(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質又はペプチドのディスプレイ及び選択並びにそれらをコードする遺伝物質の回収方法であって、
（a）複合粒子が形成され、前記複合粒子のそれぞれが少なくとも１の特有の新生タンパク質又はペプチドまたは他のDNA発現生成物と１以上のリボソームおよび前記タンパク質またはペプチドをコードする特異的なmRNAとの結合物を含むような、無細胞系におけるDNAの転写及び翻訳；
（b）前記複合粒子をリガンド、抗原、抗体又は他の物質と接触させて、該タンパク質又はペプチド生成物に結合させることで粒子を選択すること；及び
（c）前記mRNAが前記複合粒子に結合されたままで前記mRNAに対して行われる逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって、タンパク質又はペプチドをコードする遺伝情報をDNAとして回収すること；
を含む方法。
【請求項２】
転写及び翻訳が共役している請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
転写/翻訳系が、ウサギ網状赤血球ライセート系である請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
終止コドンが欠失しているDNA及びmRNAからタンパク質（又はペプチド）−リボソーム−mRNA複合体を作製することを包含する、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
複合粒子を選択する物質が固定化され、マグネチックビーズ、プラスチックシャーレ又は他の不溶性担体に結合されている、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】
DNAを、mRNAの翻訳後、１以上の真核細胞リボソームに物理的に連結されたmRNAについて行われる逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって生成する方法。
【請求項７】
タンパク質又はペプチドのディスプレイ及び選択並びにそれらをコードする遺伝物質の回収方法であって、
（a）少なくとも１の特有の新生タンパク質又はペプチド、又は他のDNA発現生成物と１以上のリボソームおよび前記タンパク質及びペプチドをコードする特異的なmRNAの結合物を含む複合粒子が形成される、無細胞ウサギ網状赤血球ライセート系における、終止コドンが欠失しているDNAの共役した転写及び翻訳；
（b）前記複合粒子を不溶化されたリガンド、抗原、抗体又は他の物質に接触させて、該タンパク質又はペプチド生成物に結合させることで粒子を選択すること；及び
（c）前記mRNAが前記複合粒子に結合したままで前記mRNA上で行われる逆転写及びポリメラーゼ鎖反応（PT-PCR）によって、タンパク質又はペプチドをコードする遺伝情報をDNAとして回収すること；
を含む方法。
【請求項８】
タンパク質が、単鎖抗体断片である請求の範囲第１、４または７項に記載の方法。
【請求項９】
単鎖抗体断片が、軽鎖の可変領域（VL）に連結した重鎖の可変領域（VH）（scFv断片）又は全軽鎖（K）に連結した重鎖の可変領域（VH）（VH/K断片）である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１または７項に記載の方法によって得られたRT-PCR生成物DNAを、発現ベクターに続いて導入し、細菌の形質転換によるタンパク質又はペプチドを産生させることを包含する請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）における複合粒子が、真核リボソームとタンパク質、ペプチド又は他のDNA発現生成物、及びそれらのタンパク質、ペプチド又は他の生成物をコードする特異的なmRNAとの複合体を含む、ディスプレイライブラリである、請求の範囲第１項または第７項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中のmRNA分子が終止コドンを欠失している、請求の範囲第11項記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中の個々のタンパク質が、リガンドに特異的に結合できるタンパク質を含んでおり、ライブラリの個々のメンバーを固定化されたリガンドに結合させることによって引き続き選択できる、請求の範囲第11又は12項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中のディスプレイされる個々のタンパク質が、異なった数のドメインを含む単鎖断片を含む抗体又は抗体断片である、請求の範囲第11又は12項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中のディスプレイされる生成物がレセプターである請求の範囲第11又は12項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中のディスプレイされる生成物がペプチドである請求の範囲第11又は12項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中のディスプレイされる生成物がタンパク質変異体である請求の範囲第11又は12項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中の抗体又は断片が、免疫された又は免疫されない動物又はヒトのリンパ球から得られる、請求の範囲第14項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）におけるディスプレイライブラリ中のDNA発現生成物が、抗体、レセプター又はそれらの断片をコードするクローン化されたDNAの変異によって生成される、請求の範囲第11又は12項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）においてディスプレイライブラリを形成すること、および、工程（ｂ）においてディスプレイライブラリからの個々の変異体を選択すること、を含む、請求の範囲第17又は19項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）のディスプレイライブラリ中のペプチドが、工程（ｂ）において特異的な抗体又はレセプターによって認識されるエピトープの同定及びマッピングのために使用される、請求の範囲第16項に記載の方法。
【請求項２２】
マウス、ラット又は他の非ヒト哺乳類の抗体の製造方法であって、
（a）マウス、ラット又は他の非ヒト哺乳類を抗原に接触させること、
（b）請求の範囲第９項におけるような単鎖FV又はVH/K断片として連結された、前記動物の免疫グロブリンのVH及びVL領域の組合せを含むDNAライブラリを作製すること、
（c）前記DNAライブラリのin vitro転写及び翻訳による真核リボソームディスプレイライブラリであって、それぞれ少なくとも１の特有の新生抗体断片を含んで形成され、該断片が１以上のリボソーム及び該抗体断片をコードする特異的mRNAと結合している複合粒子が形成されている前記ライブラリを作製すること、
（d）前記複合体粒子を抗原または他の物質と接触させ、前記抗原又は他の物質への結合によって前記複合粒子を選択すること、
（e）該mRNAについて、前記粒子に結合している間に行うRT-PCRによって、該抗体断片をコードする遺伝情報を回収すること、
（f）前記抗体断片を発現させ、収集すること
を含む方法。
【請求項２３】
ヒトの抗体の製造方法であって、
（a）導入遺伝子として免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードするヒトの遺伝子座を保有する遺伝子組換えマウスを抗原と接触させること、
（b）請求の範囲第９項におけるような単鎖FV又はVH/K断片として連結された、前記動物のヒト免疫グロブリンのVH及びVL領域の組合せを含むDNAライブラリを製造すること、
（c）前記DNAライブラリのin vitro転写及び翻訳による真核リボソームディスプレイライブラリであって、それぞれ少なくとも１の特有の新生抗体断片を含み、該抗体断片が１以上のリボソーム及び該抗体断片をコードする特異的mRNAと結合している複合粒子が形成されている前記ライブラリを製造すること、
（d）前記複合体粒子を抗原または他の物質を接触させ、前記抗原又は他の物質への結合によって前記複合粒子を選択すること、
（e）該mRNAについて、前記粒子に結合しているままで行うRT-PCRによって、該抗体断片をコードする遺伝情報をDNAとして回収すること、
（f）前記抗体断片を発現させ、収集すること
を含む方法。
【請求項２４】
複合粒子としてのタンパク質又はペプチド及びそれらをコードする遺伝情報の回収のためのディスプレイ方法であって、
（a）それぞれ少なくとも１の特有の新生のタンパク質又はペプチド又は他のDNA発現生成物と１以上のリボソーム及び前記タンパク質又はペプチドをコードする特異的mRNAとの結合物を含む複合粒子が形成されるように、真核無細胞系でmRNA又はmRNAライブラリを翻訳すること、
（b）前記複合粒子をリガンド、抗体又は他の物質と接触させて、該タンパク質又はペプチド生成物に結合させることによって前記複合粒子の選択物を得ること、及び
（c）前記mRNAが前記複合粒子に結合しているままで前記mRNAに対して行うRT-PCRによって、前記ペプチド、タンパク質または他のDNA発現生成物をコードする遺伝情報をDNAとして回収すること
を含む方法。
【請求項２５】
複合粒子としてのタンパク質又はペプチドをディスプレイする方法及びそれらをコードする遺伝情報を回収する方法であって、
（a）複合粒子が、それぞれ少なくとも１の特有の新生のタンパク質又はペプチド又は他のDNA発現生成物と、１以上のリボソーム及び前記タンパク質又はペプチドをコードする特異的mRNAとの結合物を含んで形成されるように、真核無細胞系でcDNA又はcDNAライブラリを転写及び翻訳すること、
（b）前記複合粒子をリガンド、抗体又は他の物質と接触させて、前記タンパク質又はペプチド生成物に結合させることによって前記複合粒子の選択物を得ること、及び
（c）前記mRNAが前記複合粒子に結合したままで前記mRNAに対して行う逆転写及びポリメラーゼ鎖反応によって、前記ペプチド、タンパク質またはDNA発現生成物をコードする遺伝情報をDNAとして回収すること
を含む方法。
【請求項２６】
遺伝情報の回収工程の前に、リボソームディスプレイ及び選択の反復工程が存在する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２７】
遺伝情報の回収工程の前に、リボソームディスプレイ及び選択の反復工程が存在する、請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項２８】
遺伝情報の回収工程の前に、リボソームディスプレイ及び選択の反復工程が存在する、請求の範囲第２２項記載の方法。
【請求項２９】
遺伝情報の回収工程の前に、リボソームディスプレイ及び選択の反復工程が存在する、請求の範囲第２４項記載の方法。
【請求項３０】
遺伝情報の回収工程の前に、リボソームディスプレイ及び選択の反復工程が存在する、請求の範囲第２５記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｂ）において真核リボソームディスプレイライブラリが、結合部位又はレセプターに対するリガンドであって薬剤又は治療としての潜在的な用途を有するリガンドを選択するために使用される、請求の範囲第11項または12項記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）においてリボソームディスプレイライブラリが翻訳生成物を固定化された抗体又はリガンドへ結合させることにより遺伝子を単離するために使用される、請求の範囲第11項または12項記載の方法。
【請求項３３】
細菌が大腸菌である、請求の範囲第１０項記載の方法。
【請求項３４】
異なった数のドメインを含む単鎖断片を含む抗体又は抗体断片がVH、VL、scFV、VH/K、Fabである、請求の範囲第１４項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
分子生物学及び遺伝子工学において現在関心が集まっている点は、タンパク質及びペプチドの巨大ライブラリーのディスプレイ、並びに親和性の選択によりそれらを探求する手段である。選択法の遺伝子的開発において重要なことは、ライブラリーの個々の分子（表現型）及びそれらをコードしている遺伝子情報（遺伝子型）の間の物理的結合である。多くの細胞を基にした方法、例えばファージ（1）、細菌（2）及び動物ウイルス（3）の表面などを利用することができる。これらのうち最も広範に使用されているものはファージディスプレイであり、ここにおいてタンパク質又はペプチドはファージ表面にコートタンパク質への融合物として個々に発現される一方で、このファージ粒子は該タンパク質又はペプチドをコードしているDNAを保持する。ファージの選択は、タンパク質又はペプチドの認識に関連した特異的結合反応を通じて成され、特定のファージが単離されかつクローニングされ、かつ該タンパク質又はペプチドのDNAは回収され、増幅（propagate）又は発現されることを可能にする。
ディスプレイ技術の特に望ましい用途は、コンビナトリアルライブラリーからの抗体結合部位の選択である（4）。特異的抗原に対する親和性の高い抗体のスクリーニングは、抗体断片のファージディスプレイにより広範に実施されている（4）。重鎖（H）及び軽鎖（L）の可変（V）領域がファージ表面にディスプレイされ、かつ組換えファージは、固定された抗原に結合することによって選択される。このようなライブラリーを構築するためには、VHドメインとVLドメインが自在なリンカーペプチドにより連結した１本鎖（sc）Fv断片が、広範に使用されている。別の種類の１本鎖抗体断片は、VH/Kと称され、ここでVHドメインは完全な軽鎖に連結されており、すなわちVH−リンカー−VL-CLである（10）。これには、大腸菌における発現の安定性、並びにELISA及びウェスタンブロットのような検出システムにおけるスペーサー及びタグとしてのCLドメインの使用を含む多くの利点がある。抗体のVH及びVL領域の遺伝子は、PCRにより容易に得ることができ、かつランダムに組換えて断片の巨大ライブラリーを作製することができる（21）。このようなライブラリーは、いずれかの哺乳類種の正常又は免疫性Ｂ細胞から得るか、もしくは、in vitroで形成された合成H-CDR3領域（重鎖の第三の相補的決定領域）によりクローン化した遺伝子断片から人工的に構築することができる（22）。１本鎖抗体ライブラリーは、潜在的にサイズが1010メンバーより大きい。ライブラリーは更に、特異的VH/VL組合せをコードしているクローン化したDNA断片の突然変異及び親和性又は特異性に関する改善された特性を有する変異体の選択によって作製することができる。突然変異は、好ましくはCDR領域において、特に超可変性のH-CDR3において行われ、ここにおける10個のアミノ酸領域から得られた変異体の潜在値（potential number）は2010又は1013である。
効果的に抗体をディスプレイするためには、非常に巨大なライブラリーを作製しかつ選択する手段が必要であることは明らかである。しかし作製される可能性のあるライブラリーのサイズは、全てのメンバーをディスプレイする現在の技術の能力を数桁上回っている。従って、ファージディスプレイライブラリーの作製には、DNAによる細菌の形質転換が必要であるが、細菌によるDNA取込み効率の低さは、得られる形質転換体の典型的数が１回の形質転換につきわずかに107〜109であることを意味する。巨大なファージディスプレイのレパートリーを作製することができる一方で（17）、形質転換をスケールアップすることができないので、これらは複数回電気穿孔を反復することを必要とし、この方法を煩雑又は非実践的なものとしている。形質転換の限界のほかにも、細菌によって作製されたライブラリーの多様性を低下する別の因子があり、これは例えば特定の抗体断片が、分泌されないこと、タンパク質分解されること又は封入体を形成することであり、このことは最終のライブラリーでのこのような結合部位の欠如につながる。これらの考察は、全ての細胞を基本にした方法に該当する。従って1010又はそれ以上のメンバーのライブラリーに関して現在の方法を用いると、可能性のあるライブラリーの小さな画分のみがディスプレイされかつスクリーニングされる。注記したように、動物又はヒトのＢ細胞もしくは人工的に構築されたもののいずれかから作製された抗体ライブラリーのサイズは、容易に1010メンバーを超えることができる一方で、10残基配列をコードしている可能性のあるペプチド配列の数は、1013である。
これらの制限を避けるために、別のディスプレイシステムが求められており、特にライブラリー作製における形質転換の問題点を避けるin vitroにおける方法が求められている。このような方法のひとつは、リボソーム表面上の新生タンパク質又はペプチドのディスプレイであり、更に例えばコードしているmRNAとの安定した複合体が形成され；この複合体は該タンパク質又はペプチドへのリガンドにより選択され、単離されたmRNAの逆転写により遺伝情報が得られる。これはリボソーム又はポリソームディスプレイとして公知である。このような方法の説明は、G.Kawasaki／Optein Inc.に特許付与された２件の米国特許において開示されている（16）。ここにおいてセミランダムヌクレオチド配列（ライブラリー様）は、“発現ユニット”に付着され、かつin vitroにおいて転写され;得られるmRNAはin vitroで翻訳され、ポリソームが生成され；ポリソームは目的の物質への結合によって選択され、その後破壊され;放出されたmRNAが回収され、cDNAの構築に使用される。この方法の２つの重要な部分は、安定した複合体を形成するためのリボソームの失速（stalling）であり、そのためにはシクロヘキシミドが使用され、並びにmRNAの回収であり、そのためには結合したポリソームが破壊されmRNAを放出し、その後このmRNAが個別に回収される。後者はKawasakiの開示した方法の不可欠の部分であり、現在までに広く受け入れられている。従ってこの特許（16）のセクションVIIは、マグネシウムなどの除去によるポリソームの破壊に関連し；リボソーム破壊以外の、RNA又はcDNAの回収に関する他の方法は示されていない。米国特許第5,643,768号において、請求項１は、ポリペプチド鎖が付着したままでポリソームを維持するような方法でmRNAを翻訳し、次に目的の物質と接触させ、最後にmRNAを目的のポリソームから単離することに言及している。請求項２においては、目的の物質に特異的に結合しているポリソームからmRNAを単離した後、引き続きcDNAが構築される。このことは請求項15において反復され、ここでは工程（g）は該ポリソームを破壊して該mRNAを放出することを含み、かつ工程（h）は該mRNAを回収し、これによって目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を単離することを含む。同様にこれは、目的の物質と特異的に反応するポリソームからmRNAが単離されると記された請求項29（e）において再度反復されている。米国特許第5,658,754号の請求項１（g）も、該ポリソームを破壊し、mRNAを放出することを必要とし;（h）では該mRNAを回収し;及び（i）では該回収されたmRNAからcDNAを構築している。しかしながらKawasakiは、これらの出願における実践方法を実施化（reduce）せず、結果も示していない。従って、この方法は最適化されず、発明者は、自分が開示したシステムの非効率性、特にポリソーム破壊によるmRNAの回手法に起因するものに気がついていなかった。
別の原核生物のポリソームディスプレイの説明は、Affymax Technologiesによる国際公開公報第WO 95/11922号（18）及びMattheakisらの関連文献であり（14）、今度は実践方法が実施化されている。両方ともポリソームがディスプレイしている新生ペプチドの親和性スクリーニングに関するが、この特許出願も、ポリソーム上に同様にディスプレイされた抗体ライブラリーのスクリーニングを請求している。これらは、特に転写及び翻訳が組合せられている大腸菌S30システムにおいて作製されたポリソームフライブラリーに言及している。失速したポリソーム集団を生成するために、原核生物の翻訳を阻害するリファンピシン又はクロラムフェニコールのような薬剤が添加される。失速したリボソームを選択しその後遺伝情報を収集する手段は、ここでもmRNAの溶出である。この特許出願（18）の図10に示された方法の流れ図において、不可欠の部分は工程４、すなわちcDNAを合成する前のリボソーム複合体からのmRNAの溶出である。前述の特許及び文献に記された主な実施例は、ポリソームディスプレイによる1012メンバーの巨大なペプチドライブラリーのスクリーニング、並びに特異的抗体によるエピトープの選択である。これらのポリソームは、抗体で被覆されたミクロプレートウェルにおいて選択された。結合したmRNAは、20mM EDTAを含有する溶離バッファーによって遊離され、かつ次にフェノール抽出され及びグリコーゲン存在下でエタノール沈殿され、ペレットはH2O中に浮遊させた。
Mattheakisらの記した方法は、mRNAの補足及び/又は回収時に非常に非効率であることは明らかであり；従ってAffymaxの出願（18）の72頁において、特異的ペプチドエピトープをコードしている放射標識したポリソームmRNAのわずかに1〜2％が回収され、これは低いものであることが認められている（５行目）。前記特許出願（文献ではない）も、抗体断片の選択を含んでいるが、あまり詳細ではない。この場合、抗体で被覆されたDynal磁気ビーズが親和性マトリックスとして使用されている。この実施例において、標識されたmRNAは特異的に回収されたが、これらはRT-PCRによるcDNAの回収は示さなかった。従って、効率又は感度の推定はなされておらず、及びライブラリー又は集積（enrichment）からの選択は示されていない。
より最近の文献において（15）、Hanes及びPluckthunは、Mattheakisらの方法を、１本鎖抗体断片のディスプレイ及び選択に関して改変した。その概念を維持しつつも、別の特徴を導入し、この方法を原核生物である大腸菌S30システムにおける全タンパク質のディスプレイにより適したものとした。ひとつの改良点は、通常新生タンパク質の放出をシグナル伝達する終止コドンの不在によるリボソームの失速である。ここでも遺伝物質の回収は、10mM EDTAによりリボソーム複合体を解離し、及び逆転写前に、エタノール沈殿（又はRneasyキット）により単離することにより行なわれた。個別の転写工程及び翻訳工程を用い、組み合わせた方法はより低い効率であることを示したが；しかし、この作用に関するデータは示していない。膨大なmRNAを各サイクルにおいて添加した（10μg）。
Hanes及びPluckthunによって、最初は0.001％程度であったポリソームディスプレイサイクルの後にmRNAの収率を改善するために、多くの追加事項が導入された（15）。これらは、mRNAの5'及び3'末端のステムループ構造、ヌクレアーゼ阻害剤としてバナジル−リボヌクレオシド複合体（これも部分的に翻訳を阻害する）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDI（これはジスルフィド結合の形成を触媒する）、及びアンチセンスヌクレオチド（原核生物システムにおいて一方で終止コドンなしで合成されたタンパク質の放出及び破壊を引き起こすssrA RNAを阻害する）を含んでいた。アンチ−ssrA及びPDIの組合せは、全体的に効率を12倍改善した。しかしサイクル終了時のmRNAの収率は、全てを加えても、依然添加したmRNAのわずかに0.2％であり、これはリガンド結合（ミクロタイターウェル上）、RNA放出及び増幅を含む全ての工程を一緒にした効率を示している。Affymaxは、低限として、既に収率２％、すなわち10倍高い値を記している（前述）。
更にHanes及びPluckthunは、最初に1:108の比で存在する混合物（２種類）からの特異的抗体の回収について実証している。これはサイクルを５回連続反復することを必要としており、すなわちひとつのサイクルのDNA産物を次の出発点として用いる。参照文献15の図4（A）において、選択されなかったポリソームのかなりの持ち越しがあり、おそらくこれは選択又はmRNAの回収を反映しているのであろう。結論として、濃縮度（enrichment factor）は比較的低く、１サイクルにつき約100倍である。
より新しいリボソームディスプレイ法が、Roberts及びSzostakによって記されていて（23）、これは新生タンパク質がピューロマイシン結合を介してそのmRNAへの共有結合を生じることを示している。このシステムにおいて選択は、リボソームの解離後に、タンパク質−mRNA融合体において行われる。従ってこれは、タンパク質−リボソーム−mRNA粒子の選択に関与していないので、ここに記された他の方法とは著しく異なる。その効率はわずかに20〜40倍である。
発明の簡単な説明
記載されたポリソームディスプレイの原核生物での方法は、mRNAの回収効率、感度及び選択を向上する方法の改善の範囲が依然かなりあることは明らかである。本願明細書において記した発明において、本発明者らは、新規のリボソームディスプレイの真核生物での方法を開発し、かつこれを抗体の選択及び突然変異（進化）並びに他のタンパク質のmRNAライブラリーからの選択へ適用できることを実証した。cDNAライブラリーからの遺伝子の単離にも同等に適用することができる。
本発明は、新生タンパク質又はペプチドを、in vitroにおける転写及び翻訳の後、真核生物のリボソーム及び該タンパク質又はペプチドをコードしているmRNAの複合体としてディスプレイする方法、更に特定の新生タンパク質又はペプチドを保持する複合体を、リガンド、抗原又は抗体との結合により選択する方法、引き続き逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により選択されたリボソーム複合体からタンパク質又はペプチドをコードしている遺伝情報を回収する方法を提供する。このRT-PCR回収工程は、mRNA放出前の先の解離を伴うことなく、完全なリボソーム複合体において直接実施され、従って最大の効率及び感度に寄与している。ディスプレイ、選択及び回収の工程は、連続サイクルにおいて反復することができる。この方法は、抗体−リボソーム−mRNA複合体（ARM）として１本鎖抗体構築物を使用することを例証している。この構築には、例えば1012以上の複合体のような非常に巨大なディスプレイライブラリー、及び親和性選択後の個々のタンパク質をコードしているDNAの効率的回収が適している。本発明者らは、例えば１回のサイクルで104〜105倍といった、非常に効果的な集積の証拠を提供し、かつライブラリーからの１本鎖抗体断片のディスプレイ及び選択、抗体の遺伝子操作、ヒト抗体の選択並びにmRNAライブラリーからのタンパク質の選択におけるその有用性を実証している実施例を提供する。
前述の方法の抗体断片への適用を図１に示した。この形では選択粒子は抗体−リボソーム−mRNA複合体からなるので、この方法は“ARMディスプレイ”とも称される。抗体は、前述の１本鎖断片VH/Kの形であるが、この方法は、scFVのようなあらゆる１本鎖型にも原則的に同等に適用可能である。この方法は、前述の多くの特定の形とは異なり、効率、感度及び濃縮（enrichment）に関して予想されたもの以上の改善がもたらされる。原則として、これはふたつの実験結果を基にしている：（i）１本鎖抗体は、ウサギの網状赤血球ライセートにおいてin vitroで機能的に産生されるということ（7）、及び（ii）終止コドンが存在しない場合、個々の新生タンパク質は、無細胞系において、安定した三成分（ternary）のポリペプチドリボソーム−mRNA複合体として、それらの対応するmRNAに結合しつづけるということ（8,9）である。本発明者らは、これらの知見を、真核生物ARM複合体のライブラリー作製の戦略に適用し、かつ抗原が結合した磁気粒子を用いて、特異的結合部位を有する複合体を効果的に選択した。選択は、同時に関連する遺伝子情報をmRNAとして捕らえるものである。
ここで使用した転写／翻訳組合せシステムは、効果的なDNA利用を提供するウサギの網状赤血球抽出物（プロメガ社）である。特にこれは、参考文献15に記されたような、材料及び時間の点で高コストであるmRNAの個別の単離を避ける。翻訳過程においてランダムな点で停止されるのではなく、全てのmRNAは3'末端へと読まれることは確実であるので、コードDNAからの終止コドンの欠失は、阻害剤の使用よりもリボソームの失速の手段としてより生産的である。終止コドン欠失の安定化作用は、終止コドンを認識し、かつ通常は新生ポリペプチド鎖の放出を引き起こすことにより翻訳が終了される放出因子の必要性によって説明することができる（26）。終止コドンが存在しない場合、新生鎖はリボソーム及びmRNAに結合し続ける。cDNA又はmRNAのライブラリーのように、終止コドンの欠失を操作することに問題が多い場合の代用法は、終止コドンを介して認識しかつ読みとり、これにより放出因子の作用を妨害するようなサプレッサーtRNA（アミノ酸に結合した）の使用であろう（24）。リボソーム失速の更なる戦略は、アミノ酸に結合していないサプレッサーtRNAの使用であろう。
現行法とは明らかな差異がある新規工程において、本発明者らは、cDNAをリボソーム−結合したmRNA上での１工程逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により作製しかつ増幅することができ、従って材料及び時間の点で高コストである方法によるmRNAの単離及びそれに続く回収を完全に避けることができることを示す。一般に翻訳時にいくつかのリボソームが同じmRNA分子に付着し、ポリソームを形成していると推定され、かつ１本鎖mRNA分子上の一列のいくつかのリボソームの存在の逆転写（このとき、逆転写酵素はmRNAの長さを読み取らなければならない）に対する作用はわかっていないので、この工程の成功および効率は驚くべきものである。従って、この酵素が、隣接リボソームを通って通過することができるか、もしくは、mRNAからのそれらの除去を引き起こすか、又は、単に１個のリボソームが付着したmRNA分子に対してのみ機能するかは不明である。いずれの説明であったとしても、この工程は、Mattheakisらの原核生物のシステムにおけるわずかに２％（14）及びHanes及びPluckthunの0.2％（15）と比較して、このシステムで示された最大60％の添加したmRNAが１回のサイクルで回収される（実施例６、図９）という効率に大きく貢献している。更に本発明者らは、真核生物システムにおける、前記リボソーム複合体からのmRNAの抽出が、非破壊の複合体上でのRT-PCRと比べ、回収法としての効率が1/5であること、及びEDTA抽出後であっても多くのmRNAがリボソームに結合しつづけていること（実施例８、図11）を示している。
ARMディスプレイライブラリーを用いる個々の抗体断片の濃縮も、原核生物ディスプレイについて説明されたものよりもより効果的である（15）。本発明者らは、望ましい特異性を持つ断片が105で一部分として存在する混合物を、１回のサイクル後に結合断片として得ることができ、有効濃縮度が104倍以上であること、及びこのサイクルが、非常に巨大なライブラリーからの希少（rarer）分子種の単離のために続いて実行することができることを示す実験を実施した（実施例10及び11）。これは、原核生物システムにおいて報告された結果（15）よりも、１回のサイクルにつき２〜３桁より大きい効率である。
ARMライブラリーは全体がin vitro法（PCR）により作製され、かつ細菌の形質転換を必要としないので、ライブラリーのサイズは、主に反応混合物に添加することができるリボソームの数（製造業者の情報によるとウサギ網状赤血球キットでは〜1014／ml）及び操作が簡便な１回の反応あたりのDNA量によって制限される。従って巨大なライブラリーの作製は、制限因子が細菌の形質転換であるファージディスプレイ法よりも簡単になっている。重要な用途は、変異体の巨大なライブラリーからのタンパク質の選択であり；このライブラリーは、PCR突然変異により、ランダム又は部位特異的な様式で作製することができ、かつ必要な特異性を有する変異体は抗原結合により選択される。本発明者らは、このようなライブラリーからの変更された特異性を伴う抗体（VH/K）断片を選択するためにARMディスプレイ法を使用することを示している。抗体遺伝子操作への用途は、実施例12に示しているが、ここで抗−プロゲステロン抗体の特異性は、突然変異及び選択の組合せにより、テストステロンに結合するように変更されている。このような方法は更に触媒的抗体産生に使用することができる。ARMサイクルそれ自身の操作もPCRのエラーによる低レベルランダム突然変異をもたらし、かつ本発明者らはこのようなエラー率が１サイクル当たり0.54％であることを示している（実施例９）。これは、親和性及び特異性が改善された特性の選択につながり、かつ突然変異及び選択の組合せによる新規タンパク質の開発を示す“タンパク質進化”と称されている（15）。真核生物のARMサイクルは、in vitroにおいて効果的にタンパク質進化を実行するのに適している。
本発明は更に、ハイブリドーマ法を用いずに、免疫処置したマウスから作製したライブラリーから抗体を得る新規方法を提供する。特に本発明者らは、この方法を、トランスジェニックマウス技術及びARMリボソームディスプレイの組合せを利用することによって、ヒト抗体の作製に使用することができることを示す。ヒト重鎖及び軽鎖抗体遺伝子をコードしているトランスジェニック座をゲノムに導入したマウスが利用可能であり、このようなマウスは、免疫化した場合にヒト抗体を産生する（20）。本発明者らは、本願明細書において、このようなマウスのリンパ球から調製したライブラリーのARMディスプレイによってヒト抗体をin vitroにおいて誘導した実施例を提供する（実施例13）。これは治療を目的としてヒト抗体を誘導する新規経路を提供する。
本願明細書に記載したリボソームディスプレイ法は、更にin vitroにおいて翻訳され、リボソーム及びそれをコードしているmRNAに結合し続けているようないずれかのタンパク質又はペプチドに利用可能である。本発明者らは、抗体へのARMディスプレイの利用可能性を示す実施例に加え、個体のポリペプチド鎖の選択のために正常組織から直接得たmRNAライブラリーの翻訳を通じたより一般的な適用も実証した（実施例14）。
従ってこの型のリボソームディスプレイは、タンパク質又はペプチドに関する簡便なin vitroディスプレイシステムの必要性に合致する。、遺伝情報の簡便かつ効率的選択及び回収と組合せて非常に巨大なライブラリーサイズが可能であり;更にこれまでに示された方法よりも、特定の条件が求められることが少なく、より良い感度であり、より高レベルの濃縮が可能である。効果的mRNAの回収と真核生物システムの組合せは、当該技術分野において実践された方法で予想されるものよりもはるかに優れた効率を持つシステムを提供する。
図面の説明
図１．ARM（抗体−リボソーム−mRNA）ディスプレイサイクル。これは１本鎖抗体断片（VH/K）鋳型の突然変異によるARMライブラリーの作製、抗原が結合した磁気ビースへの結合による特異的ARM複合体の選択、及びRT-PCRによる遺伝情報の回収を示している。
図２A．配列番号:1。ARM作製において使用したDB3 VH/K発現構築物の配列。プライマーの位置は、太字のイタリック体で示している。VH、VL、CKドメイン及びリンカーの開始点を示している。D1-D4は、４個の下流プライマーである。D1は、ARMディスプレイサイクルのための出発材料としての完全な長さのDB3 VH/KDNAを作製するために使用される。D2、D3及びD4は、全てT7プライマーに結合している、それぞれ第１、第２及び第３のサイクルにおいて使用される回収プライマーである（図３参照）。これらのプライマーは、全てのκ軽鎖のマウス抗体に適している。
図２B．配列番号：２．改変したARMディスプレイサイクルにおいて使用したプライマー。T7プロモーター及びタンパク質合成開始シグナルを含む新規上流T7プライマーは、収率の改善をもたらす。この図は更に、下線のXbaI切断部位を伴うEVOUプライマー配列を示す。ARMディスプレイの回収相において、上流（T7）プライマー並びにD2及びEVOUの両下流プライマーの組合せは、各サイクルにおけるほぼ完全な長さのcDNAの回収をもたらす（図４参照）。これらのプライマーは、全てのκ軽鎖のマウス抗体に適している。
図３．mRNAの3'末端がリボソームに隠れていること、その結果サイクル１及び２の回収工程について、回収には上流プライマーD2及びD3が必要であること（図2A）の証明。（A）は、完全な長さのDB3 VH/Kが転写され、かつプライマーD1（1）又はD2（2）のいずれかが回収に使用され、ゲルはD2のみが成功したことを示している。（B）では、サイクルAのPCR産物を第２のサイクルにおいてプライマーD2（2）及びD3（3）と共に使用している；ここでRT-PCRの回収は、プライマーD3についてのみ成功している。
図４．3-プライマー法を用いた５サイクルにわたる、同じサイズのVH/K DNAの回収。RTプライマー＝図2BのD2；PCRプライマー＝図2BのEVOU。
図５．ARMサイクルにおける抗体VH/K断片の特異的選択。
A.プロゲステロン−BSA−結合ビーズによるDB3R ARM複合体の特異的選択。トラック１、プロゲステロン−BSA−ビーズにより選択された翻訳されていないDB3R mRNAのRT-PCR；２、プロゲステロン−BSAビーズにより選択されたDB3R ARMのRT-PCR；３、プロゲステロン−BSAビーズにより選択されたDB3R ARMのPCR；４、テストステロン−BSAビーズにより選択されたDB3R ARMのRT-PCR；５、テストステロン−BSAビーズにより選択されたDB3R ARMのPCR；６、BSAビーズにより選択されたDB3R ARMのRT-PCR;７、BSAビーズにより選択されたDB3R ARMのPCR；８、1kbのDNAマーカー。
B．プロゲステロン−BSA−結合ビーズによるDB3H35 ARMライブラリーの非結合。トラック１、1kbのDNAマーカー；２、対照溶液のRT-PCR；３、プロゲステロン−BSAビーズにより選択されたDB3H35 ARMのRT-PCR；４、ラットの抗−κ結合ビーズにより選択されたDB3H35 ARMのRT-PCR.
C.DB3R及びDB3H35変異体を異なる比で含むARMライブラリーのDB3Rの選択。選択は、プロゲステロン−BSA結合ビーズで行った。トラック１、DB3R:DB3H35の比1:10；２、1:102；３、1:103；４、1:104；５、1:105；６、DB3H35変異体ライブラリー単独；７、1kbのDNAマーカー。
図６．ELISAにおける遊離ステロイドによる可溶性DB3 VH/K断片の特異的阻害（右側パネル）、ARMフォーマットにおけるDB3 VH/K断片の特異的阻害（中央パネル）。これらは、同じ特異性パターンを示している。中央パネルは、100ng/ml遊離ステロイドの結果を示している。これは、リボソームにおける抗体断片の正確な折りたたみを裏付けている。
図６A．ARMディスプレイにおける機能的抗体の産生に対する翻訳反応時に存在するDTT（ジチオスレイトール）濃度の効果。
DB3 VH/KをコードしているmRNAは、in vitro転写反応において生成され、フレキシ（flexi）ウサギ網状赤血球ライセートシステム（プロメガ社）に添加し、個別にDTTを添加した。トラック１、７、マーカー；トラック２、翻訳していないmRNA対照；トラック３、0mM DTT；トラック４、2mM DTT；トラック５、5mM DTT；トラック６、10mM DTT。結果は、0、2mM及び5mM DTTが全て良好なARM回収を生じたが、10mMのみが阻害したことを示した。
図７．ARMディスプレイに関するMg2+濃度の最適化。
図８．ARMディスプレイに関する時間の最適化。
図９．添加したmRNAの回収効率。各々RT-PCRにより、ARMサイクルから回収したcDNA（左側４トラック）を、mRNAから直接回収したcDNAと比較（右側トラック）。
図10．ARMディスプレイの投入感度、すなわち、１回のサイクルにいかに少ないDNAを使用し得るか。この実験においては、回収プライマー組合せは、T7及びD4とした（図2A）。（オリジナルの写真は、10pgでの、かすかであるが、明確に識別可能なバンドを示している。）
図11．リボソーム破壊を伴わないcDNA回収の（本発明の）方法と、リボソームの破壊を必要とする先行技術の方法との比較。「インタクト（intact）」と表示されたトラックは、本発明によるcDNAの回収、すなわち破壊を伴わない完全なリボソーム上でのもの；「破壊（disrupted）」は、RT-PCR前の、20mM EDTAによるリボソームの破壊とそれに続くmRNAの単離という先行技術の方法でのcDNAの回収;及び「残留（remaining）」は、先行技術の方法で破壊した後、リボソームに結合しつづけているmRNAからの本発明の方法を使用するcDNAの回収を示す。３種の回収反応の相対収率は、デンシトメトリーにより測定した。
図12．１サイクルあたりのエラー率。DB3 VH/K  ARM選択の１サイクルの間のエラー発生は、RT-PCR後に回収した産物をクローニングし、かつクローンの配列を本来のDB3の配列と比較することにより決定した。置換は、太字で強調した。
図13．変異体のライブラリーからの特異抗体断片の濃縮：クローニングにより分析。DB3H35（プロゲステロン非結合）VH/Kは遺伝子操作し、独自のHincII切断部位を除去し；ARMの選択後、HincIIで処理し、〜800bpの１本のバンドを形成した。対照的に、DB3Rの同様の消化は、〜500bp及び300bpの２個の断片を産生した。これは、示されたように、DB3Rを含むクローンを、HincII消化及びゲル分析によりDB3H35から区別することを可能にする。DB3R ARM複合体は、DB3H35非結合変異体との1:10から1:105の比の混合物から選択した。選択の１サイクル後に回収した得られたcDNAをクローニングし；DNAを、個々のクローンから調製し、かつHincII及びEcoRI消化後に分析した。各トラックにおいて、２本バンド500及び300bpはDB3Rを示し、〜800bpの１本バンドはDB3H35を示した。各比につき10クローンを選択後に分析した。結果は、１サイクルにおける〜104倍の濃縮度を示している（実施例10参照）。
図14．反復したARMディスプレイサイクルによるDB3R：DB3H35比1:106のライブラリーからのDB3Rの濃縮。選択には、プロゲステロン-BSA結合したビーズを用いた。トラック１は、1kb DNAマーカー；２、第１サイクル後のRT-PCR；３、第２サイクル後のRT-PCR；４、第３サイクル後のRT-PCRである。サイクル２及び３の間のバンドの短縮は、異なるプライマーの使用（各々、D3及びD4）に起因する。
図15．突然変異及びARM選択による抗体特異性の変化（1）。DB3の特異性は、H-CDR3ループの突然変異、その後のARM選択の１サイクルにより、プロゲステロン−結合性からテストステロン−結合性へと変化した。個々のクローンの特異性は、ARMディスプレイにより分析し、テストステロン−BSA結合したビーズにより選択した。上側パネル：選択前クローン：下側パネル：選択後クローン。
図16．突然変異及びARM選択による抗体特異性の変化（2）。阻害剤としての遊離プロゲステロン存在下におけるテストステロン−BSAビーズによる、DB3 H3の変異体の選択。トラック１：マーカー；トラック２、３：DB3Rのプロゲステロン−BSA（P）ビーズ又はテストステロン−BSA（T）ビーズへの結合;トラック４、５：DB3 H3変異体ライブラリーの遊離プロゲステロン存在下でのＰビーズ又はＴビーズへの結合；トラック６、７：トラック５のDNA産物を、更にARMディスプレイサイクルに投入し、かつＰ又はＴビーズ上で再度選択した。（オリジナルのゲル写真はトラック７で個別のバンドを示していることに注意）
図17．突然変異及びARM選択による抗体特異性の変化（3）。テストステロンビーズによる選択後の５個のクローンのステロイド結合を、ARMディスプレイ、並びにプロゲステロン−BSAビーズ（P）及びテストステロン−BSAビーズ（T）への結合により分析した。
図18．突然変異及びARM選択による抗体特異性の変化（4）。DB3 H3−変異体ライブラリーからのARMディスプレイによるテストステロン−特異性クローンの特徴。トラック１：マーカー;トラック２、３:クローンのプロゲステロン−BSA（P）ビーズ又はテストステロン−BSA（T）ビーズへの結合；トラック４、５：クローンの遊離プロゲステロン又は遊離テストステロン存在下でのＴビーズへの結合。突然変異したクローン（mut）のH3領域の配列を示した。
図19．ARMディスプレイによる免疫化したトランスジェニックマウスから単離されたヒトの抗−プロゲステロン抗体及び抗−テストステロン抗体の配列。
図20．リボソームディスプレイによるマウスの脾細胞由来の全mRNAライブラリーからの遺伝子の選択。
トラック１：マーカー
トラック２：マウス脾細胞由来の全mRNAのλ軽鎖のRT-PCR
トラック３：前記mRNAのin vitro翻訳及び抗−κ抗体被覆ビーズによるリボソーム複合体の選択後のλ軽鎖のRT-PCR
トラック４：マウス脾細胞由来の全mRNAのκ軽鎖のRT-PCR
トラック３：前記mRNAのin vitro翻訳及び抗−κ抗体被覆ビーズによるリボソーム複合体の選択後のκ軽鎖のRT-PCR
トラック６：マウスＢ細胞由来の全mRNAのIg重鎖のRT-PCR
トラック７：前記mRNA抽出物のin vitro翻訳及び抗−κ抗体被覆ビーズによるリボソーム複合体の選択後のIg重鎖のRT-PCR
ARMリボソームディスプレイサイクルの材料及び方法（図１）
１．ARM複合体を生成するために使用した１本鎖抗体構築物
本方法を調べるために使用した抗体結合部位は、本発明者らが先に記した形、すなわち重鎖可変領域（VH）が完全な軽鎖（K）に結合しているVH/Kと称される３種のドメインの１本鎖断片である（10）。本発明者らは、VH/K断片としての抗−プロゲステロン抗体（DB3）産生のためのDNA構築物及び細菌の発現システムを説明し（10）、かつ周縁細胞質及び細胞質発現の両方を示した（11）。DB3 VH/K断片は、優れた抗原−結合特性を有し、我々の手元にあるものは通常使用される１本鎖Fv（scFv）型のものよりも優れている。“メガプライマー”PCR法（12）を用い、DB3 VH/Kを含むDNAプラスミド上でのプロゲステロンの結合部位接触残基であるH100及びH35位（13）における変異体を作製した（未発表）。DB3Rは、トリプトファンH100がアルギニンに置換された変異体であり、プロゲステロンへの親和性を増すように修飾されている。大腸菌で発現されたDB3Rは、プロゲステロンに強力に結合した（Ka〜109M-1）が、テストステロンへの非常に低い親和性を有し、かつBSAを検出できなかった。対照的に、H35位の変異体ライブラリー（DBH35と称す）は、プロゲステロンに弱く結合するか、もしくは、全く結合しなかった。本発明者らは、DB3R及びDB3H35変異体を用いて、ARM選択の原理をテストした。
2．ARM複合体の製造方法
ARMｓ作製用のVH/K DNAを生成するために、PCRは、（ｉ）T7プロモーター、タンパク質開始配列及びマウス抗体の5'配列と相補的な縮退配列を含む上流のT7プライマーと、（ii）終止コドンを欠く下流プライマー（D1）とを一緒に適切なテンプレートを使用して行った。T7プライマー配列は、
［配列番号3］5'-gcgcgaatacgactcactatagagggacaaaccatgsaggtcmarcrcgagsagtcwgg-3'（ここで、s=c/g、m=a/c、r=a/g、及びw=a/t）、及び、D1プライマーは、
［配列番号4］5'-tgcactggatccaccacactcattcctgttgaagct-3'であって、クローニング目的のためのBamHI部位（下線部）を含んでいた。VH/K構築の調製は、1x PCR反応バッファー（Boehringer Mannheim UK、Lewes、East Sussex）、0.2mM dNTPs（Sigma）、0.3μMの各プライマー、0.05U/μlのTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）と、その混合物のトップに被覆された１又は２滴のヌクレアーゼ無しの鉱油を含有する溶液中で行った。以下のプログラムを用いた:94°で１分、54°で１分、72°で１分、そして72°で10分に次いで４°から成る30サイクル。
VH/K PCR構築（1ng−1μｇ）をQIAquick（QIAGEN）で精製し、又は精製せずに、0.02mMメチオニン及び30°で6時間インキュベートした混合物を含む、20μlのTNT T7クイック連結転写／翻訳系（Promega UK Ltd、Southampton、Hants SO 16 7NS、UK）に添加した。手順は、10μlに縮小してもできる。翻訳後、その混合物を同量の冷リン酸塩緩衝生理食塩水で希釈し、氷上で２分間冷却した（条件の最適化については、実施例4及び5の記述を参照せよ）。
3．プライマーの修飾
T7プロモーター及びタンパク質開始シグナルを含む上流のT7プライマーは、改良された収率で修飾することができる。その修飾された配列は、図2Bに示されるような
0004060892.tif 000002
である。
4．ARM複合体の抗原選択
マグネチックビーズ（Dynal、UK）を、ウシ血清アルブミン[SBA]、プロゲステロン-11α-BSA、テストステロン-3-BSA（Sigma-Aldrich Co.Ltd.、Poole、Dorset、UK）又は精製したラット抗−マウスκ抗体（Dr G.Butcherのギフト）に、製造業者の指示に従い、結合させた。2-3μlの抗原−又は抗−κが結合したマグネチックビーズを翻訳混合物に加えて、さらに60分間、4°に変換し、ゆるやかに振動させて沈殿しないようにした。そのビーズをマグネチック粒子濃縮器（Dyna1 MPC）で回収し、0.1%のSBA及び5mMのマグネシウムアセテートを含む50μlの冷たい無菌のリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4で３回洗浄し、もう一度PBSのみで洗浄した。可能なDNAの混入を避けるため、ビーズを37℃で25分、10単位の酵素を含む50μlのDNアーゼＩバッファー（40mM Tris-HCl、pH7.5、6mM MgCl2、10mM NaCl、10mM CaCl2）中、DNアーゼＩ（Promega又はBoehringer Mannheim）で処理し、1%ツイーン-20、5mMマグネシウムアセテートを含む50μlのPBSで３回洗浄し、10μlのジエチルピロカーボネート処理水で再縣濁した。
5．抗原選択されたARM複合体からの遺伝情報の回収及び増幅
抗原選択されたARMs、RT-PCRのmRNAからのcDNAの生成及び増幅は、上述のビーズの縣濁液2μlを、1μMの各プライマーを含有する23μlのRT-PCR混合物（Titan One-tube RT-PCR系、Boehringer Mannheim、又はAccess RT-PCR系、Promega UK Ltd）を加えて行った。プライマーは、上述の上流のT7プライマー及び、リボソーム結合mRNAの3'末端の少なくとも60ntの上流でハイブリダイズするように設計した、新しい下流プライマー、D2、配列5'-cgtgagggtgctgctcatg-3'とした（図2A）。このプライマーを使用すると、ARM複合体からmRNAを単離する必要がない（図1）。反応混合物に１又は２滴のヌクレアーゼ無しの鉱油で被覆し、サーマルサイクラーに入れた（Techne Progene）。単一段階RT-PCRのプログラムは：48°で45分を1サイクル、次いで94°で2分を１回、そして、94°で30秒、54°で１分、及び68°で2分から成る30-40サイクル；最後に68°で7分に次いで4°の1サイクルであった。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動法で解析し、ゲルから溶離して配列決定した。
6．ARM複合体作製及び選択のさらなるサイクル、及び経時的サイクルにおける効率的な回収のためのプライマーの組合せ
さらなるサイクルのため、上述のように生成されたPCR生成物をゲル精製し又は直接TNT転写／翻訳系に添加した。第２サイクルにおいて、RT-PCR下流プライマーD3、配列［配列番号11］5'-ggggtagaagttgttcaagaag-3'は、D2の上流にハイブリダイズするように設計した（図2A）；同様に第３サイクルにおいて、D3の上流にハイブリダイズするプライマーD4、［配列番号12］5'-ctggatggtgggaagatgg-3'を用いた（図2A）。回収されるDNAは、各サイクルでだんだん短くなるが、VH/Kの全長は、組換えPCRによっていずれのサイクルでも再生されうる。さらに、その短縮は、抗原結合領域ではなく、軽鎖の定常領域のみに影響する。
この手順において、各サイクルは、mRNAの3'末端がリボソームに覆われ、プライマーにアクセスできないという事実により、新しい下流プライマー（D2、D3、D4）を必要とした。このことは、リボソームからmRNAを単離する必要をなくすが、また、各サイクルで回収されるcDNAが短くなる原因となる。そこで、我々は、EVOUという新しいプライマーを設計することでこの問題を解決した。これは、D2を取り込み、下流を伸長し、大部分の3’cDNA配列を回収するもので、各サイクルで使用できる。
図2Bに示すように、EVOUプライマーの配列は:
0004060892.tif 000003
太字=XbaI部位
実験は、回収RT-PCRで、D2とEVOUの混合物を共に使用した場合にcDNAの回収が起こることを示している（実施例１，図4）。その結果の予想外の特徴は、該プライマー混合物を使用すると、２バンドが予期されたにもかかわらず、予期された全長のちょうど１バンドが生成することである。このことは、使用するPCR条件下でEVOUプライマーの効率によると考えられ、明白なかつ理想的な結果を導く。
従って、好ましい方法においては、プライマーは、上流のT7プライマー及びリボソーム結合mRNAの3'末端の少なくとも60nt上流でハイブリダイズすることを指定する下流プライマーD2、配列［配列番号14］5'-cgtgagggtgctgctcatg-3'及び図2Bに示されるようにD2を取り込んだプライマーEVOUである。
さらなるサイクルのため、上述のように生成されたPCR生成物をゲル精製し、又は直接TNT転写／翻訳系に添加した。D2とEVOUプライマーの組合せは、各連続サイクルでRT-PCRにおいて使用した。このようにして回収されたDNAは、各サイクルで同じ長さである（図4）。
7．ヒトVH/K抗体断片用のプライマー
上述の及び図2に示されるプライマーは、すべてのマウス免疫グロブリンからのVH/K断片に適用できる。ヒト抗体についての対応するプライマーは以下の通りである:
0004060892.tif 000004
（酵素部位は下線を付し；ヘキサヒスチジン タグはイタリックである）。
結果
実施例１：リボソーム複合体におけるRT-PCRによるDNAの回収及び２−又は３−プライマーの組合せ
ARM法において（図1）、リボソームは失速され、メッセージの3'末端に終止コドンがないめ、安定した複合体（新生のタンパク質−リボソーム−mRNA）を形成する。リボソームがmRNAの3'末端で失速するので、後者は3'プライマー及び/又は逆転写酵素にアクセスできないはずで、cDNAの回収で上流プライマーの使用を必要とする。これは、図３の実験によって確認される。3'終止コドンを欠く全長DB3 DNAが転写され、mRNAがin vitroで翻訳されかつプロゲステロン-BSAビーズで選択される場合は、上流プライマー（D2、図2A）がcDNAを完全に回収するのに対して、cDNAの回収は、mRNAの3'末端がRT-PCRの開始に利用できないことを示した。同様に、第２サイクルにおいて、D2はもはや有効でなく、さらに上流のプライマーが必要となった（D3、図2A）。このように、ARM複合体中のmRNAの3'末端に結合したリボソームのコンセプトは妥当のようである。この実験は、リボソーム−mRNA複合体についてのRT-PCRによるcDNAの回収を例証する。
明らかに、この方法でARMサイクルを繰り返し使用すると、回収されたcDNAを短小化し、最終的には組換えPCR反応で全長を回収する必要が生じる。しかし、変更された方法では、D2プライマーとEVOUプライマーとを組み合わせて使用することで（図2B）あらゆるサイクルにおいて全長に修復する。図4は、５サイクルの間のVH/Kの完全長の回収を示す。ARMサイクルは上述のように行われ、プライマーD2（RTプライマーとして標識された）及びEVOU（PCRプライマー）の組合せを回収に使用した。そして、その回収された生成物DNAを同様にさらに４回の連続サイクルで増幅し、その生成物をそれぞれの場合に解析した。示す通り、各サイクルで約１kbのVH/Kの完全長が回収され、該DNAを配列決定して確認した。
これらのプライマーを組合せて使用すると、他のもので記述されているような、ポリソームの解離によるmRNAの単離を必要とせずに、cDNAを有効に回収できる。それは、DNAのような遺伝情報の迅速かつ有効な回収方法である（実施例８も参照）。
実施例２：抗原特異性ARMの選択
抗原特異性ARMの選択のため、DB3RVH/Kをin vitroで翻訳し、ARMsをプロゲステロン−11α-BSA、テストステロン-3-SBA又はSBAのみのいずれかと結合したマグネチックビーズにさらした。RT-PCRの後、単一のDNA断片が、プロゲステロン-11α-BSAが結合したマグネチックビーズからのみ検出され（図5A、トラック2,4,6）、DB3RVH/Kについての公知の特異性と一致していた。さらに、回収された断片を配列決定でDB3Rとして確認した。RT-PCRではなくPCRのみを、選択の後プロゲステロン-11α-BSAビーズについて行った場合（図5A、トラック3,5,7）、又はその方法を翻訳されていないDB3RmRNAで行った場合（図5A、トラック1）は全くバンドが得られなかった。このように、RT-PCRで回収されたバンドは、DB3Rの機能性抗体結合部位によって選択されたmRNAに由来するのであり、DNA組換え又はmRNAキャリーオーバーに由来するのではない。
実施例３：固定化抗原に結合したARMの遊離抗原による阻害は、リボソームにおけるVH/Kの正確な折りたたみを示す。
遊離ステロイドによる阻害は、ARM複合体の正確な折りたたみ及び機能活性を示すのに使用できる（図6）。種々のステロイドインヒビターを用いたARMとして表されるDB3 VH/Kの阻害は、未変性のDB3及び組換えVH/Kの阻害とを区別できない。さらに、プロゲステロン-11α-HMSによる１ng（2.5nM）での50％の阻害は、DB3の阻害に非常に近い親和性を示す（図示せず）。
遊離ステロイドインヒビターをDB3 ARM混合物に添加してプロゲステロン被覆ビーズへの結合を遮断した。それらは、プロゲステロン-11α-ヘミコハク酸塩（HMS）（P11）、プロゲステロン-3-カルボキシメチルオキシム（P3）；プロゲステロン-6-HMS（P6）及びプロゲステロン-21-HMS（P21）である。ELISA反応における遊離のDB3 VH/Kの阻害は右側に示したが、P11>P3>P6>P21の順にステロイドが有効であった。全く同様の反応及び濃度が、ARMとしてリボソーム上に生じた新生のDB3 VH/Kに見られる（中央のパネルは回収RT-PCR反応の代表的な結果を示す）。
このすばらしい特異性の実証により、新生の抗体VH/K断片がARM複合体に正確に折りたたまれることが確認される。同様に、ウサギ網状赤血球系におけるシャペロンの添加を必要としないが、これは、原核生物系でも望ましい（15）。真核生物のリボソームはそれ自体、新生のポリペプチド鎖の折りたたみに有力な役割を果たす（25）。
実施例3A：ARMディスプレイのための最適なＤＴＴ濃度
単鎖の抗体は、転写／翻訳反応混合物中に存在する2mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下で正確に折りたためないと論じられてきたが、図6Aに示されるように、そうではないようである。ARMサイクルは、DTTが0-10mMの種々の濃度の存在下、in vitroの個々の転写によって生成されたDB3 VH/K mRNAを翻訳することによって行い；該翻訳反応は、フレキシウサギ網状赤血球ライセート系（Promega）で行い、この系ではDTTの添加がゆるされる。図6Aの結果は、0.2mM及び5mMのDTTはすべてARMで優れた回収率を示し（トラック3-5）、一方、10mMでのみ阻害があった（トラック6）。従って、2mM DTTは折りたたみ及び回収に有害ではない。このように、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDIは、原核生物のE．coli S30系（15）における抗体領域の折りたたみに重要であるといわれているが、ウサギ網状赤血球ライセート系における真核リボソームディスプレイには必要ない。
実施例4：マグネシウム濃度の最適化（図7）
種々の濃度のマグネシウムアセテートをTNT転写／翻訳反応系に加え、ARMサイクル後のDNAの回収を比較した。最適の収率は、0.5mM Mgアセテートで達成された。
実施例5：時間経過の最適化（図8）
ARMサイクルにおいて、連結された転写／翻訳を種々の時間で行い、反応の最適な時間経過を決定した。最適時間は60分のインキュベーションであることが示され、それ以後は回収率に改良が見られなかった。
実施例6：投入mRNAの回収効率（図9）
単一のARMサイクルのにおけるmRNAの回収効率を調べるため、DBS VH/Kをin vitro転写で個々に調製した。翻訳段階後に回収されたcDNA、プロゲステロンビーズにおけるARM複合体の選択及び該複合体についてのRT-PCRを、未処置の投入mRNAから直接回収されたものと比較した。左側の4トラックは、ARMサイクルから回収後に得られたcDNAのタイトレーションを示し、右側の4トラックは、投入mRNAから得られたタイトレーションを示す。デンシトメトリーにより、可能なcDNAの約60％が、ARM選択後実際に回収されることがわかった。この結果を得るためには、60％のmRNAが完全に機能的な抗原結合タンパク質に翻訳されなければならない。この回収率は、Mattheakisら（14）による報告の2％及びHanes及びPluchthun（15）による0.2％と比較すべきであり、本方法は効率を非常に高めることがわかった。
実施例7：投入DNAについてのARMサイクルの感度（図10）
系の効率の本質的なパラメータは、投入DNAに対する感度、すなわち、どのような小さいDNAがサイクル毎に使用できるかである。この実験は、投入DNAをタイトレーションし、10pg程度の投入でもバンドが回収できることを示す。通常使用する試験量は、1-10ngである（トラック2及び3）。滴定による原核生物の感度は報告されていないが、Mattheakis法（14）で用いる量は440ngであり、Hans及びPluckthun（15）による場合は10μgmである。後者で採用される付加的な段階、すなわち、翻訳前のかつ再び逆転写前のmRNAの回収は、DNAを非常に必要とするものと思われる。これは、大きいライブラリを探す方法の使用において重要な要素である。例えば、1μgmのDNA投入、10pgmの感度によって、単一サイクルで105倍の増加が可能であり、我々が見いだしたことである（実施例10参照）。より低いDNA感度では、原核生物系での場合に見られるように、かなり多くのDNAを導入しなければならないか、さらに選択及び回収サイクルが遂行される。
実施例8：リボソームを破壊せずにcDNAを回収する本方法（本発明に係る）と、リボソームの破壊を必要とする先行技術の方法との比較（図11）
ディスプレイサイクルの終わりにおけるcDNAの回収、すなわちインタクトの複合体におけるRT-PCRについての我々の方法が、Kawasaki（16）、Mattheakis（14）及びHanesとPluchthun（15）の先行技術よりも有効であることの程度を決定するために、我々は、リボソーム複合体の破壊及びRT-PCR前のRNAの回収による彼らの方法を繰り返した。Hanes及びPluckthun（15）による記載に従った破壊方法：溶離バッファー、50mM Tris／アセテートpH7.5、150mM NaCl、20mM EDTA；100μlをビーズに添加し、4°で10分間インキュベートし；遊離されたRNAをエタノール沈殿により回収した（標準手順）。
ゲル中（図11）、インタクトと表示したトラックは、１サイクル後の回収を示す；破壊と表示したトラックは、破壊方法による回収である；また残存と表示がされたトラックは、破壊後のリボソーム上に残されたものである。相対的な収率を濃度測定により比較し、リボソームに連結されたmRNAで果たされた回収は、真核生物系で適用した場合、リボソーム破壊より5倍効率的であること、及び破壊法によるとかなりの割合でmRNAがリボソームに結合して残り、効率が下がることがわかった。このように、リボソーム複合体におけるRT-PCRによるcDNAの回収は、先行技術を超えた本発明の効果を高めることに非常に貢献している。
実施例9：サイクル毎の精度（図12）
本発明の重要な観点は、in vitroでタンパク質を徐々に修飾する能力であり、リガンドに基づく選択に従うサイクルに含まれるいくつかのポリメラーゼ反応によるランダム点変異、すなわちタンパク質の進化の導入を利用している。同時に、非常に高率の変異は、タンパク質構造又は結合部位特異性を損傷させることによって系を無機能にする。そこで、我々は、DB3がプロゲステロン-BSAビーズによって選択されるARMサイクルの生成物をクローニングすることによってサイクル毎に導入されるエラーを調べた。図12の結果は、0.54％のエラー率を示しており、構造を維持するには低いが、有効な変異を着実に導入して、抗体結合部位の親和性のような改良タンパク質の能力を進化させるのには十分高い。
実施例10：単サイクルにおけるARMディスプレイライブラリからの個々の抗体結合部位の選択（図5及び13）。
リボソームディスプレイの他の重要な用途は、変異体のライブラリから抗体、又は他のタンパク質を選択することである。そのような選択を調べ、真核生物のリボソームディスプレイによる可能な濃縮を決定するため、DB3Rを、プロゲステロンを弱く結合する或いは全く結合しないランダムDB3H35変異体（変異体中、H35コドンAACはC/GT/A/G Aに変異されていた）と混合した。DB3H35変異体ライブラリのみをARM複合体としてディスプレイした場合は、DNAバンドは、プロゲステロン-11α-BSAビーズによる選択後に回収されなかった（図5B、トラック3；図5C、トラック6）；DB3H35の翻訳は、ラットの抗-κ抗体で被覆されたビーズによって得られるバンドで示された（図5B、トラック4）。1:10〜1:105の範囲の比率でDB3R及びDB3H35変異体を含むDNA混合物をARMsとしてディスプレイした場合は、VH/Kサイズのバンドは、１サイクル後すべての場合回収された（図5C、トラック1-5）。選択されたDNAをコドンの検出に基づき配列し、選択前はDB3Rが1:103-1:105のライブラリで検出されないにもかかわらず、1:103の比率のライブラリから選択される支配的な分子で、1:104〜1:105の比率のライブラリからのPCR生成物の主要な成分であることがわかった。このように、ARM選択の単一サイクルで104-105倍の範囲での濃縮が達成できる。
混合PCR生成物の配列決定は、濃縮についての正確な情報を与えるには、特に選択される種：選択されない（バックグラウンド）種の比率を定義するには十分に感度が高くないので、さらにDB3RとDB3H35変異体を区別する方法を導入した。特有のHincII酵素部位をDB3H35からは除去し、DB3Rには残した。従って、HincIIの消化は、〜800bpから〜500bp及び300bpの２断片へDB3R用VH/Kの大きさを減少させたが、DB3H35変異体は切断されず、〜800bpの断片として泳動された。上述と同じ割合の混合物からの選択後、RT-PCR生成物をローン化し、個々のクローンから回収されたDNAがEcoRI及びHincIIによる消化によってマップされ、これにより回収されたDB3RおよびDB3H35クローンの比率の定量化ができる。図13に示されるように、1:104ライブラリから選択されたクローンの70％及び1:105ライブラリからの40％がDB3Rであった。これにより、〜104倍という濃縮度が計算され、PCR混合物の直接的な配列決定からの前記のデータ（上述）と一致する。サイクルで多量のDNAを使用することでより多く濃縮化することさえできる。これらの濃縮化値は、100-倍（15）又は40-倍（23）という原核生物系について報告された値よりかなり高い。
実施例11：２又は３サイクルにおけるARMディスプレイライブラリからの個々の抗体結合部位の選択（図14）
1:106のDB3R:DB3H35ライブラリは、１サイクル後では検出可能なRT-PCRバンドを生成せず、さらに２サイクルのARM生成及び選択により、それぞれの繰り返しにおいて強度が増したVH/Kバンドの回収が導かれる。再び配列決定してDB3Rの選択を確認した。
実施例12：突然変異誘発及び変異体ライブラリからのARM選択による抗体特異性の変更（抗体工学）（図15-18）
プロゲステロンに対するDB3R抗体の親和性は、テストステロンに対する親和性の〜7,000倍大きい。我々は、ARMディスプレイによるH3ループ（重鎖のCDR3）の結合変異原性によるこの特異性を逆転させることを試みた。終止コドンのない3×107のメンバーからなるH3変異体ライブラリをDB3Rの残基98、99、101、102及び103のランダム変異誘発によって生成した。このライブラリからの個々のクローンを、ARM選択の前に、所望のARMフォーマットのin vitro発現によって解析した。図15で、ゲル（前選択クローン）の上部は、テストステロン-3-BSA結合ビーズに結合した後、cDNAがほとんど或いは全く回収されなかったことを示す。そして、変異体ライブラリをARM複合体としてディスプレイし、テストステロン-3-BSAビーズに結合することによって１サイクルで選択した。その回収されたcDNAをクローン化した；ここで、個々のクローンは、ほとんど、良い結合性を反映する強い回収によるテストステロン-BSAへの明白な結合性を示した（ゲルのより低い部分）。これは、ARMディスプレイ法が新しい抗原結合特性を有する変異体の選択的な濃縮化に効果的であり、ARM系が抗体クローンの結合活性の迅速な解析に使用できることを示している。
そして、そのライブラリをプロゲステロン-BSA及びテストステロン-BSAビーズに対して選択した。後者については、プロゲステロン-11α-ヘミコハク酸塩が存在してすべてのプロゲステロン結合を遮断した；それ故に、その効果はそのようなバインダーがライブラリに存在する場合はテストステロンに完全に特異的に転換させるはずである。図16では、中央の２つのトラックがこの結果を示し、ライブラリがテストステロンに特異的に結合できる変異体を含むことを図示している。遊離のプロゲステロンの存在下、テストステロン-BSAビーズへの結合後に回収されたcDNAは、プロゲステロン及びテストステロンビーズに対して再利用され、テストステロンに対する特異性を示した（トラック6、7）。この結果は、特異性は１のリガンドがに対する結合を他のものに対する結合へ切り替えることができることを意味している。（トラック7のバンドがオリジナルの写真では、はっきり視認できることに留意せよ）。
図16のトラック6で回収されたcDNAの特異性を確認するために、その特異性をクローニングによっても調べた。図17は、in vitroでARMとして発現し、プロゲステロン-BSA及びテストステロンへの結合性を調べた個々のクローンの解析を示す。５個のクローンの解析から、3個がテストステロンに優先的に結合し、単独のプロゲステロン-結合（DB3R）からテストステロン優先的結合への特異性の変換を示した（クローン1-3）。
遊離のプロゲステロンの存在下でのテストステロンに対する変異誘発及び選択により得られるクローンの１つをARMディスプレイ及びDNA配列決定によって解析した。図18では、変異体テストステロン結合クローンは、プロゲステロン-11-BSAとの交差反応なしに、テストステロン-3-BSA（T）に結合したビーズに特異的に結合し、それは遊離のプロゲステロン（P）によってではなく、遊離のテストステロン-3-BSA（T）によって阻害されうることがわかる。
これらの結果は、大きいライブラリから選択するARMライブラリディスプレイの能力を用いて、変異原性との組み合わせで抗体工学を遂行でき、特に変異及び選択の段階を通して抗体特異性の変換を起こすことができることを示している。
実施例13：遺伝子組換えマウスから遊離されたライブラリからのヒトの抗体の選択（図19）
大きい利益のある分野は、人間のin vivo診断又は診療に使用できるヒトの抗体を単離することにディスプレイ法を使用することである。このようなライブラリのソースは、天然の免疫性の又は活性的に免疫化された個体からのヒトのリンパ球でありうる。しかし、ヒトの抗原に反応するためには、その多くは重要な診療であるが、ヒトのリンパ球は非寛容化環境で発達しなければならない。これは、遺伝子組換えマウスによって達成でき、胚操作によってゲノム中のヒトの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を得ることができる；これらマウス内在性のマウス抗体の能力は，ノックアウト欠失（20）の導入によって排出されてきた。このようなマウスは、ヒト抗体の産生によってヒト抗原による免疫化に応答する（20）。我々は、5個のVH遺伝子、完全なD-J領域及びCμとCδ遺伝子を含むヒト重鎖導入遺伝子座を、8個のVL遺伝子、完全なJ領域及びCκ遺伝子を保有する軽鎖導入遺伝子座と共に保有するマウスを免疫化した。マウスは、プロゲステロン-11α-HMS-BSAで免疫化し、8週間後に脾臓細胞を除去した。VH/K DNAライブラリを、発現されたVHをRT-PCR増幅により、次いで組換えPCRを用いて標準のVH/Kリンカー配列によるランダム連結によって調製した；終止コドンを軽鎖の3'末端から欠失させた。該ライブラリは、in vitroでARM複合体として発現させ、プロゲステロン-BSA又はテストステロン-BSA連結マグネチックビーズを用いて選択した。回収されたcDNAをクローン化して配列した（図19）。その配列は、ヒトVH及びVL遺伝子を同定し、重鎖のCDR3領域との比較を可能にした。２個のヒトVH/VL組合せ（VH4/Vkl-12及びVH1-2/Vk4-01）の反復的選択があるが、H3配列ではかなり多様性がある。しかし、抗ステロイド抗体の結晶解析から同定されたVH CDR2におけるステロイド接触残基（W50、第１CDR2残基）の１つは、広く存在し、関連の芳香族もよく残基100の周囲に存在する。
実施例14：真核リボソームディスプレイによるmRNAライブラリからの遺伝子の選択、図20
ここまでに述べた実施例は、すべて抗体断片の発現及び選択に関連するが、リボソームディスプレイは、結合部位又はエピトープのような選択的な機能性を保持するいかなるタンパク質にもリボソーム上に初期の形態で結合されている場合は、適用できるはずである。従って、リボソームディスプレイフォーマットにおいてcDNA又はmRNAライブラリから遺伝子を単離すること、例えば、抗体−又はリガンド−連結粒子を有する複合体の選択は可能であろう。
この実施例は、リボソームディスプレイの用途を示し（1）哺乳類の細胞から得られるmRNA抽出により開始する発現タンパク質をコードする遺伝子を選択すること（2）選択物質としてビーズに結合した抗体を用いたリボソーム複合体としての特異的なmRNAを選択すること、及び（3）リボソーム結合mRNAについて行われるRT-PCRによる関連遺伝子を回収することである。ライブラリのため、mRNAは、Pharamacia mRNA精製キットで抽出し、Promega TNT転写／翻訳系を用いてin vitroで直接発現させた。終止コドンを除去するために何も試みなかったが、代わりに反応を１時間後に氷上で冷却して停止した。その翻訳混交物をマグネチックビーズに連結したモノクローナルラット抗-κ抗体にさらした。結合されたmRNAをcDNAに変換してκ鎖用の、及び負の対照としてλ軽鎖とIgC重鎖用の特異的プライマーを用いて、RT-PCRで増幅した。その結果を図20に示す。トラック2、4及び6のcDNAバンドをmRNAライブラリから得、ヒトのλとκ軽鎖及び重鎖がそれぞれ存在することがわかった。リボソームディスプレイフォーマットでのmRNAの発現及び抗-κ被覆ビーズによる選択後、強いκ軽鎖のバンドがRT-PCR後に回収し、λ軽鎖（トラック3）のバンドはなく、重鎖の弱いバンド（トラック7）が見られ、このようにκ鎖のcDNAの特異的選択及び回収を示している。我々の知る限り、これは初めての天然の（すなわち、通常の組織由来）ライブラリからのリボソームディスプレイによるタンパク質の選択を示す実験である。
結論
上述したディスプレイ法の多大な効果は、多くの因子、真核生物の発現系の使用、共役した転写及び翻訳、終止コドンの除去によるリボソームの失速及びリボソーム複合体について行うRT-PCRによる効率的な回収、に起因する。従って、Hanes及びPluchthunの記述におけるように種々の段階（転写後、選択後）でのmRNAの単離に、何ら時間も材料も消費しない。新規の段階は、回収の１段階であり、リボソームの解離より優れていることを実証した。また、それは系で取り扱うmRNAの量がかなり少ないという事実により、ずっと経済的でもあり、大きいライブラリからレアな分子種を選択する場合には非常に重要なことである。我々は、非常に少量の導入DNAを回収でき、大きいライブラリに実用できることを示した。
0004060892.tif 000005
0004060892.tif 000006
【図１】
0004060892.tif 000007
【図２Ａ】
0004060892.tif 000008
【図２Ｂ】
0004060892.tif 000009
【図３】
0004060892.tif 000010
【図４】
0004060892.tif 000011
【図５】
0004060892.tif 000012
【図６】
0004060892.tif 000013
【図６Ａ】
0004060892.tif 000014
【図７】
0004060892.tif 000015
【図８】
0004060892.tif 000016
【図９】
0004060892.tif 000017
【図１０】
0004060892.tif 000018
【図１１】
0004060892.tif 000019
【図１２】
0004060892.tif 000020
【図１３】
0004060892.tif 000021
【図１４】
0004060892.tif 000022
【図１５】
0004060892.tif 000023
【図１６】
0004060892.tif 000024
【図１７】
0004060892.tif 000025
【図１８】
0004060892.tif 000026
【図１９】
0004060892.tif 000027
0004060892.tif 000028
【図２０】
0004060892.tif 000029