(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Val-Pro-Arg-Gly-Lysを含んで成り、且つ酵素的に切断可能な結合を１つまたは複数有するペプチドに結合された蛍光色素基であって、色素スタッキングによって本質的に自己消光がなされるように十分な距離まで互いに近接した蛍光色素基を２個またはそれ以上含む酵素基質を提供するステップと、
前記ペプチドの前記切断可能な結合１つまたは複数を酵素的に切断し、色素スタッキングから蛍光色素基を放出し、蛍光強度を高めるステップ、
とを含む、Val-Pro-Arg-Gly-Lysを含むペプチドを認識・切断するプロテアーゼの存在を検出するための方法。
【請求項２】
式TMR-Val-Pro-Arg-Gly-Lys-TMRを有する、請求項１記載の方法において使用するためのプロテアーゼ基質。
【請求項３】
前記プロテアーゼを生み出す微生物を検出する方法であって、該方法が請求項１記載の方法によるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酵素加水分解時に蛍光性が極めて高くなるプロテアーゼ基質の調製方法および使用方法に関する。本発明には、微生物の検出と同定、滅菌の保証、薬学的発見、酵素アッセイ、イムノアッセイの他、さまざまな生物学的試験での用途がある。
発明の背景
プロテアーゼはペプチド結合を触媒的に加水分解する類の酵素である。プロテアーゼの一次化学配列と独特な三次元構造とを決めるのは、その活性および特異性である。活性サイトの組成に応じて、プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼをはじめとする主な群に分類される。生理学的なプロセスにおけるプロテアーゼの役割は広く一般に認識されている。プロテアーゼは、消化、血液凝集および線維素溶解などの機能に関与している（Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｕ．、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．、Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｐ．Ｌ．著、「Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１９８１、８０、３４１〜３６１）だけでなく、排卵、腫瘍形成能、免疫応答、ウィルス感染および細菌感染などにも関与している（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｒ．、Ｃａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｆ．、Ｌｅｙｔｕｓ，Ｓ．Ｐ．、Ｗｅｈｒｌｙ，Ｊ．Ａ．、Ｐｅｌｔｚ，Ｓ．Ｗ．、Ｐｅｌｔｚ，Ｇ．Ａ．、Ｍａｎｇｅｌ，Ｗ．Ｆ．著、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ  ｔｉｔｒａｎｔ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ；  Ｂｉｏｃｈｅｍ」１９８１、２０、４２９８〜４３０６）。例えば、ＨＩＶなどのレトロウィルスは、前駆体タンパク質を特異的な切断部位において処理するように機能するプロテアーゼをコードすることが知られている。これらの切断は、ビリオン組立の間に起こり、感染性ウィルス粒子の成熟に必要とされるものである。したがって、ＡＩＤＳ用のものをはじめとする抗ウイルス剤の設計では、これらのプロテアーゼを阻害することが重要な目的の１つとなっている。
さらに、抗生物質耐性細菌株および食物が原因の病気に対する人々の認識も高まっている。ヘルスケア産業、化粧品業界、食品および飲料業界での微生物によるリスクの管理は、衛生安全上の重大な問題の１つである。細菌試験は、微生物によるリスクを管理する際に不可欠な要素である。特定の病原種の同定と特徴付けのために広く用いられている１つの判定基準として、多くの細菌のプロテアーゼ産生能があげられる。
プロテアーゼの生物学的機能を発見および理解し、生理学的な機能障害を診断し、治療薬を開発するには、感受性酵素アッセイと定量酵素アッセイが必要である。プロテアーゼの活性の測定にはさまざまな手法が用いられており、その一例として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、タンパク質イムノブロット分析、薄層電気泳動分析があげられる。しかしながら、これらの方法は複数のステップと複数の試薬を要するのが普通であった。また、操作に時間がかかる上に高価である。さらに、プロテアーゼ阻害剤などの医薬品を高いスループットでスクリーニングするといった用途では非実用的なこともある。
蛍光発生基質は、酵素加水分解時に非蛍光から高蛍光性に変わる分子であり、ウィルスプロテアーゼや細菌プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、サッカリダーゼ、ホスファターゼおよびキナーゼの研究および試験用の分子プローブとして広く用いられている（Ｍａｎａｆｉ，Ｍ．、Ｋｎｅｉｆｅｌ，Ｗ．、Ｂａｓｃｏｍｂ，Ｓ．著、「Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」、１９９１、５５、３３５〜３４８）。その蛍光は、９６穴プレートリーダーまたはフローサイトメータにおいて、蛍光顕微鏡によってＵＶ照射下で容易に観察することができる。
市販されている蛍光発生プロテアーゼ基質にはいくつかある。一例として、ＥｎｚＣｈｅｃｋTMキット（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）があげられる。これは、これは４，４−ジフルオロ−４−ボーラータ−３ａ−アゾニア−４ａ−アザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）発蛍光団を有する高度に消光されたカゼイン基質を使用したものである。切断すると、蛍光ＢＯＤＩＰＹペプチドが放出される。一般に、５００ｎｇ／ｍＬまでのトリプシン濃度について５３０ｎｍでの蛍光強度が２倍になる。ＨＩＶプロテアーゼ切断部位と、一方の側に発蛍光団５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、他方の側に受容体発色団４−（５−ジメチルアミノフェニル）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＣＹＬ）とを含む、ＨＩＶプロテアーゼに対する蛍光発生基質を入手可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）。欧州特許出願第４２８，０００号に記載されているように、ＥＤＡＮＳの蛍光は、分子内共鳴エネルギー移動（供与体と受容体との間にペプチド鎖に沿って１００オングストローム以内の距離があることを必要とするプロセス）が起こることで、ＤＡＢＣＹＬ発色団によって消光される。発蛍光団は３４０ｎｍの輻射によって励起され、４９０ｎｍで蛍光を発するが、これは細菌培地の吸光または蛍光によって不鮮明なものになる場合がある。
米国特許第４，３１４，９３６号には、ペプチドの一部において蛍光性基が結合し、別の部分において蛍光消光基が結合した非干渉ペプチド（ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）鎖を含む酵素アッセイ基質が記載されている。上記二者間のどの箇所で鎖を切断しても発蛍光団を遊離させて検出および定量化することができる。特定の酵素ごとに特定のアミノ酸配列を調製する。発蛍光団としては、エオシンタイプ、ローダミンタイプ、フルオレセインタイプの色素ならびにＥＤＡＮＳタイプの部分があげられる。消光種（色素や発蛍光団ではない）としては、ニトロフェニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、ニトロベンゾイルなどのニトロソ化芳香族化合物があげられる。
国際特許出願公開第ＷＯ９５／０３４２９号には、蛍光発生トレーサが蛍光エネルギー移動供与体と蛍光エネルギー受容体の両方によって標識された短鎖の抗原模倣ペプチドを含むイムノアッセイ法について記載されている。溶液中で遊離状態にある間は、このトレーサの蛍光は分子内色素二量体（消光）のために非常に低く、未変性抗原の抗体に結合すると、トレーサペプチドの立体配座が変化することで生じる分子二量体の解離のために蛍光が大幅に増大する。分子内二量体を形成する代表的な蛍光エネルギー色素には、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、テキサスレッドなどのフルオレセイン族がある。このため、本願では、切断時の蛍光ではなく結合時の蛍光の増強について説明し、蛍光の消光がエネルギ移動と色素の二量体化との組み合わせに依存していることについて述べる。
米国特許第４，８２２，７４６号および同第５，２５４，４７７号には、発蛍光団と発色性光吸収化合物または別の（光吸収）発蛍光団との相互作用に基づく被検体の定量分析および定性分析について記載されている。励起状態の場合、消光は色素の二量体化ではなく発蛍光団による非放射性エネルギ移動または放射性エネルギ移動の両方によって起こる。この手段によって、’７４６特許に記載の方法では、被検体の存在下で１０〜２０％しか蛍光を高めることができない。
米国特許第５，６０５，８０９号には、プロテアーゼ検出に有用なペプチドが記載されている。このペプチドは、分子内エネルギ移動によって発蛍光団が消光するように各末端で抱合され、かつ折り畳まれた発蛍光団を有している。標的プロテアーゼによって切断されると、発蛍光団同士が極めて近接した状態がなくなり、結果として得られるシグナルが検出および定量化される。’８０９特許の図２Ａおよび２Ｂには、基質切断時に最大で９倍の蛍光増加が認められることが示されている。また、大きさがアミノ酸で２〜約８個、好ましくは２〜約６個の長さの範囲にある多数のペプチドが記載されている。蛍光指標は可視領域（４００〜７００ｎｍ）で光を吸収および放出する。
蛍光色素の消光は一般に、エネルギ移動や色素の二量体化を含む諸々のメカニズムによって引き起こされる。いずれの場合も、鎖Ｘによって結合された蛍光色素供与体と受容体（受容体は蛍光色素であってもそうでなくてもよい）とをエネルギの投入（一般に特定波長の光の照射）によって励起させると、エネルギは、蛍光によって硝酸されるのではなく供与体色素から受容体色素へと移動する。Ｆｏｒｓｔｅｒの双極子双極子相互作用とも呼ばれるエネルギ移動は通常、供与体と受容体との間の距離が上記よりも長い（約１００オングストローム）ときに起こる。例えば、Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著、Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｒｕｌｅｒ；  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６７、５８、７１９〜７２６を参照のこと。これに対して、色素二量体化または色素スタッキングは、２個またはそれ以上の蛍光分子の間に、これらの分子の平面芳香族環が相互作用して二量体および三量体のような凝集体を形成できるだけの短い距離しかない場合に起こる。二量体またはスタッキング状態の色素の吸収スペクトルは、エネルギ移動対における同一色素の吸収スペクトルとは実質的に異なっている。色素二量体の吸収スペクトルでは、色素濃度の上昇に伴って主な吸収ピークに特徴的な減少が認められ、一方ショルダーピークは特徴的な増加を示す。この現象は一般に「バンド分割」と呼ばれている。例えば、Ｋ．Ｋ．ＲｏｈａｔｇｉおよびＧ．Ｓ．Ｓｉｎｇｈａｌ著、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、１９６６、７０、１６９５〜１７０１を参照のこと。また、図２（下記）も参照のこと。濃度は、単位体積あたりの色素量を増やすか、ペプチドや他の小分子などのリンカー分子上に２個（以上）の色素分子を物理的に近接した状態で配置するかのいずれかの方法によって高めることができる。二量体化またはスタッキングは基底状態の複合体が形成される（すなわち、物理的に密に接触する）ことによって起こるが、エネルギ移動の相互作用は空間を通して起こる。このため、エネルギ移動のメカニズムによって相互作用する色素では、これらのスペクトルの変化を見ることはできない。
発明の開示
簡単に説明すると、本発明によれば、
酵素的に切断可能な結合を１つまたは複数有するペプチドに結合された蛍光色素基であって、色素スタッキング（好ましくは色素二量体化）によって本質的に自己消光がなされるように十分な距離まで互いに近接した蛍光色素基を２個またはそれ以上含む酵素基質を提供するステップと、
１つまたは複数の酵素的に切断可能な結合を酵素的に切断し、色素二量体化または色素スタッキングから蛍光色素基を放出し、蛍光強度を高めるステップと、
を含む生物学的アッセイ方法が得られる。
好ましい実施態様において、本発明によれば、自己の蛍光が分子内二量体形成によって本質的に消光されるように十分な距離まで互いに近接した２個の蛍光色素基を含むペプチドを含有するプロテアーゼ基質が得られる。
プロテアーゼ基質のペプチドに３つ以上の蛍光基を結合することができ、分子内消光に関与させ得ることは理解できよう。
特性酵素を産生する微生物の検出方法であって、ａ）該特性酵素によって切断可能な結合を１つまたは複数有するペプチドに結合された蛍光色素基であって、色素スタッキングによって本質的に自己消光がなされるように十分な距離まで互いに近接した蛍光色素基を２個またはそれ以上含む、前記特性酵素に特異な酵素基質を提供するステップと、ｂ）ペプチドの前記切断可能な結合を前記特性酵素によって切断し、色素二量体化から蛍光色素基を放出し、蛍光強度を高めるステップと、を含む方法が得られる。
好ましくは、上記の基質が蛍光色素分子（テトラメチルローダミンなど）２個を有する短鎖ペプチドを含む。このペプチドによって酵素に対する親和性と特異性とが得られる。色素分子同士が極めて近接しているため、加水分解の前に色素分子によって分子内二量体が形成され、有意な蛍光消失が生じる。特定のペプチド結合を酵素加水分解することで、色素基が互いに解離状態になるため蛍光強度が有意に増加する。その蛍光は、９６穴プレートリーダーまたはフローサイトメータにおいて、蛍光顕微鏡によってＵＶ照射下で容易に観察することができる。蛍光が可視スペクトル域で放出されると好ましい。他の発色試薬を必要としないため蛍光発生基質は一様なものであるが、これは重要なことである。蛍光発生基質が一様であることで、初代単離培地を使用して微生物の検出および同定を行い、同定前の時間のかかる単離工程の必要性をなくすことができるためである。
本願明細書において、
「色素二量体化」とは、２個の色素基間での複合体の形成を意味する。
「色素スタッキング」とは、２個またはそれ以上の色素基間での複合体の形成を意味する。
「蛍光」とは、異なる波長の光を吸収する際の特定の波長での物質による光の放出を意味する。ここで、光の放出は光の吸収時にのみ起こる。
「モル吸光率」とは、光路長１ｃｍあたりの１モル濃度の吸光度として計算される、光吸収種の相対的な光吸収を意味する。
「蛍光量子収量」とは、物質によって吸収された光子の総数に対する、放出物質によって放出された蛍光光子の数の割合を意味する。
「発蛍光団」とは、異なる（通常は短い）波長の光の吸収によって刺激された場合、特定の波長で光を放出する分子を意味する。
本発明には、従来の微生物検出方法および同定方法よりも有利な点がいくつかある。本発明によれば、時間を要せず便利な方法が得られる。本発明では、細胞外酵素および細胞内酵素の活性を測定するのに発色基質と蛍光発生基質とを利用している。本発明の方法および基質により、微生物の検出および同定における精度が改善され、検出が高速化し、総コストが削減されることになる。好ましい実施態様において、本発明によれば、切断時に高シグナルレベルを示し、インタクト状態ではノイズレベルが非常に低く、可視領域で排他的に動作する蛍光発生指標が得られる。さらに、本発明を用いると、ペプチドとこれに結合する発蛍光団とを上手に設計して選択することでいくつかの細菌の同時試験が可能になる。
【図面の簡単な説明】
図１は、色素二量体化に基づく蛍光発生基質の概念図である。
図２は、トリプシン（約１０-7Ｍ）による酵素加水分解前（記録Ａ）および後（記録Ｂ）のＴ−ＶＰＲＧＫ−Ｔ（約１０-5Ｍ）の吸収スペクトルを示している。
図３は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの可溶化液への曝露前（記録Ｄ）および曝露後（記録Ｃ）の蛍光スペクトルを示している。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明によれば、色素スタッキング（好ましくは色素二量体化）によって本質的に自己消光がなされるように十分な距離まで互いに近接した蛍光色素基を２個またはそれ以上含み、酵素的に切断可能な結合を１つまたは複数有するプロテアーゼ基質を使用し、
得られる生成物が各々蛍光強度を高める蛍光色素基を含むように１つまたは複数の酵素的に切断可能な結合を酵素的に切断する、生物学的アッセイ方法とプロテアーゼ基質とが得られる。
色素基は、切断前に１００オングストローム未満の距離で互いに離れていると好ましい発蛍光団である。
好ましくは、本方法では自己消光蛍光色素基を２個含む基質を利用する。より好ましくは、本方法では同一の自己消光蛍光色素基を２個含む基質を利用する。
他の態様において、本発明によれば、ペプチドに共有結合し、自己の蛍光が色素スタッキングによって本質的に自己消光されるように十分な距離まで互いに近接した、少なくとも２個の蛍光色素基を含む蛍光発生酵素基質が得られる。好ましくは、少なくとも２個蛍光色素基は同一のものである。より好ましくは、蛍光発生酵素基質は２個の同一の蛍光色素基を含む。
蛍光は、今日利用できる最も感度の高い検出技術の１つである。１０-21モル濃度量の酵素分子が蛍光ミクロアッセイを用いて研究されている。酵素の単分子が蛍光顕微鏡によって油分散液滴中に検出されている。酵素の個々の分子は毛細管において電気泳動操作され、蛍光分光法によってモニタリングされる。Ｘｕｅ、Ｑ．、Ｙｅｕｎｇ、Ｅ．Ｓ．著、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ；  Ｎａｔｕｒｅ  １９９５、３７３、６８１〜６８３を参照のこと。マーカー酵素としてβ−ガラクトシダーゼを用いた大腸菌型細菌検出用のアッセイが開発されている。蛍光定量法は、比色分析法と比較して感度が２５０倍高く、検出時間も５時間短いことが分かった。Ｖａｎ  Ｐｏｕｃｋｅ，Ｓ．Ｏ．、Ｎｅｉｌｓ，Ｈ．Ｊ．著、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｏｌｉｆｏｒｍ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９５、６１、４５０５〜４５０９を参照のこと。
本発明の蛍光発生基質を調製するために、ペプチド結合を介して互いに結合した２〜１０個のアミノ酸を含む選択した比較的小さなペプチドを以下に開示するようにして得て、次いでこれを蛍光色素のペアで標識する。この蛍光色素は、ペプチドに適宜結合して「複合体」を形成した場合に、両方の発蛍光団が消光されるような二量体化または「スタッキング」の特徴を持つ。この色素のペアは、必ずしも蛍光エネルギ移動供与体および受容体である必要はない。互いに十分に近い距離で近接して小さなペプチドに結合されるとこのようなスタッキング特性を呈するタイプの色素としては、略平面芳香族構造を有し、十分に高い濃度（例えば１０-2〜１０-4Ｍ）で溶液中におかれた時にホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する能力のある色素があげられる。
特に、本発明において有用な蛍光発生プロテアーゼ基質は、長さの短い（好ましくは１００オングストローム未満）ペプチドと蛍光色素の２個の分子との化学反応によって生成可能である。プロテアーゼ基質は市販されている（例えば、カリフォルニア州サンフランシスコのＧｅｎｅＭｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。蛍光色素のプロテアーゼ基質への共有結合については、従来技術において周知である。
蛍光発生プロテアーゼ基質の生成に有用な代表的なペプチドの一例としては、約２〜１０個のアミノ酸、好ましくは４〜８個のアミノ酸を有し、色素基が二量体化可能であり、ペプチドが酵素特異的切断部位を持つようなペプチドがあげられる。しかしながら、基質の切断時、分子内二量体が解離するため蛍光強度が増大する。
より好ましくは、本発明において有用な基質は、少なくとも１個のＡＲＧ−ＧＬＹ配列を有する。最も好ましくは、この基質は、蛍光色素基が各末端残基に共有結合した配列Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓを有する。
本発明において有用な蛍光発生プロテアーゼ基質は、従来技術において周知の方法で生成可能である。例えば、欧州特許出願第ＥＰ  ０  ４２８，０００号を参照のこと。
ペプチドを反応させてプロテアーゼ基質を産生させるのに有用な蛍光色素としては、色素スタッキングがなされる色素があげられる。蛍光色素の中には、互いに近い距離に置かれると水溶液中で二量体を形成するものがある（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、４，４−ジフルオロ−４−ボーラータ−３ａ−アゾニア−４ａ−アザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）などのホウ素複素環色素など）ことは周知である。
フルオレセイン族の平面芳香色素（フルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ローダミンＢ、テキサスレッドなど）は、このタイプの色素の代表である。共鳴している二量体構造の遷移双極子同士が相互作用するため、ペプチドを切断できる酵素が存在しない場合、二量体の蛍光量子収量は非常に低い。二量体が酵素による切断後に解離した場合、水溶液中で蛍光量子収量が大はばに増大するのが観察される。このようにして、一様な酵素アッセイを設計することができる。標識ペプチドを溶液に入れて酵素被検体を添加し、酵素にペプチドを切断させ、二量体化を減少させて付随的に蛍光を増加させるアッセイ法である。
酵素的切断は、蛍光発生基質と特定の酵素または酵素接触培地とを接触させることによって達成される。
本発明での使用に適した酵素としては、通常「プロテアーゼ」として分類されるすなわち、ペプチド結合を触媒的に加水分解するタンパク質（例えば、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、レトロウィルスプロテアーゼ、トリプシンプロテアーゼなど）である、あらゆる酵素があげられる。好ましい酵素としては、トロンビン、トリプシン様酵素などのトリプシン族のメンバがあげられる。
蛍光発生基質には多くの異なるタイプが存在するとはいえ、これらの基質が機能する際のメカニズムは、主に、化学的、物理的、生理化学的の３つのカテゴリに分類できる。
本発明の生物学的アッセイ法は一様である。この方法では、ＥＬＩＳＡやバイオルミネセンスなどのアッセイ形式にあるような別々のステップを必要としない。これは、エンドユーザおよびベンダーなどにとって、試薬の使用、労働、時間および機器の面で一層効率的であると解釈できる。一般に、本発明の方法に使用される発蛍光団は、紫外線領域の光を吸収する。有用であるにも関わらず、紫外域で光を多く吸収する分子を含む生物学的試料ではＵＶ検出感度が落ちる可能性がある。さらに、未切断指標の中には、実質的にバックグラウンド蛍光を持つものがある。切断時に高シグナルレベルを示し、インタクト状態ではノイズレベルが非常に低く、可視領域で排他的に動作する蛍光発生指標が得られるのが望ましい。本発明は、これらの利点を提供する方法について教示するとともに、ペプチドとこれに結合する発蛍光団とを上手に設計して選択することで、いくつかの細菌を同時に試験できる可能性があることも示している。
フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、ローダミンＢなどのローダミン族の色素は、可視波長領域（４００〜７００ｎｍ）での蛍光量子収量が非常に高い（約０．８５）。このため、遠隔探査や微量物質検出用のレーザー色素、インジケータ、生物学的標識として使用されることが多い。これらの色素は、高濃度（約１０-2〜１０-4Ｍ）になるなど互いに接近した状況におかれると蛍光を自己消光するスタッキング状態の二量体を形成することが周知である。この現象は、多くの用途で望ましくないものであることは明らかである。しかしながら、この現象を利点として活用することもできる。短鎖ペプチド（アミノ酸残基２〜１０個）の各末端残基で２個の色素分子が結合する（すなわち標識される）と、標識された複合体では自己消光が起こるため蛍光はほとんど認められない。これは局所的な濃度が効果的に増加した状態であるため、複合体は全体の濃度に関係なく消光状態を保つ。酵素によって切断されると、２個の標識は分離し、高い内在蛍光を生み出す。したがって、酵素活性と蛍光強度の総増加量との間には直接的な関連性がある可能性がある。酵素を原核細胞または真核細胞から選択すると、蛍光強度は細胞の代謝活性との間で関連性を持つ場合がある。１個の酵素分子が数百万以上の基質分子に変化する能力が増幅プロセスである。この増幅は、酵素が生細胞培養由来である場合さらに促進される。なぜなら、細胞増殖に伴ってより多くの酵素分子が産生されるからである。蛍光技術と組み合わせることで、この「二重増幅」は細菌を迅速かつ高感度で特異的に検出するための将来性のある方法になる。この概念を図１に示す。１０はバクテリア（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたはＶｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を示し、これらは酵素１２（例えば、トリプシンまたはトリプシン様酵素）を産生する。１２は、２個の消光された蛍光色素基ＮおよびＣを含むペプチド基質１８（非蛍光）を触媒的に切断し、高蛍光色素基Ｎ’およびＣ’を含む２個の生成物フラグメント１４’および１６’を産生する。
上述したように、蛍光発生プロテアーゼ基質を生成するのに有用な代表的なペプチドとしては、色素基がスタッキング可能であり、かつペプチドが酵素特異的切断部位を有するような約２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドがあげられる。多数のプロテアーゼが存在するため、本発明において有用となり得るペプチドも同じように多数存在する。具体的な条件として、標的ペプチドはプロテアーゼによって攻撃される化学結合を有するものでなければならないという点があげられる。例えば、後述するように、トリプシンはアルギニンまたはリジン残基のカルボキシル側でペプチドを加水分解することが周知であるため、このような特徴を有するペプチドであればどのようなものであってもトリプシン基質となり得る。
Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓは海産食物関連中毒を引き起こし、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの同定用のマーカーとして一般に用いられているトリプシン様酵素を細胞内生産する病原体である。この病原体はアミノ酸アルギニンより後ろのペプチド結合を特異的に加水分解する。この酵素は、外膜（ＯＭ）の透過性を増す因子を使用することで蛍光発生基質との接触に利用可能である。グラム陰性腸内細菌の外膜バリアに作用させることで、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が上記の目的に一般に用いられている。これは、リポ多糖（ＬＰＳ）において安定した２価の陽イオンをキレート化によって結合部位から取り除く。結果として、細胞由来のＬＰＳの有意なバランスが崩れる。ＬＰＳが失われることで、ＯＭの外側のリーフレットでリン脂質が生じ、このリン脂質が疎水性化合物拡散用のチャネルとして作用することになる。特定の条件下で、ＯＭは破壊され、巨大分子に対して透過性を示す。Ｖａａｒａ，Ｍ.著、「Ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ」、１９９２、５６、３９５〜４１１を参照のこと。
トリプシンは、その隣接した残基とは独立して、正に荷電したＡｒｇ残基より後ろのペプチド結合をすべて切断する強力な酵素である。しかしながら、同族の他の酵素（例えばトロンビン）は、周囲の残基に左右され、周囲の残基に特異性を付与する性質を有する。
図１では、この概念を説明するためのモデルとしてトリプシンおよびトリプシン様酵素を使用している。トリプシンは小腸由来の特異性の高い蛋白質分解酵素であり、周知の酵素のうち最も強力な酵素である。これは、アルギニンまたはリジン残基のカルボキシ側でペプチド結合を加水分解する。トリプシンの持つこの特性は十分に特徴づけられている。この発明的な概念を評価するために、以下の配列を設計した。
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式中、遊離のアミンはバリン側（Ｎ末端）であり、遊離のカルボン酸はリジン側（Ｃ末端）である。
２つの残基（太字）間のアミド結合は、トリプシン切断部位である。隣接した残基の役割は、色素が結合した場合に立体障害を減らすことである。ＶａｌおよびＬｙｓ側のアミノ基は、色素基と反応させるために使用される。Ｃ末端のカルボキシル基は適当なときに固体支持体に結合させるのに使用できる。
本発明は、作用機構および感度の両方の点で、プロテアーゼ基質を用いる業務利用可能な他の方法とは区別される。市販されている従来のアッセイキットではプロテアーゼ基質を用いても蛍光が２倍増でしかないのに対して、本発明では少なくとも１０、２０、３０倍あるいはさらに高い蛍光増加が達成されることが見いだされている。
迅速かつ高感度の試験を行うために、信号対雑音比を最大にすることが重要である。最も伝統的な蛍光発生基質は、大半の細菌増殖培地が有意な自動蛍光を持つ波長域である遠紫外線領域（３５０〜４５０ｎｍ）において発光する。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの培地では、３６０ｎｍで励起した場合に４２５ｎｍと４７５ｎｍで２つの有意な放射極大が認められる。この問題を回避するために、通常は高い基質濃度が用いられる。これによって、アッセイコストがかさみ、生物体に対するより毒性が増し、場合によっては基質の沈殿が生じることもある。本発明では、検出波長を可視スペクトル（テトラメチルローダミン：λab＝５５０ｎｍ、λem＝５８０ｎｍ）に赤色シフトすることによって、自動蛍光干渉という困難な問題を解決する。さらに、本発明に記載の概念は、発光波長をさらに長い波長に赤色シフトさせる他の色素にも応用できる。一般に、有用な色素は以下の特徴すなわち、高い吸光係数（＞８０，０００ｃｍ-1Ｍ-1）、高量子収量（水溶液中で＞０．８５）、溶剤およびｐＨに影響されないスペクトル、良好な水溶性、光耐性、高い二量体化定数を有することができる。
本発明には、微生物の検出および同定、滅菌の保証、薬学的発見、酵素アッセイ、イムノアッセイにおける用途があるが、これに限定されるものではない。また、、ＨＩＶプロテアーゼ活性を得るための蛍光発生基質は、ＡＩＤＳ治療において有用となる場合がある抗ウイルス因子についての試験として有用なものとなる可能性がある。
本発明の目的および利点を以下の実施例においてさらに説明するが、これらの実施例で引用する特定の材料およびその量ならびに他の条件および詳細については、本発明を不当に限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
以下の実施例中、
ＶａｌまたはＶ＝バリン、
ＰｒｏまたはＰ＝プロリン、
ＡｒｇまたはＲ＝アルギニン、
ＧｌｙまたはＧ＝グリシン、
ＬｙｓまたはＫ＝リジン、
ＴＭＲ＝テトラメチルローダミンまたはテトラメチルローダミン部分である。
実施例１  蛍光発生プロテアーゼ基質の調製
ＧｅｎｅＭｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州南サンフランシスコ）によってＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓを合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。その化学的アイデンティティを高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析およびアミノ酸分析によって確認した。ペプチドを０.１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８.３）中でテトラメチルローダミンスクシミジルエステル（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）と一晩反応させた。反応混合物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム、粒度１５μｍ、マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）で精製した。化学的反応性色素はいずれも、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。色素ペプチド複合体は、以下の式Ｉに示すような化学構造ＴＭＲ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＴＭＲ（図２ではＴ−ＶＰＲＧＫ−Ｔで示す）を有していた。水中のアセトニトリル（ＡＣＮ）の混合勾配を本複合体の精製に用いた。一般的な溶出で、アセトニトリル含有量を最初の１５分で１５％から３０％まで増し、その後３０％ＡＣＮで１０分間無勾配溶出（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ｅｌｕｔｉｏｎ）を溶離を行い、５分間で５０％まで勾配をかけ、次いで５０％ＡＣＮで５分間無勾配溶出を行った。溶媒にはいずれも０.１％トリフルオロ酢酸を含有させた。ＦＡＢ質量分光法によって測定した精製複合体の分子量（元素組成Ｃ74Ｈ85Ｎ13Ｏ14に基づいて計算された分子量）は１３７９であった。この二重標識複合体を以下に示すが、これは一方を標識した複合体と比べて実質的に低い蛍光を呈した。
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実施例２  精製後の酵素による蛍光発生プロテアーゼ基質の加水分解
室温において５０ｍＭカーボネート緩衝液（ｐＨ８.９）中にて、実施例１の基質を酵素加水分解した。励起波長３６０ｎｍ、５２２ｎｍ、５３０ｎｍ、５５３ｎｍの各々について、トリプシン処理前とトリプシン処理後の溶液の蛍光強度を表１に示す。図２に示すように、蛍光強度の増加だけでなく吸収スペクトルの変化も認められた。インタクト状態では、複合体はショルダー５５０ｎｍで５２０ｎｍにおいて極大吸収なった（記録Ａ）。上述したように、これは色素二量体化またはスタッキングの特徴である。切断によって２つのピークの相対吸光度が逆転すなわち、水溶液中における遊離のテトラメチルローダミンのスペクトルが逆転した（記録Ｂ）。蛍光および吸光度の両方の結果から、基底状態の相互作用が複合体中の色素分子間に存在し、酵素切断後に減少するという説得力のある証拠が得られた。
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表１のデータから、励起周波数の広い範囲にわたるスペクトルについて、切断された基質溶液の蛍光強度はインタクトな基質溶液の蛍光強度の２９倍ほどであり、人間の眼で容易に認識可能な範囲である５７０〜５８５ｎｍの放出波長では、平均２５〜２８倍であることが分かる。
実施例３  蛍光発生プロテアーゼ基質を用いてのＶｉｂｒｉｏ  Ｐａｒａｅａｍｏｌｙｔｉｃｕｓの検出
本実験で使用するＶｉｂｒｉｏ  Ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓは、Ｔｒａｎｓｏｒｔ  Ｓｗａｂ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（メリーランド州Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ）用の品質管理菌株である。この菌株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ寄託番号４９３９８）から購入した。塩化ナトリウム３％を含有する栄養ブロス中で３７℃にて細胞を増殖した。終夜培養液１０ｍｌを遠心分離した。ブロスを破棄し、１０００倍に稀釈した式Ｉの二重標識複合体（実施例１、標識ペプチドの生成手順を参照のこと）５０μｌを含有するアッセイ緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.２））３ｍｌを添加した。完全に切断するために、反応混合物を一晩インキュベートした。細胞存在下および非存在下のキュベットの蛍光強度を測定した（記録ＣおよびＤ）。得られたスペクトルを図３に示す。
トリプシン様酵素による切断によって蛍光が増大した。このアッセイでは、単純な蛍光光度計によって検出可能なだけでなく、トリプシン導入後わずか数秒で人間の眼で認識可能な、明確かつ短時間で行うことのできる方法が得られる。
本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本発明にさまざまな修正および変更を施し得ることは当業者であれば明らかであろう。本発明は、本願明細書に記載の例示的な実施態様に不当に限定されるものではないことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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