(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料に、デキストランサルフェイト、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン及びジエチルアミノエチル−β−シクロデキストリンから選ばれる１種の選択的反応促進物質の存在下、(i)リポプロテインリパーゼ、(ii)グリセロールキナーゼ、並びに(iii)グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方を含む、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法。
【請求項２】
被検試料に、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリエチレングリコール１，０００、ポリエチレングリコール１，５００、ポリエチレングリコール２，０００、ポリエチレングリコール６，０００、ポリエチレングリコール１０，０００、ポリエチレングリコール２０，０００、ＰＯＥ（７）トリメチルヘキシルエーテル、ＰＯＥ（９）ラウリルエーテル、ＰＯＥ（１０）ノニルフェニルエーテル、ＰＯＥ（８）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１１）ノニルフェニルエーテル、ＰＯＥ−ｐ−トルエンスルホアミド、ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウレート、ココイルサルコシンナトリウム、デキストランサルフェイト、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、ジエチルアミノエチル−β−シクロデキストリン及び水溶性β−シクロデキストリンポリマーから選ばれる２種以上の選択的反応促進物質を組み合わせて、(i)リポプロテインリパーゼ、(ii)グリセロールキナーゼ、並びに(iii)グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方を含む、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う、超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法。
【請求項３】
第１段階として、選択的反応促進物質の存在下、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去し、
第２段階として、選択的反応促進物質の存在下、残存するトリグリセライドのうち超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を選択的に行う請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
第１段階において存在させる選択的反応促進物質と、第２段階において存在させる選択的反応促進物質が、下記の組み合わせ（i）〜（iii）：
（i）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（ii）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（iii）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
のいずれかである請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
被検試料が、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む可能性のあるものである請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項６】
選択的反応促進物質とともに、リンタングステン酸、ハロゲンイオン、金属イオン又はレクチンから選ばれる反応補助物質を存在させる請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項７】
(i)デキストランサルフェイト、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン及びジエチルアミノエチル−β−シクロデキストリンから選ばれる１種の選択的反応促進物質、並びに(ii) (a)リポプロテインリパーゼ、(b)グリセロールキナーゼ、並びに(c)グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方を含む、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含有する、試料中の超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するための試薬。
【請求項８】
試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、選択的反応促進物質が第１試薬に含有されるものである請求の範囲第７項記載の試薬。
【請求項９】
試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、選択的反応促進物質が第２試薬に含有されるものである請求の範囲第７項記載の試薬。
【請求項１０】
(i)ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリエチレングリコール１，０００、ポリエチレングリコール１，５００、ポリエチレングリコール２，０００、ポリエチレングリコール６，０００、ポリエチレングリコール１０，０００、ポリエチレングリコール２０，０００、ＰＯＥ（７）トリメチルヘキシルエーテル、ＰＯＥ（９）ラウリルエーテル、ＰＯＥ（１０）ノニルフェニルエーテル、ＰＯＥ（８）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１１）ノニルフェニルエーテル、ＰＯＥ−ｐ−トルエンスルホアミド、ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウレート、ココイルサルコシンナトリウム、デキストランサルフェイト、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、ジエチルアミノエチル−β−シクロデキストリン及び水溶性β−シクロデキストリンポリマーから選ばれる２種以上の選択的反応促進物質、並びに(ii) (a)リポプロテインリパーゼ、(b)グリセロールキナーゼ、並びに(c)グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方を含む、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含有する、試料中の超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するための試薬。
【請求項１１】
試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、選択的反応促進物質が第１試薬及び第２試薬に含有されるものである請求の範囲第１０項記載の試薬。
【請求項１２】
試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去するものであって、
第２試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである請求の範囲第１０項記載の試薬。
【請求項１３】
試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去するものであり、
第２試薬に含有される選択的反応促進物質が、残存するトリグリセライドのうち超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである請求の範囲第１０項記載の試薬。
【請求項１４】
第１試薬において含有させる選択的反応促進物質と、第２試薬において含有させる選択的反応促進物質が、下記の組み合わせ（i）〜（iii）：
（i）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（ii）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（iii）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
のいずれかである請求の範囲第１３項記載の試薬。
【請求項１５】
被検試料が、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む可能性のあるものである請求の範囲第７項又は第１０項記載の試薬。
【請求項１６】
選択的反応促進物質とともに、リンタングステン酸、ハロゲンイオン、金属イオン又はレクチンから選ばれる反応補助物質を存在させる請求の範囲第７項又は第１０項記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動脈硬化症の臨床診断に重要な超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの選択的定量方法及び選択的定量試薬に関する。
背景技術
コレステロールやトリグリセライドは生体にとって必須の栄養素である。これらは、水に溶け難いため、両親媒性の膜に包まれて（リポ蛋白として）血液中に存在している。
リポ蛋白には、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白（Ｖｅｒｙ  Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＶＬＤＬ）、中間比重リポ蛋白（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白（Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＤＬ）などの種類があり、複雑な代謝系を形成している。
各リポ蛋白ともコレステロールとトリグリセライドを含有しているが、ＶＬＤＬとＩＤＬに関してはトリグリセライドが主成分であり、かつ動脈硬化症の発生に深く関わっている。したがって、ＶＬＤＬとＩＤＬのトリグリセライドを分別定量することは有用である。
動脈硬化症の発生に関与する諸要因を調べたいくつかの大規模追跡調査によれば、ＬＤＬコレステロールと、血清中トリグリセライドの総量（以下、総トリグリセライドと呼ぶ）は促進的に、またＨＤＬコレステロールは抑制的に作用することが証明されている。
トリグリセライドはＬＤＬとＨＤＬにはほとんどなく、大部分がカイロミクロン、ＶＬＤＬ及びＩＤＬに含まれている。
一方、カイロミクロン中のトリグリセライドは動脈硬化症の危険因子ではないことが示されている。
したがって、カイロミクロンだけを排除し、他のリポ蛋白中のトリグリセライドを定量しても一応の目的は達せられる。
各種リポ蛋白を分別せずに総トリグリセライドを定量する方法はすでに存在し、広く使われている（Ｈｅｎｒｙ、Ｊ．Ｂ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｄｅｒｓ、ｐｐ．１９６−１９８）。
これらの方法は、血清中のトリグリセライドをまずリポプロテインリパーゼでグリセロールに分解し、次にこれをグリセロールキナーゼでグリセロール−３−リン酸に変化させ、更にグリセロール−３−リン酸オキシダーゼでジヒドロキシアセトン−３−リン酸に変え、その時生成される過酸化水素をペルオキシダーゼ系で発色定量するものである。
また、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼの代りにグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて、生成したＮＡＤＨを定量する方法もある。
これらは、広く酵素的測定法と呼ばれている。
一方、ＬＤＬ又はＨＤＬに特定の界面活性剤と添加剤を選択的に作用させ、そこに含まれるコレステロールを定量する方法もすでに知られており（例えば、特開平９−３１３２００号公報及び特開平９−２８５２９８号公報）、臨床検査などの目的で広く使われている。
しかし、ＶＬＤＬ、ＩＤＬに選択的に作用するか、又はカイロミクロン、ＬＤＬ、ＨＤＬを排除するような試薬の組み合わせはまだ知られておらず、したがって前２者のリポ蛋白（ＶＬＤＬ、ＩＤＬ）に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法及び試薬はこれまでに開示されていない。
発明の開示
本発明により解決しようとする課題は、試料中の超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法及び試薬の確立である。
より具体的には、超遠心分離機による分離操作等の繁雑な操作を必要とせず、汎用されている自動分析装置への適用が可能であって、簡便かつ正確に定量が行える、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法及び試薬を確立することである。
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）被検試料に、選択的反応促進物質の存在下、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法。
（２）選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するためのものである前記（１）に記載の方法。
（３）選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を選択的に行う前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記
（３）に記載の方法。
（５）第１段階として、選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去し、
第２段階として、残存するトリグリセライドを、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を選択的に行う前記（１）又は（２）に記載の方法。
（６）第１段階において存在させる選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記（５）に記載の方法。
（７）第２段階において、第１段階に存在させた選択的反応促進物質とともにこの選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を存在させる前記（５）又は（６）に記載の方法。
（８）第１段階に存在させた選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記（７）に記載の方法。
（９）第１段階として、選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去し（但し、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの両方の消去は行わない）、
第２段階として、選択的反応促進物質の存在下、残存するトリグリセライドのうち超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を選択的に行う前記（１）又は（２）に記載の方法。
（１０）第１段階において存在させる選択的反応促進物質と、第２段階において存在させる選択的反応促進物質が、下記の組み合わせ（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（ｉｉ）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（ｉｉｉ）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
のいずれかである前記（９）に記載の方法。
（１１）トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素が、（ｉ）リポプロテインリパーゼ、（ｉｉ）グリセロールキナーゼ、並びに（ｉｉｉ）グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方である前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）被検試料が、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む可能性のあるものである前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）選択的反応促進物質が、界面活性剤、ポリオキシアルキレン若しくはその誘導体、又は多糖類若しくはその誘導体である前記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）選択的反応促進物質とともに反応補助物質を存在させる前記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）反応補助物質が、ポリアニオン、ハロゲンイオン、金属イオン又はレクチンである前記（１４）に記載の方法。
（１６）（ｉ）選択的反応促進物質、及び（ｉｉ）トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含有する、試料中の超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するための試薬。
（１７）選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するためのものである前記（１６）に記載の試薬。
（１８）選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記（１６）又は（１７）に記載の試薬。
（１９）選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去するものである前記（１６）又は（１７）に記載の試薬。
（２０）試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、選択的反応促進物質が第１試薬に含有されるものである前記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の試薬。
（２１）試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、選択的反応促進物質が第２試薬に含有されるものである前記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の試薬。
（２２）試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、選択的反応促進物質が第１試薬及び第２試薬に含有されるものである前記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の試薬。
（２３）第２試薬に含有される選択的反応促進物質が、第１試薬に含有される選択的反応促進物質と同じ又は異なる選択的反応促進物質である前記（２２）に記載の試薬。
（２４）試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去するものであって、
第２試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記（１６）又は（１７）に記載の試薬。
（２５）試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去するものであり（但し、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの両方の消去は行わない）、
第２試薬に含有される選択的反応促進物質が、残存するトリグリセライドのうち超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記（１６）又は（１７）に記載の試薬。
（２６）第１試薬において含有させる選択的反応促進物質と、第２試薬において含有させる選択的反応促進物質が、下記の組み合わせ（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（ｉｉ）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
（ｉｉｉ）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
のいずれかである前記（２５）に記載の試薬。
（２７）トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素が、（ｉ）リポプロテインリパーゼ、（ｉｉ）グリセロールキナーゼ、並びに（ｉｉｉ）グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方である前記（１６）〜（２６）のいずれかに記載の試薬。
（２８）被検試料が、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む可能性のあるものである前記（１６）〜（２７）のいずれかに記載の試薬。
（２９）選択的反応促進物質が、界面活性剤、ポリオキシアルキレン若しくはその誘導体、又は多糖類若しくはその誘導体である前記（１６）〜（２８）のいずれかに記載の試薬。
（３０）選択的反応促進物質とともに反応補助物質を存在させる前記（１６）〜（２９）のいずれかに記載の試薬。
（３１）反応補助物質が、ポリアニオン、ハロゲンイオン、金属イオン又はレクチンである前記（３０）に記載の試薬。
（３２）リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などを組み合わせて血清中のトリグリセライドを定量する酵素比色法において、陽イオン性、陰イオン性、又は非イオン性の界面活性剤を作用させることにより、超低比重リポ蛋白（中間比重リポ蛋白も性状が類似しているためこれに含める）中のトリグリセライドを選択的に定量する方法。
（３３）リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などを組み合わせて血清中のトリグリセライドを定量する酵素的測定法において、陽イオン性、陰イオン性、又は非イオン性の界面活性剤を作用させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白中のトリグリセライドを選択的に反応分解させ、その後、超低比重リポ蛋白（中間比重リポ蛋白も性状が類似しているためこれに含める）中のトリグリセライドを定量する方法。
（３４）前記（３２）に記載の超低比重リポ蛋白中トリグリセライド定量方法において、同リポ蛋白と界面活性剤との選択性を促進するポリアニオン、２価金属イオン、又は糖を添加する方法。
（３５）前記（３３）に記載の超低比重リポ蛋白中トリグリセライド定量方法において、カイロミクロン、ＬＤＬ及びＨＤＬと界面活性剤との選択性を促進するポリアニオン、２価金属イオン、又は糖を添加する方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
Ｉ．定量する方法
１．定量する方法・総論
本発明の超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法は、被検試料に、選択的反応促進物質の存在下、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行うことよりなる。
この本発明の方法において、選択的反応促進物質は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するためのものである。
２．定量の方法の態様
▲１▼  態様−１  〔本発明の第１の方法〕
本発明の方法の態様の一つは、前記本発明の方法において、選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を選択的に行うものである。（本発明の第１の方法）
この際、選択的反応促進物質は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである。
なお、定量を第１段階と第２段階の２段階に分けて行うとき、選択的反応促進物質は、第１段階に存在させてもよく、第２段階に存在させてもよく、又は第１段階及び第２段階に存在させてもよい。いずれの場合も、同様の効果を得ることができる。
また、複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、同時に存在させて使用することもできる。
▲２▼  態様−２  〔本発明の第２の方法〕
また、本発明の方法の態様の別なものとして、以下の方法を挙げることができる。
前記本発明の方法において、まず、第１段階として、選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去（分解）する。
次に、第２段階として、残存するトリグリセライドを、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を選択的に行うものである。（本発明の第２の方法）
この際、第１段階において存在させる選択的反応促進物質は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである。
なお、第２段階において、第１段階に存在させた選択的反応促進物質とともにこの選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を存在させてもよい。
この場合、第１段階に存在させた選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものであることが好ましい。
▲３▼  態様−３  〔本発明の第３の方法〕
更に、本発明の方法の態様の他のものとして、以下の方法を挙げることができる。
前記本発明の方法において、まず、第１段階として、選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去（分解）する。（但し、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの両方の消去は行わない。）
次に、第２段階として、選択的反応促進物質の存在下、残存するトリグリセライドのうち超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を選択的に行うものである。（本発明の第３の方法）
この際、第１段階において存在させる選択的反応促進物質と、第２段階において存在させる選択的反応促進物質は、下記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組み合わせより選択することもできる。
（ｉ）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質。
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
（ｉｉ）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを、消去することができる選択的反応促進物質。
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
（ｉｉｉ）
第１段階：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質。
第２段階：
第１段階において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
３．トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素
▲１▼  トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応  本発明の方法における、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応は、トリグリセライドが存在することにより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させることができる反応であれば、どのようなものでもよく、一つの反応からなるものでもよく、また、複数の反応からなるものであってもよい。
このような反応としては、例えば、試料中のリポ蛋白のトリグリセライドにリポプロテインリパーゼを作用させ、このトリグリセライドを１分子のグリセロールと３分子の脂肪酸に分解し、その後このグリセロールとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をグリセロールキナーゼの触媒作用によりグリセロール−３−リン酸とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に変え、更にこのグリセロール−３−リン酸をグリセロール−３−リン酸オキシダーゼの触媒作用によりジヒドロキシアセトン−３−リン酸に変えるとともに過酸化水素を生じさせる、一連の反応を挙げることができる。
また、他の例として、試料中のリポ蛋白のトリグリセライドにリポプロテインリパーゼを作用させ、このトリグリセライドを１分子のグリセロールと３分子の脂肪酸に分解し、その後このグリセロールとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をグリセロールキナーゼの触媒作用によりグリセロール−３−リン酸とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に変え、更にこのグリセロール−３−リン酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）〔ＮＡＤ＋〕の存在下、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によりジヒドロキシアセトンリン酸に変えるとともにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）〔ＮＡＤＨ〕を生じさせる、一連の反応等をも挙げることができる。
なお、前記のグリセロールキナーゼを用いる反応においては、グリセロールが試料に含まれると定量値に正の誤差が生じる場合があるので、これを防ぐため、予め、試料に含まれるグリセロールに、グリセロールキナーゼ及びグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、更にカタラーゼ又はペルオキシダーゼを作用させて、このグリセロールを消去する一連の反応を行わせてもよい。
ここで、カタラーゼを用いるとき、消去反応終了後トリグリセライドの定量を行う際には、アジ化ナトリウムなどのカタラーゼの活性を阻害する物質等を存在させて、生成した過酸化水素がカタラーゼにより消去（分解）されないようにする必要がある。
なお、還元型補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）〔ＮＡＤＨ（還元型）〕、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）〔ＮＡＤＰＨ（還元型）〕等を挙げることができる。
▲２▼  酵素
本発明の方法において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素は、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒するものであればいかなるものでもよいが、例えば、リポプロテインリパーゼ及びグリセロールキナーゼ、更にグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。
これらの酵素は、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
これらの酵素を存在させる濃度であるが、酵素の種類及び由来、選択的反応促進物質の種類、又は第１試薬と第２試薬の混合比率等により異なるので、一概には言えず、適宜その条件に適した濃度で存在させればよい。
なお、通常、リポプロテインリパーゼは、１〜１０，０００，０００単位／ｌの濃度で存在させることが好ましく、１００〜１，０００，０００単位／ｌの濃度で存在させることが特に好ましい。
また、グリセロールキナーゼは、通常、０．０１〜５００，０００単位／ｌの濃度で存在させることが好ましく、１０〜１０，０００単位／ｌの濃度で存在させることが特に好ましい。
そして、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼは、通常、１〜５００，０００単位／ｌの濃度で存在させることが好ましく、１００〜５０，０００単位／ｌの濃度で存在させることが特に好ましい。
なお、本来、酵素の活性値は、活性測定方法により異なるものであり、また、同じ活性測定方法、同じ酵素であっても、その酵素の由来、あるいは精製度等により異なるものでもある。
よって、先に記載した各酵素の濃度範囲を外れる酵素濃度（酵素活性値）だからといって、本発明の効果が得られないというものではない。
▲３▼  酵素以外の物質
この本発明の方法におけるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応において、前記の酵素以外にも必要な物質があれば存在させる。
この反応に必要な物質としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）若しくはその塩、マグネシウムイオン、又は酸化型補酵素等を挙げることができる。
アデノシン三リン酸又はその塩を存在させる濃度は、通常、０．００１〜５０ｇ／ｌが好ましく、０．０１〜１０ｇ／ｌが特に好ましい。
マグネシウムイオンは、ハロゲンイオン又は有機酸などとの塩の形態のものを用いればよく、通常、０．００１〜１００ｍＭの濃度で存在させることが好ましく、０．０１〜５０ｍＭの濃度で存在させることが特に好ましい。
酸化型補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）〔ＮＡＤ＋（酸化型）〕、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）〔ＮＡＤＰ＋（酸化型）〕等を挙げることができる。
４．過酸化水素又は還元型補酵素の測定
本発明の定量する方法における、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定は、前記の酵素により生成した過酸化水素又は還元型補酵素の量を測定することができる方法であればいかなる方法であってもよい。
例えば、生成した過酸化水素又は還元型補酵素から、何かしらのシグナルを導き出す方法等を挙げることができる。
より具体的には、過酸化水素の測定においては、過酸化水素電極等により過酸化水素自体を測定してもよく、又は過酸化水素から別のシグナルを導き出し、このシグナルを測定してもよい。
この過酸化水素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在のもとに、色原体を酸化させ色素を生成させて、この生成した色素の吸光度などを測定する、トリンダー反応系を利用する反応等を挙げることができる。
ペルオキシダーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルオキシダーゼを存在させる濃度は、通常、３０単位／ｌ以上とすることが好ましい。
トリンダー反応系における色原体としては、例えば、４−アミノアンチピリンとフェノール若しくはその誘導体、又は４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体との組み合わせ等を挙げることができる。
４−アミノアンチピリンは、通常、０．００１〜５０ｇ／ｌの濃度で存在させることが好ましく、０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度で存在させることが特に好ましい。
フェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げることができる。
アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、若しくはＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、又はこれらの塩等を挙げることができる。
これらのフェノール若しくはその誘導体、又はアニリン誘導体は、通常、０．００１〜５０ｇ／ｌの濃度で存在させることが好ましく、０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度で存在させることが特に好ましい。
また、還元型補酵素の測定においては、還元型補酵素自体を３４０ｎｍなどにおける吸光度を測ることなどにより測定してもよく、又は還元型補酵素から別のシグナルを導き出し、このシグナルを測定してもよい。
この還元型補酵素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、例えば、ジアホラーゼ又は１−メトキシ−フェナジンメトサルフェートなどの存在のもとに、テトラゾリウム塩などを還元させ色素を生成させて、これを測定する反応等を挙げることができる。
５．消去反応
本発明の第２の方法においては、第１段階で、選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドの消去（分解）を行う。
また、本発明の第３の方法においては、第１段階で、選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドの消去（分解）を行う。（但し、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの両方の消去は行わない）。）
これらの消去（分解）は、選択的反応促進物質の存在下、試料を、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより行うが、このトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応についての詳細は、既に記述したとおりである。
この消去（分解）の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素は、第２段階まで持ちこさずに、第１段階において消去することが好ましい。
過酸化水素の場合は、例えば、カタラーゼ又はペルオキシダーゼ等を存在させることにより、消去（分解）することができる。
カタラーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このカタラーゼを存在させる濃度は、通常、１００単位／ｌ以上とすることが好ましい。
そして、第１段階においてカタラーゼにより生成した過酸化水素を消去した後、第２段階においてはカタラーゼの活性を阻害して働かないようにする必要がある。
これは、アジ化ナトリウムなどのカタラーゼの活性を阻害する物質を、第２段階において存在させることにより、達成することができる。
また、ペルオキシダーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルオキシダーゼを存在させる濃度は、通常、３０単位／ｌ以上とすることが好ましい。
還元型補酵素の場合は、例えば、この還元型補酵素を補酵素とする脱水素酵素を存在させることにより消去（分解）することができる。
６．他の物質
本発明の定量する方法においては、必要に応じて、更に、緩衝剤、他の酵素、他の酵素の基質、他の補酵素、アルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩などの金属イオン若しくはこれを含む塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、アジ化ナトリウム、抗生物質、若しくは合成抗菌剤などの防腐剤、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、活性化剤、アスコルビン酸オキシダーゼなどの試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質、賦形剤、又は他の試薬成分等を適宜必要に応じて存在させることができる。
本発明の試薬において、試料と試薬を混合して定量を行う際のｐＨは、ｐＨ５〜１０の範囲であることが好ましく、ｐＨ５．５〜９．０の範囲であることが特に好ましい。
定量を第１段階及び第２段階より行うときは、第２段階のｐＨが前記のｐＨの範囲となるように、第１段階のｐＨを設定してもよい。
緩衝剤を存在させる場合は、定量を行う際のｐＨが前記のｐＨの範囲となるような緩衝剤を存在させることが好ましい。
例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
５．定量する方法の手順
本発明の定量する方法は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を行おうとする試料に、選択的反応促進物質の存在下、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行うものである。
この本発明の方法の定量操作は、一段階のみにて行う方法（１ステップ法、１試薬系）で実施してもよく、又は二段階等の複数段階により行う方法（多ステップ法、多試薬系）で実施してもよい。
定量反応の開始方法は基質若しくは定量反応に必須な物質を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でもよい。
定量操作時の温度は、３０℃、又は３７℃等定量反応が進行し、かつ定量反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。
また、本発明の方法において、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定は、反応速度法（レート法）、又は終点法（エンドポイント法）等のいずれの方法によるものでもよい。
生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定において、吸光度等の測定によりこれを行う場合、測定波長は測定する物質に応じて、紫外部、可視部、又は赤外部の適当な波長を使用すればよい。
なお、吸光度等の測定は、一波長のみの測定でもよく、又は二波長による測定でもよい。
本発明の方法において、定量の手法は用手法、又は自動分析装置などの装置による方法のいずれをも用いることができる。
この装置としては、例えば、臨床検査用の自動分析装置等を挙げることができる。
この臨床検査用の自動分析装置の例として、コンティニュアスフロー式若しくはフローインジェクション式などのフロー方式の自動分析装置、クローズドタイプ・バッチ式、オープンタイプ・バッチ式、パック式若しくは遠心式などのディスクリート方式の自動分析装置、又はフィルム式、若しくは試験片式などのドライケミストリー方式の自動分析装置等を挙げることができる。
装置により定量を行う手順の一例を以下に示す。
まず、本発明の定量する試薬を、使用する装置に適合した容器に入れる。
この試薬が入った容器を装置の所定の位置に置く。
また、定量を行う試料も測定装置に適合した容器に入れ、所定の位置に置く。
装置が臨床検査用の自動分析装置の場合は、、使用する試薬、及び定量を行おうとする試料等についての定量条件（定量パラメータ）等を装置に入力し、設定する。
そして、定量を開始する。
通常は、試料と試薬のそれぞれをピペット（プローブ）又はチューブ等で反応セル（反応キュベット）に分注し、混合、接触させ、温度一定の条件下に保つ。
そして、この反応セル（反応キュベット）内の試料と試薬との反応液について、規定波長の吸光度を定められた時間に測定する。
また、例えば、試薬が第１試薬と第２試薬の２試薬からなる場合は、まず、試料と試薬の第１試薬のそれぞれをピペット（プローブ）、又はチューブ等で反応セル（反応キュベット）に分注し、混合、接触させ、温度一定の条件下に保つ。
次に、この反応セル（反応キュベット）内の反応液に、試薬の第２試薬をピペット（プローブ）又はチューブ等で分注し、混合、接触させて、温度一定の条件下に保つ。
そして、この反応セル（反応キュベット）内の試料と試薬の第１試薬及び第２試薬との反応液について、規定波長の吸光度を定められた時間に測定する。
ここで得られた吸光度と濃度既知のトリグリセライド試料（標準液）の吸光度〔検量線〕を比較することにより、試料中の超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの濃度を算出して得る。
ＩＩ．定量する試薬
１．定量する試薬・総論
本発明の試料中の超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するための試薬は、（ｉ）選択的反応促進物質、及び（ｉｉ）トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含有するものである。
この本発明の試薬において、選択的反応促進物質は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するためのものである。
２．試薬の態様
▲１▼  態様−１  〔本発明の第１の試薬〕
本発明の試薬の態様の一つは、前記本発明の試薬において含有させる選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである。（本発明の第１の試薬）
なお、試薬が第１試薬及び第２試薬よりなるとき、選択的反応促進物質は、第１試薬に含有させてもよく、第２試薬に含有させてもよく、又は第１試薬及び第２試薬に含有させてもよい。いずれの場合も、同様の効果を得ることができる。
また、複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、同時に含有させて使用することもできる。
▲２▼  態様−２  〔本発明の第２の試薬〕
また、本発明の試薬の態様の別なものとして、以下の試薬を挙げることができる。
前記本発明の試薬において、試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去（分解）するものである。（本発明の第２の試薬）
なお、第２試薬において、第１試薬に含有させた選択的反応促進物質とともにこの選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を含有させてもよい。
この場合、第２試薬に含有させる、第１試薬に含有させた選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものであることが好ましい。
▲３▼  態様−３  〔本発明の第３の試薬〕
更に、本発明の試薬の態様の他のものとして、以下の試薬を挙げることができる。
前記本発明の試薬において、試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去（分解）するものである。（但し、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの両方の消去は行わない。）
そして、第２試薬に含有される選択的反応促進物質が、残存するトリグリセライドのうち超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである。（本発明の第３の試薬）
この際、第１試薬において含有させる選択的反応促進物質と、第２試薬において含有させる選択的反応促進物質は、下記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組み合わせより選択することもできる。
（ｉ）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質。
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
（ｉｉ）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質。
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
（ｉｉｉ）
第１試薬：
カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質。
第２試薬：
第１試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
３．トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素
▲１▼  トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応  本発明の試薬における、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応は、トリグリセライドが存在することにより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させることができる反応であれば、どのようなものでもよく、一つの反応からなるものでもよく、また、複数の反応からなるものであってもよい。
このような反応としては、例えば、試料中のリポ蛋白のトリグリセライドにリポプロテインリパーゼを作用させ、このトリグリセライドを１分子のグリセロールと３分子の脂肪酸に分解し、その後このグリセロールとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をグリセロールキナーゼの触媒作用によりグリセロール−３−リン酸とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に変え、更にこのグリセロール−３−リン酸をグリセロール−３−リン酸オキシダーゼの触媒作用によりジヒドロキシアセトン−３−リン酸に変えるとともに過酸化水素を生じさせる、一連の反応を挙げることができる。
また、他の例として、試料中のリポ蛋白のトリグリセライドにリポプロテインリパーゼを作用させ、このトリグリセライドを１分子のグリセロールと３分子の脂肪酸に分解し、その後このグリセロールとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をグリセロールキナーゼの触媒作用によりグリセロール−３−リン酸とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に変え、更にこのグリセロール−３−リン酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）〔ＮＡＤ＋〕の存在下、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によりジヒドロキシアセトン−３−リン酸に変えるとともにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）〔ＮＡＤＨ〕を生じさせる、一連の反応等をも挙げることができる。
なお、前記のグリセロールキナーゼを用いる反応においては、グリセロールが試料に含まれると定量値に正の誤差が生じる場合があるので、これを防ぐため、予め、試料に含まれるグリセロールに、グリセロールキナーゼ及びグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、更にカタラーゼ又は等を作用させて、このグリセロールを消去する一連の反応を行わせてもよい。
ここで、カタラーゼを用いるとき、消去反応終了後トリグリセライドの定量を行う際には、アジ化ナトリウムなどのカタラーゼの活性を阻害する物質等を第２試薬に含有させて、生成した過酸化水素がカタラーゼにより消去（分解）されないようにする必要がある。
なお、還元型補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）〔ＮＡＤＨ（還元型）〕、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）〔ＮＡＤＰＨ（還元型）〕等を挙げることができる。
▲２▼  酵素
本発明の試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素は、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒するものであればいかなるものでもよいが、例えば、リポプロテインリパーゼ及びグリセロールキナーゼ、更にグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。
これらの酵素は、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
これらの酵素を試薬に含有させる濃度であるが、酵素の種類及び由来、選択的反応促進物質の種類、又は第１試薬と第２試薬の混合比率等により異なるので、一概には言えず、適宜その条件に適した濃度で含有させればよい。
なお、通常、リポプロテインリパーゼは、１〜１０，０００，０００単位／ｌの濃度で含有させることが好ましく、１００〜１，０００，０００単位／ｌの濃度で含有させることが特に好ましい。
また、グリセロールキナーゼは、通常、０．０１〜５００，０００単位／ｌの濃度で含有させることが好ましく、１０〜１０，０００単位／ｌの濃度で含有させることが特に好ましい。
そして、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼは、通常、１〜５００，０００単位／ｌの濃度で含有させることが好ましく、１００〜５０，０００単位／ｌの濃度で含有させることが特に好ましい。
なお、本来、酵素の活性値は、活性測定方法により異なるものであり、また、同じ活性測定方法、同じ酵素であっても、その酵素の由来、あるいは精製度等により異なるものでもある。
よって、先に記載した各酵素の濃度範囲を外れる酵素濃度（酵素活性値）だからといって、本発明の効果が得られないというものではない。
▲３▼  酵素以外の物質
この本発明の試薬において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応における、前記の酵素以外にも必要な物質があれば含有させる。
この反応に必要な物質としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）若しくはその塩、マグネシウムイオン、又は酸化型補酵素等を挙げることができる。
アデノシン三リン酸又はその塩を含有させる濃度は、通常、０．００１〜５０ｇ／ｌが好ましく、０．０１〜１０ｇ／ｌが特に好ましい。
マグネシウムイオンは、ハロゲンイオン又は有機酸などとの塩の形態のものを用いればよく、通常、０．００１〜１００ｍＭの濃度で含有させることが好ましく、０．０１〜５０ｍＭの濃度で含有させることが特に好ましい。
酸化型補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）〔ＮＡＤ＋（酸化型）〕、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）〔ＮＡＤＰ＋（酸化型）〕等を挙げることができる。
４．過酸化水素又は還元型補酵素の測定
本発明の定量する試薬においては、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定は、前記の酵素により生成した過酸化水素又は還元型補酵素の量を測定することができる方法であればいかなる方法を用いたものであってもよい。
例えば、生成した過酸化水素又は還元型補酵素から、何かしらのシグナルを導き出す方法等を挙げることができる。
より具体的には、過酸化水素の測定においては、過酸化水素電極等により過酸化水素自体を測定してもよく、又は過酸化水素から別のシグナルを導き出し、このシグナルを測定してもよい。
この過酸化水素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在のもとに、色原体を酸化させ色素を生成させて、この生成した色素の吸光度などを測定する、トリンダー反応系を利用する反応等を挙げることができる。
また、還元型補酵素の測定においては、還元型補酵素自体を３４０ｎｍなどにおける吸光度を測ることなどにより測定してもよく、又は還元型補酵素から別のシグナルを導き出し、このシグナルを測定してもよい。
この還元型補酵素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、例えば、ジアホラーゼ又は１−メトキシ−フェナジンメトサルフェートなどの存在のもとに、テトラゾリウム塩などを還元させ色素を生成させて、これを測定する反応等を挙げることができる。
５．消去反応
本発明の第２の試薬においては、試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去（分解）するものである。
また、本発明の第３の試薬においては、試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、第１試薬に含有される選択的反応促進物質が、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、これにより、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドを消去（分解）するものである。（但し、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの両方の消去は行わない。）
これらの消去（分解）は、第１試薬に含有させた選択的反応促進物質の存在下、試料を、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより行うが、このトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応についての詳細は、既に記述したとおりである。
この消去（分解）の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素は、試料と第１試薬を混合し反応させる第１段階において消去して、更に第２試薬を混合させる第２段階まで持ちこさないことが好ましい。
過酸化水素の場合は、例えば、カタラーゼ又はペルオキシダーゼ等を第１試薬に含有させることにより、第１段階で発生した過酸化水素を消去（分解）することができる。
カタラーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このカタラーゼを含有させる濃度は、通常、１００単位／ｌ以上とすることが好ましい。
そして、第１段階においてカタラーゼにより生成した過酸化水素を消去した後、第２段階においてはカタラーゼの活性を阻害して働かないようにする必要がある。
これは、アジ化ナトリウムなどのカタラーゼの活性を阻害する物質を、第２試薬に含有させること等により、達成することができる。
また、ペルオキシダーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルオキシダーゼを含有させる濃度は、通常、３０単位／ｌ以上とすることが好ましい。
還元型補酵素の場合は、例えば、この還元型補酵素を補酵素とする脱水素酵素を第１試薬に含有させること等により消去（分解）することができる。
６．試薬の組成
本発明の定量する試薬は、（ｉ）選択的反応促進物質、及び（ｉｉ）トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含有するものである。
本発明の試薬においては、前記の酵素によるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応に必要な物質をも含有させる。
この反応に必要な物質として、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、トリンダー反応系における色原体、還元型補酵素、又は緩衝剤等を例示することができる。
ペルオキシダーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルオキシダーゼを含有させる濃度は、通常、３０単位／ｌ以上とすることが好ましい。
トリンダー反応系における色原体としては、例えば、４−アミノアンチピリンとフェノール若しくはその誘導体、又は４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体との組み合わせ等を挙げることができる。
４−アミノアンチピリンは、通常、０．００１〜５０ｇ／ｌの濃度で含有させることが好ましく、０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度で含有させることが特に好ましい。
フェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げることができる。
アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、若しくはＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、又はこれらの塩等を挙げることができる。
これらのフェノール若しくはその誘導体、又はアニリン誘導体は、通常、０．００１〜５０ｇ／ｌの濃度で含有させることが好ましく、０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度で含有させることが特に好ましい。
本発明の試薬において、試料と試薬を混合して定量を行う際のｐＨは、ｐＨ５〜１０の範囲であることが好ましく、ｐＨ５．５〜９．０の範囲であることが特に好ましい。
試薬が第１試薬及び第２試薬よりなるときは、試料と第１試薬を混合し、更に第２試薬を混合した後のｐＨが前記のｐＨの範囲となるように、第１試薬及び第２試薬のｐＨを設定してもよい。
緩衝剤を含有させる場合は、定量を行う際のｐＨが前記のｐＨの範囲となるような緩衝剤を含有させることが好ましい。
例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
本発明の試薬には、更に、他の酵素、他の酵素の基質、他の補酵素、アルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩などの金属イオン若しくはこれを含む塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、アジ化ナトリウム、抗生物質、若しくは合成抗菌剤などの防腐剤、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、活性化剤、アスコルビン酸オキシダーゼなどの試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質、賦形剤、又は他の試薬成分等を適宜必要に応じて含有させることができる。
本発明の試薬は、１試薬のものでもよいが、必要に応じて２試薬以上に試薬成分を含有させて構成してもよい。
ＩＩＩ．本発明の方法及び試薬に共通する事項
１．被検試料
本発明の方法及び試薬において、被検試料は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドが存在する可能性があり、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの定量を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。
この被検試料としては、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む可能性のあるものが好ましい。
特に、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白を含む可能性のあるものが好ましい。
このようなものの例として、ヒト又は動物の血液、血清、血漿等の体液；ヒト若しくは動物の臓器又は筋肉等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液；細胞又は菌体の抽出液；あるいは植物の抽出液等を挙げることができる。
２．リポ蛋白
本明細書において、リポ蛋白としては、主要な、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白について記載している。
しかしながら、厳密には、これらの主要な５種類のリポ蛋白以外のリポ蛋白も存在する。
よって、本明細書において、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドは、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドと同義とする。
また、中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドは、超低比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドと同義とする。
そして、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドは、カイロミクロン、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドと同義とする。
３．選択的反応促進物質
▲１▼  選択的反応促進物質
本発明の方法及び試薬において、選択的反応促進物質は、試料中の超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量するためのものである。
▲２▼  選択的反応促進物質の例示
この本発明の方法及び試薬における選択的反応促進物質の例として、次のａ）〜ｉ）のものを挙げる。
ａ）  超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
ｂ）  超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
これにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドは消去される。
ｃ）  超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
これにより、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドは消去される。
（但し、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの両方の消去は行わないもの。）
ｄ）  カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
これにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドが消去される。
ｅ）  前記ｄ）の消去処理において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
ｆ）  カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
これにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドは消去される。
ｇ）  前記ｆ）の消去処理において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
ｈ）  カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも１種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
これにより、カイロミクロン、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライド、並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前記トリグリセライドは消去される。
ｉ）  前記ｈ）の消去処理において、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、低比重リポ蛋白及び／又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、並びに中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、更に場合によっては超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、前記のトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
▲３▼  選択的反応促進物質の反応促進性によるタイプ分け
選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、カイロミクロン（以下、場合により「ＣＭ」という。）、低比重リポ蛋白、又は高比重リポ蛋白の各リポ蛋白に含まれるトリグリセライドが、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応する場合、各々のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを前記酵素と反応させることができる選択的反応促進物質のタイプを表１に示した。
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この表より分かるように、反応促進性により分類した選択的反応促進物質のタイプは、タイプ１〜タイプ３１までの３１通りである。
▲４▼  各タイプ選択的反応促進物質の使用方法
本発明の方法（又は試薬）において、前記▲３▼の表１でタイプ分けした選択的反応促進物質を、どのように使用することができるかについて、以下説明する。
ａ）  本発明の第１の方法（又は第１の試薬）の場合
前記の本発明の第１の方法（又は第１の試薬）の場合、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、表１におけるタイプ１０の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
また、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、タイプ２の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
そして、中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、タイプ３の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
なお、これらの場合、定量を第１段階と第２段階の２段階に分けて行うとき、前記の選択的反応促進物質は、第１段階に存在させてもよく、第２段階に存在させてもよく、又は第１段階及び第２段階に存在させてもよい。いずれの場合も、同様の効果を得ることができる。
同様に、定量の試薬が第１試薬及び第２試薬よりなるとき、前記の選択的反応促進物質は、第１試薬に含有させてもよく、第２試薬に存在させてもよく、又は第１試薬及び第２試薬に含有させてもよい。いずれの場合も、同様の効果を得ることができる。
また、複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、同時に存在（又は含有）させて使用することもできる。
例えば、表１のタイプ２の選択的反応促進物質とタイプ３の選択的反応促進物質を組み合わせて存在（又は含有）させることにより、タイプ１０の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させるのと、同様の効果を得ることができる。
そして、例えば、タイプ１０の選択的反応促進物質と同様の効果を得るのに、タイプ１０の選択的反応促進物質とともに、タイプ２の選択的反応促進物質及び／又はタイプ３の選択的反応促進物質を加えて存在（又は含有）させてもよい。
ｂ）  本発明の第２の方法（又は第２の試薬）の場合
前記の本発明の第２の方法（又は第２の試薬）の場合、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階（又は第１試薬）において、表１におけるタイプ２１の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
また、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階（又は第１試薬）において、タイプ２９の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
そして、中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階（又は第１試薬）において、タイプ２８の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
また、第２段階（又は第２試薬）において、第１段階（又は第１試薬）に存在（又は含有）させた選択的反応促進物質とともにこの選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を存在（又は含有）させてもよいが、この場合の、選択的反応促進物質の組み合わせの一例を以下に記載する。
超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階（又は第１試薬）においてタイプ２１の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させ、第２段階（又は第２試薬）においてタイプ１０の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
この場合、第１段階（又は試料と第１試薬の混合後）においてはタイプ２１の選択的反応促進物質の存在下、カイロミクロンに含まれているトリグリセライド、低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライド、及び高比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドが、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応し、消去される。
ここで消去されずに残存する超低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライド、及び中間比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドを、第２段階（又は第２試薬の添加後）において、タイプ１０の選択的反応促進物質の存在下、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う。
また、超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階（又は第１試薬）においてタイプ２１の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させ、第２段階（又は第２試薬）においてタイプ２の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。あるいは、第１段階（又は第１試薬）においてタイプ２９の選択的反応促進物質を存在させ、第２段階（又は第２試薬）においてタイプ２及び／又はタイプ１０の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
そして、中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階（又は第１試薬）においてタイプ２１の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させ、第２段階（又は第２試薬）においてタイプ３の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。あるいは、第１段階（又は第１試薬）においてタイプ２８の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させ、第２段階（又は第２試薬）においてタイプ３及び／又はタイプ１０の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させればよい。
また、複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、同時に存在（又は含有）させて使用することもできる。
例えば、表１のタイプ１の選択的反応促進物質とタイプ１５の選択的反応促進物質を組み合わせて存在（又は含有）させることにより、タイプ２１の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させるのと、同様の効果を得ることができる。
そして、例えば、タイプ２８の選択的反応促進物質と同様の効果を得るのに、タイプ２８の選択的反応促進物質とともに、タイプ１の選択的反応促進物質及び／又はタイプ１５の選択的反応促進物質等を加えて存在（又は含有）させてもよい。
ｃ）  本発明の第３の方法（又は第３の試薬）の場合
前記の本発明の第３の方法（又は第３の試薬）の場合、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階に存在させる（第１試薬に含有させる）選択的反応促進物質と第２段階に存在させる（第２試薬に含有させる）選択的反応促進物質を、表２に示したタイプの組み合わせで存在（又は含有）させればよい。
すなわち、この表において、「○」で示された欄における、「第１段階に存在させる（第１試薬に含有させる）選択的反応促進物質のタイプ」と「第２段階に存在させる（第２試薬に含有させる）選択的反応促進物質のタイプ」の組み合わせで存在（又は含有）させればよい。
なお、この表において、１〜３１までの選択的反応促進物質のタイプを示した欄に記載した文字は、そのタイプの選択的反応促進物質が反応を促進するトリグリセライドを含むリポ蛋白の種類を表す。すなわち、「Ｖ」は超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）を、「Ｉ」は中間比重リポ蛋白（ＩＤＬ）を、「Ｃ」はカイロミクロンを、「Ｌ」は低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）を、そして「Ｈ」は高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）を表す（以下の表３及び表４においても同じ。）。
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例えば、第１段階（又は第１試薬）においてタイプ９の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させ、第２段階（又は第２試薬）においてタイプ２７の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させて定量を行う場合、第１段階（又は試料と第１試薬の混合後）においてはタイプ９の選択的反応促進物質の存在下、カイロミクロンに含まれているトリグリセライド、及び高比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドが、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応し、消去される。
ここでは、超低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライド、中間比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライド、及び低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドが消去されずに残存する。
第２段階（又は第２試薬の添加後）において、タイプ２７の選択的反応促進物質の存在下、超低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライド、及び中間比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドを、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う。
なお、この第２段階（第２試薬）において存在（又は含有）させるタイプ２７の選択的反応促進物質は、超低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライド、及び中間比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドだけではなく、カイロミクロンに含まれているトリグリセライド、及び高比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドも前記酵素と反応させることができるものであるが、第１段階（又は試料と第１試薬の添加後）においてタイプ９の選択的反応促進物質の存在下、カイロミクロンに含まれているトリグリセライド、及び高比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドは既に消去され存在しないので、第２段階（又は第２試薬添加後）でタイプ２７の選択的反応促進物質を存在させても、カイロミクロンに含まれているトリグリセライド、及び高比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドを測り込んでしまうことはなく、超低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライド、及び中間比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライドだけを定量することができる。
超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階に存在させる（第１試薬に含有させる）選択的反応促進物質と第２段階に存在させる（第２試薬に含有させる）選択的反応促進物質を、表３に示したタイプの組み合わせで存在（又は含有）させればよい。
すなわち、この表において、「○」で示された欄における、「第１段階に存在させる（第１試薬に含有させる）選択的反応促進物質のタイプ」と「第２段階に存在させる（第２試薬に含有させる）選択的反応促進物質のタイプ」の組み合わせで存在（又は含有）させればよい。
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そして、中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、第１段階に存在させる（第１試薬に含有させる）選択的反応促進物質と第２段階に存在させる（第２試薬に含有させる）選択的反応促進物質を、表４に示したタイプの組み合わせで存在（又は含有）させればよい。
すなわち、この表において、「○」で示された欄における、「第１段階に存在させる（第１試薬に含有させる）選択的反応促進物質のタイプ」と「第２段階に存在させる（第２試薬に含有させる）選択的反応促進物質のタイプ」の組み合わせで存在（又は含有）させればよい。
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以上の本発明の第３の方法（又は第３の試薬）においても、複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、同時に存在（又は含有）させて使用することもできる。
例えば、表１のタイプ４の選択的反応促進物質とタイプ５の選択的反応促進物質を組み合わせて存在（又は含有）させることにより、タイプ１５の選択的反応促進物質を存在（又は含有）させるのと、同様の効果を得ることができる。
そして、例えば、タイプ２８の選択的反応促進物質と同様の効果を得るのに、タイプ２８の選択的反応促進物質とともに、タイプ１の選択的反応促進物質及び／又はタイプ１５の選択的反応促進物質等を加えて存在（又は含有）させてもよい。
▲５▼  選択的反応促進物質の具体例
本発明の方法（本発明の試薬）において、選択的反応促進物質の具体例として、界面活性剤、ポリオキシアルキレン若しくはその誘導体、又は多糖類若しくはその誘導体等を挙げることができる。
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、又は両性界面活性剤を挙げることができる。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンポリオール類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、又はｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド（ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−Ｈｅｐｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）等を挙げることができる。
ポリオキシアルキレンポリオール等におけるポリオキシアルキレンの付加モル数は、５〜１，０００の範囲が好ましく、１０〜５００の範囲が特に好ましい。
また、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、又はポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物等におけるエチレンオキサイドの付加モル数は、５〜１，０００の範囲が好ましく、５〜５００の範囲が特に好ましい。
そして、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類等におけるエチレンオキサイドの付加モル数は、５〜１，０００の範囲が好ましく、５〜５００の範囲が特に好ましい。
両性界面活性剤としては、例えば、３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＡＰＳＯ）等を挙げることができる。
また、ポリオキシアルキレン若しくはその誘導体としては、例えば、ポリオキシエチレン（ポリエチレングリコール）若しくはその誘導体、又はポリオキシプロピレン（ポリプロピレングリコール）若しくはその誘導体等を挙げることができる。
このポリオキシアルキレンの付加モル数は、５〜１，０００の範囲が好ましく、１０〜５００の範囲が特に好ましい。
多糖類若しくはその誘導体としては、例えば、シクロデキストリン若しくはその誘導体、デキストランサルフェイト若しくはその誘導体、デキストラン若しくはその誘導体、ヘパリン若しくはその誘導体等を挙げることができる。
シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、又はγ−シクロデキストリンを挙げることができる。
また、シクロデキストリン誘導体としては、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、又はγ−シクロデキストリンの水酸基が、ヒドロキシプロピル基、マルトシル基、ヒドロキシブチル基、ジエチルアミノエチル基などで置換されたもの、又はこれらのシクロデキストリン若しくはその誘導体の架橋物等を挙げることができる。
デキストランサルフェイト若しくはその誘導体は、分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲のものが好ましく、分子量が５，０００〜１，０００，０００の範囲のものが特に好ましい。
これらの選択的反応促進物質のより詳細な具体例を、表５に示した。
0004070958.tif 000008
先に述べたように、選択的反応促進物質は、複数種類のものを組み合わせて、存在（又は含有）させてもよい。
選択的反応促進物質を存在（又は含有）させる濃度は、選択的反応促進物質の種類、トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素の種類及び由来、試料中のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドの濃度、又は第１試薬と第２試薬の混合比率等により異なるので、一概には言えず、適宜その条件に適した濃度で存在（又は含有）させればよいが、通常は、０．００１〜１０％の濃度で存在（又は含有）させればよく、０．０１〜５％の濃度で存在（又は含有）させることが好ましい。
４．反応補助物質
本発明の方法（本発明の試薬）には、選択的反応促進物質とともに反応補助物質を存在（又は含有）させてもよい。
この反応補助物質の存在（又は含有）により、選択的反応促進物質の選択的反応促進の働きを高めることができる。
反応補助物質の具体例として、ポリアニオン、ハロゲンイオン、金属イオン、又はレクチン等を挙げることができる。
ポリアニオンとしては、例えば、リンタングステン等を挙げることができる。
ハロゲンイオンとしては、例えば、クロールイオン等を挙げることができる。
金属イオンとしては、例えば、銅イオン、又はマンガンイオンなどの２価金属イオン等を挙げることができる。
レクチンとしては、例えば、レンズマメレクチン等を挙げることができる。
これらの反応補助物質は、複数種類のものを組み合わせて、存在（又は含有）させてもよい。
反応補助物質を存在（又は含有）させる濃度は、選択的反応促進物質の場合と同様に各種条件により異なるので、一概には言えず、適宜その条件に適した濃度で存在（又は含有）させればよい。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願平１１−１２８９９４号及びＰＣＴ／ＪＰ９９／０６７２３号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕本発明の方法及び試薬による精製リポ蛋白画分中のトリグセライドの定量−１
選択的反応促進物質として、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシドを用いた本発明の方法及び試薬にて、精製リポ蛋白画分中のトリグリセライドの定量を行った。
第１試薬として、グリセロールキナーゼ１．０単位／ｍｌ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ８．０単位／ｍｌ、カタラーゼ、アデノシン−３−リン酸４．１ｍｍｏｌ／ｌ、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミンナトリウム０．９４ｍｍｏｌ／ｌ、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド０．４％、グッド緩衝液（ｐＨ６．０）を合わせたもの用意した。
また第２試薬として、リポプロテインリパーゼ２．０単位／ｍｌ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン２．５ｍｍｏｌ／ｌ、グッド緩衝液を合わせたものを用意した。
実際の測定では、３７℃にした試験管に血清３μｌと第１試薬３００μｌを入れ５分反応させ、次に第２試薬１００μｌを加えた。
その直後と５分後に波長６００ｎｍで反応液の吸光度を測定した。
この値を基に、予め作成しておいた検量線を用いて、トリグリセライド値を算出した。
一方、凝固阻止剤を入れた採血管で血液を採取し、密度勾配遠心法にてカイロミクロン、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、並びに高比重リポ蛋白の４種類のリポ蛋白を分離した。
この４つの試料に対して、本法による定量と市販の試薬キット（デタミナーＬＴＧ−ＩＩ；協和メデックス社製）による総トリグリセライドの定量を行い、両者の比を求めた。
この結果を図１に示す。
本発明によって、カイロミクロン、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白中のトリグリセライドが選択的に反応分解できることが示されている。
〔実施例２〕本発明の方法及び試薬による精製リポ蛋白画分中のトリグセライドの定量−２
各種の選択的反応促進物質を用い、本発明の方法及び試薬にて、精製リポ蛋白画分中のトリグリセライドの定量を行った。
１．本発明の試薬の調製
（１）  第１試薬（Ａ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．０（２０℃）の試薬を調製した。
0004070958.tif 000009
反応促進物質  〔物質名及び濃度は表６に記載〕
（２）  第２試薬（Ｂ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．０（２０℃）の試薬を調製した。
0004070958.tif 000010
反応促進物質  〔物質名及び濃度は表６に記載〕
２．総トリグリセライド定量試薬（対照）の調製
（１）第１試薬（Ｃ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．０（２０℃）の試薬を調製した。
0004070958.tif 000011
（２）第２試薬（Ｄ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．０（２０℃）の試薬を調製した。
0004070958.tif 000012
３．精製リポ蛋白画分の調製
実施例１と同様に密度勾配遠心法を用いて、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白の５種類の比重の異なるリポ蛋白の画分をそれぞれ得た。これらの５種類の画分を試料として定量に供した。
４．リポ蛋白画分中のトリグリセライドの定量
リポ蛋白画分中のトリグリセライドの測定は、以下に示す手順で日立７１５０形自動分析装置（日立製作所）を用いて行った。
前記３で調製した各リポ蛋白画分の３μｌに、前記１の（１）の本発明の第１試薬（Ａ）２５０μｌを添加し、３７℃で５分間加温した。
本発明の第１試薬（Ａ）添加５分後に、前記１の（２）の第２試薬（Ｂ）１２５μＬを添加した。
この反応混液の３７℃、５分後の吸光度を、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの二波長分析により測定した。
なお、吸光度は、試料として各リポ蛋白画分を用いて前記の方法で測定した吸光度から、試料として生理食塩水を用いて同様の方法で測定した吸光度を差し引いた値を、吸光度の測定値とした。
前記の方法と同様にし、前記２の（１）の総トリグリセライド定量試薬の第１試薬（Ｃ）、及び前記２の（２）の総トリグリセライド定量試薬の第２試薬（Ｄ）を用いて、前記３で調製した各リポ蛋白画分中のトリグリセライドの定量を行った。
本発明の試薬に含有させた各々の選択的反応促進物質の効果を確かめるため、本発明の試薬（Ａ及びＢ）を用いたときの吸光度の測定値を、総トリグリセライド定量試薬（Ｃ及びＤ）を用いたときの吸光度の測定値で除した値を求めた。
この値を表６に示した。
0004070958.tif 000013
表６の結果より、カイロミクロンに含まれるトリグリセライドだけを反応させる選択的反応促進物質（タイプ１）は、ＫＦ−７００  ０．１％であった。
超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドだけを反応させる選択的反応促進物質（タイプ２）は、デキストラン硫酸〜５００，０００  ０．１及び０．５％、γ−ＣＤ  ０．１％、並びにヒドロキシプロピル−γ−ＣＤ  ０．１及び０．５％であった。
高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドだけを反応させる選択的反応促進物質（タイプ５）は、Ｒ−１０２０  ０．１及び０．５％、並びにプルロニックＰ−８５  ０．１％であった。
カイロミクロン及び超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ６）は、サルコシネートＣＮ−１００  ０．１及び０．５％であった。
カイロミクロン及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ７）は、ＰＥＧ１，０００  ０．１％、ＰＥＧ１，５４０  ０．１及び０．５％、ＰＥＧ６，０００  ０．１及び０．５％、ＰＥＧ１０，０００  ０．１％、ＰＥＧ２０，０００  ０．５％、プルロニックＬ−３４  ０．１％、プルロニックＬ−４４  ０．１％、並びにＰＯＥ−ｐ−トルエンスルホアミド  ０．１％であった。
超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ１０）は、サンニックスＦＡ−１０３  ０．２、０．４、０．５及び０．６％、ＰＥＧ２０，０００  ０．１％、ジエチルアミノエチル−β−ＣＤ  ０．１％、並びにヒドロキシプロピル−α−ＣＤ  ０．１％であった。
中間比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ１４）は、ＫＦ−３５１  ０．１％であった。
低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ１５）は、エマルゲン９１１  ０．１％、ＢＬ−９ＥＸ  ０．１％、並びにアデカトールＮＰ−７２０  ０．１及び０．５％であった。
カイロミクロン、超低比重リポ蛋白、及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ１６）は、サンニックスＦＡ−１０３  ０．１％、ＰＥＧ２，０００  ０．５％、ＰＥＧ１０，０００  ０．５％、ＰＯＥ−ｐ−トルエンスルホアミド  ０．５％、α−ＣＤ、ヒドロキシブチル−α−ＣＤ、マルトシル−β−ＣＤ、ヒドロキシブチル−β−ＣＤ及びヒドロキシプロピル−β−ＣＤの０．１及び０．５％、水溶性β−シクロデキストリンポリマー  ０．１％、ジエチルアミノエチル−β−ＣＤ、γ−ＣＤ、並びにヒドロキシプロピル−α−ＣＤの０．５％であった。
超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ２３）は、ＴＭＨ−７ＥＸ０．１％、サンニックスＧＰ−４００  ０．１％、及びプルロニックＬ−４４  ０．５％であった。
中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ２５）は、エマルゲン９１１０．５％であった。
カイロミクロン、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、及び低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ２６）は、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％、及びサンニックスＦＡ−１０３  ０．８％であった。
超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる選択的反応促進物質（タイプ３０）は、ＮＰ−１０  ０．１及び０．５％、サンニックスＧＰ−４００  ０．５％、並びにＯＰ−１０  ０．１及び０．５％であった。
カイロミクロン、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、及び高比重リポ蛋白の全てのリポ蛋白に含まれるトリグリセライドに反応する、選択的反応促進物質（タイプ３１）は、ＴＭＨ−７ＥＸ  ０．５％、ＢＴ−７  ０．１％、アデカトールＳＯ−１２０  ０．１％、ＯＰ−８  ０．５％、ＢＴ−９ＥＸ  ０．１及び０．５％、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、並びにサンニックスＦＡ−１０３  １％であった。
これらの結果から、本発明の定量する方法及び定量する試薬において、選択的反応促進物質を単独若しくは組み合わせて存在又は含有させることによって、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量することができることが確かめられた。
すなわち、ここで検討して選択的反応促進物質としてのタイプが判明した各々の選択的反応促進物質を、先の「▲４▼  各タイプ選択的反応促進物質の使用方法」（「発明の実施の形態」の「本発明の方法及び試薬に共通する事項」の「３．選択的反応促進物質」）の記載に従って、存在又は含有させて定量を行うことにより、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量できるのである。
一例を挙げれば、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを反応させる、タイプ１０の選択的反応促進物質である、サンニックスＦＡ−１０３  ０．２、０．４、０．５若しくは０．６％、ＰＥＧ２０，００００．１％、ジエチルアミノエチル−β−ＣＤ  ０．１％、又はヒドロキシプロピル−α−ＣＤ  ０．１％を存在又は含有させることにより、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量できることが分かる。
〔実施例３〕本発明の方法及び試薬による精製リポ蛋白画分中のトリグセライドの定量−３
選択的反応促進物質として、サンニックスＦＡ−１０３を用いた本発明の方法及び試薬にて、精製リポ蛋白画分中のトリグリセライドの定量を行った。
１．サンニックスＦＡ−１０３含有第１試薬の調製
選択的反応促進物質として、サンニックスＦＡ−１０３を用い、その含有濃度を、０．２、０．４、０．６、０．８、又は１．０％（ｗ／ｖ）としたこと以外は、前記実施例２の１の（１）の本発明の第１試薬（Ａ）と同じ試薬成分及び濃度として調製を行い、５種類のサンニックスＦＡ−１０３含有第１試薬を調製した。
２．サンニックスＦＡ−１０３含有第２試薬の調製
選択的反応促進物質として、サンニックスＦＡ−１０３を用い、その含有濃度を、０．２、０．４、０．６、０．８、又は１．０％（ｗ／ｖ）としたこと以外は、前記実施例２の１の（２）の本発明の第２試薬（Ｂ）と同じ試薬成分及び濃度として調製を行い、５種類のサンニックスＦＡ−１０３含有第２試薬を調製した。
前記実施例２の３と同様の手法で調製した５種類のリポ蛋白画分を試料とし、各サンニックスＦＡ−１０３含有第１試薬及び第２試薬を用いて、前記実施例２の４と同様に各リポ蛋白画分中のトリグリセライドの定量を行った。
また、この定量の方法と同様にし、前記実施例２の２の（１）の総トリグリセライド定量試薬の第１試薬（Ｃ）、及び前記実施例２の２の（２）の総トリグリセライド定量試薬の第２試薬（Ｄ）を用いて、各リポ蛋白画分中のトリグリセライドの定量を行った。
本発明のサンニックスＦＡ−１０３含有試薬に含有させた各々の選択的反応促進物質の効果を確かめるため、サンニックスＦＡ−１０３含有試薬を用いたときの吸光度の測定値を、総トリグリセライド定量試薬（Ｃ及びＤ）を用いたときの吸光度の測定値で除した値を求めた。
この値を表７及び図２に示した。
なお、この図において、縦軸はサンニックスＦＡ−１０３含有試薬を用いたときの吸光度の測定値を、総トリグリセライド定量試薬を用いたときの吸光度の測定値で除した値を表し、横軸は本発明のサンニックスＦＡ−１０３含有試薬に含有させたサンニックスＦＡ−１０３の濃度〔％（ｗ／ｖ）〕を表す。
0004070958.tif 000014
表７及び図２より、サンニックスＦＡ−１０３の濃度が０．８％（ｗ／ｖ）までの濃度において、同物質の存在（含有）により、リポ蛋白のうち超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白を選択的に定量できることが分かる。
特に、０．２％（ｗ／ｖ）の濃度においては、選択性が顕著である。
以上の結果よりも、本発明の定量する方法及び定量する試薬は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量することができることが確かめられた。
なお、本実施例において、本発明のサンニックスＦＡ−１０３含有試薬〔サンニックスＦＡ−１０３含有濃度が０．４％（ｗ／ｖ）のもの〕を用いて各リポ蛋白画分を定量した時の、日立７１５０形自動分析装置の反応タイムコースを図３に示した。
また、前記実施例２において、総トリグリセライド定量試薬（Ｃ及びＤ）を用いて各リポ蛋白画分を定量した時の、日立７１５０形自動分析装置の反応タイムコースを図４に示した。
これらの図において、縦軸は吸光度（主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍ）を示す。また、横軸は同分析装置の測光ポイントを示し、反応時間約１０分間を５０ポイントで測定を行っているものである。
図４には、総トリグリセライド定量試薬には、リポ蛋白中のトリグリセライドに対する選択性はなく、全てのリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量していることが示されている。
それに対して図３では、リポ蛋白のうち超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドが選択的に反応しており、サンニックスＦＡ−１０３が超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に反応させ、定量することができる選択的反応促進物質であることが示されている。
これらの図からも、選択的反応促進物質を存在させる又は含有する本発明の定量する方法及び定量する試薬は、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量できることが分かる。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明の、超低比重リポ蛋白及び／又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に定量する方法及び試薬は、遠心や沈殿などの煩雑な前処置が必要なく、臨床検査用自動分析装置に適用可能であり、動脈硬化症の予防と治療に有用なデータを、簡便かつ正確に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、選択的反応促進物質としてｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシドを用いて、４種類のリポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドの定量を行ったときの結果を示した図である。
図２は、選択的反応促進物質としてサンニックスＦＡ−１０３を用いて、５種類のリポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドの定量を行ったときの結果を示した図である。
図３は、選択的反応促進物質としてサンニックスＦＡ−１０３を用いて、５種類のリポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドの定量を行ったときの、日立７１５０形自動分析装置の反応タイムコースを示した図である。
図４は、総トリグリセライド定量試薬により、５種類のリポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドの定量を行ったときの、日立７１５０形自動分析装置の反応タイムコースを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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