(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを部位特異的ニッキング・エンドヌクレアーゼに変換する方法であって、前記方法がＡｌｗＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端領域とＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼのＣ末端領域とを融合させたキメラタンパク質を作製することでＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの二量体形成機能を破壊すること、及び当該キメラタンパク質のニッキング活性を試験することを含む方法。
【請求項２】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３４２０として寄託されたプラスミドにコードされる、部位特異的ニッキング・エンドヌクレアーゼに変換されたＡｌｗＩ制限エンドヌクレアーゼ。
【請求項３】
配列番号３のアミノ酸配列において４９１番目及び４９４番目のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる、部位特異的ニッキング・エンドヌクレアーゼに変換されたＭｌｙＩ制限エンドヌクレアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを部位特異的ニッキング・エンドヌクレアーゼに変換する方法に関する。該遺伝子工学的方法の主題は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼに関係するもので、天然に存在するニッキング・エンドヌクレアーゼであるＮ．ＢｓｔＮＢＩに基づく。一般に、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼは特異的配列に結合し、特異的配列の中ではなく近接するＤＮＡ鎖を両方とも切断する。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの２本鎖切断活性は、天然の突然変異により厳密に制限されており、通常の消化条件下ではＤＮＡの一方の鎖のみにニック（切れ目）が入る。本発明に従って、第２の鎖の切断活性を不活化するか、若しくは標的のＩＩｓ型酵素と既知の又は操作されたニッキング酵素との間で切断ドメインを交換するかのいずれかによって、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼから新しいニッキング・エンドヌクレアーゼを遺伝子工学的に作ることができる。
【０００２】
【従来の技術】
制限エンドヌクレアーゼは、特異的なＤＮＡ配列を認識し、切断する酵素である。通常、メチル化し、それ故、同族の制限エンドヌクレアーゼによる消化から内因性の宿主ＤＮＡを保護する、対応ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが存在する。制限エンドヌクレアーゼは、補因子の必要条件に基づいて３つのグループ：Ｉ型、ＩＩ型（ＩＩｓ型を含む）及びＩＩＩ型に分類することができる。２００を超える異なった特異性を有する３０００を超える制限エンドヌクレアーゼが細菌から単離されている（Roberts and Macelis, Nucleic Acids Res., 26:338-350, 1998）。ＩＩ型及びＩＩｓ型制限酵素は、補因子としてＭｇ＋＋のみを必要とし、双方ともに特異的な位置でＤＮＡを切断するので、遺伝子工学及び分子クローニングで有用である。
【０００３】
ほとんどの制限エンドヌクレアーゼは、向き合ったＤＮＡ鎖の２つのリン酸ジエステル結合の加水分解を介して、ＤＮＡ基質の２本鎖切断に触媒作用を及ぼす（Heitman, Genetic Engineering 15:57-107, 1993）。例えば、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶのようなＩＩ型酵素は、パリンドローム（回文構造）配列を認識し、認識配列の中で両方の鎖を対称に切断する。ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼは、非対称のＤＮＡ配列を認識し、認識配列の外側で両方の鎖を切断する。
【０００４】
文献上に一方のＤＮＡ鎖のみ切断し、そのためＤＮＡ分子にニック（切れ目）を入れるタンパク質がいくつかある。そのようなタンパク質のほとんどは、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、及びその他のＤＮＡに関連する事象に関与する（Kornberg and Baker, ＤＮＡ複製（DNA Replication）第２版、W.H. Freeman and Company, New York, １９９２年）。例えば、バクテリオファージｆｌのｇｐＩＩタンパク質は、ファージゲノムの複製開始における極めて複雑な配列を認識し、結合する。それはプラス鎖にニックを入れ、ローリングサークル複製を開始する；それはまた、取って代わったプラス鎖の連結にも関与し、１本鎖環状ファージＤＮＡを生じる（Geider et al., J. Biol. Chem., 257:6488-6493, 1982; Higashitani et al., J. Mol. Biol., 237:388-400, 1994）。もう１つの例は、ＭｕｔＨタンパク質であり、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＤＮＡのミスマッチ修復に関与する。ＭｕｔＨは、ダム・メチル化部位（ＧＡＴＣ）に結合し、そこで、ミスマッチに結合する隣接するＭｕｔＳとタンパク質複合体を形成する。ＭｕｔＬタンパク質がこの相互作用を促進し、メチル化されていないＧＡＴＣ部位の５’末端におけるＭｕｔＨによる１本鎖切断を誘発する。次いで、ミスマッチしたヌクレオチドを取り除くために、エンドヌクレアーゼにより、ニックが翻訳される（Modrich, J. Biol. Chem., 264:6597-6600, 1989）。
【０００５】
ニッキング酵素は、通常、長く、複雑な配列を認識し、及び／又はほかのタンパク質と会合して、製造や使用が難しいタンパク質複合体を形成するという事実のゆえに、実験室でＤＮＡを操作するにはさほど有用ではない。このようなニッキング・タンパク質で市販されているものはない。ニッキング酵素、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは、好熱性細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから見い出された（Morgan et al., Biol. Chem., 381:1123-1125,2000;米国特許第６，１９１，２６７号）。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは、Ｎ．ＢｓｔＳＥＩのアイソシゾマーである（Abdurashitov et al., Mol. Biol(Mosk) 30:1261-1267, 1996）。ｇｐＩＩ及びＭｕｔＨとは異なって、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは制限エンドヌクレアーゼのように挙動する。それは、単純な非対称配列、５’−ＧＡＧＴＣ−３’を認識し、ほかのタンパク質と相互作用することなく、認識部位の３’末端から４塩基離れた一方のＤＮＡ鎖のみを切断する。
【０００６】
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは制限エンドヌクレアーゼ様に作用するので、ＤＮＡ工学では有用なはずである。例えば、特異的な位置にニックを含有するＤＮＡ基質を生じさせるのに用いることができる。ギャップ、長い突き出し、又はその他の構造を持つＤＮＡを作るためにもＮ．ＢｓｔＮＢＩを用いることができる。ニック又はギャップを含有するＤＮＡ鋳型は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復及びその他のＤＮＡに関連する主題を研究する研究者にとって有用な基質である（Kornberg and Baker, ＤＮＡ複製（DNA Replication）第２版、W.H. Freeman and Company, New York, １９９２年）。ニッキング・エンドヌクレアーゼの可能性ある適用の１つは、等温ＤＮＡ増幅法である鎖置換増幅（ＳＤＡ）における使用である。ＳＤＡは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に対する代替法を提供する。それは熱サイクルなしで、３０分で１０６倍の増幅をに達成することができる。ＳＤＡは制限酵素を用いて、ＤＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼにニックを入れ、ニックの３’−ＯＨ末端を伸長して、下流のＤＮＡ鎖を置換する（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992）。ＳＤＡアッセイは、単純（温度サイクルはなく、６０℃でインキュベートするのみ）で且つ極めて迅速な（１５分ほどと短い）検出法を提供し、ウイルスＤＮＡ又は細菌ＤＮＡを検出するのに用いることができる。ＳＤＡは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及びＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのような感染病因を検出する診断法としても導入されつつある（Walker and Linn, Clin. Chem., 42:1604-1608, 1996; Spears et al., Anal. Biochem., 247:130-137, 1997）。
【０００７】
ＳＤＡが機能するために、制限酵素によってＤＮＡ鋳型にニックが導入されなければならない。制限エンドヌクレアーゼのほとんどは２本鎖切断を行う。従って、以前の技術では、置換されたα−チオデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰαＳ）がＤＮＡに導入されていた。多数の制限エンドヌクレアーゼは、α−チオ置換によってリン酸ジエステル結合を切断しなくなる。従って、エンドヌクレアーゼは、プライマー領域の中に設計される置換されていない結合のみを切断する。α−チオデオキシヌクレオチドは通常のｄＮＴＰ（ファルマシア社製）よりも８倍高価であり、通常のデオキシヌクレオチドに比べてＢｓｔＤＮＡポリメラーゼによってうまく取り込まれない（J. Aliotta, L. Higgins and H. Kongの未発表データ）。別の方法としては、もし、ニッキング・エンドヌクレアーゼがＳＤＡで使われたとしたら、ＤＮＡ鋳型の中に自然にニックを導入しただろう。従って、ニッキング・エンドヌクレアーゼが使われる場合、ＳＤＡ反応にｄＮＴＰαＳはもはや必要でなくなるといえる。この考えがを試され、そしてその結果は本発明者らの推測に一致した。ニッキング・エンドヌクレアーゼであるＮ．ＢｓｔＮＢＩ、ｄＮＴＰｓ及びＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの存在下で目的のＤＮＡを増幅することができる（米国特許第６，１９１，２６７号）。
【０００８】
ＳＤＡ及びその他のＤＮＡ工学への適用に有用であるため、さらなるニッキング・エンドヌクレアーゼに対する需要が高まっている。本発明者らは、ニッキング・エンドヌクレアーゼであるＮ．ＢｓｔＮＢＩをクローニングし、特徴付けしてみたが、本発明者らの結果は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩが低下した２本鎖切断活性を持つ自然に突然変異したＩＩｓ型エンドヌクレアーゼであることを示している（米国特許第６，１９１，２６７号）。この種のエンドヌクレアーゼの自然発生は、全く限られており、いかなる事象においても、それらを明瞭に検出する方法はない。今までにたった２つのニッキング・エンドヌクレアーゼが報告されており、両者は同一の特異性を認識する（米国特許第６，１９１，２６７号）。本明細書で開示される方法は、タンパク質工学のアプローチを用いた新しいニッキング・エンドヌクレアーゼを作製する新規なアプローチを提供する。
【０００９】
新規のエンドヌクレアーゼを遺伝子工学的に作製するために長い間努力が尽くされたが、ほとんど成功しなかった。ＦｏｋＩは二者分担的性質（bipartite nature）である、すなわち、Ｎ−末端のＤＮＡ認識ドメイン及びＣ末端のＤＮＡ切断ドメインを示すＩＩｓ型制限酵素である（Wah et al., Nature 388:97-100, 1997）。規格構造的性質を有するＦｏｋＩが認識ドメインについてその他のＤＮＡ結合タンパク質を置換することによって、新しい特異性を持った数種の酵素の発明を導いた。ＵｂｘホメオドメインのＦｏｋＩ切断ドメインへの融合によって、Ｕｂｘ認識部位の両側で切断する酵素が得られた（Kim and Chandrasegaran, proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887, 1994）。Ｚ−ＤＮＡの近傍を切断することができる（Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-12879, 1997）及びＧａｌ４認識部位（Kim et al., Biol. Chem., 379:489-495, 1998）を切断することができる酵素を創出するためにも同様のアプローチが利用されてきた。しかしながら、かかるキメラ酵素には２つの大きな障害がつきまとっている。第１に、キメラ酵素は認識配列の両側の複数部位で切断する；従って、切断特異性がかなり弱くなる。第２に、キメラ酵素の酵素的切断活性は極めて低い。
【００１０】
ＦｏｋＩの二量体形成界面（dimerization interface）は、そのＰＤ−ＤＴＫの触媒部位から１０アミノ酸残基も離れていないところに位置する平行の螺旋、α４及びα５によって形成される（Wah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569, 1998）。α４螺旋におけるＤ４８３Ａ及びＲ４８７Ａの変化は、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断活性を大きく損なう（Bitinaite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-10575, 1998）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本特許出願では、配列特異性の高く且つ極めて活性の高いニッキング・エンドヌクレアーゼの創出を導くタンパク質工学的アプローチ及び方法を開示する。第１の実施例では、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼＭｌｙＩの二量体形成ドメインを破壊することによってニッキング酵素を遺伝子工学的に作る方法を開示する。第２の実施例では、ドメイン交換アプローチを用いたＩＩｓ型エンドヌクレアーゼＡｌｗＩをニッキング酵素に変換する方法を開示する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼをニッキング・エンドヌクレアーゼに変換するために、いくつかの方法が提供される。その最も単純な形態では、該方法は、好適な２本鎖ヌクレアーゼを同定すること、次いで、突然変異させたヌクレアーゼが認識配列内における又は認識配列に隣接している特異的位置にて一方のＤＮＡ鎖だけを切断するように２本鎖の切断に関与する二量体形成界面を突然変異させることを含む。
【００１３】
好ましい実施態様の１つでは、突然変異は、二量体形成／切断に必要な１又はそれより多くのアミノ酸残基を置換することによって生じる。アプローチを説明する特に好ましい実施態様の１つでは、アミノ酸の改変によってＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩを突然変異させる。
【００１４】
ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩと同様に同じＧＡＧＴＣ配列を認識するが、ＭｌｙＩは認識部位から５塩基目の両方のＤＮＡ鎖を切断し、一方Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは認識部位から４塩基目の上の鎖のみを切断する（図１Ａ及びＢ）。２つのアミノ酸残基（Ｔｙｒ４９１及びＬｙｓ４９４）をアラニンに変え、ニッキング・エンドヌクレアーゼＮ．ＭｌｙＩを生じた。遺伝子工学的に作られたＮ．ＭｌｙＩは依然として同じＧＡＧＴＣ配列を認識するが、ＧＡＧＴＣから５塩基下流の上の鎖のみを切断する（図１Ｃ）。
【００１５】
もう１つの好ましい実施態様では、突然変異は、両方のＤＮＡ鎖ではなく、一方の鎖のみの切断を生じる二量体形成欠損であることが判っているものと、二量体形成界面を含有する領域を交換すること又はそれで置換することを含む。特に好ましい実施態様では、ＡｌｗＩの二量体形成界面をＮ．ＢｓｔＮＢＩのそれに相当するドメインで置き換える。ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼ、ＡｌｗＩは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩにより認識されるＧＡＧＴＣ配列とは異なったＧＧＡＴＣ配列を認識する（図１Ｄ）。ＡｌｗＩの二量体形成ドメインをＮ．ＢｓｔＮＢＩのそれに相当するドメインで置き換えた（図３）。得られたキメラエンドヌクレアーゼは、ＡｌｗＩが認識するのと同じＧＧＡＴＣ配列を認識するが、遺伝子工学的に作られたＮ．ＡｌｗＩは、ニッキング酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩと同様に一方のＤＮＡ鎖を切断する（図１Ｅ）。遺伝子工学的に作られた、Ｎ．ＭｌｙＩ及びＮ．ＡｌｗＩは双方とも、極めて活性の高い、配列特異的で且つ鎖特異的なニッキング酵素である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、特異的認識配列内か又はその近傍の特異的位置において一方の鎖のみでＤＮＡを切断するニッキング・エンドヌクレアーゼを創出する方法に関する。最も単純な形態では、本方法は、好適な２本鎖ヌクレアーゼを同定すること、次いで、一方の鎖のみで切断が生じるように、２本鎖切断に必要とされる二量体形成界面を突然変異させることを含む。突然変異は、二量体形成に必要な１又はそれより多くの残基の改変、若しくは二量体形成欠損が判っている相当する領域による二量体形成界面を含有する領域の置換のいずれを含んでもよい。もう１つの好ましい実施態様では、所望の結果を達成するために両方のタイプの突然変異を用いてもよい。
【００１７】
本方法の実施態様の１つでは、認識部位に対して特定の位置で両方のＤＮＡ鎖を切断する既存のＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを改変して、一方の鎖のみを切断するようにする。
【００１８】
本発明は、好ましくは、ＭｌｙＩやＡｌｗＩのような研究されている例と同様にＩＩｓ型エンドヌクレアーゼで開始し、Ｎ末端配列特異的ＤＮＡ結合部分を、１又はそれより多くのアミノ酸によってＣ末端配列の非特異的切断部分に結合する。
【００１９】
さらに好ましくは、出発エンドヌクレアーゼは、２本鎖切断の経過中に少量のニッキング中間生成物が認められるように２つの連続工程で切断するものである。
【００２０】
本発明の方法は、第２の鎖の切断活性の不活化を可能にする切断部分における位置を同定する種々の手段を提供する。
【００２１】
本発明のこの態様の好ましい実施態様において、有利な手段は、第２の鎖の切断に必要とされる二量体形成機能に決定的な候補残基の同定を可能にするために、関連する酵素、特に、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩのアミノ酸配列によって標的酵素の切断部位のアミノ酸配列の多重配置を創出すること、次いで、第２の鎖の切断活性の抑制を評価することである。
【００２２】
本発明の本態様のもう１つの実施形態において、多重配置（multiple alignment）によって決定的な二量体形成領域が同定できない場合、別の手段としては、標的酵素の切断部分で無作為に突然変異を創出し、次いで、第２の鎖の切断活性の抑制を評価することである。
【００２３】
本発明の方法は、第２の鎖の切断活性の選択的不活化を可能にするために、二量体形成可能なエンドヌクレアーゼの切断部位を置換してもよい二量体形成欠損の切断部位も提供する。好ましい実施態様の１つでは、有利な手段は、配列認識部分と切断部分の境界の同定を可能にするために、関連する酵素のアミノ酸配列によって標的酵素の切断部位のアミノ酸配列の多重配置を創出することである。特に好ましい実施態様では、二量体形成面を含有する切断ドメインのその部分のみが置換の対象となる。
【００２４】
もう１つの実施態様では、本発明は、認識部位ＧＡＧＴＣを持ち、認識部位の３’−側５塩基目を切断する制限酵素ＭｙｌＩに由来するニッキング酵素を提供する。
【００２５】
さらにもう１つの実施態様では、本発明は認識配列ＧＧＡＴＣを持ち、認識配列の３’側５塩基目を切断するＡｌｗＩに由来するニッキング酵素を提供する。
【００２６】
一般に、１又はそれより多くのアミノ酸置換によってＩＩｓ型エンドヌクレアーゼをニッキング酵素に変換するには、以下の工程を用いることができる：
【００２７】
工程１．  目的のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子をクローニングし、配列決定をして、配列配置を行う。
【００２８】
工程２．  目的のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼが、性状分析されたＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはニッキング酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩとの配列類似性を共有していたら、配列配置によって、目的エンドヌクレアーゼの切断部分及び二量体形成部分を明らかにすることができる。もしそうでなければ、以下を参照のこと。
【００２９】
工程３．  いったん、切断／二量体形成の可能性がある部分の位置を決めたら、その部分に保存された荷電したアミノ酸残基を、好ましくはアラニンのような中性アミノ酸で置換する。次いで、一方のＤＮＡ鎖のみを切断する能力について、このような変異体の表現型をスクリーニングする（以下のＭｌｙＩの例を参照のこと）。
【００３０】
別の方法として、単独で又はアミノ酸置換法と共に、ドメイン交換法を用いることができる。ドメイン交換法は以下の工程を含む。
【００３１】
工程１．  目的のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子をクローニングし、配列決定して、配列配置を行う。
【００３２】
工程２．  目的のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼが、性状分析されたＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはニッキング酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩとの配列類似性を共有していたら、配列配置によって、目的エンドヌクレアーゼの切断部分及び二量体形成部分を明らかにすることができる。もしそうでなければ、以下を参照のこと。
【００３３】
工程３．  いったん、切断／二量体形成の可能性がある部分の位置を決めたら、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩのようなニッキング・エンドヌクレアーゼの相当する部分で上記部分を置き換える。遺伝子工学的に作ったニッキング・エンドヌクレアーゼと同様に天然のニッキング・エンドヌクレアーゼも両方共この目的に用いてもよい。一方のＤＮＡ鎖のみを切断する能力について、このような交換変異体の表現型をスクリーニングする（以下のＡｌｗＩの例を参照のこと）。
【００３４】
アミノ酸の置換及びドメインの交換法は、別々に又は互いに関連して用いることができる。
【００３５】
目的のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼが、性状分析されたＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼとの配列類似性を共有していない場合、無作為の突然変異誘発を用いることができる。目的のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼの突然変異誘発を行うには、一般に１又はそれより多くの以下のアプローチを用いることができる。
【００３６】
配置法からの情報がない場合、以下の工程を用いてニッキング酵素を明らかにすることができる。手順は以下の３つの仮定条件に依存する。第１に、突然変異によって二量体形成機能が失われた場合、突然変異したエンドヌクレアーゼはモノマーとしてのみ存在する可能性があり、従って一方のＤＮＡ鎖のみ切断する。野生型よりも低いレベルの保護的メチル化の存在下で、おそらく非存在下であったとしても、かかる変異体は目で見えるはずである。第２に、それでもやはり、ニッキング活性を持つ酵素は宿主細胞のＤＮＡに損傷を与え、それはＤＮＡ損傷反応（ＳＯＳ）システムにより検出され、第３に、かかるニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下では高いレベルのＤＮＡリガーゼによって宿主細胞は、ＳＯＳ反応から逃れることができる。
【００３７】
好ましい実施態様では、２本鎖の切断活性を欠く候補を作製するには、先ず、無作為突然変異誘発を用いることができる。例えば、ＤＮＡ酵素は、ヒドロキシルアミンで処理することができ、Ｃ／ＴトランジションをＤＮＡ鋳型に導入する、又は大腸菌のｍｕｔＳ株若しくはｍｕｔＤ株のような突然変異誘発が進む高い率を有する細胞中でＤＮＡを増やすことができ；又はエチルメタンスルホネートのようなアルキル化剤の存在下で細胞を増殖させることができ、又は紫外線で細胞を処理することができる（Miller, Jeffrey H.Aの細菌遺伝学の短期コース：大腸菌及びそれに関連する細菌に関する実験室マニュアル及びハンドブック、単位４：突然変異誘発の８３〜２１１ページ（１９９２年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより出版））。保護的修飾メチルトランスフェラーゼを欠くか、又は、さらに好ましくは、ＤＮＡを不完全に保護するレベルでそれを発現している宿主株を突然変異したプールで形質転換することにより、ＤＮＡの切断を大きく減らすか又は失くす突然変異を単離することができる。
【００３８】
その後、ＤＮＡニッキング活性を発現する突然変異体に関して生き残りの間でスクリーニングするのに遺伝的スクリーニング法である、「エンドブルー」法を用いることができる。無作為の突然変異誘発及び機能喪失変異体に関する選抜に続いて、３種の機能喪失変異体が生じる可能性がある：１）完全に不活性；２）ＤＮＡ切断を失うがＤＮＡに結合することはできる；３）２本鎖ＤＮＡの切断活性を喪失するが、一方のＤＮＡ鎖を切断することができる（ニッキング活性）の３種である。相当するメチラーゼがない大腸菌細胞（ｄｉｎＤ１：：ＬａｃＺ＋融合を伴ったＥＲ１９９２）におけるエンドヌクレアーゼ遺伝子の限られた発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡを損傷することができ、ＳＯＳ反応を誘発し、その結果、Ｘ−ｇａｌを含有する指示薬プレート上でＳＯＳ誘発の青いコロニーを生じる（米国特許第５，４９８，５３５号）。ニューイングランドバイオラブズ社（米国マサチューセッツ州、バーバリ）では、数種の好熱性制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングするのに「エンドブルー」選抜法が上手く用いられてきた。この例では、保護的メチルトランスフェラーゼの非存在下若しくは低レベルのメチルトランスフェラーゼの存在下で生き残る遺伝子のプールでこの株を、又は、低レベルのメチルトランスフェラーゼの存在下若しくは非存在下の類似の株を形質転換し、依然として青色を誘導することができるクローンをさらなる研究のために保持する。
【００３９】
最終的に、ＤＮＡニッキング活性を発現しているクローンを同定するために、Ｎ．ＡｌｗＩ及びＮ．ＭｌｙＩに関する前の説明で記載したように、２本鎖エンドヌクレアーゼに対する単一部位を含有するプラスミド基質を用いて、ＤＮＡに切れ目（ニック：nick）を入れる能力について、機能喪失選抜で回収し、依然としてＳＯＳ反応を誘発することができる（従って、無意味な変異体でもなく、ＤＮＡ結合の欠損変異体でもない）ＤＮＡプラスミドをスクリーニングする。
【００４０】
２つの標的のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼ、すなわちＭｌｙＩ及びＡｌｗＩに対する方法の適用によって、以下に本発明をより十分に説明する。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ、ＭｌｙＩの二量体形成機能は、切断−二量体形成ドメインにおける鍵となるアミノ酸残基の置換によって不活化された。ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼ、ＡｌｗＩの切断−二量体形成ドメインは、二量体形成界面が不活化されている、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの相当するドメインと置き換えた。
【００４１】
１．  二量体形成ドメインにおける部位特異的突然変異誘発によるＩＩｓ型エンドヌクレアーゼＭｌｙＩのニッキング・エンドヌクレアーゼへの変換
ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩと同様にＧＡＧＴＣ配列を認識するが、ＭｌｙＩは両方のＤＮＡ鎖を切断する一方で、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは上部の鎖しか切断しない（図１Ａ及びＢ）。ＭｌｙＩは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩと十分な配列類似性を共有する（４５．３％の配列類似性及び３２．１％の配列同一性、図２）。時間経過による切断反応は、ＭｌｙＩが、先ずＤＮＡにニックを入れ、次いで、さらに消化して最終的な線状形態にする連続方式でＤＮＡの２本鎖を切断することを示した。ニッキング・エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩの場合、おそらく自然の突然変異によって、その２本目の鎖の切断活性が損なわれており、このためニックの入ったＤＮＡは効率的に線状ＤＮＡに変換されない。このことによって、通常の消化条件下において、ニックの入ったＤＮＡの蓄積が生じる。ゲルろ過実験は、ＤＮＡ及びＭｇ＋＋の存在下においてＭｌｙＩが二量体を形成することを示し、同一条件下ではＮ．ＢｓｔＮＢＩの二量体は認められなかった（C. Besnier and H. Kong、未発表データ）。このことは、第２の鎖の切断活性には、ＦｏｋＩの場合と同様に、おそらく二量体形成が介在していることを示唆している。このモデルに基づいて、突然変異誘発により二量体形成機能を破壊することによって、かかるＩＩｓ型エンドヌクレアーゼをニッキング・エンドヌクレアーゼに変換することができると仮定した。
【００４２】
このようなエンドヌクレアーゼの切断ドメインとモデル酵素ＦｏｋＩ（示さず）の間の配列配置によって、ＦｏｋＩのα４及びα５螺旋に相当するＭｌｙＩの推定二量体形成螺旋が同定された。第１のアプローチでは、ＭｌｙＩにおいて、推定上のα４螺旋の中で又はその近傍で、二量体形成の可能性がある９つの残基を個々にアラニンに変えた（図２中、下線で示す）。変異体は、依然として２本鎖ＤＮＡの切断を行うことができた。従って、この配置法は決定的な残基を同定するには十分ではなかった。次いで、α５螺旋を調べた。推定上のα５螺旋領域における多重配列配置は、ＹＧＧＫのモチーフを示し、それはＭｌｙＩ及びＰｌｅＩ（示さず）には存在するが、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩには存在しない（図２中、太字で強調した）。ＭｌｙＩのＹＧＧＫモチーフにおけるＴｙｒ及びＬｙｓ残基をＡｌａに変えた。
【００４３】
ＰＣＲによる突然変異誘発法を用いて、プラスミドｐＵＣ１９においてＭｌｙＩ−Ｙ４９１Ａ／Ｋ４９４Ａを発現する変異体コンストラクト（Ｎ．ＭｌｙＩと命名、以下を参照のこと）を作った（Morrison and Desrosiers, Biotechniques 14:454-457, 1993）。組換えプラスミドの配列決定を行い、所望の二重変異を確認し、ＰＣＲの誤差をチェックした。変異体ＭｌｙＩを含有する細胞の粗抽出物による予備的活性試験は有望だった。さらに精度の高い試験を行うためにＮ．ＭｌｙＩタンパク質を精製した。精製工程には、アニオン交換体、カチオン交換体、及び２つのアフィニティカラムが含まれていた。最終試料の純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで調べた。Ｎ．ＭｌｙＩは、タンパク質全体の９５％を超えていた。
【００４４】
ラムダＤＮＡによって精製Ｎ．ＭｌｙＩを調べた。２本鎖ＤＮＡの切断は検出されなかった。プラスミドＤＮＡを用いてＮ．ＭｌｙＩのニッキング活性をさらに調べた。ニッキング・エンドヌクレアーゼにより一方の鎖が切断された場合、未消化プラスミドの高次コイル形態は、ニックの入った閉鎖環状形態に変換され、制限酵素により近傍で２本鎖が切断された場合、線状形態に変換される。消化アッセイにプラスミドｐＮＢＩ（ＭｌｙＩ認識部位を１つ含有する）を用いた場合、Ｎ．ＭｌｙＩ及びニッキング酵素であるＮ．ＢｓｔＮＢＩによってｐＮＢＩは、ニックの入った開放環状形態に変換され、野生型ＭｌｙＩによって線状形態に変換された（図４）。同じアッセイにプラスミドｐＮＢ０（ＭｌｙＩ認識部位を含有しない）を用いた場合、ｐＮＢ０は消化の後も高次コイル形態のままであった（図４）この結果は、Ｎ．ＭｌｙＩのニッキング活性が配列特異的であることを示唆していた。ｐＮＢ１を用いてＮ．ＭｌｙＩ活性を滴定した。３７℃にて１時間で１μｇのｐＮＢ１の完全なニッキングを達成するのに必要であるＮ．ＭｌｙＩの量として、１単位を定義した。突然変異型ＭｌｙＩの比活性は、タンパク質のｍｇ当りおよそ４００，０００単位であり、それは野生型ＭｌｙＩの比活性に極めてよく似ていた（３７℃にて１時間で１μｇのｐＮＢ１の完全な消化を達成するのに必要であるＭｌｙＩの量として単位を定義した場合）。
【００４５】
Ｎ．ＭｌｙＩの切断位置を正確に決定するために、遺伝子工学的に作ったＮ．ＭｌｙＩ及び野生型ＭｌｙＩで消化した重合伸長産物とジデオキシ配列ラダーを比較することにより、各ＤＮＡ鎖における切断部位をマッピングした。プラスミドｐＵＣ１９を鋳型として用い、２つのプライマー、上の鎖にはプライマー１２２４及び下の鎖にはプライマー１２３３を用いた（図５）。上の鎖の伸長産物は、ＭｌｙＩ（図５のレーン５）及びＮ．ＭｌｙＩ（図５のレーン６）の双方により５’−ＧＡＧＴＣ−３’配列の３’側における５塩基対で切断された。下の鎖は、ＭｌｙＩ（図５のレーン１）のみで切断され、Ｎ．ＭｌｙＩエンドヌクレアーゼ（図５のレーン２）では切断されなかった。配列決定ゲルの結果は、Ｎ．ＭｌｙＩは上の鎖のみを切断し、切断部位は、認識配列の３’側への５塩基対に位置することを示している。大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を消化産物に加えた場合、ＭｌｙＩ切断断片についてさらなる伸長は検出されなかったということは、ＭｌｙＩ切断は平滑末端の断片を生じることを示している（図５のレーン３及び７）。しかしながら、Ｎ．ＭｌｙＩの場合、ニックトランスレーション反応（図５のレーン８）におけるクレノウ断片によって切断バンドはもっと大きなサイズのバンド（図５における表示枠を超える）に伸長され、それはさらにＮ．ＭｌｙＩで切断したＤＮＡにおけるニックの存在を裏付けている。これらの結果は、遺伝子工学的に作ったＮ．ＭｌｙＩには、活性があり、配列特異的且つ鎖特異的なニッキング・エンドヌクレアーゼであることを示した。
【００４６】
２．  ＡｌｗＩの二量体形成ドメインをＮ．ＢｓｔＮＢＩの機能しない二量体形成ドメインと交換することによるＩＩｓ型エンドヌクレアーゼＡｌｗＩのニッキング・エンドヌクレアーゼへの変換
ＡｌｗＩとＮ．ＢｓｔＮＢＩの推定ポリペプチド配列は、２８．７％の配列同一性及び４１．５％の配列類似性を示す。先の結果は、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼの２本鎖切断活性が二量体形成に依存することを示唆している。ＡｌｗＩをニッキング・エンドヌクレアーゼに変換するために、ＡｌｗＩの二量体形成ドメインをＮ．ＢｓｔＮＢＩの機能しないドメインと交換した。これが、ＡｌｗＩの認識配列を認識するが、ニッキング酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの切断特性を持つキメラ・エンドヌクレアーゼを導くと仮説を立てた。以下に記載する２つの試みの１つによってこのことは首尾良く立証された。
【００４７】
成功の機会を最大にするために、２つの交換点を選択した。ＡｌｗＩの推定上のＤＮＡ認識ドメイン（Ｎ末端半分、残基１〜３２０に位置する）をＮ．ＢｓｔＮＢＩのＣ末端領域（推定上の触媒ドメイン及び二量体形成ドメインの双方を含む、残基３６１〜６０４、図３）に融合することによって、交換コンストラクトの１つを作製した。しかしながら、このキメラタンパク質（図３、交換コンストラクト１）は検出可能な切断活性を示さなかった（データは示さず）。この接合部における交換はタンパク質の折り畳みを損なう可能性があり、結果として完全に不活性な酵素を生じた。従って、別の状況では、このアプローチは目的どおり機能するといえる。
【００４８】
図３のに交換コンストラクト２に示すようなほかのキメラ酵素は、推定上のＤＮＡ結合ドメイン及び触媒中心の双方を含むＡｌｗＩのさらに長いＮ末端部分（残基１〜４３０）を極端なＣ末端でのＮ．ＢｓｔＮＢＩの推定上の二量体形成ドメイン（残基４６７〜６０４）に融合することにより構築した。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの二量体形成ドメインを含有する、このキメラエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡニッキング活性を示し、Ｎ．ＡｌｗＩと命名された。Ｎ．ＡｌｗＩを発現させ、約８０％の均質性に精製した。
【００４９】
先ず、プラスミドＤＮＡを用いてＮ．ＡｌｗＩのニッキング活性を調べた。Ｎ．ＡｌｗＩのニッキング活性が配列依存性であるかどうかを調べるために、２つのプラスミドを構築した：ＡｌｗＩの認識配列を１つ持つｐＡＣ１とそれを持たないｐＡＣ０である。プラスミドｐＡＣ０及びｐＡＣ１はそれぞれ２つ及び３つのＮ．ＢｓｔＮＢＩの認識部位を含有する。予想どおり、高次コイルのｐＡＣ０（図６のレーン１）はＡｌｗＩ（レーン２）又はＮ．ＡｌｗＩ（レーン３）では消化されなかったが、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（レーン４）によってニックが入れられた。プラスミドｐＡＣ１（レーン５）を野生型ＡｌｗＩと共にインキュベートすると、高次コイル形態は線状形態に変換された（レーン６）。それに対して、遺伝子工学的に作られたＮ．ＡｌｗＩと共にｐＡＣ１をインキュベートすると、高次コイル形態はニックの入った開放環状形態（レーン７）に変換され、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩにより生じる緩められた形態（レーン８）と同じ位置に移動した。このような結果は、Ｎ．ＡｌｗＩのニッキング活性が５’−ＧＧＡＴＣ−３’配列の存在に依存していることを立証している。
【００５０】
Ｎ．ＡｌｗＩの切断部位を正確にマッピングするために、Ｎ．ＡｌｗＩの切断産物を修飾配列反応における配列決定ラダーと比較した。図７に示すように、ＡｌｗＩ及びＮ．ＡｌｗＩの双方共、上の鎖を切断した；切断部位は両者の場合で、認識部位５’−ＧＧＡＴＣ−３’の４塩基下流に位置していた。野生型ＡｌｗＩは同様に下の鎖も切断したが、Ｎ．ＡｌｗＩは切断しなかった（図８）。従って、Ｎ．ＡｌｗＩのニッキング部位は上の鎖に位置し、認識配列から４塩基離れている（５’−ＧＧＡＴＣＮＮＮＮ−３’）。
【００５１】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。このような実施例は本発明を理解するのを助けるために提供されるのであって、それを限定するものとして解釈されるのではない。
【００５２】
上記及び以下に引用される参考文献は、参考として本明細書に組み入れられている。
【００５３】
【実施例】
実施例１
ＰＣＲが介在する突然変異誘発によるＩＩｓ型エンドヌクレアーゼＭｌｙＩのニッキング酵素への変換及び遺伝子工学的に操作されたＭｌｙＩの精製
１．  ＭｌｙＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発
ＰｌｅＩ、ＭｌｙＩ、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ及びＦｏｋＩの最後から１８０個のアミノ酸の間での配列比較に基づいて、二量体形成過程に関与する可能性のある残基としてチロシン及びリジンが同定された。それらは短い領域（５個のアミノ酸）に属し、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩでは欠損するが、ＰｌｅＩ、ＭｌｙＩ及びＦｏｋＩでは保存されていると考えられる。この２つの残基が二量体形成で鍵となる残基であるということであれば、二量体形成機能を劇的に低下させるために、チロシン及びリジンを両方共アラニンに変えた。
【００５４】
モリソンとデスロシアズ（Morrisson,H. and Desrosiers,R., Biotechniques 14:454-457, 1993）の方法に従ってＰＣＲの部位特異的突然変異誘発を行った。
【００５５】
第１回目のＰＣＲは、ｐＵＣ１９−ＭｌｙＩＲクローン（ジーンバンク受入番号ＡＦ３５５４６２）で行う２つの別々の反応から構成されていた。
【００５６】
以下のプライマーを用いてエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端と突然変異部位の間の部分を増幅する１つの反応を構築した：
５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＴ−３’（２２８−２２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
５’−ＧＧＡＡＴＡＡＴＣＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴ−３’（７５０８−０２２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
【００５７】
オリゴヌクレオチド・プライマー２２８−２２は、クローニングを円滑にするためのＨｉｎｄＩＩＩ部位、保存されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ＡＴＧ開始コドン及びハイブリッド形成のためのＭｌｙＩＲの５’末端に相補的な１８個のヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチド・プライマー７５０８−０２２は、逆方向の突然変異誘発プライマーであり、Ｙ４９１Ａ及びＫ４９４Ａの突然変異を導入する。
【００５８】
突然変異部位とエンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端の間の部分を増幅する他の反応は、以下のプライマーを用いて行った：
５’−ＡＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＡＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＴ−３’（２２８−２３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
５’−ＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＣＣ−３’（７５０８−０２１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
【００５９】
オリゴヌクレオチド・プライマー２２８−２３は、クローニングを円滑にするためのＸｂａＩ部位、停止コドン及びハイブリッド形成のためのＭｌｙＩＲの３’末端に相補的な２３個のヌクレオチドを含有する。７５０８−０２１は、正方向の突然変異誘発プライマーであり、Ｙ４９１Ａ及びＫ４９４Ａの突然変異を導入する。
【００６０】
ＰＣＲは、以下を混合して行われた：
１０ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液を１０μｌ、
２ｍＭのｄＮＴＰｓを１０μｌ、
ｐＵＣ１９−ＭｌｙＩＲクローンを１（１００ｎｇ）、
プライマー２２８−２２（反応１）又は２２８−２３（反応２）を１μｌ  （１５０ｎｇ）、
プライマー７５０８−０２２（反応１）又は７５０８−０２１（反応２）を１μｌ（１５０ｎｇ）、
蒸留水を７４μｌ、
ディープベント（Deep Vent（登録商標））ポリメラーゼを１μｌ（０．  ０５単位）、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを１μｌ（５単位）；
これらを、９５℃にて３０秒間、５０℃にて１分間及び７２℃にて２分間を１５サイクル行って増幅した。ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて得られたＤＮＡ断片を精製した。
【００６１】
反応１及び反応２からの１回目のＤＮＡ断片を１：１のモル比で鋳型として用い、ＭｌｙＩＲの５’末端と３’末端に相当するプライマーを加えた第２回目のＰＣＲを行った：
１０ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液を１０μｌ、
２ｍＭのｄＮＴＰｓを１０μｌ、
反応１からのＭｌｙＩＲ断片を１μｌ（８８ｎｇ）、
反応２からのＭｌｙＩＲ断片を １μｌ（１２ｎｇ）、
プライマー２２８−２２を１．５μｌ（１５０ｎｇ）、
プライマー２２８−２３を１．５μｌ（１５０ｎｇ）、
蒸留水を７３μｌ、
ディープベント（Deep Vent（登録商標））ポリメラーゼを１μｌ（０．０５単位）、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを１μｌ（５単位）；
これらを、９５℃にて３０秒間、５０℃にて１分間及び７２℃にて２分間を１５サイクル行って増幅した。ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて得られたＤＮＡ断片を精製した。そのような２回のＰＣＲによって、２つの予想した突然変異（Ｙ４９１ＡおよびＫ４９４Ａ）を持つ完全長のエンドヌクレアーゼ遺伝子が提供された。
【００６２】
５０μｌの反応物中にて、１ｘＮＥＢ緩衝液２中の０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを加えたＨｉｎｄＩＩＩの２０単位とＸｂａＩの２０単位との両方で、３７℃にて１時間インキュベートして、２回目の増幅産物（ＭｌｙＩＲのＰＣＲ産物）及び１μｇのｐＵＣ１９を消化した。１％の低融点アガロースゲル（ゲノム・パーフォマンス・グレード、アメリカン・バイオアナリティカル）上にて消化物を分画した。ＰＣＲのＤＮＡバンドとベクターのＤＮＡバンドを切り出し、ゲル片を６５℃にて１０分間インキュベートした。温度を４０℃まで下げ、４０℃にて以下を混合することによって、ゲル内連結反応を行った：
ＭｌｙＩＲのＰＣＲ産物（２５０ｎｇ）を２５μｌ、
調製されたｐＵＣ１９（１００ｎｇ）を５μｌ、
１０ｘのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液を５μｌ、
βアガラーゼ（２単位）を２μｌ、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４００単位）を１μｌ、
蒸留水を１２μｌ。
【００６３】
反応物を３７℃にて１時間、次いで、１６℃にて一晩インキュベートした。予めＮ．ＢｓｔＮＢＩのメチラーゼ遺伝子で修飾した大腸菌株ＥＲ２５０２を５μｌの連結反応物で形質転換した（およそ１０７個の細胞）。クローニング酵素でミニプレップ（キアゲンＱＩＡプレップ・スピンミニプレップキット）を消化することにより、個々のクローンを単離し、分析して、実際にＭｌｙＩＲがベクターにクローニングされていることを確認した：
ミニプレップを３μｌ、
１０ｘＮＥＢ緩衝液２を２μｌ、
ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ、
ＨｉｎｄＩＩＩ（２０単位）を１μｌ、
ＸｂａＩ（２０単位）を１μｌ、
蒸留水を１１μｌ；
消化物を３７℃にて１時間インキュベートした。
【００６４】
２．  Ｎ．ＭｌｙＩ（Ｙ４９１Ａ／Ｋ４９４ＡのＭｌｙＩ）の精製
０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた２４リットルのＬＢ培地中で３７℃にて、予めＮ．ＢｓｔＮＢＩのメチラーゼ遺伝子で修飾された、ｐＵＣ１９−ＭｌｙＩＲ−Ｙ４９１Ａ／Ｋ４９４Ａを含有する大腸菌ＥＲ２５０２を増殖させた。遠心により細胞を回収した。以下の手順は、すべて氷上又は４℃にて行った。１０９ｇの細胞沈殿物を５０ｍＭのＮａＣｌに加えた３２７ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ６．９）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、７ｍＭのβＭＥ、５％のグリセロール）に再浮遊し、マントン−ガウリン（Manton-Gaulin）ホモゲナイザーで破壊した。最初のパスの後、２５ｍｌのシグマ・プロテアーゼ阻害剤溶液を加えた。４℃で１５，０００ｇにて４０分間、抽出物を遠心した。
【００６５】
以下の精製工程は、すべてファルマシアのＡＫＴＡＦＰＬＣシステムを用いて行った。ＭｌｙＩ部位での特異的なニッキング活性を検出するために、活性のアッセイはＴ７ＤＮＡで行ったが、この中では部位は十分に接近した間隔となっており；これらの部位が、ニックの入ったＤＮＡが断片化される基となる。
【００６６】
３９５ｍｌの遠心処理した細胞の粗抽出物を、緩衝液Ａ１（５０ｍＭのＮａＣｌを補完した緩衝液Ａ）で平衡化した３９５ｍｌのヘパリンハイパーＤ  ＡＰ５にロードした。次いで、８００ｍｌの緩衝液Ａ１でカラムを洗浄した。緩衝液Ａ中の０．０５Ｍ〜０．７ＭのＮａＣｌ勾配、３．５リットルで酵素を溶出した（流速：３０ｍｌ／分）。１５ｍｌの分画を集め、ニッキング活性を測定した。分画９６〜１２４（平均塩濃度３３０ｍＭ）が最も高い活性を有しており、プールして、２リットルの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、７ｍＭのβ−ＭＥ、５％のグリセロール）に対して透析した。塩濃度を５０ｍＭにするために１００ｍＭのＮａＣｌを補完した緩衝液Ｂを試料に加えた。
【００６７】
次いで、緩衝液Ｂ１（５０ｍＭのＮａＣｌを補完した緩衝液Ｂ）で平衡化した８０ｍｌ（３．５ｃｍｘ８．３ｃｍ）のソース−１５Ｑファインライン３５に試料（８５０ｍｌ）をかけた。次いで１６０ｍｌの緩衝液Ｂ１でカラムを洗浄した。緩衝液Ｂ中の０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ勾配１．５リットルにより酵素を溶出した（流速：２０ｍｌ/分）。１５ｍｌの分画を回収し、ニッキング活性を測定した。分画１４〜１９（平均塩濃度１４０ｍＭ）が最も高い活性を有し、プールして緩衝液Ｂで５０ｍＭのＮａＣｌに希釈した。
【００６８】
第３のカラムは６ｍｌ（１．６ｃｍｘ３．０ｃｍ）のソース１５Ｓカラムであった。それを緩衝液Ａ１で平衡化し、３２０ｍｌの試料をこのカラムにかけた。１５ｍｌの緩衝液Ａ１でカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中０．０５ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ勾配、１２０ｍｌにて酵素を溶出した（流速：６ｍｌ／分）。３ｍｌの分画を回収してニッキング活性を測定した。しかしながら、突然変異タンパク質は樹脂に結合しなかったので、活性のあるタンパク質は流出液及び洗浄液中に見い出されることが判明した。
【００６９】
ソース１５Ｓカラムの流出液及び洗浄液（４００ｍｌ）を、緩衝液Ａ１で平衡化した８ｍｌ（１ｃｍｘ１１．３ｃｍ）のヘパリンＴＳＫ５ｐｗにかけた。１６ｍｌの緩衝液Ａ１でカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中の０．０５ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ勾配、２４０ｍｌにて酵素を溶出した（流速：４ｍｌ／分）。４ｍｌの分画を回収し、ニッキング活性を測定した。ニッキング活性は分画１８〜２４（平均塩濃度２７０ｍＭ）に見い出された。４０ｍＭのＤＴＴ（ＮＥＢ）を補完した還元ＳＤＳ泳動緩衝液を２０μｇのピーク分画（１８〜２４）に加え、９５℃にて４分間変性させ、１０〜２０％のプレ−キャストの１０ｘ１０ｃｍのＳＤＳポリアクリルアミドゲル（アウル・セパレーションシステム）で泳動した。ゲルコードブルーステイン（ピアース）を用いてゲルを染色し、蒸留水にて脱色した。最も純度の高い分画（Ｂ２０〜２４）を一緒にプールし、保存緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール及び５０％のグリセロール）に対して透析した。
【００７０】
実施例２
ドメイン交換によるＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼのニッキング・エンドヌクレアーゼへの変換
この新規なアプローチは、天然に生じたニッキング酵素であるＮ．ＢｓｔＮＢＩの非機能的二量体形成ドメインの利点を活かした。ＡｌｗＩの二量体形成ドメインを、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの相当するドメインで置き換えた（図３）。得られた組換えエンドヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡに関する特異的なニッキング活性を示す。ドメイン交換戦略は、以下の工程を活用した：
【００７１】
１．  ＰＣＲによるＡｌｗＩの５’末端の増幅
野生型ＡｌｗＩの配列に基づいて特異的なプライマーを設計した。正方向のプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）はクローニングを円滑にするためにＡｇｅＩ制限部位を含有した。逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの１３８７〜１４０７のヌクレオチド配列に相補的な２１個のヌクレオチド（１〜２１）を有する。
５’−ＴＴＡＣＣＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＧＣＡＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
５’−ＴＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
【００７２】
このような２つのプライマーを用いて、以下を混合して、ｐＬＴ７Ｋ−ＡｌｗＩＲ（K. Lunnen and G. Wilson, New England Biolabs）からのＡｌｗＩの５’領域を増幅した：
１０ｘＰＣＲ緩衝液（パーキンエルマー）を１０μｌ、
２ｍＭのｄＮＴＰｓを５μｌ、
ｐＬＴ７Ｋ−ＡｌｗＩＲを２μｌ（１００ｎｇ）、
Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー）を０．２μｌ（１単位）、
ディープベント（Deep Vent（登録商標））ポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社）を０．２μｌ（０．１単位）、
正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を５μｌ（２０μＭ）、
逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を５μｌ（２０μＭ）、
蒸留水を７３μｌ；
増幅は、９５℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、７２℃にて１分間を１５サイクル行った。キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて、増幅産物を精製し、３０μｌの蒸留水中に溶出した。
【００７３】
２．  ＰＣＲによるＮ．ＢｓｔＮＢＩの３’末端の増幅
野生型Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの配列に基づいて特異的なプライマーを設計した。正方向のプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に相補的である。逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、クローニングを円滑にするためにＸｈｏＩ制限部位を含有した。
５’−ＧＡＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
【００７４】
これらの２つのプライマーを用いて、以下を混合して、プラスミド、ｐＨＫＴ７−ｎ．ｂｓｔＮＢＩ（米国特許第６，１９１，２６７号）からＮ．ＢｓｔＮＢＩ遺伝子の３’領域を増幅した：
１０ｘＰＣＲ緩衝液（パーキンエルマー）を１０μｌ、
２ｍＭのｄＮＴＰｓを５μｌ、
ｐＨＫＴ７−ｎ．ｂｓｔＮＢＩを５μｌ（２００ｎｇ）、
Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー）を０．２μｌ（１単位）、
ディープベント（Deep Vent（登録商標））ポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社）を０．２μｌ（０．１単位）、
正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を５μｌ（２０μＭ）、
逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を５μｌ（２０μＭ）、
蒸留水を７０μｌ；
増幅は、９５℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、７２℃にて１分間を１５サイクル行った。キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて、増幅産物を精製し、３０μｌの蒸留水中に溶出した。
【００７５】
３．  組換えＮ．ＡｌｗＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の構築及びその後のプラスミドへのクローニング
工程１及び工程２で増幅したＰＣＲ産物を用いて、長さ１７０７塩基のＮ．ＡｌｗＩＰＣＲ産物（図２）を以下のＰＣＲ手順により作成した：
１０ｘのＰＣＲ緩衝液（パーキンエルマー）を１０μｌ、
２ｍＭのｄＮＴＰｓを５μｌ、
工程１のＰＣＲ産物を１０μｌ、
工程２のＰＣＲ産物を１０μｌ、
Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー）を０．２μｌ（１単位）、
ディープベント（Deep Vent（登録商標））ポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社）を０．２μｌ（０．１単位）、
正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を５μｌ（２０μＭ）、
逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を５μｌ（２０μＭ）、
蒸留水を５５μｌ。
【００７６】
増幅は、９５℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、７２℃にて１分間を１５サイクル行った。キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて、増幅産物を精製した。１０μｌの反応物中にて１ｘＮＥＢ緩衝液２中の０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを加えた１０単位のＡｇｅＩと１０単位のＸｈｏＩと共に、３７℃にて１時間インキュベートして、１００ｎｇのｐＬＴ７Ｋベクター（Kong, H. et al., Nuc. Acids Res., 28:3216-3223, 2000）及びＮ．ＡｌｗＩＰＣＲ産物（〜１００ｎｇ）を消化した。ＴＡＥ緩衝液中の１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ）で消化物を泳動した。ＰＣＲのＤＮＡバンド及びベクターのＤＮＡバンドを含有するゲル片を切り出し、等量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈し、６５℃にて５０分間インキュベートした。以下を混合することによりゲル内連結反応を行った：
調製したｐＨＫＵＶ５（１００ｎｇ）を２μｌ、
ＰＣＲ産物（２００ｎｇ）を６μｌ、
１０ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液を２μｌ、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４００単位）を１μｌ、
βアガラーゼ（０．５単位）を０．５μｌ、
蒸留水を８．５μｌ。
【００７７】
３７℃にて１時間、反応物をインキュベートし、３μｌの連結反応物で大腸菌株ＥＲ２５６６を形質転換した。Ｎ．ＡｌｗＩの存在について個々のクローンをアッセイし、その後、配列を決定した。正しいＮ．ＡｌｗＩの配列を含有するプラスミドをｐＡＢ２と命名した。
【００７８】
４．  Ｎ．ＡｌｗＩの配列特異的ニッキング活性の測定
３０℃にて４時間、０．３ｍＭのＩＰＴＧによりＮ．ＡｌｗＩタンパク質の発現を誘導した。１００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール及び５０ｍＭのＮａＣｌ）に、ｐＡＢ２を含有する４０ｇの大腸菌株ＥＲ２５６６細胞を再浮遊し、超音波処理して、４℃にて３０，０００ｇで３０分間遠心した。緩衝液Ａで平衡化した３０ｍｌのヘパリンハイパーＤカラムに上清をかけた。次いで、１５０ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄した。緩衝液Ａ中の０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌの線形勾配により酵素を溶出した。５ｍｌの分画を回収し、ＤＮＡのニッキング活性を測定した。活性のある分画をプールし、緩衝液Ａで平衡化した２０ｍｌのモノＱカラムにかけた。２００ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液Ａ中の０．０５Ｍ〜０．７ＭのＮａＣｌの線形勾配により酵素を溶出した。３ｍｌの分画を回収し、ニッキング活性を測定した。活性のある分画をプールし、緩衝液Ａで平衡化した１ｍｌのＨＰＬＫカラムにかけた。３０ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中の０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ勾配、３０ｍｌにより酵素を溶出した。１ｍｌの分画を回収し、活性を測定した。活性のある分画をプールし、保存緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５０％のグリセロール）に対して透析した。透析後、Ｎ．ＡｌｗＩタンパク質は８０％の純度に達し、以下のアッセイに使用した。
【００７９】
単一のＡｌｗＩ部位（５’−ＧＧＡＴＣ−３’）を含有するプラスミドを構築するために、ＳｆｃＩ及びＡｖａＩによりプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＮＥＢ）を消化し、クレノウ酵素を用いて埋め合わせ、自己連結させてプラスミドｐＡＣ１を作製した。いかなるＡｌｗＩ部位も持たないプラスミドを得るために、ｓｆｃＩ及びＢｓａＢＩにより、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を消化し、クレノウ酵素を用いて埋め合わせ、自己連結させてプラスミドｐＡＣ０を作製した。
【００８０】
図５に示すように、認識部位がないので、Ｎ．ＡｌｗＩもＡｌｗＩもプラスミドｐＡＣ０を切断しない（図６のレーン２及び３）。従って、反応産物は、未消化のプラスミド（図６のレーン１）と同様に移動する。ｐＡＣ０には２つのＮ．ＢｓｔＮＢＩ部位があるので、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩはｐＡＣ０にニックを入れ、それを緩めた（図６のレーン４）。ｐＡＣ１を基質として用いた場合、ＡｌｗＩは両方の鎖を切断してそれを線状化した（図６のレーン６）。それに対して、Ｎ．ＡｌｗＩは一方の鎖にニックを入れ、ｐＡＣ１の緩んだ形態を生じたが（図６のレーン７）、それは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩにより生じた緩んだ形態（図６のレーン８）と同じ分子量で移動した。結果は、Ｎ．ＡｌｗＩが５’−ＧＧＡＴＣ−３’を認識し、ＤＮＡにニックを入れることを示している。
【００８１】
Ｎ．ＡｌｗＩの正確なニッキング部位をマッピングするために、Ｎ．ＡｌｗＩで消化したｐＡＣ１のニッキング産物を、配列ラダーと平行してポリアクリルアミド配列ゲルで分画した（図７及び８）。プライマーＡｌｗＩ５ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を正方向反応（図７）に用い、プライマーＡｌｗＩ６ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を逆方向反応（図８）に用いた。
ＡｌｗＩ５ｆ  ５’−ＣＡＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１３）
ＡｌｗＩ６ｒ  ５’−ＡＡＣＧＧＴＴＡＧＣＧＣＴＴＣＧＴＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１４）
【００８２】
図７に説明するように、ＡｌｗＩ及びＮ．ＡｌｗＩの双方は上の鎖を切断し、切断部位は認識部位から４塩基離れて位置している。しかしながら、Ｎ．ＡｌｗＩは、下の鎖に対しては切断活性を有していなかった（図８）。それに対して、ＡｌｗＩは同様に下の鎖も切断した。結果は、Ｎ．ＡｌｗＩのニッキング活性は（５’−ＧＧＡＴＣＮＮＮ↓Ｎ−３’）であることを示唆している。
【００８３】
プラスミドｐＬＴ７Ｋ−Ｎ．ＡｌｗＩを含有する大腸菌株ＮＥＢ＃１３２２の試料は、ブタペスト条約の期間と条件のもと、２００１年５月３１日、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）に供託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３４２０を受領し、プラスミドｐＵＣ１９−ＭｌｙＩＲ−Ｙ４９１Ａ／Ｋ４９４Ａを含有する大腸菌株ＮＥＢ＃１３６７の試料は、ブタペスト条約の期間と条件のもと、２００１年５月３１日、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）に供託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３４２１を受領した。
【００８４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ、ニッキング・エンドヌクレアーゼの認識配列及び切断部位を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；
Ｂは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩの認識配列と部位を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；
Ｃは、遺伝子工学的に作製したニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＭｌｙＩの認識配列と部位を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；
Ｄは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ、ＡｌｗＩの認識配列と部位を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；
Ｅは、キメラのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＡｌｗＩの認識配列と部位を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
Ａ〜Ｅの認識配列は太字で示し、切断部位は矢印により示す。
【図２】図２は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ、ＭｌｙＩ（上部の配列；ジェンバンク受入番号ＡＦ３５５４６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）とニッキング・エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩ（下部の配列、ジェンバンク受入番号ＡＦ３２９０９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の間のアミノ酸配列配置を示す。
【図３】図３は、キメラのニッキング・エンドヌクレアーゼＮ．ＡｌｗＩを作製するためのドメイン交換法の模式図を示す。数字はアミノ酸残基の位置を示す。交差は、交換点を示す。
【図４】図４は、遺伝子工学的に作製したＮ．ＭｌｙＩニッキング・エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性の性状分析を示す。
未消化の（Ｃ＝対照）、ＭｌｙＩ、Ｎ．ＭｌｙＩ及びＮ．ＢｓｔＮＢＩによって消化されたプラスミド、ｐＮＢ１を示すアガロースゲル電気泳動。未消化の（Ｃ）、Ｎ．ＭｌｙＩ又はＭｌｙＩで消化した特異性対照としてプラスミドｐＮＢ０も用いた。Ｍ＝分子量マーカー（ラムダＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びΦＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ）。
【図５】図５は、遺伝子工学的に作製したＮ．ＭｌｙＩニッキング・エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性の性状分析を示す。
Ｎ．ＭｌｙＩの切断部位の決定。ジデオキシヌクレオチド鎖停止法に基づく配列決定反応に、ＧＡＧＴＣ認識配列を含有するプラスミド、ｐＵＣ１９及び２つの合成プライマーを用いた。同一プライマー、及び４種のデオキシヌクレオチド並びに［３３Ｐ］ｄＡＴＰの存在下のプライマーと共に追加の伸長反応を行った。次いで標識された基質をＭｌｙＩ又は遺伝子工学的に作製したＮ．ＭｌｙＩで消化した。消化の後、反応混合物を二等分し：１つは直ちに停止溶液と混合し（クレノウ−レーン）；もう一方は、室温にて１０分間クレノウ断片で処理し、次いで停止溶液と混合した（クレノウ＋レーン）。次いで、切断反応産物を標準Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔラダーと共に８％の変性ポリアクリルアミドゲルで分画し、オートラジオグラフィで検出した。
【図６】図６は、キメラのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＡｌｗＩのＤＮＡ切断活性の性状分析を示す。
プラスミドＤＮＡにおけるＮ．ＡｌｗＩ切断活性。レーン１、高次コイルのプラスミドｐＡＣ０；レーン２、ＡｌｗＩで消化したｐＡＣ０；レーン３、Ｎ．ＡｌｗＩで消化したｐＡＣ０；レーン４、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩで消化したｐＡＣ０；レーン５、高次コイルのプラスミドｐＡＣ１；レーン６、ＡｌｗＩで消化したｐＡＣ１；レーン７、Ｎ．ＡｌｗＩで消化したｐＡＣ１；レーン８、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩで消化したｐＡＣ１。Ｓ：ＤＮＡの高次コイル形態。Ｌ：ＤＮＡの線状化形態。Ｎ：ＤＮＡのニックが入った形態。
【図７】図７は、キメラのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＡｌｗＩのＤＮＡ切断活性の性状分析を示す。
改変配列決定反応による切断部位のマッピング。ＡｌｗＩ５ｆをプライマーにした手動配列決定反応において単一の５’−ＧＧＴＡＣ−３’配列を含有する４μｇのｐＡＣ１を用いた。同一プライマーの２つの追加反応物はジデオキシヌクレオチドを添加しないで完全に伸長され、次いで、ＡｌｗＩまたはＮ．ＡｌｗＩのいずれかで消化した。８％のポリアクリルアミドゲルで反応物を分画し、オートラジオグラフィにより検出した。
【図８】図８は、キメラのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＡｌｗＩのＤＮＡ切断活性の性状分析を示す。
プライマーＡｌｗＩ６ｒを用いたことを除いて、図７と同一である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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