(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 、配列番号8 、配列番号84、およびそれらの免疫学的に機能的なアナローグであって配列番号5の1〜4アミノ酸残基が保存的置換しているペプチドから成る群から選択される、23アミノ酸残基により分離された2 つのシステイン残基を含有する長さ25アミノ酸のIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド。
【請求項２】
配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 、配列番号8 、および配列番号84から成る群から選択される、請求項1 に記載のIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド。
【請求項３】
式：
（A ）n −（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Ｘ
式中、
各A は独立してグリシン、リジン、（ε−Ｎ）−リジンまたは配列番号13の免疫刺激性インベーシンドメインであり、
各B はグリシン、リジンまたは（ε−Ｎ）−リジンであり、
各Thは独立して配列番号9, 12、60, 86及び89から成る群から選択されるヘルパーT 細胞エピトープを構築するアミノ酸配列、またはロトバードの配列ルールに従い位置1, 4, 5, 8のアミノ酸が修飾されたそのアナローグであり、
IgE −CH3 ドメイン抗原は請求項1 に記載のIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドの配列を表し、
X はアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり、
n は0, 1, 2 または3 であり、
m は1 〜4 であり、そして
o は1, 2 または3である、
により表されるペプチド複合体。
【請求項４】
式：
（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（A ）n −Ｘ
式中、
各A は独立してグリシン、リジン、（ε−Ｎ）−リジンまたは配列番号13の免疫刺激性インベーシンドメインであり、
各B はグリシン、リジンまたは（ε−Ｎ）−リジンであり、
各Thは独立して配列番号9, 12、60, 86及び89から成る群から選択されるヘルパーT 細胞エピトープを構築するアミノ酸配列、またはロトバードの配列ルールに従い位置1, 4, 5, 8のアミノ酸が修飾されたそのアナローグであり、
IgE −CH3 ドメイン抗原は請求項1 に記載のIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドの配列を表し、
X はアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり、
n は0, 1, 2 または3 であり、
m は1 〜4 であり、そして
o は1, 2 または3である、
により表されるペプチド複合体。
【請求項５】
前記ThがSSALである、請求項3に記載のペプチド複合体。
【請求項６】
配列番号14、15、17〜27、85、87、88、90、91から成る群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
少なくとも1 つのA がインベーシンドメインである、請求項3または4に記載のペプチド複合体。
【請求項８】
n が3 であり、そして（A ）3 が（インベーシンドメイン）−Gly −Gly である、請求項3または4に記載のペプチド複合体。
【請求項９】
配列番号14、15、26、90から成る群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１０】
それぞれ、請求項3 〜6のいずれか一項に記載の2 、4 、または8 つのペプチド複合体に共有結合したリシン、トリリシン、またはヘプタリシンのコアを含んでなる分枝鎖状ポリマー。
【請求項１１】
二官能架橋剤により架橋された請求項3 〜6のいずれか一項に記載の1 またはそれ以上のペプチド複合体を含んでなるポリマー。
【請求項１２】
免疫学的に有効量の配列番号14、15、18、24、25及び85から成る群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドいずれかと、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドの前記免疫学的に有効量が0.5 μg 〜1mg ／kg体重／投与である、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項1 〜4 のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド複合体をコードする配列を含んでなる核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アレルギー治療用免疫原としてのペプチド複合体組成物に関して、その中に含有される各ペプチド複合体はIgE のイプシロン（ε）重鎖の第3 定常ドメイン（CH3 ）上のターゲット抗原部位を含んでなり、前記ターゲット抗原部位は化学的カップリングにより（1 ）担体タンパク質に、または化学的カップリングもしくは直接的合成により（2 ）ヘルパーT 細胞エピトープ及びその他の免疫刺激性配列に共有結合している。
【０００２】
さらに詳しくは、本発明は、IgE のε重鎖のCH3 ドメイン上のターゲットエフェクター部位に対して特異的な高い力価のポリクローナル抗体の産生を、ヒトを包含する哺乳動物において、誘発する免疫原として、このようなペプチド複合体組成物を使用すること、およびIgE 仲介アレルギー疾患の免疫療法を提供する薬剤として、このような組成物を使用することに関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトおよび他の哺乳動物の免疫系において、IgE はI 型過敏症を仲介する。これらはある種の食物、薬剤、および環境アレルゲンに対するアレルギー性応答であり、アレルギー性鼻炎、ぜん息、アレルギー性皮膚炎、およびアナフィラキシーのような症候により発現される。アレルギー疾患を治療する現存する戦略は、実用性が制限され、同定されたアレルゲンに対してアトピー性個体を脱感作するか、あるいは進行する反応を治療化合物で改善することから成る。アレルゲンをベースとする脱感作免疫療法に対する制限は、関係するアレルゲンを同定ことが困難であること、および同定されたアレルゲンの使用によりしばしば引き起こされる悪い反応を包含する（World   Health  Organization  and   International   Union   of  Immunological   Societies   Working   Group 、Lancet、1989；i ：259 −261 ）。アレルギーを軽減する他の治療において、アレルギー反応の原因となる急性炎症カスケードを遮断するために治療化合物を使用する。これらの治療化合物は、抗ヒスタミン薬、うっ血除去薬、β2 アゴニスト、およびコルチコステロイドを包含する。抗ヒスタミン薬、うっ血除去薬、およびβ2 アゴニストは、アレルギー性カスケードにおけるIgE の下流の事象に対して作用するので、IgE 仲介アレルギー反応の開始により近い事象に対して作用しなくてはならない予防的治療よりむしろ、アレルギー症候を扱う期待的治療剤である。これらの期待的治療剤は軽減を提供するが、短期間でありかつ部分的であり、しばしば悪い副作用を伴う。多数の重症アレルギー患者は、コルチコステロイドで有効に治療される。ステロイド療法は炎症を減少するが、広く免疫抑制的である。
【０００４】
既知の治療薬剤の欠点を回避するために、IgE をターゲットとする選択的介在によりアレルギー応答を予防することはいっそう望ましいであろう。他の免疫グロブリンと同様に、IgE は2 つの重鎖および2 つの軽鎖を有する。ε重鎖は5 つのドメイン、すなわち、1 つの可変VHドメインおよび定常ドメインCH1 〜CH4 を有する。IgE 分子の両方のε鎖からの定常ドメインは一緒になって、IgE の定常領域またはFc領域を構成する。IgE は循環し、IgE のFc領域上の部位を通してエフェクター細胞、例えば、好塩基球およびマスト細胞に結合するようになり、細胞表面上の高いアフィニティーのFcεRIレセプターに結合するようになる。アレルギー反応において、アレルゲン（例えば、花粉、ほこりダニタンパク質、ノミの抗原）はマスト細胞または好塩基球結合IgE の可変領域上の抗原結合部位に結合する。この作用はIgE 分子および根元的なFcεRIを架橋する。これによりIgE −アレルゲン複合体はマスト細胞および好塩基球の脱顆粒を示し、ヒスタミンおよび他の炎症のメディエイターを同時に解放する。これらのメディエイターは、アレルギーの症状を減少させ、IgE の産生をアップレギュレートし、アレルゲンに対する感受性を増加させる（Davis 他、Springer  Semin   Immunopathol、1993；15：51−73）。
【０００５】
マスト細胞および好塩基球へのIgE の結合を阻害する介在により、アレルギー疾患を治療できることが示唆された。例えば、IgE のFc上の種々の部位に対応する合成ペプチドは、FcεRIレセプターに対するIgE の結合に対する競合インヒビターとして研究されてきている。このようなペプチドはFcεRIレセプターに対するIgE の結合に参加するIgE 上の部位のためのアンタゴニストとして作用し、そして結合部位の部分をマッピングする働きをする。
【０００６】
IgE ペプチドを競合的阻害するアミノ酸残基および引き続く、非ヒトIgE ペプチド相同体を包含する、すべてのIgE ペプチドのアミノ酸残基は、また、下記の文献に記載されているヒトIgE についてナンバリングに従い指示される：DorringtonおよびBennich 、Immunol.  Rev.、1978；41：3 −25、下記のインターネット位置にアクセス可能である：http://www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids ）。そのヒト配列は本明細書において配列番号1 として列挙されており、表1 に示すように番号が付される。IgE についての相同的イヌ、ラットおよびマウスの配列（Patel 他、Immunogenetics、1995；41：282 −286 ；Steen 他、J.  Mol.  Biol. 、1984；177 ：19−32；およびIshida他、EMBO、1982；1 ：117 −1123）は、また、表1 に示されており、それぞれ、配列番号2 、3 、および4 として列挙されている。動物の配列はヒトIgE と位置合せされて示されている。ヒトIgE 、および他の種からの相同体における個々のアミノ酸位置は、本明細書において、特記しない限り、表1 に示すアミノ酸配列についてのナンバリング系に従い同定される。
【０００７】
Helm他、（Nature、1988；331 ：180 −183 ）が示すように、アミノ酸301 −376 から、ヒトIgE のC 末端のCH2 およびN 末端のCH3 をスパンする、76アミノ酸長さの組換えポリペプチドは、競合的阻害によりヒトマスト細胞へのIgE の結合を減少する。他の研究は、CH3 ドメインのみがFcεRIへの結合に関係することを報告している。例えば、ヒト配列のアミノ酸401 −415 に対応するラット配列のペプチド（表1 ）は、ラットマスト細胞に対してラットIgE の結合を阻害した（BurtおよびStanworth ，Eur.  J.  Immunol.、1987；17：437 −440 ）。ヒトIgE からの残基419 〜463 のペプチドはラットマスト細胞の感作を妨害した（Nio 他、FEBS  Lett. 、1992；314 ：229 −231 ）。Jardieu およびPresta（WO93/04173号）は、FcεRIレセプターに示差的に結合する、アミノ酸373 −390 、420 −428 、446 −453 、および隣接領域を含むことがある、CH3 およびCH4 領域に対して相同的なペプチドについて報告した。しかしながら、IgE 結合の有効な阻害を達成するためには、高濃度のすべてのこのようなペプチドを必要とした。これらの高濃度は有意な生理学的作用について過度に大きい投与量が予測され、療法的に実際的でない。
【０００８】
抗IgE 抗体は、また、FcεRIレセプターへの結合に参加するIgE 上の部位をマッピングする方法として適用されてきた。IgE   Fcの種々のドメインに対して向けられたマウスモノクローナル抗体を使用して研究は、CH3 ドメインに対する特異性を有する抗IgE モノクローナル抗体がIgE のその高いアフィニティーのレセプターへの結合を阻害することを明らかにした（Baniyash他、Molec.  Immunol.、1988；25：705 −711 ；およびStadler 他、Immunol.  Cell  Biol. 、1996；74：195 −200 ）。これらのモノクローナル抗体の研究は、レセプターの結合に明らかに関係する部位をマッピングするためにポリクローナル抗ペプチド抗体を使用する初期の研究と一致する。例えば、IgE アミノ酸位置401 −415 （Brut他、Molec.  Immunol.、1987；24：379 −389 ）、および355 −368 （Robertson およびLiu 、Molec.  Immunol.、1988；25：103 −113 ）に対する特異性を有するウサギ抗体は、非結合IgE に対する特異性を示したが、レセプター結合IgE との低い反応性を示した。
【０００９】
イヌIgE アミノ酸356 −479 からの少なくとも5 つの連続アミノ酸を含有するイヌIgE ペプチドフラグメントは、イヌにおけるアレルギーを診断するための抗体の製造に有用である（JP  9179795 、1997）。それらの結果はイヌε鎖のCH3 ドメイン中の表面暴露エフェクター部位を示唆するが、このようなエフェクター部位は教示されておらず、抗IgE 抗体についての療法的用途は開示されていない。
【００１０】
好塩基球およびマスト細胞へのIgE の結合の阻害を目的とする介在のために、ε重鎖のCH3 ドメインをターゲットとすることができることを、これらのエピトープのマッピングの研究はほとんど一致して証明している。しかしながら、種々の研究は、最も有用であるCH3 上の部位についての正確な位置についてまったく一致していない。また、部位特異的抗体を使用する、IgE 上の交差阻害研究からの結果（例えば、Burt他、1987）は、ε鎖上のFcεRI結合部位についての正確な位置を定めたということを意味するように、しばしば過度に解釈された。このような交差阻害研究の解釈は制限される。なぜなら、抗体認識部位はリガンド結合部位と等しいと仮定することができないからである。所望のターゲット部位への直接的結合により、抗体は阻害できるが、抗体は、また、非連続のエフェクター部位を占有し、立体障害性またはコンフォメーションの変化の誘導を通してリガンドの結合を阻害することができる。
【００１１】
したがって、エピトープのマッピングの研究は実験的観察を提供したが、CH3 ドメイン内の高いアフィニティーのレセプターについての結合部位を解明しなかった。定められた結合部位は存在しないので、FcεRIに対する結合に直接的または間接的に参加するエフェクター部位に対して免疫学的交差反応性を有する、療法上の潜在的な合成免疫原を、信頼性をもって予測する手段は存在しない。
【００１２】
さらに、IgE についてのX 線結晶学のデータは存在しないので、抗IgE の関与に適当なIgE 上の部位を信頼性をもって予測するためには、IgE の入手可能な構造的モデルは不十分である。IgG の公表された三次元構造をベースとする矛盾する構造が、IgE についてモデル化され、そしてIgE とその高いアフィニティーのレセプターとの間の相互作用に関連するIgE のCH2 ／CH3 領域についてモデル化された。これらのモデルは、IgE 分子の直線的に隣接しない残基との接触を包含する、部位について種々のコンフォメーション依存性構造を提案する。分子内のジサルファイド結合されたループ（Helm他、Eur.  J.  Immunol.、1991；21：1543−1548）または静電的相互作用により維持される分子内ループ（Presta他、J.  Biol.   Chem. 、1994；269 ：26368 −26373 ）により仲介される、いくつかのε鎖上の非隣接部位間の相互作用を、部位についてのいくつかのモデルは示唆する。他のモデルはIgE 分子の二量化ε鎖のセグメント間の分子間相互作用を提案している（McDonnell 他、Biochem.  Soc.  Trans.、1997；25：387 −392 ）。事実、実験的観察は、潜在的接触点はε鎖のCH3 ドメイン上のいくつかの散乱した、不連続部位を含んでなることを示し、そしてFcεRI結合部位の三次元構造がモデル化により容易には解明されないことを明らかにしている（Helm他、1988；Baniyash他、1988；およびPresta他、1994）。したがって、IgE 上のエフェクター部位を模擬する、有用な合成ペプチドのアンタゴニストおよび免疫原の同定は、理論的モデル化により開示されなかった。X 線結晶学により解明されたIgE の構造は存在しないので、このような有用なペプチド部位は実験により到達できるだけである。
【００１３】
好塩基球およびマスト細胞上の高いアフィニティーのレセプターに対するIgE の結合を阻害特異性を有する、抗IgE 抗体で、アレルギー疾患を治療するという概念は、また、知られている（Stadler 他、1996；Davis 他、1993）。このような抗IgE 抗体はアナフィラキシー性（架橋）または非アナフィラキシー性（非架橋）である。大部分の抗IgE 抗体はアナフィラキシー性である。それらは好塩基球およびマスト細胞の表面上のIgE に結合しかつ架橋し、アレルギーの薬理学的メディエイターの解放を誘発する。この架橋はアナフィラキシーおよび死亡に導くことがある。
【００１４】
したがって、治療のための抗IgE 抗体は非アナフィラキシー性に示すということは決定的である。ある種の非アナフィラキシー性抗体はε鎖のCH3 ドメインに対する特異性を保持し、細胞結合IgE を架橋しないが、IgE 仲介ヒスタミン解放に対して阻害活性を表示する（Davis 他、1993；Stadler 他、1996）。Rup およびKahn（米国特許第4,940,782 号）は、遊離ラットIgE およびB 細胞に結合したラットIgE と反応する、このような非アナフィラキシー性モノクローナル抗体を報告しているが、ラットマスト細胞FcεRIレセプターに結合したIgE を報告していない。さらに詳しくは、それはラットマスト細胞の感作を阻害する。ヒトIgE に対する相同的特異性を有する非アナフィラキシー性抗体は、また、同一モードにより感作を阻害する。これらの抗ヒトIgE は遊離血清IgE に結合し、B 細胞結合IgE に結合し、好塩基球およびマスト細胞の高いアフィニティーのレセプターに結合したIgE に結合せず、ヒト細胞の感作を妨害する。FcεRIレセプターに結合するIgE 上の部位に対する特異性により、これらの抗体は作用すると推定される（Rup およびKahn，米国特許第4,940,782 号；Davis 他、1993；Chang 、米国特許第5,420,251 号；Presta他、J.  Immunol.、1993；151 ：2623−2632）。さらに、また、遊離IgE を中和する、異なる特異性を有する、非アナフィラキシー性抗ヒトIgE モノクローナル抗体が発見された（Rudolf例えば、J.  Immunol.、1996；157 ：5646−5652）。この抗IgE は、また、FcεRI結合IgE を認識するので、レセプター結合部位に直接結合しない。明らかなように、抗IgE はレセプター結合IgE ／遊離IgE の熱力学的均衡を変更することによって、好塩基球の感作を減少させる機能をする。  こうして、FcεRI結合部位に直接結合する抗IgE 抗体、および他のエフェクター部位におけるFcεRI結合を妨害する抗IgE 抗体の両方は、遊離IgE によりマスト細胞および好塩基球の感作をブロックする働きをする。これらの潜在的に免疫療法性抗体は、以前のマッピング研究と一致して、高いアフィニティーのIgE   Fcレセプターと相互作用するIgE のドメインとして、CH3 を同定する。しかしながら、結合部位および別の有用なエフェクター部位、例えば、Rudolf他が記載する部位は理解しにくいままである。Rudolf他は、また、それらの抗IgE モノクローナル抗体に結合するミモトープペプチドを同定するために、ファージディスプレイ使用した；しかしながら、ペプチドミモトープはヒトIgE の主要なアミノ酸配列に対する相同性を示さなかった（Rudolf他、J.  Immunol.、1998；160 ：3315−3321）。
【００１５】
FcεRIレセプター部位に対する明らかな特異性を有するヒト化モノクローナル抗IgE 抗体は、ヒトにおいて受動免疫療法によりアレルギーを治療するために臨床的に研究されている（MacGlashan他、J.  Immunol.、1997；158 ：1438−1445）。その抗体、rhuMab−E25 を使用する注入は患者におけるIgE の血清濃度を減少させ、エフェクター細胞上のIgE レセプターの発現をダウンレギュレートし、アレルゲンによりチャレンジに対するアレルギー性感作を減少させ、そしてぜん息およびアレルギー性鼻炎の症状を改善する。抗体はすぐれた安全性プロファイルを表示する。臨床試験の結果は、アレルギー疾患を治療する抗IgE アプローチの可能性を確立する。しかしながら、この治療モードは問題的である：抗IgE の発明により免疫療法は、受動免疫化により、すなわち、抗体の注入により達成される。抗体の連続的に薬理学的に有効な濃度を達成するために、不都合な静脈内または皮下経路を介して、十分に高い投与量でかつ十分な頻度で抗体を送出さなくてはならない。有効投与量は、患者の体重、循環中の遊離IgE の基線レベル、および投与経路により決定される。最近の臨床試験において、療法的効能に必要な定常状態の濃度は2 回／週の投与により達成され、その後、2 回／週の投与により維持された。典型的なアレルギー患者の治療の全過程は合計2000〜3000mgのヒト化抗体に拡張され、7 〜10回の不都合な静脈内投与を必要とするであろう（MacGlashan他、1997；Boulet他、Am.   J.  Respir.   Crit.   Care  Med.、1997；155 ：1835−1840）。この量の抗体のコストおよび病院の設定における多数回の注入の費用および不便さは、この治療が患者の集団個体数の小さい比率を除外してすべてについて費用がかかり過ぎることを示唆する。
【００１６】
モノクローナル抗体rhuMab−E25 の臨床的有効性は、受動的に投与された抗IgE による免疫療法の可能性を確立する。このような免疫原を設計する場合およびするとき、それは、また、活性免疫化による別の抗IgE アプローチの原理的説明を提供する。
【００１７】
IgE 免疫原を使用する活性免疫化により、すなわち、内因性IgE に対する「ワクチン接種」により、抗IgE 治療は影響を受けた。IgE に対する「ワクチン接種」は受動免疫化を超えた利点を提供する：少量の安価な免疫原、少ない回数の、好都合に投与される筋肉内注射、および被検体種との適合性のためのネズミ抗体のカスタム化の不必要性、すなわち、ヒトにおいて使用するために抗体を「ヒト化」することの不必要性。なぜなら、この手法は、抗体を産生するために、患者自身の免疫系を使用するからである。しかしながら、前述のモノクローナル抗体の脱感作はIgE 免疫原が望ましいことを示唆するが、それらが安全かつ有効な免疫原のであることは不明である。このような免疫原は、交差阻害性抗体を誘導するために十分な忠実度を有すると同時に、アナフィラキシー性抗体の誘導を回避するために十分な部位特異性を保持して、関係するIgE エフェクター部位を模擬しなくてはならない。そのうえ、有効なIgE 免疫原は高度に免疫刺激性でなくてはならない。関係する、安全な部位特異性を有し、かつ十分な免疫効力を有する、このような免疫原が必要とされている。
【００１８】
アレルギーの免疫療法のためのIgE 免疫原は、IgE 仲介感作を減少するために十分なレベルの抗IgE を誘導するように、免疫刺激性でなくてはならない。このような免疫原は、自己の分子に向かって示された強い耐性を克服するように設計しなくてはならない。HabaおよびNisonoff（Proc.   Natl.   Acad.   Sci.  USA 、1990；87：3363−3367）は、マウスにおいて出生から第10日までの発生の短い新生児のウィンドウ間に、IgE を使用する免疫化によってのみ、有効な抗IgE 応答を誘導した。マウスを免疫化するために使用するIgE を外来担体タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH ）に共有結合でカップリングしないかぎり、この時間を越えて開始されたワクチン接種は所望の自己免疫応答を誘導することができなかった。同様に、ラットにおいて脱感作性抗IgE 応答は組換えタンパク質により誘導され、この組換えタンパク質はシストソマ・ジャポニクム（Schistosoma   Japonicum ）のグルタチオン−S −トランスフェラーゼに融合されたCH2 −CH3 ε鎖ドメインを含んでいた（Hellman 、Eur.  J.  Immunol.、1994；24：415 −420 ）。  他の研究者らは、よりすぐれた部位特異性を有するペプチドIgE 免疫原を探索することによって、マスト細胞および好塩基球の表面に既に結合したIgE を架橋する、アナフィラキシー性抗IgE 抗体を誘導する危険を最小とすることを試みた。例えば、IgE のCH4 ドメイン（配列番号1 の残基497 −506 ）中の部位に対応するペプチドをKLH にカップリングさせ、ラットマスト細胞中のIgE 仲介シグナルトランスダクションを抑制するとき有効である、ポリクローナル抗体を誘導するために使用した。しかしながら、ペプチド−KLH 複合体は低い免疫刺激能力を表示し、ピーク免疫ウサギ抗血清でラットを受動免疫化することによって効能を証明することを必要とした（Stanworth 他、Lancet、1990；336 ：1279−1281）。後に本発明の発明者の研究において、プロミスカスヒトT ヘルパーエピトープに共有結合を提供した合成により、1 系列の完全に合成的な免疫原として、Stanworth 他のCH4 免疫原が産生された。これらのペプチドの免疫原性はもとのKLH −ペプチド複合体のそれを超えて改良されたが、生ずる抗IgECH4抗体の効能は証明されなかった（Wang、WO95/26365号）。さらに、本明細書において実施例1 （表2 、エントリー34）に示すように、以前に開示されたCH4 エフェクター部位に対する特異性を有する抗ペプチド抗体（Stanwort他、1990）はヒトIgE に対する交差反応性をもたなかった。IgE −CH3   401 −415 ペプチドに関するBurtおよびStanworth （1987）の初期の抗ペプチド研究は、脱感作性架橋を誘導するという証拠を提供したが、これはまた選択したピークウサギ抗血清を必要とし、そしてラットモデルにおける受動免疫化による作用を観測するために、不明確なペプチド−担体タンパク質複合体の使用を必要とした。合成ペプチドは、免疫化宿主において、ヒスタミン放出を阻害できるポリクローナル抗血清の産生を誘導するとき実際に有効であることが証明されなかった。
【００１９】
効能を有しかつ安全であるために十分な免疫原性および特異性を有する、合成ペプチドの免疫原を獲得できる前に、上に論じた先行技術の免疫原を改良することが必要である。本発明は、合成ペプチドの免疫原を同定し、設計する1 組の追加の方法の組込みにより、これらの改良を達成する。これらの方法は下記の手段を包含する：（1 ）有効ターゲットエピトープを同定する有効な手順、（2 ）広く反応性のプロミスカスT ヘルパー細胞（Th）エピトープを含んでなるペプチドとB 細胞ターゲットエピトープを組合わせることによってB 細胞ターゲットエピトープの免疫原性を増強する手段、（3 ）コンビナトリアルペプチド化学を適用してT 細胞エピトープのレパートリーを拡大し、これにより異系交配集団の可変免疫応答性をさらに適合する手段、および（4 ）自然分子に対する交差反応性を最大するように、環の拘束の導入により、コンフォメーションの特徴を安定化する。
【００２０】
新しいワクチンおよび診断用薬を開発するために、タンパク質表面上の免疫優性決定因子またはエピトープを同定する「エピトープマッピング」のために合成ペプチドが使用されてきている。エピトープマッピングは、抗体−免疫原性決定因子の相互作用に参加する部位を同定するために、問題のタンパク質上の領域に対応する1 系列のオーバーラッピングペプチドを使用する。最も普通には、エピトープマッピングは、線状決定因子を正確に検出するために、比較的短い長さのペプチドを使用する。商標「PEPSCAN 」で知られているエピトープマッピングの速い方法は、固体の支持体にカップリングされた、数百の8 〜14アミノ酸長さのオーバーラッピンググペプチドを同時に合成することに基づく。カップリングされたされたペプチドを抗体に結合する能力について試験する。PEPSCAN アプローチは線状決定因子の局在化において有効であるが、不連続のエフェクター部位、例えば、FcεRI結合部位の模擬に必要なエピトープの同定において有効でない（Meloen他、Ann ．  Biol．  Clin．、1991；49：231 −242 ）。別法は1 組の15〜60残基の範囲の多数の長さを有するネステッド、オーバーラッピングペプチドに頼る方法である。これらの長いペプチドは、急速な、同時のPEPSCAN 合成によりむしろ、労力を要する系列の独立の固相ペプチド合成により信頼性をもって合成することができる。次いで生ずる組の長いネステッド、オーバーラッピングペプチドを、実験的免疫化および自然感染のような系における抗体結合の分析において使用して、簡単な不連続エピトープを包含する、免疫優性決定因子を最もよく表す長いペプチドを同定することができる。この方法は、HTLV  I ／II（米国特許第5,476,765 号）およびHCV （米国特許第5,106,726 号）からの免疫優性部位のマッピングについてのWangの研究により例示され、そしてHIV 中和性エピトープを最適に提示するgp120 配列上の正確な位置を選択するために使用された（Wang他、Science 、1991；245 ：285 −288 ）。
【００２１】
ペプチドの免疫原は一般にタンパク質よりも柔軟性であり、好ましい構造を保持する傾向がない。したがって、環の拘束の導入により、ペプチドの免疫原を安定化することは有効である。正しく環化されたペプチドの免疫原はターゲッテッドエピトープのコンフォメーションを模擬し、保存することができ、これにより真性分子上の部位と交差反応性の抗体を誘導することができる（Moore 、Chapter   2 、Synthetic   Peptides：A   User's  Guide 、Grant 編、WH  Freeman   and   Company ：New   York、1992、pp.   63−67）。
【００２２】
アレルギーの薬学上のIgE 由来ペプチドの免疫原性に影響を与える他の重要な因子は、宿主のT ヘルパー細胞レセプターおよびクラスII  MHC 分子と反応するT ヘルパー細胞エピトープによる免疫系へのIgE 由来ペプチドの提示である（Babbitt 他、Nature、1985；317 ：359 −361 ）。これらはしばしば担体タンパク質により提供されるが、よく規定されたペプチド−担体複合体の製造の困難、担体に対する大部分の抗体応答の誤った方向づけ、および担体誘導エピトープ抑制による欠点が伴う（Cease 、Intern.   Rev.  Immunol.、1990；7 ：85−107 ；Schutze 他、J.  Immunol.、1985；135 ：2319−2322）。あるいは、T ヘルパー細胞エピトープ（Th）は、また、Thを含んでなる合成ペプチドにより供給されることができる。こうして、プロミスカスThと命名するThエピトープは効率よいT 細胞ヘルパーを誘導し、そしてそれら自体免疫原性が低過ぎて効力があるペプチドの免疫原を発生できない合成B 細胞エピトープと組合わせることができる（米国特許第5,759,551 号）。よく設計されたプロミスカスTh／B 細胞エピトープキメラペプチドはThの応答を誘導することができ、そして生ずる抗体は多様なMHC ハプロタイプを発現する遺伝的に多様な集団の大部分のメンバーにおいて応答する。プロミスカスThは、タンパク質外来抗原、例えば、麻疹ウイルスF タンパク質、B 型肝炎ウイルス表面抗原、およびトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis ）主要外膜タンパク質（MOMP）に由来する特異的配列により提供されることができる。ウイルスおよび細菌の病原体から取った、多数の既知のプロミスカスThは、デカペプチドホルモンLHRHに対応する低い免疫原性のペプチドを強化するとき有効であることが示された（米国特許第5,759,551 号）。
【００２３】
外来病原体に由来するプロミスカスThエピトープは下記のものを包含するが、これらに限定されない：B 型肝炎の表面およびコアの抗原ヘルパーT 細胞エピトープ（HBs   ThおよびHBc   Th）、百日咳トキシンヘルパーT 細胞エピトープ（Pt  Th）、破傷風トキシンヘルパーT 細胞エピトープ（TT  Th）、麻疹ウイルF タンパク質ヘルパーT 細胞エピトープ（MVF   Th）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis ）主要外膜タンパク質ヘルパーT 細胞エピトープ（CT  Th）、ジフテリアトキシンヘルパーT 細胞エピトープ（DT  Th）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum ）サーカムスポロゾイト（circumsporozoite）ヘルパーT 細胞エピトープ（PF  Th）、シストソマ・マンソニ（Schistosoma   mansoni ）トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーT 細胞エピトープ（SM  Th）、および大腸菌（Escherichia   coli）TratヘルパーT 細胞エピトープ（TraT  Th）。病原体に由来するThは米国特許第5,759,551 号の中に配列番号2 〜9 および42〜52として列挙された；クラミジア（Chlamydia ）ヘルパー部位P11 として、Stagg 他、Immunology、1993；79：1 −9 に記載された；そしてHBc ペプチド50〜69として、Ferrari 他、J.  Clin.   Invest. 、1991；88：214 −222 に記載された。
【００２４】
プロミスカスThエピトープは約15〜約50アミノ酸残基長さの範囲であり（米国特許第5,759,551 号）、しばしば普通の構造的特徴を共有し、特異的ランドマーク配列を含有することがある。例えば、普通の特徴は両親媒性らせんであり、これらのらせんはらせんの1 つの面を支配する疎水性アミノ酸残基と、取り囲む面を支配帯電した極性残基とを有するアルファ−らせん構造である（Cease 他、Proc.   Natl.   Acad.   Sci.  USA 、1987；84：4249−4253）。Thエピトープはしばしば追加の主要なアミノ酸パターン、例えば、Gly または帯電した残基および引き続く2 〜3 つの疎水性残基、引き続いて帯電したまたは極性の残基を含有する。このパターンはロトバード（Rothbard）配列と呼ぶものを定める。また、Thエピトープはしばしば1 、4 、5 、8 ルールに従い、ここで正に帯電した残基に引き続いて帯電した残基後に疎水性残基が第4 、第5 および第8 位に存在し、同一面に位置する位置1 、4 、5 、および8 を有する両親媒性らせんと一致する。これらの構造のすべては、普通の疎水性の、帯電した、極性アミノ酸残基から構成され、各構造は単一のThエピトープ内に同時に存在することができる（Partidos他、J.  Gen.  Virol.、1991；72：1293−1299）。T 細胞エピトープのすべてではなく、大部分は、前述の周期性の少なくとも1 つに適合する。これらの特徴を「理想化された人工的Th部位」の設計の中に組込むことができる。
【００２５】
有用なTh部位は、また、理想化されたTh部位の設計の中に選択された縮重部位を組込む、コンビナトリアルThを包含することができる。Wang他（WO95/11998号）において、コンビナトリアルエピトープの特定のクラスは「構造化合成抗原ライブラリー」またはSSALとして表示された。SSALエピトープとして構築されたThは、不変残基の構造的フレームワークの回りに体制化された位置置換から構成されている。プロミスカスThの主要なアミノ酸配列を整列し、Thペプチドのユニーク構造の原因となる位置に比較的不変の残基を保持させ、そして多様なMHC 制限因子の認識に関連する位置に縮重を提供することによって、SSALの配列は決定される。可変の、好ましいアミノ酸のリストはMHC 結合モチーフのために入手可能である（Meister 他、Vaccine 、1995（13：581 −591 ；Alexander 他、Immunity、1994、1 ：751 −761 ）。
【００２６】
SSALのすべてのメンバーは、単一の固相ペプチド合成において、ターゲッテッドB 細胞エピトープおよび他の配列と縦列で同時に産生される。Thライブラリー配列はプロミスカスThの結合モチーフを維持し、より広い範囲のハプロタイプに対する反応性を収容する。例えば、WO95/11998号に「SSAL1TH1」として記載されているエピトープは、プロミスカスエピトープを麻疹ウイルのF タンパク質から取った後、モデル化された（Partidos他、1991）。SSAL1TH1はLHRHターゲットペプチドと縦列で使用するように設計された。麻疹エピトープと同様に、SSAL1TH1はロトバード（Rothbard）配列および1 、4 、5 、8 ルールに従う：
【化１】
0004031201.tif 000002
帯電した残基Glu またはAsp を位置1 に付加して、Thの疎水性面を取り囲む電荷を増加させる。次いで両親媒性らせんの疎水性面は2 、5 、8 、9 、10、13および16における疎水性残基により維持され、2 、5 、8 、9 、10、13および16における変動性は広い範囲のMHC 制限因子に対する結合能力を有する見かけを提供する。SSALの特徴の正味の効果は、人工的Thに対する免疫応答性の範囲を拡大することである。
【００２７】
前述のペプチド技術およびペプチド設計因子、すなわち、正確なエピトープマッピング、環の拘束、およびプロミスカスThエピトープまたは理想化プロミスカスTh，および理想化SSALThエピトープを使用して設計されたペプチドの免疫原は、本発明の有効な合成ペプチドIgE 免疫原のベースである。このようなペプチドは、最適化された位置決定および環化によるIgE エフェクター部位の有効な提示のための適当なターゲッティングおよび安全性のために好ましく、そして広く反応性のTh応答性のための免疫効力のための好ましい。
【００２８】
発明の要約
本発明は、活性免疫化によるIgE 仲介アレルギー疾患を治療するための、新しい合成ペプチド複合体組成物を提供する。免疫化は、免疫化宿主におけるIgE のエフェクター部位に対して特異的の高い力価の非アナフィラキシー性ポリクローナル抗体の産生を誘導する。これは引き続いてマスト細胞／好塩基球の誘発および活性化を妨害し、IgE 合成をダウンレギュレートする。
【００２９】
治療はペプチド組成物で宿主を免疫化することによって実施され、その中に含有される各ペプチドはターゲット抗原ペプチド配列（本明細書において「IgE −CH3 ドメイン抗原」または「IgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド」と呼ぶ）を含んでなり、ターゲット抗原ペプチド配列はヒトIgE のイプシロン（ε）重鎖のCH3 ドメイン（例えば、配列番号1 または配列番号5 のアミノ酸413 −435 ）のセグメントまたは他の種からの相同配列（例えば、配列番号6 〜8 および84）のセグメントから修飾されている。
【００３０】
一般に、IgE −CH3 ドメイン抗原は約25〜約29アミノ酸長さのペプチド配列であり、哺乳動物IgE 抗体に対して実質的に相同的であり、そして約23アミノ酸残基で分離された2 つのシステイン残基を含有する。本発明の関係において、実質的に相同的は、挿入または置換により導入することができる、2 つのシステイン残基に加えて、約4 までの他のアミノ酸置換（好ましくは保存的置換）をまた行うことができる。
【００３１】
好ましくは、ターゲット部位は次のようにして天然に存在するIgE 配列のターゲット部位から修飾される：
（1 ）システインが自然配列中の位置413 または414 に既に存在しないかぎり、位置413 または相同的位置のN 末端部位にシステイン残基を挿入する；
（2 ）自然ターゲット配列の位置415 〜434 の任意の自然システインの保存的置換（好ましくはセリン）；
（3 ）システインが自然配列中の位置435 または436 に既に存在しないかぎり、位置435 または相同的位置のC 末端部位にシステインを挿入する；そして
（4 ）保持されたシステイン間にジサルファイド結合を形成して、環状構造を産生する。これらの構造は、また、単一のジサルファイドループ構造が保存されるかぎり、IgE の413 〜435 セグメントのいずれかの末端から取った1 〜5 つの追加のアミノ酸を含んでなることができる。
【００３２】
配列Cys −Gly −Glu −Thr −Tyr −Gln −Ser −Arg −Val −Thr −His −Pro −His −Leu −Pro −Arg −Ala −Leu −Met −Arg −Ser −Thr −Thr −Lys −Cys （配列番号5 ）を有する、ヒトIgE のために最適化されたIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドは本発明により提供される。非自然末端システインおよび自然配列のシステイン残基のセリン残基の置換基を通して、ヒトIgE ターゲット部位を環化する。このIgE −CH3 ドメイン抗原を含んでなるペプチドの免疫原により誘導される抗体はヒトIgE と交差反応性であり、そしてヒトIgE によりヒト好塩基球の感作を阻害する。
【００３３】
同様に、他の種のIgE の対応するターゲット部位は、関係する種の相同的ε鎖セグメントから誘導することができる。例えば、このようなターゲット配列は表1 に示すイヌ、ラットおよびマウスのε配列（配列番号2 、3 および4 ）、またはNavarro 他、Molec.  Immunol.、1995、32：1 −8 により提供されるウマIgE −CH3 配列から取ることができる。追加のIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド（配列番号6 、7 、8 、および84）はこれらの配列から誘導することができる。
【００３４】
好ましくは、本発明のIgE −CH3 ドメイン抗原は、化学的カップリングにより担体タンパク質への共有結合を介して、より好ましくは直接的合成により、免疫刺激性因子、例えば、プロミスカスThエピトープを介して、いっそう免疫原性とされる。担体タンパク質および免疫優性因子の特定の例は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH ）担体、人工的Th（配列番号9 ）、人工的SSAL  Th（配列番号10および11）、病原体由来Th（配列番号12）、および免疫刺激性インベーシンペプチド（配列番号13）である。
【００３５】
本発明の完全に合成のペプチド複合体は、下記式により表すことができる：
（A ）n −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（B ）o −（Th）m −Ｘ
または
（A ）n −（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Ｘ
または
（A ）n −（B ）o −（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Ｘ
または
（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（B ）o −（Th）m −（A ）n −Ｘ
または
（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（A ）n −Ｘ
式中、
各A は独立してアミノ酸または一般的免疫刺激性配列であり、
各B はアミノ酸、−NHCH（X ）CH2SCH2CO −、−NHCH（X ）CH2SCH2CO （ε−N ）Lys −、−NHCH（X ）CH2S−スクシニミジル（ε−N ）Lys −、および−NHCH（X ）CH2S−（スクシニミジル）−から成る群から選択され、
各Thは独立してヘルパーT 細胞エピトープを構築するアミノ酸配列、またはその免疫増強アナローグまたはセグメントであり、
IgE −CH3 ドメイン抗原は約25〜約29アミノ酸長さのペプチドであり、哺乳動物IgE 抗体のイプシロン重鎖のCH3 ドメインの配列番号5 〜8 および84により表されるセグメントの1 つに対して実質的に相同的であり、そして約23アミノ酸残基により分離された2 つのシステイン残基を含有し、  X はアミノ酸のα−COOHまたはα−COONH2であり、
n は0 〜約10であり、
m は1 〜約4 であり、そして
o は0 〜約10である。
【００３６】
さらに詳しくは、IgE −CH3 ドメイン抗原は、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 、配列番号8 、哺乳動物IgE −CH3 抗体のイプシロン重鎖からの相同的配列、およびそれらの交差反応性、免疫学的に機能的なアナローグから成る群から選択される。
本発明のペプチド組成物は、約25〜約100 アミノ酸残基、好ましくは約25〜約80アミノ酸残基、より好ましくは約45〜約65アミノ酸残基のペプチドの免疫原を含んでなる。
【００３７】
また、ワクチン処方物に日常的に混入されるアジュバントおよび／または送出ビヒクルおよび他の成分、およびターゲッテッドIgE エフェクター部位に対して向けられた免疫療法上の抗体を発生させる投与についての取扱説明書が提供される。これは引き続いて好塩基球およびマスト細胞の循環IgE による感作を阻害し、これによりIgE −アレルゲン複合体によりマスト細胞／好塩基球の誘発および活性化を防止する。抗体により仲介され、本発明のペプチド組成物により誘導される阻害メカニズムはIgE 仲介病理を減少または排除すると同時に、免疫系の防御成分、例えば、IgG を影響を受けない状態に残す。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、IgE のFc部分の第3 ドメイン、すなわち、ε鎖のCH3 ドメイン上のターゲットエフェクター部位に対する特異性を有する高い力価のポリクローナル抗体を発生する、新規なペプチドおよびペプチド複合体組成物に関する。
【００３９】
便宜上、用語「ペプチド複合体」は、本明細書において使用するとき、単一の大きいペプチドを形成するように普通のペプチド結合を通して、あるいは他の型の共有結合を通して、IgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドに共有結合したThエピトープを含んでなる分子を意味する。
【００４０】
本発明の組成物の高い部位特異性は、好塩基球／マスト細胞表面上のFcεRIに結合した2 価IgE を架橋することができる抗IgE 抗体の発生を最小とし、これにより非アナフィラキシー性抗IgE 抗体の産生を誘導する。したがって、本発明は、さらに、ヒトを包含する哺乳動物におけるIgE 仲介アレルギー疾患を治療する安全な方法に関する。
【００４１】
有効な免疫反応性のためのヒトIgE のCH2 およびCH3 ドメイン上の候補部位を完全にスクリーニングすることによって、ターゲッテッド抗原配列は決定される。IgE のCH2 ドメインのカルボキシル末端領域において開始し、CH3 ドメインを通して進行する長い領域は潜在的エフェクター部位を含有するという、Helm他（1988）およびPresta他（1994）の開示に基づいて、CH2 およびCH3 部位はペプチド免疫原として合成のために選択される。IgE のコンフォメーションにおける潜在的ループ構造は、インターネットアドレスhttp://www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids にブルックヘブン・ナショナル・ラボラトリー（Brookhaven  National  Laboratory）により入手可能に作られたヒトIgE の三次元構造についての理論的モデルから推定され、そしてHelm他（Eur.  J.  Immunol.、1991；21：1543−1548）により報告された。予測されたループの位置を模擬し、設計されたターゲット抗原ペプチドと自然IgE 分子との間の交差反応性の可能性を最大するように、選択したペプチド免疫原の設計の中にジサルファイド結合されたループを組込んだ。潜在的ターゲット抗原部位を合成し、固相ペプチド合成に従いKLH に対する化学的複合化によるか、あるいは連続的合成に従いプロミスカスThエピトープおよび免疫刺激性配列に対する共有結合により、免疫原性とした（表2 ）。いくつかの部位を環状ペプチドとして合成し、特定のジサルファイド結合を組込んで移動性ペプチドを安定化して、予測されたIgE ループ構造に類似するコンフォメーションを形成した。次いで、超免疫血清を調製し、ヒトIgE との交差反応性について抗血清を試験することによって、潜在的に有効なエフェクターターゲット部位を同定した。ヒトIgE に対して高い交差反応性を有する血清から抗体を精製し、ヒスタミン放出についてin  vitro アッセイにおいてヒト好塩基球のIgE 仲介感作を阻害する能力について評価した。ペプチド、配列番号5 を含んでなる配列番号14および15により誘導される抗ペプチド抗体は、IgE に対して強い交差反応性を表示し（表2 ）、大部分はヒスタミン放出アッセイにおいて高い阻害活性を終始一貫して表示した（表3 ）。配列番号14および15のペプチドに対して共通のターゲットエピトープは、表1 に示すIgE   CH3 ドメインのセグメントに対応する。表1 はイヌ、ラット、およびマウスから取った相同配列と整列された、ヒトIgE のε重鎖のCH2 、CH3 およびCH4 ドメインを示す。ヒトε鎖配列上のターゲット部位は表示のために有用であると決定された。なぜなら、本発明のIgE −CH3 ドメイン抗原は表1 において下線が引かれており、そしてヒトε鎖残基413 〜435 を含むからである。表1 においてイヌ、ラット、およびマウスのタンパク質中の相同ターゲット配列にまた下線が引かれている。ウマにおける相同配列は、Navarro 他、Molec.  Immunol.、1995、32：1 −8 のアミノ酸配列中の残基296 〜318 である。
本発明の下線が引かれているターゲットIgE   CH3 エフェクター部位、および誘導されたIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドは、短いペプチド配列であり、それら自体合成されるとき、通常免疫原性が弱いか、あるいは非免疫原性であるので、自己抗原である。これらの短いペプチドは、担体タンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH ）に化学的にカップリングすることによって、免疫増強することができる。このような「IgE −CH3 ドメイン抗原−担体タンパク質」をベースとする免疫原の欠点は、大きい担体タンパク質に比較して、抗原の免疫原性が弱いということであり、これはペプチド−担体タンパク質複合体に関連する固有の問題である。このような複合体により発生される抗体の大部分は、担体タンパク質に対して向けられた非機能的抗体である。本発明の好ましい免疫原は完全に合成のペプチドであり、無関係の抗体の発生を模擬し、これによりターゲットIgE −CH3 ドメイン抗原、例えば、配列番号5 〜8 および84にいっそう集中された免疫応答を誘発する。
【００４２】
しかしながら、本発明の短いIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド（例えば、配列番号5 〜8 および84）は、非免疫原性T 細胞依存性エピトープであるので、外因性Thエピトープに対する免疫原性に依存する。これらは、共有結合されたプロミスカスThエピトープとして、本発明の好ましいペプチドのために提供された。本発明の免疫原は部位特異的免疫反応性を誘発して、エフェクター部位の正確なターゲッティングを提供し、こうして非架橋性抗IgE 抗体を産生する。生ずる部位特異的抗体は感作およびアレルギー応答を阻害するが、自発的脱顆粒を誘導しない。
【００４３】
本発明において、本発明の免疫原性ペプチド複合体の態様として、特定の例が提供される。これらの例はIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド（例えば、配列番号5 〜8 および84）への合成免疫刺激性因子の結合を提供し、こうして、遺伝的に多様な宿主集団において、IgE   CH3 ドメイン上のターゲッテッド部位に対して、効力がある交差反応性抗体が広く発生される。これらの抗IgE 抗体は非アナフィラキシー性であり、特異的にIgE に対して向けられている（実施例2 および3 ）。これらの抗体は、引き続いて、ヒスタミン放出の阻害に導き、IgE 仲介応答を減少し、こうしてIgE 仲介アレルギー疾患の有効な治療および／または予防を生ずる。
【００４４】
活性免疫化のために、用語「免疫原」は、本明細書において、IgE のε重鎖の第3 ドメイン（例えば、配列番号5 〜8 および84）上に存在するエフェクター部位に対する抗体を誘導し、IgE 仲介好塩基球およびマスト細胞の脱顆粒の阻害または抑制に導くことができる、ペプチド複合体組成物を意味する。本発明のペプチド組成物は、好ましくは化学的カップリングを介して担体タンパク質に結合された、IgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド、より好ましくは化学的カップリングを介してプロミスカスヘルパーT 細胞エピトープ（Thエピトープ）に結合されたIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド、最も好ましくはIgE −CH3 ドメイン抗原配列およびプロミスカスヘルパーT 細胞エピトープ（Thエピトープ）配列を含有する、完全に合成のペプチドを包含する。
【００４５】
担体タンパク質は、好ましくはスペーサー（例えば、Lys −Lys −Lys ）を使用して、化学的カップリングを介してIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドに共有結合される。Thペプチド（例えば、配列番号9 〜12）は、効率よい抗体応答を誘導するために、IgE −CH3 ドメイン抗原配列のN 末端またはC 末端に隣接するように、化学的カップリングを介して、または好ましくは直接的合成を介して、好ましくはスペーサー（例えば、Gly −Gly ）を使用してIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド（例えば、配列番号5 〜8 および84）に共有結合される。免疫原は必要に応じて、また、一般的免疫刺激性アミノ酸配列、例えば、細菌エルシニア（Yersinia）種からのインベーシンタンパク質のあるドメインに対応するアミノ酸配列を含んでなることができる（Brett 他、Eur.  J.  Immunol.、1993、23：1608−1614（配列番号13）。一般的免疫刺激性配列は、任意のスペーサーを含むことができ、それを通してThペプチドに結合される。
【００４６】
本発明の完全に合成のペプチド複合体は、下記式により表すことができる：
（A ）n −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（B ）o −（Th）m −Ｘ
または
（A ）n −（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Ｘ
または
（A ）n −（B ）o −（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Ｘ
または
（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（B ）o −（Th）m −（A ）n −Ｘ
または
（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（A ）n −Ｘ
式中、
各A は独立してアミノ酸または一般的免疫刺激性配列であり、
各B はアミノ酸、−NHCH（X ）CH2SCH2CO −、−NHCH（X ）CH2SCH2CO （ε−N ）Lys −、−NHCH（X ）CH2S−スクシニミジル（ε−N ）Lys −、および−NHCH（X ）CH2S−（スクシニミジル）−から成る群から選択され、
各Thは独立してヘルパーT 細胞エピトープを構築するアミノ酸配列、またはその免疫増強アナローグまたはセグメントであり、
IgE −CH3 ドメイン抗原は本明細書において定義したIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドの配列（またはその交差反応性アナローグおよび免疫学的に機能性のアナローグ）を表し、
n は0 〜約10であり、
m は1 〜約4 であり、そして
o は0 〜約10である。
【００４７】
本発明のペプチド免疫原は、約25〜約100 アミノ酸残基、好ましくは約25〜約80アミノ酸残基、より好ましくは約25〜約65アミノ酸残基のペプチドの免疫原を含んでなる。
【００４８】
A がアミノ酸であるとき、それは任意の天然に存在しないアミノ酸または任意の天然に存在するアミノ酸であることができる。天然に存在しないアミノ酸は下記のものを包含するが、これらに限定されない：D −α−アミノ酸、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびその他。天然に存在するアミノ酸は下記のものを包含する：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン。そのうえ、ｎが2 以上であるとき、各アミノ酸は独立して同一であるか、あるいは異なることができる。
【００４９】
A がインベーシンドメインであるとき、それはエルシニア（Yersinia）種のインベーシンタンパク質からの免疫刺激性エピトープである。この免疫刺激性は、T 細胞、特に活性化された免疫または記憶T 細胞上に存在するβ1 インテグリン分子と相互作用するこのインベーシンドメインの能力から生ずる。β1 インテグリンと相互作用することが見出されたインベーシンドメインの特定の配列は、Brett 他（Eur.  J.  Immunol.、1993）により記載された。プロミスカスThエピトープに対する結合についてのインベーシンドメイン（Inv ）の好ましい態様は、以前に米国特許第5,759,551 号（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載された。Inv ドメインは配列Thr −Ala −Lys −Ser −Lys −Lys −Phe −Pro −Ser −Tyr −Thr −Ala −Thr −Tyr −Gln −Phe （配列番号13）を有するか、あるいは他のエルシニア（Yersinia）種のインベーシンタンパク質中の対応する領域からのその免疫刺激性相同体である。こうして、このような相同体は、免疫刺激性を保持するかぎり、細菌株の変動を収容するために、アミノ酸残基の置換、欠失または挿入を含有することができる。免疫刺激性相同体は、また、それをThエピトープに結合させる、任意のスペーサーを含むことができる。
【００５０】
1 つの態様において、ｎは3 でありかつ（A ）3 は、下記の順序において、インベーシンドメイン（Inv ）、グリシンおよびグリシンである。
【００５１】
（B ）0 は任意のスペーサーであり、前述の天然に存在するか、あるいは天然に存在しないアミノ酸であることができるアミノ酸を含んでなる。各B は独立して同一であるか、あるいは異なる。担体タンパク質はスペーサー（例えば、Lys −Lys −Lys ）を介して化学的カップリングによりペプチドに共有結合されている。B のアミノ酸は、また、プロミスカスThエピトープ（例えば、配列番号9 ）およびIgE −CH3 ペプチド（例えば、配列番号5 ）およびその交差反応性および機能的免疫学的アナローグの間にスペーサー、例えば、Gly −Gly または（ε−N ）Lys を有することができる。スペーサーは、ThエピトープをB 細胞エピトープ、すなわち、IgE −CH3 ペプチド（例えば、配列番号5 ）およびその免疫学的アナローグから分離することに加えて、ThエピトープをIgE −CH3 ペプチド（例えば、配列番号5 ）およびその交差反応性および機能的免疫学的アナローグと結合し、これによりThおよび／またはB 細胞の応答間の干渉を排除することによって、つくられた人工的二次構造を崩壊することができる。B のアミノ酸配列は、また、ThおよびIgE ドメインの分離を増強する柔軟なヒンジとして作用するスペーサーを形成することができる。柔軟なヒンジを形成する配列の例は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域の中に見出される。柔軟なヒンジ配列はしばしばプロリンに富んでいる。1 つの特に有効な柔軟なヒンジは配列Pro −Pro −Xaa −Pro −Xaa −Pro （配列番号16）により提供され、ここでXaa は任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。B のアミノ酸により提供されるコンフォメーションの分離は、提示されたペプチド免疫原と適当なTh細胞およびB 細胞との間の、いっそう効率よい相互作用を可能とし、こうして、Thエピトープおよび抗体誘導エピトープおよびそれらの交差反応性および機能的免疫学的アナローグに対する免疫応答を増強する。
【００５２】
ThはThエピトープを含んでなるアミノ酸配列（自然または非自然のアミノ酸）である。Thエピトープは連続的または非連続的エピトープから成ることができる。それゆえ、Thのすべてのアミノ酸が必ずしもエピトープの一部分であるわけではない。したがって、Thエピトープのアナローグおよびセグメントを包含するエピトープは、IgE −CH3 抗原ペプチド（例えば、配列番号5 〜8 および84、およびそれらの免疫学的アナローグ）に対する免疫応答を増強または刺激することができる。免疫優性およびプロミスカスであるエピトープは、広く多様性のMHC 型を有する動物およびヒトの集団において高度にかつ広く反応性である（Partidos他、1991；米国特許第5,759,551 号）。主題のペプチドのドメインは、約10〜約50アミノ酸、好ましくは約10〜約30アミノ酸を有する。多数のThエピトープが存在するとき（すなわち、m ≧2 ）、各Thエピトープは独立して同一であるか、あるいは異なる。セグメントは、IgE −CH3 ペプチド（例えば、配列番号5 ）およびその免疫学的アナローグに対する免疫応答を増強または刺激するために十分であるThエピトープの連続的部分である。
【００５３】
本発明のエピトープは、例えば、下記のものを包含するが、これらに限定されない：B 型肝炎の表面およびコアの抗原ヘルパーT 細胞エピトープ（HBs   ThおよびHBc   Th）、百日咳トキシンヘルパーT 細胞エピトープ（Pt  Th）、破傷風トキシンヘルパーT 細胞エピトープ（TT  Th）、麻疹ウイルF タンパク質ヘルパーT 細胞エピトープ（MVF   Th）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis ）主要外膜タンパク質ヘルパーT 細胞エピトープ（CT  Th）、ジフテリアトキシンヘルパーT 細胞エピトープ（DT  Th）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum ）サーカムスポロゾイト（circumsporozoite）ヘルパーT 細胞エピトープ（PF  Th）、シストソマ・マンソニ（Schistosoma   mansoni ）トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーT 細胞エピトープ（SM  Th）、および大腸菌（Escherichia   coli）TratヘルパーT 細胞エピトープ（TraT  Th）。病原体に由来するThは米国特許第5,759,551 号の中に配列番号2 〜9 および42〜52として列挙された；クラミジア（Chlamydia ）ヘルパー部位P11 として、Stagg 他、Immunology、1993；79：1 −9 に記載された（また、配列番号12として本明細書において列挙されている）；そしてHBc ペプチド50〜69として、Ferrari 他、J.  Clin.   Invest. 、1991；88：214 −222 に記載された（前記参考文献はすべては引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００５４】
本発明の典型的なTh部位は、また、「Syn   Th（1 、2 、4 ）」と命名する人工的Th部位（配列番号9 ）、人工的SSAL  Th部位「（1 、4 、9   PALINDROMIC ）Th」、「IS（1 、4 、9   PALINDROMIC ）LF  Th」および「IS（1 、4 、9   PALINDROMIC ）LF  Th簡素化Th」（配列番号10、11および60）、およびそれらの免疫学的に機能的なアナローグを包含する。機能的Thアナローグは、これらのThエピトープの任意の免疫増強アナローグ、交差反応性アナローグおよびセグメントを包含する。機能的Thアナローグは、さらに、Thエピトープ中に、ThエピトープのTh刺激機能を本質的に修飾しない、1 〜約アミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失および挿入を含む。
【００５５】
本発明の合成ペプチドは、一般に、約50〜約90アミノ酸配列であり、そして
（a ）免疫刺激性インベーシンドメイン、
（b ）ヘルパーT 細胞（Th）エピトープ、および
（c ）IgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド、
を含んでなる。
【００５６】
さらに詳しくは、本発明の合成ペプチドは下記式により記載される：
（A ）n −（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Ｘ、
（A ）n −（B ）o −（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Ｘ、
（A ）n −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（B ）o −（Th）m −Ｘ、
（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（B ）o −（Th）m −（A ）n −Ｘおよび
（Th）m −（B ）o −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−（A ）n −Ｘ。
【００５７】
Thエピトープは、必要に応じてスペーサーB を通して、IgE −CH3 ペプチドおよびその交差反応性および機能的免疫学的アナローグのN 末端またはC 末端に結合される。本発明の好ましいペプチド免疫原は、IgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド（例えば、配列番号5 ）（またはそれらの免疫学的アナローグ）およびThペプチド、および必要に応じてInv （配列番号13）を含有するペプチドである。より好ましい態様において、ThエピトープはHBs   Th、HBc   Th、MVF   Th、PT  Th、TT  Th、CT  Th（例えば、配列番号12）または人工的Th（配列番号9 〜11および60）、またはそれらの機能的アナローグであり、そして必要に応じてA は（B ）0 スペーサー、例えば、Gly −Gly または（ε−N ）Lys を通して結合されたInv （配列番号13）である。
【００５８】
IgE −CH3 ドメイン抗原の構造は、ヒトIgE のCH3 ドメインから取ったペプチド配列（配列番号1 のアミノ酸413 −435 ）または他の種からの相同配列（例えば、配列番号6 〜8 および84）を含んでなり、そして下記の修飾に従う：
システインが自然配列中の位置413 または414 に既に存在しないかぎり、位置413 または相同位置のN 末端側にシステイン残基を挿入することによって、ターゲット部位を天然に存在するIgE 配列の部位から修飾する、
相同非ヒト配列の位置418 または対応する位置の自然システインまたは自然ターゲット配列をセリンで置換する（前記自然システインが位置413 または414 および435 または436 に存在しないかぎり）、
システインが自然配列中の位置435 または436 に既に存在しないかぎり、位置435 または相同位置のC 末端側にシステイン残基を挿入する、そして
環状構造を生成するように保持されたシステイン間のジサルファイド結合を形成する。
前記環状構造は、また、単一のジサルファイドループ構造が保存かぎり、IgE の413 −435 セグメントのいずれかの末端から取った1 〜5 つの追加のアミノ酸を含んでなる。配列Cys −Gly −Glu −Thr −Tyr −Gln −Ser −Arg −Val −Thr −His −Pro −His −Leu −Pro −Arg −Ala −Leu −Met −Arg −Ser −Thr −Thr −Lys −Cys （配列番号5 ）のヒトIgE について最適化標的抗原は、本発明により提供される。ヒトIgE 標的抗原は非自然末端システインを通して環化され、そして第1 セリン残基は自然配列のシステイン残基と置換する。このIgE −CH3 ドメイン抗原を含んでなるペプチド免疫原により誘導される抗体はヒトIgE と交差反応性であり、そしてヒトIgE によるヒト好塩基球の感作を阻害する。
【００５９】
同様に、他の種のIgE についての対応するIgE −CH3 ドメイン抗原配列は、関係する種のε鎖セグメントから誘導可能である。例えば、このようなターゲット配列は表1 に配列番号2 、3 および4 としてイヌ、ラットおよびマウス、およびNavarro 他が発表したウマ配列から取ることができ、そしてIgE −CH3 ドメイン抗原配列、例えば、配列番号6 、7 、8 、および84を誘導することができる。
【００６０】
本発明によるIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド（例えば、配列番号5 〜8 および84）の交差反応性、免疫学的に機能的なアナローグは、生ずるペプチドアナローグがIgE −CH3 ペプチド（例えば、配列番号5 〜8 および84）と交差反応性の免疫応答を誘発することができるかぎり、1 〜約4 アミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失、または挿入をさらに含むことができる。保存的置換、付加、および挿入は、本明細書において定義した自然または非自然のアミノ酸を使用して達成することができる。
主題のペプチド免疫原と2 またはそれ以上のThエピトープとの混合物を含有するペプチド組成物は、より広い集団において免疫効率を増強することができ、こうして、IgE −CH3 ドメイン抗原（例えば、配列番号5 〜8 および84）に対する改良された免疫応答を提供することができる。
本発明のペプチド免疫原は、当業者によく知られている化学的合成法により製造することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Fields他、Chapter   3 、Synthetic   Peptides：A   User's  Guide 、Grant 、W.  H ．編、Freeman   &   Co. ，New   York、NY、1992、p.  77。ペプチド免疫原はSSAL  Thを包含するとき、所定の可変位置におけるオールタネイティブアミノ酸のカップリングはその位置に対して特定したアミノ酸の混合物を形成することによって達成される。それゆえ、t −Boc またはFmoc化学により保護されたα−NH2 を用いる固相合成の自動化メリフィールド（Merrifield）技術に従い、例えば、アプライド・バイオシステムス（Applied   Biosystems）ペプチド合成装置430Aまたは431 で側鎖保護されたアミノ酸を使用して、ペプチドを合成することができる。
【００６１】
所望のペプチド免疫原が組立てが完結した後、標準的手順に従い樹脂を処理して樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の官能基を脱ブロックする。遊離ペプチドを、例えば、HPLCにより精製し、例えば、アミノ酸分析、質量分析、および／または配列決定により生化学的に特性決定する。ペプチドを精製し、特性決定する方法は当業者によく知られている。
【００６２】
IgE およびTh部位を含有する本発明の合成ペプチド構築物を発生させる他の化学的手段は、「チオエーテル」結合の形成によりハロアシル化およびシステイン化ペプチドの結合を包含する。例えば、システインをTh含有ペプチドのC 末端に付加し、そしてシステインのチオール基を使用して、求電子性基、例えば、IgE −CH3 ペプチド（例えば、配列番号5 ）または交差反応性および機能的免疫学的アナローグのN 末端に結合したリシンのN クロロアセチル修飾またはマレイミド誘導化α−またはε−NH2 基に対する共有結合を形成することができる。この方法において、Th−（IgE −CH3 ドメイン抗原）またはその逆方向（IgE −CH3 ドメイン抗原）−Thを有する構築物を得ることができる。
【００６３】
主題の免疫原をまた重合することができる。重合は、日常的方法に従い、例えば、免疫原を架橋剤と反応させることによって、例えば、グルタルアルデヒドをリシン残基の−NH2 基と反応させることによって達成することができる。他の方法に従い、合成免疫原、例えば、「A −Thm −スペーサー−（IgE −CH3 ドメイン抗原）」を重合するか、あるいは合成免疫原のN 末端に付加した追加のシステインを利用することによって、他の免疫原と共重合させることができる。ハロアセチル修飾アミノ酸または分枝鎖状ポリ−リシルコア分子（例えば、K2K 、K4K2K 、K8K4K2）のN 末端に結合されたリシン残基のマレイミド誘導化α−NH2 またはε−NH2 基と「チオエーテル」結合を形成するために、N 末端のシステインのチオール基を使用することができる。また、分枝鎖状ポリ−リシルコア樹脂上に直接的に所望のペプチド構築物を合成することによって、分枝鎖状ポリマーとして、主題の免疫原を製造することができる（Wang他、Science 、1991；254 ：285 −288 ）。
【００６４】
あるいは、より長い合成ペプチド免疫原をよく知られている組換えDNA 技術により合成することができる。分子クローニング技術に関する多数の標準的マニュアルは、組換えDNA およびRNA の発現により本発明のペプチドを製造する詳細なプロトコルを提供する。本発明のペプチド（例えば、配列番号5 〜8 および84を含んでなる免疫原性ペプチド、および他の種特異的相同体）をコードする遺伝子を構築するために、好ましくは遺伝子が発現される生物について最適化されたコドンを使用して、アミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳する。次に、典型的にはペプチドをコードするオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよび必要な調節因子を合成することによって、ペプチドをコードする遺伝子を作る。合成遺伝子を組立て、所望の発現ベクターの中に挿入する。本発明に含まれる合成核酸配列は、免疫学的に機能的な相同体、およびそれによりコードされるペプチドの免疫原性を変更しない非コーディング配列の変化により特徴づけられる核酸構築物を包含する。本発明のペプチドをコードする配列を含んでなる核酸もまた提供される。合成遺伝子を適当なベクターの中に挿入し、組換え体を形成し、特性決定する。次いで選択した発現系および宿主に適当なの条件下に、ペプチドを発現させる。標準的方法により、ペプチドを精製し、特性決定する。
【００６５】
本発明の核酸はそれら自体いわゆる「DNA ワクチン」の成分として有効である。本発明のこの態様において、本発明の免疫原性ペプチドの発現は、ペプチドをコードする核酸を細胞の中に導入することによって、患者自身の細胞において誘導される。DNA ワクチンを製造し、使用する方法は、下記の文献に記載されている：米国特許第5,580,859 号、米国特許第5,589,466 号、および米国特許第5,703,055 号；また、WO97/02840号およびW.  McDonnell およびF.  Askari、New   Engl.   J.  Med.、1996，334 ：2 −45、これらすべては引用することによって本明細書の一部とされる。このような本発明のペプチドおよびペプチド複合体を製造し、使用する方法は、本発明の範囲内に包含される。
【００６６】
本発明のペプチド組成物の効能はin  vitro アッセイにより確立することができ、ここで実施例2 および6 に示すように、宿主動物を本発明のペプチド組成物で免疫化し、生ずる抗体がIgE による好塩基球およびマスト細胞の感作を阻害することを示す。効能はin  vivoにおいて確立することができ、ここで実施例5 に詳述されているように、宿主に種−適当なペプチド組成物を注射し（例えば、マウスを配列番号24および／または25を含んでなる免疫原の処方物で免疫化し）次いでIgE −CH3 ペプチドおよびその交差反応性および機能的免疫学的アナローグに対する体液性免疫応答をモニターする。
【００６７】
本発明の他の面は、薬学上許容される送出系中に免疫学的に有効量の本発明の1 またはそれ以上のペプチド免疫原を含んでなるペプチド組成物を提供する。したがって、主題のペプチドは、アジュバント、薬学上許容される担体、またはワクチン組成物において日常的に提供される他の成分を使用してペプチド複合体として処方することができる。本発明において使用することができる成分の例は、アジュバントまたは乳化剤、例えば、明礬、不完全フロインドアジュバント、リポシン、サポニン、スクアレン、L121、エマルシゲン、モノホスホリル脂質A （MAL ）、QS21、ISA51 、ISA35 、ISA206、およびISA720、ならびに他の既知の有効なアジュバントおよび乳化剤である。処方物は、即時放出および／または持続放出、および全身的免疫の誘導および／または局在化粘膜免疫の誘導のために処方することができ、これらは、例えば、免疫原の捕捉または微小粒子との同時投与により達成することができる。このような処方物は当業者により容易に決定され、そしてこのような処方物を製造し、保存し、滅菌する方法はこの分野において知られている。
【００６８】
本発明の薬品は、任意の好都合な経路、例えば、皮下、経口、筋肉内、または他の非経口または腸内経路により投与することができる。同様に、薬品は、単一の投与量または多数の投与量として投与することができる。当業者は免疫化のスケジュールを容易に決定する。
【００６９】
本発明のペプチド複合体は、有効量の1 またはそれ以上の本発明のペプチド免疫原と、薬学上許容される担体とを含有する。このような組成物は適当な投与単位形態において一般に約0.5 μg 〜約1mg の免疫原／kg体重を含有する。多数の投与量で送出すとき、組成物は好都合には適当量／投与単位形態に分割することができる。例えば、最初の投与量は、本発明のペプチド組成物として提供される、例えば、0.2 〜2.5mg ，好ましくは1mg 天然に存在する免疫原を注射により、好ましくは筋肉内注射として投与し、次いで反復（ブースター）投与する。投与は、ワクチンおよび療法の分野においてよく知られているように、年齢、患者の体重および一般的健康状態に依存するであろう。
【００７０】
O'Hagan 他（Vaccine 、1991；9 ：768 −771 ）が記載する生物分解性微小粒子の中にまたはその上に捕捉させる送出しにより、合成IgE −CH3 ペプチド免疫原に対する免疫応答を改良することができる。免疫原を生物分解性の微小粒子の中にアジュバントの存在または非存在下にカプセル化して、免疫応答、例えば、粘膜的に局在化されたアレルギー反応に特に適用可能である、局在化粘膜免疫を増強し、そして持続したまたは周期的応答、経口投与、および局所投与のための時間調節的放出を提供することができる（O'Hagan 他、1991；Eldridge他、Molec.  Immunol.、1991；28：287 −294 ）。
【００７１】
本発明のペプチド複合体は、ワクチンの方法に類似する方法において、アトピー性アレルギー反応、例えば、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、ぜん息、アナフィラキシー、ノミアレルギー性皮膚炎、および他のIgE 仲介過敏性のアレルギー反応を予防するために使用される。
【００７２】
上に引用したすべての特許および文献の参考文献は、引用することによって本明細書の一部とされる。
【００７３】
特定のペプチドおよびペプチド複合体の免疫原は、本発明を例示するために下記の実施例において提供される。これらの実施例は例示のみを目的とし、本発明をいかなる方法においても限定すると解釈すべきではない。
実施例1
ヒトIgE 分子上の潜在的エフェクター部位の同定
ペプチドの設計
ヒトIgE のε重鎖のCH2 およびCH3 ドメインの両方をオーバーラップするε鎖の長いセグメントがFcεRIレセプターへのIgE の結合に参加するというHelm他（1988）およびPresta他（1994）の開示に従い、ペプチドによる模擬のためにこれらのドメイン内の部位を選択した。このような部位の配列をターゲット部位のペプチドとして合成し、（1 ）大きい担体タンパク質、例えば、KLH への化学的カップリングによりそれらを結合するか、あるいは（2 ）プロミスカスThおよびInv （配列番号13）がターゲット部位のアミノ末端に結合されたペプチドを構築することによって、抗原とした。表面暴露されたループのヒトIgE （http://www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids ）についてのブルックヘブン（Brookhaven）三次元モデルによる予測に基づいて、これらのドメイン内の特定の部位を環化のためのペプチドとして選択した。抗原と自然IgE 分子との間の交差反応性を最大するように、特定の環の拘束をそれらのペプチドの設計の中にインストールした。したがって、自然配列の中に見出されないシステインを導入して、いくつかの合成構築物を合成して、ブルックヘブン（Brookhaven）モデルにより予測されるループ構造を模擬するように、特定の位置のジサルファイド結合のループを生成した。ある場合において、天然に存在するシステインをセリンと置換して、モデルが好まないコンフォメーションの形成を防止した。
【００７４】
構築物を表2 に列挙する。表2 の記載する列において＊でマークしたペプチドは、システインジサルファイド結合により環化されている。環化のために自然配列の中に挿入されたシステイン残基は、表2 のアミノ酸配列において括弧により表示されており、挿入された他の残基、自然残基との置換、またはジサルファイド結合に参加する自然システインは表2 のアミノ酸配列において下線により示されている。他のペプチドは線状である。第3 列において「a 」で標識されているペプチドは、慣用のグルタルアルデヒドまたはMBS （m −マレイミドベンゾイル−N −ヒドロキシスクシンイミドエステル、Pierce  Chemical  Co. 、カタログNo.22510）カップリング反応によりKLH 担体タンパク質に化学結合した、IgE −CH2 ／3 または−CH3 抗原ペプチドを表す。第3 列において「b 」でマークされているペプチドは、示されているTh部位と縦列でIgE 抗原ペプチドとして合成された。使用した部位は下記のものを包含する：B 型肝炎ウイルスから取ったHBs19-32  Th、麻疹ウイルから取ったMVf   Th、および米国特許第5,759,551 号において参照されている百日咳トキシンから取ったPT149-146   Th、P11 と命名するCT  Th（Stag他、1993）および「（1 、4 、9   PALINDROMIC ）Th」（配列番号10）、「IS（1 、4 、9   PALINDROMIC ）LF  Th」（配列番号11）、「IS（1 、4 、9   PALINDROMIC ）LF  Th簡素化Th」（配列番号60）、および「Syn   Th（1 、2 、4 ））（配列番号9 ）と命名する新規な人工的Th部位。「c 」とマークするペプチドは、Inv ドメインの免疫刺激性ペプチド（配列番号13）と縦列で合成された「b 」構築物の変異型である。
【００７５】
また、IgE −CH2 ／3 または−CH3 ターゲット部位をTh部位から分離するために、そしてThをInv 免疫刺激性部位から部位するために、Gly −Gly スペーサーを使用して、「b 」および「c 」構築物を合成した。表2 における「b 」および「c 」構築物は、IgE ターゲット部位のアミノ末端に結合したThおよび／またはInv ドメインを有した。動物を超免疫化し、次いで超免疫血清をヒトIgE に対する交差反応性について試験することによって、アレルギーを治療するための候補のターゲット抗原ペプチドとして表2 のペプチド免疫原をスクリーニングした。
【００７６】
候補のターゲット抗原ペプチドをスクリーニングする特定の手順：
1.  IgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドおよび複合体の合成
アプライド・バイオシステムス（Applied   Biosystems）自動化ペプチド合成装置によりFmoc化学を使用してメリフィールド（Merrifield）固相合成技術に従い、表2 に列挙するペプチドを合成した。ペプチド免疫原がSSAL  Thを含んだとき、等モル比のアミノ酸混合物を形成することによって、所定の可変位置におけるオールタネイトアミノ酸配列の1 つのカップリングを達成した。所望のペプチドが完全に組立てられた後、標準的手順に従いトリフルオロ酢酸を使用して樹脂を処理して、樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の保護基を脱ブロックした。環状ペプチドについて、切断したペプチドを15％DMSO中に48時間溶解して、システイン間の内部のジサルファイド結合の形成を促進した。
【００７７】
2.  実験的免疫化
実験的ペプチド免疫原で、ラットまたはモルモットを筋肉内免疫化した。投与量は0.5ml の体積で懸濁したペプチドの100 μg であった。第1 投与量を完全フロインドアジュバントとともに投与した。引き続く投与量は免疫学的に機能的なアナローグとともに投与した。動物に第0 、3 、6 、および10週、または第0 、2 、4 、および8 週に注射した。試験放血を2 週の間隔で採取し、反応性をIgE ペプチドのELISA により測定し、交差反応性をヒトIgE のELISA により測定した。
【００７８】
3.  ELISA アッセイ
10mMのNaHCO3緩衝液、pH9.5 中の100 μl ／ウェルを使用して0.5 μg ／mlにおいて、担体を含まない適当な「a 」ターゲット抗原部位ペプチドと37℃において1 時間インキュベートすることによって被覆された、ペプチド被覆96ウェルのマイクロタイタープレート中で、抗IgE ペプチドの反応性を測定するペプチドELISA を実施した。抗ヒトIgE 交差反応性を測定するために、5 μg ／mlにおいてヒトIgE 骨髄腫タンパク質（Applied   Biosystems，Inc.、カタログNo.A113 ）で同様な方式において被覆した、ヒトIgE 被覆96ウェルのマイクロタイタープレート中で、ヒトIgE   ELISA を実施した。ペプチドまたはヒトIgE 被覆ウェルを250 μl のPBS 中の3 ｗ％のゼラチンと37℃において1 時間インキュベートして、非特異的タンパク質結合部位をブロックし、0.05容量％のTWEEN 20を含有するPBS で3 回洗浄し、次いで乾燥した。20容量％の正常ヤギ血清、1 容量％のゼラチンおよび0.05容量％のTWEEN 20を含有するPBS で、被験試料を連続希釈した。100 μl の希釈試料を各ウェルに添加し、37℃において1 時間反応させた。次いでPBS 中の0.05容量％のTWEEN 20でウェルを6 回洗浄して、非結合標識化抗体を除去した。PBS 中の1 容量％の正常ヤギ血清、0.05容量％のTWEEN 20中の前もって決定した最適な希釈において、100 μl のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化抗ラットIgG ヤギ抗体または抗モルモットIgG ヤギ抗体を各ウェルに添加し、37℃において20分間インキュベートした。PBS 中の0.05容量％のTWEEN 20でウェルを6 回洗浄して非結合標識化抗体複合体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.0 中に0.04重量％のo −フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD ）および0.12容量％の過酸化水素を含有する基質混合物の100 μl と15分間反応させた。100 μl の1.0MのH2SO4 の添加により反応を停止させ、A492における吸収を測定した。ELISA 力価を、希釈の逆数のlog10 として表し、0.5 設定したカットオフA492で、吸収の線形回帰分析に基づいて計算した。各アッセイで実験した希釈した正常モルモットの対照試料についての値は0.15より小さかったので、このカットオフ値は厳密であった。
【００７９】
結果
候補のターゲット抗原部位を表2 に記載する。それらはKLH 担体に結合した「a 」ペプチドとして、または合成Th部位に結合した「b 」ペプチドとして、または合成ThおよびInv に結合した「c 」ペプチドとして示されている。上記の特定の手順に記載されているようにラットまたはモルモットを免疫化し、第8 週に収集した超免疫抗血清を、特定の手順に記載されているように抗ペプチドELISA および抗ヒトIgE   ELISA により分析した。
【００８０】
多数のCH2 ／3 およびCH3 ペプチド免疫原はlog102〜5 の範囲の力価で抗ペプチド抗体を誘導したので、それらは免疫原性であった。301 −346 のヒトε鎖の長いセグメントを含んでなるCH2 ／3 抗原ターゲット部位（表1 のナンバリングスキーム）のすべては、3 より大きい抗ヒトIgE   ELISA のlog10 力価により示されるように、ヒトIgE と強く交差反応性であった。位置342 において開始し、それを越える、いくつかのCH3 ペプチド（例えば、エントリー21および22）について、交差反応性は喪失した。しかしながら、354 −372 を含んでなる比較的短い領域を含むCH3 ペプチドについて、エントリー31（354 −368 ）を除外して、交差反応性は大きく回復した（例えば、エントリー27、28、および29）。交差反応性の他の短い領域はエントリー20において見られる（環状ペプチドの走査位置374 −385 ）。
【００８１】
エントリー14、17、23、24、25、および26の交差反応性の欠如により証明されるように、365 から413 に延びる配列のストレッチは、交差反応性の354 −372 領域およびエントリー20により表される交差反応性領域（374 −385 ）とのオーバーラップにかかわらず、交差反応性を欠く。興味深いことには、エントリー27、28、29（354 −372 ）および20（374 −385 ）により例示される短い交差反応性は、それらの交差反応性領域にかかわらず、長い環化ペプチドのエントリー17（365 −396 ）のコンフォメーションにおいて喪失されている。非交差反応性部位とオーバーラップする交差反応性部位は、再び、位置399 付近における開始し、位置445 に延びる領域を越えて見出され、これはエントリー15および30の交差反応性、およびエントリー19（432 −445 ）および23（404 −413 ）の弱い交差反応性により示される。位置418 を含む2 つの同様に環化されたペプチド、15（413 −435 ）および18（404 −434 ）の意味あることは、位置418 におけるシステインがセリンで置換されているエントリー15（配列番号5 ）のみがヒトIgE と交差反応性であることである。Stanworth （Stanworth 他、Lancet、1990；336 ：1279−1281）が記載するIgE エフェクター部位に対応するCH4 部位は、交差反応性を示すことができなかた（エントリー34）。
【００８２】
これらの結果が証明するように、IgE ペプチドについての交差反応性はコンフォメーションの特徴により影響を受ける複雑な現象であり、そしてオーバーラッピング線状ペプチドの簡単な分析から予測することができない。表2 中のヒトIgE と交差反応性であることが示された候補の中から、候補のIgE −CH3 ドメイン抗原を選択し、それ以上の分析のために使用した。
【００８３】
実施例2
ヒトIgE 分子上のエフェクター部位の同定
log10 ＝3 より大きいそれぞれの抗血清についての抗IgE 力価により証明されるように、ヒトIgE に対して高いアフィニティーの交差反応性を示した表2 ペプチド複合体の中から、IgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドをそれ以上の分析のために選択した。前述したように、モルモットの超免疫血清を調製した。プロテインA アフィニティークロマトグラフィーにより、モルモットIgG 抗体を超免疫血清から精製し、アレルゲン特異的IgE によるヒト好塩基球の感作を阻害する抗IgE の能力を測定する機能的アッセイにより、分析した。アッセイの終点は、IgE 仲介ヒスタミン放出の阻害百分率として表される。
【００８４】
モルモットIgG 抗体を血清からプロテインA アフィニティークロマトグラフィー（ImmunoPureR   Immobilized   RecombR   Protein   A 、Pierce）により精製し、溶離された抗体を25mMのPIPES 緩衝液、0.15M のNaCl、pH7.2 中の8mg ／mlの標準的濃度で調製した。無関係のペプチド免疫原で免疫化されたモルモットのプールした血清から、対照抗体調製物を調製した。ヒト好塩基球のIgE 仲介感作の減少を測定するアッセイにおいて、これらの抗体を使用した。パーコール（Percoll ）密度勾配による遠心を使用して、ボランティアの静脈血液から、ヒト好塩基球を製造した（MacGalshan、J.  Allerg.   Clin.   Immunol.、1993；91：605 −615 ）。バンド化白血球を収集し、洗浄し、そして44％のD2O を含有する水で細胞の懸濁に使用したPAGCM 緩衝液を構成した以外、記載されているように（MacGalshan、1993）0.1ml のPAGCM 緩衝液中に懸濁させた。アッセイに使用したIgE はアレルゲン特異的であり、ヒトBPO 特異的IgE またはHIV 糖タンパク質gp120 に対して特異的なキメラヒトIgE であった。0.25μg ／mlにおける感作に使用するためのアレルゲン特異的IgE を等しい体積の精製されたモルモット抗体と8mg ／ml、0.1ml の全体積で37℃において15分間インキュベートした後、好塩基球に添加した。抗体混合物を細胞に添加し、20分間インキュベートして、非複合化IgE による細胞の感作を可能とした。次いで、記載されているように（MacGalshan、1993）アレルゲン、BPO21 −HSA またはgp120 ポリペプチドの添加により、感作された細胞を刺激した。
【００８５】
適当なインキュベーション期間（通常45分）後、細胞を上清から分離し、上清を自動化蛍光測定技術によりヒスタミン含量についてアッセイした（Siraganian，Anal.   Biochem.、1974；57：383 −394 ）。すべての反応は二重反復実験で実施した。ヒスタミン放出百分率を試料／全ヒスタミンの比から、自発的放出を両方から減じた後、計算した。実験の抗体によるヒスタミン放出／無関係の特異性を有する対照抗体によるヒスタミン放出の比から決定して、結果をヒスタミン放出の阻害百分率として表す。ヒト好塩基球についてのヒスタミン放出アッセイは、Donald  W.  MacGlashan博士（The   Johns   Hopkins   University  School  of  Medicine、Johns   Hopkins   Asthma  and   Allergy   Center、Baltimore ）によるコード化の条件下に実施された。
【００８６】
結果
ヒスタミン放出アッセイの結果は、log10 ＞3 のヒトIgE に対する交差反応性を表示したモルモット抗ペプチド抗体について表3 に示す。また、第12週に収集した血清から特性決定されたペプチドのエントリー15b および15c に対する抗体を除外して、第8 週の放血から精製された抗体から測定を行った。それぞれ、第8 週および第12週に採取した放血から精製された抗体ついて、61％および71％の、抗15b および抗15c 抗体について示された阻害結果を得た。別々の動物を15b および15c で免疫化したが、両方の組の動物からの抗体は第8 および18週についてプールし、結果を表3 に示す。（これらのグループのモルモットに第10週にペプチド複合体を追加投与し、こうしてこれらの動物は第12週の放血について高い抗体レベルを保持した）。表3 に示すペプチドの残部により誘導されたIgE 交差反応性抗体の反応性と比較すると、抗15抗体の有意な阻害反応性は予期せざるものであった。これらの他のIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドは阻害を提供することができないか、あるいは無視できかつ非再現性のヒスタミン放出についての阻害レベルを表した。  ペプチドのエントリー15b （配列番号14）および15c （配列番号15）の抗原部位（配列番号5 ）とオーバーラップするIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチドにより誘発される抗体について、ヒスタミン放出阻害の結果およびIgE 交差反応性を比較することができる。ペプチドのエントリー19，23，24，および33により表されるIgE 抗原は、エントリー15抗原配列（配列番号5 ）との短いオーバーラップを含んでなる。それらはIgE に対する交差反応性についてエントリー15より劣り、阻害活性を欠如する。エントリー18のIgE 抗原配列（配列番号44）はエントリー15の全体の抗原配列を含んでなり、ただし（1 ）カルボキシル末端のリシンが欠失されており、（2 ）位置418 における天然に存在するシステインが保持されており、そして（3 ）9 つの追加のN −末端のアミノ酸が存在する。それはIgE と非交差反応性であり、ヒスタミン放出を阻害することができない。対照的に、エントリー15の免疫原は、抗原配列番号5 を有し、予期せざる反応性を提供する。エントリー15のIgE −CH3 ドメイン抗原配列は、導入された末端のシステインにより特定された環状構造を有し、位置418 におけるシステインからの寄与をもたず（これは置換されている）、IgE と交差反応性でありかつIgE 感作を阻害する抗体を誘発する抗原を提供する。
【００８７】
エントリー15b （配列番号14）および15c （配列番号15）により誘発される抗体を第13週の放血から調製し、個々に試験した。第13週まで、IgE   ELISA により測定した、IgE に対する両方できる、およびヒスタミン放出の阻害百分率は第12週から減少した。それにもかかわらず、両方の調製物からの抗体はヒスタミン放出の減少において個々に有効であることが見出された：抗15b は28％阻害し、そして抗15c は20％を阻害した。
【００８８】
これらの抗体によりヒスタミン放出が阻害される程度は、抗体に対する希釈効果により証明されるように、投与量依存性であった。第13週からの抗15b の調製を完全濃度（8mg ／ml）において、次いで1 ：3 および1 ：9 希釈においてアッセイしたとき、ヒスタミン放出の阻害百分率は、それぞれ、28％、21％、および14％であった。
【００８９】
レセプター結合IgE と交差反応し、脱顆粒を誘導する抗体の評価として、モルモット抗15b の調製物を、アレルゲンの非存在下に、IgE 感作好塩基球の直接的チャレンジにより試験した。抗15b によるヒスタミン放出は、ドナー細胞による自発的ヒスタミン放出のレベルに等しかった。これにより示されるように、配列番号5 のIgE 抗原に対する特異性を有する抗体は非アナフィラキシー性である。こうして、IgE −CH3 ドメイン抗原配列番号5 を含んでなるペプチド複合体免疫原（配列番号14および15）による活性免疫化は非アナフィラキシー性抗IgE 抗体を誘発し、これらの抗体はそれら自体ヒスタミン放出を引き起こさないでIgE 仲介感作を阻害する。これらの活性的に誘発されたポリクローナル抗体は、以前の研究により記載されなかったIgE エフェクター部位に対する特異性を表示する。これらの研究は、受動免疫化によるアレルギーの治療に意図される療法的、非アナフィラキシー性抗IgE モノクローナル抗体の以前の研究を包含する（米国特許第4,940,782 号、米国特許第5,420,251 号、およびPresta他、1993）。
【００９０】
実施例3
イソ型特異性および免疫抑制についての潜在的能力
配列番号14および15に対する活性免疫応答により誘発されるポリクローナル抗体を、IgG に比較してIgE に対する特異性について検査した。実施例2 に記載し、第12週の放血からの調製された抗15b ブタモルモット抗体を、実施例1 に記載するIgE   ELISA および同様なIgG   ELISA により、IgE およびIgG に対する交差反応性の平行比較に付した。IgE   ELISA において、プレートを5 μg ／mlのヒトIgE 骨髄腫で被覆した。IgG   ELISA において、プレートを同様に5 μg ／mlのヒト精製IgG （Sigma の試薬等級のヒトIgG ）で被覆した。両方のELISA において、精製されたモルモット抗15b を0.5 および0.1 μg ／mlの濃度で反応性について試験した。結果を対照モルモット血清から精製された抗体および「非抗体」対照と比較した。IgE 上の抗15b 抗体についてのA490値は0.5 μg ／mlにおいて1.126 であり、そして0.1 μg ／mlにおいて0.344 であった。IgG 上の抗15b 抗体についてのA490値は対照抗体およびバックグラウンドの値に等しかった。ヒトIgE に対するモルモット抗15b の交差反応性は存在しなかった。本発明のペプチド組成物は、IgG 抗体を認識し、したがってIgE に対してイソ型特異的である抗体を誘発しなかった。それらはIgE 仲介アレルギー反応を抑制し、IgG 保護的抗体の応答の望ましくない免疫抑制を生じないであろう。
【００９１】
実施例4
本発明の代表的なペプチド複合体
表4Aに示す、完全に合成ペプチドである本発明の免疫原性ペプチド複合体を、実施例1 において概説する固相法により合成した。表中の各ペプチドは式（A ）n −（Th）m −（B ）0 −（IgE −CH3 ドメイン抗原）−X で表すことができるが、上に開示した他の式のペプチドは本発明のペプチドの範囲内に包含される。IgE −CH3 ドメイン抗原配列は表4Aのペプチドにおいて配列番号5 、6 、または8 であるが、他の哺乳動物種からの相同的IgE −CH3 ドメイン抗原配列は本発明のペプチドの範囲内に包含されることが理解される。免疫原性ペプチドは、外来病原体に由来するTh（例えば、配列番号20、87）、およびまた人工的Th（例えば、配列番号14、18、21および90）を含んでなる。表4Aに示す実施例に加えて、他の病原体に関係するThを表5 に例示するプロミスカスTh部位の中から選択することができ、そして人工的Thを表6 に例示するTh部位の中から選択することができる。この実施例の各ペプチドは免疫原性因子の間にGly −Gly または（ε−N ）Lys スペーサーを有するが、本発明のペプチドは他のスペーサー（例えば、配列番号16）を有するか、あるいはもたないことができる。
【００９２】
これらの実施例のペプチドは、また、任意のInv 免疫刺激性部位（例えば、配列番号15〜19および22）を含んでなる。しかしながら、本発明は追加の免疫刺激性因子としてInv に限定されないことが理解される。KLH 複合体により示されるように、本発明のペプチド複合体は、また、担体タンパク質にカップリングされたIgE −CH3 ドメイン抗原を包含する。
【００９３】
材料および方法
表4Aに列挙する本発明の代表的なペプチド複合体（配列番号18、85、87、88、90および91）を、実施例1 に記載するように、合成し、切断し、環化し、精製した。ペプチド複合体を小さい動物、例えば、モルモットの中への免疫化のために、あるいは大きい動物、例えば、ブタまたはヒヒの中への免疫化のために処方して、それらの免疫原性を評価した。ペプチドを代表的な乳化剤またはアジュバント、例えば、ISA51 、ISA720、DDA またはモノホスホリル脂質A （MPL ）を含有する体積0.5ml の中に懸濁させた。投与量はモルモットについて100 μg のペプチドまたはブタまたはヒヒについて300 μg のペプチドであり、そして動物を筋肉内的に免疫化した。
【００９４】
表4Bにおいて特定するように、動物に第0 週、第3 週および第6 週または第0 週、第2 週および第4 週に注射した。8 週後の最初の免疫化からの被験放血を実施例1 に記載するようにヒトIgE またはイヌIgE   ELISA によりIgE に対する交差反応性について評価したが、ただしイヌIgE   ELISA のためにイヌIgE 骨髄腫タンパク質（Bethyl  Laboratories  Inc.、テキサス州モントゴメリー）をプレート被覆のために1 μg ／mlで使用し、そしてセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化プロテインA ／G 試薬（Pierce  Chemical  Co. 、イリノイ州ロックフォード）を前もって決定した最適希釈においてイヌIgE の検出のためのトレーサーとして使用した。また、ペプチド誘導交差反応性をIgE 仲介ヒスタミン放出を阻害する能力について評価した。実施例2 に詳細に記載されているように、モルモット、ブタ、またはヒヒIgG を代表的免疫血清からプロテインA アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、アレルゲン特異的IgE によるヒト好塩基球の感作を阻害する能力を測定する機能的アッセイにより分析した。表4Bに示すように、無関係の抗原に対する特異性で発生させた同一種の対照抗体に比較して、IgE 仲介ヒスタミン放出の阻害PCR として、アッセイの終点を表した。
【００９５】
結果
抗ヒトIgE または抗イヌIgE   ELISA に対する3 より大きいlog10 力価により示されるように、試験したすべてのペプチドは対応するヒトIgE またはイヌIgE に対して強い部位特異的交差反応性を誘発したので、代表的ペプチド複合体は関係する免疫原性を有した（表4B）。好塩基球によるヒスタミン放出を阻害する抗IgE ペプチド抗体の能力により評価されるように、IgE 仲介感作の阻害はモルモット、ブタ、およびヒヒの抗体について観測された。ヒヒIgG によるヒトIgE の中和はほとんどヒト系であるかぎり、ヒヒ抗体により機能的交差反応性は注目に値する。こうして、本発明のペプチド複合体の効能は、活性免疫化によるアレルギーの免疫療法の薬剤として、ペプチドの種およびターゲット種に対してほとんど相同的であるモデルにおいて指示される。
【００９６】
実施例5
マウスの免疫化およびin  vivo効能の評価
下記に概説する免疫化および感作のプロトコルにより、16匹のマウスの5 グループを使用して、配列番号24および25（37b および38b ）のペプチドの効能を評価する。
【００９７】
16匹のマウス（Balb／c ）、雌、8 〜10週齢、のグループを、本発明の示したペプチド組成物で皮下的に免疫化する。マウスに第0 週、第3 週、第6 週および第11週に20μg ／0.2ml を投与する。第1 投与量は完全フロインドアジュバントを使用して調製し、引き続く投与量は免疫学的に機能的なアナローグを使用して調製する。マウスを第7 週および第10週にハプテン複合体、ジフェニル化KLH （DNP −KLH ）に対して感作させる。感作は0.4 ％の明礬中のDNP −KLH の5 μg ／0.2ml ／投与で腹腔内投与により達成される。対照グループにおいて、アジュバントおよびリン酸塩緩衝液の投与によりモック免疫化および感作を達成する。グループは次の通りである：
【００９８】
1 ：  ペプチド37b および0.4 ％の明礬を使用する、免疫化／モック感作
2 ：  ペプチド37b およびDNP −KLH を使用する、免疫化／感作
3 ：  フロインドおよびDNP −KLH を使用して、モック免疫化／感作
4 ：  ペプチド38b および0.4 ％の明礬を使用する、免疫化／モック感作
5 ：  ペプチド38b およびDNP −KLH を使用する、免疫化／感作
【００９９】
血清を第0 、5 、7 、9 、10、11、13、16、および20週に収集する。各グループからのマウスの対から第10週および第11週に脾細胞を調製する。
【０１００】
ペプチド抗原およびDNP に対するIgG 応答を慣用ELISA アッセイによりモニターする。このアッセイにおいて、抗マウスIgG セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体、およびペプチドELISA のためにウェルが非複合化ペプチド37（マウスIgE −CH3 ドメイン抗原ペプチド、配列番号18）で被覆されたマイクロタイタープレート、およびDNP   ELISA のためのDNA −BSA 複合体で被覆されたプレートを使用する。マウスモノクローナルIgE   SPE   7 （Sigma ）で被覆されたプレート上の慣用のIgG   ELISA により、マウスIgE との抗37b 抗体の交差反応性をモニターする。20週の過程を通じてペプチド免疫原に対するIgG 応答をグループの間のマウスIgE 交差反応性と比較して、1 ）一次および二次応答、2 ）IgG 応答性の望ましくない免疫抑制の存在、および3 ）本発明のペプチド組成物に対する抗体応答の可逆性および安全性の証拠として、第10週〜第20週の間における抗IgE 反応性の望ましい減少の発生。
【０１０１】
第7 、9 、10、11、13、および16週に、全IgE   ELISA およびDNP 特異的ELISA によりIgE 応答をモニターする。第10および11週に、DNP に対する特異性を有するIgE を分泌する脾細胞B 細胞をDNP 特異的ELISPOT アッセイにより数える。また、血清IgE レベルはアナフィラキシーを完全には予測することができない、すなわち、IgE 測定はin  vivo感受性に対する有意な効果を見落とすことがあるので、ラットにおけるマウス血清の受身経皮アナフィラキシー（Passive   Percutaneous  Anaphylaxis ）アッセイにより、マウスの感作を測定する（異種PCA ）。ラット皮膚マスト細胞はマウスIgG と反対にマウスIgE により選択的に交差感作されるので、異種PCA はマウスにおけるオートロガスPCA アッセイより好ましい。したがって、異種マウス／ラットPCA 反応はIgE 特異的であり、そしてオートロガスマウスPCA アッセイにおいて起こることがあるIgG 仲介アナフィラキシーにより混乱されない（Maekawa およびovary 、J.  Immunol.  Methods 、1984；71：229 −239 ）。
【０１０２】
ELISA 、ELISPOT 、およびPCA の結果をグループ間でIgE 応答性の免疫抑制および免疫抑制のイソ型特異性について比較する。実験方法を後述する。
【０１０３】
全IgE   ELISA
血清中の全マウスIgE を測定するELISA において、マイクロタイタープレートを1 μg ／mlのモノクローナルラット抗マウスIgE 、R35 −72（Pharmingen）で被覆する。記載したように、プレートを被覆し、洗浄し、ブロックする。連続希釈したマウス血清をプレートに添加し、インキュベートする。捕捉されたIgE をビオチニル化モノクローナルラット抗マウスIgE 、R35 −118 （Pharmingen）と反応させ、次いでストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Pierce）およびOPD の順次の添加により、捕捉されたIgE を検出ｌｓ。A492値を測定する。
【０１０４】
DNP 特異的IgE   ELISA
DNP −KLH で感作されたマウスからの血清中のDNP ハプテン特異的マウスIgE を測定するELISA において、マイクロタイターウェルを5 μg ／mlのDNP −BSA 複合体(Molecular  Probe ，Inc.）で被覆する。前述したように、DNP ハプテンに対する特異性を有する捕捉されたIgE を検出する。
【０１０５】
DNP 特異的ELISPOT
DNP ハプテン特異的マウスIgE を分泌するB 細胞を測定するELISPOT アッセイにおいて、ウェルが0.45μm のニトロセルロースフィルターでライニングされた、無菌のマイクロタイタープレート、例えば、MULTISCREEN   HA  Plate （Millipore   Inc.、カタログNo.MAHAS4510）のウェルを5 μg ／mlのDNP −BSA 複合体で被覆する。感作マウスおよび対照マウスから調製した、連続希釈した脾細胞をウェルに添加し、37℃において5 ％CO2 下に一夜インキュベートする。細胞をプレートから洗浄し、着色した基質として5 −ブロモ−4 −クロロ−3 −インドイルホスフェート（Sigma ）を使用するアルカリ性ホスファターゼ複合化ラットモノクローナル抗体R35 −118 で染色した後、フィルター上の局在化スポットとして、DNP ハプテンに対する特異性を有するIgE 分泌細胞を計数する。
【０１０６】
異種PCA
免疫化／感作マウスおよび対照マウスからの血清の連続希釈物を、成体雄SDラットの毛を剃った背中に皮内注射する。麻酔した動物の背側の皮膚上に3 つの平行の列の各々に希釈した血清（50μl ／部位）を10〜12回注射する。注射の各パターンを二重反復実験の動物において反復する。24時間の潜伏期間後、皮膚マスト細胞の感作を有効するために、PBS 中の1 ％のエバンスブルー色素中の1mg のDNP −BSA を静脈内注射してラットをチャレンジする。30分〜1 時間において、ラットを仮死させ、皮をはいで、背側の皮膚の内側に青くなる反応を観察できるようにする。容易に規定可能なスポットを生ずる最高の血清希釈から、PCA 力価を測定する。
【０１０７】
実施例6
マウスの免疫化および受身皮膚アナフィラキシーの阻害
IgE 仲介炎症反応に対する本発明の免疫原性ペプチドにより免疫化の効果を研究するために、本発明のペプチドでマウスを免疫化することによって、マウスIgE −CH3 ターゲット抗原部位、配列番号8 に対して抗体応答を誘発した。次いでラットマスト細胞に結合したマウスIgE の架橋により誘発された受身皮膚アナフィラキシー（PCA ）を抑制するために、生ずるマウス抗血清を使用した。
【０１０８】
材料および方法
実施例5 に記載したように、Balb／c マウスを本発明のペプチド組成物で免疫化したが、ただし皮下注射を第0 、3 、および6 週のみに行い、そしてマウスを感作しなかった。第8 週に、マウス血清を収集し、マウスIgE   ELISA によりIgE に対する交差反応性について評価した。実施例1 においてヒトIgE   ELISA について記載したようにマウスIgE   ELISA を実施したが、ただしマイクロタイターウェルを1 μg ／mlのマウス抗DNP   IgE モノクローナル抗体SPE7（Sigma   Chemical  Co. 、ミゾリー州セントルイス）で被覆し、捕捉されたマウスIgG を検出するために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP ）標識化ヤギ抗マウスIgG （Kirkegaard  and   Laboratories、マリイランド州ガイサースバーグ）を使用した。20匹の免疫化マウスのうちの13匹はマウスIgE に対する抗体と交差反応した。部位特異的抗IgE として使用するために≧log102.3のマウスIgE に対するELISA 力価を示す、7 匹のマウスから血清をプールした。
【０１０９】
10匹のBalb／c マウスの他のグループを使用してマウスIgE を産生した。0.4 ％の明礬上のオバルブミン（Oa）の1.0 μg ／0.2ml の単一の腹腔内投与により、このグループを感作した。実施例5 に記載する全IgE   ELISA により、第20日にマウス血清のIgE 含量を測定したが、ただしHRP 標識化ヒツジ抗マウスIgE （The   Binding   Site  Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ、により供給される）により、捕捉されたIgE を検出した。10匹のマウスのうちの7 匹は、力価≧log101.6の認められるIgE 応答を有した。これらの血清を抗Oa  IgE 使用ストックとして使用するためにプールした。
【０１１０】
IgE 血清プールを1 ：62、1 ：124 および1 ：248 にPBS 中に連続希釈し、次いで等しい体積の部位特異的抗IgE 血清でさらに希釈した。こうして、マウスIgE についての最後希釈は1 ：124 、1 ：248 、および1 ：496 であったが、マウス抗IgE を1 ：2 に希釈した。希釈剤としてPBS のみを有するIgE の対照希釈物を調製した。
【０１１１】
抗IgE 血清を使用しおよび使用しないで、IgE 希釈物を37℃において1 時間インキュベートし、異種PCA 反応による評価のために50μl の各々を採取した。
【０１１２】
結果
希釈したマウスIgE の50μl の試料を、1 組の2 列の4 回の注射のパターンでラットの毛を剃った背中に皮内注射した。列は次の通りであった：PBS のみの中に1 ：124 、1 ：248 、および1 ：496 に希釈したIgE の3 つの対照の列、それと平行である、部位特異的抗IgE とインキュベートした連続希釈したIgE の列。各列の第4 の注射は、組織外傷の対照として、PBS のみであった。パターンを2 匹のラットについて二重反復実験した。
【０１１３】
24時間後、1 ％のエバンスブルー色素中の1mg のDNP −Oa複合体の静脈内注射によりPCA 反応を誘導した。1 時間後、ラットを安楽死させ、皮をはいだ。DNP −Oaはラットマウスマスト細胞上のレセプター結合マウス抗Oa  IgE と架橋した。この架橋は、脱顆粒を誘発し、エバンスブルー色素の透過性を増加し、そして脱顆粒の程度に比例してラット皮膚の下側の青色ゾーンを出現させた。しかしながら、遊離IgE は部位特異的ネズミ抗IgE により消耗される場合はいつでも、ラットマスト細胞の感作に利用される量は少なく、PCA は抑制された。ラット皮膚の下側の青色ゾーンの直径を2 方向に直角に測定し、平均することによって、PCA 反応を評価した。2 匹のラットについての二重反復実験したPCA 阻害の測定結果を表7 に示す。
【０１１４】
対照および抗IgE がPCA 反応を同一ラットのみについて比較されるように、マウスIgE に対する固有の感作においてラットは異なっていた。両方のラットにおいて、マウスIgE 上のターゲット抗原部位に対する特異性を有するネズミ抗血清により、マウスIgE 仲介PCA 反応を阻害しあ。こうして、非ヒトIgE のターゲット抗原部位に対して特異的なペプチド組成物による免疫化から生ずる抗体応答は、全く同じの非ヒトIgE により仲介される炎症応答を抑制した。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
【表１０】
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【０１２５】
【表１１】
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【０１２６】
【表１２】
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【０１２７】
【表１３】
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【０１２８】
【表１４】
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【０１２９】
【表１５】
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【０１３０】
【表１６】
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【配列表】
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