(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）をコードする植物最適化ヌクレオチド配列を有するヌクレオチドであって、該植物最適化ヌクレオチド配列が、配列識別番号１であることを特徴とするヌクレオチド。
【請求項２】
配列識別番号１に従ったヌクレオチド配列を有する、精製されたＩＣＰ遺伝子。
【請求項３】
前記ＩＰＣ遺伝子がベクターｐＤＡＢ９１７に挿入されていることを特徴とする請求項２に記載の精製されたＩＣＰ遺伝子。
【請求項４】
植物細胞内で発現する合成遺伝子構成物であって、
５’から３’の配列内に、
植物細胞で転写を開始するプロモーター配列と；
翻訳エンハンサー配列と；
配列識別番号１である、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）をコードする植物最適化ヌクレオチド遺伝子配列と；
ポリアデニル化配列とを有し、
前記プロモーター配列、翻訳エンハンサー配列、植物最適化ヌクレオチド配列、およびポリアデニル化配列は、操作可能なようにリンクしていることを特徴とする合成遺伝子構成物。
【請求項５】
前記プロモーターは、誘導プロモーター、構成プロモーター、時間的調節プロモーター、発生的調節プロモーター、組織優先的プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の合成遺伝子構成物。
【請求項６】
前記プロモーターは、ＣａＭＶ  ３５Ｓであることを特徴とする請求項４に記載の合成遺伝子構成物。
【請求項７】
前記翻訳エンハンサー配列は、Ａｄｈｌ．Ｓのイントロンであることを特徴とする請求項４に記載の合成遺伝子構成物。
【請求項８】
前記Ａｄｈｌ．Ｓのイントロンは、Ａｄｈｌ．Ｓのイントロン１またはイントロン６であることを特徴とする請求項７に記載の合成遺伝子構成物。
【請求項９】
殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）をコードする植物最適化ヌクレオチド配列によって植物の細胞が形質転換される遺伝子導入トウモロコシ植物であって、該植物最適化ヌクレオチド配列が配列識別番号１であることを特徴とする遺伝子導入トウモロコシ植物。
【請求項１０】
遺伝性の合成遺伝子をゲノムに持つ植物種子であって、前記合成遺伝子は、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）をコードする植物最適化ヌクレオチド配列を含み、該植物最適化ヌクレオチド配列は配列識別番号１であることを特徴とする植物種子。
【発明の詳細な説明】
本発明は特定の昆虫に有害なバチルス・サーリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質をコードするＤＮＡ配列の設計、合成、植物での発現に関する。さらに詳しくは、本発明は植物での発現に最適化した合成ＤＮＡ配列、植物を形質転換するのに適した合成ＤＮＡ配列を含むベクター、および合成ＤＮＡ配列によってコード化されたタンパクを安定して発現する植物に関する。
発明の背景
広く使用されている微生物殺虫剤は単一の菌株Bacillus thuringiensis（Bt）に由来する。Btはグラム陽性芽胞菌で周芽胞結晶タンパク質の封入を特徴とする。結晶タンパク質はδエンドトキシンとも呼ばれることがあり２種類の態様を有する：分子量（ＭＷ）約１３０キロダルトン（ｋＤ）程度の非毒性プロトキシンと分子量約６８ｋＤの毒性体である。結晶タンパク質の封入は多数の昆虫種の幼虫消化管で活性化するプロトキシンタンパク質を含んでいる。活性化の途中で、プロトキシンが切断され、有毒成分がアミノ先端領域５８〜６８ｋＤポリペプチドに残留する。生体内（in vivo）においては、結晶は昆虫消化管のアルカリ性とプロテアーゼによって溶解することで毒性型に変わり活性化する。
Btにより生産されるタンパク質の毒性は特定の昆虫種に極めて特異的であり脊椎動物に対しては安全であると分かっている。多くの報告で、Btの多くの菌株から単離した芽胞内結晶タンパク質は鱗翅目幼虫や鞘翅目幼虫に対して特異的に極めて高い毒性レベルを有し、５０％の幼虫の成長を阻害するのに必要な有効濃度が多くの感受性昆虫で餌の１ｎｇ／ｍｌの範囲であるとされている（MacIntosh et al.,J.Invert.Pathol.565（1990）258）。
他の微生物宿主でのBtタンパク質遺伝子のクローニング、シーケンシング、発現は説明されている（国際公開番号第ＷＯ９３／０４５８７号、ヨーロッパ特許出願第８９３００３８８．９号、ヨーロッパ特許出願第９０３０４９９３号、米国特許第５，２８６，４８５号）。しかしBt由来の殺虫タンパク質遺伝子の植物における発現は極めて難しく、代表的には遺伝子組換え植物において低いレベルのタンパク質が得られているのみである（Vaeck et al.,Nature,328（1987）33;Barton et al.,Plant Physiol.,85（1987）1103;and Fischoff et al.,Bio/Technology,5（1987）807）。
遺伝子組換え植物における本来のBt遺伝子の低い発現に関して１つの考えられる説明は本来のBtタンパク質遺伝子でのコドン使用法が代表的な植物遺伝子の使用法と有意に異なること（ヨーロッパ特許出願第８９３０９０６９．６号）である。コドン使用法は翻訳、転写、またはｍＲＮＡ処理レベルで遺伝子発現に影響する。
遺伝子組換え植物で本来のBt遺伝子の低い発現レベルについて考えられる別の理由は、異常な形状のｍＲＮＡを発生する偶発的転写処理部位によるものかも知れない（国際公開番号第ＷＯ９３／０７２７８号）。考えられる処理部位としては、ポリアデニル化部位、イントロン・スプライシング部位、転写終了シグナルおよび転位シグナルが含まれる。コード領域におけるこのような処理部位の偶発的発生は遺伝子組換え宿主における遺伝子発現に入り込む可能性がある。
殺虫遺伝子の植物における発現を最適化するために、本来のBt遺伝子を変更して、遺伝子組換え使用とする宿主植物に本来含まれている遺伝子と出来る限り似せるようにする試みが行われて来た。たとえば、Adang et al.への米国特許第５，３８０，８３１号では、Bt本来の殺虫タンパク質と機能的に等価な殺虫タンパク質を遺伝暗号化し、本来のBt遺伝子より高いレベルで植物に発現されるように設計されている化学合成遺伝子を開示している。合成遺伝子は本来のBtの殺虫遺伝子タンパク質とすくなくとも８５％が同等でありコドン使用の分布頻度が高度に発現する植物遺伝子の２５％を越えて逸脱しないまた望ましくは１０％を越えないように設計される。合成遺伝子は、１０〜１５％を越えない程度まで宿主植物の配列から逸脱しないように宿主遺伝子配列の頻度に基づいてＧＣとＴＡの対（ダブレット（doublet））回避指標を有しており、ＧＣ組成は４５％を有している。
国際公開番号第ＷＯ９３／０７２７８号ではコドン使用法を変更してトウモロコシでの遺伝子発現を増加させた合成Bt結晶タンパク質遺伝子を開示している。合成遺伝子はBtの本来の殺虫タンパク質遺伝子と少なくとも６６％が相同で純粋なトウモロコシの最適化遺伝子に対しては９８％まで相同である、合成遺伝子は５０〜６４％のＧＣ組成を有し配列の３’末端にプロリンを含まない。
発明の要約
本発明は鱗翅目昆虫に対して有毒なBacillus thuringiensis HD73タンパク質をコードする植物の最適化したＤＮＡ配列の微生物および植物細胞両方における設計、合成、発現に関する。本発明はさらに、合成遺伝子の設計方法にも関する。植物の最適化ＤＮＡ配列は、５８９ないし６１９個のアミノ酸を有する殺虫植物タンパク質（以下ではＩＣＰと称する）をコードするのに有効なコドンを含む。ＩＣＰを遺伝暗号化するヌクレオチド配列は７０ないし７１％が本来のBtヌクレオチド配列コード化ＩＣＰに対して相同で純粋なトウモロコシヌクレオチド配列に対して６３％相同である。植物の最適化ヌクレオチド配列でのコドン使用法は宿主植物のそれから０．２３ないし３．４８、望ましくは１．０７５の偏差を有する。
本発明は植物細胞たとえばトウモロコシで発現させることの可能な植物発現ベクターにも関する。植物発現ベクターは、５’から３’への配列に、植物細胞での転写開始に有効なプロモーター配列、トウモロコシに特異的な翻訳エンハンサ配列、第一のベクターにユニークな制限酵素切断部位、６２０アミノ酸以下が代表的でBtＩＣＰのアミノ近位部分と実質的に相同とするのが望ましいタンパク質を遺伝暗号化するための遺伝暗号配列、第２のベクターにユニークな制限酵素切断部位、およびポリアデニル化配列を含む。
本発明の別の態様は、遺伝子組換え植物および遺伝子組換え植物の種子に関する。遺伝子組換え植物および遺伝子組換え植物からの種子は、そのゲノムに本明細書で説明する遺伝性合成Bt遺伝子を含む。このBt合成遺伝子は鱗翅目昆虫の制御に充分な量で、植物細胞または遺伝子組換え植物の種子から成長した植物の細胞に発現する。
本発明はまた、植物特にトウモロコシで最適に発現するようにあらゆる構造化遺伝子を操作する方法も提供する。遺伝子コードの冗長性による可塑性（即ちある種のアミノ酸が１つ以上のコドンで指定される）のため、本発明では何らかの遺伝子の遺伝子配列を修飾して得られた発現されるタンパク質が変化しないが、特定の植物または昆虫でタンパク質の発現を最適化するようにコドンが変更されるようにする。
本発明の方法を実施する際に、植物のコドン・バイアスを決定する。コドン・バイアスは植物がタンパク質を遺伝暗号化するために使用している統計的なコドン分布である。バイアスを決定した後、問題とする遺伝子たとえば本来のBacillus thuringiensisでのコドンのパーセント頻度を決定する。問題のタンパク質のアミノ酸配列順序を逆転写して、本来の遺伝子と同じタンパク質のものについて得られたヌクレオチド配列暗号を暗号化するが、得られたヌクレオチド配列は所望の植物の第１の好適なコドンに対応するようにする。新規配列は変更によって作り出されたであろう制限酵素部位について分析する。識別された部位はコドンを第２または第３の選択肢の好適なコドンで置き換えることによりさらに変更する。問題の遺伝子の転写または翻訳に影響すると思われる配列内の他の部位はエクソン：イントロン５’または３’結合部、ポリＡ追加シグナル、またはＲＮＡポリメラーゼ末端シグナルである。シーケンスはＴＡまたはＧＣ対の頻度を下げるようにさらに分析し変更する。対に加えて４個以上の同一であるアミノ酸残基を有するＧまたはＣ配列ブロックは配列の転写に影響することがある。したがってこれらのブロックも第１または第２の選択肢のコドン等を次の好適な選択肢のコドンで置き換えることによって変更する。上述の方法によって当該技術の熟練者であれば特定の植物にとって異質な遺伝子を変更して当該遺伝子が植物で最適に発現するように出来る。
本発明の包括的目的は昆虫による損傷から植物を保護する手段を提供することにある。さらに詳しく説明すると、本発明の特定の目的は配列識別番号１においてヌクレオチド配列を有するBtから殺虫タンパク質を遺伝暗号化するトウモロコシの最適化したヌクレオチド配列を提供することである。
本発明はさらに、３５Ｓまたは１９Ｓプロモーターよりさらに効率的なBt結晶タンパク質またはBt殺虫結晶タンパク質ならびに他のプロモーターで使用するようにさらに修飾できるＭＳＶリーダー配列を含め、異種タンパク質を発現させる２重拡張３５Ｓまたは１９Ｓプロモーターを提供する。
別の態様において、本発明は何らかのプロモーターの発現を拡張するために使用できるリーダー配列を提供する。
本発明のその他の態様、利点、特徴および特性は以下の説明と添付の請求項を勘案することで一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１はＰＣＲ合成法を示す。図１Ａは修飾ＩＣＰ遺伝子のグラフ表現でバーの上に重要な制限部位を示し、その下の数字は遺伝子での位置を表わす。別々に合成された３角遺伝子部分が遺伝子の下に図示してあり、各々の部分の末端に組み込まれるクローニング部位は各々のフラグメントの末端に図示してある。図１ＢはＩＣＰ遺伝子の５’末端フラグメントのＰＣＲ合成を説明している。合成に用いる１２オリゴヌクレオチドが矢印で示してある。矢印の方向は新生ＤＮＡストランドの合成極性に対応する。遺伝子フラグメントにおける各オリゴヌクレオチドの位置は括弧の間に示してあり、一番下のオリゴヌクレオチドの組のヌクレオチド位置の逆順が遺伝子の一番上の（遺伝暗号化）ストランドへの逆相補性を表わす。
図２はＰＡＧＥ変性によるＩＣＰオリゴヌクレオチドの生成から得られたゲルを示す。ＩＣＰオリゴヌクレオチドBt６からBt１０を実施例１に説明するような１２％変性ＰＡＧＥ上の電気泳動で分画化した。オリゴヌクレオチドの同一性は各々のレーンの上に図示してあり、各々の（ヌクレオチドの）サイズがレーンの下に図示してある。追跡染料キシレン・シアノール（ＸＣ）とブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）の易動性は右側に示してある。
図３はＩＣＰ遺伝子の３つの部分の合成の進行状況を示すゲルを示す。各々のセクションで、ＰＣＲステップ１〜６（５’および３’セクション）または１〜５（中央セクション）の生成物が１〜６または１〜５と表記してある各々のレーンに図示してある。各々のレーンは直前のＰＣＲステップから生成したＤＮＡゲル５μｌを含む。ゲルの外側で印のついていないレーンは１００ｂｐラダーＤＮＡサイズ標準（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含む。
図４は大腸菌E.coliにおけるＩＣＰ発現を表わすゲルを示す。細胞質発現ベクターからE.coli細胞に発現したＩＣＰを、実施例４で説明するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法で分析した。レーン１は細胞質発現ベクターを発現するE.coli細胞からのタンパク質抽出物の約５０ｎｇペレットに対応するE.coli全細胞タンパク質量を含む。レーン２は細胞質発現ベクター抽出ペレット約５０ｎｇを含む。レーン３はペレット抽出物約１０ｎｇを含む。陰性コントロールのレーン４はｐＥＴ−９ｄを発現するE.coli細胞の抽出物ペレット１００ｎｇを含む。レーン５，６，７は各々精製した本来のBtＩＣＰを各々２０，５０，１００ｎｇ含む。
図５はManduca sextaバイオアッセイの結果を説明するグラフ表現である。アッセイにはE.coli抽出タンパク質（ｐＥＴ−９ｄペレット）を各々５００ｎｇ供給し、ＩＣＰ細胞質発現プラスミド細胞質発現ベクター（ＣＥＶペレット）、細胞質発現ベクター発現セル（ＣＥＶセル）、本来のＩＣＰ（Btタンパク質）を含む細胞からの抽出物のペレットタンパク質は実施例６に説明してあるように実施した。幼虫の重量と死亡率は新生幼虫を食事制限してから４日後にスコア化した。
図６は実施例７でさらに説明するプラスミド・ベクターｐＤＡＢ９１０のマップを示す。
図７は実施例７でさらに説明するプラスミド・ベクターｐＤＡＢ９１１のマップを示す。
図８は実施例７でさらに説明するプラスミド・ベクターｐＤＡＢ９１７のマップを示す。
図９は遺伝子組換えＭＳＤカルスでのＩＣＰ発現を示すゲルである。ＭＳＤカルス単離で発現したＩＣＰは実施例８で説明するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法で検出した。レーン１からレーン７はMSDライン＃４のプラスミドｐＤＡＢ９１１による形質転換で得られたとうもろこし単離のカルス抽出物を含み、レーン８は非形質転換MSDライン＃４のカルス抽出物を含み、レーン９とレーン１０は各々１０ｎｇと１ｎｇの精製ＩＣＰを含む。
図１０は実施例７でさらに説明するプラスミド・ベクターｐＤＡＢ３０３のマップを示す。
図１１はプラスミドｐＫＡ８８２、ＰＤＡＢ３０５、ｐＤＡＢ３１０、ｐＤＡＢ３４８、ｐＤＡＢ３５３で調べたプロモーターの幾つかのマップを示す。さらに詳しくは、ｐＫＡ８８２は、ＣａＭＶｎｔｓ６６０５から７４３９（ＭＣＡＳＴＲＡＳ）で実施される本来の３５Ｓプロモーターを含み、これにリンカー配列Ａ（配列識別番号３）が続き、
0004030582.tif 000002
ＮｃｏＩ認識配列内にコード化されたＡＴＧ（下線部分）がＧＵＳ翻訳開始コドンである。このプロモーターからの転写は５’未翻訳リーダー配列として基本的に上記のポリリンカー配列を含む。
ｐＤＡＢ３４８は追加３’配列がありＣａＭＶＤＮＡの７０９３から７３４４として実現される拡張３５Ｓプロモーター、リンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３から７４３９を含み、上記のリンカー配列Ａが続く。
ｐＤＡＢ３０５は追加3'配列がありＣａＭＶＤＮＡのヌクレオチド７０９３から７３４４として実現される拡張３５Ｓプロモーター、リンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３から７４３９、リンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧ（配列識別番号４）、ＭＳＶのヌクレオチド１６７から１８６、ＭＳＶのヌクレオチド１８８から２７７、Ｃ残基とこれに続くトウモロコシＡｄｈ１．ｓのヌクレオチド１２０から２１０、トウモロコシＡｄｈ１．ｓのヌクレオチド５５５から６７２、リンカー配列ＧＡＣＧＧＡＴＣＴＧ（配列識別番号５）、ＭＳＶのヌクレオチド２７８から３１７、ＮｃｏＩ認識配列ＣＣＡＴＧＧの最終基部を表わすＧ残基を含む。前述の通りＧＵＳ翻訳開始コドンはＮｃｏＩ部位の一部である。このプロモーターからの転写は５’未翻訳リーダーとして基本的にＭＳＶ被毛タンパク質リーダー配列を含み、これにはトウモロコシＡｄｈ１．Ｓイントロン１の欠失されたバージョンが挿入されている。
ｐＤＡＢ３１０は追加３’配列がありＣａＭＶＤＮＡの７０９３から７３４４として実現される拡張３５Ｓプロモーター、リンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３から７４３９、リンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧ（配列識別番号６）、ＭＳＶのヌクレオチド１６７から１８６、ＭＳＶのヌクレオチド１８８から３１７、ＮｃｏＩ認識配列ＣＣＡＴＧＧの最終基部を表わすＧ残基を含む。前述の通りＧＵＳ翻訳開始コドンはＮｃｏＩ部位の一部である。このプロモーターからの転写は５’未翻訳リーダーとして基本的にＭＳＶ被毛タンパク質リーダー配列を含む。
ｐＤＡＢ３５３は追加３’配列がありＣａＭＶＤＮＡの７０９３から７３４４として実現される拡張３５Ｓプロモーター、リンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３から７４３９、リンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧ（配列識別番号７）、トウモロコシＡｄｈ１．ｓのヌクレオチド１２０から２１０、トウモロコシＡｄｈ１．ｓのヌクレオチド５５５から６７２、配列ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧ（配列識別番号８）を含む。前述のように、ＧＵＳ翻訳開始コドンはＮｃｏＩ部位の一部である。このプロモーターからの転写は５’未翻訳リーダーとして基本的ＭにトウモロコシＡｄｈ１．Ｓイントロン１の欠失されたバージョンを含む。
発明の詳細な説明
定義
以下の定義は本明細書および請求項における意図または使用範囲として明確さを提供するために設けたものである。本明細書で参照する全ての特許および公開は本明細書の参照に含まれる。
「結晶タンパク質」または「殺虫結晶タンパク質（ＩＣＰ）」または「結晶毒素」はBt菌株に形成される傍芽胞結晶の主要なタンパク質成分を表わす。このタンパク質成分はさまざまな昆虫種に対して選択毒性を呈する。傍芽胞結晶から分離した主タンパク質の分子サイズは由来するBtの菌株によって変化する。分子量１３２，６５，２８キロダルトンの結晶タンパク質が報告されている。１３２ｋＤａのタンパク質が６５ｋＤａのアミノ基昆虫毒素形成に付随するプロトキシンであると分かっている。
「結晶タンパク質遺伝子」は遺伝子が由来するBtの菌株によって、全長プロトキシンまたは毒素のどちらかで殺虫結晶タンパク質をコードするＤＮＡ配列を表わす。
本明細書で用いている術語ヌクレオチドは、糖成分（ペントース）、リン酸、窒素ヘテロサイクリック塩基から構成されるＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位を表わす。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１位炭素）を介して糖に結合する。塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドと呼ばれ、塩基はヌクレオチドを特徴付ける。４つあるＤＮＡ塩基はアデニン（Ａ）グアニン（Ｇ）シトシン（Ｃ）チミン（Ｔ）である。ＲＮＡでの４塩基はＡ、Ｇ、Ｃとウラシル（Ｕ）である。
「構造化遺伝子」はタンパク質、ポリペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡセグメントを含み、転写開始を指示する５’配列を含まない遺伝子の部分を指す。構造化遺伝子は細胞内で普通に見られる遺伝子か、またはこれが導入された細胞内の位置で普通には見られない遺伝子で、導入された場合には「異種」遺伝子と呼ばれる。異種遺伝子は全体または一部が従来技術で分かっている何らかの供給源に由来するもので、供給源は菌ゲノムまたはエピソーム、真核生物、核またはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、または化学合成ＤＮＡを含む。構造化遺伝子は遺伝暗号または非翻訳領域のどちらかに１つまたは２つ以上の変更を含むことがあり、これが発現生成物の生物学的活性または化学構造、発現率または発現制御の方法に影響することがある。このような変更には、１つまたは２つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、置換を含みこれだけに制限されない。構造化遺伝子は中断されない（uninterrupted）遺伝暗号配列を構成するか、または適切なスプライス結合部で区切られた１つまたは２つ以上のイントロンを含むことが出来る。構造化遺伝子は複数の供給源（自然発生的または合成、ただし合成は化学的に合成されたＤＮＡを表わす）に由来するセグメントの複合体であることがある。構造化遺伝子は融合タンパク質をコードすることもある。
「動作的に結合（operably linked）」は成分がその通常の機能を実行するように構成された近位を表わす。つまり、遺伝暗号配列に動作的に結合した制御配列は遺伝暗号配列の発現に影響を与えることが出来る。
植物組織（plant tissue）は植物の分化および未分化組織を含み、これには根、茎、葉、花粉、種子、腫瘍組織や培養でのさまざまな態様の細胞たとえば単細胞、プロトプラスト、胚芽、カルス組織を含みこれらに限らない。植物組織は植生または器官、組織、または細胞培養とすることが出来る。
本明細書で用いている植物細胞には植生の植物細胞および培養された植物細胞やプロトプラストを含む。
「配列相同性」はヌクレオチドまたはアミノ酸配列順序の同一性または近同一性を表わす。当該技術で考えられているように、ヌクレオチドの不一致はコドンで第３のまたは揺らぎ塩基において発生することがあり最終的ポリペプチド配列でのアミノ酸置換を起さない。また、遺伝子配列のある種の領域で僅かなヌクレオチド変更（たとえば置換、挿入、または欠失）はこのような変更によって最終生成物の機能を変更しないようなアミノ酸配列順序の変化が得られる場合には許容することが出来る。遺伝子配列全体またはその一部の化学合成したコピーが遺伝子機能の損失なしに天然遺伝子の対応する領域を置換できることが示されている。特定ＤＮＡ配列の相同性は従来技術で良く理解されているように当該技術の熟練者には厳密な条件下で核酸のクロスハイブリダイゼーションの試験を用いて識別できる（Hames et al.,Nucleic Acid Hybridisation,（1985）IRL Press,Oxford,UKに記載されている）。相同性の範囲は比較する配列間の同一性の比率として測定されることが多い。
「好適なコドン」または「好適コドン使用頻度」はヌクレオチドコドンの使用に際して任意のアミノ酸を指定するために特定の宿主細胞が呈する選択性を表わす。遺伝子内の特定コドンの使用頻度を決定するには、遺伝子内でそのコドンの発生回数を、遺伝子内の同じアミノ酸を指定する全てのコドンの発生総数で除算する。宿主細胞が呈する好適コドン使用頻度はその宿主細胞で発現した多数の遺伝子での好適コドンの使用頻度を平均化することによって計算できる。
合成遺伝子について好適コドンの使用頻度の宿主細胞で使用される頻度からのパーセント偏差は、第１に宿主細胞の使用頻度から単一コドンでの使用頻度のパーセント偏差を決定し、続けて全コドンに対する平均偏差を求めることで計算できる本明細書で定義しているように、この計算にはユニークなコドン（即ちＡＴＧとＴＧＧ）を含む。一般的な意味で、宿主細胞の使用頻度からの合成遺伝子のコドン使用の平均合計偏差は次式を用いて計算する：
0004030582.tif 000003
ここで、Ｘｎ＝宿主細胞におけるコドンｎの使用頻度；Ｙｎ＝合成遺伝子におけるコドンｎの使用頻度とし、ｎはアミノ酸を指定する個別のコドンを表わし、コドンの総数はＺである。
術語「純粋に植物に最適化したヌクレオチド配列」は特定のポリペプチドについて宿主植物に好適なコドン配列を１００％含む遺伝子またはＤＮＡ配列を表わす。「純粋にトウモロコシに最適化した配列」はトウモロコシの好適コドン配列を１００％含む遺伝子またはＤＮＡ配列である。
本明細書で用いている「植物に最適化したヌクレオチド配列」は純粋に植物に最適化した配列の変化から産生された遺伝子またはＤＮＡ配列を表わす。ここで説明しているような変化には、遺伝子操作を許容する純粋に植物に最適化したヌクレオチド配列の変更、たとえばヌクレオチドを変更して制限部位の作成または除外する等と、潜在的に有害な処理部位たとえば潜在的なポリアデニル化部位またはイントロン・スプライシング認識部位を排除する変化が含まれる。「トウモロコシに最適化したヌクレオチド配列」は純粋にトウモロコシに最適化した配列の変化から産生した遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。本発明の１つの態様において、植物に最適化したヌクレオチド配列は本来のBtヌクレオチド配列をコードするＩＣＰと７０％から７１％が相同であり、第１選択コドン使用に基づくと６３％が相同、また純粋にトウモロコシに最適化したヌクレオチド配列に対しては８３％が相同である。
「由来する」は（化学的および／または生物学的）供給源から取る、取得する、受け取る、追従する、複製する、または受け継ぐことを表わすために用いる。派生物はオリジナル供給源の化学的または生物学的操作（置換、追加、挿入、欠失、抽出、単離、突然変異、複製を含みこれに限定されない）により産生される。
ＤＮＡの配列に関して「化学合成」は要素ヌクレオチドが試験管内で組み立てられたことを表わす。ＤＮＡの用手的化学合成は充分に確立された手順を用いて実施される（Caruthers,Methodology of DNA and RNA Sequencing,（1983）,Weissman（ed.）,Praeger Publishers,New York,Chapter １）。自動的化学合成は多数の商業的に入手可能な装置の１つを用いて行うことが出来る。
本明細書で用いている術語「高度に発現するように設計された」は、全長特異ｍＲＮＡ転写産生量がノーザンブロット法で定量するのに充分な量になるような設計遺伝子の発現レベルを表わし、言うなればポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡのおよそ０．００１％より多いかまたは等しい量に対応する発現特異ｍＲＮＡのレベルを表わしている。本発明以前に、天然Bt遺伝子は産生全長特異ｍＲＮＡの量がノーザンブロット法を用いて推定するには不十分なレベルでしか転写されなかった。しかし、本発明では、高度に発現するように設計されトウモロコシに最適化した合成BtＩＣＰ遺伝子の転写は供給した昆虫を殺滅するまで充分に高いレベルのＩＣＰが蓄積する範囲に増加している。
トウモロコシに最適化したBtＩＣＰ遺伝子配列の設計
本明細書に記載する設計および合成の方針は植物、特にトウモロコシに最適化したＩＣＰ遺伝子の設計および合成のための一般に好適な方法を表わす。本プロトコルへの変更が他の植物種における発現のためのＩＣＰ遺伝子の設計および合成に向けて甚だしい経験がなくとも可能であることが当該技術の熟練者には理解されよう。
Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD73由来ＩＣＰ遺伝子のＤＮＡ配列を、Adang et al.,Gene,36,（1985）289で報告されているように、トウモロコシに最適化したBtＩＣＰ遺伝子の設計の開始配列として用いた。得られたトウモロコシに最適化したBtＩＣＰ遺伝子は配列識別番号１として識別される。トウモロコシに特異的な最適化殺虫遺伝子配列は６３％の第１選択コドンと、２２％から３７％の間の第２選択コドンと、１５％から０％の間の第３および／または第４選択コドンとを含み、合計比率が１００％となる。さらに詳しく説明すると、トウモロコシに特異的な最適化殺虫遺伝子配列は６３％の第１選択コドン、２２％から３７％の間の第２選択コドン、１５％から０％の間の第３選択コドンを含み、合計比率が１００％となる。もっとも望ましくは、トウモロコシに特異的な最適化殺虫遺伝子配列は、６３％の第１選択コドン、少なくとも２２％の第２選択コドン、７．５％の第３選択コドン、７．５％の第４選択コドンを含み、これで合計比率が１００％となる。
さらに詳しくは、B.thuringiensis CrylA（c）を開始材料に使用した。自然遺伝子の基本組成の分析により、トウモロコシ遺伝子との有意な不同性が明らかになった。たとえば、自然ＩＣＰ遺伝子のグアノシン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）組成は３７％、これに対してトウモロコシ遺伝子はＧ＋Ｃの範囲が４５％〜７５％だった（表１）。
0004030582.tif 000004
表１のデータから、遺伝子の暗号化領域がGenBank（Release 71）エントリから抽出され、MacVector（tm）プログラム（IBI,New Haven,CT）を用いて基本組成を計算した。イントロン配列は計算上無視した。グループＩとグループIIストレージタンパク質遺伝子配列はこれらの基本組成で顕著な差によって識別した。
自然BtＩＣＰ遺伝子の非常に低いＧ＋Ｃ組成（結果的に高いＡ＋Ｔ組成に向って歪む）によって非常に多くＡ＋Ｔを含むことが分かっている植物遺伝子制御配列の模倣または複製を行う配列を生成する。導入遺伝子のＤＮＡ内部で何らかのＡ＋Ｔが高濃度の配列の存在は（たとえば遺伝子プロモーターに通常見られるようなTATAボックス領域等）によって遺伝子の異常な転写が行われる。一方で、転写されるｍＲＮＡに残存する他の調節配列の存在（たとえばポリアデニル化シグナル配列ＡＡＵＡＡＡまたはプレｍＲＮＡスプライシングに関係する小さい各ＲＮＡに相補的な配列）がＲＮＡの不安定を招来する。したがってトウモロコシに最適化したBtＩＣＰ遺伝子設計の１つの目標は高いＧ＋Ｃ組成を有するＤＮＡ配列を生成することであり、望ましくは代謝酵素について暗号化するトウモロコシ遺伝子の配列に近い配列を生成することである。トウモロコシに最適化したBtＩＣＰ遺伝子設計の別の目標は高いＧ＋Ｃ組成を有するだけではなく、配列の変更によって翻訳を既存しないように変更が行われるべきＤＮＡ配列を生成することである。
遺伝子コードの冗長性によって影響される可塑性のため（即ちある種のアミノ酸が１つ以上のコドンで指定される）、異なる生物または生物クラスのゲノムの進化は冗長コドンの異なる使用方法をもたらした。この「コドンバイアス」はタンパク質暗号化領域の平均基本組成に反映されている。たとえば、比較的低いＧ＋Ｃ組成の生物は冗長コドンの第３位にＡまたはＴを有するコドンを使用し、高いＧ＋Ｃ組成を有する生物では第３位にＧまたはＣを有するコドンを使用する。遺伝子のｍＲＮＡ内部の「マイナー」コドンの存在は、特にそのマイナーコドンに対応するチャージｔＲＮＡの相対量が低い場合に、そのｍＲＮＡの絶対翻訳レートを減少することがある。この延長範囲は、個別のマイナーコドンによる翻訳レートの減少が少なくとも複数のマイナーコドンで加算的になる。したがって、高い相対量のマイナーコドンを有するｍＲＮＡはこれに対応して低い翻訳レートとなる。このレートはコードされるタンパク質の低レベルの合成によって反映されることになる。
BtＩＣＰ遺伝子のコドン組成とトウモロコシ遺伝子のコドン組成との比較（表２）ではコドン・バイアスの大きな離散が明らかになる。
0004030582.tif 000005
例外なく、Bacillus遺伝子に存在する何らかの冗長コドンが好適ではないトウモロコシ・コドンである。コドン・バイアスに見られるこれらの相違は２つのコドン選択しか存在しないような場合に特に顕著である（即ちGlu,Asp,Lys,Asn,Cys,Tyr,Phe,Gln,His）。
トウモロコシに最適化したBtＩＣＰ遺伝子の設計において、トウモロコシ遺伝子ＤＮＡ配列について編集したコドンバイアスの表から設定した非冗長性汎用コードを用いてＩＣＰのアミノ酸配列順序をＤＮＡ配列に逆翻訳した。得られたＤＮＡ配列は、コドン使用で完全に相同だったが、５箇所の反復配列をさらに変更して、高度のコドン多様性を有する以外にも、意図的に配置された制限酵素認識部位と望ましい基本組成と遺伝子の転写または産生ｍＲＮＡの翻訳を阻害するかも知れない配列の欠除とを含むＤＮＡ配列を作成した。
Mze HD73 #1 trnc：好適なトウモロコシ・コドンを含むＩＣＰ遺伝子の合成
新規のＩＣＰ遺伝子配列を作成する開始点として、「トウモロコシ遺伝コード」を作成し、各々のアミノ酸が表２からもっとも共通に発生するトウモロコシ・コドンに基づいて選択されたユニークなコドンで指定されるようにした（「トウモロコシ％」のカラムで下線のついた数値としての頻度）。未変性BtＩＣＰ・ＤＮＡ配列をこれに対応するタンパク質配列に翻訳し、アミノ末端６１０アミノ酸（ＩＣＰで最小限の殺虫性ペプチドを含む）はトウモロコシ遺伝コードに基づいた新規のＤＮＡ配列へ逆翻訳した。この配列は、Mze HD73 #1 trncと呼ばれ、全体として「好適な」トウモロコシコドンから構成されることになり、Ｇ＋Ｃ組成が６６％で、「代表的な」トウモロコシ遺伝子より幾分高い（表１参照）。新しいＤＮＡ配列は未変性BacillusＩＣＰＤＮＡ配列から６２４箇所の塩基を変更している。
Mze HD73 #2 trnc：酵素認識部位の除外
制限酵素BamH I、Bgl II、Bcl I、Nco Iは遺伝子発現カセットの構成に日常的に用いられている。そのため問題のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がこれらの酵素の認識部位を含まないことが望ましい。Mze HD73 #1 trncのＤＮＡ配列分析によって３箇所のBcl I部位、３箇所のBgl Ｉ部位、２箇所のBgl II部位、１箇所のBamH I部位、１箇所のNco Ｉ部位の認識配列が明らかになった。これらの部位を除外するような方法でのＤＮＡ配列の変更によって「好適な」トウモロコシ・コドンではなくむしろ第２選択またはそれ以下のコドンであるようなコドンの使用が必須になる。たとえば、配列の内のヌクレオチド２４９はＧからＣへ変更し、ＣＴＧから（好適なトウモロコシ・コドン、３１％存在する。表２）ＣＴＣへ（第２に高頻度で使用されるロイシン・コドン、２８％の出現率）ロイシン・コドンを変更した。この単一の変更でBcl I認識部位を除外し重複するPvu II部位も除外される。１２箇所のその他の変更とそれらの理論的根拠を表３に掲載する。
0004030582.tif 000006
得られた配列はMze HD73 #2 trncと呼ばれ、Mze HD73 #1 trncと同一のタンパク質をコードした。
配列の分析ではBamH I、Bgl II、Bcl I、Nco I、または幾つかのその他共通に使用される酵素の認識部位は見付からなかった。また分析では、Mze HD73 #2 trncのＩＣＰ暗号化ストランドが読み込みフレーム１と３でオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）全体を含むことが分かった。フレーム１のＯＲＦはＩＣＰのそれに対応し、配列に行った変更によって停止コドンが不用意に生成されることはないと確認している。フレーム３での単一のＯＲＦはＩＣＰ開始コドンのＧではじまり、配列の最後まで中断されることなく継続する。
Mze HD73 #3 trnc：合成を容易にする酵素認識部位の変更
現行技術（自動化と酵素ＤＮＡ合成の組み合わせを使用する）では、試験管内で合理的に合成することの出来るフラグメントのサイズについて数百塩基対の範囲が上限となっている。したがって、ＩＣＰでＤＮＡ配列の１８３０塩基対を幾つかのセクションに分割し、各々のセクションが適当な制限酵素認識配列によって区切られるようにする必要がある。これらの部位の間隔は、対応するＤＮＡフラグメントが試験管内で簡単に合成また操作できるようなサイズとなるようにする。部位の導入は、Mze HD73 #2の配列に６塩基の変更を導入して実現した（表４に要約してある）。
0004030582.tif 000007
これらの変更は３か所のSst II部位のうちの２か所を排除し（適切に配置されたユニークなSst II部位を残す）、また適当な間隔で制限酵素認識部位を新たに作成するために行った。またこれらの変更はコードされたタンパク質のアミノ酸配列順序を変更しておらず、何らの非常に低い頻度のトウモロコシ・コドンも使用していない。新規の部位の位置を同定するために用いた戦略はコドン使用頻度の分析に基づいたものだった（表２）。並置した時に制限部位を生成した好適な、または頻繁に使用されるトウモロコシ・コドン対を選択した。たとえば、コドンＣＴＣ（Leu）とＧＡＧ（Glu）のコドン対はXho I認識部位を形成し（ＣＴＣＧＡＧ）、ＧＴＣ（Val）とＧＡＣ（Asp）のコドン対はSal I部位（ＧＴＣＧＡＣ）を形成する。ＩＣＰ配列の分析では残基２１５／２１６にLeu/Glu対を同定し、残基４０７／４０８にVal/Asp対を同定した。適当な塩基置換を行ってこれらの部位で認識配列を生成した（表４）。この遺伝子（Mze HD73 #3 trunc）の配列分析でバージョン＃２と同じＯＲＦが見出だされた。
エクソン：イントロン５’結合（ＡＧ：ＧＴＡＡＧＴ）で植物のコンセンサス配列を用いたMze HD73 #3 trncのＤＮＡ配列の検索では、６２９〜６３２で４／８の一致［ＧＧＴＡ］、また他の８箇所の位置で３／８一致［ＧＧＴ］が見られた。６２９での（Ｔ）ＧＧＴＡ（Ｃ）はコードされたアミノ酸を変化させることなく変更できなかったが、これは遺伝コードがユニークなTrpコドン（ＴＧＧ）を使用しているためと、後続のTyrの両方のコドンがＴＡで始まる［ＴＡＣとＴＡＴ］ためである。しかし、配列ＧＧＴＡは、コンセンサス配列の５’Ａ残基が植物と動物ＲＮＡ両方でのスプライス認識部位で高度に保存されるためとＧＧＴＡ配列がE.coliβグルクロニダーゼ遺伝暗号化領域（植物細胞でうまく発現する）に発生し、またトウモロコシ・アルコール脱水素酵素（Adh）１のエクソン１に発生するため、スプライス認識部位として用いるには恐らく充分であるとは言えない。さらに、ＧＧＴＡはある種の植物遺伝子で自然発生的に見付かるKpn I認識部位［ＧＧＴＡＣＣ］全体の一部と見られるので、それ自体が潜在的にスプライス・ドナー部位を表わすことはないと思われる。
Mze HD73 #3 trncのＤＮＡ配列を、ポリＡ追加部位シグナルコンセンサスＡＡＴＡＡＡに類似またはこれと同一の配列について検索した。自然ＩＣＰ遺伝子配列では完全な一致が発見できたが、工学配列またはMze HD73 #3 trncでこれの短縮板（ＡＡＴＡまで）には相同性が見付からなかった。
テンプレートCAN ATGNNAAを用いてＲＮＡポリメラーゼＩＩ末端配列の配列類似性を検索した。ここでＮはＤＮＡに見られる４塩基のいずれかを表わす。Ｎを７から９に設定したいずれのレベルでも一致が見られなかった。
ｍＲＮＡでストランド内自己相補構造（ヘアピン）の形成が翻訳中にｍＲＮＡに沿ったリボゾームの進行を阻害すると考えられ、ヘアピン形成ＣＴＴＣＧＧとこれの相補的同一ストランドＣＣＧＡＡＧが特に不利であると考えられる。ＣＴＴＣＧＧの完全な一致が２箇所Mze HD73 #3 trncに見付かった（２０１〜２０６と１７０７〜１７１２）。しかし、ＣＣＧＡＡＧ、ＣＣＧＡＡ、ＣＧＡＡＧ、またはＣＧＡＡへの一致は見られなかった。ヘアピンの重要性は不確定であるため、ＩＣＰ配列は他のいずれかの自己相補性配列ブロックで検証されなかった。
Mze HD73 #3 trnc：ＴＡまたはＧＣ対の排除
真核生物遺伝子はヌクレオチド対ＴＡとＧＣで比較的不完全であり、ヌクレオチド対ＴＧとＣＴが豊富である。２つの「好適な」トウモロコシ・コドン（表２）だけがＴＡまたはＣＧ対を含んでいる：ＴＡＣ（Tyr）とＣＧＣ（Arg）である。合成配列でこれらのコドンを使用すると排除しようと思っている対の生成が必要になる。したがって、好適コドンを用いる利点は過剰の「禁止」対を作成する弊害に対して均衡しなければならない。Tyrの場合、第２選択コドンによる置換はＴＡ対を排除しないが、これはそのコドンの組成でもあるため（ＴＡＴ）である。しかしArgの場合には、第２選択コドン（ＡＧＧ）がトウモロコシでは第１選択コドンより僅かに少ない頻度で用いられているので（２６％に対して４０％の箇所）ＣＧＣのＡＧＧによる置換が完了した。ＴＡまたはＣＧ対を含むその他のコドン［ＧＴＡ（Val）；ＡＴＡ（Ile）；ＴＡＧ、ＴＡＡ（End）；ＴＴＡ、ＣＴＡ（Leu）；ＧＣＧ（Ala）；ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ（Art）；ＡＣＧ（Thr）；ＣＣＧ（Pro）］は暗号化領域での使用（たとえば停止コドン）に受け入れられないか、コドン・バイアス配列に含めるのに好適でないほどまれにしかトウモロコシ遺伝子に見られないか、または受け入れられるシノニムを有するコドンのセットの構成要素であるかのいずれかである（表２）。
単一コドン内での発生に加えて、ＣＧとＴＡ対はＣまたはＴで終るコドンとＧまたはＡで始まるコドンの並置によって生成される。トウモロコシの好適なコドンのいずれもＴで終っていないことから、好適なコドンだけを使用する遺伝子バージョンでは、Ｔ／Ａ並置は単一コドンの内部にある対によるものである。アミノ酸対によって生成したＣＧ対は、Ｃで終るトウモロコシの好適コドンによって表わされ、トウモロコシの好適コドンによって表わされるアミノ酸がＧで始まるアミノ酸の並置についてタンパク質配列を参照することにより特定される。Ｃで終る配列は、Gly（ＧＧＣ）Asp（ＧＡＣ）Ala（ＧＣＣ）Arg（ＣＧＣ）Ser（ＡＧＣ）Asn（ＡＡＣ）Ile（ＡＴＣ）Thr（ＡＣＣ）Cys（ＴＧＣ）Tyr（ＴＡＣ）Phe（ＴＴＣ）His（ＣＡＣ）Pro（ＣＣＣ）、Ｇで始まる配列はGly（ＧＧＣ）Glu（ＧＡＧ）Asp（ＧＡＣ）Val（ＧＴＧ）Ala（ＧＣＣ）である（表５）。
0004030582.tif 000008
このようなアミノ酸対を識別すると、コドンのどちらかを変更してＣＧ対の発生を最小限に抑さえ、かつ過剰量のコドン・バイアスを犠牲にしないように試みることが出来た。しかしＧで始まる好適コドンの代替コドンの全部がやはりＧで始まるため、これらＣＧ対のＧは変更できず、適切な代替コドンが存在する場合に対の第１のアミノ酸についてコドンの変更に限られる。幾つかの場合で（たとえば、ASP:GAC（76）>GAT（24）;Asn:AAC（81）>AAT（19）;Cys:TGC（79）>TGT（21）;Tyr:TAC（86）>TAT（14）;Phe:TTC（80）>TTT（20）;His:CAC（71）>CAT（29）で）、代替コドンは置換が選択肢とならないほど好適コドンより有意に低い頻度でトウモロコシ遺伝子に見られる。そのためこれらの並置によって生成した対は無視できる。
したがって、Mze HD73 #3 trncタンパク質配列でＣＧを生成する上記のアミノ酸の並置を含むような１２８対のリストを作成した（表６）。アミノ酸対（表６では位置番号に下線をつけた）の７４個に対応するコドンの配列への変更はＣＧ塩基対を排除するように行われた。
0004030582.tif 000009
0004030582.tif 000010
好適コドンについてどの代替コドンで置換するかの選択は代替コドンが非常にまれに用いられるコドンのクラスに含まれるべきではないと言う事実によってほとんど決定される。考慮すべき要因の１つは好適なトウモロコシコドンだけから構成されるＤＮＡ配列が発現の問題を起し得ることで、これは各々のアミノ酸で単一コドンに対する不自然な依存がそのコドンに対するｔＲＮＡまたはアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのプールを枯渇させるためである。トウモロコシ遺伝子での未変性コドン使用が選択に対応すると思われる範囲で、第２選択（または第３選択）コドンを使用することにより、コドン組成に何らかの多様性を導入するのが有利であろうと考えられる。この点について、何らかの生物遺伝子でのコドン発生頻度が普遍的な遺伝コードに見られる特定のアミノ酸に存在する同義コドンの数に対して重み付けされなければならないことには注意しなければならない。たとえばトウモロコシでのPheコドンＴＴＴ（２０％）の相対使用頻度は明らかに、ProコドンＣＣＴ（２０％）の同一の相対頻度より多量のカウンターセレクション（コドンバイアス）を反映している。これは、２種類のPheコドンと４種類のProコドンしかないためである（表２）。好適コドンの代わりとしての代替コドンの認容性は簡単な選択ではないことになる。
容認される代替コドンの選択を行ってＣＧ対の個数を減少させる場合には別の要因が絡んでくる。たとえば、好適なArgコドンＣＧＣ（４０％）がＣＧＣＧの前後関係で発生する場合、第２選択のArgコドンＡＧＧ（２６％）による置換で２個のＣＧ対が同時に排除される。明らかにこのような置換はＣＧ塩基対を減少させる観点とコドンの多様性を生成する観点の両方から望ましい。もっと細かい点では、ＡＣＣＧの前後関係で好適なThrコドンＡＣＣ（４７％）の第２選択コドンＡＣＧ（２６％）による置換、またはＡＧＣＧの前後関係で好適なSerコドンＡＧＣ（２８％）の第３選択コドンＴＣＧ（１６％）による置換が、ＣＧ塩基対の総数を変化させないが、望まれるコドンの多様性を発生する。最後に、ＡＧＣＧの前後関係で好適なSerコドンＡＧＣ（２８％）の第４選択コドンＴＣＴ（１４％）での置換はＣＧ塩基対を排除し、コドンの多様性を生成し、ＣＴ塩基対総数も増加させる。
表７はMze HD73 #4 trnc生成のためにMze HD73 #3 trnc配列に対して行ったこれらとその他の変更を要約した表である。
0004030582.tif 000011
0004030582.tif 000012
0004030582.tif 000013
２個のプロリン・コドンと停止コドン（ＴＡＧ）が配列の最後に追加され（ここでアミノ酸総数は６１２になる）、これによってMze HD73 #4 trnc＋を生成する。末端プロリン残基の存在は、カルボキシ末端のタンパク質分解を減少させると考えられる。得られた配列を制限部位についてスキャンした。Sal I部位を位置１２１９で排除して新規に位置１８１に作成し、Nar I部位を位置１５８で排除して新規にKpn I部位を位置１２１７に作成するために塩基変更を行った。ＯＲＦ検索ではフレーム１でＩＣＰＯＲＦが見られ、フレーム２と３では各々小さなＯＲＦが１つ見られた。遺伝子の直前のバージョンで存在していた長いフレーム３ＯＲＦは塩基７８で停止コドンにより中断されていた。ＡＴＧで始まり２５アミノ酸より長いその他のＯＲＦはフレーム３に存在していなかった。
Mze HD73 #5 trnc＋：ＧＣ組成の減少とコドン多様性の増加
バージョン＃４ｔｒｎｃ＋と直前のバージョンの配列（表３）の間で塩基対の出現頻度を比較した結果、ＣＧ塩基対が減少する方向で、またＴＧとＣＴ塩基対が増える方向で塩基組成が変更されたことが分かった。しかし、バージョン＃４ｔｒｎｃ＋はトウモロコシ遺伝子での目標５５％〜６０％に比較するとまだ比較的高いＧ＋Ｃ組成（６２％）を有している。このパラメータを減少するにはＡおよび／またはＴを含む代替コドンをさらに使用する必要があった。
表８はMze HD73 #4 trnc＋配列からMze HD73 #5 trnc＋を生成するために行った変更を要約した表である。
0004030582.tif 000014
0004030582.tif 000015
表の基底コードで示してあるように、これらの変更はＤＮＡのＧ＋Ｃ組成を減少させてさらなるコドンの多様性を導入し、過剰な量のコドンバイアスを犠牲にしないように行った。可能なところでは高いＧ＋Ｃ配列のブロックをＴまたはＡ置換基の追加によって遮断した。またユニークなEcoR I部位を遺伝子の３’末端付近に作成して将来考えられる配列の追加に備えた。ＧＣ組成を減少させるために有用な置換コドン選択は表９に記載した通りである。
0004030582.tif 000016
置換（表９に記載）は以下にレーン挙したような根拠に基づいて行った：
ｉ）全てのProコドンは相互に許容される置換基であるが、ＣＣＴがＣＴ塩基対を生成しＧ＋Ｃ組成を減少する。
ｉｉ）２種類のGlnコドンがトウモロコシ遺伝子でほぼ等しい頻度で存在しており、そのため互いに簡単に入れ換えることが出来る。同様に、SerコドンＡＧＣとＴＣＣは相互に交換可能であると考えられる。同様な頻度の類似性がValコドンＧＴＧとＧＴＣ、LeuコドンＣＴＧとＣＴＣ、AlaマイナーコドンＧＣＴとＧＣＧについても存在している。
ｉｉｉ）LeuとSerのマイナーコドンＴＴＧ、ＴＣＴはＣで終るコドンが後続する場合に許容できるので、追加のＣＴ塩基対が生成される。ＴＴＧはＴＧ塩基対カウントを増加させる別の特徴を提供する。
ｉｖ）ArgコドンＡＧＧは好適なコドンＣＧＣで置換できる（前節での議論を参照）。ＡＧＧは好適なコドンより実質的に低い頻度でトウモロコシ遺伝子に発生するが、第３選択コドンの２倍の頻度で見付かっている。
ｖ）ＧＡＴ（Asp）、ＧＡＡ（Glu）、ＡＴＴ（Ile）、ＡＣＴ（Thr）、ＧＴＴ（Val）などのマイナーコドンは、可能であれば控え目に使用すべきである。ＣＴまたはＴＧ塩基対の形成に関与することになるコドンの前または後ろにこれらを配置するのが望ましい。これらのコドンは未変性トウモロコシ遺伝子の特徴であるため、合成遺伝子への組み込みを全体的に回避する必要がない。
Mze HD73 #6 trnc＋：
Mze HD73 #5 trnc＋配列に幾つかの変更だけを行って最終板遺伝子であるMze HD73 #6 trnc＋を生成した（表１０に要約）。
0004030582.tif 000017
表１１に要約してあるように、Mze HD73 #5 trnc＋Mze HD73 #6 trnc＋をもたらす変更はほぼ５０％までＣＧ塩基対の個数を減少し、明らかにＴＧとＣＴを増加させた。さらにＧ＋Ｃ組成５６％がトウモロコシ代謝遺伝子の範囲内に充分に納まった。
0004030582.tif 000018
Perlak et al.（PNAS,88（1991）3324）が遺伝子植物に発現成功させたＤＮＡ配列の検証によって、自然ＩＣＰの６１５アミノ酸を（Mze HD73 #5 trnc＋でコードされた６１０ではなく）遺伝子がコードしたことが分かった。追加の５個のアミノ酸のコドンはコドン６１０とバージョン＃４で追加した２個のProコドンの間に追加されたことになる。Mze HD73 #6 trnc＋は未変性ＨＤ７３ＩＣＰの６１５個のアミノ酸と２個のカルボキシ末端プロリン残基をコードしている（配列識別番号１）。
表１２は未変性Bacillus HD73遺伝子、Mze HD73 #1 trnc＋遺伝子、Mze HD73 #6 trnc＋遺伝子のコドン使用パターンをレーン挙したものである。
0004030582.tif 000019
Mze HD73 #6 trnc＋の分析および双子葉植物とトウモロコシ遺伝子との比較を表１３に記載する。
0004030582.tif 000020
0004030582.tif 000021
0004030582.tif 000022
微生物の配列と比較した場合、Mze HD73 #6 trnc＋はＩＣＰ遺伝暗号領域で１８４５塩基対の内５３８塩基の変更（５３８／１８４５×１００＝２９％の差）、また２個のProコドンの追加によるさらなる６箇所の変更で、１８５１塩基対のうち、合計５４４塩基の差を有している。Perlak et al.,（PNAS,88（1991）3324）が発表したＤＮＡ配列との比較では、本発明によるトウモロコシに最適化したBtＩＣＰ遺伝子が１８４５のうち４２２配位が異なり（２３％の差）、コードされたタンパク質はアミノ酸２０６，２２７，２４５，２５４，２８９，３１３で異なっている（６１５アミノ酸のうち６箇所の変更、これは末端プロリンを含まない）ことが分かった。
以下に掲載する表１４は好適および好適でないトウモロコシ・コドンを用いて遺伝子を変更し植物に最適化したヌクレオチド配列を作成する方法の教示をさらに示したものである。
0004030582.tif 000023
0004030582.tif 000024
Mze HD73 #6 trnc＋において、トウモロコシ・コドンの選択は次のように配分してある：
２０個の第１選択コドンのうちで１９個を用い、考えられる６１８箇所のうちの合計３８９箇所、または６３％に使用する。
１８個の第２選択コドンのうちで１３個を用い、考えられる６１８箇所のうちの合計１３６箇所に、または２２％に使用する。
１０個の第３選択コドンのうちで５個を用い、考えられる６１８箇所のうちの４６箇所、または７．５％に使用する。
８個の第４選択コドンのうちの６個を用い、考えられる６１８箇所のうちの４７箇所、または７．５％に使用する
３個の第５選択コドンのうちの０個を使用する。
３個の第６選択コドンのうちの０個を使用する。
第１選択のトウモロコシ・コドンの使用頻度に基づくと、Mze HD73 #6 trnc＋は純粋に植物に最適化したヌクレオチド配列に対して６３％が相同である。
トウモロコシの最適化されたBtＩＣＰ遺伝子の合成
Ｍｚｅ ＨＤ７３ ＃６ ｔｒｃ＋に対応するヌクレオチド配列を、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，２０２号およびＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号の開示にもとづいて、重複したオリグヌクレオチドを段階的に添加する一連のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いて合成した。手順は、中間合成産物のＰＣＲ増幅、その後のクローニングに先立つ広範囲にわたって修飾された大きいＤＮＡフラグメントを増殖をたよりにする。増殖がワン・ラウンド終了した後に、中間生成物を精製し、つぎの重複プライマーに対してアニーリングし、さらに重複する。したがって、遺伝子全体をアニーリング、リゲーション、形質転換、および中間反応生成物の選択なしに合成するこができ、これらの工程は他のアプローチ法を必要としない。
ＰＣＲ増幅で使用される酵素であるＴａｑポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如しており、新生配列をプルーフリーディングし、誤読み取りされたヌクレオチドを除去することができない。ある条件下（５５℃アニーリング温度および２００μＭデオキシヌクレオチド濃度）では、ポリメラーゼは計算によれば５ｘ１０−６の頻度でヌクレオチドの誤読み取りする（Ｇｅｌｆｌ ａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（１９８９），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ある配列で誤りが生ずる確率は、増幅周期の数が増大するのにしたがって高くなるので、より大きな遺伝子をいくつかの中ぐらい大きさ（５００〜７００ヌクレオチド）の部分にわけて合成するのが最良であり、それらの部分はその後ＰＣＲ増幅によって播種（ｓｏｗｎ）されるか、あるいは従来の末端のリゲーションによって結合される。この戦略によってもまた、異なる部分を遺伝子の配列全体が影響を受けることなく修飾または交換することが可能となる。
Bt ＩＣＰ遺伝子を設計するための本発明の一つの態様では、いくつかの独特の制限酵素認識部位が配列に導入され、別々に合成された部分の結合がなされる（配列識別番号１）。また、完全なＩＣＰ遺伝子がいくつかのベクターのＮｃｏ Ｉ部位とＢａｍＨ Ｉ部位との間に挿入することができるように、配列識別番号１に示される配列の５’末端に２つのＣ残基を加えてＮｃｏ Ｉ部位を生成し、さらにＢａｍＨ Ｉ部位を遺伝子の３’末端（コード領域の下流）に加えた。１８５４ｎｔ ＩＣＰ配列をほぼ同程度の大きさの３つの部分に分割した。合成完了と同時に独特の制限部位が各部分の末端の各々に含まれるように各部分を設計した。これらの部位を用いて個々の部分を結合して６１７アミノ酸をコードする連続配列を構成した。５’部分は独特の５’Ｎｃｏ Ｉ部位および３’Ｘｈｏ Ｉ部位を末端に有するように、中央部分は独特の５’Ｘｈｏ Ｉ部位および３’Ｋｐｎ Ｉ部位を末端に有するように、さらに３’部分は独特の５’Ｋｐｎ Ｉ部位および３’Ｂａｍ Ｉ部位を持つように設計した（図１Ａ参照）。
本発明の別の態様では、６個のＰＣＲ工程で６５３塩基対（ｂｐ）からなる５’−最大ＩＰＣ遺伝子フラグメントを長さが６１ないし８６塩基の１２本の重複オリゴヌクレオチドから合成した。すべてのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ工程を連続して行うことで１８ないし２０塩基の重複を形成するように設計された。それぞれの場合において、図１Ｂに示すようにフラグメントの合成は「裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」から実行した。合成の第１のステップでは、オリゴヌクレオチドBt１およびBt２のアニーリングによって開始された。この２つの重複部分の中央領域のみがアニーリングされた二重鎖分子であった。分子の残りの部分は３０重複サイクルの間にＴａｑポリメラーゼによる延長によって二重鎖が作られた。第２のステップでは、この二重鎖となった分子を編成させ、その後アニーリングさせるとともにオリゴヌクレオチドBt３およびBt４による再重複を行った。第３のステップでは、この二重鎖分子（Bt３、Bt１、Bt２、およびBt４の配列に対応）を再変成、アニーリング、およびオリゴヌクレオチドBt５およびBt６による増幅を行った。このプロセスを繰り返して行い、配列がBt遺伝子の５’部分の全配列に一致する６５３ｂｐの二重鎖分子にまで伸長するまで続けた（図１Ｂ参照）。同様に、５８４ｂｐの中央フラグメントを長さが重複７５ないし８３塩基である１０本のオリゴヌクレオチドを用いて５つのＰＣＲステップで合成した。合成後、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（”ｐＢＳ”、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）ベクターでクローン化された遺伝子部分の各々を、配列分析によってたしかめた。必要に応じて、ＰＣＲ突然変異誘発アプローチを用いて行った。個々のフラグメントを完全な遺伝子に結合させる前に訂正した部分を再び配列決定し直した。
Bt ＩＣＰ遺伝子を大きさが５９ないし８６ヌクレオチドの範囲内にある合計で３４のオリゴヌクレオチドから合成した。全３４のオリゴヌクレオチドの配列を表１５に示す。
0004030582.tif 000025
0004030582.tif 000026
0004030582.tif 000027
オリゴヌクレオチドの設計に際して、いくつかの条件に従った。すなわち、（ｉ）オリゴヌクレオチド重複部分はどれも最小の１８ヌクレオチドとした。（ｉｉ）各オリゴヌクレオチドの３’側のほとんどの塩基をＧまたはＣとした。（ｉｉｉ）反対側の鎖の３’末端でＡ残基の無鋳型添加による問題を避けるために、各オリゴヌクレオチドの５’側のほとんどの塩基を配列のＴ残基に隣接の下流とした（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６（１９８８）９６７７）。（ｉｖ）各オリゴヌクレオチドにおける広範囲にわたる内部塩基対形成を可能な限り避けた。さらに、（ｖ）各フラグメントに対して第１のステップ（オリゴヌクレオチド・アニーリングを除くすべてのステップで使用されたオリゴヌクレオチド間の塩基対形成もまた可能なかぎり避けた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での遺伝子発現
適切な大きさ、抗原性、および鱗翅目の昆虫に対する毒性を有する機能性タンパク質が合成ヌクレオチド配列によってコードされていることを示すために、植物の形質転換に先立ってＥ．ｃｏｌｉを用いて発現実験を行った。この終わりに、ＩＣＰ遺伝子をコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列をＴ７発現プラスミドに挿入し、ＩＣＰ遺伝子産物がかなり濃縮されたＥ．ｃｏｌｉ抽出物を調整した。ＳＰＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析によると、遺伝子産物は適切な大きさのもので精製さらた天然のＢ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓデルタ・エンドトキシンに対する抗血清と交差反応した（図４）。タンパク質の生物学的さようをＭ． ｓｅｘｔａ食餌アッセイで示した（図５）。エンジニアリングおよび合成戦略の成功をさらに確かめるために、形質転換したトウモロコシのカルス細胞で適切な大きさの抗原的に活性なタンパク質をＩＣＰタンパク質が生産することを示した（図６）。Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ幼虫による食餌バイオアッセイによって、設計（エンジニアリング）タンパク質の殺虫活性を明らかにした。同時に、それらのデータはトウモロコシの最適化されたヌクレオチド配列が自然から単離された野生型ＩＣＰといくつかの生物学的特徴（例えば、抗原性、大きさ、生物学的活性）を共有することを示している。
トウモロコシの合成最適化BtＩＣＰ遺伝子を含む組換えＤＮＡベクターの調製
BtＩＣＰをコードするトウモロコシの最適化されたヌクレオチド配列は、天然のBt構造遺伝子で観察されたものと比較してかなり高いレベルで植物において発現された。トウモロコシの最適化ヌクレオチド配列の発現は、適当なベクターによる植物の形質転換を必要とする。BtＩＣＰに対するトウモロコシの最適化ヌクレオチド配列を植物で機能的なプロモーターと結合させた。この際、構造遺伝子およびプロモーターは、該プロモーター領域がアクティブである細胞内で該構造遺伝子が発現されるような位置および配置にあり、それによって機能遺伝子を形成する。プロモーター領域には、限定されるものではないが、細菌および植物プロモーター領域が含まれる。本発明の別の態様では、プロモーターは誘導プロモーター、構成プロモーター、時間的または発生的調節プロモーター、組織優先的または組織特異的プロモーターからなる群から選択される。
本発明の重要な態様では、ベクターはＭＳＶ（トウモロコシ条斑病ウイルス）のリーダー配列、３５Ｓプロモーター、およびトウモロコシに特異的なエンハンサー、例えば実施例で説明するようなＡｄｈイントロン１またはＡｄｈイントロン６が含まれる。
プロモーター領域／構造遺伝子の組み合わせを発現するために、この組み合わせを持つＤＮＡセグメントを細胞に含有させる。植物プロモーター領域を含む組み合わせを植物細胞に含有させ、その結果として植物または種子に含有させることができよう。細菌プロモーター領域を含む組み合わせをBtまたはＥ．ｃｏｌｉ等の細菌に含ませる。当業者に理解されることと思われるが、細菌以外の微生物での発現は、ある環境下では必要かもしれず、試みることがないとしても本発明の開示によって実行可能であろう。
トウモロコシの最適化されたBtＩＣＰ遺伝子が組み合わさる適当な組換えＤＮＡベクターを以下の実施例でさらに説明する。
合成ＩＣＰ遺伝子ベクターによるトウモロコシの形質転換と、二重にエンハンスされたプロモーターによるすべての植物の形質転換
プロモーター制御下のトウモロコシ最適化BtＩＣＰ遺伝子を持つ組換えＤＮＡ分子を当業者に既知の任意の方法でもって導入することができる。任意の植物種または植物組織の特定の型に対して使用される技術は、既知の成功している技術に依存する。外来遺伝子を植物細胞に安定的に挿入するために、さらに修飾された細胞を操作するために開発されることから、当業者は所望の結果を達成するために既知の手段から選択することが可能であろう。
二重にエンハンスされたプロモーターは、双子葉植物または他の単子葉植物と同様にトウモロコシにおいて外来遺伝子を発現させるために使用することができる。より特異的には、双子葉植物としては、限定されるものではないが、大豆、豆果、ナタネ、綿、ヒマワリ、トマト、ポテト、テンサイ、アルファルファ、チョウジノキ、および落花生が挙げられる。単子葉植物としては、もちろん限定されるものではないが、トウモロコシ、小麦、モロコシ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、米、キビ、スイートコーン、および牧草が挙げられる。
二重にエンハンスされたカリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓまたは１９Ｓプロモーターの使用に加えて、他のプロモーターもここで議論される方法によって修飾してもよい。特に、ＭＳＶリーダー配列、ａｄｈ１、ａｄｈ６、または他のイントロン（配列識別番号４３、４４、４５、４６、および４７）によって修飾することができるプロモーターとしては、限定されるものではないが、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、およびモノピン合成酵素プロモーターが挙げられる。
植物プロモーターもまた、ここの示唆によってさらに修飾することができ、限定されるものではないが、リボロース−１，６−ビホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニン・プロモーター、ファセオリン・プロモーター、ＡＤＨプロモーター、アクチン、ユビキチン、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ、ヒート・ショック・プロモーター、および組織特異的プロモーターまたは花粉特異的プロモーター、胚特異的プロモーター、トウモロコシの毛に特異的、綿繊維特異的、根特異的、種子内胚乳特異的プロモーター等が挙げられる。
外来遺伝物質を植物細胞に導入する技術や、導入された遺伝子を安定維持して発現させる植物を得るための技術はいくつか知られている。そのような技術には、微粒子上に被覆された遺伝物質が細胞に取り込まれるのを促進させることが含まれる（Ｃｏｒｎｅｌｌの米国特許第４，９４５，０５０号、ＤｏｗＥｌａｎｃｏの米国特許第５，１４１，１３１号）。植物はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）技術を用いて形質転換することが可能であり、トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）の大学の米国特許第５，１７７，０１０号、テキサスＡ＆Ｍに対する米国特許第５，１０４，３１０号、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔに対する欧州特許出願０１３１６２４Ｂ１、欧州特許出願１２０５１６，欧州特許出願１５９４１８Ｂ１および１２０５１６，欧州特許出願１５９４１８Ｂ１および１７６，１１２、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔに対する米国特許第５，１４９，６４５号、第５，４６９，９７６号、第５，４６４，７６３号、および第４，９４０，８３８号および第４，６９３，９７６号、マックスプランク（ＭａｘＰｌａｎｃｋ）に対する欧州特許出願１１６７１８、２９０７９９，３２０５００、日本たばこに対する欧州特許出願６０４６６２および６２７７５２、さらにチバガイギー（Ｃｉｂａ Ｇｅｉｇｙ）に対する欧州特許出願０２６７１５９および０２９２４３５や米国特許第５．２３１，０１９号、さらにＣａｌｇｅｎｅに対する米国特許第５，４６３，１７４号および米国特許第４，７６２，７８５号、さらにＡｇｒａｃｅｔｕｓに対する米国特許第５，００４，８６３号および第５，１５９，１３５号を参照せよ。他の形質転換技術としては、例えばＺｅｎｅｃａに対する米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号のウィスカー技術等が挙げられる。
また、電気穿孔法（エレクトロポレーション），もまた植物の形質転換に使用されている。Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対するＷＯ ８７／０６６１４、Ｄｅｋａｌｂに対する５，４７２，８６９および５，３８４，２５３、ＰＧＳに対するＷＯ９２０９６９６およびＷＯ９３２１３３５を参照せよ。このような形質転換植物および刊行物のすべてを本願では援用する。植物を形質転換させるための数多くの技術に加えて、外来遺伝子と接触する組織の種類もどうように変化の激しいものである。そのような組織としては、もちろん限定されるものではないが、胚形成組織、カルス組織型ＩおよびＩＩ、胚軸、分裂組識等が挙げられる。ほとんどすべての植物組織は、当業者に既知の適当な技術を用いて脱分化の間に形質転換されよう。
他に変えることができるものは、選択可能なマーカーを選ぶことである。特定のマーカーの選択は当業者の自由裁量ではあるが、以下の選択可能なマーカーのいずれも選択可能なマーカーとして機能することが可能な本願にはリストされていない他の遺伝子のいずれかとともに使用してもよい。そのような選択可能なマーカーとしては、限定されるものではないが、抗生物質カナマイシン、ネオマイシン、およびＧ４１８に対する耐性をコードするトランスポゾンＴｎ５（ＡｐｈＩＩ）のアミノグリコシドフォスホトランスフェラーゼ遺伝子、同様にグリホサート；ヒグロマイシン；メトトレキセート；ホスフィノスリシン（バー）；イミダゾリノン、スルホニルウレア、およびトリアゾロピリミジン除草剤、例えばクロロスルフロン；ブロモキシニル、ダラポン等が挙げられる。
選択可能なマーカーに加えて、レポーター遺伝子を使用することが望ましい。いくつかの例では、レポーター遺伝子は選択可能なマーカーなしで使用される。レポーター遺伝子は、一般にレシピエント器官または組織に存在しないか、あるいは発現しない遺伝子である。リポーター遺伝子は一般にある種の表現型の変化または酵素的特性を与えるタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は、Ｋ． ＷｅｉｓｉｎｇらのＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２２， ４２１（１９８８）に開示されており、本願ではこの文献を援用する。好ましいレポーター遺伝子はグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子である。
ひとたび植物組織に導入されると、構造遺伝子の発現を当業者に既知の任意の方法でもってアッセイすることができ、また発現はｍＲＮＡの転写またはタンパク質の合成として測定することができよう。植物組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養についてはすでに知られており、多くの場合、完全な植物の再生に関する（欧州特許８８１０３０９．０）。導入された発現複合体を市販の有効な栽培品種に移す方法は当業者に知られている。
ひとたび植物発現可能プロモーターの制御下で遺伝子を発現する植物細胞が得られると、当業者に既知の方法および技術を用いて該植物細胞から植物組織および完全な植物を再生することができる。再生植物は、さらに従来の手段を用いて再生産され、導入された遺伝子は従来の植物育種技術によって他の株や栽培品種に移される。
トウモロコシ細胞におけるＩＣＰ遺伝子の発現
植物細胞内におけるトウモロコシ最適化Bt ＩＣＰ遺伝子の機能性は、ブラック・メキシカン・スウィート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）プロトプラストで、さらに安定な形質転換されたトウモロコシ・カルス培養でトウモロコシの形質転換系を用いた試験が行われてきた。これらの研究によれば、設計されたＩＣＰ遺伝子はトウモロコシで十分に発現され、また蓄積されたＩＣＰの濃度はｉｎ ｖｉｔｒｏの食餌アッセイで昆虫制御するのに十分なものであることが示された。
米国特許第５，１４１，１３１号に記載されているようにしてヘリウム・ブラスト・トランスフォーメーションによる再生可能なトウモロコシ培養への遺伝子導入によって、その遺伝子を発現する稔性植物が得られた。遺伝子組換えトウモロコシ植物の種子から成長した植物もまたその後の世代でＩＣＰ遺伝子を発現した。
以下の実施例は本発明を実施するための方法を説明するためのものであって、該実施例によって特許請求の範囲に定められた本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例
実施例１：オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドの合成は、アプライド・バイオシステムズ社（ＡＰＰｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡ合成装置のモデル３８０Ａまたはモデル３９０のいずれかを用いて行った。この際、０．２μＭカラムおよびＦＯＤホスフォラミジト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）および標準シアノエチル化学を用いた。合成はトリチル−オフ・モードで行った。モデル３８０Ａ合成装置で合成を行った後、各オリゴヌクレオチドをカラムから採取し、５０℃、１時間でもって脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ）し、さらに５０℃での蒸発によって乾燥させた。オリゴヌクレオチドを３００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、さらに濃度を２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで決定した。
オリゴヌクレオチドの精製は、１２％変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で行った。３０ｍｌの１０ｘトリス・ほう酸塩ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ；１ ｘ ＴＢＥは０．９Ｍトリス・ほう酸塩、２ｍｌ ＥＤＴＡ）および９０ｍｌの４０％アクリルアミドのストック溶液に１２６ｇの尿素を溶解し、Ｈ２Ｏでもって溶液の堆積を合わせることで、ＰＡＧＥゲルのストック溶液３００ｍｌを調製した。４０ｍｌのＰＡＧＥストック溶液を使用し、ホッファー・スツルジエール（Ｈｏｅｆｆｅｒ  Ｓｔｕｒｄｉｅｒ）ゲル装置を用いて５穴ゲルに流し込んだ。流し込みに先立って３５０μｌの１０％過流酸アンモニウムおよび３５μｌのＴＥＭＥＤを添加することで重合を誘導した。
各オリゴヌクレオチドは以下のように調製した。すなわち、３００ないし５００μｇのオリゴヌクレオチドをＴＥ緩衝液で６０μｌに希釈し、つづいて６０μｌのホルムアミドゲル充てん緩衝液（１０ｍｌホルムアミド、１０ｍｇキシレンシアノールＦＦ、１０ｍｇブロモフェノール・ブルー、２００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を添加し、さらに試料を５分間沸騰させて、氷上で冷却した。シークエンシング・ピペット・チップを用いて試料をゲルに充てんした。電気泳動は１ ｘ ＴＢＥ中で３００ボルト、３時間にわたって行った。
アクリルアミドゲル上を試料が移動した後に、該ゲルをサランラップ（ＳａｒａｎＷｒａｐ：登録商標）に移して白の背景（例えば、Ｘ線増感紙）上に置き、さらに短波長紫外線を照射した。ＤＮＡバンドの存在、同様にキシレンシアノールおよびブロモフェノール青色色素マーカーを白の背景上の影として可視化した。
適当な大きさのＤＮＡバンドをゲルから切り取り、拡散によってＤＮＡを溶離した。各ゲル・スライスをガラス棒でもって細断し、３７℃、１６時間、回転ドラム中でコンスタントに攪拌しながら１．５ｍｌのオリゴ溶離緩衝液（１００ｍＭ ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中でインキュベートした。グラスウールのプラグを有し、かつ０．２μｍフィルターが付いた３ｃｃのシリンジを使ってポリアクリルアミド・スラリーをろ過した。溶離したオリゴヌクレオチドを、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０スピン・カラム（分子量カット・オフ１０，０００Ｄ）で３０００ｘｇ、室温、２時間にわたって遠心することで濃縮し、さらに同一の管を用いて上記のように遠心することで２ｍｌのＴＥ緩衝液で洗浄した。精製されたオリゴヌクレオチドは最終容量３０ないし４０μｌとして回収した。濃度は、２６０ｎｍでの吸光度を測定することで決定した。
オリゴヌクレオチド合成の結果の例として、オリゴヌクレオチドBt６−Bt１０のゲル精製を図２に示す。また、図２は３８−０Ａ合成装置による成功した２件の合成（Bt９およびBt１０）と３９０合成装置による成功した２件の合成（Bt６およびBt７）を示している。
実施例２：ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅はすべて１００μｌの反応液中で行った。この反応液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．３、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、各々が２００μＭのｄＡＴＡＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、さらに５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）。テンプレートおよびＰＣＲプライマーの濃度はプロトコルのステップに応じて変えた。第１のＰＣＲステップでは、テンプレートは、第１の組（図１参照）からなるプライマーの各々０．５μＭによって増幅することで各フラグメントのテンプレートを以下の通りにして生成した。すなわち、９４℃で１分間変性、５５℃で２分間アニーリング、および７２℃で３分間伸長を３０周期、つづいて７２℃で７分間の追加伸長を行う。反応生成物を５％純ポリアクリルアミド・ゲル上にのせ、１ｘＴＢＥ中で４０ボルト、１時間にわたり電気泳動した。平行なレーンとして走るＢＲＬ１２３ｂｐの梯子を大きさの標準として使用した。電気泳動の後に、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロミドを含む水のなかで１時間にあたってゲルを染色した。予想される大きさのフラグメントをゲルから切り離し、グラスウールおよび０．２μｍフィルターを介して濾過を行った後にＤＮＡを２．５容量のエタノール、２０μｇのグリコーゲン、および０．０５容量の８ＭＬｉＣｌを用いて沈降させることで濃縮した点を除いてオリゴヌクレオチド精製のところで説明（既に記述されたことを参照）したようにゲル・スライスから精製した。ＤＮＡを４０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。各フラグメントの合成における第２のＰＣＲステップはステップ１のゲル精製生成物５μｌをテンプレートとして使用し、またオリゴヌクレオチド濃度は０．２μＭであった点を除いて第１のステップと同様の反応混合物を用いて行った。ＰＣＲ反応全体を１％アガロース・ゲル上で電気泳動し、予想される大きさのバンドを切り出し、ＤＮＡをジーンクリーン・キット（ＧｅｎｅＣｌｅａｎＫｉｔ（Ｂｉ０１０１））を用いてゲル・スライスから精製し、さらに最終容量が５０μｌのＴＥに溶離した。続く反応のすべてはステップ２の記載通りに行われた。
個々のＰＣＲステップによって予想される大きさの生成物が大量に得られた。また、多くの場合において他のマイナーなバンドと同様に予想の大きさを倍にしたバンドを見ることができた。適当な大きさのＤＮＡ生成物のすべてをゲル濾過し、図３に示すゲル上に泳動させた。この図は、連続的なＰＣＲステップにおけるＤＮＡ配列の段階的添加を示している。各レーンにおける２量体の大きさとなったバンドは電気泳動の際に人為的に生じたものである。なぜなら、ゲル上に再度泳動させた場合にモノマーの大きさのバンドからゲル精製ＤＮＡもまたこの二量体の大きさのバンドが生ずるからである。遺伝子フラグメントの各々の最終生成物を、各フラグメントの末端に設けられた制限部位を認識する酵素によって消化し、同一の酵素で切断されたｐＢＳＤＮＡにリゲーションする。このリゲーション生成物をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞に形質転換させ、適当なフラグメントを持つｐＢＳプラスミドを運ぶ分離菌を同定した。このようなプラスミドのＩＣＰ遺伝子部分のＤＮＡ配列を決定し、Ｍｚｅ ＨＤ７６ ＃６ ｔｒｎｃ＋配列由来の５つのヌクレオチドの違いを見つけた。このような変化は、（１）ヌクレオチド（ｎｔ）６３０にある５’フラグメントにおける保存的な塩基変化（ＧからＴ）（ＡＴＧ開始コドンのＡを塩基＃１とする）。（２）ヌクレオチド（ｎｔ）の中央フラグメントにおける保存的な塩基変化（ＡからＧ）。（３）コード化されたポリペプチドにフレームシフトを起させるヌクレオチド（ｎｔ）６５７−６５８での中央フラグメントにおける２つのＧの欠失。（４）セリンからプロリンへの変化を生ずるヌクレオチド（ｎｔ）８７７における中央フラグメントの塩基変化（ＴからＧ）。（５）フレームシフトを生ずるヌクレオチド（ｎｔ）１４０１の３’フラグメントにおける一つのＣヌクレオチドの欠失。後の３つのエラーは実施例３（下記）に説明するＰＣＲ突然変異誘発によって訂正されるＰＣＲ修復に続いて、中央および３’フラグメントを消化し、ｐＢＳにクローン化し、さらに結果として得られるプラスミドのインサートの配列を決定して修正プロセスの間に何らかの他の変化が取り込まれていないことを確かめた。すでに存在している５’および中央フラグメントにおける保存的な塩基変化（修正していない）は別として、配列は設計された配列識別番号１のＩＣＰ配列（Ｍｚｅ ＃６ ｔｒｎｃ＋）と同一であった。
実施例３：ＩＣＰ遺伝子フラグメントの修正
ＤＮＡ操作およびＥ．ｃｏｌｉ形質転換はすべて標準的な手順にもとづいて行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）２ｎｄＥｄ．，ＣＯｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８７）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ａｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。個々のＩＣＰ遺伝子フラグメント３つをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした後、修飾ＩＣＰ配列にもとづいたシークエンシング・プライマーあるいは上記したＰＣＲ合成プライマーのいくつかを使用するシークエナーゼキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｋｉｔ）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて決定した。
ＩＣＰ遺伝子フラグメント中のエラーはＰＣＲ突然変異誘発によって修正された。各修正に対して、２種類のＰＣＲ反応をセット・アップした。１つのＰＣＲ反応は、エラー修正オリゴヌクレオチドおよび５’末端オリゴヌクレオチドを用いてフラグメントの５’半分を増幅させた。もう一方のＰＣＲ反応は、３’末端オリゴヌクレオチドと相補的エラー修正オリゴヌクレオチドとを用いてフラグメントの３’半分を増幅させた。５’および３’修正済みフラグメントをゲル精製し、５’末端および３’末端オリゴヌクレオチドのみをプライマーとする増幅で第２のＰＣＲステップの反応において結合させた。エラー修正に使用されるオリゴヌクレオチドを合成し、上記のようにしてゲル精製した。ＰＣＲ反応条件はアニーリングを５０℃で行い、２５周期を採用した点が異なる意外は既に述べた通りである。Ｂｉ０１０１から入手可能であるＧｅｎｅＣｌｅａｎＫｉｔを用いてフラグメントのゲル精製を行った。
実施例４：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現
Ｒ．ｃｏｌｉ発現用に、細胞質発現ベクターｐＥＴ−９ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．）のＮｃｏＩおよびＢａｍＨ Ｉ部位に１８６２塩基対Ｎｃｏ Ｉ ＢａｍＨ Ｉ ＤＮＡフラグメントとしてＩＣＰを挿入した。１マイクログラムのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから購入可能）からなるコンピテント細胞０．２ｍｌ中に形質転換させ、２５μｇ／ｍｌ（プラスミドｐＥＴ−９ｄについて）のカナマイシンを含有するＬＢプレート上に播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーをプレートから採取し、適当な抗生物質とイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭ含む１０ｍｌのＬＢブロスに再懸濁した。３時間にわたって３７℃で強く浸透している間に細胞がタンパク質を発現できるようにし、つぎに１０分間、４℃でもって１，０００ｘｇの遠心を行うことで回収した。
ｐＥＴ−９ｄ構成の発現について、可溶で、かつ凝集性のタンパク質分画を以下のようにして調製した。細胞ペレットを凍結させ、２回解凍状態にして細胞の溶解（溶菌）を助け、溶解物を１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１００ｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅｌ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＨ、１ｍｇ／ｍｌのリソチーム）に再懸濁し、粘性がなくなるまで３７℃でインキュベートした。
凝集した変性タンパク質から４℃、１０分間の遠心によって可溶性タンパク質が分離された。不溶性のペレットを約３００μｌの上記溶解緩衝液に再懸濁した。両分画とも最終容量が０．５ｍｌである。
両抽出物からなるペレット分画に分子の大きさが６９ｋＤである豊富なタンパク質が、細胞質発現ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞から生成される両抽出物のペレット分画中に存在した。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＣｒｙｌＡ（Ｃ）から精製した天然のデルタ・エンドトキシンに対する抗血清と交差反応し、典型的なタンパク質ゲル・イムノブロットが図４に示されている。
Ｅ．ｃｏｌｉに産生された抗ＩＣＰ交差反応性タンパク質の大きさは、ＩＣＰ遺伝子の配列から予想された６８ｋＤの大きさにかなり一致する。未変性のＩＣＰは修飾ＩＣＰ遺伝子産物と比較してわずかながら小さい（Ｍｗ６６ｋＤ）（レーン５、６、および７）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓでは、毒素は１３０ｋＤプロトキシンとして産生される。鱗翅目の昆虫によって経口摂取されると同時に、たんぱく質が可溶化し、タンパク質分解によって活性化される。タンパク質分解は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの株に依存して６０−７０ｋＤの活性毒素部分を産生する。Ｃｒｙｌ ＩＣＰのすべてにおいて、タンパク質分解処理がプロトキシンの中央部分で生じ、Ｃ末端ドメインから毒素部分を切り離す。処理は、アミノ酸Ａｒｇ２８とＩｌｅ２９との間の最大（ｅｘｔｒｅｍｅ）Ｎ末端でも生じ、このような処理はセリン型のプロテアーゼによって実行されると思われる。ＣｒｙｌＡ（ｂ）およびＣｒｙｌＣのトリプシン活性プロトキシンのアミノ末端タンパク質塩基配列決定はＮ−末端として位置２９のイソロイシンを同定した（Ｈｏｆｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．，５３（１９８９）２４２）。Ｍｚｅ ＨＤ７３ ＃６ ｔｒｎｃ＋遺伝子の配列にこの推定されるセリン・プロテアーゼ部位が含まれるので、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物内でセリン・プロテアーゼ活性によるこの部位の切断はＮ−末端の２８アミノ酸を除去する。その結果、遺伝子の配列から予想された遺伝子産物よりも約３ＫＤ程度小さい生成物が得られる。この大きさのタンパク質は未変性のＩＣＰ毒素と一緒に移動するぼんやりとしたバンド（約６６ｋＤ）として認められる。抽出タンパク質の数量化は行っていない。なぜなら、タンパク質それ自体が不溶性であり、また細胞片と凝集するからである。
実施例５：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって発現されたタンパク質濃度
タンパク質濃度をバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）プロティン・アッセイを用いて決定した。タンパク質は、製造元の忠告にしたがってホッファー・マイティ（ＨｏｅｆｆｅｒＭｉｇｈｔｙ）スモール・ミニゲル装置またはダイイチ（Ｄａｉｉｃｈｉ）ミニゲルに設けられた１２．５％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分析した。タンパク質の染色は記載通りに行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９），２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。また、ＥＣＬウエスタン・ブロッティングおよび検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて精製Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＨＤ７３毒素のウサギ抗血清によりＩＣＰはプロティン・ゲル・ブロット分析（ウエスタン・ブロッティング）によって特異的に検出した。ホッファー・セミドライ（Ｈｏｅｆｆｅｒ ＳｅｍｉＤｒｙ）ブロッタを用い、０．９ｍＡ／ｃｍ２、９０分でもってタンパク質をゲルからハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。膜をブロッキング試薬ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−Ｍｉｌｋ（ＴＢＴＭ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．４、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％ノンファット・ドライミルク）とともに室温で１時間にインキュベートした。つぎに、膜をブロッキング試薬中で１：５００の希釈率でもって一次抗血清とインキュベートし、続いて室温、１０分間、１００ｍｌ ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ミルクなし）中で３回洗浄した。膜を二次抗血清（西洋わさびペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含むブロッキング試薬中で１時間インキュベートとし、つづいて室温、１０分間、１００ｍｌのＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行った。フィルタを１０ｍｌの試薬Ａ＋Ｂ（１：１、ＥＣＬキット）中で１分間インキュベートとし、過剰な液体を排出し、さらに膜をハイバーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）−ＥＣＬフィルムに１０秒ないし１分間さらした。ＥＣＬフィルムを標準的な現像液および固定液を用いて処理した。ＩＣＰシグナルをモデル６２０ビデオ・デンシトメトリ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて走査し、１−Ｄアナリスト・ソフトウエア（Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて同一ゲル上で電気泳動されたＩＣＰ標準の走査と比較して濃度を決定した。図４は、Ｅ．ｃｏｌｉのけるＩＣＰの発現とそのような発現の濃度とを示すものである。
実施例６：食餌アッセイ
Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、かつ実施例４に示されたようにして抽出されたＩＣＰを用いてＭａｎｄｕｃａｓｅｘｔａ（タバコイモムシ）における食餌アッセイを行った。新生幼虫に対してＩＣＰまたは対照資料が含まれた人工食餌を与えた。４日後、幼虫の体重および死亡率を決定した。
Ｍ．ｓｅｘｔａ食餌アッセイにおけるＥ．ｃｏｌｉ抽出物の試験結果（図５）によれば、Ｍｚｅ ＨＤ７３ ＃６ ｔｒｎｃ＋によってコードされたＩＣＰは鱗翅目に対する毒性を有する。ＩＣＰを発現する細胞と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物のペレット分画は、顕著な成長阻害と死亡率とを示した。しかし、ＩＣＰ含有Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物および細胞はＭａｎｄｕｃａ幼虫に対する毒性が精製された非変性ＩＣＰのものよりも低かった。このことは、Ｅ．ｃｏｌｉに産生されたＩＣＰの不溶性度が高いという事実によって説明されよう。凝集によって、効果的なＩＣＰ濃度がタンパク質濃度よりもかなり低いことが示される可能性がある。
実施例７：植物発現プラスミドの構成
Ａ．二重にエンハンスされた（ｄｏｕｂｌｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの構成：
このセクションは植物プロモーターの発現エンハンサー・エレメントの重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を生ずる分子操作について述べる。タバコ植物において、この重複によって、修飾プロモーターによって発現が制御されたマーカー遺伝子の発現が増大することが示されている（Kay et a1.,Science236（1987）1299）。［注：この記述に関係する配列は、カリフラワー・モザイク・ウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｃｉｒｕｓ（ＣａＭＶ））のｃａｂｂＳ株由来のものである。ＧｅｎＢａｎｋのＭＣＡＳＴＲＡＳ配列として入手可能であり、またＦｒａｎｃｋらによって公表（Ｃｅｌｌ２１（１９８０）２８５）されている。ＤＮＡ配列のすべてが型通りの５’から３’方向に与えられている。この開始物質はＯｄｅｌｌらによって記載（Ｎａｔｕｒｅ３１３（１９８５）８１０）されたようなプラスミドＰＵＣ１３／３５Ｓ（−３４３）である。このプラスミドはｐＵＣ１３のＳｍａ Ｉ部位の３’末端の起始点（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ１０１（１９８３）２０）、およびｐＵＣ１３のｌａｃＺ遺伝子の非コード鎖に隣接する鎖上のリーディング、ＣａＭＶのヌクレオチド６４９５から６９７２、それに続くリンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ（Ｃｌａ Ｉ認識部位をコードする）、それに続くヌクレオチド７０８９から７４４３、それに続くリンカー配列ＣＡＡＧＣＴＴＧを含み、また後者の配列はＨｉｎｄ ＩＩＩの認識部位を含み、さらにその後にｐＵＣ１３プラスミドＤＮＡの残りの部分が続く。
１．ｐＵＣ１３／３５Ｓ（−３４３）ＤＮＡは、Ｃｌａ ＩおよびＮｃｏ Ｉによって消化され、３４２９塩基対（ｂｐ）のラージ・フラグメントがアガロース電気泳動によって６６ｂｐのスモール・フラグメントから分離され、標準的な方法でもって精製された。
２．ｐＵＣ１３／３５Ｓ（−３４３）ＤＮＡは、Ｃｌａ Ｉによって消化され、突出した末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる処理でもって取り除かれた。ブラントエンド化されたＤＮＡを、Ｎｃｏ Ｉ認識部位を持つＣＣＣＡＴＧＧＧの配列を有する合成オリゴヌクレオチド・リンカーにリゲーションした。リゲーション反応は、コンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞に形質転換され、さらに形質転換体は前のＣｌａ Ｉ部位に位置するＮＣＰ Ｉ部位を持つプラスミド（ｐ００＃１と命名）含むものとして同定された。ｐ００＃１のＤＮＡをＮｃｏ Ｉで消化し、ラージ・フラグメントのコンパチブルな末端を再度リゲーションすることで、ｐ００＃１から７０ｂｐの欠失が生じ、中間のプラスミドｐ００＃１Ｎｃｏ△が生じた。
３．ｐ００＃１Ｎｃｏ△ ＤＮＡをＥｃｏＲ Ｖによって消化し、ｓらにブラント・エンドをＣＡＴＣＧＡＴＧ配列を有するＣｌａ Ｉリンカーにリゲーションした。前のＥｃｏＲ Ｖ部位の位置に新しいＣｌａ Ｉ部位を持つプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を同定し、プラスミドをｐｏｏ＃１Ｎｃｏ△ＲＶ＞Ｃｌａと命名した。
４．ｐｏｏ＃１Ｎｃｏ△ＲＶ＞Ｃｌａ ＤＮＡのＤＮＡをＣｌａ ＩおよびＮｃｏ Ｉによって消化し、スモール（２６８ｂｐ）フラグメントをアガロース・ゲルから精製した。このフラグメントをつぎに上記のステップ１で調製したｐＵＣ１３／３５Ｓ（−３４３）の３４２９ｂｐ Ｃｌａ Ｉ／Ｎｃｏ Ｉフラグメントにリゲーションし、さらにＣｌａ Ｉ／Ｎｃｏ Ｉフラグメント３４２９および２６８ｂｐを持つプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＵＣ１３／３５Ｅｎとする。
５.ｐＵＣ１３／３５Ｓ Ｅｎ ＤＮＡをＮｃｏ Ｉで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理することで突出した末端をブラントにした。処理されたＤＮＡをＳｍａ Ｉで切断し、ＣＡＧＡＴＣＴＧ配列を有するＢｇｌ ＩＩリンカーにリゲーションした。４１６ｂｐのＳｍａ Ｉ／Ｎｃｏ Ｉフラグメントが少なくとも２つのコピーからなるＢｇｌ ＩＩリンカーによって置換されているプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を同定し、ｐ３５Ｓ Ｅｎ２と命名した。［注：Ｂｇｌ ＩＩ認識部位を除くこれらのＢｇｌ ＩＩリンカーのタンドミザーション（ｔａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）も、またＰｓｔ Ｉ認識部位、ＣＴＧＣＡＧを作る］
Ｐ３５ＳＥｎ２のＤＮＡ構造は以下の通りである。すなわち、ｐＵＣ１３のｌａｃＺ遺伝子の非コード鎖に隣接した鎖上のＳｍａ Ｉ部位の第３のＣ残基の次にくるヌクレオチドによる開始；リンカー配列ＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＧ（配列識別番号４８）、その後にＣｌａ Ｉリンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、その後にＣａＭＶヌクレオチド７０９から７４４３、その後にＨｉｎｄ ＩＩＩリンカー配列ＣＡＡＧＣＴＴ、その後にｐＵＣ１３配列の残りの部分が続く。この構造の特徴は、ウイルスゲノム（７０９０から７３４４ヌクレオチド）のＥｃｏＲ Ｖ部位の上流にある領域に広がるＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターのエンハンサー配列が重複していることである。このプロモーター構成は非変性の３５Ｓ転写開始部位を取り込むもので、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位の最初のＡ残基の上流１１ヌクレオチドに広がっている。
実施例７Ｂ
３５ＳプロモーターおよびアグロバクテリウムＮＯＳポリＡ配列を利用するプラスミド：第一の構築物の出発物質は、CLONTECH（カリフォルニア州パロアルト所在）から購入したプラスミドｐＢＩ２２１である。このプラスミドは、Bevanら（１９８５）、Baulcombeら（１９８６）、Jeffersonら（１９８６、１９８７）、およびJefferson（１９８７）に記載してあるように、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを若干修飾したコピーを含む。ｐＵＣ１９（Yanisch-Perronら、１９８５）のＰｓｔ Ｉ部位の３’末端から始めて、ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子をコードするのと同じ鎖を読むと、この配列は、リンカーヌクレオチドＧＴＣＣＣＣ、次いでＣａＭＶの第６６０５〜第７４３９番のヌクレオチド（実施例７Ａに記載）、次いでリンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣ  ＡＧＴＣＣＣＴＴ（配列番号４９）（下線した塩基は、ＢａｍＨ Ｉ認識配列を表す）を含む。次いでこれらの塩基に、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）タンパクをコードする大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子のコード領域を含む１８０９ｂｐと、大腸菌ゲノム（Jefferson、１９８６）に由来する５５ｂｐの３’ブランキング塩基が続き、次いでＳａｃ Ｉリンカー配列ＧＡＧＣＴＣ、そしてリンカー配列ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号５０）が続く。これらの塩基に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン（nopaline）シンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子に由来する、ＲＮＡ転写／停止／ポリアデニル化シグナル配列が続き、そして、DePickerら（１９８２）の第１２９８〜第１５５４番ヌクレオチドに対応する、２５６ｂｐのＳａｕ３Ａ Ｉ断片が含まれ、次いで２個のＣ残基、ＥｃｏＲ Ｉ認識配列ＧＡＡＴＴＣ、そしてｐＵＣ１９の残りの部分が続く。
１．ｐＢＩ２２１のＤＮＡをＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化し、その３５０７ｂｐの断片をアガロースゲルを用いて精製した。ｐＲＡＪ２７５（CLONTECH社、Jefferson、１９８７）のＤＮＡをＥｃｏＲ ＩおよびＳａｌ Ｉにより消化し、その１８６２ｂｐの断片をアガロースゲルを用いて精製した。これら２本の断片を共に混合し、配列ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧ（配列番号５１）および配列ＴＣＧＡＣＧＡＴＣＣＧ（配列番号５２）を有する、相補的合成オリゴヌクレオチドを加えた。（これらのオリゴヌクレオチドは、アニーリングした場合、ＢａｍＨ ＩとＳａｌ Ｉにより生じた付着末端に親和性のある、一本鎖の付着末端を有している。）これらの断片を連結し、制限酵素分析により、適当なＤＮＡ構造を有するプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドのＤＮＡでｐＫＡ８８１と命名したものを、Ｂａｌ ＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化し、その４１４８ｂｐ断片をアガロースゲルを用いて単離した。上記ｐ〜ＢＩ２２１のＤＮＡを同様に消化し、その１５１７ｂｐのＥｃｏＲ Ｉ／Ｂａｌ Ｉ断片をゲルを用いて精製し、上記のｐＫＡ８８１断片に連結して、プラスミドｐＫＡ８８２を作成した。
２．ｐＫＡ８８２のＤＮＡをＳａｃ Ｉで消化し、その付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより平滑にして、得られる断片を、配列ＣＧＧＡＴ．ＣＣＧを有する合成ＢａｍＨ Ｉリンカーに連結した。３７８４ｂｐおよび１８８５ｂｐのＢａｍＨ Ｉ断片を有するプラスミドを担持した大腸菌形質転換体を同定し、ｐＫＡ８８２Ｂと命名した。
３．ｐＫＡ８８２ＢをＢａｍＨ Ｉで消化し、断片の混合物を連結した。ＢａｍＨ Ｉで消化すると一本鎖の３７８３ｂｐの断片を生じるプラスミドを担持した大腸菌形質転換体を同定し、ｐ３５Ｓ／ＮＯＳと命名した。このプラスミドは、ＧＵＳ遺伝子のコード配列が削除されている以外は、ｐＢＩ２２１の本質的なＤＮＡ構造を有している。したがって、ＣａＭＶの第６６０５〜第７４３９番のヌクレオチドのあとには、
0004030582.tif 000028
が続く（前記の一重下線を付した塩基はＸｂａ Ｉ部位を表し、二重下線を付した塩基はＢａｍＨ Ｉ部位を表す）。次いでこのリンカー配列にＮＯＳポリアデニル化配列とｐＢＩ２２１の残りの部分が続く。
４．ｐ３５Ｓ／ＮＯＳのＤＮＡをＥｃｏＲ ＶおよびＰｓｔ Ｉで消化し、その３０３７ｂｐの断片を精製して、ｐ３５Ｓ Ｅｎ２のＤＮＡをＥｃｏＲ ＶおよびＰｓｔ Ｉで消化することにより得た５３４ｂｐの断片に連結した。ＥｃｏＲ ＶおよびＰｓｔ Ｉで消化すると３０３１ｂｐおよび５３４ｂｐの断片を生じるプラスミドを担持した大腸菌形質転換体を同定し、そのプラスミドをｐ３５ＳＥｎ２／ＮＯＳと命名した。このプラスミドは、実施例７Ａの工程５でｐ３５Ｓ Ｅｎ２について記載した、３５Ｓプロモーターのエンハンサー反復領域を含み、そのプロモーター配列は、特異なＸｂａ ＩおよびＢａｍＨ Ｉ部位を含むリンカー配列によって、ＮＯＳポリアデニル化配列とは離れている。
実施例７Ｃ
非翻訳合成リーダーの構築
この実施例は、トウモロコシ・ストリーク・ウイルス（Maize Streak Virus, MSV）ゲノムを右方向へ転写したものの大部分である、５’末端の非翻訳リーダー部分を含有する配列を含むＤＮＡ断片を構築するのに用いる、分子操作を記載するものである。ＭＳＶゲノム配列は、Mullineauxら（１９８４）、およびHowell（１９８４）により発表されたものであり、その転写産物はFenollら（１９８８）に記載されたものである。１５４ｂｐを含む全配列は、合成オリゴヌクレオチドのブロックを組み合わせることにより、３段階（Ａ、ＢおよびＣ）に分けて構築した。
１．Ａブロック
0004030582.tif 000029
を有する相補的オリゴヌクレオチドを合成し、標準的な手順によって精製した。これらのヌクレオチドを二本鎖構造にアニーリングすると、４塩基の一本鎖の付着末端（以下、「粘着末端」と称する）で、ＢａｍＨ Ｉにより生じるものに親和性があるもの（ＧＡＴＣ）が分子の一方の末端に残り、Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより生じる一本鎖末端に親和性があるもの（ＡＧＣＴ）が分子のもう一方の末端に残る。このようなアニーリングした分子を、ＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（以下、ｐＢＳＫと呼ぶ。カリフォルニア州ラホラ所在のStratagene Cloning Systems製）に連結した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれのＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ粘着末端で連結した場合に、それぞれの認識部位の配列が維持されるというようなものである。このオリゴヌクレオチド配列を含むプラスミドを担持した大腸菌形質転換体を制限酵素分析によって同定し、そのプラスミドをｐＭＳＶＡと命名した。
２．Ｂブロック：
0004030582.tif 000030
を有する相補的オリゴヌクレオチドを合成し、標準的な手順によって精製した。
下線した塩基は、制限酵素Ｓｍａ ＩおよびＸｍａ Ｉの認識配列を表す。これらのヌクレオチドを二本鎖構造にアニーリングすると、４塩基の粘着末端で、Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより生じるものに親和性のあるもの（ＡＧＣＴ）が分子の一方の末端に残り、Ｓａｌ Ｉにより生じる粘着末端に親和性があるもの（ＴＣＧＡ）が分子のもう一方の末端に残る。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ粘着末端に連結した場合に、そのＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列がこわれるというようなものである。
ｐＭＳＶ ＡのＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳａｌ Ｉで消化し、上記のアニーリングしたオリゴヌクレオチドに連結した。この新しいオリゴヌクレオチドを含むプラスミドを担持した大腸菌形質転換体を制限酵素地図作成によって同定し、ｐＭＳＶ ＡＢと命名した。
３．Ｃブロック
0004030582.tif 000031
を有する相補的オリゴヌクレオチドを合成し、標準的な手順によって精製した。このオリゴヌクレオチドには、Ｎｃｏ Ｉ（ＣＣＡＴＧＧ）、ＥｃｏＲ Ｖ（ＧＡＴＡＴＣ）、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）、およびＢａｍＨ Ｉ（ＧＧＡＴＣＣ）の認識部位（下線部）を含む塩基が組み込まれている。これらのヌクレオチドを二本鎖構造にアニーリングすると、４塩基の粘着末端で、Ｘｍａ Ｉにより生じるものに親和性があるもの（ＣＣＧＧ）が分子の一方の末端に残り、Ｘｈｏ Ｉにより生じる粘着末端に親和性があるもの（ＴＣＧＡ）が分子のもう一方の末端に残る。このようなアニーリングした分子を、Ｘｍａ ＩおよびＸｈｏ Ｉで消化したｐＳＭＶ ＡＢのＤＮＡに連結した。このオリゴヌクレオチド配列を含むプラスミドを担持した大腸菌形質転換体を制限酵素分析によって同定し、ＤＮＡ構造を配列解析によって確認した。このプラスミドを、ｐＭＳＶ ＣＰＬと命名した。これは、ヌクレオチドＡ、ＢおよびＣのブロックを、ＡＢＣの配列順で含んでいる。また、これと共に、ＭＳＶコートタンパク質（「ＣＰ」）遺伝子の５’末端非翻訳リーダー配列（「Ｌ」）も含んでいる。これらは、Mullineauxら（１９８４）のＭＳＶ配列の第１６７〜第１８６番のヌクレオチド、および第１８８〜第３１７番のヌクレオチドに対応しており、ＢａｍＨ Ｉのリンカー配列ＧＧＡＴＣＣＡＧの５’末端、およびリンカー配列ＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣ（配列番号６０）の３’末端に隣接している。（註：野生種ＭＳＶの配列の塩基番号第１８７番に対応するＡ残基は、意図したわけではないが、クローニングの過程で削除された。）
４．Ｂｇｌ ＩＩ部位の挿入：ｐＭＳＶ ＣＰＬのＤＮＡを、ＭＳＶゲノム配列の第２７７番の塩基に対応するＳｍａ Ｉ部位において消化し、そのＤＮＡを、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧを有するＢｇｌ ＩＩリンカーに連結した。特異なＢｇｌ ＩＩ部位をもとのＳｍａ Ｉ部位に有するプラスミドを担持した大腸菌形質転換体を同定し、ＤＮＡ配列解析によって確認して、そのプラスミドをｐＣＰＬ−Ｂｇｌと命名した。
実施例７Ｄ
欠損のあるトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（Ａｄｈ１）のイントロン１の構築
出発物質は、カリフォルニア州スタンフォード所在のスタンフォード大学のV.Walbotから入手したプラスミドｐＶＷ１１９である。このプラスミドは、第１１９番から第６７２番まで［Dennisら（１９８４）の番号付けによる］のヌクレオチドの、イントロン１を含むトウモロコシＡｄｈ１．Ｓ遺伝子のＤＮＡ配列を含有し、Callisら（１９８７）に記載されているものである。ｐＶＷ１１９において、Dennisら（１９８４）の第６７２番目の塩基に続く配列は、ＧＡＣＧＧＡＴＣＣである（下線した塩基は、ＢａｍＨ Ｉ認識部位を表す）。エクソン１の１４塩基、およびエクソン２の９塩基の付いたイントロン１の全配列は、このプラスミドをＢｃｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化した後、５５６ｂｐの断片上に得られる。
１．プラスミドｐＳＧ３５２５ａ（Ｐｓｔ）のＤＮＡをＢａｍＨ ＩおよびＢｃｌ Ｉで消化し、その３４３０ｂｐの断片をアガロースゲルを用いて精製した。
［註：プラスミドｐＳＧ３５２５ａ（Ｐｓｔ）の構造は、この一連の構築工程の最終結果に直接関係するものではない。このプラスミドは関係のない工程で構築したもので、Ｂｃｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉの双方の制限酵素認識部位を有し、かつＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｔｕ Ｉ部位を欠いていることから選んだものである。当業者には、この工程において他のプラスミドを代わりに用いても同様の結果が得られることがわかるであろう。］プラスミドｐＶＷ１１９のＤＮＡをＢａｍＨ ＩおよびＢｃｌ Ｉで消化し、ゲルを用いて精製した５４６ｂｐの断片を、上記の３４３０ｂｐの断片に連結した。ＢａｍＨ ＩおよびＢｃｌ Ｉで消化すると３４３０ｂｐと５４６ｂｐの断片を生じるプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＳＧ ＡｄｈＡ１と命名した。
２．ｐＳＧ ＡｄｈＡ１のＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで［これはDennisら（１９８４）の配列の下位鎖の第２０９番目の塩基と第２１０番目の塩基との間を切断する］、そしてＳｔｕ Ｉで（これは第５５４番目の塩基と第５５５番目の塩基との間を切断する）消化した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって末端を平滑にし、次いで連結した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｔｕ Ｉ部位を欠いたプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定し、配列解析によってそのＤＮＡ構造を確認した。このプラスミドをｐＳＧ ＡｄｈＡ１デルタと命名した。この構築において、イントロン１の内部から、３４４ｂｐのＤＮＡを削除した。これらの塩基の欠損は、このイントロンのスプライシングに影響するものではない。機能的イントロン配列は、Ｂｃｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化した後、２１３ｂｐの断片上に得られる。
３．プラスミドｐＣＰＬ−ＢｇｌのＤＮＡ（実施例７Ｃの工程４）をＢｇｌ ＩＩで消化し、線状化したＤＮＡを、ｐＳＧ ＡｄｈＡ１デルタに由来する、欠損のあるＡｄｈ１．Ｓイントロン配列を含む、２１３ｂｐのＢｃｌ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ断片に連結した。（註：ＤＮＡをＢｇｌ ＩＩ、Ｂｃｌ Ｉ、およびＢａｍＨ Ｉで消化することにより生じる粘着末端は親和性があるが、ＢａｍＨ ＩまたはＢｃｌ Ｉ粘着末端をＢｇｌ ＩＩにより生じた粘着末端に連結すると、上記３つの酵素のいずれによっても開裂しない配列ができる。）Ｂｇｌ ＩＩ／Ｂｃｌ Ｉ結合部がＭＳＶのＣＰＬリーダー配列の５’末端に最も近く、Ｂｇｌ ＩＩ／ＢａｍＨ Ｉ結合部がＣＰＬの３’末端に最も近くなるような配向でＢｇｌ ＩＩ部位に連結したイントロン配列を含むプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を、制限酵素地図作成によって同定した。この配向は、ＤＮＡ配列解析によって確認した。このプラスミドをｐＣＰＬ Ａ１Ｉ１デルタと命名した。ＭＳＶリーダー／イントロン配列は、このプラスミドをＢａｍＨ ＩおよびＮｃｏ Ｉで消化し、その３７３ｂｐの断片を精製することによって得ることができる。
実施例７Ｅ
促進された３５Ｓプロモーター、ＭＳＶのＣＰＬ、および欠損のあるＡｄｈ１イントロン１に基づく植物発現ベクターの構築
１．プラスミドｐ３５Ｓ Ｅｎ２／ＮＯＳのＤＮＡをＢａｍＨ Ｉで消化し、その３５６２ｂｐの線状断片を、ＢａｍＨ Ｉで消化したｐＭＳＶ ＣＰＬのＤＮＡから調製した１７１ｂｐの断片に連結した。この断片は、実施例７Ｃに記載したＭＳＶのＣＰＬ全配列を含んでいる。これらの配列を、Ｎｃｏ Ｉ部位がＮＯＳポリＡ配列の近くに位置するような配向で含むプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を、制限酵素地図作成によって同定した。このプラスミドをｐ３５Ｓ  Ｅｎ２ＣＰＬ/ＮＯＳと命名した。これは、後で生じる転写産物がその５’非翻訳部分にＭＳＶ配列を含むように、ＭＳＶリーダー配列に直接隣接する、促進された３５Ｓプロモーターを含んでいる。
２．プラスミドｐＫＡ８８２（実施例７Ｂの工程１を参照）のＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｃｏ Ｉで消化し、その４７７８ｂｐの長い断片を、ｐ３５ＳＥｎ２ＣＰＬ/ＮＯＳに由来する、促進された３５Ｓプロモーター配列およびＭＳＶリーダー配列を含む、８０２ｂｐのＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｃｏ Ｉ断片に連結した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｃｏ Ｉで消化すると上記の４７７８ｂｐと８０２ｂｐの断片を含むプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定し、ｐＤＡＢ３１０と命名した。このプラスミドにおいて、促進された３５Ｓプロモーターは、ＧＵＳ遺伝子の発現を制御するのに用いられる。転写産物の５’非翻訳リーダー部分は、ＭＳＶコートタンパク質遺伝子のリーダー配列を含んでいる。
３．プラスミドｐＤＡＢ３１０のＤＮＡをＮｃｏ ＩおよびＳａｃ Ｉで消化した。３７１７ｂｐの長い断片をアガロースゲルを用いて精製し、配列ＣＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号６１）および配列ＣＡＴＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴ（配列番号６２）を有する相補的合成オリゴヌクレオチドに連結した。これらのオリゴヌクレオチドは、二本鎖構造にアニーリングした場合、Ｓａｃ Ｉにより分子の一方の末端に残る粘着末端と、Ｎｃｏ Ｉにより分子のもう一方の末端に残る粘着末端とに親和性のある粘着末端を有する分子を生じる。これらの二個の酵素の認識部位の配列の復元に加え、酵素Ｋｐｎ Ｉ（ＧＧＴＡＣＣ）、Ｘｈｏ Ｉ（ＣＴＣＧＡＧ）、およびＨｐａ Ｉ（ＧＴＴＡＡＣ）についての新しい部位を形成する。これらの酵素の部位を含むプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定し、そのＤＮＡ構造を配列解析によって確認した。このプラスミドをｐＤＡＢ１１４８と命名した。
４．プラスミドｐＤＡＢ１１４８のＤＮＡをＢａｍＨ ＩおよびＮｃｏ Ｉで消化し、その３５７７ｂｐの長い断片を、ＢａｍＨ ＩおよびＮｃｏ Ｉで消化したｐＣＰＬＡ１Ｉ１デルタ（実施例７Ｄの工程３）から精製した３７３ｂｐの断片に連結した。ＢａｍＨ ＩおよびＮｃｏ Ｉによってプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定し、そのプラスミドをｐＤＡＢ３０３と命名した。このプラスミドは、次のＤＮＡ構造を有する：ｐＵＣ１９のＰｓｔ Ｉ部位の最後のＧ残基の後の塩基（第４３５番目の塩基）から始めて、ｌａｃＺ遺伝子のコード鎖に隣接する鎖を読むと、リンカー配列ＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＧＴＧ（配列番号６３）、ＣａＭＶのＤＮＡの第７０９３〜第７３４４番のヌクレオチド、リンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶの第７０９３〜第７４３９番のヌクレオチド、リンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧ（配列番号６４）、ＭＳＶの第１６７〜第１８６番のヌクレオチド、ＭＳＶの第１８８〜第２７７番のヌクレオチド、１個のＣ残基に続いてＡｄｈ１．Ｓの第１１９〜第２０９番のヌクレオチド、トウモロコシＡｄｈ１．Ｓの第５５５〜第６７２番のヌクレオチド、リンカー配列ＧＡＣＧＧＡＴＣＴＧ、ＭＳＶの第２７８〜第３１７番のヌクレオチド、Ｈｐａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、およびＳａｃ Ｉの認識部位を含むポリリンカー配列ＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号６５）、ＮＯＳの第１２９８〜第１５５４番のヌクレオチド、そして１個のＧ残基の後にｐＵＣ１９配列の残りの部分（ＥｃｏＲ Ｉ部位を含む）が続く。ＭＳＶの第３１７番目のヌクレオチドと長いポリリンカー配列との間の結合部がＮｃｏ Ｉ認識部位となることは、注目すべきである。
５．プラスミドｐＤＡＢ３０３のＤＮＡをＮｃｏ ＩおよびＳａｃ Ｉで消化し、その３９３９ｂｐの断片を、同様に消化したｐＫＡ８８２のＤＮＡから調製したＧＵＳコード領域を含む、１８６６ｂｐの断片に連結した。適当なプラスミドを制限酵素地図作成によって同定し、ｐＤＡＢ３０５と命名した。このプラスミドは、ＧＵＳ遺伝子の発現を制御するように配置された、ｐＤＡＢ３０３の促進されたプロモーター、ＭＳＶリーダー、およびＡｄｈ１イントロンを有している。
６．プラスミドｐＫＡ８８２のＤＮＡをＸｂａ ＩおよびＮｃｏ Ｉで消化し、その５６８７ｂｐの断片を、配列ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣ（配列番号６６）および配列ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴ（配列番号６７）を有する合成オリゴヌクレオチドをアニーリングしたものに連結した。これらのオリゴヌクレオチドは、アニーリングした場合、Ｘｂａ ＩおよびＮｃｏ Ｉに親和性のある粘着末端を有する二本鎖の構造を形成する。Ｓａｌ Ｉ部位を欠いた組換えプラスミドを制限酵素地図作成によって同定し、ＤＮＡ配列解析によって確認して、ｐＤＡＢ３４９と命名した。
７．プラスミドＰ３５ＳＥｎ２／ＮＯＳのＤＮＡをＸｂａ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、その長い断片（３２８７ｂｐ）を、同様に消化したｐＤＡＢ３４９に由来するＧＵＳコード領域およびＮＯＳポリアデニル化領域を含む２１５２ｂｐの断片に連結した適当な構造を有するプラスミドを制限酵素地図作成によって同定し、ｐＤＡＢ３１３と命名した。
８．プラスミドｐＤＡＢ３１３のＤＮＡをＸｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉで消化し、その３５５８ｂｐの長い断片を、同様に切断したｐＫＡ８８２のＤＮＡから調製した１８８９ｂｐの断片に連結した。適当な構造を有するプラスミドを制限酵素地図作成によって同定し、ｐＤＡＢ３４８と命名した。
９．プラスミドｐＤＡＢ３４８のＤＮＡをＢａｍＨ Ｉで消化し、その長い断片（５４３７ｂｐ）を、ｐＳＧ ＡｄｈＡ１デルタ（実施例７Ｄの工程２）に由来する、欠損のあるＡＤｈ１．Ｓのイントロン１を含む、２１３ｂｐのＢｃｌ  Ｉ/ＢａｍＨ Ｉ断片に連結した。適当な構造を有するプラスミドを制限酵素地図作成によって同定し、ｐＤＡＢ３５３と命名した。
実施例７Ｆ
出発物質は、プラスミドｐＩＣ３５である。このプラスミドは、ｐＩＣ１９Ｒ［Marshら、Gene，32（1984）481］のＮｒｕ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識部位が保持されるような配向で連結された、ｐＵＣ１３ ３５Ｓ（−３４３）（この実施例の工程Ｃを参照）に由来する、８４５ｂｐのＳｍａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を含んでいる。Ａ．ツメファシエンスＯＲＦ２５/２６配列の供給源は、プラスミドｐＩＣ１９２５である。このプラスミドは、ｐＩＣ１９Ｈ［Marshら、Gene，32（1984）481］のＳｍａ Ｉ部位に、ｐＩＣ１９ＨのＢａｍＨ Ｉ部位がＴ−ＤＮＡ断片のＯＲＦ２５末端に隣接するような配向で連結された、Ａ．ツメファシエンスのｐＴｉ １５９５５Ｔ−ＤＮＡ［Barkerら、Plant Molec.Biol.,2（1983）335］の第２１７２８〜第２２４４０番のヌクレオチドに含まれる、７１３ｂｐのＨｉｎｃ ＩＩ断片を含有している。
１．ｐＩＣ １９Ｒ３５/Ａ：プラスミドｐＩＣ３５のＤＮＡをＢａｍＨ Ｉで消化し、ｐＩＣ１９２５のＤＮＡをＢａｍＨ ＩおよびＢｇｌ ＩＩで消化することによって調製した７３８ｂｐの断片に連結した。３５Ｓプロモーター断片とＯＲＦ２５/２６ポリＡ断片との間にＢａｍＨ Ｉ部位が存在しているプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＩＣ １９Ｒ３５/Ａと命名した。（註：ＢａｍＨ ＩおよびＢｇｌ ＩＩにより生じた親和性のある粘着末端の連結によって、いずれの酵素の認識部位でもない配列ができる。）
２．ｐＩＣ３５/Ａ：プラスミドｐＩＣ １９Ｒ３５/ＡのＤＮＡをＳｍａ Ｉを用いてその特異部位において消化し、そのＤＮＡを、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧを有するＢｇｌ ＩＩリンカーに連結した。（註：このＢｇｌ ＩＩリンカーをつなげることによって、Ｂｇｌ ＩＩ認識部位に加え、Ｐｓｔ Ｉ認識部位であるＣＴＧＣＡＧもできる。）もとのＳｍａ Ｉ部位の位置に少なくとも二つのリンカーのコピーを有する（従って新たなＢｇｌ ＩＩおよびＰｓｔ Ｉの部位を有する）大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＩＣ３５/Ａと命名した。
３．ｐＩＣ ２０Ｒデルタ：プラスミドｐＩＣ ２０Ｒ［Marshら、Gene,32（1984）481］のＤＮＡをＮｒｕ ＩおよびＳｍａ Ｉで消化し、その長い断片の平滑末端同士を連結した。Ｎｒｕ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、およびＢａｍＨ Ｉの部位を欠いたプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＩＣ ２０Ｒデルタと命名した。
４．ｐＳＧ Ｂｇｌ ３５２５（Ｐｓｔ）：プラスミドｐＩＣ ２０ＲデルタのＤＮＡをＢｇｌ ＩＩで消化し、ｐＩＣ３５/Ａの１６２５ｂｐのＢｇｌ ＩＩ断片に連結した。３５Ｓプロモーター／ＯＲＦ２５ポリＡ配列を含むプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。制限酵素地図作成により、これらの配列において、ｐＩＣ ２０Ｒデルタの特異なＫｐｎ ＩおよびＸｈｏ Ｉの部位が、ＯＲＦ ２５ポリＡ配列の３’末端に位置するような配向であることがわかった。このプラスミドをｐＳＧ Ｂｇｌ ３５２５（Ｐｓｔ）と命名した。
５．ｐＳＧ ３５２５ａ（Ｐｓｔ）：プラスミドｐＳＧ Ｂｇｌ ３５２５（Ｐｓｔ）のＤＮＡを、分子内の二つのＢｇｌ ＩＩ部位のうち一つだけが開裂するような条件下において、Ｂｇｌ ＩＩで消化した。その４３０１ｂｐの線状断片を、配列ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＡＣ（配列番号６８）（下線した塩基は、Ｂｃｌ Ｉ認識配列を表す）を有するアダプター合成オリゴヌクレオチドに連結した。３５Ｓプロモーターの５’にあった元のＢｇｌ ＩＩ部位の位置にＢｃｌ Ｉ部位を有する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＳＧ ３５２５ａ（Ｐｓｔ）と命名した。
６．ｐＤＡＢ ２１８：プラスミドｐＩＪ４１０４（実施例８を参照）のＤＮＡをＳｍａ Ｉで消化し、その５６９ｂｐの断片をアガロースゲルを用いて精製した。プラスミドｐＳＧ ３５２５ａ（Ｐｓｔ）（上記参照）のＤＮＡを、３５ＳプロモーターとＯＲＦ ２５ポリＡ配列との間にある特異なＨｉｎｃ ＩＩの位置で消化して線状化し、その線状断片を５６９ｂｐのｂａｒ遺伝子断片に連結した。ｂａｒ遺伝子を、Ｂｇｌ ＩＩで消化すると４１１８ｂｐと７６４ｂｐの断片を生じるような配向で含むプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を、制限酵素地図作成によって同定した。このプラスミドをｐＤＡＢ ２１８と命名した。
７．ｐＤＡＢ ２１９：プラスミドｐＤＡＢ ２１８のＤＮＡをＢｃｌ Ｉで消化し、４８８２ｂｐの線状断片を、ｐＫＡ８８２−２ｘＢｇ（後記する工程１０を参照）のＤＮＡから調製した３１３３ｂｐのＢｇｌ ＩＩ断片に連結した。後者の断片は、３５Ｓプロモーターの転写制御下に、ＮｏｓポリＡ転写停止シグナルとともにＧＵＳコード領域を含んでいる。ＧＵＳおよびＰＡＴコード領域を含む大腸菌形質転換体を同定し、制限酵素認識部位地図を作成すると、双方のコード領域が同じＤＮＡ鎖にコードされていることがわかった。このプラスミドをｐＤＡＢ ２１９と命名した。
８．プラスミドｐＤＡＢ ２１９のＤＮＡを、プライマーとしての合成オリゴヌクレオチド：ｉ）ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣ（配列番号６９）、および
0004030582.tif 000032
を用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション［ＰＣＲ（Saikiら、Science，239（1988）487）］の鋳型として使用した。プライマーｉ）は、ｐＤＡＢ ２１９の第４１９〜第４４６番のヌクレオチドを表すものであり、Ｘｈｏ Ｉ（ＣＴＣＧＡＧ）、Ｂｇｌ ＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）、Ｘｂａ Ｉ（ＴＣＴＡＧＡ）、ＥｃｏＲ Ｖ（ＧＡＴＡＴＣ）、Ｃｌａ Ｉ（ＡＴＣＧＡＴ）、およびＥｃｏＲ Ｉ（ＧＡＡＴＴＣ）の認識部位に対応する塩基を含んでいる。プライマーｉｉ）の一重下線を付した塩基は、ＢａｍＨ Ｉの認識配列を表し、二重下線を付した塩基はｐＤＡＢ ２１９の第１１３８〜第１１５９番のヌクレオチド表すもので、ＯＲＦ２５ポリＡ断片（前記参照）の第２１７２８〜第２１７４９番のヌクレオチドに対応するものである。ＰＣＲ増幅によって、７６０ｂｐの生産物が得られた。
９．ｐＫＡ８８２−Ｂｇ：ｐＫＡ８８２のＤＮＡをＰｓｔ Ｉで消化し、その線状断片を、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡ（配列番号７１）を有する合成アダプターに連結した。（註：アニーリングした場合、これらの分子は、Ｐｓｔ Ｉにより生じる粘着末端に親和性のある粘着末端を有する二本鎖の分子を形成する。そのような分子をＰｓｔ Ｉで消化したＤＮＡに連結すると、もはやＰｓｔ Ｉでは開裂されない配列が生じ、新たなＢｇｌ ＩＩ部位が導入される。）Ｐｓｔ Ｉによって開裂せず、特異なＢｇｌ ＩＩ部位を有するプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＫＡ８８２−Ｂｇと命名した。
１０．ｐＫＡ８８２−２ｘＢｇ：ｐＫＡ８８２−ＢｇのＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉで消化し、その線状断片を、配列ＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＣ（配列番号７２）を有する合成アダプターに連結した。このアニーリングした分子をＥｃｏＲ Ｉで消化したＤＮＡに連結すると、もはやＥｃｏＲ Ｉでは開裂しない配列が生じ、新たなＢｇｌ ＩＩ部位が導入される。ＥｃｏＲ Ｉでは開裂せず、３０２７ｂｐおよび２６５８ｂｐのＢｇｌ ＩＩ断片を生じるプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。このプラスミドをｐＫＡ８８２−２ｘＢｇと命名した。
１１．ＰＤＡＢ３０５Ｂｇ：プラスミドｐＤＡＢ３０５をＥｃｏＲ Ｉで完全に消化し、線状化したＤＮＡを、配列ＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＣ（配列番号７３）を有する、キナーゼ処理した自己相補的オリゴヌクレオチドアダプターに連結した。このアダプターをＥｃｏＲ Ｉにより生じた付着末端に連結することによって、プラスミドＤＮＡを再度環状化し、新たなＢｇｌ ＩＩ認識部位を導入し、そして元のＥｃｏＲ Ｉ認識部位を壊した。得られるプラスミドをｐＤＡＢ ３０５ Ｂｇと命名した。
実施例８：ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyceshygroscopicus）のｂａｒ遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
出発物質は、Ｓ．ヒグロスコピクスのｂａｒ遺伝子のコード領域を含み、M.J.Bibb（英国ノーウィック所在のJohn Innes Institute）から入手した、プラスミドｐＩＪ４１０４［Whiteら、Nucl.Acid Res.,18（1990）1062］である。ｂａｒ遺伝子は、酵素であるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinothricin acetyl transferase,PAT）をコードしている。
ｐＤＡＢ２１９デルタ：プラスミドｐＤＡＢ ２１９のＤＮＡをＢｇｌ ＩＩで消化し、その７２５２ｂｐの断片をアガロースゲルを用いて精製して、実施例７Ｆ工程８のＰＣＲ生産物をＢｇｌ ＩＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化することにより生じた７４７ｂｐの断片に連結した。ＯＲＦ ２５ポリＡ断片の３’末端に位置する特異なＢｇｌ ＩＩ部位を含むプラスミドを担持する大腸菌形質転換体を同定した。ＰＡＴをコードする配列の３’末端のＤＮＡ構造を、ＤＮＡ配列解析によって確認した。このプラスミドをｐＤＡＢ ２１９デルタと命名した。
ＰＤＡＢ ２１９デルタのＤＮＡ配列は、以下の通りである：ｐＩＣ２０Ｒ［Marshら、Gene,32（1984）481］のｌａｃ Ｚコード鎖上のＸｂａ Ｉ部位の最後のＡ残基に続く塩基から始まって、リンカーＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣ（配列番号７４）、次いでＣａＭＶの第６６０５〜第７４３９番のヌクレオチド、次いでリンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣ（配列番号７５）、次いで３’に隣接する４４ｂｐの大腸菌ゲノムＤＮＡ［Jeffersonら（Proc.Natl Acad.Sci.,83（1986）8447）の第３０６〜第２１５２番のヌクレオチド］をもつＧＵＳのコード領域の残りの部分がある。下線した塩基は、ＧＵＳタンパク質の最初の二個のアミノ酸のコドンを表し、そのうち二番目のアミノ酸は、元の大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子［Jeffersonら、（Proc.Natl.Acad.Sci.,83（1986）8447）］におけるロイシンから、ｐＲＡＪ２７５［Jeffersonら、Plant Molec.Biol.,Reporter,5（1987）387］におけるバリンへと変わっている。これらの塩基に続いて、リンカー配列ＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ（配列番号７６）、次いでＮｏｓポリＡ配列［DePickerら、J.Molec.Appl.Genet.,1（1982）5561］の第１２９８〜第１５５４番の塩基が続く。リンカー配列ＧＧＧＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＧ（配列番号７７）の後には、ＣａＭＶの第６４９５〜第６９７２番の塩基、リンカーＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶの第７０９０〜第７４４３番の塩基が続く。これらの塩基の後には、リンカーＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣ  ＡＧＧＴＣ（配列番号７８）、次いでｐＩＪ４１０４［Whiteら、Nucl.Acids Res.,18（1990）1062］のｂａｒクローンの第２０〜第５７９番のヌクレオチドに対応する塩基、リンカーＣＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣ（配列番号７９）、ＯＲＦ２５/２６ポリＡの第２１７２８〜第２２４４０番のヌクレオチド（１）、リンカーＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ（配列番号８０）、およびｐＩＣ２０Ｒの残りの部分が続く。Ｂｇｌ ＩＩ認識部位（下線部）は、他の遺伝子を導入しうる特異な部位を表す。
トランスジェニック植物組織および植物の発現を行なうために、BtＩＣＰ遺伝子を三種の異なるベクターにサプクローニングした。第一に、選択可能かつスクリーニング可能なマーカーを担持するプラスミドで同時形質転換を行なうために、ＩＣＰ遺伝子をプラスミドｐＤＡＢ３０５Ｂｇにクローニングした。ＩＣＰ遺伝子の下流に位置するＢａｍＨ Ｉを、ＢａｍＨ Ｉ／Ｓｓｔ Ｉアダプターを挿入することによってＳｓｔ Ｉ部位に修飾した。ＩＣＰ遺伝子を担持する１８５４塩基対のＮｃｏ Ｉ−Ｓｓｔ Ｉ断片を、高発現二重促進３５Ｓプロモーター、およびノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）ポリＡ付加配列の制御下に挿入し、プラスミドｐＤＡＢ９１０（図６）とした。第二に、ＭＳＤ培養物のプロトプラストの形質転換とカナマイシン選択を行なうために、３１５０塩基対のＢｇｌ ＩＩ断片として、促進した３５Ｓ/Bt/Ｎｏｓカセットを、ｐＤＡＢ９１０からｐＤＡＢ１９９の特異なＢｇｌ ＩＩ部位にサブクローニングした。このプラスミドｐＤＡＢ１９９の調製は、Sukhapindaら（Plant Cell Reports 13（1993）63）に開示してあり、トウモロコシ（Zea maysl）のプロトプラストの形質転換と再生により、プラスミドｐＤＡＢ９１１が生じたものである（図７）。第三に、タイプＩＩカルスの刺激およびバスタ（Basta）（登録商標）選択による形質転換に用いるために、同じ３５ＳＥｎ２/Bt/Ｎｏｓカセットを、プラスミドｐＤＡＢ２１９デルタの特異なＢｇｌ ＩＩ部位にサブクローニングしてｐＤＡＢ９１７（図８）とした。
実施例９：発光性飛翔昆虫（ホタル）ルシフェラーゼ（Luciferase）をコードする参考遺伝子の構造
異なるプロモーター変種により制御される遺伝子からのＧＵＳタンパク質の生産は、しばしば、発光性飛翔昆虫ルシフェラーゼを生産する内部制御遺伝子を基準として比較された（DeWet et al.,Molec.Cell Biol.7（1987）725）。ルシフェラーゼ（LUC）コード領域を含むプラスミド（pT3/T7-1 LUC）は、CLONTECH（PaloAlto,CA）から購入し、コード領域は、標準法でその５'および３'末端で変更（modify）した。簡潔には、翻訳（translational）開始コドン（ATG）の周りの配列を変更し、第２の位置にNco Ｉサイト（CCATGG）、およびアラニンコドン（GCA）を含むようにした。３'末端で、ルシフェラーゼコード領域のストップコドンの42bp下流に位置するSsp I認識（recognition）のサイトを、T4DNAポリメラーゼを末端としたブラント（blunt）とし、結合して、Blg II認識配列をコードする合成オリゴヌクレオチドリンカー（linker）とした。これらの修正はNco IおよびBgl IIによる消化（digestion）が続く1702bpフラグメント上の無損傷のルシフェラーゼコード領域の単離を許容する。このフラグメントを、プラスミドpDAB305のGUS遺伝子（実施例7E、ステップ5を参照）を置換し、ルシフェラーゼコード領域が強化（enhanced）35sプロモーターから発現され、その結果プラスミドpDeLuxとなるようにした。一次転写産物の５'非翻訳リーダーは、変更したMSVリーダー/Adhイントロン配列を含む。
実施例１０：細胞形質転換（トランスフォメーション）
未成熟トウモロコシ小胞子（microspores）由来の細胞懸濁培養物を開始植物材料として用いた。これらの小胞子由来培養物（MSD）をミッシェルら（Mitchell et al.）によるJ.Plant Physiol.,137（1991）530に記載されるように維持した。培養物は一倍体（ハプロイド：haploid）であり、ある細胞株（line）はハプロイド植物の再生が可能である。８〜20ヶ月日の古い細胞懸濁培養株をプロトプラスト単離法に用いた。プロトプラスト濃度は、エレクトロポレーション（electroporation）溶液［20mg/L KH2P04,115mg/L Nah2P04,444mg/L CaCl2,7.5g/L NaCl,36.4g/Lマンニトール,pH7.2（Fromm et al.,Nature,319（1986）791）］に対して４×106のプロトプラスト／mlとなるように調整した。プロトプラスト懸濁液を42℃で5分間熱衝撃を与え、その後、氷上に載置した。プラスミドpDAB911単独で、またはpDAB910をpDAB326と共に、プロトプラストトランスフォメーション試験に用いた。プラスミドの等モルＤＮＡ量（例えば、pDAB911の64μg、pDAB910の31.6μg、およびpDAB326の46μg）を用いた。無菌の1.0mMトリス（Tris）20〜40μl、pH8.0、1.9mM EDTA中のプラスミドＤＮＡを、総量が0.5mlになるようにエレクトロポレーション溶液の含有する1mlポリスチレンエレクトロポレーションキュベットに入れた。単一電気パルス（400μF、300v/cm）をIBI Gene Zapperユニットから印加する直前に、1/2mlのプロトプラスト懸濁液をキュベットの中にビペットで添加した。直ぐにキュベットを10分間、氷上に載置した。プロトプラスト懸濁液の250μlの容量（約5×105プロトプラスト）を、60×15mmポリスチレンペトリプレート上のM1固体培養上に伸ばされたフィーダー細胞（300mgのMSD細胞、ライン34）上に載置されたフィルタ（Micron Separations,Inc.の47mmナイロン）の上に伸ばした。平板培養して一週間後、フィルターを100mg/Lの硫酸カナマイシンを含有する選択培地に移した。カナマイシン含有培地上で４〜６週間後、耐性カルス分離株（resistant callus isolaton）が観測され、選択された。上述したプラスミドを用いた合計４つのトランスフォーメーション試験から、400を超える分離株（isolations）を選択した。これらのカルス分離株を、さらなる分析のために十分組織が蓄積されるまで同一の培地上で成長させた。
これらの選択した分離株が変換され且つ発現された導入マーカー遺伝子かどうかを決定するため、カルス組織を、ジェファーソン（Jefferson）によりPlant Molec.Biol.Rep.,5（1987）387に開示された組織化学的（histochemical）技術を用いてβ−グルクロニダーゼ（GUS）活性を評価し、レイスら（Reiss et al.）のGene、30（1984）211に開示された技術を用いてネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ活性を評価した。選択した分離株を、上述した通り、免疫ブロット（immunoblot）分析により、導入ICP遺伝子の発現について試験した。その結果は、表16に示す。
0004030582.tif 000033
合計４つの分離株は、ICPの検出可能な量を示した。２つの分離株を、pDAB911で変換し、それらのICP発現量は、抽出可能なタンパク質（図9）の合計の約0.1％に一致する。pDAB910およびpDAB326で同時変換から得た、他の２つの分離株もまた、抽出可能なタンパク質（データは図示せず）の合計の約0.1％でICPを発現した。一つの単離からのカルス組織（pDAB911で変換した）を、Heliothis virescens新生幼虫（neonate larvae）の３日間摂食試験（feeding assay）で使用した。その結果、十分なICPから生成されたカルス組織は幼虫の大部分を殺し、残りの成長を著しく抑制したことを示した。
0004030582.tif 000034
実施例11：細胞形質転換（トランスフォメーション）
パートＡ  −  胚形成カルス培養株の樹立
胚形成カルス培養を、遺伝子型の未熟な胚、特に生体外（試験管内）操作で繁殖可能なものから開始した。代表的な２つの遺伝子型の培養を用いた：i）「BackcrossedB73」は、交配種B73x（b73xA188）由来のBC3同系繁殖体（inbred）であり、ii）「High II」は、B73xa188交配種由来の２つのＳ3系統を掛け合わせることによって形成した雑種である。適当な培養条件にさらした場合、これらの遺伝子型の両方からの未熟な胚は、繁殖力のある植物再生ができるカルス形成を一貫して高レベルで示した。
「High II」およびB73の２つのS3原種の種子を、湿らせられて且つpH6.0に調整した約4kgの乾燥土壌ミックス＃３（マサチューセッツ州、スプリングフィールドのコンラッド・ファファード・インコーポレーティド（Conrad Fafard,Inc.,Springfield,MA））を含有するポットにそれぞれに播種した。この植物を16/8の光周期の下の温室で育成した。周囲日光を、高圧ナトリウムおよびメタルハライドランプの組み合わせで補い、上記ポットの上方２ｍの最低光度レベルが約1,500ft-candlesであるようにした。温室の温度を日中は28℃、および夜間は22℃から３℃以内に維持した。植物を、400mg/Lの20-20-20肥料（ペンシルバニア、フォゲルスヴィルのダブリュ・アール・グレース・アンド・カンパニー（W.R.Grace & Co.,Fogelsvill,PA））に、8mg/Lのキレート鉄（ノースカロライナ、グリーンスボロのチバ・ガイギー（CIBA-GEIGY,Greensboro,NC））を含有する溶液を必要なときに注いだ。
花粉の散らばり（pollen shed）および毛の出現（silk emergence）が植え付け後に50〜60日で始まった。雌株を、未受精の穂部（ear shoots）の皮（husks）および毛（silks）の先端の切断により花粉が適用可能となる日の前日に受粉した。翌日、毛が成長して全て同一の長さの厚い「ブラシ」を形成した後、花粉を雄穂（tassels）の上に紙袋をかぶせることによって収集し、慎重に毛（silks）に適用した。「戻し交雑（backcrossed）B73」胚は、B73植物を、BC2培養から再生した植物（後述するように）で受粉することで生成した。「High II」胚は、S3系統をかけ合わせることにより得られた。
発育した胚が約1.5〜2.0mm（受精後、10〜14日間）の長さに達した際、穂（ear）を切除し、表面を30分間、70％v/vエタノールに１０分間浸漬し、続いて市販されている20％v/vブリーチ（1％の次亜塩素酸ナトリウム）に３０分間浸漬することによって滅菌した。滅菌に続いて、蒸留水ですすいだ後、未熟な胚を無菌に隔離し、「開始（initiation）」培地に、胚軸（embryo axis）を培地に接触させて（胚盤側（scutellar-side）を培地から離して）配置した。「開始」培地は、以下の組成物からなる：N6基本塩類およびビタミン（Chu,Proc.Symp.Plant Tissue Calture（1978）、Peking Press pp.43-56）、20g/Lのサッカロース、2.9g/Lのプロリン（proline）、100mg/Lのカゼイン加水分解物、1mg/Lの2,4ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、10ml/LのAgNO3、および2.5g/Lの、pH5.8に調整したゲルライト（gelrite）（カリフォルニア州、サンディエゴのケルト・インコーポレーティド（Kelco,Inc.,San Diego,CA））。
未熟な胚を、10〜30日間、28℃で暗所で培養した。この間、種々の型の形態学を表すカルス組織は、胚盤領域から増殖する。この間に産出したカルス組織を、３つの区分に分類した：i）如何なる明白な形態学的な組織を欠いている、軟質で、顆粒状で、半透明なカルス（非胚形成（nonembrogenic）として知られている）、ii）胚盤（scutellar-）様および鞘葉（coleoptile-）様構造を有する体細胞胚（somaticembryos）の群（しばしば、融合する）からなる小型で、小結節性（nodular）で、黄色乃至白色カルス（（特）型として知られている）、およびiii）胚柄（suspensor）様の構造に、大多数の球顆状（globular）および細長い（elongated）体細胞胚を有する軟質カルス（（監）型として知られている）。（監）型カルスは、脆い、胚形成培養株（cultures）を樹立するのに最も好適であった。しばしば、全体の胚盤がこの型の組織を持って、または、時々、この培養された形態学を示す小さいセクタのみを持って増殖した。次いで、選択的な二次培養を実行し、それによって、内在する未分化（subtending undifferentiated）、軟質組織に沿って、明確な球顆状（globular）で細長い（elongated）体細胞胚を有する組織のみを、新しい「開始」培地に移植した。この「開始」培地での2-3次培養後、胚を「維持（maintation）」培地に移植した。「維持」培地は、その中に690mg/Lのプロリン（proline）を含みAgNO3を含有しない点で「開始」培地とは異なる。（監）型胚の選択的強化（preferential enrichment）を8〜16週した後、良好に樹立された胚形成培養株が、ヘリウムブラスト（helium blasting）のために準備された。
パートＢ  −  ヘリウムブラストによる形質転換（トランスフォメーション）
ヘリウムブラストは、プラスミドDNAで被覆された、ミクロンサイズの微粒子を浸透性の（penetrating）速度まで加速することが必要である。用いた装置は米国特許No.5,141,131に記載されている。簡潔には、装置は、高圧ヘリウム源、懸濁状態のDNA被覆金微粒子のリザーバ、およびヘリウム源の出口と金懸濁液の入口との間を選択的に連結する多目的バルブとからなる。金微粒子は、選択可能で選別可能なマーカー遺伝子のコード配列を含むプラスミドDNA（pDAB917）で被覆されている。
選択可能なマーカー遺伝子は、酵素フォスヒノトリシン（phosphinothricin）アセチルトランスフェラーゼ（PAT）をコードし、除草剤Basta（商品名）への耐性を与えるバー（bar）である。選別可能なマーカー遺伝子は、β-グルクロニターゼ（GUS）をコードしたuidAであり、その活性は、組織化学的にモニターできる。両方の遺伝子を、Cauliflower Mosaic Virusからの、35s構成プロモーターにより操作される。この方法で、除草剤Basta（商品名）にさらすことにより、非変換組織のバックグラウンドから稀に変換細胞を選出でき、陽性組織が青色になる組織化学試験を用いてβ-グルクロニターゼ活性の存在が試験される。
プラスミドDNAは、変換実験で使用する前に、金微粒子の表面に吸着させた。金微粒子は約1.5〜3.0ミクロンの範囲の直径を有する球形である（ワイオミング州、ミルウォーキーのアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI））。吸着は、300μLのDNA/金懸濁液（140μLのpDAB917、0.01Mのトリス（Tris）緩衝液、および1mMのEDTA）中に、74μLの2.5M塩化カルシウム、および30μLの0.1Mスペルミジン（spermidine）を添加することにより実施した。DNA被覆金微粒子は直ぐに渦をまき、その後、エッペンドルフ（Eppendorf）チューブの底に沈み、その結果、透明な液体が完全に引き出される。その後、DNA被覆金粒子を、1mLの100％のエタノール中に再懸濁する。続いて、懸濁液を、ヘリウムブラスト試験で使用するために、エタノールのmL当たり15mgDNA/金となるように希釈した。
5〜7日間の二次培養に続いて、約250mgの胚形成細胞組織を、「維持」培地の表面に、直接、薄い円形層として設けた。組織を使用前の数分間、層流フード（laminar flow hood）中に、カバーをしないでプレートをおくことにより、多少乾燥するのを許容した。ヘリウムブラストの調製において、カルスを104ミクロンステンレススチールスクリーンで覆った。その後、DNA被覆金微粒子をカルス組織に加速した。各カルス組織サンプルを、約1μLのDNA被覆金懸濁液を運ぶそれぞれのブラストで10〜15回ブラストした。
パートＣ  −  遺伝子導入（トランスジェニック）組織、および植物再生
ブラスト後、胚組織を1〜2日間、前述した条件の下で培養させた。その後、各組織サンプルを、約60の均等断片（1-3mm直径）に分割し、30mg/LのBasta（商品名）を含有する新しい「維持」培地に移植した。３週間毎に、胚組織を非選択的に、新たなBasta（商品名）含有の「維持」培地に移植した（組織形態学に関係なく）。この除草剤の濃度で、成長がわずかに生じた。８〜16週間後、成長抑制組織のバックグランドから増殖するセクタが出現した。この組織を他の胚から単離し、Basta（商品名）含有の「維持」培地に別途保存し、選択的に10〜14日毎に二次培養した（（監）型組織に限り）。この時点で、ＧＵＳ発現の組織化学検査を後述の通り実行した。
全てのBasta（商品名）耐性カルス（GUS陽性またはGUS陰性にかかわらず）を選択的に「導入」培地に二次培養し、28℃で、低光度（125ft-candles）のもとで１週間、続いて冷却蛍光灯ランプで供給される高光度（325ft-candles）で１週間培養した。「導入」培地は、MS塩類およびビタミン（ムラシゲら（Murashige et al.）のPhsiol.Plant、15（1962）473-497）、30g/Lのサッカロース、100mg/Lのミオイノシトール（myo-inositol）、5mg/Lのベンジルアミノプリン、0.025mg/Lの2,4-D、2.5g/LのpH5.7に調整したゲルライト（gelrite）から構成される。この２週間の導入期間に続いて、カルスを非選択的に、「再生」培地に移植し、28℃で高光度で培養した。
「再生」培地は、MS塩類およびビタミン、30g/Lのサッカロース、および2.5g/Lの、pH5.7に調整したゲルライトから構成される。14〜21日毎に、カルスを、葉と根を分化して発現する組織とするように選択して、新たな「再生」培地に二次培養した。「導入」および「再生」培地の両方は、30mg/LのBasta（商品名）を含有している。苗木（plantlet）を約0.1kgの乾燥土壌ミックスを含む10cmのポットに移植し、次いで、よく湿らせ、約４日間、透明のプラスチックカップで覆った。3〜5葉段階で、植物をより大きなポットに移植し、上述したように成熟するまで成育した。同花受粉または同胞受粉を、遺伝子導入子孫を得るために、同一の培養株から再生されたまたは非変換種子由来の植物との交配で再生された植物で実施した。
実施例12：試験分野
実施例11に記載する手順および遺伝子導入子孫を用いて、四（4）遺伝子導入同系交配を、従来の培養技術から製造した。得られた同系交配を、４つの遺伝子導入雑種を育成するために用いた。
各四（4）つの遺伝子導入雑種からの種を、完全な乱塊法を用いて、単一のレーンの区画（single row plots）に移植した。立地は、インディアナ州、イリノイ州、ミネソタ州、およびアイオア州の調査拠点を含んでいる。対照区画（非遺伝子導入対照雑種）は、未変性（対照Ａ）および人工的な寄生（infestation）（対照Ｂ）による虫害の量を測定するのに用いた。対照の第二世代のヨーロピアン・コーン・ボア（ECB）は、全ての拠点で評価した。第一世代のＥＣＢおよびオオタバコガの幼虫（corn earworn）は、インディアナ州およびイリノイ州調査拠点に限って評価した。全ての虫は、単一の出所から得た。各試験では、新生幼虫が２度（4〜6日おいて）群がった。第一世代のECB研究において、40〜80の幼虫を輪生発育段階の最中に（mid-whorl development stage）で植物に添加する一方で、第二世代のECB試験では、同数の幼虫を毛段階の最中（mid-silk stage）で添加した。植物の損害を、６週後に、実存する場合には柄（stalks）および穂苗条（ear shoots）を裂くことで決定した。ECB幼虫および穴（tunnel）を同型当たり、各10植物について記録した。オオタバコが幼虫の試験は、穂（ear）当たり約5〜10のオオタバコが幼虫の一齢幼虫を人工的に群がらせるように、同型当たり10植物に要求した。約３週間後、穂を、実存する幼虫数により評価した。
分散の複合分析を第一世代ECB試験（表18）について収集したデータについて実施した。人工的に外寄生させた対照は、柄当たり、平均の１つの穴であり、70％を超える外寄生量を有した。遺伝子導入系統は、ECB穴がほとんどなく（柄当たり≦0.06の穴）、7％より低い外寄生量を有した。対照および遺伝子導入系統間では、外寄生の植物の割合と同様に、柄当たりの幼虫および穴について顕著な相違（p＜0.05）を示した。第一世代のECB対照における個々の遺伝子導入雑種間で、統計学上の相違は認められなかった。
0004030582.tif 000035
第二世代ECBにおいて、人工的に寄生させた対照は、柄当たり、平均で１〜３の穴であり、外寄生量は72〜100％の範囲に亘った（表19）。遺伝子導入雑種への損傷は、0〜23％の範囲（表19）の外寄生量と共に、ゼロからほんの僅かの範囲（柄当たり≦0.25穴）であった。穴長さについての測定値は、遺伝子導入系統で認められた穴の長さは、対照と比較して顕著に小さい（p＜0.5）ことを示した（表19）。平均および平均標準誤差だけが、平均穴長測定値について算出した。遺伝子導入の多くの型において穴がなくてデータを欠如した結果になったので、他の統計学上の分析は、有効ではない。ミネソタ州の試験は例外として、これらのデータは、遺伝子導入雑種間の平均の穴長が、対照と同様およびより小さなものであることを示している。遺伝子導入系統は、ECBから損傷された穂が、対照より顕著に少ない（p＜0.05）。一般に、顕著な相違（p＜0.05）は、対照と遺伝子導入系統との間で認められた。統計学的に顕著な相違は、第二世代ECBに対する、個々の遺伝子導入雑種とそれぞれ対照との間では認められない。
0004030582.tif 000036
0004030582.tif 000037
人工的に外寄生させた対照は、穂（ear）当たり平均で約１匹のオオタバコが幼虫があり、40〜90％の外寄生の範囲であった。遺伝子導入雑種は、穂当たりのオオタバコが幼虫、および外寄生量の両方について、対照とは顕著に異なる（p＜0.05）。遺伝子導入雑種間で統計学上の有意な相違は認められなかったが、雑種＃１は、両方の拠点でオオタバコが幼虫からの損傷を示した（表20）。雑種2,3および4は虫からの損害がほとんどないことを示した。
0004030582.tif 000038
当業者が前述した発明の詳細を考慮すると、発明の実施における多くの改良および変形が実施できると考えられる。したがって、そのような改良および変形は、以下の請求項の範囲に含まれることを意味する。
実施例１３：エレクトロポレーションにおける一時的発現による相対的プロモーター強度の決定
ブラック・メキシカン・スウィート（Black Mexican Sweet（BMS））培養（V.Walbot,Stanford University）を液体培地（Fromm et al.,PNAS USA 82（1985）351）に懸濁させて維持した。0.5％セルロース・オノズカRS、0.5％ヘミセルロース、0.02％ペクチナーゼ（Karlan Research Products,Santa Rosa,CA）を含有する４ｘ容量のプロトプラスト単離溶液（Fromm et al.,Enzymol.153（1987）351）に細胞を懸濁し、ゆっくりと振とうすることで、４日経過した培養からプロトプラストを単離した。3.5時間にわたる消化の後に、細胞およびプロトプラストを遠心により回収した（208ｘｇ、25℃、５分）。その後、プロトプラスト単離溶液にやさしく再懸濁して２回洗浄した。プロトプラストの精製は、トウモロコシ洗浄溶液（Maize Wash Solution（shanin,Theor.Appl.Genet.69（1985）235）上に浮遊させることでおこなった。プロトプラストをエレクトロポレーション溶液（Fromm et al.,Enzymol.153（1987）351）で２回洗浄し、最終密度を4x106プロトプラスト／mlとした。エレクトロポレーションに先立って、プロトプラストを５分間、42℃のヒート・ショック処理し、つづいて使用するまで氷上に静置した。約2x106プロトプラストからなる分割量を適当なDNA混合液1ml容量中でエレクトロポレーションした。典型的なDNA混合物（1ml中2x106プロトプラストあたり）は、60μgの試験プラスミドDNAと4.5μgの参照用プラスミドDNAとを含む。エレクトロポレーションの条件は、1500μF、1cmのギャップを横切る200-400V、25msecのパルス時間（Promega Model 240/250、Madison、WI）とした。エレクトロポレーションの後に、プロトプラストを氷上に10分間静置し、つづいてプロトプラスト増殖培地（Fromm et al.,PNAS USA 82（1985）351）を含んだプラスチック製ペトリ皿（事前に1.2％SeaPlaqueアガロース；FMS BioProducts,Rockland,MEの薄層でコーティング）に2.5x105プロトプラスト/mlの密度でもって播種した。
4-メチル-アンベリフェリル（umbelliferyl）-グルクロニドを基材として用いたGUS活性の蛍光分析は、本質的にJafferson（Plant Molec.Biol.Reporter 5（1987）387）に記述されているようにした。また、ルシフェリンを基材として用いたルシフェラーゼ活性の分析は、DeWetらの方法（Molec.Cell.Biol.7（1987）725）、Owらの方法（Science 234（1986）856）、Owらの方法（PNAS USA 84（1987）4870）、およびHowellらの方法（Plant Molecular Biology Manual（1989）Ch.B8,1）による。いくつかの例においてはGUSおよびLUC遺伝子を別々のプラスミドに対して同時にエレクトロポレーションし、ほかではそれらの遺伝子を単一のプラスミドに導入した。
プロモーターの強度を比較した結果を以下に示す。
0004030582.tif 000039
これらのデータによれば、トウモロコシプロトプラストでの35Sエンハンサー・エレメントの重複による発現面での優位性は認められず、またMSV被覆タンパク質リーダー配列はそれ自身によって翻訳の増強（エンハンスメント）もまた与えられれないことを示している。トウモロコシのAdh1.Sイントロン1の欠失版が５’非翻訳リーダーのなかに位置している場合にある程度の発現エンハンスメントが観察される。しかし、エンハンスト35SプロモーターがAdh1.Sイントロン1の欠失版を含むMSVリーダーと結合した場合、非変性35Sプロモーターを上回る40倍に増大されたGUS発現が観察された。プロモーター／リーダー組み合わせの配列を配列識別番号43として記載した。
実施例１４：イントロン６のクローニング
この実施例では、トウモロコシAdh1.S遺伝子のイントロン６のクローニングと、トウモロコシ条斑病ウイルス被覆タンパク質遺伝子（MSV/CPL、上記参照）由来の合成５’非翻訳リーダー配列への取り込みとについて説明する。
出発材料は、ベネットソン（J.Bennetson,Purdue University）から入手したプラスミドpB428である。これは、もしトウモロコシのゲノムDNAのab11.5kbp BamH IフラグメントがpBR322のBamH I部位に挿入されたならばクローンであり、またAdh1.S遺伝子を含む（Dennis et al.,Nuc.Acids Res.12（1984）3983）。イントロン６配列とブランキング・エクソン６および７の部分とを含む396bpフラグメントを、配列
TTCAGTGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG（配列識別番号82）のリバース・プライマーと、CGACCTGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGG(配列識別番号81）を有するフォワード・プライマーとの各々100pmolを用いて10ngのpB428テンプレートDNAから増幅した。これらのプライマーは、Bcl Iの認識配列（TGATCA、フォワード・プライマーの下線部分）と、BamH Iの認識配列（GGATCC、リバース・プライマーの下線部分）とを含む。これらは、Dennisら（Nucl.Acids Res.12（1984）3983）のAdh1.S配列のヌクレオチド2162の直前にBc I部位を導入し、またヌクレオチド2534の直後にBamH I部位を導入するように設計される。予想の大きさが396bpである結果として得られるPCRフラグメントは、Adh1.Sエクソン６の20塩基、イントロン６のすべて、さらにエクソン７のすべてを含む（配列識別番号83）。
反応（最終容量100μl）は、テンプレートおよびプライマーに加えて、1 x PCR反応緩衝液（実施例２に示したように）、最終濃度が0.2mMであるdATP、dTTP、dGTP、およびdCTP、さらに５単位のTaqDNAポリメラーゼ（Perkin Elmer/Cetus）を含むものとした。温度サイクルは、94°（１分；94°（１分）、55°（30秒）、72°（30秒）を２５サイクル、その後72°、10分の延長期間とした。適当な大きさのフラグメントをアガロース・ゲルから抽出し、制限酵素Bcl IおよびBamH Iでもって消化し、さらにpCPL-Bg（上記）のBgl II-消化DNAにリゲーションした。適当な制限酵素地図を持つプラスミドを同定し、pCPL-Adh6と命名した。
pCPL-ADh6の構造は、以下の通り（pBSKのベクター配列は含まれない。実施例７Ｃのステップ１を参照）。すなわち、BamH I認識部位を含むリンカー配列GGATCCAG、MSVのヌクレオチド167から186、MSVのヌクレオチド188から277、リンカー配列GATCA、トウモロコシAdh1.Sのヌクレオチド2162から22534、リンカー配列GGATCTG、さらに最後としてMSVのヌクレオチド278から317を有するもので、Nco I認識配列（配列識別番号84）が含まれる。pCPL A1I1△（実施例７Ｄのステップ３を参照）との類似性において、MSVリーダー／イントロン配列はBamH IおよびNco Iによる消化、および541bpフラグメントの精製によってこのプラスミドから得られる。したがって、このフラグメントは、実施例７および13に記載したプラスミドに使用されるAdh1.Sイントロン１フラグメントを含む類似のフラグメントと機能的に等価である。
配列識別番号１のヌクレオチドと配列識別番号２のアミノ酸とを有するBtからの殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を表22に示す。
0004030582.tif 000040
【図１】
0004030582.tif 000041
【図２】
0004030582.tif 000042
【図３】
0004030582.tif 000043
【図４】
0004030582.tif 000044
【図５】
0004030582.tif 000045
【図６】
0004030582.tif 000046
【図７】
0004030582.tif 000047
【図８】
0004030582.tif 000048
【図９】
0004030582.tif 000049
【図１０】
0004030582.tif 000050
【図１１】
0004030582.tif 000051