(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の物理化学的性質を有するペプチドα−１０００及びコンブをプロテアーゼ処理して得られる酵素分解物及びカキ肉をプロテアーゼ処理して得られる酵素分解物の混合物を有効成分とすること、を特徴とするヒト頭髪育毛促進用経口投与医薬。
（ペプチドα−１０００の物理化学的性質）
（Ａ）分子量
２００〜１０，０００（カラムクロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点
１１９℃で分解着色する。
（Ｃ）比旋光度
２０℃において、ナトリウムのＤ線で測定したときの比旋光度
〔α〕：−２２°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性
水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別
中性
（Ｆ）紫外吸収スペクトル
２８０ｎｍ付近に本ペプチド由来のピークが認められる。
（Ｇ）赤外吸収スペクトル
ペプチド結合（−ＣＯＮＨ−）に特異な吸収が３４００ｃｍ-1付近にみられ、アミノ基（−ＮＨ2）に特異な吸収が３３００〜３５００ｃｍ-1付近にみられ、ペプチドの骨格となる−ＣＨ2−結合に特異な吸収が２９００ｃｍ-1付近にみられ、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）由来の吸収が１６００ｃｍ-1付近及び１４００ｃｍ-1付近にみられる。
（Ｈ）特性
イワシ魚肉由来であり、加熱によって自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解して得たペプチドである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、育毛促進剤に関するものであり、更に詳細には、魚肉に由来するペプチドを有効成分とする、従来未知にして安全でありしかもきわめて効果の高い、外用はもちろんのこと内用も可能な天然系育毛促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より育毛促進剤の開発が行われており、天然物を利用する育毛促進剤についてもさかんに開発、実用化が試みられているが、魚肉を酵素分解して得られるペプチドに育毛促進作用があることは知られていないし、ましてや経口投与により育毛が促進されるという知見は、従来、全く知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年になり、食生活の洋風化、ストレスの増加等各種の要因によって頭髪がうすくなったり脱けたりする症例が非常に増加しており、老年層のみならず若年層にまでその症例は拡大しており、その解決が強く希求されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、このような当業界における強い要望に応える目的でなされたものであって、魚肉の酵素分解物の研究過程において、イワシ魚肉を加熱変性せしめて自己消化酵素を失活せしめた後プロテアーゼ処理して得たペプチドが毛包細胞の増殖を促進せしめるというきわめて有用な新知見を得、この有用新知見に基づき更に研究の結果、遂に完成されたものである。
【０００５】
すなわち本発明は、魚肉を加熱変性せしめて自己消化酵素を失活せしめた後プロテアーゼ処理して得られるペプチドを有効成分とする育毛促進剤を基本的技術思想とするものである。
【０００６】
本発明に係る育毛促進剤の有効成分として使用するペプチドとしては、上記のように魚肉を加熱変性せしめた後プロテアーゼ処理して得られるペプチドが適宜広範に使用することができるが、例えば、下記表２、表３に示される物理化学的性質を有する魚肉由来のペプチドα−１０００は好適なペプチドの１例である。
【０００７】
【表２】
ペプチドα−１０００の物理化学的性質（１）
（Ａ）分子量
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５（商標）カラムクロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点
１１９℃で分解着色する。
（Ｃ）比旋光度
２０℃において、ナトリウムのＤ線で測定したときの比旋光度
〔α〕：−２２°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性
水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別
中性
【０００８】
【表３】
0004115561.tif 000002
【０００９】
本ペプチドは魚介類を原料として製造するものであるが、先ず、これを採肉機、デボーナー等によって処理して魚肉質を分離する。原料は出来る限り新鮮なものが好ましい。分離した魚肉は、１０kg程度のすり身に分割し、このまま次の処理に使用してもよいが、−２０〜−５０℃、例えば−３０℃程度の冷気を吹き付けて急速凍結し、−２０〜−２５℃に保存しておき、必要に応じてこれを適宜使用することにしてもよい。
【００１０】
魚介類としては、イワシ、アジ、マグロ、カツオ、サンマ、サバ等赤身魚；ヒラメ、タイ、キス、コノシロ、タラ、ニシン、ブリ等白身魚；サメ、エイ等軟骨魚肉；ワカサギ、コイ、イワナ、ヤマメ等淡水魚肉；アイザメ、アンコウ等深海魚肉のほか、エビ、カニ、タコ、アミ類等も適宜使用できる。
【００１１】
本発明においては、採肉した後、粉砕機等によって魚介類を粉砕し、原料重量に対して１／２量〜２０倍量、好ましくは等量〜１０倍量の加水を行った後、加熱処理し、もって、自己消化酵素を失活させ、且つ雑菌を死滅させるとともに、タンパク質を熱変性させて後に行う酵素反応効率を上昇せしめる。加熱条件としては、このような作用が奏される条件であればすべての条件が利用できるが、例えば６５℃以上、２〜６０分、好ましくは８０℃以上、５〜３０分とするのがよい。
【００１２】
次いで、アンモニア水、水酸化ナトリウム（カリウム）水溶液等アルカリ剤を加えて、使用する蛋白分解酵素の適値にｐＨを調整し（例えばアルカリプロテアーゼの場合は、ｐＨ７．５以上、好ましくは８以上）、温度も酵素適温（使用酵素によって異なるが、２０〜６５℃、アルカリプロテアーゼの場合は３５〜６０℃、好ましくは４０〜５５℃）に加温し、蛋白分解酵素を加えて３０分〜３０時間（アルカリプロテアーゼの場合は３０分〜２５時間、好ましくは１〜１７時間）処理する。
【００１３】
蛋白分解酵素としては、中性またはアルカリ性条件下で蛋白質を分解し得る酵素であればすべての酵素が単独で又は混合して使用し得る。その起源は、動植物のほかに微生物に求めることができ、ペプシン、レニン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメレインのほか、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、放線菌プロテアーゼ等も広く利用できる。これらの酵素は、通常、市販されているものが使用されるが、未精製の酵素、酵素を含有した培養液、麹といった固体又は液体の酵素含有物も、目的により必要に応じて使用することができる。酵素の添加量としては０．１％〜５．０％程度でもよい。
【００１４】
次いで必要であれば中和処理を行った後、７０℃（好適には８０℃）以上の温度に２〜６０分間（好適には５〜３０分間）保持し、酵素を失活させるとともに後に行う分離を良好ならしめる。加熱失活処理後、バイブロスクリーン等による濾過によって粗分離し、必要によりジェクター処理した後、超遠心分離処理して、浮遊物、沈殿物を除去する。
【００１５】
次に、ケイソウ土等濾過助剤（例えばセライト）を用いて濾過し、濾液を活性炭処理して（０．０５〜２０％Ｗ／Ｖ、好ましくは０．１〜１０％Ｗ／Ｖ使用，２０〜６５℃、好ましくは２５〜６０℃、１５分〜４時間、好ましくは３０分〜２時間）、脱臭、脱色、精製する。
【００１６】
これを減圧濃縮（０〜１５℃）その他常法にしたがって濃縮（３０Ｂｘ程度にまで）した後、必要あれば再度（超）遠心分離又は濾過してペプチド原液を得る。このようにして得たペプチド原液は、殺菌（ＵＨＴＳＴその他常法による）した後、容器に充填して製品（α−１０００（液体））とする。又、希望するのであれば、更に濃縮したりあるいは逆に希釈したり、また、噴霧乾燥、凍結乾燥などの常法によって６０メッシュ程度に粉末化し、これを袋などの容器に充填して製品（α−１０００（粉末））とすることもできる。これらの製品は、冷蔵ないし冷凍保管する。
【００１７】
このようにして得た、液状、ペースト状ないし粉末状のペプチドは、その有用性に鑑み、α−１０００と命名した。このペプチドα−１０００(スプレ−ドライ粉末）の物理化学的性質は、下記表４、表５、表６に示すとおりである。
【００１８】
【表４】
ペプチドα−１０００（粉末）の物理化学的性質（１）
（Ａ）分子量
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５（商標）カラムクロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１１９℃で着色（分解点）
（Ｃ）比旋光度
２０℃において、ナトリウムのＤ線で測定したときの比旋光度
〔α〕：−２２°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性
水に易溶；エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶けない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別
中性  ｐＨ＝５．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）外観、成分：
白色粉末；水分５．１４％（減圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分５．０％（直接灰化法）
【００１９】
【表５】
0004115561.tif 000003
【００２０】
【表６】
0004115561.tif 000004
【００２１】
本発明において使用するペプチドは、いずれも魚肉を起源としこれを酵素処理したものであるため、安全性については全く問題はないし、しかも魚肉起源につきものの不快な魚臭や苦味がなく、したがって経口投与するのに好適であり、更にまた、容易に粉末化することができ、取扱い易い白色粉末となるので製剤化が容易であって、各種の剤型に製剤化することができる。
【００２２】
飲食品タイプとして使用する場合には、本有効成分であるペプチド（その処理物）をそのまま、使用したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。本有効成分を用いる本発明に係る育毛剤は、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよいが、甘味料、酸味料、ビタミン剤その他ドリンク剤製造に常用される各種成分を用いて、育毛ドリンクに製剤化すると好適である。
【００２３】
医薬品タイプとして使用する場合、本有効成分は、種々の形態で投与され、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与剤、養毛剤等の化粧料に製剤化することができる。
経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、年齢、体重、投与方法及び剤型等によって異なるが、通常は、成人に対して１回約０．１ｇ乃至１０ｇ、好適には０．２ｇ乃至８ｇを投与することができる。
【００２４】
非経口投与のための製剤としては、注射剤、軟膏、ローション、トニック、スプレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえばよく、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他外用剤や化粧料に常用される補助剤を適宜使用する。
【００２５】
本発明に係る有効成分は、天然起源でありしかも食品としても使用できるため、毒性は全くないか又は極めて低く、卓越した安全性を示し、ラットに対して１日当たり１０g／kg経口投与したが急性毒性は全く認められなかった。したがって飲食品タイプとして使用する場合は、予防用、保健用、通常の飲食品として使用する場合のいずれにおいても、有効成分の使用量に格別の限定はないし、医薬として使用する場合も、患者に応じて上記範囲内で適宜使用すればよい。また、本有効成分は多量に服用しても格別の問題はない。外用剤や育毛料と言った育毛化粧料のように皮膚に適用する場合は、必要個所に必要量適用すればよく、適用量に格別の限定はないし、局所の発赤やかゆみといった副作用も全く認められない。
【００２６】
本発明に係る育毛促進剤は、当該ペプチドを有効成分とするほか、更にコンブの酵素分解物及び／又はカキ肉の酵素分解物を配合してもよい。その場合、配合比率は、ペプチド６０〜９９％、残りをコンブ及び／又はカキ肉の酵素分解物とするのが好適である。これら酵素分解物は、等量混合物とするほか適宜の割合で混合使用してもよい。例えば、次のような割合で混合することができる：ペプチド６０〜１００％；コンブ酵素分解物０〜４０％；カキ肉酵素分解物０〜４０％。
【００２７】
コンブ及び／又はカキ肉の酵素分解物としては、コンブ、カキ肉をプロテアーゼ等の酵素で処理して得られたものをすべて包含するが、例えば先に述べたイワシ等魚肉をプロテアーゼ処理してペプチドを製造する方法にしたがって得られるコンブ、カキ肉の酵素分解物を使用してもよい。
【００２８】
ペプチドと、コンブ及び／又はカキ肉の酵素分解物は、酵素分解した後、精製、殺菌、乾燥処理等の各種後処理をした後にこれらを混合し、この混合物を本発明に係る育毛促進剤の有効成分として使用できるほか、これらの処理の途中においてこれらを混合してもよい。例えば、次のような処理が可能である。
【００２９】
先ず既述したように、イワシなどの魚肉について魚肉質を分離してこれを酵素分解し、他方、コンブ及び／又はカキを粉砕してこれを酵素分解し、これらを合した後に粗分離、超遠心分離、濾過、濃縮、殺菌（ＵＨＴＳＴ）、噴霧乾燥し、これを有効成分として使用することができる。
【００３０】
以下、本発明を製造例および実施例によって更に詳しく説明する。
【００３１】
【製造例１】
新鮮イワシをデボーナーで処理して採肉した。採肉した魚肉質を１０kgのすり身に分割し、これを−３０℃以下で急速凍結した後、粉砕機で粉砕した後等量の水を加え、これをタンクに送り、１００℃に１０分間加熱して自己消化酵素を失活させ、熱変性させた。次いでアンモニア水を加えてｐＨを１０．０に調整した。
【００３２】
これに市販のアルカリプロテアーゼ製品の０．１％液を加え、４５℃に１７時間保持して酵素分解を行った。次いで１５分間煮沸して酵素を失活せしめた。
【００３３】
これをバイブロスクリーン（１５０メッシュ）に通し５０００rpmでジェクター処理した後、シャープレス遠心分離機で処理し（１５０００rpm）、ケイソウ土を濾過助剤として用い、濾過処理したものをペプチド原液とした。
【００３４】
上記で得たペプチド原液に活性炭を１％Ｗ／Ｖ加え，３０℃で６０分間攪拌した後濾過して濾液を得た。これを常法にしたがって減圧濃縮（２０℃）した後、常法にしたがってＵＨＴＳＴ殺菌を行って、α−１０００（液体）製品を得、これを更に常法にしたがって噴霧乾燥して粒径６０メッシュのα−１０００（粉末）製品を得、それぞれこれらの製品は冷凍保管した。
【００３５】
このようにして調製したペプチドα−１０００（粉末）について、セファデックスＧ−２５（商標）カラムを用い、下記の条件でゲル濾過した結果、図３の結果が得られ、分子量は２００〜１０，０００であることが判明した。カラムサイズ：径１６〜９５０ｍｍ、溶出剤：０．１Ｍホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）、分画：２ｍｌ／チューブ、流速１０ｍｌ／ｈ、分子量マーカー：バシトラシン（分子量１４５０）。
【００３６】
上記によって得たα−１０００（液体）は、水分含量が７３．６％（減圧加熱乾燥法）であって、淡黄色を呈し、その１０％溶液のｐＨは７．５を示し、魚臭もなく苦味も認められなかった。その成分についての分析、及び、アミノ酸組成についての測定を行った結果、下記する表７及び表８に示す結果が得られた。
【００３７】
【表７】
0004115561.tif 000005
【００３８】
【表８】
0004115561.tif 000006
【００３９】
【製造例２】
コンブ１０kg及びカキ肉１０kgをそれぞれ粉砕し、これに等量の水を加えた後、ｐＨを１０．０に調整した。これに市販のアルカリプロテアーゼ製品の０．１％液を加え、４５℃に２０時間保持して酵素分解を行った。次いで、１５分間煮沸してそれぞれ酵素を失活せしめ、コンブ酵素分解物及びカキ肉酵素分解物をそれぞれ得た。
【００４０】
【実施例１】
上記によって製造したコンブ酵素分解物、カキ肉酵素分解物、及び、先に得たイワシ肉酵素分解物を５％、５％及び９０％の混合比率で混合した。得られた混合物をバイブロスクリーン（１５０メッシュ）に通し、５０００rpmでジェクター処理して、粗分離処理を行った。
【００４１】
粗分離処理した後、上記したところにしたがって、超遠心分離、濾過、濃縮、殺菌（ＵＨＴＳＴ）、噴霧乾燥し、黄白色の粉末を得た。これをセンミペプチド３Ｍと命名した。センミペプチド３Ｍの成分組成は、下記表９に示すとおりである。
【００４２】
【表９】
0004115561.tif 000007
【００４３】
【実施例２】
本発明有効成分が培養毛包細胞の増殖促進作用を有することを以下により試験し、確認した。
先ず、前培養を行った。すなわち、頭皮の各部位より、無作為に抜去した成長期毛包をTrypsin-EDTA処理し、分散した細胞を得た。IV型コラーゲンをコートした培養皿に培養液にて懸濁した毛包細胞を２×１０4/cm濃度で植え込み約２週間培養を行った。
【００４４】
次いで、上記によって得たセンミペプチド３Ｍの１μg/ml、１０μg/ml、１００μg/ml水溶液をそれぞれ試験液として、毛包細胞の増殖促進効果確認試験を行った。
すなわち、前培養にて増殖した毛包細胞をTrypsin-EDTA処理にて培養皿からはがし、遠心分離後に得られた細胞塊を培養液に懸濁した。この細胞懸濁液を２．５×１０3/cm2の濃度で組織培養用培養皿に植え込んだ。２４時間培養後、試験液を含む培養液と交換し、培養を継続した。７日および１４日間培養後、血球算定盤によるcell count法にて増殖した毛包細胞の数を測定し、試験液の細胞増殖に及ぼす影響について評価した。結果を図４に示す。
【００４５】
上記試験結果から明らかなように、本発明に係る育毛促進剤は、すぐれた育毛促進効果を有し、特に１０μg/mlの濃度においてコントロールに比べて１４０％もの増加効果を示した。
【００４６】
【実施例３】
本発明有効成分が、経口投与することによって、ヒト頭髪に対して毛成長促進効果を有することを、以下により試験し、確認した。
すなわち、男性型脱毛症である被験者１５名に、上記によって得たセンミペプチド３Ｍを１日１回、２ｇずつ２ケ月間経口投与し、軟毛、硬毛の新生につき視認により改善度を評価した。得られた結果を下記表１０に示す。その結果から明らかなように、本発明に係る育毛促進剤は、外用のみでなく内用によっても育毛が促進されるというきわめて顕著な効果が奏されることが確認された。なお、イワシ魚肉の酵素分解物であるα−１０００のみを経口投与した場合も、同様にすぐれた育毛促進効果が奏された。
【００４７】
【表１０】
0004115561.tif 000008
【００４８】
【実施例４】
実施例１で得たセンミペプチド３Ｍ粉末８０ｇ、糖類１５０ｇ、蜂蜜１５ｇ、アスコルビン酸１ｇ、クエン酸０．５ｇ、香料適量に水を加えて１kgとし、これを９５℃で２０分間殺菌し、１００mlずつ無菌的にビンに充填して、飲食品タイプの養毛ドリンクを製造した。
【００４９】
【実施例５】
製造例１で得たペプチドα−１０００（液体）２００ｇ、酢酸トコフェロール５ｇ、硝酸チアミン１０ｇ、ニコチン酸アミド２０ｇ、無水カフェイン５０ｇ、安息香酸塩及び香料適量に脱イオン水を加えて３０Ｌとし、殺菌した後３０mlずつ無菌的にビンに充填して、医薬品としての養毛ドリンクを製造した。
【００５０】
【実施例６】
結晶グルコース４００重量部、センミペプチド３Ｍ１００重量部、クエン酸７重量部、Na-Caseinate７重量部、アスコルビン酸５重量部、硬化油３重量部を用い、常法にしたがって育毛促進錠菓を製造した。
【００５１】
【実施例７】
センミペプチド３Ｍ５００重量部、精製炭酸カルシウム２０重量部、ラクトース１７８重量部、ステアリン酸マグネシウム２重量部を用い、これらの混合物を２５０mgずつ１号カプセルに充填し、１カプセル内に５００mgのセンミペプチド３Ｍを含有する育毛促進カプセル剤を製造した。
【００５２】
【実施例８】
エタノール６０ml、植物油０．５ml、プロピレングリコール５ml、塩化カルブロニウム０．５４ml、ペプチドα−１０００（液体）２ml、これに精製水を加えて全量を１００mlとし、上記成分を混合溶解して、育毛促進ヘアートニックを製造した。
【００５３】
【実施例９】
ビタミンＣ２０ｇ、グラニュー糖５０ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物３０ｇに、製造例１で得たペプチドα−１０００を５０ｇ加えて充分に混合した。混合物を１００等分して袋に詰め、１袋１．５ｇのスティック状育毛促進食品を１００袋製造した。
【００５４】
【発明の効果】
魚肉の酵素分解物を有効成分とする本発明に係る育毛促進剤は、患部に適用する非経口的に投与することにより育毛促進効果を奏することはもちろんのこと、これを内服する経口投与により抜毛を防止するとともに育毛も促進するというきわめてユニークにして卓越した著効が奏される。しかも本育毛促進剤は天然物由来であって、安全上も全く問題がない。
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドα−１０００のＵＶスペクトルを示す。
【図２】ペプチドα−１０００のＩＲスペクトルを示す。
【図３】ペプチドα−１０００のゲル濾過による分子量分布を示す。
【図４】本育毛促進剤による培養毛包細胞の増殖促進効果を示す。
【図１】
0004115561.tif 000009
【図２】
0004115561.tif 000010
【図３】
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【図４】
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