(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1個のポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）と軟膏基剤を含有する治療用軟膏剤。
【請求項２】
ポリアルキレングリコール類がポリエチレングリコールもしくはその誘導体、ポリプロピレングリコールもしくはその誘導体またはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体もしくはその誘導体である請求項１記載の治療用軟膏剤。
【請求項３】
軟膏基剤がマクロゴールまたは親水軟膏である請求項１または２記載の治療用軟膏剤。
【請求項４】
顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）および軟膏基剤を含有する治療用軟膏剤において、該顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）を少なくとも1個のポリアルキレングリコール類で化学修飾することを特徴とする該顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）の経時的変性を抑制する安定化方法。
【請求項５】
ポリアルキレングリコール類がポリエチレングリコールもしくはその誘導体、ポリプロピレングリコールもしくはその誘導体またはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体もしくはその誘導体である請求項４記載の安定化方法。
【請求項６】
軟膏基剤がマクロゴールまたは親水軟膏である請求項４または５記載の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明の目的は、化学的に修飾された生理活性ポリペプチドを含有する軟膏剤に関する。さらに、該軟膏剤の治療剤、化粧品、保湿剤としての使用に関する。
背景技術
生理活性を有するポリペプチド（以下、生理活性ポリペプチドという）は、特定の疾病に対する治療剤として有用であるが、血中に投与されると安定性が悪く、十分な薬理効果が期待できない場合が多い。例えば、分子量６０，０００程度以下のポリペプチドは血中に投与されても腎臓の糸球体より濾過され、大部分が尿中に排泄されるため、治療剤として用いられたとしても大きな治療効果が得られず、繰り返しの投与が必要になる場合が多い。また、他の生理活性ポリペプチドは血中に存在する加水分解酵素等によって分解され、生理活性を失うことがある。
外因性の生理活性ポリペプチドの場合には、その生理活性が疾患の治療に有効なことがあるが、そのような外因性の生理活性ポリペプチドや遺伝子組換えによって製造された生理活性ポリペプチド等は内因性の生理活性ポリペプチドと構造が異なるために、それが血中に投与された場合には免疫反応が誘発され、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用が引き起こされる場合もあることが知られている。さらに、生理活性ポリペプチドの中にはそれが治療剤として用いられる際に、溶解性が悪い等の物性が問題になることも多い。
生理活性ポリペプチドを治療剤として用いる際のこれらの問題を解決する方法の一つとして、１分子以上の不活性型ポリマー鎖を該ポリペプチドに化学的に結合させる方法が知られている。多くの場合、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類を該ポリペプチドに化学的に結合させることによって、該ポリペプチドに望ましい特性が付与されている。
例えば、ポリエチレングリコールで修飾されたスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）では血中の半減期が著しく延長され、作用の持続性が見出されている［ファーマシューティカル  リサーチ  コミュニケーション（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９巻、２８７頁（１９８７年）］。また、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のポリエチレングリコール修飾体も知られている［ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１５巻、８１４頁（１９９４年）］。その他にも、アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ウリカーゼ等の生理活性ポリペプチドのポリエチレングリコール修飾体の例がＧｉｌｌｉａｎ  Ｅ．Ｆｒａｎｃｉｓらによってまとめられている［ファーマシューティカル  バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３巻、スタビリティー  オブ  プロテイン  ファーマシューティカルズ  パートＢ（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＰａｒｔＢ）、２３５頁（１９９２年）、プレナムプレス、ニューヨーク（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）］。
生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで修飾することによって得られる効果としては、熱安定性が高まること［生物物理、３８巻、２０８頁（１９９８年）］、有機溶媒に可溶となること［バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．）、１２２巻、８４５頁（１９８４年）］等も知られている。
一方、ペプチドや蛋白質とポリアルキレングリコールとの結合方法も知られている。ポリアルキレングリコールの末端にカルボン酸の活性エステル、マレイミド基、カーボネート基、塩化シアヌル、アルデヒド基、エポキシド基等を導入してポリペプチドのアミノ基やチオール基に結合する方法が知られている［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］。これらの技術の中には、ポリペプチドまたは蛋白質の特定のアミノ酸残基に特異的にポリエチレングリコールを結合し、該ポリペプチドまたは蛋白質の生理活性を損なわずに血中安定性を向上させた例も含まれる。ポリペプチド中のアミノ酸残基特異的なポリエチレングリコール修飾の例としては、成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）のカルボキシ末端にノルロイシンのスペーサーを介してポリエチレングリコールを結合した例［ジャーナル  オブ  ペプチド  リサーチ（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．）、４９巻、５２７頁（１９９７年）］、インターロイキン−２のＮ末端から３番目のアミノ酸の代わりに遺伝子組換えによってシステインを導入し、この部位に特異的にポリエチレングリコールを結合した例［バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、８巻、３４３頁（１９９０年）］等が知られている。
前記のように、ポリアルキレングリコールによる化学修飾生理活性ポリペプチドでは、一般に静脈内投与や皮下投与によって血中持続性、安定性の向上が得られることが知られているが、その一方でポリアルキレングリコールによる化学修飾生理活性ポリペプチドが注射剤以外の投与形態に利用できる性質を有しているかは未だ十分に解明されていない。
一方、局所治療剤としては、軟膏剤、点眼剤、経鼻剤、経肺剤、点耳剤、座剤、クリーム剤、ローション剤、リニメント剤、バップ剤、バンソウ膏等が知られている。例えば、軟膏剤として生理活性ポリペプチド類を利用した例として、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）およびＳＯＤによる火傷の治療［バイオロジカル  アンド  ファーマシューティカル  ブレタン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、１６（１１）巻、１１４６頁（１９９３年）］が知られている。
また、臨床において、インターフェロン類を局所治療剤としての軟膏剤として利用することが試みられている。即ち、帯状ほう疹、口唇ヘルペス、角膜ヘルペス、伝染性軟疣腫、水痘、口内炎等のウイルス性の皮膚疾患や、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生由来の緑内障等の眼疾患、皮膚の腫瘍や疣に対してインターフェロン類の軟膏剤が有用であることが知られている。具体的には、インターフェロン−αによる単純ヘルペス−１型ウイルスの治療［ダーマトロジー（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）、１８４（１）巻、４０頁（１９９２年）、アクタ  ビロロジカ（Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ）、３９（３）巻、１２５頁（１９９５年）］、白血球インターフェロンによる潰瘍治療［インターナショナル  ジャーナル  オブ  クリニカル  ファーマコロジー、セラピー  アンド  トキシコロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、１９（１０）巻、４５０頁（１９８１年）］等が知られている。また、特定の血管新生による視力障害の治療剤において、インターフェロン類等の軟膏剤の利用も試みられている［特開平９−２５５５５５、日本眼科学会雑誌、９９巻、５７１頁（１９９５年）］。
これらの治療方法では病巣部位への直接の効果が得られ、著しい治療効果が認められてはいるものの、生理活性ポリペプチドを含有するこれらの局所治療剤中での生理活性ポリペプチドの安定性に関しては、何ら知見が得られていない。
我々は軟膏剤中における活性成分としての生理活性ポリペプチドの安定化について鋭意検討した結果、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで化学修飾することにより、生理活性ポリペプチドが格段に安定化され、高い生理活性が維持されることを見出した。
発明の開示
本発明の目的は、生理活性ポリペプチドに比べて軟膏中での安定性に優れた生理活性ポリペプチド誘導体を含有する軟膏剤を提供することにある。
本発明者は前記の目的を達成するために、インターフェロンに代表される生理活性ポリペプチドを化学的に修飾、例えばポリアルキレングリコール類で修飾したところ、当該ポリエチレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドは該生理活性を維持し、未修飾の生理活性ポリペプチドに比べて軟膏中での安定性に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は化学的に修飾された生理活性ポリペプチド（以下、化学修飾ポリペプチドということもある）を含有する軟膏剤に関する。
また、本発明は、上記の化学的に修飾された生理活性ポリペプチドを含有する化粧用軟膏剤および保湿用軟膏剤に関する。
さらに本発明は、軟膏剤、化粧用軟膏剤または保湿用軟膏剤の製造のための化学的に修飾された生理活性ポリペプチドの使用に関する。
また、本発明は、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコール類で修飾することを特徴とする該生理活性ポリペプチドの軟膏剤中での安定化方法に関する。さらに本発明は、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコール類で修飾することを特徴とする該生理活性ポリペプチドの軟膏剤中での活性を維持する方法に関する。
さらに本発明は、化学的に修飾された生理活性ポリペプチドと軟膏基剤等を含有する組成物に関する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
化学的に修飾された生理活性ポリペプチドとしては、例えば少なくとも１個のポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドがあげられる。
生理活性ポリペプチドは、生理活性または薬理活性を有するポリペプチドであればいかなるポリペプチドでもよい。例えば、アスパラギナーゼ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、グルタミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）、ウリカーゼ（Ｕｒｉｃａｓｅ）、スーパーオキサイドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｉｎ）、ストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、プラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ）、アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、インターロイキン１〜１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１〜１８）、インターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）、インターフェロン−β（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、インターフェロン−ω（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ω）、インターフェロン−τ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−τ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）、血小板増加因子（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、クローソ蛋白質（Ｋｌｏｔｈｏ）、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、繊維芽細胞増殖因子１〜１９（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ１〜１９）、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ１）、オステオジェニックプロテイン１（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ１）、幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）、アミリン（Ａｍｙｌｉｎ）、パラサイロイドホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）、プラスミノーゲン活性化因子類（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、形質転換成長因子類（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、グルカゴン様ペプチド類（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）、ナトリウム利尿ペプチド類（Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）、プラスミノーゲン（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アンジオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、抗体もしくはそのフラグメント、融合抗体等の生理活性を有するポリペプチドおよびそれらのアミノ酸置換体、アミノ酸欠失体、糖鎖付加体、糖鎖欠失体、部分ペプチド等をあげることができる。より好ましい生理活性ポリペプチドとしては、インターフェロン−β、インターフェロン−α、インターフェロン−γ等のインターフェロン類、スーパーオキサイドディスムターゼ活性を有する生理活性ポリペプチドがあげられる。
これらの生理活性ポリペプチドは動物臓器や組織から抽出する方法でも得られるが、通常のペプチド合成法、あるいは遺伝子組換え法で調製することによっても得ることができる。さらに、市販の生理活性ポリペプチドも用いることができる。化学修飾に使用する生理活性ポリペプチドとしては粗精製物を用いることもできるし、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、抽出等の精製法により化学修飾に適した純度に精製したものを用いることもできる。
これらの生理活性ポリペプチドはリン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液中、水もしくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の適当な有機溶媒中、またはこれらの有機溶媒と水との混合溶媒中で調製され、また化学修飾反応に用いられる。
化学的に修飾された生理活性ポリペプチドは、本発明の目的を達成できるものであればいかなるものでもよく、例えばポリエチレングリコールもしくはその誘導体、ポリプロピレングリコールもしくはその誘導体、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体もしくはその誘導体等のポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドが好ましい。ポリアルキレングリコール類としては直鎖型の構造のもの、２本以上のポリアルキレングリコールが結合した分岐型の構造のものを用いることができ、平均分子量が約１，０００〜１，０００，０００のものが好ましく、平均分子量が５００〜１０００，０００のものがより好ましい。
ポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるし、既知の方法に準じて調製することもできる。ポリアルキレングリコール類の調製方法としては、Ｓａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙの総説［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に示された方法またはそれに準じた方法を用いることができる。
ポリアルキレングリコール類と生理活性ポリペプチドとの反応は、ポリアルキレングリコール類を生理活性ポリペプチド１モルあたり１〜１０００モル程度、より好ましくは１〜５０モル程度用いて反応させることによって行われる。ポリアルキレングリコール類の生理活性ポリペプチドへの修飾の度合いは生理活性ポリペプチドに対するポリアルキレングリコール類のモル比、反応温度、ｐＨ、反応時間等を調節することによって、任意に選択することができる。また、反応に使用する溶媒は反応を妨害しないものであればいずれでもよく、例えばりん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン等、あらゆるものから選択することができる。反応温度、反応時間、ｐＨ等の反応条件は生理活性ポリペプチドの活性が損なわれない条件であればいずれでもよく、例えば反応温度は０〜５０℃、反応時間は１０分〜１００時間、ｐＨは４〜１０が好ましい。
ポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドの精製は常法に従って、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過等により行うことができる。合成または精製された生理活性ポリペプチド、あるいはポリアルキレングリコール類で化学的に修飾された生理活性ポリペプチドが当該ポリペプチドの構造を有するものであることの確認は、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびアミノ酸組成のアミノ酸分析計による分析により、またアミノ酸配列を気相プロテインシーケンサーによりエドマン分解して得られたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相ＨＰＬＣ分析すること等により行うことができる。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、インターフェロン、インターロイキン等の遊離システイン残基を有する天然型または遺伝子組み換え型の生理活性ポリペプチドはポリアルキレングリコール類で部位特異的に修飾することもできる。
本発明の好ましい１つの態様では、化学的に修飾された生理活性ポリペプチドが、特開平１１−３１０６００に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、ＷＯ９９／５５３７７に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、ＷＯ００／２３１１４に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、特表昭６２−５０３１７１、ＷＯ８７／０００５６、ＵＳ４７６６１０６、ＵＳ４９１７８８８もしくはＵＳ４８６３７２７に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチド、または特開平６−１９２３００もしくはＥＰ５９３８６８Ａ１に記載のポリエチレングリコールで修飾された生理活性ポリペプチドである。
本発明の別の好ましい１つの態様では、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、平面構造以外の環状構造を含有する基に２本の１本鎖ポリアルキレングリコール類が結合し、かつ生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類である。
中でも、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、式（Ｉ）
0004142569.tif 000002
｛式中、Ｌは平面構造以外の環状構造を含有する３〜５分岐が可能な基を表し、ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または
（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、
ｎは任意の正の整数を表し、
ｑは１〜３の整数を表し、
Ｒ１は水素原子、低級アルキルまたは低級アルカノイルを表し、
Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表し、
Ｘ１は結合、Ｏ、Ｓ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは１〜８の整数を表す）、（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記ｔａと同義である）、ＮＲ３（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキルを表す）、Ｒ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５［式中、Ｒ４は結合、アルキレンまたはＯ（ＣＨ２）ｔｃ（式中、ｔｃは前記ｔａと同義である）を表し、Ｒ５は結合、アルキレンまたはＯＲ５ａ（式中、Ｒ５ａは結合またはアルキレンを表す）を表す］、Ｒ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７［式中、Ｒ６は結合、アルキレンまたはＲ６ａＯ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ５ａと同義である）を表し、Ｒ７は結合、アルキレンまたは（ＣＨ２）ｔｄＯ（式中、ｔｄは前記ｔａと同義である）を表す］、Ｒ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記Ｒ５ａと同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記Ｒ５ａと同義である）を表し、
Ｘ２は結合、Ｏまたは（ＣＨ２）ｔｅＯ（式中、ｔｅは前記ｔａと同義である）を表し、
Ｘ３は結合またはアルキレンを表し、２つのＲ１−Ｍｎ−Ｘ１および１つ〜３つのＸ２−Ｘ３−Ｒ２はそれぞれ同一でも異なっていてもよい｝で表される分岐型ポリアルキレングリコール類であるのが好ましい。
式（Ｉ）において、ｑが１である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましく、さらにｎが１０〜１００，０００であり、ｒおよびｓならびにｒａおよびｓａが同一または異なって、１〜１００，０００である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
式（Ｉ）において、Ｒ２が水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィドまたはアジドである分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
また、式（Ｉ）においては、Ｌが式（ＩＩ）
0004142569.tif 000003
［式中、Ｒ１０は（ＣＨ２）ｕ（式中、ｕは１〜１０の整数を表す）またはＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｕａ（式中、ｕａは０〜８の整数を表す）を表し、
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同一または異なって、水素原子、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミルを表し、
ＷはＯ、Ｓ、ＣＨ２またはＮＲ１４（式中、Ｒ１４は水素原子または低級アルキルを表す）を表す］で表される化合物から水素原子を３〜５個除いた基である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。中でも、ＷがＣＨ２であり、かつｕが４である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
本発明の好ましいさらに別の態様では、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、１本鎖ポリアルキレングリコール類が３本以上結合し、かつ、生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類である。
中でも、生理活性ポリペプチドを化学的に修飾するポリアルキレングリコール類が、式（Ｉｘ）
0004142569.tif 000004
［式中、Ｌｘは４以上分岐が可能な基を表し、
ＭｘはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓｘ（式中、ｒｘおよびｓｘは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または
（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａｘ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａｘ（式中、ｒａｘおよびｓａｘはそれぞれ前記ｒｘおよびｓｘと同義である）を表し、
ｎｘは任意の正の整数を表し、ｍｘは３以上の整数を表し、ｑｘは１〜３の整数を表し、
Ｒ１ｘは水素原子、低級アルキルまたは低級アルカノイルを表し、
Ｒ２ｘはポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表し、
Ｘ１ｘは結合、Ｏ、Ｓ、アルキレン、（ＯＣＨ２）ｔａｘ（式中、ｔａｘは１〜８の整数を表す）、（ＣＨ２）ｔｂｘＯ（式中、ｔｂｘは前記ｔａｘと同義である）、ＮＲ３ｘ（式中、Ｒ３ｘは水素原子または低級アルキルを表す）、Ｒ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘ［式中、Ｒ４ｘは結合、アルキレンまたはＯ（ＣＨ２）ｔｃｘ（式中、ｔｃｘは前記ｔａｘと同義である）を表し、Ｒ５ｘは結合、アルキレンまたはＯＲ５ａｘ（式中、Ｒ５ａｘは結合またはアルキレンを表す）を表す］、Ｒ６ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７ｘ［式中、Ｒ６ｘは結合、アルキレンまたはＲ６ａｘＯ（式中、Ｒ６ａｘは前記Ｒ５ａｘと同義である）を表し、
Ｒ７ｘは結合、アルキレンまたは（ＣＨ２）ｔｄｘＯ（式中、ｔｄｘは前記ｔａｘと同義である）を表す］、Ｒ８ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８ｘは前記Ｒ５ａｘと同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９ｘ（式中、Ｒ９ｘは前記Ｒ５ａｘと同義である）を表し、
Ｘ２ｘは結合、Ｏまたは（ＣＨ２）ｔｅｘＯ（式中、ｔｅｘは前記ｔａｘと同義である）を表し、
Ｘ３ｘは結合またはアルキレンを表し、
３つ以上のＲ１ｘ−（Ｍｘ）ｎｘ−Ｘ１ｘはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ２ｘ−Ｘ３ｘ−Ｒ２ｘが２または３個存在する場合（ｑｘが２または３である場合）には、それらは同一でも異なっていてもよい｝で表わされる分岐型ポリアルキレングリコール類であるのが好ましい。
式（Ｉｘ）において、ｑｘが１である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましく、またｍｘが３または４である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。さらに、ｎｘが１０〜１００，０００であり、ｒｘおよびｓｘならびにｒａｘおよびｓａｘが同一または異なって、１〜１００，０００である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
式（Ｉｘ）において，Ｒ２ｘが水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィドまたはアジドである分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
また、上記の分岐型ポリアルキレングリコール類の中で、分子量が５００〜１，０００，０００である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
式（Ｉｘ）において、Ｌｘがトリシンから水素原子４個以上を除いた基、シキミ酸から水素原子４個以上を除いた基、キナ酸から水素原子４個以上を除いた基、エリスリトールから水素原子４個以上を除いた基、ペンタエリスリトールから水素原子４個以上を除いた基およびグルコースから水素原子４個以上を除いた基から選ばれる基である分岐型ポリアルキレングリコール類が好ましい。
以下、式（Ｉ）および式（Ｉｘ）で表される化合物をそれぞれ化合物（Ｉ）および化合物（Ｉｘ）という。他の式番号の化合物についても同様である。
式（Ｉ）の各基の定義において、低級アルキルおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分は、直鎖状または分岐状の炭素数１〜８の、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を包含する。アルキレンは、炭素数１〜８の、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン等を包含する。
式（Ｉ）において、ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓはそれぞれ前記と同義である）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記と同義である）である場合、ｒおよびｓ並びにｒａおよびｓａは、好ましくは１〜１００，０００であり、さらに好ましくは１〜１，０００である。
式（Ｉ）において、ｎは任意の正の整数を表し、好ましくは１０〜１００，０００であり、さらに好ましくは１００〜１，０００である。
式（Ｉ）において、Ｍｎで表されるポリアルキレングリコール部分の平均分子量は、約１，０００〜１，０００，０００が好ましく、５，０００〜１００，０００がさらに好ましい。Ｍｎが−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−である場合、原料となるポリエチレングリコール類はＭｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）で表される分子量分布が１．１以下の単分散のものが望ましく、平均分子量３０，０００以下であれば市販のものを用いることができる。例えば、平均分子量が２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００等のモノメトキシポリエチレングリコールが利用できる。
式（Ｉ）において開示される、平面構造以外の環状構造を含有する基に２本の１本鎖ポリアルキレングリコール類が結合し、かつ生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類、式（Ｉ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００であることが望ましい。
式（Ｉ）において、ｑは１〜３の整数を表し、好ましくは１である。
式（Ｉ）において、Ｌは平面構造以外の環状構造を含有する３〜５分岐が可能な基であり、環状構造上の置換基として、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミル等を有していてもよい。ここで、低級アルキルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、置換低級アルキルにおける置換基としては、水酸基、アミノ、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイル、低級アルキルカルバモイルオキシ等があげられる。低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイルおよび低級アルキルカルバモイルオキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。Ｌとしては、例えば、シクロヘキサン類、シクロヘキセン類、単糖類等から水素原子３〜５個除いた基があげられる。上記シクロヘキサン類、シクロヘキセン類、単糖類の具体例としては、シクロヘキサントリカルボン酸、シクロヘキサントリオール、１，３，５−トリメチル−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Ｋｅｍｐ’ｓ  ｔｒｉａｃｉｄ）、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ジアミノシクロヘキサン、２，４，１０−トリオキサアダマンタン、イノシトール、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｄ，Ｌ−ソルビトール、リボース、エリスリトール等およびそれらの立体異性体があげられる。
Ｌ部分の構造の構築は市販品の化合物をそのまま利用するか、一般の有機合成法によってポリアルキレングリコール類の結合に適した形に誘導体化して利用するか、あるいは官能基の保護を行った後に利用して行うことができる［日本化学会編、実験化学講座  第４版（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善、プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］。
上記で例示した以外のシクロヘキサン類は、例えば木檜ら［大有機化学、第６巻、１８３頁（１９５８年）、朝倉書店］またはＧ．Ｅ．ＭｃＣａｓｌａｎｄとＥ．Ｃｌｉｄｅ  Ｈｏｒｓｗｉｌｌ［ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、７６巻、２３７３頁（１９５４年）］の方法等に従って合成することができる。
また、例えば、ベンゼン環を有する化合物をＳ．ＩｓｏｄａとＨ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉの方法［ケミカル  アンド  ファーマシューティカル  ブルチン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）、２８（８）巻、２３３７頁（１９８０年）］、Ｋ．ＰｒａｓａｄとＯ．Ｒｅｐｉｃの方法［テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２５（２３）巻、２４３５頁（１９８４年）］等で平面構造以外の環状構造を有する３〜５分岐が可能な化合物に変換してＬ部分の構造の構築を行うこともできる。
化合物（Ｉ）において、Ｘ１を介したポリアルキレングリコール類とＬとの結合は通常の有機合成法で知られている反応を容易に組み合わせて行うことができる［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９−２３頁（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善］。
式（Ｉ）において、Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表す。
すなわち、上記反応性を有する基としては、ポリペプチド中の、リジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン等の各側鎖、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基のいずれかと反応性を有する基が包含され、例えば水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィド、アジド等があげられる。
上記の各基の定義において、低級アルコキシカルボニルオキシ、ハロゲン化低級アルキル、低級アルカノイルオキシおよび低級アルカノイルオキシカルボニルの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アリールオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルオキシおよびアリールジスルフィドのアリール部分としては、炭素数６〜１４の、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル等があげられる。アロイルオキシカルボニルのアロイル部分としては、炭素数７〜１３の、例えばベンゾイル、ナフトイル、フタロイル等があげられる。ハロゲン化カルボニルおよびハロゲン化低級アルキルのハロゲン部分としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。
置換低級アルコキシカルボニルオキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば、水酸基、カルボキシ、ハロゲン等があげられる。ここで、ハロゲンは、前記と同義である。
置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば水酸基、カルボキシ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル等があげられる。ここで、ハロゲンおよび低級アルキルは、それぞれ前記と同義である。
Ｒ２で表される基は、Ｌ部分の構造を構築する原料に含まれていてもよいし、該原料化合物中の必要な官能基をあらかじめ適当な保護基［プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］で保護し、Ｘ１を介してポリアルキレングリコール類をＬに結合して分岐させた後に脱保護、さらには必要により変換して形成してもよい。さらにポリアルキレングリコール類をＸ１を介してＬから分岐させた後に、通常の有機合成法によってＬに必要によりＸ２またはＸ３を介して前記Ｒ２を導入することもできる。
より具体的には、例えば以下の製造法で本発明の式（Ｉ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類を製造することができるが、製造法はこれらに限定されるものではない。
製造法１：化合物（Ｉ）においてＸ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ、または（ＣＨ２）ｔｂＯである化合物の製造
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは前記と同義である）、または（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記と同義である）である化合物（Ｉａ）は、例えば以下の方法により製造することができる。
水酸基を２個所以上有する環状ポリオール類（以下、本明細書において環状ポリオール類というときは、環状構造上の置換基として水酸基以外に、ヒドロキシ低級アルキル等を有する化合物も包含する）を、無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、ポリアルキレングリコールまたはそのモノアルキルエーテルもしくはモノカルボン酸エステル（以下、これらをまとめてポリアルキレングリコール類Ａという）のハロゲン化物もしくはトシル化物を１〜３モル相当加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて、２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物が得られる。
環状ポリオール類はシクロヘキサントリオール、キナ酸、シキミ酸、グルコース、ソルビトール、リボース、エリスリトール等の市販の化合物、または市販の化合物から導かれる化合物から選ばれる。市販の化合物から導かれる化合物としては、例えば、シクロヘキサントリカルボン酸やＫｅｍｐ’ｓ  ｔｒｉａｃｉｄ等から選ばれる環状ポリカルボン酸を通常の有機合成法［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９〜２１巻（１９９２年）、丸善］に従って適当な還元剤で還元することによって得られる環状ポリオール類があげられる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
環状ポリオール類中の水酸基の配置は何れでもよく、反応に不必要な官能基を文献［プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリーアンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］に記載の方法によって適当に保護、あるいは誘導体化してから、反応に使用することができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物はＳａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙの総括［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に開示された各種の方法で容易に製造することができる。結合に使用するポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物としては分子量分布が均一であれば（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）いかなる平均分子量のものも用いられる。
得られた２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物はそのままの純度、あるいはイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で任意の純度の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類に精製、単離して、次のステップに用いることができる。ここまでの工程で、化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）のいくつかが得られる。
一方、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類とポリアルキレングリコール類Ａを使用することによっても目的の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を調製することができる。この場合、１〜３モル相当のポリアルキレングリコール類ＡをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１モル相当の環状ポリハライド類または環状ポリトシル類を加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて目的物が得られる。
環状ポリハライド類は市販の化合物であるか、前記環状ポリオール類をハロゲン化合物に変換［日本化学会編、実験化学講座、第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］して得られる。環状ポリトシル類は環状ポリオール類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、カリウムナフタレン等の適当な塩基の存在下、水酸基当たり１〜３モル相当のハロゲン化トシルを加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させることで得ることができる。
次に、得られた２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物または精製化合物に、Ｒ２を導入する。Ｒ２としては、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に結合した後、環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に残存している官能基をそのまま利用するか、あるいはあらかじめ環状ポリオール類に結合している官能基を保護しておき、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合後、官能基の保護基を除去して得られる基を利用してもよい。この場合、前記環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類中の１個所以上の水酸基、または他の官能基を適当な保護基で保護した後、前記と同様の方法で残りの水酸基、ハロゲンまたはトシル基部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を導入し、２本のポリアルキレングリコールが結合した化合物を合成し、保護基を除去した官能基をそのまま利用するか、あるいは該官能基の少なくとも一つを後述する方法に従ってＲ２に変換する。ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合する前、もしくは結合した後に環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に存在する官能基としては、水酸基の他に、カルボキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、ホルミル、カルボニル等がある。適当な官能基の保護基としては水酸基の場合、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリル、ジフェニルｔｅｒｔ−ブチルシリル、トリメチルシリル、トリフェニルシリル、トシル、テトラヒドロピラニル等があげられ、アミノの場合、メチル、エチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｎ−フタルイミド、アセチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等があげられ、カルボキシの場合、ベンジル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、９−フルオレニルメチル、メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、シンナモイル、アリル、ニトロフェニル等があげられ、ホルミルの場合、ジメチルアセタール、ジエチルアセタール、ジベンジルアセタール、１，３−ジオキサニル等があげられる［プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）］。
あらかじめ存在する官能基をそのまま、または保護、脱保護してＲ２として利用でき、Ｌ部分の構造を構築する原料となる環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類の具体例としては、シキミ酸、キナ酸、Ｋｅｍｐ’ｓ  ｔｒｉａｃｉｄ等があげられる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｌを含む化合物に新たに置換基Ｒ２を導入して得られる化合物の場合、例えば以下の製造方法で容易に製造を行うことができる。
製造法１−１
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がカルボキシである式（Ｉａａ）
0004142569.tif 000005
（式中、Ｘ１ａは結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ、または（ＣＨ２）ｔｂＯを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がカルバモイルである式（Ｉａｂ）
0004142569.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がシアノである式（Ｉａｃ）
0004142569.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は例えば以下のように合成することができる。
化合物（Ｉａａ）、化合物（Ｉａｂ）および化合物（Ｉａｃ）は、環状ポリオール類を用いて、例えば製造法１に従って得られる化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２として水酸基を有する化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を水、塩化メチレン、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中、触媒量または１〜２０％の塩基存在下、１〜３０モル相当のアクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル等と、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させて得ることができる。塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等があげられる。
また、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モル相当のα−ハロゲン化酢酸エステルと、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させた後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、γ−アミノ酪酸、グリシン、β−アラニン等のアミノ酸またはその誘導体と反応させることによっても得られる。
また、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を前記同様の塩基存在下、無水コハク酸、無水グルタル酸等の酸無水物と反応させることによっても化合物（Ｉａａ）を製造することができる。
また、化合物（Ｉａａ）は、例えば環状ポリハライド類を用いて製造法１に従って、化合物（Ｉａ）のうちＲ２がハロゲン化低級アルキルである化合物（Ｉａｉ）を製造した後、ヒドロキシカルボン酸エステル、マロン酸エステル、γ−アミノ酪酸のエステル体、β−アラニンのエステル体、グリシンのエステル体等をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、化合物（Ｉａｉ）を加え、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応を行った後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば前記環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類の一個所以上の水酸基またはハロゲンを、あらかじめカルボン酸あるいはカルボン酸の保護体を含む残基で置換し、これを用いて製造法１で示した方法で環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類の残りの２個所の水酸基またはハロゲンをポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物で置換することで得ることもできる。この場合、カルボン酸またはカルボン酸の保護体を含む残基の導入は、前記と同様にして行うことができる。カルボン酸を保護した場合には、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類に導入した後に脱保護して遊離カルボン酸を生成させる。
カルボン酸に変換された化合物は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で、任意の純度で精製、単離することができる。
製造法１−２
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がアミノである式（Ｉａｄ）
0004142569.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１−１で得られる化合物（Ｉａｃ）に適当な還元剤を作用させて得られる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物に５当量〜過剰量のエチレンジアミン、プロピレンジアミン等のジアミン類を適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
さらに、製造法１−１で示したのと同様に、化合物（Ｉａｄ）は、例えば化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、１当量〜過剰量のエチレンジアミンやプロピレンジアミン等のジアミン類と適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のアミノまたはアミノの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がマレイミドである式（Ｉａｅ）
0004142569.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＯｓｋａｒ  Ｋｅｌｌｅｒらの方法［ヘルベチカ  キミカ  アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、５８巻、５３１頁（１９７５年）］またはＴｉｍｏｔｈｙ  Ｐ．Ｋｏｇａｎらの方法［シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎ．）、２２巻、２４１７頁（１９９２年）］に従い、化合物（Ｉａｄ）とＮ−アルコキシカルボニルマレイミドとを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させることで得ることができる。Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミドとしてはＮ−エトキシカルボニルマレイミドやＮ−メトキシカルボニルマレイミドを用いることができる。
また、化合物（Ｉａｅ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のマレイミドを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｄ）、化合物（Ｉａｅ）およびそれらの合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−３
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がホルミルである式（Ｉａｆ）
0004142569.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａ）のうちＲ２としてヒドロキシメチルを有する化合物（Ｉａｇ）を適当な酸化剤で酸化することで得られる。酸化剤としては塩化クロム酸ピリジニウム、クロム酸、銀イオン、ジメチルスルホキシド等があげられる。また、化合物（Ｉａａ）を前記と同様に適当な還元剤で還元することによっても得ることができる。
また、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）、化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物にアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール、ハロゲン化エチルアセタール、ハロゲン化メチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
同様にして、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を用い、製造法１−１で示した方法に準じて水酸基を活性化し、続いてアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
また、化合物（Ｉａｆ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のアルデヒド、あるいはアルデヒドの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法でも得られる。
化合物（Ｉａｆ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−４
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化カルボニルである式（Ｉａｈ）
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（式中、Ｚ１はハロゲンを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２がカルボキシである化合物（Ｉａａ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。
ハロゲン化カルボニルにおけるハロゲンは前記ハロゲンと同義である。
製造法１−５
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化低級アルキルである式（Ｉａｉ）
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（式中、Ｚ２はハロゲン化低級アルキルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化低級アルキルにおけるハロゲンおよび低級アルキル部分はそれぞれ前記と同義である。
また、化合物（Ｉａｉ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）またはＲ２がアミノである化合物（Ｉａｄ）に、前記同様適当な塩基存在下、５当量〜過剰量のジブロモエタンやジブロモプロパン等のジハロゲン化アルキル類を反応させることによっても得られる。
さらに、化合物（Ｉａｉ）は、例えば前記製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のハロゲン化低級アルキルを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｉ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−６
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソシアナートである式（Ｉａｋ）
0004142569.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば、化合物（Ｉａｄ）をトルエン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、ホスゲンまたは塩化オキサリルと０〜１５０℃で１〜２４時間反応させるか、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応させた後に室温で分解させて得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソチオシアナートである化合物（Ｉａｐ）はホスゲンの代わりにチオホスゲンを用いる以外は上記の方法に従って製造することができる。
製造法１−７
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルである式（Ｉａｌ）
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（式中、Ｒ２ａはスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、通常のエステル合成方法に従って製造することができる。例えば、化合物（Ｉａａ）１モルに対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、置換もしくは非置換のヒドロキシアリール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシフタルイミド１〜１０モルを、１〜１０モルのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤存在下、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中、−２０〜１００℃で１〜２４時間反応させることによって目的物を得ることができる。より詳しくは、Ａ．Ｆｒａｄｅｔら［ポリマー  ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、４巻、２０５頁（１９８１年）］、またはＫ．Ｇｅｃｋｅｌｅｒら［ポリマー  ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、１巻、６９１頁（１９７９年）］によるポリアルキレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法、カルボキシメチルポリアルキレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造方法等に準じて得ることができる。
ここで、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルは前記と同義である。アリールは前記と同義であり、置換アリールの置換基は、置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基と同義である。
製造法１−８
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がビニルスルホニルである式（Ｉａｍ）
0004142569.tif 000015
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば化合物（Ｉａｊ）を用いてＭａｒｇｈｅｒｉｔａ  Ｍｏｒｐｕｒｇｏらの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、７巻、３６３頁（１９９６年）］で製造することができる。
製造法１−９
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである式（Ｉａｎ）
0004142569.tif 000016
（式中、Ｒ２ｂは置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＴａｌｉａ  ＭｉｒｏｎとＭｅｉｒ  Ｗｉｌｃｈｅｋの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に準じて、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）と過剰量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、エチルクロロホルメート等とをジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等の塩基存在下で反応させることで得られる。
また、化合物（Ｉａｎ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上の置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法で得ることもできる。
化合物（Ｉａｎ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
ここで、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシはそれぞれ前記と同義である。
製造法２：Ｘ１がＳである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＳである化合物（Ｉｂ）は、例えば製造法１と同様に、環状ポリオール類を環状ポリハライド類に変換した化合物［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］または市販の環状ポリハライド類と、ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
また、化合物（Ｉｂ）は、前記の工程とは逆に、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリチオール類と反応させることによっても得ることができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体は市販のものを用いるか、Ｓａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってまとめられた方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］で調製できる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法２−１
化合物（Ｉｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、Ｘ１が−Ｓ−である化合物を製造法２に従って製造した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法３：Ｘ１がＮＲ３である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＮＲ３（式中、Ｒ３は前記と同義である）である化合物（Ｉｃ）は、例えば製造法１と同様に、環状ポリオール類を環状ポリアミン類に変換した化合物または市販の環状ポリアミン類と、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
化合物（Ｉｃ）は、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を環状ポリハライド類と反応させることによっても得ることができる。
また、化合物（Ｉｃ）は環状ポリアルデヒド類１当量と、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体１〜１０当量とをメタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、水、緩衝液等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、−２０〜１００℃で１〜１００当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下で反応させることによっても得ることができる。
さらに、化合物（Ｉｃ）は、環状ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体を用いても製造することができる。
前記環状ポリアルデヒド類としては市販の化合物をそのまま用いるか、環状ポリアルコール類を酸化して用いるか、あるいは環状ポリカルボン酸類を還元して用いればよい。また、ポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体としては市販の化合物を利用できるし、また、ポリアルキレングリコール類Ａの末端のアルコールを酸化して用いることもできる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法３−１
化合物（Ｉｃ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｃ）を製造法３に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて製造することができる。
製造法４：Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５またはＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄａ）は、例えばシクロヘキサントリカルボン酸やＫｅｍｐ’ｓ  ｔｒｉａｃｉｄ等から選ばれる環状ポリカルボン酸化合物をペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］に従い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中に溶解または懸濁し、次いで１〜３０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール等のアルコール体と、１〜３０当量のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩等の縮合剤を加え、さらに１〜３当量のポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を加えて反応させることによって得ることができる。反応は無水条件下、−２０℃〜１００℃で、１時間〜１０日間攪拌することによって行われる。
また、環状ポリカルボン酸分子中の１個以上のカルボキシをメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル等の適当な保護基で保護した後、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を残りの２個のカルボキシに前記の方法で導入し、続いてカルボキシの保護基を通常の脱保護法で除去することによって、Ｒ２がカルボキシである２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体を高純度に含む反応液を得ることもできる。この場合、カルボン酸の保護基の導入や該保護基の除去には通常のペプチドの合成法で用いられる方法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］を利用できる。環状ポリカルボン酸類中のカルボキシの配置は、立体配置を含めて何れでもよく、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体としては分子量分布が均一（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）であればいかなる平均分子量のものを用いてもよい。
また、化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄｂ）は、前記工程とは逆に、環状ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体の活性エステル、あるいはポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体とを反応させる方法でも得ることができる。ポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体はポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で、１〜２４時間加熱することによって得ることができる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法４−１
化合物（Ｉｄａ）および化合物（Ｉｄｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｄａ）または化合物（Ｉｄｂ）を製造法４に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法５：Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−ＯまたはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記と同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記と同義である）である化合物（Ｉｅ）は、例えばポリアルキレングリコール類Ａと環状ポリカルボン酸類、あるいはポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体と環状ポリオール類の組合わせを用いて、脱水縮合により得ることができる。脱水縮合の方法としては通常のエステル合成で用いられるような、酸または塩基触媒下に脱水する方法か、あるいはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ピリジン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤で対応するアルコール体とカルボン酸を縮合する方法等を利用することができる。さらに、上記工程において酸ハロゲン化物と、対応するアルコール体を反応させることによっても目的物を合成できる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法５−１
化合物（Ｉｅ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｅ）を製造法５に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法６：Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨまたはＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（式中、Ｒ６ａは前記と同義である）である化合物（Ｉｆａ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
市販の環状ポリアミン類、または前記製造法を組み合わせて環状ポリオール類より調製した環状ポリアミン類にポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体を１〜３モル過剰に反応させて、化合物（Ｉｆａ）を含む粗生成物が得られる。なお、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体は、Ｔａｌｉａ  Ｍｉｒｏｎらの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に従って製造することができる。また、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、イミダゾリルカルボニルオキシ誘導体等を利用することができる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ４は前記と同義である）である化合物（Ｉｆｂ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
化合物（Ｉｆｂ）は環状ポリオール類のカーボネート誘導体とポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体とを上記と同様に反応させることによって得ることができる。
他の製造法に準じて官能基の保護、脱保護を組み合わせることによって、化合物（Ｉｆａ）または化合物（Ｉｆｂ）を選択的に生成させることもできる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法６−１
化合物（Ｉｆ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｆ）を製造法６に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて調製することができる。
Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して１本鎖化合物を取得し、同様の反応で前記と同一または異なるＲ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して、２本鎖の化合物を取得することもできる。例えば、製造法１〜６に示した方法のうちいずれかの反応を利用してＬ中の１個所の官能基にポリアルキレングリコール類を結合させ、１本鎖化合物を得る。生成する１本鎖化合物の割合は、反応に使用するポリアルキレングリコール類と、Ｌ部分の構造を構築する原料の比を変えることで調節することができ、１本鎖化合物を主成分にすることも可能である。得られた１本鎖化合物はそのままの純度で、あるいは製造法１に示した方法に準じて任意の純度に、あるいは高純度に精製して次のステップに使用することができる。
このようにして得られた１本鎖化合物と、前記と同一または異なるポリアルキレングリコール類を製造法１〜６に示したいずれかの方法に準じて結合して、２本鎖化合物が調製できる。なお、２本目のポリアルキレングリコール類は１本鎖化合物を取得した反応と同様の反応に付すこともできるが、異なる反応に付し異なる結合様式を有するように調製してもよい。例えば、水酸基、アミノ、カルボキシ等の複数の官能基を有する化合物をＬ部分の構造を構築する原料に使用する場合、製造法１に示した方法でＸ１がＯである１本鎖化合物をまず取得し、次いで製造法４に示した方法で２本目のポリアルキレングリコール類をＸ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５となるように反応させることができる。以上のように製造法１〜６の組合わせで２つのポリアルキレングリコール類が同一または異なる結合様式でＬに結合した２本鎖化合物を得ることができる。さらに、使用するポリアルキレングリコール類は１本目と２本目の分子量が異なっていてもよく、各々のポリアルキレングリコール類をＬに結合させる反応で異なる平均分子量のポリアルキレングリコール類を使用することで容易に目的物が得られる。
また、Ｌにポリアルキレングリコール類を導入する反応において、Ｌ中の１個所以上の官能基（例えば製造法１の場合、１個所以上の水酸基）を残し、他の官能基を適当な保護基で保護してから、ポリアルキレングリコール類と反応、結合させ、その後、保護基を除去することも可能である。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類は、上記製造法で具体的に示された化合物以外であっても、上記製造法に準じて得ることができる。
なお、先にも述べたとおり、製造法１〜６の各工程において、原料に用いるポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるが、Ｓａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙ［バイオコンジュゲート    ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］によってまとめられた各種の方法等によって容易に製造することも可能である。
式（Ｉｘ）の各基の定義において、低級アルキルおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分は、直鎖状または分岐状の炭素数１〜８の、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を包含する。アルキレンは、炭素数１〜８の、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン等を包含する。
式（Ｉｘ）において、ＭｘはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓｘ（式中、ｒｘおよびｓｘは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａｘ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａｘ（式中、ｒａｘおよびｓａｘはそれぞれ前記ｒｘおよびｓｘと同義である）を表し、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓｘ（式中、ｒｘおよびｓｘはそれぞれ前記と同義である）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａｘ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａｘ（式中、ｒａｘおよびｓａｘはそれぞれ前記と同義である）である場合、ｒｘおよびｓｘならびにｒａｘおよびｓａｘは、好ましくは１〜１００，０００であり、さらに好ましくは１〜１，０００である。
式（Ｉｘ）において、ｎｘは任意の正の整数を表し、好ましくは１０〜１００，０００であり、さらに好ましくは１００〜１，０００である。
式（Ｉｘ）において開示される、１本鎖ポリアルキレングリコール類が３本以上結合し、かつ、生理活性ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類、（Ｍｘ）ｎｘで表されるポリアルキレングリコール部分の平均分子量は、約１，０００〜１，０００，０００が好ましく、５，０００〜１００，０００がさらに好ましい。（Ｍｘ）ｎｘが−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎｘ−である場合、原料となるポリエチレングリコール類はＭｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）で表される分子量分布が１．１以下の単分散のものが望ましく、平均分子量３０，０００以下であれば市販のものを用いることができる。例えば、平均分子量が２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００等のモノメトキシポリエチレングリコールが利用できる。
式（Ｉｘ）において、ｑｘは１〜３の整数を表し、好ましくは１である。
式（Ｉｘ）において、ｍｘは３以上の整数を表し、好ましくは３〜４である。
式（Ｉｘ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００の範囲にあることが好ましい。
式（Ｉｘ）において、Ｌｘは４以上分岐が可能な基であり、Ｌｘ上の置換基として、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミル等を有していてもよい。ここで、低級アルキルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、置換低級アルキルにおける置換基としては、水酸基、アミノ、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイル、低級アルキルカルバモイルオキシ等があげられる。低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイルおよび低級アルキルカルバモイルオキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。
Ｌｘで表わされる４以上分岐が可能な基としては、Ｘ２ｘ−Ｘ３ｘを介してポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基に変換可能な基、あるいは該反応性を有する基を結合でき、Ｘ１ｘを介して１本鎖ポリアルキレングリコール類を３分子以上分岐させることができればいかなる基を用いてもよい。Ｌｘとしては、例えばポリオール類、ポリカルボン酸等で、分子量１，０００以下の化合物から水素原子４個以上を除いた基があげられる。ポリオール類の具体例としては、グルコース、Ｄ，Ｌ−ソルビトール、リボース、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ）、イノシトール、コール酸、３，４，５−トリヒドロキシベンゾイックアシッド（３，４，５−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、２，４，６−トリヒドロキシベンゾイックアシッド、３，４，５−トリヒドロキシベンズアルデヒド、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子化合物およびそれらの立体異性体等があげられ、ポリカルボン酸の具体例としては、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸、ピロメリト酸、ジエチレントリアミンペンタアセティックアシッド、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸、クエン酸、γ−カルボキシグルタミン酸等の低分子化合物およびそれらの立体異性体等があげられる。
Ｌｘとして好ましい基としては、トリシンから水素原子４個以上を除いた基、シキミ酸から水素原子４個以上を除いた基、キナ酸から水素原子４個以上を除いた基、エリスリトールから水素原子４個以上を除いた基、ペンタエリスリトールから水素原子４個以上を除いた基およびグルコースから水素原子４個以上を除いた基等があげられる。
Ｌｘ部分の構造の構築は、例えば市販品の化合物をそのまま利用するか、一般の有機合成法によってポリアルキレングリコール類の結合に適した形に誘導体化して利用するか、あるいは官能基の保護を行った後に利用して行うことができる［日本化学会編、実験化学講座  第４版（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善、プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］。
上記で例示した以外のシクロヘキサン類は、例えば木檜ら［大有機化学、第６巻、１８３頁（１９５８年）、朝倉書店］またはＧ．Ｅ．ＭｃＣａｓｌａｎｄとＥ．Ｃｌｉｄｅ  Ｈｏｒｓｗｉｌｌ［ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、７６巻、２３７３頁（１９５４年）］の方法等に従って合成することができる。
式（Ｉｘ）において、Ｘ１ｘを介したポリアルキレングリコール類とＬｘとの結合は通常の有機合成法で知られている反応を容易に組み合わせて行うことができる［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９−２３頁（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善］。
式（Ｉｘ）において、Ｒ２ｘはポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表す。
すなわち、上記反応性を有する基としては、ポリペプチド中の、リジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン等の各側鎖、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基のいずれかと反応性を有する基が包含され、例えば水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィド、アジド等があげられる。
上記の各基の定義において、低級アルコキシカルボニルオキシ、ハロゲン化低級アルキル、低級アルカノイルオキシおよび低級アルカノイルオキシカルボニルの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アリールオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルオキシおよびアリールジスルフィドのアリール部分としては、炭素数６〜１４の、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル等があげられる。アロイルオキシカルボニルのアロイル部分としては、炭素数７〜１３の、例えばベンゾイル、ナフトイル、フタロイル等があげられる。ハロゲン化カルボニルおよびハロゲン化低級アルキルのハロゲン部分としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。
置換低級アルコキシカルボニルオキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば、水酸基、カルボキシ、ハロゲン等があげられる。ここで、ハロゲンは、前記と同義である。
置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば水酸基、カルボキシ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル等があげられる。ここで、ハロゲンおよび低級アルキルは、それぞれ前記と同義である。
Ｒ２ｘで表される基は、Ｌｘ部分の構造を構築する原料に含まれていてもよいし、該原料化合物中の必要な官能基をあらかじめ適当な保護基［プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］で保護し、Ｘ１ｘを介してポリアルキレングリコール類をＬｘに結合して分岐させた後に脱保護、さらには必要により変換して形成してもよい。さらにポリアルキレングリコール類をＸ１ｘを介してＬｘから分岐させた後に、通常の有機合成法によってＬｘに必要によりＸ２ｘまたはＸ３ｘを介して前記Ｒ２ｘを導入することもできる。
より具体的には、例えば以下の製造法で本発明における分岐型ポリアルキレングリコール類を製造することができるが、製造法は、これらに限定されるものではない。
製造法１ｘ：Ｘ１ｘが結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａｘ、または（ＣＨ２）ｔｂｘＯである化合物の製造
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘが結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａｘ（式中、ｔａｘは前記と同義である）、または（ＣＨ２）ｔｂｘＯ（式中、ｔｂｘは前記と同義である）である化合物（Ｉａｘ）は、例えば以下の方法により製造することができる。
水酸基を３個所以上有するポリオール類を、無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、ポリアルキレングリコールまたはそのモノアルキルエーテルもしくはモノカルボン酸エステル（以下、これらをまとめてポリアルキレングリコール類Ａｘという）のハロゲン化物もしくはトシル化物を３モル以上加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて、３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物が得られる。
ポリオール類はキナ酸、グルコース、ソルビトール、リボース、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリシン、イノシトール等の市販の化合物、または市販の化合物から導かれる化合物等から選ばれる。市販の化合物から導かれる化合物としては、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸（１，２，４，５−ｂｅｎｚｅｎｅｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｃ  ａｃｉｄ）等から選ばれるポリカルボン酸を通常の有機合成法［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９〜２１巻（１９９２年）、丸善］に従って適当な還元剤で還元することによって得られるポリオール類等があげられる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
ポリオール類中の水酸基の配置は何れでもよく、反応に不必要な官能基を文献［プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］に記載の方法によって適当に保護、あるいは誘導体化してから、反応に使用することができる。
ポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物およびトシル化物はＳａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙの総括［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に開示された各種の方法で容易に製造することができる。結合に使用するポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物およびトシル化物としては分子量分布が均一であれば（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）いかなる平均分子量のものも用いられる。
得られた３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物はそのままの純度、あるいはイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で３本鎖、４本鎖、５本鎖、またはそれ以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を分岐数に応じて任意の純度に精製、単離して、次のステップに用いることができる。ここまでの工程で、化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊｘ）のいくつかが得られる。
一方、ポリハライド類またはポリトシル類とポリアルキレングリコール類Ａｘを使用することによっても目的の３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を調製することができる。この場合、３モル相当以上のポリアルキレングリコール類ＡｘをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１モルのポリアルキレングリコール類Ａｘあたり１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１モル相当のポリハライド類またはポリトシル類を加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて目的物が得られる。
ポリハライド類は市販の化合物であるか、前記ポリオール類をハロゲン化合物に変換［日本化学会編、実験化学講座、第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］して得られる。ポリトシル類はポリオール類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、水酸基当たり１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、カリウムナフタレン等の適当な塩基の存在下、水酸基当たり１〜３モル相当のハロゲン化トシルを加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させることで得ることができる。
次に、得られた３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物または精製化合物に、Ｒ２ｘを導入する。Ｒ２ｘとしては、ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に結合した後、ポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に残存している官能基をそのまま利用するか、あるいはあらかじめポリオール類に結合している官能基を保護しておき、ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合後、官能基の保護基を除去して得られる基を利用してもよい。この場合、前記ポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類中の１個所以上の水酸基、または他の官能基を適当な保護基で保護した後、前記と同様の方法で残りの水酸基、ハロゲンまたはトシル基部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を導入し、３本以上のポリアルキレングリコールが結合した化合物を合成し、保護基を除去した官能基をそのまま利用するか、あるいは該官能基の少なくとも一つを後述する方法に従ってＲ２ｘに変換する。ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合する前、もしくは結合した後にポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に存在する官能基としては、水酸基の他に、カルボキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、ホルミル、カルボニル等がある。適当な官能基の保護基としては水酸基の場合、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリル、ジフェニルｔｅｒｔ−ブチルシリル、トリメチルシリル、トリフェニルシリル、トシル、テトラヒドロピラニル等があげられ、アミノの場合、メチル、エチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｎ−フタルイミド、アセチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等があげられ、カルボキシの場合、ベンジル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、９−フルオレニルメチル、メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、シンナモイル、アリル、ニトロフェニル等があげられ、ホルミルの場合、ジメチルアセタール、ジエチルアセタール、ジベンジルアセタール、１，３−ジオキサニル等があげられる［プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）］。
あらかじめ存在する官能基をそのまま、または保護、脱保護してＲ２ｘとして利用でき、Ｌｘ部分の構造を構築する原料となるポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類の具体例としては、シキミ酸、キナ酸、３，４，５−トリヒドロキシベンゾイックアシッド、コール酸またはこれらのハライド、トシル化物等があげられる。
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｌｘを含む化合物に新たに置換基Ｒ２ｘを導入して得られる化合物の場合、例えば以下の製造方法で容易に製造を行うことができる。
製造法１ｘ−１
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシである式（Ｉａａｘ）
0004142569.tif 000017
（式中、Ｘ１ａｘは結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａｘ、または（ＣＨ２）ｔｂｘＯを表し、Ｒ１ｘＬｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２ｘがカルバモイルである式（Ｉａｂｘ）
0004142569.tif 000018
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２ｘがシアノである式（Ｉａｃｘ）
0004142569.tif 000019
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は例えば以下のように合成することができる。
化合物（Ｉａａｘ）、化合物（Ｉａｂｘ）および化合物（Ｉａｃｘ）は、ポリオール類を用いて、例えば製造法１ｘに従って得られる化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘとして水酸基を有する化合物（Ｉａｊｘ）を含む反応混合物または精製化合物を水、塩化メチレン、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中、触媒量または１〜２０％の塩基存在下、１〜３０モル相当のアクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル等と、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させて得ることができる。塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等があげられる。また、化合物（Ｉａａｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）を含む反応混合物または精製化合物を無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モル相当のα−ハロゲン化酢酸エステルと、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させた後、加水分解して得ることもできる。さらに、化合物（Ｉａａｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、γ−アミノ酪酸、グリシン、β−アラニン等のアミノ酸またはその誘導体と反応させることによっても得られる。
また、製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）を前記同様の塩基存在下、無水コハク酸、無水グルタル酸等の酸無水物と反応させることによっても化合物（Ｉａａｘ）を製造することができる。
また、化合物（Ｉａａｘ）は、例えばポリハライド類を用いて製造法１ｘに従って、化合物（Ｉａｘ）のうちＲ２ｘがハロゲン化低級アルキルである化合物（Ｉａｉｘ）を製造した後、ヒドロキシカルボン酸エステル、マロン酸エステル、γ−アミノ酪酸のエステル体、β−アラニンのエステル体、グリシンのエステル体等をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、化合物（Ｉａｉｘ）を加え、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応を行った後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａｘ）は、例えば前記ポリオール類もしくはポリハライド類の一個所以上の水酸基またはハロゲンを、あらかじめカルボン酸あるいはカルボン酸の保護体を含む残基で置換し、これを用いて製造法１で示した方法でポリオール類もしくはポリハライド類の残りの３個所以上の水酸基またはハロゲンをポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物で置換することで得ることもできる。この場合、カルボン酸またはカルボン酸の保護体を含む残基の導入は、前記と同様にして行うことができる。カルボン酸を保護した場合には、ポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリオール類もしくはポリハライド類に導入した後に脱保護して遊離カルボン酸を生成させる。
カルボン酸に変換された化合物は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で、任意の純度で精製、単離することができる。
製造法１ｘ−２
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがアミノである式（Ｉａｄｘ）
0004142569.tif 000020
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１ｘ−１で得られる化合物（Ｉａｃｘ）に適当な還元剤を作用させて得られる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
また、化合物（Ｉａｄｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｉｘ）または化合物（Ｉａｉｘ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物に５当量〜過剰量のエチレンジアミン、プロピレンジアミン等のジアミン類を適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
さらに、製造法１ｘ−１で示したのと同様に、化合物（Ｉａｄｘ）は、例えば化合物（Ｉａｊｘ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、１当量〜過剰量のエチレンジアミンやプロピレンジアミン等のジアミン類と適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
また、化合物（Ｉａｄｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のアミノまたはアミノの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがマレイミドである式（Ｉａｅｘ）
0004142569.tif 000021
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＯｓｋａｒ  Ｋｅｌｌｅｒらの方法［ヘルベチカ  キミカ  アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、５８巻、５３１頁（１９７５年）］またはＴｉｍｏｔｈｙ  Ｐ．Ｋｏｇａｎらの方法［シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎ．）、２２巻、２４１７頁（１９９２年）］に従い、化合物（Ｉａｄｘ）とＮ−アルコキシカルボニルマレイミドとを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させることで得ることができる。Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミドとしてはＮ−エトキシカルボニルマレイミドやＮ−メトキシカルボニルマレイミドを用いることができる。
また、化合物（Ｉａｅｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のマレイミドを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｄｘ）、化合物（Ｉａｅｘ）およびそれらの合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１ｘ−３
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがホルミルである式（Ｉａｆｘ）
0004142569.tif 000022
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｘ）のうちＲ２ｘとしてヒドロキシメチルを有する化合物（Ｉａｇｘ）を適当な酸化剤で酸化することで得られる。酸化剤としては塩化クロム酸ピリジニウム、クロム酸、銀イオン、ジメチルスルホキシド等があげられる。また、化合物（Ｉａａｘ）を前記と同様に適当な還元剤で還元することによっても得ることができる。
また、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）、化合物（Ｉａｉｘ）または化合物（Ｉａｉｘ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物にアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール、ハロゲン化エチルアセタール、ハロゲン化メチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
同様にして、製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）を用い、製造法１ｘ−１で示した方法に準じて水酸基を活性化し、続いてアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
また、化合物（Ｉａｆｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のアルデヒド、あるいはアルデヒドの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法でも得られる。
化合物（Ｉａｆｘ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１ｘ−４
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがハロゲン化カルボニルである式（Ｉａｈｘ）
0004142569.tif 000023
（式中、Ｚ１ｘはハロゲンを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２ｘがカルボキシである化合物（Ｉａａｘ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化カルボニルにおけるハロゲンは前記ハロゲンと同義である。
製造法１ｘ−５
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがハロゲン化低級アルキルである式（Ｉａｉｘ）
0004142569.tif 000024
（式中、Ｚ２ｘはハロゲン化低級アルキルを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２ｘが水酸基である化合物（Ｉａｊｘ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化低級アルキルにおけるハロゲンおよび低級アルキル部分はそれぞれ前記と同義である。
また、化合物（Ｉａｉｘ）は、例えば製造法１ｘで得られる化合物（Ｉａｊｘ）またはＲ２ｘがアミノである化合物（Ｉａｄｘ）に、前記同様適当な塩基存在下、５当量〜過剰量のジブロモエタンやジブロモプロパン等のジハロゲン化アルキル類を反応させることによっても得られる。
さらに、化合物（Ｉａｉｘ）は、例えば前記製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のハロゲン化低級アルキルを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｉｘ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１ｘ−６
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがイソシアナートである式（Ｉａｋｘ）
0004142569.tif 000025
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば、化合物（Ｉａｄｘ）をトルエン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、ホスゲンまたは塩化オキサリルと０〜１５０℃で１〜２４時間反応させるか、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応させた後に室温で分解させて得られる。
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがイソチオシアナート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）である化合物（Ｉａｐｘ）はホスゲンの代わりにチオホスゲンを用いる以外は上記の方法に従って製造することができる。
製造法１ｘ−７
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルである式（Ｉａｌｘ）
0004142569.tif 000026
（式中、Ｒ２ａｘはスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、通常のエステル合成方法に従って製造することができる。例えば、化合物（Ｉａａｘ）１モルに対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、置換もしくは非置換の水酸化アリール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシフタルイミド１〜１０モルを、１〜１０モルのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤存在下、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中、−２０〜１００℃で１〜２４時間反応させることによって目的物を得ることができる。より詳しくは、Ａ．Ｆｒａｄｅｔら［ポリマーブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、４巻、２０５頁（１９８１年）］、またはＫ．Ｇｅｃｋｅｌｅｒら［ポリマー  ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、１巻、６９１頁（１９７９年）］によるポリアルキレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法、カルボキシメチルポリアルキレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造方法等に準じて得ることができる。
ここで、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルは前記と同義である。水酸化アリールのアリール部分はアリールオキシカルボニルのアリール部分と同義であり、置換水酸化アリールの置換基は、置換アリールオキシカルボニルの置換基と同義である。
製造法１ｘ−８
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘがビニルスルホニルである式（Ｉａｍｘ）
0004142569.tif 000027
（式中、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば化合物（Ｉａｊｘ）を用いてＭａｒｇｈｅｒｉｔａ  Ｍｏｒｐｕｒｇｏらの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、７巻、３６３頁（１９９６年）］で製造することができる。
製造法１ｘ−９
化合物（Ｉａｘ）のうち、Ｒ２ｘが置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである式（Ｉａｎｘ）
0004142569.tif 000028
（式中、Ｒ２ｂｘは置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを表し、Ｒ１ｘ、Ｌｘ、Ｍｘ、ｎｘ、ｍｘ、ｑｘ、Ｘ１ａｘ、Ｘ２ｘおよびＸ３ｘはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＴａｌｉａ  ＭｉｒｏｎとＭｅｉｒ  Ｗｉｌｃｈｅｋの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に準じて、Ｒ２ｘが水酸基である化合物（Ｉａｊｘ）と過剰量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、エチルクロロホルメート等とをジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等の塩基存在下で反応させることで得られる。
また、化合物（Ｉａｎｘ）は、例えば製造法１ｘで示した方法に準じ、あらかじめＬｘを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上の置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａｘまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法で得ることもできる。
化合物（Ｉａｎｘ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
ここで、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシはそれぞれ前記と同義である。
製造法２ｘ：Ｘ１ｘがＳである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＳである化合物（Ｉｂｘ）は、例えば製造法１ｘと同様に、ポリオール類をポリハライド類に変換した化合物［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］または市販のポリハライド類と、ポリアルキレングリコール類Ａｘのチオール誘導体とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
また、化合物（Ｉｂｘ）は、前記の工程とは逆に、ポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリチオール類と反応させることによっても得ることができる。
ポリアルキレングリコール類Ａｘのチオール誘導体は市販のものを用いるか、Ｓａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってまとめられた方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］で調製できる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１ｘに準じる。
製造法２ｘ−１
化合物（Ｉｂｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、Ｘ１ｘが−Ｓ−である化合物を製造法２ｘに従って製造した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法３ｘ：Ｘ１ｘがＮＲ３ｘである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＮＲ３ｘ（式中、Ｒ３ｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｃｘ）は、例えば製造法１ｘと同様に、ポリオール類をポリアミン類に変換した化合物または市販のポリアミン類と、ポリアルキレングリコール類Ａｘのハロゲン化物もしくはトシル化物とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
化合物（Ｉｃｘ）は、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体をポリハライド類と反応させることによっても得ることができる。
また、化合物（Ｉｃｘ）はポリアルデヒド類１当量と、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体（該ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体は、ポリアルデヒド類の１つのホルミル基あたり１〜３０当量存在させる）とを、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、水、緩衝液等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、−２０〜１００℃でシアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤（該還元剤は、ポリアルデヒド類の１つのホルミル基あたり１〜３０当量用いる）の存在下で反応させることによっても得ることができる。
さらに、化合物（Ｉｃｘ）は、ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａｘのアルデヒド誘導体を用いても製造することができる。
前記ポリアルデヒド類としては市販の化合物をそのまま用いるか、ポリアルコール類を酸化して用いるか、あるいはポリカルボン酸類を還元して用いればよい。また、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアルデヒド誘導体としては市販の化合物を利用できるし、また、ポリアルキレングリコール類Ａｘの末端のアルコールを酸化して用いることもできる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１ｘに準じる。
製造法３ｘ−１
化合物（Ｉｃｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｃｘ）を製造法３ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて製造することができる。
製造法４ｘ：Ｘ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘまたはＲ６ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７ｘである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘ（式中、Ｒ４ｘおよびＲ５ｘはそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄａｘ）は、例えばγ−カルボキシグルタミン酸、クエン酸、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸等から選ばれるポリカルボン酸化合物をペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］に従い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中に溶解または懸濁し、次いでポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール等のアルコール体と、ポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩等の縮合剤を加え、さらにポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体を加えて反応させることによって得ることができる。反応は無水条件下、−２０℃〜１００℃で、１時間〜１０日間攪拌することによって行われる。
また、ポリカルボン酸分子中の１個以上のカルボキシをメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル等の適当な保護基で保護した後、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体を残りのカルボキシに前記の方法で導入し、続いてカルボキシの保護基を通常の脱保護法で除去することによって、Ｒ２ｘがカルボキシである３本鎖以上の分岐型ポリエチレングリコール誘導体を高純度に含む反応液を得ることもできる。この場合、カルボン酸の保護基の導入や該保護基の除去には通常のペプチドの合成法で用いられる方法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］を利用できる。ポリカルボン酸類中のカルボキシの配置は、立体配置を含めて何れでもよく、ポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体としては分子量分布が均一（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）であればいかなる平均分子量のものを用いてもよい。
また、化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ６ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７ｘ（式中、Ｒ６ｘおよびＲ７ｘはそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄｂｘ）は、前記工程とは逆に、ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａｘのカルボン酸誘導体の活性エステル、あるいはポリアルキレングリコール類Ａｘの酸ハライド誘導体とを反応させる方法でも得ることができる。ポリアルキレングリコール類Ａｘの酸ハライド誘導体はポリアルキレングリコール類Ａｘのカルボン酸誘導体をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で、１〜２４時間加熱することによって得ることができる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法４ｘ−１
化合物（Ｉｄａｘ）および化合物（Ｉｄｂｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｄａｘ）または化合物（Ｉｄｂｘ）を製造法４ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法５ｘ：Ｘ１ｘがＲ８ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯまたはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９ｘである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ８ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８ｘは前記と同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９ｘ（式中、Ｒ９ｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｅｘ）は、例えばポリアルキレングリコール類Ａｘとポリカルボン酸類、あるいはポリアルキレングリコール類Ａｘのカルボン酸誘導体とポリオール類の組合わせを用いて、脱水縮合により得ることができる。脱水縮合の方法としては通常のエステル合成で用いられるような、酸または塩基触媒下に脱水する方法か、あるいはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ピリジン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤で対応するアルコール体とカルボン酸を縮合する方法等を利用することができる。さらに、上記工程において酸ハロゲン化物と、対応するアルコール体を反応させることによっても目的物を合成できる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法５ｘ−１
化合物（Ｉｅｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｅｘ）を製造法５ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法６ｘ：Ｘ１ｘがＲ６ａｘ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨまたはＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏである化合物
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ６ａｘ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（式中、Ｒ６ａｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｆａｘ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
市販のポリアミン類、または前記製造法を組み合わせてポリオール類より調製したポリアミン類にポリアルキレングリコール類Ａｘのカーボネート誘導体を３モル以上反応させて、化合物（Ｉｆａｘ）を含む粗生成物が得られる。なお、ポリアルキレングリコール類Ａｘのカーボネート誘導体は、Ｔａｌｉａ  Ｍｉｒｏｎらの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に従って製造することができる。また、ポリアルキレングリコール類Ａｘのカーボネート誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、イミダゾリルカルボニルオキシ誘導体等を利用することができる。
化合物（Ｉｘ）のうち、Ｘ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ４ｘは前記と同義である）である化合物（Ｉｆｂｘ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
化合物（Ｉｆｂｘ）はポリオール類のカーボネート誘導体とポリアルキレングリコール類Ａｘのアミノ誘導体とを上記と同様に反応させることによって得ることができる。
他の製造法に準じて官能基の保護、脱保護を組み合わせることによって、化合物（Ｉｆａｘ）または化合物（Ｉｆｂｘ）を選択的に生成させることもできる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法６ｘ−１
化合物（Ｉｆｘ）のうち、Ｒ２ｘがカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｆｘ）を製造法６ｘに従って合成した後、製造法１ｘ−１〜製造法１ｘ−９に記載された方法を組み合わせて調製することができる。
Ｒ１ｘ−（Ｍｘ）ｎｘ−Ｘ１ｘをＬｘに結合して１本鎖化合物あるいは２本鎖化合物を取得し、同様の反応で前記と同一または異なるＲ１ｘ−（Ｍｘ）ｎｘ−Ｘ１ｘをＬｘに結合して、３本鎖以上の化合物を取得することもできる。例えば、製造法１ｘ〜製造法６ｘに示した方法のうちいずれかの反応を利用してＬｘ中の１個所あるいは２個所の官能基にポリアルキレングリコール類を結合させ、１本鎖あるいは２本鎖化合物を得る。生成する１本鎖あるいは２本鎖化合物の割合は、反応に使用するポリアルキレングリコール類と、Ｌｘ部分の構造を構築する原料の比を変えることで調節することができ、１本鎖あるいは２本鎖化合物を主成分にすることも可能である。得られた１本鎖あるいは２本鎖化合物はそのままの純度で、あるいは製造法１ｘに示した方法に準じてポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度に、あるいは高純度に精製して次のステップに使用することができる。
このようにして得られた１本鎖あるいは２本鎖化合物と、前記と同一または異なるポリアルキレングリコール類を製造法１ｘ〜製造法６ｘに示したいずれかの方法に準じて結合して、３本鎖以上の化合物が調製できる。なお、３本目以上のポリアルキレングリコール類は１本鎖あるいは２本鎖化合物を取得した反応と同様の反応に付すこともできるが、異なる反応に付し異なる結合様式を有するように調製してもよい。例えば、水酸基、アミノ、カルボキシ等の複数の官能基を有する化合物をＬｘ部分の構造を構築する原料に使用する場合、製造法１ｘに示した方法でＸ１ｘがＯである１本鎖あるいは２本鎖化合物をまず取得し、次いで製造法４ｘに示した方法で３本目以上のポリアルキレングリコール類をＸ１ｘがＲ４ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５ｘとなるように反応させることができる。以上のように製造法１ｘ〜６ｘの組合わせで複数のポリアルキレングリコール類が同一または異なる結合様式でＬｘに結合した３本鎖以上の化合物を得ることができる。さらに、使用するポリアルキレングリコール類は各反応の段階で分子量が異なっていてもよく、各々のポリアルキレングリコール類をＬｘに結合させる反応で異なる平均分子量のポリアルキレングリコール類を使用することで容易に目的物が得られる。
また、Ｌｘにポリアルキレングリコール類を導入する反応において、Ｌｘ中の１個所以上の官能基（例えば製造法１ｘの場合、１個所以上の水酸基）を残し、他の官能基を適当な保護基で保護してから、ポリアルキレングリコール類と反応、結合させ、その後、保護基を除去することも可能である。
本発明のポリアルキレングリコール類は、上記製造法で具体的に示された化合物以外であっても、上記製造法に準じて得ることができる。
なお、先にも述べたとおり、製造法１ｘ〜６ｘの各工程において、原料に用いるポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるが、Ｓａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙによってまとめられた各種の方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等によって容易に製造することも可能である。
得られたポリアルキレングリコール類はシリカゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、再結晶、抽出等の方法によって、ポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度の分岐型ポリアルキレングリコール類に精製することができる。
得られた分岐型ポリアルキレングリコール類は前記生理活性ポリペプチドのアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基に直接、あるいはスペーサーを介して結合させることができる。
スペーサーとしてはアミノ酸やペプチドが好ましいが、ポリアルキレングリコール類を結合することができればそれ以外であってもよい。アミノ酸としてはリジン、システイン等の天然アミノ酸等を用いることができ、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ホモシステイン等を用いることもできる。より好ましくは、システインがあげられる。ペプチドとしては、アミノ酸残基２〜１０からなるものが好ましい。アミノ酸、ペプチド以外のスペーサーとしては、グリセロール、エチレングリコール、糖等があげあれれる。ここで、糖としては、グルコース、ガラクトース、ソルボース、ガラクトサミン、ラクトース等の単糖類や二糖類等があげられる。
これらのスペーサーは、生理活性ポリペプチド分子中のリジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等の残基の側鎖とアミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等を介して結合するか、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基とアミド結合やエステル結合するかペプチドのＮ末端アミノ基とアミド結合する。これらの結合は、通常のペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］や遺伝子組換法を用いて行うことができる。
この場合、生理活性ポリペプチドを合成するのと同時にＣ末端カルボキシル基にスペーサーとなるアミノ酸、ペプチド等を導入することが望ましいが、生理活性ポリペプチドを合成した後にスペーサーを結合してもよい。また、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基等を化学合成的に活性化してスペーサーに結合することもできる。また、ポリアルキレングリコール類を予め結合したスペーサーを前記の方法で生理活性ポリペプチドに結合することもできる。
本発明で使用される抗体は、公知の手段［アンティボディーズ  ア  ラボラトリー  マニュアル、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８年）］を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
本発明で使用される抗体として、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片等があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体等があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であればいかなるものも用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のＣＤＲのアミノ酸配列をヒトの抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の適切な位置に移植した抗体を意味する。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片、相補性決定領域を含むペプチド等があげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖとも称す）は、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬとしては、本発明のモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも称す）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［プロテイン  エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、７巻、６９７頁（１９９４年）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のジスルフィド安定化抗体に含まれるＶＨあるいはＶＬとしてはモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
本発明で使用される化学修飾ポリペプチドとしては、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドが好ましく、この化学修飾ポリペプチドを含有する医薬も好ましい。また、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドを含有する医薬としては、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドを含有する多発性硬化症治療薬、肝炎治療薬、血管新生が関与する疾患の治療薬、悪性腫瘍治療薬、眼疾患治療薬、皮膚疾患治療薬等があげられるが、好ましいのは多発性硬化症治療薬である。
本発明の化学修飾ポリペプチドを含有する軟膏剤は、通常の軟膏剤調製法によって製造することができる。例えば、軟膏基剤としては水溶性薬剤の軟膏が調製可能なマクロゴール、ソルベース等の親水性基剤、親水軟膏、親水ワセリン、親水プラスチベース、精製ラノリン等の乳剤性基剤、ベントナイト、ビーガム、澱粉糊、アルギン酸ナトリウム等の無脂肪性基剤等を用いることができ、これらの軟膏基剤に化学修飾ポリペプチド水溶液、懸濁液、またはこれらの凍結乾燥粉末を０．００００００１〜１０％の重量比で混合し、文献［「薬剤学」（瀬崎ら）、平成４年発行、廣川書店］等に示された通常の軟膏剤の調製方法に従って練合することで調製される。これらの剤形には通常用いられる緩衝剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、酸化防止剤等の慣用の添加剤を添加して用いることもできる。
投与方法としては経皮的に、あるいは経粘膜的に本発明の軟膏剤を塗布する方法か、または他の許容される方法が可能であり、投与に適する組成物を用いることができる。また軟膏剤中の化学修飾ポリペプチドの配合量は疾患の種類、患者の状態等の条件によって異なるが、化学修飾ポリペプチド中の生理活性ポリペプチドが、軟膏剤１ｇ中に０．００００００１％〜１０％（重量比）で含まれていることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。実施例中の略号は特に断らない限り、それぞれ以下のことを意味する。なお、本明細書において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告［ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１３８巻、９頁（１９８４年）］に従った。
ＨＰＬＣ：Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ
ＦＡＢ  ＭＳ：Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂｅｒｅｄ  Ｍａｓｓ
ＵＶ：Ｕｌｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ
ＲＩ：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ
ＮＭＲ：Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）
ｍＰＥＧ：モノメトキシポリエチレングリコール（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）
ＩＦＮ：インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｈＩＦＮ：ヒトインターフェロン（ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｒｈＩＦＮ：組換えヒトインターフェロン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）
ｒｈＧ−ＣＳＦ：組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）
ＳＯＤ：スーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ｂＳＯＤ：ウシスーパーオキサイドディスムターゼ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ｈＳＯＤ：ヒトスーパーオキサイドディスムターゼ（ｈｕｍａｎ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ＤＳＣ：Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）
ＴＥＡ：トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）
Ｔｓ：ｐ−トルエンスルホニル（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）
ＴｓＣｌ：ｐ−塩化スルホニルトルエン（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）
ＬＡＨ：水素化アルミニウムリチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｉｄｅ）
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＣＤＩ：Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（Ｎ，Ｎ’−ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ）
実施例１  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）
構造：
0004142569.tif 000029
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール二水和物（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）（Ｆｌｕｋａ社製）４２０．５ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ３．２ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン気流中、アセトニトリル２０ｍｌに溶解し、ＴＥＡ２．１ｍｌ（１２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、クロロホルムおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えて抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）シクロヘキサン［ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｔｒｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ］３５７ｍｇ（０．６４ｍｍｏｌ）を得た（収率：２５．７％）。
次に、モノメトキシポリエチレングリコールプロピルアミン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）（ｍＰＥＧ−ＮＨ２）［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、および上記のｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）シクロヘキサンを塩化メチレン１２．５ｍｌに溶解し、ＴＥＡ２８μｌを加え、室温で２時間攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、残渣を４７２ｍｇ取得した（収率９４．４％）。そのうち、３７２ｍｇを逆相ＨＰＬＣで精製した。カラムにはＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ１２０−Ｔ（３０ｍｍ×２５０ｍｍ）（東ソー）を用い、０．１％ＴＦＡ水溶液を移動相として、１０ｍｌ／分の流量で流し、０〜９０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させた。平均分子量１０，０００の目的の画分３０ｍｌを回収し、減圧下アセトニトリルを除去し、クロロホルムで抽出した。これをジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を濾取し減圧乾燥して目的物１２１．７ｍｇを得た（回収率３２．７％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．７ｍｌ／分
検出：ＲＩ
分離カラム：ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）（東ソー）
カラム温度：室温
保持時間：１２．２分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６１（ｓ，８ｎＨ），３．４１（ｓ，６Ｈ），４．６９（ｂｒ，４Ｈ），１．７７（ｂｒｍ，４Ｈ），５．３０（ｂｒ，２Ｈ），０．８−３．４（ｍ，９Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ）
実施例２  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）
構造：
0004142569.tif 000030
８４．０ｍｇ（０．３８８ｍｍｏｌ）のｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｆｌｕｋａ社製）をＤＭＦ５０ｍｌに溶解し、２７０．２ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔおよび１．０４ｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰを加えて０℃で３０分間攪拌した。５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）のモノメトキシポリエチレングリコールプロピルアミン［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］、続いて２１９．７μｌ（１．９ｍｍｏｌ）のＮＭＭを加え、一昼夜攪拌した。１ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を回収し、目的の化合物を含む粗生成物を３．７８ｇ（収率７５．６％）取得した。次に、３００ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。水に溶解した粗生成物をカラムに添加し、さらに水６００ｍｌでカラムを洗浄した後、０．６〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。その後、目的物の画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧下除去して目的物を６１０．４ｍｇ（収率６５．２％）取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．０分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．５６（ｍ，３Ｈ），２．１−２．５（ｍ，６Ｈ），１．７７（ｍ，４Ｈ），２．１−２．３（ｂｒ，４Ｈ），３．３８（ｂｒ，４Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３６（ｓ，６Ｈ），６．４６（ｔ，Ｊ＝５．２３Ｈｚ，２Ｈ）
実施例３  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）
構造：
0004142569.tif 000031
ｍＰＥＧ［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５０ｇ（１０ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのトルエンに溶解し、脱水還流した。ＴＥＡ３．５ｍｌ（２５ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間かけて、臭化チオニル（１．５５ｍｌ）をあらかじめトルエン（１３．６ｍｌ）に溶解した溶液を滴下した。１時間還流した後、セライトを用いて濾過し、４時間室温で静置した。次に５０℃に加熱して活性炭を５ｇ加えた。セライトを用いて活性炭を除去し、４℃で１昼夜静置した。翌日、上清を除去した後、残渣を６０℃のエタノール２５０ｍｌへ溶解した。そこへ３ｇの活性炭を加え、セライトを用いて活性炭を除去した後、４℃で一昼夜静置した。翌日、残渣を冷エタノールとジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した後、臭素化したｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−Ｂｒ）を３２．８７ｇ（収率６５．７４％）取得した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール二水和物（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）１．３２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を十分乾燥後、無水ＤＭＦ２５ｍｌに溶解し、アルゴン気流中、水素化ナトリウム０．４８ｇ（１１ｍｍｏｌ）へ滴下し、３０分間攪拌した。そこへＤＭＦ２５ｍｌに溶解した上記のｍＰＥＧ−Ｂｒ１０ｇ（２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、沈殿を減圧下乾燥した。次に、乾燥した粉末を適量の水に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解し、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥してｍＰＥＧがシクロヘキサントリオール（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ）に１分子結合した１本鎖型粗生成物を７．５ｇ（収率７５．０％）取得した。
得られた粗生成物５ｇにトルエン５０ｍｌを加え、一昼夜脱水還流を行った。また、ｍＰＥＧ−Ｂｒ５．５ｇ（１．１ｍｍｏｌ）をトルエン５０ｍｌに溶解し、１６０℃で一昼夜脱水還流を行った。次に、上記粗生成物のトルエン溶液に水素化ナトリウム１４４ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した後、ｍＰＥＧ−Ｂｒのトルエン溶液を滴下し、一昼夜脱水還流を行った後、濾過して不溶物を除去し、減圧下乾燥した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下除去し、残渣に塩化メチレン少量を加えて溶解した後、ジエチルエーテルに滴下した。生成した白色沈殿を減圧乾燥し、目的の化合物を含む粗生成物を７．７３ｇ（収率７３．６％）取得した。
粗生成物１．５ｇを８％水酸化カリウム水溶液に溶解した後、アクリルアミド１５０ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で７時間攪拌した。さらにアクリルアミド１５０ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４日間攪拌した。反応液を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾別し、減圧乾燥して粗目的物１．０１７ｇ（６７．８％）を得た。
６０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に添加し、０．４〜１．４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。目的物を含む画分をクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧除去し、目的物を５２ｍｇ取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．５９（ｔ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，２Ｈ），０．８−３．４（ｍ，９Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例４  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）
構造：
0004142569.tif 000032
ｍＰＥＧ［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］４００ｇ（８０ｍｍｏｌ）をトルエン１Ｌおよび塩化メチレン５００ｍｌの混合溶媒に溶解した。ＴｓＣｌ５０ｇ、次いでＴＥＡ４６．４ｍｌを加え、室温で８時間攪拌した。次にＴｓＣｌ５０ｇを添加し、１６時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を少量のクロロホルムに溶解して、ジエチルエーテル中に滴下した。生成した白色沈殿を回収し、減圧下で乾燥してトシルエステル化ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＴｓ）３４４ｇを得た（収率８６．０％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．４５（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，４ｎＨ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）
ｍＰＥＧ−ＯＴｓ３４４ｇをＤＭＦ１Ｌに溶解後、ヨウ化ナトリウム５４ｇを加え、８０〜９０℃で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。残渣を１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液１．５Ｌに溶解し、しばらく攪拌した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を減圧除去し、ヨウ素化したｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−１）３１４ｇを得た（収率７８．５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．２７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｓ，４ｎＨ）
４０ｇのｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Ｆｌｕｋａ社製）をｎ−プロパノール１Ｌおよび濃硫酸２０ｍｌに溶解し、室温で７２時間攪拌した。その後、反応液に適当量の酢酸エチルを添加し、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸ｎ−プロピルエステル（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｎｐｒｏｐｙｌ  ｅｓｔｅｒ）７２．４ｇ（収率：定量的）を得た。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．９４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，９Ｈ），１．６５（ｍ，６Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．５６，２．２５，２．４０（各々ｍ，計９Ｈ）
１．１９ｇのＬＡＨを５０ｍｌのジエチルエーテルに溶解後、アルゴン雰囲気下、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸ｎ−プロピルエステル３．２ｇのジエチルエーテル溶液１２．５ｍｌを滴下した。さらに攪拌しながら４１時間還流した。次いで、水２．５ｍｌを滴下し、そのまま１５分間攪拌した。さらにエタノール５ｍｌを滴下し、室温で３時間攪拌した。反応液を濾過し、不溶物を沸騰エタノールで抽出した。このエタノール溶液を先程の濾液と合わせ、溶媒を減圧下除去した。得られた残渣を沸騰１，４−ジオキサンで抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  ｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）１．５０ｇ（収率９１．７％）を得た。
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋１７５
理論値：Ｃ９Ｈ１８Ｏ３＝１７４
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．２１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，６Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，３Ｈ），０．４３，１．４０，１．７５（各々ｍ，計９Ｈ）
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール２．５ｇ（１４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ１０ｍｌに溶解し、０℃、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム２．２８ｇ（４６．２ｍｍｏｌ）へ滴下し、３０分間攪拌した。そこへＤＭＦ５０ｍｌに溶解した４０ｇ（８ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ−１を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧下乾燥させた。次に、乾燥させた上記の沈殿を適量の水に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して、ｍＰＥＧがｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールに２分子結合した２本鎖型粗生成物３３．０ｇ（８３．０％）を得た。
この粗生成物１４．０ｇを８％水酸化カリウム水溶液に溶解した後、アクリルアミド１．１８ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で７時間攪拌した。さらにアクリルアミド１．１８ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４日間攪拌した。反応液を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗生成物１０．２ｇ（７３％）を得た。この粗生成物を１０００ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて精製した。溶出は０．４〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で行った。目的物を含む画分をクロロホルムで抽出し、クロロホルム層から減圧下溶媒除去し、残渣をジエチルエーテルで沈殿させて目的物を５００ｍｇ得た。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），０．８５，１．２６（各々ｍ，計９Ｈ）
実施例５  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＵ）
構造：
0004142569.tif 000033
実施例４と同様にして、ｍＰＥＧがシクロヘキサントリメタノールに２分子結合した２本鎖粗生成物を取得した。この粗生成物２．７ｇを実施例１に示したＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ１２０−Ｔカラムを用いた逆相ＨＰＬＣで精製し、２本鎖ＰＥＧ誘導体のみを含む画分を回収した。この画分から減圧下、アセトニトリルを除去し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥し２２７ｍｇの２本鎖ＰＥＧ誘導体を得た（粗生成物からの収率８．４％）。２本鎖ＰＥＧ誘導体２０ｍｇ（２μｍｏｌ）を減圧乾燥し、１．２ｍｇ（１０μｍｏｌ）のＤＭＡＰおよび２．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）のＤＳＣを加え、塩化メチレンを１ｍｌ添加してアルゴン気流中室温で６時間攪拌した。反応液を濾過し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。生成した沈殿を回収し、減圧乾燥して、目的物を１５ｍｇ得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．５−２．０（ｍ，９Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ），３．６１（ｓ，８ｎＨ），３．４１（ｓ，６Ｈ）
実施例６  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＱＮＡ（２ＵＡ）、５ＱＮＡ（３ＵＡ）、５ＱＮＡ（４ＵＡ）
構造：
0004142569.tif 000034
式中、化合物５ＱＮＡ（２ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち２つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの２つが水素原子である。化合物５ＱＮＡ（３ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち３つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの１つが水素原子である。化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の全てがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−である）
３ｍｇの（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−（−）キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）を乾燥ＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１７μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。さらに３４４ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）を添加し、室温で１時間攪拌した。１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物３０６ｍｇ（８８％）を得た。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例２と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して以下の化合物を得た。
化合物５ＱＮＡ（２ＵＡ）の収量は３６ｍｇ（収率１０．５％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１２．４分であった。化合物５ＱＮＡ（３ＵＡ）の収量は２４ｍｇ（収率１０．２％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１１．７分であった。化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）の収量は１７ｍｇ（収率５．４％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１１．１分であった。なおゲル濾過ＨＰＬＣはＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．７−４．８（ｍ，３Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈまたは９Ｈまたは１２Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨまたは１２ｎＨまたは１６ｎＨ）
実施例７  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキセン誘導体の合成
略号：５ＳＫＡ（２ＵＡ）、５ＳＫＡ（３ＵＡ）
構造：
0004142569.tif 000035
式中、化合物５ＳＫＡ（２ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３のうち２つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの１つが水素原子である。化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３の全てがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−である）
３．２ｍｇのシキミ酸を乾燥ＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１５μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。さらに３００ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）を添加し、室温で１時間攪拌した。１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物２７０ｍｇ（８９％）を得た。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例２と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して目的化合物を得た。
化合物５ＳＫＡ（２ＵＡ）の収量は４ｍｇ（収率１．３％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１２．４分であった。化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）の収量は１８ｍｇ（収率６．０％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１１．７分であった。なおゲル濾過ＨＰＬＣはＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．６−５．１（ｍ，４Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈまたは９Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨまたは１２ｎＨ）
実施例８  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＲａ）
構造：
0004142569.tif 000036
実施例４と同様にして合成したｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール５０ｍｇを脱水ＤＭＦ０．５ｍｌに溶解した後、水素化ナトリウム１７ｍｇを添加し、０℃で１５分間攪拌した。３−ブロモプロピオンアルデヒドジメチルアセタール４７μｌを添加し、室温で１６時間攪拌した。シリカゲルカラムで精製し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールの１位にプロピオンアルデヒドジメチルアセタール（ｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｌ）が結合した化合物を１５ｍｇ得た（収率３８％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６２（ｍ，９Ｈ），１．５４−１．８８（ｍ，９Ｈ），１．８３（ｑ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，４Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｔ，Ｊ＝５．７０Ｈｚ，１Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋２７７
理論値：Ｃ１４Ｈ２８Ｏ５＝２７６
得られた化合物１５ｍｇを脱水ＤＭＦ１ｍｌに溶解し、３１μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。５９８ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）を添加し、室温で２時間攪拌した。溶液を１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。得られた白色固体５７８ｍｇを実施例１と同様な逆相ＨＰＬＣで精製し、３８３ｍｇを得た。このうち１００ｍｇを７０％酢酸水溶液に溶解し、４０℃で１６時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応液を中和し、クロロホルムで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下反応液を濃縮した。ジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。逆相ＨＰＬＣで再度精製し、目的物を３９ｍｇ得た（収率４１％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），９．７９（ｔ，Ｊ＝１．５６Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ）
実施例９  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＭ）
構造：
0004142569.tif 000037
実施例４と同様にして合成したｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール１００ｍｇおよびＤＳＣ７３５ｍｇを約１０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、ＤＭＡＰ２１０ｍｇを加えて室温で５時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、塩化メチレンおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を適量加え抽出した。有機層を減圧乾燥し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシメチル）シクロヘキサン［ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｔｒｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ］を３３３ｍｇ得た（収率９７％）。
ＦＡＢ−ＭＳ：５９８（Ｍ＋Ｈ）＋
得られた化合物３０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）とｍＰＥＧ−ＮＨ２［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、ＴＥＡ２０μｌを加え、室温で２時間攪拌した。続いて、プロピレンジアミン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ）４２μｌ（０．５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ製）を加え、室温でさらに２時間攪拌した。反応液を濾過し濾液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して４３０ｍｇの粉末を得た（収率８６％）。
得られた粉末４２５ｍｇを水２００ｍｌに溶解し、２０ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、２本鎖ＰＥＧを含む目的画分よりクロロホルムで抽出し、得られた有機層をジエチルエーテルに滴下し、精製した沈殿を減圧乾燥した。得られた沈殿６２．５ｍｇ（６．２５μｍｏｌ）を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液０．５ｍｌに溶解し、氷冷下、エトキシカルボニルマレイミド２．１ｍｇを加えて１０分間攪拌した。続いて水１．５ｍｌを加え室温で１５分間攪拌し、クロロホルムで３回抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去し２５ｍｇの目的化合物を得た（収率４０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６３−０．７５（ｍ，３Ｈ），１．７５−１．７８（ｍ，１２Ｈ），３．１−３．３（ｍ，１２Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），５．２０（ｂｒ，３Ｈ），６．７３（ｓ，２Ｈ）
実施例１０  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）
構造：
0004142569.tif 000038
実施例４と同様にして合成したｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール１００ｍｇを脱水ＤＭＳＯ２３ｍｌに溶解した後、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウムのｔｅｒｔ−ブタノール溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）９５８ｍｌを添加し、室温で１時間攪拌した。ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを添加し、９０℃で１６時間攪拌した。室温まで放冷した後、シリカゲルカラムで精製し、１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）を２２ｍｇ得た（収率１３％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６０（ｍ，９Ｈ），１．５５−１．９０（ｍ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），３．３６（ｄ，Ｊ＝６．４２Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝６．１５Ｈｚ，４Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋２８９
理論値：Ｃ１５Ｈ２８Ｏ５＝２８８
上記で得られた化合物２２ｍｇをアルゴン雰囲気下、脱水ピリジン２００μｌに溶解し、そこへ塩化トシル（２３ｍｇ）を溶解した脱水ピリジン２００μｌを添加した。０℃で３時間攪拌した後、水を２０μｌ添加し、さらにその後１００μｌ添加した。反応液を氷冷したクロロホルムで抽出し、氷冷した１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の順で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、シリカゲルカラムで精製することにより、１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−３−Ｏ，５−Ｏ−ジトシル−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−３−Ｏ，５−Ｏ−ｄｉｔｏｓｙｌ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  ｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）を２２ｍｇ得た（収率４８％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．２６（ｍ，９Ｈ），１．７５（ｍ，９Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），２．４６（ｓ，６Ｈ），３．２９（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｍ，４Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．１０Ｈｚ，２Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ＋２Ｈ）＋５４１
理論値：Ｃ２９Ｈ４０Ｏ９Ｓ２＝５９６
１．４ｇのｍＰＥＧ（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）を脱水トルエン２ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム２６ｍｇへ滴下し、３０分間攪拌した。そこへ脱水トルエン５００μｌに溶解した７６ｍｇの１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−３−Ｏ，５−Ｏ−ジトシル−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールを滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。得られた白色固体１．２ｇを１２０ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラムで実施例２と同様に精製し、目的物を１５４ｍｇを得た（収率１１％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），０．５８（ｍ，９Ｈ），１．７２−１．９３（ｍ，９Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例１１  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−トリアジン誘導体の合成
略号：ＰＥＧ２Ｃｌ
構造：
0004142569.tif 000039
平均分子量５，０００のｍＰＥＧ［日本油脂（株）社製］２．０ｇ、酸化亜鉛４４４ｍｇ、乾燥ベンゼン１０ｍｌをナスフラスコに入れ、オイルバスで９０〜９５℃に加熱し、初留４ｍｌを除去した。さらに、５時間還流し、室温まで冷却後、塩化シアヌル３６ｍｇ、モレキュラーシーブス４Ａ１ｇを加え、３日間脱水還流した。反応液を冷却後、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を回収し、減圧乾燥した。得られた白色粉末１ｇをγ−アミノ酪酸３０ｍｇを含む０．１ｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ１０．０）１０ｍｌに溶解し、４℃で３日間反応した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ１〜２に調整した後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を濃縮し、ジエチルエーテルに滴下して生成した沈殿９３０ｍｇを回収した。これを９３０ｍｌの水に溶解し、８０ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を回収し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ１〜２に調整した後、適当量のクロロホルムで抽出し、減圧濃縮した。濃縮液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥し、目的物を６１８ｍｇ得た（収率６２％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様に分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９２Ｈｚ），１．９５（ｍ，２Ｈ），５．６６（ｂｒｔ，Ｊ＝６．３３Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｂｒｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｂｒｓ，８ｎＨ）
実施例１２  ６ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−トリアジン誘導体の合成
略号：ＰＥＧ２Ｍａｌ
構造：
0004142569.tif 000040
２．０ｍｌの１，３−ジアミノプロパン（２０当量、２４ｍｍｏｌ）を０．１ｍｏｌ／ｌのほう酸緩衝液（ｐＨ１０）６００ｍｌに溶解し、実施例１１で調製した化合物６ｇを加えて一昼夜攪拌した。２ｍｏｌ／ｌの塩酸を加えてｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下除去し、残渣に塩化メチレン少量を加えて溶解した後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥して２，４−ビス［メトキシポリ（エチレングリコール）］−６−Ｎ−（３−アミノプロピル）アミノ−ｓ−トリアジン｛２，４−Ｂｉｓ［ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］−６−Ｎ−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ｝を４．４８ｇ得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ），４．４４（ｂｒｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．４９（ｂｒｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．１３Ｈｚ，），６．０２（ｂｒｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７４Ｈｚ），２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４７Ｈｚ），１．７１（ｍ，２Ｈ）
６７６ｍｇ（８ｍｍｏｌ）のマレイミドを酢酸エチル４０ｍｌに溶解し、氷冷下、Ｎ−メチルモルホリン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）を８７８μｌ（８ｍｍｏｌ）加え、続いてエトキシカルボニルクロリド（ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）９４６μｌ（９．６ｍｍｏｌ、１．２当量）加えて、３０分間攪拌した。反応液を濾過し、濾液を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、酢酸エチル−ジエチルエーテル系で再結晶してＮ−エトキシカルボニルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）を６５４ｍｇ得た（収率５５．６％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．８２（ｓ，２Ｈ），４．４２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．００Ｈｚ），１．４２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０９Ｈｚ）
上記で合成した２，４−ビス［メトキシポリ（エチレングリコール）］−６−Ｎ−（３−アミノプロピル）アミノ−ｓ−トリアジン｛２，４−Ｂｉｓ［ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］−６−Ｎ−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ｝４．４８ｇ（０．４４８ｍｍｏｌ）を氷冷下、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液４５ｍｌに溶解し、Ｎ−エトキシカルボニルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）１５１．５ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ）を加えて０℃で１０分間攪拌した。水を１８０ｍｌ加え、さらに室温で１５分間攪拌した。クロロホルムで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解し、ジエチルエーテルに滴下した。生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して目的物｛２，４−ビス［メトキシポリ（エチレングリコール）］−６−Ｎ−（３−マレイミドプロピル）アミノ−ｓ−トリアジン［２，４−Ｂｉｓ［ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］−６−Ｎ−（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ］｝を３．９ｇ得た（収率８６．７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６６（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ），６．７３（ｓ，２Ｈ），４．４６（ｂｒｍ，４Ｈ），５．７６（ｂｒｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７４Ｈｚ），２．６１（ｂｒｔ，２Ｈ），１．８５（ｍ，２Ｈ）
実施例１３  ５ＫＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−オルニチン誘導体の合成
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）
構造：
0004142569.tif 000041
１０ｇ（２ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ（平均分子量５，０００、日本油脂（株）製）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、ＤＳＣ２．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ１．２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を２００ｍｌのジエチルエーテル中に滴下し、沈殿させた。白色沈殿を濾取して減圧乾燥し、ｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅを８．６ｇ（収率８６．０％）得た。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６７（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ）
次に、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｉｎｅ）塩酸塩３３７．２ｍｇ（ナカライテスク製）を７５ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）１０ｎｌに溶解し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ１．０ｇを少しずつ加えて溶解した。１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を加えながら溶液のｐＨを７．８に維持し、室温で一昼夜攪拌した。１ｍｏｌ／ｌの塩酸でｐＨ３に調整した後、クロロホルムで抽出した。有機層から減圧下溶媒除去し、残渣を少量の塩化メチレンに溶解してジエチルエーテル中で沈殿させた。白色沈殿を濾取し、ｍＰＥＧが１分子結合したオルニチンを７６０．２ｍｇ得た（収率７６．０％）。これを、塩化メチレンに溶解し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ７６０．２ｍｇ加え、さらにＴＥＡ２１．２μｌを加えてアルゴン気流中、室温で一昼夜攪拌した。不溶物を濾別後、減圧下、溶媒を除去し、水５０ｍｌを加えて１ｍｏｌ／ｌ塩酸でｐＨ３に調整した。クロロホルムで抽出し減圧濃縮した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解してジエチルエーテル中に滴下し、生成した白色沈殿を濾取し１．２１ｇを得た（収率７９．６％）。６０ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的物を４１６ｍｇ取得した（収率３４．４％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．２１（ｂｒ，１Ｈ），５．５７（ｂｒ，１Ｈ），４．１−４．４（ｂｒｍ，４Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ），１．５−２．０（ｍ，６Ｈ）
実施例１４  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−オルニチン誘導体の合成
略号：５ＯＲＮ（２ＲａＡ）
構造：
0004142569.tif 000042
オルニチン（Ｏｒｎｉｔｉｎｅ）塩酸塩２４ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）（ナカライテスク製）をメタノール１０ｍｌに懸濁し、ＰＥＧ−アルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量５，０００）１．５ｇ（０．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で攪拌した。ソディウムシアノボロヒドリド（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）８９．５ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜攪拌した。さらにソディウムシアノボロヒドリド（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）４４．８ｍｇ（０．７ｍｍｏｌ）を追加し、攪拌した。その後、適量の水を加え、減圧下メタノールを除去した後、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去し、１．２５ｇの粗生成物を得た（収率８３．０％）。
次に、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（１２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて精製し、目的物１６５ｍｇを取得した（収率１３．３％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．６−２．１（ｍ，４Ｈ），３．０−３．３（ｍ，６Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），４．６８（ｂｒ，１Ｈ），４．７２（ｂｒ，１Ｈ）
実施例１５  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ジアミノプロピオン酸誘導体の合成
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）
構造：
0004142569.tif 000043
１０ｇ（２ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ（平均分子量５，０００、日本油脂（株）製）を塩化メチレンに溶解し、ＤＳＣ２．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ１．２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌した。不溶物を濾別し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。白色沈殿を濾取して減圧乾燥し、ｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅを８．６ｇ（収率８６．０％）得た。
次に、２，３−ジアミノプロピオン酸塩酸塩（２，３−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）２８１．１ｍｇ（２ｍｍｏｌ）（ナカライテスク製）を７５ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）１０ｍｌに溶解し、１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ１．０ｇを少しずつ加えて溶解した。１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加えながら溶液をｐＨ８．５に維持し、室温で一昼夜攪拌した。１ｍｏｌ／ｌ塩酸でｐＨ３に調整した後、クロロホルムで抽出した。有機層から減圧下溶媒除去し、ｍＰＥＧが１分子結合した２，３−ジアミノプロピオン酸を７３０．０ｍｇ得た（収率７３．０％）。これを、塩化メチレンに溶解し、先に調製したｍＰＥＧのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ７３０．０ｍｇ加え、さらにＴＥＡ２０．４μｌを加えてアルゴン気流中、室温で一昼夜攪拌した。不溶物を濾別後、減圧下、溶媒を除去し、残渣を１．１８ｇを得た（収率８０．８％）。６０ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的物を５０７ｍｇ（収率４２．９％）取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．１分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．００（ｂｒ，１Ｈ），５．７０（ｂｒ，１Ｈ），４．１〜４．４（ｂｒｍ，４Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例１６  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−トリシン誘導体の合成
略号：５ＴＲＣ（３ＵＡ）
構造：
0004142569.tif 000044
０．５ｍｇ（２．８μｍｏｌ）のトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）（Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ、ナカライテスク社）と５０ｍｇ（１．０μｍｏｌ）のｍＰＥＧ−ＮＣＯ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量５，０００、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）をアルゴン気流下０．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、１．４μｌ（１．０μｍｏｌ）のＴＥＡを加え、さらに少量の塩化銅を加え、室温で攪拌した。さらに、２５ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯおよび１μｌのＴＥＡを追加して攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を５０ｍｌ加えた後、５０ｍｌのクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去し、粗生成物１５ｍｇを取得した（収率２０％）。次に、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）カラムで精製し、目的物を６．０ｍｇ取得した（収率８．０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ）（東ソー）を用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１１．５分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈ）、３．６４（ｓ，１２ｎＨ）、４．１０（ｓ，６Ｈ）、５．４３（ｂｒ，３Ｈ）
実施例１７  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）
構造：
0004142569.tif 000045
ペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをアルゴン気流中ＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ７７８ｍｇを加え、一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ２）５．０ｇをＤＭＦ１０ｍｌに溶解し、前述した反応混合物１．２５ｍｌを加え、室温で攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ１０）１００ｍｌにγ−アミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）２．６ｇを溶解した溶液を氷冷し、ここに反応液を注いだ。反応終了後、塩酸でｐＨを酸性に調整し、クロロホルムで抽出し、残渣を４．２ｇ得た（８４．６％）。残渣３．８ｇを１０００ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的物を２５４ｍｇ得た（収率６．７％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．４４（ｂｒｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ），５．２５（ｂｒ，１Ｈ），４．０９（ｂｒｓ，８Ｈ），３．６５（ｓ，１２ｎＨ），３．２９（ｓ，９Ｈ），３．２６（ｍ，８Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．８０（ｂｒｍ，２Ｈ），１．７７（ｍ，６Ｈ）
実施例１８  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＭ）
構造：
0004142569.tif 000046
ペンタエリスリトール１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ７７８ｍｇを加えてアルゴン気流中で一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ２）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物０．２５ｍｌを加え、室温で反応させた。続いて１８７μｌのプロピレンジアミンを加えて反応後、ジエチルエーテルを加えた。白色沈殿を回収し、減圧乾燥して残渣９７５ｍｇを得た（収率９７．５％）。この残渣を１００ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、白色粉末１１０ｍｇを得た（収率１１．３％）。
次に、この白色粉末１００ｍｇを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、０℃でエトキシカルボニルマレイミド２．３ｍｇを加え、さらに０℃で１０分間攪拌した。水を加え室温で１５分間攪拌後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を減圧濃縮後、ジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を減圧乾燥し、目的物３５ｍｇを得た（収率３５％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．３分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．７３（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｂｒ，３Ｈ），４．０８（ｂｒｓ，８Ｈ），３．６４（ｓ，１２ｎＨ），３．３６（ｓ，９Ｈ），３．２５（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｍ，８Ｈ）
実施例１９  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）
構造：
0004142569.tif 000047
ペンタエリスリトール１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ６８１ｍｇを加えて、アルゴン気流中で攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物２８６μｌを加え、室温で反応した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を回収して減圧乾燥し、残渣を１ｇ得た（収率１００％）。続いて残渣をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、東ソー）を用いて精製し、白色粉末を１６５ｍｇ得た（収率１６．５％）。
次に、この白色粉末８０ｍｇを塩化メチレンに溶解し、ＤＳＣ４．１ｍｇ、ＤＭＡＰ２．１ｍｇを加え、アルゴン気流中室温で攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、目的物を６３ｍｇ得た（収率７８．８％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１０．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．４９（ｂｒ，３Ｈ），４．１１（ｂｒｓ，８Ｈ），３．６４（ｓ，１２ｎＨ），３．３８（ｓ，９Ｈ），３．２５（ｍ，６Ｈ），２．８７（ｓ，４Ｈ），１．７８（ｍ，８Ｈ）
実施例２０  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＲａ）
構造：
0004142569.tif 000048
ペンタエリスリトール１３６ｍｇ、ＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ６８１ｍｇを加えてアルゴン気流中で攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物２８６μｌを加え、室温で反応した。応液をジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を回収して減圧乾燥し、残渣を９５０ｍｇ得た（収率９５％）。続いて残渣をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、東ソー）を用いて精製し、白色粉末を３００ｍｇ得た（収率３１．６％）。
次に、この白色粉末３００ｍｇを塩化メチレンに溶解し、ＤＳＣ１５．４ｍｇ、ＤＭＡＰ７．３ｍｇを加え、アルゴン気流中室温で攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥した。塩化メチレン１ｍｌを加えて溶解し、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｅｔｈｙｌａｅｔａ）３．５μｌを加え、室温で攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、残渣を２５０ｍｇ得た（収率８３．３％）。
残渣１００ｍｇを１０％ＴＦＡを含む塩化メチレンに溶解し、０℃で１時間静置後、ジエチルエーテルに滴下して白色沈殿を減圧乾燥し、４０ｍｇの目的物を得た（収率４０．０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１０．６分
実施例２１  ３〜４本鎖分岐型ポリエチレングリコール−糖誘導体の合成
略号：５ＳＵＧ（３ＵＡ）、５ＳＵＧ（４ＵＡ）
構造：
0004142569.tif 000049
（式中、化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち３つがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−であり、残りの１つが水素原子である。化合物５ＳＵＧ（４ＵＡ）においてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の全てがＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−である）
５．１８ｇのα−Ｄ−グルコースペンタアセテートをＤＭＦ８０ｍｌに溶解し、２．３７ｇのヒドラジンアセテートを添加し、室温で１．５時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出後、酢酸エチル層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶液を減圧濃縮して、α−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４，６−テトラアセテート（α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ−２，３，４，６−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）を４．０ｇ得た（収率８７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｍ，１Ｈ），５．０９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）
８５０ｍｇの上記化合物を塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、０℃にて４．８ｍｌのトリクロロアセトニトリル、３６５ｍｌのＤＢＵ（１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ）を添加した。溶液を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、α−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４，６−テトラアセテート１−（２，２，２−トリクロロエタンイミデート）（α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ−２，３，４，６−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ−１−（２，２，２−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｉｍｉｄａｔｅ））を６３５ｍｇ得た（収率５３％）
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．５７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ），６．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），８．７１（ｓ，１Ｈ）
６９３ｍｇの上記化合物と１０９μｌのグリコール酸メチルを塩化メチレンに溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で攪拌した。反応液を冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルと脱水塩化メチレンの混合溶液（２：１）１６３μｌを添加し、一昼夜攪拌した。７７μｌのトリエチルアミンを添加し、セライトで濾過した。溶液を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］酢酸メチルエステル［（２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒを１６２ｍｇ得た（収率２７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：２．０１（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．０５（ｍ，１Ｈ），５．０９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），５．２５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ）
１６２ｍｇの上記化合物をメタノール１ｍｌに溶解し、アンバーリストを添加した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２８％）９．４μｌを添加し、室温で攪拌した。反応液をセライトで濾過し、濾液を減圧下濃縮して［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］酢酸メチルエステル［（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒを８０ｍｇ得た（収率８２％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ）＞
（ｐｐｍ）：３．３９（ｓ，２Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），３．６９（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ）４．４４（ｍ，１Ｈ）
２ｍｇの上記化合物をＤＭＦ１００μｌに溶解し、７μｌのトリエチルアミン、少量のＣｕＣｌを添加した。２４０ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯを添加し、攪拌した。溶液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を回収し、減圧乾燥した。得られた白色固体２００ｍｇを１ｍｏｌ／Ｌ炭酸カリウム水溶液に溶解し、室温で４時間攪拌した。反応液にクロロホルムおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加し、クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧乾燥し、白色固体１９５ｍｇを得た。２０ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、下記に示す化合物を得た。
化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）の収量は６ｍｇ（収率５．０％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１０．８分であった。化合物５ＳＵＧ（４ＵＡ）の収量は１２ｍｇ（収率７．６％）でありゲル濾過ＨＰＬＣでの保持時間は１０．４分であった。なおゲル濾過ＨＰＬＣはＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈまたは１２Ｈ），３．６４（ｔ，１２ｎＨまたは１６ｎＨ），４．１〜５．６（ｍ，７Ｈ）
実施例２２  １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール誘導体の合成
略号：１０ＳＣＭ
構造：
0004142569.tif 000050
Ｓ．ＺａｌｉｐｓｋｙとＧ．Ｂａｒａｎｙの方法［ジャーナル  オブ  バイオアクティブ  アンド  コンパチブル  ポリマーズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）５巻、２２７頁（１９９０年）］に準じて以下の方法で製造した。
ｍＰＥＧ［モノメトキシポリエチレングリコール、平均分子量１０，０００、日本油脂（株）社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＶＦＭ−３０１０Ｍ］１０ｇを乾燥トルエン５０ｍｌに溶解し、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウム１．１２ｇを加え蒸留し、初めの留分３０ｍｌを除去した。アルゴン気流中、５０℃に冷却後、α−ブロモ酢酸エチル１．１ｍｌを加え、一昼夜攪拌を続けた。反応混合物を５００ｍｌのジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾過により回収し、減圧下乾燥した。続いて、得られた乾燥粉末９．２ｇを１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１５０ｍｌに溶解し、室温で１時間攪拌した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１６０ｍｌを加え、クロロホルム５００ｍｌで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、１０ｍｌまで減圧濃縮した後、３００ｍｌのジエチルエーテル中に滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して目的化合物を白色粉末として７．５ｇ得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），４．１５（ｓ，２Ｈ）
実施例２３  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．３ｍｇ／ｍｌの参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β１．２ｍｌに、実施例１で取得した化合物１５ｍｇ（蛋白質１モル当たり２０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分１４．５ｍｌを回収し、水１４．５ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．２４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．４ｍｌを回収した（収率２１．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜５分子結合体のバンドを確認した。
＜電気泳動条件＞
ゲル：ＰＡＧＥＬ  ＳＰＧ  ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＦＡＳＴ  ＳＴＡＩＮＴＭ
分子量マーカー：Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
分離カラム：ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ×２本連結）（東ソー社製）
保持時間：４０．３分（１〜４分子結合体）
実施例２４  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例２の化合物１００ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）を、１．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．７ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中０℃で３０分間攪拌した。その後３時間室温で攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例２の化合物のＮＨＳエステルを６５．０ｍｇ得た（収率６５．０％）。
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液１．２８ｍｌ（１．０６７ｍｇ／ｍｌ）へ、上記ＮＨＳエステルを１７ｍｇ（蛋白質１モルに対して２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分２４ｍｌを回収し、水２４ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．４９ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．５ｍｌを回収した（収率４４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを２本用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
0004142569.tif 000051
実施例２５  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例３の化合物２０ｍｇを塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ１．１５ｍｇおよびＤＣＣ２．０６ｍｇを加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥して実施例３の化合物のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率７２．５％）。
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液０．７８ｍｌ（０．９３７ｍｇ／ｍｌ）に、上記ＮＨＳエステルを９．１ｍｇ（蛋白質１モルに対して２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分８．５ｍｌを回収し、水８．５ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．０６７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分０．５ｍｌを回収した（収率４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
保持時間：３５．９分（１〜３分子結合体）
実施例２６  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中ＮＨＳ１６．８ｍｇ（１４６．０μｍｏｌ）およびＤＣＣ３０．１ｍｇ（１４５．９μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥して実施例４の化合物のＮＨＳエステルを２６０．０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
続いて、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られる未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．２２ｍｇ／ｍｌ）に上記ＮＨＳエステルを１４．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、０．２〜１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．１９４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分３．７５ｍｌを回収した（収率４９．７％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜２分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000052
実施例２７  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１３の化合物１００ｍｇ（１０μｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍｌに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ３．５ｍｇ（３０μｍｏｌ）とＤＣＣ６．２ｍｇ（３０μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。反応液を濾過し、不溶物を除去した後、濾液をジエチルエーテル中に滴下して沈殿させた。沈殿を減圧乾燥して実施例１３の化合物のＮＨＳエステルを６５ｍｇ得た（収率６５％）。
次に、エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．０ｍｇ／ｍｌ）へ、上記で活性化した修飾剤を１２ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。
反応液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で実施例２３と同様に精製し、０．１１３ｍｇ／ｍｌの目的物を４．４ｍｌ得た（収率４１．４％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
0004142569.tif 000053
実施例２８  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＯＲＮ（２ＲａＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１４の化合物１００ｍｇ（１０μｍｏｌ）を１ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．７ｍｇ（５０μｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．３ｍｇ（５０μｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中氷冷下３０分、続いて室温で２時間攪拌した。反応液を濾過し不溶物を除去した後、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。沈殿を減圧乾燥して実施例１４の化合物のＮＨＳエステル５８ｍｇ（収率５８％）を得た。
次に、エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製したｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、上記のＮＨＳエステルを１４．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、反応した。反応液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．１２ｍｇ／ｍｌの目的物を３．５ｍｌ得た（収率３５．０％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
0004142569.tif 000054
実施例２９  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１５の化合物１００ｍｇ（１０μｍｏｌ）を１ｍｌの塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中ＮＨＳ５７．５ｍｇ（５０μｍｏｌ）およびＤＣＣ１０．３ｍｇ（５０μｍｏｌ）を加え０℃で３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下した。沈殿を減圧下乾燥して、実施例１５の化合物のＮＨＳエステルを７１ｍｇ（収率７１％）得た。
次に、エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製したｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．１ｍｇ／ｍｌ）へ、上記のＮＨＳエステルを１３．２ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、反応した。反応液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．１２ｍｇ／ｍｌの目的物を３．５ｍｌ得た（収率３１．８％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを２本用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
0004142569.tif 000055
実施例３０  ６ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：ＰＥＧ２Ｍａｌ−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウム、尿素、マンニトールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した２．４４ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β溶液０．６２ｍｌに、実施例１２で得た化合物（平均分子量１２，０００）２．７ｍｇ（蛋白質１モルあたり３モル）を加え、反応した。次に、反応液０．３８ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（カラムサイズ２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈｉａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でゲル濾過精製し、０．１７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．５ｍｌを回収した（収率１６．９％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして測定した。
保持時間：４４．４分
実施例３１  ２０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：２０Ｍａｌ−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウム、尿素、マンニトールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した１．７２ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β溶液０．４２ｍｌに、ｍＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（平均分子量２０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）２．１ｍｇ（蛋白質１モルあたり３モル）を加え、反応した。次に、反応液０．３８ｍｌを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラム（カラムサイズ２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でゲル濾過精製し、０．１０ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．５ｍｌを回収した（収率２２．７％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様に分析した。
保持時間：４０．０分
実施例３２  ５ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５Ｍａｌ−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウム、尿素、マンニトールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した１．７ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β溶液０．４２ｍｌに、ｍＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）０．５５ｍｇ（蛋白質１モルあたり３モル）を加え、反応した。次に、反応液０．３８ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラム（カラムサイズ２０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でゲル濾過精製し、会合体および未反応のｒｈＩＦＮ−βを除いた目的画分４．５ｍｌを回収した。さらに、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（カラムサイズ１ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製し、０．０８２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１ｍｌを回収した（収率１１．３％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして測定した。
保持時間：４６．２分
実施例３３  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＴＲＣ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１６の化合物５ｍｇ（０．３３μｍｏｌ）に塩化メチレンで調製した１．５ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ溶液５０μｌ（０．６６μｍｏｌ）、１．４ｍｇ／ｍｌのＤＣＣ溶液１００μｌ（０．６６μｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中、氷冷下３０分間室温で２時間攪拌した。ジエチルエーテルを加えて生成した沈殿を減圧下乾燥してＮＨＳエステルを３．５ｍｇ（収率７０％）得た。
次に、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１５０μｌ（０．９ｍｇ／ｍｌ）へ、上記のＮＨＳエステルを３３．４ｍｇ（蛋白質１モルに対して３４モル）加え、４℃で一昼夜静置して反応した。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．０９１ｍｇ／ｍｌの目的物を０．４０ｍｌ得た（収率２７．０％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様に分析した。
保持時間：４２．０分（１分子結合体）
４４．１分（２分子結合体）
実施例３４  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。ジエチルエーテルに滴下して生成した白色沈殿を減圧乾燥し、上記化合物のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
次に、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１００μｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、上記で得られたＮＨＳエステルを８．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１００モル）加え、４℃で一昼夜静置して反応した。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．６ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、４７μｇ／ｍｌの目的物を８０μｌ得た（収率３．３％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムを２本用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
保持時間：４１．７分（１分子結合体）
実施例３５  ５ｋＤａ  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液０．５ｍｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１９で得られた化合物５ＰＥＴ（３ＵＵ）を４．５ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液０．５ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．８ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．６７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３６ｍｌを得た（収率４０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000056
実施例３６  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１７の化合物５ＰＥＴ（３ＵＡ）２５４ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）を、２．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．９ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．５ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中０℃で１時間、室温で２時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥して実施例１７の化合物のＮＨＳエステルを１３２．８ｍｇ得た（収率５２．３％）。
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．０ｍｌ（１．１６ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１７の化合物のＮＨＳエステルを１３ｍｇ（蛋白質１モルに対して１５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．１４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１．０ｍｌを得た（収率１２％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４３．８分（１分子結合体）
４１．２分（２分子結合体）
実施例３７  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール（従来型試薬）修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．３ｍｌ（０．９７ｍｇ／ｍｌ）へ、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（平均分子量１０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）を８．３ｍｇ（蛋白質１モルに対して１２．５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３６ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液２．７ｍｌを得た（収率７６．７％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000057
実施例３８  ２０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：２０ＳＰＡ−ｒｈＩＦＮ−β
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β１．３ｍｌに、ｍＰＥＧ−プロピオン酸のＮＨＳエステル（平均分子量２０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）７．９ｍｇ（蛋白質１モル当たり６モル）を加え、一昼夜４℃で静置して反応を行った。次に、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、０．５２ｍｇ／ｍｌの反応液２．１ｍｌを得た。この内、１．９ｍｌをＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム２ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製し、０．１８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分４．９ｍｌを回収した（収率６６．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
0004142569.tif 000058
実施例３９  ５ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＳＰＡ−ｒｈＩＦＮ−β
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した０．８ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−β１．３ｍｌに、ｍＰＥＧ−プロピオン酸のＮＨＳエステル（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）１．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり６モル）を加え、一昼夜４℃で静置して反応を行なった。次に、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、０．４０ｍｇ／ｍｌの反応液２．１ｍｌを得た。この内、１．９ｍｌをＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製し、０．１５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分４．２ｍｌを回収した（収率６０．１％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様に分析した。
0004142569.tif 000059
実施例４０  １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：１０ＳＣＭ−ｒｈＩＦＮ−β
実施例２２の化合物１．０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ２１．８ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ３９．０ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥して実施例２２の化合物のＮＨＳエステルを５０６．８ｍｇ得た（収率５０．７％）。
続いて、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例１で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液３．０ｍｌ（０．８１ｍｇ／ｍｌ）に上記のＮＨＳエステルを１６．２ｍｇ加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて脱塩した。ゲル濾過で得られた画分４．５ｍｌをＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．２２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分４．０ｍｌを回収した（収率３６．２％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜３分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000060
実施例４１  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾天然型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−天然型ｈＩＦＮ−β
天然型ｈＩＦＮ−β１０μｇ（ＳＴＲＡＴＨＭＡＮＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＧＭＢＨ）を等張りん酸緩衝液２００μｌに溶解し、実施例２６で得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステルを１．５ｍｇ（蛋白質１モルに対して３００モル）加え、２０℃で一昼夜反応した。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液に緩衝液交換した。次いで、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．０２１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．１９ｍｌ得た（収率３９．９％）。
実施例４２  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−１７Ｓｅｒ  ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．６）で調製した１７Ｓｅｒ  ｒｈＩＦＮ−β（Ｃｈｉｒｏｎ社製）の溶液０．１ｍｌ（１．０ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例２６と同様にして得られた実施例４の化合物（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ））のＮＨＳエステル１．３ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．２５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈｉａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、３９μｇの目的物を含む画分０．７５ｍｌを回収した（収率３９％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜３分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４１．３分（１〜３分子結合体）
実施例４３  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−１７Ｓｅｒ  ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１７Ｓｅｒ  ｒｈＩＦＮ−β（Ｃｈｉｒｏｎ社製）の溶液０．０５ｍｌ（２．１ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例３６で得られる実施例１７の化合物（５ＰＥＴ（３ＵＡ））のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、２７．８μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３０ｍｌを得た（収率７．９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例４４  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−αの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌに、実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１．５ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液８０μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これを、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、８０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率４０．０％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
0004142569.tif 000061
実施例４５  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−αの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した０．９５ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌに、実施例２６で得られる５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル１．５ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液０．１ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これを、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、５０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．６ｍｌを得た（収率３１．６％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様の条件で分析した。
0004142569.tif 000062
実施例４６  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロンαの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α溶液［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌへ、実施例３６で得られる実施例１７の化合物（５ＰＥＴ（３ＵＡ））のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．５３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液６５μｌを得た（収率３４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000063
実施例４７  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−γ
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例２で得られるｒｈＩＦＮ−γ（０．１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌに、実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２００モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例４８  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−γ
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例２で得られるｒｈＩＦＮ−γ（０．８ｍｇ／ｍｌ）０．８ｍｌに、実施例２６で得られる５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル１０．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例４９  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．２ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに実施例１の化合物１．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、そのうち９００μｌを同緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、４０２μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液３６０μｌを得た（収率５０．３％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000064
実施例５０  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに５．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）の実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を希釈し、そのうち９００μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、１７９μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液５００μｌを得た（収率２５．８％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000065
実施例５１  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに６．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）の実施例２５で得られる５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）のＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を希釈し、そのうち９００μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、３３５μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４５０μｌを得た（収率４４．２％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000066
実施例５２  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ１６．８ｍｇ（１４６．０μｍｏｌ）、ＤＣＣ３０．１ｍｇ（１４５．９μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下した。沈殿を回収し、減圧乾燥して化合物４のＮＨＳエステルを２６０．０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１．２５ｍｌ（４．０ｍｇ／ｍｌ）に上記のＮＨＳエステルを２６．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液１．０ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．５ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム５．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．８６ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．７ｍｌを取得した（収率３２．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000067
実施例５３  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに、実施例５の化合物１．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例５４  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー形成刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例１０の化合物１００ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）を１．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ３．５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ６．２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中０℃で９０分間、その後室温で２時間攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例１０の化合物のＮＨＳエステルを５６．５ｍｇ得た（収率５６．５％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体２１０μｌに４．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）の上記ＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、続いてＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分を９６５μｌ得た（収率３９．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000068
実施例５５  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー形成刺激因子誘導体の調製
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＲａ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに、実施例８で得られた化合物５．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり５０モル）を添加し、１２０ｍｍｏｌ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウム１０μｌを加え、室温で一昼夜反応させた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
実施例５６  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．７ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに、実施例２７記載の方法で実施例１３の化合物を活性化して得られる化合物２ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、０．８ｍｌを回収した。次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、３７０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４００μｌを得た（収率２５．９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000069
実施例５７  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＯＲＮ（２ＲａＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに２．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）の活性化ＰＥＧ誘導体（実施例１４の化合物を実施例２８記載の方法で活性化した化合物）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、０．８ｍｌを回収した。次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、７１μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４２０μｌを得た（収率１９．９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000070
実施例５８  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．７ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに２．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）の活性化ＰＥＧ誘導体（実施例１５の化合物を実施例２９記載の方法で活性化した化合物）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、０．８ｍｌを回収した。次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、６７μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液３５０μｌを得た（収率１６．０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000071
実施例５９  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下して生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．７ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに上記のＮＨＳエステル３．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．７ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を濃縮し、０．４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１６５μｌを取得した（収率３６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000072
実施例６０  ５ｋＤａ４本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＱＮＡ（４ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例６の化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）６９ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を５００μｌの塩化メチレンに溶解し、１．８ｍｇのＤＳＣと０．５６ｍｇのＤＭＡＰを加え、室温で６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例６の化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）のＮＨＳエステルを４４ｍｇ得た（収率６３％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ８）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに上記のＮＨＳエステル５．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４０．８分（１分子結合体）
実施例６１  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．１ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．５ｍｌに、実施例１９で得られた化合物１２．２ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．７５ｍｌを得た（収率５８．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000073
実施例６２  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．０５ｍｌに、実施例３６で得られる実施例１７の化合物のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３０ｍｌを得た（収率５６．７％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000074
実施例６３  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＳＵＧ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ導体
実施例２１で調製した化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）１００ｍｇ（６．７μｍｏｌ）に２．３ｍｇのＮＨＳと４．１ｍｇのＤＣＣを加え、氷冷下１ｍｌの塩化メチレンに溶解し、氷冷下１時間、室温で１．５時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例２１の化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）のＮＨＳエステルを７６．６ｍｇ得た（収率７６．６％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．１ｍｌに、上記活性化した化合物（実施例２１の化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル）１０．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して３５モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．２８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３９ｍｌを得た（収率２７．８％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000075
実施例６４  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＲａ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２．３５ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．６ｍｌに、実施例２０の化合物５６．３ｍｇ（蛋白質１モルに対して５０モル）および１２０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したソディウムシアノボロヒドリド（ＮａＢＨ３ＣＮ）１０μｌを加え、４℃で一昼夜反応した。反応液を塩酸で酸性にして反応を停止し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．２４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５５ｍｌを得た（収率８．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４１．２分（１分子結合体）
実施例６５  １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：１０ＳＣＭ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体２．５ｍｌに２１．３ｍｇ（蛋白質１モル当たり４モル）の実施例２２の化合物のＮＨＳエステル（実施例４０で調製）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、４．０ｍｌを回収した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１０．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で精製し、２．０ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液８６０μｌを得た（収率３４．４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000076
実施例６６  ２０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：２０ＳＰＡ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．６）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体９９５ｍｌに１９．１ｇ（蛋白質１モル当たり４．５モル）の活性化ＰＥＧ誘導体（Ｍ−ＳＰＡ−２０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量２０，０００）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。次いで、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム２０００ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し精製した。目的画分４０００ｍｌを濃縮し、１１．２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液３２０ｍｌを得た（収率９０．４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000077
実施例６７  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例３で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．５ｍｌに、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（平均分子量１０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）を１０．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．０５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率２６．３％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000078
実施例６８  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４のｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．９ｍｌに、実施例２６で得られる５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル２８．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１５当量）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
反応液０．８ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．５ｍｌを回収した。これをＳＰ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム５．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１．０ｍｌを得た（収率３３．０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000079
実施例６９  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．２ｍｌに、実施例２４で得られる５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１０．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５当量）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
反応液０．２ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．０ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３ｍｌを得た（収率２６．８％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
0004142569.tif 000080
実施例７０  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例７の化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．４ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４で得られたｒｈＧ−ＣＳＦ１４０μｌに、上記活性化したＮＨＳエステル１２．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．８ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を濃縮し、１．１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１１０μｌを取得した（収率１９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４０〜４５分（１〜３分子結合体）
実施例７１  ５ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４．４ｍｇ／ｍｌに調製した参考例４のｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．５ｍｌに、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）１１．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、１．７８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率４０．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４４．２分（１分子結合体）
４１．８分（２分子結合体）
実施例７２  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｂＳＯＤ
実施例２の化合物３０ｍｇ（３μｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍｌに溶解し、ＮＨＳ１．７ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ３．１ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分間攪拌した。その後３時間室温で攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例２の化合物のＮＨＳエステルを２１ｍｇ得た（収率７０％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例７３  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ
実施例３の化合物２０ｍｇを実施例２５と同様の条件で活性化し、実施例３の化合物のＮＨＳエステルを１３ｍｇ得た（収率６５％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例７４  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｂＳＯＤ
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに実施例１で得た化合物の水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例７５  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を実施例２６記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例４の化合物のＮＨＳエステルを２６０ｍｇ得た。
（収率５３．４％）
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例７６  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの精製
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ（精製品）
実施例４の化合物３６０ｍｇ（３６．０μｍｏｌ）を実施例２６記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例４の化合物のＮＨＳエステルを１８１．９ｍｇ得た（収率５０．５％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）２．２ｍｌに上記の実施例４の化合物のＮＨＳエステル３３．９ｍｇ（蛋白質１モルあたり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。次に、この反応液を４．３ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。未修飾ＳＯＤの含まれない目的画分を濃縮し３．７３ｍｇ／ｍｌの溶液を２００μｌ得た（収率１７．２％）。さらにＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加えて活性を回復した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例７７  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの調製
略号：５ＯＲＮ（２ＵＡ）−ｂＳＯＤ
実施例１３の化合物２０ｍｇを実施例２７記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例１３の化合物のＮＨＳエステルを１６．０ｍｇ得た（収率８０．０％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型−ＳＯＤ溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌへ、上記の活性化したＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜５分子結合体のバンドを確認した。なお、未修飾のＳＯＤは検出されなかった。
実施例７８  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの調製
略号：５ＤＰＡ（２ＵＡ）−ｂＳＯＤ
実施例１５の化合物２０ｍｇを実施例２９記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例１５の化合物のＮＨＳエステルを１２．０ｍｇ得た（収率６０．０％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型−ＳＯＤ溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌへ、上記のＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜５分子結合体のバンドを確認した。なお、未修飾のＳＯＤは検出されなかった。
実施例７９  １０ｋＤａ直鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：１０ＳＣＭ−ｂＳＯＤ（精製品）
ウシＣｕ，Ｚｎ型−ＳＯＤ溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）、和光純薬製）１．０ｍｌに実施例２２の化合物のＮＨＳエステル（実施例４０で調製）１８．８ｍｇ（蛋白質１モルあたり１５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。
次に、この反応液を２．０ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、未修飾ｂＳＯＤを含まない目的画分を濃縮し、５．９ｍｇ／ｍｌの溶液を１２０μｌ得た（収率３５．４％）。さらにＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加えて活性を回復した。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例８０  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｈＳＯＤ
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を実施例２６記載の方法と同様の条件で活性化し、実施例４の化合物のＮＨＳエステルを２６０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
ヒトＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（１．９ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例８１  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＭ）−ｈＳＯＤ（精製品）
実施例９の化合物３．１３ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）をヒトＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液［２．６３ｍｇ／ｍｌ、りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製］０．６ｍｌに加えて４℃で一昼夜静置して反応した。
次に、２０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。未反応のＳＯＤを含まない修飾体の画分を回収し、０．５ｍｌまで濃縮した。この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、目的画分を濃縮した。さらに、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を含む溶液各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加え、ＳＯＤの活性を回復した。０．２５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液を１８０μｌ取得した（収率４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
実施例８２  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＭ）−ｈＳＯＤ（精製品）
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したＣｕ，Ｚｎ型ｈＳＯＤ溶液（ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製）０．５ｍｌ（１．３４ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１８で得られる化合物３．１ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．３３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．６２ｍｌを得た（収率３０．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例２３と同様にして分析した。
保持時間：４１．１分（１分子結合体）
実施例８３  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ＫＭ−８７１
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２．６ｍｇ／ｍｌに調製したＫＭ−８７１水溶液０．５ｍｌ（特開平５−３０４９８９に従って調製）に、実施例４で得られた化合物のＮＨＳエステルを１．０ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液０．５ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．２ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．５９ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３８ｍｌを得た（収率１７．１％）。
＜電気泳動＞
実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例８４  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ＫＭ−８７１
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１．１ｍｇ／ｍｌに調製したＫＭ−８７１溶液１．０ｍｌ（特開平５−３０４９８９に従って調製）に、実施例３６で得られる５ＰＥＴ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル０．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して５モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液１．０ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．５２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４３０μｌを得た（収率２０．４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例２３と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
試験例１  化学修飾インターフェロン−βの抗ウイルス活性
実施例２３〜実施例４３で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−βおよび化学修飾天然型ｈＩＦＮ−β、未修飾ｒｈＩＦＮ−β、ならびに未修飾天然型ｈＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を下記のニュートラルレッド（ＮＲ）取り込み法で調べた。
＜ＮＲ取り込み法＞
小長谷らの方法［蛋白質核酸酵素（別冊）、３５５頁（１９８１年）］を参考に抗ウイルス活性を測定した。
すなわち、滅菌したトランスファープレートに５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加イーグルＭＥＭ培地を添加した。次に、ＩＦＮ国内標準品［α（ミドリ十字）およびβ（東レ）］溶液を各々５０μｌずつウェルに分注し、２倍ずつの段階希釈を行った。一方、所定の濃度に培地で調製した化学修飾ＩＦＮまたは未修飾ＩＦＮ溶液も同様に５０μｌずつウェルに分注した。これらの溶液を、所定の細胞数のヒト羊膜由来の株化細胞（ＦＬ細胞）を入れた９６穴プレートにトランスし、数秒間攪拌した。３７℃で一昼夜、ＣＯ２インキュベーターで培養し、抗ウイルス状態を作った。
次に、培養液を除去した後、ウイルス溶液を添加し、３７℃で２日間、ＣＯ２インキュベーターで培養してウイルスを感染させた。ＩＦＮにより細胞の抗ウイルス状態が変化し、細胞変性が起こった。続いて、培養液を除去し、ＮＲ溶液を添加した。３７℃で１時間ＣＯ２インキュベーターに放置し、ＮＲ溶液を除去した。等張りん酸緩衝液でウェルを洗浄し、抽出液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸−３０％エタノール）を添加し、２〜３分間攪拌した。
ＮＲにより生き残った細胞を染色し、抽出後、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、定量曲線をプロットした。定量曲線より算出した未修飾ＩＦＮの活性を１００％としたときの化学修飾ＩＦＮの相対活性を算出した。
各ＩＦＮ−βの比活性を第１表、第２表および第３表に示す。
0004142569.tif 000081
0004142569.tif 000082
0004142569.tif 000083
以上の結果より、本発明で使用される化学的に修飾されたＩＦＮ−βはいずれも抗ウイルス活性を保持していることが確認された。
試験例２  化学修飾インターフェロン−αの抗ウイルス活性
実施例４４から実施例４６で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−α、および未修飾ｒｈＩＦＮ−αの抗ウイルス活性を試験例１に示したＮＲ取り込み法で調べた。
各ＩＦＮ−αを濃度１μｇ／ｍｌで作用させたときには、化学修飾された各ＩＦＮ−α（実施例４４の５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−α、実施例４５の５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−α、実施例４６の５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−α）では、抗ウイルス活性が完全に保持されていた（未修飾ｒｈＩＦＮ−αと同等の活性を有していた）。
試験例３  化学修飾スーパーオキサイドディスムターゼの酵素活性
実施例７２〜実施例８２で調製した化学的に修飾されたＳＯＤの酵素活性をＭｃｃｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．とＦｒｉｄｏｖｉｃｈｉ，Ｉのキサンチン−キサンチンオキシダーゼ−シトクロムＣ系［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４４巻、６０４９頁（１９６９年）］で測定した。ＳＯＤ活性１ユニット（Ｕ）とは、ｐＨ７．８、３０℃下で、シトクロムＣの還元速度を５０％阻害するＳＯＤの酵素量を示し、以下の式で算出した。
0004142569.tif 000084
化学的に修飾されたウシＳＯＤ、および化学的に修飾されたヒトＳＯＤの酵素活性を各々第４表、第５表に示す。
ＳＯＤ  ５０Ｕ／ｍｌ＝０．０００２５６ｍｇ（３９００Ｕ／ｍｇの場合）
ΔＡ／分：測定値
0004142569.tif 000085
0004142569.tif 000086
本発明で使用される化学修飾ヒトＳＯＤは酵素活性を維持していることが確認された。
試験例４  化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
実施例４９〜実施例７１の化合物、未修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体および未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦのマウス白血病細胞ＮＦＳ６０［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、６６８７頁（１９８５年）］に対する増殖促進活性を、浅野らの方法［薬理と治療、１９巻、２７６７頁（１９９１年）］に従って測定した。
実施例４９〜実施例６３および実施例６６の化合物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた場合には、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体（１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた）と同等のＮＦＳ６０細胞増殖促進活性が認められた（未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体と同等の活性を保持していた）。
実施例６８〜実施例７０の化合物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた場合には、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させた）と同等のＮＦＳ６０細胞増殖促進活性が認められた（未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦと同等の活性を保持していた）。
本発明で使用される化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体および化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦはいずれもＮＦＳ６０細胞に対する増殖促進作用を維持していることが確認された。
試験例５  化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性
実施例８４で調製した化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性をＫｅｎｙａ．Ｓらの方法［キャンサー  イミュノロジー  アンド  イミュノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、３６巻、３７３頁（１９９３年）］に基づいて測定した。
化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３結合活性を第６表に示す。
活性は、未修飾の抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性を１００％としたときの相対活性で示した。
0004142569.tif 000087
本発明で使用される化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体ではＧＤ３への結合活性が残存していることを確認された。
試験例６  化学修飾組換え型ヒトインターフェロン−βのマクロゴール軟膏剤中での安定化効果
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように実施例２６のポリエチレングリコール修飾ｒｈＩＦＮ−β（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β）溶液、未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液、または未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液に２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量２０，０００）を添加した溶液を各々調製した。次に、各々の溶液１００μｌをマクロゴール軟膏基剤（東豊薬品（株）製）０．９ｇに添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して室温に保存した。軟膏剤調製直後および２４時間後にサンプリングし、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて軟膏剤を溶解し、抗ウイルス活性を測定した。
軟膏剤調製直後の活性を１００％としたときの２４時間後の活性を第７表に示す。
未修飾ｒｈＩＦＮ−β、および未修飾ｒｈＩＦＮ−βにｍＰＥＧを添加したものでは活性の低下が確認されたが、化学的に修飾されたｒｈＩＦＮ−β溶液では活性は維持されていた。
0004142569.tif 000088
試験例７  化学修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの親水軟膏剤中での安定化効果
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように実施例２６のポリエチレングリコール修飾ｒｈＩＦＮ−β（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β）溶液、または未修飾ｒｈＩＦＮ−β溶液に２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量２０，０００）を添加した溶液を各々調製した。次に、各々の溶液１００μｌを親水軟膏（岩城製薬（株）製）０．９ｇに添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して３７℃に保存した。各々の軟膏剤を経時的にサンプリングし、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて軟膏剤を懸濁した。この懸濁溶液中のｒｈＩＦＮ−βの含有量を各々ＥＬＩＳＡの検量線から算出した。
結果を図１に示す。化学的に修飾されたｒｈＩＦＮ−βと未修飾のｒｈＩＦＮ−βの濃度はいずれも徐々に低下したが、未修飾ｒｈＩＦＮ−βに比較し、化学的に修飾されたｒｈＩＦＮ−βでは残存率が高値を示した。
試験例８  化学修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼのマクロゴール軟膏剤中での安定化効果
２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて、３．７３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ（精製品）溶液（実施例７６で調製）、未修飾ｂＳＯＤ溶液、または未修飾ｂＳＯＤ溶液とｍＰＥＧを混合したものを各々５０μｌずつ、マクロゴール軟膏基剤４５０ｍｇへ加え、均一な軟膏剤を調製した。経時的に５０ｍｇずつ採取し、２００μｌの等張りん酸緩衝液を加え、その一部を用いて活性測定した。
軟膏剤調製直後のｂＳＯＤ活性を１００％として、経時的な活性の変化を図２に示す。軟膏剤では何れも時間と共に活性が低下したが、ＰＥＧ修飾体の５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤのみで長期間高い活性が維持された。
試験例９  化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマクロゴール軟膏剤中での安定化効果
マクロゴール軟膏基剤（東豊薬品（株）製）０．９ｇに酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した実施例６６の誘導体（２０ＳＰＡ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体）溶液、同濃度の未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液、または同濃度のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に１２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量２０，０００、日本油脂（株）社製）を添加した溶液を各々１００μｌ添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して室温に保存した。経時的に各チューブをサンプリングし、１５０ｍｍｏｌ／塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液を加えて軟膏剤を溶解した。この溶液の上清を実施例２３の条件で電気泳動により分析し、蛋白質のバンドの変化を観察した。
図３及び図４に示すように、化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では７２時間後もバンドの変化は観察されなかったのに対し、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では軟膏剤調製後２４時間で次第にバンドが薄くなり、７２時間でほぼ完全に消失した。
以上の結果はマクロゴール軟膏剤中では化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は安定に存在しているが、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は次第に変性し沈殿したことを示唆している。
試験例１０  化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での安定化効果
親水軟膏（岩城製薬（株）製）０．９ｇに酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した実施例６６の誘導体（２０ＳＰＡ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体）溶液、または同濃度の未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液を各々１００μｌ添加し、５分間均一に練ることで軟膏剤を調製した。各軟膏剤を１００ｍｇずつエッペンドルフチューブに分注し、密閉して３７℃に保存した。経時的に各チューブをサンプリングし、１５０ｍｍｏｌ／塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液を加えて軟膏剤を懸濁した。この懸濁溶液を均一になるように懸濁し、１５，０００回転で２０分間遠心分離した。水相（下層）を回収し実施例２３と同様の条件で電気泳動により分析した。
図５および図６に３７℃で保存した軟膏剤の経時変化を示す。
化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では２４時間後もバンドの変化は観察されなかったのに対し、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では軟膏剤調製直後から次第にバンドが薄くなり、２時間でほぼ完全に消失した。
図７および図８は、室温で保存した軟膏剤の経時変化を示す。
化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では３０日後もバンドの著しい変化は観察されなかったのに対し、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では次第にバンドが薄くなり、３０日後ほぼ完全に消失した。未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に単にｍＰＥＧを添加した溶液（１２ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ（平均分子量：２００００）と６ｍｇ／ｍｌの未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含有した酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１００μｌ）で調製した軟膏剤でもバンドの消失は抑制されなかった。
以上の結果は親水軟膏剤中では化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は安定に存在しているが、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は軟膏剤を保存中に次第に変性したことを示唆している。
参考例１  組換え型ヒトインターフェロン−β（未修飾ｒｈＩＦＮ−β）の製造  ｒｈＩＦＮ−βは水上ら［バイオテクノロジー  レター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒ）、第８巻、６０５頁（１９８６年）］、および久我ら［現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人］の方法に従って製造した。
ｒｈＩＦＮ−βをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭＧ−１を保有する大腸菌Ｋ−１２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−βの生産には２リッタージャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して数日間２０℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液から凍結融解法［ＤＮＡ、２巻、２６５頁（１９８３年）］で抽出液を調製した。さらに、菌体残渣から特開昭６１−６９７９９に開示された方法に従ってｒｈＩＦＮ−βを得た。
参考例２  組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
ｒｈＩＦＮ−γは前記ｒｈＩＦＮ−βの製造法に準じ、伊藤ら［医科分子生物学、３５５頁（１９８７年）、南江堂］、および久我ら（現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人）の方法に従って製造した。
ｒｈＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＹＰ１０を保有する大腸菌ｐＧＫＡ２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−γの生産には２リッタージャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して１〜２日間３７℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＣ  ＰＯＷＥＲ  ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ＣＥＬＬ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ  ２００、ＯＵＴＰＵＴ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
さらに、菌体残渣に尿素や塩酸グアニジン等の強力な蛋白質変性剤を加えてｒｈＩＦＮ−γを溶解した後に、マーストンらの方法［バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、２巻、８００頁（１９８４年）］に準じ、ｒｈＩＦＮ−γを抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例３  組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体の調製
配列番号３に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、特公平７−９６５５８に記載の方法により取得した。
上記のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＥＣｆＢＤ２８  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７９）をＬＧ培地（バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース１ｇを水１Ｌに溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．０とする）で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４０．６％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、塩化ナトリウム０．５％、カザミノ酸０．５％、ＭｇＳＯ４１ｍｍｏｌ／Ｌ、ビタミンＢ１４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌに摂取し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＣ  ＰＯＷＥＲ  ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ＣＥＬＬ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ  ２００、ＯＵＴＰＵＴ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
菌体残渣からマーストンらの方法［バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、第２巻、８００頁（１９８４年）］に準じ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例４  組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
配列番号３に示したアミノ酸配列を有するｒｈＧ−ＣＳＦを参考例３に記載した方法に準じて調製した。
産業上の利用可能性
本発明により、生理活性ポリペプチドに比べて、軟膏剤中での安定性に優れた化学的に修飾された生理活性ポリペプチドを含有する軟膏剤が提供される。
【配列表】
0004142569.tif 000089
0004142569.tif 000090
0004142569.tif 000091
【図面の簡単な説明】
図１は化学修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの親水軟膏剤中での安定化効果を示す。図１において、符号（−◆−、−■−）は各々下記の意味を表す。
−◆−：未修飾ｒｈＩＦＮ−βにおけるｒｈＩＦＮ−βの残存量の変化
−■−：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−βにおけるｒｈＩＦＮ−βの残存量の変化
図２は化学的に修飾されたウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼのマクロゴール軟膏剤中での安定化効果を示す。図２において符号（−△−、−〇−、−□−、−●−）は各々下記の意味を表す。
−△−：化学的に修飾されたｂＳＯＤ（５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ）を含有するマクロゴール軟膏剤
−○−：ｂＳＯＤにマクロゴールを混合した軟膏剤
−□−：ｂＳＯＤとｍＰＥＧを混合したものにマクロゴールを混合した軟膏剤  −●−：ｂＳＯＤ水溶液
図３は組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマクロゴール軟膏剤中での安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図３において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１時間後
▲５▼：室温１日後
▲６▼：室温２日後
▲７▼：室温３日後
▲８▼：室温７日後
図４は化学的に修飾された組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマクロゴール軟膏剤中での安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図４において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：化学修飾Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１時間後
▲５▼：室温１日後
▲６▼：室温２日後
▲７▼：室温３日後
▲８▼：室温７日後
図５は組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での３７℃における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図５において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼、▲９▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：３７℃３０分後
▲５▼：３７℃１時間後
▲６▼：３７℃２時間後
▲７▼：３７℃４時間後
▲８▼：３７℃８時間後
▲９▼：３７℃２４時間後
図６は化学的に修飾された組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での３７℃における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図６において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼、▲９▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：化学修飾Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：３７℃３０分後
▲５▼：３７℃１時間後
▲６▼：３７℃２時間後
▲７▼：３７℃４時間後
▲８▼：３７℃８時間後
▲９▼：３７℃２４時間後
図７は組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での室温における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図７において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１０日後
▲５▼：室温２０日後
▲６▼：室温３０日後
図８は化学的に修飾された組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の親水軟膏剤中での室温における安定化効果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。図８において番号（▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼、▲６▼）は各々下記の意味を表す。縦軸は分子量を表す。
▲１▼：分子量マーカー
▲２▼：化学修飾Ｇ−ＣＳＦ誘導体水溶液
▲３▼：軟膏剤調製直後
▲４▼：室温１０日後
▲５▼：室温２０日後
▲６▼：室温３０日後
【図１】
0004142569.tif 000092
【図２】
0004142569.tif 000093
【図３】
0004142569.tif 000094
【図４】
0004142569.tif 000095
【図５】
0004142569.tif 000096
【図６】
0004142569.tif 000097
【図７】
0004142569.tif 000098
【図８】
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