(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の内耳支持細胞増殖を促進する量のＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、またはこれらの組み合わせを含み、哺乳類の内耳支持細胞の増殖を促進する、哺乳類の内耳支持細胞増殖の促進において使用するための組成物。
【請求項２】
無菌である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
製薬上許容されるキャリアをさらに含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
支持細胞がヒト細胞である、請求項１から３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
支持細胞が器官移植片中にある、請求項１から４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、またはこれらの組み合わせが蝸牛インプラントの拡散部材として提供される、請求項１から５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
ＩＧＦ−１がヒトＩＧＦ−１である、請求項１から６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
ＦＧＦ−２がヒトＦＧＦ−２である、請求項１から６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
ＩＧＦ−１を含む場合、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、またはＩＧＦＢＰ−６からなる群から選択される１つ以上のＩＧＦ結合タンパク質をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳類の内耳支持細胞増殖を誘発する量のＴＧＦ−αをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
ＮＴ４／５、ＢＤＮＦ、またはＮＴ−３、あるいはこれらのキメラからなる群から選択される、有効量のｔｒｋＢまたはｔｒｋＣアゴニストをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
（ａ）請求項３から１１のいずれか一項記載の組成物を含む容器と、（ｂ）内耳疾患治療のために当該容器（ａ）の内容物を使用するための説明書とを具備してなるキット。
【請求項１３】
ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、またはこれらの組み合わせの、哺乳類の内耳支持細胞増殖を増進する医薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
この出願は、内耳組織、特に内耳上皮有毛細胞の成長、増殖、または再生の誘発、促進、または増進に関する。さらに、この出願は、内耳疾患及び病状、特に聴覚障害の予防または治療処置のための方法、組成物及び装置を提供する。この方法は、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）及び／または線維芽成長因子−２（ＦＧＦ−２）、またはこれらのアゴニストの投与を含む。
関連開示の説明
聴覚障害は重大なハンディキャップであり、百万人に影響を及ぼしている。聴覚障害は、感染、機械的外傷、大音響、老化、及び、末梢聴覚系のニューロン及び／または有毛細胞に損傷を与える化学物質誘発性耳毒性を含む広範な原因によって起こりうる。末梢聴覚系は、聴覚受容器、コルティ器官の有毛細胞、及び、主要聴覚ニューロンである蝸牛のらせん神経節からなる。らせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）は主要な求心性の聴覚ニューロンであり、末梢聴覚受容器、コルティ器官の有毛細胞からのシグナルを、蝸牛神経を通して脳に伝達する。第八神経は、らせん神経節の主要聴覚ニューロンを脳幹に連結する。また、第八神経は、平衡を司る主要求心性感覚ニューロンであり内耳の卵形嚢、小嚢、及び膨大部からのシグナルを脳に伝達する前庭神経節ニューロン（ＶＧＮ）も脳幹に連結する。らせん神経節及び有毛細胞における主要求心性ニューロンの破壊は、聴覚障害の主な原因であるとされてきた。末梢聴覚系に対する損傷は、聴覚欠陥の大多数の原因である（Dublin, 1976; Rybak, 1986; Lim, 1986; Pryor, 1994）。
聴覚欠陥又は障害は、哺乳類に共通して発生する。外耳道から中枢神経系までの聴覚経路に沿ったいずこかの障害は聴覚欠陥をもたらし得る。聴覚器は、外耳及び中耳、内耳及び聴覚神経及び中枢聴覚経路に分けられる。種と種の間で幾分の相違はあるものの、一般的な特徴は全ての哺乳類で共通している。聴覚刺激は外耳聴覚道、鼓膜、及び耳小骨連鎖を通して内耳に機械的に伝達される。中耳及び乳様突起は、通常空気で満たされている。外耳及び中耳の疾患は、通常、この機械的伝達を妨害することによる伝音聴覚欠陥を生ずる。伝音聴覚欠陥の共通の原因は、耳閉塞症または耳垢によって起こりうる外耳道の閉塞；外傷または感染で起こりうる鼓膜の厚化又は穿孔；耳小骨連鎖の要素の固定または吸収；及び、液体に満たされた中耳空間をもたらしうるエウスターキオ管の閉塞を含む。聴覚情報は、内耳において神経上皮細胞（有毛細胞）及びＳＧＮの作用により、機械的シグナルから神経伝達される電気インパルスに変換される。ＳＧＮからの全ての中枢神経は、橋脳幹の蝸牛神経核においてシナプスを形成する。蝸牛神経核からの聴覚投射は両性であり、下丘、視床の内側膝状体、及び側頭葉の聴覚皮質にある主要な神経核を持つ。聴覚に含まれるニューロンの数は、蝸牛から聴覚脳幹及び聴覚皮質に向けて劇的に増加する。全ての聴覚情報は、限られた数の有毛細胞によって変換されるが、これらは内耳における感覚細胞であり、いわゆる内耳有毛細胞は、比較的僅かな数しか無く、主要聴覚ニューロンの約９０パーセントとシナプスを形成するので極めて重要である。これに対して、蝸牛神経核のレベルにおいて、含まれる神経成分の数は何百何千と測定される。即ち、聴覚上皮における比較的少数の細胞に対する損傷は、重大な聴覚欠陥を導き得る。従って、感音欠陥の多くの原因は、内耳の病変に帰することができる。この聴覚欠陥は進行性である。さらに、動物の加齢による耳の解剖学的構造の変化により、聴覚の鋭さは有意に低下する。
胚形成の間、前庭神経節、らせん神経節、及び耳小胞は、同じ神経原性外胚葉である耳板から誘導される。よって、前庭及び聴覚系は、有毛細胞の上皮ニューロン神経支配および脳幹神経核への中心投影を含む多くの特性を有する。これらの系はともに、治療薬、抗腫瘍性薬、食品または医薬の混入物、及び、環境及び工業汚染物質を含む耳毒素に対して感受性である。耳毒性薬は、広く用いられている化学治療薬シスプラチン及びその類似物（Fleischman等, 1975; Stadnicki等, 1975; Nakai等, 1982; Berggren等, 1990; Dublin, 1976; Hood及びBerlin, 1986）、グラム陰性細菌によって生じた感染の治療に通常用いられているアミノグリコシド抗生物質、例えば、ゲンタマイシン（Sera等, 1987; Hinojosa及びLerner, 1987; Bareggi等, 1990）、キニーネ及びその類似物、サリチル酸塩及びその類似物、並びにループ利尿薬を含む。
聴覚細胞及びらせん神経節ニューロンに対するこれらの薬の毒性効果は、それらの治療的有用性の限定要素となることが多い。例えば、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン等の抗細菌性アミノグリコシドは、重大な毒性、特に耳毒性及び腎毒性を有し、それらの抗微生物薬の有用性を低下させていることが知られている（Goodman及びGilmanのThe PhrmacologicalBasis of Therapeutics, 6th ed., A.Goodman等, eds.; Macmillan Publishing Co.,Inc., New York, pp. 1169-71（1980）またはより最新版を参照）。アミノグリコシド抗生物質は、例えば、グラム陽性、グラム陰性、酸耐性細菌に対して有効な広範な抗微生物薬として一般に用いられる。感受性微生物は、Escherichia spp.、Hemophilus spp.、Listeria spp.、Pseudomonas spp.、Nocardia spp.、Yersinia spp.、Klebsiella spp.、Enterobacter spp.、Salmonella spp.、Staphylococcus sp.、Streptococcus spp.、Mycobateria spp.、Shigella spp.、及び、Serratia spp.を含む。にもかかわらず、アミノグリコシドは、グラム陰性細菌によって生じた感染の治療、及び、例えば相乗効果のためにペニシリンと組み合わせて用いられはしない。このファミリーについての一般名称によって意味されるように、アミノグリコシド抗生物質は、全てグリコシド結合したアミノ糖を含有する。耳炎媒体は、中耳の感染を記載するのに用いられる用語であり、この感染は特に子供に極めて多い。典型的には、抗生物質は、例えば応答または予防的方法で中耳の感染に対して全身投与される。中耳感染と闘うために抗生物質を全身投与することは、一般に、中耳で治療レベルに達するまでに長い遅延時間を招き、そのレベルを達成するために高い初期投与量を必要とする。これらの欠点は、治療レベルを得る可能性を複雑化し、抗生物質の使用を全く排除することもある。全身投与は、感染が進行段階にあるときに有効であることが多いが、この点において、中耳及び内耳構造に永久損傷が既に与えられてしまっていることもある。明らかに、耳毒性は、抗生物質投与の投与量を制限する副作用である。例えば、１日２グラムのストレプトマイシンを６０から１２０日与えられた患者の７５％近くが、幾分の前庭障害を示すのに対し、１日１グラムでは発生率は２５％に減少する（米国特許第5,059,591号）。聴覚障害が観察され：１日１グラムを１週間以上受けた患者の４から１５％が測定可能な聴覚欠陥を発症し、それは悪化し、治療を続けた場合には完全に永久的な難聴に導くことがある。
また、耳毒性は、精巣、卵巣、膀胱、及び頭頸部ガンを含むヒトの種々のガンに対して有効であることが証明されているプラチナ配位錯体であるシスプラチンについての投与量を制限する副作用でもある。シスプラチンは、聴覚及び前庭系を損傷する（Fleischman等, 1975; Stadnicki等, 1975; Nakai等, 1982; Carenza等, 1986; Sera等, 1987; Bareggi等, 1990）。アスピリン等のサリチル酸塩は、それらの抗炎症、鎮痛、解熱及び抗血栓効果により最も一般に用いられている治療薬である。残念ながら、これらは耳毒性効果を有する。これらは、耳鳴り（”耳内での響音”）と同時に聴覚欠陥を導く（Mayers及びBernstein, 1965）。しかしながら、薬を高投与量で長時間用いると、臨床的に報告されているように、聴覚障害は永続的かつ不可逆的になる（Jarvis, 1966）。
従って、内耳組織、特に内耳有毛細胞を含み任意に聴覚神経を伴う内耳疾患及び聴覚障害の発生及び／または重篤性の防止、抑制又は治療するための手段への要求が存在する。特に興味深いのは、シスプラチン及びその類似物、アミノグリコシド抗生物質、サリチル酸塩及びその類似物、またはループ利尿薬を含む耳毒性治療薬の望まない副作用として生ずるこれらの病状である。さらに、これらの耳毒性誘発性製薬製剤を高い、即ち有効な投与量で投与することを可能にすると同時に、これらの薬剤によって生ずる耳毒性効果を防止又は抑制できる方法への要求も存在する。必要なのは、特に耳毒性誘発された、特に内耳有毛細胞を含む内耳組織損傷、欠陥、または破壊に関連する聴覚障害の予防又は治療的処理のための、安全、効果的、かつ長期に渡る手段を提供する方法である。本発明は、おこれら及び他の目的を達成する組成物及び方法を提供するものである。
概要
本発明は、内耳有毛細胞がin vivoでＦＧＦ−２を産生したこと、卵形嚢の上皮細胞がin vitroでＦＧＦレセプターを発現したこと、及び、ある種の成長因子の投与が、有毛細胞の先祖である支持細胞の増殖を誘発することにより新たな内耳有毛細胞の産生を刺激できることという、ここに開示する発見に部分的に基づくものである。試験した３０の成長因子の中で、ＦＧＦ−２は最も強力なマイトジェンであった。ＩＧＦ−１も有効であった。従って、本発明の目的は、内耳組織、特に内耳の上皮有毛細胞の、in vitro、ex vivo、またはin vitroでの成長、増殖、または再生を誘発、促進、または増進する手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、内耳有毛細胞関連聴覚障害または疾患（または平衡障害）、特に耳毒性誘発した又は誘発する可能性のある聴覚障害の発症又は重篤さを防止、抑制または治療するために哺乳類を処理する方法を提供することであり、その方法は、そのような処理を必要としている哺乳類に、予防的または治療的に有効な量の、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、それらのアゴニスト、それらの機能的フラグメント又は誘導体、ＦＧＦ−２又はＩＧＦ−１を含むキメラ成長因子、それらの小分子または抗体アゴニスト、または上記の組み合わせを投与することによる。聴覚または前庭神経損傷も存在または予想される場合には、任意に、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣアゴニスト、好ましくはニューロトロフィン（neurotrophin）、より好ましくはＮＴ−４／５、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦ、最も好ましくはＮＴ−４／５、あるいは、それらの機能的フラグメント又は誘導体、キメラニューロトロフィン、向汎性ニューロトロフィン、またはそれらの小分子または抗体アゴニストも投与される。本発明の方法によれば、本発明の組成物が、聴覚障害誘発性内耳組織損傷、好ましくは耳毒性を誘発した又は誘発しうる聴覚障害の投与またはそれへの曝露の前、後、あるいは同時に、適当な間隔をもって投与される。
また、耳毒性、聴覚障害性副作用を持つ製薬の投与を必要とする治療についての改良された組成物及び方法が提供され、その改良点は、治療的有効量のＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１これらのアゴニスト、これらの機能的フラグメント又は誘導体、ＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１を含むキメラ成長因子、これらの小分子又は抗体アゴニスト、又は前記の組み合わせを投与し、製薬による耳毒性を治療又は予防することである。従って、本発明の目的は、耳毒性、聴覚障害性製薬製剤とともに、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、これらのアゴニスト、又はこれらの組み合わせを含む哺乳類に投与するための改良された組成物を提供することである。このような組み合わせられた組成物は、製薬上許容されるキャリアをさらに含むことができる。製薬組成物は、耳毒性製剤のみより低い耳毒性を有し、好ましくは、耳毒性製剤が典型的に用いられる量より高い投与量を有する。このような改良された組成物の例は、シスプラチン又は他の耳毒性腫瘍薬またはアミノグリコシド抗生物質とともに、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、これらのアゴニスト、またはこれらの組み合わせを含む。ニューロン損傷が存在、疑われる、または予測される場合は、ｔｒｋＢ又はｔｒｋＣアゴニストは、任意にそれらに混合または共に投与される。
さらにまた、本発明は本発明の組成物の、細菌感染の場合における医薬での使用にも関する。本発明は、現在ある種の抗生物質、特に一般かつ共通に使用されているアミノグリコシド抗生物質に付随している耳毒性効果を、アミノグリコシドの抗微生物効果を犠牲にすることなく処理できる治療及び医薬が長い間求められていた分野にひとつの解決策を提供する。
さらにまた、本発明は、本発明の組成物の、ガンの場合における医薬での使用にも関する。本発明は、現在ある種の化学治療薬、特に一般かつ共通に使用されているシスプラチン化学治療薬に付随している耳毒性効果を、シスプラチン又はその類似物の抗腫瘍効果を犠牲にすることなく処理できる治療及び医薬が長い間求められていた分野にひとつの解決策を提供する。
さらにまた、本発明は、本発明の組成物の、利尿薬が必要とされる場合における医薬での使用にも関する。本発明は、現在ある種の利尿薬、特に一般かつ共通に使用されているループ利尿薬に付随している耳毒性効果を、それら利尿薬の有効性を犠牲にすることなく処理できる治療及び医薬が長い間求められていた分野にひとつの解決策を提供する。
さらにまた、本発明は、本発明の組成物の、キニーネまたはキニーネ様化合物が必要とされる場合における医薬での使用にも関する。本発明は、現在ある種のキニーネに付随している耳毒性効果を、それらの有効性を犠牲にすることなく処理できる治療及び医薬が長い間求められていた分野にひとつの解決策を提供する。
本発明のさらなる目的及び特徴は、図面とともに、以下の詳細な説明及び添付する請求の範囲から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ−１Ｇは、卵形嚢の上皮細胞培地及び免疫染色を示す。図１Ａは、P4-5ラットから単離した２つの無傷の卵形嚢上皮シートを示す。図１Ｂは、平板培養（プレート）時に部分的に解離した上皮シートを示す。相（図１Ｃ）及び蛍光（図１Ｄ）の写真は、ビメンチンに対する抗体ラベルされた２日目の上皮細胞培地を示す。ＺＯ１に対する抗体（図１Ｅ）、ファロイジン−ＦＩＴＣ複合体（図１Ｆ）及び全サイトケラチンに対する抗体（図１Ｇ）での２日目培地の免疫染色を示した。バーは、図１Ａ及び１Ｂでは200μm、図１Ｃ−１Ｇでは100μmである。
図２は、Ｐ４−５卵形嚢上皮細胞によるトリチウムチミジン取り込みを示すグラフである。各々の場合において、同一容量の懸濁細胞を、5%ウシ胎児血清添加した媒質中に、100ng/ml成長因子の有無においてプレートした。3Ｈ-チミジンは、プレートの24時間後に添加し、取り込みは24時間後に測定した。５から１０培養ウェルから回収したデータは、平均±s.e.m.で表した。星印はコントロール培地に比較したチミジン取り込みの有意な増加を示す（P<0.05）。ＦＧＦ−２のみを含有する培地に比較して、ＦＧＦ−２とＩＧＦ−１またはＴＧＦ−αの組み合わせを含む培地は有意に高いチミジン取り込みをもたらした（p<0.05）。
図３Ａ及び３Ｂは、卵形嚢上皮細胞培地のＢｒｄＵ免疫細胞化学反応を示す。図３Ａは、コントロール培地を示す。図３Ｂは100ng/mlのＦＧＦ−２を含有する培地を示す。ＢｒｄＵは、培養の24時間後に添加し、培地は48時間目に免疫化学反応のために固定した。ＦＧＦ−２の存在により、ＢｒｄＵ-陽性細胞の数が顕著に増加したことに注意すべきである。バーは200μmである。
図４は、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１及びＴＧＦ−αの投与量依存的なマイトジェン効果を示す。実施例で説明するように、3Ｈ-チミジン取り込みアッセイは、0.1から100ng/mlの範囲の濃度でＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１及びＴＧＦ−αを含有する培地、及びコントロール培地で実施した。符号＊及び＊＊は、各々、コントロール培地に比較した場合のp<0.05及びP<0.01を示す。ＩＧＦ−１及びＴＧＦ−αに比較して、ＦＧＦ−２は1-100ng/mlの濃度においてさらに強力であった（P<0.01）。
図５Ａ−５Ｆは、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１及びＮＧＦのレセプターに対する抗体を有する卵形嚢上皮細胞培地の免疫細胞化学反応を示す。２日目の上皮細胞培地の蛍光（図５Ａ、５Ｃ、５Ｅ）及び相（図５Ｂ、５Ｄ、５Ｆ）の写真を示すが、これらの培地は、ＦＧＦレセプターに対する抗体（図５Ａ、５Ｂ）、ＩＧＦ−１レセプターｂに対する抗体（図５Ｃ、５Ｄ）、及び、ＮＧＦの高親和性結合レセプターであるＴｒｋＡに対する抗体（図５Ｅ、５Ｆ）を有する。培養された細胞の多くは、高レベルのＦＧＦレセプター及びＩＧＦ−１レセプターを発現するが、検出可能なＴｒｋＡレセプターは観察されなかった。バーは100μmである。
図６Ａ及びＢは、ＦＧＦ−２に対するモノクローナル抗体でのＰ５ラット卵形嚢断面の免疫細胞化学反応の蛍光（図６Ａ）及び相（図６Ｂ）顕微鏡観察を示す。感覚上皮においては有毛細胞が明らかにＦＧＦ−２抗体によってラベルされているのに対し、有毛細胞の下部に位置し、それを取り囲んでいる支持細胞及び基底膜細胞はラベルされ廷内ことに注意すべきである（図６Ａ）。略語：ＨＣ、有毛細胞；ＳＣ、支持細胞；ＳＥ、感覚上皮；ＢＭ、基底膜及び下部結合組織を含む基底膜領域。バーは50μmである。
図７は、抗−ＦＧＦ−２または抗−ＩＧＦ−１中和抗体による、Ｐ４−５卵形嚢上皮細胞のトリチウムチミジン取り込みの阻害を示すグラフである。各場合において、同一容量の懸濁細胞を、1%ウシ胎児血清添加した媒質中に、抗−ＦＧＦ−２、抗−ＩＧＦ−１、抗−ＴＧＦ−αまたは抗−ＣＮＴＦ抗体、または、ＴＧＦ−α（100ng/ml）と抗−ＦＧＦ−２抗体あるいはＴＧＦ−α（100ng/ml）と抗−ＩＧＦ−１抗体との組み合わせの有無においてプレートした。3Ｈ−チミジンはプレートの24時間後に添加し、取り込みは24時間後に測定した。１０培地から集めたデータを、平均±s.e.m.で表した。抗−ＴＧＦ−α及び抗−ＣＮＴＦ抗体ではなく、抗−ＦＧＦ−２及び抗−ＩＧＦ−１抗体が有意な阻害を示したことに注意すべきである。ＴＧＦ−αのマイトジェン効果は、抗−ＦＧＦ−２抗体または抗−ＩＧＦ−１抗体の存在によって影響されなかった。
好ましい実施態様の詳細な説明
定義
ここで用いられる、処理の対象たる「哺乳類」は、ヒト、家畜、農場動物、及び、動物園、運動又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む、哺乳類に分類される如何なる動物であってもよい。ここで好ましい哺乳類はヒトである。
ここで用いられる、「ＩＧＦ−１」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、そして好ましくはヒトを含む任意の種からのインシュリン様成長因子であり、無傷の配列または変異体であって、天然、合成、または組換の任意の原からのものを意味する。ここで動物に使用するのに好ましいのは、処理されるべき特定の種からのＩＧＦ−１を形成するものであり、ブタを処理するためのブタＩＧＦ−１、ヒツジを処理するためのヒツジＩＧＦ−１、ウシを処理するためのウシＩＧＦ−１等である。ヒトに用いるのに好ましいのはヒト天然配列、成熟ＩＧＦ−１、より好ましくは、例えば、1987年8月5日に発行されたEP230,869;1984年12月19日に発行されたEP128,733；または1988年10月26日に発行されたEP288,451に記載された方法で調製される、Ｎ−末端のメチオニンを持たないものである。さらなる好ましいＩＧＦ−１変異体は、米国特許第5,077,276号；第5,164,370号；または第5,470,828号；またはWO87/01038に記載されたもの、即ち、成熟分子のＮ−末端から３番目の位置において、少なくともグルタミン酸を欠くもの、または、Ｎ−末端において５アミノ酸μでの欠失を持つものである。最も好ましい変異体は、Ｎ−末端から最初の３アミノ酸が欠失している（脳IGF、tIGF-1、des（1-3）-IGF-1、またはdes-IGF-1）。天然配列ＩＧＦ-1は、組み換え的に製造され、臨床実験のためには、Genentech,Inc., South San Fransisco, CA,から入手可能である。
ここで用いられる「ＦＧＦ−２」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、そして好ましくはヒトを含む任意の種からの線維芽成長因子−２であり、無傷の配列または変異体であって、天然、合成、または組換の任意の原からのものを意味する。ここで動物に使用するのに好ましいのは、処理されるべき特定の種からのＦＧＦ−２を形成するものであり、ブタを処理するためのブタＦＧＦ−２、ヒツジを処理するためのヒツジＦＧＦ−２、ウシを処理するためのウシＦＧＦ−２等である。ヒトに用いるのに好ましいのはヒト天然配列、成熟ＦＧＦ−２である。米国特許第5,352,589号は、ＦＧＦ−２の好ましい欠失変異体及びその製造方法を提供している。米国特許第5,514,566号は、組換えＦＧＦ−２の製造方法を提供している。米国特許第5,464,943号は、グリコシル化ＦＧＦ−２をコードするＤＮＡ及びその製造方法を提供している。遺伝子工学技術を用いたＦＧＦの製造方法は周知である。遺伝子工学技術を用いて製造方法は、Biochem. Biophys.Res. Commun. 146:470（1987）; Biotechnology, 5:960（1987）; J.Biol.Chem. 263:16471（1988）; J.Biol.Chem. 263:18452（1988）; J.Biol.Chem. 263:16297（1988）等に記載されている。
「処理（treatment）」は、治療的処理又は予防的手段の両方を含み、その目的は、好ましくは耳毒性誘発したまたは誘発しうる、内耳有毛細胞を含む内耳組織損傷関連の聴覚疾患または障害（または平衡障害）を防止または遅延化（低減）することである。処理を必要とするものは、既に聴覚障害を経験しているもの、障害を生じる傾向を持つもの、及び、障害を防止すべきものを含む。聴覚障害は、内耳有毛細胞の損傷又は損失によるものであり、その障害又は損失は、感染、機械的外傷、大音響、老化、あるいは、好ましくは化学物質誘発性耳毒性によって生じ、耳毒素は、抗腫瘍薬、サリチル酸塩、キニーネ及びアミノグリコシド抗生物質を含む治療薬、食品混入物または医薬、及び環境または工業汚染物質を包含する。典型的には、処理は、特に治療薬の投与によって生ずる又は生じうる耳毒性を防止するために行われる。好ましくは、治療的に有効な組成物は、耳毒性効果の防止又は低減に曝露された直後に与えられる。より好ましくは、処理は、耳毒性薬あるいは耳毒素への曝露の前または同時に予防的に提供される。
本発明の内容において、「耳毒性薬」は、その化学的作用を通して、聴覚に関連する神経系の成分に活性を損傷、喪失または阻害し、聴覚（及び／または平衡）を喪失させる物質を意味する。本発明の内容において、耳毒性は内耳有毛細胞に対する有害効果を含む。聴覚障害を生ずる耳毒性薬は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチン、タキソール（taxol）、またはジデオキシ化合物、例えば、ジデオキシイノシン等の腫瘍薬；アルコール；金属；職業又は環境曝露に含まれる工業毒素；食品または医薬品の混入物質；または、ペニシリンまたはクロラムフェニコール等の抗生物質、またはメガドーズ（megadoses）のビタミンＡ、ＤまたはＢ６、サリチル酸塩、キニーネ及びループ利尿薬等といったビタミン類または治療薬の過剰投与を含むが、これらに限定されない。耳毒性誘発性聴覚障害を生じ得る他の毒性薬は、ここに教示する方法によって同定及び特徴付けすることができる。「耳毒性薬への曝露」は、耳毒性薬が哺乳類に利用可能、または接触するようになることを意味する。耳毒性薬への曝露は、直接投与、例えば、食品、医薬品、または治療薬、例えば化学治療薬をにより、偶発的混入により、または環境曝露、例えば、空気または水への曝露により起こりうる。
ここで用いられる、「慢性」は、急性ではなく、多かれ少なかれ連続的なレベルで起こる疾患を意味する。「疾患」は、本発明の因子及び組成物での処理から利益を得る任意の状況である。処理される疾患は、上記疾患の２つ又はそれ以上の組み合わせであってもよく、聴覚又は前庭ニューロンの損傷又は喪失を含んでもよい。
発明の実施の形態
本発明によって処理の対象とされる患者は、ここに定義した内耳有毛細胞関連病状を持つ患者である。
本発明に関連する聴覚疾患は、好ましくは内耳細胞を含む末端器官の損傷による感覚聴覚喪失、例えば、音響外傷、ウイルス性内リンパ迷路炎、メニエール病等である。聴覚障害は、音響刺激無しでの音の知覚である耳鳴、そして間欠性、連続性を問わず、感音喪失と診断される感音障害を含む。聴覚喪失は、細菌性またはウイルス性感染、例えば、急性中耳炎から生じる耳帯状疱疹、化膿性迷路炎、化膿性髄膜炎、慢性中耳炎、例えば、マンプス、はしか、インフルエンザ、水痘、単核細胞症、及びアデノウイルスを含むウイルスによって生ずるウイルス性内リンパ迷路炎といったウイルス起源のものを含む突発性聴覚消失などである。聴覚喪失は、風疹、新生児無酸素症、輸送中の耳内出血、母胎に投与された耳毒性薬、胎児赤芽球症、並びにワールデンブルヒ症候群及びフルラー症候群を含む遺伝病によって生ずるような先天性のものであってもよい。聴覚喪失は、内耳に損傷を与える、一般に８５デシベル（ｄｂ）より大きなノイズによる、ノイズ誘発性であってもよい。聴覚喪失は、通常老化の一部である感音難聴性聴覚喪失である老人性難聴、内耳に延びた側頭骨の骨折、鼓膜及びおそらく耳小骨連鎖の破壊、蝸牛に影響する骨折、並びに、一般に第八神経の聴覚または前庭部分から生ずるシュワン（Schwann）細胞の腫瘍である聴神経鞘腫を含む。好ましくは、聴覚喪失は、内耳の聴覚部分、特に内耳有毛細胞に影響する耳毒性薬によって生ずる。ここで参考として取り入れるのは、Mmerck Manual of Diagnosis and Therapy, 14th Edition,（1982）, merck Sharp & Dome Research Laboratories, N.J.の第196、197、198及び199章、並びに、最新の第16版の、聴覚及び平衡障害の記載及び診断に関連する、第207及び210章を含む対応する章である。
聴覚障害を診断するための試験は知られており利用可能である。神経−耳科学的、神経−眼科的、及び神経学的試験、及び電気−眼球運動記録法が用いられる（Wennmo等, Acta Otolaryngol（1982）94: 507-15）。聴覚障害を持つ患者を同定するための敏感かつ選択的方法が利用可能である。例えば、感音難聴性聴覚喪失からの伝音の鑑別、及び喪失が一側性であるか否かの測定に、回転フォーク試験が使用できる。聴力喪失を定量化するのに、デシベルで測定される聴力計が用いられる。この装置により、各耳の聴覚が典型的には125から8000Ｈｚまで測定され、オージオグラムとしてプロットされる。語音聴力検査を行うこともできる。言語認識しきい値、言語が有意義なシンボルとして認識される強度が、種々の言語周波数で測定される。言語音の解析は内耳及び第八神経に依存しているため、言語又は音素識別も測定され、感音難聴性聴覚喪失のインジケータとして用いられる。伝音性聴覚喪失の診断のために、そして、感音難聴性聴覚喪失を持つ患者の診断を目的として、チンパノメトリー（tympanometry）を用いることができる。音響刺激に対する、蝸牛マイクロホン反応及び第八神経の作用能力を測定する蝸電図法、並びに、脳幹及び聴覚皮質からの誘発された反応を測定する誘発反応聴力検査が、患者、特に乳児及び小児患者または不明瞭な病因の感音難調整聴覚喪失を持つ患者に使用される。これらの試験は、治療に対する応答の評価において診断機能並びに臨床機能を提供する。
感覚及び神経性聴覚喪失は、レクルートメント（音の大きさに対する知覚の異常な増加、または聴覚喪失によらない大音響を聞く能力）、強度における小増分に対する感受性、及びあびみ骨逆流崩壊を含む病原学的適応についての試験に基づいて区別できる。レクルートメントは、一般に、神経性聴覚喪失には存在しない。感覚性聴覚喪失において影響される耳における大きな音の刺激は、強度での各増分を平常耳における場合より増大させる。強度における小増分に対する感受性は、聴覚しきい値より20db高い連続音を与え、1dbずつ間欠的に増大させることにより示される。検出された小増分の比率は、「短増分感受性係数（short increment sensitivity index）」値を与える。８０から１００％という高い値は、感覚性聴覚喪失の特徴であり、神経性聴覚喪失患者及び平常聴覚を持つ者では、そのような強度における小さな変化は検出されない。ベーケーシーオージオメータまたはその同等物は、これらの臨床的かつ診断的兆候の測定に使用でき、タイプＩＩパターン、タイプＩＩＩパターン及びタイプＩＶパターンのオージオグラムパターンは、本発明の処理方法に適した好ましい聴覚喪失を示している。聴覚喪失は、前庭障害を伴うことが多いので、特に病因の不明瞭な感覚性聴覚喪失が発現している場合、前庭機能を試験することもできる。可能ならば、オージオメトリー測定等の診断を曝露に先立って実施し、患者の平常聴覚ベースラインを得ておくべきである。耳毒性薬に対する曝露時に、オージオメトリー試験を週に２回行い、聴覚喪失は休止後数日まで起こらないこともあるので薬物処理の休止後も続けて試験すべきである。米国特許第5,546,956号は、患者を診断し処理を監視するのに使用できる聴覚試験方法を提供する。米国特許第4,637,402号は、患者を診断し処理を監視するのに使用できる聴覚障害の定量的測定方法を提供する。
下等脊椎動物及び鳥類での研究は、内耳の支持細胞が有毛細胞の先祖であることを示している（例えば、27及び49参照）。外傷に対して、支持細胞は、新たな有毛細胞への増殖及び分化が誘発される。しかし、哺乳類系では、支持細胞増殖及び有毛細胞再生が起こるのは、鳥類系に比較して極めて少ない（48、92、127）。哺乳類卵形嚢上皮支持細胞は、接着結合タンパク質（ＺＯ１）、サイトケラチン、及びＦ-アクチンを含む上皮抗原を発現するが、線維芽抗原、ビメンチン及びＴｈｙ１．１またはグリア細胞及び神経性抗原は発現しない。特徴的に、培地において、支持細胞は生存のための細胞−対−細胞接触を必要とし、それらは、解離したひな鳥上皮細胞に見られるように、他の支持細胞によって、そして線維芽細胞単層によって提供されうる（16）。有毛細胞の発達及び認識にある分子性及び細胞性メカニズムの特定は、小さな組織サイズ、内耳の複雑な骨構造、及び有毛細胞増殖剤培養系の欠如によって妨害されていた。
卵形嚢上皮は、中枢、感覚上皮、及び末梢、周辺ゾーンからなる（Lambert 1994）。ここで得られた結果は、卵形嚢が培養された実施例において、幾つかの実施例で感覚周辺ゾーンに位置する移行細胞のキャリオーバー及びそれによる増殖のみが起こり、他の実施例では非感覚性上皮細胞を全く含まない感覚上皮が得られたことから、主に感覚上皮細胞の増殖を反映している。さらに、ここに提示するin vivo分析は、in vitroの結果と一致する。
本発明の一実施態様は、聴覚（または平衡）障害を持つ又は持つ蛍光がある哺乳類を処理するための方法、あるいは、好ましくは耳毒性薬の内耳細胞損傷、喪失、または破壊からもたらされる聴覚（または平衡）障害の発生または重篤性を防止または低減する哺乳類の予防的処理方法からなり、治療的有効量の本発明の内耳支持細胞または成長因子またはアゴニスト、有毛細胞再生、成長、増殖を促進し、または、支持上皮細胞の増殖の誘発により有毛細胞の毒性を阻害又は抑制する化合物が、新たな有毛細胞の生成を導く。このような分子は、卵形嚢上皮細胞ＦＧＦ-及びＩＧＦ-１−高親和性結合レセプターのアゴニストであり、ここで、感覚上皮細胞表面に発現されるものとして同定される。好ましい化合物はＦＧＦ−２又はＩＧＦ−１、それらの抗体アゴニスト、または前記の組み合わせである。神経細胞損傷も疑われるまたは予測される場合は、任意に、哺乳類にｔｒｋＢまたはｔｒｋＣアゴニストも投与される。好ましくは、ｔｒｋＢ又はｔｒｋＣアゴニストは、ニューロトロフィン、より好ましくはニューロトロフィンＮＴ−４／５、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦ、それらの機能的フラグメント、融合物または誘導体、例えば、キメラニューロトロフィン（ｔｒｋＢとｔｒｋＣアゴニスト性の両方を有する）、向汎性ニューロトロフィン、あるいは、ここで詳細に議論するそれらの小分子または抗体である。最も好ましくは、アゴニストはＮＴ−４／５又はそのキメラまたは向汎性変異体で、少なくともｔｒｋＢとｔｒｋＣアゴニスト活性の両方を有するものである。好ましいキメラまたは向汎性ニューロトロフィンは、ＮＴ−３−レセプター結合特異性を持つ領域、及び、ＮＴ−４／５−レセプター結合特異性を持つ領域を有する。好ましい向汎性ニューロトロフィンはＭＮＴＳ−１である。好ましい実施態様では、キメラまたは向汎性ニューロトロフィンのニューロトロフィンレセプターへの結合は、天然ニューロトロフィンリガンドのレセプターへの結合の少なくとも８０％である。患者がヒトである場合、成長因子及びニューロトロフィンは、好ましくはヒトの成長因子及びニューロトロフィンまたはヒト遺伝子配列から誘導され、部分的に外来物としてのアゴニスト認識を回避又は最小化する。本発明の方法は、聴覚障害が耳毒性誘発性または誘発されうるものであるときに特に有効である。
本発明の他の目的は、哺乳類の聴覚障害、疾患、または不均等、好ましくは耳毒性誘発性聴覚症状を防止、抑制又は治療する処理方法であり、そのような処理を必要とする哺乳類に本発明の組成物を投与するにとによる。一実施態様は、聴覚疾患または障害の処理方法であり、耳毒性が治療的有効量の耳毒性製薬製剤の投与の結果もたらされる。典型的な耳毒性薬は、化学治療薬、例えば、抗腫瘍薬、及び抗生物質である。他の可能な候補は、ループ利尿薬、キニーネ又はキニーネ様化合物、及びサリチル酸塩又はサリチル酸様化合物である。
本発明の方法は、耳毒性化合物が抗生物質、好ましくはアミノグリコシド抗生物質であるときに特に有効である。耳毒性アミノグリコシド抗生物質は、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、バイオマイシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジベカシン（dibekacin）、フォルチミシン（fortimicin）、及びジヒドロストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせを含む。特に抗生物質は、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、及びゲンタマイシンＣ２を含む。
アミノグリコシドによって誘発された聴覚障害は、本発明の方法によって防止又は抑制できる。アミノグリコシドは、感受性生物による感染における迅速な殺菌作用によって特に有用であるが、耳毒性及び腎臓毒性副作用により、それらの使用はより重大で複雑な感染に制限されている。そのため、アミノグリコシドは、全身に使用される他の抗生物質に比較して治療性／危険性比率が低いと考えられている。
アミノグリコシドは、微生物におけるタンパク質合成を阻害する能力によって特徴づけられる化合物類である。アミノグリコシドは、ヘキソース（またはアミノシクリトール）核にグリコシド結合で結合した２つ又はそれ以上の糖を有する。これまで知られているヘキソース核はストレプチジンまたは２-デオキシストレプトアミンであるが、他は予想できる。アミノグリコシド類は、アミノシクリトールに結合したアミノ糖によって区別される。例えば、ネオマイシン類は中心の２-デオキシストレプトアミンに結合した３つのアミノ糖を含む。カナマイシン及びグルタミシン類は、アミノシクリトールに結合した２つのアミノ糖のみを含む。アミノグリコシドは：ネオマイシン（例えば、ネオマイシンＢ及びその誘導体）、パロマイシン、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン（例えば、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、及びこれらの類似物及び誘導体）、アミカシン、トブラマイシン、バイオマイシン、ゲンタマイシン（例えば、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイシンＣ２、及びそれらの類似物及び誘導体）、シソマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジベカシン、フォルチミシン、及びジヒドロストレプトマイシンを含む。
本発明の耳毒性阻害組成物と共に用いられるアミノグリコシド抗生物質は、任意のアミノグリコシド抗生物質である。そのようなアミノグリコシド抗生物質の例は、カナマイシン（Merck Index 9th ed. #5132）、ベンタマイシン（Merck Index 9th ed. #4224）、アミカシン（Merck Index 9th ed. #A1）、ジベカシン（Merck Index 9th ed. #2969）、トブラマイシン（Merck Index 9th ed. #9193）、ストレプトマイシン（Merck Index 9th ed. #8611/8612）、パロモマイシン（Merck Index 9th ed. #6844）、シソマイシン（Merck Index 9th ed. #8298）、伊勢派マイシン及びネチルマイシンを含み、全てこの分野で周知である。有用な抗生物質は、上記化合物の幾つかの構造変異体（例えば、カナマイシンＡ、Ｂ及びＣ；ゲンタマイシンＡ、Ｃ１、Ｃ１ａ、Ｃ２及びＤ；ネオマイシンＢ及びＣ等）を含む。これらアミノグリコシド抗生物質の遊離塩基、並び製薬上許容される酸付加塩も使用できる。
この開示の趣旨では、「製薬上許容される酸付加塩」という用語は、アミノ繰り岸度抗生物質の一分子と１つ又はそれ以上のモル数の製薬上許容される酸との相互作用によって形成されるモノまたはポリ塩を意味する。これらの酸に含まれるのは、酢酸、塩酸、硫酸、マレイン酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、及びクエン酸、そして、アミン含有製剤の塩を製造するのに通常用いられる他の酸である。
従って、本発明の方法及び組成物は、先天性または獲得された免疫欠陥あるいは化学治療薬の副作用の結果免疫抑制された動物及びヒトの日和見性の感染の予防及び治療のための用途が見いだされる。従って、本発明の別の実施態様では、本発明の組成物は、好ましくは周知の抗細菌薬と組み合わせて用いられ、非限定的にStaphylococcus aureus、Streptococcus pneumonia、Hemophilus influenzaを含むグラム陽性細菌、非限定的にEscherichia coli; Bacterium enteritis,Francisella tularensisを含むグラム陰性細菌、非限定的にMycobacterium tuberculosis及びMycobacterium lapraeを含む抗酸性細菌によって誘発された疾患の予防及び／または治療のための改善された方法及び組成物を提供する。本発明の組成物と共に抗微生物薬を組み合わせて使用することは、重大な耳毒性を持つことが知られ、そのような抗微生物の使用を抑制されていたゲンタマイシン、ストレプトマイシンなどの抗微生物薬にとって有利である。本発明の組成物をそのような薬と組み合わせて使用することは、毒性抗微生物薬の投与量を低減しながら治療（抗微生物）効果を達成することを可能にする。
幾つかの実施態様において、本発明の組成物は耳毒素と共に投与される。例えば、哺乳類の感染の治療のためのアミノグリコシド抗生物質による改善された方法が提供され、その改善点は、治療的有効量のＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１またはこのアゴニストを、そのような処理を必要としている患者に投与し、抗生物質に伴う耳毒素誘発性聴覚障害を防止することである。さらに他の実施態様では、化学治療薬の投与による哺乳類のガンの治療のための改善された方法が提供され、その改善点は、治療的有効量の本発明の組成物を、そのような処理を必要とする患者に投与し、化学治療薬に伴う耳毒素誘発性聴覚障害を防止することである。
また、ここで、聴覚または平衡の障害または疾患を誘発しうる薬または効果に曝露する時、その前又は後に、内耳支持細胞の増殖、再生または成長を誘発することによる、新たな内耳有毛細胞を増進する方法も提供される。このような薬又は効果は、ここに記載したものである。この方法は、内耳有毛細胞に、有効量のＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、またはそれらのアゴニスト、あるいはここで有用であると記載した因子を投与する過程を含む。好ましくは、この方法は、聴覚障害性耳毒素に曝露する時、その前または後に用いる。
一実施態様では、この処理方法は、化学治療薬の投与による聴覚障害に対して、その耳毒性副作用を治療するために適用される。本発明の方法に適用可能な耳毒性化学治療薬は、シスプラチン又はシスプラチン様化合物を含む抗腫瘍薬、タキソール又はタキソール様化合物、及び、耳毒素誘発性聴覚障害を生ずると考えられる他の化学治療薬、例えば、ビンクリスチン、血液学的悪性疾患及び肉腫の治療に用いられる抗腫瘍薬を含むが、これらに限定されない。
一実施態様では、本発明の方法は、マラリア治療に典型的に用いられるキニーネまたはその合成物質の投与による聴覚障害に、その耳毒性副作用を治療するために適用される。
他の実施態様では、本発明の方法は、利尿薬の投与による聴覚障害に、その耳毒性副作用を治療するために適用される。利尿薬、特に「ループ」利尿薬、即ち、主にヘンレのループに作用するものが候補となる利尿薬である。本発明を限定しない例示は、フロセミド、エタクリン酸、及び水銀剤を含む。利尿薬は、典型的には、水腫を防止または除去するために用いられる。また、利尿薬は、高血圧症、高カルシウム血症、突発性高カルシウム血症、及び腎原性尿崩症などの非水腫状態にも用いられる。
他の実施態様では、本発明の組成物は、ニューロン細胞の成長、増殖、または再生を促進する薬とともに投与される。この分野で知られているように、低濃度のゲンタマイシンは、優先的に有毛細胞を殺すが、神経節ニューロンへの損傷は重大ではない。しかし、高濃度のゲンタマイシンは、有毛細胞並びに神経節ニューロンの破壊を誘発する。従って、このアミノグリコシドの二重毒性は、本発明の方法により、好ましくは本発明の組成物によって処理される。
ＦＧＦ−２及び／またはＩＧＦ−１、またはアゴニストは、腸管外、鼻腔内、肺内、経口、または皮膚を通した吸収を含む適当な技術によって患者に投与される。これらが共に投与される場合、それらは同じ経路で投与する必要はない。これらは、局所又は全身に投与することができる。腸管外投与の例は、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、及び、腹腔内、及び蝸牛内投与を含む。これらは、毎日の皮下注射によって投与することができる。これらはインプラントによって投与することができる。これらは、耳管に液滴で投与でき、内耳の鼓室階室に輸送でき、または、蝸牛聴覚インプラントの拡散部材として提供できる。
ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２、またはアゴニストは、混合し、吸入及び注入を含む任意の適当な技術により哺乳類に直接投与できる。投与の特定な経路は、例えば、ＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１を単独で用いたとき察知されるまたは予想される副作用、及び治療すべき特定の疾患を含む患者の医療歴に依存する。腸管外投与の例は、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、及び腹腔内投与を含む。最も好ましくは、投与は連続注入（例えば、徐放装置、または浸透ポンプ等のミニポンプ、または皮膚パッチを用いる）、または注入（例えば、静脈内又は動脈内手段を用いる）である。また、一回のボーラスとして、あるいは徐放貯蔵製剤によって投与してもよい。アゴニストは、必要に応じて、予防的または治療滴適用について、多くの経路によって急性又は慢性的に投与され、その経路は、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、皮下、または病変部内での注入または吸入、局所投与、経口活性小分子が用いられる場合は経口、下記の徐放系の使用、ポンプ等の連続投与手段を用いた留置カテーテル、パッチ、あるいは、インプラント系、例えば、成長因子及び／またはニューロトロフィンを分泌する徐放性媒体または免疫分離細胞のインプラントを含む。アゴニストは、クリアランスレートが十分低い場合は注入または周期的ボーラスにより、あるいは、血流、リンパ、ＣＮＳまたは髄液中への投与により連続的に投与される。好ましい投与形態は、耳または前庭の障害部位に、典型的には例えばインプラントにより、このμｓくは障害有毛細胞、それらの支持細胞、及び（任意に）付随するニューロンに直接なされ、分子を原に配向させてアゴニストのサイズ効果を最小にする。
前記したように、組成物は、慢性的に埋め込まれたカテーテルを通して注入しても、浸透ミニポンプの助力により慢性的に注入させてもよい。小管を通してタンパク質を適当な領域に輸送する皮下ポンプが利用可能である。非常に精巧なポンプは皮膚を通して再補充され、それらの輸送速度は外科的介入無しにセットできる。好ましい投与プロトコール、及び、皮下ポンプ装置または全体的に埋め込まれた薬物輸送系（ドラッグ・デリバリー・システム）を通した連続注入を含む輸送系の例は、アルツハイマー患者及びパーキンソン病の動物モデルにドーパミン、ドーパミンアゴニスト、及びコリン作用アゴニストを投与するのに使用されたものであり、それらは、Harbaugh, J.Neural Transm. Suppl., 24: 271-277（1987）及びDe Yebenes等, Mov.Disord., 2: 143-158（1987）に記載され、その開示はここに参考として取り入れる。アゴニスト濃度を増加させることが必要な領域に、アゴニストを能動的に産生する細胞を導入することも可能であると考えられる。
治療的に用いられるアゴニストの有効量は、例えば、治療対象、投与経路、患者の種、及び患者の状態に依存する。従って療法士は、最適の治療効果を得るために必要な場合は、それらの投与量をタイター（titer）し、投与経路を修正する必要がある。この分野で知られているように、年齢並びに体重、一般的健康、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び疾患の重篤さに対する調節は必要であり、当業者は、日常の実験で確認できるであろう。アゴニストのみを用いた典型的な一日の投与量は、上記の要因に依存して、１日当たり患者の体重に対して、約１μg/kgから１００mg/kgであり、好ましくは、約１０μg/kgから10mg/kgである。典型的には、医師は、聴覚障害を回復するためにニューロン機能が修復、維持、そして任意に再確立する投与量に達するまで投与するであろう。一般に、アゴニストは、製剤され標的とする部位に輸送されるが、その投与量は、当該部位におけるアゴニストレベルを約０．１nm/ml以上、より典型的には、約０．１ng/mlから５mg/ml、好ましくは約１から２０００ng/mlとする量である。本発明の特別の実施態様では、有効な製薬組成物が、約１から１００ng/ml、好ましくは５から２５ng/ml、より好ましくは１０から２０ng/mlの局所濃度を与える。この治療の進行は、従来のアッセイ及び聴覚及び平衡診断法によって容易にモニターされる。
２つのアゴニストが共に投与される場合、それらは同じ経路で投与する必要も同じ製剤で投与する必要はない。しかし、それらは所望により１つの製剤に混合できる。好ましい実施態様では、ＦＧＦ−２は任意にＩＧＦ−１と混合されるか、共に投与される。両方のアゴニストは、各々の有効量で、あるいは、各々が最適ではないが混合されて有効な量で患者に投与できる。好ましくは、その量は、各々、約１０μg/kg/日から１０mg/kg/日、好ましくは１００から２００μg/kg/日である。他の好ましい実施態様では、両方のアゴニストの投与は、用いるアゴニストのタイプに応じて、例えば内耳に近づける手段を用いて局所的に注入される。より好ましくは、投与はインプラントまたはパッチである。典型的には、医師は、聴覚障害を治療するための所定効果に達するまで投与するであろう。この治療の進行は、従来のアッセイ法で容易にモニターできる。
治療に用いられるＦＧＦ−２及び／またはＩＧＦ−１は、個々の患者の臨床的状態（特にＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１での処理の副作用）、ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２組成物の輸送部位、投与方法、投与計画、及び実施者に知られた他の要因を考慮して、良好な医療実務に適する形式で製剤され投与される。ここでの趣旨における各成分の「有効量」は、そのような考察によって決定され、内耳細胞機能の損傷または破壊を予防し、内耳細胞機能を再生する量である。
またＦＧＦ−２は、内耳内に常に存在し、それがＦＧＦ−２の投与の間維持されるように投与してもよい。これは、例えば、浸透ポンプ等のミニポンプを介した連続注入によって行われる。さもなくば、ＦＧＦ−２の頻繁な（即ち、１日１回以上、例えば、毎日２又は３回）注射又は局所投与を用いて適切に実施される。
さらに他の実施態様では、ＦＧＦ−２は、内耳からのＦＧＦ−２のクリアランスを遅延させるか、例えば注射即ち投与部位からのＦＧＦ−２の徐放を生ずる長時間作用性ＦＧＦ−２製剤を用いて投与される。ＦＧＦ−２血漿クリアランスを遅延させる長時間作用性製剤は、ＰＥＧ及びポリプロピレングリコールホモポリマー、及びポリオキシエチレンポリオールから選択される水溶性ポリマー、即ち、室温で水に溶解するもの等の巨大分子に配位または共有的に（可逆又は不可逆結合によって）共役したＦＧＦ−２の形態であってよい。あるいは、ＦＧＦ−２はポリマーに配位または結合して、その循環半減期を向上させてもよい。この目的のために有用なポリエチレンポリオール及びポリオキシエチレンポリオールの例は、ポリオキシエチレングリセロール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチレングルコースなどを含む。ポリオキシエチレングリセロールのグリセロール骨格は、例えば、動物及びヒトにおけるジ-及びトリグリセリドで生じる骨格と同様である。
このポリマーは、特定の分子量を持つ必要はないが、3500から100,000の間が好ましく、5000から40,000の間がさらに好ましい。好ましくは、ＰＥＧホモポリマーは置換されていないが、一端においてアルキル基で置換されていてもよい。好ましくは、アルキル基はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。最も好ましくは、ポリマーは、ＰＥＧの非置換ホモポリマー、ＰＥＧのモノメチル置換ホモポリマー（ｍＰＥＧ）、またはポリオキシエチレングリセロール（ＰＯＧ）であり、約5000から40,000の分子量を有する。
他の実施態様では、上記で同定された患者は、有効量のＩＧＦ−１で処理される。一般的提案として、腸管外投与される投与量当たりの全製薬的有効量のＩＧＦ−１は、患者の体重に対して、約１０μg/kg/日から１０mg/kg/日、好ましくは１００から２００μg/kg/日であるが、上記したように、この量は大幅に治療上の裁量を受ける。
ＩＧＦ−１は、ＦＧＦ−２又はその混合物に対して記したように、注射又は注入を含む任意の手段で投与できる。ＦＧＦ−２と同様に、ＩＧＦ−１は、ＦＧＦ−２について記したように処理の間内耳に常に存在するように製剤してもよい。即ち、それはポリマーに共有結合させて徐放製剤としてもよいし、因子を産生する埋め込み細胞によって供給してもよい。
さらに、ＩＧＦ−１は、その結合タンパク質、例えば現在知られているもの、即ち、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、またはＩＧＦＢＰ−６の任意の１つ又はそれ以上と共に適当に投与される。またＩＧＦ−１は、投与のために、レセプターまたは抗体または抗体フラグメントに結合させてもよい。好ましい結合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ−３であり、それは、米国特許第5,258,287号、及び、Martin等, J,Biol.Chem., 261: 8754-8760（1986）に記載されている。このグリコシル化ＩＧＦＢＰ−３タンパク質は、ヒト血漿に見られ、内因性ＩＧＦの殆どを具備し、ＧＨによって調製される、125-150Kdの糖タンパク質複合体の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の約53Kdの酸安定性成分である。
ＩＧＦとともにＩＧＦ結合タンパク質を投与することは、例えば、米国特許第5,187,151号及び第5,407,913号に記載された方法によって実施できる。簡単に言えば、ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰとが、約０．５：１から約３：１のモル比率で有効量投与される。ＩＧＦ−１の殆ど全部は、ＩＧＦＢＰ−３に結合し、ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３は、ヒト及び他の動物において複合体の形態で普通に循環する。この複合体は、第３のタンパク質（ＡＬＳ）を伴い、それはＩＧＦ及びＩＧＦ−３の平常濃度より過剰に存在する。従って、ＡＬＳはＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体に結合した状態と遊離の状態の両方で見られる。その結果の３成分複合体は、約150kDのサイズを有する。ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰ−３の複合体の投与は、天然または組み換え原のいずれかから得られ、普通は過剰のＡＬＳを持つ３成分複合体が形成される。このタイプの処理は、３成分または２成分複合体から徐々に放出される循環ＩＧＦのレベルの長時間増加を生ずることが解った。この投与方法は、遊離のＩＧＦ−１の投与に伴う悪性の副作用（例えば、低血糖症、成長ホルモン及びＡＬＳ生成の抑制、通常循環しているＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦＢＰ−３複合体において投与された遊離のＩＧＦ−１が内因性ＩＧＦ−ＩＩと置換することによる内因性ＩＧＦＢＰ−３からの内因性ＩＧＦ−ＩＩの放出）を回避させる。ＩＧＦＰＢ−４及びＩＧＦＢＰ−６は、身体に広く分布するグリコシル化タンパク質である。ＩＧＦＢＰ−４の一次構造は、Shimasaki等（Mol. Endocrinol.（1990）4: 1451-1458）によって報告されている。ＩＧＦＢＰ−６は、そのｃＤＮＡがShimasaki等（Mol. Endocrinol.（1991）4: 938-48）によって単離されており、ＩＧＦ−１よりＩＧＦ−ＩＩへの親和性が極めて高い。ＩＧＦＢＰ−５は、252アミノ酸結合タンパク質であり、グリコシル化されていない。Shimasaki等（J.Biol.Chem.（1991）266: 10646-53）は、ヒトＩＧＦＢＰ−５ｃＤＮＡをヒト胎盤ライブラリからクローンした。
ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ複合体製剤に要求される結合、代謝及び薬物速度論的特徴によって、これらの結合タンパク質を、種々の比率で複合体製剤に添加することができる。これらのＩＧＦＢＰ類は、ＩＧＦ−１及び／またはＩＧＦ−ＩＩと広範な比率で混合することができる。ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰ−３は、１：１のモル比で自然に複合するので、上記のように、ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰ−３の等量組成物が好ましい。製品は、ＩＧＦ：ＩＧＦＢＰ−３のモル比を０．５から１．５の範囲として処方することができる。より好ましくは、このモル比は０．９から１．３であり、最も好ましくは、製品は、約１：１のモル比で調製される。他のＩＧＦＢＰ類を用いる場合、ＩＧＦに対するＩＧＦＢＰ類の比率を変えてもよい。ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰは、好ましくは天然又は組み換え原から得られるヒトのタンパク質である。最も好ましくは、ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰは、組み換え手段によって作製され、各々ｒｈＩＧＦ−１及びｒｈＩＧＦＢＰ−３と呼ばれるヒトのＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３である。ｒｈＩＧＦＢＰ−３は、グリコシル化又は非グリコシル化形態で投与できる。E.coliは、組み換え非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３の原である。グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から組み換え形態で得ることができる。
ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２の両方の投与量を工夫する療法士は、これらの因子での処理の周知の副作用を考慮すべきであることを記しておく。ＩＧＦ−１の主要な明白な副作用は低血糖症である。Guler等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86: 2868-2872（1989）。
ＩＧＦ−１濃度は、酸エタノール注出に続くＲＩＡまたはＥＬＩＳＡ（IGF-I RIAキット, Nichol Institute, San Juan Capistrano, CA）を用いてサンプル内で測定できる。ＦＧＦ−２は、同様に、あるいは他の適当かつ特異的な手段を用いて測定できる。
内耳の組織構造、例えば、ヒトの身体の中で最も密な骨組織である側頭骨内に包含された耳の部分に対する、制御された効率的な方法での治療薬の輸送は知られている。最も重要な内耳組織構造の例は、これらに限られないが、蝸牛、内リンパ嚢／管、前庭迷路、及びこれらの成分を包含する全ての区画を含む。前記内耳組織領域への接近は、典型的には様々な構造を通して行われ、正円窓膜、卵円窓／あぶみ骨底、及び輪状靱帯を含むが、これらに限定されない。中耳は、鼓膜（例えば鼓膜（ear drum））の後方と内耳の前方の間の生理学的空気含有組織領域として定義される。また、内耳への接近は、内リンパ嚢／内リンパ管及び耳嚢を通して行われることも記しておく。内耳組織は、最小サイズであり、一般に顕微手術手法を通して接近できる。内耳組織を処理するのに典型的に用いられる医薬の例は、これらに限られないが、尿素、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、キシロカイン、エピネフリン、免疫グロブリン、塩化ナトリウム、ステロイド、ヘパリン、ヒアルロニダーゼ、アミノグリコシド抗生物質（ストレプトマイシン／ゲンタマイシン）、及び、ヒトの身体を処理するのに適した他の薬物、生物学的材料、及び製薬組成物を含む。同様に、内耳組織及び／又は液体の処理は、それらの圧力、容積、及び温度特性の変化を含む。そのような液体の圧力レベルの不均等は、種々の問題を生じ、後に詳細に議論するような内リンパ水欠乏（hydrop）、内リンパ高圧、リンパ周囲高圧、及びリンパ周囲水欠乏を含むが、これらに限定されない。
患者の内耳への治療薬の輸送は、内耳への接触または外耳道及び中耳を通して、注射またはカテーテルを介して行なうことができ、それは米国特許出願第5,476,446号に記載され、それは特にヒト患者の内耳の治療及び／または診断を目的とする多機能装置を提供している。この装置は、本発明の実施に有用であるが、多くの機能的能力を有しており、それは、（１）内耳内または中耳界面組織への治療薬の輸送；（２）内耳からの液体物質の引き出し；（３）内耳の液体／液体室における温度、圧力及び容積変化の発生；及び（４）内耳の電気生理学的モニターの可能化を含むが、これらに限られない。さらに、本発明の因子及び組成物を輸送するのに他の系を用いることもでき、それは、限定されないが、Kingma,G.G.,等, ”Chronic drug infusion into the scala tympani of the guinea pig cochlea”, Journal of Neuroscience Methods, 45: 127-134（1992）に記載された浸透ポンプを含む。例えば、商業的に入手可能な浸透ポンプは、Palo Alto, Calif．（USA）のAlza Corp.から得ることができる。米国特許第4,892,538号は、本発明の因子及び組成物の輸送のための移植装置を提供する。ＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１を発現するように遺伝子的に加工された細胞、またはそれらの混合物、そして任意に、促進または増強因子又は治療薬（例えば、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣアゴニスト）を宿主に移植し、有効レベルの因子を提供することができる。この細胞は、米国特許第4,892,538号及び第5,011,472号、WO 92/19195、WO 95/05452、または、Aeischer等, Nature 2: 696-699（1996）に記載されているように調製、カプセル化及び移植でき、例えば、米国特許第5,350,580号は、治療的に有効な放出可能な量の本発明に有用な少なくとも１つの薬剤を取り込んだ生分解性支持体を具備する装置を開示しており、この装置は、外科的に中耳に挿入され、活性薬の中耳への延長された放出を可能にしている。
ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、またはアゴニストも、徐放系によって適切に共に投与される。徐放組成物の好ましい例は、成形品、例えば、フィルム、マイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクスは、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556［1983］）、ポリ（２-ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer等, J.Biomed.Mater.Res., 15: 167-277（1981）及びLanger, Chem.Tech., 12: 98-105（1982））、エチレンビニルアセテート（Langer等，上記）、またはポリ-Ｄ-（−）-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988）を含む。また、徐放性ＩＧＦ−１組成物は、リポソームに捕捉されたＩＧＦ−１も含む。ＩＧＦ−１を包含するリポソームは、それ自体知られた方法で調製される: DE 3,218,121; Epstein等, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 82: 3688-3692（1985）; Hwang等, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 77: 4030-4034（1980）; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 日本国特許出願83-118008; 米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号；及びEP 102,324。通常、リポソームは小さな（約200から800オングストローム）ユニラメラタイプであり、その脂肪含有量は約３０モルパーセントコレステロールより大きく、その割合は最適なＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２治療のために調節される。
腸管外投与について、一実施態様では、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、またはアゴニストが、一般的に、各々を所定の純度で、単位投与量の注入可能形態（溶液、懸濁物、またはエマルション）で、製薬的または腸管外的に許容されるキャリア、例えば、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、製剤の他の成分に相溶性であるキャリアと混合される。例えば、この製剤は、酸化剤及びポリペプチドに有害であると知られた他の化合物を含まないのが好ましい。
一般に、製剤は、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、またはアゴニストを、液体キャリアまたは微粉砕された固体キャリア又はその両方に、各々均一かつ強力に接触させることによって調製される。キャリアは、腸管外キャリア、より好ましくは溶液であり、それは受容者の血液と等張であり、さらに好ましくは、内耳への局所投与用に調製される。キャリア媒体の例は、水、塩水、リンゲル液、バッファ溶液、及びデキストロース溶液を含む。ここで、不揮発性油及びエチルオレエートなどの非水媒体も有用である。
キャリアは、等張性及び化学的安定性を向上させ、局所的に投与されたとき耳の細胞及び構造、特に内耳に非毒性である物質といった添加物を含むのが好ましい。このような物質は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、及び他の有機酸またはそれらの塩といったバッファ；アスコルビン酸等の酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、またはアルギニン等のアミノ酸；単糖類；二糖類；及びセルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンを含む他の炭化水素；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤；及び／または天然の塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2等を含む。
ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２は、典型的には、そのような媒体中に約４．５から８のｐＨで処方される。全長ＩＧＦ−１は、一般に６．５以下のｐＨで安定であり、好ましくはｐＨ５から５．５で調製され；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−１は、約３．２から５のｐＨで安定である。前記の賦形剤、キャリア、または安定化剤のある種のものを使用することにより、ＩＧＦ−１またはインシュリン塩が形成されることが理解されるであろう。最終組成物は、安定な液体または凍結乾燥した固体である。好ましい安定化剤は、ベンジルアルコール又はフェノール又は両方であり、好ましいバッファ溶液は、酢酸塩緩衝液である。トレハロース及びマンニトールも好ましい安定化剤である。より好ましくは、オスモライト（osmolyte）塩化ナトリウムであり、酢酸塩は酢酸ナトリウムである。さらに、組成物は界面活性剤、好ましくはポリソルベート又はポロキサマーを含有する。
「オスモライト」は、バッファ溶液に等張性を与える浸透圧修正剤または浸透圧調整剤を意味する。等張性は、イオン及び非イオン化分子によって溶液に寄与する全浸透活性を意味する。例は、塩化ナトリウム及び塩化カリウム等の無機塩、マンニトール、ＰＥＧ、プロピレングリコール、グリシン、スクロース、トレハロース、グリセロール、アミノ酸、及びマンニトール等の糖アルコールを含み、一般的に安全（ＧＲＡＳ）として知られているものである。ここで好ましいオスモライトは、特に局所投与される場合、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
「安定化剤」は、製剤中の活性成分、例えば、ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２を維持する作用を持つ任意の化合物であり、それらは、分解せず、合理的な時間に渡って不活性となり、それらの使用を防止させる病原または毒素を展開する。安定化剤の例は、製剤中での細菌、ウイルス、及び真菌の増殖を防止する防腐剤、酸化防止剤、または、種々の方法で製剤の安定性を維持する作用を持つ他の化合物を含む。
例えば、第４級アンモニウム塩は有用な安定化剤であり、その分子構造において、４つの有機（通常はアルキル又はアリール）基に結合した窒素原子、及び、負に荷電した酸基を有する。これらの塩は、多くの病原性非胞子形成細菌及び真菌の界面活性殺菌薬及び安定化剤として有用である。例は、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムを含む。他のタイプの安定化剤は、フェノール及びベンジルアルコール等の芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、及びｍ−クレゾールを含む。
典型的には、安定化剤は製剤の安定な液状形態に含有され、製剤の親油性形態には含有されない。後者の場合、安定化剤は、再形成に用いられる注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）中に存在する。しかい、トレハロースまたはマンニトール等は、親油性形態中に存在できるし存在するであろう。また、界面活性剤は再形成希釈液中に任意に存在する。
「無機塩」は、炭化水素ベースのカチオン又はアニオンを持たない塩である。例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム等を含む。好ましくは、カチオンはナトリウムで、アニオンは塩化物又は硫酸であり、最も好ましい無機塩は塩化カリウム又は塩化ナトリウムである。
「界面活性剤」は、約４から７のｐＨにおけるＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２の溶解性を向上させる作用をする。ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、６０または８０、ポロキサマー、例えば、ポロキサマー１８４または１８８、あるいは、この分野で知られＧＲＡＳである他の任意のものといった非イオン性界面活性剤が好ましい。より好ましくは、界面活性剤は、ポリソルベートまたはポロキサマー、より好ましくはポリソルベート、最も好ましくはポリソルベート２０である。
「バッファ」は、ＧＲＡＳであり、ＮＰＨインシュリン＋ＩＧＦ−１製剤に一般に４．８から８、好ましくは５から７、より好ましくは５から６のｐＨを与え、ＩＧＦ−１製剤に好ましくは５から６、より好ましくは５から５．５のｐＨを与える任意の適当なバッファでよい。例は、酢酸ナトリウム及び酢酸カリウムを含む任意の酢酸塩である酢酸塩バッファ、コハク酸バッファ、リン酸バッファ、クエン酸バッファ、ヒスチジンバッファ、又は所定の効果を持つことが知られている任意の他のものを含む。最も好ましいバッファは酢酸ナトリウムであり、任意に、リン酸ナトリウムと組み合わされる。
最終製剤が液体である場合、約２から８℃の温度で４週間まで貯蔵するのが好ましい。しかしながら、製剤は、親油性化され、注入のために水で再形成される粉末として提供され、液体製剤について記載したように貯蔵してもよい。
米国特許第5,482,929号は、有用な安定化ＦＧＦ−２組成物を提供し、それは、ＦＧＦの安定化のために硫酸デキストリンのアルミニウム塩を含有している。組み換えヒト塩基性線維芽成長因子（ＦＧＦ−２）は、特にinvitroで用いるとき、０．１ng/mlを越える、好ましくは約０．５−４０ng/ml、より好ましくは約２ng/mlの濃度で用いることができる。
治療投与のために用いられるＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２は、好ましくは無菌である。無菌性は、除菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通して濾過することにより容易に達成される。治療的ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを具備する静脈内溶液バッグまたはビンに収容される。
ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２は、一単位又は多単位投与量容器、例えば、密封アンプル又はビンに、水性溶液として、あるいは再形成用親油性化製剤として貯蔵することができる。親油性化製剤の例として、１０-mLビンを、５mLの滅菌濾過した1%（w/v）水性ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２溶液で満たし、得られた混合物を親油性化する。注入溶液は、親油性化ＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２を、注入用の静菌性水を用いて再形成して調製される。
ここで、組成物は、他の成長因子を含むのも好ましく、最も好ましいのは、聴覚または前庭ニューロン細胞成長因子、または因子の混合物、または他の有毛細胞再生因子、例えば、レチノイン酸またはＴＧＦ−αと組み合わせたレチノイン酸である。このようなペプチドを含む成長因子は、所期の目的、例えば、望まれるなら、ニューロン細胞の生存、成長、増殖、再生、修復、又は回復、そして任意に、聴覚または前庭ニューロンの成長または回復に有効な量で存在するのが好ましい。
本発明の方法での聴覚障害の治療の有効性は、以下の回復サインによって評価でき、それは、ここに述べたような周知の診断技術によって試験される通常の聴覚機能の回復、電気生理学的に試験される神経伝達速度の正規化を含む。
他の実施態様において、本発明のアゴニスト組成物は、臨床的器官インプラントまたは移植の間、内耳細胞の妥当性を維持又は向上させるために使用される。好ましくは、ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣアゴニストを含む、ここに教示された因子の組み合わせがインプラントまたは移植に用いられる。
また、本発明にはキットが考えられる。典型的なキットは、製薬的に許容されるバッファ中にＩＧＦ−１を含有するＩＧＦ−１製剤用の容器、好ましくはビン、及び／または、製薬的に許容されるＦＧＦ−２を収容した容器、好ましくはビン、及び製品挿入物またはラベルといった説明書を含み、説明書は、使用者に容器の使用、特に２つの容器の内容物、即ち２つの組成物を混合し、製薬製剤を提供することを指示する。好ましくは、製薬製剤は聴覚障害治療用である。
ここで実施例の節で提供する今回の実験において、酵素的及び機械的を組み合わせた方法で分離した無傷の卵形嚢上皮シートは、実質的に支持細胞及び有毛細胞のみを含有する（Corwin等, 1995）。培養した細胞の上皮の同一性は、主事の特異的細胞マーカーを用いて確認した。これらの細胞は、接着結合タンパク質（ＺＯ１）、細胞ケラチン及びＦ−アクチンを含む上皮抗原を発現するが、線維芽抗原、ビメンチン及びＴｈｙ１．１、またはグリア及びニューロン抗原は発現しない。有毛細胞（不動線毛束保有細胞）の殆どは損傷を受け、その多くは、酵素的消化及び機械的粉砕に対する感受性によって培地中で２日後に死亡した。従って、これらの培地は、実質的に、有毛細胞の先祖である卵黄嚢支持細胞の集団を代表する（Corwin及びCotanche, 1988; Balak等, 1990; Weisleder及びRubel, 1992）。これらの培地は、内耳支持細胞の増殖及び分化を研究するためのin vitro系を提供する。
培養された内耳上皮細胞は、生存及び増殖のために、隣接する上皮細胞と、細胞−細胞接触を必要とした。完全に解離された上皮細胞を培養する最初の試みは、事実上すべての細胞死をもたらした。上皮細胞先祖についての生存及び増殖のための細胞−細胞接触の要求は知られていないが、脳胚ゾーン先祖細胞（Gao等, 1991）及びＥ９ラット感覚上皮細胞（Li等, 1996）では既に観察されている。感覚上皮細胞の増殖が、in vivoの高緻密ＣＮＳ心室ゾーン、及び、in vitroで先祖再凝集物（Gao等, 1991）またはニューロン球体（Reynolds及びWeiss, 1992）でのみ起こるという事実は、感覚上皮細胞の成長のための膜−結合因子の存在を示唆している。この考えに一致して、Ｃ６グリオーム細胞系からの膜−結合成分が、解離した単一の皮質先祖細胞の増殖及び生存に必要であることが示された（Davis及びTemple, 1994）。器官移植（Warchol及びCorwin, 1993）に反して、部分的に解離した上皮細胞は、血清を含まない媒質中で殆ど成長せず、膜結合分子に加えて、血清中の可溶性因子もこれらの細胞の成長を促進することを示している。線維芽細胞のモノレイヤ（monolayer）が、完全に解離されたトリ蝸牛上皮細胞の成長を支持するのに十分であることが報告されている（Finley及びCorwin, 1995）。
卵形嚢上皮が、中枢、感覚上皮及び末梢、周辺ゾーンからなることを記しておく（Lambert 1994）。ここで、解剖の間、感覚上皮のみを回収することがなされた。しかし、初期の実験では、感覚上皮と周辺ゾーンの界面に位置する幾つかの移行細胞を、小さく脆弱な上皮シートから完全に分離するのは困難であるため、その少量も含まれていた。部分的に解離された上皮シートの懸濁により、これらの細胞を培養ウェル内に均一に分けた。得られたデータは、主に感覚上皮細胞の増殖を反映するが、移行細胞の少量も少ないながら寄与しうる。胚形成の間に、２つのドメインからの上皮細胞が同じ前駆体（例えば、プロ感覚細胞、Kelley等, 1993参照）から誘導できるが、それらは有毛細胞分化又は再生の間に異なる役割を演ずると思われる。卵形嚢感覚上皮において中枢有毛細胞が末梢有毛細胞より発達が早いことが解ったので、おそらく、感覚上皮の細胞は周辺領域よりも分化される（Sans及びChat, 1982）。それにも関わらず、従来の実験（Lambert, 1994）は、アミノグリコシドまたへの曝露、またはＴＧＦ−αによる誘発のときに、卵形嚢上皮の感覚及び周辺ドメインの両方において等価な増殖が観察されることを報告している。
ここで、実施例において開示するように、感覚上皮は完全に解離され、上皮、非−感覚上皮細胞を含まない（しかし、極めて微量の細胞のみが得られて培養ウェルにプレートされる）。ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αのマイトジェン効果が初期実験と実質的に同様に得られた。トリチウムチミジンとｒこみのｃｐｍは以下の通り：コントロール＝671±92；ＦＧＦ−２処理＝1787±221；ＩＧＦ−１処理＝1592±174；ＥＧＦ処理＝1168±130；ＴＧＦ−α処理＝1483±109（群当たりｎ＝１０）。
トリチウムチミジンアッセイに沿った純粋な上皮細胞培養は、内耳上皮先祖細胞の増殖に対する成長因子の効果を評価する迅速かつ便利な方法である。抗体の多くのパネルが比較的短時間で試験でき、それを実行した。トリチウムチミジンアッセイの結果は、ＢｒｄＵ免疫細胞化学データによって支持された。この実験において、３０の成長因子の中から、幾つかのＦＧＦファミリーの成員、即ち、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＴＧＦ−α及びＥＧＦは、卵形嚢支持細胞の増殖に対してマイトジェン的因子であった。
また、この培養は、初期有毛細胞マーカーの発見及び発達に向けての努力を増すことにより、有毛細胞の分化を直接研究するのにも有用であることが解った（Holley及びNishida, 1995）。先祖細胞増殖及び有毛細胞分化についての薬剤を試験することは、in vivo即ち器官培養に比較して、ここに開示した純粋な卵形嚢上皮細胞培養において格段に促進され単純化された。例えば、本発明の見地から、これらの培養において、有毛細胞分化に含まれる与えられた成長因子のシグナル伝達経路をさらに解体するために、特異的阻害剤又は活性化剤を使用することがもはや可能である。ここでのＴＧＦ−α及びＥＧＦのマイトジェン効果の観察は、従来の報告と一致するが（Lambert, 1994; Yamashita及びOesterle, 1995）、幾つかのＦＧＦファミリーの成員、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びＦＧＦ−２とＴＧＦ−α又はＩＧＦ−１との組み合わせの結果は新規であり驚嘆に値する。これら後者の発見は、Yamashita及びOesterleによって報告された無傷の器官培養における研究に反する。これらの結果間の不一致の一つの可能性は、この解離した卵形嚢上皮細胞培地における有毛細胞の剥奪がＦＧＦ及びＩＧＦ−１レセプターのアップレギュレーションをトリガーし、ＦＧＦ及びＩＧＦ−１に対する反応を促進するかもしれない。もしそうならば、これは内耳損傷または強襲の間に起こる状況を反映すると思われる。近年、Lee及びCotanche（1996）は、騒音によるトリ蝸牛上皮の損傷が、支持細胞におけるＦＧＦレセプターに対するｍＲＮＡのアップレギュレーションをもたらすことを報告している。Finley及びCorwin（1995）は、ＦＧＦ−２が、完全に解離され線維芽細胞モノレイヤ上にプレートされたトリ蝸牛支持細胞の増殖を促進することを報告している。有毛細胞の剥奪及びＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１に対する中和抗体による細胞増殖の阻害の後の内耳上皮細胞における高レベルのＦＧＦレセプター及びＩＧＦ−１レセプターの存在は、ＦＧＦ−２及びＩＧＦ−１が、内耳支持細胞に直接作用し、有毛細胞の除去に続いてその増殖を誘発するという考えを支持する。ＦＧＦ−２及びＩＧＦ−１は、特にアミノグリコシドまたは騒音による負荷（challenge）に続く有毛細胞再生の間に、内耳支持細胞の増殖を調整する候補分子である。
あるいは、内耳上皮の成熟の間に、ＦＧＦ−２及びＩＧＦ−１を含む成長因子に対する発達的反応変化もあり得る。成熟内耳上皮が発達中の上皮とは御ｋとなる反応をすることも可能である。外から添加されたＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１は、それらが未成熟卵形嚢にある場合、無傷の成熟卵形嚢（Yamashita及びOesterle, 1995）または非常に低濃度のアミノグリコシドで処理されたトリ組織（1nM, Oesterle, 1996）の増殖を誘発しないかもしれない。騒音または薬物による強力な損傷（有毛細胞の大きな変性）時に、未成熟上皮は、より早期の発達段階に戻るようにトリガーされるかもしれない。このような損傷誘発性状態変化は、発達ニューロンに知らされる（Gao及びMacagno, 1988）。この研究は、未だ成熟を受けている出生後ラット内耳細胞に実施されるが、それにも関わらず、成人における聴覚損傷または高投与量のアミノグリコシドへの曝露の後の有毛細胞再生に対するＦＧＦ−２及びＩＧＦ−１の影響について立証できると思われる。
ＦＧＦファミリー成員の幾つかはマイトジェン性であるが、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−５は効果を誘発しないことは興味深い。少なくとも４種のＦＧＦレセプター及びレセプターの異なる繋ぎ（splicing）形態が存在するため（Johnson及びWilliams, 1993）、いずれのサブレセプターがシグナル伝達経路を媒介しているかわからない。らせん神経節に存在し、有毛細胞の栄養因子であると提唱されているＦＧＦ−１による効果が無いことは特に興味深い（Pivola等, 1995）。
ＩＧＦ−１が、耳発生の初期段階において耳小嚢の増殖的成長を刺激することは既に報告されている（Leon等, 1995）。ここに報告する研究は、さらに、ＩＧＦ−１が、やや遅い段階−−支持細胞増殖の段階において内耳上皮の発達を調整することを示す。ＩＧＦ−１が、増殖（Gao等, 1991）、分化及び生存（Neff等, 1993; Beck等, 1995）を含むニューロンの発達の間の複数の段階で作用することが示され、それが有毛細胞発達の後段階でも作用するか、または、それが他の成長因子と共同して働くかを決定するのは興味深い。Gray等（1996）による予備的研究は、ＩＧＦ−１が有毛細胞をアミノグリコシド誘発性アポプトシスから保護すると報告した。ＩＧＦ−１レセプターは培養された卵形嚢上皮細胞によって発現されるので（図５）、ＩＧＦ−１はＩＧＦ−１レセプターに作用すると思われる。しかしながら、インシュリンもマイトジェン的効果を誘発するので（データは示さず）、ＩＧＦ−１のインシュリンレセプターを介した交差反応の可能性も排除できない。
卵形嚢上皮細胞がＦＧＦ−２及びそのレセプターを発現するという発見は、ＦＧＦ−２が有毛細胞の発達、維持及び／または再生のための生理学的成長因子であることを示している。ＦＧＦ−２は、その作用をオートクライン機構を通じて発揮しうる。このモデルでは、有毛細胞から産生されたＦＧＦ−２は、それら自身の栄養支持器を提供しうる。最近の研究は、神経系の細胞分化及び生存が、成長因子に媒介されたオートクライン相互作用によって調整されることを示唆している。例えば、ニューロトロフィン及びそれらのｍＲＮＡのコロカリゼーション（colocalization）がラットの前脳に見られ（Miranda等, 1993）、ＢＤＮＦオートクラインループが培養された後根神経節細胞の生存を調整する（Acheson等, 1995）。Low等（1995）は、ＦＧＦ−２が、生後ラット蝸牛をアミノグリコシド誘発性損傷から保護することを示唆している。あるいは、有毛細胞に合成されたＦＧＦ−２が隣接する有毛細胞の維持及び支持細胞の増殖に局所的に影響するパラクライン作用も仮定される。この場合、有毛細胞の分解が、ＦＧＦ−２の爆発的放出を導き、翻って内耳上皮における支持細胞増殖を刺激する。ＦＧＦ−２はシグナル配列を持たず、細胞損傷がその放出の主要な経路であるので、後者の仮説は、聴覚損傷またはアミノグリコシドへの曝露による有毛細胞死に続く支持細胞増殖を説明しうる。抗−ＴＧＦ−α抗体ではなく抗−ＦＧＦ−２抗体が細胞増殖を有意に阻害するというこのデータ（図７）は、この仮説をある程度支持している。抗−ＦＧＦ−２抗体による部分的だが完全ではない効果のブロッキングは、培地中の他のマイトジェンの存在の可能性、解離過程の間の（有毛細胞損傷による）ＦＧＦ−２の喪失、及び／または解離に続く上皮内での接触阻害からの免荷によると思われる。
ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５を含むニューロトロフィンは、神経系の発達のために重要な分子である。特に、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３は、らせン神経節及び前庭神経節ニューロンの、in vivo及びinvitroでの生存因子である（Zheng等, 1995a, 1995b）。また、これらの分子は、培地中の耳毒素に対して２つのタイプのニューロンを保護する（Zheng等, 1995a, 1995b）。しかし、これらは有毛細胞の生存にとって臨界的ではなく（Ernfors等, 1995; Fritzsch等, 1995）、耳毒素に対して有毛細胞を保護しない（Zheng及びGao, 1996）。今回の観察は、ニューロトロフィンが先祖細胞の増殖に直接影響しないが、有毛細胞増殖のより遅い段階に幾分の影響を与える可能性は排除しないことを示している。ＢＤＮＦ及びＮＴ−３遺伝子の両方を欠くマウス（Ernfors等, 1995）、または、ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣ遺伝子の両方を欠くもの（Minichiello等, 1995）において、タイプＩ卵形嚢有毛細胞の表現型及び卵形嚢上皮の厚さにおけるある程度の異常が観察された。さらに、皮質顆粒細胞の発達におけるニューロトロフィンの段階特異的効果が例証された。そこで、特異的ニューロトロフィンは、分化の遅い段階で作用するが、増殖の段階では作用しない（Gao等, 1995）。
ニューロトロフィンと同様に、この実験で試験された多くの他の成長因子は、卵形嚢支持細胞に有意なマイトジェン効果を示さなかった。しかし、それらは有毛細胞再生の遅い相には含まれる。例えば、レチノイン酸は、発育中の蝸牛において、細胞増殖無しの補足的有毛細胞の形成を誘発する（Kelley等, 1993）。一方、初期の分化因子は、先祖増殖を阻害し、先祖を細胞サイクルに入れて分裂後期細胞となるようにすることができる。この態様について、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３及びＴＧＦ−β５が、内耳上皮細胞の増殖に阻害を示すことは興味深い。このような観察が、有毛細胞の分化にＴＧＦ−β類が含まれる可能性を意味するか否かは決定されていない。
ＦＧＦ−２及びＩＧＦ−１またはＴＧＦ−αが付加的マイトジェン効果を有するという発見は、幾つかの成長因子が有毛細胞の発達中に共同して働くことを示唆している。例えば、ＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１は、耳嚢形成の間、軟骨形成を相乗的に調整することが示された（Frenz等, 1994）。支持細胞増殖を抑制して新たな有毛細胞分化を誘発する、有毛細胞から来る阻害シグナルが存在し得る。複数の成長因子が共に有毛細胞の分化又は再生に寄与することは全く可能である。それらは、連続的方法または多段過程で作用できる。ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−１及びレチノイン酸の組み合わせは、卵形嚢有毛細胞修復または再生を促進する。
要するに、我々は、精製した哺乳類卵形嚢上皮細胞培養を確立し、それは、支持細胞の増殖、通常の発達の初期相、及び新たな有毛細胞の再生に対する成長因子の効果の迅速な試験を可能にする。我々が試験した３０の成長因子の中で、ＦＧＦ−２が最も有効なマイトジェンであった。内耳有毛細胞がin vivoでＦＧＦ−２を産生し、卵形嚢上皮細胞がin vitroでＦＧＦレセプターを発現するという観察は、有毛細胞発達、維持または再生におけるＦＧＦ−２の生理学的役割を示唆している。
以下の実施例は例示のために提供され、限定のためではない。この明細書における参考文献の開示は、ここに参考として全て取り入れるものとする。
実施例
実施例Ｉ
有毛細胞の特徴付け
培養した卵形嚢上皮細胞は、線維芽、グリアまたはニューロン細胞ではなく上皮細胞の特徴を発現すると決定された。
卵形嚢上皮シートを、既に報告された方法（Corwin等, 1995）に基づいて、0.5mg/mlサーモリシン（thermolysin）（Sigma; カルシウム及びマグネシウムを含まないHansの調整塩水中）を用いて、37℃で30分間、生後4-5日（Ｐ４−５）のウィスターラットから分離した。上皮シート（図１参照）は、次いで、0.125%トリプシンと0.125%コラゲナーゼ混合物中、37℃で8分間インキュベーションした。酵素活性を、0.005%ダイズトリプシン阻害剤（Sigma）及び0.005%ＤＮａｓｅ（Worthington）の混合物で不活性化した後、ＢＭＥ中0.05%のＤＮａｓａ中において、1mlのピペットチップで10回ピペットアップ及びダウンした。このようにして、上皮シートを部分的に、約10-80細胞を含む小片に解離させた（図１Ｂ）。これらの細胞が血清を含まない媒質中で殆ど成長しないことを見いだしたので、5%のウシ胎児血清を添加した媒質を使用した。細胞懸濁物は、最終的にポリリジン（500μg/ml）被覆した96-ウェルプレート（トリチウムチミジンアッセイ用）、または16-ウェルLabTekスライド（BrdUラベル化及び他の免疫細胞化学用）に、200μlの血清含有媒質（DMEMプラス5%ウシ胎児血清、4.5mg/mlグルコース、2mMグルタミン、25ng/mlフンギゾン、及び10単位/mlペニシリン）中、約70細胞/mm2の密度でプレートした。典型的には、4リットルのパップ（pups）（40のＰ４−５ラット）から調整した細胞は、80ウェルに等しく分けた。
単離した単独細胞の殆どは培養後２日で死亡したが、約10-80の細胞を含む集塊が、血清添加媒質中で良好に生存し、斑状に成長した（図１Ｃ）。異なるタイプの細胞マーカーによる免疫細胞化学的染色により、これらの培養された細胞が接着結合タンパク質（ＺＯ１、図１Ｅ）、Ｆ−アクチン（図１Ｆ）及び細胞ケラチン（図１Ｇ）を含む上皮細胞抗原を発現することが解った。これらは、グリア繊維タンパク質（ＧＦＡＰ）、オリゴ星状細胞抗原（ミエリン）、神経繊維タンパク質または線維芽抗原、ビメンチン（図１Ｃ、１Ｄ）及びＴｈｙ１．１等の他のタイプの細胞の抗原は発現しなかった。これらの結果を表１にまとめる。
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これらの結果は、培養された細胞が純粋な上皮細胞であることを示唆している。ファロイジン染色（図１Ｆ）から明らかなように、不動線毛束を持つ細胞（有毛細胞）は殆ど見られず、この培養条件下での培地中で有毛細胞の大多数が損傷を受け、その多くが２日後に死亡したことを示唆している。現在我々は、有毛細胞または支持細胞の特異的マーカーを持っていない。卵形嚢上皮シートは主に支持細胞及び有毛細胞を含むので、培地中の生存細胞の大多数は、卵形嚢支持細胞の群を代表している。
実施例ＩＩ
有毛細胞再生の刺激
現在知られている成長因子が卵形嚢支持細胞の増殖を刺激するか否かを試験するために、我々は、トリチウムチミジン取り込みアッセイを用いてＤＮＡ合成を測定した。ＤＮＡ合成を測定するために、24時間目の培地に、3Ｈ−チミジン（2μci/ウェル）を24時間かけて添加し、Tomtec細胞ハーベスターを用いて細胞を収穫した。上皮細胞はポリリジン基体上で成長させたので、トリプシンは（1mg/ml）は培養ウェルに37℃で25分かけて添加して収穫まで放置した。次いで、Cpm/ウェルを、既に記載されているように（Gao等, 1995）、マトリクス9600ガスカウンター（Packard Instrument Company, IL）でカウントした。各実験群の５から１０培地からデータを回収し、平均±s.e.m.で表した。統計的分析のために両側非対称ｔ検定を用いた。コントロール培養条件下では、中程度のレベルのチミジン取り込みが観察された。
ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６及びＦＧＦ−７（R & D Systems）、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２（R & D Systems）、ＴＧＦ−α（R & G Systems）、ＥＧＦ（Collaborative Research）、ヒト組み換えニューロトロフィン（Genentech）、ＴＧＦ−β１（Genentech）、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５（R & D Systems）、アクチビン（activin）、インヒビン（inhibin）、ニューロトロフィン因子誘導グリア細胞（ＧＤＮＦ）、ヘレグリン、Ｇａｓ−６、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）、毛様体ニューロトロフィン因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、カージオトロフィン−１（cardiotrophin-1）、ｃ−ｋｉｔリガンド（Genentech）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）（Gibco）、及び、レチノイン酸（Sigma）を含むＦＧＦファミリーの成員は、細胞がプレートされたときに培地に添加された。ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１及びＴＧＦ−αの最大効果は、100ng/ml（0.1-100ng/mlで試験された）で見られ、従って、全ての成長因子は100ng/mlの濃度で使用したが、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３及びＴＧＦ−β５は1ng/mlで試験し、ニューロトロフィンは20ng/mlで試験した（Zheng等, 1995a）。レチノイン酸の濃度は10-8Mであった（Kelley等, 1993）。
ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６及びＦＧＦ−７を含む幾つかのＦＧＦファミリーの成員が培地に添加されたとき、チミジン取り込みの有意な増加（p<0.05、図２）が見られた。それらの中で、ＦＧＦ−２が最もマイトジェン性であった。それに対して、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−５は、有意な効果を示さなかった（p>0.05、図２）。培地にＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２を包含であるすることも、チミジン取り込みを有意に増加させた（p<0.05）。正のコントロールとして、２つの既に報告されている支持細胞のマイトジェンであるＴＧＦ−α及びＦＧＦ（Lambert, 1994, Yamashita及びOesterle, 1995）を培地に添加した。ＤＮＡ合成は、ＴＧＦ−α及びＥＧＦにより、各々約１．７倍及び１．５倍促進された（図２）。
チミジン取り込みにおける増加が細胞分割の数の増加を反映しているか否かを決定するために、我々はブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）免疫細胞化学を実施した。ＢｒｄＵラベルは、既に報告されている方法を用いて実施した（Gao等, 1991）。簡単に言えば、培養１日後に、ＢｒｄＵ（1:400; Amersham cell Proliferation kit）を培養媒質に２４時間かけて添加した。培地は4%パラホルムアルデヒド（30分間）で固定し、2N HCl（40分間）で処理し、抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Becton-Dickinson, 1:40 0.1%のTriton-X100を含有するリン酸緩衝塩水）とともに4℃で終夜インキュベーションした。次いで、培地をベクターABCキットで加工した。ジアミノベンジジン−ペルオキシド反応の後、細胞をエタノールで脱水し、Histoclear（American Histology）で透明化し、Permount（Fisher）に充填した。各実験群の１０又はそれ以上の培養ウェルの全領域からＢｒｄＵ−陽性細胞をカウントした。データは、平均±s.e.m.で表した。統計的分析には両側非対称ｔ試験を用いた。
図３に示すように、ＦＧＦ−２を含む培地中に極めて多くの数のＢｒｄＵ−陽性細胞が見られた。コントロール培地及び10ng/mlのＦＧＦ−２含有培地での細胞カウントにより、ＦＧＦ−２が卵形嚢支持細胞の増殖を有意に増進することが確認された（p<0.01，表２）。コントロール培地に比較して有意に高い数のＢｒｄＵ−陽性細胞は、100ng/mlのＩＧＦ−１（p<0.05）またはＴＧＦ−α（p<0.01）を含有する培地でも見られた（表２）。
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実施例ＩＩＩ
マイトジェンの比較
ＦＧＦ−２からＩＧＦ−１及びＴＧＦ−αの能力を比較するために、卵形嚢上皮細胞培地において、0.1-100ng/mlの範囲で投与量依存的研究を実施した（表４）。0.1ng/mlの濃度では、３つの成長因子のいずれも検出可能な効果を示さなかった（p>0.05）。1ng/mlの濃度では、ＦＧＦ−２は有意なマイトジェン効果を示したが（p<0.01）、ＩＧＦ−１及びＴＧＦ−αは検出できる効果を持たなかった。より高い投与量（10-100ng/ml）では、３つの成長因子全てがコントロール培地に比較して有意なマイトジェン効果を示した（p<0.05）。しかし、ＦＧＦ−２は、ＩＧＦ−１又はＴＧＦ−αより能力があった（p<0.01、図４）。ＩＧＦ−１またはＴＧＦ−αより高いＦＧＦ−２の能力は、ＢｒｄＵ免疫細胞化学でも観察された（表２）。
ＦＧＦ−２及びＩＧＦ−１またはＴＧＦ−αが相乗的に作用するか否かを測定するために、ＦＧＦ−２をＩＧＦ−１またはＴＧＦ−αのいずれかとともに添加した。トリチウムチミジン取り込み及びＢｒｄＵ免疫細胞化学の両方により、ＦＧＦ−２とＩＧＦ−１、またはＦＧＦ−２とＴＧＦ−αの組み合わせが、有意に高い細胞増殖をもたらすことが確認された（p<0.05、図２及び表２）。ＦＧＦ−２は、ＩＦＧ−１またはＴＧＦ−αよりマイトジェン能力があった。
ＦＧＦファミリーであるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＴＧＦ−α及びＥＧＦに加えて、多くの他の因子が細胞増殖及び分化に影響すると報告されている。これらは、ニューロトロフィン、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ヘレグリン及びＧａｓ-６等のグリア細胞マイトジェン、ＶＥＧＦ等の上皮細胞マイトジェン、及び、表３に挙げた他のものを含む。これらの培地を試験したところ、上記成長因子のいずれも、卵形脳上皮細胞に検出できる有意なマイトジェン効果（p>0.05）を示さなかった（表３）。実際に、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３及びＴＧＦ−β５は、細胞増殖の30-67%の阻害を示した。ニューロトロフィン及び試験された他の成長因子は、培養された卵形脳上皮細胞の増殖を促進しなかった。
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実施例ＩＶ
培養された卵形嚢上皮細胞はＦＧＦレセプター及びＩＧＦ−１レセプターを発現する
ＦＧＦファミリーの成員及びＩＧＦ−１が、これらの上皮細胞に直接作用することのさらなる証拠を提供するために、我々は、ＦＧＦレセプター及びＩＧＦ−１レセプターに対する抗体を用いて両方の卵形嚢断面に免疫染色を行い、Ｐ４−５ラットから調製した上皮細胞を培養した。培養２日後に、細胞を4%のパラホルムアルデヒド（0.1Mリン酸バッファ中、pH7.4）で30分間固定した。組成物は、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中0.1% triton-X100中の10%平常ヤギ血清で20分間最初にブロックし、次いで、3%の平常ヤギ毛正及び0.1% Triton-X100を含有するＰＢＳ中の、ビメンチン（10μg/ml、Boehringer）、Ｔｈｙ１．１（1:200、Chemicon）、神経繊維200kd（5μg/ml、Boehringer）、ミエリン（1:200、Ceder Lane Laboratories）及びパン−サイトケラチン（1:50、Sigma）に対するモノクローナル抗体（Ｎ５２）、あるいは、接着結合タンパク質（ZO1、1:200、Zymed）に対するウサギ抗血清及びＧＦＡＰ（）で、4℃において終夜インキュベーションした。次いで、ＦＩＴＣ結合した二次抗体（1:200；Cappel）を用い、ラベル化パターンを表した。Ｆ−アクチンの染色パターンを試験するために、組成物をＰＢＳ中の0.5μg/mlファロイジン−ＦＩＴＣ結合体とともに、室温で45分間インキュベーションした。培養された細胞が成長因子のレセプターを発現するか否かを決定するために、ＦＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体（1:200、Chemicon）及びＩＧＦ−１レセプタ−ｂ（1:100、Santa Cruz Biotech．）及びｔｒｋＡ（1:10,000、ＵＣＳＦにおいてDr.L.Reichardtから親切にも提供されたもの）に対する抗血清を一次抗体として使用した。ＦＩＴＣ結合二次抗体（1:200、Cappel）は、染色パターンを表すために用いた。卵形嚢断面の感覚上皮における免疫反応性は低いが（データは示さず）、培養した卵形嚢上皮細胞の多くは、ＦＧＦレセプター（図５Ａ、５Ｂ）及びＩＧＦ−１レセプター（図５Ｃ、５Ｄ）を高レベルで発現し、これは有毛細胞の変質によると思われる。これに対して、ＴｒｋＡに対する抗血清は、ＮＧＦの高親和性レセプターであるが、培養された細胞を染色しない（図５Ｅ、５Ｆ）。これらの結果は、ＦＧＦ類及びＩＧＦ−１のマイトジェン的効果が、これらの培養された細胞上の高親和性結合レセプターの活性化を通すものと思われる。
実施例Ｖ
卵形嚢上皮細胞はin vivoでＦＧＦ−２を産生する
ＦＧＦ−２が卵形嚢中に生理学的に存在するか否かを決定するために、我々は、Ｐ５ラット卵形嚢に、ＦＧＦ−２に対するモノクローナル抗体で免疫細胞化学実験を実施した。免疫細胞化学実験のために、Ｐ５ラット卵形嚢を、0.1Mリン酸バッファ（pH7.4）中の4%パラホルムアルデヒドで1時間固定した。組成物をＰＢＳ中でリンスし、30%スクロール溶液中でクリオプロテクト（cryoprotect）し、ＯＣＴに埋め込んだ。25マイクロメーター断片（section）を切り出し、低温槽装置上に集めた。次いで、断片を、ＦＩＴＣketugou niji koutai（1:200,Vector）を通してＦＧＦ−２に対するモノクローナル抗体（3μg/ml、UBI）で免疫染色した。負のコントロールは、一次抗体ステップをとばすことにより実施した。組成物を、抗消滅剤を含み、Zeiss Axiophot epifluorescent顕微鏡を用いて観察できるフルオロマウント-Ｇ（Southern Biotech.Assoc., AL）に充填した。図６に示すように、卵形嚢感覚上皮の中の支持細胞ではなく有毛細胞が、中程度のレベルのＦＧＦ−２を発現した。このような免疫反応性は、基底膜領域には存在しなかった。卵形嚢断片が二次抗体のみとインキュベーションされたとき全く染色が見られなかったので、ＦＧＦ−２抗体ラベル化は特異的であった。in vivoにおける卵形嚢感覚上皮の有毛細胞によるＦＧＦ−２の発現は、ＦＧＦ−２が生理学的成長因子であることを示唆している。
実施例ＶＩ
ＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１に対する中和抗体は卵形嚢上皮細胞増殖を有意に阻害した
卵形嚢細胞増殖が、培地からの外因性ＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１の除去によりブロック又は阻害されるか否かを見つけるため、我々は、中和抗体を培地に添加した。部分的に解離したＰ４−５ラット卵形嚢シートを、ポリリジン（500μg/ml）被覆した96-ウェルプレートに、100μlの1%ＦＢＳ添加媒質中でプレートした。抗−ＦＧＦ−２（20μg/ml、UBI）、抗−ＩＧＦ−１（40μg/ml、UBI）、抗−ＴＧＦ−α（20μg/ml、R&D Systems）、または抗−ＣＮＴＦ（20μg/ml、R&D Systems）中和抗体を、プレート時に培地に添加した。3Ｈ−チミジン（1μCi/ウェル）を、培養２４時間に、２４時間かけて添加し、上述のようにして細胞を収穫した。これらの細胞は血清を含まない培地で殆ど成長しなかったので、それらを希釈したウシ胎児血清（1%）を加えた媒質にプレートした。これらの条件下で、卵形嚢上皮細胞増殖は、抗−ＦＧＦ−２または抗−ＩＧＦ−１抗体の存在により有意に阻害された（p<0.01）。これに対して、負のコントロールを提供する抗ＴＧＦ−α抗体及び抗−ＣＮＴＦ抗体は、如何なる阻害効果も示さなかった。抗−ＦＧＦ−２または抗−ＩＧＦ−１抗体による阻害は部分的（約２５％）であり、培養媒質中に存在しうる他のＦＧＦ成員、ＥＧＦ及びＩＧＦ−２（上記参照）等の他のマイトジェンの存在によるものと考えられる。それにも関わらず、これらの結果は、培地中に内因性ＦＧＦ−２及びＩＧＦ−１が存在し、卵形嚢上皮細胞増殖を刺激したことをさらに支持する証拠を提供する。抗−ＴＧＦ−α及び抗−ＣＮＴＦ抗体が細胞増殖に影響せず、ＴＧＦ−αのマイトジェン活性が抗−ＦＧＦ−２または抗−ＩＧＦ−１抗体のいずれかの存在下で影響されないので、抗−ＦＧＦ−２または抗−ＩＧＦ−１抗体による細胞増殖の阻害は、一般的な毒性によるものではない（図７）。
引用した参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図４】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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