(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の毛小皮からアルカリ性の還元条件下で抽出することにより得られる、毛小皮由来抽出物を配合することを特徴とする毛髪処理剤。
【請求項２】
毛小皮由来抽出物が、該抽出物に含有される蛋白質のＳＨ基の全部又は一部を修飾した、毛小皮由来抽出物誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載の毛髪処理剤。
【請求項３】
ＳＨ基の修飾が、モノヨード酢酸あるいはエチレンイミンによる修飾であることを特徴とする、請求項２に記載の毛髪処理剤。
【請求項４】
哺乳類が、人、羊又は豚から選ばれることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の毛髪処理剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、毛髪損傷の予防または修復に有用な、毛髪処理剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
毛髪がパーマ処理等により損傷を受けキューティクルの捲れや枚数の減少が起こることが知られている。この際、毛髪から蛋白質が溶出されるという報告はあるが、その由来については不明であった。
【０００３】
また、損傷毛髪の修繕剤として従来シリコンなどの毛髪コート剤や毛髪ケラチン、その加水分解物またはその誘導体を補う試みが行われてきている。しかし、毛髪ケラチンは不溶性の蛋白質でパーマ処理等により溶出される蛋白質とは全く異なる物性を持つため充分な損傷毛髪の修繕効果を得ることは困難なのが実情である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等はかかる事情に鑑み鋭意検討した結果、毛小皮から抽出操作を行うことにより得られる、毛髪の表層を構成する特定の蛋白質が上記の毛髪の損傷により溶出される蛋白質の成分の一つであり、また該蛋白質が毛髪を還元剤を含む緩衝液で抽出することにより効率良く製造できること、さらには該蛋白質を含有せしめた毛髪処理剤として有用であることを見い出し本発明を完成するに至ったものであって、その目的は、毛髪損傷予防あるいは損傷毛髪修復に有用な、毛髪処理剤を提供するにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って、上述の目的は、哺乳類の毛小皮より抽出される、毛小皮由来抽出物、又はさらに蛋白質のＳＨ基の全部又は一部を修飾することによって得られる毛小皮由来抽出物誘導体を配合することを特徴とする毛髪処理剤によって達成される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成について詳説する。
【０００７】
本発明で用いられる毛小皮（キューティクル）の取得方法としては、公知の毛髪から分離して得る方法が挙げられる。例えば、毛髪を水中で振とう、攪拌あるいは超音波処理することにより、物理的に剥離することができる（Journal of the Society of Cosmetic Chemists,25巻，13頁，1974年参照）。剥離した毛小皮は、ガーゼやメッシュで濾過することにより、毛髪から分離した後、遠心分離又は濾過することにより収集することができる。なお、本発明で用いる毛髪は人毛のほか羊毛、豚毛などの由来のものが挙げられる。
【０００８】
本発明の毛小皮由来抽出物の製造方法としては、例えば収集した毛髪より分離して得た毛小皮を、(1)還元剤のみを含む緩衝液， (2)還元剤及び可溶化剤を含む緩衝液、等の抽出液で抽出する方法等が挙げられる。特に(1)の還元剤のみを含む緩衝液中で抽出操作を行うと、より混在物の少ない毛小皮由来抽出物を得ることができるので好ましい。
【０００９】
抽出操作は、毛小皮の抽出緩衝液の液性をアルカリ性として行う。温度を25℃から 100℃の条件として行うことが好ましい。
【００１０】
また、毛小皮から毛小皮由来抽出物を製造する際には毛小皮を抽出液中で攪拌するか、ホモジナイザー等を用いて毛小皮を抽出液中擦り潰すと、効率良く本発明の毛小皮由来抽出物が得られ好ましい。
【００１１】
本発明に用いられる還元剤としては、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、亜硫酸ナトリウム、チオグリコール酸アンモニウム等が挙げられる。
【００１２】
本発明に用いられる還元剤の、単独使用の濃度としては、緩衝液総量の１〜３重量％が好ましい。
【００１３】
抽出液に用いられる可溶化剤としては、周知公用の変性剤、界面活性剤等の可溶化剤等を用いることができ、例えば変性剤としては尿素、塩酸グアニジン等が挙げられ、界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
【００１４】
本発明の毛小皮由来抽出物誘導体の製造方法としては、本発明の毛小皮由来抽出物に含有される蛋白質のＳＨ基を例えば、モノヨード酢酸あるいはエチレンイミン等で修飾する通常の方法が挙げられる。
【００１５】
本発明の毛小皮由来抽出物誘導体は、還元剤や可溶化剤が存在しなくても水に溶解するので広い範囲に応用することができる。
【００１６】
本発明の毛小皮由来抽出物、並びに毛小皮由来抽出物誘導体自体もＳ−Ｓ架橋又はＳＨ基を多量に含有した蛋白質であるので、直接シャンプー、リンス、ヘアートリートメント等の毛髪処理剤に配合することによって、毛髪の保護成分として使用することも可能である。
【００１７】
本発明の毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体を含む毛髪処理剤の剤形としてはトリートメント、リンス、シャンプー、ヘアクリーム、ヘアーローション、ヘアーパック、パーマネント用剤等、毛髪に対して用いる各種のものが挙げられる。
【００１８】
本発明の毛小皮由来抽出物および毛小皮由来抽出物誘導体の含有量は、組成物の総量を基準として0.01重量％〜５重量％が好ましく0.1 重量％〜１重量％が特に好ましい。
【００１９】
この他、本発明の毛小皮由来抽出物、並びに毛小皮由来抽出物誘導体は、例えば毛小皮を特異的に認識する抗体を作製する際の抗原としても有用である。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例、比較例によって本発明を更に詳細に説明する。
【００２１】
製造例１、２及び参考例１、２（ヒト毛小皮からの毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体、毛小皮特異蛋白質及び毛小皮特異蛋白質誘導体の製造）
（１）ヒト毛小皮 800mgを、8M尿素及び 0.2M 2-メルカプトエタノールを含む0.2Mトリス（pH 9.5）3ml に加え、50℃１時間インキュベートした後、ガラスホモジナイザーを用いて擦り潰した。更に50℃１時間インキュベートした後、遠心分離（10,000 g）して上清を集め、毛小皮由来抽出物（蛋白質量として21mg；製造例１）を得た。
【００２２】
（２）また、この毛小皮由来抽出物（製造例１）の半量にモノヨード酢酸75mgを加え、トリスでｐH 9.0 とし、遮光下室温で1.5 hr攪拌した。10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）により透析して毛小皮由来抽出物（カルボキシメチル化）誘導体（製造例２）を得た。
【００２３】
（３）毛小皮特異蛋白質ならびにその毛小皮特異蛋白質（カルボキシメチル化）誘導体はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により分離した。上記によって得られた製造例１又は２の抽出物を、6M尿素を含む15％ゲルを用いて電気泳動した後、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜に転写し、得られた毛小皮抽出物の分子量約7,000 のバンドならびにその毛小皮抽出物誘導体の分子量約15,000のバンドを切り取り、酢酸／アセトニトリル／水（7:2:1)の混合溶液で抽出し、毛小皮特異蛋白質（参考例１）及び毛小皮特異蛋白質（カルボキシメチル化）誘導体（参考例２）を得た。
【００２４】
PVDF膜上の毛小皮特異蛋白質（カルボキシメチル化）誘導体を0.5%ポリビニルピロリドンで処理した後、トリプシン（プロメガ社製）を加え24時間37℃で反応させた。得られた分解物を下記条件の逆相液体クロマトグラフィーに付し、保持時間14.2分及び18.3分の画分を分取した。
【００２５】
カラム：A-312 ODS（6.O×150 mm, YMC 社製）
溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸 (90:10:0.1)から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸 (30:70:0.1)の直線的濃度勾配（60分間かけて濃度勾配をかける）
流速：2.O ml/min
検出：220 nmにおける吸光度
【００２６】
得られた画分を減圧乾燥後、アプライドバイオシステムズ社製471A気相プロテインシークエンサーでアミノ酸配列を分析し、下記の結果を得た。
【００２７】
保持時間14.2分の画分のアミノ酸配列分析結果：
【００２８】
【化１】
0004194669.tif 000002
【００２９】
保持時間18.3分の画分のアミノ酸配列分析結果：
【００３０】
【化２】
0004194669.tif 000003
【００３１】
（但し、Ｘは未同定のアミノ酸である。）
【００３２】
製造例３、４及び参考例３、４（ヒト毛小皮からの毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体、毛小皮特異蛋白質及び毛小皮特異蛋白質誘導体の製造）
ヒト毛小皮100 mgを用いる以外は、製造例１、２及び参考例１、２と同様にして、ヒト毛小皮からの毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体、毛小皮特異蛋白質及び毛小皮特異蛋白質誘導体を製造した（製造例３、４及び参考例３、４）。
【００３３】
得られた画分を減圧乾燥後、アプライドバイオシステムズ社製471A気相プロテインシークエンサーでアミノ酸配列を分析し、下記の結果を得た。
【００３４】
保持時間14.2分の画分のアミノ酸配列分析結果：
【００３５】
【化３】
0004194669.tif 000004
【００３６】
保持時間18.3分の画分のアミノ酸配列分析結果：
【００３７】
【化４】
0004194669.tif 000005
【００３８】
製造例５（変性剤及び還元剤含有緩衝液による毛小皮由来抽出物の製造）
ヒト毛小皮800 mgを、8M尿素及び 0.2M 2-メルカプトエタノールを含む0.2Mトリス（pH 9.5）3ml に加え、50℃１時間インキュベートした後、ガラスホモジナイザーを用いて擦り潰した。更に50℃１時間インキュベートした後、遠心分離（10,000 g）して上清を収集した。残渣をガラスホモジナイザーを用いて擦り潰し、50℃１時間インキュベートした後、遠心分離（10,000 g）し上清を収集する操作を、計６回繰り返し、得られた上清を集めて毛小皮由来抽出物（蛋白質量として21mg）を得た。
【００３９】
製造例６（界面活性剤及び還元剤含有緩衝液による毛小皮由来抽出物の製造）
ヒト毛小皮を抽出する溶液として、2%ドデシル硫酸ナトリウム及び 10mM ジチオスレイトールを含む0.2Mトリス（pH 9.0）3ml を用いる以外は製造例５と同様にして、毛小皮由来抽出物（蛋白質量として15mg）を得た。
【００４０】
製造例７（ヒト毛小皮からの還元剤含有緩衝液による毛小皮由来抽出物の製造）
ヒト毛小皮を抽出する溶液として、0.2M 2-メルカプトエタノールを含む0.2Mトリス（pH 9.5）3ml を用いる以外は製造例５と同様にして、毛小皮由来抽出物（蛋白質量として8.9 mg）を得た。
【００４１】
参考例５（全毛髪のパーマ液による毛小皮特異蛋白質画分の製造）
ヒト毛髪2.5gをパーマ第１液（12％チオグリコール酸アンモニウム、１％エタノールアミン、0.05％エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、0.42％アンモニア水溶液）50mlに室温15分間浸した。５回パーマ第１液を交換して溶出液を集め、限外濾過膜を用いて濃縮し毛小皮特異蛋白質画分（蛋白質量として0.13mg）を得た。
【００４２】
製造例８、９及び参考例６、７（羊毛小皮からの毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体、毛小皮特異蛋白質及び毛小皮特異蛋白質誘導体の製造）
羊毛小皮 200mgを用い、製造例１、２及び参考例１、２の（１）と同様の方法により、毛小皮由来抽出物（蛋白質量として5.2 mg；製造例８）を得た。
【００４３】
また、この毛小皮由来抽出物（製造例８）の半量にモノヨード酢酸を25mg加える他は、製造例１、２及び参考例１、２の（２）と同様にして、毛小皮由来抽出物（カルボキシメチル化）誘導体（製造例９）を得た。
【００４４】
毛小皮特異蛋白質ならびにその毛小皮特異蛋白質（カルボキシメチル化）誘導体はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により分離した。上記によって得られた製造例８又は９の抽出物を、6M尿素を含む15％ゲルを用いて電気泳動した後、得られた毛小皮抽出物の分子量約7,000 のバンドならびにその毛小皮抽出物誘導体の分子量約15,000のバンドを切り取り、蛋白質溶出装置（ISCO社製、1750）を用いて抽出し、毛小皮特異蛋白質（参考例６）及び毛小皮特異蛋白質（カルボキシメチル化）誘導体（参考例７）を得た。
【００４５】
得られた画分を6M塩酸で加水分解後、日立製アミノ酸分析機でアミノ酸を分析した、下記の結果を得た。なお、システイン含量は参考例６では過ギ酸酸化後加水分解して得たシステイン酸、参考例７ではS-カルボキシメチルシステインとしての定量値である。
【００４６】
【表１】
0004194669.tif 000006
【００４７】
比較製造例１（変性剤及び還元剤含有緩衝液による毛皮質由来抽出物の製造）
原料として、毛小皮を除いた毛髪、すなわち毛皮質 800mgを用いる以外は製造例１と同様にして、可溶性抽出物（蛋白質量として 160mg）を得た。
【００４８】
試験例１（蛋白質の分析）
毛小皮由来抽出物及び毛小皮特異蛋白質画分（製造例１，２，６，７，８，参考例５）ならびに毛皮質由来抽出物（比較製造例１）の蛋白質の分析結果を図１に示した。尚、毛小皮由来抽出物ならびに毛皮質由来抽出物中の蛋白質の分析は、毛小特異蛋白質（参考例１）ならびに毛小皮特異蛋白質（カルボキシメチル化）誘導体（参考例２）の分離に用いたSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により行った。
【００４９】
製造例１，２，６，７，８ではいずれも低分子の蛋白質バンドが観察されるのに対し、比較製造例１では観察されなかった。
【００５０】
試験例２（蛋白質の分析）
試験例１と同様にして、製造例５，６，７，比較製造例１の蛋白質の分析を行い、結果を図２に示した。
【００５１】
製造例５，６，７ではいずれも低分子の蛋白質バンドが観察されるのに対し、比較製造例１では観察されなかった。
【００５２】
試験例３（毛小皮特異蛋白質の分析）
毛小皮由来抽出物中の毛小皮特異蛋白質の分析は、毛小皮特異蛋白質に対する特異抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法により行った。毛小皮特異蛋白質に対する特異抗体は、アミノ酸配列に基づき合成して得られるペプチド抗原を免疫して得た抗血清を用いた。
【００５３】
ここでは抗原として、毛小皮特異蛋白質の部分アミノ酸配列に基いて合成した下記の構造を持つ多抗原性ペプチドを使用した。
【００５４】
【化５】
0004194669.tif 000007
【００５５】
多抗原性ペプチド 250μｇを、３週間毎４回、FCA(初回免疫時) 又は、FIA(追加免疫時) と共にウサギに免疫し、初回免疫から10週後に全採血して得た抗血清を、以下の試験に用いた。
【００５６】
製造例１，２，６，７，８，参考例５で得た毛小皮由来抽出物及び毛小皮特異蛋白質画分、並びに比較製造例１で得た毛皮質由来抽出物を試験例１の方法で電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した後、0.8%の塩化ナトリウム及び0.1%のTween 20を含む20mMトリス塩酸緩衝液で1,000倍に希釈した抗毛小皮特異蛋白質血清に浸し、１時間室温で反応させた。結合した抗体をプロテインブロッティングキット（RPN23,Amersham社製）で検出した結果を図３に示した。
【００５７】
製造例１，２，６，７，８ではいずれも低分子の蛋白質バンドへの抗毛小皮特異蛋白質特異抗体の結合が観察されるのに対し、比較製造例１では観察されなかった。従って、製造例１，２，６，７，８の毛小皮由来抽出物がいずれも毛小皮特異蛋白質を多量に含有することは明らかである。
【００５８】
試験例４（毛小皮特異蛋白質の分析）
試験例３と同様にして、製造例５〜７の毛小皮特異蛋白質の分析を行なった結果を、図４に示す。
【００５９】
製造例５〜７ではいずれも低分子の蛋白質バンドへの抗毛小皮特異蛋白質特異抗体の結合が観察されるのに対し、比較製造例１では観察されなかった。従って、製造例５〜７の毛小皮由来抽出物がいずれも毛小皮特異蛋白質を多量に含有することは明らかである。
【００６０】
実施例１〜５（毛小皮由来抽出物含有毛髪処理剤）
製造例１，２，６，７，８で得た毛小皮由来抽出物及び毛小皮由来抽出物誘導体10mgを20mM2-メルカプトエタノールを含む生理リン酸緩衝液１mlに溶解し、毛小皮由来抽出物含有の毛髪損傷修復用毛髪処理剤（実施例１〜５）を調製した。
【００６１】
試験例５（損傷毛髪に対する修復効果）
予め、パーマ処理を３回施した毛髪７束を、実施例１〜５の毛小皮由来抽出物含有毛髪損傷修復剤に各々室温で30分間浸した後、水洗した。無処理毛髪（健常毛），修復剤処理前及び処理後のパーマ処理毛髪の３種の毛髪に、キューティクルの捲れが観察し易い様にそれぞれ結び目を作り、走査型電子顕微鏡観察を行った。パーマ処理毛髪に観察されるキューティクルの捲れが、いずれの処理剤で処理することによっても健常毛程度に修復した様子が観察された。
【００６２】
実施例６〜１１（毛小皮由来抽出物含有毛髪トリートメント剤）
下記に示す組成の、製造例１，２，６，７，８，９で得た毛小皮由来抽出物及び毛小皮由来抽出物誘導体を含有した毛髪トリートメント剤（実施例６〜１１）を調製した。
【００６３】
【表２】
0004194669.tif 000008
【００６４】
試験例６（毛小皮由来抽出物含有毛髪トリートメント剤の官能試験）
ヒト毛束（黒髪5g）を実施例６〜１１の毛小皮由来抽出物含有毛髪トリートメント剤に１時間浸漬後、流水で10分間水洗して風乾した。処理後毛束のくし通り、しなやかさ、風合について処理前の毛束とどちらがよいか官能評価を行った結果、いずれも毛小皮由来抽出物含有毛髪トリートメント剤で処理した毛束の方がくし通り、しなやかさ、風合が良好であった。
【００６５】
応用例１（毛小皮由来抽出物を利用した毛髪診断キット）
以下に記載した４種の溶液よりなる毛髪診断キットを作製し、ヒト毛髪で損傷度を診断した。
【００６６】
Ａ液：製造例７で得た毛小皮由来抽出物１mgを、３週間毎４回、FCA(初回免疫時) 又は、FIA(追加免疫時) と共にウサギに免疫し、初回免疫から10週後に全採血して得た抗血清を、0.05%Tween 20 を含むPBS で1,000 倍希釈して作製した。
【００６７】
Ｂ液：ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG 抗体（カッペル社製）を、0.05%Tween20を含むPBS で7,000 倍希釈して作製した。
【００６８】
Ｃ液：オルトフェニレンジアミン20mg及び過酸化水素10μｌを含む0.2Mリン酸二ナトリウム−0.1Mクエン酸緩衝液, pH 5.0（ペルオキシダーゼの基質溶液）
【００６９】
Ｄ液：生理食塩水
【００７０】
髪の傷んだ人と健常な人の毛髪10mgにＡ液を加え37℃、１時間インキュベートした。Ｄ液で６回洗浄した後、Ｂ液と室温、30分間インキュベートした。Ｄ液で６回洗浄した後、Ｃ液を加えると、傷んだ人の毛髪を入れた試験管が発色した。
【００７１】
以上の結果から、毛小皮由来抽出物を抗原として得た抗体で、毛髪の損傷状態あるいは健康状態を知ることができることは明らかである。
【００７２】
尚、Ａ液を加え37℃、１時間インキュベートした時点で、傷んだ毛髪の方は、ハリが戻る等の損傷修復効果も見られた。このことから、本発明の毛小皮由来抽出物を抗原として得た抗体は、毛髪の損傷の修復・予防にも有用であることが明らかとなった。
【００７３】
【発明の効果】
以上の結果から、本発明により、毛髪の損傷状態あるいは健康状態を知るマーカーとして，あるいは損傷毛の修復および予防用素材として有用な、毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体、及び該抽出物を配合した毛髪処理剤を提供できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体及び毛皮質由来抽出物を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（6M尿素存在下、15％ゲル）により分離し、蛋白質をクマシーブリリアントブルー（CBBG）で染色した図面代用写真である。
矢印は、毛小皮特異蛋白質のバンドを示す。
レーン１；製造例１の蛋白質画分
レーン２；製造例２の蛋白質画分
レーン３；製造例６の蛋白質画分
レーン４；製造例７の蛋白質画分
レーン５；参考例５の蛋白質画分
レーン６；製造例８の蛋白質画分
レーン７；比較製造例１の蛋白質画分
【図２】  毛小皮由来抽出物及び毛皮質由来抽出物を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（6M尿素存在下、15％ゲル）により分離し、蛋白質をクマシーブリリアントブルー（CBBG）で染色した図面代用写真である。
矢印は、毛小皮特異蛋白質のバンドを示す。
レーン１；製造例５の蛋白質画分
レーン２；製造例６の蛋白質画分
レーン３；製造例７の蛋白質画分
レーン４；比較製造例１の蛋白質画分
【図３】  毛小皮由来抽出物、毛小皮由来抽出物誘導体及び毛皮質由来抽出物の毛小皮特異蛋白質を分析した図面代用写真である。試験例１の条件で電気泳動後、PVDF膜に転写し、毛小皮特異蛋白質の特異抗体で検出した。
矢印は、毛小皮特異蛋白質のバンドを示す。
レーン１；製造例１の蛋白質画分
レーン２；製造例２の蛋白質画分
レーン３；製造例６の蛋白質画分
レーン４；製造例７の蛋白質画分
レーン５；参考例５の蛋白質画分
レーン６；製造例８の蛋白質画分
レーン７；比較製造例１の蛋白質画分
【図４】  毛小皮由来抽出物及び毛皮質由来抽出物の毛小皮特異蛋白質を分析した図面代用写真である。試験例２の条件で電気泳動後、PVDF膜に転写し、毛小皮特異蛋白質の特異抗体で検出した。
矢印は、毛小皮特異蛋白質のバンドを示す。
レーン１；製造例５の蛋白質画分
レーン２；製造例６の蛋白質画分
レーン３；製造例７の蛋白質画分
レーン４；比較製造例１の蛋白質画分
【図１】
0004194669.tif 000009
【図２】
0004194669.tif 000010
【図３】
0004194669.tif 000011
【図４】
0004194669.tif 000012