(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７に示された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号１１に記載のＤＮＡ断片および配列番号１２に記載のＤＮＡ断片からなる一対のＰＣＲ用プライマー。
【請求項３】
ヒト気道トリプシン様酵素イントロンＣの遺伝子多型を検出する方法であって、
５’末端に配列番号５に示された塩基配列からなるＤＮＡ断片を有し、かつ３’末端に配列番号６に示された塩基配列からなるＤＮＡ断片を有する、３．４ｋｂのヒト気道トリプシン様酵素イントロンＣのＤＮＡフラグメントを、請求項２記載のＰＣＲ用プライマーを用いて増幅する工程、
増幅されたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢｓｔＵＩで切断する工程、ならびに
制限酵素処理により、３．４ｋｂの未消化ＤＮＡフラグメントから遺伝子型ＢＢであることを、２．４５ｋｂおよび０．９５ｋｂのＤＮＡフラグメントの生成から遺伝子型ｂｂであることを、３．４ｋｂ、２．４５ｋｂおよび０．９５ｋｂのＤＮＡフラグメントの生成から遺伝子型Ｂｂであることを、決定する工程
を含む検出する方法。
【請求項４】
ヒト気道トリプシン様酵素イントロンＣの遺伝子多型を検出する方法であって、
５’末端に配列番号５に示された塩基配列からなるＤＮＡ断片を有し、かつ３’末端に配列番号６に示された塩基配列からなるＤＮＡ断片を有する、３．４ｋｂのヒト気道トリプシン様酵素イントロンＣのＤＮＡフラグメントを、請求項２記載のＰＣＲ用プライマーを用いて増幅する工程、
増幅されたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｂｏＩで切断する工程、ならびに
制限酵素処理により、１．３ｋｂのＤＮＡフラグメントの生成から遺伝子型ＭＭであることを、１．０５ｋｂのＤＮＡフラグメントの生成から遺伝子型ｍｍであることを、１．３ｋｂおよび１．０５ｋｂのＤＮＡフラグメントの生成から遺伝子型Ｍｍであることを、決定する工程
を含む検出する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により特定の疾患が発症しやすい体質や該疾患患者の治療方法に対する効果の予測、あるいは治療の予後を予測する方法に関する。
背景技術
近年、単一の遺伝子の欠損や変異による遺伝子疾患だけでなく、いくつかの遺伝子素因と環境要因とが絡み合って引き起こされる多因子疾患においても、関係する遺伝子の研究が進められてきた。その結果、それら多因子疾患に関わる遺伝子の欠損や点変異、およびアイソフォーム、さらには、実際に翻訳されるアミノ酸配列に影響しない遺伝子部分（イントロン、プロモーター）の変異が疾患のリスクファクターとして考えられるようになってきた。
従来技術としては、骨疾患分野においては骨密度とビタミンＤレセプターのイントロンの遺伝子多型との相関が認められることが発表されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６７：２８４−２８７，１９９４）。循環器分野においてはアシジオテンシン変換酵素のＩ型（挿入型）とＤ型（欠損型）の遺伝子多型が心筋梗塞の発症（Ｃａｍｂｉｅｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：６４１−６４４，１９９２）に関係するという報告やアンジオテンシノーゲンのＭ２３５Ｔのアミノ酸置換とＧ−６Ａのプロモーター領域の多型が本態性高血圧発症と関連しているという報告（Ｉｎｏｕｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：１７８６−１７９７，１９９７）がなされている。また、神経系の分野では、痴呆の発症とａｐｏＥ蛋白のアイソフォームとの関連性が報告されている。さらに、癌関連では、グルタチオンＳトランスフェラーゼの遺伝多型と癌の発症の関連性について多くの研究がなされている。呼吸器疾患分野としては喘息の発症や病態と、ＴＮＦ（Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６（４）：５５１−５５４，１９９７）やアンジオテンシン変換酵素（Ｂｅｎｅｓｓｉａｎｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９（１）：５３−５７、１９９７）の遺伝子多型の関連性が報告されている。
また、疾患治療に用いられる薬剤の感受性が患者によって異なる原因の一つとして遺伝的な背景が注目されており、遺伝子多型診断により個々人の薬剤感受性に応じた治療方法が選択されるという方向性が医療現場からも望まれている。また、臨床治験において薬剤の効果の期待される患者群を遺伝子多型により選定して薬剤開発を行うのは有効であると考えられる（Ｋｌｅｙｎ  Ｋ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：  １８２０−１８２１，１９９８）。薬剤感受性と遺伝子多型に関する従来の報告としては、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ））のイントロンの遺伝子多型とＡＣＥ阻害剤の効果に関する報告（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２１６２−２１６９，１９９５）やｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの遺伝子多型とａｓｔｈｍａに対するｂｅｔａ−ａｇｏｎｉｓｔの効果に関するもの（Ｌｉｇｇｅｔｔ，Ｓ．Ｂ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１５６（４  Ｐｔ  ２）：Ｓ１５６−１６２，１９９７）などが挙げられる。
一方、本発明に関わるヒト気道トリプシン様酵素は、慢性気道疾患患者の喀痰中より精製され（特開平７−０６７６４０号公報およびＹａｓｕｏｋａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：３００−３０８，１９９７）、そのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列がすでに明らかとなっている（特開平８−８９２４６号公報およびＹａｍａｏｋａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（１９）：１１８９５−１１９０１，１９９８）。この酵素のもつ活性についてはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいていくつか検討がなされている。粘液繊毛運動に対する関与をはじめ、ヒト気管支上皮細胞株からのＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの産生増強作用（寺尾紀子ら、１９９８年度日本呼吸器学会）を有することから気道炎症の病態への関与の可能性が考えられる。また、ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎの分解活性およびｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）活性化作用などの酵素活性（吉永純子ら、１９９８年度病態と治療におけるプロテアーゼとインヒビター研究会（Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））を有していることから気道粘膜面におけるｆｉｂｒｉｎ形成を介して抗炎症的に作用したり、慢性気道疾患ではその病態を修飾している可能性が想定され、さらに癌転移などに関与している可能性も考えられている。しかし、この酵素の生体内での生理的な機能や病態における関与についてはまだ充分に解明されておらず、遺伝子に関しても実際に翻訳されるアミノ酸配列に該当しない遺伝子部分（イントロン、プロモーター）については全く知られていなかった。さらに、このヒト気道トリプシン様酵素についての遺伝子多型の有無や遺伝子多型と疾患との関連性についてはこれまで調べられたことはない。
ところで、遺伝子解析により疾病関連体質を予測することは、特定疾患の発症の予測、治療予後の予測、適切な治療法や投与薬剤の選定などに多くの情報を与えることができる。そのため、多くの医者および患者から望まれており、さらにこれらのことは発病予防、早期治療を可能とするため、多額の医療費を削減することに結びつき、将来の医療には欠かせないものとなると考えられる。
しかし、疾患と関連する遺伝子を見つけだし、その解析方法を確立することは非常に困難であり、既に述べたように、疾患との関連性が認められている遺伝子解析方法の例は少ない。従って、さまざまな疾病関連体質を予測しうる遺伝子解析手法の開発は強く望まれている。
一方、ヒト気道トリプシン様酵素が何の疾患に関連するかは現在のところまだ解明されていない。
発明の開示
そこで本発明者は、かかる従来技術の課題を鑑みて鋭意研究した結果、ヒトの気道において特異的に発現しているヒト気道トリプシン様酵素のゲノム上のイントロン部分を遺伝子増幅するためのプライマーをデザインし、増幅された遺伝子断片の両端およびエキソン／イントロン境界部分のＤＮＡ配列を新規に決定し、増幅された遺伝子断片および新規に決定したＤＮＡ配列に遺伝子多型があることを見出した。さらに、その遺伝子多型解析によって、個々人のヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子型と疾患との関わりをはじめて見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により、個々人の特定の疾患が発症しやすい体質、または患者に対する治療の効果、または治療の予後、を予測する方法を提供する。
また、本発明はヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により粘液繊毛生体防御系の異状の診断をする方法であって、個々人の特定の疾患が発症しやすい体質、または患者に対する治療の効果、または治療の予後を予測する方法である。
さらに、本発明はヒト気道トリプシン様酵素のイントロンの塩基配列の一部もしくはすべてを含む遺伝子断片である。
発明を実施するための最良の形態
本発明によれば、個々人の体質と特定の疾病との関連を予測する方法、およびその遺伝子解析に用いる遺伝子断片あるいはＤＮＡ配列を提供する。
本発明の方法により発症しやすい体質が判別される特定の疾患、あるいはその治療の効果判定や治療の予後が予測される特定の疾患としては、呼吸器系の疾患、肺ガン、ことに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に属する肺気腫（ＰＥ）、副鼻腔気管支症候群、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）、気管支拡張症（ＢＥ）、または粘液繊毛生体防御系の異常が例示される。
本発明のヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析方法は、ひとつまたはそれ以上の塩基変異を検出することにより分類される遺伝子型の解析、ひとつまたはそれ以上の塩基変異を検出することにより分類されるハプロタイプの解析が例示される。
気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析方法は、例えば制限酵素切断による制限酵素切断断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＲＦＬＰ）による解析方法によりなされる。本発明における遺伝子多型解析方法はヒト気道トリプシン様酵素のｃＤＮＡ配列を用いてサザンハイブリダイゼーションによって検出できる遺伝子多型解析方法も含んでいる。つまり、本発明で開示されている遺伝子多型を検出しうる制限酵素でゲノムＤＮＡを切断した後、ゲル電気泳動を行い、ニトロセルロース膜などに転写した後、ヒト気道トリプシン様酵素ｃＤＮＡをプローブとしてヒト気道トリプシン様酵素ゲノムの切断されたパターンをサザンハイブリダイゼーションにより解析するという方法である。また、遺伝子多型部位を含むようにＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、その後一本鎖にして電気泳動の移動度の違いにより解析する方法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法）などでも解析可能である。多型部位を検出できる方法として他にもミスマッチＰＣＲ法、アリル特異的なオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ−ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏ）法、オリゴプローブをもちいてアニーリングを行い判定する方法、直接遺伝子多型部位の塩基配列を決定するピンポイントシーケンシング法など多数挙げられ、ＤＮＡチップなどを用いた遺伝子診断にも応用できる。
遺伝子多型解析の部位としては、イントロンでもよく、具体的遺伝子多型解析の部位としては、次の遺伝子断片が例示される。
（ａ）配列番号７と配列番号８に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｂ）配列番号９と配列番号１０に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｃ）配列番号１１と配列番号１２に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｄ）配列番号１３と配列番号１４に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｅ）配列番号１５と配列番号１６に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｆ）配列番号１１と配列番号１２に示されたプライマーを用いて増幅されうる、イントロンＣを含む遺伝子断片
（ｇ）配列番号７と配列番号８に示されたプライマーを用いて増幅されうる、イントロンＡを含む遺伝子断片
ここで、遺伝子多型解析の部位としては、イントロンＣにおいては制限酵素ＢｓｔＵＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｅＩ、またはＦｂａＩによって認識される配列部分を含む遺伝予断片、イントロンＡにおいては制限酵素ＭｂｏＩ、ＴａｑＩ、またはＡｆａＩによって認識される配列部分を含む部分、配列番号１７に示される遺伝子多型部位の１つあるいはそれ以上の組合せが例示される。これらの部位の解析により、遺伝子型もしくはハプロタイプ分類が判定される。
さらに、本発明はヒト気道トリプシン様酵素のイントロンの塩基配列の一部もしくはすべてを含む遺伝子断片であるが、特に次の遺伝子断片が例示される。
（ａ）配列番号７と配列番号８に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｂ）配列番号９と配列番号１０に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝予断片
（ｃ）配列番号１１と配列番号１２に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝予断片
（ｄ）配列番号１３と配列番号１４に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｅ）配列番号１５と配列番号１６に示されたプライマーを用いて増幅されうるイントロン領域を含む遺伝子断片
（ｆ）配列番号１ないし配列番号６のいずれかに示された塩基配列からなるヒト気道トリプシン様酵素のイントロンの遺伝子断片、またはそれらの塩基配列によって挟まれたイントロン領域を含む遺伝子断片。
（ｇ）配列番号１７に示された塩基配列からなるヒト気道トリプシン様酵素イントロンＣの遺伝子断片
実施例
以下、実施例によって詳細に説明するが、本ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析による疾患関連体質予測法は、これに限定されるものではない。
【標準的操作法】
以下、本発明において用いることができる標準的なＤＮＡ抽出操作、遺伝子増幅操作、制限酵素切断操作および電気泳動操作について説明する。
（ａ）標準的なＤＮＡ抽出操作
本発明の遺伝子増幅に用いる生体試料には特に限定はないが、血球成分が検体を採取しやすく、また、ＤＮＡを抽出しやすいので好適である。
１．全血０．５ｍｌ（２Ｎａ−ＥＤＴＡ抗凝固剤使用）を１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管に入れる。
２．溶解液を０．５ｍｌ加えて、チューブを数回軽く、逆さにして液を混ぜる。
（下記の混合操作はこれに従う）
溶解液例：１×ＳＳＣ
これは１リットル中にＮａＣｌ  １７５．３ｇ、クエン酸ナトリウム
８８．２ｇを含む１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した２０×ＳＳＣを１０倍に希釈したものである。
３．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、黒っぽいペレットが流出しないように上清を除く。
４．溶解液を１ｍｌ加えて攪拌する。
５．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、上清を除く。
６．ステップ４〜５をさらにもう１回繰り返す。
７．酵素反応液２００μｌとタンパク分解酵素１０μｌを加えて混合する。
酵素反応液例：０．０４Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、
０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）および０．４％ＳＤＳの混合液タンパク分解酵素液例：１０ｍｇ／ｍｌプロティナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）
８．３７℃で１時間保温する。（途中２〜３回軽く振り混ぜる）
９．ヨウ化ナトリウム溶液を３００μｌ加えて混合する。
１０．イソプロピルアルコールを０．５ｍｌ加えて、白い線状のＤＮＡが完全に見えてくるまで、混合する。
１１．遠心（１０，０００ｇ、１０分、室温）した後、上清をゆっくり除く。容器を濾紙の上に逆さに置く等の方法で、器壁に残った溶液を十分に除く。
１２．洗浄液（Ａ）を１ｍｌ加えて混合する。沈殿が器壁から剥がれる程度に十分混合する。
洗浄液（Ａ）例：７０％ＥｔＯＨ
１３．遠心（１０，０００ｇ、５分、室温）した後上清を除く。
１４．洗浄液（Ｂ）を１ｍｌ加えて混合する。沈殿が器壁から剥がれる程度に十分混合する。
洗浄液（Ｂ）例：８０％ＥｔＯＨ
１５．遠心（１０，０００ｇ、５分、室温）した後上清を除く。
１６．ＤＮＡ沈殿を軽く減圧乾燥する。（乾燥しすぎると、ＤＮＡが溶けにくいので、乾燥時間は３分以内にする。）
（ｂ）標準的な遺伝子増幅操作
遺伝子増幅法については、いくつかの原理が知られているが、ここではポリメレース・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）を標準的なものとして記載する。
反応液組成：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ９．０、２５℃）、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１５μＭフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）、１５μＭリバースプライマー（Ｒｉｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）、１ｍｇ／リットル  ゲノムＤＮＡ、１ユニットＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、全容積５０μｌ
反応サイクル：９４℃、１分；６４℃、１分；７２℃、１分を１サイクルとし、４０サイクル実施。
用いるプライマーは、下記Ｃ１（３５塩基）とＣ２（３５塩基）を用いる。
Ｃ１：５’−ＧＧＡＧＣ  ＣＡＴＣＴ  ＴＧＴＣＴ  ＧＧＡＡＴ  ＧＣＴＧＴ  ＧＴＧＣＴ  ＧＧＡＧＴ−３’
Ｃ２：５’−ＣＡＣＡＡ  ＴＡＡＡＣ  ＣＡＡＡＧ  ＣＣＧＣＣ  ＧＴＧＡＧ  ＴＣＴＴＣ  ＴＴＧＴＡ−３’
（ｃ）標準的な制限酵素切断操作
ＭｂｏＩ用反応液組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、
１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
Ｍｂｏｌを１０ユニット／２０μｌ反応液の濃度で加え、３７℃、３時間インキュベートする。
（ｄ）標準的な電気泳動操作
電気泳動用緩衝液は、０．５×ＴＢＥである。但し、５×ＴＢＥは１リットル中Ｔｒｉｓベース５４ｇ、ホウ酸２７．５ｇおよびＥＤＴＡ  １ｍＭを含有し、ｐＨ８．０に調整してある。上記緩衝液を用いて、１％もしくは３％アガロースゲル［Ｓｅａｋｅｍ  ＧＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）使用］（０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド含有）を使用して、電圧１００Ｖで３０分間泳動する。その後ＵＶランプでＤＮＡのバンドを観察する。
［実施例１］  ヒト気道トリプシン様酵素ゲノム上のイントロンを含むＤＮＡ断片の遺伝子増幅による取得およびその塩基配列の解析
成熟ヒト気道トリプシン様酵素のゲノム上のイントロン部位を探索するため、いくつかのトリプターゼ類縁酵素のゲノムのエキソン、イントロンの構成を参考にしてプライマーを作成し、ヒトゲノムＤＮＡを増幅したところ、プライマーＡ１（配列番号７）とＡ２（配列番号８）によって約６ＫｂのＤＮＡフラグメント（遺伝子断片）、プライマーＢ１（配列番号９）とＢ２（配列番号１０）によって約１．５Ｋｂ、プライマーＣ１（配列番号１１）とＣ２（配列番号１２）によって約３．４ＫｂのＤＮＡフラグメントが増幅された（図１）。
これらのＤＮＡフラグメントをゲルから切り出して精製し、ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社製）にそれぞれのフラグメントを挿入した。そのいくつかのクローンについてインサートＤＮＡの両サイド（５’末端、３’末端）の塩基配列を決定したところ、プライマーの配列に続いてヒト気道トリプシン様酵素のｃＤＮＡの配列が存在し、それに続き５’末端、３’末端共に、両サイドにエキソン−イントロンの境界領域における共通配列が認められ、増幅したＤＮＡ断片がヒト気道トリプシン様酵素のイントロン領域を含んだＤＮＡ断片であることが判明した。
本発明で明らかになったヒト気道トリプシン様酵素の成熟タンパクをコードする遺伝子領域のイントロンの配列は、５’側からそれぞれイントロンＡ、イントロンＢおよびイントロンＣと呼ぶこととする（図３）。明らかになったそれぞれのイントロンの５’末端、３’末端の塩基配列は、配列番号１、２、３、４、５、６で示されるとおりである。さらに、イントロンＣに関しては、全塩基配列を配列番号１７に示す。
一方、ヒト気道トリプシン様酵素のプロペプチドをコードする領域に関しては、いくつかのプライマーを作成し、遺伝子増幅を行ったところ、プライマーＤ１（配列番号１３）とＤ２（配列番号１４）によって約５．５ＫｂのＤＮＡフラグメント、プライマーＥ１（配列番号１５）とＥ２（配列番号１６）によって約５ＫｂのＤＮＡフラグメントが増幅されることが明らかになった（図２）。これらの遺伝子断片にはイントロンが含まれていると考えられる。
［実施例２］  ヒト気道トリプシン様酵素のイントロンにおける遺伝子多型の解析
イントロンＡ、Ｂ、Ｃにおいて遺伝子多型が存在するか否かを調べるために、健常人２３名のゲノムＤＮＡを全血より抽出し（標準操作法）、これをそれぞれイントロンＡ増幅用プライマーＡ１、Ａ２、イントロンＢ増幅用プライマーＢ１、Ｂ２、イントロンＣ増幅用プライマーＣ１、Ｃ２にてＰＣＲ増幅し、各種制限酵素による切断パターンを比較した。その結果、イントロンＡにおいては、制限酵素ＭｂｏＩ、ＴａｑＩ、ＡｆａＩによって遺伝子多型が観察されることを見出した。
逆に、制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＡｌｕＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＭｓｐＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｆａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶによっては遺伝子多型は観察されなかった。
イントロンＢにおいては、制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＡｌｕＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＭｓｐＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｆａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｂｏＩ、ＡｆａＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｅＩ、ＣｌａＩ、ＮｓｉＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＮｄｅＩ、ＰｍｌＩ、ＡｐａＬＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＢｓｍＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＥｃｏＲＶによって遺伝子多型は観察されなかった。
イントロンＣにおいては制限酵素ＭｂｏＩ、ＢｓｔＵＩ、ＭｓｅＩ、ＦｂａＩによって遺伝子多型が観察されることを見出した。逆に、制限酵素ＡｌｕＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＭｓｐＩ、ＢｆａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＡｆａＩ、ＴａｑＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＰｖｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩによっては遺伝子多型は観察されなかった。
Ｃ１−Ｃ２のプライマーの組み合わせを用いて増幅したイントロンＣを含むＤＮＡフラグメントをＭｂｏＩまたはＢｓｔＵＩにより切断した場合、ＭｂｏＩによる切断についての実験では、電気泳動により１．３Ｋｂにバンドが現れる場合を遺伝子型ＭＭ、１．０５Ｋｂにバンドが現れる場合を遺伝子型ｍｍ、１．３Ｋｂと１．０５Ｋｂのバントが２本一緒に現れる場合を遺伝子型Ｍｍと判定でき、一方ＢｓｔＵＩの場合、ＢＢは３．４Ｋｂ、ｂｂは２．４５Ｋｂと０．９５Ｋｂであり、Ｂｂは３本一緒に現れる。
イントロンＡのＴａｑＩおよびイントロンＣのＭｂｏＩ、ＢｓｔＵＩによって検出される遺伝子多型の電気泳動パターンを図３に示す。さらにイントロンＣについては一例のｂｂｍｍ型の健常人のゲノムよりＰＣＲにより得られたＤＮＡフラグメントよｂｍ型ハプロタイプの全塩基配列を決定した（配列番号１７）。イントロンＣの塩基配列の中で、ＢｓｔＵＩおよびＭｂｏＩによって検出される遺伝子多型部位を白抜きの矢印で示した。
ＢＢｍｍ型のＢＥの患者のゲノムを一例、塩基配列決定をしたところ、ＢｍハプロタイプのＢｓｔＵＩ遺伝子多型部位の塩基配列はＣＧＣＧがＡＣＣＧになっているためＢｓｔＵＩによって切断されないことがわかった。
［実施例３］  ヒト気道トリプシン様酵素のイントロン遺伝子多型解析による疾患関連体質の解析
統計学的解析に関しては、統計解析ソフトＳｔａｔ  Ｖｉｅｗ４．０２（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社）を使用してカイ二乗検定により解析を行った。
実施例３−１遺伝子型分類による疾患関連体質の解析
実施例２に開示されている遺伝子多型のうち、イントロンＣにおけるＭｂｏＩ、ＢｓｔＵＩによって検出される遺伝子多型について、ヒト気道トリプシン様酵素の関連する疾患を分類することが可能か否かを検討した。対象として選んだ疾患は、呼吸器疾患のびまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）、気管支拡張症（ＢＥ）、肺気腫（ＰＥ）、気管支喘息（ＢＡ）である。
健常人１０６人、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）２９人、気管支拡張症（ＢＥ）３８人、肺気腫（ＰＥ）２２人、気管支喘息（ＢＡ）３２人を選び、標準的操作法に従い各人の遺伝子型を判定した。制限酵素は、ＭｂｏＩおよびＢｓｔＵＩを用いた。
各遺伝子型の出現人数および出現頻度、各ａｌｌｅｌｅ型の出現数および出現頻度は表１および表２のとおりであった。
0004031199.tif 000002
0004031199.tif 000003
表１、表２より、上記遺伝子型での判定で、ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥにおいてＢＢ型の出現頻度が高い傾向を示していることがわかる。すなわち、この遺伝子型をもつ個々人がＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥになりやすい体質であると判定しうることを示す。さらにＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥを慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）という分類で呼吸器３疾患患者群としてまとめると、ＢＢ型の出現頻度が健常人と比較して統計学的に有意に高いという結果を得た（カイ二乗ｐ値＝０．０４、カイ二乗値＝４．２）。
0004031199.tif 000004
実施例３−２  ハプロタイプ分類による疾患関連体質の解析
ハプロタイプの出現頻度
健常人１０６人、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）２９人、気管支拡張症（ＢＥ）３８人、肺気腫（ＰＥ）２２人、気管支喘息（ＢＡ）３２人におけるＢｓｔＵＩ、ＭｂｏＩ遺伝子多型の両者の組み合わせによるハプロタイプの出現人数および出現頻度を表に示す。２３８人調べた結果、Ｂｂ−ＭＭ、ｂｂ−ＭＭ、ｂｂ−Ｍｍの遺伝子型は一人も存在しなかったことから、日本人にはｂＭハプロタイプはほとんど存在しないということを示唆している。
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以下の解析に関しては、日本人のヒト気道トリプシン様酵素遺伝子ハプロタイプがＢＭ、Ｂｍ、ｂｍの３種であることを前提に呼吸器疾患との関連を統計学的手法（カイ二乗法）を用いて解析を進めた。（以下のｐ値は、出現数が５以上の場合はカイ２乗ｐ値、出現数が４以下のフレームを含む２×２表の場合はＦｉｓｈｅｒの直接法ｐ値を示した。）
ａｌｌｅｌｅ分類（１）
日本人の３種のハプロタイプについて各ａｌｌｅｌｅの出現頻度を調べたところ、ＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）と健常人の間の出現頻度に関して、統計学的有意差をもって分布に偏りがあった（Ｐ＝０．０２７）。特に、Ｂｍ  ａｌｌｅｌｅは健常人に比べてＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）における出現頻度が高かった。
疾患ごとにみても、ＢＥ、ＤＰＢ、ＰＥにおけるＢｍ  ａｌｌｅｌｅの出現率が高かった。
逆にＢＡに関してはＢｍ  ａｌｌｅｌｅの出現頻度が低かった。
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ａｌｌｅｌｅ分類（２）
上記よりＢｍ  ａｌｌｅｌｅが疾患と関わりが強いと思われるので、特にこの型に注目してＢｍ型のａｌｌｅｌｅの数とＢｍ以外のａｌｌｅｌｅの数とで疾患との関連を解析した。
ＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）でみると、健常人と呼吸器３疾患患者群とを比べた場合、呼吸器３疾患患者群におけるＢｍ  ａｌｌｅｌｅの出現頻度は明らかに高く、分布の偏りに関して統計学的有意差が認められた（Ｐ＝０．０００２）。こうした比較によりＢｍ型のａｌｌｅｌｅとＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）の発症との関わりが示された。
疾患ごとにみても、ＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）はいずれも正常人に比しＢｍ型の出現頻度が高かった。（ＢＥ；ｐ＝０．０１２、ＤＰＢ；ｐ＝０．００２５、ＰＥ；Ｐ＝０．００５２）
一方、ＢＡにおいてはＢｍ型の出現頻度が健常人と比べ有意に低かった。（ｐ＝０．０４９）
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個体分類（１）
ａｌｌｅｌｅ分類の解析結果から、３ハプロタイプのうちとくにＢｍ型が呼吸器疾患との関連が深いと考えられるので、以下とくにこの型に注目して、これをもたない個体、１個もつ個体（ヘテロ）、２個もつ個体（ホモ）とを分類し解析した。
ＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）でみると、健常人と呼吸器３疾患患者群とを比べた場合、Ｂｍに基づくハプロタイプ分類Ｂｍ−０、１、２の出現頻度に関して、分布に有為差がみられた（ｐ＝０．００９３）。
疾患別にみると、ＤＰＢおよびＰＥを発症した患者で分布の偏りに有為差がみられ（ＤＰＢ：ｐ＝０．００２４、ＰＥ：ｐ＝０．００６９）、ＢＥでもその傾向があった（ｐ＝０．０８９）。
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個体分類（２）
Ｂｍハプロタイプを保有しているか否かで分析した（Ｂｍ−０  ｖｓ  Ｂｍ−１、２）。
ＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）でみると、健常人と比べた場合、呼吸器３疾患患者群におけるＢｍを保有している個体の出現頻度が高く、分布の偏りに関して有意差が認められた（ｐ＝０．０３９）。一方、ＢＡにおいては逆にＢｍハプロタイプをもたない個体が多く、健常人群と比較して分布に有為な偏りが見られた（ｐ＝０．０３７）。
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個体分類（３）
さらにＢｍハプロタイプをホモでもつ個体（ＢＢｍｍ；Ｂｍ−２）とそうでない個体（Ｂｍ−０、１）で出現頻度を比較した（Ｂｍ−０、１  Ｖｓ  Ｂｍ−２）。ＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患群（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）でみると、健常人と比べた場合、Ｂｍハプロタイプをホモでもつ個体（ＢＢｍｍ）とそうでない個体は出現頻度に関して、分布の偏りに統計学的有意差がみられ（ｐ＝０．０２１）、Ｂｍホモ型（Ｂｍ−２）の６人は皆、ＣＯＰＤに属する呼吸器３疾患（ＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥ）のいずれかに罹患しており、３人はＤＰＢ、２人はＰＥ、１人はＢＥであった。健常人１０６人中およびＢＡ３２人中にＢｍホモ型（Ｂｍ−２）は１人もいなかった。
疾患別にみると、ＤＰＢおよびＰＥを発症した患者で分布の偏りに統計学的有意差がみられた（ＤＰＢ：ｐ＝０．００８２、ＰＥ：ｐ＝０．０２９）。
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以上、ヒト気道トリプシン様酵素のイントロン遺伝子多型解析により、Ｂｍ型のハプロタイプ何らかのメカニズムで呼吸器疾患における慢性気道炎症に関連していることが示された。さらにヒト気道トリプシン様酵素の疾患に対する関与が慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）に属するＤＰＢ、ＢＥ、ＰＥの３疾患とＢＡでは異なることも示された。
ただし、ある遺伝子多型をもつ個体すべてがある疾患を発症するということではないので、ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型はいわゆる遺伝病のような決定的な発症因子ではなく、易病症性因子とでもいえるものである。すなわち、Ｂｍハプロタイプ保有する個体にさらに環境因子などが加わったときＢＥ、ＰＥ、ＤＰＢなどの呼吸器疾患を発症しやすくなるである。
これらの結果より、ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型を用いることにより、ヒト気道トリプシン様酵素関連疾患の分類をすることができることが示された。また、このヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析方法は、個々人におけるヒト気道トリプシン様酵素関連疾患の発病体質の予測や、該疾患の治療に対する効果や、その予後の再発可能性の予測などに応用できる手段である。
産業上の利用可能性
本発明は、ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析法により、個々人の疾患関連体質を判定する方法を提供する。従ってこの解析によりヒト気道トリプシン様酵素と関連する疾患が同定できれば、そのヒト気道トリプシン様酵素のある遺伝子型を有する個人がある疾患にかかりやすいことが推定できる。
すなわち疾患発病体質（個人がある疾患に罹患しやすい体質を持っていること）を予測することにより、上記個人の治療法に対する情報を早期に与えることが可能となり、早期診断、早期治療に結びつく。また、治療後においてもその疾患は再発する可能性を推定することができる。すなわち治療の予後（患者の治療後の治癒の経過や再発の危険性）を予測することで、医師は患者に対して十分な注意を払うことができ、また適切な指導を行うことができる。
さらにヒト気道トリプシン様酵素が関与する病態において、ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析が投与する薬剤の効果判定や薬剤開発における投与薬剤の有効な患者群を絞り込む手段となる可能性がある。
以上、述べたように早期診断、早期治療および適切な予防法の指導、適切な投薬、治療後の適切なアフターフォローにより、現在問題となっている多額の医療費を削減することにつながる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１  遺伝子増幅により得られたヒト気道トリプシン様酵素の成熟タンパクをコードする遺伝子のイントロン領域を含むＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。レーン１、５はマーカー（上から１０Ｋｂ、７Ｋｂ、５Ｋｂ、４Ｋｂ、３Ｋｂ、２．５Ｋｂ、２Ｋｂ、１．５Ｋｂ、１Ｋｂ）、レーン２はプライマーＡ１（配列番号７）とＡ２（配列番号８）によって増幅された約６ＫｂのＤＮＡフラグメント、レーン３はプライマーＢ１（配列番号９）とＢ２（配列番号１０）によって増幅された約１．５ＫｂのＤＮＡフラグメント、レーン４はプライマーＣ１（配列番号１１）とＣ２（配列番号１２）によって増幅された約３．４ＫｂのＤＮＡフラグメントが観察される。
図２  遺伝子増幅により得られたヒト気道トリプシン様酵素のプロペプチドをコードする遺伝子のイントロン領域を含むＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。レーン１、４はマーカー（上から１０Ｋｂ、７Ｋｂ、５Ｋｂ、４Ｋｂ、３Ｋｂ、２．５Ｋｂ、２Ｋｂ、１．５Ｋｂ、１Ｋｂ）、レーン２はプライマーＤ１（配列番号１３）とＤ２（配列番号１４）によって増幅された約５．５ＫｂのＤＮＡフラグメント、レーン３はプライマーＥ１（配列番号１５）とＥ２（配列番号１６）によって増幅された約５ＫｂのＤＮＡフラグメントが観察される。
図３  ヒト気道トリプシン様酵素ゲノム上のイントロンＡ、Ｂ、Ｃの相対的な位置、イントロンＡのＴａｑＩおよびイントロンＣのＭｂｏＩ、ＢｓｔＵＩによって検出される遺伝子多型（ＲＦＬＰ）のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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