(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、該方法が、
（a）（i）第１鎖および第２鎖を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドであって、ここで、該第１鎖は、5’-ヒドロキシル基を有する該ポリヌクレオチドの一方の末端で終結し、そして該第２鎖は、3’-リン酸基を有する同じ該ポリヌクレオチド末端で終結する、二本鎖標的ポリヌクレオチド、および（ii）第１鎖および第２鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチドアダプターであって、ここで、該第１鎖は、3’-ヒドロキシルブロッキング基を有する該アダプターの一方の末端で終結し、そして該第２鎖は、5’-リン酸基を有する同じ該アダプター末端で終結する、二本鎖ポリヌクレオチドアダプター、を提供する工程；
（b）該標的ポリヌクレオチドの該第２鎖が、該アダプターの該第２鎖にライゲートされるように、該標的ポリヌクレオチド末端を該アダプター末端にライゲートし、１本鎖のライゲートした標的-アダプター付加物を形成する、工程；
（c）該付加物における該3’-ヒドロキシルブロッキング基を3’-ヒドロキシル基に変換し、そして該付加物における該5’-ヒドロキシル基を5’-リン酸基に変換する工程であって、該変換が、同時にまたはいずれかの順で連続して行われる、工程；
（d）該標的ポリヌクレオチドの該第２鎖を、工程（c）後の該アダプターの該第２鎖にライゲートし、２本鎖のライゲートした標的-アダプター付加物を形成する、工程；および
（e）工程（d）に続いて、該標的ポリヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオチドを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記アダプターが、該アダプターの前記末端に対する配向を有するII型エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、そのため、工程（d）の前記２本鎖のライゲートした標的-アダプター付加物が該エンドヌクレアーゼと反応する場合、（i）該エンドヌクレアーゼの切断部位が、該アダプターの該末端から少なくとも１つのヌクレオチドを越えた前記付加物内で生じ、そして（ii）該エンドヌクレアーゼの該切断のパターンが、該アダプターの該末端に相補的な末端を有する短縮型標的ポリヌクレオチドフラグメントを生成するために効果的であり、そして該方法が、該認識部位に特異的なII型エンドヌクレアーゼで該２本鎖のライゲートした付加物を切断し、１つ以上のヌクレオチドによって短縮された短縮型標的ポリヌクレオチドフラグメントを産生する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで前記切断工程後、前記短縮型標的ポリヌクレオチドフラグメントが、該切断工程によって生じる5’-末端リン酸基を除去するために処理される、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記3’-ブロッキング基がリン酸基であり、そして該3’-ブロッキング基を3’-ヒドロキシル基に変換する前記工程が、ホスファターゼを使用することによって達成される、方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記3’-ブロッキング基を3’-ヒドロキシル基に変換する前記工程が、前記アダプターの前記第２鎖を、（i）置換された鎖の配列と同じ配列を有し、そして（ii）3’-ブロッキング基よりも3’-ヒドロキシル基を含む、新しい第２鎖と置換する工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記アダプターが、以下の式を有する、方法：
0004110216.tif 000026
ここで、NおよびN’は相補的ヌクレオチドであり、pはリン酸基であり、zは3’ブロッキング基であり、nは２から５までの全部の整数であり、qは８以上の整数であり、そしてrは８以上の整数でありそしてｑと同じまたは異なり得る。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここでzがリン酸基であり、qが12〜50の範囲であり、そしてrが12〜50の範囲である、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドアダプターの前記末端が、互いに相補的である5’-オーバーハングを含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドアダプターの前記末端が、互いに相補的である3’-オーバーハングを含む、方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、固相支持体に付着される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（b）〜（e）が１回以上繰り返される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法における使用のための組成物であって、該組成物が、以下の式の二本鎖核酸アダプターを含む、組成物：
0004110216.tif 000027
ここで、NおよびN’は相補的ヌクレオチドであり、pはリン酸基であり、zは3’ブロッキング基であり、nは２から５までの全部の整数であり、qは８以上の整数であり、そしてrは８以上の整数でありそしてｑと同じまたは異なり得る。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、ここでzがリン酸基であり、qが12〜50の範囲であり、そしてrが12〜50の範囲である、組成物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の組成物であって、ここで前記標的ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドアダプターの前記末端が、互いに相補的である5’-オーバーハングを含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１２または１３に記載の組成物であって、ここで前記標的ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドアダプターの前記末端が、互いに相補的である3’-オーバーハングを含む、組成物。
【請求項１６】
同一の二本鎖ポリヌクレオチドの均一な集団を付着しているマイクロパーティクルであって、各ポリヌクレオチドが、同じ末端によって該マイクロパーティクルに付着し、そして各ポリヌクレオチドが、該マイクロパーティクルと離れた方の末端で脱リン酸化された5’-または3’-突出鎖を有する、マイクロパーティクル。
【請求項１７】
前記突出鎖が２〜５ヌクレオチド長である、請求項１６に記載のマイクロパーティクル。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、cDNAである、請求項１６または請求項１７に記載のマイクロパーティクル。
【請求項１９】
前記マイクロパーティクルが、制御された孔ガラス（CPG）マイクロパーティクル、グリシダルメタクリレート（GMA）マイクロパーティクル、またはポリスチレンマイクロパーティクルである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のマイクロパーティクル。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的に、核酸を分析するための改良された方法および組成物に関し、そしてより具体的には、標識されたアダプターの特異的ライゲーションによってポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドを分析する方法に関する。
背景
疾患の遺伝学的根拠および異なる遺伝子発現パターンと関連した他の生理学的状態の宿主を理解する要望は、DNAの大規模分析へのいくつかのアプローチの開発をもたらした。Adamsら編, Automated DNA Sequencing and Analysis（Academic Press, New York, 1994）。遺伝子発現パターンを分析するための現在の技法には、大規模配列決定、ディファレンシャルディスプレイ、インデックススキーム、サブトラクションハイブリダイゼーション、cDNAまたはオリゴヌクレオチドの固相アレイとのハイブリダイゼーション、および多くのDNAフィンガープリンティング技法が挙げられ、例えば、Lingoら, Science, 257:967-971（1992）；Erlanderら，国際特許出願PCT/US94/13041；MacClellandら，米国特許5,437,975；Unrauら, Gene, 145:163-169（1994）；Schenaら, Science, 270:467-469（1995）；Velculescuら, Science, 270:484-486（1995）などに挙げられる。
このような技法の重要なサブクラスは、ポリヌクレオチドの集団を分類するためにおよび／またはポリヌクレオチドの末端のヌクレオチドを同定するために、二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを用いる。例えば、Unrauら（上で引用）および米国特許5,508,169；Sibson, 国際出願PCT/GB93/01452およびPCT/GB95/00109；Cantor, 米国特許5,503,980；およびBrenner, 国際出願PCT/US95/03678および米国特許5,552,278。このようなアダプターは、代表的には、相補的末端を有するポリヌクレイトドへの特異的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを可能にする突出鎖を有する。同定または分類は、別々の容器中でこのような反応を行うことによって、またはライゲートされたアダプターの突出鎖中の１つ以上のヌクレオチドを同定する標識を提供することによってもたらされる。
これらの技術では、特別な問題は、図１に示されるような、自己ライゲーションが可能であるポリヌクレオチド末端またはアダプターのいずれかを処理することで生じ、ここで、繋ぎ止めたポリヌクレオチドの４ヌクレオチド突出鎖は、互いに相補的である。自己ライゲーションが起こる場合、アダプターまたは標的ポリヌクレオチドのいずれかの突出鎖は、分析またはプロセシングにもはや利用可能ではない。次に、これは、標的ポリヌクレオチドへのアダプターの正確なライゲーションに応じて生成するシグナルの喪失または消失をもたらす。同一の標的ポリヌクレオチドが固相支持体に繋ぎ止められる場合、自己ライゲーション問題は、特に深刻である。この状況では、自己ライゲーションを可能にする末端の局所濃度は、代表的には、二本鎖アダプターの濃度に対して非常に高く、それによって、相補的配列が存在する場合はいつでも、自己ライゲーションを好ましい反応にする。図１に示すように、相補的配列は、ハイブリダイゼーションの際にパリンドローム二本鎖を形成する。ランダム配列でパリンドローム４マーが生じる確率は、ヌクレオチドの繰り返した対の確率と同じであるので（6.25％）、新規配列決定のためのアダプターに基づく方法は、自己ライゲーションのため、２、３のサイクルの後、高い失敗の可能性を有する。これが生じる場合、ポリヌクレオチドのさらなる分析が不可能になる。
核酸配列分析におけるアダプターに基づく技術の増加した重要性を考慮して、自己ライゲーション問題を克服するための利用可能な方法および物質が、非常に望まれる。
発明の要旨
したがって、本発明の目的は、アダプターも標的ポリヌクレオチドもどちらも自己ライゲートしないアダプターに基づく分析方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ライゲーションによるDNA配列決定の改良された方法を提供することであり、ここで固相支持体に繋ぎ止められた同一の標的ポリヌクレオチドは、リガーゼの存在下で互いにライゲートし得ない。
本発明のさらに他の目的は、互いにライゲートし得ないが、同時に相補的突出鎖を有する標的ポリヌクレオチドにライゲートされ得る、オリゴヌクレオチドアダプターを提供することである。
本発明の他の目的は、固相支持体へ一方の末端によって繋ぎ止められた同一のポリヌクレオチドの均一な集団を含む組成物を提供することであり、このポリヌクレオチドは、そのフリーの末端に、5’リン酸基を含まない突出鎖を有する。
本発明は、二本鎖アダプターを使用してポリヌクレオチドを分析するための方法および組成物を提供することによって、これらおよび他の目的を達成する。本発明の重要な局面は、特に、酵素的ライゲーションを用いる実施態様で、自己ライゲーションが生じ得ないような、分析されるべきポリヌクレオチドの末端からの5’リン酸の除去である。本発明の他の重要な局面は、分析されるべきポリヌクレオチドの鎖に相補的な突出鎖をそれぞれ有し、そして鎖がライゲートされ得ないようにブロックされた3’炭素を含む鎖をそれぞれ有する、二本鎖アダプターの使用である。好ましくは、本発明の二本鎖アダプターは、以下の式によって定義される：
0004110216.tif 000002
ここで、NはヌクレオチドでありそしてN’は相補物であり、pはリン酸基であり、zは3’ブロッキング基であり、nは２から６まで全部の整数であり、qは８以上の整数であり、そしてrは８以上の整数であり、これはｑと同じまたは異なり得る。
好ましくは、zはリン酸基であり、そしてアダプターの二本鎖部分は、認識部位がその切断部位とは別々であるヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を含む。以下により十分に記載のように、後者のエレメントは、DNA配列決定についてのライゲーションおよび切断の繰り返されたサイクルを用いる実施態様で有用である。
図2aに示される、好ましい実施態様では、本発明は、ポリヌクレオチドの末端のヌクレオチドの同一性を決定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（a）ポリヌクレオチドの末端に二本鎖アダプターをライゲートする工程であって、このポリヌクレオチドの末端が脱リン酸化5’ヒドロキシルを有し、そして二本鎖アダプターが第１鎖および第２鎖を有し、この二本鎖アダプターの第２鎖が3’ブロッキング基を有する、工程；（b）第１鎖のライゲーション後に3’ブロッキング基を除去する工程；（c）ポリヌクレオチドの5’ヒドロキシルをリン酸化する工程；（d）二本鎖アダプターを再生するためにブロックされていない3’部分を有する第２鎖をライゲートする工程；および（e）そこにライゲートしたアダプターの同一性によってポリヌクレオチドの末端の１つ以上のヌクレオチドを同定する工程。3’ブロッキング基を除去する工程は、いくつかの方法によって行われ得、例えば、完全な3’ブロックされた第２鎖を洗浄し次いでブロックされていない鎖との置換によって、3’ブロッキング基を化学的もしくは酵素的に除去することによって、あるいはそうでなければ第２鎖の除去なしに第２鎖上の3’ヒドロキシルを活性化または再生することによって、物理的に除去することを包含する。3’リン酸は、好ましくは3’ブロッキング基であり、そして除去する工程は、好ましくは、第２鎖をホスファターゼで処理することによって行われ、3’リン酸を除去しそしてフリーの3’ヒドロキシルを再生する。
さらに好ましくは、二本鎖アダプターは、認識部位がその切断部位とは別であるヌクレアーゼの認識部位を含む。これは、標的ポリヌクレオチドの追加のヌクレオチドを同定するためにライゲーションおよび切断の繰り返されたサイクルを行うことを可能にする。したがって、本発明の方法は、好ましくは、以下のさらなる工程を包含する：（f）上記ポリヌクレオチドが１つ以上のヌクレオチドで短縮されるように、上記二本鎖アダプターのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼで上記ポリヌクレオチドを切断する工程、（g）上記切断の工程がこのような5’末端リン酸基の形成を生じる場合はいつでも、5’末端リン酸基を除去するために上記切断されたポリヌクレオチドを処理する工程、および（h）上記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで、上記工程（a）〜（g）を繰り返す工程。
他の重要な実施態様では、本発明は、二本鎖アダプターの使用によって、集団のポリヌクレオチドを分類するための方法を提供する。一般的に、本発明のこの局面では、ポリヌクレオチドは、（a）エンドヌクレアーゼで混合物のポリヌクレオチドを処理し、突出鎖を有するポリヌクレオチドを産生する工程、（b）混合物中で二本鎖アダプターをポリヌクレオチドにライゲートする工程であって、ポリヌクレオチドが二本鎖アダプターの鎖に相補的な突出鎖を有し、ポリヌクレオチドの末端が脱リン酸化5’ヒドロキシルを有し、そして二本鎖アダプターが第１鎖および第２鎖を有し、ここで二本鎖アダプターの第２鎖が3’ブロッキング基を有する、工程、（c）第１鎖のライゲーション後に3’ブロッキング基を除去する工程、（d）ポリヌクレオチドの5’ヒドロキシルをリン酸化する工程、（e）二本鎖アダプターを再生するためにブロックされていない3’部分を有する第２鎖をライゲートする工程、および（f）そこにライゲートしたアダプターの同一性によってポリヌクレオチドを分類する工程、によって分類される。
本発明は、DNAを分析または配列決定するためのアダプターに基づく方法における重要な問題：すなわち、標的ポリヌクレオチドおよびアダプターの自己ライゲーションの問題を克服する。自己ライゲーションがない場合、アダプターに基づく方法は、著しくより効果的およびより信頼のおけるものになり、次に、市販の適用性を非常に増強させる。
【図面の簡単な説明】
図１は、固相支持体に繋ぎ止められる同一のポリヌクレオチドの自己ライゲーションの現象を示す。
図2aは、ブロックされた3’炭素を有する二本鎖アダプターが標的ポリヌクレオチドにライゲートされる、本発明の好ましい方法における工程を示す。
図2bは、ライゲーションおよび切断の段階的サイクルによるDNA配列決定の方法における好ましい実施態様の使用を示す。
図3a〜3eは、ライゲーションおよび切断のサイクルを必要としないDNA配列決定のための本発明の実施態様を示す。
定義
本明細書で使用される場合、用語「ライゲーション」とは、１つ以上（通常２つ）のオリゴヌクレオチドの末端間の共有結合の形成を意味する。この用語は、通常、以下の反応から生じるホスホジエステル結合の形成をいい、これは通常、リガーゼによって触媒される：
オリゴ1（5’）-OP（O-）（=O）O+HO-（3’）オリゴ2-5’
→オリゴ1（5’）-OP（O-）（=O）O-（3’）オリゴ2-5’
ここでオリゴ1およびオリゴ2は、２つの異なるオリゴヌクレオチドかまたは同じオリゴヌクレオチドの異なる末端のいずれかである。この用語は、ホスホジエステル結合の非酵素的形成、ならびにホスホロチオエート結合、ジスルフィド結合などのような、オリゴヌクレオチドの末端間の非ホスホジエステル共有結合の形成を包含する。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドに関して「配列決定」または「ヌクレオチド配列を決定すること」は、ポリヌクレオチドの部分ならびに全配列情報の決定を含む。すなわち、この用語は、配列比較、フィンガープリンティング、および標的ポリヌクレオチドについての情報の類似のレベル、ならびに標的ポリヌクレオチドにおける、ヌクレオシド、通常は各ヌクレオチド、の発現同定および順序づけを包含する。この用語はまた、標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの４つのタイプのうちの１、２、または３つの同定、順序づけ、および位置の決定を包含する。例えば、いくつかの実施態様では、配列同定は、その配列が、バイナリーコード、例えば、「C-（非C）-（非C）-C-（非C）-C...」については「100101...」などとして表されるように、標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの単一タイプ、例えば、シトシンの順序づけおよび位置を同定することによって行われ得る。
プローブおよび標的ポリヌクレオチドの突出鎖に関して「完全に一致した二重鎖」とは、二本鎖構造中の各ヌクレオチドが、反対の鎖上のヌクレオチドとのワトソン・クリック塩基対形成を受けるように、一方からの突出鎖が他方と二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、アダプターの複雑性を減少させるために用いられ得る、デオキシイノシン、2-アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなどのような、ヌクレオシドアナログの対形成を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む、ヌクレオシドまたはそのアナログの直鎖状オリゴマーを含む。通常、オリゴヌクレオチドは、２、３のモノマーユニット、例えば、３〜４から、数百のモノマーユニットまでのサイズの範囲である。オリゴヌクレオチドが、「ATGCCTG」のような文字の配列によって表される場合はいつでも、ヌクレオチドは、左から右に5’→3’の順であり、そして他に指示がなければ、「A」はデオキシアデノシンを表し、「C」はデオキシシトシンを表し、「G」はデオキシグアノシンを表し、そして「T」はチミジンを表すと理解される。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、例えば、KornbergおよびBaker, DNA Replication, 第2版（Freemen, San Francisco, 1992）に記載のように、2’-デオキシおよび2’-ヒドロキシル形態を含む、天然のヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関して、「アナログ」は、例えば、Scheit, Nucleotide Analogs（John Wiley, New York, 1980）に一般的に記載される、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。このようなアナログは、結合特性を増強し、縮重を減少させ、特異性を増加させるなどのために設計された合成ヌクレオシドを含む。
発明の詳細な説明
本発明の方法および組成物は、分析のためにポリヌクレオチドにライゲートされる二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを用いる多数の核酸分析技法、特にインデックススキーム（Unrauら（上で引用）およびSibson（上で引用））、およびDNA配列決定スキーム（Cantor（上で引用）、Brenner（上で引用）、およびSibson（上で引用））における適用を見いだす。
図１に示すように、本発明の重要な特徴は、「自己相補的」配列（114）がフリーの突出鎖に存在する場合、アダプターに基づく分析方法が、完全に失敗し得るという発見であった。この問題は、分析されるべきポリヌクレオチド（l12）が、固相支持体（110）に付着した同一のポリヌクレオチドの均一な集団としてアダプターに提示される実施態様で、特に難しい。これらの状況では、繋ぎ止められたポリヌクレオチドのフリーの末端は、互いに完全に一致した二重鎖（l16）を形成するために巻き付き得る。末端の5’鎖がリン酸化されるならば、ポリヌクレオチドは、リガーゼの存在下で容易にライゲートされる。類似の問題も、二本鎖アダプターについて存在する。すなわち、5’鎖がリン酸化される場合はいつでも、１つのアダプターの5’鎖は、その突出鎖のヌクレオチド配列が相補的である場合はいつでも、もう１つのアダプターのフリーの3’ヒドロキシルにライゲートされ得る。
一般的に、本発明の方法は、好ましい実施態様についての図2aに示される以下の工程によって、上記の問題を提示する：（a）ポリヌクレオチドの末端（122）に二本鎖アダプターをライゲートする工程（120）であって、ポリヌクレオチドの末端が脱リン酸化した5’ヒドロキシルを有しそしてライゲートされるべき二本鎖アダプター末端（124）が第１鎖（126）および第２鎖（128）を有し、二本鎖アダプターの第２鎖が3’ブロッキング基（130）を有する、工程；（b）例えば、洗浄（132）によって、あるいは、例えば、ブロッキング基がリン酸であるならばホスファターゼでの処理によって、インサイチュで酵素的または化学的に除去することによって、ライゲーション後に第２鎖の3’ブロッキング基を除去する工程；（c）ポリヌクレオチドの5’ヒドロキシルをリン酸化する工程（134）；（d）二本鎖アダプター（138）を再生するためにブロックされていない3’部分を有する第２鎖（142）をライゲートする工程（136）；および（e）例えば、蛍光標識（140）、コードされたアダプター（以下に記載）、増幅（プライマー結合部位を提供することによって）などによって、そこにライゲートされるアダプターの同一性によってポリヌクレオチドの末端で１つ以上のヌクレオチドを同定する工程（144）。二本鎖アダプターおよび標的ポリヌクレオチドは、単一でまたは混合物としてライゲーションについて組み合わされ得る。例えば、所定の配列を有する単一種のアダプターは、共通（およびおそらく、未知の）ヌクレオチド配列を有する単一種のポリヌクレオチドと組み合わされ得；あるいは、定義された配列を有する単一種のアダプターは、例えば、Brennerら，国際出願PCT/US96/09513に記載される、同じ反応容器中の異なる固相支持体に付着した同一のポリヌクレオチドの複数の均一集団のような、ポリヌクレオチドの混合物と組み合わされ得；あるいは、二本鎖アダプターの混合物、特に、突出鎖中に異なるヌクレオチド配列を有する混合物は、単一種のポリヌクレオチドと組み合わされ得；あるいは、二本鎖アダプターの混合物は、ポリヌクレオチドの混合物と組み合わされ得る。用語「アダプター」、または「二本鎖アダプター」が、単独で使用される場合、突出鎖の異なる配列を有するアダプターの混合物、ならびに用語「プローブ」の用法と類似の方法で、突出鎖の同じ配列を有する単一種のアダプターを包含することを意味する。
ライゲーションおよび切断のサイクルを用いる好ましい実施態様は、以下の工程を包含する：（a）ポリヌクレオチドの末端（222）に二本鎖アダプターをライゲートする工程（220）であって、ポリヌクレオチドの末端が脱リン酸化された5’ヒドロキシルを有し、ライゲートされるべき二本鎖アダプターの末端（224）が第１鎖（226）および第２鎖（228）を有し、二本鎖アダプターの第２鎖が3’ブロッキング基（230）を有し、そして二本鎖アダプターが認識部位がその切断部位とは別であるヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位（250）を有する、工程；（b）例えば、第２鎖（232）を洗い流すことによって、ライゲーション後に3’ブロッキング基を除去する工程；（c）ポリヌクレオチドの5’ヒドロキシルをリン酸化する工程（234）；（d）二本鎖アダプター（238）およびヌクレアーゼ認識部位（250）を再生するためにブロックされていない3’部分を有する第２鎖（242）をライゲートする工程（236）；（e）そこにライゲートされたアダプターの同一性によってポリヌクレオチドの末端の１つ以上のヌクレオチドを同定する工程（244）；（f）ポリヌクレオチドが１つ以上のヌクレオチドで短縮されるように、認識部位を認識するヌクレアーゼでポリヌクレオチドを切断する工程（252）であって、認識部位が示されるアダプター（224）中に配置され、そのため切断（254）がポリヌクレオチドから２つのヌクレオチドを除去する、工程（222）；（g）ポリヌクレオチドの5’末端を脱リン酸化する工程（256）；および（h）工程（a）〜（g）を繰り返す工程（258）。
代表的には、ライゲーションの前に、分析されるべきポリヌクレオチドの末端は、通常3’または5’突出鎖、すなわち、「粘着」末端を有する、所定の切断を産生する１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断することによって調製される。このような切断は、通常、5’鎖をリン酸化したままにする。好ましくは、これらの5’リン酸化末端は、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, 第2版（Cold Spring Harobor Laboratory, New York, 1989）に記載のような標準的プロトコルを使用して、ウシ腸アルカリホスファターゼ、または類似の酵素のようなホスファターゼでの処理によって脱リン酸化される。5’リン酸の除去によって、標的ポリヌクレオチドは、リガーゼの存在下でライゲートされ得なくなる。脱リン酸化の工程は、好ましくは、フリーの5’ヒドロキシルを放出する。
ポリヌクレオチドの脱リン酸化末端への二本鎖アダプターのライゲーションは、特定の実施態様に依存して、酵素的または化学的に行われ得る。好ましくは、ライゲーションは、標準的プロトコルでリガーゼを使用して酵素的に行われる。多くのリガーゼは公知であり、そして本発明での使用に適切である。例えば、Lehman, Science, 186:790-797（1974）；Englerら, DNA Ligases, 3-30頁, Boyer編, The Enzymes, 15B巻（Academic Press, New York, 1982）など。好ましいリガーゼには、T4 DNAリガーゼ、T7 DNAリガーゼ、E. coli DNAリガーゼ、Taqリガーゼ、Pfuリガーゼ、およびTthリガーゼが挙げられる。それらの使用のためのプロトコルは周知であり、例えば、Sambrookら（上で引用）；Barany, PCR Methods and Applications, 1:5-16（1991）；Marshら, Strategies, 5:73-76（1992）などである。一般的に、リガーゼは、5’リン酸基が、隣接する鎖の3’ヒドロキシルへのライゲーションのために存在することを必要とする。したがって、リガーゼが、標的ポリヌクレオチドに二本鎖アダプターをライゲートするために用いられる場合はいつでも、二本鎖アダプターの相補的末端の5’鎖はリン酸化されなければならない。
一般的に、本発明の二本鎖アダプターは、Unrauら（上で引用）、Sibsonら（上で引用）、およびBrenner（上で引用）に記載のアダプターと同じ機能を提供し、その後者は、アダプター（またはこの参考文献では「プローブ」と命名される）の記載についておよび段階的ライゲーションおよび切断によるDNA配列決定における操作の記載については、参考として援用される。アダプターは、２つの操作の１つまたは両方のいずれかを行うための「プラットホーム」を提供する：第１は、その相補的突出鎖の標的ポリヌクレオチドの鎖への特異的ハイブリダイゼーションによって、アダプター（または時にはアダプターの対）は、標的ヌクレオチドの突出鎖中の１つ以上のヌクレオチドを同定するための手段、あるいは、例えば、Unrauら（上で引用）に記載のように、選択的増幅のためのプライマー結合部位を提供することによって、標的ポリヌクレオチドのサブ集団を分類するための手段を提供する。第２に、アダプターは、ヌクレアーゼが、アダプターがライゲートされる標的ポリヌクレオチドを切断し得る認識部位を提供する。Brenner（上で引用）に記載のように、アダプターは、必ずしもあらゆる実施態様で両方の機能を提供しない。
上記の二本鎖アダプターについての式に関して、好ましくは、nは２〜６を含む範囲であり；そしてrおよびqは、別々に８〜50を含む範囲である。3’ブロッキング基「z」は、種々の形態であり得、そして、ライゲーションを妨げそしてこの方法の他の工程、例えば、3’ブロックされた鎖の除去、ライゲーションなどを妨害しない、ほとんどの任意の化学実体を含み得る。代表的3’ブロッキング基には、水素（すなわち、3’デオキシ）、リン酸、ホスホロチオエート、アセチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、3’ブロックされた鎖の合成中の基の添加における便利性、および鎖をリガーゼでのライゲーションを可能にするホスファターゼでの基の除去の便利性のため、3’ブロッキング基はリン酸である。3’リン酸を有するオリゴヌクレオチドは、Eckstein編, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach（IRL Press,Oxford, 1991）の12章に記載のプロトコルを使用して合成され得る。
融解による除去の他に、3’デオキシは、Kuijperら, Gene, 112:147-155（1992）；Aslanidisら, Nucleic Acids Research, 18:6069-6074（1990）などの参考に開示されるポリメラーゼ「交換」反応によって第２鎖から除去され得る。簡単にいえば、T4 DNAポリメラーゼおよび類似の酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、溶液中でプライミング鎖中のヌクレオチドをその三リン酸相対物と交換するために使用され得る。したがって、このような反応では、3’ジデオキシヌクレオチドは、反応混合物から2’-デオキシ-3’-ヒドロキシヌクレオチドと交換され得、これはポリヌクレオチドキナーゼでの処理後に第２鎖を標的ポリヌクレオチドにライゲート可能にする。
さらなる3’ブロッキング基は、例えば、以下の参考文献に開示される、塩基毎配列決定スキームにおける可逆的チェーンターミネーティングヌクレオチドについて開発された化学作用から利用可能である：Cheeseman, 米国特許5,302,509；Tsienら，国際出願WO 91/06678；Canardら, Gene,148:1-6（1994）；およびMetskerら, Nucleic Acids Research, 22:4259-4267（1994）。概略的には、これらの化学作用は、プライミング鎖の3’末端のフリーのヒドロキシルを生成するために特異的ブロッキング基（通常、付加標識を有する）の化学的または酵素的除去を可能にする。
アダプターの相補鎖は、例えば、以下の参考文献に開示される、ホスホロアミダイト化学作用のような、標準的化学作用を使用して、自動化DNA合成機、例えば、Applied Biosystems, Inc.（Foster City, California）model 392または394 DNA／RNA Synthesizerで便利に合成される：BeaucageおよびIyer, Tetrahedron, 48:2223-2311（1992）；Molkoら，米国特許4,980,460；Kosterら，米国特許4,725,677；Caruthersら，米国特許4,415,732；4,458,066；および4,973,679など。生じるオリゴヌクレオチドが、ライゲーションおよび切断試薬と適合可能であるならば、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダイトなどのような、非天然骨格基を生じる、代わりの化学作用も用いられ得る。合成後、相補鎖は、二本鎖アダプターを形成するために合わせられる。アダプターの突出鎖は、混合物として合成され得、そのためあらゆる可能な配列は、Brenner（上で引用）に記載のように、突出部分で表される。
Brenner（上で引用）でもまた説明されるように、アダプターの突出鎖が5’または3’末端であるかどうかは重要ではない。しかし、標的ポリヌクレオチドおよびアダプター（または少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドに適用された混合物）の突出鎖は、特異的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを可能にするために完全に一致した二重鎖を形成し得ることは重要である。標的ポリヌクレオチドおよびアダプターの突出鎖が、異なる長さであるならば、得られるギャップは、例えば、Backmanら，ヨーロッパ特許出願91100959.5に開示される「ギャップLCR」のように、ライゲーションの前にポリメラーゼによって充填され得る。このようなギャップ充填は、標的ポリヌクレオチドの突出鎖において１つ以上のヌクレオチドを同定するための手段として使用され得る。好ましくは、それぞれの突出鎖中のヌクレオチドの数は、同じであり、そのため、アダプターおよび標的ポリヌクレオチドの両方の鎖が充填工程なしにライゲートされ得る。好ましくは、アダプターの突出鎖は、２〜６ヌクレオチドの長さである。
上記のように、好ましい二本鎖アダプターは、以下の式によって定義される：
0004110216.tif 000003
ここで、p、N、N’、n、q、およびrについての好ましい値は、上記の通りである。より好ましくは、nは２〜５の範囲であり；そしてqおよびrは12〜50の範囲であり、そして同じまたは異なり得る。最も好ましくは、nは４である。5’モノリン酸は、化学的またはキナーゼで酵素的のいずれかで付着され得る。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版（Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1989）。化学的リン酸化は、HornおよびUrdea, Tetrahedron Lett., 27:4705（1986）に記載され、そして開示されたプロトコルを行うための試薬は、市販されており、例えば、Clontech Laboratories（Palo Alto, California）からの5’Phosphate-ONTMである。
本発明のアダプターは、Brenner（上で引用）（アダプターについての標識様式の記載について参考として援用される）に開示されるように、放射能部分、蛍光部分、比色部分などの直接または間接的付着を含む、種々の方法で標識され得る。好ましくは、アダプターは、例えば、Menchenら，米国特許5,188,934；Begotら，PCT出願PCT/US90/05565に開示されるような、１つ以上の蛍光色素で標識される。蛍光エネルギー輸送を使用する色素の対は、Juら, Proc. Natl. Acad. Sci., 92:4347-4351（1995）およびJuら, Nature Medicine, 2:246-249（1996）によって教示されるように、各アダプターで用いられ得る。
いくつかの実施態様では、配列決定操作において、１つまたは２つのタイプの蛍光色素のような１つまたは２つのシグナル生成部分を使用することが所望であり得る。このような条件下で、配列は、ポリヌクレオチドに沿った連続した位置で特定のヌクレオチドの存在または不在によって特徴づけられ得る。例えば、配列「acggttaat」は、tの存在および不在に関して記載され「（非t）-（非t）-（非t）-（非t）-tt-（非t）-（非t）-t」として表され得る。あるいは、このような配列は、プリンの存在および不在に関して記載され、「プリン-（非プリン）-プリン-プリン-（非プリン）-（非プリン）-プリン-プリン-（非プリン）」として表され得る。好ましくは、２つの色素は、特定のヌクレオチドまたは塩基の不在を示すためでさえ、ポジティブシグナルが測定されるような実施態様で用いられる。このようなバイナリー配列は、配列が十分に長いならば、cDNAライブラリーのような、集団からポリヌクレオチドを独特に同定するために使用され得る。
単一の蛍光色素のような単一のシグナル生成部分は、国際特許出願PCT/US95/12791に記載のような並行配列決定操作において、異なる空間的にアドレス可能な固相支持体に付着したいくつかの異なる標的ポリヌクレオチドを配列決定する場合に用いられ得る。これは、複数の標的ポリヌクレオチドに連続的に適用されるアダプターの４つのセットを提供することによって達成され得る。このようなアダプターの代表的セットを以下に示す：
0004110216.tif 000004
ここで、挙げられたアダプターのそれぞれは、４3=64オリゴヌクレオチドの混合物を表し、その結果、上部鎖の3’末端ヌクレオチドの同一性は固定され、そして突出鎖中の他の位置は、３つのヌクレオチドまたは複雑性を減少させるアナログの配列のあらゆる順列によって満たされる。挙げられたアダプターはまた、「T*」として示される、末端チミジンに付着したシグナル生成部分を有する一本鎖ポリTテイルを有することが示される。非標識アダプター上の「d」は、ライゲーションブロッキング部分を表し、または3-ヒドロキシルの不在を表し、これは非標識アダプターがライゲートされることを防ぐ。好ましくは、このような3’-末端ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。この実施態様では、セット１のアダプターは、最初に複数の標的ポリヌクレオチドに適用され、そしてリガーゼで処理され、そのため標識されたアダプターの3’末端アデノシンに相補的なチミジンを有する標的ポリヌクレオチドがライゲートされる。非標識アダプターは、不適切なライゲーションを最小にするために同時に適用される。「A」で終わるアダプターとのライゲートされた複合体を形成する標的ポリヌクレオチドの位置は、アダプターで行われる標識によって生成されるシグナルによって同定される。洗浄および切断後、セット２のアダプターが適用される。この場合、「C」で終わるアダプターとのライゲートされた複合体を形成する標的ポリヌクレオチドは、位置によって同定される。同様に、セット３および４のアダプターが適用され、そして陽性シグナルの位置が同定される。アダプターの４つのセットを連続的に適用するプロセスは、ヌクレオチドの所望の数が、標的ポリヌクレオチドで同定されるまで、持続する。
他の実施態様では、２つの標識、例えば、蛍光色素は、国際特許出願PCT/US95/12791に記載のような並行DNA配列決定スキームにおいて、プリンおよびピリミジンを二者択一的に同定するために用いられ得る。異なるII型ヌクレアーゼ、すなわち、第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼについての認識部位を有するアダプターの２つのセットが提供される。ヌクレアーゼは、切断後のオーバーハングの同一種を残すために選択される。各セットのアダプターは、第１のセットについてはそれぞれAまたはGの存在下で、あるいは第２のセットについてはそれぞれCまたはTの存在下で、首尾よいライゲーションを生じるために設計されるかどうかに依存して、第１の標識または第２の標識のいずれかで標識される。両方のセットのアダプターは、適切な突出鎖を有する固定された標的ポリヌクレオチドのコレクションに適用され、そして本発明に従ってライゲートされる。標識によって生成されるシグナルの位置および特徴づけ、例えば色が記録される。次に、ライゲートされたアダプターは、第１のヌクレアーゼで切断され、そして洗浄される。シグナルが消失する部位は、AおよびGが標的ポリヌクレオチドに存在する部位に対応し、そしてシグナルが残る部位は、標的ポリヌクレオチドに存在するCおよびTの位置に対応する。次いで、アダプターは、第２のヌクレアーゼで切断されて、ライゲーションおよびヌクレアーゼ切断のサイクルを完了する。
オリゴヌクレオチドタグおよびコードされたアダプター
コードされたアダプターを使用して、標的ポリヌクレオチドは、その末端への（または並行配列決定操作で使用される場合、多数の標的ポリヌクレオチドの末端への）コードされたアダプターの１つ以上のセットの単一ライゲーションに基づいて分析され得る。すなわち、ライゲーションおよび切断のサイクルが使用され得るが、必要ではない。本明細書で使用される場合、用語「コードされたアダプター」とは、オリゴヌクレオチドの最小に交差ハイブリダイズするセットから選択されたオリゴヌクレオチドタグを含む、上記のような二本鎖アダプターを意味する。突出鎖が標的ポリヌクレオチドの相補的突出鎖と完全に一致した二重鎖を形成するコードされたアダプターは、本発明に従ってライゲートされる。ライゲーション後、突出鎖におけるヌクレオチドの同一性および順序は、ライゲートされたアダプターにおける対応するタグへの標識されたタグ相補物を特異的にハイブリダイズすることによって、決定または「解読」される。
例えば、5’-AGGTという、４つのヌクレオチドの突出鎖を有するコードされたアダプターが、標的ポリヌクレオチドの相補的突出鎖と完全に一致した二重鎖を形成しそしてライゲートされるならば、ポリヌクレオチドにおける４つの相補的ヌクレオチド、3’-TCCAは、突出鎖のあらゆる可能な４つのヌクレオチド配列についての１つである、256のこのようなタグのセットから選択された独特のオリゴヌクレオチドタグによって同定される。タグ相補物は、ライゲートされたアダプターのオリゴヌクレオチドタグと完全に一致した二重鎖（または三重鎖）を形成するそれらのタグ相補物のみの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ライゲートされたアダプターに適用される。タグ相補物は、個々に、あるいは、オリゴヌクレオチドタグの同一性、したがって突出鎖の配列を決定するために１つ以上の混合物として、適用され得る。以下でより詳細に説明するように、コードされたアダプターの連続するセットは、好ましくは、各セットが標的ポリヌクレオチドの異なる部分のヌクレオチド配列を同定し得るように、標的ポリヌクレオチドに適用される。
コードされたアダプターの重要な特徴は、例えば、国際特許出願PCT/US96/09513および米国特許5,604,097に記載のように、オリゴヌクレオチドの最小の交差ハイブリダイズするセットのメンバーであるオリゴヌクレオチドタグの使用であり、その後者は、オリゴヌクレオチドタグの記載について参考として援用される。このようなセットのオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドが同じセットのあらゆる他のメンバーの配列とは異なる。したがって、このようなセットの各メンバーは、２つよりも少ないミスマッチのある任意の他のメンバーの相補物と二重鎖（または三重鎖）を形成し得ない。好ましくは、最小の交差ハイブリダイズするセットの各メンバーは、特定の適用に必要とされるセットのサイズと一致するできるだけ多くのヌクレオチドによりあらゆる他のメンバーとは異なる。例えば、コードされたアダプターに標識を送達するための12〜20マーのような、より長いオリゴヌクレオチドタグが使用される場合、最小の交差ハイブリダイズするセットのメンバー間の差は、好ましくは、２つより著しく大きい。好ましくは、このようなセットの各メンバーは、少なくとも４ヌクレオチドがあらゆる他のメンバーとは異なる。より好ましくは、このようなセットの各メンバーは、少なくとも６ヌクレオチドがあらゆる他のメンバーとは異なる。本発明のオリゴヌクレオチドタグの相補物は、本明細書では「タグ相補物」という。
オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖であり得、そして二重鎖形成による一本鎖タグ相補物への特異的ハイブリダイゼーションのために設計され得る。オリゴヌクレオチドタグはまた、二本鎖であり得、そして三重鎖形成による一本鎖タグ相補物への特異的ハイブリダイゼーションのために設計され得る。
粘着切断点で標的ポリヌクレオチドにライゲートされるコードされたアダプターの多数のセットが用いられ得、その結果コードされたアダプターは、標的ポリヌクレオチドの複数の連続する部分のそれぞれからの配列情報を提供する。このような連続する部分は、好ましくは、この方法で生成した標的ポリヌクレオチドの突出鎖に対応する。
本発明は、認識部位がその切断部位とは別であるヌクレアーゼを使用する。以下でより十分に説明するように、このようなヌクレアーゼは、好ましくは、II型制限エンドヌクレアーゼである。ヌクレアーゼは、コードされたアダプターがライゲートされる標的ポリヌクレオチドにおいて突出鎖を生成するために使用される。本発明の所定の実施態様で得られる配列情報の量は、一部は、どれくらいのこのようなヌクレアーゼが用いられるかに依存し、そして切断時に生じる突出鎖の長さに依存する。
本発明の重要な局面は、並行して多くの標的ポリヌクレオチドを配列決定する能力である。この局面では、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（a）レパートリーからの各第１のオリゴヌクレオチドタグが第１の最小の交差ハイブリダイズするセットから選択されるように、タグのレパートリーからの第１のオリゴヌクレオチドタグをポリヌクレオチドの集団中の各ポリヌクレオチドに付着させる工程；（b）集団中の実質的にすべての異なるポリヌクレオチドが付着した異なる第１のオリゴヌクレオチドタグを有するように、ポリヌクレオチドの集団をサンプリングする工程；（c）集団中のポリヌクレオチドの末端に１つ以上のコードされたアダプターをライゲートする工程であって、このポリヌクレオチドが脱リン酸化した5’末端を有し、そして各コードされたアダプターが3’ブロッキング基を有し、第２のオリゴヌクレオチドタグが第２の最小の交差ハイブリダイズするセットから選択され、そして突出鎖が集団のポリヌクレオチドの突出鎖に相補的である、工程；（d）第１のオリゴヌクレオチドタグをそれぞれの相補物と特異的にハイブリダイズすることによって集団からポリヌクレオチドをソーティングする工程であって、このそれぞれの相補物が、１つ以上の固相支持体上の空間的に分離した領域において実質的に同一のオリゴヌクレオチドの均一な集団として付着される、工程；および（e）タグ相補物を１つ以上のコードされたアダプターの各第２のオリゴヌクレオチドタグに特異的にハイブリダイズすることによってポリヌクレオチドの上記突出鎖中の複数のヌクレオチドを同定する工程。
本発明の上記の局面は、図3a〜3eに示す実施態様によって説明される。この実施態様では、k標的ポリヌクレオチドは、以下に、およびBrenner，国際特許出願PCT/US95/12791に記載のように調製される。すなわち、試料は、小さい「t」によって示されるオリゴヌクレオチドタグと結合したポリヌクレオチドの集団から採取される。これらのタグは、ときどき、ソーティングについてのオリゴヌクレオチドタグ、または「第１の」オリゴヌクレオチドタグと呼ばれる。試料のタグ-ポリヌクレオチド結合体は、例えば、図3aの（14）〜（18）に示される、結合体の１〜kの集団を与えるために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはクローニングによって増幅される。好ましくは、（小さい「t」）タグの末端とは反対の結合体の末端は、１つ以上のアダプターをライゲートするために調製され、そのそれぞれは、切断部位がその認識部位とは別であるヌクレアーゼについての認識部位を含む。示された実施態様では、本明細書では「切断アダプター」という、３つのこのようなアダプターが用いられる。用いられるこのようなアダプターの数は、所望される配列情報の量に依存する。好ましくは、１〜３の切断アダプターが使用される。
本発明の方法が、cDNA集団の特徴的配列決定に適用される場合、切断アダプターのライゲーションの前に、タグ-ポリヌクレオチド結合体は、Taq I、Alu I、HinPl Iなどのような、認識部位の高い頻度の制限エンドヌクレアーゼで切断され得る。平滑末端を放出するAlu Iのような酵素については、粘着末端は、例えば、Brenner，国際特許出願PCT/US95/12791、およびKuijperら, Gene, 112:147-155（1992）に記載のように、T4 DNAポリメラーゼで産生され得る。標的ポリヌクレオチドがTaq Iでの切断によって調製される場合、以下の末端は、ライゲーションについて利用可能である：
0004110216.tif 000005
したがって、３つの切断アダプターの代表的セットは、以下のように構築され得る：
0004110216.tif 000006
ここで、切断アダプター（1）、（2）、および（3）は、下線を引いたヌクレアーゼBbs I、Bbv I、およびBsm FIのそれぞれの認識部位が大文字で示され、そして5’リン酸は「p」として示される。標的ポリヌクレオチドの二重下線部分は、ライゲーションおよび切断後の突出鎖の位置を示す。すべての場合、標的ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチドの5’突出鎖に残される。明らかに、多くの異なる実施態様は、ヌクレアーゼの種々の数および種を使用して構築され得る。
説明された実施態様に戻ると、切断アダプターA1、A2、およびA3は、図1bに示さ肌る結合体を得るためにk標的ポリヌクレオチドに1:1:1の濃度比でライゲートされ（20）、その結果タグ-ポリヌクレオチド結合体の各集団内に、付着したA1、A2、およびA3を有する結合体のほぼ等しい数がある。ライゲーション（20）後、標的ポリヌクレオチドは、切断アダプターのヌクレアーゼのそれぞれで連続して切断され、そしてコードされたアダプターのセットにライゲートされる。第１に、標的ポリヌクレオチドは、コードされたアダプターの第１のセットが、得られる突出鎖にライゲートされた後、切断アダプターA1のヌクレアーゼで切断される（22）。切断は、ライゲーションに利用可能である、各タイプ、すなわち、t1、t2、...tkの標的ポリヌクレオチドの約３分の１を生じる。好ましくは、コードされたアダプターは、突出鎖のあらゆる可能な配列を含むアダプターの混合物として適用される。反応条件は、突出鎖が標的ポリヌクレオチドの鎖と完全に一致した二重鎖を形成するコードされたアダプターのみが、コードされた結合体（28）、（30）、および（32）を形成するためにライゲートされるように選択される。下付きのある大文字「T」は、独特のオリゴヌクレオチドタグが、標識のためにコードされたアダプターによってもたらされることを示す。コードされたアダプターによってもたらされるオリゴヌクレオチドタグは、ときどき、コードされたアダプターに標識を送達するためのタグ、または「第２の」オリゴヌクレオチドタグといわれる。以下により十分に記載のように、ソーティングのために使用される一本鎖オリゴヌクレオチドタグは、好ましくは、４つのヌクレオチドのうちの３つのみからなり、その結果T4 DNAポリメラーゼ「ストリッピング」反応は、固相支持体上にローディングするために標的ポリヌクレオチドを調製するために使用され得る。他方では、標識を送達するために用いられるオリゴヌクレオチドタグは、ヌクレオチドについてすべてからなり得る。
上記のように、コードされたアダプターは、突出鎖（24）およびオリゴヌクレオチドタグ（26）を含む。したがって、t1-ポリヌクレオチド結合体の「A1」切断によって以下の末端を得るならば：
0004110216.tif 000007
次いで、オリゴヌクレオチドタグT24は、以下の構造（配列番号１）を有し得た：
0004110216.tif 000008
ここで二本鎖部分は、独特のタグ相補物と完全に一致した三重鎖を形成し、そしてすべての他のタグ相補物と少なくとも６つのミスマッチを有する三重鎖を形成する、768（＝３×256）二本鎖20マーオリゴヌクレオチドタグのセットの１つであり得る。必要に応じて、コードされたアダプターはまた、上の例で示されるように、スペーサー領域を含み得、ここで４ヌクレオチド配列「ttct」は、突出鎖およびオリゴヌクレオチドタグとの間のスペーサーとして作用する。
コードされたアダプター（28）、（30）、および（32）の第１のセットのライゲーションの後、タグ-ポリヌクレオチド結合体は、切断アダプターA2のヌクレアーゼで切断され（34）、その後コードされたアダプターの第２のセットは、結合体（36）、（38）、および（40）を形成するために適用される。最後に、タグ-ポリヌクレオチド結合体は、切断アダプターA3のヌクレアーゼで切断され（42）、その後コードされたアダプターの第３のセットは、結合体（44）、（46）、および（48）を形成するために適用される。コードされたアダプターの切断およびライゲーションの連続の完了後、混合物は、以下により十分に記載のようにおよびBrenner（上で引用）に教示されるように、オリゴヌクレオチドタグt1〜tkを介して１つ以上の固相支持体上にロードされる（50）。単一標的ポリヌクレオチドが分析されるならば、多数のオリゴヌクレオチドタグt1、t2、...tkは必要ではないことが明らかであるべきである。このような実施態様では、ビオチン、または類似の部分は、ソーティングが必要とされないので、ポリヌクレオチド-コードされたアダプター結合体を繋ぎ止めるために用いられ得た。
配列情報は、個々にまたは混合物としてのいずれかで、標識したタグ相補物を連続的に適用することによって得られる。好ましくは、図3a〜3eに示す実施態様について、タグ相補物は、64タグ相補物それぞれの12混合物に連続して適用される。各混合物のうちには、タグ相補物の４つの別のサブセットがあり、それぞれは異なる蛍光標識を含む。４つのサブセットは、突出鎖における所定の位置（そこにコードされたアダプターがライゲートされた）で４つのヌクレオチドのうちの１つを解読または同定するタグ相補物に対応する。例えば、64タグ相補物の混合物は、突出鎖配列「nnxn」においてヌクレオチド「x」を同定し得、そのため第１の蛍光標識は、x＝Aであるならば観察され、第２の蛍光標識は、x＝Cであるならば観察され、第３の蛍光標識は、x＝Gであるならば観察されるなどである。12の混合物のうちの４つは、切断アダプターA1のヌクレアーゼでの切断によって産生される突出鎖においてヌクレオチドを同定するためであり、４つは、切断アダプターA2のヌクレアーゼでの切断によって産生される突出鎖においてヌクレオチドを同定するためであり、そして４つは切断アダプターA3のヌクレアーゼでの切断によって産生される突出鎖においてヌクレオチドを同定するためである。
さらなる配列情報は、Brenner，国際特許出願PCT/US95/03678に開示される「マルチステッピング」プロセスに類似のプロセスにおいて、上記の実施態様を使用して得られ得る。この実施態様では、本明細書で「ステッピングアダプター」と呼ばれる、第４のアダプターは、例えば、3:1:1:1の濃度比で、切断アダプターA1、A2、およびA3とともに標的ポリヌクレオチドの末端にライゲートされる。したがって、利用可能な末端のほぼ半分が、ステッピングアダプターにライゲートされる。ステッピングアダプターは、そのリーチ（以下で定義される）が切断アダプターA1、A2、およびA3によって決定される配列の末端で標的ポリヌクレオチドの切断を可能にするように配置されるII型ヌクレアーゼについての認識部位を含む。切断アダプターの上記のセットと使用され得るステッピングアダプターの例は、以下のとおりである：
0004110216.tif 000009
ここで、上記のように、この場合はBpM Iにおいて、ヌクレアーゼの認識部位は、一重下線を引き、そして切断部位でのヌクレオチドに二重下線を引く。ステッピングアダプターのヌクレアーゼで切断された標的ポリヌクレオチドは、切断アダプターA4、A5、およびA6のさらなるセットにライゲートされ得、これは切断アダプターA1、A2、およびA3に含まれる部位と同じまたは異なるヌクレアーゼ認識部位を含み得る。コードされたアダプターの拡大したセットが必要とされるかされないかは、切断およびライゲーション反応がシグナル測定装置で容認され得るかどうかに依存する。上記のように、シグナル測定と関連して酵素反応を最小にすることが所望される場合、コードされたアダプターの追加のセットが用いられねばならない。すなわち、768以上のオリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物が適当であり、そして６つの切断反応が４ヌクレオチドそれぞれの突出鎖を産生する場合、1536オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物（64個のタグ相補物のそれぞれの24個の混合物）が必要とされた。代表的には、A1、A2、およびA3と同じヌクレアーゼ認識部位を有し、そして上記で示されるステッピングアダプターとともに使用され得る、切断アダプターA4、A5、およびA6は、以下のとおりである：
0004110216.tif 000010
ここで、切断部位は、二重下線によって示される。切断アダプターA4、A5、およびA6は、好ましくは、混合物として適用され、そのため、あらゆる可能な２ヌクレオチド突出鎖が表される。
一旦コードされたアダプターがライゲートされると、標的ポリヌクレオチドが、Brenner，国際特許出願PCT/US95/12791に開示されるように、固相支持体、好ましくは、マイクロパーティクル上へのローディングのために調製される。簡単にいえば、ソーティングのためのオリゴヌクレオチドタグは、以下により十分に議論される、T4 DNAポリメラーゼとの「ストリッピング」反応を使用して一本鎖になる。一本鎖オリゴヌクレオチドタグは、マイクロパーティクル上のタグ相補物に特異的にハイブリダイズしそしてライゲートする。次いで、ロードされたマイクロパーティクルは、Brenner（上記で引用）に記載のような機械で分析され、これは連続的送達、特異的ハイブリダイゼーション、およびコードされたアダプターへおよびアダプターからの標識されたタグ相補物の除去を可能にする。
コードされたアダプターは、12〜16ヌクレオチドが10000〜50000フラグメントのそれぞれにおいて同定される場合、数キロベース〜数十キロベースの長さ、例えば、10〜25キロベースの標的ポリヌクレオチドにおいて、ショットガン配列決定を行うために、Bernnerら（上記で引用）に記載のソーティング方法論とともに使用され得る。
アダプターの合成
コードされたアダプターおよび切断アダプターは、例えば、以下の参考文献に開示される、ホスホロアミダイト化学作用のような、標準的化学作用を使用して、自動化DNA合成機で都合よく合成される：BeaucageおよびIyer, Tetrahedron, 48:2223-2311（1992）；Molkoら，米国特許第4,980,460号；Kosterら，米国特許第4,725,677号；Caruthersら，米国特許第4,415,732号；同4,458,066号；および同4,973,679号など。得られるオリゴヌクレオチドが、ライゲーションおよび切断試薬と適合可能であるならば、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダイトなどのような非天然骨格基を生じる、代替的化学作用もまた用いられ得る。相補鎖の合成後、鎖は、組み合わせられ、二本鎖アダプターを形成する。コードされたアダプターの突出鎖は、混合物として合成され得、そのためあらゆる可能な配列が、突出部分で表される。このような混合物は、周知の技術を使用して容易に合成され、例えば、Teleniusら, Genomics, 13:718-725（1992）；Welshら, Nucleic Acids Research, 19:5275-5279（1991）；Grothuesら, Nucleic Acids Research, 21:1321-1322（1993）；Hartley, ヨーロッパ特許出願第90304496.4号などに開示される。一般的に、これらの技術は、多数のヌクレオチドを導入することを所望する場合、カップリング工程中に伸長するオリゴヌクレオチドに活性化モノマーの混合物を適用することを単純に必要とする。上記のように、いくつかの実施態様では、アダプターの複雑性を減少させることが所望であり得る。これは、例えば、Kong Thoo Linら, Nucleic Acids Research, 20:5149-5152に教示されるように、または米国特許第5,002,867号；Nicholsら, Nature, 369:492-493（1994）などによって、デオキシイノシン、2-アミノプリンなどのような、複雑性を減少させるアナログを使用して達成され得る。
いくつかの実施態様では、自己相補的領域を含む単一のポリヌクレオチドとして、コードされたアダプターまたは切断アダプターを合成することが所望され得る。合成後、自己相補的領域は、アニールし、一方の末端の突出鎖および他方の末端の一本鎖ループを有するアダプターを形成することを可能にする。好ましくは、このような実施態様では、ループ領域は、約３〜10ヌクレオチド、または他の匹敵する連結部分（例えば、米国特許第4,914,210号に開示されるようなアルキルエーテル基）を含み得る。多くの技術は、以下で引用される参考文献で議論されるように、標識のために、塩基またはヌクレオシド間結合への反応性基の付着のために利用可能である。
従来のリガーゼが本発明で用いられる場合、以下でより十分に記載のように、アダプターの5’末端は、いくつかの実施態様でリン酸化され得る。5’モノリン酸は、化学的にまたはキナーゼで酵素的にのいずれかで、第２のオリゴヌクレオチドに付着され得る。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989）。化学的リン酸化は、HornおよびUrdea, Tetrahedron Lett., 27:4705（1986）に記載され、そして開示されたプロトコルを行うための試薬は、市販されている。例えば、Clontech Laboratories（Palo Alto, California）からの5’Phosphate-ONTM。
標的ポリヌクレオチドの調製
好ましくは、本発明における使用のための標的ポリヌクレオチドは二本鎖であり、そして１つ以上の突出鎖を有するように調製される。突出鎖は、5’または3’のいずれかであり得、好ましくは、鎖の突出部分におけるヌクレオチドの数は、２〜６の範囲である。標的ポリヌクレオチドは「-k」といい、ここで、kは、5’鎖が突出する場合はいつでも、いくつかの整数、例えば、通常２〜６である。逆に、標的ポリヌクレオチドは、3’鎖が突出する場合はいつでも、「+k」という。例えば、以下は、この命名法に従って-4標的ポリヌクレオチドである：
0004110216.tif 000011
本発明の１つの好ましい実施態様では、標的ポリヌクレオチドは、磁性粒子、ポリマーマイクロスフェア、フィルター物質などのような、固相支持体に繋ぎ止められ、これは、複雑かつ時間がかかる精製工程なしに試薬の連続適用を可能にする。標的ポリヌクレオチドの長さは広く変化し得る；しかし、調製の便利のために、従来の配列決定に用いられる長さが好ましい。例えば、数百塩基対、200〜300から１〜２キロ塩基対の範囲の長さが好ましい。
標的ポリヌクレオチドは、種々の従来の方法によって調製され得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、従来DNA配列決定で使用されるものを含む、従来のクローニングベクターの任意のインサートとして調製され得る。適切なクローニングベクターを選択および使用するための広範なガイダンスは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989）、および類似の参考文献で見られる。SambrookらおよびInnisら編, PCR Protocols（Academic Press, New York, 1990）もまた、標的ポリヌクレオチドを調製するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用するためのガイダンスを提供する。好ましくは、この方法で使用される他の試薬から標的ポリヌクレオチドを分離することの容易さのため、磁性ビーズまたは他の固体支持体への付着を可能にするクローン化されたまたはPCR増幅した標的ポリヌクレオチドが調製される。このような調製技術についてのプロトコルは、Wahlbergら, Electrophoresis, 13:547-551（1992）；Tongら, Anal. Chem., 64:2672-2677（1992）；Hultmanら, Nucleic Acids Research, 17:4937-4946（1989）；Hultmanら, Biotechniques, 10:84-93（1991）；Syvanenら, Nucleic Acids Research, 16:11327-11338（1988）；Dattaguptaら，米国特許第4,734,363号；Uhlen, PCT出願第PCT/GB89/00304号などの参考文献に十分に記載される。このような方法を実施するためのキットもまた市販されており、例えば、Dynal AS.（Oslo, Norway）からのDynabeadsTMテンプレート調製キットである。
標的ポリヌクレオチドの集団は、マイクロパーティクル、例えば、磁性ビーズ、制御された孔のガラスパーティクルなどの使用によって並行して調製され得、これらはそれぞれが、Brennerら，国際出願PCT/US96/09513に記載のように、付着されたオリゴヌクレオチドを同一の最小に交差ハイブリダイズする均一な集団を有する。
この用語が本発明に従って使用される場合、「ヌクレアーゼ」は、ライゲートされた複合体に適用される場合、以下により十分に記載されるように、ライゲートされた複合体を切断し、増大されたアダプターおよび短縮された標的ポリヌクレオチドを産生する、任意の酵素、酵素の組み合わせ、または他の化学試薬、あるいは化学試薬および酵素の組み合わせを意味する。本発明のヌクレアーゼは、単一のタンパク質である必要はなく、またはタンパク質の組み合わせからのみなる必要もない。ヌクレアーゼの、またはヌクレアーゼとして用いられる試薬の組み合わせの、重要な特徴は、その切断部位がその認識部位とは別であることである。ヌクレアーゼの認識部位とその切断部位の間の距離は、本明細書ではその「リーチ」という。便宜上、「リーチ」は、認識部位と各鎖の加水分解されたホスホジエステル結合との間のヌクレオチドの数を与える２つの整数によって定義される。例えば、Fok Iの認識および切断特性は、代表的には、それが以下のような二本鎖DNA（配列番号２）を認識しそして切断するので、「GGATG（9/13）」として表される：
0004110216.tif 000012
ここで、太字のヌクレオチドは、Fok I認識部位であり、そしてNは、任意のヌクレオチドおよびその相補物である。
ヌクレアーゼが、その認識部位と複合体を形成した後に標的ポリヌクレオチドを切断するのみであること；および好ましくは、ヌクレアーゼが切断後に標的ポリヌクレオチド上の突出鎖を放出することが重要である。
好ましくは、本発明で用いられるヌクレアーゼは、（i）その認識部位がその切断部位とは分離しており、そして（ii）その切断によって標的ポリヌクレオチド上に突出鎖を生じる、天然のタンパク質エンドヌクレアーゼである。最も好ましくは、II型制限エンドヌクレアーゼは、例えば、Szybalskiら, Gene, 100:13-26（1991）；Robertsら, Nucleic Acids Research, 21:3125-3137（1993）；ならびにLivakおよびBrenner，米国特許第5,093,245号に記載されるように、本発明においてヌクレアーゼとして用いられる。本発明での使用のための例示的なII型ヌクレアーゼとしては、Alw XI、Bsm AI、Bbv I、Bsm FI、Sts I、Hga I、Bsc AI、Bbv II、Bce fI、Bce 85I、Bcc I、Bcg I、Bsa I、Bsg I、Bsp MI、Bst 71 I、Ear I、Eco 57I、Esp 3I、Fau I、Fok I、Gsu I、Hph I、Mbo II、Mme I、Rle AI、Sap I、Sfa NI、Taq II、Tth lllII、Bco 5I、Bpu AI、Fin I、Bsr DI、およびそれらのイソシゾマーが挙げられる。好ましいヌクレアーゼは、Bbv Iである。
好ましくは、ヌクレアーゼ切断工程の前に、通常は、配列決定操作の開始時に、標的ポリヌクレオチドは、用いられるヌクレアーゼの認識部位および／または切断部位をブロックするために処理される。これは、標的ポリヌクレオチド中の内部位置でのヌクレアーゼ認識の偶然の発生のため、標的ポリヌクレオチドの望ましくない切断を抑制する。ブロッキングは、メチル化ならびに配列特異的アプタマー、DNA結合タンパク質、または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドによる処理を含む、種々の方法で達成され得る。天然のタンパク質エンドヌクレアーゼが用いられる場合はいつでも、認識部位は、使用されるヌクレアーゼのコグネイトメチラーゼで標的ポリヌクレオチドをメチル化することによって都合よくブロックされ得る。すなわち、細菌II型制限エンドヌクレアーゼの全てではなくともそのほとんどについて、その認識部位をメチル化するいわゆる「コグネイト」メチラーゼが存在する。このようなメチラーゼの多くは、Robertsら（上で引用）およびNelsonら, Nucleic Acids Research, 21:3139-3154（1993）に開示され、そして種々の供給源、特にNew England Biolabs（Beverly, MA）から市販されている。あるいは、PCR工程が配列決定のための標的ポリヌクレオチドの調製に用いられる場合、5-メチルシトシン三リン酸は、天然のシトシンが、アンプリコンにおいてメチル化されたシトシンによって置換されるように、増幅工程において使用され得る。この後者のアプローチは、固相支持体に結合した標的ポリヌクレオチドを他の酵素で処理する必要性を排除するという追加された有利点を有する。
本発明の方法は、各サイクルにおいて１つ以上のキャッピング工程を含み得る。用語「キャッピング」は、ポリヌクレオチド合成における用語（例えば、Andrusら，米国特許4,816,571）の用途との類似して本明細書で使用される。これは、前工程の形質転換を受けるまたはこれに関与することができない、標的ポリヌクレオチドの処理をいう。キャッピング処理は、標的ポリヌクレオチドが後続のサイクルの任意の処理工程に関与しないように設計される。この様式では、「相外の」切断またはライゲーションからの偽シグナルが抑制される。キャッピング工程は、ライゲーション工程および／または切断工程後に遂行され得る。例えば、第１のキャッピング工程は、ライゲートされていないアダプターが、標的ポリヌクレオチドから洗浄された後に、遂行され得る。用いられるヌクレアーゼが、標的ポリヌクレオチド上の5’突出鎖を放出するならば、キャッピングは、好ましくは、４つのジデオキシヌクレオシド三リン酸、または他のチェーンターミネーティングヌクレオシド三リン酸、およびDNAポリメラーゼの混合物に、未反応の標的ポリヌクレオチドを曝露させることによって、達成される。DNAポリメラーゼは、１つのチェーンターミネーティングヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチドによって、未反応の標的ポリヌクレオチドの3’鎖を伸長し、それによってその後のサイクルにおけるライゲートを不可能にする。
第２のキャッピング工程は、切断工程後に遂行され得る。用いられるII型ヌクレアーゼの認識部位に依存して、切断できないアダプターは、アダプター中のII型認識部位をブロックするためにメチラーゼでの処理によって「キャップ」され得、それによって、ライゲートされた複合体を、さらなるプロセシング工程に供させない。II型ヌクレアーゼによる処理下で切断できないアダプターの切断によって、キャッピングを可能にする追加の制限部位を含むアダプターはまた、構築され得る。このようなアダプターの例は、以下に示される（配列番号３）：
0004110216.tif 000013
Eco RVでの処理によって、その後のライゲーションに関与し得ない平滑末端標的ポリヌクレオチドの形成を生じる（突出末端を必要とする実施態様で）。このようなキャッピングアプローチは、ライゲートされたアダプターの末端に付着し得る任意の標識を除去することの追加された利点を有し、それによって、その後の検出工程においてノイズへの寄与を減少させる。
明らかに、当業者は、本発明に従ってさらなる実施態様を設計するために上記の実施態様の特徴を組み合わせ得るが、特に上に記載しない。
固相支持体
本発明での使用のための固相支持体は、広範な形態を有し得、微粒子、ビーズ、およびメンブレン、スライド、プレート、マイクロマシン化チップなどを含む。同様に、本発明の固相支持体は、広範な組成物を含み得、ガラス、プラスチック、シリコン、アルカンチオレート誘導体化金、セルロース、低架橋および高架橋ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミドなどを含む。好ましくは、別々の粒子の集団（その結果、各々は、実質的に同一のポリヌクレオチドの均一コーティング、または集団を有する）が用いられるか、あるいは単一または２、３の支持体が空間的に別々の領域（各々は、実質的に同一のポリヌクレオチドの均一コーティング、または集団を含む）で用いられるかのいずれかである。後者の実施態様では、領域の面積は、特定の適用に従って変化し得；通常、領域は、数μm2、例えば、３〜５から数百μm2、例えば、100〜500間の面積の範囲である。好ましくは、このような領域は、空間的に別々であり、そのため、隣接領域での事象（例えば、蛍光発光）によって生じるシグナルは、用いられる検出システムによって解析され得る。
好ましくは、本発明で用いられる固相支持体は、微粒子であり、制御された孔ガラス（CPG）、高架橋ポリスチレン、アクリル性コポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどから作成される微粒子を含み、これらは、以下の代表的参考文献に開示される：Meth. Enzymol., Section A, 11-147頁, 44巻（Academic Press, New York, 1976）；米国特許4,678,814；4,413,070；および4,046,720；およびPon, Chapter 19, Agrawal編, Methods in Molecular Biology, 20巻，（Humana Press, Totowa, NJ, 1993）。微粒子支持体は、さらに、市販のCPGおよびポリスチレンビーズ（例えば、Applied Bio systems, Foster City, CAから入手可能）；誘導体化磁性ビーズ；ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン（例えば、TentaGelTM, Rapp Polymere, Tubingen Germany）などを含む。物質、多孔性、サイズ、形状などのような支持体特徴、および用いられる連結部分のタイプの選択は、ビーズ-ポリヌクレオチド結合体が使用される条件に依存する。例えば、酵素との連続的プロセシングに関連する適用では、酵素の立体障害を最小にし、そして基質へのアクセスを容易にする支持体およびリンカーが好ましい。最も適切な微粒子支持体の選択において考慮されるべき他の重要な因子には、サイズ均一性、合成支持体としての効率、表面積が公知である程度、および光学特性を含み、例えば、表面上で多数のビーズを扱う場合に全くなめらかなビーズが機器における利点を提供する。一般的に、微粒子のサイズおよび形状は重要ではない；しかし、数（例えば、１〜２）μmから数百（例えば、200〜1000）μm直径のサイズ範囲の微粒子が好ましい。
他の好ましい適用では、非孔性微粒子は、光学的特性について用いられ、これは、顕微鏡スライドのような、平坦な支持体上で多数の微粒子を追跡する場合に、有利に使用され得る。特に好ましい非孔性微粒子は、Bangs Laboratories（Carmel, IN）から入手可能なグリシダルメタクリレート（GMA）ビーズである。このような微粒子は、種々のサイズで有用であり、そしてタグまたはタグ相補物を合成するための種々の連結基で誘導体化される。好ましくは、タグ化された微粒子の大規模な並行操作のために、５μm直径のＧＭＡビーズが用いられる。
実験
pGEM7Zから増幅された標的ポリヌクレオチドを配列決定する：ライゲーション反応によるヌクレオチドの同定
この実施例では、プラスミドpGEM7Z（Promega, Madison, WI）のセグメントを増幅し、そして二本鎖DNAリンカーによってガラスビーズに結合させ、その一本鎖をビーズ上で直接（したがって共有結合される）合成する。ライゲーション後の各配列決定サイクルでは、ビーズのアリコートを、反応混合物から取り出し、そしてライゲートした複合体の非共有結合鎖を分析するためのゲル電気泳動カラム上にロードする。非共有結合鎖が、常に分析のための蛍光標識を有するように、プローブを設計する。
47マーオリゴヌクレオチドを、標準的自動化DNA合成機プロトコルを使用してKF169 Ballotiniビーズ上で直接合成する。47マーへの相補鎖を、別々に合成し、そしてHPLCによって精製する。ハイブリダイズした場合、得られる二重鎖は、ビーズから離れた末端にBst XI制限部位を有する。相補鎖を以下の混合物中で付着した47マーにハイブリダイズする：200pmol/μlでの25μlの相補鎖；47マーを有する20mgのKF169 Ballotiniビーズ；6μlのNew England Biolabs #3制限緩衝液；および25μlの蒸留水。混合物を、93℃まで加熱し、次いで55℃までゆっくり冷却し、その後40ユニットのBst XI（10ユニット／μlで）を添加して、反応容量を60μlにする。混合物を55℃にて２時間インキュベートし、その後ビーズをTE（pH8.0）で３回洗浄する。
ビーズに付着されるべきpGEM7Zのセグメントを、以下のように調製する：２つのPCRプライマーを、標準的プロトコルを使用して調製した（配列番号４および配列番号５）：
0004110216.tif 000014
PCR反応混合物は、以下からなる：１ng/μlでの１μl pGEM7Z；10pmol/μlでの10μlプライマー１；10pmol/μlでの10μlプライマー２；2.5mMでの10μlデオキシリボヌクレオチド三リン酸；10μl 10×PCR緩衝液（Perkin-Elmer）；５ユニット/μlでの0.5μl Taq DNAポリメラーゼ；および100μlの最終容量にするための58μl蒸留水。反応混合物を、93℃にて30秒間；60℃にて15秒間；および72℃にて60秒間の25サイクルにかけて、172塩基対産物を得、これを、Bbv I（100μl PCR反応混合物、12μl 10×#1 New England Biolabs緩衝液、１ユニット/μlでの8μl Bbv Iを、37℃にて６時間インキュベートする）およびBst XI（5μl 1M NaCl、67μl蒸留水、および10ユニット/μlでの8μl Bst XIを、Bbv I反応混合物に添加し、そして得られる混合物を55℃にて２時間インキュベートする）で連続して切断した。
上記の反応混合物を製造者のプロトコルに従ってCentricon 30（Amicon, Inc.）スピンカラムに通した後、Bbv I/Bst XI制限フラグメントを、以下の混合物中でBallotiniビーズに付着した二本鎖リンカーにライゲートする：17μl Bbv I/Bst XI制限フラグメント（10μg）、10μlビーズ（20mg）、6ml 10×ライゲーション緩衝液（New England Biolabs, 以下NEBという）、2000ユニット/μlでの5μl T4 DNAリガーゼ、および22μl蒸留水、この混合物を、25℃にて４時間インキュベートし、その後、ビーズを、TE（pH8.0）で３回洗浄し、5’リン酸を有する配列決定のための以下の標的ポリヌクレオチドを放出する：
0004110216.tif 000015
5’リン酸を、製造者のプロトコルを使用して、New England Biolabs（Beverly, MA）から入手可能な、例えばウシ腸からの、アルカリホスファターゼで、ビーズ混合物を処理することによって除去する。
以下のアダプターの鎖（標識した鎖で24ヌクレオチドおよび非標識鎖で18ヌクレオチド）を、標準的方法を使用して、自動化DNA合成機（model 392 Applied Biosystems, Foster City）で別々に合成する（配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９）：
0004110216.tif 000016
ここで、pはモノリン酸であり、Nは、A、C、G、またはTを示し、Qは、標識の付着のための保護されたアミノ基を有する分枝状リンカーである（例えば、Uni-Link AminoModifier、Clontech Laboratories, Palo Alto, CAから入手可能）。TAMRA（テトラメチルローダミン）、FAM（フルオレセイン）、ROX（ローダミンＸ）、およびJOE（2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロフルオレセイン）は、Perkin-Elmer Applied Biosystems Division（Foster City, CA）から入手可能である。各アダプターの等モル量を、TE中で合わせて、1000pmol/μlの濃度で混合物を形成させる。
標的ポリヌクレオチドへのアダプターのライゲーションを、5μlビーズ（20mg）、3μl NEB 10×リガーゼ緩衝液、5μlアダプター混合物、2.5μl NEB T4 DNAリガーゼ（2000ユニット/μl）、および14.5μl蒸留水からなる混合物中で行う。この混合物を、16℃にて30分間インキュベートし、その後ビーズを、TE（pH8.0）で３回洗浄する。
遠心分離およびTEの除去後、ライゲートされたアダプターの3’リン酸を、製造者のプロトコルを使用して、ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）（New England Biolabs, Beverly, MA）でポリヌクレオチド-ビーズ混合物を処理することによって除去する。3’リン酸の除去後、CIPを、製造所のプロトコルとともに、例えば、PronaseTM（Boeringer Mannheim, Indianapolis, INから入手可能）、または等価のプロテアーゼを使用して、タンパク質分解切断によって不活性化する。次いで、ポリヌクレオチド-ビーズ混合物を洗浄し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理して、標的ポリヌクレオチドとアダプターとの間のギャップに5’リン酸を付加する。洗浄後、ピーズ-ポリヌクレオチド混合物を、上記のようにT4 DNAリガーゼで処理して、標的ポリヌクレオチドへのアダプターのライゲーションを完了する。
切断を、5μlビーズ（20mg）、3μl 10×NEB緩衝液#3、3μl NEB FokI（4ユニット/μl）、および19μl蒸留水からなる混合物中で行う。混合物を、37℃にて30分間インキュベートし、その後ビーズを、TE（pH8.0）で３回洗浄する。
各ライゲーション後、ライゲートした複合体を有するビーズの試料を、672 GeneScanソフトウェア（Applied Biosystems）を使用するmodel 373 DNAシークエンサーでのサイズ分析のために取り出す。システムの読み出しは、４つの異なる染料で標識したフラグメントについての異なる着色された曲線を提供する（TAMRAについては黒、FAMについては青、JOEについては緑、およびROXについては赤）。６％変性（8M尿素）ポリアクリルアミドゲルを、製造者のプロトコルに従って用いる。約0.5mgのビーズを、配列決定フラグメントを分析するために製造者のプロトコルに従って4μlのホルムアミドローディング緩衝液中に入れる。試料を、95℃にて２分間加熱し、次いで氷上におくことによって冷却し、その後試料全体を、分析のために１つのレーンにロードする。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：ロバート  ビー．ダブリッジ，
グレン  アルブレクト，
シドニー  ブレナー，
セルゲイ  エム．グリヤツノフ，
サラ  エヌ．マカルディ
（ii）発明の名称：アダプターに基づく配列分析の改良
（iii）配列数：９
（iv）連絡住所：
（A）名称：デリンガー  アンド  アソシエイツ
（B）番地：ピー．オー．ボックス  60850
（C）市：パロ  アルト
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：94306
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：3.5インチ  ディスケット
（B）コンピューター：IBM  互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：マイクロソフト  ワード  フォー  ウインドウズ，バージョン  2.0
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：1998年4月14日
（vii）先願データ：
（A）出願番号：08/842,608
（B）出願日：1997年4月15日
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：ビンセント  エム．パワーズ
（B）登録番号：36,246
（C）照会／記録番号：5525-033.41
（ix）電話回線情報：
（A）電話：（650）324-0880
（B）テレファックス：（650）324-0960
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：28ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１：
0004110216.tif 000017
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：18ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：16ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0004110216.tif 000018
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：15ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３：
0004110216.tif 000019
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：34ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４：
0004110216.tif 000020
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：55ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号５：
0004110216.tif 000021
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：24ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号６：
0004110216.tif 000022
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：24ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号７：
0004110216.tif 000023
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：24ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号８：
0004110216.tif 000024
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：24ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号９：
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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