(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトノギンポリペプチド（配列番号２）、または、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列であって配列番号１に由来する核酸配列にコードされるノギンポリペプチドであって、少なくともアミノ酸配列ＫＫＬＲＲＫの欠失によって改変されており、かつ背方発生を誘導しそして脊椎動物において骨誘導因子（ＢＭＰ）活性をブロックする、ポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸残基１３８〜１４４の欠失により改変された、ヒトノギンポリペプチド（配列番号２）。
【請求項３】
アミノ酸残基１３３〜１４４の欠失により改変された、ヒトノギンポリペプチド（配列番号２）。
【請求項４】
請求項１、２、または３に記載の改変されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項５】
発現制御配列に作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子である、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
改変されたノギンポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）請求項６に記載のＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を増殖させ、その結果、該宿主細胞に該ＤＮＡ分子を発現させて、該改変されたノギンポリペプチドを産生する工程；および
（ｂ）発現した、改変されたノギンポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した、請求項１、２、または３に記載の改変されたノギンポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
本国際出願は、１９９７年７月１７日出願の米国特許出願第８９７,２３６号の優先権を主張する。この出願の開示を本明細書に参考として援用する。本明細書中には、種々の刊行物が引用される。これら刊行物の開示を、全体として、本明細書に、参考として援用する。
【０００１】
本発明は、一般に、背方成長誘導活性を有する成長因子に関する。より詳細には、本発明は、シュペーマン（Ｓｐｅｍａｎｎ）オーガナイザーシグナルであるノギンの改変された形態、この改変されたノギンを含む組成物、改変されたノギンのコード（センス）もしくはアンチセンス配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列に関する。
【０００２】
（発明の背景）
成長因子は、インビボもしくはインビトロで、動物細胞の規定された集団の成長（増殖）に影響するが、栄養素物質ではない、ポリペプチドホルモンのような物質である。組織の成長または分化に関与するタンパク質は、成長または分化を促進し得るかまたは阻害し得る。したがって、一般的用語「成長因子」は、サイトカインおよび栄養因子を含む。
【０００３】
成長因子、そのレセプター、そのＤＮＡもしくはＲＮＡのコードもしくはアンチセンス配列およびフラグメントは、多くの治療、臨床、研究、診断、および薬物設計の適用において有用である。例えば、１９８９年８月１５日発行の米国特許第４,８５７,６３７号（動物をその成長ホルモンレセプターに対して免疫する方法）；１９９０年６月１２日発行の米国特許第４,９３３,２９４号（ヒトＥＧＦレセプターを含むアッセイおよび治療法）；１９９１年７月９日発行の米国特許第５,０３０,５７６号（製薬産業による薬物設計および薬物スクリーニングにおけるレセプターおよびレセプターハイブリッドの役割）；１９９２年２月１１日発行の米国特許第５,０８７,６１６号（成長因子結合体を含む組成物を使用する、腫瘍細胞を破壊する方法）；１９９２年３月２４日発行の米国特許第５,０９８,８３３号（治療もしくは診断組成物に有用な発現系）；および１９９２年４月２日公開の国際出願公開第ＷＯ９２/０５２５４号（新規神経栄養因子についての単離、調製、および適用の種々の局面）を参照。これらはそれぞれ、本明細書中に参考として援用される。
【０００４】
シュペーマンオーガナイザーは、Ｘｅｎｏｐｕｓにおいて、背側外胚葉から神経組織を誘導しそして側板中胚葉および腹側中胚葉を背方化する。予測された性質を有する、シュペーマンオーガナイザーシグナルの最初の分子は、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚において背側構造を誘導する活性についての発現スクリーニングで同定され、そしてノギンと呼ばれた（Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｃ．およびＨａｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ．  Ｃｅｌｌ  ７０：８２９−８４０（１９９２））。ノギンのようなオーガナイザーシグナルは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）遺伝子スーパーファミリーの骨誘導因子（ＢＭＰ）クラスのメンバーによって拮抗され得る。ノギンタンパク質が、ＢＭＰ−４と高い親和性で結合し、そして同族の細胞表面レセプターへの結合をブロックすることによってＢＭＰ−４活性を廃止することが最近報告された（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｂら  Ｃｅｌｌ  ８６：５９９−６０６（１９９６））。
【０００５】
正常な骨形成における役割に加えて、ＢＭＰは、ＢＭＰが異常な骨成長を促進する疾患に関与しているようである。例えば、ＢＭＰは、患者が、動作を妨げる異常な「第２の骨格」を成長させる進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）として公知である疾患において原因的役割を演じていると報告されている。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明のポリペプチドは、脊椎動物において背方成長を誘導し、そして多くの治療、臨床、および診断適用のために、可溶性で生理学的に活性な形態で調製され得る。
【０００７】
好ましい実施態様において、図１Ａ〜１Ｂに示されるヒトノギンタンパク質（配列番号２）、または例えば図１４に示される改変されたノギンタンパク質（配列番号２３）は、治療、臨床、および診断適用における使用のために調製される。
【０００８】
本発明の別の局面において、配列番号１に対して実質的に類似性を有するオリゴヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）が提供される。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基から形成され得、そして配列番号１に関してアンチセンス方向であり得る。配列番号１は、発現する場合、脊椎動物において背方発生を誘導し得る、本発明者らが「ノギン」と名付けた機能的なポリペプチドをコードする。
【０００９】
ノギンまたはそのフラグメントもしくはムテイン（これもまたインビトロ方法によって合成され得る）は、（組換え発現またはインビトロ共有法により）免疫原性ポリペプチドに融合され得、そしてこれは、次に、ノギンエピトープに対する抗体を惹起させるため、動物を免疫するために使用され得る。抗ノギンは、免疫した動物の血清から回収可能である。あるいは、モノクローナル抗体が、従来の様式で、免疫した動物の細胞から調製され得る。慣用的なスクリーニングにより同定された抗体は、ノギンに結合するが、「ｗｎｔ」または他の成長因子とは実質的に交差反応しない。固相化した抗ノギン抗体は、ノギンの診断（インビトロまたはインビボ）または精製に特に有用である。
【００１０】
ノギンの置換、欠失、もしくは挿入変異体が、インビトロもしくは組換え法により調製され得、ノギンとの免疫交差反応性およびノギンアンタゴニストもしくはアゴニスト活性についてスクリーニングされ得る。
【００１１】
ノギンまたはそのフラグメントもしくはムテインはまた、ノギンもしくはその抗体の診断のため、またはノギン抗体のアフィニティー精製のため、固相化されたノギンおよび標識されたノギンを調製するために、インビトロで誘導体化され得る。
【００１２】
本発明はさらに、原核生物および真核生物の発現系における生物学的に活性なノギン分子の発現を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、治療および診断適用に十分な量でのノギンまたはそのフラグメントもしくはムテインの産生を提供する。同様に、抗ノギン抗体は、治療および診断適用に利用され得る。ほとんどの目的について、治療または診断目的には、同じ種由来のノギン遺伝子または遺伝子産物を使用することが好ましいが、ノギンの種間利用が、本発明の特定の実施態様において有用であり得る。
【００１４】
さらなる実施態様において、本発明のノギン核酸、タンパク質、およびペプチドは、哺乳動物における神経組織形成の誘導またはＢＭＰ活性のブロックに使用され得る。
（発明の詳細な説明）
本明細書を通じて、ポリペプチドをコードする核酸配列が示される場合、そのことにより、そのコード配列の相補鎖もまた教示されると理解される。
【００１５】
本発明者らは、実質的に純粋な可溶性形態で容易に入手可能である構造的に独特な成長因子を見出した。本発明者らは、本発明のポリペプチドを「ノギン」と名付けた。この成長因子は、脊椎動物において、背方発生を誘導し、そしてＢＭＰ活性をブロックする。
【００１６】
背方発生を誘導するタンパク質のより早く記載されたファミリーは、「ｗｎｔ」タンパク質である。しかし、これらは、ノギンとは対照的に、細胞表面に強固に結合したままである。ノギンを用いた本発明者らの最初の研究は、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚においてであった。しかし、ノギンは、マウスノギンを用いた本発明者らの研究が証明したように、脊椎動物間で高度に保存されている。先行技術である公知のＦＧＦ増殖因子ファミリーもまた、初期の胚性誘導に関与することが知られている。しかし、ＦＧＦタンパク質およびそのレセプターはともに、ノギンとは明確に異なる。ノギンは、例えば、増殖を増強することによって、ＦＧＦ（およびアクチビンもまた）の作用を改変し、したがって（治療アジュバントととして）他の成長因子と組み合わせて使用するための治療組成物において、例えば、その効果を改変または増強することが特に示唆される。
【００１７】
本発明者らは、ノギンのｃＤＮＡをクローニングした。ノギンｃＤＮＡは、疎水性アミノ末端配列を有する２６ｋＤａタンパク質をコードする、単一のリーディングフレームを含む。ノギンは分泌される。ノギンのｃＤＮＡは、タンパク質を２６ｋＤａタンパク質としてコードするが、本発明者らは、ノギンが、外見上、約３３ｋＤａの開始の見かけの分子量を有する二量体糖タンパク質として（野生型サブユニットとして）、インビボで分泌されると決定した。グリコシル化されない場合、モノマー単位は、約２５〜３０ｋＤａのＳＤＳ  ＰＡＧＥ上の見かけの分子量を有する。
【００１８】
本発明者らは、ヒトノギンの遺伝子（図１Ａ〜１Ｂ；配列番号１）をクローニングした。この配列は、ノギン活性を有するタンパク質（配列番号２）をコードする。ノギンのカルボキシ末端領域は、クニッツ型プロテアーゼインヒビターとの相同性を示す。このことは、ノギンタンパク質またはそのフラグメントが、プロテアーゼインヒビターの活性を示し得ることを示す。
【００１９】
本発明者らは、真核生物および原核生物の両方の宿主細胞において、生物学的に活性なノギンを発現させ得た。本発明者らが生物学的に活性なノギンを発現させるために使用することに成功した２つの発現系は、哺乳動物細胞株（ＣＯＳおよびマウス２９３）であった。第３の発現系は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞への合成ｍＲＮＡの注射である。さらに、本発明者らは、原核生物系、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびバキュロウイルスにおいて、生物学的に活性なヒトノギンを発現させることに成功した。
【００２０】
これらいくつかの異なる系における発現はまた、ノギンに関する高度な保存を示す。本発明者らは、例えば、多くの完全に保存されたストレッチを有する、カエルノギンとマウスノギンとの間の実質的な配列類似性を見出した。したがって、以下のアミノ酸配列は、カエルノギンとマウスノギンとの間のように、完全に保存された部分を示す：
ＱＭＷＬＷＳＱＴＦＣＰＶＬＹ（配列番号３）；
ＲＦＷＰＲＹＶＫＶＧＳＣ（配列番号４）；
ＳＫＲＳＣＳＶＰＥＧＭＶＣＫ（配列番号５）；
ＬＲＷＲＣＱＲＲ（配列番号６）；および
ＩＳＥＣＫＣＳＣ（配列番号７）。
【００２１】
マウス配列とカエル配列との間に約８７％の全体的な保存が存在し、本発明者らはまた、この２つの間で独特なシステイン分布を観察した。
【００２２】
ノギン核酸またはオリゴヌクレオチドは、ノギンポリペプチドをコードするか、またはそのようなＤＮＡとハイブリダイズし、そしてストリンジェントな条件下でこれと安定に結合したままであり、そして長さが約１０塩基より大きい。しかし、ただし、このようなハイブリダイズする核酸は、他の成長因子をコードするか、またはこれをコードする核酸と相補的であるものを含む従来技術の核酸に対して、新規でかつ非自明である。
【００２３】
「ストリンジェントな条件」とは、（１）洗浄のためには、低イオン強度および高温、例えば、５０℃の０.１５Ｍ  ＮａＣｌ/０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム/０.１％ＮａＤｏｄＳＯ4を用いるか、または（２）ハイブリダイゼーションの間には、ホルムアミドのような変性剤、例えば、０.１％ウシ血清アルブミン/０.１％Ｆｉｃｏｌｌ/０.１％ポリビニルピロリドン/５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）を含む４２℃の５０％（ｖｏｌ/ｖｏｌ）ホルムアミドを使用する条件を意味する。
【００２４】
「実質的な類似性」とは、本発明者らがヌクレオチド配列に言及する場合には、標準的な緩衝液（Ｗａｈｌら、ＰＮＡＳ  ７６：３６８３）中で３０℃にて１００ヌクレオチド長を超えるプローブを使用し、そして３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０.２％ＳＤＳ（ｐＨ７）中で３７℃にて洗浄する、中程度のストリンジェンシー条件下での配列のクロスハイブリダイゼーションを意味する。あるいは、配列番号３〜７のものをコードする縮重配列のプライマーを使用する場合、ポリメラーゼ連鎖反応により、ノギンまたはノギンファミリーのメンバーをコードするＤＮＡのフラグメントを単離し得る。
【００２５】
「実質的な類似性」とは、タンパク質に対してなされた言及の場合には、異なる種由来のノギンまたは１種内のノギンファミリーのメンバーが、そのタンパク質を通じて、少なくとも８０％の位置において、システイン残基の位置を保存することである。ニューロトロフィンファミリーと同様に、成熟形態のノギンおよびノギン関連ポリペプチドの配列は、少なくとも４０％の位置が同一である。タンパク質レベルでの実質的な類似性は、レセプターとの結合、およびノギンエピトープに対して惹起させたいくつかの（しかしすべてではない）モノクローナル抗体との結合についてノギンと競合する、主題のタンパク質の能力を誘導する。
【００２６】
図１３Ａ〜１３Ｂに示されるような、マウスノギンの完全配列についてのｃＤＮＡがクローニングされた（配列番号１０）。ヒト配列は、本明細書中で配列番号１と呼ばれる。本発明者らは、胚をレスキューし、そしてノギンＲＮＡを腹方化胚に注入した場合、それらを実質的に正常な発生に復帰させるために、カエルノギンクローン由来のＲＮＡ転写物を使用した。高用量において、これは、過剰な頭部発生を生じ、そして本発明者らがこのタンパク質を「ノギン」と名付けたのはこの理由のためである。ノーザンブロット分析において、ノギンｃＤＮＡは、母系的および接合生殖的の両方で発現する２つのｍＲＮＡにハイブリダイズする。
【００２７】
本発明のノギンの部分またはすべてをコードするヌクレオチド配列を使用する場合、配列の長さは、少なくとも、サイズが、脊椎動物自身のノギンの内因性ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分であるべきである。代表的には、（例えば、診断プローブとしての使用のために）十分な配列サイズは、約１５の連続する塩基（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。いくつかの診断および治療適用において、ヌクレオチドノギンコード配列（配列番号１０または配列番号１または図１４（配列番号２３）のすべてもしくは部分と類似）を、配列番号１０または１または図１４（配列番号２３）のいずれかに関してアンチセンス方向で使用することが、望まれ得る。
【００２８】
本発明者らは、他の種（例えば、ヒト）からノギンを増幅させるための数個の好ましいプライマーとして示唆する：
５'プライマー１配列番号１２。
【００２９】
ＣＡＡ/ＧＡＣＮＴＴＣ/ＴＴＧＣ/ＴＣＣＮＧＴＮ
５'プライマー２配列番号１３
ＴＴＣ/ＴＴＧＧＣＣＮＣ/ＡＧＮＴＡＣ/ＴＧＴＮＡＡＡ/ＧＧＴＮＧＧ
５'プライマー３配列番号１４
ＣＣＮＧＡＡ/ＧＧＧＮＡＴＧＧＴＮＴＧ
３'プライマー１配列番号１５
ＣＡＮＣ/ＧＴ/ＡＡ/ＧＣＡＣ/ＴＴＴＡ/ＧＣＡＣ/ＴＴＣ
３'プライマー２配列番号１６
ＣＡＮＡＣＣＡＴＮＣＣＣ/ＴＴＣＮＧＧ
３'プライマー３配列番号１７
ＣＧ/ＴＮＣＧ/ＴＴ/ＣＴＧＧ/ＡＣＡＮＣＧ/ＴＣＣＡ
ここで、Ｎは、４種すべてのヌクレオチドの混合物を示し、２つのヌクレオチドの混在は代替物を示す（例えば、Ａ/Ｇ）。
【００３０】
ノギン転写物は卵母細胞および卵割期胚に局在しないが、接合体転写物は、最初は、推定に基づく背側中胚葉に限定され、そして原口背唇（シュペーマンのオーガナイザー）において原腸胚期に最高レベルに達する。神経胚において、ノギンは、脊索および脊索前方中胚葉で転写される。
【００３１】
理論に拘束されることなく、本発明者らは、発現する場所、および胚におけるＲＮＡ注入の効果に基づいて、ノギンの胎生学的効果についての仮説を案出した。
ノギンは、シュペーマンオーガナイザーにおいて発現するので、本発明者らは、ノギンが、シュペーマンオーガナイザーの効果（すなわち、中胚葉の神経誘導および背方化）のメディエーターであると考えた。本発明者らは、ノギンが、神経組織形成を直接誘導し得ることを示した。ノギンは、脊索および頭部中胚葉のおいて発現するので、本発明者らは、ノギンが、神経板の背側−腹側パターンまたは前方−後方パターンのいずれかに影響すると考えた。ノギンは鰓弓性神経堤に発現するので、本発明者らは、ノギンが、神経堤細胞が軟骨に堆積するかどうかに影響し得、そしてより後期の鰓弓成長および再造形に影響すると考えた。ノギンは,尾部ヒレ神経堤（ｔａｉｌ  ｆｉｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ）で発現し、そして神経堤がそのヒレの成長に必要とされるので、ノギンは、表皮または間葉の成長因子として作用し得る。
【００３２】
本発明者らの実験的研究の多くが、胚発生のレスキューを含んでいたが、脊索における発現が成長中の尾芽において持続し、そして染色された細胞の不連続線（新たな部位で開始されたノギンの発現を示す）が、神経管の上衣板の端から端まで走る（頭部中胚葉においてもまた明らかである）ので、本発明者らは、ノギンが生体細胞機能としてもまた発現されると考えた。
【００３３】
ノギンについて多くの適用が、その特性から示唆される。ノギンｃＤＮＡは、診断ツールとして有用であるはずである（例えば,そのオリゴヌクレオチドプライマーと配列類似性を有するオリゴヌクレオチドを増幅するため、およびどのくらいのノギンが存在するかを調べるための、ＰＣＲ試験におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチド、例えば、５'プライマー１〜３および３'プライマー１〜３のようなプライマーの使用）。
【００３４】
ノギンは、胚頭部における軟骨産生を調節するため使用されると示唆する、発現パターンを有するので、軟骨および骨の成長を調節するための臨床的使用が、少なくともいくつかの成長因子を増強するノギンの特性に起因して、治療組成物におけるノギン、特に、他の成長因子との組み合わせたノギンについて示唆される。神経堤細胞は、おたまじゃくしヒレが成長するために必要とされるので、ノギンは、組織マトリクスおよび表皮の成長因子であるようであり、そして例えば創傷治癒組成物において有用であると証明されるはずである。
【００３５】
ノギンを複合体中のリガンドとしてみる場合、本発明の複合体は、ノギンに結合される抗体、ノギンから誘導したペプチドに結合される抗体、そのレセプターに結合されるノギン、またはそのレセプターに結合されるノギンから誘導されたペプチドを含む。変異体形態のノギン（これは、より強力なアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであるか、または改善された特性、例えば、増大したバイオアベイラビリティーを有する）は、臨床上有用であると考えられる。ノギンとその結合タンパク質パートナーとのこのような複合体は、多くの適用における使用が見出される。
【００３６】
本発明の実施には、哺乳動物、細菌、またはウイルス発現ベクターにおける、ノギンおよびノギンに作動可能に連結されたプロモーター配列をコードする配列を含むオリゴヌクレオチド構築物の使用を包含する。発現およびクローニングベクターは、そのベクターを、１またはそれ以上の選択された宿主細胞において、複製可能にするヌクレオチド配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、そのベクターを宿主の染色体とは独立して複製可能にし、そして複製起点または自律複製配列を含む配列である。周知のプラスミドｐＢＲ３２２は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、２μプラスミド起源は酵母に適切であり、そして種々のウイルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。
【００３７】
発現およびクローニングベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる）を含むべきである。代表的には、これは、上記ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の存在は、上記ベクターを欠失するいずれの宿主細胞も、形質転換された宿主を超える増殖または生殖における利点を入手しないことを確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養素要求性欠損を補償するタンパク質をコードする。
【００３８】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、ノジン核酸を取り込む能力があった細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体は、形質転換体のみが、マーカーを取り込んだことにより、生存するために独特に適応される選択圧の下に置かれる。選択圧は、培地における選択因子の濃度が連続して変化される条件下で、形質転換体を培養することによって強いられる。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生についてより強く要求される遺伝子が、連続する世代の組換え細胞の染色体内で縦列に繰り返されるプロセスである。したがって、増大した量のノギンが、増幅したＤＮＡから合成され得る。
【００３９】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、すべての形質転換体を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で培養することによって同定される。この場合において適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７，４２１６（１９８０）によって記載されたように調製しそして増殖させる。次いで、形質転換細胞を、増加したレベルのＭｔｘに曝す。このことが、ＤＨＦＲ遺伝子の複数コピー、および混入した形で、上記発現ベクターを含む他のＤＮＡ（例えば、ノギンをコードするＤＮＡ）の複数コピーの合成を導く。あるいは、ノギンおよびアミノグリコシド３'ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより掲出転換した宿主細胞は、アミノグリコシド抗生物質（例えば、カナマイシン、またはネオマイシン、またはＧ４１８）を含む培地中での細胞増殖により選択され得る。真核生物細胞は、通常、内因性ＡＰＨ活性を発現しないので、ＡＰＨタンパク質をコードする遺伝子（通常、ｎｅｏ耐性遺伝子と呼ばれる）は、広範囲の真核生物宿主において、優性選択マーカーとして使用され得る。これにより、上記ベクターにより形質転換された細胞が、容易に同定され得る。
【００４０】
発現ベクターは、クローニングベクターとは異なり、宿主生物により認識され、そしてノギン核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むべきである。プロモーターは、その制御下で核酸の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子の開始コドンから上流（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する非翻訳配列である。プロモーターは、代表的には、２つのクラス、誘導性および構成性、に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のいくらかの変化（栄養素の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、 ＤＮＡからの増大したレベルの転写を開始するプロモーターである。現時点で、種々の可能性ある宿主細胞により認識される多数のプロモーターが公知である。これらプロモーターは、制限酵素により元の遺伝子からそのプロモーターを取り出し、続いてノギンの開始コドンに対して５'側に挿入することによって、ノギンコード配列に作動可能に連結され得る。
【００４１】
核酸は、その核酸が、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、作動可能に連結されている。例えば、プレ配列または分泌性リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドが、そのポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、当該ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、それが、コード配列の転写に影響する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列と作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が、連続していること、そして分泌性リーダーの場合、連続し、かつリーディングフェーズにあることを意味する。連結は、従来の制限部位でのライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが、従来の実務に従って使用される。
【００４２】
哺乳動物宿主細胞におけるノギンコード配列の転写は、ウイルス（例えば、ポリオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノム、または異種性哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター）から得られたプロモーターによって制御される。もちろん、宿主細胞または関連する種からのプロモーターもまた、本明細書において有用である。
【００４３】
本発明の特定の実施態様において、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるノギンの発現は、好ましくは、以下を含むベクターを使用して実施される：ラクトースオペロンリプレッサーにより制御され得るｌａｃ  ＵＶ５プロモーター；強力なリボソーム結合部位、例えば、バクテリオファージＴ７のリボソーム結合部位；コピー数を増加させ得る、プラスミドの複製制御領域における変異；および抗生物質耐性タンパク質の発現を制限する変異。
【００４４】
好ましい実施態様において、ノギンは、 ｌａｃ  ＵＶ５プロモーターの制御下で、高コピー数のカナマイシン耐性ｐＢＲ３２２由来プラスミドにおいて発現される。さらなる好ましい実施態様において、ノギンは、昆虫宿主細胞におけるＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルスのポリヘドリンプロモーターの制御下でバキュロウイルス中で発現される。
【００４５】
本発明の目的は、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）を含むがこれに限定されない疾患または障害の処置のために、そして股置換手術、外傷、火傷、または脊髄損傷後の骨の病的な成長のような異常な骨成長を処置するために、新規の改変されたノギン分子を提供することである。
【００４６】
本発明のさらなる目的は、改善された治療特性を有する、本明細書に具体的に記載されたもの以外の改変されたノギン分子を産生する方法を提供することである。
【００４７】
これらの目的および他の目的は、本発明に従って達成され、これにより、ヒトノギンタンパク質におけるアミノ酸欠失は、その治療特性を増強する。
【００４８】
本発明は、アミノ酸残基１３８〜１４４の欠失によって改変されたヒトノギン、およびアミノ酸残基１３３〜１４４の欠失により改変されたヒトノギンを提供する。本発明はまた、改変されたヒトノギンをコードする、単離された核酸分子を提供する。この単離された核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結された、組換えＤＮＡ分子であり得る。本発明はまた、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００４９】
さらに、本発明は、改変されたノギン分子を産生する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を増殖させ、このＤＮＡ分子が、宿主細胞により発現されて、改変されたノギン分子を産生する、工程；および（ｂ）発現した、改変されたノギン分子を単離する工程、を包含する。この方法は、真核生物細胞または原核生物細胞において実施され得る。
【００５０】
本発明は、改変されたヒトノギンおよびキャリアを含む組成物、および患者に有効量の該組成物を投与する工程を包含する処置方法を提供する。処置され得る疾患または障害には、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、および股置換手術、外傷、火傷、または脊髄損傷後の骨の病的な成長のような異常な骨成長が含まれるが、これらに限定されない。ノギンおよび改変されたノギンは、ＢＭＰと結合し、そしてこれに拮抗することが知られているので、本発明の分子は、骨産生および骨代謝回転に関与するプロセスを調節するために使用され得る。
【００５１】
したがって、本発明に従えば、ヒトノギンタンパク質における特定のアミノ酸欠失が、動物の血清において改善したバイオアベイラビリティーを示すが、骨誘導因子に結合する能力を保持する、改変されたヒトノギンタンパク質を生じる。このような改変されたノギンタンパク質は、増強した治療特性を有すると期待される。
【００５２】
さらに、タンパク質のポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、安定性およびバイオアベイラビリティーを増強する一方で、免疫原性を最小にすることによって、そのタンパク質のインビボ効力を増大させることが示されている。特定のタンパク質の特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの付着（これは、そのタンパク質の水力学的体積を増加させ、そのことによって腎臓濾過によるクリアランスを緩慢にする）によって改変され得る。（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７を参照）。本発明者らは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を改変されたヒトノギンに共有結合することによって、改善された薬物動態特性を有する分子を作成した。
【００５３】
本発明はまた、本明細書に記載される改変されたノギン分子および適切な薬学的キャリアを含む薬学組成物を提供する。
【００５４】
活性成分（ノギン分子を含み得る）は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、神経膜、神経周囲、脊髄内、室内、硝子体内、鞘内など）、上皮もしくは粘膜皮膚の内層を通じての吸収（例えば、口腔粘膜、直腸および小腸粘膜など）、または持続放出移植物（細胞もしくは組織移植物を含む）を含むがこれに限定されない任意の適切な経路によりインビボで全身的もしくは局所的に投与するために、適切な薬学的キャリアに処方されるべきである。
【００５５】
投与形態に依存して、活性成分は、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマー、またはワックスベースおよび制御放出調製物中に組み込まれた、生理食塩水のような液体キャリアに処方され得るか、あるいは錠剤、丸剤、またはカプセル形態に処方され得る。
【００５６】
処方物中に使用される活性成分の濃度は、必要とされる効果的な用量および使用される投与形態に依存する。使用される用量は、有効である活性成分の循環血漿濃度を達成するに十分であるべきである。効果的な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導かれる用量−応答曲線から外挿され得る。
【００５７】
本発明の実施は、診断的または治療的薬剤の調製および使用を包含する。この薬剤は、図１４（配列番号２３）、配列番号１０、または配列番号１、あるいは、バクテリオファージｈｎｏｇλ−９またはｈｎｏｇλ−１０に含まれる核酸配列のいずれかのすべてもしくは部分に類似する少なくとも約１５ＤＮＡもしくはＲＮＡ塩基のヌクレオチド配列を含む。すなわち、ノギン調製物は、放射性ヨウ素、酵素、蛍光体、スピンラベルなどで標識された場合、ノギンについてのアッセイおよび競合型レセプター結合アッセイにおいて標準として有用である。ノギンの治療処方物は、貯蔵のために、所望の程度の純度を有するノギンと、随意の生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤、または安定化剤とを混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で調製される。受容可能なキャリア、賦型剤、または安定化剤は、レシピエントに対して、用いられる投薬量および濃度で非毒性であり、これには、リン酸、クエン酸および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質が含まれる。他の成分としては、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、および、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の糖；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトール、ソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および/またはＴｗｅｅｎ、ＰｌｕｒｏｎｉｃまたはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれ得る。
【００５８】
ノギンは、上記のように、本発明に従って使用され得る。処方物に使用される活性成分の濃度は、必要とされる効果的な用量および使用される投与形態に依存する。使用される用量は、有効である、活性成分の循環血漿濃度を達成するに十分であるべきである。効果的な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導かれる用量−応答曲線から外挿され得る。
【００５９】
ノギンに言及することにより、本発明はまた、ノギン分子のフラグメント、誘導体、ムテイン、アゴニスト、またはアンタゴニストの使用を意図する。
【００６０】
ノギンは、任意の薬学的に受容可能なキャリアにおいて投与され得る。投与経路は、当該分野において公知の任意の投与形態であり得、静脈内、鞘内、皮下、関与する組織への注射、動脈内、鼻内、経口、または移植されたデバイスを介するものを含むが、これらに限定されない。本発明は、ノギンを薬学的に受容可能なキャリアに含む薬学的組成物を提供する。
【００６１】
投与は、身体全体または限局された領域における、ノギンの分布を生じ得る。例えば、神経系の離れた領域を含むいくつかの条件では、ノギンの静脈内または鞘内投与が望ましくあり得る。あるいは（そして限定のためではなく）、神経系の限局された領域が含まれる場合、局所投与が望ましくあり得る。このような状況では、ノギンを含む移植物が、損傷された領域中または近傍に配置され得る。適切な移植物には、ゲルフォーム（ｇｅｌｆｏａｍ）、ワックス、または微粒子ベースの移植物が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の複合体は、配列番号３〜７のうちの１またはそれ以上により特徴付けられるリガンドを含む。このリガンドは、タンパク質（例えば、抗体）に結合し得る。このような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。ノギンに対するポリクローナル抗体は、一般に、ノギンおよびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物中で惹起される。二官能性または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用して、ノギンまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター）に結合することが有用であり得る。
【００６３】
動物は、１ｍｇまたは１μｇの結合体（それぞれ、ウサギ用またはマウス用）を、３容量のフロイント完全アジュバントと合わせ、そしてその溶液を、複数の部位へ皮内注射することによって、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫され得る。１ヵ月後、その動物を、複数の部位での皮下注射による、フロイント完全アジュバント中の、最初の量の１/５〜１/１０の結合体で追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、そして血清を、抗ノギン力価についてアッセイする。動物を、力価がプラトーになるまで追加免疫する。好ましくは、同じノギンポリペプチドの結合体であるが、異なるタンパク質に、そして/または異なる架橋化剤により結合した結合体で、動物を追加免疫する。結合体はまた、タンパク質融合体として、組換え細胞培養物中で作製され得る。また、ミョウバンのような凝集化剤を使用して免疫応答を増強させる。
【００６４】
モノクローナル抗体は、免疫動物から脾臓細胞を回収し、そしてその細胞を従来の様式で（例えば、ミエローマ細胞との融合、またはＥＢウイルス形質転換により）不死化させ、そして所望の抗体を発現するクローンについてスクリーニングすることにより調製される。
【００６５】
好ましい実施態様において、組換えヒトノギンでのラットの免疫後に調製されるラットモノクローナル抗体（ＲＰ５７−１６）は、Ｘｅｎｏｐｕｓおよびヒトの両方のノギンと特異的に反応するが、ニューロトロフィンＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４とは反応しない。
【００６６】
ノギン抗体は、ノギンまたはその抗体についての診断アッセイにおいて有用である。レセプター結合アッセイの１つの実施態様において、ノギンファミリー選択された複数のメンバーのすべてに結合する抗体組成物は、不溶性マトリクスに固相化され、試験サンプルを、すべてのノギンファミリーメンバーを吸着させるために、その固相化抗体組成物と接触させ、次いで、固相化されたファミリーメンバーを、複数の、各メンバーに特異的な抗体と接触させる。ここで、それぞれの抗体は、個々に、例えば、独自の標識（例えば、別個の蛍光体）などによって、所定のファミリーメンバーに特異的であるとして同定可能である。それぞれの独自の標識の存在および/または量を決定することによって、各ファミリーメンバーの相対的比率および量が決定され得る。
【００６７】
ノギン抗体はまた、組換え細胞培養物または天然供給源からのノギンのアフィニティー精製に有用である。他の成長因子と検出可能に交差反応しないノギン抗体は、これら他のファミリーメンバーを含まないように、ノギンを精製するために使用され得る。
【００６８】
本発明の局面は、ここで以下の実施例により例示される.
（実施例）
Ｘｅｎｏｐｕｓ胚の作製
ＣｏｎｄｉｅおよびＨａｒｌａｎｄ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０１，９３−１０５，１９８７）により記載されるプロトコル）によって、 Ｘｅｎｏｐｕｓ胚を調製した。胚を、ＮｉｅｕｗｋｏｏｐおよびＦａｂｅｒの表（「アフリカツメガエルの正常表」（Ｄａｕｂｉｎ），Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ，１９６７）に従ってステージ付けた。腹方化した胚を、Ｓｔａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の照射により作製し、そして特定の「ｗｎｔ」タンパク質（「Ｘｗｎｔ−８」と呼ばれる）に関する本発明者らの論文（ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６７，７５３−７６５（１９９１）（参考として援用し、場合によっては、以後「Ｓ＆Ｈ（前出）」と呼ぶ））において本発明者らにより記載されたように、背方化した胚を、ＬｉＣｌでの処理により作製した。
【００６９】
（実施例１）
ノギンｃＤＮＡの単離および配列決定
ステージ１１のＬｉＣｌ処理した胚からサイズ選択したプラスミドｃＤＮＡライブラリーの構築は、以下のとおりであった。ステージ１１のＬｉＣｌ処理した胚からの６０マイクログラムのポリ（Ａ）ＲＮＡを、水酸化メチル水銀の存在下で、１０％〜３０％のスクロースグラジエント上でサイズ分画化した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩの認識部位を含むオリゴ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドでプライムした、２μｇのサイズ分画化ポリ（Ａ）ＲＮＡから合成した。第２鎖の合成後、ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、ＥｃｏＲＩリンカーと連結し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして最後に１２５ｇの改変されたｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と連結した。本明細書で使用するｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）は、 ＮｓｉＩ部位へオリゴヌクレオチドを付加して、ＥｃｏＲＩ部位を作製することによって改変されていた。ベクターをアルカリホスファターゼで処理しなかったが、切り出したポリリンカー配列を、セファロース４ＢＣＬカラム上で取り除いた。連結した産物を使用して、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、そして１０ｃｍプレートあたり１００,０００コロニーを与えるようにプレートした。プラスミドＤＮＡをプレート培養物から、アルカリ溶解/ポリエチレングリコール沈澱プロトコルにより単離した。
【００７０】
ライブラリー中の背方化活性を、プールしたプラスミドＤＮＡから作製したＲＮＡ転写物を注入することによってアッセイした。単一クローンを、姉妹選択法のプロセスにより単離した。この手順において,プラスミドライブラリーを、１２プレート上に、プレートあたり１０倍少ないコロニーで再プレートした。ＲＮＡを、各プレートから単離したプールしたプラスミドＤＮＡから合成し、そしてＵＶ腹方化した胚に注入することによって、背方化活性について試験した。背方化活性を有するプールを再プレートし、上記のようにスクリーニングした。単一クローンを単離するまで、このプロセスを繰り返した。
【００７１】
インビトロＲＮＡ合成、背側軸レスキューについての注入アッセイ、および姉妹選択もまた、Ｓ＆Ｈ（前出）において本発明者らにより記載されたとおりに行った。
【００７２】
単離したノギンｃＤＮＡクローンの両鎖のヌクレオチド配列を、改変されたＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いるジデオキシ終止法により決定した。欠失を、配列決定テンプレートに、制限酵素およびエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化の両方により調製した（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５５，１５６−１６５，１９８７）。
【００７３】
インビトロ翻訳
１.５μｇのインビトロ合成したノギン、Ｘｗｎｔ−８、およびグースコイドｍＲＮＡを、製造業者の指示に従って35Ｓ−メチオニンを加えた、ヌクレアーゼ処理したウサギ網赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で翻訳した。翻訳産物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ゲル）、続いて蛍光間接撮影により可視化した。ノギンタンパク質は、オープンリーディングフレームにより予測される分子量を有していた。
【００７４】
（ＲＮＡ単離および分析）
全ＲＮＡを胚および卵母細胞から、ＣｏｎｄｉｅおよびＨａｒｌａｎｄ（前出）により記載されたとおりの小規模プロトコルによって単離した。背唇を、３０の非固定のステージ１０.５胚から摘出し、そして全ＲＮＡ調製物用にプールした。２.５胚の全ＲＮＡ等価物または約２μｇのポリＡ＋ＲＮＡのいずれかを含むサンプルを、ノーザンブロッティングにより分析した。ランダムプライムしたＤＮＡプローブを、ノギンｃＤＮＡの１,３２３ｂｐフラグメント（ヌクレオチド−８３のＥｃｏＲＩ部位からそのベクターにおいてｃＤＮＡの末端の直ぐ３'側にあるＥｃｏＲＶ部位まで）から調製した。
【００７５】
ＲＮＡアーゼ保護アッセイを、Ｍｅｌｔｏｎら（Ｎｕｃ.Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６，１９８４）により詳述されたプロトコルを若干改変して使用して行った（Ｃ．Ｋｉｎｔｎｅｒ，Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ＸｅｎｏｐｕｓノギンｃＤＮＡエキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失クローン（ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ，Ｃｅｌｌ，７０：８２９−８４０（１９９２）の図２Ａに対応するが、３'末端からヌクレオチド３８３までの欠失を有する）を、合成ＲＮＡプローブ用のテンプレートとして使用した。テンプレートＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限酵素消化により直線化し、そして32Ｐを組み込んだ４６３塩基アンチセンスＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。３８７塩基アンチセンスＥＦＩαＲＮＡプローブを、サンプルあたりのＲＮＡの量についてのコントロールとして使用した。プローブを、使用前にゲル精製した。
【００７６】
インサイチュハイブリダイゼーション
固定および貯蔵後、胚を検査して、分割腔および原腸が穿刺されていることを確認した。神経胚の残りの分割腔およびオタマジャクシならびに原腸を注意深く穿刺した。胚を室温にて１００％エタノール中で２時間再び洗浄して、残りの脂質を除去した。ハイブリダイゼーション後、染色を一晩発色させ、次いで胚をブワン固定液で固定した。新たに染色した胚は、ピンク染色の高いバックグランドを有するが、このほとんどが洗い流され、特異的染色が残る。一晩の固定後、胚を７０％エタノール、ＰＢＳで緩衝化した７０％エタノール、およびメタノールで十分に洗浄した。胚をマレー混合液中でクリアにし、 Ｚｅｉｓｓ  ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（焦点合わせを補助するための３×１２Ｂ望遠鏡を備えた２.５または５×対物レンズ）を使用して、Ｋｏｄａｋ  Ｅｋｔａｒ２５フィルムで写真撮影した。
【００７７】
系統追跡
核局在性Ｂ−ガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡを用いる系統追跡（ｌｉｎｅａｇｅ  ｔｒａｃｉｎｇ）は、本発明者らがＳ＆Ｈ（前出）において記載したとおりであった。腹方化した胚に、３２細胞ステージで、０.５ｎｇのＢ−ガラクトシダーゼおよび２５ｐｇのノギンΔ５'ｍＲＮＡを同時注入した。約ステージ２２に、胚を固定し、そしてＸ−ｇａｌで染色した。
【００７８】
結果
ノギンｃＤＮＡは新規なポリペプチドをコードする
選択したクローンの１８３３ヌクレオチド配列が、ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ，Ｃｅｌｌ  ７０：８２９−８４０（１９９２）の図２Ａに示され、そして時折「クローンＡ３」とも呼ばれる。この配列は、２６ｋＤａの予測分子量を有する２２２アミノ酸ポリペプチドをコードする、単一の長いオープンリーディングフレームを含む。アミノ末端のアミノ酸の疎水性ストレッチは、このポリペプチドが分泌経路に進入することを示唆する。アミノ酸６１（Ａｓｎ）にＮ結合グリコシル化の単一の可能性のある部位が存在する。広範な非転写領域は、リーディングフレームの５'側および３'側の両方に位置する（それぞれ、５９３ｂｐおよび５７３ｂｐ）。３'非翻訳領域は、反復ｄＡおよびｄＴヌクレオチドが特に豊富であり、ポリＡテールの開始から２４ｂｐ上流に位置するポリアデニル化シグナル配列に加え、１４７ｂｐさらに上流に、第２の可能性のあるポリアデニル化配列を含む。
【００７９】
ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローンＡ３から合成したセンスＲＮＡを、ウサギ網状赤血球溶解物系において翻訳した。３Ｓ標識産物を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分画化し、蛍光間接撮影により可視化した。主要なタンパク質産物は、約２６ｋＤａの予測分子量を有した。
【００８０】
推定ポリペプチドのアミノ酸配列と、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＢＬＡＳＴネットワーク（非冗長データベース）との比較は、いかなる類似配列も同定しなかった。したがって、このクローンは、分泌され、そしてＸｅｎｏｐｕｓにおいて背側誘導活性を有する、本発明者らが「ノギン」と名付けた新型のタンパク質をコードする。
【００８１】
ノギンｍＲＮＡは、完全な背側−腹側軸をレスキューする
４細胞ステージのＵＶ腹方化した胚の単一卵割球へのノギンＲＮＡの注入は、背側構造の完全なスペクトルを保存し得る。軸レスキューの程度は、注入したＲＮＡの量に依存した。低用量を投与された胚は、後方背側構造のみを有した。他方、より高い用量を投与された胚は、過剰な背側前方組織を有した。２つのノギンプラスミドからのＲＮＡ転写物を試験した。第１は、完全なｃＤＮＡを含んでいた。第２（ｐＮｏｇｇｉｎΔ５'）は、 ＥｃｏＲＩ部位までの５'非翻訳領域の最初の５１３ヌクレオチドを取り除いた欠失を有した。これら２つのプラスミドのＲＮＡ転写物ならびに比較のためのＸｗｎｔ−８ＲＮＡの注入から得られた胚を、ＲａｏおよびＥｌｉｎｓｏｎ（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７，６４−７７，１９８８）の背側前方指標（ＤＡＩ）スケールに従って、スコア付けた。このスケールにおいて、完全に腹方化した胚を０とし、正常な胚を５とスコア付け、最も重篤な背方前方化した胚（放射線状の背方前方構造を有するもの）を１０とスコア付けた。ｐＮｏｇｇｉｎΔ５'から合成したＲＮＡ（ｎｏｇｇｉｎΔ５'）は、完全なｃＤＮＡから合成した等量のｍＲＮＡより、高いＤＡＩを繰り返し与えた。ｎｏｇｇｉｎΔ５'ｍＲＮＡによる軸レスキューの用量依存性は、Ｘｗｎｔ−８  ｍＲＮＡのそれと非常に類似していた。
【００８２】
ＵＶ処理した胚にまた、より高い用量（１,０００ｐｇ）のノギンｍＲＮＡを注入した。４細胞ステージの１つの卵割球への、この用量のノギンｍＲＮＡの注入は、非常に重篤な過剰背方化（ＤＡＩ＞７）を有する胚を生じた。しかし、これらの胚のほとんどが、後期原腸胚/初期神経胚ステージで死亡した。明らかに過剰に強力な原腸形成移動は、分割腔の上衣（ｒｏｏｆ）の薄化および破裂を生じた。本発明者らはまた、注入したＸｗｎｔ−８  ｍＲＮＡの高用量でこの効果を観察した。
【００８３】
ｎｏｇｇｉｎΔ５'およびＸｗｎｔ−８の両方のｍＲＮＡによる背方発生のレスキューは、漸増量のｍＲＮＡが、レスキューされる、漸次より前方の構造を導く不変のパターンに続いた。例えば、１ｐｇのＲＮＡを与えられた胚は、主として後方および体幹背方構造をレスキューさせ、そして大部分は、頭部構造を欠いていた。より高用量（１０または１００ｐｇ）の両ＲＮＡは、より前方発生を有する胚を生じ、多くが正常に近い表現型かまたは過剰背方化表現型のいずれかを有した。
【００８４】
ノギン注入した卵割球はニューコープセンターとして作用する
ノギンｍＲＮＡ注入部位を変える効果を研究した。３２細胞ステージのＵＶ処理した胚に、０.５ｎｇのＢ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡ単独または２５ｐｇのｎｏｇｇｉｎΔ５'ｍＲＮＡと混合した０.５ｎｇのＢ−ガラクトシダーゼのいずれかを注入した。植物階層（ｔｉｅｒ）の卵割球へのノギンｍＲＮＡの注入は、最も強く背方前方化した胚を与えた。植物性の注入胚の両方において、核Ｘ−Ｇａｌ染色は、ほぼ独占的に内胚葉において見出された（このｍＲＮＡは、核へトランスロケートするＢ−ガラクトシダーゼをコードし、拡散性のバックグランド染色との識別を可能にする）。示された胚の１つは、ノギンｍＲＮＡ注入の結果として強く過剰背方化し（ＤＡＩ約７）、そしてひどく短縮されたテールおよび肥大した頭部構造を有した。胚はまた、辺縁層へのノギンｍＲＮＡ注入によりレスキューされた。これらの胚において、Ｂ−ガラクトシダーゼ染色は、主として、軸および頭部中胚葉で観察された。動物極へのノギンｍＲＮＡの注入は、軸形成に対して非常に小さな効果しか有さなかった。同様に、Ｂ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡ単独は、効果がなかった。
【００８５】
ノギンｍＲＮＡは、母系的および接合生殖的に発現する
Ｘｅｎｏｐｕｓ胚由来のＲＮＡのノーザンブロット分析において、およそのサイズ１.８および１.４ｋｂの２つのノギンｍＲＮＡ種を観察した。相対的に低いレベルのノギンｍＲＮＡが、卵母細胞に検出された。ステージ１１まで、ノギンｍＲＮＡのレベルは、有意により高く、接合翻訳に反映した（卵母細胞において観察された母方に置かれた転写物とは反対に）。ノギンｍＲＮＡは、調べられた最も遅いステージ（ステージ４５）まで、上昇したレベルで維持された。
【００８６】
本発明者らは、本発明者らのライブラリー中の主要な背方化ＲＮＡは、正常もしくはＵＶ処理した胚と比較して、ＬｉＣｌ処理した胚において上昇していると予測する。リチウムイオン処理の結果、発現したノギンｍＲＮＡの量が、無処理胚に比較して、大きく増加した。ＵＶ処理は反対の効果を有した。ノギンｍＲＮＡ発現は、これらの胚からの全ＲＮＡサンプルにおいて、本質的に検出不可能であった。したがって、操作された胚におけるノギンｍＲＮＡの豊富さは、レスキュー活性と平行する。
【００８７】
本発明者らは、卵母細胞および卵割ステージの胚においてノギンの分布を分析した。母方に堆積したノギンＲＮＡは非常に低く、インサイチュハイブリダイゼーションが、バックグランドを超えて検出できなかったので、本発明者らは、ＲＮアーゼ保護アッセイを使用した。卵母細胞を動物性の半分および植物性の半分に切断した。全卵母細胞ＲＮＡに対して、いずれの半球でもノギンｍＲＮＡの富化は見られなかった。４細胞ステージの胚を、背側の半分および腹側の半分、ならびに動物性の半分および植物性の半分に切断した。ノギン転写物は、背側の半球と腹側の半球、ならびに動物性の半球および植物性の半球の間で均一に分布していることが見出された。受精直後に９０°傾け、次いで将来の背側を示すために最も上側をバイタルダイ（ｖｉｔａｌ  ｄｙｅ）でマークした胚を用いて同じ結果を得た。より時間を経た（３２細胞ステージ）の胞胚もまた、背側-腹側の半分および動物性−植物性の半分に分割した。いずれの半球においても、全胚に対して、ノギンｍＲＮＡの富化は認められなかった。さらに、処置は、母系に堆積したノギンＲＮＡの豊富さを改変なかった。このことは、腹側組織において、優先的な破壊がないことを示す。既知の量のインビトロ合成されたノギンｍＲＮＡを有するサンプルを、ＲＮアーゼ保護アッセイに含ませた。これらおよび他のデータから、本発明者らは、胞胚ステージの胚あたり約０.１ｐｇのノギンｍＲＮＡが存在し、そして原腸胚ステージの胚あたり１ｐｇのノギンｍＲＮＡが存在すると予測する。
【００８８】
ノギン転写物の局在を、初期原腸胚ステージの胚において研究した。背唇をステージ１０.５の胚から摘出した。背唇の摘出後、インタクトな胚、摘出した背唇、および残りの胚からの等量の全ＲＮＡのノーザンブロットを、ノギンプローブとハイブリダイズさせ、次いでサンプルあたりロードされたＲＮＡの量についてのコントロールとして、 ＥＦＩａプローブと再びハイブリダイズさせた。ブロットのオートラジオグラフは、このステージのノギンｍＲＮＡが、背唇において富化されていることを示した。
【００８９】
インサイチュハイブリダイゼーション：シュペーマンオーガナイザーにおけるノギンの接合発現
発生中の胚におけるノギン転写物の局在を、ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションより詳細に検査した。固定した全胚を、ＲＮＡプローブを含むジゴキシゲニンとハイブリダイズさせた。
【００９０】
ハイブリダイズしたＲＮＡプローブを、次いで、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体で可視化した。アンチセンスノギンプローブを用いて観察されたハイブリダイゼーションの特異性を、胚とセンスノギンプローブとをハイブリダイズさせること、および２つの非重複アンチセンスプローブを使用することによって試験した。低レベルの発現およびバックグランド染色の両方に起因して、ノギンｍＲＮＡは、後期胞胚ステージ以前には、明確に検出され得なかった。接合転写の活性化後に、ノーザンブロットにより検出された、増加したレベルのノギンｍＲＮＡは、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、ステージ９で、胚の背側の染色細胞のパッチとして明らかであった。植物極から望むと、細胞のこのパッチは、約６００のセクターに限定されていた。同じ胚の側面図から、染色細胞は、辺縁層内（すなわち、動物極と植物極との間で、恐らく背側中胚葉を形成する領域内）に位置したことが示される。転写物は、大部分、このステージで、核に限定される。
【００９１】
初期原腸胚ステージ胚３０（ほぼステージ１０.５）の側面図から、主に、背唇で内旋する中胚葉中の特異的ハイブリダイゼーションが示される。同じ胚を植物極側から望むと（原口唇が矢印で示される）、ノギンｍＲＮＡは背側で最も豊富であるが、発現は、より低いレベルで、胚の腹側にまで広がることが示される。インサイチュハイブリダイゼーションのこの方法は、胚の最も卵黄の内胚葉領域（ｍｏｓｔ  ｙｏｌｋｙ  ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）において転写物を検出しないので、本発明者らは、この図において観察されるものよりさらに植物性領域における発現を除外し得ない。背唇のサイズに影響することが公知である処理（ＬｉＣｌ処理、ＵＶ照射）は、ノギンインサイチュハイブリダイゼーションのパターンに対して強い効果を有した。ＬｉＣｌ処理した胚において、染色は、辺縁層全体を通じて激しい。ＵＶ処理は、ハイブリダイゼーションシグナルを低レベルに減じた。この結果は、ノーザンブロット分析により観察されるノギンｍＲＮＡの量と一致する。ＵＶ処置した胚はまた、ハイブリダイゼーションの特異性についてのネガティブコントロールである。
【００９２】
原腸形成が進むにつれて、ノギンｍＲＮＡ染色は、内旋中の背側中胚葉に続き、推定される脊索において最も高い。後期神経胚ステージ（約１８）までに、ノギンｍＲＮＡ発現細胞は、最も背側の中胚葉において最もクリアであった（主として脊索であるが、より前方に脊索前方中胚葉にも広がる）。脊索の前方先端に矢印を付す。尾芽ステージの間、背側中胚葉におけるノギンの発現は減少するが、脊索における発現は、成長中の尾芽において持続する。ノギンの発現は、いくつかの新たな部位で開始される。これは、オタマジャクシが成熟するにつれて、漸次、よりクリアになる。染色された細胞の不連続線が、神経管の上衣板の端から端まで走る。染色はまた、頭部中胚葉、主として顎弓および鰓弓において明らかである。本発明者らは、この発現が、体細胞原性の神経堤細胞に対応すると考える。さらに、これら細胞のサブセットは、頭部神経堤の異なる前方−後方レベルをマークするホメオボックス遺伝子を発現する。例えば、顎弓におけるＥｎ−２は抗体染色により観察される。星状形態を有する細胞は、尾ヒレのノギンｍＲＮＡから染色された。これらの星状細胞はまた、神経堤に由来する可能性が高い。これらのパターンのいずれも、センスプローブでも、多くの他のプローブでも観察されなかった。
【００９３】
（実施例２）ＣＯＳ細胞中にトランスフェクトされたノギンｃＤＮＡは、活性な馴化培地を産生する
ＣＯＳ細胞のために、ノギンｃＤＮＡをＣＯＳ細胞発現ベクター中に挿入した。ＣＯＳ細胞をトランスフェクトし、そして導入したノギン遺伝子の発現を可能にさせた後、培地を回収した。この培地を、動物極キャップアッセイにおいて、中胚葉誘導活性または背方化活性について試験した。本発明者らは、２つのトランスフェクションプロトコル、標準的なプロトコルおよび別のプロトコルを試験した。標準的なプロトコルでは、細胞を回収し、次いで無血清培地に移す。別のプロトコルでは、細胞を、血清を欠くが、トランスフェリン、インスリン、およびＢＳＡを含む規定培地に移す。細胞は、補充した培地において健常なままであり、そして同時トランスフェクトされたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、補充しなかった培地より１００倍高い活性を与える。これらの培地で細胞を処理した結果を下記の表１に示す。動物極キャップを、腹方化した動物から取り出し、処理し、そして神経胚形成の終わりに、これらを、延長（通常、脊索または神経組織が誘導されたというサイン）についてスコア付けした。延長を、表１において、「＋」で示し、なおさらに強い延長を、「＋＋」で示す。さらに、これらを、ノーザンブロットにより分子マーカーについてスコア付けした。
【００９４】
表１のデータが示すように、ノギンｃＤＮＡは、ＣＯＳ細胞馴化培地に対して大きな効果を有する。しかし、ノギンは、恐らく、その培地において、何か他のものと相互作用する。なぜなら、ＣＯＳ細胞馴化培地単独では、いくらかの活性を有するのみであるからである。ノギンが、細胞に、その細胞が通常には分泌していない何かの分泌を引き起こしているとすることは可能である。しかし、実験により、ノギンが分泌され、これがその活性のいくらかを担っていることが確かに示される。
【００９５】
【表１】
0004181300.tif 000002
【００９６】
卵母細胞中に注入されたノギンｍＲＮＡは、活性な分泌ノギンタンパク質を産生する
タンパク質が活性形態で分泌されるかどうかの研究への第２のアプローチは、卵母細胞にｍＲＮＡを注入し、そしてその卵母細胞が分泌する物質を採取することである。この方法の特別な利点は、注入されたｍＲＮＡが効率的に翻訳され、そしてその卵母細胞の翻訳のほとんどが、注入されたｍＲＮＡにより開始されることである。新たなタンパク質（その合成は、注入されたノギンｍＲＮＡによって導かれる）は培地中に分泌される。ノギンは明らかに、アクチビンと共同作用して、上昇したレベルの筋肉アクチンを発現する延長した外植片を産生する。
【００９７】
ノギンの生化学的特性
注入された卵母細胞にｍＲＮＡを注入し、35Ｓメチオニンで標識する。培地中に分泌された放射活性タンパク質のほとんどが、注入されたｍＲＮＡに由来する。次いで、ノギンタンパク質（これは、同位体的にほぼ純粋である）が分析され得る。この分析から、本発明者らは、ノギンが二量体糖タンパク質であると決定した。還元条件下で泳動し、そしてＮ−グリカナーゼで処理して糖残基を除去した場合、ノギンは、２６ｋＤａの予想分子量より、ほんのわずかに遅く移動する。糖鎖の除去は、３３ｋＤａの開始の見かけ分子量から約４ｋＤａの損失を生じる。非還元条件下で泳動した場合、ノギンはこの値の２倍で移動する。
【００９８】
本発明者らは、このタンパク質の二量体が活性種であるかどうかも、活性な、タンパク質分解的にプロセスされた形態が存在するかどうかも未だ知らない。アクチビンｍＲＮＡを用いたコントロール実験において、卵母細胞はアクチビン活性を生じるが、バルクの放射標識タンパク質は、前駆体形態として移動する。少量のプロセスされたタンパク質（１５ｋＤａ）のみが、検出された。ノギンを注入された卵母細胞は、プロセスされていないタンパク質を優勢に分泌し、本発明者らが検出しなかった極端に活性な、プロセスされたタンパク質は微量にしか発現しない可能性がある。上記の注意書にもかかわらず、注入された卵母細胞およびトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の分析からの主要点は、活性なノギンが、自由に可溶な、分泌ポリペプチドとして得られ得るということである。このことは、ノギンを、背方化活性を有する他のグループの遺伝子（ｗｎｔ）と区別する。ｗｎｔタンパク質は、可溶形態では入手可能でなく、このことは、その生物学的活性およびそれに結合するレセプターの分析を大いに妨げてきた。
【００９９】
（実施例３）マウスノギンホモログのクローニング
発生中のＸｅｎｏｐｕｓ胚から接合ノギン転写を排除することは、現在、不可能である。対照的に、マウスにおいてホモ接合のヌル変異を生じさせることは可能であるはずである。本発明者らは、マウスノギンｃＤＮＡをクローニングした。これは変異体マウスの作製に有用である。プローブおよび変異体マウスを作製するためのツールを作製することに加えて、ノギン配列の比較は、保存されたドメインおよび機能の有用な予言物（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）であるにちがいない。Ｃ末端８０アミノ酸は、Ｘｅｎｏｐｕｓノギンとマウスノギンとの間で８７％同一である。
【０１００】
マウスノギンを、胚ｃＤＮＡライブラリーから、中程度にストリンジェントな条件（以前に規定された）下で放射標識したカエルノギンｃＤＮＡでプローブすることによって単離した。続いて、高ストリンジェンシー条件（規定されるもの。しかし、４２℃でハイブリダイズさせ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１.５ｍＭクエン酸ナトリウムで４０℃にて洗浄した）下でゲノムライブラリーをマウスノギンｃＤＮＡでプローブすることによって、ゲノムクローンを単離した。マウスノギンｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列（配列番号１０）および推定アミノ酸配列（配列番号１１）を、図１３Ａ〜１３Ｂに示す。マウスノギンとヒトノギンとの間には、わずか２つのアミノ酸が異なる。
【０１０１】
（実施例４）ヒトノギンホモログのクローニング
材料および方法
プローブ調製
２つのオリゴヌクレオチドを、マウスノギン配列（上記）に基づいて合成した。そのオリゴヌクレオチドの配列は、マウスノギンタンパク質のアミノ酸ＱＭＷＬＷＳ（配列番号１９）に対応する、ｎｏｇｇｉｎ５'：５'−ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＴＣＡ−３'（配列番号１８）、ならびに、アミノ酸ＥＣＫＣＳＣ（配列番号２１）に対応する、ｎｏｇｇｉｎ３'：５'−ＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴＡＣＡＣＴＣ−３'（配列番号２０）である。
【０１０２】
実施例３に記載されたように調製されたマウスｃＤＮＡクローンをテンプレートとして使用して、これらのオリゴヌクレオチドを、２６０ヌクレオチドからなるＤＮＡのセグメントのＰＣＲ増幅に使用した。増幅させたフラグメントは、図１３に示されるマウス配列（配列番号１０）のヌクレオチド８５６〜１１１６に対応するヌクレオチド配列を有した。増幅後、ＰＣＲ反応物を、アガロースゲルにおいて電気泳動し、２６０ｎｔのＤＮＡバンドをＭａｇｉｃ  ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製し、そしてプローブ標識反応のためのテンプレートとして使用した。２０ｎｇのＤＮＡテンプレート、および、 ｄＣＴＰの代わりの、０.２ｍＣｕｒｉｅのα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に対して標準的なＰＣＲ反応（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、プローブを標識した。組み込まれなかった標識を、Ｇ５０  ＮＩＣＫカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でプローブから分離した。排除容量の反応物は、合計１.８×１０８ｃｐｍを含んでいた。
【０１０３】
さらに、保存されたマウスおよびＸｅｎｏｐｕｓノギン配列に対応する、１つの縮重オリゴヌクレオチド（ｎｏｇｇｉｎ  Ｄと呼ばれる）を以下のとおり合成した：ｎｏｇｇｉｎ  Ｄ：５'−ＧＡＲＧＧＩＡＴＧＧＴＩＴＧＹＡＡＲＣＣ−３'（配列番号２２）。ｎｏｇｇｉｎ  Ｄ（配列番号２２）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ３２Ｐ  ＡＴＰを使用するキナーゼ反応によって標識した。標識したオリゴヌクレオチドを、 ＮＡＰ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにより精製し、そしてライブラリーハイブリダイゼーションに使用した。
【０１０４】
ライブラリースクリーニング
ベクターＥＭＢＬ−３中のヒト胎盤ゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ＃ＨＬ１０６７Ｊ，平均挿入物サイズ１５ｋｂ）を、ＮＭ  ５３８  Ｅ．ｃｏｌｉに、製造業者の仕様書に従ってプレートした。約３百万のプラークを、３つのレプリカ（Ａ、Ｂ、およびＣと呼ぶ）のニトロセルロースフィルター（ＢＡ−８５  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、そしてＭａｎｉａｔｉｓら［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］に従ってスクリーニングした。レプリカフィルターＡおよびＣを、０.５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.２）、７％ドデシル硫酸ナトリウム、１％結晶ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍｇ/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび約１×１０６ｃｐｍ/ｍｌのＰＣＲプローブ（上記）を含む緩衝液にてハイブリダイズさせた。６５℃にて１２時間のハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２回、２×ＳＳＣ（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０.３Ｍ  ＮａＣｌ）、０.１％ＳＤＳ中で室温にて、次いで２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で６５℃にて２０分間洗浄し、そしてＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムに曝露した。フィルターレプリカＢを、５１℃にて１２時間、６×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で標識オリゴヌクレオチドｎｏｇｇｉｎ  Ｄとハイブリダイズさせ、続いて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで室温にて、そして６×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で５０℃にて洗浄し、そしてＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムに曝露した。すべてのレプリカからの陽性プラークを単離し、上記のように再スクリーニングすることによって精製した。精製した陽性プラークを、５００μｌのＳＭ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.０１％ゼラチン）に懸濁した。１６０μｌのファージ懸濁物を、０.５ｍｌ飽和ＮＭ５３８培養物と混合し、２０分間３７℃にてインキュベートし、次いで１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０.２％マルトースを含む２５０ｍｌのＬＢ中に接種した。培養物を、細胞溶解（７〜８時間）まで、３７℃にてインキュベートした。。製造業者の推奨（ Ｑｉａｇｅｎ ）に従って、Ｑｉａｇｅｎ手順によるファージＤＮＡ精製のために、ファージ溶解物を使用した。
【０１０５】
配列決定
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ自動シーケンサーおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙTMターミネーターサイクル配列決定キットを使用することによって、配列決定を行った。
【０１０６】
結果
ＰＣＲマウスノギンプローブ（配列番号１８および２０）にハイブリダイズしたフィルターは、ｈｎｏｇλ−９およびｈｎｏｇ−１０と呼ばれるファージプラークに対応する、２つの強いシグナルを示した。縮重オリゴヌクレオチドプローブｎｏｇｇｉｎＤ（配列番号２２）にもハイブリダイズしたこれらのプラークは、これらのクローンが、ヒトノギン遺伝子に対応することを明らかにした。さらに、ｈｎｏｇλ−５およびｈｎｏｇλ−７と呼ばれる他の２つのプラークは、ＰＣＲプローブにハイブリダイズした場合、わずかに弱いシグナルを生じた。これらのクローンは、ヒトノギンまたは関連遺伝子のいずれかに対応する。すべてのヒトＤＮＡインサートが、それぞれの特定のライブラリーに関する文献に記載されるような公知の制限部位を使用してベクターから切り出され得る。
【０１０７】
ヒトノギン遺伝子を含むクローンｈｎｏｇλ−９由来の１.６ｋｂ  Ｓａｃｌフラグメントをサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を図１Ａ〜ＡＢに記載のように決定した。ヌクレオチド配列から推定されるヒトノギンのアミノ酸配列もまた図１Ａ〜１Ｂに示す。遺伝子またはｃＤＮＡは、種々の真核生物または原核生物発現系において発現されて、生物学的に活性なヒトノギンタンパク質を産生する。ヒトタンパク質は、Ｘｅｎｏｐｕｓノギンタンパク質が示す活性と同様な神経栄養活性を示すと予測される。
【０１０８】
（実施例５）ヒトのノギンについてのメッセージの組織局在
材料および方法
プローブの調製
プローブを、実施例４に示すように調製した。使用したオリゴは以下の通りである：
配列番号８：
５’ＧＡＣ．ＴＣＧ．ＡＧＴ．ＣＧＡ．ＣＡＴ．ＣＧＣ．ＡＧＡ．ＴＧＴ．ＧＧＣ．ＴＧＴ．ＧＧＴ．ＣＡＣ
配列番号９：
５’ＣＣＡ．ＡＧＣ．ＴＴＣ．ＴＡＧ．ＡＡＴ．ＴＣＧ．ＣＡＧ．ＧＡＡ．ＣＡＣ．ＴＴＡ．ＣＡＣ．ＴＣＧ．Ｇ
（下線を引いた配列は、マウスのノギン配列を示す；残りの配列はクローニングのための制限部位を含むテールである。）
約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、実施例３に記載するように調製したマウスのｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅によって得た。
【０１０９】
ＲＮＡの調製およびノーザンブロット
選択した組織を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから切除し、そして液体窒素中ですぐに凍結させた。ＲＮＡを、Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、１９９０（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＳ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ）に記載されているように、３ＭのＬｉＣｌ、６Ｍの尿素中での組織のホモジナイゼーションによって単離した。ＲＮＡ（１０μｇ）を、４連の１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル（Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＳ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ）による電気泳動によって分画し、続いて１０×ＳＳＣ（ｐＨ７）を用いてナイロンメンブレン（ＭａｇｎａＧｒａｐｈ，Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）にキャピラリー転移させた。ＲＮＡを、紫外線（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）への暴露によってメンブレンにＵＶ架橋させ、そして０．５ＭのＮａＰＯ4（ｐＨ７）、１％のウシ血清アルブミン（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｍａｈｏｕｄｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：３３１−３３３（１９９１））、１００μｇ／ｍｌの超音波処理した変性させたサケ精子ＤＮＡの存在下で、放射標識したプローブと６８℃でハイブリダイズさせた。フィルターを、３×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６８℃で洗浄し、そして１日から２週間、１枚または２枚の増感スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ，ＤｕＰｏｎｔ）およびＸ線フィルム（ＡＲ−５，Ｋｏｄａｋ）を用いて、７０℃にてオートラジオグラフィーに供した。ゲルのエチジウムブロマイド染色によって、種々のサンプルについて等しいレベルの全ＲＮＡをアッセイしたことを実証した（Ｍａｉｓｏｎｐｌｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４４６−１４５１（１９９０）におけるように）。ＲＮＡを以下のヒト細胞株から調製した：
【０１１０】
【表２】
0004181300.tif 000003
【０１１１】
結果
本発明者らは、マウスのノギンプラスミドから、Ｘｅｎｏｐｕｓとマウスのノギンとの間で保存された領域に対応するＤＮＡフラグメントを増幅した。
【０１１２】
約３００ｂｐの増幅されたフラグメントを、成体および胚性組織から、ならびに種々の細胞株から調製したＲＮＡとともに、ノーザンのハイブリダイズするためのプローブとして使用した。約２ｋｂのサイズのノギン転写物を、成体ラット脳、および細胞株ＳＫＭＥＳ（小細胞肺ガン腫）において検出した。
【０１１３】
ノギン転写物の発現を、種々の発生ステージおよび成体で、ラットおよびマウスに由来する種々の組織において試験した。マウスにおいては、ノギン転写物は、Ｅ９からＥ１２までの胚または頭部、ならびに新生仔脳および成体脳において検出され得る。骨格筋中を除いて、試験した末梢組織においては、検出可能なシグナルは存在しなかった。豊富なレベルの発現をまた、出生後のマウスから単離した海馬星状細胞において見出した。
【０１１４】
ラットにおいては、ノギン転写物は、Ｅ９からＥ１８までの胚または頭部において、ならびにＰ１、Ｐ１９からの脳および成体脳において検出可能であった。小脳においては、ノギンの発現は、Ｅ１８およびＰ１でより高いようであった；脊髄においては、ノギンｍＲＮＡの発現はＰ１でピークであった。全てのＣＮＳ領域中でのノギンの発現の試験は、特に、嗅球、中脳、後脳、および小脳である。成体においては、ノギン  ｍＲＮＡは、全てのＣＮＳ領域（特に、嗅球および小脳）で検出され得た。皮膚においては低いレベルであるようであった。
【０１１５】
（実施例６）
ノギンによる神経誘導
材料および方法
ＸｅｎｏｐｕｓノギンＣＨＯ細胞馴化培地の調製
ＸｅｎｏｐｕｓノギンＣＨＯ馴化培地を、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞についての選択によって作製した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ親細胞（Ｊ．Ｐａｐｋｏｆｆ，．Ｓｙｎｔｅｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子とタンデムにノギンを含有する、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ノギン発現プラスミドでトランスフェクトした。ヌクレオシドを含まない培地中での増殖を、トランスフェクトに成功した細胞を選択するために使用した。トランスフェクタントの９個のコロニーを採取し、そして別々に増殖させた。これらの細胞中のノギン遺伝子を、ＤＨＦＲのインヒビターであるメトトレキセートの用量をゆっくりと増大させることによって増幅させた。ノギン転写物の存在を、ノーザン分析によって最初に試験した。続いて、２つのクローンＢ３およびＣ３が、ノギンタンパク質を分泌することを示した。なぜなら、これらの株に由来する馴化培地が、腹側辺縁層を背方化し得たからである。さらに、３５Ｓ−メチオニンでＢ３細胞性タンパク質を標識することによって、ノギンタンパク質を、還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３０ｋＤのバンドとして、そして非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥで６０ｋＤのバンドとして同定し得た。このことは、これが、予想される二量体を形成することを示す。これらの特性は、前出（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１，５４７−４９，１９９３）においてＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中で以前に産生されたノギンタンパク質の特性と一致した。Ｂ３馴化培地を、１部のαＭＥＭおよび９部のＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の混合物中に回収した。細胞を、３日間、この培地に馴化させた。親細胞（ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−）に由来するコントロール培地を全く同様に回収した。２０倍に濃縮した培地を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０濃縮機を使用して作製し、ここで２０倍の変化を容量によって測定した。
【０１１６】
ＣＯＳ細胞からのヒトノギンの精製
ヒトノギンタンパク質を、陽イオン交換カラムによって精製した。ＣＯＳ／Ｍ５細胞を、ヒトノギン発現プラスミドｐＣＡＥ１１で一過性にトランスフェクトした。細胞をＤＭＥＭ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）に２から３日間馴化させ、その後、培地を取り出した。この培地から微粒子を、遠心分離工程および続く０．２μｍの酢酸セルロースフィルターを通過させることによって除去した。この明澄化した培地を、数倍の容量の４０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄したＭｏｎｏＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上にポンプで載せた。次いで、タンパク質を４０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１．８ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡでの直線勾配中に溶出した。ノギンタンパク質は、０．８ＭのＮａＣｌで溶出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９０％以上の純度である。
【０１１７】
Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｔｘの単離
Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｏｔｘクローンを単離するために、オタマジャクシ頭部のｃＤＮＡライブラリー（Ｈａｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０６，６１１−６１７，１９８９）を、低いストリンジェンシーでマウスｏｔｘ  ｃＤＮＡ（Ｓ−Ｌ  ＡｎｇおよびＲｏｓｓａｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ）を用いてスクリーニングした。採取したクローンを２つのクラスに分けた。１つのクラス（本発明者らがｏｔｘＡと命名した）は、ここで使用したプローブｐＸＯＴ２１．２を含んだ。インサイチュハイブリダイゼーションにより、転写物は、背側浅層で原腸胚形成の前に最初に検出される。神経胚形成の間には、大きな前方ドメインが遺伝子を発現し、そして神経組織および非神経組織の両方を含む。尾芽オタマジャクシ中での発現の低下後、この遺伝子は、脳および眼において特異的に再度発現される。
【０１１８】
腹側の辺縁領域のアッセイ
胚の調製
Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの胚を受精させ、そして記載されているように（ＣｏｎｄｌｅおよびＨａｒｌａｎｄ、１９８７，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０１、９３−１０５）解剖の前の晩に常法で脱ゼリー化する。胚を一晩１５℃にて培養する。それぞれの発生中の胚の周辺の卵黄膜を、翌朝、後期胞胚ステージでモニタリングの後に手作業で除去した。解剖まで、胚を、アガロースでコートしたディッシュ中の１／３×の改変したリンゲル中で維持した。
【０１１９】
腹側辺縁層の摘出
胚を、背側が同定され得るように、それらの卵黄植物性半球を上に向ける。初期原腸胚の背側は、「背唇」と呼ばれる密度の高い色素の小さな弧線の存在によって明らかである。背唇は、背側中胚葉の内旋の開始を示す。腹側辺縁層（ＶＭＺ）を、背唇の正反対に見出し、そして摘出した。卵黄膜を除去しているので、胚は平らになる。ワックスでガラスピペット上に取り付けた、眉毛から作製した特別に構築したナイフを使用して、上に面している植物極から動物極まで、平坦になった胚を通して２つの切れ目を作製する。切れ目を、これらがより側面の組織から離れた腹側の約３０〜６０度を単離するように、作製する。最初の２つの切れ目に対して垂直である第３の切れ目で、腹側辺縁層の組織を、胚の残りから完全に単離する。この第３の切れ目は、中心から胚の半径の約３分の２のレベルである。処理の前に、ＶＭＺを培養培地中で１回洗浄する。
【０１２０】
アッセイ
約５〜１０のＶＭＺを、１回のアッセイについて使用する。洗浄したＶＭＺを、アッセイのための所望の処理タンパク質培地を含有するエッペンドルフチューブ中に穏やかに滴下する（液体の移動を最小にするように試みる）。ＶＭＺを、コントロールの全胚の発生によって評価されるような、後期神経胚または初期尾芽ステージまで発生させる。この時点で、ＲＮＡをＶＭＺおよびコントロールの全胚から、記載されているように単離する（ＣｏｎｄｉｅおよびＨａｒｌａｎｄ，ｉｂｉｄ）。ＶＭＺにおける筋肉アクチンの発現は、背方化事象を示す（ＬｅｔｔｉｃｅおよびＳｌａｃｋ，１９９３．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１７，２６３−７２）。各サンプルに由来するＲＮＡを、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で泳動し、そして遺伝子スクリーニングするためにブロットする。次いで、ブロットを、Ｘｅｎｏｐｕｓ筋肉アクチンプローブでハイブリダイズする（Ｄｗｏｒｋｉｎ−Ｒａｓｔｌら、１９８６．Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．９１、１５３−６８）。背方化の定量を、偏在して発現されるＥＦ−１αのシグナルに対して筋肉アクチンのシグナルを規格化することによって行い得る（Ｋｒｉｅｇら、１９８９．Ｄｅｖｌ．Ｂｉｏｌ．１３３，９３−１００）。定量を、蛍光体画像化を使用して行う。
【０１２１】
ＲＮアーゼ保護アッセイ
ＲＮアーゼ保護を、消化を１０単位／ｍｌのＲＮアーゼＴ１のみ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ５５６７８５）を使用して室温（２２℃）で行う改変をなして、記載されているように行った（Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２，７０３５−５６，１９８４）。２０〜３０の動物極キャップを各レーンから回収し、その８０％を、神経のマーカーに、そして１０％を筋肉アクチンおよびＩＩ型コラーゲンに使用した。グースコイドおよびブラキュリについては、２０のキャップを使用した。暴露は１２時間から５日間の範囲であった。全ての場合において、フィルムを予めフラッシュした。マーカーが発現されなかった場合は、結果を、蛍光体画像化を使用してより大きな感度を有すると確認した。
【０１２２】
結果
脊椎動物の胚の発生は、いくつかの誘導性相互作用を必要とする。中胚葉（これは、最終的に組織（例えば、脊索、筋肉、心臓、間葉組織、および血液）を形成する）は、胚の赤道領域で誘導される（Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ，Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｒｏｕｘ’  Ａｒｃｈ．ＥｎｔｗＭｅｃｈ．Ｏｒｇ，１６２、３４１−３７３、１９６９）。この誘導性の事象は十分に研究され、そして線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、およびアクチビン（ＪｅｓｓｅｌｌおよびＭｅｌｔｏｎ，Ｃｅｌｌ  ６８，２５７−７０  １９９２；Ｓｉｖｅ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７，１−１２，１９９３）、およびＴＧＦｂファミリー（Ａｓａｓｈｉｍａら、Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８，３３０−３３５，１９９０；Ａｓａｓｈｉｍａら、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ７７，８，３８９−９１，１９９０；ＧｒｅｅｎおよびＳｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４７，３９１−３９４，１９９０；Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５，６２７７，７２９−３１，１９９０；Ｔｈｏｍｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  ６３，４８５−４９３，１９９０；ｖａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５，６２７７，７３２−４，１９９０）のメンバーを含む内因性のインデューサーのいくつかの候補が存在する。ＦＧＦ（Ａｍａｙａら、Ｃｅｌｌ  ６６，２５７−２７０，１９９１）およびアクチビン（Ｈｅｍｍａｔｉ−ＢｒｉｖａｎｌｏｕおよびＭｅｌｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９，６０９−６１４，１９９２）の両方の優性ネガティブレセプターのＸｅｎｏｐｕｓ胚における使用は、これらの分子によって活性化されたシグナル伝達経路が適切な中胚葉形成に必須であることを強力に示唆する。ｗｎｔ（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１，１０４５−１０５５，１９９１；ＭｃＭａｈｏｎおよびＭｏｏｎ，Ｃｅｌｌ  ５８、１０７５−８４，１９８９；ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ，Ｃｅｌｌ  ６７，７５３−７６５，１９９１；Ｓｏｋｏｌら、Ｃｅｌｌ  ６７，７４１−７５２，１９９１）およびノギン（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１，５４７−４９，１９９３）のような分子は、中胚葉を直接誘導することなく作製される中胚葉の種類を改変する。
【０１２３】
続く誘導において、シュペーマンオーガナイザーの背側中胚葉は、より背側の運命になるように、すぐ近くの側部中胚葉にシグナルを送る（ＤａｌｅおよびＳｌａｃｋ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １００，２，２７９−９５，１９８７；ＬｅｔｔｉｃｅおよびＳｌａｃｋ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１７，２６３−２７１，１９９３；ＳｐｅｍａｎｎおよびＭａｎｇｏｌｄ，Ａｒｃｈ．ｍｉｋｒｏｓｋ．Ａｎａｔ．ＥｎｔｗＭｅｃｈ．１００，５９９−６３８，１９２４；ＳｔｅｗａｒｔおよびＧｅｒｈａｒｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９，３６３−３７２，１９９０）。オーガナイザー中で発現され、そしてその背方化活性を模倣し得る唯一の既知の因子が、ノギンである。
【０１２４】
シュペーマンオーガナイザーの背側中胚葉はまた、近くの外胚葉に神経組織になるためのシグナルを送る。背側中胚葉による神経誘導が、両生類（ＤｉｘｏｎおよびＫｉｎｔｎｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０６，７４９−７５７，１９８９；Ｄｏｎｉａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７、５０６９，５４２−５，１９９２；Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｔｈｅ  Ｈｅｒｉｔａｇｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：Ｈａｎｓ  Ｓｐｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ，１９８８；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＭｌｔｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９９，３１１−２５，１９８７；Ｓｐｅｍａｎｎ，Ａｒｃｈ．ｍｉｋｒｏｓｋ．Ａｎａｔ．ＥｎｔｗＭｅｃｈ．１００，５９９−６３８，１９３８）、鳥類（ＫｉｎｔｎｅｒおよびＤｏｄｄ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３，１４９５−１５０６，１９９１；Ｔｓｕｎｇら、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｌ  ｅｘｐ  Ｓｉｎｉｃａ  １０，６９−８０，１９６５）において、そして最近、マウス（ＡｎｇおよびＲｏｓｓａｎｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｐｍｅｎｔ  １１８，１３９−１４９，１９９３）において実証されている。１０年間の努力にもかかわらず、この誘導を担う因子の分子的性質についてはほとんどわかっていない。既知のインデューサーの中でも、アクチビンは、神経組織の形成を促進し得るが、これは、アクチビンが誘導する背側中胚葉による二次的な誘導に起因する（Ｇｒｅｅｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０８，１，１７３−８３，１９９０；ＧｒｅｎおよびＳｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４７，３９１−３９４，１９９０；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＤｏｄｄ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３，１４９５−１５０６，１９９１）。従って、アクチビンは、原腸胚外胚葉に添加された場合は、神経組織の形成を促進し得ない；しかし、このような外胚葉は、原腸胚形成の終わりまで、背側中胚葉によって神経形成されることに対してコンピテントのままである（ＳｈａｒｐｅおよびＧｕｒｄｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｐｍｅｎｔ  １０９，７６５−７４，１９９０）。
【０１２５】
ノギンによる直接神経誘導
内因性誘導因子についての候補は、背側中胚葉の不在下で神経組織を誘導することが予期される。後期胞胚ステージ胚（Ｓｔ９）からの反応能を有する動物極キャップ外胚葉を使用して、ノギンの神経誘導能を試験した。Ｘｅｎｏｐｕｓノギンタンパク質馴化培地を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から採集し、そして２０倍濃縮培地を使用して、Ｓｔ９動物極キャップを処理した。ＲＮアーゼ保護アッセイにおいて使用されるマーカーは、Ｎ−ＣＡＭ（ＪａｃｏｂｓｏｎおよびＲｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１８，５２４−３１，１９８６；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＭｅｌｔｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９９，３１１−２５，１９８７）、神経細胞接着分子、後脳および脊髄で発現されるｂ−チューブリンの神経特異的イソ型（Ｇｏｏｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７，８０００、１９８９；Ｇｏｏｄら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １３７、４１４−８、１９９０；Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５、８０８６−９０、１９８８）、およびＸＩＦ３、神経発現中間フィラメント遺伝子（Ｓｈａｒｐｅら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０７，７０１−１４，１９８９）（神経誘導についてアッセイするための）であった。これらの全てのマーカーは神経組織に制限されるが、ＮＣＡＭのみが神経系全体にわたって発現される。本発明者らは、Ｘｅｎｏｐｕｓ−ノギン馴化培地が、筋肉アクチン（レーン１３）を誘導することなく、処理動物極キャップにおいて、高レベルのＮ−ＣＡＭおよびＸＩＦ３発現［図２；レーン８］を誘導することを見出した（Ｄｗｏｒｋｉｎ−Ｒａｓｔｌら、Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．  ９１，１５３−１６８，１９８６；Ｍｏｈｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１１、７１６−７２１，１９８４）。コントロールＣＨＯ細胞培地は、筋肉組織も神経組織も誘導しない（レーン７、１２）。Ｓｔ９アクチビン処理動物極キャップは、筋肉アクチン（レーン１１）および３つの全ての神経マーカー（レーン６）を発現し、このことは、アクチビンが、間接的に神経組織を生成し得ることを実証する。ノギンは、高レベルのＮ−ＣＡＭを誘導する一方、いくらかはあるが、非常にわずかなｂ−チューブリン発現しか誘導しないのに対し、アクチビン誘導は、ほとんど逆の効果を有することに興味深く留意される。
【０１２６】
ノギンタンパク質が神経組織を誘導するのに十分であるか否かを決定するために、ＣＯＳ細胞をｐＣＡＥ１１、ヒトノギン発現プラスミドでトランスフェクトし、そして馴化培地をカチオン交換クロマトグラフィーによって精製し、９０％純粋であるノギン調製物を生じさせた［図３］。このような精製ヒトノギンタンパク質もまた、動物極キャップにおいて神経組織を誘導させ得る［図４ａ、以下を参照のこと］。
【０１２７】
本発明者らは、ノギンが、後期胞胚ステージ動物極キャップでは筋肉を誘導しないことを示しているが、ノギンは、他のタイプの背側中胚葉を誘導することが考えられる。この関心ごとに取り組むために、本発明者らは、ノギンが、初期中胚葉マーカーであるグースコイド（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３、１９４−６，１９９１；Ｃｈｏら、Ｃｅｌｌ  ６７、１１１１−２０、１９９１）、オーガナイザー組織のマーカー、および続いて頭部中胚葉またはＸ−ブラキュリ（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ  ６７、７９−８７、１９９１）（これは、全ての中胚葉前駆体において初期に発現されるようであり、そして続いて後方中胚葉および脊索で発現される）を誘導し得るか否かを求めた。正常胚でグースコイドおよびブラキュリの発現が高いとき、動物極キャップを９ステージで処理し、１１ステージで採集した。いずれのマーカーも、示された神経誘導活性を有する（図６、レーン１５）用量では、精製ヒトノギンによって現れない（図４ｂ、レーン５）；逆に、アクチビンで同様に処理した動物極キャップは、この中胚葉誘導因子（Ｃｈｏら、Ｃｅｌｌ  ６７、１１１１−２０，１９９１；Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ  ６７，７９−８７，１９９１）について予期されるように、グースコイドおよびＸ−ｂｒａの両発現を示す（図４ｂ、レーン４）。未処理動物極キャップは、これらの中胚葉マーカーの発現を示さず（レーン３）、そして採集された動物極キャップにおけるＲＮＡレベルは、ＥＦ−１ａレベルを用いたときと匹敵することが示されている（Ｋｒｉｅｇら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １３３、９３−１００，１９８９）。
【０１２８】
精製ヒトノギンが神経誘導を駆動し得るので、粗馴化培地に存在し得るさらなる因子は必要とされない。さらに、Ｘｅｎｏｐｕｓおよびヒトノギン（８０％アミノ酸同一性を有する）はともに、Ｘｅｎｏｐｕｓにおいて神経組織を誘導するように作用し得、このことは、これらの２つのタンパク質の保存された機能を示唆する。しかし、ノギンが候補内因性神経誘導因子であるためには、神経誘導が正常胚全体で生じるステージにおいて、神経組織を誘導できなければならない。いつ最初の指令的なシグナルが、胚において背側中胚葉から外胚葉まで送られるかは、不明である。しかし、初期原腸胚ステージまでに、背側外胚葉はすでに、神経組織になるように特殊化されていることが知られている（ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｌａｎｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０７、７８５−９１、１９８９）。従って、神経誘導シグナルは、このステージの前に出発すると思われる。動物極キャップが神経誘導中胚葉に応答するように反応能を有することが示されている最も遅いステージは、初期神経胚（Ｓｔ１３−１４）である（ＳｈａｒｐｅおよびＧｕｒｄｅｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９，７６５−７４，１９９０）。従って、候補内因性神経誘導因子は、原腸胚ステージ反応能外胚葉から神経組織を誘導できるにちがいない。
【０１２９】
原腸胚ステージにおける神経誘導
ノギンに応答する外胚葉の反応能を評価するために、本発明者らは、胞胚（Ｓｔ８）ステージ胚、後期胞胚（Ｓｔ９）ステージ胚、初期原腸胚（Ｓｔ１０）ステージ胚から採取した動物極キャップ、および中期原腸胚（Ｓｔ１０．５）ステージ胚からの腹側動物極キャップを精製ヒトノギンで処理した［図２］。本発明者らはまた、同様にステージ付けられた動物極キャップをアクチビンで処理し、その中胚葉誘導活性および二次神経誘導活性を示し、そしてアクチビンの効果をノギンの効果と対比させた［図４ａ］。アクチビン処理動物極キャップは、背側中胚葉の誘導（例えば、筋肉および脊索）と共にのみ神経誘導を示す（レーン３、６、９）。多数の実験において、本発明者らは、アクチビンが背側中胚葉、および結果として神経組織を誘導する能力は、原腸胚ステージで急速に減少することを確認した（レーン１２）（Ｇｒｅｅｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０８，１７３−８３，１９９０；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＤｏｄｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３、１４９５−１５０６、１９９１）。ここで示した実験では、通常より多くの用量のアクチビンが与えられた。これらの条件下では、少量の神経組織のみが生成される。これは、おそらく、非常に多くの内胚葉が誘導されるため、神経化されるべき外稙片に、多くの反応能を有する外胚葉が残らないからである。対照的に、ノギンは、これらのステージの全てから採取された動物極キャップにおいて、脊索および体節マーカー、ＩＩ型コラーゲン（Ａｍａｙａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８、４７７−８７、１９９３；ＢｉｅｋｅｒおよびＹａｚｄａｎｉ−Ｂｕｉｃｋｙ、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４０、１１１７−２０、１９９２）、または筋肉アクチンを誘導することなく、神経組織を誘導し得る（レーン４、７、１０、１３）。これは、ノギンが、直接的な神経誘導因子であるという提唱にさらなる支持を与える。なぜなら、これは、初期および後期の両方の中胚葉マーカーの不在下で作用し得るからである。さらに、本発明者らは、ノギンは、中胚葉誘導因子が不活性である時点で、反応能を有する外胚葉において、神経組織を誘導し得ることを示している。
【０１３０】
いくつかの実験において、原腸胚（胞胚ではない）動物極キャップへのノギン添加は、筋肉の誘導を生じた。これは、アクチビンが、もはや筋肉を誘導し得ないステージにおいて生じた。本発明者らは、これを、弱い中胚葉誘導シグナルを受容した組織におけるノギンによる背方化作用の結果であると解釈する。原腸胚動物極キャップに伝播されるこの中胚葉誘導シグナルは、中胚葉を誘導するのに十分ではないが、Ｘｗｎｔ−８またはノギンの存在下では、筋肉が形成される。筋肉の誘導の１つの興味深い推論は、外稙片で見られる神経組織の性質が改変されることである。筋肉を含まない外稙片における誘導は、通常、Ｎ−ＣＡＭ発現を生じるが、筋肉が存在すれば、Ｎ−ＣＡＭおよびｂ−チューブリンの両方の発現が見られる。この現象は、Ｓｔ．９動物極キャップにおけるアクチビンによる二次神経誘導において［図２］、および腹側辺縁層対動物極キャップにおけるノギンにより誘導された神経組織の比較において［図６］、示される。筋肉が存在する腹側辺縁層および動物極キャップでは、Ｎ−ＣＡＭおよびｂ−チューブリンの両方が発現され、一方、筋肉のない誘導された動物極キャップは、Ｎ−ＣＡＭ発現のみを示す。
【０１３１】
ノギンをコードするＤＮＡの注入後の神経誘導
別の実験アプローチを使用して本発明者らの結論を確認するために、本発明者らは、プラスミドｐＣＳＫＡ−ｎｏｇｇｉｎを１細胞ステージ胚の動物極に注入することにより、原腸胚ステージ動物極キャップにノギン発現を指向させた。このプラスミド（ノギンが、細胞骨格アクチンプロモーターの制御下にある）は、原腸胚形成の開始時にノギンｍＲＮＡの発現を作動させる（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１，５４７−４９，１９９３）。胞胚ステージで、動物極キャップを解剖し、次いで分子分析のために尾芽ステージまで成熟させる。ノギンプラスミドを注入した動物極キャップは、筋肉または脊索マーカーの不在下でＮ−ＣＡＭの発現を示す（図４ｃ、レーン２）。ｌａｃＺの発現を指向するコントロールプラスミドは、予期されるように、神経誘導も中胚葉誘導も示さなかった（レーン１）。この実験は、異所性ノギン発現が、原腸胚ステージ外胚葉（神経誘導が胚全体において生じているステージ）において神経組織を直接的に誘導し得ることを示す。
【０１３２】
背側動物極キャップおよび腹側動物極キャップの間の反応能の差異
原腸胚ステージ胚の背側から採取された動物極キャップは、退縮された前方中胚葉が誘導因子として使用される場合、腹側動物極キャップよりも、神経組織形成に対してより大きな反応能を示す（ＯｔｔｅおよびＭｏｏｎ、Ｃｅｌｌ  ６８、１０２１−２９、１９９２；Ｓｈａｒｐｅら、Ｃｅｌｌ  ５０，７４９−５８，１９８７）。しかし、このタイプの中胚葉は、退縮された中胚葉の残りよりも弱い誘導能を有する（Ｓｉｖｅら、Ｃｅｌｌ  ５８、１７１−１８０、１９８９）。さらに、胚の腹側は、オーガナイザーがその側に配置されるとき、完全な二次軸の形成を支持し得（ＧｉｍｌｉｃｈおよびＣｏｏｋｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０６、４７１−３、１９８３；ＳｍｉｔｈおよびＳｌａｃｋ、Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．  ７８、２９９−３１７、１９８３；Ｓｐｅｍａｎｎ、Ａｒｃｈ．  ｍｉｋｊｒｏｓｋ．  Ａｎａｔ．  ＥｎｔｗＭｅｃｈ．１００、５９９−６３８、１９３８）、このことは、反応能において質的な差異はないことを示している。従って、弱い誘導因子が、外胚葉の反応能においてわずかな差異を暴露し得る一方、強い神経誘導因子は、背側外胚葉および腹側外胚葉に対するその効果においてほとんど差異を示さないことが示唆されている（ＳｅｒｖｅｔｎｉｃｋおよびＧｒａｉｎｇｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１２、１７７−８８、１９９１）。従って、本発明者らは、初期原腸胚からの背側外胚葉および腹側外胚葉に対するノギンの効果を試験した。Ｎ−ＣＡＭ発現における差異は、検出されず（図５、レーン４、６）、ノギンで処理した腹側動物極キャップは、（おそらく低級中胚葉誘導を受容した組織の背方化によって）より多くの量の筋肉アクチン発現を示す。アクチビン処理背側極キャップは、腹側ノギン処理極キャップとほぼ同じレベルの筋肉アクチン発現（レーン５）の誘導を示すが、アクチビン処理は、検出可能な神経特異的転写物を誘導しなかった（レーン３、５）。このことは、このステージで誘導された筋肉組織は、神経組織を二次誘導するのに十分でないこと、およびノギンは神経組織を誘導するために存在しているに違いないことを示している。
【０１３３】
本発明者らは、ノギン仲介神経誘導において背側−腹側差異がなく、このことは、ノギンがシュペーマンオーガナイザーの強い神経誘導シグナルと同様に挙動し、初期前方中胚葉からの弱いシグナルと同様ではないことを示唆すると結論する。
【０１３４】
用量依存性
どのレベルのノギンタンパク質が神経誘導活性に必要とされるかを決定するために、本発明者らは、用量応答実験を実行した。動物極キャップにおいて神経誘導に必要とされる用量を決定することに加え、本発明者らはまた、これらの２つのタイプの誘導に必要とされる用量を比較するために、腹側辺縁層の背方化の用量応答を実施した。９ステージ動物極キャップまたはＳｔ．１０．５  ＶＭＺを精製ヒトノギンで処理し、そしてＮ−ＣＡＭおよびβ−チューブリンを神経誘導をアッセイするために使用し、一方筋肉アクチンを、背側中胚葉のマーカーとして使用した。この実験は、神経誘導が、１μｇ／ｍｌの用量で生じ、これは、ＶＭＺの背方化に必要とされるより２０倍高い用量であることを示す［図５］。明らかに高い用量が必要とされることを説明し得る、いくつかの知見がある。第一に、背側中胚葉から最大神経応答を得るためには、組織は、神経胚形成のほとんどと接触して置かれなければならない（ＳｈａｒｐｅおよびＧｕｒｄｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９、７６５−７４、１９９０）；逆に、ノギンで処理した動物極キャップは急速に閉塞し、これは、因子接近を阻害し、そして結果としてそれら動物極キャップは、短時間有効な用量のみを受容する。第二に、ノギンが、胚において活性である唯一の神経誘導因子ではないと思われる；種々の両生類において、体節（Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，８００−８０２，１９９０；ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｌａｎｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０７、７８５−９１、１９８９）および神経板が、神経誘導活性を有し（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ、Ｔｈｅ  Ｈｅｒｉｔａｇｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：  Ｈａｎｓ  Ｓｐｅｍａｎｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ，１９８８；ＳｅｒｖｅｔｎｉｃｋおよびＧｒａｉｎｇｅｒ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １４７、７３−８２、１９９１）、そしてノギン転写物がそこでは検出されないことがことが示されている。従って、ノギンは、いくつかの神経誘導活性のうちの１つであることが、もっともらしく思われる。これに関連して、ノギンが、腹側辺縁層において神経組織を誘導することにおいて、それらを背方化して筋肉を生成させることにおいてと、同等に有効であることに留意する価値がある。多数の他の実験（図５を参照のこと）は、アクチビンによるこのステージにおける類似の量の筋肉の誘導は、神経誘導を生じないことを示す。第四に、少ない割合の精製タンパク質のみが活性であること、およびこの実験は、神経誘導に必要とされるタンパク質の量を過剰評価しているようであり得る。最後に、外因的に添加された可溶性ノギンへの接近性は、内因的に分泌されたノギンタンパク質よりも有意に低いと考えられる。
【０１３５】
パターンニング
胚神経組織は、種々の脳構造、眼、および脊髄を有する、前後方向（Ａ−Ｐ）パターンを呈する。Ａ−Ｐ神経パターンは、それが平面構造で応答外胚葉に近接しているか（ＤｉｘｏｎおよびＫｉｎｔｎｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０６、７４８−７５７、１９８９；Ｄｏｎｉａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７、５４２−５、１９９２；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＭｅｌｔｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９９、３１１−２５、１９８７；Ｒｕｉｚ  ｉ  Ａｌｔａｂａ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０８、５９５−６０４、１９９０）、または垂直方向の相互作用で外胚葉の直下にあるか（ＤｉｘｏｎおよびＫｉｎｔｎｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０６、７４９−７５７、１９８９）に関わらず、背側中胚葉の存在を必要とすると考えられる（Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０、８００−８０２、１９９０；ＳｈａｒｐｅおよびＧｕｒｄｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９、７６５−７４、１９９０；Ｓｌｖｅら、Ｃｅｌｌ  ５８、１７１−１８０、１９８９）。これらの両タイプの相互作用は、正常な発生を生じ、そしておそらく共に、得られるパターンに寄与する。ノギンが、パターン化された神経組織を誘導するかどうか、そしてもしそうであれば、どの神経領域が表されるかを決定するために、本発明者らは、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、前脳および中脳のマーカーとしてＸｅｎｏｐｕｓ  ｏｔｘ；中脳−後脳境界のマーカーとしてＥｎ−２（Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１、７１５−７２４、１９９１）；および後脳の第三および第五の菱脳神経小片のマーカーとしてＫｒｏｘ−２０（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、４６１−４、１９８９）を使用した（Ｈａｒｌａｎｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３６、６７５−６８５、１９９１）。ＸＩＨｂｏｘ  ６に対して指向された抗体（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９、２２５−３４、１９９０）は、後方後脳構造および脊髄構造をマークする。これらのマーカーの使用の前に、本発明者らは、ノギン処理動物極キャップにおいてセメント腺の形成を観察した。セメント腺は、神経板に対して前方に見出される外胚葉起源の誘導組織であるので、この結果は、ノギンが前方構造を誘導することを示唆する。インサイチュハイブリダイゼーションは、ノギン処理動物極キャップにはセメント腺特異的転写物、ＸＡＧ−１（Ｓｉｖｅら、Ｃｅｌｌ  ５８、１７１−１８０，１９８９）が存在するが、コントロール処理動物極キャップでは存在しないことを示すことにより、これを確認する［図７Ａ−Ｌ］。領域特異的神経マーカーを用いるインサイチュハイブリダイゼーション［図７Ａ−Ｌ］は、ノギン処理動物極キャップにおけるｏｔｘの発現によって見られるように、ノギンが前脳タイプ組織を誘導することを示す。本発明者らは、Ｅｎ−２、Ｋｒｏｘ２０、またはＸＩＨｂｏｘのいずれも検出しておらず、このことは、これらのより後方のマーカーが、ノギンによって誘導されないことを示唆する。
【０１３６】
神経抗原の発現
本発明者らは、ノギンが、神経特異的転写物の発現を直接的に誘導することを実証している。さらなる実証は、神経特異的抗原に対する抗体を使用して、ノギン誘導組織が表現型が神経性のものであることを示すことである。このために、本発明者らは、動物極キャップ組織をノギンで処理し、そして抗体染色のためにそれらを後期段階（Ｓｔ３５）まで培養した。本発明者らは、６Ｆ１１抗Ｎ−ＣＡＭ抗体を使用している。この抗体は、正常胚の神経管全体を染色する。ノギン処理動物極キャップは、この抗原を発現し［図７Ａ−Ｌ］、コントロール未処理動物極キャップは、発現しない。このことは、ノギンが、処理動物極キャップで神経特異的タンパク質の産生を誘導し得ることを示している。本発明者らは、分化神経細胞の種々のサブクラスに特徴的な多数の他の抗原の発現を検出し得なかった。これらは、２Ｇ９（大部分の神経組織（末梢神経細胞を含む）を染色する）、Ｔｏｒ  ２４．５５（これは、感覚神経細胞を染色する）、およびＴｏｒ  ２３（これは、種々の神経細胞（運動神経細胞を含む）を染色する）を含んだ。
【０１３７】
（実施例７）
Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルスからの組換えヒトノギンの産生
材料および方法
遺伝子操作および細胞培養
ラクトース誘導性発現プラスミドを、ｐＲＰＮ４０（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５７，１００８−１０１２，１９９１）のＳｗａ１／Ｂｓｍ１領域を、ＰＣＲにより得られ、そして同じ制限部位にまたがる、ヒトノギン遺伝子のＳｗａ１／Ｂｓｍ１領域と置換することにより構築し、プラスミドｐＲＧ３０１を生じさせた。ｐＲＧ３０１は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるヒトノギン遺伝子を有するｐＢＲ３２２由来の高コピー数カナマイシン耐性プラスミドである。高コピー数のカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドは、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＮＲＲＬ），  Ｐｅｏｒｉａ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓに寄託されており、そして受託番号Ｂ−１８６００を有する。このプラスミドは、米国特許出願第０７／４７８，３３８号（これはその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載された。本質的には、記載されるように（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、同書）、ｐＲＧ３０１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｌａｃｌｑ細胞を３７℃で増殖させ、ラクトースで誘導し、遠心分離によって採取し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８で１回洗浄し、凍結保存した。
【０１３８】
封入体からの回収
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペースト（３２ｇ）を、１０容量（ｖ／ｗ）の５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＩ−ｐＨ８．０−５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に懸濁し、８，０００ｐｓｉおよび８℃でフレンチプレスで溶解し、そして４℃で３０分間８，０００×ｇで遠心分離した。ノギンを含有するペレットを、元の容量の２Ｍ尿素−２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０中に懸濁し、そして３０分間攪拌した。懸濁液を４℃で３０分間８，０００×ｇで遠心分離し、ほとんど封入体（ＩＢ）からなるペレットを２０容量（ｖ／ｗ）の６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＤＴＴ中に懸濁し、そして室温で１時間攪拌した。３０分間８，０００×ｇでの遠心分離後、０．４５〜０．５０ｇの変性および還元型ノギンを含む上清を１０容量の６Ｍ尿素−５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．１ｍＭ  ＤＴＴに対してＯｍｅｇａ  １０，０００ＭＷカットオフ膜を用いてダイアフィルトレートした。０．４〜０．４４ｇのノギンを含有するダイアフィルトレーション濾過物を、３０ｍｌ／分の流速で、６Ｍ尿素−５０ｍＭ酢酸ナトリウム−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．１ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ４．５で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の２．６×１０ｃｍカラム上にロードした。カラムをまず同じ緩衝液で、次いで１リットル勾配（０〜１Ｍ  ＮａＣｌ）で、３０ｍｌ／分の流速で洗浄した。ノギンを含有する画分をゲル電気泳動によって同定し、そしてプールした。収量は、０．２〜０．２５ｇノギンであった。
【０１３９】
再折り畳み
変性および還元型ノギン溶液を、０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度に調整し、そして４℃でゆっくりと攪拌しながら、１．５〜２．５ＭグアニジンＨＣｌ−０．１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣ  ｐＨ８．０−０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．２〜２ｍＭ還元型グルタチオン−０．０２〜０．２ｍＭ酸化型グルタチオン（好ましくは、１０：１還元型グルタチオン対酸化型グルタチオンの比で）に供した。２４〜７２時間後、２つの再折り畳みノギンイソ型が、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって同定された（図８）。再折り畳みノギン溶液を、２０容量の０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５に対してダイアフィルトレートし、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２に供し、そして４℃で最少１時間、ゆっくりと攪拌した。間違って折り畳みされたノギンは沈澱し、そしてこれを８，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。
【０１４０】
逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
再折り畳みノギンは、溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）で平衡化された１２ｍｍ  Ｃ８、１×２５ｃｍ  Ｄｙｎａｍａｘ  ３００Ａカラム上でクロマトグラフィーによって精製され得る。ローディング後、カラムを溶媒Ａで洗浄し、４ｍｌ／分の流速で、以下のプロトコルに従って展開させた：（ａ）１０分間、７０％の溶媒Ａ、３０％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）でイソクラティックに；３０分間、６０％溶媒Ｂおよび４０％溶媒Ａへの線形勾配。正確に再折り畳みされたノギンは、４４％〜４６％溶媒Ｂでより早く溶出する。収量は、０．０７〜０．１ｇノギンであった。
【０１４１】
バキュロウイルス細胞培養物におけるヒトノギンの産生
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳＦ２１株を、慣用的に、ラクトアルブミン加水分解物およびｙｅａｓｔｏｌａｔｅを添加したグレース昆虫細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）で、細胞単層として維持した。１０％ｖ／ｖ熱失活ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補完したこの培地を、ＴＭＮＦＨ−１０と同定する。細胞をまた、適応化後に無血清培地（ＳＦ−９００−ＩＩ；Ｇｉｂｃｏ）において培養した。いずれの培地中の懸濁培養物も、８０ｒｐｍの攪拌速度を使用して、マイクロキャリア培養フラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ）中で上昇させた。全ての培養物は、トリパンブルー排除により判断されるように、＞９６％生存度で維持された。
【０１４２】
組換えバキュロウイルスの構築
ヒトノギンに相当する配列を、５’−ＢａｍＨ１−Ｐｓｔｌ−３’フラグメントとして、ヒトノギン遺伝子を含有する発現プラスミドから切り出した。このフラグメントを、ＢａｍＨ１−Ｐｓｔ１消化ｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドｐＴＲ１００９は、Ａｕｔｒｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多面体ウイルス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ）のポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターのすぐ下流にヒトノギン配列を有し、そしてこのプロモーター−異種遺伝子融合は、順に、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリン領域に由来する組換え標的に隣接される。組換えプラスミドＤＮＡをアルカリ溶解およびＣｓＣｌ遠心分離によって精製した。ＳＦ２１細胞を、プラスミドおよびウイルスＤＮＡで、以下の方法によって同時トランスフェクトした：プラスミドＤＮＡ（３ｍｇ）を０．５ｍｇの線状化した欠失型ウイルスＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏ  ＧｏｌｄTM、Ｐｈａｒｍｉｎｉｇｅｎ）と混合し、そしてエタノールで沈澱させた。乾燥させたＤＮＡを、次いで、水（５０ｍｌ）中に再懸濁し、１．５ｍｌグレース培地と混合し、そして３０ｍｌ  ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTMカチオン性リポソーム（ＢＲＬ）。ＤＮＡ−リポソーム混合物をボルテックスし、室温で１５分間静置し、そしてＳＦ２１細胞の単層に滴下により添加した（２×１０6細胞／６０ｍｍプレート）。２７℃で４時間インキュベートした後、２ｍｌのＴＭＮＦＨ−１０を添加し、そして培養物を、５日間インキュベーションに戻した。組織培養培地を採取し、そしてプラーク単離のためのウイルスの供給源として使用した。
【０１４３】
組換えウイルスを、ＳＦ２１細胞上の多数回のプラーク精製によって単離した。希釈ウイルス（０．５ｍｌ）を、２７℃で１時間の期間、細胞単層（２×ｌ０6細胞／６０ｍｍプレート）に吸着させ、吸引し、そしてウイルスプラークを、６日間の期間、ＴＭＮＦＨ−１０培地において０．５％アガロースの被覆を用いて発生させた。ウイルスプラークを、顕微鏡観察後に釣り上げ、そして２ｍｌ  ＳＦ９００−ＩＩ培地に溶出させた。ウイルスストックを、低い感染多重度（０．１ｐｆｕ／細胞）によって増幅した。ノギンを発現するウイルスクローンを、感染培養物の３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインで代謝標識し、総標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって分析することにより同定した。期待見かけ分子量２０，０００〜３０，０００の標識タンパク質が、この方法によって、候補クローンにおいて検出されたが、コントロール培養物においては検出されなかった。
【０１４４】
バキュロウイルス誘導ノギンの発現および精製
ＳＦ２１細胞を、ＳＦ９００−ＩＩ培地において約１．８×１０6／ｍｌの密度にまで、懸濁フラスコ中で培養した。培養物（５００ｍｌ）を、１０００×ｇで１０分間遠心分離し、そして２０ｍｌの増殖培地（５〜１０ｐｆｕ／細胞の組換えウイルスを含有する）中に再懸濁した。ウイルスを、室温で１時間、穏やかに混合させながら吸着させた。次いで、感染細胞を、新鮮な増殖培地でそれらのもとの容量に希釈し、そして２７℃で３日間インキュベートした。続いて、細胞および細片を、１０００×ｇで２０分間遠心分離することによって増殖培地から清澄化した。
【０１４５】
細胞上清をｐＨ８．０にし、０．４５ｍｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ６０フィルターを通過させ、そして５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０で平衡化しておいたＦａｓｔ  Ｓカラムに付与した。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、線形ＮａＣｌ勾配を用いて展開し、他の培地成分を除去した。ノギンは、１Ｍ  ＮａＣＩで、このカラムから溶出した。
【０１４６】
結果
Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルスにおけるヒトノギンの特徴づけ
逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、再折り畳みされ、Ｅ．ｃｏｌｉから精製された組換えノギンが、単一の鋭いピークで溶出することを示す。このことは、１つの優勢なイソ型の存在を示す（図９）。１５％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ還元ゲルは、Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫細胞のいずれかからのノギンが、９５％より良好に純粋であり、２０〜３０ｋＤのタンパク質に相当する単一のバンドで移動することを示す。昆虫細胞由来のノギンは、明らかには、単一のコンセンサス部位におけるＮ結合型グリコシル化に由来するさらなる質量に起因して、わずかによりゆっくりとした移動度を示す（図１０）。Ｅｎｄｏ  Ｆでの処理は、昆虫産生ノギンの移動度を、細菌産生タンパク質の移動度に変換する。
【０１４７】
還元剤の不在下では、Ｅ．ｃｏｌｉまたはバキュロウイルスのいずれかで産生されたノギンは、ジスルフィド結合型オリゴマータンパク質として挙動する（図１０）。しかし、ゲル濾過分析および質量分析によって、ノギンは、主に、ダイマータンパク質である。
【０１４８】
円二色性研究は、再折り畳みされ、Ｅ．ｃｏｌｉから精製された組換えノギンおよび昆虫細胞から精製されたノギンは、非常に類似するコンフォメーションを有することを示す（図１１）。この方法によって決定された二次構造は、ノギンが４８％α−ヘリックス、０％β−構造、および５２％ランダムコイルからなることを示す。
【０１４９】
Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルスにおいて産生されたヒトノギンの生物学的活性
Ｅ．ｃｏｌｉまたはバキュロウイルスにおいて産生されたヒトノギンの生物学的活性を、上述のような腹側辺縁層アッセイにおける筋肉アクチン発現のアッセイによって決定した。図１２に示される結果は、細菌産生ヒトノギンまたはバキュロウイルス産生ヒトノギンに曝露されたＶＭＺにおける筋肉アクチンｍＲＮＡの誘導についてのポジティブな用量応答を示す。
【０１５０】
（実施例８）ヒトノギンと反応性のラットモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６の産生および特徴づけ
材料および方法
抗体の産生
組換えヒトおよびＸｅｎｏｐｕｓノギンと反応性のＲＰ５７−１６ラットモノクローナル抗体を、雌Ｌｅｗｉｓラットを２ヶ月にわたって精製組換えヒトノギン（Ｅ．ｃｏｌｉで産生された）を４回３５μｇ注射することで免疫化することによって産生した。初回免疫のために、タンパク質を、フロイント完全アジュバント中で、後蹠に注射した。引き続く注射を、同じ後蹠に、フロイント不完全アジュバント中で与えた。ラットを４回目の注射の３日後に安楽死させた。
【０１５１】
免疫化ラット由来のリンパ節細胞を、ＳＰ２／０−Ｅ．Ｏ．マウス骨髄腫細胞と、２：１の比で混合した。遠心分離後、細胞混合物を、０．２５ｍｌの４２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ３３５０（Ｂａｋｅｒ）（１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）を有するリン酸緩衝生理食塩水中）中に、３７℃水浴中で全体で３分間再懸濁した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３０７２）において１ウェルあたり５×１０4リンパ球の密度で、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（１０％ＦＢＳ（ストレプトマイシン、ペニシリン、ピルビン酸塩、およびグルタミンを添加した）およびＨＭＧＴ（１．６×１０-3Ｍチミジン、４．０×１０-4メトトレキセート、１．３×１０-3炭酸水素ナトリウム、および１．０×１０-2ヒポキサンチン）を含む）中にプレートした。培養１０日後、上清を採取し、間接的ＥＬＩＳＡによって組換えヒトノギンに対する抗体活性についてアッセイした。ヒトノギン遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ−Ｍ５細胞由来の上清を、Ｐｒｏｂｉｎｄ９６ウェルアッセイプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３９１５）において一晩風乾した。非特異的結合を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて周囲温度で２時間インキュベートすることによって除去した。プレートをＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。次いで、培養上清を添加し、そして周囲温度で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡに１：２０００希釈した二次抗体、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ結合体（Ｃａｌｔａｇ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを周囲温度で１時間インキュベートした。再度、プレートをＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。抗体結合を、ジエタノールアミン緩衝液ｐＨ９．８中ｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート，Ｓｉｇｍａ）１ｍｇ／ｍｌと共に、暗所で周囲温度で１時間インキュベートすることによって、可視化した。反応を、等容量の１００ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって停止させた。吸光度を、Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４０５ｎｍで読み取った。反応を、その吸光度がネガティブコントロール（希釈物単独続いて二次抗体および基質）の２倍であったとき、ポジティブであるとみなした。ポジティブクローンを拡大させ、そしてモノクローナル抗体を含有する培養上清を、特異性分析のために採集した。
【０１５２】
ＲＰ５７−１６を、軟寒天においてクローン化した。クローン化されたハイブリッド細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（１０％ＦＢＳ（ストレプトマイシン、ペニシリン、ピルビン酸塩、およびグルタミンを添加した）を含む）において拡大した。抗体を含む上清をアリコートに分け、使用するまで−７０℃で保存した。
【０１５３】
特異性分析
ＥＬＩＳＡ
１００ｎｇの精製化組換えヒトノギン、Ｘｅｎｏｐｕｓノギン、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ４タンパク質を、個々に、ｐＨ９．６の５０ｍＭ重炭酸バッファ中で４℃で一晩インキュベーションすることによってＰｒｏｂｉｎｄの９６穴アッセイプレートに受動的に吸着させた。ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４を使用して、ラットのモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６の非特異的結合を評価した。ヒトノギン遺伝子を含むプラスミドまたはｆｌｇＣ末端タグ化Ｘｅｎｏｐｕｓノギン遺伝子を含むプラスミドのいずれかでトランスフェクトされたＣＯＳ−Ｍ５細胞からの上清を、Ｐｒｏｂｉｎｄの９６穴プレートに風乾させた。非特異的結合をＰＢＳ／１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて周囲温度で２時間インキュベーションすることによって除去した。ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてプレートを２度洗浄した。希釈していないＲＰ５７−１６を加え、周囲温度で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてプレートを４度洗浄した。ＰＢＳ／１％  ＢＳＡ中で１：２０００に希釈した２次抗体、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ結合体（Ｃａｌｔａｇ）を各穴に加え、そのプレートを周囲温度で１時間インキュベーションした。再度、ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてプレートを４度洗浄した。抗体結合を、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）中で１ｍｇ／ｍｌのｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸）とともに暗所において周囲温度で１時間インキュベーションすることによって、可視化した。反応を、等量の１００ｍＭ  ＥＤＴＡを加えることによって停止させた。Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で、４０５ｎｍの吸光度を読み取った。この吸光度がネガティブコントロール（希釈液のみに２次抗体および基質を加えたもの）の吸光度の２倍であった場合に、反応を陽性と考えた。
【０１５４】
電気泳動およびウエスタンブロッティング
ラットのモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６をまた、ウエスタンブロッティングによって分析した。５０ｎｇの非還元型および還元型の組換えヒトノギンを１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、そしてニトロセルロース膜上でエレクトロブロッティングした。膜をＰＢＳ／１％  カゼイン／０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いてブロックし、そして次に希釈していないＲＰ５７−１６培養上清とともに２時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０中で４回洗浄した後、 ＰＢＳ／１％  ＢＳＡ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０中の１：５０００希釈のヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ）とともに膜をインキュベーションした。膜をＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いて４回洗浄した。タンパク質をＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてその製造者の指示にしたがって可視化した。次に、膜をＸＡＲ  ５  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇフィルム（Ｋｏｄａｋ）に５秒間さらした。
【０１５５】
結果
ラットのモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６は、組換えヒトおよびＸｅｎｏｐｕｓノギンの両方のノギン、ならびにＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、およびＣＯＳ−Ｍ５細胞において生成された組換えヒトノギンと反応する。この抗体は、ニューロトロフィンであるＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４とは反応しない。ウエスタンブロッティングは、この抗体が還元されたタンパク質および還元されていないタンパク質の両方を検出することを示した。
【０１５６】
（実施例９）ノギン欠失ムテイン
本発明はさらに、ネイティブヒトノギンが非常に望ましい特性を有する新規の化合物を生成するように改変され得るという発見に関する。
【０１５７】
Ｘｅｎｏｐｕｓノギンの塩基性領域は、この分子のアミノ酸１２３−１３５（ＫＫＨＲＬＳＫＫＬＲＲＫＬ）に対応する。（配列については、Ｓｍｉｔｈ、Ｗ．Ｃ．およびＨａｒｌａｎｄ、Ｒ．Ｍ．  Ｃｅｌｌ  ７０：８２９−８４０（１９９２）を参照のこと）。ＴＧＦ−βファミリーの分子について公知であることに基づき、この塩基性領域は、プロセッシング部位であり得るように見える。この塩基性領域の機能をよりよく理解するために、非常によく保存された塩基性領域（Δ１２３−１３５）、または塩基性領域（Δ９１−１３５）を含むペプチドのより大きな部分を欠失したＸｅｎｏｐｕｓノギンの構築物を作成した。これらの欠失変異体の両方は、活性であり、ＲＮＡとして注入した場合に過剰に背方化された胚を生じた。さらに、予備的な実験は、ノギンがヘパリンに対して親和性を有する一方、塩基性領域を欠失する改変された形態がこの結合活性を有さないことを示した。
【０１５８】
ネイティブヒトノギン（ｈＮＧ）は、おそらく細胞外マトリクスへそれが結合するために、動物血清において低いバイオアベイラビリティを示す。Ｆｃタグ化ヒトノギン（ｈＮＧ−Ｆｃ）は、非常に高親和性でＢＭＰ４に結合することが示されてきた。（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ  ８６：５９９−６０６（１９９６））。ｈＮＧを改変した結果、骨誘導因子（ＢＭＰ）に結合および拮抗する能力を保持しつつ、改善されたバイオアベイラビリティを示す化合物が同定されてきた。変化した生物学的特質を生じる特異的改変は、ヘパリン結合活性をネイティブヒトノギン分子に与える原因として同定されるアミノ酸の欠失を含む。その結果得られる改変されたノギンは、ヘパリン結合活性を欠くが、予想外なことに、ＢＭＰ４に結合および拮抗する能力を保持する。
【０１５９】
具体的には、出願人は、ｈＮＧΔ１３８−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃとして公知の２つの分子を作成した。これらの分子は、ヒトノギンの、Ｆｃタグ化欠失ムテインであって、アミノ酸１３８〜１４４（ｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃについて）または１３３〜１４４（ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃについて）のいずれかを欠き、そしてそのＣ末端にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインをタグ化されたムテインである。Ｆｃタグ化ノギンを構築するために、ＢｓｐＥＩ−ＮｏｔＩヒトＩｇＧ１フラグメント（Ｄａｖｉｓ、Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：８１６−８１９（１９９４）；Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ、Ａ．Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１３５１−１３５３（１９９５））が、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ  ８６：５９９−６０６（１９９６）に記載されるようなぺプチド架橋配列をコードするオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトノギンに融合され得る。以下に説明されるように、欠失ムテインであるｈＮＧΔ１３８−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、ＢＭＰ４への結合についてｈＮＧ−Ｆｃと同一の活性を示し、さらにｈＮＧに比較して、ヘパリンに対する親和性が低減し、動物血清中の薬物動態がより優れることを示した。
【０１６０】
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの構築
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、アミノ酸１３３〜１４４（番号付けは、アミノ酸番号１である開始メチオニンから始まる）の欠失を有するヒトノギン（ｈＮＧ）の配列からなり、そのヒトノギンは、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ「架橋」（遺伝子工学により改変されたＢｓＰ  ＥＩ制限酵素部位によってコードされる）を介してヒト免疫グロブリンＧ１（Ｆｃ）の定常領域に融合されている（図１４）（配列番号２３）。ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃをＰＣＲによって構築し、そして標準の遺伝子工学技術を使用して哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２１中にクローン化した（ｐＭＴ２１．ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃ）。ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの配列が正確であることを、配列決定によって確認した。その後、この欠失ムテインはまた、発現ベクターｐＳＲａに移入され、そしてＦｃタグ化および非タグ化バージョンのこのｈＮＧムテインの両方を構築した（それぞれ、ｐＳＲａ．ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃ、およびｐＳＲａ．ｈＮＧΔ１３３−１４４）。
【０１６１】
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの発現
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、まずトランスフェクションプロトコルに基づいてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用してＣＯＳ７細胞中で発現させる。ｈＮＧと同様に分泌されるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させ、そして１００ｍＭの酢酸を用いて溶出し、その後トリスバッファを用いてｐＨ７に中和することによって馴化上清から精製した。この調製物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、蛍光色素のＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて染色することによって調べた。得られた調製物は、この判断基準によると９０％より大きい純度であり、主にジスルフィド架橋された二量体の形態であり、非タグ化ｈＮＧおよびｈＮＧ−Ｆｃ（どちらもまたジスルフィド架橋された二量体を形成する）の両方でなされた以前の観察と一致した。
【０１６２】
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの活性
ＢＭＰ４への結合：
このｈＮＧムテインが活性がどうかを決定するために、そのｈＢＭＰ４への結合能力をｈＮＧ−Ｆｃの能力と比較した。ｈＮＧ−Ｆｃは、非タグ化ｈＮＧの親和性と本質的に同じ親和性でヒト骨誘導因子４（ｈＢＭＰ４）に結合する。ｈＢＭＰ４がＥＬＩＳＡプレートの表面上に捕捉されるＥＬＩＳＡ式アッセイを使用して、上記２つのタンパク質を比較した。ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃムテインは、ｈＮＧ−Ｆｃと同じＢＭＰ４への結合性を示し（図１５）、この２つのタンパク質が同じ生物学的活性を有することを示す。
【０１６３】
ヘパリンへの結合
発明者らは、ｈＮＧ−Ｆｃのヘパリン結合プロフィールを調べ、そしてｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃ、および塩基性領域により短い欠失を有する別のｈＮＧ欠失ムテイン、すなわちｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃ（ｈＮＧΔＫＫＬＲＲＫ−Ｆｃとも称される）のヘパリン結合プロフィールと比較した。図１６上に示されるように、ｈＮＧ−Ｆｃは、約０．７５Ｍ  ＮａＣｌでヘパリンから溶出し始めるが、ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃは、０．２５Ｍ  ＮａＣｌで溶出を開始する。０．５Ｍより大きいＮａＣｌでのヘパリンへの結合は、ヘパリンとの親和性相互作用と考えられるが、０．５Ｍより小さいＮａＣｌでのヘパリンへの結合は、イオン性の相互作用によるものと考えられる（ヘパリンは、負に荷電した硫酸基を含み、そしてｈＮＧは、正に荷電した領域を有する）。したがって、２つのｈＮＧ欠失ムテインのｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃはイオン性の相互作用を介してヘパリンと相互作用するが、ｈＮＧ−Ｆｃは、ヘパリンに対する親和性を示す。ＫＫＬＲＲＫ欠失（すなわち、ｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃによって実施されるもの）は、ヘパリンとの相互作用を、イオン性の効果について予想にされる相互作用にまで低減するのに十分であるので、発明者らは、配列ＫＫＬＲＲＫ（すなわち、ｈＮＧにおけるアミノ酸１３８〜１４４）がｈＮＧのヘパリン結合領域であるか、またはそれを含むと結論づける。Ｆｃドメインは、ヘパリンに結合しなかった。
【０１６４】
発明者らはまた、上記方法によってｈＮＧおよびｈＮＧ−Ｆｃがヘパリンへの同一の結合性を示すことを見い出してきたが、化学的に改変された形態のｈＮＧ（シトラコニル−ｈＮＧ）は、ヘパリンに結合しない。発明者らはまた、上記塩基性領域を超えるより長い欠失を有する別のｈＮＧ欠失ムテイン、すなわちｈＮＧΔ１３３−１７９Ｆｃのヘパリン結合プロフィールを調べてきた。ｈＮＧΔ１３３−１７９Ｆｃは、ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃと同じヘパリン結合プロフィールを示し、上記塩基性領域の下流の配列をさらに欠失してもヘパリンへのｈＮＧ結合のイオン成分をさらに低減することはないことを示す。このことから、発明者らは、ヘパリンへのｈＮＧ結合のイオン成分は、ｈＮＧのクニッツ様ドメイン内に位置するに違いないと結論づける。さらに、化学的に改変されたシトラコニル−ｈＮＧならびに２つの欠失ムテインであるｈＮＧΔ１３８−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃはすべて、生物学的に活性（すなわち、これらはｈＮＧ−Ｆｃと見かけ上は同じ親和性でＢＭＰ４に結合する）が、欠失ムテインｈＮＧΔ１３３−１７９Ｆｃは、非活性である。まとめると、これらの結果は、ｈＮＧのヘパリンへの結合は、ＢＭＰ４への結合と区別され得ること、およびｈＮＧのヘパリン結合ドメインは、ｈＮＧのＢＭＰ４をブロックする活性には必要でないことを示す。
【０１６５】
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態プロフィール
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態的特性を、マウスおよびラットの両方において試験した。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そして再び折り畳まれた非改変ｈＮＧが、静脈投与後のラット血清において、見かけの半減期が６０分より小さいという非常に低いバイオアベイラビリティしか示さないことが以前に決定されてきた。ヘパリンに結合しないシトラコニル−ｈＮＧは、バイオアベイラビリティにおいて３０倍の改善を示すが、注射後約２時間で循環から消失もする。発明者らは、ヘパリンに結合しない、そしてまたＦｃタグ化ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃはインビボ中でより長い半減期を有し得ると考えた。この可能性を調べるために、発明者らは、マウスおよびラットにｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを注射し、そして血清におけるバイオアベイラビリティを測定した。
【０１６６】
ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃをマウスに腹腔内（ｉｐ）注射した場合、２４時間という最も遅いサンプルされた時点においても、２μｇ／ｍｌのレベルを達成し、ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃが検出可能であった（図１７Ａ）。ラットにおける静脈注射はまた、好ましい薬物動態を示したが、最も遅い血清サンプルは、６時間で採取した。この実験において、約１８μｇ／ｍｌのｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを検出した（図１７Ｂ）。同様の結果が、ｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃを用いて得られ、ｈＮＧのヘパリン結合ドメインの欠失が、これらの分子の、ｈＮＧより改善された薬物動態プロフィールの原因であることを示した。腹腔内または静脈内注射後に動物血清においてｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを検出するために使用したアッセイは、ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃのＢＭＰ４に結合する能力に依存するので、発明者らはまた、検出されるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃが機能的であり、そしてＢＭＰ４と相互作用し得ることが分かった。さらに、ｈＮＧはＢＭＰ４に対して非常に高い親和性を示すので、発明者らは、これらの実験において達成されたｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベルが、動物モデルおよび臨床状況においてＢＭＰ４活性をブロックし得ると予想する。
【０１６７】
（実施例１０）ｈＮＧΔＢ２哺乳動物発現プラスミドであるｐＳＲα．ｈＮＧΔＢ２の構築
ヒトノギンムテインであるｈＮＧΔ１３３−１４４（Ｆｃタグなし）に対するｃＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクターを以下のように構築した。以下、ｈＮＧΔ１３３−１４４はまた、ｈＮＧΔＢ２と称されることがある。同様に、ｈＮＧΔ１３８−１４４は、ｈＮＧΔＢ１と称されることがある。
【０１６８】
哺乳動物発現ベクターｐＳＲα中にサブクローン化された野生型ヒトノギンのｃＤＮＡ（ｈＮＧ）を含む、ｐＣＡＥ２９４と名付けられたプラスミドを、制限酵素であるＥｃｏＲ  ＩおよびＭｌｕ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて消化した。この制限消化によって、全ｐＳＲαベクター配列および野生型ヒトノギン（ｈＮＧ）のＣ末端側の３分の１（２２３ヌクレオチド）を含む４ｋｂのＤＮＡフラグメントが放出された。このフラグメントを、標準的な分子生物技術によってゲル精製した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照のこと）。
【０１６９】
発現ベクターｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）中にサブクローン化されたｈＮＧΔ１３３−１４４−ＦＣ（実施例９を参照のこと）のｃＤＮＡを含む、ｐＣＡＥ３０２と名付けられたプラスミドを、制限酵素であるＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩを用いて消化した。この制限消化によって、アミノ酸１３３〜１４４をコードする配列の欠失を有するヒトノギンムテインのＮ末端側の３分の２（４３９ヌクレオチド）をコードする５００ｂｐのＤＮＡフラグメントが放出された。このＤＮＡフラグメントをまたゲル精製した。上記５００ｂｐのＤＮＡフラグメントおよび上記４ｋｂのＤＮＡフラグメントを標準的な技術に従って連結し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照のこと）、新しい哺乳動物発現ベクターｐＳＲα．ｈＮＧΔＢ２を作成した。
【０１７０】
（実施例１１）ｈＮＧΔＢ２原核生物発現プラスミドｐＲＧ６２５の構築
ヒトノギンムテインｈＮＧΔ１３３−１４４（ｈＮＧΔＢ２）に対するｃＤＮＡを含む原核生物発現ベクターを以下のように構築した。
【０１７１】
ヒトノギン（ｈＮＧ）に対するｃＤＮＡをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＵＣにサブクローン化されたヒトノギンに対するｃＤＮＡを含む、ｐＵＣ−ｈＮｏｇ＃７と名付けられたプラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ反応は、標準的な技術を使用し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照のこと）、以下の増幅プライマー：
ＥＶＤ−８４（５’−ＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＧＴＣＣＧＧＣＡ−３’）（配列番号２４）
ＥＤＶ８５（５’−ＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＧＴＡＣＴＧＧ−３’）（配列番号２５）
を使用して行われた。
【０１７２】
得られたＰＣＲ増幅化１００５ｂｐＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｓｐｈ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて消化し、そしてｐＲＧ０９に連結した。ｐＲＧ０９は、βラクタマーゼ遺伝子およびｌａｃＵＶ５プロモーターを含む低コピー数プラスミドであり、そして制限酵素Ｓｐｈ  ＩおよびＮｒｕ  Ｉを用いた消化による連結のために調製しておいた。連結および細菌形質転換につづいて、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にヒトノギン遺伝子を含むクローンを同定し、そしてｐＲＧ２９２と名付けた。ｐＲＧ２９２プラスミドを制限酵素Ｓｗａ  ＩおよびＢｓｍ  Ｉを用いて消化し、１０５４ｂｐのＤＮＡフラグメントを放出させた。このＤＮＡフラグメントを標準的な技術によってゲル精製し、そしてｐＣＰ１４６中に連結した。ｐＣＰ１４６は、ｋａｎ１遺伝子をコードする高コピー数プラスミドであり、制限酵素であるＳｗａ  １およびＢｓｍ  １を用いた消化による連結のために調製しておいた。得られたプラスミドをｐＲＧ３０１と名付けた。ΔＢ２欠失（アミノ酸１３３−１４４をコードする配列の欠失）を構築するために、ｐＲＧ３０１を制限酵素Ｍｌｕ  ＩおよびＭｓｃ  Ｉを用いて消化し、ヒトノギン遺伝子内部の２３８ｂｐフラグメント（配列番号１のＮＴ３７８−６１５）を放出させた。次に、このフラグメントをｐＣＡＥ３０２（実施例９−ｐＭＴ２１．ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを参照のこと）中で、ｈＮＧΔＢ２内部の２０２ｂｐフラグメント（ＭｌｕＩおよびＭｓｃＩを用いた消化によって放出させた）と置き換えた。得られた原核生物発現プラスミドをｐＲＧ６２５と名付けた。
【０１７３】
（実施例１２）Ｅ．ｃｏｌｉ中のｈＮＧΔＢ２の発現
ｈＮＧΔＢ２発現プラスミドｐＲＧ６２５を含むＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＲＦＪ１４１を、６０Ｌのバイオリアクター（ＡＢＥＣ、Ｉｎｃ．、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）中の４０Ｌの培地中で増殖させた。最小グルコース培地は、二塩基リン酸カリウム（５ｇ／Ｌ）、一塩基リン酸カリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（０．３５ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸ナトリウム（１．３ｇ／Ｌ）、Ｄｏｗ  Ｐ２０００消泡剤（１ｍＬ／Ｌ）、塩化カルシウム（０．０７５ｇ／Ｌ）、３０ｇ／Ｌのグルコース、および適切な痕跡レベルの硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、塩化コバルト、およびモリブデン酸ナトリウムを含む３ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（３ｍＬ／Ｌ）を含んだ。
【０１７４】
３７℃の温度で発酵を行った。この発酵のｐＨは、アンモニアガス、および２０％の溶解した酸素を使用して、設定点を維持するための漸増する圧力、撹拌、酸素フローにより７．０に制御した。光学密度が５０に達したとき、タンパク質合成の誘導が、化学的誘導物質イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって開始された。十分な量のｈＮＧΔＢ２タンパク質が細胞内に蓄積するように、発酵をさらに３時間つづけた。この細胞をＫｏｃｈ  ５００  ＮＭＷＣＯ中空ファイバーフィルタを使用する接線フローろ過によって収穫し、そして２０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶解バッファ中へダイアフィルトレーションし、そして−２０℃に冷凍された。
【０１７５】
（実施例１３）ｈＮＧΔＢ２の再折り畳みおよび精製
上記発酵からの細胞を解凍し、２０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｗｅｅｎ８０バッファ中に再懸濁し、そしてＭａｎｔｏｎ  Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーを用いて８０００ｐｓｉｇで破壊した。０．２ミクロンの公称孔サイズを有するＭｉｃｒｏｇｏｎ中空ファイバー膜（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ、ＣＡ）を用いる接線フローろ過システムを使用して、封入体を洗浄し、混入するＥ．ｃｏｌｉタンパク質を除去した。この封入体を洗浄するために使用されたバッファは、２０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％Ｔｗｅｅｎ８０を含んだ。洗浄された封入体を６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ中に可溶化した。そのタンパク質を１００Ｋ限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）に通過させることによって部分的に精製し、高分子量混入物および脂質を除去した。このタンパク質を１０Ｋフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）を用いて濃縮し、次に再折り畳みのために、１．５Ｍ塩酸グアニジン、２０％グリセロール、２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、５ｍＭ還元化グルタチオンを含むバッファ中で最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。このタンパク質を、８日間４℃で再折り畳みさせた。再び折り畳まれたタンパク質を、４Ｍ尿素、２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含み、ｐＨ４．０のバッファ中に濃縮およびダイアフィルトレーションし、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０％グリセロール、４Ｍ尿素、０．０２％ＣＨＡＰＳを用いて平衡化した２．８Ｌ  ＳＰ  セファロースＦＦ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む直径１０ｃｍのカラムにロードした。このカラムを、３カラム体積の３５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む同じバッファを用いて洗浄した。このタンパク質を漸増する塩勾配（４００−７５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて１０カラム体積にわたり同じバッファを使用して溶出した。さらなる量のタンパク質を、２０ｍＭビシン、２０ｍＭアセテート、２０％グリセロール、４Ｍ尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌを使用して、ｐＨ８．５で溶出した。溶出したタンパク質を、可溶性を維持するために４倍に希釈した。このタンパク質を、４Ｍ尿素、２０ｍＭビシンを含むｐＨ８．５のバッファ中に濃縮およびダイアフィルトレーションし、そしてバッファＡ（４Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭビシン、０．０２％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５）を用いて平衡化した２．８Ｌ  Ｑ  セファロースＦＦ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む直径１０ｃｍのカラムにロードした。このカラムをバッファＡを用いて洗浄し、そして１００ｍＭから３００ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配を用いて７カラム体積にわたり１００ｍＬ／分で溶出した。その画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析し、そしてプールされ、１．８グラムの精製ｈＮＧΔＢ２タンパク質を提供した。
【０１７６】
（実施例１４）ｈＮＧΔＢ２のＰＥＧ化
上記欠失変異体ｈＮＧΔＢ２を、以下の手順を使用してポリエチレングリコールの共有結合によって改変した。Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−ＡＬＤ−２００００）からのメトキシ−ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド（ＭＷ＝２０，０００）を、ＰＥＧ試薬対タンパク質が２０：１の化学量論的比で３００ｍｇのｈＮＧΔＢ２（ＭＷ＝２１，４９５）と反応させた。この反応混合物を、フィルタ滅菌し、そしてその反応を、１００ｍＭビシン、５ｍＭシアノホウ化水素ナトリウム、２０％グリセロール、４Ｍ精製尿素を含むｐＨ８．１のバッファ中でアルゴン雰囲気下に１２日間室温で進行させた。この反応混合物中のｈＮＧΔＢ２の濃度は、０．７５ｍｇ／ｍＬであった。尿素を使用の前に、陽イオン交換カラムに通して混入アミンを除去することによって予め精製した。シアノホウ化水素の使用は、シッフ塩基中間体をメトキシキャップ化ＰＥＧと上記タンパク質の反応したアミノ基との間の２次アミン架橋に還元するために必要である。反応生成物は、ＰＥＧ化されていない形態、モノＰＥＧ化された形態、およびポリＰＥＧ化された形態の混合物を含む。
【０１７７】
（実施例１５）ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２の精製）
モノＰＥＧ化ｈＮＧΔＢ２の精製を、陽イオン交換とそれにつづくサイズ排除を含む２工程クロマトグラフィー手順を使用して行った。第１工程において、反応混合物を、４Ｍ尿素、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、２０％グリセロール、ｐＨ５．５を含むバッファＡを用いて５倍に希釈し、そしてＳＰセファロースＨＰ陽イオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を詰め込んだ直径５ｃｍ長さ１３ｃｍのクロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ５０）上に４５ｃｍ／時の直線速度でロードした。ロード後に、このカラムをバッファＡを用いて洗浄し、そしてＰＥＧ化ｈＮＧΔＢ２を、バッファＡ中の０から５００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配を使用して、６カラム体積にわたって４５ｃｍ／時の直線速度で溶出した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル分析を、カラム画分について行い、モノＰＥＧ化されたｈＮＧΔＢ２を含む画分をプールした。このモノＰＥＧ化タンパク質（ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２）を、直径７ｃｍのＡｍｉｃｏｎ撹拌セル濃縮器を使用して０．７６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。このタンパク質を、２Ｍ尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて平衡化した９５ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む１００ｃｍＸＫ２６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にロードした。このタンパク質を３ｍＬ／分のフロー速度で溶出した。その画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析し、そして適切な画分をプールした。プールされたモノＰＥＧ化ｈＮＧΔＢ２を、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．５中に透析した。このタンパク質をアリコートし、そして−４０℃で凍結保存した。
【０１７８】
（実施例１６）ｈＮＧ、ＰＥＧ−ｈＮＧ、シトラコニル−ｈＮＧ、ｈＮＧΔＢ１、ｈＮＧΔＢ２、ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２、およびｈＮＧΔＢ２−Ｆｃのヘパリン結合プロフィールの比較
ヘパリンへの低い親和性を示すタンパク質は、ヘパリンへの高い親和性を示すタンパク質よりも、早くに−すなわち、より低いＮａＣｌ濃度で、親和性カラムから溶出され得る（Ｌｏｂｂ，ＲＲら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４月  １５４：１−１４（１９９６））。０．１および０．５Ｍ  ＮａＣｌの間の塩濃度でヘパリンに結合するのは、ヘパリン上に存在する硫酸基とのイオン性の相互作用によるものであるが、０．５Ｍ  ＮａＣｌより高くでの結合は、本物のヘパリン結合部位によるものである。発明者らは、ヘパリンへの低い結合性は、全身的な送達用のタンパク質ベースの薬物にとって望ましい性質であるという考えのもとに、ｈＮＧおよびｈＮＧムテイン、ならびにタグ化されたかまたは化学的に改変されたｈＮＧおよびｈＮＧムテインの、ヘパリンに結合する能力を、高解像度ヘパリン親和性カラムを使用して比較した。高解像度親和性クロマトグラフィーが選択の方法であった。なぜなら、それが正確かつ非常に再現性のある結果を提供し、ヘパリン結合性における小さな差違さえも明らかにし得るからである。
【０１７９】
ｈＮＧ、ＰＥＧ−ｈＮＧ、シトラコニル−ｈＮＧ、ｈＮＧΔＢ１、ｈＮＧΔＢ２、ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２、およびｈＮＧΔＢ２−Ｆｃのヘパリン結合プロフィールを、以下のようにＴＳＫ−５Ｗヘパリンカラム（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）上に順次注入することによって比較した：それぞれ４０μｇのｈＮＧ、ＰＥＧ−ｈＮＧ、 ｈＮＧΔＢ２−Ｆｃ、およびｈＮＧΔＢ２；９μｇのシトラコニル−ｈＮＧ；および１５μｇのＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２、それぞれの体積は５０μｌ。各サンプルを注入した後に、そのサンプルを、１００ｍＭトリスｐＨ７．６中で１５０ｍＭから２Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配にかけ、そして上記タンパク質の溶出プロフィールをＡ280によってモニターした。
【０１８０】
ｈＮＧは、１．２Ｍ  ＮａＣｌで溶出することが分かったが（図１８Ａ〜１８Ｃ）、これはバッチ溶出方法を使用した以前の実験と一致する。２０，０００ＭＷのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＰＥＧ−ｈＮＧを形成するようにｈＮＧを化学的に改変することは、ヘパリンに対するほんのわずかにより低い親和性を示す分子（約１Ｍ  ＮａＣｌ（図１８Ａ）で溶出する）を生じた。対照的に、接近可能なリジン（ＬＹＳ）の位置でシトラコニル基で化学的に改変し、これらの（生理学的条件で）正に荷電した残基を負に荷電した残基に効果的に変化させたｈＮＧであるシトラコニル−ｈＮＧは、ヘパリンに対して極度に低い親和性を示した（０．１５Ｍ  ＮａＣｌで溶出する（図１８Ａ））。このことは、５つのＬＹＳを含むｈＮＧの塩基性領域（アミノ酸１３３〜１４４；番号１としての開始メチオニンからの番号付け）がヘパリンに対するｈＮＧのヘパリン結合部位である。
【０１８１】
欠失ムテインｈＮＧΔＢ１（上記ｈＮＧΔＫＫＬＲＲＫまたはｈＮＧΔ１３９−１４４として公知）は、約０．７５Ｍ  ＮａＣｌで溶出し（図１８Ｂ）、ヘパリンに対する低減された結合性を示す。さらに２つのＬＹＳ残基を欠く欠失ムテインｈＮＧΔＢ２は、上記勾配においてさらに早くに、約０．６Ｍ  ＮａＣｌ（図１８Ｂ）で溶出する。さらに、このムテインをｈＮＧΔＢ２二量体あたりＰＥＧ１分子の化学量論比で１分子のＰＥＧ２０，０００によって化学的に改変すること（ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２）は、ヘパリンへの結合性のさらなる低減を生じる（０．４５Ｍ  ＮａＣｌでの溶出（図１８Ｂ））。このことは、ＰＥＧが、ＰＥＧが共有結合するタンパク質に増加した可溶性を与えるという考えと合致し、そしてまたｈＮＧΔＢ２とヘパリンとの間に存在するイオン性相互作用のいくらかをマスクすることによるとされ得る。興味深いことに、結合における同じタイプの低減が、ｈＮＧΔＢ２にヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）をタグ化してキメラタンパク質ｈＮＧΔＢ２−Ｆｃを作成することによって達成される（図１８Ｃ）。
【０１８２】
微生物の寄託
以下を、ブダペスト条約の条項の下に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に寄託した。
【０１８３】
【表３】
0004181300.tif 000004
【０１８４】
本発明は、好ましい特定の実施態様とともに上記されたが、記載および実施例は、本発明の範囲を例示することを意図されるものであって、それを限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  ヒトノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、および推定アミノ酸配列（配列番号２）。ヘパリンとの相互作用を、イオン効果について予測される相互作用まで減少させるに適切なように、実施例９に記載されるＫＫＬＲＲＫ欠失体（ｈＮＧΔ１３８−１４４）は、ヌクレオチド４１５からコードされる（ＡＡＧ．．．）。
【図１Ｂ】  ヒトノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、および推定アミノ酸配列（配列番号２）。ヘパリンとの相互作用を、イオン効果について予測される相互作用まで減少させるに適切なように、実施例９に記載されるＫＫＬＲＲＫ欠失体（ｈＮＧΔ１３８−１４４）は、ヌクレオチド４１５からコードされる（ＡＡＧ．．．）。
【図２Ａ】  実験計画デザイン：コンピテントな動物極キャップ（ＡＣ）外胚葉を、示されるようにステージ付けられた胚（ｓｔａｇｅｄ  ｅｍｂｒｙｏ）から摘出した。Ｓｔ１０.５背側および腹側ＡＣならびに腹側辺縁層（ＶＭＺ）もまた示されるように摘出した。外植片を、低Ｃａ/Ｍｇリンゲル（ＬＣＭＲ）溶液中で１回洗浄し、次いでＬＣＭＲ＋０.５％ＢＳＡ中に希釈した因子を含む処理培地中に置いた。後期（Ｓｔ２０＋）まで培養した外植片を、処理開始６〜１６時間後に処理培地から取り出し、ＬＣＭＲ中に置いた。外植片が所望のステージに到達した時点で、それらを、ＲＮＡのために回収するか、またはホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションもしくは抗体染色のために固定した。
【図２Ｂ】  筋肉の非存在下でのノギンによる神経誘導。レーン１〜３はそれぞれ、全Ｓｔ２４胚ＲＮＡにおいて、Ｎ−ＣＡＭ、β−チューブリン、およびＸＩＦ−３プローブにより保護された特定のフラグメントを示す。レーン４〜８は、これら３つのプローブの混合物による保護を示す。他方、レーン９〜１３は、５０ｐＭアクチビン（Ａ）、２５％の２０倍濃縮コントロールＣＨＯ細胞培地（Ｃ）もしくは２５％の２０倍濃縮ノギン馴化ＣＨＯ細胞培地（Ｎ）で処置したＳｔ９  ＡＣから回収したｔＲＮＡ（ｔ）、Ｓｔ２４胚ＲＮＡ（Ｅ）、およびＲＮＡに対するアクチンプローブによる保護を示す。ローディングコントロールとして使用した、偏在して発現した細胞骨格アクチンは、ＲＮＡレベルが、すべての処置において匹敵していることを示す（レーン１１〜１３）。
【図３】  還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）ラン。銀染色によりタンパク質を可視化した。レーン１は分子サイズ標準を示す。レーン２〜７は、０.０、０.１、０.２、０.５、１.０、および２.０μｇの精製ヒトノギンを示す。
【図４Ａ】  精製ノギンで処理した動物極キャップ対アクチビンで処理した動物極キャップの時間経過；直接神経誘導対間接神経誘導。動物極キャップを、図２Ａに示されるように摘出し、そしてＬＣＭＲ＋０.５％ＢＳＡ（Ｕ）、アクチビン馴化ＣＯＳ細胞培地の２０％希釈物（Ａ）、または１μｇ/ｍｌ精製ヒトノギン（Ｎ）で処理した。処理した動物極キャップから単離したＲＮＡ（レーン２〜１３）ならびにＳｔ２２全胚ＲＮＡ（レーン１）およびｔＲＮＡ（レーン１４）を、Ｎ−ＣＡＭ、β−チューブリン、筋肉および細胞骨格アクチン、II型コラーゲン、およびＥＦ−１ａについてプローブした。
【図４Ｂ】  ノギン誘導性ではなくアクチビン誘導性の動物極キャップにおける初期中胚葉マーカーの発現。動物極キャップをＳｔ８胚から摘出し、図４Ａに記載のように処理し、そしてＳｔ１１で採集した。レーン１および２はそれぞれ、Ｓｔ１０.５全胚ＲＮＡによるｇｏｏｓｅｃｏｉｄおよびＸｂｒａプローブ保護を示す。レーン３〜６は、これら２つのプローブの混合物による保護を示す。相対的ＲＮＡレベルを、別個のＥＦ−１αプローブ保護により示す。
【図４Ｃ】  プラスミド特異的原腸胚期ノギン発現は、神経組織を直接誘導する。１細胞ステージの胚に、２０ｐｇのｐＣＳＫＡｌａｃＺまたはｐＣＳＫＡｎｏｇｇｉｎを動物極に注入した。注入した胚からの動物極キャップを、Ｓｔ８〜９に摘出し、Ｓｔ２０まで培養した。これらを、Ｓｔ２０で、ＲＮアーゼ保護により、分析のために採集した。
【図５】  ノギンによる神経誘に対する導背側および腹側の動物極キャップの反応性。Ｓｔ１０.５腹側および背側の動物極キャップを、図２Ａ〜２Ｂに示されるように摘出した。背側および腹側の動物極キャップを、アクチビン培地（ＤＡ、ＶＡ）または１μｇ/ｍｌヒトノギン（ＤＮ、ＶＮ）で処理し、そしてＳｔ２６に、プローブとしてＮ−ＣＡＭ、β−チューブリン、およびアクチンを使用するＲＮアーゼ保護分析のために採集した。
【図６】  ヒトノギンタンパク質に対する腹側辺縁層および動物極キャップの用量応答。Ｓｔ１０.５ＶＭＺおよびＳｔ９動物極キャップを、図２Ａに示されるように摘出し、０、１、１０、５０、２００、および１０００μｇ/ｍｌのヒトノギンで処理した（それぞれ、レーン３〜８および１０〜１５）。次いで、処理した外植片およびＳｔ２６期のコントロール全胚からのＲＮＡを、プローブとしてＮ−ＣＡＭ、β−チューブリン、アクチン、およびII型コラーゲンを使用するＲＮアーゼ保護により分析した。この実験において、１ｎｇ/ｍｌの用量での筋肉誘導は、１０ｎｇ/ｍｌより強く、そして非誘導ＶＭＺでは筋肉アクチン発現は低レベルである。これは実験的変動に起因し得る。なぜなら、反復実験において、本発明者らは、５０ｎｇ/ｍｌ以上の用量でのみ筋肉誘導を観察したからである。
【図７Ａ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｂ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｃ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｄ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｅ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｆ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｇ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｈ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｉ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｊ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｋ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図７Ｌ】  インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭ  ＲＮＡは、神経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンについて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるように、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。
【図８】  ノギンの２つの再折り畳みイソフォームの逆相ＨＰＬＣプロフィール。再折り畳みノギン溶液を、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＡＸ−３００  ０.４６×２２ｃｍ  ＨＰＬＣカラムに、１ｍｌ/分の流速で適用した。カラムを、水中０.１％のＴＦＡを含む溶媒Ａで平衡化した。溶媒Ｂは、アセトニトリル中０.１％のＴＲＡであった。カラムを以下のプロトコルに従って展開した：ａ）９５％の溶媒Ａ−５％の溶媒Ｂに平等に２分；６５％の溶媒Ｂおよび３５％の溶媒Ａまでの線形グラジエント６０分。正確に再折り畳みされたノギンは、４４％〜４６％の溶媒Ｂに早期に溶出する。
【図９】  Ｅ．ｃｏｌｉから再折り畳みされ、そして精製された組換えノギンの逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー特徴付け。図８の説明文と同様な条件。
【図１０】  １２.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された、Ｅ．ｃｏｌｉおよび昆虫細胞において産生された組換えノギン。レーンＨ、Ｌ：それぞれ示されたサイズの高分子量および低分子量マーカー。レーン１、２：電気泳動の前に２−メルカプトエタノールで処理された、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉおよび昆虫細胞において産生された組換えノギン。昆虫細胞由来のノギンのより遅い移動度は、単一コンセンサス部位でのＮ結合グリコシル化に起因して生じるサイズ増加に対応する。レーン３、４：電気泳動の前に２−メルカプトエタノールで処理されなかった、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉおよび昆虫細胞において産生された組換えノギン。
【図１１】  Ｅ．ｃｏｌｉ（−−）および昆虫細胞（−）において産生された組換えノギンの円偏光二色性スペクトル。
【図１２】  バキュロウイルスにおいて産生されたヒトノギン（０.０１、０.０５、０.２μｇ/ｍｌ）、バキュロウイルスの偽トランスフェクトした培養物（０.０２、１μｇ/ｍｌ）、またはＥ．ｃｏｌｉにおいて産生されたヒトノギン（０.１、０.５、２、もしくは１０μｇ/ｍｌ）への暴露後の筋肉アクチンｍＲＮＡの誘導を示す、腹側辺縁層アッセイ。
【図１３Ａ】  マウスノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）および推定アミノ酸配列（配列番号１１）。
【図１３Ｂ】  マウスノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）および推定アミノ酸配列（配列番号１１）。
【図１４】  ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのアミノ酸配列。ヒトノギン（ｈＮＧ）の推定シグナルペプチド配列をイタリック体で示す。
（†）は下記を除いてシステインの位置を示す。
（￥）はＮ結合グリコシル化部位の位置を示す。
（Δ）はΔ１３３−１４４欠失が作成された位置を示す。野生型ｈＮＧにおけるアミノ酸１３３〜１４４の配列は、ＫＫＱＲＬＳＫＫＬＲＲＫであり、ｈＮＧの「塩基領域」と呼ばれ得る。
ｈＮＧにおいて鎖間ジスルフィド架橋に関与するＣＹＣは、太字で示される（．．．ＳＥＫＣＳＣ．．．）。
ｈＮＧΔ１３３−１４４配列をヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）の定常領域と接続するＳｅｒ−Ｇｌｙ架橋の位置を、太字で示す（ＳＧ）。Ｆｃドメインの配列を下線を付して示す。
（◇）は、ヒトＩｇＧ１の２つのＦｃドメインを連結する鎖間ジスルフィド架橋を形成する、Ｆｃに先行するＩｇＧヒンジの２つのシステイン（アミノ酸番号３７１および３７４）を示す。
（●）は停止コドンの位置を示す。
【図１５】  ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃはヒトＢＭＰ４に結合する。ｈＮＧまたはｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのいずれかの活性を、ヒト骨誘導因子４（ｈＢＭＰ４）へ結合する能力を比較することによって試験した。ｈＢＭＰ４（２μｇ/ｍｌ）を、受動結合によりＥＬＩＳＡプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）上にコートした。ＰＢＳで４回洗浄することによって、非結合ｈＢＭＰ４を取り除き、そしてプレートを、ＰＢＳ中１％のＢＳＡでブロックした。 ｈＢＭＰ４へのｈＮＧ−Ｆｃの用量依存的結合を示すために、ｈＮＧ−Ｆｃの標準曲線を行い、そして同量のｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃと比較した。１時間のインキュベーション後、ＰＢＳで４回洗浄することによって、非結合ｈＮＧ−ＦｃまたはｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを取り出し、そして０.５μｇ/ｍｌ抗ヒトＩｇＧ・アルカリホスファターゼ結合体（抗Ｆｃ・ＡＰ）を各ウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、ＴＢＳ＋０.１％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄することによって、非結合抗Ｆｃ・ＡＰを取り除き、、次いでアルカリホスファターゼ基質（パラニトロフェニルホスファターゼ；Ｓｉｇｍａ）を加えた。アルカリホスファターゼは、この基質を、その産生が４０５ｎｍの吸光度を測定することによりモニターされ得る産物に変換する。ｈＮＧまたはｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃがＢＭＰ４に結合する能力を、Ａ４０５単位を比較することによって視覚化した。
注記：ｈＢＭＰ４を省略した場合、プレートへのｈＮＧ−ＦｃもしくはｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの結合は存在しない。
【図１６】  ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、ヘパリンに、減少した親和性で結合する。
それぞれ約１μｇのｈＮＧ−Ｆｃ、ｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃ、またはｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを、１ｍｌのＰＢＳ中１％ＢＳＡにおいて、５０μｌヘパリン・アガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートした。室温での１時間のインキュベーション後、ヘパリン・アガロースビーズを、遠心分離により沈澱させ、ＰＢＳ中に懸濁し、そして新しいチューブに移した。その後、各ペレットを、１００μｌの０.１、０.２５、０.５、０.７５、および１.０Ｍ  ＮａＣｌで続けて洗浄し、そしてこれらの工程のそれぞれからの上清を、還元条件下での４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ/ＭＥＳゲル（Ｎｏｖｅｘ）にロードするために維持した。各上清の１/５および再懸濁したヘパリン・アガロースペレットを、ゲルにロードした。Ｆｃタグ化ｈＮＧを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．）を用いるウェスタンブロッティング、続いて化学発光検出（Ｐｉｅｒｃｅ）により視覚化した。
【図１７Ａ】  マウスにおけるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態。
０.１ｍｇのｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを、６週齢のＢａｌｂ/ｃ雄性マウス（２匹のマウス、０.１ｍｇ/マウス）に、腹腔内（ｉｐ）注射した。注射の前に、各マウスから血液サンプルを採取した（「ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ」）。その後、注射後１、３、６、および２４時間で、マウスから血液を取り出した。標準的な血清学的手順に従うことにより、これらのサンプルから血清を調製し、そしてｉｐ注射後のＢａｌｂ/ｃマウスの血清において利用可能な、生物学的に活性なｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベルを、機能的ＥＬＩＳＡを使用することによって決定した。
ｈＢＭＰ４（２μｇ/ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡプレート（ＤｙｎａｔｅｃｈのＩｍｍｕｌｏｎ４）に受動結合によりコートした。ＰＢＳでの４回の洗浄により非結合ｈＢＭＰ４を取り除き、そしてプレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックした。ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの標準曲線を行った。１時間のインキュベーション後、 ＰＢＳでの４回の洗浄により、非結合ｈＮＧ−ＦｃまたはｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを取り除き、そして０.５μｇ/ｍｌの抗ヒトＩｇＧ・アルカリホスファターゼ結合体（抗Ｆｃ・ＡＰ）をプレートに加え、上記（図１６）のようにプロセスした。各時点で採取した血清中のｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベルを、ｈＢＭＰ４コードＥＬＩＳＡプレート上で各血清サンプルの系列希釈を実行し、そして上記のアッセイを使用してＦｃ免疫反応性を検出することによって決定した。次いで、Ａ４０５単位をｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの濃度に変換し、そして時間の関数としてプロットした。
注記：これらのアッセイ中に存在する血清タンパク質の量は、ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの結合および検出を妨げなかった。
【図１７Ｂ】  ラットにおけるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態。
１.０ｍｇのｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを、２５０グラムの生体雄性ラットに、静脈内（ｉｖ）注射した。注射の前に血液サンプルを採取した（「ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ」）。その後、注射後１０、３０、６０、１２０、および２４０分で、ラットから血液を取り出した。標準的な血清学的手順に従うことにより、これらのサンプルから血清を調製し、そして血清サンプルにおいて利用可能な、生物学的に活性なｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベルを、図１７Ａに記載の機能的ＥＬＩＳＡを使用することによって決定した。
【図１８】ヒトノギン（ｈＮＧ）および改変されたヒトノギン分子の薬物動態プロフィール。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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