(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法であって、以下の工程を含むことにより、ＩｇＡ濃度が０．００３ｍｇ／ｍｌ以下となるようにすることを特徴とする方法：
ａ：ヒト血漿をエタノールで分画することによりγグロブリンＧの沈殿を得る；
ｂ：得られたγグロブリンＧの沈殿を糖−アルコールを含む水溶液に懸濁させる；
ｃ：４．８〜５．５のｐＨでＰＥＧ処理を行うことにより上記懸濁液中の汚染物質の含有量を減少させる；
ｄ：上記汚染物質を減少させた懸濁液をカラム中の陰イオン交換樹脂に通して流出液を得る；
ｅ：上記流出液の限外濾過を行ってＰＥＧの含有量を低減した濾液を得る；
ｆ：上記濾液のウイルス不活性化処理を下記（ｉ）および（ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも一つの方法によって順次に行う：
（ｉ）低温殺菌処理する
（ｉｉ）溶媒／界面活性剤で処理する
ｇ：ひとたびｐＨを７．０と９．０の間に調整して、ＰＥＧによる沈殿および上記ウイルス不活性化処理を施した処理液に対して洗浄処理を行う；
ｈ：上記沈殿および洗浄処理で得られたウイルス不活性化γグロブリンＧを可溶化し、液のｐＨを変化させることにより、タンパク質汚染物質の除去を行う；
ｉ：上記タンパク質汚染物質を除去したγグロブリンＧを限外濾過することにより、体積およびＰＥＧ含有量を減少させる。
【請求項２】
上記工程ｅに続いて、酸性ｐHで流出液を処理する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに最終工程として、
ｋ：ウイルスの濾過とそれに続く濃縮を行うことにより、所望のタンパク質価を得ることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
エタノールを用いた分別によって単離する前記画分がコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩであることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項５】
前記糖−アルコールが２％と１０％の間の濃度（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項６】
２．５％〜５．５％の濃度（ｗ／ｗ）および４．８〜５．５のｐＨで、ＰＥＧを用いた沈殿を行うことを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項７】
樹脂カラムに注入する溶液のｐＨを５．７と６．３の間に調整することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項８】
前記陰イオン交換カラムがＤＥＡＥ−アガロース樹脂を含み、樹脂１ｍｌ当たり１ｇと２．５ｇの間のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからなる装入物を収容することを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項９】
ｐＨ４．０〜４．８および膜間圧力１．２バール（１２０ｋＰａ）未満の条件下で、糖−アルコールを２％〜１０％の濃度（ｗ／ｖ）含む溶液の３倍以上の体積に対してダイアフィルトレーションした１００ｋＤａの見かけの分子断片の膜を介して、前記カラムの流出液を限外濾過することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１０】
３５℃〜３８℃で１〜４時間３．９５〜４．０５のｐＨで、２％〜１０％の濃度（ｗ／ｖ）の糖−アルコールの存在下において、酸性ｐＨにおける前記任意の処理を行うことを特徴とする、請求項２から９のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１１】
２５％〜３５％の濃度（ｗ／ｗ）の糖−アルコールの存在下における低温殺菌処理後、溶媒／洗浄剤を用いる前記化学的不活性化処理を行う前に、注入用の水を用いた希釈を行い、糖−アルコール濃度を２５％（ｗ／ｗ）未満、タンパク質濃度を１％と３％（ｗ／ｖ）の間にすることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１２】
溶媒／洗浄剤を用いてウイルス不活性化した前記溶液を注入用の水を用いて、溶液１ｋｇ当たりについて１ｋｇと２ｋｇの間の量を加えて、希釈し、ひとたびｐＨを７．０と９．０の間に調整し、１２％と１７％の間の最終濃度（ｗ／ｗ）までＰＥＧを添加することによって沈殿を行うことを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１３】
溶媒／洗浄剤を用いてウイルス不活性化した前記溶液を注入用の水を用いて、溶液１ｋｇ当たりについて１ｋｇと２ｋｇの間の量を加えて、希釈し、ひとたびｐＨを７．８と８．４の間に調整し、１２％と１７％の間の最終濃度（ｗ／ｗ）までＰＥＧを添加することによって沈殿を行うことを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１４】
ＰＥＧを用いた前記沈殿の懸濁液を、最初の値の４分の１〜８分の１倍程度に体積を減少させることによって、孔サイズが０．１ミクロン〜０．４５ミクロンの接面流動型濾過膜上で分離することを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１５】
前記接面流動型濾過膜によって保持されるＰＥＧを用いた前記沈殿物を、前記沈殿条件と等しいかまたは類似の組成物特性を有する溶液を４倍以上の体積加えることによって、同一器具中で洗浄することを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１６】
ｐＨが５．５未満であり糖−アルコールを含み、１ｍＭ〜１０ｍＭに調整した濃度の酢酸によって形成される酸性溶液を加え、それに５％〜２０％の濃度（ｗ／ｗ）の糖−アルコールをアルカリを用いてｐＨ４．０〜４．５に調整して、加えることによって、同一の接面流動型濾過器具中でＰＥＧで洗浄した前記沈殿物の懸濁液を可溶化することを特徴とする、請求項１から１５のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγ グロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１７】
ＰＥＧで洗浄した前記沈殿物の懸濁液に加える酸性可溶化溶液の量が、前記懸濁液の量の２．５倍〜４．５倍であり、ＰＥＧの最終濃度（ｗ／ｗ）が２％〜４％であり、糖−アルコールの濃度（ｗ／ｗ）が５％〜２０％であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１８】
ＰＥＧで洗浄した前記沈殿物の懸濁液に加える酸性可溶化溶液の量が、前記懸濁液の量の２．５倍〜４．５倍であり、ＰＥＧの最終濃度（ｗ／ｗ）が２．８％〜３．４％であり、糖−アルコールの濃度（ｗ／ｗ）が５％〜２０％であることを特徴とする、請求項１から１７のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項１９】
アルカリを加えることによって前記可溶化生成物をｐＨ７．５〜８．５に調整し、不溶性の高分子量凝集体を沈殿させ濾過によって分離することを特徴とする、請求項１から１８のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２０】
高分子量凝集体が実質的にない前記濾過液をダイアフィルトレーションし、１００ｋＤａの見かけの分子断片の限外濾過膜を介して濃縮し、糖−アルコールを２％〜１０％の濃度（ｗ／ｖ）含む溶液の５倍以上の体積に関して、膜間圧力１．２バール（１２０ｋＰａ）未満および１％〜３％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度で、ひとたびｐＨを４．０〜４．８に調整することを特徴とする、請求項１から１９のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２１】
前記糖−アルコールがソルビトールである請求項１から２０のいずれかに記載のウイルス不活性化γグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２２】
ダイアフィルトレーションし１％〜３％（ｗ／ｖ）のタンパク質に濃縮し、ｐＨを４．４と５．０の間に調整した溶液を、２５±５℃に加熱し、次いでみ  かけの孔サイズが５０ｎｍ未満でありタンパク質の回収率が９０％を超え面積１ｍ２当たり濾過生産性がタンパク質１ｋｇを超える膜を介してナノ濾過によって任意のウイルス分離を行うことを特徴とする、請求項１から２１のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２３】
ダイアフィルトレーションし１％〜３％（ｗ／ｖ）のタンパク質に濃縮し、ｐＨを４．４と５．０の間に調整した溶液を、２５±５℃に加熱し、次いでみかけの孔サイズが約２０ｎｍでありタンパク質の回収率が９０％を超え面積１ｍ２当たり濾過生産性がタンパク質１ｋｇを超える膜を介してナノ濾過によって任意のウイルス分離を行うことを特徴とする、請求項１から２２のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２４】
ダイアフィルトレーションし１％〜３％（ｗ／ｖ）のタンパク質に濃縮し、ｐＨを４．４と５．０の間に調整した溶液を、２５±５℃に加熱し、次いでみかけの孔サイズが１５〜２０ｎｍでタンパク質の回収率が８０％を超える膜を介してナノ濾過によって任意のウイルス分離を行うことを特徴とする、請求項１から２３のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２５】
１００ｋＤａの見かけの分子断片または孔サイズがより小さい膜を介して、ダイアフィルトレーションおよび任意にウイルス濾過した溶液を限外濾過によって５％〜１０％（ｗ／ｖ）に濃縮し、ｐＨを５〜６に調整し清澄化および滅菌濾過した後、その最終容器中に９９％、超えるモノマー二量体分子形を含み、目に見える粒子が存在せず濁度が５ＮＴＵ未満であり、検出可能な量のＩｇＡ（０．００３ｍｇ／ｍｌ未満）およびＩｇＭ（０．００２ｍｇ／ｍｌ未満）が存在せず、ＰＥＧが５００ｐｐｍであり、非イオン洗浄剤が５０ｐｐｍであり有機溶媒が検出不可能であり（３．６ｐｐｍ未満）、抗補体活性がタンパク質１ｍｇ当たり１  ＣＨ５０未満であり、Ｆｃフラグメントを有する全長分子構造が１００％を超え、ＩｇＧ分布サブクラスが生理学的範囲であることを特徴とする、請求項１から２４のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２６】
１００ｋＤａの見かけの分子断片または孔サイズがより小さい膜を介して、ダイアフィルトレーションおよび任意にウイルス濾過した溶液を限外濾過によって５％〜１０％（ｗ／ｖ）に濃縮し、ｐＨを５〜６に調整し清澄化および滅菌濾過した後、その最終容器中に９９．９％を超えるモノマー二量体分子形を含み、目に見える粒子が 存在せず濁度が５ＮＴＵ未満であり、検出可能な量のＩｇＡ（０．００３ｍｇ／ｍｌ未満）およびＩｇＭ（０．００２ｍｇ／ｍｌ未満）が存在せず、ＰＥＧが５００ｐｐｍであり、非イオン洗浄剤が５０ｐｐｍであり有機溶媒が検出不可能であり（３．６ｐｐｍ未満）、抗補体活性がタンパク質１ｍｇ当たり１  ＣＨ５０未満であり、Ｆｃフラグメントを有 する全長分子構造が１００％を超え、ＩｇＧ分布サブクラスが生理学的範囲であることを特徴とする、請求項１から２５のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【請求項２７】
パッケージした最終生成物を２５℃で１５日間の最小限の検疫に通し、前記溶液が透明であり目に見える粒子が明らかに存在しないことが証明されており、２℃〜８℃および２５℃までの両方の保存温度で安定性があることを証明することを特徴とする、請求項１から２６のいずれかに記載のウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法に関する。本発明のγグロブリン（ヒト免疫グロブリンＧすなわちＩｇＧ）を得るための出発原料は、抗体活性のある多価混合物を形成するヒト血漿のドナー（１０００を超える）のプールに由来し、その個々の単位は感染性（ＨＩＶ、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス）の典型的なマーカーに対して試験されている。
【０００２】
【従来の技術】
γグロブリンの投与は筋肉内経路、または静脈内経路によってより効果的に実施することができる。この第２の経路には第１の経路と比較して、効率が良いことなどの大きな治療上の利点があるが、重大な副作用を引き起こす可能性がある。変性を助長せず純度が適度である条件において得られる生成物のみが、静脈内経路用に許容される。
【０００３】
本発明の生成物の好ましく最も効果的な臨床用途は静脈内経路であり、その治療的徴候は、組成物および分子構造の性質が同等であるこのタイプの生成物（ＩｇＧ）に関して認められる徴候である。ＩｇＧの最も一般的な治療的徴候は、以下の３つの一般的な病状のグループに限られる。すなわち、原発性免疫不全（体液性の応答の欠如）、続発性（すなわち、たとえばウイルス感染の結果としての後天性）免疫不全、自己免疫原の病状（自己抗体の発生）である。
【０００４】
第１のグループに関して、本発明のＩｇＧは一般的なさまざまな免疫不全、ＩｇＧのサブクラス群の欠如、ＩｇＡの欠如などに有用である可能性がある。第２のグループに属する最も一般的な病状は、ウイルスおよび細菌（ＨＩＶまたはヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペス、帯状疱疹、Ｂ型肝炎ウイルスなど）、新生種などによる感染の結果として生み出される病状であろう。自己免疫成分を有する病状において同定されるＩｇＧの徴候は常に増加しており、この中で顕著なのは血小板の破壊の原因となる、川崎病などの特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）である。
【０００５】
γグロブリンの調製および注入に関する以前の例に関しては、これらは４０年代末期の物質にさかのぼり、これらの物質はＣｏｈｎ（Ｃｏｈｎ  Ｅ．Ｊ．、Ｓｔｒｏｎｇ  Ｌ．Ｅ．他）の知られている血漿分別の方法（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ。Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８、４５９−４７５；１９４６）によって生成され、その後Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ（Ｋｉｓｔｌｅｒ  Ｐ．およびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ  Ｈｓ．のＬａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．７：４１４−４２４；１９６２）によって改質された。Ｃｏｈｎの血漿分別から得られる中間体物質から出発するＯｎｃｌｅｙ（Ｏｎｃｌｅｙ  Ｊ．Ｌ．他のＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１、５４１−５５０；１９４９）によって導入された他の精製によって、知られているＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法が生み出された。これらの方法はいずれも冷液中でエタノールを濃縮媒体として使用するので、Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法はγグロブリンの一般的な精製方法として依然として効力がある。任意の初期の方法によって生成されるγグロブリンは、カラム中における高分解能ゲル濾過（ＨＰＬＣ）によって分析すると、分子量が大きい重合しまたは凝集した形の含有部分が非常に多い分子分布を示す。同様に、このようにして得られる液体状態によって、安定性、保存中に観察される乳光性または濁度、γグロブリン分子の破砕および重合、いくつかのより不安定な抗体の活性が低下する傾向、抗補体活性の特発的な発生などが与えられる可能性はほとんどない。
【０００６】
静脈内注入によるγグロブリン分子の治療的な使用に関する問題点は、Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法によって得られる第１の調製物（その多くの変異体を含めて）にさかのぼり、これによって特に静脈内注入を受けたγグロブリン患者において、非常に高い発生率で（症例の９０％まで）拒絶反応（アナフィラキシー）が引き起こされた。記載した反応は、この経路によって治療された患者の補体の減少と関係があった（Ｂａｒａｎｄｕｎ、Ｓ．他のＶｏｘ  Ｓａｎｇ．１９６２；７：１５７−１７４）。
【０００７】
γグロブリンを得るための方法中に生成されたタンパク質の変性の結果として、アルコール分別によって得られたγグロブリン、特に分子量の大きな形態を生み出し、補体を自由に固定する能力を有する抗体−抗原複合体として任意選択で作用するであろうγグロブリンの凝集体は、補体を自然に固定するための顕著な能力を有していることが観察された。
【０００８】
従来的な技法によるγグロブリンの凝集体の分離によって、超遠心分離または排除クロマトグラフィ（ゲル中での透過）のいずれでも、静脈内経路によって許容される抗補体活性の低い生成物を得ることが可能である（Ｂａｒａｎｄｕｎ他、前述）。しかしながら、超遠心分離またはゲル中での透過の技法を、γグロブリン数キログラム程度のバッチサイズの産業的な生成のためにスケールアップさせることはできない（超遠心分離の場合はグラムのスケールまでスケールアップさせることができない）。
【０００９】
一方、分子量の大きな凝集した化合物がひとたびなくなるアルコール分別によるγグロブリンの生成によって、プロセスの最終操作中（殺菌、凍結乾燥）またはその保存中（液体の形での）に、その抗補体活性を容易に取り戻すことが可能である。
【００１０】
Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法（エタノールによる沈殿）によって得られる古典的な調製物（またはその変異体）の重大な欠点を回避するために、現在技術では、静脈内に注入するための生成物の安定性および耐性を改善する更なるステップを代用しているか、または取り込んでいる。
【００１１】
Ｐｏｌｓｏｎ他（Ｐｏｌｓｏｎ、Ａ．他のＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、８２：４６３−４７５；１９６４）は、エチレングリコールポリマーによってヒト血漿を分別するための方法を記載しており、その方法の全体を通じてγグロブリンの精製した画分を分離することが可能である。Ｃｏｖａｌ、Ｌ．（米国特許第４０９３６０６号および第４１６５３７０号、それぞれ１９７６年および１９７８年の優先権を主張）は、Ｃｏｈｎ分別（画分ＩＩまたはＩＩ＋ＩＩＩ）から分離した物質から出発して静脈内γグロブリンを得るために、精製剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を取り入れている。その後、ポリエチレングリコールを用いる同等の精製方法が公開されており、Ｕｅｍｕｒａ  Ｙ．他によって開示された方法（１９８１年に出願された、スペイン特許第５０６６７９号）、またはこれもＵｅｍｕｒａ  Ｙ．他によって発表された同様の方法であるが、唯一の違いは、ポリエチレングリコールを用いる精製の前または後にγグロブリンを含む物質について任意に低温殺菌を行うことである同様の方法（欧州特許第０２４６５７９号、１９８６年の優先権を主張）などがある。有機溶媒および洗浄剤を用いるウイルス不活性化の化学的方法もこれと関係があり、脂質コーティングを有するウイルスに対して非常に効率的であり、Ｎｅｕｒａｔｈ他（米国特許第５１４３７５号）によって、ヒト血漿から誘導されるタンパク質に適用されている。
【００１２】
ペプシン（スペイン特許第８６１１５０１６号およびフランス特許２３８２Ｍ）、プラスミン（ドイツ特許第２７５２６９４号）、固定型トリプシン（スペイン特許Ｐ０５３０５９２）などの酵素による処理を使用して、または適度な酸性ｐＨにおける処理（Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、２２：４９０−４９６；１９６８）（Ｂａｒａｎｄｕｎ  Ｓ．他、前述）によって、静脈内投与に許容可能なγグロブリンを得るための方法が記載されている。
静脈内投与に許容可能なγグロブリンを得るために記載されている他の方法は、ＩｇＧ分子を化学的および部分的に改質し、これらの分子を還元剤で処理すること（Ｗｉｅｄｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１１３：６０９−６１３；１９６３）、アルコール化（スペイン特許第４１２５５２号）、アルキル化（スペイン特許第０５３３９０８号）、およびスルホン化（Ｙａｍａｎａｋａ  Ｔ．他のＶｏｘ  Ｓａｎｇ．、３７：１４−２０；１９７９）に基礎を置いている。
【００１３】
イオン交換クロマトグラフィに基づいて、γグロブリンを得るために使用される出発原料から望ましくない汚染物質を除去する方法が記載されている（米国特許第３８６９４３６号、スペイン特許第５１８１８１号、ＥＰ９１３００７９０、およびＷＯ９４／２９３３４）。Ｓａｒｎｏ  Ｍ．Ｅ．他（欧州特許第０４４０４８３号）は、弱酸性ｐＨでのイオン交換クロマトグラフィおよびダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）に基づく、生成物の静脈内の調製を助長するために有用な技術を組み合わせたものを開示している。
【００１４】
調製物の最終的な調合は、生成物の適切な安定化のために特に重要である。凍結乾燥した調製物は、生成物がその保存中にわずかな変化しか示さない場合に現況技術によって当初許容されたものである。血清アルブミンの存在下で炭水化物、ポリオール、グリコールまたはその誘導体、アミノ酸を使用して、主に凍結乾燥操作（スペイン特許第５２５２４６号）中のγグロブリンの変性に対する保護性を与える、静脈内投与に許容可能な凍結乾燥した生成物の組成物が発表された。
【００１５】
さらに最近、イオン強度が非常に低くｐＨが４．２５である水性媒質中において（米国特許第４３９６６０８号）、または弱酸性ｐＨ５〜６において（欧州特許第０２７８４２２号）、炭水化物を使用する安定した液体調合物が開示されている。
【００１６】
したがって、現況技術によれば、今日まで市場に出ている静脈内γグロブリンは以下にあげる３つのグループのうちの１つに属し、これらは基本的にその調製方法によって区別される。
【００１７】
第１の族、すなわち酵素（ペプシン、トリプシン、プラスミンなど）を用いる方法によって得られるもの。
第２の族、すなわち化学的に改質されたもの（還元、スルホン化、アルキル化、β−プロピオラクトンによる処理など）。
第３の族、すなわちＩｇＧの無傷の分子に対応するもの（低ｐＨにおけるダイアフィトレーション、クロマトグラフィ、ポリエチレングリコールを用いる沈殿、酸性ｐＨおよび低イオン強度における調合）。
【００１８】
現在の調製物を静脈内に投与することによって重大なアレルギー反応が引き起こされるわけではないが、調製物にはそれぞれある種の治療上の欠点、不便さまたは禁忌がある。したがって酵素によって処理した生成物は、正常なγグロブリンＧ（２０〜２５日）よりも体外での平均半減期が短く（約８日）、オプソニン作用能がなく（Ｆｃフラグメントが存在しない）、断片化（ｆｒａｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を示したりサブクラス群ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の量が非常に限られたりする可能性がある。
【００１９】
化学的な改質によって得られるγグロブリンは、体外での平均半減期（１０〜１５日）が生理学的な半減期未満であり、オプソニン能または容量および分子の無欠性を維持しているが、処理方法に応じてその溶菌容量が減少し、新しい抗原決定基を形成する可能性がある（β−プロピオラクトンによる処理によって）。
【００２０】
ごく最近、ＩｇＧ分子の変性を避ける方法によって、無傷でもとのままのγグロブリンが得られている。開発された生産方法はエタノールを用いる分別法と結びつけることができる場合もあり、したがって、たとえばＣｏｈｎ、Ｃｏｈｎ−ＯｎｃｌｅｙまたはＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法によって分離された、γグロブリンが豊富な画分の１つを、出発原料と考えることが可能である。
【００２１】
今日までに開示された方法によれば、無傷のＩｇＧを調製するためには、酸性ｐＨで適度に処理すること、酸性ｐＨでダイアフィルトレーションすること、低イオン強度およびｐＨ４．２５でＩｇＧ分子を安定化することが、頼みとなる重要な手段である。このような方法では、凝集した形のＩｇＧ（高分子量ポリマーおよび二量体までの中間体オリゴマーおよび二量体を含む中間体オリゴマー）のレベルを低下させることは任意的であり、モノマーＩｇＧの割合は増大する。ｐＨ４．２５における最終的な液体調合物は、保存中にＩｇＧ分子が再凝集するのを阻害し、抗補体活性のレベルが充分に低い溶液中で安定状態が保たれる（ただし２℃〜８℃の保存温度においてのみ）。
【００２２】
もっぱら酸性化処理によって得られる液体調製物が抱える主な問題点は、ｐＨの低下によって誘導される抗補体活性を阻害する効果が可逆的であることであり、媒質のｐＨ条件を生理的値またはそれに近い値に再び設定すると前記活性は再び取り戻される。一方、このような酸性ｐＨ値（ｐＨ４．２５）において調合された多量のγグロブリン調製物を、静脈内に注入することの無害性は充分に疑わしい（特に新生児および腎臓障害のある患者において）。
【００２３】
他の精製方法では、陽イオンおよび／または陰イオンイオン交換樹脂が使用され、ＣｏｈｎまたはＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙによるエタノール分別の中間体の調製物（画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは好ましくはＩＩ）から生じる溶液に、または血漿プールに直接イオン交換樹脂が加えられ、エタノールによる分別を回避する。このようにして精製されるγグロブリンは、初期酸性化方法のγグロブリン（中間体または調合中の）、またはγグロブリンの液体調合物に関する他の同等な方法のγグロブリンと結合させることができ、それ以外の場合は凍結乾燥させた形でその安定性を保つべきである。
【００２４】
従来技術によって使用されるイオン交換体は、強陰イオンタイプ（第四級アンモニア−エチル：ＱＡＥ）および弱陰イオンタイプ（ジエチルアミノエチル：ＤＥＡＥ）のリガンド、または強陽イオン（スルホプロピル：ＳＰ）および弱陽イオン（カルボキシメチル：ＣＭ）のリガンドからなる。リガンドは不溶性担体またはマトリックス上に共有結合的に固定され、その組成はシリカ（セラミックス）、アクリル（ポリアクリルアミド、ポリスチレン）、炭水化物（セルロース、デキストラン、アガロース）であってもよい。とりわけ、デキストラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａのＳｅｐｈａｄｅｘ）またはアガロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａのＳｅｐｈａｒｏｓｅ）によって形成されるものが、最も効率的で最も使用されている。しかしながら、これらは従来技術によって依然として改善されていないいくつかの欠点を有しており、そして、場合に応じて、汚染タンパク質を効果的に分離するのに多量の樹脂が必要であり、γグロブリンＧの回収とサブクラス群（本質的にＩｇＧ４）の適正な分布に対する影響に関連する。精製（汚染タンパク質の除去：ＩｇＡ、ＩｇＭおよび他のもの）とＩｇＧ（ＩｇＧ４）の回収の間で生み出される妥協的な状況は、場合に応じて一方の側または他方の側に都合の良いように解決される。したがって、市場に出ているγグロブリンの効能および治療的品質はそれぞれ大きく異なる可能性があるからである。
【００２５】
ＰＥＧを用いる血漿の分別によって、または中間体Ｃｏｈｎ画分または画分ＩＩ＋ＩＩＩなどの均等物から出発するＰＥＧを用いた沈殿によって、静脈内に投与することができる凍結乾燥したγグロブリンを得ることが可能であるが、液体状態では安定性が不十分であることが証明される可能性がある。中間の低温殺菌処理が含まれる場合（ＰＥＧを用いて沈殿させる前に）には、主に不安定なタンパク質が存在するために、安定剤（たとえばソルビトールなど）が存在する場合も含めて、かなり多くの分子の凝集が生じる。後の段階において高度凝集体を完全に除去しなければならないので、これによって生成物の回収率が大幅に低下することになる。より精製された画分（画分ＩＩ、または均等物）から出発する場合には、出発原料中に存在するかまたは低温殺菌によって生じる高分子量凝集体は、現在開示されている技法によって設定される条件下でＰＥＧを用いて沈殿させることによっては、本質的に分離することはできない。これらの条件は、ｐＨ４〜６でＰＥＧの濃度が４〜５％（Ｃｏｖａｌ  Ｌ．、前述）、ｐＨ４．８〜６．５でＰＥＧの濃度が４〜１０％（Ｕｅｍｕｒａ  Ｙ．他、前述）であり、γグロブリンが、高分子量凝集体と共に沈殿する能力を有する他の付随タンパク質の存在下（たとえば画分ＩＩ＋ＩＩＩの存在下）に存在するときのみこれらは有効であろう。
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ウイルス不活性化ヒトγグロブリンＧを生成するための方法を提供することである。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
γグロブリンを炭水化物の存在下でエタノールを用いた分別によって単離した画分から抽出し、ＰＥＧを用いて汚染物質の含有量を減少させた後、γグロブリンをカラム中の陰イオン交換樹脂に適用し、続いて限外濾過によってＰＥＧ含有量を減少させ、酸性ｐＨにおける任意の処理と低温殺菌処理および溶媒／洗浄剤を用いる処理からなるその後のウイルス不活性化ステップの少なくとも１つとを順次に行うために濃縮した流出液を得て、その後ＰＥＧを用いて生成物を沈殿させ洗浄してあらゆる化学的ウイルス不活性化試薬を除去し、次いで可溶化しｐＨおよびタンパク質の汚染物質を変化させることによって、最終的に限外濾過によって精製して体積およびＰＥＧ含有量を減少させ、次いで任意のウイルス濾過を行い、濃度をタンパク質値５％または１０％にする。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は本技術分野の現況を実質的に大幅に改善する。なぜなら本発明について詳細に述べられた的確な条件下で行われる方法ステップの革新的な組み合わせによって、最も感度の良い分析技法を使用することにより、分子の無欠性またはＩｇＧサブクラス群の分布および回収を害さずに、補体を自然に固定するための小さな能力または容量を維持しながら、検出可能なタンパク質汚染物質がほとんどないγグロブリンが生成される結果となるからである。
【００２９】
ウイルス伝播の潜在的な危険性に関する、生成物の安全性は、本出願人がここに記載した方法において最大である。ここには、糖−アルコール（たとえばソルビトール）および／またはトリ−ｎ−ブチルリン酸塩（ＴｎＢｐ）およびポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはその均等物を伴なう溶媒−洗浄剤の存在下における低温殺菌の方法が、効率が良く相補的である、制御されたウイルス不活性化の主なステップとして、導入されている。これらのステップには、酸性ｐＨにおける任意の前処理であるウイルス撲滅操作が加えられており、主たる不活性化ステップに進む前に、これによってウイルス含有物が除去または弱毒化される。酸性ｐＨにおける処理中にウイルスを保持するために生成物の溶液をナノ濾過すること、または好ましくは最終的な濃縮および調合前に大量にダイアフィルトレーションすることも可能である。
【００３０】
ウイルス除去のための前述の方法を組み合わせることによって、ウイルスに対する安全性が最大である生成物が提供され、その組み合わせた技術は、単一の個々の不活性化ステップを用いる現況技術に優り、そして連続的に、したがって単一の不活性化ゾーンまたは単一の安全レベルにおいて、本発明の方法のステップ（任意に４つまで）を行うことができるという大きな産業上の利点を有する。
【００３１】
驚くべきことに、Ｃｏｈｎアルコール分別物（好ましくは画分ＩＩ＋ＩＩＩ）の中間体物質から出発すると、希釈体積、ｐＨおよびイオン強度に従ってＩｇＧの抽出に関する条件を調整し、炭水化物（好ましくは糖−アルコール）の存在下でほぼすべてのγグロブリンを抽出すること、およびＰＥＧを用いた沈殿によって大部分の付随タンパク質を分離することは任意的であることを本発明者は発見した。結果として生じた上澄み（濾過液）は粒子およびコロイドのない液体であり、これによってイオン交換カラム中でのその後の効率の良い吸着が任意選択的となり、結果として生じた流出液は望ましくない汚染物質（ＩｇＡ、ＩｇＭ、タンパク質分解酵素など）を実質的に含まず、しかもＩｇＧの収率またはサブクラス群の分布を害することもなかった。
【００３２】
さらに驚くべきことに、本発明者は、充分に精製されたカラム流出液中では、また本発明に適した特定の条件下では、限外濾過によって存在する残存ＰＥＧおよびエタノールを大幅に減少させること、および所望のタンパク質を濃縮させることことは任意選択的であることを証明した。これによって、その後のウイルス不活性化処理（酸性ｐＨにおける任意の処理、低温殺菌、溶媒／洗浄剤）を１つに結びつけることが可能になり、大きな変性（粒子およびコロイド形成がないことによって検出可能）も、また凝集（分子量の大きなわずか１〜２％の可溶性ポリマー）も引き起こすことがなかった。このポリマー含有量の低下は、低温殺菌より前に行われる全操作中で溶液を安定化させるある炭水化物（他の成分中の）の存在に起因する。
【００３３】
非常に驚くべきことに、本発明者は、前のステップに加えられる溶媒／洗浄剤によるウイルス不活性化の試薬を除去しまたは減少させる従来技術が開示した方法とは異なる方法を発見したが、この発見は、ＰＥＧを用いてγグロブリンを沈殿させること、そして溶液中に希釈した化学薬品を低温に維持して菌糸体含有量を低下させるのを助長することを基礎としている。次いで接面での流動ミクロ濾過よって沈殿物を分離し、その直後に前記試薬を完全に取り除くために保持していた物質を洗浄する。沈殿物を適切な溶液と接触させることによって、物理的操作を必要とせずに、同じミクロ濾過装置中で直接可溶化する。
【００３４】
記載した方法によって得られる溶液は、わずか１〜２％のポリマーしか含まなかったが、静脈内投与に許容可能であるとはみなされなかった。本発明者は、驚くべきことに、ＰＥＧおよび炭水化物（以前に加えた）が特定の濃度に達するように前述の可溶化した沈殿物を適切に希釈することによって、特定のｐＨ範囲に達したときに高分子量凝集体は不溶化し、これらは溶液内の大部分のモノマーおよび二量体から完全に分離することを観察した。炭水化物（好ましくは糖−アルコール）の濃度およびＰＥＧの濃度が、ＩｇＧのモノマー／二量体の共沈殿を避けるため、および溶液中の最大ＩｇＧを回収するための決め手となることが証明された。形成された沈殿は、接面でのミクロ濾過または従来的な濾過によって容易に分離することができた。本発明の一部を形成する実際のプロセス条件下で限外濾過によってダイアフィルトレーションされた、凝集体のない生成濾過液は、ウイルス保持膜によって任意に濾過することができる生成物をもたらした。また、この生成物は、最終的には、この方法中で加えた化学薬品が存在しないか、またはごく少量しか存在しないように、濃縮することができた（γグロブリン５％または１０％まで）。
【００３５】
本発明の方法は、前述した市販のγグロブリンがもつ一般的な欠陥を完全に改善することによって現況技術に優る。（ＩｇＧの濃度が１０％で）得られるγグロブリンには、以下のものがほとんど存在しない（または検出することができない）。ポリマーまたは高分子量凝集体（モノマー＋二量体＞９９％、好ましくは＞９９．９％）;γグロブリンの異なるタンパク質汚染物質;ＩｇＡ（＜０．００３ｍｇ／ｍｌ）;ＩｇＭ（＜０．００２ｍｇ／ｍｌ）;ＰＫＡ（＜２．７７ＩＵ／ｍｌ）およびカリクレイン;プラスミンおよびプラスミノゲン;アルブミン;トリ−ｎ−ブチルリン酸塩（＜３．６ｐｐｍ）;ポリソルベート−８０（＜５０ｐｐｍ）;ＰＥＧ−４０００（＜５００ｐｐｍ）。このγグロブリンは不安定なサブクラス群ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の含有量が高く、また分子の無欠性（Ｆｃフラグメント＞１００％）が高く、補体が自発的に活性化するための能力が小さい（ＡＣＡ＜１  ＣＨ５０／タンパク質１ｍｇ）。ソルビトールによる液体調合物は、少なくとも２年間、２℃〜８℃および２５℃までの両方で安定性がある。優れた生成物特性と共に、血漿の誘導体によるウイルス伝播の危険に関して最大限の安全性が提供され、溶媒／洗浄剤の潜在的な不活性能力、低温殺菌、酸性ｐＨにおける任意のインキュベーション、および任意のウイルス濾過（ナノ濾過）、ウイルス量を減少させることに貢献するプロセスステップ（エタノールを用いた沈殿、ＰＥＧを用いた沈殿、イオン電荷の吸着など）が考えられる。一方、この方法全体は適切な装置中で５日未満の日数で行うことができ、ＩｇＧの最終的な収率は最初の血漿１リットル当たりで４．５ｇを超える可能性があることを指摘することが重要である。
【００３６】
本発明の方法を、以下で詳細に説明する。
本発明の方法は、ヒト血漿のエタノール分別によって得られるＩｇＧの豊富な沈殿物から、好ましくはＣｏｈｎ法の画分ＩＩ＋ＩＩＩから出発する。前記沈殿物の１キログラムを、好ましくは溶液当たり５ｋｇ〜２５ｋｇの割合で、炭水化物、好ましくは糖−アルコール、より好ましくはソルビトールを２％〜１０％の濃度（ｗ／ｖ）含む水溶液に懸濁させる。画分ＩＩ＋ＩＩＩの水性懸濁液のｐＨが４．８と５．８の間にあり、伝導率が２ｍＳ／ｃｍを超えないような濃度で、リン酸塩および酢酸イオンをｐＨバッファーとして使用することが好ましい。最小限の撹拌時間の後、この場合１時間より長いことが好ましいのであるが、２．５％〜５．５％の濃度範囲（ｗ／ｗ）で、２℃〜８℃の好ましい温度で、みかけの分子量が好ましくは４０００であるＰＥＧを用いて、ＩｇＧを付随する抽出したグロブリンの大部分を沈殿させる。その直後、沈殿物の分離を行う前に、懸濁液の濾過性を高めるように、たとえばベントナイトなどの脂質およびリポタンパク質の吸着剤、たとえば好ましくはＨｙｆｌｏ−ｓｕｐｅｒｃｅｌまたはＣｅｌｉｔｅ（両方ともＪ．Ｍａｎｖｉｌｌｅによって市場に出されている）またはその均等物などの、濾過用共アジュバンド剤を加えることが好ましい。得られる濾過液の濁度が５ＮＴＵ（比濁計の濁度単位）未満であるように、デプス（ｄｅｐｔｈ）セルロースフィルタシートまたはプレート（グレードはＣｕｎｏブランドの５０ＳＡ、またはＳｅｉｔｚブランドのＫＳ−８０またはＫ−２００、または均等物）を使用して、形成される沈殿物を圧力濾過によって保持することが好ましい。所望により、遠心分離および濾過することによって、沈殿物を１つにした形で分離することができる。圧力濾過によって沈殿物が保持される場合、沈殿物を調整する条件と均等になるようにＰＥＧ、リン酸塩−酢酸塩イオンの濃度およびｐＨを調整した、適切な溶液で沈殿物を洗浄することができ、これによってＩｇＧの回収率の増大が助長される。
【００３７】
好ましくは水酸化ナトリウムの希釈溶液を加えることによって、得られる濾過液を５．７と６．３の間のｐＨとし、イオン交換カラムに注入することによって清澄化を施す。
【００３８】
イオン交換カラムは、陰イオンのリガンド、好ましくはジエチルアミノエーテル（ＤＥＡＥ）のものを有し、アガロースの不溶マトリックス、または好ましくはＤＥＡＥアガロースおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅとして商業的に知られているもの、好ましくは動的能力が高いもの（ＦＦすなわち高速で流れる）に結合した樹脂を含む。使用するカラムは放射状流分配タイプであり、長さ（すなわち床からの高さ）が８ｃｍと１５ｃｍの間であることが好ましい。最初の出発原料（好ましくは画分ＩＩ＋ＩＩＩ）と同等の導入量が好ましくは樹脂１ｍｌ当たり１ｇと２．５ｇの間であるように、溶液を排出する前に、好ましくは１時間当たりでカラム体積の４倍未満の流速に、樹脂が充填されているカラムに注入する濾過液を調整する。溶液の装入がひとたび完了した後、イオン強度およびｐＨが前に注入した生成物の溶液と同等な、カラムの２．５〜４．５倍の体積の溶液でカラムを洗浄することが好ましい。
【００３９】
ＰＥＧ含有量を低下させタンパク質の適切な濃度を得ることによって、装入および洗浄中の、またはカラムから取り除かれた液体流出液（非吸着画分）を限外濾過して、ウイルス不活性化に続くステップを行う。好ましい限外濾過膜は１００ｋＤａの見かけの分子断片を有し、商業ブランドＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＰａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎのポリスルホン（またはその誘導体）で構築されていることが好ましい。最初に、弱酸（たとえば希釈酢酸）を加えることによって、溶液を５．０と５．５の間のｐＨに調整し、２℃〜８℃の温度に維持し、好ましくは１．５バール（１５０ｋＰａ）と２バール（２００ｋＰａ）の間の膜間圧力で濾過を開始する。体積を好ましくは最初の体積の半分に減少させた後、好ましくは注入用の水の１〜３倍の体積を使用して、好ましくは一定体積でダイアフィルトレーションを行う。次いで鉱酸を添加することによって、溶液のｐＨを４．０〜４．８、好ましくは４．２と４．６の間にする。膜間圧力を１．２バール（１２０ｋＰａ）未満の値、好ましくは０．５バール（５０ｋＰａ）と１．０バール（１００ｋＰａ）の間に調整し、現在の体積を半分に減少させることによって所望により再び濃縮を行う。好ましくは糖−アルコール、より好ましくはソルビトールを２％〜１０％の濃度（ｗ／ｖ）含み酢酸を用いてｐＨ４〜５に調整した溶液を３倍以上の体積加えることによって、ダイアフィルトレーションを行う。最後に、必要とされる値、好ましくは４５ＡＵ（吸収単位）を超える光学濃度（２８０ｎｍでの）までタンパク質の濃縮を行い、その後好ましくは０．２２ミクロンの絶対膜を使用して濾過によって滅菌する。所望により、滅菌し安定化させた溶液を（元来はダイアフィルトレーション溶液の糖−アルコールを含む）、２℃〜８℃の温度で長期間保存することができる。
【００４０】
この方法を続けるにあたって、２℃〜８℃の温度において希釈鉱酸をゆっくりと添加することによって、２℃〜８℃に冷却した溶液を任意選択で酸性ｐＨ、好ましくは３．７５と４．２５の間にすることができる。任意にｐＨ調整した溶液を２℃〜４０℃で０．５時間〜４８時間、より好ましくは３．９５と４．０５の間のｐＨ、３５℃〜３８℃で１時間〜４時間、ダイアフィルトレーション前に加えられる２％〜１０％（ｗ／ｖ）の糖−アルコール、好ましくはソルビトールの存在下でインキュベートすることが好ましい。これも任意に、たとえば酸性ｐＨでの処理中に、好ましくは孔サイズが１５ｎｍ〜５０ｎｍである、たとえば５０ｎｍフィルタ（ＰａｌｌブランドのＤＶ５０）、３５ｎｍ（ＡｓａｈｉブランドのＢＭＭ−Ｐｌａｎｏｖａ  ３５Ｎ）、２０ｎｍ（ＰａｌｌブランドのＤＶ２０）、１５ｎｍ（ＡｓａｈｉブランドのＢＭＭ−Ｐｌａｎｏｖａ  １５Ｎ）、または均等な孔を有するものなどのナノメートル孔の膜を介して、溶液をウイルス濾過することができる。
【００４１】
酸性ｐＨでの任意の処理が終了するとき、温度は２℃〜８℃になり、好ましくは希釈強塩基を加えることによって溶液はアルカリ性になり、ｐＨは４．７と５．２の間の値に達する。その直後、炭水化物（好ましくは糖−アルコール、より好ましくはソルビトール）を安定剤として加え、好ましい最終濃度は２５％と３５％の間（ｗ／ｗ）である。低温殺菌は、好ましくは両方の場合とも、６０℃〜６２℃で１０〜１２時間行うことが好ましい。
【００４２】
次いで、炭水化物（すなわち好ましくは糖−アルコール）の濃度が２５％（ｗ／ｗ）未満になり、タンパク質が１％と３％の間（ｗ／ｖ）になるまで、溶液を注入用の水で希釈する。ひとたび溶液を室温に冷却し、溶媒／洗浄剤の混合物の濃縮溶液を加え（アルキル−リン酸塩試薬および非イオン性洗浄剤によって形成されることが好ましく、トリ−ｎ−ブチルリン酸塩およびポリソルベート−８０によって形成されることがより好ましい）、その結果最終濃度（ｗ／ｖ）はそれぞれ２つの試薬の０．３％および１％であることが好ましい。好ましくは両方の場合とも、２４℃〜２８℃で４〜８時間、インキュベーションを行うことが好ましい。（ウイルス不活性化溶液はこのときから不活性化生成物用の排他的ウイルス安全エリアにあるはずであり、この中で残りの操作を行う）。
【００４３】
その後溶液を注入用の冷水で希釈し、好ましくは溶液の１キログラムについて１キログラム〜２キログラムの水を加え、充分な量のＰＥＧ（分子量４０００であることが好ましい）を加えることによって存在するほぼすべてのタンパク質を沈殿させ、溶液をＰＥＧ濃度１２％〜１７％の最終濃度（ｗ／ｗ）にし、２℃〜８℃の好ましい温度においてｐＨを７．０と９．０の間、好ましくは７．８と８．４の間にあらかじめ調整する。充分な均質化時間の後（撹拌による）、好ましくは１時間を超える時間の後、任意にそのままの状態にしておくこともできるが、接面流動型濾過（ＴＦＦ）膜を有する装置中で沈殿物の保持を開始する。特に、分離されている濾過された液体は、前の溶媒−洗浄剤ステップにおいて使用される不活性化試薬を含む。好ましい接面濾過膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅブランドのフッ素化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）（Ｐｒｏｓｔａｋ構造または均等のモデル）で構築されているものである。溶液が含む試薬に匹敵するポリスルホンなどの他の物質を、ＰＶＤＦの代わりに任意に使用することができる。濾過膜の孔サイズは０．１ミクロンと０．４５ミクロンの間であることが好ましい。濾過液の分離は、１．５バール（１５０ｋＰａ）未満の膜間圧力で行う。
【００４４】
ひとたび最初の懸濁液の体積を好ましくは１／４〜１／８まで減少させ、ＰＥＧ（好ましくは前の沈殿で使用したものと同じ濃度のＰＥＧ）、好ましくは低温殺菌において使用したものと同じ炭水化物（好ましくは５％〜２０％の濃度（ｗ／ｗ）の糖−アルコールであることが好ましい）を含む溶液を一定体積加えることによって、保持している沈殿物の洗浄を開始する。前述の洗浄溶液を好ましくは４〜６倍の体積使用した後、ｐＨ５．５未満の酸性溶液で残渣を可溶化し、これは前のステップにおいて使用したものと同じ炭水化物を含むことが好ましい。溶液は１ｍＭ〜１０ｍＭの酢酸によって形成されることが好ましく、これに好ましくは５％〜２０％の濃度（ｗ／ｗ）の糖−アルコールを加え、アルカリを用いてｐＨ４．０〜４．５に調整する。溶液の温度は３７℃を超えず、２℃と８℃の間であることが好ましい。残りの懸濁液の２．５〜４．５倍の量を可溶化するために、一定量の酸性溶液を加える。このようにしてＰＥＧの最終濃度（ｗ／ｗ）は２％と４％の間、好ましくは２．８％と３．４％の間であり、糖−アルコールは好ましくは５％と２０％の間である。可溶化溶液は、沈殿が完全に溶解されるまで、再循環によって保持されている沈殿と接触して残る。
【００４５】
希釈水酸化アルカリまたは許容可能な弱塩基を加えることによって、可溶化した生成物を７．５と８．５の間、好ましくは７．８と８．３の間のｐＨにし、好ましい温度は２℃〜８℃である。均質化の後、形成された沈殿を好ましくは前に使用したものと同じＴＦＦ装置によって分離し、当該の生成物として濾過液を回収する。他の処理法は、ＴＦＦ装置を膜の使い捨てフィルタ、プレートまたは多層カートリッジ（デプス）に置き換えることである。
【００４６】
高分子量凝集体および溶媒／洗浄剤の試薬の大部分がない得られる濾過液を、希釈酸を加えることによって５と６の間のｐＨにすることが好ましい。
【００４７】
ＰＥＧおよび他の低分子量化合物の含有率を低下させ、生成物を最終調合物に調整するためのタンパク質の適切な濃度を得ることによって、溶液を限外濾過する。好ましい限外濾過膜は１００ｋＤａの見かけの分子断片を有し、商業ブランドＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＰａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎのポリスルホン（またはその誘導体）で構築されていることが好ましい。好ましくは１．５バール（１５０ｋＰａ）と２バール（２００ｋＰａ）の間の膜間圧力で限外濾過を開始する。体積を好ましくは最初の体積の１／２〜１／３に減少させた後、好ましくは注入用の水の１倍の体積を使用して、一定体積でダイアフィルトレーションを行う。次いで希釈鉱酸を添加することによって、溶液のｐＨを４．０〜４．８、好ましくは４．２と４．６の間にする。膜間圧力を１．２バール（１２０ｋＰａ）未満の値、好ましくは０．５バール（５０ｋＰａ）と１．０バール（１００ｋＰａ）の間に調整し、現在の体積を最初の体積の１／２〜１／３に減少させることによって溶液を再び濃縮する。糖−アルコール、より好ましくはソルビトールを２％〜１０％の濃度（ｗ／ｖ）含み酢酸を用いてｐＨ４〜５に調整した溶液を５倍以上の体積加えることによって、ダイアフィルトレーションを行うことが好ましい。ダイアフィルトレーションし好ましくは１％〜３％（ｗ／ｖ）のタンパク質に濃縮した前の溶液を、必要があればｐＨ４．４〜５．０に調整し、好ましくは２５±５℃に加熱する。その後、ナノメートル孔がみかけで５０ｎｍ以下である保持膜によって、任意選択のウイルス濾過を行う。みかけで約２０ｎｍ以下（ＰａｌｌブランドのＤＶ２０）であり、タンパク質の回収率が９０％を超え、２４時間未満の方法時間中の濾過領域１平方メートル当たり１キログラムを生産性が超えるものが好ましく、タンパク質の回収率が８０％を超え（いずれもＡｓａｈｉブランドであるＢＭＭ−Ｐｌａｎｏｖａ  １５ＮまたはＰ２１、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＶＮＦ「Ｐａｒｖｏ」）、みかけで１５と２０ｎｍの間の範囲のものも好ましい。
【００４８】
最後に、１００ｋＤａまたはより小さいサイズのみかけの分子断片を用いる限外濾過によって、必要とされる値（最終的な光学濃度（２８０ｎｍでの）は約７５ＡＵであることが好ましい）までタンパク質を濃縮して、５％のＩｇＧ濃度、すなわち１０％の濃度について約１５０ＡＵを得る。
【００４９】
ダイアフィルトレーション溶液の安定剤（糖−アルコール）の濃縮によって適切に調合される溶液をｐＨ５〜６にし、デプスフィルタ（Ｃｕｎｏブランドのグレード９０ＬＡ、または均等物）によって清澄化する。０．２２ミクロン膜を使用する絶対濾過によってこの溶液を滅菌し、次いでガラス容器に盛る。生成物を２５℃で１５日間の最小限の検疫に通し、この溶液は透明であり目に見える粒子が存在しないことを示す。この生成物は２℃〜８℃および２５℃までの温度で安定性がある。
本発明に関する非限定的な情報によって、適用のいくつかの実施例を以下に記載する。
【００５０】
実施例１
Ｃｏｈｎ法に従って得られた分画ＩＩ＋ＩＩＩペースト（バッチ番号９００３；出発血漿１４９０．９リットルに相当）９０．０ｋｇを、５ｍＭリン酸二ナトリウムおよび５％（ｗ／ｖ）のソルビトールから生成され、０．５Ｍ酢酸２３．０リットルを加えることによってｐＨ４．８３に調整された抽出溶液１３２３ｋｇに懸濁した。１時間の撹拌の後、０．５Ｍ酢酸１．４リットルを加えることによって懸濁液のｐＨを５．０５に調整し、２℃と６℃の間でさらに２時間撹拌させた。ｐＨが変化しないこと、および導電率が１．０５ｍＳ／ｃｍであることを確認した。次いで、十分に撹拌しながら、ＰＥＧ−４０００溶液（５０％）１３５．５ｋｇを加えた。その直後にベントナイト３６００ｇを加え、０．５Ｍ酢酸２リットルによりｐＨを５．０３に再調整した後、４時間放置して全体を沈降させた。濾過による沈降物の分離を実行する直前に、撹拌しながら、懸濁液１ｋｇ当たり３２．５ｇの割合でハイフロスーパーセルを加え、沈降物を保持するのに適当なプレスフィルタを用い、デプスプレート（ｄｅｐｔｈ  ｐｌａｔｅ）（Ｃｕｎｏブランド、等級５０ＳＡ）を通して混合物を直ちに濾過した。一方では、合計１７６８ｋｇの濾液（後洗浄液が含まれる）が集まり、この濾液は透明でわずかに黄色がかっており、吸光度（２８０ｎｍにおける）は８．３８ＡＵで濁度は２．７ＮＴＵであった。他方では、沈降物１８８．３ｋｇが得られ、これは捨てた。
【００５１】
上記濾液を、０．５Ｍ水酸化ナトリウム８０００ｍｌを加えることによってｐＨ５．９２に調整すると、得られた溶液の導電率は１．１１３ｍＳ／ｃｍであった。
【００５２】
十分に前もって、およそ１０〜１２ｃｍの層厚で放射状に充填されたＤＥＡＥ−セファロースＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）５０リットルの入ったラジアルフローイオン交換カラム（Ｓｅｐｒａｇｅｎブランド）を調製した。生成物の溶液に等しいイオン強度およびｐＨを有する酢酸ナトリウムおよび酢酸の溶液でカラムを平衡化した。次いで、生成物の溶液を、処理時間が１２時間１８分となるような流速でカラムに注入し、添加中にインラインで濾過した。最後に、平衡溶液１８０ｋｇで後洗浄を行った。合計１９３０ｋｇのカラム溶離液（吸着されない分画）が集められ、これは唯一のタンパク質成分として基本的にＩｇＧを含み、５．９９のｐＨ、１．０８１ｍＳ／ｃｍの導電率、２．４ＮＴＵの濁度、および６．９５ＡＵの吸光度（２８０ｎｍにおける）を有していた。
【００５３】
０．５Ｍ酢酸１３リットルを加えることにより、この溶液をｐＨ５．１９に調整し、１．９５〜２．２０バール（１９５〜２２０ｋＰａ）の膜間圧力および約４℃の温度でＢｉｏｍａｘＡ−２ブランド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）の１００ｋＤａ分子カットオフの膜による限外濾過により１０３０ｋｇまで濃縮し、吸光度（２８０ｎｍにおける）０．１５０ＡＵ未満の濾液を捨てた。その直後、注入用の水２０５４ｋｇと共に一定容積でダイアフィルトレーションを行うと、保持された溶液の最終的な導電率は０．１６４ｍＳ／ｃｍであった。次いで、限外濾過を停止することなく、冷たい０．２Ｍ塩酸を加えることによってｐＨ４．２６とし、この場合には、１．０５〜１．１０バール（１０５〜１１０ｋＰａ）の膜間圧力および約４℃で、ｐＨ４．１２に調整された５％（ｗ／ｗ）のソルビトールおよび２ｍＭ酢酸の溶液３８３３ｋｇについて一定容積でダイアフィルトレーションを続けた。最後に、吸光度（２８０ｎｍにおける）が７２．７ＡＵに達するまで残渣を濃縮した。次いで、ダイアフィルトレーション溶液で装置を洗い流すと、吸光度（２８０ｎｍにおける）５５．５ＡＵのバルク２３３．５ｋｇが得られ、続いて、０．２２ミクロンの細孔膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣＶＧＬ型フィルタ）を通す濾過により滅菌した。
【００５４】
滅菌溶液を６．０℃まで冷却し、冷たい０．２Ｍ塩酸７２５０ｍｌをゆっくりと加えることにより、ｐＨ４．００とした。前記添加中はｐＨをモニターした。その後、バルク溶液を、３６．５℃〜３７．３℃に温度調節しながら４時間、撹拌しながら加熱ジャケットを備えたタンク中で速やかに予熱した。
【００５５】
処理が終了したら、溶液を冷却し、固体ソルビトール１１４．３ｋｇを加えることによって安定化させ、完全に溶けるまで撹拌した。冷たい０．２Ｍ水酸化ナトリウム７０００ｍｌをゆっくりと加えることにより溶液のｐＨを４．８５とした。溶液３８８．８ｋｇが得られ、濁度は１．４１ＮＴＵであり吸光度（２８０ｎｍにおける）は３６．０ＡＵであった。前記溶液は、６０．１℃と６０．７℃の間で正確に１０時間、直ちに低温殺菌した。
【００５６】
続いて冷却し、注入用の冷水１３１ｋｇを加えることによって希釈すると、吸光度（２８０ｎｍにおける）２７．５ＡＵが得られた。この希釈溶液５０７ｋｇに３％（ｗ／ｖ）のリン酸トリｎ−ブチルおよび１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０（ツイーン−８０）から生成されたＳＤの濃縮液５１．２ｋｇを加え、２５．８℃と２６．４℃の間で正確に６時間、インキュベーションを行った。
【００５７】
ＳＤで処理した溶液は、注入用の冷水８４１．５ｋｇで直ちに希釈し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム４２００ｍｌを加えることによりｐＨを８．０５に調整した後、ＰＥＧ−４０００の５０％溶液６５４．３ｋｇを撹拌しながらゆっくりと加え、２．６℃〜３．８℃の温度で沈降させた。
【００５８】
ＰＥＧによる沈降物の上記懸濁液２０６５ｋｇは、０．１〜０．３バール（１０〜３０ｋＰａ）の膜間圧力および３．６℃〜５．０℃で０．２２ミクロンの細孔膜（Ｐｒｏｓｔａｋ型、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を通し、平行流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）（ＴＦＦ）精密濾過装置中で４００ｋｇまで濃縮した。ＴＦＦ中に保持される沈降物の懸濁液は、ｐＨ７．９７に調整された１５％（ｗ／ｗ）のＰＥＧおよび８％（ｗ／ｗ）のソルビトールを含有する溶液２０００ｋｇにより一定容積で洗浄した。
【００５９】
次いで、保持された懸濁液を、水酸化ナトリウムでｐＨ４．１４に調整された１４％（ｗ／ｗ）のソルビトールおよび４ｍＭ酢酸の溶液１２２６ｋｇを加えることによって可溶化した。溶液は、完全に可溶化するまで（２５分）ＴＦＦ装置中で再循環接触（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔ）させた。次いで、０．５Ｍ水酸化ナトリウム６５００ｍｌをゆっくりと加えることにより溶液のｐＨを８．０３とし、約１５分間の撹拌の後、同じＴＦＦ装置（０．２２ミクロンの細孔膜を備えた）で濾過を開始し、濾液中にＩｇＧを回収した。濾液１４７４ｋｇを集めた後、懸濁液と同様な組成物特性を有する溶液により、保持された懸濁液の洗浄を開始し、最終的に合計１８２７ｋｇの濾液を得た。濾液プールは、５．６６ＡＵの吸光度（２８０ｎｍにおける）、１．９９ＮＴＵの濁度、０．１５８ｍＳ／ｃｍの導電率を有していた。
【００６０】
０．５Ｍ酢酸３０００ｍｌを加えることにより、溶液をｐＨ５．５３とし、１．７５バール（１７５ｋＰａ）と１．９５バール（１９５ｋＰａ）の間の膜間圧力で１００ｋＤａ分子カットオフの膜（Ｐａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎ製のＯｍｅｇａシリーズ）による限外濾過により濃縮すると、容積が減少し、７３９ｋｇが得られた。注入用の水７３６ｋｇについて、一定容積でダイアフィルトレーションを行い、続いて０．２Ｍ塩酸５６００ｍｌを加え、ｐＨ４．５１とした。すると、膜間圧力は０．６〜０．９バール（６０〜９０ｋＰａ）まで低下し、２９６ｋｇまで濃縮が行われ、ｐＨ４．１６に調整された２ｍＭ酢酸を含有する５％ソルビトール（ｗ／ｗ）の溶液２０７２ｋｇについて一定容積でダイアフィルトレーションを直ちに開始した。上記溶液が消費されたら、吸光度の値が１４２．５ＡＵとなるまで濃縮を行い、５％と１０％のＩｇＧ濃度で２種類の溶液を調製した。ｐＨ５．２５に調整された前記溶液は、デプスプレート（Ｃｕｎｏブランド、等級９０ＬＡ）および細孔サイズ０．２２ミクロンの絶対（ａｂｓｏｌｕｔｅ）膜（ＣＶＧＬ型、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を通して濾過し、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌおよび２００ｍｌのガラス製フラスコ中に計り取った。調整溶液の最終生成物産出量は、出発血漿１リットル当たりのＩｇＧのグラム数に関して４．６８であった。
【００６１】
実施例２
ＩＶＩＧのいくつかのバッチについて、それぞれ分画ＩＩ＋ＩＩＩの９０ｋｇから出発し、本発明の方法に記載された方法で処理し、最終生成物（５０ｍｌのバイアルに入った５％ＩＶＩＧ）を厳密な分析対照の対象とし、その品質のコンシステンシーを検証した。得られた結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
0004070468.tif 000002
Ｎ．Ｄ．；測定せず。
【００６３】
タンパク質は、対照としてγグロブリンを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。濁度は比濁分析により測定し、対照溶液について定量した。γグロブリンの純度は、酢酸セルロースプレート上の電気泳動およびアミドブラックによる染色によって検出される総タンパク質について測定した。ポリマー（すなわちγグロブリンの二量体より大きな分子会合体（または凝集体））および低分子量タンパク質分画は、ゲル内の排除カラム（Ｔｏｙｏｓｏｄａ製ＴＳＫ  Ｇ−３０００ＳＷカラム）中のＨＰＬＣにより測定し、２８０ｎｍにおける吸光度により、指定された分子形の分布％を検出された総タンパク質に対して定量した。ＰＥＧは、屈折率検出器を用い、ゲル内のＨＰＬＣ濾過カラム（ＴＳＫ  Ｇ−３０００ＳＷＸＬカラム）によって測定した。ソルビトールの濃度は、酵素法によって定量した。ポリソルベート−８０は、比色法によって分析し、ＴＮＢＰはガスクロマトグラフィによって分析した。プレカリクレインアクチベータ（ＰＫＡ）は、色素生産性試験によって測定した。付随的なタンパク質ＩｇＡおよびＩｇＭは、免疫比濁法により測定した。抗補体活性（ＡＣＡ）は、サンプル存在下または非存在下でのインキュベーション後に残留する補体の測定に基づくＥｕｒ．Ｐｈａｒ．法によって測定した。
【００６４】
実施例３
本発明の方法では、添加された化学的ウイルス不活性化試薬は、ＰＥＧとの沈降によって減少し、ＴＦＦ装置中で洗浄される。いくつかの検討の後、ＴＦＦプロセス中に前記試薬の濃度を間接的にモニターすることができる簡単な方法を確立した。ＴＦＦによる濾液の２８０ｎｍにおける吸光度は基本的に、非イオン性洗浄剤および濾液と一緒に逃げる可溶性タンパク質の残余の濃度に由来することを考慮すると（ＰＥＧは２４５〜２８０ｎｍの範囲で吸収しない）、タンパク質の寄与は２４５ｎｍで読み取ることによって補正される。この波長で検出されるタンパク質の吸収は最も小さく、反対に、洗浄剤に関しては極めて高い（市販のポリソルベート−８０の場合にはタンパク質よりも約１４．５倍大きい）。
【００６５】
次いで、２８０ｎｍおよび２４５ｎｍにおける吸光度の読み取り値に基づき、ＴＦＦプロセスのステップを続け、ＳＤの減少に対する濃度および表面洗浄（ｆａｃｅ  ｗａｓｈｉｎｇ）の有効性を明らかにした。開発した測定手順に従い、前記実施例１の方法に準じて残留ＳＤを定量した。結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
0004070468.tif 000003
（１）ＳＤに由来する２８０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．）の％は、吸光度の比率（２４５ｎｍ／２８０ｎｍ）から出発し、ＳＤとタンパク質間の２４５ｎｍにおける相対吸収係数１４．５で割り、１００を乗じて算出した。
（２）ＳＤの濃度の回収率（％）は、濃縮開始時に見いだされる値（０．３３９）について対応するステップの２８０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．の値に従って算出し、ＳＤが寄与するＯ．Ｄ．の％（およそ）により、以下の式に従って補正した。回収率（％）＝（Ｏ．Ｄ．読み取り値（２８０ｎｍ）／０．３３９）×（ＳＤのＯ．Ｄ．の％）／１００）。
Ｎ．Ｄ．；、測定せず。
ｎ．ａ．；、該当せず。
【００６７】
結果は、濃縮および洗浄中にＳＤ（ポリソルベート−８０）が減少する経過を示しており、最終的には５回の洗浄容積後に得られたのは初期濃度の２．７４％に過ぎなかった。その結果、減少係数は３６．５倍（１００％／２．７４％）となり、タンパク質濃縮増分×５（２０６５ｋｇ／４００ｋｇ）によって補正すると実際の減少係数１８２倍が得られる。次いで、上記の値に従い、保持された沈降物のポリソルベート−８０の濃度は１００ｐｐｍよりやや少なく、タンパク質濃度の約２％であると計算される。
【００６８】
５％と１０％のタンパク質で１００ｐｐｍ未満の濃度に到達するためには、存在するポリソルベートの量は５回以上に減らなければならない。ポリソルベートの濃度は菌糸体（ｍｙｃｅｌｉａ）形成の濃度に近い値まで十分に低下したことから、続いて１００ｋＤＡの限外濾過膜を使用することは任意選択であり、その分離も任意選択になる。本実施例のバッチの場合、最終生成物に見いだされる濃度（ＩｇＧ５％において）は３０ｐｐｍ未満で、分析技法の定量限界以下であった。
【００６９】
別の２バッチ、Ｎｏ．８００６およびＮｏ．８００７を、本実施例３と同様の方法で調製用スケールで処理した。ＰＥＧで沈降を行い、濃縮し、前に使用したものと同じタイプの膜を備えるＴＦＦ装置中で洗浄したが、この場合には、洗浄溶液の容積数はＮｏ．８００６および８００７でそれぞれ、４および２．５とした。１００ｋＤａの膜を通し、最終濃度（ＩｇＧ５％）までダイアフィルトレーションと濃縮を行い、最終生成物（ＩＶＩＧ５％）中のそれぞれのバッチについて残留ポリソルベートの濃度を測定した。見いだされた値（バッチＮｏ．９００３を含む）を表３に示す。
【００７０】
【表３】
0004070468.tif 000004
【００７１】
表３の結果は、残留ポリソルベートの量と洗浄容積数との間に依存性のあることを示しており、本発明の条件下では、ＴＦＦによる洗浄が非イオン性洗浄剤（ポリソルベート）を有効に減少させるための重要なステップであることを実証している。実測値から、最終生成物中の残余が１００ｐｐｍ未満であることを保証するために少なくとも４回の洗浄容積を定めることが選択される。
【００７２】
実施例４
ＩｇＧのいくつかのバッチについて、それぞれ分画ＩＩ＋ＩＩＩの９０ｋｇから出発して、本発明の方法に従って処理した。ＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムにより精製し、ＰＥＧ−４０００約４％を含有する溶液が得られたら、すべての場合に、実施例１に記載の条件に等しい条件の下で、公称で１００ｋＤａ分子をカットオフするＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＢｉｏｍａｘＡ−２ブランドのポリスルホン膜２７．６ｍ２の表面を通し、限外濾過を行った。得られたタンパク質（吸光度値による）およびＰＥＧ−４０００の濃度を表４に示す。
【００７３】
【表４】
0004070468.tif 000005
ＰＥＧ−４０００の濃度は、屈折率検出器を用い、ゲル中の排除カラム中でＨＰＬＣにより測定した。
【００７４】
調製用スケールで一バッチ（Ｎｏ．９００１）について行った別の実験では（分画ＩＩ＋ＩＩＩ８ｋｇから開始）、ＦＦ  ＤＥＡＥ−セファロースカラム溶出のステップまで本方法を行った。バッチサイズに適合させ、実施例１に記載の条件下で１００ｋＤａ分子カットオフのＢｉｏｍａｘＡ−２膜を通して限外濾過を行った。この場合、実施例１とは異なり、生成物のｐＨを４．２〜４．６に調整することなく、５％ソルビトールについてダイアフィルトレーションを行い、１．５バール（１５０ｋＰａ）を超える膜間圧力でダイアフィルトレーションを行った。最終的には、およそのタンパク質の濃度は、Ｏ．Ｄ．（２８０ｎｍ）４５ＡＵに相当し、ＰＥＧの濃度は３３ｍｇ／ｍｌ、すなわち表４の実測値よりも約６倍高かった。低温殺菌まで処理した生成物は、会合体４％を生成し、表４のバッチとは異なる挙動を示し、その増分は、前記会合体の１．０％〜１．５％に過ぎなかった。
【００７５】
表４の結果は、本発明の限外濾過の方法が、ＰＥＧを効率よく減らすという目的を極めて満足に実行し、その溶液を、それに続くウイルス不活性化処理に適当なタンパク質およびＰＥＧ濃度にすることができることを示している。
【００７６】
実施例５
本発明の条件に従い、生成物のいくつかのバッチを処理した。最後の限外濾過を行う前に、５．４と５．６の間のｐＨとし、膜間圧力約１．５〜２バール（約１５０〜２００ｋＰａ）で１００ｋＤＡ膜を通して２．５倍に濃縮した。次いで、同容積の注入用水で洗浄し、０．５Ｍ塩酸を加えることにより直ちに４．３と４．５の間にｐＨを調整すると、膜間圧力は１バール（１００ｋＰａ）以下の値まで低下し、それぞれの溶液の容積は２．５倍以上濃縮された。最後に、水酸化ナトリウムでｐＨ４．２に調整され、２ｍＭ酢酸を含有する７倍容積の５％ソルビトール（ｗ／ｗ）でダイアフィルトレーションを行った。
【００７７】
最終生成物中の残留ＰＥＧの濃度の結果は、前表２に見られるように、５％ＩｇＧで約２００ｐｐｍ（０．０２％）である。限外濾過前の溶液のＰＥＧおよびＩｇＧ濃度がそれぞれ３．２５％および４ｍｇ／ｍｌであることを考慮すると、ＰＥＧ減少係数（タンパク質による補正後）は１０００〜２０００倍である。
【００７８】
前のバッチに関しては、バッチサイズに適合された実施例１による本発明に記載の方法により調製用スケールでテストを行った。出発溶液を約ｐＨ５．０とし、１００ｋＤａ分子カットオフ膜を通して約４倍に濃縮した。次いで、１．２バール（１２０ｋＰａ）以上の膜間圧力で９倍容積の５％ソルビトール溶液について、同じ装置で一定容積のダイアフィルトレーションを行った。ＰＥＧおよびタンパク質濃度値、ならびにＰＥＧ減少係数は表５に見いだされる。
【００７９】
【表５】
0004070468.tif 000006
（１）減少係数は、タンパク質濃度に従って補正した。
（２）ｐＨ８のＰＥＧ３．２５％を含む濾液に対応する出発溶液。
ｎ．ｄ．；測定せず
ｎ．ａ．；該当せず
【００８０】
表５の結果は、テスト条件の下で１００ｋＤａの膜をＰＥＧが離散的に移動することを示しており、これは主に４．８を超える媒質のｐＨおよび１．２バール（１２０ｋＰａ）を超える膜間圧力に起因している。したがって、本発明の実際の条件下ではＰＥＧの減少がさらに効率的あり、その大きさは約５０倍にのぼる（前記バッチの減少係数１０００〜２０００とこのテストの２８．８を比較すると）ことが確認される。
【００８１】
実施例６
γグロブリン溶液の中間低温殺菌、ならびにそれに続く溶媒／洗浄剤による化学的不活性化処理は、分子会合をほとんど誘発しない。
【００８２】
実施例１で詳細に記載した本発明の方法に従い、工業スケール（それぞれ分画ＩＩ＋ＩＩＩ９０ｋｇから出発）でいくつかのバッチを処理した。酸ｐＨでインキュベーションを行い、ソルビトールを最終濃度約３３％（ｗ／ｗ）まで加えることにより濃度３．５％のγグロブリン溶液を安定化させ、０．５Ｍ水酸化ナトリウムを加えることによってｐＨを４．８０±０．０５に調整すると、吸光度（２８０ｎｍにおける）は３５．６ＡＵと４１．２ＡＵの間であった。その直後、加熱ジャケットを備えたタンク中、６０〜６１℃で１０時間、まとめて低温殺菌した。すべての場合に、ソルビトールの濃度が２５％（ｗ／ｗ）未満となるように、注入用冷水で吸光度（２８０ｎｍにおける）が２５．９ＡＵと２８．０ＡＵの間になるまで溶液を希釈した。２５℃〜２６℃まで冷却し、ポリソルベート−８０  １％およびリン酸トリ−ｎ−ブチル０．３％の最終濃度（ｗ／ｖ）が得られるまで、溶媒／洗浄剤の濃縮（×１０倍）溶液を加えた。約３０分間混ぜた後、２５℃〜２６℃で６時間、全体をインキュベートした。
【００８３】
溶液のポリマーすなわち高分子量会合体の含量（ＨＰＬＣによって測定）を低温殺菌の前後、および溶媒／洗浄剤による処理後に測定した。低温殺菌中のコロイド状粒子の生成も、濁度の比濁測定によって定量した。得られた値を表６にまとめる。
【００８４】
【表６】
0004070468.tif 000007
ｎ．ｄ．；検出されず
Ｎ．Ｄ．；測定せず
【００８５】
結果は、会合体（２％未満）および濁度の離散的な増加を考慮すると、温度、時間および材料の組成について記載された（安定剤、タンパク質およびＰＥＧの濃度、ｐＨなど）条件下で行われた低温殺菌および溶媒／洗浄剤処理は、γグロブリンの変性を促進しないことを示している。同様に、この方法のγグロブリンの濃度（約３．５％）では、製造バッチ当たり多量を処理することが選択できる。
【００８６】
実施例７
イオン交換樹脂カラムで精製するための最良の充填条件を確立するためにいくつかのテストを行った。
分画ＩＩ＋ＩＩＩの同一バッチから出発し、出発材料１ｋｇを使用し、ＰＥＧによる最初の沈降からの濾液が得られるまで、本発明の方法に従って調製用スケールでいくつかのテストを行った。
【００８７】
それぞれのテストでは、ｐＨ５．９〜６．０に調整した必要量の溶液を浄化し（０．５ミクロンフィルタ）し、その後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を１３ｃｍ〜１７ｃｍの高さに充填した（示した１ケースを除く）直径６５ｍｍまたは９０ｍｍのカラムに注入した。添加は２℃〜８℃、および場合によるが、すべてのカラム溶出液を集め、それぞれのテストについて対応する洗い落としを、酢酸でｐＨ５．９５＋／−０．０５に調整したカラム容積の３．５倍の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで行う時間が１２〜１５時間または６時間となるような流速で行った。
【００８８】
表７には、γグロブリン回収率の値および溶出液の電気泳動的純度（酢酸セルロースによる）を示す。
【００８９】
【表７】
0004070468.tif 000008
ｎ．ｄ．；測定せず
（１）シンボル：（−）は検出されないことを示し、（＋）は痕跡量であることを示し、（＋＋＋）は多量に存在することを示す（主要な不純物）。
（２）当初の充填溶液に対し、総タンパク質値（２８０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．による）およびカラム溶出液の純度（電気泳動）により回収率を％で算出。
【００９０】
樹脂１ｍｌに対し分画ＩＩ＋ＩＩＩ２．５ｇ以下の充填を行うことにより、電気泳動によって検出可能な主な不純物のほぼ完全な吸着（アルブミンが存在しない）が得られ、γグロブリンの回収に対する有害な影響もなく、試験した全範囲ですぐれている。しかしながら、過剰な容積のカラムを使用するのを避けるためには、樹脂１ｍｌ当たり分画ＩＩ＋ＩＩＩ  １ｇという低めの充填範囲に制限することが好ましい。一方、予想されたように、一部のアガロースマトリックス樹脂に注入する流速は関連因子であることが判明し、連続流れの条件下で１２時間の接触が必要である。
【００９１】
カラム吸着によりいくつかの主要な付随タンパク質が減少することを具体的に発見する目的で、実施例１の記載に従い、ただし指示されたバッチサイズに調整して、調製用スケール（分画ＩＩ＋ＩＩＩ８ｋｇから出発）で処理（バッチ番号９００１）を行った。ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ１ｇ当たり分画ＩＩ＋ＩＩＩ１．８ｇの充填比を適用し、接触時間は約１２時間とし、ＩｇＡ、アルブミンおよびトランスフェリンの濃度は、カラム溶出液とカラム前の溶液中の両方で測定した。得られた結果は、表８に見いだすことができる。
【００９２】
【表８】
0004070468.tif 000009
タンパク質の定量は、免疫比濁法によって行った。
（１）回収率（％）は、カラムの前後の溶液中に見いだされるタンパク質の絶対量を考慮して算出した。
【００９３】
表８から、本発明の特定の条件下では、出発分画ＩＩ＋ＩＩＩ中に存在し、ＩｇＧに関係する主要なタンパク質の分離に対しこの樹脂が極めて選択的かつ効率的であることは明らかである。溶出液中にはＩｇＧと共に離散的な量のトランスフェリンが検出されるに過ぎない。ＩｇＧの高回収率は、カラム溶出液中のサブクラスの比率を維持する良好な指標である。
【００９４】
実施例８
高度に精製されたＩ．Ｖ．γグロブリン溶液から出発し、酸ｐＨ（ｐＨ４．０）で処理するステップの条件をシミュレートし、ソルビトールの保護効果、γグロブリンの濃縮およびインキュベーション時間、ならびに続く低温殺菌ステップに対する影響を検討した。
【００９５】
５％のＩＶＩＧ（Ｆｌｅｂｏｇａｍｍａ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｇｒｉｆｏｌｓ製）の同一バッチのサンプルを使い、０．５Ｍ塩酸でｐＨ４．００〜４．０５とする場合に、２０℃〜２５℃の周囲温度において酸区域でｐＨを調整する間のソルビトールの保護効果を立証するためにテストを行った。同様に、他のテストも行い、出発５％ＩＶＩＧを５％ソルビトール溶液で希釈することに対するγグロブリン濃度の効果、ならびにｐＨ４．０への調整を行う温度が周囲温度２０℃〜２５℃あるいは２℃〜８℃に冷却して行うかを評価した。ｐＨ４．０で１時間のインキュベーションおよびそれに続く３３％のソルビトール存在下の６０℃〜６１℃における１０時間の低温殺菌の後、２８０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．によって検出可能な会合体すなわちポリマーの定量をＨＰＬＣによって行った。得られた結果を表９に示す。
【００９６】
【表９】
0004070468.tif 000010
ｎ．ｄ．；検出されず
Ｎ．Ｄ．；測定せず
すべての場合、出発ＩＶＩＧは会合体を含有していない（ｎ．ｄ．）。
【００９７】
これらの結果から、酸区域でｐＨを変化させた場合にソルビトールによる保護が行われ、より高温であってもはっきりしていることが分かる。周囲温度では、５％（またはより高濃度）のγグロブリンを効率よく保護するためには１０％以上の濃度のソルビトールが必要である。γグロブリンの濃縮は会合をより促進し、２℃〜８℃でｐＨ４．０に調整してもタンパク質の濃度は５％（または、より希釈された、好ましくは３．５±０．５％）まで達し、５％ソルビトールのみで安定化され、酸ｐＨにおけるインキュベーションと、続く低温殺菌の条件を満たしているであろう。２℃〜８℃の温度でｐＨを調整することにより、５％ソルビトールと５％γグロブリンについて検討された高濃度においてほんの離散的な会合（ポリマーの０．４３％）が観察され、２０℃〜２５℃でｐＨを調整した場合よりも（ポリマーの０．８３％）有意に低いことが分かった。温度の低下によるこの低い会合、タンパク質の濃縮範囲、およびソルビトールによって行われる保護は、本発明の方法の様々なステップ中で確立された条件が正しいことを証明している。
【００９８】
会合体の形成に関し、酸ｐＨ（ｐＨ４．０および３６〜３７℃）におけるインキュベーション時間を、２種の異なるγグロブリン（Ｆｌｅｂｏｇａｍｍａ）およびソルビトール双方の濃度について、２℃〜８℃のｐＨ調整温度で検討した。得られた結果は、表１０中に見いだされる。
【００９９】
【表１０】
0004070468.tif 000011
ｎ．ｄ．；検出されず
【０１００】
結果は、酸ｐＨにおけるインキュベーションおよびそれに続く３３％ソルビトール存在下の低温殺菌を行うのに用いられる２種の組成物の妥当性を十分明らかにしている。０から２４時間まで検討された最大範囲内に妥当なインキュベーション時間が見いだされ、任意選択の最適条件は３６〜３７℃における４時間の暴露である。
【０１０１】
実施例９
高度に精製された５％ＩＶＩＧ（Ｆｌｅｂｏｇａｍｍａ）から出発し、直接５％の濃度（導電率約４５０マイクロＳ／ｃｍ）あるいは注入用の水で２．５％まで１：１に希釈し（導電率約２２５マイクロＳ／ｃｍ）、最適な低温殺菌条件を決定した。それぞれの溶液に３３％（ｗ／ｗ）までソルビトールを加え、０．５Ｍ塩酸で様々なｐＨレベルに調整した。異なる濃度およびｐＨのそれぞれのサンプルを６０℃〜６１℃で１０時間の熱処理を受けさせた後、分子分布をＨＰＬＣにより分析し、会合の程度（ポリマーすなわち高分子量会合体、および二量体）を測定した。得られた値を表１１に示す。
【０１０２】
【表１１】
0004070468.tif 000012
出発材料として使用した５％ＩＶＩＧ中のポリマー含量は検出されない。
【０１０３】
この結果から、極めて低いイオン強度および約２．５％のタンパク質濃度で、ソルビトールで安定化され、５．５〜４．５のｐＨ範囲において１０時間、６０℃〜６１℃で低温殺菌することが可能であることが分かり、その最適値はｐＨ４．７と５．０の間で、会合体（ポリマーおよび二量体）の増分は最小である。
【０１０４】
実施例１０
上記のウイルス不活性化ステップに起因する（によって生成する）高分子量会合体を除去する本発明の方法の能力を測定するために、いくつかの実験を行った。
【０１０５】
３３％のソルビトールの存在下に低温殺菌し、続いて０．３％のＴＮＢＰおよび１％のポリソルベート−８０で処理した、本発明の方法に従って処理した様々なバッチの溶液を、溶液１ｋｇ当たり水１ｋｇから１．５ｋｇの割合で注入用の水で希釈し、２℃〜８℃まで冷却した。その直後、ＰＥＧ−４０００を加えて異なる濃度とし、ｐＨを７．５と８．１の間に調整した。高分子量会合体を沈降させた後、細孔サイズ０．５〜０．１ミクロンにより懸濁液を濾過すると、それぞれの場合に透明な液体が得られ、精製されたＩｇＧが含まれていた。
それぞれのサンプルについてＨＰＬＣによりポリマーの％を定量したが、実測値を表１２に示す。
【０１０６】
【表１２】
0004070468.tif 000013
ＨＰＬＣにより検出できない値は（ｎ．ｄ．）、この場合０．００で示した。
【０１０７】
３．００％〜３．４５％のＰＥＧ濃度範囲でポリマー全体の除去が検出されたが、媒質のｐＨとの相互作用が存在し、ｐＨが７．７５と８．０６の間の場合に分離が最も有効であることが分かる。７．４７で検討したｐＨの最低値では、ポリマーを完全に除去するためには少なくとも３．４５％のＰＥＧ濃度が必要であるが、それは、より低い濃度（例えば、ＰＥＧ３．１５％−ｐＨ７．５１）では前記ポリマーを完全に沈降することができず、濾液中に残渣が残るからである。
【０１０８】
ソルビトール安定剤の存在は同様に作用し、非会合分子種（一量体および二量体）がポリマーと一緒に共沈降するのを回避し、前記沈降中の生成物の回収率を大きく改善する。ソルビトールが存在する効果を測定するため、異なる濃度条件の下でタンパク質の沈降および回収率（吸光度による）に対していくつかのテストを行った。実験は精製した５％ＩＶＩＧ溶液（検出可能なポリマーなし）から出発して行い、水または場合によっては１０％のソルビトールを用いて吸光度（２８０ｎｍにおける）約６ＡＵまで希釈し、ｐＨ８．０に調整した。少なくとも１時間、溶液を沈降させ、次いで沈降物の存在を観察した。同じ実験を、本発明の方法のウイルス不活性化ステップからのＩｇＧ溶液（ポリマー含量３．９７％）について繰り返し、この場合は５％ソルビトールまたは水で希釈し、沈降させ、濾過によって会合体を分離した後、濾液からのタンパク質の回収率（％）を初期値に対して測定した。
得られた結果を下表１３に示す。
【０１０９】
【表１３】
0004070468.tif 000014
（１）：＋印の数は、検出された沈降物の量を示す：（＋＋＋）多量；（＋）徴候あり；（−）なし。
（２）：沈降前の初期溶液に対する濾液中に見いだされる総タンパク質の割合。
ｎ．ｄ．；検出されず。
Ｎ．Ｒ．；実施せず。
【０１１０】
５％以上のソルビトール濃度は、ＩｇＧの単量体／二量体がＩＶＩＧ溶液中に単一分子種として存在する場合に沈降することを予防し、ＰＥＧを添加しても沈降物は検出されない。同様に、ＩｇＧ溶液に含まれるポリマーが除去される場合には、検討したソルビトールの最高濃度（１３％）でＩｇＧの回収率の改善（ポリマーなし）が観察される。この結果、ポリマーすなわち高分子量会合体の沈降中にソルビトールが存在すると、共沈降を予防し、ＩｇＧの最適な回収率を得るのに有益である。
【０１１１】
実施例１１
実施例１に従って得られた２種類の異なる出発材料、すなわち、３６±１℃で酸ｐＨ（ｐＨ＝４．００±０．０５）に調整した溶液（材料Ａ）、およびｐＨ４．５±０．１で２６±１℃の最後にダイアフィルトレーションしたタンパク質２．５±０．５％の溶液（材料Ｂ）を使用し、ナノメートルの細孔サイズの市販フィルタを用いて調製用スケールでウイルス濾過を比較してテストした。使用した濾過領域に対する濾過された量に関して得られた結果、所要時間および使用フィルタ（Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ１５ＮおよびＤＶ２０）によるタンパク質の回収率を表１４に示す。
【０１１２】
【表１４】
0004070468.tif 000015
*  後洗浄前に得られた回収率
【０１１３】
前表から、材料Ａと材料Ｂは共に、３５ｎｍ以下、１５ｎｍまでの細孔サイズであってもウイルス濾過に適当であることが明らかである。しかしながら、タンパク質の回収率（＞９０％）およびフィルタの細孔サイズ当たりのウイルス除去能力に関する生産力（＞１ｋｇ／ｍ２）を考慮すると、約２０ｎｍの細孔サイズが最も適当であるように見える。