(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含有せず、セルロモナス属に属する微生物、セルロモナスｓｐ．Ｋ３２Ａ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６６）由来の多糖類分解酵素を含有する植物性繊維分解剤を、野外において植物性廃棄物に作用させることからなる植物性廃棄物処理法。
【請求項２】
植物性廃棄物が稲ワラ、籾殻、麦ワラ、バッカス、芋のつる落葉または木片から選ばれる請求項１記載の処理法。
【請求項３】
前記植物性繊維分解剤を作用させる前に植物性廃棄物を破砕する工程を含む請求項１または２記載の処理法。
【請求項４】
２０℃から５０℃の温度条件にて実施される請求項１、２または３記載の処理法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物性繊維分解剤および植物性廃棄物処理法に関する。詳しくは、好気性細菌セルロモナス属、嫌気性細菌クロストリジウム属および／または多糖類分解酵素を産生し得る他の微生物から得られる多糖類分解酵素を用いて行なう稲ワラや籾殻などの植物性廃棄物処理法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
稲作や小麦生産、とうもろこし、サトウキビなどの穀物生産や豆類の生産において排出される植物組織からなる廃棄物の処理方法としては、田畑で焼却する方法、焼却炉で重油や軽油などの燃料により焼却する方法、または植物性廃棄物におがくずや米糠などと混ぜて堆積し、肥料とする方法がとられてきた。しかしながら、焼却炉で処理する方法は多量の燃料と輸送費を必要とし、また田畑で焼却する方法は発生する煤煙による環境汚染（稲藁公害）の問題から焼却処分の禁止が検討されている。植物性廃棄物の堆肥化に関しては、植物性廃棄物にワラやおがくず、米糠などを混ぜ、消石灰を散布し野積みすることによって自然に腐食させる方法と、植物性廃棄物を細かく破砕したものにおがくず、籾殻、鶏糞などを混ぜて水分を調節した後、醗酵菌や処理済み堆肥などを加え、容器内で撹拌するなどして醗酵を行なうことにより堆肥化する方法がとられてきた。しかし植物性廃棄物の堆肥化は、農業の近代化および機械化にともない、その手間と熟成までの期間の長さから実施されない傾向にある。したがって該廃棄物は、有効な資源と認知されているにもかかわらず産業廃棄物化しつつある。
【０００３】
前記以外の植物廃棄物の処理方法としては、微生物の固定化物により植物性廃棄物を処理する方法がある。植物性廃棄物は、その構造上の理由から難分解性であり、その主たる原因は植物性廃棄物中のセルロースおよび／またはヘミセルロースに起因する。このため、植物性繊維を処理して有効に利用するためには、第一段階としてセルロースおよび／またはヘミセルロースを部分的にでも加水分解することが必要となる。これらセルロースおよび／またはヘミセルロースを加水分解する方法としては、多種類の菌混合物からなる稲ワラなどの分解剤を用いた処理方法が知られている。特開平８−１５７２８５には、ペクチン、セルロースまたはヘミセルロースの少なくとも１つを、かび類または細菌類が生産する多糖類分解酵素によって分解することにより液状堆肥とする植物性廃棄物の液状堆肥化方法が記載されている。しかしながら、該方法は処理場を確保して処理設備を設けなければならず、植物性廃棄物を該処理場まで輸送する労力が必要であった。また、特開平７−２６１３には、田畑に直接散布する農業用細菌製剤が記載されている。しかし該製剤による植物性廃棄物の分解は、製剤が田畑に散布されてからその効果がみられるまで、とくに植物性廃棄物の腐熟化までに時間がかかる。これは、増殖した微生物が産生する多糖類分解酵素により植物性廃棄物が分解されるためであり、すなわち、該製剤による植物性廃棄物の分解は、土壌における該微生物の増殖を必要とするからである。
【０００４】
日本の穀倉地帯である東北・北海道などの寒冷地において、既存の微生物製剤および石灰・窒素製剤を有効に作用させるためには、該製剤の田畑への鋤き込み作業が１回では不充分であり、２回必要としていた。また稲作においては、分解できなかった廃棄物が田植え後に醗酵することによりガスが発生し、苗の定着および根の成長を阻害していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術では解決が困難であった前記処理費用の問題、エネルギー問題、環境問題および処理に要する時間などの問題を解決し、微生物の生存条件に依存することなく、かつ、植物性繊維を含む廃棄物の輸送を必要としない植物性廃棄物処理法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、微生物を含有せず、微生物由来の多糖類分解酵素を含有する植物性繊維分解剤を提供し、さらに、該植物性繊維分解剤を植物性廃棄物に作用させることからなる植物性廃棄物処理法を提供することにより、前記課題を解決するものである。
【０００７】
本発明の植物性繊維分解剤は、以下で説明する本発明の実施態様に基づいて得ることができ、また本発明の植物性廃棄物処理法も、以下の本発明の実施態様に基づいて実施することができる。以下、本発明について詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本明細書における多糖類分解酵素とは、土の中で植物性繊維を分解する作用を有する微生物由来の酵素類であり、たとえばセルラーゼ、キシラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼおよびグルコシダーゼなどを挙げられる。本明細書における微生物とは、多糖類分解酵素を産生するものであれば制限されず、セルラーゼおよび／またはキシラーゼを少なくとも産生する微生物が好ましい。たとえば、セルロモナス属（Cellulomonas）、バチルス属（Bacillus）、セルビブリオ属（Cellvibrio）、シュードモナス属（Pseudomonas）、スポロシトファーガ属（Sporocytophaga）、アセチビブリオ属（Acetivibrio）、クロストリジウム（Clostridium）、バクテリオイデス属（Bacterioides）、ブチリビブリオ属（Butyrivibrio）、トレポネマ（Treponema）、ルミノコッカス属（Ruminococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、サーモアクチノミセス属（Thermoactinomyces）、サーモノスポラ属（Thermonospola）、チャエトミウム属（Chaetomium）、フミコラ属（Humicola）、ミセリオフソラ属（Myceliophthola）、スポロトリシューム属（Sporotrichum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスコス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、アクレモニウム属（Acremonium）、アグリコス属（Agricus）、アルタナリア属（Alternaria）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ボトリオジプロディア属（Botryodiplodia）、フサリウム属（Fusarium）、イルペックス属（Irpex）、ミイロセシウム属（Myrothecium）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペリシュラリア属（Pellicularia）、ペニシリウム属（Penicillium）、ペスタロチオプシス属（Pestalotiopsis）、プレウロタス属（Pleurotus）、ポリポルス属（Polyporus）、ポリア属（Poria）、ピシノポルス属（pycnoporus）、ピリクラリア属（Pyricularia）、リゾプス属（Rhizopus）、シゾフィリウム属（Schizophyllum）、スクレロチウム属（Sclerotium）、スクイタリジウム属（Scytalidium）、テルミトミセス属（Termitomyces）、トラーメテス属（Trametes）、トリコダーマ属（Trichoderma）などに属するもので、多糖類分解酵素を産生する微生物を挙げることができる。これらの微生物の中でも、セルロモナス属またはクロストリジウム属に属する微生物由来の多糖類分解酵素が好ましく、セルロモナス属由来の多糖類分解酵素がさらに好ましい。具体的に好ましい種としては、セルロモナスｓｐ．Ｋ３２Ａ（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所における受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６６）菌株およびクロストリジウム  セルロボランス（Clostridium cellulovorans）ＡＴＣＣ  ３５２９６菌株を挙げることができる。田畑にて多糖類分解酵素を機能させることから、多糖類分解酵素としては中温菌由来であることが好ましい。ここで中温菌とは、高温域（５５℃以上）にも低温域（０℃以下）にも増殖できない微生物である。なお、セルラーゼまたはキシラーゼ活性は常法にて測定することができるため（Walfgang, H.、Analitical Biochem.、第１６４巻、７２〜７７頁、１９８７年；Wood, T. M.ら、Methods of Enzymology、第１６０巻、８７〜１１２頁、１９８８年）、当業者は多糖類分解酵素を産生する適当な微生物を適宜選択することができる。さらに、本明細書における多糖類分解酵素としては、遺伝子組換え技術により微生物由来の多糖類分解酵素遺伝子を含有した微生物または培養細胞などの形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することで得られる酵素も含まれる。
【０００９】
多糖類分解酵素には、植物性繊維の末端から分解するエキソ型多糖類分解酵素および繊維の内部から分解するエンド型多糖類分解酵素が存在する。本発明においては、どちらの多糖類分解酵素も好ましい。また、本発明における多糖類分解酵素としては、１０℃〜６０℃、好ましくは１５℃〜５５℃において、酵素活性を有するものが好ましい。酵素活性は、当業者に周知の手法により測定することができる。たとえば、セルラーゼ、キシラーゼ、エンドグルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性などの多糖類分解酵素も、前述の従来法（Walfgang. H.、１９８７年、Analitical Biochem.、第１６４巻、７２頁〜７７頁；Wood, T. M.ら、Methods of Enzymology、第１６０巻、８７〜１１２頁、１９８８年）により測定することができる。
【００１０】
本明細書における植物性繊維分解剤は、前記多糖類分解酵素を含有するものを意味し、とくにセルラーゼおよび／またはキシラーゼを少なくとも含有するものが好ましい。該分解剤の形状はとくに限定されず、たとえば液状、粉末状または顆粒状などを挙げることができる。また該分解剤は、前記エンド型およびエキソ型双方の多糖類分解酵素を含有しているものが好ましい。植物性繊維分解剤は、前記多糖類分解酵素を産生し得る微生物を培養することによって得ることができる。該微生物の培養は、それぞれの微生物に適切な培地を用い、適切な条件で実施する。それらの培地および培養条件は、当業者が適宜選択および設定することができる。たとえば培地の炭素源としては、濾紙、セルロース粉末などの各種繊維質原料を、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩およびペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、コーングルーテンミール、綿実油、脱脂大豆などの有機物を用いることができる。その他微量の無機金属類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチアミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添加してもよい。これらの培地成分は微生物の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は通常０．０２５〜０．５重量％用いるのが適当である。窒素源は通常０．０５〜１重量％用いるのが適当である。培地は通常ｐＨ６．５〜８．５に調整し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は微生物が生育し得る温度であればよく、当業者によって適宜設定されることができる。液体培養は、たとえば好気性微生物の場合は、前記培地を用いる通常の振とう培養または通気撹拌培養で実施することができる。嫌気性微生物の場合も、液体培養は通常の方法、たとえば前記培地に適当な濃度の還元剤を添加することにより低い酸化還元電位を保持させて、２０〜４０℃で２４時間〜１週間振とう培養を行なうことにより、実施することができる。還元剤としては、０．０３〜０．０５％Ｌ−システイン塩酸、０．０１〜０．２％チオグリコール酸ナトリウム、０．００１％ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムまたは０．１％アスコルビン酸を用いることができる。酵素を得るためには、培地の炭素源として用いたもの、たとえば砕いた濾紙などが消失するまで培養を実施する。
【００１１】
培養終了後、培養上清または該培養上清を遠心分離もしくは濾過することにより粗酵素液を得て、これらの培養上清または粗酵素液を本発明の植物性繊維分解剤として用いることができる。あるいは、培養上清をウルトラフィルトレーションにより濃縮したものでもよく、硫安塩析法、溶媒沈殿法、透析法または凍結乾燥法などの常法を適用し、粗酵素粉末としてもよい。また、粗酵素液にアビセルなどのセルロースを加えてセルラーゼ活性画分などを吸着させたのち、吸着した成分を溶出させることにより得られた精製酵素液も、植物性繊維分解剤として用いることができる。
【００１２】
本明細書における植物性廃棄物とは、稲作や小麦生産、とうもろこし、サトウキビなどの穀物、豆類または芋類などの生産において排出され、植物性繊維を含有する廃棄物を意味する。具体的には、たとえば稲ワラ、籾殻、麦ワラ、バッカス（サトウキビの絞り粕、トウモロコシの芯）および芋のつるなど、さらには落葉および木片なども植物性廃棄物の例として挙げることができる。
【００１３】
本明細書における植物性廃棄物処理法は、前記植物性繊維分解剤を用いるほかはとくに限定されず、たとえば、農作物の収穫後に田畑に残された植物性廃棄物に対し植物性繊維分解剤を直接散布することにより、野外にて実施することができる。植物性繊維分解剤を効率良く作用させるという観点からは、該分解剤を作用させる前に植物性廃棄物を破砕しておくとよい。植物性廃棄物の破砕法としては、コンバインにより収穫と同時に稲ワラなどを切断する方法、樹木をチェーンソーなどを用いて切断する方法、樹木をチップ化する破砕装置を用いて破砕する方法、または粉砕具や剪断用の刃を設けた処理装置により裁断および粉砕する方法を例として挙げることができる。また、植物性廃棄物処理は、２０℃〜５０℃の温度条件下にて実施するのが好ましい。ハウス栽培などが行なわれる温室にて本発明の植物性繊維分解剤を使用する際には、室内を４０℃〜５０℃に加温するのが好ましい。野外における一般の田畑などでは、市販の微生物製剤、石灰窒素製剤などの鋤き込み剤と併用してもよい。
【００１４】
【実施例】
次に実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
セルロモナスｓｐ．Ｋ３２Ａの前培養には、５０ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、ペプトン  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／Ｌ）を用いた。該前培養培地に該Ｋ３２Ａのシングルコロニーを接種し、旋回振とう機（商品名：Ｇ１０ Gyrotory shaker、ニューブランスウィックサイエンティフィック社（New Brunswick scientific）製）にて３７℃で一晩振とう培養（２５０ｒｐｍ、振幅１０ｍｍ）することにより前培養を実施し、前培養液を得た。ついで、アビセル（商品名）を０．０５％添加した１／５ＰＴＹ培地（酵母エキス１ｇ／Ｌ、トリプトン  １ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  １ｇ／Ｌ）２５０ｍＬを本培養の培地として用い、該本培養培地に前培養液を１％接種して、基質のアビセルが消失するまで３７℃で振とう培養（２５０ｒｐｍ、振幅１０ｍｍ）することにより本培養を実施した（約７２時間）。培養終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）して培養上清を得た。培養上清をろ過滅菌し、硫酸アンモニウムを加えて８０％飽和硫酸アンモニウムとし上清中のタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を５０ｍＭ  モルホリンプロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳと略称する）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＮａＮ3の緩衝液に溶解透析し、これを粗酵素液とした。調製した粗酵素液中のタンパク質濃度は２ｍｇ／ｍＬであった。
【００１６】
該粗酵素液５ｍＬ中に基質として１ｇの稲ワラまたは籾殻を加え、表１および２記載の温度でそれぞれ７２時間または１週間反応させた。反応終了後に遠心（３５００ｒｐｍ、２０００×ｇで１５分間）し、得られた沈殿物に滅菌水を加えて遠心機（商品名：ＫＮ−７０、クボタ製）で遠心（３５００ｒｐｍ、１５分間）することにより３回洗浄し、凍結乾燥後に沈殿物の重量を天秤で測定した。反応後の重量を初期重量から引いた重量が初期重量に占める百分率を除去率とした。この結果を表１および表２に示す。
【００１７】
【表１】
0004077158.tif 000002
【００１８】
【表２】
0004077158.tif 000003
【００１９】
実施例２
１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＮａＮ3を含んだ５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ  ７．０）に基質として籾殻を１％加えたもの５０ｍＬに、実施例１にて得たＫ３２Ａの粗酵素液をタンパク質量として１ｍｇ加え、５０℃で２４時間保温した。保温後、遠心分離し、沈殿画分を凍結乾燥して、乾燥重量を対照群（粗酵素液を加えなかったもの）と比較した。その結果、粗酵素液を加えたものは対照群に比較しその重量が３０〜３２％減少していた。また、目視により遠心分離前の溶液を観察すると、籾殻が一部溶解していることが観察された。
【００２０】
実施例３
リン酸処理したアビセルを０．１％添加し嫌気的に調製した１／５ＰＴＹ培地２５０ｍＬにクロストリジウム  セルロボランス（ＡＴＣＣ  ３５２９６）のシングルコロニーを接種し、３７℃で７２時間振とう培養（２５０ｒｐｍ、振幅１０ｍｍ）することにより培養を実施した。培養終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）して培養上清を得た。ついで、培養上清をろ過滅菌し、硫酸アンモニウムを加えて８０％飽和硫酸アンモニウムとし上清中のタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を５０ｍＭリン酸−１２ｍＭクエン酸緩衝液に溶解透析し、これを粗酵素液とした。ついで、粗酵素液のタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍＬに調製した。
【００２１】
粗酵素液５ｍＬ中に基質として１ｇの稲ワラまたは籾殻を加え、表３および４記載の温度で７２時間または１週間反応させた。反応終了後に遠心（３５００ｒｐｍ、２０００×ｇで１５分間）し、得られた沈殿物に滅菌水を加えて遠心機（商品名：ＫＮ−７０、クボタ製）で遠心（３５００ｒｐｍ、１５分間）することにより３回洗浄し、凍結乾燥後に沈殿物の重量を天秤で測定した。反応後の重量を初期重量から引いた重量が初期重量に占める百分率を除去率とした。この結果を表３および表４に示す。
【００２２】
【表３】
0004077158.tif 000004
【００２３】
【表４】
0004077158.tif 000005
【００２４】
【発明の効果】
本発明は、従来と比較してより少ない労力で植物性廃棄物を処理するために有用な植物性廃棄物処理法を提供した。本発明を用いれば、田畑など野外にて植物性廃棄物を処理することができ、従来技術では解決が困難であった処理費用の問題、エネルギー問題、環境問題および処理に要する時間などの問題を解決し、微生物の生存条件に依存することなく植物性廃棄物を処理することができる。