(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉで表されるヘムペプチド。
【化１】
0004070081.tif 000019
（式中、X2はAla またはGlnを表し；Hemeは次式：
【化２】
0004070081.tif 000020
で表されるヘム核を表し；X2がAlaを表すとき、A1がアミノ酸配列Phe Ser Ala Asnからなるペプチド鎖を表し且つA2がアミノ酸配列Ala Gly Gly Asn Asn Alaからなるペプチド鎖を表すか、またはA1がアミノ酸配列Val Phe Ser Ala Asnからなるペプチド鎖を表し且つA2がアミノ酸配列Ala Gly Gly Asn Asn Ala Ile Met Pro Asp LysまたはAla Gly Gly Asn Asn Ala Ile Met Pro Asp Lys Thr Leu Lys Lys Asp Val Leu Gluからなるペプチド鎖を表し；X2がGlnのとき、A1が水素原子を表し且つA2がアミノ酸配列Thr Val Glu Lysからなるペプチド鎖を表すか、A1がアミノ酸配列Val Gln Lysからなるペプチド鎖を表し且つA2がアミノ酸配列Thr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn Leuからなるペプチド鎖を表すか、またはA1がアミノ酸配列Gly Asp Val Glu Lys Gly Lys Lys Ile Phe Val Gln Lys からなるペプチド鎖を表し且つA2がThr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn Leu His Gly Leu Phe Gly Arg Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Phe Thr Tyr Thr Asp Ala Asn Lys Asn Lys Gly Ile Thr Trp Lys Glu Glu Thr Leu Metからなるペプチド鎖を表すか、またはA1がアミノ酸配列Lys Gly Lys Lys Ile Phe Val Gln Lysからなるペプチド鎖を表し且つA2がアミノ酸配列Thr Val Gluからなるペプチド鎖を表す）。
【請求項２】
上記式I中、X2及びHemeは上記の意味を表し、X2がAlaのとき、A1がアミノ酸配列Phe Ser Ala Asnからなるペプチド鎖を表し且つA2がアミノ酸配列Ala Gly Gly Asn Asn Alaからなるペプチド鎖を表し；X2がGlnのとき、A1が水素原子を表し且つA2がアミノ酸配列Thr Val Glu Lysからなるペプチド鎖を表すか、A1がアミノ酸配列Val Gln Lysからなるペプチド鎖を表し且つA2がアミノ酸配列Thr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn Leuからなるペプチド鎖を表すか、またはA1がアミノ酸配列Gly Asp Val Glu Lys Gly Lys Lys Ile Phe Val Gln Lys からなるペプチド鎖を表し且つA2がThr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn Leu His Gly Leu Phe Gly Arg Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Phe Thr Tyr Thr Asp Ala Asn Lys Asn Lys Gly Ile Thr Trp Lys Glu Glu Thr Leu Metからなるペプチド鎖を表す請求項１記載のヘムペプチド。
【請求項３】
次式で表される請求項１記載のヘムペプチド。
【化３】
0004070081.tif 000021
【請求項４】
次式で表される請求項１記載のヘムペプチド。
【化４】
0004070081.tif 000022
【請求項５】
次式で表される請求項１記載のヘムペプチド。
【化５】
0004070081.tif 000023
【請求項６】
次式で表される請求項１記載のヘムペプチド。
【化６】
0004070081.tif 000024
【請求項７】
シトクロムｃをサーモライシン、トリプシン、キモトリプシン、AchromobacterプロテアーゼI及びStaphylococcus aureus V8プロテアーゼからなる群から選択される酵素で消化または臭化シアンで分解し、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製することからなる請求項１〜６のいずれかに記載のヘムペプチドの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘムペプチドを含むＮＯ捕捉剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ヘムペプチド、特にＮＯ捕捉能を有するヘムペプチド、該ヘムペプチドの製造方法、並びに該ヘムペプチドを含むＮＯ捕捉剤及び医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病、動脈硬化、癌等の生活習慣病への一酸化窒素（ＮＯ）の関与が報告されている。即ち、ＮＯの生産異常が多くの生理機能や病気に関与していることが報告されている。例えば、ＮＯの不足が、高血圧、高脂血症、動脈硬化、心不全、冠動脈攣縮等に関与しており、ＮＯの過多が脳卒中、ハンチントン病、パーキンソン病等に関与していることが知られている。
また、ＮＯは、環境汚染物質ＮＯｘの一つでもあり、ＮＯを捕捉する物質の開発は、環境汚染の測定において、また汚染された大気、水等の浄化においても重要である。
従って、ＮＯの定量や捕捉物質の開発が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＮＯは常温でガス体であり、不安定であるため、取扱いや定量が困難であり、有効なＮＯ捕捉物質も知られていなかった。
本発明者らは、これまでにシトクロムｃがＮＯ捕捉能を有することを見出している（化学と生物３４(12),784-785(1996))。また、同様のC-typeシトクロムを紅藻スサビノリ、緑藻クロレラ、光合成細菌など各種生物から単離し、ＮＯ捕捉能を確認している（Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(3), 628-632, 2000, Jap. J. Pharmacol., 75(Suppl.I), 113 P(1997))。さらに、本発明者らは、紅藻スサビノリPorphyra yezoensis由来のシトクロムｃ６のＸ線立体構造解析により三次構造を決定しており（Acta Cryst., D56, 1577-1582(2000))、またシトクロムｃ６の組換え大腸菌での発現系を構築している。
本発明者らは、ＮＯ捕捉能を有する物質についてさらに研究を進め、シトクロムｃに比べてさらに高いＮＯ捕捉能を有するヘムペプチドを見出した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記式Ｉで表されるヘムペプチドに関する。
【０００５】
【化３】
0004070081.tif 000002
【０００６】
（式中、A1は水素原子または１〜２０個、好ましくは１〜１０個、特に１〜５個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
A2は水酸基または１〜５０個、好ましくは１〜１０個、特に１〜５個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
Hemeは次式：
【０００７】
【化４】
0004070081.tif 000003
【０００８】
で表されるヘム核を表し、
X1,X2は各々独立に任意のアミノ酸残基を表し、
X3は、His LysまたはArgを表す。）
上記ヘム核は、3,8位のシステイニルチオエーテル結合を介してシステイン残基に結合することができる。
（２）X1及びX2が各々独立にAla、Gln、Lys、Arg及びValからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す（１）のヘムペプチド。
（３）X1がAlaであり、X2がGlnまたはAlaであり、X3がHisである（１）のヘムペプチド。
（４）A1が、水素原子またはアミノ酸配列Val Gln Lysを有するペプチド鎖であり、
A2がアミノ酸配列Thr Val Glu Lysまたはアミノ酸配列Thr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn Leuを有するペプチド鎖であり、
X1がAlaであり、X2がGlnであり、X3がHisである（１）のヘムペプチド。
（５）A1がアミノ酸配列Phe Ser Ala Asnを有するペプチド鎖であり、
A2がアミノ酸配列Ala Gly Gly Asn Asn Alaを有するペプチド鎖であり、
X1がAlaであり、X2がAlaであり、X3がHisである（１）のヘムペプチド。
【０００９】
また、本発明は、シトクロムｃをタンパク質分解酵素で消化し、所望により塩折処理を行った後、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製することからなる（１）〜（５）のヘムペプチドの製造方法に関する。タンパク質分解酵素は、好ましくはサーモライシン、トリプシン、キモトリプシン、AchromobacterプロテアーゼI及びStaphylococcus aureus V8プロテアーゼからなる群から選択される。
さらに、本発明は、（１）〜（５）のヘムペプチドを含むＮＯ捕捉剤に関する。
本発明の上記ペプチドは、特に、シトクロムｃの少なくとも１４番目のCysから１８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列、または該配列において１５番目、１６番目及び１８番目のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有するペプチドを含み、ヘム核が１４番目のCysと１７番目のCysに3,8位のシステイニルチオエーテル結合を介して結合しており、１８番目のアミノ酸残基がHis、LysまたはArgであり、１５番目及び１６番目のアミノ酸が好ましくはAla,Gln,Lys,ArgまたはValであり、１４番目のCysのＮ末端側のペプチド鎖と１７番目のCysのＣ末端側のペプチド鎖が好ましくは５０塩基以下、より好ましくは１０塩基以下であることを特徴とするものである。このようなヘムペプチドがシトクロムｃよりも高いＮＯ捕捉能を有することは、本発明者の鋭意研究により見出されたものであるが、これは、おそらく分子が小さくなることにより単位面積あたりの溶媒分子数が増大することに加えて、ヘム核が溶媒面に露出してＮＯとの衝突確率が高まったためであると考えられる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
A1の具体例としては、例えば、配列表の配列番号１（ウマ心筋シトクロムｃの配列）または配列番号２（紅藻スサビノリのシトクロムｃ６の配列）のアミノ酸番号１〜１３のアミノ酸配列またはそれらの１〜数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３からＮ末端側に連続する１〜１３個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖が挙げられる。
A2の具体例としては、例えば、配列表の配列番号１（ウマ心筋シトクロムｃの配列）または配列番号２（紅藻スサビノリのシトクロムｃ６の配列）のアミノ酸番号１９〜７０のアミノ酸配列またはそれらにおいて１〜数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９のアミノ酸からＣ末端側に連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖が挙げられる。
【００１１】
本明細書において「ＮＯ捕捉剤」は、ＮＯの捕捉に用いられるものであれば、目的を問わない。典型的には、生体内、例えば血中のＮＯ濃度の測定のための診断剤、生体内、例えば血中のＮＯの捕捉するＮＯの過多に関連する疾病の予防剤・治療剤、研究用試薬、大気中、排気ガス中、または水中のＮＯ濃度の測定のための試薬、また水処理または排気ガス処理のための処理剤として使用されるものである。
【００１２】
本発明のヘムペプチドは、シトクロムｃのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、またはこれに部位特異的変異を導入したＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養し、培養物からシトクロムｃを単離し、これをタンパク質分解酵素で消化した後、クロマトグラフィー等の方法により精製することにより製造することもできる。この場合、形質転換に用いるベクターとしては、バイオテクノロジーの分野で慣用のプラスミド、ファージ等を使用することができる。宿主細胞は、好ましくは原核生物の細胞、より好ましくは細菌、特に大腸菌である。シトクロムｃの単離は、例えば培養細胞を採取し、物理的に破砕し、抽出し、精製することにより行うことができる。培養細胞の採取は、固体培地の場合は培養細胞をかきとることにより、また液体培地の場合には遠心分離により行うことができる。
なお、本発明において、「シトクロムｃ」は、シトクロムｃ１、シトクロムｃ２、シトクロムｃ６、シトクロムｃ-551等、全てのc型シトクロムを含む。
また、本発明のペプチドを構成する「アミノ酸残基」には、修飾されたアミノ酸残基も含まれる。
【００１３】
【実施例】
以下の実施例において、試薬は特記しない限り、和光純薬製のものを使用した。等電点は、Ampholine PAGplateゲル（Pharmacia社製、IEF用、pH3.5-9.5）を用いた等電点電気泳動により解析した。吸収極大は、HITACHI U-3310spectrophotometer (HITACHI社製）を用いて測定した。酸化還元電位は、HITACHI U-3310spectrophotometer (HITACHI社製）、ＯＲＰ電極(Metrohm社製）を用いて測定した。
【００１４】
実施例１：ヘムペプチド（ｍｐ１５）の調製
下記のアミノ酸配列を有するヘムペプチドを調製した。
【００１５】
【化５】
0004070081.tif 000004
【００１６】
（配列番号３の配列を有するペプチドの５番目及び８番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
紅藻スサビノリ（Porphyra yezonesis)より精製したシトクロムｃ６１ｍｇを０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．８（２ｍＭ塩化カルシウムを含む）２００μｌに溶解した。得られたシトクロムｃ６溶液を３７℃で５分間保温し、これに０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に溶解した１ｍｇ／ｍｌサーモライシン溶液６２．５μｌを添加し、さらに上記と同じ緩衝液３７．５μｌを添加した。この反応溶液を、３７℃で４．５時間保温した。この反応溶液を氷冷して反応を停止させた後、上記と同じ緩衝液７００μｌを加えた。得られた反応溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Toyopearl HW-40F, 1.0 x 80cm, 東ソー社製）で精製し、標記のペプチドを得た。得られたペプチドを電気泳動にかけ、単一物質であることを確認した。また、このペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサーで調べ、標記の配列を有するペプチドであることを確認した。
【００１７】
また、得られたペプチドは、下記の物理学的性質を有していた：
等電点：４．１５，酸化型の吸収極大：404, 526nm，還元型の吸収極大：413.5, 549.5nm，酸化還元電位-82.2mV，分子量：2200。
【００１８】
実施例２：ヘムペプチド（ｍｐ９）の調製
下記のアミノ酸配列を有するペプチドを調製した。
【００１９】
【化６】
0004070081.tif 000005
【００２０】
（配列番号４の配列を有するペプチドの１番目及び４番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
ウマ心筋シトクロムｃ（和光純薬社製）１ｍｇを０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌに溶解した。得られたシトクロムｃ溶液を３７℃で５分間保温し、これに０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に溶解した１ｍｇ／ｍｌトリプシン溶液４０μｌを添加し、さらに上記と同じ緩衝液６０μｌを添加した。この反応溶液は、３７℃で２４時間保温した。この反応溶液を氷冷して反応を停止させた後、硫酸アンモニウム７８ｍｇを添加した後、沈殿物を濾取し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Toyopearl HW-40F, 1.0 x 80cm, 東ソー社製）で精製し、標記のペプチドを調製した。得られたペプチドを電気泳動にかけ、単一物質であることを確認した。また、このペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサーで調べ、標記の配列を有するペプチドであることを確認した。
また、得られたペプチドは、下記の物理学的性質を有していた：
等電点：4.95，酸化型の吸収極大：395, 619nm，還元型の吸収極大：412, 520, 549nm，酸化還元電位-132mV，分子量：1637。
【００２１】
実施例３：ヘムペプチド（ｍｐ２２）の調製
下記のアミノ酸配列を有するペプチドを調製した。
【００２２】
【化７】
0004070081.tif 000006
【００２３】
（配列番号５の配列を有するペプチドの４番目及び７番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
ウマ心筋シトクロムｃ（和光純薬社製）１ｍｇを０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌに溶解した。得られたシトクロムｃ溶液を３７℃で５分間保温し、これに０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に溶解した１ｍｇ／ｍｌキモトリプシン溶液４０μｌを添加し、さらに上記と同じ緩衝液６０μｌを添加した。この反応溶液は、３７℃で２４時間保温した。この反応溶液を氷冷して反応を停止させた後、硫酸アンモニウム７８ｍｇを添加した後、沈殿物を濾取し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Toyopearl HW-40F, 1.0 x 80cm, 東ソー社製）で精製し、標記のペプチドを調製した。得られたペプチドをＨＰＬＣにかけ、単一物質であることを確認した。また、このペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサーで調べ、標記の配列を有するペプチドであることを確認した。
また、得られたペプチドは、下記の物理学的性質を有していた：
等電点：6.02，酸化型の吸収極大：398, 620nm，還元型の吸収極大：416, 520, 549nm，酸化還元電位-66.5mV，分子量3065。
【００２４】
実施例４：ヘムペプチド（ｍｐ６５）の調製
下記のアミノ酸配列を有するペプチドを調製した。
【００２５】
【化８】
0004070081.tif 000007
【００２６】
（配列番号６の配列を有するペプチドの１４番目及び１７番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
ウマ心筋シトクロムｃ（和光純薬社製）１ｍｇを１０ｍｇ／ｍｌ臭化シアン（７０％ギ酸に溶解したもの）１００μｌに溶解し、反応チューブ内を窒素通気した。得られたシトクロムｃ溶液を２０℃で２４時間保温した。この反応溶液を水冷して反応を停止させた後、超純水４００μｌを加え、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Toyopearl HW-40F, 1.0 x 80cm, 東ソー社製）で精製し、標記のペプチドを調製した。得られたペプチドを電気泳動にかけ、単一物質であることを確認した。また、このペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサーで調べ、標記の配列を有するペプチドであることを確認した。
また、得られたペプチドは、下記の物理学的性質を有していた：
等電点：9.52，酸化型の吸収極大：404, 535nm，還元型の吸収極大：415, 520, 549nm，酸化還元電位-62.1mV，分子量8900。
【００２７】
実施例５：タンパク質分解酵素として、キモトリプシンの代わりにAchromobacterプロテアーゼI（リシルエンドペプチダーゼ）を使用すること以外は、実施例３と同様の方法により、下記式で表されるＮＯ捕捉ヘムペプチドを調製した。
【００２８】
【化９】
0004070081.tif 000008
【００２９】
（配列番号７の配列を有するペプチドの１番目及び４番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
【００３０】
実施例６：タンパク質分解酵素として、サーモライシンの代わりにAchromobacterプロテアーゼI（リシルエンドペプチダーゼ）を使用すること以外は、実施例１と同様の方法により、下記式で表されるＮＯ捕捉ヘムペプチドを調製した。
【００３１】
【化１０】
0004070081.tif 000009
【００３２】
（配列番号８の配列を有するペプチドの６番目及び９番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
【００３３】
実施例７：タンパク質分解酵素として、キモトリプシンの代わりにStaphylococcus aureus V8プロテアーゼ（エンドプロテナーゼGlu-C)を使用し、リン酸緩衝液の代わりにアンモニウム系緩衝液を使用すること以外は、実施例３と同様の方法により、下記式で表されるＮＯ捕捉ヘムペプチドを調製した。
【００３４】
【化１１】
0004070081.tif 000010
【００３５】
（配列番号９の配列を有するペプチドの１０番目及び１３番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
【００３６】
実施例８：タンパク質分解酵素として、サーモライシンの代わりにStaphylococcus aureus V8プロテアーゼ（エンドプロテナーゼGlu-C)を使用し、リン酸緩衝液の代わりにアンモニウム系緩衝液を使用すること以外は、実施例１と同様の方法により、下記式で表されるＮＯ捕捉ヘムペプチドを調製した。
【００３７】
【化１２】
0004070081.tif 000011
【００３８】
（配列番号１０の配列を有するペプチドの６番目及び９番目のシステインに前記式IIのヘム核が結合したもの）
【００３９】
試験例１：ＮＯ捕捉能の測定
１０ｍｌのバイアルに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ、１０ｍＭ亜硝酸ナトリウム０．４ｍｌ、上記各ペプチド溶液０．５ｍｌ、３ｍＭメチルビオロゲン（東京化成工業株式会社製）０．４ｍｌを入れ、ブチルゴム栓とアルミシールで密封した。このバイアルを、アルゴンを通気しながら３７℃で５分間保温した後、１００ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウム（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムに溶解したもの）０．３ｍｌを添加することにより、反応を開始した。一定の時間間隔で反応液を０．２ｍｌずつ分取し、ボルテックスミキサーで空気酸化させることにより反応を停止した。
残存亜硝酸量をジアゾ化法により測定した。反応液を０．０２ｍｌとり、超純水を１．９８ｍｌ添加した後、１％スルファニルアミド１ｍｌ、０．０２％のN-1-ナフチルエチレンジアミン塩酸塩１ｍｌ、超純水１ｍｌを添加し、室温で２０分間放置した後、生成アゾ色素の５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、既知濃度の亜硝酸溶液から作製した検量線より、残存亜硝酸量を算出した。
測定は、SHIMADZU UV-1600 UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETERを用いて行った。
反応速度論的解析は、２，４，６，８，１０ｍＭ亜硝酸ナトリウムに対する比活性を求め、その後Linewever-Burkプロットにより反応回転数ｋｃａｔ(s−１）を算出することにより行った。
各実施例で得られたペプチドの反応速度定数を下記の表に示す。
また、比較のためにウマ心筋シトクロムｃ及び紅藻スサビノリシトクロムｃ６の反応速度定数を併記した。
【００４０】
【表１】
0004070081.tif 000012
【００４１】
表より、本発明のヘムペプチドが、シトクロムｃと比較して、著しく高いＮＯ捕捉能を有することが明らかである。
【００４２】
【発明の効果】
生体内でのＮＯの定量のための試薬、生体内でＮＯを制御する医薬品組成物、環境中のＮＯ濃度を測定するための試薬、汚染大気や汚染排水の浄化剤として利用可能なＮＯ捕捉剤が提供される。さらに、本発明のヘムペプチドのうち、水溶性のものは、液体試料中での用途に適している。
【００４３】
【配列表】
0004070081.tif 000013
0004070081.tif 000014
0004070081.tif 000015
0004070081.tif 000016
0004070081.tif 000017
0004070081.tif 000018