(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化抗脈管内皮増殖因子抗体であって、非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がＶＬκサブグループＩ（ＶＬκＩ）およびＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）を含むヒトのフレームワークに移植されており、そのＶＬドメインおよびＶＨドメインが以下の組合せから選択されるアミノ酸配列からなる、ヒト化抗脈管内皮増殖因子抗体：
（１）ＶＬドメインは、配列番号７において４番目のメチオニンがロイシンで置換されているアミノ酸配列であり、ＶＨドメインは、配列番号１０において３７番目のバリンがイソロイシン、６８番目のフェニルアラニンがトレオニン、７２番目のアルギニンがロイシン、７４番目のアスパラギンがトレオニン、７６番目のリシンがアラニン、７７番目のアスパラギンがセリン、７９番目のロイシンがバリン、９８番目のアルギニンがリシンで置換されているアミノ酸配列である；
（２）ＶＬドメインは、配列番号８のアミノ酸配列であり、ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列である；または
（３）ＶＬドメインは、配列番号８において４６番目のロイシンがバリンで置換されているアミノ酸配列であり、ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列である。
【請求項２】
非ヒト抗脈管内皮増殖因子抗体をヒト化する方法であって、次の工程：
非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をＶＬκサブグループＩ（ＶＬκＩ）およびＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）を含むヒトのフレームワークに移植すること；
そのＶＬドメインでＫａｂａｔ番号付けシステムによる残基４、残基４６および残基７１の中の少なくとも１個、およびそのＶＨドメインでＫａｂａｔ番号付けシステムによる残基３７、６７、７１、７３、７５、７６、７８および９４の中の少なくとも３個を本来その位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸によって置換すること
を含み、それにより該ＶＬドメインおよび該ＶＨドメインが以下の組合せから選択されるアミノ酸配列を有する、方法：
（１）ＶＬドメインは、配列番号７において４番目のメチオニンがロイシンで置換されているアミノ酸配列であり、ＶＨドメインは、配列番号１０において３７番目のバリンがイソロイシン、６８番目のフェニルアラニンがトレオニン、７２番目のアルギニンがロイシン、７４番目のアスパラギンがトレオニン、７６番目のリシンがアラニン、７７番目のアスパラギンがセリン、７９番目のロイシンがバリン、９８番目のアルギニンがリシンで置換されているアミノ酸配列である；
（２）ＶＬドメインは、配列番号８のアミノ酸配列であり、ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列である；または
（３）ＶＬドメインは、配列番号８において４６番目のロイシンがバリンで置換されているアミノ酸配列であり、ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列である。
【請求項３】
請求項１のヒト化抗体を含む組成物を形成することを含む有糸分裂シグナルを阻止することによって腫瘍の増殖を阻止するために使用するための薬剤を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の技術分野
本発明はヒト化抗体およびヒト化抗体の製造法を指向する。殊に本発明は一価ファージ提示系を使用し、また、必須フレームワーク残基の小さな組合せにランダム的突然変異誘発をしてヒトの単一フレームワークとして製造された抗体の突然変異体を使用する、ヒト化抗体の製造法を指向する。さらに特定的にはこの発明は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合するマウス抗体のヒト化を指向する。
本発明の背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は殊に定義されたシステムを調節するために使用できる時には治療剤として大きな可能性を有する。例えばある環境では、たとえば現存する小血管の壁から新らしい毛細血管が形成される脈管形成のような系を調節することは望ましいであろう。損傷した組織の近辺で毛細管成長の急激な出現が刺激を受けることができるように創傷または感染を受けた後には脈管形成は一般的に重要である。しかしながら、脈管形成は腫瘍の増殖にも重要である。何故なら連続的増殖のためには腫瘍は腫瘍塊に侵入する毛細血管網の形成を誘導しなければならないからである。
ある種の増殖因子は脈管形成を調節するものとして確認されている。殊に興味深いものは脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であって、これはある種の腫瘍が豊富な血液供給を獲得するための作因であると思われる。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ・ｏｆ・ｔｈｅ・Ｃｅｌｌ（細胞の分子生物学）」、第３版、Ａｌｂｅｒｔｓほか著、Ｇａｒｌａｎｄ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１１５４頁（１９９４年）。それ故、ＶＥＧＦに対するｍＡｂは、例えば脈管形成の調節における使用、さらに特定的には抗腫瘍剤としての使用を含む種々の理由から有用であることができる。ＶＥＧＦ受容体の結合を遮断するマウス抗ＶＥＧＦｍＡｂ・Ａ４．６．１は以前に報告されている。この抗体が有糸分裂の信号を阻害することが証明されている。Ｋｉｍほか著、Ｇｒｏｗｔｈ・Ｆａｃｔｏｒｓ、７巻：５３頁（１９９２年）；Ｋｉｍほか著、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：８４１頁（１９９３年）。
前記抗−ＶＥＧＦを含む殆どのｍＡｂはマウスその他の非ヒト起源から誘導されたものなので、臨床的効能が限定されている。殊に身体は非ヒト抗体に対して免疫反応を起こすことが多く、そこでその抗体はいかなる治療的効果も起きない間に急速に排除される。ヒトに投与した時に発動される非ヒトｍＡｂの免疫原性に加えて、エフェクター機能の動員が弱いという別の限定が発生する。
これらの欠点を回避する手段として抗体の「ヒト化」として知られている製法によって非ヒトｍＡｂの抗原結合性能をヒトの抗体に授けることができる。ヒト化抗体はヒトの抗体のフレームワークに移植された元のｍＡｂまたは対応する非ヒトｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ：抗体分子の抗原結合部位）６個のアミノ酸配列を含む。それ故、非ヒト抗体のヒト化は通常ＣＤＲ移植と呼ばれる。このようなヒト化抗体の中の非ヒト配列の割合を低くする（〜５％）ことが免疫原性を低下させ、ヒトの投与された抗体の血清中半減期を延長するために有効であることが証明されている。とりわけ、ヒト化モノクローナル抗体（「キメラ免疫グロブリン」）は、米国特許第４８１６５６７号に開示されている。
不都合にもＣＤＲ配列の単純な移植は抗原には元の非ヒト化ｍＡｂよりもずっと弱く結合するヒト化抗体を与えることが多い。親和性を高く維持するためにはその抗体を微調整するように抗原結合ループの構造をさらに処理しなければならない。これは元のマウス抗体にあるマッチング配列を持つ抗体の可変ドメインのフレームワーク領域にある、鍵となる残基を置換することによって達成される。これらのフレームワーク残基は通常ＣＤＲループの立体配座を保持することに関与しているが、フレームワークの残基によってはそれ自体が直接的に抗原と接触するものもあるかも知れない。ＣＤＲ立体配座に対するフレームワーク残基の重要性に注目した研究が行われて抗原結合に影響を与えることのできるフレームワーク残基全ての網羅的なリストが集積されている。Ｃｈｏｔｈｉａほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４巻：４８７頁（１９９２年）；Ｆｏｏｔｅほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４巻：４８９頁（１９９２年）。この網羅的な表にはＣＤＲ構造に寄与する可能性のある「補助的（vernier）」残基３０個（thiry）ほどを包含する。高度な抗原親和性はヒト化抗体内の補助的残基の組合せ全部を対応する元の非ヒト配列にマッチするように編集することから得られると思われるけれども、これは非ヒト配列の要素をそれ以上の追加することによって負わされる免疫原性の危険度が増大するので一般的には望ましくない。そこで、治療的観点からすると、フレームワークの変化を親和性の高いヒト化抗体を与えるための最小の組合せに限定することが望ましい。
それ故、結合を最適化するために十分な変化の小さな組合せを確認することは望ましいことであるが、しかしながら必要な変化はヒト化抗体ごとに相違するものと予期される。この所望の結果を達成するためには一つの手段はそのマウス対応物によって置換された「容疑（suspect）」フレームワーク残基を有する一群の突然変異体を構築することによって突然変異の正しい組合せを確認することであった。これらの変異体を個々に形成して抗原に対して試験し、次に望ましい結合親和性を有する別の変異体と結合する。しかしながら、この方法には個々の部位特異的突然変異誘発、分離および検索の反復含み、時間がかかり、退屈なので、それ故に望ましくない。
抗体のヒト化を単純化する手段として相異なる手法が多数開発されている。例えばＱｕｅｅｎほか著、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８６巻１００２９頁（１９８９年）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈほか著、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇ．、４巻：７７３頁（１９９１年）；Ｔｅｍｐｅｓｔほか著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：２６６頁（１９９１年）；Ｐａｄｌａｎ著、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻：４８９頁（１９９１年）；Ｒｏｇｕｓｋａほか著、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９１巻９６９頁（１９９４年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａほか著、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇ．、７巻：８０５頁（１９９４年）；Ａｌｌｅｎほか著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５巻：３６８頁（１９８５年）；Ｃａｒｔｅｒほか著、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａほか著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年）；Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔほか著、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１８巻：４９頁（１９９４年）；Ｓｈａｌａｂｙほか著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７頁（１９９２年）；Ｋａｂａｔほか著、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ・ｏｆ・Ｐｒｏｔｅｉｎｓ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的意義のある蛋白質の配列）」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ・Ｈｅａｌｔｈ・Ｓｅｒｖｉｃｅ社、ＮＩＨ、ベセスダ、ＭＤ（１９９１年）；およびＲｏｓｏｋほか著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻：２２６１１頁（１９９６年）参照。
本発明の目的の一つはヒト化抗体のそれが連結する抗原への結合を改善して、個々の部位特異的突然変異誘発と検索との反復に基づくフレームワーク最適化を用いている現行の方法を無用にする、フレームワーク突然変異を迅速に選択する一般的手段を提供することにある。
また、免疫原性が低い抗体を提供すること、および一般的な骨組として単一なヒトのフレームワークを利用する抗体をヒト化する迅速な方法を提供することも目的の一つである。
本発明の別の目的はフレームワークの変化を持たない最初のヒト化抗体と比較して抗原に対する親和性が強化されるように突然変異させたヒト化抗体を提供することにある。
これに加えて、本発明の他の目的は排出速度が減少しており、そのために体内に投与した後の保持時間が長く、治療効果を得るために全身投与に必要な物質が低用量になったヒト化抗体を提供することである。
ＶＥＧＦに対するヒト化モノクローナル抗体を提供することは本発明のまた別の目的である。
本発明の要約
本発明は脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化抗体を提供する。最初のヒト化抗ＶＥＧＦはヒトの最も豊富なサブクラス、すなわち、ＶＬκサブグループＩ（ＶＬκＩ）およびＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）の共通配列から誘導されたフレームワークを有し、それに非ヒト抗ＶＥＧＦからのＣＤＲが移植されたものである。最初の構築物で必須なフレームワーク残基のランダム突然変異誘発をするとフレームワークが変化していなかった最初のヒト化抗体と比較して抗原に対する親和性が１２５倍も強化された本明細書に記載するヒト化抗ＶＥＧＦを与える。単一な追加的突然変異で結合がさらに６倍もの改善を与えた。本明細書に記載する方法によって、または本明細書に提供する配列情報が与えられれば慣用的組換え技術によって、このヒト化抗ＶＥＧＦを再生産できる。
本明細書中には連結抗原に対するヒト化抗体の結合を改良するフレームワーク突然変異を迅速に製造、確認する方法を提供する。好適な態様では非ヒトＣＤＲをヒトのＶＬκＩ−ＶＨＩＩＩフレームワーク上に移植する。必須なフレームワーク残基の小さな組合せにランダム突然変異誘発も行い、続いて得られた抗体分子のライブラリーを線状ファージの表面にモノバレントディスプレイをさせる。
次に最適なフレームワーク配列を親和性に基づく選択によって確認する。所望ならば選択された抗体をさらに突然変異させてＶＬ−ＶＨ境界に存在する補助的残基を元の非ヒト抗体にマッチする残基に置換できる。
本明細書に記載する方法はいかなる非ヒト抗体にも適用できる。従って本発明によってヒト化抗体が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１はネズミＡ４．６．１（ＶＬおよびＶＨの各ドメイン配列：配列番号６および９）、ヒト化Ａ４．６．１変異体ｈｕ２．０（ＶＬおよびＶＨの各ドメイン配列：配列番号７および１０）およびヒト化Ａ４．６．１変異体ｈｕ２．１０（ＶＬおよびＶＨの各ドメイン配列：配列番号８および１１）のアミノ酸配列を示す。
各配列の番号付けはＫａｂａｔほか著、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ・ｏｆ・Ｐｒｏｔｅｉｎｓ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｌ・Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的意義のある蛋白質の配列）」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ・Ｈｅａｌｔｈ・Ｓｅｒｖｉｃｅ社、ＮＩＨ、ベセスダ、ＭＤ（１９９１年）に従ったもので、ミスマッチは星印（ネズミＡ４．６．１対ｈｕ２．０）または黒丸（ｈｕ２．０対ｈｕ２．１０）で示した。変異体ｈｕ２．０はヒトの軽鎖ＫサブグループＩ、重鎖サブグループＩＩＩのフレームワークに移植されたマウス抗体からのＣＤＲ配列（太字）のみを含む。変異体ｈｕ２．１０は本明細書中に記載するファージ分類実験から得られた共通ヒト化クローンである。
図２はランダム化の標的にしたフレームワーク残基を示す。
図３はファージにあるＦａｂ−ｐＩＩＩ融合体を表面提示させるためのファージミド構築物を示す。このファージミド構築物はＭ１３遺伝子ＩＩＩコート蛋白質の一部に融合した抗体Ａ４．６．１に対するＦａｂ断片のヒト化変異体をコードする。この融合蛋白質は重鎖のカルボキシル末端で単一グルタミン残基（ｓｕｐＥ・Ｅ．ｃｏｌｉにあるアンバーコドンの抑制からの）、続いて遺伝子ＩＩＩ蛋白質のＣ末端領域（残基２４９〜４０６）に結合したＦａｂからなる。Ｆ+Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換とそれに続くＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージによるスーパーインフェクションでファージミド粒子が産生されるが、その粒子ではこれらの小さな割合が融合蛋白質の単一（single）コピーをディスプレイされる。
本発明の詳細な説明
Ａ．定義
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同じ構造的特性を有する糖蛋白質である。抗体は特定の抗原に結合する特異性を示すが免疫グロブリンは抗体の他に、抗原特異性のない他の抗体様分子も含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低濃度で産生され、骨髄腫によってそれよりも高濃度で産生される。
「在来型の抗体」および「在来型の免疫グロブリン」は通常約１５００００ダルトンのヘテロテトラマー性の糖蛋白質であって、２個の同一な軽鎖（Ｌ）および２個の同一な重鎖（Ｈ）からなる。各軽鎖は１個の共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に結合しており、一方ジスルフィド結合の数は異なるアイソタイプに属する免疫グロブリンが持つ重鎖の間では変化が認められる。各重鎖と軽鎖とはまた規則的な間隔で鎖内ジスルフィド橋を持つ。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）および他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインに並列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖の可変ドメインと重鎖の可変ドメインとの間の界面を形成すると信じられている。Ｃｌｏｔｈｉａほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８６巻：６５１頁（１９８５年）；Ｎｏｖｏｔｎｙほか、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８２巻：４５９２頁（１９８５年）。
用語「可変」は可変ドメインのある部分が抗体間で配列が著しく異なり、特定の抗体が特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を示す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインを通じて均等に分布してはいない。それは軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインの双方にある「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「超可変領域」と呼ばれる３個の分節に集中している。可変ドメインの中で比較的高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。在来型の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４個のＦＲ領域を含み；主にｐ−シート構造を取り、ＣＤＲ３個によって結合しており、β−シート構造に結合するループを形成し、場合によってはβ−シート構造の一部を形成する。各鎖内のＣＤＲはＦＲ領域により相互に近くに保たれ、他の鎖からのＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。Ｋａｂａｔほか著、前出。定常ドメインは抗体と抗原との結合には直接的な関与はないが、たとえば依存性細胞傷害性における抗体の寄与のような種々のエフェクター機能を示す。
抗体のパパイン消化でＦａｂ断片と呼ばれ、各々が単一な抗原結合部位を持つ２個の同一な抗原結合性断片および残りの容易に結晶する性能を示す「Ｆｃ」断片という名前の断片が作られる。ペプシン処理は（Ｆａｂ1）２断片を与えるが、これは抗原結合部位２個を有し、なお抗原と交差結合することができる。
「Ｆｖ」は完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は重鎖１個および軽鎖可変ドメイン１個の強固で非共有結合的会合によるダイマーからなる。各可変ドメインのＣＤＲ３個が相互作用してＶＨ−ＶＬダイマー表面の抗原結合部位を定義付けているのはこの配置である。６個のＣＤＲは集合的にその抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえも完全な結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する性能を持つ。
「Ｆａｂ」断片は軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ1断片は重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域からのシステイン１個またはそれ以上を含む数個の残基が追加されている点で、Ｆａｂ断片とは異なる。ここに、Ｆａｂ1−ＳＨはＦａｂ1であって、その定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するものを示す。（Ｆａｂ1）２抗体断片は本来一対のＦａｂ1断片として産生されたものであるが、これはそれらの間にヒンジのシステインを有する。その他に抗体断片の化学的結合体も知られている。
いずれの脊椎動物から得られる抗体（免疫グロブリン）の軽鎖も定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる明らかに相異なるタイプ２種の中の１種に分類できる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンには主なクラスが５つある：すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであって、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２などに分類される。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは各々α、デルタ、イプシロン、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンにあるこれらのサブユニットの構造および三次元配置は良く知られている。
用語「抗体」は最も広い定義で使用され、所望の生物学的作用を示す限り、単一なモノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ的な特異性を有する抗体、ならびに抗体断片（たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ1）２、およびＦｖ）を特異的に包含する。
本明細書中に使用する用語「モノクローナル抗体」は実質的に均一な抗体から得られる抗体を示す。すなわち、その集団を構成する各抗体が天然起源の可能性がある僅かな量の突然変異を除いて同一なものである。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一な抗原部位を指向する。さらにその上、異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含む通常の抗体（ポリクローナル抗体）製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一な決定基を指向する。
その特異性に加えてモノクローナル抗体はハイブリドーマ培養物によって他の免疫グロブリンによる汚染なしに合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は実質的に均質な抗体集団から得られるというその抗体の特性を示し、およびいずれか特定な方法による抗体の産生が必要であると理解すべきではない。
例えば、本発明に従って使用すべきモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒほか著、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）に初めて記載されたハイブリドーマ法によって産生してもよく、また、組換えＤＮＡ法によって製造してもよい。たとえば米国特許第４８１６５６７号参照。
「キメラ抗体（キメラ免疫グロブリン）」は所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体の対応する配列または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同的な抗体であり、一方では、その鎖（単数または複数）の残りの部分は他の種から誘導した抗体の対応する配列または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同的である抗体、ならびにそのような抗体の断片である。米国特許第４８１６５６７号。
非ヒト（たとえばマウス）抗体の「ヒト化」型はキメラ性免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ1、Ｆ（ａｂ1）２またはその他の抗原結合性抗体のサブ配列のようなもの）であって、最少量の非ヒト免疫グロブリン由来配列を含む。多くの部分でヒト化抗体はヒトの免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエント相補性決定領域からの残基が、たとえばマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種の所望の特異性、親和性および能力を有するＣＤＲ（ドナー抗体）からの残基によって置換されている。時にはヒト免疫グロブリン残基のＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置換されている。さらにその上、ヒト化抗体はレシピエントの抗体にも、インポートしたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも存在しない残基を含むこともある。これらの修飾は抗体のパフォーマンスをさらに精密化し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は実質的に全ての可変ドメイン少なくとも１個、および典型的には２個を含み、そこではＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、Ｆｖ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである。最適には、ヒト化抗体には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含むこととなろう。さらに詳細な点についてはＪｏｎｅｓほか著、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎほか著、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ著、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３頁（１９９２年）参照。
「ヒトで非免疫原性の」は治療的に有効な用量でヒトの適当な組織とヒト化抗体とが接触する時にヒト化抗体に対する過敏性または耐性の状態が投与に際して実質的に示されないことを意味する。
本明細書中に使用する「脈管内皮細胞増殖因子」または「ＶＥＧＦ」は米国特許第５３３２６７１号に規定している哺乳類の増殖因子であってその特許の図１に記載のアミノ酸配列のものを含むものを意味する。在来型ＶＥＧＦの生物学的活性はそのいかなる類似体または変異体とも共有されており、それらは脈管内皮細胞の選択的増殖を促進することができるものであるが、ウシ角膜内皮細胞、レンズ上皮細胞、副腎皮質細胞、ＢＨＫ−２１繊維芽細胞またはケラチノサイトのものではなく、または対応する在来型ＶＥＧＦのエピトープの少なくとも一つに対して産生された抗体と免疫学的交差反応性のある免疫エピトープを有する。
「部位特異的突然変異誘発」は当分野で標準的な技術であって、突然変異誘発すべき単一鎖ファージＤＮＡとは所望の突然変異を示す僅かなミスマッチを除いて相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して実行される。略述すれば、合成的オリゴヌクレオチドをファージに相補的な鎖の直接的な合成を指向するプライマーとして使用し、得られた二重鎖ＤＮＡでこのファージを支持する宿主細菌を形質転換する。形質転換した細菌の培養物を寒天上に塗布し、ファージを含有する単一細胞からできたプラークを形成させる。理論的には新規プラークの５０％が突然変異した型の単鎖のファージを含み、５０％が元の配列を有するものである。正しいマッチングはハイブリッド形成できるが、元の鎖とのミスマッチをハイブリッド形成できない温度でキナーゼ処理した合成プライマーとこのプラークとをハイブリッド形成させる。プローブとハイブリッド形成したプラークを次に選択し、培養してＤＮＡを回収する。
「発現系」は所望のコード配列および制御配列を作動可能な結合において含むＤＮＡ配列を示し、この配列で形質転換した宿主はコードされた蛋白質を産生できるものとする。形質転換を起こすためには、発現系はベクターに含まれていてもよいが、関与するＤＮＡが宿主の染色体に挿入されていてもよい。
本明細書に使用する「細胞」、「細胞系列」および「細胞培養物」は互換的に使用され、これらの語句は子孫を全て含む。そこで「形質転換体」および「形質転換した細胞」は初代の細胞および形質転換の回数に拘らずそれから誘導された培養物を包含する。また子孫は故意のまたは偶発的な突然変異のためにＤＮＡ含有が正確に同一である必要はないものと理解される。本来の形質転換した細胞について検索したものと同じ機能性を有する突然変異体の子孫も包含する。厳密な命名を意図するものは記載から明らかとなろう。
「プラスミド」は先頭に小文字ｐおよび／または続いて大文字および／または数字で記載する。本明細書に記載する出発プラスミドは公衆が商業的に購入し、制限なしに入手できるか、またはそのような入手可能なプラスミドから発表されている操作法に従って構築できる。それに加えて、その他の等価なプラスミドはこの技術分野で知られており、通常の専門家にとって明らかになろう。
「親和性結合」は抗体上にある単一の抗原結合部位と単一なエピトープとの間の非共有結合的相互作用の強さの総計を示す。低親和性抗体は抗原に弱く結合して容易に分離する傾向があるが、高親和性抗体はさらに強く抗原に結合し、結合したままで長時間存在する。
「形質転換」はＤＮＡを染色体外エレメントとして、または染色体への挿入によるかのどちらかで、ＤＮＡが複製できるように生物体に導入することを意味する。形質転換は使用する宿主細胞に依存してその細胞に適する標準的技術を用いて行われる。Ｃｏｈｅｎ著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９巻：２１１０頁（１９７２年）およびＭａｎｄｅｌほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５３巻：１５４頁（１９７０年）に記載されている塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法は一般的に原核生物またはその他の実質的な細胞壁障壁を有する細胞に対して使用する。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞にはＧｒａｈａｍおよびｖａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂ著、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６頁（１９７８年）に記載の燐酸カルシウム沈殿法が好適である。哺乳類細胞宿主系の形質転換の一般的な側面は、１９８３年８月１６日に発行されたＡｘｅｌの米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母への形質転換は典型的にはＶａｎ．Ｓｏｌｉｎｇｅｎほか著、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０巻：９４６頁（１９７７年）およびＨｓｉａｏほか著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻：３８２９頁（１９７９年）の方法に従って実行する。しかしながらＤＮＡを細胞に導入する、たとえば核内注射、電気穿孔法または原形質融合によるようなその他の方法を使用してもよい。
所定のＤＮＡ断片の制限消化物からの「回収」または「分離」は消化物をポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で電気泳動し、易動度を既知分子量のマーカーＤＮＡ断片のものと比較して目的とする断片を確認し、所望の断片を含むゲル区分を取出し、ゲルからＤＮＡを分離することを意味する。この操作法は一般に知られている。例えばＬａｗｎほか著、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、９巻：６１０３頁（１９８１年）およびＧｏｅｄｄｅｌほか著、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）参照。
「連結」は二重鎖核酸断片２個の間にホスホジエステル結合を形成する工程を示す。特段の記載がない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結すべき両ＤＮＡ断片０．５ｍｇにつき、ＤＮＡリガーゼＴ４（「リガーゼ」）１０ユニットを既知の緩衝液および条件を使用して達成してもよい。
用語「制御配列」はコード配列に作動可能に結合している特定の宿主生物体での発現に必要なＤＮＡ配列を示す。原核生物に適する制御配列は、例えばプロモータ、所望によってはオペレータ配列、リボソーム結合部位および場合によってはその他の十分には理解されていない配列を含む。真核生物細胞はプロモータ、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。核酸はその他の核酸配列との機能的関係において配置されている時には「作動できる結合」または「作動可能に結合」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡはそれがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現されるならポリペプチドのＤＮＡと作動可能に結合しており、プロモーターまたはエンハンサーはそれらが配列の転写に影響を与えるならコード配列と作動可能に結合しており、またリボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように配置されているならコード配列に作動可能に結合している。一般に「作動できる結合」または「作動可能に結合」は結合するＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接しており読取り枠内にあることを意味する。しかしながらエンハンサーは隣接する必要がない。結合は便宜的な制限部位での連結によって達成される。もしそのような部位が存在しなければ、通常の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを用いる。
本明細書中に使用する「代表的な番号で」は特定配列における所定残基の位置番号および種々の配列における対応する位置番号を示す。対応する位置番号は配列内、一般にはヒトの抗体フレームワーク配列内の位置であって、ヒト化抗体の構築に使用する時にはそれらは機能的に代表的な番号での位置と等価である。
通常は用語「アミノ酸」は天然起源のＬ−α−アミノ酸全てを示す。しかし、ある態様では配座的制限を促進するために本発明のポリペプチドまたはペプチドにはＤ−アミノ酸が存在してもよい。アミノ酸は一文字表記または三文字表記のいずれかで記載される。
Ａｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸      Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン
Ｔｈｒ  Ｔ  トレオニン          Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン
Ｓｅｒ  Ｓ  セリン              Ｔｙｒ  Ｙ  チロジン
Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸        Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン            Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン
Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン            Ｌｙｓ  Ｋ  リジン
Ａｌａ  Ａ  アラニン            Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン
Ｃｙｓ  Ｃ  システイン          Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン
Ｖａｌ  Ｖ  バリン              Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン
Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン          Ａｓｎ  Ｎ  アスパラギン
用語「アミノ酸配列変異体」は在来型アミノ酸配列と比較してアミノ酸配列にいくらかの相違を有する分子を示す。
置換変異体は在来型配列中のアミノ酸残基少なくとも１個が除去されて異なるアミノ酸をその同じ場所に挿入したものである。この置換は分子内のアミノ酸１個だけが置換された単一置換であってもよく、または同じ分子内のアミノ酸２個またはそれ以上が置換された多重置換であってもよい。
ハイブリッド形成は「緊縮条件」下に行うのが好ましい。これは（１）洗浄に低イオン強度と高温、例えば０．０１５Ｍ−塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ−クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃、を採用する；または（２）ハイブリッド形成の間にたとえばホルムアミドのような変性剤を、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドに０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％ファイコル／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｎＭ−燐酸ナトリウムのｐＨ６．５緩衝液を７５０ｍＭ−塩化ナトリウム、７５ｍＭ−クエン酸ナトリウムとともに４２℃で採用すること；を意味する。別の例では５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ−ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ−クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで４２℃で洗浄する。さらに別の例では１０％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ（ＮａＣｌ／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドを５５℃で使用するハイブリッド形成を行い、続いてＥＤＴＡ添加０．１×ＳＳＣからなる５５℃での高緊縮条件で洗浄する。ある核酸分子の核酸配列が与えられた時には前記条件下にそれとハイブリッドを形成する他の核酸分子はその配列の範囲内にあると考えるものとする。
アミノ酸配列が記載される時にはこれらの配列は合成的にアミノ酸配列を最構築することによって、または突然変異によって再現できると理解される。その他に組換え技術を使用してそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが回収されるように使用できるものと理解される。このＤＮＡは所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡから得たライブラリーを形成することによって回収される。次にプローブをそのアミノ酸配列に基づいて作製する。そのプローブにハイブリッド形成するＤＮＡを分離して分析し、そのＤＮＡがコードする産物が所望の産物かどうかを決定する。一般的には細胞をそのＤＮＡ（またはＲＮＡ）で形質転換して、発現研究を行う。
Ｂ．ヒト化抗体に関する一般的方策
本明細書中に記載する方法はいかなる抗体をヒト化するためにも使用できる。同様にして本明細書中に記載するヒト化抗体であるヒト化抗ＶＥＧＦは本明細書に記載する方法によってまたは通常のＤＮＡ組換え技術によって再生産できると理解される。特定的には、必須なフレームワーク残基の突然変異を本明細書中に記載するので、ヒト化抗体は一価ファージディスプレイ系を使用して再生産しないでも同じ突然変異を持つものを再生産できる。むしろ、ここに記載するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは合成または通常のＤＮＡ組換え技術による製造ができる。次にそのＤＮＡの産物を発現し、確認し、回収できる。これとは別に当技術分野で知られている方法によって抗体に部位特異的突然変異の誘発を行うか、またはその抗体が本明細書に記載する突然変異を持つように合成することもできる。
本明細書に記載するヒト化抗体を製造する特に好適な方法は次のものを含む：ヒトＶＬκＩ−Ｃκ１軽鎖およびヒトＶＨＩＩＩ−ＣＨ１γ重鎖Ｆｄをコードするベクター上での部位特異的突然変異誘発によって移植したＣＤＲ配列を持つＦａｂ断片のモノバレントディスプレイのための抗体ファージミドベクターを製造する；抗体Ｆａｂファージミドライブラリーを選択した必須フレームワーク残基の小さな組合せのランダム的突然変異誘発によって構築する；このヒト化Ｆａｂ断片を発現、精製する；ヒト化Ｆａｂ変異体を選択する；および結合親和性を決定する。これらの工程を特定の順序で行う必要はない。下記の「特定的実施例」の欄にこれらの工程を特定的に記載するが、一般的には次のようにして実行される。
Ｆａｂ断片を１価ディスプレイするための抗体ファージミドベクターの製造
最初にヒト化する抗体を選択して相補性決定領域（ＣＤＲ）を確認する。この抗体のＣＤＲ配列はＫａｂａｔほか著、前出、の配列定義に従って確認できる。このＣＤＲ配列をヒトＶＬκＩ−Ｃκ１軽鎖およびヒトＶＨＩＩＩ−ＣＨ１γ重鎖のＦｄをコードするベクターへの部位特異的突然変異誘発によって移植する。次にこのＦａｂをコードする配列をファージミドベクターにサブクローニングする。この構築物は最初のヒト化抗体をコードするが、その重鎖のＣ末端はファージのコート蛋白質のカルボキシル部分に正確に融合される。大腸菌ｓｕｐＥサプレッサー株で分泌重鎖または重鎖−遺伝子ＩＩＩ融合体双方の発現を提供するファージミドベクターを選択するのが好ましい。
抗体Ｆａｂのファージミドライブラリーの構築
ヒトＶＬκＩ−ＶＨＩＩＩフレームワークに非ヒト抗体をヒト化した多数の結果の集積に基づいて抗原の結合を最適化するために必要なフレームワークの変化がいくつかの残基の組合せに限定されると考えた。Ｃａｒｔｅｒほか著、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａほか著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年）；Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔほか著、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１８巻：４９〜６２頁（１９９４年）；Ｓｈａｌａｂｙほか著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７頁（１９９２年）参照。従って新規な残基群をランダム化について選択した。これらの確認された重要なフレームワーク残基をランダム化すると、線状ファージ表面にディスプレイするべき所望のＦａｂ変異体のライブラリーを得た。特定的にはＶＬの残基４および７１およびＶＨの残基２４、３７、６７、６９、７１、７１、７５、７６、７８、９３および９４を抗原の結合に重要なカギとなるフレームワーク残基として選択して、ランダム化の標的とした。
ヒト化Ｆａｂ断片の発現および精製
当技術分野では断片の発現および精製のためには様々な方法が知られている。
本明細書に記載するように、非サプレッサーである大腸菌３４Ｂ８株をファージミドｐＭＢ４１９またはその変異体で形質転換した。単一コロニーをカルベニシリン５０μｇ／ｍＬ添加２ＹＴ５ｍＬ中で一夜３７℃で増殖させた。これら培養物をＣｈａｎｇほか著、Ｇｅｎｅ、５５巻：１８９頁（１９８７年）に記載されているＡＰ５培地２００ｍＬにカルベニシリン２０μｇ／ｍＬを添加したもので希釈して、２６時間３０℃でインキュベーションした。細胞を４０００×ｇでペレット化して−２０℃で少なくとも２時間凍結した。次に細胞ペレットを１ｍＭ−ＥＤＴＡ添加１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５ｍＬに再懸濁し、４℃で９０分間振盪し、１００００×ｇで１５分間遠心分離した。上清液を１ｍＬのストレプトコッカスＧ蛋白質−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のカラム）に入れて１０ｍＭ−ＭＥＳ（ｐＨ５．５）１０ｍＬで洗浄した。結合したＦａｂ断片を１００ｍＭ−酢酸で溶離し、直ちに１Ｍ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．００．７５ｍＬで中和した。Ｆａｂ製品の緩衝液をＰＢＳと交換し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮した。Ｆａｂの典型的な収量はＧ蛋白質での精製後に約１ｍｇ／培養液Ｌであった。精製Ｆａｂ試料をエレクトロスプレー質量分析法によって特性分析し、濃度はアミノ酸分析によって決定した。
ヒト化Ｆａｂ変異体の選択
マイクロタイター板に精製標識抗原を被覆する。被覆溶液を廃棄し、ウェルをブロックし、ファージミドの貯蔵液を添加する。所定時間後、ウェルを洗浄し、結合したファージを溶離し、力価を測定する。ＶＥＧＦ被覆ウェルから溶離した残りのファージを培養して次の選択サイクルで使用する。この工程を数回反復して所望数のクローンを得ることができる。例えば個々のクローンを数ダース選択して、配列決定できる。
ＥＧＦ結合親和性の決定
ＶＥＧＦへのヒト化変異体の結合について会合−解離の速度定数を測定する。結合のプロファイルを分析して最高な親和性を示す変異体をいくつか選択する。
ヒト化抗ＶＥＧＦの投与
ヒト化抗ＶＥＧＦの投与はＫｉｍほか著、Ｇｒｏｗｔｈ・Ｆａｃｔｏｒｓ、７巻：５３頁（１９９２年）；Ｋｉｍほか著、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：８４１頁（１９９３年）に記載のマウス抗ＶＥＧＦについて報告されているデータから外挿できる。殊に、Ｋｉｍほかの報告はＶＥＧＦ抗体の毎週２回わずか１０μｇが腫瘍増殖を顕著に阻害することを証明している。最大の効果は５０〜１００μｇの抗体用量で達成された。
以下の実施例は現在知られている本発明を実行するために最善な態様を例示することのみを意図したものであるが、本発明がこの実施例の詳細部分に限定されるものと考えるべきではない。
特定的実施例１
ファージミドベクターの構築および最初のヒト化抗ＶＥＧＦ
マウス抗ＶＥＧＦ・ｍＡｂ・Ａ４．６．１は以前にＫｉｍほか著、Ｇｒｏｗｔｈ・Ｆａｃｔｏｒｓ、７巻：５３頁（１９９２年）；Ｋｉｍほか著、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：８４１頁（１９９３年）に記載されている。ヒト化Ａ４．６．１の最初のＦａｂ変異体、ｈｕ２．０をヒトＶＬκＩ−Ｃκ１軽鎖およびヒトＶＨIII−ＣＨ１γ１重鎖Ｆｄ断片をコードするプラスミドｐＡＫ２のデオキシウリジン添加鋳型を使用する部位特異的突然変異誘発によって構築した。Ｃａｒｔｅｒほか著、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）。移植したＡ４．６．１ＣＤＲ配列を、われわれが両配列および構造の定義を含むように即ち、ＶＨの残基２６〜３５にまで拡張したＣＤＲ−Ｈ１以外はＫａｂａｔほか著、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ・ｏｆ・Ｐｒｏｔｅｉｎｓ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的意義のある蛋白質の配列）」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ・Ｈｅａｌｔｈ・Ｓｅｒｖｉｃｅ社、Ｎａｔｉｏｎａｌ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ・ｏｆ・Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、ＭＤ（１９９１年）の定義配列に従って選択した。Ｃｈｏｔｈｉａほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９８７年）。このＦａｂをコードする配列をファージミドベクターｐｈＧＨａｍｇ３にサブクローニングした。ＢａｓｓとＷｅｌｌｓ著、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９頁（１９９０年）；Ｌｏｗｍａｎほか著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０巻：１０８３２頁（１９９１年）。この構築物、ｐＭＢ４−１９はＭ１３遺伝子ＩＩＩのコート蛋白質のカルボキシル部分に正確に融合する重鎖Ｃ末端を有する最初のヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ、ｈｕ２．０をコードする。ｐＭＢ４−１９は構築がＦａｂ断片を１価ディスプレイするために以前に報告されたプラスミド、ｐＤＨ１８８と類似している。Ｇａｒｒａｒｄほか著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．、９巻：１３７３〜１３７７頁（１９９１年）。ｐＭＢ４−１９とｐＤＨ１８８との間の注目すべき相違点はＭ１３遺伝子ＩＩＩ分節（コドン２４９〜４０６）が短いことと抗体重鎖Ｆｄ断片の直後にアンバー停止コドンを使用することを含む。これが大腸菌ｓｕｐＥ株で分泌される重鎖または重鎖−遺伝子III融合体の両者の発現を可能にする。
ヒトのＶＬκＩ−ＶＨＩＩＩフレームワークにＡ４．６．１からのＣＤＲが移植されている最初のヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ断片（ｈｕ２．０）を図１に示す。ｈｕ２．０のＶＬドメインを配列番号７に記載し、ｈｕ２．０のＶＨドメインを配列番号１０に記載する。
移植されたＣＤＲ以外の残基は全てヒトの配列として維持された。この最初のヒト化抗体とＶＥＧＦとの結合は弱すぎて検出できなかった。弱く結合する他のヒト化Ａ４．６．１変異体の相対的な親和性に基づいて（データは記載せず）、ｈｕ２．０の結合についてのＫＤを＞７μＭと評価した。これはマウスのＡ４．６．１からの未変化なＶＬおよびＶＨドメインとヒトの定常ドメインとからなるキメラＦａｂ構築物の親和性である１．６ｎＭとは対照的である。このようにｈｕ２．０のＶＥＧＦへの結合はキメラ体と比べて少なくとも４０００倍弱かった。
抗−ＶＥＧＦ・Ｆａｂファージミドライブラリーの設計
ヒトＶＬκＩ−ＶＨＩＩＩフレームワークを使用する時に抗原結合を最適化するために必要なフレームワーク変化の群を表１および図２に示すように選択した。ヒト化Ａ４．６．１ファージミドライブラリーをＫｕｎｋｅｌほか著、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０４巻：１２５頁（１９９１年）の方法に従って部位特異的突然変異誘発によって構築した。ＶＨの２４、３７、６７および９３コドン（配列番号はＫａｂａｔほか著、前出、による）にＴＡＡ停止トリプレットを含むｐＭＢ４−１９の誘導体を製造して突然変異誘発鋳型として使用した。この修飾は後に野生型配列による背景夾雑物を防止するためのものである。ランダム化の標的としたコドンは４および７１位（軽鎖）および２４、３７、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７８、９３および９４位（重鎖）であった。
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ヒト化Ａ４．６．１ファージミドのライブラリーの設計に際しての懸念はランダム化の標的とした残基がＶＨとＶＬとの配列にわたって広く分布していることであった。合成オリゴヌクレオチドの長さについての制限があるためにこれらのフレームワーク位置の各々における同時的なランダム化には多重なオリゴヌクレオチドの使用が必要で、それによってのみ達成できることになった。しかしながらオリゴヌクレオチドの数が増加するとともに、突然変異誘発の効率（すなわち、突然変異誘発オリゴヌクレオチド全てから誘導された配列を挿入して得られる突然変異体の比率）が低下する。この難点を回避するために、ライブラリー構築に２つの改良を導入した。第一に可能なＶＬフレームワーク結合の各々をコードする４種の異なる突然変異誘発鋳型を製造するものである。これで、限られた多様性の軽鎖フレームワーク（異なる配列４種のみ）を得るのは簡単であったが、これは突然変異誘発戦略からのオリゴヌクレオチド２種についての必要性を排除した点で有益であった。第二に小さな合成断片を予め結合させて１２６塩基のオリゴヌクレオチドとした。これで短いオリゴヌクレオチド２個でなくて長いオリゴヌクレオチド１個を用いてＶＨのコドン６７、６９、７１、７３、７５、７６、９３および９４をランダム化できた。そこで最終的なランダム化突然変異誘発の戦略には異なる鋳型４個に同時にたった２個のオリゴヌクレオチドを採用した。
さらに特定的には重鎖のコドン６７、６９、７１、７３、７５、７６、７８、９３および９４を単一な突然変異誘発ヌクレオチドでランダム化するために、鋳型を使用する酵素的連結によって６０量体の断片と６６量体の断片とを予め結合して１２６量体のオリゴヌクレオチド２個とした。特定的には１．５ナノモルの５’−ホスホリル化オリゴヌクレオチド    ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＮＹＴ  ＡＣＴ  ＷＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＢＹＴ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ（配列番号１２）または  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＮＹＴ  ＡＣＴ  ＷＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＡ ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＢＹＴ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  （配列番号１）と１．５ナノモルのＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＤＹＡ ＡＲＧ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＧＧＧ（配列番号２）とを結合した。ランダム化したコドンには下線を付した。ＮはＡ／Ｇ／Ｔ／Ｃを表し；ＷはＡ／Ｔを表し；ＢはＧ／Ｔ／Ｃを表し；ＤはＧ／Ａ／Ｔを表し；ＲはＡ／Ｇを表し；ＹはＣ／Ｔを表す（ここに「／」は「または」を表す）。次に、１．５ナノモルの鋳型オリゴヌクレオトチド  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＡ（配列番号３）を配列番号１２および１の５’末端および配列番号３の３’末端の相補配列を加えて連結結合の各末端をハイブリッド形成させた。この混合物にＴａｑ・ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ社製の熱安定性リガーゼ）および緩衝液を加え、反応混合物を温度サイクル（１．２５分間９５℃および５分間５０℃）に４０回付して鋳型オリゴヌクレオチドを連結および非連結結合の間を循環するようにした。生成した１２６量体のオリゴヌクレオチドを６％尿素／ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で精製し、ポリアクリルアミドから緩衝液で抽出した。２種の１２６量体オリゴヌクレオチド等モル量を混合し、エタノール沈殿させ、最終的に１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ−ＥＤＴＡに溶解した。混合した１２６量体オリゴヌクレオチド産物を５０４−０１と名付けた。
選択したフレームワークコドン（ＶＬの４、７１位；ＶＨの２４、３７、６７、６９、７１、７３、７５、７６、９３、９４位）のランダム化は２段階として行った。第一に、異なる修正鋳型誘導体３種を製造しててＶＬをランダム化した。軽鎖のフレームワークコドン４および７１を突然変異誘発オリゴヌクレオチド  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  （配列番号１３）および  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ（配列番号４）を使用して個々にまたは対として置換した。デオキシウリジン添加鋳型をこれらの新らしい誘導体の各々から調製した。元の鋳型とともに、これら４個の構築物は４個の可能な軽鎖フレームワーク配列の組合せの各々をコードする（表１参照）。
オリゴヌクレオチド５０４−０１、１２６量体オリゴヌクレオチド２種の混合物およびＣＧＴ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＲＹＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＲＴＣ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  （配列番号５）を用い、重鎖フレームワークコドンを前記の鋳型４種を使用してランダム化した。４種のライブラリーを大腸菌ＸＬ−１ＢＬＵＥ・ＣＥＬＬＳ（マーカー細胞、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に電気穿孔して混合した。独立の形質転換体の全数は＞１．２×１０8個で、ライブラリー中にあるＤＮＡ配列の最大数よりも約１５００倍も大きいことが推測された。
この方策から軽鎖の残基４および７１および重鎖の２４、３７、６７、７８および９３は部分的にランダム化されてマウスのＡ４．６．１、ヒトのＶＬκＩ−ＶＨIII配列、またはその他のヒトおよびマウスのフレームワークに共通に見られる配列の選択を可能にした（表１）。これら残基のランダム化はヒトのＶＬκＩ−ＶＨIII共通配列またはＡ４．６．１フレームワーク配列の間の選択を制限しないことに注目すべきである。むしろヒトおよびマウスの他のフレームワーク配列に共通に見られる別のアミノ酸を加えると追加的な多様性がより強固な結合変異体の選択に導くかもしれない可能性が生じる。
重鎖フレームワーク残基のいくつかを二元的様式でヒトのＶＨIIIおよびネズミＡ４．６．１フレームワーク配列に従ってランダム化した。ＶＨの残基７１、７３、７５および７６は抗原結合部位に隣接するヘアピンループに位置している。ＶＨの７１および７３位の側鎖は主に規範的抗体構造に埋没しており、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の立体配座を形成するための潜在的役割はよく知られている。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈほか著、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇ．、４巻：７７３頁（１９９１年）；Ｃａｒｔｅｒほか著、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；Ｓｈａｌａｂｙほか著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７頁（１９９２年）。一方、ＶＨの７５位および７６位の側鎖は溶媒に露出しているが（図２）、しかしながらこれら２個の残基も抗原結合に影響を与えることがあるとの観察があり（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ著、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１８巻：４９頁［１９９４年］）、おそらく、ある種の抗体抗原複合体における抗原との直接的な接触によると思われる。配列内での近接性および相互依存性の可能性のために、ＶＨの７１位、７３位、７５位および７６位はこの四分子（テトラド）による可能な結合２種のみが全ヒトＶＨIIIまたは全ネズミＡ４．６．１配列のいずれかで選択できるように一括してランダム化された。最後にＶＨの６９位と９４位との残基はランダム化されたがＶＨIIIおよびＡ４．６．１配列を表すためのみであった。このＶＨの６９および９４位は以前の抗体ヒト化で置換されておらず、それらはＶＨIII共通配列とＡ４．６．１配列との間では相違しており（図１）、正しい立体配座のために潜在的に重要なことが指摘されているので（Ｆｏｏｔｅほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４巻：４８７頁［１９９２年］）、それらもこのランダム化方策に含めた。
ファージミド表面にディスプレイされたヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂライブラリー
線状ファージ表面における抗体断片の機能的ディスプレイについては種々の系が開発されている。Ｗｉｎｔｅｒほか著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３頁（１９９４年）。これらにはＦａｂまたは、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIII外殻蛋白質のいずれかへの融合体としての単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片のディスプレイを含む。本明細書で選択する系は、Ｆａｂ断片を遺伝子III融合体として１価にディスプレイするＧａｒｒａｒｄほか著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．、９巻：１３７３頁（１９９１年）に記載のものと類似している（図３）。この系は注目すべき特性２つを有する。殊に、ｓｃＦｖｓとは異なり、Ｆａｂ断片は２量体分子種を形成する傾向を持たず、その存在は親和力効果のために最強固な結合剤の選択が防止されることがある。それに加え、ディスプレイされた蛋白質は１価性なので、そうでなければ各ファージミド粒子に現れる蛋白質の多重コピーの存在に由来する親和力効果の二次的原因の可能性がない。ＢａｓｓとＷｅｌｌｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９頁（１９９０年）；Ｌｏｗｍａｎほか著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２頁（１９９１年）。
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ断片を提示するファージミド粒子を大腸菌ＸＬ−１・Ｂｌｕｅ・ｃｅｌｌｓで増殖させた。略述すれば、ランダム化ｐＭＢ４−１９構築物が固着した細胞をカルベニシリン５０μｇ／ｍＬおよび約１０10個のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＶｉｅｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ著、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻：３頁［１９８７年］）添加２ＹＴ２５ｍＬ培地中、３７℃で一夜増殖させた。貯蔵ファージミドを培養上清液から食塩水ポリエチレングリコール溶液で沈殿させ、ＰＢＳ１００μＬ（ファージミド約１０14個／ｍＬ）に再懸濁することによって精製した。
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ変異体の選択
精製ＶＥＧＦ１２１（１００μＬ、１０μｇ／ＰＢＳｍＬ）でマイクロタイター板のウェルを一夜４℃で被覆した。被覆溶液を除去し、このウェルおよび非被覆ウェルを６％スキムミルクで１時間ブロックし、０．０５％トゥイーン２０（洗剤）添加ＰＢＳで洗浄した。次に貯蔵ファージミド１０μＬを０．１％ＢＳＡおよび０．０５％トゥイーン２０添加２０ｍＭ−トリス（ｐＨ７．５）１００μＬで希釈して各ウェルに加えた。２時間後、ウェルを洗浄して結合したファージを０．１Ｍ−グリシン（ｐＨ２．０）１００μＬで溶離し、１Ｍ−トリス、ｐＨ８．０、２５μＬで中和した。この適量を使用して溶離したファージの数を力価検定した。ＶＥＧＦ被覆ウェルから溶離した残りのファージは増殖させて次の選択サイクルで使用した。合計８回の選択を行った後、個々のクローン２０個を選択して配列決定した（Ｓａｎｇｅｒほか著、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、７４巻：５４６３頁［１９７７年］）。
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂファージミドライブラリーから得られた変異体をそれでＶＥＧＦとの結合に基づいて選択した。ＶＥＧＦ被覆マイクロタイタープレートウェルと非被覆マイクロタイタープレートウェルとから溶離したファージの力価を比較することによって測定される機能的ファージミドの豊富化は７回目の親和性選択まで進行した。さらに１回区分した後、２０個のクローンを配列決定してランダム化した各位置で選択された好適なフレームワーク残基を確認した。表２に示すこれらの結果は選択したクローンの中の強固な共通点を示した。クローン２０個の中で１０個はｈｕ２．１０と命名した同一のＤＮＡ配列を持っていた。ｈｕ２．１０ではランダム化されたフレームワーク位置１３個の中で８個の置換が選択されていた（ＶＬ：７１；ＶＨ：３７、７１、７３、７５、７６、７８および９４）。興味深いことに、ＶＨ３７（Ｉｌｅ）残基および７８（Ｖａｌ）残基はヒトのＶＨIII配列またはネズミＡ４．６．１配列のいずれにおいても選択されなかった。この結果はあるフレームワーク位置が標的とするヒトのおよび元のマウスのフレームワーク配列を超えて多様性を拡大することから利益が得られるかもしれないことを示唆する。
0004191258.tif 000003
分析した残りの１０個にある他の独特なアミノ酸配列は：ｈｕ２．１、ｈｕ２．２、ｈｕ２．６およびｈｕ２．７であった。これらのクローンは全てｈｕ２．１０に加え、同一のフレームワーク置換をＶＨ３７（Ｉｌｅ）、７８（Ｖａｌ）および９４（Ｌｙｓ）の位置に有していたが、位置２４および位置９３ではヒトＶＨIIIの共通配列を保存していた。クローン４個では軽鎖コード配列が失われ、ファージＥＬＩＳＡ検定法で試験するとＶＥＧＦには結合しなかった（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍほか著、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１３巻：２５０８頁［１９９４年］）。われわれは時々他のＦａｂファージミドライブラリーで重鎖配列または軽鎖配列の欠損に気付き（未公開データ）、これらのクローンは発現強化のゆえに選択されたものと推測した。このような人為的産物は選択サイクル数の減少によって、またはライブラリーを固相で増殖させることによって削減できることが多い。
ＶＥＧＦ結合親和性の決定
ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ変異体がＶＥＧＦ１２１に結合する反応の会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）をＰｈａｒｍａｃｉａ社のＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いる表面プラズモン共鳴法（Ｋａｒｌｓｓｏｎほか著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４５巻：２２９頁［１９９１年］）によって測定した。ＶＥＧＦ１２１はバイオセンサーチップに１級アミノ基を介して共有結合的に固定化した。ヒト化Ａ４．６．１Ｆａｂ変異体の結合はＦａｂをＰＢＳ／０．００５％トゥイーン２０（洗剤）に溶解した流動溶液を流速２０μＬ／分でチップ上に流して測定した。各結合測定に続いて、５０ｍＭ−ＨＣｌ水５μＬを３μＬ／分の流速で洗って固定化リガンドから残留Ｆａｂを取出した。結合プロファイルは単純１価結合モデル（ＢＩＡ・ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ・ｓｏｆｔｗａｒｅ、第２版、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を使用して非線形回帰式によって分析した。
ファージ選択変異体ｈｕ２．１、ｈｕ２．２、ｈｕ２．６、ｈｕ２．７およびｈｕ２．１０は振盪フラスコを用いて大腸菌で発現し、Ｆａｂ断片を周縁細胞質の抽出物からＧ蛋白質親和性クロマトグラフィーによって精製した。これら５種のクローンについて、Ｆａｂ回収量は０．２（ｈｕ２．６）から１．７ｍｇ／Ｌ（ｈｕ２．１）の範囲であった。ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いる表面プラスモン共鳴によって測定したこれら各変異体の抗原（ＶＥＧＦ）に対する親和性を表３に示す。
0004191258.tif 000004
この結合データの分析で検査した変異体５種中で共通クローンｈｕ２．１０がＶＥＧＦに最高な親和性を持つことを示された。こうして、われわれのＦａｂファージミドライブラリーは最も強固に結合するクローンを選択的に豊富化した。ｈｕ２．１０の算出されたＫＤは５５ｎＭであり、フレームワーク変化を含まないｈｕ２．０（ＫＤ＞７μＭ）よりも少なくとも１２５倍強固であった。その他の選択した変異体４種は全てＶＥＧＦに対して最低ＫＤ３６０ｎＭまでの範囲の弱い結合を示した。ｈｕ２．６のＫＤ、６７ｎＭはｈｕ２．１０のものよりも僅かに弱かったが、このクローンは配列決定された２０クローンの中で１コピーが見出されたのみであったことは興味深い。これはこの変異体の可溶性変異体を発現する場合と同様に発現およびディスプレイのレベルが低いためかも知れない。しかしながら、発現速度が小さいがこの変異体はヒト化抗体として有用である。
ヒト化変異体ｈｕ２．１０の追加的な改良
最初のヒト化変異体に行った抗原親和性の大きな改良にも拘らず、ｈｕ２．１０のＶＥＧＦに対する結合はまだネズミＡ４．６．１ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むキメラＦａｂ断片より３５倍も弱かった。このかなり大きい相違はヒト化フレームワークのさらなる最適化が追加的突然変異によって可能であることを示唆していた。Ｆｏｏｔｅほか著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９９２年）が確認した補助的残基について、Ａ４．６．１フレームワークとヒトＶＬκＩ−ＶＨIIIフレームワークとの間ではＶＬ４６、ＶＨ２およびＶＨ４８の残基のみが相違していた（図１）が、われわれのファージミドライブラリーではここはランダム化しなかった。ヒト化Ａ４．６．１Ｆｖ断片の分子モデルではＶＬ４６はＶＬ−ＶＨ界面に存在しており、ＣＤＲＨ３の立体配座に影響を与えることがあるかも知れないことが示された。さらにその上、多くのＶＬκフレームワークではこのアミノ酸はほとんど常にロイシンである（Ｋａｂａｔほか著、前出）が、Ａ４．６．１ではバリンである。そこで、ｈｕ２．１０を背景にしてこの位置でＬｅｕ→Ｖａｌ置換を行った。この新変異体ｈｕ２．１０Ｖの結合機構を分析した結果ＶＥＧＦ結合のＫＤにさらに６倍の改善を示した。ｈｕ２．１０ＶのＫＤ（９．３ｎＭ）はキメラ体のものの６倍以内となった。ＶＬ４６とは対照的に、ＶＨ２およびＶＨ４８をネズミＡ４．６．１からの対応する残基に置換しても、ｈｕ２．１０の結合親和性改良は認められなかった。親和性の最後の変化に先行する改良部分は会合速度定数（ｋｏｎ）の増大によるもので、ＬＬ４６が抗原結合に適するように抗体構造を予備構成することに一定の役割を果たすことを示唆したことは興味深い。抗原親和性に影響を与えた別の突然変異は主に結合の解離速度（ｋｏｆｆ）の変化によるものであった。ｈｕ２．１０とｈｕ２．１０とを比較するとＡ４．６．１配列でのＶＨ残基７１、７３、７５、および７６の置換に対する親和性に５倍の改良を示した。ＶＬ７１をＡ４．６．１配列に変換しても（Ｐｈｅ→Ｔｙｒ）結合には無視すべき効果を示したが（ｈｕ２．２対ｈｕ２．７）、一方、ＶＬ４のロイシン変異体はＡ４．６．１フレームワークとヒトのＶＬκＩフレームワークとの双方に天然に存在するメチオニンのもの（ｈｕ２．２対ｈｕ２．１）よりも僅か（＜２倍）に悪化した。本明細書には記載しないが、他のヒト化Ａ４．６．１変異体の比較でＶＨ９４Ａｒｇ→Ｌｙｓの変化はこの基による直接的抗原接触か、ＣＤＲ−Ｈ３の正しい立体配座を維持する構造的役割かのどちらかによって、ＫＤに５倍の改良を示した。変異体ｈｕ２．６は共通クローンｈｕ２．１０とは配列に３個の相違を有するが、類似のＫＤを示し、これら３個の置換が抗原結合には殆ど影響しないことを示唆する。ＶＬ４およびＶＬ７１における保存的変化の効果が殆どないことは他の変異体に対する結合データと一致するが、なおＶＨ６７での変化（Ｐｈｅ→Ｔｈｒ）は結合には殆ど影響がなかった。
結語
以上に本発明の実行に採用できる特定的方法を詳記した。このような特定的な方法を詳記したので当技術分野の熟練者は本発明の成果を用いて同じ情報に到達するために信頼に足る別法を工夫する方法を十分に知ることとなろう。しかし、以上に詳記したものは文章に表されているが、それが本発明の範囲の全体を限定するものとして理解するべきでなく、本発明の範囲は添付する請求項の合法的な構成によってのみ決定されるべきである。本明細書に引用する文献は全て参考のために明示的に挿入したものである。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）  特許出願人：ジェネンテク・インコーポレイテッド
（ii）  発明の名称：ヒト化抗体およびヒト化抗体の形成法
（iii）  配列の数：１４
（iv）  連絡先：
（Ａ）名宛人：Flehr, Hohbach, Test, Albritton & Herbert
（Ｂ）通り：フォー・エンバルカデロ・センター，スイート３４００
（Ｃ）市：サンフランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：９４１１１
（ｖ）  コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：フロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパティブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30
（vi）  本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：PCT HEREWITH
（Ｂ）出願日：１９９８年４月２日
（Ｃ）分類：
（vii）  優先権出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／８３３，５０４
（Ｂ）出願日：１９９７年４月７日
（viii）  弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ドレジャー，ウォルター・エイチ
（Ｂ）登録番号：２４，１９０
（Ｃ）参照／整理番号：Ａ−６４２５４
（ix）  電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：（４１５）−７８１−１９８９
（Ｂ）ファックス番号：（４１５）−３９８−３２４９
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：６６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）  配列：配列番号１：
0004191258.tif 000005
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：６０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）  配列：配列番号２：
0004191258.tif 000006
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）  配列：配列番号３：
0004191258.tif 000007
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）  配列：配列番号４：
0004191258.tif 000008
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：７５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）  配列：配列番号５：
0004191258.tif 000009
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：１０７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列：配列番号６：
0004191258.tif 000010
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：１０７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列：配列番号７：
0004191258.tif 000011
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：１０７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列：配列番号８：
0004191258.tif 000012
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：１２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列：配列番号９：
0004191258.tif 000013
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：１２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列：配列番号１０：
0004191258.tif 000014
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：１２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列：配列番号１１：
0004191258.tif 000015
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：６６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）  配列：配列番号１２：
0004191258.tif 000016
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）  配列：配列番号１３：
0004191258.tif 000017
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）長さ：６０７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（ix）  配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：459..460
（Ｄ）他の情報：/note＝“第４５９塩基で始まる軽鎖”
（ix）  配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：1101..1102
（Ｄ）他の情報：/note=“第１１０１塩基で始まる重鎖”
（ix）  配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：1254..1255
（Ｄ）他の情報：/note=“第１２５４塩基で始まる重鎖”
（ix）  配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：2424..2425
（Ｄ）他の情報：/note=“第２４２４塩基で始まる重鎖”
（xi）  配列：配列番号１４：
0004191258.tif 000018
0004191258.tif 000019
0004191258.tif 000020
0004191258.tif 000021
【図１】
0004191258.tif 000022
【図２】
0004191258.tif 000023
【図３】
0004191258.tif 000024