(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
6,9−オクタデカジエン酸、8,11−エイコサジエン酸、及び5,8,11−エイコサトリエン酸の群から選ばれるオメガ９系不飽和脂肪酸を含んでなる、関節症又は変形性関節症から選択される軟骨組織の異常に起因する疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記関節症又は変形性関節症が、変形性膝関節症又は変形性脊椎症である請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オメガ９系不飽和脂肪酸を有効成分とする、軟骨組織の異常に起因する疾患の予防又は治療薬、並びに軟骨組織の異常に起因する医学的症状の予防又は改善作用を有する飲食品及びその製造方法に関するものである。より詳細には、6,9−オクタデカジエン酸、8,11−エイコサジエン酸、及び5,8,11−エイコサトリエン酸の群から選ばれた少なくとも１つを有効成分とする関節症、変形性関節症、変形性膝関節症、変形性脊椎症等の軟骨変性を伴う疾患の予防又は治療薬、並びに関節の疼痛、運動痛や、関節の可動域制限、関節の腫張、水腫等の予防又は改善作用を有する飲食品及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
関節症は軟骨変性を起こす何らかの原疾患があって発症する二次性関節症と、特定の原疾患がない一次性関節症に大別され、膝関節に最も多くみられるが、肘、股、足及び指関節にもみられる。病変の主体は軟骨の変性とそれに対する修復機転であり、病変が進行すると滑膜の変化や軟骨下骨の破壊や関節辺縁部の軟骨肥大あるいは骨新生が起こる。
【０００３】
また変形性関節症は、関節に慢性の退行性変化及び増殖性変化が同時に起こり、関節の形態が変化する疾患であり、一次性変形性関節症と二次性変形性関節症に大別される。前者は中年以降にみられ、老化現象に加え、力学的ストレスが加わって発症し、後者は若年者にもみられ、関節の外傷、形態異常、疾患、代謝異常など明らかな原因を有するものに続発して生じるものである。さらに組織学的には軟骨の生化学的変化の結果、軟骨の摩耗が起こり、軟骨の粘弾性の低下とともに亀裂が徐々に深部までに及ぶものである。また変形性脊椎症は、脊柱の退行性変性による病変であり、年齢的変化が主体であるが、体質的素因、職業などの環境因子、広義の外傷などの関与も考えられている（以上「医学大辞典  1991.3.25  発行  南山堂」より）。
【０００４】
特に一次性変形性関節症については、近年人口構成の高齢化を背景としてその患者数の増大が社会問題の一つとなっている。変形性関節症の薬物療法としては、関節軟骨及び骨膜の炎症を抑える目的で非ステロイド性消炎鎮痛剤の投与や、ステロイド剤の関節腔内注射が行われてきたが、いずれも対症療法であり、軟骨の破壊等の進行を止めるにはおよばず満足すべき効果は得られていないのが現状である。
【０００５】
また、機械的ストレス等による外因性の軟骨破壊に対する防護剤として高分子ヒアルロン酸製剤が開発され治療に用いられているが、本質的な治療薬とはいえない。近年、軟骨細胞に対する生化学的研究の進展に伴って明らかになってきた軟骨細胞自身の代謝異常による内因性の軟骨破壊の改善剤や、変形性関節症でよく見られる軟骨の欠如及び変性した軟骨を再生するような原因療法剤は知られておらず、その開発が強く望まれている。
【０００６】
（発明の開示）
従って本発明は、軟骨組織の異常に起因する疾患の予防又は治療薬、特に関節症、変形性関節症、肩関節周囲炎、変形性脊椎症等の軟骨変性を伴う疾患の治療薬として有効で、かつ比較的、副作用が小さく、慢性症状への適用が可能な薬剤、並びに軟骨組織の異常に起因する医学的症状の予防又は改善作用を有する新規な飲食品を提供しようとするものである。
【０００７】
（課題を解決するための手段）
軟骨組織は、間葉由来の組織の中では極めて例外的に無血管の組織であるが、正常軟骨組織中においても脂質は存在している（AnnRheum Dis 24 123-135, 1965）。しかし脂質の過剰な蓄積が、例えばリポヘム関節症（J. Bone Joint Surg［Am］52 1147-1158, 1970）やプレコシヤス関節症（Arthritis Rheum 24 965-968, 1981）において、その病理像として認めることができる。さらに変形性関節症においても脂質代謝の異常が病態と相関すること（Metabolism 40 571-576, 1991）が報告されている。
【０００８】
またウサギ関節内に脂質を投与することにより、実験的に変形性関節症様の関節炎を誘発できること（J. Anat 133 309-314, 1981）や、必須脂肪酸欠乏ウイスターラットにおいて、軟骨への３５S0４の取り込みが減少すること（Arthritis Rheum 14 379 1971）、さらにはin vitroにおいて、軟骨細胞の正常な増殖には、脂質の供給が必要であること（Exp Cell Res 145 415-423, 1983）といった報告から、適度な脂質の量及び適度な脂肪酸組成が軟骨細胞の正常な代謝や機能の維持に重要であると考えられている。
【０００９】
しかしながら、関節炎のイニシエーションや、増悪の過程において、上述の脂質変化が果たす役割については、充分研究されておらず、さらには関節症、特に変形性関節症の治療に脂質の投与が有効か否かについては不明である。一方、オメガ９系不飽和脂肪酸が軟骨組織に局在し老化に伴って含有比率が低下すること（FASEB J 5344-353, 1991）が知られており、軟骨細胞の機能維持に重要であると考えられている。また、5,8,11−エイコサトリエン酸についてはラットカラゲニン浮腫モデルにおいて抗炎症作用が確認されているが、関節症における薬理作用については、殆ど知られていない。
【００１０】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の不飽和脂肪酸の研究を行い、5,8,11−エイコサトリエン酸が軟骨の変性を抑制する作用を有し、軟骨組織の異常に起因する疾患の予防又は治療に極めて有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
（発明の実施の形態）
本発明の有効成分であるオメガ９系不飽和脂肪酸は、例えば6,9−オクタデカジエン酸、8,11エイコサジエン酸、及び5,8,11−エイコサトリエン酸の群から選ばれる。
本発明の脂肪酸は、シス型、トランス型のいずれの幾何異性体であってもよいが、天然に存在するオメガ９系不飽和脂肪酸のほとんどがシス型であるため、本発明の飲食品に用いる場合には、シス型のオメガ９系不飽和脂肪酸を使用することが好ましい。
【００１２】
また本発明のオメガ９系不飽和脂肪酸は遊離脂肪酸の形態で用いることができるが、薬剤として許容されうる塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、又は他のアルカリ金属塩、亜鉛塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のような他の金属の塩の形態や、モノ、ジ、トリグリセライド、低級アルコールのエステル、リン脂質、糖脂質、アミド等の種々の形態で使用してもよく、とくにエチルエステルやトリグリセリドが好ましい。ここで低級アルコールとは炭素数６以下の一価アルコールをさし、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールなどを例示することができる。またこれらはそれぞれ単独でまたは混合して使用することができる。
【００１３】
本発明に使用するオメガ９系不飽和脂肪酸の供給源は何であっても構わない。すなわちオメガ９系不飽和脂肪酸を生成することができる微生物や、必須脂肪酸欠乏に陥った動物組織、必須脂肪酸欠乏に陥った動物培養細胞によって産生されたものであっても、化学的又は酵素的に合成されたものであっても、また天然物、例えば動物の軟骨から抽出・分離・精製されたものであってもよい。
【００１４】
オメガ９系不飽和脂肪酸を生成することができる微生物とは具体的には特開平5-91888号に記載されているΔ５不飽和化酵素活性及びΔ６不飽和化酵素活性を有しかつΔ１２不飽和化酵素活性の低下または欠失した微生物、例えばモルティエレラ・アルピナSAM 1861（FERM BP-3590）を使用することができる。
【００１５】
遊離のオメガ９系不飽和脂肪酸又はそのエステルは、上記のオメガ９系不飽和脂肪酸含有物から常法に従って、抽出・分離・精製することができる。例えば微生物から得る場合には、培養菌体から例えばｎ−ヘキサンなどによる有機溶媒抽出や超臨界炭酸ガス抽出処理により得られた油脂に、加水分解及びエステル化操作を行い、遊離脂肪酸混合物、又は脂肪酸エステル混合物とした後、尿素分画法、液々分配クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー等により、目的とする6,9−オクタデカジエン酸、8,11−エイコサジエン酸、及び5,8,11−エイコサトリエン酸等の遊離脂肪酸又は脂肪酸エステルを純度80％以上で得ることができる。さらに詳細には、特開平5-91888号に記載されている方法により抽出・分離精製を行うことができる。
【００１６】
本発明の有効成分であるオメガ９系不飽和脂肪酸は、必ずしも高純度精製品に限ったことはなく、オメガ９系不飽和脂肪酸を含有する油脂（該油脂中にはオメガ９系不飽和脂肪酸を有するトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、糖脂質、あるいは遊離のオメガ９系不飽和脂肪酸又はそのエステルが存在し得る）やオメガ９系不飽和脂肪酸を含有する遊離脂肪酸混合物又は脂肪酸エステル混合物を使用することができる。
【００１７】
オメガ９系不飽和脂肪酸を含有する油脂は、オメガ９系不飽和脂肪酸を生成することができる微生物の培養菌体から、菌体を破壊し、例えばｎ−ヘキサンなどによる有機溶媒抽出処理や超臨界炭酸ガス抽出処理によって得ることができる。またオメガ９系不飽和脂肪酸を含有する天然物から常法により抽出することによって得ることができる。そして該油脂に加水分解及びエステル化操作を行うことにより、オメガ９系不飽和脂肪酸を含有する遊離脂肪酸混合物又は脂肪酸エステル混合物を得ることができる。より具体的には特開平5-91888号に記載されている方法により培養菌体から抽出・分離することができる。
【００１８】
本発明の脂肪酸は、常法に従って経口又は非経口の形態で、医薬品、医薬部外品、化粧品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、老人用食品、飲食品の分野で利用することができる。
【００１９】
本発明の対象となる軟骨組織の異常に起因する疾患としては、例えば膝や肘、股、足、指、肩関節等の関節症や変形性関節症、変形性膝関節症、肩関節周囲炎、変形性脊椎症等が挙げられ、もちろんこれらの疾患に起因する種々の医学的症状も本発明の対象となり、例えば変形性関節症の症状として知られる関節のこわばり、運動痛、関節可動域制限、関節の腫張や、変形性膝関節症の症状として知られる疼痛、特に運動痛、運動制限、関節水腫や、変形性脊椎症の症状として知られる頸痛、背痛、腰痛、手足ときには体幹部の放散痛、しびれ、脱力といった神経根ないし脊髄症状、高度麻痺や膀胱・直腸障害、間欠性跛行、あるいは冷感等の種々の症状が挙げられる。なお本発明の脂肪酸は選択的に軟骨変性を抑制するため比較的、副作用が小さく、慢性症状への適用が可能である。
【００２０】
本発明の有効成分を医薬品として用いる場合、投与形態は、経口投与または非経口投与が都合よく行われるものであればどのような剤形のものであってもよく、例えば注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性など）、あるいは用時乳濁又は懸濁して用いる固形注射剤の形で、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤等を挙げることができ、これらを症状に応じてそれぞれ単独で、または組み合わせて使用することができる。これら各種製剤は、主薬に薬理学的、製剤学的に認容される製造助剤を加えることにより常法に従って製剤化することができる。
【００２１】
上記製造助剤としては、内服用製剤（経口剤）、注射用製剤（注射剤）、粘膜投与剤（バッカル、トローチ、坐剤等）、外用剤（軟膏、貼付剤等）などの投与経路に応じた適当な製剤用成分が使用される。例えば、経口剤及び粘膜投与剤にあっては、賦形剤（例えば澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸）、崩壊剤（例えばカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、アルギン酸ナトリウム）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、硫酸パラフィン、タルク）、結合剤（例えばジメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン）、コーティング剤（例えばヒドロキシエチルセルロース）、矯味剤、着色剤、香味剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、水性注射剤を構成し得る溶解剤ないし溶解補助剤（例えば注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、グリセリン）、懸濁化剤（例えばポリソルベート80、ツイーン80などの界面活性剤、アラビアゴム溶液）、pH調整剤（例えば有機酸又はその金属塩）、安定剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤（例えばアルコール、脂肪酸エステル類）、粘着剤（例えばカルボキシビニルポリマー、多糖類）、乳化剤（例えば界面活性剤）などの製剤用成分が使用される。また本発明の脂肪酸は不飽和脂肪酸であるため、ブチレート化ヒドロキシトルエン、ブチレート化ヒドロキシアニソール、プロピルガレート、医薬として許容されうるキノンおよびα−トコフェロール等の抗酸化剤を含有させることが望ましい。
【００２２】
特に関節症や変形性関節症、変形性膝関節症、肩関節周囲炎等の治療に際しては、例えば本発明の有効成分を水性溶媒に懸濁し、pHを6.0〜7.0に、0.9％生理食塩水に対する浸透圧比を0.8〜1.2に調節し、関節腔内への投与製剤として調製することができる。前記水性溶媒としては、例えば生理食塩水、３〜５％ブドウ糖液、３〜５％キシリトール液、リン酸緩衝液などを使用することができる。
【００２３】
また注射剤を調製する場合の可溶化剤としては、例えば医薬品用の非イオン界面活性剤等を使用することができ、さらに具体的には、本発明の有効成分を１／２倍容量のＰＯＥ（６０）硬化ヒマシ油あるいはPOEソルビタンモノオレート等の非イオン界面活性剤と完全に混合させ、生理食塩水で希釈することで調製することができる。必要に応じて適宜等張化剤、酸化安定剤（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムなど）、防腐剤（安息香酸、サリチル酸など）、無痛化剤などを加えてもよい。
【００２４】
また本発明の予防又は治療薬においては、本発明の有効成分の他に、ヒアルロン酸等の従来から軟骨組織の異常に起因する疾患の治療に使用されている薬剤や、副腎皮質ホルモン薬、局所麻酔薬、抗生物質などを配合してもよい。
【００２５】
また本発明の有効成分の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重等）により異なるが、通常、成人に対して本発明のオメガ９系不飽和脂肪酸の総量が、経口投与の場合、１日あたり１〜5000mg、好ましくは１〜2000mg、さらに好ましくは１〜1000mgの範囲で、また非経口投与の場合、１日あたり0.1〜500mg、好ましくは0.1〜200mg、さらに好ましくは0.1〜100mgの範囲で適宜調節して投与することができる。
【００２６】
特に関節症や変形性関節症、変形性膝関節症、肩関節周囲炎等の治療に際しては、成人１人あたり１回0.1〜500mg、好ましくは0.1〜200mgの割合で関節腔内に注入し、これを１〜７日間に１回の割合で行うことができる。しかしながら、上市されている高分子ヒアルロン酸製剤が、機械的ストレスの防護剤としての性質上、関節腔内への注入に限定されるのに対し、本発明の脂肪酸は軟骨組織の変性を抑制する作用を有しているため、本発明の投与方法は関節腔内に注入することに限定されるものではなく、経口投与あるいは経腸栄養や経皮吸収など種々の方法をとることができる。
【００２７】
本発明の有効成分である脂肪酸は、生体内で必須脂肪酸欠乏状態時に生合成されることが知られており、７週令のICR雄性マウスに対し、２g/日/kgを２週間連投（経口投与）したところ、何ら異常な症状は認められなかったことからも安全性の面で優れているのは明らかである。
本発明の脂肪酸を飲食品として用いる場合、その形態は、固形、あるいは液状の食品ないしは嗜好品のいずれであってもよい。
【００２８】
例えば油脂を含む食品として肉、魚、ナッツ等の油脂を含む天然食品、中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品、天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品、おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等を挙げることができるが、油脂を含む食品に限定しているわけではなく、例えばパン、めん類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐およびその加工品などの農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、味噌などの発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージなどの畜農食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺんなどの水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶などの飲料等を挙げることができる。
【００２９】
本発明の飲食品は、所定量の6,9−オクタデカジエン酸、8,11−エイコサジエン酸、及び5,8,11−エイコサトリエン酸の群から選ばれた少なくとも１種以上のオメガ９系不飽和脂肪酸、又はこれを主成分とする抽出物を、オメガ９系不飽和脂肪酸を実質上含有しない飲食品原料とともに配合し、一般の製造法により加工製造することができる。その配合量は剤形、食品の形態性状により異なるが、一般には食品全量に対して0.001重量％以上、好ましくは0.1重量％以上、より好ましくは１重量％以上が好ましいが特に限定されるものではない。
【００３０】
ここでオメガ９系不飽和脂肪酸を実質上含有しない飲食品原料とは、オメガ９系不飽和脂肪酸の含量が微量であるため、その飲食品原料が配合された最終製品の１日摂取量において6,9−オクタデカジエン酸、8,11−エイコサジエン酸、及び５，8,11−エイコサトリエン酸の総合量が１mg未満のもの、好ましくは２mg未満のもの、あるいは5,8,11−エイコサトリエン酸含量が１mg未満のもの、好ましくは２mg未満のものを挙げることができる。
【００３１】
また、本発明において、オメガ９系不飽和脂肪酸を主成分とする抽出物とは、オメガ９系不飽和脂肪酸を生産することができる微生物の培養菌体から、菌体を破壊し、例えばｎ−ヘキサンなどによる有機溶媒抽出処理や超臨界炭酸ガス抽出処理によって、あるいはオメガ９系不飽和脂肪酸を含有する天然物から常法により抽出することによって得られるオメガ９系不飽和脂肪酸を含有する油脂（該油脂中にはオメガ９系不飽和脂肪酸を有するトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、糖脂質、あるいは遊離のオメガ９系不飽和脂肪酸又はそのエステル等が存在し得る）や、オメガ９系不飽和脂肪酸を含有する遊離脂肪酸混合物又は脂肪酸エステル混合物を挙げることができる。なお該抽出物のオメガ９系不飽和脂肪酸の含量は１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは10％以上がよく、特に5,8,11−エイコサトリエン酸の含量は１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは10％以上がよい。
【００３２】
特に健康食品、機能性食品、栄養補助食品、老人用食品として用いる場合には、形態としては、前記医薬製剤の形態であっても、また例えば蛋白質（蛋白質源としてはアミノ酸バランスのとれた栄養価の高い乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミン等の蛋白質が最も広く使用されるが、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物等の他、アミノ酸単体の混合物も使用される）、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸が配合された自然流動食、半消化態栄養食および成分栄養食や、ドリンク剤、カプセル剤、経腸栄養剤等の加工形態をあげることができるが、前記飲食品の形態であってもよい。
【００３３】
本発明の健康食品、機能性食品、栄養補助食品又は老人用食品は、オメガ９系不飽和脂肪酸及び／又はオメガ９系不飽和脂肪酸を主成分とする抽出物を用いて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ドリンク剤、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、経腸栄養剤等の形態として製造することができる。より具体的には、本発明のオメガ９系不飽和脂肪酸を１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは10％以上含有する油脂を用いて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ドリンク剤、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、経腸栄養剤等の形態として製造することができる。この際、本発明のオメガ９系不飽和脂肪酸を含有する油脂とともにいずれの栄養成分あるいは機能性成分を配合してもよい。
【００３４】
また医師の指示に基づく栄養士の管理下に、病院給食の調理の際に任意の食品に本発明の脂肪酸を加え、その場で調整した食事を、軟骨変性に起因する医学的症状を呈する患者に与えることもできる。
【００３５】
本発明の軟骨組織の異常に起因する医学的症状としては、例えば膝や肘、股、足、指、肩関節等の関節症や変形性関節症、変形性膝関節症、肩関節周囲炎、変形性脊椎症等の疾患に起因する種々の医学的症状が挙げられ、より具体的には例えば変形性関節症の症状として知られる関節のこわばり、運動痛、関節可動域制限、関節の腫張や、変形性膝関節症の症状として知られる疼痛、特に運動痛、運動制限、関節水腫や、変形性脊椎症の症状として知られる頸痛、背痛、腰痛、手足ときには体幹部の放散痛、しびれ、脱力といった神経根ないし脊髄症状、高度麻痺や膀胱・直腸障害、間欠性跛行、あるいは冷感等の種々の症状を挙げることができる。
【００３６】
本発明の脂肪酸を含有する飲食品は、軟骨組織の異常に起因する医学的症状に対する予防改善や健康維持を目的として、目安として１日あたり本発明のオメガ９系不飽和脂肪酸の総量が、１〜５０００mg、好ましくは１〜２０００mg、さらに好ましくは１〜１０００mgの範囲で経口摂取されることが望ましい。
【００３７】
実施例
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例１ オメガ９系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を用いた5,8,11−シス−エイコサトリエン酸エチルエステルの製造方法
オメガ９系不飽和脂肪酸生産能を有する微生物として、特開平5-91888号に記載されているΔ５不飽和化酵素活性及びΔ６不飽和化酵素活性を有しかつΔ12不飽和化酵素活性の欠失したモルテイエレラ・アルピナSAM 1861（FERM BP-3590）を用い、グルコース２％、酵母エキス１％、オリブ油0.1％を含む培地（７ton、pH6.3）を10tonタンクに入れ滅菌後、温度24℃（培養初日から培養10日目）、20℃（培養10日目から培養１２日目）、通気量1.0vvm、攪拌50rpmの条件下でモルテイエレラ・アルピナSAM 1861の通気攪拌培養を12日間実施した。なお、グルコースの流下培養を行いトータルとしてグルコース3.49％添加した。
【００３８】
培養終了後、造粒乾燥によりオメガ９系不飽和脂肪酸含有油脂を32.7％含む乾燥菌体6.8kg得た。得られた乾燥菌体から含有油脂をヘキサンで抽出し、常法により精製し、オメガ９系不飽和脂肪酸含有油脂（6,9−シス−オクタジエン酸13.2％、8,11−シス−エイコサジエン酸3.5％、5,8,11−シス−エイコサトリエン酸11.2％）20kg得た。そして、常法に従って、得られた油脂をエチルエステル化工程、真空蒸留工程、高速液体クロマトグラフ精製工程を経て、5,8,11−シス−エイコサトリエン酸エチルエステル（5,8,11−シス−エイコサトリエン酸90.1％、6,9−シス−オクタジエン酸7.9％、オレイン酸１．４％、アラキジン酸0.6％）260ｇ得た。
【００３９】
実施例２
関節ギブス固定法により変形性関節症モデルを作製した。動物は１２週齢の雄ウサギ（Kb1:NZW、北山ラベス株式会社）を用いた。２mg／Kgのキシラジン塩酸塩（セラクタール、バイエル株式会社）及び50mg／Kgの塩酸ケタミン（動物用ケタラール50、三共株式会社）の筋肉内投与による麻酔下（以下、麻酔下とする）にて、右後肢を毛刈りし、大腿上部より足尖までをストッキネットとキャストパッドで包んだ後、キャスティングテープ（以上、スリーエム薬品株式会社）を用いて膝関節を伸屈位で３週間、固定した。
【００４０】
ギブス固定期間終了時に異常の認められなかった動物を用いて、体重および関節可動域を指標として、各群の平均体重及び関節可動域値が均一になるように１群４〜５匹の４群に割り付けた。
投与サンプルは、実施例１で得た90%の5,8,11−シス−エイコサトリエン酸エチルエステル（以下「ミード酸エチルエステル」という）と62.5μlのHCO-60（POE（60）硬化ヒマシ油、日光ケミカルズ株式会社）を完全に混合したのち、100mlの生理食塩水に懸濁し、ミード酸エチルエステル１mg／ml溶液を調製した。別に62.5μlのHCO-60を100mlの生理食塩水に溶かし、低用量サンプル調製用及び溶剤投与群用として使用した。
【００４１】
投与群は以下の様に設定した。（１）溶剤投与群：0.6ml／関節、（２）ミード酸エチルエステル低用量投与群：0.12mgミード酸エチルエステル／関節、（３）ミード酸エチルエステル高用量投与群：0.60mgミード酸エチルエステル／関節、（４）アルツ（商標）（生化学工業株式会社）：0.6ml（６mgの高分子ヒアルロン酸ナトリウムを含む）／関節。投与は麻酔下で投与部位を毛刈りし、２％イソジン液（動物用イソジン液、明治製菓株式会社）および70％エタノールで消毒した後、ディスポーザブル注射器（注射針：25G）を用いて行なった。右膝関節腔内に投与検体を週２回、５週間投与した。薬効評価として関節可動域の測定は週１回、麻酔下で約400gの加重を脛骨軸に直角に加えて、大腿骨との間に形成される角度を測定した。（最大伸展角）−（最大屈曲角）の差を右膝関節の可動域（ROM）とした。
【００４２】
試験期間中飼料は固形飼料RC4（オリエンタル酵母工業株式会社）を、飲料水は公共水道水をそれぞれ自由に摂取させた。
試験終了後、関節の病理学的検査を行なった。すなわち、ペントバルビタールナトリウム溶液（ネンブタール注射液、ダイナボット株式会社）の耳介静脈内投与による麻酔下で膝関節の外表観察およびROM測定を行なった後、放血致死させた。全例の両後肢を摘出した後、膝関節腔内を肉眼的に観察し、写真撮影した。また、全例について大腿骨、脛骨骨頭および滑膜を採取し、10％中性緩衝ホルマリン液で固定し、EDTA脱灰を施した。包埋、薄切の後、ヘマトキシリン・エオジン（H-E）およびサフラニンＯ染色を施し、鏡検した。
【００４３】
右膝関節のROMを図１に示す。投与開始１週間後、ミード酸高用量群及びアルツ（商標）投与群では有意にROMが上昇し、５週目には、拘束前値87％にまで回復した。ミード酸低用量群においても投与後２週目から回復傾向が認められた。投与終了時の軟骨組織の脂肪酸組成の解析結果を図２に示す。無処置ウサギの関節軟骨組織のアラキドン酸／ミード酸比（ARA/MA）に対し、溶媒投与群では高値、ミード酸投与群では正常化する傾向があることが明かとなった。
【００４４】
実施例３
実施例１と同様の手法により調製した95％の6,9−シス−オクタデカジエン酸エチルエステル125μl、又は95%の8,11−シス−エイコサジエン酸エチルエステル125μlを、62.5μlのHCO-60（POE（60）硬化ヒマシ油、日光ケミカルズ株式会社）と完全に混合した後、100mlの生理食塩水に懸濁し、6,9−シス−オクタデカジエン酸エチルエステル１mg／ml溶液（溶液Ａ）、又は8,11−シス−エイコサジエン酸エチルエステル１mg／ml溶液（溶液Ｂ）を調製した。別に62.5μlのHCO-60を100mlの生理食塩水に溶かし溶剤投与群用として使用した。
【００４５】
実施例２に従って、関節ギブス固定法により変形性膝関節症モデルを作製し、各群の平均体重及び関節可動域値が均一になるように１群５匹の３群に割り付けた。投与群は以下の様に設定した。（１）溶剤投与群：0.6ml／関節、（２）6,9−シス−オクタデカジエン酸エチルエステル投与群：0.6ml溶液Ａ／関節、（３）8,11−シス−エイコサジエン酸エチルエステル投与群：0.6ml溶液Ｂ／関節。実施例２に従って、右膝関節腔内に投与検体を週２回、５週間投与し、右膝関節の可動域（ROM）を測定した。
その結果、投与開始５週目の可動域は、溶剤投与群、溶液Ａ投与群、溶液Ｂ投与群でそれぞれ、70％、80.2％、83.6％であり、有意な回復効果が認められた。
【００４６】
実施例４ ソフトカプセル剤の製造
ゼラチン                      70.0％
グルセリン                    22.9％
パラオキシ安息香酸メチル       0.15％
パラオキシ安息香酸プロピル     0.51％
水                            適量
計                            100％
上記成分からなるソフトカプセル剤皮の中に、5,8,11−シス−エイコサトリエン酸エチルエステルを、常法により充填し、１粒180mgのソフトカプセル剤を得た。
【００４７】
実施例５ ソフトカプセル剤の製造
オメガ９系不飽和脂肪酸生産菌SAM 1861より、特開平5-91888号公報の記載に従って調製したオメガ９系不飽和脂肪酸含有トリグリセリド油（6,9−シス−オクタデカジエン酸14.5重量％、8,11−シス−エイコサジエン酸2.3重量％、5,8,11−シス−エイコサトリエン酸17.4重量％含有）99.7％に、α−トコフェロール0.3重量％を添加した油状質を、実施例４に示した成分からなるソフトカプセル剤皮に、常法により充填し、１粒180mgのソフトカプセル剤を得た。
【００４８】
実施例６ ジュースの製造（参考例）
β-シクロデキストリン２を20％エタノール水溶液20mlに添加し、ここにスターラーで撹拌しながら、5,8,11−シス−エイコサトリエン酸エチルエステル100mgを加え、50℃で２時間インキュベートした。室温冷却（約１時間）後、さらに撹拌を続けながら４℃で10時間インキュベートした。生成した沈殿を、遠心分離により回収し、ｎ−ヘキサンで洗浄後、凍結乾燥を行い5,8,11−シス−エイコサトリエン酸エチルエステル含有シクロデキストリン包接化合物1.8gを得た。この粉末１ｇをジュース10リットルに均一に混ぜ合わせ、5,8,11−シス−エイコサトリエン酸エチルエステル含有ジュースを調製した。
【００４９】
実施例７ （脂肪輸液剤）
5,8,11−エイコサトリエン酸エチルエステル40ｇ、精製大豆油360ｇ、精製卵黄レシチン48g、オレイン酸20g、濃グリセリン100g、0.1N−苛性ソーダ40mlを加え、ホモミキサーで分散させたのち、注射用蒸留水を加え全液量を４リットルとする。これを高圧噴射式乳化機にて乳化し、脂質乳液を調製した。該脂質乳液を200mlずつプラスチック製バッグに分注したのち、121℃、20分間、高圧蒸気滅菌処理して脂肪輸液剤とする。
【００５０】
実施例８ （乳濁性注射液）
90重量%5,8,11−エイコサトリエン酸エチルエステルを、常法に従って下記の処方で乳濁性注射液として調製した。乳濁性注射液中のミード酸エチルエステルの含量は１５％（W/V）であり、乳化剤として卵黄レシチン1.2％（W/V）を加え、更に血液と等張となるようにグリセリンにて浸透圧を調整した。
【００５１】
実施例９ （乳濁性注射液）
実施例５で使用したオメガ９系不飽和脂肪酸含有トリグリセリド油を、常法に従って乳濁性注射液として調製した。乳濁性注射液中のオメガ９系不飽和脂肪酸含有トリブリセリド油の含量は10％（W/V）であり、乳化剤として卵黄レシチン1.2％（W/V）を加え、更に血液と等張となるようにグリセリンにて浸透圧を調整した。
【００５２】
実施例10．
ウサギ膝関節軟骨細胞初代培養系を用いてタイプIIコラーゲンの合成に与えるミード酸の影響を他の脂肪酸、特にアラキドン酸と比較した。使用した脂肪酸としてミード酸の場合は実施例１と同様の手法によりさらに純度を高めた99%5,8,11−シス−エイコサテトラエン酸エチルエステルを、アラキドン酸、オレイン酸及びリノール酸の場合は市販の９９％エチルエステルを使用した。
【００５３】
４週齢日本産白色種ウサギ膝関節より鈴木・下村らの方法に従って軟骨細胞を調製した〔Shimomura, Y., Yoneda, T., Suzuki, F. Osteogenesis by chondrocyte from growth cartilage of rat rib. Calcif. Tissue Int., 19:179−187, 1975.〕軟骨細胞は、10％牛胎児血清含有αＭＥＭ培地（50μg／mlビタミンＣ、l ng／mlｂ-FGF添加）にて、96穴プレート（イワキガラス社製）に１万細胞／穴となるようにまき、２日間前培養（5%CO2，37℃）した。脂肪酸は用事調製とし0.0625%HCO-60に懸濁した。脂肪酸による前処理として、プレートを３群に分けそれぞれ、同培地にＡ群：溶媒（0.0625%HCO-60）、Ｂ群：ミード酸（最終濃度300μM）、Ｃ群：アラキドン酸（最終濃度300μM）を加え２日毎に培地及び脂肪酸を交換し約５日間培養した。
【００５４】
次いで、培地を血清無添加αＭＥＭ培地（1μg／mlトランスフェリン、lμＭデキサメタゾン、２μg／mlインシュリン、50μg／mlビタミンＣ）に換え、最終濃度として300μMになるよう各脂肪酸（ミード酸、アラキドン酸、オレイン酸、及びリノール酸）を添加して７日間培養し、細胞外マトリックスを合成させた。培地及び各脂肪酸は、２日毎に新しく調製し交換した。その後、プレートにペプシン（２mg／ml）酢酸液を200μl／穴づつ加え、37℃24時間処理した。各穴より残査を回収し１万５千回転10分間の遠心処理により生じた沈殿をトリス−EDTA緩衝液（pH8.0）にて１回洗浄しＳＤＳサンプルバッファ100μlに溶解した。
【００５５】
タイプIIコラーゲンの合成量は、各サンプル液１／１０体積量をマルチゲル４／２０（第一化学社製）にて電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色後の１１６ｋＤ付近のバンドの濃淡により調べた。染色後のゲルの写真を図３に示す。アラキドン酸（３００μＭ）の添加により、タイプIIコラーゲンの合成が阻害されることが判明した（図３、サンプル番号１〜５）。またこの阻害は、アラキドン酸にて前処理したＣ群の結果でより顕著に現われたが、ミード酸（300μM）の添加により回復した（図３、サンプル番号11〜15）。アラキドン酸によるタイプIIコラーゲンの合成阻害を回復させる作用は、ミード酸に特徴的で他のオレイン酸やリノール酸には、認められなかった。さらに、ミード酸（300μM）にて則処理したＢ群の結果から、ミード酸の前処理によりアラキドン酸添加によるタイプIIコラーゲン合成量の低下が、抑制されることが判明した（図３、サンプル番号６〜10）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ウサギ変形性関節炎モデルにおけるミード酸の治療効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ウサギ変形性関節炎モデルにおける関節軟骨組織中のアラキドン酸／ミード酸比を示すグラフである。
【図３】図３は、軟骨細胞によるII型コラーゲンの合成に及ぼす各種脂肪酸の影響を示す電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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