(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造
0004181632.tif 000195
（式中、
Ａｒは、フェニル、またはＣ1−Ｃ5アルキルで置換したフェニル、Ｃ1−Ｃ5アルコキシルで置換したフェニル、ハロゲン、ナフチル、フリル、インドリル、ピロリル、ピリジル若しくはチエニル基で置換したフェニル、
Ｒ1は、ハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノＣ1−Ｃ5アルキルアミノ、ジＣ1−Ｃ5アルキルアミノ、トリＣ1−Ｃ5アルキルアンモニウム、Ｃ1−Ｃ5アルキルチオ、ジＣ1−Ｃ5アルキルスルホニウム、スルフェート、またはホスフェートであり、
Ｒ2は、ＯＨ、またはＳＨであり、または
Ｒ1およびＲ2が一緒になって、エポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、スルフェート環、またはモノＣ1−Ｃ5アルキルホスフェート環を形成することができ、または
Ｒ1およびＲ2が一緒になって、Ｃ18とＣ19との間に二重結合を形成することができ、
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ5アルキル基であり、
Ｒ4およびＲ5はＨであり、または
Ｒ4およびＲ5が一緒になって、Ｃ13とＣ14との間に二重結合を形成することができ、
Ｒ6は、ベンジル、ヒドロキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロＣ1−Ｃ5アルコキシベンジル、またはジハロＣ1−Ｃ5アルコキシベンジル基であり、
Ｒ7、およびＲ8は、それぞれ独立してＣ1−Ｃ5アルキル基であり、
Ｒ9、およびＲ10は、それぞれ独立してＨまたはＣ1−Ｃ5アルキル基であり、並びに
ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯ、ＮＨまたはＣ1−Ｃ5アルキルアミノであり、
但し、次式で表される構造を除く
0004181632.tif 000196
を有するクリプトフィシンまたはその薬学上許容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ8がエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項３】
Ｒ7がエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項４】
Ｒ8がメチルであり、Ｒ3がメチルであり、ＸおよびＹは両方共Ｏではない、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項５】
Ｒ3がエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項６】
Ｒ9がエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項７】
Ｒ10がエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項８】
Ｃ3、Ｃ6、Ｃ10、Ｃ16、Ｃ17およびＣ18に結合した基の少なくとも１個がＲ立体化学を有する、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項９】
Ｃ3、Ｃ6、Ｃ10、Ｃ16、Ｃ17およびＣ18に結合した基の少なくとも１個がＳ立体化学を有する、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１０】
Ａｒがフェニルであり、Ｒ1およびＲ2が一緒になってＣ18とＣ19との間に二重結合を形成し、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8がメチルであり、Ｒ4およびＲ5が一緒になってＣ13とＣ14との間に二重結合を形成し、Ｒ6が３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9がイソブチルであり、Ｒ10が水素であり、Ｘが酸素、およびＹが酸素または窒素である、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１１】
Ｒ1およびＲ2が一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成している、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１２】
Ｒ1およびＲ2が一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成している、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１３】
Ｒ4およびＲ5が一緒になってＣ13とＣ14との間に二重結合を形成している、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１４】
Ｒ4およびＲ5が水素である、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１５】
Ｒ1がハロであり、およびＲ2がヒドロキシルである、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１６】
Ｒ1およびＲ2が一緒になってエピスルフィド環を形成している、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１７】
Ａｒがフェニルであり、Ｒ1およびＲ2が一緒になってＲ，Ｒ−アジリジン環を形成し、Ｒ3，Ｒ7およびＲ8がメチルであり、Ｒ4およびＲ5が一緒になってＣ13とＣ14との間に二重結合を形成し、Ｒ6が３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9がイソブチルであり、Ｒ10が水素であり、Ｘが酸素、およびＹが酸素または窒素である、請求項１に記載のクリプトフィシン。
【請求項１８】
薬学上許容可能なキャリヤーおよび
構造
0004181632.tif 000197
（式中、
Ａｒは、フェニル、またはＣ1−Ｃ5アルキルで置換したフェニル、Ｃ1−Ｃ5アルコキシルで置換したフェニル、ハロゲン、ナフチル、フリル、インドリル、ピロリル、ピリジル若しくはチエニル基で置換したフェニル、
Ｒ1は、ハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノＣ1−Ｃ5アルキルアミノ、ジＣ1−Ｃ5アルキルアミノ、トリＣ1−Ｃ5アルキルアンモニウム、Ｃ1−Ｃ5アルキルチオ、ジＣ1−Ｃ5アルキルスルホニウム、スルフェート、またはホスフェートであり、
Ｒ2は、ＯＨ、またはＳＨであり、または
Ｒ1およびＲ2が一緒になって、エポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、スルフェート環、またはモノＣ1−Ｃ5アルキルホスフェート環を形成することができ、または
Ｒ1およびＲ2が一緒になって、Ｃ18とＣ19との間に二重結合を形成することができ、
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ5アルキル基であり、
Ｒ4およびＲ5はＨであり、または
Ｒ4およびＲ5が一緒になって、Ｃ13とＣ14との間に二重結合を形成することができ、
Ｒ6は、ベンジル、ヒドロキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロＣ1−Ｃ5アルコキシベンジル、またはジハロＣ1−Ｃ5アルコキシベンジル基であり、
Ｒ7、およびＲ8は、それぞれ独立してＣ1−Ｃ5アルキル基であり、
Ｒ9、およびＲ10は、それぞれ独立してＨまたはＣ1−Ｃ5アルキル基であり、
ＸはＯであり、
およびＹは、ＯまたはＮＨであり、
但し、次式で表される構造を除く
0004181632.tif 000198
であるクリプトフィシン化合物またはその薬学上許容可能な塩の治療有効量を含む、過増殖性の哺乳動物細胞の増殖を抑制するのに有用な医薬組成物。
【請求項１９】
代謝拮抗剤、アルキル化剤、植物アルカロイド類、抗生物質、ホルモン類および酵素類からなるグループから選択される少なくとも１種類の追加の抗腫瘍薬をも含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
代謝拮抗剤が、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、２−クロロデオキシアデノシン、またはそれらの併用である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
アルキル化剤が、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、パラプラチン、クロラムブシル、窒素マスタード、またはそれらの併用である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
植物アルカロイド類が、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、エトポシド、またはそれらの併用である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
抗生物質が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、またはそれらの併用である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ホルモン類が、カルステロン、ジオモスタボロン、プロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、タモキシフェン、リン酸ポリエストラジオール、酢酸メゲステロール、フルタミド、ニルタミド、トリロタン、またはそれらの併用である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
酵素類が、Ｌ−アスパラギナーゼ、アミノアクリジン誘導体、またはそれらの併用である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１８に記載のクリプトフィシンまたはその薬学上許容可能な塩を含む、過増殖している哺乳動物細胞に起因する病理的状態の治療薬。
【請求項２７】
哺乳動物細胞がヒトである、請求項２６に記載の治療薬。
【請求項２８】
病理的状態が腫瘍の形成を特徴とする、請求項２６に記載の治療薬。
【請求項２９】
腫瘍が、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、白血病、メラノーマ、膵臓腺がん、中枢神経系腫瘍、卵巣がん、前立腺がん、骨軟部組織の肉腫、頭頸部がん、膵臓および食道を含む胃がん、胃がん、ミエローマ、膀胱がん、腎臓がん、甲状腺を含む神経内分泌系腫瘍、並びに、非ホジキン病およびホジキン病腫瘍からなるグループから選択される、請求項２８記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
本発明は認可番号第ＣＡ１２６２３号、第ＣＡ５３００１号のもとずく保健社会福祉省、国立ガン研究所からの合衆国政府の援助を受けて１部なされたものであり、従って合衆国政府は本発明にある種の権利を有するものである。
発明の背景
細胞成長の正常な管理に従はない細胞増殖を特徴とする腫瘍性疾患はヒトの死亡の主原因である。化学療法での臨床経験は新規でより効果的な医薬がこれらの疾患の治療に望まれていることを示している。かかる経験は細胞骨格の微小管系を崩壊させる医薬が腫瘍性細胞の増殖を阻止するのに有効であることも示している。
真核細胞の微小管系は細胞骨格の主構成成分であり、結合と解離の動力学的状態にある。即ち、チュブリンのヘテロ二量体は重合して微小管を形成し、微小管はこれらの構成成分に解重合する。微小管は細胞の構築、代謝分裂の制御で重要な役目を果たしている。微小管の動力学的状態はこれらの正常な機能にとってきわめて重要である。細胞分裂に関しては、チュブリンは重合して、分裂紡錘体を形成する微小管になる。次いで、この紡錘体は分裂紡錘体の用途が達成されたときに解重合する。従って、微小管の重合又は解重合を中断させ、これにより分裂を阻止する薬剤は臨床的用途ではいくつかのもっとも有効な化学療法剤となる。
かかる抗分裂剤又は毒はその分子的作用機構にもとずき３つのグループに分類される。その第１のグループはコルヒチンとコルセミドを含む薬剤から成り、これはチュブリンを隔絶（ゼクエスタリング）することにより微小管の形成を抑制する。第２のグループはビンブラスチンとビンクリスチンを含む薬剤から成り、チュブリンの準結晶性集塊を誘起する。ビンブラスチンとビンクリスチンは公知の抗ガン剤である。分裂紡錘体微小管を崩壊させるこの作用により過増殖細胞を優先的に抑制する。第３のグループはチュブリンの重合を促進し、従って微小管構造を安定化させる、タクソールを含む薬剤から成る。
しかし、単に抗分裂剤としての活性があるだけでは腫瘍細胞、確かに薬剤耐性表現型示す腫瘍細胞に対しての効力は保証されない。ビンカ・アルカロイド、例えばビンブラスチンとビンクリスチンは腫瘍性細胞と腫瘍に有効であるが、いくつかの薬剤耐性腫瘍と細胞への活性に欠ける。薬剤耐性（ＤＲ）又は多剤耐性（ＭＤＲ）を示す腫瘍性細胞の１基準はＰ−糖タンパク質の過表現による。Ｐ−糖タンパク質運搬体用基質として劣る化合物がこのようなＤＲ又はＭＤＲ表現型を迂回するのに有用である。
従って、多くの腫瘍細胞によるＤＲ又はＭＤＲ表現型の提示と腫瘍性細胞に対する抗微小管剤作用の臨床的検証態様から薬剤非耐性の腫瘍性細胞に対して細胞抑制性であり、且つ薬剤耐性表現型の腫瘍性細胞に対して細胞抑制性のある抗微小管剤の開発が必要となる。この点に関して見込みのある薬剤にはクリプトフィシン類として知られている一連の化合物が含まれる。
クリプトフィシン類の製造法に関しては、クリプトフィシン類の全体的合成法は目下のところ知られていない。クリプトフィシン化合物は藍藻類〜緑藻類からの単離により現在製造されているものか、またはこのような天然産化合物の半合成的改変物である。完全合成法の欠除はこの化合物の活性を最大にし、その安定性を増加する立体特異性クリプトフィシン類の製造が必然的に困難になる。例えば、研究の結果、からそのままの手を加えていない大環状環を有するクリプトフィシン類は活性がより高い。従って、天然誘導クリプトフィシン類よりも安定性がより高い大環状環を有するクリプトフィシン類が製造できる完全合成法が望ましい。本発明はこの問題を解決するものである。
発明の開示
本発明は下記の構造を有する新規クリプトフィシン化合物を提供する。
0004181632.tif 000002
（式中、Ａｒはメチル又はフェニル又は任意の簡単な未置換又は置換芳香族又は複素芳香族基；
Ｒ1はハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルキルチオ、ジアルキルスルホニウム、サルファイト又はホスフェート；
Ｒ2はＯＨ又はＳＨ；又は
Ｒ1とＲ2は一緒にエポキシド環、アジリデン環、エピサルファイド環、サルフェート環又はモノアルキルホスフェート環を形成してもよく；
Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19間で二重結合を形成してもよく；
Ｒ3は低級アルキル基；
Ｒ4とＲ5はＨ；又は
Ｒ4とＲ5は一緒にＣ13とＣ14間で二重結合を形成してもよく；
Ｒ6はベンジル、ヒドロキシベンジル、アルコキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロアルコキシベンジル又はジハロアルコキシベンジル基；
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10はそれぞれ独立してＨ又は低級アルキル基；および
ＸとＹはそれぞれ独立してＯ、ＮＨ又はアルキルアミノである）。
本発明は更にクリプトフィシン類の完全合成法に関する。本発明はまたクリプトフィシン類を医薬に使用して哺乳類の細胞の増殖を抑制し、腫瘍の治療することである。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の選択したクリプトフィシン化合物の一般構造と、選択した実施態様でのヒドロキシ酸単位Ａ、Ｄとアミノ酸単位Ｂ、Ｃの番号付け系を示す。
図２Ａと２Ｂはクリプトフィシン化合物とビンブラスチンのジャーカット（Jurkat）細胞増殖と細胞周期の進行への効果をグラフにして示す。ジャーカット細胞はクリプトフィシン化合物（Ａ）又はビンブラスチン（Ｂ）の指示濃度で２４時間培養した。試料毎に生存細胞数（■）と分裂指数（□）を実験の部に記載したようにして測定した。数値は３回の類似実験のうちの１回での３つの同一試料についての平均値±標準偏差（sd）を表わす。
図３はビンブラスチン、クリプトフィシン類、タクソールの細胞成長への効果の可逆性をグラフにして示す。ＳＫＯＶ３細胞は０．１nMビンブラスチン（□）、０．１nMクリプトフィシン類（■）又は１nMタクソール
0004181632.tif 000003
で時間＝０のときに処理した。これらの各化合物濃度で細胞成長を５０％抑制した。２４時間後、細胞は洗滌し、薬剤非添加培地で指示した時間培養した。細胞密度を実験の部に記載したようにしてスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染色で測定し、３回の実験のうちの１回での３つの同一試料について５６０nmでの平均値±sd吸光度として表わす。
図４はビンブラスチンとクリプトフィシン類の細胞増殖への組合せ効果のイソボログラム（isobologram）である。ＳＫＯＶ３細胞はビンブラスチン（０〜６００pM）および／もしくはクリプトフィシン（１〜１００pM）で４８時間処理した。次いで、細胞数を実験の部に記載のようにしてＳＲＢ染色で測定し、ビンブラスチンとクリプトフィシン化合物の組合せのＩＣ50s（■）と加成性線（−）を求めた。数値はそれぞれ３つの同一の試料を含む２回の実験での平均値を表わす。
図５は本発明のクリプトフィシン類合成の第１の概略図である。
図６はヒドロキシ酸単位Ａ製造の概略図である。
図７はヒドロキシ酸単位Ａとアミノ酸単位Ｂとから成るクリプトフィシンの下部単位製造の概略図である。
図８はアミノ酸単位Ｃとヒドロキシ酸単位Ｄとから成るクリプトフィシン下部単位製造の概略図である。
図９は本発明の選択したクリプトフィシン類合成の第１の概略図である。
図１０は本発明の選択したクリプトフィシン類合成の第２の概略図である。
図１１はヒドロキシ酸Ｄから成るクリプトフィシン下部単位合成の概略図である。
図１２は本発明の選択したクリプトフィシン類合成の第３の概略図である。
図１３は本発明の選択したクリプトフィシン類合成の第４の概略図である。
図１４は本発明の選択したクリプトフィシン類合成の第５の概略図である。
発明の詳細な説明
本発明は、下記の構造
0004181632.tif 000004
（式中、
Ａｒは、メチル、またはフェニル、または任意の単純な未置換若しくは置換芳香族または複素芳香族基であり、
Ｒ1は、ハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルキルチオ、ジアルキルスルホニウムスルフェート、またはホスフェートであり、
Ｒ2は、ＯＨ、またはＳＨであり、または
Ｒ1およびＲ2が一緒になって、エポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、スルフェート環、またはモノアルキルホスフェート環を形成することができ、または
Ｒ1およびＲ2が一緒になって、Ｃ18とＣ19との間に二重結合を形成することができ、
Ｒ3は、低級アルキル基であり、
Ｒ4およびＲ5はＨであり、または
Ｒ4およびＲ5が一緒になって、Ｃ13とＣ14との間に二重結合を形成することができ、
Ｒ6は、ベンジル、ヒドロキシベンジル、アルコキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロアルコキシベンジル、またはジハロアルコキシベンジル基であり、
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立してＨまたは低級アルキル基であり、
ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯ、ＮＨまたはアルキルアミノである）を有する新規なクリプトフィシン化合物を提供する。
本発明の一態様では、下記の構造
0004181632.tif 000005
［式中、
Ｒ1は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ケトン基のＯ、ＮＨ2、ＳＨ、低級アルコキシル基、または低級アルキル基であり、
Ｒ2は、Ｈ、ＯＨ、ケトン基のＯ、ＮＨ、ＳＨ、低級アルコキシル基、または低級アルキル基であり、または
Ｒ1およびＲ2が一緒になって、エポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、またはＣ10とＣ11との間の二重結合を形成することができ、または
Ｒ1およびＲ4が一緒になってテトラヒドロフラン環を形成することができ、
Ｒ3は、Ｈまたは低級アルキル基であり、
Ｒ4は、ＯＨ、低級アルカノイルオキシ基、または低級α−ヒドロキシアルカノイルオキシ基であり、
Ｒ5は、ＨまたはＯＨ基であり、
Ｒ6は、Ｈであるか、または
Ｒ5およびＲ6が一緒になって、Ｃ5とＣ6との間に二重結合を形成することができ、
Ｒ7は、ベンジル、ヒドロキシベンジル、メトキシベンジル、、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロメトキシベンジル、またはジハロメトキシベンジル基であり、
Ｒ8は、ＯＨ、低級β−アミノ酸であって、Ｃ1がβ−アミノ酸のＮに結合しているものであり、またはエステル化した低級β−アミノ酸であって、Ｃ1がエステル化した低級β−アミノ酸基のＮに結合しているものであり、
Ｒ4およびＲ8が一緒になって、低級α−ヒドロキシアルカン酸に結合した低級β−アミノ酸からなるジデプシペプチドを形成することができ、
Ｒ5およびＲ8が一緒になって、低級α−ヒドロキシアルカン酸に結合した低級β−アミノ酸からなるジデプシペプチドを形成することができ、
但し、
Ｒ2がＯＨ、ケトン基のＯ、ＮＨ2、ＳＨであるときにのみ、Ｒ1はＨ、低級アルキル基、または低級アルコキシル基であり、
Ｒ1がＯＨ、ケトン基のＯ、ＮＨ2、ＳＨであるときにのみ、Ｒ2はＨ、低級アルキル基、または低級アルコキシル基であり、
Ｒ1がＯＨであるとき、Ｒ2はＯＨであり、Ｒ3はメチルであり、Ｒ5およびＲ6が一緒になってＣ5とＣ6との間に二重結合を形成し、Ｒ4およびＲ8が一緒になって、構造Ｘ
0004181632.tif 000006
（式中、ＸのＯ1はＲ4に相当し、ＸのＮ8はＲ8に相当し、Ｒ9はメチルであり、Ｒ10はイソブチルであり、Ｒ7は３−クロロ−４−メトキシベンジルではない）を有するジデプシペプチドキを形成し、
Ｒ1およびＲ2が一緒になってエポキシド環を形成するときには、Ｒ3はメチルであり、Ｒ5およびＲ6が一緒になってＣ5とＣ6との間に二重結合を形成し、
Ｒ4およびＲ8が一緒になって、構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成し、
Ｒ9はメチルであり、Ｒ10はイソブチルであり、Ｒ7は３−クロロ−４−メトキシベンジルではなく、
Ｒ1およびＲ2が一緒になってＣ10とＣ11との間に二重結合を形成するときには、Ｒ3はメチルであり、Ｒ5およびＲ6が一緒になってＣ5とＣ6との間に二重結合を形成し、Ｒ4およびＲ8が一緒になって、構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成し、Ｒ9はメチルであり、Ｒ10はイソブチルであり、Ｒ7は３−クロロ−４−メトキシベンジルではなく、
Ｒ1およびＲ2が一緒になってエポキシド基を形成するときには、Ｒ3はメチルであり、Ｒ5およびＲ6が一緒になってＣ5とＣ6との間に二重結合を形成し、Ｒ4はロイシン酸のカルボキシ末端に結合しており、Ｒ8は３−アミノ−２−メチルプロピオン酸または３−アミノ−２−メチルプロピオン酸メチルエステルの窒素末端に結合しており、Ｒ7は３−クロロ−４−メトキシベンジルではない）を有するジデプシペプチド基を形成する］を有する新規なクリプトフィシン化合物が提供される。
本発明は、Ｃ2、Ｃ8、Ｃ9、Ｃ10およびＣ11に結合している基の少なくとも１個がＲ立体化学を有するクリプトフィシン化合物も提供する。本発明のもう一つの態様では、Ｃ2、Ｃ8、Ｃ9、Ｃ10およびＣ11に結合している基の少なくとも１個はＳ立体化学を有している。
本発明は、前記構造に準じたクリプトフィシン化合物であって、Ｒ4またはＲ5がＲ8と一緒になるときに形成されるジデプシペプチドの構造が、下記の構造Ｘ
0004181632.tif 000007
（式中、ＸのＯ1はＲ4またはＲ5に相当し、ＸのＮ8はＲ8に相当し、Ｒ9はＨまたは低級アルキル基であり、Ｒ10はＨまたは低級アルキル基である）であるものも提供する。
本明細書で用いられる下記の用語は、本文での使用から反対の意味が明確に示されない限り、表示された意味を有する。
「低級β−アミノ酸」は、３〜８個の炭素を有する任意のβ−アミノ酸を意味し、線形および非線形炭化水素鎖、例えば３−アミノ−２−メチルプロピオン酸が挙げられる。
「エステル化された低級β−アミノ酸」は、３〜８個の炭素を有する任意のβ−アミノ酸であって、カルボン酸基の水素がメチル基で置換されているもの、例えば３−アミノ−２−メチルプロピオン酸メチルエステルを意味する。
「低級アルカノイルオキシ基」は、１〜７個の炭素を有するアルカノイルオキシ基を意味し、線形および非線形炭化水素鎖が挙げられる。
「低級α−ヒドロキシアルカノイルオキシ基」は、２〜７個の炭素を有するα−ヒドロキシアルカノイルオキシ基を意味し、線形および非線形炭化水素鎖、例えば２−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸が挙げられる。
「低級アルコキシル基」は、酸素原子に結合した１〜５個の炭素を有する任意のアルキル基を意味する。
「低級アルキル基」は、１〜５個の炭素を有するアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、第二ブチル、メチル化されたブチル基、ペンチル、および第三ペンチル基などの線形および非線形炭化水素鎖が挙げられる。
「アリル置換されたアルケン」は、アルキル置換基を有する任意のアルケンを意味する。
「エポキシド環」は、主鎖が２個の炭素と１個の酸素原子とからなる３員環を意味する。
「アジリジン環」は、主鎖が２個の炭素と１個の窒素原子とからなる３員環を意味する。
「エピスルフィド環」は、主鎖が２個の炭素と１個の硫黄原子とからなる３員環を意味する。
「スルフェート環」は、炭素−炭素−酸素−硫黄−酸素主鎖であって、硫黄原子に結合した２つの追加の酸素原子を有するものからなる５員環を意味する。
「モノアルキルホスフェート環」は、炭素−炭素−酸素−リン−酸素主鎖であって、２個の追加の酸素原子を有し、その一方が低級アルキル基を有し、リン原子に結合しているものからなる５員環を意味する。
「単純な未置換芳香族基」は、単環性の共役系（例えば、フリル、ピロリル、チエニル、ピリジル）または二環性の共役系（例えばインドリルまたはナフチル）に４ｎ＋２個のπ電子を有する通常の芳香族環を表わす。
「単純な置換芳香族基」は、単独の基（例えば、低級アルキル基またはハロゲン）で置換されたフェニル基を表わす。
「複素芳香族基」は、酸素、窒素または硫黄のような１個以上の非炭素置換基を有する芳香族環を表わす。
「ハロゲン」は、歴史的にハロゲンとして知られている周期表の群の成員を表わす。ハロゲン化の方法としては、ハロゲン化水素の付加、高温での置換、光ハロゲン化などが挙げられるが、これらに限定されず、またこのような方法は当業者に知られている。1,2
本発明のクリプトフィシン化合物の１実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド環を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデペプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ちクリプトフィシン２の構造は以下に示す：
0004181632.tif 000008
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が４−メチルベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。このクリプトフィシン、即ちクリプトフィシン４の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000009
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ4が一緒になってテトラヒドロフラン環を形成し、Ｒ2がＯＨ基、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ8が（２−カルボメトキシプロピル）アミノ基であるときのものである。この化合物、即ちクリプトフィシン６の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000010
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ4が一緒になってテトラヒドロフラン環を形成し、Ｒ2とＲ8がＯＨ基、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成させて二重結合を存在させ、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジルであるときのものである。この化合物、即ちクリプトフィシン７の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000011
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1がクロロ基、Ｒ2がＯＨ基、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ちクリプトフィシン８の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000012
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1がメトキシ基、Ｒ2がＯＨ基、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ちクリプトフィシン９の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000013
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1がメトキシ基、Ｒ2とＲ4がＯＨ基、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ8が２−カルボキシプロピル）アミノ基であるときのものである。この化合物、即ちクリプトフィシン１０の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000014
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ4が一緒になってテトラヒドロフラン環を形成し、Ｒ2がＯＨ基、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ8が（２−カルボキシプロピル）アミノ基であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン１２の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000015
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ4がＯＨ基、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ8が（２−カルボキシプロピル）アミノ基であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン１４の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000016
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−ヒドロキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン１６の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000017
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−ヒドロキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン１７の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000018
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8は一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン１８の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000019
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトオキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジテプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソプロピル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン１９の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000020
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド環を形成し、Ｒがメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9は水素、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン２１の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000021
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン２３の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000022
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデピシペプチドを形成（式中、Ｒ9は水素、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン２４の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000023
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ4がヒドロキシ、Ｒ6が水素、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ5とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン２６の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000024
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3が水素、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン２８の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000025
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9は水素、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン２９の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000026
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5がヒドロキシ、Ｒ6が水素、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン３０の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000027
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３，５−ジクロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン３１の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000028
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5が水素、Ｒ6が水素、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン３５の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000029
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3が水素、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン４０の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000030
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシベンジル、Ｒ4とＲ5が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はイソブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン４５の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000031
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3はメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はプロピル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン４９の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000032
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってＣ10とＣ11炭素間で二重結合を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はプロピル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン５０の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000033
本発明の化合物の別の実施態様はＲ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成し、Ｒ3がメチル、Ｒ5とＲ6が一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成し、Ｒ7が３−クロロ−４−メトキシベンジル、Ｒ4とＲ8が一緒になって構造Ｘを有するジデプシペプチドを形成（式中、Ｒ9はメチル、Ｒ10はsec-ブチル）であるときのものである。この化合物、即ち、クリプトフィシン５４の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000034
上記の化合物のうち、クリプトフィシン２、４、１６〜１９、２１、２３、２４、２６、２８〜３１、４０、４３、４５、４９、５０、５４は藍藻類−緑藻類（シアノバクテリア）のNostoc sp株を培養したときに生成する代謝物であり、これらの化合物はこの培養物から単離されたものである。クリプトフィシン６、７はこの単離工程にメタノールを含有する溶媒を用いたときに生ずる人工産物である。クリプトフィシン８、９、１０〜１２、１４、３５はこれらの天然産の代謝物の誘導体であり、本明細書の実験の部に記載の方法又はこの技術分野での通常の技量を有する者が利用できる列挙の化合物、および非列挙の化合物の生成方法で化学的に改変したものである。
本発明はNostoc sp株を培養して上記のクリプトフィシン化合物の製造法を提供する。米国特許第４，９４６，８３５号に記載のように藍藻類−緑藻類（シアノバクテリア）のNostoc spの形態的特徴は線状であり、増殖形細胞から成ることである。長軸糸中には異質細胞が時々部間位置に観察され、アキネートは観察されない。増殖は無差別糸状体切断に加えて連鎖体による。Nostoc spの同定基準はJ．Gen．Micro．，１１１：１−６１（１９７９）に記載されている。
更に、本発明はNostoc sp株を培養して新規の代謝物と、以前に開示したクリプトフィシン代謝物をこの培養物から単離することを提供する。本発明の好ましい実施態様ではＧＳＶ２２４と指定したNostoc sp株は培養すると下記の構造で表わされる化合物が単離される株である：
0004181632.tif 000035
（式中、Ｒ1はＨ、ＯＨ、ハロゲン、ケトン基のＯ、ＮＨ2、ＳＨ、低級アルコシル基又は低級アルキル基；
Ｒ2はＨ、ＯＨ、ケトン基のＯ、ＮＨ2、ＳＨ、低級アルコキシル基又は低級アルキル基；または、
Ｒ1とＲ2は一緒になってエポキシド環、アジリジン環、エピサルファイド環、Ｃ10とＣ11間で二重結合を形成するか；または
Ｒ1とＲ2は一緒になってテトラヒドロフラン環を形成するものであり；
Ｒ3はＨ又は低級アルキル基；
Ｒ4はＯＨ、低級アルカノイルオキシ基又は低級α−ヒドロキシアルカノイルオキシ基；
Ｒ5はＨ又はＯＨ基；
Ｒ6はＨ；または
Ｒ5とＲ6は一緒になってＣ5とＣ6間で二重結合を形成するもので；
Ｒ7はベンジル、ヒドロキシベンジル、メトキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロメトキシベンジル又はジハロメトキシベンジル基であり；
Ｒ8は低級β−アミノ酸基であって、Ｃ1がβ−アミノ酸のＮに結合しているか又はエステル化低級β−アミノ酸であって、Ｃ1がエステル化低級β−アミノ酸基のＮに結合しているものであり；
Ｒ4とＲ8は一緒になって低級α−ヒドロキシアルカン酸に結合した低級β−アミノ酸から成るジデプシペプチド基を形成するか；または
Ｒ5とＲ8は一緒になって低級α−ヒドロキシアルカン酸と結合した低級β−アミノ酸から成るジデプシペプチド基を形成するものであり、但し、Ｒ2がＯＨ、ケトン基のＯ、ＮＨ2、ＳＨのときだけはＲ1はＨ、低級アルキル基又は低級アルコキシル基である）。
本発明の好ましい実施態様では、上記の方法で単離したクリプトフィシン代謝物を化学的に改変すると、またこの構造を有する別箇の化合物のが得られる。クリプトフィシン化合物を化学的に改変して本発明の範囲の追加化合物を作る方法は当該技術での通常の技量を有する者に利用できる。更に、追加の方法が本明細書の実験の部に詳述してある。
本発明の新規クリプトフィシン化合物に加えて、本発明は下記の以前に開示したクリプトフィシン種、即ち、クリプトフィシン１、３、５、１３、１５を含む構造の新規製造法、使用法を提供する。これらの化合物の構造を以下に示す：
0004181632.tif 000036
本発明はノストク（Nostoc）sp．のすべての菌株に関し、そして特にクリプトフィシン（cryptophycin）化合物を生産するノストクsp．ＧＳＶ２２４菌株に関する。その目的のため、前記のノストクsp．のＧＳＶ２２４菌株は「特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約」に従って１９９３年１０月７日にアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２アメリカ合衆国（American Type Culture Collection，１２３０１Parklawn Drive，Rockville，Maryland ２０８５２Ｕ．Ｓ．Ａ．）にＡＴＣＣ受託番号第５５４８３号として寄託された。その他のノストクsp．の菌株、特にメルク社（Merck and Co．）によりＡＴＣＣ受託番号第５３７８９号として寄託された菌株、は本発明の実施のため使用されることを予期される菌株である。
他の微生物の場合と同様に、ノストクsp．の特性は変異を受ける。例えば、特定の菌株の組換え体、変異体、または突然変異体がいろいろな既知の物理的および化学的変異誘発要因、例えば、紫外線、Ｘ線、ガンマ線、およびＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、による処理により得られることがある。クリプトフィシン化合物を生産する特性を保有する特定の菌株のすべての天然のおよび誘発された変異体、突然変異体、および組換え体は特許請求される本発明の範囲内に入ることを意図されている。
本発明のクリプトフィシン化合物はノストクsp．の一つの菌株を水中好気性条件下に適当な培養液の中で十分な抗生物質的活性が生産されるまで培養することにより製造されることができる。その他の培養技術、例えば、固形化培地上の表面増殖、もまたこれらの化合物を製造するために使用することができる。特定の菌株を増殖させるために用いられる培養液は当業者に既知の多くの窒素および炭素発生源と無機塩のどれでも一つを含むことができる。製造における経済性、最適の収率、および製品単離の容易さなどは使用される炭素源および窒素源を選択するとき考慮すべき因子である。培養液に混入されることができる栄養源の無機塩の中には鉄、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩酸、炭酸、燐酸、硫酸、硝酸などのイオンを生成することのできる慣用の可溶性の塩類が入る。
微生物の成長と発育のために必要な必須微量元素もまた培養液の中に含まれるべきである。そのような必須微量元素は微生物の成長要求を満たすために十分な量に培養液のその他の成分中に不純物として一般に見いだされる。発泡が問題になる場合には少量（すなわち、０．２mL／Ｌ）の消泡剤、例えば、プロピレングリコール（Ｍ．Ｗ．２０００）を大規模培養液に添加することが望ましいことがある。
かなり多量のクリプトフィシン化合物を製造するためには、タンク中での液内好気培養を用いることができる。少量は振とうフラスコ培養により得ることができる。微生物の大タンク培養に一般に伴われる代謝物生産における時間的ずれのために、増殖用接種材料を用いることが望ましい。増殖用接種材料は増殖用トリコーム（trichome）または異質細胞を含む形の微生物の断片を含む少量の培養液を保温して新鮮な、活発に生育する微生物の細胞集団を得ることにより調製される。その増殖用接種材料は次により大型のタンクに移される。増殖用接種材料のために使用される培養液はより大規模な培養または発酵のために用いられるものと同じであることができるが、その他の培養液もまた使用されることができる。
これらの微生物は約２０℃と３０℃の間の温度および約１００〜２００μモル光量子ｍ-2秒-1の入射照度（光合成的活性放射線）で成長させられることができる。
この種類の液内好気培養において通例であるように、培養液を通して泡たて通気される滅菌空気流に添加することにより二酸化炭素ガスが培養に導入される。クリプトフィシン化合物の効果的生産のためには、二酸化炭素の割合は約１％（２４℃および１気圧において）であるべきである。
従来の技術、特に米国特許第４，９４６，８３５号、はノストクsp．を培養する方法を提供しており、その内容は引用によりここに組み入れられる。
クリプトフィシン化合物の製造は培養の間に、これらの抗生物質に感受性であると知られている微生物に対して肉汁試料を試験することにより追跡されることができる。一つの有用な試験用微生物はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）である。
液内好気培養条件下におけるそれらの生産に続いて、本発明のクリプトフィシン化合物は培養物からおよび培養液から当業者に既知の方法により回収されることができる。回収は一般に初めに培養液を濾過して藻類に属する細胞を分離し、次にそれらの分離された細胞を凍結乾燥することにより達成される。凍結乾燥された藻は適当な溶媒、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、またはジクロロメタン、により抽出されることができる。クリプトフィシン化合物はこの抽出物、並びに培養液、を逆相カラム上で高速クロマトグラフィーにかけることにより分離されることができる。それらのクリプトフィシン化合物は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＬＰＣ）により生成されることができる。
それらの構造から明らかなように、クリプトフィシン化合物は化学的変形のできる基を有する。本発明の属化合物は抗腫瘍活性を示すクリプトフィシン化合物を意図している。例えば、本発明において例証される誘導体は図１の単位ＡのＣ−７およびＣ−８上にエポキシド酸素またはヒドロキシ基を、または単位Ｂのロイシック酸（leucic acid）基を有する化合物を含む。望ましい抗腫瘍活性を示すそのような新規のおよび以前に開示された化合物の誘導体は特許請求される本発明の中に含まれる。さらに、クリプトフィシン化合物の構造と抗腫瘍活性との関係は下記の実験の部（Experimental Section）において提示される。
選択されたクリプトフィシン化合物は本発明の藻類により生産される代謝物であると知られているが、その他のクリプトフィシン化合物、例えば、クリプトフィシン８−１５、は当業者に既知の公開された技術、例えば、米国特許第４，８６８，２０８号、第４，８４５，０８６号および第４，８４５，０８５号に開示されている合成法、それらの内容はここに引用により組み込まれる、を用いる代謝物から、または当業者に既知のその他の方法を用いることにより誘導されることができる。さらに、本発明は実験の部において誘導体を製造する方法を提供する。
クリプトフィシン化合物はノストカセエー（Nostocaceae）に属する青−緑藻類（シアノバクテリア）からの効力のある抗腫瘍性および抗真菌性デプシペプチドである。最初のクリプトフィシン化合物、クリプトフィシン１、は陸生のノストクsp．ＡＴＣＣ５３７８９より単離され、そして真菌、特にクリプトコカス（Cryptococcus）、に対して非常に活性であることが発見された（R.E．Schwartz et al．，J．Ind．Microbiol，１９９０，５：１１３−１２４）。クリプトフィシン１はまた陸生のノストクsp．ＧＳＶ２２４より、藻の微量成分として２４のその他のクリプトフィシン類似体と共に単離され、マウス体内に皮下移植された固い腫瘍に対して非常に活性であることが発見された（G．Trimurturu et al．，J．Am．Chem．Soc．１９９４，１１６：４７２９−４７３７；R．Barrow et al．，J．A m．Chem．Soc．１９９５，１１７−２４７９−２４９０）。ノストクsp．ＧＳＶ２２４からの二つの類似体、クリプトフィシン３および５、は以前にクリプトフィシン１の半合成類似体としてに記載されたことがある（D.F．Sesin，米国特許第４，８４５，０８５号、１９８９年７月４日発行；D.F．Sesin,米国特許第４，８６８，２０８号、１９８９年９月１９日発行）。それらのクリプトフィシン化合物はコルベット検定（Corbett assay）において著しい腫瘍選択的細胞毒性を示し、そして薬品感受性および薬品抵抗性腫瘍細胞に対して同等に細胞毒性であった。クリプトフィシン１はビンブラスチン（vinblastine）と同じ作用形態を有するように見えるが、微細管の集合を不可逆的に阻害することにおいて後者の薬品と異なる（C.D．Smith et al．，Cancer Res．１９９４，５４：３７７９−３７８４）。ノストクsp．ＧＳＶ２２４からのクリプトフィシン化合物の一つ、クリプトフィシン２４、は海綿から単離されてアレナスタチンＡ（arenastatin Ａ）と命名された（M．Kobayashi et al．，Tetrahedron Lett．１９９４，３５；７９６９−７２；M．Kobayashi et al．，Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu  １９９４，３６st，１０４−１１０）。
ここでクリプトフィシン２，４，６，７，１６−１９，２１，２３，２４，２６，２８−３１，４０，４３，４５，４９，５０および５４と命名された、２４の追加されたクリプトフィシン化合物は米国特許出願番号第０８／１７２，６３２号（１９９３年１２月２１日出願）、同第０８／２４９，９５５号（１９９４年５月２７日出願）および国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４７４０号（１９９４年１２月２１日出願）明細書に開示されており、そのような化合物はノストクsp．の菌株より単離された代謝生成物であるか、またはそのような代謝生成物から半合成されたものかのいずれかである。またこれらの特許出願において開示されているのは、ＤＲおよびＭＤＲ腫瘍を含む、マウスの体内に移植された広範な種類の腫瘍に対して示された臨床型の活性を有する抗微細管剤として選択されたクリプトフィシン化合物の特徴である。
本発明は次の構造式を有する新規なクリプトフィシン化合物を提供する。
0004181632.tif 000037
上式中、
Ａｒはメチルまたはフェニルまたはいずれかの簡単な非置換または置換された芳香族またはヘテロ芳香族基であり、
Ｒ1はハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アリキルチオ、ジアルキルスルホニウム、スルファート、またはホスファートであり、
Ｒ2はＯＨまたはＳＨである、または
Ｒ1とＲ2は一緒になってエポキシド環、アジリジン環、およびエピスルフィド環、スルファート環またはモノアルキルホスファート環を形成することもあり、または
Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成することもあり、
Ｒ3は低級アルキル基であり、
Ｒ4とＲ5はＨである、または
Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成することもあり、
Ｒ6はベンジル、ヒドロキシベンジル、アルコキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロアルコキシベンジル、またはジハロアルコキシベンジル基であり、
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9および10はそれぞれ独立にＨまたは低級アルキル基であり、そして
ＸとＹはそれぞれ独立にＯ、ＮＨまたはアルキルアミノである。
このクリプトフィシンの好ましい態様においてクリプトフィシンのＲ8はエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである。このクリプトフィシンの他の一つの好ましい態様において、Ｒ7はエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである。さらに追加されるこのクリプトフィシンの一つの好ましい態様において、Ｒ7はＨであり、Ｒ8メチルであり、Ｒ3はメチルであり、ＸとＹは二つともＯでない。
本発明はさらに追加されるこのクリプトフィシンの一つの好ましい態様を与えるが、その場合Ｒ3はエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである。このクリプトフィシンの他の一つの好ましい態様において、Ｒ9はメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである。このクリプトフィシンのさらに一つの好ましい態様において、Ｒ10はメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはイソペンチルである。
本発明はさらにクリプトフィシン化合物を提供するが、それらにおいてＣ3、Ｃ6、Ｃ10、Ｃ16、Ｃ17、およびＣ18に付着する基の少なくとも一つはＲ立体化学性を有する。本発明のさらに一つの態様において、Ｃ3、Ｃ6、Ｃ10、Ｃ16、Ｃ17、およびＣ18に付着する基の少なくとも一つはＳ立体化学性を有する。
本発明のクリプトフィシン化合物の一つの態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン５１、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000038
さらに本発明のクリプトフィシン化合物の一つの態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン５２、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000039
さらに本発明のクリプトフィシン化合物の一つの態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成し、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン５３、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000040
さらに本発明のクリプトフィシン化合物の一つの態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1はＳ−クロロであり、Ｒ2はＲ−ヒドロキシルであり、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン５５、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000041
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は水素であり、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン５７、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000042
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1はＳ−クロロであり、Ｒ2はＲ−ヒドロキシルであり、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は水素であり、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン５８、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000043
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エピスルフィド環を形成し、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン６１、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000044
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−メトキシフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン８１、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000045
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはメチルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン８２、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000046
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはメチルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン９０、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000047
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはメチルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン９１、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000048
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−アジリジン環を形成し、Ｒ3、Ｒ7およびＲ8はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン９７、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000049
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−フルオロフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１０、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000050
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−トリルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１１、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000051
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒは２−チエニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１２、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000052
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−フルオロフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１５、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000053
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−フルオロフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１６、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000054
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−トリルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１７、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000055
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−トリルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１８、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000056
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒは２−チエニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１１９、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000057
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒは２−チエニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１２０、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000058
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸは酸素でありまたＹは単一の水素を付けている窒素である。この化合物、クリプトフィシン１２１、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000059
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸは酸素でありまたＹは単一の水素を付けている窒素である。この化合物、クリプトフィシン１２２、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000060
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸは酸素でありまたＹは単一の水素を付けている窒素である。この化合物、クリプトフィシン１２３、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000061
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−クロロフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１２４、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000062
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−クロロフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１２５、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000063
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−クロロフェニルであり、Ｒ1とＲ2は一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成し、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１２６、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000064
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはフェニル、Ｒ1はＳ−クロロであり、Ｒ2はＲ−ヒドロキシルであり、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸは酸素でありまたＹは単一の水素を付けている窒素である。この化合物、クリプトフィシン１２７、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000065
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−トリル、Ｒ1はＳ−クロロであり、Ｒ2はＲ−ヒドロキシルであり、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１２８、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000066
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−トリル、Ｒ1はＲ−クロロであり、Ｒ2はＳ−ヒドロキシルであり、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１３０、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000067
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−トリル、Ｒ1はＲ−クロロであり、Ｒ2はＲ−ヒドロキシルであり、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１３１、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000068
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−クロロフェニル、Ｒ1はＳ−クロロであり、Ｒ2はＲ−ヒドロキシルであり、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１３２、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000069
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−クロロフェニル、Ｒ1はＲ−クロロであり、Ｒ2はＳ−ヒドロキシルであり、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１３３、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000070
本発明の化合物の他の一つ態様において、Ａｒはｐ−クロロフェニル、Ｒ1はＲ−クロロであり、Ｒ2はＲ−ヒドロキシルであり、Ｒ3およびＲ7はメチルであり、Ｒ4とＲ5は一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成し、Ｒ6は３−クロロ−４−メトキシベンジルであり、Ｒ9はイソブチルであり、Ｒ8とＲ10は水素であり、そしてＸとＹは酸素である。この化合物、クリプトフィシン１３４、の構造は次のようである。
0004181632.tif 000071
以下には、追加のクリプトファイシン化合物、それらの置換基を、下記構造式に基づいて説明する：
0004181632.tif 000072
式中、
Ｒ1はＨまたはハロゲンである；
Ｒ2はＨ、ケトンの酸素、またはＯＨである；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってエポキシド環を形成していてもよい；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってエピスルフィド環を形成していてもよい；
Ｒ3はＨまたは低級アルキル基である；
Ｒ4はＨまたはＯＨである；
Ｒ5はＨまたはＯＨである；または
Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成していてもよい；
Ｒ6はＨまたはハロゲンである；
但し、Ｒ1とＲ2が一緒になってエポキシド基を形成しており、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6が塩素である場合には、Ｒ3がメチルでないことを条件とする。
本発明のクリプトファイシン化合物の一態様は、Ｒ1が水素であり、Ｒ2がケトン基の酸素であり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン２０の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000073
本発明の化合物の別の態様は、Ｒ1がＳ−ブロモであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン２５の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000074
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−クロロであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン２７の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000075
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1とＲ2が一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成しており、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4およびＲ5が水素であり、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン３２の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000076
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1、Ｒ4およびＲ5が水素であり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＲ−メチルであり、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン３３の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000077
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が水素であり、Ｒ3がＲ−メチルであり、そしてＲ6が水素である場合である。この化合物、クリプトファイシン３４の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000078
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＲ−ブロモであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン３７の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000079
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1とＲ2が一緒になってＳ，Ｓ−エポキシド環を形成しており、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン３８の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000080
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1とＲ2が一緒になってＳ，Ｒ−エポキシド環を形成しており、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン３９の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000081
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1とＲ2が一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成しており、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ5がＲ−ヒドロキシであり、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン４１の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000082
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1とＲ2が一緒になってＲ，Ｒ−エポキシド環を形成しており、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ5がＳ−ヒドロキシであり、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン４２の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000083
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1が水素であり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＲ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン４８の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000084
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−クロロであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4およびＲ5が水素であり、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン５９の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000085
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1とＲ2が一緒になってＳ，Ｓ−エピスルフィド環を形成しており、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン６０の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000086
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−クロロであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3が水素であり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン６３の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000087
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＲ−クロロであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4およびＲ5が水素であり、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン６４の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000088
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＲ−クロロであり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン６９の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000089
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−クロロであり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン７０の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000090
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＲ−ブロモであり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン７１の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000091
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−ブロモであり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン７２の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000092
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−クロロであり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン７３の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000093
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−クロロであり、Ｒ2がＳ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6が水素である場合である。この化合物、クリプトファイシン７４の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000094
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＳ−フルオロであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン７５の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000095
本発明の化合物の更に別の態様は、Ｒ1がＲ−フルオロであり、Ｒ2がＲ−ヒドロキシであり、Ｒ3がＳ−メチルであり、Ｒ4とＲ5が一緒になって二重結合を形成しており、そしてＲ6がクロロである場合である。この化合物、クリプトファイシン７６の構造は下記の通りである：
0004181632.tif 000096
本発明は総合的合成によって上記クリプトファイシン化合物および全ての既知クリプトファイシン化合物を製造する方法を提供する。
本発明はさらに、本発明において提供された方法を使用して新規クリプトファイシン代謝物および以前開示のクリプトファイシン代謝物が合成されてもよいことを規定する。
本発明は、アリル的に置換されたＥアルケンを選択し；このアリル的に置換されたＥアルケンを、立体特異性ウィッティヒ転位（stereospecific Wittig rearrangement）によって転位し；この化合物を第一のδ−アミノ酸またはδ−ヒドロキシ酸に転化し；この第一の酸を第二のα−アミノ酸にカップリングして第一のサブユニットを生成し；第三のβ−アミノ酸を第四のα−ヒドロキシ酸またはα−アミノ酸にカップリングして第二のサブユニットを生成し；そして第一のサブユニットを第二のサブユニットにカップリングしてクリプトファイシンを生成することからなるクリプトファイシン製造方法を提供する。
さらに、本発明は製造されるクリプトファイシンが下記構造を有する好ましい態様の方法を提供する：
0004181632.tif 000097
式中、
Ａrはメチルまたはフェニルまたはいずれかの簡単な非置換または置換芳香族またはヘテロ芳香族基である；
Ｒ1はハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルキルチオ、ジアルキルスルホニウム、スルフェートまたはホスフェートである；
Ｒ2はＯＨまたはＳＨである；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってエポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、スルフェート環またはモノアルキルホスフェート環を形成していてもよい；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ3は低級アルキル基である；
Ｒ4およびＲ5はＨである；または
Ｒ4とＲ5が一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ6はベンジル、ヒドロキシベンジル、アルコキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロアルコキシベンジル、またはジハロアルコキシベンジル基である；
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は各々独立にＨまたは低級アルキル基である；
そして
ＸおよびＹは各々独立にＯ、ＮＨまたはアルキルアミノである。
本発明の好ましい態様においては、この方法は、Ａrがフェニルであり、Ｒ3がメチルであり、Ｒ6がハロメトキシベンジルであり、Ｒ7がＨであり、Ｒ6がメチルであり、Ｒ9がイソブチルであり、Ｒ10がＨであり、ＸがＯであり、そしてＹがＯであるクリプトファイシンを製造する。
本発明が上記構造のクリプトファイシンを提供することに加えて、本発明は以前開示のクリプトファイシンおよび先行技術のクリプトファイシンを製造する方法を提供する。クリプトファイシン１、８および３５が総合的合成によって製造された。総合的合成によって製造される、以前開示の及び先行技術のクリプトファイシンの代表を以下に提供する：
0004181632.tif 000098
式中、
Ｒ1はハロゲンである；
Ｒ2はＯＨである；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってエポキシド環を形成していてもよい；
Ｒ3はＨである；そして
Ｒ4はＨである；または
Ｒ3とＲ4が一緒になって二重結合を形成していてもよい。
本発明はまた、製薬上許容できる担体と共に有効量の下記構造のクリプトファイシンを含んでいる、過増殖性哺乳類細胞（hyperproliferative mammalian cell）の増殖を抑制するのに有効な医薬品組成物を提供する：
0004181632.tif 000099
式中、
Ａrはメチルまたはフェニルまたはいずれかの簡単な非置換または置換芳香族またはヘテロ芳香族基である；
Ｒ1はハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルキルチオ、ジアルキルスルホニウム、スルフェートまたはホスフェートである；
Ｒ2はＯＨまたはＳＨである；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってエポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、スルフェート環またはモノアルキルホスフェート環を形成していてもよい；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ3は低級アルキル基である；
Ｒ4およびＲ5はＨである；または
Ｒ4とＲ5が一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ6はベンジル、ヒドロキシベンジル、アルコキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロアルコキシベンジル、またはジハロアルコキシベンジル基である；
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は各々独立にＨまたは低級アルキル基である；
そして
ＸおよびＹは各々独立にＯ、ＮＨまたはアルキルアミノである。
本発明の好ましい態様においては、この医薬品組成物はさらに少なくとも一つの追加の抗腫瘍剤（anti−neoplastic agent）を含んでいる。
本発明はまた、哺乳類細胞を、細胞の増殖を抑制するのに十分な量の、下記構造を有するクリプトファイシン化合物と接触させることからなる、哺乳類細胞の増殖を抑制する方法を提供する：
0004181632.tif 000100
式中、
Ａrはメチルまたはフェニルまたはいずれかの簡単な非置換または置換芳香族またはヘテロ芳香族基である；
Ｒ1はハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルキルチオ、ジアルキルスルホニウム、スルフェートまたはホスフェートである；
Ｒ2はＯＨまたはＳＨである；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってエポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、スルフェート環またはモノアルキルホスフェート環を形成していてもよい；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ3は低級アルキル基である；
Ｒ4およびＲ5はＨである；または
Ｒ4とＲ5が一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ6はベンジル、ヒドロキシベンジル、アルコキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロアルコキシベンジル、またはジハロアルコキシベンジル基である；
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は各々独立にＨまたは低級アルキル基である；
そして
ＸおよびＹは各々独立にＯ、ＮＨまたはアルキルアミノである。
本発明の好ましい態様においては、この方法はさらに、細胞を少なくとも一つの追加の抗腫瘍剤と接触させることを含んでいる。本発明の好ましい態様においては、接触される哺乳類細胞は過増殖性である。本発明のさらに好ましい態様においては、過増殖性細胞はヒト細胞である。
本発明はまた、多剤耐性表現型（multiple drug resistant phenotype）を有する過増殖性哺乳類細胞の増殖を抑制する方法を提供するが、その方法は該細胞を、微小管（microtubule）の重合と解重合の動的状態を混乱させて細胞の有糸分裂（mitosis）を阻止するのに有効な量の、下記構造を有するクリプトファイシン化合物と接触させ、それによって細胞の増殖を抑制することからなる：
0004181632.tif 000101
式中、
Ａrはメチルまたはフェニルまたはいずれかの簡単な非置換または置換芳香族またはヘテロ芳香族基である；
Ｒ1はハロゲン、ＳＨ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルキルチオ、ジアルキルスルホニウム、スルフェートまたはホスフェートである；
Ｒ2はＯＨまたはＳＨである；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってエポキシド環、アジリジン環、エピスルフィド環、スルフェート環またはモノアルキルホスフェート環を形成していてもよい；または
Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ18とＣ19の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ3は低級アルキル基である；
Ｒ4およびＲ5はＨである；または
Ｒ4とＲ5が一緒になってＣ13とＣ14の間に二重結合を形成していてもよい；
Ｒ6はベンジル、ヒドロキシベンジル、アルコキシベンジル、ハロヒドロキシベンジル、ジハロヒドロキシベンジル、ハロアルコキシベンジル、またはジハロアルコキシベンジル基である；
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は各々独立にＨまたは低級アルキル基である；
そして
ＸおよびＹは各々独立にＯ、ＮＨまたはアルキルアミノである。
本発明の好ましい態様においては、この方法はさらに、細胞を少なくとも一つの追加の抗腫瘍剤と接触させることを含んでいる。本発明のさらに好ましい態様においては、哺乳類細胞はヒト細胞である。
本発明はまた、過増殖性哺乳類細胞によって生じた病理状態を緩和する方法を提供し、その方法は対象に対して、細胞の増殖を抑制するのに有効な量の、ここに開示のクリプトファイシン化合物を投与することからなる。本発明の好ましい態様においては、哺乳類細胞はヒト細胞である。
本発明の好ましい態様においては、この方法はさらに、対象に対して、病理状態を緩和するのに向けられた少なくとも一つの追加の治療を施すことを含んでいる。本発明の好ましい態様においては、病理状態は新生物（neplasms）の形成を特徴とする。本発明のさらに好ましい態様においては、新生物は、乳房（mammory）、スモール細胞肺臓（small-cell lung）、非スモール細胞肺臓（non-small-cell lung）、結腸直腸（colorectal）、白血病（leukemia）、黒色腫（melanoma）、膵臓腺癌（pancreatic adenocarcinoma）、中枢神経系（central nervous system（ＣＮＳ)）、卵巣（ovarian）、前立腺（prostate）、軟組織または骨の肉腫（sarcoma of soft tissue or bone）、頭と頸（head and neck）、膵臓（pancreatic）や食道（esophageal）を含む胃部（gastric）、胃（stomach）、骨髄腫（myeloma）、膀胱（bladder）、腎臓（renal）、甲状腺（thyroid）を含む神経内分泌（neuroendocrine）、および非ホジキン病およびホジキン病、の新生物からなる群から選ばれる。
クリプトファイシン化合物を製造する方法は図５に描かれている通りのスキーム１にまとめられる。出発物質は、Ｓ−立体配置におけるＸＨ基（但し、Ｘは酸素またはＮＨである）によってＣ−２を置換されている３Ｅ−アルケン（ａ）である。Ｌ−アラニンおよびＬ−乳酸は出発物質ａの安価な源として利用できる。合成における主な工程は、ａのプロパルギルエーテル（ｂ）から（３Ｒ，４Ｒ）−３−（ＸＨ−置換）−４−アルキルヘプト−５（Ｅ）−エン−１−イン（ｃ）（但し、Ｘは酸素または保護された窒素例えばｔ−ブチルジメチルシリルアミノである）への立体選択性［２，３］ウィッティヒ転位（D．J−S．Tsai等のJ．Org．Chem．１９８４，４９，１８４２−１８４３；K．Mikami等のTetrahedron １９８４，２５，２３０３−２３０８；N．Sayo等のChem Lett．１９８４，２５９−２６２）である。それから、当業者に既知の方法を使用して、化合物ｃを、クリプトファイシンのδ−ヒドロキシまたはアミノ酸ユニットＡ前駆体、（５Ｓ，６Ｒ）−５−（ＸＰ−置換）−６−アルキル−８−アリール−オクタ−２Ｅ，７Ｅ−ジエン酸メチル（ｄ）（但し、Ｐは適する保護基である）に転化することができる。
δ−ヒドロキシまたはアミノ酸単位Ａ、α−アミノ酸単位Ｂ、β−アミノ酸単位Ｃおよびα−ヒドロキシまたはアミノ酸単位Ｄから構成されるクリプトフィシンを合成するための一つの戦略はクリプトフィシン分子の部分を表わす２つの前駆体、例えば、δ−ヒドロキシまたはアミノ酸単位Ａとα−アミノ酸単位Ｂとを含有するＡ−Ｂ前駆体（ｅ）およびβ−アミノ酸単位Ｃとα−ヒドロキシまたはアミノ酸単位Ｄとを含有するＣ−Ｄ前駆体（ｆ）から大員環（macrocycle）を組み立てることである。
本明細書において記載される方法において、（１）Ａ−Ｂ前駆体およびＣ−Ｄ前駆体における単位Ａの末端と単位Ｄの末端とを接合して非環式Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ中間体を形成しそして（２）単位Ｂおよび単位Ｃの末端を接合して環式生成物を形成することによる２つの工程でＡ−Ｂ前駆体およびＣ−Ｄ前駆体からクリプトフィシンが組み立てられる。
実験セクションにおいて記載されるクリプトフィシン５１の合成において、Ａ−Ｂ部分における単位Ａのδ−ヒドロキシ基とＣ−Ｄフラグメントにおける単位Ｄのカルボン酸基との間でエステル結合が形成されて非環式Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ中間体が形成されそして次にＡ−Ｂ部分における単位Ｂのカルボン酸基とＣ−Ｄ部分における単位Ｃのβ−アミノ基との間でアミド結合が形成される。化合物ＫはＡ−Ｂ部分前駆体であり、化合物ＰはＣ−Ｄ部分前駆体でありそして化合物Ｒはクリプトフィシン５１の非環式Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ前駆体である。化合物Ｋおよび化合物Ｐは、工程１においてカップリングして単位Ａと単位Ｄとの間でエステルを形成するのを制限するために、単位Ｂのカルボン酸基上および単位Ｃのβ−アミノ基上に保護基を有する。これらの保護基はＣ−Ｄ−Ａ−Ｂ中間体から除去されて、その結果工程２において単位Ｂと単位Ｃとの間でアミド形成を起こさせることが出来る。
メチル（５Ｓ，６Ｒ）−５−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−６−メチル−８−フェニル−オクタ−２Ｅ，７Ｅ−ジエノエート（Ｇ）である、クリプトフィシン５１の単位Ａ前駆体の合成は図式２（図６）において要約される。（Ｓ）−トランス−３−ペンテン−２−オール（Ａ）である出発物質はラセミ化合物の酵素分割により造られる。相間移動条件下の塩化プロパルギルおよび塩基とのＡの反応は８６％の収率でプロパルギルエーテルＢを生成した。−９０℃でのブチルリチウムでのＢの処理は７１％の収率でアルコールＣに導いた。所望の３Ｒ，４Ｒアンチ化合物Ｃはウィッティッヒ転位において形成された唯一の生成物であった。tert−ブチルジメチルシリルエーテル（またはtert−ブチルジメチルシリエエーテル）としてのＣのヒドロキシ基の保護の後、三重結合のヒドロホウ素化（１９７５年Wiley社発行H．C．Brown著、Organic Synthesis Via Boranes）はＣからの７３％収率でアルデヒドＤに導いた。次にHorner-Emmons反応により９０％収率でtrans  α，β不飽和エステルＥに転換された。ＤにおけるＣ６−Ｃ７二重結合の選択的オゾン分解は８３％の収率でアルデヒドＦを提供した。最後にブチルリチウムの存在下の塩化ベンジルトリフェニルホスホニウムとのＦのウィッティッヒ反応は８０％収率でＧを生成した。ＡからのＧの収率は２６％であった。
Ａ−Ｂ前駆体（Ｋ）を生成するためのＤ−３−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）アラニン単位Ｂとの単位Ａ前駆体Ｇのカップリングは図式３（図７）に要約される。アセトン中の水酸化リチウムを用いてのＧにおけるメチルエステル基の加水分解は９５％の収率でカルボン酸Ｈを生成した。Ｊを生成するためのトリクロロエチルエステルＩとのＨのカップリングはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＨの溶液を小過剰のペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィネート（ＦＤＰＰ）、等モル量のＩのトリフルオロ酢酸塩で処理し、次に２５℃で３当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）で処理することにより６５％の収率で達成されることが出来た（S．Chen等によるTetrahedron Lett．１９９１，３２第６７１１頁〜第６７１４頁）。次にＪのフルオロ脱シリル化は９５％の収率でＫに導いた。
保護されたアミノ酸Ｉは５工程でＤ−チロシンから造られた。第一に、Ｄ−チロシンは氷酢酸中の塩化スルフリルを用いて塩素化された（R．ZeynekによるHopper-Seyler’s Z.f．Physiol．Chemie１９２６，１４４第２４７頁〜第２５４頁）。次にＮ−（tert−ブトキシカルボニル）−３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｄ−アラニンは５０％水性ジオキサン中のアミノ酸の懸濁液をトリエチルアミンの存在下にジ−tert−ブチルジカーボネートで処理することにより９４％の収率で得られた。得られた生成物は還流しているアセトン中の炭酸カリウムの存在下に硫酸ジメチルで、８４％の収率でジメチル化された。次にメチルエステルは水性ジオキサン中の水酸化ナトリウムでけん化されて８６％の収率でＮ−（tert−ブトキシカルボニル）−３−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−Ｄ−アラニンを生成した。ジクロロメタン中のトリクロロエタノール、ピリジンおよびＤＣＣにＢＯＣ−保護されたアミノ酸を曝すと６５％の収率でトリクロロエチルエステルＩに導いた。トリフルオロ酢酸を用いてのこの物質の処理は定量的収率のＩのトリフルオロ酢酸塩に導いた。
（２Ｓ）−２−〔３′（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２′，２′−ジメチルプロパノニルオキシ〕−４−メチルペンタン酸（Ｐ）であるＣ−Ｄ前駆体の合成は図式４（図８）に要約される。Ｐの単位Ｃ部分についての出発点はアミノアルコールＬであった。トリエチルアミンの存在下でのジ−tert−ブチルカーボネートを用いてのＬのアミノ基の保護（９３％収率）、次の四酸化ルテニウムを用いての第一級アルコールの酸化（P．H．J．Carlsen等によるJ．Org．Chem．１９８１，４６第３９３６頁〜第３９３８頁）はカルボン酸Ｍ（６６％収率）を提供した。Ｌ−ロイシン酸はジクロロメタン中の臭化アリルと、塩化tetra−ｎ−ブチルアンモニウムを含有する水性重炭酸ナトリウムとの混合物にそのＬ−ロイシン酸を曝すことにより、相間移動条件下に９３％の収率でアリルエステルＮに転換された（S．Friedrich-Bochnitschek等によるJ．Org．Chem．１９８９，５４第７５１頁〜第７５６頁）。ＮとのＭのカップリング反応はジクロロメタン中の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて行なわれて７５％の収率でＯを達成した。Ｏのアリルエステルの開裂はモルホリンおよび触媒テトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウムを含有するＴＨＦ中で行なわれて９５％の収率でＰを得た（P．D．Jeffrey等によるJ．Org．Chem．１９８２  ４７，第５８７頁〜第５９０頁）。
Ａ−Ｂ前駆体（Ｋ）とＣ−Ｄ前駆体（Ｐ）とのカップリングは図式５（図９）において示されるとおりに達成された。ジクロロメタン中のＤＣＣ／ＤＭＡＰを用いてのＫおよびＰの処理は８４％の収率で十分に保護されたＣ−Ｄ−Ａ−Ｂ中間体（Ｑ）に導いた。Ｑにおけるトリクロロエチルエステル基の還元性開裂は酢酸中の活性化亜鉛粉末を用いて達成された。次にＢＯＣ保護用基はトリフルオロ酢酸によって除去されて９１％のＱからの全体的収率でトリフルオロ酢酸塩としてＲを得た。ＦＤＰＰを用いてのＲのマクロラクタム化は６１％の収率でクリプトフィシン５１に導いた（J．Dudash，Jr．等によるSynth．Commun．１９９３，２３第３４９頁〜第３５６頁）。Ｓ−トランス−３−ペンテン−２−オール（Ａ）からの全体的収率は７％であった。
クリプトフィシン５１はＲ，Ｒ−エポキシドであるクリプトフィシン５２の前駆体およびＳ，Ｓ−エポキシドであるクリプトフィシン５３の前駆体として役に立った。次にクリプトフィシン５２は１８Ｒ，１９Ｓ−クロロヒドリンであるクリプトフィシン５５の前駆体および１３，１４−ジヒドロ類似体であるクリプトフィシン５７の前駆体として役に立った。クリプトフィシン５７はクリプトフィシン５８の前駆体として役に立った。クリプトフィシン５３はT．H．ChanおよびJ．R．FinkenbineによるJ．Am．Chem．Soc．１９７２，９４第２８８０頁〜第２８８２頁に記載された方法を用いるクリプトフィシン６１の前駆体およびY．Ittah等によるJ．Org．Chem．１９７８，４３第４２７１頁〜第４２７３頁に記載された方法を用いるクリプトフィシン９７の前駆体として役に立った。
フェニル基とは異なるAr基を有するクリプトフィシン類の合成のために、アルデヒドＦ（図式２；ＴＢＳ保護用基）またはＳ（図式６；ＴＢＰＳ保護用基）を、ブチルリチウムの存在下に適当な塩化アリールトリフェニルホスホニウムとウィッティッヒ反応させることにより一般構造式ｄ（図式１、R3＝Me）の単位Ａ前駆体が造られることが出来る。クリプトフィシン８１は図式６および７（図１０および１１）に示されるとおりにして前駆体ｄ（Ar＝ｐ−メトキシフェニル、R3＝Me）から造られた。
Ar基はまた合成の後の工程で新しいクリプトフィシンに導入されることが出来る。第一前駆体ｄ（Ar＝R3＝Me）は図式８（図１２）に示されるとおりにして適当なＡ−Ｂ（ｅ）前駆体およびＣ−Ｄ（ｆ）前駆体をカップリングすることによりクリプトフィシン８２に転換された。クリプトフィシン８２の選択的なオゾン分解および対応するエポキシド類のクリプトフィシン９０および９１の過ヨウ素酸酸化はアルデヒドであるクリプトフィシン１０８に導いた。ブチルリチウムの存在下での適当なアリールトリフェニルホスホニウムとのクリプトフィシン１０８のウィッティッヒ反応は新しいクリプトフィシン（図式９；図１３）を提供した。この方法を用いて、クリプトフィシン１１０（Ar＝ｐ−フルオロフェニル）、クリプトフィシン１１１（Ar＝ｐ−トリル）、クリプトフィシン１１２（Ar＝２−チエニル）およびクリプトフィシン１２４（Ar＝ｐ−クロロフェニル）が造られた。クリプトフィシン１１０はエポキシド類であるクリプトフィシン１１５および１１６の前駆体として役に立った。クリプトフィシン１１１はエポキシド類であるクリプトフィシン１１７および１１８の前駆体およびクロロヒドリン類であるクリプトフィシン１２８，１３０および１３１の前駆体として役に立った。クリプトフィシン１１２はエポキシド類であるクリプトフィシン１１９および１２０の前駆体として役に立った。クリプトフィシン１２４はエポキシド類であるクリプトフィシン１２５および１２６の前駆体およびクロロヒドリン類であるクリプトフィシン１３２，１３３および１３４の前駆体として役に立った。
クリプトフィシンを合成するための他の戦略は３つの前駆体、例えばδ−ヒドロキシまたはアミノ酸単位Ａを含有するＡ−Ｂ前駆体（ｅ）、δ−ヒドロキシまたはアミノ酸単位Ｄを含有する前駆体およびβ−アミノ酸単位Ｃを含有する前駆体から大員環を組み立てることである。本明細書に記載される方法において、（１）Ａ−Ｂ前駆体およびＤ前駆体における単位Ａおよび単位Ｄの末端を接合して非環式Ｄ−Ａ−Ｂ中間体を形成し、（２）Ｄ−Ａ−Ｂ前駆体およびＣ前駆体における単位Ｄおよび単位Ｃの末端を接合して非環式Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ中間体を形成しそして（３）単位Ｂおよび単位Ｃの末端を接合して環式生成物を形成することによる３つの工程でＡ−Ｂ前駆体、Ｃ前駆体およびＤ前駆体からクリプトフィシンが組み立てられる。
実験セクションにおいて記載されたクリプトフィシン１２１の合成において、Ａ−Ｂ部分における単位Ａのδ−ヒドロキシ基とＤフラグメントにおける単位Ｄのカルボン酸基との間でエステル結合が形成されて非環式Ｄ−Ａ−Ｂ中間体を形成する。次に単位Ｃのカルボン酸基とＤ−Ａ−Ｂフラグメントにおける単位Ｄのアミノ基との間でアミド結合が形成される。最後に、Ａ−Ｂ部分における単位Ｂのカルボン酸基とＣ−Ｄ部分における単位Ｃのβ−アミノ基との間でアミド結合が形成される。化合物ＫはＡ−Ｂ部分前駆体でありＢＯＣ−Ｌロイシン無水物はＤ単位前駆体でありそして化合物ＡＬは単位Ｃ前駆体である。化合物ＡＫはクリプトフィシン１２１の非環式Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ前駆体である（図式１０；図１４）。化合物ＫおよびＢＯＣ−Ｌ−ロイシン無水物は、工程１において、カップリングして単位Ａと単位Ｄとの間でエステルを形成するのを制限するために、単位Ｂのカルボン酸基上および単位Ｄのα−アミノ基上に保護基を有する。Ｄ−Ａ−Ｂ中間体における単位Ｄのアミノ基から保護基が除去されて、その結果工程２において単位Ｂにおけるアミノ基とカルボン酸Ｃとの間でアミド形成が生ずること出来る。
本発明の新規なクリプトフィシン化合物はクリプトフィシン１におけるエポキシド環とは異なる速度で求核剤により開環されるエポキシド環を有するかあるいは、クリプトフィシン８のクロロヒドリン官能性がクリプトフィシン１のエポキシド環に転換されるのとは異なる速度でエポキシド環を形成するクロロヒドリン官能性を有する。クリプトフィシン１のエポキシド環またはクリプトフィシン８のクロロヒドリン官能性（マスクされたエポキシド環）は最適のインビボ活性のために必須である。もしエポキシド酸素が（クリプトフィシン３において見い出されるように）除去されるかまたはエポキシド環が（クリプトフィシン１５において見い出されるような）ジオールに加水分解されるならば、抗腫瘍活性が非常に減少される。クリプトフィシン１はクリプトフィシン８と比較して動物において認識出来る毒性を示す。これはクリプトフィシン８についての値（ほとんど０％のＴ／Ｃ値および＞２．８の総対数死滅値（gross log kill values））と比較してクリプトフィシンについてのＴ／Ｃ（ほとんど＞０％）および総対数死滅値（ほとんど＜２．０）において反映される。対応するブロモヒドリン類似体であるクリプトフィシン２５はクリプトフィシン１についての値と比較し得るＴ／Ｃおよび総対数死滅値を示す。インビボ活性におけるこの顕著な差はブロモヒドリンクリプトフィシン２５がクリプトフィシン８よりもインビボでクリプトフィシン１により迅速に転換されることを示唆している。これはより低い毒性のクリプトフィシン８が活性化合物クリプトフィシン１に変換されるまえに腫瘍部位で蓄積するためのより多くの時間を有する可能性があることをさらに示唆している。クリプトフィシン１のエポキシド基は腫瘍細胞におけるその標的受容体に共有的に恐らくは結合する。本発明における新規なクリプトフィシン類は、対応するクロロヒドリンプロドラッグからのインビボエポキシド形成および腫瘍細胞における標的受容体への共有結合、の一層好ましい速度を示すことにより、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８よりも良好なインビボ活性を潜在的に持つことが出来るだろう。
本発明の化合物はクリプトフィシン１および２１より加水分解および加溶媒分解に対して一層安定である。クリプトフィシン１における単位Ｃおよび単位Ｄを接合するエステル結合はおだやかな塩基加水分解に対して比較的に感受性があり、pH１１でヒドロキシ酸に開裂し、０．８３時間の半減期を有する。単位ＣのＣ−２上のメチル基を欠いているクリプトフィシン２１におけるＣ−Ｄエステル結合は０．２５時間の半減期を有するより速い速度で開く。Ｃ−Ｄエステル結合はまた加溶媒分解に感受性である。メタノールが単離計画において用いられる場合、クリプトフィシン１および２１のかなりのメタノリシスが起る。クリプトフィシン２１はクリプトフィシン１よりメタノリシスに対してずっと感受性である。クリプトフィシン１は抗腫瘍活性を示すがしかるに、クリプトフィシン２１は不活性であり、恐らくはその理由はクリプトフィシン２１のＣ−Ｄエステル結合が、インビボでクリプトフィシン１のＣ−Ｄエステル結合より速く加水分解されるからである。Ｃ−Ｄエステル結合の加水分解はまた、医薬の腹腔内経路および皮下経路の投与によりクリプトフィシン１の減少したインビボ活性を、一部分説明することが出来る。クリプトフィシン５２において見い出されるような、単位ＣのＣ−２上に２つのメチル基を持つクリプトフィシン類のＣ−Ｄエステル結合はpH１１で安定である。
本発明の化合物およびまえに開示されたクリプトフィシン化合物は抗新生物（腫瘍）剤として治療的に使用されることが出来そしてそれにより新生物（腫瘍）疾患を治療するための方法において使用されることが出来る。本明細書において用いられる用語として、“新生物（腫瘍）の”とは、異常な生長である新生物（腫瘍）に関係し、そのような生長は生長の通常の制限に付されない細胞の増殖に起因して起る。本明細書において用いられる用語として“抗新生物（腫瘍）剤”とは新生物（腫瘍）表現型の細胞を阻止するか、排除するか、遅らせるかまたは逆転させる任意の化合物、組成物、混合物、共混合物またはブレンドである。
化学療法、外科手術、放射線治療、生物学的応答調製剤を用いての治療および免疫療法は癌の治療において現在使用されている。治療の各々の様式は当業者に知られている特定の指針を有しそして１つまたはすべては新生物（腫瘍）細胞の完全な破壊を達成させる試みにおいて使用されることが出来る。１種またはそれ以上のクリプトフィシンを使用する化学療法が本発明によって提供される。さらに組み合わせ化学療法、他の抗新生物（腫瘍）剤と組み合わせてクリプトフィシンを使用する化学療法は、組み合わせ治療が１種の抗新生物（腫瘍）剤の使用より一般に一層有効であるので、本発明によりまた提供される。したがって、本発明の追加の面は、上に挙げられた治療的利益を提供するのに役に立つ、本発明の新規なクリプトフィシン化合物の非毒性付加塩を包含する、少なくとも１種の本発明の新規なクリプトフィシン化合物の治療的に有効な量を含有する組成物を提供する。そのような組成物はまた、生理学的に許容出来る液体、ゲルまたは固体の担体、希釈剤、佐剤および賦形剤と一緒に提供されることが出来る。そのような担体、希釈剤、佐剤および賦形剤はメリーランド州ロックビルのU．S．Pharmacopeia Convention，Inc．のUnited States Pharmacopeia Vol．XXIIおよびNational Formulary Vol．XVII（これらの内容を参照することにより本明細書に組み入れる）において見い出されることが出来る。治療の追加の様式はAmerican Hospital Formulary ServiceによるＡＨＦＳ Drug Information １９９３年版、第５２２頁〜第６６０頁（この内容を参照することにより本明細書に組み入れる）に提供される。
本発明は新生物（腫瘍）疾患を治療するために使用される製薬組成物が少なくとも１種のクリプトフィシン化合物および少なくとも１種の追加の抗新生物（腫瘍）剤を含有する製薬組成物を提供する。クリプトフィシンと組み合わせて使用されることが出来る抗新生物（腫瘍）化合物はMerck & Co．，Inc.（１９８９年）発行のThe Merck Index第１１版pp．Ther  １６〜１７（その内容を参照することにより本明細書に組み入れる）に提供される化合物を包含する。本発明の追加の態様において、抗新生物（腫瘍）剤はメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素および２−クロロデオキシアデノシンを包含出来るがしかしそれらに限定されない代謝拮抗物質であってよい。本発明の他の態様において、意図される抗新生物（腫瘍）剤はシクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、パラプラチン、クロラムブシルおよび窒素マスタードを包含出来るがしかしそれらに限定されないアルキル化剤である。本発明の追加の態様において、抗新生物（腫瘍）剤はビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびエトポシドを包含出来るがしかしそれらに限定されない植物アルカロイド類である。本発明の追加の態様において、意図される抗新生物（腫瘍）剤はドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、マイトマイシンＣおよびブレオマイシンを包含出来るがしかしそれらに限定されない抗生物質である。本発明の追加の態様において、意図される抗新生物（腫瘍）剤はカルステロン、ジオモスタボロン（diomostavolone）、プロピオネート、エピチオスタノール（epitiostanol）、メピチオスタン（mepitiostane）、テストラクトン、タモキシフェン、りん酸ポリエストラジオール、酢酸メゲステロール、フルタミド、ニルタミド（nilutamide）およびトリロタン（trilotane）を包含出来がしかしそれらに限定されないホルモン類である。本発明の別の態様において、意図される抗新生物（腫瘍）剤は、アムサクリン（amsacrine）を包含出来るがしかしそれに限定されないＬ−アスパラギナーゼまたはアミノアクリジン誘導体類を包含出来るがしかしそれらに限定されない酵素類を包含する。追加の抗新生物（腫瘍）剤は、Little Brown & Co．（１９９１年）発行Handbook of Cancer Chemotherapy（第３版）においてのSkeel Roland T．，による“Antineoplastic Drugs and Biologic Response Modifier：Classification，Use and Toxicity of Clinically Useful Agents”（この内容を参照することにより本明細書に組み入れる）において提供される薬剤を包含する。
本クリプトフィシン化合物および組成物は家畜のためのような、獣医学的使用のために哺乳動物に投与されることが出来、そして他の治療薬と同様な方法でヒトの臨床的使用のために投与されることが出来る。一般に治療的効能のために必要とされる投与量は投与の使用のタイプおよび様式、ならびに各患者の特定化された要件に従って変化する。通常、投与量は０．００１〜１０００mg／患者の体重のkg、さらに普通には０．０１〜１０mg／kgの範囲にある。別法として、これらの範囲内の投与量は、所望の治療的効果が得られるまで、通常２４時間を超る長期の時間にわたって一定の注入により投与されることが出来る。実際には、医薬投与量ならびに投与の経路は相対的有効性、相対的毒性、腫瘍の生長特性、細胞（分裂）周期上へのクリプトフィシンの効果、医薬薬剤速度論、年令、性、患者の身体状態および以前の処置に基づいて選択されねばならない。
追加の抗新生物（腫瘍）剤とともにまたはそれなしで、本クリプトフィシン化合物は本来のままでまたは塩形として治療組成物に配合されることが出来る。製薬的に許容出来る非毒性塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸第二鉄のような無機塩基そしてイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等のような有機塩基から誘導されることが出来る（遊離カルボキシルまたは他のアニオン基で形成された）塩基付加塩を包含する。そのような塩はまた任意の遊離なカチオン基を有する酸付加塩として形成されることが出来そして一般に例えば塩酸または燐酸のような無機酸あるいは酢酸、修酸、酒石酸、マンデル酸、等のような有機酸を用いて形成される。別の本発明が提供する追加の賦形剤は当業者に手に入れることが出来る賦形剤であり、例えばメリーランド州、ロックビルのU．S．Pharmacopeia Convention，Inc．，発行のUnited States Pharmacopeia Vol．XXIIおよびNational Formulary Vol．XVII（これらを参照することにより本明細書に組み入れる）において見い出される賦形剤である。
一定の治療組成物に包含させるための特定の担体の適合性は投与の好ましい経路により左右される。例えば、抗新生物（腫瘍）組成物は経口投与のために配合されることが出来る。そのような組成物は典型的には液体溶液または懸濁液としてかあるいは固体形で造られる。経口配合物は通常、結合剤、充てん剤、保存料、安定化剤、乳化剤、緩衝剤そして例えば製薬級のマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような賦形剤のような通常使用される添加剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル持続放出性配合物、または粉末の形をとりそして典型的には、１％〜９５％の活性成分、好ましくは２％〜７０％の活性成分を含有する。
本発明の組成物は、注射出来る、液体溶液、懸濁液、または乳濁液としてまた造られることが出来：注射する前に液体が造られる溶液または懸濁液のために適している固体として本発明の組成物は造られることが出来る。そのような注射出来る組成物は、皮下に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、くも膜下にまたは胸膜内に投与されることが出来る。１種の活性成分または複数の活性成分は、生理学的に許容出来るそして活性成分（１種または複数種）と相容れることが出来る希釈剤または賦形剤と多くの場合混合される。適当な希釈剤および賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、等、そしてそれらの組み合わせである。また、所望ならば、組成物は湿潤剤または乳化剤、安定化剤またはpH緩衝剤のような少量の補助物質を含有してもよい。
本発明はさらに哺乳動物細胞の増殖を阻止するのに十分な量で哺乳動物の細胞をクリプトフィシン化合物と接触させることにより哺乳動物の細胞の増殖を阻止するために属構造物により包み込まれるクリプトフィシン化合物を用いる方法をさらに提供する。好ましい態様は過増殖性哺乳動物細胞の増殖を阻止するための方法である。この発明の目的のために、“過増殖性哺乳動物細胞”は生長の特徴的限界、例えばプログラム細胞死（アポプトーシス（枯死））に付されない哺乳動物細胞である。別の好ましい態様は哺乳動物細胞がヒトである場合である。本発明は哺乳動物細胞を少なくとも１種のクリプトフィシン化合物および少なくとも１種の追加の抗新生物（腫瘍）剤と接触させることをさらに提供する。意図される抗新生物（腫瘍）剤のタイプは本明細書において上に開示された抗新生物（腫瘍）剤と同じである。
本発明は、過剰増殖性哺乳動物細胞の増殖を阻止するのに十分な量で、該細胞をクリプトフィシン化合物と接触することにより、複合薬剤耐性表現型を包含する、薬剤耐性表現型を有する過剰増殖性細胞の増殖を阻止するために属構造により取り囲まれたクリプトフィシン化合物を用いる方法をさらに提供する。好ましい態様は哺乳動物がヒトである場合である。本発明は哺乳動物細胞をクリプトフィシン化合物および少なくとも１種の追加の抗新生物（腫瘍）剤と接触させることを提供する。意図される抗新生物（腫瘍）剤のタイプは本明細書において上に開示された抗新生物（腫瘍）剤と同じである。
本発明は過増殖している細胞の増殖を阻止するために本明細書の上に提供された製薬組成物の有効量を対象に投与することにより、哺乳動物細胞を過剰増殖すること、例えば新形成（異常増殖）により生じた病理学的症状を緩和するための方法さらに提供する。本明細書において用いられる用語として“病理学的症状”とは、細胞生長の正常な限界に付されない哺乳動物細胞の増殖から生ずる任意の病理学を云う。細胞のそのような増殖は次の新生物（腫瘍）；乳房の新生物、小区画肺の新生物、非小区画の肺の新生物、結腸直腸の新生物、白血病、黒色腫、中枢神経系の新生物、卵巣の新生物、前立腺の新生物、軟組織および骨の肉腫、頭部および頸部の新生物、膵臓の新生物および食道の新生物を含む胃の新生物、胃の新生物、骨髄腫、膀胱の新生物、腎臓の新生物、甲状腺腫およびりんぱ腫を包含する神経内分泌の新生物、非ホジキン肉腫およびホジキン肉腫を包含するがしかしそれらに限定されない新生物（腫瘍）に起因している可能性がある。本発明の追加の態様において、新生物（腫瘍）細胞はヒトである。本発明は他の治療、ならびに他の抗新生物（腫瘍）剤と組み合わせてクリプトフィシンを使用する、そのような病理学的症状を緩和する方法をさらに提供する。種々の異なる新形成（異常増殖）に対してのそのような治療およびそれらの適合性はLippincott Co．（１９９３年）発行DeVita，V．、Hellman，S．およびRosenberg S．編集Cancer Principles and Practice of Oncology（これらの内容を参照することにより本明細書に組み入れる）に見い出されることが出来る。
本開示において、クリプトフィシン化合物は培養細胞における微小管構造を強力的に分裂させることが示される。さらにそしてVincaアルカロイドとは対照的に、クリプトフィシン化合物は薬剤−流出ポンプＰ−糖たんぱく質のための貧弱な基質であるように思われる。クリプトフィシン１は、ＧＳＶ２２４と称されるラン藻（ラン菌）Nostoc sp．菌株において主要な細胞毒である。この環式ジデプシペプチドは、抗真菌剤としてNostoc sp．ＡＴＣＣ承認第５３７８９から以前に単離されたそしてその総構造は以前に決定された。この潜在的に重要な医薬の相対的および絶対的立体化学は化学技術およびスペクトル技術の組み合せを用いて今や確立された。２４の追加のクリプトフィシン化合物であるクリプトフィシン２〜７、１６〜１９、２１、２３、２４、２６、２８〜３１、４０、４３、４５、４９、５０および５４はまたＧＳＶ２２４から単離されたそしてそれらの全体的構造および細胞毒性が決定された。数種の誘導体および低位化生成物が化学的におよび生理学的にの両方において記載される。
以下の例は本発明の或る好ましい態様および面を例示するために供されそしてその範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
実験セクション
以下の実験的開示において、すべての重量はグラム（ｇ）、ミリグラム（mg）、ミクログラム（μg）、ナノグラム（ng）、ピコグラム（pg）、モル（モル）またはミリモル（ｍモル）で提供され、すべての濃度は容量によるパーセント（％）、モル濃度（Ｍ）、ミリモル濃度（mM）、ミクロモル濃度（μM）、ナノモル濃度（nM）、ピコモル濃度（μM）または規定（Ｎ）として提供され、すべての容量はリットル（Ｌ）、ミリリットル（mL）またはミクロリットル（μL）で提供されそして線の測定はミリメートル（mm）で提供され、これらは他のように示されないかぎり使用される。
以下の例はクリプトフィシン化合物の単離および合成ならびに本発明に従っての治療薬としてのそれらの使用を示す。
抗腫瘍活性についての、１０００以上のラン藻（ラン菌）のスクリーニング抽出物において、Nostoc sp．ＧＳＶ２２４の親油性抽出物はＫＢ，ヒト鼻咽頭癌細胞系に対して０．２４ng／mLおよびL0V0、ヒト結腸直腸腺癌細胞系に対して６ng／mL、の最大阻止濃度（ＭＩＣ）を示す、強い細胞毒性3であることが分かった。さらに重要なことには、その抽出物はCorbett検定法4,5において重大な腫瘍選択性細胞毒性を示した。その藻類の抽出物の生物学的定量法監視逆相クロマトグラフィは、Merckでの研究者によりNostoc sp．ＡＴＣＣ５３７８９から以前に単離された6,7そしてCryptococcusの菌株に対して非常に活性であると分かった強力な殺真菌剤であるクリプトフィシン１で主として、あった分画に導いた。
クリプトフィシン１はNostoc sp．ＧＳＶ２２４の粗製藻類抽出物の細胞毒性活性の大部分を表わしそしてその純粋な化合物はＫＢに対して３pg／mLそしてL0V0に対して５pg／mLのＩＣ50値を示した。Corbett検定法においてクリプトフィシン１は強力な腫瘍選択性、そして薬品感受性および薬品耐性腫瘍細胞に対して等しく細胞毒性であることが分かった。蛍光免疫検定法はクリプトフィシン１がビンブラスチンの標的と類似の細胞標的と相互作用するがしかしより長い時間コースの作用を有する点でそして準結晶を形成しない点で後者の医薬とは異なることを示した。予備インビボ実験において、クリプトフィシン１はマウスに埋め込まれた腫瘍に対して非常に有望な活性を示した。
少量の幾種かの他のクリプトフィシン化合物がNostoc sp．ＧＳＶ２２４中に存在した。これらのうちの２１は、１：５のジクロロメタン／アセトニトリルを用いての藻類の抽出および抽出物の逆相ＨＰＣＬにより、構造決定およびインビトロ抗腫瘍評価のために十分な量で単離されることが出来た。クリプトフィシン２、３、４、１６、１７、１８、１９、２１、２３、２４、２６、２８、２９、３０、３１、４０、４３、４５、４９、５０および５４は、６５：３５のアセトニトリル／水を用いての逆相フラッシュカラムから溶離された分画においてクリプトフィシン１を伴なった。クリプトフィシン２、３、４、５、６および７は、藻がメタノールで抽出されそしてメタノール／水を用いて逆相クロマトグラフィが行なわれたときに見い出されたそれらだけの化合物であった。クリプトフィシン２、３、４、５および６は３：１のメタノール／水で溶離されそしてクリプトフィシン７は１：３のメタノール／水を用いて溶離された早期のより低い細胞毒性の分画に見い出された。アクリル性クリプトフィシン５、６および７は単離処理中にクリプトフィシン１の分解により生成された人工品であると思われる。
クリプトフィシン３および５はMerckでの研究者によりクリプトフィシン１から造られた殺カビ性半合成化合物8,9と同一であると思われた。クリプトフィシン３は亜鉛−銅カップルを用いてまたは四沃化二燐を用いて9クリプトフィシン１を処理することにより造られた。クリプトフィシン５はクリプトフィシン１のメタノリシス9（メタノールによる加溶媒分解）により造られた。
例１ 構造決定
新しい化合物、即ちクリプトフィシン２、４、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２１、２３、２４、２６、２８、２９、３０、３１、４０、４３、４５、４９、５０および５４ならびに以前に開示された化合物の構造の決定は当業者に周知である方法論を用いて直接法で行なわれた。質量スペクトルデータは分子組成と一致した。ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、およびＮＯＥＳＹスペクトルから得られたプロトンおよび炭素ＮＭＲデータは、それらをこれらのデプシペプチドタイプの化合物の総構造のすべてを組み立てるのを可能にした。各々の化合物における種々のヒドロキシおよびアミノ酸単位の存在はガスクロマトグラフィ質量分光分析により確認された。絶対立体化学を包含する全体的構造はクリプトフィシン化合物の適当な誘導体についての化学的分解技術および特殊な分析技術の組み合せを用いて決定された。
例２ 構造−活性相関（ＳＡＲ）
最適活性のために必要とされるクリプトフィシン１における構造的特徴を精査のために、本明細書に記載された化合物のすべてはＫＢ（ヒト鼻咽頭癌、L0V0（ヒト結腸癌）およびＳＫＯＶ３（ヒト卵巣癌）の細胞系に対する細胞毒性について評価された。ＩＣ50値が表１および２に挙げられる。細胞毒性の比較はクリプトフィシン１の、完全なマクロライド環、７，８−エポキシ−５−ヒドロキシ−６−メチル−８−フェニル−２−オクテン酸単位におけるエポキシ基およびメチル基および二重結合（図１における単位Ａ参照）、３−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）アラニン単位（単位Ｂ）におけるクロロ基およびＯ−メチル基、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸単位（単位Ｃ）におけるメチル基およびロイシン酸単位（単位Ｄ）におけるイソブチル基が最適な細胞毒性のために必要とされることを示した。クリプトフィシン８は、恐らくはマスクされたエポキシドとして働らくクロロヒドリン官能性にほとんど起因していると思われる。
最も活性な化合物は、抗真菌テストおよび抗菌テストにおいて普通に使用される検定にならってモデル化されたCorbett検定、デスク拡散検定を用いて４つの異なる細胞タイプ、即ちねずみ白血病（Ｌ１２１０またはＰ３８８）、ねずみ充実性腫瘍（結腸腺癌３８、膵管腺癌０３、乳房腺癌Ｍ１６／Ｍ１７）、ヒト充実性腫瘍（結晶ＣＸ−１、ＨＣＴ８、Ｈ１１６；肺Ｈ１２５；乳房ＭＸ−１、ＭＣＦ−７）および低い悪性線維芽細胞）に対して選択的細胞毒性についてまた評価された。表１において示された結果は、クリプトフィシン１〜５および８が充実性腫瘍選択性でなく、また白血病選択性でなかったがしかしむしろＭ１７のような薬剤耐性細胞系を包含する腫瘍細胞系に対して等しく活性であった。白血病細胞系についての阻止域より大きい２５０域（zone）単位、即ち７．５mmであった、充実性腫瘍細胞系のいずれかについて阻止の域を示した化合物はなかった。しかしながら、クリプトフィシン１〜５および８は線維芽細胞ＬＭＬについての阻止の域と比較して、腫瘍細胞系のすべてに阻止の著しく大きな域（４００域単位）を示した。診断的にＬＭＬは臨床的に有用な細胞毒性剤（表１の５−フルオロウラシル、エトポシドおよびタキソールについてのCorbett検定データ参照）に関して腫瘍細胞よりも一層正常細胞のように挙動することが分かった。示差的細胞毒性が＞２５０域単位であったのでクリプトフィシン１〜５および８は腫瘍選択性であった。したがってこれらの化合物はインビボ試験の候補者となった。
クリプトフィシン１は薬剤耐性腫瘍を包含する、マウスに植込まれたねずみおよびヒトの腫瘍の広いスペクトルに対して活性である（表３）。１０％未満である腫瘍荷重Ｔ／Ｃ（処理された動物における平均腫瘍荷重（burden）／非処理動物における平均腫瘍荷重）値を示す、５つの早期段階ねずみ腫瘍、即ち結腸腺癌＃３８および＃５１、タキソール感受性およびタキソール耐性乳房＃１６／Ｃ／ＲＰおよび膵管腺癌＃０３およびＳＣＩＤマウスにおいて試験された２つの早期段階ヒト腫瘍、即ちＭＸ−１胸部およびＨ１２５腺鱗肺（adenosquamous lung）に対して優れた活性を示す。
４２％未満であるＴ／Ｃ値はＮＣＩ標準により活性であると考えられる；１０％未満であるＴ／Ｃ値はＮＣＩ標準により優れた活性および有力な臨床活性を有すると考えられる4。試験の２つは、２．０の総（腫瘍細胞）対数死滅値（log kill value）を示した。総対数死滅（Gross log kill）はＴ−Ｃ／３．２Td（但し、Ｔは７５０mgに到達するための処理されたグループの腫瘍について日での中央時間であり、Ｃは７５０mgに到達するための対照グループの腫瘍についての日での中央時間でありそしてTdは腫瘍容量二重時間（tumor volume doubling time）である）として定義される。５〜２０日の薬剤処理の期間を用いて、＞２．８、２．０〜２．８、１．３〜１．９、０．５〜０．８および＜０．５の総対数死滅値はそれぞれ、＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋および−（不活性）と得点化される。臨床的活性の表示である＋＋＋〜＋＋＋＋の活性等級は１００〜３００mg大きさのかたまりのほとんど移植されたマウスの充実性腫瘍の部分的または完全な退縮を行なうのに必要とされる。
クリプトフィシン８はまたマウスに植込まれた広いスペクトルの腫瘍に対して活性である。それは今日まで試験されたすべての腫瘍に対して優れた活性を示し、＜１０％の腫瘍荷重（burden）Ｔ／Ｃ値を示す、がしかしさらに重要なことには＋＋＋〜＋＋＋＋の総対数死滅活性等級を示しそして或るものは治癒する。
良好なインビボ活性は、今日まで行なわれた１つの試験においてクリプトフィシン３５を用いてまた見られた。
クリプトフィシン１および８の試験中に観察された致命的毒性はすべての臨床的に使用される抗腫瘍薬剤に共通である白血球減少症に起因していた。
例３ 培養条件
Nostoc sp．ＧＳＶ２２４はミシガン州大学のＭＳＵ−ＤＯＥ  Plant Research LaboratoryのC．P．Wolk教授から得られた。Nostoc sp．ＡＴＣＣ５３７８９はAmerican Type Culture Collectionから購入された。藻のＩＬフラスコ培養はpHをNaOHで７に調節された変性ＢＧ−１１3と称される無機培地を含有する、オートクレーブに入れられた２０Ｌガラス耐酸ビンに接種するために用いられた。培養は数列の冷白色蛍光管から２００μモル光量子ｍ-2秒-1（光合成的に活性な照射線）の入射強度で連続的に照射されそして２４±１℃の温度で空気中０．５％CO2の混合物で５Ｌ／分の速度で通気された。典型的には培養は２１日後、ろ過により採取された。凍結乾燥されたNostoc sp．ＧＳＶ２２４の収量は０．６１ｇ／培養のＬ平均でありそしてＡＴＣＣ５３７８９の収量は０．３ｇ／培養のＬ平均であった。
例４ 単離
方法Ａ：凍結乾燥されたNostoc sp．ＧＳＶ２２４（５０ｇ）を４８時間１：５のCH2Cl2／CH3CNの２Ｌで抽出しそして抽出液を真空濃縮して暗緑色固体を得た。残留物（１ｇ：ＫＢ  ＭＩＣ  ０．２４ng／mL）をＯＤＳ−被覆シリカカラム（５５ｇ、７×５cm）に適用しそして１：３のCH3CN／H2O（０．８Ｌ）、１：１のCH3CN／H2O（０．８Ｌ）、６５：３５のCH3CN／H2O（１．０Ｌ）、MeOH（０．８Ｌ）およびCH2Cl2（０．５Ｌ）を用いてフラッシュクロマトグラフィに付した。６５：３５のCH3CN／H2Oで溶離された分画（４２０mg；ＫＢ  ＭＩＣ１４pg／mL）を逆相ＨＰＬＣ（Econosil  Ｃ１８、１０μ、２５cm×２１．５mm、２５０nmでＵＶ検出、６５：３５のCH3CN／H2O、６mL／分の流速）に付してクリプトフィシン１（ｔR ４９．３分、２２０mg）および多数の不純物分画を得た。ｔR ２８．８分でのEconosil  Ｃ１８カラムから溶離された分画は順相ＨＰＬＣ（Econosilシリカ５μカートリッジ、２５０×４．６mm、６：４の酢酸エチル／ヘキサン、３mL／分）によりさらに精製されてクリプトフィシン１６（３．０mg）を得た。ｔR ３２．５分でのEconosil  １８カラムから溶離された分画は３mL／分で５５：４５の酢酸エチル／ヘキサンを用いる、Econosilシリカカラム上のＨＰＬＣに付されてクリプトフィシン２４（０．８mg）を得た。ｔR ３５．５分でのEconosil  １８から溶離された分画は第１に３mL／分での１：１の酢酸エチル／ヘキサンを用いそして第２に２．５mL／分での４：６の酢酸エチル／塩化メチレンを用いて、Econosilシリカカラム上で２回ＨＰＬＣに付されてクリプトフィシン２３（１．２mg）およびクリプトフィシン４３（０．１mg）を得た。ｔR ３９．５分でのEconosil  Ｃ１８カラムから溶離された分画は３mL／分で１：１の酢酸エチル／ヘキサンを用いてのEconosilシリカカラム上のＨＰＬＣに付されてクリプトフィシン２（６mg）およびクリプトフィシン２１（１４mg）およびｔR ３２．５分で溶離されたクリプトフィシン類の複合混合物を得た。４００ｇの乾燥藻から集められた、この後者の分画は３５：６５の水／アセトニトリルを用いてセミプレパレーチブカラム（partisil  Ｃ１８、２５０×９．４mm、１０μ）上でそして１．３mL／分で５：４：１の水／アセトニトリル／メタノールを用いて逆相分析カラム（Econosil、１５０×４．６mm、５μ）上で順次クロマトグラフィにかけてクリプトフィシン５０（ｔR ３４．８、０．４mg）およびクリプトフィシン４０（ｔR ３８．８分、０．３mg）を得た。ｔR ４４．５分でEconosil  Ｃ１８カラムから溶離された分画は３mL／分での１：１の酢酸エチル／ヘキサンを用いてのEconosilシリカカラム上のＨＰＬＣに付されてクリプトフィシン１７（０．３mg）を得た。クリプトフィシン１に対するショルダーとしてｔR ５４．５でEconosil  Ｃ１８から溶離された分画の順相ＨＰＬＣ精製は、１：１の酢酸エチル／ヘキサンを用いての溶離の際クリプトフィシン４５（ｔR ６．７分、０．１mg）、クリプトフィシン２６（ｔR ８．９分、０．５mg）およびクリプトフィシン５４（ｔR １９．８分、＜０．１mg）を生じた。広いピーク（ｔR ５８〜７０分）としてEconosil  Ｃ１８カラムから溶離された分画は２．５mL／分での４３：５７の酢酸エチル／ヘキサンを用いてのEconosilシリカカラム上のＨＰＬＣに付されて、クリプトフィシン４（ｔR ���９．６分、１．５mg）、クリプトフィシン３１（ｔR ９．４分、０．８mg）、クリプトフィシン１９（ｔR ２５．８分、０．３mg）、クリプトフィシン４９（ｔR ２８分、０．１mg）、クリプトフィシン２８（ｔR ２９．０分、０．５mg）そして不純なクリプトフィシン２９（ｔR ５２．５分、２．０mg）およびクリプトフィシン３０（ｔR ４９分、３．０mg）を得た。クリプトフィシン２９および３０は逆相ＨＰＬＣ（Econosil  Ｃ１８、１０μ、２５０×１０mm、３：１メタノール／水）に付した後に純粋なのが得られた。ｔR ７８．９分でのEconosil Ｃ１８カラムから溶離された分画はEconosilシリカカラム上のＨＰＬＣに付されて、クリプトフィシン３（ｔR １６．４分、３．０mg）を得た。ｔR ８２．８分でEconosil  Ｃ１８カラムから溶離された分画は、３mL／分での４５：５５の酢酸エチル／ヘキサンを用いてのEconosilシリカカラム上のＨＰＬＣに付されてクリプトフィシン１８（ｔR １９．２、０．８mg）を得た。
方法Ｂ：１２時間（ｈ）MeOHの７００mL部分を用いてそして５時間MeOHの４００mLの部分を用いて２回、凍結乾燥されたNostoc sp．ＧＳＶ２２４（１２．２３ｇ）は抽出された。抽出液を合併しそして真空濃縮して１．８４ｇの暗緑色固体を得、これを水とCH2Cl2との間に分配した。親油性部分（０．６５ｇ；ＫＢ  ＭＩＣ  ０．２４mg／mL）をＯＤＳ被覆シリカカラム（５５ｇ、７×５cm）に適用しそして１：３のMeOH／H2O（０．８Ｌ）、１：１のMeOH／H2O（０．８Ｌ）、３：１のMeOH／H2O（０．８Ｌ）、MeOH（０．８Ｌ）およびCH2Cl2（０．５Ｌ）を用いてのフラッシュクロマトグラフィにかけた。３：１MeOH／H2Oで溶離され（２２mg；ＫＢ  ＭＩＣ１４pg／mL）、本質的にすべての細胞毒活性を表わす分画は溶離剤として１：５のMeOH／H2Oを用いる逆相ＨＰＬＣ（Econosil  Ｃ１８、１０μ  ２５０×１０mm、２５０nmでＵＶ検出、流速３mL／分）に付されてクリプトフィシン７（ｔR ７．６分、０．２mg）、５（ｔR １５．４分、２．３mg）、２（ｔR １６．０分、１．０mg）、１（ｔR １９．０分、１２．０mg）、４（ｔR ２６．５分、１．２mg）、および３（ｔR ３０．２分、１．４mg）を得た。培養の１つから、１：３MeOH／H2Oを用いてフラッシュカラムから溶離された分画（８．１mg）はよりおだやかな細胞毒性を示した（ＫＢ  ＭＩＣ  ２μｇ／mL）。溶離剤として２：３MeOH／H2Oを用いてのＨＰＬＣ上での精製はクリプトフィシンＧ（７、ｔR ６．０分、２．４mg）を生成した。
実施例５  クリプトフィシン１〜７のスペクトルデータ
下記のスペクトルデータ中のイタリック体太字は図１のＡ〜Ｄに対応する。
0004181632.tif 000102
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例  ６ クリプトフィシン誘導体の合成
クリプトフィシン８
３．８mgのクリプトフィシン１の１．５mlの１，２−ジメトキシエタン／水２：１１の溶液に９μLの１N HCLを加えた。その溶液を室温で4時間攪拌し続け、炭酸カリウムで中和してから、蒸発させた。残留物を水とCH2CL2の間に分配した。CH2CL2に溶解する物質を逆相HLPCにより精製して３．３mgの純粋なクリプトフィシン８を得た。
EIMS m/z(相対強度)690/692/694(0.8/0.5/0.2).高分解能EIMS m/z 690.2533(C35H44Cl2N2O8で計算,-5.8mmu誤差).1H NMR(CDCl3):アミノまたはヒドロキシ酸単位δ(炭素位置、多重度;HzでのJ)8-クロロ-5,7-ジヒドロキシ-6-メチル-8-フェニル-2-オクテン酸(A)5.79(2,dt;15.4),6.69(3,ddd;15.4,9.7と5.6),2.68(4,ddt;14.0,5.5と1.8),2.38(4,m),5.11(5,ddd;10.8,8.6と1.8),2.51(6,m),1.05(6-Me,d;7.0),4.01(7,dd;9.6と1.9),4.65(8,d;9.6),7.36-7.41(10/11/12/13/14,m);ロイシック酸(D)4.92(2,dd;10.1と3.5),1.76(3/4,m),1.45(3,m),0.94(5,d;6.6),0.94(4-Me,d;6.4);3-アミノ-2-メチルプロピオン酸（C）2.73(2,m),1.22(2-Me,d;7.2),3.25(3,ddd;13.6,6.8と6.1),3.54(3,ddd;13.5,6.1と3.4),6.91(3-NH,brt;6.1);3-クロロ-4-メトキシフェニルアラニン(B)4.82(2,ddd;8.8,7.25と5.6),5.64(2-NH,d;8.8),3.03(3,dd;15.4と7.2),3.16(3,dd;15.4と5.6),7.23(5,d;2.2),3.88(7-OCH3,s),6.85(8,d;8.5),7.09(9,dd;8.5と2.2)。
クリプトフィシン９
１０mgのクリプトフィシン１の乾燥メタノール１mL中溶液に１０μLのメタノール性HCl（1.25gのチオニルクロリドを25mLのMeOHで処理することにより得られた）を加えた。4時間攪拌の後、溶媒を真空で除いてから、その試料を真空下に12時間放置した。逆相HLPCは８mgの純粋なクリプトフィシン９を与えた。
1H NMR(CDCl3):アミノまたはヒドロキシ酸単位δ(炭素位置、多重度;HzでのJ);5,7-ジヒドロキシ-8-メトキシ-6-メチル-8-フェニル-2-オクテン酸(A)5.76(2,dt;15.5),6.67(3,ddd;15.5,9.5と5.6),2.34(4,ddd;14.1,11.1と9.5),2.62(4,dddd;14.1,5.6,1.8と1.5),5.09(5,ddd;11.1,7.8と1.8),2.24(6,dqd;7.8,7.0と2.2),1.03(6-Me,d;7.0),3.71(7,dd;8.3と2.2),4.03(8,d;8.3),3.20(8-OCH3,s),7.31-7.40(10/11/12/13/14,m);ロイシック酸(D)4.86(2,dd;9.8と3.5),1.71(3/4,m),1.41(3,m),0.89(5/4-Me,d;6.4);3-アミノ-2-メチルプロピオン酸(C)2.71(2,ddq;6.8,3.9と7.2),1.21(2-Me,d;7.2),3.23(3,ddd;13.5,6.8と6.0),3.52(3,ddd;13.5,6.0と3.9),6.90(3-NH,brt;6.0);3-クロロ-4-メトキシフェニルアラニン(B)4.82(2,ddd;8.8,7.4と5.7),5.66(2-NH,d;8.8),3.023(3,dd;14.4と7.4),3.15(3,dd;14.4と5.5),7.23(5,d;2.2),3.87(7-OCH3,s),6.84(8,d;8.5),7.08(9,dd;8.5と2.2)。
クリプトフィシン１０
１mLのアセトンと０．３mLの水の中に７mgのクリプトフィシン９を攪拌した溶液に８μLの２N NaOHを加えた。その溶液を4時間攪拌した後、１N HClでpH７に中和してから、溶媒を減圧で除いた。残留物を逆相HPLCに７：３MeOH/H2Oを用いてかけると純粋なクリプトフィシン１０（５mg）を得た。
1H NMR(CD3OD):アミノまたはヒドロキシ酸単位δ(炭素位置、多重度;HzでのJ);5,7-ジヒドロキシ-6-メチル-8-フェニル-2-オクテン酸(A)5.99(2,dt;15.4と1.3),6.82(3,dt;15.4と7.3),2.30(4,m),3.66(5,td;7.8と3.5),2.05(6,dペンテット;1.8と7.0),0.96(6-Me,d;7.0),4.04(7,dd;8.8と2.0),4.01(8,d;8.8),3.12(8-OCH3,s),7.26-7.36(10/11/12/13/14,m);3-アミノ-2-メチルプロピオン酸(C)2.50(2,m),1.02(2-Me,d;7.3),3.16(3,dd;13.4と6.9),3.82(3,dd;13.4と6.6);3-クロロ-4-メトキシフェニルアラニン(B)4.57(2,dd;8.5と6.5),2.82(3,dd;13.9と8.6),3.03(3,dd;13.9と6.5),7.25(5,d;2.2),3.82(7-OCH3,s),6.96(8,d;8.6),7.13(9,dd;8.6と2.2).13C NMR(CD3OD);δ179.5,173.4,168.2,155.4,143.7,141.7,131.9,131.7,129.8,129.3(2C),129.2(2C),128.8,126.2,123.2,113.4,85.9,74.5,74.1,56.8,56.6,56.3,42.3,41.2,40.2,38.8,38.0,15.5,9.9。
クリプトフィシン１２
５mgのクリプトフィシン１、５または８の１mLの４：１アセトン／水の中の溶液に１５μLの２N NaOHを加えた。室温で５時間攪拌の後、反応混合物を１N HClでpH７に中和してから、蒸発させた。CH2Cl2溶解性物質をCH2Cl2、１：１EtOAc／CH2Cl2、およびEtOAcと共に小さなシリカカートリッジを通過させた。EtOAcと共に溶出した画分は純粋なクリプトフィシン１２を含んでいた。
1H NMR(CD3OD):アミノまたはヒドロキシ酸単位δ(炭素位置、多重度;HzでのJ),5,7,8-トリヒドロキシ-6-メチル-8-フェニル-2-オクテン酸(A)6.07(2,ddd;15.5,1.3と1.2),6.40(3,dt;15.5と7.3),2.49(4,m),2.60(4,m),3.92(5,ddd;9.3,6.7と4.5),1.94(6,m),1.07(6-Me,d;6.6),3.61(7,dd;8.9と7.6),4.56(8,d;7.6),7.36(10/14,dd;7.4と1.5),7.32(11/13,brt;7.5),7.25(12,m);3-アミノ-2-メチルプロピオン酸(C)2.54(2,ddq;7.0,6.6と7.0),1.02(2-Me,d;7.0),3.14(3,dd;13.5と7.0),3.42(3,dd;13.4と6.6);3-クロロ-4-メトキシフェニルアラニン(B)4.57(2,dd;8.4と6.7),2.83(3,dd;13.8と8.4),3.02(3,dd;13.8と6.6),7.25(5,d;2.1),3.82(7-OCH3,s),6.95(8,d;8.5),7.12(9,dd;8.5と2.1)。ジアゾメタンによるクリプトフィシン１２のメチル化はクリプトフィシン６を与えた。
クリプトフィシン１４
３mgのクリプトフィシン６の１mLの３：１アセトン／水の中の溶液に５μLの２N NaOHを加えた。５時間攪拌の後、反応混合物を１N HClでpH７に中和してから、蒸発乾固させた。残留物を逆相HLPCにかけると２．４mgのクリプトフィシン１４を与えた。
1H NMR(CD3OD):アミノまたはヒドロキシ酸単位δ(炭素位置、多重度;HzでのJ),5-ヒドロキシ-6-メチル-8-フェニル-2,7-オクタジエン酸(A)5.98(2,d;15.3),6.78(3,dt;15.3と7.5),2.35(4,m),3.64(5,td;7.2と4.8),2.47(6,m),1.14(6-Me,d;6.9),6.22(7,dd;15.9と8.1),6.39(8,d;15.9),7.24-7.36(10/11/12/13/14,m);3-アミノ-2-メチルプロピオン酸(C)2.35(2,m),1.02(2-Me,d;6.9),3.18(3,dd;13.2と6.6),3.36(3,dd;13.2と4.5);3-クロロ-4-メトキシフェニルアラニン(B)4.58(2,dd;8.7と6.3),2.80(3,d;13.8と9.0),3.05(3,dd;13.8と6.3),7.25(5,d;2.1),3.82(7-OCH3,s),6.95(8,d;8.4),7.13(9,dd;8.4と2.1)。
クリプトフィシン３５
触媒量のPtO2を０．５mLのCH2CL2を入れたフラスコに加えた。フラスコ内の空気を排気し、水素を導入し、そして前記の混合物を室温で２０分間攪拌した。１０mgのクリプトフィシン１の最小量CH2CL2溶液を加えてから、混合物を室温で45分間攪拌した。触媒をセライト／綿を通す濾過により除いてから、溶媒を蒸発させた。Ｃ１８ラム上での残留物の逆相HLPCは６．５mgのクリプトフィシン３５を与えた。
EIMS m/z(相対強度)656/658(25/10),412/414(25/12),280/282(20/10),195/197(78/25),141(58),91(100);高分解能EIMS m/z 656.2864(C35H45Cl-N2O8で計算,0.0mmu誤差).1H NMR(CDCl3):アミノまたはヒドロキシ酸単位δ値(炭素位置、多重度;HzでのJ)2,3-ジヒドロ-7,8-エポキシ-5-ヒドロキシ-6-メチル-8-フェニルオクタン酸(A)2.32(2,ddd;14.5,9.2,5.8),2.10(2,ddd;14.5,9.2,6.2),1,5-1.8(3/4重なりm),5.07(5,ddd;12.5,5.6,2.0),1.80(6,m),1.12(6-Me,d;7.0),2.90(7,dd;7.4,1.8),3.67(8,d;1.8),7.24(10/14m),7.32-7.38(11/12/13,m);3-クロロ-4-メトキシフェニルアラニン(B)4.71(2,dd;8.7,6.4,6.3),5.62(2-NH,d;8.7),3.08(2H-3,br d;6.4),7.19(5,d;2.0),3.87(7-OMe,s),6.83(8,d;8.5),7.07(9,dd;8.4と2.0);3-アミノ-2-メチルプロピオン酸(C)2.72(2,m),1.18(2-Me,d;6.9),3.12(3,ddd;11.4,10.6,5.6),3.70(3,ddd),6.76(3-NH,br t,6.0);ロイシック酸(D)4.83(2,dd;9.9,3.8),1.39(3,m),1.70(3,m),1.72(4,m),0.87(5/4-Me,d;5.3),0.86(5,d;5.3);13C NMR(CDDl3)単位δ値(炭素位置)A172.4(1),36.2(2),32.0(3),21.1(4),76.6(5),40.2(6),13.6(6-Me),63.3(7),59.2(8),136.8(9),125.6(10/14),128.7(11/13),128.6(12);B170.7(1),53.7(2),35.5(3),130.0(4),131.1(5),122.2(6),153.8(7),56.1(7-OMe),112(8),128.5(9);C175.2(1),38.2(2),13.6(2-Me),42.1(3);D171.9(1),71.7(2),39.6(3),24.5(4),22.9(4-Me),21.4(5)。
実施例７ クリプトフィシンの微小管解重合活性の分析
材料
ビンブラスチン、シトカラシンＢ、イソシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）−ファロイジン、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）及びβ−チューブリンに対する抗体及びビメンチンをシグマケミカルカンパニーから入手した。アール（Earle）塩を含有するイーグルの基礎培地（ＢＭＥ）をギブコ（Gibco）から、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をハイコロンラボラトリーズから購入した。
細胞系
ジャーカット（Jurkat）Ｔ白血病細胞系とＡ−１０ラットの大動脈平滑筋細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）から入手してＦＢＳを１０％と硫酸ゲンタマイシンを５０μg／mL含有するＢＭＥ中で培養した。ヒトの卵巣がん腫細胞（ＳＫＯＶ３）とビンブラスチンに抵抗するために選んだ亜系（ＳＫＶＬＢ１）は、オンタリオがん研究所のビクター  リング（Victor Ling）博士からの贈物であった。両細胞系をＦＢＳを１０％と硫酸ゲンタマイシンを５０μg／mL含有するＢＭＥ中に維持した。Ｐ−グリコプロテイン過剰表現細胞に対する選択圧力を維持するために経過後２４時間ＳＫＶＬＢ１細胞にビンブラスチンを１μg／mLの最終濃度まで添加した。
細胞増殖及びサイクル停止測定
細胞増殖測定をスケハン（Skehan）等11により記述されたように行なった。ジャーカット細胞について、培養物をスケハン11の文献に記載指示された薬品によって処理して全細胞を血球測定盤中で細胞を計数することにより測定した。有系分裂中の細胞の百分率をＰＢＳ中で０．４％ギームサで染色し続いてＰＢＳによって３回迅速に洗浄することにより測定した。処理当り少なくとも１０００細胞が有系分裂形の存在のために獲得され、有系分裂指数を計数した細胞の全数に対する有系分裂形を持つ細胞の割合として計算した。
免疫蛍光検定
Ａ−１０細胞をＢＭＥ／１０％ＦＢＳを用いてカバーガラス上で近集密的に成長させた。ＰＢＳ中の化合物を指示された最終濃度まで添加して細胞を更に２４時間インキュベートした。微小管と中間フィラメントの染色のために、細胞を冷メタノールで固定し、子牛血清を１０％含有するＰＢＳを使用してインキュベートして非特異性結合点を遮断した。次いで細胞を製造業者によって推奨された稀釈度のモノクローナル抗ビメンチンかモノクローナル抗β−チューブリンのいずれかを使用して３７℃で６０分間インキュベートした。結合一次抗体を引き続きフルオロセイン複合ウサギアンチマウスＩｇＧを使用して４５分間のインキュベーションにより目に見えるようにした。カバーガラスを顕微鏡のスライドガラス上に据え付け、蛍光パターンをフルオレセイン用エピフルオレセンスレンズを取り付けたツアイス光学顕微鏡IIIを使用して検査して写真に撮った。ミクロフィラメントの染色のために、細胞を３％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％トリトンＸ−１００を使用して透過性を上げて水素化ホウ素ナトリウム（１mg／mL）で化学的に還元した。次いで１００nMのＴＲＩＴＣ−ハロイジンを含有するＰＢＳを添加して混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。カバーガラスを据え付ける前に細胞をＰＢＳで３回迅速に洗浄してただちに上記のように写真に撮った。
ジャーカット細胞の増殖と細胞周期に対するクリプトフィシンとビンブラスチンの影響
細胞増殖に対するクリプトフィシン化合物とビンブラスチンの影響に関する用量応答曲線と有系分裂中の細胞の百分率をそれぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。未処理細胞の３％以下が有系分裂形を示した。クリプトフィシン化合物とビンブラスチンの両方とも有系分裂において観察された細胞の百分率に用量依存性増加をもたらした。有系分裂指数の増加は、細胞増殖の減少、すなわち有系分裂において蓄積する細胞の５０％を引き起こす濃度が５０％だけ細胞増殖を阻害する濃度と実質的に同一であるクリプトフィシン化合物とビンバルスチンの両方の濃度と密接に相関する。これらの効果に対するクリプトフィシン化合物とビンバルスチンに関するＩＣ50は、それぞれ０．２及び８nMであった。
細胞骨格に対するシトカラシンＢ、ビンブラスチン及びクリプトフィシンの影響
大動脈平滑筋（Ａ−１０）細胞をカバーガラス上で成長させてＰＢＳ、２μMシトカラシンＢ、１００nMビンブラスチン又は１０nMクリプトフィシン化合物で処理した。２４時間後、微小管とビンメチン中間フィラメントを間接免疫蛍光により目に見えるようにし、ミクロフィラメントをＴＲＩＴＣ−ファロイジンを使用して染色した。各薬品の形態的影響を試験した。未処理細胞は核周辺の微小管組織中心によって完全なものになる広範囲にわたる微小管網状構造を示した。ビメンチン中間フィラメントもまた細胞質を貫いて均一に分布したが、ミクロフィラメントの束は細胞の主軸に沿って集中した。シトカルシンＢは、準結晶性残留物の蓄積と共にミクロフィラメントの完全解重合をもたらした。この化合物は微小管か中間フィラメントのいずれかの分布に影響しなかった。ビンブラスチンとクリプトフィシン化合物の両方とも微小管の著しい減少をもたらした。ミクロフィラメント組織に影響する化合物はなかったが、ビメンチン中間フィラメントは崩壊し、ビンブラスチンかクリプトフィシン化合物のいずれかによって処理された細胞の核のまわりに同心環を生成した。
タクゾール（taxol）−安定化微小管に対するクリプトフィシンとビンブラスチンの影響
Ａ−１０細胞をＰＢＳ、１００nMビンブラスチン又は１０nMクリプトフィシン化合物の添加前に０又は１０μMタクゾールで３時間処理した。２４時間後、微小管組織を上記のように免疫蛍光により試験した。対照細胞と比較して、タクゾール処理した細胞の微小管は、特に細胞極性領域において広範囲にわたって束になっていた。前記のように、ビンブラスチンは非前処理細胞の微小管の完全解重合をもたらした。しかしながら、タクゾールによる前処理は、ビンブラスチンに応じて微小管の解重合を防止した。同様に、タクゾール前処理はクリプトフィシン誘起解重合に対して微小管を完全に安定化した。
ビンブラスチン及びクリプトフィシンによる微小管解重合の可逆性
Ａ−１０細胞を１００nMビンブラスチン又は１０nMクリプトフィシンのいずれかによって２４時間処理して、完全な微小管解重合を生じた。次いで細胞を薬品を含まない媒体中で１時間又は２４時間洗浄及びインキュベートした。ビブラスチンの除去後微小管は迅速に再重合し、１時間後かなりの水準の微小管を、２４時間までに完全な形態回復を示した。対照的に、微小管は化合物の除去後１時間又は２４時間でクリプトフィシンで処理した細胞には再現しなかった。
細胞増殖のクリプトフィシン、ビブラスチン及びタクゾール阻害の可逆性
ＳＫＯＶ３細胞をビンブラスチン、クリプトフィシン化合物又はタクゾールの先に決定したＩＣ50用量（すなわち、表５に要約した実験で決定した数値）で２４時間処理した。この時間の間に、細胞密度は０．４から０．５±０．０５吸光度単位に増加し（図３）、３種全ての処理に対して細胞数の２５％増加を示した。薬品の除去は、それらの数が２４時間内に約３倍増加するようなビンブラスチン処理細胞の迅速な成長を生じた。対照的に、クリプトフィシン化合物又はタクゾールで処理した細胞は阻止されたままで、薬品の除去に続く２４時間内に僅か０．２〜０．４倍増加するだけであった。クリプトフィシン又はタクゾール処理した細胞の増殖容量は、細胞がそれから次の２４時間内に２倍になるから引き続き回復した。
細胞増殖に対するビンブラスチンとクリプトフィシンの組合せの影響
ＳＫＯＶ３細胞をクリプトフィシンとビンブラスチンの組合せで４８時間処理した。次いで生き続ける細胞の百分率を測定して各組合せに対するＩＣ50を計算した。単一薬品処理と同様に、これらの組合せ処理の影響をイソボログラム（isobologram）として描写した（図４）。クリプトフィシン化合物とビンブラスチンの組合せに対するＩＣ50は、加成性の線に非常にきっちりと合い、これらの二つの薬品が細胞増殖の加成性阻害だけを誘起することを示した。
ＳＫＯＶ３及びＳＫＶＬＢ１細胞に対するクリプトフィシン、ビンブラスチン及びタクゾールの毒性
ＳＫＶＬＢ１細胞は、それらのＰ−グリコプロテインの過剰発現12のために天然産抗がん薬品に対して抵抗性がある。ＳＫＯＶ３及びＳＫＶＬＢ１細胞の成長を阻害するタクゾール、ビンブラスチン及びクリプトフィシン化合物の能力を表５に要約する。タクゾールは、それぞれ１及び８０００nMのＳＫＯＶ３及びＳＫＶＬＢ１細胞に対するＩＣ50を持つ両細胞系の増殖の用量依存性阻止をもたらした。ビンブラスチンもまた、それぞれＳＫＯＶ３及びＳＫＶＬＢ１細胞に対し０．３５及び４２００nMのＩＣ50によって、両細胞系の成長を阻止した。クリプトフィシンは、ＳＫＯＶ３及びＳＫＶＬＢ１細胞に対しそれぞれ７及び６００pMのＩＣ50を証明した。化合物に対するＳＫＶＬＢ１細胞について得られた抵抗因子をＳＫＶＬＢ１に対するＩＣ50として計算した。ＳＫＯＶ３細胞に対するＩＣ50もまた表５に示す。
このように、本発明は、先に開示されたクリプトフィシン化合物と同様に、細胞増殖の強力な阻害剤であり、微小管網状構造の崩壊及び有系分裂の阻害により作用する新規のクリプトフィシン化合物を提供することが証明された。クリプトフィシン化合物は微小管組織、従って有系分裂のそれらを含む正常な細胞機能を崩壊する。
コルヒチン及びビンカアルカロイドのような古典的な抗微小管剤は、有系分裂における細胞分裂を阻止する。クリプトフィシン化合物と細胞増殖におけるこれらの薬剤の一つの影響を比較することは適切と思われる。この目的のために、ビンカアルカロイドビンブラスチンを古典的抗微小管剤の代表として選んだ。従って、ジャーカットＴ細胞白血病細胞の増殖と細胞周期進行に対するクリプトフィシン化合物とビンブラスチンの影響を比較した。両化合物は有系分裂における細胞増殖と細胞の蓄積の平行な用量依存性阻害をもたらした。
抗有系分裂的効果は有系分裂紡錘体中の微小管の崩壊により一般的に媒介されるから、細胞骨格構造に対するクリプトフィシン化合物の影響は蛍光顕微鏡法により特性描写される。クリプトフィシン化合物がビンブラスチンのいずれかによって処理された細胞の免疫蛍光染色は、両化合物が微小管の完全喪失をもたらすことを明瞭に証明した。ＳＫＯＶ３細胞を使用した類似の研究は、クリプトフィシン化合物の抗微小管効果が平滑筋細胞系に対し独特でないことを証明した。どちらの薬品も、シトカラシンＢにより容易に示されるようなミクロフィラメント束の水準や分布に影響しなく、微小管の損失は非特異性機構、例えばプロテアーゼの活性化やエネルギー充足率の減損によらないことを示した。ビンブラスチンとクリプトフィシン化合物の両方もまたあざやかに染色する環が細胞核のまわりに生成されるような、ビメンチン中間フィラメントの著しい崩壊を促進した。
培養液からビンブラスチンの除去は、微小管の迅速な再重合を生じた。対照的に、クリプトフィシン化合物で処理した細胞は、化合物を培養液から除去後少なくとも２４時間は微小管が減少されたままであった。
本発明は、クリプトフィシン化合物がＰ−グリコプロテイン媒介多重薬品抵抗を妨げることを証明した。Ｐ−グリコプロテインによる輸送は、獲得したすなわち新たな薬品耐性による腫瘍細胞の成長を阻害する天然産抗がん薬品の能力を制限する13-15。ビンカアルカロイドは、化学療法の初期過程において非常に有用であるが、Ｐ−グリコプロテインによる輸送に対して非常に良好な基質で、そして確かにＰ−グリコプロテイン媒介ＭＤＲ腫瘍に対して非常に限定された有用性のものである。それゆえ、多重薬品耐性に打ち勝つ薬剤の固定は、有用かつ新規の抗がん剤の開発を導きうるだろう。本発明のクリプトフィシン化合物は、Ｐ−グリコプロテイン媒介輸送に対する不十分な基質であるから、そのような薬剤であると思われる。この事実は、ビンブラスチン、タクゾール及び他の天然産薬品に較べたクリプトフィシン化合物に対する低い細胞抵抗因子に反映される。
クリプトフィシンの全合成
新規の合成化合物、すなわちクリプトフィシン５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８及び６１の構造は、この技術に訓練された者によく知られている方法論を使用して簡単な方法で確認された。質量スペクトルは分子組成と一致した。プロトン及び炭素ＮＭＲデータは、クリプトフィシン１及び関連天然産及び半合成類似体のデータと非常に似ていた。
次の実施例は、本発明に係る治療剤としてのそれらの使用と同様にクリプトフィシン化合物の全合成を示す。
実施例８ クリプトフィシン５１の合成
Ｓ−トランス−３−ペンテン−２−オール（Ａ）
無水ジエチルエーテル２５mL中のラセミトランス−３−ペンテン−２−オール（９３３mg、１１ミリモル）、ラウリン酸トリフルオロエチル（４．１４ｇ、１５ミリモル）及びブタ膵リパーゼ（ＰＰＬ、２．０ｇ）の混合物を８０時間攪拌した。次いでＰＰＬを濾別してエーテルで３回洗浄した。エーテル濾液を蒸発させて次いで粘稠な油を短絡真空蒸留に付した。Ｓ−トランス−３−ペンテン−２−オール（Ａ）を液体窒素冷却トラップ中に凝縮させた（３８３mg）。
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Ｓ−トランス−２−（２−プロピンルオキシ）−３−ペンテン（Ｂ）
０℃の水（５mL）中のＳ−鏡像体Ａ（６２８mg、７．３ミリモル）、硫酸水素テトラブチルアンモニウム（１３８mg、０．４１ミリモル）と４０％NaOHの激しく攪拌している混合物に、塩化プロパルギル（７６７mg、１０．３ミリモル、７４５μL）を滴下様式で添加した。激しい攪拌を一夜続けその時間の後で混合物を０℃のHClにより中和してプロパルギルエーテルをペンタン中に抽出した。抽出物を蒸発させてプロパルギルエーテルを短いシリカゲルカラム（２％ジエチルエーテル／ペンタン）によって精製して７７８mgのプロパルギルエーテルＢを得た。
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（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチルヘプト−５−（Ｅ）−エン−１−イン−３−オール（Ｃ）
ブチルリチウムヘキサン溶液のアリコート（２．５Ｍ、５．１mL、１２．８ミリモル）を真空蒸発して残留物を−９０℃に冷却した。ＴＨＦ１０mL中のプロパルギルエーテルＢ（４５４mg、３．６６ミリモル）の溶液をゆっくり添加した。温度を一夜かけて室温まで上昇させた後、反応混合物をNH4Cl溶液で冷却した。エーテルで３回抽出、乾燥抽出物の蒸発及び残留物のシリカゲルカラム（５％EtOAc／ヘキサン）による精製で３２２mgのアルコールＣ（収率７１％）を得た。
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（３Ｓ，４Ｒ）−３−tert−ブチルジメチルシリロキシ−４−メチルヘプト−５Ｅ−エナール（Ｄ）
乾燥ＤＭＦ３mL中のアルコール（（２４８mg、２ミリモル）とイミダゾール（３４０mg、５ミリモル）の攪拌溶液に塩化tert−ブチルジメチルシリル（４５２mg、３ミリモル）を添加した。混合物を一夜攪拌後、１０％NaOHを１０mL添加して過剰の塩化tert−ブチルジメチルシリルを破壊した。生成物をエーテル中に抽出して抽出液を水、０．５Ｎ HCl及び水で連続して洗浄して乾燥、蒸発した。ヘキサンを使用したシリカゲル上のクロマトグラフィによる残留物の精製で４５７mgの（３Ｒ，４Ｒ）−３−tert−ブチルジメチルシリロキシ−４−メチルヘプト−５（Ｅ）−エン−１−イン（収率９６％）を得た。
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同様の手順を使用して対応するＴＢＤＰＳ誘導体、（３Ｒ，４Ｒ）−３−tert−ブチルジフェニルシリロキシ−４−メチルヘプト−５（Ｅ）−エン−１−インを収率９２％で生成した。
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２−メチルブテン（ＴＨＦ中の２Ｍ溶液１．１５mL）を−２５℃でBH3 ＴＨＦ溶液（１Ｍ、１．１ミリモル）１．１mLに添加し、混合物を氷浴中で２時間攪拌した。次いで室温を−５０℃に冷却してＴＨＦｌmL中のＴＢＳ誘導体（２３８mg、１ミリモル）の溶液を全て一度に添加した。冷却浴を取り除いて反応混合物を温まるにまかせて室温に１時間維持した。次いで２．２Ｍ  KH2PO4／K2HPO4溶液（４．８mL）と３０％H2O2（０．８mL）を０℃で添加した。１時間後、ＴＨＦを蒸発させて残留物をエーテル中に抽出した。乾燥エーテル抽出液を蒸発させて残留物をシリカゲル上でクロマトグラフ（１％EtOAc／ヘキサン）にかけて１９４mgのアルデヒドＤ（収率７６％）を得た。
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アルデヒドのtert−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＰＳ）誘導体を収率８３％で生成した。
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メチル（５Ｓ，６Ｒ）−５−tert−ブチルジメチルシリロキシ−６−メチル−７−オキソノナ−２Ｅ，７Ｅ−ジエノエート（Ｅ）
−７８℃に冷却したＴＨＦ５ml中のアルデヒドＤ（０．７４ｇ、２．９ミリモル）とトリメチルホスホノアセテート（６３２mg、３．５ミリモル）の攪拌溶液にテトラメチルグアニジン（４３５μL、３．５ミリモル）を添加した。３０分後冷却浴を取り除き混合物を更に１時間攪拌した。混合物を１Ｎ  HClで中和して生成物をエーテル中に抽出した。乾燥エーテル抽出液を蒸発して残留物を残し、それをシリカゲル上でクロマトグラフ（５％EtOAc／ヘキサン）にかけて０．８１４ｇのＥ（収率９０％）を得た。
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アルデヒドのtert−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＰＳ）誘導体を収率９０％で生成した。
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メチル（５Ｓ，６Ｒ）−５−tert−ブチルジメチルシリロキシ−６−メチル−７−オキソヘプト−２（Ｅ）−エノエート（Ｆ）
−７８℃のCH2Cl2  １５mL中のメチルエステルＥ（３２８mg、１．０ミリモル）と９７μLのピリジンの溶液にオゾンを通過させてオゾン分解の進行をＴＬＣ分析により監視した。メチルエステルが消費された後、約５００mgの亜鉛末と１mLの氷酢酸を添加した。温度を２５℃までゆっくり上昇させた。混合物を濾過して濾液を飽和CuSO4とNaHCO3溶液で連続して洗浄した。溶媒の蒸発後、粗製アルデヒドＦ（２４９mg、８３％）を更に精製することなく次工程に使用した。
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メチル（５Ｓ，６Ｒ）−５−ｔ−ブチルジメチルシリロキシ−６−メチル−８−フェニル−オクタ−２Ｅ，７Ｅ−ジエノエート（Ｇ）
−７８℃のＴＨＦ１．５mL中のアルデヒドＦ（２５．０mg、０．０８ミリモル）の攪拌溶液に塩化ベンジルトリフェニルホスホニウム（２６８mg、０．６９ミリモル、ＴＨＦ６．９mL中）とｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中の２８０μL、２．５Ｍ）の冷（−７８℃）混合物０．８０mLを添加した。１５分後、冷浴を取り除いて攪拌を２時間継続した。反応物を飽和塩化アンモニウム溶液で冷却しＴＨＦを蒸発させた。濃縮物をヘキサンで２回抽出し、合わせた抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥蒸発させた。残留油、ＥとＺ異性体の５：１混合物、をチオフェノール（０．０２Ｍ）と１，１′アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＶＡＺＯ、０．００６Ｍ）を含有するベンゼン１．５mLに溶解し、混合物を５時間還流させた。室温に冷却後、ヘキサン（１５mL）を添加して有機溶液を１０％NaOHと食塩水で連続して洗浄し、乾燥（MgSO4）して蒸発させた。シリカゲル上の残留物のクロマトグラフィ（２％EtOAc／ヘキサン）で２４mg（８０％）のＧを得た。
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（５Ｓ，６Ｒ）−５−ｔ−ブチルジメチルシリロキシ−６−メチル−８−フェニルオクタ−２Ｅ，７Ｅ−ジエン酸（Ｈ）
アセトン７mL中のエステルＧ（１５９mg、０．４３ミリモル）の溶液に１Ｎ  LiOH水５mLを添加した。混合物を２５℃で３時間攪拌し、Et2O  ２０mLで稀釈し、１Ｎ  HClで約pH４に酸性化した。有機層を分離して食塩水と水のそれぞれ２０mLづつで洗浄し、乾燥し（MgSO4）て蒸発させた。AcOHを０．５％含有するヘキサン中の４０％EtOAcを使用してシリカゲル上の残留油のクロマトグラフィで淡黄色の流動性油として純粋な酸Ｈを生じた（１４５mg、収率９５％）。
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３−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−Ｄ−アラニンの２，２，２−トリクロロエチルエステル（Ｉ）
Ｄ−クロロチロシンＢＯＣ誘導体（１６０mg、０．３５ミリモル）の試料を純トリフルオロ酢酸３mLに溶解して室温に１時間放置した。減圧下の過剰の試薬の除去でトリフルオロ酢酸塩として所望のアミンＩを生じた（１６５mg、収率１００％）。
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化合物Ｊ
アルゴン雰囲気下の無水ＤＭＦ３mL中のＨ（２５mg、０．０７ミリモル）の攪拌溶液にペンタフルオロジフェニルホスフィネート（ＦＤＰＰ、３２mg、０．０８ミリモル）、トリフルオロ酢酸塩Ｉ（３５mg、０．０７ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２７mg、約３６μL、０．２１ミリモル、約３当量）を連続して添加した。攪拌を２５℃で１時間継続し次いで反応混合物をEt2O  ２０mLで抽出した。エーテル抽出物を１Ｎ  HCl １０mL、続いて飽和NaHCO3  １０mL、食塩水２０mL及び水２０mLで洗浄し、乾燥（MgSO4）し、蒸発した。残留淡黄色油をシリカゲル上でクロマトグラフィ（ヘキサン中の１５％EtOAc）に付して無色の油としてＪを得た（３２mg、収率６５％）。
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（１′Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−Ｎ−１′−（カルボ−２″，２″，２″−トリクロロエトキシ）−２′−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）エチル−５−ｔ−ブチルジメチルシリロキシ−６−メチル−８−フェニル−オクタ−２Ｅ，７Ｅ−ジエンアミド（Ｋ）
MeCN  ４mL中のＪ（５０mg、０．０７ミリモル）の溶液に５０％ＨＦ水４００μLを添加して混合物を２５℃で１時間攪拌した。Et2O  ３０mL中への抽出、続いて飽和NaHCO3、食塩水及び水をそれぞれ３０mLづつを使用したエーテル抽出液の洗浄、乾燥（MgSO4）及び蒸発で無色の泡としてアルコールＫを得た（４０mg、収率９５％）。
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３−（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２，２−ジメチルプロパン酸（Ｍ）
MeOH中のトリエチルアミンの１０％溶液の５１mL中の３−アミノ−２，２−ジメチルプロパン−１−オール（Ｌ）（３．０ｇ、２９ミリモル）の溶液にジ−tert−ブチルジカーボネート（６．７ｇ、３１ミリモル）を添加して混合物を２５℃で１時間攪拌した。溶媒の除去後、残留物をCH2Cl2（３０mL）に溶解して溶液を１Ｍ  KHSO4（pH２）で２回及び飽和NaCl溶液で１回洗浄し、乾燥（MgSO4）した。真空で溶媒を除去して５．８ｇ（収率９３％）の３−（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２，２−ジメチルプロパン−１−オールを白色固体として得て、それを更に精製することなく次工程に使用した（ＮＭＲ分析による純度９８％以上）。
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四塩化炭素（５２mL）、アセトニトリル（５２mL）と水（７８mL）中のアルコール３−（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２，２−ジメチルプロパン−１−オール（５．３ｇ、２５．９ミリモル）と過ヨウ素酸ナトリウム（１６．６ｇ、７７．７ミリモル）の溶液に三塩化ルテニウム水和物（１２２mg）を添加し、混合物を２５℃で１時間攪拌した。混合物をセライトを通して濾過して水（５０mL）中の飽和炭酸カリウム溶液を添加した。水層を分離し、エーテル（２０mL）で洗浄し、HClでpH２まで０℃で酸性化してCH2Cl2（３０mLで３回）で抽出した。合わせた抽出液を飽和NaCl溶液で洗浄して乾燥（MgSO4）した。真空で溶媒を除去して残留物を得てそれを先ずＣ１８シリカ上で逆相クロマトグラフィ（ＯＤＳ１２０Å、５０〜９０％MeOH）に付し次いでエーテルによって結晶化させて白色固体として３．７ｇ（収率６６％）のＭを得た。融点１０６〜１０８℃；
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アリル（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタノエート（Ｎ）
０℃の水３０ml中の２．６６ｇのＬ−ロイシン酸（２０ミリモル）と１．７４ｇの重炭酸ナトリウム（２０ミリモル）の溶液に６．４４ｇの塩化テトラブチルアンモニウム（２０ミリモル）と１．７４mLの臭化アリル（２０ミリモル）のCH2Cl2溶液３０mLを添加した。混合物を２４時間激しく攪拌後、CH2Cl2を蒸発させた。水約５０mLを添加して水層をEt2Oで４回抽出した。エーテル溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し次いで蒸発させた。残留物を短いSiカラムを通過させて無色の油として３．２１ｇのアリルエステル（Ｎ）（収率９３％）を得た。
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アリル（２Ｓ）−２−〔３′（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２′，２′−ジメチルプロパノイロキシ〕−４−メチルペンタノエート（Ｏ）
０℃の乾燥CH2Cl2  １０mL中の０．８ｇのＭ（３．７ミリモル）、０．７６ｇのＮ（４．４ミリモル）及び９２mgのＤＭＡＰの溶液に、CH2Cl2中の０．８４ｇのＤＣＣ（４．１ミリモル）を添加した。混合物を２５℃で３時間攪拌して濾過した。濾液を重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、乾燥（Na2SO4）して真空蒸発した。フラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、５％EtOAc／ヘキサン）で無色の油として１．０ｇ（収率９２％）の純粋なＯを得た。
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（２Ｓ）−２−〔３′（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２′，２′−ジメチルプロパノイロキシ〕−４−メチルペンタン酸（Ｐ）
乾燥ＴＨＦ（アルゴン雰囲気下）中の１８０mg（０．４９ミリモル）のＯと６０mg（０．０５ミリモル）の溶液１０mLに乾燥モルホリン４７０μL（５．４ミリモル）を１０分間にわたってゆっくり添加した。５０分間攪拌後、エーテル４０mLを添加して溶液を１Ｎ HCl(４０mL）で洗浄し次いで飽和重炭酸ナトリウム（３０mLで２回）で抽出した。抽出水を０．５Ｎ  HClで酸性化してエーテル（４０mL）で抽出した。エーテル抽出液を水（３０mLで２回）で洗浄し、乾燥（MgSO4）して真空蒸発して無色の流動性の油（１５２mg、９５％）としてＰを得た。
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化合物Ｑ
アルゴン雰囲気下に０℃で攪拌されている乾燥CH2Cl2（４mL）中のアルコールＫ（８０mg、０．１４ミリモル）、酸Ｐ（６８mg、０．２１ミリモル）及びＤＭＡＰ（４mg）の溶液に乾燥CH2Cl2（ｌmL）中のＤＣＣ（４４mg、０．２１ミリモル）を添加した。混合物を０℃で３０分間攪拌し、その時間の間に白色沈殿が発生し、次いで室温まで暖まるにまかせて更に４時間攪拌した。沈殿物を濾別して濾液をEt2O（４０mL）で稀釈し、稀HCl（１Ｍ、４０mL）、飽和NaHCO3（４０mL）及び食塩水（４０mL）で連続して洗浄した。エーテル性層を乾燥（MgSO4）して真空蒸発してワックス様固体を得た。クロマトグラフィ（シリカ、EtOAc：ヘキサン、１：３）で無色の粘稠な油として純粋なＱを得た（１０３mg、８４％）。
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アミノ酸Ｒ
アミノ酸Ｑ（１００mg、０．１１ミリモル）に活性化亜鉛末（４００mg、過剰）とAcOH（４mL）を添加した。不均質混合物を４５分間音波処理し、更に室温で９０分間攪拌し、次いでセライトのパッド上に注いだ。有機物をCH2Cl2を使用してセライトパッドから洗浄した。溶媒を真空除去し、無色無定形固体としてカルボン酸を得た。
粗製の酸を精製せずにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、５mL）に溶解し、室温で１時間静置した。この時間のあと過剰のＴＦＡを真空除去して得られた無定形固体をクロマトグラフィ精製（Sep-Pak（商標）、シリカ、頭初CH2Cl2次いで１０％MeOH／CH2Cl2）に付し、所望の化合物のトリフルオロ酢酸アンモニウム塩を得た。塩の水溶液の反覆凍結乾燥で無色の無定形固体として遊離アミノ酸Ｒを生じた（６８mg、２工程の間を通して９１％）。
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クリプトフィシン５１
アルゴン雰囲気下に室温の無水ＤＭＦ（２０mL）中のアミノ酸Ｔ（７５mg、０．１１ミリモル）の攪拌溶液にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４４mg、６０μL、０．３４ミリモル、約３当量）、続いてＤＭＦ（２mL）中のペンタフルオロジフェニルホスフィネート（ＦＤＰＰ、５５mg、０．１４ミリモル、約１．３当量）を添加した。混合物を１２時間攪拌し、Et2O（４０mL）を添加し、エーテル層をHCl（１Ｍ、４０mL）、食塩水（４０mL）及びH2O（４０mL）で連続して洗浄し、乾燥（MgSO4）して減圧下に蒸発した。残留ワックス様固体を更に逆相クロマトグラフィ（ＯＤＳ、１０μ、３０％H2O／MeCN、３mL／分）により精製して無色の無定形固体としてクリプトフィシン５１を得た（４５mg、６１％）。
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実施例９ クリプトフィシン５２及びクリプトフィシン５３の合成
アルゴン雰囲気下の０℃の無水ジクロロメタン（７．５mL）中のクリプトフィシン５１（７５mg、０．１２ミリモル）の攪拌溶液に、ジクロロメタン（１mL）中のｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ、５０mg、０．２３ミリモル、８０％活性酸素に基づいて約２当量）の溶液を添加した。３０分後反応混合物を室温まで暖まるにまかせて更に１２時間攪拌した。次いで溶媒を減圧下に除去して無定形固体として、それぞれ、クリプトフィシン５２と５３の１．８：１混合物（ＮＭＲ分析による）を得た。位置異性体のエポキシドの混合物を最小のアセトニトリルに溶解して逆相クロマトグラフィ（ＹＭＣ−ＯＤＳ、１０μ、２５０mm×２２．５mm、３０％H2O／MeCN、６mL／分）に付してクリプトフィシン５２（３７mg、４８％）とクリプトフィシン５３（１９mg、２５％）に分離した。
クリプトフィシン５２に対するスペクトルデータ
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クリプトフィシン５３に対するスペクトルデータ
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実施例１０  クリプトフィシン５５の合成
２：１の１，２−ジメトキシエタン／水０．６mL中のクリプトフィシン５２（６mg、０．００９ミリモル）の溶液に１２Ｎ  HClを２μL添加した。溶液を室温で２０時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、５μのフィルターで濾過して蒸発させた。アセトニトリル可溶性物質を４：１MeOH／H2Oを使用してＣ１８（２５０×１０mmのカラム）上の逆相ＨＰＬＣにより精製して３．０mgのクリプトフィシン５５を得た（４８％）。
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対応するジオール、クリプトフィシン５６（２．８mg、収率４４％）もまた得られた。
実施例１１ クリプトフィシン５７の合成
少量のPtO2（約１mg）をCH2Cl2を０．５mL含有するフラスコに添加した。フラスコ中の空気を排気し、H2を導入して混合物を室温で２０分間攪拌した。CH2Cl2（０．３mL）中に１０．２ｇのクリプトフィシン５２（０．０１５ミリモル）を含有する溶液を添加して混合物を室温で更に３０分間攪拌した。触媒をセライト／綿を通して濾過することにより除去して溶媒を真空除去した。残留物の逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＳ、１０μ、２５０×２２．５mm、MeCN／H2O（３：１）、５mL／分）で純クリプトフィシン５７（９．１mg、８９％）を得た。
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実施例１２ クリプトフィシン５８の合成
約−６０℃のエタノールを含まないクロロホルム３mL中のクリプトフィシン５７（５．５mg、０．００８ミリモル）の攪拌溶液にＴＭＳＣ１（アルドリッチから入手したまま使用、約４．５mg、約５．２μL、約０．０４ミリモル）を添加した。反応混合物を２０分間攪拌したが、その時間によりＴＬＣは出発材料が全く残っていないことを示した。この材料をアセトニトリルに溶解してＨＰＬＣ（ＯＤＳ、１０μ、２５０×２２．５mm、MeCN／H2O（３：１）、５mL／分）に付して主生成物として純クリプトフィシン５８（５．４mg、９３％）を生じた。
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実施例１３ クリプトフィシン６１の合成
乾燥ベンゼン０．５mL中のクリプトフィシン５３（５mg、０．００７ミリモル）の溶液に硫化トリフェニルホスフィン（４mg、０．０１４ミリモル）、続いて乾燥ベンゼン（１００μL）中の溶液としてトリフルオロ酢酸０．６５μLを添加した。溶液を室温で６時間攪拌し、重炭酸ナトリウムで中和し、濾過して蒸発した。残留物を水とCH2Cl2に分配した。CH2Cl2−可溶物を４：１MeCN／H2Oを使用してＣ１８上の逆相ＨＰＬＣにより精製して純クリプトフィシン６１（１．９mg、３７％）を得た。
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実施例１４ クリプトフィシン８１の合成
化合物Ｓ
化合物Ｓは、Ｆのtert−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）誘導体である。
化合物Ｔ
−７８℃の塩化ｐ−メトキシベンジルトリフェニルホスホニウムのＴＨＦ溶液１０mLにブチルリチウム溶液（１ミリモル、ヘキサン中の２．５Ｍ）４００μLを添加した。混合物を３０分間攪拌し次いでアリコート２．６４mLを−７８℃のアルデヒドＳ（７５．０mg、０．２４ミリモル）のＴＨＦ溶液３mLに添加した。３０分後、冷却を中止したが、攪拌を更に２時間継続しその時間の間に温度はゆっくり２５℃に上昇した。反応液を塩化アンモニウム飽和溶液で冷却し、ＴＨＦを蒸発させた。生成物をヘキサンで２回抽出し、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、乾燥し次いで濃縮した。残留物をフラッシュシリカカラム（３％EtOAc／ヘキサン）にかけて６３mgの化合物Ｔと４０mgのＴとＺ異性体を得た。
化合物Ｔは次の物性を有していた。
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追加の化合物ＴをＴとＺ異性体の混合物から得た。ＥとＺ異性体の混合物４０mgをチオフェノール（０．０２Ｍ）とＡＣＮ（０．００６Ｍ）を含有するベンゼン溶液４mLに溶解した。混合物を５時間還流加熱した。短いシリカカラムによる後処理と精製で３７．２mgの化合物Ｔを得た。
化合物Ｕ
化合物Ｔ（７６mg、０．１５ミリモル）のアセトン溶液６mLに水中の１Ｎ  LiOHを４．４mL添加した。アセトンを蒸発して水溶液を１Ｎ  HClで酸性化した。生成物をEtOAcで３回抽出した。有機層を乾燥、濃縮した。シリカカラム（２０％EtOAc／AcOHを０．５％有するヘキサン）による精製で化合物Ｕの酸６２．２mg（８１％）を得た。
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化合物Ｖ
化合物Ｕ（５９mg、０．１２ミリモル）、化合物Ｉのトリフルオロ酢酸塩（５７．２mg、０．１２ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、６２μL、０．３６ミリモル）を乾燥ＤＭＦ１．５mLに溶解した。この溶液にＥＤＰＰ（ＤＭＦ０．６mL中の５５mg、０．１４ミリモル）を添加して反応混合物を２時間攪拌した。エーテルを添加して有機相をそれぞれ１Ｎ HCl、飽和重炭酸ナトリウム、及び食塩水で連続して洗浄した。クロマトグラフィ（シリカカラム、８％EtOAc／ヘキサン）による濃縮と精製で化合物Ｖ７４．２mg（７２％）を得た。
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化合物Ｗ
アセトニトリル５．７mL中の化合物Ｖ（５５．８mg、０．０６５ミリモル）の溶液に０℃で４９％フッ化水素酸を２．０mL添加した。氷浴を５分後に取り除き反応混合物を１７時間激しく攪拌した。生成物をエーテル中に抽出して抽出液を飽和重炭酸ナトリウムと食塩水で連続して洗浄した。濃縮と順相クロマトグラフィ（シリカカラム、２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で化合物Ｗ３１．６ｇ（７９％）を得た。
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（２Ｓ，２’Ｒ）−２−〔３’（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２’−メチルプロパノイル−オキシ〕−４−メチルペンタン酸（ＡＣ）
メタノール中の約９Ｍアンモニア３００mL中のメチル（Ｓ）−（＋）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロパノエート（Ｘ）（１０ｇ、８５ミリモル）の溶液を密封ガラスフラスコ中で５０℃に１６８時間加熱し、窒素を流して過剰のアンモニアを除去し、次いで真空乾燥まで蒸発した。残留物をエーテルで粉砕して、白色固体として（Ｓ）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（５．７ｇ、収率６６％）を残した。
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無水ＴＨＦ（２０mL）中の（Ｓ）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（２．１ｇ、２０ミリモル）の懸濁液を０℃に冷却した１Ｍボラン−ＴＨＦ錯体（６１ミリモル、６１mL）にゆっくり添加した。混合物を６時間還流し、０℃に冷却し、濃ＨＣｌ（１０mL）で注意深く分解し、真空濃縮した。濃縮物をＮａＯＨ（２０ｇ）で飽和し、ＣＨＣｌ3（１５mLで４回）で抽出し、合わせた抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ4）した。濾過して溶媒を除去後、真空蒸留で無色の油として１．４ｇ（収率７７％）の（Ｒ）−３−アミノ−２−メチルプロパン−１−オール（Ｙ）を得た。
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ＭｅＯＨ中のトリエチルアミンの１０％溶液３９mL中のアミノアルコールＹ（２．０ｇ、２２ミリモル）の溶液にジ−tert−ブチルジカーボネート（５．４ｇ、２５ミリモル）を添加し、混合物を２５℃で３０分間攪拌した。溶媒の除去後、残留物をＣＨ2Ｃｌ2に溶解して溶液を１Ｍ  ＫＨＳＯ4（pH２）で２回、ＮａＣｌ飽和溶液で１回洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）した。溶媒の真空除去で粘稠な油として４．３ｇ（収率１００％）の（Ｒ）−３−（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２−メチルプロパン−１−オールを得て、それを更に精製せずに（ＮＭＲ分析による純度９５％以上）次工程に直接使用した。
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四塩化炭素（２５mL）、アセトニトリル（２５mL）及び水（３８mL）中のアルコール（Ｒ）−３−（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２−メチルプロパン−１−オール（２．２ｇ、１２ミリモル）の溶液に三塩化ルテニウム水和物（５１mg、０．２５ミリモル）を添加し、混合物を２５℃で１時間攪拌した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１００mL）で稀釈し次いでセライトを通して濾過した。濾液を２Ｍ  Ｋ2ＣＯ3溶液で塩基性化（pH９）し水層をエーテルで洗浄した。水層を１Ｍ  ＫＨＳＯ4でpH２に０℃で酸性化してＣＨ2Ｃｌ2（２０mLで３回）で抽出した。合わせた抽出液をＮａＣｌ飽和溶液で洗浄して乾燥（ＭｇＳＯ4）した。溶媒を真空除去して粘質固体として２．０ｇ（収率８５％）の（Ｒ）−３−（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２−メチルプロパン酸（Ｚ）を得た。純Ｚ（１．７５ｇ、収率７４％）をエーテルによって結晶化した。
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０℃の水３０mL中の重炭酸ナトリウム１．７４ｇ（２０ミリモル）とＬ−ロイシン酸２．６６ｇ（２０ミリモル）の溶液に塩化テトラブチルアンモニウム６．４４ｇ（２０ミリモル）と臭化アリル１．７４mL（２０ミリモル）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を３０mL添加した。混合物を２４時間激しく攪拌後、ＣＨ2Ｃｌ2を蒸発した。水約５０mLを添加して水層をＥｔ2Ｏで４回抽出した。エーテル溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し次いで蒸発した。残留物を短いＳｉカラムを通過させて無色の油として３．２１ｇのアリル（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタノエート（ＡＡ）（９３％）を得た。
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０℃の乾燥ＣＨ2Ｃｌ2１２mL中の１．７４ｇのＺ（８．５５ミリモル）、１．３４ｇのＡＡ（８．０ミリモル）及び６４mgのＤＭＡＰの溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2中のＤＣＣ（２．４７ｇ、１２ミリモル）の溶液８mLを滴下様式で添加した。白色沈殿を濾別し、溶媒を蒸発して、残留物をＥｔ2Ｏに再溶解した。エーテル溶液を冷０．５Ｎ  ＨＣｌ、重炭酸ナトリウム及び食塩水で連続して洗浄した。乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）したエーテル層を蒸発し、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル）により精製して無色の油として２．６２ｇ（収率９２％）の純アリル（２Ｓ，２’Ｒ）−２−〔３’（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２’−メチルプロパノイル−オキシ〕−４−メチルペンタノエート（ＡＢ）を得た。
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乾燥ＴＨＦ中の２８２mg（０．８ミリモル）のＡＢと９１mg（０．０８ミリモル）のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムの溶液１０mLに乾燥モルホリン６８８μＬ（８ミリモル）をゆっくり添加した。４０分間攪拌後、溶媒を蒸発してＣＨ2Ｃｌ2１００mLを添加した。溶液を２Ｎ  ＨＣｌと水で連続して洗浄した。有機層を濾過して濾液を飽和重炭酸ナトリウムで２回抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2で逆洗後、水層を先ず０℃の冷ＫＨＳＯ4でpH３に酸性化し次いでエーテルで３回抽出した。乾燥エーテル抽出物を蒸発してワックス様固体として２５０mgの（２Ｓ，２’Ｒ）−２−〔３’−（tert−ブトキシカルボニル）アミノ−２’−メチルプロパノイル−オキシ〕−４−メチルペンタン酸（ＡＣ）（収率１００％）を得た。
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化合物ＡＤ
アルコールＷ（３４．８mg、０．０５６ミリモル）、化合物ＡＣ（２６．８mg、０．０８５ミリモル）及びＤＭＡＰ（１．７４．mg）をジクロロメタン２８３μＬに溶解した。この混合物にＤＣＣ（１７．５mg、０．０８５ミリモル）のジクロロメタン溶液６６６μＬを添加した。反応混合物を一夜攪拌した。溶媒を窒素流で蒸発し、エーテルを添加し、白色沈殿を濾別した。濾液を０．５Ｎ  ＨＣｌ、飽和重炭酸ナトリウム及び食塩水で連続して洗浄した。濃縮とクロマトグラフィ（シリカカラム、２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で４６mgの化合物ＡＤ（９０％）を得た。
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クリプトフィシン８１
化合物ＡＤ（４６mg、０．０５ミリモル）をＨＯＡｃ１．３mL中で活性化亜鉛末（１７８mg、過剰）と混合した。混合物を４５分間超音波処理し次いで更に９０分間攪拌した。ジクロロメタン約３０mLを添加した。固体を濾別して濾液を真空蒸発した。残留物をＴＦＡ１．１mLに溶解して溶液を１時間攪拌した。ＴＦＡを真空蒸発して水を添加した。凍結乾燥で遊離アミノ酸を得た。アミノ酸をＤＭＦ４．６mLに溶解した。この溶液にＤＩＥＡ２６μＬとＦＤＰＰ（３０mg、０．０７５ミリモル、ＤＭＦ２．２mL中）をそれぞれ添加した。６時間攪拌後、溶媒を蒸発してＥｔＯＡｃを添加した。溶液を０．５Ｎ  ＨＣｌと食塩水でそれぞれ洗浄した。溶媒の蒸発続いてクロマトグラフィ精製（Ｓｉ、エーテル）で２０．５mgのクリプトフィシン８１（６１％）を得た。
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実施例１５  クリプトフィシン８２の合成
化合物ＡＥ
化合物ＡＥはＥのtert−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）である。
化合物ＡＦ
ＡＥ（１５０mg）のＡＦ（１２５mg）への加水分解を、ＴのＵへの加水分解のために上記した手順を使用して収率８７％で行った。
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例１５ クリプトフィシン８２の合成
化合物ＡＥ
化合物ＡＥはＥのｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）誘導体である。
化合物ＡＦ
ＡＥ（１５０mg）のＡＦ（１２５mg）への加水分解はＴよりＵへの加水分解について上述した方法を用いて８７％の収率で行われた。1H NMR δ 7.69/7.64(SiPh2,2’-H,6’-H/2”-H,6”-H,d,6.3),7.41(SiPh2,4’-H/4”-H,m),7.39(SiPh2,3’-H,4-Me-H/3”-H,5”H,m),6.86(3-H;dt;15.5,7.5),5.62(2-H,d,15.5),5.30(7-H/8-H,m),3.72(5-H,m).2.28(4-H,m),2.20(6-H,m),1.52(9-H,bd.7.7),1.08(CMe3,s),1.00(6-CH,d,6.7)。
化合物ＡＧ
ＡＦ（７６mg，０．１８ミリモル）からのＡＧ（９６mg）の製造はＵよりＶの製造について上述した方法を用いて70%の収率で行われた。1H NMR δ  単位A7.67(SiPh2,2’-H,6’-H/2”-H,6”-H;m),7.46-7.31(SiPh2,3’-H,4’-H,4-Me-H/3”-H,4”-H.5”-H,m),6.62(3-H;dt;15.4,7.6),5.51/5.48(2-H,d,15.4),5.33(7/8,m),3.70(5-H,m).2.22(4-H/6-H,m),1.61(9,bd.7.4),1.06(CMe3,s),0.98(6-Me,d,6.8);単位B7.16(5-H,d,1.7),7.00(9-H,dd,8.5,1.7),6.83/6.82(8-H,d,8.5),5.68/5.66(NH,d,7.3),5.03(2-H,m),4.78/4.73(CH2Cl3,ABq,-11.9),3.87(OMe,S),3.16(3-H;m),3.09(3-H’,m).13CNMRδ単位A165.1(1),143.0/142.9(3),136.0(SiPh2,2’,6’/2”,6”),134.3/133.7(SiPh2,1’/1”).132/5(7),129.6(SiPh2,4’/4”),127.5(SiPh2,3’,4Me/3”,5”),125.7/125.4(2),76.3(5),41.6(6),36.9/36.8(4),27.0(CMe3),19.5(CMe3),18.1(9),16.4/16.3(6-Me);単位B170.0(1),154.2(7),131.0(5),128.4(4/9),122.5(6),112.1(8),94.2(CCl3),74.7(CH2CCl3),56.1(OMe),52.9(2),36.4(3)。
化合物ＡＨ
ＡＧ（８４mg、０．１１ミリモル）からのＡＨ（５３．４mg）の製造はＶよりＷの製造について上述した方法を用いて９２％の収率で行われた。1H NMR δ単位A6.83(3-H,dt,15.4,7.5),5.80(2-H,d,15.4),5.51(8-H,m),5.33(7-H,dd,15.2,8.3),3.50(5-H,m),2.42(4-H,m),2.30(4-H’,m)2.28(6,m),1.68(9,d,7.3),0.99(6-Me,d,6.7);単位B7.20(5-H,d,1.8),7.03(9-H,dd,8.4,1.8),6.80(8-H,d,8.4),6.10(NH,bd,7.0),5.07(2-H,m),4.80/4.70(CH3Cl3,ABq.-11.5),3.88(OCH3,S),3.20(3-H,dd,5.5,-14.3),3.10(3H’,dd,7.2,-14.3).13C NMR δ  単位A164.1(1),142.8(3),132.2(7),127.7(2),125.7(2),73.6(5),42.8(6),36.9(4),18.1(9),16.8(6-Me);単位B170.2(1),154.2(7),131.0(5),128.5(4/9),122.5(6),112.2(8),94.2(CCl3),74.7(CH2CCl3),56.1(OMe),53.1(2),36.5(3)。
クリプトフィシン８２
化合物ＡＩ（３６．８mg，８６％収率）は２７．４mg（０．０５２ミリモル）の化合物ＡＨからＡＤについて上述した方法を用いて製造された。
化合物ＡＩ（６８mg，０．０８３ミリモル）はＡＤのクリプトフィシン８１への環化について上述した方法を用いてクリプトフィシン８２に環化された。
[α]D+19.9°(CHCl3,c2.0).1H NMR(500MHz)δ  単位A6.65(3-H,ddd,15.4,9.5,5.6),5.76(2-H,d,15.4),5.48(8-H,dq,15.3,6.5),5.27(7-H,ddd,15.3,8.4,1.5),4.89(5-H,ddd,10.7,5.6,1.5),2.38(4-H,m),2.33(4-H’/6-H,m),1.66(9-H,dd,6.4,1.5),1.00(6-Me,d,6.9);単位B7.22(5-H,d,2.0),7.08(9-H,dd,8.4,2.0),6.83(8-H,d,8.4),5.74(NH,m),4.81(2-H,ddd,8.5,7.3,5.6),3.87(OMe,S),3.13(3-H;dd,5.6,-14.4),3.04(3-H’,dd,7.3,-14.4);単位C,6.93(NH,bdd,6.7,4.7),3.52(3-H,ddd,4.7,3.9,-13.5),3.27,(3-H’,ddd,6.8,6.7,-13.5),2.72(2-H,dqd,7.1,6.8,3.9),1.20(2-Me;d,7.1);単位D4.88(2-H,dd.9.6,3.4,),1.75(3-H/4-H;m),1.47(3-H’,m),0.94(5-H,d,6.2),0.91(4-Me-H,d,6.4).13C NMR(125MHz)δ単位A165.5(1),141.7(3),131.4(7),127.1(8),125.2(2),77.7(5),41.5(6),36.2(4),17.9(9),17.2(6-Me);単位B171.0(1),153.9(7),131.1(5),129.9(4),128.4(9),122.4(6),112.2(8),56.1(OMe),53.5(2),35.1(3);単位C17.5(1),41.3(3)38.2(2)14.0(2-Me);単位D17.9(1),71.5(2),39.6(3),24.6(4),23.0(5),21.5(4-Me)。
実施例１６ クリプトファイシン９０およびクリプトファイシン９１の合成
スチレン型クリプトファイシンのエポキシ化についての一般的手順
ジクロロメタン中のクリプトファイシン（約１０mg／mL）の溶液に、ジクロロメタン中の３当量のｍ−クロロ過安息香酸（約１０mg／mL）の溶液を加えた。全ての出発物質が消費されるまで溶液を室温で攪拌した。溶液を短いシリカカラム中にＣＨ2Ｃｌ2それから１：４のＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ2Ｏを使用して通して２つのエポキシドの混合物を与えた。エポキシドはＨＰＬＣ（Ｃ−１８、７：３のＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ）によって分離した。
この手順を使用して、クリプトファイシン８２（５mg）を、２．２mgのクリプトファイシン９０と１．２mgのクプトファイシン９１に転化した。
クリプトファイシン９０のスペクトルデータ
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クリプトファイシン９１のスペクトルデータ
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実施例１７ クリプトファイシン９７の合成
ジメチルスルホキシド（１mL）の中に溶解した環式デプシペプチド、クリプトファイシン５３（９mg、０．０１３ミリモル）の溶液に、ナトリウムアジド（４０mg）と濃硫酸（４μＬ）を加えた。それから、この混合物を７５〜８５℃で２日間攪拌した。この時間の後、反応混合物を室温に冷却し、Ｅｔ2Ｏ（１５mL）で希釈し、そして有機層をブライン（２×２０mL）そしてＨ2Ｏ（２０mL）で洗浄した。それから、このエーテル抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ4で）、そして溶剤を真空除去して無定形の無色固体を回収した。それは主にアジドアルコール、クリプトファイシン８６であった。逆相クロマトグラフィー（ＯＤＳ、１０μ、２５０×１０mm、２５％Ｈ2Ｏ／ＭｅＣＮ、３mL／分）によって精製を達成して純粋アジドアルコール、クリプトファイシン８６を、無定形の無色固体（７．４mg、７７％）として回収した。
クリプトファイシン８６のスペクトルデータ
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クリプトファイシン９７
Ｅｔ2Ｏ／ＣＨ2Ｃｌ2（３：１、０．５mL）の中に溶解した環式デプシペプチド、クリプトファイシン８６（５．５mg、０．００８ミリモル）の溶液に、トリフェニルホスフィン（３mg、０．０１１ミリモル）のエーテル溶液を加えた。それから、この混合物を室温で３日間攪拌した。この時間の後、溶剤を真空除去し、そして残留物をＣＨ2Ｃｌ2の中に溶解し、そしてＨＰＬＣ精製（ＣＮカラム、１０μ、２５０×１０mm、８０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ2Ｃｌ2、３mL／分）を施して純粋クリプトファイシン９７を、無定形の無色固体（４．２mg、８２％）として回収した。
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実施例１８ クリプトファイシン１１０〜１１２および１２４の合成
クリプトファイシン１０８
テトラヒドロフランド０．８mLの中のクリプトファイシン９０とクリプトファイシン９１の混合物（２７mg、０．０４５ミリモル）に、過ヨウ素酸（３２mg、０．１４ミリモル）の水溶液４００μＬを加えた。この明澄な溶液を室温で５時間攪拌した。水を加え、そして水性相を酢酸エチルで２回抽出した。有機相を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。残留物を、ＯＤＳカラム（１：１のＭｅＣＨ：Ｈ2Ｏ）での逆相クロマトグラフィーによって精製して９０％収率のクリプトファイシン１０８を与えた。
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クリプトファイシン１０８はまた、ＥからＦへのオゾノリシスについての上記手順を使用してクリプトファイシン８２の選択性オゾノリシスによっても製造された。
ウィッティヒ反応についての一般的手順
−７８℃の、ＴＨＦ中のアリールトリフェニルホスホニウムクロライド（１ミリモル）の溶液１０mLに、ブチルリチウム（０．４mL、ヘキサン中の２．５Ｍ、１ミリモル）を加えた。この反応混合物を−７８℃で１５分間攪拌し、それから、氷浴の中に１時間置いた。３当量の上記混合物を、−７８℃の、クリプトファイシン１０８（約３０mg／mL）のＴＨＦ溶液に加えた。この溶液を２０分間攪拌した後に冷浴を取り除いた。温度が２５℃に上昇したときに、反応を塩化アンモニウム飽和水溶液によって静止させた。この混合物を酢酸エチルで２回抽出した。有機抽出物を水洗し、乾燥し、そして濃縮した。残留物をＯＤＳフラッシュカラム（６５：３５のＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ）で精製してＥとＺの異性体混合物（アリール基の本性に依存して８％〜１３％のＺ異性体を含有；ＮＭＲによって測定した分析）を与えた。所望のＥ異性体はエーテルから結晶化された。
クリプトファイシン１１０
ウィッティヒ反応は、７．３mgのクリプトファイシン１０８から５．１mgのｐ−フルオロフェニル同族体（約８％のＺ異性体を含有）に導いた（約１mgの未反応アルデヒドが回収された）。エーテルからの結晶化の後で、４．０mgの純粋クリプトファイシン１１０が得られた：
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クリプトファイシン１１１
ウィッティヒ反応は、５５mgのクリプトファイシン１０８から４３mgのｐ−トリル同族体（約９％のＺ異性体を含有）に導いた。エーテルからの結晶化の後で、３４mgの純粋クリプトファイシン１１１が得られた：
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クリプトファイシン１１２
ウィッティヒ反応は、５１mgのクリプトファイシン１０８から３５mgのｐ−チエニル同族体（約１３％のＺ異性体を含有）に導いた。エーテルからの結晶化の後で、２５mgの純粋クリプトファイシン１１１が得られた：
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クリプトファイシン１２４
ウィッティヒ反応は、１５３mgのクリプトファイシン１０８から１３１mgのｐ−クロロフェニル同族体（約１０％のＺ異性体を含有）に導いた。エーテルからの結晶化の後で、１０７mgの純粋クリプトファイシン１２４が得られた：
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実施例１９ クリプトファイシン１１５〜１２０、１２５および１２６の合成
クリプトファイシンｌ１５および１１６
スチレン型クリプトファイシンのエポキシ化についての上記一般手順を使用して、クリプトファイシン１１０（３．５mg）を２．０mgのクリプトファイシン１１５と１mgのクリプトファイシン１１６に転化した。
クリプトファイシン１１５のスペクトルデータ
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クリプトファイシン１１７および１１８
スチレン型クリプトファイシンのエポキシ化についての上記一般手順を使用して、クリプトファイシン１１１（６．２mg）を３．５mgのクリプトファイシン１１７と１mgのクリプトファイシン１１８に転化した。
クリプトファイシン１１７のスペクトルデータ
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クリプトファイシン１１８のスペクトルデータ
1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、フェニルプロトンについての７．３０−７．３８における多重線がｐ−トリルプロトンについての７．１４における４Ｈ多重線と２．３５における３Ｈ一重線によって置き換えられた以外はクリプトファイシン３８のものと同じである。
クリプトファイシン１１９および１２０
スチレン型クリプトファイシンのエポキシ化についての上記一般手順を使用して、クリプトファイシン１１２（８mg）を、１．２mgのクリプトファイシン１１９と０．５mgのクリプトファイシン１２０に転化した。
クリプトファイシン１１９のスペクトルデータ
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クリプトファイシン１２５および１２６
スチレン型クリプトファイシンのエポキシ化についての上記一般手順を使用して、クリプトファイシン１２４（４７mg）を、２６mgのクリプトファイシン１２５と１２mgのクリプトファイシン１２６に転化した。
クリプトファイシン１２５のスペクトルデータ
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クリプトファイシン１２６のスペクトルデータ
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例２０ クリプトフィシン１２１〜１２３および１２７の合成
化合物  ＡＪ
３０mLの無水ＣＨ2Ｃｌ2中のＢＯＣ−Ｌ−ロイシン−水和物（１．２４５ｇ、１５５ミリモル）の溶液に、０℃でかきまぜながらＮ2下固体ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）（０．５３ｇ、２．７５ｍモル）を加えた。１．５時間０℃でかき混ぜた後、混合物を５℃以下で濃縮しそして残留物を３５mLの冷ＥｔＯＡｃで希釈しそして５％水性ＫＨＳＯ4、５％水性ＮａＨＣＯ3および食塩水、の氷冷溶液の各々の２つの部分（１０mL）で連続的に洗浄した。有機相を分離し、５℃で（ＭｇＳＯ4上で）乾燥しそして５℃以下で蒸発させた。残留油を氷冷ＴＨＦ（５mL）で希釈しそして氷冷無水ＴＨＦ（５mL）中の化合物Ｋ（２９５mg、０．５ｍモル）の溶液に加えた。次にＤＭＡＰの少しの結晶を混合物に加え、これをかき混ぜそして一夜放置して２５℃に到達させた。５％水性ＮａＨＣＯ3溶液（５mL）を加えそして得られた二相混合物を２時間２５℃で激しくかき混ぜた。ＥｔＯＡｃ（４０mL）を加え、水性相を追加のＥｔＯＡｃ（２×２０mL）で抽出しそして合併した有機層を水および食塩水で洗浄し、（ＮａＳＯ4上で）乾燥し、ろ過しそして蒸発させた。残留物をヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃとともに、シリカゲルのプラグ中を通過させてろ過して無色油状物として化合物ＡＪを生成した（３８５mg、９６％収率）：〔α〕D
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化合物  ＡＫ
化合物ＡＪ（１１５mg、０．１３４ｍモル）をＴＦＡ（３mL）中に溶解しそして１時間２５℃で放置した。溶媒を除去しそして残留物をＣＨ2Ｃｌ2から、次にトルエンから繰り返して蒸発させて無定形固体を残した。この固体を無水ＴＨＦ（５mL）中に溶解しそして溶液のpHをpH８〜９に調節するのに十分なジエチルイソプロピルアミンを加え、そのとき、溶液の分別量を湿ったpH紙上にスポットさせた。溶液をかき混ぜながら０℃に冷却しそしてＴＨＦ（３mL）中の化合物ＡＬの溶液を加えた。化合物ＡＬを造るために化合物Ｚ（５５mg、０．２７ｍモル）をＴＨＦ（３mL）中に溶解しそしてジエチルイソプロピルアミン（０．０４６mL、０．２７ｍモル）を加えた。−１５℃に冷却後、この混合物に、塩化ピバロイル（０．０３３mL、０．２７ｍモル）を滴下して加えそして１０分間−１５℃でそして２０分間０℃でかき混ぜた。次に得られた懸濁液を、ＴＨＦ中の化合物ＡＪの溶液に移した。得られた混合物を０℃でかき混ぜそして一夜放置して２５℃に到達させた。２５℃で１２時間後、５％水性ＮａＨＣＯ3溶液を加えそして得られた混合物を１．５時間２５℃ではげしくかき混ぜた。ＥｔＯＡＣ（４０mL）を加えそして相を分離させた。水性相を追加のＥｔＯＡＣ（２×１０mL）で抽出した。合併した有機抽出液を５％水性ＮａＨＣＯ3溶液（２０mL）、５％水性ＫＨＳＯ4溶液（２０mL）および食塩水で洗浄し、（ＮａＳＯ4上で）乾燥しそして蒸発させた。残留油をヘキサン中の３５％ＥｔＯＡｃで溶離してシリカゲル上でクロマトグラフィにかけて無色泡状物として化合物ＡＫを生成した（９８mg、８３％収率）
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クリプトフィシン１２１
化合物ＡＫ（７３mg、０．０８２ｍモル）をＡｃＯＨ（３．５mL）中に溶解し、活性化Ｚｎ粉末（４００mg）を加えそして得られた懸濁液を４５分間音波にかけた。追加の１．５時間２５℃でかき混ぜた後、混合物をＣＨ2Ｃｌ2（５mL）で希釈しそしてCeliteR中を通過させてろ過した。固体を追加のＣＨ2Ｃｌ2（１０mL）で洗浄しそして得られたろ液を蒸発させた。さらに精製することなしに、残留物をＴＦＡ（３mL）中に溶解し、１時間２５℃に維持しそして溶媒を真空除去した。無色の固体が得られるまで、残留物をＣＨ2Ｃｌ2から、次にトルエンから繰り返して蒸発させた。この固体を乾燥ＤＭＦ（３mL）に溶解し、ＦＤＰＰ（４３mg、０．１０８ｍモル）を加え、次に溶液のpHをpH８〜９に調節するのに十分な量のジエチルイソプロピルアミンを加え、そのとき分別量を湿ったpH紙上にスポットさせた。１６時間２５℃でかき混ぜた後、混合物をエーテル（４０mL）で希釈しそして５％水性ＫＨＳＯ4溶液（２×１mL）、５％水性ＮａＨＣＯ3（１５mL）および食塩水で洗浄した。（Ｎａ2ＳＯ4上で）乾燥しそして蒸発させた後、残留物を６mL／分で６５：３５のＣＨ3ＣＮ／水で溶離して、Ｃ−１８シリカ（EconosilR Ｃ−１８、２２×２５０mm）上で逆相ＨＰＬＣにかけることにより残留物を精製した。ｔR ４８分で溶離する分画を集めそして蒸発させて無定形固体（２６mg、５０％収率）が残った。
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クリプトフィシン１２２および１２３
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１．３mL）中のクリプトフィシン１２１（２０mg、０．３２ｍモル）のかき混ぜた溶液（０℃）に一回で９９％ｍＣＰＢＡ（１７mg、０．１ｍモル）を加えた。次に無水トルエン（０．７mL）を加えそして得られた混合物を７２時間２５℃でかき混ぜた。溶媒を真空蒸発させそして残留固体を６mL／分で６５：３５のＣＨ3ＣＮ／水で溶離してＣ−１８シリカ（EconsilR Ｃ−１８、２２×２５０mm）上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。クリプトフィシン１２２（９mg、４４％）はｔR ３７．５分で溶離しそしてクリプトフィシン１２３（５mg、２３％）はｔR ４０分で溶離した。
クリプトフィシン１２２
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クリプトフィシン１２３
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クリプトフィシン１２７
クリプトフィシン１２２（５mg、０．００７５ミリモル）をＣＨＣｌ3（２mL）に溶解しそしてＮ2下−４０℃に冷却した。塩化トリメチルシリル（０．０２mL、０．１５７ｍモル）を滴下して加えそして得られた混合物を１時間−４０℃でかき混ぜた。溶媒を蒸発させそして残留物をジエチルエーテル中の１５％ＥｔＯＨとともに、シリカゲルのプラグ中を通過させてろ過してクリプトフィシン１２７（４mg、７７％収率）を生成した。
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例２１ クリプトフィシン１２８および１３０〜１３４の合成
クリプトフィシン１２８、１３０および１３１
クリプトフィシン１１７と１１８との粗製２：１の混合物の５．７mgをＣＨＣｌ3（０．５mL）に溶解しそして３時間−６０℃で塩化トリメチルシリル（５μL）で処理した。クロロヒドリンの得られた混合物を逆相ＨＰＬＣによりクリプトフィシン１２８、クリプトフィシン１３０およびクリプトフィシン１３１に分離した。順相ＨＰＬＣによりさらに精製して純粋なクリプトフィシン１２８（２．１mg）を得た。
クリプトフィシン１２８についてのスペクトルデータ
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クリプトフィシン１３０についてのスペクトルデータ
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クリプトフィシン１３１についてのスペクトルデータ
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クリプトフィシン１３２、１３３および１３４
ジクロロメタン（６mL）中に溶解されたクリプトフィシン１２４とそのＺ異性体（１３４mg、０．１９９ｍモル）との混合物を３６時間室温でｍ−クロロ過安息香酸（１０３mg、０．５９８ｍモル）と反応させた。反応中生成したクロロ安息香酸を除去するためにりん酸塩緩衝液（１０mL、pH８）を加えた。３０分後、水性層を、硫化ジメチル（５０μL）およびりん酸塩緩衝液（１０mL）の新しいサンプルと入れ換えた。３０分間かき混ぜ続けた。有機層を分離し、溶媒を蒸発させそして残留物を１２時間真空乾燥した。主としてクリプトフィシン１２５と１２６との粗製混合物をＣＨＣｌ3（５mL）中に溶解しそして３時間−６０℃で過剰の塩化トリメチルシリル（５０μL）で処理した。溶媒を蒸発させそして残留物を逆相ＨＰＬＣ（Econsil ＯＤＳシリカ、２５０mm×２２mm、３５％Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ、３mL／分）により精製してクリプトフィシン１３４（ｔR ５２．５分、９mg、６％）、部分的に純粋なクリプトフィシン１３３（ｔR ６１分、３２mg、２２％）および粗製クリプトフィシン１３２（ｔR ６７．５分、７２mg）を得た。順相ＨＰＬＣ（Econsilシリカ、２５０mm×１０mm、５６％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３mL／分）によりさらに精製して純粋なクリプトフィシン１３２（６５mg、４５％）を得た。
クリプトフィシン１３２についてのスペクトルデータ
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クリプトフィシン１３４についてのスペクトルデータ
1Ｈ  ＮＭＲスペクトルはフェニルプロトンについての７．３１（１０／１４）および７．３６−７．４０（１１／１２／１３）での２つの多重線がｐ−クロロフェニルプロトンについての７．２６（１０／１４）および７．３６（１１／１３）での２つの二重線により置き換った以外はクリプトフィシン２７の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルと同様である。
例２２ 構造−活性相関（ＳＡＲ）およびインビボ評価
ヒト腫瘍細胞系ＫＢおよびＬ0Ｖ0に対するクリプトフィシン１、３および８および新しいクリプトフィシン類の細胞毒性は表６に示される。クリプトフィシン５１およびクリプトフィシン３は比較出来る細胞毒性を示す（ＩＣ50  ３．５〜５．８nM）。しかしながら、クリプトフィシン５２（ＩＣ50  ４３〜７０pM）はクリプトフィシン１（ＩＣ50  ９〜２９pM）よりやや低い細胞毒性でありそしてクリプトフィシン５５（３３〜４７pM）はクリプトフィシン８（ＩＣ50  ９〜１９pM）よりやや低い細胞毒性である。クリプトフィシン１１７、１２２、１２５、１２７、１２８および１３２についての細胞毒性ＩＣ5はクリプトフィシン１、８、５２および５５についての細胞毒性ＩＣ50と比較出来る；しかしながらそのデータは一層意味がある比較とは現在認めていない。
クリプトフィシン５２はインビボで活性であるがしかしクリプトフィシン１と比較しておおざっぱに３倍の合計投与量を必要とする。５つのねずみ由来の充実性腫瘍および３つのヒト充実性腫瘍に対するクリプトフィシン５２のインビボ活性を表７に要約する。同様にクリプトフィシン５５はインビボで活性であるがしかしクリプトフィシン８と比較して３倍の合計投与量をまた必要とする。６つのねずみ由来の充実性腫瘍および４つのヒト充実性腫瘍に対するクリプトフィシン５５のインビボ活性を表８に要約する。インビボデータはインビトロデータと相関連しているように思われる。
クリプトフィシン１１７、１２５、１２８および１３２はねずみ由来の膵臓腺癌（Panc  ０３）に対してインビボで活性である。クリプトフィシン１１７および１１８は一層強力であると思われ、即ちそれらはクリプトフィシン１および８、それぞれよりも少ない合計投与量を必要とするが、しかるにクリプトフィシン１２５および１３２は強力性が低い、即ちそれらはクリプトフィシン１および８、それぞれよりも高い合計投与量を必要とする。データを表９に要約する。
４２％未満であるＴ／Ｃ値はＮＣＩ標準により活性であると考えられる；１０％未満であるＴ／Ｃ値はＮＣＩ標準により優れた活性および有力な臨床活性を有すると考えられる。総対数死滅（Gross log kill）はＴ−Ｃ／３．２Td（但し、Ｔは７５０mgに到達するための処理されたグループの腫瘍について日での中央時間であり、Ｃは７５０mgに到達するための対照グループの腫瘍についての日での中央時間でありそしてTdは腫瘍容量二重時間（tumor volume doubling time)である）として定義される（T．H．Corbett等、Cytotoxic Anticancer Drugs；Models and Concepts for Drug Discovery and Development，pp３５〜８７；Kluwer：Norwell，１９９２）。５〜２０日の薬剤処理の期間を用いて、＞２．８、２．０〜２．８、１．３〜１．９、０．７〜１．２および＜０．７の総対数死滅値はそれぞれ、＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋および−（不活性）と得点化される。臨床的活性の表示である＋＋＋〜＋＋＋＋の活性等級は１００〜３００mgの大きさのかたまりのほとんど移植されたマウスの充実性腫瘍の部分的または完全な退縮を行なうのに必要とされる。クリプトフィシン５２はねずみ腫瘍について０〜１４％そしてヒト腫瘍について４．１〜１６の範囲のＴ／Ｃ値を示しそしてねずみ腫瘍について１．１〜２そしてヒト腫瘍について０〜３．２の範囲の総対数死滅値を示す。クリプトフィシン１は０〜２７％の範囲のＴ／Ｃ値を示しそして＜１〜２の範囲の対数死滅値を示す。クリプトフィシン５５はほとんど０〜４．４％の範囲のＴ／Ｃ値を示しそして１．２の総対数死滅値を示した１つの試験Colon  ２６実験を除いてのすべてについて２．１〜＞４．６（治癒）の範囲の対数死滅値を示した。表１０に示されるように、クリプトフィシン８はほとんど０％のＴ／Ｃ値および＞２．８（幾つか治癒）の対数死滅値を示す。クリプトフィシン１１７および１２５は他のエポキシドタイプのクリプトフィシン、即ちクリプトフィシン１および５２の値と比較出来るＴ／Ｃ値および総対数死滅値を有すると思われ、しかるにクリプトフィシン１２８および１３２は他のクロロフィシンタイプのクリプトフィシン、即ちクリプトフィシン８および５５の値と比較出来るＴ／Ｃ値および総対数死滅値を有する。
この明細書において引用されたがしかし参照により個々にそして特に組み入れられなかったすべての刊行物および特許はそれらが参照により組み入れられるべきことを特にそして個々に示されたように参照することにより本明細書に組み入れられる。
上記本発明は明確化および理解の目的のために例示および例により幾分詳細に記載されたけれども、請求の範囲の精神および範囲から離れることなしにそれらに或る変化および修正が行なわれることが出来ることはこの発明の教示からみて当業者に明らかであろう。
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表５に関して、４８時間下に示される化合物の種々の濃度を用いて細胞を処理した。次に方法のセクションにおいて示されたとおりにして細胞数を測定しそして各々の化合物についてのＩＣ50が計算された。値は３つの実験についての平均±ＳＥＭを表わす。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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