成の模式図である。工程（Ａ）〜（Ｅ）は図１と同じである。（Ｆ）ｂＦＧＦおよびＥＧＦの存在下、増殖因子含有無血清培地（Ｎ２ＥＦ培地）中で増殖するＮ３ＦＬ培養物から生成した神経球。この段階の細胞を低温保存してもよい。（Ｇ）増殖因子停止によって誘導されるＥＳ細胞由来神経球のインビトロ分化。球はニューロン、星状細胞およびオリゴデンドロサイトを生じる。（Ｈ）ＥＳ細胞由来神経球の神経系への移植。（Ｉ）プレーティングしたＥＳ細胞由来神経球からのグリア前駆細胞の生成（タッチダウン培養物）。ＥＳ細胞由来神経球を、増殖因子の存在下で、非コート細胞培養ディッシュに付着し始めるまで増殖させる。この時点で、グリア前駆細胞は球から出て細胞培養ディッシュへ移動する。（Ｋ）球の除去後、球由来グリア前駆体をさらに増殖因子の存在下で増殖させる。（Ｉ）および（Ｋ）において生成した細胞を低温保存することができ、（Ｋ）で得たグリア前駆細胞を神経系への移植に使用してもよい。（Ｌ）および（Ｍ）増殖因子停止の間にＣＮＴＦおよびＴ３を添加することによって、ＥＳ細胞由来グリア前駆体の星状細胞（Ｌ）およびオリゴデンドロサイト（Ｍ）分化が促進される。
【００２２】
図３は、ＥＳ細胞のインビトロ増殖および分化後の神経前駆細胞の培養物を示す。（Ａ〜Ｂ）Ｎ２ＦＰ培地中で増殖するＪ１  ＥＳ細胞由来の神経前駆細胞の位相差写真。（Ｃ〜Ｄ）ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦの停止４日後のＮ２ＦＰ培養物のオリゴデンドロサイト分化。多数の細胞がオリゴデンドロサイトマーカー抗原０４を発現している。対応する免疫蛍光および位相差写真をそれぞれＣおよびＤに示す。（Ｅ〜Ｆ）Ｎ２ＦＰ培養物の星状細胞分化。増殖因子の停止４日後に、多数のＧＦＡＰ陽性星状細胞を検出することができる。対応する免疫蛍光および位相差写真をそれぞれＥおよびＦに示す。（Ｇ〜Ｈ）Ｎ２ＦＰ培養物のニューロン分化。オリゴデンドロサイトおよび星状細胞に加えて、ニューロンを増殖因子の停止後に検出することができる。これらは、長い突起およびニューロンマーカー抗原β−ＩＩＩ−チューブリンの顕著な発現を示す。対応する免疫蛍光および位相差写真をそれぞれＧおよびＨに示す。
【００２３】
図４。ＥＳ細胞由来グリア前駆体の移植後にレシピエント脳から得たビブラトーム切片。胎児ラット脳への移植後、グリア前駆細胞はオリゴデンドロサイトおよび星状細胞に分化する。ＥＳ細胞由来オリゴデンドロサイトは宿主脳をミエリン化する。（Ａ）胎児ラット脳への脳室内移植の後、ドナー由来星状細胞は脳組織に移動する。この実験において、Ｎ２ＦＰ培養物の単一細胞懸濁物を、１７日齢ラット胚の脳室系に注射した。レシピエント動物を生後３週目に分析した。マウス特異的グリア抗原Ｍ２に対する抗体を使用してドナー由来細胞を検出した。第３脳室が顕微鏡視野の上半分に見える。（Ｂ）新生ラットの大脳皮質におけるＥＳ細胞由来グリア細胞の取り込み。細胞を宿主脳室に胚１６日目に移植した。マウス特異的抗原Ｍ６に対する抗体を使用した免疫蛍光分析。細胞は特徴的なアストログリア形態を示す。（Ｃ）胚１７日目にＮ２ＦＰ培養物の脳室内注射を受けた２２日齢ミエリン欠損ラットの蓋（下丘）へのＥＳ細胞由来オリゴデンドロサイトの取り込み。マウスサテライトＤＮＡに対するＤＮＡプローブを用いるＤＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを使用してドナー細胞を同定した（黒色核標識）。取り込まれた細胞は宿主脳のミエリン化を開始している。ミエリン欠損ラットは中枢神経系におけるＰＬＰ免疫反応性を欠いているので、ＰＬＰに対する抗体を使用してミエリン化を検出することができる（暗突起）。（Ｄ）２２日齢レシピエント動物の視床下部への取り込み後のＥＳ細胞由来ミエリン化オリゴデンドロサイトの高倍率観察。細胞は核ハイブリダイゼーションシグナルおよびＰＬＰ陽性突起を典型的な平行配向で示す。
【００２４】
図５。ＥＳ細胞由来神経球および球由来細胞集団の培養物。（Ａ）ＥＳ細胞株Ｊ１由来の５日齢神経球。この段階の球を神経系への移植に使用してもよい。（Ｂ）Ｊ１  ＥＳ細胞由来の２週齢神経球を、神経前駆細胞において代表的に発現される中間フィラメントであるネスチンに対する抗体で染色した。この段階で、神経球は肉眼で見える（免疫蛍光写真）。（Ｃ〜Ｄ）ＣＪ７  ＥＳ細胞由来の５日齢神経球を、ポリオルニチンおよびフィブロネクチンをプレーティングした細胞培養ディッシュ中にプレーティングし、増殖因子の非存在下でさらに５日間培養した。球は崩壊し、神経細胞に分化している。（Ｄ）は、ニューロン抗原β−ＩＩＩ−チューブリン（明シグナル）および神経前駆細胞マーカーネスチン（暗シグナル、矢印）に対する抗体を使用する二重免疫蛍光分析を示す。対応する位相差写真（Ｃ）との比較によって、この視野に示される全ての細胞が２個のマーカーの両方を発現していることが示される。（Ｅ〜Ｆ）増殖因子の非存在下でポリオルニチンおよびフィブロネクチン上でさらに７日間分化させ、ニューロンマーカー微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２；Ｅ）および神経伝達物質ＧＡＢＡ（Ｆ）に対する抗体で染色した、５日齢ＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）の培養物。これらの免疫蛍光顕微鏡写真は、多数のニューロンが神経伝達物質ＧＡＢＡを発現していることを示す。ＧＡＢＡ作動性細胞を富化した細胞集団をハンティングトン病患者における神経移植に使用してもよい。（Ｇ〜Ｈ）ニューロンマーカーＭＡＰ２（Ｇ）および神経伝達物質グルタミン酸（Ｈ）に対する抗体で染色した同じ細胞培養実験由来の細胞（ＧおよびＨは免疫蛍光顕微鏡写真である）。多数のニューロンが神経伝達物質グルタミン酸を発現している。（Ｉ）増殖因子の非存在下でポリオルニチンおよびフィブロネクチン上でさらに２週間分化させ、ニューロンマーカー抗原β−ＩＩＩ−チューブリン（細胞突起における繊維状染色）およびシナプシン（細胞突起に結合した点状シグナル）に対する抗体で二重標識した、５日齢ＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）の培養物。ニューロンの分化を支持するために、細胞をニューロトロフィンである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；２０ｎｇ／ｍｌ）でインビトロ分化の最後の５日間に処理した。写真は、ＥＳ細胞由来神経球から生成したニューロンが成熟形態を発達させ、ニューロンシグナリングに重要なシナプスタンパク質を発現していることを示す。（Ｋ）増殖因子の非存在下でポリオルニチンおよびフィブロネクチン上で分化させ、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体で標識した、５日齢ＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）の培養物。チロシンヒドロキシラーゼを発現しているニューロンをパーキンソン病患者における移植に使用する。この免疫蛍光分析は、多数のＥＳ細胞由来ニューロンがこの酵素を発現していることを示す。（Ｌ）増殖因子の非存在下でポリオルニチンおよびフィブロネクチン上でさらに１週間分化させ、アストログリア抗原であるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体で標識した、１１日齢ＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）の培養物。この免疫蛍光分析は、ＥＳ細胞由来神経球が星���細胞も生じさせることを示す。（Ｍ）増殖因子の非存在下でポリオルニチンおよびフィブロネクチン上でさらに５日間分化させ、オリゴデンドロサイトマーカー０４に対する抗体で標識した、５日齢ＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）の培養物。この免疫蛍光分析は、ＥＳ細胞由来神経球がオリゴデンドロサイトも生じさせることを示す。
【００２５】
図６。ＥＳ細胞由来神経細胞球から生成したグリア前駆細胞。（Ａ）いわゆるタッチダウン培養物の代表例。ＥＳ細胞株Ｊ１由来の神経球は非コート細胞培養ディッシュに付着し、グリア細胞の外殖を生成する。付着球は振盪によって容易に除去することができ、精製グリア前駆細胞の単層が後に残る。（Ｂ）ＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）からタッチダウン培養物として生成したグリア前駆細胞集団の免疫蛍光分析。この免疫蛍光分析は、グリア前駆細胞が神経抗原Ａ２Ｂ５を発現していることを示す。
【００２６】
図７。単一因子の添加による、ＥＳ細胞由来グリア前駆体の標的化分化。ＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）から生成し、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下で増殖させたタッチダウン培養物をＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＴ３（３ｎｇ／ｍｌ）で処理した。２日後、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを停止し、一方、細胞にＣＮＴＦまたはＴ３を与え続けた。増殖因子停止の５日後、細胞を固定し、星状細胞抗原ＧＦＡＰおよびオリゴデンドロサイト抗原０４に対する抗体で染色した。対応する免疫蛍光および位相差写真により、ＣＮＴＦまたはＴ３の添加がＥＳ細胞由来前駆細胞の分化に影響を及ぼすことが示される。ＣＮＴＦの存在下では、細胞の大部分が星状細胞形態を獲得し、星状細胞マーカーＧＦＡＰを発現している。Ｔ３の存在下では、細胞は多極性オリゴデンドロサイト形態を獲得し、オリゴデンドロサイトマーカー０４を発現している。
【００２７】
図８。インビトロ（Ａ〜Ｂ）およびハンティングトン病の動物モデルであるイボテン酸傷害ラットの神経系への移植後（Ｃ〜Ｄ）のＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）のニューロン分化。５日齢神経球を成体イボテン酸傷害ラットの線条に移植した。同時に、球のアリコートを増殖因子停止によって５日間にわたってインビトロにおいて分化させ、続いて神経伝達物質ＧＡＢＡに対する抗体で染色した（Ａ、免疫蛍光；ｂ、対応する位相差画像）。図は、多数のＥＳ細胞由来ニューロンが神経伝達物質ＧＡＢＡを発現していることを示す。移植の７週間後に、ニューロン分化を示す生存移植片が成体ラット脳に検出される（ＣおよびＤ）。（Ｃ）マウス特異的神経抗原Ｍ６に対する抗体を用いて同定される移植片の低倍率概観（免疫蛍光）。移植片は均質な染色を示し、そしてレシピエント脳に良好に組込まれている。この動物は、イボテン酸傷害によって誘発される回転行動の正常化をともなう機能改善も示した。（Ｄ）移植片から隣接宿主脳へ成長したドナー細胞由来軸索。Ｍ６に対する抗体での免疫蛍光染色。
【００２８】
神経前駆細胞の生成を開始するために、胚幹細胞（例えば、マウス起源の）を、所望の数に、血清含有培地中で、非有糸分裂胚線維芽細胞の支持細胞層上で、標準的な方法（Hoganら, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994）に従って増殖させてもよい。Ｊ１（Liら, Cell 69:915-926, 1992）、Ｒ１（Nagyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8424-8428, 1993）およびＣＪ７（SwiatekおよびGridley, Genes Dev. 7:2071-2084, 1993）のような樹立マウスＥＳ細胞株に加えて、ＥＳ細胞を胚（例えば、３〜４日齢マウス胚盤胞由来）から得てもよい（Hoganら, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994）。ラット（Iannaconneら, Dev. Biol. 163:288-292, 1994）、ハムスター（Doetschmanら, Dev. Biol. 127:224-227, 1988）、鳥類（Painら, Development 122:2339-2348, 1996）、魚類（Sunら, Mol. Mar. Biol. Biotechno. 4:193-199, 1995）、ブタ（Wheeler, Reprod. Fertil. Dev. 6:563-568, 1994）、ウシ（Firstら, Reprod. Fertil. Dev. 6:553-562）、霊長類（Thomsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848, 1995）のような他の種または胚ヒト組織からＥＳ細胞を得てもよい。独国特許出願第１９７  ５６  ８６４．５号の提出の数ヶ月後に、２つの研究チームが胚ヒト組織からのＥＳ細胞およびＥＳ細胞様幹細胞の単離に成功した（Thomsonら, Science 282: 1145-1147, 1998; Shamblottら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726-13731, 1998）。
【００２９】
より最近の研究によって、胚および胚幹細胞を成熟個体の細胞由来の核を脱核した卵母細胞に移植することによって生成することができることが示されている（Wilmutら, Nature 385:810-813, 1997）。専門家にとっては、そのような核移入ストラテジーと本明細書に記載の発明との組合せによって、同じ個体の分化した細胞からの自己神経前駆細胞の生成が可能となることは明らかである。成熟細胞由来の核の脱核した卵母細胞への移植を介する胚の生成は、ヒツジのような大哺乳動物に適用されており（Wilmutら, Nature 385:810-813, 1997）、それゆえヒトにも適用可能である。ＥＳ細胞またはＥＳ細胞様細胞を胚生殖細胞から得てもよい。本出願の優先日以降に発行された研究によって、ヒトＥＳ細胞をヒト胚盤胞から単離することができること（Thomsonら, Science 282: 1145-1147, 1998）、およびヒトＥＳ細胞様細胞をヒト始原生殖細胞から得ることができること（Shamblottら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726-13731, 1998）が示されている。これらの研究は、本出願に記載の方法が、単独でまたは核移植ストラテジーとの組み合わせで、ヒトにも適用可能であることを示す。
【００３０】
支持細胞依存性ＥＳ細胞株をゼラチンコート細胞培養ディッシュ中にプレーティングし、次いで非コートペトリ皿中でＬＩＦの非存在下で凝集させて、胚様体を形成させてもよい（Okabeら, Mech. Dev. 59:89-102, 1996）。次いで、３〜４日齢胚様体を細胞培養ディッシュ中にプレーティングし、４〜８日間無血清培地（ＩＴＳＦｎ培地；Okabeら, Mech. Dev. 59:89-102, 1996）中で増殖させてもよい。この時期に、顕著な細胞死を非神経細胞に検出することができる。
【００３１】
ＩＴＳＦｎ培地中での４〜８日間の後、小口径ピペットを使用して細胞を単一細胞懸濁物に分離し、Ｎ３ＦＬ培地に移してもよい。Ｎ３ＦＬはｂＦＧＦを含有する無血清培地である（Okabeら, Mech. Dev. 59:89-102, 1996）。ｂＦＧＦを使用して、神経前駆細胞の増殖を促進する。
【００３２】
Ｎ３ＦＬ培地中での４〜８日間の後、グリアおよびニューロン前駆細胞集団の生成が開始される。ニューロン前駆体とは対照的に、グリア前駆体は、顕著な増殖能を示す。本明細書に記載の方法は、この増殖能を利用する。Ｎ３ＦＬ培養物由来の細胞を連続的に異なる無血清増殖因子含有培地で増殖させる。この時期の間、星状細胞およびオリゴデンドロサイト分化能を有する両能性前駆体の強い富化を観察することができる。付随して、始原胚細胞および非神経細胞が分化し、培養物から除かれる。最後に、Ｎ３ＦＬ培地中で培養した細胞を機械的に収集し、単一細胞懸濁物に分離し、無血清培地（これは増殖因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含有してもよい（Ｎ３ＥＦＬ培地））に移す。この培地中で、細胞を単層としてサブコンフルエントになるまで増殖させる。約２回の継代の後、この培地中で培養した細胞を移植目的に使用してもよい。さらなる精製のために、さらなる工程を含めてもよい。
【００３３】
Ｎ３ＥＦＬ培地中で培養した細胞を機械的に収集し、単一細胞培養物に分離し、増殖因子の第２の組合せ（例えば、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ）を含有する無血清培地中に再プレーティングしてもよい。
【００３４】
このプロトコルで得られる細胞を、この培地中でのさらなる継代を介して増殖させてもよい。約２回の継代の後に、培養物は精製された神経前駆細胞からなり、これを直接または単離後に、例えば再ミエリン化移植片用に使用してもよい。この段階で、それらは二極性または多極性形態を有する細胞の均質な層を形成する。これらを、この段階またはより初期に、前駆細胞特性の損失なしに凍結融解し得る。増殖因子を数日間添加しない場合、増殖因子停止がインビトロにおける分化を誘導する。この場合、免疫組織化学分析によって、神経前駆細胞のマーカー（例えば、ネスチン）に加えてオリゴデンドロサイトのマーカー抗原（例えば、０４）および星状細胞のマーカー抗原（例えば、ＧＦＡＰ）の存在が示される。０４およびＧＦＡＰ陽性細胞はそれぞれ細胞集団の２０〜４０％および３０〜７０％を占め得る。さらにニューロン抗原を発現している細胞をこれらの培養物中に見出し得る。
【００３５】
神経球の形態におけるニューロンおよびグリアの前駆細胞の産生もまた、Ｎ３ＦＬ培地中で４〜８日後に始まる。神経細胞を豊富にするために、Ｎ３ＦＬ培地中で増殖した細胞を機械的に採取し、破砕して単細胞懸濁液にし、さらにコーティングしていない細胞培養皿内の成長因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含んでいてよい無血清培地中で増殖させた。数日間のうちに、当該細胞は、主にネスチン陽性神経前駆細胞からなる細胞凝集体（神経球）を形成する。神経球はさらに懸濁培養物として増殖できる。対照的に、分化神経細胞および非神経細胞は細胞培養皿表面に付着する傾向がある。
小さな球が形成されるとすぐに、それらを培養物から除去し、コーティングしていない新しい培養皿へ移す。数日（５〜７日）間のうちに、その球を移植目的に用いることができる。この場合、その球の中の神経前駆体は、宿主脳に神経を分布する成熟神経細胞へと分化する。小さな未分化神経球を液体窒素中で無血清凍結培地中に凍結し、および解凍して、後の時点で分化させることができる。
【００３６】
本発明はまた、移植に適切でありうる球組成物中の分化神経細胞にも関する。これらの細胞は、本明細書に記載のニューロンおよびグリアの性質により、ＥＳ細胞由来前駆細胞のインビトロ分化を通じて得ることができる。インビトロ分化を誘導するため、成長因子を回収し、未分化神経細胞を含む球を、例えばポリオルニチンおよびフィブロネクチンでコーティングした細胞培養皿に蒔く。これらの条件下で、当該球は、細胞培養皿表面、さらに、ネスチン陽性神経前駆体、産生ニューロン、星状細胞およびオリゴデンドロサイトに付着する。付着ニューロンはさらに分化して、様々なニューロンマーカー、例えばＭＡＰ２、β−III−チューブリン、シナプシン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、グルタミン酸塩、セロトニン、ペリフェリンおよびカルビンジンなどを発現する。分化ニューロンの変異および生存は、ニューロトロフィン、例えばＢＤＮＦまたはニューロトロフィン３（ＮＴ−３）などの添加により促進される。
【００３７】
成長因子、例えばｂＦＧＦおよびＥＧＦなどを含む無血清培地中で、ＥＳ細胞由来神経球を数週間懸濁培養物中に維持できる。この段階で、当該球は容易に裸眼で検出可能な大きさに成長する。これらの条件下で、細胞分化レベルの増進が神経球内で観察できる。したがって、分化の進行した段階でさえも、これらの球を用いてＥＳ細胞由来ニューロンを移植できる。単層細胞培養における分化ＥＳ細胞由来ニューロンを用いる場合は、これらの細胞の採取は常にニューロンの突起の重大な損傷およびニュロン細胞体の破壊を導くので、これは可能ではない。
【００３８】
この２年間に、ニューロン細胞集団の分化に影響を与える数多くの因子が同定された。これらの因子は、例えば、神経組織内の分極を導くことができる。例えば、ソニックヘッジホッグ遺伝子産物は神経組織の腹側の表現型を誘導することが示されている（Ericsonら、Cell 81:747-756,1995）。かかる因子はＥＳ細胞から人為的に生じた神経細胞の分化にも影響を与えると考えられる。専門家にとって、かかる因子の適用が特有の表現型でのニューロン細胞およびグリア細胞の産生を可能にすることは自明である。例えば、腹側の中脳の表現型の誘導は、パーキンソン病患者への移植に適切な細胞をもたらす。神経組織の培養断片においては、ソニックヘッジホッグがドーパミン作動性腹側中脳ニューロンを誘導できることがすでに示されている（Wangら、Nature Med. 1:1184-1185, 1995）。
【００３９】
ＥＳ細胞由来神経球からのグリア前駆細胞の産生のために、成長因子を含有する無血清培地中で、当該球を、細胞培養皿のコーティングしていない表面への付着を始めるまで増殖させる。この期間、ｂＦＧＦおよびＥＧＦをそれぞれまたは組み合わせて増殖因子として用いることができる。当該球の付着の後、グリア組織は球から培養皿表面上へと移動する（タッチダウン細胞と称される）。この細胞集団の正確な発生は分かっていない。おそらく、当該球内での細胞分化の増加が付着の促進と移動行動を示すグリア前駆体の形成を導くのであろう。タッチダウン細胞を産生する球を、グリア前駆体の産生系として用いることができる。この目的のため、コーティングしていない細胞培養皿内で短期間（＜１日）だけグリア前駆体産生球を培養する。グリア細胞が付着するとすぐに、当該球を機械的に皿からはずし、別の皿へ移す。これにより、成長因子、例えばｂＦＧＦおよびＥＧＦ（それぞれまたは組み合わせて適用）などの存在下でさらに増殖できる環形単層のグリア前駆体が得られる。
【００４０】
この方法で生じた「タッチダウン細胞］は神経抗原Ａ２Ｂ５（Eisenbarthら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4913-4917, 1979）し、成長因子回収において、星状細胞およびオリゴデンドロサイトへ分化する。免疫組織化学的方法を用い、オリゴデンドロサイト用マーカー抗原（例えば、04）および星状細胞用マーカー抗原（例えば、GFAP）をこれらの分化細胞内に検出できる。未分化タッチダウン神経球を液体窒素中で無血清凍結培地中に、その増殖および分化能を緩めることなく凍結する。この方法で生じたグリア前駆細胞もまた神経系の移植に用いることができる。
ＥＳ細胞由来グリア前駆体の分化は、単一の因子の添加によって影響を受けうる。成長因子回収の間および直前のＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）の添加は、星状細胞分化を促進する。この段階の間の甲状腺ホルモンＴ３の添加は、オリゴデンドロサイトの分化促進の結果を与える。成長因子処理中または処理後の血清含有培地の添加は、これらの培養において星状細胞の数の激しい増加の結果を与える。
【００４１】
専門家にとって、凍結神経前駆細胞を解凍後に移植に用いることもできることは自明である。インビトロ分化プロセスの初期段階で凍結した細胞を、標準的な方法で解凍し、さらに二極および多極細胞の均一な集団が得られるまで増殖させ、経過させることができる。
さらに本明細書に記載の方法を、確立している細胞分離細胞選別法と組み合わせることができる。例えば、神経の下位集団を所定の時点で、蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、免疫パンニング、または類似の方法を用いて分離できる。詳細な選別および下位分類は個々の患者の必要性に合わせた代替細胞（遺伝的に修飾した代替細胞を含む）の産生を可能にしうる。ＥＳ細胞および本明細書に記載のＥＳ細胞由来の神経前駆細胞のどちらもその特性を緩めることなく凍結し解凍することができるので、自己由来のセルバンクを含むセルバンクを確立することが可能である。
【００４２】
本明細書に記載の方法論は、神経前駆細胞、例えばニューロン細胞、星状細胞およびオリゴデンドロサイトなどの、例えば神経系の損傷の修復に要求される純度および量での産生を可能にする。本明細書に記載の方法論によって産生される細胞は、わずかに初期胚の、または初期胚でない細胞および非神経細胞を含む。本明細書に記載の神経前駆細胞の純度は、前にOkadaらによって記載された約８５％（Mech. Dev. 59:89-102,1996）をはるかに超える。本明細書に記載の方法論は１００％までの純度での神経前駆細胞の産生を可能にする。さらに、本明細書に記載する方法論は脳組織に依存することなく多数の神経前駆細胞の産生を可能にする。本明細書に記載の神経前駆細胞は、様々な種、例えばマウス、ラット、ハムスター、鳥、魚、ブタ、畜牛、霊長類またはヒトなどのＥＳ細胞から得ることができる。確立されたＥＳセルラインおよび胚由来のＥＳ細胞の双方を用いることができる。さらに、ＥＳ細胞を増殖卵母細胞から得ることもできる。当該卵母細胞を除核し、例えば分化組織から得られた細胞核と共に移植し、自己由来の卵母細胞およびＥＳ細胞の産生を可能にすることができる。ＥＳ細胞またはＥＳ様細胞を胚芽細胞から得ることもできる。当該ＥＳ細胞を標準的な方法で遺伝的に修飾してもよい。例えば、相同組換えによって、欠陥遺伝子を「正常な」遺伝子と置き換えることができる。さらに、標準的な方法を用いて遺伝子を欠失させてもよい。これらの方法は、マウスにおいて広く用いられており、その結果、到達水準である。
【００４３】
ＥＳ細胞の速い増殖およびそれらの遺伝的修飾への従順性は、多数の遺伝的に修飾されたニューロンおよびグリア前駆細胞の産生を可能にする。ニューロンおよびグリア前駆細胞の広範囲の移動可能性と組み合わせにより、このことは、神経系の大きな領域が、欠けている因子を代用し、または神経防御もしくは他の適用のためにデザインされたポリペプチドを分泌できる遺伝的修飾前駆細胞とともに存在することを可能にする。細胞の遺伝的修飾によって、移植片拒絶に関与する表面抗原をコードする遺伝子を除去することもできる。かかる戦略は、ＥＳ細胞由来前駆細胞の、免疫抑制を必要としない広範な臨床上の適用を可能にする。
本明細書に記載の神経前駆細胞を、神経欠損治療用の治療用医療手段として用いることもできる。本明細書に記載の神経前駆細胞の適用の典型例は、失われた、または機能的に損なわれた神経の移植神経前駆細胞による復元である。
【００４４】
失われた神経を置き換え、およびこの損失に関連する神経学的な欠損を改善するために、本明細書に記載の神経球を、例えば浮遊させて４〜７日間成育させ、ついでニューロン欠損を示している脳の領域へ移植する。移植６週間後、分化神経が宿主脳に神経を分布させているのが観察できる。宿主脳組織へ広がっているドナー由来軸索は、たとえばドナー特異的神経抗原に対する抗体を用いて検出できる。ニューロンの復元は機能的改善も導く。このことは、移植前後のイボテン酸傷害ラットにおける行動試験で示すことができる。この目的のため、神経毒イボテン酸の定位注入により多数の線条体ニューロンを死滅させる。その結果得られる欠損は、ハンチントン病と類似性を示す。したがって、この実験モデルはこの疾病の動物モデルとして頻繁に用いられる。単側方イボテン酸損傷の後、作用を受けた動物は、特定の薬剤、例えばアンフェナミンによって誘導できる機能的に非対称で定量可能な、異常な回転行動を現す。ニューロン細胞が多い移植組織は、当該回転行動を正常化できる。この正常化が特に当該移植組織内のＧＡＢＡ作動性ニューロンの数に依存することは明らかである。回転行動の分析によるイボテン酸損傷モデルおよび神経移植の機能的評価は、詳細に記載されている（Bjorklundら、Functional Neural Transplantation、Saiten 157-195、Raven Press、New York、1994）。本明細書に記載のイボテン酸損傷ラット脳への神経球の移植は、イボテン酸損傷によって誘導される異常な回転行動の有意な手術後の改善の結果を与える。例えば、神経細胞のヒト神経系への移植はすでに患者に実施されている（Olanowら、TINS 19:102-109、1996）。
【００４５】
神経球または単層培養物のいずれかから得られる、本明細書に記載のグリア前駆細胞を、神経損傷の治療手段として用いることもできる。本明細書に記載のグリア前駆細胞の適用の典型例は、細胞移植による脱髄した脳領域の再有髄化である。本明細書に記載のグリア前駆細胞は著しい移動可能性を示すので、ＣＮＳの広い領域を包囲する脱髄疾病の治療に用いることができる。この場合、当該細胞の局所注入は、ＣＮＳの広い領域に十分に定着し、再有髄化できる。この方法で治療できる疾病の典型例は、一般的にＣＮＳの異なる領域での脱髄の複数の病巣に関連する原因不明の疾病である多発性硬化症（ＭＳ）である。本明細書に記載の神経前駆体の移植を用いてかかる損傷を再有髄化できる。この場合、神経前駆細胞の著しい移動可能性を利用し、単一または少数の移植部位から、脱髄の多くの領域を標的とし、修復することができる。
【００４６】
ミエリン欠損脳領域を有髄化するために、単層培養物またはＥＳ細胞由来神経球から得た細胞を、成長因子含有培地で増殖させ、機械的に採取し、破砕して単細胞懸濁液にできる。かかる細胞懸濁液のミエリン欠損脳領域への移植により、典型的には、移植の約３週間後に容易に検出可能なドナー由来星状細胞およびオリゴデンドロサイトが得られる。典型的には、移植細胞は、ミエリン鞘で宿主軸索を覆う。免疫組織化学的方法を用いて、これらのミエリン鞘中にミエリン基礎タンパク質（ＭＢＰ）などのミエリンタンパク質およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）を検出できる。
本明細書に記載のＥＳ細胞由来神経前駆体を、臨床上および商業上の適用のためのポリペプチチドのインビトロ産生に用いることができる。
以下の例により、本発明をＥＳ細胞由来神経前駆体の産生および移植のために使用する方法を説明する。
【００４７】
実施例１：
１.１．ＥＳ細胞増殖
常法に従って（Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994）、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Life Technologies No. 10119）および１,０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ（Life Technologies No. 13275）を含有するＤＭＥＭ培地（Life Technologies No. 11965）中、一層の未分裂マウス胚線維芽細胞の上でＥＳ細胞（Ｊ１株；Li et al., Cell 69:915-926, 1992）を増殖させる。この培地は、ＦＢＳおよびＬＩＦに加えて、標準濃度の、非必須アミノ酸（Life Technologies No. 11140；Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996）、アデノシン（Sigma No. A-4036）、グアノシン（Sigma No. G-6264）、シチジン（Sigma No. C-4654）、ウリジン（Sigma No. U-3003）、チミジン（Sigma No. T-1895）ならびに０.１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Sigma No. M-7522）、１０ｍＭ Ｌ−グルタミン（Sigma No. G-5763）および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma No. H-0763）を含有している。この段階および後に続く全ての段階の間、細胞を、５％ＣＯ2中、３７℃で加湿インキュベーター（湿度＞８５％）にて培養する。
【００４８】
１.２．養育細胞の除去
ＥＳ細胞が亜集密度（subconfluency）に達するとすぐに、それらをＰＢＳ中０.０４％ＥＤＴＡで１回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中０.０５％トリプシン（Life Technologies No. 35400）および０.０４％ＥＤＴＡを添加して採集した。細胞を、パスツールピペットを介して数回トリチュレートして、単一細胞浮遊液を得る。ＥＳ細胞の増殖に用いた含血清培地を同量添加してトリプシンを中和する。室温で５分間、３００×ｇで遠心分離に付した後、細胞をゼラチンコーティングした細胞培養皿（Sigma No. G-2500）に６ｃｍの皿１枚あたり細胞約６×１０6個の密度でプレーティングし、さらに、段階１.１で用いた培地中で増殖させる。
【００４９】
１.３．胚様体（embryoid bodies）の発生
細胞が亜集密的になるとすぐに（すなわち、約２〜３日後）、ＰＢＳ中０.０５％トリプシンおよび０.０４％ＥＤＴＡ（例えば、６ｃｍの皿１枚あたり１.５ｍｌ）を添加してそれらをゼラチンから分離する。分離後、ＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳ（例えば、６ｃｍの皿１枚あたり６.５ｍｌ；この培地は、段階１.２で用いた培地と同等のものであるが、１０％ＦＢＳを含むだけであり、ＬＩＦを含まない）を添加してトリプシンを中和する。次いで、細胞浮遊液を、例えば、コーティングしていないペトリ皿（Nunc No. 240045）８枚にプレーティングし、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（例えば、６ｃｍの皿１枚あたり４ｍｌ）中でさらに増殖させる。
【００５０】
１.４．胚様体のプレーティング
３〜４日後、該胚様体を５０ｍｌの試験管に移し、沈殿により（１×ｇ；５分）回収する。上清を廃棄し、胚様体を１０ｃｍの細胞培養皿にプレーティングする。プレーティングした胚様体は、細胞培養皿の表面の約５０％を覆うようにする。典型的には、ペトリ皿４〜６枚から回収した胚様体は、１０ｃｍの皿１枚にプレーティングするのに十分であろう。胚様体をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（１０ｃｍの皿１枚あたり１０ｍｌ）中で一夜培養する。
【００５１】
１.５．ＩＴＳＦｎ培地への移動
プレーティングの１日後、細胞培養皿に付着した胚様体をＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ変法イーグル培地／Nutritient Mix F12（１：１）；Life Technologies No. 11320）で３回洗浄する。１０ｃｍの皿の各々にＩＴＳＦｎ培地１０ｍｌを添加する。この培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５μｇ／ｍｌインスリン（Intergen No. 540101）、５０μｇ／ｍｌアポトランスフェリン（Intergen No. 445275）、３０ｎＭ塩化セレン（Sigma No. S-5261）、５μｇ／ｍｌフィブロネクチン（Life Technologies No. 33010）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ；Life Technologies No. 15140）を含有している。細胞をこの培地中で４〜７日間増殖させ、２日ごとに培地交換する。この期間に、非神経細胞の間で大量の細胞死を観察することができる。さらに、神経前駆細胞が出現し、小さな細胞クラスターを形成するであろう。このＩＴＳＦｎ培養を確立する方法は、従前に開示されている（Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996）。
【００５２】
１.６．Ｎ３ＦＬ培地への移動
ＩＴＳＦｎ培地中の細胞培養物をＰＢＳ中０.０５％トリプシンおよび０.０４％ＥＤＴＡを用いて採集する。同量の含血清培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）を添加してトリプシンを中和する。遠心分離（３００×ｇ；５分、室温）後、細胞を、０.１％ＤＮａｓｅ（Worthington No. 2139）を含有する無カルシウム−および無マグネシウム−ハンクス緩衝塩溶液（CMF-HBSS、Life Technologies No. 14180）に再浮遊させる。１０ｃｍの皿１枚から得られた細胞ペレットを全容量３ｍｌに再浮遊させる。次いで、該細胞を、火炎処理した（flame-polished）パスツールピペットをその孔の大きさを減少させつつ（例えば、０.８ｍｍ、０.５ｍｍおよび０.２ｍｍ）用いて単一細胞浮遊液にトリチュレートする。残りの細胞クラスターを沈殿により（１×ｇ、５分）回収し、廃棄する。遠心分離（３００×ｇ、５分間、室温）後、細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１；Life Technologies No. 11320）、２５μｇ／ｍｌインスリン、５０μｇ／ｍｌヒト・アポトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン（Sigma No. P-8783）、１００μＭプトレッシン（Sigma No. P-5780）、３０ｎＭ塩化セレン、１μｇ／ｍｌラミニン（Life Technnologies No. 23017）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ）および１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えｂＦＧＦ（R&D Systems No. 233-FB）中、ポリオルニチンコーティングした細胞培養皿上に細胞約３０,０００個／ｃｍ2の密度でプレーティングする。この培地は、Okabeら（Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996）により開示されたＮ３ＦＬ培地と同等のものである。ポリオルニチンでコーティングするために、細胞培養皿をＨ2Ｏ中１５μｇ／ｍｌポリオルニチン（Sigma No. P-3655）で少なくとも２時間満たす。該ポリオルニチン溶液を除去し、該培養皿をＰＢＳで３回洗浄する。Ｎ３ＦＬ培地中での培養の間、毎日、ｂＦＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるまで添加する。２日ごとに培地交換する。
【００５３】
実施例２：神経前駆細胞の発生
２.１．Ｎ３ＥＦＬ培地への移動
Ｎ３ＦＬ培地中で４〜５日後、セル・スクレーパー（Costar Nr. 3008）を用いて機械的に採集する。削り取る前に細胞をＣＭＦ−ＨＢＳＳで３回（最後の洗浄液は０.１％ＤＮａｓｅを含む）洗浄する。それらを、段階１.６に記載した火炎処理したパスツールピペットを用いて単一細胞浮遊液にトリチュレートする。遠心分離（３００×ｇ、５分間、室温）後、１０ｃｍの皿１枚から採集した細胞を、Ｎ３ＥＦＬ培地中、ポリオルニチンコーティングした１０ｃｍの皿約５枚にプレーティングする。この培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、２５μｇ／ｍｌインスリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン、１００μＭプトレッシン、３０ｎＭ塩化セレン、１μｇ／ｍｌラミニン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ）、１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えｂＦＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＥＧＦ（R&D Systems No. 236-EG）を含有している。毎日、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを各々最終濃度１０ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌになるまで添加する。２回目の培地交換後は、ラミニンの添加は、省略できる。
【００５４】
２.２．Ｎ２ＦＰ培地への移動
細胞が９０％集密的になるとすぐに（例えば、１〜２週間後）、それらを、トリプシンを用いずにセル・スクレーパーを用いて採集し、火炎処理したパスツールピペットを用いて単一細胞浮遊液にトリチュレートする。遠心分離（３００×ｇ、５分間、室温）後、１０ｃｍの皿１枚から採集した細胞を、Ｎ２ＦＰ培地中、ポリオルニチンコーティングした１０ｃｍの皿約５枚にプレーティングする。この培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、２５μｇ／ｍｌインスリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン、１００μＭプトレッシン、３０ｎＭ塩化セレン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ）、１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＰＤＧＦ−ＡＡ（R&D Systems No. 221-AA）を含有している。毎日、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＡＡを添加し、２日ごとに培地交換する。
【００５５】
２.３．Ｎ２ＦＰ培地での細胞の継代
細胞が亜集密的になるとすぐに、それらを、トリプシンを用いずにセル・スクレーパーを用いて採集し、１：５の比で継代する。通常、単一細胞浮遊液を得るためにさらなるトリチュレーション段階を必要としない。含ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ培地中で少なくとも２回継代した後、細胞は、ミエリン再形成移植に用いられる前駆体の個体群を表す。別法として、細胞を、トリプシンを用いずにセル・スクレーパーを用いて採集し、後の使用のために無血清凍結培地（Sigma No. C-6295）中で凍結保存できる。精製した神経前駆体を単離し、注射に適している培地、例えば、ＣＭＦ−ＨＢＳＳ（Life Technologies Nr. 14180）に移すことができる。
【００５６】
２.４．神経前駆細胞のインビトロ分化
インビトロ分化のために、神経前駆細胞を、トリプシンを用いずにセル・スクレーパーを用いて採集し、ポリオルニチンコーティングした細胞培養皿にプレーティングして約５０％の集密度にする。該細胞を、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦを添加していない段階２.２に記載した培地中でさらに４〜７日間増殖させる。２日ごとに培地交換する。培養物を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（Sigma No. P-6148）中で固定し、オリゴデンドログリア抗原Ｏ４に対する抗体（Boehringer No. 1518925、希釈１：１０）および星状細胞抗原ＧＦＡＰに対する抗体（Chemicon No. AB1980、希釈１：１００）を用いて蛍光免疫分析法に付す。分析により、成長因子を用いなくなって４日後に、細胞の３２％までが、Ｏ４の発現を伴って典型的なオリゴデンドログリア構造を示す。同時に、細胞の４９％までがＧＦＡＰを発現する。さらに、これらの培養物は、神経抗原ベータ−ＩＩＩ−チューブリンに対する抗体（BAbCO No. MMS-435P-250、希釈１：５００）と免疫反応する細胞を含有した。
【００５７】
実施例３：神経球（neural spheres）およびその神経前駆体の発生
３.１．Ｎ２ＥＦ培地中での神経球の発生
Ｎ３ＦＬ培地（段階１.６を参照）中で４〜５日後、細胞を、セル・スクレーパー（Costar Nr. 3008）を用いて機械的に採集する。削り取る前に、細胞をＣＭＦ−ＨＢＳＳで３回（最後の洗浄液は０.１％ＤＮａｓｅを含む）洗浄する。それらを、段階１.６に記載した火炎処理したパスツールピペットを用いて単一細胞浮遊液にトリチュレートする。遠心分離（３００×ｇ、５分間、室温）後、細胞を、Ｎ２ＥＦ培地中、細胞１,２００〜１２,０００個／ｃｍ2の密度で、コーティングしていない細胞培養皿にプレーティングする。この培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、２５μｇ／ｍｌインスリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン、１００μＭプトレッシン、３０ｎＭ塩化セレン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ）、２０ｎｇ／ｍｌヒト組換えｂＦＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＥＧＦ（R&D Systems No. 236-EG）を含有している。毎日、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを各々最終濃度２０ｎｇ／ｍｌまで添加し、２日ごとに培地交換する。培地交換の間に浮遊している球を失わないように、細胞を、室温で３分間、１５０×ｇで沈殿させる。ペレットを新しい培地に再浮遊させ、新しいコーティングしていない細胞培養皿にプレーティングする。
【００５８】
３.２．ＥＳ細胞由来神経球のインビトロ分化
インビトロ分化のために、５日齢のＥＳ細胞由来神経球を室温で３分間１５０×ｇで沈殿させ、ポリオルニチンおよびフィブロネクチンでコーティングした細胞培養皿にプレーティングし、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを添加していない段階３.１に記載した培地中で培養する。ポリオルニチンおよびフィブロネクチンによる二重コーティングは、まず、段階１.６に記載したポリオルニチンで該培養皿にコーティングすることにより行われる。次いで、該培養皿をＰＢＳで３回洗浄し、さらに、１μｇ／ｍｌフィブロネクチンを含有するＰＢＳで２〜１２時間インキュベートする。フィブロネクチン溶液を除去した直後に球をプレーティングしてもよい。プレーティングの１日後、神経球は、典型的には、細胞培養皿に付着した。上清を除去した後、付着した球を新しい培地またはＣＭＦ−ＨＢＳＳで３回洗浄する。次いで、該培養物に新しい培地を添加し、次いで、２日ごとに培地交換する。
【００５９】
プレーティングの５日後に固定された神経球に対して行った蛍光免疫分析により、神経抗原の以下の発現プロフィールが得られた（標識細胞の平均パーセンテージ±ＳＥＭ）：ネスチン陽性神経前駆細胞：６６±３％（アメリカ合衆国ベセスダのNIH、M. Marvin und R.D.G. McKayからの抗体、希釈１：１,０００）；ベータ−ＩＩＩ−チューブリン陽性ニューロン：３４±３％（BAbCOからの抗体 No. MMS-435P-250、希釈１：５００）；ＧＦＡＰ陽性星状細胞：３０±２％（Chemiconからの抗体 No. AB1980、希釈１：１００）；オリゴデンドログリア構造を有するＯ４陽性細胞：６.２±１.７％（Boehringerからの抗体、No. 1518925、希釈１：１０）。
【００６０】
さらに、５日間分化したＥＳ細胞由来神経球から発生したニューロンは、微小管会合蛋白質２（MAP-2、Sigmaからの抗体、No. M 4403およびNo. M 1406、希釈１：２００）および神経伝達物質ＧＡＢＡ（Sigmaからの抗体、No. A-2052、希釈１：７００）およびグルタメート（Sigmaからの抗体、No. G-6642；希釈１：７００）を発現する。ニューロンの６０％までがＧＡＢＡ作動性表現型を示した調製物もあった。１０日間を超えて成長因子の不在下で分化したＥＳ細胞由来神経球の蛍光免疫分析は、また、ニューロンがチロシンヒドロキシラーゼ（Eugeneからの抗体、No. TE101、希釈１：２００）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Chemiconからの抗体、No. MAB305、希釈１：２５０）、セロトニン（Eugeneからの抗体、No. NT102、希釈１：２００）、シナプシン（アメリカ合衆国カリフォルニア州パサデナのDr. M. B. Kennedyからの抗体、希釈１：１,０００）、ペリフェリン（Chemiconからの抗体、No. AB1530、希釈１：１,０００）およびカルビンジン（Sigmaからの抗体、No. C-8666、希釈１：１００）を発現することを示した。球由来ニューロンの分化および生存は、ノイロトロフィン類、脳由来神経栄養性因子（BDNF；２０ｎｇ／ｍｌ；Pepro Tech Inc. No. 450-02）および／またはノイロトロフィン３（NT-3；Pepro Tech Inc. No. 450-03）の添加により促進させることができた。１０日間以上分化したＥＳ細胞由来神経球は、また、環状ヌクレオチド３'−ホスホジエステラーゼに対する抗体（CNPase；Sigmaからの抗体、No. C-5922、希釈１：２００）と免疫反応する分化性乏突起膠細胞を含有していた。
【００６１】
３.３．ＥＳ細胞由来神経球からのグリア前駆体の発生（「タッチダウン培養」）
グリア前駆細胞を発生させるために、段階３.１に記載した含成長因子培地中で増殖した球を、それらが組織培養皿のコーティングしていない表面に付着し始めるまで保持する。これは、通常、球培養の１０〜１４日目に生じる。環形の外殖を個々の球の周囲から分離するとすぐに、穏やかに攪拌することにより該球を細胞培養皿から分離し、ピペットを用いて培養物から取り出す。これらの分離した球を新しいコーティングしていない細胞培養皿にプレーティングしてグリア前駆細胞の環形コロニーをさらに発生させる。このようにして得られたグリア前駆細胞のコロニーを同含成長因子培地中でさらに増殖させる。８０％の集密度に達した後、細胞を、トリプシンを用いずにセル・スクレーパーを用いて採集し、１：５の比で再度プレーティングする。蛍光免疫分析により、このようにして発生したグリア前駆細胞が神経抗原Ａ２Ｂ５（Boehringerからの抗体、No. 1300 016、希釈１：２００）の強い発現を示すことが判明した。それらを、無血清凍結培地（Sigma No. C-6295）中、液体窒素で凍結し、その後、さらに、増殖、移植または分化に付すことができる。
【００６２】
３.４．ＥＳ細胞由来グリア前駆体の標的分化
単一因子によるＥＳ細胞由来グリア前駆体の標的分化を以下の試験によって立証した：
段階３.３に記載したｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で増殖しているグリア前駆体を機械的に採集し、ポリオルニチンコーティングした細胞培養皿に継代し、それらが約５０％の集密度に達するまで増殖させた。次いで、以下の条件下でさらに２日間増殖させた：
１．ＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下で培養を続けた；
２．ＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下で培養を続けた；
３．毎日、ＣＮＴＦ（Regeneron, Inc.；最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加しつつＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下で培養を続けた；
４．毎日、Ｔ３（Sigma No. T 6397；最終濃度３ｎｇ／ｍｌ）を添加しつつＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下で培養を続けた。
【００６３】
２日後、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを２群、３群および４群から取り除き、２日ごとに培地交換しつつ、細胞をさらに５〜７日間増殖させた。全培養物をＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（Sigma No. P-6148）にて固定し、オリゴデンドログリアマーカー抗原Ｏ４および星状細胞抗原ＧＦＡＰに対する抗体を用いて蛍光免疫分析に付した。個々の群について以下の発現プロフィールを得た（平均±ＳＥＭ）。
0004090692.tif 000002
これらのデータは、ＣＮＴＦおよびＴ３を用いて、各々、星状細胞系列およびオリゴデンドログリア系列に向けてＥＳ細胞由来グリア前駆体の分化を誘導できることを示している。
【００６４】
実施例４：乏突起膠細胞／星状細胞前駆体の移植
４．１  移植のための細胞懸濁液の世代
ＥＳ細胞由来の膠前駆体の髄鞘形成ポテンシャルは、以下の実験によって証明された。
２．３に記載のように得られたやや集密的な培養体を細胞スクレーバーでトリプシンを使用しないで採集し、３００ｘｇで５分間の遠心分離によって沈殿させ、０．１％ ＤＮａｓｅを含有するＣＭＦ−ＨＢＳＳ中に再懸濁した。火炎によって仕上げたパスツールピペットを用いて細胞を単一細胞懸濁にトリチュレートし、血球計においてカウントし、再び遠心分離によって沈殿させ、約５０，０００−１００，０００細胞／μｌの濃度で２ｇ／Ｌグルコース（Sigma No. G-7021）を含有するＣＭＦ−ＨＢＳＳ中に再懸濁した。該細胞懸濁液を移植実験の完了まで（すなわち、４−６時間）氷上で維持した。
【００６５】
４．２  胚性ラット脳への脳室内移植
ミエリン欠損ラット（Ian Duncan, Department of Medical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2015 Linden Drive West, Madison, Wisconsin 53706, USA）を移植レシピエントとして使用した。胚性移植の主要な利益は、移植拒絶を誘発することなく異種移植が行われることにある。ミエリン欠損レシピエント動物は、ドナー由来のミエリンを容易に検出することができるという利益を提供する。異種移植片パラダイムの利益は、移植された細胞を容易かつ確実に種特異的ＤＮＡプローブ（Bruestleら、Neuron 15: 1275-1285, 1995）で同定できることにある。胚性脳への子宮内移植の方法は、よく確立されている（Bruestleら、Neuron 15: 1275-1285, 1995；Bruestleら、Current Protocols in Neuroscience, John Wiley, New York, 1997）。
【００６６】
移植のために、妊娠１６または１７日目に妊娠したラットにケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射によって麻酔をかけた。開腹後、ファイバーオプティック光源を用いる徹照下で個々の胚を同定した。記載のように、ドナー細胞を小さいガラスキャピラリー（孔サイズ５０−１００μｍ）中に充填し、キャピラリーを子宮壁および胚性頭蓋を通過させてレシピエント胚の側脳室中に前進させた（Bruestleら、Current Protocols in Neuroscience, John Wiely, New York, 1997）。２ないし９μｌの細胞懸濁液（１００，０００ないし９００，０００細胞を含有する）を脳室系中に注入した。いくつかのまたは全ての胚の移植後、外科的縫合で腹を閉じ、母動物を自然分娩させた。該動物モデルにおけるミエリン欠損はＸ関連の劣性障害であるので、約５０％の雄の仔が冒される。冒された動物は第３週齢で強い震えを発現し、通常、出生後第４週以内に死亡する。
【００６７】
４．３  移植レシピエントの組織学的分析
ドナー由来のミエリン形成を検出するために、出生後第３または第４週のレシピエント動物に麻酔をかけ、標準的方法にしたがって、経心臓的にＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Sigma No. P-6148）を灌流させた。脳を頭蓋から取り出し、同一の固定液中４℃で一晩固定した後、ビブラトーム（vibratome）を用いて５０μｍの切片に切断した。ドナー細胞をマウスサテライトＤＮＡに対するプローブを用いるＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出した（Hoerz & Altenburger, Nucl. Acids Res. 9: 683-696, 1981; Bruestleら、Neuron 15: 1275-1285, 1995）。ドナー細胞由来のミエリンをミエリン塩基性タンパク質（MBP; Boehringer No. 1118099）またはプロテオリピドタンパク質（PLP; Ian Griffiths, Department of Veterinary Clinical Studies, University of Glasgow, Bearsden, Scotlandから提供された）のようなミエリンタンパク質に対する抗体を用いて視覚化した。続いて、ミエリンタンパク質に対する抗体で標識された切片をマウスサテライトＤＮＡに対するプローブを用いるＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに付した（Bruestleら、Neuron 15: 1275-1285, 1995）。該二重標識法により、ドナー細胞由来のミエリンの明確な同定が可能になる。実験は、脳室に移植されたドナー細胞が多種の終脳、間脳および中脳領域に移動することを示した（１４匹の分析したレシピエント動物）。ハイブリダイズした細胞は、例えば、皮質、海馬、中隔、線状体、球、嗅覚器（olfactorius）、視床、視床下部、天蓋、小脳ならびに脳梁、前交連、視索および視神経に見出された。ドナー細胞の空間占有クラスターは、脳室系への移植後に観察されなかった。３５個の移植された胚のうち１１匹の雄の仔がミエリン欠損の徴候を示した。これらのうち８匹が成功した脳室内移植を受けた。これら８匹のうち６匹において、ドナー由来のミエリン形成がＭＢＰまたはＰＬＰ−抗体とハイブリダイズした細胞の二重標識によって証明された。残る２匹の動物において、取り込まれた細胞の数は、二重標識法によるドナー由来のミエリン形成の確実な評価について非常に少なかった。しかしながら、マウス特異的抗体Ｍ２（Zhouら、J. Comp. Neurol. 292:320-330, 1990）を用いるこれらの動物由来の切片の免疫組織化学的スクリーニングは、また、宿主組織において取り込まれたドナー由来の膠細胞を示した。ドナー由来のミエリン形成は、脳梁、前交連および天蓋の交連線維のような線維路において最も著しかった。さらに、髄鞘形成ドナー細胞は、皮質、中隔、視床、視床下部および天蓋のような灰白質領域において検出された。８匹の移植が成功した動物のうち７匹は、また、取り込まれたＥＳ細胞由来の星状細胞を示した。ドナー由来の星状細胞は、マウス特異的抗原Ｍ２（Zhouら、J. Comp. Neurol. 292: 320-330, 1990）およびＭ６（Lundら、Neurosci. Lett. 61: 221-226, 1985）に対する抗体を用いる免疫組織化学によって、または膠線維酸性タンパク質（GFAP; ICN No. 69-110）に対する抗体を用いるマウス特異的ＤＮＡプローブでハイブリダイズされた細胞の二重標識によって検出された。
【００６８】
実施例５：ＥＳ細胞由来の神経球の移植
５．１  ＥＳ細胞由来の神経球のイボテン酸病変ラットへの移植
神経細胞の解剖学的および機能的再構成に対する本明細書に記載のＥＳ細胞由来の前駆体のポテンシャルを評価するために、５日齢の神経球を３．１に記載のようにＥＳ細胞系統Ｊ１から生じさせた。線状体における片側の神経変性を誘導するために予め神経毒素イボテン酸の定位注入に付した成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの線状体に、これらの球を移植した。該病変モデルはよく特徴付けられており、これらの実験に用いられた病変プロトコールは以前に公表されている（Bruestleら、Current Protocols in Neuroscience, Unit 3.10, John Wilev. new York, 1997）。移植のために、遊離した球を細胞培養皿から取り出し、５０ｍｌの試験管に移した。最終濃度０．１％までＤＮａｓｅを添加後、球を室温にて１５０ｘｇで５分間沈殿させ、続いて、ＣＭＦ−ＨＢＳＳ中の２ｇ／Ｌグルコース（Sigma No. G-7021）を含有する０．５ｍｌ試験管に移した。該方法で懸濁された球を移植実験の完了まで（４時間まで）氷上で維持した。レシピエント動物に麻酔をかけ、球を線状体に定位注入した。孔サイズ０．２５−０．７５ｍｍを有するガラスキャピラリーを注入に用いた。該移植プロトコールはよく特徴付けられており、詳細に公表されている（Bruestleら、Current Protocols in Neuroscience, Unit 3.10, John Wiley, New York, 1997）。全部で６匹のレシピエント動物を実験に用いた。試験管の底に蓄積した球をガラスキャピラリー中に充填した。定位フレーム（Stoelting No. 51600）を用いて、細胞を線状体中に注入した。球は病変線状体内の２（ｎ＝３）または５（ｎ＝３）箇所の異なる部位にデリバリーされた。以下の定位的座標を注入に用いた。
【００６９】
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【００７０】
５箇所の移植部位について：
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球懸濁液１０μｌを各部位に移植した。
【００７１】
異種移植片の拒絶を防止するために、レシピエント動物を免疫抑制に付した。移植１日前に開始し、レシピエント動物は毎日、シクロスポリン（サンディマン（Sandimmun）, サンドズ（Sandoz）; ２０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹膜内注射を受けた。免疫抑制の間の日和見感染を防止するために、飲料水をテトラサイクリン（アクロマイシン（Achromycin）, リダール（Lederle）; 最終濃度１００ｍｇ／Ｌ）で補足した。
【００７２】
５．２  移植レシピエントの機能改善の分析
６匹の移植された動物のうち４匹が移植後４週間以上生き延びた。これらの動物におけるアンフェタミン誘発性回転運動の分析により、以下の値を得た（１分あたりの平均回転数）。
【００７３】
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【００７４】
回転運動の評価のために、レシピエント動物はＤ−アンフェタミン硫酸塩（Sigma No. A-3278; ５ｍｇ／ｋｇ体重）の腹膜内注射を受けた。注射後５分で開始し、誘発された回転数を９０分間にわたって計測した。アンフェタミン誘発性回転運動の評価は、線状体移植の機能分析のための確立された方法であり、大量に公表されている（Bruestleら、Current Protocols in Neuroscience, Unit 3.10, John Wiley, New York, 1997）。データは、４匹の動物のうち３匹が病変に誘発される回転を明らかに減少させることを示す。
【００７５】
５．３  移植レシピエントの組織学的分析
組織学的分析のために、レシピエント動物は移植後５−９週間目に麻酔をかけ、標準的方法にしたがって、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで経心臓的に灌流した。脳を頭蓋から取り出し、同じ固定液中４℃で一晩固定した後、ビブラトームを用いて５０μｍの切片に切断した。ドナー細胞は、マウスサテライトＤＮＡに対するプローブを用いてＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出された（Hoez & Altenburger, Nucl. Acids Res. 9:683-696, 1981; Bruestleら、Neuron 15: 1275-1285, 1995）。ハイブリダイズしたドナー細胞を運動分析（５．２）に付した全４匹の動物の移植部位において検出した。ドナー細胞のいくつかは、移植部位から隣接する宿主脳領域、特に脳梁に移動した。動物番号２００において、移植片は拡張した側脳室内に局在した。該動物において、イボテン酸注入は、側脳室の連続的な拡張を伴う著しい線状体萎縮をもたらした。これらの解剖学的変化のため、移植された細胞は線状体の代わりに脳室にデリバリーされた。移植片の間違った局在性は、該動物において観察された回転分析における機能的発現の欠損を説明する。
【００７６】
正のハイブリダイゼーションシグナルに加えて、移植された細胞もまた、マウス特異的神経抗原Ｍ６の強い発現を展示した。該抗原の発現は、特に軸索において著しい（Lundら、Neurosci. Lett. 61: 221-226, 1985; Ｍ６抗原は、C. Langenaur, Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 818A Scaife Hall, Pittsburgh, Pennsylvania 15261, USAによって提供され、１：１０に希釈して使用された）。レシピエント脳において、多くのドナー由来Ｍ６陽性軸索が移植片から隣接する宿主脳組織中へ放出することが見出された。これらの観察は、移植ＥＳ細胞由来の神経球からもたらされるニューロンが宿主脳を刺激することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＥＳ細胞由来神経前駆体の生成の模式図を示す。
【図２】  ＥＳ細胞からの神経球および球由来細胞集団の生成の模式図を示す。
【図３】  ＥＳ細胞のインビトロ増殖および分化後の神経前駆細胞の培養物を示す。
【図４】  ＥＳ細胞由来グリア前駆体の移植後にレシピエント脳から得たビブラトーム切片の様子を示す。
【図５】  ＥＳ細胞由来神経球および球由来細胞集団の培養物を示す。
【図６】  ＥＳ細胞由来神経細胞球から生成したグリア前駆細胞を示す。
【図７】  単一因子の添加による、ＥＳ細胞由来グリア前駆体の標的化分化を示す。
【図８】  インビトロ（Ａ〜Ｂ）およびハンティングトン病の動物モデルであるイボテン酸傷害ラットの神経系への移植後（Ｃ〜Ｄ）のＥＳ細胞由来神経球（ＥＳ細胞株Ｊ１由来）のニューロン分化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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