(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
おもちゃの銃と生物発光生成系の成分を含有する組成物との組み合わせであり、前記おもちゃの銃が、
ａ）２つの室；
ｂ）前記２つの室と連結している混合室；
ｃ）前記混合室と連結しているノズル；及び
ｄ）前記２つの室の内容物を前記混合室内及び前記ノズルの外に移行する手段より成り、１つの室が生物発光生成系の１つの成分を除く全ての成分より成る組成物を含み、他の室が残余の成分を含む前記組み合わせ。
【請求項２】
前記生物発光生成系の生物が昆虫、有櫛動物、細菌、軟体動物及びミミズから選択される請求項１の組み合わせ。
【請求項３】
前記生物発光生成系の生物がエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）、バルグラ（Ｖａｌｇｕｌａ）、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ホタルから選択される請求項１の組み合わせ。
【請求項４】
おもちゃの銃と生物発光生成系の成分を含有する組成物との組み合わせであり、
ａ）その各々が導入口と排出口を有する２つの室；
ｂ）加圧気体の容器を受容するのに適合した気体室；
ｃ）その各々がハウジングの１つとシリンダの１つとの間に配置された２つの第１チエック・バルブ；
ｄ）その各々が別々のシリンダ内に包含された２つのピストンアッセンブリ；
ｅ）シリンダと連結している混合室；
ｆ）混合室とシリンダの間に配置された第２チエック・バルブ；
ｇ）混合室と連結しているノズル；及び
ｈ）ピストンアッセンブリと連結しているトリガより成り、１つの室が生物発光生成系の１つの成分を除く全ての成分より成る組成物を含み、他の室が残余の成分を含む前記組み合わせ。
【請求項５】
前記生物発光生成系の生物が、昆虫、腔腸動物、有櫛動物、細菌、軟体動物及びミミズから選択される請求項４の組み合わせ。
【請求項６】
前記生物発光生成系の生物が、エクレオア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）、バルグラ（Ｖａｒｇｕｌａ）、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ホタルから選択される請求項４の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、生物発光を生じる系及び玩具、織物、食物及び飲料を含む製造物品の組み合わせに関する。得られる組み合わせは、その組み合わせにより、生物発光成分を発光し、又は生じ、又は放出する新規用品である。また、生物発光生成試薬が封入された組成物、及び生物発光を生成するための方法も提供される。
発明の背景
発光は、エネルギーが分子に限定的に注がれて励起状態を生じる現象である。低エネルギー状態への復帰には光子（ｈν）の放出が伴う。発光には蛍光、リン光、化学発光及び生物発光が含まれる。生物発光は、生物が他の生物に見える光を放射するプロセスである。発光は以下のように表すことができる：
Ａ＋Ｂ→Ｘ*＋Ｙ
Ｘ*→Ｘ＋ｈν、
ここで、Ｘ*は電子的に励起した分子であり、ｈνはＸ*が低エネルギー状態に戻る際の光放射を表す。発光が生物発光である場合、励起状態の創出は酵素で触媒された反応から誘導される。生物発光（又は化学発光又は他の発光）反応における放射光の色は励起した分子に特有のものであり、その励起源及び温度とは無関係である。
生物発光の必須条件は、ルシフェラーゼの存在下における結合しているか、もしくは遊離の分子酸素の使用である。ルシフェラーゼは分子酸素の存在下において基質ルシフェリンに作用し、その基質を励起状態に転換させる酸素添加酵素である。低エネルギー水準に戻る際に、エネルギーは光の形で放出される［検討のためには、例えば、細胞生理学における分子構造（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），Ｈａｙａｓｈｉら編，プレンティス−ホール社（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ．），Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ，ｐｐ．６３−８０のＭｃＥｌｒｏｙら（１９６６）；Ｗａｒｄら，化学発光及び生物発光（Ｃｈｅｍｉ−  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の第７章，Ｂｕｒｒ編，マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ＮＹ，ｐｐ．３２１−３５８；細胞生理学：原本（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｏｏｋ），Ｎ．Ｓｐｅｒｅｌａｋｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ  ６６５−６８１のＨａｓｔｉｎｇｓ，Ｊ．Ｗ．（１９９５）；深海における発光、昏睡状態及び生活（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｎａｒｃｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｅｐ  Ｓｅａ），Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｖａｎｔａｇｅ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，特にｐｐ５０−５６を参照］。
全体的には希ではあるが、生物発光は陸生生物よりも海洋生物においてより一般的である。生物発光は３０種もの進化の上で異なる起源から発達し、したがって様々な方法で現れ、そのため、異なる生物における生物発光をもたらす生化学的及び生理学的機構は異なる。生物発光種は多くの属にまたがり、細菌［主として、ビブリオ種を含む海洋細菌］、真菌、藻類及び渦鞭毛藻類のような顕微鏡的生物から、節足動物、軟体動物、棘皮動物、及び脊索動物を含む海洋生物、並びに環形虫及び昆虫を含む陸生生物が含まれる。
他の型の化学発光に加えて、生物発光は生物学及び医学において特定の基質の定量的な測定に用いられる。例えば、多くの検定において、多くの目的で、ルシフェラーゼ遺伝子がクローン化されてレポーター遺伝子として利用されている。異なるルシフェラーゼ系は異なる要件を有するため、様々な物質の検出及び定量にそれらを用いることができる。大部分の商業的な生物発光の応用はホタル［ホチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）］のルシフェラーゼに基づくものである。最初の、かつ依然として広範に用いられる検定の１つは、ＡＴＰの存在を検出するのにホタルのルシフェラーゼを用いることを包含する。また、この反応における他の物質又は補因子の検出及び定量にも用いられる。ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）もしくは長鎖アルデヒドを直接もしくは間接的に生じ、又は利用するあらゆる反応を、細菌性ルシフェラーゼの光放射反応と結びつけることができる。
分析の目的で商業的に用いられている別のルシフェラーゼ系はエクオリン系である。精製されたクラゲの発光タンパク質、エクオリンは細胞内Ｃａ2+及び様々な実験条件下におけるその変化の検出及び定量に用いられる。エクオリン発光タンパク質は比較的小さく［〜２０ｋＤａ］、非毒性であり、広範な濃度範囲［３×１０-7ないし１０-4Ｍ］にわたるカルシウムの検出に適する量を細胞に注入することができる。
それらの分析上の有用性のため、多くのルシフェラーゼ及び基質が研究され、十分に特徴付けられ、商業的に入手可能である［例えば、ホタルルシフェラーゼはシグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ＭＯ及びベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナポリス、ＩＮから入手可能であり；組換えにより生成したホタルルシフェラーゼ及びこの遺伝子に基づいた、もしくはこのタンパク質と共に用いられる他の試薬はプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マジソン、ＷＩ；クラゲに由来するエクオリン発光タンパク質ルシフェラーゼ及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）に由来するルシフェラーゼはシーライト・サイエンシズ（Ｓｅａｌｉｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ボガート、ＧＡから商業的に入手可能であり；コエレンテラジン、これらのルシフェラーゼの天然の基質、はモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン、ＯＲから入手可能である］。これらのルシフェラーゼ及び関連試薬は、診断、品質管理、環境試験及び他のそのような分析の試薬として用いられる。これらの試薬は、エンターテインメント及びレクレーションに関連して生物発光の生成の際に生じる発光、照明及び色について用いられていることはない。
したがって、製造物品と組み合わせて娯楽製品として用いられる生物発光を、玩具、身辺用品、食物、噴水、飲料、塗布組成物、例えばペンキ及びインク、衣類を含む織物、おもちゃのシガレット、魚の餌、特にルシフェラーゼを発現する遺伝子組換え魚類に給餌するためのもの、宝石及び他のそのような製品を含む新規用品に利用することがここでの目的である。また、そのような組み合わせを提供し、かつそのような組み合わせを生成及び使用するための手段を提供することもここでの目的である。
発明の要約
生物発光を生成させるための系及び装置、並びにこれらの系及び装置と新規用品を製造するための無生物製造物品との組み合わせが提供される。製造物品であるこれらの新規用品はエンターテインメント、レクレーション及びアミューズメント用に設計されており、玩具、特に水鉄砲、おもちゃのシガレット、“リトル・ニュー・イヤー（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｎｅｗ  Ｙｅａｒ）”フェスティバルに用いられるもののようなランタン、おもちゃの“ハロウィン”エッグ、フットバッグ、ボード／カードゲーム；フィンガーペイント及び他の塗料、スライム状の遊技用素材；織物、特に衣類、帽子及びスポーツ用スーツ、繊維、糸；泡立て玩具及び他の泡を製造する玩具；風船；置物；入浴剤、ボディローション、ジェル、パウダー及びクリーム、マニキュア液、化粧、練り歯磨き及び他の歯磨剤、石鹸、ボディペイント及び泡立て剤のような身辺用品；インク、紙のような製品；ゼラチン、糖衣（アイシング）及び糖衣（フロスティング）のような食物；ルシフェリンを含む魚の餌及び遺伝子組換え魚類、特にルシフェラーゼを発現する遺伝子組換え魚類；ルシフェリン又はルシフェラーゼを含む植物栄養分、ルシフェラーゼを発現する遺伝子組換え植物に関して用いられるルシフェリン、並びにビール、ワイン、シャンパン、ソフトドリンク及び角氷及び他の形状の氷のような飲料；液体“花火”を含む噴水器、発光液を滴下もしくは噴霧する携帯型発光“ランタン”、及び溶液、混合物、懸濁液、粉末、ペースト、粒子もしくは他の適切な形態にある組成物の他のその種の噴射、スプレー又はエアロゾルを含むがこれらに限定されるものではない。
したがって、ここで提供される新規用品には、発光する織物、発光インク、発光塗料、特にフィンガーペイント、発光する紙製品、玩具、特に生物発光液を射出する再充填可能な水鉄砲、発光する内部器官もしくは部品を有する人形及び模型、発光する置物及び新規用品；吐き出す際に発光する“煙”を生じるおもちゃの“シガレット”、発光する黄身及び／又は白身を有するおもちゃの卵、発光するおもちゃのフットバッグ、発光するトランプ、サイコロ、ゲームボードのような発光する部品を有するおもちゃのボード及びカードゲーム；発光する食物及び飲料、泡を吹き飛ばして発光する多数の泡を作るための石鹸様組成物、発光する泡を生じる泡立て剤組成物、発光する液体を放出する噴水器、生物発光“花火”、線香花火、魔法の杖のおもちゃ、及び多くの他のその種の製品が含まれるがこれらに限定されるものではない。遺伝子組換え魚類のようなルシフェラーゼを発現する植物及び動物に関して適切な発光基質を含む食物を給餌する際に用いられるルシフェリンを含む食物もここで意図されている。
生物発光は、非毒性、非腐食性及び非着色性の試薬を用いて生成させることができるため、この種の新規用品と組み合わせて有利に用いられる。また、生物発光は、所望であれば数分から数時間まで持続する発光をもたらすように維持することができるため、有利に用いられる。
ここに提供される生物発光生成系と組み合わせ、それにより、レクレーション用の製品又は注目を引きつけるための製品、例えば、広告用品及び／又はロゴもしくは商標を連想するサービスの使用を含むエンターテインメント、レクレーション及び／又はアミューズメントを提供することができるあらゆる製造物品がここで意図されている。このような使用は、その種の用品の通常の、もしくは正常な使用に付け加えるものでも、それと合同するものでも、それに代わるものであってもよい。この組み合わせの結果、これらの用品は発光し、又は、水鉄砲及び噴水器の場合のように、発光する液体又は液体もしくは粒子の噴霧を生じる。この新規用品の新規性はその生物発光に由来する。
好ましい生物発光生成反応は、酸素（もしくは酸素を含む水）又はカルシウムイオンもしくは他の適切な金属イオンをルシフェリン及びルシフェラーゼ混合物にここで説明される装置及び系を用いて添加することにより行われる。生物発光を生成するための装置、系及び基質が提供される。これらの系は、生物発光生成試薬でコートしたマトリックス材料、試薬を収容するカプセル状坦体並びに試薬を収容する単一室及び複数室装置を含む。マトリックス材料は、例えば、衣料品の製造において、及びここで説明される装填カートリッジにも用いられる。
新規用品と組み合わせて生物発光を生成させるための方法及び組成物も提供される。生物発光生成試薬を収容するマイクロ及びマクロカプセル状坦体が提供される。カプセル状坦体は、リポソーム、単離エンドソーム、単離液胞、ゼラチンカプセル、及び他のその種の送達坦体のようなカプセルであり、装置には容器並びに１室、２室及び３室以上の装置が含まれる。これらの坦体は生物発光生成系試薬を封入し、典型的には、生物発光反応を生じるのに必要な試薬の全てに満たないものを収容する。カプセル状坦体には、リポソームのような薬剤の送達にしばしば用いられる坦体及び徐放性カプセル；並びにガラス、プラスチック及び他のその種の材料製のカプセルも含まれる。
例えば、生体発光生成試薬（又は成分）はガラスキャピラリ管のようなガラス容器の内側にコートされていてもよい［例えば、米国特許５，３８７，５２６号を参照］。分子酸素、ＡＴＰ、レダクターゼ、Ｃａ2+［又は他の適切な金属イオン］のような必要な活性化剤を含む組成物を添加すると、このコーティングが活性化剤と接触して発光する。これらのカプセル状坦体は製造物品と組み合わせて用いることが意図されている。
このように、マイクロもしくはマクロカプセル状坦体は、それらが破壊され、開封され、溶解し、又は他の方法で内容物の搬送を生じる条件下におかれた場合、空気及び／又は水分及び／又は他の活性化剤（１種もしくは複数）と接触した場合に発光する物質を放出する。これらの坦体の大きさ［最も大きい寸法］は０．１μｍ未満という小さいものから．１ｃｍ以上まで変化する。
生物発光生成試薬が結合する、ガラス、プラスチック、綿及び他の織物材料のようなマトリックス材料も提供される。例えば、生物発光生成系の１以上の成分は、吸着、吸収又は他の手段により、直接もしくは間接的に（例えば、リンカーにより）、マトリックス材料に結合させる。マトリックス材料、例えば、ルシフェラーゼもしくはルシフェリンのような分子の結合に適合する織物、ガラス、プラスチックもしくはセラミックの表面又は粒子は、その生物発光生成系の少なくとも１つの成分、特にはルシフェリン、ルシフェラーゼ、又は、それらの成分の感受性が高い場合には、ルシフェリン及びルシフェラーゼと結合させる。ルシフェラーゼのような成分（１種もしくは複数）は、タンパク質合成の技術分野における当業者に公知のペプチドもしくはタンパク質を固体基材に結合させるための方法を用いて綿のようなマトリックスに結合させる［例えば、Ｅｉｃｈｌｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１１０３５−１１０４１；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：１３８５−１３９０を参照］。結合は共有結合的に、又は非共有結合的に達成し、かつ直接であってもリンカーによるものであってもよい。この種の方法及びリンカーは化学技術分野の当業者には公知である。生物発光生成系の成分が結合するマトリックスを製造物品と接触させると、例えば反応の残りの成分を含む組成物上に噴霧することにより適切に処理した場合に発光し、もしくは生物発光を生じる新規用品が得られる。このマトリックス材料はここで提供される装填カートリッジにおいて有利に用いられる。
また、生物発光を生成させるための単一及び複数室、特には２室の装置も提供され、かつこれらの装置と生物発光生成試薬との組み合わせも提供される。この種の装置は、生物発光の生成に必要な試薬又は成分の少なくとも１種を除いて全てを収容する少なくとも１つの室を具備する。成分を室に添加すると、又は室の内容物の幾らかもしくは全てを排出させると、生物発光が発光し、又は発光する液体、噴霧もしくは噴射が生じる。これらの装置に装填するのに適する再充填もしくは充填カートリッジも提供される。これらの装置は、例えば、生物発光液を射出するおもちゃの水鉄砲として用いるのに適する。
充填もしくは再充填カートリッジは、生物発光生成系の成分を製造物品内又はその表面上に装填して新規用品を製造するのに用いられるように、また、生物発光生成系が消費された後の再利用を可能にするように設計される。１以上の室を有するこのカートリッジは、例示的な態様においては、２つの室を伴って製造される。好ましい態様において、このカートリッジは多孔性膜又は綿ボールのようなマトリックス材料を有し、このマトリックス材料にはルシフェラーゼもしくはルシフェリンのような生物発光生成試薬が、適切な組成物が勢いよく流された場合にそのマトリックスから放出されるように吸着又は吸収されている。第１室は生物発光プロセスにおいて用いられる生物発光生成系の１以上の成分を収容し、かつ第２室はマトリックス材料から多量の成分を押し流し、又は他の方法で脱着させる組成物を収容する。典型的には、この組成物は容易に穿刺可能であり、又は圧縮可能であるバイアルに収容され、マトリックス材料に隣接して配置される。操作の上では、プランジャー、２つ以上の室が存在する場合には２つの突起を有するプランジャーを、そのプランジャーの突起の１つが各々の室内に位置するように一列に並べ、又はプランジャーを移動可能にカートリッジに取り付け、そのカートリッジの出力ノズルを新規用品、例えば水鉄砲、の充填材口とは反対方向に向けて一列に並べることができる。次に、プランジャーをカートリッジに押し込み、それにより成分を第１室のノズルから新規用品の第１室内に送り込み、かつ液体のバイアルを圧縮して生物発光生成系の残りの成分を第２室のノズルから新規用品の第２室内に勢いよく流し込む。このようにして、生物発光の生成に必要な成分のいずれかもしくは全てを補給することにより、ここで意図される新規用品に最初に充填し、又は繰り返し再充填することができる。
生物発光生成系の１種以上の成分又は組成物、例えばＡＴＰ又はＣａ2+を含む組成物を包装材料内に具備し、かつその内容物が生物発光の生成に用いられるものであることを示すラベルを具備する製造物品も提供される。
製造物品、及び、例えばその製造物品と共に、その内部で、もしくはその表面上で用いられる、生物発光を生成させるのに適切な試薬を具備するキットも提供される。
図面の説明
添付の図面において：
図１は、２室構造を組み込んだ水鉄砲の一部を切り欠いた側面図であり；
図２は、図１の２−２線での断面図であり；
図３は、図１の３−３線での断片図であり；
図４は、２室の脱着可能な液体容器を有するおもちゃの空気銃の一部を切り欠いた側面図であり；
図５は、一部を切り欠いた図４のおもちゃの銃の平面図であり；
図６は、２室系を組み込んだ気体充填液体分注装置の一部を切り欠いた側面図であり；
図７は、図６の７−７線での断面図であり；
図８は、一部を切り欠いた図６の構造の平面図であり；
図９は、噴水型形状のガス充填２室液体分注装置の一部を切り欠いた側面図であり；
図１０は、図９の１０−１０線での断面図であり；
図１１は、２室の圧縮可能な分注容器の一部を切り欠いた側面図であり；
図１２は、泡を吹き出す組成物と共に用いるために設計されたビン／浮体の一部を切り欠いた側面図であり；
図１３は、混合された成分及び使用のために脱着された泡を吹き出す杖を備える、図１２に類似する図であり；及び
図１４は、その開封によって作動する浮体装置を備える飲料容器の一部を切り欠いた側面図である。
図１５は、泡を吹き出す組成物と共に用いるのに適する、１回使用の２室液体包装装置の一部を切り欠いた側面図である。
図１６は、プランジャー組立体を押し下げてコルクキャップ内に収容されたカプセルを破裂させることにより作動するキャップ装置の一部を切り欠いた側面図である。
図１７は、プランジャー組立体をコルクキャップにねじ込んでそこに収容されたカプセルを破裂させることにより作動するキャップ装置の一部を切り欠いた側面図である。
図１８は、スクリューキャップをビンの頂部にねじ込み、それがプランジャー組立体をそのビンの首の内部に収容されるカプセルに押し付け、それによってカプセル膜が破裂することにより作動する、キャップ装置の一部を切り欠いた側面図である。
図１９は、キャップ装置がビンの頂部にしっかりと固定され、カプセル膜が破裂した、図１８の図に類似する図である。
図２０は、その底部が噛み合わされていない噴霧容器もしくは缶の一部を切り欠いた側面図である。
図２１は、その底部が噛み合わされている噴霧容器の一部を切り欠いた側面図である。
図２２は、生物発光生成試薬を含み、かつ噴霧容器と共に用いるのに適する例示的なペレットの側面図である。
図２３は、２室構造を組み込んだ水鉄砲の別の態様の一部をり切り欠いた側面図であり、
図２４は、図２３の水鉄砲のノズル端部の一部を切り欠いた平面図であり；
図２５は、図２３の２５−２５線での断面図であり；及び
図２６は、図２３の２６−２６線での断面図である。
図２７は、一部を切り欠いた圧縮可能な管形状の側面図である。
図２８は、充填、又は再充填カートリッジの絵図であり；
図２９は、プランジャーがその出発位置にある図２８の２９−２９線での断面図であり；
図３０は、図２に示されるような典型的なユニットの受容室内に排出されたカートリッジ内容物を示す、図２９に類似する断面図であり；
図３１は、プランジャー固定装置を示す、図２９に類似する断面図であり；
図３２は、プランジャーの圧縮が可能となるように解除されている固定装置を示す、図３０に類似する断面図であり；
図３３は、図３１の３３−３３線に沿い、かつ固定装置の位置を示す断面図であり；及び
図３４は、２室再充填カートリッジの代替の実施態様の断面図である。
図３５は、新規水鉄砲の代替の実施態様である。
図３６は、カートリッジ容器から取り外されたカートリッジ、及び混合室に生物発光生成試薬を充填するために引き伸ばされた銃身を示す、図３５の新規水鉄砲の図である。
図３７は、引き伸ばされた銃身及びカートリッジ容器から取り外されたカートリッジを示す、図３６の新規水鉄砲の断面図である。
図３８は、図３７の新規水鉄砲のカートリッジ容器の詳細な図である。
図３９は、図３５の新規水鉄砲のノズル及び混合室の代替の実施態様の断面図である。
図４０は、混合室に生物発光液を充填するために引き伸ばされた銃身を示す、図４０の代替の実施態様の断面図である。
図４１は、生物発光生成試薬含有組成物をノズルから噴出させるために銃本体に押し込まれる銃身を示す、図４１の代替態様の断面図である。
図４２は、カートリッジ容器に挿入されるカートリッジを示す、カートリッジ組立体の代替の実施態様の断面図である。
図４３は、プランジャー及びピストンを示す、図４２の代替の実施態様の端面図である。
図４４は、ピストン及び組成物を液体容器に導入するためにカートリッジ本体に押し込まれるプランジャーを示す、図４２の代替の実施態様の断面図である。
発明の詳細な説明
目次
Ａ．定義
Ｂ．生物発光生成系
１．一般的な説明
ａ．ルシフェラーゼ
ｂ．ルシフェリン
ｃ．活性化剤
ｄ．反応
２．有櫛動物及び腔腸動物系
ａ．エクオリン系
（１）エクオリン発光タンパク質
（２）ルシフェリン
ｂ．レニラ系
３．甲殻類、特定のシルピジナ［バルグラ］、系
ａ．バルグラのルシフェラーゼ
（１）シルピジナからの精製
（２）組換え法による調製
ｂ．バルグラのルシフェリン
ｃ．反応
４．ホタル、コメツキムシ、及び他の昆虫系を含む昆虫生物発光生成系
ａ．ルシフェラーゼ
ｂ．ルシフェリン
ｃ．反応
５．細菌系
ａ．ルシフェラーゼ
ｂ．ルシフェリン
ｃ．反応
６．他の系
ａ．渦鞭毛藻類生物発光生成系
ｂ．ラチア及びホラスのような軟体動物からの系
ｃ．ミミズ及び他の環形生物
ｄ．ツチボタル
ｅ．海洋多毛虫系
ｆ．南部鉄道甲虫
７．蛍光タンパク質
ａ．緑色及び青色蛍光タンパク質
ｂ．フィコビリンタンパク質
Ｃ．製造物品と組み合わせた反応の実施
Ｄ．生物発光系の包装
１．生物発光生成系の成分と組み合わせるための分注及び包装装置
２．カプセル、ペレット、リポソーム、微粉化粒子
ａ．封入坦体−一般
ｂ．封入坦体−リポソーム
ｃ．封入坦体−ゼラチン及びポリマー坦体
ｄ．微粉化粒子
３．装置及び基材
ａ．マトリックス材料
ｂ．固定化及び活性化
４．単室、ハウジング又は容器を具備する装置
５．２室式及び多室式の液体分注装置
ａ．機械式ポンプ分注装置
ｂ．気体充填分注装置
ｃ．圧縮可能な分注装置
６．特に１回もしくは複数回使用のために設計された、他の液体分注及び包装装置
ａ．ビン型の単室容器／浮体装置
ｂ．食物及び飲料と共に用いるための２室のビン型容器／浮体装置
ｃ．食物及び飲料と共に用いるための缶型容器／浮体装置
ｄ．発光噴霧を発生するために用いられる噴霧容器
７．単室容器を用いるためのキャップ装置
Ｅ．製造物品及び生物発光の組み合わせ
１．入浴剤、泡立て剤、爪、髪、皮膚、唇及びその他で用いるための製品を含むパーソナルケア製品
ａ．入浴剤
ｂ．発光ダスト及び粉末
ｃ．ローション、ジェル及び他の局所塗布製剤
（１）ローション
（２）クリーム
（３）局所塗布用の溶液及び懸濁液
（４）ジェル
（５）固体
２．発光玩具及び他の用品
ａ．単、２室及び多室のおもちゃの銃及びペレット又は液体を発射するおもちゃの兵器
ｂ．泡を作る玩具
ｃ．ボード／カードゲーム
ｄ．おもちゃの卵
ｅ．フットバッグ、お手玉及びボール
３．発光織物及び紙製品
４．角氷を含む食物及び飲料
ａ．飲料
ｂ．氷
５．宝石、衣類及び他の製品
６．噴水器
７．タバコではないおもちゃのシガレット
８．魚類及び魚の餌
９．植物栄養分
Ｆ．新規用品に装填（充填）又は再装填（再充填）するためのカートリッジ
Ａ．定義
他に定義されない限り、ここで用いられる全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。ここで参照される全ての特許及び刊行物は参照することによりそれら全体が組み込まれる。
ここで用いられる場合、新規用品は、例えそれが僅かな瞬間にすぎないとしても、アミューズメント、エンターテインメント、装飾又はレクレーションをもたらすことが意図されている無生物の製造物品を指す。レクレーション又はエンターテインメントのための使用はその用品の唯一の使用方法であっても、ここに説明されるように生物発光と組み合わせることにより改変されている衣類のように、その用品の他の使用方法もしくは利益に追加されるものであってもよい。
新規用品は、一般購入者に加えて、その種の用品の製造における当業者によって理解されるものであり、ここでは、おもちゃの銃、例えば水鉄砲、人形、模型、置物、風船、泡、“フェアリーダスト”、例えば微粉化凍結乾燥粒子、パズル、並びにインク及び塗料、特にフィンガーペイントを含む玩具；例えばドライアイス又は煙霧と混合した場合の劇場用蒸気；土産物；織物、特にＴシャツ、帽子、水着（ｓｗｉｍｓｕｉｔｓ）、水着（ｂａｔｈｉｎｇ  ｓｕｉｔｓ）、ウェットスーツ、スキューバダイビング用スーツ、サーフィン用スーツ、及び他のウォータースポーツ（１種もしくは複数）用の物品を含む衣類；ゼラチン、角氷及び他の形状の氷、ビール、ワイン、シャンパン、ソフトドリンク、アイスクリーム、シャーベット、氷、糖衣、並びにキャンディを含む食物及び飲料；宝石、メダル、装飾物品、人造花、営業上の信用を促進することを目的とするＴシャツ、帽子、塗料、包装紙、贈り物のような販促用もしくは他のその種の用品に名称、営業上の商品名、標語、商標を表示するための物品；身辺用品、例えば、ボディペイント、ボディスプレー、泡風呂、化粧、ボディローション、歯磨剤；噴水器；“花火”、線香花火、及び魔法の杖のおもちゃを含む、粒子もしくは液体の噴射もしくは噴霧のような用品、並びに多くの他のその種の新規用品を含むことが意図されている［例えば、新規用品と考えられ、かつここで用いることができる型の用品を記述する米国特許５，４３５，０１０号、５，４６０，０２２号、５，４５８，９３１号、５，４３５，７８７号、５，４３５，０１０号、５，４３２，６２３号、５，４２１，５８３号、５，４１９，５５８号、５，４１６，９２７号、５，４１３，４５４号、５，４１３，３３２号、５，４１１，４２７号、５，４１０，９６２号、５，４０７，６９１号、５，４０７，３９１号、５，４０５，９５８号、５，４０５，２０６号、５，４００，６９８号、５，３９９，１２２号、５，３９８，９７２号、５，３９７，６０９号、５，３９６，４０８号、５，３９３，５８０号、５，３９０，０８６号、５，３８９，０３３号、５，３８３，６８４号、５，３７４，８０５号、５，３６８，５１８号、５，３６３，９８４号、５，３６０，０１０号、５，３５３，３７８号、５，３５１，９３１号、５，３４６，４５５号、５，３４１，５３８号、５，３２３，４９２号、５，２８３，９１１号、５，２２２，７９７号、５，１７７，８１２号、５，１５８，３４９号、４，９２４，３５８号、３，５９７，８７７号及び他の多くのものを参照］。生物発光と組み合わされているこの種のあらゆる無生物の用品がここで包含されることが意図されている。
このように、ここでの目的上、新規用品は、たとえそれが僅かな期間にすぎないとしても、生物発光と組み合わせられた場合にアミューズメント、エンターテインメント、レクレーション又はエンジョイメントを提供する無生物の製造物品を指す。製造物品への生物発光系の追加は用品の機能に追加するものではなく、得られる組み合わせが新規用品となるようにその用品にエンターテインメント、アミューズメント又はレクレーションの側面を追加するものである。したがって、ここに提供される組み合わせは、無生物製造物品と生物発光との組み合わせのために新規用品である。ここに提供される他の組み合わせには、そのエンターテインメント、アミューズメント又はレクレーション的な使用もしくは側面が生物発光を付与することにより変更又は改善されている新規用品が含まれる。
ここで用いられる場合、無生物は、その製造物品が生きているものでも、かつて生きていた［すなわち、死んだ］ものでもないことを意味する。したがって、ここでの新規用品は生きている生物、例えば、遺伝的に改変されたホタルもしくはルシフェラーゼを発現する遺伝的に加工された植物又は生物発光を生じる他のその種の生物は包含しない。ルシフェリン（もしくはルシフェラーゼ）及び／又は対応するルシフェラーゼ（もしくはルシフェリン）を発現する遺伝子組換え動物もしくは植物と共に用いらられる他の活性化剤を含む動物の食物及び植物栄養分が提供される。これらは、その食物の摂取又は消費又は吸収の結果、彩飾された動物又は植物が生じることが意図されている。したがって、遺伝子組換え魚類及び餌もここで提供される。
ここで用いられる場合、身辺用品は身体に対して用いられる用品、例えば、練り歯磨き、歯磨剤、化粧品、マニキュア液、ボディローション、ボディクリーム、ボディペイント及びボディパウダーを含む。
ここで用いられる場合、化学発光は、エネルギーが分子に特異的に伝わり、それによってその分子が電子的に励起して光子を放出するようになり、それにより可視光を放射する化学反応を指す。温度はこの流れ込むエネルギーには寄与しない。したがって、化学発光は化学エネルギーの光エネルギーへの直接変換に関与する。生物発光は、ルシフェリン及びルシフェラーゼ（又は発光タンパク質）に関与する化学発光反応のサブセットを指す。生物発光は、ここでは、リン光を含まない。
ここで用いられる場合、“フェアリーダスト（妖精のチリ）”は、空気と接触する際に発光する光感受性リポソーム又は微小粉末化粒子のような粒子、例えば、子供がティンカーベル又は他のその種のキャラクターの振りをする際に用いる“ダスト”を指す。
ここで用いられる場合、角氷に対する言及には、立方体；予め成形された型から作製した氷の形成体、例えば、置物、氷柱、氷の彫刻及び氷から形成される他のその種の新規用品を含むがこれらに限定されるものではないあらゆる形状もしくは形態の氷が含まれる。
ここで用いられる場合、発光は、発エネルギー性化学プロセスの励起生成物が光の放射を伴ってその基底状態に復帰する際に生じる検出可能なＥＭ放射、一般には、ＵＶ、ＩＲもしくは可視ＥＭ放射を指す。化学発光は化学反応から生じる発光である。生物発光は、生物学的分子［又は、それらの合成物もしくは類似体］を基質及び／又は酵素として用いる化学反応から生じる化学発光である。
ここで用いられる場合、化学発光の型の１つである生物発光は、生物学的分子、特にはタンパク質による光の放射を指す。生物発光の必須条件は、基質であるルシフェリンに対して作用するオキシゲナーゼであるルシフェラーゼの存在下における、結合した、もしくは遊離の分子酸素である。生物発光は酵素又は他のタンパク質［ルシフェラーゼ］によって生じるものであり、これらの酵素は分子酸素の存在下において基質ルシフェリン［生物発光基質］に対して作用し、かつその基質を励起状態に変換し、これが低エネルギー水準に戻る際にエネルギーを光の形態で放出する。
ここで用いられる場合、生物発光を生成させるための基質及び酵素は、包括的に、それぞれルシフェリン及びルシフェラーゼと呼ばれる。明確にするためにそれらの特定の種に言及がなされる場合、例えば細菌ルシフェリン又はホタルルシフェラーゼのように、各々の総称がそれが由来する生物の名称と共に用いられる。
ここで用いられる場合、ルシフェラーゼは発光反応を触媒するオキシゲナーゼを指す。例えば、細菌ルシフェラーゼは、フラビンモノヌクレオチド［ＦＭＮ］及び脂肪族アルデヒドの酸化（この反応は光を生じる）を触媒する。海洋節足動物の間で見出される他のクラスのルシフェラーゼはシプリジナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）［バルグラ（Ｖａｒｇｕｌａ）］ルシフェリンの酸化を触媒し、別のクラスのルシフェラーゼは鞘翅類ルシフェリンの酸化を触媒する。
したがって、ルシフェラーゼは生物発光反応［生物発光を生じる反応］を触媒する酵素又は発光タンパク質を指す。ホタル及びレニラルシフェラーゼのようなルシフェラーゼは触媒的に作用する酵素であり、生物発光生成反応の間に変化することはない。ルシフェラーゼ発光タンパク質、例えば、ルシフェリンが非共有結合的に結合するエクオリン及びオベリン発光タンパク質は、生物発光生成反応の間に、例えばルシフェリンの放出により、変化する。ルシフェラーゼは、生物体内で天然に生じるタンパク質、又はそれらの変種もしくは変異体、例えば、天然のタンパク質とは異なる１以上の特性、例えば熱及びｐＨ安定性、を有する突然変異によって生じる変種である。複数のルシフェラーゼ及びそれらの改変変異体もしくは変種形態が公知である。
したがって、例えば“レニラルシフェラーゼ”に対する言及は、レニラ属の構成要素から単離される酵素、又は他のあらゆる源、例えば別の花虫綱、から得られる等価分子、もしくは合成により調製された等価分子を指す。
ルシフェラーゼ及びルシフェリン及びそれらの活性化剤は生物発光生成試薬もしくは成分と呼ばれる。典型的には、これらの試薬のサブセットが提供され、又は製造物品と組み合わされる。この組み合わせを残りの試薬と接触させることにより生物発光が生じる。したがって、ここで用いられる場合、成分ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びＯ2、Ｍｇ2+、Ｃａ2+のような他の因子は生物発光生成試薬［又は剤もしくは成分］とも呼ばれる。
ここで用いられる場合、“厳密に触媒的ではなく”は、その発光タンパク質が触媒として基質の酸化を促進するように作用するものの、その反応において結合基質が酸化され、かつ結合分子酸素が用いられるためにその反応において変化しないことを意味する。この種の発光タンパク質は、当該技術分野における当業者に公知の適切な条件下において基質及び分子酸素を添加することにより再生される。
ここで用いられる場合、生物発光基質は、ルシフェラーゼ及びあらゆる必要な活性化剤の存在下において酸化され、かつ光を生じる化合物を指す。これらの基質はルシフェリンと呼ばれ、これは生物発光反応において酸化を受ける基質である。これらの生物発光基質にはあらゆるルシフェリンもしくはそれらの類似体、又はルシフェラーゼが相互作用して光を生じるあらゆる合成化合物が含まれる。好ましい基質は、光生成反応においてルシフェラーゼもしくはタンパク質の存在下で酸化されるものである。したがって、生物発光基質には当該技術分野における当業者がルシフェリンとして認識する化合物が含まれる。例えば、ルシフェリンには、ホタルルシフェリン、シプリジナ［バルグラとしても知られる］ルシフェリン［コエレンテラジン］、細菌ルシフェリンが、これらの基質の合成類似体又は生物発光を生じる反応においてルシフェラーゼの存在下で酸化される他の化合物の他に含まれる。
ここで用いられる場合、生物発光基質に変換することが可能であるとは、生物発光基質を生じる化学反応、例えば酸化もしくは還元、に感受性であることを意味する。例えば、生物発光細菌の発光生成反応は、フラビンレダクターゼ酵素によるフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の還元フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ2）への還元を含む。この還元フラビンモノヌクレオチド［基質］は次に酸素［融化剤］及び細菌ルシフェラーゼと反応して中間ペルオキシフラビンを形成し、これが長鎖アルデヒドの存在下においてさらに反応を受けて光を生じる。この反応に関しては、還元されたフラビン及び長鎖アルデヒドが基質である。
ここで用いられる場合、生物発光系［又は生物発光生成系］は生物発光生成反応に必要な試薬の組を指す。したがって、特定のルシフェラーゼ、ルシフェリン及び他の基質、溶媒並びに生物発光反応を完了させるのに必要とされ得る他の試薬が生物発光系を形成する。したがって、生物発光系（又は等価に生物発光生成系）は、適切な反応条件下において生物発光を生じる試薬のあらゆる組を指す。適切な反応条件は生物発光反応が生じるのに必要な条件、例えば、ｐＨ、塩濃度及び温度を指す。一般に、生物発光系は生物発光基質（ルシフェリン）、酵素ルシフェラーゼ及び発光タンパク質を含むルシフェラーゼ、並びに１種以上の活性化剤を含む。特定の生物発光系はそのルシフェラーゼが由来する特定の生物に言及することにより同定することができ、例えば、バルグラ［シプリジナとも呼ばれる］生物発光系（もしくはバルグラ系）はバルグラルシフェラーゼ、例えば、オストラコッド（ｏｓｔｒａｃｏｄ）、バルグラから単離されるルシフェラーゼ、又は組換え手段もしくはこれらのルシフェラーゼの改変を用いて生成されるものを含む。また、この系は生物発光反応の完了に必要な特定の活性化剤、例えば、酸素及び酸素の存在下においてルシフェラーゼと反応して光を生じる基質をも含む。
ここで用いられる場合、用品の再充填又は再装填は、消費された生物発光生成成分を用品に追加する手段を指す。再充填は、一般に、ルシフェラーゼのような１成分を織物のような用品に追加するプロセスを指し、再装填は全ての成分を再充填可能な水鉄砲のような用品に追加するプロセスを指す。
ここで用いられる場合、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨは、それぞれ、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化形態）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元形態）を指す。
ここで用いられる場合、組換えＤＮＡ法を用いる組換え手段による生成は、クローン化ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるための分子生物学の公知方法の使用を意味する。
ここで用いられる場合、生成物に実質的に同一とは、十分に類似していて関心のある特性が十分に未変化であり、そのためその生成物の代わりにその実質的に同一の生成物を用いることができることを意味する。
ここで用いられる場合、実質的に純粋とは、この種の純度を評価するのに当業者が用いる標準的な分析法、例えば、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による決定で容易に検出できる不純物が存在しないと考えるのに十分な均一性、又はさらなる精製が基質の物理的及び化学的特性、例えば酵素的及び生物学的活性、を検出可能に変更しないようにするのに十分な純度を意味する。化合物を精製して実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための方法は当業者には公知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体の混合物であってもよい。そのような場合には、さらなる精製によってその化合物の比活性を高めることができる。
ここで用いられる場合、核酸の２つの配列に言及する場合の等価は、問題の２つの配列がアミノ酸又は等価タンパク質の同じ配列をコードすることを意味する。“等価”が２つのタンパク質又はペプチドへの言及において用いられる場合には、その２つのタンパク質又はペプチドが、タンパク質又はペプチドの活性又は機能を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換［例えば、下記表２を参照］のみを伴う実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。“等価”が特性を指す場合には、その特性は同じ程度に存在する必要はない［例えば、２つのペプチドが同じ型の酵素活性を異なる割合で示してもよい］が、その活性は好ましくは実質的に同じである。“相補的”は、２つのヌクレオチド配列に言及する場合には、そのヌクレオチドの２つの配列がハイブリダイズすることが可能であり、対向するするヌクレオチドの間でのミスマッチが好ましくは２５％未満、より好ましくは１５％未満、さらにより好ましくは５％未満、最も好ましくは全く存在しないことを意味する。好ましくは、これらの２つの分子は厳密性の高い条件下でハイブリダイズする。
ここで用いられる場合、ミスマッチのパーセンテージの決定におけるハイブリダイゼーションの厳密性は以下の通りである：
１）高厳密性：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２）中厳密性：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３）低厳密性：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
代替の緩衝液、塩及び温度を用いて等価の厳密性を達成することができることは理解される。
“実質的に”という用語は、関連分野における当業者によって理解されるように状況に伴って変化し、一般には少なくとも７０％を意味し、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を意味する。
ここで用いられる場合、生物学的活性は化合物のイン・ビボでの活性又は化合物、組成物もしくは他の混合物を投与した際に生じる生理学的応答を指す。生物学的活性は、その種の活性を試験し、又はそれを用いるように設計されたイン・ビトロ系において観察することができる。したがって、ここでの目的上、ルシフェラーゼの生物学的活性は、それによって基質の酸化の際に光が生じる、そのオキシゲナーゼ活性である。
ここで用いられる場合、組成物はあらゆる混合物を指す。それは溶液であっても、懸濁液であっても、液体であっても、粉末であっても、ペーストであっても、水溶液であっても、非水溶液であっても、あるいはそれらのいかなる組み合わせであってもよい。
ここで用いられる場合、組み合わせは２つもしくはそれ以上の用品の間でのあらゆる関わり合いを指す。
ここで用いられる場合、流体は流動可能なあらゆる組成物を指す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ジェル、ローション、クリーム及び他のその種の組成物の形態にある組成物を包含する。
ここで用いられる場合、植物栄養分は、成長を促進又は維持するために植物に適用される、窒素、カリウム及び／又はリン、製剤、組み合わせ、ポリマー又は植物成長促進剤、例えばオーキシン及びホルモンをあらゆる割合で含むあらゆる液体、水溶性もしくは水不溶性固体、例えば肥料を指す［例えば、米国特許４，０１６，８８０号、４，７１１，６５９号、４，８０４，４０３号、５，５４７，４８６号、５，５５３，８５３号、ＲＥ３５，３２０号、及びＲＥ３１，８０１号を参照］。植物栄養分は土壌に直接適用しても、植物の葉に噴霧しても、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。植物栄養分は遅放性であってもよく、又は植物による消費に直ちに利用可能なものであってもよい。植物栄養分は、生物発光生成系の成分、好ましくはルシフェラーゼをコードする異種遺伝子を含むように遺伝的に処理することが可能なあらゆる植物に適用することができる。この種の植物の例は草本、農業用植物及び観賞用植物であるが、これらに限定しようとするものではない。
Ｂ．生物発光生成系
生物発光生成系は生物発光を生じるのに必要かつ十分な成分を指す。これらには、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及び必要なあらゆる補因子もしくは条件が含まれる。事実上、当業者に公知のあらゆる生物発光生成系がここに提供される装置、系、組み合わせ及び方法において用いることが許容される。生物発光生成系の選択において考慮される要素には、生物発光との組み合わせで用いられる用品；反応を実行する媒体；成分の安定性、例えば温度もしくはｐＨ感受性；成分の貯蔵寿命；それが恒常的であろうと断続的であろうと、光放射の持続性；成分の利用可能性；所望の光の強度；及び他のこの種の要素が含まれるがこれらに限定されるものではない。
１．一般的な説明
一般に、生物発光は、特定の化学的基質、ルシフェリン、が酵素、ルシフェラーゼ、によって触媒される酸化を受けるエネルギー発生化学反応を指す。生物発光反応は維持が容易であり、反応を継続もしくは回復させるために消耗したルシフェリン又は他の基質もしくは補因子又は他のタンパク質を補充することのみを必要とする。生物発光生成反応は当業者に公知であり、この種の反応のあらゆるものをここに記述される製造物品との組み合わせでの使用に適用することができる。
多くの生物発光生成系の生物及び源が存在し、生物発光を示す幾つかの代表的な属及び種を以下の表に示す［（１９９５）細胞生理学：原本，Ｎ．Ｓｐｅｒｅｌａｋｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，６６１−６８１頁のＨａｓｔｉｎｇｓから部分的に再掲載］。
0004146515.tif 000002
0004146515.tif 000003
ここで用いようとする他の生物発光生物は、ゴナドストミアス（Ｇｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓ）、ガウスシア（Ｇａｕｓｓｉａ）、ハリスツリア（Ｈａｌｉｓｔｕｒｉａ）、バンパイアイカ、グリフス（Ｇｌｙｐｈｕｓ）、ミコトフィズ（Ｍｙｃｏｔｏｐｈｉｄｓ）（魚）、ビンシグエリア（Ｖｉｎｃｉｇｕｅｒｒｉａ）、ホウェルラ（Ｈｏｗｅｌｌａ）、フロレンシエラ（Ｆｌｏｒｅｎｃｉｅｌｌａ）、カウジオドゥス（Ｃｈａｕｄｉｏｄｕｓ）、メラノコスツス（Ｍｅｌａｎｏｃｏｓｔｕｓ）及びシーペンである。
生物発光生成系は上記表中のもののような天然資源から単離するも、合成によって生成させることも可能であることは理解される。加えて、ここで用いるためには、それらの成分は、それらの混合物が適切な条件下で発光を生じるのに十分な純度であることのみが必要である。したがって、幾つかの態様において、粗製抽出物又はその生物を単にすり砕くことで十分であり得ることが見出されている。しかしながら、一般には実質的に純粋な化合物が用いられるが、必要であれば、正確な純度を経験的に決定することができる。また、成分は天然資源からは単離されない合成成分であってもよい。ルシフェラーゼをコードするＤＮＡが利用可能であり［例えば、配列番号１−１３を参照］、修飾されており［例えば、配列番号３及び１０−１３を参照］、かつ合成及び代替基質が考案されている。ここに掲載されるＤＮＡは、利用可能なルシフェラーゼをコードするＤＮＡを代表するものにすぎない。
それが合成のものであろうと天然資源から単離されたものであろうと、あらゆる生物発光生成系、例えば表１、ここの別の箇所に示されるもの又は当業者に公知のものが、ここに提供される組み合わせ、系及び方法において用いられることが意図されている。オキシゲナーゼ［ルシフェラーゼ］に依存しない化学発光系それ自体はここでは含まれない。
ａ．ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼは、必要とされるあらゆる活性化剤の存在下において、遊離であろうと結合するものであろうと分子酸素が存在する条件下で、生物発光基質の低エネルギー状態から高エネルギー状態への酸化を、低エネルギー状態に戻る際に光を放射するように触媒するあらゆる化合物を指す。ここでの目的上、ルシフェラーゼは、基質の酸化により光を生じるように触媒的に作用する酵素、及び、厳密には触媒的ではない［その種のタンパク質が反応において消耗するため］が、基質と共に酸素の存在下において光を生じるように作用するエクオリンのような発光タンパク質をも包含するものとして広範に用いられる。ここでは、エクオリンのような発光タンパク質を含むこれらのルシフェラーゼもルシフェラーゼに含まれる。これらの試薬には、天然に生じるルシフェラーゼ［発光タンパク質を含む］、組換えＤＮＡによって生成されるタンパク質、並びに適切な基質、補因子及び活性化剤の存在下において光を生じる能力を保持するそれらの変異もしくは改変変種、又は触媒として作用して基質を酸化し、それにより光が生じるあらゆる他のその種のタンパク質が含まれる。
包括的に、生物発光反応を触媒し、もしくは開始させるタンパク質をルシフェラーゼと呼び、酸化可能な基質をルシフェリンと呼ぶ。酸化された反応生成物はオキシルシフェリンと呼ばれ、特定のルシフェリン前駆体はエチオルシフェリンと呼ばれる。したがって、ここでの目的上、生物発光は生物学的タンパク質又はそれらの類似体、誘導体もしくは変異体によって触媒され［酵素的に作用するルシフェラーゼの場合］、又は開始される［反応において再生されないエクオリンのような発光タンパク質の場合］反応によって生じる光を包含する。
明確にするため、ここでは、これらの触媒的タンパク質はルシフェラーゼと呼ばれ、これにはルシフェリンの酸化、光の放出及びオキシルシフェリンの放出を触媒するルシフェラーゼのような酵素が含まれる。ルシフェリンの酸化を触媒して光を放射させるものの、その反応において変化を受けて再度用いるには再構成しなければならない発光タンパク質もルシフェラーゼに含まれる。ルシフェラーゼは天然に生じるものであってもよく、又は、例えば遺伝子工学によって改変して特定の特性を改善もしくは変更することもできる。生じる分子が生物発光反応を触媒する能力を保持する限り、それはここに包含される。
ルシフェラーゼ活性を有するあらゆるタンパク質［ここで定義されるように、分子酸素の存在下において基質の酸化を触媒して光を生じるタンパク質］をここで用いることができる。好ましいルシフェラーゼはここに説明されるもの、又は僅かな配列の変化を有するものである。この種の僅かな配列の変化には、僅かな対立形質もしくは種の変化及び残基、特にはシステイン残基、の挿入もしくは欠失が含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般に、生じる分子の生物学的活性を変更することなく行うことができる。当業者は、一般にポリペプチドの非必須領域における１アミノ酸置換は生物学的活性を実質的には変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ），第４版，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．ｃｏ．，２２４頁を参照）。この種の置換は、好ましくは、下記表２に示されるものに従って行われる。
0004146515.tif 000004
他の置換も許容できるものであり、経験的に、又は公知の保存的置換に従って決定することができる。この種のポリペプチドの修飾のあらゆるものは当業者に公知のあらゆる手段によって達成することができる。
ルシフェラーゼは商業的に入手し、天然資源から単離し、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて宿主細胞中で発現させ、又は当業者に公知のあらゆる方式で得ることができる。ここでの目的上、選択された源生物をすり砕くことにより得られる粗製抽出物も十分であり得る。大量のルシフェラーゼが望まれることがあり得るため、宿主細胞からのルシフェラーゼの単離が好ましい。この種の目的のためのＤＮＡはそれらの修飾形態として広範に利用可能である。
ルシフェラーゼの例には、有櫛動物ムネミオプシス（Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｓ）（ムネミオプシン）及びベロエ・オバタ（Ｂｅｒｏｅ  ｏｖａｔａ）（ベロビン）から単離されるもの、腔腸動物エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）（エクオリン）、オベリア（Ｏｂｅｌｉａ）（オベリン）、ペラギア（Ｐｅｌａｇｉａ）から単離されるもの、レニラルシフェラーゼ、軟体動物ホラス（Ｐｈｏｌａｓ）（ホラシン）から単離されるルシフェラーゼ、アリストストミアス（Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ）及びポリクチス（Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓ）魚並びにシプリジナ（バルグラとも呼ばれる）のようなオストラコッドから単離されるルシフェラーゼが含まれるがこれらに限定されるものではない。ここで用いるのに好ましいルシフェラーゼはエクオリンタンパク質、レニラルシフェラーゼ及びシプリジナ［バルグラとも呼ばれる］ルシフェラーゼである［例えば、配列番号１、２及び４−１３を参照］。反応して赤及び／又は近赤外光を生じるルシフェラーゼも好ましい。これらには、Ａ．シンチランス（Ａ．ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｓ）のようなアリストストミアス、パキストミアス（Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉｓａ）、Ｍ．ニガー（Ｍ．ｎｉｇｅｒ）のようなマラコステウス（Ｍａｌａｃｏｓｔｅｕｓ）の種において見出されるルシフェラーゼが含まれる。
ｂ．ルシフェリン
この反応の基質には、ルシフェラーゼが反応して光を生じるあらゆる分子（１つもしくは複数）が含まれる。この種の分子には、天然に生じる基質、それらの修飾形態、及び合成基質が含まれる［例えば、米国特許５，３７４，５３４号及び５，０９８，８２８号を参照］。例示的なルシフェリンには、ここに説明されるものが、それらの誘導体、それらの類似体、ジオキセタンのような合成基質［例えば、米国特許５，００４，５６５号及び５，４５５，３５７号を参照］及び光生成反応においてルシフェラーゼによって酸化される他の化合物［例えば、米国特許５，３７４，５３４号、５，０９８，８２８号及び４，９５０，５８８号を参照］の他に含まれる。この種の基質は、生物発光反応において酸化される化合物を選択することにより経験的に同定することもできる。
ｃ．活性化剤
生物発光生成系は、ここで論じられ、かつ当業者に公知のさらなる成分をも必要とする。全ての生物発光反応は、溶解し、もしくは結合した酸素の形態の分子酸素を必要とする。したがって、水中もしくは空気中に溶解し、もしくは発光タンパク質に結合した分子酸素は生物発光反応の活性化剤である。成分の形態に応じて、他の活性化剤にはＡＴＰ［ホタルルシフェラーゼ用］、ＦＭＮからＦＭＮＨ2を再生するためのフラビンレダクターゼ［細菌系］、並びにＣａ2+及び他の適切な金属イオン［エクオリン］が含まれるがこれらに限定されるものではない。
ここに提供される系の大部分は、ルシフェラーゼ及びルシフェリンが混合され、かつ空気もしくは水に露出されたときに光を生じる。しかしながら、結合酸素を有する発光タンパク質、例えばエクオリンは、Ｃａ2+［又は他の適切な金属イオン］に露出することを必要とし、このＣａ2+はカルシウム塩の水性組成物の形態で提供することができる。これらの場合、ルシフェラーゼ［エクオリン］及びルシフェリン［例えば、コエレンテラジン］の混合物にＣａ2+［又は他の適切な金属イオン］を添加することにより光の生成が生じる。レニラ系及び他の花虫綱の系もＣａ2+［又は他の適切な金属イオン］を必要とする。
すり砕いたシプリジナ［エビ］又はすり砕いたホタルのような粗製調製品が用いられる場合、水のみを添加することが必要であることがある。ホタル［又は、ホタルもしくは甲虫のルシフェラーゼ］が用いられる場合には、その反応はＡＴＰを添加することのみを必要とする。厳密な成分は、ここでの開示に照らして、当業者には明らかであり、又は経験的に容易に決定することができる。
これらの混合物が各々の反応の進行に必要なあらゆる追加の塩又は緩衝液又はイオンをも含むであろうことも理解される。これらの反応は十分に特徴付けられているため、当業者は正確な割合及び必要とされる成分を決定することが可能である。成分の選択は装置、製造物品及びルシフェラーゼに依存する。様々な実施態様がここに説明され、かつ例示されており、それらの記述を鑑みて他の実施態様は明らかである。
ｄ．反応
全ての実施態様において、生物発光生成系の１つを除いて全てに至る成分が選択された製造物品と混合され、又はそれと共の包装され、又は他の方法でそれと組み合わされて新規用品が製造される。生物発光が望まれる場合には、残りの成分（１種もしくは複数）を添加して光を生じさせる。
一般に、達成しようとする結果が肉眼で見ることができるエンターテインメント、アミューズメント又はレクレーションのための光の生成であるため、ここでの目的上、生物発光反応の成分の正確な割合及び量を厳密に決定し、又はそれを満たす必要はない。それらは光を生じるのに十分なものでなければならない。一般に、可視発光を生じるのに十分な量のルシフェリン及びルシフェラーゼの量が用いられる；この量は経験的に容易に決定することができ、選択された系及び選択された用途に依存する。
ここでの目的上、そのような量は、好ましくは、少なくとも当業者が分析の目的で用いる濃度及び割合である。発光が十分に明るくない場合には、より高い濃度を用いることができる。また、その反応が用いられる条件が実験室での条件ではなく、かつそれらの成分が貯蔵を受けるため、活性のいかなる喪失をも克服するためより高い濃度を用いることができる。典型的には、その量は反応混合物のリットル当たりルシフェラーゼ１ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇであり、又はＴシャツもしくは他の織物もしくは紙の一部にコートされて１ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇである。このようなコーティングは、各々の成分を少なくとも約０．０１ｍｇ／ｌ、典型的には０．１ｍｇ／ｌ、１ｍｇ／ｌ又は１０ｍｇ／ｌ以上含む組成物を用品上で乾燥させることにより生成させることができる。ルシフェリンの量も約０．０１ないし１００ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ないし１０ｍｇ／ｌであり、多くの反応でさらにルシフェリンを追加して反応を継続させることができる。ルシフェラーゼが触媒的に作用し、かつ再生させる必要がない実施態様においては、より少量のルシフェラーゼを用いることができる。反応の間にそれが変化するものにおいては、補充することができる；典型的には、より高い濃度が選択される。各々の成分が０．１ないし２０ｍｇ、好ましくは０．１ないし１０ｍｇ、より好ましくは約１ないし１０ｍｇのオーダーの、各々の成分のリットル当たりの濃度範囲［又は、その種の組成物と接触させることから生じる基材上のコーティングの量］が十分なものである。コートされた基材を調製する場合、ここに説明されるように、より高い濃度のルシフェラーゼ又はルシフェリンを含むより多量のコーティング組成物を用いることができる。
すなわち、例えば、カルシウムの存在下で、コエレンテラジンのようなルシフェリン５ｍｇは水１リットル中で、エクオリン発光タンパク質ルシフェラーゼあるいはＲｅｎｉｌｌａからのルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ約１０ｍｇを加えた時、水の温度に応じて少なくとも約１０〜２０分間明るく光る。ルシフェラーゼの濃度を、例えば１００ｍｇ／ｌに上昇させると、特に輝かしい光の発現が得られる。
所望の場合には、生物発光生成反応の阻害因子、例えばマグネシウムを加えることによって生物発光の開始を遅延させることができる。また、阻害を所望しない場合は、エチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］のようなキレート剤の十分量を加えることにより、遊離マグネシウム濃度を低下させてもよい。ＥＤＴＡおよびカルシウムの量は、所望する生物発光を阻害するあるいは妨げることなく、適切にマグネシウムをキレートするように経験的に決定することができる。
使用すべき濃度と量は選択する製造品目に依存し、経験的に容易に決定しうることは了解されている。特に経験的な決定を開始する時に使用する比率は、一般に分析目的に使用されるものであり、量あるいは濃度は少なくとも分析目的に使用されるものであるが、特に持続的でより明るい光を所望する場合は、量を増加することができる。
２．クシクラゲおよび腔腸動物系
Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｓ（ムネミオプシン）やＢｅｒｏｅｏｖａｔａ（ベロビン）のようなクシクラゲ類、およびＡｅｑｕｏｒｅａ（エクオリン）、Ｏｂｅｌｉａ（オベリン）、Ｐｅｌａｇｉａのような腔腸動物は、同様の化学的性質を用いて生物発光を生じる［例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ６７８：６５−７５；Ｈａｒｔら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２０４−２２１０；米国特許出願通し番号第０８／０１７，１１６号に基づく国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９４／１８３４２号、米国特許第５，４８６，４５５号、および本文中で引用する他の参考文献と特許参照］。ＡｅｑｕｏｒｉｎおよびＲｅｎｉｌｌａ系が代表的であり、例証として、また現在のところ好ましい系のひとつとして本文中で詳細に述べる。ＡｅｑｕｏｒｉｎとＲｅｎｉｌｌａ系は同じルシフェリンを使用することができ、同じ化学的性質を用いて光を生じるが、各々のルシフェリンは異なっている。Ａｅｑｕｏｒｉｎルシフェラーゼ、エクオリン、ならびに、例えばルシフェラーゼ、ムネミオプシンおよびベロビンは、結合酸素および結合ルシフェリンを含む発光タンパク質であり、反応を引き起こすためにＣａ2+［あるいは他の適当な金属イオン］を必要とし、反復使用のためには再生されねばならない；これに対し、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、反応中変化せず、溶解分子酸素を必要することから、真の酵素として働く。
ａ．エクオリン系
エクオリン系は広く知られている［例えば以下参照：Ｔｓｕｊｉら（１９８６）「カルシウム結合発光タンパク質、エクオリンの部位特異的突然変異」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１０７−８１１１；Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８５）「生物発光カルシウム結合タンパク質、エクオリンをコードするｃＤＮＡコードのクローニングと発現」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １２６：１２５９−１２６８；Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：２８８−２９７；Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８７）「エクオリンアイソタイプをコードするｃＤＮＡの配列比較」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２６−１３３２；Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら（１９８５）「カルシウム依存性発光タンパク質、エクオリンのアミノ酸配列」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６７６２−６７７１；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら（１９８１）「エクオリンのアポタンパク質の変性に対する抵抗性および部分変性したアポタンパク質からの発光タンパク質の再形成」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９：８２５−８２８；Ｉｎｏｕｙｅら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５：４７３−４７７；Ｉｎｏｕｙｅら（１９８６）「大腸菌におけるアポエクオリン相補的ＤＮＡの発現」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ  ２５：８４２５−８４２９；Ｉｎｏｕｙｅら（１９８５）「発光タンパク質、エクオリンに関するｃＤＮＡのクローニングと配列分析」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３１５４−３１５８；Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔら（１９７８）「エクオリンおよびＡｅｑｕｏｒｅａｆｏｒｓｋａｌｅａから分離した緑色蛍光タンパク質の化学および物理特性」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１７：３４４８−３４５３；ヨーロッパ特許出願第０  ５４０  ０６４  Ａ１号：ヨーロッパ特許出願第０  ２２６  ９７９  Ａ２号、ヨーロッパ特許出願第０  ２４５  ０９３  Ａ１号およびヨーロッパ特許明細書第０  ２４５  ０９３  Ｂ１号；米国特許第５，０９３，２４０号；米国特許第５，３６０，７２８号；米国特許第５，１３９，９３７号；米国特許第５，４２２，２６６号；米国特許第５，０２３，１８１号；米国特許第５，１６２，２２７号；およびアポタンパク質をコードするＤＮＡを示す配列番号５−１３；および米国特許第５，１６２，２２７号、ヨーロッパ特許出願第０  ５４０  ０６４  Ａ１号およびＳｅａｌｉｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．３（１９９４）に述べられている形態は、ＡＱＵＡＬＩＴＥとしてＳｅａｌｉｔｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡから市販されている］。
この系は本発明で使用するのに好ましい系のひとつである。明白になるように、エクオリン発光タンパク質は、非共有結合による結合ルシフェリンと分子酸素を含むので、凍結乾燥粉末あるいは選択された送達賦形剤に被包された形態での保存に適する。この系は、リポソームあるいは他の送達賦形剤のようなペレット剤中に被包することができ、あるいは単一室の二元的あるいは他の多室装置中の保存することができる。使用する時には、賦形剤をＣａ2+［あるいは他の適当な金属イオン］を含む組成物と、水道水でもよいが、接触させ、光る混合物を生成する。この系は、ペレット剤を使用する実施態様におけるような、本発明の数多くの実施態様における使用にとって好ましい。これらの実施態様は、水鉄砲、フェアリーダスト、シャボン玉玩具、浴用発泡剤、石けん、織物関連製品、飲み物や食物への添加物を含む。
（１）エクオリンと関連発光タンパク質
クラゲ、Ａｅｑｕｏｒｅａから分離された発光タンパク質、エクオリンは、Ｃａ2+［あるいは他の適当な金属イオン］を加えると光を発する。Ｃａ2+によって放出される結合ルシフェリンと結合酸素を含むエクオリン発光タンパク質は、溶解酸素を必要としない。酸素と、アポエクオリンを生成するルシフェリン基質を放出するカルシウムによって発光が引き起こされる。
生物発光タンパク質、エクオリンはクラゲ、Ａｅｑｕｏｒｅａの多くの種から分離される。２２キロダルトン［ｋＤ］の分子量のペプチド複合体である［例えば、Ｓｈｉｍｏｍｏｒａら（１９６２）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５９：２３３−２３８；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：３９９１−３９９７；Ｋｏｈａｍａら（１９７１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０：４１４９−４１５２；およびＳｈｉｍｏｍｕｒａら（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１６０２−１６０８参照］。その天然タンパク質は、酸素とそれに非共有結合した複素環式化合物コエレンテラジン、ルシフェリン［以下参照］を含む。該タンパク質は３つのカルシウム結合部位を有する。発光タンパク質に極微量Ｃａ2+［あるいはストロンチウムのような他の適当な金属イオン］を加えると、立体配座変化を受け、タンパク質結合酸素を用いて結合コエレンテラジンの酸化を触媒する。この酸化からのエネルギーが４６９ｎｍを中心とする青色光の閃光として放出される。１０-6Ｍという低いカルシウムイオン濃度でも、酸化反応を引き起こすのに十分である。
天然に生じるアポエクオリンは単一化合物ではなく、むしろ微変異性分子種の混合物である。Ａｅｑｕｏｒｉａクラゲ抽出物は１２もの異なる変異体のタンパク質を含む［例えば、Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２６−１３３２；Ｂｌｉｎｋｓら（１９７５）Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．３４：４７４参照］。数多くの形態をコードするＤＮＡが分離されている［例えば、配列番号５−９および１３参照］。
発光タンパク質は、酸素と２−メルカプトエタノールのような還元剤の存在下で［例えば、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：２３６−２３８；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊ．１９９：８２５−８２８参照］、大腸菌において組換えによって生成されるタンパク質のようなアポタンパク質を、合成コエレンテラジンのようなコエレンテラジンと組み合わせることによって再構成することができ［例えば、米国特許第５，０２３，１８１号参照］、またＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡ［ここでの適用のためには約５から約１００ｍＭあるいはそれ以上の濃度］は、Ｃａ2+と結合して、所望の時まで酸化反応が引き起こされるのを防ぐ。再形成のために２−メルカプトエタノールを必要としない、修正された形態のアポタンパク質をコードするＤＮＡも入手可能である［例えば、米国特許第５，０９３，２４０号参照］。再形成された発光タンパク質も市販されている［例えば、米国特許第５，１６２，２２７号に述べられている、ＡＱＵＡＬＩＴＥ▲Ｒ▼の商標名で販売されている］。
光反応は、キレート剤の作用を克服し、１０-6Ｍ濃度を達成するのに十分な濃度のＣａ2+を加えることによって引き起こされる。本発明の方法と装置において使用するにはそのような低濃度のＣａ2+で反応を引き起こすことができるので、より高い濃度のキレート剤を発光タンパク質の組成物中に含めることができる。従って、カルシウム塩の形態のより高濃度のＣａ2+を加えることが必要となる。正確な量は経験的に決定することができる。本発明での使用のためには、濃縮組成物の形態あるいは凍結乾燥または粉末形態で提供される発光タンパク質に、単に水を加えるだけで十分であると考えられる。例えば、本発明の目的において、大半の水道水あるいはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）あるいは他の適当な緩衝液あるいは場合によって皮膚上の水分中に存在するような、少量のＣａ2+の添加が発光反応を引き起こすはずである。
エクオリンアポタンパク質の数多くのアイソフォームが同定され、単離された。これらのタンパク質をコードするＤＮＡがクローニングされており、該タンパク質およびその修正された形態が適当な宿主細胞を用いて生成された［例えば、米国特許第５，１６２，２２７号、第５，３６０，７２８号、第５，０９３，２４０号参照；またＰｒａｓｈｅｒら（１９８５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２６：１２５９−１２６８；Ｉｎｏｕｙｅら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：８４２５−８４２９参照］。米国特許第５，０９３，２４０号；米国特許第５，３６０，７２８号；米国特許第５，１３９，９３７号；米国特許第５，２８８，６２３号；米国特許第５，４２２，２６６号、米国特許第５，１６２，２２７号および、アポタンパク質をコードするＤＮＡを示す配列番号５−１３；また一形態がＡＱＵＡＬＩＴＥとしてＳｅａｌｉｔｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡから市販されている。アポエクオリンあるいはその変異体をコードするＤＮＡは、大量のアポタンパク質の組換え産生に有用である。発光タンパク質は、ルシフェリン、コエレンテラジン、好ましくはその硫酸誘導体、あるいはその類似体、および分子酸素を加えると再構成される［例えば、米国特許第５，０２３，１８１号参照］。アポタンパク質と、発光タンパク質の他の成分および生物発光生成反応は、適切な条件下で混合して発光タンパク質を再生することができ、同時に発光タンパク質に光を生じさせることができる。再構成は、以下に述べるように、還元剤を必要としないようにデザインされた修正形態を除いて［例えば、米国特許第５，０９３，２４０号参照］、メルカプトエタノールのような還元剤の存在を必要とする。
本発明において使用するためには、エクオリンが、配列番号５−１３に示されており、当業者には既知であるものあるいはその修正形態のように、ＤＮＡを用いて生成されることが好ましい。エクオリンをコードするＤＮＡは、大腸菌のような宿主細胞において発現され、単離され、再構成されて、発光タンパク質を生じる［例えば、米国特許第５，４１８，１５５号、第５，２９２，６５８号、第５，３６０，７２８号、第５，４２２，２６６号、第５，１６２，２２７号参照］。
ここで興味深いのは、生物発光活性が未修正アポエクオリンよりも高いように修正された形態のアポタンパク質である［例えば、米国特許第５，３６０，７２８号、配列番号１０−１２参照］。未修正アポエクオリンよりも高い生物発光活性を示す修正形態は、配列番号１０−１２に示された配列を有するタンパク質を含み、かかる配列においては、アスアスパラギン酸１２４がセリンに、グルタミン酸１３５がセリンに、またグリシン１２９がアラニンにそれぞれ変更されている。高い生物発光性を有する他の修正形態も入手可能である。
本発明のいくつかの実施態様において使用するためには、アポタンパク質およびエクオリン生物発光生成系の他の成分は、所望する時に、アポタンパク質、ルシフェリンと酸素から発光タンパク質が再構成される条件に供することができる混合物としてパッケージされるかあるいは提供される［例えば、米国特許第５，０２３，１８１号；および米国特許第５，０９３，２４０号参照］。特に好ましいのは、再形成のために２−メルカプトエタノールのような還元剤を必要としない形態のアポタンパク質である。例えば米国特許第５，０９３，２４０号に述べられているこれらの形態は［Ｔｓｕｊｉら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：８１０７−８１１１も参照のこと］、例えばセリンを有する３個のシステイン残基の１個以上、好ましくは全部の置換によって修正されている。置換は、配列番号５に示されているような、エクオリンアポタンパク質をコードし、システインコドンをセリンで置換するＤＮＡの修飾によって実施されうる。
Ｏｂｅｌｉａのような関連種からの発光タンパク質およびルシフェラーゼも、本発明で使用が意図されている。ヒドイドロポリプ、Ｏｂｅｌｉａ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａからのＣａ2+活性化発光タンパク質、オベリンをコードするＤＮＡは既知であり、入手可能である［例えば、Ｉｌｌａｒｉｏｎｏｖら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５３：２７３−２７４；およびＢｏｎｄａｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３１：２９−３２参照］。この発光タンパク質はまたＭｎ2+によっても活性化されうる［例えば、Ｖｙｓｏｔｓｋｉら（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１６：９２−９３、Ｖｙｓｏｔｓｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．８：３０１−３０５参照］。
一般に本発明での使用のためには、生物発光の成分は、反応を引き起こすには金属イオンが不十分であるようにパッケージされるかあるいは提供される。使用時に、極微量の金属イオン、特にＣａ2+を他の成分と接触させる。より持続的な輝きのためには、エクオリンを継続的に再構成させるか、あるいは高い過剰量を加えるかまたは提供することができる。
（２）ルシフェリン
エクオリンのルシフェリンはコエレンテラジンとその類似体であり、［式（ＩＩ）］の構造を持つ分子を含む：
0004146515.tif 000005
ここで、Ｒ1はＣＨ2Ｃ6Ｈ5あるいはＣＨ3である；Ｒ2はＣ6Ｈ5であり、Ｒ3はｐ−Ｃ6Ｈ4ＯＨあるいはＣＨ3あるいは活性を持つ他の類似体である。好ましいコエレンテラジンは、Ｒ1がｐ−ＣＨ2Ｃ6Ｈ4ＯＨであり、Ｒ2がＣ6Ｈ5であり、且つＲ3がｐ−Ｃ6Ｈ4ＯＨであって、既知の方法によって調製しうる構造を持つ［例えば、Ｉｎｏｕｙｅら（１９７５）Ｊａｐ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｔｒｓ．ｐｐ１４１−１４４；およびＨａｌｔら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２０４−２２１０参照］。好ましいコエレンテラジンは、［式（ＩＩ）］の構造とその硫酸誘導体を持つ：
0004146515.tif 000006
同様に好ましいのは、ターンオーバー数を上昇させ、特定の酵素によってより多くの光を生じるように立体配置されているコエレンテラジン誘導体である。例えば、フェノールの代わりに３位にアセチルあるいはプロピレンＲ1基を有するコエレンテラジンは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによってターンオーバーを約７倍に上昇させるが、Ｏｐｌｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ［既にレニラ酵素の約１０倍のターンオーバー数を有する］では上昇しない。その光放射特性を変化させるコエレンテラジンの他の変更も意図されている。コエレンテラジンのメチル−ベンジル中間体は、光子出量の３０％低下を伴って、オベリンおよびおそらくはエクオリンの閃光期間を低下させることが示された。これはより短い閃光を生じさせる。
Ｃａ2+の存在下で、結合酸素を有するエクオリン発光タンパク質に結合した時のコエレンテラジンの反応は次のように表わすことができる：
0004146515.tif 000007
発光タンパク質エクオリン［腔腸動物ルシフェリン分子に結合したアポエクオリンを含む］および以下に述べるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、同じ腔腸動物ルシフェリンを使用することができる。エクオリン発光タンパク質は、青色光［λmax＝４６９ｎｍ］の同時産生を伴って、腔腸動物ルシフェリン［コエレンテラジン］からオキシルシフェリン［コエレンテラミド］への酸化を触媒する。
重要な点として、腔腸動物ルシフェリンの硫酸誘導体［ラウリルルシフェリン］は水中で特に安定であり、従って腔腸動物様の生物発光生成系において使用しうる。この系では、アデノシンン二リン酸（ＡＤＰ）とスルファキナーゼを用いてコエレンテラジンを硫酸化形態に変換する。次にスルファターゼを用いてラウリルルシフェリンを未変性コエレンテラジンに再変換する。すなわち、照明する品目中ではより安定なラウリルルシフェリンを使用し、照明を所望する時に、スルファターゼと結合したルシフェラーゼをルシフェリン混合物に加える。
従って、Ａｅｑｕｏｒｅａの生物発光生成系は本発明の方法および装置における使用に特に適している。成分を提供する個々の量および方法は、選択する製造品目の組合せに依存する。この系は、Ｃａ2+を加えると光る、凍結乾燥形態で提供することができる。好ましくは反応が引き起こされるのを防ぐ十分なキレート剤の存在下で、被包したり、多孔性ガラスのような基質に連結したり、あるいは溶液または懸濁液のような組成物として包含することができる。エクオリン発光タンパク質の濃度は多様であり、経験的に決定することができる。典型的には、少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌ以上の濃度が選択される。いくつかの実施態様では、１−１０ｍｇルシフェリン／１００ｍｇルシフェラーゼを選択容量と所望する濃度で使用する。
ｂ．Ｒｅｎｉｌｌａ系
腔腸動物系の代表はＲｅｎｉｌｌａ系である。ｓｅａ  ｐａｎｓｙとしても知られるＲｅｎｉｌｌａは腔腸動物綱、Ａｎｔｈｏｚｏａ（花虫類）の成員であり、この綱はＣａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、ＡｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍおよびＰａｒａｚｏａｎｔｈｕｓのような他の生物発光属を含む。Ａｎｔｈｏｚｏａ属の生物発光性成員は、構造的に類似したルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む［例えば、Ｃｏｒｍｉｅｒら（１９７３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１：２９１−２９８参照；同様にＷａｒｄら（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：２５３０−２５３４も参照のこと］。これらの各々の花虫類からのルシフェラーゼとルシフェリンは交叉反応し、特徴的な青色発光を生じる。
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼや、エクオリン発光タンパク質のような他の腔腸動物およびクシクラゲのルシフェラーゼは、イミダゾピラジン基質、特に一般名コエレンテラジンと呼ばれる基質を用いる［上記の式（Ｉ）および（ＩＩ）参照］。コエレンテラジンを用いるルシフェラーゼを有する他の属には次のものが含まれる：Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｗａｔａｓｅｎｉａのようなヤリイカ；コウイカ、Ｓｅｐｉｏｌｉｎａ；Ｏｌｏｐｈｏｒｕｓ、Ｓｅｒｇｅｓｔｅｓ、Ｇｎａｔｈｏｐｈａｕｓｉａのようなコエビ；Ａｒｇｙｒｏｐｅｌｅｃｕｓ、Ｙａｒｅｌｌａ、Ｄｉａｐｈｕｓ、およびＮｅｏｓｃｏｐｅｌｕｓのような深海魚。
しかし、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは結合酸素を持たず、従って適当なルシフェリン基質存在下で光を生じるためには溶解酸素が必要である。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは真の酵素として働く［すなわち、さらなる使用のために再構成する必要がない］ので、生じる発光は飽和レベルのルシフェリンの存在下で長時間持続性となりうる。また、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは比較的熱に対して安定である。
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡ、および組換えルシフェラーゼを生成するためのＤＮＡの使用、ならびに他の腔腸動物からのルシフェラーゼをコードするＤＮＡは周知であり、入手可能である［例えば、配列番号１、米国特許第５，４１８，１５５号および第５，２９２，６５８号参照；同様にＰｒａｓｈｅｒら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２６：１２５９−１２６８；Ｃｏｒｍｉｅｒ（１９８１）「ＲｅｎｉｌｌａとＡｅｑｕｏｒｅａの生物発光」、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ｐｐ．２２５−２３３；Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：７６９−７８０；Ｗａｒｄら（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：７８１−７８８；Ｌｏｒｅｎｚら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：４４３８−４４４２；Ｈｏｒｉら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：４２８５−４２８７；Ｉｎｏｕｙｅら（１９７５）Ｊａｐ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４１−１４４；およびＭａｔｔｈｅｗｓら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：８５−９１も参照のこと］。ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡおよびかかるＤＮＡを含む宿主細胞は、大量の酵素を生産するのに都合のよい手段を提供する［例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの組換え生産と他のルシフェラーゼ、特に関連生物からのものをコードするＤＮＡを分離するためのＤＮＡの使用を述べた、米国特許第５，４１８，１５５号および第５，２９２，６５８号参照］。組換え酵素のより高いレベルの発現をもたらす、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの組換え生産のための方法の修正版が本実施例に示されている。
本発明で使用する時、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、単独であるいはルシフェリン基質と組合わせて、玩具中に、あるいは凍結乾燥形態で、あるいは賦形剤中に被包してパッケージすることができる。使用前に、混合物を水性組成物、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水あるいはｐＨ７−８、好ましくは約ｐＨ８のトリスペースの緩衝液［０．１ｍｍトリス、０．１ＥＤＴＡなど］のような他の適当な緩衝液と接触させる；溶解Ｏ2が反応を活性化させる。グリセロール［約１％］の添加は光の強さを増大させる。光る混合物中のルシフェラーゼの最終濃度は約０．０１−１ｍｇ／ｌまたはそれ以上である。ルシフェリンの濃度は少なくとも約１０-8Ｍであるが、１−１００またはそれ以上の次数のレベルは長時間持続性の生物発光の生成を高める。
本発明のいくつかの実施態様では、約１−１０ｍｇ、好ましくは２−５ｍｇ、より好ましくは約３ｍｇのコエレンテラジンを、約１００ｍｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと共に使用する。もちろん、正確な量は経験的に決定することができ、また同時に最終的な濃度と適用にもある程度依存する。特に、Ｒｅｎｉｌｌａを発現する細菌からの粗抽出液約０．２５ｍｌを適当な検定緩衝液１００ｍｌに加える。目に見える持続的な輝きを生じるには約０．００５μｇで十分であった［Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの組換え生産を述べた、米国特許第５，４１８，１５５号および５，２９２，６５８号参照］。
凍結乾燥混合物、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを含む組成物も提供される。ルシフェラーゼあるいはルシフェラーゼとルシフェリンの混合物も、リポソーム、ガラス粒子、毛細管、薬剤送達賦形剤、ゼラチン、持続放出被覆あるいは他のそのような賦形剤などの適当な送達賦形剤中に被包することができる。これらの混合物、組成物、あるいは賦形剤を含むキット、ならびに玩具の銃、発泡組成物、風船、衣類品目、身辺用品のような選択製造物品も提供される。ルシフェラーゼはまた、綿、ポリエステル、ポリエステル−綿混合物、ポリプロピレン、ポリビニルトルエン、ポリビニルプロピレン、ガラス、セラミック、あるいはプラスチックのような基質に連結することもでき、製造物品と組合わせて、あるいは製造物品の一部として提供される。
３．甲殻類、特にＣｙｒｐｉｄｉｎａ系
Ｖａｒｇｕｌａ  ｓｅｒｒａｔｔａ、ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉおよびｎｏｃｔｉｌｕｃａなどの貝虫類は、時としてウミホタルと呼ばれる小さな海洋甲殻類である。これらのウミホタルは日本の沿岸から離れた海域に認められ、ルシフェリンとルシフェラーゼを水中に噴出することによって光を発し、水の中で明るい青色の発光雲を生じる反応が起こる。この反応は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび分子酸素だけに関わっており、従って本発明での適用に非常に適している。
Ｖａｒｇｕｌａ生物発光生成系のような系は、乾燥して粉末化するとその成分が室温で安定であり、汚染された場合でも反応し続けるので、本発明では特に好ましい。さらに、その生物発光反応は、処理する水および分子酸素１０億につき１：４０から１：１００の割合という低い濃度のルシフェリン／ルシフェラーゼ成分しか必要としない。枯渇した系はルシフェリンを加えて回復させることができる。
ａ．Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ
Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼは、Ｖａｒｇｕｌａからの単離によって、ならびに適当な細菌および哺乳類宿主細胞において該ＤＮＡを発現することによる組換え技術を用いて生成された５５５アミノ酸のポリペプチドである［例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５６７−６５７１；Ｉｎｏｕｙｅら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：９５８４−９５８７；Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９７８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ＬＶＩＩ：３３１−３４９；Ｔｓｕｊｉら（１９７８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５７：３６４−７２；Ｔｓｕｊｉ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：５２０４−５２０９；日本特許出願第ＪＰ  ３−３０６７８号  Ｏｓａｋａ；およびヨーロッパ特許出願第ＥＰ  ０  ３８７  ３５５  Ａ１号参照］。
（１）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａからの精製
Ｖａｒｇｕｌａ［Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ］ルシフェラーゼの精製のための方法は周知である。例えば、活性成分を含む粗製抽出液は、Ｖａｒｇｕｌａエビを粉砕するあるいは破砕することによって容易に調製できる。他の実施態様では、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉルシフェラーゼの標本は、冷凍保存したＣ．ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉを、０．５−５．０Ｍの塩、好ましくは０．５−２．０Ｍの塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、硫化アンモニウムを含む蒸留水に、０−３０℃、好ましくは０−１０℃で、１−４８時間、好ましくは１０−２４時間液浸して抽出し、その後疎水性クロマトグラフィーにかけ、さらにイオン交換または親和性クロマトグラフィーにかけて調製することができる［ＴＯＲＡＹ  ＩＮＤ  ＩＮＣ、１９９３年９月１４日公開の日本特許出願第ＪＰ  ４２５８２８８号；同様に他の方法に関してＴｓｕｊｉら（１９７８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５７：３６４−７２参照］。
ルシフェリンは、抽出物を加熱することにより粉砕した乾燥Ｖａｒｇｕｌａから単離することができ、これはルシフェラーゼを破壊するが、ルシフェリンは無傷のまま残る［例えば、米国特許第４，８５３，３２７号参照］。
（２）組換え法による調製
ルシフェラーゼは、好ましくはルシフェラーゼをコードするクローニングしたＤＮＡの発現によって生成される［ヨーロッパ特許出願第０  ３８７  ３５５  Ａ１号；国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９０／０１５４２号；また、日本特許出願第ＪＰ  ３−３０６７８号からの配列を示す配列番号５およびＴｈｏｍｐｓｏｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５６７−６５７１も参照のこと］。適当なベクターを用いてルシフェラーゼあるいはその変異体をコードするＤＮＡを大腸菌に導入し、標準的な方法を用いて単離する。
ｂ．Ｖａｒｇｕｌａルシフェリン
式（ＩＩＩ）の化合物のような、置換されたイミダゾピラジン核における天然ルシフェリン：
0004146515.tif 000008
その類似体および光生成反応においてルシフェラーゼと反応する他の化合物も使用しうる。
Ｖａｒｇｕｌａルシフェリンと反応することができるルシフェラーゼを持つ他の生物発光生物は、Ａｐｏｇｏｎ、Ｐａｒａｐｒｉａｃａｎｔｈｕｓ、およびＰｏｒｉｃｈｔｈｙｓ属を含む。
ｃ．反応
酸素と反応したルシフェリンはジオキセタノン中間体［ホタルの環状過酸化分子中間体と同様の環状過酸化物を含む］を形成する。生物発光反応の最終段階で、過酸化物は分解してＣＯ2と励起（ｅｘｃｉｔｅｄ）カルボニルを生じる。励起分子はその後青色から青緑色の光を発する。
反応にとっての至適ｐＨは約７である。本発明においては、反応が起こるいずれのｐＨも使用しうる。試薬の濃度は、通常分析反応に使用されるものかあるいはそれ以上である［例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９６：２５７−２６２参照］。代表的には、０．１から１０ｍｇ／ｌまで、好ましくは０．５−２．５ｍｇ／ｌのルシフェラーゼ濃度が使用される。同様の濃度あるいはより高い濃度のルシフェリンを使用してもよい。
４．ホタル、コメツキムシおよび他の昆虫系を含む昆虫生物発光生成系
ホタルの生物発光の生化学は、特性付けられた最初の生物発光生成系であり［例えば、Ｗｉｅｎｈａｕｓｅｎら（１９８５）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４２：６０９−６１１；ＭｃＥｌｒｏｙら（１９６６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｙａｓｉら、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ．編集、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ、ＮＪ、ｐｐ．６３−８０参照］、市販されている［例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩより、例えば、Ｌｅａｃｈら（１９８６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：５１−７０、特に表１参照、同様に米国特許第５，５０３，９２４号も参照のこと］。様々な種のホタルからのルシフェラーゼは抗原的に類似している。これらの種は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ、ＰｈｏｔｕｒｉｎｓおよびＬｕｃｉｏｌａ属の成員を含む。さらに、生物発光反応は２０℃よりも３０℃でより多くの光を生じ、ルシフェラーゼは少量のウシアルブミン血清によって安定化され、また反応はトリシンによって緩衝することができる。
ａ．ルシフェラーゼ
様々な昆虫からのルシフェラーゼをコードするＤＮＡクローン、およびコードされたルシフェラーゼを生成するためのその使用はよく知られている。例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａからのルシフェラーゼをコードするＤＮＡクローン［例えば、ｄｅ  Ｗｅｔら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：７８７０−７８７３；ｄｅ  Ｗｅｔら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：３；米国特許第４，９６８，６１３号参照、また配列番号３も参照のこと］が入手可能である。該ＤＮＡはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属［例えば、１９８８年１２月２６日に公開された日本特許出願第ＪＰ  ６３３１７０７９号、ＫＩＫＫＯＭＡＮ  ＣＯＲＰ参照］およびタバコにおいても発現されている。
野生型ルシフェラーゼの他に、修正された昆虫ルシフェラーゼが調製されている。例えば、熱に安定なルシフェラーゼ突然変異体、突然変異体をコードするＤＮＡ、ルシフェラーゼを生成するためのベクターと形質転換細胞が入手可能である。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌ．ｃｒｕｃｉａｔａあるいはＬ．ｌａｔｅｒａｌｉｓからのルシフェラーゼと６０％のアミノ酸配列相同性を持ち、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質が入手可能である［例えば、国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９５／２５７９８号参照］。これは、天然に生じる昆虫ルシフェラーゼよりも３０℃以上で安定であり、３７℃またはそれ以上でより高い収率で生成されうる。
異なる波長［天然のルシフェラーゼと比べて］の光を生じる修正ルシフェラーゼは、その色生成特性に関して選択することができる。例えば、合成突然変異体甲虫ルシフェラーゼ、および野生型ルシフェラーゼとは異なる波長の生物発光を生じるようなルシフェラーゼをコードするＤＮＡが知られている［Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、米国特許出願通し番号第０８／１７７，０８１号１／３／９４に基づく国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９５／１８８５３号］。突然変異体甲虫ルシフェラーゼは、１または２箇所の置換によって、対応する野生型Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａとは異なるアミノ酸配列を持つ［例えば、米国特許第５，１８２，２０２号、第５，２１９，７３７号、第５，３５２，５９８号参照、また配列番号３も参照のこと］。突然変異体ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼによって生じるものと少なくとも１ｎｍ異なるピーク強度の波長を持つ生物発光を生じる。
他の突然変異体ルシフェラーゼも生成されている。野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列を持つが、２３３位のアミノ酸においてバリンがイソロイシンによって置換されているか、２３９位でバリンがイソロイシンによって、２８６位でセリンがアスパラギンによって、３２６位でグリシンがセリンによって、４３３位でヒスチジンがチロシンによって、あるいは４５２位でプロリンがセリンによって置換されている、少なくとも１つの突然変異を備えた突然変異体ルシフェラーゼが知られている［例えば、米国特許第５，２１９，７３７号および第５，３３０，９０６号参照］。該ルシフェラーゼは、大腸菌において各々の突然変異体ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを発現し、そのタンパク質を単離することによって生成される。これらのルシフェラーゼは野生型とは異なる色を持った光を生じる。突然変異体ルシフェラーゼはルシフェリンを触媒して、赤色［λ６０９ｎｍと６１２ｎｍ］、橙色［λ５９５ｎｍと６０７ｎｍ］あるいは緑色［λ５５８ｎｍ］の光を生じる。突然変異体ルシフェラーゼのその他の物理・化学特性は、天然の野生型ルシフェラーゼと実質的に同じである。突然変異体ルシフェラーゼは、Ａｓｎによって置換された２８６位のＳｅｒのＡｓｎによる置換、３２６位のＧｌｙのＳｅｒによる置換、４３３位のＨｉｓのＴｙｒによる置換あるいは４５２位のＰｒｏのＳｅｒによる置換から選択される変更を備えたＬｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａルシフェラーゼのアミノ酸配列を持つ。熱安定性ルシフェラーゼも入手可能である［例えば、米国特許第５，２２９，２８５号参照、また３５４位のグルタミン酸がリシンで置換されたＰｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼと３５６位のグルタミン酸がリシンで置換されたＬｕｃｉｏｌａルシフェラーゼを提供する、国際ＰＣＴ特許出願第９５／２５７９８号も参照のこと］。
これらの突然変異体ルシフェラーゼならびに野生型ルシフェラーゼは、特に多様な色を所望する時あるいはより高温での安定性を所望する場合に、本発明において好ましいものである。ホタルルシフェラーゼがアルカリ性の至適ｐＨ［７．５−９．５］を持ち、それ故アルカリ性ｐＨを有する発泡組成物のような製造物品と組み合わせて用いるのに適していることも注目すべきである。
ｂ．ルシフェリン
ホタルのルシフェリンはベンゾチアゾールである：
0004146515.tif 000009
このルシフェリンの類似体および合成ホタルルシフェリンも当業者には既知である［例えば、米国特許第５，３７４，５３４号および第５，０９８，８２８号参照］。これらは式（ＩＶ）の化合物を含む［例えば、米国特許第５，０９８，８２８号参照］：
0004146515.tif 000010
ここで、Ｒ1はヒドロキシ、アミノ、線形または分枝Ｃ1−Ｃ20アルコキシ、Ｃ2−Ｃ20アルケニルオキシ、αアミノ基を通してのＬ−アミノ酸基結合、終末単位のαアミノ基を通して結合した１０個までのＬ−アミノ酸単位を有するオリゴペプチド基である；
Ｒ2は水素、Ｈ2ＰＯ3、ＨＳＯ3、置換されていないまたはフェニル置換された線形または分枝Ｃ1−Ｃ20アルキルまたはＣ2−Ｃ20アルケニル、６−１８個の炭素原子を含むアリール、あるいＲ3−Ｃ（Ｏ）−である；
Ｒ3は、式（ＩＶ）がＤ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリンメチルエステルである時を除いて、置換されていないまたはフェニル置換された線形または分枝Ｃ1−Ｃ20アルキルまたはＣ2−Ｃ20アルケニル、６−１８個の炭素原子を含むアリール、１−３個のリン酸基を有するヌクレオチド基、あるいはグリコシド結合した単糖類または二糖類である。
ｃ．反応
ホタルルシフェラーゼおよび関連する昆虫ルシフェラーゼが触媒する反応は、ＡＴＰ、Ｍｇ2+ならびに分子酸素を必要とする。外因性のルシフェリンを加えなければならない。ホタルルシフェラーゼは、ホタルルシフェリンの活性化と、励起産物を導くその後の段階を触媒する。ルシフェリンはＡＴＰと反応してルシフェリルアデニレート中間体を形成する。この中間体はその後酸素と反応し、腔腸動物の中間体環状過酸化物に類似した、環状ルシフェリル過酸化種を形成する。これが分解してＣＯ2と励起状態のカルボニル産物を生じる。励起分子はその後黄色の光を発する；ただし、色はｐＨの関数である。ｐＨが低くなると共に、生物発光の色は黄緑色から赤色に変化する。
異なる種のホタルは異なる色の生物発光を生じるので、反応の色はルシフェラーゼが得られる種に依存する。さらに、反応はｐＨ７．８で至適となる。
枯渇した反応にＡＴＰとルシフェリンを加えると、付加的な光放射が生じる。従ってこの系は、ひとたび確立されると比較的容易に維持される。それ故、持続的な輝きが所望される、あるいはその品目の再使用が期待される実施態様においての本発明における使用に極めて適している。すなわち、ホタル系の成分はおもちゃの銃のような製造物品と共にパッケージすることができ、また使用前にその品目と組み合わせることもできる。例えば、ルシフェラーゼを含む穏やかな発泡組成物あるいはタンパク質組成物に、その発泡製品を使用するたびごとにルシフェリンとＡＴＰを加えることができる。
５．細菌系
発光性細菌は、典型的に、通常は青緑色の持続的な光を発する。強く発現される時には、単一細菌は１０4−１０5光子／秒を発することができる。細菌の生物発光系は、特に、Ｐｈｏｔｏｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、ＶｉｂｒｉｏおよびＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属の生物発光種において認められる系である。これらの系は周知であり、広く特性付けられている［例えば、Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７；Ｎｉｃｏｌｉら（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：２３９３−２３９６；Ｗｅｌｃｈｅｓら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：５１２−５１７；Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：８３−９９；Ｆｒａｎｃｋｍａｎら（１９９０）Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｅｔｒｉｏｌｏｇｙ  １７２：５７６７−５７７３；Ｍｉｙａｍｏｔｏら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：７０；米国特許第４，５８１，３３５号参照］。
ａ．ルシフェラーゼ
Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉから誘導されるルシフェラーゼ［ＥＣ  １．１４．１４．３、アルカノール還元−ＦＭＮ−酸素オキシドレダクターゼ１−水酸化、発光性］によって例証されるように、細菌ルシフェラーゼは２つの異なるタンパク質サブユニットαとβの結合によって形成される混合機能オキシダーゼである。αサブユニットは約４２，０００ｋＤの見かけ分子量を持ち、βサブユニットは約３７，０００ｋＤの見かけ分子量を持つ［例えば、Ｃｏｈｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０２−１２３参照］。これらのサブユニットが結合して２本鎖複合ルシフェラーゼ酵素を形成し、これがＶｅｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ［米国特許第４，５８１，３３５号；Ｂｅｌａｓら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８：７９１−７９３、Ｖｉｂｒｉｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒｉ［Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３２：７７３−７８１；Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：４１５４−４１５８］および他の海洋細菌のような生物発光細菌の光放射反応を触媒する。
細菌のルシフェラーゼ遺伝子はクローニングされている［例えば、米国特許第５，２２１，６２３号；米国特許第４，５８１，３３５号；ヨーロッパ特許出願第ＥＰ  ３８６  ６９１  Ａ号参照］。Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉのような細菌ルシフェラーゼの発現のためのプラスミドは、ｐＦＩＴ００１（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８０８０）、ｐＰＡＬＥ００１（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８０８２）およびｐＭＲ１９（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８０８１）を含むことが知られている。例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉからのｌｕｘレギュロン全体の配列が決定されている［Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７；Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：５１２−５１７；Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：３６６３−３６６７；同様に、例えば米国特許第５，１９６，３１８号、第５，２２１，６２３号および第４，５８１，３３５号も参照のこと］。このレギュロンは、自己インデューサーを必要とするタンパク質をコードするｌｕｘＩ遺伝子［例えば、Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：４１５４−４１５８参照］、アルデヒド基質を伴うルシフェラーゼを提供する酵素をコードするｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子、ならびにルシフェラーゼのαおよびβサブユニットをコードするｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ遺伝子を含む。
他の細菌からのｌｕｘ遺伝子もクローニングされており、入手可能である［例えば、Ｃｏｈｎら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：６１３９  ６１４６；Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉからのｌｕｘＡとｌｕｘＢ遺伝子の融合を提供する米国特許第５，１９６，５２４号参照］。このように、ルシフェラーゼαおよびβサブユニットをコードするＤＮＡが提供されており、ルシフェラーゼを生成するために使用することができる。α［１０６５塩基対］およびβ［９８４塩基対］サブユニットをコードするＤＮＡ、２１２４塩基対のルシフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ、両方のサブユニットをコードするＤＮＡを含む組換えベクター、ならびにコードされたルシフェラーゼの発現と産生のための形質転換された大腸菌および他の細菌宿主が入手可能である。さらに、細菌ルシフェラーゼは市販されている。
ｂ．ルシフェリン
細菌ルシフェリンは以下を含む：
0004146515.tif 000011
Ｒは、例えば、
0004146515.tif 000012
であり、還元フラビンモノヌクレオチドを伴うテトラデカナルがルシフェリンとみなされる。いずれも光放射反応の間に酸化されるからである。
ｃ．反応
細菌系は生物発光反応を達成するために、還元フラビンに加えて、５個のポリペプチドを必要とする：細菌ルシフェリンの２つのサブユニット、αとβ、およびテトラデカナルアルデヒドを供給する脂肪酸レダクターゼ系複合体の３つの単位。本発明により提供される装置と方法において有用な細菌生物発光生成系の例は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉとＶｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉから誘導されるものである。この系のひとつの利点は、低温で機能する能力である。それ故、角氷中で特に使用しやすい。細菌系のすべての成分が角氷中に冷凍できる。角氷はより暖かい飲み物中に溶けて溶解Ｏ2を生じるので、反応が進行し、それによって持続的な発光が提供される。
細菌ルシフェラーゼは、フラビンを媒介とする長鎖アルデヒドの水酸化を触媒して、カルボキシル酸と励起フラビンを生じる；フラビンは、青緑色の光を放射しながら基底状態まで崩壊する［λmax＝４９０ｎｍ；例えば、Ｌｅｇｏｃｋｉら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：９０８０；米国特許第５，１９６，５２４号参照］：
0004146515.tif 000013
還元フラビンモノヌクレオチド［ＦＭＮＨ2］を細菌ルシフェラーゼ、酸素、および長鎖アルデヒド、通常はｎ−デシルアルデヒドの混合物と接触させることにより、反応を開始させることができる。
蛍光細菌Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｎｅｄａｉからのルシフェラーゼをコードするＤＮＡが知られている［ＣＨＩＳＳＯ  ＣＯＲＰ；また、例えば、１９９５年８月２２日公開の日本特許出願第ＪＰ  ７２２２５９０号も参照のこと］。還元フラビンモノヌクレオチド［ＦＭＮＨ2；ルシフェリン］は、細菌ルシフェラーゼの存在下で酸素と反応して、中間体ペルオキシフラビンを生じる。この中間体は長鎖アルデヒド［テトラデカナル］と反応して、酸と励起状態のルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンを形成する。励起ルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンはその後光を発して、酸化フラビンモノヌクレオチド［ＦＭＮ］および水としてルシフェラーゼから解離する。ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＭＮは再び還元されてリサイクルされ、アルデヒドが酸から再生される。
フラビンレダクターゼはクローニングされている［例えば、米国特許第５，４８４，７２３号；この特許からの代表的な配列を示す配列番号１４参照］。これらならびにＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、細菌ルシフェラーゼおよび長鎖アルデヒドとの反応のための、ＦＭＮＨ2を再生する反応に含めることができる。フラビンレダクターゼは、ルシフェラーゼ反応であるＦＭＮからＦＭＮＨ2への反応を触媒する；それ故、ルシフェラーゼとレダクターゼが反応系に含まれていれば、生物発光反応を維持することが可能である。すなわち、細菌ルシフェラーゼは何度も回転するので、長鎖アルデヒドが反応系に存在する限り生物発光が継続する。
生物発光細菌による作られる光の色も、タンパク質青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］の生物発光反応への関与から生じる。よく知られているこのタンパク質［例えばＬｅｅら、（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ＬＶＩＩ：２２６−２３４を参照］を、色の変化を引き起こすために細菌生物発光反応に加えてもよい。
６．他のシステム
ａ．  渦鞭毛虫生物発光発生系
渦鞭毛虫において、生物発光がシンチロンと呼ばれる細胞器官で生じる。これらの細胞器官は細胞質の細胞液胞中への外側ポケットである。シンチロンは渦鞭毛虫ルシフェラーゼおよびルシフェリンのみを［その結合タンパク質とともに］含み、他の細胞質成分はなぜか排除されている。渦鞭毛虫ルシフェリンはクロロフィルに関連した以下のテトラピロールである：
0004146515.tif 000014
またはその類似体
ルシフェラーゼはｐＨ６．５で活性のある１３５ｋＤの単一鎖タンパク質であるが、ｐＨ８で不活性である［例えば、Ｈａｓｔｉｎｇｓ、（１９８１）、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＤｅＬｕｃａら編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３４３−３６０を参照］。ルシフェラーゼ活性は、ｐＨ８にした抽出物中に、そのｐＨを８から６に変えることにより得ることができる。これは可溶性フラクションと粒子フラクションとに存在する。そのままのシンチレーション中に発光閃光がインビボでの閃光時間である〜１００ｍ秒間起こる。溶液中、反応速度はすべての酵素反応と同じように希釈に依存する。ｐＨ８において、ルシフェリンは、ルシフェリンのルシフェラーゼとの反応を妨げるタンパク質［ルシフェリン結合タンパク質］に結合する。しかし、ｐＨ６ではルシフェリンが放出され遊離して該酵素と反応する。
ｂ．  ＬａｔｉａおよびＰｈｏｌａｓ等の軟体動物由来の系
軟体動物Ｌａｔｉａ  ｎｅｒｉｔｏｉｄｅｓおよびＰｈｏｌａｓ種は生物発光動物である。そのルシフェリンは下記構造を有し：
0004146515.tif 000015
そして合成されてきた［例えば、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、（１９６８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：１７３４−１７３８；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６９：２０８６−２０８９を参照］。ルシフェラーゼおよびルシフェリンに加えて、反応は第三成分である「紫色タンパク質」を有する。外因性還元剤により開始されうる反応は下記反応式により表される：
0004146515.tif 000016
（ＸＨ2は還元剤である）。
よって、ここでの実施のために、該反応は紫色タンパク質ならびに還元剤を必要としよう。
ｃ．  地虫および他の環形動物
Ｄｉｐｌｏｃａｒｄｉａ  ｌｏｎｇａ、ＣｈａｅｔｏｐｔｅｒｕｓおよびＨａｒｍｏｔｈｏｅ等の地虫種は生物発光を示す。そのルシフェリンは下記構造を有する：
0004146515.tif 000017
この反応はルシフェリンおよびルシフェラーゼ以外に過酸化水素を必要とする。ルシフェラーゼは発光タンパク質である。
ｄ．  ツチボタル
ニュージーランド洞窟、オーストラリアおよび英国で見つけられたツチボタルのルシフェラーゼ／ルシフェリン系もここでの使用に意図される。
ｅ．  海の多毛環虫系
海の多毛環虫の生物発光発生系、例えばＰｈｙｘｏｔｒｉｘおよびＣｈａｅｔｏｐｔｅｒｕｓもここでの使用に意図される。
ｆ．  南米鉄道甲虫
南米鉄道甲虫由来の生物発光系もここでの使用に意図される。
ｇ．  魚
ここで興味深いのは、赤色光を発生するルシフェラーゼおよび生物発光発生系である。これらにはＡｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ種、例えばＡ．ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｓで発見されたルシフェラーゼ［Ｏ’Ｄａｙら、（１９７４）、Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．１４：５４５−５５０を参照］、Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、Ｍａｌａｃｏｓｔｅｕｓ、例えばＭ．ｎｉｇｅｒで発見されたルシフェラーゼがある。
７．蛍光タンパク質
ａ．  緑色および青色蛍光タンパク質
ここに記載されたように、青色光はＣａ2+およびコエレンテラジンルシフェリンまたはその類似体の存在下にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたはＡｅｑｕｏｒｅａ発光タンパク質を用いて作られる。この光は緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が反応に加えられると緑色光に変換し得る。精製された緑蛍光タンパク質［例えばＰｒａｓｈｅｒら、（１９９２）、Ｇｅｎｅ  １１１：２２９−２３３を参照］およびクローン化された緑蛍光タンパク質［例えば、ここで参照としてとり込まれる米国出願第０８／１１９，６７８号および米国出願第０８／１９２，２７４号に基づく国際ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９５／０７４６３号を参照］はエネルギー転移受容体として刺胞動物によって用いられている。ＧＦＰはルシフェラーゼ−オキシフェリン励起状態複合体またはＣａ2+活性化発光タンパク質からエネルギーを受け取る際にインビボで蛍光を発生する。その発色団はポリペプチド内の修飾アミノ酸残基である。最もよく特性付けられたＧＦＰはＡｅｑｕｏｒｅａおよびＲｅｎｉｌｌａのものである［例えば、Ｐｒａｓｈｅｒら、（１９９２）、Ｇｅｎｅ  １１１：２２９−２３３；Ｈａｒｔら、（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２０４−２２１０を参照］。例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑蛍光タンパク質［ＧＦＰ］は２３８アミノ酸を含み、青色光を吸収し、緑色光を発する。よって、コエレンテトラジンおよび酸素を充填したエクオリン発光タンパク質を含有する組成物にこのタンパク質を含ませる結果として、カルシウムの存在下に緑色光を作り得る。よって、ＧＦＰは、得られる生物発光の色を高めるか、変更するためにエクオリンまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたは他の適当なルシフェラーゼを用いる生物発光生成反応に含まれてもよいことが意図される。
ＧＦＰは青色光により活性化されて緑色光を発するので、ここに記載のように、新規用品とともにルシフェラーゼの不存在下および外部光源と組合せて用いてもよい。同様に、例えばＶｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉまたはＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍに由来する青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を適当な波長の外部光源と組合せて青色光を発生させてもよい（例えば、Ｋａｒａｔａｎｉら、「黄色発光細菌の青色蛍光タンパク質」、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５５（２）：２９３−２９９（１９９２）；Ｌｅｅら、「生物発光細菌Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍからの青色蛍光タンパク質の精製」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．）、５７：２２６−２３４（１９７８）；およびＧａｓｔら「青色蛍光タンパク質の細菌ルシフェラーゼからの分離」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０（１）：１４−２１（１９７８）を参照。尚、これらの各引例はそれら全部を参照よりここに取り込む）。特に、ＧＦＰ、および／またはＢＦＰまたは他のそうした蛍光タンパク質はここに提供される飲物および／または食物の組合せに用いてもよく、適当な波長の光に照らされる部屋に用いて蛍光タンパク質に蛍光を発しさせてもよい。
ＧＦＰおよび／またはＢＦＰまたは他のそのような蛍光タンパク質は、飲物および玩具、例えばシャボン玉発生玩具、特にシャボン玉発生組成物または混合物等のここに提供される新規用品および組合せのいずれに用いてもよい。ルシフェラーゼが発光タンパク質を活性化するために必要とされないため、および該タンパク質は容易に消化されるためにそのようなシステムは特に興味深い。生物発光系以外に、これらの蛍光タンパク質を用いて一連の異なる色を高めるか作ってもよい。
これらのタンパク質は単独または生物発光発生系とともに用いて別の色を作るために用いてもよい。これらは例えば飲料の色が時間とともに変化するか、または異なる色の相を含有するように組合せて用いてもよい。
ｂ．  フィコビリタンパク質
フィコビリタンパク質はシアノバクテリアおよび真核藻類に由来する水溶性蛍光タンパク質である［例えば、Ａｐｔら、（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：７９−９６；Ｇｌａｚｅｒ、（１９８２）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１７７−１９８；およびＦａｉｒｃｈｉｌｄら、（１９９４）、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８６８６−８６９４を参照］。これらのタンパク質は蛍光標識として免疫検定法で用いられており［Ｋｒｏｎｉｃｋ、（１９８６）、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈ．９２：１−１３を参照］、これらタンパク質は単離されており、それらをコードするＤＮＡも利用できる［例えば、Ｐｉｌｏｔら、（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６９８３−６９８７；Ｌｕｉら、（１９９３）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０３：２９３−２９４；およびＨｏｕｍａｒｄら、（１９８８）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５５１２−５５２１を参照；これらのタンパク質は例えばカリフォルニア州サンレアンドロのＰｒｏＺｙｍｅ社から市販されている］。これらの細菌において、フィコビリタンパク質はフィコビリゾームと呼ばれる副細胞構造中に配置され、可視光を吸収して得られたエネルギーを直接的な蛍光エネルギー転移機構を経てクロロフィルに移すことにより光合成反応に関与する付属的な色素として機能する。
二種類のフィコビリタンパク質がそれらの光に基づいて知られており、それらはそれぞれ４９０〜５７０ｎｍおよび６１０〜６６５ｎｍの報告された吸収極大を有するフィコエリトリン（赤）およびフィコシアニン（青）である。フィコエリトリンおよびフィコシアニンは、一種類以上の直鎖テトラピロール発色団が共有結合している異なる比率のアルファモノマーとベータモノマーとからなる不均一複合体である。特別なフィコビリタンパク質は（αβ）6凝集タンパク質としばしば会合した第三のγサブユニットも含有してもよい。該γ−サブユニットはフィコロビンに共有結合してＢ−およびＲ−フィコエリトリンの４９５〜５００ｎｍ吸収ピークをもたらす。すべてのフィコビリタンパク質はフィコトロンビンまたはフィコエリトリン発色団のいずれかを含有し、他のビリン、例えばフィコロビン、クリプトビオリンまたは６９７ｎｍビリンを含有してもよい。よって、フィコビリタンパク質の分光学的特性は異なる発色団の組合せ、アポ−フィコビリタンパク質のサブユニット組成および／またはフィコビリタンパク質の第三および第四構造に影響を与える局所的な環境により影響を受けよう。
ＧＦＰとＢＦＰに関して既に説明したように、フィコビリタンパク質は適当な波長の可視光によっても活性化されるのでルシフェラーゼの不存在下で、外部光源と組み合わせて用いて、特にここに記載されているように新規用品を照らしてもよい。特に、フィコビリタンパク質はここに提供される飲物および／または食物の組合せに用いられ、また適当な波長の光に照らされた部屋に用いて蛍光タンパク質に蛍光を発しさせてもよい。上記のように、これらのタンパク質は他の蛍光タンパク質および／または生物発光発生系と組み合わして用いて一連の色を作るか、または異なる色を経時的に提供してもよい。
フィコビリタンパク質の固体支持体への結合は公知である（例えば、米国特許第４，７１４，６８２号、第４，７６７，２０６号、第４，７７４，１８９号および第４，８６７，９０８号を参照）。ここでの使用のために、生物発光反応の一種類以上の成分、好ましくはルシフェリンに結合されたマトリックスまたはマイクロキャリヤーにフィコビリタンパク質を結合させて、生物発光反応から生じた光の波長を変換してもよい。一種類以上のフィコビリタンパク質に結合させたマイクロキャリヤーはここに提供される新規用品および組合せ、例えばシャボン玉生成玩具、特にシャボン玉生成組成物または混合物等を含む多色飲物および玩具等のいずれに用いてもよい。
Ｃ．  製品と組み合わされた反応の実施
各生物発光系が選択された製品と組み合わされる特定の方法は製品の機能および所望の効果による。しかし、一般的には、反応の一部成分を製品に提供し、次にこれを残りの成分に接触させて発光させる。この結果を得るために多くの代替手段が存在し、一部がここに記載されるが、他のものはここの記載から明らかとなるだろう。
最も単純な実施態様では、細菌を粉砕して乾燥できる。例えば、水とＡＴＰと混合されたホタルを粉砕することにより光が発する。粉砕されたＶａｒｇｕｌａエビを合せ、水、好ましくは冷水［室温以下］を加えることによっても光は発せられよう。但し、唯一の注意すべきことは、水はあまり熱いものであってはならず、というは高温はルシフェラーゼ活性を壊す。
別の実施態様では、実質的に純粋な試薬を製品と一緒にして製品に発光させるか、発光スプレーまたは噴流を噴出させる。試薬は懸濁物、粉末、ペーストまたは他の適当な形態のいずれかとして組成物中に提供してもよい。それらはスプレー、エアゾールとして、またはいかなる適当な形態で提供してもよい。試薬はマトリックスに結合させるか、製品と組合せるか、または製品中に形成させてもよい。典型的には、反応に必要な一種類以上の成分を除いたすべて、好ましくは１種類の成分を除いたすべてを混合して一緒にして提供し、その混合成分を残りの成分と、例えばＣａ2+、ＦＭＮを加えることによりリダクターゼ、ＦＭＮＨ2、ＡＴＰ、空気または酸素と接触させて反応を開始させる。得られたマトリックスは衣料品等の多様な新規用品と組み合わせて有利に使用される。それらはここに提供されるカートリッジにも用いられる。
好適な実施態様において、ルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ／ルシフェリン、例えばエクオリン発光タンパク質が製品と組み合わされて提供されるか、または使用前に添加される。次に製品を残りの成分と接触させる。ここで明らかとなるように、各系が選択された製品と組合してもよい多くの方法が存在する。
Ｄ．  生物発光系の包装
ここで提供される生物発光生成試薬の包装は、試薬を組み合わせようとする製品に応じて選択されなければならない。一般的に、包装はそれに含まれる組成物と反応しないものであり、これらの物質が発光反応を進めさせるために必要とする程度まで水およびまたは空気を排除しなけらばならない。しかし、生物発光発生系の特定の用途は特定の包装を必要とするかもしれないことが理解されよう。以下のものは、生物発光発生系の多様な最終用途の特別な包装要件の一部の例である。これらは単に実施態様として提供されるものであって決して限定を意図するものではない。
生物発光発生試薬はペレット中に提供され、マイクロカプセルかマクロカプセルとしてカプセル化され、マトリックスに結合され、製品中またはその表面上、または製品内の室中または他の形状物中に混合物として含ませる。ある種の玩具等の室または容器などの他の製品に関して主に考慮すべきことは生物発光発生系は使用者によって自由に活性化を受け、容器は非反応性であり、所望であれば生物発光に対して半透明とすることである。容器の実施態様としては飲物容器、皿または他の皿、花瓶、ジャー、ビン、スプレー缶および他の容器がある。一般的に、ここでの方法を実施するために用いられる容器は、生物発光発生系のほとんどの成分を含有する閉じられて定められた空間、および残りの必要な成分を含する別個の閉じられて定められた空間を有し、ここで、それらの二つの空間は容易に除去可能な膜により分けられており、その除去の際に該成分を混合させ、反応させて発光させる。もしくは、容器は生物発光発生系の最終成分以外のすべてを含有し、かつ使用者により例えば区画室中の開口部から最終成分を添加することのできる単一の区画室を有することができる。
生物発光発生系成分を含有するための空間を定める通常半透明の被覆を有するようにすることができ、かつ発光反応に必要な最終成分の添加を可能とさせる単純な操作をなすことのできるいかなる玩具、容器または他の製品も意図される。
よって、発光液体、噴流またはスプレーを発光させるか作る用品が玩具、容器または他の製品であるかにかかわらず、その一般的な設計は同じである。生物発光発生系成分の少なくとも１成分は残りの成分から分けられている。残りの成分は使用前に加えられる。これらは製品に包含させて他の成分から物理的に分けられ得る。例えば、物理的分離手段は使用者により容易に除去されるものであり、混合を可能として、成分の発光をもたらす。例えば、製品は一区画室中にルシフェラーゼと基質を包含し、隣接する区画室中に生物発光活性化剤を包含してもよく、もしくは一つの区画室はルシフェラーゼを包含し、他の区画室は基質のルシフェリンと溶解酸素または他の必要な活性化剤を包含してもよい。それらの区画室は隔膜、例えば膜により分離され、製品の圧縮の際に破裂して分離成分を混合させて発光させることができる。適当な実施態様のために、下記の実施例を参照［さらに、例えば米国特許第３，５３９，７９４号および第５，１７１，０８１号に記載の容器を参照］。
ここで意図される他の実施態様として、液体が噴霧または噴流として排出されるか、または玩具か噴水等の装置からの排出前に生物発光する実施態様が挙げられる。一般的に、これらの方法は排出直前に生物発光発生系成分を水に添加することにより、その排出された噴霧または噴流または流れを発光させる。これを達成するための多様な装置がここで提供される。ここでの開示を鑑みれば、他の装置をそうした用途に適合させることができる。実施態様としては、水の排出直前に該成分を水室に排出する玩具内の室、または該成分を恐らく前測定された量で収容するピン付き装置が挙げられ、この装置は玩具に接続され、手動または自動的に働いて該成分を水室に排出する。同様に、該成分を含有する室中に水を導入させて排出させることができる。
別の実施態様において、成分は独立した組成物中に包装されて、混合の際に発光させてもよい。例えば、ルシフェラーゼを含有する組成物は生物発光基質と生物発光活性化剤とを含有する独立した組成物とは別に提供して使用のために一緒にしてもよい。もう一つの例において、ルシフェラーゼ組成物とルシフェリン組成物を別々に提供してもよく、その２組成物の混合後またはそれと同時に別の生物発光活性化剤を添加してもよい。
同様に、ルシフェラーゼおよび生物発光基質を、単一の包装装置、混合物、懸濁物、粉末、ペーストである組成物、または必要な生物発光活性化剤を除外するように設計された他の適当な組成物中に提供してもよい。生物発光活性化剤の残りの成分への添加または該成分の生物発光活性化剤への添加の際に反応が始まり、混合物が発光する。そのようなシステムの一例が「フェアリーダスト」（“ｆａｉｒｙ  ｄｕｓｔ”）である。この実施態様において、例えばルシフェラーゼと生物発光基質とが水および／または空気、生物発光活性化剤を排除するように包装される。該成分を包装から空気および／空気中の湿気に放出すると、該成分は活性化され、それにより生物発光を生じる。もう一つの実例はルシフェラーゼおよび基質を容器のキャップ装置中に包装して、キャップ装置の操作で容器に含まれる組成物中に該成分を放出して発光させる。
１．  生物発光発生系成分と組合せるための分注及び包装装置
一側面において、ここに提供される生物発光装置系は分注または包装装置と組み合わされた生物発光系である。本明細書の他の個所で詳細に説明される生物発光系は、生物発光基質［例えばルシフェリン］、ルシフェラーゼ［例えば、ルシフェラーゼまたは発光タンパク質］、および単一または複数の生物発光活性化剤［例えば、分子状酸素またはＣａ2+］の３成分を包含する。分注包装装置は生物発光の発生が所望な場合、前記３成分の少なくとも一つを他の２成分から分離して保持するように形状付けられている。
一般的に、分注包装装置はここに含まれる生物発光発生系成分と反応せず、湿気、空気または他の活性化剤、例えばＯ2またはＣａ2+を排除することができ、またはある方法で生物発光反応のために接触させる必要のあるすべての必要な成分を所望とされるまで保持することができる。
しかし、生物発光系の特定の利用と構成は特定の装置を必要とすることが理解されよう。以下はここでの使用が意図される多様な計量分注装置および包装の例示的な説明である。これらは実施態様のためだけに提供され、決して限定を意図するものではない。ここでの記載を鑑みて、新規用品に組合せて生物発光を作るための使用に適する他の装置を改変または工夫してもよいことを理解されたい。
２．  カプセル、ペレット、リポソーム、エンドソーム、液胞、マイクロ化粒子
ここに提供される新規用品組合せのある種の実施態様は使用前の環境からの成分の隔離を必要とするか、または成分を粒子形で提供されることが必要である。そのような実施態様の実施態様は飲物、食物および粒子、例えばフェアリーダストとしてまたは玩具中での使用、粒子の噴水および他のそのような利用が挙げられる。特に、生物発光発生系が、発光飲料または食物を作る食物または飲物の一部として作られる実施態様は、特定の包装の考慮が必要である。人に消費される飲物への添加物として利用できるようにするために、包装は無毒でなければならず、生物発光発生系成分の飲物への接触を提供するために容易に開口しなければならない。そのような使用のための適当な包装の実施態様は、カプセル化材料の分散または溶解等により内容物の放出を可能とする一またはマイクロ［約１００μｍの大きさまで］またはマクロ粒子［１００μＭを超える］材料中に生物発光発生系成分をカプセル化することを伴なう。リポソームおよび他のカプセル用担体［例えば、化合物のゼラチンへのカプセル化を記載する米国特許第４，５２５，３０６号を参照；米国特許第４，０２１，３６４号、第４，２２５，５８１号、第４，２６９，８２１号、第４，３２２，３１１号、第４，３２４，６８３号、第４，３２９，３３２号、第４，５２５，３０６号、第４，９６３，３６８号は多様なポリマー中に生物活性物質のカプセル化を記載する］は、例えばここで議論され、当業者に公知なもの［例えば可溶性紙、米国特許第３，８５９，１２５号を参照］を含めて当業者に公知である。同様に、食物製品に対する添加用の本システム成分の包装に同じ考慮を向けなければならない。乾燥および粉末成分を直接に食物にかけるか、または間接的に例えば該成分を含有するカプセルを食物に加えることにより該成分を食物物質に添加してもよい。
ａ．  一般的なカプセル用担体
選択された系に依存しながら、酸素または水またはＣａ2+以外の生物発光発生系の全成分を、内容物の環境への放出を引き起こす条件に置かれるまで環境から内容物を保護するリポソーム等のカプセル化用材料中に導入することができる。ここでの使用に意図されるカプセル化用材料はリポソームおよび医薬送達送担体等のカプセル化用薬品のために用いられる他のそのような材料を包含する。
ｂ．  カプセル化用担体  −  リポソーム
例えば、該成分を溶解し、ルシフェラーゼ系のための溶解酸素またはＣａ2+またはＡＴＰさえも包含する選択された飲物中へ該成分をゆっくりと放出させるリポソームがここで意図される。それらは、溶液、懸濁物、ジェル、ローション、クリーム、および軟膏等の組成物中に配合することができる。リポソームおよび他の遅延放出力プセル化用組成物はよく知られ、生物発光生成成分の遅延放出送達の使用に適合させることができる。典型的には、ルフェリンおよびルシフェラーゼは酸素またはＣａ2+またはＡＴＰまたは他の活性化成分の不存在下にカプセル化させられよう。環境またはこの成分を適当な濃度で含有する媒体中への放出の際に、反応が進み、光が作られよう。一般的に、カプセル化された成分の濃度はおそらく０．１〜１ｍｇ／ｍｌ以上に比較的高くして、放出の際に目で見えるために十分に高い局所的濃度を確保しなければならない。
例えば、軟膏または遅延放出の局所的担体中に配合されるリポソームまたは他の徐放性の放出送達系はボディーペイント、ローション中の使用に適するだろう。懸濁物として配合されるものはスプレーとして有用であろう。多様な軟膏および適当なリポソーム配合物が公知である［例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社、（１９８４）；米国特許第５，４７０，８８１号、第５，３６６，８８１号、第５，２９６，２３１号、第５，２７２，０７９号、第５，２２５，２１２号、第５，１９０，７６２号、第５，１８８，８３７号、第５，１８８，８３７号、第４，９２１，７５７号、第４，５２２，８１１号を参照］。例えば、適当な軟膏担体はペトロラタム、鉱油および／または無水液体ラノリンを含有するだろう。徐放性放出担体、例えばリポソーム、膜またはコンタクトレンズ送達系、またはゲル形成プラスチックポリマーも適当な送達担体であろう。局所的な送達のためのリポソームがよく知られている［例えば、米国特許第５，２９６，２３１号；Ｍｅｚｅｉら、（１９９０）、「リポソーム  −  局所的投与経路のための選択的医薬送達系、Ｉ．ローション投与形」、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２６：１４７３−１４７７；Ｍｅｚｅｉら、（１９８１）、「リポソーム  −  局所的投与経路のための選択的医薬送達系：ゲル投与形」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：４７３−４７４；Ｇｅｓｚｔｅｓら、（１９８８）、「リポソームによる皮膚の局所麻酔  −  カプセル化テトラカイン」、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  ６７：１０７９−１０８１；Ｐａｔｅｌ、（１９８５）、「調節放出系としてのリポソーム」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１３：５１３−５１６；Ｗｏｈｌｒａｂら、（１９８７）、「ヒト皮膚におけるリポソームヒドロコルチゾンの浸透反応速度論」、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  １７４：１８−２２を参照］。
リポソームは選択された混合物を含有するマイクロカプセル［直径は典型的にはほぼ０．１〜２０μｍ未満である］であり、それらの内容物を徐放的にゆっくりと放出することができる。リポソームまたは他のカプセル、特に、酸素、空気、湿気、可視または紫外［ＵＶ］光または特定のｐＨまたは温度にされらされると溶解する経時的放出被膜［例えば、米国特許第４，８８２，１６５号；Ｋｕｓｕｍｉら、（１９８９）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．ｎｏ．３，４３３−４３６；Ｋｏｃｈ  Ｔｒｏｅｌｓら、（１９９０）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：２９６−３０４；米国特許第５，４８２，７１９号；米国特許第５，４１１，７３０号；米国特許第４，８９１，０４３号；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、（１９８３）、Ｃｅｌｌ  ３２：１０６９−１０７９；およびＳｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、（１９８５）、ＦＥＢＳ  Ｌｔｔｒｓ．１７９：１４８−１５４；それにＤｕｚｇｕｎｅｓら、Ｃｅｌｌ  ＦＵＳＩＯＮの本の第１１章、Ａ．Ｅ．Ｓｏｗｅｒｓ編集；Ｅｌｌｅｎｓら、（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：１５３２−１５３８；Ｙａｔｖｉｎら、（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １４９：７７−８７を参照］が水鉄砲または玩具用機関銃またはフェアリーダストまたは玩具用タバコに用いてもよい。パン焼きに用いられるリポソーム配合物［例えば、米国特許第４，９９９，２０８号］も利用可能である。それらは食されるか加熱されるとそれらの内容物を放出する。そのようなリポソームはここので食物製品への導入、または加熱による成分の放出が所望である実施態様に適するかもしれない。
リポソームは当業者に公知の方法により調製する［例えば、Ｋｉｍｍら、（１９８３）、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９−３９８；Ａｓｓｉｌら、（１９８７）、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０５：４００；および米国特許第４，５２２，８１１号、およびここに挙げた参考文献および当業者に公知のものを参照］。
低いＰＨに感受性のあるリポソーム［例えば、米国特許第５，３５２，４４８号、第５，２９６，２３１号、第５，２８３，１２２号、第５，２７７，９１３号、第４，７８９，６３３号を参照］は使用直前に入浴剤またはシャボン玉組成物への添加に特に適当である。低ｐＨ洗浄剤または石鹸組成物または高ｐＨ組成物に接触した際に、リポソームの内容物が放出されよう。他の成分、特にＣａ+または水中の溶解Ｏ2の存在は、成分が放出するにしたがってそれらを発光させる。温度感受性リポソームは、温かい浴槽水中への放出させるための入浴剤中の利用にも適する。
ｃ．  カプセル化用担体  −  ゼラチンおよび高分子担体
飲物または食物中の内容物を、空気または光との接触、または温度の変化の際に溶解または放出するゼラチンまたは他のそのようなポリマーからなるマクロカプセルまたはマイクロカプセルを用いて生物発光発生系の成分をカプセル化してもよい。そのようなマイクロカプセルまたはマクロカプセルは固体石鹸中に導入してもよく、石鹸が溶解するにしたがって導入されたカプセルまたはペレットが内容物を放出させ、それら内容物は石鹸が置かれている水と接触する際に発光する。
エクオリン系はこの利用のために特に適当である。それは、生物発光の放出を妨げるＥＤＴＡ等の十分なキレート剤を有する緩衝液の懸濁物または液体中で、またはペーストとして、または他の適当な形態にてカプセル化することができる。例えば食物または飲物中、ここに記載されているような二室装置または単一室装置中、またはＣａ2+を含有する湿気環境中にＣａ2+を含有するカプセル［マイクロカプセルまたはマクロカプセル］が湿気にさらされると、ゆっくりと放出される該成分発光するだろう。
よって、カプセル化生物発光生成成分は食物、飲物、氷および立方体の氷（および他の形の氷）、小球またはペレット、例えば「フェアリーダスト」［光にあたった際に溶解し、それにより、Ｒｅｎｉｌｌａ系等のルシフェラーゼ／ルシフェラーゼを放出する、空気にあたった際に光を出すペレット］および他のそうした用品と組合せて用いることができる。
生物活性系とともに用いられる他のカプセル化用容器または担体は水に十分に溶解してそれらの内容物を放出するか、または手でしぼったときに容易に開くか、または水性混合物と混合されたときに内容物を分散させるものである。これらの容器は水を排除することで該容器中で生物発光発生系成分を乾燥させて置いてもよい。水性組成物中や大気中の水分にさらすと、該担体は溶解するか、もしくは内容物を放出させて、該成分が反応して発光する。同様に、すべての生物発光生成試薬のではない一部をペレットの形または濃縮されたペーストとして提供してもよい。例えば、成分をゼラチンまたは類似の硬化剤と混合し、必要ならば鋳型に注ぎ、乾燥して水溶性ペレットを作ってもよい。
カプセル、カプセル化用容器または担体をゼラチンまたは類似の水溶性物質から形成してもよい。包装物を食物または飲物に加える場合、毒性がなく、反応性がなく、味のないものを選択しなければならない。手で容易に開けられるためには、包装物は薄いプラスチックで作られるか、または１／２にわけて両者は結合されたときに気密性シールを形成するが、成分の放出を望むときに容易に分離される形状としてもよい。
一つの側面において、包装装置のこれらのカプセルの実施態様は、飲物、クリーム、ソース、ゼラチンまたは他の液体または半固体に対する添加物としての利用が意図される。もう一つの側面において、包装装置の内容物を空気中に放出させることにより、大気中の湿気および／または分子状酸素と接触した際に発光させることが意図される。
ｄ．  エンドソームおよび液胞
ルシフェラーゼが当業者に公知の方法を用いて発現されている組換え宿主細胞からのエンドソームまたは液胞を用いて担体を作ってもよい［例えば、米国特許第５，２８４，６４６号、第５，３４２，６０７号、第５，３５２，４３２号、第５，４８４，５８９号、第５，１９２，６７９号、第５，２０６，１６１号および第５，３６０，７２６号を参照］。例えば、大腸菌等の宿主中での発現により産生されるエクオリンはタンパク質合成後に小胞、例えばエンドソームまたは液胞中に単離されうる。通常の方法を用いて細胞を可溶化し、小胞をそれらの内容物をそのままの状態にして放出させる。小胞は送達担体としても働く。使用時、ルシフェリン、例えばコエレンテラジンおよび溶解酸素を例えば分散により、加圧下で、または他の適当な手段で小胞に充填してもよい。
ｅ．  超微粉砕粒子
凍結乾燥に適するエクオリン発光タンパク質、Ｒｅｎｉｌｌａ系およびＶａｒｇｕｌａ系等の生物発光発生系成分を超微粉砕して微粉末を形成し、乾燥剤等を用いる乾燥条件下に保存できる。使用時、該微粉末を、身辺用品、銃または噴水中の室等の選択された製品と組合せるか、またはフェアリーダストとして用いることができる。空気中または供給することのできる噴霧中、または加えられたものの中の溶解酸素またはＣａ2+と接触させることにより該粒子はその内容物を放出して発光する。
３．  装置と基質
ここでの組合せは選択された新規用品を組合せ、それを、生物発光を作る系と装置とに組合せることにより作られる。系の選択は所望とされる色および所望の生物発光時間ならびに特定の用品等の因子に依存する。装置の選択は主に組み合わされる用品に依存する。
ここでの最も単純な実施態様の中には、装置が単一の室［容器］またはマトリックス材料および所望であれば排出手段を含有する実施態様がある。生物発光反応の成分、一般的には少なくとも一種類の成分を除いた全成分、典型的にはここに記載の活性化剤を除く全成分を収容器または容器中に、または基質上に、液相中の混合物または粉末または他のペーストまたは他の慣用の組成物として導入する。使用前に最終成分を加えるか、または他の成分を最終成分と接触させる。
ａ．  マトリックス材料
衣料、紙、織物、プラスチック、ガラス、セラミックから作られた用品または他のそうした材料、例えば小立像等の製品の組合せの調製のために、およびカートリッジ中の使用のために、生物発光発生系の少なくとも一成分をマトリックス基質に結合させる。所望であれば、残りの成分を含有する単一または複数の混合物、典型的には液体混合物をマトリックス基質に注ぐか噴霧することにより適用して発光させる。例えば、コエレンテトラジンおよび酸素を含むエクオリン発光タンパク質を基質に結合させる。所望であれば、Ｃａ2+を含有する液体、例えば水道水、または好ましくはＣａ2+を適当な緩衝液に含む液体混合物を例えば噴霧により結合ルシフェラーゼを有するマトリックスと接触させる。接触の際に材料は発光する。
他の実施態様において、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ等のルシフェラーゼは基質材料と結合させ、これを、ルシフェリンを適当な緩衝液中に含む液体混合物に接触させる。接触は噴霧によるか、注ぐか、または他の適当な方法により行うことができる。マトリックス材料は、衣料またはセラミック、ガラス、プラスチック小立像、玩具、ゴム風船、フロッキング剤、例えばクリスマスツリー用フロッキング剤、または他の用品の製品中またはその表面に導入するかまたは製品そのものに形成する。得られた新規用品は、非結合成分を含有する混合物の容器、例えば、蓋付き缶、スプレービンまたは缶、または他の適当な形で有するキットとして売ることができる。
これらのキットは、液体として噴霧または風乾した形で提供できる結合成分の組成物を含有する容器も包含し、これらを基質に適用すると該用品を再び発光させることができる。よって、キットは、基質、例えば衣料またはプラスチック、セラミックまたはガラス用品等、およびルシフェラーゼまたはルシフェリンまたはその両方およびルシフェリンを含有する第一組成物およびその残りの成分を含有する第二成分を含有する。キット中に提供される用品に第一組成物を、例えば該組成物を塗布または乾燥させて充填することができ、または最初の使用の前に充填を必要としてもよい。もしくは、発光を作ることが望まれるときに両組成物を該用品に噴霧してもよい
正確な成分、または適用か保存のための最適手段は選択された生物発光系の関数であることを理解されたい。実験的に決定することのできる成分濃度は重要でないが、一緒にされたときに可視的な光を作るために十分でなければならない。典型的な濃度はマイクロモル／ｌ程度に低く、好ましくはほぼ１ｍｇ／ｌ以上である。基質上の濃度は、そうした典型的な濃度を含有する組成物が材料に塗布されたときに作られる濃度である。再びそのような理想的な濃度は第一組成物を適用し、それを乾燥させ、第二組成物を噴霧し、その結果を観察することにより実験的に決定することができる。
ここで意図されるマトリックス材料は、通常はリガンドおよび他の分子を固定化するために用いられる不溶性材料であり、多くの化学的合成および分離に用いられるものである。マトリックスとも呼ばれるそのような基質は例えば親和性クロマトグラフィーに、生物活性材料の固定化、およびタンパク質、アミノ酸および他の有機分子等の生物分子およびポリマーの化学合成中に用いられる。マトリックスの調製と使用は当業者によく知られており、そうした多くの材料と調製が知られている。例えば、アガロースおよびセルロース等の天然マトリックス材料がそれらの各原料から単離され、公知の方法により処理され、合成材料が公知の方法により調製することができる。
基質材料は典型的には固体、多孔性、変形性、または堅い不溶性材料であり、ビーズ、ペレット、皿、キャピラリー、中空繊維、針、固体繊維、ランダムな形、薄いフィルムおよび膜等の、しかしこれらに限定されない必要されるどのような構造および形を有してもよい。よって、用品をマトリックス材料から作ってもよく、または表面のすべてまたは一部を被覆するか粒子に含侵させること等により一緒にしてもよい。
典型的には、マトリックスが粒状である場合、それらの粒子は少なくとも１０〜２０００μＭであるが、選択された利用に基づきながらそれよりも小さくても大きくてもよい。マトリックスの選択は少なくとも部分的にはそれらの物理学的および化学的性質、例えば可溶性、官能基、機械的安定性、表面積膨張傾向、疎水性または親水性および意図される用途等によって支配されよう。
必要であれば、支持体マトリックスは適当な反応性部分を有するように処理でき、またある場合では、それらは反応性部分をすでに含有する市販品として得てもよく、それにより、分子が結合するマトリックス支持体として役立つだろう。アミノシラン結合、ヒドロキシル結合またはカルボキシシラン結合等の反応性表面部分を含有する材料は、シラン化反応等を伴うよく確立された表面化学技術により作ってもよい。これらの材料の実施態様は表面酸化ケイ素部分をガンマアミノプロピルシランおよびＮ−［３−（トリエトキシシリル）プロピル］フテラム酸およびビス−（２−ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシランなどの他の有機部分に共有結合させたものである。アミノ基反応官能性を有する容易に利用できる具体的な材料はパラ−アミノフェニルトリエトキシシランが挙げられるがこれに限定されない。また、誘導体化ポリスチレンおよび他のそうしたポリマーがよく知られており、当業者に利用可能である［例えば複数の官能基を有するＴｅｎｔａｇｅｌ▲Ｒ▼が利用可能であり、ドイツ、チュービンゲンのＲａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅから販売されている；米国特許第４，９０８，４０５号および米国特許第５，２９２，８１４号を参照；さらに、Ｂｕｔｚら、（１９９４）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．７：２０−２３；Ｋｌｅｉｎｅら、（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９０：５３−６６も参照］。
これらのマトリックス材料としては興味のある分子の結合のための支持体マトリックスとして働くことのできるどの材料でもよい。そのような材料は当業者には公知であり、支持体マトリックスとして用いられているものが挙げられる。これらの材料としては、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼンに架橋されたポリスチレン等［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９６４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：１３８５−１３９０を参照］、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ゴム、シリコン、プラスチツクス、ニトロセルロース、天然スポンジ等の、しかしこれらに限定されない無機物、天然ポリマー、および合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。特にここで興味深いのは高度多孔性ガラス［例えば米国特許第４，２４４，７２１号を参照］、およびケイ酸ガラス、アルコールおよび水を混合して得られる他のものである。
合成マトリックスとしてはアクリルアミド、デキストラン誘導体およびデキストラン共重合体、アガロース−ポリアクリルアミドブレンド、他のポリマーおよび多様な官能基を有する共重合体、メタクリレート誘導体および共重合体、ポリスチレンおよびポリスチレン共重合体が挙げられるが、これらに限定されない［例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：１３８５−１３９０；Ｂｅｒｇら、（１９９０）、Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｐａｐ．，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．，１st，Ｅｐｔｏｎ，Ｒｏｇｅｒ（編集）、ｐｐ．４５３−４５９；Ｂｅｒｇら、（１９８９）、Ｐｅｐｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，２０th，Ｊｕｎｇ，Ｇ．ら（編集）、ｐｐ．１９６−１９８；Ｂｅｒｇら、（１９８９）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０２４−８０２６；Ｋｅｎｔら、（１９７９）、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１７：２４３−２４７；Ｋｅｎｔら、（１９７８）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：２８４５−２８５２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、（１９７６）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２：３７９５−３７９８；米国特許第４，５０７，２３０号；米国特許第４，００６，１１７号；および米国特許第５，３８９，４４９号を参照］。そのようなマトリックスの調製方法は当業者によく知られている。
合成マトリックスとしては、ポリマーおよび共重合体から作られたもの、例えばポリビニルアルコール、アクリレートおよびアクリル酸、例えばポリエチレン共アクリル酸、ポリエチレン共メタクリル酸、ポリエチレン共エチルアクリレート、ポリエチレン共メチルアクリレート、ポリプロピレン共アクリル酸、ポリプロピレン共メチルアクリル酸、ポリプロピレン共エチルアクリレート、ポリプロピレン共メチルアクリレート、ポリエチレン共ビニルアセテート、ポリプロピレン共ビニルアセテート、および酸無水物基を含むもの、例えばポリエチレン共マレイン酸無水物、ポリプロピレン共マレイン酸無水物等が挙げられる。リポソームは親和性精製のための固体支持体としても用いられている［Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８９）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ  ３３：１７３］。
例えば、米国特許第５，４０３，７５０号はポリウレタン系ポリマーの調製を記載している。米国特許第４，２４１，５３７号は鎖延長ポリオールから調製された親水性ポリウレタンゲル組成物を含有する植物生長培地を記載し、プレポリマーが室温で液体であるように５０％酸化プロピレン単位までのランダム共重合が望ましい。米国特許第３，９３９，１２３号は、３５％までのポリ（プロピレンオキシ）グリコールまたはポリ（ブチレンオキシ）グリコールを有するポリ（エチレンオキシ）グリコールを含有するイソシアネート末端プレポリマーの軽度架橋ポリウレタンポリマーを記載する。これらのポリマーを作る際に、有機ポリアミンが架橋剤として用いられる。他のマトリックスおよびその調製が米国特許第４，１７７，０３８号、第４，１７５，１８３号、第４，４３９，５８５号、第４，４８５，２２７号、第４，５６９，９８１号、第５，０９２，９９２号、第５，３３４，６４０号、第５，３２８，６０３号に記載されている。
米国特許第４，１６２，３５５号は、アミンイミドと、少なくとも一つの側鎖ハロ−メチル基を有するビニル化合物とのポリマーである、親和性ークロマトグラフィーの使用に適するポリマーを記載する。親和性ークロマトグラフィーでの結合部位を提供するアミンリガンドは側鎖ハロ−メチル基の部分との反応によりポリマーと結合させ、残りの側鎖ハロ−メチル基は側鎖親水基を含有するアミンと反応させる。支持体をこのポリマーと被覆する方法も記載されている。例示的なアミンイミドは１，１−ジメチル−１−（２−ヒドロキシオクチル）アミン、メタクリルイミドであり、ビニル化合物はクロロメチルスチレンである。
米国特許第４，１７，４１２号には、共有結合したＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸単位を含むペプチドを持ち、好ましくはマクロ多孔性の特性を有する親水性高分子ジェルをベースにした特定のマトリックスが記載されている。基本支持体は、アクリル酸またはメタクリル酸のヒドロキシアルキルエステルまたはヒドロキシルアルキルアミドと架橋アクリレートとの共重合によって調製されるか、メタクリレート共単量体をジアミン、アミノ酸またはジカルボン酸で変性し、生成する末端カルボキシル基または末端アミノ基とアミノ酸またはペプチドのＤ−類似体とを縮合させる。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドも担体表面上で段階的に合成することが可能である。例えば、米国特許４，１７８，４３９号にはカチオン交換体とその製法が記載されている。米国特許第４，１８０，５２４号にはシリカ支持体上での化学合成について記載されている。
固定人工膜も使用することができる［ＩＡＭｓ；例えば米国特許第４，９３１，４９８号および第４，９２７，８７９号を参照］。細胞膜と優先的に会合する分子を結合するのにＩＡＭｓ模擬細胞膜環境を利用できるかもしれない［例えば、Ｐｉｄｇｅｏｎら（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｏｌ．１２：１４９を参照］。これらの物質は、玩具、風船、小さな立像、スポンジ、小物、キー・チェーン、衣服、半透明または透明な石鹸、そして好ましくはマイルドな石けんなどの製品を作るのにも使用され、そして分子、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、それらの混合物を結合しやすい。
例えばマトリックス粒子を活性化剤と接触する品目に浸漬してもよい。例えば、ルシフェリンと結合したマトリックス粒子、好ましくはエクオリン発光タンパク質のようなルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体が、透明または半透明な石けん［例えば、米国特許第４，０８１，３９４号、第５，１８３，４２９号および第５，１４１，６６４号および英国特許第２，２３５，９３１号］、好ましくはマイルドな石けんに取り込まれている。石けんが水と接触すると表面近くのマトリックス粒子が発光する。
生物発光する成分の被膜を持つマトリックス物質、または持たないマトリックス物質などの品目を含むキットおよび残る成分を含む組成物が提供されている。
ｂ．  固定化と活性化
タンパク質およびその他の生体分子を固体または液体支持体上に固定化する方法については多くの手法が開発されている［例えば、Ｍｏｓｂａｃｈ（１９７６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４４；Ｗｅｅｔａｌｌ（１９７５）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｋｅｎｎｅｄｙら（１９８３）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｓｃｏｕｔｅｎ編、２５３−３９１を参照、；全般的な事項に関してはＡｆｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ，３４，Ｗ．Ｂ．Ｊａｃｋｏｂｙ，Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４２，Ｒ．Ｄｕｎｌａｐ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４）］。
最も良く使用される方法としては、当業者に知られた吸収と吸着、または直接的な支持体への結合または多くのジスルフィド結合、チオエーテル結合、立体障害ジスルフィドなどのリンカーを介する支持体への共有結合、およびアミンやチオールなど、遊離反応性基の間の共有結合があげられる［例えば、ｔｈｅ  ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴＡＬＯＧ，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９２−１９９３、このハンドブックにはそのような試薬の調製と応用が記載され、販売元の情報も収載されている；さらにＷｏｎｇ（１９９３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ  Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；また、ＤｅＷｉｔｔら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｚｕｃｋｅｒｎｍａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６；Ｋｕｒｔｈら（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１；Ｅｌｌｉｍａｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９１：４７０８；Ｓｕｃｈｏｌｅｉｋｉ（１９９４）（１９９４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｔｔｒｓ，３５：７３０７；さらに次にあげる文献には光応答性リンカーについて記載されているＳｕ−Ｓｕｎ  Ｗａｎｇ（１９７６）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４１：３２５８；Ｐａｄｗａら（１９７１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４１：３５５０およびＶｅｄｅｊｓら（１９８４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９：５７５］。
固定化を行うには、タンパク質またはその他の生体分子を含む組成物をアルミナ、カーボン、イオン交換樹脂、セルロース、ガラス、セラニックスなどの支持材料に接触させる。吸着によって生体分子を固着させる支持体としてフルオロカーボンポリマーが使用されている［米国特許第３，８４３，４４３号；公開国際ＰＣＴ出願  ＷＯ／８６／０３８４０を参照］。
タンパク質および核酸を含め、生体分子を固体支持体に固着させる様々な方法が知られている［例えば、米国特許第５４５２６８３号を参照］。例えば、米国特許第４，６８１，８７０号にはシリカマトリックス上に遊離アミノ基またはカルボキシル基を導入する方法が記載されている。これらの基は、カルボジイミドの存在下にタンパク質やその他の抗リガンド等、その他の基と共有結合によって連結される。別の方法として、アルカリ条件下にシリカマトリックスをハロゲン化シアノーゲンで処理して活性化してもよい。そして活性化した表面に抗リガンドを加えると、共有結合によってその表面に結合する。ビオチン、アビジンおよび増量剤をくり返し塗布した多重層によって高分子表面を変性する別の方法もある「例えば米国特許第４，２８２，２８７号を参照」；また、感光性の非天然アミノ酸基をポリペプチド鎖に組み込み、その生成物を低エネルギーの紫外線に曝露して、固体の基体にポリペプチド鎖を結合する光活性化方法もある。［例えば、米国特許第４，７６２，８８１号を参照］。プソラレンのような光化学的に活性な試薬と光試薬を基質に結合させるカップリング試薬を用いてオリゴヌクレオチドも結合されている［例えば、米国特許第４，５４２，１０４号および米国特許第４，５６２，１５７号］。光試薬を光活性化すると基体に核酸分子が結合し、表面結合型のプローブが得られる。
タンパク質やその他の生体分子または有機分子、または生体関連粒子を、ガラス、合成高分子、そして架橋多糖類など、化学的活性化した固体マトリックス支持体に共有結合で結合する方法は、よく使用される固定化法である。分子または生体関連粒子をマトリックス支持体に直接、または金属のようなリンカーを介して連結してもよい［例えば、米国特許第４，１７９，４０２号；およびＳｍｉｔｈら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．４：７３−７８］。この方法の例として、アガロースのような多糖類を臭化シアノゲンによる活性化がある。酵素の固定化および親和性クロマトグラフィの支持体としてパーフルオロカーボンポリマーを基体とする支持体の使用が米国第４，８８５，２５０号に記載されている。この方法では、まず生体分子に米国特許第４，９５４，４４４号に記載されているパーフルオロオクチルプロピルイソシアナートのようなパーフルオロアルキル化剤と反応させて変性し、つづいて変性タンパク質をフルオロカーボン支持体に吸着させて固定化する。
マトリックスの活性化と使用はよく知られており、そのような既知の方法であればいかなる方法でも実施することができる［例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら（１９９２）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔａｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ］。例えば、アミノ酸のカップリングは、当業者に親しまれている、例えばＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，１９８４．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄに記載されている技術を用いて実施することができる。
分子を固体支持体に結合する別の適当な方法も当業者に良く知られている［例えば、米国特許第５，４１６，１９３号を参照］。そうした方法には、タンパク質などの分子を支持体に化学的に連結するのに適したリンカーが含まれ、さらにジスルフィド結合、チオエーテル結合、立体障害ジスルフィド結合およびアミノ基やチオール基といった遊離反応性基の間の共有結合も含まれるが、これらの結合に限定されるものではない。これらの結合はヘテロ２官能性試薬を用いて一方または双方に反応性チオール基を作り、それから一方にあるチオール基を、反応性マレイミド基またはチオール基を結合させることができる、他方にある反応性チオール基またはアミノ基と反応させることによって作ることができる。その他のリンカーとして、より酸性の強い細胞内の区画で切断されるビスマレイミドエトキシプロパン、酸に敏感なトランスフェリン複合体、アジピン酸ジヒドラジドのような酸で切断可能なリンカー；紫外線または可視光線に曝露すると開裂するクロスリンカー、および、ヒトＩｇＧ1の一定の領域からのＣH１，ＣH２，ＣH３といったさまざまな領域のようなリンカーがある（Ｂａｔｒａら（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，３７９−３８６を参照）。現在の好ましい結合は、分子をマトリックス表面に吸着させることによって実現される直接結合である。その他の結合として、光を当てることによって活性化しうる光開裂性結合があげられる［例えば、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．３：１０４−１０７にこれらのリンカーが参照により取り込まれている］。光開裂性のリンカーは結合する要素に損傷を与えないように開裂波長が選択される。光開裂性リンカーは光に曝露された時に切断されるリンカーである［例えば、Ｂｒｕｎｄｆｅｌｄｔ，Ｋ編，Ｐｅｐｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，１６ｔｈ，Ｈａｚｕｍら（１９８１），１０５−１１０にはシステインの光開裂性保護基として、ニトロベンジル基が記載されている］；Ｙｅｎら（１９８９）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９０：６９−８２には、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体などの水溶性の光開裂性共重合体が記載されている；Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒら（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｉ．Ｃｈｅｍ．３：１０４−１０７には近紫外線（３５０ｎｍ）を当てると光分解される架橋リンカーおよび試薬が記載されている；Ｓｅｎｔｅｒら（１９８５）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４２：２３１−２３７には光で開裂が可能な結合を形成する塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋試薬が記載されている。どのようなリンカーを選ぶかは具体的な用途によって変わるため、必要に応じて、実験的に選定する必要がある。
複合のためにデザインされたエクオリンおよびそのようなエクオリンを含む複合体が作られている［例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１８３４２号を参照；さらにＳｍｉｔｈら（１９９５）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙも参照］。その他の分子にＶａｒｇｕｌａルシフェラーゼも結合されている［例えば、日本特許出願５０６４５８３号、１９９３年３月１９日］。本発明では、タンパク質とカップリングさせたエクオリン、あるいは選択されるマトリックスに連結させるその他のそのような分子を合成するために、このような方法を選択することができる。最後に、別の方法として、連結するのに、例えば選択した基体への結合にとりわけ適したアミノ酸残基を付加するといったように、生物発光生成系の構成要素を改変してもよい。これは、ＤＮＡを修飾したり、このようなＤＮＡを修飾してＮ−末端またはＣ−末端に残基を付加したルシフェラーゼを作製することによって、容易に実現することができる。
４．  単室、ハウジングまたは容器を備えた装置
容器の例として、飲料容器、様々な皿、花瓶、ジャー、風船、ビン、その他の入れ物があげられる。
単室、ハウジングまたは容器として、生物発光に必要な成分の１つを除いた、最大全成分まで、生物発光生成系の１つまたは複数の成分を混合物、パウダーまたは粒子の懸濁液の形で容器内に含む、単室の水鉄砲、インキ、塗料などの品目が含まれる。残りの成分は使用直前に導入される。例えば、水鉄砲や風船、その他の品物では、粉末を室内に入れ、または品目の内部に入れてその品目と一緒に包装することもでき、あるいはパウダーなどその他の成分を加えることもでき、それから水が加えられる。別の方法では、Ｒｅｎｉｌｌａ，Ｖａｒｇｕｌａおよび蛍のルシフェラーゼといったルシフェラーゼを品目の表面に結合させることができ、水が加えられる。生物発光生成系に応じて、水として、水道水または溶解酸素、Ｃａ2+またはＡＴＰ、またはその他の適当な成分、または適当なルシフェリン／生物発光基質またはこれら両成分を添加した水を選択することができる。同様に、活性化剤だけを加えれば発光が起こるように、ルシフェリン／ルシフェラーゼとルシフェリン／生物発光基質を一緒に品目の表面に結合させることができる。
インクや塗料や多のそのような組成物の場合、成分はインクまたは塗料に懸濁させ、それから最終成分が添加される。別の方法として、Ｒｅｎｉｌｌａまたはエクオリン系のような、生物発光生成系の成分を含むペレットをインクまたは塗料などの品目に加えることも可能で、ペレットが溶けるに従って内容物が拡散しその品目が光る。
品目と生物発光生成系を含むキットも本発明で提供される。典型的にキットには、飲料容器、風船、ビンが含まれ、さらに、生物発光に必要な緩衝液組成物やその他の成分、そしてさらに使用説明書を入れることもできる。キットにはその品目の詰め替え用カートリッジを入れてもよい。
５．  ２室式および多室式流体分注装置
本発明において意図されている分注装置の例は２室式流体分注装置である。一般に、この装置は２つの室を持ち、発光させるまではそれによって、発光生成系の少なくとも１つを、残りの成分から隔離して保持する。この装置には、装置から分注する前に成分を混合する混合室を設けてもよい。さらに、装置は、例えば、水性の組成物またはクリーム／ローション系のような流体または半流体の生物発光生成系に対して使用することができる。
ａ．機械式ポンプによる分注装置
２室式流体分注装置の別の実施態様は、それを作動させるのに機械式ポンプ機構を使用する。この実施態様では分注装置が、基質、ルシフェラーゼまたは活性化剤など、生物発光成分のうちの少なくとも１つを隔絶した室に保持する。ポンプ機構は各室から内容物を取り出して混合室へ送る。混合室内では放出と同時に混合された組成物が、例えば空気中の酸素により、または１つの室にあった成分が反応して活性化され、発光する。ポンプ機構は手動式で、例えばおもちゃの水鉄砲のように引き金を引いてもよいし、例えばモーターで機械的に作動してもよい。
ｂ．ガス充填分注装置
２室式流体分注装置の別の実施態様は、二酸化炭素または、好ましくは酸素を含む混合ガスなどを使用して、生物発光生成系の成分、例えば生物発光基質およびルシフェラーゼを混合室内へ押し出し、そこでそれらの成分を混合した後、分注ノズルから排出する装置である。このような分注装置では、混合室内で内容物を混合すると内容物が発光する。
これらの装置はおもちゃの鉄砲、大砲などおもちゃの武器、シェービングクリームなど、発光するフォームの缶、置物の噴水や火山などほとんどあらゆる流体を噴出する装置に配置することができる。火山型の分注装置は例えば形がよく似た従来の花火を演出する代替物として使用することができる。
２室式流体分注装置を使う用途に、ほとんどあらゆる生物発光生成系を選択することができる。空気を生物発光の活性化剤とする場合、内容物は混合後、または分注装置から排出される時に発光する。別の方法として、ルシフェラーゼまたは生物発光基質のどちらか一方と一緒に、１つまたは２つの室に生物発光活性化剤を入れることができる。また、混合室に接続した第３の室に入れてもよい。かくして、ここに述べるすべての組み合わせについて、分注装置の重要な局面は、生物発光生成系の成分の少なくとも１つを、反応を望むまで他の成分から隔離しておくことである。
ｃ．圧縮分注装置
本発明において意図している２室式流体分注装置の別の実施態様は、圧縮が可能なビンまたはチューブの形態を取る。ビンはその内部に２つの区画を持ち、生物発光生成系成分の少なくとも２つを隔離して保持する。ビンのキャップが混合室としての機能を果たすこともできるし、混合室が２つの室とキャップの間に位置してもよい。生物発光生成系の成分はビンからの圧縮によって混合室に押し出される。続いて、混合室から分注される。例えば、混合された内容物は、プランジャー／シリンジ装置を分注器の端に取り付け、その装置を通して内容物を抜き出すことにより、ビンから取り出すことができる。
このような圧縮ビンまたはチューブは、生物発光性のボディクリーム、ジェルまたはローション、フィンガーペイント、歯磨き、シャンプー、ヘアージェル、化粧品その他、粘度の高い液体および半固体を分注するのに特に有益である。ビンまたはチューブはプラスチック、プラスチック／金属ラミネートなど、内容物が放出されることによって容器内に真空部分が形成されないよう、変形できる複合材で構成することが好ましい。例えば、米国特許第４，６８７，６６３号に歯磨きに使用される２室式のチューブが記載されており、本特許に引用するすべての特許や出版物と同様、その全体が本特許に組み込まれている。このチューブは、本特許で提供される生物発光生成系と組み合わせた用途に採用することができる。使用されるまで、最終産物の成分を隔離して保持するために使用される、２室を持ったその他のチューブまたは容器も本特許で使用することができる［例えば、米国特許第５，４０５，０５６号、第４，６７６，４０６号、第４，４３８，８６９号、第５，０５９，４１７号、第４，５２８，１８０号、第４，８４９，２１３号、第４，８９５，７２１号、第５，０８５，８５３号、特に５，０３８，９６３号を参照］。
６．  １回限りの使用向けにデザインされたその他の流体分注装置および包装装置
本特許における用途を目的とした分注および包装装置の別の実施態様として、生物発光性の流体を使った用途向けにデザインした流体包装装置がある。これらの装置は、発光させるまで、生物発光生成系成分の少なくとも１つを残りの成分から隔離して保持する。しかし２室式分注装置と違って、これらの装置では包装内容全部が発光するため、基本的に１回限りの使用を前提としている。しかし、基質、ルシフェラーゼ、あるいは使い尽くしたその他の成分を再充填することが可能である。
ａ．ビン型の単室容器／浮体装置
本発明における用途を意図した流体包装装置の一例は、その中に浮体を持ち、生物発光生成系の成分の少なくとも１つを含むをビン型の装置である。浮体を破るための刺し針またはそのような手段もビンの中に備えられている。ビン内部で空気浮体が破裂すると、その内容物がビンの内容物と混合し、生成した混合物が空気などの活性化剤と接触して発光する。
生物発光生成系の成分はビン全体で混合されるので、内容物は混合したら速やかに使用しなければならない。このように、このタイプの包装は、１回の使用で消費されるような、生物発光生成系を使用する用途またはシャボン玉遊びに特に適している。
ｂ．食品および飲料用の２室式ビン型容器／浮体装置
本発明で提供される流体包装装置の別の例は、使用が１回限りの２室式のビンである。この装置では２つの室の間に膜が配置されている。１方の室が壊れやすく、一旦それが壊れると室を隔てている膜が破れるように設計されている。膜が破れると２つの室の中身が混合し、流体が発光する。別の方法として、膜で隔てる代わりに、２つの室の間に一方向バルブを設置しても良い。このような使用が１回限りの２室式装置は、発泡組成物、飲料、１回使用分のシャンプー、石けん、クリーム、ローションなどへの用途に特に適している。
ｃ．食品および飲料用の缶タイプの容器／浮体装置
生物発光性食品または飲料に使用しやすい流体包装装置の別の例は、容器／浮体の組み合わせである。その一つの実施態様において、容器はソーダ水を入れた缶のようにリング引き上げ式（プルトップ式）に設計されている。生物発光生成系の成分の少なくとも１つを浮体を缶のプルトップ部分の下に取り付ける。缶内部の飲料には残りには生物発光生成系の成分が含まれている。缶を開けると浮体に穴があき、その内容物が缶の残りの内容物と混合し、そのために飲み物が発光する。ほとんど直ちに発光が目に見えるように容器は透明である方が好ましい。本発明の用途向けに改変可能なその他のプルトップが知られている［例えば、米国特許第５，３９７，０１４号を参照］。
容器／浮体装置の別の設計も同様に意図される。例えば、容器には浮体が取り付けられる移動可能なトップが配置され、その形状はどのようなものでもよい。飲料を発光させるため、浮体に穴を開けるか、別の適当な方法でその内容物を容器に加える。このようにして食品または飲料の発光が起こる。容器の内容物は食品または飲料である必要はなく、いかなる流体または半固体でも使用することができ、本発明の対象として考慮されている。
ｄ．発光する噴霧を発生する噴霧容器
発光する噴霧を発生するのに適した噴霧容器が、本発明において提供される。これらの容器も、２つの成分とりわけ溶液または液体成分が使用直前に混合されることを想定した用途を意図している。これらの容器には第１成分のためのハウジング部分と、第２成分を注入または導入するよう設計された第２の部分が含まれる。
図２０−２２［実施例１０も参照］に図解されているこれらの容器の好ましい実施態様は、上部のハウジング部分と底部のプランジャー部の２つの部分からなる。生物発光を起こさせるために、上部のハウジング部に生物発光生成系の成分の内、１成分または複数成分を除いてすべての成分を含む。前に述べたように、生物発光生成系の残りの成分はペレット内に含まれているか、カプセル化されている。
上部ハウジング部分は、その底部にペレットがちょうどはまり込む陥入部を持っている。そのくぼみの少なくとも１つの壁は破ることができる膜または材料でできている。また、上部ハウジング部分は、底部プランジャー部分に適合し、ぴったり当たり、はまり込む。底部プランジャー部分を上部ハウジングにしっかりはめ込んだ時、プランジャーは、底部プランジャー部分の内側、上部ハウジング部分の陥入部に位置する。扱う際、ペレットまたはカプセル化された担体は上部ハウジングの陥入部の中に置かれ、底部プランジャー部を上部ハウジング部にしっかりはめ込む。底部プランジャー部分の内部のプランジャーがペレットを押し、その結果、ペレットが破裂膜または破裂材を押し破って上部ハウジング部の内容物に溶解、混合する。別の方法では、ペレットに鋭利な部分を持たせ、それによってハウジングの壁を破る。混合した内容物が漏れるのを防ぐため噴霧缶装置の底部プランジャー部の内部、上部ハウジング部の底に角度の付いたシールを取り付けてもよい。上部ハウジング部にはさらに、内容物を放出するための導管など適当な手段が設けられている。
噴霧缶の２つの部分にネジを切り、それによって噴霧容器の上部ハウジング部が底部プランジャー部を受けて互いにはまり込むようにしてもよい。［例えば、底部プランジャー部が完全にねじ込まれた噴霧缶装置を図示した図２１を参照］。別の方法として、一方の部分から舌部を他方の溝に挿入して２つの部分をカチッとはめ込むようにすることもできる。
前述のように、上部ハウジング部の底部に設けられた陥入部またはポケットは、破裂可能な膜で形成された少なくとも１つの壁を持っている。その壁は上部にあって、例えば、ペレットまたはプランジャーからの押す力、またはプランジャーがペレットを押す力で容易に破られることが好ましい。ペレットは内容物を水性媒体へ放出する材料で作られる。ペレットには噴霧缶に穴を開けるように設計された鋭利な先を備えることもできる。
噴霧容器はプラスチック、アルミニウム、合金、スズなど、適当な材料で製作され、エアロゾルやスプレーを噴射するように設計されたヘアースプレー缶などの噴霧缶および噴霧容器が作られる。噴霧缶装置の大きさは用途と市場の需要によって変わるが、使いやすい大きさとしては約１００ｍｌから約１Ｌ程度であろう。
底部プランジャー部は典型的にはアルミニウムなどの金属で作られ、底部プランジャー部がネジ山の部分にしっかり入った時、プランジャーは上部ハウジング部のポケット内に適合するように形状と位置が決められる。底部プランジャー部は圧縮可能なプラスチックまたはそれに類する材料で作ることも可能で、陥入部、溝穴またはポケットに挿入され、そして緊密に適合することで保持されるペレットを圧縮し送り出すように設計することができる。
７．  単室容器用のキャップ装置
本発明で考慮されている包装装置の別の例は容器で使用する用途向けのキャップ装置である。この実施態様では、生物発光生成系の１成分または複数成分、すなわち１つの成分を除く最大すべての成分までが容器のキャップの中にあり、残りの成分は容器内に含まれる。キャップ装置を作動させると生物発光生成系の成分が容器内の組成物に添加され、組成物が発光する。容器は生物発光に対して半透明である方が好ましい。しかし、発光する組成物は容器から出してもよい。
一般的には、キャップにはその内部にキャップの底に向かって開いたポケットが設けられる。例えば、キャップの底はＵ字形にしてポケットを形成させることができる。キャップ装置は、そのポケット内に、生物発光生成系の成分のうちの１成分または複数成分、すなわち１つの成分を除く最大すべての成分までを含むカプセルまたはそれに類する包装を含む。生物発光生成系の成分を容器内に展開する手段がキャップに取り付けられている。そのような展開手段として、プランジャーアセンブリーであってもよい。キャップ装置はプランジャーを押し下げることによって作動し、包装された成分が容器内の組成物内へ押し進められるか、包装が破られて内容物が容器内の組成物内へ放出される。包装は組成物に溶解しうるものであるか、その包装に含まれる成分の拡散を助けるか、またはプランジャーアセンブリーと接触すると容易に破壊されるものでなければならない。
別の方法として、キャップ装置内の包装が、生物発光生成系の成分を、容器内の組成物からまたは容器内の組成物からおよびお互いから、隔離する膜または一連の膜であることも可能である。この方法では、プランジャーが膜を破り、それによってその中に含まれる生物発光生成系の成分が容器内に含まれる組成部中へ放出される。この場合も、成分と組成物が混合すると発光が起こる。
キャップの内部に含まれる生物発光生成系の成分は、容器の中に含まれる組成物と混合することができる、溶液、粉末または粒子の懸濁液、またはキャップ装置の内部に包装しやすいその他の形で組成物の中に入っていてもよい。また、キャップ装置は膜の破片が容器内に入らないように、キャップの底に網またはフィルターを取り付けてもよい。
本特許に記載するすべての装置と同様生物発光生成系の成分と接触するキャップ装置は、成分に対して非反応性でなければならず、特に人間が消費することが意図されている場合には無毒であることが好ましい。キャップは、例えばコルクで作ることが可能であり、ワインやシャンパンの瓶に使われる可能性もある。別の方法として、キャップをプランジャーと一体にしたねじぶた型にすることもできる。その場合、ネジぶたを容器の上部に締め付けると包装された生物発光生成系成分の方へプランジャーが押されて包装を破るか包装が容器内へ押される。
Ｅ．製造物品と生物発光の組み合わせ
ここでは製造物品と生物発光の組み合わせが提供される。生物発光は人を楽しませ心を和ませるので、生物発光によって、その組み合わせは新規な用品である。新規な［例えば娯楽と心の安らぎ］用品をもたらす、製造物品と生物発光とのこのようないかなる組み合わせであれ、ここで意図される。それゆえ、組み合わせは製造物品または生産における材料と生物発光生成系または装置を接触させることによって形成される。生物発光生成系の成分は用品の一部として生産され、生産後に、それに塗るか、浸漬するか添加される。別の方法として、製造物品は、生物発光生成系の成分を含む装置、または生物発光生成系の成分が添加される装置、および生物発光を作り出す装置と組み合わされる。
ここで提供される生物発光生成系は物質を光らせる様々な物質での用途を意図している。後で論じるように、例えば、生物発光生成系の成分は、製造物品の透明な部分に収納された発光性の水性混合物を作り、製造物品のその部分を発光させるのに使用することができる。さらに、生物発光生成系の成分は発光性の食品、飲料、織物、クリーム、ローション、ジェル、石けん、泡製品、紙、パウダー製品または水を作るのに使用することができる。以下に、ここで考慮される生物発光生成系と製造物品の組み合わせの簡単な例と、その結果生まれる新規な用品について紹介する。
１．浴用パウダー、バブルバスおよび爪、毛髪、肌、唇、その他に使用する製品を含むパーソナルケア製品
パーソナルケア製品は、粉末、圧縮粉末、スプレー、フォーム（泡状）、アエロゾル、ローション、ジェル、軟膏、その他適当な形態で作ることができる。共通の要素は、このような用品と生物発光試薬の組み合わせとなろう。そして組み合わせの結果、使用する前または身体に付けた時または使用された時に製品は発光する。これらの用品には、ボディパウダー、ローション、ジェル、水性組成物および溶液、マニキュア、メークアップ、ボディペイント、シェービングクリームおよび歯磨きがある。ここに記すように、用品は生物発光生成系の１成分または複数成分と組み合わされ、発光させたい時には、残りの成分を添加するか他の成分と組み合わせる。
ａ．入浴剤
ここに例示する多くの入浴剤は本発明における生物発光生成系と組み合わせた用途に適している。このような入浴剤としてはｐＨが中性に近い非洗浄剤系が好ましい。選択された生物発光生成系は生じるｐＨで活性なものを選択しなければならない。さらに、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｖａｒｇｕｌａまたはエクオリン系のようなルシフェリンとルシフェラーゼを含み、ｐＨ、温度に敏感な、または水に溶ける、またはそうでなければ放出されるリポソームまたは送達担体など、カプセル状担体、そして好ましくはマイクロカプセルが本発明における用途に好ましい。いくつかの実施態様においては、カプセルに２種類のタイプがある。すなわち、１つは生物発光反応に必要な成分の内で１つだけ除いて残り全部を含むカプセル、もう１つは残りの成分を含むカプセルである［所望なら、風呂の湯に存在する成分、例えばＣａ2+を除外する］。このようなカプセルは入浴剤の成分としてもよいし、浴槽に入れて発光させてもよい。湯または特定のｐＨの水に触れるとカプセルまたはペレットの内容物が、好ましくはゆっくりと放出され、光を放つことになる。
別の実施態様では、１つのカプセルにはルシフェラーゼとその他の成分が入っている。そしてルシフェリンは入浴剤に入れてもよいし、別に加えてもよい。本発明の開示に照らせば、成分を組み合わせる方法は当業者には明らかであろう。入浴剤および生物発光反応は組み合わせとして、またはキットとして提供される。
これらの組み合わせによる用途に適する入浴剤や泡浴剤、その他の浴用組成物は当業者によく知られている［例えば、米国特許第５，４７８，５０１号、第４，５６５，６４７号、第５，４７８，４９０号、第５，４１２，１１８号、第５，４０１，７７３号ほか、数多くの例を参照］。これらの例は生物発光生成系成分を添加して改変してもよい。
ｂ．発光する散剤または粉剤
ここに記載する組み合わせの別の具体例は、演劇用製品用のように発光する散剤または粉剤、もしくは蒸気としての例である。この実施態様では、生物発光生成系成分の内の１つを除く、最大全部までの成分を凍結乾燥または乾燥したもの、マイクロカプセル化したもの、またはその他の適当な組成物が、前記のように容易に破裂、経時的に放出、温度、ｐＨまたは光に感応するマイクロスフィアまたはカプセルにされる。カプセル化剤は光または温度感応性であって、環境に曝露されると内容物がカプセルから放出されることが好ましい。すなわち、散剤の周辺の空気中の湿気または酸素、酸素を溶解した皮膚面の水分によって発光する。散剤は、もし気密性の容器に保存するなら、ボディパウダーのような別のパウダーに加えることができる。このパウダーは一旦空気中および皮膚の湿気にふれると発光する。
別の方法として、凍結乾燥パウダーをマイクロ化した粒子に乾燥状態が保持できるような包装を施す。湿った空気または水滴を含む空気［例えば霧］に触れるとマイクロカプセル化したパウダーは発光する。
ｃ．ローション、ジェル、その他の局所用配合品
肌に適用する場合、マクロな粒子、ミクロな粒子、ルシフェラーゼ、ルシフェリンまたはその混合物を化粧品組成物に添加してもよい。組成物は、毒性がなく皮膚に受容可能なジェル、クリーム、ローション、固体および、溶液または懸濁液、またはアエロゾルまたは固体の基剤または当業者に知られている担体など、その他の組成物の形態で提供することができ、これらに、粒子の内容物と反応する分子状酸素またはＣａ+2、または両者を含むジェル、クリーム、ローション、固体、溶液または懸濁液、またはアエロゾル中に内容物が放出される条件下で、十分な数の粒子が添加される。皮膚に適用すると、これらのジェル、クリーム、ローション、固体、溶液または懸濁液、またはアエロゾルが発光する。
（１）ローション
ローションは、１つまたは複数の生物発光生成系に対する全試薬より少ない試薬を有効濃度で含む。試薬は、担体の内容物が放出されるにつれてその内容物がローション中または皮膚上、または両方に存在する酸素またはＣａ2+と反応するように、光または温度に曝露されるとその内容物を放出する担体中にカプセル化するのが好ましい。使用する前に、皮膚に水、緩衝液または必要なイオンを含有するその他の組成物を噴霧することができる。有効濃度とは皮膚に接触した時に目に見える光を発するに十分な濃度である。皮膚軟化剤は、それが生物発光反応を不活性化しない限り、当業者に知られたいかなる皮膚軟化剤でも、人間の肌への適用に適するものとして使用することができる。そのような軟化剤には次のようなものがあげられるが、これらに限定されるものではない：
（ａ）鉱物油、石油、パラフィン、セレシン、オゾケライト、微結晶ワックス、ポリエチレンおよびペルヒドロスクワレンなどの炭化水素系油およびワックス。
（ｂ）ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、水溶性およびアルコール可溶性シリコン−グリコール共重合体などのシリコン油。
（ｃ）植物、動物および海洋の資源から誘導されるトリグリセリド油脂。その例として、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、コーン油、オリーブ油、たら肝油、アーモンド油、アボカド油、パーム油、胡麻油、大豆油があげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｄ）アセチル化モノグリセリドなどのアセトグリセリドエステル。
（ｅ）エトキシル化グリセリルモノステアレートなどのエトキシル化グリセリド。
（ｆ）１０ないし２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルキルエステル。本発明で有用なのは、脂肪酸のメチル、イソプロピルおよびブチルエステルである。例として、ラウリン酸ヘキシル、ラウリン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソヘキシル、パリミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、オレイン酸イソデシル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸デシル、イソステアリン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソヘキシル、アジピン酸ジヘシルデシル、セバシン酸ジイソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチルおよび乳酸セチルがあげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｇ）１０ないし２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルケニルエステル。その例として、ミリスチン酸オレイル、ステアリン酸オレイル、およびオレイン酸オレイルがあげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｈ）９ないし２２個の炭素原子を有する脂肪酸。適する例として、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキドン酸、ベヘン酸およびエルカ酸があげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）１０ないし２２個の炭素原子を有する脂肪アルコール。その例としてラウリル、ミリスチル、セチル、ヘキサデシル、ステアリル、イソステアリル、ヒドロキシステアリル、オレイル、リシノレイル、ベヘニル、エルシルおよび２−オクチルドデシルアルコールがあげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｊ）脂肪アルコールエーテル。その例として、１０ないし２０個の炭素原子を有するエトキシル化脂肪アルコールエーテルがあげられるが、これに限定されるものではない。例として、１ないし５０個のエチレンオキシド基または１ないし５０個のプロピレンオキシド基またはそれらの混合物が結合したラウリル、セチル、ステアリル、イソステアリル、オレイルおよびコレステロールアルコールがあげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｋ）エーテル−エステル、例えばエトキシル化脂肪アルコールの脂肪酸エステル。
（ｌ）ラノリンと誘導体。その例として、ラノリン、ラノリン油、ラノリンワックス、ラノリンアルコール、ラノリン脂肪酸、ラノリン脂肪酸イソプロピル、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化コレステロール、プロポキシル化ラノリンアルコール、アセチル化ラノリン、アセチル化ラノリンアルコール、ラノリンアルコール＝リノレエート、ラノリンアルコール＝リシノレエート、ラノリンアルコール＝リシノレエートの酢酸エステル、エトキシル化アルコールエステルの酢酸エステル、ラノリンの水素化分解、エトキシル化水素化ラノリン、エトキシル化ソルビトールラノリンおよび液体および半固体ラノリン吸着基体があげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｍ）多価アルコールおよびポリエーテル誘導体。その例として、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール［分子量２０００−４０００］、ポリオキシエチレン＝ポリオキシプロピレン＝グリコール、ポリオキシプロピレン＝ポリオキシエチレン＝グリコール＝グリセリン、グリセロール、エトキシル化グリセロール、プロポキシル化グリセロール、ソルビトール、エトキシル化ソルビトール、ヒドロキシプロピルソルビトール、ポリエチレングリコール［分子量２００−６０００］、メトキシ＝ポリエチレン＝グリコール３５０、５５９、７５０、２０００、５０００、ポリ（エチレンオキシド）ホモポリマ［分子量１００，０００−５，０００，０００］、ポリアルキレングリコールおよび誘導体、ヘキシレングリコール［２−メチル−２，４−ペンタンジオール］、１，３−ブチレングリコール、１、２、６−ヘキサントリオール、エトヘキサジオールＵＳＰ（２−エチル−１、３−ヘキサンジオール）、Ｃ15−Ｃ18ビシナルグリコールおよびトリメチロールプロパンのポリオキシプロピレン誘導体があげられるが、これらに限定されるものではない。
（ｎ）多価アルコールのエステル。その例として、エチレングリコール一および二脂肪酸エステル、ジエチレングリコール一および二脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール［分子量２００−６０００］一および二脂肪酸エステル、プロピレングリコール一および二脂肪酸エステル、ポリプロピレングリコール  ２０００モノオレエート、ポリプロピレングリコール  ２０００モノステアレート、エトキシル化ブロピレングリコールモノステアレート、グリセリル一および二脂肪酸エステル、ポリグリセロール＝ポリ脂肪酸エステル、エトキシル化グリセロールモノステアレート、１，３−ブチレングリコールモノステアレート、１，３−ブチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレンポリオール＝脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレン＝ソルビタン＝脂肪酸エステルがあげられるが、これらに限られるものではない。
（０）ろうエステル。その例としてミツろう、クジラろう（ｓｐｅｒｍａｃｅｔｉ）、ミリスチン酸ミリスチルおよびステアリン酸ステアリルがあげられるが、これらに限定されるものではない。また、ミツろうの誘導体。その例として、ミツろうにエチレンオキシド含量が様々なエトキシル化ソルビトールとの反応生成物であり、エーテル−エステルの混合物であるポリオキシエチレン＝ソルビトール＝ミツろうがあげられるが、これに限定されるものではない。
（ｐ）植物性ろう。その例としてカルナウバロウとキャンデリラろうがあげられるが、これらに限られるものではない。
（ｑ）レシチンおよびその誘導体などのリン脂質
（ｒ）ステロール。その例として、コレステロールおよびコレステロールの脂肪酸エステルがあげられるが、これらに限られるものではない。
（ｓ）アミド。その例として脂肪酸アミド、セラミド、エトキシル化脂肪酸アミドおよび固体脂肪酸アルカノールアミドがあげられるが、これらに限られるものではない。
さらに、ローションには乳化剤が１％（重量）ないし１０％含まれていることが好ましいが、２％ないし５％がさらに好ましい。乳化剤としては、非イオン性でも陰イオン性でも、あるいは陽イオン性でもよい。申し分のない非イオン性乳化剤の例として、１０ないし２０個の炭素原子を有する脂肪アルコール、２ないし２０モルのエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドと縮合させた、１０ないし２０個の炭素原子を有する脂肪酸、２ないし２０モルのエチレンオキシドと縮合させた、側鎖に６ないし２０個の炭素原子を有するアルキルフェノール、エチレンオキシドの一および二脂肪酸エステル、脂肪酸部分に１０ないし２０個の原子原子をを含むエチレングリコールの一および二脂肪酸エステル、ジエチレングリコール、分子量が２００ないし６０００のポリエチレングリコール、分子量が２００ないし３０００のプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、ソルビタン、ポリオキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチレンソルビタンおよび親水性のろうエステルがあげられるがこれらに限られるものではない。好適な陰イオン性の乳化剤の例として、脂肪酸石けん、例えば脂肪酸部分が１０ないし２０個の炭素原子からなるナトリウム、カリウムおよびトリエタノールアミン石けんがあげられるが、これらに限られるものではない。別の適当な陰イオン性乳化剤としては、アルキル部分に１０ないし３０個の炭素原子を含む硫酸アルキル、アルキルアリールスルホン酸およびアルキルエトキシエーテルスルホン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩または置換アンモニウム塩があげられるが、これらに限られるものではない。アルキルエトキシエーテルスルホン酸塩は１ないし５０個のエチレンオキシド単位を含んでいる。申し分のない陽イオン性乳化剤としては、四級アンモニウム化合物、モルホリウム化合物およびピリジニウム化合物がある。前項で述べた皮膚軟化剤のいくつかは乳化性も持っている。そのような皮膚軟化剤を含むローションを処方する場合は、組成物中にその乳化剤を含ませることはできるが、必ずしも添加する必要はない。
他の従来の成分をこのようなローションに加えてもよい。そのような添加物として、組成物に対して１％ないし１０％濃度で添加される増粘剤は、そのような添加物の１つである。ふさわしい増粘剤の例としでは、架橋カルボキシポリメチレン重合体、エチルセルロース、ポリエチレングリコール、トラガカントゴム、カラヤゴム、キサンタンゴムおよびベントナイト、ヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースがあげられるが、これらに限られるものではない。
ローションの残り成分は、水、Ｃ2またはＣ3アルコール、または水とアルコールの混合物である。ローションの配合は全成分を一緒に混合して行われる。好ましくは、生体発光系試薬は混合物に懸濁させるか均一に分散させる。
ある実施態様では、成分の混合は使用直前に行われる。混合するための装置は当業者に知られており、本特許に例示されている。
ローションおよびパウダー、カプセル賦形剤および任意にＡＴＰ，Ｃａ2+を含む緩衝組成物、および生物発光反応に必要なその他の成分を含むキットも提供される。
（２）クリーム
クリームも、典型的には、本発明で提供される生物発光生成系の１つまたは複数を、約０．１％［重量］、好ましくは１％より高い濃度と５０％までおよび５０％より高い濃度の間、好ましくは約３％と５０％の間、より好ましくは約５％と１５％の間の有効濃度で含むように配合される。クリームも軟化剤を５％ないし５０％、好ましくは１０％ないし２５％含み、残りは水または毒性を持たない適当な保持体、例えばアイソトニック緩衝液である。ローションの項で述べたように、クリーム組成物にも柔軟剤を使用することができる。クリームには前述のように適当な乳化剤を含めてもよい。添加される乳化剤の濃度は、３％ないし５０％、好ましくは５％ないし２０％である。
（３）局所用溶液および懸濁液
これらの組成物には、発光が肉眼で認められる量、典型的には約０．１−１０ｍｇ／ｌ、好ましくは１ないし５ｍｇ／ｌのルシフェラーゼが添加、配合される。ルシフェリンの量も同様に、０．１ないし１０ｍｇ／ｌであるが、所望の発光時間に応じてその量が選択される。残りは水または適当な有機溶媒またはその他の溶媒または緩衝液である。溶媒として、または溶媒の一部として有用な適当な有機物質は次のようなものである：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール［分子量２００−６００］、ポリプロピレングリコール［分子量４２５−２０２５］、グリセリン、ソルビトールエステル、１，２，６−ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、酒石酸ジエチル、ブタンジオールおよびこれらの混合物。このような溶媒系には水を含むこともできる。
局所用に使われる溶液または懸濁液は、次にあげる成分のいずれを含むこともできる：希釈剤として、例えば食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒；抗菌剤として、例えばベンジルアルコールおよびメチルパラベン；酸化防止剤として、例えばアスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤として、例えばＥＤＴＡ；緩衝液として、例えば酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液およびリン酸塩緩衝液；浸透圧調整剤として、例えば塩化ナトリウムおよびデキストロース。液体調製品は、ガラス、プラスチックその他の適当な材料で作られたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数投与バイアルびんに封入することができる。適当な担体として、生理食塩水またはリン酸塩でｐＨ緩衝した食塩水［ＰＢＳ］を含んでもよい。懸濁液および溶液には増粘剤および可溶可剤としてグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物を含んでいてもよい。リポソーム懸濁液も薬物学的に許容される担体として適当であろう。これらは、当業者に知られた方法に従って調製することができる。
これらの組成物は、溶液または懸濁液として皮膚に適用してもよいし、エアロゾルまたはフォームとして調製し、皮膚に噴霧してもよい。エアロゾル組成物は、適当な噴射剤を、典型的には［重量で］２５％ないし８０％、好ましくは３０％ないし５０％含む。このような噴射剤の例は、塩素化、フッ素化およびクロロフッ素化低級炭化水素である。亜酸化窒素、二酸化炭素、ブタンおよびプロパンも噴射ガスとして使用される。これらの噴射剤は、当業者に容器の内容物を放出するのに適当であると理解されている量および圧力下で使用される。
溶液は、適当な塩類でｐＨ約５−８の０．０１％−１０％等張液として調合することができ、好ましくは本発明における化合物の１成分または複数成分を約０．１％の濃度で、そして好ましくは１％より高い濃度、５０％まで、またはそれより高い濃度で含む。好適なマイルドな溶液が知られている［例えば、米国特許５，１１６，８６８号に眼科洗浄液および局部用の典型な組成物が記載されている］。このような溶液は、ｐＨ約７．４に調整されており、例えば、９０−１００ｍＭ塩化ナトリウム、４−６ｍＭ二塩基性リン酸カリウム、４−６ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム、８−１２ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５−１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１５−２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１０−２０ｍＭＤＬ−β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムおよび５−５．５ｍＭグルコースを含む。
活性な物質は、所望の作用を賦与しない他の活性な物質、または所望の作用を補足する物質と混合することもできる。
（４）ゲル
ゲル組成物は適当な増粘剤を前記［第（３）項］の溶液または懸濁液組成物に混合することによって調製することができる。適当な増粘剤の例はローションの項に記載されている。
ゲル化組成物は、典型的には、本発明によって提供されるシステムの１つまたは複数が０．１ｍｇ−１０ｍｇ／ｌまたはそれより高い濃度、そして増粘剤が約０％ないし７５％、好ましくは０．５％ないし２０％、さらに好ましくは１％ないし１０％において、１つまたは複数の抗痛感過敏症剤の有効量を含む。残りは水またはその他の水性の担体である。
（５）固体
固形組成物は、唇または身体の他の部分への適用を目的とした棒状組成物として調製してもよい。このような組成物は、本発明において提供される１つまたは複数の化合物を有効量含む。その量は、典型的には、本発明において提供される系の１つまたは複数が約０．１ｍｇ／ｌ−１０ｍｇ／ｌまたはそれより高い濃度で、湿った皮膚、例えば唇に触れた時に、発光するのに有効な量である。固体も前記皮膚軟化剤を約４０％ないし９８％、好ましくは約５０％ないし９０％含んでいる。さらにこの組成物は、１％ないし２０％、好ましくは５％ないし１５％の適当な増粘剤、そして、所望するかまたは必要とする場合には、乳化剤と水または緩衝液を含むこともできる。固形の組成物に使用する増粘剤は、ローションの項に記載したものが適当である。
所望の安定性や芳香、色、あるいは太陽からの紫外線の遮蔽など、望ましい性質を賦与することが知られているメチルパラベンやエチルパラベンといった保存剤や香水あるいは色素など、その他の配合成分も局所用組成物に使用してもよい。
２．発光する玩具やその他の用品
生物発光生成系を玩具に使用する例の中には、人形、おもちゃの乗り物、フラフープ、ヨーヨー、風船、おもちゃの潜水艦のように水の中に潜って光る泡を発生するおもちゃなど、生物発光生成系を封じ込め、発光反応に必要な最終的な成分を添加するための空間を規定する一般的に半透明な領域、を持つことができるあらゆるおもちゃの光が含まれる。また、液体を飛び出させたり噴出したりするおもちゃも本発明で意図されている。例えば、酸素がない環境にルシフェラーゼと生物発光する基質を含むおもちゃまたは遊びの発射物が意図される。こうした発射物は硬い表面に衝突すると壊れ、生物発光を活性化する溶解酸素を含む中味が空気中の湿気にさらされ、反応する。
身体の透明または半透明な部分に生物発光生成系の１つまたは２つの成分を含む人形や模型も本発明で意図されている。生物発光生成系の残りの成分が添加されるとその身体の部分や領域が明るく照らされる。例えば、半透明な人形は、水を含まない環境にルシフェラーゼと基質を含む、消化器系を有することができる。例えば、この人形の口から水を加えると、水が「摂取」されると消化器系が発光し、または明るく光る。
玩具に生物発光生成系を使用する別の例として、明るく、光るフラフープやヨーヨー、アルギン酸ナトリウムとグリセリンをベースにした粘着遊具材料［米国特許第５，３１０，４２１号］、ＦＬＯＡＭ▲Ｒ▼、ＧＡＫ▲Ｒ▼及びＳＭＵＤ▲Ｒ▼といった名称でＭＡＴＴＥＬ▲Ｒ▼から市販されているもの、及び米国特許第２，５４１，８５１号、第３，３８４，４９８号、第３，５６５，８１５号、第３，６３４，２８０号、第３，６６１，７９０号、第３，８０４，６５４号、第３，８７３，４８５号、第４，０７６，５４７号、第４，１７２，０５４号、第４，２２９，７９０号、第４，６２４，９７６号、第４，７３５，６６０号などに記載されているような成形可能な遊具材料などが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらはすべて、その全体が本発明の中に取り込まれる。粘着遊具材料および成形可能な遊具材料に関しては、製造過程で生物発生成光成分をリポソームまたは素材に結合する形で遊具材料に取り込むことができる。
粘着遊具材料は植物性ゴム［例えば米国特許第４，０６７，３１３号を参照］またはおしめに使用されているポリアクリレート［例えば米国特許第５，５５２，０１２号、第４，６５７，５３７号、第４，７４７，９６０号、第４，２９５，９８７号、及び米国特許第５、５３２、３５０号も参照］およびその他のそうした製品から製造することができる。容易に入手できるこれらの材料をほう砂またはグリセリンと混合して所望の稠度の粘着物が製造される。１つの実施態様では、粘着遊具材料は、自己架橋アルギン酸、グリセリン溶液［９０％より高い濃度］、水および保存料から製造される。別の実施態様では粘着遊具材料は、インデイアン・グアル（Ｉｎｄｉａｎ  ｇｕａｒ  ｔｒｅｅ）の種子の内乳に目的のものができるようにほう砂の量を加減して混合し、調製される。さらに代替の実施態様では粘着遊具材料はポリビニルアルコールとテトラホウ酸塩から作られる。おしめの吸水材として使用されているようなポリアクリレートも粘着材料として用いることができる。いずれの場合でも、粘着材料に本発明に記載されている生物発光生成系と組み合わされる。
さらに別の実施態様では、更に以下で論じ、実施例にも記載されているように、粘着遊具材料は、例えば図２７に図解してあるように、圧縮可能な分注装置内に包装される。このような装置では、生物発光生成試薬の１つを除くすべてが分注装置内の区画に備えることができる。装置内の第２の区画には、粘着遊具材料の組成が完全に揃うために必要な全成分より少ない成分を含んでもよく、装置の本体には残りの生物発光生成試薬及び／又は残りの粘着遊具材料の成分を含んでもよい。
別の方法として、圧縮可能な分注装置の内部に３つの区画を設けてもよく、そして第３の区画には残りの生物発光生成試薬のどちらか１つまたは両方、もしくは残りの粘着遊具材料成分が含まれる。その場合、装置の本体には、その中へ３つの区画の内容物または生物発光生成試薬または第３の区画に含まれない粘着遊具材料成分を混合すべき水性組成物が含まれることになる。
さらに別の実施態様では、生物発光生成試薬を含まずに粘着材料が提供され、生物発光生成試薬は、時間の経過に沿って放出する担体やその他の担体に入れられた別の組成物として提供され、使用前に粘着材料中に混合される。
本発明で提供される別の粘着材料は、２−４％テトラホウ酸ナトリウム２−３ｍｌおよび１００μｇｓのエクオリンまたは他の適当なルシフェラーゼを加えた１０ｍｌと混合した２−８％ポリビニルアルコールから調製される。エクオリンとともに使用する場合は、少量の水［水道水またはカルシウムを含む水性媒質］を加えると明るく光る粘着材料が得られる。前述のように、粘着遊具材料含み、輸送するように設計した装置の実施態様が図２７に示してある。装置は例えば歯磨きチューブのような圧縮可能な装置で、その内部に１つ、２つまたは３つ、好ましくは２つの区画を持っている。区画は、圧縮可能な装置を絞ると区画の内容物が装置の本体に放出され、混合するように、少なくとも一部が例えばプラスチックのような容易に破ることができる材料で形成されている。
圧縮可能な装置の１つの区画には粘着材料とルシフェラーゼを含むことができ、もう１つの区画には残りの生物発光生成成分または粘着物の残りの成分を含むことができる。あるいは１つの区画はテトラホウ酸とルシフェラーゼを含み、もう１つの区画はポリビニルアルコールを含む。３つの区画からなるシステムでは、１つの区画に無酸素の状態で包装されたルシフェリンとルシフェラーゼを入れることができる。第２の区画にはポリビニルアルコールを入れることができ、第３の区画にはテトラホウ酸ナトリウムを入れる。そうすると、装置の本体には残りの粘着材料の成分およびカルシウムイオンのような残りの生物発光生成試薬が入れられることになる。酸素が生物発光に必要な最終的な試薬である場合には、酸素は装置本体に収容される水性の粘着材料の組成物中に存在させてもよいし、粘着材料が放出される時に大気中から供給してもよい。成分を分ける他の方法も本発明において意図されている。
成形が可能な遊具の別の実施態様には、ジメチルシリコンをホウ素の化合物で処理し、好ましくは、米国特許第２，５４１，８５１号に記載されているように熱または触媒、または熱と触媒で処理して製造されるもの；米国特許第３，３８４，４９８号に記載されているように、マノガラクタンゴム、ホウ酸アルカリ金属塩、ホウ酸、高分子量多糖類、抗バクテリア剤、抗真菌剤、フィルター、着色剤および香料から作られるもの；米国特許第３、８０４、６５４号に記載されているように、粘土やタルクといった充填材と一緒に石油留分炭化水素油、ワックス様のパラフィン系炭化水素油、液体シリコン化合物、収れん剤、湿潤剤、ニカワおよび水から製造されるもの；米国特許第４，６２４，９７６号に記載されているように、合成樹脂および木材粉と油性配合物とから製造され、合成樹脂がゴムで補強したスチレン樹脂、使用される油が芳香族系炭化水素油であるもの；または、米国特許第４、７３５、６６０号に記載されているように、架橋が可能なガーゴムをゲル化剤とする水性ゲルを組み合わせたウッド・フラワー（ｗｏｏｄ  ｆｌｏｗｅｒ）から製造されるものがある。
米国特許第５，３１０，４２１号に記載されているグリセリンをベースにした粘着遊技材料は、２．５−４．０重量（％）、３．３３％の自己架橋性アルギン酸ナトリウム；グリセリンが９０％を超えるグリセリンおよび水１．０−３，５重量％；保存料；塩化ナトリウム４．０重量％；および水を含み、０．０４−０．０８重量％の着色料を含めることができる。本発明で改変してあるように、それは、例えばルシフェラーゼ、レニラ、Ｖａｒｇｕｌａあるいはホタルのルシフェラーゼ、またはルシフェリンとルシフェラーゼ、またはエクオリン発光タンパク質とＥＤＴＡといった、生物発光生成系の１つの成分を除く全成分までを含む。粘着材料の第２の成分は残りの成分を含む。
好ましい粘着材料は、２．５−４．０重量％、好ましくは３．３３重量％の自己架橋性アルギニン酸ナトリウム；グリセリンが９０％を超える１．０−３．５重量％の水とグリセリンの溶液；１種類または複数種類の保存料；２．０−７．０％、好ましくは約４重量％の塩化ナトリウム；および水を含み、０．０４−０．０８％の１種類または複数種類の着色料を含めることができる。材料は、例えばルシフェラーゼあるいはレニラ、Ｖａｒｇｕｌａまたはホタルのシフェラーゼ、またはルシフェリンとルシフェラーゼ、またはエクオリン発光タンパク質とＥＤＴＡといった、生物発光生成系の１つの成分を除く全成分までを含む。
粘着遊具材料は、それを生物発光生成系の残りの成分を含む粘着材料の第２の混合物と接触させることにより、あるいは、反応を完結させるために酸素分子またはカルシウムイオンが必要な場合には、それを空気もしくは水性組成物と接触させることによって発光させることができる。第２の混合物は別の着色料を含むことができ、それにより、混合によって材料が発光するばかりでなく、色が変化することになる。
ルシフェラーゼのような生物発光生成系の成分の濃度は、発光が目で認められるに十分な濃度である。ルシフェラーゼの濃度は経験的に決定できるが、一般には材料１リットル当たり約０．１ないし１ｍｇであろう。ルシフェリンの量は一般に過剰である。ルシフェラーゼとルシフェリンおよびその他の成分は、時限的放出担体として提供することもできるし、別々に供給して後で加えるようすることもできる。
この粘着材料は生物発光生成試薬の少なくとも１つを除いて全部を含む第１の粘着組成物と残りの成分を含む第２の粘着組成物を含むキットまたは製造物品として包装することができる。キットには２つの組成物を混合して発光する組成物を作るための説明書が添付される。さらに、キットには、生物発光生成試薬の追加組成物、担体または乾燥粉末を添付することができ、材料が再使用できるよう、使用前に加えることができる。
さらに別の実施態様では、以下に論じ、実施例にも記載されているように、粘着遊具材料は、例えば図２７に図解してあるように、圧縮可能な分注装置内に包装される。このような装置では、生物発光生成試薬の１つを除き、最も多い場合ですべてを分注装置内の区画に備えることができる。装置内の第２の区画には、粘着遊具材料の組成が完全に揃うために必要な全成分より少ない成分を含んでもよく、装置の本体には残りの生物発光生成試薬及び／又は残りの粘着遊具材料の成分を含んでもよい。
別の方法として、圧縮可能な分注装置の内部に例えば３つの区画を設けてもよい。そして第３の区画には残りの生物発光生成試薬の１つまたは全部、もしくは残りの粘着遊具材料成分が含まれる。その場合、装置の本体は、その中へ３つの区画の内容物または生物発光生成試薬または第３の区画に含まれない粘着遊具材料成分を混合すべき組成物、典型的には水溶液を含むことになる。
さらに別の実施態様では、生物発光生成試薬を含まずに粘着材料が提供され、生物発光生成試薬は、時限的に放出する担体やその他の担体に入れられた別の組成物として提供され、使用前に粘着材料中に混合される。
本発明で提供される別の粘着材料は、２−４％テトラホウ酸ナトリウム２−３ｍｌおよび１００μｇｓのエクオリンまたは他の適当なルシフェラーゼを加えた１０ｍｌと混合した２−８％ポリビニルアルコールから調製される。エクオリンと使用する場合は、少量の水［水道水またはカルシウムを含む組成物］を加えると明るく光る粘着材料が得られる。前述のように、粘着遊具材料を含み、輸送するように設計された装置の実施態様が図２７に示してある。装置は例えば歯磨きチューブのような圧縮可能な装置で、その内部に１つ、２つまたは３つ、好ましくは２つの区画を持っている。区画は、圧縮可能な装置を絞ると区画の内容物が装置の本体に放出され、その結果、混合するよう、少なくとも一部が、例えばプラスチックのような容易に破ることができる材料で形成されている。
圧縮可能な装置の１つの区画には粘着材料とルシフェラーゼを含むことができ、もう１つの区画には残りの生物発光生成成分または粘着物の残りの成分を入れることができる。３つの区画からなるシステムでは、１つの区画に無酸素の状態で包装されたルシフェリンとルシフェラーゼを入れることができる。第２の区画にはポリビニルアルコールを収納することができ、第３の区画にはテトラホウ酸ナトリウムを入れる。そうすると、装置の本体には残りの粘着材の成分およびカルシウムイオンのような残りの生物発光生成試薬が入れられることになる。酸素が生物発光生成に必要な最終的な試薬である場合には、酸素は装置本体に存在する水性の粘着材料の成分中に存在させてもよいし、粘着材料が放出される時に大気中から供給してもよい。成分を分ける他の方法も本発明において意図されている。
生物発光の実現の余地がある他の玩具、ゲーム、新規用品、衣類、装飾品、食品、飲料、噴水式水飲み器、水分注器、石けん、クリーム、化粧品およびスポーツ用品は、ここで開示した組み合わせのさらに別の実施態様である。かくして、生物発光が可能なように改変することができる製造物品または物質のすべてが、本発明において意図される。
本発明で提供される生物発光生成系と共に使用する余地がある製造物品は良く知られている［例えば、おもちゃの水鉄砲、または飲料またはクリームおよびローション用の容器として有用な装置を記載している米国特許第５，４１５，１５１号、第５，０１８，４４９号、第３，５３９，７９４号、第５，１７１，０８１号、第４，６８７，６６３号、第５，０３８，９６３号、第４，７６５，５１０号、第４，２８２，６７８号、第５，３６６，１０８号、第５，３９８，８２７号、第５，３９７，０１４号、第５，２１９，０９６号、第５，３０５，９１９号、第５，１８４，７５５号、第５，０２９，７３２号、第４，２１４，６７４号、第４，７５０，６４１号、第４，６７６，４０６号を参照］。本発明における実施態様で使用の余地があるためには、それぞれが例えば、混合室を付け加えるといった改変が必要であろう。
本発明の開示に照らして、このような改変は明らかであろう。特許のいくつかには別のおもちゃの仕掛けや訓練模擬兵器装置、人形、飲料および歯磨き容器［すなわち、練り歯磨き用チューブ］が記載されている。最も簡単な改変では、おもちゃの鉄砲や水を噴出する玩具の水を入れる室に生物発光生成系を含む粉末担体またはカプセル担体を加えてもよい。粉末が溶解し、あるいは担体が内容物を放出するにつれて、典型的に、ルシフェリンおよびルシフェラーゼが鉄砲の中の水との接触によって、生物発光の反応を起こす。
これまでに述べたことから明らかなように、おもちゃの鉄砲はよく知られた用品であり、それを作るための材料と仕様もよく知られている［前にあげたリストおよび米国特許第５，０２９，７３２号および第５、４１５、１５１号を参照］。単室式の水鉄砲では、本発明の生物発光生成系と組み合わせる場合、成分を鉄砲の室で混合して使うことができる。もちろん、選択する系は発光が維持されるものでなければならない。別の方法として、エクオリン発光タンパク質またはレニラ・ルシフェラーゼおよびルシフェリンといった生物発光成分をカプセル化したペレットを水鉄砲の水を入れる室に添加してもよい。エクオリン発光タンパク質およびレニラ・ルシフェリンの場合には、添加した水道水で十分である。レニラ系の場合、ペレットにはルシフェリンとルシフェラーゼの両方を含んでいてもよいし、どちらか一方でもよい。残りの成分は鉄砲の室に加えられることになる。ペレットが使用される場合、内容物がゆっくり放出されるので、発光は持続して起こる。
どんな噴水または水を噴出する装置に対しても、同じ様な仕掛けおよびデザインが使用される。このような装置［例えば米国特許第５，３６０，１４２号を参照］であれば、改変を加えて、生物発光生成系を導入して光る流れを作り出すことができる。
これらの装置ではすべて、水としては水道水または適当な緩衝液、特にリン酸塩で緩衝させた塩水を使用することができる。用品はルシフェリンとルシフェラーゼを包装したものに水を含め、キットとして包装することができる。
ａ．ペレットまたは液体を発射する単室式、２室式および多室式のおもちゃの鉄砲やその他のおもちゃの兵器
本発明に例示する以外にも、ペレットまたは液体を発射する多数のおもちゃの鉄砲やその他のおもちゃの兵器が、本発明の生物発光生成系と組み合わせて使用するのに適している。おもちゃの兵器は、本発明に記載してあるように、ルシフェリン及び／又はルシフェラーゼを微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）の形で含む組成物、もしくは凍結乾燥したルシフェリン／ルシフェリンまたはそれ以外の混合物を装填してもよい。ジェット流または水の霧を発射する適当なおもちゃの兵器または装置は次にあげる特許の見本例に記載されている：米国特許第５，４６２，４６９号［泡を打ち出すおもちゃの鉄砲］；第５，４４８，９８４号［ボールおよび水を発射するおもちゃの鉄砲で、光および温度に感受性を有するペレットを発射するように改変することができるもので、光に曝露するとルシフェリン／ルシフェラーゼを放出し、適切な条件で保管または適切な包装を施さなければならない］；第５，４３９，１３９号；第５，４２７，３２０号；第５，４１９，４５８号；第５，３８１，９２８号；第５，３７７，６５６号；第５，３７３，９７５号；第５，３７３，８３３号；第５，３７３，８３２号［加圧した浮体の空気圧を解放し、それによって発射体を発射するおもちゃの鉄砲で、ルシフェリン／ルシフェラーゼをカプセル化したものを発射体として発射するように変更できるおもちゃの鉄砲が記載されている］第５，３７０，２７８号［ヘッドバンドに設けられた口から放出される液体について記載している］；第５，３７０，２７８号［ポンプ式またはその他の水を推進する機構と組み合わせて使用する供給および送り出しアセンブリについて記載している］；第５，３６６，１０８号；第５，３６０，１４２号［ポンプ式水鉄砲あるいはその他の推進装置と組み合わせて使用する供給送達アセンブリについて記載している］：第５，３４６，４１８号；第５，３４３，８５０号［本発明で提供されるペレットと組み合わせて使用するための発射体発射装置について記載している］：第５，３４３，８４９号；第５，３３９，９８７号［少なくとも１個の加圧空気／水貯留タンク、加圧機構、水を発射するための放出路および放出機構を持つ水鉄砲について記載している］；第５，３２６，３０３号；第５，３２２，１９１号；第５，３０５，９１９号；第５，３０３，８４７号［指先を保護するために使用者の手先に取り付けられる装具で、水を入れる容器のハウジング、水ポンプと電動モータ、および使用者の身体に固定するバッテリーパックを含む装具について記載している］：第５，２９２，０３２号；第５，２８４，２７４号［水を含み、本発明において生物発光生成系の成分を含むことになるカプセルを含み、オリフィスおよびオリフィスから水を駆動するためのプランジャーとスプリングによる装填機構を有するシステムの動作について記載されている。アクション玩具は、銃身を通って発射するために尾筒にあらかじめ装填した複数個のカプセルの弾丸を収容するショットガン、発射装置の前面にカプセルを装着し、そのカプセルから目標めがけて水を放出するミサイル発射装置、またはスプリングによって弓をつがえ、そして弓を解放することによって水の流れを作り出すおおゆみとして構成することができる］；第５，２８４，２７２号［液体を噴射するためのビンとフタの組み合わせについて記載している］；第５，２５６，０９９号；第５，２４４，１５３号；第５，２４１，９４４号；第５，２３８，１４９号；第５，２３４，１２９号；第５，２２４，６２５号；第５，２１３，３３５号；第４，８５４，４８０号；第５，２１３，０８９号；第５，１８４，７５５号；第５，１７４，４７７号；第５，１５０，８１９号；第５，１４１，４６７号；第５，１４１，４６２号；第５，０８８，９５０号；第５，０７１，３８７号；［水を噴射する立像型の玩具を記載している］：第５，０６４，０９５号［水の大砲装置について記載している］；第５，０２９，７３２号；第５，００４，４４４号；第４，８９２，２２８号；第４，８６７，２０８号［加圧下で貯蔵し分注する装置について記載している］；さらに、第４，８０８，１４３号；第４，７８４，２９３号；第４，７６８，６８１号；第４，７３３，７９９号；第４，６１５，４８８号など多数の特許。米国特許第５，４１５，１５１号は、本特許で提供される光に感応し、光に曝露されると分解するようなペレットを打ち出すのに適合しうる発射体を発射するおもちゃの鉄砲を記載している。
ここで図３５を参照すると、図には新規な水鉄砲の別な実施態様が示してあり、一般に３５００で示される。水鉄砲３５００は、銃本体３５０２、カートリッジ３５０６を装着する装着部３５０４、およびノズル３５１０を持つ銃身３５０８からなる。銃本体は、ハンドル３５２０を形成し、片手をハンドル３５２０に、そして他方の手を銃身３５０８に置いて容易に銃３５００を保持しうるような形に作られている。カートリッジはめ込み部３５０４は、銃本体の上部から突き出し、後部表面２６１２には内部に向かって一対のネジが切られており（図３７および３８に示す）、それによって第１の液体容器３５１４と第２の液体容器３５１６を取付けることができるようになっている。前に述べた水鉄砲およびその他の実施態様に関連して本発明で論じてあるように、容器３５１４および３５１６には必要な生物発光生成試薬が入れられ、生物発光生成試薬が混合されるまでは隔離して保持される。あとで図３６に関連して論じるが、生物発光生成試薬は、生物発光液が銃から発射される直前に混合されのが好ましい。容器３５１４および３５１６を銃の正しい位置に保持するため、容器固定金具３５１８が形成されていて、これらの２つの容器を収容し、正しい位置に保持する。この支持体は、各容器に液体を満たすことを考えるならば、とりわけ重要であって、もし支えられなければカートリッジの容器後部表面に過大な力がかかることになる。
銃本体３５０２にはのぞき窓３５２４を設けてもよく、それによって、生物発光液体を銃から発射する前に見ることができる。より詳細には、銃身３５０８が矢印３５２２方向に移動するのに合わせて、生物発光生成試薬が窓３５２４を通過して銃身内へ吸引される。従って水鉄砲の使用者は、試薬が容器３５１４および３５１６から吸引されるにつれ、生物発光の反応が起こる様子を観察することができる。
ここで図３６を参照すると、この図にはカートリッジ３５０６が取り外され銃身３５０８が銃の本体３５０２から突き出た様子が示してある。カートリッジ本体３５２６をカートリッジ装着部３５０４の開口部３５２８中へ滑らせるようにして入れると、カートリッジ内の生物発光生成試薬を容器３５１４および３５１６に装填する。生物発光生成試薬が容器内に入れば、銃は使用可能状態になる。使用する時には、銃身３５０８を銃本体３５０２から３５２２の方向に引き出し、容器３５１４および３５１６から銃身内部の室に液体混合物を装填する。銃身を引き出して装填されると、銃身は３５３４の方向へ銃本体３５０２の方に向かって引かれ、液体が流れ３５３６または液滴３５３８となってノズル３５１０から噴射される。噴霧のタイプは銃身をいかに速く銃本体に押し込むかにかかっている。
ここで図３７を参照すると、この図には銃３５００の断面が示してある。カートリッジ３５０６は、カートリッジ装着部３５０４の開口３６２８から取り外した状態で示してある。カートリッジは、銃に生物発光生成に必要な生物発光生成試薬を再充填するために、開口部に挿入することができる点に留意すべきである。銃３５００に再充填するには、使用済みのカートリッジ３５０６を取り外し、生物発光生成試薬が入った新しいカートリッジを方向３５４２に開口部３５２８に押し込んで化学物質を容器３５１４および３５１６内へ充填する。
ここで図３８を参照すると、この図では容器３５１４および３５１６、カートリッジ３５０６、およびカートリッジ装着部３５０４が詳細に示してある。具体的には、容器３５１４および３５１６には液体３５９０および３５９２が−杯に入っている状態が示されている。最初、容器３５１４および３５１６には液体、典型的には水で満たされる。一旦容器に水が満たされると、カートリッジ装着部３５０４の後部表面３５１２に取り付けられる。取り付けは、容器３５１４および３５１６の首の部分３５５０をカートリッジはめ込み部のネジ部分３５５２にねじ込むことによって行われる。容器の漏れを防ぐには、各ネジの部分３５５２にシールリング（図示せず）を使用することもできる。そのシールリングは各容器の首の部分３５５０またはネジ部分３５５２と一体化させるか、単に両者の間にはさんでもよい。
カートリッジ３５０６のカートリッジ本体３５２６には第１のカートリッジ室３５６０と第２のカートリッジ室３５６２が形成される。第１のカートリッジ室３５６０には生物発光生成試薬またはその混合物３５７６を含む第１の組成物が充填され、第２のカートリッジ室３５６２には第２の試薬またはその混合物３５７８が充填される。第１の組成物は、プランジャーシール３５７２およびエンドシール３５６４によって、第１のカートリッジ室３５６２の内部に保持される。プランジャーシール３５７２は、カートリッジのフタ３５２７から伸びる第１ピストン３５６８の先に取り付ける。同様に、組成物は、プランジャーシール３５７４およびエンドシール３５６６によって第２のカートリッジ室３５６２に保持される。また、プランジャーシール３５７４はカートリッジのフタ３５２７から伸びる第２ピストン３５７０によって取り付けられる。
カートリッジ３５０６はカートリッジ装着部３５０４の開口部３５２８の大きさに合わせて作られ、その中に保持される。このような保持は様々な方法で実施することができる。例えば、カートリッジの大きさをカートリッジ装着部の内部にぴったり合うように作り、摩擦によってカートリッジを保持させる。また別の方法として、カートリッジを開口部３５２８に挿入した時に、カートリッジ装着部の内側にエンボス加工した隆起部（図示せず）とカートリッジ本体３５２６の表面に形成された合わせ隆起部とがかみ合うことによって、カートリッジをカートリッジ装着部に保持させてもよい。カートリッジをカートリッジ装着部３５０４に取り外し可能な状態で保持させるのであれば、カートリッジを当業者に知られているクリップ、ラッチなどの留め金具で保持させてもよい。
カートリッジをカートリッジ装着部に挿入すると、シール３５６４および３５６６は、それぞれ、第１の注入管３５４４および第２の注入管３５４６の開口部に隣接する位置を取る。カートリッジをカートリッジ装着部３５０４に挿入したら、カートリッジのフタ３５２７をカートリッジ本体３５２６に向かって押し、第１ピストン３５６８および第２のピストン３５７０、およびプランジャーシール３５７２および３５７４を第１のカートリッジ室３５６０および第２のカートリッジ室３５６２に進める。こうすることによってカートリッジ内の圧力が高くなり、シール３５６４および３５６２が破れて、組成物３５７６および３５８が第１注入管３５４４および第２注入管３５４６に入る。注入管３５４４および３５４６は液体容器３５１４および３５１６と連絡している。このように、カートリッジのフタ３５２７がカートリッジ本体に向かって押し進むに従って、組成物３５７６および３５７８は第１注入管３５４４および第２注入管３５４６を通って容器３５１４および３５１６へ注入される。組成物が容器の中に入るに従って、既に容器の中に存在する液体、典型的には水とそれぞれ混合し、それによって、粉末またはペーストまたはその他の濃縮組成物は溶液または懸濁液になる。一般に、第１の室３５６０には、凍結乾燥品、ペーストまたはその他の濃縮された形のルシフェリンを入れるのが好ましく、第２の室３５６２には典型的に凍結乾燥品、ペーストまたはその他の濃縮された形のルシフェラーゼを入れるのが好ましい。これらの試薬は乾燥形態が好ましい。このように、第１組成物３５７６と第２組成物３５７８を容器内に注入すると、化学物質は液体と混合してルシフェリンを含む組成物とルシフェラーゼを含む組成物を形成する。好ましい実施態様では、ルシフェリンおよびルシフェラーゼは溶液状態であり、それゆえ、両者を合わせた時、混合はより完全に行われ、生物発光はそれだけ速やかに発現する。前に示したように、組成物３５７６および３５７８は粉末である。しかし、生物発光生成試薬を含む組成物は、当業者に知られた、そして本発明で論じた別のどのような形で提供されてもよい、ということを認識しなければならない。例えば、それは粉末、顆粒、ペースト、懸濁液または液状であってもよく、カートリッジ３５０６の構造は化学物質が注入管へ適切に分注されるように適合される。このような構造としては、各カートリッジ室３５６０および３５６２の端に、各注入管３５４４および３５４６への注入に対してシールをするテーパー状のノズルを設けることができる。
組成物または液体が容器３５１４および３５１６からカートリッジに逆流するのを防ぐため、各注入管３５４４及び３５４６の内部にバルブ３５４８を設けてもよい。バルブ３５４８は、物質が一方向にしか流れないように設計される。典型的なバルブとして、図示されているようなｄｕｃｋ−ｂｉｌｌ（カモノハシ）タイプのバルブがあげられるが、リード（ｒｅｅｄ）バルブなど、さまざまな種類のバルブも使用できるだろう。ただし、選択するバルブは、いかなるものでも容器からカートリッジへの逆流を防止できるものでなければならない。また、注入管に対してカートリッジ３９０６を確実にシールすることも可能であり、そうすればバルブの必要性はなくなる。すなわち、カートリッジ装着部内のカートリッジと注入管の間の漏れ防止のシールがあれば、容器からの液体の漏れの心配はなくなり、バルブ３５４８は必要がなくなる。
ここで図３８を再び参照すると、銃身３５０８は、銃本体３５０２から付き出し、混合室３５３２を持つシャフト３５３０を示している。液体は第１の容器の液体管３５５４および第２の容器の液体管３５５６を通って混合室３５３２に入る。各管は容器３５１４および３５１６から混合室３５３２までの液体の通路となる。より詳細には、第１容器の液体管３５５４は首の部分３５５０を通って容器３５１４に入る。液体管は、容器の中で自由に位置が取れるように、典型的には、軟質ビニルで作られる。このような材料を使うことによって、銃本体自体の方向とは関係なく、液体管は常に液体３５９０の内部に位置することになる。汚れや破片あるいは不溶成分が液体管に入るのを防止するため、フィルター３５５８が液体管３５５４の先端に取り付けられる。このようなフィルターは、粒子が液体管に入った場合にそれを阻止する多孔性テフロンかその他のフィルター材料で作られる。第２の容器の液体管３５５６も第１の容器の液体管と類似し、この管にもフィルター３５５８が備えられる。
組成物が混合室３５３２から容器３５１４および３５１６に逆流するのを防ぐため、１組の入り口バルブ３６８２および３５８４が備えられる。これらの入り口バルブは容器から混合室への流れは阻止しないが、もし逆流が認められればこれを阻止する。この実施態様において、フロート型のバルブが使用され、混合室が真空になって液体が混合室へ引き込まれる時には、入り口バルブは開いた状態にあり、混合室内に正圧が発生するとバルブ３５８２および３５８４は閉じる。このようにして混合室から容器への液体の逆流は防止される。このような逆流が発生すると、混合室でのみ行われる生物発光反応が容器内で開始することになり、とりわけ不都合である。
混合室３５３２は、液体管３５５４および３５５６と反対側の端に開口部を持ち、ノズル３５１０に続いている。ノズル３５１０には室の出口バルブが組み込まれていて、入り口バルブと反対の機能を果たす。より詳細には、銃身３５０８が銃身本体３５０２から突き出ている時は、出口バルブ３５８６は閉じており、混合室３５３２に真空を作り出す。真空が発生すると入り口バルブ３５５４および３５５６が開き、液体は容器から混合室３５３２内へ流れる。混合室が液体で一杯になると、銃身３５０８が銃の本体の方へ押し込まれ、それにより出口バルブ３５８６は開き、入り口バルブ３５５４および３５５６は閉じる。
混合室３５３２の内部に作られる圧力の量は、ノズル径、および銃身３５０８を銃本体３５０２に向かって押し進める力の関数である。具体的には、ノズル３５１０の開口部の径が小さくなるほど、混合室の圧力は高くなる。また、銃身に働いて銃身を銃本体３５０２に向かって押す力が強くなるほど、圧力は高くなる。混合室内部の圧力を高くすると、ノズル４５１０から噴射される液体ジェット流３５３６の速度は速くなり、それだけ液体ジェット流の距離も伸びる。また、混合室内の圧力を急激に短時間高くし、液体ジェット流３５３６を瞬発的に飛ばしたり液滴３５３８にしたりすることも可能である。
ここで図３９を参照すると、この図は、新規水鉄砲の別の実施態様を部分的に示してある。具体的には、図３９は別の実施態様の銃身部分の詳細図であり、一般に３６００で示される。銃身３６００は、グリップ部分３６０２を含み、銃身本体管３６０５に取り付けられている。銃身本体管３６０５の大きさは、銃本体３６０６から突き出した滑り管３６０４の上を滑るように作られている。より詳細には、図４０を参照すると、銃身３６００は、本体管３６０５の外表面上を銃本体から方向３６３２に向かって突き出した状態にある。液体管３６０８は、銃身３６００の長さを延ばし、容器（図示せず）から液体入り口管３６１８および液体入り口バルブ３６１６を通って混合室３６３０まで液体連絡路が通じる。
混合室への液体の流れは、室のバルブ３６１２と入り口のバルブ３６１６によって制御される。室のバルブ３６１２は、保持クリップ（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｃｌｉｐ）３６２６を液体管のフタ３６１０にあけられた中心穴に差し込んで液体管のフタ３６１０に取り付けられている。室バルブ３６１２は、頭部３６２０に室のシールリング３６２８を持ち、混合室３６３０の内壁をシールしている。室バルブ３６１２の保持クリップ３６２６は、液体管のフタ３６１０に合わさった位置から液体管のフタより離れた位置まで、室バルブの運動に備えている。シールリング３６２４は、液体のフタ３６１０に対して、テーパー状の欠き込み（シート）３６２２に当たり、液体が混合室３６３０から液体管３６０８へ流れ込むのを防いでいる。液体管３６１０から遠ざかった位置では、シールリング３６２４はテーパー状の欠き込み３６２２から離れた位置にあり、その結果、液体は方向３６３４に向かって混合室３６３０へ流れ込む。このような液体の流れを容易にするため、室バルブには１つまたは複数の孔（図示せず）が形成されており、頭部３６２０を通って延びている。ノズルを方向３６３２に動かして液体管３６０８から液体を吸引する時に、混合室３６３０の内部に十分な真空が存在しさえすれば、これらの貫通孔の大きさはどんな大きさでもかまわない。
入り口バルブは、第１容器の液体管３６１４および第２容器の液体管３６１６を通して容器３５５４および３５５６から第１の組成物と第２の組成物を受け入れる。図３９から図４１までの図には、液体管３６１８は１本しか描かれていないが、混合過程が必要になるまで生物発光生成試薬を隔離しておくには２本の液体管が必要である。入り口バルブ３６１６は、一方の容器からの液体入り口管３６１８と接続されている。第２の液体入り口管（図示せず）は入り口バルブ３６１６に取り付けることもできるし、第２の入り口バルブを使用してもよい。いずれにしても、入り口バルブ３６１６によって内容物が液体管３６０８から液体入り口管３６１８へ逆流しないようにする。これによって既に混合された２種類の生物発光物質が液体入り口管の１つに逆流するのが防止される。もしこのような流れが防止されなかった場合、生体発光反応が液体入り口管３６１８の内部で起こり、さらに容器３５１４および３５１６の液体が汚染される可能性さえある。
銃身の動作は、おそらく図４０と図４１を比べれば理解しやすくなるだろう。そこで、最初に図４０を参照すると、銃身３６００は銃本体３６０６から方向３６３２に延びている。銃身のこのような動きによって混合室３６３０の内部に真空が作られ、室バルブ３６１２が開く。より詳細には、混合室３６３０内に形成された真空によって、室バルブ３６１２が液体管のフタから引き離され、その結果、シールリング３６２４はテーパー状になった欠き込み３６２２から浮き上がり、液体は方向３６３４に向かって混合室内へ流れ込む。グリップ部分３６０２を本体管３６０５の先端まで一杯に引き出すと、混合室は、容器３５１４および３５１６からの、適当な百分率の液体からなる液体で満たされる。混合室内に入れば液体は混合し、生物発光反応が開始する。
混合室３６３０が生物発光液体で十分満たされたら、グリップ部分３６０２を３６３６方向に銃本体３６０６に向かって押し進める。グリップ部分が銃本体に向かって移動するにつれて、混合室内の圧力が増し、室バルブ３６１２が液体管のフタ３６１０に向かって押される。室バルブ３６１２が液体のフタ３６１０に当たると、シールリング３６２４がテーパー状の欠き込み３６２２に接触し、液体が混合室３６３０から液体管３６０８に逆流するのを防止する。混合室３６３０の圧力が高まると液体は方向３６３８へ向かってノズル３６３０から流出し、液体の噴霧流れ３６４０を形成する。グリップ部分３６０２を銃本体３６０６に向かって押す力を強くするほど、混合室内部の圧力が高くなり、液体噴霧流れ３６４０の速度が速くなることに留意しなければならない。
グリップ部分３６０２を銃身３６０６から伸ばすとき、混合室３６３０内を真空にしやすくするために、ノズル３６１４内にノズルバルブ（図示していない）を取り付けてもよい。そのようなノズルバルブは、混合室内に作られた真空状態が、ノズルを通って流入する空気と平衡してしまうことを防げるであろう。典型的なノズルバルブとしてダックビルバルブまたはリードバルブなどが使えるだろう。ノズルバルブがバレル３６００の本来の操作には必要ではなく、単に混合室３６３０内の真空度を上げるために取り付けられるにすぎないことを、理解すべきである。あるいは、ノズル３６１４をその先端に狭い開口部を備えるような形にしてもよく、あるいは、断面積を小さくして混合室３６３０内への空気の逆流を最小限にとどめるように設計してもよい。
一旦液体が容器３５１４及び３５１６から排出されてしまえば、それぞれの容器を取りはずして、再び液体を、典型的な場合は水を、満たす。こうしてから水を満たした容器を装着部３５０４に再び取り付ける。これらの容器を取り付けてから、空になったカートリッジ３５０６をカートリッジ装着部３５０４からはずす。次に、生物発光生成試薬３５７６及び３５７８の全量を入れた新たなカートリッジを、カートリッジ装着部３５０４に挿入し、これらの生物発光生成試薬を、図３８に関連して上述したように、カートリッジキャップ３５２７をカートリッジ装着部の方向に押し進めることによって、容器内に注入する。容器内へ試薬を注入するのに続いて、銃３５００が再装填されたことになり、これでいつでも使用できる。再装填に要する段階は必ずしも記載した順序に行う必要はなく、銃３５００を発射する準備のために混合室内で混合するまで第一と第二の化学物質が別々に保持されるかぎり、実質上どの順序で行ってもよいということを、理解すべきである。
図４２〜図４４を参照すると、カートリッジアセンブリーのもう一つ別の実施態様が示されており、一般的に４２００で示される。より詳細には、カートリッジアセンブリー４２００は、図３８のカートリッジ装着部３５０４と同様に銃身３５０４に取り付けられているか、またはその一体となった部分であるカートリッジ装着部４２０２を含んでいる（本図には示されていない）。カートリッジアセンブリー４２０２は、内面に一連のリブ４２０６を備えた形をしたカートリッジ本体４２０４を受け入れるような大きさであり、これらのリブは第一及び第二のシリンダー４２０８及び４２１０をカートリッジ本体４２０４内にきちんと納めるような大きさと形状をなしている。
第一及び第二のシリンダー４２０８及び４２１０は、ピストン４２１２及び４２１４を備えている。ピストン４２１２は、生物発光反応を完了させるのに必要な組成物４２２０を保持するよう設計された室４２１６を限定するよう作られている。ピストン４２１４も、組成物４２２２を保持するための室４２１８を限定するよう作られている。各ピストン４２１２及び４２１４はそれぞれシャフト４２２４及び４２２６の一端に取り付けられている。これらのシャフト４２２４及び４２２６は、その他端が、ロッキングノッチ４２２８と一体となっているプランジャー４２３２に取り付けられている。ロッキングノッチ４２２８は、カートリッジ本体４２０４と一体となっているロッキングポスト４２３０を受け入れるような大きさであり、カートリッジがカートリッジ装着部内に挿入されていないときプランジャーが圧迫されるのを効果的に防いでいる。
カートリッジ装着部４２０２には、容器４２３８及び４２４０（幽霊画法で示されている）を受け入れる大きさの、ネジ山を刻んだ一対の部分４２３４がある。図４４に示したように、これらの容器４２３８及び４２４０はカートリッジ装着部内にねじこまれる。これらの容器を納めてから、プランジャー４２３２を矢印４２４８の方向に押し進めると、第一及び第二ピストン４２１２及び４２１４がそれぞれのシリンダー４２０８及び４２１０から押出される。ピストンがカートリッジから押出されると、ピストンは容器４２３８及び４２４０の首の部分に入り、ここで組成物４２２０及び４２２２が室４２１６及び４２１８を出て容器内の液体と混合する。典型的には液体は水であり、生物発光生成試薬の組成物は水溶液となる。
水及び／又は溶液が容器４２３８及び４２４０からカートリッジ内へ逆流するのを防ぐために、各プランジャー４２３２にはプランジャーシール４２３６が備えられている。これらのプランジャーシール４２３６はシリンダー４２０８及び４２１０の内壁に対して液体を遮断するシールであり、上記容器からの液体の漏れを防ぐ。シール４２３６がピストン４２１２及び４２１４のすぐ隣にあるため、ピストンは容器内の液体に完全に浸っており、このため組成物４２２０及び４２２２の完全な放出と混合が保証されている。図４４に示したように、ピストン４２１４が実質上容器４２４０内でむき出しになるように、シール４２３６はシリンダー４２０８の端に置かれている。その結果、組成物４２２２は単純にこのピストンから容器内に落ち、その容器内で懸濁液となるか、好ましくは溶解して溶液となる。
ピストン４２１２及び４２１４は外側の円錐形ピストン４２４２を備え、これらの円錐形ピストンはカートリッジ本体４２０４から出るとき、及びカートリッジ装着部４２０４及び容器４２３８及び４２４０内に挿入中、上記ピストンの整列を助けるように設計されている。さらに、図に示したように、ピストン４２１２及び４２１４は内側の円錐形ピストン４２４４も備えており、この内側円錐形ピストンは、溶解しなかったか部分的に溶解した組成物４２２０及び４２２２をピストン自身内に蓄積するのを防ぐよう設計されている。さらに詳しく言えば、ピストンが容器４２３８及び４２４０内に押し進められると、内側円錐形部分がこれらの組成物を容器に送り出すのを助ける。
図４２については、化学物質４２２０及び４２２２は本書の別の箇所で論じたタイプのうちどれでもよいということを、理解すべきである。例えば、これらの組成物は、粉末、液体、顆粒、その他のどの形態でもよい。カートリッジアセンブリー４２００を液体状の組成物の導入に使用するために、もう一つピストンシールを備えてもよい（図示していない）。このようなもう一つのピストンシールは、つけるとすれば、組成物が送り出される容器内にピストンが押し進められるまで、組成物をシリンダー４２０８及び４２１０内に効果的にシールするように、ピストンの遠位末端につけることになろう。
カートリッジの製造工程を簡略化しようと、充填開口部４２４６はシリンダー４２０８の壁に備えられている。この充填開口部はシリンダー内のピストン４２１２の位置の上方にある。ピストン室４２１６を必要な組成物４２２０で満たすには、シリンダー４２０８及びピストン４２１２をカートリッジ本体４２０４内に納める前に、このピストンをシリンダー４２０８内に引張って、ピストン室が充填開口部４２４６のすぐ隣にくるようにする。ピストン室４２１６が正しい位置にきてから、適切な試薬をピストン室内に注入するだけでよく、ピストン４２１２はプランジャーシール４２３６が試薬をシリンダー内にシールするようにシリンダー内に押し進める。試薬は両シリンダー内に同様な方法で納められるということも、認識すべきである。
ｂ．泡を作る玩具
シャボン玉は、せっけんまたは他の界面活性剤を含む水溶液や他の水性組成物からふくらむ。実に様々な発泡製剤が入手でき、その中には発泡に特殊な効果を特徴とするものもある。大きな泡、「長続きのする」泡、きれぎれの泡、自己回復作用のある泡、多重の泡、消える泡、ひらひらした泡、はじける泡、高く上がる泡及び／又は遠くまでとぶ泡、沈む泡などを作るための溶液がある。一般に、これらの組成物内に空気その他のガスを吹込む場合には、表面張力の低い、陰イオン性、非イオン性、両性の多くの水溶液が、発泡に適している。
そのような組成物、好ましくはほぼ中性ｐＨを示す組成物は、本書に提示した生物発光生成系の成分と組み合わせることができる。とくに、ルシフェラーゼとルシフェリンの混合物、例えばＲｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）系や蛍系またはＣｙｐｒｉｄｉｎａ（ウミホタルの一種）系、好ましくは例えばリポソームその他の時限放出カプセルのような顆粒またはミクロスフェア状で、発泡混合物に添加することができる。使用時、この混合物に添加された空気が光のもとになり、あるいは顆粒の内容物が組成物内に放出されるとき光が生まれる。あるいは、生物発光系の一つまたは複数の成分を、例えばルシフェラーゼ及び必要な活性化物質を、発泡組成物に添加してもよく、残りの成分、例えばルシフェリンは、アトマイザーからの細かな噴霧や他の適当な噴霧手段や霧発生手段を用いて泡に直接塗布してもよい。
さらに、ＧＦＰ、ＢＦＰ、フィコビリプロテインのような蛍光性タンパク質を発泡組成物に添加し、つぎに外部からの光源を用いて照らしてもよい。例えば、蛍光性タンパク質を含有する泡を、蛍光性タンパク質が蛍光を発するような適切な波長の光で照らした部屋の中で作ってもよい。
また代替の方法として、蛍光性タンパク質を、生物発光生成系の成分すべてを含んだ発泡組成物に添加して泡の色を変化させるようにしてもよい。例えば、蛍光性タンパク質は、発泡組成物に直接添加するか、あるいは時限放出または緩慢溶解するミクロスフェアやリポソームとして添加して、例えばＧＦＰやフィコビリプロテインのような、発泡組成物中の蛍光性タンパク質が、泡の色を変化させるようにしてもよい。容器が開けられ使用されてから、組成物のなかに蛍光性タンパク質を放出させるのは、とくに有利である。たった一瓶の発泡溶液で複数の色の泡を作ることができる。例えば、空気にふれたり、泡をふくらませるのに使用する杖や棒でかき混ぜるとこわれやすい微小顆粒やリポソームはとくに興味深い。
好ましくは中程度のｐＨを示す（５〜８）そのようなせっけん組成物と、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含んだ生物発光生成試薬及び蛍光性タンパク質を含んだキットが本書に提示されている。これらのキットは、例えば、泡を膨らませたり泡を発生させる玩具とともに利用できる。これらのキットは、本書に提示したカートリッジのような、詰め替えまたは充填カートリッジも含めることができる。
泡を発生させる玩具として、膨らませるための杖で作る泡、自転車、空を飛ぶ玩具、人形、剣、おもちゃ楽器、泡のあごひげ、などがあり、その他の多数の玩具がよく知られている［例えば、米国特許番号：第ＲＥ３２，９７３号（発泡おもちゃ芝刈り機について記載）第４，５１１，４９７号（玩具用の非毒性非刺激性泡組成物について記載）、第２，５７９，７１４号；第５，４８０，３３４号；第５，０４１，０４２号；第５，４７８，２６７号；第５，４６２，４６９号；第５，４１９，７２８号；第５，３９３，２５６号；第５，３６６，４０２号；第５，３４８，５０７号；第５，３２２，４６４号；第５，３０４，０８５号；第５，２６９，７１５号；第５，２２４，８９３号；第５，１８３，４２８号；第５，１８１，８７５号；第５，１５６，５６４号；第５，１３５，４２２号；第５，０８０，６２３号；第５，０７８，６３６号；第４，９５７，４６４号；第４，９５５，８４０号；第４，９４３，２５５号；第４，９２３，４２６号；第４，８６７，７２４号；第４，８６１，３０３号；第４，８４０，５９７号；第４，８０８，１３８号；第４，８０４，３４６号；第４，７６４，１４１号；第４，７００，９６５号；第４，５５６，３９２号；第４，３３４，３８３号；第４，２９２，７５４号；第４，２４６，７１７号；その他多数］。
ｃ．ボード／カードゲーム
ボードゲーム、カードゲームその他の類似の娯楽用品を、本書に記載した生物発光生成系と組み合わせて使用してもよい。これらのボードやカードは、本書に記載したように紙や布で出来ていても、生物発光生成成分を共有結合または非共有結合で付着させることのできるプラスチックその他の重合体で出来ていてもよい。
ゲームボードやカードの特別な部分を、一つ以上ではあるが最多でも一つを残して他の全ての生物発光生成成分で覆うかそれを染み込ませる。発現させるための杖またはスポンジまたはこれと似たような仕掛けには、残りの生物発光生成成分を染み込ませるか、これで被覆してこの残りの成分を送り出す［展開試薬］。カードやゲームボードを、展開させるための杖やスポンジや送り出し仕掛けの内容物と、拭くなどして接触させると、光が生まれる。
この展開試薬は様々な形態で発現するための杖やスポンジに塗布することができる。例えば、展開試薬は溶液でも懸濁液でもよく、スポンジや杖をこの溶液中に浸したのち、気密包装して封印し、使用直前に開封するようにする。あるいは、発現試薬を凍結乾燥または乾燥し、粉末状態で杖やスポンジに塗布してもよい。使用直前に水を杖やスポンジに加えてから、ゲームボードやカードを拭く。
あるいはまた、ボードやカードが、吸着または吸収または凍結乾燥された生物発光生成試薬を含んでいてもよい。これらの物品を、例えばエクオリン系を用いる場合はカルシウム、蛍系を用いる場合はＡＴＰなどの適切な塩及び緩衝液を含んだ水と接触させる。
ゲームボードまたはカードに塗布される生物発光成分は、例えば言葉を綴るとか絵柄を描くように特殊な模様に塗布することができる。好ましくは、選んだ生物発光系は反復使用できるものである。例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ系は好ましい系の例である。ルシフェラーゼをピースに結合し、ルシフェリンをボードやカードと、ゲームをするたびに使用する新しい発現用の杖またはスポンジに塗布することができる。
さらに別の実施態様が考えられる。例えば、そのゲームが、プレーヤーが発現用の杖やスポンジを使って問題の正しい答えを見つけるような教育的なものであるような場合である。同様に、ゲームボードが、展開用の杖またはスポンジで、完成されたパズルを拭くと、「隠された」絵柄やメッセージが現れるようなパズルであってもよい。
ｄ．おもちゃの「タマゴ」その他のカプセル入り用品
周囲の空気に触れると光を発するような液体またはペーストを含んでいるタマゴ型（その他の所望のどのような形でもよい）の玩具は、本書で意図するもう一つの組み合わせ例である。このタマゴ組成物の成分は、活性化に酸素を必要とするＣｙｐｒｉｄｉｎａまたはＶａｒｇｕｌａ（ウミホタルの一種）ルシフェリン及びルシフェラーゼのようなルシフェリンとルシフェラーゼを含んでいる。上記液体またはペーストをこの「タマゴ」に導入し、タマゴを窒素、あるいは、酸素または空気以外のその他の適当なガスのもとで封入する。タマゴを割るかひびを入れて空気にふれると、タマゴ組成物が光を発する。この原理は、おもちゃの銃から発射されて衝撃で破裂するような球形のマクロカプセルのような他の用途にも、標的に印をつけるために塗料ボールを投げつけるのに現在使用されている塗料ボール銃と同様にして、使える。実際には、例えば水の中をアルゴンまたは窒素の気泡を通すことによって、水を脱酸素化する。つぎにこの脱酸素化された水を使って、分子酸素以外の生物発光成分を混合する。この混合は、生物発光成分の消耗を防ぐために、空気や酸素が排除された厳密な条件下、例えば窒素下のフード内で行なわれるべきである。
ある実施態様では、本物そっくりのタマゴ様の混合物を作るために、タマゴ容積３０ｍｌあたりほぼ１〜２ｍｇのルシフェリン／ルシフェラーゼ組成物を、例えばヒドロキシメチルセルロースのような適当な元のりと組み合わせ、本物のタマゴの堅さを作る。タマゴの「殻」は酸素（空気）を排除し使用直前に消費者が開けやすいような適当な材料で作られる。例えば、タマゴ混合物を張り子に包み、気密になるようにワックスをかけることができる。同様に、「殻」は気密ではあるが望みのときに容易に割れるようなプラスチックなどの重合体で作ってもよい。
ｅ．フットバッグ、お手玉、ボール
光を発するフットバッグ、お手玉、ボールも本書に提示される。Ｗｈａｍ−Ｏ社の登録商標であり、米国特許第４，１５１，９９４号に記載されているＨＡＣＫＹ  ＳＡＣＫのようなフットバッグは、一般に、豆その他の顆粒状材料などの小さな顆粒をつめた直径約３インチの外側の皮革製ケーシングで構成されている［米国特許第５，４２９，３５１号、第４，９６３，１１７号、第４，７１７，１５８号、第４，００２，８３９号も参照のこと］。このサックは、プレーヤーが手を使わずに、このサックを動かしたまま地上から離しておくように、互いに蹴り合うゲームで使われる。
本書で意図されるのは、プレーヤーが蹴りまわすとき光を発するようなフットバッグ及びボールである。これらのバッグはプラスチックのような不燃性の半透明な材料から制作される。上記のタマゴ混合物と同様に、フットバッグ内の顆粒は、酸素のない環境で作られ、サックが使われるまで空気／酸素が排除されるように包装される。例えば、これらの顆粒は分子酸素を排除した生物発光生成系成分のゼラチン化混合物から作られ、海洋エレクトロニクスや破裂可能なリポソーム顆粒によく使われるドライ窒素パッケージ法のような無酸素パッケージに包装される。
これらの顆粒を様々な厚さの弾性プラスチックで覆って、このプラスチック膜を通って酸素が時限的に進入するようにすることができる。プレーヤーがフットバッグを繰り返し蹴ると、顆粒にかかる物理的ストレスによって、その中に含まれている発光成分と反応する酸素が多くなり、光が強くなる。
本書で意図される代替の実施態様は、例えば、半透過膜で仕切られた二つの区画に含まれている組成物をゆっくりと透過させるような膜を使って、フットバッグ内で顆粒を仕切り分けることである。こうして一つの区画に一つ以上ではあるが最多でも一つを除くその他の全ての生物発光成分を満たし、もう一方の区画にはその残りの成分を満たす。フットバッグを蹴りまわすと、隔膜にかかる物理的ストレスがこの二つの区画の内容物をいやおうなく混合させ、そうすることによって閃光がまたたき、発光する時間と発光しない時間とが交互に繰り返される。例えば、一方の区画にカルシウム含有組成物をビーズに加え、他の区画にはコエレンテラジンを結合しているエクオリンを添加することができる。フットバッグを蹴ると閃光がまたたく。
フットバッグを包むものは、発光が見えるように、半透明、透明、またはそれらのなんらかの組み合わせでなければならない。つまり、「サック」は、透明なナイロン網、半透明または透明な柔軟なプラスチック、半透明または透明な布または同様な材料で作ることができる。
ｆ．小立像
光を発する小立像も本書で提供される。小立像は大きさも形状もどのようなものであってもよく、好ましくは液体を保持する少なくとも一つの室があるものである。小立像は適当な材料から作られる鋳造物、塑像、製造品である。小立像の一部または全体が、生物発光反応で生まれる光の波長に対して半透明であることが好ましい。小立像はデザインやテーマはなんでもよく、例えば娯楽やスポーツの有名人の特徴を表すもの、記憶すべき事件、スローガンやロゴ、登録商標や他の販売促進物品、動物、クリスマス飾りその他の無生物物体などである。例えば、小さめのものは、例えばレストランのテーブルの上などのうす暗がりに置かれることがあり、ルシフェラーゼのような生物発光系の一つ以上の成分を含んでいる。生物発光反応の残りの成分、即ちルシフェリン及び必要な活性化物質は、望みの時点で添加すると、小立像が光を発する。
もう一つの実施態様では、生物発光生成系の一つ以上の成分を、その小立像を制作する材料に取り込むか結合させる。生物発光反応の残りの成分は、小立像の表面に吹き付けるか塗布して、生物発光反応を開始させる。
３．光を発する織物及び紙の製品
本書に記載された生物発光系は織物及び紙と組み合わせた用途をも対象とする。生物発光系試薬の一つまたは二つを織物または紙に塗布し、発光を望むとき残りの成分を添加する。例えば、生物発光基質とともにルシフェラーゼを共有結合または非共有結合性の相互作用によって織物または紙に塗布してもよい。水その他の適切な活性化物質を材料に塗布すると、発光が起こる。織物への用途例として、傘の布部分、衣類、タオル、人工植物や花の布部分、布部分を持つ玩具、その他の織物材料から製造される物品などがある。
紙については、ルシフェラーゼは生物発光基質とともに紙に塗布する。このような紙は紙に生物発光活性化物質を添加すると光を発する。このように、生物発光活性化物質が水であれば、例えばエアロゾルとして水を紙に添加すると、紙に光が発せられる。生物発光系成分の一つまたは二つで紙に「書き」、これらの成分の上から残りの成分で「書いたり」スプレーすると、紙が光る。本書に公開した他の系の場合と同様に、操作の重大な側面は、発光を望むまで、少なくとも一つの生物発光生成系成分を他の成分から離しておくことである。紙はほとんどどのような形やタイプのものであってもよく、例えば、筆記用紙、包装紙、箱、ポスター用紙、本、紙製の装身具、紙タオル、ナプキン、その他の紙製品などである。
４．角氷も含めた食品及び飲料
生物発光系と組み合わせることができる飲料及び食品の例として、これに限定されるわけではないが、アルコール飲料、ソーダ及びジュース、アップルソースやマッシュポテトなどの食品が含まれる。さらに、生物発光生成系は、ケーキやアイスクリームのような食品やその他のおよそ食べられるものならほとんど何でも、それに使用するために選び適合させることができる。生物発光系を食品及び／又は飲料と組み合わせるうえで考慮すべき点は、この系を加工後に添加するのでないかぎり、まずこの系が食品や飲料の加工中安定であること、この系がその最終的に必要とされる成分と接触して生物発光を生じさせることができること、系の成分と、それを添加する食品とがいっしょになった時の味である。
生物発光食品も本書で意図される。本書に記載した生物発光系と組み合わせることができるそのような製品として、約０℃から３５℃で保存できるようなものがある。一般に、ルシフェラーゼまたは生物発光基質が食品に添加されると、その食品は約１００℃を超えて加熱することができない。したがって、消費する前に調理が必要な食品は、ルシフェラーゼまたは生物発光基質の添加前に調理するということも可能である。
本書に記載した生物発光生成系と組み合わせて使用することができる食品の例は、これらに限定されるわけではないが、アイシング及びその他のトッピングまたはソース、クツキー、ビスケット、同様な調理済み食品などがある。例えば、生物発光性アイシングは、脱水したアイシング混合物内にルシフェラーゼ及び生物発光基質を含めて作成してもよい。使用直前の水の添加によってこの混合物が光を発する。あるいは、生物発光活性化物質と、ルシフェラーゼまたは生物発光基質とを、調製したアイシング混合物に含め、欠けている生物発光系成分を使用直前にアイシング内に混ぜ入れてもよい。
さらにあるいは、フィコビリプロテインあるいは緑色または青色蛍光性タンパク質のような蛍光性タンパク質を含むように食品を製造し、外部光源を用いて発光させてもよい。例えば、蛍光性タンパク質を含有するアイシングを、蛍光性タンパク質が蛍光を発するに適した波長の光で照明した部屋の中で供してもよい。同様に、蛍光性タンパク質を、アイスクリーム混合物、アイスクリームトッピングソース、サラダドレッシング、ケーキ、プディング、類似の食品に含め、そのような食品を蛍光を開始させるに適した波長の外部光源にさらしてもよい。
ａ．飲料
飲料製品も、本書に記載した生物発光系と組み合わせて使用することが意図される。他の実施態様と同様に、少なくとも一つの生物発光系成分を、生物発光を望むときまで飲料から除いておく。例えば、一般的に上記に述べ下記に詳述するように、容器や浮体状の仕掛けが、ルシフェラーゼ及び生物発光基質を飲料と離して保持している。その容器を開けると、ルシフェラーゼ及び基質が飲料に添加されて、飲料が光を発する。
あるいは、すでに一つまたは二つの生物発光生成系成分を含んだ飲料を製造・包装し、残りの成分の添加で光を発するようにしてもよい。そのような飲料の一例は、生物発光ビール、ワイン、シャンパン、ソフトドリンクなどである。この実施態様では、ビールその他の飲料のアルコール分の製造に使用される酵母を遺伝学的に形質転換させて、例えばルシフェラーゼをコード化する遺伝子と、この酵母にルシフェラーゼを製造し分泌させる命令を出すのに必要な相補的遺伝子を含ませるようにする。Ｏ2または空気が生物発光活性化物質であるとすれば、光発生を望むとき、生物発光基質をビールに添加する。
本書で意図される生物発光飲料のもう一つの例は、三つの生物発光系成分のうち二つを含有するソフトドリンクである。生物発光を望むとき、残りの一つの生物発光生成系成分を添加する。生物発光系が例えばエクオリン系またはＲｅｎｉｌｌａ系であれば、ルシフェリンを結合したエクオリンルシフェラーゼまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとそのルシフェリンをソフトドリンクに含ませ、生物発光活性化物質であるＣａ2+［エクオリン系の場合］または溶解したＯ2をこの飲料に添加して光を発生させる。そのような飲料に適した容器は本書に提示され［実施例を参照のこと］、当業者に知られている［例えば、第５，３９８，８２７号参照］。
同様に、ソフトドリンク飲料は、例えば選択された生物発光生成系が生物発光反応を完了させるのに酸素を必要とする場合は、溶解した酸素以外のすべての生物発光系成分を含んだものを製造することができる。二酸化炭素の代わりに、この飲料はその中に溶解した別のガス（複数の場合もある）、例えば窒素、ヘリウム、亜酸化窒素、ヘリウム酸素（ｈｅｌｉｏｘ）を含んでいてもよい。このソフトドリンクは無酸素条件下で包装され、ソフトドリンク容器を開けてその内容物を空気に触れさせたとき、空気中の酸素が生物発光反応を活性化してソフトドリンクが光を発する。
上記実施態様のそれぞれにおいて、リポソームや孤立したエンドソームのような（これに限定されるわけではないが）、溶解が緩慢な、または時限放出性の微小粒子を、追加の生物発光成分を含有する飲料に含めることも意図される。微小粒子は、例えば一つまたは複数のルシフェラーゼ、フィコビリプロテイン、緑色または青色蛍光性タンパク質、ルシフェリン、あるいはこれらの任意の混合物や組み合わせを含んでいる。微小粒子が溶解したり、別の方法で内容物が放出されると、微小粒子の内容物が飲料その他の液体中に放出され、その結果、例えば、飲料が発する光の色が変化したり、生物発光の色が変化したり及び／又は飲料全体やその一部の発する光が強まる。適切な微小粒子を選ぶことによって、この反応の一つまたは複数の成分の放出が順次に起きたり同時に起きたりする。このように数種類の発光色が出るような飲料が本書で意図される。生物発光生成物質や蛍光性タンパク質を適当に選択することによって、複数の色の変化が可能である。
例えば、ＧＦＰまたはフィコビリプロテインを含む適切な時限放出式または緩慢溶解式の微小粒子を、Ｒｅｎｉｌｌａまたはエクオリン生物発光生成系を含む飲料に添加する。この蛍光性タンパク質が媒質中に溶解または放出されると、光を発している飲料の最初の青色が別の色に変わる。例えばＧＦＰによって緑色になる。ＧＦＰの放出後、飲料のなかに微小粒子が溶解または放出されるように特殊な設計がされた場合、吸収最大が緑色スペクトルにあるフィコビリプロテインを含む別の微小粒子を含めると、この飲料はもう一度色を変えて、例えば赤色になるであろう。飲料の色は順次変化し、望みの回数だけ繰り返すこともできる。可能な色の変化の回数は、飲料のタイプ、望みの色、それぞれの色の持続時間によって決まる。本書に記載した色の変化の対象となる飲料は何でもよく、例えば、ソフトドリンク類、アルコール飲料、ジュースなどである。
あるいはまた、色の変化を飲料のごく一部に起こるように設計してもよい。例えば、蛍光性タンパク質を、飲料より密度が高いか低いような組成物［例えば、飽和しょ糖溶液、または、密度の高い非毒性の適切な高粘稠溶液］と組み合わせて含んでいるような微小粒子である。これらの微小粒子の内容物の溶解または放出の結果、二相溶液が形成され、この溶液では、例えば、飲料の上層部が青い光を発しているが、放出された蛍光性タンパク質［例えば、ＧＦＰまたはフィコビリプロテイン］を含有するこの飲料の下層は、緑、赤、その他の色の光を発する。これらの蛍光性タンパク質の濃度、密度のより高いまたはより低い液体の選択、その中に使用すべき比率は、当業者によって経験的に決められる。
微小粒子またはマクロ粒子に依存して［例えば、直接添加による封入、時限放出粒子、熱またはｐＨ感受性微小粒子のどれを採用したかによって］、各層の色は順次変化させることもあり、任意の順序で効果的に色の変化が反復されることもある。
ｂ．氷
例えば凍結乾燥成分またはカプセル封入成分などの生物発光成分を含有する氷が本書で意図される。残りの成分を含有する液体に添加するか空気に暴露すると、この氷の内容物が氷が解けるとき放出されて光を発する。氷はどのような形状でもよい。氷の形態の例として、これらに限定されるわけではないが、球形や立方体のような幾何学的な形状；小立像、つらら、ポプシクルのようなプレキャスト鋳型から作成した氷の形状；スキー、そり、スノーモービルなどのリクリエーション活動用のスノーコーンやイミテーションスノーなどの削った氷；氷の彫刻などがあり、このような物体では氷が光を発するか、氷の内部に凍結された光を発する無生物物体と組み合わせてある。さらにリクリエーションのアイススケートやホッケーのための面として使用される氷も本書で意図される。
氷は一つまたは複数の生物発光生成成分を含んでいる。例えば氷の成分として、ＣｙｐｒｉｄｉｎａまたはＶａｒｇｕｌａのルシフェリン及びルシフェリンのような、ルシフェリン及び／又はルシフェラーゼを含んでいるが、これは活性化に酸素を必要とする。緑や青以外の光を発する別の品種から分離されたルシフェラーゼ、例えば赤色を発するＡｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓまたはＰａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、あるいは発せられた光の波長を変えるような別の成分、例えば緑色蛍光性タンパク質またはフィコビリプロテインは、ルシフェラーゼとともに用いられるが、これらも本書で意図される。
実際には、例えばアルゴンまたは窒素ガスを泡状に通すことによって水の脱酸素を行う。この脱酸素された水を用いて分子酸素以外の生物発光成分すべてを混合する。ごの混合は、生物発光成分の消耗を防ぐために、空気や酸素を排除するような厳密な条件下で、例えば窒素下のフード内で行うべきである。
不活性雰囲気で貯蔵し保存したトレー、容器、特殊な形状やデザインのプレキャスト型に水を入れ、液体窒素を用いて急速凍結する。こうして出来た氷を分子酸素のない不活性雰囲気（例えばアルゴンや窒素）で封入容器に包装する。空気や、溶解した酸素を含む液体に触れると、この氷は光を発する。
あるいは、生物発光生成系の一つまたは複数の成分を氷の表面に塗布して生物発光反応を開始または再発生させる。この方法は、アイススケートリンクのような光を発する氷表面を作成するのにとくに適している。この反応の成分をザンボニー氷清掃器械内に含まれた水に添加してもよい。この器械から出る水が、生物発光生成系の少なくとも一つの成分を含んでいる（または表面に最初にコーティングされている）既存の氷の上に、生物発光生成系の別の一つまたは複数の成分を含む組成物の薄いコーティングとして重ねられる。この二つの層が出会うと、生物発光生成系が出来上がるか回復されて、氷が光を発する。
さらに、追加の生物発光成分を含む微小粒子を急速凍結前に水に添加してもよい。例えば、フィコビリプロテインまたは緑ないし青の蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）を含有するかこれと結合させた微小粒子を製造することができる。この追加の成分は凍結後の氷の表面に添加してもよい。上記の飲料の場合と同様に、微小粒子が氷の中に溶けるか、氷が解けると、蛍光性タンパク質その他の成分が放出される。蛍光性タンパク質の存在が、生物発光系の成分を含んだ氷の表面または内部から発せられる光の波長を変え、そうすることによって氷または液体の色を、例えば青から緑や赤に変える。ＧＦＰの添加によって、発せられる緑の光の強度も約２〜５倍に増強される。このように、そのような氷を含んだ飲料は時間の経過とともに色を変えるだけでなく、さらに輝きを増すであろう。液体の光の強さは、溶解したとき追加の基質となるか生物発光反応を促進するような適切なルシフェリンや活性化物質を含んだ微小粒子の添加によっても、高めることができよう。
これらの成分はドライアイスと組み合わせてもよく、ドライアイスが昇華するとき、成分を放出し、空気中で凝縮している水分と接触する。こうして、例えば劇場での上演に使用するための、光を発する霧を作る。
５．宝石、衣類、その他の製品
生物発光生成系は、宝石、衣服、小立像、その他の用品と組み合わせて使うことができる。とくにこれらの用品はマトリックス材料から、またはマトリックス材料と他の材料との混合物から製造される。あるいは、マトリックス材料をコーティングするかそのような物品のなかに埋め込む。生物発光生成試薬、とくにルシフェラーゼをマトリックス材料に結合させることができる。光が必要な時、その物品を残りの成分を含んだ組成物と接触させることができる。
さらに、衣類、とくにＴシャツやスポーツ用品、紙製品のような物品は、一つは必要なものすべてではない試薬を含み、もう一つは残りの試薬を含んでいるような２種類の組成物をスプレーする。
他の実施態様では、その中に含まれた所望の成分が接触し反応して生物発光を起こさせるように、除去可能な分離手段で分離した二つの容器で物品を構成してもよい。
６．噴水
多数の噴水その他の水を噴射させる仕掛けやそのような仕掛けで使用する仕組みが、本書に例示したものに加えて、本書の生物発光生成系と組み合わせて使用するのに適している［例えば、米国特許第５，４８０，０９４号；第５，４７２，１４０号；第５，４３９，１７０号；第５，４０２，８３６号；第５，３８８，２８５号；第５，３８１，９５６号；第５，３３７，９５６号；第５，２８８，０１８号；第５，１６７，３６８号；第４，８５２，８０１号；第３，８９４，６８９号；第３，８８９，８８０号；第３，８３８，８１６号；第３，８２０，７１５号；第３，７７３，２５８号；第３，７４９，３１１号参照］。本書の用途には、生物発光物質を含有する液体のジェットが吹き出すようにこれらの噴水を改変するか調整する［例えば実施例参照］。
噴水は、例えば追加の基質その他の活性化物質を添加することによって再充填することができる。使われた基質は、例えば酸化された基質に特異的な親和性マトリックスのなかを水を通すことによって、除くべきである。
７．たばこでないシガレット
シガレットのような形をして、生物発光生成系を含み、使用者が息を吐くと光を発する「煙」を出すような新規用品も本書で意図される。本書で意図される使用者は、煙の輪を吐き出すことが楽しい大人のかつての喫煙者である。このおもちゃのシガレットは、例えば、無酸素条件下で、生物発光系成分の凍結乾燥し微小粉末にした混合物を、上記のようなリポソームまたはＴＹＧＯＮその他の生物適合性非毒性材料でできた他の包装材料の中に入れることによって、作成することができる。これらのリポソーム（その他の包装品）は、使用者の細気管支内を通過しやすくするか通過するような適当な大きさのものを選ぶ。これらのリポソームは好ましくは直径５〜１０μＭのものであり、円筒状の担体容器に納める［「シガレット」］。
適切な担体容器の一例は、プラスチックで囲まれたガラスバイアルであり、硝酸アミル、ベタジン、安息香溶液の保存に用いられる当業者に知られているバイアルに類似している。この担体容器は好ましくは普通のシガレットの形と大きさである。プラスティックのカバーは好ましくは円筒状であり、吸い込んだときに空気が通るように両端が開いている。この装置からリポソームを通過させるが、バイアルが割れた場合に例えばガラスなど微粒子を偶発的に吸入することを防ぐようなフィルター材料で、このプラスチックカバーの回りを取り囲む。孔径約１０μＭの追加のフィルターを、「シガレット」の片端にとりつけてリポソームより大きな材料の吸入を防ぐための追加の障壁とする。しっかりしたプラスティックまたは同様な材質のキャップを「シガレット」の両端にとりつけて、その中に含まれるリポソームがこぼれでないようにしてもよい。これらのキャップは「シガレット」使用直前に取り除き、この仕組み全体に空気が自由に流れるようにする。リポソームは摩擦によって担体内に保持するのが好ましい。
実際に使うとき、使用者はリポソームや類似のカプセル入り担体を吸入するが、これは肺に接触したときその内容物を放出する。そうすると気管支の湿った環境が、生物発光反応を完了するのに必要な水と酸素を提供する。息を吐くと、使用者の肺を出ていく空気が光り、光を発する「煙」となる。生物発光生成成分用に選んだ包装装置がＴＹＧＯＮのような多孔性のプラスチック製ミクロスフェアであれば、身体の気管支繊毛輸送機構によって、使用済みのミクロスフェアが気管支から排出され消化器官内へと運ばれる。プラスチックは生物学的に非反応性であるため、ミクロスフェアは身体から通常の排泄経路を経て、免疫や毒性反応を誘発することなく、出て行く。
８．魚及び魚食品
ルシフェリンまたは好ましくはルシフェラーゼを発現するような遺伝学的技術で作成された魚及びそれから製造される食品も、本書で意図される。そのような魚は形質転換魚を作成する当業者に知られた方法で生産される。例えば、そのような魚を生産するために、魚卵を、特別なルシフェラーゼをコードする遺伝子または他の遺伝子または、魚にルシフェラーゼを製造し発現するよう命令するのに必要な調節配列で、当業者に知られた方法でトランスフェクトする。形質転換魚を作る方法は既知である［例えば米国特許第５，５１２，４２１号、第５，５１０，０９９号、第５，４８９，７４２号、第５，４７６，７７９号、第５，４１６，０１７号、第５，１６６，０６５号を参照のこと。またＯｚａｔｏら（１９８６）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖｅｌ．１９：２３７−２４４、Ｉｎｏｕｅら（１９９０）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖｅｌ．２９：１２３−１２８、Ｒｏｋｋｏｎｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ．１５８：７５１−７５８、Ｇｕｙｏｍａｒｄら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７１：８５７−８６３も参照。それぞれ、形質転換メダカ、メダカ、サケ、マスの作成について記載している］。多数の品種の形質転換魚がこれまでに作られ、当業者に形質転換魚の開発のための様々な方法を提供している。このように、当業者に既知のトランスフェクション法とルシフェラーゼの導入及び発現の方法を用いると、ルシフェラーゼを発現する形質転換魚が作られる。望ましくは、この魚が、例えば、メンブランに拡がるタンパク質をコードするＤＮＡ内にルシフェラーゼを導入することによって膜細胞表面でルシフェラーゼを発現させるか、ルシフェラーゼが魚の消化器系または口に分泌されるようにルシフェラーゼを発現させる。
このようにしてできた魚に、適切なルシフェリンまたは複数のルシフェリン（またはルシフェラーゼ）と必要なその他の生物発光生成試薬を含んだ餌を食べさせる。典型的には、ルシフェリンが魚の餌の中に約百万分の１（ｐｐｍ）から１０分の１（重力比）の範囲の濃度で存在する。ルシフェリン、生物発光活性化物質、その他の系成分が、形質転換魚によって発現されたルシフェラーゼと接触すると、魚や選択された臓器や組織が光を発する。例えば、ルシフェラーゼが形質転換魚の口の内側の組織に発現されると、魚が餌を食べるときその口が照明される。同様に、ルシフェラーゼ遺伝子で形質転換された魚が半透明であれば、消化器、とくに胃が、生物発光成分が接触し生物発光反応が完了するとき、光を発する。選択されるルシフェラーゼ／ルシフェリン系は、消化器系の酸性ｐＨのような魚の体内条件に抵抗性があるものでなければならない。
このように、本書の目的には、ルシフェリンを、好ましくは凍結乾燥した形で、とくにＲｅｎｉｌｌａコエレンテラジン及びＶａｒｇｕｌａルシフェリンを含む魚餌が提供される。ルシフェラーゼまたはルシフェリンを発現する形質転換魚も提供される。
９．肥料
ルシフェリンまたはルシフェラーゼを発現する形質転換植物とともに用いるためのルシフェラーゼまたはルシフェリンを含有する肥料。例えばルシフェリンを発現する形質転換植物は既知である［例えば、米国特許第５，４６４，７５８号、第５，４３６，３９２号、第５，４３２，０８１号、第５，４１２，０８５号、第５，３６２，８６５号、第５，２６８，４６３号、第５，０１５，５８０号参照］。ルシフェラーゼ及び生物発光系の他の必要な成分を含む肥料で処理する［即ち、与える］と、これらの植物は光を発する。
生物発光生成系の一つまたは複数の成分、好ましくはルシフェリンを含む肥料はルシフェラーゼを発現する形質転換植物に投与するために本書で提供される。ルシフェリン及び他の必要な活性化物質を含有する肥料は、どのような組成物であってもよく、典型的には植物に与えて成長を促進または維持させるものである［例えば、米国特許第４，０１６，８８０号、第４，７１１，６５９号、第４，８０４，４０３号、第５，５４７，４８６号、第５，５５３，８５３号、ＲＥ３５，３２０号、ＲＥ３１，８０１号参照］。このルシフェリン及び活性化物質は、肥料混合物に直接加えてもよく、あるいは別に収容し、使用直前に肥料に添加してもよい。肥料は土壌に与えても、植物の葉にスプレーしても、あるいはそれらを組み合わせてもよい。
Ｆ．新規用品の充填または再充填用のカートリッジ
新規用品の一部である生物発光生成系を、効果的に充填したり、詰め替えたり、再充填するために、多様なカートリッジが本書で意図される。本書で考察する充填装置は、水鉄砲のような新規用品に最初に詰め込むか、生物発光系の一つまたは複数の成分がからになってからそのような新規用品に詰め替えることができることを理解すべきである。例示的な実施態様は図２８〜図３４に示してあり、下記の実施例１４に記載されている。
実施例
下記の実施例は具体的に説明する目的のためのみに含まれており、本発明の範囲を制限することは意図されていない。
実施例１
２室式液体分注装置−おもちゃの水鉄砲
２室式液体分注装置の１つの例示的な実施態様は、図１から３に示されているおもちゃの水鉄砲である。下記ではそれらの図を参照しながら好ましい実施態様に関して説明する。おもちゃの水鉄砲は２つのハウジング又は室１０、１２を含有しており、これらは射出成形されたプラスチック又はその他の適切な材料から都合よく構成されてよい。２つのハウジング１０、１２は、水鉄砲の本体を形成するために中央の継ぎ目４６に沿って接着剤、ヒートシール又はその他の同様の手段によって貼り合わされている。詳細には図２及び３を参照。
操作中には、１つのハウジング１０は生物発光を生成させるために必要な全成分よりは少ない成分を含んでいる混合物を含有しており、もう１つのハウジング１２は残りの成分又は生物発光活性化因子を除く残りの成分を含んでいる混合物を含有している。トリガ１４を引くとピストン２６、３６が各々のシリンダ３８、４８を押し、次に各シリンダがトリガスプリング２８、４３を圧縮してシリンダの中味を第２逆止め弁３４を通って混合室２０内に、さらにはノズル口２２の外へ押し出す。トリガ１４が緩められると、トリガスプリング２８、４３は元の弛緩状態に戻り、ピストン２６、３６をシリンダ３８、４８から押し出してその中に真空を作り出し、第１逆止め弁３３、３２を各々通過したハウジング１０、１２の中味を各々シリンダ３８、４８内に吸引する。繰り返し押したり緩めたりしてトリガをポンピングすると、ハウジングに含まれている混合物が水鉄砲の中を通ってノズル口２２の外へ移動させられる。
混合物がシリンダ３８、４８を離れると、それらは導管手段４４及び第２逆止め弁３４を通って混合室２０内に進入する。生物発光は成分の混合時又は混合された組成物がおもちゃの水鉄砲から放出されて空気に接触した時点のいずれかに始まる。これらの混合物は凍結乾燥によって作り出されるように粉末化されていても、又は液体であってもよい。粉末状の場合は、使用前に水を添加することができる。
ハウジング１０、１２は、各ハウジングの上部に配置されている各々フィリングキャップ１７、１９を通して充填及び再充填することができる。トリガ１４は２つのピストンアセンブリ２５に向けてトリガ１４を誘導するのに役立つトリガガイド１３に取り付けられている。トリガ１４を引くと２つのピストンアセンブリ２５が作動する。これは各ハウジング１０、１２に配置された組成物の一部分が水鉄砲を通過して混合室２０内に入り、さらにノズル口２２から出て行く動きを引き起こす。図に示した好ましい実施態様にはトリガガード１５が備えられているが、これは不注意による水鉄砲の発射を防止するのに役立ち、水鉄砲の外観をより実際的なものにする。確認補助装置２１、２３はおもちゃの水鉄砲の照準定めに役立ち、さらに水鉄砲がより現実期なものに見えるようにするために役立つ。
図には２つのピストンアセンブリ２５のうちの１つしか示されておらず、これは図１に見ることができる。もう１つのピストンアセンブリは好ましい実施態様に隣接しており、図に示されているものと同一である。これらのアセンブリは実質的に同一手段によって作動し、単一トリガ１４を引くことによって作動する。ピストンアセンブリ２５はリング形パッキンを通過するピストンを含んでおり、トリガスプリング２８に連結されており、シリンダ３８内で動く。ピストンアセンブリはさらに、トリガスプリング２８の一端をシリンダの端面の壁に固定するスプリング保持器４０を含有している。シリンダ３８は吸込管１８の一端と連絡しており、吸込管１８に対してほぼ垂直に付けられている。シリンダ３８も又導管手段４４によって混合室２０と連絡している。
図２及び３に示されている水鉄砲の断面図では、第２の隣接ピストンアセンブリの一部分が見える。つまり、図２では第２トリガスプリング保持器４２及びトリガスプリング４３を見ることができ、図３では第２ピストン３６を見ることができる
図１に示されたピストンアセンブリ２５を参照すると、ピストン２６はリング形パッキン３０を通って水鉄砲内に通過してシリンダ３８内に進入する。トリガスプリング２８は一端によってピストンに取り付けられ、もう一端によってシリンダのピストンとは反対側の端部に位置するスプリング保持器４０へ取り付けられている。トリガ１４が引かれると、ピストン２６はシリンダ３８内に移動してリング形パッキン３０を通過する。これがトリガスプリング２８をシリンダ３８内で圧縮する。トリガ１４が緩められると、トリガスプリング２８は伸長してトリガスプリングとピストン２６とを静止位置へ戻す。
ピストン２６はリング形パッキン３０によってシリンダ３８内に密閉されているので、その繰り返し運動はシリンダ内の空気の置換を引き起こし、それによって水鉄砲の吸込管１８内に真空が作り出される。ハウジング１２内に配置された組成物はその後吸込管１８内に吸引され、第１逆止め弁３２を通過し、トリガースプリング２８を通過し、第２逆止め弁３４を通過し、混合室２０内に進入し、放出管２４を通ってノズル口２２から放出される。第２逆止め弁３４は、操作中に水鉄砲内に真空の形成を許容するように、逆止め弁３４をピストンアセンブリシリンダ２８と導管手段４４とを混合室２０から分離する閉鎖位置に保持するために役立つスプリング機構３５と一緒に図示されている。
同一機構は、同時に組成物を相補的ハウジング１０から吸込管１６を通って混合室２０内に引き出すためにも機能する。従って、図２及び３を参照すると、そのシリンダ内でのピストン３６の作動はトリガスプリング４３をスプリング保持器４２に向けて圧縮し、吸込管１６内に真空を作り出し、ハウジング１０内に配置された組成物の一部を吸込管１６を通って混合室２０内に、さらにノズル口２２の外へ移動させる。
図２に示されているように、２本の吸込管１６及び１８は各々ハウジング１０及び１２を起点とする。各吸込管１６、１８は各々逆止め弁３２及び３３を含んでいる。第１逆止め弁３２、３３はピストンアセンブリシリンダ３８、４８から液体がハウジング１０、１２内に逆流するのを防止するのに役立つ。単一の第２逆止め弁３４は混合された組成物が混合室２０から出てピストンアセンブリシリンダ３８、４８内に逆流することを防止する。
従って、トリガ１４が繰り返し引かれると水鉄砲内の圧力が増大し、それによって混合室２０に２つのハウジング１０、１２に配置された組成物の組み合わせが充填され、その後混合された組成物は放出管２４を通過してノズル口２２から外へ押し出される。
実施例２
２室式液体分注装置−ガス充填型おもちゃの水鉄砲
上記に記載したおもちゃの水鉄砲とは対照的に、ガス充填型おもちゃの水鉄砲は系を通して生物発光混合物を移動させるためにピストンアセンブリではなく圧縮ガスを用いて作動する。本装置の好ましい実施態様は図４及び５に示されている。本実施態様では、水鉄砲の台尻８６は生物発光生成系の成分を含有する２つの室６４、７４を収容している。さらに、台尻８６は取り外し可能なので、容易に取り換えることができる。
作動させるのに水鉄砲に加圧するために、ＣＯ2又は空気又はその他の適切な気体［若しくはそれらの混合気］容器５０が、図に示されているようにガス室５６内に挿入されている。ガス室の底面に配置されたスクリューキャップ５２が容器５０を室５６内に固定している。スクリューキャップ５２をきつく締めると、ＣＯ2又は空気容器に穿刺ピン５４が押し付けられ、それによってＣＯ2又は空気がガス室５６内に放出され、使用のために水鉄砲に充填される。
トリガ５８を引くと、ガスコック６０と２本のガス導管６２及び７２の各々及びガス室５６が整列する。ガスコック６０がそのように整列すると、ＣＯ2ガス又は空気がガス導管６２及び７２内に進入し、２つの室６４及び７４内に通過する。ガスの圧力は、各混合物の一部を組成物吸込管６６、７６を通って室６４、７４から流出させる。組成物吸込管６６、７６は放出管７８、８０へ連結されており、これらを通って混合物は混合室６８内に通過して結合させられる。ＣＯ2ガス又は空気の連続的圧力は結合させられた混合物を混合室６８から押し出してノズル口７０の外に放出する。
ガス導管６２、７２及び放出管７８、８０は水鉄砲の本体内に収容されており、水鉄砲の台尻８６が本体に取り付けられている領域で本体より突き出ている。組成物吸込管６６、７６は完全に水鉄砲の台尻８６内にある。水鉄砲の台尻から本体への漏れのないアセンブリを得るために、ガス導管６２、７２及び放出管７８、８０は各々水鉄砲の台尻８６内に配置された耐密シール８８を通過している。耐密シール８８はゴム又は類似の軟質のシール材料を用いて構成することができ、その中に含有されている組成物のこぼれを防止するために取り外し可能なキャップ又は穿刺に敏感な材料のいずれかを用いてカバーしなければならない。
水鉄砲の台尻８６を本体に取り付けると、ガス導管６２、７２及び放出管７８、８０が耐密シール８８を通過してこれらのチューブと水鉄砲の台尻との間で密なシールを形成する。また、図４に見ることができるように、分注管７８、８０は組成物吸込管６６、７６内でそれらが水鉄砲の台尻に進入する箇所に置かれている。
図４及び５に示されている好ましい実施態様の追加の特徴には、水鉄砲の本体上に配置されており、水鉄砲の台尻を本体に固定するために使用されている保持フック又はラッチ９０、９２及び９４が含まれている。さらに、２つの室６４及び７４は、置換のための代替品として再充填されることを可能にする、図示されている充填キャップ８２、８４を含めた形状にすることができる。
本明細書に記載されているガス充填型液体分注装置を作動させるために使用するガスが二酸化炭素以外の気体であってよいことは理解されるであろう。同一方法で作動する空気又はＯ2及びＣＯ2の混合気のようなあらゆるガス又はガスの混合気を使用することができる。
実施例３
２室式液体分注装置−ガス充填型
図６、７及び８は本明細書において提供されるガス充填型液体分注装置の好ましい実施態様を示している。本実施態様は特定用途に採用することができる；例えば、それによって装飾的水飲み台として機能する、装飾的彫刻の内側に収容されてよい。本実施態様を含む代替の実施態様は、図４及び５［実施例２］及び図９及び１０［実施例４］に示されている。
図６及び７を参照すると、ガス充填型２室式液体分注装置には２つの室１００及び１０２が含まれている。図示されている好ましい実施態様では、２つの室１００及び１０２は室の上部端面上に配置された充填キャップ１０４及び１０６を通して再充填することができる。ガス室１０８は２つの室からほぼ等距離の位置にあり、ガス管１１７を通して各々の室と連絡している。ガス管１１７は２つの室１００、１０２と連絡している吸気口１１８で終了する。吸気口１１８は室１００及び１０２の上部端面の近くに配置されている。１つの吸気口が描出されているが、各室１００、１０２には各々にそうした吸気口が備えられていると理解されている。
ガスボンベ１１２はガス室１０８内に適合し、スクリューキャップ１１０によってその中に固定されている。スクリューキャップ１１０をきつく締めると、ガスボンベ１１２の上面が穿刺針１１４に向けて押し付けられ、それによってガスがガス室１０８内に放出される。ガス室１０８からガス管１１８内へのガスの流量を調節するためにガス調節弁１１６が使用される。
混合室１２４も又２つの室１００及び１０２からほぼ等距離の位置にあり、液体流出口のような分注管手段１２２を通してそれらと連絡している。分注管［液体流出口］１２２は、室の中味を空にできるように室１００及び１０２の底面の十分近くに配置されている。２つの室１００、１０２の底部端面の近くには液体流出口１２２に連絡している液体分注管が配置されている。ブローアウトプラグ１２０はその中に含まれている組成物が室内に残留することそして装置の作動前に液体流出口に進入することを防止する。ブローアウトプラグ１２０は一方向弁又は類似装置に取り換えることができる。底面の流入口及び上面の分注口を備えている混合室１２４は、混合室に取り付ける又は一体成形することのできるノズル１２６と連絡している。任意では、ノズル１２６には混合室１２４から遠位に閉鎖キャップが備えられる。
図６、７及び８に示された好ましい実施態様では、上部サポート１３０が示されている。この上部サポート３０は両方の室１００及び１０２の上部端面及びガス室１０８の上部端面の上方に及んでいる。ガス管１１８及び吸気口１１７は上部サポート１３０内にある。ノズル１２６は上部サポート１３０を通過し、それによって支えられている。
同様に好ましい実施態様に示されているのは、室１００及び１０２の底部端面に渡って及んでおり、混合室１２４と一体成形されている下部サポート１２３である。室１００及び１０２を混合室１２４と連結している液体流出口１２２は下部サポート１２３内に含まれている［図６及び７参照］。
基本的な２室式ガス充填型液体分注装置を作動させるためには、例えば加圧ＣＯ2のような圧縮されたガスを含有するガスボンベ１１２がガス室１０８内に挿入される。スクリューキャップ１１０をきつく締めると、ガスボンベが穿刺針１１４に押し付けられる。ガスが容器から放出されると、ガス室が充填される。ガス調節弁１１６を開くと、ガスはガス管１１７内に進入することができ、吸気口１１８を通って室１００及び１０２内に進入する。
室内のガスの圧力がその中に含まれる混合物をブローアウトプラグ１２０に向けて、又は一方向弁を通過するように押し出し、混合物は液体分注管の外へ、液体流出口１２２又はその他の液体管手段内へ、そして底面の流入口を通って混合室内へ送られる。混合室１２４内では、混合物は結合し、ガスの持続的圧力が結合混合物をノズル１２６を通ってノズル口１２８の外へ押し出す。
実施例４
２室式液体分注装置及び火山型ガス充填装置
図９及び１０は、図６、７及び８に示された上記で説明されたガス充填型液体分注装置の好ましい実施態様を図示している。本実施態様では、各室は一般に半円錐形又は取り付けられたときに火山型装置を形成するようなその他の意図される使用に依存して適切な形状を備えている。ガス室１６０及びガス管１６２は室１５０、１５２の内壁各々１７６、１７８によって境界が定められている。
図６、７及び８の装置と同様に、ガスボンベ１５４はガス室１６０内に収容されており、ガススクリューキャップ１５６を締めることによって作動させられ、これによってガスボンベ１５４は穿刺針１５８に押し付けられ、それによってガスがガス室１６０内に放出される。ガスはガス管１６２内に進入し、ブローアウトプラグ１６４から押し出されて室１５０、１５２内に吸気口１６６を通って進入する。あるいは、調節弁又はその他の適切な調節手段がガス室とガス管の間又はガス管手段間に配置され、ガス室内へのガスの流速を調節するために使用されることがある。
一方は例えば生物発光生成反応のために必要な１成分を除く全成分を含有し、他方が残りの成分を含有している２つの室１５０、１５２内では、ガスは生物発光生成混合物を混合室１７０内に押し入れる。室１５０、１５２及び混合室１７０の間に位置するブローアウトプラグ１６８が、本装置が作動させられるまで生物発光混合物が混合室１７０内に進入することを防止する。ガスの連続的加圧は結合された混合物を混合室１７０からノズル１７２を通ってノズル口１７４の外へ押し出す。
本装置は特に火山の形状に構成される「花火」として使用するために設計されている。結合された生物発光混合物が本装置から空中に押し出されると、それらは伝統的花火と類似した方法で光を放つ。
上記の特定の実施態様の代替の実施態様も又同様に意図される。例えば、ブローアウトプラグは一方向弁又は調節弁に取り換えられてよい。手動で作動させる弁は電気的又は機械的に調節される弁に取り換えられてよい。本装置は火山型にしなければならない訳ではなく、動物、人間、植物又は抽象形のようなあらゆる形状に形成されてよい。
図示されていない別の代替の実施態様では、混合された生物発光組成物がそれを通って本装置から押し出されるノズル１７２は短縮され、混合室１７０はノズル口１７４のもっと近くに移動させられる。これは特に、好ましくは生物発光性成分が装置から放出される直前まで分離して保持されるように、本装置で使用される生物発光生成系が短時間の光のバーストを生成させる、又はいったん作動させると急速に消耗する場合に適切である。そうした代替の実施態様では、分注管は本装置から放出される直前まで生物発光生成成分を別々に維持するように提供されてよい。本代替の実施態様においては実施例１１に記載の図２３、２４及び２６に示されている分注管を同様に使用できるであろう。
実施例５
圧縮式分注装置−ローション／クリーム容器
図１１は、ボディーローション又はフィンガーペイントのようなワックス状、ペースト状又は半固形組成物を分注するために特に有用な圧縮式分注装置の好ましい実施態様を示している。本実施態様では、容器、好ましくはチューブは２つの室２００、２０２を備えている。ある実施態様では、１つの室内には１又は２以上を除く生物発光生成系の全成分が含まれており、もう１つの室内には残りの成分が含まれている。ボディーローション又はクリームのような組成物は１又は好ましくは両方の室に含まれている。本容器は好ましくはプラスチック、プラスチック／金属ラミネート又は類似のつぶすことができる混成のような、手で絞ることのできる、柔軟でつぶすことの可能な又は圧縮可能な材料から構成される。非常に数多くのそうしたチューブは当業者には周知であり、フィンガーペイント類、練り歯磨き、ジェル類、ローション類及びその他の物品のような製品を分注するために使用されている。
本容器の上部端面［分注端］の膜シール２０４は室の中味が混合されるのを防止する。本容器のキャップ装置２０６は上面２１０に分注用キャップを備えており、間隙２０８が膜シール２０４と分注用キャップ２１０との間に存在し、この間隙が混合室２０８として機能するように構成されている。
従って、ローション／クリーム容器を作動させるためには、膜シール２０４が穿刺又はさもなければ開封され、容器に圧力が加えられることによって２つの室２００、２０２の中味の一部が同時に混合室２０８内に絞り入れられる。分注用キャップ２１０が取り除かれ、混合室２０８の中味が分注口２１２から絞り出される。混合された組成物は容器を絞ることによって、又はキャップ装置２０６を絞ることによって分注されてよい。あるいは、プランジャ／シリンジ装置［図示されていない］を分注口に取り付けて混合されたクリーム組成物がそれによって混合室２０８から引き出されてもよい。
室２００、２０２及び混合室２０８の間に据えられている膜シール２０４は、混合室２０８の中味が室２００、２０２のいずれか内に逆流することを防止するように機能する。膜シールは、例えば、中味が通過する小さな孔をもつゴム、プラスチック、又はその他の適切な多孔性材料の薄層から構成されてよい。容器の両側に圧力が加わると、室の中味の一部分が膜の孔を通って混合室内に押し入れられ、圧力が解除されると膜は「密閉された」状態に戻る。混合室２０８の中味が室２００、２０２のいずれかに逆流するのを同様に防止するものであれば、膜シール２０４が一方向弁又は類似装置に取り換えられてもよい。
実施例６
ビン／浮体装置−発泡組成物ビン
図１２及び１３は生物発光発泡組成物と一緒に使用するために適したビン／浮体装置の好ましい実施態様を示している。この発泡組成物ビンはその中に配置され、摩擦によって適所であるビンの首部３０２に保持されている浮体３００を有している。カラー３０４がビン３０２の首部上に配置されており、キャップ３０６がビンの上面で完全にねじ込まれるのを防止する。キャップ３０６は、カラー３０４が取り外され、キャップ３０６がきつくねじ込まれたときにはビンの本体内に浮体３００を押し入れるように作動するプランジャ３０８を含んでいる。ビンの本体内に入ると、浮体はビンの底面に配置された穿刺ピン３１０によって穴があけられる。それによって浮体の中味がビン内に放出される。図１３はカラー３０４が取り外され、キャップ３０６がきつくねじ込まれ、そして浮体３００がその中でつぶれているビンを示している。
浮体内には生物発光生成反応の［全部よりは少ない］成分が含まれている。これらの成分は、溶液、懸濁液、浮遊微粒子又は微粒子の形であってよい。使用する前にビンは静かに攪拌されてよい。微粒子はそれらの中味を発泡組成物へ曝露させた時点に中味を放出する又は浮体の中味と発泡組成物とが混合されると中味が拡散する時限放出カプセルであってよい。Ｃａ2+又はＡＴＰのような残りの成分は発泡組成物３１４に含まれており、これは好ましくは軽度の気泡生成組成物である。生物発光生成組成物の選択は選択される気泡組成物及びさら所望の作用に依存する。他の実施態様では、ＡＴＰ、ＦＭＮ、フラビンレダクターゼ又はその他の発泡組成物にいくらか感受性のある可能性のある成分のような残りの成分は使用直前に発泡組成物に添加されてよい。
ビンのカラー３０４はそれに一体成形されているアームを備えた発泡リングを備えているように適合されている。従って、カラー３０４が取り外され、浮体３００は上記のようにビン内で穴が空けられ、発泡リング３１２が混合された組成物内にちょっと浸されて取り出されると、生物発光性の気泡が形成される。図１２に描出されているものの代わりに標準的な発泡棒［リング付きアーム］が使用及び／又は装備されてもよい。
浮体３００は針又はピンのような穿刺手段によって穴を空けることのできる例えば薄いプラスチック又は他の高分子フィルムから作られている材料で構成しなければならない。好ましくはビンの首部の底面から穿刺針の先端までの距離は、浮体の先端がビンの首部の底面を越える前に針によって浮体に穴が空けられるように浮体の全長より短い。
ビン３１６は泡を分散させるために通常使用されるあらゆる材料から製造されてよい。ビンはビン内のあらゆる発光を見ることができるように生物発光の光に対して透明又は透光性であってよい。
実施例７
容器／浮体装置−飲料缶
図１４に示されている容器／浮体装置の実施例は飲料缶又は飲料瓶として使用するために適している。これはプルトップ式のアルミニウム飲料缶と同様に構成されているが、プルトップの下には缶が開けられたときにプルトップ４０２によって穴が空けられる浮体４００が備えられている。浮体は図のように缶の上面の下の中央に配置されていても、中心から外れていても、あるいは缶の上部及び側面に取り付けられていてもよい。浮体の配置は、容易に穴が空けられてその中味が容器４０４の中味と混合されるように選択される。従って、浮体はプルトップ４０２が穴を空けてその中味を飲料缶の中味と混合させることができるのに十分な程度の薄さでなければならない。缶は好ましくは発光している飲料を観察できるような透光性又は透明の材料で製造される。
代替の実施態様には、２つのプルトップを備えた飲料容器を含んでいて、１つは浮体を穿刺するように端部に点をもっていることを含むように設計されており、他方はグラス又はヒトの口の中へ注入することによるような缶の中味を空にするために使用される典型的なプルトップである。これらの用品の新規性は結果として生じる飲料中の発光にあるので、飲料はグラス又は容器内に注入されなければならない、又は容器が生物発光に対して透明又は透光性でなければならない。
本発明において予想されるまた代替の実施態様には、浮体を取り囲んでいて破裂した浮体の細片が缶の中味と混合することを防止するために機能するメッシュフィルターを含んでいる。浮体の中味は水性組成物である。従って、メッシュフィルターの密度はルシフェラーゼ及びその他の生物発光生成成分に対して透過性である。
同様に、他の開封タイプを使用する実施態様も又意図されている。例えば、浮体及び対応する容器を開けるためには、先の尖ったストロー又は他の鋭利な器具を用いて穴が空けられてよい。同様に、分注開口部［浮体連結開口部とおそらく同一である］は薄いアルミニウム製プルタブを用いて被覆されてよい。缶／浮体の組み合わせの作動に決定的に重要であるのは、消費者が浮体を破る行為を行うまでは浮体と缶の中味の混合を浮体が防ぐことである。
浮体は上記のように穴があけられるのに従順なあらゆる材料から構成されてよく、好ましくは穴が空けられたときにたとえあってもごくたまにしか細片化されない材料から構成される。例えば、薄いプラスチックコーティングを施したアルミホイルは、特に先の尖ったストローを用いて穴を空けたときに破れて細片化するのはごくまれであろう。缶の本体はアルミニウム、プラスチック又は類似の材料から構成されてよく、好ましくはプラスチックのような透明材料から構成される。
浮体は生物発光生成系の１成分を除く全成分までを含んでおり、飲料は残りの成分を含んでいる。例えば、浮体は発光タンパク質の活性化を防止するためのキレート剤を含む組成物中にエクオリン発光タンパク質を標準的には０．１〜１ｍｇ以上を含んでおり、飲料はＣａ2+を含有している。
実施例８
一回限り使用の２室式液体包装装置
図１５は、一般的には上記で説明されたディスポーザブルの、２室式液体包装装置又はビンを示しており、下記ではこの図を参照して説明する。このビンは生物発光生成系成分の１つを除く全成分までのうちの１又は２以上の成分を含有する組成物を含んでいる第１室５００を有している。第１室の下方にあってそれに作動的に取り付けられているのは、組成物の残りの生物発光生成系を含有する第２室５０２である。図示された実施態様では、第１室５００は第２室５０２内にサイドシーム５０６及び分離膜５０４に沿って据えられている。
第２室５０４はプラスチックのような柔軟性の材料から構成されており、図示されでいる矢印の方向に第１室の底面に向けて容易につぶれるように回旋状５０８である。この方法でつぶされると、第２室内に含まれていた組成物の力が分離膜５０４Ａを破裂させ、組成物の混合を許容する。いったん混合されると、組成物は発光し始める。
図示されている本装置は発泡組成物と一緒に使用するために適合されており、発泡合成中ではビンのキャップ５１０がそれに取り付けられた発泡棒５１２を有している。あるいは、本装置は飲料と一緒に使用してもよく、そのように使用される場合は図示されている発泡棒５１２を有していないであろう。
図示されていないが本明細書において意図される本装置の別の実施態様は、第２室を第１室に又はつぶれた位置の第２室自身に固定することのできるビンである。例えば、第２室はつぶれたときにそれ自体がひっかかるようにその外部上にフック機構を備えるように適合させることができる。
実施例９
組成物容器と一緒に使用するためのキャップ装置
図１６、１７及び１８＆１９は、組成物容器と一緒に使用するための３種のキャップ装置の実施態様を示している。
Ａ．コルクキャップ装置
図１６を参照すると、ビンの首部６０２の内側に据えられていてその中に収容された破裂可能なカプセル６０４を有しているコルク６００が示されている。本実施態様では、コルク６００の下端部はポケットが形成されるように実質的にＵ型である。ポケット内に含まれているのはコルクの下端に固定的に取り付けられているスクリーン６０８と連絡しているカプセルである。カプセルは生物発光生成系成分の１つを除く全成分までのうち１又は２以上の成分を含有している。プランジャアセンブリ６０６は、プランジャアセンブリ６０６を押すとカプセルが破裂してその中味がビン内の組成物内に放出されるのを引き起こすように一部はコルク内に配置されている。スクリーン６０８又は他のフィルター装置が破裂したカプセルの細片が容器内に進入するのを防止する。
図１６に示されているプランジャアセンブリ６０６にはステム部分６１２と一体成形されている上端部分６１０がある。上端部分６１０を押すと、ステム部分６１２がコルク６００内及びカプセル６０４に対して押し付けられ、それによってカプセルが破裂してその中味が容器内に放出される。
図１７は、コルクキャップ装置の代替の実施態様を図示している。本実施態様では、コルク７００がビンの首部７０２の上端とほぼ同一高さであるように示されている。プランジャ装置７０４は取扱いが容易であるようにフィンガーリング７０６を備えるように適合されている。先が尖っている、鈍である又はそれらのあらゆる組み合わせであってよいステム７０８にはネジが切られている。操作中には、プランジャアセンブリ７０４がコルク７００内にねじ入れられ、そこでカプセル７１２に接触させられ、カプセルを破裂させ、その中味をスクリーン７１４又はフィルターに対して放出させる。カプセルは好ましくは粉末化された、又はさもなければ濃縮された生物発光生成成分を含有するであろう。
カプセル内に入れられた組成物及びそれらに取り付けられたスクリーン又はフィルターと一緒にコルクキャップが２つの図示されたコルクキャップ装置の代替の実施態様であることは理解されるであろう。本実施態様では、カプセルを破裂させてコルクキャップを取り除くためにコルクスクリューが使用されてもよい。
Ｂ．スクリュートップ・キャップ装置
図１８及び１９は、組成物容器と一緒に使用するためのキャップ装置のまた別の例示的な実施態様を示している。図１８は作動又はかみ合わせ前のキャップ装置を示している。これは特にワイン又はシャンパンビンと一緒に使用するために適合されており、カプセルに入れられた生物発光生成系成分を含んでいる。
本実施態様は、一般的にビンの首部８０４の周囲に据えられたカラー８０２及びカラー８０２のすぐ上方のビンの上端に取り付けられているキャップ８００を備えたビン型容器を含んでいる。ビン８０４の首部はスクリューオンキャップ８００を受け入れるためにネジが切られている。カラー８０２は、ビンの首部８０４上のネジの下方部分を被覆し、それによってスクリューオンキャップ８００が完全にビンに付着するのを防止するように据えられている。スクリューオンキャップ８００が確実に、だが完全にではなくビンの上端に取り付けられるようにビンの上端上には十分なネジがむき出しで残っている。
スクリューオンキャップ８００は、ビンの首部８０４内に伸びていて一体成形されているプランジャ８０６を有している。スクリーン又はフィルターアセンブリ８１２はビンの首部８０４内のビンの内側に取り付けられている。膜系８０８、８１０又はカプセル又は類似の組成物パッケージはスクリューオンキャップ８００のプランジャ８０６とスクリーン／フィルターアセンブリ８１２との間に据えられている。操作中には、カラー８０２は例えばスクリューキャップ８００を取り外して持ち上げる、又はカラー８０２のネジを外すことによって、又はカラー８０２を剥ぎ取ることによって取り外され、スクリューオンキャップ８００がビンの上部に対して締められる。これはプランジャ８０６を膜８０８、８１０を通して押し付けてそれらを破り、その中に含まれていた組成物を放出させる。組成物はスクリーンアセンブリ８１２を通過し、ビンの中味と混合される。図１９は破裂した膜系と十分にかみ合っているキャップ装置を図示している。
図示された実施態様では、スクリーンアセンブリ８１２はビンの首部８０４の内側に沿って並びに首部の内側の沿って取り付けられており、それによってその中に膜系８０８、８１０が据えられているバスケットが形成されている。あるいは、スクリーンアセンブリはビンの首部の円周の周囲にのみ取り付けることができ、図示されているようにビンの上部へその側面に沿って取り付けることはできない。
カラー８０２の正確な高さはプランジャ８０６の長さ及び膜系８０８、８１０の位置によって決定されるであろう。高さは使用者によって作動化される前にプランジャ８０６が膜系８０８、８１０を通ってかみ合うのを防止し、他方ではスクリューオンキャップ８００がビンの上部に固定されるのを許容するのに十分であろう。
膜系８０８、８１０は生物発光生成系成分の１つを除いて全成分までのうちの１又は２以上の成分を含有している。典型的には、これらの成分はルシフェラーゼ及びルシフェリンを凍結乾燥された形で含有するであろう。
図示された実施態様は、ビンに取り付けられるように図示かつ説明されている。しかし、キャップ装置が取り付けられている容器が缶、チューブ又はあらゆるその他の容器であってよいことは理解されるであろう。さらに、実施態様はビンの首部を参照して例示及び図示されている。容器はキャップ装置を機能させるために「首部」を有することは必要ではない。例えば、容器が首部を有していない場合は、カラーを適切な場所に停止させるための容器上、ネジの下に形成されたリップのようなカラーをスクリューオンキャップの下方の適所に保持するための他の手段が使用されてもよい。
組成物容器と一緒に使用するように適合されたキャップ装置のこれらの３種の実施態様に関して、プランジャアセンブリのステムはスクリーン又はフィルター装置に穴を空けることがないような短さで、いったんかみ合ったらカプセル、膜又はその他のパッケージを効果的に破裂させるのに十分な長さである。キャップ装置内に含まれている生物発光生成系成分は粉末化されてよい、又は組成物若しくは容器内に含まれている組成物に添加するのに適したあらゆる形態であってよい。さらに、成分は１より多くのカプセル、膜又はその他のパッケージ内に含まれていてよい。この場合には、成分パッケージは各々がプランジャのかみ合いによって破裂するように隣接して配置されている。好ましくは、生物発光反応の完了のために必要な残りの成分は容器内の何らかの組成物内に含まれている。これらの実施態様は特にワイン又はシャンパン又はその他の飲料と一緒に使用するように適合されている。
実施例１０
スプレー容器装置
図２０、２１及び２２は本明細書で提供されるスプレー容器の実施態様を図示している。この容器は典型的には本明細書に記載された生物発光生成系と組み合わせて使用することが意図された缶装置である。これらの図を参照して下記に実施態様について説明する。
スプレー容器装置は２つの部分、つまり上部ハウジング部分９０２と底部プランジャ部分９０４を含んでいる。上部ハウジング部分９０２は生物発光生成系の１つを除く全成分までを含有している。上部ハウジング部分９０２はさらにスプレーノズル９２０に作動性で取り付けられた容器９１２を含有している。
スプレー容器装置の上部ハウジング部分９０２は底部プランジャ部分９０４を受け入れるように適合されている。本実施態様では、上部ハウジング部分９０２及び底部プランジャ部分は、底部プランジャ部分９０４を上部ハウジング部分９０２上にねじ入れることができるように各々９０３及び９１０にネジが切られている。［底部プランジャ部分が完全に適所にねじ入れられているスプレー容器装置を示している図２１参照］。
上部ハウジング部分９０２はさらに円錐形の側壁９２２と上部壁／破裂膜９１６によって規定されているポケット９２６を有している。ポケット９２６は、生物発光を生成させるために必要な残りの成分を含有しているペレット９０６を受け入れるように適合されている。
スプレー容器装置の底部プランジャ部分９０４は、底部プランジャ部分９０４が適所にきっちりとねじ入れられたときに上部ハウジング部分９０２のポケット９２６内に適合するような形状で据え付けられるプランジャ９１４を有している。底部プランジャ部分９０４はそれによってスプレー容器装置の中味の漏れを防止するように上部ハウジング部分９０２に対して底部プランジャ部分９０４を密閉するために役立つ角ばったシール９１８を備えるように適合されている。
操作中には、ペレット９０６は上部ハウジング部分９０２のポケット９２６内に入れられ、そこでポケット９２６の上部壁／破裂膜９１６に接触する。底部プランジャ部分９０４はその後に上部ハウジング部分９０２上にねじ入れられ、それによってプランジャ９１４はペレット９０６に向かって押し付けられ、これがポケット９２６の上部壁／破裂膜９１６に向かって加圧してこれを破裂させる。ペレットは上部ハウジング部分９０２内に含まれる組成物中に溶解又は懸濁させられて組成物が発光する。スプレーノズル９２０を押すとスプレー容器装置の中味が放出される。
このスプレー容器装置の代替の実施態様があることは理解されるであるう。例えば、ペレット９０６はスプレー容器装置９００の上部ハウジング部分９０２に含まれている組成物中で溶解できる又は懸濁させられるであろう材料から製造されている、又は受動的拡散によるような組成物に接触するとその中味を放出するであろう必要な生物発光生成成分を含有する容器であってよい。そうした材料の例にはリポソーム類、ゼラチン、可溶性の紙及び水性組成物内で溶解する又は中味を放出するであろうその他の材料が含まれるがこれらに限定されない。さらに、スプレー容器装置９００は底部プランジャ部分９０４が適所にねじ入れられるのではなく上部ハウジング部分９０２上にパチンとはめられるように適合することができる。
実施例１１
２室式液体分注装置の代替の実施態様−おもちゃの水鉄砲
２室式液体分注装置のまた別の実施態様は、図２３から２６に示されているようなおもちゃの水鉄砲である。このおもちゃの水鉄砲は２つのハウジング又は室４０６、４０８を含んでおり、これらは射出成形されたプラスチック又はその他の適当な材料で構成されてよい。２つのハウジング４０６、４０８は水鉄砲の本体を形成するために中央の継ぎ目４６２に沿って接着剤、ヒートシール又はその他の同様の手段によって貼り合わされている。詳細には図２５及び２６を参照。
操作中には、１つのハウジング４０６は生物発光を生成させるために必要な全成分より少ない成分を含んでいる混合物を含有しており、もう１つのハウジング４０８は残りの成分又は空気を除く残りの成分を含んでいる混合物を含有している。トリガ４１０を引くとピストン４２８、４３０が各々のシリンダ４５０、４５２を押し、次に各シリンダがトリガスプリング４３２、４３４を圧縮してシリンダの中味を各容器手段４５８、４６０を通って第２逆止め弁４４２、４４４を通過させ、分注管４２４、４２６から混合室４２０内に、さらにはノズル口４２２の外へ押し出す。トリガ４１０が緩められると、トリガスプリング４３４、４３２は元の弛緩状態に戻り、ピストン４３０、４２８をシリンダ４５２、４５０から押し出してその中に真空を作り出し、ピックアップ４１２、４１４を各々通過したハウジング４０６、４０８の中味を各々シリンダ４５０、４５２内に吸引する。繰り返し押したり緩めたりしてトリガをポンピングすると、ハウジングに含まれている混合物が水鉄砲の中を通って混合室４２０内に入り、ノズル口４２２の外へ移動させられる。
混合物が分注管４２４、４２６を離れると、ノズル口４２２を通っておもちゃの水鉄砲から発射される直前に混合２０内に進入する。生物発光は成分の混合時又は混合された組成物がおもちゃの水鉄砲から放出されて空気に接触した時点のいずれかに始まる。混合物は凍結乾燥によって作り出されるように粉末化されていても、又は、ペースト状に濃縮されていても、又は液体であってもよい。粉末状又は濃縮状態にされている場合は、水又は適当な緩衝剤のような適当な組成物を使用前に添加することができる。
ハウジング４０６、４０８は各ハウジングの上部に配置されているフィリングキャップ４６４、４６６各々を通して充填及び再充填されてよい。トリガ４１０は２つのピストンアセンブリ４７２に向けてトリガ４１０を誘導するのに役立つトリガガイド４１６に取り付けられている。２つのピストンアセンブリ４７２のうちの１つしか完全には示されておらず、これは図２３で見ることができる。もう１つのピストンアセンブリは好ましい実施態様に隣接しており、図に示されているものと同一である。トリガ４１０を引くと２つのピストンアセンブリ、例えば４７２が作動する。これは各ハウジング４０６、４０８に配置された組成物の一部分が水鉄砲を通過して混合室２０内に入り、さらにノズル口４２２から出て行く動きを引き起こす。
ピストンアセンブリ、例えば４７２は、リング形パッキン４３６、４２９を通過してトリガスプリング４３４、４３２に連結されており、シリンダ４５２、４５０内で動くピストン４３０、４２８を各々含有している。ピストンアセンブリは各々さらにトリガスプリング４３４、４３２の一端をシリンダの端面壁に固定するスプリング保持器４５６、４５４も含有している。各シリンダ４５２、４５０は吸込管４１４、４１２の一端と連絡しており、吸込管４１４、４１２に対してほぼ垂直である。各シリンダ４５２、４５０はさらに又導管手段４５８、４６０とも連絡している。
ピストン４２８、４３０はリング形パッキン３０によってシリンダ４５０、４５２内に密閉されているので、ピストンのシリンダ内での繰り返し運動はシリンダ内の空気の置換を引き起こし、それによっておもちゃの水鉄砲の吸込管４１２、４１４内に真空が作り出される。これは上記で詳細に説明したようにおもちゃの水鉄砲の作動を開始する。
図に示した実施態様にはトリガガード４１１が付けられているが、これは不注意による水鉄砲の発射を防止するのに役立ち、水鉄砲の外観をより実際的なものにする。確認補助装置４６８、４７０はおもちゃの水鉄砲の照準定めに役立ち、さらに水鉄砲がより現実的なものに見えるようにするために役立つ。
図２５に示されているように、２本の吸込管４１２及び４１４は各々ハウジング４０６及び４０８を起点とする。各吸込管４１２、４１４は各々逆止め弁４４０及び４３８を含んでいる。第１逆止め弁４４０、４３８はピストンアセンブリシリンダ４５０、４５２から液体がハウジング４０６、４０８内に逆流するのを防止するのに役立つ。第２逆止め弁４４２、４４４は同様に液体が分注管４２４、４２６から出てピストンアセンブリシリンダ４５２、４５０内に逆流することを防止する。
従って、トリガ４１０を繰り返し引くと水鉄砲内の圧力が増大し、それによって混合室４２０に２つのハウジング４０６、４０８に配置された組成物の組み合わせが充填され、その後混合された組成物はおもちゃの水鉄砲を通過してノズル口４２２から外へ押し出される。
実施例１２
圧縮式分注装置
図２７は圧縮式分注装置の代替の実施態様を示している。本実施態様は特に本明細書に記載された生物発光性のねばねばした遊びの材料を含有して分注するために適合されているが、その他の成分を分注するために使用されてもよい。図１１に示された実施態様と図２７に示された実施態様との主要な相違は、後者が装置内に配置された１又は２以上の小区画９４２、９４４を有している点である。これらの区画は、装置の圧縮が小区画の中味を装置の本体９４０内に発射させ、そこでそれらの中味と本体９４０内に含まれるあらゆる中味が混合するように配置されている。
図２７に示されている実施態様には圧縮式分注装置の本体９４０内に含まれている第１区画９４２と第２区画９４４を有している。区画９４２、９４４は好ましくはプラスチック膜又はその他の容易に穿刺される分割手段によって少なくとも１つの端９５０、９５２に沿って形成されている。各区画９４６、９４８の少なくとも他の１つの端は本装置の本体９４０の内側に固定的に貼り付けられている。従って、装置が圧縮されると、２つの区画９４２、９４４の中味は破裂可能な膜９５０、９５２に向かって押されてこれらの膜を破裂させ、２つの区画９４２、９４４の中味の本装置の本体９４０内への発射を生じさせる。各区画９４６、９４８の少なくとも１つの端は本装置の内側に固定的に貼り合わされているので、これらの区画は圧縮中にその位置に留まり、容易に破裂する。
好ましくは２つの区画９４２、９４４は本装置内の１つの接触端９５４に沿って相互に接触するのに十分に大きさである。本装置の側面が圧縮されると、２つの区画の中味はこの接触辺９５４に向かって、そして破裂可能な膜９５０、９５２に向かって押され、これがその後これらの膜を破裂させる。好ましくは、本装置のキャップ９５６は２つの区画が破裂させられ、装置内で中味が混合されるまではそのままにしておく。
圧縮式分注装置は図２７では２つの区画９４２、９４４を備えて示されている；しかし、１、３又はそれより多くの区画を適切に含めてよいことは理解されるであろう。区画の適切な数を決定するときに考慮に入れるべき要素は使用される生物発光生成系、成分、特に使用されるねばねばした遊びの材料の成分、発光の望ましい時機及び持続時間、さらにねばねばした遊びの材料のような結果として生じる組成物の最終的用途である。
例としてのみ、図２７に示されているように装置に２つの区画が含まれている場合、１つの区画はエクオリン発光タンパク質とコエレンテラジン及び酸素とのような荷電ルシフェリン／ルシフェラーゼ混合物を含み、第２区画はポリビニルアルコール混合液を含有していてよい。本装置の本体は、生物発光生成反応を完成するために必要なカルシウムイオン類のような残りの成分を含んでおり、さらに又四ホウ酸ナトリウムのようなねばねばした遊びの材料の他の成分を含んでいる。
あるいは、本装置が本体内に３つの区画を含めて構成される場合は、２区画実施態様の本体内に含まれる成分の１又は２以上が第３区画内に含まれていてよい。例えば、四ホウ酸ナトリウムが第３区画に含められ、水性溶媒中のカルシウムイオン類が本装置の本体に含められてよい。さらに又、各区画及び／又は本体の中味が粉末、液体又は半固形であってよいことは理解されるであろう。液体又は半固形が好ましい。
実施例１３
組換え製造Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ溶解物
ファージミドｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア社製）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために設計され、細菌宿主において組換えタンパク質を発現させるために有用な多目的ＤＮＡベクターである。このベクターは、アンピシリンに対する抵抗によって形質転換細胞の選択を可能にするβ−ラクタマーゼ遺伝子及びｌａｃＺ’遺伝子に隣接するポリリンカー部位を含有している。関心のある異種遺伝子はポリリンカーに挿入され、誘発によって例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてｌａｃプロモーターから転写される。
Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼをコードするＤＮＡはクローン化されてきた（例えば、米国特許第５，２９２，６５８号及び第５，４１８，１５５号参照）。プラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１は、２．２  Ｋｂｐ  ＥｃｏＲＩからＳｓｔＩにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片をｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩおよびＳｓｔＩ部位へ挿入されたものである（プラスミド構築は米国特許第５，２９２，６５８号及び第５，４１８，１５５号に記載されている；さらにＬｏｒｅｎｚら（１９９１）の“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡの分離と発現）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：４４３８−４４４２を参照）。ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｃＤＮＡの転写の開始はｌａｃＺ’プロモーターの制御下で行われる。プラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１を有するＥ．ｃｏｌｉ菌株は生物発光検定において機能性であり、天然酵素の極めて重要な特性のほとんどを保持しているＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現する（例えば米国特許第５，２９２，６５８号及び第５，４１８，１５５号を参照）。
ｐＴＺＲＬｕｃ−１の誘導体であるｐＴＺＲＬｕｃ−３．６は同一Ｅ．ｃｏｌｉ宿主内に形質転換されるとｐＴＺＲＬｕｃ−１に比して約７倍高い濃度の組換えＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを産生する。コンピーテントＥ．ｃｏｌｉ菌株ＸＬ−１は製造業者が提供する取扱説明書（ＸＬ−１スーパーコンピテント細胞（ＴＭ）及びプロトコル；ストラータジーン社製Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニブ州）に従って精製ｐＴＺＲＬｕｃ−３．６を用いて形質転換された。トランスフェクタントは１００μｇ／ｍｌアンピシリンが添加されたＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）プレート上での平板培養により選択された。
単一アンピシリン耐性コロニーを対数増殖中期に到達するまで、連続振とうにより周囲温度で１００μｇ／ｍｌアンピシリンが添加されたＬＢ培地中で増殖させた（即ち細胞培養物がＯ．Ｄ．600nm＝０．６−０．８単位）。ｌａｃプロモーターからの転写は１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘発され、細胞培養物は周囲温度でさらに８時間に渡って攪拌された。
細胞は１０，０００×ｇで遠心によって回収され、２０℃で冷凍された。細胞ペレットが解凍され、４ｍｇ／ｍｌイソザイムを含有する１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する組成物中に１：５の比率（ｗ／ｗ）で再懸濁させられた（シグマ．ケミカル．コーポレーション）。細胞は２５℃の水浴中に３０分入れられ、その後氷上に約１時間移し替えられた。細胞は、ウルトラソニックス社Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．製のセル・ディスラプチャー（細胞破壊装置）からの１分パルスを使用して０℃での超音波処理によって破壊させられた。
破壊された細胞デブリスは３時間に渡る３０，０００×ｇの遠心分離により取り除かれ、上清はデカンテーションされて保管された。ペレットは上記の組成物中に１：５の比率で再懸濁させられ、溶解及び遠心分離のステップが繰り返された。２つの上清が結合され、−７０℃で貯蔵された。
その結果として生じた「透明溶解物」が組換えルシフェラーゼの原料として使用された。あるいは、さらに溶解物を濃厚にするため、又は精製酵素の均一源を提供するために溶解物にさらに精製ステップを与えてもよい（例えば米国特許第５，２９２，６５８号及び第５，４１８，１５５号を参照）。
実施例１４
装填、充填、再充填用カートリッジおよび充填用生物発光新規用品
図２８〜３４は、例示的な装填、再充填または充填用カートリッジを示している。最初の図２８を参照すると、充填用カートリッジが示され、一般に１０００で示される。この充填用カートリッジは、第１シリンダー１０１０および第２シリンダー１０１２からなる２つのシリンダーをもつブロック１００２、および第１ピストン１００６および第２ピストン１００８を有するプランジャー１００４を含む。追加の室も包含している。また、これらの外に単一室装置とともに使用される装置も提供されている。
図に示す如く、ブロックは、２シリンダー１０１０および１０１２で形成され、またプランジャーは、２つのシリンダー状ピストン１００６と１００８とから形成されている。三角形、四角形またはその他の幾何学的ベッセルもまた、ピストンの形状が、ブロック内に挿入することが可能であれば、どの様なシリンダーにも代えることができる。更に、例えば、プランジャー１００４は、時間差でブロック１００２にピストン１００６および１００８を挿入するため、２つのピストン１００６および１００８を互いに分離できるできるようにしてもよい。
ブロック１００２およびプランジャー１００４は、当業者に既知の生物発光発生系の成分と反応しない材料で製作することができる。ブロック１００２およびプランジャー１００４は、好ましい実施形態において、選択された特殊な形状に、容易に射出成型できるプラスチック材料で作られたブロック１００２およびプランジャー１００４が示されている。好適なプラスチックは、塩化ビニール（ＰＶＣ）、その他のプラスチック、ＴＥＦＬＯＮ、ポリエチレン、またはブロック１００２に貯留され、放出される成分中に挿入される他の材料であるが、これらに限定されない。これらの代わりとして、ブロック１００２およびプランジャー１００４は、機械加工、鋳造されるか、または特殊な形状に製造することができる金属で製作することも可能である。
図２９を参照すると、第１シリンダー１０１０は、プラグ１０１６を有し、これはシール１０２２に対してシリンダー１０１０内に貯留されている生物発光発生系の単数または複数の成分１０１８、好ましくは、ルシフェラーゼ及び／又はルシフェリンおよび必要とされる緩衝液および活性物質、例えば、ＡＴＰまたはＣａ2+、およびより好ましくはルシフェラーゼ、緩衝液および必要な活性物質を、凍結乾燥またはその他の適切な形で含有する乾燥成分１０１８を貯留する。従って、乾燥または濃縮成分１０１８は、プランジャー１００４およびピストン１００６が、第１シリンダー１０１０に挿入されるまで、プラグ１０１６とシール１０２２との間で第１シリンダー内に封入されている。この場合、これらの成分１０１８は、漏斗手段１０２０を経て、シール１０２２を突き破り、ノズル１０２４および外側開口部１０２６を通過して、ブロック１００２から成分１０１８を放出する。また、シール１０２２は、プランジャー１００４に加えられる最小圧力のみで破ることのできる材料で製作されることが好ましい。この様な材料には、例えば、紙、蝋紙、プラスチック紙、フォイル、セロファンまたはその他の必要な特性を発揮することのできる材料が含まれる。
第２シリンダー１０１２は、ブロック１００２に挿入されている液体スリーブ１０１４内に形成されている。この様にして、スリーブ１０１４は、例えば、プラスチック、ガラス、または圧縮可能及び／又は破れ易く、液体１０３０を、スリーブ１０１４から放出することができるその他の材料によるシール管である。スリーブ１０１４は、前もって製作し、ブロック１００２内に挿入する前に、液体１０３０を負荷するか、または、一旦、これをブロック１００２内にセットした場合には、スリーブ１０１４に液体１０３０を注入し、さらにプラグ１０２８によってその中にこの液体を貯留する。
ピストン１００８は第２シリンダー１０１２内にスライドし、プラグ１０２８に当てて、ブロック１００２内に進入させる。進入したプラグ１０２８は、スリーブ１０１４内に液圧を発生させ、これは、シール１０３２を破り、さらに液体１０３０中にマトリックス材料１０３４を任意に浸すことができる。第１シリンダー１０１０内のシール１０２２の如く、第２シリンダー１０１４内のシール１０３２は、プランジャー１００８に加えられる最小圧力のみで破れ、裂けまたは破裂することのできるどの様な材料でも作ることができる。この様な材料としては、紙、蝋紙、プラスチック紙、フォイル、セロファン紙、または必要な特性を発揮できる他の材料でもよい。
マトリックス材料１０３４は、生物発光発生成分を吸着、吸収または結合でき、本書で記述されている如く、生物発光発生系の成分と反応しない多孔質材料とする。必要な場合には、マトリックス材料１０３４は、液体１０３０に含まれ且つ浸され、マトリックス材料に添加された生物発光発生系の成分は、液体１０３０中に放出される。連続的にピストンが前に進むに従って、マトリックス材料から溶出された、生物発光発生成分を含んだ液体は、フィルター１０３６を経て、さらにノズル１０３８と外側開口部１０４０から放出される。また、フィルター１０３６は、第２シリンダー１０１４からマトリックス材料１０３４が放出されるのを防止するために使用されている。結果として、フィルター１０３６は、布または金属織布、または第２シリンダー１０１４内に存在する多様な成分および合成物と反応しない他の材料で製作することができる。
しかしながら、生物発光反応の多種成分は、２つのシリンダー１０１０、１０１２およびマトリックス材料１０３４の間に存在する異なった組合わせ間に分配されている。第１シリンダー１０１０の様なシリンダーは、通常、乾燥または濃縮成分１０１８を含み、さらに第２シリンダー１０１２は、液体１０３０および生物発光反応に不可欠な残りの成分を含有するマトリックス材料を含む。乾燥または濃縮成分は、ルシフェラーゼやルシフェリン、緩衝塩、ＡＴＰ、Ｃａ2+またはその他の必要とされる活性化物質の如き生物発光発生系の成分の組合わせを含有している。また、液体１０３０は、水、緩衝液、有機溶剤、または生物発光新規用品内に放出される生物発光発生系の単数または複数成分を溶解するかまたは懸濁するのに適当な他の水性媒体である。
好ましい実施形態において、乾燥成分１０１８は、粉末状の凍結乾燥ルシフェラーゼおよび緩衝液、および液体は、基剤に添加された若干のルシフェリンを溶解または懸濁するアルコールを含有している。あるいは、Ｖａｒｇｕｌａ系の如き生物発光発生系の全ての成分は、分子酸素の存在しない下で第１および／または第２シリンダー内に添加またはパッケージされ、従って、空気と結合し、また空気に曝露された時に成分は活性化される。
図３０を参照すると、典型的生物発光新規用品１０４２と連結して使用されるカートリッジ１０００が示されている。図に示す如く、ブロック１００２に完全に押し入れられたプランジャー１００４は、第１ピストン１００６および第２ピストン１００８をブロック１００２内に完全に挿入させる。ピストン１００６がブロック１００２内で前進したとき、例えば、乾燥または濃縮成分１０１８が第１シリンダー１０１０から、漏斗１０２０を通過して押し出され、これによってシール１０２２を破り、さらにノズル１０２４および外側開口部１０２６から新規用品１０４２内の室１０４４に放出される。同様に、ピストン１００８が、ブロック１００２内で前進したとき、スリーブ１０１４上のシール１０３２は、破裂して、液体１０３０を放出し、任意にマトリックス材料１０３４を液中に浸す。また、ピストン１００８が、さらに前進したとき、液体１０３０は、フィルター１０３６を通過し、ノズル１０３８および外側開口部１０４０から放出されて、さらに新規用品１０４２の室１０４６に送られる。この様にして、新規用品は、新規用品に必要とされる化学物質の分離を維持する一方、生物発光反応に不可欠な生物発光発生系の成分で十分に再充填される。
図は、本出願における他の箇所の記述と同様、典型的新規用品１０４２のフィルター孔内に挿入されるカートリッジ１０００を示している。例えば、カートリッジは、次の新規用品の如き多数の新規用品、即ち、図１および３に示す室１０、１２に関連するフィルターキャップ１７、１９、図４、５に示すフィルターキャップ８２、８４、図６、７および８に示すフィルターキャップ１０４、１０６、および図２３〜２６に示すハウジング４６６上のフィルターキャップ４０６、４０８に適合させるために採用されている。若干の新規用品は、ここに開示されているカートリッジを使用して新規用品における充填または再充填が規定されているが、このようなことは、単に例示的なものであり、このカートリッジの使用を、これらの特定新規用品へのみ限定することを目的としていないことを認識すべきである。反対に、ここに記述されているカートリッジは、事実上、如何なる生物発光新規用品の充填または再充填にも採用することも可能である。
図３１を参照すると、充填用カートリッジの第２番目の実施形態が示され、一般に１１００で示される。カートリッジ１１００は、実際に、カートリッジ１０００と同様な形状をしており、新規用品内に正確に挿入されない場合における、カートリッジからの事故または偶然による放出を防止するための安全性面での特徴が加わっている。事故による放出は、人間および人間以外の動物にとって物理的に有害ではないが、このような放出は、生物発光物質の早発的放出となる。おそらく、子供のように新規用品の多くについて故意に使用する場合があることを考慮すると、この様な事故による放出の可能性は、さらに増大するものと考えられる。
この例示的な実施形態として、カートリッジ１１００は、カートリッジ１０００と同様、第１ピストン１１０６と第２ピストン１１０８を含むブロック１１０２およびプランジャー１１０４とを含む。しかしながら、カートリッジ１０００とは異なり、各ピストン１１０６および１１０８は、それぞれピストンヘッド１１１０および１１１２を備えてる。これらのピストンヘッドは、キャップ１１１８と連結してブロック１１０２からのプランジャー１１０４の除去を防止している。この結果、カートリッジ１１００は、解体されシリンダー１１１４および１１１６の内容物に直接アクセスすることはできない。ピストンヘッド１１１０、１１１２に加えて、カートリッジ１１００もまた、カートリッジが、新規用品内に挿入されていない間に、ブロック１１０２内にプランジャー１１０４が事故によって押し入れられるのを防止するためのストップ１１２０およびスライド１１２２が備えられている。より詳細には、ストップ１１２０は、通常、ブロック１１０２内への第１ピストン１１０６の前進を防止するために第１ピストン１１０６の経路に位置している。一旦、カートリッジ１１００が、適切な新規用品上に位置した場合には、スライド１１２２は、自動的に上方向に押し上げられ、これによって、ドライピストン１１０６の経路からストップ１１２０が移動する。一旦、ストップ１１２０が経路から外れると、２つのピストン１１０６および１１０８は、ブロック１１０２内に押し入れられ、これにより図２８〜３０に示した内容と同一方法で、第１シリンダー１１１４および第２シリンダー１１１６の内容物を放出する。
図３２を参照すると、適正に装備された新規用品１１５２に関連して使用されるカートリッジ１１００が示されている。図に示す如く、新規用品１１５２は、新規用品１１５２から上方向へと伸びているピン１１６２を備えている。カートリッジ１１００が新規用品１１５２の上に位置しているため、ピン１１６２は、スライド１１２２を上方向に押し上げ、これによってピストン１１０６の経路から、ストップ１１２０が移動する。一旦、ピストン１１０６がブロック内に押し入れられると、ピストン１１０６およびピストン１１０８は、ブロック１１０２に押し入れられる。特に、ピストン１１０６がブロック１１０２に押し入れられると同時に、乾燥または濃縮成分１１２８によって交互にシール１１３０を破るプラグ１１２６を前進させる。一旦、シール１１３０が破れると、乾燥または濃縮成分１１２８は、さらにノズル１１３２および外側開口部１１３４を通過して、新規用品１１５２の第１室１１５４に入る。同様に、プランジャーが押し入れられたとき、ウエットピストン１１０８は、液体シリンダー１１１６に押し入れられ、さらにプラグ１１３８に突き当たる。ウェットピストンが前進するにつれて、プラグ１１３８は、スリーブ１１３６内に水圧を発生させ、この水圧でシール１１４２を破り、液体１１４０をマトリックス材料１１４４、フィルター１１４６、およびノズル１１４８と外側開口部１１５０を経由して新規用品１１５２内の第２室へと放出する。
図３３は、カートリッジ１１００の横断面図で、ピストンヘッド１１１０に関連するストップ１１２０およびスライド１１２２の配置を詳細に示している。図の如く、シリンダー１１１４に十分に伸びたストップ１１２０は、シリンダー１１１４内のピストン１１２６の前進を防止している。ストップ１１２０がピストン１１１０のみの前進を防止する間に、ピストン１１１２は、ピストン１１１０に加えて、またはそれに代わる適当な位置に明らかに停止する。さらに、ストップ１１２０およびスライド１１２２は、ブロック１１０２内の何れかの位置にあり、従って、ピン１１６２は、双方の何れかの位置を占めている新規装置の上に位置することになる。スプリング（図示されない）は、ストップ１１２０を静止位置に保持するために使用され、従って、スライド１１２２の移動によってのみ、ドライピストン１１０６は、ブロック内で前進することができる。また、スプリング（図示されない）は、ブロック１１０２内の孔１１２４方向にスライドを自然に移動させる位置となり、これによりピン１１６２の介入なしでスライドの事故による移動を防止することができる。
上記のカートリッジに加えて、その他の手段が、ここに記述されている種々の新規用品と共同して生物発光発生系の内容物の漏出を最小限にするために採用されている。特に、生物発光発生系の成分漏出を最小限にするために、新規用品１１５２は新規用品１１５２の室１１５４と１１５６をシールするのに使用される移動式キャップ１１６４を備える。さらに、一連のシール１１５８および１１６０、または一方向シールバルブは、これらが新規用品１１５２の室内に位置することによって、成分の漏出を防止することができる。シール１１６０は、通常、一方向の物質通過を防止するために閉位置にバイアスしているタイプである。本出願で、シール１１６０は、閉方向にバイアスされ、従って室１１５４および１１５６内の物質は室内に保持されている。シール１１５８および１１６０を経てノズル１１３２および１１４８を挿入したときにのみ、物質がシールを通過することができる。この様にして、一旦、シール１１５８および１１６０を経て新規用品１１５２中にノズル１１３２および１１４８挿入すると、シリンダー１１２８および１１４０の内容物を容易に注入することができる。しかしながら、一旦、内容物が注入されると、ノズルが移動し、室１１５４、１１５６から化学物質が漏れるのを防止するために、通常の閉位置のバイアスに戻る。
さらに、他のカートリッジの代替の実施形態として、図３４に、注入用シリンジが示され、一般に１２００で示される。シリンジ１２００は、円周フランジ（またはボディの各側面から伸びる一対のタブ）１２０４を含むボディおよびプランジャー１２０６とを含む。この構造は、新規用品の片手による操作を可能にしている。さらに、使用者の人差し指と中指との間で、円周フランジに接しているボディを鋏み、親指を用いてプランジャー１２０６をボディ１２０２内に前進させることにより、注入用シリンジ１２００中の内容物全部を新規用品内に注入することができる。
プランジャー１２０６は、それぞれプラグ１２１２と１２２０を含む２つのピストン１２１０および１２０８を含む。これらのプラグ１２１２および１２２０は、シリンダー、例えば、シリンダー１２１３および１２２１内にきっちりと挿入可能なサイズになっている。一つのシリンダー、例えば、シリンダー１２１３は、乾燥成分１２１４で充填され、さらにシール１２１６に対して適当な位置に支持されている。上記のカートリッジ１０００および１１００と同様、ピストン１２１２がシリンダー１２１３内を前進すると、シール１２１６が破裂しノズル１２１８から成分１２１４が放出され、新規用品１２３２の室１２３４に入る。
プラグ１２２０は、シリンダー１２２１内に位置し、例えば、シール１２２４とプラグ１２２０との間に、液体１２２２を貯留する。上記のカートリッジと同様、ピストン１２０８がボディ１２０２中を前進すると、シリンダー１２２１内の液圧が上昇し、これによりシール１２２４が破裂する。一旦、シールが破れると、液体が放出し、生物発光発生系の単数または複数成分を液中で溶解するために、マトリックス材料１２２６を任意に液体に浸す。ピストン１２１２がさらに前進したとき、液体１２２２は、フィルター１２２８を経てノズル１２３０から新規用品１２３２の室１２３６内に放出される。
ノズル１２１８および１２３０の代替法として、混合用室（図示されない）をボディ１２０２内に形成するか、またはこれに取り付けることができる。このような室は、新規用品内に化学物質を導入する前に、乾燥成分１２１４および液体１２２２の完全な混合を可能にする。この様な液体混合は、化学物質注入用ポートが単一室の新規用品内での直接反応が必要となるまでに、生物発光発生系の成分を分離することができない場合には有利である。さらにまた、混合室は、カートリッジ１０００と１１００内、またはそれに連結してに容易に形成できることが認めれている。
図示および本書で記述されている充填用カートリッジ１０００、１１００および１２００は、実際に、液状または固体の形状で、分離または共同で生物発光発生系の成分を貯留するシリンダー状室である。しかしながら、如何なる形状の室も本実施例において意図され定屡ことを認識すべきである。また特に、カートリッジ１０００および１１００は、矩形横断面を有する一対の室で構成されているか、またはシリンダー状ブロックの半分を示す半円横断面をもつ各室で構成されている。事実、ブロックおよび室に関する如何なる形状も本実施例では意図されており、図２８〜３４に図示されている特定の実施形態は、単なる例示に過ぎない。
さらに、代替的実施形態（図示されていない）としては、カートリッジ１０００と１１００のシリンダー状室を、ブロック内に設置し、必要とされる化学物質を充填でき、容易に配管内の化学物質の排出もできる圧縮用配管に交換する方法がある。圧縮配管は、プラスチック、ゴムの如き化学物質またはその他の物質を含有している十分に堅固で、ピストンを使用して化学物質を放出することができる十分曲げ易い如何なる物質を用いても製作することができる。配管は、配管壁内に前もって形成されたひだをもつアコーディオン型で製作することができ、または化学物質の放出が簡単にできるならば如何なる方法によっても製作することができる。このよりな配管構造は、ブロック内に化学物質を貯留するためのプラグが不要となり、さらに生物発光成分の直接操作が無くなることによってカートリッジの製造も簡単となる。
ブロックおよびプランジャーを有するカートリッジの代替法として、化学物質配管の圧縮を可能にする曲げ易い材料またはブロックの側面を圧搾するのに適した材料から作られたブロックをもつ構造にする方法がある。換言すれば、化学物質配管を圧搾するピストンを含むプランジャーを必要とする代わりに、ブロックは、ブロック内に収容されている化学物質配管でシールでき、同時に、化学物質が化学物質配管内での破裂に必要な圧力を発生させるためブロックの側面を圧搾することにより化学物質を排出できる。
さらに、生物発光新規用品を充填及び／又は再充填するための充填用カートリッジの外に、ブロック内に圧縮用配管を組み合わせたカートリッジを、ブロック内で圧縮用配管部分の交換ができるような構造にすることができる。より詳細には、一旦、カートリッジは、新規用品を充填または再充填するために使用されると、液体および少なくとも生物発光反応の１成分を有する圧縮用配管が、ブロックから取り外され、新しい化学物質配管のセットがブロック内に装填される。結果として、カートリッジは、反復使用され、化学物質配管のみを取り替えることになる。このことは、使用後、カートリッジ全体を廃棄する代わりに、化学物質配管部分のみを取り替えれば良いため、新規用品の使用および繰り返し使用によるコストを最小限に抑制することができる。
改造については、明らかに当業者の権利に属し、本発明は特許請求の範囲内に限定されるものとする。
本配列表に示す一連の代表的ルシフェラーゼおよび還元酵素の概要
１．配列番号１．Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｉｎｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ［米国特許番号５，４１８，１５５］
２．配列番号２．Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉルシフェラーゼ［ＥＰ  Ｏ  ３８７３５５］
３．配列番号３．修飾  Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔｅルシフェラーゼ［蛍；米国特許番号４，９６８，６１３］
４．配列番号４．Ｖａｒｇｕｌａ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８９）］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８６：６５６７−６５７１および、ＪＰ３−３０６７８  Ｏｓａｋａ
５．配列番号５．アポエクオリンをコードする遺伝子［米国特許番号５，０９３，２４０，ｐＡＱ４４０］
６．配列番号６．遺伝子組換え  Ａｅｑｕｏｒｉｎ  ＡＥＱ１［Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８７）］「エクオリンイソタイプをコードするｃＤＮＡの配列比較」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６：１３２６−１３３２
７．配列番号７．遺伝子組換えエクオリンＡＥＱ２［Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８７）］
８．配列番号８．遺伝子組換えエクオリンＡＥＱ３［Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８７）］
９．配列番号９．エクオリン発光タンパク質［Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら（１９８５）］
「カルシウム依存性発光タンパク質エクオリンのアミノ酸配列」Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ  ２４：６７６２−６７７１
１０．配列番号１０．生物発光活性が上昇したエクオリン変異体［米国特許番号５，３６０，７２８，Ａｓｐ１２４からＳｅｒに変更］
１１．配列番号１１．生物発光活性が上昇したエクオリン変異体［米国特許番号５，３６０，７２８，Ｇｌｕ１３５からＳｅｒに変更］
１２．配列番号１２．生物発光活性が上昇したエクオリン変異体［米国特許番号５，３６０，７２８，Ｇｌｙ１２９からＡｌａに変更］
１３．配列番号１３．遺伝子組換えアポエクオリン［エクオリンを形成するために再構成し、ＡＱＵＡＬＩＴＥ▲Ｒ▼の製品名でＳｅａｌｉｔｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｇａｒｔ、ＧＡから販売］
１４．配列番号１４．Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉフラビン還元酵素［米国特許番号５，４８４，７２３］
［配列表］
配列番号：１
配列の長さ：１１９６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．９４２
その他の情報：Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｉｎｆｏｒｍｉｓ  ルシフェラーゼ
公表情報：特許番号：５，４１８，１５５
配列
0004146515.tif 000018
0004146515.tif 000019
配列番号：２
配列の長さ：１８２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．１６６５
その他の情報：Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ  ルシフェラーゼ
公表情報：特許番号：ＥＰ  Ｏ  ３８７  ３５５  ＴＯＲＡＹ
配列
0004146515.tif 000020
0004146515.tif 000021
0004146515.tif 000022
配列番号：３
配列の長さ：１６４４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．１６４４
その他の情報：Ｌｕｃｉｏｌａ  Ｃｒｕｃｉａｔａ  ルシフェラーゼ（蛍）
公表情報：特許番号：４，９６８，６１３
配列
0004146515.tif 000023
0004146515.tif 000024
0004146515.tif 000025
配列番号：４
配列の長さ：１８２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．１６６４
その他の情報：Ｖａｒｇｌａ（ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ
公表情報：ＴｈｏｍｐｓｏｎらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６，６５６７−６５７１（１９８９）
配列
0004146515.tif 000026
0004146515.tif 000027
0004146515.tif 000028
配列番号：５
配列の長さ：９５８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１１５．．７０２
その他の情報：アポエクオリンをコードする遺伝子
公表情報：特許番号：５，０９３，２４０
Ｉｎｏｕｙｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，３１５４−３１５８（１９８５）
配列
0004146515.tif 000029
配列番号：６
配列の長さ：５９１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５８８
その他の情報：遺伝子組換えエクオリン  ＡＥＱ１
公表情報：Ｐｒａｓｈｅｒら、「エクオリン  アイソタイプをコードする配列の比較」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，１３２６−１３３２（１９８７）
配列
0004146515.tif 000030
配列番号：７
配列の長さ：５９１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５８８
その他の情報：遺伝子組換えエクオリン  ＡＥＱ２
公表情報：Ｐｒａｓｈｅｒら、「エクオリン  アイソタイプをコードする配列の比較」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，１３２６−１３３２（１９８７）
配列
0004146515.tif 000031
配列番号：８
配列の長さ：５９１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５８８
その他の情報：遺伝子組換えエクオリン  ＡＥＱ３
公表情報：Ｐｒａｓｈｅｒら、「エクオリン  アイソタイプの配列の比較」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，１３２６−１３３２（１９８７）
配列
0004146515.tif 000032
配列番号：９
配列の長さ：５６７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５６７
その他の情報：エクオリン発光タンパク質
公表情報：Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら、「カルシウム依存性発光タンパク質エクオリンのアミノ酸配列」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，６７６２−６７７１（１９８５）
配列
0004146515.tif 000033
配列番号：１０
配列の長さ：５８８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５８８
その他の情報：生物発光活性が上昇したエクオリン変異体
公表情報：特許番号：５，３６０，７２８
関連残基：Ａｓｐ１２４からＳｅｒに変更
配列
0004146515.tif 000034
配列番号：１１
配列の長さ：５８８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５８８
その他の情報：生物発光活性が上昇した遺伝子組換えエクオリン部位特異的変異体
公表情報：特許番号：５，３６０，７２８
関連残基：Ｇｌｕ１３５からＳｅｒに変更
配列
0004146515.tif 000035
配列番号：１２
配列の長さ：５８８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：
起源：
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５８８
その他の情報：生物発光活性が上昇した遺伝子組換えエクオリン部位特異的変異体
公表情報：特許番号：５，３６０，７２８
配列
0004146515.tif 000036
配列番号：１３
配列の長さ：５６７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
存在位置：１．．５６７
その他の情報：遺伝子組換えアポエクオリン（ＡＱＵＡＬＩＴＥ▲Ｒ▼）
配列
0004146515.tif 000037
配列番号：１４
配列の長さ：２３６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
公告情報：特許番号：５，４８４，７２３
配列の特徴：
その他の情報：Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉフラビン還元酵素
配列
0004146515.tif 000038
【図１】
0004146515.tif 000039
【図２】
0004146515.tif 000040
【図３】
0004146515.tif 000041
【図４】
0004146515.tif 000042
【図５】
0004146515.tif 000043
【図６】
0004146515.tif 000044
【図７】
0004146515.tif 000045
【図８】
0004146515.tif 000046
【図９】
0004146515.tif 000047
【図１０】
0004146515.tif 000048
【図１１】
0004146515.tif 000049
【図１２】
0004146515.tif 000050
【図１３】
0004146515.tif 000051
【図１４】
0004146515.tif 000052
【図１５】
0004146515.tif 000053
【図１６】
0004146515.tif 000054
【図１７】
0004146515.tif 000055
【図１８】
0004146515.tif 000056
【図１９】
0004146515.tif 000057
【図２０】
0004146515.tif 000058
【図２１】
0004146515.tif 000059
【図２２】
0004146515.tif 000060
【図２７】
0004146515.tif 000061
【図２３】
0004146515.tif 000062
【図２４】
0004146515.tif 000063
【図２５】
0004146515.tif 000064
【図２６】
0004146515.tif 000065
【図２８】
0004146515.tif 000066
【図２９】
0004146515.tif 000067
【図３０】
0004146515.tif 000068
【図３１】
0004146515.tif 000069
【図３２】
0004146515.tif 000070
【図３３】
0004146515.tif 000071
【図３４】
0004146515.tif 000072
【図３５】
0004146515.tif 000073
【図３６】
0004146515.tif 000074
【図３７】
0004146515.tif 000075
【図３８】
0004146515.tif 000076
【図３９】
0004146515.tif 000077
【図４０】
0004146515.tif 000078
【図４１】
0004146515.tif 000079
【図４２】
0004146515.tif 000080
【図４３】
0004146515.tif 000081
【図４４】
0004146515.tif 000082