(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換された大腸菌を培養してα−心房性ナトリウム利尿ペプチドを製造する方法において、ヒスチジン、メチオニン又はグリシンの少なくとも一つを最初の培地に３ｇ／Ｌ以上添加することを特徴とする、セリン残基の代わりにＯ−アセチルセリン残基が取り込まれた副生成物であるポリペプチドの生成を抑制する方法。
【請求項２】
形質転換された大腸菌を培養してα−心房性ナトリウム利尿ペプチドを製造する方法であって、ヒスチジン、メチオニン又はグリシンの少なくとも一つを最初の培地に３ｇ／Ｌ以上添加して培養し、セリン残基の代わりにＯ−アセチルセリン残基が取り込まれた副生成物であるポリペプチドの生成を抑制することを特徴とする、α−心房性ナトリウム利尿ペプチドの製造方法。
【請求項３】
心房性ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチドである請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子組換え技術を用いたポリペプチドの生産における副生成物の生成を抑制する方法及び副生成物の生成を抑制することを特徴とする遺伝子組換えポリペプチドの製造方法に関するものである。
背景技術
生理活性ポリペプチドの生産においては遺伝子組換え技術が汎用されている。本来、遺伝暗号の翻訳は通常極めて忠実に行われるが、目的ポリペプチド遺伝子の翻訳時において当該目的ポリペプチドのみならず、コドン表で指定されたアミノ酸とは異なるアミノ酸又はアミノ酸誘導体が取り込まれたポリペプチドが副生成する場合がある。例えば、リボソームのｍＲＮＡ翻訳の正確度については、高度に精製されたシステインを含まない大腸菌タンパク質であるフラジェリンに［３５Ｓ］Ｃｙｓが取り込まれる割合から推定した場合、当該アミノ酸が取り込まれる確率はコドン当たり約１０−４であった。抗生物質のストレプトマイシンが存在するとコドン表で指定されたアミノ酸とは異なるアミノ酸が取り込まれる確率が著しく増大し、当該翻訳はＡｒｇコドン（ＣＧＵとＣＧＣ）がＣｙｓコドン（ＵＧＵとＵＧＣ）に取り違えられるためと考えられている（ヴォート生化学（下），第２版，東京化学同人，ｐ８６９−８７０，１９９８）。
また、Ｔｓａｉらは、ヒトＩＬ−２の大腸菌内での発現において、本来メチオニンが取り込まれれるべき位置に高頻度でノルロイシンが挿入されることを報告している（Ｔｓａｉ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１５６，ｐ７３３−７３９，１９８８）。同様の報告がウシソマトトロピンの発現（Ｂｏｇｏｓｉａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６４，ｐ５３１−５３９，１９８９）にも見出されており、これらは大腸菌のロイシン合成経路の活性化により、細胞内でノルロイシンが合成され、これがメチオニンの代わりにメチオニンｔＲＮＡに付加された結果、発現したタンパク質に取り込まれたものと推定されている。
更にノルロイシンの取り込みとは別に、Ａｐｏｓｔｏｌらは大腸菌による組換えヘモグロビンの生産において、本来ロイシンが取り込まれるべき位置にノルバリンが取り込まれたことを示している（Ａｐｏｓｔｏｌ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７２，ｐ２８９８０−２８９８８，１９９７）。この場合についても、大腸菌のロイシン合成経路の活性化がノルバリンの生成に結びつきロイシンの代わりに取り込まれたものと推測されている。
上記事例のうち、メチオニンの代わりにノルロイシンが目的ポリペプチドに取り込まれる事例においては、発酵培地中のメチオニン及び／若しくはロイシンの濃度を増加させるか、又はノルロイシンの量を減少させるか、あるいは双方を行うことによって、培地中で増殖させた形質転換微生物において発現される異種ポリペプチドへのノルロイシン取り込みを抑制する方法が知られている（日本国特許第２８７９０６３号、米国特許第５５９９６９０号）。
一方、本発明者らは、大腸菌を宿主細胞とした遺伝子組換えによるヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈｕｍａｎ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ：以下、ｈＡＮＰと記載することもあり、アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである：Ｋａｎｇａｗａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１１８，ｐ１３１−１３９，１９８４）の効率的な生産方法を検討した結果、ｈＡＮＰを融合タンパク質から生産する効率的生産方法の構築に成功した（日本国特許第１９６３６２４号）。本生産方法において融合タンパク質は、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端部分の９７アミノ酸から成る保護ペプチド、リジン残基を含む３アミノ酸残基のリンカー配列（Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）及びｈＡＮＰより構成され、この融合タンパク質遺伝子はｐＢＲ３２２由来の発現ベクター上にコードされている。融合タンパク質遺伝子の転写は大腸菌由来のラクトースプロモーターにより行われ、発現した融合タンパク質は大腸菌内で封入体として蓄積する。得られた融合タンパク質は変性剤で可溶化後、リジン残基を特異的に認識し切断するプロテアーゼであるＡＰＩ（アクロモバクタープロテアーゼＩ［Ｍａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．６６０，ｐ５１−５５，１９８１］）を作用させることでｈＡＮＰが遊離し、クロマトグラフィーによる精製を経てｈＡＮＰが得られる。
本発明者らはこのｈＡＮＰ生産プロセスを検討していく中で、ｈＡＮＰに物理化学的性質が類似し、クロマトグラフィー操作による分離が容易ではない不純物を見出した。この不純物は分析用の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分析において、ｈＡＮＰの溶出位置のわずか後方に溶出される物質として検出され、酵素反応で切り出されたｈＡＮＰに対して約５％の割合で存在する（以後この不純物である副生成ポリペプチドをＲ１と記載する）。また、当該Ｒ１は生産スケールで用いられる分取用のＨＰＬＣを用いた場合、ｈＡＮＰとはベースライン分離せず、ｈＡＮＰの溶出ピークのテール部分に重なって溶出するため、容易に分離できない性質を有していた。
ｈＡＮＰは急性心不全の治療用医薬品としても使用されており、このように医薬品として使用されるｈＡＮＰは高純度であることが重要である。現在の生産方法でも充分に医薬品としての純度は確保されているが、精製工程において副生成ポリペプチドであるＲ１を除去するために収量が減ってしまうことが生産コストの面から問題であった。従って、当該不純物の生成を抑える手段を見出すことは、高純度のｈＡＮＰを生産する上で重要な課題であった。
遺伝子組換えポリペプチドの製造において、精製工程において不純物である副生成物を除去するために収量が減ってしまうことが生産コストの面から問題となる場合があり、当該副生成物の生成を抑える手段を見出すことは、高純度の遺伝子組換えポリペプチドを生産する上で重要である。従って、本発明は遺伝子組換えポリペプチドの生産における副生成物の生成を抑制する方法及び副生成物の生成を抑制することを特徴とする遺伝子組換えポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、形質転換細胞を培養してセリン残基を含有するポリペプチドを製造する方法において、ヒスチジン、メチオニン又はグリシンの少なくとも一つを培地に添加することによりセリン残基の代わりにＯ−アセチルセリン残基が取り込まれた副生成物であるポリペプチドの生成を抑制する方法を提供する。
本発明はさらに、形質転換細胞を培養してセリン残基を含有するポリペプチドを製造する方法であって、ヒスチジン、メチオニン又はグリシンの少なくとも一つを培地に添加して培養し、セリン残基の代わりにＯ−アセチルセリン残基が取り込まれた副生成物であるポリペプチドの生成を抑制することを特徴とするセリン残基を含有するポリペプチドの製造方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
（１）不純物Ｒ１の同定
本発明者らは、ｈＡＮＰの生産プロセス中に生じる上記不純物について解析すべく、分析用Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィーを用いてＲ１ピークを分取し、その構造解析を行った。分析はマススペクトル分析、アミノ酸配列分析により行った。その結果、Ｒ１はｈＡＮＰに比べ分子量が４２だけ大きい物質であることが確認された。またＲ１のアミノ酸配列を分析したところ、ｈＡＮＰと同じアミノ酸配列であったことから、Ｒ１はｈＡＮＰ中のあるアミノ酸が別のアミノ酸と置換されたものではなく、何らかの修飾を受けたアミノ酸が含まれたｈＡＮＰの誘導体であると判断された。
さらに、もし修飾部位が複数個存在した場合、それらの組み合わせにより生ずる多数の誘導体の出現が考えられるが、実際は分析用ＨＰＬＣでシングルピークしか得られておらず、このことから修飾部位は１箇所と考えられた。修飾基の構造については、生合成の過程において生ずる修飾反応でかつ分子量が４２であったことから、アセチル化されたものであることが考えられる。
アセチル化の部位についてはｈＡＮＰのアミノ酸配列から、セリン残基、アルギニン残基及びチロシン残基に対する修飾の可能性が考えられるため、まずｈＡＮＰのＣ末端に１箇所存在するチロシン残基についてＣ末端アミノ酸分析を行ったところ、Ｒ１のＣ末端アミノ酸はチロシンであることが判明し、チロシン残基における修飾の可能性は否定された。さらにアルギニン残基についてはアルギニンを特異的に認識するプロテアーゼ（トリプシン）の切断がＲ１においても正常に行われることからその可能性は低いと考えられる。従って、アセチル化はセリン残基において生じているものと判断した。これはセリンのアセチル体であるＯ−アセチルセリン残基は細胞内で合成されることが判明しており、ポリペプチドへの翻訳時にセリン残基の代わりに取り込まれる可能性があることからも十分に考えられる。また、Ｒ１がポリペプチドへの翻訳時に生じていることは、融合タンパク質からｈＡＮＰを遊離させた時点からＲ１が検出できることからも推測される。従って、Ｒ１に生じた修飾は、融合タンパク質の発現時に生じたものであり、精製過程で生じたものではないと判断された。
（２）不純物Ｒ１の生成抑制
本発明者らは培養工程においてＲ１の生成を減少させることを検討した。大腸菌を宿主細胞として組換えペプチドを生産した場合、分子量を４２だけ大きくするような修飾についての報告はなく、従って、Ｒ１に関して生成を抑制する手段について全く不明であった。そこで本発明者らは、タンパク質の構成成分であるアミノ酸に着目し、培地へアミノ酸を添加することで当該アミノ酸の生合成を抑制し、Ｏ−アセチルセリン等の生合成中間体の生成を抑制することによりＲ１の生成を抑制することを試みた。
検討は１８種類（Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−ヒスチジン）のアミノ酸のいずれかを添加してｈＡＮＰ生産菌を培養し、ｈＡＮＰ及びＲ１の生成量を比較することにより行った。
なお、Ｌ−バリン添加は菌の増殖阻害を引き起こすため実施しなかった。またＬ−チロシンの添加はチロシンの溶解度が低く、大量培養時に不適切と考えられたため検討しなかった。
検討の結果、１８種類のＬ−アミノ酸のうち、グリシン、ヒスチジンあるいはメチオニンの添加がＲ１生成を５０％以上抑制し、これらのアミノ酸の添加がＲ１生成の抑制の効果が大きいことが明らかになった。即ち、これらのアミノ酸を培地へ添加することで、Ｒ１の生成が抑制されること、また菌体当たりの封入体生産量も増加させる効果もあることが明らかとなり、高純度のｈＡＮＰを大量生産する際に有用な方法であることが判明した。なお、上記アミノ酸の添加量は、培養終了時点においても、添加したアミノ酸（グリシン、ヒスチジン及び／又はメチオニン）の宿主細胞における生合成が抑制される量を培地中に添加すればよく、例えば、培養中に培地中のアミノ酸含有量をモニターしてそれが欠乏しないように適宜添加してもよい。また菌体のアミノ酸組成（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ  ｐｒｅｓｓ，ｐ．１３−１６に記載）、得られる菌体濃度、発現させるタンパク質のアミノ酸組成及びその発現量により、必要とされる添加アミノ酸量を算出し、それが培養終了時点においても十分に残存する量を最初から培地に添加することも可能である。
本発明の実施例においてはグリシン、ヒスチジン又はメチオニンについてそれぞれのアミノ酸を単独で添加した場合についての検討を実施したが、これらを組み合わせることにより、さらにＲ１の生成が抑制されることは十分に期待できる。
また発明者らはｈＡＮＰ生産を例にこれらの検討を実施したが、遺伝子組換え技術を用いたポリペプチドの生産において＋４２の分子量を与える不純物の生成はｈＡＮＰ以外のペプチド又はタンパク質（特にセリンを含有するもの）を生産する場合でも十分に起こり得るものであり、本方法は遺伝子組換えで生産するペプチド又はタンパク質に広く適応できる。また、ペプチド又はタンパク質の構造によっては、１個のセリン残基のみならず、複数のセリン残基を有する場合があり、その複数のセリン残基の１箇所以上にＯ−アセチルセリン残基が取り込まれた副生成物が１種類以上生成することが考えられ、本発明はそれらの生成の抑制をすることも期待できる。
本発明において適応が可能なペプチドの例としては、Ａ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｂ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ、Ｂｉｇ  Ｇａｓｔｒｉｎ、  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ、Ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ、Ｃ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｄｅｆｅｓｉｎ  １、Ｅｌａｆｉｎ、α−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ、β−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ、γ−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−２、Ｂｉｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、Ｂｉｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−２、Ｂｉｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３、Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ、Ｇａｌａｎｉｎ、Ｂｉｇ  Ｇａｓｔｒｉｎ、Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、Ｇｈｒｅｌｉｎ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１、Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ  ５、Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、Ｍｉｄｋｉｎｅ、Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ａ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ、Ｏｘｙｔｏｃｉｎ、Ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ２０  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ＰＴＨ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎ−２７、Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ３８、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ−４、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔ、Ｓｅｃｒｅｔｉｎ、Ｓｅｒｕｍ  Ｔｈｙｍｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、Ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ及びこれらの誘導体が挙げられ、タンパク質の例としてはＧｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ及びその誘導体を挙げることができる。
本発明では、セリン残基を含有するポリペプチドの分子量が約１０００〜２００００であるポリペプチドについて実施することが好ましい。また、セリン残基を含有するポリペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチドであることがより好ましく、心房性ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチドであることが最も好ましい。
本発明に用いることができる宿主細胞は、遺伝子組換えポリペプチドの製法に用いることができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、原核細胞又は真核細胞の何れでもよく、原核細胞としては細菌（大腸菌、枯草菌等）、真核細胞としては酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属等）、動物細胞（ＣＨＯ細胞等）を挙げることができる。宿主細胞としては、細菌、酵母などを含む微生物が好ましく、特に大腸菌が好ましい。
即ち、本発明は以下のものに関する。
ａ）形質転換細胞を培養して遺伝子組換えポリペプチドを製造する方法において、ヒスチジン、メチオニン又はグリシンの少なくとも一つを培地に添加することにより、副生成物であるポリペプチドの生成を抑制する方法、
ｂ）形質転換細胞を培養して遺伝子組換えポリペプチドを製造する方法であって、ヒスチジン、メチオニン又はグリシンの少なくとも一つを培地に添加して培養し、副生成物であるポリペプチドの生成を抑制することを特徴とする遺伝子組換えポリペプチドの製造方法、
ｃ）副生成ポリペプチドの分子量が遺伝子組換えポリペプチドに対して＋４２の修飾を受けた誘導体であるａ）又はｂ）記載の方法、
ｄ）副生成ポリペプチドがアセチル化された誘導体であるａ）乃至ｃ）記載の方法、
ｅ）遺伝子組換えポリペプチドがセリンを分子内に有するポリペプチドであるａ）乃至ｄ）記載の方法、
ｆ）遺伝子組換えポリペプチドの分子量が約１０００〜２００００であるａ）乃至ｅ）記載の方法、
ｇ）遺伝子組換えポリペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチドであるｆ）記載の方法、
ｈ）心房性ナトリウム利尿ペプチドがヒト心房性ナトリウム利尿ペプチドであるｇ）記載の方法、
ｉ）形質転換細胞を培養して遺伝子組換えポリペプチドを製造する方法において、宿主細胞が原核細胞又は真核細胞微生物であるａ）乃至ｈ）記載の方法、
ｊ）宿主細胞が、微生物であるｉ）記載の方法、及び
ｋ）微生物が、大腸菌であるｊ）記載の方法。
産業上の利用可能性
本発明は、形質転換細胞を培養して遺伝子組換えポリペプチドを製造する方法において、ヒスチジン、メチオニン又はグリシンの少なくとも一つを培地に添加することにより副生成物ポリペプチドの生成を抑制する方法、及び副生成物の生成を抑制することを特徴とする遺伝子組換えポリペプチドの製造方法に関するものである。特にセリン残基の代わりにＯ−アセチルセリン残基が取り込まれた副生成物ポリペプチドの生成を抑制する効果があり、本発明により、高純度の遺伝子組換えポリペプチドを従来よりも低い生産コストで提供することが可能となる。
実施例
以下に、実施例において本発明を詳細に述べる。本発明についての種々の変更、修飾を行うことが当業者には可能であり、従って、本発明は実施例に限定されることなく、これらの変更、修飾をも含むものである。
実施例１：発現ベクターの作製
大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端部分の９７アミノ酸から成る保護ペプチド（配列番号２）、リジン残基を含む３アミノ酸残基のリンカー配列（Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）及びｈＡＮＰ（配列番号１）より構成される融合タンパク質をコードする遺伝子を、ＢａｌＩ−ＰｖｕＩＩ領域を欠失させたｐＢＲ３２２（Ｎａｔｕｒｅ．１９８０；２８３：２１６−８）のＥｃｏＲＩ、ＤｒａＩ部位にクローニングし、発現ベクターｐＧＨα９７ＳＩＩを作製した（図１：融合タンパク質遺伝子配列は省略）。発現ベクターの構築方法は常法に従った。
実施例２：Ｒ１の同定
（１）培養及び封入体回収
上記の発現プラスミドが導入された大腸菌Ｗ３１１０株（Ｗ３１１０／ｐＧＨα９７ＳＩＩ）を、ジャーファーメンターを用いて表１に示すＮＵ培地を用いて培養した。
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培養はグルコース濃度４．５％、３３℃、ｐＨ７．０、溶存酸素濃度３０％の条件で行い、ｐＨ及び溶存酸素濃度はそれぞれアンモニア水の滴下、攪拌回転数の上昇により制御した。グルコースが消費された後、培養温度を３７℃に制御してグリセロールを炭素源として逐次添加することにより、ｈＡＮＰ融合タンパク質の発現を促し、約３０時間の培養を行った。培養後の菌体には封入体の形成が認められ、発現した融合タンパク質は全菌体タンパク質の３０％以上であった。
培養後、マントン−ゴーリンホモジナイザー（１５Ｍ−８ＡＴ）を用いて、培養液を５００Ｋｇ／ｃｍ２の条件でホモジナイズ処理し、遠心機により沈殿画分（封入体）を回収した。次に、培養液と等量の３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．３）緩衝液を添加し、懸濁後、再度遠心分離を行い、沈殿を回収した。この洗浄操作をさらにもう一度繰り返し、最終的に得られた沈殿を適量の３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．３）緩衝液に懸濁した。
（２）Ｒ１の検出
次に、得られた封入体を５Ｍ尿素を含む３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．３）緩衝液に懸濁・溶解した。封入体は水に懸濁した場合、ＯＤ６６０値が２２０になる分量を使用した。この封入体溶解液に、３．５ユニット／Ｌの割合でＡＰＩ（和光純薬）を添加し、３０℃で１．５時間切断反応を実施した。図２は酵素反応の終了後、切り出されたｈＡＮＰを逆相ＨＰＬＣで分析したものである。分析はカラム温度４０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎ．、Ａ液；トリフルオロ酢酸溶液（１→１０００）、Ｂ液；アセトニトリル・トリフルオロ酢酸溶液（０．９５→１０００）混液（１：１）を使用し、Ｂ液の初期濃度を４３％とし、分析開始後Ｂ液を一定量ずつ増加させて、１６分間で５２％となるようなグラジエント法により行った。Ｒ１はｈＡＮＰに対する相対溶出時間が１．１の不純物として検出された。
（３）Ｒ１の精製
次に、Ｒ１の構造分析のため、Ｒ１の精製を行った。酵素処理の終了後の反応液にｐＨが５．０となるように酢酸を添加し、保護ペプチドを沈殿させた後、沈殿を遠心分離で除去した。次に、２．５Ｍ尿素を含む５０ｍＭ酢酸アンモニウム液（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−トヨパール（ＴＯＳＯＨ）に上清を添加して、Ｒ１及びｈＡＮＰを吸着させた後、塩化ナトリウムの塩濃度勾配で溶出させ、ｈＡＮＰ及びＲ１を含む画分を分取した。
得られた分画に２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に相当する量の酢酸を加え、オクタデシル（Ｃ１８）をリガンドとする逆相系カラム（ｓｏｋｅｎ  ＯＤＳ）に通液し、ｈＡＮＰをカラムに吸着させた後、アセトニトリル濃度勾配によりｈＡＮＰを溶出させ、ｈＡＮＰ及びＲ１を含む画分を分取した。
このようにして得られた分画を分析用逆相ＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ−３０２：４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ）にかけ、Ｒ１のピークを分取することで、高純度のＲ１を得た。
（４）Ｒ１の構造分析
Ｒ１の構造分析は、エドマン法によるＮ末端からのアミノ酸配列、及びマススペクトル（エレクトロスプレー・イオニゼーション法）による分子量測定により行った。その結果、Ｎ末端からの配列はｈＡＮＰの配列に一致していることが判明した。一方、マススペクトル分析の結果は分子量３１２２となり、ｈＡＮＰの分子量３０８０に比べ４２だけ大きい分子であることが明らかとなった（図３）。これらの分析結果を考察したところ、Ｒ１は何らかの修飾を受けたｈＡＮＰであると推測された。この修飾基については＋４２の分子量及び細胞内で生じる修飾反応であることからアセチル基と推測された。ｈＡＮＰのアミノ酸配列からは、セリン残基、アルギニン残基及びチロシン残基に対する修飾の可能性が考えられるが、特にセリン残基での修飾の可能性が高いと考えられた。これはセリンのアセチル体であるＯ−アセチルセリンが細胞内で合成されることが知られており（Ｋｒｅｄｉｃｈ，Ｎ．Ｍ．：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＳＭ  ｐｒｅｓｓ，ｐ５１４−５２７）、ポリペプチドへの翻訳時にＯ−アセチルセリンがセリンの代わりに取り込まれると考えられるためである。
実施例３：アミノ酸の添加とＲ１の生成抑制
（１）培養
Ｗ３１１０／ｐＧＨα９７ＳＩＩの凍結保存菌を１００ｍｌのＬＢＤ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ブドウ糖、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液［ｐＨ７．０］）に接種し、３７℃で約７時間振盪培養を行った。得られた培養液に最終濃度１０％になるようにグリセロールを添加したのち１ｍＬずつバイアル２０本に分注し、凍結保存を行い以降の実験に用いた。
この凍結保存菌を２００ｍＬの表１のＮＵ培地（但し、ｐＨ７．２、炭素源にはグルコース（４ｇ／Ｌ）を使用し、酵母エキス０．１ｇ／Ｌに変更したもの）に植え、３３℃で一晩振盪培養した。菌体を遠心により集菌し、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で一度洗浄し、最初の菌体濃度の７倍から８倍になるように生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を適量加え懸濁した。
次に、この菌体懸濁液２ｍＬを、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−ヒスチジンのいずれかを３ｇ／Ｌの濃度で含む１００ｍＬのＮＵ培地（但し、ｐＨ６．９−７．０、酵母エキスは０．１ｇ／Ｌ、炭素源にはグリセリン（１０ｇ／Ｌ）を使用）に添加し、３７℃で一晩培養した。
（２）封入体回収及びＲ１の生成抑制
各フラスコの培養液から遠心分離（７０００ｒｐｍ、２０分）により菌体を回収後、５ｍｌの脱イオン水に懸濁し、超音波細胞破砕機により破砕処理を行った。次に、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）により封入体を沈殿画分に回収し、５ｍｌの３０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．３）緩衝液で懸濁し、再度遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）を行い、封入体の洗浄及び濃縮を行った。
次に、得られた封入体を５Ｍ尿素を含む３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．３）緩衝液１ｍＬに懸濁・溶解した。封入体は１ｍＬの水に懸濁した場合、ＯＤ６６０値が２２になる分量を使用した。融合タンパク質からのｈＡＮＰの遊離は、０．００４ユニット／ｍＬ反応液のＡＰＩプロテアーゼ（和光純薬）を添加し、３０℃で約１５０ｍｉｎの反応により行った。反応後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）を行い、得られた上清３００μＬに１３．５〜１５．５μＬの５％酢酸を添加し、４５０μＬの精製水で希釈した。この操作で生じた沈殿は遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）により除去し、上清をＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ３０２）で分析した。Ｒ１濃度は、ｈＡＮＰに対するピークのエリアの面積比により算出した。
表２はｈＡＮＰに対するＲ１の生成量を相対比較したものである。
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その結果、検討を行ったアミノ酸の内、ヒスチジン、メチオニンあるいはグリシンの添加はＲ１の生成抑制に効果が大きく、対照（アミノ酸を添加しない場合）に比べ、５０％以上Ｒ１の生成量が減少することが判明した。またこれらのアミノ酸の添加は菌体当たりの封入体生産量を増加させる効果があることが明らかとなった。Ｒ１生成抑制効果のあるヒスチジン、メチオニンあるいはグリシンの中では、封入体生産量を含めて考慮した際に、メチオニン添加がｈＡＮＰに対するＲ１生成量が最も低く、Ｒ１の生成抑制に効果的であることが判明した。
なお、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、及びＬ−システインは、融合タンパク質発現を低下させたため、封入体が回収できず、これらのアミノ酸の添加はｈＡＮＰ生産に有効でないことが明らかとなった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、発現ベクターｐＧＨα９７ＳＩＩの模式図を示す。
図２は、酵素反応の終了後、融合タンパク質から切り出されたｈＡＮＰを逆相ＨＰＬＣで分析した結果を示す。
図３は、Ｒ１の構造分析に係るマススペクトル分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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