(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポジティブセンス核酸上の５’から３’方向に向かって、一番端の５’末端保存配列を含む機能性５’非翻訳領域（ＮＴＲ）であって当該機能性５’非翻訳領域はＮＣＣＡＧＣＣからなり、Ｎは１〜３の任意のヌクレオチドである５’非翻訳領域と、ＨＣＶ非構造タンパク質コーディング領域コンセンサス配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、当該非構造タンパク質コーディング領域コンセンサス配列は、少なくとも３つのＨＣＶ分離体のクローン由来のコンセンサス残基を同定することにより決定され、又は該コンセンサス配列は配列番号１の非構造タンパク質コーディング領域ヌクレオチド配列において一個又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加したものであり、及び、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する一番端の３’末端保存配列を含む３’非翻訳領域（ＮＴＲ）からなる、宿主細胞において複製能を有する遺伝子操作されたＣ型肝炎（ＨＣＶ）核酸クローンまたはＲＮＡである該核酸クローン。
【請求項２】
配列番号１で表される配列のうち、少なくとも、機能性部分である一番端の５’末端保存配列、ＨＣＶ非構造タンパクコード領域、又は３’非翻訳領域（ＮＴＲ）を含む請求項１に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項３】
配列番号１で表される完全長配列からなる請求項１又は２に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項４】
５’末端配列はＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＧＣＣＡＧＣＣ；ＵＧＣＣＡＧＣＣ；ＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＡＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＵＧＣＣＡＧＣＣ及びＧＣＧＣＣＡＧＣＣから成る群から選ばれるＲＮＡ配列と同一である又は相補的であり、ここで配列ＧＣＣＡＧＣＣは配列番号３の５’末端である請求項１に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項５】
３’ＮＴＲの一番端の末端は配列５’−ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴ−３’（配列番号４）からなるＤＮＡに少なくとも９５％同一である又は相補的である請求項１に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項６】
発現調節配列と操作上関連する異種遺伝子をさらに有し、ここで異種遺伝子と発現調節配列はポジティブ鎖核酸分子上に配向されている請求項１又は２に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項７】
異種遺伝子は抗生物質耐性遺伝子又はレポーター遺伝子である請求項６に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項８】
抗生物質耐性遺伝子は３’ＮＴＲのＳｆｉ  Ｉ部位に挿入された内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）と操作上関連するネオマイシン耐性遺伝子である請求項７記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項９】
二本鎖ＤＮＡ、ポジティブセンスｃＤＮＡ又はネガティブセンスｃＤＮＡからなる群から選ばれる請求項１又は２に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項１０】
ポジティブセンスＲＮＡ又はネガティブセンスＲＮＡである請求項１又は２に記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項１１】
ポジティブセンスＤＮＡ上の５’−ＮＴＲのプロモーターをさらに有し、それによりプロモーターからのテンプレートＤＮＡの転写が複製能のあるＲＮＡを生じる請求項９記載のＨＣＶ核酸クローン。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ登録番号９７８７９として寄託され、配列番号５で表される配列からなる、全長ＨＣＶ＿ｃＤＮＡを内部に有するプラスミドクローン、
又は以下のａ）、ｂ）からなる群から選ばれる前記全長ＨＣＶ＿ｃＤＮＡの誘導体を内部に有するプラスミドクローン、
ａ）  一番端の５’末端配列はＮＣＣＡＧＣＣからなり、Ｎは１〜３の任意のヌクレオチドであって、配列ＧＣＣＡＧＣＣは配列番号３の５’末端である、配列番号５で表される全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡの誘導体、および
ｂ）  配列番号５の３’−ＮＴＲが短いポリピリミジン領域を含む、配列番号５で表される完全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡの誘導体。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプラスミドクローンに内包されるＨＣＶ  ＤＮＡ、又は請求項１２に記載のプラスミドクローンに内包される全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ。
【請求項１４】
組織培養中の株化細胞を請求項１０記載の感染量のＨＣＶ  ＲＮＡと接触させ、株化細胞の細胞中でのＨＣＶの複製を検出することを含むＨＣＶの感染に許容である株化細胞を同定する方法。
【請求項１５】
異種発現調節配列を発現させる細胞を選択する条件下において、組織培養中の株化細胞を、感染量の請求項１３に記載のＨＣＶ  ＲＮＡと接触させることを含むＨＣＶの感染に許容である株化細胞を同定する方法。
【請求項１６】
培養中の株化細胞を、感染量の請求項１０記載のＨＣＶ  ＲＮＡと接触させ、株化細胞内のＨＣＶ  ＲＮＡレベルが前進的に増加するのを検出することを含む許容株化細胞における高いレベルのＨＣＶ複製を可能にする適応突然変異のあるＨＣＶを選択する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のＨＣＶ核酸クローンでトランスフェクト、トランスフォーム又はトランスデユースされた宿主株化細胞。
【請求項１８】
バクテリア細胞、イースト細胞、植物細胞、昆虫細胞と哺乳類細胞からなる群から選ばれる請求項１７に記載の宿主株化細胞。
【請求項１９】
請求項１０に記載のＨＣＶ  ＲＮＡの感染供与量をヒトを除く動物に投与することを含む動物をＨＣＶに感染させる方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載のＨＣＶ  ＲＮＡの感染供与量をヒトを除く動物に投与することを含む動物をＨＣＶに感染させる方法。
【請求項２１】
請求項１又は２に記載のＨＣＶ核酸クローンのゲノムＲＮＡ配列からなるＨＣＶで感染させた非ヒト動物。
【請求項２２】
ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を可能とする条件下において、請求項１０記載のＨＣＶ  ＲＮＡの感染量で接触させた株化細胞を培養することを含む生体外でＨＣＶを増殖させる方法。
【請求項２３】
ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を可能とする条件下において請求項１３記載のＨＣＶ  ＲＮＡの感染量で接触させた株化細胞を培養することを含む生体外でＨＣＶを増殖させる方法。
【請求項２４】
請求項１又は２に記載のＨＣＶ核酸クローンのゲノムＲＮＡ配列からなるＨＣＶで感染させた生体外株化細胞。
【請求項２５】
肝臓株化細胞である請求項２４の株化細胞。
【請求項２６】
ＨＣＶで非ヒト動物を感染させるのに効果的な量の請求項６記載のＨＣＶ核酸クローンを非ヒト動物に投与することを含む、異種遺伝子で非ヒト動物をトランスデユースする方法。
【請求項２７】
ＨＣＶ  ＲＮＡで非ヒト動物を感染させるのに効果的な量の請求項１３記載のＨＣＶ  ＲＮＡを非ヒト動物に投与することを含む、異種遺伝子で非ヒト動物をトランスデユースする方法。
【請求項２８】
ａ）  ＨＣＶ複製とウイルス粒子形成を可能にする条件下において、請求項１７記載の株化細胞を培養し、かつ
ｂ）  前記株化細胞培養物からＨＣＶウイルス粒子を分離する
ことを含むＨＣＶウイルス粒子を生産する方法。
【請求項２９】
ａ）  ＨＣＶ複製とウイルス粒子形成を可能にする条件下において、請求項２４記載の株化細胞を培養し、かつ
ｂ）  前記株化細胞培養物からＨＣＶウイルス粒子を分離する
ことを含むＨＣＶウイルス粒子を生産する方法。
【請求項３０】
ａ）  ＨＣＶ粒子タンパク質の発現を可能にする条件下において、請求項１記載のＨＣＶ核酸でトランスフェクトされた宿主発現株化細胞を培養し、かつ
ｂ）  前記細胞培養物からＨＣＶ粒子タンパク質を分離する
ことを含むＨＣＶ粒子タンパク質を生産する方法。
【請求項３１】
請求項１又は２に記載のＨＣＶ核酸クローンであって、複製能のあるＨＣＶゲノムＲＮＡであるＨＣＶ核酸クローンを含むＨＣＶウイルス粒子。
【請求項３２】
請求項１０記載のＨＣＶ＿ＲＮＡのゲノムテンプレート、機能性ＨＣＶレプリカーゼ要素及びリボヌクレオチドトリホスフェート塩基を含む等張緩衝培地を含むＨＣＶ用の生体外無細胞アッセイキット。
【請求項３３】
請求項１３記載のＨＣＶ＿ＲＮＡのゲノムテンプレート、機能性ＨＣＶレプリカーゼ要素及びリボヌクレオチドトリホスフェート塩基を含む等張緩衝培地を含むＨＣＶ用の生体外無細胞アッセイキット。
【請求項３４】
ａ）  候補剤を請求項２１記載のＨＣＶ感染動物に投与し、及び
ｂ）  候補剤の投与前の動物におけるＨＣＶ感染又は活性レベルと比較してＨＣＶ感染又は活性レベルの増加又は減少をテストする、
ことを含むＨＣＶ複製の調節可能な剤をスクリーニングする方法であって、
ここで候補剤の投与前の動物におけるＨＣＶ感染又は活性レベルと比較してＨＣＶ感染又は活性レベルの減少はＨＣＶ感染又は活性を阻害させる能力がある剤であることを示すものであるスクリーニング方法。
【請求項３５】
ａ）  動物からの組織サンプル中のウイルスタイターを測定すること、
ｂ）  動物からの組織サンプル中のウイルスタンパク質を測定すること、及び
ｃ）  肝臓酵素を測定することから成る群から選ばれる、ＨＣＶ感染レベルをテストする方法である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
動物を感染させるために使用するＨＣＶゲノムが発現調節配列と操作上関連した異種遺伝子を含み、ここで異種遺伝子及び発現調節配列はポジティブ鎖核酸分子上に配向され、ＨＣＶ活性レベルのテストは動物からの組織サンプル中のマーカータンパク質のレベルを測定することを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ａ）  請求項２４の株化細胞を候補剤と接触させること、及び
ｂ）  候補剤の投与前のコントロール株化細胞又は株化細胞でのＨＣＶ感染レベル又はＨＣＶ活性レベルと比較してＨＣＶ感染又はＨＣＶ活性のレベルの増加又は減少をテストすること、
を含むＨＣＶ複製を調節可能な剤のスクリーニング方法であって、
ここで候補剤の投与前のコントロール株化細胞または株化細胞でのＨＣＶ感染レベル又はＨＣＶ活性レベルと比較してＨＣＶ感染又はＨＣＶ活性のレベルが減少していることは、ＨＣＶ感染又はＨＣＶ活性を阻害する能力がある剤であることを示すものであるスクリーニング方法。
【請求項３８】
ＨＣＶ感染のレベルのテストが、
ａ）細胞、培地、又はその両方におけるウイルスタイターを測定すること、及び
ｂ）細胞、培地、又はその両方におけるウイルスタンパク質を測定すること
からなる群から選ばれてなる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
株化細胞を感染させるために使用するＨＣＶゲノムが発現制御配列に操作可能に結合した異種遺伝子を含み、当該異種遺伝子及び発現制御配列はポジティブ鎖核酸分子上に配置され、かつＨＣＶ活性のレベルのテストは動物由来の組織サンプルのマーカータンパク質のレベルを測定することを含むものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）  請求項３２又は３３記載の生体外アッセイキットを候補剤と接触させること、及び
ｂ）  候補剤を投与する前のコントロール細胞系又は系におけるＨＣＶ複製のレベルに比べ、ＨＣＶ複製のレベルの増減をテストすること
を含むＨＣＶ複製を調節することができる剤をスクリーニングする方法であって、候補剤を投与する前のコントロール株化細胞又は株化細胞におけるＨＣＶ複製のレベルに比べ、ＨＣＶ複製のレベルが減少することは、ＨＣＶ感染又はＨＣＶ活性を阻害する能力を有する剤であることを示すものであるＨＣＶ複製を調節することができる剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
政府援助
本発明に先行する研究は、少なくとも部分的に米国パブリックヘルスサービスの研究助成第ＣＡ５７９７３号及びＡＩ３１５０１号からの助成金により援助された。したがって、政府は本発明にある種の権利を有する。
本発明の分野
本発明は機能性ＨＣＶウイルスゲノムＲＮＡ配列の決定に関し、感染ＨＣＶ  ＤＮＡクローンの構造に関し、治療、ワクチン及び診断応用におけるクローン、若しくはその誘導体の使用に関する。さらに本発明はＨＣＶベクター、例えば遺伝子治療若しくは遺伝子ワクチンに関する。
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルスの簡潔な一般的概要
Ａ型肝炎ウイルス及びＢ型肝炎ウイルス用の診断テストの開発の後、チンパンジーへ実験的に伝染させる更なる作用物質（AlterらによるLancet 1, 459-463（1978）；HollingerらによるIntervirlogy 10, 60-68（1978）; TaborらによるLancet 1, 463-466（1978））が、輸血による肝炎の主な原因として認識されるようになった。Ｃ型肝炎ウイルスと呼ばれる非Ａ型非Ｂ型（ＮＡＮＢ）肝炎の原因に相当するｃＤＮＡクローンは１９８９年に報告された（ChooらによるScience 244, 359-362（1989））。このブレークスルーはＨＣＶの診断法、及び疫学、病原論及び分子ウイルス学の理解に急速な進展をもたらした（概観のためにはHoughtonらによるCurr Stud Hematol Blood Transfus 61, 1-11（1994）を参照）。ＨＣＶ感染の証明は世界中で発見され、ＨＣＶ特異抗体の普及率は、多くの国で０．４-２％から、エジプトでの１４％までの範囲にある（HibbsらによるJ. Inf. Dis. 168, 789-790（1993））。血液若しくは血液生成物、又はあまり頻繁ではない性的及び先天性ルートを経由する伝染に加えて、周知の危険要因と関連しない散発性のケースは、ＨＣＶの場合の４０％以上を占める（AlterらによるJ. Am. Med. Assoc. 264，２２３１−２２３５（1990）; MastとAlterによるSemin. Virol. 4, 273-283（1993））。感染は通常慢性上の（AlterらによるＮ．Eng. J. Med. 327, 1899-1905（1992））、臨床上の不適切なキャリア状態から急性肝炎、慢性活性肝炎及び肝硬変にわたる結果であり、肝硬変は肝細胞癌の進展とかなり関連している。インターフェロン（ＩＦＮ）-αは、慢性ＨＣＶ感染（DavisらによるN. Engl. J. Med. 321, 1501-1506（1989）; DiBisceglieらによるNew Engl. J. Med. 321, 1506-1510（1989））とチンパンジーモデル（ChooらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 91. 1294-1298（1994））においてある種の兆候を示すサブユニットワクチンのある少数の患者の治療には有用であることが示されており、より有効な治療及びワクチンを開発するために更なる効果が必要とされる。さまざまなＨＣＶ分離体の間に観測されたかなりの多様性（概観のために、BukhらによるSem. Liver DIs. 15, 41-63（1995）を参照）、慢性的に感染した個体における遺伝的変異体の発生（EnomotoらによるJ. Hepatol. 17, 415-416（1993）; HijikataらによるBiochem. Biophys. Res Comm. 175, 220-228（1991）; KatoらによるBiochem. Biophys. Res. Comm. 189, 119-127（1992）; KatoらによるJ. Virol. 67, 3923-3930（1993）; KurosakiらによるHepatology 18, 1293-1299（1993）；LesniewskiらによるJ. Med. Virol. 40, 150-56（1993）; OgataらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3392-3396（1991）; WeinerらによるVirology 180, 842-848（1991）; WeinerらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3468-3472（1992））、及びＨＣＶ感染後に惹起された保護免疫の欠如（FarciらによるScience 258, 135-140（1992）; PrinceらによるJ. Infect. Dis. 165, 438-443（1992））は、上記目的に対する大きなチャレンジである。
ＨＣＶの分子生物学
分類。ゲノム構造及びビリオン性質に基づいて、ＨＣＶは、二つの他の属であるフラビウイルス（例えば黄熱（ＹＦ））と動物ペスチウイルス（例えばウシのウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）と古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）（FranckiらによるArch, Virol. Suppl.2, 223（1991））を含むフラビウイルス系統における分離属として分類されてきた。上記系統の全てのメンバーは、単一の長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳を経由して、全ての周知のウイルス特異タンパク質をコード化する（encoding）プラス鎖ＲＮＡゲノムを含むビリオンを包み込む。
ビリオンの構造及び物理的性質。ＨＣＶの構造と複製に関しては殆ど情報が入手できない。効率的なウイルス複製を支えることが可能な細胞培養の欠如と、一般的には血清に存在する感染性ウイルスの低いタイターにより研究は邪魔される。濾過実験に基づく感染性ウイルスのサイズは、３０-８０nmの間である（BradleyらによるGastroenterology 88, 773-779（1995）; HeらによるJ. Infect. Dis. 156, 636-640（1987）; YuasaらによるJ. Gen. Virol. 72, 2021-2024（1991））。スクロースにおける感染物質の浮遊密度の初期の測定により、１．１g/ml以下の低密度のものが、ある値の範囲で主に存在していることが分かった（BradleyらによるJ. Med. Virol. 34, 206-208（1991））。その後研究では、慢性的に感染したヒト若しくは実験的に感染させたチンパンジーからの血清に存在する潜在的感染性ウイルスの間接的測定として、ＨＣＶ特異ＲＮＡを検出するためにＲＴ/ＰＣＲが利用された。これらの研究から、さまざまな臨床サンプルの間にはかなりの不均一性が存在し、しかも多くの要因がＨＣＶ  ＲＮＡを含む粒子の挙動に影響を与えることが、ますます明らかになってきた（HijikataらによるJ. Virol. 67, 1953-1958（1993）; ThomssenらによるMed. Microbiol. Immunol. 81, 293-300（1992））。かかる要因は免疫グロブリン（Hijikataらによる（1993）の上記の文献）若しくは低密度リポタンパク質（Thomsennらによる1992の上記文献；ThomsennらによるMed. Microbil. Immunol. 182, 329-334（1993））と関連している。かなりの感染性急性期チンパンジーの血清において、ＨＣＶ特異ＲＮＡは低浮遊密度（１．０３-１．１g/ml）の感染で通常検出される（CarrickらによるJ. Virol. Meth. 39, 279-289（1992）；Hijikataらによる（1993）の上記文献）。他のサンプルにおいて、ＨＣＶ抗体の存在及び免疫複合体の形成は、高い密度と低い感染力の粒子と相関関係がある（Hijikataらによる（1993）の上記文献）。感染力を破壊するクロロホルムによる（BradleyらによるJ. Infect. Dis. 148, 245-265（1983）; FeinstoneらによるInfect. Immun. 41, 816-821（1983））、若しくは非イオン性界面活性剤による粒子の処理は、ＨＣＶヌクレオキャプシドを表わすと信じられている高密度（１．１７-１．２５g/ml）の粒子を含むＲＮＡを生じさせる（Hijikataらによる（1993）の上記文献；KantoらによるHepatology 19, 296-302（1994）; MiyamotoらによるJ. Gen. Virol. 73, 715-718（1992））。
血清及び血漿にあるネガティブ-センスＨＣＶ特異ＲＮＡの報告がある（FongらによるJournal of Clinical Investigation 88: 1058-60（1991）を参照）。しかしながら、高感染力を有する血清は、ネガティブ-センスＲＮＡの低レベル若しくは検出不可能なレベルであるので、かかるＲＮＡは感染粒子の本質的成分であるとは思われない（SimizuらによるProc. Natl. Acad. USA 90: 6037-6041（1993））。
ビリオンタンパク質成分は活発には決定されていないが、推定されるＨＣＶ構造タンパク質は、塩基性Ｃタンパク質と二つの細胞膜糖タンパク質Ｅ１及びＥ２を含む。
ＨＣＶ複製。ＨＣＶ複製の初期の出来事は殆ど理解されていない。ＨＣＶ糖タンパク質の細胞受容体は確認されていない。ＨＣＶ粒子とベータリポタンパク質及び免疫グロブリンの関連性は、これらの宿主（host）分子がウイルス摂取と組織向性（tropism）を調整する可能性を高める。ＨＣＶの複製を調べる研究は、ヒト患者若しくは実験的に接種させたチンパンジーに主として限られていた。チンパンジーモデルにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは接種後三日目に速くも血清に検出され、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル（肝臓損傷の指標として）のピークから持続する（ShimizuらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6441-6444（1990））。ウイルス血症の兆候は、肝臓のＨＣＶ感染の間接的な特徴の発生を伴う。このことは細胞質抗原の発生（Shimizuらによる（1990）の上記文献）と、クロロホルムに敏感な“作用物質を形成する細管（tubule）”若しくは“ＴＦＡ”（Bradleyらにより概観されているProg. Med. Virol. 37: 101-135（1990））と従来から呼ばれるＨＣＶに対する微小管凝集物の形成のような肝細胞における超微構造の変化の発生を伴う。ウイルス抗原の発生（BlightらによるAmer. J. Path. 143: 1568-1573（1993）; HiramatsuらによるHepatology 16: 306-311（1992）;KrawczynskiらによるGastroenterology 103: 622-629（1992）; YamadaらによるDigest. Dis. Sci. 38: 882-887（1993））及びポジティブネガティブセンスＲＮＡの検出（Fongらによる（1991）の上記文献; GunjiらによるArch. Virol. 134: 293-302（1994）; HarumaらによるJ. Hepatol. 18: 96-100（1993）; LamasらによるJ. Hepatol. 16: 219-223（1992）; Nouri AriaらによるJ. Clin. Inves. 91: 2226-34（1993）; SherkerらによるJ. Med. Virol. 39: 91-96（1993）; TakeharaらによるHepatology 15: 387-390（1992）; TanakaらによるLiver 13: 203-208（1993））により示されるように、特に急性感染中では、肝細胞はＨＣＶ複製の主な部位であるらしい（NegroらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2247-2251（1992））。ＨＣＶ感染の後段階では、ＨＣＶ特異抗原の発生、ウイルス血症の持続若しくは分割、及び肝臓病の発病度は、チンパンジーとヒト患者の双方では大きく変化する。ある種の肝臓損傷は、ＨＣＶ感染及び細胞変性の直接的な結果として発生するが、新たに出てきているコンセンサスは宿主免疫応答、特にウイルス特異細胞毒性Ｔリンパ球は細胞損傷の媒介においてより支配的な役割をする。
さらにＨＣＶは肝臓外の貯蔵所においても複製することは推測されてきた。ある場合には、ＲＴ/ＰＣＲ若しくは切片上ハイブリッドは、ＨＣＶ  ＲＮＡとＴ細胞、Ｂ細胞及び単核細胞を含む周辺の血液単核細胞との関連を示す（BlightとGowansによりViral Hepatitis Rev 1: 143-155（1995）に概観されている）。かかる細胞向性は慢性感染の確率に関連しており、ＨＣＶ感染と混合寒冷グロブリン血症（FerriらによるEur. J. Clin. Invest. 23: 399-405（1993））糸球体腎炎、及び稀な非ホジキンＢリンパ腫（Ferriらによる（1993）の上記文献；KagawaらによるLancet 341: 316-317（1993））のようなある種の免疫異常との間の関連性において役割を担っている。しかしながら、血清中の循環性ネガティブ（マイナス）鎖ＲＮＡの検出、本当の鎖特異ＲＴ/ＰＣＲを得る困難性（Gunjiらによる（1994）の上記文献）、及び見かけ上の感染細胞の数が少ないことは、生体外での上記組織における複製の明らかな証拠を得ることを難しくしている。
ゲノム構造。数多くのＨＣＶ分離体の完全長若しくは殆ど完全長に近いゲノム配列が、報告されている（LinらによるJ. Virol. 68: 5063-5073（1994a）; OkamotoらによるJ. Gen. Virol, 75: 629-635（1994）; SakamotoらによるJ. Gen. Virol, 75: 1761-1768（1994）及び上記文献の引用文献を参照）。分離体の間でかなりの遺伝的多様性があると仮定すると、幾つかの主なＨＣＶ遺伝子型が世界中に分布していることが明らかである。米国でかなり重要なタイプは、遺伝子型１、サブタイプ１a及び１bである（遺伝子型の有病率と分布は以下を参照し、Bukhらによる（1995）の上記文献を参照）。ＨＣＶゲノムＲＮＡは長さが約９．６キロベース（ｋｂ、図１）である。５’ＮＴＲは３４１-３４４ベース（base）の長さであり、かなり保存されている。長いＯＲＦの長さは、３０３０、３０３１のポリタンパク質若しくは３０３３個のアミノ酸をコード化する分離体の間では僅かに変化している。報告された３’ＮＴＲ構造は成分と長さ（２８-４２の塩基）の双方においてかなりの多様性を示し、３’末端ポリ（Ａ）トラクト（tract）を含むある場合（ＨＣＶ-１、タイプ１a）以外は、ポリ（Ｕ）で終結するようだ（ChenらによるVirology 188: 102-113（1992）; OkamotoらによるGen. Virol. 72: 2697-2704（1994）; TokitaらによるJ. Gen. Virol. 66: 1476-83（1994）を参照）。対照的に、我々の最近の分析により、Ｈ-菌株（タイプ１aも）のゲノムＲＮＡは、内部ポリピリミジントラクトとそれに続く新規なＲＮＡ要素を含むことを示唆している（係属中の１９９５年８月２９日に出願した米国特許出願０８/５２０、６７８号及び１９９６年８月２８日に出願した国際特許出願第ＰＣＴ/ＵＳ９６/１４０３３号）。係属中の米国特許出願第０８/５２０、６７８号に示した結果からは、このタイプ１a分離体のゲノムＲＮＡは、従来考えられていたようにホモポリマートラクトで終結せずに、むしろ約９８の塩基の新規な配列で終結することが分かる。さらに、この３’ＮＴＲ構造及び新規な３’末端要素は、これまでに調査された全てのＨＣＶ遺伝子型に共通の特徴である（KolykhalovらによるJ. Virol. 70: 3363-3371（1996）; TanakaらによるBiochem. Biophys. Res. Comm. 215: 744-749（1996）; TanakaらによるJ. Virol. 70: 3307-12（1996）; YamadaらによるVirology 223: 255-261（1996））。
翻訳とタンパク質分解プロセシング（processing）。幾つかの研究は、翻訳開始における５’ＮＴＲの役割の調べるために、無細胞翻訳及び細胞培養での一過性発現を利用した（FukushiらによるBiochem. Biophys. Res. Comm. 199:425-432（1994）; Tsukiyama-KoharaらによるJ. Virol. 66: 1476-1483（1992）; WangらによるJ. Virol. 67: 3338-3344（1993）; YooらによるVirology 1991:889-899（1992））。このかなり保存された配列は多重の短いＡＵＧ-開始ＰＲＦを含み、ペスチウイルス属の５’ＮＴＲ領域と重要な相同性を示す（BuhkらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4942-4946（1992）; Hanらによる（1991）の上記文献）。一連のステムループ構造は、コンピュータモデリングとさまざまなリボ核酸による消化に対する感度に基づいて提案されている（BrownらによるNucl. Acids Res. 20: 5041-5045（1992）; Tsukiyama-Koharaらによる（1992）の上記文献）。幾つかのグループからの結果により、この要素は長いＯＲＦの第一のＡＵＧで効率的な翻訳の開始を可能にする内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）として機能することが分かる（Fukushiらによる（1994）の上記文献; Tsukiyama-Koharaらによる（1992）の上記文献; Wangらによる（1993）の上記文献; Yooらによる（1992）の上記文献）。ＨＣＶとペスチウイルスＩＲＥＳ要素の幾つかの予想される特徴は、お互いに同じである（Browらによる（1992）の上記文献）。ＩＲＥＳとして機能するこの要素の能力から、ＨＣＶゲノムＲＮＡは，５’キャップ構造が欠いていることを示唆している。
ＨＣＶポリタンパク質（図１）の組織とプロセシングは、ペスチウイルスのそれと殆ど同じである。少なくとも１０個のポリペプチドは確認され、ポリタンパク質でのこれらの切断生成物の順序は、ＮＨ２-Ｃ-Ｅ１-ｐ７-ＮＳ２-ＮＳ３-ＮＳ４Ａ-ＮＳ４Ｂ-ＮＳ５Ａ-ＮＳ５Ｂ-ＣＯＯＨである。図１に示すように、タンパク質分解プロセシングは、宿主単一ペプチダーゼ及び二つのＨＣＶコード化（encoded）プロテイナーゼ、ＮＳ２-３オートプロテイナーゼ並びにＮＳ３-４Ａセリンプロテイナーゼにより媒介される（New YorkにあるRaven Pressにより発行された“Fields Virology”（B. N. Fields, D. M. KnipeとP. M. Howleyによる編集）のRiceによるpp.931-960；概観のためにはShimotohnoらによるJ. Hepatol. 22: 87-92（1995）を参照）。Ｃはウイルスコア若しくはキャプシドタンパク質であると信じられている塩基性タンパク質であり、Ｅ１及びＥ２は推定されるビリオンエンベロープ糖タンパク質であり、ｐ７はＥ２糖タンパク質から非効率的に切断された未知の機能を有する疎水性タンパク質であり（Linらによる（1994a）の上記文献; MizushimaらによるJ. Virol. 68: 6215-6222（1994）; SelbyらによるVirology 204: 114-122（1994））、同様にＮＳ-２-ＮＳ５ＢはウイルスＲＮＡ複製複合体において機能する非構造（ＮＳ）タンパク質である。特にＮ末端セリンプロテイナーゼドメインのほかにも、ＮＳ３はＲＮＡヘリカーゼの特徴的なモティーフを含み、ＲＮＡ刺激ＮＴＰase活性を有することを示し（SuzichらによるJ. Virol. 67, 6152-6158（1993））、ＮＳ５Ｂは、プラス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの特徴的なＧＤＤモティーフを含む。
ＨＣＶ  ＲＮＡ複製。フラビウイルスとの類似により、プラスセンスＨＣＶビリオンＲＮＡの複製はマイナス鎖中間体を経由して起こるものと考えられる。この戦略は以下のように簡潔に説明される：（ｉ）進入するウイルス粒子の脱外被は、たぶん共翻訳と翻訳後に処理される単一の長いポリタンパク質を生じるように翻訳されるゲノムプラス鎖を放出し、個々の構造及び非構造タンパク質が生じる；（ｉｉ）非構造タンパク質はマイナス鎖の合成用のテンプレートとしてビリオンＲＮＡを利用する複製複合体をたぶん形成する；（ｉｉｉ）上記のマイナス鎖はプラス鎖の合成のテンプレートとして働き、ウイルスタンパク質、マイナス鎖合成の更なる翻訳に利用される若しくは後代ビリオンにパッケージングされる。ウイルス増殖用の良好な実験システムがないので、ＨＣＶ複製過程についての詳細はほとんど入手できない。本物のＨＣＶ複製とウイルス生命サイクルにおける他の段階の詳細な解析は、細胞培養でのＨＣＶ複製の効率的なシステムの開発により容易になるであろう。
多くの試みが、ＨＣＶ感染個体から集められた血清のある培養細胞を感染させるために行われてきており、低レベルの複製はＢ細胞（BertoliniらによるRes. Virol. 144: 281-285（1993）; NakajimaらによるJ. Virol. 70; 9925-9（1996）; ValliらによるRes. Virol. 146: 285-288（1995））、Ｔ細胞（KatoらによるBiochem. Biophys. Res. Commun, 206: 863-9（1996）; MizutaniらによるBiochem. Biophys. Res. Comm. 227: 822-826；MizutaniらによるJ. Virol. 70: 7219-7223（1996）; Nakajimaらによる（1996）の上記文献; ShimizuとYoshikuraによるJ. Virol. 68: 8406-8408（1994）; ShimizuらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5477-5481（1992）; ShimizuらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6037-6041（1993））と肝細胞（KatoらによるJpn. J. Cancer Res., 87: 787-92（1996）; Tagawa, J. Gastoenterol. and Hepatol., 10: 523-527（1995））、細胞系統と同様に周辺の血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）（CribierらによるJ. Gen. Virol., 76: 2485-2491（1996））とヒト致死肝細胞の一次培養（CarloniらによるArch. Virol. Suppl. 8: 31-39（1993）; Cribierらによる（1995）の上記文献; IacovacciらによるRes. Virol., 144: 275-279（1993））若しくは大人のチンパンジーからの肝細胞（LanfordらによるVIrology 202: 606-14（1994））を含む方法により感染された多くの細胞タイプに報告されている。さらにＨＣＶ複製は、培養前に（ItoらによるJ. Gen. Virol. 77: 1043-1054（1996））生体内でウイルスに感染したヒトＨＣＶ患者から取出された一次肝細胞において、ＨＣＶ-１ｃＤＮＡクローンからの生体外で転写されたＲＮＡでのトランスフェクションに続くヒト肝細胞系統Ｈｕｈ７において（YooらによるJ. Virol., 69: 32-38（1995））検出された。ＨＣＶ-１クローンはホモポリマーの３’ＮＴＲ配列下流を欠いているので、ＨＣＶ-１クローンから誘導されたＲＮＡでトランスフェクト（transfect）された細胞での複製の観察報告はわけがわかならい（以下を参照）。ＨＣＶ複製用の最もよく特徴付けられる細胞培養は、レトロウイルス（ＨＰＢ-Ｍａ若しくはＭＴ-２）で持続的に感染されるＢ細胞系統（Daudi）若しくはＴ細胞系統を利用する（Katoらによる（1995）の上記文献; MizutaniらによるBiochem. Bioohys. Res. Comm., 227: 822-826（1996a）; Mizutaniらによる（1996）の上記文献; Nakajimaらによる（1996）の上記文献; ShimizuとYoshikuraによる（1994）の上記文献; ShimizuによるProc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6037-6041（1993））。ＨＰＢＭａはマウス肉腫ウイルスの両栄養性マウス白血病ウイルスで感染するのに対し、ＭＴ-２はヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルスタイプＩ（ＨＴＬＶ-Ｉ）で感染する。非クローン集団より効率的にＨＣＶ複製を助けるクローン（ＨＰＢＭａ１０-２及びＭＴ-２Ｃ）は、二つのＴ細胞系統ＨＰＢＭａ及びＭＴ-２のために分離された（MizutaniらによるJ. Virol,（1996）の上記文献; Shimizuらによる（1993）の上記文献）。しかしながら、インプットＲＮＡの分解後の上記細胞系統若しくはDaudi系統において得られたＲＮＡ複製の最大レベルは、依然として１０6細胞当たりたったの約５ｘ１０4ＲＮＡ分子（Mizutaniらによる（1996）の上記文献; Mizutaniらによる（1996）の上記文献）若しくは培地のml当たり１０4ＲＮＡ分子（Nakajimaらによる（1996）の上記文献）である。複製のレベルは低いが、一つのシステム（MizutaniらによるBiochem. Biophys. Res. Comm. 227: 822-826（1996a））において１９８日までの長期間の感染、別のシステム（Nakajimaらによる（1996）の上記文献）において一年��上の感染が報告されており、感染ウイルス生産は固有（naive）細胞へのウイルスの系列無細胞若しくは細胞媒介継代により実証された。
しかしながら、効率的なＨＣＶ複製は今までのところいずれの細胞培養でも観測されておらず、複製、マイナス鎖の誤った検出、及び複製されたＲＮＡの一般的に低いタイターにより生成したプラス鎖からインプットＲＮＡを識別する困難さを含む多くの問題に遭遇するかかるシステムを確立するように、全てのグループにより試されている。よって、以上の進展にもかかわらず、ＨＣＶ増殖用のより効率的な細胞培養システムは、高濃度のウイルスストックの生産、ビリオン成分の構造解析、及びＲＮＡ複製を含む細胞内でのウイルス過程の改善された解析のために必要である。
ビリオン構築及び放出。この過程は直接調べられておらず、複合多糖の欠如、発現ＨＣＶ糖タンパク質のＥＲ局在化（DubuissonらによるJ. Virol. 68: 6147-6160（1994）; RalsonらによるJ. Virol. 67: 6753-6761（1993））及び細胞表面に上記タンパク質の不存在（Dubuissonらによる（1994）の上記文献; SpaeteらによるVirology188: 819-830（1992））により、初期のビリオンの形態形成は、細胞内のベシクルにバディング（budding）することにより起こることを示唆している。これまでのところ、効率的な粒子形成と放出は一過性発現検定において観測されておらず、本質的なウイルス若しくは宿主要因は存在しない又はブロックされていることを示唆している。ウイルスの実質的なフラクション（fraction）は、ペスチウイルスで発見されたように細胞に関連したままであるので、ＨＣＶビリオン形成と放出は非効率的である。最近の研究により、ヒト血漿から部分的に精製された細胞外ＨＣＶ粒子は複合Ｎ結合多糖を含むが、これらの炭水化物部分はＥ１又はＥ２と特別に関連していないことを示す（SatoらによるVirology 196: 354-357（1993））。放出ビリオン上の糖タンパク質と関連する複合多糖は、トランスゴルジ体を通して移動し、宿主分泌経路を通してビリオンの移動を示唆している。このことが正しければ、ＨＣＶ糖タンパク質の細胞内セクエストレーション（sequestration）及びビリオン形成は、免疫監視を最小化し、抗体及び補体（complement）によりウイルス感染細胞の溶菌（lysis）を防止することにより慢性感染の確立に重要な役割を担う。
遺伝的変異性。全てのプラス鎖ＲＮＡウイルスに関して、ＨＣＶ（ＮＳ５Ｂ）のＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）は、取込み違いの塩基の除去のための３’-５’エキソヌクレアーゼ校正活性が欠如していると信じられている。したがって、複製は誤りがちであり、多くの数の変異体から成る“準種（quasi-species）”ウイルス集合体へ導く（MartellらによるJ. Virol. 66: 3225-3229（1992）; MartellらによるJ. Virol. 68: 3425-3436（1994））。この変異性はマルチレベルにおいて明らかである。第一に、慢性的に感染した個体において、ウイルス集合体における変化は時がたつにつれて起こり（Ogataらによる（1991）の上記文献; OkamotoらによるVirology 190: 894-899（1992））、上記変化は病気に重要な結果をもたらす。特定の興味ある例としては、Ｅ２糖タンパク質のＮ末端の３０残基セグメントがあり、これはポリタンパク質の残りよりもかなり高い変異性を示す（例えば、HigashiらによるVirology 197, 659-668. 1993; Hijikataらによる（1992）の上記文献; Weinerらによる（1991）の上記文献）。たぶんＨＩＶ-１  ｇｐ１２０のＶ３ドメインに類似するこの超可変性領域は、ＨＣＶ特異抗体を循環させることによる免疫選択下にあることを証明するものが蓄積されている（Katoらによる（1993）の上記文献; TaniguchiらによるVirology 195: 297-301（1993）；Weinerらによる（1992）の上記文献）。このモデルにおいて、Ｅ２の上記部分に対して向けられた抗体は、ウイルス中和に寄与し、よって中和から逃げることを可能にする置換により変異体の選択を引き起こす。この柔軟性は、Ｅ２超可変性領域における特異アミノ酸配列はビリオン吸着（attachment）、浸透若しくは集合のようなタンパク質の他の機能に対して必須ではないことを示唆している。
さらに遺伝的変異性は、慢性感染患者のＩＦＮ-α治療後に観測されたさまざまな応答のスペクトルに寄与する。減少血清ＡＬＴレベルと、循環するＨＣＶ  ＲＮＡのレベルの減少と通常相関関係にある改善肝組織学は、約４０％の治療で確認される（Greiser-WilkeらによるJ. Gen. Virol. 72: 2105-2019（1991））。治療後、約７０％の応答個体が再発する。ある場合には、循環ウイルスＲＮＡの一過性損失後に、治療中若しくは治療後に新たなウイルス血症が観測される。このことは、ＩＦＮ耐性ＨＣＶ遺伝子型若しくは変種体の存在若しくは発生を示唆するが、更なる研究が、ウイルス遺伝子型の相対的寄与及び免疫応答における宿主特異的差異を決定するために必要である。
最終的に、世界中のさまざまなＨＣＶ分離体の配列比較により、莫大な数の遺伝的多様性を示している（Bukhらによる（1995）の上記文献を参照して概観される）。交差中和テストのような生物学的に関連する血清学的検定がないので、ＨＣＶタイプ（数により示される）、サブタイプ（文字により示される）、及び分離体は、ヌクレオチド若しくはアミノ酸配列類似性に基づいて、現在分類されている。多くの多様な遺伝子型間のアミノ酸配列類似性は、比較されたタンパク質に依存して、約５０％ほどである。この多様性は、特に診断、ワクチン設計及び治療によっては重要な生物学的意味を有する。
ｃＤＮＡからの感染性ＨＣＶ転写物（transcript）を生じさせるための他人による試み
最近の論文（YooらによるJ. Virol. 69: 32-38（1995））には、Ｈｕｈ７細胞のトランスフェクション後の転写ＨＣＶ-１  ＲＮＡの複製が報告されている。この論文では、ＨＣＶ-１  ｃＤＮＡクローンの種々の誘導体からのＴ７転写物は、ヒト肝癌細胞系統、Ｈｕｈ７の次に続くトランスフェクションを複製させる能力をテストした。起こり得るＨＣＶ複製は、鎖特異ＲＴ/ＰＣＲ（５’ＮＴＲプライマーを利用して）と3Ｈ-ウリジンのあるＨＣＶ特異ＲＮＡの代謝ラベリングにより評価された。明らかに、ポリ（Ａ）若しくはポリ（Ｕ）で終結している完全長転写物は、上記評価によりポジティブ（プラス）であったが、５’末端１４４塩基に欠失のある転写物は存在しなかった。ある培養では、ＨＣＶ特異ＲＮＡは培地で検出され、この推定されるウイルスはフレッシュなＨｕｈ７細胞を再感染させるために利用された。
本発明者らは、上記結果を再現させることができなかった。上記報告は、複製とウイルス生産の本物のＨＣＶ感染よりもむしろ一過性複製を報告しているようである。例えば、上記論文で報告されているポジティブコントロール（positive control）は、高いタイターのチンパンジー血漿から抽出されたＲＮＡのあるＨｕｈ７細胞の生産的トランスフェクションであった。この抽出サンプルは、潜在的感染性のある完全長のＨＣＶ  ＲＮＡの最大１０7個の分子を含んでいたであろう。（顕微注射以外の）最適トランスフェクション条件下において、一般にはビリオンＲＮＡの１０5個以上のＲＮＡ分子（少なくともポリオウイルス、シンドビスウイルス若しくはＹＦによっては）は、一つの感染イベントを開始させる必要がある。このことは１００個よりも少なく報告されたＨＣＶ-１実験では、細胞は生産的にトランスフェクトされるであろうことを示唆している。さらに、トランスフェクションの１６日後、ポジティブ及びネガティブ鎖ＲＮＡの双方は、代謝ラベリングの８時間後に繰り返して検出された。この方法によるマイナス鎖ＲＮＡの検出（トランスフェクトされたビリオンＲＮＡと転写ＲＮＡの双方）は、ＨＣＶは効率的な複製とスプレッド（spread）の双方が可能であり、しかもＨＣＶ  ＲＮＡ合成のレベルは、ＹＦのようなより強いフラビウイルス（高い多重感染のピークで）で予期されるレベルと同じである。しかしYooらは多様な抗血清を利用した上記細胞においてＨＣＶ抗原の検出は報告しておらず、さらにノーザン分析（3Ｈ-ウリジンによる代謝ラベリングよりもかなり高感度である）による完全長のポジティブ及びネガティブ鎖の検出も報告していない。最終的に、ＲＮＡ若しくはＨＣＶ-１クローンから誘導されたウイルスが、チンパンジーモデルで感染されたことを示す重大な実験は報告されていない。
ＨＣＶ研究用の感染クローン技術の重要性
ここ最近の数年における大きな進歩にもかかわらず、ＨＣＶ複製、病原論及び免疫に関する数多くの疑問は未解決のままである。この分野は、我々にＨＣＶ  ＲＮＡゲノム及びそのコード化されたタンパク質の機能のある面を理解させ、本物のウイルスの複製関係において構造/機能の疑問を実験的にテストさせる方法を全く有しないボトルネックに急速に近づいている。かかる分析は、保護ワクチン、有効な治療法及びＨＣＶ診断薬の設計を可能にするために、ウイルス生命サイクルにおける各段階を理解することは重要である。よって、この技術分野では感染ＨＣＶ  ＲＮＡの発現のための本物のＨＣＶ遺伝物質が必要である。
さらにこの技術分野では、固有（naive）ＨＣＶビリオン及びＨＣＶビリオン構造の特徴付けを可能にするウイルス粒子タンパク質の発現のための本当の遺伝物質が必要である。
さらにこの技術分野には、ＨＣＶレセプター結合、細胞感染、複製、ビリオン集合体及び放出の分析を可能にする感染性ＨＣＶに対する生体外での培養方法が必要である。
この技術分野における上記及び他の必要なことは、本発明で扱われる。
本願での参考文献の引用は、かかる参考文献が緊急出願の“先行技術”として利用可能であることの承認として、解釈されるべきではない。
発明の要約
本発明は複製、機能的ＨＣＶタンパク質の発現及び坑ウイルス性治療及び診断薬の開発のための生体内と生体外での感染が可能な本物のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡクローンを提供する。
広い態様において、本発明は、ポジティブ-センス核酸上の５’から３’と、一番端の（extreme）５’末端保存配列から成る機能性５’非翻訳領域（ＮＴＲ）と、切断生成物がＨＣＶウイルス粒子とＲＮＡ複製機械装置（replication machinery）の機能構成部品を形成するＨＣＶポリタンパク質の少なくとも一部分をコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、一番端の３’末端保存配列から成る３’非翻訳領域（ＮＴＲ）と、若しくは適応ウイルス、弱毒化ウイルス、複製能のある非感染ウイルス、及び欠損ウイルスから成る群から選ばれる誘導体から成る遺伝子的に特別設計された（engineered）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸クローンに関する。本発明者らにより、遺伝子工学技術を利用して実施される多くの操作は、本物のＨＣＶ核酸、例えば感染ＨＣＶ  ＲＮＡを生じるように転写されるｃＤＮＡを発生させることが必要であることが分かった。特別設計された本物のＨＣＶ核酸を提供することにより、本発明者らは、ＨＣＶ複製機械装置とタンパク質活性の解剖、及び多様なＨＣＶ誘導体の調製を始めて可能にした。従来では、ある一定のＨＣＶクローンが機能することが不可能になる誤り若しくは突出然変異を含んでいるかどうか不確実であったので、ＨＣＶの更なる分析用の出発物質が、人工物（artifact）により有用であるか又は簡単であるか確かではなかった。よって、本発明の大きな利点は、本物のＨＣＶを提供し、よって変種が先行技術で提供されたクローンでの誤りによる人工物よりもむしろ本当の変化をもたらすことを保証することにある。
本発明の更なる利点は、感染ＨＣＶゲノム、特にポリタンパク質暗号づけ（coding）領域の特徴の認識にある。特定実施例において、ＨＣＶ核酸は、ＨＣＶ分離体若しくは遺伝子型の少なくと三つのクローンの大部分の配列から決定されたコンセンサス核酸配列を有する。ＨＣＶ核酸は、本願で実証された本発明の特定実施例を表わすＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すような配列の少なくとも機能部分を有することが好ましい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はＤＮＡ配列であるが、本発明は対応するＲＮＡ配列、及びＤＮＡとＲＮＡの相補的配列のことも考えていることを指摘しておくべきである。更なる実施例において、ＨＣＶ分離体からの領域は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を有するＨＣＶ核酸の相同領域と置換される。本願で実証された更に好ましい実施例において、ＨＣＶ核酸は、複製能のあるＨＣＶ  ＲＮＡ複製用の発現上に遺伝暗号を指定する（code）ＤＮＡであり、又は自身は複製能のあるＨＣＶ  ＲＮＡレプリコンである。以下の特定例において、本発明のＨＣＶ核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された若しくは対応する完全長配列を有する。さらに５’及び３’のさまざまな変異は、本発明により熟慮される。例えば５’末端配列は、ＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＧＣＣＡＧＣＣ；ＵＧＣＣＡＧＣＣ；ＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＡＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＵＧＣＣＡＧＣＣ；及びＧＣＧＣＣＡＧＣＣから成る群から選ばれるＲＮＡ配列に相同若しくは相補的であり、ここで配列ＧＣＣＡＧＣＣはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の５’末端である。本発明の更に別の利点は、感染ＨＣＶクローン用の完全３’-ＮＴＲの重要性のデモンストレーションである。３’-ＮＴＲ、特にＨＣＶ遺伝子型の間でかなり保存されている約９８の塩基の一番端の末端配列は、本願の全体の参考文献中に引用されている１９９５年８月２９日に出願された米国特許出願番号０８/５２０、６７８号と、これも本願の全体の参考文献中に引用されている１９９６年８月２８日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ/ＵＳ９６/１４０３３号の主題である。よって、好ましい態様において、機能性３’ＮＴＲは、ＨＣＶ遺伝子型の中でかなり保存されている約９８の塩基の３’末端配列から成る。特定実施例において、３’ＮＴＲの一番端にある末端は、配列５’-ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴ-３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を有するＤＮＡに相同若しくは相補的である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で実証された特定実施例において、３’ＮＴＲは長いポリピリミジン領域（例えば約１３３の塩基）から成るが、代わりのポリピリミジン領域は、短い領域（約７５の塩基）、若しくは短い又は長い領域を含んでさらに包み込まれる。当然、ポジティブ（プラス）鎖ＨＣＶ  ＤＮＡ核酸において、ポリピリミジン領域はポリ（Ｔ/ＴＣ）領域であり、ポジティブ鎖ＨＣＶ  ＲＮＡ核酸において、ポリピリミジン領域はポリ（Ｕ/ＵＣ）領域である。
本発明のさまざまな態様によれば、ポリタンパク質暗号づけ領域を含むＨＣＶ核酸は突然変異し、若しくは特別設計されて、例えばサイレント突然変異、保存突然変異などのある変異体若しくは誘導体が生じる。さらにかかるクローンは、例えば動物若しくは生体外で増殖のための選択により適応される。さらに本発明は、ＨＣＶキメラの生成を可能とし、他の遺伝子型若しくは分離体のゲノム部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又は以下の付着（deposited）実施例のようなＨＣＶクローンの相同領域と置換される。更に別の実施例において、本発明はＨＣＶ-１、ＨＣＶ-１ａ、ＨＣＶ-１ｂ、ＨＣＶ-１ｃ、ＨＣＶ-２ａ、ＨＣＶ-２ｂ、ＨＣＶ-２ｃ、ＨＣＶ-３ａ、及びそれらの“準種”変異体から成る群から選ばれるＨＣＶ遺伝子型からのポリタンパク質暗号づけ配列から成るクローンの調製方法を提供する。更なる好ましい実施例において、サイレントヌクレオチドは、特定ＨＣＶクローンのマーカーとして取込まれたポリタンパク質暗号づけ領域において変化する（つまり同じアミノ酸をコード化するコドンの３つの塩基の変異）。
本発明の更なる態様において、弱毒化および欠損変異体を含むＨＣＶ核酸は、発現制御配列と操作上関連した異種遺伝子から成り、ここで異種遺伝子及び発現制御配列はプラス鎖核酸分子上に配向される。特定の実施例において、異種遺伝子は、ＨＣＶポリタンパク質暗号づけ配列とのインフレーム融合と追加的シストロンの生成から成る群から選ばれる戦略により挿入される。異種遺伝子は抗生物質耐性遺伝子又はレポーター遺伝子である。あるいは、異種遺伝子は、治療遺伝子若しくはワクチン抗原をコード化する遺伝子、つまり夫々遺伝子治療若しくは遺伝子ワクチン応用のための遺伝子である。異種遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である特定の実施例において、抗生物質耐性遺伝子は、３’ＮＴＲにおけるＳｆｉＬ部位に挿入された内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）と操作上関連するネオマイシン耐性遺伝子である。
上記したように当然、本発明のＨＣＶ核酸は、二本鎖ＤＮＡ、ポジチブ-センスｃＤＮＡ、若しくはネガティブ-センスｃＤＮＡ、又はポジチブ-センスＲＮＡ又はネガティブ-ＲＮＡから成る群から選ばれる。よって本発明の核酸の特定の配列が明らかにされると、ＤＮＡ及び対応するＲＮＡ双方は、ポジティブ及びネガティブ鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを含むことが意図される。
ＨＣＶ  ＤＮＡは対応するＨＣＶ  ＲＮＡの翻訳用のプラスミドベクターに挿入される。よって、ＨＣＶ  ＤＮＡはポジティブ−センスＤＮＡ上の５’-ＮＴＲのプロモーター５’から成り、ここでプロモーターからのテンプレートＤＮＡの転写は、複製能のあるＲＮＡを生じさせる。プロモーターは真核性プロモーター、イーストプロモーター、植物プロモーター、バクテリアプロモーター、若しくはウイルスプロモーターから成る群から選ばれる。以下の特定例において、ファージＴ７及びＳＰ６プロモーターが利用される。特定実施例において、本発明はプラスミドクローン、ｐ９０/ＨＣＶＦＬ（長いポリ（Ｕ））に関し、これは１９９７年２月１３日に米国のメリーランド州ロックビル、パークローンドライブにあるAmerican Type Culture Collection（アメリカンタイプカルチャーコレクション）に寄託された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列を有する受託番号９７８７９号と帰属される感染ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物を生じるように転写された完全長のＨＣＶ  ｃＤＮＡに宿る。当然、さらに本発明は、５’末端配列がＧＣＣＡＧＣＣ，ＧＧＣＣＡＧＣＣ、ＵＧＣＣＡＧＣＣ、ＡＧＣＣＡＧＣＣ，ＡＡＧＣＣＡＧＣＣ、ＧＡＧＣＣＡＧＣＣ、ＧＵＧＣＣＡＧＣＣ，及びＧＣＧＣＣＡＧＣＣから成る群から選ばれるＲＮＡ配列に相同若しくは相補的であるプラスミドの誘導体を含み、ここで配列ＧＣＣＡＧＣＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の５’末端と３’ＮＴＲが短いポリピリミジン領域から成る誘導体である（好ましい付着実施例では長いポリピリミジンを有するからである）。更なる実施例において、付着実施例の誘導体は、他のＨＣＶ分離体又は遺伝子型からの相同領域の置換により生じた誘導体、突然変異誘発により生じた誘導体、適応された、弱毒化された、複製能のある非感染性、及び欠損変異体から成る群から選ばれた誘導体、発現制御配列と操作上関連する異種遺伝子から成る誘導体、及び上述の誘導体のいずれかの機能フラグメントから成る誘導体から成る群から選ばれる。あるいは、５’ＮＴＲ、ポリタンパク質暗号づけ領域、３’ＮＴＲ若しくはＨＣＶゲノムのより一般的な暗号づけ又は非翻訳領域のような付着ＤＮＡクローンの部分は、さまざまなＨＣＶ遺伝子型からの対応する領域で置換され、新しいキメラ感染クローンが生じる、若しくは他の分離体及び遺伝子型の拡張感染クローンにより生じる。例えば、ＨＣＶ-１ｂ若しくは-２ａポリタンパク質暗号づけ領域（あるいは共通ポリタンパク質暗号づけ領域）は、付着クローンのＨＣＶ-Ｈ（１ａ菌株）ポリタンパク質に置換される。
当然、更に本発明は、ＨＣＶ  ＤＮＡ若しくは上記に示したプラスミドクローンに宿る完全長のＨＣＶ  ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡを提供する。
よって、特異ＨＣＶゲノム自身はＨＣＶの変種変異体を誘導するための優れた出発物質を提供する。なぜなら変種は変化及び誤りの蓄積からの結果から生じる人工物よりむしろ、本物のウイルスへの変化から生じるからである。本発明のＨＣＶ  ＤＮＡクローン若しくはＲＮＡは多くの方法、又は以下に明らかにするように本物のＨＣＶ成分を誘導するために利用される。
例えば、本発明は上記に再度引用されたプラスミドクローンから生産されるＨＣＶ  ＲＮＡの感染量で組織培養中の細胞系統と接触させることから成るＨＣＶとの感染を許容する細胞系統を確認する方法を提供し、細胞系統の細胞中のＨＣＶの複製を検出する。当然、本発明は、例えば上記プラスミドにより生産されるＨＣＶ  ＲＮＡの感染量を動物に導入することから成るＨＣＶで感染を許容する動物を確認する方法にも拡張され、動物中でのＨＣＶの複製を検出する。優性選択可能なマーカー（dominat selectable marker）から成ることが好ましい本物の感染性ＨＣＶを与えることにより、本発明は、培養中の細胞系統に接触させる、若しくはＨＣＶ  ＲＮＡの感染量を動物に導入し、細胞系統又は動物におけるＨＣＶ  ＲＮＡの進行的に増加するレベルを検出することから成る許容細胞系統又は動物での高いレベルのＨＣＶ複製を可能にする適応突然変異でＨＣＶを選択する方法をさらに提供する。特定実施例において、適応突然変異はＨＣＶ向性の変形を可能にする。本発明の上記態様の直接的に意味することは、ＨＣＶ感染に対する新しい有効な動物モデルの生産である。
本発明の核酸を利用して確認された許容細胞系統又は動物は、とりわけＨＣＶ感染の自然の歴史を研究する、ＨＣＶの機能成分を分離するため、及び本物のＨＣＶウイルス若しくはそれらの成分を生産することに加えて、感度よく迅速に診断を行うために、非常に有用である。上述したように、本発明の特定の利点は、動物又は細胞系統で生産的感染を開始させることが可能なＨＣＶ  ＤＮＡクローンを、始めてうまく調製できたことにある。
本発明のＨＣＶ  ＤＮＡ、例えばプラスミドベクターは本物のＨＣＶ成分をコード化するので、ＨＣＶ  ＤＮＡによりトランスフェクト、トランスフォーム、若しくはトランスデュースされた宿主細胞系統におけるかかるベクターの発現は実行される。例えば、バキュロウイルス又は植物発現システムは利用され、ＨＣＶウイルス粒子若しくはそれらの成分を発現する。よって、宿主細胞系統は細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞から成る群から選ばれる。
本発明は、とりわけ感染ＨＣＶ  ＲＮＡを提供するので、本発明は上述したプラスミドから転写されたＨＣＶ  ＲＮＡのようなＨＣＶ  ＤＮＡの感染供給量（dose）を動物に投与することから成るＨＣＶで動物を感染させる方法を提供する。当然、本発明は本発明のＨＣＶで感染された非ヒト動物を提供し、非ヒト動物は前述の方法により調製される。
本発明の更なる利点は、完全な機能性ＨＣＶゲノムを与えることにより、サブユニット発現システムにおいて不可能である方法による固有ＨＣＶタンパク質又はＲＮＡで生産された本物のＨＣＶウイルス粒子又はそれらの成分を調製することにある。加えて、本発明のＨＣＶの各成分は機能的であり（よって本物のＨＣＶが発生する）、ある特定成分は本物の成分である、つまり少なくとも一部は先行技術のクローンに影響を与える誤りが欠けている。実際に、本発明の更なる利点は、天然ＨＣＶビリオン若しくはタンパク質と構造的に同じ又はかなり関連しているＨＣＶウイルス粒子又はウイルス粒子を発生させる能力にある。よって、更なる実施例において、本発明は、本発明のＨＣＶ  ＲＮＡの感染量と、例えばＨＣＶ  ＲＮＡの複製を可能とする条件下において上述したプラスミドから翻訳されたＨＣＶ  ＲＮＡと接触させた細胞系統を培養させることから成る生体外でＨＣＶを増殖させる方法を提供する。当然、本発明はＨＣＶで感染された生体内の細胞系統にまで拡張され、ここでＨＣＶは上述したようにゲノムＲＮＡ配列を有する。特定実施例において、細胞系統は肝細胞系統である。更に本発明は、本発明のＨＣＶ感染させた非ヒト動物からのＨＣＶウイルス粒子を分離し、ＨＣＶ複製及びウイルス粒子生成を可能にする条件下で本発明の細胞系統を培養させる、又はＨＣＶ粒子タンパク質の発現を可能にする条件下で、ＨＣＶ  ＤＮＡでトランスフェクトさせた宿主発現細胞系統を培養し、細胞培養からＨＣＶ粒子若しくは粒子タンパク質を分離することを含み、ＨＣＶウイルス粒子を生産させるさまざまな方法を提供する。本発明は、複製成分ＨＣＶゲノムＲＮＡ、若しくは本発明のＨＣＶ核酸に対応する複製欠損ＨＣＶゲノムＲＮＡから成るＨＣＶウイルス粒子に拡張される。
ＨＣＶ核酸、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡベクターにおける異種遺伝子を挿入させることにより、本発明は、例えばＨＣＶ  ＲＮＡで動物を効果的に感染させるために、ＨＣＶ  ＲＮＡのある量を動物へ投与することによる遺伝子治療若しくは遺伝子予防接種のために、異種遺伝子でＨＣＶ感染しやすい動物をトランスデュースする方法を提供する。特定実施例において、かかるＨＣＶベクターは上述したプラスミドに宿るＨＣＶにおいて発生する。
例えば前述した本発明のプラスミドから転写されたように、本発明のＨＣＶゲノムテンプレートＲＮＡから成るＨＣＶ用の生体外無細胞システムは、機能性ＨＣＶレピリカーゼ成分及びリボヌクレオチドトリホスフェート塩基から成る等張性緩衝培地を提供する。上記要素は複製機械装置及び原材料（ＮＴＰ）を提供する。
本物のＨＣＶウイルス粒子及びウイルス粒子タンパク質は、ＨＣＶ抗原として好ましい出発物質である。よって、更なる実施例において、本発明はＨＣＶウイルス粒子の免疫原性量を動物に投与し、動物からアンチＨＣＶ抗体を分離させることから成るＨＣＶへの抗体を生産させる方法を提供する。かかる抗体は、例えばＨＣＶの存在を検出するために，診断的に利用される、若しくは例えば受身免疫治療において治療的に利用される。ＨＣＶへの抗体を生産させる更なる方法は、本発明のＨＣＶウイルス粒子との反応性のヒト抗体ライブラリーをスクリーニングすることと、ＨＣＶウイルス粒子と反応性のある抗体を発現させるライブラリーからのクローンを選択することとから成る。当然、抗体を発生させることに加えて、本発明の本物のＨＣＶウイルス粒子及びタンパク質はＨＣＶワクチン用の好ましい出発物質である。好ましくは、本発明のワクチンは薬学的に許容なアジュバントを含む。
本願で提供された本物の物質は、生体外及び生体内でＨＣＶ複製を調節することが可能な作用物質用のスクリーニング法を提供する。かかる方法は、候補物質を本発明のＨＣＶ感染動物へ投与し、ＨＣＶ感染若しくは活性レベルの増加又は減少を、候補物質投与前の動物におけるＨＣＶ感染若しくは活性レベルと比較してテストすることを含み、ここで候補物質の投与前の動物におけるＨＣＶ感染もしくは活性レベルと比較して、ＨＣＶ感染若しくは活性レベルの減少は、ＨＣＶ感染若しくは活性を阻害する能力があることを示している。ＨＣＶ感染レベルをテストすることは、動物からの組織サンプル中のウイルスタイターを測定し、動物からの組織サンプル中のウイルスタンパク質を測定し、若しくは肝臓酵素を測定することにより実施される。あるいは、動物を感染させるのに利用されたＨＣＶゲノムは、発現制御配列に操作上関連する異種遺伝子を含み、ここで異種遺伝子及び発現制御配列はプラス鎖核酸分子上に配向され、ＨＣＶ活性レベルのテスト法は、動物からの組織サンプル中のマーカータンパク質のレベルを測定することから成る。
あるいは、かかる分析は、例えば候補物質で請求項３２の細胞系統と接触させ、候補物質を投与する前のコントロール細胞系統若しくは細胞系統におけるＨＣＶ感染又は活性のレベルと比較して、ＨＣＶ感染又は活性レベルの増加又は減少をテストすることにより生体外で行われ、ここで候補物質の投与前のコントロール細胞系統若しくは細胞系統におけるＨＣＶ感染又は活性レベルと比較して、ＨＣＶ感染又は活性レベルが減少していることは、ＨＣＶ感染又は活性を阻害させる能力があることを示している。生体外でＨＣＶ感染レベルをテストすることは、細胞、培地、若しくはその両方でウイルスタイターを測定することと、細胞、培地、若しくはその両方でウイルスタンパク質を測定することにより実施される。あるいは、細胞系統を感染させるために利用されたＨＣＶゲノムが発現制御配列と操作上関連する異種遺伝子を含むとき、ここで異種遺伝子及び発現制御配列がポジティブ鎖核酸分子上に配向されているが、ＨＣＶ活性レベルをテストする方法は、動物からの組織サンプル中のマーカータンパク質レベルを測定することから成る。
ＨＣＶ複製の調節可能な作用物質をスクリーニングする更なる方法は、上述の無細胞システムを含む。この方法は、本発明の生体外でのシステムを接触され、候補物質の投与前のコントロール細胞システム若しくはシステム中のＨＣＶ複製レベルと比較して、ＨＣＶ複製レベルの増加若しくは減少をテストすることから成り、ここで候補作用物質の投与前のコントロール細胞系統若しくは細胞系統中でのＨＣＶ複製レベルと比較して、ＨＣＶ複製レベルが減少していることは、ＨＣＶ感染又は活性を阻害する能力があることを示している。
本発明は、プラスセンスＤＮＡ上の５’から３を接合し、一番端の５’末端保存配列から成る機能性５’非翻訳領域（ＮＴＲ）と、機能性ＨＣＶタンパク質の発現のために与えるＨＣＶタンパク質をコード化するポリタンパク質暗号づけ領域と、一番端の３’末端保存配列からなる３’非翻訳領域（ＮＴＲ）から成るＨＣＶ核酸を調製する方法を含む。更に上記方法は、５’-ＮＴＲ、ポリタンパク質暗号づけ配列、及びＨＣＶ分離体又は遺伝子型の少なくとも三つのクローンの大部分の配列からの３’-ＮＴＲのコンセンサス配列を決定することから成る。特定実施例において、３’-ＮＴＲは、配列５’-ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴ-３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を有するＤＮＡに相同である一番端の末端配列から成る。更なる特定実施例において、ＨＣＶ核酸は、描かれた若しくは他のＨＣＶ分離体又は遺伝子型からの相同領域の置換から成るＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応するポジティブ鎖配列を有する。
さらに本発明は、重要な診断上の意味を有する。一実施例において、例えばＨＣＶウイルス粒子とサンプル中のＨＣＶ特異抗体とを結合させることを可能にする条件下において、上述のように調製された本発明のＨＣＶウイルス粒子で被験者からの生物学的サンプルを接触させ、ＨＣＶウイルス粒子とサンプル中の抗体との結合を検出することから成る、生物学的サンプルにおけるＨＣＶへの抗体を生体外で検出する方法を提供し、ここでＨＣＶウイルス粒子とサンプル中の抗体との結合を検出することは、サンプル中のＨＣＶへの抗体の存在を示す。
被験者からの生物学的サンプル中のＨＣＶの存在を検出する生体外での代わりの方法は、生産的ＨＣＶ感染を許容する細胞系統と生物学的サンプルとを接触させることから成り、ここで細胞系統はＨＣＶにより生じたトランス-作用要因（trans-acting factor）の制御下において発現されたレポーター遺伝子生成物を発現する導入遺伝子（transgene）を含むように変種され、レポーター遺伝子生成物の発現を検出し、さらにここでは、レポーター遺伝子生成物の発現を検出することは、被験者からの生物学的サンプル中にＨＣＶが存在することを示している。関連した実施例において、本発明は、生物学的サンプルと生産的ＨＣＶ感染を許容する細胞系統とを接触させ、レポーター遺伝子生成物の発現を検出することから成る被験者からの生物学的サンプル中のＨＣＶの存在を生体外で検出する方法を提供し、ここで細胞系統はＨＣＶにより生じるトランス-作用要因の制御下において高いレベルでレポータ遺伝子生成物を発現する欠陥ウイルス導入遺伝子を含むように変種され、レポーター遺伝子生成物の発現の検出は被験者からの生物学的サンプル中にＨＣＶが存在していることを示す。よって、本発明の重要な利点は、上記の生体外での診断用の許容（感染しやすい）細胞系統を提供することにある。請求項６４による方法では、欠損ウイルス導入遺伝子は特別に設計されたアルファウイルスを生じ、トランス-作用ヘルパー要因はアルファウイルスｎｓＰ４ポリメラーゼであり、ここでアルファウイルスｎｓＰ４ポリメラーゼは、ＨＣＶ  ＮＳ４Ａとのキメラ融合タンパク質として発現され、アルファウイルスｎｓＰ４ポリメラーゼ-ＨＣＶ  ＮＳ４Ａキメラ融合タンパク質はＨＣＶ  ＮＳプロテイナーゼにより切断され、機能性アルファウイルスｎｓＰ４ポリメラーゼを放出する。前述の方法において生物学的サンプルは血液、血清、血漿、血球、リンパ球、及び肝臓組織バイオプシーから成る群から選ばれる。
関連した態様において、さらに本発明は本物のＨＣＶウイルス成分から成るＨＣＶ用テストキットと、本物のＨＣＶウイルスから誘導される成分から成るＨＣＶ用診断テストキットを提供する。
よって本発明の主要目的は、感染ＨＣＶをコード化するＤＮＡを提供しなければならない。
本発明の関連目的は、ＤＮＡクローンからの感染ＨＣＶゲノムＲＮＡを提供することである。
本発明の更に別の目的は、細胞に侵入するが感染ウイルスを増殖させないワクチン開発に適する弱毒化されたＨＣＶ  ＤＮＡ若しくはゲノムＲＮＡを提供することである。
本発明の別の目的は、アンチＨＣＶ（または坑ウイルス性）薬剤をテストし、薬剤耐性を評価し、弱毒化ＨＣＶウイルスワクチンをテストするためのＨＣＶ感染の生体外及び生体内モデルを提供することである。
本発明の更に別の目的は、中和検定においてＨＣＶレポーター、アンタゴニストに結合するレポーターを確認するのに利用されたＨＣＶビリオン若しくはウイルス粒子タンパク質の発現を提供することである。加えて、発現ＨＣＶビリオン若しくはウイルス粒子タンパク質は、固有ＨＣＶと構造的に同じ若しくはほとんど関連している抗原により、より効果的なＨＣＶワクチンを開発するために利用される。
本発明の更なる目的は、特別設計されたレポーター細胞を用いて感染ＨＣＶを検出する能力に基づくＨＣＶ診断薬を提供することである。
さらに別の目的は、ＨＣＶ特異抗体を分析し、ＨＣＶ特異抗体を発生させるために、本物のウイルス抗原、特にウイルス粒子を提供することである。
本発明の上記及び他の目的は、図面と本発明の詳細な説明により詳述される。
【図面の簡単な説明】
図１（先行技術）。ＨＣＶゲノム構造、ポリタンパク質プロセシング、とタンパク質の特徴。上には構造及び非構造タンパク質暗号づけ領域と、３’及び５’ＮＴＲと、推定される３’の第二の構造のあるウイルスゲノムを示す。ゲノムの下の箱は、タンパク質分解プロセシングカスケードにより生じたタンパク質を示す。推定される構造タンパク質は陰のある箱（shaded box）で示され、非構造タンパク質はオープンな箱（open box）で示される。電荷のないアミノ酸の隣接した部分の広がりは黒のバーで示される。星印はＮ結合グリカンを示すが、位置若しくは利用した部位の数を必ずしも示さない。図示した切断部位は、宿主シグナラーゼ（◆）、ＮＳ２-３プロテイナーゼ（曲がった矢印）、ＮＳ３-４Ａセリンプロテイナーゼ（下向き矢印）に切断させた。
図２。ＨＣＶベクターを利用する異種ＲＮＡ及びタンパク質の発現の戦略。図２の上部は、単一の長いＯＲＦ及びタンパク質分解プロセシングの翻訳により成熟ウイルスタンパク質を発現させるプラス極性ＲＮＡウイルスＨＣＶの図である。構造タンパク質（ＳＴＲＵＣＴＵＲＡＬ）及び非構造タンパク質（ＲＥＰＬＩＣＡＳＥ）をコード化するポリタンパク質の領域は、夫々薄く陰のある、オープンな箱として示される。それ以下には、多くの提案された複製能のある“レプリコン”発現構成物（construct）を示す。第一の四つの構成物（Ａ-Ｄ）は構造遺伝子が欠けており、したがってパッケージングを感染ウイルスへ入れることを可能とするヘルパーシステムは必要である。構成物Ｅ-Ｇは複製若しくはパッケージング用のヘルパー機能は必要ない。黒く陰のある箱は異種若しくは外来遺伝子配列（ＦＧ）を示す。翻訳開始（ａｕｇ）と終結シグナル（ｔｒｍ）はオープン三角形と黒い菱形で夫々示される。内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）は垂直なストライプのある箱として示す。構成物Ａ及びＨはＨＣＶポリタンパク質とインフレーム融合としての異種生成物の発現を示す。かかるタンパク質融合連結は、プロセシングが宿主若しくはウイルスプロテイナーゼ（矢印で示す）のいずれかにより媒介されるように特別に設計された。
図３。ＨＣＶ感染を分析するための特別設計された細胞系統。パネルＡは三つのサイレント導入遺伝子を発現させる細胞を示す。（ｉ）シンドビスウイルス（Ｓｉｎ）非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）と融合したＨＣＶ  ＮＳ４Ａから成るポリタンパク質のタンパク質を発現するｍＲＮＡと、（ｉｉ）ｎｓＰ４暗号づけ領域を欠く欠損シンドビスウイルスレプリコンであるが、レポーター遺伝子の発現を駆動させるサブゲノミックプロモーター（矢印）と、（ｉｉｉ）ｎｓＰ４を欠くが、サブゲノミックＲＮＡプロモーターの制御下においてユビキチン-ｎｓＰ４融合遺伝子を含む欠損シンドビウイルスＲＮＡは、核プロモータ要素により駆動される。シンドビスレプリコン及び欠損ＲＮＡは、シンドビスウイルス特異ＲＮＡ複製に必要な全てのシグナルを含み、転写及びパッケージングシグナル（ステムループ構造）は活性ｎｓＰ４が存在しないとサイレントである。パネルＢ。ＨＣＶにより感染しやすい細胞の生産的感染において、ウイルスは脱外被され、翻訳され、複製を始める（段階１）。このことにより、活性ＮＳ３セリンプロテイナーゼ（段階２）を生産し、ＨＣＶ  ＮＳ４Ａ-シンドビスｎｓＰ４連結（段階３）で切断させ、活性ｎｓＰ４が生じる。他の三つのシンドビスｎｓＰ４のあるｎｓＰ４集合は、活性シンドビス複製複合体を形成し（段階４）、両方のシンドビス特定ＲＮＡを複製し、シンドビスウイルスサブゲノミックプロモーターからの転写を導く（段階５）。欠損ＲＮＡのサブゲノミックＲＮＡから発現されたＵｂ-ｎｓＰ４は切断され、ｎｓＰ４ポリメラーゼのより活性な形を形成し、さらにシンドビス特異ＲＮＡｓの複製および転写を増幅させる（段階６）。これらレポーターの高いレベルの遺伝子発現をもたらす（段階７）。
図４。チンパンジーモデルでテストされた構成物の初期の組（チンパンジー実験Ｉ）。正しいＨＣＶ５’及び３’末端がクローン化され決定される前に、チンパンジーモデルでクローンのテストを行った。図はＴ７若しくはＳＰ６プロモーター要素を示し、ＨＣＶ  ｃＤＮＡ及びランオフ（run-off）部位は、ポリ（Ａ）若しくはポリ（Ｕ）で終結する転写物の生産のために利用された。
図５（Ａ及びＢ）。（Ａ）コンビナトリアルライブラリー用に増幅されたＨＣＶ  Ｈ７７の領域。上部には、ＨＣＶ  Ｈ  ｃＤＮＡのダイアグラムを、示されたコンビナトリアルライブラリー（ＫｐｎＩとＮｏｔＩ：オープンな箱）をクローン化させるために利用された制限部位と共に示す。領域はレシピエントベクター、ｐＴＥＴ/ＨＣＶΔＢｇＩＩＩ/５’+３’corrへクローン化された。このレシピエントベクターは黒で示す５’及び３’末端領域のＨＣＶ  Ｈ７７のコンセンサス配列を含む。おおよそのタンパク質境界も示される。以下には、ＨＣＶ  Ｈ７７  ＲＮＡからのＲＴ-ＰＣＲにより増幅されたフラグメントを、ＡからＧとして示す。各セグメントの上にある数字は、ライブラリーにおける領域の最小の複雑度（complexity）を示す。プライマーペアと正確な位置を表２及び３に示す。（Ｂ）コンビナトリアルライブラリーの構築における中間体と最終フラグメント。表２及び３に示すように、とりわけ、アセンブリＰＣＲ過程での中間体とＨＣＶ  ｃＤＮＡにおけるおおよその位置を示す。
図６。アセンブリＰＣＲ法。アセンブリＰＣＲ法の一般的なスキームを示す。アセンブリに利用した特異ＨＣＶフラグメント及びプライマーを表３に示す。
図７。ｃＤＮＡ希釈のＰＣＲによる複雑度決定の例。増幅領域Ａ，Ｄ、及びＧにおいて、第一の鎖ｃＤＮＡのさまざまな希釈溶液は、ＰＣＲによるうまい増幅でチェックされた。生成物はアガロースゲル上にて分析された。この分析から、コンビナトリアルライブラリーにおける上記領域の最小の複雑度は、夫々ｃＤＮＡの８０、１０及び１０分子であった。
図８。長いポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトを通した効率的な転写の分析。生体外でのＨＣＶ  ＲＮＡｓの最適転写用の条件を利用して、幾つかのテンプレートＤＮＡｓからの転写生成物を示す。（Ａ）レーン１、スーパーコイルｐＴＥＴ/ＨＣＶＦＬ  ＣＭＲ/５’３’corr．ＤＮＡ；レーン２、Ｘｍｍ-消化ｐＴＥＴ/ＨＣＶＦＬ/ＣＭＲ/５’３’corr．テンプレート（予想されるサイズは１１７４０の塩基である）；レーン３、ＨｐａＩ-消化ｐＴＥＴ/ＨＣＶＦＬ  ＣＭＲ/５’３’corr．テンプレート（予想されるサイズは薬９６００の塩基である）；レーン４及び５、夫々１１、７５０と９４００の塩基の転写されたＲＮＡサイズマーカー。転写反応は３ｍＭ  ＵＴＰ及び１ｍＭ  Ａ、Ｇ、とＣＴＰを含む。（Ｂ）レーン１、ＢｓｍＩ-消化ｐ９２/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ/５’ＧＧ  ＤＮＡ（予想されるサイズは約９６００の塩基である）；レーン２、ＸｂａＩ-消化ｐ９２/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ/５’ＧＧ  ＤＮＡ（予想されるサイズは約１３０００塩基である）。パネルＢにおける転写反応は、３ｍＭでの全て四つのＮＴＰを含む。両パネルとも、ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトで終結するＨＣＶ  ＲＮＡ転写物は長さ約９５００の塩基であろう。両パネルにおけるレーンＭはＨｉｎｄＩＩＩ-消化ラムダＤＮＡサイズマーカーである。
図９。ＨＣＶ  Ｈ７７コンセンサス配列の決定用の配列アラインメント。決定されたＨＣＶ  Ｈ配列のアラインメントを示す。各ブロックの下部でのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＨＣＶ  Ｈ  ＣＭＲ基本形配列である。コンビナトリアルライブラリーからの配列クローンの数は左に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、２０）。ＧｅｎＢａｎｋはInchaupeらによって決定されたＨＣＶ-Ｈ配列である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10292, 1991; Accession #M67463）。“cons.”はＨＣＶ  Ｈ７７コンセンサス配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を示す。ＨＣＶ  Ｈ  ＣＭＲ配列に同じ位置はドットで示し、ある配列領域のギャップは点線で示す。差が発見されたところでは、下のケースレターはサイレントヌクレオチド置換を示し、上のケースレターは特定ヌクレオチド置換により遺伝暗号指定の変化を招くことを示す。
図１０。コンセンサスクローンの直接構築における段階。図はコンセンサスクローンの直接構築に利用された各配列クローンの領域を示す。各クローンからの一次フラグメントは斜め線が引かれた箱により示され、中間構築サブクローンはオープン箱として示され、完全長のコンセンサスクローンの構築に利用された最終のクローン及び領域は、陰のある箱で示される。表４はクローニング段階の詳細をまとめたものである。
図１１。チンパンジーでテストされた１０の完全長クローンの特徴/マーカー  実験ＩＩＩ。上部には、ＨＣＶ  Ｈ７７  ｃＤＮＡコンセンサスＲＮＡのスキームを示す。うまくチンパンジーに接種させた実験に利用された１０のＲＮＡ転写物を以下に図解する。追加の５’ヌクレオチドと“短い”対“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトを示す。全てのクローン/転写物は、マーカーとして２つのサイレントヌクレオチド置換を含む。位置８９９（Ｔに代わりＣ；星印で示す）；位置５９３６（Ａに代わりＣ；円の星印で示す）。追加の５’塩基のあるクローンは、位置５１４（三角形）のＸｈｏＩを不活性化させる突然変異を含む。“短い”対“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトのあるクローンは、Ａ（黒点）対位置８０５４でのＧにより夫々区別される。
図１２。接種動物からの血清サンプルには繰越（carryover）テンプレートＤＮＡを含まない。図示するように、添加した競争者ＲＮＡのない（レーン１）、若しくは１０2（レーン２から７）又は１０3（レーン８から１４）分子のある接種後の指摘した週間からの重複ＲＮＡサンプル（１０μｌ血清）は、逆転写段階での（+）若しくは（-）酵素なしでＲＴ-ＰＣＲにより増幅された（KolykhalovらによるJ. Virlo. 70: 3363（1996））。ｃＤＮＡ合成が存在しないと、特定ＰＣＲ帯は検出されず、ＨＣＶ特異核酸シグナルはＲＮＡによるものであることを示す。図示した分析はチンパンジー＃１５３５に対してであり、接種ＨＣＶ  ＲＮＡの高いレベルを受け取り、テンプレートＤＮＡはＤＮａｓｅＩによる消化では分解されない。
図１３。接種動物からの循環ＨＣＶ  ＲＮＡはＲＮＡaseから保護される。レーン１において、１０μｌの血清は３ｘ１０5分子の競争者ＲＮＡと混合され、０．５μｇのＲＮａｓｅ  Ａで室温１５分間消化させ、ＲＮＡｚｏｌで抽出され、（Kolykhalovによる1996の上記文献）に記載されている入れ子（nested）ＲＴ-ＰＣＲに利用された。レーン２に示すサンプルでは、競争者ＲＮＡはＲＮＡzol（ＲＮＡｓｅ処理されていない）による溶菌後に添加された。レーン３において、競争者ＲＮＡなしの１０μｌ血清は、レーン１に示すようなＲＮＡｚｏｌによる抽出前にＲＮＡｓｅ  Ａで予め消化させた。レーン４はＲＴ-ＰＣＲのネガティブコントロール（negative control）である。実験から、トランスフェクトされたチンパンジーからの物質を含むＨＣＶ  ＲＮＡは、過剰の競争者ＲＮＡが完全破壊された（destroyed）条件下においてＲＮａｓｅ耐性があることを示している。分析されたサンプルは、ＲＮＡタイターが６ｘ１０6分子/ｍｌであった６週間後のチンパンジー＃１５３６からのものであった。
発明の詳細な説明
以上に指摘したように、好ましくは、本発明は本物のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、クローンを提供する。本発明の機能性ＨＣＶ核酸は、感染しやすい動物及び細胞系統を提供することが好ましい。根気強い努力にもかかわらず、従来から感染性のあるＨＣＶはうまくクローン化されておらず、よってウイルスの複製機構の系統的評価、レポーター結合及び細胞侵入、生体外及び生体内での分析システムを利用した坑ウイルス治療薬の開発、及び生体外での診断分析システムの開発を妨げてきた。加えて、本発明のクローンにより、適切なプロセシングを可能とする条件下において、ＨＣＶ粒子及び粒子タンパク質の発現、よって固有ＨＣＶにかなり近い構造類似性を有するタンパク質の発現を可能とする。かかる粒子及びタンパク質は、アンチＨＣＶワクチン開発にとって好ましい。加えて、感染に必要とされるＨＣＶゲノムの要素を確認することにより、本発明者らは遺伝子治療ベクターの調製のために、慢性肝臓感染を導くＨＣＶの性質を利用する。多くのタンパク質源であり、よって被験者の中で欠失を補うための溶解性要因の発現を好ましい器官で行うベクターは肝臓を目標とするので、かかるベクターは特に有用である。
本発明は、一部機能性遺伝子型１ａ  ｃＤＮＡクローンの発生を基礎としており、他のＨＣＶ遺伝子型（例えば同様な方法を利用して組立られ調べられる）のための調製の基礎として、利用可能である。上記生成物は、（ｉ）より効率的なＨＣＶ治療；（ｉｉ）ＨＣＶワクチン；（ｉｉｉ）ＨＣＶ診断薬と；（ｉｖ）ＨＣＶに基づく遺伝子発現ベクターの開発のためのさまざまな応用がある。上記応用例は以下に説明する。
本発明は、ＨＣＶコンセンサス配列の決定と複製能のある感染ＲＮＡ転写物を産することが可能な完全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンを作り上げるための情報の利用について説明する。５’及び３’末端でのかなり保存された配列を含む末端配列の決定、ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンを増幅させ構築させるための誤りの少ない方法の利用、及びコンセンサス配列を反映させたクローンの構築の全ては、本発明の成功に寄与する。
用語“本物の”とは、本願ではＨＣＶ核酸のことを言い、ＤＮＡ（つまりｃＤＮＡ）若しくはＲＮＡは、完全なゲノム複製及び機能性ＨＣＶタンパク質の生産、若しくはそれらの成分を与える。特定実施例において、本物のＨＣＶ核酸は、例えばチンパンジーモデル若しくは組織培養中で感染性があり、ウイルス粒子（つまりビリオン）がチンパンジーモデルと組織培養の双方で形成される。しかしながら、本発明の本物のＨＣＶ核酸は、幾つかの（全てではないが）機能性ＨＣＶタンパク質を生産するように、若しくはヘルパー細胞系統又はプラスミドなどの存在なしに、複製せずに細胞を生産的に感染させるように弱毒化される。本出願で例証された本物のＨＣＶは、生体内での野生型ウイルスの複製に相当するＨＣＶ複製サイクルの開始に必要である、全てのウイルスをコード化させる（virus-encoded）情報をＲＮＡ要素若しくはコード化されたタンパク質のいずれかを有する。本願で説明した又は例証されたＡＴＣＣ及びその変異体で付着された実施例を含む、本願で説明した特異ＨＣＶクローンは、ＨＣＶ治療、ワクチン、診断薬及び発現ベクターを開発するための好ましい出発物質である。特に、本発明のＨＣＶ核酸の利用は、本物のＨＣＶ成分が含まれていることを保証する。なぜなら、先行技術のクローン化されたＨＣＶとは異なり、上記成分は共同して感染性タンパク質を与えるからである。本願で説明する特定出発物質、及び好ましくは本物のＨＣＶ  ｃＤＮＡに宿る付着プラスミドクローンは、本願で説明するように変種され、例えば部位特異的変異の導入（sited-directed mutagenesis）により変種され、欠損又は弱毒化された誘導体が生じる。あるいは、他の遺伝子型又は分離体からの配列は、本願で説明された特定実施例の相同配列にとって置換される。例えば、本発明の本物のＨＣＶ核酸は、本願で開示された、例えばレシピエントプラスミド上のコンセンサス５’及び３’配列から成り、他の分離体又は遺伝子型（コンセンサス領域若しくは非常に高い忠実度のクローニングにより得られた領域）からのポリタンパク質暗号づけ領域は、本願で例証されたＨＣＶの相同性ポリタンパク質暗号づけ領域に置換される。加えて、一番端の５’若しくは３’配列、又は双方を含みことに限らず、特定実施例におけるＨＣＶウイルス粒子及びＲＮＡ複製機械装置の機能性成分からの切断生成物のポリタンパク質をコード化するＯＲＦを含むことに限らず、本願で説明した本当のＨＣＶの一般的特性は、本物のＨＣＶクローンを得るために提供された特定分離体又は遺伝子型のコンセンサス配列を取込む。
特に、本発明は、例えば正真正銘の複製をすることができず、ＨＣＶタンパク質を生産することができず、ノーザン分析により検出されるＨＣＶ  ＲＮＡを生産せず、動物若しくは生体外の細胞系統を感染させることができない、変種若しくは“補正（correcting）”非機能性ＨＣＶクローンを提供する。例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃＤＮＡ配列のような本発明の本物のＨＣＶ核酸配列と非機能性ＨＣＶクローンの配列とを比較することにより、非機能性クローンの欠損は確認され補正される。当業者に入手可能な核酸配列を修正させる全ての方法は、部位特異的変異の導入と、例えば非機能性クローンにおける相同配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の本当のＨＣＶクローンからの機能性配列の置換とに限られないものを含む非機能性ＨＣＶゲノムでの変種をもたらす。
用語“コンセンサス配列”とは、５’-ＮＴＲ、ポリタンパク質暗号づけ配列機能又はその部分及びＨＣＶの菌株又は遺伝子型のクローンに無関係に、三つ又はそれ以上、好ましくは六つ又はそれ以上からのコンセンサス残基を確認することにより決定された３’-ＮＴＲを含むＨＣＶゲノム配列又はその部分のことを言及するために本願では利用する。以下の例において、５’-ＮＴＲ（ポリタンパク質暗号づけ領域からの幾つかのキャプシドタンパク質を含む）及び３’-ＮＴＲ（ポリタンパク質のＣ末端をコード化するゲノムの幾つかの部分を含む）コンセンサス配列は、レシピエントプラスミド（例３）において決定され、取込まれた。ＫｐｎＩ部位からＮｏｔＩ部位までのポリタンパク質暗号づけ領域の大部分のコンセンサス配列も、以下の図８及び例４にて示されるように決定されコンセンサス配列を与える。ポリタンパク質暗号づけ配列のＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ部分の挿入は、コンセンサス５’及び３’コンセンサス配列を含むレシピエントプラスミドにて行われ、本物のＨＣＶゲノムＤＮＡクローンを与える。
本発明の本物のＨＣＶ核酸は、ＨＣＶ核酸の機能性活性に影響を与えずに保存配列の追加の塩基上流を有する、５’末端配列ＧＣＣＡＧＣＣから成る５’-ＮＴＲの一番端の保存配列を含むことが好ましい。好ましい実施例において、５’-ＧＣＣＡＧＣＣは０から１０の追加の上流塩基、好ましくは０から５の上流塩基を、さらに好ましくは０、一つ、二つの上流塩基を含む。特定実施例において、一番端の５’末端配列はＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＧＣＣＡＧＣＣ；ＵＧＣＣＡＧＣＣ；ＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＡＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＡＧＣＣＡＧＣＣ；ＧＵＧＣＣＡＧＣＣ；若しくはＧＣＧＣＡＧＣＣであり、ここで配列ＧＣＣＡＧＣＣはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の５’末端である。
本発明の本物のＨＣＶ核酸において、３’-ＮＴＲは長いポリピリミジン領域から成る。ポジティブ鎖ＨＣＶ  ＲＮＡにおいて、その領域はポリ（Ｕ）/ポリ（ＵＣ）トラクトに相当する。当然、ポジティブ鎖ＨＣＶ  ＤＮＡにおいて、これはポリ（Ｔ）/ポリ（ＴＣ）トラクトである。以下の例では、ポリピリミジントラクトは可変の長さである；長いポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトを含むＨＣＶクローンがかなり感染力があると分かったが、短い（約７５の塩基）と長い（１３３の塩基）ものは効果的である。長いトラクトは自然にＨＣＶ分離体が発生するときに発見された。よって、本発明の本当のＨＣＶ核酸可変長さのポリピリミジントラクトを有する。
本発明の特定実施例において、ファージプロモータの制御下において感染性ＨＣＶ  ＲＮＡをコード化するｃＤＮＡに宿るプラスミドｐ９０/ＨＣＶＦＬ（長いポリ（Ｕ））は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８０１以下参照の規定にしたがい、特許保護を目的とした微生物の寄託の国際認識であるブダベスト条約を順守する目的で、ワシントン大学のメディカルスクールを代表して、１９９７年２月１３日に米国メリーランド州のロックビル、パークローンドライブ  １２３０１にあるAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託した。
上記技術の利益はものすごく、簡単には到達できない。直接的な重要性は、生物化学、細胞培養、及び遺伝子導入動物手法を利用して、個々のＨＣＶタンパク質及びＲＮＡ要素の機能の研究用の出発物質として、上記機能性クローンからのＨＣＶ  ｃＤＮＡの使用である。ｃＤＮＡ合成若しくはＰＣＲ増幅中に誤って導入されることがないので、ネガティブ若しくは誤解を招く結果を得る可能性は最小化されるであろう。さらにかかるクローンは、本物のウイルス複製に関係するＨＣＶ生物学の多くの面にわたる将来の分子遺伝子研究用の明確な出発物質を提供する。治療及びワクチン開発に関係する利用は、（ｉ）ウイルス中和、吸着、浸透及びエントリの生体外及び生体内検定を開発するための明確なＨＣＶウイルスストックの発生；（ｉｉ）ＨＣＶタンパク質、ＲＮＡ要素及び新しい坑ウイルスターゲットの構造/機能の研究；（ｉｉｉ）ＨＣＶ  ＲＮＡ複製及び粒子放出を支援するシステムや条件を確認するための細胞培養システム及び条件の系統的調査；（ｉｖ）細胞培養中でのより効率的な複製を可能とする適合ＨＣＶ変種体の生産；（ｖ）変質組織若しくは種向性（species tropism）のあるＨＣＶ変種体の生産；（ｖｉ）ＨＣＶ複製を支援するモデルを含む阻害評価の代替の動物モデルの確立；（ｖｉｉ）無細胞ＨＣＶ複製分析の開発；（ｖｉｉｉ）ワクチン用の免疫ＨＣＶ粒子の生産；（ｉｘ）可能なワクチン候補としての弱毒化されたＨＣＶ誘導体のエンジニアリング；（ｘ）遺伝子治療及びワクチン応用のための異種遺伝子生成物の発現用の弱毒化された若しくは欠損ＨＣＶ誘導体；（ｘｉ）適切な受容体による肝臓若しくは他の細胞系統への治療剤の目標へのデリバリーのためのＨＣＶ糖タンパク質の利用を含む。
本願で利用されたさまざまな用語は以下に定義される。
フレーズ“薬学的に許容な”とは、ヒトに投与した際に、生理的に許容であり、胃の不調、めまいなどのアレルギー性若しくは同様な不適当な反応を一般には生じない分子構成要素及び成分のことを言う。本願で用いられるように、用語“薬学的に許容な”とは、連邦政府若しくは州政府、又は米国薬局に掲載された、又は動物、特にヒトに使用するための薬局で一般的に認められ、調整委員（regulatory agency）により承認されていることを意味している。用語“キャリア”とは、投与される化合物との希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は溶剤のことである。かかる薬学的なキャリアは、水や、石油、ピーナッツオイル、大豆オイル、ミネラルオイル、ゴマオイルなどのような動物、野菜又は合成物であるオイルのような、無菌溶液である。水又は水溶液、生理食塩水や水溶性デキストローズやグリセリン溶液は、キャリアとして、特に注射可能な溶液として用いられることが好ましい。適切な薬学的キャリアはE. W. Martinによる“Reminton’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
フレーズ“治療的に効果のある量”とは、活性、機能及び宿主の応答における臨床的に重要な欠損を、少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント減少させ、最も好ましくは防止させるのに十分な量を意味する。あるいは、治療的に効果のある量は、宿主における臨床的に重要な状態の改善を生じさせるのに十分な量である。
用語“アジュバント”とは、抗原に対する免疫応答を増大させる化合物若しくは混合物のことである。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポー剤として、さらに免疫応答を特別にではなく増大させるリンパ系活性化剤として働く。（HoodらによるImmunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p.384）。しばしば、アジュバントの存在しない場合での抗原とのみの主なチャレンジは、ヒト又は細胞免疫応答を引き出せない。アジュバントは、これらに限らないが、フロイント完全アジュバント、不完全なフロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル又は炭化水素エマルジョン、キーホールリンペット（keyhole limpet）ヘモシアン、ジニトロフェノールのような表面活性化物質とＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）及びコリネバクテリウムパルブムのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含む。アジュバントは薬学的に許容であることが好ましい。
特定実施例において、用語“約”若しくは“おおよそ”とは、特定の値若しくは範囲の２０％以内，好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内であることを意味する。
前述に開示したものを更に詳述する本願の以下のサブセクションは、発明を限定させるものではなく、都合を考慮して提供される。
他のＨＣＶ分離体及び遺伝子型の機能性完全長クローン
本願で説明した手法を利用して、他のＨＣＶ遺伝子型の機能性完全長クローンが形成され、生物学的研究と坑ウイルススクリーニング及び評価に利用される。本発明の拡張において、ライブラリーは、高いＲＮＡタイター（１０6以上）と周知の臨床歴史のある単一エクスポージャー患者からのＲＮＡを利用して組立てられた。分離体のコンセンサス配列は、ライブラリーの個々のクローンの配列から生じる。プロモータと、５’及び３’末端コンセンサス配列（分離体から若しくは例えばＨＣＶ-Ｈ７７のような異なる分離体のいずれかから決定された）とランオフ転写物の生産の３’制限部位を含む新しいレシピエントプラスミドが作られる。
コンビナトリアルライブラリーからの限定数のクローンのスクリーニングが、あまり誤りのない方法として出現し機能性クローンを与える。あるいは、本願に説明したように、多重クローンと方向性のある（directed）構築から誘導された配列は、機能性コンセンサスクローンを生産するのに利用される。
よって、本発明は他のＨＣＶゲノム配列、若しくはコンセンサスゲノム配列の分離を考えている。本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学、と現在の技術水準にある組換えＤＮＡ技術を利用する。かかる技術は文献に十分に説明されている。例えばSambrok, Fritsh&Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York（本願ではSambrookらによる1989の文献）; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes IとII（D. N. Glove編集1985）; Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait編集1984）; Nucleic Acid Hybridixation（B. D. Hames&S. J. Higgins、編集（1985））; Transcription And Translation（B. D. Hames & S. J. Higgins編集（1984）9; Animal Cell Culture（R. I. Freshney,編集（1986））; Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press,（1986）; B. Perbal, A Practical Guide To Molecuar Cloning（1984）; F. M. Ausubelらによる編集，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.（1994）。
したがって、本願で現れるならば、以下の用語は次に示す定義を有する。“３’末端配列要素”、“３’末端”“３’配列要素”のような用語ＨＣＶ配列は、以下の配列を全て含むことを意味する；（ｉ）ポジティブ-センスゲノムＲＮＡのＲＮＡ配列；（ｉｉ）例えばＨＣＶネガティブ-センスＲＮＡのような上記ＲＮＡ配列の補体；（ｉｉｉ）ＲＮＡ要素のポジティブ-センス配列に対応するＤＮＡ配列；（ｉｖ）ＲＮＡ要素のネガティブ-センス配列に対応するＤＮＡ配列である。したがって、実質的に等価若しくは変質を示すヌクレオチド配列も同様に考えられる。上記変種体は、例えば部位特異的変異の導入を介して得られた変種体のように計画的であり、若しくは複合体又はその名のサブユニトの生産者である宿主における突然変異を介して得られた変種体のように偶発的である。
“ベクター”は、他のＤＮＡ（ＲＮＡ）セグメントが参加し、付着セグメントの複製が起こるプラスミド、ファージ、又はコスミッドのようなレプリコンである。“カセット”とは、ベクターの特定制限部位に挿入されたＤＮＡ  ＲＮＡのセグメントのことである。ＤＮＡ又はＲＮＡのセグメントは関心のあるポリペプチド若しくはＲＮＡをコード化し、カセット及び制限部位は転写及び翻訳の適切なリーディングフレーム中のカセットに挿入されることを確実にするように設計される。
転写及び翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニレーションシグナル、ターミネーター、ＩＲＥＳ要素などのようなＤＮＡ若しくはＲＮＡ調節配列であり、宿主細胞暗号づけ配列の発現が生じる。暗号づけ配列は、ＲＮＡポリメラーゼが暗号づけ配列をＲＮＡへ転写するときに細胞内の転写及び翻訳制御配列の“制御下に”若しくは“操作上関連して”いる。さらにＲＮＡ配列は、翻訳、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ複製、及びＲＮＡ転写（ＲＮＡウイルスのために）を調節する能力により発現制御配列として働く。
“プロモーター配列”は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）暗号づけ配列又は非暗号づけ配列の転写を開始することができるＤＮＡ又はＲＮＡ調節領域である。よって、プロモーター配列は、ＲＮＡウイルス複製と転写における類似のＲＮＡ配列又は同様な機能の構造のことを言うことにも利用される。本発明の感染性ＨＣＶ  ＤＮＡクローンの無細胞又はバクテリア発現のための好ましいプロモーターは、ファージプロモーターＴ７、Ｔ３とＳＰ６である。あるいは、サイトメガロウイルスの直接早期の（immediate-early）プロモーターのような核プロモータが利用される。実際には、利用したシステムに依存して、発現は真核、原核又はウイルスプロモーター要素から引き起こされる。ＨＣＶ  ＲＮＡ発現用のプロモーターはキャップのある（capped）又はキャップのない（uncapped）転写物を与える。
本願で利用されているように、全ての文法的形及びスペルの変形における用語“相同である（homologous）”とは、スーパーファミリー（例えば免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質と、異なる種（例えばミオシンＬ鎖など）からの相同なタンパク質を含む“共通の進化起源”を有するタンパク質間の関係をさすことをいう（ReekらによるCell 50: 667（1987））。かかるタンパク質（及び遺伝子をコード化するもの）は、高度な配列類似性を有している。全ての文法的形における用語“配列類似性”とは、核酸配列間若しくは共通の進化起源を所有するか否かのタンパク質のアミノ酸配列間の同一又は一致の程度のことをいう（Reekらによる上記文献を参照）。しかしながら、共通の使用及び緊急の出願において、“実質的に”若しくは“かなり”のような副詞と共に修飾されたときには、用語“相同である”とは配列類似性のことをいい、共通の進化起源を有するものではない。
特定実施例において、二つのＤＮＡ又はＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の定義された長さ上のヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％であり、さらに好ましくは少なくとも約９０又は９５％である）がマッチすれば、“相同であり”若しくは“実質的に類似”している。実質的に相同である配列は、配列データバンク入手可能な標準ソフトウエアを利用して、又は例えば特定のシステムで定義される緊縮条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験から、配列を比較することにより確認される。適切なハイブリダイゼーションの条件を制限することは、当業者には可能である。Maniatisらによる上記文献; DNA Cloning, Vols. I & II,上記文献; Nucelic Acid Hydridization，上記文献。
同様に、特定実施例において、３０％以上のアミノ酸が同じである、若しくは約６０％以上が類似である（機能的に同一である）ときに、二つのアミノ酸配列は“相同である”若しくは”実質的に類似”である。好ましくは、類似若しくは相同である配列は、例えばＧＣＧ（（Genetic Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアップを利用したアライメントにより確認される。
核酸又はアミノ酸に関して、用語“対応する”とは、本願では類似若しくは相同な配列を言うときに利用され、正確な位置が同一であるか、分子から類似性又は相同性が異なるかどうかが測定される。核酸若しくはアミノ酸配列アライメントはギャップを含む。よって、用語“対応する”とは配列類似性若しくは相同性の領域のことをいい、アミノ酸残基若しくはヌクレオチド塩基のナンバリングではない。
ＨＣＶゲノム核酸は感染性ＨＣＶ源から、特に組織サンプル（血、血漿、血清、肝臓検体、白血球）、感染ヒト若しくはサル、又は許容動物種から分離される。ゲノムＨＣＶクローン又はそれらの部分を得る方法は、上述したように（Sambrookらによる1989の上記文献を参照）本技術分野においては周知である。ポリタンパク質暗号づけ領域配列を含むＨＣＶ分離体は、例えばHoughtonらによる１９８９年６月１日発行の国際特許出願第ＷＯ８９/０４６６９号に；Houghtonらによる１９９０年１０月４日発行の国際特許出願第ＷＯ９０/１１０８９号に；Houghtonらによる１９９４年９月２７日発行の米国特許第５、３５０、６７１号に；Miyamotoらによる１９９４年１２月１３日発行の米国特許第５，３７２，９２３８号に；Choらによる１９９３年１月７日発行の欧州特許第ＥＰ０５２１３１８  Ａ２号に；及び１９９２年１０月２８日発行の欧州特許第ＥＰ０５１０９５２  Ａ１号に記載されており、各文献は本願の引用文献全体の中に取込まれる。さらに代表的な遺伝子型は、決してこれに制限されないが、他の分離体１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａなどを含む（Bukhらによる（1995）の上記文献；Simmonds, Hepatology 21: 570-83（1995）; SimmondsらによるHepatology 19: 1321-1324（1994）; SimmondsらによるJ. Gen. Virol. 77: 3013-3024（1996））。多くのサブタイプと遺伝子型にとって、十分な配列データはＲＴ/ＰＣＲとＰＣＲアセンブリのプライマーを設計するために利用可能である。
分子クローニングゲノムＨＣＶ  ＲＮＡ又はＤＮＡにおいて、ＤＮＡフラグメントが、例えばｃＤＮＡへの逆転写とＰＣＲにより発生する。上記フラグメントは集められ完全長の配列を形成する。多くのかかるフラグメントを調製することにより、ＨＣＶクローンのコンビナトリアルライブラリーが得られる。かかるライブラリーは感染性のあるクローンを生じさせ、同様にコンセンサス配列は、かかるライブラリーからの全ての若しくは重要な数のクローンの配列を比較することにより決定すべきである。十分なクローンが評価されるべきであり、その結果多様な位置にある大部分の塩基は同じである。よって、コンセンサスは少なくとも三つのクローン、好ましくは約五つのクローン、より好ましくは六つ又はそれ以上のクローンの配列を解析することにより決定される。当然、誤りがちなクローニング方法を用いれば用いるほど、配列されるべきクローンの数は増え、本物のＨＣＶコンセンサス配列を与える。
それからコンセンサス配列は感染性ＨＣＶ  ＤＮＡクローンを調製するのに利用される。結果生じたクローンの忠実度は、配列決定により確立されることが好ましい。しかしながら、例えばクローンが感染性ＨＣＶ  ＲＮＡをコード化するならば、クローンの性質に基づいて選択が実行される。よって、感染性ＨＣＶ  ＤＮＡクローンをうまく調製することは、クローンでトランスフェクトされた又は感染された動物若しくは細胞培養の物理的、病理的又は免疫学的性質に基づく分析により検出される。例えば、ｃＤＮＡクローンは、類似又は同一の物理-化学的、電気泳動移動、等電点電気泳動、又は非平衡ｐＨゲル電気泳動挙動、タンパク質分解性消化マップ、又は固有ＨＣＶ又はＨＣＶウイルス粒子タンパク質として知られているような抗原性質を有するＨＣＶビリオン又はウイルス粒子タンパク質を生産するように選択される。
機能性ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンの成分。本発明で説明される機能性ＨＣＶ  ｃＤＮＡの成分は、以下に説明するように、既知又は新しく確認されたＨＣＶ坑ウイルスターゲットのための無細胞、細胞培養、キメラウイルスと動物に基づくスクリーニング検定法を開発するために利用される。既知又は仮のターゲット及び分析法の例は、これに限定されないが以下のものを含む（Houghton, In“Field Virology”（概観のためにB. N. Fields, D. M. KnipeとP. M. Howley，編集），Vol.pp. 1035-1058. Raven Press, New York（1996）; Rice（1996上記文献; RiceらによるAntiviral Therapy 1, Suppl. 4, 11-17（1997）; Shimotohno, Hepatology 21; ８８７−８（1995）を参照）。
入ってくるＨＣＶゲノムＲＮＡの翻訳に必須な要素を含むかなり保存された５’ＮＴＲは、一つのターゲットである。この配列又はその補体は、ＲＮＡ複製及び/又はパッケージングに重要なＲＮＡ要素を含むであろう。潜在的な治療戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（上記）；トランス-作用リボザイム（上記）；ＲＮＡデコイ；上記要素の機能を干渉する小さな分子化合物（これらはＲＮＡ要素自身と、又は同族体ウイルス若しくは活性に必要とされる細胞要因と結合することにより作用する）を含む。
別のターゲットは、かなり保存され以下の機能と関連するＨＣＶ  Ｃ（キャプシド又はコア）タンパク質である：ＲＮＡ結合とＨＣＶゲノムＲＮＡの特異包膜；細胞（ReyらによるVirus Res. 37: 209-220（1995））及び他のウイルス（ShihらによるJ. Virol. 69: 1160-1171（1995）; ShihらによるJ. Virol. 67: 5823-5832（1993））遺伝子の転写モジュレーション；細胞形質転換（RayらによるJ. Virol. 70: 4438-4443（1996a））；アポトーシスの防止（RayらによるVirol. 226: 176-182（1996b））；ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーとの結合を介した宿主免疫応答のモジュレーション（MatsumotoらによるJ. Virol. 71: 1301-1309（1997））。
ビリオンエンベロープの成分を形成するＥ１、Ｅ２及びＥ２-ｐ-７糖タンパク質は、潜在的な中和抗体のターゲットである。介入のキー段階は以下を含む。；シグナルペプチダーゼがポリタンパク質からのこれら前駆体の切断を媒介させる（Linらによる（1994a）の上記文献）；Ｅ１Ｅ２糖タンパク質複合体のＥＲ集合と細胞シャペロンと上記タンパク質に関連し、機械装置を折重ねる。（Dubuissonらによる（1994）の上記文献; DubuissonとRice, J. Virol. 70: 778-786（1996））；ウイルス粒子集合はヌクレオキャプシドとビリオンエンベロープとの間の相互作用を含む；ウイルス粒子の運搬と放出；免疫監視の回避若しくは結合及びＬＤＬ受容体を発現させる細胞のエントリにおいて役割を担うＶＬＤＬのような宿主成分とウイルス粒子の関連（Hijikataらによる（1993）上記文献; Thomssenらによる（1992）上記文献; ThomssenらによるMed. Microbil. Immunol. 182: 329-334（1993））；ビリオン中の保存され可変な決定因子は、抗体による中和のため、又は抗体と結合し、同族体Ｆｃ受容体との相互作用により細胞の免疫増大感染を容易にするターゲットである；受容体結合及びエントリに重要なビリオン中の保存され可変な決定因子；ビリオン決定因子がエントリ、細胞膜との融合に参加し、入ってくるウイルスヌクレオキャプシドを脱外被させる。
２/３部位での切断に必要であるＮＳ２-３オートプロテアーゼが、さらなるターゲットである。
複合体を形成し、ＨＣＶポリタンパク質（概観のためにRice，（1997）の上記文献参照）での四つの切断を媒介させるＮＳ３セリンプロテアーゼとＮＳ４Ａ補助因子は、更に適当なターゲットである。ターゲットはセリンプロテアーゼ活性自身を含む；セリンプロテアーゼのＣ末端ドメインでの四面体Ｚｎ2+配位部位；ＮＳ３-ＮＳ４Ａ補助因子相互作用；ＮＳ４Ａの膜関連；ＮＳ４ＡによるＮＳ３の安定性；ＮＳ３プロテアーゼ領域の形質変換能力（SakamuroらによるJ. Virol. 69: 3893-6（1995））である。
ＮＳ３ＲＮＡ刺激ＮＴＲａｓｅ（Suzichらによる（1993）の上記文献）、ＲＮＡヘリカーゼ（JinとPeterson, ArchＢｉｏｃｈｅｍBiophys 323: 47-53（1995）; KimらによるBiochem. Biophys. Res. Commun. 215: 160-6（1995））、ＲＮＡ結合（KanaiらによるFEBS Lett 376: 221-4（1995））活性；まだ明確でない機能のＲＮＡ複製複合体の成分としてのＮＳ４Ａタンパク質；他の推定される複製成分のＮＳ５Ａタンパク質は、セリン残基上で主にホスホリレイト（phosphorylate）され（TanjiらによるJ. Virol. 69: 3980-3986（1995））、薬開発の全てのターゲットである。治療用のターゲットであるＮＳ５Ａの可能な特性は、ＮＳ５Ａホスホリレーション（phosphorylation）の責任を担うキナーゼと、ＮＳ５Ａとの相互作用を含む；ＮＳ５Ａとの相互作用とＨＣＶ複製複合体の他の成分である。
ＨＣＶポジティブ及びネガティブ鎖ＲＮＡの実際の合成の責任を担う酵素であるＮＳ５Ｂ  ＲＤＲＰは別のターゲットである。その活性の特異な面はポリメラーゼ活性自身を含む（BehrensらによるEMBO J. 15: 12-22（1996））；ＨＣＶ  ＲＮＡを含み、他のレプリカーゼ成分とＮＳ５Ｂの相互作用；ネガティブ及びポジティブ鎖ＲＮＡ合成の開始に関連する段階；ＮＳ５Ｂのホスホリレーション（HwangらによるVirology 227: 438（1997））である。
他のターゲットは宿主細胞機能のＨＣＶ  ＲＮＡ複製及び/又はモジュレーションに重要な構造又は非構造タンパク質機能を含む。ウイルスが入ること、出ること若しくは宿主細胞遺伝子発現のモジュレーションによって重要なチャンネルを形成することが可能な可能な疎水性タンパク質成分はターゲットである。
３’ＮＴＲ、特別にかなり保存された要素（ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクト；９８の塩基末端配列）はターゲットである。治療的手法は、ゲノムの上記部分がマイナス鎖合成の開始に重要な役割をするであろう以外は、５’ＮＴＲに説明されたものに平行である。翻訳、ＲＮＡ安定性、若しくはパッケージングを含むＨＣＶ  ＲＮＡ複製の他の面にも関連する。
機能性ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンは、全てのウイルスタンパク質及びＲＮＡパッケージングに必要とされるＲＮＡ要素をコード化する。上記要素は坑ウイルス化合物の開発にとってターゲットである。電気泳動移動シフト、ＵＶ交差結合、フィルター結合、及び三つのハイブリッド（SenGuptaらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8496-8501（1996））検定法は、ＨＣＶ  ＲＮＡパッケージングに重要なタンパク質とＲＮＡ要素を定義し、上記過程の阻害剤のスクリーニングのための分析を確立させるために利用される。かかる阻害剤は生体外で生産された小さな分子又はＲＮＡデコイを含む（Goldらによる（1995）の上記文献）。
複雑なＨＣＶライブラリーはＰＣＲシャーフリング（sherffling）を利用して、若しくは“ペプチドディスプレイ”ライブラリーに発生したようなランダム（randomized）配列を取込むことにより調製可能である。“ファージ法”を利用して（ScottとSmith, 1990, Science 249: 386-390（1990）; CwirlaらによるProc. Natl. Acad. Sci., 87: 6378-6382（1990）; DevlinらによるScience, 249: 404-406（1990））、かなり大規模なライブラリーは構築される（１０6-１０8の化学物質）。上述し以下に例証するように、かかるライブラリーからのクローンはコンセンサスゲノム配列を発生させるために利用される。
ヌクレオチド暗号づけ配列の変質により、ＨＣＶポリタンパク質暗号づけ領域として実質的に同じアミノ酸配列をコード化する他のＤＮＡ配列は、本発明で実際に利用される。このことは、以下のことに限らないが、他の種からの相同性遺伝子、配列内の同じアミノ酸残基をコード化するさまざまなコドンの置換により変質されたＨＣＶポリタンパク質遺伝子の全て又は一部から成るヌクレオチド配列を含み、サイレント変化が生じる。かかるサイレント変化は、多重感染動物モデルでの特定の感染分離体を確認するために利用されるゲノムマーカーの生成を可能とする。同様に、本発明のＨＣＶゲノム誘導体は、これらに限らないが、一次アミノ酸配列として保存アミノ酸置換を招く配列内の残基に置換される機能的に等価なアミノ酸残基での変質配列を含むＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸配列の全て又は一部を含む誘導体を包含する。例えば、配列内の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基は類似の極性のアミノ酸により置換され、機能的に等価として振る舞い、サイレント変化をもたらす。配列内でのアミノ酸の置換は、アミノ酸の属する分類の他のメンバーから選択される。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンとメチオニンがある。芳香族環構造を有するアミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンがある。極性のある中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンとグルタミンがある。正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンとヒスチジンがある。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸がある。
特に好ましい置換は
正の電荷が維持されるように、Ｌｙｓに対してＡｒｇ、又はその逆と；
負の電荷が維持されるように、Ｇｌｕに対してＡｓｐ、又はその逆と；
フリーな水酸基が維持されるようにＳｅｒに対してＴｈｒと；
フリーなアミノ基が維持されうようにＧｌｎに対してＡｓｎとの置換が挙げられる。
別の実施例において、本物のＨＣＶクローンが変種され、タンパク質機能が減少する若しくは排除されるアミノ酸置換が導入される。さらに本物のＨＣＶクローンが変種され、ウイルス向性を変化させるアミノ酸置換が導入される。
さらに、ＨＣＶは校正活性がないので、ウイルス自身は容易に突然変異し、本発明内でさらに考えられたＨＣＶの突然変異体“準種”が形成される。かかる突然変異体は、本願で説明したように被験者からの分離体の配列決定により容易に確認される。
ＨＣＶ誘導体をコード化するクローンと本発明の類似体は、本技術分野で周知のさまざまな方法により生産される。そのような生産を招く操作は、遺伝子若しくはタンパク質レベルで起きる。例えば、クローン化されたＨＣＶゲノム配列は、本技術分野では周知の数多くの戦略により変形される（Sambrookらによる1998の上記文献）。ゲノム配列は制限エンドヌクレアーゼで適当な部位で切断され、必要ならば続いて酵素変種され、生体外で分離され、ライゲート（ligate）される。あるいは、ゲノムフラグメントは、例えばＰＣＲで接合され、ＨＣＶゲノムが生じる。ゲノム核酸誘導体若しくはＨＣＶの類似体の生産において、変種ゲノムが固有ＨＣＶゲノムとして同じ翻訳リーディングフレーム内に残り、所望の活性がコード化される領域において翻訳停止シグナルにより中断されないことを保証するように注意しなければならない。
ＨＣＶポリタンパク質コード化核酸配列は、生体外若しくは生体内で突然変異し、翻訳、開始、及び/又は終結配列を生じさせ及び/又は破壊し、若しくは暗号づけ領域における変種体を生じさせる及び/又は新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、若しくは予め存在したエンドヌクレアーゼ部位を破壊し、生体外での変種を容易にする。かかる突然変異は、ＨＣＶの機能活性の変質をもたらし、例えばウイルス活性の弱毒化、又は以下に示すような欠損ウイルスを発生させる。利用される本技術分野で周知の突然変異形成の技法は、これらに限らないが、生体外での部位特異的変異の導入（Hutchinsonやによる1978, J. Biol. Chem. 253: 6551; ZollerとSmith, 1984, DNA 3: 479-488; Oliphantらによる1986, Gene 44: 177; Hutchinsonらによる1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 710）、ＴＡＢリンカー（Pharmacia）の使用がある。ＰＣＲ技術は部位特異的変異の導入には好ましい（Higuchi, 1989,“Using PCR to Engineer DNA”in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich編集., Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70）。
細胞培養若しくは代わりの宿主におけるより効率的な複製のためのＨＣＶの適合。以前に述べたように、細胞培養中でのＨＣＶ複製は非効率である。さらにＨＣＶ複製機械装置の制御下での優性選択可能なマーカーは、ＨＣＶ複製機械装置における適応突然変異を選択するために利用される。かかる適応突然変異が現れるが、これらに限定されない、：（ｉ）ＨＣＶ  ＲＮＡ  複製の向性を変質させる；（ｉｉ）宿主細胞への有毒効果の原因であるウイルス生成物を変質させる；（ｉｉｉ）ＨＣＶ  ＲＮＡ複製効率を増加させる又は減少させる；（ｉｖ）ＨＣＶ  ＲＮＡ  パッケージング効率及び/又はＨＣＶ粒子の構築及び放出を増加させる又は減少させる；（ｖ）受容体結合とエントリのレベルでの細胞向性を変質させる。ＨＣＶオリジナルｃＤＮＡクローンの配列は、特定細胞タイプ中で複製を確立させることと適合性がたとえなくても、突然変異は生体外転写、ＨＣＶ媒介ＲＮＡ合成の初期段階中に起こる、又は上記化学的若しくは生物学的な多様な方法により、テンプレートＤＮＡに取込まれ、特定細胞環境又は動物宿主において複製を可能にする。発現が生産的ＨＣＶ  ＲＮＡ複製に依存する特別設計された優性選択可能なマーカーは、ＨＣＶ複製機械装置若しくはトランスフェクトされた宿主細胞のいずれか、又はその双方において適応突然変異を選択するために利用される。
キメラＨＣＶクローン。さらに上記機能性クローンの成分は、ＨＣＶ遺伝子機能とその阻害剤の分析用のキメラウイルスを作り上げるために利用される（FilocamoらによるJ. Virol. 71: 1417-1427（1997）; HahmらによるVirology 226:318-326（1996）; LuとWimmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1412-7（1996））。本発明の一つのそのような拡張において、５’ＩＲＥＳ、プロテアーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ、ポリメラーゼ又は３’ＮＴＲのような機能性ＨＣＶ要素は、複製が一つ又はそれ以上の上記ＨＣＶ要素に依存するＢＶＤＶのキメラ誘導体を生じさせるために利用される。かかるＢＶＤＶ/ＨＣＶキメラは上記機能性成分に対する坑ウイルス戦略用のスクリーニング及び評価するために利用される。
加えて、優性選択可能なマーカーは、ＲＮＡ複製若しくは粒子生成の高いレベルを可能にするＨＣＶ複製機械装置において突然変異を選択させるために利用される。一つの例において、ＤＨＦＲの突然変異形を発現する特別設計されたＨＣＶ誘導体は、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する抵抗性を比較するために利用される。優性選択可能なマーカーとして、殆ど化学量論的量がＭＴＸ抵抗性には必要であるので、突然変異体ＤＨＦＲは非効率である。培地中にてＭＴＸの濃度をうまく増加させることにより、ＤＨＦＲの増加した量が、複製するＨＣＶ  ＲＮＡが宿る細胞の継続生存に必要である。この選択スキーム、又はこの概念に基づく同様なスキームは、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製とＲＮＡ蓄積の高いレベルを可能にするＨＣＶ  ＲＮＡ複製機械装置において、突然変異の選択を招く。同様な選択はＨＣＶ粒子の高収量の生産を可能にする突然変異に、若しくは変質された細胞向性での突然変異ＨＣＶ粒子に応用可能である。かかる選択スキームは、培養上澄からのＨＣＶ粒子を宿し、又は細胞破壊（cell disruption）後ＭＴＸ抵抗性のために選択し、固有細胞の再感染による粒子をトランスデュースさせることを含む。
確認され分離されたゲノムＲＮＡはｃＤＮＡへ逆転写される。さらにｃＤＮＡは、プロモーター及びランオフ部位を含むように“長い”ＰＣＲにより作られる、又は適当なレシピエントベクターにおける挿入用の３’末端コンセンサス配列特異プライマーを用いて作られる。上記ｃＤＮＡは適当なクローニングベクター、例えば適当なプロモータと３’ランオフ配列に沿ってコンセンサス５’及び３’-ＮＴＲから成るベクターに挿入される。プライマーとランオフ配列を含むクローンは、機能性ＨＣＶ  ＲＮＡの生産に直接利用される。本技術分野において周知の数多くのベクター-宿主システムが利用される。ベクターの例としては、以下のものに限られないが、E. coli、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２誘導体又はｐＵＣプラスミド誘導体のようなプラスミド、例えばｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ-ｃ、ｐＦＬＡＧ、ｐＴＥＴなどがある。例えばクローニングベクターへの挿入は、ＤＮＡフラグメントを相補的粘着末端を有するクローニングベクターへライゲートさせることにより達成される。しかしながら、ＤＮＡをフラグメント化させるのに利用された相補的制限部位がクローニングベクターに存在しないのなら、ＤＮＡ分子の端は酵素的に修飾される。あるいは、望ましい部位は、ＤＮＡ末端上のヌクレオチド配列（リンカー）をライゲートすることにより作られる。上記ライゲートリンカーは、制限エンドヌクレレアーゼ認識配列をコード化する特別に化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから成る。組換え分子は、遺伝子配列の多くのコピーが発生するように、トランスフォーメーション、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどにより宿主へ導入される。
ＨＣＶ  ＲＮＡ及びポリタンパク質の発現
ＨＣＶ  ＲＮＡとＨＣＶタンパク質、特にＨＣＶ  ＲＮＡレプリカーゼ又はビリオンタンパク質の遺伝暗号を指定するＨＣＶ  ＤＮＡは、適当な発現ベクター、つまり挿入されたタンパク質暗号づけ配列の転写及び翻訳用の必要な要素を含むベクターへ挿入される。かかる要素は本願では“プロモーター”という。よって、本発明のＨＣＶ  ＤＮＡは本発明の発現ベクター内のプロモーターと操作上（又はoperably）関連する。さらに発現ベクターは複製起点を含ことが好ましい。必要な転写及び翻訳シグナルは、組換え発現ベクター上に与えられる。機能性ＲＮＡの生体外合成の好ましい実施例において、Ｔ７、Ｔ３若しくはＳＰ６プロモーターが利用される。
潜在的宿主-ベクターシステムは、これらに限らないが、ウイルス組換え体（例えばワクチンウイルス、アデノウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルスなど）で感染された哺乳類細胞システム；組換えウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染された昆虫；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；植物細胞；又はバクテリオファージでトランスフォームされたバクテリア、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミッドＤＮＡを含む。ベクターの発現要素は抵抗性と特異性が変化する。利用した宿主-ベクターシステムに依存して、多くの適当な転写及び翻訳要素のいずれか一つが利用される。
ＨＣＶ  ＤＮＡクローンが導入された細胞から成る組換えベクターは、ＨＣＶ  ＲＮＡの発現又は細胞によるかかるＨＣＶタンパク質を与える条件下で、適当な細胞培養地にて培養される。ＤＮＡフラグメントをクローニングベクターへ挿入させる前述したいずれの方法も、適当な転写/翻訳制御シグナルとタンパク質暗号づけ配列から成る遺伝子を含む発現ベクターを作り上げるために利用される。上記方法は、生体外組換えＤＮＡと合成技術と生体内組換え（遺伝子的組換え）を含む。
ＨＣＶ  ＲＮＡの発現又はタンパク質は本技術分野で知られているプロモーター/エンハンサーにより制御されるが、上記調節要素は発現のために選択された宿主で機能的でなければならない。発現を制御するために利用されるプロモーターは、これらに限定されないが、ＳＶ４０早期プロモーター領域（BenoistとChambon, 1981, Nature 290: 304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端リピートに含まれるプロモーター（Yamamotoらによる1980, Cell 22: 787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wangerらによる1981,Proc, Natl, Acad. Sci. USA. 78: 1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調整配列（Brinsterらによる1982, Nature 296:39-42）、β-ラクタマーゼプロモーターのような原核発現ベクター（Villa-Kamariffらによる1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3727-3731）、又はtacプロモーター（DeBoerらによる1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25;“Useful proteins from recombinant baecteria”in Scientific American, 1980, 242: 74-94も参照）、Gal 4プロモーターのような酵母又はカビからのプロモーター要素、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、組織特異性を示し遺伝子導入動物において利用される動物転写制御領域、膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftらによる1984, Cel 38: 639-646; OrnitzらによるCold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409;MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515）、膵臓ベータ細胞において活性であるインシュリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 351: 115-122）、リンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlらによる1984, Cell 38: 647-658; Adamesらによる1985, Nature 318: 533-538; Alexamderらによる1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444）、精巣、胸部、リンパ及びマスト細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Lederらによる1986, Cell 45: 485-495）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertらによる1987, Genes and Devel. 1: 268-276）、肝臓において活性であるアルファ胎児性タンパク質遺伝子制御領域（Krumlaufらによる1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammerらによる1987, Science 235: 53-58）、肝臓において活性であるアルファ１-トリプシン遺伝子制御領域（Kelseyらによる1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄細胞において活性であるベータグロブリン遺伝子制御領域（Mogramらによる1985, Nature 315: 338-340; Kolliasらによる1986, Cell 46: 89-94）、脳の乏突起こう細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadらによる1987, Cell 48: 703-712）、骨格筋において活性であるミオシンＬ鎖遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314: 283-286）と視床下部において活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mansonらによる1986, Science 234: 1372-1378）を含む。
宿主/発現ベクターの幅広い組合せは、本発明のＤＮＡ配列を発現する時に利用される。例えば有用な発現ベクターは、染色体セグメント、非染色体と合成ＤＮＡ配列を含む。適当なベクターはＳＶ４０ｎ誘導体と周知のバクテリアプラスミド、例えばＥ．ｃｏｌｉプラスミド、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ-Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Smithらによる1988, Gene 67: 31-40）、ｐＭＢ９とその誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド、例えばＮＭ９８９のファージλの数多くの誘導体のようなファージＤＮＡＳと他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３、糸状一本鎖ファージＤＮＡ、２μプラスミド又はその誘導体のようなイーストプラスミド、真核細胞において有用なベクター、昆虫又は哺乳類細胞において有用なベクター、プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター、ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を利用して修飾されたプラスミド、及び本技術分野で周知なものから成る。
好ましい配列分析に加えて、本発明のＨＣＶ  ＤＮＡクローンを含む発現ベクターは、以下の五つの手法により確認される：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡ若しくは特異ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の存否、（ｄ）適当な制限エンドヌクレアーゼによる分析、（ｅ）挿入配列の発現である。第一の手法において、核酸はＰＣＲにより増幅されて増幅生成物の検出を可能にする。第二の手法において、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、ＨＣＶ  ＤＮＡと相同である配列から成るプローブを利用して、核酸ハイブリダイゼーションにより検出する。第三の手法において、組換えベクター/宿主システムはベクターにある外来遺伝子の挿入により引き起こされるある“選択マーカー”遺伝子機能（β-ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗、形質変換表現型、バキュロウイルスにおいてオクルージョンボディ（occlusion body）形成）の存否に基づいて確認され選択される。第四の手法において、組換え発現ベクターは適当な制限酵素で消化されることにより同じである。第五の手法において、組換え発現ベクターは、組換えにより発現された遺伝子生成物、例えばＨＣＶ  ＲＮＡ  ＨＣＶビリオン若しくはＨＣＶウイルスタンパク質の活性、生化学的、若しくは免疫特性を分析することにより確認される。
例えば、バキュロウイルス発現システムにおいて、非融合トランスファーベクターは、これらには限定されないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位；Summers）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲ１，ＮｏｔＩ，ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩとＰｓｔＩクローニング部位；Invitrogen）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ，ＰｓｔＩ，ＮｏｔＩ，ＸｍａＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ，ＳｍａＩ，とＢａｍＨＩクローニング部位；SumersとInvitrogen）とｐＢｕｌｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ，ＮｃｏＩ、とＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、青（blue）/白（white）組換えスクリーニングが可能；Invitrogen）が利用され、融合トランスファーベクターは、これらには限定されないがｐＡｃ７００（ＢａｍＨＩとＫｐｎＩクローニング部位、ＢａｍＨＩ認識部位は開始コドンで始まる;Summers）、ｐＡｃ７０１とｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同じで異なるリーディングフレームを有する）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンのＢａｍＨＩクローニング部位３６ベースペア下流；Invitrogenn（195））、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ（ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ，ＰｓｔＩ，ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位で、三つの異なるリーディングフレーム、ＰｒｏＢｏｎｄ精製用のＮ末端ペプチド、とプラークの青/白組換えスクリーニング；Invitrogen）が利用される。
本発明において利用されることが考えられた哺乳類発現ベクターの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターのような誘発性プロモーター、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ、ＳｂａＩ，ＳｍａＩとＥｃｏＲＩクローニング部位、クローン化された遺伝子とＤＨＦＲの双方を発現させるベクター）（Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12（1991））のようなＤＨＦＲ発現ベクター又はＤＨＦＲ/メトトレキセート共増幅ベクターのある発現ベクターを含む。あるいは、ｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ，ＳｍａＩ，ＳｂａＩ，ＥｃｏＲＩとＢｃｌＩクローニング部位、ベクターはグルタミンシンセターゼとクローン化された遺伝子を発現する；Celltech）のようなグルタミンシンセターゼ/メチオニンスルフォキシイミン共増幅ベクターも含まれる。別の実施例において、ｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩとＫｐｎｌクローニング部位、ＰＳＶ-ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカーを構成する；Invitrogen）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ，ＳｆｉＩ，ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｈｅＩ，ＰｖｕＩＩとＫｐｎＩクローニング部位、ｈＣＭＶ直接早期遺伝子、ハイグロマイシン選択可能マーカーを構成する；Invitrogen）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ，ＰｖｕＩ，ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ，ＳｆｉＩ、ＢａｍＨＩクローニング部位、誘発性メタロチオネインＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカーを構成する；Invitrogen）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｈｅＩとＫｐｎＩクローニング部位、ＰＳＶ-ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択可能マーカーを構成する；Invitrogen）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ，ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ，ＳｆｉＩとＢａｍＨＩクローニング部位、ＰＳＶ-ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択可能マーカーを構成する；Invitrogen）とｐＢＶＨｉｓ（ＰＳＶ-ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂により精製可能で、エンテロキナーゼにより切断されたＮ末端ペプチド）のような、エプスタインバ−ウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソーム発現を導くベクターが利用される。ＴｅｔとｒＴｅｔ（GossenとBujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 5547-51（1992）; GossenらによるScience 268: 1766-1769（1995））のような調節可能な哺乳類発現ベクターが利用される。本発明に利用される選択可能な哺乳類発現ベクターは、ｐＲｃ/ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ，ＳｂａＩとＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Invitrogen）、ｐＲｃ/ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｅＩ，ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ，ＸｂａＩクローニング部位；Ｇ４１８選択；Invitrogen）と他を含む。本発明による利用されるワクチンウイルス哺乳類発現ベクター（Kaufman（1991）上記文献参照）は、これらに限らないが、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ-とβ-ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ，ＡｆｌＩ，ＮａｒＩ，ＢｓｐＭＩＩ，ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ，ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩ，とＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ-とβ-ｇａｌ選択）とｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｏＲＩ、ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ，ＢａｍＨＩとＨｐａクローニング部位、ＴＫ又はＸＰＲＴ選択）を含む。
本発明によるイースト発現システムの例は、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ，ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ，ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ，ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，とＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Invitrogen）又は融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ（ＸｂａＩ，ＳｐｈＩ，ＳｈｏＩ，ＮｏｙＩ，ＢｓｔＸＩ，ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，とＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製されエンテロキナーゼで切断されるＮ末端ペプチド）を含み、利用される。加えて、宿主細胞菌株は挿入された配列の発現を調節する、又は望ましい特定の方法で遺伝子生成物を変種され処理するように選択される。さまざまな宿主細胞は翻訳と翻訳後のタンパク質のプロセシング及び変種（例えば、糖鎖形成、切断（例えば配列のシグナル））の特徴的な特異機能を有する。イーストにおける発現は糖結合生成物が生成する。真核細胞における発現は“固有”糖鎖形成及びＨＣＶタンパク質の折畳み（folding）の可能性を増大させる。さらに、哺乳類細胞における発現は、ウイルス粒子タンパク質の固有ＨＣＶビリオンを再組立若しくは組立てる手段を提供する。
さらに、さまざまなベクター/宿主発現システムは、タンパク質分解切断のようなプロセシング反応に、異なる程度で、影響を及ぼす。
他のＲＮＡウイルス研究に有用である多くのトランスフェクション法は、本願では利用できる。例としては、微小注射、細胞融合、lipofectinのようなカルシウム-ホスフェイトカチオンリポソーム（RiceらによるNew Biol. 1: 285-296（1989）;“HCV-based Gene Expression Vector”下記文献を参照）、ＤＥ-デキストラン（RiceらによるJ. Vriol. 61: 3809-3819（1987））とエレクトロポレーション（BredenbeekらによるJ. Virol. 67: 6439-6446（1993）; LiljestronらによるJ. Virtol. 65: 4107-4113（1991））がある。上記他の方法によるトランスフェクションに対する細胞タイプ治療抵抗性のためにスクレイプローディング（scrape loading）（KumarらによるBiochem. Mo. Biol. Int. 32: 1059-1066（1994））及びバリスティック法（Ballistic method）（BurkholderらによるJ. Ommunol. Meth. 165: 149-156（1993））もさらに検討される。ＤＮＡベクタートランスポーターが検討される（Wuらによる1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967; WuとWu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624; Hartmutらによる１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第２，０１２，３１１号）。
ＨＣＶによる生体外感染
ＨＣＶ複製を支持する細胞系統の確認。本発明の重要な態様は、本物の標準化された生体外ＨＣＶ複製システムを利用して、さまざまな治療的戦略の効力を評価する能力を比較することによる、新しくより効率的なアンチＨＣＶ治療を開発する方法を提供することである。かかる検定法はチンパンジーやＨＣＶ感染ヒト患者のような稀で価値のある実験動物を利用して試す前には、非常に貴重である。発明の背景で説明したように、せいぜい僅かな量のＨＣＶ複製が細胞培養中で観察されており、報告された多くのシステムはドラッグスクリーニング又は評価には適応できない。報告された中で最も見込みのあるシステムは、ＨＴＬＶ１感染ＭＴ-２ＣＴリンパ球サブライン（subline）であり、約１０００：１のＳＮ比を有するＨＣＶ複製を支持することが分かった（MizutaniらによるJ. Virol.,70: 7219-23（1996））。しかしながら、上記システムにおける複製は患者接種での感染により開始されていることを指摘しておく。かかるシステムは有用ではあるが、細胞向性及び複製の検出に影響を与える接種源間の差により限定されてしまう。
ＨＣＶ感染性クローン技術は、ＨＣＶ複製とパッケージングの分析用の生体外及び生体内システムを確立するために利用される。上記技術は、これらに制限されるわけではないが、（ｉ）許容細胞タイプの確認と選択（ＲＮＡ複製、ビリオン構築及び放出のため）；（ｉｉ）細胞培養パラメータ（例えば培養条件、細胞活性化を変化させる）若しくは細胞培養中でのＨＣＶ複製の効率を増加させる適合突然変異の選択；（ｉｉｉ）感染性ＨＣＶ粒子の効率生産用の条件の明確（細胞上澄へ放出する若しくは細胞破壊（cell disruption）後に得るのいずれか）を含む。上記及び本発明の他に容易に拡張したものは、ＨＣＶ治療、ワクチン、及び診断開発に幅広い有用性を有する。
許容細胞タイプを確認するための一般的手法を以下に概説する。ＲＮＡトランスフェクション（上記を参照）の最適方法は、細胞タイプにより変化し、ＲＮＡレポーター構成物を利用して決定される。上記方法は、例えばトランスフェクション条件を最適化し（ＣＡＴ；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性）、細胞タイプがＨＣＶ  ＩＲＥＳ媒介翻訳に許容かどうかを決定するのに（ＬＵＣ；ルシフェラーゼ活性）、双方で利用された５’-ＣＡＴＨＣＶ  ＩＲＥＳ-ＬＵＣ-３’構造のあるビシストロニック（bicistronic）ＲＮＡ（WangらによるJ. Virol. 67: 3338-44（1993））を含む。実際のＨＣＶ  ＲＮＡトランスフェクション実験では、５’キャップルシフェラーゼレポーターＲＮＡ（Wangらによる（1993）の上記文献）のあるコトランスフェクションは、生産的トランスフェクションと翻訳の内部標準を提供する。ＨＣＶ複製の潜在的に許容な細胞タイプの例には、これらに制限されないが、一次ヒト細胞（例えば肝細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、包皮繊維芽細胞）だけでなく連続ヒト細胞系統（例えばＨｅｐＧ２，Ｈｕｈ７，ＨＵＴ７８、ＨＰＢ-Ｍａ，ＭＴ-２、ＭＴ-２Ｃと他のＨＴＬＶ-１とＨＴＬＶ-ＩＩ感染Ｔ細胞系統、Namalawa, Daudi, EBV-トランスフォームされたＬＣＬ）がある。加えて、他の種、特にＲＮＡで容易にトランスフェクトされ、フラビウイルス若しくはペスチウイルス（例えばＳＷ-１３、ベロ、ＢＨＫ-２１、ＣＯＳ，ＰＫ-１５，ＭＢＣＫなど）に許容である細胞系統もテストされた。細胞は上記に説明した方法を用いてトランスフェクトされる。
複製検定では、ＲＮＡ転写物は機能性クローンと対応する非機能性である、例えばΔＧＤＤ（例参照）誘導体を利用して合成され、ＨＣＶ  ＲＮＡの存続のネガティブコントロールと生産的複製がない場合の抗原として利用される。テンプレートＤＮＡ（コンプリケイト（complicates）は後で分析される）はＤＮａｓｅＩ処理の繰返しサイクルと酸フェノール抽出により取除かれ、その後に続くゲル電気泳動若しくはゲル濾過のいずれかにより精製された（転写ＲＮＡの１０9分子につき増幅可能なＤＮＡの１分子以下に）。ＤＮＡフリーなＲＮＡ転写物はＬＵＣレポーターＲＮＡと混合され、上記で決定された最適条件を利用して細胞培養をトランスフェクトさせるのに利用した。細胞回収後に、ＲＮａｓｅＡが培地に添加され過剰のインプットＲＮＡが消化され、さまざまな時間インキュベートされた。早い段階で（トランスフェクト後約１日）収集され、ＬＵＣ活性と（生産的トランスフェクションを確認するために）細胞と上澄液（ベースラインとして）中でのポジティブ鎖ＲＮＡレベルを分析した。サンプルは２-３週間ごとに定期的に集められ、ＱＣ-ＲＴ/ＰＣＲ（Kolykhalovらによる（1996）の上記文献参照）によりプラス鎖ＲＮＡレベルを検定した。無傷の感染転写物と非機能性誘導体、例えばΔＧＤＤの間の明らかで再現可能な差を示す細胞タイプ、欠失、制御は、本当の複製を確認するためにもっと徹底的な分析が行われた。かかる検定法は、ＱＣ-ＲＴ/ＰＣＲ（Gunjiらによる（1994）の上記文献；LanfordらによるVirology 202: 606-14（1994））、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、若しくは代謝ラベリング（Yooらによる（1995）の上記文献）及びin situハイブリダイゼーション（ISH;GowansらによるIn“Nucleic Acid Probes”（R. H. Symons,編集）. Vol. pp.139-158. CRC Press, Boca Raton.（1989））、in situ ＰＣＲ（ISHに続いてＨＣＶ特異増幅生成物のみを検出する；HaaseらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4941-4975（1990））、と免疫組織化学によるネガティブ鎖ＨＣＶ  ＲＮＡの蓄積の測定を含む。
ウイルス-受容体相互作用の研究のためのＨＣＶ粒子。ＨＣＶ感染と複製に許容である細胞系統の確認と組合せて、感染性クローン技術を用いて生産された明確なＨＣＶストックは、細胞受容体とＨＣＶの相互作用を評価するために利用された。検定は感染しやすい細胞へのウイルスの結合若しくは生産的感染を測定するように設けられ、上記過程の阻害剤のスクリーニングに利用される。
ＨＣＶ受容体の特徴付けのための細胞系統の確認。ＲＮＡトランスフェクションにより検定されたＨＣＶ  ＲＮＡ複製に許容な細胞系統は、ウイルスにより感染される能力に対してスクリーニングされた。ＲＮＡ複製に許容であるが相同なウイルスにより感染しない細胞系統は、ＨＣＶ結合及びエントリに必要な一つ又はそれ以上の宿主受容体が欠けている。かかる細胞は、（ｉ）ＨＣＶ受容体と共受容体の機能性確認と分子クローニング；（ｉｉ）ウイルス-受容体相互作用の特徴付け；（ｉｉｉ）上記相互作用を阻害する化合物若しくは生物製剤（例えば抗体、ＳＥＬＥＸ  ＲＮＡｓ（BartelとSzostak, In“RNA-protein interaction”（K. NagaiとI. W. Mattajによる編集）、Vol. pp. 82-102. IRL Press, Oxford（1995）; GoldらによるAnnu. Rev. Biochem. 64: 763-797（1995），など）のスクリーニングするための検定法の開発のための価値ある道具を提供する。
このような方法で一旦明確になると、上記ＨＣＶ受容体は治療のターゲットとしてだけでなく、ＨＣＶに感染しやすくされた遺伝子導入された動物において発現させる働きがある（KoikeらによるDev. Biol. Stand. 78: 101-7（1993）; RenとRacaniello, J. Virol. 66: 296-304（1992））。ＨＣＶ複製とスプレッドを支持するかかる遺伝子導入動物モデルは、アンチＨＣＶ薬を評価するのに重要な応用を有する。
許容細胞系統を確認するための代わりの手法。機能性クローンから誘導された未変種ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物を利用することに加えて、上記機能性ＨＣＶクローンはＨＣＶ複製用の選択可能なマーカーを与えるように特別に設計される。例えば、優性選択可能なマーカーをコード化する遺伝子は、ＨＣＶポリタンパク質の一部として、若しくはＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの許容領域に位置する分離シストロンとして発現される。かかる特別設計された誘導体（概観のために、BredenbeekとRice, Semin. Virol. 3: 297-310（1992）を参照）は、シンドビスウイルス（Frolovらによる，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 11371-11377（1996））又はフラビウイルス（KhromykhとWestaway, J. Virol. 71: 1497-1505（1997））のような他のＲＮＡウイルス用にうまく構築された。哺乳類細胞用の選択可能なマーカーの例には、これらに限定されないが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ；メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ（ｔｋ：メトトレキセート耐性）、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ：ピューロマイシン耐性）、ネオマイシン耐性（neo:ネオマイシン若しくはＧ４１８に対する耐性）、ミコフェノール酸耐性（ｇｐｔ）、ハイグロマイシン耐性、及びゼオシン（zeocin）に対する耐性を含む。他の選択可能なマーカーは、イースト（ura3, his3, trp1）のようなさまざまな宿主に利用される。異種遺伝子の機能性発現の戦略は記述されている（概観のためにBredenbeekとRiceによる（1992）の上記文献参照）。例（図２）は、（i）細胞若しくはウイルスプロテアーゼにより媒介される選択可能なタンパク質を生じるように、切断によるウイルスポリタンパク質へのインフレーム挿入；（ii）特別設計された転写開始と停止シグナルを利用した分離シストロンの生産を含む。例は、これらに限定されないが、細胞若しくはウイルスｍＲＮＡｓから誘導された内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ要素の使用（JangらによるEnzyme 44: 292-309（1991）; MacejakとSarnow, Nature 353: 90-94（1991）; MollaらによるNature 356: 255-257（1992））を含む。特別な明示において、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ要素とネオマイシン耐性遺伝子を含むカセットをＨＣＶ  Ｈ７７３’ＮＴＲ超可変領域に挿入される。転写されたＲＮＡは、ヒト肝細胞若しくは他の細胞系統及び耐性細胞集団を選択するために利用された抗生物質Ｇ４１８をトランスフェクトさせるために利用される。この手法の一つの明示において、ｐＨＣＶＦＬ/３’ＥＭＣＶＩＲＥＳｎｅｏ（以下に示す）からの転写物は、多種多様な細胞系統をトランスフェクトさせるのに利用される。
ＨＣＶ  ｃＤＮＡの変種は、ＨＣＶ複製の間接的な指標として便利な検定可能なマーカーを発現する系統を発生させるように作られる。かかる自己複製ＲＮＡは、全体のＨＣＶゲノムＲＮＡ若しくはＲＮＡレプリコンを含み、ＲＮＡ複製に必須でない領域は削除される。検定可能な遺伝子は第二の選択可能なマーカー，又は便利な分析によりタンパク質をコード化する遺伝子を含む。例は、これらに限定されないが、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ホタル若しくはバクテリアルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦ）とそれらのヒトでの誘導体、細胞表面マーカーと分泌（secreted）マーカーを含む。かかる生成物は直接検定される、又は追加のレポーターの発現又は活性を活性化させる。
ＨＣＶ感染及び複製用の動物モデル
チンパンジーに加えて、本発明はＨＣＶ複製を研究し、新規な治療を評価するための代わりの動物モデルの開発を可能にする。出発物質として本発明に記載された本物のＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンを利用して、ＨＣＶ複製の代わりの動物モデルを確立するために、多くの手法が検討された。一つの明示において、チンパンジーのトランスフェクションにより、又は細胞培養中での複製により生産されたよく定義されたＨＣＶストックは、ＨＣＶ複製を支えることが可能なヒト組織に宿る免疫不全マウスを接種させるために利用される。本技術の例は、ＳＣＩＤ：Ｈｕマウスであり、厳しく組合された免疫不全のあるマウスは、これらに限定されないが、胎児肝臓、大人の肝臓、脾臓、又は周辺の血液単核細胞を含むさまざまなヒト（又はチンパンジー）組織と合体させる。ＳＣＩＤマウスに加えて、正常な放射マウスはヒト又はチンパンジー組織の合体のレシピエントとして働く。上記キメラ動物は接種源を含む明確なウイルスで半ビボ（ex vivo）又はインビボ（in vivo）で感染された後に、ＨＣＶ複製と置換されるであろう。
別の明示において、代わりの種にてＨＣＶ複製を可能にする適応突然変異は、上記動物における複製に対して許容である変種体を生じる。例えば、連続げっ歯類細胞系統又は一次組織（肝細胞のような）のいずれかにおける複製及びスプレッドに対する適応ＨＣＶは、小さなげっ歯類モデルにおけるウイルスの複製を可能にする、あるいは、化学若しくは生物学的（Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747（1994））方法により発生したＨＣＶ変種体の複雑なライブラリーは、潜在的に感染しやすい動物の接種用に作られ、利用される。かかる動物は、前述したように免疫適格若しくは免疫不全のいずれかである。複製可能な変種体は分離され、分子的にクローン化され、選択された非ヒト種の複製に対して機能的である完全長クローンへ適応突然変異が取込まれる。
ＨＣＶの機能活性は遺伝子導入的に（transgenically）評価される。この点に関して、遺伝子導入されたマウスモデルが利用される（WilmutらによるExperoentia 47: 905（1991）を参照）。ＨＣＶ  ＲＮＡ若しくはＤＮＡは、ウイルスベクター又はコスミッドクローン（又はファージクローン）を含む遺伝子導入ベクターを調製するために利用される。コスミッドは公開された手順（Jaenisch, Science 240: 1468-1474（1988））を利用して、遺伝子導入マウスへ導入される。遺伝子導入マウスの調製において、胚幹細胞は胚盤胞胚（blastocyst embryos）（Joyner, In Gene Targeting: A Practical Approach. The Practical Approach Series, Rickwood, D.とHames, B. D.編集IRL Press: Oxford（1993）から得られ、ＨＣＶ  ＤＮＡ若しくはＲＮＡによりトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、早期胚、例えば文献（HammerらによるにNature 315: 680（1985））に説明されたようなマウス胚へ注射される。遺伝子導入された動物の調製用のさまざまな技術が説明されている（１９９６年６月２５日に発行された米国特許第５，５３０，１７７号；１９９６年１２月３１日に発行された米国特許第５，８９８，６０４号）。特に、関心は遺伝子導入動物モデルにあり、遺伝子導入の表現及び病原効果が研究される。例えば、ラットホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ-ウシ成長ホルモン融合遺伝子の効果はブタにおいて研究された（WieghartらによるJ. Reprod. Fert., Suppl. 41: 89-96（1996））。アルツハイマー病と関連するヒトアミロイド前駆体タンパク質をコード化する遺伝子を発現する遺伝子導入マウスは、アルツハイマー病と他の疾患を研究するために利用される（１９９６年３月７日に発行された国際特許出願第ＷＯ９６/０６９２７号；QuonらによるNature 352: 239（1991））。さらに遺伝子導入されたマウスは肝炎デルタ剤（PoloらによるJ. Virol. 69: 5203（1995））とＢ型肝炎ウイルス（Chisar, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 206: 149（1996））を発生させ、上記特別設計された動物内で複製は起こる。
よって、本願で説明される機能性ｃＤＮＡまたはその部分は、ＨＣＶ複製及び病原に関連する遺伝子導入モデルを作るために利用される。一例にて、全体のＨＣＶゲノムに宿る遺伝子導入動物が作られる。本発明の遺伝子導入マウスにおける全体のＨＣＶゲノムの遺伝子導入発現の適当な構成物は、適当な５’末端、完全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列、シス-切断デルタリボザイム（Ball, J. Virol. 66: 2335-2345（1992）; PattnaikらによるCell 69: 1011-1020（1992））のある転写物を生じるように特別設計された核プロモータを含み、本物の３’末端が、続いて正しい核プロセシングを促進し細胞質（ＨＣＶ  ＲＮＡ複製が起こる場所）へ運搬させるシグナルが生じる。全体のＨＣＶゲノムに加えて、動物が特別に設計されて、ＨＣＶタンパク質とＲＮＡ要素の個々の若しくはさまざまな組合せを発現する。例えば、ＨＣＶ  ＩＲＥＳの制御下で、ＨＣＶ遺伝子生成物若しくはレポーター遺伝子を発現するように特別設計された動物は、特異ＲＮＡターゲットに対して向けられた治療を評価するのに利用される。同様の動物モデルにより、多くの周知ＨＣＶターゲットを検討される。
かかる代わりの動物モデルは、（i）全動物システムにおけるＨＣＶ複製へのさまざまな坑ウイルス剤の効果を研究するのに、（ii）基礎をなす関連する反応機構を明示し、治療に関与するための戦略を確認しテストして、肝細胞及び他の細胞タイプへのＨＣＶ遺伝子生成物の潜在的な直接細胞障害作用を調べ、（iii）ＨＣＶ病原に関連する細胞及び組織損傷の免疫媒介機構を研究し、上記過程を干渉する戦略を確認しテストすることによって有用である。
薬剤耐性変種体の選択と分析
ＨＣＶ複製を支える細胞系統及び動物モデルは、従来と新規な治療に抵抗性のあるＨＣＶ変種体の発生を調べるために利用される。全てのＲＮＡウイルスと同様に、ＨＣＶレピリカーゼは校正活性が欠けていると推定され、したがってＲＮＡ複製は誤りがちであり、高いレベルの変種が生じる（Bukhらによる（1995）上記文献）。変異性は、時間の経過にわたって感染患者において及びさまざまな分離体の間で観測されたかなりの多様性において、それ自身が明らかになる。薬剤耐性変種体の発生は、ＨＣＶモノ及び組合せ治療の設計及び評価において、重要な考察であろう。本発明のＨＣＶ複製システムは、さまざまな治療配合物下において変種体の発生を研究するために利用される。このことは、単一の治療（monotherapy）若しくはさまざまな治療の組合せ（例えばＩＦＮ−α、リバビリン、及び新しい坑ウイルス化合物）をもたらす。耐性突然変異は耐性の分子的及び構造的基礎を明確にし、新しい治療配合物、若しくは効果的なアンチＨＣＶ薬剤（以下に）のスクリーニング検定法における配合物を評価するのに利用される。
アンチＨＣＶ剤のスクリーニング
ＨＣＶ許容細胞系統又は動物モデル（好ましくは、げっ歯類モデル）は、新規な阻害剤のスクリーニングに，若しくはアンチＨＣＶ治療の候補を評価するのに利用される。かかる治療は、これらに限定されないが、（i）保存ＨＣＶ  ＤＮＡターゲットを目標とするアンチセンスオリゴヌクレオチド；（ii）ＨＣＶ複製を阻害できる注射可能な化合物；（iii）ＨＣＶ複製を阻害できる生物学的に利用可能な経口化合物を含む。かかる配合物のターゲットは、これらに制限されないが、（i）ＲＮＡ複製及びＲＮＡパッケージングによって重要な保存ＨＣＶ  ＲＮＡ要素；（ii）ＨＣＶ-コード化酵素；（iii）ＨＣＶ  ＲＮＡ複製、ウイルス集合、ウイルス放出、ウイルス受容体結合、ウイルスエントリ、及びウイルスＲＮＡ複製の開始によって重要なタンパク質-タンパク質及びタンパク質-ＲＮＡ相互作用；（iv）慢性感染を確立させるようにＨＣＶ能力を調節するウイルス-宿主相互作用；（v）肝臓発病度を調節し、アポトーシス及び肝毒性に影響を与える要因を含むウイルス-宿主相互作用；（vi）肝硬変及び肝細胞癌を含むより重症な臨床的結果の展開を導くウイルス-宿主相互作用と；（vii）他のあまり頻繁でなく、ＨＣＶと関連するヒト疾病を招くウイルス-宿主相互作用を含む。
アンチセンス及びリボザイム治療の評価。本発明はＨＣＶ複製を干渉する能力をテストされたアンチセンスヌクレオチド及びリボザイムの調製に拡張される。この手法は特異ｍＲＮＡの翻訳を、アンチセンス核酸によるマスク若しくはリボゾームによる切断のいずれかのによりブロックするためのアンチセンス核酸及びリボザイムを利用する。
アンチセンス核酸は、特異ｍＲＮＡの少なくともある部分と相補的であるＤＮＡ若しくはＲＮＡである（Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 298（1988））。細胞内において、アンチセンス核酸はｍＲＮＡとハイブリダイゼーションして二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡ若しくはＲＮＡ：ＤＮＡ分子を形成する。この二本鎖形のｍＲＮＡを翻訳しない。したがって、アンチセンス核酸はタンパク質へのｍＲＮＡの発現を干渉する。約１５のヌクレオチドのオリゴマーとＡＵＧ開始コドンとハイブリダイゼーションする分子は特に効率的である。なぜなら上記ヌクレオチドと分子は合成が容易であり器官細胞に導入されたときには、大きな分子に問題を引き起こさないからである。アンチセンス法は、生体外の多くの遺伝子の発現を阻害するのに利用される（Marcus-Sekura, 1988,上記文献; HamborらによるJ. Exp. Med. 168: 1237（1988））。合成アンチセンスヌクレオチドは、天然ホスホエステル結合よりもむしろホスホロチオレート、又はチオエステルのようなホスホエステル類似体を含むことが好ましい。かかるホスホエステル結合類似体は分解に対して抵抗性があり、安定性が増加し、したがってアンチセンス核酸の効力が増す。
遺伝アンチセンス手法において、野生型対立遺伝子の発現は、アンチセンスＲＮＡの発現にために抑制される。この技術は組織培養におけるＴＫ合成を阻害し、ショウジョウバエにおけるクラッペル（Kruppel）変異と、マウスにおけるシバラー変異の表現型を発生させるように利用される（IzantらによるCell, 36: 1007-1015（1984）; GreenらによるAnnu. Rev. Biochem., 55: 569-597（1986）; KatsukiらによるScience, 241: 593-595（1988））。この手法の重要な利点は、極僅かな遺伝子の部分が、全ｍＲＮＡの同族体の発現の効率的な抑制のために発現される必要がある。アンチセンス遺伝子導入は、正しい細胞タイプにおいて発現された自身のプロモータ若しくは他のプロモータの制御下に置かれ、ＳＶ４０ポリＡ部位の上流に配置される。
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼとある程度類似する方法で、他の一本鎖ＲＮＡ分子を特別に切断させる能力を有するＲＮＡである。リボザイムは、あるｍＲＮＡが自身のイントロンを切除する（excise）能力を有するという観察から発見された。上記ＲＮＡｓのヌクレオチド配列を変質させることにより、研究者らはＲＮＡ分子内の認識特異ヌクレオチドを配列させ、切断する分子を設計できるようになる（Cech, J. Am. Med. Assoc. 260: 3030（1988））。配列特異であるので、特定配列のあるｍＲＮＡのみが不活性化される。
研究者らは二つのタイプのリボザイム、テトラヒメラタイプと“ハンマーヘッド”タイプを確認した。テトラヒメラタイプリボザイムは、四つの塩基配列を認識するが、“ハンマーヘッド”タイプは１１から１８の塩基配列を認識する。認識配列が長くなればなるほど、ターゲットＭＲＮＡ種において専ら起こるであろう。したがって、“ハンマーヘッド”タイプリボザイムは、特異ｍＲＮＡ種を不活性化させるにはテトラヒメラタイプよりは好ましく、１８の塩基認識配列は認識配列を短くするのに好ましい。
化合物ライブラリーのアンチＨＣＶ活性に対するスクリーニング。さまざまな天然生成物若しくは合成ライブラリーは、本発明により与えられる生体外若しくは生体内モデルにおいて、アンチＨＣＶ活性に対してスクリーニングされる。コンビナトリアルライブラリーを調製する一つの手法は、主にGeysen法（GeysenらによるMolecular Immunology 23: 709-715（1986）; GeysenらによるJ. Immunologic. Method 102: 259-274（1987））の化学方法とFodorらの方法（FodorらによるScience 251: 767-773（1991））を利用する。例としてはFurkaらによるもの（14th International Congress of Biocchemistry, Volume 5 Abstract FR:013（1988）; Int. J. Peptide Protein Res. 37: 487-493（1991））、Houghtonによるもの（１９８６年１２月に発行された米国特許第４，６３１，２１１号）、Riceらによるもの（１９９１年４月２３日に発行された米国特許第５，０１０、１７５号）があり、アンチＨＣＶ活性がテストされるペプチド混合物を生じさせる方法が記載されている。
別の態様には、合成ライブラリー（NeedelsらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10700-4（1993）; OhlmeverらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926（1993）; Lamらによる国際特許出願第ＷＯ９２/００２５２号；Kocisらによる国際特許出願第ＷＯ９４２８０２８号）などが、本発明によるアンチＨＣＶ化合物のスクリーニング用に利用された。上記文献には生物学的検定法におけるライブラリースクリーニングへの適応が説明されている。
中和検定法用の明確な/特別設計されたＨＣＶウイルス粒子。本願で説明した機能性クローンは、感染力と中和検定法用のＨＣＶ-Ｈ粒子の明確なストックを生産するように利用される。均質なストックは、チンパンジーモデル、細胞培養システムにおいて、さまざまな非相同発現システムを利用して生産される（例えばバキュロウイルス、イースト、哺乳類細胞、上記参照）。前述したように、ＨＣＶ-Ｈの均質ウイルス調製に加えて、他の遺伝子型又は分離体のストックが生産される。上記のストックは細胞培養若しくは生体内分析に利用され、ＨＣＶ粒子生産又は感染性を中和することができる分子若しくは遺伝子治療の手法を明確にする。かかる分子の例には、これらに制限されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、特別設計された/最適化された特異性のある人工抗体、単鎖抗体（以下の抗体のセクション参照）、核酸若しくは特異結合及び中和用に選択された核酸誘導体、少量の生物学的に利用可能な経口化合物などがある。保存ウイルス若しくは細胞ターゲットに向けられるかかる中和剤は、遺伝子型である、若しくは分離体特異である、又は広く交差反応性があるのいずれかである。中和剤は予防的に利用される、又はウイルス負荷を減少させ、他の坑ウイルス剤（ＩＦＮ-α、リバビリン）と組合せてより効果的な治療の可能性を増加させる受身免疫治療が利用される。さらにＨＣＶ感染クローンの方向性のある（directed）操作は、糖タンパク質超可変領域における、又は抗体中和、ＣＴＬ認識、免疫エスケープ及び免疫エンハンスメントの機構を研究するためのエピトープにおける明確な変化のあるＨＣＶストックを生産するために利用される。上記研究は坑ウイルス治療の他のウイルス特異機能の確認をもたらす。
ＨＣＶ複製の解剖
他のＨＣＶ複製検定法。本発明はＨＣＶ複製の方向性のある分子遺伝子解剖を始めて可能とする。かかる分析により、（i）現在追跡されている坑ウイルスターゲットを確認すること；（ii）治療介入の影響を受けやすいＨＣＶ複製の予期せぬ新しい面を発見することが期待される。突然変異誘発研究によるターゲットの直接確認には、以下の５’ＮＴＲ、ＨＣＶポリタンパク質と切断生成物、及び３’ＮＴＲが含まれる。前述したように、感染性クローン技術と許容細胞培養を利用する分析は、感染性ＲＮＡで細胞培養をトランスフェクトさせた後の親と突然変異複製表現型を比較することに利用される。たとえＰＲ-ＰＣＲがウイルスＲＮＡ蓄積の感度のよい検出を可能にしても、条件突然変異が回復しなけれえば、ＲＮＡ複製の効率を減少させる突然変異を解析するのが難しい。第一サイクルへの補体として、トランス-相補性検定法（trans-complementation assays）は、ＨＣＶ突然変異表現型の分析と阻害剤のスクリーニングを容易にするために利用される。非相同性システム（ワクシニア、シンドビス、又は非ウイルス）は、ＨＣＶ  ＲＮＡレプリカーゼ及び/又はパッケージング機械装置の発現を駆動させるために利用される（LemmとRice, J. Virol. 67: 1905-1915（1993a）; LemmとRice, J. Virol. 67: 1916-1926（1993b）; LemmらによるＥｍｂｏJ. 13: 2925-2934（1994）; LiらによるJ. Virol. 65: 6714-6723（1991））。仮にこれらの要素がトランスに機能するならば、適当なシス要素のあるＲＮＡの共発現はＲＮＡ複製/パッケージングをもたらす。したがって、かかるシステムは本当のＲＮＡ複製とビリオン構築の段階を模倣するが、ＨＣＶ複製からのウイルス成分のアンカップル（uncouple）生産は真似ない。ＨＣＶ複製がなんとか自己制御的であるならば、非相同システムはかなり高いレベルのＲＮＡ複製若しくは粒子生産を引き起こし、突然変異表現型の解析と坑ウイルススクリーニングを容易にする。第三の手法は、ＨＣＶテンプレート依存ＲＮＡ複製の無細胞システムを考案することである。結合（coupled）翻訳/複製と構築システムは、ＨｅＬａ細胞中のポリオウイルスのために説明され（BartonとFlanegan, J. Virol. 67:822-831（1993）; MollaらによるScience 254:1647-1651（1991））、ネガティブ鎖合成開始のテンプレート依存生体外検定法はシンドビスウイルスに対して確立される。ＨＣＶ用の同様な生体外システムは、阻害剤スクリーニングと評価だけでなく、ＨＣＶ複製の多くの面を研究することにとっても価値がない。それぞれの戦略例は以下のようである。
ウイルス又は非ウイルス発現システムを利用したＨＣＶ  ＲＮＡ複製及び/又はパッケージングのトランス相補性。非相同性システムはＨＣＶ複製を駆動させるために利用される。例えば、ワクシニア/Ｔ７細胞質発現システムは、ＲＮＡウイルスレプリカーゼとパッケージング機能のトランス相補性には非常に有用である（Ball,（1992）の上記文献；LemmとRice,（1993a）の上記文献；LemmとRice,（1993b）の上記文献; Lemmらによる（1994）の上記文献；Pattnaikらによる（1992）の上記文献；PattnaikらによるVirology 206: 760-4（1995）; PorterらによるJ. Virol. 69:1548-1555（1995））。簡単には、ワクシニア組換え体（ｖＴＦ７-３）は、関心のある細胞タイプ中でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させるために利用される。Ｔ７プロモーターから下流に位置するターゲットｃＤＮＡは、ワクシニア組換え体として、又はプラスミドトランスフェクションによるのいずれかで運搬される。このシステムは高いレベルのＲＮＡとタンパク質発現を導く。ワクシニアの必要性がない（ＨＣＶ  ＲＮＡレピリカーゼ又はビリオン形成を干渉する）上記手法の変形はｐＴ７Ｔ７システムであり、Ｔ７プロモーターはＴ７ＲＮＡｐｏｌの発現を引き起こさせる（ChenらによるNucleic Acids Res. 22: 2114-2120（1994））。ｐＴ７Ｔ７はＴ７ＲＮＡｐｏｌ（タンパク質）と混合し、関心のあるＴ７駆動ターゲットプラスミドとコトランスフェクトされた。添加されたＴ７ＲＮＡｐｏｌは転写を開始し、自身の生産と高いレベルのターゲット遺伝子の発現を導く。いずれかの手法を用いて、正確な５’及び３’末端を有するＲＮＡ転写物は、Ｔ７転写開始部位（５’）とシス切断ＨＣＶリボザイム（Ｒｚ）（３’）を利用して生産される（Ball,（1992）の上記文献；Pattnaikらによる（1992）の上記文献）。
上記又は同様な発現システムは、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製と粒子形成と上記過程を阻害する化合物の評価の検定法を確立するために利用される。ＨＣＶ機能性クローン技術の別の拡張において、Ｔ７駆動タンパク質発現構成物と３’ＮＴＲに続くＨＣＶリボザイムを取込んだ完全長ＨＣＶクローンが利用される。検定を確認する典型的な実験プランは、ｐＴ７Ｔ７で説明されるが、本質的に同様な検定はｖＴＦ７-３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞系統を用いて検討される。ＨＣＶ許容細胞はｐＴ７Ｔ７+Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ+ｐ９０/ＨＣＶＦＬ長いｐＵＲｚ（又はΔＧＤＤのようなネガティブコントロール）でコトランスフェクトされる。トランスフェクション後のさまざまな時間で、ｐＴ７Ｔ７システムにより駆動されたＨＣＶタンパク質とＲＮＡの蓄積は、それぞれウエスタン及びノーザンブロッティングにより追跡される。ＨＣＶ特異レピリカーゼ機能を検定するためには、Ａｃｔ．ＤがＤＮＡ依存Ｔ７転写をブロックするため（LemmとRiceによる（1993a）の上記文献）に添加され、Ａｃｔ．Ｄ耐性ＲＮＡ合成は代謝ラベリングにより監視される。放射能がｐ９０/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ/Ｒｚの完全長ＨＣＶ  ＲＮＡに取込まれるが、ｐ９０/ＨＣＶＦＬΔＧＤＤ/Ｒｚには取込まれない。この検定システム又は精巧な誘導体は、阻害剤をスクリーニングさせるためにと、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製への効果を研究するために利用される。
ＨＣＶ複製とその阻害剤を検定するための無細胞システム。ＨＣＶ  ＲＮＡ複製と阻害剤のスクリーニングを研究するための無細胞検定は、本発明に説明された機能性ｃＤＮＡクローンを利用してさらに確立される。ビリオン若しくは転写ＲＮＡのいずれかが、基質ＲＮＡとして利用される。ＨＣＶによっては、生体外でトランスフェクトされた完全長ＨＣＶ  ＲＮＡは、ポリオウイルスで説明された生体外システム及び検定された複製を計画するように利用される（Bartonらによる（1995）の上記文献参照）。ＨＣＶ  ＲＮＡ複製には肝細胞特異性又は他の要因が必要であり、システムは肝細胞又は他の細胞抽出物が補充され、あるいは比較可能なシステムは、ＨＣＶ複製許容であると分かった細胞系統を利用して確立される。
上記手法の一つの心配事は、正しい無細胞合成とＨＣＶポリタンパク質のプロセシングが発生しなければならないことである。正しくプロセシングされたレピリカーゼ成分の十分な量が生じることは難しい。この問題を克服するために、Ｔ７発現システムが適当な細胞中で高いレベルのＨＣＶレプリカーゼ成分を発現させるために利用される（Lemmらによる（1997）の上記文献参照）。（緩衝液、Ｍｇ2+、ＡＴＰ再生システムとＮＴＲを添加した）上記細胞からのＰ１５膜フラクションは、ＨＣＶ特異テンプレートＲＮＡを添加したときに、完全長ネガティブ鎖ＲＮＡを開始し合成されるべきである。
上記検定法のいずれか若しくは双方とも確立することにより、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製におけるさまざまな段階での複製と阻害剤が関係するＨＣＶ突然変異の効果、宿主要因の速く正確な分析を可能にする。さらに上記システムは、複製欠損ＨＣＶベクターを調製するヘルパーシステムの条件を確立する。
予防接種と防御免疫
効果的なＨＣＶワクチンの開発に悪影響を与える多くの未知のパラメータがいまだに存在する。幾つかの個体は感染を克服することが、ヒト及びチンパンジーの双方で明らかである。さらに１０-２０％のＩＦＮで処理した個体はＨＣＶ  ＲＮＡの循環が行われないことの証明として、持続的応答を示すらしい。他の研究から、相同なタイプで再感染されるだけでなく、関連するＨＣＶタイプよりもかなり離れているタイプでも感染することで証明されるように、防御免疫の欠如を示す（Farciらによる（1992）の上記文献; Princeらによる（1992）の上記文献）。にもかかわらず、Ｅ１Ｅ２オリゴマーと上記タンパク質を発現するワクシニア組換え体から成るサブユニットワクチンで免疫されたチンパンジーは、低投与対抗量（challenge）に対して部分的に保護される（ChooらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1294（1994））。本発明で説明される感染性クローン技術は、ＨＶＣに対する防御免疫応答の性質の理解を目的とする基礎研究としてだけでなく、新規なワクチン生産方法にとっても有用である。
ＨＣＶに対する活性免疫は、弱毒化された又は不活性化されたＨＣＶビリオン、又はＨＣＶウイルス粒子タンパク質の免疫原性量で、好ましくは免疫的に効果的なアジュバントで免疫化（予防接種）されることにより誘発される。“免疫的に効果的なアジュバント”は免疫応答を促進させる物質である。
アジュバントの選択はワクチン予防接種される被験者に依存する。好ましくは、薬学的に許容なアジュバントが利用される。例えば、ヒト用のワクチンは完全及び不完全なフロイントアジュバントを含むオイル若しくは炭化水素エマルジョンアジュバントは避けるべきである。ヒトへの使用に適するアジュバントの一例には、みょうばん（alum、アルミナゲル）がある。しかしながら、動物へのワクチンには、ヒトの使用に適さないアジュバントを含む。
抗原とアジュバントから成る伝統的ワクチンの代わりのものには、被験者組織の細胞による抗原の発現のために、抗原をコード化するＤＮＡ若しくはＲＮＡの被験者への生体内での直接導入を含む。かかるワクチンは、本願では“ＤＮＡワクチン”、“遺伝子ワクチン”若しくは“核酸に基づくワクチン”と呼ぶ。ＤＮＡベクター若しくはベクタートランスポーターのような前述したトランスフェクションの方法は、ＤＮＡワクチンに利用される。
ＤＮＡワクチンは国際特許出願第ＷＯ９５/２０６６０号と、国際特許出願第ＷＯ９３/１９１８３号に説明されており、上記文献の開示内容は全体の引用文献に含まれる。防御免疫応答を顕在化させるようにウイルスタンパク質又はゲノムをコード化する、直接注射されたＤＮＡの能力は、数多くの実験システムにおいて説明されてきた（ConryらによるCancer Res., 54: 1164-1168（1994）; CoxらによるVirol, 67: 5664-5667（1993）; DavisらによるHum. Mole. Genet., 2: 1847-1851（1993）; SedegahらによるProc. Natl. Acad. Sci., 91: 9866-9870（1994）; MontgomeryらによるDNA Cell Bio., 12: 777-783（1993）; UlmerらによるScience, 259: 1745-1749（1993）; WangらによるProc. Natl. Acad. Sci., 90:4156-4160（1993）; XiangらによるVirology, 199: 132-140（1994））。インフルエンザウイルスの中和におけるこの戦略へアクセスするための研究は、抗体の生産を誘発するようにエンベロープ及び内部ウイルスタンパク質の双方を利用するが、特にウイルス赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）に集中していた（FynanらによるDNA Cell. Biol., 12: 785-789（1993A）; FynanらによるProc. Natl. Acad. Sci., 90: 11478-11482（1993B）; RobinsonらによるVaccine, 11: 957（1993）; WebsterらによるVaccine, 12: 1495-1498（1994））。
防御免疫応答を顕在化させるようにタンパク質をコード化するＤＨＮＡ若しくはＲＮＡを直接注射する予防接種は、細胞媒介及び体液性応答の双方を生じさせる。このことは肝臓ウイルスで得られた結果と類似する（RazらによるProc. Natl. Acad. Sci., 91: 9519-9523（1994）; Ulmer, 1993の上記文献；Wang, 1993の上記文献；Xiang, 1994の上記文献）。ケナガイタチでの研究により、インフルエンザの保存内部ウイルスタンパク質に対するＤＮＡワクチンは、表面糖タンパク質と協力して、不活性化された又はサブビリオンワクチンよりインフルエンザの変種体に対してより効果的である（DonnellyらによるNat. Medicine, 6: 583-587（1995））。実際には、ヌクレオタンパク質をコード化するＤＮＡへの再現可能な免疫応答は、動物の寿命を本質的に持続させるには必要であることが、マウスにおいて報告されている（YankauchasらによるDNA Cell Biol.,12: 771-776（1993））。
本発明のワクチンは、これらに限定されないが、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内（例えば肝動脈）などを含む非経口ルートを経由して投与される。好ましくは予防接種の所望結果は、直接投与若しくはウイルスベクターのターゲティング又は選択、間接的にリンパ系細胞へ、例えばリンパ節や脾臓でのＨＣＶの免疫応答を説明する。免疫細胞は連続して複製されるので、免疫細胞はレトロウイルスに基づく核酸ワクチンの理想的目標である。なぜならレトロウイルスは複製細胞を必要とするからである。
受動免疫は、坑血清を投与する、ポリクローナル抗体を中和する、若しくは患者へのＨＣＶに対するモノクローナル抗体を中和することにより、ＨＣＶによる感染を患っていると疑われる動物検体へ与えられる。受動免疫は長期間の保護を与えないが、予防接種されていない被験者の急性感染の治療には価値ある手段である。受動免疫治療に投与された抗体は、自己由来の抗体であることが好ましい。例えば、被験者がヒトならば、抗体はヒト器官である、若しくは抗体に対する免疫応答の可能性を最小にするように“ヒト化”されていることが好ましい。加えて、抗体の中和をコード化する遺伝子は生体内、例えば肝細胞で発現のベクターに導入される。
受動免疫治療用の抗体。前述のように調製されたＨＣＶビリオン若しくはビリオン粒子は、ＨＣＶを認識する抗体を発生させる免疫原として利用される。かかる抗体は、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖（single chain）、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーを含む。本技術分野で知られているさまざまな手順は、ＨＣＶへのポリクローナル抗体の生産に利用される。抗体に生産にとっては、さまざまな宿主動物は、例えば以下に説明されるように、これらに限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むＨＣＶビリオン又はポリタンパク質で注射されて免疫される。さなざまなアジュバントは、これらに限定されないが、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾシチレンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペット、ヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）やコリネバクテリウムパルブムのような潜在的にヒトに有用なアジュバントを含む宿主種に依存して、免疫応答を促進させる。
前述したようにＨＣＶに向かうモノクローナル抗体の調製には、培地における連続細胞系統による抗体分子の生産をもたらす技術が利用される。上記のことは、これらに限定されないが、KohlerとMilsteinにより独自に開発されたハイブリドーマ技術（Nature 256: 495-497（1975））だけでなくトリオマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（KozborらによるImmunology Today 4: 72（1983）; CoteらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030（1983））とヒトモノクローナル抗体を発生させるためのＥＢＶ-ハイブリドーマ技術（Coleらによるin Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96（1985））を含む。本発明のさらなる実施例において、モノクローナル抗体は無菌動物においても生産される（１９８９年１２月２８に発行された国際特許出願第ＷＯ８９/１２６９０号）。実際に、本発明によれば、適当な生物活性のあるヒト抗体分子からの遺伝子と共に、ＨＣＶ特異マウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる“キメラ抗体”（MorrisonらによるJ. Bacteriol. 159 : 870（1984）; NeubergerらによるNature 312: 604-608（194）; TakedaらによるNasture 314: 452-454（1985））の生産用に開発された技術が利用できる。かかる抗体は本発明の範囲内である。ヒト又はヒト化された抗体は特にアレルギー応答において、外因性抗体よりはあまり免疫応答を誘発しないので、かかるヒト又はヒト化されたキメラ抗体は、ヒト疾病及び疾患の治療（以下に説明）において好ましく利用される。
本発明によれば、単鎖抗体（Hustonへの米国特許第５、４７６、７８６号と第５、１３２、４０５号；米国特許第４、９４６、７７８号）の生産に説明された技術は、ＨＣＶ特異単鎖抗体を生産するように適応される。本発明の追加の実施例は、所望の特異性でモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な確認を可能にするＦａｂ発現ライブラリーの構築用に説明された技術を利用する（HuseらによるScience 246: 1275-1281（1989））。
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、周知の技術で発生される。例えば、かかるフラグメントは、これらに限定されないが、抗体分子のペプシン消化により生じるＦ（ａｂ’）2フラグメント；Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィドブリッジを還元させることにより発生するＦａｂ’フラグメント；抗体分子をパパインと還元剤で処理することにより発生するＦａｂフラグメントを含む。
サブユニット予防接種のためのＨＣＶ粒子。機能性ＨＣＶ-ＨｃＤＮＡクローンと同様に構築され確認された他の遺伝子型のクローンは、予防接種用のＨＣＶ様（like）粒子を生産するために利用される。正しい糖鎖形成、折畳み、及びＨＣＶ粒子の構築は、適当な抗原及び防御サブユニットワクチンを発生させるためには重要である。幾つかの方法が粒子生産に利用される。上記方法には、ＨＣＶ様粒子（バクテリア、イースト、哺乳類細胞を用いて）の誘発性又は構成性発現のための安定な細胞系統のエンジニアリング、若しくは組換えバキュロウイルス、ワクシニアウイルス（Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11341-11348（1996））又はアルファウイルス（Frolovらによる（1996）の上記文献）のような高いレベルの真核異種発現システムの使用を含む。免疫化用のＨＣＶ粒子は局在化に依存して、培地若しくは破壊（disrupted）細胞のいずれかから精製される。かかる精製ＨＣＶ粒子又はＨＣＶ遺伝子型のスペクトルを表わす粒子の混合物は、免疫抗原性を高めるためにさまざまなアジュバントと共に若しくはなしで注射される。
感染性非複製ＨＣＶ粒子。別の明示において、受容体結合、エントリとゲノムＲＮＡの翻訳が可能なＨＣＶ粒子が生産される。かかる粒子の異種発現手法は、これらに制限されないが、Ｅ  ｃｏｌｉ、イースト、又は哺乳動物細胞系統、感染された若しくは組換えバキュロウイルスに宿る適当な宿主細胞、組換えワクシニナ、組換えアルファウイルス又はＲＮＡレプリコン、若しくは組換えアデノウイルス、適当なＨＣＶ  ＲＮＡ及びタンパク質を発現するように特別設計されたものを含む。一例において、二つの組換えバキュロウイルスが特別設計される。あるバキュロウイルスは、ＨＣＶ粒子の構築に必要とされるＨＣＶ構造タンパク質（例えばＣ-Ｅ１-Ｅ２-ｐ７）を発現する。第二の組換え体は、ΔＧＤＤのような欠失がＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＤＰＲを不活性化させるように含まれている以外は、正確な５’と３’末端のある全ＨＣＶゲノムＲＮＡを発現する。さらに生産的ＨＣＶ複製を破壊する他の突然変異は、代わりに若しくは組合せて利用させる。二つの組換え体との適当な宿主細胞の共感染（Ｓｆ９，Ｓｆ２１など）は、高いレベルのＨＣＶ構造タンパク質とＨＣＶ様粒子へのパッケージングのためのゲノムＲＮＡが発生する。かかる粒子は高いレベルで発生し、精製され、予防接種に利用される。ワクシニアへ一旦導入されると、かかる粒子は正常な受容体結合とＨＣＶ感染しやすい細胞の感染を示す。エントリが起こり、ゲノムＲＮＡは翻訳されて、ゲノムの更なる複製が不活性化された５Ｂポリメラーゼで完全にブロックされる以外は、全ての正常なＨＣＶ抗原が発生する。かかる粒子は、構造及び非構造ＨＣＶタンパク質抗原に対する効果的なＣＴＬ応答を顕在化させることが期待される。この予防接種戦略のみが、若しくは好ましくは前述したサブユニット戦略と共に、中和抗体とウイルスをクリアにさせるのを助けるＣＴＬ応答の双方の高いレベルを顕在化させるのに利用される。多種多様なＨＣＶゲノム配列が、広い交差反応性及び防御免疫応答を確実にするために利用される。加えて、遺伝子工学，又は生体外での誘導化のいずれかによるＨＣＶ粒子の変種は、防御及び長く持続する免疫応答を顕在化させるときに、最も効果的に感染を細胞へターゲットさせるために利用される。
弱毒化ＨＣＶ誘導体。ＨＣＶゲノムＲＮＡ配列を操作し、それによって変質病原性を有する突然変異体が発生する能力は、予防接種に適当な弱毒化されたＨＣＶ突然変異体を構築するための手段を提供する。かかるワクチン候補は防御抗原を発現するが、その能力を損なうと、病気を発症させ、慢性感染を確立させ、自己免疫応答を誘発し、細胞をトランスフォームさせる。当然、本発明の感染性ＨＣＶウイルスは弱毒化され、不活性化され、化学的又は熱処理により死滅される。
ＨＣＶに基づく遺伝子発現ベクター
ヒトの慢性肝臓感染を導くＨＣＶの幾つかの同じ性質は、細胞培養システム、遺伝子予防接種、及び遺伝子治療における遺伝子発現ベクターを設計するのにかなり有用である。本願で説明した機能性クローンは、異種遺伝子生成物（ＲＮＡｓとタンパク質）の発現のために設計されたキメラＲＮＡを生産するように特別設計される。戦略は上記及び他の文献（BredenbeekとRice,（1992）の上記文献; Frolovらによる（1996）の上記文献）に説明され、これらに限定されないが、（i）ＨＣＶポリタンパク質のある異種暗号づけ配列のインフレーム融合；（ii）ＨＣＶゲノムＲＮＡにおける追加のシストロンの生成と；（iii）一つ又はそれ以上の異種遺伝子（図２）を発現可能なマルチシストロン自己複製ＨＣＶベクターＲＮＡを発生させるためのＵＲＥＳ要素の封入を含む。かかるベクターに利用される機能性ＨＣＶ  ＲＮＡバックボーンは、これらに限定されないが、（i）複製及びスプレッド可能な弱毒化誘導体；（ii）ウイルススプレッドに必要な一つ又はそれ以上のウイルス成分（例えば構造タンパク質）を欠いているＲＮＡ複製能のある“デッドエンド（dead end）”誘導体；（iii）高い及び低いレベルのＨＣＶ特異ＲＮＡ合成と蓄積が可能な突然変異誘導体；（iv）さまざまなヒト細胞タイプでの複製に適応された突然変異誘導体；（v）ヒト細胞中での長い非細胞変性複製が可能な特別設計された若しくは選択された突然変異誘導体を含む。ＲＮＡ複製能はあるがパッケージング又はスプレッド能はないベクターは、裸のＲＮＡ，ＤＮＡ若しくはパッケージＲＮＡ、ＤＮＡとしていずれかがウイルス様粒子へ導入される。かかるウイルス様粒子は前述されたように生産され、未変種若しくは肝細胞若しくは他のヒト細胞タイプのターゲット感染のために設計された変種ＨＣＶビリオン成分から成る。あるいは、ＨＣＶ  ＲＮＡベクターは異種ウイルスパッケージング機械装置を用いて包膜され運ばれる、又は効率的な遺伝子運搬用に変形されたリポソームへカルセル化される。上記パッケージング戦略とその変形は、ＨＣＶベクターＲＮＡを特異細胞タイプへ効率よく狙わせことに利用される。前述の方法を利用して、他の種において複製及び発現能のある同様なＨＣＶ誘導ベクターシステムが導かれる。
例えば上記に示したように、細胞とＤＮＡワクチンのトランスフェクションと関連したさまざまな方法は、本発明のＨＣＶベクターを導入させるために利用される。主に関心があるのは、機能性ＨＣＶ  ＲＮＡ又はビリオンを、例えば肝臓に直接注入することである。ターゲット遺伝子運搬は、１９９５年１０月に発行された国際特許出願第ＷＯ９５/２８４９４号に記述されている。あるいは、ベクターはリポフェクションにより生体内に導入される。過去１０年間の間に、生体外で核酸のカルセル化及びトランスフェクション用のリポソームの使用は増加している。トランスフェクションを媒介させるリポソームと遭遇する困難さと危険を制限するために設計させた合成カチオン脂質は、マーカーをコード化する遺伝子の生体内トランスフェクション用のリポソームを調製するために利用される（FelgnerらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417（1987）; MackeyらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-8031（1988）参照; UlmerらによるScience 259: 1745-1748（1993））。カチオン脂質の使用は負の電荷を帯びた核酸のカルセル化を促進し、さらに負に電荷を帯びた細胞膜との融合をも促進する（FelgerとRingold, Science 337: 387-388（1989））。外因性遺伝子を生体内で特定器官へ導入させるためにリポフェクションを使用することは、実用的には利点がある。特定細胞へリポソームを分子的に狙うことは、その方法の恩恵の一面である。特定細胞タイプへトランスフェクションを向かわせることは、膵臓、肝臓、腎臓及び脳のような細胞不均一性のある組織においては、特に利点がある。脂質はターゲティングのために他の分子と化学的に結合する（Mackeyらによる上記文献参照）。標的ペプチド、例えばホルモン或いは神経伝達物質、及び抗体のようなタンパク質又は非タンパク質は、リポソームと化学的に結合する。さらにレポーター媒介ＤＮＡ運搬手法も利用される（CurieらによるHum. Gene. Ther. 3: 147-154（1992）; WuとWu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432（1987））。
遺伝子治療の応用例は、これらに限定されないが、（i）生来の又は後天性代謝欠陥を正すために酵素又は他の分子の発現；（ii）創傷治癒を促進させるための分子の発現；（iii）ヒト癌の免疫媒介後退若しくは排除を促進させるための免疫調節分子の発現；（iv）腫瘍における細胞毒を活性化させることができる毒性分子又は酵素の標的発現；（ｖ）病原感染細胞における坑ウイルス若しくは坑微生物剤の標的発現を含む。さまざまな治療異種遺伝子は本発明の遺伝子治療に組込まれ、以下に限定されないが、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を治療するためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）；腫瘍浸潤（ＴＩＬ）Ｔ細胞へのマーカー遺伝子又はリンフォカイン遺伝子（KasisらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 473（1990）; Culverらによる同様雑誌．88:3155（1991））；血友病を治療するためのFactor VIIIとFactor IXのような凝固因子用の遺伝子（DwarkiらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1023-1027（19950）; Thompson, Thromb and Haemostatis, 66: 119-122（1991））があり、以下に限定されないが、β-グロビン、ジストロフィン、インシュリン、エリスロポエチン、成長ホルモン、グルコセレブロシド、β-グルクロニダーゼ、α-アンチトリプシン、フェニルアラニン、ヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アポリポタンパク質などのようなさまざまな他の既知治療遺伝子がある。一般にはAndersonらへの米国特許第５、３９９、３４６号を参照。
遺伝的予防接種（ＨＣＶ以外の病原からの保護）の応用例には、これらには限定されないが、バクテリア（例えばプラスモジウム、リーシュマニア、トキソプラマ）、カビ（例えばカンジダ、ヒストプラズマ）、とウイルスヒト病原（例えばＨＩＶ，ＨＳＶ，ＣＭＶ，インフルエンザ）からの防御抗原の発現を含む。ＨＣＶ-誘導ＲＮＡ発現ベクターを利用して発現された防御抗原の免疫原性は、所望のＴｈ１対Ｔｈ２応答の展開を容易にするサイトカイン（例えばＩＬ-２、ＧＭ-ＣＳＦ）のような免疫調節分子の共発現を含み、アジュバントを利用して増大される。かかるアジュバントは、ＨＣＶベクター自身による取込みと共発現されるか、又は他の方法を用いて上記ベクターと組合せて投与される。
感染性ＨＣＶの診断方法
診断細胞系統。本願で説明する本発明は、患者サンプル内の感染性ＨＣＶの感度良好な診断のための細胞系統を引き出すためにも利用される。概念としては、機能性ＨＣＶ成分は感染しやすい細胞系統をテストし、発生させるために利用され、容易に検定されたレポーターシステムはＨＣＶ感染により選択的に活性化される。これらに制限されないが、例には、（i）導入遺伝子として取込まれ、複製がアップレギュレートされる又はＨＣＶ感染により誘発される、レピリカーゼ成分を欠いた欠損ＨＣＶ  ＲＮＡｓ；（ii）ＨＣＶ感染により活性化される敏感な異種増幅可能なレポーターシステムがある。第一の明示では、ＨＣＶ  ＲＮＡ増幅に必要なシスＲＮＡシグナルは、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β-ガラクトシダーゼ、又は選択可能なマーカー（上記説明）のような便利なレポーター遺伝子に接する。かかるキメラＲＮＡの発現は、適当な核プロモーターと適切な核プロセシングに必要な要素と細胞質への運搬により駆動される。ＨＣＶで特別設計された細胞系統が感染すると、導入遺伝子の細胞質複製と増幅が誘発され、生産的ＨＣＶ感染の指標として、高いレベルのレポーター発現が引き起こされる。
第二の例において、細胞系統はよりしっかりと制御されるが、ＨＣＶ感染の際にかなり誘発可能なレポーター遺伝子の増幅及び発現がされるように設計される。この増幅システムは特異成分に関係して説明されるが、他の等価な成分も利用される。一つのかかるシステムにおいて、図３に図解されるように、特別設計されたアルファウイルスレプリコン導入遺伝子は、アルファウイルスｎｓＰ４ポリメラーゼがなく生産され、アルファウイルスＲＮＡ増幅に絶対必要とされる酵素は、通常非構造タンパク質からの切断により生じる。この欠損アルファウイルスレプリコンの他の特徴は、サブゲノニックＲＮＡプロモーターを含み、ルシフェラーゼ若しくはＧＦＰレポーター遺伝子の発現を駆動させる。このプロモーター要素は、生産的細胞質アルファウイルスレプリコンがない場合に静止状態である。細胞系統は、ＨＣＶ  ＮＳ４Ａタンパク質とアルファウイルスｎｓＰ４  ＲＤＲＰから成る遺伝子融合の発現用の第二の導入遺伝子を含む。この融合遺伝子は発現され、細胞質膜区画に向かうが、ｎｓＰ４活性には正確なＮ末端のある孤立ｎｓＰ４タンパク質は必要であるので、ｎｓＰ４の形はアルファウイルス複製複合体の機能成分としては不活性である（LemmらによるEMBO J. 13: 2925（1994））。任意の第三の導入遺伝子は、複製用のシスシグナル、ユビキチン-ｎｓＰ４融合をコード化するサブゲノミックＲＮＡの転写と、アルファウイルスパッケージングシグナルのある欠損アルファウイルスＲＮＡを発現する。ＨＣＶによるかかる細胞系統の感染により、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテイナーゼが生成し、ＮＳ４Ａ-ｎｓＰ４融合タンパク質のトランス切断を媒介し、ｎｓＰ４ポリメラーゼを活性化させる。この活性ポリメラーゼはトランスに機能し、少量で効果的であり、欠損アルファウイルスレプリコンだけでなくユビキチン-ｎｓＰ４をコード化する欠損アルファウイルスＲＮＡの増幅を導く機能性アルファウイルス複製複合体を形成する。サブゲノミックＲＮＡから発現されたユビキチン-ｎｓＰ４は、細胞ユビキチンカルビキシ末端ヒドロラーゼにより効率よく切断され、追加のｎｓＰ４が生じるが、この場合酵素は限られる。一旦活性化されると、このシステムは非常に高レベルのレポータータンパク質を生じる。かかるＨＣＶ感染力検定の時間スケールはちょうど時間の単位が必要である（十分なレポーター遺伝子発現のためには）。
抗体診断薬。本願で説明した細胞系統に加えて、細胞系統をトランスフェクトされ若しくは感染され、又感染動物から分離されて発生したＨＣＶウイルス粒子（ビリオン）は、抗原として、患者血液若しくは血液生成物におけるアンチＨＣＶ抗体を検出するために利用される。ＨＣＶウイルス粒子は本物のＨＣＶゲノムから誘導されるので、粒子は天然ＨＣＶウイルスに非常に近い類似性又は同じ構造的特性を有するようである。上記反応剤は、患者が血清変換、つまりＨＣＶ特異抗体の集団発生を検出することにより、ＨＣＶに感染することを確立するために利用される。
あるいは、本願で説明したように調製された本物のＨＣＶ生成物を与える抗体は、被験者からの生物学的サンプルにおけるＨＣＶの存在を検出するために利用される。
発明の典型として提供される、以下の非限定例を参照して、本発明はより理解される。
例
以下の例は実験の背景、最初に感染性ＨＣＶ  ＲＮＡをコード化するＨＣＶ  ＤＮＡを調整することにうまくいかなかった試みや、最終的には機能性クローンの発生について報告する。
例１．ＨＣＶ-Ｈゲノム構造及び発現の分析
ＨＣＶ-Ｈ菌株、ｃＤＮＡクローニング、配列分析と殆ど完全長のｃＤＮＡクローンの構築の原理。ＨＣＶ-Ｈ菌株はPrucellとその同僚らによりチンパンジーにおいて広範囲にわたり特徴付けられ（Shimizuらによる（1990）の上記文献）、ごく最近ではShimizuとその共同研究者により生体外（Hijikataらによる（1993）の上記文献; ShimizuらによるJ. Virol. 68: 1494-1500（1994）; ShimizuらによるProc. Natl. Acad. Aci. USA 89: 5477-5481（1992）; ShimizuらによるProc. NAtl. Acad. Sci. USA 90, 6037-6041（1993））で研究されているので、最初の研究用に選択された。ＨＣＶ-Ｈは輸血後のＮＡＮＢ肝炎のアメリカ人からの遺伝子型１ａヒト分離体である（FeinstoneらによるJ. Infect. Dis. 144: 588-598（1981））。
ＨＣＶ-Ｈの最初のｃＤＮＡクローニングと配列分析。オリジナルのＨＣＶ-Ｈ７７分離体はチンパンジーに２回継代接種（passage）させ、高い血清ＡＬＴレベルと急性肝炎を発生させた。第二のチンパンジー継代接種からの肝臓組織は、ｃＤＮＡ合成と入れ子（nested）ＰＣＲ増幅に適する粗ＲＮＡの調製に利用した。ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡはプラスミド発現ベクターへクローン化され、幾つかの独立したクローンは分離され、配列分析、発現研究及び再構築させる長いｃＤＮＡクローンに利用された。部分配列データと制限酵素マッピングを利用して、ｐＴＥＴ/Ｔ７ＨＣＶＦＬＣＭＲと呼ばれる殆ど全体のＨＣＶ-ＨｃＤＮＡを含むクローンが集められ配列決定された（Daemerらによる未発表結果；GrakouiらによるJ. Virol. 67: 1385-1395（1993c））。このプラスミドに含まれるＨＣＶ配列はその後ＨＣＶ-Ｈ  ＣＭＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）と呼ばれる。このクローンの配列は同一直線状であり、Inachauspeらにより（InachauspeらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10292-10296（1991））発表されたチンパンジー継代接種されたＨＣＶ-Ｈ７７配列に９８．５％相同であり、Ogataらにより（Ogataらによる（1991）の上記文献）発表された部分ＨＣＶ-Ｈ９０配列にかなりの類似性を示す。
プロトタイプＨＣＶ-Ｈクローンの特徴。ＨＣＶ-Ｈ  ｃＤＮＡクローンと免疫試薬は、無細胞翻訳と細胞培養一過性発現検定に利用され、ＨＣＶ-Ｈ遺伝子発現のかなり詳細な絵を提供する。一般的には、上記結果は異なるＨＣＶ遺伝子型の他の結果と同様である。この研究は、（i）ＨＣＶ-Ｈポリタンパク質切断生成物の確認とマッピング（Grakouliらによる（1993c）の上記文献；Linらによる（1994a）の上記文献）；（ii）タンパク質分解プロセシング部位の決定（GrakouliらによるJ. Virol. 67: 2832-2843（1993a）; GrakouliらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10583-l0587（1993b）; Linらによる（1994a）の上記文献）；（iii）ＮＳ２-３オートプロテイナーゼ（Grakouliらによる（1993b）の上記文献; ReedらによるJ. Virol. 69: 4127-4136（1995））、ＮＳ３-４Ａセリンプロテイナーゼ（Grakouliらによる（1993a）の上記文献; LinらによるJ. Virol. 68: 8147-8157（1994b）; LinとRice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7622-7626（1995）; LinらによるJ. Virol. 69: 4373-4380（1995））とそれらの切断条件（KolykhalovらによるJ. Virol. 68: 7525-7533（1994）; Reedらによる（1995）の上記文献）の決定；（iv）ＮＳ４Ａセリンプロテイナーゼ共同因子とＮＳ３との関連の研究（Linらによる（1994b）の上記文献; LinとRice（1995）の上記文献; Linらによる（1995）の上記文献）と（v）折畳みとカルネキシン、オリゴマー形成及びサブセルラーローカリゼーション（subcellular localization）との関連を含むＨＣＶ糖タンパク質生合成の調査（Dubuissonらによる（1994）の上記文献; DubuissonとRice,（1996）の上記文献）を含んでいた。他の生物学的に重要な活性の検定法は、部分的に精製されたＮＳ３（Suzichらによる（1993）の上記文献）と関連するＲＮＡ刺激ＮＴＰａｓｅとＲＮＡヘリカーゼ活性とＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を含むプロトタイプＨＣＶ-ＨｃＤＮＡクローンを用いて開発された。さらにクローン化されたｃＤＮＡから発現された抗原は、慢性ＨＣＶ感染の患者からの血清（Grakouliらによる（1993c）の上記文献参照）と細胞毒性Ｔリンパ球（BattegayらによるJ. Virol. 69: 2462-2470（1995）; KozielらによるJ. Clin. Invest. 96: 2311-21（1995））により認識される。
本発明にとっては、ＨＣＶポリタンパク質プロセシングの研究により、機能性ＩＲＥＳ要素、無傷ＯＲＦ、適切な膜トポロジーと全ての１０のポリタンパク質切断生成物により証明された活性ウイルスプロテイナーゼの予めスクリーニングするための候補の完全長クローンの手段を提供した。
例２．ｃＤＮＡからの機能性ＨＣＶの回収の第一の試み
プラスミド構築。高特異感染力のある潜在的に感染性のあるＨＣＶ  ＲＮＡ転写物（AhlquistらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7066-7070（1984）; RiceらによるNew Biol. 1: 285-296（1989）; Riceらによる（1987）の上記文献とその引用文献を参照）の生産の好ましい戦略は、ランオフＲＮＡ転写物（図４）の生産のＨＣＶ３’末端に続く制限部位のあるバクテリオファージプロモーター（ＳＰ６又はＴ７）からの候補の完全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡ直後の下流のクローニングと関係していた。Ｔ７若しくはＳＰ６転写システムは、幾つかの理由のために潜在的に感染性のあるＲＮＡの生産に選択された。まず、Ｔ７又はＳＰ６のいずれかが比較的高い特異感染性のキャップのある又はキャップのないＲＮＡ転写物の高収量を転写させるのに利用された他のＲＮＡウイルスの数多くの例が存在する（BoyerとHaenni, J. Gen. Virol. 198: 415-426（1994））。加えて、Ｔ７システムはトランスフェクション用の明確なＲＮＡの生体外での合成だけでなく、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションを用いた幾つかの生体内手法を可能にするので、Ｔ７システムは特に有用である。一例にはワクシニアＴ７システムがあり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニア組換え体はトランスフェクトされたプラスミドテンプレートの細胞質転写を可能にする（FuerstらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126（1986））。ワクシニアウイルスの必要性を回避する第二の生体内での手法には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドのコトランスフェクションである（Chenらによる（1994）の上記文献）。明確な５’と３’末端のある転写物の生産用に設計されたＨＣＶプラスミドＤＮＡでのトランスフェクションは、トランスフェクション手順中に長いＲＮＡの感染性が分解するならば、有利であろう（Ball（1992）の上記文献; Pattnaikらによる（1992）の上記文献）。しかしながら、生体内での上記方法は、転写ＲＮＡの構造上での正確な制御とＨＣＶ  ＲＮＡ複製が起こると信じられている細胞質への輸出を可能としない。よって、生体外転写法が通常の我々の研究に利用された。
プロセシング研究の大部分に利用された配列決定されたプロトタイプＨＣＶ-Ｈ  ｃＤＮＡクローンは、これらの構築用の出発物質であった。上記実験が開始したときにはＨＣＶ-ＨゲノムＲＮＡの末端配列は未知であったので、他の分離体で報告された配列がＰＣＲによる５’及び３’末端を設計するために利用された。テストされた第一組の構成物（図４）では、更なる５’末端配列はＨＣＶ-１分離体（Hanらによる（1991）の上記文献）から誘導された。３’ＮＴＲにとっては、二つの代わりの構造のあるプラスミドが構築された。３’ＮＴＲと末端ポリ（Ａ）トラクトを含む一組（ＳＰ６若しくはＴ７）は、HanらによるＨＣＶ-１に報告された（Hanらによる（1991）の上記文献）。第二の組は、全ての他の分離体のコンセンサス３’ＮＴＲ配列とそれに続く３’末端ポリ（Ｕ）トラクトを用いて構築された。
ＨＣＶ  ＲＮＡの感染力を検定する方法。潜在的に機能性のあるクローンの初期の確認用の所望の方法は、許容細胞培養のトランスフェクション後のＲＮＡ複製のスクリーニングであろう。幾つかの研究所からさまざまな細胞培養中で感染と複製が報告されているが（上記及び下記の発明の背景を参照）、上記システムは極端に非効率的であり、殆ど特徴付けられておらず、再現させることが難しい。生体外で効率的な複製を妨げている要因は知られていないが、ウイルス生命サイクル（吸着、エントリ、ＲＮＡ複製、構築又は放出）における一つ又は多重の段階を含んでいる。さらに、細胞培養で発生したＨＣＶが“本物である”、例えばチンパンジーモデルにおいて病気を誘発可能であることをだれも示していない。上記理由のために、ＲＮＡトランスフェクション後の複製を明らかに示すことに関連した技術的に困難さのために、チンパンジーモデルはライブラリーからの機能性クローンを確認するために利用された。外科的手順及び直接的肝臓内接種が利用された。なぜなら上記技術はラビット出血性疾患ウイルスビリオンＲＮＡ（OhlingerらによるJ. Virol. 64: 3331-3336（1990））の感染性をうまく示し、生体外転写により肝炎ＡウイルスＲＮＡ（EmersonらによるJ. Virol. 66: 6649-6654（1992））をうまく発生させるからである。
チンパンジー実験Ｉ
キャップのある若しくはキャップのない完全長ＲＮＡ転写物は、各四つの直線化されたプラスミドテンプレートから合成され、経皮肝臓バイオプシー技術を利用して、チンパンジー肝臓の直接肝臓内接種により感染力を検定された。簡単に言えば、ＲＮＡ転写後に反応はＤＮａｓｅで消化され、フェノールで抽出され、ＲＮＡはエタノール沈殿により集められた。各転写ＲＮＡの収量と完全性は、変性条件下でアガロース電気泳動により求められた。転写物（ＳＰ６、Ｔ７、キャップのある、キャップのない）を含む夫々のポリ（Ｕ）若しくはポリ（Ａ）の等量はプール（pool）され、二つの動物に別々に検定された。上記動物は以前はＨＣＶ若しくはプールされた血液生成物に晒されておらず、ＨＣＶ抗体であり、ＲＮＡネガティブであった。各動物にとって、二つの注入部位が利用された。一つの部位において、１ｍｌのＲＮａｓｅのないＰＢＳ中の２００μｇのプールされたＲＮＡが注入された。第二の部位において、０．８ｍｌのＲＮａｓｅのないＰＢＳと２００μｌのLIPOFECTIN（ＢＲＬ）とを混合させた２００μｇのプールされたＲＮＡが注入された。接種前後の血漿と肝臓バイオプシーサンプルが週単位で集められた。血漿サンプルはＡＬＴ及びＧＧＴＰ（肝臓損傷の指標）を、利用可能な血清学的検定法を用いてＨＣＶ特異抗体を、及びＲＴ/ＰＣＲによるＨＣＶ  ＲＮＡを循環させる証拠を検定された。肝臓バイオプシー組織の組織学的調査に加えて、さらにサンプルは免疫蛍光検査及び電子顕微鏡による可能な分析のために保存された。６ヶ月間動物を追跡したにもかかわらず、上記検定法を利用して生産的ＨＣＶ感染の証拠は得られなかった。
以下に十分に説明される方法を利用して、さらに上記クローンからの転写物は、幾つかの異なる細胞タイプにおける感染力が測定された。ある場合には、ＨＣＶ抗原は数日間トランスフェクトされた細胞において検出された。しかしながら、同様な結果はＮＳ５Ｂ  ＲＤＲＰにおける欠失を含むコントロールＨＣＶ転写物を利用して得られ、複製に対して不活性であるべきである。よって、複製の説得力のある証拠は、第一組の実験において得られなかった。
例３．ｃＤＮＡからＨＣＶを回収させる第二の試み
試みＩの失敗の可能な理由。幾つかの可能な説明は、単独で若しくは組合せて、プロトタイプＨＣＶ-Ｈクローン（ｐＴＥＴ/ＨＣＶＦＬＣＭＲ）からの感染性のあるＨＣＶ  ＲＮＡを回収させるための以前のうまくいかなかった試みの原因に当てはまる。これらには、欠けている若しくは正しくない末端配列、ＨＣＶ複製にとって内部の誤りのある有害若しくは致死、又は感染及び複製を検定する不十分な方法が含まれる。第一の心配事を扱うために、ＨＣＶ-Ｈ５’及び３’末端配列は正確に決定された。有害な誤りのない完全長クローンを回収するための可能性を増加させるために、高忠実度ＲＴ/ＰＣＲとアセンブリＰＣＲが、新しい末端配列を含む完全長ＨＣＶ-Ｈの新しいライブラリーを構築するために利用された。ライブラリーからの多重クローンは、チンパンジーモデルにおける感染をテストされた。
ＨＣＶ-Ｈ末端を正確に決定する原理。上述したように、ＨＣＶ-Ｈの５’及び３’末端配列は未知であり、機能性転写物を発生させる以前の試みは（例２）、他のＨＣＶ分離体に対して決定された末端配列を有するｃＤＮＡクローンからのものであった。他のＲＮＡウイルスシステムでの研究により、特異末端配列は機能性である複製能ＲＮＡの発生には重要であることが示された（BoyerとHaenni,（1994）の上記文献を参照）。かかる配列はマイナス及びプラス鎖ＲＮＡ合成の開始に関係していると信じられている。ある場合には、２、３の追加塩基、若しくはさらに長い非ウイルス配列が、５’及び３’末端で許容される；典型的には上記配列はなくなる若しくは本物のウイルス複製中に選択される。他のＲＮＡウイルスにとって、余分の塩基、特に５’末端での塩基は有害である。対照的に、本物の末端配列を欠いた転写物は、通常非機能的である。例えば、３’末端の第二の構造の欠失又はフラビウイルスゲノムＲＮＡの３’ＮＴＲにおける保存配列要素は、ＹＦ又はＴＢＥ  ＲＮＡ複製には致命的である。他のウイルスにとって上記配列が重要であるならば、我々はＨＣＶ-Ｈ末端配列をより正確に決定するように試みた。
ＨＣＶ-Ｈ５’ＮＴＲの構造。ＲＮＡの一番端の５’末端を増幅させクローン化させるのに利用された方法は、第一の鎖ｃＤＮＡ（５’ＲＡＣＥ）へのホモポリマーのテーリング若しくは合成オリゴヌクレオチドの連結合成（ligation）（Schaefer, Anal. Biochem. 227: 255-273（1995））、第一の鎖ｃＤＮＡの環化に続く逆ＰＣＲ（ZeinerとGehring, Biotechniques 17: 1051-1053（1994））又はＲＮＡリガーゼによるゲノムＲＮＡの環化（必要ならば５’キャップ構造を取除くように処理した後）に続くｃＤＮＡ合成と５’-３’接合にわたるＰＣＲ増幅（MandlらによるBiotechniques 10: 486（1991））を含む。上記手法の夫々は問題を有し、特に珍しいＲＮＡには問題がある。にもかかわらず、５’末端配列は多くのＨＣＶ分離体に対して決定されており、一般的には一致している。ＨＣＶ-Ｈにとっては、環化/逆ＰＣＲ及び５’ＲＡＣＥ法は、高いタイター血漿からのＨＣＶ-Ｈ  ＲＮＡに対して５’末端コンセンサス配列を決定するために利用された（ＨＣＶ-Ｈの新しいデータを強調文字で示す）：５’-ＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧ    ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣ．．．-３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。この配列は他の分離体で決定されたものとかなり相同であるが、二つの位置（下線部）で我々のプロトタイプの完全長ｃＤＮＡ配列とは異なる。低い頻度で、さらに追加の５’残基（通常１つの追加のＧ）が回収される。表１には５’末端分析の結果を示す。
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１８のクローンは配列５’-ＧＣＣＡＧＣＣ．．．-３’で始まり；９つのクローンは配列５’-ＧＧＣＣＡＧＣＣ．．．-３’で；３つのクローンは配列５’-ＵＧＣＣＡＧＣＣ．．．-３’で；１つのクローンは配列５’-ＡＧＣＣＡＧＣＣ．．．-３’で；２つのクローンは配列５’-ＡＡＧＣＣＡＧＣＣ．．．-３’で；３つのクローンは配列５’-ＧＣＧＣＣＡＧＣＣ．．．-３’で始まる。上記配列決定されたクローンに加えて、１つの追加の５’塩基のある１８のクローンは制限分析により確認された。遺伝子型１ｂ分離体に報告された配列は、Ｕ残基（５’-ＵＧＣＣＡ．．．-３’）で開始するという観察は注目すべきである。上記結果はＨＣＶ５’末端における追加の配列若しくは異質性の存在を示すが、追加の塩基は人工産物であり、５’キャップ構造の部分コピーにより、若しくは第一の鎖ｃＤＮＡ合成中の逆転写酵素による非テンプレート３’塩基の添加により発生する。ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’末端が５’キャップ構造、又はピコルナウイルスのＶＰｇのような共有結合的に結合した末端タンパク質を含むことを排除することはできない（VartapetianとBogdanov, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 34: 209-51（1987））。上記可能性は、ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’末端の構造を直接決定できるようになるまで未解決のままであろう。ペスチウイルスでは、最近の結果からゲノムＲＮＡは５’キャップ（BrockらによるJ. Virol. Meth. 38: 39-46（1992））を含まず、しかもその構造は転写ＲＮＡの感染に必要ではない（MeyersらによるJ. Virol. 70: 8606-8613（1996a）; MeyersらによるJ. Virol. 70: 1588-95（1996b）; MoormannらによるJ. Virol. 70: 763-70（1996）; RuggliらによるJ. Virol. 70: 3478-87（1996）; VassilevらによるJ. Virol. 71: 471-478（1997））ことを示唆している。
ＨＣＶ-Ｈ３’ＮＴＲの構造。一番端の３’末端ＨＣＶ配列の決定は、本願の全体の引用文献に含まれる同時係属中の、共同出願人による１９９５年８月２９日に出願された米国特許出願第０８/５２０、６７８号と、１９９６年８月２８日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ/ＵＳ９６/１４０３３号に説明されている。簡単に言えば、上記結果はＨＣＶ３’ＮＴＲは三つの要素（プラスセンス、５’から３’）：（i）遺伝子型の間でかなりの変異性のある短い配列；（ii）ホモポリマーポリ（Ｕ）トラクトに続くＣ残基が散在し、主にＵから成るポリピリミジンストレッチ；（iii）９８の塩基の新規な配列から成ることを示す。上記新規な９８の塩基配列はヒトゲノムＤＮＡには存在せず、ＨＣＶ遺伝子型の間でかなり保存されている。３’末端４６の塩基は安定なステム-ループ構造を形成することが予想される。定量的競争ＲＴ/ＰＣＲ検定法を利用して、高特異感染接種物からのＨＣＶゲノムＲＮＡのかなりのフラクションは、この３’末端配列要素を含むことが分かった。上記結果より、ＨＣＶゲノムＲＮＡは、本物のＨＣＶ複製に、したがってｃＤＮＡから感染性のＲＮＡの回収に必要とされるであろうかなり保存されたＲＮＡ要素で終結することを示す。上記結果は二つの他のグループにより確認された（Tanakaらによる（1995）の上記文献; Tanakaらによる（1996）の上記文献; Yamadaらによる（1996）の上記文献）。さらにかなりの数の臨床分離体は調査され、新規な保存３’末端要素を含むことが分かった（UmlauftらによるJ. Clin. Invest. 34: 2552-2558（1996））。
ＨＣＶ  Ｈ７７５’と３’コンセンサス配列を含むレシピエントベクター。ＨＣＶ  Ｈ末端配列の我々の分析を基にして、レシピエントベクターは決定されたコンセンサスＨ７７配列５’のＫｐｎＩ（５８０）と３’からＮｏｔＩ（９２１９）部位（上記末端ＨＣＶ配列はｐ９０/ＨＣＶＦ長いｐＵの配列と同じである、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：５の以下を参照）を含むように構築された。このベクターはｐＴＥＴ/Ｔ７ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’３’corr．と称し、以下に説明するコンビナトリアル完全長ライブラリーの構築に利用された。
ＨＣＶ-Ｈ菌株の完全長ｃＤＮＡライブラリーの構築の更なる検討。先の試み（例２）に関して、第二回目のトライは、バクテリオファージＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、生体外及び生体内で転写されるプラスミドベクターでの完全長ｃＤＮＡテンプレートの構築を含む。正しい５’及び３’末端を有することに加えて、さらにＲＮＡ転写物は機能性ＨＣＶポリペプチドの完全な補体をコード化しなければならない。欠損ＨＣＶゲノムをクローン化させる可能性を最小にするために、高特異感染性ＨＣＶ-Ｈ血漿（Ｈ７７）は我々の新しいライブラリーのためのビリオンＲＮＡ源として利用される（初期に述べたように、先のクローンは感染チンパンジーの肝臓ＲＮＡから作られたｃＤＮＡから集められた）。しかしながら、逆転写とｃＤＮＡクローニング前の増幅の多重サイクルは、ＨＣＶ  ｃＤＮＡテンプレートがウイルス複製に対して有害である一つ又はそれ以上の突然変異を含む可能性を高めた。上記理由のために、完全長クローンの複雑なライブラリーが、高忠実度アセンブリＰＣＲを利用して、それから感染性ＲＮＡの生産用のプールにおいてスクリーニングされて構築された。
完全長ＨＣＶ-Ｈ  ｃＤＮＡクローンの新しいライブラリーの構築。我々は４１のＨＣＶプライマーペアをスクリーニングして、ゲノムＲＮＡのオーバーラップ１-４ｋｂ部分を増幅させるのに有用である１１の組を発見した（図５と表２及び３）。
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熱安定酵素の混合物は過ち頻度を減少させ、完全長生成物の合成を促進させるために利用された（Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-2220（1994）; LunbergらによるGene 108: 1-6（1991））。かかる中間ＰＣＲ生成物は結合され、アセンブリＰＣＲの順次ラウンドを用いて完全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡが生じる（MullisらによるCold Spring Harbor Symp. 51: 263-273（1986）; Stemmer,（1994）の上記文献）。アセンブリＰＣＲは結合される二つのオーバーラップフラグメントの一番端の末端のプライマーと、限定数の増幅サイクルを利用する（図６）。この手法は、機能性の誤りのないＨＣＶ  ｃＤＮＡテンプレートのあるフラクションを含むべき複雑なコンビナトリアルライブラリーを生じさせるという利点を有する。この手法の主な検討は、ライブラリーがあるクローンは誤りがないことを保証するのに十分な複雑度を含むことを確かめることである。初期の夫々の増幅反応では、第一の鎖ｃＤＮＡの希釈はテストされ（図７）、多重の独立ｃＤＮＡ分子が増幅されたことを示す（７以上から１００；図５に示す）。図７に示すように、完全長ライブラリーは５．６ｘ１０5（８０ｘ７ｘ１０ｘ１０ｘ１０）以上の異なる組合せを含む。プライマー配列がＰＣＲ増幅のために選択され、構築が不適当であれば、起こり得る有害な突然変異はクローンの半分へ導入された。しかしながら、不均一性はＰＣＲに利用されたプライマーに相当する配列には存在しないことが後で確認された。
ＨＣＶ-Ｈ７７ゲノムの大部分は（ヌクレオチド３９-９３５２から）集められ上記のように増幅され、レシピエントプラスミド（ｐＴＥＴ/Ｔ７ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ５’３’corr．）へのＫｐｎＩ（５８０）-ＮｏｔＩ（９２１９）フラグメントとしてクローン化され、完全長ライブラリーができる。前述したように、ｐＴＥＴ/Ｔ７ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ５’３’corr．はＴ７プロモーター、コンセンサスＨＣＶ-Ｈ５’と３’末端配列、ＫｐｎＩ部位への５’とＮｏｔＩ部位からの３’と、ランオフＲＮＡ転写物のテンプレート直線化及び生産用のＨｐａＩ部位とを含む。ＨｐａＩによる直線化は一つの余分な３’Ｕ残基を含むランオフ転写物を生じるように予測されることを指摘しておく。
ライブラリーからのクローンは二つの基準に基づく感染検定法のために選択された。まず一連の制限消化が実行され、明らかに欠失若しくはＨＣＶ  ｃＤＮＡへの挿入を有するクローンを排除した。２３３のクローンを分析し、このスクリーンを通過したクローンは、それから予想されるＨＣＶポリタンパク質切断生成物の生産のためにワクシニアＴ７一過性発現システム（Grakouliらによる（1993a）の上記文献; Grakouliらによる（1993ｃ）の上記文献を参照）を用いて分析された。ＢＨＫ細胞における予備研究により、ＨＣＶ  ＩＲＥＳはＨＣＶポリペプチドの発現のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳと殆ど同じように効率的に機能することが分かったので、完全長クローンは上記技術を用いて直接分析された。１２９のクローンは慢性ＨＣＶ（JHF: Grakouliらによる1993cの上記文献）の患者からのポリクローナル坑血清を利用してスクリーニングされた。４９のクローンは、ＮＳ５Ｂ、ＨＣＶ-Ｈ  ＯＲＦにおけるＣ末端タンパク質の生産のために分析された（Grakouliらによる1993aの上記文献; Grakouliらによる1993cの上記文献）。上記テストを通過した３４のクローン（予想制限パターン；無傷のＯＲＦ及び正しいプロセシング；ＮＳ５Ｂ生産）は、潜在的な感染力のあるＲＮＡの生体外での転写と感染分析のために選択された。
内部ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトと９８の塩基要素を含む完全長ＨＣＶ  ＲＮＡの転写の特別な条件。Ｔ７駆動転写では、生体外転写条件は最適化され、結果生じたＲＮＡは一番端の３’末端配列を含むことを示した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ終結シグナル（第二の構造とそれに続くポリＵ）は３’の新規な要素に先行するＨＣＶ配列と似ており、我々はこの部位で終結を観測したので、上記のことは特に関心があった。加えて、酵素はポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクト内部の終結を早期に始める傾向があるようだ。図８Ａに示すように、転写反応中のＵＴＰ濃度を３ｍＭまで増大させることにより、高収量の完全長ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物を得た。この点に関して、Ｔ７ポリメラーゼはＳＰ６ポリメラーゼよりも明らかに良く、ＵＴＰの比較的高濃度でさえも、ポリ（Ｕ）トラクトでのかなり早い終結を示した。
チンパンジー実験ＩＩ
本質的には前述したように（例２）、外科的手順と直接肝臓内接種が転写ＲＮＡの感染力を検定するのに利用された。先のＨＣＶ研究には利用されなく、ＨＣＶ血清学及びＲＮＡではネガティブであった三つの動物が接種された。夫々二つの動物は１７の独立のクローンからのＲＮＡ転写物で、肝臓の３４の個々の部位に注入され接種された。各転写物調製に利用された二つの個々の接種は、ある部位に注入されたＰＢＳ中の５０-１００μｇのＲＮＡと、第二の部位への１０μｇのlipofectin（ＲＮＡトランスフェクションを促進させるカチオン性リポソーム（Riceらによる（1989）の上記文献参照））と混合させた１μｇのＲＮＡであった。この手順は各クローン/ＲＮＡ調製用の生産的トランスフェクションの可能性を最大限にする目的であった。ネガティブコントロールとして、第三の動物（チンパンジー  １５５７）は、ＨＣＶ  ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ΔＧＤＤと呼ばれる）の活性部位を取り囲むＮＳ５Ｂにおける２１の残基のインフレーム欠失を含む転写物（約１５００μｇ）で３４の部位を同様に接種させた。接種に続き、血清サンプルを集めて（一週間間隔で）ＨＣＶ  ＲＮＡ、肝臓トランスアミラーゼの上昇及びＨＣＶ特異抗体を分析した。実験動物又はネガティブコントロール動物（ΔＧＤＤ）のいずれも生産的感染の兆候を示さなかった（循環ＨＣＶ  ＲＮＡ、上昇した肝臓酵素、組織病理学）。更なる実験では、接種後の一週間ぐらいの早い段階でさえも検出可能な循環ＨＣＶ  ＲＮＡを全く存在しなかったことは注目すべきことであった。
例４：ｃＤＮＡから感染性のあるＨＣＶの成功した回収
ＨＣＶ-Ｈコンセンサス配列の決定。限定されたプールのスクリーニング手法はうまくいかなかったので、我々はＨＣＶ-Ｈ菌株の完全なコンセンサス配列を決定した。上記配列決定されたクローンのセグメントは、コンセンサス配列を有する完全長ＨＣＶ-Ｈクローンの方向性のある集合に対して利用された。この手順は、ｃＤＮＡ合成若しくはＰＣＲ増幅中に起こるであろう、又はオリジナルＨＣＶ集団に存在する致死突然変異を排除するように期待される。したがって、コンセンサス方法は機能性ＨＣＶを発生させる大きな可能性を有していた。
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ＨＣＶ  ｃＤＮＡにおけるＫｐｎＩ（５８０）とＮｏｔＩ（９２１９）部位の間の完全な配列は、クローンＡＡＫ＃２４８、ＡＡＫ＃２２７、ＡＡＫ＃２１３、ＡＡＫ＃２１１、ＡＡＫ＃２０９、とＡＡＫ＃１２に対して決定された。プロトタイプＨＣＶ-Ｈ  ＣＭＲの配列（Daemerらによる上記文献; Grakouliらによる（1993c）の上記文献）とＨＣＶ-ＨＧｅｎＢａｎｋ（Inachauspeらによる（1991）の上記文献）は以前に決定された。上記配列は図９に並べる。ドットは、下（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１９と２０）に示すＨＣＶ-Ｈ  ＣＮＲ配列に同じ位置を示し、点線はギャップを示し、配列“ＰＣＲｓｅｑ”はＰＣＲ増幅ＨＣＶ-Ｈ７７  ｃＤＮＡの直接配列決定により求めた。我々のコンビナトリアルライブラリー（ＡＡＫ＃８３、＃８４、＃８６、＃８７、＃８９、＃９０、＃９２、＃９３、＃９５、＃９６、＃９９、＃１０１）からの追加のクローンの配列は、Ｅ２（多くはヌクレオチド１４６４-１８２３の間で配列決定された。）におけるＨＶＲ１超可変領域に対して決定された。アライメントの検査により、多くの位置でＨＣＶ  Ｈ７７共通配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を示す。しかしながら、ある位置では明らかなコンセンサス配列は出現しなかった。上記可変な位置は、２１７０（Ｇａｃ対Ａａｃ；可変塩基が上のケースタイプで示される）、３９４０（ｇＡｇ対ｇＧｇ）と５５６０（ｃａＡ対ｃａＴ）であった。上記の場合には、コンセンサスクローンに利用された配列は、配列決定されたＨＣＶ分離体の大部分の位置にて発見されたアミノ酸を生じるヌクレオチドに相当した。
コンセンサス配列の決定に関して、ＨＣＶゲノムの追加の領域はさらなるコメントをするのに値する。第一に、Ｅ２のＮ末端部分はかなり可変であり、免疫選択のターゲットであると信じられている（Houghton,（1996）の上記文献）。Ｈ７７サンプルにおいて、かなりの変異性がＨＶＲ１に存在する（NakajimaらによるJ. Virol. 70: 3325-9（1996）; Ogataらによる（1991）の上記文献）。この領域からの多重の独立クローンは配列決定され、各位置における主要なＨＶＲ１配列はコンセンサスクローンにおいて利用された。利用された主要な配列は他人により決定されたもの（Inchauspeらによる（1991）の上記文献; Nakajimaらによる（1996）の上記文献; Ogataらによる（1991）の上記文献）とは位置が異なる。しかしながら、上記配列は、Ｈ７７接種チンパンジーから分離された肝臓ＲＮＡから誘導されたプロトタイプＨＣＶ-Ｈクローンのそれとかなり類似している。よって、上記配列はチンパンジーのＨＣＶ複製には許容であろう。以下に示すように、上記配列は機能的であるが、さらに多くの他のＨＶＲ配列変異も許容であろう。
ＨＣＶ-Ｈ配列の第二の領域である３’ＮＴＲポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトの長さと成分ははっきりとは決定されていなかった。二本鎖ｃＤＮＡの十分な量が、ＰＣＲ増幅にたよらずに上記領域の直接クローニングに対しては得られなかった。ＰＣＲ増幅は上記ホモポリマートラクトの長さを収縮及び拡張させることができる。よって、この手順から生じるクローンは固有ＨＣＶゲノムＲＮＡ構造を反映しない。ＰＣＲ増幅により誘導された多重独立クローンにおいて、上記トラクトの長さは４１から１３３のヌクレオチドへ変化した（Kolykhalovによる（1996）と特許出願番号第０８/５２０、６７８号を参照）。よって、ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトの二つの異なる長さがテストされた：“短い（７５の塩基）”又は“長い（１１３の塩基）”。“短い”トラクトの長さは、実際には我々（Kolyhaiovらによる（1996）の上記文献）又は他の研究者（Tanakaらによる（1995）の上記文献; Tanakaらによる（1996）の上記文献; Yamadaらによる（1996）の上記文献）により報告された全ての配列（異なる遺伝子型）のほぼ中間の長さである。“長い”トラクトは一つのＨＣＶ-Ｈクローン（ｐＧＥＭ３Ｚｆ（-）ＨＣＶ-Ｈ３’ＮＴＲ＃１０）のみにおいて回収された；同様な長さのトラクトは、遺伝子型４分離体ＷＤ（Kolykhalovらによる（1996）の上記文献）の一つのクローンにおいて回収された。かかる長いポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトは他の研究者らにより報告されていない（Tanakaらによる（1995）の上記文献; Tanakaらによる（1996）の上記文献；Yamadaらによる（1996）の上記文献）。
５’末端配列、サイレントマーカー、３’ＮＴＲポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトの長さと３’ランオフ部位における変異。追加の塩基が幾つかのＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンの５’末端において発見され、ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトの長さについて不確実であるならば、幾つかの代わりのクローンが作られた。誘導体が後の分析において機能的であることを確認するためのマーカーとして働き、複製ウイルスが構築ｃＤＮＡクローンから実際に回収されたことを示すために、サイレントヌクレオチド置換がＯＲＦに組込まれた。先に使用したＨｐａＩ部位を置き換えることは、ＢｓｍＩ部位がＨＣＶ  ｃＤＮＡの３’末端に続いて生じ、ＨＣＶゲノムＲＮＡの正確な３’末端に対応するランオフ転写物の生産を可能にする。上記構築の詳細な説明は以下のようである。
５’末端での追加の塩基。ｐＴＥＴ/Ｔ７ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ+３’ｃｏｒｒ．と呼ばれる最も頻繁に出現する５’末端配列（５’-ＧＣＣＡ．．．-３’）を含むレシピエントクローンは、チンパンジーにおいてテストされたプロトタイプＨＣＶ-Ｈ  ｃＤＮＡクローンの一つであるｐＴＥＴ/ＨＣＶ５’Ｔ７Ｇ３’ＡＦＬのＢｓｓＨＩＩ（４７９）からＫｐｎＩ（５８０）フラグメントをサブクローニングすることにより変種され、ｐ６７/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-が生じた。上記クローンは５１４位置におけるＸｏｈＩ部位の存在（ｐＴＥＴ/Ｔ７ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’ｃｏｒｒ．）又は（ｐ６７/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-）存在しないにことにより異なる。それからｐ６７/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-は、異なる５’末端配列のある四つの誘導体を構築させるためのベクターとして利用された。
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上記誘導体は適当な合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ増幅と配列分析により確認された構造を利用して構築された。
ＫｐｎＩ（５８０）とＮｏｔＩ（９２１９）の間のコンセンサス配列を含むクローンの構築。構築段階のスキームを図１０に示す。７つの配列決定されたＨＣＶ-Ｈクローンが、プロトタイプコンセンサスクローンを構築するのに利用された。プラスミド源、ＨＣＶ  ｃＤＮＡにおける位置、構築に利用された制限部位を表５にまとめる。
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構築の最終段階ではＫｐｎＩ-ＮｏｔＩコンセンサス領域をレシピエントベクターｐＴＥＴ/Ｔ７ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’ｃｏｒｒへサブクローニングさせることを含み、ｐ６１/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓが生成した。
ＨＣＶ  ｃＤＮＡとＢｓｍＩランオフ部位におけるＢｓｍＩ-置換の導入。先に使用したＨｐａＩランオフ部位は有害である追加の３’末端Ｕ残基のある転写物が生じたので、クローンは正確なＨＣＶ３’ヌクレオチドで終結する転写物が合成されるように再度特別に設計された。このことはＢｓｍＩ部位をＨＣＶ３’末端からの適当な下流位置に位置決めすることにより達成された。ＢｓｍＩによる切断により、ＨＣＶ３’末端に相当する位置で終結するテンプレート鎖が生じる。Ｈ７７コンセンサス配列は位置５９３４にＢｓｍＩ部位を含むので、この部位は部位特異的変異の導入により特別設計された翻訳的サイレント置換により不活性化された。
構築の本シリーズの第一の段階は、ＨＣＶ  Ｈ７７  ｃＤＮＡにおけるＢｓｍＩ部位を不活性化させることであった。ｐ６２/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓ/Ｂｓｍ（-）と呼ばれるこのクローンは、以下に含まれる四つのフラグメント連結反応において発生した：（１）ＢｓｍＩ部位（位置５９３４でのＡに代わりにＣ）を不活性化するサイレント置換を含むＳａｃＩ（５９２３）とＳａｕ３ＡＩ（５９４２）の間のアニールされた合成オリゴ；（２）ｐ６１/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓのＮｓｉＩ（５２８２）からＳａｃＩ（５９２３）のフラグメント；（３）ｐ６１/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓのＳａｕ３ＡＩ（５９４２）からＢｓｕ３６Ｉ（６２０９）；（４）ｐ６１/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓを消化させたＢｓｕ３６Ｉ（６２０９）とＮｓｉＩ（５２８２）。ｐ６２/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓ/Ｂｓｍ（-）は、構築されたコンセンサスクローンの構造と、位置８９９（Ｔに代わりにＣ）でのサイレントマーカー突然変異、切断された（ablated）ＢｓｍＩ部位、及び位置８０５４（以下参照）でのサイレントマーカー突然変異の存在とを確認して、完全に配列決定された。
３’ＢｓｍＩランオフ部位を含む中間体プラスミドｐ６５/３’ＨＣＶＢｓｍ（+）/Ｎｏｔ-Ｍｌｕは、以下の三つのフラグメント連結反応により発生した：（１）ＢｓｍＩ部位（５’-ｔｇＴｃｇｃａｔｔｃ-３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）ここで強調文字で示したヌクレオチドはＢｓｍＩ部位を指し、上の場合ヌクレオチドはＨＣＶゲノムの３’末端塩基に相当する）を含むＳａｕ３ＡＩ（９６３９）とＭｌｕＩ（９６５６）の間のアニールされた合成オリゴ；（２）ｐ６２/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓ/Ｂｓｍ（-）のＮｏｔＩ（９２１９）からＳａｕ３ＡＩ（９６３９）のフラグメント；（３）ｐ６１/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓのＭｌｕＩ（９６５６）からＮｏｔＩ（９２１９）。上記クローンは内部ＢｓｍＩ部位（５９３４）と特別設計されたＢｓｍＩランオフ部位の双方を含むことを指摘しておく。
オリジナルコンセンサス完全長クローンであるＰ６１/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓ．は、ＮＳ５Ｂ暗号づけ領域においてサイレント置換を含む（位置８０５４でのＧに代わりＡ）。この置換は“短い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクト（三つのクローンは位置８０５４にＡを含む）又は“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクト（位置８０５４にはＧを有する）を含むクローン間を区別させるためのマーカーとして利用された。長いポリ（Ｕ/ＵＣ）と位置８０５４でのＧを含むｐ９０/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、四つのフラグメントの連結反応により構築された：（１）ｐ６２/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓ/Ｂｓｍ（-）のＸｂａＩ（-２０）からＨｉｎｄＩＩＩ（７８６１）；（２）位置８０５４にＧ残基を含むライブラリークローンＡＡＫ＃２０９（図９）のＨｉｎｄＩＩＩ（７８６１）からＥｃｏＲＩ（８０２５）；（３）ｐ６２/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓ/Ｂｓｍ（-）のＥｃｏＲＩ（８２０５）からＮｏｔＩ（９２１９）；（４）ｐ６５/３’ＨＣＶＢｓｍ（+）/Ｎｏｔ-ＭｌｕのＮｏｔＩ（９２１９）からＸｂａＩ（-２０）。
“短い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトと位置８０５４でサイレントマーカーＡを含む誘導体であるｐ９１/ＨＣＶＦＬ短いｐＵは、以下のフラグメントの連結反応により発生した：（１）ｐＧＥＭ３Ｚｆ（-）ＨＣＶ-Ｈ３’ＮＴＲ＃８のＢｇｌＩ（９３９８）からＮｈｅＩ（９５２０）；（２）ｐ６５/３’ＨＣＶＢｓｍ（+）/Ｎｏｔ-ＭｌｕのＮｈｅＩ（９５２０）からＭｌｕＩ（９５９７）；（３）ｐ６２/ＨＣＶＦＬｃｏｎｓ/Ｂｓｍ（-）のＭｌｕＩ（９５９７）からＮｏｔＩ（９２１９）。上記構築のナンバリングは最終のｐ９１/ＨＣＶＦＬ短いｐＵ配列について言う。
長いポリ（Ｕ/ＵＣ）と５’末端での追加のヌクレオチドのある完全長構成物の最終セットを発生させるために、ｐ９０/ＨＣＶＦＬ長いｐＵのＫｐｎＩ（５８０）からＭｌｕＩ（９６５６）フラグメントが、ｐ７０/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＧ、ｐ７１/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＡＧ、ｐ７２/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＵＧと、ｐ７３/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＣＧへクローン化され、それぞれｐ９２/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ/５’ＧＧ、ｐ９３/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ/５’ＧＡＧ、ｐ９４/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ/５’ＧＵＧ、ｐ９５/ＨＣＶＦＬ長いｐＵ/５’ＧＣＧＧＣＧが生じた。
短いポリ（Ｕ/ＵＣ）のある完全長構成物の類似のセットを発生させるために、ｐ９１/ＨＣＶＦＬ短いｐＵのＫｐｎＩ（５８０）からＭｌｕＩ（９５９７）フラグメントが、ｐ７０/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＧ、ｐ７１/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＡＧ、ｐ７２/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＵＧと、ｐ７３/ＨＣＶΔＢｇｌＩＩ/５’+３’/ＸｈｏＩ-/ＧＣＧへクローン化され、それぞれｐ９６/ＨＣＶＦＬ短いｐＵ/５’ＧＧ，ｐ９７/ＨＣＶＦＬ短いｐＵ/５’ＧＡＧ、ｐ９８/ＨＣＶＦＬ短いｐＵ/５’ＧＵＧ、ｐ９９/ＨＣＶＦＬ短いｐＵ/５’ＧＣＧが生じた。
上記１０のクローンの目立った特徴を（５’塩基、サイレントマーカー、ポリ（Ｕ/ＵＣ）の長さ）、図１１にまとめる。プラスミドはＥ．ｃｏｌｉ（ｔｅｔsＳＵＲＥ菌株）中で増殖され、精製プラスミドＤＮＡは、ＣｓＣｌ勾配での２回バンディング（banding）を含む標準的な方法により調製された（AusubelらによるCurrent protocols in molecular biology. eds. Greene Publishing Associates, New York（1993）; SambrookらによるCold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1989））。
完全長ＲＮＡの転写。上述したように、Ｔ７転写反応におけるＵＴＰ濃度が３ｍＭまで増加することは、ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトの読み過しを容易にすることにより、完全長ＨＣＶ  ＲＮＡの収量が増加する。ＵＴＰ（３ｍＭ）に対する他のｒＮＴＲ（１ｍＭ）斜傾（skewed）比はＵ残基の誤った取込みを導き、特に他のＮＴＲが実質的に除去されたときに転写反応を遅くする。この心配事は、他の三つのＮＴＲの濃度を３ｍＭまで増加させることにより回避された。精製プラスミドＤＮＡはＢｓｍＩにより消化され完成し、フェノール-クロロホルムにより一度抽出され、エタノールで析出させた（Ausubelらによる（1993）の上記文献; Sambrookらによる（1989）の上記文献）。ＤＮＡペレットをＥｔＯＨで洗浄し、塩を取除き、ＲＮａｓｅのないＨ2Ｏ中で再懸濁させた。転写反応（１００μｌ）は以下の成分を含む：１０μｇのＢｓｍＩ直線化されたテンプレートＤＮＡ，４０ｍＭのTris-Cl、ｐＨ７．８、１６ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＮａＣｌ、各３ｍＭのｒＮＴＲ、１００ユニットＴ７ＲＮＡポリメラーゼと０．０２Ｕ無機ピロホスファターゼ。３７℃での一時間のインキュベーション後に、典型的収量は、ゲル電気泳動により見積られた８０％以上の完全長ＲＮＡの約３００μｇであった。
チンパンジー実験ＩＩＩ
１０のコンセンサスクローンからの転写物は、前述した本質的には同じ外科的手順を利用して、二つの異なる動物へ接種させるのに利用した。実験手順はＦＤＡ及びＮＩＨ動物研究委員会により評価され認可された。動物は全ての肝炎ウイルスに対して血清陰性であり、入れ子ＲＴ-ＰＣＲによりＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性であり、肝臓酵素の正常なベースラインを有していた。二つの異なる接種/トランスフェクション実験手順を利用した。チンパンジー＃１５３５では、１００μｌの転写反応は４００μｌＰＢＳで希釈され、接種に利用されるまで-８０度で冷凍保存された。これらの保存条件がテストされ、ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物の完全性に対する観察可能な効果は何も示さなかった。接種前に、サンプルは解凍され、各サンプルは肝臓内の２箇所に注入された（１箇所につき約０．２５ｍｌ）。１０のクローンの注入箇所は肝臓の三つのローブ（lobe）に分布された。この手順のポジティブコントロールとして、チンパンジー＃１５５７は二つの異なるＡ型肝炎ウイルスクローンからのＲＮＡ転写物により、同様に接種させた。この場合には、クローン当たり８０-１００μｇの転写ＲＮＡが２箇所に接種された。第三の動物であるチンパンジー＃１５３６は、lipofectinと混合させたＲＮＡの少量で接種させた。この場合には、１０の完全長ＨＣＶ-Ｈ７７クローンからの同じ転写ＲＮＡは、ＤＮａｓｅＩで処理され、テンプレートＤＮＡを取除き、０．１５μｇ、０．５μｇと１．５μｇ部分がＰＢＳで５０μｌへ希釈され、接種に利用されるまで-８０度で保存された。解凍後、９μｇのlipofectin（Besthesda Research laboratory）を含む１００μｌのＰＢＳが各サンプルに添加され、混合し単一の部位へ注入された。よって、異なるＲＮＡ/lipofectin比を有する各クローン/転写調製物が三つのさまざまな部位へ注入された。
血清サンプル及び肝臓バイオプシーは接種前に取られ、その後１週間間隔で取られた。接種後殆ど２ヶ月間、サンプルは肝臓酵素（ＡＬＴ，ＩＣＤ，ＧＧＴＰ）肝炎ウイルス血清学と、定量的競争ＲＴ-ＰＣＲ（Kolykhalovらによる（1996）の上記文献）によるウイルス血症を検定された。
感染と複製がうまく開始されたことの証明。これまでの我々の結果を表６にまとめる。
0004094679.tif 000008
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チンパンジー＃１５３５は接種後２週間で肝臓酵素はピークを示し、徐々に接種前のベースラインに減少した。１０週間後に、肝臓酵素の第二のピークが観察された。ＨＣＶ  ＲＮＡタイターは接種前は我々の検出限界以下であったが（＜１０2）、１週間で１０5/ｍｌまで増加し、５週間で２ｘ１０6/ｍｌに達するまでに着実に増加した。これは１週間後と比較して２０倍の増加を示す。
チンパンジー＃１５３６は、２週間後でのＩＣＤレベルに僅かなピークを示して初期に肝臓損傷のはっきりとした証拠は示さず、その後値は変動した。しかしながら、酵素のかなり増大したレベルが１０及び１１週間後に観察された。さらにこの動物は、１０及び１１週間後にＨＣＶ血清陽性になった。１週間では、ＨＣＶ  ＲＮＡタイターは１０4/ｍｌであったが、６週間後には６ｘ１０6/ｍｌまで増加した。このことは１週間と比較して６００倍増加したことを示す。
ＨＡＶ転写物で接種させたポジティブコントロール（チンパンジー＃１５５７）は、４週間で肝臓酵素に鋭いピークを示し、この時期に明らかに血清学的に変換した（seroconverted）ことを示した。ＨＡＶ特異免疫反応は５週間で鋭く増加し、その後高レベルを持続させた。上記の結果はＨＡＶ感染の明らかな証拠を示し、チンパンジー＃１５３５に利用した接種方法は有効である。
さらにＨＣＶ  ＲＮＡに対して分析された全てのサンプルは、逆転写段階での酵素を無視することにより残留テンプレートＤＮＡの存在を測定された。生成物は全く得られず、定量的競争ＰＣＲ検定法において検出されたシグナルはＲＮＡに由来するものであることを示す（図１２）。加えて、上記サンプル物質を含むＨＣＶ  ＲＮＡは、完全に分解された裸の競争者ＲＮＡが分析される血清と混合している同じ条件下でＲＮａｓｅ消化に抵抗性があった（図１３）。残留接種ＲＮＡとは反対に、ＲＮＡがエンベロープＲＮａｓｅ耐性ウイルス粒子にパッケージされたなら、このことは予想された結果である。さらに、接種に利用された転写ＲＮＡの全量はチンパンジー＃１５３５で３０００μｇ、チンパンジー＃１５３６でたったの約２２μｇであった。約１５０倍以下のＲＮＡ接種にもかかわらず、チンパンジー＃１５３６はチンパンジー＃１５３５よりも高いレベルのウイルス血症を示した。よって、ウイルス血症のレベルはインプットＲＮＡとは相関関係にはなく、ウイルス増幅とスプレッドの暗示する。最終的には、非コンセンサスコンビナトリアルライブラリークローンとΔＧＤＤネガティブコントロールを利用した先のネガティブな実験において（例３）、１０００-２０００μｇのＨＣＶ特異ＲＮＡが、同様の手順を利用して動物当たりにつき接種された。１週間後又はその後でもＨＣＶ  ＲＮＡは検出されておらず、この実験で観測されたシグナルは本物のウイルス複製と、血清に放出によるものであることを示唆している。
接種転写ＲＮＡに由来する上記動物で観測された感染の証拠は、制限酵素と特別設計されたマーカーの存在に対する回収ウイルスの配列分析により得られた。二つのサイレント突然変異は全てのトランスフェクトされたＲＮＡをマークさせた。このことは位置８９９での置換（Ｔに代わりＣ）であり、内部ＢｓｍＩ部位（５９３４）を切断する位置５９３６での置換（Ａに代わりＣ）であった。ヌクレオチド８９９マーカーにとって、４６６から９５０の間の領域は入れ子ＲＴ-ＰＣＲにより増幅され、直接配列決定され、位置８９９でのサイレントＣ（Ｔに代わり）マーカーを含む予想されたＨ７７配列を有することを示した。さらに５８０１から６２５７の領域は入れ子ＲＴ-ＰＣＲにより増幅され、ＢｓｍＩにより消化に対して耐性があることが分かった。しかしながら、Ｈ７７  ｃＤＮＡ配列の上記領域（ＳｓｔＩ（５９２３）；ＢｓｐＨＩ（５９４４）；Ｂｓｕ３６Ｉ（６２０９）；ＲｓａＩ（６２４４））において切断する他の四つの酵素に対して、予想される生成物が得られた。この分析はチンパンジー＃１５３５（５週間）とチンパンジー＃１５３６（６週間）の双方で行われた。
ＲＮＡ接種動物の病原プロフィールは、Ｈ７７物質若しくは他のＨＣＶを含むサンプルで接種させたチンパンジーでの先の実験で得られたものを暗示させる。ヒトと同様に、チンパンジーでの病気の進行は、肝臓の損傷の程度、慢性への進行、ウイルス血症のレベル、血清変換（seroconversion）のタイミングに関して、かなり可変である。
感染動物から回収されたウイルスに存在するサイレントマーカーを評価することにより機能性“感染性のある”クローンの確認。前述のように、追加のサイレントマーカーは、５’末端配列と感染を開始させるに必要若しくは好ましいポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトの長さを確認するのを助けるために組込まれた。
単一のＧ（５’-ＧＣＣＡ．．．-３’）を含む転写物は、Ｃタンパク質暗号づけ領域でのＸｈｏＩ（５１４）サイレントマーカーの存在により、追加の５’残基と区別された。上記マーカーを含む領域は、代表的数の独立ｃＤＮＡが分析される（この場合には５０以上）ことを保証する条件下でＲＴ-ＰＣＲにより増幅された。結果生じた生成物は、ＸｈｏＩ若しくはコントロールとしてのＡｃｃＩ、全ての入力クローンのフラグメントを消化すべき酵素のいずれかによる消化を分析された。チンパンジー＃１５３５（３週間後のサンプル）では、ＸｈｏＩで消化された生成物のフラクションは入力接種物に平行であった：約２０％はＸｈｏＩ（４Ｕと３０Ｕの双方）で消化され、８０％は消化に対して抵抗があった（値はＩＣ１０００イメージングシステムにより臭化エチジウム染色消化を走査させることにより決定された）。完全な消化はＡｃｃＩで観測された。チンパンジー＃１５３６で分析された４週間後のサンプルにおいて、５５％はＸｈｏＩで消化され、４５％は消化に対して抵抗性があった。また、完全な消化はＡｃｃＩで観測された。よって、第二の動物において、単一Ｇ（５’-ＧＣＣＡ．．．-３’）のみの転写物で利点が観測された。特異感染性での在り得る差異に関する上記データから確固たる定量結果を引き出すことは可能ではないが、明らかに結果は、追加のヌクレオチドのない転写物は感染力があることを示している（クローンｐ９０/ＨＣＶＦＬ長いｐＵとｐ９１/ＨＣＶＦＬ短いｐＵ）。これまでの我々の分析はさまざまなクローンを区別すことはできないが、さらに追加のヌクレオチドのある転写物も感染を生じさせる。
“短い”若しくは“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトを含む転写物は、ＮＳ５Ｂ暗号づけ領域の位置８０５４にあるサイレントマーカーにより区別される。７９５５と８０８８の間の領域は、１００以上の分子的にクローン化された独立ｃＤＮＡ分子の増幅を保証する十分なｃＤＮＡを利用して、ＲＴ-ＰＣＲにより増幅された。１０若しくは９の独立クローンの配列は、それぞれチンパンジー＃１５３５（３週間後）とチンパンジー＃１５３６（４週間後）で決定された。チンパンジー＃１５３５の１０のクローンのうち９つ（９０％）は、位置８０５４でＧを含み、“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトを示唆している。チンパンジー＃１５３６の９つのクローンのうち６つ（６６％）は、位置８０５４でＧを含み、“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトを示唆している。結果は“短い”若しくは“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトのいずれかを含む転写物は感染力があるが、“長い”ポリ（Ｕ/ＵＣ）トラクトが好ましいようだ。しかしながら、我々は上記効果が８０５４でのマーカー突然変異の有害な効果によるものである可能性を排除することはできない。上記の追加の分析は、これらの動物で観測されたウイルス血症は我々の完全長クローンから誘導された転写物により開始されたことをさらに確認するをこと与える。
本例で説明された機能性遺伝子型１ａ  ｃＤＮＡクローン、又は他のＨＣＶ遺伝子型の機能性クローン（同様な方法で構築され確認された）には、（i）より効果的なＨＣＶ治療；（ii）ＨＣＶワクチン；（iii）ＨＣＶ診断薬と；（iv）ＨＣＶに基づく遺伝子発現ベクターの開発のさまざまな応用がある。
例５：肝細胞系統の生産的ＨＣＶ感染
ｐＣＥＮからのＥｃｏＲＩ-ＢｓｔＢＩフラグメントは、ｐ９０/ＨＣＶＦＬ長いｐＵのユニークなＳｆｉＩ部位へクローン化された。連結反応前に、突出した末端はｄＮＴＲの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、鈍く終結した（blunt end）。ｐＣＥＮからのＥｃｏＲＩ-ＢｓｔＢＩフラグメントは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ要素とそれに続くネオマイシン耐性（ＮＥＯ）暗号づけ領域を含む。このＩＲＥＳ  ＮＥＯカセットはGhattasらにより説明されたものと本質的には同じである（Mol. Cell Biol. 11: 5848（1991））。正しい配向（ＨＣＶゲノムＲＮＡに関してプラスセンス（positive-sense））の上記カセットを含むクローンは、適当な制限酵素での消化により確認された。
ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ  ＮＥＯカセットはｐ９０/ＨＣＶＦＬ長いｐＵの３’ＮＴＲにおけるＳｆｉＩ部位へ挿入された。この転写ＲＮＡはヒト肝細胞系統をトランスフェクトさせるのに利用され、それからＧ４１８を利用してネオマイシン耐性に対して選択された。多くの細胞は死滅したが、Ｇ４１８集団は数ヶ月以上の間成長した。驚くことに、ＨＣＶ  ＲＮＡは細胞当たり約１０００ＲＮＡ分子のコピー数で、上記細胞にいまだに存在しているらしい。ネオマイシン耐性はＨＣＶ  ＲＮＡにより媒介されると信じられている。なぜなら上記細胞のゲノムには混入テンプレートＤＮＡの組込み（integration）の証拠がないからである。
本発明は本願で説明した特定の実施例により範囲を限定されるものではない。実際に、本願で説明した例に加えて、本発明のさまざまな変形例は、前述の説明と添付図面から当業者には明らかである。かかる変形例は、添付した特許請求の範囲内にある。
核酸若しくはポリペプチドに対して与えられた全ての塩基サイズ若しくはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量又は分子質量値はおおよそであり、説明のために提供された。
さまざまな刊行物が本願では引用され、それらの開示は全体の引用文献に組込まれる。
配列リスト
（１）一般情報：
（i）出願人：  Rice, Charlesら
（ii）発明の名称：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）用の機能性ＤＮＡクローン及びその使用
（iii）配列数：  21
（iv）通信住所：
（A）受信人：  David A. Jackson, Esq.
（B）ストリート：  411 Hackensack Ave, Continental Plaza, 4th Floor
（C）市  ：  Hackensack
（D）州  ：  New Jersey
（E）国  ：  USA
（F）郵便番号：  07601
（V）コンピュータ読取可能形態：
（A）媒体タイプ  ：  フロッピーディスク
（B）コンピュータ：  IBM PC互換機
（C）オペレーティングシステム：  PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウエア：  パテントインリリース♯1.0,バージョン#1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：  US
（B）出願日：  1997年3月3日
（C）分類：
（viii）弁護士／エージェント情報：
（A）名前：  Jackson Esq., David A.
（B）登録番号：  26,742
（C）参照／整理番号：  1113-1006
（ix）通信情報：
（A）電話：  201-487-5800
（B）ファックス：  201-343-1684
（２）SEQ ID NO:１の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  9646ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  cDNA
（iii）仮説：  なし
（iv）アンチセンス：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１：
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（２）SEQ ID NO:２の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  3012アミノ酸
（B）タイプ：  アミノ酸
（C）ストランドネス：  一本鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  タンパク質
（iii）仮説：  なし
（v）フラグメントタイプ：  Ｎ末端
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:２：
0004094679.tif 000018
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（２）SEQ ID NO:３の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  38ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:３：
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（２）SEQ ID NO:４の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  101ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:４：
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（２）SEQ ID NO:５の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  12980ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  cDNA
（iii）仮説：  なし
（iv）アンチセンス：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:５：
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（２）SEQ ID NO:６の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  21ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ： DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:６：
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（２）SEQ ID NO:７の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  20ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:７：
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（２）SEQ ID NO:８の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  27ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:８：
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（２）SEQ ID NO:９の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  18ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
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（２）SEQ ID NO:１０の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  16ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１０：
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（２）SEQ ID NO：１１の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  17ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１１：
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（２）SEQ ID NO：１２の情報：
（i）配列特徴：
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（B）タイプ：  核酸
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（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
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（２）SEQ ID NO:１３の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  18ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１３：
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（２）SEQ ID NO:１４の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  16ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１４：
0004094679.tif 000049
（２）SEQ ID NO:１５の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  17ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１５：
0004094679.tif 000050
（２）SEQ ID NO:１６の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  18ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１６：
0004094679.tif 000051
（２）SEQ ID NO:１７の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  16ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：SEQ ID NO:１７：
0004094679.tif 000052
（２）SEQ ID NO:１８の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  30ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:１８：
0004094679.tif 000053
（２）SEQ ID NO:１９の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  9416ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：cDNA
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：SEQ ID NO:１９：
0004094679.tif 000054
0004094679.tif 000055
0004094679.tif 000056
0004094679.tif 000057
0004094679.tif 000058
0004094679.tif 000059
0004094679.tif 000060
（２）SEQ ID NO:２０の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  3011アミノ酸
（B）タイプ：  アミノ酸
（C）ストランドネス：  一本鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  タンパク質
（iii）仮説：  なし
（v）フラグメントタイプ：  Ｎ末端
（xi）配列記述：  SEQ ID NO:２０：
0004094679.tif 000061
0004094679.tif 000062
0004094679.tif 000063
0004094679.tif 000064
0004094679.tif 000065
0004094679.tif 000066
0004094679.tif 000067
0004094679.tif 000068
0004094679.tif 000069
0004094679.tif 000070
0004094679.tif 000071
（２）SEQ ID NO:２１の情報：
（i）配列特徴：
（A）長さ：  10ベースペア
（B）タイプ：  核酸
（C）ストランドネス：  二重鎖
（D）トポロジー：  直線
（ii）分子タイプ：  DNA（ゲノム）
（iii）仮説：  なし
（xi）配列記述：SEQ ID NO:２１：
0004094679.tif 000072
【図１】
0004094679.tif 000073
【図２】
0004094679.tif 000074
【図３ａ】
0004094679.tif 000075
【図３ｂ】
0004094679.tif 000076
【図４】
0004094679.tif 000077
【図５】
0004094679.tif 000078
【図６】
0004094679.tif 000079
【図７】
0004094679.tif 000080
【図８】
0004094679.tif 000081
【図９】
0004094679.tif 000082
0004094679.tif 000083
0004094679.tif 000084
0004094679.tif 000085
0004094679.tif 000086
0004094679.tif 000087
0004094679.tif 000088
0004094679.tif 000089
0004094679.tif 000090
0004094679.tif 000091
0004094679.tif 000092
0004094679.tif 000093
0004094679.tif 000094
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0004094679.tif 000099
0004094679.tif 000100
0004094679.tif 000101
0004094679.tif 000102
0004094679.tif 000103
0004094679.tif 000104
0004094679.tif 000105
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0004094679.tif 000107
0004094679.tif 000108
0004094679.tif 000109
0004094679.tif 000110
0004094679.tif 000111
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0004094679.tif 000113
0004094679.tif 000114
【図１０】
0004094679.tif 000115
【図１１】
0004094679.tif 000116