(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
から成り、CDR1、CDR2及びCDR3が以下のアミノ酸配列：
CDR1：Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
CDR2：Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
CDR3：Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala
からなる３個の相補性決定領域（CDR）であり、そしてFR1、FR2、FR3及びFR4がヒト抗体REIのＬ鎖Ｖ領域の４個のフレームワーク領域（FR）である構造を有するヒト髄芽腫細胞に対する抗体のＬ鎖可変領域（Ｖ領域）において、
（１）前記Ｌ鎖Ｖ領域のFR2中の42位及び43位のアミノ酸がREI配列中のアミノ酸と同一のアミノ酸残基であるか又は異なるアミノ酸残基に置換されていてもよく、そして
（２）前記Ｌ鎖Ｖ領域のFR2中の46位のアミノ酸がプロリンに置換されている、
ことを特徴とするＬ鎖Ｖ領域、並びにヒトＬ鎖定常領域（Ｃ領域）から構成されるＬ鎖；並びに
以下の構造：
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
から成り、CDR1、CDR2及びCDR3が以下のアミノ酸配列：
CDR1：Asp Thr Tyr Ile His
CDR2：Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
CDR3：Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr
からなる３個のCDRであり、そしてFR1、FR2及びFR3がヒト抗体Eu由来でありそしてFR4がヒト抗体ND由来であることを特徴とするＨ鎖Ｖ領域の４個のFRである構造を有するヒト髄芽腫細胞に対する抗体のＨ鎖Ｖ領域、並びにヒトＨ鎖Ｃ領域から構成されるＨ鎖；
から成るヒト髄芽腫細胞に対する抗体。
【請求項２】
前記Ｌ鎖Ｖ領域のFR2において42位及び43位のアミノ酸が各々、グルタミン及びセリンに置換されていることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
以下の構造：
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
から成り、CDR1、CDR2及びCDR3が以下のアミノ酸配列：
CDR1：Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
CDR2：Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
CDR3：Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala
からなる３個の相補性決定領域（CDR）であり、そしてFR1、FR2、FR3及びFR4がヒト抗体REIのＬ鎖Ｖ領域の４個のフレームワーク領域（FR）である構造を有するヒト髄芽腫細胞に対する抗体のＬ鎖可変領域（Ｖ領域）において、
（１）前記Ｌ鎖Ｖ領域のFR2中の42位、43位及び46位のアミノ酸がそれぞれグルタミン、セリン及びプロリンにより置換されており、且つ
（２）前記Ｌ鎖Ｖ領域のFR1及びFR3のアミノ酸について下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの置換：
（ａ）前記FR1の20位及び21位のアミノ酸のそれぞれセリン及びバリンへの置換、
（ｂ）前記FR1の20位及び21位のアミノ酸のそれぞれセリン及びバリンへの置換、並びに前記FR3の73位及び87位のアミノ酸のそれぞれロイシン及びフェニルアラニンへの置換、
（ｃ）前記FR1の20位及び21位のアミノ酸のそれぞれセリン及びバリンへの置換、並びに前記FR3の73位、85位及び87位のアミノ酸のそれぞれロイシン、アスパラギン酸及びフェニルアラニンへの置換、
（ｄ）前記FR1の８位、９位及び10位のアミノ酸のそれぞれグルタミン、リジン及びフェニルアラニンへの置換、
が施されていることを特徴とするＬ鎖Ｖ領域、並びにヒトＬ鎖定常領域から構成されるＬ鎖；並びに
以下の構造：
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
から成り、CDR1、CDR2及びCDR3が以下のアミノ酸配列：
CDR1：Asp Thr Tyr Ile His
CDR2：Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
CDR3：Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr
からなる３個のCDRであり、そしてFR1、FR2及びFR3がヒト抗体Eu由来でありそしてFR4がヒト抗体ND由来であることを特徴とするＨ鎖Ｖ領域の４個のFRである構造を有するヒト髄芽腫細胞に対する抗体のＨ鎖Ｖ領域、並びにヒトＨ鎖Ｃ領域から構成されるＨ鎖；
から成るヒト髄芽腫細胞に対する抗体。
【請求項４】
前記Ｌ鎖が、以下の式：
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
で表されるＬ鎖Ｖ領域であり、CDR1、CDR2及びCDR3が以下のアミノ酸配列：
CDR1：Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
CDR2：Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
CDR3：Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala
からなる３個のCDRであり、そしてFR1、FR2、FR3及びFR4が以下の（１）または（２）の配列：
（１）FR1：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
FR2：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
FR3：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
FR4：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
（２）FR1：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
FR2：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
FR3：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
FR4：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
の組み合わせである４個のFRを有するＬ鎖Ｖ領域、並びにＬ鎖Ｃ領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がκC領域であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記Ｈ鎖が、以下の構造：
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を有し、CDR1、CDR2及びCDR3が以下のアミノ酸配列：
CDR1：Asp Thr Tyr Ile His
CDR2：Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
CDR3：Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr
からなる３個のCDRであり、そしてFR1、FR2、FR3及びFR4が以下の配列：
FR1：Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
FR2：Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
FR3：Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Ser
FR4：Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
からなる４個のFRであることを特徴とするＨ鎖Ｖ領域、並びにＨ鎖Ｃ領域を含む、請求項１〜５に記載の抗体。
【請求項７】
前記ヒトＣ領域がγ−1C領域又はγ−4C領域であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
前記Ｌ鎖Ｖ領域が、配列番号58、61、63、66、70又は73に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜107のアミノ酸配列から成り、そして前記Ｈ鎖Ｖ領域が、配列番号80で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜117のアミノ酸配列から成る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＬ鎖をコードするDNA及び請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨ鎖をコードするDNAを一緒に含むベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＬ鎖をコードするDNAを含むベクターと、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨ鎖をコードするDNAを含むベクターとからなる１組のベクター。
【請求項１１】
Ｌ鎖Ｖ領域が、配列番号：58、61、63、66、70又は73で示されるヌクレオチド配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域が、配列番号：80で示されるヌクレオチド配列を有する請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
Ｌ鎖Ｖ領域が、配列番号：58、61、63、66、70又は73で示されるヌクレオチド配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域が、配列番号：80で示されるヌクレオチド配列を有する請求項10に記載の１組のベクター。
【請求項１３】
請求項９〜12のいずれか１項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１４】
請求項13に記載の形質転換体を培養し、次いで産生された目的とする抗体を分離することを特徴とする遺伝子組み換え技術を使用したヒト髄芽腫細胞に対する抗体の製造方法。
【請求項１５】
配列番号：80に記載のアミノ酸配列中アミノ酸番号１から117までのアミノ酸配列から成るＨ鎖Ｖ領域と、配列番号：58、61、63、66、70又は73の内いずれかに記載のアミノ酸配列中アミノ酸番号１から107までのアミノ酸配列から成るＬ鎖Ｖ領域を含んで成り、該Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とがペプチドリンカーを介して連結して成るヒト髄芽腫細胞に対する一本鎖Ｆｖ領域。
【請求項１６】
配列番号：80に記載のアミノ酸配列中アミノ酸番号１から117までのアミノ酸配列から成るＨ鎖Ｖ領域と、配列番号：73に記載のアミノ酸配列中アミノ酸番号１から107までのアミノ酸配列から成るＬ鎖Ｖ領域を含んで成る請求項15に記載の一本鎖Ｆｖ領域。
【請求項１７】
前記リンカーペプチドが次のアミノ酸配列：Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Serを有する請求項15及び16に記載の一本鎖Fv領域。
【請求項１８】
配列番号：89に記載のアミノ酸配列から成るヒト髄芽腫細胞に対する抗体の一本鎖Ｆｖ領域。
【請求項１９】
請求項15から18のいずれか一項に記載の一本鎖Fv領域をコードするDNA。
【請求項２０】
請求項19に記載のDNAを含んで成る組換えDNAベクター。
【請求項２１】
請求項20に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主。
【請求項２２】
請求項21に記載の形質転換体を培養し、該培養物から一本鎖Fv領域を採取することを特徴とする一本鎖Ｆｖ領域の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とから成るヒト／マウスキメラ抗体、ヒト軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及びヒト重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＣＤＲにより置き換えられている再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体およびそれらの抗体を構成するＬ鎖またはＨ鎖に関する。
【０００２】
本発明はさらに、上記の抗体特にそのＶ領域をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒト髄芽腫細胞に対するキメラ抗体の製造方法、及びヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
【０００３】
本発明はまた、ヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域と該抗体のＬ鎖Ｖ領域とを連結して成る一本鎖Ｆｖ領域に関する。本発明はまた、該一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された宿主、及び該宿主を用いる、前記一本鎖Ｆｖ領域の製造方法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
髄芽腫は、グリオーマと共に脳腫瘍の４０％を占める、原始神経外胚葉性腫瘍の一つであり、１０才未満の小児、特に、５〜１０才の間で好発する悪性脳腫瘍である。この腫瘍は胎生期の髄質上皮および基質層を構成する未分化な細胞の形態と配列のパターンを模倣する代表的な未分化腫瘍であり、神経細胞とグリア細胞の両方に分化する可能性を持つ未成熟な腫瘍であるとされている（Ｔａｍｕｒａ，Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：５３８０−５３８４（１９８９））。このような悪性脳腫瘍は、放射線、化学療法剤に感受性を示すことから、放射線療法および化学療法、さらには外科的療法が治療として行われる。
【０００５】
しかしながら、これらの治療法では、一時的な症状の緩解はみられるものの、数年以内に再発死亡するものが多く、平均生存日数は１５カ月である。この原因は再発ガンが化学療法剤、放射線に耐性を持つようになるためであると考えられている。
一方、脳腫瘍の正確な判断は、組織学的手法に負うところが大きく、非常に高度な専門的知識と補助的診断技術が必要である。
【０００６】
従って、早期に診断し、根本的な治療をするための診断薬、治療薬の開発が急務とされている。
従来においても、いくつかの髄芽腫を認識するモノクローナル抗体による治療の試みがされている（Ｋｅｍｓｈｅａｄ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１，１８７−１９５（１９８３）、Ａｌｌａｎ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１，５９１−５９８（１９８３）、Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，５７，６２１−６３１（１９８４）、Ｇｒｏｓｓ，Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６，２９９８−２９９４（１９８６）、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６，５９３３−５９４０（１９８６）、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９，５５４−５５９（１９８７）、Ｆｅｉｃｋｅｒｔ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９，４３３８−４３４３（１９８９）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，８９，６３−７８（１９８９）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．らＮｅｕｒｏｓｕｒｇ．，２７，９７−１０２（１９９０）を参照）。
【０００７】
しかしながら、これらの抗体のほとんどは、正常組織や他の腫瘍をも認識するために、髄芽腫の診断・治療薬としては不適である等の問題がある。
最近、ヒトグリオーマに反応し、ＡＤＣＣ活性を示すヒト由来のモノクローナル抗体を用いた脳腫瘍の免疫療法（特開昭５８−２０１９９４、特開昭５９−１３７４９７、特開平４−３４６７９２を参照）が報告されている。
【０００８】
マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの療法的価値は制限される。さらに、マウス抗体は、予定された効果を妨害するのみならず、患者における不都合なアレルギー応答の危険をもたらす免疫応答を惹起することなくして頻回投与することはできない。
【０００９】
これらの問題を解決するため、ヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクローナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することを期待することができる。
【００１０】
さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来する蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそれ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０−４２２４，１９８９）。
【００１１】
マウス抗体をヒト型化するための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト抗体可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体可変領域を作製する。
【００１２】
次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト抗体定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型抗体のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲと極く一部のフレームワーク（ＦＲ）のみである。ＣＤＲは超可変蛋白質配列により構成されている。これらは種特異的配列を示さない。これらの理由のため、マウスＣＤＲを担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
【００１３】
再構成ヒト抗体についてはさらに、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４，７７３−７８３，１９９１；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，１２４−１３４，１９９１；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１８１−４１８５，１９９１；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７１，１９９１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，１９９１；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２；Ｃｏ．Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４９−１１５４，１９９２；及びＳａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，８５１−８５６，１９９３を参照のこと。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のごとく、再構成ヒト抗体は治療目的のために有用であると予想されるが、ヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体は知られていない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法であって任意の特定の抗体に普遍的に適用し得る方法は存在しない。従って、特定の抗原に対して十分に活性がある再構成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，８５１−８５６（１９９３））。
【００１５】
本発明者等は、髄芽腫患者の小脳より髄芽腫細胞株（ＯＮＳ−７６）を分離・確立した（Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９，５３８０−５３８４（１９８９））。そして、該髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６をマウスに免疫することによりヒト髄芽腫を特異的に認識するが、正常な脳組織と末梢血球細胞とは交差反応しないマウスモノクローナル抗体（ＯＮＳ−Ｍ２１）を見い出した（Ｍｏｒｉｕｃｈｉ，Ｓ．らＢｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６８，８３１−８３７（１９９３））。本抗体が認識する抗原は髄芽腫をはじめ一部のグリオーマ等の脳腫瘍に強く発現していることより、本抗体の診断薬としての利用、さらにはＡＤＣＣ，ＣＤＣの誘導あるいはトキシン、ラジオアイソトープ結合体による癌細胞の直接の破壊が期待される。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明はヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の再構成ヒト抗体に関する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用なヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、マウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の再構成ヒト抗体並びにキメラ抗体の製造のための遺伝子工学的方法に関する。
【００１７】
具体的には、本発明は、
（１）ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域、または
（１）ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、及び前記ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、及びヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒト髄芽腫細胞に対するキメラ抗体、さらには、
【００１８】
（１）ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、及び
（２）ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
を含んで成る、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
を含んで成る、再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域から構成されるヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の再構成ヒト抗体に関する。
【００１９】
本発明はまた、前記種々の抗体を構成するＬ鎖またはＨ鎖のポリペプチド、およびそれらをコードするＤＮＡに関する。
さらに、本発明は、上記ＤＮＡを含んで成る発現ベクターおよび
それら発現ベクターにより形質転換された宿主に関する。
本発明はさらにまた、ヒト髄芽腫細胞に対するキメラ抗体の製造方法、及びヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体の製造方法に関する。
本発明はまた、ヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域と該モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域とを連結して成る一本鎖Ｆｖ領域に関する。
本発明はさらに、上記一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る組換えベクター、及び該組換えベクターにより形質転換された宿主に関する。
本発明はさらに、上記の宿主を培養し、該培養物から一本鎖Ｆｖ領域を採取することを特徴とする、一本鎖Ｆｖ領域の製造方法に関する。
【００２０】
【具体的な説明】
マウス抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをクローン化するためには、マウスモノクローナル抗体産生細胞からｍＲＮＡを調製した後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的とするＤＮＡを増幅することで得られる。このｍＲＮＡの供給源として、ヒト髄芽腫細胞に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することが必要である。この様なハイブリドーマとして、ＯＮＳ−Ｍ２１を挙げることができる。ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１の作製方法を参考例１に後記する。
【００２１】
（１）全ＲＮＡの採取
本発明において、全ＲＮＡを採取するため、ハイブリドーマ細胞を破壊し、グアニジンチオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾配遠心を行った（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９，１９７９）が、すでに他の蛋白質の遺伝子をクローニングする際に用いられた方法、例えばバナジウム複合体等のリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノール処理を行う（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５１４３−５１４９，１９７９）方法を用いることができる。
【００２２】
（２）二本鎖ｃＤＮＡの採取
上記の如くして得た全ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを得るには、全ＲＮＡを鋳型にして、その３′末端にあるｐｏｌｙＡ鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆転写酵素で処理して全ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４−９３８，１９８９）ことができる。また、その時に、ランダムプライマーを用いてもよい。
【００２３】
（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によるマウス抗体Ｖ領域の増幅
次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記ｃＤＮＡからマウス抗体Ｖ領域の特異的増幅を行う。マウス抗体Ｖ領域の増幅には、Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．らＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１に記載されているプライマーを用いることができる。ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１が産生するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のクローニングに用いるプライマーを決定するにあたり、Ｈ鎖およびＬ鎖のタイピングをして両鎖の型を決める必要がある。
【００２４】
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（アマシャムインターナショナルｐｌｃ社製）を用いて、ＯＮＳ−Ｍ２１抗体のタイピングを行った結果、ＯＮＳ−Ｍ２１抗体はＣκ型Ｌ鎖およびγ−１Ｃ型のＨ鎖を有することが明らかになった。ＯＮＳ−Ｍ２１のタイピングについて参考例２に後記する。
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてマウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域を増幅するため、配列番号：１〜１１に示す１１種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００２５】
前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号：１３〜２４に示す１２種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２５に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００２６】
なお、本実施例では５′−末端プライマーはその５′−末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして３′−末端プライマーはその５′−末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有するものを使用している。これらの制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のＤＮＡ断片をクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位でもよい。
【００２７】
次に、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を得るために、増幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩで切断した後、低融点アガロースまたはカラム〔ＰＣＲ産物精製用キット（ＱＩＡＧＥＮ等）、ＤＮＡ精製用キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮII等）など〕により、分離・精製を行う。他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクローニングベクターを同じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩにより切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を連結することにより、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。
【００２８】
クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意の常法例えば、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
目的とするＤＮＡのクローン化及びその配列決定を実施例１及び２に具体的に記載する。
【００２９】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
Ｌ鎖及びＨ鎖の各対のＶ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上の可変領域は共通性のある比較的保存された４個のフレームワークと３個の超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  １９８３）。
【００３０】
前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の多くの部分はβ−シート構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部分を形成することもある。３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。
【００３１】
これらのＣＤＲ領域は、得られた抗体のＶ領域のアミノ酸配列と既知抗体のＶ領域の既知アミノ酸配列とを照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」の経験則から見出すことができ、実施例３において具体的に説明する。
【００３２】
キメラ抗体の作製
ヒト髄芽腫細胞に対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域を形成することを確かめる必要がある。この目的のため、キメラ抗体を作製した。さらに実施例１に記載されるモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のクローン化されたＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒト髄芽腫細胞抗体のアミノ酸配列を既知のマウス及びヒトの抗体のＶ領域と比較した。
【００３３】
モノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のマウスＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ領域をヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗ヒト髄芽腫細胞抗体が得られる。
キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んで成る。
【００３４】
前記ヒト抗体Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＬ鎖ＣκあるいはＨ鎖γ−１Ｃやγ−４Ｃを各々挙げることができる。
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えばＷＯ９１−１６９２８）。
【００３５】
あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
【００３６】
キメラ抗体の作製を実施例４に記載する。
マウスＯＮＳ−Ｍ２１κ型Ｌ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてサブクローンし、ヒトゲノムＬ鎖Ｃκ鎖領域をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のγ１型Ｈ鎖リーダー及びＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いてサブクローン化し、ヒトγ−１Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。
【００３７】
特に設計されたＰＣＲプライマーを用いて、マウスＯＮＳ−Ｍ２１のＶ領域をコードするｃＤＮＡをそれらの５′−及び３′−末端において適当な塩基配列を導入して、それらが発現ベクターに容易に挿入されるように、且つそれらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列の導入により転写効率を上げるように工夫されている）。次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得たマウスＯＮＳ−Ｍ２１のＶ領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＥＦ発現ベクター（図１）に挿入した。これらのベクターは、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現のために適当である。
【００３８】
キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体はヒト髄芽腫細胞に結合する活性を示した。従って正しいマウスＶ領域がクローン化されそして配列が決定されていたことが示された。
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｖ領域の設計
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較した。
【００３９】
マウスＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループIV（ＨＳＧIV）のコンセンサス配列に最も類似しており、６１．９％の相同性が存在する。
マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域は既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、ヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１構成員であるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩに６０．４％の類似性を示した。従って、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてＲＥＩのＦＲを使用した。
【００４０】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１６のバージョン「ａ」〜「ｐ」を設計した。第一のバージョン（バージョン「ａ」）においては、ヒトＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２７，（１９８８））（ＷＯ９２−１９７５９に記載の再構成ヒトＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」）と同一であり、そしてマウスＣＤＲはマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一とした。
【００４１】
表１，２は、マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域、ＲＥＩのＦＲ及び１６バージョンの再構成ＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を示す。
【００４２】
【表１】
0004111554.tif 000002
【００４３】
【表２】
0004111554.tif 000003
【００４４】
注：ＲＥＩのＦＲ中の下線を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列（Ｐａｌｍ，Ｗ．ら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５６，１６７−１９１，１９７５）とは異なるアミノ酸の位置を示す。
マウスＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳＧＩ）のコンセンサス配列に最も類似しており、５７．９％の相同性が存在する。マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ鎖Ｖ領域は既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較において、ＦＲ１からＦＲ３までは、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１構成員であるヒト抗体ＥｕのＨ鎖Ｖ領域（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９，３１６１，１９７０）に非常に類似していた。さらには、ＣＤＲのサイズもマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体とヒト抗体Ｅｕとの間で非常に類似していた。
【００４５】
このため、ヒト抗体ＥｕのＦＲを、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料として用いた。
しかしながら、ヒト抗体ＥｕのＦＲ４のアミノ酸配列は、ヒト抗体のサブグループＩコンセンサス配列と異った配列を有しているために、今回ＦＲ４に関してはヒトＨ鎖Ｖ領域がサブグループＩに属するヒト抗体ＮＤ（Ｋｅｎｔｅｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７９，６６６１−６６６５（１９８２））のＦＲ４のアミノ酸配列を用いることとした。
【００４６】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ鎖Ｖ領域を設計した。ヒトＦＲ１中の２７位、２８位、２９位、３０位およびＦＲ３中の９４位のアミノ酸をマウスＯＮＳ−Ｍ２１のアミノ酸と同一とした。
【００４７】
【表３】
0004111554.tif 000004
【００４８】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体の作製
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｖ領域の作製を実施例５に具体的に記載する。
本発明の再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体は、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒト髄芽腫に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒト髄芽腫に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成るＨ鎖；
から構成される。
【００４９】
特定の抗原に対して十分に活性がある再構成ヒト型化抗体を作成するために、前記ヒトＦＲのアミノ酸配列の一部を置換することが望ましい。
好ましい態様においては、前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲ２の４６位のアミノ酸がプロリンであること、または、４２，４３，４６位のアミノ酸が各々、グルタミン、セリン、プロリンの如きマウスＦＲ由来のアミノ酸を有するものがよく、さらに好ましくは、表１、表２に於けるＲＶＬｉ，ＲＶＬｊ，ＲＶＬｌ，ＲＶＬｍ，ＲＶＬｏ，ＲＶＬｐのアミノ酸配列を有するものである。
【００５０】
前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトκＣ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトγ−１Ｃ領域、ヒトγ−４Ｃ領域等である。あるいは、前記ヒトＬ鎖Ｃ領域および／または前記ヒトＨ鎖Ｃ領域のかわりにトキシン、ラジオアイソトープを結合させてもよい。
【００５１】
再構成抗体の製造のためには、２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して再構成ヒト抗体を生産せしめる（例えば、ＷＯ９１−１６９２７）。
【００５２】
あるいは、再構成Ｌ鎖をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗体を生産せしめる。
さらには、ＦａｂあるいはＦｖを、またはＦｖを連結させたシングルチェインＦｖを適当な宿主で産生させ、前述の目的に使用することができる（例えばＢｉｒｄ等、ＴＩＢＴＥＣＨ，９，１３２−１３７，（１９９１）を参照）。
【００５３】
以上のようにして目的とするキメラ抗体あるいはヒト型化抗体をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体あるいはヒト型化抗体は、細胞内または細胞外から分離し均一にまで精製することができる。
なお、本発明の目的蛋白質であるキメラ抗体あるいはヒト型化抗体の分離・精製を、プロテインＡアガロースカラムを用いて行うことができる。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩折、透析等を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体あるいはヒト型化抗体は分離・精製することができる。
【００５４】
ヒト髄芽腫細胞に対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【００５５】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣK 等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９参照）が含まれる。
【００５６】
また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２７７  １０８（１９７９））、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，５３２２，（１９９０））に従えば容易に実施することができる。
【００５７】
複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３′）IIあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
【００５８】
本発明はまた、ヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結して成る一本鎖Ｆｖ領域を提供する。このＦｖポリペプチドにおいてＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は好ましくはリンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結されている。
一本鎖Ｆｖ領域におけるＨ鎖Ｖ領域は、再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域として前記記載したもののいずれであってもよい。このＨ鎖Ｖ領域は、下記に定義されるアミノ酸配列：
【００５９】
CDR1：Asp Thr Tyr Ile His
CDR2：Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
Gly
CDR3：Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr
またはその一部から成る３個のＣＤＲ、および４個のＦＲを含む。
【００６０】
また、Ｌ鎖Ｖ領域は、下記に定義されるアミノ酸配列：
CDR1：Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
CDR2：Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
CDR3：Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala
またはその一部から成る３個のＣＤＲ、および４個のＦＲを含む。
【００６１】
具体例として、配列番号：８０に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１から１１６までのアミノ酸配列から成るＨ鎖Ｖ領域と、配列番号：４０，４３，４６，４７，５０，５１，５４，５５，５８，６１，６２，６３，６６，６９，７０又は７３の内のいずれかに記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１から１０６までのアミノ酸配列から成るＬ鎖Ｖ領域を含んで成る一本鎖Ｆｖ領域が挙げられる。
また、好ましい１例として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１から１１６までのアミノ酸配列から成るＨ鎖Ｖ領域と配列番号：７３に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１から１０６までのアミノ酸配列から成るＬ鎖Ｖ領域とを含んで成る一本鎖Ｆｖ領域が挙げられる。
【００６２】
これらのＶ領域は好ましくはペプチドリンカーにより連結されている。ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９個から成る任意の一本鎖Ｆｖ領域が挙げられるが、具体的な一例としてGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser （配列番号：９０）から成るペプチド断片が用いられる。
一本鎖Ｆｖ領域の一例のアミノ酸配列を配列番号：８９に示し、このアミノ酸配列を有する一本鎖Ｆｖ領域を、本発明においてｓｃＦｖ−ｈＭ２１と称し、実施例６において詳細に説明する。
【００６３】
本発明の一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡは、すでに詳細に説明した再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ鎖、又はＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、及び再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖、又はＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鎖型とし、それらの配列の内の所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅することにより得られる。
【００６４】
実施例６において、Ｈ鎖Ｖ領域と、Ｌ鎖Ｖ領域バージョンｐとを含んで成る一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡの作製方法を具体的に記載するが、Ｌ鎖Ｖ領域のバージョンａ〜ｏのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの作製方法が詳細に記載されているから、それらにバージョンｐにおいて用いた方法を適用することにより、本発明の種々の一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡを作製することができる。
【００６５】
また、一旦一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主は常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、一本鎖Ｆｖ領域を得ることができる。これらの具体例を実施例６に詳細に記載する。
ＯＮＳ−７６細胞に対するマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体の結合阻害能を指標にしてｓｃＦｖ−ｈＭ２１の抗原結合活性をヒト型化ＯＮＳ−Ｍ２１抗体、およびＦａｂ断片と比較した結果、ｓｃＦｖ−ｈＭ２１はＦａｂ断片と同等の結合阻害能を示した。以上より、オリジナルの抗体と同程度のアフィニティーを持つ一本鎖Ｆｖ領域の構築に成功した。
【００６６】
一般に、一本鎖Ｆｖ領域はｗｈｏｌｅ  ＩｇＧに比べ組織、腫瘍への移行性が優れており、今回構築したｓｃＦｖ−ｈＭ２１は今後ＲＩ標識によるイメージングへの利用、およびトキシン、ＲＩと結合させる事により治療薬としての利用が期待される。
【００６７】
【実施例】
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１．ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化
ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン化した。
【００６８】
１．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の調整
ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１からのｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて調整した。
【００６９】
２．二本鎖ｃＤＮＡの合成
約４μｇのｍＲＮＡよりＴＨＥ  ＣＯＰＹ  ＫＩＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社）を用いてＰＣＲ法を行なった。
【００７０】
（１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅
ＰＣＲ法に使用するプライマーは、マウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列とハイブリダイズする配列番号：１〜１１に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，（１９９１））を用いた。
【００７１】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM  ＫＣｌ，０．１mM  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５mM  ＭｇＣｌ2 ，５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社）、０．１μＭの配列番号１〜１１に示すＭＫＶプライマーと０．４μＭの配列番号１２に示すＭＫＣプライマー及び二本鎖ｃＤＮＡ０．１μｇを含有し、各々のＭＫＣ１〜１２プライマーについて別々に増幅した。これを５０μｌの鉱油で覆った後、９４℃の初期温度にて３分間そして次に９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュベートした。
【００７２】
（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１３〜２４に示すＭＨＶ（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー１〜１２、及び配列番号：２５に示すＭＨＣ−Ｇ１（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，（１９９１））を使用した。
【００７３】
ｃＤＮＡの増幅は、０．２５μＭのそれぞれのＭＨＶプライマーと２．５μＭのＭＨＣ−Ｇ１プライマーの混合物を用いて増幅した点を除いて、前記３．（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を行なった。
４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）にて精製し、そして１０mM  ＭｇＣｌ2 及び１mMジスレイトールを含有する１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．９）中で５ユニットの制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いて３７℃にて３時間消化した。
【００７４】
次に、４０ユニットの制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮＡ断片を、１．５％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。
約４５０bp長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２mM  ＥＤＴＡ及び２００mM  ＮａＣｌを含有する２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM  ＥＤＴＡを含有する１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。
【００７５】
こうして、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウスＨ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片を得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′−末端にＳａｌＩ接着末端を有しそしてその３′−末端にＸｍａＩ接着末端を有する。
５．連結及び形質転換
上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩ  ＤＮＡ断片約０．３μｇを、ＳａｌＩ及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクター約０．１μｇと、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６），１０mM  ＭｇＣｌ2 、１０mMジチオスレイトール、１mM  ＡＴＰ，５０mg／mlのポリエチレングリコール（８０００）及び１ユニットＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）を含有する反応混合物中で、１６℃にて４時間反応させ連結した。
【００７６】
次に、１０μｌの上記連結混合物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞５０μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置した。次いで４００μｌの２×ＹＴ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））を加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【００７７】
この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１０ml中で３７℃にて一夜培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９））に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
【００７８】
こうして得られた、ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＵＣ−Ｍ２１−ＶL と命名した。
上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ  ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH と命名した。
【００７９】
実施例２．ＤＮＡの塩基配列の決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ製）およびＴａｑ  Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ製）を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って塩基配列を決定した。
【００８０】
プラスミドｐＵＣ−Ｍ２１−ＶL に含まれるマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２６に示す。また、プラスミドｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH に含まれるマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２７に示す。
実施例３．ＣＤＲの決定
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
【００８１】
この様な事実に基づき、ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表４に示す如く決定した。
【００８２】
【表４】
0004111554.tif 000005
【００８３】
実施例４．クローン化ｃＤＮＡの発現の確認（キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体の作製）
発現ベクターの作製
キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＯＮＳ−Ｍ２１κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＵＣ−Ｍ２１−ＶL 及びｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH をＰＣＲ法により修飾した。そしてＨＥＦ発現ベクター（前記、ＷＯ９２−１９７５９参照）（図１を参照のこと）に導入した。
【００８４】
Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＯＮＳ−Ｌ７２２Ｓ（配列番号：２８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＯＮＳ−Ｈ３．２Ｓ（配列番号：２９）は、各々のＶ領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＨｉｎｄIII 制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＯＮＳ−Ｌ７２２Ａ（配列番号：３０）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＯＮＳ−Ｈ３．２Ａ（配列番号：３１）は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限部位を有するように設計した。
【００８５】
１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM  ＫＣｌ，１００μＭ  ｄＮＴＰｓ，１．５mM  ＭｇＣｌ2 、１００pmole ずつの各プライマー、１００ngの鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣ−Ｍ２１−ＶL 又はｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH ）、及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ酵素を含有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物を５０μｌの鉱油で覆い、９４℃にて最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【００８６】
ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そしてＬ鎖Ｖ領域については、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶL −ｇκに、Ｈ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶH −ｇγにそれぞれクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−Ｍ２１Ｌ−ｇκ，ＨＥＦ−Ｍ２１Ｈ−ｇγ１と命名した。
【００８７】
ＣＯＳ細胞へのトランスフェクション
キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＥＦ−Ｍ２１Ｌ−ｇκと、ＨＥＦ−Ｍ２１Ｈ−ｇγ１  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０7 細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、１，９００Ｖ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
【００８８】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）に加えた。７２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、５倍量の結合緩衝液で平衡化したプロテインＡアガロースカラム（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳIIキット、ＢｉｏＲａｄ）に適用した。カラムを１５倍量の結合緩衝液で洗浄し、次に５倍量の溶出緩衝液で溶出した。溶出液を濃縮し、そしてマイクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００，Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて緩衝液をＰＢＳに変えた。
【００８９】
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調整した。９６穴プレートに１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培養液により１×１０6 細胞／mlに調整したヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９，５３８０−５３８４，（１９８９））を加え、一晩培養した後、０．１％グルタルアルデヒド（半井化学薬品社製）にて固定した。ブロッキングの後、キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体を順次希釈して、各穴に加え、室温にてインキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。
【００９０】
その結果、キメラ抗体ＯＮＳ−Ｍ２１は、髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６と特異的に結合したことにより、このキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＶ領域の正しい構造を有することが示唆された（図２を参照のこと）。
実施例５．再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体の作製
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。この方法を図３に模式的に示す。ヒト抗体ＲＥＩ由来のＦＲを有する再構成ヒト抗体ＯＮＳ−Ｍ２１（バージョン「ａ」）の作製のために８個のＰＣＲプライマーを使用した。外部プライマーＡ（配列番号：３２）及びＨ（配列番号：３３）は、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶL −ｇｋのＤＮＡ配列とハイブリダイズするように設計された。
【００９１】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＢ（配列番号：３４）、Ｃ（配列番号：３５）及びＤ（配列番号：３６）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲ−グラフティングプライマーＥ（配列番号：３７）、Ｆ（配列番号：３８）及びＧ（配列番号：３９）はアンチ−センスＤＮＡ配列を有しそしてそれぞれプライマーＢ，Ｃ及びＤの５′−末端のＤＮＡ配列に対する相補的ＤＮＡ配列（２３〜３５bp）を有する。
【００９２】
第一ＰＣＲ段階において４つの反応Ａ−Ｅ，Ｂ−Ｆ，Ｃ−Ｇ、及びＤ−Ｈを行い、そして各ＰＣＲ生成物を精製した。第一ＰＣＲからの４つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた（ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマーＡ及びＨを加えて、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを増幅した（第２ＰＣＲ）。前記ＰＣＲにおいては、ヒト抗体ＲＥＩからのＦＲに基く再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコードするプラスミドＨＥＦ−ＲＶL −ＳＫ２ａ（特願平５−１２９７８７を参照）を鋳型として用いた。
【００９３】
第一ＰＣＲ段階においては、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mMＫＣｌ，１００μＭ  ｄＮＴＰｓ，１．５mM  ＭｇＣｌ2 、１００ngの鋳型ＤＮＡ、１００pmole の各プライマー及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する１００μｌのＰＣＲ混合物を用いた。各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆膜した。最初に９４℃で変性した後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応サイクルを行い、次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【００９４】
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｅ（２１８bp），Ｂ−Ｆ（１０１bp），Ｃ−Ｇ（１３１bp）及びＤ−Ｈ（１４７bp）を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいては、１μｇの各第一ＰＣＲの生成物、及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間で２サイクルインキュベートし、そして次に１００pmole の各外部プライマー（Ａ及びＨ）を加えた。ＰＣＲチューブを５０μｌの鉱油で覆い、そして前記と同一の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。
【００９５】
第二ＰＣＲにより生じた５１６bpのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルで精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶL −ｇｋにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４０に示す。
【００９６】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ｂ」を、ＰＣＲを用いる変異誘発法によって作製した。変異原プライマーＦＴＹ−１（配列番号：４１）およびＦＴＹ−２（配列番号：４２）は、７１位のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設計した。
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅した後、最終生成物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングし、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｂ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｂ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号４３に示す。
【００９７】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の各バージョン「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」，「ｉ」，「ｊ」，「ｋ」，「ｌ」，「ｍ」，「ｎ」，「ｏ」，「ｐ」を以下のようにして作製した。
バージョン「ｃ」は、変異原プライマーとして８７位のチロシンがフェニルアラニンに変異するように設計したＭ２１Ｍ２Ｓ（配列番号：４４）およびＭ２１Ｍ２Ａ（配列番号：４５）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｃ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｃ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号４６に示す。
【００９８】
バージョン「ｄ」は、変異原プライマーとしてＦＴＹ−１およびＦＴＹ−２とＭ２１Ｍ２ＳおよびＭ２１Ｍ２Ａを用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｄ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｄ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号４７に示す。
【００９９】
バージョン「ｅ」は、変異原プライマーとして２０位のスレオニンがセリンに、２１位のイソロイシンがバリンに変異するように設計したＭ２１Ｍ３Ｓ（配列番号：４８）およびＭ２１Ｍ３Ａ（配列番号：４９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｅ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｅ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸配列および塩基配列を配列番号５０に示す。
【０１００】
バージョン「ｆ」は、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｃ−ｇκをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｆＩで、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｅ−ｇκをＨｉｎｄIII およびＨｉｎｆＩで各々消化し、１５２bpおよび２５０bpのＤＮＡ断片を得た。これらＤＮＡ断片を１５％低融点アガロースゲルを用いて分離、精製した後、連結し、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬ−ｇκに挿入して、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｆ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｆ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号５１に示す。
【０１０１】
バージョン「ｇ」は、変異原プライマーとして７３位のフェニルアラニンがロイシンに変異するように設計したＭ２１Ｍ４Ｓ（配列番号：５２）およびＭ２１Ｍ４Ａ（配列番号：５３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｆ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号５４に示す。
【０１０２】
バージョン「ｈ」は、変異原プライマーとしてＭ２１Ｍ４ＳおよびＭ２１Ｍ４Ａを用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｈ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｈ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号５５に示す。
【０１０３】
バージョン「ｉ」は、変異原プライマーとして４２位のリジンがグルタミンに、４３位のアラニンがセリンに、４６位のロイシンがプロリンに変異するように設計したＭ２１Ｍ５Ｓ（配列番号：５６）およびＭ２１Ｍ５Ａ（配列番号：５７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号５８に示す。
【０１０４】
バージョン「ｊ」は、変異原プライマーとしてＭ２１Ｍ５Ｓ，Ｍ２１Ｍ５Ａおよび８５位のスレオニンがアスパラギン酸に変異するように設計したＭ２１Ｍ６Ｓ（配列番号：５９）とＭ２１Ｍ６Ａ（配列番号：６０）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｊ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｊ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号６１に示す。
【０１０５】
バージョン「ｋ」は、変異原プライマーとしてＭ２１Ｍ６ＳおよびＭ２１Ｍ６Ａを用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｋ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｋ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号６２に示す。
【０１０６】
バージョン「ｌ」は、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκをＢａｍＨＩおよびＳｆａＮＩで、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκをＨｉｎｄIII およびＳｆａＮＩで各々消化し、２２７bpおよび１６９bpのＤＮＡ断片を分離、精製した。得られたＤＮＡ断片を連結し、発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬ−ｇκに挿入し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｌ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｌ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号６３に示す。
【０１０７】
バージョン「ｍ」は、変異原プライマーとしてＭ２１Ｍ５Ｓ，Ｍ２１Ｍ５Ａおよび８位のプロリンがグルタミン酸に、９位のセリンがリジンに、１０位のセリンがフェニルアラニンに変異するように設計したＭ２１Ｍ７Ｓ（配列番号：６４）とＭ２１Ｍ７Ａ（配列番号：６５）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｍ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｍ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号６６に示す。
【０１０８】
バージョン「ｎ」は、変異原プライマーとして４２位のリジンがグルタミン酸に、４３位のアラニンがセリンに変異するように設計したＭ２１Ｍ８Ｓ（配列番号：６７）およびＭ２１Ｍ８Ａ（配列番号：６８）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｎ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｎ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号６９に示す。
【０１０９】
バージョン「ｏ」は、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｂ−ｇκをＢａｍＨＩおよびＢｓｒＩで、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκをＨｉｎｄIII およびＢｓｒＩで各々消化し、各プラスミドから２５１bpおよび１４２bpのＤＮＡ断片を分離、精製した。得られた各々のＤＮＡ断片を連結し、発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκに挿入し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｏ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｏ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号７０に示す。
【０１１０】
バージョン「ｐ」は、４６位のロイシンをプロリンに変更するように設計した変異原プライマーＭ２１Ｍ９Ｓ（配列番号：７１）およびＭ２１Ｍ９Ａ（配列番号：７２）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号７３に示す。
【０１１１】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを次の様にして設計した。ヒト抗体ＥｕのＦＲ１〜３およびヒト抗体ＮＤのＦＲ４をコードするＤＮＡ配列をＶ領域（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐｔ  Ｈｅａｌｔｈａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）の「ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ」に基いて設計し、そしてマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列とつなげることにより、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを設計した。
【０１１２】
次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′−側及び３′−側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配列を付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるようにした。
こうして設計したＤＮＡ配列を４個のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析した。
【０１１３】
４個のオリゴヌクレオチド配列を配列番号：７４〜７７に示す。これらのオリゴヌクレオチドは１１１〜１３７塩基の長さを有し、２３〜２６bpのオーバラップ領域を有する。オリゴヌクレオチドの内のＶＨ２（配列番号：７４）、ＲＶＨ４（配列番号：７５）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他のＶＨ１（配列番号：７６）、ＲＶＨ３（配列番号：７７）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これら４個のオリゴヌクレオチドのＰＣＲ法によるアセンブリーの方法を図に示す。（図４参照）
【０１１４】
１００ngずつの４種のオリゴヌクレオチド及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて２分間の最初の変性の後、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のから成る２サイクルのインキュベーションを行った。１００ｐmoleずつのＲＨＰ１（配列番号：７８）及びＲＨＰ２（配列番号：７９）を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲチューブを５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の３８サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１１５】
４３８bpのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶH −ｇγ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：８０に示す。
【０１１６】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体の各鎖を評価するため、まず、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１とキメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−Ｍ２１Ｌ−ｇγ１とによりＣＯＳ細胞を前記のようにして同時トランスフェクションし、前記のようにして抗体生成物を回収した後、前記のようにして抗原結合測定にかけた。
【０１１７】
この結果を図５に示す。図５に示すように陽性対照としてのキメラ抗体（ＣｈＭ２１）および再構成Ｈ鎖とキメラＬ鎖とからなる抗体（ＣｈＬ／ＲＶＨ）との間には抗原結合性に差がないことが確認された。
次に、再構成ヒト化ＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖の「ａ」から「ｐ」の各バージョンと再構成ヒト化ＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖との組み合せを評価するため、Ｌ鎖の各バージョンの発現プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκからＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκの内のいずれか一つとＨ鎖発現プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨとをＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションし、前記実施例４のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡに記載のとおりの方法を用いて、得られた抗体について抗原結合測定を行った。その結果Ｌ鎖のバージョン「ａ」から「ｈ」を有する抗体には抗原結合活性が見られなかった（図６を参照のこと）。
【０１１８】
一方、「ｉ」，「ｊ」，「ｌ」，「ｍ」，「ｏ」，「ｐ」の各Ｌ鎖バージョンを有する抗体は、陽性対照であるキメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体（ＣｈＭ２１）に匹敵する程度の良好な抗原結合性を示し、この組み合せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成することが示唆された。なお、Ｌ鎖バージョン「ｋ」および「ｎ」を有する抗体には抗原結合活性が見られなかった（図７を参照のこと）。
このことから、Ｌ鎖ＦＲ２の４６位にプロリンを有する抗体は、良好な抗原結合性を示す機能的抗原結合部位を再形成することが示唆された（表１，２を参照）。
【０１１９】
実施例６．再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）領域の作成
リンカー領域の構築
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser （配列番号：９０）からなるリンカー領域をコードするＤＮＡを次のようにして設計した。リンカー領域をコードするＤＮＡ配列（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３，（１９８８））の５′−側にＨ鎖Ｖ領域のＦＲ４のＣ末端の５アミノ酸残基をコードする１５bpのＤＮＡ配列を、３′−側にＬ鎖Ｖ領域のＦＲ１領域のＮ末端の５アミノ酸残基をコードする１５bpのＤＮＡ配列を付加し、さらにｐＵＣ１９ベクターに挿入できるように、それぞれ５′−側及び３′−側にＨｉｎｄIII 認識部位及びＥｃｏＲＩ認識部位を付加した。
【０１２０】
こうして設計したＤＮＡ配列を基にセンス及びアンチセンス方向の２個のオリゴヌクレオチドｓｃＦｖ−ＳおよびｓｃＦｖ−Ａを合成した。
２個のオリゴヌクレオチド配列を各々配列番号：８１及び８２に示す。これらのオリゴヌクレオチドは８４塩基の長さを有し、８１bpのオーバーラップ領域を有する。
【０１２１】
１００pmole ずつの２種のオリゴヌクレオチドを、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）、１０mM  ＭｇＣｌ2 、１０mM  ジチオスレイトール、１mM  ＡＴＰ、５０mg／mlのポリエチレングリコール（８０００）を含有する反応混合物２０μｌ中で、９６℃にて５分、６５℃まで２０分かけ温度を下げた後、６５℃にて１０分、３７℃まで２０分かけ温度を下げた後、３７℃にて１０分、さらに７℃まで２０分かけ温度を下げた後、７℃にて１夜インキュベートしてアニーリングを行った。
【０１２２】
上記のようにアニーリングしたＤＮＡを、ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクターと連結した。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＵＣ−ｓｃＦｖ−５と命名した。
【０１２３】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域の作製
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域を次の様にして作製した。再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域、及びリンカー領域、及び再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域を作製した。この方法を図８に模式的に示す。再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域の作製のために６個のＰＣＲプライマー（Ａ−Ｅ）を使用した。プライマーＡ，ＣおよびＥはセンス配列を有し、プライマーＢ，ＤおよびＦはアンチセンス配列を有する。
【０１２４】
Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＳＣＰ１（プライマーＡ、配列番号：８３）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＮｃｏＩ認識部位を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＳＣＰ２（プライマーＢ、配列番号：８４）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つリンカーにオーバーラップするように設計した。リンカーのための後方プライマーＳＣＰ３（プライマーＣ、配列番号：８５）は、リンカーのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにオーバーラップするように設計した。
【０１２５】
リンカーのための前方プライマーＳＣＰ４（プライマーＤ、配列番号：８６）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにオーバーラップするように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＳＣＰ４（プライマーＥ、配列番号：８７）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにオーバーラップするように設計した。
【０１２６】
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＷＳ４−２（プライマーＦ、配列番号：８８）は、Ｌ鎖Ｖ領域Ｃ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＦＬＡＧペプチドをコードする配列（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０４−１２１０，１９８８）、２個の転写停止コドン及びＥｃｏＲＩ認識部位を有するように設計した。
【０１２７】
第一ＰＣＲ段階において３つの反応Ａ−Ｂ，Ｃ−Ｄ、及びＥ−Ｆを行い、そして各ＰＣＲ生成物を精製した。第一ＰＣＲから得られた３つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブルさせた。次に、プライマーＡ及びＦを加えて、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域をコードする全長ＤＮＡを増幅した（第２ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１（実施例５を参照）、リンカー領域をコードするプラスミドｐＵＣ−ｓｃＦｖ−５、及び再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ｐ」をコードするプラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκ（実施例５を参照）をそれぞれ鋳型として用いた。
【０１２８】
第一ＰＣＲ段階においては、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mMＫＣｌ、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１．５mM  ＭｇＣｌ2 、１００ngの各鋳型ＤＮＡ、１００pmole の各ＰＣＲプライマー及び５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社）を含有する１００μｌのＰＣＲ混合物を用いた。各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆った後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１２９】
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（３８２bp）、Ｃ−Ｄ（９２bp）、及びＥ−Ｆ（３６３bp）を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第２ＰＣＲでアッセンブルした。第２ＰＣＲにおいては、鋳型として１μｇの各第一ＰＣＲの生成物、及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて２分、５５℃にて２分及び７２℃にて２分間で２サイクルインキュベートし、そして次にそれぞれ１００pmole のプライマーＡ及びＦを加えた。ＰＣＲチューブを５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１分、５５℃にて１分及び７２℃にて２分間で３０サイクルのＰＣＲを行った。
【０１３０】
第二ＰＣＲにより生じた７６７bpのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルで精製し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を発現ベクターｐＳＣＦＶＴ７にクローニングした。なお、本発現ベクターｐＳＣＦＶＴ７は、大腸菌ペリプラズム分泌発現系に適するｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９，４３７９−４３８３，１９８７）を含んでいる。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１と命名した（図９を参照のこと）。本プラスミドｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１に含まれる再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：８９に示す。
【０１３１】
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
１０ngの上記プラスミドｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞５０μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて９０秒間そして再び氷上で１分間静置した。次いで４００μｌの２×ＹＴ培地を加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１３２】
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域の発現誘導
この形質転換体を、１％グルコース及び５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））３０ml中で３７℃にて一夜培養した。次に、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地で１００倍に希釈し、３７℃にて培養した。６５０nmでの吸光度が０．３程度に達したところで、最終濃度が０．５mMになる様にｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加し、Ｔ７プロモーターの発現を誘導した。
【０１３３】
３７℃にてさらに一夜培養した後、培地を回収し、遠心分離により細胞破片を除去し、等量のＰＢＳを加え、１５mlの０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（pH３．０）で平衡化した後、等量のＰＢＳにて中和した抗ＦＬＡＧアフィニティーカラム（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ，ＩＢＩ）に適用した。カラムを３倍量のＰＢＳで洗浄し、次に６mlの０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（pH３．０）で溶出した。溶出液を濃縮し、マイクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０，Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて緩衝液をＰＢＳに変えた。
【０１３４】
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
マウスモノクローナルＯＮＳ−Ｍ２１抗体の抗原結合に対する阻害活性を指標に再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域の抗原結合活性を測定した。前記のようにして調整したＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングの後、５００ng／mlの濃度のマウスモノクローナルＯＮＳ−Ｍ２１抗体と一緒に順次希釈した再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体及び再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体より調整したＦａｂ断片を各穴に加え、室温にてインキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。
【０１３５】
その結果、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ−ｈＭ２１）は再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体（ｈＭ２１）に比べ約１／１０程度に阻害活性が減少していたものの、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体より調整したＦａｂ断片（ｈＭ２１−Ｆａｂ）と同程度の阻害活性を示した（図１０を参照のこと）。
このことから、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域は、オリジナルの再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体と同程度のアフィニティーを示すことが示唆された。
【０１３６】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκ）、およびプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１を含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成５年１１月１８日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４７２および、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４７１としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１３７】
参考例１．ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１の作製
抗ヒト髄芽腫細胞モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ヒト髄芽腫細胞ＯＮＳ−７６で免役したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１をポリエチレングリコールを用いた常法により融合して作製した。髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６と結合する活性を指標としたスクリーニングを行い、ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１を樹立した（Ｍｏｒｉｕｃｈｉ，Ｓ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６８，８３１−８３７（１９９３））。
【０１３８】
参考例２．マウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のタイピング
ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１をマウス腹腔に移植し、得られた腹水をプロテインＡアガロースカラムにかけ、精製マウスモノクローナル抗体を得た。得られたマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖およびＨ鎖のタイプを調べるために、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（アマシャムインターナショナルｐｌｃ社製）を用いてタイピングを行った。その結果、ＯＮＳ−Ｍ２１抗体はκ型Ｌ鎖およびγ１型Ｈ鎖を有することが明らかになった。
【０１３９】
【配列表】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【０１４２】
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【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
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【０１７６】
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【０１７７】
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
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【０１９７】
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【０１９８】
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【０１９９】
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【０２００】
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【０２０１】
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【０２０２】
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【０２０３】
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【０２０４】
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【０２０６】
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【０２０７】
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【０２０９】
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【０２１０】
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【０２１１】
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【０２１２】
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【０２１３】
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【０２１４】
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【０２１５】
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【０２１６】
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【０２１７】
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【０２１８】
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【０２１９】
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【０２２０】
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【０２２１】
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【０２２２】
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【０２２３】
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【０２２４】
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【０２２５】
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【０２２６】
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【０２２７】
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【０２２８】
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【０２２９】
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【０２３０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、それぞれＬ鎖およびＨ鎖の発現のために有用な、ヒトＥＦ１−αプロモーター／エンハンサーを含んでなる発現プラスミドＨＥＦ−ＶＬ−ｇκおよびＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１を示す。
【図２】図２は、キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体（ＣｈＭ２１）のヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６に対する結合能を示すグラフである。
【図３】図３は、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第１バージョン（バージョン「ａ」）の作製ダイヤグラムである。
【図４】図４は、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｖ領域の作製のダイヤグラムである。
【図５】図５は、再構成ヒトＨ鎖とキメラＬ鎖からなる抗体のヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６に対する結合能を示すグラフである。
【図６】図６は、再構成ヒトＨ鎖と再構成ヒトＬ鎖のバージョン「ａ」から「ｈ」の内一つとからなる８種類の再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６に対する結合能を、キメラ抗体（ＣｈＭ２１）と比較して示す図である。
【図７】図７は、本発明の再構成ヒトＨ鎖と再構成ヒトＬ鎖のバージョン「ｉ」，「ｊ」，「ｌ」，「ｍ」，「ｏ」および「ｐ」の内一つとからなる６種類の再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６に対する結合能を、キメラ抗体（ＣｈＭ２１）と再構成Ｌ鎖バージョン「ｋ」および「ｎ」を有する抗体と比較して示す図である。
【図８】図８は、本発明の一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡの作製過程を模式的に示す図である。
【図９】図９は、本発明の一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡを発現させるために使用する発現プラスミドの一例の構造を示す。
【図１０】図１０は、本発明の一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ−ｈＭ２１）の抗原結合活性を、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体及び該抗体のＦａｂ断片の抗原結合活性と比較して、マウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の抗原結合に対する阻害を指標として示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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