(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、  １）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、  ２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項２】
リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、  １）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、  ２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させ、  ３）再結晶化された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−２０重量％のｐＨ４−９の水溶液とし、  ４）次に、カラムの床容積の少なくとも１−１００％の液量になるようにして逆相カラムクロマトグラフィーで処理し、その後に水に可溶な有機溶媒又は含水有機溶媒を溶離剤として用いて、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液を得ること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項３】
リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、  １）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、  ２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させ、  ３）再結晶化された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−２０重量％のｐＨ４−９の水溶液とし、  ４）次に、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して約１−１００重量％の活性炭を水溶液に添加し、水溶液中の不純物を活性炭へ吸着後、活性炭を含有する媒質をろ過することにより、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を得ること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項４】
リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、  １）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、  ２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させ、  ３）再結晶化された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−２０重量％のｐＨ４−９の水溶液とし、  ４）次に、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して約１−１００重量％の活性炭を水溶液に添加し、水溶液中の不純物を活性炭へ吸着後、活性炭を含有する媒質をろ過して、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を得て、  ５）次に、水溶液に、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して１０−２００重量％の高分子量吸着樹脂を添加し、水溶液中の不純物を高分子量吸着樹脂へ吸着後、高分子量吸着樹脂を含有する媒質をろ過することにより、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液を得ること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項５】
請求項２の１）〜４）の工程により得られた精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液を、１０−６０℃の温度で５’−ＦＭＮの濃度が５−２０％になるまで濃縮し濃縮液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加して、５’−ＦＭＮを結晶化することを特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項６】
請求項３の１）〜４）の工程、又は、請求項４の１）〜５）の工程により得られた精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液において、１）溶液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加、又は、２）溶液を、１０−６０℃の温度で５’−ＦＭＮの濃度が５−２０％になるまで濃縮し濃縮液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加して、５’−ＦＭＮを結晶化することを特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項７】
逆相カラムクロマトグラフィーに用いるカラム充填剤が、ＯＤＳ（Ｃ１８，オクタデシルシラン）及び／又はＣ８（オクチルシラン）である請求項２又は５記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項８】
逆相カラムクロマトグラフィーの溶離剤として用いる有機溶媒又は含水有機溶媒中の有機溶媒が、低級脂肪族アルコール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン又はそれらの２種類以上の混合物である請求項２、５、７のいずれか１項記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項９】
溶離剤として用いる含水有機溶媒中の有機溶媒含量が、０．１〜５０体積％である請求項２、５，７，８のいずれか１項記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項１０】
活性炭が、水蒸気賦活法で製造されたピート、亜炭、石炭及び／又は化学賦活法で製造された木材である粉末炭又は粒状炭である請求項３，４、６のいずれか１項記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項１１】
高分子量吸着樹脂が、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、メタクリル酸重合体である請求項４又は６記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項１２】
粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させる際に、３０−８０℃に加温することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項１３】
粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩が、下記に示すリボフラビン（１）とオキシ塩化リンとの反応、又は、リボフラビン（１）とオキシ塩化リンを反応後水酸化ナトリウムとのナトリウム塩化反応において製造されるものであって、リボフラビン（１）とオキシ塩化リンを反応させて粗製５’−ＦＭＮ（３）を製造する反応において、反応中間体であるリボフラビン・サイクリック−４’，５’−ホスホリデート（２）またはその塩を系外に取り出し、酸性条件下にて加水分解・異性化することにより製造されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
0004130177.tif 000032
【請求項１４】
酸性条件が、１−３５．５（ｗ／ｖ）％濃度の酸を出発原料であるリボフラビン（１）に対し１−１０倍容量用いて調製される条件である請求項１３記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項１５】
リボフラビン５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）の薬理学的に許容される塩が、リボフラビン−５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）である請求項１〜１４のいずれか１項記載の高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬、食品添加物、飼料、工業中間体などとして有用な高純度リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩、特にリボフラビン５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）の工業的に優れた新規製造方法に関する。
従来技術
リボフラビン、リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩は、生体内の異なる酵素反応における補酵素として重要な役割を持ち、特にナトリウム塩（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）の形で医薬品、食品、および飼料添加物として使用されることが多い。また、特開平５−２０１８６４号公報には、リボフラビン、リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）やその薬理学的に許容される塩（リボフラビン５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）等）に代表されるリボフラビン誘導体による免疫賦活・感染防御治療剤が開示されている。さらに、特表平６−５０６２１２号公報には、マラリア疾患の予防と治療にリボフラビンが有効であることが開示されている。
従来、リボフラビンを用いてリボフラビン５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩、特に汎用されるリボフラビン−５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）を製造する方法においては、高純度品を得ることが極めて難しく、不純物として、生体内では非活性型の異性体であるリボフラビン４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェート、リボフラビンポリホスフェート、未反応リボフラビンを多く含有しがちであった。
リボフラビン５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の製造法としては、通常、リボフラビンのホスホリル化法が用いられており、例えば、特開平４８−５４０９９号公報には、極性溶媒、三級アミン、オキシ塩化リン及び水の混合物にリボフラビンを添加して反応させ、さらに水を添加して過剰のオキシ塩化リンを分解し、そこで生成する塩酸により加水分解し、ｐＨ調製後に濃縮する方法、特開平１１−４９７９０号公報には、リボフラビンとオキシ塩化リンを反応させ、反応中間体であるリボフラビン・サイクリック４’−，５’−ホスホリデートまたはその塩を系外に取り出し、特に酸性条件下にて加水分解・異性化することにより製造する方法が開示されている。特に後者の製造法では５’−ＦＭＮ−Ｎａ８７〜９０％の高含量が得られている。しかしながら、医薬品の純度としては、必ずしも十分なレベルとは言えない。したがって、さらに、精製工程を加えることが必要とされる。
ホスホリル化等により得られたリボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩、特に汎用されるリボフラビン−５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）の精製法としては、例えば、特許第２８５６７６０号公報に、粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の濃度１〜５重量％、ｐＨ４〜８の水溶液を調製して、高分子量吸着樹脂で処理し、得られた溶液から単離し、さらにＲＰ（逆相）シリカゲル処理して水又は低級脂肪族アルコール含量０〜８０％の水性混合物で溶離し、濃縮、結晶化させる方法が開示されている。しかしながら、この精製法で得られる５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩、特に汎用されるリボフラビン５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）の純度は未だ十分ではなく、不純物であるリボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェートを十分には除去することができない。
したがって、リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩、特に汎用されるリボフラビン−５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）の高純度製造法が、非常に待ち望まれている。
特に、ホスホリル化法等により得られたリボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩を主成分とする混合物から、リボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェート、リボフラビンポリホスフェート、リボフラビン、ルミフラビン、ルミクロム等の不純物を簡便な手段で除去できる製造法及び／又は精製法が求められている。
発明の開示
以上のような状況を鑑み、本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す構成により所期の目的を達成できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、１）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法である。１）の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させる際の溶液温度は、特に限定されないが必要に応じて加温してもよく、通常、１０−１００℃であり、望ましくは１０−９０℃であり、特に望ましくは３０−８０℃である。２）の水に可溶な有機溶媒の先に得られた水溶液に対する添加量は、通常、１−１００重量％であり、好ましくは１−５０重量％であり、さらに好ましくは２０−４０重量％である。また、その温度は、通常０−６０℃であり、好ましくは５−５５℃であり、さらに好ましくは４０−５０℃である。
また、本発明は、リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、１）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させ、３）再結晶化された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−２０重量％のｐＨ４−９の水溶液とし、４）次に、カラムの床容積の少なくとも１−１００％の液量になるようにして逆相カラムクロマトグラフィーで処理し、その後に水に可溶な有機溶媒又は含水有機溶媒を溶離剤として用いて精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶離液を得ること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法である。
この１）〜４）の工程により得られた精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶離液から、例えば、濃縮、蒸発乾固、結晶化の方法により、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を得ることができるが、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を１０−６０℃の温度で５’−ＦＭＮの濃度が５−２０％になるまで濃縮し、濃縮液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加して５’−ＦＭＮを結晶化することが望ましい。濃縮方法は、例えば、減圧濃縮、逆浸透膜濃縮等が挙げられるが、特に限定されない。
１）及び２）の工程に関しては先に記載した通りである。４）の逆相カラムクロマトグラフィー処理に用いるカラム充填剤は、特に限定されないが、通常、ＯＤＳ（Ｃ１８，オクタデシルシラン）、Ｃ８（オクチルシラン）又はＣ４（ブチルシラン）であり、望ましくは、ＯＤＳ（Ｃ１８，オクタデシルシラン）又はＣ８（オクチルシラン）であり、特に望ましくはＯＤＳ（Ｃ１８，オクタデシルシラン）である。また、逆相カラムクロマトグラフィー処理された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶離剤は、水に可溶な有機溶媒又は含水有機溶媒であれば特に限定されないが、通常、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の低級脂肪族アルコール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、又はその含水溶液、又はそれらの２種類以上の混合物、又はその含水溶液であり、特に望ましくは、アセトニトリル又はアセトニトリル水溶液である。逆相カラムクロマトグラフィー処理の溶離剤として用いる含水有機溶媒（有機溶媒水溶液）中の有機溶媒含量は、特に限定されないが、望ましくは、０．１〜５０体積％であり、より望ましくは、１〜３０体積％であり、特に望ましくは３〜２０体積％である。
さらに、本発明は、リボフラビン５−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、１）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させ、３）再結晶化された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−２０重量％のｐＨ４−９の水溶液とし、４）次に、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して約１−１００重量％の活性炭を水溶液に添加し、水溶液中の不純物を活性炭へ吸着後、活性炭を含有する媒質をろ過することにより、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液（ろ液）を得ること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法である。この１）〜４）の工程により得られた精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液から、例えば、濃縮、蒸発乾固、結晶化の方法により、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を得ることができる。即ち、１）〜４）の工程により得られた精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液において、通常、（１）溶液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加、又は、（２）溶液を、１０−６０℃の温度で５’−ＦＭＮの濃度が５−２０％になるまで濃縮し濃縮液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加して、５’−ＦＭＮを結晶化することができるが、特に、（２）溶液を、１０−６０℃の温度で５’−ＦＭＮの濃度が５−２０％になるまで濃縮し濃縮液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加して、５’−ＦＭＮを結晶化することが望ましい。濃縮方法は、例えば、減圧濃縮、逆浸透膜濃縮等が挙げられるが、特に限定されない。
１）〜３）の工程に関しては先に記載した通りである。
４）の活性炭処理においては、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液中に溶解状態で存在する不純物が吸着される。水溶液への活性炭の添加量は、通常、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して約１−１００重量％であり、好ましくは５〜５０重量％であり、より好ましくは１５〜３０重量％である。本発明に係る活性炭は、通常、水蒸気賦活法で製造される活性炭の場合、原料がピート、亜炭、石炭等であり、化学賦活法で製造される活性炭の場合、原料が木材等であるが、これらに限定される訳ではない。また、活性炭の内表面積は、特に限定されないが、好ましくは、５００−１５００ｍ２／ｇである。活性炭の形状は、特に限定されないが、好ましくは粉末状又は粒状であり、さらに好ましくは粉末状である。活性炭末の粒径は、特に限定されず、好ましくは０．１〜１５０μｍであり、特に０．１〜１５０μｍの粉末状活性炭が好ましい。市販の活性炭としては、例えば、化学賦活法で製造される活性炭として、二村化学工業製の太閤Ｙ（登録商標）、Ｎｏｒｉｔ製のＣＡＳＰ（登録商標）等が、水蒸気賦活法で製造される活性炭としては、武田薬品工業製の白鷺Ｐ（登録商標）等が挙げられるが、もちろん、これらに限定される訳ではない。
また、本発明は、リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩の精製法において、１）粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−１５重量％のｐＨ４−８の粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を調製し、  ２）得られた水溶液を機械的に攪拌しつつ、０−６０℃の温度にて水に可溶な有機溶媒を、先に得られた水溶液に対して１−１００重量％添加して５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を再結晶化させ、  ３）再結晶化された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を、水又は緩衝液に溶解させて濃度１−２０重量％のｐＨ４−９の水溶液とし、  ４）次に、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して約１−１００重量％の活性炭を水溶液に添加し、水溶液中の不純物を活性炭へ吸着後、活性炭を含有する媒質をろ過して、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液を得て、  ５）次に、水溶液に、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して１０−２００重量％の高分子量吸着樹脂を添加し、水溶液中の不純物を高分子量吸着樹脂へ吸着後、高分子量吸着樹脂を含有する媒質をろ過することにより、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液を得ること、を特徴とする高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法である。
この１）〜５）の工程により得られた精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液から、例えば、濃縮、蒸発乾固、結晶化の方法により、精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を得ることができる。即ち、１）〜４）の工程により得られた精製された５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶液において、通常、（１）溶液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加、又は、（２）溶液を、１０−６０℃の温度で５’−ＦＭＮの濃度が５−２０％になるまで濃縮し濃縮液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加して、５’−ＦＭＮを結晶化することができるが、特に、（２）溶液を、１０−６０℃の温度で５’−ＦＭＮの濃度が５−２０％になるまで濃縮し濃縮液に水に可溶な有機溶媒を０−６０℃で１−１５０重量％添加して、５’−ＦＭＮを結晶化することが望ましい。濃縮方法は、例えば、減圧濃縮、逆浸透膜濃縮等が挙げられるが、特に限定されない。
１）〜４）の工程に関しては先に記載した通りである。
５）の高分子量吸着樹脂処理においては、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の水溶液中に溶解状態で存在する不純物が吸着される。水溶液への高分子量吸着樹脂の添加量は、通常、５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩に対して１０−２００重量％であり、好ましくは５０〜１５０重量％であり、より好ましくは８０〜１１０重量％である。本発明に係る高分子量吸着樹脂は、特に限定されないが、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、メタクリル酸重合体等である。高分子量吸着樹脂の粒径は、特に限定されず、好ましくは３〜１０００μｍであり、より好ましくは５０〜２５０μｍである。市販の高分子量吸着としては、例えば、三菱化学製のＤＩＡＩＯＮ  ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）特にＳＰ２０７、ＳＰ７００、ＳＰ８５０、ＨＰ２０、ＨＰ２ＭＧ等が挙げられる。
本発明において、リボフラビン−５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）の薬理学的に許容される塩とは、特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等無機塩、種々の有機塩が挙げμられるが、望ましくは、リボフラビン−５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）である。
本発明において、１）で使用する粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法は限定されないが、特に、下記に示すリボフラビン（１）とオキシ塩化リンとの反応、又は、リボフラビン（１）とオキシ塩化リンを反応後水酸化ナトリウムとのナトリウム塩化反応において製造されるものであって、リボフラビン（１）とオキシ塩化リンを反応させて粗製５’−ＦＭＮ（３）を製造する反応において、反応中間体であるリボフラビン・サイクリック−４’、５’−ホスホリデート（２）またはその塩を系外に取り出し、酸性条件下にて加水分解・異性化することにより製造される５’−ＦＭＮ（３）又はその薬理学的に許容される塩、特に５’−ＦＭＮ−Ｎａ（４）が望ましい。
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この粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩は、ピリジン及びオキシ塩化リンの存在下で反応中間体リボフラビン・サイクリック４’−，５’−ホスホリデート（２）を黄色結晶として単離し、洗浄後乾燥して酸性条件で加水分解・異性化を行なうことにより製造される。加水分解・異性化の条件は、特に限定されないが、１−３５．５（ｗ／ｖ）％濃度の酸、望ましくは５−１８％濃度の酸を出発原料であるリボフラビン（１）に対し１−１０倍容量、望ましくは１−８倍容量、特に望ましくは２−４容量用いて、１０〜１００℃、望ましくは３０〜８０℃、特に望ましくは３０〜６０℃で攪拌反応により調製することが望ましい。酸の種類は、特に限定されないが、例えば塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸が挙げられ、望ましくは塩酸である。異性化の進行はＨＰＬＣにてチェックを行い５’−ＦＭＮの純度が９０％を超えた時点を仮の終点とし、これを確認後、得られた懸濁反応液中に酸又はアルカリを添加し溶解後に、先に溶解した液性とは逆のアルカリ又は酸でｐＨを４−８、望ましくはｐＨ５．５に調整する。この溶液を冷却後濾取し、アルコールで洗浄後乾燥して、５’−ＦＭＮの薬理学的に許容される塩、例えば５’−ＦＭＮ−Ｎａが得られるのである。
本発明においては、各種水溶液、反応液、反応工程、及びカラムクロマトグラフィーの溶離剤などに水を使用する。本発明において使用する水は特に限定されないが、望ましくは、蒸留水、イオン交換水及び／又は精製水である。
本発明における高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法の最大の特徴は、粗製５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の再結晶化による精製を行なうことである。
望ましくは、本発明における高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法の最大の特徴は、その少なくとも２段階の精製工程にある。即ち、リボフラビンのホスホリル化工程により得られた粗製５’−ＦＭＮ又はその薬埋学的に許容される塩の再結晶化による精製を行なった後に、ＯＤＳカラム等の逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製または活性炭処理による精製を行うのである。
本発明における高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩、特に５’―ＦＭＮ−Ｎａの製造法においては、再結晶化工程で、粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ中の不純物のリボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェート等を除去し、次の逆相クロマトグラフィーによるカラム処理工程または活性炭処理工程により、粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ中の未反応のリボフラビン、ルミフラビン、ルミクロムを除去する。したがって、本発明に係る高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法を使用することにより５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩中のほとんどの不純物を除去することが可能となるのである。
尚、従来、高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の製造法として、例えば、特許第２８５６７６０号公報には、吸着クロマトグラフィーによるカラム処理と逆相クロマトグラフィーによるカラム処理の２段階の精製工程が知られているが、両工程において主に未反応リボフラビン、ルミフラビン、ルミクロムを除去するのみであり、リボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェートは十分には除去できなかったのである。
本発明における高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩、特に５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法においては、再結晶化工程で、粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ中の不純物のリボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェート等を除去し、次に活性炭処理工程により、粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ中の未反応のリボフラビン、ルミフラビン、ルミクロムを除去して高純度を確保した後、純度０．１％以下の微量不純物を更に除去する必要がある場合は、活性炭処理工程後に高分子量吸着樹脂で処理しても良い。
本発明においては、例えば、次の方法により、高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を製造することができる。
（１）粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造
コルベン中にアセトニトリル５００ｍｌ、ピリジン２５０ｇ、オキシ塩化リン５０７ｇを入れ１０℃にて攪拌する。次に、水３３ｍｌをアセトニトリル２００ｍｌに溶解した液を１時間かけて滴下してリン酸化試薬を調製し、リボフラビン１８０ｇ（０．４７８ｍｏｌ）を徐々に添加し１０℃にて１２時間攪拌する。析出した黄色の中間体リボフラビン・サイクリック−４’，５’−ホスホリデートの結晶を濾過し、アセトニトリル５００ｍｌにて洗浄後、風乾し、これを６％塩酸６００ｍｌ（１０℃）中に添加し、４０℃にて２７時間攪拌する。反応液を１０℃に冷却し、２５％水酸化ナトリウム水溶液５４０ｍｌを添加し生成物を完全に溶解後に、８℃に冷却しつつ濃塩酸４５ｍｌを滴下してｐＨを５．５に調製し、５’−ＦＭＮ−Ｎａの黄色結晶を析出させた。析出した結晶を濾過し、メタノール４００ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ１９５ｇを得る。
（２）粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの再結晶化精製
（１）で得た粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５０ｇを１０００ｍｌコルベンに入れ、水４００ｍｌに懸濁下攪拌し、５０℃で加温攪拌することにより完全に溶解させる。この溶液にエタノール１００ｍｌを滴下し攪拌しつつ８℃に冷却し、５’−ＦＭＮ−Ｎａの黄色結晶を再結晶化により析出・濾過後、エタノール１５０ｍｌで洗浄し減圧乾燥して３８．３５ｇの精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを得る。
（３）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理による５’−ＦＭＮ−Ｎａのカラム精製
（２）で得た精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ２０ｇを水４００ｍｌに溶解して、濃度５重量％のｐＨ５．５の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液を調製する。この５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液をＯＤＳカラムにチャージした後、溶離剤として１０％アセトニトリルを用いて展開し、溶離液を捕集する。
（４）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離
（３）で得た５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する１０％アセトニトリル溶離液を、５０℃の水浴上にて約１５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、濃縮液を攪拌しつつエタノール３０ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出、濾過しエタノール３０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを１６．９ｇ得る。この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは、９８％以上の５’−ＦＭＮ−Ｎａ含量を有し、不純物のリボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）含有量は約１％であり、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェート、リボフラビンは検出されない。
また、本発明においては、例えば、次の方法によっても、高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を製造することができる。
（１）粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造、及び（２）粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの再結晶化精製の工程は、上記のとおりである。
（３）活性炭処理による５’−ＦＭＮ−Ｎａの精製
精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水３０ｍｌに溶解して、１Ｎ−ＮａＯＨ水５．６ｍｌを加え、濃度１２重量％のｐＨ７．９の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液を調製する。この５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液に活性炭（二村化学製の太閤Ｙ）０．７５ｇ（５’−ＦＭＮ−Ｎａに対して１５重量％）を添加し、３０℃で１時間懸濁後、活性炭をろ別する。ろ別した活性炭を水２５ｍｌで洗浄し、その洗浄水は先に得られたろ液と合わせる。
（４）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離
（３）で得た５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液に、１Ｎ−ＨＣｌ水４．３ｍｌを加え、ｐＨ６．０にして、攪拌しつつエタノール６０ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出、濾過しエタノール１０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを３．６６ｇ得る。この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは、９７％以上の５’−ＦＭＮ−Ｎａ含量を有し、不純物のリボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）含有量は約２％であり、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）は約０．２％、リボフラビン−ジホスフェート０．１％以下、リボフラビンは約０．２％である。
さらに、本発明においては、例えば、次の方法によっても、高純度５’−ＦＭＮ又はその薬理学的に許容される塩を製造することができる。
（１）粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造、及び（２）粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの再結晶化精製の工程は、上記のとおりである。
（３）活性炭処理による５’−ＦＭＮ−Ｎａの精製
精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水５０ｍｌに溶解して、濃度９重量％のｐＨ６の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液を調製する。この５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液に活性炭（Ｎｏｒｉｔ製ＣＡＳＰ）０．６ｇ（５’−ＦＭＮ−Ｎａに対して１２重量％）を添加し、５０℃で１時間懸濁後、活性炭をろ別する。ろ別した活性炭を水１０ｍｌで洗浄し、その洗浄水は先に得られたろ液と合わせる。
（４）高分子量吸着樹脂による５’−ＦＭＮ−Ｎａの精製
（３）で得た５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液に、高分子量吸着樹脂（三菱化学製のＳＰ７００）５ｇを加え、３０℃で１時間懸濁後、高分子量吸着樹脂をろ別する。ろ別した高分子量吸着樹脂を水１５ｍｌで洗浄し、その水は先に得られたろ液と合わせる。
（５）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離
得られたろ液に攪拌しつつエタノール７５ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出、濾過しエタノール１０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを３．２３ｇ得る。この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは、９７％以上の５’−ＦＭＮ−Ｎａ含量を有し、不純物のリボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）含有量は約２％であり、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）は約０．３％、リボフラビン−ジホスフェート０．１％以下、リボフラビンは約０．１％である。
本発明によるとリボフラビン５’−リン酸（５’−ＦＭＮ）又はその薬理学的に許容される塩、特に汎用されるリボフラビン−５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）の高純度製造法の提供が可能である。即ち、粗製リボフラビン５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）から、リボフラビン−４’−リン酸ナトリウム（４’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−３’−リン酸ナトリウム（３’−ＦＭＮ−Ｎａ）、リボフラビン−ジホスフェート、リボフラビンポリホスフェート、リボフラビン、ルミフラビン、ルミクロム等の不純物を簡便な手段でほとんど除去することが可能である。その効果例を以下に示す。
実験例
（１）本発明における精製法（再結晶化精製及び逆相カラムクロマトグラフィーによるカラム精製）の５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度に及ぼす効果
下記に示す組成の粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａを用いて、（１）再結晶化精製を行い、次に、（２）逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製を行ない、さらに引き続いて（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離を行なった。
使用した粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの粗成
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即ち、最初に、上記の粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５０ｇを水４００ｍｌに懸濁下攪拌しつつ、５０℃で加温攪拌して完全に溶解させ、この溶液にエタノール１００ｍｌを徐々に滴下し８℃で冷却攪拌して５’−ＦＭＮ−Ｎａの黄色結晶が析出させた。析出した結晶を濾過後、エタノール１５０ｍｌで洗浄し減圧乾燥して５’−ＦＭＮ−Ｎａ３８．５ｇを得た（（１）再結晶化精製）。この再結晶化精製した５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度を下記に示す条件でＨＰＬＣによる評価を行なった。その結果を表１に示した。
ＨＰＬＣ分析条件
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２５４ｎｍ）
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−５Ｃ１８、４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相：２％リン酸二水素カリウム水溶液：メタノール：アセトニトリル＝４          ０：９：１
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：５ｕｌ
次に、上記で得た再結晶化された精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水１００ｍｌに溶解し濃度５重量％のｐＨ５．５に調整した水溶液（原液）を、ポンプによりＹＭＣ社製のＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ＡＱ−Ｃ１８、内径２０ｍｍ×長さ５０ｍｍ）にチヤージした後に、溶離剤として５％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）で展開し、溶離液はｕｖ２５４ｎｍで検出しフラクションごとに４画分に分割し、画分中の５’−ＦＭＮ−Ｎａ（（２）逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製）の純度をＨＰＬＣで評価した。この評価結果を表２に示した。
さらに、次に、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理をしたＮｏ．２〜４画分を合わせ、５０℃の水浴上にて約５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、これにエタノール１０ｍｌを滴下し８℃に冷却攪拌して、５’−ＦＭＮ−Ｎａの結晶を析出させ、濾過後エタノール１０ｍｌにて洗浄し減圧乾燥して精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ４．０ｇを得た（（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離）。この濃縮・結晶化精製した５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度をＨＰＬＣで評価し、その結果を表３に示した。
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また、比較対照実験として、特許第２８５６７６０号公報に準じた方法により５’−ＦＭＮ−Ｎａの精製を行なった。即ち、「再結晶化精製」の代わりに（１）’高分子量吸着樹脂を充填した吸着カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製を行ない、次に、（２）逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製を行ない、さらに引き続いて（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離を行なった。
即ち、最初に、先述した組成の粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水１００ｍｌに溶解し濃度５重量％のｐＨ５．５に調整した水溶液をポンプにより三菱化学製の吸着剤樹脂ＳＰ−８５０が充填された吸着カラム（内径２０ｍｍＸ長さ５００ｍｍ）にチヤージした後に、溶離剤として１０％メタノール水溶液（Ｖ／Ｖ）で展開した。溶離液はＵＶ吸収２５４ｎｍで検出し溶離液中の５’−ＦＭＮ−Ｎａ（（１）’高分子量吸着樹脂を充填した吸着カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製）の純度をＨＰＬＣで同様に評価し、その結果を表４に示した。
次に、上記の吸着カラム精製された精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水１００ｍｌに溶解し濃度５重量％のｐＨ５．５に調整した水溶液を、ポンプによりＹＭＣ社製のＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ＡＱ−Ｃ１８、内径２０ｍｍＸ長さ５００ｍｍ）にチャージした後に、溶離剤として１０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）で展開し、溶離液はＵＶ２５４ｎｍで検出しフラクションごとに４画分に分割し、画分中の５’−ＦＭＮ−Ｎａ（（２）逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製）の純度をＨＰＬＣで評価した。この評価結果を表５に示した。
さらに、次に、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理をしたＮｏ．２〜４画分を合わせ、５０℃で蒸発濃縮し、２０℃に冷却して５’−ＦＭＮ−Ｎａの結晶を析出させ、濾過後エタノール１０ｍｌにて洗浄し減圧乾燥して精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを得た（（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離）。この濃縮・単離した５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度をＨＰＬＣで評価し、その結果を表６に示した。
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本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法及び比較対照実験の対比の結果、本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法では、（１）再結晶化精製工程により、４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａ及びリボフラビン・ジホスフェートがかなり除去され、（２）逆相カラム精製（溶離剤：５％アセトニトリル水溶液）によりリボフラビン及びリボフラビン・ジホスフェートが除去され、（３）結晶化による精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離により、さらに４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａが除去され、最終の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度は９７％強の高純度であった。一方、比較対照実験（特許第２８５６７６０号公報に準じた精製方法）に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法では、（１）’高分子量吸着樹脂を充填した吸着カラム精製によりリボフラビンがかなり除去され、（２）逆相カラム精製（溶離剤：１０％メタノール水溶液）によりさらにリボフラビンが除去されたが、（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離では不純物量の変化は認められず、また、（１）〜（３）のいずれの精製工程においても、４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａ、リボフラビン・ジホスフェートはほとんど除去されず、最終の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度は９０％強と低かった。また、逆相カラム精製では、溶離剤の種類が、リボフラビンの除去効率に影響を及ぼし、本発明に係るアセトニトリルの５〜１０％水溶液ではリボフラビンを完全に除去できたが、１０％メタノール水溶液ではリボフラビンのわずかな残存が認められた。尚、光分解物のルミフラビン、ルミクロムは、本発明及び比較対照実験のいずれにおいても検出されずほぼ完全に除去されていた。
本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法（粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａを用いて、（１）再結晶化精製を行い、次に、（２）逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製を行ない、さらに引き続いて（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離を行なう）は、従来法と比較して、主要な不純物（４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａ、リボフラビン・ジホスフェート、リボフラビン）の除去効果が大きく、際立って優れた高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法であることは明らかである。
（２）逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製における溶離剤の種類の５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度に及ぼす効果
逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製において、溶離剤の種類の５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度に及ぼす効果を評価するために、実施例１３（カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−４０−１８、溶離剤：１０％アセトニトリル水溶液）の対照実験として、実施例１３の溶離剤のみを１０％エタノールに代えた実験を行い、溶離液はＵＶ２５４ｎｍで検出しフラクションごとに５画分に分割し、画分中の５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度をＨＰＬＣで評価した。この評価結果を表７に示した。
次に、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理をしたＮｏ．２〜５画分を合わせ、５０℃の水浴上にて約１５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、濃縮液を攪拌しつつエタノール３０ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出させた。この結晶を濾過しエタノール３０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａ１６．４ｇ（回収率８２．０％）を得て、この濃縮・精製した５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度をＨＰＬＣで評価し、その結果を表８に示した。また、旋光度は＋４１．８℃であった。
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尚、また、旋光度は＋４１．８℃であった。
同様に、実施例１６（カラム：ＹＭＣ−ＡＱ−Ｃ１８、溶離剤：５％アセトニトリル水溶液）の対照実験として、実施例１６の溶離剤のみを１０％エタノールに代えた実験を行い、溶離液はＵＶ２５４ｎｍで検出しフラクションごとに６画分に分割し、画分中の５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度をＨＰＬＣで評価した。この評価結果を表９に示した。
次に、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理をしたＮｏ．２〜６画分を合わせ、５０℃の水浴上にて約５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、濃縮液を攪拌しつつエタノール１０ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出させた。この結晶を濾過しエタノール１０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａ４．１ｇ（回収率８２．０％）を得た後に、この濃縮・精製した５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度をＨＰＬＣで評価し、その結果を表１０に示した。また、旋光度は＋４１．９度であった。
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本発明に係る実施例１３及び１６の５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法及び対照実験の対比の結果、本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法では、逆相カラム精製の溶離剤としてアセトニトリル水溶液の使用によりリボフラビンが完全に除去され５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度も高かった。一方、逆相カラム精製の溶離剤としてエタノール水溶液を使用した対照実験では、不純物としてリボフラビンの残留が認められた。また、不純物除去に必要な溶離剤の量は、本発明（溶離剤：アセトニトリル水溶液）では、対照実験（溶離剤：エタノール水溶液）の１／２量で十分であった。
本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法において、逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製に使用する溶離剤は、アセトニトリル水溶液がエタノール水溶液よりも優れた効果を有することは明らかである。
（３）本発明に係る精製法（再結晶化精製及び活性炭処理による精製）の５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度に及ぼす効果
下記に示す組成の粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａを用いて、（１）再結晶化精製を行い、次に、（２）活性炭処理による精製を行ない、さらに引き続いて（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離を行なった。
使用した粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの粗成
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即ち、最初に、上記の粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５．５ｇを水５５ｍｌに懸濁下攪拌しつつ、５０℃で加温攪拌して完全に溶解させ、この溶液にエタノール２８ｍｌを徐々に滴下し１℃で冷却攪拌して５’−ＦＭＮ−Ｎａの黄色結晶が析出させた。析出した結晶を濾過後、エタノール１０ｍｌで洗浄し減圧乾燥して５’−ＦＭＮ−Ｎａ４．８ｇを得た（（１）再結晶化精製）。この再結晶化精製した５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度のＨＰＬＣによる評価結果を表Ａに示した。
次に、上記で得た再結晶化された精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ４ｇを水５６ｍｌに溶解して、１Ｎ−ＮａＯＨ水４．７ｍｌを加え、濃度６重量％のｐＨ７．８の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液を調製した。この５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液に活性炭（二村化学製の太閤Ｙ）３．２ｇ（５’−ＦＭＮ−Ｎａに対して８０重量％）を添加し、５０℃で２時間懸濁後、活性炭をろ別した。ろ別した活性炭を水１５ｍｌで洗浄し、その洗浄水は先に得られたろ液と合わせた（（２）活性炭処理による精製）。
さらに、この活性炭処理された精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液に、１Ｎ−ＨＣｌ水２．５ｍｌを加え、ｐＨ６．０にして、攪拌しつつエタノール４０ｍｌを滴下し４℃に冷却して、黄色結晶を析出、濾過しエタノール１０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを１．９８ｇ得た（（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離）。この結晶化精製した５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度をＨＰＬＣで評価し、その結果を表Ｂに示した。
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また、比較対照実験として、先に示した［（１）本発明における精製法（再結晶化精製及び逆相カラムクロマトグラフィーによるカラム精製）の５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度に及ぼす効果］の評価の際に用いた［特許第２８５６７６０号公報に準じた方法による５’−ＦＭＮ−Ｎａの精製］を行なった。即ち、「再結晶化精製及び活性炭処理による精製」の代わりに（１）’高分子量吸着樹脂を充填した吸着カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製を行ない、次に、（２）逆相カラムクロマトグラフィー処理によるカラム精製を行ない、さらに引き続いて（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離を行なった。
本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法及び比較対照実験の対比の結果、本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法では、（１）再結晶化精製工程により、４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａ及びリボフラビン・ジホスフェートがかなり除去され、（２）活性炭処理及びそれに続く精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離によりリボフラビンが主に除去され、さらに４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａが除去され、最終の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度は９３％強の高純度であった。一方、比較対照実験（特許第２８５６７６０号公報に準じた精製方法）に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法では、（１）’高分子量吸着樹脂を充填した吸着カラム精製によりリボフラビンがかなり除去され、（２）逆相カラム精製（溶離剤：１０％メタノール水溶液）によりさらにリボフラビンが除去されたが、（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離では不純物量の変化は認められず、また、（１）〜（３）のいずれの精製工程においても、４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａ、リボフラビン・ジホスフェートはほとんど除去されず、最終の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの純度は９０％強と低かった。尚、光分解物のルミフラビン、ルミクロムは、本発明及び比較対照実験のいずれにおいても検出されずほぼ完全に除去されていた。
本発明に係る５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造・精製法（粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａを用いて、（１）再結晶化精製を行い、次に、（２）活性炭処理による精製、さらに引き続いた（３）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離）は、従来法と比較して、主要な不純物（リボフラビン、４’−ＦＭＮ−Ｎａ、３’−ＦＭＮ−Ｎａ、リボフラビン・ジホスフェート）の除去効果が大きく、優れた高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法であることは明らかである。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される訳ではない。
実施例１  粗製リボフラビン−５’−リン酸ナトリウム（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）の再結晶化精製法
１）粗製５’−ＦＭＮ及び粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造
攪拌機、塩化カルシウム管、温度計、バッフルを付けた２Ｌ４頚コルベン中にアセトニトリル５００ｍｌ、ピリジン２５０ｇ（３．１４ｍｏｌ）、オキシ塩化リン５０７ｇ（３．３ｍｏｌ）を入れ１０℃にて攪拌した。次に、水３３ｍｌをアセトニトリル２００ｍｌに溶解した液を１時間かけて滴下してリン酸化試薬を調製し、リボフラビン１８０ｇ（０．４７８ｍｏｌ）を徐々に添加し１０℃にて１２時間攪拌した。析出した黄色の中間体リボフラビン・サイクリック−４’，５’−ホスホリデートの結晶を濾過し、アセトニトリル５００ｍｌにて洗浄後、風乾した（収量３６０ｇ）。
ついで２Ｌ４頚コルベンに６％塩酸（水）６００ｍｌを入れ、１０℃で攪拌しつつ上記に得た中間体３６０ｇを添加し、４０℃にて２７時間攪拌した。ＨＰＬＣにて原料中間体の消失を確認後、反応液を１０℃に冷却し、２５％水酸化ナトリウム（水）溶液５４０ｍｌを１時間かけて滴下し生成物を完全に溶解させた（ｐＨ＝９．２６）。
この反応液を８℃に冷却しつつ濃塩酸４５ｍｌを滴下してｐＨを５．５に調製し、５’−ＦＭＮ−Ｎａの黄色結晶を析出させた。析出した結晶を濾過し、メタノール４００ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して５’−ＦＭＮ−Ｎａ１９５ｇを得た（収率８５．３％）。
ＨＰＬＣ評価の結果、この生成物は以下の組成であった。
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２）粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの再結晶化精製
１）で得た５’−ＦＭＮ−Ｎａ５０ｇ（０．１０４５ｍｏｌ）を１０００ｍｌコルベンに入れ水４００ｍｌに懸濁下攪拌し、５０℃で加温攪拌することにより完全に溶解させた。この溶液にエタノール１００ｍｌを滴下し攪拌しつつ８℃に冷却し、５’−ＦＭＮ−Ｎａの黄色結晶が析出させた。
析出した結晶を濾過後、エタノール１５０ｍｌで洗浄し減圧乾燥して３８．３５ｇの精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを得た（回収率７６．７％）。
ＨＰＬＣ評価の結果、この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは以下の組成であった。また、旋光度は＋４１．５度であった。
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実施例２−１２．  粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの再結晶化精製法
実施例１と同様に、実施例１の１）により得られた粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇ（０．０１０４ｍｏｌ）を１００ｍｌコルベンに入れ水４０ｍｌに懸濁下攪拌し、５０℃で加温攪拌することにより完全に溶解させた。この溶液に水に可溶な溶媒を滴下し攪拌しつつ８℃に冷却し、５’−ＦＭＮ−Ｎａの黄色結晶を得た。析出した結晶を濾過後、エタノール１５ｍｌで洗浄し減圧乾燥して精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを得た（回収率７６．７％）。
ＨＰＬＣ評価により得られた各々の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの組成及び再結晶化精製法による回収率を、表１１に示した。
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実施例２−１２においてリボフラビン−ジホスフェートの含有量は０．２１−０．２３％であった。
実施例１３．  再結晶化品５’−ＦＭＮ−ＮａのＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理による高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法
実施例１の２）で得られた再結晶化された精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ２０ｇを水４００ｍｌに溶解し、濃度５重量％のｐＨ５．５の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液（原液）を調製した。和光純薬社製のＯＤＳカラムＷａｋｏｓｉｌ−４０−Ｃ１８（内径５０ｍｍｘ長さ５００ｍｍ）を１０％アセトニトリル水溶液であらかじめ置換しておき、上記の原液をポンプでＯＤＳカラムにチャージした後、溶離剤として１０％アセトニトリルを用いて展開し、溶離液をフラクションごとに４画分に分割した。
ＨＰＬＣ評価により得られた各々の画分の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの組成を、表１２に示した。
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ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理をしたＮｏ．２〜４画分を合わせ、５０℃の水浴上にて約１５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、濃縮液を攪拌しつつエタノール３０ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出させた。この結晶を濾過しエタノール３０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを１６．９ｇ得た（回収率８４．５％）。ＨＰＬＣ評価の結果、この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは以下の組成であった。また、旋光度は＋４２．２度であった。
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実施例１４−１５．  再結晶化品５’−ＦＭＮ−ＮａのＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理による高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法
ＯＤＳカラムにチャージ後に展開に用いる溶離剤の種類だけを変え、それ以外は実施例１３と同様の方法で高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを製造した。
即ち、実施例１の２）で得られた再結晶化された精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ２０ｇを水４００ｍｌに溶解し、濃度５重量％のｐＨ５．５の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液（原液）を調製した。和光純薬社製のＯＤＳカラムＷａｋｏｓｉｌ−４０−Ｃ１８（内径５０ｍｍｘ長さ５００ｍｍ）を用いて、上記の原液をポンプでＯＤＳカラムにチャージした後、溶離剤として１０％アセトン水溶液（実施例１４）又は１０％ＴＨＦ水溶液（実施例１５）を用いて展開し、溶離液の画分を捕集した。
ＨＰＬＣ評価により得られた各々の捕集画分の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの組成を、表１３に示した。
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次に、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理をし捕集した各々の溶離液の画分を、５０℃の水浴上にて約１５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、濃縮液を攪拌しつつエタノール３０ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出させた。この結晶を濾過しエタノール３０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを得た。
ＨＰＬＣ評価の結果、この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは以下の表１４に示す組成であった。
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実施例１６．  高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法
実施例１の２）で得られた再結晶化された精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水１００ｍｌに溶解し、濃度５重量％のｐＨ５．５の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液（原液）を調製した。ＹＭＣ社製のＯＤＳカラムＹＭＣ−ＡＱ−Ｃ１８（内径２０ｍｍＸ長さ５００ｍｍ）を５％アセトニトリル水溶液であらかじめ置換しておき、上記の原液をポンプでＯＤＳカラムにチャージした後、溶離剤として５％アセトニトリルを用いて展開し、溶離液をフラクションごとに４画分に分割した。
ＨＰＬＣ評価により得られた各々の画分の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの組成を、表１５に示した。
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ＯＤＳカラムクロマトグラフィー処理をしたＮｏ．２〜４画分を合わせ、５０℃の水浴上にて約５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、エタノール１０ｍｌを滴下して８℃に冷却攪拌して、高純度５’−ＦＭＮの結晶を析出させ、濾過後エタノール１０ｍｌにて洗浄し減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａ４．２ｇを得た（回収率８４．０％）。
ＨＰＬＣ評価の結果、この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは以下の組成であった。また、旋光度は＋４２．１度であった。
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実施例１７．  再結晶化品５’−ＦＭＮ−Ｎａの活性炭処理による高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法
下記に示す組成の再結晶化精製品５’−ＦＭＮ−Ｎａを用いて、活性炭処理を行ない、さらに引き続いて精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離を行なった。
使用した粗製５’−ＦＭＮ−Ｎａの粗成
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（１）活性炭処理による５’−ＦＭＮ−Ｎａの精製
上記組成の再結晶化精製品５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水３０ｍｌに溶解して、１Ｎ−ＮａＯＨ水５．６ｍｌを加え、濃度１２重量％のｐＨ７．９の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液を調製した。この５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液に活性炭（二村化学製の太閤Ｙ）０．７５ｇ（５’−ＦＭＮ−Ｎａに対して１５重量％）を添加し、３０℃で１時間懸濁後、活性炭をろ別した。ろ別した活性炭を水２５ｍｌで洗浄し、その洗浄水を先に得られたろ液と合わせ、活性炭処理による精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液を得た。
（２）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離
（１）で得た５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液に、１Ｎ−ＨＣｌ水４．３ｍｌを加え、ｐＨ６．０にして、攪拌しつつエタノール６０ｍｌを滴下し８℃に冷却して、黄色結晶を析出、濾過し、エタノール１０ｍｌにて洗浄後減圧乾燥して高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａを３．６６ｇ得た。ＨＰＬＣ評価の結果、この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは以下の組成であった。
精製後の５’−ＦＭＮ−Ｎａの粗成
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実施例１８．  再結晶化品５’−ＦＭＮ−Ｎａの活性炭処理と高分子量吸着樹脂による高純度５’−ＦＭＮ−Ｎａの製造法
実施例１７で用いた再結晶化精製品５’−ＦＭＮ−Ｎａを用いて、活性炭処理を行ない、引き続いて高分子量吸着樹脂による精製を行い、さらに引き続いて精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離を行なった。
（１）活性炭処理と高分子量吸着樹脂による５’−ＦＭＮ−Ｎａの精製
精製５’−ＦＭＮ−Ｎａ５ｇを水５０ｍｌに溶解して、濃度９重量％のｐＨ６の５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液を調製した。この５’−ＦＭＮ−Ｎａ水溶液に活性炭（Ｎｏｒｉｔ製ＣＡＳＰ）０．６ｇ（５’−ＦＭＮ−Ｎａに対して１２重量％）を添加し、５０℃で１時間懸濁後、活性炭をろ別した。ろ別した活性炭を水１０ｍｌで洗浄し、その洗浄水は先に得られたろ液と合わせて、活性炭処理による精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液を得た。この活性炭処理による精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液に、高分子量吸着樹脂（三菱化学製のＳＰ７００）５ｇを加え、３０℃で１時間懸濁後、高分子量吸着樹脂をろした。ろ別した高分子量吸着樹脂を水１５ｍｌで洗浄し、その水は先に得られたろ液と合わせて、高分子量吸着樹脂処理による精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液を得た。
（２）精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離
（１）で得た高分子量吸着樹脂処理による精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを含有する水溶液を攪拌しつつエタノール７５ｍｌを滴下し、８℃に冷却して、黄色結晶を析出、濾過しエタノール１０ｍｌにて洗浄後、減圧乾燥して高純度の精製５’−ＦＭＮ−Ｎａを３．２３ｇ得た。ＨＰＬＣ評価の結果、この精製５’−ＦＭＮ−Ｎａは以下の組成であった。
精製５’−ＦＭＮ−Ｎａの単離
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