(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−リベチン溶液を７０℃で、３０分加熱する反応を用いることを特徴とする水不溶性γ−リベチンを主構成成分とする水不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【請求項２】
γ−リベチン溶液濃度が５０〜５００ｍｇ／ｍｌ未満であり、且つ反応生成物から水不溶性成分を分離する工程を有することを特徴とする請求項１記載の水不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【請求項３】
加熱反応の後、γ−リベチンの活性が９０％以上残存することを特徴とする請求項１又は２記載の水不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不溶性γ−リベチン複合体の製造法に関する。更に詳しくは、特異的抗体活性を有する不溶性γ−リベチン複合体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
もともとγ−リベチンは可溶性の蛋白質である為に、そのままの形では利用できない分野が存在する。一例を挙げると検査薬分野で使用するラッテクス凝集法や生化学分野で使用するアフィニティクロマトグラフ等は、γ−リベチンに結合させる不溶性の担体が必ず必要であり可溶性のγ−リベチンをこのまま利用することは出来ない。その為利用する際には担体に結合させることが必要であった。担体に結合させる方法としてグルタルアルデヒド等を用いた修飾法（高次構造の化学的研究法、学会出版センター編、第４章）等が用いられてきたが、いずれも担体への修飾率が低いなど問題点も多い。
又、養殖ウナギのパラコロ病(Edwardsiella tarda 菌の感染症）は養鰻場における被害額が最も大きな腸管感染症として知られている。従来こうした養殖魚感染症の予防分野においてもγ−リベチンの応用が行われ、Edwardsiella tarda菌（以下E.tarda 菌とする）に対する特異的γ−リベチンの予防効果が報告されている(Hatta et al., Japanese Journal of Dairy and Food Science., 41, 6,(1992)) 。しかし、実際の養鰻場ではウナギの餌にγ−リベチンが練り込まれる為、水溶性のγ−リベチンは餌から池の水に溶け出しウナギの体内に運ばれる割合が少なくなるという欠点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明は、不溶性担体を必要としないイムノアフィニティークロマトグラフィーや養殖魚の魚病予防・治療などの抗体利用分野において有用な特異的抗体活性を有する不溶性γ−リベチン複合体の製造法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、γ−リベチンに不可逆な反応を施すことにより特異的抗体活性を有する不溶性複合体が得られることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、不可逆反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを構成成分とする不溶性γ−リベチン複合体の製造法である。
【０００５】
【発明の実施形態】
本発明における不可逆反応とは、γ−リベチン間もしくはγ−リベチンと夾雑する蛋白質との間における共有結合を形成する反応のことをいう。とくに限定するものではないが、共有結合を判定する方法として例えばSDS-PAGE法が挙げられる。本発明の不溶性γ−リベチン複合体は、この方法において測定される分子量が３６０ｋＤａ以上の蛋白質複合体である。高塩濃度下で生じるγ−リベチン同士の二量体は、疎水結合又はイオン結合であって不可逆な結合ではなく、SDS-PAGEでは単量体として存在するため、本発明の不溶性γ−リベチン複合体とは異なる。
本発明における不可逆反応法は、特に限定するものではないが加熱反応法、超高圧反応法、還元剤を用いた反応法が挙げられ、特に加熱反応法は複合体を形成する割合が多く且つ簡便であるため好ましい。
【０００６】
本発明における加熱反応条件とは、特に限定されるものではなくγ−リベチンの活性が９０％以上残存する条件が選ばれる。具体的にはγ−リベチン含有溶液を６０〜８０℃、１０〜１２０分で加熱することが好ましく、その際のγ−リベチン含有溶液の濃度は５０ｍｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌの溶液濃度が好ましい。更に好ましくは、８０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌの濃度が好ましい。濃度が５０ｍｇ／ｍｌより低いと不溶化の複合体を形成しにくくなる為、不溶性γ−リベチンが主構成成分とならない。又５００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度になると固形分が多く水分が少ないため加熱条件には適さない。
本発明において主構成成分とは、γ−リベチン複合体中に占めるγ−リベチンの割合が５０％以上を占め、好ましくは８０％以上占めることをいう。
本発明における加熱処理時のｐＨ条件は、ｐＨ５．０からｐＨ１１．０が好ましく、さらに好ましくは、ｐＨ７．０からｐＨ９．０である。ｐＨがｐＨ５．０より酸性側、又はｐＨ１１．０よりアルカリ性側に傾くとγ−リベチンの持つ活性が失活する恐れがある。
【０００７】
本発明において不溶性とは、特に限定するものではないが水緩衝液、油、溶剤等の溶媒に対し溶解性がないことをいう。
不溶性γ−リベチン複合体はさらに精製して使用してもよく、その精製法としては特に限定するものではないが濾過法、遠心法が好適に使用できる。
本発明における濾過法とは、特に限定するものではないが孔径が０．１μｍ以上の濾紙、濾板、ガラスフィルターより選ばれた１種類以上の膜を使用して分離する方法のことをいう。更に、本発明における遠心法とは特に限定するものではないが回転数は５００回転以上、時間は５分以上の遠心法により沈殿物を分離する方法のことをいう。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、これらによって発明を制限するものではない。
【０００８】
【実施例】
実施例１
抗S.mutans  γ−リベチン含有卵黄水溶性蛋白質溶液の調製
特定抗原として、ストレプトコッカス・ミュータンス  MT8148（以下S.mutansという）菌体を含む菌溶液(CFU 108）を調製し、産卵鶏を免疫した。得られた卵より卵黄を分離し均質化した溶液を卵黄液とした。
得られた卵黄液１ｋｇに対し１ｋｇの水を加え均質化し、そこに０．１５％のλ−カラギーナン水溶液を４ｋｇ加え撹拌した。静置後、吸引濾過を行い濾液を分取した。このとき得られた濾液を卵黄水溶性蛋白質溶液とした。
【０００９】
実施例２
抗S.mutansγ−リベチン含有粉末の調製
実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１Ｌに硫酸ナトリウム  １５０ｇを少しずつ加え溶解した後、３０分間静置し遠心（常温、8000rpm ×15分間）した。上清を捨て、沈殿物に１０ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー２００ｍｌを加え溶解した。得られた溶液を用い上記同様の方法にて再度塩析法を行った。本溶液を１０ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファーを用い一晩透析を行なった。得られた溶液を凍結乾燥し、特異的γ−リベチン含有粉末を得た。
得られた粉末は、ゲル濾過法（”蛋白質Ｉ”、日本生化学会編、第11章、東京化学同人(1990)) により全蛋白質に対するγ−リベチンの割合が９０％以上であることを確認した。
【００１０】
実施例３
γ−リベチン複合体の調製
実施例２で得られた特異的γ−リベチン含有粉末を純水を用い１００ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。調製した溶液２００ｍｌを耐熱性の容器に封入し７０℃の恒温層にて３０分間加熱し不溶物を得た。出来た不溶物に２００ｍｌの水を加えホモジナイザーにて１０分間撹拌し、その後濾紙（トーヨー濾紙No.131）により水溶液と不溶化γ−リベチン複合体画分とに分離した。分離した不溶物を集め凍結乾燥機にて乾燥させた。
【００１１】
試験例１
γ−リベチン複合体の不可逆反応の確認
実施例３で得られた粉末を用いSDS-PAGEにて泳動させ、本複合体がイオン結合もしくは疎水結合か、又は共有結合であるかを確認した。
使用したポリアクリルアミドゲルはパジェル(AE-6000 NPG-310L ：アトー株式会社） (分画分子量40〜500kDa) を用い泳動を行った。泳動サンプルは実施例３で得られた粉末を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かし本溶液５μｌをゲルにアプライした。
その結果実施例３で得られたサンプルは、ほとんど泳動されず上端部分で止っていた。このことより本サンプルは共有結合を有し、もとの単量体には戻ることのない５００ｋＤａ以上の蛋白質であることが示唆された。
【００１２】
試験例２
特異抗体活性回収率の比較
実施例３により得られた特異的γ−リベチン複合体粉末のS.mutansに対する特異的抗体力価を、酵素免疫測定法（以下ELISA 法という）により測定し特異抗体活性回収率の比較を行った。各試料液を１００μｌ／ウエルの割合で、抗原として用いたS.mutansを固相へコーティングしたELISA プレート（９６穴, ヌンク社製）へ添加し、２５℃、２時間静置することにより、抗原と特異的抗体の反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、抗ニワトリＩｇＧウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ザイメット社）のPBS-Tween 希釈液(2000 倍）を１００μｌ／ウエルの割合で添加した。２５℃で１時間放置することにより、抗原と反応した特異的抗体と上記コンジュゲートの反応を行った。
各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、０．１％  Ｐ−フェニルジソジウムホスフェート溶液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６に溶解）を基質として１００μｌ／ウエルの割合で添加し、２５℃、１５分間酵素反応を行った。反応の停止は２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ／ウエル添加することにより行い、４０５ｎｍにおける各ウエルの吸光度をプレートリーダーにより測定した。なお、対照としては試料の代わりにPBS-Tween を用いた。各試料につき、４ウエルを用いた。各試料の示す吸光度の平均値から対照の示す吸光度を引き、それぞれの試料重量を乗じた値（総吸光度）を各試料の総抗体活性とした。
総抗体活性を測定した結果、実施例２により得られた特異的γ−リベチン粉末と実施例３により得られた特異的γ−リベチン複合体粉末を比較すると、特異的γ−リベチン粉末を１００％として特異的γ−リベチン複合体粉末は約９０％抗体活性回収率が得られた。
【００１３】
実施例４
アフィニティクロマトグラフィーへの応用
S.mutans菌体から抽出した抗原蛋白を分離精製する目的で、アフィニティークロマトグラフィー法を用いた。
S.mutans菌体を燐酸バッファーに懸濁後、超音波破砕機により破砕した菌体をサンプルとした。
実施例２で得られた抗S.mutans  γ−リベチンをアフィ・ゲルＨｚイムノアフィニティーキット（日本バイオラット）を用い担体に吸着させた。この吸着担体をカラムに詰めアフィニティークロマトカラムを完成させた。この時γ−リベチンの担体に対するカップリング効率をアフィ・ゲルＨｚイムノアフィニティーキットの手順に従い計算した結果約５０％の利用効率であった。
更に実施例３で得られた不溶性の特異的抗S.mutans  γ−リベチン複合体を用い上記同様カラムに詰め吸着担体なしのアフィニティークロマトカラムを完成させた。この時のγ−リベチンの加熱処理による高分子化率は約９０％であった。
共に試験例２の方法により特異抗体活性回収率を測定し、上記のカップリング率を乗じた値を利用効率とした。表１に不溶化粒子作製法の違いによるγ−リベチン利用化効率の比較を示す。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
表１の結果よりγ−リベチンの利用効率に大きな差が見られ、更にアフィニティークロマトカラムを作製する操作性が簡便であることより、実施例３で得られた不溶性の特異的抗S.mutans  γ−リベチン複合体を用いたアフィニティクロマトカラムが良好な結果を得た。また、上記２つのアフィニティーカラムにおいてS.mutans菌体抽出蛋白の分離はどちらのカラムでも良好に行うことが出来た。
実施例５
抗E.tarda γ−リベチン含有卵黄水溶性蛋白質溶液の調製
特定抗原として、E.tarda 菌のホルマリン死菌を用い、産卵鶏に実施例１同様免疫した。卵を集め卵黄を分離した。卵黄はホモミキサーにより均質化し、この溶液を卵黄液とした。
得られた卵黄液１ｋｇに対し１ｋｇの水を加え均質化し、そこに０．１５％のλ−カラギーナン水溶液を４ｋｇ加え撹拌後３０分間静置した。静置後、濾過助剤を用いた吸引濾過を行い約５Ｌの濾液を分取した。この時の濾液のｐＨは６．５であった。このとき得られた濾液を卵黄水溶性蛋白質溶液とした。
【００１６】
実施例６
不溶性の抗E.tarda γ−リベチン複合体の調製
実施例６で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液を用い、実施例２同様の塩析法で抗E.tarda γ−リベチン溶液を得た。得られた溶液を凍結乾燥し、抗E.tarda γ−リベチン粉末を得た。
得られた粉末は、ゲル濾過法により全蛋白質に対するγ−リベチンの割合が９０％以上であることを確認した。
得られた不溶性の抗E.tarda γ−リベチン粉末を純水を用い１００ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。調製した溶液を耐熱性の容器に封入し70℃の恒温層にて３０分間加熱し、出来た不溶物を遠心法を用いてγ−リベチン単量体を分離し精製した。沈殿物を凍結乾燥機にて乾燥させ粉末を得た。
【００１７】
試験例３
γ−リベチン複合体の不可逆反応ならびに特異抗体活性回収率の確認
実施例６で得られた粉末を用い試験例１同様のSDS-PAGE法にて確認したところ、本サンプルは共有的な結合をし、もとの単量体には戻ることのない５００ｋＤａ以上の蛋白質であることが示唆された。
更に、実施例６により得られた抗E.tarda γ−リベチン複合体粉末のE.tarda 菌に対する特異的抗体力価を、試験例２同様の酵素免疫測定法（以下ELISA 法という）により測定し、同じく実施例６で得られた抗E.tarda γ−リベチンの抗体と活性回収率の比較を行った。
総抗体活性を測定した結果、抗E.tarda γ−リベチンの抗体粉末と抗E.tarda γ−リベチン複合体粉末を比較すると、特異的γ−リベチン粉末を１００％として特異的γ−リベチン複合体粉末は約９０％抗体活性回収率が得られた。
【００１８】
実施例７
不溶性抗E.tarda γ−リベチン複合体の養殖魚餌への応用
不溶性抗E.tarda γ−リベチン複合体の養鰻場における効果を確認するため、抗E.tarda γ−リベチンと不溶性抗E.tarda γ−リベチン複合体を用い簡易水槽による模擬フィールドテストを行った。
ウナギをパラコロ病に感染させ、抗E.tarda γ−リベチンをウナギの練餌に混合し、水槽に投与した時の細菌の水平感染の防止効果について検討した。結果を図１に示す。
図１の結果より、抗E.tarda γ−リベチンを投与した群では、０．５％量添加配合飼料の場合投与期間中における斃死魚数の減少は見られず、１〜３％量添加配合飼料の場合投与期間中における斃死魚数の減少が見られた。
又、不溶性抗E.tarda γ−リベチン複合体を投与した群では、０．５％量添加配合飼料の場合投与期間中における斃死魚数の減少が見られ、更に３％量添加配合飼料の場合投与期間中における斃死魚数の顕著な減少が見られた。
このことは、γ−リベチンを活性を有したまま不溶性複合体にしたことにより、練餌から池中にγ−リベチンが溶け出すことなく餌として効率良くウナギの体内に運ばれた為と推察される。
この結果、γ−リベチンの不溶性凝集物は養食魚の餌等に利用する際に、多大な効果を発揮することが認められた。
【００１９】
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
（１）不可逆な反応を用いることを特徴とするγ−リベチンを主構成成分とする不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（２）不可逆な反応が加熱処理である前記１記載の不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（３）加熱処理の条件が６０〜８０℃、１０〜１２０分、γ−リベチン溶液濃度が５０〜５００ｍｇ／ｍｌである前記１記載の不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（４）不可逆な反応が超高圧処理である前記１記載の不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【００２０】
（５）不可逆な反応が還元剤を用いることを特徴とする前記１記載の不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（６）γ−リベチン複合体が水、緩衝液、油、溶剤等に不溶の状態である前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
（７）不溶性γ−リベチン複合体を孔径が０．１μｍ以上の膜を使って分離することを特徴とする前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
（８）膜が濾紙、濾板、ガラスフィルターであることを特徴とする前記１記載の不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（９）不溶性γ−リベチン複合体を遠心法を使って分離することを特徴とする前記１記載のγ−リベチン複合体の製造法。
（１０）単独でアフィニティークロマトグラフィへの応用が出来る前記１記載の不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
（１１）効率良く養殖魚餌として与えることの出来る前記１記載の不溶性γ−リベチン複合体の製造法。
【００２１】
【発明の効果】
本発明は、γ−リベチンを不可逆な反応を使って不溶性の複合体にすることにより、従来のγ−リベチンではそのままの形で利用が出来ないもしくは利用効率が悪い等の欠点を補い新たな機能を付加することを可能とした。本発明技術は、γ−リベチンの応用範囲を広げ産業上への貢献も大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】斃死魚率の比較の図である。
【図１】
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