(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をダイビング又はサブダイビングするための方法であって、該ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子はエクソン２の３０〜３３位で５’−ＧＣＣＡ−３’配列を含み、該方法が下記の工程：
（ｉ）（ａ）下記の配列：
0004031028.tif 000075
を有する少なくとも１つの５’末端増幅プライマーと
（ｂ）該ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子に対して適切な少なくとも１つの３’末端増幅プライマーと
によりＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の核酸
を増幅すること；そして
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成された増幅産物を、適切な条件で、ＨＬＡ−Ｂエクソン２領域の１５〜２６１領域から選択される１つ以上の適切なプローブとハイブリダイズすること、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において形成されたハイブリダイズされた産物を適切な洗浄条件で洗浄すること、
（ｉｖ）ハイブリダイズされた産物を検出すること；そして
（ｖ）観察されるハイブリダイゼーションパターンから対立遺伝子の有無を推定すること、
を含む方法。
【請求項２】
ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子が、Ｂ−５４（２２）、Ｂ５２（５）、Ｂ７８０１、Ｂ６２（１５）、Ｂ７５（１５）、Ｂ７１（７０）、Ｂ７２（７０）、Ｂ４６、Ｂ７９、Ｂ５３、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３またはＢ５８（１７）と命名されているＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの３’末端増幅プライマーが、下記の配列：
0004031028.tif 000076
を有する、請求項１〜２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
５’および３’増幅プライマーが、検出可能な標識を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
検出可能な標識が、ビオチンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの下記のプライマーセットの組合せ：
−  Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２と組合せたＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１、又は
−  Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３と組合せたＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１
を増幅のために使用する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
選択された２つのプライマーセットとの増幅反応が異なる反応試験管で行われ、増幅産物が別々にハイブリダイズされる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
選択された２つのプライマーセットとの増幅反応が異なる反応試験管で行われ、増幅後に増幅産物が混合されて、一緒にハイブリダイズされる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
選択されたプライマーが混合されて、増幅反応が単一の反応試験管で行われ、その後増幅産物が一緒にハイブリダイズされる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上のハイブリダイゼーションプローブが、下記のリスト：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４９、又は  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５２、
或は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相補体、或は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドよりなる上述のオリゴヌクレオチドプローブ、或は、脂肪族基、ＮＨ2、ＳＨ又はカルボキシル基を含有するそれらの誘導体プローブから選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上のハイブリダイゼーションプローブが、標識されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
得られた増幅産物が固体支持体に固定化され、予め標識された請求項１０記載の任意のプローブと接触させることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
得られた増幅産物を、請求項１０記載の少なくとも１つのプローブが予め固定化された固体支持体と接触させることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
得られた増幅産物を、膜ストリップに平行線として固定化されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を検出し同定するための方法であって、下記の工程：
−  請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法により、生物学的試料中に存在する核酸が属するＨＬＡ−Ｂタイプを決定し、
−  表１に定義されるものに対応するハイブリダイゼーションパターンを生成しない試料を観察した場合は、決定されるべきＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の、異常にハイブリダイズするプローブに対応する、ＨＬＡ−Ｂエクソン２配列の部分を配列決定すること、
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法を使用して、Ｂ７２（Ｂ*  １５０３）と非Ｂ７２ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を識別するための方法であって、この非Ｂ７２ＨＬＡ対立遺伝子が、Ｂ*  １５０３対立遺伝子にハイブリダイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２５からなる群から選択される少なくとも１つのプローブとはハイブリッドを形成しないことにより特徴付けられる方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の方法を使用して、Ｂ７２（Ｂ*  １５０３）と非Ｂ７２ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を識別するための方法であって、プローブ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８）とはハイブリッドを形成するが、プローブ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９）とはハイブリッドを形成しないことにより特徴付けられる方法。
【請求項１８】
下記の配列：
0004031028.tif 000077
を有する、
ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチド増幅プライマー。
【請求項１９】
下記のリスト：
0004031028.tif 000078
から選択されるオリゴヌクレオチド増幅プライマーの少なくとも１つと、請求項１８記載のプライマーの少なくとも１つとを組合せて含む組成物。
【請求項２０】
検出可能な標識を有する、請求項１８記載のオリゴヌクレオチド増幅プライマー。
【請求項２１】
検出可能な標識が、ビオチンである、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド増幅プライマー。
【請求項２２】
下記のリスト：
0004031028.tif 000079
から選択される、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチド増幅プライマーの少なくとも１つと、請求項２０または２１記載のプライマーの少なくとも１つとを組合せて含む組成物。
【請求項２３】
下記のリスト：
0004031028.tif 000080
から選択される、ビオチン標識を有するオリゴヌクレオチド増幅プライマーの少なくとも１つと、請求項２０または２１記載のプライマーの少なくとも１つとを組合せて含む組成物。
【請求項２４】
下記のプローブのリスト：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４９、又は  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５２；
或は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相補体；或は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドよりなる任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブ
から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法のための組成物。
【請求項２５】
ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピング用逆相ハイブリダイゼーション分析に組み込むために固定化された、請求項２４記載の１つ以上のプローブ。
【請求項２６】
請求項２４記載の１つ以上のプローブが表面に結合している固体支持体。
【請求項２７】
生物学的試料から、１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピングまたはサブタイピングするためのキットであって、下記：
−  １つ以上のプライマーセットの組合せ：Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５）と組み合わせたＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４）、または
−  Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ６）と組合わせたＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４）；
−  請求項２４記載の１つ以上のハイブリダイゼーションプローブ、
−  ハイブリダイゼーションのための適切な緩衝試薬、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２８】
さらに、自動走査並びに結果を解釈し、そのハイブリダイゼーションパターンから対立遺伝子を推定するための解釈装置を含む、請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子が、Ｂ−５４（２２）、Ｂ５２（５）、Ｂ７８０１、Ｂ６２（１５）、Ｂ７５（１５）、Ｂ７１（７０）、Ｂ７２（７０）、Ｂ４６、Ｂ７９、Ｂ５３、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３またはＢ５８（１７）と命名されているＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子にある、請求項２７また２８記載のキット。
【請求項３０】
ハイブリダイゼーションプローブが固体支持体に固定されている、請求項２７〜２９のいずれか１項記載のキット。
【請求項３１】
固体支持体が、膜ストリップである、請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
さらにハイブリダイゼーションから生じたハイブリッドを検出するための手段を含む、請求項２７〜３１のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法及び試薬に関する。
本発明の基礎となっている技術的問題は、特に血清学的方法により識別するのが困難である、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の識別を可能にする特異的プライマー及びプローブセットを使用したＤＮＡタイピング方法を提供することである。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系は、第６染色体の短腕上の一連の連結遺伝子よりなる。３つのクラスの遺伝子が定義されている：第１５染色体上にコードされる、β２ミクログロブリンと非共有結合で結合しているα鎖よりなるクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）；α鎖及びβ鎖よりなるクラスII抗原（ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ）；補体系の成分に対応するクラスIII産物。クラスＩ及びクラスII抗原は、多型性の膜通過型糖タンパクであり、抗原提示における共通の免疫学的役割を共有する。ＨＬＡクラスＩに制限された外来抗原の提示により、成熟Ｔリンパ球中に細胞毒性のＴ細胞リセプターが現われる。更に、クラスＩ及びクラスII抗原は、移植の免疫学及び自己免疫疾患の罹病性において重要な役割を占める。
多くの座に広範囲な多型（polymorphism）が存在する。これらの抗原の生物学的及び医学的重要性の観点から、ＨＬＡタイピングのための高感度で迅速な方法が求められている。これまで異なるプロトコールが使用されてきた。それらは、血清学的方法、細胞学的方法及びＤＮＡに基づく制限断片長多型（restriction fragment polymorphism）（ＲＦＬＰ）法及び最近の配列特異的オリゴヌクレオチド（sequence specific oligonucleotide）（ＳＳＯ）ハイブリダイゼーション法である。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによるＤＮＡタイピングは、完全な配列分析に次いでＨＬＡ多型性の最も優れた直接の定義を与える。しかし、配列分析は費用と時間がかかるため、ルーチンの使用には適さない。
多型性はＨＬＡ抗原の機能にとって根本的に重要であり、多くは機能的に重要な細胞外ドメインをコードするエクソンに局在する。
クラスＩ遺伝子については、多くの多型はアミノ末端α１とα２ドメインに局在する。α３ドメインは、高度に保存されたイムノグロブリン様ドメインである。全部で４０個のＨＬＡ−Ａ、６４個のＨＬＡ−Ｂ、及び２４個のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子が同定されている（ZemmourとParham, Tissue Antigens, 40: 221-228, 1992）。異なる対立遺伝子間の相違は、α１及びα２ドメインの特定の領域に発生する。異なる対立遺伝子間に、複数の短い相同部分が存在するパッチワークパターンが発生する。相同組み換えやエクソンシャフリング（exon shuffling）のような遺伝学的機構により、座特異的（locus specific）対立遺伝子の多様性が生じる（ParhamらPNAS（USA）85: 4005-4009, 1988）。
非常に多型性のクラスＩ及びクラスII座の異なる対立遺伝子を識別するために、異なるタイピング法が開発されてきた。これらの異なるタイピング法の概要を以下に示す：
血清学的方法：ミクロ毒性試験（microtoxicity test）において、異なるＨＬＡクラスＩ又はクラスII抗原に対する抗血清を、溶解した精製リンパ球と一緒にインキュベートする。溶解した細胞はエオシン又は他の色素で染色されるが、一方溶解されない細胞は染色されないままである。この方法は、クラスＩＡ、Ｂ、Ｃ対立遺伝子及びクラスIIＤＲ及びＤＱ対立遺伝子に使用される。ＤＰ対立遺伝子は、発現のレベルが低すぎ抗血清の入手が困難なため、タイピングできない。クラスII対立遺伝子の反応は、精製したＢリンパ球上で行われる。超定型的（supertypic）な群の対立遺伝子の限定された測定は、更なるサブタイピングなしに可能である。ＨＬＡ−Ｃ座の３個の対立遺伝子は、血清学的に未解明のままである。ＨＬＡ分子上のエピトープが検出されるため、α鎖及びβ鎖間の識別は不可能でありαβヘテロダイマーが同定される。クラスII分子に対するアロ血清（allosera）は、しばしば抗クラスＩが混入しており、使用の前に吸収する必要がある。同一又は異なる座上の対立遺伝子間で交差反応が発生し、これにより結果の解析が困難になっている。モノクローナル抗体が使用されるとしても、交差反応の問題は解決されない。本法は非常に迅速な方法（完全なタイピングに３時間）であるが、不完全で誤った結果が得られることが大きな問題である。
細胞学的方法：放射線照射されたホモ接合体タイピング細胞による刺激に対するＴ細胞培養の増殖応答に基づいて、混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction）（ＭＬＲ）が開発された。増殖は、Ｈ3−チミジンの取り込みにより測定される。本法は、ＤＲ及びＤＱ対立遺伝子のＨＬＡクラスIIタイピングのために使用される。ＤＰは膜発現のレベルが低いため、ＤＰタイピングは不可能である。これらの分析は、血清学的特異性を更に細分するＤＷ特異性を規定した。ＨＬＡ−ＤＷ特異性は、ＤＲ及びＤＱ抗原により決定されるが、これはほとんどいつもＤＲ及びＤＱ座上のある特定の対立遺伝子と関連している。ＨＬＡ−ＤＰタイピングについては、２次的ＭＬＲを行うことができる。この分析は、インビトロ（試験管内）の２次的又は記憶応答（in vitro sacondary or memory responses）に基づく。放射線照射された刺激細胞にリンパ球が応答した時には、培養の１０日後これらは芽細胞の広がりから小リンパ球の産物へ逆戻りする。これらの細胞は、タイピングすべき、そして最初の陽性反応を与えた１次刺激細胞と抗原を共有する照射された刺激細胞に対して、培養においてより強力で加速した応答を与える能力を有する（FestensteinとOllier, 1987）。本分析法は、極めて完全で正確であるが、非常に時間がかかり実施は困難である。抗原の表面発現と関係しないという利点を有する、異なるＤＮＡタイピング法が開発された。これらのＤＮＡタイピング法の概要を示す：
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法：高分子量ＤＮＡを幾つかの制限酵素で消化し、ゲル電気泳動により大きさに従い分離し、フィルターにブロットし、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＤＱＢ、ＤＰＢ又はＤＲＢのｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。異なる対立遺伝子について明確なパターンのバンドが得られる。異なる制限部位の多型性を見い出すため、また使用される異なる酵素を決定するために配列分析が使用された。しかしこの方法は幾つかの欠点を有する：大量の高分子量ＤＮＡが必要とされること、さほど多くない対立遺伝子しか識別することができないこと、幾つかの制限酵素の使用、表現型では無関係な特異的アミノ酸の差異の検出。
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）（ＰＣＲ）法：全てのクラスII対立遺伝子の配列は公知であるため、多型領域を増幅するために座特異的プライマーを設計することができる。増幅後、大量の特異的配列がＲＦＬＰ分析又はＳＳＯハイブリダイゼーションにより分析される。ＰＣＲ産物は、異なる制限酵素により消化することができ、断片を電気泳動によりゲル上で分離できる。代替法はハイブリダイゼーション法である。配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を設計する。ハイブリダイゼーションは、従来法のドットブロット法で行うことができる。ＰＣＲ産物は、膜に共有結合し、32Ｐ標識ＳＳＯにハイブリダイズする。他の標識方法も可能である。陽性シグナルの検出は、オートラジオグラフィーにより行われる。全てのＳＳＯは長さ及びＧＣ含有量が異なるため、従来法のドットブロット法では異なるＳＳＯには異なるハイブリダイゼーション温度が必要であろう。
ＨＬＡクラスＩ抗原に関する従来法の血清学的及び細胞学的タイピング法は、充分確立している。しかし、抗血清の特異性、自己抗体の存在又は薬物療法のため、誤った結果が発生することがある。ＨＬＡ−Ｂについては、下記のタイプでタイピングの問題が目立って経験される：
0004031028.tif 000002
ＤＮＡに基づくタイピング系は、これらの難しいＨＬＡ−Ｂタイプの同定を大きく改良し加速するであろう。その結果、これは、臓器及び骨髄移植の成功率及びかかる総費用に有益な影響をもたらす。移植の成功率と、提供者と受容者のＨＬＡ−Ｂ適合性との間には高い相関が存在するという充分な証拠がある。
更により正確なＨＬＡ−Ｂタイピングはまた、疾患罹病性の研究及び法医学的調査を相当に改善又は容易にするであろう。
一般に、簡便、迅速かつ信頼できるＤＮＡタイピング法が使用可能であれば、ＤＮＡタイピング法は、血清学的タイピング法よりも好適であることに注意すべきである。これは、サブタイプレベルのある差異（これはＤＮＡ法では通常検出可能である）が、同種移植片拒絶を引き起こすにも拘らず、現在の血清学的タイピング法により検出されないためである（Fleischhauerら, New Eng.J.Med.323:1818-1822,1990）。
ＨＬＡクラスII遺伝子の定義に関して分子生物学の応用が成功したのとは対照的に、クラスＩ分子タイピングの開発は未だに困難である。これは、この領域の著しい多型性、ヌクレオチド置換の複雑さ及び多くの非古典的クラスＩ遺伝子と偽遺伝子の存在による。クラスＩ抗原は、血清学的交差反応性群（ＣＲＥＧ）を規定するほとんどＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ抗原内の、異なる対立遺伝子との交差反応性により特徴付けられる。ＨＬＡ−Ａ及びＢ対立遺伝子は、各々５個及び１０個の古典的ＣＲＥＧ群に分類される。現在までのところ、全ての公知のＨＬＡ−Ａ特異性は配列決定されており、このためこれらの交差反応を説明する配列の相同性が規定され、そして最近、配列特異的プライマー（ＳＳＰ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用できるようになった。これとは対照的に、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子は、より広範囲の多型性、及び高レベルの交差反応性により特徴付けられる。更に、Ｂ対立遺伝子の大部分は、未だ配列決定されていない。交差反応性とＤＮＡ配列の間の相関には、幾つかの矛盾が存在する。
クラスIIと比較すると、クラスＩ対立遺伝子のＰＣＲとＤＮＡプローブタイピングを扱っている文献の数は限定されている。Yoshidaらの論文（1992, 下記を参照）を除いて、本発明の主題である対立遺伝子はこれらの研究には含まれていない。Summersら（Hum.Immunol. 32: 176-182, 1991）は、配列決定のためのクラスＩ対立遺伝子のＰＣＲの使用を記載している。Ｂ４４対立遺伝子（Ｂ*４４０１、Ｂ*４４０２）の識別のための、ＰＣＲと、オリゴヌクレオチドプローブを用いる古典的ドットハイブリダイゼーションの組合せが、Fleischhauerら（N.Eng.J.Med. 323:1818-1822, 1990）により記載されている。
２つの研究グループが、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子のＤＮＡタイピングとサブタイピングについて報告している（Hillら,The Lancet, 337: 640-642, 1991; Dominguezら, Immunogenetics 36:277-282, 1992）。
0004031028.tif 000003
ら（Hum.Immunol. 33:163-173, 1992）は、ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ２８対立遺伝子のＰＣＲ増幅に続くオリゴヌクレオチドタイピングを記載しており；そして増幅不応性増幅系（amplification refractoryamplification systemを使用する、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のより一般的なタイピング法が、最近Krausaらにより記載されている（The Lancet, 341:121-122, 1993）。
Yoshidaら（Hum.Immunol. 34: 257-266, 1992）も、ＰＣＲを古典的ドットブロット法及び／又は１本鎖確定多型分析（singlestrand confirmation polymorphism analysis）と組合せた。彼らは、２６個のＨＬＡ−Ｂ特異性のタイピングのためのＰＣＲ−プライマーとプローブの組合せを設計した。彼らのタイピング法は、主に、Ｂｗ４とＢｗ６スープラタイプ（supratypes）を識別するプライマーを用いるディフェレンシャル増幅の使用、及びＨＬＡ−Ｂ特異的５’−側プライマーの使用に基づいている。記載したプライマーセットとプローブにより、この著者らは下記の対立遺伝子を識別しなかった：Ｂ*５４０１、Ｂ*７８０１及びＢ*７９０１（これらは従来法でもタイピングが難しい）。対立遺伝子間の配列の差異が、彼らのプライマーで増幅した領域の外側に位置しているため、Ｂ*５２０１とＢ*５２０１２や、Ｂ５３とＢ５１対立遺伝子も彼らは識別できなかった。
従って本発明は、ハイブリダイゼーション法により１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をＤＮＡタイピング又はサブタイピングするための方法を提供することを目的とする。
更に詳しくは、本発明は、対応する血清学的タイピング法では問題があるか、又は不可能であるこれらＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の、ＤＮＡタイピング及び／又はサブタイピングのための方法を目的とする。血清学的タイピング法では問題のある主要な対立遺伝子は、下記のものである：
0004031028.tif 000004
別の実施態様により、本発明は、上記リストから選択されるような血清学的タイピング法では問題のあるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングを可能にする配列特異的オリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
更に別の実施態様により、本発明は、上記リストから選択されるような血清学的タイピング法では問題のあるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングを可能にする配列特異的プライマーを提供することを目的とする。
本発明はまた、少なくとも１つの上述の配列特異的オリゴヌクレオチド及び／又は特異的プライマーよりなる組成物又は固体支持物を提供することを目的とする。
更に詳しくは、本発明の方法は、特異的なプライマー（ＳＰ）により、血清学的タイピング法では問題のある対立遺伝子に対応する、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の特異的サブセットのエクソン２を増幅すること、及び続いて増幅産物を、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２の増幅領域を含む配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の適切なセットにハイブリダイズさせることを目的とする。
本発明はまた、上記リストから選択されるような血清学的タイピング法では問題のあるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングのためのキットを提供することを目的とする。
本発明は、新規な方法と試薬を提供することにより、上述の目的を満たしている。更に詳しくは、特異的プライマー（ＳＰ）と配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の特異的なセット、及びこれと一緒になってＨＬＡ−Ｂ遺伝子の対立遺伝子をタイピングするための迅速、簡便かつ正確な系を提供するその方法を実行するためのキットを提供することにより、本発明は、上述のニーズを満たしている。
本発明による新規な方法と試薬により、以前には未知のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子が発見され、またこれらの対立遺伝子を本法によりタイピング及び同定することができる。Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ６１、Ｂ６７及びＢ５９のような、幾つかの他のタイプ（上記の表にはリストされていない）もまた、血清学によるタイピングは困難である。核酸配列は未知であるが、これらの特異性が本発明の方法を使用してタイピングできるかどうかを予測することが時々可能なことがある。これは、本明細書ではＢ７１について例示される。
「タイピング又はサブタイピング」という表現は、生物学的試料に存在するタイプ又はサブタイプを決定及び／又は識別することとして理解されるべきである。タイプ又はサブタイプにより、そのタイピング方法により識別される全ての変異体が理解される。１つの対立遺伝子のタイプを識別する場合には、タイピング方法は、その特異的対立遺伝子の存在を決定する。
公式に認められた血清学的タイプ（ＨＬＡ特異性とも呼ばれる）及びこれらの対応する対立遺伝子（配列が公知であれば）は、毎年更新される参照リストに集められる（Bodnerら, Tissue Antigens, 39: 161-173, 1992）。
本発明の方法は、増幅プライマーの特定のセット（ＳＰとも呼ばれる）を用いる、恐らく試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のサブセットのエクソン２の増幅に基づく。続いて増幅産物を、ＤＮＡプローブの適切なセット（ＳＳＯとも呼ばれる）とハイブリダイズさせ、その後形成されたハイブリッドを検出し、生成したハイブリダイゼーションパターンからＨＬＡ−Ｂタイプを導きだす。本法では、特に、血清学的方法により区別するのが困難であるか、又は全然区別できないタイプの同定を目的としており、５’末端増幅プライマーが、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３領域（ZemmourとParham, 1992により与えられた番号付けによる）を特異的に標的とすることが特に有利である。これらの著者により与えられた配列データにより、本発明により決定することができる全ての公知の対立遺伝子は、エクソン２の３０〜３３位に下記の配列を有している：５’−ＧＣＣＡ−３’。このため、この配列で終わる増幅プライマーは、必要な全ての対立遺伝子を増幅し、同時に他の多くのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子（エクソン２の３０〜３３位の対応する５’−ＴＣＣＧ−３’配列により特徴付けられる）のエクソン２の増幅を除外して、これによりＤＮＡタイピング法を相当に単純化する。ＤＮＡ配列が公知（ZemmourとParham, 1992）であり、３０〜３０位の５’−ＧＣＣＡ−３’配列により特徴づけられるＨＬＡ−Ｂエクソン２対立遺伝子を第１表にリストする。
このように本発明は、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３位（番号付けは、ZemmourとParham, 1992による）の５’−ＧＣＣＡ−３’配列により特徴づけられる試料中の１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピング又はサブタイピングするための方法に関し、更に詳しくは、例えばＢ５４（２２）、Ｂ５２（５）、Ｂ７８０１、Ｂ６２（１５）、Ｂ７５（１５）、Ｂ７１（７０）、Ｂ７２（７０）、Ｂ４６、Ｂ７９、Ｂ５３、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３及びＢ５８（１７）のような、血清学的には識別が困難であるＨＬＡ−Ｂタイプを識別する方法に関し、この方法は少なくとも下記の工程よりなる：
（ｉ）場合により試料中の核酸を抽出し、
（ii）ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３位の５’−ＧＣＣＡ−３’配列により特徴づけられるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の核酸を、下記のリスト：
0004031028.tif 000005
又は次のようなこれの配列変異体、
0004031028.tif 000006
又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、３’末端ＧＣＣＡ配列が保存されており、かつこれらの配列変異体が上記のＢ２５Ｐプライマー又はその変異体と同一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができる）から選択される少なくとも１つの５’末端増幅プライマーと一緒に、上記で定義された５’末端プライマーと同一の対立遺伝子から選択される適切な３’末端プライマー（５’及び３’末端プライマーは、場合により標識されている）と組合せて増幅し；そして
（iii）場合により増幅中又は増幅後に標識された増幅産物を、適切な条件で、ＨＬＡ−Ｂエクソン２領域の１５〜２６１領域（番号付けは、ZemmourとParham, 1992による）から選択される１つ以上の適切なプローブとハイブリダイズさせて、
（iv）適切な洗浄条件で洗浄し、
（ｖ）形成されたハイブリッドを検出し；そして
（vi）観察されるハイブリダイゼーションパターンから存在する対立遺伝子を推定する。
上記に示した本発明の方法を実行するために、当該分野で公知の任意の方法により試料核酸の抽出を行うことが必要になることがある。ＲＮＡの抽出の場合には、ｃＤＮＡの作成が必要であり；そうでなければ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを抽出する。
「プライマー」という用語は、１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列、即ち、複製される核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成のための開始点として作用することができる特異的プライマー（ＳＰ）のことをいう。プライマーの長さと配列は、伸長産物の合成を開始させることができるものでなければならない。好適には、プライマーは約５〜５０個のヌクレオチドであり、更に好適には約１０〜２１個のヌクレオチドである。プライマーの具体的な長さと配列は、必要なＤＮＡ又はＲＮＡ標的の複雑さ、並びに温度やイオン強度のようなプライマー使用の条件に依存する。
プライマーの３’末端の最後の３つのヌクレオチドが正確に一致していれば、増幅プライマーが、適正な増幅を保証するために、対応する鋳型配列と正確に一致する必要はないという事実は、文献上詳細に報告されている（Kwokら, Nucleic Acids Research 18:999-1005, 1990; SommerとTautz, Nucleic Acids Research 17,6749,1989）。
「プローブ」という用語は、検出すべき対立遺伝子の標的配列に、正確に相補的な配列を有する、１本鎖の配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）のことをいう。
好適には、これらのプローブは、約５〜５０個のヌクレオチドの長さ、更に好適には約１０〜１８個のヌクレオチドである。
「適切な」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件という表現は、ほとんどの場合にそのプローブが、正確に相補的な配列にだけハイブリダイズする事実をいう。このような条件は、実施例の項に例示される。例えばプローブ１７については、好適なハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、ハイブリダイゼーション及び洗浄溶液として３MのＴＭＡＣが使用されるならば、各々５４℃及び５８℃である。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知のとおり厳重にすべきである（例えば、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982）。
しかし、ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）により、これらのプローブは、充分な特異性を得るためにこれらの適切な温度でハイブリダイズさせるべきである（ほとんどの場合に、１つの点変異のレベルで差異が識別されるはずである）。
上述の５’末端プライマーは、Ｂ２５Ｐプライマーと呼ばれる。「試料」という用語は、任意の起源の生物学的物質であり、例えば血液のしみ、毛髪、上皮細胞又は末梢血液細胞のことをいう。典型的な試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）、リンパ芽球様細胞株（lymphoblastoid cell line）（ＬＣＬ）、毛髪細胞などを含む。好適な単離された核酸は、ゲノムＤＮＡである。しかし、細胞質性、細胞性及びポリ（Ａ）＋ＲＮＡも使用できる。
「観察されるハイブリダイゼーションパターンから存在する対立遺伝子を推定する」という表現は、オリゴヌクレオチドプローブのパネルの結合のパターンを解析することによる、試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を同定（決定又は識別ともいう）することよりなる、本発明のＨＬＡ−Ｂタイピング法の中心的特徴のことをいう。単一のプローブも有用な情報を提供するかもしれないが、種々のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子が天然に分散しており、任意の１つのプローブが独特に特異的な変異体を同定することができることは稀である。むしろ、実施例に示されるように、対立遺伝子の同一性は、オリゴヌクレオチドプローブのパネルの結合のパターンから推定され、このパターンは、異なるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の異なるセグメントに特異的である。これらのオリゴヌクレオチドプローブの選択に依存して、公知の各対立遺伝子は、プローブの特異的組合せの使用による特異的なハイブリダイゼーションパターンに対応する。各対立遺伝子はまた、オリゴヌクレオチドプローブの選択に依存して、同一プライマーで増幅された他の任意の対立遺伝子から識別することができる。例えば、１つ以上の未知のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含有する試料についての陽性にハイブリダイズするプローブの生成したパターンを、第１表に示す予測されるハイブリダイゼーションパターンのスキームと比較することにより、その試料に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を明確に推定することが可能になる。
標的の対立遺伝子はエクソン２の３’末端の配列が多少異なるため（ZemmourとParham, 1992）、目的の全ての対立遺伝子の特異的な増幅を達成するために、異なる３’末端プライマーを５’末端プライマー（Ｂ２５Ｐ又はその変異体）に組合せるべきである。
このように、本発明は上記で定義された方法に関し、更に、少なくとも１つの下記の３’末端増幅プライマー（Ｂ２３）：
0004031028.tif 000007
又は次のようなこれの配列変異体、
0004031028.tif 000008
又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のＢ２３Ｐ１プライマー又はその変異体であるＢ２３Ｐ２若しくはＢ２３Ｐ３と同一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができ、またそのプライマーは、場合によりビオチンのような検出可能な標識を与えられている）を使用することを特徴とする方法に関する。
示されるように、これらのプライマーは更に、各々Ｂ２３Ｐ１、Ｂ２３Ｐ２及びＢ２３Ｐ３と呼ばれる。Ｂ２３Ｐ１及びＢ２３Ｐ２プライマーは、ＨＬＡ−Ｂエクソン２の２４１〜２６１領域を標的とし；Ｂ２３Ｐ３プライマーは、２１９〜２３７領域を標的とする（ZemmourとParham, 1992による番号付け）。ＤＮＡ配列が上述のプライマーの３’末端と完全に一致する対立遺伝子が、表１に同定される。
これらのデータから、目的の全てのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を増幅するためには、プライマーセット
Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１
による増幅を、下記のセット：
Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２、又は
Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３
の１つと少なくとも組合せるべきであることが結論される。
表１に与えられたデータから、幾つかの対立遺伝子は、１つのプライマーセットでのみ増幅され、他の組合せのセットでは増幅されないことも結論される。例えば、特にＢ*４６０１又はＢ*７８０１は、Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１プライマーセットでのみ増幅される。これに対して、例えばＢ*１５０３又はＢ*５８０１対立遺伝子は、各々Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１とＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３、及びＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２とＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３で増幅される。
また、この利用可能な配列データ（ZemmourとParham, 1992）から、５’末端プライマーのＢ２５Ｐ又はその変異体と組合せられるならば、ＨＬＡ−Ｂエクソン２対立遺伝子の特定の部分の増幅が達成される、他の３’末端増幅プライマーが選択できることも言及されるべきである。
本発明の１つの実施態様においては、選択した２つのプライマーセットによる増幅を異なる反応試験管で行い、増幅産物を図１のタイピングスキームに示されるように別々にハイブリダイズさせる。
本発明の別の実施態様においては、選択した２つのプライマーセットによる増幅を異なる反応試験管で行い、増幅産物を増幅後混合して一緒にハイブリダイズさせる。
本発明の好適な実施態様においては、関係する異なるプライマー（Ｂ２５Ｐ、Ｂ２３Ｐ１とＢ２３Ｐ２、又はＢ２５Ｐ、Ｂ２３Ｐ１とＢ２３Ｐ３のいずれか）を混合して、増幅を単一の反応試験管で行い、その後増幅産物を一緒にハイブリダイズさせる。
使用される増幅方法は、ＰＣＲ法（Saikiら,Science 239:487-491, 1988）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ法,Guateli, PNAS（USA）; 87: 1874-1878, 1990; Compton, Nature; 350: 91-92, 1991）、転写に基づく増幅系法（ＴＡＳ法, Kwohら, Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）86: 1173-1177, 1989）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法, Duckら, Biotechniques 9: 142-147, 1990; Walkerら, Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）89: 392-396, 1992）、Ｑβレプリカーゼによる増幅法（Lizardiら, Bio/Technology 6:1197-1202, 1988; Lomeliら, Clin.Chem. 35: 1826-1831, 1989）又はプライマー伸長を使用して核酸分子を増幅するような任意の他の適した方法であってよい。増幅中、増幅産物は、標識プライマーを使用するか、又は標識ヌクレオチドを取り込んで標識することが便利である。標識物は、アイソトープ（32Ｐ、35Ｓなど）であっても、又は非アイソトープ（ビオチン、ジゴキシゲニンなど）であってもよい。
増幅した対立遺伝子を相互に区別するために、選択した増幅プライマー領域間に位置するＨＬＡ−Ｂエクソン２領域を標的とする配列特異的ＤＮＡプローブ（ＳＳＯとも呼ばれる）のセットに、増幅産物をハイブリダイズさせる。従来法のドットブロット形式、サンドイッチハイブリダイゼーション又は逆ハイブリダイゼーション（例えば、逆ドットブロット形式）のような、異なるハイブリダイゼーション形式を使用することができる。目的の対立遺伝子を相互に、及び記載した他の対立遺伝子（これらの対立遺伝子がホモ接合状態で存在しているにせよ、又はヘテロ接合状態で存在しているにせよ）から区別することのできる、ＤＮＡプローブの特定のセットが選択された。
この目的のために、実施例の項に説明されるように、ＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄条件で、機能するように設計されている２０個の基本のＤＮＡプローブ配列を同定した。これらのプローブの大部分は、ＨＬＡ−Ｂエクソン２の最可変領域を標的とし、２つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子にハイブリダイズさせうる。幾つかのプローブは、対立遺伝子特異的であるために選択された；これらのプローブは、プローブ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１８）、及び１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２２）であり、これらは各々Ｂ*５４０１、Ｂ*４６０１、及びＢ*７９０１にのみハイブリダイズする。異なるプローブに標的にされる領域は、図２にスキームとして表される。表２には、プローブの配列が示される。説明を表１に示す。更に、実施例５と表２−２で再検討されるように、ＳＳＰＥに特異的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件で、同じ２０個の基本のプローブ又はその変異体を試験した。表２−２に示されるように、使用した特異的ＳＳＰＥ緩衝液条件の下では、元のＴＭＡＣ試験プローブの中の９個と新規変異体プローブの幾つかが、他のものに比べて特に好適である。
従って本発明は、１つ以上のハイブリダイゼーションプローブが、表２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７〜２６）、又はその変異体［この配列変異体は、主にその末端（３’又は５’のいずれか）に１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、又は幾つかの本質的でないヌクレオチド（即ち、対立遺伝子間を識別するために必須ではないヌクレオチド）の他のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む）による置換を含むか；或はこの変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相補鎖よりなるか；或はこの変異体は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドよりなるが、この変異体のプローブは、これらが誘導されたオリゴヌクレオチドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさせうる］から選択される上記で定義された方法に関する。
上記は、異なるが厳重なハイブリダイゼーション及び洗浄条件（異なる溶液、異なる濃度の緩衝液、異なる濃度のプローブ、異なる温度）下で、これらが誘導されたプローブと同じ特異性でハイブリダイズするプローブとして、本発明のこの面で意図される変異体を定義しうることを意味する。このような変異体は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２７〜５２（表２−２）に与えられた配列に含まれる。
ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＴＭＡＣなど）に従って、充分な特異性を達成するために、これらのプローブを、その適切な温度で厳重にハイブリダイズさせるべきである（ほとんどの場合に、１つの点変異のレベルで差異が識別されるはずである）。しかし、その末端（３’又は５’のいずれか）で少数のヌクレオチドを添加又は削除するか、或は幾つかの本質的でないヌクレオチド（即ち、対立遺伝子間を識別するために必須でないヌクレオチド）を他のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む）により置換することにより、表２にリストされたＤＮＡプローブをわずかに修飾することにより、これらのプローブ又はその変異体を、同一のハイブリダイゼーション条件（即ち、同一の温度及び同一のハイブリダイゼーション溶液）で特異的にハイブリダイズさせうる。使用されるプローブの量（濃度）を相互に関連させて変化させることも、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るために有益であろう。これに関連して、ＳＳＰＥに基づく緩衝液とは反対に、そのＧＣ含量に関係なく同じ長さのプローブは、ＴＭＡＣ溶液中でほぼ同じ温度で特異的にハイブリダイズすることに注意すべきである（Jacobsら,Nucleic Acids Research 16: 4637-4650, 1988）。
異なるハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液条件を利用する好適な基本の及び変異体のプローブは、本発明の実施例の項で説明する。これらの好適なプローブの幾つかは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７〜５２に含まれる。
本発明の主題である対立遺伝子の中で、Ｂ*１５０１とＢ*１５０４は、これらの配列が第２エクソンにおいて全く同一であるため、相互に識別することができない。両方の対立遺伝子間の差異は、エクソン３の５’末端に見い出される（ZemmourとParham, 1992）。同じ理由で、Ｂ*５１０１〜Ｂ*５１０４は、区別しえない。これらの対立遺伝子についても、識別はエクソン３で行いうる（ZemmourとParham, 1992）。従って、より完全なタイピング系は、エクソン３のタイプを識別するためのプライマー及びプローブの組合せを含むであろう。
プライマー対Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２が使用され、ハイブリダイゼーションがＳＳＯの７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３）と９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１５）で観察される上述のＤＮＡタイピング法は、好適には更に別々にプライマー対Ｂ２５ＰとＢ２３Ｐ１及び／又はＢ２３Ｐ３プライマーで行われる。この後者の適用のために、Ｂ２５Ｐプライマーの代わりに下記の配列：
0004031028.tif 000009
を使用することができる。
実施例の項に詳細に説明されるように、追加の増幅工程は、ＨＬＡ−ＡＲ偽遺伝子（Ｂ２３Ｐ２プライマーが使用される時）の同時増幅（co-amplification）が発生する可能性を除外し、そしてより正確なＨＬＡ−Ｂタイピング法を可能にする。
オリゴヌクレオチドプローブと試料中の核酸配列間に形成されるハイブリッドを検出するための、本発明の目的に適切な分析法は、当該分野で公知の任意の分析法よりなる。例えば、この検出は、ドットブロット形式を使用して、非標識増幅試料を膜に結合させ、適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、この膜に少なくとも１つの標識プローブを取り込み、そして結合したプローブの存在をモニターすることにより行うことができる。プローブは放射性アイソトープで標識してもよいし、発色性又は化学発光性検出を可能にする標識物で標識してもよい（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合プローブ）。
代替法として、増幅配列が標識を含む「逆」ドットブロット形式がある。この形式では、非標識オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に結合させて、適切で厳重なハイブリダイゼーション及び続いての洗浄条件下で標識試料に暴露する。試料中の核酸と本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ間のハイブリッドの形成に依存する任意の他の分析法も使用しうることは理解されるべきである。
１つの有利な実施態様では、生物学的試料中に含まれるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピング法は、遺伝物質から誘導された増幅コピーを、上記で定義されたプローブが前もって固定化された固体支持体と接触させる工程よりなる。
「固体支持体」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーション特性を保持し、かつハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低く保持される限り、このようなプローブが結合することができる任意の基質のことをいう。通常固体支持体は、マイクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロン又はニトロセルロース）又は微小球（ビーズ）である。
膜への適用又は固定の前に、固定を容易にするために、又はハイブリダイゼーション効率を改善するために、核酸プローブを修飾するのが便利であろう。このような修飾は、ホモポリマーテーリング（homopolymer tailing）、脂肪族基、ＮＨ2基、ＳＨ基、カルボキシル基のような異なる反応性基との結合、又はビオチン又はハプテンとの結合を包含する。
別の有利な実施態様では、生物学的試料中に含有されるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピング法は、遺伝物質から誘導された増幅コピーを、固体支持体に平行線として固定化されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程よりなる。
本発明のこの好適な実施態様では、上記で定義された方法によるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピングのために、固定化及び逆相ハイブリダイゼーション分析への組み込み（好適には膜ストリップのような固体支持体上に平行線として固定化）のために、１つ以上の上記で定義されたプローブが使用される。
この有利な方法により、プローブは、ラインプローブアッセイ（Line Probe Assay）（ＬｉＰＡ）形式で固定化される。これは、便利にはその上に２０個以上のオリゴヌクレオチドプローブ（陰性又は陽性対照のオリゴヌクレオチドを含む）が平行線として適用される膜ストリップを使用する逆ハイブリダイゼーション形式（Saiki, PNAS（USA）; 86: 6230-6234, 1989）である。ＬｉＰＡストリップは、Stuyverら（J.Gen.Virol. 74: 1093-1102, 1993）により記載されたように調製される。
従って本発明はまた、上記で定義された１つ以上のプローブが、平行線の形で支持体の表面に結合している固体支持体（好適には膜ストリップ）に関する。
ＬｉＰＡは、非常に迅速で使いやすいハイブリダイゼーション試験である。結果は、増幅の開始後４時間で読むことができる。通常非アイソトープ標識が増幅産物に組み込まれている増幅、及びアルカリ性変性の後、増幅産物を膜上のプローブに接触させ、ハイブリダイゼーションを約１〜１．５時間行う。簡単に洗浄（１０〜３０分）後、検出操作を開始する。これら全ての工程は、同一のハイブリダイゼーション容器中で行われ、このため手作業の時間を少なくすることができる。生成したハイブリダイゼーションパターンから、存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を、視覚的にしかし好適には専用のソフトウェアを使用して推定することができる。ＬｉＰＡ形式は、市販されている走査装置に何の問題もなく適合し、従って結果の自動解釈は非常に信頼性の高いものとなる。これら全ての利点により、ＬｉＰＡ形式はルーチン設定でのＨＬＡタイピングの使用に適している。ＬｉＰＡ形式は、ルーチンの血清学的方法にタイピングが困難な対立遺伝子をタイピングするために特に有利であろう。
本発明はまた、公知のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子とは異なる、新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を検出し同定するための方法に関し、この方法は下記の工程よりなる：
−  上記で定義した方法により、生物学的試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を決定し、
−  表１に定義されるものに対応するハイブリダイゼーションパターンを生成しない試料を観察した場合は、決定されるべき新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の異常にハイブリダイズするプローブに対応する、ＨＬＡ−Ｂエクソン２配列の部分を配列決定する。
本発明のプローブセットにより、配列が公知である対立遺伝子を識別しうるのみでなく、実施例３で例証されるように未知の配列を有する対立遺伝子を検出することもできる。この実施例では、プローブ１３を使用してＢ７１がＢ７２（Ｂ*１５０３）から区別できることが示される。これは、血清学に基づくＢ７１とＢ７２の識別に問題があるため、特に有利である。
従って本発明は、上記で定義される方法を使用して、Ｂ７２（Ｂ*１５０３）とＢ７０群（Ｂ７０、Ｂ７１、即ち、Ｂ*１５０３とは異なる対立遺伝子）の非Ｂ７２ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を識別する方法に関し、ここで、非Ｂ７２ＨＬＡ対立遺伝子は、Ｂ*１５０３対立遺伝子［例えば、プローブ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９）、プローブ７（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ  Ｏ１３）、プローブ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１６）、プローブ１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２４）、及びプローブ１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２５）］にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブとはハイブリッドを形成しない。
これらの新規な対立遺伝子が一旦使用可能になると、これら新規対立遺伝子の特異的検出を可能にする新規プローブを推定することができる。表１にリストされる２０個の基本のプローブのセットにこれらのプローブを追加することにより、本タイピング法の識別力と信頼性のレベルが改善される。
本発明はまた、更に上記で定義された方法により決定される、核酸配列レベルで未決定のＢ７０ＨＬＡ−Ｂタイプに対応する新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子に関し、ここで、この対立遺伝子は、プローブ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８、表２を参照のこと）とはハイブリッドを形成するが、プローブ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９、表２参照）とはハイブリッドを形成せず、かつこの対立遺伝子は、ヌクレオチド１９２〜２０９（番号付けは、ZemmourとParham, 1992による）の範囲の領域の少なくとも１個のヌクレオチドの位置でＨＬＡ−ＢのＢ７０対立遺伝子であるＢ*１５０３とは異なっている。
本発明はまた、下記のリスト：
0004031028.tif 000010
又は次のようなこれの配列変異体、
0004031028.tif 000011
又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、３’末端ＧＣＣＡ配列が保存されており、かつこれらの配列変異体が上記のＢ２５Ｐプライマー又はその変異体と同一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができる）、
0004031028.tif 000012
又は次のような、これの配列変異体、
0004031028.tif 000013
又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のＢ２３Ｐ１プライマー又はその変異体であるＢ２３Ｐ２若しくはＢ２３Ｐ３と同一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができ、また、そのプライマーは、場合によりビオチンのような検出可能な標識物を与えられており、かつそのプライマーは場合により固体支持体に固定されている）から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含む組成物に関する。
好適にはこのような組成物は、上記のリストから選択される少なくとも２つ以上の増幅プライマーを含む。更に好適には、増幅プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１が、少なくとも１つの下記のセット：
Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２、又はＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３
と組み合わせられる。
上述の成分に追加して、この組成物はまた、少なくとも１つの下記のプライマー：
0004031028.tif 000014
よりなってもよい。
本発明はまた、下記のプローブのリスト：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２５、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２６（表２に与えられる）、
又はその配列変異体［この配列変異体は、主にその末端（３’又は５’のいずれか）に１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、又は幾つかの本質的でないヌクレオチド（即ち、対立遺伝子間を識別するために必須ではないヌクレオチド）の他のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む）による置換を含むか；或はこの変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相補鎖よりなるか；或はこの変異体は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドよりなるが、この変異体のプローブは、これらが誘導されたオリゴヌクレオチドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさせうる］から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含む組成物に関する。このような変異体は、例えば、下記のプローブのリスト：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５１、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５２（表２−２に与えられる）
から選択されてよい。
好適にはこのような組成物は、少なくとも２つ、３つ又はそれ以上のこれらのプローブを含有する。
本発明はまた、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含むかもしれない生物学的試料から、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピングするためのキットに関し、このキットは、下記の成分：
−  適宜、上記で定義される任意のプライマーから選択される少なくとも１つの増幅プライマー、
−  少なくとも１つのプローブ（このプローブは、好適には固体基質上に、更に好適には１つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは、上記で定義される任意のプローブから選択される）、
−  緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、
−  適宜、前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するための手段、を含む。
本発明はまた、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含むかもしれない生物学的試料から、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピングするためのキットに関し、更に詳しくは、血清学的には識別するのが困難なＨＬＡ−Ｂタイプを含むかもしれない試料から、この試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をコードするヌクレオチドの増幅に続いて、上記で定義される方法による１つ以上のプライマーセットの組合せを使用する、下記：
−  少なくとも１つのプローブ（このプローブは、好適には固体基質上に、更に好適には１つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは、上記で定義される任意のプローブから選択される）、
−  緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、
−  前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するための手段、
−  場合により結果を解釈し、観察されるハイブリダイゼーションパターンから存在する対立遺伝子を推定するための、自動走査及び解釈装置も含む、キットに関する。
図と表の凡例
図１：本発明によるタイピング法のスキームによる表示。
図２：ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のエクソン２を表す軸上への本発明のプライマーとプローブの局在。番号付けは、ZemmourとParham, 1992による。
図３：１３の患者試料と７つの対照から得られた増幅（上のパネル）及びドットブロットハイブリダイゼーション（下のパネル）結果。実施例１及び２に記載されるように、試料をプライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１を使用して増幅し、ドットブロットし、そしてプローブ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）及び１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３）とハイブリダイズさせた。
図４：Ｂ７０変異体対立遺伝子及びＢ４６対立遺伝子を含む、１５の試料（ｎ°１〜１５）について得られたドットブロットハイブリダイゼーションの結果。
増幅した物質をナイロン膜に適用した。続いてこれらの膜を、示されるようにＳＳＯ−プローブ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１８）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２１）、６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）、及び２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８）とハイブリダイズさせた。結果を、実施例ＳＳＯ３及び４で検討し、表３に要約した。
表１：本発明のプライマーセットで増幅したＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子（エクソン２）。対立遺伝子中の３’末端プライマー配列の存在、及び１９ＳＳＯ−プローブのセットとのハイブリダイゼーションパターンも示される。
表２：ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピング用ＳＳＯ−プローブのパネル。
表２−２：逆ハイブリダイゼーション（ラインプローブアッセイ、ＬｉＰＡ）形式で使用するために、試験されるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピング用ＳＳＯ−プローブのパネル。これら全てのプローブは、表２に与えられた基本セットの２０個のＳＳＯから誘導される。好適なプローブは、「＋」として示される。
表３：実施例３及び４で記載される５個のＳＳＯ−プローブとハイブリダイズさせた１５の増幅試料から得られたハイブリダイゼーション結果の要約。図４も参照。
表４：２０個のオリゴヌクレオチドプローブを固定したＬｉＰＡストリップで得られたハイブリダイゼーション結果。各々増幅１及び２（実施例６参照）後に得られた試料とのハイブリダイゼーション後の陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、「＋」として示される。
略語
ＴＭＡＣ：塩化テトラメチルアンモニウム
ＳＳＯ：配列特異的オリゴヌクレオチド
ＤＩＧ１１−ｄｄＵＴＰ：ジゴキシゲニン−１１−２’，３’−ジデオキシ−ウリジン−５’−三リン酸
ＤＩＧ：ジゴキシゲニン
ＡＭＰＰＤ：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）−フェニル−１’，２−ジオキセタン
ＡＰ：アルカリ性ホスファターゼ
実施例
実施例１．プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１によるあるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の特異的増幅
実施例により、１つのプライマーセットでの増幅特異性を説明する。図３に示したように、１２の試料と７つの対照をプライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１及び４）で増幅した。細胞物質から出発して、標準的プロトコールによりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ約０．５μｇを、各プライマー１２．５pmoles；２００mMの各ｄＮＴＰ（Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden）；１０mMのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）；５０mMのＫＣｌ；１mMのＭｇＣｌ2；０．０１％のゼラチン；０．０２５％のＮＰ−４０及びＴａｑ（Thermusaquaticus）ＤＮＡポリメラーゼ（Boerhinger, Mannheim GmbH,FRG）１単位を含有する、２倍の蒸留水で最終容量５０μｌに調整したＰＣＲ緩衝液と混合した。試料を９５℃で１０分間加熱して、各９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間、そしてＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Thermal Cycler）（Techne and Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT）中で、７２℃で１０分間の最終延長でＰＣＲのサイクルを３５回行った。増幅産物を１．５％ゲル電気泳動により性状解析した。
結果を図３に示した。増幅可能な対立遺伝子が存在する全ての試料中に、入手できる配列データにより予測されるように、臭化エチジウム染色後に約２４６塩基対の明瞭なバンドを観察した。
試料１、４、５、６、８、９、１０、１１、及び１２は、Ｂ*７８０１対立遺伝子を含んでいた（図１にＢＳＮＡ、ＢＸ１又はＢＴｅ７６として示した）。試料２と３及び対照１５では、Ｂ８対立遺伝子（Ｂ*０８０１）を見い出した。試料１６〜１９は、各々Ｂ３５、Ｂ５５、Ｂ５６及びＢ５４のホモ接合体の対照であった。陰性対照（１３及び１４は、各々Ｂ*３７０１及びＢ*１８０１対立遺伝子を含んでいた）では、バンドを観察できなかった。これらの対立遺伝子には、エクソン２の３０〜３３位に５’−ＧＣＣＡ−３’の代わりに５’−ＴＣＣＧ−３’配列があった（ZemmourとParham, 1992）。
実施例２．Ｂ７８対立遺伝子の検出のためのドットブロットタイピング測定
本実施例では、プローブ６及び１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２及び２３）を使用した、Ｂ*７８０１対立遺伝子の特異的タイピングを説明する。Ｂ*７８０１は、両方のプローブ（６及び１７）とハイブリダイズする唯一の対立遺伝子であるため、プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１で増幅した他の対立遺伝子からＢ*７８０１を識別することができる。
配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯ）を化学合成し、ジゴキシゲニン−１１−２’，３’−ジデオキシ−ウリジン−５’−三リン酸（ＤＩＧ−１１−ｄｄＵＴＰ）とＤＮＡデオキシヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼを用いてその３’末端を標識した。１３の試料と７つの対照を、実施例１で記載したようにプライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１で増幅した。
次にＰＣＲ産物２μｌを、ナイロン膜（Hybond N Plus, Amersham, Buckinghamshire, UK）上にドットブロットし、フィルターを０．４NのＮａＯＨ中で５分間浸漬することにより変性させ、そして１０×ＳＳＰＥ（生理食塩水リン酸ナトリウムＥＤＴＡ）１０ml中で１５分間中和した。プロッティング後、５０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％のＳＤＳ、２mMのＥＤＴＡ、３MのＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム、Janssen Chimica, Geel, Belgium）を含有するハイブリダイゼーション溶液１０ml中で、５４℃で３０分間、膜を予備的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションのために、ＳＳＯ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）（５２℃）を除いて、５４℃で１時間、この予備的ハイブリダイゼーション溶液に３pmol/mlのＤＩＧ標識ＳＳＯを添加した。過剰のプローブを除去するために、（２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ）中で２回、室温で１０分間、次いでハイブリダイゼーション溶液中で１５分間厳密に５８℃で、フィルターを洗浄した（５４℃で洗浄したＳＳＯ−６を除く）。
抗ＤＩＧアルカリ性ホスファターゼ、Ｆａｂ断片（抗−ＤＩＧ−ＡＰ）を使用して非アイソトープ検出を行い、化学発光性基質ＡＭＰＰＤ［３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）−フェニル−１，２−ジオキセタン］により可視化した。水気を切った膜を、カセット中で１５〜３０分間Ｘ線フィルム（X-omat AR5, Kodak）に暴露した。このオリゴタイピング法で使用した全ての試薬は、Boerhinger, Mannheim GmbH, FRGから購入した。結果を図３に示した。Ｂ７８タイプの対立遺伝子が存在する（ＢＳＮＡ、ＢＸ１又はＢＴｅ７６）全ての試料が、プローブ６及び１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２及び２３）と明白にハイブリダイズした。他の試料（ｎ°２、３、７、１５、１６、１７、１８、及び１９）は、プローブ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３）又はプローブ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）のいずれかとハイブリダイズするが、両方とはハイブリダイズしなかった。試料１３及び１４は、使用したプライマーセットでは増幅しなかったため、プローブ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）とプローブ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３）のいずれでもハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった。
実施例３．Ｂ７０変異体のタイピング及びサブタイピング
本実施例では、Ｂ７０変異体を含んでいる７つの試料を使用して、Ｂ７０変異体のタイピング及びサブタイピングを説明する。ブランクと７つの非Ｂ７０試料も対照として用いた（表３を参照のこと）。Ｂ７１とＢ７２は、ブロードな抗原ＨＬＡ−Ｂ７０のサブタイプの対立遺伝子である。Ｂ７２対立遺伝子（Ｂ*１５０３）の配列は文献上公知（ZemmourとParham, 1992）であり；Ｂ７１配列は最近まで公知でなかった。単独特異的なＢ７１及びＢ７２試薬は記載されてなく、他の抗原（主にＢ３５とＢ６２）の存在によりＢ７０変異体の正確な血清学的指定が確立していない。Ｂ７０変異体の識別は等電点フォーカシング（isoelectric focusing）により可能であるが、これはルーチン設定の好ましい方法ではない。
プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１及び４）及び本発明の幾つかのプローブの組合せを使用することにより、Ｂ７２変異体を他のＢ７０変異体から区別することができた。ここで強調したいことは、Ｂ７１及びＢ７２以外の他の変異体は未だ同定されていないが存在するかもしれないということである。
Ｂ７０変異体対立遺伝子を含んでいることが公知（表３の、試料１〜６及び８）の一連の試料からＤＮＡを抽出して、実施例１で記載したように増幅した。増幅産物を５つのナイロン膜に適用し、これを更に実施例２で記載したように処理した。これらの膜を各々下記のプローブのセット：２、６、１２、１３及び１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８、１２、１８、１９及び２１）とハイブリダイズさせた。これらのプローブで得られた結果を図４に示した。これらの結果を表３に要約した。全ての場合に、７つのＢ７０試料の内４つに存在するＢ７２変異体（Ｂ*１５０３）を、Ｂ７１又は他の可能性のある変異体から区別することができた。Ｂ*１５０３（Ｂ７２）は、プローブ２及び１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８及び１９）とハイブリダイズすることにより特徴づけられるが、一方他のＢ７０変異体はプローブ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１９）と非反応性であった。従って本実施例は、配列情報がない時にでも、対立遺伝子を識別できる可能性を明白に示している。
実施例４．Ｂ４６変異体のタイピング
実施例３で記載したのと同じ方法、プライマーセット、及びプローブの組合せを使用して、２つのＢ４６含有試料をタイピングした。図４と表３にタイピング結果を示した。プローブパネル中のプローブ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１８）の存在によって、Ｂ*４６０１を容易に追跡でき、他の対立遺伝子から明確に区別できた。プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１／４）により増幅した全ての対立遺伝子の中で、Ｂ*４６０１はプローブ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１８）とハイブリダイズした唯一の対立遺伝子であった。
実施例５．ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピングのためのラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）及びＳＳＯ
ラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）のために好適なハイブリダイゼーション及び洗浄媒体は、ＳＳＰＥに基づく緩衝液である。基本的にはStuyverら（J.Gen.Virol. 74: 1093-1102, 1993）により記載されたようにＬｉＰＡストリップを調製した。ＬｉＰＡ形式では全てのプローブが同一のハイブリダイゼーション及び洗浄条件（同一塩濃度及び温度）下で特異的に反応するため、またＳＳＰＥ中のＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融点がＧＣ含量とプローブの長さに依存するため、ＴＭＡＣに基づく緩衝系からＳＳＰＥに基づく緩衝系に変更するために表２のリストに示したプローブの修飾が幾つかのプローブについて必要になる。
ＬｉＰＡ形式に使用するための最も適したプローブを選択するために、多数のプローブ（表２−２にリストされる）を合成し、ＴＴＰと末端トランスフェラーゼを使用して３’末端につなぎ、固体支持体（ニトロセルロース膜）に固定した。
下記のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用して、これらのプローブを標的物質にハイブリダイズさせた。
−  ハイブリダイゼーション：
−  ５×ＳＳＰＥ／０．５％ＳＤＳ
−  ５５℃
−  洗浄：
−  ２×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ
−  ５５℃
（１×ＳＳＰＥは、０．１８MのＮａＣｌ、０．０１MのＮａＨ2ＰＯ4、１mMのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）である）
上述の条件下で特異性と感度に関して最良の試験結果を示したプローブを、更にＬｉＰＡストリップ上での使用のために選択した。これらのプローブを表２−２に陽性（＋）として評点した。ＴＭＡＣ緩衝系で使用された２０プローブの内９つだけ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７ｂ、１１、１２、１３、１８、１９、２１、２３及び２４）が、ＳＳＰＥに基づく系で修飾なしに使用することができた。
これらの結果により、使用されるプローブの配列のわずかな修飾が重要であり、信頼できるＬｉＰＡ試験の開発のためには細心のプローブ設計が必須であることが明白に証明された。
実施例６．ＬｉＰＡストリップを使用するより代表的なホモ接合性細胞株のタイピング
プローブ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３）及び９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１５）の配列に対応する配列がそのＨＬＡ−ＡＲ偽遺伝子に存在するため、ＨＬＡ−ＡＲ偽遺伝子の同時増幅（プライマーＢ２３Ｐ２が使用される時）により、プローブ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３）及び９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１５）によるハイブリダイゼーション結果はあいまいなものになっている。
陽性のハイブリダイゼーションシグナルのもとを最終的に突きとめるために、少なくとも１つのＢ２３プライマーと下記の配列：
0004031028.tif 000015
を有するプライマーを使用する追加の増幅を行った。
次に、得られた増幅産物を、少なくともプローブ７と９が固定化されるストリップとハイブリダイズさせた。
本測定におけるプローブ７及び９についての陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、プローブ７及び／又は９配列が、分析された試料のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子に存在していることを示しており、従ってプローブ７及び／又は９は陽性とすべきである。陰性の結果は、それらの最初の陽性ハイブリダイゼーションシグナルは偽遺伝子に由来し、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子自体に由来しないため、１回目の増幅後の結果の解釈において、これらのプローブは無視すべきであることを意味する。
プライマーＢ２５ＰとＢ２３Ｐ１／Ｂ２３Ｐ２（増幅１）、及びプライマーＢ２５Ｘ１とＢ２３Ｐ１／Ｂ２３Ｐ２（増幅２）による別々の増幅後の、幾つかの選択した試料（ホモ接合性細胞株Ａ〜Ｇ）で得られたハイブリダイゼーション結果を、表４に要約した。
これらの結果により、試料Ａについて、プローブ７及び９の陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子に由来することが示された。試料Ｅ及びＦの、プローブ９で得られた陽性シグナルについても同じことがいえた。
増幅工程１及び２後の結果を組合せると、表１の助けにより下記のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を推定することができた：
試料    対立遺伝子
Ａ      Ｂ*０８０１
Ｂ      Ｂ*１５０１
Ｃ      Ｂ*４００１
Ｄ      Ｂ*４６０１
Ｅ      Ｂ*５１０１
Ｆ      Ｂ*５３０１
Ｇ      Ｂ*５７０１
増幅２について下記のプライマーセット：
Ｂ２５ＰとＢ２３Ｐ１／Ｂ２３Ｐ３
を使用した時に、基本的に同一の結果が得られた。
0004031028.tif 000016
0004031028.tif 000017
0004031028.tif 000018
0004031028.tif 000019
0004031028.tif 000020
0004031028.tif 000021
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：Innogenetics N.V.
（B）町：Industriepark Zwijnaarde 7 Bus 4
（C）市：Gent
（E）国：ベルギー
（F）郵便コード（ZIP）：９０５２
（G）電話：００−３２−０９．２４１．０７．１１
（H）ファックス：００−３２−０９．２４１．０７．９９
（ii）発明の名称：
特異的プライマー及びプローブセットを使用するＨＬＡ−Ｂタイピングの方法
（iii）配列の数：５３
（iv）コンピューター可続形式：
（A）メジウムタイプ：フロッピーディスク
（B）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（C）オペレーションシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：パテントインリリーズ＃１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２５Ｐ
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*３５０１のエクソン２のヌクレオチド１５〜３３にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１：
0004031028.tif 000022
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２５Ｐ変異種
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４００１のエクソン２のヌクレオチド１５〜３３にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２：
0004031028.tif 000023
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：gencmic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２５Ｐ変異種
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*０８０１のエクソン２のヌクレオチド１５〜３３にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３：
0004031028.tif 000024
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：YES
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２３Ｐ１
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４００１のエクソン２のヌクレオチド２４１〜２６１にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４：
0004031028.tif 000025
（２）配列番号（SEQ ID No.）：５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：YES
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２３Ｐ２
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*１３０１のエクソン２のヌクレオチド２４１〜２６１にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.５：
0004031028.tif 000026
（２）配列番号（SEQ ID No.）：６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：YES
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２３Ｐ３
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*５１０１のエクソン２のヌクレオチド２１９〜２３７にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.６：
0004031028.tif 000027
（２）配列番号（SEQ ID No.）：７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４００１のエクソン２のヌクレオチド６１〜７８にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.７：
0004031028.tif 000028
（２）配列番号（SEQ ID No.）：８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ２
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*０８０１のエクソン２のヌクレオチド６０〜７７にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.８：
0004031028.tif 000029
（２）配列番号（SEQ ID No.）：９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ３
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*５１０１のエクソン２のヌクレオチド６０〜７７にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.９：
0004031028.tif 000030
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ４
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*３５０１のエクソン２のヌクレオチド６０〜７７にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１０：
0004031028.tif 000031
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ５
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*１５０１のエクソン２のヌクレオチド１２６〜１４３にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１１：
0004031028.tif 000032
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ６
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*３５０１のエクソン２のヌクレオチド１２５〜１４２にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１２：
0004031028.tif 000033
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ７
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*０８０１のエクソン２のヌクレオチド１２３〜１４０にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１３：
0004031028.tif 000034
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ８
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*５４０１のエクソン２のヌクレオチド１４３〜１６１にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１４：
0004031028.tif 000035
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ９
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*０８０１のエクソン２のヌクレオチド１７８〜１９５にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１５：
0004031028.tif 000036
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１０
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４００１のエクソン２のヌクレオチド１７９〜１９６にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１６：
0004031028.tif 000037
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１１
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*５７０１のエクソン２のヌクレオチド１７９〜１９６にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１７：
0004031028.tif 000038
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１２
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４６０１のエクソン２のヌクレオチド１８９〜２０６にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１８：
0004031028.tif 000039
（２）配列番号（SEQ ID No.）：１９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１３
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４００１のエクソン２のヌクレオチド１９２〜２０９にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.１９：
0004031028.tif 000040
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１４
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*０８０１のエクソン２のヌクレオチド１９１〜２０８にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２０：
0004031028.tif 000041
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１５
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*５４０１のエクソン２のヌクレオチド１９２〜２０９にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２１：
0004031028.tif 000042
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１６
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*７９０１のエクソン２のヌクレオチド１９１〜２０８にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２２：
0004031028.tif 000043
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１７
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*７８０１のエクソン２のヌクレオチド２１２〜２２９にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２３：
0004031028.tif 000044
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１８
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４００１のエクソン２のヌクレオチド２１１〜２２８にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２４：
0004031028.tif 000045
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１９
（B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ*４００１のエクソン２のヌクレオチド２２０〜２３７にアニールする
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２５：
0004031028.tif 000046
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２６：
0004031028.tif 000047
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２７：
0004031028.tif 000048
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２８：
0004031028.tif 000049
（２）配列番号（SEQ ID No.）：２９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.２９：
0004031028.tif 000050
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３０：
0004031028.tif 000051
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３１：
0004031028.tif 000052
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３２：
0004031028.tif 000053
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３３：
0004031028.tif 000054
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述；SEQ ID No.３４：
0004031028.tif 000055
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３５：
0004031028.tif 000056
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３６：
0004031028.tif 000057
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３７：
0004031028.tif 000058
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３８：
0004031028.tif 000059
（２）配列番号（SEQ ID No.）：３９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.３９：
0004031028.tif 000060
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４０：
0004031028.tif 000061
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４１：
0004031028.tif 000062
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４２：
0004031028.tif 000063
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４３：
0004031028.tif 000064
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述；SEQ ID No.４４：
0004031028.tif 000065
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４５：
0004031028.tif 000066
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４６：
0004031028.tif 000067
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４７：
0004031028.tif 000068
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４８：
0004031028.tif 000069
（２）配列番号（SEQ ID No.）：４９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.４９：
0004031028.tif 000070
（２）配列番号（SEQ ID No.）：５０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.５０：
0004031028.tif 000071
（２）配列番号（SEQ ID No.）：５１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.５１：
0004031028.tif 000072
（２）配列番号（SEQ ID No.）：５２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（xi）配列の記述：SEQ ID No.５２：
0004031028.tif 000073
（２）配列番号（SEQ ID No.）：５３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス配列：NO
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：他の特徴
（B）位置：９
（D）他の情報：／標準名＝Ｇ又はＣ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／キイ：他の特徴
（B）位置：１２
（D）他の情報：／標準名＝Ｔ又はＡ
（xi）配列の記述：SEQ ID No.５３：
0004031028.tif 000074
【図１】
0004031028.tif 000081
0004031028.tif 000082
【図２】
0004031028.tif 000083
【図３】
0004031028.tif 000084
【図４】
0004031028.tif 000085