(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞成分および血清成分を実質的に含まず、非感染性、非免疫増強性、免疫原性かつ防御性である精製、不活性化ヒト・レスピラトリーシンシシヤル（ＲＳ）ウイルスおよびそのキャリヤーを含み、これを用いて免疫化したヒト・ホスト中にヒト・ＲＳウイルス特異性免疫反応を起こさせることができるヒト・ＲＳウイルスに対するワクチン用としての免疫原性組成物。
【請求項２】
ヒト・ＲＳウイルスにより誘発される疾患からヒトを防御するためのヒト・ホストに対して生体内投与するためのワクチンとして製剤された、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記のキャリヤーがさらにアジュバントを含む、請求項１もしくは２に記載の組成物。
【請求項４】
注射剤、鼻腔経由、経口または粘膜表面に投与するように製剤された、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
細胞株上でヒト・レスピラトリーシンシシヤル（ＲＳ）ウイルスを増殖させて増殖ヒト・ＲＳウイルスを生産し、
上記の増殖ヒト・ＲＳウイルスを採取して採取ヒト・ＲＳウイルスを取得し、
上記の採取ヒト・ＲＳウイルスを非変性条件下で精製して細胞成分および血清成分を実質的に含まない精製ヒト・ＲＳウイルスを調製し、
不活性化剤を用いて上記の精製ヒト・ＲＳウイルスを不活性化して、非感染性、非免疫増強性かつ免疫原性の精製ヒト・ＲＳウイルスを調製し、かつ、
上記の非感染性、非免疫増強性かつ免疫原性の精製ヒト・ＲＳウイルスをヒト・ＲＳウイルスに対するワクチン用の免疫原性組成物として製剤する、
ことを含む、これを用いて免疫化したヒト・ホスト中にヒト・ＲＳウイルス特異性免疫反応を起こさせることができるヒト・ＲＳウイルスに対するワクチン用の非免疫増強性、免疫原性組成物の製造方法。
【請求項６】
上記の不活性化剤がβ−プロピオラクトン、非イオン性界面活性剤またはアスコルビン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記の非イオン性界面活性剤が、ｎ−オクチルーα−Ｄ−グルコピラノシドおよびｎ−オクチルーβ−Ｄ一グルコピラノシドのいずれかである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記の細胞株がワクチン品質の連続細胞株である、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
上記の連続細胞株がＶＥＲＯ細胞株である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記のヒト・ＲＳウイルスの上記の増殖がマイクロキャリアービーズの存在下で行われる、請求項５から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
上記の増殖ヒト・ＲＳウイルスの採取が、上記の増殖ステップから培養液を収集し、上記の収集した培養液を上記の精製ステップに送ることにより行う、請求項５から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
上記の精製ステップが、
細胞砕片を除くための精密ろ過工程と、
血清成分を除くための接線流限外ろ過工程と、
以下の（ａ）または（ｂ）の工程：
（ａ）血清成分を除くための超遠心分離による精密ろ過物のペレット化とペレット化物質をスクロース密度勾配遠心分離で処理する工程、
（ｂ）血清成分を除くためのゲルろ過工程およびさらに血清成分を除くためのイオン交換クロマトグラフィーによる工程、
を有する請求項５から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記の接線流限外ろ過が、名目分子量１００〜３００ｋＤａカットオフ膜を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のヒト・レスピラトリーシンシシヤル（ＲＳ）ウイルスタンパクと特異的に反応する抗体の存在の測定方法であって、
（ａ）試料を、ヒト・ＲＳウイルスを含む免疫原性組成物と接触させて、該ヒト・ＲＳウイルスと、これと特異的に反応性のある試料中に存在するあらゆる抗体から成る複合体を生成させる工程と、
（ｂ）複合体の生成を測定する工程と、
を有し、
前記ヒト・ＲＳウイルスを含む免疫原性組成物が、細胞成分および血清成分を実質的に含まず、非感染性、非免疫増強性、免疫原性かつ防御性である精製、不活性化ヒト・ＲＳウイルスおよびそのキャリヤーを含み、これを用いて免疫化したヒト・ホスト中にヒト・ＲＳウイルス特異性免疫反応を起こさせることができる免疫原性組成物である
ことを特徴とする試料中のヒト・ＲＳウイルスタンパクと特異的に反応する抗体の存在の測定方法。
【請求項１５】
ヒト・レスピラトリーシンシシヤル（ＲＳ）ウイルスタンパクと特異的に反応する試料中の抗体の存在を測定するための診断キットであって、
（ａ）ヒト・ＲＳウイルスを含む免疫原性組成物、
（ｂ）前記ヒト・ＲＳウイルスを含む免疫原性組成物を試料と接触させて、該免疫原性組成物中のヒト・ＲＳウイルスおよび試料中に存在するあらゆる抗体から成る複合体を生成するための手段、および
（ｃ）複合体の生成を測定する手段、
を有し、
前記ヒト・ＲＳウイルスを含む免疫原性組成物が、細胞成分および血清成分を実質的に含まず、非感染性、非免疫増強性、免疫原性かつ防御性である精製、不活性化ヒト・ＲＳウイルスおよびそのキャリヤーを含み、これを用いて免疫化したヒト・ホスト中にヒト・ＲＳウイルス特異性免疫反応を起こさせることができる免疫原性組成物である
ことを特徴とするヒト・ＲＳウイルスタンパクと特異的に反応する試料中の抗体の存在を測定するための診断キット。
【請求項１６】
細胞および血清成分を実質的に含まず、かつ、非感染性、非免疫増強性、免疫原性かつ防御性である精製されかつ不活性化されたヒト・レスピラトリーシンシシヤル（ＲＳ）ウイルスを含むヒト・ＲＳウイルスに対するワクチン。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、免疫学の分野、特には不活性化レスピラトリーシンシシャル（respirastory syncytial、ＲＳ）ウイルスワクチンに関する。
関連する特許出願
本出願は、１９９３年８月６日に出願した同時係属米国特許、出願番号０８／１０２，７４２の一部継続出願である。
発明の背景
ヒト・レスピラトリーシンシシャルウイルスは、幼児および小児における下部気道感染の主要な原因である（引用文献１〜３、本明細書の末尾に引用文献表が添付してあり、表中の文献はいずれも引用として本明細書に含まれる）。世界的にも、毎年６千５百万人が感染し、１６０，０００人が死亡している（文献４）。米国だけでも、ＲＳウイルス感染により起きる肺炎および細気管支炎のために一年で小児１００，０００人が入院している（文献５、６）。ＲＳウイルス感染小児の入院および外来患者の診療のために、米国で毎年３億４千万ドルの費用がかかっている（文献７）。ＲＳウイルス感染による重い下部気道疾患は、主として２〜６月齢の小児に起きる（文献８）。ＲＳウイルスおよびパラインフルエンザ・タイプ３ウイルス（ＰＩＶ−３）の感染による重い気道疾患から起きる合併症により、米国で毎年小児約４０００人が死亡している。世界保健機関（ＷＨＯ）および合衆国アレルギーおよび感染症協会（ＮＡＩＡＤ）ワクチン諮問委員会は、ワクチン開発に関してＲＳウイルスをＨＩＶに次ぐ順位としている。
ＲＳウイルスは、パラミクソウイルス科肺炎ウイルス属に属している（文献２）。主要な２種の防御抗原は、エンベロープフュージョン（Ｆ）および付着（Ｇ）糖タンパクである（文献９）。Ｆタンパクは、６８ｋＤａ前駆体分子（Ｆ０）として合成され、これはタンパク分解により分割されてＳ−Ｓ結合Ｆ１（４８ｋＤａ）およびＦ２（２０ｋＤａ）ポリペプチド断片となる（文献１０）。Ｇタンパク（３３ｋＤａ）は高度にＯ−グリコシル化され、見かけ分子量９０ｋＤａの糖タンパクを増加させる（文献１１）。ＲＳウイルスの広範な二種の亞型は、ＡおよびＢとして定義されている（文献１２）。これらの亞型の間の主要な抗原の相違点は、Ｇ糖タンパク中に認められている（文献７、１３）。
安全で効果があるＲＳウイルスワクチンが利用できないので、緊急に要請されている。ＲＳウイルスワクチン開発のアプローチ法は、ホルムアルデヒドを用いるウイルスの不活性化、低温抵抗性および／または温度感受性突然変異ウイルスの単離およびウイルスの防御抗原の単離である。臨床試験結果は、生の弱毒化およびホルマリン不活性化ワクチンのいずれもＲＳウイルス感染に対してワクチン被接種者を適当に防御することに失敗したことを示している（文献１４〜１６）。鼻腔内投与した低温適応化および／または温度感受性ＲＳウイルス突然変移体に認められた問題点には、臨床上の病的状態、遺伝的不安定性および過剰な弱毒化が含まれていた（文献１７〜１９）。皮下投与した生のＲＳウイルスワクチンも効力がなかった（文献２０）。不活性化ＲＳウイルスワクチンは、通常、不活性化剤としてホルムアルデヒドを用いて調製されている。マーフィーら（Murphy et al．、文献２１）は、ホルマリン不活性化ＲＳウイルスを用いて免疫化した幼児および小児内の免疫応答に関するデータを報告している。幼児（２〜６月齢）は、Ｆ糖タンパクに対して大量の抗体を生成したが、Ｇタンパクに対する反応は良くなかった。これより年を取った個体（７〜４０月齢）は、ＲＳウイルスに感染した小児のものと同程度のＦおよびＧ抗体量を生成した。しかし、いずれの幼児も小児も、天然ＲＳウイルス感染した同年齢の個体よりも中和抗体の量が低かった。主要な免疫原性ＲＳウイルスタンパクのＦ（フュージョン）およびＧ（付加）タンパクに対する抗体の量は高いが中和抗体量が低いという不釣合な免疫反応は、ホルマリン処理によるＦおよびＧ糖タンパク中の主要なエピトープの変化によるものであろう。さらに、ホルマリン不活性化ＲＳウイルスワクチンを接種された一部の幼児は、その後、天然ＲＳウイルスに対して暴露すると、免疫化していない個体よりも重い下部気道疾患となった（文献１５、１６）。従って、ホルマリン不活性化ＲＳウイルスワクチンは、ヒトへの使用には適しないと考えられている。
異常な免疫反応の証拠は、ホルマリン不活性化ＲＳウイルスワクチンで免疫化されたコトンラットでも認められた（文献２２）。その上、コトンラット中のホルマリン不活性化ＲＳウイルスワクチンを評価するとために生のウイルスを抗原投与すると、免疫化動物に激しい肺の組織疾患が発生した（文献２３）。
ホルマリン不活性化ＲＳウイルスワクチン製剤で起きる疾患増強の機構は、まだ決定されていないが、有効なＲＳウイルスワクチン開発に大きい障害となっている。この増強は、一部はＦおよびＧ糖タンパクに対するホルマリンの作用によるものであろう。さらに、ワクチン製造の間に発生する汚染となる細胞または血清成分に対する免疫学的反応が、疾患の悪化に部分的に貢献するという疾患増強の非ＲＳウイルス特異性機構が示唆されている（文献２４）。確かに、ＨＥｐ−２細胞の溶解産物を接種し、ＨＥｐ−２細胞上で培養したＲＳウイルスを抗原投与したマウスおよびコトンラットには、激しい肺の炎症反応が発生した。
さらに、酸性ｐＨ溶離を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたＲＳウイルス糖タンパクは、免疫原性で防御性であるが、しかしコトンラットに免疫増強を誘発した（文献２２、２５）。
明らかに、ＲＳウイルスにより起きる疾患に対する防御性付与に有効であり、望ましくない副作用、例えば免疫増強がないワクチンを含む免疫製剤が必要である。また、例えばＲＳウイルスにより起きる疾患の診断に使用されるＲＳＶ感染を診断するための抗原およびＲＳＶタンパクを特異的に認識する抗体（モノクロナール抗体も含む）生成のための免疫原が必要である。
ＲＳＶワクチン開発のための一般に認められた手法は、最近の総説文献（文献２、３１〜３５）に集約されているが、いずれも不活性化ＲＳＶワクチンの開発を提案してはいない。
発明の要約
本発明は、精製ＲＳウイルスの不活性化によるこのような抗原および免疫原の供給への新たな方法を提供する。
本発明の一つの実施例によると、レスピラトリーシンシシャル（ＲＳ）ウイルスに特異性の免疫反応を、これで免疫化されたホスト、特にはヒト・ホスト内に発生させることができ、複数のステップから成る免疫原性組成物調製のための方法が提供される。先ず、ＲＳウイルスを適当な細胞株で増殖し、ウイルスを採取する。非変性条件下で精製すると、採取したウイルスは、細胞および血清成分を実質的に含まない精製ウイルスが得られる。次いで、不活性化剤を用いて、精製ウイルスを不活性化すると、非感染性、非免疫増強性かつ免疫原性ＲＳウイルスが得られる。次いで、このＲＳウイルスを免疫原性組成物として製剤する。
不活性化剤は、β−プロピオラクトン、非イオン性界面活性剤、例えば、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシドおよびｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、またはアスコルビン酸であってもよい。
採取したウイルスに対する精製ステップは、細胞砕片を除くための精密ろ過、血清成分を除くために特には名目分子量約１００〜約３００ｋＤａカットオフ膜を用いる接線流限外ろ過、さらに血清成分を除くための超遠心分離により限外ろ過物のペレット化およびペレット化した物質をスクロース密度勾配遠心して分離して行うと有利である。あるいは、さらに血清成分を除くために、接線流限外ろ過の固定物をゲルろ過し、次いでイオン交換クロマトグラフィー処理してもよい。
この方法により、これを用いて免疫化したホスト中にＲＳウイルス特異性免疫反応を発生する能力がある新規の免疫源原性組成物が得られ、これは本発明の別の実施例となる。このような免疫原性組成物は、細胞および血清成分を実質的に含まず、また非感染性、非免疫増強性、免疫原性かつ防御性であり、精製し不活性化したＲＳウイルス、およびこのためのキャリヤーから成る。この免疫原性組成物は、ＲＳウイルスにより誘発される疾患からヒトを防御するために、ヒト・ホストに生体内投与するワクチンとして製剤してもよい。この免疫原性組成物のためのキャリヤーは、アジュバントを含んでいてもよい。この免疫原性組成物は、注射、鼻腔内または経口投与するためのワクチンとして製剤してもよい。
さらに、本発明は、ホスト、特にヒト・ホストを、ＲＳウイルスにより起きる疾患に対して免疫化する方法も提案し、これは本発明により提供される免疫原性組成物の有効量をホストへ投与することから成る。このような手順で免疫化されたホストは、幼児、若い小児、妊婦、出産期の女性、老人、免疫無防備状態の個体、およびその他の感受性が高い個人のいずれでもよい。
本発明により提供される不活性化ＲＳウイルスは、ＲＳウイルスによる感染を検出するための診断薬としても使用できる。従って、本発明は、さらに、
（ａ）試料を本発明の免疫原性組成物と接触させて、非感染性、非免疫増強性かつ免疫原性ＲＳウイルスおよびこれと特異的に反応性の試料中に存在するあらゆる抗体から成る複合体を生成させ、かつ
（ｂ）複合体の生成を測定する
ステップから成る試料中のＲＳウイルスタンパクと特異的に反応性の抗体の存在の測定方法も含む。
さらに、本発明は、
（ａ）ＲＳウイルスタンパクに特異的な抗体を生成させるために本発明の免疫原性組成物を用いて対象を免疫化し、
（ｂ）試料を抗体と接触させ、試料内に存在するあらゆるＲＳウイルスタンパクとＲＳウイルスタンパク特異性抗体とから成る複合体を生成させ、かつ
（ｃ）複合体の生成を測定する
ステップから成る試料中のＲＳウイルスタンパクの存在の測定方法も提供する。
さらに、本発明は、
（ａ）本発明の免疫原性組成物、
（ｂ）非感染性、非免疫増強性かつ非免疫原性ＲＳウイルスを試料と接触させ、非感染性、非免疫増強性かつ免疫原性ＲＳウイルスおよび試料中に存在するあらゆる上記の抗体から成る組成物を生成させる手段、
および
（ｃ）複合体の生成を測定する手段
から成る、ＲＳウイルスタンパクに特異的に反応性の試料中の抗体の存在を測定するための診断キットも提供する。
ＲＳウイルスワクチン製剤に関する従来の技術の難点を考慮すると、本明細書に記載した手順が、免疫原性および防御能力を示し、一方では非感染性で非免疫増強性である免疫原性組成物を提供することは意外である。
発明の詳細な説明
一つの実施例では、本発明は、ヒト用ワクチンの使用に許容できる条件下における不活性化レスピラトリーシンシシャルウイルスの調製に関する。ＲＳウイルス、亞種ＡまたはＢは、ワクチン品質細胞株、特にはＶＥＲＯ細胞株上の制御された発酵器内の組織培地中で増殖される。ウイルスを採取した後、ウイルスを精製し、次いで不活性化して不活性化ＲＳウイルスワクチンを得る。
細胞の増殖
ワクチン品質細胞株、例えばアフリカングリーンモンキー腎（African green monkey kidney）（ＶＥＲＯ）細胞を一般にマイクロキャリヤビーズ（Cytodex-1）上で増殖される。一般に、このビーズは、緩衝液中、例えばカルシウムおよびマグネシウムを含まないｐＨ約６．９〜約８．２の燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、２〜４時間、室温で軽く攪拌（毎分３０〜５０回転（ｒｐｍ））して膨潤させる。洗浄したビーズを１１０〜１３０℃において３０〜６０分間滅菌し、スピナーフラスコまたは小型（２〜２０Ｌ）または大型（２０〜２０００Ｌ）制御発酵器内で、細胞培地、例えばＣＭＲＬ１９６９内で順化させる。次いで、容器は、培地、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＣＭＲＬ１９６９内でワクチン品質ＶＥＲＯ細胞を用いて接種（例えば０．５ｘ１０5〜２ｘ１０5細胞／ｍＬ）される。
ＲＳウイルス増殖
細胞が約８０〜９０％集密化すると（細胞接種後３〜５日後）、培地の上清をデカンテーションし、培地、例えばＣＭＲＬ１９６９を用いて細胞を一回洗浄する。ＦＢＳが存在しないＣＭＲＬ１９６９中でＲＳウイルスを細胞に感染させる。ウイルス吸着の後、感染させた細胞を培地内で洗浄し、感染後５〜７日間、ウイルス増殖を監視する。
ウイルスの処理および濃縮
次いで、採取したウイルスを非変性条件下で精製して、細胞および血清成分を実質的に含まないようにする。この精製は、利用できるどのような方法でもよい。このような一つの方法では、ＲＳウイルス上清を精密ろ過（孔径０．２２〜８μｍのフィルター）して、細胞砕片を除く。次いで、分子量約１００〜約３００ｋＤａカットオフ限外ろ過膜を用いる接線流遠心分離により静澄となった液体を濃縮し、血清成分を除く。
免疫原性製剤および抗原として使用するために、濃縮したＲＳウイルスをさらに精製する。一つの方法では、濃縮ウイルスを超遠心分離によりペレット化し、超遠心分離からの上清を捨てて、これによりさらに血清成分を除いてもよい。ペレット化したウイルスをＰＢＳまたはその他の適当な媒体内に再懸濁する。次いで、スクロース密度勾配超遠心分離により濃縮したウイルスを精製する。あるいは、接線流遠心分離ステップからの固定物をゲルろ過し、次いでイオン交換クロマトグラフィーによりさらに血清成分を除いてもよい。得られたＲＳウイルス物質は、さらに超遠心分離によりペレット化してもよい。ペレット化した精製ＲＳウイルスをＰＢＳに再懸濁し、使用するまで−７０℃で保管してもよい。
ウイルスの不活性化
次に精製ウイルスを不活性化する。この不活性化は、精製ウイルスを非感染性、非免疫増強性かつ免疫原性型とする物質を用いて行う。本ステップで用いる不活性化剤は、一般にβ−プロピオラクトン、アスコルビン酸または非イオン性界面活性剤を含む。不活性化ステップで用いることができる非イオン性界面活性剤は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グリコピラノシドまたはｎ−オクチル−α−Ｄ−グリコピラノシドを含むグリコピラノシド類である。
非感染性、非免疫増強性かつ免疫原性物質を生成させるための希望に沿って、あらゆる不活性化剤の量および望ましい反応条件が使用できる。
例えば、約０．１％β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）溶液を用いて、約３０〜１２０分間、またはアスコルビン酸を用いて約２４時間、約３７℃で振とうを続けながらＲＳウイルスを不活性化してもよい。分子量１０，０００〜２０，０００の膜を用いてＰＢＳに対して透析して残留ＢＰＬを不活性化試料から除いてもよい。
コトンラットの免疫原性試験
この方法で得られた精製、不活性化ＲＳウイルス物質は免疫原性かつ防御性があり、一方では、非感染性である。この結果は、コトンラット内の免疫原性ＲＳウイルス物質を評価して測定でき、これには下記のように生のＲＳウイルス抗原投与に対して動物を防御するための能力も含まれる。本発明で提供されるワクチン調剤はＲＳウイルス特異性中和抗体を誘発し、生のウイルスの抗原投与からコトンラットを防御した。
本発明の各種の実施例は、ワクチン接種、診断、レスピラトリーシンシシャルウイルスにより起きる疾患の処置および免疫学的試薬の製造の分野に多くの応用を有することは、この技術の専門家には明らかである。さらに、限定するものではないこのような応用の考察を以下に記載する。
ワクチン調製および使用
ワクチンとしての使用に適する免疫原性組成物は、下記のようにして不活性化ＲＳＶから調製できる。このワクチンは、抗−ＲＳＶ抗体を生成する個体内で免疫反応を誘発する。ワクチンを投与した個体がＲＳＶ抗原投与された場合には、抗体はウイルスに結合し、これを不活性化する。
ワクチンを含む免疫原性組成物は、注射剤、液剤または乳剤として調製できる。不活性化したＲＳＶは、これと相溶性で薬剤的に許容できる賦形剤と混合してもよい。このような賦形剤には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールおよびこれらの組み合わせが含まれる。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはこれらの効力を強化するアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントの効果を発揮させる方法には、水酸化または燐酸アルミニウム（ミョウバン）のような薬剤の使用が含まれ、これは通常燐酸塩緩衝塩水中の０．０５〜０．１％溶液として使用される。免疫原性組成物およびワクチンは、経口、皮下または筋肉内注射により投与される。あるいは、本発明により調製された免疫原性組成物は、粘膜面に免疫反応を起こすように製剤および投与してもよい。この場合に、免疫原性組成物は、例えば鼻または口を経由して粘膜面に投与してもよい。あるいは、座薬および経口製剤を含むその他の方法による投与も適する。座薬には、結合剤およびキャリヤー、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含んでいてもよい。経口製剤は、通常用いられる助剤、例えば医薬品質のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムを含んでいてもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、ピル、カプセル、除放製剤または粉剤の型を取り、その中に不活性化ＲＳＶ約１〜９５％を含むことができる。免疫製剤およびワクチンは、投与剤型に調和し、治療的に有効、防御的で免疫原性となるような方法で投与される。投与されるべき量は処置する個体により異なり、例えば抗体の合成および必要ならば細胞媒介免疫反応を発生させる個体の免疫システムの能力も含まれる。投与すべき有効成分の正確な量は、臨床医の判断に任される。しかし、投与量の適当な範囲は、専門家には容易に決定できる。最初の投与および追加投与のための適当な方法は種々あるが、最初の投与の後に引き続き投与する方法も含まれる。投与量は投与経路によって左右され、ホストの大きさによっても異なるであろう。
本発明による免疫原性組成物中の不活性化ＲＳウイルスの濃度は、一般に１〜９５％である。一種の病原のみに対する抗原物質を含むワクチンは、単価ワクチンである。数種の病原の抗原物質を含むワクチンが混合ワクチンであり、本発明のものである。このような混合ワクチンは、例えば種々の病原から、または同じ病原の種々の系統から、または種々の病原の組み合わせからの物質を含む。
免疫学的検定
本発明の不活性化ＲＳＶ製剤は、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよびその他の非酵素結合抗体結合検定法または細菌抗体の検出に専門家に公知の方法を含む免疫検定法中の抗原としてＲＳＶタンパクと特異的に反応性の抗体（モノクロナール抗体も含む）の生成のための免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡ検定法においては、不活性化ＲＳＶは、選定された表面、例えばタンパクを結合できる表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートのウエルに固定化される。吸着が不十分なウイルスを除くために洗浄した後に、試験試料に対して抗原的に中性であることが知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液などの非特異的タンパクを選定した表面に結合させてもよい。これは、固定化表面上の非特異的吸着サイトをブロックし、これにより表面上への非特異的結合により起きるバックグラウンドを低下させる。
次いで、固定化した表面を臨床または生物学的物質などの試料と接触させ、免疫複合体（抗原／抗体）形成に導くようにして試験する。これには、希釈剤、例えばＢＳＡ溶液、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／または燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／トゥィーン（Tween）を用いる試料の希釈も含まれる。次いで、試料を２〜４時間、温度２５〜３７℃程度で培養する。培養の後、試料と接触した面を洗浄し、非免疫化複合物質を除く。洗浄手順には、溶液、例えばＰＢＳ／トゥィーンまたはホウ酸塩緩衝液を用いる洗浄が含まれる。試験試料と結合不活性化ＲＳＶとの間の特異性免疫複合体形成および引き続く洗浄の後、免疫複合体の生成およびその量を、第一の抗体に特異性を有する第二の抗体に免疫複合体を作用させて測定する。試験試料がヒト起源の場合には、第二の抗体は、ヒトイムノグロブリン、一般にはＩｇＧに対して特異性を有する抗体である。検出手段を与えるために、第二の抗体は、例えば、適当な色素形成性の基質を用いて培養すると発色するような酵素活性等の関連活性を有していてもよい。次いで、定量は、例えば可視光線分光分析計を用いて発色の程度を測定して行うことができる。
実施例
上記の開示は、本発明を一般的に説明したものである。下記の特定の実施例を参照すると、さらに完全な理解が得られるであろう。これらの実施例は、本発明の説明を目的とし、その範囲の制限を目的とするものではない。周囲の状況が許し、または得策な場合には、形態の変化および同等のものとの交換も考えられる。特定の用語がこの中に使用されているけれども、これらの用語は説明を目的とし、限定するためではない。
本開示中に明確には記載していない５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）、プラークおよび中和価の測定法は、科学文献中に一般に報告されており、従来の技術の範囲内である。タンパク濃度は、引用して本明細書に含まれるピアスマニュアル［Pierce Manual(23220, 23225; Pierce Chemical Company, U.S.A.)］中に記載されているビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により測定した。
細胞培養およびウイルス増殖にはＣＭＲＬ１９６９培地を使用した。本研究に使用した細胞は、メリエ研究所（Institut Merieux）から入手したワクチン品質アフリカングリーンモンキー腎細胞（ＶＥＲＯロットＭ６）であった。使用したＲＳウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection、ＡＴＣＣ）から入手したＲＳウイルス亞種Ａ（ロングおよびＡ２株）およびトレーシー（Tracy）およびＲＳＶ−３−ＤＩＴと称する最近の亞種Ａ臨床分離株であった。いずれのＲＳＶを用いても下記の実施例と同様の結果が得られた。
実施例Ｉ：本実施例では、アフリカングリーンモンキー腎（ＶＥＲＯ、ロットＭ６）細胞の増殖を説明する。
アフリカングリーンモンキー腎（ＶＥＲＯ）細胞は、マイクロキャリヤービーズ（Cytodex-1, Pharmacia）上で増殖させた。濃度２．５ｇ／Ｌで使用したこのビーズは、カルシウムおよびマグネシウムが存在しない燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ８．０内でゆっくりと攪拌（５０ｒｐｍ）しながら３時間、室温で膨潤させた。この培養期間の後、ＰＢＳ溶液をデカンテーションし、ＰＢＳ１．５Ｌを用いてビーズを一回洗浄した。上清をデカンテーションし、ＰＢＳの量を２Ｌとした。マイクロキャリヤービーズを１２１℃で４５分間滅菌し、大型（４０Ｌ）発酵器内のＣＭＲＬ１９６９培地内で順化させた。ウシ胎児血清を加えたＣＭＲＬ１９６９培地（最終濃度５％）中のＶＥＲＯ、Ｍ６細胞を用いて培養容器を接種した（１０5細胞／ｍＬ）。
実施例ＩＩ：本実施例では、組織培地内でのＲＳウイルスの増殖を説明する。
細胞が集密度約９０％に達すると、培地の上清をデカンテーションし、ＣＭＲＬ培地を用いて細胞を洗浄した。外因的にＰＢＳを加えない培地中の感染多重度（ｍｏｉ）０．００１でＲＳウイルスを細胞に感染させた。ゆっくり攪拌しながら、１時間、３７℃でウイルスを細胞に吸着させた。吸着期間の後、ＣＭＲＬ１９６９を用いて細胞を一回洗浄し、ＣＭＲＬ１９６９培地内で培養した。感染１０日後に、培地液を採取（試料Ｉ）、実施例ＩＩＩ記載の方法で処理し、スクロース２０％の存在下で−７０℃で保管した。次いで、培養器にＣＭＲＬ１９６９を加え、ウイルス感染細胞をさらに４日間培養し、第二のウイルス試料（試料ＩＩ）を採取した。次いで、この第二ウイルス試料を実施例ＩＩＩ記載のようにして処理した。液内に存在する感染ウイルスの力価は、プラク検定法により監視した。
実施例ＩＩＩ：この実施例では、ＲＳウイルスの処理を説明する。
感染１０および１４日後に収集したＲＳウイルス感染ＶＥＲＯ細胞からのウイルス液（試料ＩおよびＩＩ）は、別々に処理した。それぞれのウイルス試料を５μｍ孔径フィルターを用いて精密ろ過（行き止まりろ過）し、細胞砕片を除いた。清澄となったウイルス上清は、分子量１００ｋＤａカットオフ膜を用いてさらに接線流限外ろ過〔サルトリウス（Sartorius）〕によりさらに濃縮した。ＲＳウイルス固定物は−７０℃で保管した。
実施例ＩＶ：この実施例では超遠心分離によるＲＳウイルスの濃縮を説明する。
５０．２Ｔｉベックマン（Beckman）固定角度ローターを用いて４５，０００ｒｐｍにおいて、ＲＳウイルス固定物を２時間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、ペレット化したウイルスを燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．３中に再懸濁した。
実施例Ｖ：この実施例では、スクロース密度勾配遠心分離によるＲＳウイルスの精製を説明する。
再懸濁したペレット化ウイルスは、さらに線型１０〜６０％（ｗ／ｖ）スクロース勾配上でレートゾーン（rate zone）遠心分離（２時間、２４，０００  ｘ  ｒｐｍ、ベックマンＳＷ２８ローター）によりさらに精製した。３５〜４０％ゾーンから採取した散漫なウイルスバンドをＰＢＳを用いて最終濃度スクロース１０％となるまで希釈した。４５，０００ｒｐｍ、９０分間ベックマン５０．２Ｔｉローターを用いた超遠心分離により精製ウイルスをさらに濃縮した。上清を捨てた。ペレット化ウイルスをＰＢＳ中に再懸濁し、タンパク濃度約１ｍｇ／ｍＬとし、−７０℃で保管した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動および抗ＲＳＶ特異性抗体を用いる免疫ブロッティング法により精製ＲＳウイルスを分析すると、純度が少なくとも約６０％であることが分かり、これは実質的に細胞および血清成分を含まないと考えられる。
実施例ＶＩ：この実施例では、ゲルろ過およびクロマトグラフィーによるＲＳウイルスの精製および濃縮を説明する。
実施例ＩＩＩ記載のようにして調製したＲＳＶ−３−ＤＩＴからのウイルス固定物をゲルろ過およびカラムクロマトグラフィーにより下記のようにして精製および濃縮した。
塩化ナトリウム１０ｍＭおよびグリセリン２０％を含む燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３、１０ｍＭ中に平衡化したゲルろ過カラム（Sephacryte  Ｓ−５００）中に実施例ＩＶからのウイルス固定物を通し、主要な汚染物であるウシ血液アルブミン（ＢＳＡ）を除いた）。上記の緩衝液と平衡化したイオン交換カラム（ＤＥ−５２、Whatman）上で、このウイルスをさらに精製、濃縮した。平衡緩衝液、次いで塩化ナトリウム１００ｍＭおよびグリセリン２０％を含む燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３、１０ｍＭをカラムの５倍量用いて樹脂を洗浄した。このステップにおいて、ゲルろ過により精製しウイルス画分中にまだ存在しているＢＳＡを主とする非ウイルス成分を溶出させた。燐酸ナトリウム５０ｍＭおよび塩化ナトリウム１．５Ｍを含むカラムからウイルスを溶出させた。
実施例ＶＩＩ：この実施例では、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）によるＲＳウイルスの不活性化を説明する。
実施例ＶおよびＶＩ記載のようにして調製したＲＳウイルスをｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１％重量／体積）を用いて２時間室温で処理して不活性化した。次いで、ウイルス試料を燐酸塩緩衝塩水に対して透析し、タンパク混合液から界面活性剤を除いた。不活性化ウイルスの感染性は、ＴＣＩＤ50検定法を用いて試験し、感染性ウイルスは認められなかった。
実施例ＶＩＩＩ：この実施例では、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）により不活性化されたＲＳウイルス製剤の免疫原性を説明する。
６週齢のコトンラットに、実施例ＶＩに記載したようにして調製した燐酸アルミニウム吸着ＯＧ不活性化ＲＳウイルスまたは無関連抗原（プラシーボ）のいずれかを３０μｇ／ｋｇ筋肉内注射した。動物の一群は、１００μＬ中の生のＲＳウイルスの約１００コトンラット感染量（ＣＲＩＤ50）を鼻腔から接種した。２８日後に、すべての動物を放血し、生のウイルスを投与されたもの以外の動物に、第一回接種に使用したものと同じアジュバントを加えた同量の抗原を用いて追加接種した。追加投与の一週間後（３５日目）に血清試料を採取した。ＲＳウイルス特異性中和価を測定し、これは下記の第一表に示す。（表は、この説明の後に添付してある）。
この表から分かるように、第一回放血（２８日目）からのデータは、ＯＧ不活性化ＲＳウイルス製剤は、強い一次免疫反応を誘発している。アジュバントを加えたＯＧ不活性化したＲＳウイルスの同量を４週間後に追加投与した動物からの血清は、３５日目において生のウイルスを接種した動物の血清から得られたと同程度の中和抗体力価を有していた。ここに記載したデータは、ＯＧ不活性化ＲＳウイルスが高度に免疫原性であることを示している。
実施例ＩＸ：この実施例では、肺疾患を増強することなく、免疫化コトンラット中に防御反応を誘発するＯＧ不活性化ＲＳウイル製剤の能力を説明する。
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド不活性化ＲＳウイルス製剤の防御能力を評価するために、生のＲＳウイルス接種または不活性化ＲＳウイルス投与または無関連抗原（プラシーボ）を３０μｇ二回注射されたコトンラットに、Ｈｅｐ２細胞中で増殖したＲＳウイルスのＡ２株の約１００コトンラット感染投与量（ＣＲＩＤ50）を鼻腔から抗原投与（追加投与の７日後）した。ウイルス抗原投与から４日後に、動物の半分を屠殺した。これらの肺を取り出し、洗浄し、得られた液体の肺ウイルス力価および白血球数を評価した（肺炎症の指標として）。ウイルス抗原投与から７日後に、残りの動物を屠殺し、肺を取り出し、ウイルス量を検定した。肺気管支洗浄細胞の存在も測定した。パラフィン切片のヘマトキシリン・エオシン染色を用いて肺切片に関して組織病理学検査を行った。
抗原投与４日後における肺ＲＳウイルス力価が表２に要約してある。プラシーボ対照動物には、肺組織のグラム当たりにウイルスの６．６ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50単位の反復により担持されている無関連タンパク製剤を投与した。ＯＧ不活性化ＲＳウイルス製剤を用いて免疫化した動物の肺の中には、ウイルスは検出されなかった。これらの結果は、ＯＧ不活性化ＲＳウイルスの防御性能を示している。７日目におけるＲＳウイルス肺力価（データは示していない）は、試験したすべての肺において最低であった。ＲＳウイルスは通常抗原投与７日後には肺からなくなるので、これは予想されなかったものではない。
ＯＧ不活性化ＲＳウイルス製剤を用いて免疫化した動物の肺洗浄細胞カウント（表３）は、無関連タンパク製剤（プラシーボ）を接種した動物の肺からの細胞カウントより有意に低かった。さらに、ＯＧ不活性化ＲＳウイルスを接種した動物からの７日後における細胞カウントは、プラシーボ対照カウントと有意には異ならなかった。７日目の肺細胞カウントは、プラシーボ対照カウントより有意には大きくなかったので、ＯＧ不活性化ＲＳウイルス製剤は、生のウイルス抗原投与の後の免疫化した動物中に増強された肺炎症を起こさないと結論できる。
ヘマトキシリン・エオシン染色切片は、無関連タンパク製剤（プラシーボ）を与えた動物の肺が、感染および炎症の最高の徴候を示し、一方、生のウイルスまたはＯＧ不活性化ＲＳウイルス製剤のいずれかにより免疫化したコトンラットの肺は、感染も炎症も最小の徴候しかなかったことを示した。この結果を表８に示す。
これらの結果に基づいて、ＯＧ不活性化ＲＳウイルス製剤は、増強された肺疾患を起こすことなく、防御的免疫反応を誘発できると結論できる。
実施例Ｘ：この実施例では、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いたＲＳウイルスの不活性化を説明する。
孔径０．２２μｍのフィルターを通すろ過により、不活性化剤のβ−プロピオラクトン（蒸留水中０．１％ｗ／ｖ）を滅菌した。実施例Ｖと同様にして調製した精製ＲＳウイルスを比率１：１（ｖ／ｖ）で不活性化剤と混合させ、２時間３７℃で振とうを続けながら培養した。さらに、温度４℃で分子量１２０００カットオフ膜を用いてＰＢＳに対してこのウイルス試料を一晩透析して残留ＢＰＬを除去した。処理したウイルス試料の感染性は、プラーク検定法で評価し、感染性のウイルスは検出されなかった。透析した試料は、−７０℃で保管した。
実施例ＸＩ：この実施例では、β−プロピオラクトン不活性化ＲＳウイルスの免疫原性および防御能力、およびこれが増強された肺疾患を起こさないことを説明する。
６週齢のコトンラットに、燐酸アルミニウムに吸着させたＰＢＬ不活性化ＲＳウイルス１０μｇ／ｋｇを筋肉内注射した。プラシーボ対照動物は、ＰＢＳと燐酸アルミニウムを用いて免疫化した。また一群の動物には、ＲＳウイルスの１００ＣＲＩＤ50鼻腔から滴下した。２８日目に動物を放血し、生のウイルスを用いて免疫化したコトンラットを除き、同量の抗原製剤を用いて追加投与した。８４日目に血清試料を採取し、ＲＳウイルス特異性中和価を測定した。生のウイルスの抗原投与から動物を防御する不活性化ＲＳウイルス製剤の能力を評価するために、コトンラットの肺から採取したＲＳウイルストレーシー単離体の約１００ＣＲＩＤ50を用いてコトンラットに鼻腔から抗原投与した。ウイルス抗原投与の４日後に動物を屠殺し、その肺を取り出し、洗浄し、得られた液体を肺ＲＳウイルス力価に関して試験した。
ＢＰＬ不活性化ＲＳウイルスを用いて免疫化した動物の血清中のＲＳウイルス特異性中和価を表４に要約してある。第一回放血（２８日目）における結果は、ＢＰＬ不活性化ＲＳウイルス製剤が良好な一次免疫反応を誘発することを示した。さらに、不活性化ＲＳウイルスの同量を４週間目に追加投与した動物からの血清は、生のウイルスを接種した動物から得られたものと同程度の中和抗体力価を有する。
ＢＰＬ不活性化ウイルス製剤は、表５の肺ＲＳウイルス力価により示すように、ＲＳウイルスの抗原投与からのコトンラットの防御にも有効であった。従って、ＢＰＬ不活性化ウイルス製剤の二回の投与により免疫化された動物は、生のウイルス抗原投与に対して防御されていた。肺ウイルス力価の低下は、生のＲＳウイルスウイルス（０．６ｌｏｇ10／ｇ肺）を用いて免疫化されたコトンラットの場合と同程度であった。
β−プロピオラクトン不活性化ＲＳＶ製剤による増強肺疾患は、上記の実施例ＸＩで測定されている。
これらの研究から得られた結果は、ＢＰＬ不活性化ウイルスが高度に免疫原性で防御性であることを示している。
実施例ＸＩＩ：この実施例では、アスコルビン酸を用いたＲＳウイルスの不活性化を説明する。
孔径０．２２μｍフィルターを用いてアスコルビン酸（１０ｍｇ／ｍＬ）および硫酸銅（０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を滅菌した。上記の実施例ＶＩ記載のようにして精製したウイルスをこの溶液と混合させて、最終濃度がアスコルビン酸１ｍｇ／ｍＬおよび硫酸銅５０μｇ／ｍＬとし（ウイルス４部および各溶液０．５部）、混合物を３７℃で２４時間振とうしながら培養した。
処理したウイルス試料の感染性は、プラーク検定法により評価し、感染したウイルスは検出されなかった。透析した試料を−７０℃で保管した。
実施例ＸＩＩＩ：この実施例では、アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルスの免疫原性および防御能力およびこれが増強肺疾患を起こさないことを説明する。
コトンラット（５〜８週齢）に、燐酸アルミニウムを加えたアスコルビン酸不活性化ＲＳＶ（ＡＡＩ−ＲＳＶ）１０μｇ／ｋｇまたはプラシーボ対照（ミョウバンとＰＢＳ）を筋肉内注射した。別の一群の動物に、生のＲＳウイルスの約１００コトンラット感染量（ＣＲＩＤ50（１００μＬ中）を鼻腔から接種した。２８日目にすべての動物を放血し、生のウイルスを与えられたものを除き、すべての動物に一次接種と同様に同じ量のアジュバント添加抗原を用いて追加投与した。追加抗原投与の後１週間目（３５日目）に血清試料を採取した。ＲＳウイルスウイルス特異性中和価を測定し、これを下記の表６に示した。
表に示した第一回放血（２８日目）の結果から、アスコルビン酸不活性化ＲＳＶ製剤は、強い一次免疫反応を誘発することが分かる。さらに、第二回免疫化の後に得た結果は、これらの動物の血清が、生のウイルスを接種した動物の血清中から得られたものと同程度の中和抗体力価を有することを示している。
実施例ＸＩＶ：この実施例では、アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルス製剤が免疫化コトンラット内に防御反応を誘発する能力を説明する。
コトンラットに生のＲＳウイルスの接種またはＡＡＩ−ＲＳＶまたはプラシーボ対照（ＰＢＳ＋ミョウバン）の１０μｇ２回の注射のいずれかを施した。追加投与の後７日目に、動物にＨｅｐ２細胞中で増殖したＲＳウイルスのＡ２株の約１００ＣＲＩＤ50を鼻腔から抗原投与した。ウイルス抗原投与から４日後に、動物の半分を屠殺した。これらの肺を取り出し、洗浄し、得られた両方の液体の肺ウイルス力価を測定した。上記のようにして組織病理学的試験も実施した。プラシーボ対照動物の肺組織中の肺ウイルス力価は、肺組織のグラムの単位当たりに４．０ｌｏｇ60ＴＣＩＤ50単位であった（表７）。アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルス製剤を用いて免疫化した動物の肺に、ウイルスは検出されなかった。これらの結果は、アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルス（ＡＡＩ−ＲＳＶ）ワクチン製剤が、増強肺疾患を起こさずにＲＳウイルス抗原投与に対して防御する防御性能を示している。
アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルス（ＡＡＩ−ＲＳＶ）を用いて免疫化した動物の血清中のＲＳウイルス特異性中和価は表６に要約してある。第一回放血（２８日目）における結果は、アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルス製剤は良好な一次免疫反応を誘発するこを示している。さらに、不活性化ワクチンを４週間後に追加投与された動物からの血清は、生のウイルスを接種された動物中から得られたものと同程度の中和抗体力価を有していた。
また、アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルス製剤は、表７に示す肺ＲＳウイルス力価から分かるようにＲＳウイルスの抗原投与からコトンラット防御にも有効であった。従って、アスコルビン酸不活性化ＲＳウイルス製剤の２回投与により免疫化された動物は、生のＲＳウイルスの抗原投与に対して防御されている。肺ウイルス力価の低下は、生のＲＳウイルスを用いて免疫化されたコトンラット中のものと同程度であり、ウイルスは発見されなかった。
このデータに基づいて、ＡＡＩ−ＲＳＶ製剤は、免疫化動物の血清中にウイルス特異性中和抗体を誘発し、生のウイルスの抗原投与からコトンラットを防御できることが示唆される。
開示の要約
本開示を要約すると、本発明は、これを用いて免疫化されたホスト中のＲＳウイルスウイルス特異性反応を起こすことができる精製不活性化ＲＳウイルスを含む新規の免疫原性組成物およびその調製および使用の方法を提供する。本発明の範囲を変更しないで変更も可能である。
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