(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析により得られる下記構造式で表される二糖体組成において（ａ）の規定を充たし、且つ（ｂ）に規定する物性を有するヘパリンがアフィニティークロマトグラフィー用担体に結合していることを特徴とするヘパリン結合担体。
（ａ）ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓのそれぞれのモル％が全て３％以下であり、ΔＤｉＨＳ−６Ｓのモル％が５０％以上である。（但し、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1、Ｒ2、Ｒ3がＳＯ3-であることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1及びＲ2がＳＯ3-であり、Ｒ3がＨであることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1がＨであり、Ｒ2及びＲ3がＳＯ3-であることを意味し、更にΔＤｉＨＳ−６Ｓは、式中においてＲ1がＳＯ3-であり、Ｒ2及びＲ3がＨであることを意味する。）
（ｂ）平均分子量が９，０００〜１１，０００Ｄａである。
【化１】
0004166846.tif 000007
【請求項２】
ヘパリンがその還元末端において共有結合を介して該担体に結合していることを特徴とする請求項１記載のヘパリン結合担体。
【請求項３】
該担体が、アミノアガロースであることを特徴とする請求項１又は２に記載のヘパリン結合担体。
【請求項４】
フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの含有物から、請求項１〜３のいずれか一項記載のヘパリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより当該酵素を分離することを特徴とするフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。
【請求項５】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を包含することを特徴とする請求項４記載のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。
（ａ） フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの含有物を、コンドロイチンポリ硫酸固定化アフィニティークロマトグラフィーを行い分画すること及び（ｂ） 工程（ａ）で得られる吸着画分を、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘパリン結合担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、該酵素を選択的に吸着させ、溶出すること。
【請求項６】
請求項５記載の分離方法において、更に工程（ｂ）で得られる溶出物を分子ふるいにより精製することを特徴とするフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。
【請求項７】
フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの含有物は哺乳動物の組織から得られることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項記載のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。
【請求項８】
請求項７記載の分離方法において、哺乳動物の組織が筋肉、肝臓、心臓、腎臓及び脳からなる群から選択される１つ以上の組織であることを特徴とするフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘパリンが結合した担体及び該ヘパリン結合担体を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの含有物から当該酵素を分離する方法に関するものであり、さらに、当該酵素に特異的な親和性を有するヘパリンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンは、ウロン酸残基とグルコサミン残基から成る二糖単位の連なったヘパリン骨格を有し、そのウロン酸残基の２位水酸基並びにグルコサミン残基の２位アミノ基及び６位水酸基が様々な程度に硫酸化されているグリコサミノグリカンの一種である。この物質は一般にアンチトロンビンIII結合部位を有し（FEBS Lett.(1980)117, 203-206）、ATIIIとの結合の結果としてトロンビン活性を阻害して抗凝固活性を発現するため、古くから透析治療薬等の成果を向上させるための医薬品として盛んに用いられてきた。また、ヘパリンがリポプロテインリパーゼと相互作用すること（J. Biol. Chem.(1981)256, 12893-12898）、塩基性繊維芽細胞増殖因子と親和性を有すること（J. Cell Biol.(1990)111, 1651-1659）など、様々な生理活性物質と相互作用することが明らかになってきた。
【０００３】
上記のようにヘパリンは様々な物質と親和性を有することから、ヘパリンと生理活性物質の結合に関与する構造の解明が着目されつつあり、またATIII結合部位に由来する抗凝固作用を低減させた上で、生理活性物質との相互作用を増強させることを目的として、ヘパリンポリマーの脱硫酸化を中心とした化学修飾が盛んに行われている（J. Carbohydr.Chem.(1993)12, 507-521；Carbohydr. Res.,193, 165-172(1989)；Carbohydr. Res.46,87-95(1976)；Can. J. Chem.,67, 1449(1989)；米国特許第5,296,471号）。また、ヘパリンを硫酸化及び脱硫酸化等の手法を用いて修飾することによりヘパリン誘導体が創作されているが、そのヘパリン誘導体の中には生理活性物質と親和性を有するものがあるので、生理活性物質と親和性を有したり、あるいは生理活性物質の活性を制御し得るヘパリン誘導体の探索が行われている。
【０００４】
一方、進行性筋ジストロフィー、急性肝炎、心筋梗塞、悪性腫瘍の診断上有用な酵素であるフルクトース−１,６−ビスリン酸アルドラーゼ(EC 4.1.2.13)は、これまで筋肉、肝臓、心臓、腎臓、および脳などから得られた粗抽出物から、硫安沈殿、リン酸セルロースカラムクロマトグラフィー、DEAEセルロースカラムクロマトグラフィーさらには結晶化法等の手法を複雑に組み合わせることにより単離・精製されたもの（Methods Enzymol.(1975)42, 240-249）が供給されてきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼは上述の各種疾患の診断上有用であり、単離された状態で必要とされているにもかかわらず、当該酵素を得る手段は複雑なカラムワークが必須であった。しかし、前記カラムワークによって得られる酵素は非常に微量であり、大量の当該酵素を得るためには簡略化された効率のよい精製方法が必要とされていた。
本発明は、特定の担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる極めて簡便な手法で当該酵素を分離・精製する方法を提供し、更にその為の該酵素にたいする親和性を有する特定構造のヘパリン及びヘパリン結合担体を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヘパリン骨格（ウロン酸とグルコサミンの繰り返し構造）を有するグリコサミノグリカンが様々な生理活性物質と親和性を有することに注目し、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼが特定の構造を有するヘパリンに親和性が高く、当該ヘパリンが結合した担体を使用するアフィニティクロマトグラフィーにより、上記酵素の含有物から該酵素のみを高純度に分離・精製することができることを見出し本発明を完成した。すなわち、５０％以上のグルコサミンの６位の水酸基が硫酸化されたヘパリンは上記酵素との高い親和性を有しているので、このようなヘパリンを結合したヘパリン結合担体を用いて、上記酵素の含有物から酵素を単離、精製する過程でアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行えば前記酵素を効率的に、且つ高純度で分離・精製し得るのである。そして、上記アフィニティ担体に結合するヘパリンとしては、６位の水酸基が硫酸化されたグルコサミンが５０％以上で、しかも２位のアミノ基に硫酸基が結合したグルコサミン残基が多くても１０％であり、更にヘパリン中のウロン酸残基の５０％以上が２−Ｏ−硫酸基を有しないヘパリンが最も効率よく前記酵素を分離・精製することを可能にするのである。
【０００７】
本発明の第１の要旨は、グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析により得られる下記構造式で表される二糖体組成において（ａ）の規定を充たし、且つ（ｂ）に規定する物性を有するヘパリンがアフィニティークロマトグラフィー用担体に結合していることを特徴とするヘパリン結合担体であり、
（ａ）ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓのそれぞれのモル％が全て３％以下であり、ΔＤｉＨＳ−６Ｓのモル％が５０％以上である。（但し、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1、Ｒ2、Ｒ3がＳＯ3-であることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1及びＲ2がＳＯ3-であり、Ｒ3がＨであることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1がＨであり、Ｒ2及びＲ3がＳＯ3-であることを意味し、更にΔＤｉＨＳ−６Ｓは、式中においてＲ1がＳＯ3-であり、Ｒ2及びＲ3がＨであることを意味する。）
（ｂ）平均分子量が９，０００〜１１，０００Ｄａである。
【化１】
0004166846.tif 000002
第２の要旨は、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの含有物から、本発明のヘパリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより当該酵素を分離する方法に存する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を詳説する。
本発明のヘパリン結合担体は５０％以上のグルコサミン残基の６位が硫酸化しているヘパリン、特に、５０％以上のグルコサミン残基の６位が硫酸化し、さらに２位にＮ−硫酸基を有するグルコサミン残基は多くても１０％であるヘパリンが担体に結合しているものである。
本発明の結合担体における担体としては、特に限定はされず、不溶性担体、水溶性高分子担体が使用される。不溶性担体としては、クロマトグラフィー用担体として使用されている不溶性天然高分子及びその活性化物のような担体が好ましい。例えばアミノアガロース、アミノヘキシルアガロース及び臭化シアン活性化アガロース等が挙げられ、アミノアガロースが最も好ましいが特に限定はされない。これらの担体としては、セファロース、バイオゲル等の商品名で市販されているものから適宜選ぶこともできる。水溶性高分子担体としては、ポリエチレングリコール等が用いられる。
【０００９】
本発明において上記担体に結合するヘパリンとしては、その平均分子量は特に限定されないが、通常８，０００〜１３，０００Ｄａ、好ましくは９，０００〜１１，０００Ｄａである。又、その好ましい構造としては、ヘパリン骨格中５０％以上のグルコサミン残基の６位の水酸基が硫酸化されており、しかも２位にＮ−硫酸基を有するグルコサミン残基は多くても１０％であることを特徴とする。このようなヘパリンとしては、グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析により得られる下記構造式で表される二糖体組成において（ａ）の規定を充たし、且つ（ｂ）に規定する物性を有することを特徴とするヘパリンが最も好ましい。
（ａ）ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓのそれぞれのモル％が全て３％以下であり、ΔＤｉＨＳ−６Ｓのモル％が５０％以上である。
（但し、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1、Ｒ2、Ｒ3がＳＯ3-であることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1及びＲ2がＳＯ3-であり、Ｒ3がＨであることを意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓは、式中においてＲ1がＨであり、Ｒ2及びＲ3がＳＯ3-であることを意味し、更にΔＤｉＨＳ−６Ｓは、式中においてＲ1がＳＯ3-であり、Ｒ2及びＲ3がＨであることを意味する。）
（ｂ）平均分子量が９，０００〜１１，０００Ｄａである。
【００１０】
【化１】
0004166846.tif 000003
【００１１】
更に好ましいヘパリンは、上記（ａ）及び（ｂ）の規定に加えて、二糖体組成においてΔＤｉＨＳ−ＮＳのモル％が３％以下であることを満たすものである（但し、ΔＤｉＨＳ−ＮＳは、上記式中においてＲ1及びＲ3がＨでありＲ2がＳＯ3-であることを意味する。）。
本発明のヘパリン結合担体としては、これらの最適ヘパリンをアミノアガロースに結合させたものが最も好ましい。
本発明の上記特定の構造を有するヘパリンは、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼに対し親和性を有するものである。ここで、親和性とは、後述の試験例４に示すフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの活性測定法により測定し、その比活性が少なくとも１．０であることを意味する。
【００１２】
本発明における上記ヘパリンの二糖体組成は、後述する実施例に記載の二糖分析法による測定値から算出したものであり、また分子量は実施例に記載の分子量測定法による測定値である。二糖体組成は試験法１に記載の酵素消化による二糖分析により得られる特定が可能な構造をもつ不飽和二糖の量［ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ、ΔＤｉＨＳ−ＵＳ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓのモル％の合計］を１００％として、上記特定の構造をもつ二糖の割合を示したものであり、当該数値は酵素消化前のヘパリンの構成糖における硫酸化の位置を反映するものである。
なお、本願明細書において、二糖体組成の表記は、下記を意味する。
【００１３】
【表１】
0004166846.tif 000004
【００１５】
本発明ヘパリン結合担体に結合するヘパリンの製造方法としては、市販のヘパリン中のグルコサミンの６位の水酸基を硫酸化することによって得ることが可能であるが、上述の最も好ましいヘパリンは、市販のヘパリンを公知の完全脱硫酸化法により脱硫酸化した後にグルコサミンのアミノ基をアセチル化した後、特公平６−９９４８５に記載の方法等によりグルコサミンの６位の水酸基を選択的に硫酸化することによって得ることが可能である。グルコサミンの６位の水酸基が選択的に硫酸化されたヘパリンを、以下選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンと記載する。
【００１６】
最適ヘパリンの具体的製造法としては、例えば以下の方法が挙げられる。５００ｍｇのヘパリン（ブタ小腸由来：ＳＰＬ社製）を１０ｍｌの蒸留水に溶解後、蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０Ｂカラム（φ2 x 15cm）に吸着させ、溶出液の酸性画分を回収し、ピリジンを添加してｐＨを５．０〜７．５、好ましくは６．０〜７．０に調整する。この溶液を凍結乾燥することにより、ヘパリンピリジニウム塩を得る。得られたヘパリンピリジニウム塩５００ｍｇに対し、例えば５ｍｌのメタノール、３０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び１５ｍｌの１，４−ジオキサンを添加してヘパリンピリジニウム塩を完全に溶解し、この溶液を、Ogamoらの方法（Carbohydr. Res.,193, 165-172(1989)）に従って、８０〜９５℃にて２０時間以上、好ましくは４０時間以上、より好ましくは６０〜７５時間加熱することによりヘパリンの完全脱硫酸化を行う。脱硫酸反応終了後、１００〜２００ｍｌの氷冷蒸留水を添加し、反応混液のｐＨをＮａＯＨを添加することにより８〜１１、好ましくは９〜１０に調整する。次いで、反応混液を蒸留水に対して２０時間以上透析した後、透析内液を凍結乾燥処理し、完全脱硫酸化ヘパリンを黄色パウダーとして回収できる。
【００１７】
次いで、Danishefskyらの方法（Arch. Biochem. Biophys.,90, 114-121(1960)）に従い、完全脱硫酸化ヘパリンのグルコサミンのＮ−アセチル化反応を行う。例えば、４００ｍｇの完全脱硫酸化ヘパリンを６０ｍｌの５０ｍＭの炭酸ナトリウムを含む１０％メタノールに溶解した後、酢酸を適量添加して溶液のｐＨを６以上、好ましくは７〜８の間に調整する。次いで、反応混液を氷冷しながら、よく撹拌する。次の１時間の間に３００〜５００μｌの無水酢酸を５〜８回添加し、そのたびごとに低下した反応混液のｐＨを、飽和炭酸ナトリウムを含む１０％メタノールを適量添加することにより、７〜８の間に調整する。反応終了後、１００〜１５０ｍｌの蒸留水を添加し、蒸留水に対して４８時間以上、好ましくは７２時間程度透析する。透析内液を凍結乾燥することにより 完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリンを得ることができる。
【００１８】
次いで、４００ｍｇの完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリンを１０ｍｌ程度の蒸留水に溶解した後、蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０Ｂカラム（φ２×１５ｃｍ）に通塔し、溶出液の酸性画分を回収し、１０％トリブチルアミンエタノール溶液を添加してｐＨを４．５〜７．０、好ましくは５．５〜６．５に調整する。この溶液を凍結乾燥することにより得られる完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリントリブチルアンモニウム塩を、Takanoらの方法（Biosci. Biotech. Biochem.,56, 1413-1416(1992)）に従い、５〜１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して氷冷した後、１０〜１５ｍｌの４．６ｍｌジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を含むＤＭＦを添加する。さらに撹拌した後、４〜５ｍｌの１．２ｍｍｏｌ硫酸を含むＤＭＦを添加し、氷冷条件下にて１０〜２０分間撹拌を続けて反応を進行させる。反応終了後、反応混液全量を５０〜１００ｇの氷中に投入し、直ちに炭酸水素ナトリウムで中和してｐＨを６．５〜７．５に調整する。次いで、この反応混液を蒸留水に対して透析した後、ガラス繊維濾紙、メンブレンフィルター（４．５μｍ）の順に通して、ジシクロヘキシル尿素の塩を除去した後、凍結乾燥処理を施すことにより選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを合成することができる。
【００１９】
本発明においてヘパリンの担体への結合方法は特に限定はされないが、共有結合が好ましく、ヘパリンの還元末端部に存在しうるアルデヒド基と担体が共有結合していることが結合力が強く、アフィニティー担体として最も好ましい。
上記のようにして得た選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを担体に結合することにより本発明ヘパリン結合担体とすることができる。選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの種々の官能基と活性化クロマトグラフィー用坦体（アミノ基等の官能基を導入した誘導体）の官能基とのカップリング反応を利用して選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの坦体への固定化を行うことができる。一般には、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン分子中の還元末端部に存在しうるアルデヒド基を担体とのカップリング反応に使用することが好ましく、この場合は、担体としてアミノ基を有する不溶性担体（例えば、アミノヘキシルアガロース又はアミノアガロース）を使用する。又、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン分子中のカルボキシル基を担体とのカップリング反応に使用する場合は、担体として上記と同様のアミノ基を有する担体を使用し、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン分子中の遊離のアミノ基を担体とのカップリング反応に使用する場合は臭化シアン活性化アガロースの担体を使用する。アミノアガロースの担体がヘパリンと最も結合し易いため好ましい。
【００２０】
選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンと担体とを結合させる方法としては以下の方法が挙げられる。選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン中の還元末端部に存在しうるアルデヒド基とアミノアガロースゲルのアミノ基を結合する方法としては、シッフ塩基を形成した後、NaB(CN)H3等の還元剤を作用させ、アルキルアミノ架橋を生成させる。この方法としては、例えば公知の一般的な方法で行うことが可能であり、Sakaiらの方法（J. Chromatogr.,400, 123(1987)）等が挙げられる。
また、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン中ウロン酸残基中のカルボキシル基とアミノアガロースゲルのアミノ基を結合する方法としては、該カルボキシル基を１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカルボジイミド試薬により活性化して酸アミド結合(-CONH-)の架橋を生成させる方法である。しかし、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの立体構造上、担体としてより結合力が強いと考えられる前者の結合方法が好ましい。
【００２１】
選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンが結合したヘパリン結合担体中に未反応（遊離）のアミノ基が残存すると、非特異的な相互作用を引き起こし、特にアフィニティークロマトグラフィーの担体として使用した際に特異的な結合が起こらず、不特定物質を結合するため好ましくない。従って、ヘパリン結合担体中の未反応の残存アミノ基は以下の方法によりアセチル化して不活化することが好ましい。すなわち例えば、上記で調製したヘパリン結合担体を５ｍｌの０．２Ｍ  酢酸ナトリウム溶液に懸濁させ、２．５ｍｌの無水酢酸を添加して氷冷条件下にて２０〜４０分間、次いで室温にて２０〜４０分間反応させることによってアミノ基をアセチル化し不活化することが可能である。
ヘパリンの固定化（場合により、更にアセチル化反応後）したヘパリン結合担体は、水洗して完全に脱塩することが好ましい。
また、Bitter&Muirの方法（Anal. Biochem.,4, 330-334(1962)）に従ってカルボキシル基の定量を行い、単位重量あたりのアガロースゲルに固定化された選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの重量を見積ることにより、ヘパリンの固定化量を確認することが可能である。
【００２２】
本発明の不溶性担体にヘパリンが結合した結合担体は、カラムに充填して酵素含有物と接触させ、非吸着画分と分離するのに使用出来、またバッチ法で酵素含有物と接触後、濾過、遠心分離等により分離することもできる。また、水溶性高分子担体とヘパリンとの結合担体は、酵素含有物と接触させた後、分子ふるい等の方法で分離することができる。
【００２３】
本発明のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼを分離・精製する方法は、上記本発明ヘパリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの含有物から当該酵素を分離・精製する方法である。
本発明方法においては、本発明ヘパリン結合担体を使用したアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法であれば、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼを分離・精製する為に、常法に従い付随的に行われる予備処理等の他の処理操作は特に制限されない。本発明の好ましい態様として、例えば、当該酵素の素材原料をホモジナイズして得られた液状物をコンドロイチンポリ硫酸固定化アフィニティークロマトグラフィーを行って分画し、その吸着画分の流出物を本発明ヘパリン結合担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより分画し、その吸着画分から上記酵素を分離・取得する方法が挙げられる。
【００２４】
本発明方法におけるアフィニティークロマトグラフィーは、本発明のヘパリン結合担体を充填したカラムを使用し、それ以外の操作は常法に従っておこなわれ、その特異的吸着画分を溶離剤（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどのアルカリ金属塩水溶液）で処理することにより、酵素を含有した溶出物を得ることが出来る。更に、この溶出物をゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過等の分子ふるいを行って、より高純度の酵素を得ることができる。
【００２５】
本発明方法においてフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼを分離・精製するための素材原料は、上記酵素が発現している組織であれば限定はされないが、哺乳動物類由来の組織が好ましい。組織としては、好ましくは筋肉、肝臓、心臓、腎臓及び脳などが挙げられ、その中でも脳が好ましく、特に大脳が好ましい。これらの組織を、通常、緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離したものを酵素源として用いる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り本実施例により限定されることはない。
なお、実施例における各試験法は、以下の通りである。
【００２７】
試験法１
［酵素消化による二糖分析］
ヘパリンの硫酸基の位置の分析は、次のようにして行った。すなわち、それぞれの硫酸化多糖を酵素消化し、生成した不飽和二糖（前記構造式：化１）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した（新生化学実験講座３、糖質II（東京化学同人刊、１９９１）、４９−６２頁に記載の「２・８グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組み合わせた構造解析」参照）。各不飽和二糖のピーク面積を計算して、全面積に対するピーク面積をパーセントとして表した。
【００２８】
（１）ヘパリンの完全脱硫酸化６−Ｏ−硫酸化処理によって生成したヘパリンの分解酵素による消化
新生化学実験講座３、糖質II  ５４−５９頁に記載の方法により、ヘパリン１．０ｍｇを２ｍＭ酢酸カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）溶液２２０μｌに溶解して、２０ｍＵのヘパリチナーゼ、２０ｍＵのヘパリチナーゼＩ及びＩＩを加えて、３７℃、２時間反応させた。
【００２９】
（２）ＨＰＬＣによる分析
ヘパリンの分解酵素による消化を行った後の溶液２０μｌを、ＨＰＬＣ（医理化、モデル８５２型）を用いて分析した。イオン交換カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１カラム  φ４．０ｍｍ×２５０ｍｍ）を使用し、２３２ｎｍでの吸光度を測定した。流速１ｍｌ／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（５０ｍＭ→２．５Ｍ）を用いる方法に準拠した（Kariya, et al.,Comp.Biochem.Physiol.,103B,473,(1992)）。
【００３０】
試験法２
［分子量測定］
ヘパリンの３％溶液１０μｌをＨＰＬＣによるゲルろ過で分析した。カラムはＴＳＫｇｅｌ−（Ｇ４０００＋Ｇ３０００＋Ｇ２５００）ＰＷXL（東ソー、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用い、溶離液に０．２Ｍ塩化ナトリウムを使用して、１．０ｍｌ／分の流速で展開した。ヘパリンの検出には、示差屈折計（島津製作所、ＡＩＤ−２Ａ）を用いた。平均分子量はヘパリンの分子量標準品を対照にして求めた（Kaneda et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,220 ,108-112(1996)）。標準ヘパリンの分子量の測定は光散乱法を用いて行った（Nagasawa et al., J. Biochem.,81 ,989-993(1977)）。
【００３１】
試験例３
［ＮＭＲ分析］
13Ｃ−ＮＭＲは、ＧＥ社製ＱＥ３００型ＮＭＲスペクトロメーターを用い、１００％Ｄ2Ｏ置換を行った試料につき１０％濃度のＤ2Ｏ溶液を調製したうえ、ＴＳＰを０ｐｐｍとした時のケミカルシフトが５１．６６ｐｐｍのメタノールを内部標準とし、測定温度８０℃、パルス幅６０°、積算回数９０，０００回の条件にて実施した。
【００３２】
試験例４
［フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ活性測定］
Herbert G. Lebherz and William J. Rutterらの方法( Methods Enzymol.,42, 249 - 258(1975)）に準じ、下記の如く活性測定を行った。すなわち、試薬として次の５種類のものを調製した。
▲１▼０．１Ｍ グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ  ７．５）、
▲２▼５０ｍＭ フルクトース−１，６−ビスリン酸ナトリウム溶液、
▲３▼０．１Ｍ フルクトース−１−リン酸ジモノシクロヘキシルアンモニウム溶液、  ▲４▼１０ｍｇ／ｍｌ濃度のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオースリン酸イソメラーゼ複合体溶液、
▲５▼ＮＡＤＨ。
【００３３】
４ｍｇのＮＡＤＨ、５０μｌのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオースリン酸イソメラーゼ複合体溶液、１ｍｌのフルクトース１，６−ビスリン酸ナトリウム溶液および１ｍｌのフルクトース−１−リン酸ジモノシクロヘキシルアンモニウム溶液を含む０．１Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ  ７．５）の２０ｍｌに対し、５〜５０μｌのフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼを含む測定検体を添加することにより反応を開始させた。単位時間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少量につき、２５℃の温度条件下で測定した。３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数が６．２２×１０6ｃｍ2・ｍｏｌ なので、吸光度の変化が１２．４４から６．２２への減少であった場合、それぞれ１μｍｏｌのフルクトース−１、６−ビスリン酸あるいは１μｍｏｌのフルクトース−１−リン酸が開裂したとし、これに基づき、様々な試料における開裂量を算出した。フルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼの単位（活性；ｕｎｉｔ）は、上記の反応系において２５℃にて１μｍｏｌの基質を１分間で開裂する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。比活性は、１ｍｇのタンパク質あたりのｕｎｉｔ数として定義した。
【００３４】
実施例１  選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの合成
５００ｍｇのヘパリン（ブタ小腸由来；ＳＰＬ社製）を１０ｍｌの蒸留水に溶解した後、蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０Ｂカラム（φ２×１５ｃｍ）に通塔し、溶出液を３ｍｌごとに分画した。最終的に得られた５０本の各画分のｐＨを測定した後、酸性画分を集め ピリジンを添加してｐＨを６．５に調整した。この溶液を凍結乾燥することによりヘパリンピリジニウム塩を約５１０ｍｇ得た。完全脱硫酸化反応を行うために、このうちの５００ｍｇに対し、５ｍｌのメタノール、３０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および１５ｍｌの1,4-ジオキサンを添加してヘパリンピリジニウム塩を完全に溶解した後、Ogamoらの方法（Carbohydr. Res.,193, 165-172(1989)）に従って、この反応混液を９０℃にて７２時間加熱した。脱硫酸化反応終了後、１５０ｍｌの氷冷蒸留水を添加し、反応混液のｐＨを、１Ｎの水酸化ナトリウムを添加することにより９．５に調整した。次いで、反応混液を蒸留水に対して２４時間透析した後、透析内液を凍結乾燥処理に付した。その結果、４３０ｍｇの完全脱硫酸化ヘパリンを黄色パウダーとして回収した。
【００３５】
次いで、Danishefskyらの方法（Arch. Biochem. Biophys.,90, 114-121(1960)）に従い、Ｎ−アセチル化反応を行った。すなわち、４００ｍｇの完全脱硫酸化ヘパリンを、６０ｍｌの５０ｍＭ 炭酸ナトリウムを含む１０％ メタノールに溶解した後、酢酸を適量添加して溶液のｐＨを７〜８の間に調整した。次いで、反応混液を氷冷水槽中にて冷却しながら、よく撹拌を続けた。次の１時間の間に４００μｌの無水酢酸を６〜７回添加し、そのたびごとに低下した反応混液のｐＨを、飽和炭酸ナトリウムを含む１０％ メタノールを適量添加することにより、７〜８の間に調整した。反応終了後、１２０ｍｌの蒸留水を添加し、蒸留水に対して７２時間透析した。透析内液を凍結乾燥することにより４１０ｍｇの完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリンを得た。
【００３６】
次いで、４００ｍｇの完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリンを１０ｍｌの蒸留水に溶解した後、蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０Ｂカラム（φ２×１５cm）に通塔し、溶出液を３ｍｌごとに分画した。最終的に得られた５０本の各画分のｐＨを測定した後、酸性画分を集め１０％トリブチルアミンエタノール溶液を添加してｐＨを５．５に調整した。この溶液を凍結乾燥することにより完全脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリントリブチルアンモニウム塩を４３０ｍｇ得た。このものを Takanoらの方法（Biosci. Biotech. Biochem.,56, 1413-1416(1992)）に従い、８ｍｌのジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)に溶解して０℃に冷却した後、４．６ｍｌのジクロロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)を含む１２ｍｌのＤＭＦを添加した。さらによく撹拌した後、４．４ｍｌの１．２ｍｍｏｌ硫酸を含むＤＭＦを添加し、０℃にて１５分間撹拌を続けて反応を進行させた。
【００３７】
反応終了後、反応混液全体を８０ｇの氷中に投入し、直ちに炭酸水素ナトリウムで中和してｐＨを７．０に調整した。次いで、この反応混液を蒸留水に対して透析した後、ガラス繊維濾紙、メンブレンフィルター（４．５μｍ）の順に通して、ジシクロヘキシル尿素の塩を除去した。最終的に、凍結乾燥処理を施し、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを４５０ｍｇ合成した。この選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを光散乱法により分子量を測定すると、未処理のヘパリンの１．３７×１０4Ｄａに対し、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンは０．９７×１０4Ｄａであった。これらのゲルろ過ＨＰＬＣによる溶出パターンは（図１）の通りであり、未処理ヘパリンの溶出時間は３３．５分（ａ）、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの溶出時間は３５．１分（ｂ）であった。また、これらの物質の二糖分析を行った（図２）。この溶出パターンから二糖体組成を算出した（表−２）。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
また、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを13Ｃ−ＮＭＲにより分析した（図３）。その結果、二糖体組成同様、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンは従来のヘパリンでは得られなかった、グルコサミン残基にＮ−硫酸基が存在せず、６−Ｏ−硫酸を多く有するヘパリンであることが明らかになった。また、当該ヘパリンをアフィニティークロマトグラフィーの担体に結合する場合、特異的な結合を有するヘパリンはΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓのモル％はそれぞれ全て３％以下であることが好ましい。
【００４０】
実施例２  選択的6-O-硫酸化ヘパリンをリガンドとするヘパリン結合坦体の調製  Sakaiらの方法（J. Chromatogr.,400, 123(1987)）に従い、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン２００ｍｇを５ｍｌの２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．２）に溶解した。次いで、５ｇのアミノアガロースゲル粉末を懸濁し、１５ｍｇのＮａＢ（ＣＮ）Ｈ3を添加して十分撹拌しながら室温にて２４時間反応を進行させた。反応終了後、カップリング産物を含有したゲルを濾過した。さらに、水洗処理を２〜３回施すことにより、完全に脱塩した。
【００４１】
未反応（遊離）のアミノ基が残存すると、非特異的な相互作用を引き起こす可能性があるので、残存アミノ基はアセチル化して不活化することにした。すなわち、調製した選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン固定化アガロースゲルを ５ｍｌの０．２Ｍ 酢酸ナトリウム溶液に懸濁させ、２．５ｍｌの無水酢酸を添加して０℃にて３０分、次いで室温にて３０分間反応させた。反応終了後、生成したゲルを水洗して完全に脱塩した。Bitter & Muirの方法（Anal. Biochem.,4, 330-334(1962)）に従い、カルボキシル基の定量を行うことにより、単位重量あたりのアガロースゲルに固定化された選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの重量を見積もった。その結果、従来報告されている最大結合量に匹敵する、ゲル湿重量１ｇあたり、約１０ｍｇの選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの固定化が確認されたため、遊離のアミノ基は存在しないことが確認された。
【００４２】
実施例３  選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン結合坦体を用いたフルクトース−１，６ービスリン酸アルドラーゼの精製
９ｇのウシ大脳に対し、０℃に冷却した８０ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ ７．４緩衝液)を添加し、大脳組織を冷却した。次いで、大脳組織を取り出し、剃刀を用いて細片化した後、再度０℃に冷却した上記緩衝液を２倍量（V/W）添加し、グラスホモジナイザー中でホモジナイズした。このように調製したホモジネイトを適量の遠沈管に入れ、０℃にて１００，０００×ｇの加速度の下、６０分間の遠心分離を行った。遠心終了後、上澄液（粗抽出液）を用いさらに精製を進めた。
【００４３】
上記粗抽出液をコンドロイチンポリ硫酸固定化アガロースアフィニティーカラム（φ２×２０ｃｍ）を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液で平衡化した。このアフィニティーカラムに粗抽出液を全量をアプライした後、６０ｍｌの １ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液で洗浄し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ メルカプトエタノール及び１０％グリセロールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液１００ｍｌにより吸着画分を溶出させた。この吸着画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli, U. K., J. Biol. Chem., 252, 1102-1106(1977)）により多数のバンドを示した。
【００４４】
次いで、上記実施例２で調製したヘパリン結合担体を充填したカラム（φ１×１０ｃｍ）を１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ メルカプトエタノール、１０％グリセロールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液で平衡化した。このアフィニティーカラムに、コンドロイチンポリ硫酸固定化アガロースアフィニティーカラムクロマトグラフィー吸着画分のうち４０ｍｌをアプライした後、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ メルカプトエタノール及び１０％グリセロールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液８０ｍｌで洗浄した。特異的吸着画分につき、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭメルカプトエタノール及び１０％グリセロールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液１５ｍｌおよび１．５Ｍ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ メルカプトエタノール及び１０％グリセロールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液１５ｍｌの２種溶出液による塩化ナトリウムの直線的濃度勾配（０〜１．５Ｍ）を用いて溶出した。なお、検出は２２０ｎｍの吸光度により行い、その溶出パターンを図４に示した。塩化ナトリウムの直線的濃度勾配においてシングルピークが出現したので、この画分を分取してＳＤＳ−ＰＡＧＥに付したところ、分子量約４０ｋＤａのシングルバンドが観察された。また、この画分はフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼ活性を有していた。
【００４５】
実施例４  フルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼのアイソフォーム
次いで、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液で十分平衡化したＭｏｎｏＱカラム（商品名：ファルマシア社製）を装着したＨＰＬＣに、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの特異的吸着画分をアプライし、１５ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液で洗浄した。吸着画分につき、７．５ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液並びに７．５ｍｌの０．５Ｍ  塩化ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液の２種溶出液による塩化ナトリウムの直線的濃度勾配（０〜０．５Ｍ）を用いて溶出を試みた。なお、検出は２２０ｎｍの吸光度により行い、その溶出パターンを図５に示す。
【００４６】
塩化ナトリウムの直線的濃度勾配の開始直前にブロードなピークが１本（Fr.1)、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配においてシャープなピークが４本（Fr.2〜Fr.5)出現した。得られた５種画分につき、Superdex G-200を装着したＨＰＬＣによりゲル濾過分析と分取を行い純度の検定ならびに最終精製を行ったところ、図６に示すようにいずれの画分も約１３分の保持時間にシャープなピークが検出され（２２０ｎｍの吸光度による検出）、すべての画分ともきわめて高純度に精製されていることが判明した。Fr.1〜Fr.5の収量は、それぞれ ２．７ｍｇ、１６．５ｍｇ、７．１ｍｇ、５．４ｍｇ、７．７ｍｇであった。なお、実施例５に示すように、これら５種画分のフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼ活性を測定したところ、全ての画分が高い活性を有した。
【００４７】
これら５種画分につき、さらに Davidの方法（Ann. N. Y.  Acad. Sci.,121, 404(1964)）に従ってＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。その結果、Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4 および Fr.5 の順に移動度が大きくなることから、マイナスの帯電はFr.1＜Fr.2＜Fr.3＜Fr.4＜Fr.5 の順に大きいことが判明した。したがって、Fr.1〜Fr.5 はフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼのアイソフォームであると考えられる。脳に存在するフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼは等電点の高いＡおよび等電点の低いＣの２種サブユニットの４量体であり、Ａ4、Ａ3Ｃ、Ａ2Ｃ2、ＡＣ3、Ｃ4 の５種アイソフォームが存在することが報告されている（Methods Enzymol.,42, 240-249(1975)）。ＡとＣは分子量はほとんど変わらない。Fr.1、2、3、4、および 5 は、それぞれＡ4、Ａ3Ｃ、Ａ2Ｃ2、ＡＣ3、Ｃ4に相当すると考えられる。
【００４８】
実施例５  フルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼの活性測定
実施例３で得た選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを結合したヘパリン結合坦体への特異的吸着画分、実施例４においてＭｏｎｏＱカラムによるイオン交換で分画されたFr.1〜5の各画分及びSuperdex G-200 により精製後の分画Fr.1〜5のフルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼの活性測定を行った。その結果、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン結合アフィニティーカラムの特異的吸着画分の全活性および比活性は １４２．６５および１．４８であった。又、ＭｏｎｏＱカラムからの画分Fr.1の活性および比活性は２．９２および２．１７、Fr.2の活性および比活性は３２．４２および５．０、Fr.3の活性および比活性は４０．９８および１３．５、Fr.4の活性および比活性は２５．１９および８．８、Fr.5の活性および比活性は１６．１１および４．６であった（表−３）。尚、表−３中のＭｏｎｏＱカラム及びSuperdex  columnの全活性及び比活性はそれぞれFr.1〜5の活性の合計及び各Fr.の活性の平均を表す。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
【発明の効果】
本発明により、進行性筋ジストロフィー等の各種疾患の診断に有用なフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼに対して親和性を有する特異的構造を有するヘパリン及びこのヘパリンが結合した新規ヘパリン結合担体が提供される。また、このヘパリン結合担体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ含有物から該酵素の分離・精製に使用することにより、単純な操作で、高度な精製を可能とする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  (a)未処理ヘパリン及び(b)選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンのゲルろ過ＨＰＬＣ溶出パターンを示す図。
【図２】  (a)不飽和二糖標品、(b)未処理ヘパリン、(c)選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの酵素消化物のイオン交換ＨＰＬＣ溶出パターンを示す図。
【図３】  選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図４】  選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン結合アフィニティー担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーの溶出パターンを示す図。
【図５】  ＭｏｎｏＱカラムを装着したＨＰＬＣにおけるイオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを示す図。
【図６】  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  カラムを装着したＨＰＬＣによるゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パターンを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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