(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性剤の放出性を調節するための組成物であって、金属カチオンを含まない組成物と比較して、金属カチオンが生理活性剤の放出パターンの変更を提供するように選ばれることを特徴とする、下記のものを含んでなる組成物、
ａ）ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、それらの混合物及びそれらの共重合体からなる群より選ばれる生体適合性ポリマーマトリックス、
ｂ）生理活性剤の有効量、但し、該剤は副腎皮質刺激ホルモンではなく、該生理活性剤は、ポリマーマトリックス内に分散され、及び
ｃ）該ポリマーマトリックスからの該生理活性剤の放出を調節するための１以上の金属カチオン成分、ここで、該金属カチオン成分は、Ｚｎ（ＩＩ）及びＭｇ（ＩＩ）からなる群より選ばれるカチオンを含み、並びに該金属カチオン成分は、別に該ポリマーマトリックス内に分散されてなる。
【請求項２】
該金属カチオン成分が、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、炭酸亜鉛、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、クエン酸マグネシウム及びクエン酸亜鉛からなる群より選ばれる請求項１記載の放出調節組成物。
【請求項３】
該生理活性剤が、ヌクレアーゼ、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、腫瘍壊死因子及びコロニー刺激因子からなる群より選ばれるタンパク質である請求項１〜２いずれか記載の放出調節組成物。
【請求項４】
生理活性剤の放出性を調節するための組成物であって、金属カチオンを含まない組成物と比較して、金属カチオンが生理活性剤の放出パターンの変更を提供するように選ばれることを特徴とする、下記のものを含んでなる組成物、
ａ）ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーの生体適合性ポリマーマトリックス、
ｂ）生理活性剤の有効量、但し、該剤は副腎皮質刺激ホルモンではなく、該生理活性剤は、ポリマーマトリックス内に分散され、及び
ｃ）ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節するための１以上の金属カチオン成分、ここで、該金属カチオン成分は、Ｚｎ（ＩＩ）及びＭｇ（ＩＩ）からなる群より選ばれるカチオンを含み、並びに該金属カチオン成分は、別に該ポリマーマトリックス内に分散されてなる。
【請求項５】
該金属カチオン成分が、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、炭酸亜鉛、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、クエン酸マグネシウム及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる請求項４記載の放出調節組成物。
【請求項６】
該生理活性剤が、ヌクレアーゼ、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、腫瘍壊死因子及びコロニー刺激因子からなる群より選ばれるタンパク質である請求項４又は５記載の放出調節組成物。
【請求項７】
ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出性を調節するための組成物を製造する方法であって、
ａ）生体適合性ポリマーを溶媒に溶解し、ポリマー溶液を調製すること、ここで該生体適合性ポリマーが、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−ゴリコール酸共重合体）、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、それらの混合物及びそれらの共重合体からなる群より選ばれる、
ｂ）１以上の金属カチオン成分を該ポリマー溶液に分散し、但し、該金属カチオン成分は、Ｚｎ（ＩＩ）及びＭｇ（ＩＩ）からなる群より選ばれるカチオンを含み、
ｃ）該ポリマー溶液に生理活性剤を別々に分散させ、但し、該剤は副腎皮質刺激ホルモンではなく、及び
ｄ）該ポリマー溶液から該ポリマーを凝固させてポリマーマトリックスを形成させ、それによって、金属カチオン成分が、ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節し、
ここで、金属カチオンを含まない組成物と比較して、金属カチオンが生理活性剤の放出パターンの変更を提供するように選ばれる、
からなる方法。
【請求項８】
ポリマーマトリックスが、微粒子の形状である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
該金属カチオン成分が、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、炭酸亜鉛、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、クエン酸マグネシウム及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
該生理活性剤が、タンパク質を含む請求項７、８又は９記載の製造方法。
【請求項１１】
該タンパク質が、ヌクレアーゼ、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、腫瘍壊死因子及びコロニー刺激因子からなる群より選ばれる請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
ポリマー溶液に金属カチオン成分を分散させる前に、第２の溶媒に該金属カチオン成分を溶解させる工程をさらに含んでなり、第２の溶媒が第１の溶媒と混合でき、及び該ポリマーが第２の溶媒に溶解できるものである、請求項７記載の製造方法。
【請求項１３】
ポリマー溶液に金属カチオン成分を分散させる前に、第２の溶媒に該金属カチオン成分粒子を懸濁させる工程をさらに含んでなり、第２の溶媒が第１の溶媒と混合でき、及び該ポリマーが第２の溶媒に溶解できるものである、請求項７記載の製造方法。
【請求項１４】
ポリマーマトリックスが、微粒子の形状である、請求項１記載の放出調節組成物。
【請求項１５】
ポリマーマトリックスが、微粒子の形状である、請求項４記載の放出調節組成物。
【請求項１６】
治療に使用するための請求項１〜６、１４及び１５いずれか記載の放出調節組成物。
【請求項１７】
イン・ビボでの生理活性剤の放出調節における使用に用いる医薬の製造のための、請求項１〜６、１４及び１５いずれか記載の組成物の使用方法。
【請求項１８】
該医薬が、皮下、筋肉内、腹腔内、皮内、静脈内、動脈内、もしくは鞘内の注射及び／又は埋入、粘膜への投与又はイン・シテュ（in situ）で送達することによって投与されるものである、請求項１７記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
多くの疾患または病態に対し最も効果的な予防、治療、または診断成績を得るためには、イン・ビボで一定レベルの薬物または剤が必要である。かつては、薬物は投薬レベルにバラツキが生じるような間隔で投与されていた。
やがて、薬物を含有するポリ（ラクチド）またはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）微粒子など多くの生分解性物質が投薬の制御・安定化の試みに用いられるようになった。これらの微粒子の使用により、ポリマーが本質的に有している生分解性を利用して薬物放出性を向上させるとともに、薬物レベルのさらなる均一化と制御を図ることで、薬物の放出制御性が向上した。ところが、生分解性ポリマーはイン・ビボでは初期薬物放出速度が高すぎたり低すぎたりするために一定の水和期間の後でかなり分解してしまい、放出制御微粒子の有効時間が制限される場合がある。したがって、生分解性ポリマーからの薬物の放出制御を調節して薬物の初期放出レベルを上げるとともに、イン・ビボにおける十分に一定した薬物放出レベルが持続する期間を延長する手段が求められている。
発明の概要
本発明は、生理活性剤の放出性を調節するための組成物に関する。本発明の組成物は、生体適合性ポリマーマトリックス、該ポリマーマトリックスに分散された生理活性剤、および生理活性剤とは別に該ポリマーマトリックスに分散された金属カチオン成分から成り、該金属カチオン成分がポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節することからなる。
本発明はまた、生体適合性ポリマーを溶媒に溶解させてポリマー溶液を作製し、別に金属カチオン成分と生理活性剤をやはり該ポリマー溶液に分散させる工程を含むことからなる、ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節する方法に関する。次いで、ポリマー溶液を凝固させて、金属カチオン成分の少なくともかなりの部分を生理活性タンパク質とは別にポリマーマトリックスに分散させることで、金属カチオン成分がポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節するポリマーマトリックスを作製する。
本発明は、生分解性ポリマーからの生理活性剤のイン・ビボでの放出を調節することによって、予防剤、治療剤、および診断剤のイン・ビボ放出レベルの制御性が強化されるとともに、単回投与における制御放出が維持できる期間が延びるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
図１は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（以下ＰＬＧＡと称す）、ｂ）ガラスビーズを含むＰＬＧＡ、及びｃ）カーボンブラックを含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対するガラスビーズ及びカーボンブラックの効果を図示する。
図２は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ、ｂ）２％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、ｃ）５％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、ｄ）１０％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、ｅ）１５％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、及びｆ）３０％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対する種々の濃度のＭｇＣＯ3の効果を図示する。
図３は、以下のポリマーフィルムの５０ｍＭ  ＰＢＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ、ｂ）５％Ｍｇ（ＯＨ）2を含むＰＬＧＡ、ｃ）１０％Ｍｇ（ＯＨ）2を含むＰＬＧＡ、及びｄ）２０％Ｍｇ（ＯＨ）2を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対する種々の濃度のＭｇ（ＯＨ）2の効果を図示する。
図４は、以下のポリマーフィルムの５０ｍＭ  ＰＢＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間に対してプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ及びｂ）１０％ＺｎＣＯ3を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対するＺｎＣＯ3の効果を図示する。
図５は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間に対してプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ及びｂ）５％Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対するＭｇ（ＯＡｃ）2の効果を図示する。
図６は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間に対してプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ及びｂ）５％Ｚｎ（ＯＡｃ）2を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対するＺｎ（ＯＡｃ）2の効果を図示する。
図７は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間に対してプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ及びｂ）１５％ＭｇＳＯ4を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対するＭｇＳＯ4の効果を図示する。
図８は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間に対してプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ及びｂ）１０％ＺｎＳＯ4を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡフィルムの水の吸収に対するＺｎＳＯ4の効果を図示する。
図９は、以下のポリマーペレットの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での水の取り込みのパーセント（％ｗ／ｗ）を、水和時間に対してプロットした図である。ａ）対照ブロックされたＰＬＧＡ及びｂ）対照ブロックされないＰＬＧＡ。ＰＬＧＡペレットの水の吸収に対するＰＬＧＡ末端基の効果を図示する。
図１０は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での分子量を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ、ｂ）１０％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、及びｃ）２０％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ。水和によるＰＬＧＡフィルムの分子量の変化に対する種々の濃度のＭｇＣＯ3の効果を図示する。
図１１は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での分子量を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ、ｂ）１０％ＺｎＣＯ3を含むＰＬＧＡ、及びｃ）２０％ＺｎＣＯ3を含むＰＬＧＡ。水和によるＰＬＧＡフィルムの分子量の変化に対する種々の濃度のＺｎＣＯ3の効果を図示する。
図１２は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での分子量（Ｍｗ）を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ及びｂ）５％Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含むＰＬＧＡ。ＰＬＧＡの分子量に対するＭｇ（ＯＡｃ）2の効果を図示する。
図１３は、以下のポリマーペレットの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での分子量（Ｍｗ）の対数を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブロックされないＰＬＧＡ及びｂ）ブロックされたＰＬＧＡ。水和によるＰＬＧＡの分子量の分解に対するＰＬＧＡ末端基の特性の効果を図示する。
図１４は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中でのガラス転移温度（Ｔｇ）を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ、ｂ）１０％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、及びｃ）２０％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ。水和によるＰＬＧＡのガラス転移温度の変化に対する種々の濃度のＭｇＣＯ3の効果を図示する。
図１５は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中でのガラス転移温度（Ｔｇ）を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ、ｂ）１０％ＺｎＣＯ3を含むＰＬＧＡ、及びｃ）２０％ＺｎＣＯ3を含むＰＬＧＡ。水和によるＰＬＧＡのガラス転移温度の変化に対する種々の濃度のＺｎＣＯ3の効果を図示する。
図１６は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中でのガラス転移温度（Ｔｇ）を、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ及びｂ）５％Ｍｇ（ＯＡｃ）2。水和によるＰＬＧＡのガラス転移温度の変化に対する種々の濃度のＭｇ（ＯＡｃ）2の効果を図示する。
図１７は、以下のポリマーフィルムの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での重量減量パーセントを、水和時間の関数としてプロットした図である。ａ）ブランクＰＬＧＡ、ｂ）５％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、ｃ）１０％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ、及びｄ）１５％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ。水和によるＰＬＧＡの分解に対する種々の濃度のＭｇＣＯ3の効果を図示する。
図１８は、以下のポリマーペレットの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中での質量減量パーセントを、水和時間に対してプロットした図である。ａ）ブロックされたＰＬＧＡ、ｂ）ブロックされないＰＬＧＡ、ｃ）１０％ＭｇＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡ、ｄ）１０％ＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡ、ｅ）１０％ＭｇＣＯ3を含むブロックされないＰＬＧＡ、及びｆ）１０％ＺｎＣＯ3を含むブロックされないＰＬＧＡ。水和によるＰＬＧＡの分解に対するＰＬＧＡ末端基の特性効果と塩の効果を図示する。
図１９は、１０％ＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡ微粒子の分子量（Ｍｗ）を、時間の関数としてプロットした図である。ａ）イン・ビトロで５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中、及びｂ）イン・ビボで微粒子を皮下に投与されたラットで。図１９のブロックされたＰＬＧＡ微粒子と比較して、イン・ビボでの微粒子と比較したイン・ビトロでの微粒子に対して、１０％ＺｎＣＯ3を含む（イン・ビトロで及びイン・ビボで）ブロックされたＰＬＧＡ微粒子のより遅い分解率を図示する。
図２０は、ブロックされたＰＬＧＡ微粒子の分子量（Ｍｗ）を、時間の関数としてプロットした図である。ａ）イン・ビトロで５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中、及びｂ）イン・ビボで微粒子を皮下に投与されたラットで。イン・ビボでの微粒子と比較してイン・ビトロでの微粒子に対して、増加した分解率を図示する。
図２１は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中、１０％ＲＮアーゼＡ及び０％Ｍｇ（ＯＨ）2もしくは１０％Ｍｇ（ＯＨ）2を含むＰＬＧＡ微粒子からのＲＮアーゼＡの累積放出パーセントをプロットした図である。水和によるＰＬＧＡ微粒子からＲＮアーゼＡの放出の動態に対するＭｇ（ＯＨ）2の効果を図示する。
図２２は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中、１０％ＲＮアーゼＡ及び０％ＺｎＣＯ3、５％ＺｎＣＯ3、１０％ＺｎＣＯ3もしくは１５％ＺｎＣＯ3を含むＰＬＧＡ微粒子からのＲＮアーゼＡの累積放出パーセントをプロットした図である。水和によるＰＬＧＡ微粒子からＲＮアーゼＡの放出の動態に対するＺｎＣＯ3の効果を図示する。
図２３は、５０ｍＭ  ＰＢＳ中、１０％副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）及び０％ＭｇＣＯ3もしくは１５％ＭｇＣＯ3を含むＰＬＧＡ微粒子からのＡＣＴＨの累積放出パーセントをプロットした図である。水和によるＰＬＧＡ微粒子からＡＣＴＨの放出の動態に対するＭｇＣＯ3の効果を図示する。
図２４は、炭酸亜鉛とＺｎ+2で安定化させたインターフェロン−α、２ｂを、ａ）１：１、ｂ）３：１及びｃ）８：１のモル比で含む微粒子を一回皮下投与されたラットにおけるインターフェロン−α、２ｂの血清濃度（ＩＵ／ｍｌ）を７日間に渡ってプロットした図である。
発明の詳細な説明
本明細書で使用する場合、「生理活性剤の調節放出」という用語は、生理活性剤とは別に分散された金属カチオン成分を含有する生体適合性ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出をいう。調節放出においては、ポリマーマトリックスに分散される金属カチオン成分の種類と量を選択することによって、該剤の初期放出レベル、その後の剤放出レベル、剤の放出量、および／または放出期間の長さなどのうち少なくとも１つの放出特性が、分散金属カチオン成分を含有しないポリマーマトリックスからの該生理活性剤の放出特性（単数または複数）から変化される。
本発明の組成物のポリマーマトリックスのポリマーは生体適合性ポリマーであるが、このものは生分解性ポリマーでも非生分解性ポリマーでもよく、それらの混合物や共重合体であってもよい。
本明細書で使用する場合、「生分解性」という用語は、組成物がイン・ビボで分解または腐食して、より分子量の小さい化学物質を形成することをいう。分解はたとえば酵素的、化学的、および物理的過程によって引き起こされる。適当な生体適合性生分解性ポリマーとしては、たとえばポリ（ラクチド）類、ポリ（グリコリド）類、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）類、ポリ（乳酸）類、ポリ（グリコール酸）類、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）類、ポリ無水物類、ポリオルトエステル類、ポリエーテルエステル類、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド類、それらの混合物および共重合体などが挙げられる。
本発明の調節放出組成物に適した生体適合性非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート類、エチレン酢酸ビニル類およびその他のアシル置換酢酸セルロース類のポリマー、非分解性ポリウレタン類、ポリスチレン類、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネートポリオレフィン類、ポリエチレンオキシド、それらの混合物および共重合体などが挙げられる。
ポリマーおよびそのすべての分解産物が受容体に対し無毒でかつ受容体の生体に対して問題となる有害または好ましくない作用を及ぼさないのであれば、ポリマーまたはポリマーマトリックスは生体適合性があるとする。
さらに、ポリマーはブロックされていてもされていなくてもよいし、ブロックポリマーと非ブロックポリマーの混合物であってもよい。当該分野における従来の定義に従えば、ブロックポリマーとは、具体的には、ブロックされたカルボキシル末端基を有するポリマーである。一般に、ブロック基は重合開始剤に由来するものであって、アルキル基が代表的である。また、当該分野における従来の定義に従えば、非ブロックポリマーとは、遊離状態のカルボキシル末端基を有するポリマーである。
本発明に使用されるポリマーの許容分子量は、当該分野における通常の技術を有する者であれば、目標のポリマー分解速度、機械的強度などの物理的性質、およびポリマーの溶媒溶解速度などの要素を考慮したうえで、これを決定することができる。通常、分子量の許容範囲は約２，０００ダルトンから約２，０００，０００ダルトンである。好ましい態様においては、ポリマーは生分解性のポリマーまたは共重合体である。より好ましい態様においては、ポリマーはラクチド：グリコリド比が約１：１で分子量が約５，０００ダルトンから約７０，０００ダルトンのポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（以下「ＰＬＧＡ」という）である。さらに好ましい態様においては、本発明に使用されるＰＬＧＡの分子量は約５，０００ダルトンから約４２，０００ダルトンである。
本明細書で使用する場合、「生理活性剤」という用語は、イン・ビボで治療作用、予防作用、または診断作用を示す剤をいう。適当な治療用および／または予防用生理活性剤の例としては、ホルモン、抗原、成長因子などのタンパク質；アンチセンス分子などの核酸；および抗生物質、ステロイド剤、うっ血除去薬、神経作用薬、麻酔薬、および鎮静剤などの小型分子などが挙げられる。適当な診断用および／または治療用生理活性剤の例としては、放射性同位体および放射線不透過剤などが挙げられる。
本発明の調節放出組成物においては、有効量の生理活性剤粒子をポリマーマトリックスに分散させる。有効量の生理活性剤とは、治療上、予防上、または診断上有効な量をいい、当該分野における通常の技術を有する者であれば、体重、年齢、体調、目標の治療、予防、または診断成績、使用する剤の種類、使用するポリマーの種類、目標の初期バーストレベルおよびその後の放出レベル、および目標の放出速度などの要素を考慮したうえで、これを決定することができる。通常、生理活性剤の放出を調節するためのポリマーマトリックスは、重量比で約０．０１％（ｗ／ｗ）から約５０％（ｗ／ｗ）の生理活性剤を含有している。
生理活性剤の粒子としては、たとえば結晶性粒子、非結晶性粒子、フリーズドライ粒子および凍結乾燥粒子などが挙げられる。該粒子は生理活性剤のみを含有するものであってもよいし、安定剤および／またはその他の添加剤をさらに含有していてもよい。
１つの態様においては、タンパク質が生理活性剤である。調節放出組成物に含ませるタンパク質として好ましいものとしては、たとえばヌクレアーゼ類、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン類、インターロイキン類、腫瘍壊死因子、副腎皮質刺激ホルモン、成長因子類、およびコロニー刺激因子類などが挙げられる。
調節制御放出組成物は、たとえばエリスロポエチンと顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子など２種類のタンパク質に例示される複数の生理活性剤を含有していてもよい。
本明細書で使用する場合、「金属カチオン成分」という用語は、少なくとも１種類の多価金属カチオン（２価以上の価数を有するもの）を非解離状態、解離状態、または非解離状態と解離状態が混在する状態で含有する成分をいう。適当な金属カチオン成分としては、たとえば金属塩、金属水酸化物、および塩が金属カチオンを含有している弱酸の塩基性（ｐＨ約７以上）塩などが挙げられる。金属カチオンは２価であることが好ましい。
本発明の調節放出組成物においては、適当濃度の金属カチオン成分をポリマーマトリックスに分散させる。適当濃度の金属カチオン成分とは、ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節する金属カチオン成分の濃度をいう。１つの態様においては、ポリマーに分散させようとする金属カチオン成分の比率は約１％（ｗ／ｗ）から約３０％（ｗ／ｗ）の間が適当である。最適比率は、使用するポリマー、金属カチオン成分、および生理活性剤によって決まる。好ましい態様においては、ポリマーに分散させようとする金属カチオン成分の量は約５％（ｗ／ｗ）から約２０％（ｗ／ｗ）の間が適当である。
１つの態様においては、金属カチオン成分は水性液体に実質的に不溶である。本明細書で使用する場合、「水性液体に実質的に不溶」であるとは、金属カチオン成分が水またはＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、または消化管液などの液体に一般に溶解しないか、溶解度が低いことを意味する。適当な不溶性金属カチオン成分の例としては、たとえばＭｇ（ＯＨ）2、炭酸マグネシウム（４ＭｇＣＯ3・Ｍｇ（ＯＨ）2・５Ｈ2Ｏなど）、炭酸亜鉛（３Ｚｎ（ＯＨ）2・２ＺｎＣＯ3など）、ＣａＣＯ3、Ｚｎ3（Ｃ6Ｈ5Ｏ7）2（以下酢酸亜鉛という）、またはこれらを組み合わせたもの、またはこれらを含有するものなどが挙げられる。
別の態様においては、金属カチオン成分は水性液体に実質的に可溶である。本明細書で使用する場合、「水性液体に実質的に可溶」であるとは、金属カチオン成分が水またはＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、または消化管液などの液体に普通に溶解することを意味する。適当な可溶性金属カチオン成分の例としては、たとえばＭｇ（ＯＡｃ）2、ＭｇＳＯ4、Ｚｎ（ＯＡｃ）2ＺｎＳＯ4、ＺｎＣｌ2、ＭｇＣｌ2、Ｍｇ3（Ｃ6Ｈ5Ｏ7）2（以下酢酸マグネシウムという）、およびこれらを組み合わせたもの、またはこれらを含有するものなどが挙げられる。
さらに別の態様においては、金属カチオン成分は実質的に可溶な成分と実質的に不溶な成分を組み合わせたものである。
ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節する方法の１つの態様においては、適当なポリマーを溶媒に溶解させてポリマー溶液を作製する。適当な溶媒の例としては、たとえば塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、およびヘキサフルオロイソプロパノールなどの極性有機溶媒などが挙げられる。
次いで、少なくとも１つの金属カチオン成分の粒子を該ポリマー溶液に分散させる。金属カチオン成分をポリマー溶液に分散させるのに適当な手段としては、超音波処理、攪拌、混合、および均一化などが挙げられる。金属カチオン成分は、固体、好ましくは粒状でポリマー溶液に直接添加することができるが、この場合、次いで金属カチオン成分をポリマー溶液に分散させた固体粒子の状態で懸濁させるか、ポリマー溶液中で解離させて遊離の金属カチオンを形成させる。また、金属カチオン成分は、ポリマー溶液に添加する前に、固体粒子の状態で懸濁させてもよいし、第２の溶媒に溶解させてもよく、この場合、次いで第２の溶媒をポリマー溶液に添加する。第２の溶媒がポリマーの溶媒と同じ溶媒である場合、または第２の溶媒がポリマーの溶媒に相溶であってポリマーが第２の溶媒に可溶である場合が適当である。第２の溶媒として適当なものとしてはアセトンが例示される。
別の態様においては、金属カチオン成分を溶媒に懸濁または溶解させた後で、適当なポリマーを該溶媒に溶解させる。
少なくとも１つの生理活性剤も、金属カチオン成分、金属カチオン成分懸濁液、または金属カチオン成分溶液の添加とは別にポリマー溶液に添加される。１つの態様においては、生理活性剤を溶媒に溶解させるが、この溶媒はポリマーの溶媒としても適当なものであり、次いでポリマー溶液に混合される。
金属カチオン成分と生理活性剤は相前後してポリマー溶液に添加してもよいし、逆の順序で添加してもよいし、間欠的に添加してもよいし、それぞれを同時に添加してもよい。また、生理活性剤は、ポリマーを該溶媒に溶解させる前に、金属カチオン成分の溶媒中溶液または懸濁液に懸濁させることもできる。
ポリマー溶液に添加される生理活性剤の量は、少なくとも１つの金属カチオン成分と少なくとも１つの生理活性剤を様々な濃度で含有するポリマーマトリックスのイン・ビトロ比較試験により実験的に決定することができる。使用量は剤の種類、計画放出レベルにおける剤の目標効果、および剤が放出される期間の長さによって異なる。
ＲＮアーゼ−Ａ、ＡＣＴＨ、インターフェロン−α，２ｂ、およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の放出を調節するためのポリマーマトリックス微粒子の作製について実施例９、１０、１１、１２でさらに説明する。ポリマー微粒子からのＲＮアーゼ−ＡまたはＡＣＴＨのイン・ビトロ放出を調節する方法の有効性についても実施例９で説明する。さらに、ポリマー微粒子からのインターフェロン−α，２ｂのイン・ビボ放出を調節する方法の有効性について実施例１０で説明する。また、ポリマー微粒子からのｈＧＨのイン・ビボ放出を調節する方法の有効性について実施例１１と１２で説明する。
別の態様においては、ポリマー溶液に添加されるタンパク質は、当該分野において公知の少なくとも１つの安定剤などの添加剤と混合することができる。
本発明のポリマーマトリックスは、フィルム、ペレット、円筒、円盤、または微粒子など多くの形状に成型することができる。本明細書で使用する場合、「微粒子」という用語は、約１ミリメートル未満の直径を有する粒子であって、生理活性剤の粒子を分散させた状態で含有するものをいう。微粒子は球状、非球状、または不規則な形状を有するものであってよい。好ましい微粒子形状は球状である。
好ましい態様においては、本発明の方法は、調節放出ポリマーマトリックスを微粒子状に形成する工程を含む。適当な金属カチオン成分を固体粒子または遊離した解離カチオンとして分散させ、これとは別に生理活性剤を約５〜３０重量％のポリマーを含有するポリマー溶液に固体粒子として分散させる。さらに好ましい態様においては、ポリマー溶液は約５〜１５重量％のポリマーを含有する。生分解性ポリマーが好ましいが、なかでもＰＬＧＡがより好ましい。
次いで、ポリマー溶液から微粒子を作製する。許容される微粒子をポリマー溶液から形成する方法として適当なものが、ゴムボッツら(Gombotz et al.）に発行された米国特許第５，０１９，４００号に記載されている。米国特許第５，０１９，４００号の内容は引例により本願に含まれるものとする。
別の態様においては、シュノーリングら（Schnoring et al.）に発行された米国特許第３，７３７，３３７号、ビランフェンら（Vranchen et al.）に発行された米国特許第３，５２３，９０６号、キタジマら（Kitajima et al.）に発行された米国特許第３，６９１，０９０号、またはティセら（Tice et al.）に発行された米国特許第４，３８９，３３０号に記載の溶媒蒸発法によって調節放出組成物を作製するが、これらの記載内容は引例により本願に含まれるものとする。
溶媒蒸発法では、分散状態の金属カチオン成分と分散状態の生理活性剤とを含有するポリマー溶液を、ポリマーの溶媒が実質的に非相溶である連続相と混合または攪拌することで、乳剤を作製する。該連続相は通常は水性溶媒である。連続相に乳化剤を添加して乳剤の安定化を図ることが多い。次いで、ポリマーの溶媒を数時間以上かけて蒸発させることでポリマーを凝固させ、金属カチオン成分と生理活性剤が別々に分散されたポリマーマトリックスを作製する。
別の態様においては、本発明の方法は、調節放出ポリマーマトリックスをフィルムまたはその他の形状に成型する工程を含む。金属カチオンがポリマー溶液全体に均一に分散するまで、たとえば超音波処理によって、粒状または解離状態の金属カチオン成分を含むポリマー溶液を混合する。続いて、ポリマー溶液をペトリ皿などの型に注型する。次いで、一定の乾燥重量のフィルムなどの形状が得られるまで、当該分野において公知の手段によって溶媒を除去する。ポリマーマトリックスフィルムとポリマーペレットの作製については実施例１と２でさらに説明する。
上記以外にも、本発明の組成物を用いるいくつかの方法をポリマーの物理的性質の調節に用いることができる。本発明の組成物の使用方法の１つの態様は、実質的なポリマー分解を引き起こすことなく、水分吸収または水和能力を変化させる方法から成る。本発明の方法は、ポリマーの溶液を作製した後、このポリマー溶液に金属カチオン成分を分散させることを特徴とするものである。次いで、ポリマー溶液を凝固させて、金属カチオン成分が分散されたポリマーマトリックスを作製する。この初期水和性向上方法についてのさらに詳細な説明は、実施例３を参照されたい。
本発明の組成物の使用方法のさらに別の態様は、ポリマーの溶媒溶液を作製した後、該ポリマー溶液に金属カチオン成分を分散させる工程を含むことを特徴とする水和中のポリマーのガラス転移温度を有意に安定化させる方法から成る。次いで、ポリマー溶液を凝固させて、金属カチオン成分の粒子が分散されたポリマーマトリックスを作製する。
ガラス転移温度（Ｔｇ）はポリマーの分子量に比例し、分子量が低下すると通常Ｔｇも低下するので、Ｔｇはポリマー分解の間接的指標となりえる。ガラス転移温度（Ｔｇ）は、ポリマーがガラス相からゴム相へと変化するときの温度であると定義される。Ｔｇはポリマーの分子量に影響される。ポリマー水和中のＴｇを安定化させるこの方法についての詳細な説明は、実施例５を参照されたい。ポリマーマトリックスが微粒子の形で存在する態様においては、Ｔｇを安定化させることでポリマーの物理的性質が維持され、剤放出の制御性が高まる。
本発明の組成物の使用方法のさらに別の態様は、実質的なポリマー分解を引き起こすことなくポリマーの多孔性を増大させる方法から成る。この方法は、ポリマーの溶媒溶液を作製した後、該ポリマー溶液に金属カチオン成分を分散させる工程を含む。次いで、ポリマー溶液を凝固させて、金属カチオン成分が分散されたポリマーマトリックスを作製した後、これを水和させて少なくとも１つのギャップを該ポリマーマトリックス内に作製することで、ポリマーの多孔性を増大させる。本明細書で使用する場合、「ギャップ」という用語は、孔隙および／またはボイドをいう。この使用方法のさらに詳細な説明は、実施例６を参照されたい。
本発明の使用方法のさらに別の態様は、ポリマーの分解速度を遅くする方法から成る。この方法においては、ポリマーの溶液を作製した後、金属カチオン成分を該ポリマー溶液に分散させる。続いてポリマー溶液を凝固させて、金属カチオン成分が分散されたポリマーマトリックスを作製する。実施例４、７、８では、ポリマーへの金属カチオンの添加およびポリマー末端基の選択の結果得られるイン・ビトロとイン・ビボの両方の条件におけるポリマー分解速度の調節についてさらに詳細に説明する。
本発明の組成物は、たとえば皮下、筋肉内、腹腔内、皮内、静脈内、動脈内、または鞘内の注射および／または埋入によるか、鼻腔内投与製剤または座剤として粘膜に投与するか、様々な医学的状態を生理活性剤で治療する際の既知測定項目値に基づいて決定される剤の目標用量に到達するようイン・シテュ（in situ）で送達することによって、ヒトまたはその他の動物に投与することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。
実施例１
塩含有ポリマーフィルムの作製
すべてのフィルム試験では、分子量４２，０００ダルトンのブロックＰＬＧＡ（５０：５０）（静脈内投与、０．７ｄｌ／ｇバーミンガムポリマー、Birmingham AL.）を用いた。ポリマーフィルムはフィルム注型法を用いて製造したものである。ポリマーを室温で最大２４時間にわたり塩化メチレン（５％ｗ／ｖ）に溶解した。
２価カチオンを含む水不溶性塩と水溶性塩の両者を用いてフィルムを作製した。塩は、粒状で、または適当な共溶媒中でポリマーと塩を共可溶化させることによって、ポリマーに取り込ませた。作製方法を以下に説明する。
３種類の低水溶性塩、すなわちＭｇＣＯ3、Ｍｇ（ＯＨ）2、およびＺｎＣＯ3（Spectrum Chemical MFG，Corp.社、Gardena，CA）および２種類の水溶性塩、すなわちＭｇＳＯ4とＺｎＳＯ4（Spectrum Chemical MFG，Corp.社、Gardena，CA）を粒状でフィルムに取り込ませた。フィルム注型に先立ち、３８ミクロン米国標準試験用ふるいを用いてＭｇＣＯ3、Ｍｇ（ＯＨ）2、およびＺｎＣＯ3をふるい分け、粒径を揃えた。ふるい分け済みの塩をカプセル化する前の平均粒径を表１に示した。
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非イオン性水不溶性粒子として、カーボンブラックまたはガラスの粒子（直径２０ミクロン、Polysciences Inc．社、Warrington，PA）を用いた。ふるい分けた塩を最終濃度範囲０〜３０％（ｗ／ｗ、塩／ポリマー）となるようにポリマー溶液に添加することによってポリマーフィルムを作製した。得られたポリマー懸濁液を約４分間超音波処理して、塩粒子を分散させた。次いで、懸濁液１００ｍｌの試料を９ｘ５ｘ１インチのテフロン製ペトリ皿（Plastic Structures Co.社、Wilmington，MA）に注型した。対照ポリマーフィルムは塩含有率０．０％のポリマーを用いた。
フィルムは２層に注型することで塩粒子の沈澱を防止した。最初の２４時間は、大気圧下のフード内で室温で塩化メチレンを蒸発させた。フィルムを真空オーブンに移し、３０℃で６時間、４０℃で３日間、次いで５０℃で３日間乾燥させた。この乾燥サイクルの終了時点では、もはや乾燥重量の低下は見られなかった。
塩をアセトン中でＰＬＧＡと共可溶化させることによって、水溶性塩である酢酸マグネシウムと酢酸亜鉛を含有するポリマーフィルムを作製した。５ｇのポリマーを５０ｍｌのアセトンに室温で溶解することによって、１０％ポリマー溶液を作製した。いずれかの塩０．２６ｇを５０ｍｌの室温アセトンに溶解することによって、Ｍｇ（ＯＡｃ）2またはＺｎ（ＯＡｃ）2の溶液を作製した。等容量の塩溶液とポリマー溶液を合わせ、得られた混合物を約４分間超音波処理した。この塩−ポリマー溶液１００ミリリットルの試料をテフロン製ペトリ皿に注いだ。上記と同様にして塩化メチレンを蒸発させた。
実施例２
塩含有ポリマーペレットの作製
すべてのポリマーペレット試験では、ブロックＰＬＧＡおよび非ブロックＰＬＧＡ（５０：５０）ポリマー（それぞれＲＧ５０２（Ｍｗ＝１２，７００ダルトン）とＲＧ５０２Ｈ（Ｍｗ＝９，３００ダルトン）；Boehringer Ingelheim Chemicals，Inc.社、Montvale，NJ）を用いた。ブロックＰＬＧＡと非ブロックＰＬＧＡの試料をＭｇＣＯ3（１０％ｗ／ｗ）またはＺｎＣＯ3（１０％ｗ／ｗ）と混合し、粒状でペレットに取り込ませた。ＰＬＧＡに混合する前に、実施例１と同様の方法で塩をふるい分け、粒径を揃えた。塩含有率が０．０％のブロックＰＬＧＡと非ブロックＰＬＧＡを対照として用いた。
カルバーラボラトリープレス機Ｃ型（Carver Laboratory Press Model C）を用いて、ブロックＰＬＧＡまたは非ブロックＰＬＧＡのポリマーペレット（０．０％塩、１０％ｗ／ｗＭｇＣＯ3または１０％ｗ／ｗＺｎＣＯ3含有）を作製した。各ポリマー試料を６０℃で１０分間加熱した後、１５，０００ポンドで１分間圧縮してポリマーペレットを作製した。
実施例３
ポリマーフィルムとペレットの水分取り込み
実施例１のポリマーフィルムと実施例２の対照ポリマーペレットの水分取り込み試験を行った。この試験に用いた緩衝液は、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3、０．１％プルロニックスＦ６８、ｐＨ７．３）またはＰＢＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、７８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3、０．１％プルロニックスＦ６８、ｐＨ７．２）である。ポリマーフィルム試料（５０〜８０ｍｇ）は、３７℃で緩衝液（０．５ｍｌ／ｍｇフィルム）中で保温した。ポリマーペレット試料（１６０ｍｇ）は、３７℃で緩衝液（０．１ｍｌ／ｍｇペレット）中で保温した。保温時、ペレットはシンチレーションバイアルに入れておいた。各測定時点ごとに２つ１組のポリマーフィルム試料を用いて、乾燥重量と湿重量の両方を測定できるようにした。
所定の時間間隔で試料を回収し、吸い取り紙で表面の水分を取り、試料を秤量した。次いで、ポリマー試料の水分取り込み量（湿重量）を重量測定法によって求めた。
次いで、ポリマーフィルム試料とペレット試料を−８０℃で凍結後、乾燥重量が一定になるまで３〜４日間凍結乾燥させた。凍結乾燥後、フィルムの乾燥重量を測定した。緩衝液の全量を保温中のフィルム試料と交換して、水分取り込み量測定に備えた。
各時点における水分取り込み量は下記式を用いて計算した。
％Ｈ2Ｏ取り込み量＝［（水和重量−乾燥重量）／乾燥重量］ｘ１００
２つ１組のフィルム試料について得られた値を平均した。
ブロックＰＬＧＡフィルムの水分取り込み量に及ぼす塩の影響を図１〜８に示した。塩を含まない対照フィルム（ブランクフィルム）は、試験開始後１５日目から２０日目までの期間の水分吸収量の増加が遅くゆっくりしていた（図１）。この期間の後、水分取り込み量の大幅な増加が見られた。この二次水分取り込み相はポリマー分解と関連していた（実施例４参照）。不活性粒子（カーボンブラックまたはガラス粒子）を含有するフィルムは、対照ポリマーフィルムと似た水分取り込みプロフィルを示した（図１）。
不溶性塩（ＭｇＣＯ3、Ｍｇ（ＯＨ）2、およびＺｎＣＯ3）を含有するフィルムはいずれも対照フィルムより大きい初期水分取り込み量を示した（図２〜４）。約３日間の初期取り込み相の出現後、ＭｇＣＯ3およびＭｇ（ＯＨ）2を含有するフィルムの吸水量は３０日後まで変化しなかった。二次水分取り込み相は対照ポリマーフィルムの場合より約２週間後に出現した。
ＺｎＣＯ3フィルムは対照フィルムより連続的で程度も高い水分取り込みを示した（図４）。ＺｎＣＯ3フィルムでは、初期水分取り込み相と二次水分取り込み相の明確な区別はなかった。
Ｍｇ（ＯＡｃ）2含有フィルムはブランクフィルムより初期水分取り込み量が多かったが（図５）、不溶性マグネシウム塩の場合ほど多くはなかった。二次水分取り込み相が出現する２１日目まではそれ以上の水分取り込みは見られなかった。二次水分取り込みはブランクフィルムより数日遅れた時点で起きた。Ｚｎ（ＯＡｃ）2、ＭｇＳＯ4、およびＺｎＳＯ4フィルムによる水分取り込み挙動はＭｇ（ＯＡｃ）2フィルム試料のものと似ていた（図６〜８）。
ブロックＰＬＧＡペレットと非ブロックＰＬＧＡペレットの水分取り込み量を比較したものを図９に示した。最初の１４日間における初期水分取り込み量は非ブロックＰＬＧＡペレットの方がはるかに大きく、このペレットは７日目までに乾燥重量と同じだけの水を吸収した。一方、ブロックＰＬＧＡペレットは１０日目の時点で乾燥重量の３％しか吸収していなかった。１４日目以後は、ポリマーペレットの軟化と分解のために非ブロックポリマーの湿重量の正確な測定はできなかった。
実施例４
ポリマー分解に及ぼす塩の影響
ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で求めた分子量を基準に、ポリマー分解速度に及ぼすカプセル化塩の影響を調べた。実施例１のフィルムと実施例２の対照ペレットを実施例３と同様の方法で水和させた。ポリマー試料をクロロホルム（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）に再度溶解させ、０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。ＧＰＣは、クロロホルムを溶出液とし、屈折率を検出の目安として、ミックストカラム（MIXED column）（３００ｘ１０ｍｍ、Polymer Labs社）を用いて行なった。ポリスチレンを標準物質とし（５８０〜９５０，０００ダルトン）、ユニバーサル校正法を用いて分子量を計算した。
図１０に示したように、対照フィルムの分子量は３０日後に４２０００ダルトンから３０００ダルトンに減少した。
一方、ＭｇＣＯ3含有フィルムの分子量の減少速度は対照フィルムの場合より小さかった（図１０参照）。ＺｎＣＯ3含有フィルムの分子量減少は対照フィルムより遅かったが（図１１）、ＭｇＣＯ3含有フィルムよりは早かった。Ｍｇ（ＯＡｃ）2でも同様の分解動態が見られた（図１２）。
実施例２の対照ペレットについては図１３に示したように、直線最小二乗法で求めた非ブロックＰＬＧＡペレットの初期分解速度はブロックＰＬＧＡペレットの初期分解速度の約６．５倍であった。１０日目以後、ブロックＰＬＧＡペレットの分解速度は非ブロックＰＬＧＡペレットとほぼ同じになったが、これは、非ブロックＰＬＧＡペレットの水分吸収が増加し始める時点に相当する。したがって、いずれの対照ペレットについても、ポリマー分解速度は対照ペレットの水分吸収増大と強く相関していたといえる。
実施例５
ガラス転移温度に及ぼす塩の影響
インジウムを標準物質とし、示差走査熱量計（ＤＳＣ）（ＤＳＣ７シリアル、Perkin Elmer社、Norwalk，CT）を用いて、窒素雰囲気中でフィルムのガラス転移温度（Ｔｇ）を測定した。各試料を０℃まで冷却した後、１０℃／分の速度でで６０℃まで加熱した。実施例３と同様の方法で、凍結乾燥後のフィルム試料のＴｇ測定を行なった。
対照フィルムの経時Ｔｇ低下を図１４に示した。１０日目から１５日目までの期間に見られたＴｇの低下は、ポリマーのＭＷが２０，０００ダルトン未満まで減少する点に対応している。
一方、Ｍｇ塩とＺｎ塩を含有するポリマーフィルムにおけるＴｇ低下率（図１４〜１６）は、無視できる程度であるか（ＭｇＣＯ3の場合、図１４）、対照フィルムより有意に遅かった（ＺｎＣＯ3とＭｇ（ＯＡｃ）2、それぞれ図１５と図１６）。ＭｇＣＯ3およびＺｎＣＯ3含有フィルムでは、塩含有量の増加に伴いＴｇ低下が遅れる傾向が見られた。
実施例６
フィルムの多孔性に及ぼす塩の影響
ＳＥＭを用いてフィルム多孔性の質的変化を観察するとともに、フィルム表面および断面の形態の経時変化をモニターした。試料は、実施例３と同様の方法で凍結乾燥させた。乾燥試料は、厚さ２００〜３００オングストロームの金層をスパッター被覆した後、ＪＥＯＬ−６４００ＳＥＭを用いて観察した。
すべてのフィルムは、水和前には視野全体に少数の孔隙が散在する高密度構造を示したが、水分取り込み速度は含有されている塩によって異なった。したがって、水分取り込み量の増大は試料の初期多孔性とは無関係であったが、ポリマーフィルムに分散されている塩の種類と相関していたことになる。
塩を含まない対照フィルムのＳＥＭ観察で、水和期間が１４日までなら高密度でスムーズな構造が認められた。１４日目から２２日目までの期間では、フィルム表面と試料断面全体に大型の孔隙が見られるようになった。これらの孔隙の外観は、ポリマーの分解と腐食に関連する二次水分取り込み相と一致する（実施例３〜５参照）。
水不溶性塩を負荷したフィルムは、２４時間という短時間の水和後に孔隙数の増加を示した。２％ＭｇＣＯ3含有フィルムを２４時間水和させた試料のＳＥＭ分析で、フィルム試料内、とくにフィルム表面に集中的に孔隙網状構造の形成が認められた。７日後、フィルムは断面全体に均一な孔隙分布を示すようになっていた。孔隙の直径は約１〜２０μｍの範囲であった。７日目から２２日目までの期間ではそれ以上の孔隙増加は見られなかった。ＭｇＣＯ3含有率の高いフィルムでも同様の挙動が見られた。
１０％ＺｎＣＯ3を含有するフィルムも水和開始後３日以内に高度多孔性になっているのが見られた。３日間水和試料は、孔隙網状構造がフィルムの断面全体に広がっているのが見られた。ＺｎＣＯ3含有水和フィルムの形態はＭｇＣＯ3含有水和フィルムのものと似ていた。
水溶性マグネシウム塩を含有するフィルムも、対照フィルムで孔隙形成が起きるより前の時点で、内部および表面の孔隙とボイドを形成した。５日間水和試料では、直径が約１〜５０μｍの範囲の孔隙が見られた。
５〜７日間水和した水溶性塩と不溶性塩を負荷したフィルムの間には形態的な違いが見られた。Ｍｇ（ＯＡｃ）2を負荷したフィルムは、不溶性塩を含有するフィルムと比べて、多孔性が低いように思われ、ボイドが大きい（約５０ミクロン）傾向があった。ＭｇＣＯ3およびＺｎＣＯ3フィルムは多孔性が高かったが、孔隙容積の大半は直径１０ミクロン未満の孔隙で占められていた。
実施例７
ポリマーの重量減量に及ぼす塩の効果
インキュベーションの間ポリマーの重量減量の経時経過をモニターすることにより、水和したポリマー試料中のポリマーの分解における不溶性の塩の効果も評価した。実施例１のフィルム及び実施例２のペレットを、実施例３に記載のように水和した。試料を指示された時間間隔で回収し、実施例３に従って凍結乾燥した。凍結乾燥後、乾燥ポリマーの試料の重量を重量測定した。種々の時間での重量減量パーセントを次式により計算した。
％重量減量（ｔ）＝１００ｘ（Ｗ初期−Ｗt）／Ｗ初期
式中、Ｗ初期は、ポリマーの最初の重量、Ｗtは、t時点における試料の重量を示す。
実施例１のＰＬＧＡフィルムの重量減量に及ぼす種々の塩の効果を図１７に示す。図中に示されるように、対照フィルムの重量減量の経時経過は、１４日までは小さく、その後急速な重量減量が起こる。重量減量のこの相は、水の取り込みの増加により明らかなように、ポリマーの分解と侵食、分子量やＴｇの減少並びにフィルム試料のＳＥＭでの孔隙やボイドの出現と相関している（実施例３、４、５及び６参照）。また、５、１０及び１５％のＭｇＣＯ3を含むポリマーフィルムに対する重量減量のプロフィールを図１７に示す。むしろ、これらのフィルムにおける重量減量は、よりゆるやかで、より小さかった。
ＭｇＣＯ3を含むフィルムに起こる重量減量の一部は、封入された塩粒子の溶解によるためであった。塩を含むフィルム試料において、全重量減量の測定値をいかにポリマーの重量減量値に近似させるかを評価するために、ポリマーの重量減量を、以下の２つの両極端のシナリオに従って測定した。（１）水和開始と第１時点の間ですべての封入された塩が溶解した、及び（２）全試験を通じて塩が溶解しなかった。どちらの塩溶解シナリオが選ばれるかに係わらず、対照フィルムのポリマーの重量減量がＭｇＣＯ3を含むフィルムのそれを超えており、不溶性の塩を組み込むことが、ポリマーのマトリックスの侵食を予防し又は遅らせることが示された。
実施例２のブロックされたＰＬＧＡペレット及びブロックされないＰＬＧＡペレットのポリマーの重量減量における種々の塩及びポリマーの末端基の選択効果を、図１８に示す。図中に示されるように、対照ブロックされたＰＬＧＡペレット（０．０％の塩を有するブロックされたＰＬＧＡペレット）及びブロックされないＰＬＧＡペレット（０．０％の塩を有するブロックされないＰＬＧＡ）の重量減量の経時経過は、それぞれ、１０日と２０日まではほとんど減量せず、その後、急激な重量減量が起こった。従って、ＰＬＧＡ末端基の選択により、実質上ポリマーの分解を調節することが可能である。
また、１０％ＭｇＣＯ3又は１０％ＺｎＣＯ3を含むブロックされないＰＬＧＡペレットにおける重量減量のプロフィールを図１８に示す。ＺｎＣＯ3を含むブロックされないＰＬＧＡペレットにおける重量減量は、対照ブロックされないＰＬＧＡと実質的に異なっていなかった。１０％ＭｇＣＯ3を含むブロックされないＰＬＧＡペレットにおける重量減量は、２５日まではよりゆるやかであった。
さらに、１０％ＭｇＣＯ3又は１０％ＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡペレットにおける重量減量のプロフィールを図１８に示す。ＭｇＣＯ3又はＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡペレットにおける重量減量は、対照ブロックされたＰＬＧＡペレットよりも実質的によりゆるやかで、より小さかった。これらのブロックされたＰＬＧＡペレットは、３０日後まではほとんど重量減量がなかった。
実施例８
ブロックされたＰＬＧＡ微粒子のイン・ビボ及びイン・ビトロでの分解における炭酸亜鉛の効果の比較
６％ｗ／ｗＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡ微粒子（５０：５０ＰＬＧＡ、１０，０００ダルトン；Ｌｏｔ＃１１５−５６−１、バーミンガムポリマーズ社、Birmingham，AL）を、ゴンボッツ（Gombotz）らに発行された米国特許第５，０１９，４００号に記載された方法により作製した。具体的には、ＰＬＧＡの塩化メチレン溶液に、ＺｎＣＯ3を粒子の状態で添加し、４℃で３０秒間超音波処理して懸濁させた。それから、凍結エタノールを重層した液体窒素中に該懸濁液をスプレーした。塩化メチレンは、−８０℃でエタノール中に抽出された。微粒子を濾過し、凍結乾燥して乾燥粉末を調製した。
ブロックされたＰＬＧＡのイン・ビトロでの分子量分解に及ぼす炭酸亜鉛の効果を測定した。３７℃で１０ｍｇ微粒子／ｍｌの濃度で、ブロックされたＰＬＧＡ微粒子をＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中でインキュベートした。微粒子試料を指定された時間間隔で回収し、−８０℃で凍結することによりフリーズドライし、続いて２〜３日間凍結乾燥させた。
また、ブロックされたＰＬＧＡのイン・ビボでの分子量分解に及ぼす炭酸亜鉛の効果を測定した。各試験群３匹のラットを有する正常ラット（Taconics，Inc．社）の別々の試験群に、０．０％及び６％ｗ／ｗＺｎＣＯ3を含むＰＬＧＡ微粒子を投与した。ラットの肩甲骨の内側の領域に７５０μｌのビイクル（生理食塩水中３％カルボキシメチルセルロース（低粘度）と１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）中、５０ｍｇの微粒子の用量を注射した。
ラット（雄性スプラーク−ドーリー）をハロタンと酸素の混合物で麻酔した。注射部位（肩甲骨の内側の領域）を剃り、永久的な入れ墨で印を付けて、サンプリングの時点で皮膚の正確な切除ができるようにした。１８〜２１ゲージの針を用いて微粒子の全バイアルを各ラットに注射した。
ブロックされたＰＬＧＡ微粒子を受けた動物に対して、指定された日に（注射後１５日目と３０日目）、ラットをＣＯ2ガスで窒息させることにより死亡させ、注射部位の皮膚（微粒子を含む）を切除した。それから、残余の微粒子を集めた。
ブロックされたＰＬＧＡポリマーのイン・ビトロ及びイン・ビボでのポリマーの分解速度に及ぼすＺｎＣＯ3の効果を、実施例３に記載のゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定した分子量を用いて測定した。これらの分析結果を図１９と２０に示す。図中に示されるように、ＺｎＣＯ3の添加は、実質的にイン・ビトロ及びイン・ビボでの微粒子の両方で、ブロックされたＰＬＧＡの分子量の分解を遅らせた。
実施例９
ＰＬＧＡ微粒子からのＲＮアーゼ−Ａ又はＡＣＴＨの放出に及ぼす塩の効果
ＲＮアーゼ−Ａ（Ｒ５５００；Sigma Chemicals社）を脱イオン水に溶解させることにより、１０ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼ−Ａ溶液を調製した。凍結乾燥したブタＡＣＴＨ粉末（Diosynth社、Chicago，IL）を６０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液に溶解して、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の緩衝液を調製した。
それから、別々の手順で、各溶液（ＲＮアーゼ−Ａ溶液及びＡＣＴＨ緩衝溶液）を超音波ノズル（タイプＶ１Ａ、Sonics and Materials，Inc．社、Danbury，CT）を用いて微小化し、ポリプロピレン管（直径１７ｃｍ、深さ８ｃｍ）中の液体窒素にスプレーし、ＲＮアーゼ−Ａ溶液の凍結粒子又はＡＣＴＨ緩衝溶液の凍結粒子を調製した。その後、ポリプロピレン管を−８０℃のフリーザー内に置いて液体窒素を蒸発させた。それから、ＲＮアーゼ−Ａ溶液の凍結粒子又はＡＣＴＨ緩衝溶液の凍結粒子を凍結乾燥させて、それぞれ、凍結乾燥ＲＮアーゼ−Ａ又は凍結乾燥緩衝ＡＣＴＨを調節した。
それから、凍結乾燥ＲＮアーゼ−ＡをＺｎＣＯ3またはＭｇ（ＯＨ）2のいずれかとともに５０００ダルトンのブロックされたＰＬＧＡ（Ｉ．Ｖ．０．１５ｄｌ／ｇBirmingham Polymers社，Birmingham，AL）内に微粒子化した。ゴンボッツ（Gombotz）らに発行された米国特許第５，０１９，４００号に記載された方法を用いて、０％、５％、１０％又は１５％ｗ／ｗの塩を含むＰＬＧＡ中に凍結乾燥ＲＮアーゼ−Ａ（１０％ｗ／ｗ）をカプセル化した。具体的には、凍結乾燥ＲＮアーゼ−Ａ及び塩を、塩化メチレン中のＰＬＧＡ溶液に粒子の状態で添加し、４℃で３０秒間超音波処理をして懸濁させた。それから、凍結エタノールを重層した液体窒素中に該懸濁液をスプレーした。塩化メチレンを、−８０℃でエタノール中に抽出した。微粒子を濾過し、凍結乾燥して乾燥粉末を調製した。
凍結乾燥緩衝ＡＣＴＨも、上述の方法により、ＭｇＣＯ3を含む同じ型のＰＬＧＡ内に微粒子化した。
ＲＮアーゼ−Ａ及びＡＣＴＨのイン・ビトロ放出の動態に及ぼす塩の効果を測定した。３７℃で１ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に２０ｍｇの微粒子を懸濁させることにより、放出試験を行った。２ｍｌのポリプロピレンエッペンドルフチューブ中で測定を行った。ＡＣＴＨの放出試験は、ＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりにＰＢＳを用いることを除いて、同様に行った。指示された時点で、十分緩衝液を除き、新しい緩衝液に置換した。緩衝液中のＲＮアーゼ−Ａの濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイ（Pierce社、Rockford，IL）を用いて測定し、ＡＣＴＨの濃度は、Ｂｉｏｒａｄプロテインアッセイ（Biorad社、Richmond，CA）を用いて測定した。
ＲＮアーゼ−Ａの放出動態に及ぼすＭｇ（ＯＨ）2又はＺｎＣＯ3の効果を、図２１及び２２に示す。ＰＬＧＡ内にカプセル化したＲＮアーゼ−Ａは、単独で最初の２４時間にわたって、タンパク質の放出が見られ、その後、２１日目までさらなる放出は観察されなかった。Ｍｇ（ＯＨ）2は、１４日以上持続的なタンパク質の放出という結果となった。ＺｎＣＯ3は、３５日以上持続的なタンパク質の放出という結果となった。
ＡＣＴＨの放出動態に及ぼすＭｇＣＯ3の効果を、図２３に示す。ＰＬＧＡ内にカプセル化したＡＣＴＨは、単独で最初の２４時間にわたって、タンパク質の約４０％の放出が見られ、その後、さらなる放出は観察されなかった。ＭｇＣＯ3は、同様な期間、持続的なタンパク質の放出という結果となった。
実施例１０
ＰＬＧＡ微粒子からのインターフェロン−α２、ｂのイン・ビボ放出に及ぼす塩の効果
本明細書で使用するインターフェロン−α、２ｂ（ＩＦＮ−α、２ｂ）は、ＩＦＮ−α、２の２３位のリジンがＩＦＮ−α、２ｂのアルギニンである点を除き、ルーベンスタイン（Rubenstein）ら、Biochem．Biophys．Acta，695:705-716（1982）に記載のＩＦＮ−α、２と同一である。ＩＦＮ−α、２ｂを１０ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解してＩＦＮ溶液を調製した。脱イオン水と酢酸亜鉛二水和物により、１０ｍＭ  Ｚｎ+2溶液を調製し、それから、Ｚｎ+2：ＩＦＮ−α、２ｂを２：１のモル比でＩＦＮ溶液に添加し、ＩＦＮ−α、２ｂの最終濃度が約１．３ｍｇ／ｍｌを有する溶液を調製した。それから、１％酢酸を添加することにより、溶液のｐＨを７．１に調整した。そして、Ｚｎ+2−安定化ＩＦＮからなる曇った懸濁状の沈殿物が生成した。
実施例９と同様に、該懸濁液を微小化し、凍結し、凍結乾燥して、次に乾燥させてＩＦＮ粉末を調製した。炭酸亜鉛とＩＦＮ粉末を、それぞれ、約１：１、３：１及び８：１の質量比で、約４ｍｌの塩化メチレン中約０．４ｇのＰＬＧＡを含むＰＬＧＡ溶液に添加し、それから、また実施例９と同様に、ＰＬＧＡ中に微粒子化し、ＩＦＮ微粒子を調製した。
それから、凍結乾燥したＺｎ−ＩＦＮ沈殿物からのＩＦＮのイン・ビボでの放出動態に及ぼす炭酸亜鉛の効果を測定した。各試験群３匹のラットを有する正常ラット（Taconics，Inc．社）の別々の試験群に、各型のＩＦＮ微粒子を投与した。ラットの肩甲骨の内側の領域に０．５％ゼラチン、１％グリセロール及び０．９％ｗ／ｗのＮａＣｌのビイクル中、０．９ｍｇ／ｋｇの微粒子の用量を注射した。それから、注射後、１、２、４、８、１２、２４、３２、２８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間に、各ラットの尾の静脈から血液試料を採取した。それから、ＩＦＮ−αイムノラジオメトリックアッセイ（Celltech社、Slough，U.K.）を用いて、ラット血清試料中のＩＦＮ−α、２ｂの濃度を決定した。アッセイの結果を図２４に表す。図より、免疫学的に活性なＩＦＮ−α、２ｂの持続した放出レベルは、ＰＬＧＡポリマー中の凍結乾燥したＺｎ−ＩＦＮに対するＺｎＣＯ3の比率に依存して調節されていたことが示される。ＺｎＣＯ3：凍結乾燥したＺｎ−ＩＦＮの比率がより高くなると、ＩＦＮ−α、２ｂの血清レベルにより測定されるように、微粒子由来のＩＦＮ−α、２ｂの放出比率がより低くなることがわかった。
実施例１１
イン・ビボでのＰＬＧＡ分解に及ぼす末端基の効果
ゲッデル（Goeddel）らに発行された米国特許第４，８９８，８３０号にＤＮＡ配列が記載されているＺｎ+2で安定化したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含む微粒子を、遊離のカルボキシ末端基を有する親水性ポリマーＲＧ５０２Ｈ（以下、ブロックされないＰＬＧＡと称す）（５０：５０ＰＬＧＡ、９，３００ダルトン；Boehringer Ingelheim Chemicals，Inc．社）又はブロックされたカルボキシ末端基を有するより疎水性なポリマー（以下、ブロックされたＰＬＧＡと称す）（５０：５０ＰＬＧＡ、１０，０００ダルトン；Lot#115-56-1、Birmingham Polymers Inc．社、Birmingham，AL）から調製した。
第１に、亜鉛と不溶性の複合体を形成することにより、ｈＧＨをＺｎ+2で安定化させた。重炭酸緩衝液中のｈＧＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）に、酢酸亜鉛の０．９ｍＭ水溶液を添加し（０．３３６ｍｇ／ｍｌ）、Ｚｎ：ｈＧＨが６：１のモル比を有する不溶性の複合体を形成させた。該複合体のｐＨを、１％の酢酸で約７．２に調整した。
実施例９に記載の方法を用いて、Ｚｎ：ｈＧＨ複合体の形態での０％又は１５％ｗ／ｗのｈＧＨ、さらに０％、１％又は６％ｗ／ｗのＺｎＣＯ3塩を、ブロックされたＰＬＧＡ並びにブロックされないＰＬＧＡ内にカプセル化することにより、微粒子を調製した。微粒子の試料をラットに注射し、それから注射後種々の時間で注射部位に残る微粒子を分析することにより、ブロックされないＰＬＧＡ微粒子対ブロックされたＰＬＧＡ微粒子のイン・ビボでの分解を比較した。各微粒子の試料に対して各時点で３匹のラットをアッセイした。微粒子の投与日に、７５０μｌのビイクル（生理食塩水中３％カルボキシメチルセルロース（低粘度）と１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）を、５０±１ｍｇの微粒子を含むバイアルに添加した。その直後に、バイアルを強く振って懸濁液を作り、それから針のない１．０ｃｃのシリンジに、該懸濁液を吸入させた。
ラット（雄性スプラーク−ドーリー）をハロタンと酸素の混合物で麻酔した。注射部位（肩甲骨の内側の領域）を剃り、永久的な入れ墨で印を付けて、サンプリングの時点で皮膚の正確な切除ができるようにした。１８〜２１ゲージの針を用いて微粒子の全バイアルを各ラットに注射した。
指定された日に（ブロックされたＰＬＧＡ微粒子を受けた動物に対しては注射後１５、３０、５９及び９０日目又はブロックされないＰＬＧＡ微粒子を受けた動物に対しては注射後７、１４、２１、２８及び４５日目）、ラットをＣＯ2ガスで窒息させることにより死亡させ、注射部位の皮膚（微粒子を含む）を切除した。微粒子は、注射部位に固まる傾向があったので、微粒子が存在するか又は存在しないかは、目視により決定された。
視覚的な調査により、ブロックされないＰＬＧＡ微粒子は、ブロックされたＰＬＧＡ微粒子よりも実質的に速く分解し、ブロックされたＰＬＧＡへのＺｎＣＯ3の添加は、実施的にポリマーの分解を遅らせることがわかった。例えば、０％ｈＧＨ並びに０％もしくは１％ＺｎＣＯ3を含むブロックされないＰＬＧＡ微粒子を注射したラットにおいて、２１日目には微粒子が見られなかった。さらに、０％ｈＧＨ及び０％ＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡ微粒子を注射したラットにおいて、６０日目にはわずかの微粒子しか見られず、９０日目には全く微粒子が見られなかった。さらに、０％もしくは１５％ｈＧＨ並びに６％ＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡ微粒子を注射したラットにおいては、９０日目に微粒子が見られた。
実施例１２
ブロックされたＰＬＧＡ−Ｚｎ+2で安定化したｈＧＨ微粒子のイン・ビボでの分解後のｈＧＨのアッセイ
実施例９に記載の方法により、１６％ｗ／ｖのＺｎ+2で安定化したｈＧＨ及び０％、６％、１０％もしくは２０％ＺｎＣＯ3を含むブロックされたＰＬＧＡ微粒子を調製した。また、実施例１１に記載の方法により、５０ｍｇの種々のｈＧＨ微粒子の試料を、試験ラット群に注射した。６０日後にラットを殺し、注射部位から皮膚の試料を切除した。少なくとも２４時間、切除された皮膚の試料を１０％の中性緩衝ホルマリン中に置いた。それから、該試料から剃刀の刃で余分な皮膚を取り除き、ＰＢＳ中に置いた。組織試料は、Pathology Associates，Inc．社（Frederick，MD）により処理された。皮膚の試料をグリコメタクリレート中に包埋させ、切片を作り、HistoScan/LymphoScan Staining Kit（製品#24-408M;Accurate Chemical & Scientific Corp．社、Westbury，NY）を用いて、製造者の指示に従って、ｈＧＨの存在をアッセイした。組織試料は、試料中のｈＧＨの有無の指標となる染色の有無を記録した。ｈＧＨ微粒子の注射を伴う皮膚の試料はすべて、ｈＧＨの存在が陽性という試験結果となり、ブロックされたＰＬＧＡ微粒子は、イン・ビボで６０日経過後もｈＧＨを含有していることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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