(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛乳由来の蛋白質を加水分解した後、ゲル濾過クロマトグラフィーまたは分画膜により分子量２００ダルトン以上の画分を分取して得られる蛋白質の加水分解物であって、次のａ）〜ｈ）、
ａ）平均分子量が１０００乃至１３０００ダルトンであること
ｂ）メチオニンの含有率が２乃至３（重量）％であること
ｃ）トリプトファンの含有率が１（重量）％以下であること
ｄ）ヒスチジンの含有率が０．５乃至２．５（重量）％であること
ｅ）チロシンの含有率が２乃至５（重量）％であること
ｆ）アルギニンの含有率が１乃至３．５（重量）％であること
ｇ）５（重量）％グルコース中に１０（重量）％の蛋白質加水分解物を添加し、２００℃で１時間加熱反応した反応液を、セルの厚さ１ｃｍのガラスセルを用いて５４０ｎｍの波長で測定した透過率が９０％以上であること
ｈ）ＥＳＲスピントラップ法によるヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値が２×１０１１Ｍ−１・ｓ−１以上３．４×１０１２Ｍ−１・ｓ−１以下であることの理化学的性質を有する抗酸化性蛋白質加水分解物。
【請求項２】
請求項１に記載の抗酸化性蛋白質加水分解物を蛋白質素材として使用した食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品等の酸化防止、特にヒドロキシラジカルの生成を抑制する抗酸化性蛋白質加水分解物、およびこれを用いた食品に関するものである。
【０００２】
詳しくは、第一の発明は、牛乳由来の蛋白質を加水分解した後、ゲル濾過クロマトグラフィーまたは分画膜により分子量２００ダルトン以上の画分を分取して得られる蛋白質の加水分解物であって、
ａ）平均分子量が１０００乃至１３０００ダルトンであること
ｂ）メチオニンの含有率が２乃至３（重量）％であること
ｃ）トリプトファンの含有率が１（重量）％以下であること
ｄ）ヒスチジンの含有率が０．５乃至２．５（重量）％であること
ｅ）チロシンの含有率が２乃至５（重量）％であること
ｆ）アルギニンの含有率が１乃至３．５（重量）％であること
ｇ）５（重量）％グルコース中に１０（重量）％の蛋白質加水分解物を添加し、２００℃で１時間加熱反応した反応液を、セルの厚さ１ｃｍのガラスセルを用いて５４０ｎｍの波長で測定した透過率が９０％以上であること
ｈ）ＥＳＲスピントラップ法によるヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値が２×１０１１Ｍ−１・ｓ−１（モル濃度−１・秒−１）以上３．４×１０１２Ｍ−１・ｓ−１以下であること、の理化学的性質［以下、ａ）〜ｈ）をまとめて特定の理化学的性質と記載することがある。］を有する抗酸化性蛋白質加水分解物に関するものである。
また第二の発明は、上記第一の発明に係る抗酸化性蛋白質加水分解物を蛋白質素材として使用した食品である。
【０００３】
本明細書において、百分率は、透過率を除き、特に断りのない限り、重量による表示である。
【０００４】
【従来の技術】
従来、抗酸化性蛋白質加水分解物としては、牛乳、大豆、酵母由来の蛋白質を蛋白分解酵素により分解して得られる分子量５００乃至５０００の抗酸化作用を有するペプチド（特開平１０−２０３９９４号公報。以下、従来技術１と記載する。）、及び大豆蛋白質を蛋白分解酵素により分解して得られる分子量２５００乃至３０００の抗酸化力を有するペプチド（日本食品工業学会誌、第２２巻、第９号、第４３１乃至４３５頁、１９７４年。以下、従来技術２と記載する。）等が知られている。
【０００５】
しかしながら、これらの従来技術には、次に記載するとおりの不都合があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来の技術に開示されているとおり、各種の抗酸化性蛋白質加水分解物が開発されていた。しかしながら、前記従来技術の抗酸化性蛋白質加水分解物は、抗酸化性、特に生体組織の損傷防止のために、生成抑制手段が求められているヒドロキシラジカル生成抑制能が不十分であるという問題点があった。また、前記従来技術のアルギニン等の含有率が低減されていない抗酸化性蛋白質加水分解物をグルコース等の還元糖が含有される食品等の酸化防止に使用すると、蛋白質加水分解物中のアルギニン残基等とグルコース等の間でメイラード反応に代表される着色反応が生じ易く食品等に望ましくない着色を生じるという問題点があった。更に、従来より加水分解の程度が高く平均分子量が小さい蛋白質加水分解物が着色反応が生じ易く食品等に望ましくない着色を生じるという問題点があった。
【０００７】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、抗酸化性の向上、特に生体組織の損傷防止のために、発生抑制手段が求められているヒドロキシラジカル生成抑制能の向上、並びにメイラード反応等による着色の抑制を目的とし、種々の蛋白質加水分解物について試験した。その結果、従来は、従来技術２に記載されるとおり、抗酸化力が強いアミノ酸であるメチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、及びチロシンを多く含有する蛋白質加水分解物の抗酸化力が強いと考えられていたが、本発明者らは、従来の考えと全く逆に、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、及びチロシンの含有率が低い蛋白質加水分解物である特定の理化学的性質を有する抗酸化性蛋白質加水分解物が、従来技術に比較して、抗酸化性、特にヒドロキシラジカル生成抑制能に優れており、かつ着色の抑制に優れていることを見い出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明の目的は、新規な抗酸化性蛋白質加水分解物およびこれを用いた食品を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する第一の発明は、牛乳由来の蛋白質を加水分解した後、ゲル濾過クロマトグラフィーまたは分画膜により分子量２００ダルトン以上の画分を分取して得られる蛋白質の加水分解物であって、次のａ）〜ｈ）、
ａ）平均分子量が１０００乃至１３０００ダルトンであること
ｂ）メチオニンの含有率が２乃至３％であること
ｃ）トリプトファンの含有率が１％以下であること
ｄ）ヒスチジンの含有率が０．５乃至２．５％であること
ｅ）チロシンの含有率が２乃至５％であること
ｆ）アルギニンの含有率が１乃至３．５％であること
ｇ）５％グルコース中に１０％の蛋白質加水分解物を添加し、２００℃で１時間加熱反応した反応液を、セルの厚さ１ｃｍのガラスセルを用いて５４０ｎｍの波長で測定した透過率が９０％以上であること
ｈ）ＥＳＲスピントラップ法によるヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値が２×１０１１Ｍ−１・ｓ−１以上３．４×１０１２Ｍ−１・ｓ−１以下であることの理化学的性質を有する抗酸化性蛋白質加水分解物である。
また、第二の発明は、上記第一の発明に係る抗酸化性蛋白質加水分解物を蛋白質素材として使用した食品である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について詳述する。
【００１１】
本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物の原料である蛋白質は、ヒドロキシラジカル生成抑制能を考慮すると、特に牛乳由来の乳蛋白質、カゼイン、乳清蛋白質が望ましい。また、これらの蛋白質を含有する素材を、限外瀘過、イオン交換樹脂処理等の処理により濃縮した蛋白質の濃縮物、例えば全乳蛋白質濃縮物（ＴＭＰ）、乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、乳清蛋白質分離物（ＷＰＩ）を使用することができる。
【００１２】
この原料蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、５〜１５％程度の蛋白質濃度とすることが効率性及び操作性の点から望ましい。
【００１３】
次いで、前記蛋白質溶液を８０〜９０℃で１０分間程度加熱殺菌することが、雑菌の汚染による腐敗防止の点から望ましい。
【００１４】
本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物の製造方法は、特定の理化学的性質を有する抗酸化性蛋白質加水分解物を取得できる方法であれば特に限定されるものではないが、酸分解法に比較して加水分解の制御が容易で、特定の理化学的性質を有する抗酸化性蛋白質加水分解物の取得が容易な酵素分解法が望ましい。
【００１５】
本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物の製造に使用される蛋白質分解酵素は、動物由来（例えば、パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等）、植物由来（例えば、パパイン、ブロメライン、フィシン等）、微生物由来（例えば、乳酸菌、酵母、カビ、枯草菌、放線菌等）のエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼ、並びにこれらの粗精製物、菌体破砕物等を例示することができる。特定の理化学的性質、特に特定アミノ酸の含有率を有する本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物を速やかに製造するためには、動物由来の蛋白質分解酵素（例えば、トリプシン）、若しくは植物由来の蛋白質分解酵素（例えば、パパイン、ブロメライン）と、微生物由来の蛋白質分解酵素［バシラス（Bacillus）属菌、若しくはアスペルギルス（Aspergillus ）属菌由来の蛋白質分解酵素）を組み合わせて使用することが望ましい。
【００１６】
前記原料蛋白質に対する蛋白質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間により異なるが、一般的には、原料蛋白質１ｇ当り５０〜１００００活性単位の割合で酵素を単独、又は複数組み合わせて添加することにより加水分解が行われる。
【００１７】
また、蛋白質加水分解反応のｐＨは、格別の制限はなく、特定の理化学的性質を有する抗酸化性蛋白質加水分解物が取得できる実用的な範囲から選択される。通常、使用酵素の種類にもよるが、ｐＨ２〜１０の範囲から選択される。具体的には、前記蛋白質溶液に酵素を添加する前に、使用酵素の種類によりｐＨ２〜１０の範囲内で酸又はアルカリ剤の添加により所望のｐＨに調整することにより実施される。この場合、酸としては塩酸、クエン酸、リン酸等を、また、アルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等をそれぞれ例示することができる。
【００１８】
更に、蛋白質加水分解反応の温度は、格別の制限はなく、酵素作用の発現する最適温度範囲を含む実用に供せられ得る範囲、即ち、通常３０〜７０℃の範囲から選択される。温度を５０〜６０℃の範囲に維持することにより蛋白質加水分解反応中の腐敗を防止することもできる。
【００１９】
また、蛋白質加水分解反応の時間は、使用酵素の種類及び組合せ、反応温度、初発ｐＨ等の反応条件によって進行状態が異なり、酵素反応の反応継続時間を一定とすると製造バッチ毎に異なる理化学的性質を有する分解物が生じる可能性があるため、一概に決定できない。従って、予め酵素反応をモニターし、反応継続時間を決定する必要がある。
【００２０】
尚、蛋白質加水分解反応のモニター方法としては、特開平８−１１２０６４号公報に記載の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により各種遊離アミノ酸量及び総遊離アミノ酸量を測定し、原料中の各種アミノ酸量から、蛋白質加水分解物中に残存する各種アミノ酸量及び総アミノ酸量を算出すること等が例示できる。
【００２１】
加水分解の程度は、蛋白質加水分解物が、平均分子量が１０００乃至１３０００ダルトンであり、メチオニンの含有率が２乃至３％であり、トリプトファンの含有率が１％以下であり、ヒスチジンの含有率が０．５乃至２．５％であり、チロシンの含有率が２乃至５％であり、並びにアルギニンの含有率が１乃至３．５％である範囲で、反応温度、反応時間、酵素添加量等の反応条件を設定する。
【００２２】
酵素反応の停止は、加熱（例えば、８５℃で１５分間等）して酵素を失活させることにより行う。
【００２３】
前記蛋白質加水分解反応終了後の溶液中に存在する抗酸化性蛋白質加水分解物の取得は、前記溶液のｐＨを６．５〜７．５に調整し、ゲル瀘過剤又は分画膜により分子量２００ダルトン以上の画分を分取することにより行われる。具体的には、ゲル瀘過剤としてSUPERDEX 30 PREP GRADE（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）等を充填したカラムに前記溶液を通液し、のち０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液により溶出することにより、分子量２００ダルトン以上の画分を分取する。
【００２４】
得られた抗酸化性蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて、この溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮した濃縮液として使用することもでき、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末として使用することもできる。
【００２５】
以上のようにして得られる本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物は、後記する実施例からも明らかなとおり、特定の理化学的性質を有し、ヒドロキシラジカル生成抑制能に優れており、かつ着色の抑制に優れているという優れた性質を有する抗酸化性蛋白質加水分解物である。即ち、本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物は、前記のとおりの特定の理化学的性質を有することから、ヒドロキシラジカル生成抑制能に優れており、かつ着色の抑制に優れていることから、抗酸化性、特にヒドロキシラジカル生成抑制能が要求され、還元糖を含有し、着色を生じる可能性が大きい各種一般食品、栄養食品、飼料、化粧品、及び医薬品等の蛋白質素材として広範に応用可能で有用である。
【００２６】
尚、本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物は、蛋白質が乳蛋白質であることが、ヒドロキシラジカル生成抑制能及び着色の抑制に一層優れる抗酸化性蛋白質加水分解物であることから望ましい。
【００２７】
更に、特定の理化学的性質の内、ａ）の平均分子量が２０００乃至１００００ダルトンであること、ｂ）のメチオニンの含有率が２乃至２．５％であること、ｃ）のトリプトファンの含有率が０．５％以下であること、ｄ）のヒスチジンの含有率が１乃至２％であること、ｅ）のチロシンの含有率が３．５乃至４．５％であること、ｆ）のアルギニンの含有率が２乃至３％であること、ｇ）の透過率が９５％以上であること、並びにｈ）のｋ値が７×１０11Ｍ-1・ｓ-1以上であることが、ヒドロキシラジカル生成抑制能及び着色の抑制に、より一層有効な抗酸化性蛋白質加水分解物であることから特に望ましい。
【００２８】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明においては、次の試験方法を採用した。
【００２９】
（１）平均分子量の測定方法
高速液体クロマトグラフィー（宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第１０２号、第２４１頁、株式会社化学同人、１９８４年）により次のとおり測定した。
【００３０】
ポリハイドロキシメチル・アスパルアミド・カラム［Poly Hydroxyethyl Aspartamide column: ポリ・エル・シー（PolyLC）社製。直径４．６ｍｍ及び長さ２００ｍｍ］を使用し、２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭぎ酸により溶出速度０．４ｍｌ／分で溶出した。検出はＵＶ検出器（島津製作所製）を使用し、データ解析はＧＰＣ分析システム（島津製作所製）を使用し、蛋白質加水分解物の重量基準の平均分子量を測定した。
【００３１】
（２）各アミノ酸の含有率の測定方法
トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミノ酸については、試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及びメチオニンについては、過ぎ酸処理後、６Ｎ塩酸で１１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸分析機（日立製作所製：８３５型）により分析し、各アミノ酸の質量を測定し、全アミノ酸に対する各アミノ酸の含有率を算出した。
【００３２】
（３）透過率の測定方法
５％グルコース中に１０％の各蛋白質加水分解物試料を添加し、２００℃で１時間加熱反応した反応液を、セルの厚さ１ｃｍのガラスセルを用い、分光光度計Ｕ−３２００型（日立製作所社製）により波長５４０ｎｍによりその透過率を測定し、この透過率の数値の大きさと着色の程度が相関することから、これを着色の指標とした。
【００３３】
（４）ヒドロキシラジカル生成抑制能の測定方法
ＥＳＲスピントラップ法［ブルチン・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティー・オブ・ジャパン（Bulletin of the Chemical Society of Japan ）、第６４巻、第１４４７乃至１４５３頁、１９９１年］に従って各蛋白質加水分解物試料のヒドロキシラジカル生成抑制能を示す指標であるヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値（Ｍ-1・ｓ-1）を次のとおり測定した。尚、ｋ値が大きいほど、ヒドロキシラジカル生成抑制能に優れることを意味する。
【００３４】
０．８８ＭのＤＭＰＯ（dimethyl-pyrroline-N-oxide。バイオテック社製）を２０μｌを試験管に収容し、１ｍＭの過酸化水素溶液（ナカライテスク社製）７５μｌ及び被検試料溶液５０μｌを添加し、のち０．１ｍＭの硫酸第一鉄（ナカライテスク社製）及び０．０５５ｍＭＤＴＰＡ（diethyleneamine-pentaacetic acid。バイオテック社製）の混合溶液７５μｌを添加して２０℃で反応し、６０秒後に電子共鳴信号の強さであるＥＳＲシグナル強度をＥＳＲシグナル測定装置（ＦＲ−３０。日本電子社製）により測定し、付属のデータ処理装置により、ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値（Ｍ-1・ｓ-1）を算出した。
【００３５】
試験例１
この試験は、従来技術と比較して本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物が優れていることを示すために行った。
【００３６】
（１）試料の調製
次に示す４種類の試料を調製した。
試料１：本発明の実施例１で得られた本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物
試料２：参考例１と同一の方法により調製した従来技術１の製造例１の抗酸化作用を有する牛乳分解物（フラクション２〜５の分画）
試料３：参考例２と同一の方法により調製した従来技術１の製造例３の抗酸化作用を有する酵母分解物（フラクション２〜５の分画）
試料４：参考例３と同一の方法により調製した従来技術２に記載の分子量２８００の抗酸化力を有する大豆蛋白質由来のペプチド
【００３７】
（２）試験方法
各試料の平均分子量、各アミノ酸の含有率、透過率、及びヒドロキシラジカル生成抑制能（ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値）を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００３８】
（３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、従来技術の試料２乃至試料４に比較して本発明の試料１が、透過率が大きく、いわゆる着色の抑制に優れており、ヒドロキシラジカル生成抑制能（ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値）に優れていることが判明した。
【００３９】
尚、本発明の試料については、蛋白質の種類、加水分解の程度を特定の理化学的性質の範囲で変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４０】
【表１】
0004141584.tif 000002
【００４１】
試験例２
この試験は、透過率及びヒドロキシラジカル生成抑制能（ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値）を指標として、抗酸化性蛋白質加水分解物の適正な平均分子量及び特定アミノ酸の含有率を調べるために行った。
【００４２】
（１）試料の調製
酵素反応の停止時期を変更して、表２に示すとおり、抗酸化性蛋白質加水分解物の平均分子量及び特定アミノ酸の含有率を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により７種類の試料（試料番号５〜１１）を調製した。
【００４３】
（２）試験方法
各試料の平均分子量、各アミノ酸の含有率、透過率、及びヒドロキシラジカル生成抑制能（ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値）を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００４４】
（３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなとおり、透過率が大きく、いわゆる着色の抑制に優れ、ヒドロキシラジカル生成抑制能（ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値）に優れた抗酸化性蛋白質加水分解物は、平均分子量が１０００乃至１３０００ダルトンであり、メチオニンの含有率が２乃至３％であり、トリプトファンの含有率が１％以下であり、ヒスチジンの含有率が０．５乃至２．５％であり、チロシンの含有率が２乃至５％であり、並びにアルギニンの含有率が１乃至３．５％であることが判明した。また、より一層着色の抑制に優れ、ヒドロキシラジカル生成抑制能（ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値）に優れる抗酸化性蛋白質加水分解物の平均分子量及び特定アミノ酸の含有率は、平均分子量が２０００乃至１００００ダルトンであり、メチオニンの含有率が２乃至２．５％であり、トリプトファンの含有率が０．５％以下であり、ヒスチジンの含有率が１乃至２％であり、チロシンの含有率が３．５乃至４．５％であり、並びにアルギニンの含有率が２乃至３％であることが望ましいことが判明した。
【００４５】
尚、本発明の試料については、蛋白質の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４６】
【表２】
0004141584.tif 000003
【００４７】
参考例１
従来技術１の製造例１に従って、市販の牛乳（１０ｋｇ）を反応釜に入れ、９０℃に昇温して滅菌する。次いで３７℃まで冷却して、これに牛乳素材５０に対して蛋白質分解酵素としてトリプシンを１の割合で添加し、３７℃、ｐＨ７で８時間無菌的に加水分解する。その後、８０℃以上に昇温して酵素を失活させ、のち遠心分離して沈澱を除去する。得られた溶液部を凍結乾燥し、約８０ｇの牛乳分解物の粉末を得た。次いで、この５ｇを２００ｍｌの水に溶解し、次のカラム分画条件でカラム分画し、フラクション１〜６を得た。
［カラム分画条件］
樹脂：セファデックスＧ−２５  ファイン（ファルマシア社製）
カラムサイズ：２．１×９６ｃｍ
溶出液：０．４％炭酸アンモニウム溶液
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
【００４８】
参考例２
従来技術１の製造例３に従って、前記参考例１の市販の牛乳を１％酵母分散液に変更したこと、及び蛋白質分解酵素としてトリプシンをキモトリプシンに変更したことを除き、前記参考例１と同一の方法により酵母分解物を調製し、カラム分画し、フラクション１〜６を得た。
【００４９】
参考例３
従来技術２に記載の方法に従って、大豆蛋白質１０ｇを脱イオン水２００ｍｌに懸濁し、沸騰水中で２０分加熱した後、３５℃まで冷却し、蛋白質分解酵素としてBiosaime A-1（天野製薬社製）２００ｍｇを添加し、３５℃で４８時間無菌的に加水分解する。その後、この加水分解溶液２５ｍｌを採取し、直火で煮沸し、酵素を失活させ、のち１００ｍｌに希釈した。次いで、この希釈液２０ｍｌを採取し、湯浴上で乾固したのち２ｍｌの脱イオン水に溶解し、セファデックスＧ−２５が充填された２．５×４０ｃｍのカラムサイズのカラムを使用し、溶出液として脱イオン水を使用し、流量７ｍｌ／２０ｍｉｎ、１フラクション７ｍｌの条件で、カラム分画し、フラクションＮｏ．２９の分画を取得し、平均分子量２８００の抗酸化力を有する大豆蛋白質由来のペプチドを得た。
【００５０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
【実施例】
実施例１
市販カゼインナトリウム［ニュージーランド・デイリー・ボード製。アラネート（蛋白質含有量８０％）］１ｋｇに蒸留水１５ｋｇに溶解し、蛋白質濃度約５％のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を９０℃で１０分間加熱殺菌し、液温を５５℃に調整し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを９．０に調整し、のち豚由来の結晶トリプシン（ノボインダストリー社製）及びアマノＡ（天野製薬社製）をそれぞれカゼイン蛋白質１ｇ当たり４０活性単位及び１９活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。
【００５２】
蛋白質加水分解反応を特開平８−１１２０６４号公報に記載の高速液体クロマトグラフィー［Inertsil PREP-ODS （ＧＬサイエンス社製。６．５×２５０ｍｍ）カラムを高速液体クロマトグラフ装置に装着し、分解液０．１ｍｌを供給し、溶離液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸溶液）に対する溶離液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液）の割合が１００分間で５０％となる濃度勾配で１．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、各種遊離アミノ酸量及び総遊離アミノ酸量を測定する。］により経時的にモニターし、カゼイン蛋白質加水分解物のメチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、及びアルギニンの含有率がそれぞれ２％、０．５％、１％、３．５％、及び２％となった時点で、１３０℃で２秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００５３】
この加水分解液（ｐＨ７．５）をマイクローザＥＭＰ−３１３（旭化成社製。孔径０．２５μｍ）を使用して、膜瀘過法（マイクロフィルトレーション）により不溶物を瀘過し、のちゲル瀘過剤としてSUPERDEX 30 PREP GRADE（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を充填したカラムを使用して、ゲル瀘過クロマトグラフィーにより、分子量２００ダルトン以上の画分を分取し、抗酸化性カゼイン蛋白質加水分解物を含有する溶液を得た。
【００５４】
得られた抗酸化性カゼイン蛋白質加水分解物を含有する溶液を常法により濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の抗酸化性カゼイン蛋白質加水分解物約０．５ｋｇを得た。
【００５５】
得られた抗酸化性カゼイン蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗酸化性カゼイン蛋白質加水分解物は、平均分子量が２０００ダルトンであり、メチオニンの含有率が２％であり、トリプトファンの含有率が０．５％であり、ヒスチジンの含有率が１％であり、チロシンの含有率が３．５％であり、並びにアルギニンの含有率が２％であった。
【００５６】
また、前記試験方法により試験した該抗酸化性カゼイン蛋白質加水分解物は、透過率が９７％で着色がなく、ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値が３．４×１０12Ｍ-1・ｓ-1であり、ヒドロキシラジカル生成抑制能に優れていた。
【００５７】
実施例２
市販乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ。ミライ社製。蛋白質含有量８０％）１．４ｋｇを蒸留水１２．６ｋｇを添加し、十分分散させ、乳清蛋白質を完全に溶解し、蛋白質濃度約８％の乳清蛋白質水溶液を調製した。該乳清蛋白質水溶液を８５℃で１０分間加熱殺菌し、液温を６１℃に調整し、のちパパイン（天野製薬社製）及びビオプラーゼＳＴ２０（長瀬生化学工業社製）をそれぞれ乳清蛋白質１ｇ当たり２２５活性単位及び９８活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。
【００５８】
蛋白質加水分解反応を特開平８−１１２０６４号公報に記載の高速液体クロマトグラフィー［Inertsil PREP-ODS （ＧＬサイエンス社製。６．５×２５０ｍｍ）カラムを高速液体クロマトグラフ装置に装着し、分解液０．１ｍｌを供給し、溶離液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸溶液）に対する溶離液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液）の割合が１００分間で５０％となる濃度勾配で１．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、各種遊離アミノ酸量及び総遊離アミノ酸量を測定する。］により経時的にモニターし、乳清蛋白質加水分解物のメチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、及びアルギニンの含有率がそれぞれ２．２％、０．５％、１．５％、３．７％、及び２．３％となった時点で、９０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００５９】
この加水分解液（ｐＨ７．０）をセライトスーパースタンダードセル（セライト社製）を用いて、珪藻土瀘過法により不溶物を瀘過し、のちゲル瀘過剤としてSUPERDEX 30 PREP GRADE（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を充填したカラムを使用して、ゲル瀘過クロマトグラフィーにより、分子量２００ダルトン以上の画分を分取し、抗酸化性乳清蛋白質加水分解物を含有する溶液を得た。
【００６０】
得られた抗酸化性乳清蛋白質加水分解物を含有する溶液を常法により濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の抗酸化性乳清加水分解物約０．７ｋｇを得た。
【００６１】
得られた抗酸化性乳清蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗酸化性乳清蛋白質加水分解物は、平均分子量が３０００ダルトンであり、メチオニンの含有率が２．２％であり、トリプトファンの含有率が０．５％であり、ヒスチジンの含有率が１．５％であり、チロシンの含有率が３．７％であり、並びにアルギニンの含有率が２．３％であった。
【００６２】
また、前記試験方法により試験した該抗酸化性乳清蛋白質加水分解物は、透過率が９５％で着色がなく、ヒドロキシラジカル生成抑制反応定数ｋ値が１．０×１０12Ｍ-1・ｓ-1であり、ヒドロキシラジカル生成抑制能に優れていた。
【００６３】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、本発明は、特定の理化学的性質を有し、着色の抑制に優れ、ヒドロキシラジカル生成抑制能に優れるという良好な特性を具備した抗酸化性蛋白質加水分解物およびこれを用いた食品に関するものであり、本発明により奏せられる効果は次のとおりである。
１）本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物は、ヒドロキシラジカル生成抑制能に優れていることから、生体組織の損傷防止のために、ヒドロキシラジカル生成抑制が要求される各種一般食品、栄養食品、飼料、化粧品、及び医薬品等の蛋白質素材として広範に使用できる。
２）本発明の抗酸化性蛋白質加水分解物は、着色の抑制に優れていることから、還元糖を含有し、着色を生じる可能性が大きい各種一般食品、栄養食品、飼料、化粧品、及び医薬品等の抗酸化性の蛋白質素材として広範に使用できる。