(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、
配列番号３９のアミノ酸番号２４〜７９からなるアミノ酸配列の少なくとも一部からなり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡと、
他のタンパク質をコードするＤＮＡとを含み、核局在化シグナルと、前記ポリペプチドと、前記他のタンパク質とからなる融合タンパク質を発現し得るベクターであって、
ベクターを保持する細胞において、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、ベクター。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項５】
前記細胞が微生物細胞である請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記微生物がエシェリヒア・コリである請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が培養細胞である請求項４に記載の細胞。
【請求項８】
前記他のタンパク質が標識のためのタンパク質である請求項３に記載のベクターを保持
する細胞であって、低酸素条件下の細胞を、標識のためのタンパク質の存在をモニターすることにより検出する方法であって、低酸素条件下の細胞において標識のためのタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において標識のためのタンパク質は分解される、低酸素条件下の細胞を検出する方法。
【請求項９】
請求項１に記載のベクターを保持する細胞において、酸素濃度に依存した他のタンパク質の安定性を利用して細胞内の他のタンパク質の存在を調節する方法であって、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、細胞内の他のタンパク質の存在を調節する方法。
【請求項１０】
核局在化シグナルと、配列番号３９のアミノ酸番号２４〜７９からなるアミノ酸配列の少なくとも一部からなり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、他のタンパク質とからなる融合タンパク質を保持する細胞において、酸素濃度に依存した他のタンパク質の安定性を利用して細胞内の他のタンパク質の存在を調節する方法であって、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、細胞内の他のタンパク質の存在を調節する方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記他のタンパク質が細胞毒性を有するタンパク質である請求項３に記載のベクターを保持する細胞において、前記細胞毒性を有するタンパク質を利用して、低酸素条件下の細胞の生育を阻害する方法であって、低酸素条件下の細胞において前記細胞毒性を有するタンパク質は安定に存在する、低酸素条件下の細胞の生育を阻害する方法。
【請求項１３】
核局在化シグナルと、膜透過性活性を有するタンパク質と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと、他のタンパク質とからなる融合タンパク質であって、融合タンパク質を保持する細胞において、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、融合タンパク質。（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号３９のアミノ酸番号２４〜７９からなるアミノ酸配列の少なくとも一部からなり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１４】
前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）を含むタンパク質である請求項１３に記載の融合タンパク質。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項１５】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質と、他のタンパク質とからなる融合タンパク質であって、融合タンパク質を保持する細胞において、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、融合タンパク質。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号３９のアミノ酸番号２４〜７９からなるアミノ酸配列の少なくとも一部からなり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項１６】
前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である請求項１３〜１５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞外から細胞内へ透過させ、細胞内が低酸素条件下であるとき前記融合タンパク質は安定に存在させ、細胞内が有酸素条件下であるとき前記融合タンパク質を分解させる、細胞内のタンパク質の存在を調節する方法。
【請求項１８】
核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、膜透過性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡと、他のタンパク質をコードするＤＮＡとを含み、核局在化シグナルと、膜透過性活性を有するタンパク質と、前記ポリペプチドと、前記他のタンパク質とからなる融合タンパク質を発現し得るベクターであって、ベクターを保持する細胞において、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、ベクター。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号３９のアミノ酸番号２４〜７９からなるアミノ酸配列の少なくとも一部からなり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１９】
前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）を含むタンパク質である請求項１８に記載のベクター。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項２０】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）を含むタンパク質をコードするＤＮＡと、他のタンパク質をコードするＤＮＡとを含み、ＴＡＴを含むタンパク質と、前記ポリペプチドと、前記他のタンパク質とからなる融合タンパク質を発現し得るベクターであって、ベクターを保持する細胞において、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、ベクター。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号３９のアミノ酸番号２４〜７９からなるアミノ酸配列の少なくとも一部からなり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項２１】
前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である請求項１８〜２０の何れか一項に記載のベクター。
【請求項２２】
配列番号３９のアミノ酸番号２４〜７９からなるアミノ酸配列の少なくとも一部からなり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列のうち連続した少なくとも１６個以上のアミノ酸残
基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、他のタンパク質とを含む融合タンパク質を保持する細胞において、酸素濃度に依存した他のタンパク質の安定性を利用して、細胞内の他のタンパク質の存在を調節する方法であって、低酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において前記他のタンパク質は分解される、細胞内の他のタンパク質の存在を調節する方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドと他のタンパク質にさらに膜透過性活性を有するタンパク質を融合させることにより、細胞外から透過された該融合タンパク質を保持する細胞において他のタンパク質の存在を調節する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の方法であって、前記他のタンパク質が標識のためのタンパク質であるとき、標識のためのタンパク質の存在をモニターし低酸素条件下の細胞を検出するために用いる方法であって、低酸素条件下の細胞において標識のためのタンパク質は安定に存在し、有酸素条件下の細胞において標識のためのタンパク質は分解される、方法。
【請求項２５】
請求項２２又は２３に記載の方法であって、前記他のタンパク質が細胞毒性を有するタンパク質であるとき、細胞毒性を有するタンパク質を利用し低酸素条件下の細胞の生育を阻害するために用いる方法であって、低酸素条件下の細胞において細胞毒性を有するタンパク質は安定に存在する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有酸素条件下におかれた細胞内でタンパク質を不安定化させるポリペプチドと、同ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び同ＤＮＡを利用する方法に関する。また、該ＤＮＡを含み、細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質を発現し得るベクターに関する。
【０００２】
さらに本発明は、上記ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質、及び、該融合タンパク質を用いる方法に関する。また、該融合タンパク質を発現し得るベクターに関する。
【０００３】
本発明は、微生物工業、医薬、医療等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００４】
固形腫瘍内の酸素分圧は均一ではなく、腫瘍細胞はさまざまな酸素環境にさらされている。これは、血管から腫瘍組織へ酸素分子が拡散する距離が限られていることに起因する。放射線生物学の分野では、各腫瘍細胞に供給される酸素量に応じて固形腫瘍の内部を１）有酸素領域、２）懐死領域、３）低酸素領域という３つの領域に分類している。
【０００５】
１）毛細血管からの距離がおよそ７０μｍまでの腫瘍細胞には酸素分子が非常に多く供給されることから、この領域は有酸素領域と呼ばれている。固形腫瘍に対する放射線治療の効果を得るためには酸素分子が必須である。したがって文字どおり酸素分子に富む有酸素領域は、放射線感受性が非常に高い領域である事が知られている。化学療法を実施する際にも、血管系から有酸素領域へ抗癌剤が容易に拡散する事から、有酸素領域に対する化学療法の治療効果は高いと考えられている。
【０００６】
２）血管から放出された酸素分子は拡散途中に有酸素領域の腫瘍細胞に消費される。し
たがって、毛細血管から遠い領域に存在する腫瘍細胞には生存に十分な酸素分子が供給されない。その結果、血管系からの距離がおよそ７０μｍ以上離れている腫瘍細胞は懐死に陥り、懐死領域を形成している。
【０００７】
３）これら有酸素領域と懐死領域の間の領域に低酸素性細胞からなる低酸素領域が存在する。低酸素領域には腫瘍細胞の生存に必要最低限の酸素分子は供給されている。しかし、放射線治療の効果を得るために十分な量の酸素分子は供給されていない状態になっている。したがって、腫瘍内低酸素領域は放射線感受性が非常に低く、放射線治療後の腫瘍再増殖の一因であるとされている。化学療法を行う際においても、血管系から低酸素領域へ拡散する抗癌剤の量が限られている事から、十分な治療効果を期待できないのが現実である。
【０００８】
また、この様な低酸素性細胞の存在の確認は困難であった。それは、細胞に於ける酸素の存在状態をモニターする手段が実質的に存在しなかったためである。この様な低酸素性細胞のモニター方法としては、微小電極を用いて細胞の酸素電圧を測定する方法や、低酸素性細胞指示薬として知られるピモニダゾール(Hypoxyprobe-1)を用いた免疫組織染色、さらに低酸素条件下におかれた細胞内で発現が誘導される遺伝子産物を標識とする免疫組織染色等が知られている。ところが、これらは技術的にも難しいばかりか、装置も複雑で汎用されていないのが現状であった。即ち、汎用的な低酸素細胞の検知手段の開発が望まれていた。
【０００９】
また、上述のとおり、癌療法に於いては、低酸素性癌細胞の存在は、放射線治療や化学療法剤による治療の妨げになるものであり、これらを効果的に取り除く手段が望まれていた。この様な低酸素性細胞に対する処置としては、低酸素性細胞放射線増感剤と放射線治療の併用が知られているのみであったが、目下１品が臨床試験にあるのみで、現在実用に供されている低酸素性細胞放射線増感剤はまだ存在していない。これは、低酸素性細胞放射線増感剤の母核である２−二トロイミダゾールに神経毒性があり、この毒性と薬効とのコントロールが難しかったことに起因する。即ち、効果的に低酸素性の癌細胞を駆逐する手段の開発が望まれていた。
【００１０】
ところで、低酸素環境にある細胞内では血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)や赤血球系前駆細胞増殖因子(erythropoietin; EPO)をはじめとする生理的に重要な遺伝子の発現が誘導される。これらの遺伝子の発現は低酸素誘導因子−１(hypoxia-inducible factor-1 complex,以下HIF-1)によって転写レベルで誘導される。
【００１１】
ＨＩＦ−１はＨＩＦ−１αタンパク質とＨＩＦ−１βタンパク質からなるヘテロダイマーである。両サブユニットともそのＮ末端にベーシック−ヘリックス−ループ−ヘリックス・ドメイン(basic-helix-loop-helix domain; bHLH domain)と呼ばれるＤＮＡへの結合を担う領域と、パス・ドメイン(PER-aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT)-SIM (PAS) domain)と呼ばれるヘテロダイマーの形成を担う領域を有する。また、ＨＩＦ−１αタンパク質は２つのトランスアクティベーションドメイン(N-/ C- transactivation domain; N-TAD, C-TAD)を有することも明らかになっている。
【００１２】
近年、ＨＩＦ−１の酸素濃度に依存した活性化機構が明らかになった。ＨＩＦ−１β  ｍＲＮＡの転写、および翻訳は常に活性化されており、その遺伝子産物（タンパク質）は外界の酸素分圧に非依存的に常に発現している。同様にＨＩＦ−１α  ｍＲＮＡの転写、および翻訳も常に活性化されているが、生合成されたＨＩＦ−１αタンパク質は有酸素条件下で積極的に分解され、低酸素条件下でのみ安定に存在する。
【００１３】
このように、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定性は外界の酸素濃度に依存して制御されて
おり、主にそのタンパク質量に依存してＨＩＦ−１の転写活性も制御されていることが明らかになっている。
【００１４】
また、現在までにHIF-1αの部分欠失変異体を用いた実験で、HIF-1αの低酸素条件下での安定化には401a.a.-603a.a.の領域が重要である事が報告されている（Huang LE, Gu J,
Schau M and Bunn HF. 1998. Regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:7987-7992.：文献１（非特許文献１））。この領域はODDドメイン（Oxygen Dependent Degradation domain）と呼ばれている。
【００１５】
ＨＩＦ−１αの酸素依存的安定性は、この領域にあるアミノ酸残基が、有酸素状態で酸素依存的になんらかの修飾を受けることが示唆されており、最終的にユビキチン化され、プロテアゾームで分解されることが判っていた(Huang, L. E., Gu, J. Schau, M. and Bunn, H. F. Regulation of hypoxia-inducible factor 1α is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 7987-7992, 1998.)。
【００１６】
従って、ＨＩＦ−１αの安定性は、プロテアゾーム阻害剤、例えばN-カルボベンゾキシル-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ノルバリナル（N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norvalinal）（以下、「Cbz-LLL」ともいう）(Rock, K. L., Gramm, C., Rothstein, L., Clark, K., Stein, R., Dick, L., Hwang, D. and Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell 78: 761-771, 1994.: 文献３（非特許文献２）)を加えた培地で培養することにより、低酸素状態と同様の安定性を得ることができることも判っていた(Sutter, C. H., Laughner, E. and Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1α protein exprssion is controlled by oxygen-regulated ubiquitination that is disrupted by deletions and missense mutations. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 97: 4748-4753, 2000.: 文献４（非特許文献３）)。このことから、該ポリペプチドを含む融合蛋白の分解も、ＨＩＦ−１α同様にユビキチン−プロテアゾームによる分解機構を介しておこなわれることが想定され、低酸素状態およびCbz-LLLを含む培地で安定化することが想定された。
【００１７】
また、HIF-1αタンパク質の530a.a.-652a.a.を融合させたGal-4タンパク質は、酸素濃度が高い場合にのみ培養細胞内で積極的に分解されるといった制御を受ける事が報告されている（Vickram Srinivas,Li-Ping Zhang,Xiao-Hong Zhu and Jaime Caro .1999.Characterization of an Oxygen/Redox-Dependent Degradation Domain of Hypoxia-Inducible Factorα（HIFα）Proteins.Biochem.Biophy.Res.Com.260:557-561：文献５（非特許文献４））。また、Gal-4とHIF-1αの529a.a.-826a.a.を融合させた遺伝子の中のHIF-1α561a.a.-568a.a.をアラニン残基に置換すると、上記の制御が消失する事も報告されている。この事から、マウスのHIF-1αからヒトのHIF-1αまで良く保存されているHIF-1αの561a.a.-568a.a.を中心とする領域が 酸素濃度に依存したタンパク質の安定化に関わっているのではないかと推測されている。尚、HIF-1αの557a.a.−571a.a.の領域が、HIF-1αタンパク質の安定性の制御に重要な役割を果たしているのではないかとも論じられている（上記文献５）。
【００１８】
しかしながら、本発明者らは、前記557a.a−571a.a.の領域のみでは、融合タンパク質の安定化を酸素濃度に依存させることができないことを見い出した。また、ＨＩＦ−１αタンパク質のうち、融合タンパク質の安定化に関与する領域は同定されているとはいえなかった。
【００１９】
一方、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）由来のTATと呼ばれるタンパク質が細胞膜を通過する活性を持つ事が1988年に報告されている（Cell ; 55,1179(1988)、Proc.Natl.Acad.Sci
USA ; 91,664(1994)）。その後、TATタンパク質のわずか11アミノ酸からなる領域（TAT protein transduction domain）が上記の活性を担っている事が明らかにされた。同時にこのTAT protein transduction domainが融合されたβ−ガラクトシダーゼのタンパク質が細胞内に取り込まれる事も報告されている。
【００２０】
しかし、上記ＨＩＦ−１αとＴＡＴの関係、ひいてはＨＩＦ−１αと膜透過性活性を有するタンパク質の関係については従来知られておらず、よって、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定化を制御する特定領域を利用して、該特定領域を有するＨＩＦ−１αタンパク質、膜透過性活性を有するタンパク質及び他のタンパク質を融合したときに、該融合タンパク質を細胞内に取り込ませることができること、並びに融合タンパク質を保持する細胞内において、融合タンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与することができることについては知られていない。
【００２１】
【非特許文献１】Huang LE, Gu J, Schau M and Bunn HF. 1998. Regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:7987-7992
【非特許文献２】Rock, K. L., Gramm, C., Rothstein, L., Clark, K., Stein, R., Dick, L., Hwang, D. and Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell 78: 761-771, 1994.
【非特許文献３】Sutter, C. H., Laughner, E. and Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1α protein exprssion is controlled by oxygen-regulated ubiquitination that is disrupted by deletions and missense mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 4748-4753, 2000.
【非特許文献４】Vickram Srinivas,Li-Ping Zhang,Xiao-Hong Zhu and Jaime Caro .1999.Characterization of an Oxygen/Redox-Dependent Degradation Domain of Hypoxia-Inducible Factorα（HIFα）Proteins.Biochem.Biophy.Res.Com.260:557-561
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、上記の様な状況下なされたものであり、融合させることによって任意のタンパク質の安定性を酸素濃度依存的に制御し得るＨＩＦ−１αタンパク質の領域を同定すること、及び、同領域を利用して酸素の多少に応じ、特定遺伝子の発現、及びそれに対応する融合タンパク質の発現を制御することを課題とする。
【００２３】
また、特定されたＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を有するタンパク質を含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質、及び、該融合タンパク質を好適に細胞に取り込ませ、かつ取り込ませた細胞において、酸素の多少に応じ融合タンパク質の安定性を調節することができる、融合タンパク質の調節方法を提供することを課題とする。
【００２４】
また、これら融合タンパク質を発現し得るベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＩＦ−１αタンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列を有する領域が、同領域を融合させたタンパク質が有酸素下で分解を受ける場合のシグナルとなる部分の要部となっていることを見出した。
【００２６】
また、上記特定領域を有するＨＩＦ−１αタンパク質と膜透過性活性を有するタンパク質とを含む融合タンパク質は好適に細胞に取り込まれることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２７】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（２）低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて安定化される（１）に記載のＤＮＡ。
（３）配列番号２の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する（１）又は（２）に記載のＤＮＡ。
（４）核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、核局在化シグナル、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（５）前記他のタンパク質をコードするＤＮＡを含む（４）に記載のベクター。
（６）細胞内が有酸素条件下であるときに、ベクター含有細胞において前記融合タンパク質を不安定にさせ得る（５）に記載のベクター。
（７）前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である（６）に記載のベクター。
（８）（４）〜（７）のいずれかに記載のベクターが導入された細胞。
（９）前記細胞が微生物細胞である（８）に記載の細胞。
（１０）前記微生物がエシェリヒア・コリである（９）に記載の微生物。
（１１）（７）に記載のベクターを保持する細胞であって、前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質である細胞において、同タンパク質の存在状態をモニターすることを特徴とする、低酸素条件下の細胞を検出する方法。
（１２）（６）に記載のベクターを細胞に導入し、同ベクターがコードする融合タンパク質を発現させることを特徴とする、細胞内のタンパク質存在の調節方法。
（１３）タンパク質をコードするＤＮＡを保持する細胞における同タンパク質の存在を調節する方法であって、前記ＤＮＡに核局在化シグナル及び（１）に記載のＤＮＡを連結し、核局在化シグナル、（１）に記載のＤＮＡがコードするポリペプチド及び前記タンパク質が融合した融合タンパク質として発現させることを特徴とする方法。
（１４）前記融合タンパク質を、低酸素条件下では細胞中に存在させ、有酸素条件下では存在させないように調節することを特徴とする（１３）に記載の方法。
（１５）前記他のタンパク質が、細胞毒性を有するタンパク質である（７）に記載のベクターを細胞に保持させ、低酸素条件下で同ベクターがコードする融合タンパク質を細胞中に存在させることを特徴とする、低酸素条件下の細胞の生育を阻害する方法。
（１６）核局在化シグナルと、膜透過性活性を有するタンパク質と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと、他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（１７）前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質である（１６）に記載の融合タンパク質。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（１８）以下の（Ａ）又は（Ｂ１）に示すポリペプチドと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質と、他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
（Ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、ＴＡＴからなるタンパク質、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（１９）低酸素条件下の細胞内では有酸素条件下に比べて安定に存在する（１６）〜（１８）の何れかに記載の融合タンパク質。
（２０）前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である（１６）〜（１９）の何れかに記載の融合タンパク質。
（２１）（１６）又は（１８）に記載の融合タンパク質を細胞外から細胞内に透過させ、該透過した細胞中における酸素状態に応じて、該融合タンパク質の安定性を調節することを特徴とする、融合タンパク質存在の調節方法。
（２２）低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質を有酸素条件下に比べて安定に存在させる（２１）に記載の融合タンパク質存在の調節方法。
（２３）核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、膜透過性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したときに、核局在化シグナル、膜透過性活性を有するタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（２４）前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質である（２３）に記載のベクター。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（２５）以下の（Ａ）又は（Ｂ１）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したときに、ＴＡＴからなるタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（Ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からな
るアミノ酸配列を有し、かつ、ＴＡＴからなるタンパク質、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（２６）低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて安定に存在する（２３）〜（２５）の何れかに記載のベクター。
（２７）ポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する（２３）〜（２５）の何れかに記載のベクター。
（２８）ＴＡＴからなるタンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号５の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する（２３）〜（２５）の何れかに記載のベクター。
（２９）前記他のタンパク質をコードするＤＮＡを含む（２３）〜（２８）の何れかに記載のベクター。
（３０）前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である（２９）に記載のベクター。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を同定することができた。
また、特定されたＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を有するタンパク質を含む融合タンパク質であって、細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質を提供することができた。
【００２９】
また、特定されたＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を有するタンパク質を含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質を提供することができた。
【００３０】
本発明により、融合タンパク質を保持する細胞内において、酸素の多少に応じ所望のタンパク質の存在を調節することができるため、低酸素条件下の細胞を検出すること、及び低酸素条件下の細胞の生育を阻害すること等に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３２】
本発明の第１の発明であるＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。該ポリペプチドは核局在化シグナル（以下、「ＮＬＳ」ともいう）、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与する。
【００３３】
そして、上記融合タンパク質は、該融合タンパク質を保持する細胞が、低酸素条件下にあるときは、有酸素条件下に比べて、安定的に保持される。また、有酸素条件下の細胞内においては、低酸素条件下に比べて速やかに分解される。
【００３４】
本発明において、例えば、インキュベータの中の酸素濃度を１％以下にした細胞培養は低酸素条件である。
【００３５】
第１の発明のＤＮＡは、コードされるポリペプチドが、同ポリペプチドを含む融合タンパク質に、前記のような細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与することができる限り、その一部であってもよい。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する１６個以上、好ましくは１７個以上、より好ましくは１８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有しているポリペプチドが挙げられる。また、ポリペプチドは、１２０個以下、好ましくは５０個以下、より好ましくは３０個以下、特に好ましくは２０個以下のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。さらに具体的には、配列番号１のアミノ酸番号１〜１６からなるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号３〜１８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３６】
また、第１の発明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、同ポリペプチドを含む融合タンパク質に、前記のような細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与することができる限り、前記配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する１５個以上、かつ２０個以下のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチドと８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。但し、配列番号１のアミノ酸番号９のチロシン残基に相当するチロシン残基は、保存されていることが必要である。
【００３７】
ＮＬＳとは、細胞内に核膜構造を持つ真核細胞でタンパク質が核に局在するために必要なアミノ酸配列をいう。つまり、同配列を有するタンパク質は核膜を通って核に輸送される。ＮＬＳはＤＮＡ結合タンパク質など核内での活性を有するタンパク質に見られる配列である。
【００３８】
第１の発明においては、ＮＬＳは、第１の発明のＤＮＡがコードするポリペプチド及び他のタンパク質と融合したときに、融合タンパク質を保持する細胞内において同融合タンパク質が核へ移行する活性を有していれば特に制限されないが、例えばSV40 (simian virus 40) large-T antigenに由来するNLS（large-T antigenの126a.a.〜132a.a.の領域）が挙げられる（Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:9327-9331:文献７）。また、HIF-1αも固有のNLSを含んでおり、同NLSを用いることもできる。
【００３９】
他のタンパク質としては、細胞内において酸素濃度に依存して安定化を制御することを目的とするものであれば特に制限されないが、例えば、標識のためのタンパク質、細胞毒性を有するタンパク質等が挙げられる。
【００４０】
標識のためのタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等、発色反応を触媒する酵素が挙げられる。これらの発色反応は、酵素免疫測定法や、細胞内のタンパク質の存在状態を調べる手法として、抗体分野及び微生物分野等でよく知られている。また、前記タンパク質として、ＧＦＰ（グリーンフローエッセンス、プロテイン）の蛍光性を有するタンパク質も使用できる。
【００４１】
細胞毒性を有するタンパク質としては、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼの毒素タンパク質、その他アポトーシス誘導因子等が挙げられる。
【００４２】
第１の発明のＤＮＡは、コードするアミノ酸配列が、上記条件をみたすものであれば特に制限されないが、具体的には例えば配列番号２に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４３】
第１の発明のＤＮＡは、コードするアミノ酸配列に基づいて、通常の化学合成法にしたがって化学合成することができる。また、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列又はそれをコードしたｃＤＮＡの塩基配列は既に知られており（Gene Bank Accession No.U22431）、それらの配列及び配列番号２に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライ
マーとするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）により、ヒト又はマウス等の動物の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから増幅することによっても、取得することができる。そのようなプライマーとしては、実施例に示す各種プライマーが挙げられる。プライマーの配列に、ＮＬＳをコードする配列や遺伝子の発現に必要な配列（例えばKozak配列）、また制限酵素の認識配列を含ませておくと、融合タンパク質をコードするＤＮＡの作製が容易になる。
【００４４】
ＰＣＲにより得られた増幅産物は、エシェリヒア・コリ等の遺伝子組換えに適した宿主用のベクターに組み込んでおくと、以降の操作が容易になる。そのようなベクターとしては、pBluescript II（TOYOBO）が挙げられる。
【００４５】
次に、本発明の第１の発明であるベクターは、ＮＬＳをコードするＤＮＡと、第１の発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、核局在化シグナル、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクターである。
【００４６】
上記ベクターにおいて、ポリペプチドをコードするＤＮＡとは、具体的には、上述の配列番号２に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４７】
また、ＮＬＳをコードするＤＮＡは、例えば配列番号６に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４８】
また、本発明の第１の発明であるベクターの他の態様は、上記のような他のタンパク質をコードするＤＮＡを、ＮＬＳ及び第１の発明に係わるポリペプチドをコードするＤＮＡとともに、融合タンパク質を発現するように含むベクターである。融合タンパク質は、例えば、Ｎ末端から、ＮＬＳ、第１の発明に係るポリペプチド、他のタンパク質の順に含む。すなわち、第１の発明のベクターにおいて、これらのポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡは、フレームが一致するように連結され、さらに遺伝子発現に必要なプロモーター等の発現制御配列を含む。
【００４９】
前記プロモーターとしては、SV40 early promoter、lac promoter等が挙げられる。
【００５０】
本発明の第１の発明である細胞は、前記第１の発明であるベクターが導入された細胞である。細胞としては、微生物細胞が挙げられる。微生物としては、エシェリヒア・コリ等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニジュランス等の糸状菌、及び、動物又は植物の培養細胞が挙げられる。これらの細胞に第１の発明のベクターを導入するには、通常の形質転換法を用いればよい。
【００５１】
第１の発明のＤＮＡを含むベクターの一例として後記実施例に示すプラスミドpCH/557-574を保持するエシェリヒア・コリＤＨ５αＩＱ／ＰＣＨ５５７−５７４は、平成１３年２月１日に独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地  中央第６）（旧：産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号））に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１９３として寄託されている。
【００５２】
また、上記プラスミドpCH/557-574を保持するエシェリヒア・コリＤＨ５αＩＱ／ＰＣＨ５５７−５７４は、平成１３年１２月１７日に、上記独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２８として国際寄託に移管されている。
【００５３】
次に、第１の発明のＤＮＡでコードされたポリペプチドを含む融合タンパク質を利用する方法について説明する。
【００５４】
核局在化シグナル、第１の発明のＤＮＡがコードするポリペプチド、及び他のタンパク質とが融合した、第１の発明である融合タンパク質は、細胞中における酸素状態に応じて、存在状態が異なる。
【００５５】
具体的には、細胞内が低酸素条件下にあるときは、融合タンパク質は安定に存在し、有酸素条件下にあるときは、融合タンパク質は積極的に分解される。
【００５６】
よって、上述した第１の発明のベクターを細胞に導入し、同ベクターがコードする融合タンパク質を発現させる場合、細胞内の酸素状態に応じて、第１の発明の融合タンパク質を構成するタンパク質の存在を調節することができる。
【００５７】
具体的には、細胞内を低酸素条件にすればタンパク質を安定に保持させることができ、有酸素条件にすればタンパク質量を減少させることができる。
【００５８】
他のタンパク質として標識のためのタンパク質を使用した第１の発明のベクターを細胞に保持させ、標識のためのタンパク質を含む第１の発明の融合タンパク質を発現させ、該標識を指標として、該標識のためのタンパク質をモニターすると、言い換えると該第１の発明の融合タンパク質の存在状態をモニターすると、低酸素条件下の細胞を検出することができる。特に、標識として可視化可能なものを用いると、低酸素細胞を可視化することができる。
【００５９】
また、他のタンパク質として細胞毒性を有するタンパク質を使用した第１の発明のベクターを細胞に保持させ、細胞毒性を有するタンパク質を含む第１の発明の融合タンパク質を該細胞中に発現させると、低酸素条件下の細胞の生育を阻害することができる。具体的には、レトロウィルスやアデノウィルスに第１の発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、これを体内に投与することで癌治療の現場で問題となっている腫瘍内低酸素領域でのみ毒性タンパク質を発現させることができる。したがって、低酸素条件にある細胞を選択的に除去することができるため、癌治療での新しい治療法の開発へと結びつく可能性がある。
【００６０】
次に、上述した第１の発明に係わるポリペプチドを含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する第２の発明の融合タンパク質について説明する。
【００６１】
第２の発明の融合タンパク質は、ＮＬＳと、膜透過性活性を有するタンパク質と、他のタンパク質と、ＮＬＳ及び他のタンパク質と融合したときに同融合タンパク質を保持する細胞内において他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドとを含む融合タンパク質であり、細胞外から細胞内に透過することができ、細胞内の酸素状態に依存して安定性が異なる融合タンパク質である。
【００６２】
上記第２の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、上述した第１の発明のＤＮＡでコードされるポリペプチド、つまり第１の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドと同様のポリペプチドが使用できる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与することができる限り、配列番号１のアミノ酸配列の一部であってもよい。その一部の目安については、上述した第１の発明のＤＮＡでコードされるポリペプチドの記載箇所で説明している通
りである。
【００６３】
また、上記第２の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、第１の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチド、つまり配列番号１のHIF-1α557a.a.-574a.a.の特定領域に対応するポリペプチドを用いることが特に好ましい。但し、第２の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、該特定領域を有するものであればよく、例えば、HIF-1αの401a.a.-603a.a.の領域に対応するポリペプチドを用いることもできるし、好ましくは、例えばHIF-1αの548a.a.-603a.a.の領域に対応するポリペプチドを用いることもできる。
【００６４】
また、上記第２の発明の融合タンパク質に使用されるＮＬＳは、上述した第１の発明の融合タンパク質におけるＮＬＳと同様のものが使用できる。
【００６５】
また、上記第２の発明の融合タンパク質に使用される膜透過性活性を有するタンパク質とは、上記ポリペプチド及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質に細胞膜を透過する活性を付与するタンパク質であれば特に制限されないが、好ましくはＴＡＴ、the third alpha-helix of Antennapedia homeodomain、VP22 protein from herpes simplex virus等が挙げられる。
【００６６】
ＴＡＴとは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）由来の細胞膜を通過する活性を持つタンパク質である。具体的には、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
【００６７】
また、本発明でいうＴＡＴは、細胞膜を透過する活性を有する限り、配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち一部であってもよい。具体的には、配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、９以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。さらに具体的には、配列番号４のアミノ酸番号３〜１１からなるアミノ酸配列を有するたんぱく質が挙げられる。
【００６８】
また、上記第２の発明の融合タンパク質に使用される他のタンパク質は、上述した第１の発明の融合タンパク質における他のタンパク質と同様のものが使用できる。例えば、標識のためのタンパク質、細胞毒性を有するタンパク質等同様の例が挙げられる。
【００６９】
また、本発明の第２の発明である融合タンパク質の他の態様は、上記ＴＡＴと、他のタンパク質と、ＴＡＴと他のタンパク質と融合したときに同融合タンパク質を保持する細胞内において他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドとを含む融合タンパク質であり、細胞外から細胞内に透過することができ、細胞内の酸素状態に依存して安定性が異なる融合タンパク質である。
【００７０】
膜透過性活性を有するタンパク質として、上記ＴＡＴを用いた場合、ＮＬＳを有さない態様においても、細胞膜透過性及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質が得られる。つまり膜透過性活性を有するタンパク質にＴＡＴを用いる場合、ＮＬＳの有無に係わらず、本発明の第２の発明である融合タンパク質となる。
【００７１】
尚、本発明の第２の発明である融合タンパク質の他の態様におけるポリペプチド、他のタンパク質については、本発明の第２の発明である融合タンパク質に関する説明箇所で述べたとおりである。
【００７２】
本発明の第２の発明であるベクターは、上述の第２の発明の融合タンパク質を発現し得るベクターである。具体的には、ＮＬＳをコードするＤＮＡと、膜透過性活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡと、ＮＬＳと他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、核局在化シグナル、膜透過性活性を有するタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクターである。
【００７３】
また、本発明の第２の発明であるベクターの他の態様は、ＴＡＴをコードするＤＮＡと、ＴＡＴと他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、ＴＡＴ、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクターである。
【００７４】
第２の発明のベクターにおいて、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、上記第２の発明の融合タンパク質の説明箇所で述べた条件をみ
たすものであれば特に制限されない。具体的にはHIF-1α557a.a.-574a.a.又はその一部のポリペプチドをコードするＤＮＡとして例えば配列番号２に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、HIF-1αの548a.a.-603a.a.又はその一部のポリペプチドをコードするＤＮＡとして例えば配列番号３に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００７５】
また、第２の発明のベクターにおいて、ＮＬＳをコードするＤＮＡは、例えば上述の第１の発明のベクターの記載箇所で説明しているとおり、配列番号６に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００７６】
また、第２の発明のベクターにおいて、膜透過性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして、具体的には例えばＴＡＴをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００７７】
そして、ＴＡＴをコードするＤＮＡは、細胞膜を通過する活性を有する限り特に制限されないが、具体的には配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡや配列番号４のアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３〜１１からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる、より具体的には、例えば配列番号５に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００７８】
本発明の第２の発明のベクターにおけるさらなる態様は、上記のような他のタンパク質をコードするＤＮＡを、ＮＬＳ、膜透過性活性を有するタンパク質及びポリペプチドをコードするＤＮＡとともに、又は、上記のような他のタンパク質をコードするＤＮＡを、ＴＡＴ及びポリペプチドをコードするＤＮＡとともに、第２の発明の融合タンパク質を発現するように含むベクターである。第２の発明の融合タンパク質は、例えば、Ｎ末端から、ＮＬＳ、膜透過性活性を有するタンパク質、ポリペプチド、他のタンパク質の順に含む。すなわち、第２の発明のベクターにおいて、これらのポリペプチド及び各種タンパク質をコードするＤＮＡは、フレームが一致するように連結され、さらに遺伝子発現に必要なプロモーター等の発現制御配列を含む。
【００７９】
前記プロモーターとしては、SV40 early promoter、lac promoter等が挙げられる。
【００８０】
本発明の第２の発明であるベクターを導入する細胞としては、微生物細胞が挙げられる。微生物としては、エシェリヒア・コリ等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニジュランス等の糸状菌、及び、動物又は植物の培養細胞が挙げられる。
【００８１】
第２の発明のベクターの一例として、後記実施例に示すプラスミドpBAD/3-0とpBAD/557-574をそれぞれ保持するエシェリヒア・コリＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ３−０とＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ５５７−５７４は、平成１３年３月１６日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地  中央第６）（旧：産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号））に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２５８とＦＥＲＭ  Ｐ−１８２５９としてそれぞれ寄託されている。
【００８２】
また、上記プラスミドpBAD/3-0とpBAD/557-574をそれぞれ保持するエシェリヒア・コリＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ３−０とＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ５５７−５７４は、平成１３年１１月２６日に、上記独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０９とＦＥＲＭ  ＢＰ−７８１０としてそれぞれ国際寄託に移管されている。
【００８３】
次に、第２の発明の融合タンパク質を用いた、融合タンパク質存在の調節方法について説明する。
【００８４】
該調節方法は、上記第２の発明の融合タンパク質を細胞外から細胞内に透過させ、該透過した細胞中における酸素状態に応じて、第２の発明の融合タンパク質の存在状態を調節することを特徴とする。第２の発明の融合タンパク質を用いると、好適に細胞に取り込ませることができる。ここで、取り込ませるとは、細胞外から細胞内に透過させる場合をいうが、ある細胞の細胞内から細胞外へ融合タンパク質を排出させ、それを他の細胞の細胞内へ取り込ませる場合も含めることができる。
【００８５】
酸素状態に応じて、融合タンパク質の存在状態が調節されるとは、具体的には上記第１の発明の融合タンパク質の箇所でも説明しているように、低酸素条件下の細胞内では第２の発明の融合タンパク質が有酸素条件下に比べて安定に存在するように調節されることをいう。
【００８６】
尚、第２の発明の融合タンパク質の存在状態の調節方法を用いて、他のタンパク質として標識のためのタンパク質を使用し、該標識を指標として該融合タンパク質の存在状態をモニターすると、低酸素条件下の細胞を検出することができる点は、第１の発明の融合タンパク質の存在状態を調節する方法の箇所で説明しているとおりである。
【００８７】
また、第２の発明の融合タンパク質の存在状態の調節方法を用いて、他のタンパク質として細胞毒性を有するタンパク質を使用し、低酸素条件下で同融合タンパク質を細胞中に存在させれば、低酸素条件下の細胞の生育を阻害することができる点は、第１の発明の融合タンパク質の存在状態を調節する方法の箇所で説明しているとおりである。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
〔Ａ：材料と方法〕
＜１＞NLS/HIF1-αODDドメイン/lacZ融合遺伝子発現プラスミドの構築
【００８９】
全ての表記したベクターは、プラスミドpCH110 Eukaryotic Assay Vector（Amersham Pharmacia Biotech）をもとに構築した。同プラスミドは、Simian virus 40 early プロモーターを有している。
（１）プラスミド：pCH / 0-0、0-1、0-2、0-3、1-2、1-3、1-0、2-0、3-0、3-4、4-0の構築（図１及び２）
【００９０】
まず、Kozak配列（配列番号７の塩基番号８〜１４）（Nucl. Acid Res. (1987)vol.15,
20, 8125〜8131：文献８）とNLS（核局在シグナル）（文献７）を含むDNA（配列番号７の塩基番号１７〜３７）を合成し、それぞれをアニーリングさせ、制限酵素HindIII及びBglII処理した。次にヒトHIF1-αのODDドメイン（Oxgen Dependent Degradation domain）をPCRによりヒトｃＤＮＡから増幅し、制限酵素BglIIとKpnIで処理した。上記ＤＮＡ断片をpCH110/NLSのHindIII部位とKpnI部位の間に翻訳フレームが合うように３分子ライゲーションにより挿入した。ＰＣＲに使用した合成DNAは以下の通りである。
【００９１】
１）Kozak ATG/NLSセンスDNA（配列番号７）
taagcttgacatggcgcctaagaagaagaggaagagatctg
２）Kozak ATG/NLSアンチセンスDNA（配列番号８）
cagatctcttcctcttcttcttaggcgccatgtcaagctta
３）ODD-BglII.F0プライマー（配列番号９）
gagatctgccccagccgctggagacacaa
４）ODD-BglII.F1プライマー（配列番号１０）
ggagatctttggcaatgtctccattacccacc
５）ODD-BglII.F2プライマー（配列番号１１）
ggagatctcctagtccttccgatggaagcact
６）ODD-BglII.F3プライマー（配列番号１２）
ggagatctaacccattttctactcaggacaca
７）ODD-BglII.F4プライマー（配列番号１３）
ggagatctcagttgtcaccattagaaagcagt
８）ODD-KpnI.R0アンチセンスプライマー（配列番号１４）
aggtacctgctggaatactgtaactgtgc
９）ODD-KpnI.R1アンチセンスプライマー（配列番号１５）
aaggtacctgatttatattctgtaatttttcgtt
10）ODD-KpnI.R2アンチセンスプライマー（配列番号１６）
aaggtacctgtgtctgatcctgaatctggggcat
11）ODD-KpnI.R3アンチセンスプライマー（配列番号１７）
aaggtacctgctttgcttctgtgtcttcagcaaa
12）ODD-KpnI.R4アンチセンスプライマー（配列番号１８）
aaggtacctgtaatggtgacaactgatcgaagga
【００９２】
各プラスミドに挿入したODD ドメインをPCRにて増幅した際に用いたプライマーの組み合わせは以下の通りである。
【００９３】
【表１】
0004130955.tif 000002
【００９４】
それぞれのプラスミドは、表２に示すODD ドメインと、NLS及びlacZ遺伝子をタンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。「a.a.」は、ODDドメインのアミノ酸残基の位置を示す。表２中、例えばpCH/0-0は、ＯＤＤドメインの401位から603位をコードするＤＮＡ鎖と、ＮＬＳ及びlacZ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖を融合させたことを示している。
【００９５】
【表２】
0004130955.tif 000003
【００９６】
図１中、ＦＯ、ＲＯはＰＣＲに用いたプライマーの位置を表している。また、図中の太線は、各プラスミド中でlacZ遺伝子と融合させたＯＤＤドメイン、及びその長さを表している。pCH/0-0は、ＯＤＤドメインの401位から603位をコードするＤＮＡ鎖と、ＮＬＳ及びlacZ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖が融合している。図２中、Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、ＲＯ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、ＰＣＲに用いたプライマーの位置を表している。
（２）プラスミドpCH / 557-574、562-569、557-571、560-574、557-574（Y565A）557-574（ΔNLS）の構築（図３）
【００９７】
ヒトHIF1-αのODD ドメイン（Oxgen Dependent Degradation domain）の一部をコードするDNA（配列番号１９〜２８）を合成し、それぞれの組み合わせでアニーリングさせ、pCH110/3-0のBglII部位とKpnI部位の間に翻訳フレームが合うように挿入した。使用した合成DNAは以下の通りである。
【００９８】
13）ODD 557-574 センスDNA（配列番号１９）
gatctttagacttggagatgttagctccctatatcccaatggatgatgacttccagttacaggtac
14）ODD 557-574 アンチセンスDNA（配列番号２０）
ctgtaactggaagtcatcatccattgggatatagggagctaacatctccaagtctaaa
15）ODD 562-569センスDNA（配列番号２１）
gatctttagctccctatatcccaatggatcaggtac
16）ODD 562-569アンチセンスDNA（配列番号２２）
ctgatccattgggatatagggagctaaa
17）ODD 557-571センスDNA（配列番号２３）
gatctttagacttggagatgttagctccctatatcccaatggatgatgaccaggtac
18）ODD 557-571アンチセンスDNA（配列番号２４）
ctggtcatcatccattgggatatagggagctaacatctccaagtctaaa
19）ODD 560-574センスDNA（配列番号２５）
gatctgagatgttagctccctatatcccaatggatgatgacttccagttacaggtac
20）ODD 560-574アンチセンスDNA（配列番号２６）
ctgtaactggaagtcatcatccattgggatatagggagctaacatctca
21）ODD 557-574 Y565AセンスDNA（配列番号２７）
gatctttagacttggagatgttagctcccgctatcccaatggatgatgacttccagttacaggtac
22）ODD 557-574 Y565AアンチセンスDNA（配列番号２８）
ctgtaactggaagtcatcatccattgggatagcgggagctaacatctccaagtctaaa
【００９９】
それぞれのプラスミドは、表３に示すODD ドメインと、NLS及びlacZ遺伝子をタンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。
【０１００】
【表３】
0004130955.tif 000004
【０１０１】
図３中、「Ｌ」や「Ｄ」等は、各プラスミド中でlacZ遺伝子と融合させたＯＤＤドメインのアミノ酸配列を表している。例えば、pCH/562-569は「ＬＡＰＹＩＰＭＤ（配列番号２９）」をコードするＤＮＡ鎖と、ＮＬＳ及びlacZ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖が融合している。
（３）＜１−３＞プラスミドpCH/557-574（ΔNLS）、3-0（ΔNLS）の構築（図４）
【０１０２】
pCH/557-574（ΔNLS）、及びpCH/3-0（ΔNLS）の構築は、それぞれpCH/557-574、pCH/3-0を基に行った。Kozak配列とNLS（核局在化シグナル）を含むHindIII-BglII領域を、pCH/557-574とpCH/3-0から切り出し、代わりにKozak ATG配列のみをコードする下記のDNAを合成し、それぞれをアニーリングさせたDNA断片を挿入した。
【０１０３】
23）Kozak ATGセンスDNA（配列番号３０）
agcttgacatggcga 
24）Kozak ATGアンチセンスDNA（配列番号３１）
gatctcgccatgtca
【０１０４】
それぞれのプラスミドは、表４に示すODD ドメインとlacZ遺伝子をタンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。
【０１０５】
【表４】
0004130955.tif 000005
【０１０６】
図４中、太線は各プラスミド中でlacZ遺伝子と融合させたＯＤＤドメインの長さを表している。例えば、pCH/3-0（ΔNLS）は、548a.a.-603a.aのＯＤＤドメインをコードするＤＮＡ鎖とlacZ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖が融合している。
＜２＞細胞培養
【０１０７】
HEK293(ヒト胎児腎臓由来)細胞は、通常培地として、５％ FCS, 100U/ml  ペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン(明治製薬)を含むダルベッコMEM培地（GIBCO BRL）を用い、37℃、5% CO2  インキュベーターにて培養した。
＜３＞DNAトランスフェクション及びX-gal 染色
【０１０８】
１×105HEK293細胞（Graham FL, Smiley J, Russel WC, and Nairn R., J Gen Virol. 36(1):59-74, 1977：文献１０）を６穴マルチウエルデッシュにまき、翌日５マイクログラムのプラスミドをリン酸カルシウム変法（Chen, C. and H. Okayama., Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752, 1987：文献１１）により細胞に導入した。24時間、37℃, 3% CO2インキュベーターで培養した後、トリプシン処理により細胞をデッシュから剥がし、６穴マルチウエルデッシュ２穴にまき直した。その際、低酸素状態におかれた細胞内と同様にユビキチン−プロテアゾーム系を阻害する目的で、一方の細胞をCbz-LLL（文献３）を５０μM含む通常培地で24時間培養した。その後、X-gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）染色（Sanes,J.R.,J.L.Rubenstein and J.F.Nicolas.1986.Use of a recombinant retrovirus to study post-implantation cell lineage in mouse embroyos. EMBO J.5:3133-3142.：文献１２）を行った。
【０１０９】
（実施例１）
＜１＞ODDドメインのCbz-LLL依存的融合タンパク質安定性制御の確認
【０１１０】
HIF-1αタンパク質のODDドメイン（401a.a.-603a.aの領域）を融合させたタンパク質の安定性を酸素濃度に依存して制御できるか検討するために、まずODD ドメイン（401a.a.-603a.a）とNLS及びlacZ遺伝子を融合させたプラスミド：pCH / 0-0（NLS / HIF-1α 401a.a.-603a.a. / lacZ）を構築した（［Ａ：材料と方法］＜１＞（１））。尚、野生型のHIF-1αにはNLS配列がコードされているため、pCH / 0-0は、ODDドメインとともにNLSを融合させる様に構築した。
【０１１１】
１×105 HEK293細胞を６穴マルチウエルデッシュにまき、翌日５μｇのプラスミドpCH / 0-0をリン酸カルシウム変法により細胞に導入した。24時間、37℃,3% CO2インキュベーターで培養した後、EDTA処理により細胞を２群に分け、一方は通常培地で、他方はCbz-LLLを50μM含む培地で24時間培養した。そして最後に融合タンパク質の発現を確認するためにX-gal染色を行った。結果を表５に示す。
【０１１２】
X-gal染色の結果、Cbz-LLL非存在下で培養した場合に、Cbz-LLL存在下で培養した場合と比較して、青く染色された細胞の数とその染色の濃さは有意に減少した。尚、表５中（以下の表も同様とする）、このようにCbz-LLLの有無により融合タンパク質の安定性に違いが生じた場合、つまり、Cbz-LLLに依存して融合タンパク質の安定性が制御できることが観察できた場合を、＋（プラス）と表示する。
一方、ODDドメインを含まないプラスミドpCH110を導入した場合、Cbz-LLLの有無に関わらず青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。尚、表５中（以下の表も同様とする）、このようにCbz-LLLの有無に関わらず融合タンパク質の安定性に違いが生じない結果が観察された場合を、−（マイナス）と表示する。
【０１１３】
【表５】
0004130955.tif 000006
【０１１４】
Cbz-LLLは、転写活性にもmRNAの安定性にも影響をおよぼさないことが報告されているので、これらの結果はHIF-1αの401a.a.- 603a.aの領域を融合させることによって、β−ガラクトシターゼ（β-gal）タンパク質の安定性をCbz-LLLに依存して制御できたことを示している。
＜２＞ODDドメインのCbz-LLL依存的融合タンパク質安定性制御に必要な領域の同定
（１）次に、融合タンパク質のCbz-LLLに依存的な安定性制御に必須なODDドメイン中の領域を同定するために、ODDドメインのＮ末端側及び／又はＣ末端側を系統的に欠失させ、ＮＬＳおよびlacZ遺伝子と融合させたプラスミドを構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（１）参照）、上記＜１＞と同様にしてHEK293細胞にプラスミドを導入し、X-gal染色を行った。結果を表６に示す。
【０１１５】
その結果、pCH/0-1、0-2、0-3、1-2、1-3、4-0を導入した場合、Cbz-LLLの有無に関わらず、青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。一方、pCH/1-0、2-0、3-0、3-4を導入し、Cbz-LLL非存在下で培養した場合、Cbz-LLL存在下で培養した場合と比較して、青く染色された細胞の数とその染色の濃さは有意に減少した。
【０１１６】
【表６】
0004130955.tif 000007
【０１１７】
これらの結果から、HIF-1αの548a.a.- 583a.a.の領域が、融合タンパク質のCbz-LLLに依存した安定性制御に重要であることが明らかになった。尚、pCH/3-0のX-gal染色の結果をpCH110と比較して、図５に示した。図中、Ａ，ＢはHEK293細胞にプラスミドpCH110を導入したものである。一方、Ｃ、ＤはpCH / 3-0を導入したものである。また、Cbz-LLLを含む培地で培養した場合がＢ、Ｄであり、Cbz-LLLを含まない培地で培養した結果がＡ，Ｃである。
（２）ヒトHIF-1αのODDドメイン548a.a.-583a.a.の領域について、既知データベースに対して相同性検索を行った結果、この領域は、ヒトHIF-1αだけでなくマウスのHIF-1αにも保存されている18残基のアミノ酸からなる配列（557a.a.- 574a.a.）を含むことが明かとなった。そこで、HIF-1αの557a.a.- 574a.a.領域をlacZ遺伝子と融合させたプラスミドpCH/557-574を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（２）、図３参照）、上記＜２＞と同様にしてHEK293細胞にプラスミドを導入し、X-gal染色を行った。
【０１１８】
【表７】
0004130955.tif 000008
【０１１９】
その結果、pCH/ 557-574を導入しCbz-LLL非存在下で培養した場合に、Cbz-LLL存在下で培養した場合と比較して、青く染色された細胞の数とその染色の濃さは有意に減少した。
これは、557a.a.- 574a.a.の領域のみを融合させただけで、β-galタンパク質の安定性がCbz-LLLに依存することを示している。
（３）続いて、β-galタンパク質と融合させるHIF-1αの領域をさらに短くしたプラスミドpCH/562-569、557-571、560-574（それぞれHIF-1αの562a.a.-569a.a.、557a.a.-570a.a.、560a.a.-574a.a.をNLS及びLacZと融合させた）を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（２）、図３参照）、上記＜２＞と同様にしてHEK293細胞にプラスミドを導入し、X-gal染色を行った。結果を表８に示す。
【０１２０】
【表８】
0004130955.tif 000009
【０１２１】
その結果、これらのプラスミドを導入した場合、Cbz-LLLの有無に関わらず、青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。
【０１２２】
上記の結果から、β-galタンパク質の安定性を有意にCbz-LLLに依存させるためには、HIF-1αの557a.a.−574a.a.の領域を融合させればよいことが明らかになった。
＜３＞ODDドメイン557a.a.-574a.a領域のチロシン残基のCbz-LLL依存的安定性制御に対する重要性
【０１２３】
タンパク質のユビキチン／プロテアソーム系による分解は、標的タンパク質のリン酸化状態の変化によって制御されることが知られている。そこで、構築した融合タンパク質のユビキチン系による分解も、リン酸化状態の変化によって制御されている可能性が考えられる。そこで、プラスミドpCH/557-574のHIF-1α 557a.a.−574a.a.内で唯一リン酸化されうるアミノ酸である５６５位のチロシン残基をアラニン残基に置換したプラスミドpCH/557-574（Y565A）を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（２）、図３参照）、上記と同様にしてHEK293細胞にプラスミドを導入し、X-gal染色を行った。結果を表９に示す。
【０１２４】
【表９】
0004130955.tif 000010
【０１２５】
その結果、pCH/557-574（Y565A）を導入した場合、Cbz-LLLの有無に関わらず青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。これにより、HIF-1αの557a.a.−574a.a.を融合させたタンパク質の安定性に、５６５位のチロシン残基が特に重要なアミノ酸であることが明らかになった。
（実施例２）
【０１２６】
一連の融合タンパク質のCbz-LLLに依存した安定性の制御に、NLS（核局在化シグナル）が必要なのかを確認するために、pCH/557-574及びpCH/3-0からNLSを欠失させたプラスミド：pCH/557-574（ΔNLS）及びpCH/3-0（ΔNLS）を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（３）、図４参照）、実施例１と同様にしてHEK293細胞にプラスミドを導入し、X-gal染色を行った。結果を表１０に示す。
【０１２７】
【表１０】
0004130955.tif 000011
【０１２８】
その結果、これらのプラスミドを導入した場合、Cbz-LLLの有無に関わらず青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。これにより、融合タンパク質のCbz-LLLに依存した安定性の制御に、NLSが関与することが確認された。
〔Ｂ：材料と方法〕
【０１２９】
以下に記載の実施例３以降において用いた一般的な操作について説明する。
【０１３０】
合成オリゴヌクレオチドのアニーリングは、次のようにして行う。互いに相補的な合成一本鎖オリゴヌクレオチド（濃度100μM）を10μlずつ混ぜ、20μlのNaCl溶液（1M）、及び160μlの精製水を加えて、計200μlの反応液を調整する。これを95℃で1分間熱した後、75℃で1分間保温し、さらに1℃あたり2分をかけて37℃まで徐々に冷却する。次に100μlのDNA溶液に10μlの酢酸ナトリウム溶液（3M）と、250μlのエタノールを加え、12krpmで10分間（4℃）遠心分離する。その後、上清を捨て70%エタノールで沈殿物を洗い、最後
に70%エタノールを除去する事で精製したDNAを得る。
【０１３１】
制限酵素処理は、エタノール沈澱によって精製したプラスミドDNA 1μgを10μlのユニバーサルバッファ（TAKARA Biomedical）と90μlの精製水で溶解し、これに、目的の制限酵素を添加し、ピペッティング後37℃で30分間保温することにより行う。
【０１３２】
DNA断片の分離（切り出し）は、次のようにして行う。制限酵素処理した目的のDNA断片を他のDNA断片から単離するために、まず、アガロースゲル（含EtBr）電気泳動を行う。このアガロースゲルに365nmのUVランプをあてる事によりDNA断片を可視化し、目的のDNA断片を含むアガロースゲルをカミソリで切り出す。最後にQIAクイックゲルエクストラクションキット（Qiagen）を用いて、このアガロースゲルから目的のDNA断片を抽出し精製する。
【０１３３】
ライゲーションは、試験管内（in vitro）で複数のDNA断片をホスホジエステル結合させるために、DNAライゲーションキットVer.2（TAKARA Biomedical）を用い、キットの手順に従って行う。ライゲーションに用いたベクターDNA断片及びインサートDNA断片の量はどちらも10ngとする。
【０１３４】
（実施例３）ODDドメイン、His残基×6、NLS、TAT及びlacZ融合遺伝子を発現するプラスミドの構築
＜１＞NLS/HIF1-αODDドメイン/lacZ融合遺伝子含有プラスミドの構築
【０１３５】
プラスミド：pCH / 3-0、及びプラスミドpCH/557-574の構築は、上記［Ａ：材料と方法］＜１＞（１）及び（２）に記載の方法（表２、表３、図１、図２、及び図３も参照）に従って行った。
【０１３６】
＜２＞His/NLS/TAT/HIF1-αODDドメイン/lacZ融合遺伝子発現プラスミドの構築
【０１３７】
全ての表記したベクターは、プラスミドpBAD/His/lacZ Vector（Invitrogen）をもとに構築した。
（１）プラスミド：pCH/TAT/3-0、pCH/TAT/557-574の構築
【０１３８】
TAT配列をコードする下記の合成オリゴDNA（配列番号３２、３３）をアニーリングさせたDNA断片を、pCH/3-0又はpCH/557-574を制限酵素BglIIで処理したベクターに組み込み、pCH/TAT/3-0、pCH/TAT/557-574を得た。
【０１３９】
２５）TAT.Bgl IIセンスDNA（配列番号３２）
gat cat atg gtc gta aga aac gtc gcc aac gtc gcc gaa
２６）TAT.Bgl IIアンチセンスDNA（配列番号３３）
gat ctt cgg cga cgt tgg cga cgt ttc tta cga cca tat
（２）プラスミド：pBAD/3-0、pBAD/557-574の構築
【０１４０】
プラスミドpBAD/His/lacZ VectorにはBamHI部位が２ケ所存在する。このうち413塩基目の消化部位のみを切断した後、DNA末端を平滑化した。引き続き制限酵素SacIで消化して生じた約5170bpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動により切り出し、pBAD/His/lacZ BamHI-SacIベクターとした。一方、pCH/TAT/3-0、pCH/TAT/557-574を制限酵素HindIIIで消化後、DNA末端を平滑化し、さらに制限酵素SacIで処理して生じた約2250bpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動により切り出した。これらをpBAD/His/lacZ BamHI-SacIベクターにライゲーションし、pBAD/3-0、pBAD/557-574を得た。
（３）プラスミド：pBAD/P.C.の構築
【０１４１】
まず、pCH/3-0を制限酵素Hind III及びKpn Iで処理して生じた約6900bpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動で切り出した。これにKozak ATGおよびNLSをコードする下記の合成DNA（配列番号３４、３５）断片をアニーリングさせたものを挿入し、pCH/P.C.とした。
【０１４２】
２７）Kozak ATG/NLS HindIIIセンスDNA（配列番号３４）
agc ttg aca tgg cgc cta aga aga aga gga agc agg tac
２８）Kozak ATG/NLS KpnIアンチセンスDNA（配列番号３５）
ctg ctt cct ctt ctt ctt agg cgc cat gtc a
【０１４３】
次に、TAT配列をコードする下記の合成オリゴDNA（配列番号３６、３７）をアニーリングさせたDNA断片を、pCH/P.C.を制限酵素Kpn Iで処理したベクターに組み込みpCH/TAT/P.C.を構築した。
【０１４４】
２９）TAT.KpnIセンスDNA（配列番号３６）
gat atg gtc gta aga aac gtc gcc aac gtc gcc gac agg tac
３０）TAT KpnIアンチセンスDNA（配列番号３７）
ctg tcg gcg acg ttg gcg acg ttt ctt acg acc ata tcg tac
【０１４５】
引き続き、pCH/TAT/P.C.を制限酵素HindIIIで消化後、DNA末端を平滑化し、さらに制限酵素SacIで処理して生じた約2000bpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動により切り出した。これらをpBAD/His/lacZ BamHI-SacIベクターにライゲーションし、pBAD/P.C.を得た。
（４）各プラスミドの説明
【０１４６】
pBAD/P.C.、pBAD/3-0、pBAD/557-574においては、下記の表１１に示すODDドメインと、His残基×6、TAT、NLS及びlacZ遺伝子がタンパク質レベルで融合されている（図６参照）。
【０１４７】
尚、表１１中、「a.a.」は、ODDドメインのアミノ酸残基の位置を示す。表１１中、例えばpAD/3-0は、ＯＤＤドメインの548位から603位をコードするＤＮＡ鎖と、His、NLS、TAT及びlacZ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖を融合させたことを示している。
【０１４８】
また、図６は、各融合タンパク質の構造を表す概略図である。本発明は、図６に示すような活性領域を持つように、各融合タンパク質を発現するプラスミドを構築した。
【０１４９】
図６中、「６×His」はヒスチジン残基を６つ連続させた領域を、「NLS」はSV40 large
T antigen 由来の核移行シグナルを、「TAT」はHIV由来のTATシグナル配列（Cell;55,1179(1988)、Proc.Natl.Acad.Sci USA;91,664(1994)）を、「ODD」はヒトHIF−1α遺伝子由来の酸素誘導分解ドメイン（Oxgen Dependent Degradation domain）を、「β-gal」はE.
coli lacZ遺伝子産物を表している。N.C.β-galは野生型β-galタンパク質を用いた。また、3-0β-gal及び557-574β-galに融合されたヒトHIF−1α遺伝子由来の酸素誘導分解ドメインは、それぞれHIF−1α548a.a.-603a.a.、HIF−1α557a.a.-574a.a.である。
【０１５０】
【表１１】
0004130955.tif 000012
【０１５１】
また、各プラスミドの全塩基配列は表１２のように対応している。
【０１５２】
【表１２】
0004130955.tif 000013
【０１５３】
また、各プラスミド中の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は表１３のように対応している。
【０１５４】
【表１３】
0004130955.tif 000014
【０１５５】
（実施例４）融合タンパク質のCbz-LLL依存的安定性の確認
＜１＞融合タンパク質の精製
【０１５６】
３種の発現ベクターａ）pBAD/P.C.、ｂ）pBAD/3-0、ｃ）pBAD/557-574を用いて、E. coli LMG194株を形質転換した。翌日、それぞれの培養プレートからシングルコロニーをつつき取り、10mlのTB培地（50μg/mlのアンピシリンを含む）に植菌して、37℃で振とう培養した。さらに翌日、それぞれ1mlのオーバーナイトカルチャーを200mlのTB培地（50μg/mlのアンピシリンを含む）に加え、37℃で振とう培養した。培養液の吸光度OD600が0.5に達したところで、それぞれの培養液に0.4gのL-(+)-アラビノースを添加して融合タンパク質の発現を誘導し、翌日まで培養を続けた。
【０１５７】
次に、Ni-NTAアガロース（QIAGEN）を用い、付属のプロトコールに従って融合タンパク質の粗精製を行った。粗精製を終えた融合タンパク質の精製度をさらに高めるため、また、融合タンパク質の濃度を高めるため、さらに緩衝液をPBSに置換する目的で、MICROCON YM-100（AMICON）を付属のプロトコール通りに使用した。
＜２＞
【０１５８】
以下の操作において、A549 (ヒト肺癌由来)細胞は、通常培地として５％ FCS, 100U/ml
ペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン(明治製薬)を含むダルベッコMEM培地（GIBCO BRL）を用い、37℃で、5% CO2インキュベーターにて培養した。
【０１５９】
１×１０4個のA549細胞を24穴マルチウェルデッシュにまき、翌日、無血清D-MEMで各ウェルを2回洗浄した。これに下記表１４の様に融合タンパク質を添加し、37℃の5% CO2インキュベーターで30分培養した。
【０１６０】
【表１４】
0004130955.tif 000015
【０１６１】
尚、表１４中、※1として、N.C.タンパク質には野生型β-galタンパク質を用いたことを特記する。また、「U」は37℃、pH＝7.5の条件下で１分間に１μMのＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-b-D-lactopyranoside）をo-nitrophenolとgalactoseに分解するために必要なタンパク量を示す。
【０１６２】
そして、再度無血清D-MEMで各ウェルを2回洗浄した後、ウェルNo.1、3、5、7には通常培地で、ウェルNo.２、４、6、８には低酸素状態におかれた細胞内と同様にユビキチン−プロテアゾーム系を阻害する目的で、Cbz-LLL（文献３）を５０μM含む培地で20時間培養した。その後、X-gal染色（文献１２）を行った。
【０１６３】
その結果、N.C.タンパク質を添加したA549細胞は、Cbz-LLLの有無に関わらず青く染色された細胞は見られなかった。一方、P.C.タンパク質を添加したA549細胞は、Cbz-LLLの有無に関わらず全ての細胞が青く染色された（図７Ａ、Ｂ参照）。これは、添加したタンパク質に融合させたHIV由来のTAT領域の活性によって融合タンパク質が細胞内に取り込まれた事を表わしている。
【０１６４】
3-0タンパク質を添加したA549細胞はCbz-LLLを添加した場合に、有意に濃く染色された細胞が見られた（図７Ｃ、Ｄ参照）。これは、3-0タンパク質に融合させたODD領域（HIF-1αの548a.a.-603a.a）の活性によって、Cbz-LLL存在下で融合タンパク質の安定性が増した事を表わしている。557-574タンパク質を添加し同様の実験を行った場合にも、3-0タンパク質で得られた結果と同じ傾向の結果を得る事ができた。
【０１６５】
尚、図７中、Ａ、Ｂは、P.C.β-galを導入したものであり、Ｃ、Ｄは3-0β-galを添加したものである。また、Ａ、ＣはCbz-LLLを含まない培地で培養した場合であり、Ｂ、ＤはCbz-LLLを含む培地で培養した場合である。
【０１６６】
（実施例５）融合タンパク質の酸素濃度依存的安定性の確認
【０１６７】
上記、実施例４において、低酸素状態を形成する形成方法を、以下で示すように変えた他は、実施例４と同様な方法を用いてX-gal染色を行った。
【０１６８】
融合タンパク質を添加し、その３０分後融合タンパク質を除去する。次に、有酸素条件とする場合には２０％Ｏ2ガスを、一方低酸素条件とする場合には１％Ｏ2ガスをそれぞれ培地に通気し、約２４時間培養する。そして、最後にX-gal染色を行う。
【０１６９】
その結果、P.C.タンパク質を添加したA549細胞は、酸素濃度に係わらず、全ての細胞が
青く染色された（図８Ａ、Ｂ参照）。
【０１７０】
一方、3-0タンパク質を添加したA549細胞は１％Ｏ2ガスを通気した低酸素状態とした場合に、有意に濃く染色された細胞が見られた（図８Ｃ、Ｄ参照）。
【０１７１】
尚、図８中、Ａ、Ｂは、P.C.β-galを導入したものであり、Ｃ、Ｄは3-0β-galを添加したものである。また、Ａ、Ｃは２０％Ｏ2ガスを通気した培地（有酸素条件）であり、Ｂ、Ｄは１％Ｏ2ガスを通気した培地（低酸素条件）である。
【０１７２】
（実施例６）融合タンパク質の酸素濃度依存的安定性の確認
＜１＞TAT-ODD-Caspase3融合タンパク質発現ベクター（pGEX/TAT-ODD3-0-Casp3）の構築
【０１７３】
まず、pBAD/3-0を鋳型とし、下記の２種類の合成オリゴDNAを用いてPCRを行い、HIV由来のTATシグナル配列とHIF-1α遺伝子由来の酸素誘導分解ドメイン（ODD）がコードされているDNAを増幅した。これを制限酵素BamHI及びEcoRIで処理した後、pGEX-6P-3プラスミド（Amersham Pharmacia Biotech）のBamHIとEcoRIの間に組み込み、pGEX/TAT-ODDを構築した。
【０１７４】
３１）TAT-sense-BamHIプライマー  （配列番号５２）
aggatcctatggtcgtaagaaacgt
３２）ODD-anti-EcoRIプライマー  （配列番号５３）
agaattcctggaatactgtaactgt
【０１７５】
一方、ヒト肺癌由来細胞株A549のcDNAを鋳型とし、下記２種類の合成オリゴDNAを用いてPCRを行い、ヒト由来Caspase-3遺伝子を増幅し、制限酵素EcoRI及びSalIで処理した後、pGEX/TAT-ODDのEcoRIとSalIの間に組み込み、GSTタグをN末端に融合させたタンパク質GST-TAT-ODD-wt.Caspase3を発現するプラスミドpGEX/TAT-ODD3-0-wt.Casp3を構築した。
【０１７６】
３３）Casp-sense-EcoRIプライマー（配列番号５４）
agaattcatggagaacactgaaaac
３４）Casp-anti-SalIプライマー（配列番号５５）
agtcgacttagtgataaaaatagag
【０１７７】
また、アポトーシス誘導活性を持たない変異Caspase3（以下mut. Caspase3）をVocero-Akbani, A. M., Heyden, N. V., Lissy, N. A., Ratner, L. and Dowdy, S. F. Killing HIV-infected cells by transduction with an HIV protease-activated caspase-3 protein. Nat. Med. 5: 29-33, 1999.の文献に従って構築し、この構造遺伝子をCasp-sense-EcoRIプライマーとCasp-anti-SalIプライマーを用いたPCRで増幅後、制限酵素EcoRI及びSalIで処理し、pGEX/TAT-ODDのEcoRIとSalIの間に組み込み、pGEX/TAT-ODD3-0-mut.Casp3を構築した。
＜２＞TAT-ODD-wt./mut.Caspase3融合タンパク質の精製
【０１７８】
pGEX/TAT-ODD3-0-wt.Casp3およびpGEX/TAT-ODD3-0-mut.Casp3を用いてE. coli BL21 (DE3) pLysS competent cells（Novagen）を形質転換した。翌日、それぞれの培養プレートからシングルコロニーをつつき、10mlのTB培地（50μg/mlのアンピシリンを含む）食菌して37℃で浸透培養した。
【０１７９】
さらに翌日、1mlのオーバーナイトカルチャーを200mlのTB培地（50μg/mlのアンピシリンを含む）に加え、37℃でさらに浸透培養した。培養液の吸光度OD600が0.5に達したところで、最終濃度が0.5MになるようにIPTGを添加し融合タンパク質の発現を誘導し、さらに
翌日まで培養を続けた。
【０１８０】
大量発現させたそれぞれの融合タンパク質の精製はGlutathione Sepharose 4Bゲル（Amersham Pharmacia Biotech）、及びPreScission Protease（Amersham Pharmacia Biotech）を用い、付属のプロトコールに従って行った。
＜３＞酸素濃度依存的なアポトーシス誘導活性の検討
【０１８１】
以下の操作において、マウス胎児由来細胞株NIH3T3は、通常培地として10% FCS、100U/ml  ペニシリン、100μg/ml  ストレプトマイシン（明治製薬）を含むダルベッコMEM培地（GIBCO BRL）を用い、37℃で、5% CO2インキュベーターにて培養した。
【０１８２】
1×105個のNIH3T3細胞を6穴マルチウェルディッシュにまき、ウェルNo.４、５、６はCbz-LLLを最終濃度50μMになるように添加し、ウェルNo.１、２、３には、No.４、５、６のウェルに入れたCbz-LLLと同量のdimethyl sulfoxide(DMSO)を加えた。翌日、無血清D-MEMで各ウェルを2回洗浄した。これに下記表１５の様に融合タンパク質等を添加した。さらに24時間ウェルNo.１、２、３は２０％Ｏ2、ウェルNo.４、５、６は１％Ｏ2の条件で培養し、最後に各融合タンパク質による酸素濃度に依存したアポトーシス誘導活性を観察した。
【０１８３】
【表１５】
0004130955.tif 000016
【０１８４】
その結果、下表１６の様にTAT-ODD-wt.Caspase3融合タンパク質を添加し、かつ低酸素培養した場合に、特に強いアポトーシスを観察する事ができた（ウェル番号６）（表１６において+++で示す）。ウェルNo.４および５で観察されたわずかなアポトーシスは、ゲノム由来のCaspase3の活性がCbz-LLLによってわずかに誘導された結果であると考えられる。
【０１８５】
【表１６】
0004130955.tif 000017
【０１８６】
また、この各ウェル毎のアポトーシスの観察結果を図９に示す。
【０１８７】
これらの結果は、TAT-ODD-Caspase3融合タンパク質が有酸素条件下に置かれた細胞内では分解され、一方、低酸素条件下に置かれた細胞内では安定化し、かつ活性化する事によってアポトーシスを誘導した事を示している。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】プラスミドpCH/0-0の概略図を示す。
【図２】プラスミドpCH/0-0〜pCH/4-0の概略図を示す。
【図３】プラスミドpCHシリーズの概略図を示す。
【図４】プラスミドpCH/3-0（ΔNLS）、pCH/557-574（ΔNLS）の概略図を示す。
【図５】X-gal 染色の結果を示す図（写真）である。
【図６】各融合タンパク質の構造を表す概略図を示す。
【図７】X-gal 染色の結果を示す図（写真）である。
【図８】X-gal 染色の結果を示す図（写真）である。
【図９】実施例６の酸素濃度に依存したアポトーシスの観察結果を示す図（写真）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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