(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ指示薬の存在下で尿素とウレアーゼを反応させて、生成するアンモニアによる液相のｐＨ変化を光学的に検出する尿素窒素の測定方法であって、
測定試薬系が少なくとも２種類の緩衝液を含んでいること、及び
前記測定試薬系において、吸光度をＸ軸としｐＨ値をＹ軸とする前記ｐＨ指示薬の滴定曲線と、酸又はアルカリ添加量をＸ軸としｐＨ値をＹ軸とする前記測定試薬系の滴定曲線とが同じ形状となり、酸又はアルカリ添加量をＸ軸とし吸光度をＹ軸とする検量線が原点を通る直線性を示すように前記緩衝液を組み合わせること、
を特徴とする尿素窒素の前記測定方法。
【請求項２】
少なくともｐＨ指示薬を含有する第一試薬、及び少なくともウレアーゼを含有する第二試薬とからなる尿素窒素測定用試薬であって、
前記第一試薬が少なくとも２種類の緩衝液を含んでいること、及び
前記第一試薬及び第二試薬を混合した条件において、吸光度をＸ軸としｐＨ値をＹ軸とする前記ｐＨ指示薬の滴定曲線と、酸又はアルカリ添加量をＸ軸としｐＨ値をＹ軸とする前記混合液の滴定曲線とが同じ形状となり、酸又はアルカリ添加量をＸ軸とし吸光度をＹ軸とする検量線が原点を通る直線性を示すように前記緩衝液を組み合わせること、
を特徴とする前記尿素窒素測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、尿素窒素（以下、ＵＮともいう）測定方法および尿素窒素測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬は、作業効率向上の為、安定な酵素の開発や、不安定な試薬組成物を安定化するための各種添加剤、ｐＨ条件が検討され、溶液状態で長期間安定な測定試薬が開発されている。さらに、定量範囲の拡大、共存物質による影響の回避、再現性を向上させることにより再検率を低下させる事は作業効率の向上に欠かせない。また、低コスト化を目指し、より安価な試薬の開発が望まれている。
【０００３】
現在、ＵＮ測定試薬は試料をα−ケトグルタル酸またはその塩、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨともいう）あるいは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨともいう）の存在下に、グルタミン酸脱水素酵素を作用させ、微量の（内因性）アンモニアを予め除去する工程と、ウレア−ゼを加え試料中の尿素をアンモニアに分解し、このアンモニアの生成量に対応するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ［以下、両者を総じてＮＡＤ（Ｐ）Ｈともいう］の減少速度を測定する工程（手順）を順次経て測定されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度から尿素窒素を求める方法が良く用いられている。この方法は共存物質の影響が少なく、定量範囲が広く（以下、直線性ともいう）、同時再現性にも優れている。さらに近年、長期間安定な試薬や検体由来アンモニアの影響を受けない試薬が開発されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】
しかしながら、長期間安定化させるために各種添加剤や精製度の高い原料が必要になり、製造コストが大きくなる。また、検体由来アンモニアの影響を受けなくするためには、アンモニアを消去する反応系が必要となり、これもまた製造コストが大きくなる。他の反応系、例えば、ウレアーゼの作用で生じたアンモニアをベルテロー（Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ）反応で発色させ測定するウレアーゼ−インドフェノール法は、安価ではあるが直線性が悪く、共存物質による影響がある。ウレアーゼの作用で生じたアンモニアによるｐＨ上昇をｐＨ指示薬により比色定量するウレアーゼ−ｐＨ指示薬法も安価ではあるが直線性が悪い。先行技術としてウレアーゼ、緩衝剤及び変色域の異なる２種以上のｐＨ指示薬を含む、尿素濃度の変動の幅の大きい検体にも有効に使用できる方法があるが（特開平０５−１６１５００号公報）、ｐＨ指示薬は種類によってｐＨによる変色域、吸収特性、塩や蛋白による影響が一様ではなく、検体種、検体中夾雑物により測定値への影響がみられる。また、直線性を向上させるために脱カルボン酸反応に於いて、ｐＨ指示薬と緩衝液が同じｐＫａであれば定量性よく測定可能であると紹介されている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８１，５９−６５（１９８９））。確かに使用する緩衝液の緩衝能のあるｐＨ域では同じｐＫａのｐＨ指示薬との組み合わせにより定量性は向上するが、同じｐＫａのｐＨ指示薬と緩衝液であっても滴定曲線の形状は異なるため緩衝能からはずれたｐＨ域では定量性は得られない。よって、従来からある測定方法では長期間安定で、定量範囲が広い、より安価な試薬の開発は困難だと思われた。従って、本願の目的は、長期間安定で、定量範囲が広い、より安価なＵＮ測定試薬を供することにある。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】
本発明は、少なくとも２種類の緩衝液が含まれている液相中で、ｐＨ指示薬の存在下で尿素とウレアーゼを反応させて、生成するアンモニアによる液相のｐＨ変化を光学的に検出することを特徴とする尿素窒素の測定方法、に関する。
また本発明は、少なくともｐＨ指示薬を含有する少なくとも２種類の緩衝液からなる第一試薬、及び少なくともウレアーゼを含有する溶液からなる第二試薬とからなる尿素窒素測定用試薬、にも関する。
【０００６】
以下、本発明を詳述する。
長期間安定で、定量範囲が広い、より安価なＵＮ測定用試薬を供するため鋭意検討した結果、尿素がウレアーゼにより加水分解されて生じるアンモニア量に依存して変化するｐＨをｐＨ指示薬由来のシグナルを検出することでＵＮを定量するために、尿素とウレアーゼとの反応を２種類以上の緩衝液中で行い、そこに１種類のｐＨ指示薬を存在させることで、定量的にＵＮを測定することができる方法を確立した。ｐＨ指示薬と緩衝液の選択はｐＨ指示薬の滴定曲線（Ｘ軸：アンモニア量、Ｙ軸：吸光度）がアンモニア量に依存して吸光度も定量的に変化するような２種類以上の緩衝液と１種類のｐＨ指示薬を選択、使用することにより目的は達成される。
【０００７】
本発明のＵＮ測定方法の基本は、使用するｐＨ指示薬のｐＫａ付近のｐＨ域で使用する緩衝液の緩衝能を高く、ｐＫａから離れたｐＨ域で緩衝能を低くするような２種類以上の緩衝液を組み合わせることにある。しかし、試薬を構成する成分は、共存物質による影響を回避するためや、再現性を向上するため、保存安定性を向上するために各種添加剤を添加するのが一般的であり、添加剤の中にはｐＨ指示薬の滴定曲線を変化させることがあるため、これらの添加物が添加された条件でのｐＨ指示薬の滴定曲線（Ｘ軸：アンモニア量、Ｙ軸：吸光度）がアンモニア量に依存して吸光度も定量的に変化するように２種類以上の緩衝液を選択する。一般に緩衝液はｐＨを変動させないように用いるものであって、緩衝能のないｐＨ域での使用はされない。しかしながら、本願は緩衝能のある領域から、緩衝能の弱い領域までの広範囲のｐＨ域も使用することによりｐＨ指示薬の広範囲な変色域を利用できる。緩衝能の弱いｐＨ域での呈色測定はｐＨが安定しないため正確な測定ができないと予想されたが、意外にも緩衝能の弱いｐＨ域も含む広範囲な測定域で再現性良く測定できることが確認され、本願を完成するに至った。
【０００８】
本発明に用いることができるｐＨ指示薬としては、ウレアーゼ活性の発現できるｐＨ域で変色するｐＨ指示薬であれば良い。例えば、テトラ・ブロム・フェノールブルー、ブロム・フェノールブルー、メチルオレンジ、ブロム・クレゾールグリーン、メチルレッド、クロルフェノールレッド、Ｐ−ニトロフェノール、ブロム・クレゾールパープル、ブロム・チモールブルー、フェノールレッド、クレゾールレッド、クレゾールベンゼイン、メタ・クレゾールパープル、プロピル−α−ナフトールオレンジ、Ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソンが好適に使用でき、これらの水溶性を高めるために塩（塩とはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、塩酸塩等をいう）や水和物を用いることができるが、これらのｐＨ指示薬に限定されるものではない。使用できる濃度は、反応時や保存中に塩析しない濃度であれば良く、１０μＭから１０ｍＭが好ましい。
【０００９】
本発明における緩衝液は、ＵＮ測定用試薬を完成させるために必要な各種添加剤を添加した条件において、使用するｐＨ指示薬の滴定曲線（Ｘ軸：吸光度、Ｙ軸：ｐＨ）と同じ形状の滴定曲線（Ｘ軸：酸またはアルカリ添加量、Ｙ軸：ｐＨ）となるように、２種類以上の緩衝液を適宜組み合わせて使用すればよい。グッド緩衝液（例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ）、トリエタノールアミンあるいはその塩酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グリシルグリシン、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等、緩衝液の種類は限定されない。使用できる濃度は、ウレアーゼの作用で生じたアンモニアによりｐＨが上昇できる緩衝能を持つ濃度でｐＨ指示薬の滴定曲線（Ｘ軸：吸光度、Ｙ軸：ｐＨ）と同じ形状の滴定曲線（Ｘ軸：酸またはアルカリ添加量、Ｙ軸：ｐＨ）となるように緩衝液を組み合わせることが必要である。使用できる濃度は、反応時や保存中に塩析しない濃度であれば良く、０．１ｍＭから１００ｍＭが好ましい。
【００１０】
ウレアーゼは、検体中の尿素を所望の反応時間内にアンモニアに加水分解できる活性が必要である。使用できる活性濃度は０．０１Ｕ／ｍｌ以上であれば良く、０．１Ｕ／ｍｌから１０Ｕ／ｍｌが好ましい。ウレアーゼの由来は特に限定されないが、ナタマメやバクテリア由来が好適に使用できる。
【００１１】
ｐＨ指示薬を含有する２種類以上の緩衝液である第一試薬のｐＨは、中性付近が好ましく、特にｐＨ６．０から８．０が好ましい。また、検体中の共存物質による影響を回避する為や、再現性を向上させる為に各種添加剤を使用することができる。乳び検体による影響の回避や同時再現性の向上には、非イオン性界面活性剤が好適に使用できる。使用できる濃度は、０．１％から３．０％が好ましい。ビリルビン検体による影響の回避にはアルブミンが好適に使用できる。使用できる濃度は、０．０２％から１．０％が好ましい。溶血検体による影響の回避には、還元剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸ヒドロキシルアミン、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム）が好適に使用できる。トリンダー試薬を使用した測定試薬は、還元剤の添加により測定値への影響が見られるが、本発明においては還元剤による測定値への影響を受けないという点で優れている。使用できる濃度は、０．０１ｍＭ以上で使用でき、０．０２ｍＭから１．０ｍＭが好ましい。検体中の蛋白による影響は、塩類（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム）により回避される。使用できる濃度は０．０１Ｍ以上で使用でき、０．０５Ｍから０．５Ｍが好ましい。
【００１２】
ウレアーゼを含有する溶液からなる第二試薬のｐＨは中性付近が好ましく、特にｐＨ６．０から８．０が好ましい。ウレア−ゼを安定化するためにＮ−アセチルシステイン、アルブミン、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＤＨＥＧ、ＩＤＡ、ＥＤＤＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＮＴＰ、Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＴＰＯ、ＮＴＰＯ、ＢＡＰＴＡ、ＣＮ）、アセトヒドロキサム酸と共存させても良い。
【００１３】
上記試薬を尿素を含む試料と混合、反応させると、ウレアーゼの作用によってアンモニアが生成される。このアンモニア量依存的に反応の液相のｐＨが高くなり、ここにある種のｐＨ指示薬を存在させておけば、このｐＨ指示薬による液相の変色は尿素窒素の量を反映させるものとなる。従って、この変化を光学的（例えば、比色法）に検出することで、尿素窒素の含有量を定量することができる。
【００１４】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（１）試薬１は以下に示す６種類を作製した。
（試薬１−Ａ）
０．０４％  フェノールレッド
２．０  ％  ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社製、商品名エマルゲン４２０）（以下同様）
０．０５Ｍ  塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．７）
（試薬１−Ｂ）
０．０４％  フェノールレッド
２．０  ％  ポリオキシエチレンオレイルエーテル
０．０５Ｍ  塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ６．７）
（試薬１−Ｃ：本発明）
０．０４％  フェノールレッド
２．０  ％  ポリオキシエチレンオレイルエーテル
０．０５Ｍ  塩化ナトリウム
を含む１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ６．７）
（試薬１−Ｄ）
０．１  ｍＭ  Ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン
１．０  ％    ポリオキシエチレンオレイルエーテル
５．０  ｍＭ  塩化カルシウム２水和物
０．０５Ｍ    塩化ナトリウム
を含む２０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ７．６）
（試薬１−Ｅ）
０．１  ｍＭ  Ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン
１．０  ％    ポリオキシエチレンオレイルエーテル
５．０  ｍＭ  塩化カルシウム２水和物
０．０５Ｍ    塩化ナトリウム
を含む２０ｍＭ  ＴＡＰＳＯ（ｐＨ７．６）
（試薬１−Ｆ：本発明）
０．１  ｍＭ  Ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン
１．０  ％    ポリオキシエチレンオレイルエーテル
５．０  ｍＭ  塩化カルシウム２水和物
０．０５Ｍ    塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭ  ＴＡＰＳＯ、１０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ７．６）
（２）試薬２
０．４ｍｇ／ｍｌ  ウレアーゼ（ナタマメ由来、東洋紡績株式会社）水溶液
（３）検体
尿素を用いて、尿素窒素量が０，５０，１００，２００，３００，４００，５００ｍｇ／ｄｌとなるように調製した各希釈列水溶液。
（４）測定方法
各希釈列水溶液１２μｌに各試薬１を２４０μｌ加え攪拌し、３７℃、５分間加温した後、それぞれに試薬２を６０μｌ加え攪拌し、３７℃、５分間加温し、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１及び図２に示す。図１〜図２において、◇は試薬１−Ａ、□は試薬１−Ｂ、○は試薬１−Ｃ（本発明）、◆は試薬１−Ｄ、■は試薬１−Ｅ、そして●は試薬１−Ｆ（本発明）を用いた場合を示す。
【００１５】
図１及び図２によれば１種類の緩衝液からなる試薬１−Ａ（図１内の◇）、試薬１−Ｂ（図１内の□）、試薬１−Ｄ（図２内の◆）及び試薬１−Ｅ（図２内の■）を用いた場合では、その検量線は直線性が得られていない。これに対し、本発明の試薬１−Ｃ（図１内の○）及び試薬１−Ｆ（図２内の●）によれば、少なくとも尿素窒素濃度が０〜５００ｍｇ／ｄｌまでの間において、その検量線は原点を通る直線性を示し、尿素窒素の定量法として用いることができる。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、尿素窒素の濃度が低値から高値に渡り広い範囲で尿素窒素を定量することができる。また、従来法と比較して高価な酵素を用いず、安価な試薬を提供することができる。更に、これらの試薬は液状試薬として長期間安定的に使用できる。本発明はかかる格段の効果を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来法と本発明方法による検量線を示すグラフである。
【図２】従来法と本発明方法による検量線を示すグラフである。
【図１】
0004194158.tif 000002
【図２】
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