(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵によるリプスタチンの製造方法であって、以下の工程
ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物を、脂肪および油を含まない水性培地であって適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培地中で、初期の増殖相が終了し十分な細胞集団が産生されるまで好気的に培養する工程、および
ｂ）場合によってカプリル酸とともに、リノール酸、ここで、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もしくは全部は対応するエステルおよび／または塩で置換することができる、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であって、該リノール酸もしくはそのエステルもしくはその塩が酸化防止剤によって安定化されている、工程；
を包含する方法。
【請求項２】
テトラヒドロリプスタチンの製造方法であって、以下の工程
ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物を、脂肪および油を含まない水性培地であって適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培地中で、初期の増殖相が終了し十分な細胞集団が産生されるまで好気的に培養する工程、および
ｂ）場合によってカプリル酸とともに、リノール酸、ここで、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もしくは全部は対応するエステルおよび／または塩で置換することができる、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であって、該リノール酸もしくはそのエステルもしくはその塩が酸化防止剤によって安定化されている、工程；
ｃ）該ブロスからリプスタチンを単離し、リプスタチンをテトラヒドロリプスタチンに水素化する工程、
を包含する方法。
【請求項３】
Ｌ−ロイシンを添加する、請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は発酵によるリプスタチン生産のための新規な流加方法に関し、この方法は以下の工程：
ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物を、実質的に脂肪(fat) および油(oil) を含まない水性培地であって適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十分な細胞集団が産生されるまで好気的に培養する工程、および
ｂ）リノール酸、場合によってカプリル酸とともに、ここで、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もしくは全部が対応するエステルおよび／または塩で置換され得る、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であって、このリノール酸もしくはそのエステルもしくはその塩が酸化防止剤によって安定化されている工程、を包含する。
【０００２】
【従来の技術】
リプスタチン、発酵によるその製造方法、ブロスからのその単離方法、ならびにテトラヒドロリプスタチン（ＴＨＬ、Orlistat、抗肥満剤）へのその水素化方法は米国特許第４，５９８，０８９号に記載されている。
【０００３】
米国特許第４，５９８，０８９号に記載されているリプスタチンを産生する生物は、Streptomyces toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova （Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 、第８版、811 頁参照）である。それは１９８３年６月１４日にthe Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Ill.にＮＲＲＬ  １５４４３として寄託された。本発明の方法は、この生物もしくはそれから誘導された任意の他の株、例えば、より高い生産性を選択するための変異株を用いて行うことができる。それはまた、ストレプトミセス科（streptomycetes）に属するかもしくは放線菌目の別の科に属する放線菌類の他のリプスタチン産生生物を用いて行うこともできる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
米国特許第４，５９８，０８９号に記載されている発酵系を適用する場合、培養後の発酵ブロスには、数mg/Lというごく少量のリプスタチンが含まれ、経済的にも技術的にも適した方法によってそれを単離するのは困難である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、発酵ブロス内に生じている高濃度のリプスタチンを上記の流加培養法を用いることによって、発酵によるリプスタチンの生産の改良された方法を提供する。この方法の第１の工程ａ）において、リプスタチンを産生する微生物の細胞を基本培地で増殖させる。この方法の第２の工程ｂ）において、この基本培地にある成分を添加する。それらは直接生化学的前駆体として作用するか、あるいは短期の生化学的変換を受けて生合成経路の前駆体として作用する。この系により、その微生物は所望の産物、すなわちリプスタチンを、かなり高い濃度で合成することが可能になる。
【０００６】
リプスタチンにいたる生合成経路は、一連の一般的制御機作、例えば、窒素抑制、の対象である。容易に利用可能な窒素源、特にアミノ酸およびその誘導体（Ｌ−ロイシンもしくはＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンを含む）を培地に添加することにより、リプスタチンの形成は強力に抑制される。本発明では、これは、これらのアミノ酸の添加を生合成酵素の形成後にのみ開始することにより克服され、その結果、もはや遺伝子レベルでは抑制されなくなる。さらに、Ｌ−ロイシンもしくはＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンをそのように添加すると、ブロス中のそれらの濃度は低いままである。
【０００７】
好都合なことに、リプスタチンを産生する放線菌類は、１以上の炭素源、例えば、デンプン、デンプン加水分解物および糖類（例えば、グルコースおよび／またはスクロース）、グリセロール、リン脂質、ならびに１以上の窒素源、例えば、ダイズ細粉、綿花種子細粉(cotton seed flour) 、コーンスティープパウダーもしくはコーンスティープリカーおよびイーストエクストラクトを含む適切な水性基本培地中で増殖する。炭素源および窒素源はどちらも十分な増殖を可能とする量で供給され、代表的には培地１L 当たり、各炭素源および各窒素源が５〜５０ｇの範囲である。さらに、この培地にはマクロエレメント（例えば、リン酸塩、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなど）およびミクロエレメント（例えば、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオンなど）が添加される。それらは複合培地成分に含まれるか、もしくは無機塩として添加される。
【０００８】
前記の水性培養培地は、実質的に脂肪(fat) および油(oil) を含まず、そしてトリグリセリドを培地１L 当たり１０ｇより少なく含む。この場合、例えば、ストレプトミセス科の微生物を培養する。適切には、リノール酸および／またはカプリル酸および／またはそれらのエステル若しくは塩は、ブロス中で自由に用いることができるがそれらの蓄積を防止するような速さで供給され、特に１０〜１０００mg/L/ 時間、好ましくは１００〜３００mg/L/ 時間の速度である。リノール酸およびカプリル酸および／またはそれらの塩若しくはそれらのエステルの供給は、好ましくは、ブロス中のそれらの濃度が、１０００mg/L、好ましくは３００mg/Lより低く維持されるように行われ、そしてこのブロスが実際に上記脂肪酸および／またはそのエステル若しくは塩を含まないようにリプスタチンが単離される前に停止される。適切には、リノール酸およびカプリル酸は、リノール酸１〜１０重量部、好ましくは１．５〜３重量部に対してカプリル酸１重量部の比でブロスに添加される。適切には、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好ましくはＬ−ロイシンが、その濃度が２５mMより低く維持されるように、１〜１００mg/L/ 時間、好ましくは５〜５０mg/L/ 時間の速度でブロスに添加される。
【０００９】
リノール酸もしくはそのカプリル酸との混合物の一部（もしくは全部）と置換することができる塩およびエステルの例は、アルカリもしくはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、もしくはマグネシウム塩）および低級アルキルエステル（例えば、メチルエステル）、もしくはグリセリドである。
【００１０】
リノール酸〔またはそのエステル若しくは塩〕の酸化を防止するため、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸パルミチン酸エステル(ascorbyl palmitate)、トコフェノール、レシチン、もしくはそれらの混合物）、および／または遊離基捕捉剤（例えば、ＢＨＡ（ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−アニソール）もしくはＢＨＴ（２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）をリノール酸〔またはそのエステル若しくは塩〕と混合する。
【００１１】
本発明はさらにテトラヒドロリプスタチンの製造方法に関し、その方法は、以下の工程
ａ）リプスタチンを産生する放線菌目に属する微生物を、実質的に脂肪および油を含まない水性培地であって適切な炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む水性培地中で、初期の増殖相が実質的に終了し十分な細胞集団が産生されるまで好気的に培養する工程、
ｂ）リノール酸、好ましくはカプリル酸とともに、ここで、リノール酸および／またはカプリル酸の一部もしくは全部が対応するエステルおよび／または塩で置換され得る、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンもしくは好ましくはＬ−ロイシンを、ブロスに添加する工程であって、このリノール酸もしくはそのエステルもしくはその塩が酸化防止剤によって安定化されている工程、
ｃ）このブロスからリプスタチンを単離し、リプスタチンをテトラヒドロリプスタチンに水素化する工程、を包含する。
【００１２】
発酵ブロスからのリプスタチンの単離は、それ自体公知であり、かついかなる当業者も通じている方法に従って実施することができる。例えば、それは以下のように実施することができる：
【００１３】
発酵が完了した後、発酵ブロスを遠心分離する。次いで、得られた細胞集団を低級アルカノール（例えば、メタノールもしくはエタノール）で処理し、同じ溶媒で抽出する。遠心分離物は適切な有機溶媒（例えば、塩化メチレンもしくは酢酸エチル）で抽出することができる。抽出物から生成された物質は所望のリプスタチンを含んでおり、クロマトグラフィー法により濃縮および精製することができる（例えば、米国特許第４，５９８，０８９号に記載のように）。
【００１４】
リプスタチンのテトラヒドロリプスタチンへの水素化は、適切な触媒の存在下で、それ自体公知の方法（例えば、米国特許第４，５９８，０８９号に記載の）に従って実施できる。用いることのできる触媒の例は、パラジウム／炭素、プラチナ酸化物(platinum oxide)、パラジウムなどである。適切な溶媒は、例えば、メタノールおよびエタノールのような低級アルコールである。水素化は、好ましくは低い水素圧で、および室温で実施される。
【００１５】
【実施例】
実施例１
ａ）以下の前培養培地からなるシード培養物を調製した：１０ｇの脱脂ダイズ細粉、１０ｇのグリセロール、５ｇのイーストエクストラクト、および１L とするための水。ｐＨは２８％のＮａＯＨで７．０に調整し、滅菌後に６．８となるようにした。この培地１００mlを５００mlの三角フラスコに入れて綿栓で塞ぎ、滅菌した。次いで、これにStreptomyces toxytriciniのＮＲＲＬ  １５４４３株の胞子を１白金耳接種し、続いて振盪しながら２７℃で２４時間インキュベーションした。
【００１６】
ｂ）このシード培養物１００mlを用いて、８L の生産用培地の入った容器サイズが１４L の発酵槽に接種した。生産用培地には１L 当たり：３２ｇの脱脂ダイズ細粉、２０ｇのグリセロール、１４ｇのレシチン、消泡剤として０．２５mlのポリプロピレングリコールが含まれており、ｐＨは２８％のＮａＯＨで７．４に調整した。この培地は１L 当たり５ｇ未満のトリグリセリドを含んでいた。
【００１７】
ｃ）４７時間の増殖相の後、流加(feeding) を開始した。流加は、脂肪酸リノール酸、およびカプリル酸からなり、ここで、７０％(w/w) のレシチン、２５％のアスコルビン酸パルミチン酸エステル、および５％のトコフェノールからなる０．２％(w/w) の酸化防止剤(RONOXAN A) の添加によりリノール酸は安定化された。これらの脂肪酸を１３６〜１９０mg/L/ 時間の割合で添加し、添加の速度は、リノール酸およびカプリル酸各々の濃度が７０mg/Lより低くとどまるような方法で調整した。発酵の進行中に添加した総量はリノール酸が１０８ｇ、カプリル酸が５４ｇであった。Ｌ−ロイシンを、流加１L 当たり８０ｇのロイシンを含む水性溶液として、１４．４mg/L/ 時間の速度で添加し、２８％のＮａＯＨでｐＨを１１に調整した。合計１０．２ｇのＬ−ロイシンを添加した。
【００１８】
前述のシード培養物による播種後であって前述の脂肪酸およびＬ−ロイシンを流加中の培地を撹拌しながらインキュベーションし、空気を４L/分の速度で通気して培養物を好気的に維持した。pHを硫酸または水酸化ナトリウム溶液の自動添加により６．１〜７．３に維持した。溶解した酸素濃度が１０％の飽和濃度を下回るのを撹拌速度を調整することにより防止した。回収時には、培養物は実際にリノール酸もカプリル酸も含まなかった。リプスタチンの力価、すなわち、培養培地中のその濃度は、１３８時間のインキュベーション時間後に１５０mg/Lであった。
【００１９】
実施例２
上記の実施例１ａ）と同じシード培養物を用いて、米国特許第４，５９８，０８９号に記載の生産用培地、すなわち、実施例１の生産用培地Ｎ７を有する１４L 発酵槽に接種した。この培地は、８L 当たり：８０ｇの馬鈴薯デンプン、４０ｇのグルコース、８０ｇのリボース、４０ｇのグリセロール、１６ｇのペプトン、１６０ｇのダイズ細粉、１６ｇの硫酸アンモニウムを含んでいた。消泡剤（培地１L 当たり０．２５mlのポリプロピレングリコール）を上記実施例１ｂ）のように添加した。pHは滅菌前に２８％のＮａＯＨで７．０に調整した。４００rpm で撹拌し、１分当たり空気４L の通気速度で好気的にインキュベーションを行った。
【００２０】
インキュベーション後、１０mg/L未満のリプスタチン濃度が培養培地中で見られた。