(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体血液中のＭＣＰの量を測定し、正常血液中のＭＣＰ量の測定値と比較することからなる、腎機能評価方法。
【請求項２】
検体尿中のＭＣＰの量を測定し、正常尿中のＭＣＰ量の測定値と比較することからなる、腎機能評価方法。
【請求項３】
抗ＭＣＰモノクローナル抗体を含む腎機能診断用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は尿、血液などの生物学的試料中に含まれるメンブレン・コファクター・プロテイン（Ｍembrane  Ｃofactor  Ｐrotein、以下ＭＣＰと称する）などの補体制御因子の検出方法を提供する。また、本発明は、尿中に排出された補体制御因子量を測定することからなる腎機能評価方法に関する。さらに本発明は、抗補体制御因子モノクローナル抗体を含む腎機能診断用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎臓の血液濾過作用や解毒作用が全く機能しない末期腎不全においては、腎移植が唯一の治療手段であるが、我が国においては、移植腎の供給体制が十分に整備されているとは言い難く、また、移植療法自体に対する社会的認知も進んでいないことなどから、腎代用療法としては透析療法に頼らざるを得ないのが現状である。
【０００３】
現在我が国の透析患者は推定約１７万人を数えるが、一人当たりの治療費は年間約６００万円を必要とし、医療保険制度を圧迫する大きな原因の一つとされている。また、毎週２〜３日、１日４〜６時間を透析治療のために拘束されることから、患者本人の社会活動も大きく妨げられることになる。
【０００４】
腎不全は、腎疾患患者が最終的に至る病態であるが、その原因、経歴は一様ではなく、薬物中毒、感染症、悪性腫瘍、糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの本来腎臓以外の病変により、腎障害が発症し、腎不全に至る場合も数多くみられる。
【０００５】
かかる腎障害においては、末期即ち腎不全近くになるまで顕著な自覚症状が現れないことから、その発生が見過ごされ易く、発症した時点では既に腎臓は回復不可能なダメージを受けている場合が多い。従って、自覚症状の発現をみる前に、できる限り初期の段階で腎障害を発見することが、腎不全への移行を防ぐために、また、透析治療による保険財政圧迫を避けるためにも大切である。
【０００６】
従来、腎障害を診断する手がかりとして、いわゆる検尿による尿蛋白や尿沈渣の検査が広く行われている。しかし、尿蛋白は健常人でも過激な運動、精神的ストレス、多量の肉食、月経前などで一過性に増加する。また、若年者に多くみられる（健常人の０.５％程度）起立性蛋白尿など、腎疾患に由来しない尿蛋白もある。さらに尿路疾患、膀胱疾患、女性性器疾患などでも尿蛋白が認められる。従って、尿蛋白の検査で腎障害を確定診断することは不可能である。
【０００７】
尿沈渣は、尿を遠心分離し、その沈渣を顕微鏡で観察するものであるが、赤血球沈渣は健常人でもみられ、腎障害以外の尿路系関連臓器に由来する場合もあるので、これもまた腎障害の確定診断には不十分である。
また、尿成分の血中停滞を検査する目的で血清クレアチニン（Ｃｒ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の測定なども行われるが、これらの検査も食事の影響を受けやすい。
このように、尿蛋白や血清Ｃｒ、ＢＵＮの検査において異常値が顕れても、それが必ずしも腎障害に由来するものとは限らず、健常人や他の疾患でもしばしば異常値が発現する。
【０００８】
他に、尿中β２−ミクログロブリン、Ｎ−Ａcetyl−β−Ｄ−glucosamidase、ＩｇＧ、トランスフェリン、インターロイキン−６など様々な物質の測定による腎障害の診断が試みられているが、腎障害の重症度と一致しない場合も多く、いずれも有効でない。そして、これら以外には、腎障害の診断および重症度の判定に充分な感度および特異性を有する検査方法はまだ知られていない。
故に、腎障害の診断、重症度の最終的判定には、腎生検による組織学的診断が不可欠である。
【０００９】
しかしながら、腎生検は侵襲的検査であり、出血、感染などの合併症の危険性が常につきまとう。また、検査を実施するためには、専門医と設備の整った施設に入院しなければならず、患者への肉体的、社会的負担は無視できない。
以上のように、検尿による検査は簡便で、且つ、多量の検体を処理できる優れた検査方法ではあるが、腎障害の確定診断という観点からは満足できるものではない。一方、腎生検は、腎障害の診断、重症度の判定は確実であるものの、その利用は極く限られたものとならざるを得ない。
故に、検尿の簡便さと、腎生検の正確さを兼ね備えた腎障害の診断方法が望まれていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような課題を解決して腎疾患の診断、重症度の判定を行うことを目的としたものである。
はじめに本発明者らは、腎障害の確定診断および重症度を判定するためには、病態と密接に関連した特異的な蛋白を測定する必要があると考えた。そこで、まず、腎障害の代表的病態であり、腎炎の４割を占めるＩｇＡ腎症が、抗体の１種であるＩｇＡと抗原の免疫複合体が腎臓の糸球体に沈着して起こることに着目した。また、糸球体腎炎が、抗原と抗体の結合した免疫複合体が組織に沈着し、活性化された補体系によって腎組織が傷害されるIII型アレルギー反応の１種であることに着目した。
【００１１】
補体系とは、感染、炎症反応、免疫反応などに動員され、溶菌、溶血など、種々の生物学的活性を示し、易熱変性で免疫複合体に非特異的に反応する抗体の補助蛋白成分から構成される生体防御系である。
さらに本発明者らは、補体系に存在する補体制御因子に注目した。
すなわち、補体制御因子は補体系の無秩序な活性化を抑制する蛋白質で、補体系が亢進する場合には補体制御因子の発現も増加することが知られている。そして、前述したように、腎炎の完成には免疫複合体および補体系が関与している。そこで、本発明者らは、糸球体および尿細管において補体系が亢進し、それに伴って、補体制御因子の発現が増加すれば、尿中へ補体制御因子が漏出し、しかもその漏出量は病態の進行に伴って増加するのではないかと考え、尿中の補体制御因子の量を測定することにより、補体系が関与した腎局所の炎症の程度を推定し得るものと考えた。
そこで、ＥＬＩＳＡ法などの通常の免疫測定法を用いた補体制御因子の測定を試みたが、感度が低く必ずしも実用的ではなかった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
一方、本出願人は、ヒト精子の受精能を評価するための試薬として、固体顆粒の表面に、先体反応後のヒト精子と特異的に反応するモノクローナル抗体を結合してなる、精子受精能試験用顆粒を開発した（特許第２６５１２４９号）。この発明によると、先体反応後のヒト精子と特異的に反応するモノクローナル抗体を固体顆粒に結合させて試験用顆粒とし、これに精子を結合させて、結合した精子を計数することにより、ヒト精子の受精能を評価できるようにしたので、放射能、蛍光などの煩雑な測定手段を必要とせず、短時間で容易・確実に受精能の試験ができる。また、固体顆粒は磁性を有するので、磁石により容易に固体顆粒を集束させることができ、微量サンプルの測定も可能となった。
【００１３】
本発明者らは、この技術を補体制御因子の検出に適用することにより、簡便・正確な補体制御因子の検出が可能になるのではないかと考え、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
（１）固体顆粒の表面に、抗補体制御因子抗体を結合してなる、生物学的試料中に含まれる補体制御因子検出用顆粒、
（２）生物学的試料中に含まれる補体制御因子の検出方法であって、下記工程、すなわち、
（イ）生物学的試料と、固体顆粒の表面に第１の抗補体制御因子抗体（ａ）を結合した補体制御因子検出用顆粒を接触させ、
（ロ）前記補体制御因子検出用顆粒を接触させた検体に、標識分子を結合した第２の抗補体制御因子抗体（b）を接触させた後、
（ハ）前記第２の抗補体制御因子抗体（b）を介して補体制御因子と結合している前記標識分子を検出する、工程を含むことを特徴とする、生物学的試料中に含まれる補体制御因子の検出方法、
（３）（イ）上記（１）に記載の補体制御因子検出用顆粒及び（ロ）磁石を含む、補体制御因子検出用キット、
（４）検体尿中の補体制御因子の測定値を正常尿中の補体制御因子値と比較することからなる、腎機能評価方法、および、
（５）抗補体制御因子モノクローナル抗体を含む腎機能診断用試薬
を提供するものである。
【００１４】
本発明において測定対象とする補体抑制因子としては、Ｃ１不活化因子、Ｃ４結合蛋白、Ｉ因子、Ｈ因子などが挙げられるほか、自己補体反応からの防御機能を有するメンブレン・コファクター・プロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９および１型補体受容体（ＣＲ１）などがあり、限定はされないが、特に好ましいのはＭＣＰである。
【００１５】
ＭＣＰは、赤血球以外の全血液細胞に存在する分子量４５０００〜７００００の酸性糖タンパク質で、細胞性補体制御因子のひとつとして１９８５年に同定された（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイティッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ）、第８２巻、８５９−８６３頁、１９８５年）。
【００１６】
また、本発明において用いられる測定法についても限定はなく、例えば光散乱法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光・発光免疫測定法、酵素免疫測定法などが挙げられ、適宜選択して使用することができる。また、これらに用いる放射性物質、蛍光・発光物質、酵素も何ら制限はなく、例えば放射性物質であればＩ１２５、Ｉ１３１、Ｃ１４、Ｈ３などがあり、蛍光・発光物質としてはＦＩＴＣ、ウンベリフェロン、ルミノール、アクリジニウム誘導体、ルシフェラーゼなどがあり、酵素としては、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどを用いることができる。抗体についてもポリクローナル抗体，モノクローナル抗体いずれも限定せず用いることが可能であるが、特異性の観点から特に好ましいのはモノクローナル抗体である。
【００１７】
例えば、ＭＣＰに特異的なモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ株Ｍ７５（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９４）から産生されるモノクローナル抗体Ｍ７５、ハイブリドーマ株Ｍ１６０（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９５）から産生されるモノクローナル抗体Ｍ１６０、ハイブリドーマ株Ｍ１７７（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９６）から産生されるモノクローナル抗体Ｍ１７７、ハイブリドーマ株ＭＨ−６１（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２５７）から産生されるモノクローナル抗体ＭＨ−６１、およびモノクローナル抗体ＣＤ４６（コスモバイオ製）などを挙げることができる。さらにこれらのモノクローナル抗体は、常法により標識と結合させることもできる。
【００１８】
その他免疫測定方法については、基質、検出方法など全てについて既知の方法に従って実施することができる。
また、対象疾患たる腎障害の種類についても特に限定はなく、例えば、ＩｇＡ腎症、急性進行性糸球体腎炎、急性糸球体腎炎、急性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎、巣状糸球体硬化症、微少変化型ネフローゼ症候群、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、ループス腎炎、腎アミロイドーシス、慢性腎不全などが本発明の方法によって広く測定可能である。
【００１９】
前記抗体のうち、ヒトＭＣＰに結合する抗血清（ポリクローナル抗体）は、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．）、第１８巻、１２８９−１２９４頁、１９８８年の記載に従って得ることができる。また、抗ヒトＭＣＰモノクローナル抗体および該抗体産生ハイブリドーマ細胞は、特開平４−４５７９６号公報の記載に従って製することができる。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）抗体の製造
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
動物の免疫は、例えば次のように行う。公知の方法、例えば、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅxp．Ｍed．）、第１６３巻、８３７−８５５頁、１９８６年の記載に従って精製したヒトＭＣＰをラット、マウスなどの哺乳類動物に免疫する。哺乳類動物は細胞融合する際の相手の永久増殖性細胞と同系統の動物を用いるのが好ましい。動物の週令は、例えばマウスでは６〜８週令が好適である。性は雌雄何れでも構わない。免疫の方法は、精製したヒトＭＣＰを適当なアジュバント（例えばフロイントコンプリートアジュバントまたは水酸化アルミニウムゲル−百日咳菌ワクチンなど）と混合しエマルジョンとした後、動物の皮下、腹腔内、静脈内などに投与する。以後、この免疫操作を１〜２週間間隔で２〜５回行う。最終免疫は、０.５〜２μｇのヒトＭＣＰを動物の腹腔内に投与することにより行う。このようにして免疫した動物の体液からは、ポリクローナル抗体が得られる。各免疫操作後３〜７日後に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を以下に示すプロテインＡロゼットアッセイ法（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．）、第４巻、５００−５０７頁、１９７４年）により測定し、抗体価が充分上昇したとき、抗体または抗体産生細胞を採取する。
【００２１】
プロテインＡロゼットアッセイ法：
７２穴のテラサキプレート（ファルコン製）にヒト赤芽球性細胞株Ｋ５６２（ジャパニーズ・キャンサー・リサーチ・リソーシズ・バンク(JCRS)製）をコートし、ダルベッコＰＢＳ（リン酸二ナトリウム２.９０ｇ、リン酸一カリウム０.２０ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０.２ｇ、蒸留水１Ｌ）で希釈した試料を加え、ＣＯ2インキュベーター内に３７℃で３０分間放置する。ＰＢＳで洗浄後、プロテインＡ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）をコートしたヒツジ赤血球を加えてロゼットの形成を顕微鏡で観察する。
上記のようにヒトＭＣＰで免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、脾臓、リンパ節、末梢血などから得ることができるが、特に脾臓が好ましい。例えば、最終免疫の３〜４日後に脾臓を無菌的に摘出し、ＭＥＭ培地（日水製薬製）中で細断し、ピンセットで解し、１２００rpm×５分間の条件で遠心分離させた後、上清を除き、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.６５）で１〜２分間処理して赤血球を除去し、さらにＭＥＭ培地で３回洗浄して細胞融合用脾臓細胞を得る。
【００２２】
（２）永久増殖性細胞の調製
融合される相手方の永久増殖性細胞には、永久増殖性を有する任意の細胞を用いることができるが、骨髄腫細胞が特に繁用される。永久増殖性細胞は抗体産生細胞と同種の動物由来のものを用いるのがよい。例えばマウスの場合、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）由来骨腫瘍細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃurrent  Ｔopics  in  Ｍicrobiol．and  Ｉmmunol．）、第８１巻、１−７頁、１９７８年）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｅur．Ｊ．Immunol.)、第６巻、５１１−５１９頁、１９７６年）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（ネイチャー(Ｎature)、第２７６巻、２６９−２７０頁、１９７８年）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ．Ｉmmunol.)、第１２３巻、１５４８−１５５０頁、１９７９年）、およびＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（ネイチャー(Ｎature)、第２５６巻、４９５−４９７頁、１９７５年）などが用いられる。これらの永久増殖性細胞株は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１.５ｍＭ)、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）およびウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＣＬＳ製）(１０％)を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地）で継代培養し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０7個以上の細胞数を確保する。
【００２３】
（３）細胞融合
細胞融合は例えば次のように行う。（１）で得られた抗体産生細胞と（２）で得られた永久増殖性細胞をＭinimal  Ｅssential  Ｍedium（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が５〜１０：１の比になるように混合する。１２００rpm×５分間遠心分離した後、上清を除き、沈殿した細胞群をよく解した後、攪拌しながら３７℃に保ちつつ、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）１〜４ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｍＬおよびジメチルスルホキシド０.５〜１.０ｍＬの混液０.１〜１.０ｍＬ／１０8個細胞を加えて細胞融合を起こさせる。その後、１０分毎にＭＥＭ培地３ｍＬを数回添加し、ＭＥＭ培地を全量が５０ｍＬになるように加えて希釈し、細胞融合を停止させる。次に、遠心分離（１５００rpm×５分間）して上清を除去し、緩やかに細胞を解した後、正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＦＣＳ）１００ｍＬを加え、メスピペットによる吸い込み、吹き出しで緩やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を９６ウエルの培養用プレートに１００μＬ／ウエルずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で３〜５日間培養する。培養プレートに１００μＬ／ウエルのＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１.５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を添加した培地）を加え、さらに３日間培養する。以後３日間毎に培養上清の半容量を除去し、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で約２週間培養する。
【００２４】
（４）ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
融合細胞がコロニー状に生育しているのが認められるウエルについて、上清の半容量を除去し、ＨＴ培地（ＨＴＡ培地からアミノプテリンを除いたもの）を同量加え、４日間培養する。培養上清の一部を採取し、前述のプロテインＡロゼットアッセイ法によりＭＣＰに対する抗体価を測定する。ＭＣＰに反応するウエルにつき、限界希釈法によりクローニングを４回繰り返し、安定したＭＣＰの抗体価を示すものを抗ＭＣＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
上記の操作により得られるハイブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマ株Ｍ７５（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９４）、ハイブリドーマ株Ｍ１６０（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９５）、ハイブリドーマ株Ｍ１７７（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９６）およびハイブリドーマ株ＭＨ−６１（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２５７）を挙げることができる。
【００２５】
（５）モノクローナル抗体の調製
上記のようにして得られたハイブリドーマをインビトロおよびインビボで培養することによりモノクローナル抗体を産生させる。インビボで培養する場合、任意の動物にハイブリドーマを移植するが、細胞融合に用いた脾臓細胞を採取した動物と同種の動物を使用するのが好ましい。例えば、プリスタン処理（２,６,１０,１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン）０.５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する。）をした８〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに（４）で得られた抗ＭＣＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の２〜４×１０6個／匹腹腔内投与する。２〜３週間でマウスの腹腔内にモノクローナル抗体を高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大してくる。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３０００rpm×５分間）して固形分を除去した後、５０％硫酸アンモニウムを用いて塩析し、ＰＢＳで１〜２週間透析する。この透析画分をプロテインＡセファロースカラムに通し、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得る。
【００２６】
抗体のイソタイプは、オクタロニィ（二重免疫拡散）法（免疫学実験入門、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、７４頁、１９８１年）により決定した。タンパク質量は、フォーリン法および２８０ｎｍにおける吸光度（１．４（ＯＤ280）≒イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ）により算出する。
得られたモノクローナル抗体のＭＣＰ依存ファクターＩ・コファクター活性に対する抑制活性は、公知の方法（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅxp．Ｍed．）、第１６３巻、８３７−８５５頁、１９８６年）に従い、液相系測定法により定量する。すなわち、蛍光ラベルしたＣ３ｂとファクターＩを、あらかじめ抗体処理した一定量のＭＣＰと混合し、一定時間インキュベートした後、Ｃ３ｂのＣ３ｂｉへの変換をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析し、蛍光光度計を用いて測定する。
【００２７】
（６）モノクローナル抗体の特性
上記のようにして得られたモノクローナル抗体の特性は、例えば、（１）細胞表面をヨウ素ラベルしたＨＳＢ−２、Ｋ５６２などのヒトリンパ球由来の細胞株を用いる免疫沈降反応（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉmmunol．）、第１３８巻、２８５０−３８５５頁、１９８７年）、（２）ＭＣＰがコファクターとして働くファクターＩによるＣ３ｂ分解反応に対する阻害試験（バイオケミカル・ジャーナル（Ｂiochem．Ｊ．）、第２６４巻、５８１−５８８頁、１９８９年）および（３）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉmmunol．）、第１４２巻、２７４３−２７５０頁、１９８９年）により検討した。
【００２８】
（７）標識結合モノクローナル抗体の調製
得られた精製モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒド法（イムノケミストリー（Ｉmmunochem．）、第６巻、４３頁、１９６９年）、過ヨウ素酸法（ジャーナル・オブ・ヒストケミカル・アンド・サイトケミストリー（Ｊ．Ｈistochem．Ｃytochem．）、第２２巻、１０８４頁、１９７４年）、マレイミド法（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂiochem．）、第７９巻、２３３頁、１９７６年）、ピリジル・ジスルフィド法（バイオケミカル・ジャーナル（Ｂiochem．Ｊ．）、第１７３巻、７２３頁、１９７８年）などの方法により、酵素標識することができる。
【００２９】
例えば、過ヨウ素酸法を用いた場合、ペルオキシダーゼ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）に５０μＬの過ヨウ素酸（３８.５ｍｇ／ｍＬ）を攪拌しながら加え、室温で２０分間反応させた後、１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４.５）に置換したセファデックス（登録商標）Ｇ−２５充填カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）を用いて緩衝液交換を行う。次に０.２Ｍの水酸化ナトリウム４０μＬを加える。このものに１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９.５）で透析したモノクローナル抗体１０ｍｇを加え、室温で２時間反応する。反応終了後、氷冷し、１００μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を加え２時間反応する。反応液をＰＤ−１０を用いてＰＢＳに交換した後、３０００rpm×３０分間遠心分離し、上清をセファクリルＳ２００ＨＲ２６×３０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）を用いてゲル濾過して、４０３および２８０ｎｍの吸光度を測定し標識モノクローナル抗体の画分を分取する。得られた分画にウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、−２０℃で保存し、使用直前にＰＢＳ−Ｔween（登録商標）２０で希釈する。
【００３０】
（Ｂ）試験用顆粒の製造
この発明で使用する試験用顆粒は、適当な顆粒、例えばクロマト用ゲルに、物理的または化学的にこの発明で用いる抗体を結合させることによって製造することができるが、好ましいのは活性化された顆粒に本発明で用いる抗体を結合させる方法であり、特に好ましくは、ｐ−トルエンスルフォニルクロライドによってトシル化活性された顆粒に本発明で用いる抗体を結合させる方法である。
顆粒としては、ガラス、アガロース、セファロース、アガロース充填多孔性珪藻土、親水性共重合アクリルゲル、ポリスチレン等からなるビーズが用いられるが、好ましいのは可磁性物質（例えばＦe2Ｏ3）を例えばコア内に含ませることにより超常磁性をもたせたものである。磁性を有するビーズを使用すれば、磁石等を用いてビーズを集束することができるので、微量サンプルの測定が可能となる。また、比重の大きなビーズを用いた場合もビーズの集束が容易となり、磁性を有するビーズを用いたときと同様の効果が得られる。さらにこの場合、ビーズを集束するための遠心分離の条件を緩徐にできるため、結合が外れ易い抗体を使用する際にも便利である。
【００３１】
顆粒の形状は球形、不定破砕形等任意であるが、球形が好ましい。粒径は特に制限されず、例えば数〜数十〜数百μｍであり得る。
上記のような顆粒に二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧを化学的に結合させるには、顆粒を活性化させてから結合させるのが好ましい。顆粒の活性化は、この種の顆粒にタンパク質を結合させる際の任意の活性化法を選択することができる。このような活性化法には、トシルクロライド法、ブロムシアン法、ブロムアセチル法、グルタールアルデヒド法等がある。活性化顆粒の中には市販されているものもある。このような活性化、および活性化顆粒と二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧ等のタンパク質との結合は、常法によって行うことができる。
【００３２】
また、既に二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧ等を結合した顆粒も市販されている。このような顆粒としては日本ダイナル株式会社輸入、株式会社ベリタス販売のダイナビーズ（登録商標）Ｍ−４５０、Ｍ−２８０のヒツジ抗マウスＩｇＧコートタイプ、ヤギ抗マウスＩｇＧコートタイプ、ヒツジ抗ラットＩｇＧコートタイプ、ヒツジ抗家兎ＩｇＧコートタイプや、ポリサイエンス・インコーポレイティッド製のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）カルボキシレートビーズ、ヤギ抗家兎ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）カルボキシレートビーズ、プロテインＡカルボキシレートビーズ、ヤギ抗家兎ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ミクロマグネットパーティクル、ヤギ抗家兎ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ミクロマグネットパーティクル、プロテインＡミクロマグネットパーティクル、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ミクロマグネットパーティクル等がある。
上記のような顆粒に本発明で用いる抗体を結合させるには、適当な媒質中で懸濁した顆粒をタンパク質溶液で処理して非特異的吸着を防止した後、抗体を含む腹水または精製した抗体の溶液を混合する。
【００３３】
（Ｃ）試験法
本発明の試験法を実施するには、被験者から血液または尿を採取し、遠心分離後の上清を検体とする。前記のようにして製造した試験用顆粒に希釈した検体および（７）で得られた標識結合抗体を加え、室温で２時間インキュベーションする。反応終了後、洗浄し、遠心分離して顆粒を除去し、上清をマイクロプレートに移し、４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。同様に正常人の検体も測定し、値を比較する。
【００３４】
（Ｄ）キット
上記の実験を実施するには、実施に必要な材料をキットにしておくのが便利である。このようなキットは、前述した試験用顆粒および磁石を含み得る。さらに標識分子を結合した抗体を含み得る。そのほか、キットには、試験管、遠心管、その他類似の容器、ピペットまたは類似の吸引器具、あるいは顕微鏡を含ませることができる。なお、上記試験用顆粒の代わりに、その製造原料となる固体顆粒と抗体の組合せとすることもできる。
【００３５】
【実施例】
以下、この発明を参考例および実施例によりさらに詳細に説明する。
参考例（モノクローナル抗体の精製）
プリスタン（シグマ製）処理した８〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにハイブリドーマ株Ｍ７５（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９４）、ハイブリドーマ株Ｍ１６０（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９５）、ハイブリドーマ株Ｍ１７７（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８９６）およびハイブリドーマ株ＭＨ−６１（微工研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２５７）をそれぞれ１×１０7個／匹腹腔内に注射した。２〜３週間後に、ハイブリドーマは腹水型癌細胞として増殖した。腹水を採取し、遠心分離（３０００rpm×５分間）して固形物を取り除いた。５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳで透析した後、ペットボリュームが２０ｍＬのプロテインＡセファロースカラム（ファルマシア製）に通し、ＩｇＧ画分を集め、ハイブリドーマ株Ｍ７５、Ｍ１６０、Ｍ１７７およびＭＨ−６１より、それぞれ精製モノクローナル抗体Ｍ７５、Ｍ１６０、Ｍ１７７およびＭＨ−６１を得た。
【００３６】
実施例１（ＰＯＤ標識結合モノクローナル抗体の調製）
西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）に５０μＬの過ヨウ素酸（３８.５ｍｇ／ｍＬ）を攪拌しながら加え、室温で２０分間反応させた後、１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に置換したセファデックス（登録商標）Ｇ−２５充填カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）を用いて緩衝液交換を行う。次に０.２Ｍの水酸化ナトリウム４０μＬを加える。このものに１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９.５）で透析したモノクローナル抗体Ｍ１６０を１０ｍｇ加え、室温で２時間反応する。反応終了後、氷冷し、１００μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を加え２時間反応する。反応液をＰＤ−１０を用いてＰＢＳに交換した後、３０００rpm×３０分間遠心分離し、上清をセファクリルＳ２００ＨＲ２６×３０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）を用いてゲル濾過して、４０３および２８０ｎｍの吸光度を測定し標識モノクローナル抗体の画分を分取する。得られた分画にウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、−２０℃で保存し、使用直前にＰＢＳ−Ｔween（登録商標）２０で希釈する。
【００３７】
実施例２（試験用顆粒の製造）
ダイナビーズ（登録商標）Ｍ−４５０トシルアクティベイティッド（トシル活性化された均一な常磁化ポリスチレンビーズ：日本ダイナル製）の１ｍＭ塩酸懸濁液を無菌蒸留水で１回洗浄する。必要であれば簡単に攪拌して、均一な懸濁液とする。次に精製ＩｇＧ抗体を０.２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９.５）に１５０μｇ／ｍＬの濃度に溶解する。等容量の活性化ビーズ懸濁液を前記のＩｇＧ溶液に加える（抗体／ビーズ＝７５μｇ／１５ｍｇ）。ゆっくり攪拌しながら２２℃で２４時間インキュベートする。磁石を用いて抗体結合ビーズを集め、磁石にビーズを付けたまま上清を捨て、（１）５ｍＬの０.１Ｍ  ＰＢＳで１０分間、（２）０.１％Ｔween（登録商標）２０を含有する５ｍＬの１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ９.５）で２時間、（３）０.１Ｍ塩化ナトリウム、０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０.０１％メチルチオレートおよび０．１％Ｔween２０を含有する０.０５Ｍトリス（ｐＨ７.５）の５ｍＬで１２時間、および（４）Ｔween２０を含まない（３）の緩衝液で５ｍＬ、２時間の順に洗浄する。洗浄後、磁石でビーズを集め、上清を捨て、ＰＢＳ／ＢＳＡに約４×１０8ビーズ／ｍＬ（３０ｍｇ／ｍＬ）の濃度に懸濁する。得られたＩｇＧ結合ビーズは、４℃で少なくとも６カ月間は安定である。保存緩衝液には０.１Ｍ塩化ナトリウムおよび０.１％ＢＳＡ含有０.０５Ｍトリスを用いる。
ビーズ５０μＬを採り、同量のモノクローナル抗体Ｍ１７７を加える。３７℃で１時間振盪しながらビーズに抗体を結合させた後、１ｍＬのＰＢＳを加えて４℃で１０００rpm×５分間遠心分離する。沈殿物をＰＢＳで２回洗浄し、モノクローナル抗体Ｍ１７７結合ビーズを得、試験用顆粒とする。
【００３８】
実施例３（血清ＭＣＰの測定プロトコール）
血清ＭＣＰの測定は、以下の手順により行った。
（１）９６穴プレート（ダイナテック製）の各ウェルに一次抗体（モノクローナル抗体Ｍ１７７）のＰＢＳ（ｐＨ７.４）希釈溶液（５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加する。
（２）４℃で一晩静置する。
（３）３００μＬのイオン交換水で５回洗浄する。
（４）各ウェルに２５％ブロックエース（登録商標：コスモバイオ製）３５０μＬを添加し、室温で１時間放置し、ブロッキングする。
（４）検体の希釈系列を作製し、その１００μＬずつを添加する。ただし、スタンダード溶液は毎回作製する（検体およびスタンダード溶液は、あらかじめ等量の１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で混和しておく）。
（５）室温で２時間静置する。
（６）３００μＬの０.００５％Ｔween（登録商標）２０／生理食塩水にて５回洗浄する。
（７）３００μＬのイオン交換水で１回洗浄する。
（８）ＰＢＳ（ｐＨ７.４）で０.１μｇ／ｍＬに希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体Ｍ１６０の１００μＬを添加する（抗体は目的の２倍濃度に調整し、等量の１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で混和しておく）。
（９）室温で２時間静置する。
（１０）３００μＬの０.００５％Ｔween２０／生理食塩水にて５回洗浄する。
（１１）３００μＬのイオン交換水で１回洗浄する。
（１２）次の組成からなる基質溶液１００μＬを添加する。
基質溶液（２００ｍＬ中）
ｏ−フェニレンジアミン      ２０ｍｇ
クエン酸−リン酸緩衝液      ２００ｍＬ
（０.１Ｍクエン酸（２１.０ｇ／Ｌ）  ５１.４ｍＬ）
（０.２Ｍリン酸水素ナトリウム（７１.６２８ｇ／Ｌ）  ５１.４ｍＬ）
（蒸留水  １００ｍＬ）
３０％過酸化水素水          １０μＬ
（１３）室温で３０分間放置する。
（１４）１００μＬの停止液（１Ｎ硫酸）を加える。
（１５）４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００３９】
実施例４（試験法）
正常者１２例および腎疾患患者２１例の尿、ならびに正常者１０例および腎疾患患者２０例の血清についてＭＣＰ量を測定した。腎疾患患者の内訳は、尿検体ではＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）１４例、急速進行性糸球体腎炎症候群（ＲＰＧＮ）７例である。また、血清検体ではＩｇＡ腎症１４例、急速進行性糸球体腎炎症候群６例であった。
随時尿および血清を採取し、−８０℃に凍結保存し、使用時に解凍し、３０００ｒｐｍ×５分間の条件で遠心分離した後の上清を検体とした。
実施例１で得られたＰＯＤ標識モノクローナル抗体Ｍ１６０、および実施例２で得られたモノクローナル抗体Ｍ１７７結合磁性ビーズを使用した。
また、尿は原液を、血清はＰＢＳを用いて２〜１０倍に希釈したものを検体とした。
【００４０】
モノクローナル抗体Ｍ１７７が結合した磁性ビーズ（ダイナビーズ（登録商標）Ｍ−４５０）５０万個、検体５００μＬ、およびＰＢＳを用いて１０００倍に希釈したＰＯＤ標識モノクローナル抗体Ｍ１６０の５００μＬをあらかじめブロッキングした１.５ｍＬ容量のプラスチック製チューブに加え、室温で２時間回転させながら反応させた。磁石を用いてビーズを集束、固定した後、上清を捨てる。０.０２％Ｔween（登録商標）２０および１０％ブロックエース加ＰＢＳで５回洗浄後、基質液（ο−フェニレンジアミン４ｍｇ、過酸化水素水２μＬ、クエン酸−リン酸緩衝液(pＨ５)１０ｍＬ）１５０μＬを加え、回転させながら更に１５〜３０分反応させた後、２Ｎ硫酸を加えて反応を止めた。磁石を用いてビーズを集束、固定した後、上清２００μＬを採り、マイクロプレートに移し、吸光光度計（モレキュラー・デバイス製）を用い、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
血清ＭＣＰ値は、モノクローナル抗体Ｍ１６０を用い、ＰＯＤ標識モノクローナル抗体Ｍ１６０を検出用抗体としたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４１】
正常者および腎疾患患者の尿中ＭＣＰ値（対尿中クレアチニン比）を測定した結果を図１に、血清ＭＣＰ値の測定結果を図２に示す。その結果、尿中ＭＣＰ値においては、正常者とＩｇＡ腎症患者の間でｐ＜０.０５、正常者と急速進行性糸球体腎炎症候群患者の間でｐ＜０.０１の有意差を示した。また、ＩｇＡ腎症患者と急速進行性糸球体腎炎症候群患者の間においてもｐ＜０.０５の有意差を示した。また、血清ＭＣＰ値では、正常者とＩｇＡ腎症患者の間でｐ＜０.００１、正常者と急速進行性糸球体腎炎症候群患者の間でｐ＜０.００１の有意差を示した。また、ＩｇＡ腎症患者と急速進行性糸球体腎炎症候群患者の間においてはｐ＜０.００１の有意差を示した。
【００４２】
これらの結果から明らかなように、尿中および血清ＭＣＰ値は、正常者に比べ腎疾患患者において高値に分布する。また、ＩｇＡ腎症患者と急速進行性糸球体腎炎症候群患者では、より重篤な急速進行性糸球体腎炎症候群患者において高値となった。従って、本発明の方法によれば、腎障害の判定のみならず、腎疾患の病態の確定が可能となることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  正常者および腎疾患者の尿中ＭＣＰ値（対尿中クレアチニン比）の測定結果を示す。
【図２】  正常者および腎疾患者の血清ＭＣＰ値（対尿中クレアチニン比）の測定結果を示す。
【図１】
0004143172.tif 000002
【図２】
0004143172.tif 000003