(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアドレナリンβ３受容体遺伝子導入によりヒトアドレナリンβ３受容体発現能及び脱共役蛋白質発現能を付与された、脂肪細胞へ分化または変換しうる３Ｔ３−Ｌ１細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脱共役蛋白質の発現能を有する培養細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アドレナリン受容体は、大きくα、βのタイプに分類されており、後者のアドレナリンβ受容体は更にβ１、β２、β３といったサブタイプに細分化されている。またこれらを構成するアミノ酸配列には動物種による差も明らかとなっている。アドレナリン受容体は、中枢神経系や自律神経系、及び心臓、肝臓、腎臓などの臓器に分布し、精神活動、血圧調節、消化管運動、脂質や糖の代謝などに対して重要な働きを担っており、特に脂肪組織におけるアドレナリンβ受容体を刺激することにより、白色脂肪細胞における脂肪分解が促進し、同時に褐色脂肪細胞等に存在する脱共役蛋白質（以下、ＵＣＰと略す）が活性化し、熱産生が生じることが報告されている。このアドレナリンβ受容体を刺激、あるいはＵＣＰを活性化することは、体内エネルギー代謝の促進につながることから、ＵＣＰの活性化物質、及びＵＣＰの発現促進物質は肥満の予防や治療の面で有益なものとなる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＵＣＰに関する研究は、ＵＣＰを多く発現する細胞として実験動物生体から単離された細胞やこれを初代培養した細胞を用いていたため、いずれの場合も発現するＵＣＰの量も一定でなく、その結果その研究結果も一定でないという問題があった。
従って、本発明の目的はＵＣＰの発現能を有する培養細胞を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、鋭意検討を行った結果、線維芽細胞などの脂肪細胞に分化または変換しうる培養細胞を宿主とし、これにヒトアドレナリンβ受容体遺伝子を導入し、ヒトアドレナリンβ受容体を発現させることにより、驚くべきことにＵＣＰの発現能を有する培養細胞が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、遺伝子導入によりヒトアドレナリンβ受容体発現能及び脱共役蛋白質発現能を付与された、脂肪細胞へ分化または変換しうる３Ｔ３−Ｌ１、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３、ＢＡＬＢ ３Ｔ３、ＮＩＨ ３Ｔ３及び３Ｔ３ Ｆ４４２Ａから選ばれるマウス胎児由来の前駆脂肪細胞もしくは線維芽細胞、またはｏｂ１７７１細胞を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の培養細胞は、脂肪細胞へ分化または変換しうる培養細胞を宿主とし、これにヒトアドレナリンβ受容体遺伝子を導入することにより得られる。ここで、脂肪細胞に分化または変換しうる細胞としては、脂肪細胞に分化または変換する能力を有し、継代培養できる細胞であれば特に制限されないが、マウス胎児由来の前駆脂肪細胞あるいは線維芽細胞の細胞株として確立されている３Ｔ３−Ｌ１、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３、ＢＡＬＢ ３Ｔ３、ＮＩＨ ３Ｔ３、３Ｔ３ Ｆ４４２Ａ、ｏｂ１７７１や筋細胞、結合組織由来の細胞等が挙げられる。これ以外に、悪性化した細胞、ハイブリドーマ等も挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】
本発明における遺伝子導入の方法としては、ヒトアドレナリンβ受容体遺伝子を宿主細胞に導入し、発現させる方法であれば特に限定されないが、通常、ヒトアドレナリンβ受容体をクローニングし、発現ベクターを介して宿主細胞にトランスフェクションする。ヒトアドレナリンβ受容体のクローニングは種々の方法を採用できる。例えば、ヒト由来の組織や培養細胞から構築した鋳型ＤＮＡ（以下、ｃＤＮＡと略す）のライブラリー、もしくは市販ライブラリーから、常法により合成したプローブを用いてアドレナリン受容体ｃＤＮＡをクローニングする。上記アドレナリン受容体は、アドレナリン受容体としての機能に影響がない範囲であれば、少数のヌクレオチドの付加または欠失を含む変異型であってもよい。また、近年発見された局在突然変異（Walston J.ら, N. Engl. J. Med. 333:343-347, 1995）の他、ノックインなどの人為的変異を含んでもよい。
【０００８】
アドレナリン受容体ｃＤＮＡは、種々の発現ベクターに挿入し、ベクターを利用して宿主細胞に導入する。遺伝子導入の方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション（電気穿孔）による方法、マイクロインジェクション法、アデノウィルスを用いた方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターは特に限定しないが、宿主細胞内で自立的に増殖できるプラスミドまたはファージから構築されたものが用いられ、前駆脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞への遺伝子導入に適した発現ベクターとしてはＢＣＭＧＳｎｅｏ、ｐＳＧ５、ｐＬＥＮＧＴ、ｐＲＳＶｎｅｏが挙げられる。
【０００９】
かくして得られた培養細胞は、ヒトアドレナリンβ受容体を発現し、かつＵＣＰ発現能を有し、継代培養できるものである。得られた培養細胞にＵＣＰを発現させるには、種々のホルモンまたは薬物の存在下に培養すればよい。ここで用いられるホルモンまたは薬物としては、アドレナリン、ノルアドレナリン、その他のアドレナリン受容体アゴニストが挙げられる。また、これらのホルモンまたは薬物の存在下の培養は、１〜６０日間、好ましくは２〜２０日間、連続的に培地にこれらのホルモンまたは薬物を添加して行うことが好ましい。
【００１０】
本発明の培養細胞は、脂肪細胞へ分化または変換する能力を有し、脂肪細胞への分化または変換は、例えば種々のホルモン処理、薬物処理を施せばよく、脂肪細胞に分化または変換した細胞においてもＵＣＰを発現させることができる。ここで当該分化または変換処理のためのホルモンまたは薬物としては、インスリン、成長ホルモン、ステロイドホルモン、ホスホジエステラーゼ抑制剤、プロスタグランジン及びこれらの誘導体等が挙げられる。また、分化または変換処理は、これらのホルモンや薬物の存在下に細胞を培養すればよい。培養条件は、温度３７℃にて５％ＣＯ2 の加湿エアー中で、ウシ胎児等の血清を添加した組織培養用培地、例えばＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍを用いるのが好ましい。
【００１１】
【発明の効果】
本発明の培養細胞は、ヒトアドレナリンβ受容体を発現し、更にＵＣＰをも発現する機能を有する培養細胞であるため、ヒトアドレナリンβ受容体及びＵＣＰに関連した細胞内情報伝達やエネルギー代謝の解析、及びこれらを制御する薬物の探索に応用でき、有用な評価モデルとなる。
【００１２】
【実施例】
下記の実施例は本発明を例示するものであるが、本発明は該実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
培養前駆脂肪細胞におけるヒトアドレナリンβ受容体の遺伝子導入
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ヒト神経芽細胞腫由来細胞）から、ヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡをクローニングし、図１に示す塩基配列を確認した。図中の下線は翻訳領域、四角は開始コドン及び停止コドンを示し、開始コドンからの番号を右に記した。この配列は、公表されている塩基配列と一致するものである（Granneman, J. G.ら, Mol. Pharmacol., 42:964-970, 1992）。クローニングしたヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）を介して発現ベクターＢＣＭＧＳｎｅｏに挿入し、図２に示す発現ベクター（BCMGSneo-human β3AR 16.OKb）を構築した。図中のｈｕｍａｎβ３ＡＲはヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡ、Ｘｈｏ Ｉ及びＮｏｔ Ｉは各制限酵素による切断位置、ｐｏｌｙ（Ａ）はポリ（Ａ）付加シグナル、ｈｕｍａｎβ−ｇｌｏｂｉｎはヒトβグロビンＤＮＡの一部、ＢＰＶ６９％はウシパピローマウィルスベクターＤＮＡの６９％領域、ＣＭＶｐはサイトメガロウィルスプロモーター、Ｎｅｏ及びＡｍｐはそれぞれネオマイシン及びアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【００１４】
上記の発現ベクターをリポフェクション法により３Ｔ３−Ｌ１細胞に移入し、コロニークローニングすることで、ヒトアドレナリンβ３受容体を遺伝子導入した３Ｔ３−Ｌ１細胞を得た（以下、３Ｔ３−ｈβ３と略す）。この細胞は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号FERM P-15728）。
【００１５】
実施例２
培養前駆脂肪細胞におけるヒトアドレナリンβ受容体の遺伝子導入
実施例１に記述したヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）を介して発現ベクターｐＳＧ５に挿入し、図３に示す発現ベクター（pSG5-human β3AR 5.6Kb）を得た。図中のｈｕｍａｎβ３ＡＲはヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡ、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩは各制限酵素による切断位置、ｐｏｌｙ（Ａ）はポリ（Ａ）付加シグナル、ＳＶ４０ｐはｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ＤＮＡの初期プロモーター、ｒａｂｂｉｔ β−ｇｌｏｂｉｎはウサギβグロビンＤＮＡの一部、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を示す。これをリポフェクション法により３Ｔ３−Ｌ１細胞に移入し、コロニークローニングすることで、ヒトアドレナリンβ３受容体を遺伝子導入した３Ｔ３−Ｌ１細胞を得た。
【００１６】
実施例３
培養前駆脂肪細胞におけるヒトアドレナリンβ３受容体の発現
実施例１記載の培養細胞３Ｔ３−ｈβ３を充分に増殖させ、ヒトアドレナリンβ３受容体の発現をノザンブロット解析及び免疫組織化学的に検定した。陽性対照としてＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞、比較例としてヒトアドレナリンβ３受容体ＤＮＡを含まない発現ベクターを移入した３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた。
【００１７】
ノザンブロット解析に用いたプローブを図４に、検定結果の１例を図５に示した。図４で、四角は開始コドンを示し、開始コドンからの番号を左に記した。検定結果より、比較例ではヒトアドレナリンβ３受容体ｍＲＮＡの発現が認められず、３Ｔ３−ｈβ３ではこの発現が明確に認められる。
【００１８】
免疫組織化学的検定にて用いた抗体の認識部位を図６の●で示した。ヒトアドレナリンβ３受容体のアミノ酸配列を○及び●で示し、その内、●で示すＮ末端２０残基を含んだ多抗原性ポリペプチドを合成し、これをウサギに免疫することで、抗ヒトアドレナリンβ３受容体ポリクローナル抗体を作製して検定に用いた。得られた検定結果の１例を図７に示す。３Ｔ３−ｈβ３では比較例より陽性染色が強く認められ、アドレナリンβ３受容体蛋白質の発現が大きいことがわかる。
【００１９】
実施例４
培養前駆脂肪細胞におけるｃＡＭＰ蓄積
実施例１記載の培養細胞３Ｔ３−ｈβ３を充分に増殖させ、インスリン、デキサメサゾン、１−メチル−３−イソブチルキサンチン等を用いて脂肪細胞様に分化誘導した後、イソプロテレノール１０μＭを含む緩衝液で１５分間培養後、薬物反応の指標として細胞内ｃＡＭＰを抽出、定量した。検定結果１例を図８に示した。図中、縦軸はｃＡＭＰ濃度、値は平均値±ＳＥ（ｎ＝４）を示す。イソプロテレノール添加により３Ｔ３−ｈβ３のｃＡＭＰ濃度上昇がみられ、明確な薬物反応が認められた。
【００２０】
実施例５
培養前駆脂肪細胞におけるＵＣＰの発現
実施例１に記載の培養細胞３Ｔ３−ｈβ３を、ノルアドレナリンを１０μＭ含む培地にて１４日間培養後、ＵＣＰの発現をin situ hybridization で検定した。同様に３Ｔ３−ｈβ３を、イソプロテレノールを１０μＭ含む培地にて１４日間培養後、ＵＣＰの発現を免疫組織化学的に検定した。
【００２１】
in situ hybridization には、ＵＣＰ ｃＤＮＡの開始コドンより５８９−６０８の（5'-GTGAAGGTCAGAATGGAAGC-3'）及び同７８５−７６６の（5'-AGGGCCCCCTTCATGAGGTC-3'）をそれぞれセンスプライマー、及びアンチセンスプライマーとしてＰＣＲ法にて増幅したプローブ（１９６残基）を用いた。その検定結果１例を図９に示す。３Ｔ３−ｈβ３の細胞像に陽性染色がみられ、ＵＣＰｍＲＮＡの発現が検出された。尚、実施例３に記述した比較例においてはＵＣＰｍＲＮＡの発現は認められなかった。
【００２２】
免疫組織化学的検定においては、ラット褐色脂肪組織より精製したＵＣＰをウサギに免疫することで、抗ＵＣＰポリクローナル抗体を作製して用いた。得られた検定結果の１例を図１０に示す。３Ｔ３−ｈβ３では細胞像に陽性染色がみられ、ＵＣＰ蛋白質が検出された。尚、同上比較例では、ＵＣＰの発現は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１でクローニングしたヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図２】ヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡをＢＣＭＧＳｎｅｏに挿入した発現ベクターＢＣＭＧＳｎｅｏ−ｈｕｍａｎβ３ＡＲを示す図である。
【図３】ヒトアドレナリンβ３受容体ｃＤＮＡをｐＳＧ５に挿入した発現ベクターｐＳＧ５−ｈｕｍａｎβ３ＡＲを示す図である。
【図４】実施例３でノザンブロットに用いたプローブを示す図である。
【図５】実施例３のノザンブロットの結果を示す図である。
【図６】ヒトアドレナリンβ３受容体及び抗体認識部位を模式的に示した図である。
【図７】実施例３の３Ｔ３−ｈβ３細胞と比較例における免疫組織化学的検定の結果を示す光顕写真である。
【図８】実施例３の３Ｔ３−ｈβ３細胞のイソプロテレノール刺激によるｃＡＭＰ蓄積効果を示す図である。
【図９】実施例５の３Ｔ３−ｈβ３細胞のＵＣＰ発現検定のためのin situ hybridization の結果を示す電気泳動像である。
【図１０】実施例５の３Ｔ３−ｈβ３細胞のＵＣＰ発現の免疫組織化学的検定の結果を示す光顕写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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