(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、配列番号：１５に示される配列に対し９０％より大きな同一性を有する配列である、組換えヘモフィルス付着タンパク質。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号：１５に示される配列または配列番号：１５の配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入された配列である、請求の範囲第１項に記載の組換えヘモフィルス付着タンパク質。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列番号：１５に示される配列である、請求の範囲第１項に記載の組換えヘモフィルス付着タンパク質。
【請求項４】
アミノ酸配列が、配列番号：１５に示される配列または配列番号：１５の配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入された配列である、組換えヘモフィルス付着タンパク質をコードする組換え核酸。
【請求項５】
配列番号：１４に示される核酸配列と高ストリンジェンシー条件下ハイブリダイズし得るＤＮＡを含む請求の範囲第４項に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号：１４に示される配列からなるＤＮＡを含む請求の範囲第４項に記載の核酸。
【請求項７】
ヘモフィルス付着タンパク質をコードする請求の範囲第４項に記載の核酸に実施可能なように結合された転写及び翻訳調節核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
ヘモフィルス付着タンパク質をコードする請求の範囲第４項に記載の核酸を含む発現ベクターにより形質転換さえた宿主細胞。
【請求項９】
a）請求の範囲第１項に記載のヘモフィルス付着タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、そして
b）前記核酸を発現してヘモフィルス付着タンパク質を生産すること、
を特徴とするヘモフィルス付着タンパク質の生産方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１項に記載のヘモフィルス付着タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
米国政府は国立健康協会からの助成金番号AI-21707及びHD-29687に従ってこの発明に或る種の権利を有する。
発明の分野
本発明は新規なヘモフィルス付着タンパク質、核酸、及び抗体に関する。
発明の背景
殆どのバクテリア疾患は特別な粘膜表面の集落形成により開始する（Beacheyら，1981, J.Infect.Dis. 143:325-345）。成功裏の集落形成は、生物が粘膜表面の機械的浄化を克服し、局所免疫応答を免れることを必要とする。集落形成のプロセスは宿主細胞への結合を促進する特殊微生物因子に依存する（Hultgrenら，1993 Cell, 73:887-901）。或る場合には、集落形成生物がその後にこれらの細胞に入り（侵入し）、細胞内で生存する（Falkow, 1991, Cell 65:1099-1102）。
ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）はヒト呼吸道の普通の共生生物である（Kuklinska及びKilian, 1984, Eur.J.Clin.Microbiol. 3:249-252）。それはバクテリア髄膜炎の最も普通の原因及びその他の侵入性（菌血）疾患をもたらす原因である。加えて、この生物は急性及び慢性の中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、及び肺炎のかなり大きな部分の原因である。
ヘモフィルス・インフルエンザは、通常ヒト鼻咽頭中にあり、消滅を避けるためにこの部位を集落形成する必要があるヒト特異的生物である。この微生物は宿主細胞への付着を促進することができる幾つかの表面構造を有する（Guerinaら，1982, J.Infect.Dis. 146:564; Pichicheroら，1982, Lancet ii:960-962; St.Gemeら，1993, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 90:2875-2879）。加えて、ヘモフィルス・インフルエンザはこれらの細胞内に侵入し、生存する能力を獲得していた（Forsgrenら，1994, Infect.Immun. 62:673-679; St.Geme及びFalkow, 1990, Infect. Immun. 58:4036-4044; St.Geme及びFalkow, 1991, Infect. Immun. 59:1325-1333, Infect.Immun. 59:3366-3371）。その結果、このバクテリアは局所呼吸道及び全身の疾患の両方の重大な原因である（Turk, 1984, J.Med.Microbiol. 18:1-16）。非被包、非類型（non-typable）株は局所疾患の大半の原因である（Turk, 1984，上記文献）。対照的に、血清型b株（これはリボースとリビトール−５−ホスフェートのポリマー（PRP）を含むカプセルを発現する）はヘモフィルス・インフルエンザ全身性疾患の原因の95％以上の原因である（Turk, 1982, Clinical importance of Haemophilus influenzae, p.3-9, S.H.Sell及びP.F.Wright編集,Haemophilus influenzae epidemiology, immunology, and prevention of dise-ase, Elsevier/North-Holland Publishing Co., New York）。
ヘモフィルス・インフルエンザによる疾患の病因における初期段階は上部呼吸粘膜の集落形成を伴う（Murphyら，1987, J.Infect.Dis. 5:723-731）。特別な株による集落形成は数週〜数ケ月にわたって続くことがあり、殆どの個体がこの期間中に無症候のままである（Spinolaら，1986, J.Infect.Dis. 154:100-109）。しかしながら、或る状況では、集落形成に続いて呼吸道内に連続の広がりが起こり、中耳、副鼻腔、結膜または肺中に局所疾患を生じるであろう。また、時折、バクテリアが鼻咽頭上皮バリアに侵入し、血流に入る。
in vitro観察及び動物研究は、線毛（またはフィンブリア）と称されるバクテリア表面付属器がヘモフィルス・インフルエンザ集落形成に重要な役割を果たすことを示唆する。1982年に、二つのグループがピリエーション（piliation）とヒトの口咽頭上皮細胞及び赤血球への増大された付着の間の相関関係を報告していた（Guerinaら，上記文献；Pichicheroら，上記文献）。その他の研究者らは、抗線毛抗体が線毛状（piliated）ヘモフィルス・インフルエンザによる付着をin vitroで阻止することを実証していた（Forneyら，1992, J.Infect.Dis. 165:464-470; van Alphenら，1988, Infect.Immun. 56:1800-1806）。最近、Weberらはヘモフィルス・インフルエンザ型ｂ株中の線毛構造遺伝子を挿入不活化し、それにより線毛の発現を排除した。得られる変異体は年老いたモンキーの集落形成について低下された能力を示した（Weberら，1991, Infect.Immun. 59: 4724-4728）。
幾つかの論文は、無線毛因子がまたヘモフィルス集落形成を促進することを示唆している。ヒト鼻咽頭臓器培養モデルを使用して、Farleyら（1986, J.Infect.Dis. 161:274-280）及びLoebら（1988, Infect.Immun. 49:484-489）は、無線毛状（nonpiliated）型ｂ株が粘膜に付着することができることを観察した。Read及び共同研究者らは臓器培養中に鼻甲介組織を使用するモデルで非類型株を調べた際に同様の観察をしていた（1991, J.Infect.Dis. 163:549-558）。Weberら（1991,上記文献）によるサル集落形成研究において、無線毛状生物は、減少された密度であるが、集落形成の能力を保持した。更に、線毛状株で初期感染されたサルの中で、鼻咽頭から回収された実際に全ての生物が無線毛状であった。これらの観察の全ては、ヘモフィルス・インフルエンザで集落形成された幼児からの鼻咽頭分離物が頻繁に無線毛状であるという知見と一致する（Masonら，1985, Infect. Immun. 49:98-103; Brintonら，1989, Pediatr. Infect.Dis.J. 8:554-561）。
先の研究は、ヘモフィルス・インフルエンザが線毛非依存性メカニズムにより培養ヒト上皮細胞に入る（侵入する）ことができることを示していた（St.Geme及びFalkow, 1990，上記文献; St.Geme及びFalkow, 1991，上記文献）。ヘモフィルス・インフルエンザは一般に細胞寄生虫と考えられないが、最近の論文は、これらのin vitro知見がin vivo相関関係を有するかもしれないと示唆している（Forsgrenら，1994，上記文献）。Forsgren及び共同研究者らは、長い間存続する分泌性中耳炎またはアデノイド肥大のためにアデノイドを除去した10人の幼児からのアデノイドを調べた。全ての10の症例において、生存細胞内ヘモフィルス・インフルエンザがあった。電子顕微鏡は、これらの生物が細網陰窩上皮中及び組織の上皮下の層中のマクロファージ様細胞中に集中されることを示した。一つの可能性は、宿主細胞へのバクテリア侵入が局所免疫応答の回避のメカニズムを与え、それにより呼吸道中の存続を可能にすることである。
こうして、ヘモフィルス・インフルエンザの治療上及び予防上の措置のためのワクチンが望ましい。それ故、本発明の目的は組換えヘモフィルス付着（HA）タンパク質及びその変異体を提供し、組換えＤＮＡ技術を使用してこれらのHAタンパク質の有益な量を生産することである。
本発明の更に別の目的はHAタンパク質をコードする組換え核酸、並びにHAタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供することである。
本発明の追加の目的はヘモフィルス感染症の診断のためのモノクローナル抗体を提供することである。
本発明の更に別の目的はHAタンパク質の生産方法、及び本発明のHAタンパク質を含むワクチンを提供することである。
また、ヘモフィルス感染症の治療上及び予防上の措置方法が提供される。
発明の要約
以上の目的に従って、本発明は組換えHAタンパク質、及び本発明のHAタンパク質をコードする単離核酸または組換え核酸を提供する。また、転写及び翻訳の調節ＤＮＡに実施可能なように結合されたHAタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、及び発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
また、本発明は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、HAタンパク質をコードする核酸の発現を生じて組換えHAタンパク質を生産することを特徴とするHAタンパク質の生産方法を提供する。
また、本発明は免疫応答を患者中で生じる際の予防上または治療上の使用のためのHAタンパク質を含むヘモフィルス・インフルエンザ感染症のワクチンを含む。ヘモフィルス・インフルエンザ感染症の治療方法または予防方法はワクチンを投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
図1A、1B、及び1CはHA1の核酸配列を示す。
図２はHA1のアミノ酸配列を示す。
図3A、3B、3C、3D、3E、3F及び3GはHA2の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。
図４はHA1及びHA2の図式配置を示す。配列類似性の領域が夫々Ｎ−末端ドメイン、内部ドメイン、及びＣ末端ドメインに相当する陰影付きバー、縞のあるバー、及びオープンバーにより示される。中実の円は保存されたウォーカーボックスATP結合モチーフ（GINVSGKT）を表す。バーの上の数字は完全長タンパク質中のアミノ酸残基位置を表す。HA2バーの下の括弧中の数字はこれらのドメインと相当するHA1ドメインの間の類似性％／同一性％を表す。アミノ酸残基51〜173、609〜846、及び1292〜1475により形成されたHA2の領域はHA1のアミノ酸51〜220に対する最小類似性を示す。
図５はHA1及びHA2のＮ末端アミノ酸配列の間の相同性を示す。１文字略号がアミノ酸に使用される。線は残基間の同一性を示し、二つの点は保存変化、即ち、残基間の類似性を示す。
図６はファージ11-17及びプラスミドpT7-7サブクローンの制限地図を示す。
図７はpDC400及び誘導体の制限地図を示す。pDC400はpUC19にクローン化された株C54からの9.1kbインサートを含む。ベクター配列がハッチ付きボックスにより表される。上部水平線の上の文字は制限酵素部位：Bg、BglII;Ｅ、EcoRI; Ｈ、HindIII; P、PstI; S、SalI; Ss、SstI; X、XbaIを示す。矢印を含む太い水平線はpDC400内のhsf遺伝子座の位置及び転写の方向を表す。縞のある水平線はサザン分析のためのプローブとして使用された3.3kb遺伝子内フラグメントを表す。プラスミドpDC602（これは示されていない）はpDC601と同じインサートを含むが、反対の配向である。
図８はバクテリオファージT7発現系を使用するプラスミドによりコードされたタンパク質の同定を示す。バクテリアをトランス−[35S]標識で放射能標識し、全細胞溶解産物を7.5％SDS-ポリアクリルアミドゲルで分解した。タンパク質をオートラジオグラフィーにより視覚化した。レーン１、未誘導E.coliBL21（DE3）/pT7-7;レーン２、誘導BL21（DE3）/pT7-7;レーン３、未誘導BL21（DE3）/pDC 602;レーン４、誘導BL21（DE3）/pDC602; レーン５、未誘導BL21（DE3）/pDC601; レーン６、誘導BL21（DE3）/pDC601。プラスミドpDC602及びpDC601は、反対配向のpDC400からの8.3kb XbaIフラグメントを含むpT7-7の誘導体である。アステリスクはBL21（DE3）/pDC601中の過剰発現されたタンパク質を示す。
図９は、HA2 vs HA1で探査する、ヘモフィルス・インフルエンザ株C54及び11からの染色体ＤＮＡのサザン分析を示す。ＤＮＡフラグメントを0.7％のアガロースゲルで分離し、HA1またはHA2で探査する前にニトロセルロース膜に二方向に移した。レーン１、BglIIで消化されたC54染色体ＤＮＡ；レーン２、ClaIで消化されたC54染色体ＤＮＡ；レーン３、PstIで消化されたC54染色体ＤＮＡ；レーン４、BglIIで消化された11染色体ＤＮＡ；レーン５、ClaIで消化された11染色体ＤＮＡ；レーン６、XbaIで消化された11染色体ＤＮＡ。A.株C54からのHA2の3.3kb PstI-BglII遺伝子内フラグメントとのハイブリダイゼーション。
B.株11からのHA1の1.6kb StyI-SspI遺伝子内フラグメントとのハイブリダイゼーション。
図10はHA2 vs HA1を宿すE.coli DH5αの細胞結合特異性の比較を示す。記載されたようにしてバクテリアを30分間にわたって真核細胞単層とともにインキュベートした後に付着を測定し、付着コロニー形成単位の数を接種されたコロニー形成単位の数で割ることにより計算した（St.Gemeら，1993）。値は代表的な実験から３回反復して行った測定の平均±SEMである。プラスミドpDC601はヘモフィルス・インフルエンザ株C54からのHA2遺伝子を含み、一方、pHMW8-5は非類型ヘモフィルス・インフルエンザ株11からのHA1遺伝子を含む。pT7-7をクローニングベクターとして使用して、pDC601及びpHMW8-5の両方を調製した。
図11はHA2、HMW1、HMW2、AIDA-I、Tsh、及びSepAのＮ末端の比較を示す。HA2のＮ末端配列がHA1（Barenkamp,S.J．及びJ.W.St.Geme, III.Identification of a second family of high molecular weight adhesion proteins expressed by nontypable Haemophilus influenzae. Mol.Microbiol.印刷中）、HMW1及びHMW2（Barenkamp,S.J.及びE.Leininger, 1992, Cloning, expression, and DNA sequence analysis genes encoding nontypable Haemophilus influenzae high molecular weight surface-exposed proteins related to filamentous hemagg-lutinin of Bordetella pertussis, Infect.Immun. 60:1302-1313）、AIDA-I（Benz,I.及びM.A.Schmidt, 1992, AIDA-I, the adhesin involved in diffuse a dherenceof the diarrhoeagenic Escherichia coli strain 2787（O126:H27）is synthesizedvia a precursor molecule. Mol.Microbiol. 6:1539-1546）、Tsh（Provence,D.及びR.Curtiss III.1994, Isolation and characterization of a gene involved in hemagglutination by an avian pathogenic Escherichia coli strain. Infect.Immun. 62:1369-1380）、及びSepA（Benjelloun-Touimi,Z.、P.J.Sansonetti及びC.Parsot. 1995, SepA, the major extracellular protein of Shigella flexn-eri: autonomous secretion and involvement in tissue invasio. Mol.Microbiol.17:123-135）のＮ末端配列と並べられる。コンセンサス配列が下の行に示される。
図12はヘモフィルス・インフルエンザ型ｂの疫学上異なる株からの染色体ＤＮＡのサザン分析を示す。染色体ＤＮＡをBglIIで消化し、0.7％のアガロースゲルで分離し、ニトロセルロースに移し、株C54からのhsfの3.3kb PstI-BglII遺伝子内フラグメントで探査した。レーン１、株C54;レーン２、株1081; レーン３、株1065; レーン４、株1058; レーン５、株1060; レーン６、株1053; レーン７、株1063; レーン８、株1069; レーン９、株1070; レーン10、株1076; レーン11、株1084。
図13はヘモフィルス・インフルエンザの非型ｂ被包株からの染色体ＤＮＡのサザン分析を示す。染色体ＤＮＡをBglIIで消化し、0.7％のアガロースゲルで分離し、ニトロセルロースに移し、株C54からのhsfの3.3kb PstI-BglII遺伝子内フラグメントで探査した。レーン１、SM4（型ａ）；レーン２、SM72（型ｃ）；レーン３、SM6（型ｄ）；レーン４、Rd（型ｄ）；レーン５、SM7（型ｅ）；レーン６、142（型ｅ）；レーン７、327（型ｅ）；レーン８、351（型ｅ）；レーン９、134（型ｆ）；レーン10、219（型ｆ）；レーン11、346（型ｆ）；レーン12、503（型ｆ）。
図14A及び14BはHA3の核酸配列である。
図15はHA3のアミノ酸配列である。
図16A及び16BはHA1とHA3のアミノ酸配列の間の相同性を示す。１文字略号がアミノ酸について使用される。線は残基間の同一性を表し、二つの点は保存変化、即ち、残基間の類似性を示す。
発明の詳細な説明
本発明は新規なヘモフィルス付着（HA）タンパク質を提供する。好ましい実施態様において、HAタンパク質はヘモフィルス株からのものであり、好ましい実施態様において、ヘモフィルス・インフルエンザからのものである。特に、ヘモフィルス・インフルエンザ被包型ｂ株が本発明のHAタンパク質をクローン化するのに使用される。しかしながら、以下に概説される技術を使用して、その他のヘモフィルス・インフルエンザ株、またはナイセリア（Neisseria）種またはボルデタラ（Bordetalla）種の如きその他のバクテリア種からのHAタンパク質がまた得られてもよい。
３種のHAタンパク質、HA1、HA2及びHA3が夫々図２、３及び15に示される。HA2は表面フィブリルの形成と関連し、これらは種々の宿主細胞への付着に関係する。また、HA1は同様の一連の宿主細胞への付着にかかわっていた。HA1またはHA2核酸が以下に記載されるようにE.coliの非付着株中で発現される場合、E.coliはヒト宿主細胞に付着する能力を獲得する。文献には、HA1がhia（ヘモフィルス・インフルエンザ付着）と称され、またHA2がhsf（ヘモフィルス表面フィブリル）と称されることが注目されるべきである。
HAタンパク質は幾つかの方法で同定し得る。HA核酸またはHAタンパク質は最初に図１、２、３、14または15に示された配列に対する実質的な核酸及び／またはアミノ酸配列相同性により同定される。このような相同性は全体の核酸またはアミノ酸配列或いはその部分に基き得る。
本明細書に使用されるように、図２及び／または図３及び／または図15に示されたアミノ酸配列に対するタンパク質配列の全体の相同性が好ましくは約45〜50％より大きく、更に好ましくは約65％より大きく、最も好ましくは80％より大きい場合、タンパク質は“HAタンパク質”である。幾つかの実施態様において、相同性は約90〜95または98％程度に高いであろう。即ち、HA1、HA2及びHA3のアミノ酸配列の一つ、二つまたは三つ全部に対し少なくとも50％（またはそれより大）の相同性を有するタンパク質がHAタンパク質と考えられる。この相同性は、Devereuxら，Nucl.Acid Res. 12:387-395（1984）により記載されたベスト・フィット配列プログラムまたはBLASTXプログラム（Altschulら，J.Mol.Biol. 215: 403-410（1990））の如き当業界で知られている通常の技術を使用して測定されるであろう。その整列は並べられる配列中のギャプの導入を含んでもよい。以下に特に言及されるように、HA1及びHA3とHA2の如き異なる長さのタンパク質の比較においては、相同性は短い配列の長さに基いて測定される。
好ましい実施態様において、HAタンパク質は図４、５及び15に示されたHA1、HA2及びHA3タンパク質のＮ末端領域もしくはＣ末端領域またはその両方に対し有意な相同性を有するものと定義される。約50アミノ酸のＮ末端領域が実際にHA1とHA3の間で同一であり（98％の相同性）、またHA1またはHA3とHA2の間では74％である。図11に示されるように、HA1及びHA2のＮ末端の最初の24アミノ酸は幾つかのその他のタンパク質に対し制限された相同性を有するが、この相同性は50％以下である。こうして、HAタンパク質は少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約70％、最も好ましくは少なくとも約80％のＮ末端領域に対する相同性を有するものとして定義されてもよく、90または95％程度に高い相同性が特に好ましい。同様に、Ｃ末端領域の少なくとも約75、好ましくは100、最も好ましくは125アミノ酸残基がまた高度に相同であり、HAタンパク質を同定するのに使用し得る。図16に示されるように、HA1及びHA3のＣ末端120程度のアミノ酸の間の相同性は約98％であり、またHA1またはHA3とHA2の間では約98％である。こうして、Ｃ末端における相同性はHAタンパク質を同定する特に有益な方法である。それ故、HAタンパク質は少なくとも約60％、好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも約80％のＣ末端領域に対する相同性を有するものとして定義でき、90または95％程度に高い相同性が特に好ましい。好ましい実施態様において、HAタンパク質はＮ末端領域及びＣ末端領域の両方に対し相同性を有する。
加えて、HAタンパク質は図４に示されるように少なくともHA1及びHA2タンパク質中に見られるアミノ酸相同性の少なくとも一つのストレッチを含むものとして同定されてもよい。HA2はアミノ酸221〜658により形成されたHA1の領域に対し有意な相同性を示すアミノ酸の三つの別個のストレッチ（夫々174〜608、847〜1291、及び1476〜1914）を含む。
本発明のHAタンパク質はヘモフィルス・インフルエンザの高分子量タンパク質-1（HMW1）、並びにE.coliのAIDA-I付着に対し制限された相同性を有する。HMW1について、この相同性はHA1タンパク質の残基60-540とHMW1の残基1100〜約1550の間で最大であり、この重なり領域では20％の相同性を有する。AIDA-Iタンパク質について、AIDA-Iの最初の30アミノ酸とHA1の間におよそ50％の相同性があり、タンパク質間の全体の相同性はおよそ22％である。
加えて、本発明のHA1、HA2及びHA3タンパク質は図４、５及び16に示されるように互いに相同性を有する。HA1とHA2の間では、相同性は全体で81％の類似性及び72％の同一性である。HA3とHA1は51％同一であり、65％類似している。こうして、本発明の目的のために、HA1、HA2及びHA3は全てHAタンパク質である。
“HA1”タンパク質は図２に示された配列に対する実質的な相同性により特定される。この相同性は好ましくは約60％より大きく、更に好ましくは約70％より大きく、最も好ましくは80％より大きい。好ましい実施態様において、相同性は約90〜95または98％程度に高いであろう。同様に、“HA2”タンパク質は図３に示された配列に対する同じ実質的な相同性により特定されてもよく、“HA3”タンパク質は上記のように図15を参考にして特定される。
加えて、図２、３及び15に示されたタンパク質より多いか、または少ないアミノ酸を含む配列について、相同性の％はアミノ酸の合計数に対する相同のアミノ酸の数に基いて測定されるであろう。こうして、例えば、以下に説明されるように、図２、３及び15に示された配列より短い配列の相同性は、短い配列中のアミノ酸の数を使用して測定されるであろう。
本発明のHAタンパク質は図２、３及び15に示されたアミノ酸配列より短くてもよい。こうして、好ましい実施態様において、図２、３及び15に示された配列の部分またはフラグメントがHAタンパク質の定義に含まれる。一般に、HAタンパク質フラグメントは約７アミノ酸から約800アミノ酸までのサイズの範囲であってもよく、約15から約700アミノ酸までが好ましく、約100から約650アミノ酸までがまた好ましい。特に好ましいフラグメントはHAに特有の配列である。これらの配列は、HAタンパク質に特異性の抗体を産生するため、またはワクチンとしての特別な使用のために、その他の生物からHAタンパク質をクローン化するのに特別な用途を有する。特有の配列はHAタンパク質配列の試験及びその他のタンパク質との比較により、例えば、図５及び16に示された配列整列の試験により当業者により容易に同定される。好ましい特有の配列は、図２、３及び15に示された、およそ50アミノ酸及びＣ末端120アミノ酸を含む、HA1、HA2及びHA3タンパク質のＮ末端領域を含む。HAタンパク質の定義に含まれるHAタンパク質フラグメントは、タンパク質が生物活性であることを依然として可能にし、例えば、以下に記載されるように付着を依然として可能にするＮ末端またはＣ末端のトランケーション及び欠失を含む。加えて、HAタンパク質が、例えば、ワクチンとして抗体を産生するのに使用される場合、HAタンパク質は図２、３及び15に示された配列を有する少なくとも一つのエピトープまたは決定基を共有する必要がある。好ましい実施態様において、エピトープはHAタンパク質に特有である。即ち、特有のエピトープに対して産生された抗体はその他のタンパク質との交差反応性を殆どまたは全く示さない。しかしながら、その他のタンパク質との交差反応性は免疫原用途または診断用途のためのこのようなエピトープまたは抗体を排除しない。本明細書中の“エピトープ”または“決定基”は抗体を産生し、かつ／または結合するタンパク質の部分を意味する。こうして、殆どの場合、小さいHAタンパク質に対してつくられた抗体は完全長タンパク質に結合することができるであろう。
幾つかの実施態様において、抗体を産生するのに使用されるHAタンパク質のフラグメントは小さい。こうして、それらは当業界で知られているようにハプテンとして使用され、タンパク質キャリヤーにカップリングされて抗体を産生し得る。
加えて、図２、３及び15に示された配列よりも長い配列がまたHAタンパク質の定義に含まれる。
抗体は、外膜、即ち、露出表面において、露出するHAタンパク質の一部分に対し産生されることが好ましい。HA1、HA2及びHA3のアミノ末端部分は外部に露出されたタンパク質であると考えられる。
また、HAタンパク質はバクテリア付着と関連するものと同定されてもよい。こうして、天然産微生物、例えば、ヘモフィルス種からのHAタンパク質の欠失は結合能力の低下または不在をもたらす。幾つかの実施態様において、非付着性バクテリア、例えば、E.coli中のHAタンパク質の発現は細胞に結合する生物の能力をもたらす。
核酸の場合、核酸配列の全体の相同性はアミノ酸相同性に相応するが、異なる生物の遺伝子コード及びコドンバイアスにおける縮重を考慮する。それ故、核酸配列相同性はタンパク質配列の相同性よりも低くてもよく、また高くてもよい。こうして、図１、３及び14の核酸配列と較べて、核酸配列の相同性は約40％より大きいことが好ましく、約60％より大きいことが更に好ましく、80％より大きいことが最も好ましい。幾つかの実施態様において、相同性は約90〜95または98％程度に高いであろう。
タンパク質配列について概説されたように、好ましい実施態様はHA1、HA2及びHA3配列の特異なＮ末端領域及びＣ末端領域に対し実質的な相同性を有するHA核酸を使用する。
一実施態様において、核酸相同性はハイブリダイゼーション研究により測定される。こうして、例えば、高ストリンジェンシー下で図１、３及び14に示された核酸の全部または一部にハイブリッドを形成する核酸がHAタンパク質遺伝子と考えられる。高ストリンジェンシー条件として、65℃で２時間にわたる0.1X SSCによる洗浄が挙げられるが、これに限定されない。
本発明のHAタンパク質及び核酸は組換え体であることが好ましい。本明細書に使用される“核酸”はＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはデオキシ−及びリボヌクレオチドの両方を含む分子を表し得る。核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びセンス核酸及びアンチセンス核酸を含むオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス核酸が核酸の定義中に特別に含まれる。アンチセンス核酸は図１、３及び14に示された核酸配列の相当する非コードストランドにハイブリッドを形成するが、リボヌクレオチド並びにデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。一般に、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの発現を阻止するように機能し、その結果、HAタンパク質はつくられないか、または減少されたレベルでつくられる。核酸は二本鎖、一本鎖であってもよく、または二本鎖配列もしくは一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。本明細書中の“組換え核酸”という用語は、自然に通常見られない形態の、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によりin vitroで最初に生成された核酸を意味する。こうして、直線状形態の単離されたHAタンパク質遺伝子、または通常結合されないＤＮＡ分子をつなぐことによりin vitroで生成された発現ベクターが両方とも本発明の目的のための組換え体と考えられる。即ち、HA核酸は、それが通常見られる天然産ヘモフィルス染色体以外に結合される。組換え核酸が一旦つくられ、宿主細胞または生物に再度導入されると、それは非組換え的に、即ち、in vitro操作ではなく宿主細胞のin vivo細胞機構を使用して複製するであろう。しかしながら、このような核酸は、一旦組換え生産されると、その後に非組換え的に複製されるが、依然として本発明の目的のための組換え体と考えられる。
同様に、“組換えタンパク質”は、組換え技術を使用して、即ち、上記の組換え核酸の発現によりつくられたタンパク質である。組換えタンパク質は少なくとも一つ以上の特徴により天然産タンパク質から区別される。例えば、タンパク質は、それが通常その野生型宿主中に混在し、または宿主細胞それ自体の不在下で見られるタンパク質及び化合物の一部または全部から単離されてもよい。こうして、タンパク質は部分的または実質的に精製されてもよい。定義は異なる生物中の一種の生物または宿主細胞からのHAタンパク質の生産を含む。また、タンパク質は、誘導プロモーターまたは高発現プロモーターの使用により、通常見られるよりもかなり高い濃度でつくられてもよく、その結果、タンパク質は増大された濃度レベルでつくられる。また、タンパク質は、エピトープ標識の付加またはアミノ酸置換、挿入及び欠失のように、自然に通常見られない形態であってもよい。更に、“組換え体”と通常考えられないが、図２、３及び15の配列情報を使用して化学的に合成されるタンパク質またはタンパク質の部分が同様に本明細書中組換え体と考えられる。
また、以下に概説されるようにクローン化され、発現される、その他の生物からのHAタンパク質がHAタンパク質の定義に含まれる。
アンチセンス核酸の場合、アンチセンス核酸は図１、３及び14に示された配列の相当する非コード配列の全部または一部にハイブリッドを形成するものと定義される。一般に、アンチセンスハイブリダイゼーションの測定に使用されるハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェンシー条件、例えば、65℃における0.1X SSCであろう。
HAタンパク質核酸が一旦同定されると、それがクローン化され、必要により、その構成部分が組換えられて全HAタンパク質核酸を生成し得る。一旦、その天然源から単離され、例えば、プラスミドまたはその他のベクター中に含まれ、または直線状核酸セグメントとしてそれから切除されると、組換えHAタンパク質核酸はその他のHAタンパク質核酸を同定し、単離するためのプローブとして更に使用し得る。また、それは修飾された、または変異体のHAタンパク質核酸及びタンパク質をつくるための“前駆体”核酸として使用し得る。
HAタンパク質をコードする本発明の核酸を使用して、種々の発現ベクターがつくられる。発現ベクターは自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組込むベクターであってもよい。一般に、これらの発現ベクターはHAタンパク質をコードする核酸に実施可能なように結合された転写及び翻訳調節核酸を含む。この文脈中の“実施可能なように結合された”とは、転写が開始されるような様式で、転写及び翻訳調節ＤＮＡがHAタンパク質のコード配列に対し配置されることを意味する。一般に、これは、プロモーター及び転写開始配列がHAタンパク質コード領域に5’に配置されることを意味するであろう。転写及び翻訳調節核酸は一般にHAタンパク質を発現するのに使用される宿主細胞に適するであろう。例えば、バチルスからの転写及び翻訳調節核酸配列がバチルス中でHAタンパク質を発現するのに使用されるであろう。多数の型の適当な発現ベクター、及び好適な調節配列が種々の宿主細胞について当業界で知られている。
一般に、転写及び翻訳調節配列として、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写終止配列、翻訳開始配列及び翻訳終止配列、並びにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、調節配列はプロモーター配列並びに転写開始配列及び転写終止配列を含む。
プロモーター配列は構成的プロモーターまたは誘導プロモーターをコードする。プロモーターは天然産プロモーターまたはハイブリッドプロモーターであってもよい。ハイブリッドプロモーター（これは一種よりも多いプロモーターの要素を組み合わせる）がまた当業界で知られており、本発明に有益である。
加えて、発現ベクターは付加的な要素を含んでもよい。例えば、発現ベクターは二つの複製系を有してもよく、こうして、それが２種の生物中、例えば、発現のための哺乳類細胞または昆虫細胞中、またクローニング及び増幅のための原核生物宿主中で維持されることを可能にする。更に、発現ベクターを組込むために、発現ベクターは宿主細胞ゲノムに相同の少なくとも一つの配列、好ましくは発現構築物に隣接する二つの相同配列を含む。組込みベクターは、ベクター中のとり込みに適した相同配列を選択することにより宿主細胞中の特定の遺伝子座に誘導されてもよい。組込みベクターのための構築物は当業界で公知である。
加えて、好ましい実施態様において、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界で公知であり、使用される宿主細胞により変化するであろう。
本発明のHAタンパク質は、HAタンパク質の発現を誘導し、または生じるのに適した条件下で、HAタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することにより生産される。HAタンパク質発現に適した条件は発現ベクター及び宿主細胞の選択により変化し、ルーチン実験により当業者により容易に確かめられるであろう。例えば、発現ベクター中の構成的プロモーターの使用は宿主細胞の成長及び増殖を最適化することを必要とし、一方、誘導プロモーターの使用は誘導に適した生育条件を必要とする。加えて、幾つかの実施態様において、回収の時期が重要である。例えば、昆虫細胞発現に使用されるバキュロウイルス系は溶解性ウイルスであり、こうして回収時間選択は生産歩留りに重要であり得る。
適当な宿主細胞として、酵母、バクテリア、古細菌、菌類、及び昆虫並びに哺乳類細胞を含む動物細胞が挙げられる。ドロソフィラ・メランガスター（Drosop-hila melangaster）細胞、サッカロミセス・セレビジアエ（Saccharomyces cere-visiae）及びその他の酵母、E.coli、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、SF9細胞、C129細胞、293細胞、ノイロスポラ（Neurospora）、BHK、CHO、COS、及びヒーラ細胞、不死化哺乳類ミエロイド及びリンパ細胞系が特に重要である。
好ましい実施態様において、HAタンパク質はバクテリア系中で発現される。バクテリア発現系は当業界で公知である。
好適なバクテリアプロモーターは、バクテリアＲＮＡポリメラーゼを結合することができ、かつｍＲＮＡへのHAタンパク質のコード配列の下流（3’）転写を開始することができるあらゆる核酸配列である。バクテリアプロモーターは、通常コード配列の5’末端に近位に配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は典型的にはＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は特に有益なプロモーター配列を与える。例として、糖代謝酵素、例えば、ガラクトース、ラクトース及びマルトースに由来するプロモーター配列、並びにトリプトファンの如き生合成酵素に由来する配列が挙げられる。また、バクテリオファージからのプロモーターが使用されてもよく、当業界で知られている。加えて、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターがまた有益である。例えば、tacプロモーターはtrpプロモーター配列及びlacプロモーター配列のハイブリッドである。更に、バクテリアプロモーターは、バクテリアＲＮＡポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する非バクテリア起源の天然産プロモーターを含むことができる。
機能性プロモーター配列の他に、有効なリボソーム結合部位が望ましい。E.coliにおいて、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガーノ（SD）配列と称され、開始コドンと、開始コドンの3-11ヌクレオチド上流に配置された長さ3-9ヌクレオチドの配列とを含む。
また、発現ベクターはバクテリア中のHAタンパク質の分泌を与えるシグナルペプチド配列を含んでもよい。シグナル配列は典型的には当業界で公知のように細胞からのタンパク質の分泌を誘導する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は生育培地（グラム陽性バクテリア）または細胞（グラム陰性バクテリア）の内膜と外膜の間に配置された周辺質空間に分泌される。
また、バクテリア発現ベクターは形質転換されたバクテリア株の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。好適な選択遺伝子として、バクテリアを薬剤、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対して耐性にする遺伝子が挙げられる。また、選択可能なマーカーは生合成遺伝子、例えば、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路中の生合成遺伝子を含む。
これらの成分は発現ベクターに構築される。バクテリアに関する発現ベクターは当業界で公知であり、中でも、バチルス・スブチリス、E.coli、ストレプトコッカス・セレモリス（Streptococcus cremoris）、及びストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）を含む。
バクテリア発現ベクターは、当業界で公知の技術、例えば、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション、等を使用してバクテリア宿主細胞に形質転換される。
一実施態様において、HAタンパク質は昆虫細胞中で生産される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特に、バキュロウイルスをベースとする発現ベクターが当業界で公知である。簡単に言えば、バキュロウイルスはその外殻タンパク質を非常に高レベルで生産する非常に大きいＤＮＡウイルスである。バキュロウイルスゲノムのサイズのために、外在性遺伝子は組換えによりウイルスゲノム中に入れられる必要がある。それ故、発現系の成分は、移入ベクター、通常バクテリアプラスミド（これはバキュロウイルスゲノムのフラグメントと、HAタンパク質の挿入に都合の良い制限部位の両方を含む）；移入ベクター中のバキュロウイル特異性フラグメントに相同の配列を有する野生型バキュロウイルス（これはバキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；並びに適当な昆虫宿主細胞及び生育培地を含む。
また、哺乳類発現系が当業界で知られており、一実施態様に使用される。哺乳類プロモーターは哺乳類ＲＮＡポリメラーゼを結合することができ、かつｍＲＮＡへのHAタンパク質のコード配列の下流（3’）転写を開始することができるあらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始部位の上流に配置された25-30塩基対を使用して、通常コード配列の5’末端に近位に置かれる転写開始領域とTATAボックスとを有するであろう。TATAボックスはＲＮＡポリメラーゼIIを誘導して正確な部位でＲＮＡ合成を開始するものと考えられる。また、哺乳類プロモーターは、典型的にはTATAボックスの上流の100〜200塩基対内に配置された、上流プロモーター要素を含むであろう。上流プロモーター要素は、転写が開始される速度を決定し、いずれかの配向で作用し得る。哺乳類ウイルス遺伝子からのプロモーターが哺乳類プロモーターとして特別に使用される。何となれば、ウイルス遺伝子がしばしば高度に発現され、しかも広い宿主範囲を有するからである。例として、SV40早期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、及び単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。
典型的には、哺乳類細胞により認識される転写終止配列及びポリアデニル化配列は翻訳終止コドンに3’に配置された調節領域であり、こうして、プロモーター要素と一緒に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの3’末端は部位特異性後翻訳開裂及びポリアデニル化により形成される。転写ターミネーターシグナル及びポリアデニル化シグナルの例として、SV40に由来するシグナルが挙げられる。
外在性核酸を哺乳類宿主、並びにその他の宿主に導入する方法は当業界で公知であり、使用される宿主細胞により変化するであろう。これらの技術として、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中の一種以上のポリヌクレオチドの封入、及び核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
好ましい実施態様において、HAタンパク質は酵母細胞中で生産される。酵母発現系は当業界で公知であり、サッカロミセス・セレビジアエ、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・マルトーサ（C.maltosa）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyve-romyces fragilis）及びクルイベロミセス・ラクチス（K.lactis）、ピチア・ギレリモンジ（Pichia guillerimondii）及びピチア・パストリス（P.pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schzosaccharomyces pombe）、並びにヤロビア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）に関する発現ベクターを含む。酵母中の発現に好ましいプロモーター配列として、誘導GAL1,10プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルベートキナーゼ、及び酸ホスファターゼ遺伝子からのプロモーターが挙げられる。酵母選択可能なマーカーとして、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1、及びALG7（これはツニカマイシンに対する耐性を与える）；G418耐性遺伝子（これはG418に対する耐性を与える）；及びCUP1遺伝子（これは酵母を銅イオンの存在下で成長させる）が挙げられる。
組換えHAタンパク質は細胞内で発現され、または分泌されてもよい。また、HAタンパク質は、当業界で公知の技術を使用して、融合タンパク質としてつくられてもよい。こうして、例えば、所望のエピトープが小さい場合、HAタンパク質はキャリヤータンパク質に融合されて免疫原を生成し得る。また、HAタンパク質は発現を増大するために融合タンパク質としてつくられてもよい。
また、アミノ酸配列変異体が本発明のHAタンパク質の定義に含まれる。これらの変異体は三つのクラス：置換変異体、挿入変異体または欠失変異体の一つ以上に入る。これらの変異体は通常当業界で公知のカセット突然変異誘発またはその他の技術を使用するHAタンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異性突然変異誘発により変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後ＤＮＡを先に概説したように組換え細胞培養物中で発現することにより調製される。しかしながら、約100-150までの残基を有する変異体HAタンパク質フラグメントが、確立された技術を使用してin vitro合成により調製されてもよい。アミノ酸配列変異体は変化の前もって決められた性質により特性決定され、その特徴がそれらをHAタンパク質アミノ酸配列の自然に起こる対立遺伝子変化または種間変化と区別する。変異体は典型的には天然産類似体と同じ定性生物活性を示すが、以下に充分に概説されるように変更された特徴を有する変異体をまた選択し得る。
アミノ酸変化を導入するための部位または領域は前もって決められるが、突然変異それ自体は前もって決められる必要はない。例えば、所定の部位で突然変異の性能を最適化するために、ランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で行われてもよく、発現されたHAタンパク質変異体が所望の活性の最適組み合わせについてスクリーニングされてもよい。既知配列を有するＤＮＡ中の前もって決められた部位で置換突然変異を行うための技術、例えば、M13プライマー突然変異誘発が公知である。変異体のスクリーニングは、HAタンパク質活性のアッセイを使用して行われる。例えば、HA突然変異遺伝子がHA欠失株に入れられ、本明細書に開示されたようにHA活性について試験される。遺伝子配列が与えられるとすると、欠失株の発生は当業界で知られている。例えば、変異体をコードする核酸が付着欠損株中で発現され、変異体ヘモフィルス・インフルエンザの付着及び感染力が評価されてもよい。例えば、以下に概説されるように、変異体がE.coli DH5α非付着株中で発現され、形質転換されたE.coli株がチャン結膜細胞を使用して付着について評価されてもよい。
アミノ酸置換は典型的には単一残基の置換である。挿入は通常約１〜20アミノ酸のオーダーであるが、かなり大きい挿入が寛容し得る。欠失は約１〜30残基の範囲であるが、幾つかの場合、例えば、HAタンパク質のドメインの一つが欠失される場合、欠失は極めて大きくてもよい。
置換、欠失、挿入またはこれらのあらゆる組み合わせが最終誘導体に到達するのに使用し得る。一般に、これらの変化は分子の変化を最小にするために少ないアミノ酸について行われる。しかしながら、或る状況下では、大きな変化が寛容し得る。
HAタンパク質の特徴の小さい変化が所望される場合、置換が一般に下記のチャートに従って行われる。
0004141496.tif 000002
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、チャート１に示された置換よりも保存的ではない選択を選択することによりつくられる。例えば、変化の領域中のポリペプチド主鎖の構造、例えば、α−らせんまたはβ−シート構造；標的部位における分子の電荷または疎水性；または側鎖の嵩に有意に影響する置換がなされてもよい。一般にポリペプチドの性質に最大の変化を生じるものと予想される置換は（a）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルに代えて（または、により）置換され、（b）システインまたはプロリンがその他の残基に代えて（または、により）置換され、（c）電気的に正の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルが電気的に負の残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに代えて（または、により）置換され、または（d）嵩高の側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖を有しない残基、例えば、グリシンに代えて（または、により）置換されるものである。
変異体は典型的には同じ定性生物活性を示し、天然産類似体と同じ免疫応答を誘発するが、変異体はまた必要によりポリペプチドの特徴を変更するように選択される。また、変異体は、HAタンパク質の生物活性が変更されるように設計されてもよい。例えば、ウォーカーボックスATP結合モチーフが変化または排除されてもよい。
好ましい実施態様において、HAタンパク質は発現後に精製または単離される。HAタンパク質は、どんなその他の成分がサンプル中に存在するのかに応じて当業者に知られている種々の方法で単離または精製されてもよい。通常の精製方法として、電気泳動技術、分子技術、免疫技術並びにイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び逆相HPLCクロマトグラフィー、並びにクロマトフォーカシングを含むクロマトグラフィー技術が挙げられる。例えば、HAタンパク質は、通常の抗HA抗体カラムを使用して精製されてもよい。タンパク質濃縮と連係して、限外濾過技術及び透析濾過（di-afiltration）技術がまた有益である。好適な精製技術の一般の手引きについて、Scopes,R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY（1982）を参照のこと。必要な精製の程度はHAタンパク質の用途に応じて変化するであろう。幾つかの場合、精製は必要ではないであろう。
一旦、発現され、必要により精製されると、HAタンパク質は幾つかの用途に有益である。
例えば、HAタンパク質は、通常の技術を使用して、アフィニティークロマトグラフィーカラムにカップリングし得る。次いでこれらのカラムはヘモフィルス・インフルエンザ生物に暴露された動物または患者から得られたサンプルから抗体を精製するのに使用し得る。次いで精製された抗体が以下に概説されるように使用し得る。
更に、HAタンパク質はHAタンパク質の抗体をつくるのに有益である。これらの抗体は幾つかの用途に使用される。抗体はサンプルまたは患者中のヘモフィルス・インフルエンザ感染症の存在を診断するのに使用される。好ましい実施態様において、抗体は非類型ヘモフィルス・インフルエンザ（NTHI）の存在を検出するのに使用されるが、類型ヘモフィルス・インフルエンザ感染症がまた抗体を使用して検出される。
この診断は、当業界で公知の技術を使用して行われるであろう。例えば、血液サンプルまたは組織サンプルの如きサンプルが患者から得られ、例えば、ELISAの如き通常の技術を使用して抗体との反応性について試験されてもよい。好ましい実施態様において、モノクローナル抗体が、当業界で公知の技術を使用して、HAタンパク質に対して産生される。先に概説したように、抗体は完全長HAタンパク質、またはHAタンパク質の一部に対して産生されてもよい。
また、HAタンパク質に対して産生された抗体は、当業界で知られているように受動免疫化処理に使用されてもよい。
また、HAタンパク質の特異な配列に対し産生された抗体は、その他の生物からのHA核酸を見出し、続いてクローン化するためにその他の生物から発現ライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。
一実施態様において、抗体は直接または間接に標識されてもよい。本明細書中の“標識された”は、化合物の検出を可能にするために付着された少なくとも一つの元素、放射性同位元素または化学化合物を有する化合物を意味する。一般に、標識は三つのクラス：a）放射性同位元素標識（これは放射性同位元素または重同位元素であってもよい）；b）免疫標識（これは抗体または抗原であってもよい）；及びc）着色色素または蛍光色素に入る。標識はあらゆる位置で化合物にとり込まれてもよい。こうして、例えば、HAタンパク質抗体は検出のために標識されてもよく、またはHAタンパク質抗体の二次抗体が産生され、標識されてもよい。
一実施態様において、本発明のHAタンパク質に対し産生された抗体はサンプルからHAタンパク質またはヘモフィルス・インフルエンザ生物を精製または分離するのに使用される。こうして、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ生物に結合するHAタンパク質に対し産生された抗体は、通常の技術を使用して、アフィニティークロマトグラフィーカラムにカップリングされてもよい。これらのカラムは環境サンプルまたは組織サンプルからヘモフィルス生物を取り出すのに使用し得る。
好ましい実施態様において、本発明のHAタンパク質は患者のヘモフィルス・インフルエンザ感染症の予防措置または治療措置のためのワクチンとして使用される。本明細書中の“ワクチン”または“免疫原組成物”は、動物または患者中で免疫応答を誘発する抗原または化合物を意味する。ワクチンは、例えば、抗原に先に暴露されなかった患者に予防上投与されてもよく、その結果、ヘモフィルス・インフルエンザ生物によるその後の感染が阻止される。また、ワクチンはヘモフィルス・インフルエンザ生物に既に暴露または感染された患者に治療のために投与されてもよい。この場合、感染は阻止し得ないが、免疫応答が生じられ、これが患者の免疫系を感染と有効に闘わせる。こうして、例えば、感染と関連する症候の減少があり得る。
本発明の目的のための“患者”として、ヒト並びにその他の動物及び生物の両方が挙げられる。こうして、その方法はヒト治療及び獣医用途の両方に適用し得る。
ワクチンとしてのHAタンパク質の投与は種々の方法で行われる。一般に、HAタンパク質は医薬上有益な組成物を調製するのに知られている方法に従って製剤化でき、それにより治療有効量のHAタンパク質が医薬上許される担体ビヒクルと混合して合わされる。好適なビヒクル及びそれらの製剤化は当業界で公知である。このような組成物は、宿主への有効投与のために医薬上許される組成物を調製するために適当な量のビヒクルと一緒に有効量のHAタンパク質を含むであろう。組成物は塩、緩衝液、キャリヤータンパク質、例えば、血清アルブミン、HAタンパク質を生物内の適当な部位または組織に局在化するためのターゲッティング分子、及びその他の分子を含んでもよい。組成物は同様にアジュバントを含んでもよい。
一実施態様において、ワクチンは単一投薬量で投与される。即ち、一投薬量はヘモフィルス・インフルエンザ感染症を予防上または治療上措置するのに充分な免疫応答を誘発するのに適している。別の実施態様において、ワクチンは予備接種及び“ブースター”接種として、或る期間にわたって幾つかの投薬として投与される。
本明細書中“治療有効量”は、免疫応答を誘発するのに充分であるHAタンパク質の量を意味する。この量は、予防措置または治療措置のいずれが所望されるのかに応じて異なってもよい。一般に、これは約0.001mgから約1gまでの範囲であり、好ましい範囲は約0.05g〜約0.5gである。アジュバントが使用される場合、これらの量が調節されてもよい。
以下の実施例は、上記発明を使用する様式を更に充分に記載するのに役立つだけでなく、本発明の種々の局面を実施するのに意図される最良の様式を示すのに役立つ。これらの実施例は本発明の真の範囲を限定するのに何ら役に立たないが、例示目的のために示されることが理解される。本明細書中に引用された全ての文献は参考として特別に含まれる。
実施例１
HA1のクローニング
多くのプロトコルはSt.Gemeら，Mol.Microbio. 15（1）:77-85（1995）に概説されたプロトコルと実質的に同じである。
バクテリア株、プラスミド、及びファージ
非類型ヘモフィルス・インフルエンザ株11はプロトタイプのHMW1/HMW2非発現株として選ばれた臨床分離株であったが、種々の被包型株が、図の配列を使用してタンパク質をクローン化するのに使用し得る。その生物を急性中耳炎の幼児の中耳液から純粋培養で単離した。その株を通常の方法によりヘモフィルス・インフルエンザとして同定し、ヘモフィルス・インフルエンザ型ａ〜ｆ（Burroughs Wellcome Co., Research Triangle Park, N.C.）についてダイピング抗血清のパネルで凝集しないこと、及び向流免疫電気泳動アッセイにおいてこれらの抗血清との沈殿のラインを示さないことにより非類型として分類した。株11はHMW1/HMW2様タンパク質を発現するNTHI株について既に実証されたレベルに匹敵するレベルでin vitroでチャン結膜細胞に有効に付着する（データは示されていない）。この株で感染された幼児からの回復期血清は、100kDaより大きい分子量を有する表面露出された高分子量タンパク質に対し主として誘導された抗体応答を示した。
M13mp18及びM13mp19をNew England BioLabs.Inc.（Beverly, Mass.）から入手した。pT7-7はStanley Taborの贈答品であった。このベクターはT7RNAポリメラーゼプロモーターφ10、リボソーム結合部位、及び多重クローニング部位から上流のT7遺伝子10タンパク質の翻訳開始部位を含む。
分子クローニング及びプラスミドサブクローニング
HA1遺伝子を含む組換えファージを単離し、既に記載された方法と同様の方法を使用して特性決定した。簡単に言えば、株11からの染色体ＤＮＡを調製し、ＤＮＡのSau3A部分制限消化物を調製し、0.7％のアガロースゲルで分別した。９〜20kbp範囲のＤＮＡフラグメントを含むフラクションを溜め、ライブラリーをλEMBL3アームへの結合により調製した。結合混合物をin vitroでギガパック（Stratagene）でパッケージし、E.coli LE392のP2溶原菌中でプレート増幅した。λプラーク免疫スクリーニングをManiatisら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２編（1989）, Cold Spring Harbor Pressにより記載されたようにして行った。プラスミドサブクローニング研究について、組換えファージからのＤＮＡをT7発現プラスミドpT7-7にサブクローン化した。通常の方法をManiatisら（上記文献）により記載されたようにしてクローン化ＤＮＡの操作に使用した。
11kbp XbaIフラグメントを組換えファージクローン11-17からの精製ＤＮＡから単離し、XbaI切断pT7-7につなぐことによりプラスミドpHMW8-3を生成した。10kbp BamHI-Cial切断pT7-7を単離することによりプラスミドpHMW8-4を生成した。プラスミドpHMW8-3ＤＮＡをClaIで消化し、大きいフラグメントを単離し、再度つなぐことによりプラスミドpHMW8-5を生成した。pHMW8-4をSpeI（これはHA1遺伝子中の特異な部位を切断する）で消化し、得られるフラグメントを平滑断端し、カナマイシン耐性カセットをSpeI部位に挿入することによりプラスミドpHMW8-6を生成した。pHMW8-3をNruI及びHindIIIで消化し、pT7-7を含むフラグメントを単離し、平滑断端し、再度つなぐことによりプラスミドpHMW8-7を生成した。プラスミド制限地図を図６に示す。
ＤＮＡ配列分析
バイオケミカルズ・シーケナーゼキットを製造業者により示唆されたようにして用いて、ＤＮＡ配列分析をジデオキシ方法により行った。[36S]dATPをNew England Nuclear（Boston, Mass.）から購入した。データをデジタルVAX 8530コンピューターでウィスコンシン大学からのコンプゲン・ソフトウェア及びゲネチクス・コンピューター・グループ・プログラムで分析した。幾つかの21-merオリゴヌクレオチドプライマーを必要により生成して配列を完成した。
付着アッセイ
付着アッセイをチャン上皮細胞[Wong-Kilbourne誘導体、クローン1-5c-4（ヒト結膜）、ATCC CCL20.2）]を用いて行い、これらを記載されたようにして（St.Geme IIIら，Infect.Immun. 58:4036（1990））24ウェル組織培養プレートのウェルに接種した。バクテリアをブロースに接種し、１ml当たり約2 x 109コロニー形成単位の密度まで増殖させた。約2 x 107コロニー形成単位を上皮細胞単層に接種し、プレートを５分間にわたって165 x gで穏やかに遠心分離してバクテリアと上皮表面の接触を促進した。37℃で５％のCO2中で30分間のインキュベーション後に、単層を食塩加リン酸緩衝液（PBS）で５回すすいで非付着生物を除去し、PBS中でトリプシン-EDTA（0.05％のトリプシン/0.5％のEDTA）で処理してそれらをプラスチック担体から放出した。ウェル内容物を攪拌し、希釈液を固形培地に塗布して単層当たりの付着バクテリアの数を生じた。単層当たりの付着コロニー形成単位の数を接種したコロニー形成単位の数で割ることにより、付着％を計算した。
株11高分子量付着タンパク質を発現する組換えファージの単離及び特性決定
非類型ヘモフィルス・インフルエンザ11染色体ＤＮＡライブラリーを株11で感染された幼児からの回復期血清で免疫スクリーニングした。免疫反応性クローンを見掛分子量>100dDaを有する高分子量タンパク質の発現についてウェスタンブロットによりスクリーニングし、組換えクローンの二つの異なるクラスを回収した。HA1タンパク質を発現する11-17と称される単一クローンを回収した。このクローンにより発現された組換えタンパク質は200kDaより大きい見掛分子量を有していた。
E.coliへの形質転換
エレクトロポレーション（Dowerら，Nucl.Acids Res. 16:6127（1988））を使用して、プラスミドをE.coliのDH5α株（Maniatis,上記文献）（これは非付着株である）に導入した。結果を表１に示す。
0004141496.tif 000003
加えて、株11タンパク質に対し誘導された、通常の操作によりつくられたモノクローナル抗体は60の疫学的に無関係のNTHIのうちの57中でタンパク質を認識した。しかしながら、その遺伝子を使用するサザン分析は、試験した株のおよそ25％のみが実際に遺伝子にハイブリッドを形成することを示した（データは示されていない）。
実施例２
HA2のクローニング
最近の研究において、本発明者らは透過電子顕微鏡により一連のヘモフィルス・インフルエンザ型ｂ分離株を調べ、線毛とは異なる短い、薄い表面フィブリルを視覚化した（St.Geme, J.W.III.及びD.Cutter, 1995. Evidence that surface fib-rils expressed by Haemophilus influenzae type b promote attachment to hum-an epithelial cells. Mol.Microbiol. 15:77-85）。その研究において、これらの付属器の発現に関与する大きい遺伝子座を単離した。
バクテリア株及びプラスミド
ヘモフィルス・インフルエンザ株C54は既に記載された型ｂ株である（Pichic-hero,M.E., P.Anderson, M.Loeb,及びD.H.Smith, 1982, Do pili play a role in pathogenicity of Haemophilus influenzae type b ？ Lancet. ii:960-962）。株C54-Tn400.23はhsf遺伝子座中にmini-Tn10kan要素を含み、最小のin vitro付着を示す変異体である（St.Geme, J.W.III.及びD.Cutter, 1995. Evidence that surface fibrils expressed by Haemophilus influenzae type b promote atta-chment tohuman epithelial cells. Mol.Microbiol. 15:77-85）。株1053、1058、1060、1063、1065、1069、1070、1076、1081、及び1084はJ.Musser（Baylor Uni-versity,Houston, Texas）により寛大に提供されたヘモフィルス・インフルエンザ型ｂ分離株である（Musserら，1990, Global genetic structure and molecu-lar epidemiology of encapsulated Haemophilus influenzae. Rev.Infect.Dis.12:75-111）。ヘモフィルス・インフルエンザ株SM4（型ａ）、SM6（型ｄ）、SM7（型ｅ）、及びSM72（型ｃ）はCenters for Disease Control（Atlanta, Georgia）のR.Facklamから入手した型株である。株142、327、及び351はヘモフィルス・インフルエンザ型ｅ分離株であり、株134、219、256、及び501はH.Kayhty（Finnish National Public Health Institute, Helsinki）から入手したヘモフィルス・インフルエンザ型ｆ分離株である。株Rd（型ｄ）及びサザン分析により調べた15種の非類型分離株は既に記載されていた（Alexanderら，J.Exp.Med. 83:345-359（1951）; Barencampら，Infect.Immun. 60:1302-1313（1992））。E.coli DH5αは、Gibco BRLから最初に入手された非付着実験株である。E.coli株BL21（DE3）はF.W.Studierからの贈答品であり、lac調節系の制御下にT7RNAポリメラーゼ遺伝子の単一コピーを含む（Studier,F.W.及びB.A.Moffatt, 1986, Use of bacteriophage T7RNA polymerase to direct high-level expression of cloned genes. J.Mol.Biol. 189:113-130）。プラスミドpT7-7はS.Taborにより提供され、T7RNAポリメラーゼプロモーターf10、リボソーム結合部位、及び多重クローニング部位から上流のT7遺伝子10タンパク質の翻訳開始部位を含む（Tabor,S.及びC.C.Richardson, 1985, A bacteriophage T7RNA polymerase/promoter sys-tem for controlled exclusive expression of specific genes. Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 82:1074-1078）。pUC19は既に記載された高コピー数プラスミドである（Yanish-Perronら，Gene 33:103-119（1985））。pDC400はヘモフィルス・インフルエンザC54表面フィブリル遺伝子座を宿し、E.coliの実験株によるin vitro付着を促進するのに充分であるpUC19誘導体である（St.Geme, J.W.III.及びD. Cutter, 1995. Evidence that surface fibrils expressed by Haemophilus influenzae type b promote attachment to human epithelial cells. Mol.Microbiol. 15:77-85）。pHMW8-5はヘモフィルス・インフルエンザ株11 hia遺伝子座を含み、またE.coliの非付着実験株による付着を促進するpT7-7誘導体である（Barenkamp. S.J.及びJ.W.St.Geme, III.Identification of a second family of high mole-cular weight adhesion proteins expressed by nontypable Haemophilus infl-uenzae. Mol.Microbiol.,印刷中）。pHMW8-6はカナマイシンカセットにより中断されたヘモフィルス・インフルエンザhia遺伝子座を含む（Barenkamp.S. J.及びJ.W.St.Geme, III.Identification of a second family of high molecular weight adhesion proteins expressed by nontypable Haemophilus influenzae.Mol.Microbiol.,印刷中）。pUC4Kはサザン分析においてプローブとして使用されたカナマイシン耐性遺伝子の起源として利用することができた（Vieira.J.及びJ.Messing, 1982, The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequecing with synthetic universal primers. Gene.19:259-268）。
培養条件
ヘモフィルス・インフルエンザ株をヘミン及びNAD（BH1-DB寒天）を補給した脳心臓注入寒天で１％のイソビテール（Isovitale）Xを補給したチョコレート寒天で、またはヘミン及びNAD（BH1s）（Anderson,P., R.B.Jhonston,Jr.及びD.H.Smith.1972. Human serum activity against Haemophilus influenzae type b. J.Clin.Invest. 51:31-38）を補給した脳心臓注入ブロース中で増殖させた。これらの株を25％のグリセロールを含む脳心臓注入ブロース中で-80℃で貯蔵した。E.coli株をルリア・ベルタニ（LB）寒天で、またはLBブロース中で増殖させ、50％のグリセロールを含むLBブロース中で-80℃で貯蔵した。ヘモフィルス・インフルエンザについて、カナマイシンを25mg/mlの濃度で使用した。E.coliに関する抗生物質濃度は、下記の濃度：アンピシリンまたはカルベニシリン100mg/ml及びカナマイシン50mg/mlを含んだ。
プラスミドによりコードされたタンパク質の誘導
プラスミドによりコードされたタンパク質を同定するために、バクテリオファージT7発現ベクターpT7-7を使用し、適切なpT7-7誘導体をE.coliBL21（DE3）に形質転換した。T7プロモーターの活性化をT7 RNAポリメラーゼの発現をイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（最終濃度、１mM）で誘発することにより達成した。37℃で30分間の誘導後に、リファムピシンを200mg/mlの最終濃度まで添加した。30分後、培養液１mlを５分間にわたって50mCiのトランス−[35S]−標識（ICN、Irvine、Calif.）でパルス化した。バクテリアを回収し、全細胞溶解産物を7.5％のアクリルアミドゲルによるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Laemmli,U.K. 1970, Cleavage of structual proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature（London）.227:680-685）による分析のためにレムリ（Laemmli）緩衝液中で再度懸濁させた。オートラジオグラフィーをコダックXAR-5フィルムを用いて行った。
組換えＤＮＡ方法
ＤＮＡ結合、制限エンドヌクレアーゼ消化、及びゲル電気泳動を通常の技術（Sambrook,J., E.F.Fritsch.及びT.Maniatis, 1989, Molecular cloning: a la-boratory manual.第２編，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N,Y.）に従って行った。プラスミドを記載されたようにして（Dower,W.J., J.F. Miller及びC.W.Ragsdale, 1988, High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation, Nucleic Acids Res. 16:6127-6145, Sambrook,J., E.F.Fritsch.及びT.Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual．第２編，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y.）化学形質転換またはエレクトロポレーションによりE.coli株に導入した。ヘモフィルス・インフルエンザ中の形質転換を、HerriottらのMIV方法（Herriott,R.M.,E.M.Meyer及びM.Vogt. 1970. Defined nongrowth media for stage II compet-ence in Haemophilus influenzae. J.Bacteriol. 101:517-524）を使用して行った。
付着アッセイ
付着アッセイを既に記載されたようにして（St.Gemeら，Infect.Immun. 58:4036-4044（1991））24ウェル組織培養プレートのウェルに接種された組織培養細胞を用いて行った。バクテリアを記載されたようにして（St.Geme, J.W.III,S.Falkow及びS.J.Barenkamp. 1993. High-molecular-weight proteins of nontypable H-aemophilus influenzae mediate attachment to human epithelial cells. Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90:2875-2879）上皮単層とともに30分間インキュベートした後、付着を測定した。組織培養細胞はチャン上皮細胞（Wong-Kilbourne誘導体、クローン1-5c-4（ヒト結膜）（ATCC CCL20.2）、KB細胞（ヒト口類表皮癌）（ATCC CCL17）、HEp-2細胞（ヒト喉頭類表皮癌）（ATCC CCL23）、A549細胞（ヒト肺癌）（ATCC CCL185）、腸407細胞（ヒト胚腸）（ATCC CCL6）、ヒーラ細胞（ヒト子宮癌）（ATCC CCL2）、ME-180細胞（ヒト子宮類表皮癌）（ATCC HTB33）、HEC-IB細胞（ヒト子宮内膜）（ATCC HTB113）、及びCHO-K1細胞（チャイニーズハムスター卵巣）（ATCC CCL61）を含んでいた。チャン細胞、KB細胞、腸407細胞、ヒーラ細胞、及びHEC-IB細胞を、アール塩及び非必須アミノ酸を含む改良イーグル培地中で管理した。HEp-2細胞をダルベッコ改良イーグル培地中で管理した。A549細胞及びCHO-K1細胞をF12培地（Ham）中で管理し、ME-180細胞をMcCoy5A培地中で管理した。全ての培地に10％の熱不活化ウシ胎児血清を補給した。
サザン分析
サザンブロッティングを既に記載されたようにして（St.Geme, J.W.III,及びS.Falkow, 1991. Loss of capsule expression by Haemophilus influenzae type b results in enhanced adherence to and invasion of human cells. Infect.Immun. 59:1325-1333）高ストリンジェンシー条件を使用して行った。
顕微鏡検査
バクテリアと混在した上皮細胞のサンプルをギムザ染色で染色し、記載されたようにして（St.Geme, J.W.III,及びS.Falkow,S. 1990. Haemophilus influenzae adheres to and enters cultured human epithelial cells. Infect.Immun. 58:4036-4044）光学顕微鏡により調べた。
ネガチブ染色電子顕微鏡検査について、バクテリアを0.5％の水性ウラニルアセテート（St.Geme, J.W.III,及びS.Falkow, 1991. Loss of capsule expression by Haemophilus influenzae type b results in enhanced adherence to and invasion of human cells. Infect. Immun. 59:1325-1333）で染色し、ザイス（Zeiss）10A顕微鏡を使用して調べた。
先の研究は、プラスミドpDC400を宿す実験E.coli株が培養されたヒト上皮細胞に有効に付着することができることを示した（St.Geme, J.W.III.及びD.Cutter, 1995. Evidence that surface fibrils expressed by Haemophilus influenzae type b promote attachment to human epithelial cells. Mol.Microbiol. 15:77-85）。サブクローニング及びトランスポゾン突然変異誘発は、pDC400の関連のコード領域が8.3kb XbaIフラグメント中に存在することを示した（St.Geme, J.W.III.及びD.Cutter, 1995. Evidence that surface fibrils expressed by Ha-emophilus influe-nzae type b promote attachment to human epithelial cells.Mol.Microbiol.15:77-85）（図７）。この結論を確かめるために、本研究において、このXbaIフラグメントをpT7-7にサブクローン化して、pDC601及びpDC602と称されるプラスミドを生成し、これらはそのインサートを反対配向で含んでいた（図７）。予想されるように、E.coli DH5α中のこれらのプラスミドの発現は高レベルのin vitro付着の能力と関連していた（表１）。
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転写の方向を測定し、プラスミドによりコードされたタンパク質を同定するために、その後pDC601及びpDC602をE.coli BL21（DE3）に導入して、夫々、BL21（DE3）/pDC601及びBL21（DE3）/pDC602を生産した。陰性対照として、また、pT7-7をBL21（DE3）に形質転換した。これらの３種の株中のT7プロモーターをIPTGで誘導し、誘導されたタンパク質をトランス−[35S]標識を使用して検出した。図８に示されるように、BL21（DE3）/pDC601の誘導は幾つかのわずかに小さいタンパク質（これらはおそらく分解生成物に相当する）とともにサイズが200kDaを越える大きいタンパク質の発現をもたらした。対照的に、BL21（DE3）/pDC602及びBL21（DE3）/pT7-7を誘導した時、これらのタンパク質の発現がなかった。この実験は8.3kb XbaIフラグメント中に含まれる遺伝子物質が図７に示されるように左から右に転写されることを示し、単一の長い読み取り枠が存在するかもしれないことを示唆する。
ヌクレオチド配列決定
シーケナーゼキット及び二本鎖プラスミド鋳型を使用して、ヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡフラグメントをpUC19にサブクローン化し、プライマーウオーキングにより両ストランドに沿って配列決定した。ウィスコンシン大学からのゲネチクス・コンピューター・グループ（GCG）ソフトウェアパッケージ（Devere-ux,J., P.Haeberli及びO.Smithies. 1984. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res. 12:387-395）を使用してＤＮＡ配列分析を行った。国立バイオテクノロジー情報センターのBLASTプログラム（Altschul.S.F., W.Gish, W.Miller, E.W.Myers及びD.J.Lipman. 1990.Basis local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215:403-410）を使用して配列類似性研究を行った。
8.3kb XbaIフラグメントの配列決定は7059bp遺伝子を明らかにし、これはヘモフィルス表面フィブリルについてhsfとして文献目的のために指定され、本明細書中HA2と称される。この遺伝子は243.8kDaの計算分子量を有する、HsfまたはHA2と称される、2353アミノ酸ポリペプチドをコードし、これはBL21（DE3）/pDC601の誘導後に検出された観察されたタンパク質種にサイズが似ている。HA2遺伝子は全ゲノムに関する38〜39％の公表推定値（Fleischmannら，1995,Whole-genome random sequencing and assembly oh Haemophilus influenzae Rd.Science. 269:496-512., Kilian, M. 1976. A taxonomic study of the genus Haemophilus, with proposal of a new species. J.Gen.Microbiol. 93:9-62）よりも若干大きい42.8％のGCカウントを有する。配列AAGGTAを有する推定リボソーム結合部位は推定開始コドンの13塩基対上流で開始する。rho非依存性転写ターミネーターに似た配列が終止コドンを越えて20ヌクレオチドを開始して存在し、２塩基のループ及び11塩基の幹を含むヘアピン構造を形成する可能性を有する中断された逆リピートを含む。重要なことに、29チミンのストリングはHA2の上流の149から121までのヌクレオチドの領域をスパンする。
HAI/HA1に対する相同性
非類型ヘモフィルス・インフルエンザ無線毛タンパク質HA1タンパク質（文献にはHiaと称される）は先に概説したように培養されたヒト上皮細胞への付着を促進する。HA2の予想アミノ酸配列とHA1の配列の比較は全体として81％の類似性及び72％の同一性を明らかにした。図５に示されるように、二つの配列はそれらのＮ末端及びＣ末端で高度に保存され、両方がウォーカーボックスヌクレオチド結合モチーフを含む。重要なことに、HA1は3.2kb遺伝子によりコードされ、わずかに115kDaである。この文脈において、HA2の三つの別個のストレッチ（夫々、アミノ酸174〜608、847〜1291、及び1476〜1914に相当する）は、アミノ酸221〜658により形成されたHAIの領域に対しかなりの相同性を示す（図５）ことが注目に値する。表２はHA2のこれらの三つのストレッチの間の互いの類似性及び同一性のレベルを要約する。その示唆は、HA2の大きなサイズがHA1中の単一コピー中に存在する反復ドメインの存在に一部関係するかもしれないことである。
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HA1及びHA2が同じ遺伝子座の対立遺伝子であるか否かを評価するために、一連のサザンブロットを行った。株C54及び11からの染色体ＤＮＡのサンプルをBglII、ClaI及びPstIまたはXbaIによる消化にかけた。得られるＤＮＡフラグメントをアガロース電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に２方向で移した。一つの膜をHA2遺伝子の3.3kb内部フラグメントで探査し（図７）、他の膜をHA1遺伝子の1.6kb遺伝子内フラグメントで探査した。図９に示されるように、両方のプローブは同じ染色体フラグメントを正確に認識した。
HA2遺伝子及びHA1遺伝子が相同であるという追加の証拠を得るために、挿入不活化されたHA1によるヘモフィルス・インフルエンザ株C54b’p’の形質転換によるHA2の不活化を試みた。プラスミドpHMW8-6（Barenkamp.S.J.及びJ.W.St. Geme. III.Identification of a second family of high molecular weight ad-hesion proteins expressed by nontypable Haemophilus influenzae. Mol.Mic-robiol.,印刷中）（これは遺伝子内カナマイシンカセットを有するHA1遺伝子を含む）をNdeIで直線状にし、コンピテントC54に導入した。サザンハイブリダイゼーションはHA2へのカナマイシンカセットの挿入を確かめた（示されていない）。更に、ネガチブ染色透過電子顕微鏡検査によるC54変異体の試験は表面フィブリルの損失を明らかにした（示されていない）。これらの知見と一致して、変異体株はチャン結膜細胞への最小の付着を示した（表１）。
追加の実験において、HA2タンパク質及びHA1タンパク質により与えられた細胞結合特異性を比較した。図10に示されるように、DH5 α/pDC601（HA2を発現する）はチャン細胞、KB細胞、ヒーラ細胞、及び腸407細胞への高レベル付着、HEp-2細胞への中間レベル付着、並びにHEC-IB細胞、ME-180細胞、及びCHO-K1細胞への最小の付着を示した。pHMW8-5を宿すDH5 α（HA1を発現する）は実際に付着の同じパターンを示した。ギムザ染色、続いて光学顕微鏡検査による試験はこれらの生存カウント付着アッセイ結果を確かめた。
その他のバクテリア細胞外タンパク質に関する相同性
タンパク質配列類似性研究を、国立バイオテクノロジー情報センターのBLASTネットワークサービス（Altschul.S.F., W.Gish, W.Miller, E.W.Myers及びD.J.Lipman. 1990. Basis local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215:403-410）を使用してHA2予想アミノ酸配列を用いて行った。この研究はHMW1及びHMW2（HA1欠損非類型ヘモフィルス・インフルエンザ株中で重要なアドヘジンであると既に同定されたタンパク質；（St.Geme,J.W.III, S.Falkow及びS.J.Barenkamp.1993.High-molecular-weight proteins of nontypable Haemophilus influenzae med-iate attachment to human epithelial cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:2875-2879）、AIDA-I（幾つかの下痢原性E.coli株により発現された付着タンパク質；Benz,I．及びM.A.Schmidt, 1992, AIDA-I, the adhesin involved in diff-use adherence of the diarrhoeagenic Escherichia coli strain 2787（O126:H27）is synthesized via a precursor molecule. Mol.Microbiol. 6:1539-1546）、及びTsh（アビアン病原性E.coli株により産生された血球凝集素：Provence,D．及びR.Curtiss III.1994, Isolation and characterization of a gene involved inhemagglutination by an avian pathogenic Escherichia coli strain. Infect.Immun. 62:1369-1380）を含む一連のその他のバクテリア付着因子に対し低レベルの配列類似性を明らかにした。加えて、HA2は組織侵入に役割を果たすことが明らかであるシゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）分泌タンパク質であるSepA（Benjelloun-Touimi,Z., P.J.Sansonetti及びC.Parsot. 1995. SepA, the major extracellular protein of Shigella flexneri;autonomous secretion and involvement in tissue invasion. Mol.Microbiol.17:123-135）に対し相同性を示した。HMW1、HMW2、AIDA-I、Tsh、及びSepAとのHA2の整列は、高度に保存されたＮ末端ドメインを明らかにした（図11）。AIDA-I、Tsh、及びSepA中で、このＮ末端は典型的な原核シグナル配列に先行する（Benjelloun-Touimi,Z., P.J.Sansonetti及びC.Parsot. 1995. SepA, the major extracellular protein of Shigella flexneri; autonomous secretion and involvement in tissue invas-ion. Mol.Microbiol. 17:123-135）。同様に、HA2中で、この保存ドメインは正に帯電した領域、続いて疎水性残基のストリング、次いでアラニン−グルタミン−アラニンを特徴とする26アミノ酸セグメントに先行する。
その他の被包株及び未被包株中のHA2同族体の存在
先の研究は、HA2同族体がヘモフィルス・インフルエンザ型ｂ株M42及びイーガン（Eagan）中に存在することを実証した（St.Geme, J,W.III.及びD.Cutter,1995. Evidence that surface fibrils expressed by Haemophilus influenzae type b promote attachment to human epithelial cells. Mol.Microbiol.15:77-85）。HA2遺伝子座がその他の型ｂ株により共有される程度を特定するために、サザン分析による進化上多様な型ｂ分離株のパネルを調べた。これらの株の中に、系統門Ｉに属する６種及び系統門IIに属する４種があった（Musser.J.M., J.S.Kroll,E.R.Moxon及びR.K.Selander. 1988. Evolutionary genetics of the en-capsulated strains of Haemophilus influenzae. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85: 7758-7762）。染色体ＤＮＡをBglIIで消化し、次いでHA2遺伝子の遺伝子内の3.3kbフラグメントで探査した。図12に示されるように、10種の株は全てハイブリダイゼーションを示した。ヘモフィルス・インフルエンザ型ｂ中の普遍の存在はその他の非型ｂ被包ヘモフィルス・インフルエンザ中のこの遺伝子座の優勢の疑問を生じた。再度、一連の型ａ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆ分離株のサザン分析は全ての場合に同族体を示した（図13）。
最近、Fleischmannら（Fleischmann R.D．ら，1995. Whole-genome random se-quencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd.Science. 269:496-512）は、サザン分析により調べられた２種の血清型ｄ株の一つであるヘモフィルス・インフルエンザ株Rdのゲノム配列を報告した。サザンブロッティング結果に従って、Rdゲノムの研究はHA2に対し顕著な配列類似性を有する読み取り枠を明らかにした。Rd遺伝子は長さが894ヌクレオチドであり、298アミノ酸のタンパク質をコードすることが予想される。総合して、Rd遺伝子座はC54 HA2遺伝子と70％同一であり、Rd由来アミノ酸配列はC54 HA2と62％同一であり、75％類似である。重要なことに、Rd読み取り枠は“早期”終止コドンのためにトランケートされることが明らかである。
先の実験は、HMW1/HMW2関連タンパク質を欠いている15種の非類型株のうちの13種がHA1同族体の証拠を有することを明らかにした（Barenkamp,S.J．及びJ.W.St.Geme, III.Identification of a second family of high molecular weight adhesion proteins expressed by nontypable Haemophilus influenzae. Mol.Microbiol.，印刷中）。HA2及びHA1が相同であるという実証と一致して、hsfの3.3kbフラグメントで探査する、これらの15種の株のサザン分析は同13種のうちの12種中でハイブリダイゼーションを示した（示されていない）。
HA2遺伝子座の染色体位置
先の研究において、非類型株11中のHA1遺伝子座はE.coliエキソリボヌクレアーゼIIに対する有意な相同性を有する読み取り枠により上流で隣接されることがわかった（Barenkamp,S.J．及びJ.W.St.Geme, III.Identification of a second family of high molecular weight adhesion proteins expressed by nontypable Haemophilus influenzae. Mol.Microbiol.，印刷中）。同様に、株C54中のHA2遺伝子座はE.coliエキソリボヌクレアーゼIIに対する類似性を有する読み取り枠により5’側で隣接される。この遺伝子はHA2開始コドンの前で357塩基対で終端し、そのＣ末端でエキソリボヌクレアーゼIIに61％類似し、33％同一である予想アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。重要なことに、Rd HA2同族体はまたエキソリボヌクレアーゼII遺伝子座により上流で隣接される。
実施例３
HA3のクローニング
非類型ヘモフィルス株32HA3遺伝子を含む組換えファージを単離し、既に記載された方法（Barenkamp及びSt.Geme, Molecular Microbiology 1996，印刷中）からわずかに改良された方法を使用して特性決定した。簡単に言えば、株32からの染色体ＤＮＡをMarmur（Marmur, 1961）の方法の改良により調製した。ＤＮＡのSau3A部分制限消化物を調製し、0.7％のアガロースゲルで分別した。9kbp〜20kbpの範囲のＤＮＡフラグメントを含むフラクションを溜め、ライブラリーをλEMBL3アームへの結合により調製した。結合混合物をギガパック▲Ｒ▼（Stratagene,La Jolla, CA）でin vitroでパッケージし、E.coli LE392のP2溶原菌中でプレート増幅した。
株32染色体ＤＮＡに由来する３種のPCR産物の混合物を使用して、λプラークスクリーニングを行った。株11HA1遺伝子の5’末端でＤＮＡセグメントを増幅することが既に示されたプライマー対を使用して、これらのPCR産物を増幅した。プライマーは以下のとおりであった。
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株11及び株32染色体ＤＮＡから生じたPCR産物はサイズが同じであり、これらの染色体領域のヌクレオチド配列が２種の株で類似していたことを示唆した。高ストリンジェンシーで通常の方法（Berger及びKimmel, 1987）を使用して、プラークスクリーニングを行った。最終洗浄条件は2XSSC及び１％のSDSを含む緩衝液中で65℃で１時間であった。陽性プラークをオートラジオグラフィーにより同定し、プラークを精製し、ファージＤＮＡを通常の方法により精製した。次いでスクリーニングプローブを生じるのに使用したのと同じプライマー対を使用してファージＤＮＡに由来する種々の制限フラグメントを増幅することによりHA3遺伝子を局在化した。一旦局在化されると、通常の方法を使用して株32HA3遺伝子及び隣接ＤＮＡを配列決定した。
HA3遺伝子の発現に欠損の株32同系内ヘモフィルス・インフルエンザ変異体を構築するために、MIV（Herriottら，1970）を使用してバクテリアをコンピテントにし、直線状にされたpHMV8-6で形質転換し、カナマイシン耐性について選択した。対立遺伝子交換をサザン分析により確かめた。最早HA3を発現しなかった変異体は、先に概説した方法を使用して、チャン上皮細胞に結合することの著しい低下を示した（データは示されていない）。
E.coliの非付着株中の発現は付着をもたらさなかったが、そのタンパク質が実際に発現されたことは確認されなかった。
配列表
（2）配列番号:1の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 3294塩基対
（B）配列の型: 核酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: DNA（genomic）
（xi）配列: 配列番号:1:
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（2）配列番号:2の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 1098アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:2:
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（2）配列番号:3の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 7291塩基対
（B）配列の型: 核酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: DNA（genomic）
（ix）特徴:
（A）名称/ 特徴を表す記号: CDS
（B）存在位置: 163..7221
（xi）配列: 配列番号:3:
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（2）配列番号:4の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 2353アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:4:
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（2）配列番号:5の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 658アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:5:
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（2）配列番号:6の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 607アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:6:
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（2）配列番号:7の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:7:
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（2）配列番号:8の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:8:
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（2）配列番号:9の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:9:
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（2）配列番号:10:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:10:
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（2）配列番号:11の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:11:
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（2）配列番号:12:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:12:
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（2）配列番号:13の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:13:
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（2）配列番号:14の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 2037塩基対
（B）配列の型: 核酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: DNA（genomic）
（xi）配列: 配列番号:14:
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（2）配列番号:15の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 679アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: 配列番号:15:
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（2）配列番号:16の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 21塩基対
（B）配列の型: 核酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: DNA（genomic）
（xi）配列: 配列番号:16:
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（2）配列番号:17の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 21塩基対
（B）配列の型: 核酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: DNA（genomic）
（xi）配列: 配列番号:17:
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（2）配列番号:18の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 21塩基対
（B）配列の型: 核酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: DNA（genomic）
（xi）配列: 配列番号:18:
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（2）配列番号:19の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 21塩基対
（B）配列の型: 核酸
（C）鎖の数: 不明
（D）トポロジー: 不明
（ii）配列の種類: DNA（genomic）
（xi）配列: 配列番号:19:
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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