(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｌｅｕ−Ｘａａ8−Ｐｒｏ−Ｘａａ10
を有する直鎖ＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
［式中、
Ｘは、７個以下の炭素原子を有するアシル基、またはＱであり、
該Ｑは、
0004191259.tif 000009
（式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキル（Ｃ1〜Ｃ5）である。）であり、
Ａは、４Ｃｌ、４Ｆ、４Ｂｒ、４ＮＯ2、４ＣＨ3、４ＯＣＨ3、３，４Ｃｌ2、またはＣαＭｅ４Ｃｌであり、
Ｘａａ3は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ、またはＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、
Ｘａａ5は、Ｔｙｒ、Ａｐｈ（アミノフェニルアラニン）（Ｑ1）、Ａｍｆ（アミノメチルフェニルアラニン）（Ｑ1）、またはＬｙｓ（Ｎｉｃ）
（ここで、Ｑ1は、Ｑ、Ｆｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、β−Ａｌａ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｇａｂ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、
0004191259.tif 000010
である。）であり、
Ｘａａ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ2）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ2）、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ、またはＤ−Ｐａｌ（ここで、Ｑ2は独立して、Ｑ1の構成員のいずれかである。）であり、
Ｘａａ8は、Ｌｙｓ（ｉｐｒ）、Ａｒｇ、Ｈａｒ、Ｈａｒ（Ｅｔ2）、またはＡｒｇ（Ｅｔ2）であり、そして
Ｘａａ10は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、Ｇｌｙ−ＮＨ2、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2、Ａｌａ−ＮＨ2、Ａｇｌ−ＮＨ2、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ2、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2、またはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2であり、
Ｘａａ5のα−アミノ基は、メチル化されていてもよく、Ｌｅｕ7の代わりにＰｈｅ7を用いてもよく、
Ｄｐｒは、α，β−ジアミノプロピオン酸を意味し、
Ｎｉｃは、ニコチノイルを意味し、
Ｆｏｒは、ホルミルを意味し、
Ｇａｂは、ガンマアミノ酪酸を意味し、
ｉｐｒは、イソプロピルを意味する。］
【請求項２】
請求項１に記載のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドであって、
Ｘは、Ｆｏｒ、Ａｃ、Ａｃｒ、Ｐｎ、Ｂｙ、Ｖｌ、Ｖａｃ、Ｂｚ、またはＱであり、
Ｘａａ5は、Ａｐｈ（Ｑ1）またはＡｍｆ（Ｑ1）（ここでＱ1は、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、Ｑ、または
0004191259.tif 000011
である。）であり、
Ｘａａ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ2）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ2）、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ、またはＤ−Ｐａｌ（ここで、Ｑ2は、Ｆｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、Ｑ、または
0004191259.tif 000012
である。）であり、
Ｑ、Ａ、Ｘａａ3、Ｘａａ8、およびＸａａ10は、請求項１で定義したものであり、
Ｘａａ5のα−アミノ基は、メチル化されていてもよく、
Ｆｏｒは、ホルミルを意味し、
Ａｃｒは、アクリリルを意味し、
Ｐｎは、プロピオニルを意味し、
Ｂｙは、ブチリルを意味し、
Ｖｌは、バレリルを意味し、
Ｖａｃは、ビニルアセチルを意味し、
Ｂｚは、ベンゾイルを意味する、ＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項３】
式：
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｌｅｕ−Ｌｓｙ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2
を有する請求項１に記載のＧｎＲＨ拮抗物質または薬学的に許容可能なその塩。
［式中、
Ｘは、７個以下の炭素原子を有するアシル基、またはＱであり、
該Ｑは、
0004191259.tif 000013
（式中、Ｒは、Ｈ、メチル、またはエチルである。）であり、
Ｘａａ3は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、またはＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、
Ｘａａ5は、Ａｐｈ（Ａｃ）、Ａｐｈ（Ｑ）、Ａｍｆ（Ｑ）、またはＡｐｈ（ａｔｚ）であり、そして
Ｘａａ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ａｃ）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ）、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ）、またはＤ−Ａｐｈ（ａｔｚ）であり、
ｉｐｒは、イソプロピルを意味し、
Ｄｐｒは、α，β−ジアミノプロピオン酸を意味する。］
【請求項４】
ＸがＡｃであり、Ｘａａ5が４Ａｐｈ（Ｑ1）または４Ａｍｆ（Ｑ1）であり、Ｘａａ6がＤ−４Ａｐｈ（Ｑ2）またはＤ−４Ａｍｆ（Ｑ2）であり、Ｘａａ8がＬｙｓ（ｉｐｒ）であり、Ｘａａ10がＤ−Ａｌａ−ＮＨ2であり、
ｉｐｒは、イソプロピルを意味する、
請求項１または請求項２に記載のＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項５】
Ｘａａ5が４Ａｐｈ（Ａｃ）であり、Ｘａａ6がＤ−４Ａｐｈ（Ａｃ）であるか、あるいはＸａａ5が４Ａｐｈ（ａｔｚ）であり、Ｘａａ6がＤ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）である請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載のＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項６】
Ｘａａ5がＴｙｒであり、Ｘａａ6がＤ−ｃｉｔであるか、またはＸａａ5がＬｙｓ（Ｎｉｃ）であり、Ｘａａ6がＤ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）であるか、またはＸａａ5がＴｙｒであり、Ｘａａ6がＤ−Ｈｃｉであり、
Ｎｉｃは、ニコチノイルを意味する、請求項１または請求項２に記載のＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項７】
Ｘａａ3がＤ−Ｇｌｎである請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載のＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項８】
Ｘａａ3がＧｌｎである請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載のＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項９】
Ｘａａ3がＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、ＲがＨ、Ｍｅ、またはＥｔであり、Ｄｐｒはα，β−ジアミノプロピオン酸を意味する、請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載のＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項１０】
次式：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2；Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2；およびＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（式中、Ｘａａ3は、Ｄ−ＧｌｎまたはＧｌｎである。）の１つを有し、Ｄｐｒはα，β−ジアミノプロピオン酸を意味し、ｉｐｒはイソプロピルを意味する、請求項１に記載のＧｎＲＨ拮抗物質。
【請求項１１】
非毒性の希釈剤とともに、活性成分として、有効量の、請求項１乃至請求項１０のいずれか一項に記載のＧｎＲＨ拮抗物質を含む、哺乳動物でのゴナドトロピン分泌を抑制するための医薬組成物。
【請求項１２】
ＧｎＲＨが過剰なホルモン分泌または腫瘍の増殖を引き起こしている状態のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断に使用するための処方剤の製造における、請求項１乃至請求項１１のいずれか一項に記載のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドの使用であって、その診断において、ＧｎＲＨ拮抗物質を投与することと、ホルモン分泌または腫瘍細胞増殖をモニタすることを特徴とする使用。
【請求項１３】
有効量を投与することによって、哺乳動物でのゴナドトロピン分泌を抑制するのに使用するための医薬の製造のための請求項１〜１０に記載のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に、ヒトゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の拮抗物質であるペプチドであって、有利な物理的、化学的、および生物学的特性を有するペプチドに関する。より詳細には、生殖腺機能と、ステロイドホルモンであるプロゲステロンおよびテストステロンの放出とを長時間にわたって抑制し、共通点のあるＧｎＲＨペプチド拮抗物質より製造費用が安い、デカペプチド、ならびにこのような目的において、特に生殖腺ステロイドの過剰分泌によって生じる諸状態を管理するために、このデカペプチドを含有する医薬品組成物を投与する方法に関する。
発明の背景
ゴナドトロピンまたは性腺刺激ホルモンと呼ばれることもある、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体化ホルモン（ＬＨ）は、柄によって視床下部に付いている下垂体から放出される。
通常、下垂体前葉からホルモンが放出されるには、例えばＧｎＲＨデカペプチドなどの、視床下部で産生されるホルモンが予め放出される必要がある。
一般に哺乳動物においてゴナドトロピンの分泌を抑制するために、また排卵を抑制または遅延するために、ＧｎＲＨの正常な作用に拮抗するＧｎＲＨアナログの投与が用いられてきた。
改善されたＧｎＲＨ拮抗物質の探求の結果、アンチド（Ａｎｔｉｄｅ）すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌl，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ2，Ｄ−３Ｐａｌ3，Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）5，Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）6，ＩＬｙｓ8，Ｄ−Ａｌａ10］−ＧｎＲＨ；およびセトロレリックス（Ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ2，Ｄ−３Ｐａｌ3，Ｄ−Ｃｉｔ6，Ｄ−Ａｌａ10］−ＧｎＲＨが生成された。米国特許第５，５１６，８８７号には、血漿テストステロンの抑制においてアンチドより有効であると言われるＧｎＲＨ拮抗物質、例えばアンタレリックス（Ａｎｔａｒｅｌｉｘ）と呼ばれる［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ2，Ｄ−３Ｐａｌ3，Ｄ−Ｎε−カルバモイルＬｙｓ6，ＩＬｙｓ8，Ｄ−Ａｌａ10］−ＧｎＲＨについて記載されている。
１９９４年３月２２日発行の米国特許第５，２９６，４６８号には、多くのＧｎＲＨ拮抗物質の設計および合成について開示されているが、ここでは、選択された残基の側鎖は反応してシアノグアニジノ部分を生じ、その一部は続いて自発的に所望の複素環に変換するものであり、例えば３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（ａｔｚ）がある。このようなシアノグラニジノ部分は、リジン、オニチン、４−アミノフェニルアラニン（４Ａｐｈ）、または４Ａｐｈの延長鎖型である４−アミノホモフェニルアラニン（４Ａｈｐ）などのアミノ酸側鎖のオメガアミノ基において形成される。このように有意に修飾されたアミノ酸または非天然アミノ酸を５位および６位に有するＧｎＲＨ拮抗物質は、良好な生物学的な効力を呈し、シアノグラニジノ部分がＡｐｈ上に作られているものが一般に好ましいとされている。特に好ましいＧｎＲＨ拮抗物質は、アザリンＢ（Ａｚａｌｉｎｅ  Ｂ）Ｂ、すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ2，Ｄ−３Ｐａｌ3，４Ａｐｈ（ａｔｚ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）6，ＩＬｙｓ8，Ｄ−Ａｌａ10］−ＧｎＲＨである。米国特許第５，５０６，２０７号には、５位および６位の残基のアミノ置換フェニルアラニン側鎖がアシル化されている生物作用能が大きいＧｎＲＨ拮抗物質が開示されているが、特に効力の大きいデカペプチドは、アシリン（Ａｃｙｌｉｎｅ）、すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ2，Ｄ−３Ｐａｌ3，４Ａｐｈ（Ａｃ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）6，ＩＬｙｓ8，Ｄ−Ａｌａ10］−ＧｎＲＨである。
これらのＧｎＲＨ拮抗物質が有する魅力ある特性にもかかわらず、より一層改善されたＧｎＲＨ拮抗物質、特に生物学的作用が長時間持続するＧｎＲＨ拮抗物質の探求は今日まで続いている。ペプチドアナログは、短期および長期の治療適応症のいずれの場合にも、ＬＨ分泌に対する活性の持続時間が長いものであること、すなわち体内でのタンパク質分解酵素に対する分解ペプチドの抵抗性によって助長される特性を呈すること、および比較的わずかなヒスタミン放出を刺激することがしばしば重要となる。さらに、これらの化合物をゲル化することなしに、哺乳動物、特にヒトに対して投与することを容易にするには、このようなＧｎＲＨ拮抗物質デカペプチドが、通常の生理学的ｐＨ、すなわち約ｐＨ５から約ｐＨ７．４において、水に対する溶解度が高いことが非常に有利であると考えられる。さらに、これらの化合物は臨床的究明目的のためと考えられるため、上記ペプチドはすべて、購入または合成するのに特に安価な保護アミノ酸を必用とし、３位にある３Ｐａｌを利用していることに注意すべきである。より安価に合成することができる生物作用能が等しいアナログは、魅力的であり、３位が、費用減少を図る１つの標的である。
発明の概要
セトロレリックス、アンタレリックス、アシリン、アザリンＢ、アンチドなどを含む、直鎖ＧｎＲＨ拮抗物質のサブクラスにおいて、より安価な３位の残基を置換することにより、生物作用能を減少させないで費用を安くすることができることが判明した。これらのアナログは、今まで好ましいとされたＤ−３Ｐａｌ３を含有するペプチドよりも製造費用が安価であるだけでなく、生物活性の持続期間が長いという特に有利な特性がしばしば意外にも得られる。一般に、式：
Ｘ−Ｄ−２Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｌｅｕ−Ｘａａ8−Ｐｒｏ−Ｘａａ10
を有するＧｎＲＨ拮抗物質デカペプチド、密接に関連するそのアナログ、および薬剤学的に許容可能なその塩は、類似する従来技術の化合物よりも合成費用が安価であり、特に生物活性持続期間が長いという改善された薬理学的特性をしばしば有する：
上式で、
Ｘは、７個以下の炭素原子を有するアシル基、またはＱであり、
該Ｑは、
0004191259.tif 000002
であり、
式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ａは、４Ｃｌ、４Ｆ、４Ｂｒ、４ＮＯ2、４ＣＨ3、４ＯＣＨ3、３，４Ｃｌ2、またはＣαＭｅ４Ｃｌであり、
Ｘａａ3は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ、またはＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、
Ｘａａ5は、Ｔｙｒ、Ａｐｈ（Ｑ1）、Ａｍｆ（Ｑ1）、またはＬｙｓ（Ｎｉｃ）であって、式中Ｑ1は、Ｆｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、β−Ａｌａ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｇａｂ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−Ｈｏｒ、Ｄ／Ｌ−Ｈｏｒ、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−Ｈｏｒ、またはＤ／Ｌ−Ｈｏｒであり、
Ｘａａ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ2）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ2）、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ2は、Ｑ、Ｆｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、β−Ａｌａ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｇａｂ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−Ｈｏｒ、Ｄ／Ｌ−Ｈｏｒ、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−Ｈｏｒ、またはＤ／Ｌ−Ｈｏｒであり、
Ｘａａ8は、Ｌｙｓ（ｉｐｒ）、Ａｒｇ、Ｈａｒ、Ｈａｒ（Ｅｔ2）、またはＡｒｇ（Ｅｔ2）であり、そして
Ｘａａ10は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、Ｇｌｙ−ＮＨ2、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2、Ａｌａ−ＮＨ2、Ａｇｌ−ＮＨ2、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ2、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2、またはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2であり、
ただし、Ｘａａ5のα−アミノ基は、任意選択でメチル化されていてもよい。
別の態様において、本発明は、ＧｎＲＨが過剰なホルモン分泌または腫瘍の増殖を引き起こしている状態をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法を提供するものであり、該方法には、前記種類のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドを投与することと、ホルモン分泌および腫瘍細胞の増殖をモニタすることとが含まれる。
これらの拮抗物質は、デカペプチドの３位に存在する残基の結果、活性の持続期間が長いため、すなわち少なくとも約４日間にわたってＬＨの分泌を有意に抑制しつづけるために、ヒトでのゴナドトロピンの分泌の抑制、および受胎能調整剤として特に有効である。生理学的ｐＨでの水性緩衝液へのこれらの溶解性は非常によく、ヒスタミン放出の刺激に関する副作用も許容でき、すなわち現在臨床的に用いられているＧｎＲＨスーパーアゴニストに比べてより良好である。さらに、皮下（ＳＣ）注射してもゲル化は最小限しか認められない。これらのＧｎＲＨ拮抗物質は、比較的小さな膨疹を引き起こすアナフィラキシーアッセイ（ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄ  ａｓｓａｙ）においても良好に機能する。その結果、これらのペプチドを、受胎能調整剤として、あるいは性的早熟症、ホルモン依存性腫瘍形成、月経困難症、子宮内膜症、ステロイド依存性腫瘍、およびその他本明細書で先に言及した短期適応症もしくは長期適応症の治療用に、哺乳動物、特にヒトへの投与において、特に用いることが見出される。これらは診断にも有用である。
これらのＧｎＲＨ拮抗物質は、約５から約７．４の生理学的ｐＨ範囲で容易に溶解するため、特にｐＨ約５からｐＨ約７において濃縮された形態で製剤化および投与することができる。その極性ゆえに、既知コポリマーをベースとした徐放性調製品での使用に特に適している。３位の置換ゆえに、これらのアナログは、Ｄ−Ｐａｌ3を含有する共通点のあるアナログよりも製造費用が安価である。これらのＧｎＲＨ拮抗物質は、長期にわたってＬＨおよびＦＳＨの抑制に有効であるため、雄哺乳動物の避妊治療に（テストステロンを任意選択で投与しながら）、およびステロイド依存性腫瘍の治療に、特に有効でもある。
好ましい実施形態の詳細な説明
最近１０年から１２年にわたって、有効な拮抗物質をつくるという観点から、ＧｎＲＨ配列における１０個の残基それぞれの特性について徹底した研究がなされてきた。その結果、等価な残基として選択し得る種々の残基があること、およびこれらの等価な残基の１つを別の等価な残基と置換してもデカペプチドＧｎＲＨ拮抗物質の生物作用能が有意に損なわれることはないことが分かった。本発明のＧｎＲＨ拮抗物質において、このような等価な置換を行うことができる。
例えば、パラ−置換Ｄ−Ｐｈｅ、２，４ジクロロ−置換Ｄ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ｃαメチル４ＣｌＰｈｅ残基を２位に有するようにすると、ＧｎＲＨ拮抗物質の活性は有意に増すが、環置換基の特有の独自性は、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、メチル、およびアルコキシの中から選択した場合には、あまり重要でないことが一般に認められている。したがって、２位のこのような残基は、一般的に用いるＤ−４ＣｌＰｈｅの等価体であると考えられる。Ｎ末端は、好ましくはアセチル（Ａｃ）により、Ｎ−アシル化されていることが好ましいが、例えばホルミル（Ｆｏｒ）、アクリリル（Ａｃｒ）、プロピオニル（Ｐｎ）、ブチリル（Ｂｙ）、バレリル（Ｖｌ）、ビニルアセチル（Ｖａｃ）、およびベンゾイル（Ｂｚ）などの７個以下の炭素原子を有するその他のアシル基により、Ｎ−アシル化されていても好ましい。あるいは、置換カルバモイルまたは非置換カルバモイルが存在していてもよい。その他のより長いアシル基も等価体であると考えられるが、あまり好ましくない。米国特許第５，１１０，９０４号に開示されているように、５位の残基のα−アミノ基を任意選択でメチル化して水溶性を高めることもできるが、このような修飾を行うとＬＨ抑制持続期間が短縮され、ヒスタミン放出の可能性が大きくなる。Ｃ末端は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2であることが好ましいが、Ｇｌｙ−ＮＨ2、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2、Ａｌａ−ＮＨ2、Ａｇｌ−ＮＨ2、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ2、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2、およびＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2も、既知の等価体と考えられることから、代わりに使用することができる。
本明細書で先に開示したように、本発明は、３位を置換して既知のＧｎＲＨ拮抗物質を一般的に改良した、下式で表されるＧｎＲＨ拮抗物質の部類（ｇｅｎｕｓ）を提供し、該式は、
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｌｅｕ−Ｘａａ8−Ｐｒｏ−Ｘａａ10
であって、上式で、
Ｘは、７個以下の炭素原子を有するアシル基、またはＱであり、
該Ｑは、
0004191259.tif 000003
であり、
式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ａは、４Ｃｌ、４Ｆ、４Ｂｒ、４ＮＯ2、４ＣＨ3、４ＯＣＨ3、３，４Ｃｌ2、またはＣαＭｅ４Ｃｌであり、
Ｘａａ3は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ、またはＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、
Ｘａａ5は、Ｔｙｒ、Ａｐｈ（Ｑ1）、Ａｍｆ（Ｑ1）、またはＬｙｓ（Ｎｉｃ）であり、式中Ｑ1は、Ｆｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、β−Ａｌａ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｇａｂ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−Ｈｏｒ、Ｄ／Ｌ−Ｈｏｒ、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−Ｈｏｒ、またはＤ／Ｌ−Ｈｏｒであり、
Ｘａａ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ2）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ2）、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ2は、Ｑ、Ｆｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、β−Ａｌａ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｇａｂ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−ＨＯｒ、Ｄ／Ｌ−Ｈｏｒ、Ｄ−Ｈｏｒ、Ｌ−Ｈｏｒ、またはＤ／Ｌ−Ｈｏｒであり、
Ｘａａ8は、Ｌｙｓ（ｉｐｒ）、Ａｒｇ、Ｈａｒ、Ｈａｒ（Ｅｔ2）、またはＡｒｇ（Ｅｔ2）であり、そして
Ｘａａ10は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、Ｇｌｙ−ＮＨ2、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2、Ａｌａ−ＮＨ2、Ａｇｌ−ＮＨ2、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ2、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2、またはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2であり、
ただし、Ｘａａ5のα−アミノ基は、任意選択でメチル化されていてもよい。
Ｄ−Ｎａｌは、β−炭素原子でナフチルが置換したアラニンのＤ−異性体を意味し、すなわちβ−Ｄ−Ｎａｌまたは３−Ｄ−Ｎａｌともいう。ナフタレンとの結合が環構造上の２位である、Ｄ−２Ｎａｌを用いることが好ましいが、Ｄ−１Ｎａｌを用いることもできる。Ｄ−ＣＰａは、クロロ−Ｄ−Ｐｈｅを表わしており、Ｄ−４ＣｌＰｈｅすなわちＤ−４ＣＰａが好ましい。Ｄ−Ｐａｌは、β−炭素原子でピリジルが置換したアラニンのＤ−異性体を表わし、ピリジン環の３位に結合していること、すなわちβ−３−ピリジル−Ｄ−Ａｌａであることが好ましい。Ｄ−２Ｐａｌは、等価体であると考えられる。４Ａｐｈは、フェニル環上のアミノ置換基が４位にある４ＮＨ2Ｐｈｅを意味し、３ＮＨ2Ｐｈｅ（３Ａｐｈ）は、それの等価体であると考えられる。４Ａｍｆは、メチレン結合を介してフェニル環に結合しているフェニルアラニンを意味する。４位に結合していることが好ましいが、３Ａｍｆが、等価体であると考えられる。Ｇａｂは、ガンマアミノ酪酸を意味する。ａｔｚは、３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを意味する。Ａｐｈ（ａｔｚ）は、より正確な化学名である４−（３′−アミノ−１Ｈ−１′，２′，４′−トリアゾール−５′−イル）アミノフェニルアラニンでも知られている。Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）は、Ｎε−ニコチノイルリジンを意味し、すなわちＬｙｓのε−アミノ基が３−カルボキシピリジンでアシル化されている。Ｈａｒは、ホモアルギニンを意味する。Ｄ−Ｃｉｔは、シトルリンのＤ−異性体を意味し、Ｄ−Ｈｃｉは、Ｄ−Ｎε−カルバモイルリジンとも呼ばれる、ホモシトルリンのＤ−異性体を意味する。ＩＬｙｓまたはＬｙｓ（ｉｐｒ）は、Ｎε−イソプロピルリジン、すなわちＬｙｓのε−アミノ基がアルキル化されていることを意味する。ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2は、ＮＨＮＨＣＯＮＨ2を意味する。Ｄｂｕは、アルファ、ガンマ−ジアミノ酪酸を意味し、Ｄｐｒは、α，β−ジアミノプロピオン酸を意味する。Ａｇｌは、α−アミノグリシンを意味し、Ａｇｌ（Ｍｅ）では、アミの基の側鎖がメチル化されている。Ｃｂｍは、カルバモイルを意味し、ＭｅＣｂｍは、メチルカルバモイルまたは−ＣＯＮＨＣＨ3を意味する。低級アルキルは、Ｃ1〜Ｃ5を意味し、好ましくはＣ1からＣ3を、さらに好ましくはＣ1またはＣ2、すなわちメチル（Ｍｅ）またはエチル（Ｅｔ）を意味する。
これらＧｎＲＨ拮抗物質の６位に組み込まれる好ましいＤ−異性体を具体例によって開示したが、過去２０年にわたる当分野の広範な研究の結果、多くの既知の等価なＤ−異性体が存在する。このような従来技術のＤ−異性体置換によって、これらの改良化合物の生物作用能、特に本明細書に開示した３位の置換によって得られるより長い持続時間と合致するものであって、これが損なわれることもなく、したがって該置換を任意選択で用いることができる。同様に、Ｌｕｅ7をＰｈｅ7で置換して、等価な特性を有するＧｎＲＨ拮抗物質を得ることができる。
ＧｎＲＨ拮抗物質の好ましい下位部類（ｓｕｂｇｅｎｕｓ）は、式：
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｌｅｕ−Ｌｓｙ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2
であって、上式で、
Ｘは、７個以下の炭素原子を有するアシル基、またはＱであり、
該Ｑは、
0004191259.tif 000004
であり、
式中Ｒは、Ｈ、メチル、またはエチルであり、
Ｘａａ3は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、またはＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、
Ｘａａ5は、Ａｐｈ（Ａｃ）、Ａｐｈ（Ｑ）、Ａｍｆ（Ｑ）、またはＡｐｈ（ａｔｚ）であり、そして
Ｘａａ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ａｃ）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ）、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ）、またはＤ−Ａｐｈ（ａｔｚ）である。
本発明の特徴を具体化した、５位および６位に別の置換を含む、別のＧｎＲＨ拮抗物質の部類は、式：
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｌｅｕ−Ｘａａ8−Ｐｒｏ−Ｘａａ10
であって、上式で、
Ｘは、Ｆｏｒ、Ａｃ、Ａｃｒ、Ｐｎ、Ｂｙ、Ｖｌ、Ｖａｃ、Ｂｚ、またはＱであって、
該Ｑは、
0004191259.tif 000005
であり、
式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ａは、４Ｃｌ、４Ｆ、４Ｂｒ、４ＮＯ2、４ＣＨ3、４ＯＣＨ3、３，４Ｃｌ2、またはＣαＭｅ４Ｃｌであり、
Ｘａａ3は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ、またはＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、
Ｘａａ5は、Ａｐｈ（Ｑ1）またはＡｍｆ（Ｑ1）であって、式中Ｑ1は、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、Ｑ、
0004191259.tif 000006
であり、
Ｘａａ6は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ2）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ2）、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ2は、ＦｏｒまたはＱ1であり、
Ｘａａ8は、Ｌｙｓ（ｉｐｒ）、Ａｒｇ、Ｈａｒ、Ｈａｒ（Ｅｔ2）、またはＡｒｇ（Ｅｔ2）であり、そして
Ｘａａ10は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、Ｇｌｙ−ＮＨ2、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2、Ａｌａ−ＮＨ2、Ａｇｌ−ＮＨ2、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ2、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2、またはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ2であり、
ただし、Ｘａａ5のα−アミノ基は、任意選択でメチル化されていてもよい。
Ｈｏｒは、Ｌ−ヒドロオロチルまたはヒドロオロト酸を意味する。Ｉｍｚは、Ｌ−２−イミダゾリドン−４−カルボニルを意味する。ＨｏｒおよびＩｍｚのいずれもＤ−異性体もしくはＤ−異性体として、またはＤ／Ｌ混合物として用いることもできる。
ＧｎＲＨ拮抗物質の好ましい下位部類は、式：
Ｘ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｘａａ3−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−ＩＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ10
であって、上式で、
Ｘａａ3は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、またはＤ−Ｄｐｒ（Ｑ）であり、
式中Ｑは、
0004191259.tif 000007
であり、式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、そして
Ｘａａ10は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2または等価体である。
本発明の化合物は、古典的なペプチド溶液合成によって合成することができ、このような合成は、大量の製品を合成するのに好ましい。例えば１ｋｇ未満の限られた量を得るためには、固相技術を利用して合成することが好ましい。クロロメチル化樹脂またはヒドロメチル化樹脂を用いることができるが、切断に際にＣ−末端アミドが直接得られる、メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂、ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂、または当該技術分野で知られているその他のある適当な樹脂を用いることが好ましい。Ｃ−末端に置換アミドを有する等価なペプチドが所望する場合、１９８６年２月１１日に発行された米国特許第１４，５６９，９６７号に述べられているＮ−アルキルアミノメチル樹脂を用いて、これらを合成することが好ましい。固相鎖延長合成は、例えば、米国特許第５，２９６，４６８号に詳細に述べられている方法のようにして、個々のアミノ酸を鎖に順次加える方法で、通常、行われる。当技術分野で周知であるように、側鎖の保護基は、アミノ酸が樹脂上につくられる鎖にカップリングするときに著しく活性な側鎖または不安定な側鎖を有する任意アミノ酸の一部として、含まれていることが好ましい。このような合成によって、充分保護された中間体ペプチド樹脂が得られる。
３位に所望のカルバモイル含有残基を有するＧｎＲＨ拮抗物質の合成に用いる化学中間体の一例は、式：Ｘ1−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅ−Ｘａａ3（Ｘ3またはＸ5）−Ｓｅｒ（Ｘ2）−Ａｐｈ（Ｘ3）−Ｄ−Ａｐｈ（Ｘ3）−Ｌｅｕ−Ｉｌｙｓ（Ｘ4）−Ｐｒｏ−Ｘ6で表わされる。上式で、Ｘ1は、当技術分野においてポリペプチドの段階的合成に有用であることが知られている型のα−アミノ保護基であり、所望のペプチド組成物中のＸが特定のアシル基である場合、その基を保護基として用いることができる。Ｘ1に含まれるα−アミノ保護基の種類は、（１）ホルミル（Ｆｏｒ）、トリフルオロアセチル、フタロイル、ｐ−トルエン−スルホニル（Ｔｏｓ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンゼンスルホニル、ジチアスクシノイル（Ｄｔｓ）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）、トリチルスルフェニル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、アクリリル（Ａｃｒ）、クロロアセチル、アセチル（Ａｃ）、およびγ−クロロブチリルなどの、アシル型保護基、（２）ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ならびにｐ−クロロベンジルオキシ−カルボニル（ＣｌＺ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなどの置換ベンジルオキシカルボニルなどの、芳香族ウレタン型保護基、（３）ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルなどの、脂肪族ウレタン型保護基、（４）シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなどの、シクロアルキルウレタン型保護基、（５）フェニルチオカルボニルなどの、チオウレタン型保護基、（６）アリル（Ａｌｙ）、トリフェニルメチル（トリチル）、およびベンジル（Ｂｚｌ）などの、アルキル型保護基、（７）トリメチルシランなどの、トリアルキルシラン基である。好ましいα−アミノ保護基は、Ｂｏｃである。
Ｘ2は、Ａｃ、Ｂｚ、トリチル、２，６−ジクロロベンジル、またはベンジルエーテル（Ｂｚｌ）などの、Ｓｅｒのヒドロキシル側鎖の保護基であり、Ｂｚｌであることが好ましい。
Ｘ3は、α−アミノ保護基または別のアミノ保護基を除去するときに除去されない、Ｄｐｒなどの側鎖アミノ基の保護基である。具体例には、（１）Ｆｍｏｃまたはその他の弱酸性に安定な芳香族ウレタン型保護基などの塩基に不安定な基、（２）チオール分解により除去または切断することができるジチアスクシノイル（Ｄｔｓ）などのチオールに不安定な基、（３）ヒドラジン分解によって切断されるフタロイル（Ｐｈｔ）などのヒドラジンに不安定な基、（４）チオアセトアミドまたは弱酸もしくはその塩によって切断されるｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）などの求核試薬に不安定な基、（５）光分解によって切断される光に不安定な基、および（６）Ｄｔｓなどの還元によって選択的に取り除かれる基などが含まれる。Ｆｍｏｃは、Ｂｏｃ  ＳＰＰＳストラテジーに好ましい。
Ｘ4は、Ｚまたは２ＣｌＺなどの、第一級または第二級アミノ側鎖基に用いる酸に不安定な保護基である。
Ｘ5は、水素、またはキサンテニル（ｘａｎ）などのＧｌｎのアミド基の保護基である。しかしながら、ＧｌｎまたはＡｓｎは、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＡＢｔ）の存在下で側鎖を保護せずにカップリングすることが好ましい。
Ｘ6は、Ｄ−Ａｌａ−、Ｇｌｙ−、Ａｌａ−、Ａｇｌ−、Ｄ−Ａｇｌ−、Ａｇｌ（Ｍｅ）−、もしくはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ−［樹脂保持体］であってもよいし、Ｎ（Ｅｔ）−［樹脂保持体］であってもよい。Ｘ6は、ＧｌｙもしくはＤ−Ａｌａのいずれかのアミド、Ｐｒｏに直接付いている低級アルキル置換アミド、またはＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2であってもよい。
側鎖保護基Ｘ2〜Ｘ5の選択基準は、合成の各段階におけるα−アミノ保護基（Ｂｏｃが好ましい）の除去用に選択される反応条件下で、保護基が試薬に対して概ね安定であることである。これらの保護基は、一般にカップリング条件下で分離されるようなことがあってはならないが、所望のアミノ酸配列の合成が完了したときに、ペプチド鎖に変化を生ずることのないような反応条件下で取り除くことが可能でなければならない。３位のアミノ酸と、５位および６位の残基とに最初に用いた保護基は、取り除かれることが好ましく、本明細書中で後述するが、該選択的反応は、樹脂から最終段階のペプチドを切断する前に行う。
Ｘ6基がＤ−Ａｌａ−ＮＨ−［樹脂保持体］であるとき、保護基Ｄ−Ａｌａは、アミド結合によってＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ樹脂に結合するが、このことはＡｇｌまたはＤ−ＡｇｌをＣ末端に用いた場合も同様である。Ｘ5基がＮ（Ｅｔ）−［樹脂保持体］のとき、Ｐｒｏは、アミド結合によってＮ−アルキルアミノメチル樹脂（ＮＡＡＭ）に結合する。
Ｎ末端をアセチル化する場合に、例えば、１位のβ−Ｄ−Ｎａｌのα−アミノ基に対するＸ1保護基としてアセチルを用いることが可能であるが、このことは、β−Ｄ−Ｎａｌをペプチド鎖にカップリング前にアセチルを該アミノ酸に加えることにより可能となる。しかしながら、樹脂上のペプチド中間体を用いて反応を行うことが好ましい。α−アミノ保護基を脱保護した後、所望の側鎖が保護されたまま状態で、無水酢酸を用いた反応によってアセチル化を行うことが好ましい。あるいは、ジイソプロピルカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＩＣまたはＤＣＣ）の存在下で、酢酸を用いて反応を行うこともでき、あるいは当技術分野で知られているその他の適当なアシル化反応によって行うこともできる。Ｎ末端にカルバモイル基または置換カルバモイル基を所望する場合も、同様の手順が行われる。残基がペプチド鎖の一部となっている状態で、脱保護した側鎖アミノ基を修飾する場合には、例えばＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）などの適当な塩基の存在下、適当なイソシアネートを用いて反応を行う。ただし、このような塩基の使用は任意選択である。最終製品に非置換カルバモイル基が所望される場合、脱保護したアミノ側鎖をベンジルイソシアネート、トリメチルシリルイソシアネート、またはｔｅｒｔ−ブチルイソシアネートと反応させてもよいが、ｔｅｒｔ−ブチルイソシアネートと反応させることが好ましい。このようなストラテジーを用い、ｔ−ブチル部分を脱保護の際に取り除き、カルバモイル基が尿素の一部として残される。
本発明はさらに、例えば、式：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2を有するＧｎＲＨ拮抗物質を生成する新規方法を提供するものであって、該方法には、（ａ）式：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｘ2）−Ａｐｈ（Ｘ3）−Ｄ−Ａｐｈ（Ｘ3）−Ｌｅｕ−Ｉｌｙｓ（Ｘ4）−Ｐｒｏ−Ｘ6（式中、Ｘ2は、水素、またはＳｅｒのヒドロキシル基の保護基であり；Ｘ3は、塩基に不安定なアミノ基保護基、ヒドラジンに不安定なアミノ基保護基、またはその他の適当な不安定なアミノ基保護基であり；Ｘ4は、酸に不安定なアミノ側鎖保護基であり；Ｘ6は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−［樹脂保持体］である。）を有する中間ペプチドを生成すること、（ｂ）４ＡｐｈおよびＤ−４ＡｐｈからＸ3を取り除き、脱保護された第一級アミノ基を無水酢酸と反応させること、（ｃ）鎖の延長を完了して、中間体Ｘ1−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（Ｘ3）−Ｓｅｒ（Ｘ2）−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｙｓ（Ｘ4）−Ｐｒｏ−Ｘ6（上式で、Ｘ1は、α−アミノ保護基である。）を生成すること、（ｄ）３位の残基からＸ3を取り除き、中間体ペプチドのこのアミノ酸残基の側鎖一級アミノ基を脱保護すること、（ｅ）この脱保護された側鎖第一級アミノ基をメチルイソシネートと反応させること、（ｆ）Ｎ−末端をアシル化すること、ならびに（ｇ）残存するすべての保護基を分離すること、および／またはＸ6に含まれる樹脂保持体から切断することとが含まれる。
最終的なペプチドの精製は、当技術分野で知られているクロマトグラフィー、分配クロマトグラフィーにより、またはＨＰＬＣを用いて行う。Ｊ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、２８８巻、３０３〜３２８頁、１９８４年；ならびにＣ．ＭｉｌｌｅｒおよびＪ．Ｒｉｖｉｅｒ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４０巻、２６５〜３１７頁、１９９６年を参照のこと。
本発明のＧｎＲＨ拮抗物質は、雌ラットの排卵を防止するために、発情前期の正午頃に皮下投与した場合、体重１ｋｇ当たり１００マイクログラム未満のレベルで有効であると考えられる。排卵抑制期間を長くするには、体重１ｋｇ当たり約０．１ミリグラムから約２．５ミリグラムの範囲の用量レベルを使用する必要がある。この拮抗物質を哺乳動物の雄に規則的に投与すると、精子形成の停止にも有効であり、したがって避妊薬としても使用できる。これらの化合物はテストステロンレベルを低下させ、したがってリビドーをも低下させるため（正常な性的活動力のある雄にとっては望ましくない結果）、リビドーを維持しながら無精子症または髪の増殖を達成するためには、ＧｎＲＨ拮抗物質と併用して補充用量（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｄｏｓａｇｅ）のテストステロンを投与することが望ましかろう。この拮抗物質は、ゴナドトロピンおよび性ステロイドの調整に用いることもでき、本明細書で先に述べたようなその他の長期および短期の適応症にも用いることもでき、これをペットの避妊薬として獣医学にも適用できる。
本発明によって提供されるペプチドは、生理学的ｐＨ値において著しい溶解性があり、したがって比較的高濃度の投与液剤として、特に皮下注射剤として調製することができる。これらのペプチドは体内で充分耐性であり、有効濃度で皮下投与する場合に容易にはゲル化しない。一般に、このようなペプチドと、医薬品として容認可能な好適な賦形剤とを含有する医薬品組成物を、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約２．５ｍｇの間のレベルで、静脈、腹腔、皮下などに投与することができ、通常は１日体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇで充分である。
適正に保護されたＤ−もしくはＬ−ヒドロオルチル−含有アミノ酸、カルバモイル−含有アミノ酸、および／またはＤ−もしくはＬ−イミダゾリドン−カルボニル−含有アミノ酸を合成し、次いで鎖延長ペプチド合成で用いることができる。しかしながら、等しく有効な合成は、適正に保護された４Ａｐｈ残基、４Ａｍｆ残基、またはＤｐｒ残基を、ペプチド中間体の所望の位置に最初に組込むことによって達成され、このような方法は、最初はわずか少量だけが望まれる実験室向けの方法として選択することができよう。この方法における最後のストラテジーは、特定の残基を順次に脱保護し（合成中直ちにまたは順次のいずれか）、次いで脱保護した側鎖アミノ基を所望の試薬と反応させることによって達成される。
本発明を以下の実施例でさらに説明する。
実施例１
式：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（Ｎｉｃ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（アンチド）を有するペプチドは、現在アシリンと呼ばれている、アンチドとは５位および６位のみが異なるペプチドと同様、ＧｎＲＨの拮抗物質として非常に良好な生物学的性質を示すことが判明している。現在では、これらのデカペプチドの３位残基、または他の既知の生物作用能をもつＧｎＲＨ拮抗物質の３位残基に置換を施した場合、製造費用がより安価である、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性持続時間が改善された、ＧｎＲＨ拮抗物質が得られることが判明している。
以下のデカペプチド［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣＢｍ）3］−アシリン、あるいは［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ1、Ｄ−４Ｃｐａ2、Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3、４Ａｐｈ（Ａｃ）5、Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）6、ＩＬｙｓ8、Ｄ−Ａｌａ10］−ＧｎＲＨ（ペプチド番号１）は、固相合成法によって合成される。このペプチドは以下の式を有する：
Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2。
ＭＢＨＡ樹脂（Ｂａｃｈｅｍ社）約９．３グラム（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ）を最初に用い、そしてＢｏｃ−保護Ｄ−Ａｌａを該樹脂にカップリングさせるが、このカップリングは、活性化試薬またはカップリング試薬として約１０ミリモルのＢｏｃ誘導体、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、および無水１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を用いて、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）／ＣＨ2Ｃｌ2中で、約８時間かけて行う。Ｄ−Ａｌａ残基は、アミド結合によりＭＢＨＡ残基と結合する。
各アミノ酸残基のカップリングの後、出発樹脂約０．５グラムから１グラムに対し、洗浄、脱保護、次いで次のアミノ酸残基のカップリングを以下の合成計画要覧に従って行う。
0004191259.tif 000008
前記の計画は、最初のアミノ酸を結合した後、本発明ペプチドの各アミノ酸のカップリングに用いる。ＮαＢｏｃ保護は、合成全体を通して、カップリングされる各アミノ酸に用いる。ＮαＢｏｃ−β−Ｄ−２Ｎａｌは、例えば１９８０年１１月１８日に発行された米国特許第４，２３４，５７１号で詳述されているように、当技術分野で知られている方法によって調製することができるし、米国オレゴン州ＳｙｎｔｈｅＴｅｃｈ社から市販されてもいる。５位における４Ａｐｈ、および６位におけるＤ−４Ａｐｈの側鎖の第一級アミノ基は、Ｆｍｏｃによって保護する。ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）をＳｅｒのヒドロキシル基の側鎖保護基として用いることが好ましいが、Ｓｅｒは側鎖の保護を行わずにカップリングすることができる。ＮαＢｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ、Ｚ）を８位残基に用いる。
４位残基にＮαＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）としてＳｅｒを付加すると、以下の中間体：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ、Ｚ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−［ＭＢＨＡ樹脂保持体］が得られる。２５％ピペリジンのＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）を用いて、それぞれ約１５分間、連続的に処理することによって、Ｆｍｏｃ保護基を除去する。ペプチド樹脂をＤＭＦで洗浄した後、ＤＭＦ中の大過剰の無水酢酸を用いて、室温で、約３０分間またはニンヒドリン試験で検査しながら反応が完了するまで、新しく遊離したアミノ基を処理して、双方の側鎖をアセチル化する。次いでペプチド樹脂をＭｅＯＨおよびＤＣＭで標準的に洗浄する。
４Ａｐｈ残基およびＤ−４Ａｐｈ残基の側鎖のアセチル化が完了した後、ＮαＢｏｃ、ＮαＦｍｏｃ−保護のＤ−Ｄｐｒを鎖にカップリングして３位の残基とする。ひとたび残基をカップリングしたならば、Ｂｏｃ保護を除去し、最後の２つの残基を順次付加して鎖を完成させる。Ｎ末端のα−アミノ基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で脱保護した後、約３０分間、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の大過剰の無水酢酸を用いて、アセチル化を行う。適度に大量の樹脂を用いて出発することにより、本明細書中で以後に記載する３つの並行して行う合成で用いるために、ペプチド樹脂中間体の分画をこのときに除去することができる。
Ｎ−末端のアセチル化の後、ペプチド樹脂約５００ｍｇを２５％ピペリジンで処理して、Ｄ−Ｄｐｒ側鎖を選択的に脱保護する。次いで、適当な塩基であるＤＩＥＡ２．７モルの存在下、ＤＭＦ１０ｍｌ中、室温で２時間、部分的に脱保護されたペプチド樹脂をメチルイソシアネートで処理して、メチルカルバモイル置換残基を形成する。
ペプチド樹脂を乾燥し、そして樹脂からのペプチドの切断と、ＳｅｒおよびＬｙｓ側鎖の脱保護とを、ＨＦ１５ｍｌおよび不純物除去剤としてのアニソール（０．５ｍｌ）を用いて、約０℃で約１．５時間行う。真空下でＨＦを除去した後、エチルエーテル１００ｍｌで樹脂を２回洗浄する。切断されたペプチドは、０．２％ＴＦＡの２５％ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ溶液で毎回１００ｍｌずつ繰り返し抽出する。抽出液を集め、凍結乾燥して、粗ペプチド粉末約１６０ｍｇを得る。
次いで、ペプチドを、当技術分野で知られており、Ｊ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、２８８巻、３０３〜３２８頁、１９８４年で具体的に述べられている、分取用逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分離による最初の分取ではＴＥＡＰ（リン酸トリエチルアンモニウム）を用い、最終の分離は、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙの文献にすべて詳述されているように、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）勾配を用いて行う。
ペプチド（約５１ｍｇ）は、キャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて実質的に均質であると判断され、その純度は約１００％と推定される。精製されたペプチドのアミノ酸分析は、調製された構造式と一致する。液体二次イオン質量分析計（ＬＳＩＭＳ）によって測定した分子量は、１５２７．８Ｄａとして測定され、これはこのペプチドの期待される分子量１５２７．８Ｄａと一致する。
親水性は、緩衝液ＡをｐＨ７．０のＴＥＡＰとし、緩衝液ＢをＣＨ3ＣＮ７０％および緩衝液Ａ３０％とし、３０分間にわたり緩衝液Ｂ４０％から緩衝液Ｂ７０％の濃度勾配としたＲＰ−ＨＰＬＣを用いて保持時間を測定することにより、検査した。ペプチド番号１は、アシリンより親水性であって、アシリンより先に約１．８分間溶出する。ｐＨ約５から約７の水性緩衝液での溶解度、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのゲル化抵抗性により、循環ＬＨレベルを抑制する長時間作用生物作用能（後述）を有しながら、概ね同等の生物学的な効力を有する短時間作用の化合物に比べて、特に皮下注射による投与に適するものとなる。
該ペプチドを本明細書中で以後ペプチド番号１と呼ぶ。ラットでのＬＨ分泌抑制効果を測定するために、ペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏでアッセイした。ペプチドで皮下処理したスプラーグ−ダウレー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの精巣除去した雄における循環ＬＨレベルの測定を、Ｃ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃ．、２９巻、３７４〜３７８頁、１９８３年に報告されているように行う。ペプチドをまず１．０ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で静菌水に溶解し、次いでさらに０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液０．０４Ｍで希釈する。以後の希釈はリン酸緩衝液で行う。ペプチドを５匹のラットに皮下注射し、メトタン麻酔して血液試料（３００μｌ）を集める。血清（５０μｌ）のＬＨレベルを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＩＤＤＫ）から提供された試薬を用いて２回検査する。ラット当たりペプチド５０μｇの用量で、最初の３日間、コントロールレベルの５０％より低いレベルに抑制することが検査により示されたが、このレベルは、アシリンを５０マイクログラムの用量で同様に注射したラットにより示されるＬＨレベルとほぼ同じである。さらに、注射後９６時間後では、ＬＨレベルは、アシリンを注射したラットで示されるＬＨレベルの約７５％にすぎない。ラットの実験により、該ペプチドは、注射箇所での著しいゲル化は検出できず、耐性が良好であることがあることが示された。
数多くのＧｎＲＨ拮抗物質の検査から得られた経験から、このような長時間ＬＨの抑制作用を表すペプチドは、成熟したメスのスプラーグ−ダウレーラットでｉｎ  ｖｉｖｏで測定した場合、２．５マイクログラムの用量で完全に排卵を遮断することが示される。
実施例２
実施例１で合成されたペプチド樹脂中間体の一部を用いて、［Ｄ−Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3］−アシリンを生成する。実施例１のようにして、Ｄ−Ｄｐｒ残基の側鎖からＦｍｏｃ保護基を取り除いた後、ｔ−ブチルイソシナネートで中間体を室温で約６時間処理する。実施例１に述べたように、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行うと、ｔ−ブチルが取り除かれ、Ｄ−Ｄｐｒ残基のアミノ側鎖上に置換されたカルバモイル基が残ることとなる。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（カルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号２）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量１５１３．７Ｄａが示されるが、これは計算質量１５１３．７Ｄａに一致する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがペプチド番号１よりも親水性であることが分かる。
実施例１のようにして、このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、ペプチド番号１とほぼ同等のＬＨ抑制効果がある生物活性を有することが示される。
実施例２Ａ
実施例１で述べた合成法で調製したペプチド樹脂中間体の一部を本明細書において利用して、［Ｄ−Ｄｐｒ（ＥｔＣｂｍ）3］−アシリンを形成する。実施例１のようにして、Ｄ−Ｄｐｒ残基の側鎖からＦｍｏｃ保護基を取り除いた後、ＤＩＥＡの存在下、室温で約６０分間、中間体をエチルイソシナネートで処理して、Ｄ−Ｄｐｒ残基のアミノ側鎖ともにエチル尿素を形成する。実施例１に述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（エチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量１５４１．４Ｄａが示されるが、これは計算質量１５４１．８Ｄａに一致する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンとほぼ同じ親水性であることが分かる。
実施例１のようにして、このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、ペプチド番号２とほぼ同等のＬＨ抑制効果がある生物活性を有することが示される。
実施例２Ｂ
実施例１で調製したペプチド樹脂中間体の別の一部を利用して、デカペプチド［Ｄ−Ｄｐｒ（ｉｐｒＣｂｍ）3］−アシリンを形成する。実施例１のようにして、Ｄ−Ｄｐｒ残基の側鎖からＦｍｏｃ保護基を取り除いた後、ＤＩＥＡの存在下、イソプロピルイソシナネートで中間体を室温で約３０分間処理して、Ｄ−Ｄｐｒ残基のアミノ側鎖とともにイソプロピル尿素基を形成する。実施例１に述べたように、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（イソプロピルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９５パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量１５５５．５Ｄａが示されるが、これは計算質量１５５５．８Ｄａに一致する。
実施例１のようにして、このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、２日間はペプチド番号２とほぼ同等のＬＨ抑制効果がある生物活性を有することが示される。３日目では、アシリンよりもＬＨ抑制効果が低い。
実施例２Ｃ
実施例１で述べた合成を一般的に利用して、Ｄ−Ｄｐｒ残基、４Ａｐｈ残基、およびＤ−４Ａｐｈ残基すべてがＦｍｏｃで保護されたままのデカペプチド中間体を形成する。実施例１のように、Ｎ−末端をアセチル化し、次いで３つの側鎖からＦｍｏｃ保護基を取り除いた後、ＤＩＥＡの存在下、イソプロピルイソシナネートで中間体を室温で約２時間処理して、３つのアミノ側鎖とともにメチル尿素基を形成する。実施例１に述べたように、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（メチルカルバモイル）−Ｄ−４Ａｐｈ（メチルカルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。該ペプチドは、実質的に均質であり、アシリンよりも親水性であると判断される。
実施例１のようにして、このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、アシリンとほぼ同等の抑制効果のある生物活性を有することが示される。
実施例３
実施例１に概要を示した合成法を用いて、式Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2を有するセトロレリックスペプチドのアナログを合成する。６位および５位にＮαＢｏｃ−Ｄ−４ＡｐｈおよびＮαＢｏｃ−４Ａｐｈをカップリングする代わりに、ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｃｉｔを６位にカップリングし、ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）を５位にカップリングする。ＮαＢｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ、Ｚ）の代わりに、ＮαＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を用いる。あるいは、ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｆｍｏｃ）を６位にカップリングし、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）を５位に付加した後、一時的に鎖延長を中断し、次式のペプチド中間体：Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−［ＭＢＨＡ樹脂保持体］を得る。次いで、実施例１のように、Ｆｍｏｃ保護を除去することによりＯｒｎ残基のアミノ側鎖を脱保護し、中間体を過剰のｔ−ブチルイソシアネートのＤＭＦ溶液で約６時間室温で処理して、Ｏｒｎ残基の側鎖と反応させる。次いで、実施例１のようにして、デカペプチド中間体の合成を完了し、続いてＤ−Ｄｐｒ側鎖を脱保護し、メチルイソシアネートと反応させる。
次いで、実施例１で述べたようにして、このペプチド樹脂を洗浄し、そして樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号３）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後に得られる。このペプチドは、セトロレリックスよりも親水性であり、セトロレリックスよりもｉｎ  ｖｉｖｏで長時間ＬＨが抑制されると考えられる。
実施例３Ａ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｃｉｔの代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｈｃｉを、Ａｒｇ8の代わりにＩＬｙｓ8を用いて、実施例３で記載した合成を繰り返し、アンタレリックスデカペプチドのアナログを合成する。Ｄ−Ｄｐｒ側鎖を脱保護した後、メチルイソシアネートと反応を行う。次いで、実施例１で述べたようにして、樹脂からの切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−β−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。
このペプチドは、ペプチド番号３と実質的に同じｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＨ分泌抑制能を有している。
実施例４
Ｄ−３Ｐａｌの代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）を用いることを除き、米国特許第５，１６９，９３５号の実施例１に概要を示した合成法を用いて、式Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（ニコチノイル）−Ｄ−Ｌｙｓ（ニコチノイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2を有する、アンチドペプチドのアナログを合成する。実施例１のように、デカペプチド中間体の合成を完了した後、Ｄ−Ｄｐｒ側鎖の脱保護およびメチルイソシアネートとの反応を行う。
次いで、実施例１で述べたようにして、このペプチドを標準的に洗浄し、次いで樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号４）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アンチドよりも長時間ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＨ分泌を抑制する。
実施例５
米国特許第５，２６９，４６８号の実施例ＶＩＩＩに概要を示した合成法を用いて、式Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）−Ｄ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2を有する、アザリンＢペプチドのアナログを合成する。３位にＮαＢｏｃ−Ｄ−３Ｐａｌをカップリングする代わりに、ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）を用いる。実施例１のようにして、デカペプチド中間体の合成を完了した後、Ｄ−Ｄｐｒ側鎖の脱保護およびメチルイソシアネートとの反応を行う。
次いで、実施例１で述べたようにして、このペプチドを標準的に洗浄し、次いで樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）−Ｄ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号５）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性であり、アザリンＢよりも長時間ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＨ分泌を抑制する。
実施例５Ａ
実施例１に概要を示した合成法を用いて、アンチドペプチドのアナログ［Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）3、４Ａｐｈ（Ｇａｂ）（ａｔｚ）5、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｇａｂ）（ａｔｚ）6］を合成する。ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）およびをＮαＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）を６位および５位にカップリングした後、一時的に鎖延長を中断し、側鎖保護ガンマ酪酸（Ｇａｂ）との反応を行い、続いて米国特許第５，５０６，２０７号の実施例１に述べられているトリアゾール修飾を行う。実施例１のようにして、デカペプチド中間体の合成を完了した後、Ｄ−Ｄｐｒ側鎖の脱保護およびメチルイソシアネートとの反応を行う。
次いで、実施例１で述べたようにして、このペプチドを標準的に洗浄し、次いで樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｇａｂ）（ａｔｚ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｇａｂ）（ａｔｚ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号５Ａ）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性であり、アザリンＢよりも長時間ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＨ分泌を抑制する。
実施例５Ｂ
実施例１に概要を示した合成法を用いて、アンチドペプチドのアナログ［Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）3、４Ａｐｈ（β−Ａｌａ）（ａｔｚ）5、Ｄ−４Ａｐｈ（β−Ａｌａ）（ａｔｚ）6］を合成する。６位および５位のＤ−４Ａｐｈおよび４Ａｐｈの側鎖アミノ基と、Ｇａｂとを反応させる代わりに、ＮαＦｍｏｃ−β−Ａｌａとの反応を最初に行う。残りの合成法は同じである。実施例１のように、デカペプチド中間体の合成を完了した後、Ｄ−Ｄｐｒ側鎖の脱保護およびメチルイソシアネートとの反応を行う。
次いで、実施例１で述べたようにして、このペプチドを標準的に洗浄し、次いで樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（β−Ａｌａ）（ａｔｚ）−Ｄ−４Ａｐｈ（β−Ａｌａ）（ａｔｚ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号５Ｂ）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アンチドよりも親水性であり、アンチドよりも長時間ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＨ分泌を抑制する。
実施例５Ｃ
実施例１に概要を示した合成法を用いて、アンチドペプチドのアナログ［Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）3、４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）5、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）6］−アンチドを合成する。６位および５位のＤ−４Ａｐｈおよび４Ａｐｈの側鎖アミノ基をＧａｂと反応させる代わりに、ギ酸および無水酢酸の混合物との反応を行う。実施例１のようにして、デカペプチド中間体の合成を完了した後、Ｄ−Ｄｐｒ側鎖の脱保護およびメチルイソシアネートとの反応を行う。
次いで、実施例１で述べたようにして、このペプチドを標準的に洗浄し、次いで樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号５Ｃ）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アンチドよりも長時間ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＨ分泌を抑制する。
実施例５Ｄ
実施例１に示した概要のようにして、アナログ［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリンを合成する。ＮαＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）を鎖に付加する前に、６位のＤ−４Ａｐｈをアセチル化する。４Ａｐｈ側鎖の脱保護の後、ＤＩＣおよびＨＯＢｔの存在下、ＤＭＦ中、約８時間、室温でヒドロオロト酸（Ｃ4Ｎ2Ｈ5（Ｏ）2ＣＯＯＨ）との反応を行う。次いで、実施例１で述べたようにして、合成を完了し、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６２５．５Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６２５．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは２日間、ＬＨレベルの抑制においてアシリンとほぼ同等の活性であり、３日目では、アシリンよりもＬＨ抑制レベルが低いことが示される。
実施例５Ｅ
実施例５Ｄに述べたようにして、アナログ［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）6］−アシリンを合成する。６位のＤ−４Ａｐｈ残基および５位の４Ａｐｈ残基を同時に反応させる。実施例５Ｄで述べたようにして、２つの４Ａｐｈ側鎖の脱保護の後に、ヒドロオロト酸との反応を行い、次いで合成を完了し、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９５パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１７３５．５Ｄａが示されるが、これは期待される質量１７３５．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、１日目、２日目、および３日目には、ＬＨレベルの抑制においてアシリンとほぼ同等の活性を有することが示され、長時間作用するものと考えられる。
実施例５Ｆ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｄｂｕ（Ｆｍｏｃ）を用いて、実施例５Ｄに示した概要のようにして、アナログ［Ｄ−Ｄｂｕ（ＭｅＣｂｍ）3、４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）5］−アシリンを合成する。次いで、実施例１で述べたようにして、合成を完了し、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｂｕ（ＭｅＣｂｍ）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。該化合物は、ＬＨ分泌抑制の生物活性を有する。
実施例５Ｇ
実施例５Ｄに示した概要のようにして、アナログ［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3、４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリンを合成するが、、６位残基に対しＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を用い、次いで、ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）を付加する前に、脱保護した側鎖をｔ−ブチルイソシアネートと反応させる。次いで、実施例１で述べたようにして、合成を完了し、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。該化合物は、ＬＨ分泌抑制の生物活性を有する。
実施例６
実施例１に記載した合成を繰り返して、ペプチド［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3、４Ａｐｈ（Ｃｍｂ）5、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｍｂ）6］−アンチドを合成する。Ｄ−４Ａｐｈ残基および４Ａｐｈ残基の側鎖アミノ基を無水酢酸と反応させる代わりに、これら双方をｔ−ブチルイソシアネートと反応させる。次いで、Ｂｏｃを取り除くことにより、ペプチド鎖をさらに延長することが可能となる。Ｎ−末端をアセチル化し、次いでＤ−Ｄｐｒ側鎖の脱保護の後、メチルイソシアネートとの反応を行う。実施例１で述べたように、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行い、その結果、ｔ−ブチル部分が取り除かれる。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（メチルカルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（カルバモイル）−Ｄ−４Ａｐｈ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１５２９．９Ｄａが示されるが、これは期待される質量１５２９．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、アシリンとほぼ同じ時間作用するものと考えられる。
実施例６Ａ
実施例５Ｇに概要を示した合成を行って、ペプチド［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アンチドを形成する。Ｄ−４Ａｍｆの側鎖アミノ基をｔ−ブチルイソシアネートと反応させる。Ｂｏｃを取り除いた後、ＮαＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）をペプチド鎖に付加する。Ｆｍｏｃを取り除いた後、ヒドロオロト酸との反応を行う。Ｎ−末端をアセチル化し、次いでＤ−Ｄｐｒ側鎖の脱保護の後、ｔ−ブチルイソシアネートとの反応を行う。実施例１で述べたように、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｄｐｒ（カルバモイル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、ＬＨ分泌抑制の生物活性を有する。
実施例７
実施例１に示した概要のようにして、ペプチドアナログ［Ｄ−Ｇｌｎ3］−アシリンを合成する。３位にＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）をカップリングする代わりに、ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎを用いる。任意選択で、ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）を用いる。しかしながら、側鎖を保護しないで、Ｄ−Ｇｌｎをカップリングすることが好ましい。実施例１で述べたように、デカペプチド中間体の合成を完了した後、このペプチド樹脂を標準的に洗浄し、次いで樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＬＳＩＭＳ分析によって、質量１５１２．９Ｄａが示されるが、これは計算質量１５１２．７Ｄａに一致する。実施例１のようにして、このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイにより、該ペプチドは、３日間にわたり生物活性持続時間がアシリンとほぼ同じであることが示される。
実施例７Ａ
実施例５Ｄおよび実施例７に示した概要のようにして、アナログ［Ｄ−Ｇｌｎ3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリンを合成する。ＮαＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）を鎖に付加する前に、６位のＤ−４Ａｐｈをアセチル化する。実施例５Ｄのようにして、４Ａｐｈ側鎖の脱保護の後、ヒドロオロト酸との反応を行う。次いで、合成の完了および精製の後、ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９５パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６１０．９Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６１０．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、１日目、２日目、および３日目には、ＬＨレベルの抑制においてアシリンとほぼ同等の活性を有することが示され、９６時間後には、アシリンよりも非常に低いレベルにまでＬＨが抑制されることが示される。該ペプチドは、長時間作用するものと考えられる。
実施例７Ｂ
実施例７Ａで示した合成を繰り返して、Ｄ−Ｇｌｎ3の代わりにＤ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）3としたペプチドを生成する。単にＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎを用いることとする。あるいは、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（ＯＦｍ）を付加し、フルオレニルメチルエステル側鎖保護基を取り除いた後、ＤＩＥＡおよびＢＯＰ（ベンゾトリアゾイル−Ｎ−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）の存在下、ＮＨ2Ｃｌ3・ＨＣｌとの反応を行い、Ｎ−メチルアミノを形成する。次いで、実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ（メチル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６２４．８Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６２４．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、アシリンとほぼ同じ期間作用することが示される。このペプチドは、３日間は等しい効果を有し、４日目を過ぎると少々効果が低下する。
実施例７Ｃ
実施例７Ａで示した合成を繰り返すが、ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を用い、次いでＮαＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）を鎖に付加する前に、その脱保護した側鎖をｔ−ブチルイソシアネートと反応させる。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６２５．８Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６２５．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、２日間から３日間、アシリンとほぼ同じ効果を有することが示される。
実施例７Ｄ
実施例７Ｃの合成に概ね従って、［Ｎ−ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1、Ｄ−Ｇｌｎ3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）6］−アンチドを合成する。しかしながら、Ｎ−末端の修飾後まで、Ｆｍｏｃ保護を４Ａｐｈから取り除かない。Ｎ−末端の脱保護の後、α−アミノ基をイソシアネートと反応させる。次いで、実施例７Ａのようにして、Ｆｍｏｃ保護を取り除き、４ＡｐｈをＬ−ヒドロオロト酸と反応させる。次いで、実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＮ−メチルカルバモイル−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６４０．８Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６４０．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、２日間から３日間、アシリンとほぼ同じ効果を有することが示される。
実施例７Ｅ
実施例７Ｃで示した合成を繰り返すが、Ｄ−４Ａｍｆの脱保護した側鎖との反応を行うときにｔ-ブチルイソシアネートの代わりにメチルイソシアネートを用いる。実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（メチルカルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６３９．７Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６３９．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、２日間から３日間、アシリンとほぼ同じ効果を有することが示される。
実施例７Ｆ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を用い、実施例７Ｃで示した合成を繰り返して、［Ｄ−Ｇｌｎ3、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アンチドのアナログを生成する。実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６３９．７Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６３９．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、効果が持続し、４日後からアシリンよりも少々良好となる。
実施例７Ｇ
実施例７Ｃで示した合成を繰り返すが、４Ａｐｈの脱保護した側鎖との反応においてＬ−ヒドロオロト酸の代わりにＤ−ヒドロオロト酸を用いて、アナログ［Ｎ−ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1、Ｄ−Ｇｌｎ3、４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アンチドを生成する。イソシアネートとの反応が行われるときにペプチド樹脂がヒドロオロト酸を含有する別のプロトコールを用いるならば、ＤＩＥＡなどの塩基を添加せずに、３等量の特定のイソシアネートのみを用いる。実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＮ−メチルカルバモイル−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６４０．７Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６４０．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量において、該ペプチドは、短期間作用を示し、１日間はアシリンと近似した効果であり、その後効果が非常に急速に低下した。
実施例７Ｈ
実施例７Ｄで示した合成を繰り返すが、４Ａｐｈの脱保護した側鎖との反応においてＬ−ヒドロオロト酸の代わりにＬ−Ｉｍｚを用いて、アナログ［Ｎ−ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1、Ｄ−Ｇｌｎ3、４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アンチドを生成する。実施例１に記載したように、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＮ−メチルカルバモイル−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌ−ａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性であり、２日間から３日間、アシリンとほぼ同じＬＨ抑制効果を有する。
実施例７Ｉ
実施例７Ｆで示した合成を繰り返すが、Ｄ−４Ａｍｆの脱保護した側鎖との反応においてｔ-ブチルイソシアネートの代わりにメチルイソシアネートを用いて、［Ｄ−Ｇｌｎ3、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）6］−アンチドのアナログを生成する。実施例１に記載したように、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（メチルカルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６５３．７Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６５３．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、３日間アシリンとほぼ同等の効果を有し、４日目を過ぎても効果が持続していることが示される。
実施例７Ｊ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を用いて、実施例７Ａで示した合成を繰り返し、［Ｄ−Ｇｌｎ3、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5］−アシリンのアナログを生成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６２４．８Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６２４．８Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、３日後および４日後の双方ともアシリンに近似した効果を有することが示される。
実施例７Ｋ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎの代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−Ａｓｎを用いることを除いて、実施例７Ａで示した概要のようにして、［Ｄ−Ａｓｎ3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリンのアナログを合成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１５９６．９Ｄａが示されるが、これは期待される質量１５９６．７Ｄａによく相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、２日間ＬＨレベルの抑制についてアシリンとほぼ同様の活性を有し、３日後にはアシリンよりも低いレベルにまでＬＨが抑制されることが示される。
実施例７Ｌ
Ｄ−４Ａｍｆを６位の残基として用いることを除いて、実施例７Ａで示した概要のようにして、アナログ［Ｄ−Ａｓｎ3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリンを合成する。Ｄ−４Ａｍｆを脱保護した後、鎖を延長するためにＢｏｃを取り除く前に、これをｔ−ブチルイソシアネートと反応させる。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−Ａｍｆ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、ＬＨ分泌抑制の生物活性を有する。
実施例８
３位にＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎの代わりにＮαＢｏｃ−Ｇｌｎを用いることを除いて、実施例７で示した合成を繰り返して、ペプチド［Ｇｌｎ3］−アシリンを合成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（ペプチド番号８）が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＬＳＩＭＳ分析によって、質量１５１２．７Ｄａが示されるが、これは計算質量１５１２．７Ｄａと一致する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。実施例１のようにｉｎ  ｖｉｖｏでＬＨ抑制を検査したとき、このペプチドは、アシリンとほぼ同じ生物活性持続時間を示し、４日間にわたってアシリンとほぼ等しい。このペプチドは、長時間作用すると考えられる。
実施例８Ａ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎの代わりにＮαＢｏｃ−Ｇｌｎを用い、実施例７Ａで示したようにして、アナログ［Ｇｌｎ3、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリンを合成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られ、該ペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は約９９パーセントであると推定される。ＭＳ分析によって、質量１６１０．７Ｄａが示されるが、これは計算質量１６１０．８Ｄａに良く相応する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることが分かる。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、４日間にわたって、ＬＨレベルの抑制についてアシリンとほぼ同等の効果であることが示される。このペプチドは、長時間作用すると考えられる。
実施例８Ｂ
実施例７Ａで示した合成を繰り返して、Ｄ−Ｇｌｎ3の代わりにＧｌｎ（Ｍｅ）3としたペプチドを生成する。単にＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎを用いる。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ（メチル）−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性である。５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、アシリンとほぼ同じ作用期間である。
実施例８Ｃ
実施例８Ａで示した合成を繰り返すが、ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を用い、次いで脱保護した側鎖をｔ−ブチルイソシナネートと反応させる。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性である。このペプチドは、実質的に均質であると判断され、その純度は約９９パーセントより高いと推定される。ＭＳ分析によって、質量１６２５．６Ｄａが示されるが、これは計算質量１６２５．８Ｄａに一致する。
このペプチドをラットの標準ｉｎ  ｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、２４時間アシリンとほぼ同等の効果である生物活性を有することが示される。２日目に、ＬＨ抑制がアシリンよりも少々低下し、その後急速にその効果が低下する。
実施例８Ｄ
Ｄ−４Ａｍｆの脱保護した側鎖との反応を行うときにｔ-ブチルイソシアネートの代わりにメチルイソシアネートを用いて、実施例８Ｃで示した合成を繰り返す。実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（メチルカルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性である。５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、２〜３日間アシリンとほぼ同じ効果を示す。
実施例８Ｅ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を用いて、実施例８Ｃで示した合成を繰り返し、ペプチド［Ｇｌｎ3、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アンチドを生成する。実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性である。５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、４日間にわたってアシリンとほぼ同等の効果を示す。
実施例８Ｆ
Ｄ−４Ａｍｆの脱保護した側鎖との反応においてｔ-ブチルイソシアネートの代わりにメチルイソシアネートを用いて、実施例８Ｅで示した合成を繰り返す。実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（メチルカルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性である。５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、３日間アシリンとほぼ同等の効果を示す。
実施例８Ｇ
ＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮαＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を用いて、実施例８Ａで示した合成を繰り返し、ペプチド［Ｇｌｎ3、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5］−アシリンのアナログを生成する。実施例１に記載したようにして、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を順次行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性である。５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、３日間にわたってアシリンとほぼ同等の効果を示す。
実施例８Ｈ
実施例７Ａで示した合成を繰り返して、Ｄ−Ｇｌｎ3の代わりにＡｓｎ3としたペプチドを生成する。単にＮαＢｏｃ−Ｄ−ＧｌｎをＮαＢｏｃ−Ａｓｎの代わりに用いる。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。このペプチドは、アシリンよりも親水性である。５０マイクログラムの用量で、該ペプチドは、アシリンとほぼ同じ作用期間を示す。
実施例９
実施例１から８で概要を述べた手順を用いて、以下のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドも調製する：
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＦＤ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3］−アシリン
［Ｂｚ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＮＯ2Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｆｏｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＯＣＨ3Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5］アシリン
［Ｂｚ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＢｒＤ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，Ｄ−４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）6］−アシリン
［Ｐｎ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＣＨ3Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，４Ａｐｈ（ＭｅＣｂｍ）5］−アシリン
［Ｂｙ−Ｄ−２Ｎａｌ1，３，４Ｃｌ2Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）5］−アシリン
［Ｖｌ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＮＯ2Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｇｌｎ3，Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｖａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ1，ＣαＭｅ４ＣｌＤ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｐｎ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，Ａｐｈ（Ｉｍｚ）5，Ｄ−３Ａｍｆ（Ｈｏｒ）6，Ａｇｌ10Ｊ−アンチド
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，４Ａｈｐ（Ｈｏｒ）5，Ａｒｇ8，Ｄ−Ａｇｌ（Ｍｅ）10］−アシリン
［ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）5，Ａｇｌ（Ｍｅ）10］−アシリン
［Ｃｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）5，Ｄ−Ａｇｌ10］−アシリン
［ＥｔＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，４Ａｍｆ（ｉｐｒＣｂｍ）5，Ｐｒｏ9ＮＨＣＨ2ＣＨ3］−アシリン
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6，Ａｌａ10］−アンチド
［Ｃｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3，４Ａｐｈ（ＭｅＣｂｍ）5，Ａｒｇ（Ｅｔ2）8］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3，４Ａｈｐ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｈｐ（Ｉｍｚ）6，Ｄ−Ａｇｌ10］−アンチド
［Ａｃ−Ｄ−１Ｎａｌ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，３Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）6，Ａｒｇ8］−アンチド
［ＰｒＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，Ｄ−３Ａｐｈ（ＥｔＣｂｍ）6，Ｐｒｏ9ＮＨＣＨ2ＣＨ3］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，ＡｚａＧｌｙ10］−アンチド
［Ｄ−Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3，４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−Ｃｉｔ，Ｈａｒ8］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＥｔＣｂｍ）3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（Ｄ−Ｉｍｚ）6，Ｇｌｙ10］−アンチド
［Ｄ−Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3，Ｄ−Ｈｃｉ6，Ａｇｌ（Ｍｅ）10］−アンチド
［Ｄ−Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−２Ｐａｌ6，Ｈａｒ8，Ａｌａ10］−アンチド
［Ｄ−Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）6，Ｄ−Ａｇｌ（Ｍｅ）10］−アンチド
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＥｔＣｂｍ）3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）6，Ｈａｒ（Ｅｔ2）8］−アンチド
［Ｄ−Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（ｉｐｒＣｂｍ）6，Ｄ−Ａｇｌ10］−アンチド
［Ｆｏｒ−Ｄ−１Ｎａｌ1，Ｄ−Ｄｐｒ（ＥｔＣｂｍ）3，４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（ａｔｚ）6］−アンチド
これらのペプチドはＬＨの分泌を阻害する生物作用能を有する。
実施例１０
実施例１から５、および米国特許第５、４９１、２１７号に概要を述べた手順を用いて、以下のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドも調製する：
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ａｃ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ａｃ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＥｔＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ａｃ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（ｉＰｒＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ａｃ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−Ａｐｈ（Ｈｏｒ）6］−アシリン
［Ｄ−Ｄｂｕ（ＭｅＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｄｐｒ（ＭｅＣｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｄｐｒ（Ｃｂｍ）3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ａｃ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3（Ｍｅ），ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［ＮαＭｅＣｂｍ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）6］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［ＮαＭｅＣｂｍ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［ＮαＭｅＣｂｍ1，Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）6］−アシリン
［Ｄ−Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｄ−Ａｓｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｄ−Ａｓｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ａｃ）5］−アシリン
［Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｇｌｎ3（Ｍｅ），ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）6］−アシリン
［Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）6］−アシリン
［Ｇｌｎ3，ＮαＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ａｓｎ3，ＮαＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
実施例１１
実施例１から８に概要を述べた手順を用いて、以下のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドも調製する：
［Ｆｏｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＣＨ3Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｇｌｎ3，４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｂｚ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＢｒＤ−Ｐｈｅ2，Ｇｌｎ3，Ｄ−４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）6］−アシリン
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｇｌｎ3，４Ａｈｐ（Ｈｏｒ）3，Ａｒｇ8，Ｄ−Ａｇｌ（Ｍｅ）10］−アシリン
［Ｆｏｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，４ＮＯ2Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｇｌｎ3，Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）6］−アシリン
［Ｂｚ−Ｄ−２Ｎａｌ1，ＣαＭｅ４ＣｌＤ−Ｐｈｅ2，Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5］−アシリン
［Ｐｎ−Ｄ−１Ｎａｌ1，Ｇｌｎ3，３Ａｐｈ（Ｉｍｚ）5，Ｄ−３Ａｍｆ（Ｈｏｒ）6，Ａｇｌ10］−アンチド
［ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）5，Ａｇｌ（Ｍｅ）10］−アシリン
［ＰｒＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｇｌｎ3，Ｄ−４Ａｐｈ（ＥｔＣｂｍ）6，Ｐｒｏ9ＮＨＣＨ2ＣＨ3］−アシリン
［Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（ｉｐｒＣｂｍ）6，Ｄ−Ａｇｌ10］−アンチド
［Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−３Ｐａｌ6，Ｈａｒ8，Ａｌａ10］−アンチド
［Ａｃ−Ｄ−１Ｎａｌ1，Ｇｌｎ3，４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）6，Ａｒｇ8］−アンチド
［Ｇｌｎ3，３Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−Ｃｉｔ6，Ｈａｒ8］−アシリン
［Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）6，Ｈａｒ（Ｅｔ2）8］−アンチド
［Ｆｏｒ−Ｄ−１Ｎａｌ1，Ｇｌｎ3，３Ａｍｆ（Ｈｏｒ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（ａｔｚ）6］−アンチド
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ1，Ｇｌｎ3，４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）5，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）6，Ａｌａ10］−アンチド
これらのペプチドは、ＬＨ分泌を抑制する生物作用能を有し、かつ生理的ｐＨの水に極めて良好な溶解性を有する。
アッセイした前述の化合物は、ＬＨ抑制の観点から、アンチドとして知られるＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドに少なくとも概ね匹敵する程度の生物作用能を示すことが示され、これらはアンチドのアナログであると考えられる。この地域での１０年にわたる熱心な検査の結果として、広く受け入れられている検査で測定した生物作用能は、ゴナドトロピン分泌を抑制する、したがって抗生殖効果および抗排卵効果を示す、このような化合物の生物作用能についての証拠となる。優れた溶解性、ｉｎ  ｖｉｖｏでのゲル化に対する抵抗性、長時間持続する生物活性、およびその他の特性に基づき、これらの化合物は、例えば抗排卵剤として、ゴナドトロピン分泌を抑制すること、および生殖腺によるステロイドの放出を阻害することにおいて、一般的に有用であると考えられる。本発明の化合物は、薬剤学的に許容可能な、酸付加塩などの無毒性の塩の形態、例えば、亜鉛、バリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウムなどの金属の錯体の形態（本発明の目的から付加塩として考える）、または双方の組み合わせの形態で、しばしば投与される。このような付加塩の具体例は、塩化水素、臭化水素、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、タンニン酸塩、パモ酸塩（ｐａｍｏａｔｅ）、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、アルギン酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、および酒石酸塩などであり、好ましくは酢酸塩と、パモ酸（ｐａｍｏｉｃ  ａｃｉｄ）の塩であるパモ酸塩とが好ましい。薬効成分を錠剤の形態で投与した場合、その錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、もしくはゼラチンなどの結合剤、アルギン酸などの崩壊剤、またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含む、薬剤学的に許容可能な無毒性の希釈剤を含んでいてもよい。液剤の形態で投与することを所望する場合、甘味剤および／または香味剤を薬剤学的に許容可能な希釈剤の一部として用いることができるし、等張生理的食塩水またはリン酸緩衝液に入れて静脈投与すると効果があるだろう。
医薬品組成物には、通常、慣用的な薬剤学的に許容可能な担体または希釈剤とともに、有効量のペプチドを含むこととする。通常、用量は、静脈投与する場合、被験体の体重１ｋｇあたり約１０マイクログラムから約２．５ミリグラムのペプチドとする。これらの化合物の性質より、経口投与も効果的なものとすることができる。しかしながら、経口での用量は多くなるであろう。総合すると、一般にこれらのペプチドによる被験者の治療は、化合物が溶解しやすい適当な担体を用い、患者のＬＨレベルおよびＦＳＨレベルを抑制するのに充分な用量を投与するといった、他のＧｎＲＨ拮抗物質を用いた臨床的治療と同様の方法で行う。
長時間にわたって（例えば１回の投与から、１週間から１年間にかけて）、ＧｎＲＨアナログが運ばれることが望ましく、除放投与形態、貯留（ｄｅｐｏｔ）投与形態、または移植投与形態を利用することができる。
これらの化合物は、哺乳動物に、静脈内に、皮下的に、筋肉内に、経口的に、経皮的に、鼻腔内に、肺内に、直腸内に、または腟内に投与することにより、一般にゴナトロピンの分泌を抑制することができ、例えば、受胎能の抑制および／または制御をすることができ、性早熟症の管理などの生殖腺活性の可逆的抑制が必用となる用途において投与したり、または放射線治療あるいは化学治療の際に投与したりできる。それらは、ステロイド依存性腫瘍の治療にも有用である。効果的な用量は、投与形態および治療される哺乳動物の特定の種類により変化する。ある典型的な投与形態の例は、該ペプチドを含有するｐＨ約６の静菌水溶液であり、その溶液は、１日当たり約０．１／ｋｇ体重から２．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の有効な用量を与えるように非経口的に投与される。これらの化合物はｉｎ  ｖｉｖｏで非常に耐性であって、ゲル化に抵抗性があると考えられる。したがって、注射点におけるゲル化の危険を伴わずに、適当な濃度（約０．７５ｍｇ／ｍｌ以上、さらには約１．０ｍｇ／ｍｌ以上）の静菌水溶液に入れて、皮下注射投与することに特に良く適していると考えられる。
これらのＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの両方の診断にも有用である。これらのペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで注射し、続いてホルモン分泌、例えばＬＨ分泌の減少の程度を測定するために患者の血流をアッセイすることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行って、ある種の腫瘍細胞がＧｎＲＨに対して感受性であるか否かを測定することができる。このようなアッセイでは、腫瘍細胞培養物をＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドで処理し、次いでホルモン分泌や細胞増殖をモニタする。
本発明は、その好ましい実施形態に関して述べてきたが、本明細書付属の請求の範囲で述べられている本発明の範囲から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術を有する者に明らかな改変や変更をしてもよいものであることを理解しておくべきである。例えば、合成において、鎖の一部の状態としながら修飾するのではなく、α−アミノ保護アミノ酸をペプチド鎖にカップリングする前に、イソシアネートをアミノ側鎖と反応させてもよい。ペプチドの効果をあまり減じない、当該技術分野で知られた他の置換を、本発明の置換に用いることもできる。ペプチドの有効性を著しく損なわない当該技術分野で知られた他の置換も、本発明ペプチドに用いることもできる。Ｎ末端は非置換のままでもよいし、あるいは他の等価なアシル化基を用いることもできるが、アセチル、置換カルバモイル、または非置換カルバモイルのいずれかが好ましい。４Ａｐｈ（Ａｃ）の代わりに、アミノＰｈｅ基を、米国特許第５，５０６，２０７号で開示されているように、ギ酸、β−Ａｌａ（ａｔｚ）、およびガンマ−アミノ酪酸（ａｔｚ）などの他のアシル化剤で処理することができ、これにより実施例中に示されているように同様に、長時間の作用を示すＧｎＲＨ拮抗物質を得ることができる。したがって、これらはそれぞれ、Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）およびＬ−４Ａｐｈ（Ａｃ）の等価体であると考えられる。ＡｐｈもしくはＤ−Ａｐｈの代わりに、Ａｐｈ（アミノホモフェニルアラニン）もしくはＤ−Ａｐｈを５位および６位にそれぞれ用いることができる。Ｌｙｓ（Ｂｕ）およびＬｙｓ（Ｅｔ2）は双方とも、Ａｒｇ、Ａｒｇ（Ｅｔ2）、Ｈａｒ、およびＨａｒ（Ｅｔ2）と同様に、ＩＬｙｓの等価体であると考えられるが、ＩＬｙｓが最も好ましい。その他の疎水性アミノ酸残基も、好ましくはＤ−異性体形で、１位および６位に用いることができる（前述の通り）が、これらは明細書中で述べられたものの等価体であると考えられる。Ｃ−末端のＤ−Ａｌａ−ＮＨ2の代わりに、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌまたはＡｌａ−ｏｌを等価体として用いてもよい。さらに、拮抗物質を、前述した薬剤学的にまたは獣医学的に許容可能な無毒性塩の形態で投与してもよく、これらは等価体であると考えられる。