(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスリトール生産能を有するモニリエラ属又はトリコスポロノイデス属に属する微生物を、５〜１２０ｐｐｍの濃度のカルシウムを含有する培地で培養してエリスリトールを生成させ、その培養物からエリスリトールを採取することによりなるエリスリトールの製造方法。
【請求項２】
モニリエラ属に属する微生物が、モニリエラ・ポリニス、モニリエラ・アセトアブテンス又はモニリエラ・スアベオレンスから選ばれる微生物である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
トリコスポロノイデス属に属する微生物が、トリコスポロノイデス・エドセファリス、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス、トリコスポロノイデス・スパスラータ、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス又はトリコスポロノイデス・マジダから選ばれる微生物である請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はエリスリトールの製造方法に関し、更に詳しくは、培地中にカルシウムを含有させることにより、発酵法により工業的に有利にエリスリトールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エリスリトールの製造方法としては、トリゴノプシス属（Trigonopsis）、キャンジダ属（Candida）の酵母を、グリセロールを炭素源とし、カゼイン加水分解物を窒素源とする培地に培養して製造する方法（特公昭４７−４１５４９号公報）、キャンジダ属（Candida）、トルロプシス属（Torulopsis）、ハンゼヌラ属（Hansenula）の酵母を炭化水素などを炭素源とし、酵母エキス、尿素を窒素源とする培地に培養して製造する方法（特公昭５１−２１０７２号公報）が知られている。しかしながら、これらの方法は、炭素源として使用される原料が実際の工業生産において適当でないため、未だ工業化されてない。
【０００３】
また、モニリエラ・トメントサ・バール・ポリニス（Moniliella tomentosa var.pollinis）をグルコースなどの糖質を炭素源とし、コーンステープリカー、尿素、酵母エキスを窒素源とする培地に培養して製造する方法（特開昭６０−１１０２９５号公報など）、エリスリトール生産菌を酵母エキス、コーンステープリカーを窒素源とする培地に培養して製造する方法（特開平１−１９９５８４号公報）も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
エリスリトールの製造方法としては上記の様な種々のものが知られている。しかしながら、それらの方法においては、グリセリンが大量に副生したり発酵の終了（グルコースの消失）に時間がかかる等、製造工程に負荷がかかり、また経済的にも不利である。
【０００５】
本発明は、上記観点からなされたものであり、エリスリトールを、工業的発酵生産に適した培地を用いて効率的に製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく研究を重ねた結果、発酵培地中にカルシウムを含有させることにより、安価な培地を用いてエリスリトールを効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の要旨は、エリスリトール生産能を有する微生物をカルシウムを含有する培地で培養してエリスリトールを生成させ、その培養物からエリスリトールを採取することによりなるエリスリトールの製造方法に存する。
【０００８】
本発明により、上記方法の好ましい態様として、前記培地が、５ｐｐｍ以上の濃度のカルシウムを含有する培地である上記方法、及び
前記微生物が、モニリエラ属又はトリコスポロノイデス属に属する微生物から選ばれる微生物である上記方法、を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００１０】
本発明で用いる微生物としては、発酵性糖質からエリスリトールを産生する能力を有するものであれば、特に制限されない。具体的には、モニリエラ属（Moniliella）又はトリコスポロノイデス属（Trichosporonoides）に属する微生物が挙げられる。
【００１１】
モニリエラ（Moniliella）属に属する微生物としては、例えばモニリエラ・ポリニス（Moniliella polinis）、モニリエラ・アセトアブテンス（Moniliella acetoabutens）、及びモニリエラ・スアベオレンス（Moniliella suaveolens）が挙げられる。
【００１２】
これらの中で好ましい菌株としては、モニリエラ・ポリニス（Moniliella polinis）ＣＢＳ４６１．６７、モニリエラ・ポリニス（Moniliella polinis）ＭＣＩ３５５４（FERM BP-6170）、モニリエラ・ポリニス（Moniliella polinis）ＭＣＩ３３７１（FERM BP-6173）、モニリエラ・アセトアブテンス（Moniliella acetoabutens）ＣＢＳ１７０．６６、モニリエラ・スアベオレンス・バール・ニグラ（Moniliella suaveolens var. nigra）ＣＢＳ２２３．３２、モニリエラ・スアベオレンス・バール・ニグラ（Moniliella suaveolens var. nigra）ＣＢＳ３８２．３６、モニリエラ・スアベオレンス・バール・ニグラ（Moniliella suaveolens var. nigra）ＣＢＳ２２３．７９等を挙げることができる。
【００１３】
またトリコスポロノイデス（Trichosporonoides）属に属する微生物としては、例えば、トリコスポロノイデス・エドセファリス（Trichosporonoides oedocephalis）、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）、トリコスポロノイデス・スパスラータ（Trichosporonoides spathulata）、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス（Trichosporonoides nigrescens）、及びトリコスポロノイデス・マジダ（Trichosporonoides madida）が挙げられる。
【００１４】
これらの中で好ましい菌株としては、例えば、トリコスポロノイデス・エドセファリス（Trichosporonoides oedocephalis）ＣＢＳ６４９．６６、トリコスポロノイデス・エドセファリス（Trichosporonoides oedocephalis）ＣＢＳ５６８．８５、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）ＣＢＳ５６７．８５、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）ＡＴＣＣ７６７１８、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）SN-r96（FERM BP-1431）、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）ＭＣＩ３３６９（FERM BP-6172）、トリコスポロノイデス・マジダ（Trichosporonoides madida）ＣＢＳ２４０．７９、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス（Trichosporonoides nigrescens）ＣＢＳ２６８．８１、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス（Trichosporonoides nigrescens）ＣＢＳ２６９．８１、トリコスポロノイデス・スパスラータ（Trichosporonoides spathulata）ＣＢＳ２４１．７９、トリコスポロノイデス・スパスラータ（Trichosporonoides spathulata）ＣＢＳ２４１．８１、トリコスポロノイデス・スパスラータ（Trichosporonoides spathulata）ＣＢＳ２４２．７９Ａ、トリコスポロノイデス・スパスラータ（Trichosporonoides spathulata）ＣＢＳ２４２．７９Ｂ等を挙げることができる。
【００１５】
これらの菌株は、いずれも国際寄託機関であるオランダ国の Centraal Bureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）、アメリカ合衆国の American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、日本国の工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託されている菌株であり、当業者に容易に入手可能なものである。
【００１６】
また、本発明には、これらの微生物から、自然変異や紫外線照射や変異剤による変異処理により得られる変異株も同様に使用することができる。変異処理は、紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤処理、遺伝子組み替え、細胞融合等の人為的変異処理等のそれ自体既知の通常用いられる方法を用いて行えばよい。
【００１７】
本発明に好ましく用いられる上記菌株のうちでも更に好ましい菌株として、モニリエラ・ポリニスＭＣＩ３３７１株、及びトリコスポロノイデス・メガチリエンシスＭＣＩ３３６９株等を挙げることができる。
【００１８】
上記菌株の中で、ＭＣＩ３３６９株は、セントラル  ビューロー  フォー  シュメルカルチャーズ（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）にトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）ＣＢＳ５６７．８５として寄託されている菌株を、グルコース３０％、酵母エキス１．５％の培地にて３０℃で２日間培養し、菌を集め生理食塩水にて２度洗浄し、ついでＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）５００〜１０００μｇ／ｍｌを含む生理食塩水にて３０℃にて６０分間変異処理を行い、その後菌体を集め、培地に懸濁し、３０℃にて浸透して変異の安定化を行い、この菌体を同一組成上の寒天培地に広げコロニーを形成させ、その中から泡の出ないコロニーを選択することにより得た変異株である。
【００１９】
また、ＭＣＩ３３７１株は、セントラル  ビューロー  フォー  シュメルカルチャーズ（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）にモニリエラ・ポリニス（Moniliella polinis）ＣＢＳ４６１．６７として寄託されている菌株を、上記と同様な変異処理して得られた変異株である。
【００２０】
ＭＣＩ３３６９株およびＭＣＩ３３７１株はそれぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−６１７２およびＦＥＲＭ  ＢＰ−６１７３として寄託されている。ＭＣＩ３３６９株およびＭＣＩ３３７１株の菌学的性状は以下の通りである。
【００２１】
〔ＭＣＩ３３６９株〕
ＭＣＩ３３６９株はＰＤＡ（potato dextrose agar）上、２４℃培養ではじめ白色、後にオリーブがかった灰色、２週間以上の古い培養ではオリーブ褐色に変色する。菌の生育は速く、酵母様の出芽により増殖する。酵母様の細胞は、はじめ無色、後にはオリーブがかった褐色を呈する。栄養菌糸はよく発達し、隔壁を有し分枝する、幅２〜３．８μｍ、はじめ無色、後に若干厚膜化し褐色に変色する。気中菌糸の発達は旺盛で、気中菌糸の側面より出芽型分生子を形成する。栄養菌糸、気中菌糸は断片状に切れて分節型の分生子となる。分節型分生子は円筒形〜樽形、３．６〜２５μｍ×２．２〜４．３μｍ、はじめ無色、後に淡褐色になる。出芽型分生子は単一または３〜４個の連鎖となる。分生子は細長い楕円形、大きさは３．４〜７．５μｍ×１．９〜４．１μｍ（平均６．５±１．２μｍ×３．８±０．６μｍ）、はじめ無色、後にオリーブがかった褐色を呈する。
【００２２】
本菌株（ＭＣＩ３３６９）の形態学的性状は親株であるトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis) ＣＢＳ５６７．８５の基準株の特徴によく一致した。従って、本菌株はトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis) と同定した。
【００２３】
〔ＭＣＩ３３７１株〕
ＭＣＩ３３７１株はＰＤＡ上、２４℃培養で始め白色〜黄味白色、培地一週間後ににぶ黄色、さらに古い培養では黒褐色に変色する。菌の生育は速く、酵母様の出芽により増殖する。出芽細胞は、はじめ薄膜でオリーブがかった褐色を呈し、後に厚膜化して着色する。酵母様の出芽と同時に栄養菌糸が伸長する。栄養菌糸は隔壁を有し、分枝する。幅２〜４．５μｍ、はじめ無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子となる、または菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽形、６〜３５μｍ×２．５〜５．０μｍ、はじめ無色、後に褐色になる。出芽型分生子は単一または２〜３個の連鎖となって形成される、卵形〜楕円形、あるいは亜球形、大きさは４．７〜９．４μｍ×３．１〜５．６μｍ（平均６．８±１．３μｍ×４．５±０．６μｍ）、はじめ無色、後にオリーブがかった褐色となる。
【００２４】
本菌株（ＭＣＩ３３７１）は分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有し、出芽型分生子は求頂的に形成され同調的に形成されない特徴を有する。これらの特徴に基づいてDe Hoog & Hermanides-Nijhof (1977)のモノグラフに従って属の検索を行ったところ、本菌株はモニリエラ（Moniliella) 属に帰属することが判明した。De Hoog (1979)の“The Black yeasts, II：Moniliella and Allied Genera”Studies in Mycology No.19,1〜90によれば、モニリエラ（Moniliella）属にはモニリエラ・スアベオレンス・バール・スアベオレンス（Moniliella suaveolens var. suaveolens)、モニリエラ・スアベオレンス・バール・ニグラ（Moniliella suaveolens var. nigra）、モニリエラ・アセトアブテンス（Moniliella acetoabutens）およびモニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis）の３種２変種が知られている。これらの種や変種は主として出芽型分生子あるいは分節型分生子の形態学的特徴によって区別されている。本菌株の形態学的性状を精査した結果、本菌はモニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis）の記載によく合致した。従って本菌株はモニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis）と同定した。
【００２５】
本発明において、発酵性糖質からエリスリトールを産生する能力を有する微生物を培養するには、カルシウムを含む培地を用いる。カルシウム以外の成分については、使用する微生物に応じて適宜選択されるが、通常用いられる主な成分を以下に示す。
【００２６】
主炭素源としては、グルコース、フルクトース、グリセロール等の発酵性糖質が利用される。これらは単独でも組み合わせでも使用できる。使用濃度は特に限定されないが、エリスリトールの生産を阻害しない範囲で使用できる。好ましい濃度は２０％〜６０％（Ｗ/Ｖ）の範囲である。
【００２７】
培地の窒素源としてはアンモニア塩、尿素、コーンステープリカー等の各種の有機、無機の窒素化合物が用いられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビタミン、ヌクレオチド、アミノ酸等の微生物の生育を促進する因子を必要に応じて添加することができる。また、培養中の発泡を押さえるために市販の消泡剤を添加することもできる。
【００２８】
培地に添加するカルシウム源は、カルシウム化合物であれば特に制限されるものではなく、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）等が挙げられる。
【００２９】
また、カルシウム源としては、培地調製時に使用する水に含まれるカルシウムであってもよく、具体的にはカルシウムを含有する上水を培地調製に用いてもよい。
【００３０】
本発明においては、カルシウム源の種類に関わらず、本発明に用いる微生物を培養する際に培地に一定濃度以上のカルシウムが含まれていればよい。カルシウムの濃度は、５ｐｐｍ以上が好ましく、３０ｐｐｍ以上がより好ましい。カルシウム濃度の上限は特に制限されないが、通常、一定濃度以上になるとエリスリトールの産生量が頭打ちとなるので、それ以上加える必要はない。エリスリトールの産生量が頭打ちとなるカルシウム濃度、あるいは好ましいカルシウムの濃度は、カルシウム濃度が異なる培地を複数用意し、それらの培地でエリスリトール産生能を有する微生物を培養し、生成するエリスリトールの量を測定することによって決定することができる。
【００３１】
培養に際しては、斜面培養から直接菌体を培地に接種しても構わないが、液体培地にて予め１日〜４日の培養で得られる前培養物を培地に接種するのが望ましい。
【００３２】
培養条件は、用いる微生物に応じて適宜設定することができるが、モニリエラ属又はトリコスポロノイデス属に属する微生物を用いる場合には、例えば以下に示す条件が挙げられる。
【００３３】
培地のｐＨは、培養の初めは３〜７、好ましくは３〜４.５に調整する。ｐＨを制御可能な培養においては、培養中に、酸またはアルカリにて３〜４.５に調整することが望ましい。培養温度は２５℃〜３７℃、好ましくは２７℃〜３７℃が適当である。また培養は、通気攪拌、振とう等の好気的条件で行うのが望ましい。
【００３４】
培養時間は、主炭素源が消費されるまで行うのが望ましく、通常は３日〜８日間行われる。
【００３５】
培養液中のエリスリトール生成量は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の方法で測定できる。
【００３６】
上記の様にして培養液中に蓄積したエリスリトールは、常法に従って培養物より分離・精製される。具体的には、遠心分離、濾過等により固形物を除去した後、活性炭、イオン交換樹脂により脱色・脱塩し、その溶液から結晶化することによりエリスリトールを分離・精製することができる。
【００３７】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、以下に記載する方法に限定されるものではない。
【００３８】
なお、以下の実施例及び比較例に用いた培地の組成は、下記表１又は表２のとおりである。
【００３９】
【表１】
0004194152.tif 000002
【００４０】
【表２】
0004194152.tif 000003
【００４１】
【実施例１】
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地２０ｍｌを綿栓した２００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したモニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis）ＭＣＩ３３７１株（FERM BP-6173）を１白金耳植菌し、３５℃で３日間振とう培養した。
【００４２】
上記表１に示す組成の培地２０ｍｌを入れた２００ｍｌのバッフル付きフラスコに塩化カルシウム２水塩（ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ））をカルシウム濃度として５ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍになるように添加して上記の種培養液を０.５ｍｌ接種し、温度３５℃、回転数２４０ｒｐｍにて４日間振とう培養した。比較実験としてカルシウムを添加しない培地にても同様に培養した。培養液中のエリスリトール（以下これを「ＥＲＴ」と略記することがある）とグリセリン（以下これを「ＧＬＹ」と略記することがある）の濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
0004194152.tif 000004
【００４４】
【実施例２】
塩化カルシウム２水塩の代わりに水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）を同様の濃度にて添加した以外は、実施例１と同様にして培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
0004194152.tif 000005
【００４６】
【実施例３】
グルコース３０％（Ｗ/Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地２０ｍｌを綿栓した２００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis)ＭＣＩ３３６９株（FERM BP-6172）を１白金耳植菌し、３５℃で３日間振とう培養した。
【００４７】
上記表１に示す組成の培地２０ｍｌを入れた２００ｍｌのバッフル付きフラスコに塩化カルシウム２水塩（ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）をカルシウム濃度として５ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍになるように添加して上記の培養液を０.５ｍｌ接種し、温度３５℃、回転数２４０ｒｐｍにて４日間振とう培養した。比較実験としてカルシウムを添加しない培地にても同様の条件にて培養を行った。培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
0004194152.tif 000006
【００４９】
【実施例４】
塩化カルシウム２水塩の代わりに水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）を同様の濃度にて添加した以外は、実施例３と同様にして培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表６に示す。
【００５０】
【表６】
0004194152.tif 000007
【００５１】
【実施例５】
グルコース２０％（Ｗ/Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地２０ｍｌを綿栓した２００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したトリコスポロノイデス・エドセファリス（Trichosporonoides oedocephalis）ＣＢＳ６４９.６６株を１白金耳植菌し、３０℃で３日間振とう培養した。表１に示す組成の培地２０ｍｌを入れた２００ｍｌのフラスコに塩化カルシウム２水塩（ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）をカルシウム濃度として１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍになるように添加して上記の種培養液を０.５ｍｌ接種し、温度３０℃、回転数１６０ｒｐｍにて４日間振とう培養した。比較実験としてカルシウムを添加しないものも同様の条件にて培養した。培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果を表７に示す。
【００５２】
【表７】
0004194152.tif 000008
【００５３】
【実施例６】
菌株としてＣＢＳ６４９.６６の代わりにトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis)ＣＢＳ５６７.８５を用いた以外は実施例５と同様の条件にて培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表８に示す。
【００５４】
【表８】
0004194152.tif 000009
【００５５】
【実施例７】
菌株としてＣＢＳ６４９.６６の代わりにトリコスポロノイデス・ニグレッセンス（Trichosporonoides nigrescens）ＣＢＳ２６８.８１を用いた以外は実施例５と同様の条件にて培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表９に示す。
【００５６】
【表９】
0004194152.tif 000010
【００５７】
【実施例８】
グルコース３０％（Ｗ/Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地２０ｍｌを綿栓した２００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis)ＭＣＩ３３６９株（FERM BP-6172）を１白金耳植菌し、３５℃にて３日間振とう培養した。表１に示す組成の培地を脱イオン水と上水（カルシウムを１８ｐｐｍ含む）にてそれぞれ調製し、２０ｍｌづつ２００ｍｌのバッフル付きフラスコに分注して、上記の種培養液を０.５ｍｌ接種し、温度３５℃、回転数２４０ｒｐｍにて４日間振とう培養した。培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果を表１０に示す。
【００５８】
【表１０】
0004194152.tif 000011
【００５９】
【実施例９】
グルコース３０％（Ｗ/Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地２０ｍｌを綿栓した２００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したモニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis）ＭＣＩ３３７１株（FERM BP-6173）を１白金耳植菌し、３５℃で３日間振とう培養した。ついで表２に示す組成の培地にカルシウム濃度が３０ｐｐｍになるように塩化カルシウム２水塩（ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）を添加し、その６００ｍｌを１リットル容の発酵槽に入れた。上記培養物を１０ｍｌ発酵槽に植菌し、温度３５℃、通気量０.５ｖｖｍ、回転数８００ｒｐｍの条件で４日間培養した。培養中はｐＨを３.８〜４.０に５Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）にて制御した。培養液中のグルコース（以下これを「ＧＬＵ」と略記することがある）、ＥＲＴ、ＧＬＹの濃度は高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果を表１１に示す。
【００６０】
【表１１】
0004194152.tif 000012
【００６１】
【比較例１】
培地中にカルシウムを添加しない以外は実施例９と同様の条件にて培養し、培養液中のＧＬＵ、ＥＲＴおよびＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表１２に示す。
【００６２】
【表１２】
0004194152.tif 000013
【００６３】
【実施例１０】
グルコース３０％（Ｗ/Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地２０ｍｌを綿栓した２００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis)ＣＢＳ５６７.８５株を１白金耳植菌し、３５℃で３日間振とう培養した。ついで表２に示す組成の培地を上水（カルシウムを１８ｐｐｍ含む）で調製し、その６００ｍｌを１リットル容の発酵槽に入れた。上記培養物を１０ｍｌ発酵槽に植菌し、温度３５℃、通気量０.５ｖｖｍ、回転数８００ｒｐｍの条件で４日間培養した。培養中はｐＨを３.８〜４.０に５Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）にて制御した。培養中のＧＬＵ、ＥＲＴ、ＧＬＹの濃度は高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果を表１３に示す。
【００６４】
【表１３】
0004194152.tif 000014
【００６５】
【比較例２】
培地の調製に上水の代わりに脱イオン水を用いた以外は実施例１０と同様の条件にて培養し、培養液中のＧＬＵ、ＥＲＴおよびＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表１４に示す。
【００６６】
【表１４】
0004194152.tif 000015
【００６７】
【実施例１１】
実施例５において、菌株としてトリコスポロノイデス・マジダ（Trichosporonoides madida）ＣＢＳ２４０．７９を用いた以外は同様の条件にて培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表１５に示す。
【００６８】
【表１５】
0004194152.tif 000016
【００６９】
【実施例１２】
実施例５において、菌株としてモニリエラ・スアベオレンス・バール・ニグラ（Moniliella suaveolens var. nigra）ＣＢＳ２２３．７９を用い、表１に示す組成の培地のグルコースを２０％（Ｗ／Ｖ）にした以外は同様の条件で培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表１６に示す。
【００７０】
【表１６】
0004194152.tif 000017
【００７１】
【実施例１３】
実施例５において、菌株としてトリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）SN-r96（FERM BP-1431）を用い、表１に示す組成の培地のグルコースを２０％（Ｗ／Ｖ）にした以外は同様の条件で培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表１７に示す。
【００７２】
【表１７】
0004194152.tif 000018
【００７３】
【実施例１４】
実施例５において、菌株としてトリコスポロノイデス・スパスラータ（Trichosporonoides spathulata）ＣＢＳ２４１．８１を用いた以外は同様の条件にて培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表１８に示す。
【００７４】
【表１８】
0004194152.tif 000019
【００７５】
【実施例１５】
実施例５において、菌株としてモニリエラ・アセトアブテンス（Moniliella acetoabutens）ＣＢＳ１７０．６６を用いた以外は同様の条件にて培養し、培養液中のＥＲＴとＧＬＹの濃度を測定した。その結果を表１９に示す。
【００７６】
【表１９】
0004194152.tif 000020
【００７７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、カルシウムまたは上水という安価な原料を用いて、効率良くエリスリトールを製造できるばかりでなく、グリセリン等の副産物の低減による精製コストの削減、さらに培養時間の短縮という工業的に有利なプロセスを構築できる。