(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８０−９９％の初期生存率を有する低温保存された肝細胞を含む、人工肝臓維持システムであって、ここで低温保存された肝細胞が以下の工程を含むプロセスにより低温保存される、前記人工肝臓維持システム：
ａ．肝細胞を冷凍コンテナに分配すること；
ｂ．上述のコンテナを、以下のようにプログラムされた変温速度調節フリーザー中で、−５０℃から−９０℃の間に冷凍すること：
（ｉ）試料の温度が−４℃に達したときに変温速度の調節を開始し、
（ｉｉ）潜熱の放出（−１２℃）前は毎分１−１０℃の間の冷却速度であり、
（ｉｉｉ）潜熱の放出の間は、庫内温度を、温度が−６０から−７０℃の間に低下するまで毎分２５℃の割合で低下させ、その後庫内温度を毎分１５℃の割合で−１２℃から−２０℃の間まで即座に上昇させ、
（ｉｖ）その後、最終の凍結温度である−５０から−９０℃の間に到達するまで、毎分１−１０℃の冷却速度で冷却を続ける
ｃ．上述のコンテナを液体または蒸気窒素中で保存すること；
ｄ．使用準備ができた時に上述の低温保存された肝細胞を解凍すること；および
ｅ．残余の凍結防止剤含有培地を除去すること。
【請求項２】
低温保存された肝細胞が新鮮な細胞の５０−８０％の代謝活性を有する、請求項１に記載の人工肝臓維持システム。
【請求項３】
低温保存された肝細胞が５０−８０％のジアゼパム代謝活性を有する、請求項１に記載の人工肝臓維持システム。
【請求項４】
６５−８５％の初期生存率を有する低温保存された肝細胞を含む肝臓維持装置からなる人工肝臓であって、ここで低温保存された肝細胞が以下の工程を含むプロセスにより低温保存される、前記人工肝臓：
ａ．肝細胞を冷凍コンテナに分配すること；
ｂ．上述のコンテナを、以下のようにプログラムされた変温速度調節フリーザー中で、−５０℃から−９０℃の間に冷凍すること：
（ｉ）試料の温度が−４℃に達したときに変温速度の調節を開始し、
（ｉｉ）潜熱の放出（−１２℃）前は毎分１−１０℃の間の冷却速度であり、
（ｉｉｉ）潜熱の放出の間は、庫内温度を、温度が−６０から−７０℃の間に低下するまで毎分２５℃の割合で低下させ、その後庫内温度を毎分１５℃の割合で−１２℃から−２０℃の間まで即座に上昇させ、
（ｉｖ）その後、最終の凍結温度である−５０から−９０℃の間に到達するまで、毎分１−１０℃の冷却速度で冷却を続ける
ｃ．上述のコンテナを液体または蒸気窒素中で保存すること；
ｄ．使用準備ができた時に上述の低温保存された肝細胞を解凍すること；および
ｅ．残余の凍結防止剤含有培地を除去すること。
【請求項５】
肝臓維持装置が、微小な担体、平板状の膜、中空の繊維、充填したゲルベッド、流動床、または撹拌槽を含む、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項６】
新鮮な細胞の５０−８０％の代謝活性を有する低温保存された肝細胞を含む、請求項４の人工肝臓。
【請求項７】
肝細胞を冷凍コンテナへ分配するのに先立って、凍結防止培地を調製し、且つ肝細胞を上述の培地に懸濁する工程をさらに含む、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項８】
凍結防止剤がＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール、アミノ酸、またはプロパンジオールである、請求項７に記載の人工肝臓。
【請求項９】
肝細胞の培養培地がチーズ必須培地、修飾イーグル培地、ダルベッコの修飾イーグル培地、ライボビッツ培地、ウェイマス培地およびクレブス培地である、請求項７記載の人工肝臓。
【請求項１０】
肝細胞の培養培地が、チミジン、アルギニン、インシュリン、デキサメタゾン、グルタミン、および哺乳動物の血清を加えたチーズ必須培地である、請求項７記載の人工肝臓。
【請求項１１】
哺乳動物の血清が、ウシ胎児血清、子牛血清、および／またはブタ血清を含む、請求項１０記載の人工肝臓。
【請求項１２】
哺乳動物の血清が、１０−９０％の範囲の濃度であるウシ胎児血清、子牛血清、および／またはブタ血清を含む、請求項１１記載の人工肝臓。
【請求項１３】
約１０から約１５％の範囲のＤＭＳＯ、約３．５から約１５％の範囲のアルブミン、および約１０から約２０％の範囲のグリセロールをさらに肝細胞の培養培地に加えた、請求項１０記載の人工肝臓。
【請求項１４】
肝細胞の培養培地が、５−２０％のウシ胎児血清および５−１５％のジメチルスルホキシドを加えたチーズ必須培地である、請求項７記載の人工肝臓。
【請求項１５】
冷凍コンテナがガラスビン、バッグ、またはカンである、請求項４記載の人工肝臓。
【請求項１６】
上述の冷凍コンテナ内の低温保存された肝細胞の濃度が約５から約４０×１０6細胞／ｍｌである、請求項４記載の人工肝臓。
【請求項１７】
上述の冷凍コンテナが、冷凍プレートの間に挟み込まれる、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項１８】
冷凍プレートがスペーサー手段により隔離されている、請求項１７に記載の人工肝臓。
【請求項１９】
氷点以下に冷却された後に、肝細胞に核形成を与える工程をさらに含む、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項２０】
核形成の提供が上述の冷凍コンテナへの低温金属棒の挿入により達成される、請求項１９に記載の人工肝臓。
【請求項２１】
核形成の提供が上述の冷凍コンテナへの液体窒素の噴射の導入により達成される、請求項１９に記載の人工肝臓。
【請求項２２】
潜熱の放出が窒素の噴射により補償される、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項２３】
変温速度調節フリーザーが確認装置をさらに含む、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項２４】
肝細胞が−１２０℃以下の温度で保存される、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項２５】
肝細胞が３７−４２℃の水浴で解凍される、請求項４に記載の人工肝臓。
【請求項２６】
半解けの氷が現れた時に細胞を水浴から取り出し、続いて冷却した培養培地を含む遠心管に注ぎ込む、請求項２５に記載の人工肝臓。
【請求項２７】
遠心管内の細胞懸濁液の最初の量を、最初の細胞量の５から１０倍の新たな冷却した培養培地を加えることにより希釈する、請求項２６に記載の人工肝臓。
【請求項２８】
懸濁液を続いて７−１５ｇで２−５分間遠心して落とす、請求項２７に記載の人工肝臓。
【請求項２９】
残余のＤＭＳＯが除去される、請求項２８に記載の人工肝臓。
【請求項３０】
約２から約４倍の新鮮な培地が細胞懸濁液に加えられる、請求項２９に記載の人工肝臓。
【請求項３１】
以下の工程：
ａ．肝細胞を冷凍コンテナに分配すること；
ｂ．上述のコンテナを、以下のようにプログラムされた変温速度調節フリーザー中で、−５０℃から−９０℃の間に冷凍すること：
（ｉ）試料の温度が−４℃に達したときに変温速度の調節を開始し、
（ｉｉ）潜熱の放出（−１２℃）前は毎分１−１０℃の間の冷却速度であり、
（ｉｉｉ）潜熱の放出の間は、庫内温度を、温度が−６０から−７０℃の間に低下するまで毎分２５℃の割合で低下させ、その後庫内温度を毎分１５℃の割合で−１２℃から−２０℃の間まで即座に上昇させ、
（ｉｖ）その後、最終の凍結温度である−５０から−９０℃の間に到達するまで、毎分１−１０℃の冷却速度で冷却を続ける
ｃ．上述のコンテナを液体または蒸気窒素中で保存すること；
ｄ．使用の準備ができた時に上記低温保存された肝細胞を解凍すること；および
ｅ．残存する凍結防止剤を含有する培地を除去すること、
を含む、肝細胞の低温保存方法。
【請求項３２】
冷凍コンテナ内の低温保存された肝細胞の濃度が約５から約４０×１０6細胞／ｍｌである、請求項３１の肝細胞の低温保存方法。
【発明の詳細な説明】
背景技術
本発明は、概ね細胞の凍結保存、および更に特別にブタ肝細胞の大量凍結保存に関連するものである。
肝臓は、巨大分子の合成、エネルギー製造および保存、有害物質の異化作用および処理に関連するさまざまな重要な機能を担い、中間代謝の産物を廃棄するという理由で、ヒトの生存にとって必須の器官である。肝臓が主要な役割を担っている生化学的な機能には、アミノ酸、アンモニア、タンパク質、炭水化物および脂質の代謝、生化学的な酸化作用、および薬物、ビタミンおよびホルモンの代謝および解毒作用を含む。前述のように、急性または慢性の肝臓損傷の場合は、予後に乏しい。
末期の急性または慢性の肝不全の治療法は、2つの範疇すなわち、いわゆる人工肝臓支持系（ALS）および正所性肝臓移植（OLS）に分類される。ALS法は、血液灌流、血液透析、血液透過および血漿搬出法を含む。これらの方法は代謝的な支持を供給しないため、不幸なことに生存率を改善していない。
対照的に、移植は1年生存率が50-90%である。しかし不幸にも、提供者（ドナー）の肝臓は高需要であるものの、低供給である。患者の15-30%は、提供者が見つかる前に死亡すると報告されている。
近年、ALSおよび肝細胞移植法が研究されている。障害を受けた肝臓における代謝機能の欠失を補う人工肝臓装置において使用するために、特に単離された肝細胞が研究されている。完全な肝臓移植ではなく細胞移植もまた、代替的な治療形態として研究されてきた。しかし両者とも効果的にするには、生存している肝細胞の大量凍結保存が必要である。
Shinichi KasaiおよびMichio Mitoは、”Large-scale Cryopreservation of Isolated Dog Hepatocytes”, Cryobiology 30, 1-11, 1993において、保存された肝細胞の生存率が75+/-3%、および推定回復率が約50%である単離法を説明している。さらに、アンモニアおよびフルクトース・ローディング試験、ATP含有量、C-14ロイシン取り込み量によって調べたところ、保存された肝細胞は新鮮な細胞の20-50%の代謝活性を示した。この技術は初歩段階であり、肝細胞の収率および生存率の両方における改善の余地が数多く残されている。
このように、生存している凍結保存肝細胞の高収率を提供するような、急性および慢性肝不全のための治療法を供給することが本発明の最初の目的である。さらなる目的は、生存している凍結保存肝細胞の高収率によって質の調節および生物負担試験を可能にすることを提供することである。
発明の概要
前述の目的は、肝細胞を凍結容器に分配し、その容器を摂氏マイナス50℃からマイナス90℃の間で凍結させ、その容器を液体または蒸気窒素内で保存し、使用に際して、凍結保存肝細胞を解凍し、および残った凍結保護剤を除去する工程を含む方法による、肝細胞の凍結保存を含む人工肝臓の提供という、新規および優美な手法により解決された。
発明の詳細な説明
本発明は、ALS装置における使用のための大量凍結保存肝細胞の使用を意図する。一度提供者（ドナー）および製品がすべての品質調節試験に合格すれば、治療施設により使用されることが可能である。使用直前に細胞は解凍され、ALS装置内に導入される。説明として挙げ、これに限らないが、本発明は、中空繊維、微小担体、平面シート膜などを含むALS装置を意図するものである。この肝細胞を含んだALSカートリッジは本質的には、提供者の肝臓が移植のために入手されるまで、または患者の肝臓が自己再生するまで肝臓機能を橋渡しする生体人工肝臓として働く。
単離された肝細胞は培養で数日または数週間のみしか生存可能でなく、およびハイブリッドALS装置におけるそれらの使用には長期の生存が必要であるため、長期間の凍結保存技術は不可欠である。さらに、長期間の凍結保存は以下の利点を提供する。すなわち、生物負荷、エンドトキシン、マイコプラズマ、細菌およびウィルス等の試験のための時間的ゆとりを与える、提供者動物の完全な組織学的試験にかかる時間のゆとりを与える、在庫産物および顧客への供給の管理を改善する、細胞試料または治療後に試験する細胞保存所の維持が可能になる、治療のための細胞の使用に先立つ細胞機能のスクリーニングを改善する等である。
ごく一般的に述べるなら、本発明は、凍結保護培地の調製、肝細胞のその培地への懸濁、その肝細胞の凍結安全容器への分配、その容器の液体または蒸気の窒素による特定の条件下での特定の時間の凍結、その容器の保存およびその細胞の使用時の解凍を含む凍結保存の方法を開示する。一般的に述べて、凍結保護物質は、凍結の間の細胞内の氷の形成などの凍結保存の有害な効果を最小化するために使用される化合物である。説明として挙げ、これに限らないが、DMSO,ポリエチレングリコール、アミノ酸、プロパンジオール、などが挙げられる。次に、前述の一般的な方法をより具体的に説明する。
肝細胞培養培地は文献によく記載されており、本発明の部分には含まない。さらに、本発明は、特定の培地に限定されるものではない。説明として挙げ、これに限らないが、以下の培養培地をあげることができる。Gibco, BRLライフテクノロジーズ・カタログ1993-1994に記載されているように、チーズ必須培地（Chee’s Essential培地）、修飾イーグル培地（Modified Eagle培地）、ダルベッコの修飾イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle培地）、ライボビッツ（Leibowitz），ウェイマス（Waymouth）およびクレブス（Kreb’s）培地など。
好ましい肝細胞培養培地は、液体窒素保存によって遭遇する過激な温度変化に最小限の細胞の崩壊で細胞が耐えられるものである。説明として挙げると、これに限らないが、チミジン、アルギニン、インシュリン、デキサメタソン、グルタミンおよび哺乳類血清により補われたChee’s modified Essential培地がある。哺乳類血清は、10から90%の濃度範囲のウシ胎児血清、子牛胎児血清、およびブタ血清を含む。この好ましい培地は、約10から約15%の範囲のDMSO、約3.5から約15%の範囲のアルブミン、および約10から約20%の範囲のグリセロールをさらに補ってもよい。
最も好ましい培地はChee’s Essential培地にウシ胎児血清（以下FBS）、ジメチルスルホキシド（以下DMSO）を加えたものを含む。さらに特に、凍結保護培地は約5から約20%のFBSおよび約5から約15%のDMSOを含む。最も好ましいものは10% FBSおよび10% DMSOを含む凍結保護培地である。
本発明はまた、いずれか一種類の既知の単離技術に依存するものではない。しかし、単に説明上の目的のためであるが、the ASAIO Journal 1995; 41:155-161およびSeglen, P.O. Preparation of Isolated rat liver cells. Prescott, D.M. ed Methods in cell biology. Vol.13. New York: Academic Press; 1976:29-83;（両方とも本明細書中に参照により援用される）に概要が記載されている技術があげられる。
単離された肝細胞は次に凍結のための準備がされる。それらは特定の密度で凍結耐性の容器に入れて冷凍庫に配置される。説明のために挙げ、これに限らないが、以下の凍結容器が挙げられる：バイアル、バッグ、缶など。好ましくは、プラスチックバッグであり、および最も好ましくは、約250から約500mlの範囲の容量を持つ、バクスターのプラスチックバッグ（Baxter plastic bags：商標名Cryocyte）である。
注射器の助けにより、凍結バッグへ分注することは最も好ましい。この方法では、細胞は重力により注射器を通過し、または穏やかな圧力によりバッグに注入される。一度細胞がバッグに注入されると、注射器は、過剰な空気を除去するための便宜のためにもまた使われ得、これにより後に解凍過程が促進される。その後バッグは封をされる。密封方法は機械的なアルミニウム封止、温度衝動の熱密封器、ルアーロックプラグなどを含む。熱密封が最も好ましい。この密封された容器は、凍結保存されるべきすべての容器が満たされ同時に凍結保存できるようになるまで、好ましくは摂氏0-4℃に保存される。
広い範囲の細胞密度、すなわち約5から約40x106細胞/ml、が前述の方法を用いて効果的に凍結保存される。体積の範囲が約10から約50mlのものは250ml凍結容器にて保存され、約50から約150mlのものは500mlの凍結容器にて凍結保存される。
核形成は、冷凍下で既に冷やされている溶液の調節的な結晶化または氷形成の誘導に用いられる技術である。核形成は氷形成に関連した傷害を最小化することが可能であり、それゆえに細胞の生存にとって利点となる。
本発明は任意の既知の核形成の方法を用いてもよく、低温の金属棒を凍結容器に挿入すること、凍結容器に液体窒素の風を導入することなどが挙げられる。
均一な凍結を確実にするために、本発明では所望により冷凍プレートの使用を考慮にいれている。冷凍コンテナを上述の冷凍プレートに挟み込む。上述のプレートは、鉄、アルミニウム等の任意の熱伝導物質からでも製造することができる。アルミニウムがもっとも好ましい。これも好ましくは、上述のプレートはスペーサー手段により分割する。スペーサー手段に関して言えば、本発明では、楔、バネ、ロール、クッション等を考慮に入れている。上述のスペーサー手段は0.25インチまでの厚さが好ましい。上述のスペーサーは、プレートと同一の材料、すなわち、鉄、アルミニウム等の熱伝導物質のいずれからでも製造することができる。アルミニウムがもっとも好ましい。アルミニウムは効率の良い熱伝導体であり、アルミニウムは冷凍のサイクル中に生じる潜熱の除去を助けるため、もっとも好ましい。細胞の損傷が凍結の際の温度の上昇により生じるために、潜熱の除去は重要である。さらに、アルミニウムは外部から与える氷の結晶核形成部位として作用する。これは結晶化を都合良く制御し、過冷却を防ぐ。要するに、冷凍プレートおよびスペーサーの使用により、細胞の全ロットに対して熱の均一な発散が為される。さらに、これらのプレートにより、特定のロットにおける冷凍コンテナの全てが均一の厚さに凍結し、均一であり、且つ再現性のある解凍時間を有することが確実になる。このように、冷凍プレートおよびスペーサーを使用しないで凍結させることは可能ではあるが、使用した方が好ましい。
一旦肝細胞を冷凍コンテナに分配してしまえば、フリーザーに入れる準備は整う。約４℃から約-90℃まで冷凍することが可能なフリーザーはどれでも考慮に入れられているが、変温速度調節フリーザーが好ましい。
変温速度非調節フリーザーを使用する場合には、約5から約40×106細胞/mlの範囲の濃度の細胞を安全冷凍コンテナに入れる。その後上述のコンテナをスタイロフォームの箱に入れ、約2から約24時間上述のフリーザー内に置く。その後コンテナをフリーザーから取り出し、長期保存のためにすぐに液体窒素中で冷却する。使用する準備が整えば、細胞は37-42℃の水浴中で解凍し、一連の洗浄により余分な凍結防止剤を除去する。
変温速度調節フリーザーを使用する場合には、均一な凍結を確実にするために、凍結の過程を上述のフリーザーのプログラムに組み込む。本発明により考慮されているすべての過程は、一旦試料の温度が-4℃に達した時に開始される。冷却速度は潜熱の放出（-12℃）までは毎分1-10℃の間であるべきである。潜熱の放出の間は、庫内温度は、温度が-60℃から-70℃の間まで低下するまでは毎分25℃の割合で低下させる。一旦庫内温度が-60℃から-70℃の間に低下すれば、庫内温度は毎分15℃の割合で-12℃から-20℃の間まで即座に上昇させる。続いて、-50℃から-90℃の間の最終凍結温度に達するように、毎分1-10℃の間の冷凍速度を使用する。
好ましくは、変温速度調節フリーザーの過程には、潜熱の放出を補償するためにプログラムされた窒素の噴射が含まれる。潜熱の放出の補償により、細胞の低温保存の間の細胞の損傷の可能性が低減される。このプログラムされた冷気噴射はまた、凍結サイクルにおける全ての冷凍コンテナに対して外部からの氷の投与を同調させるのを助ける。これは、細胞の低温保存の重大な局面が氷晶の形成期の間に起こるために特に有利である。氷晶の形成は、液層中に任意に生じる分子の集団であり得る、結晶核形成部位から始まる。凝集した氷の結晶は、凝固が完了するまで液体中を拡がる氷晶前面を形成する。
このように、変温速度調節フリーザーは、再現性の良い凍結サイクルおよび従って均一な低温保存を確実にするために、好ましい。さらに再現性を向上させるために、変温速度調節フリーザーに、低温保存の全工程をモニターし、かつ詳細に記録することができ、そのためにさらに均一性および再現性を確実にする、確認装置を付加的に付けることもできる。確認装置は、記録可能で、かつ較正された熱電対を有する、コンピューターにプログラムされた温度モニターシステムである。熱電対により、冷凍プログラムのある部分を開始させるのと同様に、凍結サイクルを通じての庫内および試料の温度を記録するためのさらなるモニターが可能になる。限定のためではなく例示のために、以下の熱電対：Omega sub-mini Thermocoupleおよびテフロンコーティングしたワイヤー等、について言及することができる。前述の過程により低温保存した肝細胞は、規制の遵守および製品としての均質性のために非常に望ましい。
一旦細胞を前述のフリーザー法によって凍結したら、それらは長期保存用の低温保存箱により窒素保存フリーザー内に維持できる。長期保存とは数カ月または数年を意味している。冷凍コンテナは蒸気または液体窒素中のいずれかの状態で保存できる。本発明は、生物学的な時間および活性は停止し、そのために細胞を何年もの間保存できると一般的に信じられている、水のガラス転移温度、つまり-120℃以下の温度での保存を考慮に入れている。
使用に先だって細胞を解凍し、DMSOを除去しなければならない。解凍は37-42℃の水浴により行う。半解けの氷が現れた時点で細胞をコンテナから取り出す。次に冷却した培養培地を入れた遠心管へ細胞を注ぎ込む。最初の細胞量を、最初の細胞量の5から10倍量の新鮮な冷却した培地を加えることにより遠心管内において希釈する。次に懸濁液を7-15gで、2から5分間遠心して沈降させる。残余のDMSOを含む培地を除去するために上清を吸引除去する。その後、約２倍から約４倍の新鮮な培地を細胞の沈殿物（ペレット）に加える。
限定のためではなく例示のために、以下の実施例は、本発明をさらに定義付けている。
実施例１
冷凍培地
以下の物質を追加したChee’s Essential Medium（CEM）：
90mlのCEM当たり10mlのFBS
90mlのCEM当たり10mlのDMSO
１lのCEM当たり0.584gのグルタミン
１mlのCEM当たり10mUのインシュリン
10-6Mのデキサメタゾン
１mlのCEM当たり50ugのゲンタマイシン
実施例２
充填法
バッグまたは管に充填するのに先だって、細胞懸濁液を予め冷却しておいた滅菌瓶内において保存した。細胞濃度を一定に保つために懸濁液を継続的に撹拌した。
Cryocyte Bagsに充填したら、Ｙ字型のローラー・クランプを締めて口を閉じた。バッグは使用前に約30分間2-8℃に予め冷却しておいた。プランジャーを60ccのシリンジから無菌的に取り外し、Ｙ字型の管を取り付けたルアーロック内にシリンジバレルをはめ込み、そして50mlの肝細胞の低温懸濁液を無菌的にシリンジバレルへ注入した。その後、入口の管状クランプを開け、そして細胞懸濁液を重力によりバッグへ注ぎ込ませた。次に、バッグから余分な空気を全て除去するために、入口管まで細胞の流れが上昇するのが観察されるまで、バッグを穏やかに圧縮した。その後、細胞が再度バッグ内に戻るまで圧縮を止め、空気が再度バッグ内に戻ることが観察された瞬間にＹ結線を締めて口を閉じた。最後にＹ字型の管を熱シーラーを用いてシールして口を閉じ、余分の管を除去した。
実施例３
変温速度非調節フリーザー法
実施例２に従って充填した冷却用バッグまたは管を1/2インチの厚さのスタイロフォームの箱の中に入れた。続いてどちらの低温コンテナも-70℃に設定した超低温フリーザーに入れ、約２時間から２時間半の間そこに保存した。次に低温コンテナをフリーザーから取り出し、すぐに液体窒素で冷却し、長期保存した。低温保存の間は、低温保存サイクルはKaye Portable Validatorによりモニターされ、詳細に記録される。
実施例４
変温速度調節フリーザー法
細胞を満たした低温用バッグを通例のアルミニウムの冷凍板の間に挟み込んだ。次にそれらを、以下の冷凍過程をプログラムした変温速度調節フリーザーの庫内に入れた。細胞は１℃/分の割合でゆっくりと４℃まで冷却した。その後、潜熱の放出の時点である-12℃に温度が到達するまで、冷却速度を2.5℃/分に変えた。放出された潜熱は、温度が-70℃に下がるまで25℃/分で庫内の温度を下げることにより補償した。その時点において、庫内の温度をすぐに15℃/分の割合で-20℃まで上昇させた。次に1.5℃/分という冷却速度を用いて最終凍結温度である-70℃に到達させた。一旦この温度に達したら、低温保存した細胞を変温速度調節フリーザーから取り出し、蒸気相の窒素中に10-24時間置いた。その後、それらを長期保存のために直接液体窒素中に入れた。
凍結周期の庫内および試料の温度はNIST（National Institute of Science and Technology）の熱電対を用いて詳細に記録される。
前述の一般的で且つ特定の指針により低温保存された肝細胞は、概して新鮮な細胞の80-99％の初期生存率および50-80%の代謝活性を示した。これらの結果は以下の表のデータにより例示される。
0004191798.tif 000002
ここで：
新鮮な細胞=新たに単離/培養された豚の肝細胞
低温保存された細胞=低温保存され、液体窒素中に保存され、そして解凍された豚の肝細胞
生存率=トリパン・ブルー除去分析により評価した
ジアゼパムの代謝活性=代謝産物の生産
概括すると、本発明は、肝細胞を単離すること、凍結防止培地を調整すること、肝細胞を上述の培地に懸濁すること、前述の肝細胞を安全冷凍コンテナに分配すること、特定の条件下において特定の期間上述のコンテナを凍結すること、長期保存を望むならば上述のコンテナを窒素保存すること、および使用の準備が整った時に上述の細胞を解凍することを含む新規の低温保存法により生産された、新規の低温保存された肝細胞を含む、新規の人工的な肝臓維持装置を開示する。このようにして低温保存された細胞は新鮮な細胞の80-99％の生存率および50-80%の代謝活性を示し、それらをハイブリッドALS装置で使用したり、または肝細胞移植のための基質としての使用したりするために非常に望ましいものとしている。人工肝臓として、供与者の肝臓が移植に入手可能になるまで、または患者の肝臓が自身を再生するまで、それらが肝機能を代替しうる。
本明細書中に記載ているように、発明の観点から逸脱しない範囲で特定の変化は加え得るため、実施例を含めて明細書において記載されているあらゆる事柄は、限定の意味においてではなく、例示として解釈されるべきであることを意図している。