(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液試料を上澄みとペレット相に分けられるまで遠心分離し、次いで、得られる試料ペレットのサイズを測定して、試料ペレットのサイズと唾液試料中の大分子車のDNAの量を相関させることを特徴とする、唾液試料中の大分子量DNA含量を決定する方法。
【請求項２】
該大分子量のDNAが、約500塩基対より大きいサイズを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遠心分離に先立ち唾液試料に希釈剤が添加される請求項1に記載の方法。
【請求項４】
希釈剤が唾液重量の50%に等しい容積で加えられる水である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
唾液試料が嚢胞性線維症を患っている患者からのものである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
唾液試料が肺炎を患っている患者からのものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
唾液試料が気管支炎を患っている患者からのものである請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本願発明は、感染気道分泌物に関連した呼吸器病を患っている哺乳動物の患者の唾液試料のコンパクションを測定する検定に関する。
本願発明は、呼吸器病にかかっている患者の肺機能を改善する治療の可能性を測るコンパクション検定に関する。
特に、本願発明は、患者集団におけるDNアーゼの治療効力について予想するコンパクション検定に関する。
関連技術の説明
呼吸器病
肺分泌物は、粘着性の親水性ゲルを形成する複合した不均一な物質である。これらの分泌物は、呼吸気道の機能の正常化に重要な役割を演じている。嚢胞性線維症（Cystic Fibrosis（CF））、気管支炎及び肺炎のような感染気道分泌物に関連した呼吸器病は、呼吸器病に関連した呼吸器機能障害に主要な役割を演じる化膿性分泌物で特徴付けられる。
未感染肺分泌物の粘性の原因は、粘液の糖タンパク質によるものとされているが、感染性又は化膿性肺分泌物の粘性は、粘液タンパク質及びDNA（Shak等、PNAS87:9188-9192［1990］）及び糖タンパク質、DNA、タンパク質、脂質及びカチオン（Yeates, DB, The Lung:Scientific Foundations,編集Crystal等、出版Raven Press, pp 197-203［1991］）が原因とされている。
嚢胞性線維症（CF）は、起電性塩化物輸送に係わる分泌上皮の欠陥で特徴付けられる一つの遺伝病であり、白色人種の中で最も一般的な（2,500人の生存出生のほぼ1人に見られる）致死遺伝病である（Boat等、The Metabolic Basis of Inherited Disease, 編集Scriver等、出版McGraw Hill, pgs. 2649-2860［1989］）。分泌上皮の機能上の外乱は、膵臓の酵素分泌物低下、胃腸管の呼吸不良、及び気管支粘液過多を含むいくつかの異常となって現れる（Kerem等、New England Journal of Medicine 323:1517-1522［1990］）。これらの気管支粘液過多は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のような日和見病原体によって慢性肺感染を支援する環境を与えている（George, RH, Arch Dis Child 62:438-439［1987］）。大多数の炎症性白血球は、これらの感染部位に入り込み、短時間後に溶解して、それらの細胞核のデオキシリボ核酸（DNA）を気管支分泌物中に放出する。極端に化膿性の分泌物は、これらは15mg/ml程のDNAを含有していることが示されているものであるが（Matthews等、Am Rev Respir Dis 88:199-204［1963］）、CFの患者には濃くなり過ぎて取り除くことができず、その結果、呼吸器病や進行性肺破壊（lung destruction）となる（Welsh等、J CLin Invest 80:1523-1526［1987］）。
肺炎は、肺実質の炎症により特徴付けられる。肺炎のほとんどの場合は、バクテリア又はウイルスによる感染に起因しており、薬物の吸入又は胸郭壁に対する外傷による場合もいくらかあり、リケッチア細菌、菌類、及び酵母菌による場合も小数ある。炎症は、大葉、体節、又は小葉に分布するであろう。肺炎の一つの臨床的兆候は、呼吸気道における化膿性分泌物の存在である。
気管支炎は、気管支管の粘液膜の炎症によって特徴付けられる。気管支炎には、慢性気管支炎、出血性気管支炎、線維素性気管支炎、毛細血管気管支炎、喘息性気管支炎を含む多くの種類がある。慢性気管支炎は、気管支感染に冒され易くなることに関連した、長期間にわたる咳、粘液の分泌過多、及び唾液の喀出によって特徴付けられる気管支の樹枝状分岐（bronchial tree）の一つの状態である。化膿性分泌物の粘性の増加は、慢性気管支炎をもっている患者の喀出の困難さに関係がある（Dulfano等、Am. Rev. Respir. Dis. 104:88-98［1971］）。
過去において、感染気道分泌物に関連した呼吸器病にかかっている哺乳動物患者の化膿性気管気管支分泌物の粘弾性の性質を減ずるために、患者によるこの物質の取り除きを改善することに希望を持って、いくつかのアプローチが講じられてきた。水吸入のような治療（Rosenbluth等、Archives of Disease in Chidhood 49: pp606-610［1974］）及びn-アセチルシステイン（商標Mucomyst）のような粘液分解を使うのは成功しなかった。
ウシの膵臓のDNアーゼ1（ドルナーゼ）は、肺炎の治療に効果があることが示されたが（Clifton等、Caccer,（14）:414-420［1961］）、その使用は、このウシのタンパク質を使っているヒトに起こると思われる刺激問題（Shak等、PNAS 87:9188［1990］）のため認可から漏れた。最近、Hubbard等（NEJM, 326:812-815［1992］）およびAitken等（JAMA vol. 267 pp.1947-1951［1992］）は、ヒトのDNアーゼは気道における化膿性分泌物中の高分子量のDNAを開裂し、従って化膿性分泌物の粘弾性を減じ、肺機能を改善する、ということを報告した。ヒトのDNアーゼはまた、慢性気管支炎の気管支拡大症、腔感染及び他の呼吸器病の処置に必要とされている（WO90/07572、1990年7月12日発行）。
その他の治療、例えば、抗好中球エラスターゼ剤及び分泌ロイコプロテアーゼ阻害剤は、CF処置に対する新治療法を潜在的に予想させるものである（Mulherin等、Dig Dis 10（1）pp29-37［1992］）。抗生物質の治療は、CF及び他の呼吸器病に関連した慢性呼吸器管感染の処置に必要とされている（Mulherin等、Ir J Med Sci 160（6）pp 173-175［1991］及びde Montalembert等、Ann Pediatric 38（8）p523-528［1991］）。胸部の物理療法はまた、嚢胞性線維症（Zach等、Infection 15（5）pp.381-384［1987］）及び喘息、慢性気管支炎、及び気管支拡大症（Eid等、Respir Carc36（4）pp.270-282［1991］）における抗感染治療に対する機械的アプローチとして必要とされている。
DNアーゼ
DNアーゼは、ポリデオキシリボ核酸を加水分解できるホスホジエステラーゼである。それはDNAを広範囲に且つ非特異的に分解するよう作用するもので、この観点から相対的に制限された配列特異性のある制限エンドヌクレアーゼとは区別される。DNアーゼIは、中性に近い至適pH、二価カチオンに関して必須の要件を有しており、DNAの加水分解で5'リン酸ヌクレオチドを生成する。DNアーゼIIは、酸性の至適pHを示し、二価カチオンによって活性化でき、DNAの加水分解で3'-リン酸ヌクレオチドを生成する。DNアーゼI及びDNアーゼIIの多重分子形は公知である。
DNアーゼは、多数の既知の効用を有しており、治療の目的で用いられてきた。その主要な治療用途は、呼吸器病、例えば、嚢胞性線維症、肺炎、及び気管支炎における感染気道分泌物の粘弾性の性質を減ずることにあり、従って、呼吸気道の邪魔物の排除及び肺機能の改善に役立つ。
ウシのDNアーゼA、B、C、及びDは、早くも1973年に精製され、完全に配列決定された。ウシの膵臓のDNアーゼは、商品名Dornavac（Merck）を付けて販売されており、肺炎及び嚢胞性線維症を患っている患者の治療に用いられた。この製品は、臨床医がその使用による酷い合併症を観察して（Raskin,Am. Rev. Resir. Dis. 98:597-598［1968］）以来市場から姿を消した。
ヒトのDNアーゼIは、上記のShak等［35］によってクローン化され、表現されたもので、彼は、触媒量の組換えヒトDNアーゼ（rhDNアーゼ）は化膿性嚢胞性線維症の唾液の粘性を大幅に減じ、それを非流動の粘性ゲルから流動性液体に変換し、従って唾液の排除を増進することを報告した。上記のHubbard等、及びAiken等（JAMA 267:1947-1951［1992］）は、CFの患者の肺機能がエーロゾル化rhDNアーゼを用いた治療で改善されたことを報告した。
呼吸気道に及ぼす粘液流動学の効果
粘液のような呼吸器分泌物は、呼吸気道の正常な機能化に重要な役割を演じている。これらの呼吸器分泌物は、繊毛上皮の推進作用に基づき分泌物を連続的に流動させ、又は輸送することにより気道を浮遊微生物及び他の外来粒子から保護している。この輸送は、気道に張り付いている粘液が捕獲された粒子及び微生物を排除するのに役立つ。正常な粘液の粘弾性ゲルの性質は、有効な粘液繊毛輸送には重要である（上記Yeates等）。
感染気道分泌物で特徴付けられる呼吸器病を患っている患者は、異常な粘弾性の性質を有する過剰量の化膿性分泌物を分泌することが明かとなっている。感染した唾液の粘弾性には呼吸器病の種類、酷さ、及び処置期間を予告できない存続期間によって変動性がある。
King等（Rheology 24:589-597［1987］）は、粘弾性と繊毛輸送の間には逆関係があることを示している；粘弾性が大きければ大きいほど、繊毛輸送は小さくなる。繊毛輸送が損なわれると、呼吸器病を引起こすことができる感染分泌物による気道の肺破壊になり得るし、ある場合には、呼吸器不全そして死に至り得る。
研究者達は、唾液の流動学的性質の生体外及び生体内の査定間の関係を見つけようとしたが失敗した。Reid等（"Rheology-Relation to the Composition of Sputum" Scandinavian Journal of Respiratory Diseases :Munksgaard International Publishers出版,Vol 103 Suppl. pp 27-35［1974］）は、唾液のせん断率の生体外査定は、生体内の唾液の流動学的性質を査定するのに使用できないと述べている。Rosenbluth等（Archives of Disease in Childhood 49:606［1974］）は、噴霧治療は、生体外のCF唾液の水含量を増加させるけれど、CFをもっている患者の唾液の粘性又は量に影響しないことを示している。
唾液の流動学的性質の測定
呼吸器病にかかっている患者の唾液についての適切な流動学的測定は、単一の流動学的方法で行うのは困難であろう。事実、１つの技法から得た結果は、患者の唾液試料の粘弾性の固有の変動性及び粘性と弾性の値が分析方法に左右される非ニュートン特性（non-Newtonian characteristics）のため、他の技法で得られた結果とはほとんど比較できない。
粘液の流動学的性質を研究するため、動的円錐平板粘度計（dynamic cone and plate viscometer）、毛管レオメーター、振動磁気ボール・マイクロレオメーター、及び磁気式レオメーターを含む種々の装置が用いられている。これらの装置は粘性と弾性に関連したダイナミック率を測定するものである。
動的円錐平板粘度計は、これらの方法の中でも最低破壊式の1つであり、試料の粘性と弾性の両方について同時に情報をもたらすことができる；しかし、この方法では、比較的大量の唾液を必要とする。毛管レオメーターは、小量の試料量でよいが、試料の取扱いに関する問題を含むいくつかの制約がある。磁気式マイクロレオメーターは、唾液のように極めて不均質な物質では、粒子運動がより高い粘性領域に移動する際しばしば停止されるので、満足に作動しない。
上記のYeates等は、別々の装置で引出された流動学的値の比較は、それぞれが別々の流動学的原理の応用に依存しているので、慎重に行う必要があることを警告している。
流動学的測定に用いられる方法は、多くは破壊的であり、保管又はデータ採取中に唾液の物理的特性を取消不能的に改質する。このことは、粘性測定に頻繁に用いられる冷凍及び静的円錐平板粘度計のような装置の使用についても当てはまることである。動的円錐平板粘度計を含む多くの装置は、非常に高価であり、装置を運転し、得られるデータを解釈するには訓練された技術者が必要である。
本願発明までは、呼吸器病を患っている患者の肺機能を改善する治療の可能性を検定するための簡単で、有効な又は標準化された生体外の流動学的検定は存在しなかった。本願発明までは、粘弾性の関数として呼吸器病の酷さを測定するための簡単で、有効な又は標準化された生体外の流動学的検定は存在しなかった。本願発明までは、呼吸器病を患っている哺乳動物の患者に対するrhDNアーゼ処置の治療的効能を検定する方法は、何らなかった。
本願発明のコンパクション検定は、唾液の生体外DNアーゼ処置に続く遠心性の場（フィールド）での唾液の圧縮化性（compactability）の変化に基づいている。遠心ペレットサイズで測定するとして、唾液の圧縮化性の範囲は、大分子量のDNAの含量に関連がある。唾液試料中の大分子量DNAの量が多ければ多いほど、圧縮に対する抵抗が大きい。DNアーゼは、化膿性唾液に存在する大分子量DNAを加水分解するよう作用し、それによって生体外のDNアーゼ処置試料の遠心圧縮化性を増大する。患者から得た生体外のDNアーゼ処置試料の圧縮化性の増大率が大きいほど、生体内rhDNアーゼ処置で見られる患者の肺機能の改善度は大きい。
患者集団の肺機能を改善する治療の可能性を検定するための簡単で高速の標準化された検定を求めるニーズはある。このニーズは、感染気道分泌物によって特徴付けられる呼吸器病を患うどの患者集団にも存在している。
多くの場合、呼吸器病の処置上有用な治療の効果的摂取用量を決めるために、哺乳動物患者の呼吸器病の酷さを検定するのは望ましかろう。DNアーゼ治療を求める患者集団においてDNアーゼ治療の生体内効能について予測可能な高速且つ簡単な生体外検定を行うことは特に望ましいはずである。
従って、患者集団の肺機能を改善する治療の可能性を検定できる高速且つ簡単な標準化検定を提供することは、本願発明の目的の一つである。
呼吸器病の処置上有用な治療の効果的摂取用量を決めるために、哺乳動物患者の呼吸器病の酷さを検定する高速且つ簡単な生体外検定を提供することは、本願発明の目的の一つである。DNアーゼ治療を求める患者集団においてDNアーゼ治療の生体内効能について予想する生体外検定を提供することも本願発明の関連目的である。
本願発明のこれらの及び他の目的は、熟練した当業者に明かとなろう。
発明の概要
本願発明は、コンパクション検定で得られた粘弾性の生体外測定によって、哺乳動物患者の呼吸器病の酷さが予想され且つ肺機能改善に際し、呼吸器病処置で有用な生体内治療効能が予想される、という予期せぬ実験的知見に基づいている。
本願発明の目的は、感染気道分泌物に関連した呼吸器病にかかっている哺乳動物患者から得た唾液試料のコンパクションを測定するための、哺乳動物患者から唾液試料を得ることと、前記唾液試料を上澄み液とペレット相に分かれるまで遠心分離することと、さらにそのペレットを測定することから成る方法を提供することにより達成されるものである。
1つの具体例では、唾液試料は嚢胞性線維症にかかっている哺乳動物患者からのものである。他の具体例では、唾液試料は気管支炎を患っている哺乳動物患者からのものである。
さらに別の具体例では、本願発明は、生体外で治療処置された哺乳動物患者の唾液試料のコンパクションを測定するための、哺乳動物患者から唾液試料を得ることと、その唾液試料に治療を施すことと、前記唾液試料を上澄み液とペレット相に分かれるまで遠心分離することと、さらにそのペレットを測定することから成る方法を提供する。
1つの具体例では、治療はヒトのDNアーゼである。他の具体例では、治療は呼吸器病の処置に効果的な抗生物質である。
本願発明のさらに別の具体例では、DNアーゼ治療の必要がある哺乳動物患者のDNアーゼで処置された唾液試料のコンパクションを測定するための、哺乳動物患者から唾液試料を得ることと、その唾液試料にDNアーゼを添加することと、前記DNアーゼで処置された唾液試料を上澄み液とペレット相に分かれるまで遠心分離することと、さらにそのペレットを測定することから成る方法が提供される。
1つの具体例では、DNアーゼは、少なくとも1μgDNアーゼ/ml唾液の濃度のヒトのDNアーゼである。
【図面の簡単な説明】
図1は、DNアーゼのヌクレオチド及びアミノ酸配列（SEQ.ID NO.1）を示す。
図2は、唾液試料内のDNAサイズのアガロースゲル電気泳動の研究を示す。唾液試料は、希釈剤（（-）レーン）かrhDNアーゼ（（+）レーン）の何れかで処理して作製し、0.5%アガロースゲル中へ電気泳動させた。
図3は、希釈剤（灰色棒線）かrhDNアーゼ（黒色棒線）の何れかの添加に続くコンパクション検定で得た6つのCF唾液試料についてのペレット高パーセントを示す。
図4は、代表的唾液試料に対し動的円錐平板粘度計によって応力変形の関数として測定された粘性及び弾性率を示す。
図5は、6つの化膿性試料の物理特性を示す。
図6は、希釈剤かrhDNアーゼの添加に続いて6つの試料のペレットと上澄み画分で検出されたDNAの限度を示す。
図7は、CF唾液試料のrhDNアーゼ作用に対する用量一応答曲線を示す。化膿性CF唾液は、rhDNアーゼの濃度を増やして処理し、コンパクション検定で評価した。rhDNアーゼの濃度は、唾液＋酵素添加容積に対して計算。
図8は、コンパクション検定の結果と測定弾性率との間の関係を示す。弾性率は、説明したように、20%応力変形での動的円錐平板粘度計によって測定。（コンパクション検定結果からの）ペレットパーセントは、この研究で完全に特徴付けされた6つの試料並びに他の4つの化膿性CF唾液に対して関連したものである。データポイントは、希釈剤処理（充填記号）とrhDNアーゼ処理（中空記号）した両方の試料を表す。
好ましい具体例の説明
ここで用いている用語"コンパクション"（compaction）の用法は、遠心分離での唾液試料の変形に対する抵抗を指し、試料の粘弾性率の直接関数である。試料の粘弾性率が大きければ、遠心分離ペレットサイズで測定されるような遠心分離で受ける試料の圧縮化性は小さくなる。コンパクション検定結果は、呼吸器病の酷さを、唾液の粘弾性率の関数として、検定し、且つ呼吸器病にかかっている哺乳動物患者の肺機能を改善する際の治療の可能性を検定する臨床的設定に有用である。
DNアーゼ治療を必要としている哺乳動物患者の肺機能を改善する際のDNアーゼ治療の効能は、生体外のDNアーゼによる処置に続く哺乳動物患者の唾液試料の圧縮化性を検定することにより予想することができる。もし遠心分離ペレットサイズが生体外のDNアーゼ処置で減少するなら、ヒトのDNアーゼで哺乳動物を処置することにより肺機能が改善されるであろうことが予想される。DNアーゼ処置によるペレットサイズの減少は、長鎖DNAのより短い鎖への加水分解に起因している。それに続く短鎖DNAの上澄み液への放出は、ペレットコンパクションが増え、上澄み液の容積が増すことになる。この効果は定量化でき、生体内rhDNアーゼ処置による粘弾性率変化の程度の指標として用いることができる。DNアーゼ処置を必要としているそれらの患者は、もし生体外rhDNアーゼ処置によって患者の唾液試料のコンパクションが増やされるなら、DNアーゼ治療に感じ易いことが予想される。
DNアーゼ処置を必要としている哺乳動物患者からの未処理の唾液試料の遠心分離によって、残留している上澄みにおけるより遠心分離ペレットで大きいDNA濃度を有する試料が生ずる。DNアーゼ処置を必要としている哺乳動物患者の唾液の脱水条件のため、10,000xgの遠心分離だけでは、必ずしも上澄み相を生成するとは限らない。試料の2つの相への遠心分離分画を得るためには唾液試料に希釈剤を添加することがしばしば必要であり、添加する希釈剤の量は、全被検試料に対して同一でなければならない。もし被検唾液試料を測定するのに容積式ピペットを用いるなら、遠心分離で少なくとも20%の上澄み容積を確保できるよう測定される試料容積の50%に等しい容積で唾液試料に希釈剤を添加するのが望ましい。もし唾液試料が重量で測定される場合は、遠心分離で少なくとも20%の上澄み容積を生ずるためには正確な試料重量の50%に等しい容積で唾液試料に希釈剤を添加するのが望ましい。例えば、容積式ピペットで測定して正確な試料容積が100マイクロリットル（μl）なら、遠心分離で少なくとも20%の上澄み容積を生ずるためには50μlの希釈剤の添加が通常に必要であり、又は例えば、正確な試料重量が100ミリグラム（mg）なら、遠心分離で少なくとも20%の上澄み容積を保証するためには50μlの希釈剤の添加が通常に必要である。代表的には、唾液試料の重量を測るにはメトラー（Mettler）の化学天秤を使用する。もし唾液試料の容積を測るのに容積式ピペットが使われないなら、唾液試料の重量をベースにした希釈剤容積の添加は、容積の測定に影響し得る気泡と粘液凝固物が唾液試料中に存在するという理由から必要である。希釈剤又はDNアーゼの添加とそれに続く遠心分離の後は、得られる上澄みは弾性も粘性もないが、残留ペレットは完全に固形又は弾力性がある。残留するペレット相は、全唾液の弾性率に寄与する成分を含有している。
DNアーゼは、図1のアミノ酸配列とDNアーゼの定性的酵素活性を保持するそのアミノ酸配列の変異型とを併せ持つポリペプチドと定義される。ここで用いる用語"DNアーゼ"は、WO90／07572（1990年7月12日発行）に記述されているELISA、RIAのような許容されたDNアーゼの検定、32P-標識DNAの加水分解、又はPAGE電気泳動もしくは寒天平板DNアーゼ検定（Smith等、Applied Microbiology 18:991［1969］）で生物学的に活性であることが知られているようなヒト及び非ヒトの動物DNアーゼの全ての種類に種々属するもので、且つ天然の源から得られたものであろうと、化学的に合成されたものであろうと、又は組換えDNA工学の技術によって生成されたものであろうと、成熟型（mature）、不活性型（pro）、又はメット型（met）のDNアーゼを含むものとする。
組換えヒトDNアーゼ（rhDNアーゼ）作製についての完全な記述（そのcDNA及びアミノ酸配列と表現を含む）は、Shak等、PNAS 87:9188-9192［1990］）及びWO90/07572に示されている。例えば、ウシ、ブタ、及び羊を含む非ヒトの動物DNアーゼは、Liao等（J. Biol. Chem. 248:1489［1973］）;Salnikow等（J. Biol. Chem. 248:1499［1973］）;Liao等（J. Biol. Chem. 249:2354［1973］）;Paudel等（J. Biol. Chem. 261:16006［1986］）;及びPaudel等（J. Biol. Chem. 261:16012［1986］）に開示されている。
用語DNアーゼは、当業者に公知であろうと将来利用できるようになるものであろうと、種々にグリコシル化された型と他の変異型及びそのようなDNアーゼの誘導体を包含する。そうした変異型の例は、対立遺伝子（alleles）であり、残基が削除、挿入及び／又は置換される部位指定型（site directed）突然変異誘発の生成物である。好ましくは、変異型はヒトに免疫原性がない。変異型は、より大きい酵素活性、改善された溶解度をもっていてよく、又は宿主細胞によってより高いレベルで表現してよい。
DNAコード化ヒトDNアーゼは、生体外の方法で合成されるか、又は上記のShak等によって説明されたようにヒトの膵臓cDNAライブラリから容易に得られる。rhDNアーゼの表現型は、上記のShak等及びWO90/07572に記述されている。
ヒトDNアーゼは、必要な補因子と共に治療処方化され、ウシ膵臓DNアーゼのような動物のDNアーゼの場合に採られた方法と同じやり方で随意に投与される。ヒトDNアーゼの好ましい処方化は、緩衝液又は非緩衝液であり、好ましくは、pH7の1.0mMカルシウムを含有する150mM塩化ナトリウムのような等張食塩水である。塩化ナトリウムの濃度は、75mMから250mMまでの範囲にあってよい。カルシウムの濃度は、0.01から0.05mMの範囲でよく、DNアーゼを安定化する他の二価カチオンが含まれるか又はカルシウムと置換されてよい。pHは、5.5-9.0の範囲でよく、含まれる二価カチオンと相溶性の緩衝液も用いてよい。これらの溶液は、例えば感染気道分泌物に関連した呼吸器病を患っている患者の気道又は肺に直接投与するのに有用なジェットネブライザ及び超音波ネブライザを含む市販のネブライザに使用するのに特に適している。処方化は、同じくカルシウムを含有する凍結乾燥粉末であってよい。
ジェットネブライザ及び超音波ネブライザを含む液体処方用の市販のネブライザは、投与に役に立つものである。液体処方は直接噴霧してよく、凍結乾燥粉末は復元後噴霧する。あるいは、DNアーゼは、過フッ化炭素の製剤形態と規制用量吸入器を使って霧状に分散させるか、又は凍結乾燥粉末及び粉砕粉末として吸入してよい。
精製されたDNアーゼは、唾液の粘弾性率の酵素変性に用いられる。ヒトDNアーゼは、急性又は慢性の気管支肺病（伝染性肺炎、気管支炎又は気管気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、喘息、TB又は菌感染）、気管または気管支の閉塞、及び気管開口術の複雑化に起因するアテレクターゼのような状態にあって異常な、粘りのある又は濃くなった化膿性分泌物を有する肺病患者の治療に特に有用である。そのような治療には、ヒトDNアーゼの溶液又は細かく割った乾燥製剤を気管支に従来のやり方で、例えばDNアーゼの溶液の霧状分散によって、滴下する。
唾液試料の生体外rhDNアーゼ処置の化学作用は、上記のShak等及びWO90/07572の処理に続いて行うアガロースゲル電気泳動を用いて確認することができる。
DNアーゼはまた、上に挙げた状態を処置するのに用いられる他の薬理学的薬剤、例えば抗生物質、気管支拡張剤、抗炎症剤、及び粘液分解剤、例えばn-アセチルシステイン、と一緒に投与してもよい。
DNアーゼ治療を必要とする哺乳動物患者は、感染気道分泌物に関連した呼吸器病にかかっているそれらの患者である。
感染気道分泌物に関連した呼吸器病にかかっているヒトの患者の処置に使われるDNアーゼの治療上有効な量は、患者体重のキログラム当たりヒトDNアーゼ約1μgから約100mgの用量であり、ここに説明されるように、製薬組成物とともに投与される。DNアーゼの治療上有効な量は、例えば、治療対象、投与経路、及び患者の状態によって左右されるであろう。従って、臨床医は最適治療効果が得られるよう所要用量を規定し、投与経路を変更することが必要となろう。
呼吸器病患者の唾液中のDNA
多くの呼吸器病では、唾液のデオキシリボ核酸（DNA）含量は、化膿の程度に応じて増加する（Picot等、Thorax 33:235-242［1978］）。高レベルの分泌物が唾液DNAレベルの増加と関連しているCFの場合が特にそのケースである（Carswell等、Eur. J. Respir Dis 65:53-57［1984］）。呼吸器病の患者の唾液試料から採ったDNAの性質には固有の変化性がある。
DNAは、粘液の糖タンパク質を含む唾液の他の成分との相互作用を通して唾液の粘弾性率に影響を与える。
呼吸器病の患者の唾液に存在するDNAは、感染している器官からか又は患者自身の細胞から源を発する（Lethem等、Eur. Respir J.,3:19-23［1990］）。もし宿主細胞が全ての唾液のDNAに対する主因であるなら、これは、炎症に起因して含まれる白血球と上皮細胞の含量を反映している。上記のLethem等は、粘液の糖タンパク質と共純化（co-purifying）するDNAは、起源がヒトであり、それは、感染そのものというよりはむしろ感染から生ずる炎症プロセス（CF唾液中のDNAの源）であることを示唆するものだと報告している。
呼吸器病における抗生物質の使用
呼吸器病の患者の気道に化膿性の呼吸分泌物が存在することは、微生物には最良の成長培地となり、正常な宿主防御機構にもかかわらず肺感染が普通である。抗生物質の使用は、これらの感染を防ぐために必要である。
嚢胞性線維症（CF）の患者の唾液から分離される最も一般的な3つのバクテリア病原体は、黄色ブドウ状球菌（Staphylococcus aureus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、およびインフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）である。プロテウス及びクリブシェラの種類はそれほど頻繁には観察されない。これらのバクテリアの存在は、嚢胞性線維症の患者の肺におけるいくつかの破壊的変化の原因となると思われる。
慢性蓄膿症もまたCFに見られるが、排液を妨げる腔溝の障害物に起因すると思われるもので根元的な肺病とは関係がない。これらの蓄膿症の場合に一般的に分離されるバクテリアには、緑膿菌、インフルエンザ菌、連鎖球菌（streptococci）、及び嫌気性菌（anaerobes）がある。
CFに抗生物質を使うことは、議論のあるところであり且つ困難に満ちているが（Pharmacotherapy:a Pathophysiologic Approach ,DiPiroとTalbert等編集、出版：Elsevier New York, pp 836-843［1989］）、ほとんどの臨床医はCFに関連した肺感染を抗生物質で処置している。特別の治療は、証明されたか又はありそうな病原体、例えば緑膿菌及び黄色ブドウ状球菌に向けられており、通常、アミノ配糖体と範囲拡張のペニシリンを含む。病原体の完全な根絶は抗生物質治療における実行上の最終点であるが、緑膿菌の全体的根絶は希であり且つ一時的である。それ故、抗生物質使用の実際の終点は、悪化する以前の臨床状態又は肺機能状態へ再び戻ることである。
CFに抗生物質を使うことに関連した他の問題は、ほとんどのCFの患者でいくつかの抗生物質の薬物速度論的処理が変わることである。多くのCF患者は、多くの抗生物質に対して全身浄化量（total body clearance）が上昇しており、従って治療密度を得るためにはこれらの薬剤のより高い用量が必要であろう。残念ながら、これらの薬物速度の変更は固定しておらず、又は予想できないものである。用量の高い方への調整は、ある程度の注意をもって行うべきであり、その後で血清濃度についての測定を行わなければならない。
慢性気管支炎に抗生物質を使用することについては議論があるが（於Pharmacotherapy: a Pathophysiologic Approach：編集DiPiroとTalbert等、出版Elsevier New York, pp 1092-1095［1989］）、慢性気管支炎の治療に最頻度で選択される抗生物質（アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、トリメトプリム-スルファメトキサゾール）は、通常の唾液分離体、H型インフルエンザ（H.influenzae）、S型肺炎（S.pneumoniae）、及びM型肺炎（M.pneumoniae）に対して生体外活性を有する。
肺炎の治療には多数の抗生物質が利用できる。ひとたび原因となる病原体（病原体群）が同定されてしまえば、抗生物質の養生法は、同定された特定の病原体（病原体群）を標的とすることができる。肺炎の治療に有用な抗生物質は、限定はしないが、エリスロマイシン、アンピシリン、ペニシリン、半合成ペニシリン、テトラサイクリン、セフロキシム、セファロスポリン、クリンダマイシン、アミノ配糖体、及びチカルシリンである。特異的に指向される治療用の抗菌剤の完全な列挙は、The Medical Letter Handbook of Antimicrobial Therapy（於Pharmacotherapy: a Pathophysiologic Approach,編集DiPiroとTalbert等、出版Elsevier New York, pp 1100-1105［1989］）で見付けることができる。
ここで用いる用語"流動学"（rheology）及び文字通りのその派生語は、物質の変形及び流動性に関連している。唾液のような粘弾性物質に関しては、流動性は粘性と弾性に基づいている。
粘液の流動学的性質の検討のために、何種類かのレオメーターが用いられてきた。回転式レオメーターは、同軸シリンダか（Davis "Pheological Examination of Sputum and Saliva and the Effect of Drugs, 於：Gabelnick HL, Litt M, 編集 Rheology of Bioloical Systems. Springfield, Il: Charles C Thomaspub pp158-193［1973］）、円錐平板（Mitchell-Heggs "Physical Properties of Microliter Quantities of Normal Mucus"於：Elstein and Parke Eds. Mucus in Health and Disease. Advances in Exerimental Medicine and Biology vol 89.New York: Plenum Press, pp. 203-215［1977］）、又は平行円盤センサ系（Puchelle Biorheology 21:265-272［1984］）かを備えている。これらのレオメーターは、一定の回転速度で使用でき、または振動モードで使ってもよい。これらのレオメーターは、繊毛に推定される値の200-1000倍のせん断ひずみを使うことが必要となる。これらの高せん断率は、生体内条件と相関させるのはほとんど不可能である。
円錐平板レオメーターでは、被験流体は、円錐と平板の間に置く。これらの2枚の圧板のうちの1つは回転させ、これによってせん断率として知られているせん断力が加えられる。液体の粘性が大きければ大きいほど、その中で大きい応力が生じ、それが上方の圧板に導かれ、せん断応力として測定される。従って、粘性は、せん断率に対するせん断応力の比として計算される。ひずみパーセントは、円錐と平板間の間隔単位での振動の振幅を表す。それ故、ひずみパーセントが低いほど、振動振幅は低くなり、そして唾液試料に与える損傷は小さくなる。
磁気式レオメーターは、繊毛に推定されるそれらの10-50倍の、小さいひずみを誘導できる微小寸法の強磁性粒子を用いて開発されたものである。磁気式レオメーターでのデータの生体内相関は回転式レオメーターでのそれより良好であるが、磁気式レオメーターは実験的に複雑であり、日常の試験には適しない。また、磁気式レオメーターからのデータの数学的解析には、デジタル計算機を使わなければならず、日常の臨床的用途には向かない。
毛管レオメーターは、小試料についての生理的流体粘性と弾性を測定する為に使われてきた。粘性は、既知の圧力降下に応答する流体の流速を測って測定する。回復可能なせん断ひずみは、この差圧がゼロに戻る時に決められる。これらの装置で毛管中に流体の流れを誘導するために加えられるひずみは、繊毛で作られると推定されるそれらの約10,000倍であり、従って生体内条件とは相関しない（上記Yeates等）。
唾液の流動学的性質
気道の機械的取除き（クリアランス）は、粘液繊毛輸送系を経て起こり、その機能は主として2つの主要要素の相互作用に依存する:系の運動性要素に対応する繊毛と輸送要素である粘液。分泌物は、繊毛の作用により呼吸気通路のライニング膜に沿って推進される。粘液は2-層系から成る:下方、繊毛周縁（periciliary）とも呼ばれる非粘着性層、上方、ゲル粘弾性層。Puchelle（Biorheology 21:265-272［1984］）は、粘液繊毛輸送速度は、繊毛周縁層の粘性の増加につれて減少するであろう。気道の感染分泌物で特徴付けられる呼吸器病患者の呼吸粘液の粘性と弾性が増加すると、彼らが気道から分泌物を取り除くことは困難となり、従って肺不全、肺感染、及び死の原因となる。
粘性、即ち変形に抗する物質の力は流体の流れ挙動に影響を及ぼす最も顕著な性質である。粘性は、流速に依存してひずみ応力の量を引き出し且つ維持すること、従って流れに対し連続した抵抗力を与えることを可能にするような流体又は半流体のそんな性質である。
粘性についてのニュートンの法則によれば、単位面積当りのこの力は、層間の速度勾配に比例する。故に、τ=μγ、ここでτ=せん断応力、μ=粘性、γ=せん断率である。この挙動に従う流体は、ニュートン流体と記される。
非ニュートン流体は、粘性についてのニュートンの法則に従わず、従って粘性はそのせん断率で決まる。粘性はせん断（ずれ）の増加につれて減少する。せん断は、隣合った層のそれに比例した層の動きである。唾液は、非ニュートン流体の一例である。唾液にせん断応力が加えられると、ゲルのように振る舞い、概略、加えられた応力に比例して変形するであろう。せん断ひずみは、唾液層の深さと比べた表面移動距離の比であり、従って無次元（dimensionless）である。
弾性は、せん断力を受けた時、エネルギーを保存しようとする、又は変形に抵抗しようとする唾液の能力を指す。極く小量加えられた応力で著しく変形するが、それにもかかわらずその元の形状に戻るような流体は、非常に弾性的であると呼ばれる。rhDNアーゼ処置以前の唾液試料は、粘性より大きい弾性を示すが、rhDNアーゼ処置以後は、実質上、その差は少なくなる。両方とも減少するとはいえ、弾性は粘性よりも大幅にrhDNアーゼ処置で影響を受ける。弾性は、全DNA濃度に依存しない。しかし、高分子量のDNAの量と弾性測定値の間にはある関係が存在している。
粘弾性の性質は、唾液を含む生理的流体で示される粘性と弾性の結合した性質を指す。Lethem等（Eur Respir J. 3:19-23［1990］）は、CFの唾液の粘弾性は、外因性DNAの添加の後では増加することを示し、上記のPicot等は、唾液の粘弾性は、DNAの含量には依存しないが、加水分解されていない長鎖の小牛胸腺DNAの生体外添加で大いに増えることが見出されたことを示した。
唾液の乾燥重量パーセントは、唾液試料を160℃で2時間乾燥後に存在している固形物の百分率での値である。乾燥重量パーセントは、乾燥後の失った重量%を100から差し引いて計算した。
ここで用いられる用語"唾液"（sputum）は、呼吸気道からの唾液と放出物から作られた喀出物質を指す。唾液は、顕著なゲル様構造を有する非ニュートンの極めて複雑な物質である。化膿性である唾液は、粘液の糖タンパク質とDNAの両方に起因する増加粘弾性を有し、炎症の流体生成物例えば、白血球及び死亡細胞の破片で特徴付けられる。化膿性唾液の流動学的性質には固有の変化性がある。
本願発明の検定に使用される唾液を採集するため、Byrne等（Laboratory Tests:Implications for Nursing Care第2版，編集Byrne等、出版Addison-Wesley California［1986］）は、患者が数回の深い咳で出た物質を蓋付きの容器に採集することを提案している。あるいは、唾液は、Kim等（Bull. Europ. Physio-path Resp. 18:915-927［1982］）に記載されているように気管支鏡を使って採集してもよい。
遠心分離
遠心分離は、液体から固体を又は別の液体から1つの液体を分離するために用いる。遠心分離はまた、重い相から軽い相を安定させるため又は重力を強くして懸濁している固体をふるい分けるためにも用いられる。
遠心分離は、中心点の回りを一定半径で回転する物体は力を受けるという原理を利用できるよう選定される。物体の速度は一定だが、その方向は連続的に変化し、物体は回転の中心方向に求心力を受ける。
遠心分離は、一般的に、その成分に遠心力が作用する回転子又はボールと、ボールをその軸の回りに駆動・回転させる系と、その系を支える骨組み構造と、回転子を収容し分離した生成物を別々に保持する囲いとから構成される。
工業上の遠心分離では、遠心加速度は重力の加速度より何倍も大きい。遠心力は、回転速度及び回転中心からの半径距離で変わる。
rhDNアーゼの用量
本願発明において、コンパクション検定で活性を示す最小の生体外rhDNアーゼ濃度は、1μg rhDNアーゼ/mL唾液であった。現行のrhDNアーゼの用量フォーム、0.25mg/mLを使い、さらに0.5mLの処方が実際に肺に分配され且つrhDNアーゼの濃度がその上に乗せられる唾液容積が100mLであると仮定すれば、生体内の最終濃度は1.25μg/mLであると見積もることができる。
1mg/mLと4mg/mLのrhDNアーゼ溶液を使用する臨床的研究では、CF患者の肺機能が増大する結果となった（上記Aitken等及び上記Hubbard等）。10mgのrhDNアーゼを吸入の後で、吸入後1時間に採集された唾液中のrhDNアーゼの濃度は、典型的に1-20μg/mLの範囲であった。これは生体外データと一致しており、処方でのrhDNアーゼの濃度は、唾液の粘弾性を減ずる効果をもたすには十分であることを暗示している。最小しきい値を超えるrhDNアーゼ濃度は、唾液特性とエアロゾルの堆積の変動を考慮するためには望ましい。
ここで用いられる用語"治療薬"（therapeutic）の用法は、感染気道分泌物に関連した呼吸器病の治療に効力があるような薬剤を指し、それには、限定はしないが、抗生物質、DNアーゼ、粘液分解剤、抗好中球エラスターゼ剤、及び分泌性白色プロテアーゼ阻害剤がある。
本願発明のなおいっそうの詳細は、次の非限定実施例で説明する。
実施例1
rhDNアーゼで処置したCF患者の唾液のコンパクション検定
この実施例は、感染気道分泌物で特徴付けられる呼吸器病を患っている患者からの化膿性唾液の生体外DNアーゼ処置によって試料中に存在する長鎖DNAが加水分解され、その結果唾液の粘性が減少する、ということを示している。この実施例は、本願発明のコンパクション検定からの結果は、平板円錐レオメーターから得られた流動学的測定値と相関する、ということを示している。
試料の特性付け及び試験溶液
rhDNアーゼー未実施嚢胞性線維症（CF）の入院患者から得た化膿性唾液試料は、DNA評価及び流動学的分析ができるようアリコート（aliquot）に分割した。全DNAの含量と長さを調べるためのアリコートは分析するまで凍結し、流動測定用のそれらは試験するまで（採集して24時間以内）冷蔵した。唾液の乾燥重量は、160℃で2時間乾燥した後で重量測定した。乾燥重量パーセントは、乾燥後の失った重量%を100から差し引いて計算した。DNアーゼIの遺伝子は、上記のShak等［1990］の説明のようにGenentech社でクローン化され、発現された。発現されたrhDNアーゼは、1mM CaCl2及び150mM NaClに溶かしたpH 7.4の4mg/mL溶液として用いた。コントロールの添加、"希釈剤"と呼ばれる、及び4mg/mLのrhDNアーゼの希釈は、rhDNアーゼのない同じ塩溶液を用いた。
全DNAの含量と長さの検定
唾液試料のDNA含量は、KissaneとRobins（J Biol Chem 233:18-188［1958］）によって開発された、長さとは無関係に全DNA濃度を定量化するジアミノ安息香酸（DABA）検定法を改良して測定した。前もって凍結した唾液アリコートを検定希釈剤（25mM HEPES, 1mg/mLのウシ血清アルブミン、4mM CaCl2, 4mM MgCl2, 0.05%ポリソルベート20,及び0.01%チメロサール, pH 7.5）で10倍に希釈し、60℃で1時間保温した。希釈した試料（50μL）を微小滴定プレートウエルにピペットで採り、50μLの20% 3,5-ジアミノ安息香酸塩酸塩（DABA）溶液を添加し、その後プレートを漏れないよう密閉した。60℃で1時間保温後、50μLの5N HClを添加して反応を停止させた。プレートを読むためにCytofluor（Millipore社）微小滴定プレート蛍光光度計（390nm励起及び530nm放射フィルタ付き）を用いた。Salmon tests DNA（Sigma）を用いて標準曲線を設定した。0.125から8mg/mLまでの唾液のDNA濃度を測定した。その検定に対する変分係数は≦6%であると決められた。
唾液試料中のDNAの長さは、上記のShak等の説明のようにアゲロースゲル電気泳動により定性的に決定した。唾液DNAの長さに及ぼす凍結の効果は、-70℃での1サイクルの凍結をする場合としない場合で試料を電気泳動することにより検討した。試料は、100mM NaCl, 5mM EDTA, 0.5% SDS, 100μg/mLプロテイナーゼK（proteinase K）（Sigma）, 50mM Trisを含有する緩衝液pH 8.0で4倍に希釈し、時折混ぜ合わせながら37℃で3時間保温した。次いで、試料を0.5%アガロースゲルで電気泳動し、標準の手法（Sambrook等、MolecularCloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press［1989］）を使って臭化エチジウムで染色した。分子量の標準として500bpと12Kbの間に12主帯（major bands）を有する1Kb DNAラダー（Gibco/BRL 5615SA）を用いた。
流動測定（Rheometry）
唾液の流動測定は、0.02ラジアン、25mm半径の円錐平板ツールを備えたRheometrics流体レオメーター（RFR-7800, Rheometrics社. Piscataway, NJ）を使って外界温度で実施した。ほぼ0.8mLの唾液をプレート上に置きその上に25μLの希釈剤又はrhDNアーゼを層にして乗せた。円錐を試料の上まで下げ、一方、底板を5rpmでゆっくりと回転させて円錐と平板間の間隙全体に試料が均一に分布するようにした。試料周縁が乾くのは、0.1ポアズのシリコン油（Dow Chemical）を円錐の露出した周縁上にピペットでかけて防いだ。平板の回転を5分間停止して試料を緩和させた。各試料を10ラジアン/秒の変形率で試験し、ひずみパーセントを10%づつ増やして10%から200%まで変化させた。ひずみパーセントは、粘度計の円錐と平板間の空間で分割されたせん断運動距離の100倍として定義される。第二のひずみ値、20%ひずみ（正確な測定をするための可能な最低ひずみ）は、試料と処理法との間の比較に用いた。装置の始動によってしばしば最初のデータ点が外れ、高めのひずみでネットワーク構造が損傷を受けることがあり（Ferry, J Viscoelastic Properties of Polymers. 3rd ed. John Wiley and Sons, Inc. New York pp. 245-［1980］）人為結果で且つ再生不能のデータとなる。
コンパクション検定
約100μLの唾液を容積式ピペットで風袋を計ったEppendorf微小遠心機管に移した（Gilson Microman（商標）、ステンレススチールシャフト及びプラスチックプランジャー付き）。rhDNアーゼかコントロール希釈剤を容積が正確な唾液試料の重量の50%に等しくなるよう加えた。Eppendorf管を15秒間強く渦巻運動させ、次いで外界温度で15分間保温した。処理した唾液のアリコートをKimax-51, 1.5-1.8 x 9Omm融点毛管（Kimbie Products）に50μLのドラモンド（Drummond）ガラス毛管（Microcaps）を使って充填した。充填した管は、水平ヘマトクリット式ロータヘッド（Heraeus Sepatech）を装備したBiofuge A微小遠心機（Heraeus Sepatech GmbH）で12,000rpm-20分間遠心分離し、続いて上澄み／ペレット界面の分離具合を調べた。上澄みーペレット界面を明確に分離するのにさらに20分未満を要する試料も時折あった。これらの場合は、ロータに充填した全試料は、それより長い時間遠心分離した。毛管に充填した材料の全高とペレット高はミリメートルで測った。ペレットパーセントの計算は、充填した材料の全高でペレット高を割り、100を乗算して行った。
結果
代表的唾液試料に関して動的円錐平板粘度計によりひずみの関数として測定した粘性及び弾性率を図4に示す。rhDNアーゼを減らした治療により試験したひずみ範囲を越える粘性値が測定されたが、弾性はさらに大きく影響を受けた。CF唾液のrhDNアーゼ効果に対するより劇的な流動基準として弾性を使い、6つの化膿性試料のいくつかの物理的特性を評価し、それを図5に提示する。動的円錐平板レオメーター及びコンパクション検定によって査定された全DNA濃度、平均乾燥重量パーセント、rhDNアーゼの処置に対する反応性から、6つの全ての試料はかなりのDNA含量を有するがrhDNアーゼ処置に対する反応性は一定ではないことが示された。以前の研究、上記Rosenbluth等に一致して、唾液試料の乾燥重量パーセントは、初期弾性又は初期粘性のどちらとも相関しない。
図2に示すアガロースゲルから、rhDNアーゼ処置に先立ち、6つの全ての試料は極めて大きいDNAの可変量を有することが示される。大き過ぎてゲルに入り込むことができず、塗布位置に保持されたDNAもある。比較的小さいDNAフラグメント（約500の塩基対から12kb以上まで変化）は、分離することができた。6つの全ての唾液試料は、36mcM rhDNアーゼと共に25℃で20分間保温した後は完全な加水分解（500塩基対を下回る）を示した。
全DNAは、図6に示すように、コンパクション検定において希釈剤添加及び遠心分離した後は、これらのrhDNアーゼー未実施試料の上澄み液でよりペレット画分でかなり大きい範囲まで検出された。これらのrhDNアーゼー未実施試料のペレットと上澄み液間のDNA分布の比は、広範肥であることが示された。試料4と6はペレットの最大画分を有しており、このことは、これらの同じ2つの試料が最大比率の大分子量のDNAを有することを示唆したアガロースゲル電気泳動の検討（図2）と相関した。試料3は、それに続く最高のペレット/上澄み液DNA比を有し（図6）、且つ定性的にもその次の最高量の大DNAを有していた（図2）。試料1、2、及び5は最低のペレット／上澄み液DNA比を有し、且つ明らかにより小さいサイズのDNAを有していた。
rhDNアーゼ処置に続き、6つの全ての試料は、コンパクション後はペレットから上澄み液まで全DNAの再分布を示した（図6）。この観察はアガロースゲルのデータと一致しており（図2）、これらの各々の試料についてDNAの劇的減少を表示している。
rhDNアーゼまたは希釈剤のどちらかの添加に続くコンパクション検定において得られた6つのCF唾液試料についてのペレット高パーセントを図3に示す。このデータ（並びにその他のCF唾液試料からのデータ）は、動的円錐平板レオメーターで得られた弾性測定値と相関できるものである（図8）。これらの結果は、共に、コンパクション検定は化膿性CF唾液に対するrhDNアーゼ作用の有用な指標であることを示唆している。コンパクション検定は、CF唾液試料に対するrhDNアーゼ作用の用量応答曲線を得るために用いられた（図7）。このデータを合わせてみると、rhDNアーゼはCF唾液が0.1μg/mL以下では効果としては最低であり1μg/mL以上で最高に有効であることが示唆される。
前述の説明により、熟練した当業者が本願発明を十分実施できるものと思う。前記のものは特定の望ましい実施態様に属するとはいえ、本願発明はそのように限定されるものではないことが理解されるであろう。発明の全体的概念から外れることなく開示された実施態様に種々の変更を成し得ることは、普通に熟練した当業者には思い当たるであろう。前述の全ての変更は本願発明の範囲内にあるものとする。
配列表
(1)一般情報：
(i)  出願人：  ジェネンテック  インク．
(ii)  発明の名称：  呼吸器病治療の査定用コンパクション検定
(iii)  配列番号：１
(iv)  問い合わせ先：
(A)  あて先：  ジェネンテック  インク．
(B)  通り：    460ポイント  サン  ブルーノ  ブルーバード
(C)  市：      サウス  サンフランシスコ
(D)  州：      カルフォルニア
(E)  国：      アメリカ合衆国
(F)  郵便番号：94080
(v)コンピュータ読み取り形式：
(A)  媒体形式：  5.25インチ、360Kbフロッピーディスク
(B)  コンピュータ：  IBM PC互換機
(C)  オペレーティングシステム：  PC-DOS/MS-DOS
(D)  ソフトウェア：  パティン（ジェネンテック）
(vi)現行出願データ：
(A)  出願番号：
(B)  出願日：
(C)  分類：
(vii)先の出願データ：
(A)  出願番号：
(B)  出願日：
(viii)弁護士／代理人情報：
(A)  名前：  ジョンストン，シーン  エイ．
(B)  登録番号：35,910
(C)  参照／訴訟人番号：792C1
(ix)通信情報：
(A)  電話：  415/225-3562
(B)  テレファックス：  415/952-9881
(C)  テレックス：  910/371-7168
(2)SEQ ID NO:1に関する情報
(i)配列の特徴：
(A)  長さ：  1039塩基
(B)  型：  核酸
(C)  鎖型：一本鎖
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列表示：SEQ ID NO:1:
0004077873.tif 000002
0004077873.tif 000003
0004077873.tif 000004
【図１Ａ】
0004077873.tif 000005
【図２】
0004077873.tif 000006
【図１Ｂ】
0004077873.tif 000007
【図３】
0004077873.tif 000008
【図４】
0004077873.tif 000009
【図５】
0004077873.tif 000010
【図６】
0004077873.tif 000011
【図７】
0004077873.tif 000012
【図８】
0004077873.tif 000013