(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレンオキサイドから選ばれる接着剤0.01〜0.15重量％、（ｂ）キサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれるゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有するアルコール懸濁液を調製し、該アルコール懸濁液を、防水性平板上に載置された該ゲル化剤の粒径より大きいメッシュを有する繊維質吸水性シートに含浸させ、これを非開放空間内でアルコールガスと空気の置換を行いながら乾燥して、吸水性シートを防水性平板に固着させることを特徴とする簡易培地の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の微生物の検出、同定、輸送等に有用な簡易培地、特に、接種した際の被検液の拡散が極めて速く、また傾斜させた状態又は逆さまの状態、あるいは無重力状態でも試料の接種が可能な簡易培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の微生物を検出、同定するに際し、従来行われている微生物の培養方法としては、平板塗抹法、混釈法、液体培地法等が一般的である。しかし、これらの方法は、培養を行う前に培地や器具類の滅菌が必要であり、また被検試料を培地に接種する際には、塗抹、混釈等の熟練を要する操作が必要であった。更に、従来の培地では、滅菌を培地調製後や密封包装後に行った場合には、輸送中及び保管中の品質性能の維持が難しく、このような滅菌法の実施が困難であった。
【０００３】
そのため、手軽に培養できる簡易培地についての多くの研究がなされ、（１）防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培養装置（特開昭57-502200号公報）、（２）防水性平板の表面に、冷水可溶性ゲル化剤と微生物培養基の混合物層及び繊維質吸水性シートを順次積層した培養装置（特開平6-181741号公報）、（３）接着剤、ゲル化剤及び菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤の粒径より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させてなる簡易培地（特開平9-19282号公報）が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記（１）の培養装置においては、試料接種後、慎重に上部シートをかぶせ、スプレッダーにより試料を一定面積に広げる操作を必要とし、これら一連の操作は机等の平らな面で注意深く行う必要があるなど、接種操作が煩雑となる問題があった。また（２）の培養装置においては、作製時に繊維質吸水性シートを培地成分のコーティング後に挿入する手間がかかり、また検出可能な面積以上に培地成分をコーティングする必要があるなど、製造上の問題があるとともに、繊維質吸水性シートが固定されていないために接種時にシートが動かないように慎重に操作する必要があった。更に、（３）の簡易培地においては、被検液の拡散が遅く、液がシートに十分浸透拡散するまで静置する必要があり、また吸水性シートを防水性平板に積層固着させた場合であっても、このシートが極めて剥がれやすいという問題があった。
【０００５】
従って、本発明の目的は、被検液を接種した際の培地への拡散が極めて速く、また吸水性シートが防水性平板にしっかり固定され、水平のみならず、傾斜した又は逆さまの状態、あるいは無重力状態でも接種が可能で、簡易な操作で微生物の検出、同定を行うことができ、輸送、滅菌等が容易な簡易培地を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記（３）の簡易培地（特開平9-19282号公報）について、被検液の拡散速度の向上及びシートの確実な固定の観点から改良を加えるべく、鋭意検討を重ねた。その結果、培地組成物を含有するアルコール懸濁液中の接着剤量をより低濃度にとどめ、当該懸濁液を吸水性シートに十分に含浸させた後、徐々に乾燥させることにより、意外にも高濃度に接着剤を配合し通常に乾燥させた場合に比べ、極めて強固にシートを防水性平板に固定させることができ、かつ被検液の拡散速度が極めて大きく、接種の際、被検液が瞬時に拡散しうる簡易培地が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、（ａ）ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレンオキサイドから選ばれる接着剤0.01〜0.15重量％、（ｂ）キサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれるゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有するアルコール懸濁液を調製し、該アルコール懸濁液を、防水性平板上に載置された該ゲル化剤の粒径より大きいメッシュを有する繊維質吸水性シートに含浸させ、これを非開放空間内でアルコールガスと空気の置換を行いながら乾燥して、吸水性シートを防水性平板に固着させてなる簡易培地の製造方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
培地組成物を構成する（ａ）成分の接着剤としては、水及びアルコールに可溶なものであることが必要であり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド等が挙げられるが、なかでもヒドロキシプロピルセルロースが特に好ましい。
【０００９】
（ｂ）成分のゲル化剤としては、水に可溶でアルコールに不溶であることが必要で、例えばキサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン等の天然ゲル化剤、ヒドロキシエチルセルロース等の合成ゲル化物質が挙げられるが、なかでもキサンタンガムが特に好ましい。かかるゲル化剤は、平均粒径500μm以下、特に0.5〜50μmの粉体を使用するのが好ましい。
【００１０】
また、（ｃ）成分の菌体栄養成分としては、検出しようとする微生物の生育に適したものが選択される。例えば、多種の微生物を増殖させる場合には、一般的な栄養培地成分が用いられ、特定の微生物を選択的に増殖させる場合には選択培地成分が用いられる。
【００１１】
更に、この培地組成物には、コロニーの観察を容易にするために、適当な発色剤を配合するのが好ましい。かかる発色剤には、コロニーを着色する色素、例えばトリフェニルテトラゾリウムクロライド、3-(p-ヨードフェニル)-2-(p-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロライド、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド等の色素；5-ブロモ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド等の酵素基質；ブロムチモールブルー、ニュートラルレッド等のpH指示薬などが含まれる。
【００１２】
培地組成物を懸濁するためのアルコールとしては、例えばエタノール、2-プロパノール等が挙げられる。
【００１３】
上記培地組成物を担持させる繊維質吸水性シートは、接種された被検液が毛細管現象により容易に拡散し、かつ培地組成物中のゲル化剤をその網目構造中に担持できるものであることが必要である。そのためには、繊維質吸水性シートはゲル化剤の粒径よりも大きいメッシュを有し、かつ厚さも当該粒径より厚いことが必要であり、例えば、網目の大きさが15〜100メッシュ、特に20〜50メッシュで、厚さが10〜1000μm、特に50〜600μmのものが好ましい。
【００１４】
このような繊維質吸水性シートとしては、レーヨン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布等が挙げられる。これらのシートの形状は特に制限されず、正方形、長方形、円形等の何れであってもよい。またその大きさも特に制限されないが、微生物の簡易検出用の場合には長径１〜15cmのものが好ましい。
【００１５】
上記繊維質吸水性シートを固着させる防水性平板としては、プラスチック、ガラス等の防水性の材質のものであれば何れでもかまわないが、外部からの観察のため透明のものが好ましい。
【００１６】
本発明の簡易培地の製造は、以下のようにして行われる。
【００１７】
まず、（ａ）〜（ｃ）の培地成分をアルコールに添加してアルコール懸濁液を調製する。この際、成分（ａ）の濃度は、0.01〜0.4重量％とする必要があり、特に0.01〜0.15重量％とするのが好ましい。アルコール懸濁液中の成分（ａ）がこの範囲より高濃度の場合、懸濁液中での培地成分の動きが高濃度の成分（ａ）により制限され、そのまま培地成分がシート内部でのみ乾燥固化してしまい、防水性平板への固定化が不十分となり、またシートの吸水性も劣るものとなる。またこのアルコール懸濁液中の成分（ｂ）の濃度は0.1〜20重量％、特に２〜６重量％、成分（ｃ）の濃度は0.5〜20重量％、特に１〜５重量％になるようにするのが好ましい。
【００１８】
次いで、このアルコール懸濁液を、防水性平板上に載置した繊維質吸水性シートに注下、噴霧、塗布等によって含浸させる。含浸させるアルコール懸濁液は、上記濃度のものをシート１cm3当り0.5〜２mlとするのが好ましい。その後乾燥してアルコールを蒸発除去することにより、培地成分が担持された繊維質吸水性シートが防水性平板に積層固着されるが、この乾燥に際しては、アルコールの急速な蒸発を抑制しつつ行う必要がある。このようにアルコールの急速な蒸発を抑制しつつ乾燥を行うための手段としては特に限定されるものではないが、例えばアルコールの蒸気圧の高い雰囲気中で乾燥を行う、低温で乾燥を行う等の方法が挙げられる。
【００１９】
このように乾燥を徐々に行うことにより、アルコール懸濁液中の培地成分が乾燥中に十分に沈降して、乾燥後の吸水性シートの防水性平板への固着が強固なものとなる。一方、吸水性シートの表面付近では繊維質吸水性シートの繊維が高い吸水性を保持したまま乾燥され、当該繊維目と防水性平板との立体的空洞部の毛細管現象と相俟って、被検液の拡散速度が高くなる。こうした現象の総合的成果として、被検液の拡散速度が極めて大きく、更に極めて強固にシートを防水性平板に固定させることが可能な、本発明の培地を得ることができた。この乾燥が急速な場合には、アルコール懸濁液中の培地成分の沈降が不十分なまま固化してしまうため、吸水性シートの防水性容器への固定が不十分となり、また被検液の拡散性に劣るものとなってしまう。
【００２０】
本発明の簡易培地は、汚染及び乾燥を防止するために、その表面をフィルムで覆うか、容器に収納するのが好ましく、特に、防水性平板として容器一体型の防水性容器を用い、これに培地成分を担持させた繊維質吸水性シートを積層固着させるのが好ましい。
【００２１】
このようにして製造された本発明の簡易培地は、エチレンオキサイドガス、γ線、電子線等によって滅菌するのが好ましい。好ましい滅菌方法としては、アルミ包材等、ガスバリヤー性と遮光性を兼ね備えた包材で包装した後、γ線、電子線等の放射線照射を行う方法が挙げられ、特にこの包装の際に簡易培地と共に乾燥剤を封入しておくことが最も好ましい。このような方法で滅菌処理を行うことにより、簡易培地の製造の全行程を無菌状態に管理する必要がなくなり、かつ滅菌後の微生物の混入や光及び湿気による培地の経時変化を抑制することが可能となる。
【００２２】
本発明の簡易培地を用いて微生物を検出するには、当該培地表面に被検液を接種する。そうすると、被検液がメッシュ間の立体的な空洞部の毛細管現象によって容易に拡散し、それに続いて膨潤ゲル化が起こって、被検液中の微生物は捕捉され、自由移動が抑制され、培養によってコロニーが形成される。従って、培地形成面を観察すれば、形成したコロニーが容易に観察できる。試料を定量的に簡易培地へ接種すれば、培養後出現したコロニーを計測することにより、容易に菌数を算定することができる。
【００２３】
なお、菌体液の接種は通常ピペット等により一定量を接種する方法が採用されるが、水分の多い個体へスタンプする方法や試料液へ浸す方法でもよい。また、被検液接種後の培養は、静置して行っても、また輸送期間中に行ってもよい。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
(1)培地の作製
ペプトン1.0ｇ、酵母エキス0.5ｇ、ブドウ糖0.2ｇ、キサンタンガム３ｇ及びテトラゾリウムクロライド0.002ｇを、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）を0.01〜１重量％含有するエタノール溶液100mlに加え、懸濁液とした。このエタノール懸濁液を１mlずつ繊維質吸水性シート（50φmm）を収納した容器（50φmm）に分注した後２段に重ね、非開放空間内で徐々に一夜乾燥した後、蓋をして本発明の簡易培地を作製した。本簡易培地を乾燥剤と共にアルミ包材に密封包装した後、表面線量10〜20kGyのγ線照射を行って滅菌した。
この簡易培地は、吸水性シートが容器にしっかり固定され、傾斜させた状態又は逆さまの状態でも接種可能なものであった。
【００２６】
(2)拡散性試験
本簡易培地の吸水性シートの中心部に精製水を１ml滴下し、容器全面に拡散するまでの時間を計測した結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
0004143219.tif 000002
【００２８】
その結果、表１から明らかなように、HPC濃度が0.4重量％以下では、拡散性の良好な培地となり、特に0.15重量％以下では10秒以内の極めて迅速な拡散性を示した。
【００２９】
実施例２
実施例１と同様に製した培地を乾燥剤と共にアルミ包材により密封包装し、表面線量10〜20kGyの電子線照射又はγ線照射を施した後、以下の試験を行った。
大腸菌をトリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）にて35℃で24時間培養後、10倍段階希釈を行い、それぞれ１mlずつを本発明培地（電子線滅菌，γ線滅菌）、標準寒天培地（日水製薬社製）に接種し、35℃で48時間培養した後、菌数を測定した。
その結果、５回の平均で、電子線滅菌した本発明培地が2.6×108cfu/ml、γ線滅菌した本発明培地が2.7×108cfu/ml、標準寒天培地が2.7×108cfu/mlであり、いずれの培地でもほぼ同様の菌数を示し、発育性能に差がないことが確認された。
【００３０】
実施例３
ペプトン1.0ｇ、酵母エキス0.5ｇ、ブドウ糖0.2ｇ、キサンタンガム３ｇ及びテトラゾリウムクロライド0.002ｇを、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）を0.1重量％含有するエタノール溶液100mlに加え、懸濁液とした。このエタノール懸濁液を１mlずつ繊維質吸水性シート（50φmm）を収納した容器（50φmm）に分注した後２段に重ね、非開放空間内で徐々にアルコールガスと空気の置換を行いながら乾燥した後、蓋をして本発明の培地を作製した。本培地を乾燥剤と共にアルミ包材に密封包装した後、表面線量10〜20kGyのγ線照射を行って滅菌した。この培地は、吸水性シートが容器にしっかり固定され、傾斜させた状態又は逆さまの状態でも接種可能なものであった。
【００３１】
本培地の吸水性シートの中心部に精製水を１ml滴下し、容器全面に拡散するまでの時間を計測したところ、5.53秒と良好な拡散性を示した。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、接種後の被検液の拡散が極めて速く、瞬時に拡散させることができると共に、培地を傾けた又は逆さまにした状態、あるいは無重力の状態でも接種が可能であることから、室内のみならず野外、宇宙空間等、場所を限定されることがなく簡易かつ迅速な微生物検査が可能となる。