(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチド。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の蛋白質又はポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
【請求項５】
蛋白質又はポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号５で示されるＤＮＡである請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
蛋白質又はポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号４で示されるＤＮＡである請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
所望の遺伝子産物をコードする塩基配列とベクターとを有し、該塩基配列が請求項４、５又は６に記載の塩基配列であることを特徴とする組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターで微生物を形質転換した形質転換体。
【請求項９】
ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素より、その等電点の差を利用して、精製することにより配列番号１、２又３のアミノ酸配列を含むアイソザイムを分離することを特徴とする催涙成分生成酵素のアイソザイムの製造方法。
【請求項１０】
請求項４、５又は６に記載のＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、培地中又は細胞中に産生されたＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドを分離することを特徴とする、催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、タマネギ等を粉砕又は切断した時に発生する催涙成分の生成に関与する催涙成分生成酵素のアイソザイムに関するものであり、更に詳しくは、タマネギ等に存在する含硫化合物のＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる活性を持つ催涙成分生成酵素の３種のアイソザイム、そのアミノ酸配列及び当該アイソザイムをコードするＤＮＡ等に関するものである。
本発明の催涙成分生成酵素のアイソザイム、そのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡは、例えば、催涙成分の生成を制御すること、破砕又は切断した時に発生する催涙成分の量を低減化させたタマネギ品種の開発において、材料や交配物などの選別指標として使用すること、当該酵素の発現量を抑制するための情報を提供すること、当該酵素を大量に生産すること、催涙成分を大量に生産すること、等を実現化するものとして有用である。
背景技術
タマネギを粉砕又は切断した時に発生する催涙成分については、これまで、多くの研究成果が報告され、Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシドがアリイナーゼによって分解されると催涙成分が生成されると考えられて来た。
しかし、本発明者らの研究によって、Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシドがアリイナーゼによって分解されただけでは催涙成分は生じず、他の酵素（催涙成分生成酵素）の関与が不可欠であることが判明した。
そこで、本発明者らは、鋭意研究を積み重ね、催涙成分生成酵素（催涙性物質生成酵素）の製造方法を開発すると共に、催涙成分生成酵素の理化学的性質をも明かにして、先に、特許出願をした（特開平１０−２９５３７３号公報）。
すなわち、タマネギ等に存在する催涙成分（Lachrymatory Factor;ＬＦ）の形成及びその分解については、これまで、多くの研究成果が報告されているが、上記催涙成分の生成メカニズムについては、従来は、上記前駆物質のＰｅＣＳＯに酵素アリイナーゼが作用し、スルフェン酸を経て非酵素的により安定な催涙成分になると考えられていた。しかし、本発明者らが研究したところによれば、実際に、上記成分は酵素アリイナーゼの作用だけでは生じず、他の酵素の関与が不可欠であることが判明した。
そこで、本発明者らは、鋭意研究を積み重ね、上記スルフェン酸を異性化して催涙成分を生成すると考えられる新しい酵素（催涙成分生成酵素）の存在することを見出し、それによって、上記前駆物質は、当該酵素の作用の如何によって、催涙成分（香り成分）あるいはこれと別の風味成分になることが分かった。
この催涙成分生成酵素のアミノ酸配列や、それをコードするＤＮＡ情報を用いれば、例えば、タマネギの品種開発において、遺伝子組換えや変異の誘導・交配などが効果的に行え、粉砕や切断しても催涙成分が発生し難いタマネギの作出などに役立てることができる。
一方、催涙成分生成酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ情報を利用すれば、遺伝子組換え技術等によって当該酵素を大量に生産することが可能になり、例えば、涙欠乏症（ドライアイ）などの治療に役立つ催涙成分を効率的に製造する技術の開発にも役立つ。
しかしながら、催涙成分生成酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子に関しては、これまで、全く報告例がなく、情報がないため、催涙成分生成酵素に関する遺伝子レベルでの研究は困難であった。
発明の要約
本発明は、催涙成分生成酵素のアイソザイム、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子等を提供することを目的とするものである。
本発明は、タマネギ等に存在する催涙成分の生成に関与する催涙成分生成酵素の３種のアイソザイム、その蛋白質又はポリペプチドである配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列、上記蛋白質又はポリペプチドをコードする塩基配列を含有する配列番号４〜５に示されるＤＮＡ、上記アイソザイムの製造方法、上記ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した形質転換体、該宿主細胞を培養して、催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドを製造する方法、に関する。
発明の開示
このような状況の中で、本発明者らは、酵素アリイナーゼの存在下でタマネギ等に存在するＰｅＣＳＯから催涙成分を生成する作用を有する催涙成分生成酵素の構造を解明することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、催涙成分生成酵素の複数のアイソザイム、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列の解明に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、催涙成分生成酵素の３種のアイソザイムと、そのアミノ酸配列を提供することを目的とする。
また、本発明は、催涙成分生成酵素のアイソザイム蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子配列を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記催涙成分生成酵素のアイソザイムの作用を制御して、催涙成分生成酵素活性の発現を抑制したり、当該酵素活性を阻害したタマネギを作り出すことを実現化する方法等を提供することを目的とする。
更に、本発明は、上記遺伝子配列を有する組換えベクター、及び催涙成分生成酵素のアイソザイムを遺伝子組換え技術により効率的に作り出すことを実現化する方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチド。
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチド。
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチド。
（４）前記（１）、（２）又は（３）に記載の蛋白質又はポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
（５）蛋白質又はポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号５で示されるＤＮＡである前記（４）に記載のＤＮＡ。
（６）蛋白質又はポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡが、配列番号４で示されるＤＮＡである前記（４）に記載のＤＮＡ。
（７）所望の遺伝子産物をコードする塩基配列とベクターとを有し、該塩基配列が前記（４）、（５）又は（６）に記載の塩基配列であることを特徴とする組換えベクター。
（８）前記（７）に記載の組換えベクターで微生物を形質転換した形質転換体。
（９）ＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素より、その等電点の差を利用して、精製することにより配列番号１、２又３のアミノ酸配列を含むアイソザイムを分離することを特徴とする催涙成分生成酵素のアイソザイムの製造方法。
（１０）前記（４）、（５）又は（６）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、培地中又は細胞中に産生されたＰｅＣＳＯ（Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド）の酵素アリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドを分離することを特徴とする、催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドの製造方法。
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明では、上記課題を達成するために、まず、従来法で精製した催涙成分生成酵素（Ｅ２）中に含まれるアイソザイムを、その等電点の差を利用して、等電点電気泳動ないしクロマトフォーカシング法によって精製し、３種類のアイソザイムを単離する。次いで、単離した３種類のアイソザイムについて、Ｎ末端アミノ酸配列を明らかにし、これから予想される遺伝子の塩基配列を基にプライマーを設計し、タマネギのｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によって催涙成分生成酵素の遺伝子を選択的に合成する。
本発明者らは、こうして得た遺伝子の構造解析を行った結果、一つのオープンリーディングフレームが検出され、そこから予想された成熟蛋白質の分子量は、単離したアイソザイムの分子量の実測値（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）と一致したことから、上記遺伝子は、催涙成分生成酵素の遺伝子であることを確認した。
Ｓ−１−プロペニル−システインスルフォキシド（ＰｅＣＳＯ）のアリイナーゼによる分解物から催涙成分（チオプロパナールＳ−オキサイド）を生成させる催涙成分生成酵素は、タマネギの風味改質や加工適性の向上に関して重要な成分である。したがって、催涙成分生成酵素の生産や植物育種の分野においては、この催涙成分生成酵素のアミノ酸配列の決定及びそれをコードする遺伝子配列の決定は、極めて有意義である。
本発明者らは、上記催涙成分生成酵素（Ｅ２）のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列を明らかにすることを主たる目標として研究をスタートした。すなわち、催涙成分生成酵素の遺伝情報を解明することができれば、例えば、タマネギの加工時に催涙成分が生成しないタマネギ品種の開発などへの応用が期待できる。そこで、Ｅ２の構造遺伝子配列を決定し、その遺伝子及びアミノ酸配列を明らかにすることを目標として研究に着手した。
しかし、研究を進めるにつれて、通常の精製方法で得たＥ２の精製酵素試料ではＮ末端アミノ酸配列の決定は困難であることが分かった。すなわち、本発明者らが検討したところ、先に、本発明者らが開発した従来の方法で得たＥ２には、複数のアイソザイムが含まれていること、そのために、Ｅ２のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を解明する前に、アイソザイムの単離が必要となること、が判明した。本発明者らは、これらの知見を踏まえて、更に研究を重ねて、Ｅ２の主要アイソザイム３種（Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３）を単離し、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。これを基にプライマーを設計し、ＰＣＲ等の手法を用いて、各Ｅ２アイソザイムをコードする遺伝子配列とアミノ酸配列を決定することに成功した。
更に、この点について詳述すると、従来の方法で精製した催涙成分生成酵素試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動で１バンドとして検出されたので、単一の蛋白質であると推定し、Ｎ末端のアミノ酸分析を試みた。しかし、この部分精製試料には、複数のアイソザイムが混在していたため、Ｎ末端のアミノ酸配列を特定することはできなかった。
そこで、イオン交換樹脂の種類や溶出条件、ゲルろ過カラムのサイズやゲルの種類等について種々検討し、アイソザイムの分離を試みたが、いずれの方法でも分離できなかった。一方、ネイティブのポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動では、アイソザイムが複数のバンドとして検出できた。そこで、ゲルから切り出して精製する方法を試みた。しかし、この方法では、各アイソザイムの分離が不充分であることや、切り出すアイソザイムの位置が泳動毎に変動したため、正確な切り出しが行えず、純度の高いアイソザイムを得ることはできなかった。こうした試みを繰り返した結果、等電点の差を利用した精製方法である、等電点ゲル電気泳動ないしクロマトフォーカシングを用いれば、複数のアイソザイムを効率的に分離できることが分かった。
尚、等電点電気泳動については、例えば、ｐＨ４．０〜６．５のアンフォラインを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、泳動後のゲルを切り出し、水やＢｕｆｆｅｒで溶出してアイソザイムを単離する方法が採用できる。クロマトファーカシングについては、例えば、Ｍｏｎｏ  Ｐカラム（ファルマシア製）を無水ピペラジン−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒで平衡化した後、Ｐｏｌｙ  Ｂｕｆｆｅｒ７４（ファルマシア製）を用いたＢｕｆｆｅｒで溶出してアイソザイムを単離することができる。
部分精製試料中に含まれる、主要なアイソザイムは、３種類（Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３）であったので、この３種類のアイソザイムを、等電点ゲル電気泳動やクロマトフォーカシングで精製した。しかし、この様な精製方法を採用しても、純度の高いアイソザイムを得るためには、精製操作を数回繰り返して行う必要があった。このような経過をへて、本発明者らは、主要な３種のアイソザイムの単離に成功した。
上記催涙成分生成酵素試料は、好適には、タマネギ等を原料として、抽出、精製し、製造されるが、原料として、タマネギと同様に、上記酵素含有材料であれば、タマネギ以外のものを使用することができる。この場合、上記酵素の抽出、精製工程として、例えば、以下の方法が好適なものとして例示される。
すなわち、例えば、タマネギを原料とし、これを水で加水し、ミキサー等で破砕する。得られた破砕物を遠心し、その上澄み液を塩析して蛋白質を沈澱させる。次いで、上記沈澱物をリン酸バッファー等の緩衝液に溶解し、遠心し、その上澄み液を粗酵素液として採取する。
ここで、緩衝液としては、各種のものが使用できるが、例えば、リン酸カリウムバッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、酒石酸バッファー、コハク酸バッファー、マレイン酸バッファー、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、クエン酸−リン酸バッファー、等が例示される。
次に、上記方法によって得られた粗酵素液を、例えば、ハイドロキシアパタイト、硫安塩析、透析、陰イオン交換、ゲル濾過等の手段を適宜組合わせて、精製処理することにより、部分生成酵素液とすることができる。
粗酵素液からの上記酵素の部分精製は、上記方法に限らず、公知の分離、精製方法が適用できるが、例えば、粗酵素液から硫安塩析法、有機溶媒沈澱法などにより粗酵素蛋白を得て、更に、これをイオン交換、ゲル濾過、アフィニティー等の各種クロマトグラフィーを適宜組合わせることによって精製処理することができる。
催涙成分生成酵素のアイソザイムのｃＤＮＡを取得する具体的な方法としては、例えば、Ｅ２−１〜Ｅ２−３の各Ｎ末端アミノ酸配列をもとにｃＤＮＡプローブを作製し、タマネギのバルブから抽出したＥ２のｍＲＮＡを鋳型にして作製したｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションにより、Ｅ２のｃＤＮＡを釣り上げる方法や、ｍＲＮＡのポリＡ鎖にアンカーを付加し、これに相補するプライマーとＥ２−１〜Ｅ２−３の各Ｎ末端アミノ酸配列をもとに作製したプライマーを用い、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法で、Ｅ２の３’末端側配列を明かにした後、５’ＲＡＣＥ法で５’末端側配列を明らかにする方法など、が例示される。
上記３種類のアイソザイムは、好適には、例えば、以下の方法によりその遺伝子配列を決定することができるが、以下の方法に制限されるものではない。
１）タマネギの鱗片からフェノール／ＳＤＳ／ＬｉＣｌ法でトータルＲＮＡを抽出する。
２）トータルＲＮＡをオリゴｄＴカラムで処理してｍＲＮＡを精製する。
３）ｍＲＮＡを逆転写酵素で処理してｃＤＮＡを合成する。
４）Ｅ２−１のＮ末端アミノ酸５残基を基にして作製した、デジェネレートプライマーとポリＡ鎖の末端に付けたアンカー部分に対応するプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｅ２−１の下流側に由来する増幅産物を得る。
５）得られたＰＣＲ増幅産物を精製した後、サブクローニングして、塩基配列を明らかにする。
６）ＰＣＲで得られた増幅産物がＥ２−１に由来することは、Ｅ２−１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分子量測定結果とアミノ酸配列から予測される分子量が良く一致することから確認できる。
７）Ｅ２−１の内部配列から設計したプライマーと、５′末端に付加したオリゴｄＣ鎖に付けたアンカーから設計したプライマーを用いたＰＣＲ（５′ＲＡＣＥ）を行い、上流側に由来する増幅産物を得る。
８）得られたＰＣＲ増幅産物を精製した後、サブクローニングして、塩基配列を明らかにする。
シークエンスの分析結果を解析し、Ｅ２−１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在を確認した結果、Ｅ２−１は１６９個のアミノ酸からなる蛋白質として合成された後、プロセッシングによってＮ末端の１６個のアミノ酸が除かれ、成熟した蛋白質になることが判明した。
すなわち、催涙成分生成酵素のアイソザイムのｃＤＮＡを取得し、解析した結果、上記Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３は、同じ遺伝子を基に蛋白質に翻訳されるが、その後のプロセッシングのされ方の違いによって、Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３になることが分かった。また、Ｅ２−２のＮ末端から２番目、並びに、Ｅ２−３のＮ末端から４番目のアミノ酸は、Ａｓｎが翻訳後、Ａｓｐに変化することも分かった。この様にして、Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３の遺伝子配列とアミノ酸の一次配列を決定した。
Ｅ２−２とＥ２−３は、同一の遺伝子を基に合成され、プロセッシングの違いにより生じるアイソザイムであることが、実験の結果、明らかとなった。
Ｅ２−３のＮ末端アミノ酸配列を１０残基まで解析した結果、Ｅ２−２のＮ末端アミノ酸配列５残基は、Ｅ２−３のＮ末端３残基目から７残基目と完全に一致することが分かった。
（Ｅ２−２のＮ末端アミノ酸配列）
Ala Asp Gly Ala Arg
（Ｅ２−３のＮ末端アミノ酸配列）
Asp Ser Ala Asp Gly Ala Arg Lys Trp Ser
この結果から、Ｅ２−３は、Ｅ２−２のＮ末端側にSer とAsp が付加した蛋白質であることが分かった。
以上の結果から、Ｅ２−２とＥ２−３は、同一の遺伝子を基に合成されていると考えられる。
次に、Ｅ２−３の遺伝子配列を解明するため、Ｅ２−３のＮ末端アミノ酸９残基を基にして作製したデジェネレートプライマーと、ポリＡ鎖の末端に付けたアンカーから設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得る。
得られたＰＣＲ増幅産物を精製した後、サブクローニングして、塩基配列を明らかにする。
シークエンスの分析結果を解析した結果、Ｅ２−３の下流側配列は、Ｅ２−１で確認した配列と一致することが分かった。
ここで、Ｅ２−３の下流側配列は、Ｅ２−１で確認した配列と一致したため、５′ＲＡＣＥ用プライマーは、Ｅ２−１の上流配列を確認するために使ったプライマーと同じになる。
５′ＲＡＣＥでは共通したアンカープライマーを用いるので、Ｅ２−３の上流配列がＥ２−１の上流配列と違うとすると、Ｅ２−１で行った５′ＲＡＣＥの増幅産物には、Ｅ２−３の上流配列とＥ２−１の上流配列の両方が含まれ得ることが考えられる。
そこで、異なる組換え体コロニーからＤＮＡを抽出して、Ｅ２−１の５′ＲＡＣＥ産物を更に２回シークエンスした。
解析の結果、追加して行った２個の５′ＲＡＣＥ産物の配列は、先に解析したＥ２−１の上流配列と一致した。
以上の結果、Ｅ２−３の上流配列もＥ２−１の上流配列と同じである可能性が高いと考えられる。
そこで、種々検討を重ねた結果、Ｅ２−３はＥ２−１と同じ遺伝子を元に翻訳されること、並びに、成熟した蛋白質になる過程で、Asn からAsp に変化する、との結論を得た。
上記結論が正しいことは、Ｅ２−２とＥ２−３のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分子量測定結果とアミノ酸配列から予測される分子量がよく一致することからも確認できる。
Ｅ２−２（１５５アミノ酸）の分子量は１７６８９、実測値は１７７２２。
Ｅ２−３（１５７アミノ酸）の分子量は１７８９２、実測値は１７９０９。
次に、ＰｅＣＳＯ、アリイナーゼ、Ｅ２の混合系における至適ｐＨと至適温度について説明する。
Ｅ２の至適ｐＨは、いずれも４．５〜５．０で３者に大きな差はない。
Ｅ２−１〜３の至適温度についても、１５℃から２５℃の室温領域であり、大きな差はないことが判った。
上記３種類のアイソザイムは、いずれも分子量、至適ｐＨ及び催涙成分を生成する作用において、著しい一致をみせている。本発明においては、いずれのアイソザイムも、本発明の催涙成分生成酵素のアイソザイムに包含される。
なお、Ｅ２−１を試料にして、Ｎ末端アミノ酸分析を行ったところ、含有量が少ない他の２種類のアイソザイム（Ｅ２−１−１、Ｅ２−１−２と命名した）が検出され、これらのＮ末端アミノ酸配列も決定した。
すなわち、粗精製したＥ２試料中には、上記した３種類のアイソザイムの他、マイナーなアイソザイム（Ｅ２−１−１、Ｅ２−１−２）も存在した。
各アイソザイムのＮ末端アミノ酸配列と分子量測定値を以下に示す。
分子量
（アイソザイム）  （Ｎ末端のアミノ酸配列）  (MALDI-TOFMS) 
E2-1            Gly Ala Arg Lys Trp           17465
E2-1-1          Ala Arg Lys Trp
E2-1-2          Ser Ala Asn Gly Ala
E2-2            Ala Asp Gly Ala Arg           17722
E2-3            Asp Ser Ala Asp Gly Ala Arg Lys Trp Ser
17909
Ｅ２−２のＮ末端から２番目とＥ２−３のＮ末端から４番目のAsp は、Asn の形で合成された後、Asp に変換されると考えられるため、上記の位置のAsp がAsn であるＥ２−２、Ｅ２−３も存在すると推測される。配列から判明した分子量は、Ｅ２−１（１５３アミノ酸）は１７５０３、Ｅ２−２（１５５アミノ酸）は１７６８９、Ｅ２−３（１５７アミノ酸）は１７８９２であり、ＭＳでの測定値と近い。
本発明の催涙成分生成酵素のアイソザイムをコードするＤＮＡは、配列番号５の塩基配列で表されるＤＮＡ、及び上記蛋白質のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を行って得られる誘導体を含む蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
本発明の催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドは、上記酵素活性を有し、上記蛋白質のアミノ酸配列にアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を行って得られる誘導体を含む蛋白質又はポリペプチド、配列番号１〜３のアミノ酸配列で表される、上記酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドを包含する。
本発明の上記Ｅ２のアイソザイムをコードするＤＮＡ、上記アミノ酸配列は、例えば、催涙成分の生成を制御する方法、これらを指標として、交配に供するタマネギを選抜する方法、催涙成分生成酵素活性を低減させたタマネギの品種を作出する方法、催涙成分生成酵素を遺伝子組換え技術により大量に生産する方法、等を実現させるものとして有用である。
本発明の催涙成分生成酵素のアイソザイムの応用例として、例えば、以下の例が例示される。
（１）催涙成分生成酵素の生産
前記のようにして得た催涙成分生成酵素のアイソザイムのｃＤＮＡを適宜の発現ベクターに組み込んで、組換えベクターを作製することができる。
使用するベクターは、宿主細胞内で自律的に複製可能であって、上記ＤＮＡ、すなわち、Ｅ２アイソザイム遺伝子を組み込み得る挿入部位を持ち、更に、この組み込んだＤＮＡを宿主細胞内で発現せしめることを可能とする領域を有するものであれば、その種類は、特に制限されない。
また、ベクターに組み込むＥ２アイソザイム遺伝子としては、本発明の催涙成分生成酵素活性を有する蛋白質又はポリペプチドをコードするように設計して合成されたＤＮＡを用いることができる。また、組み込む生物種での発現を促進するために、組み込む生物種に合わせてコドンを変換することがあるが、これらのコドン変換されたＤＮＡも本発明の範囲に含まれることは云うまでもない。この様なアミノ酸配列を基にした遺伝子の合成は、例えば、ＤＮＡ自動合成機を利用して合成したオリゴヌクレオチドをアニール後に連結する等の方法により、適宜実施することができる。
更に、Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３では、Ｎ末端のアミノ酸配列が異なるにも拘わらず、酵素的性質は、著しく一致していることからも明白なように、１もしくは複数の一部のアミノ酸が付加、欠失しても、天然のＥ２と同じ酵素的性質が得られる可能性がある。また、一部のアミノ酸残基が置換しても、結果として天然のＥ２と同じ酵素的性質が得られる可能性がある。このような遺伝子の改変は、市販遺伝子の部位特異的変異導入キットを用いたり、合成遺伝子を挿入する等の方法により、容易に実現することが可能である。したがって、ベクターに組み込むＥ２アイソザイム遺伝子としては、天然のＥ２と同じ酵素的性質が維持されている限り、その変異体であってもよい。次いで、上記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る。組換え発現ベクターの宿主細胞への導入は、慣用的に用いられている方法により行うことができる。その方法として、例えば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等、種々のものが例示されるが、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を採用すればよい。本発明のＥ２のアイソザイムを産生する宿主としては、好適には、大腸菌、枯草菌、酵母、麹菌などの微生物、カイコ培養細胞等の細胞が例示される。
上記のようにして得られた形質転換体を培養することにより、培養物中にＥ２のアイソザイムを生産させることができる。これを公知の方法で単離し、あるいは精製することにより、安定に催涙成分生成酵素のアイソザイムを得ることが可能となる。
（２）アンチセンスＲＮＡによる催涙成分を生成しない植物の生産
本発明のＥ２のアイソザイムをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、アンチセンスＲＮＡを植物内で発現させることにより、上記遺伝情報の発現を抑制することができる。アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡに対して相補的塩基配列を持ち、ｍＲＮＡと塩基対を形成することにより、遺伝情報を遮断し、最終産物であるＥ２のアイソザイムの蛋白質合成を抑制する。本発明において使用できるアンチセンスＲＮＡは、配列番号４に示す塩基配列を元に合成されるｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスヌクレオチドのターゲット部位は、遺伝子によって様々であり、どの部位が必ずよいと言うコンセンサスはない。しかし、一般的には、ＡＴＧスタートサイトなどが、ターゲット部位の候補になり得る。更に、最近では、ターゲット部位とアンチセンスヌクレオチドをデザインするためのコンピューター解析ソフト（ＨＹＢ  ｓｉｍｕｌａｔｏｒなど）も数種発売されているので、これらを利用してアンチセンスヌクレオチドを設計することも可能である。なお、アンチセンスヌクレオチドの長さは、１８〜２３ｍｅｒ、ＧＣコンテントは５０％以上が好ましい。
上記アンチセンスＲＮＡを植物内で機能させる方法としては、例えば、発現ベクターのプロモーターの下流にｃＤＮＡを逆向きに組み込んで宿主細胞に導入してアンチセンスＲＮＡを合成させる方法が例示される。
外来遺伝子を導入する方法としては、アグロバクテリウムによる形質転換方法や、直接導入による形質転換法を用いることができるが、タマネギなどの単子葉植物については、特に直接導入による形質転換方法で良好な結果が得られている（Klein, T. M. et al. Nature 327, 70-73, 1987 参照）ので、直接導入する方法が好ましい。
（３）Ｅ２蛋白質の大量生産
本発明におけるＥ２蛋白質のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型べクターは、例えば、（イ）Ｅ２をコードするＲＮＡを単離し、（ロ）該ＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ハ) 該ｃＤＮＡをプラスミドに組み込み、（ニ）得られたプラスミドで宿主を形質転換し、（ホ) 得られた形質転換体を培養後、適当な方法により、目的とするプラスミドを単離し、（ヘ）そのプラスミドからクローン化ＤＮＡを切り出し、（ト）該クローン化ＤＮＡを発現型べクターのプロモーターの下流に連結することにより製造することできる。
Ｅ２をコードするＲＮＡは、Ｅ２を含有する材料であれば、タマネギ以外のものも使用することができる。Ｅ２含有材料からＲＮＡを調製する方法としては、フェノール／ＳＤＳとＬｉＣｌ法（細胞工学別冊、細胞工学シリーズ２、植物のＰＣＲ実験プロトコールｐ５１  秀潤社) などが挙げられる。このようにして得られたＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のｐＢＲ３２２（ジーン（ｇｅｎｅ）, ２，９５（１９７７）），ｐＢＲ３２５（ジーン，４，１２１（１９７８），枯草菌由来のｐＵＢ１１０（バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１１２，６７８（１９８３））などが挙げられるが、その他のものであっても、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも用いることができる。プラスミドに組み込む方法としては、ベクターとインサートのモル比を１：１から１：１０にした混合液を作製し、Ｔ４リガーゼで処理する方法が一般的である（細胞工学別冊、バイオ実験イラストレイテッド  （２）遺伝子解析の基礎、ｐ７８、秀潤社)。このようにして得られたブラスミドは、適当な宿主、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。
上記エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｃｈｉａ）属菌の例としては、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）６０，１６０（１９６８））などが挙げられる。上記バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（ジーン，２４，２５５（１９８３））などが挙げられる。形質転換する方法としては、カルシウムクロライド法（バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、４９、１５６８（１９７２））などが挙げられる。このようにして得られた形質転換体中から、公知の方法、例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法（ジーン、１０、６３（１９８０）及びＤＮＡ塩基配列決定法（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、７４、５６０（１９７７））などを用い、求めるクローンを選出する。このようにして、クローン化されたＥ２をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを有するべクターを保持する微生物が得られる。
次に、該微生物からプラスミドを単離する。単離法としては、アルカリ法（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１５１３（１９７９））などが挙げられる。上記クローン化されたＥ２をコードする塩基配列を含有するプラスミドは、そのまま、又は所望により制限酵素で切り出す。クローン化された遺伝子は、発現に適したべクター中のプロモーターの下流に連結して発現型べクターを得ることができる。
べクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０）、酵母由来プラスミド（例えば、ｐＳＨ１９）あるいはλファージなどのバクテリオファージ及びレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。該遺伝子はその５’末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧを有しても良い。また、既知の蛋白質をコードする遺伝子の３’末端に該遺伝子の５’末端を結合させ、融合蛋白質として発現させる場合は、翻訳開始コドンは必ずしも必要としない。更に、該遺伝子を発現させるためにはその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでも良い。また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモーターがｌａｃプロモーターであることが好ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ましい。
このようにして構築されたＤＮＡを含有するべクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主としては、エシェリキア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては、前記したものと同様のものが挙げられる。上記酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシアエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒなどが挙げられる。動物細胞としては、例えば、去る細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなどが挙げられる。この様にして、ＤＮＡを含有するべクターで形質転換された形質転換体が得られる。
その一例としては、例えば、後述の実施例（１１）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−Ｅ２−３−１が挙げられ、該微生物は、ブタペスト条約基づき、２００１年７月２５日に独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７５として寄託され、同研究所に保管されている。宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば、ＬＢ培地やＳＯＣ培地（細胞工学別冊  バイオイラストレイテッド、１．分子生物学実験の基礎、ｐ９８−９９、秀潤社) が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率良く働かせるために、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス菌属の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホルダー最小培地（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス７７，４５０５（１９８０））が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて、通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＮ培地（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２２，５０１（１９５２）ＤＭＥＭ培地（ヴィロロジー（Ｖｉｒｏ−ｌｏｇｙ）、８、３９６（１９５９））などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃から４０℃で約１５時間から６０時間行い、必要に応じて、二酸化炭素濃度を高めることができる。
上記培養物からＥ２蛋白を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。Ｅ２蛋白を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体又は細胞を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を含む緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び（又は凍結融解) によって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離によりＥ２蛋白を得る方法などが適宜用いられる。上記上澄液からＥ２蛋白を精製するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製方法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解性を利用する方法、透析法、ゲルろ過法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法などが挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例
（１）催涙成分精生成酵素のアイソザイムの単離
催涙成分生成酵素試料は、タマネギを原料として、本発明者らが開発した従来の方法（特開平１０−２９５３７３号公報）を用いて作製した。
１）クロマトフォーカシングによる精製
クロマトフォーカシング用カラムであるＭｏｎｏ  Ｐ  ＨＲ５／２０（５φ×２００ｍｍ）（ファルマシア製）をＳｔａｒｔ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０２５Ｍ無水ピペラジンをＨＣｌでｐＨ５．７に調整したもの）で平衡化した後、５００μｌの試料をアプライした。アプライ後は、Ｅｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ（ファルマシア製１０％  Ｐｏｌｙ  ｂｕｆｆｅｒをＨＣｌでｐＨ４．０に調整したもの）にて溶出し、溶出液を分画して回収した。溶出液の流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、分析温度は４℃とし、２８０ｎｍの吸収と催涙成分生成酵素活性を測定した。
２）活性の測定方法
活性の測定方法は、試料を希釈用Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸カリウムＢｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．５）で希釈し、希釈試料１０μｌに、ニンニクアリイナーゼ（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）４０μｌとＰｅＣＳＯ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加え、室温で３分間反応させた後、反応液１μｌをＨＰＬＣにアプライし、催涙成分の生成量を定量した。なお、分析にはＯＳＤカラム（４．６φ×２５０ｍｍ）（センシュウ科学社製）、又はＤＯＣＯＳＩＬカラム（４．６φ×２５０ｍｍ）（センシュウ科学社製）を用いた。その他、移動相には３０％（ｖ／ｖ）の酸性ＭｅＯＨを、流速は、０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は３５℃、検出は２５４ｎｍとした。
３）結果
Ｍｏｎｏ  Ｐカラムでの精製の結果、Ｅ２には複数のアイソザイムが存在すること、並びに含有量が高いアイソザイムはそのうちの、３種類であることが分かった。そこで、この３種類のアイソザイム（Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３）を単離した。
Ｍｏｎｏ  Ｐカラムからの代表的な溶出パターンを図１に示す。Ｅ２−１はフラクションＮｏ．４、Ｅ２−２はフラクションＮｏ．６、Ｅ２−３はフラクションＮｏ．１０、１１である。また、Ｅ２−１には微量成分としてＥ２−１−１及びＥ２−１−２が含まれていた。
Ｎ末端のアミノ酸配列を確定できたＥ２のアイソザイムは、含有量が多い３種類と、含有量が少ない２種類の全５種類であった。
（２）アイソザイムの至適ｐＨ及び至適温度の比較
精製したＥ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３の各試料を３５０ｍＭのリン酸カリウムＢｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．４〜８．０）で希釈し、上記（１）と同じ方法で活性を測定した。反応液のｐＨは反応終了後に実測した。活性の強さは、最大活性を示した点を１００％とし、相対値で評価した。
実験の結果、Ｅ２の各アイソザイムの至適ｐＨはいずれも４．５〜５．０で類似していることが判明した。至適ｐＨの測定結果を図２に示す。
上記（１）で示した方法で反応液を作製し、反応温度を０℃から６０℃まで変化させた。活性の強さは、最大活性を示した点を１００％とし、相対値で評価した。実験の結果、Ｅ２の各アイソザイムの至適温度はいずれも１５℃〜２５℃で類似していることが判明した。至適温度の測定結果を図３に示す。
（３）催涙成分生成酵素のアイソザイムのＮ末端アミノ酸配列の決定
等電点電気泳動及びクロマトフォーカシングで精製した催涙成分生成酵素のアイソザイムを、フェニルイソチオシアナート法で分析することによって、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。この場合、プロテインシークエンサーとしては、Ｇ１００Ａ（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ）を、また、ＰＴＨアナライザーとしては、１０９０（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ）を使用した。
得られたＮ末端アミノ酸配列は、以下の通りであった。
試料名    含有量                  配  列
E2-3      多い    Asp Ser Ala Asp Gly Ala Arg Lys Trp Ser
E2-1-2    少ない      Ser Ala Asn Gly Ala
E2-2      多い            Ala Asp Gly Ala Arg
E2-1      多い                    Gly Ala Arg Lys Trp
E2-1-1    少ない                      Ala Arg Lys Trp
（４）タマネギ由来のｃＤＮＡの合成
タマネギの燐片２．４ｇから、フェノール／ＳＤＳ／ＬｉＣｌ法によって全ＲＮＡを調製した。更に、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーによって、ｍＲＮＡを含むポリＡ−ＲＮＡ１．５μｇを単離し、これを鋳型としてオリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。全ＲＮＡからｍＲＮＡの調製には、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ファルマシア製）を、また、ｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡの合成には、ＲＴＧ−Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄキット（ファルマシア製）を用いた。
（５）Ｅ２−１をコードするｃＤＮＡの３’末端側塩基配列の決定
Ｅ２−１のＮ−末端アミノ酸配列からＤＮＡの塩基配列を推定し、合成プライマー、５’−ＧＧＩＧＣＩ（Ａ／Ｃ）ＧＩＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧＧ−３’を作製した。また、オリゴｄＴプライマーに付けたアンカー部分に相補するリバースプライマー、５’−ＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧ−３’も作製した。作製した２つのプライマーを用いて、タマネギ由来のｃＤＮＡを鋳型として、サーマル  サイクラー（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、以下の温度条件下でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、９５℃、９分間の熱変性の後、９４℃、１分間の熱変性、続いて４３℃、１分間のアニーリング、７２℃、１分間の伸長反応を４０サイクル繰り返し、その後、７２℃、２分間の伸長反応を行って反応を停止した。その結果、約６６０ｂｐの単一な産物を得た。尚、プライマーの塩基配列において、「／」は「又は」を、「Ｉ」はイノシンを示す。
（６）ＰＣＲで増幅されたＥ２−１をコードするｃＤＮＡの３’末端側の塩基配列の解析
ＰＣＲで増幅された約６６０ｂｐの塩基配列を決定するために、増幅産物をアガロースゲルから切り出して精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングした。これを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）に導入し、増幅させた後、組換え大腸菌からプラスミドを採取し、精製した。このプラスミドを試料とし、ダイデオキシ法によって３’末端側の塩基配列を決定した。
（７）Ｅ２−１をコードするｃＤＮＡ５’末端側塩基配列の決定
Ｅ２−１の５’末端側ｃＤＮＡの解析には、５’ＲＡＣＥ法を用いた。具体的には、５’ＲＡＣＥシステムキット（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を用い、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡの５’末端にオリゴｄＣをｔａｉｌｉｎｇして、これを鋳型として用いた。プライマーには、キット付属のＡｎｃｈｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ、５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３’とＥ２−１の３’末端側ｃＤＮＡの解析で判明した配列を基に作製したリバースプライマー、５’−ＴＣＣＴＣＧＴＡＣＣＣＴＧＴＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧ−３’を用い、サーマル  サイクラー（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて以下の温度条件下でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、９５℃、９分間の熱変性の後、９４℃、１分間の熱変性、続いて５５℃、１分間のアニーリング、７２℃、１分間の伸長反応を４０サイクル繰り返し、その後、７２℃、７分間の伸長反応を行って反応を停止した。その結果、約４３０ｂｐの単一な産物を得た。
（８）Ｅ２−１由来ｃＤＮＡの５’末端側の塩基配列の解析
ＰＣＲで増幅された約４３０ｂｐの塩基配列を決定するため、増幅産物をアガロースゲルから切り出して精製し、前記３’末端側の塩基配列の場合と同じ手順で配列を決定した。３’側及び５’側の解析により得られた全長の塩基配列を配列番号４に示す。また、配列番号４に検出されたオープンリーディングフレーム部分の配列を配列番号５に示す。
（９）塩基配列から得られたアミノ酸配列
配列番号５に示した塩基配列からアミノ酸配列を推測し、これを、Ｅ２−１のＮ末端アミノ酸配列と比較したところ、該当する配列が見出されたため、単離されたｃＤＮＡは催涙性物質生成酵素のアイソザイムＥ２−１のｃＤＮＡであることが確認された。更に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで測定したＥ２−１の分子量は、塩基配列から得られたアミノ酸配列から推測される分子量と良く合致することも確認した。
Ｅ２−１分子量：測定値１７４６５、計算値１７５０３
更に、単離されたｃＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列と成熟蛋白質のアミノ酸配列を比較検討した結果、ｃＤＮＡがコードする蛋白質のＮ末端側に、成熟蛋白質には含まれないペプチドが存在することが見出された。その結果、Ｅ２−１は蛋白質への翻訳後、Ｎ末端側１６個のアミノ酸が切断され成熟蛋白質になることが確認された。この成熟したＥ２−１のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
（１０）Ｅ２−２、Ｅ２−３のアミノ酸配列の決定
上記（２）〜（９）の方法と同様の方法により、Ｅ２−２、Ｅ２−３のアミノ酸配列を決定した。
前述のアイソザイムのＮ末端アミノ酸配列の分析結果から、Ｅ２−２は、Ｅ２−１よりＮ末端側のアミノ酸が２残基分長い産物、Ｅ２−３は４残基分長い産物であろうと予測されたが、実際には、Ｅ２−１をコードする遺伝子から推定されるアミノ酸をＥ２−２，Ｅ２−３のＮ末端アミノ酸と比較すると１箇所だけ合致しないことが判明した。
合致しなかったアミノ酸は、Ｅ２−２のＮ末端から２残基目、Ｅ２−３のＮ末端から４残基目のアスパラギン酸で、Ｅ２−１をコードする遺伝子では、アスパラギンがコードされていた。したがって、Ｅ２−１をコードする遺伝子とＥ２−２やＥ２−３をコードする遺伝子が異なる可能性が考えられたため、前記Ｅ２−１の場合と同様の方法で、Ｅ２−２及びＥ２−３をコードする遺伝子を解析した。
先ず、３’末端側塩基配列の決定用に、Ｅ２−３のＮ−末端アミノ酸９残基の配列から、次のＥ２−３−Ｎ９−１とＥ２−３−Ｎ９−２並びにＥ２−３−Ａｓｐの３種類の合成プライマーを作製した。
Ｅ２−３−Ｎ９−１・・５’−ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＣＩ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＧＣＩＣＧＩＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧＧ−３’
Ｅ２−３−Ｎ９−２・・５’−ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＩＧＣＩ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＧＣＩＣＧＩＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧＧ−３’
Ｅ２−３−Ａｓｐ・・５’−ＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＡＡＴＧＧ−３’
Ｅ２−３−Ｎ９−１のプライマーと前記（５）で合成したリバースプライマーとの組み合わせ、及びＥ２−３−Ｎ９−２のプライマーとリバースプライマーとの組み合わせ、Ｅ２−３−Ａｓｐのプライマーとリバースプライマーとの組み合わせで、タマネギ由来のｃＤＮＡを鋳型として、サーマル  サイクラー（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲ条件は、アニーリング温度を５３℃に変更した以外、前記（５）の場合と同様にした。
ＰＣＲの結果、いずれのプライマーの組み合わせでも約６６０ｂｐの単一な産物が得られた。また、得られた３種類の産物の塩基配列は、プライマー部分を除き、Ｅ２−１の配列と一致した。この結果は、Ｅ２−２及びＥ２−３をコードする遺伝子の３’末端側塩基配列はＥ２−１をコードする遺伝子の配列と同じであることを示す。
次に、５’末端側塩基配列の決定を行った。前記（７）の場合と同様の手順で増幅させた産物について、更に、シークエンスを２度行った結果、増幅産物の塩基配列は、いずれもＥ２−１の５’末端側配列と一致した。
以上の結果より、Ｅ２−２及びＥ２−３をコードする遺伝子は、Ｅ２−１をコードする遺伝子と同一であることが示唆された。
Ｅ２のアイソザイムをコードする遺伝子が同一であることから、Ｅ２−２のＮ末端から２残基目、及びＥ２−３のＮ末端から４残基目のアスパラギン酸は、アスパラギンとして翻訳された後、アスパラギン酸に変換されることが判明した。
アスパラギンがアスパラギン酸に変化する反応については、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｑｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１５（６＆７），１１１５−１１２８（１９９２）などに紹介されており、アスパラギンのＣ末端側にグリシンが結合すると、アスパラギン酸への変化が起き易いことが報告されている。
なお、塩基配列から推定されるＥ２−２の分子量（１７６８９）は、Ｅ２−２分子量測定値（１７７２２）と、Ｅ２−３の分子量（１７８９２）は、Ｅ２−２分子量測定値（１７９０９）とほぼ合致したことからも、Ｅ２−２やＥ２−３をコードする塩基配列はＥ２−１をコードするｃＤＮＡ配列と同一であることを確認した。
以上の結果より、Ｅ２−２は、蛋白質への翻訳後、Ｎ末端側１４個のアミノ酸の切断と、Ｎ末端から２残基目のアスパラギンがアスパラギン酸への変換を受けて、成熟蛋白質になること、Ｅ２−３は、蛋白質への翻訳後、Ｎ末端側１２個のアミノ酸の切断と、Ｎ末端から４残基目のアスパラギンがアスパラギン酸への変換を受けて、成熟蛋白質になることが判明した。
その結果を、配列番号２、配列番号３に各々示す。更に、上記Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３をコードする遺伝子領域を含む５０７塩基から成る構造遺伝子（ＯＲＦ）の塩基配列を配列番号５に、また、７３７塩基から成る全長の塩基配列を配列番号４に、更に当該全長の塩基配列及びＥ２のアミノ酸配列を図４に示す。
（１１）発現プラスミドの構築
本実施例のＥ２−２、Ｅ２−３のアミノ酸配列の決定で述べた方法に従い、Ｅ２−３−Ｎ９−１のフォワードプライマーとオリゴｄＴプライマーに付けたアンカー部分に相補するリバースプライマー（前記（５）で合成したリバースプライマー）を使い、タマネギ由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行って、約６６０ｂｐの産物（産物Ａ）を得た。
また、Ｅ２−３−Ｎ９−１のフォワードプライマーの代わりに、Ｅ２−３−Ｎ９−２をフォワードプライマーとして用いたＰＣＲを行い、同様に約６６０ｂｐの産物（産物Ｂ）を得た。
得られた産物Ａ及びＢを、先に述べた塩基配列の決定方法に従って、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングした後、大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）に導入し、塩基配列を解析した。図７に、サブクローニングの手順を示す。
産物Ａが組み込まれたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒを持つ大腸菌の中から、配列番号３で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を持つ大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅ２−３−１）を得た。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅ２−３−１に導入された産物Ａの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号６及び配列番号７、及び図５に示す。
同様に、産物Ｂが組み込まれたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒを持つ大腸菌の中から、配列番号３のアミノ酸配列番号４位のＡｓｐだけが、Ａｓｎに置き代わったポリペプチドをコードする塩基配列を持つ大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅ２−３−２）を得た。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅ２−３−２に導入された産物Ｂの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号８及び配列番号９、及び図６に示す。
蛋白質の発現用ベクターとして、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の配列の下流にプロテアーゼ認識部位とマルチクローニングサイトを持つ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャムファルマシア製）を用いた（図８）。
ｐＧＥＸ−４Ｔ−３をＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ社製）とＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ社製）で切断して得られる大断片と上記ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅ２−３−１をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断して得た約７００ｂｐの断片を連結し、発現プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３−Ｅ２−３−１を構築した。
同様に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断して得られる大断片と上記ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅ２−３−２をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断して得た約７００ｂｐの断片を連結し、発現プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３−Ｅ２−３−２も構築した。
（１２）発現プラスミドを用いた大腸菌の形質転換体の作製と培養
コンピテントセル法により、上記のｐＧＥＸ−４Ｔ−３−Ｅ２−３−１を大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に導入し、形質転換体ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−Ｅ２−３−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７５）を得た（図８）。
また、同様に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−Ｅ２−３−２を大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に導入し、形質転換体ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−Ｅ２−３−２を得た。
得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で振とう培養した。培地にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して生産誘導するとＧＳＴとＥ２−３−１の融合蛋白質（以下、当該融合蛋白質をＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｐという）、並びにＧＳＴとＥ２−３−２の融合蛋白質（以下、当該蛋白質をＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｎという）が菌体内に蓄積した。
（１３）蛋白質の単離（精製）
上記のようにして形質転換体を培養し、菌体を遠心分離によって集めた後、超音波破砕した。遠心によって回収した上澄をグルタチオンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（アマシャムファルマシア製）に流し、ＧＳＴ融合蛋白質をカラムに吸着させた。カラムを洗浄後、還元型グルタチオンを含む溶出Ｂｕｆｆｅｒで、融合蛋白質を溶出し、２種のＥ２−３融合蛋白質試料（ＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｐ、ＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｎ）の精製物を得た。
融合蛋白質試料２種をＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（アマシャムファルマシア製）に流し、還元型グルタチオンを除去し、再度グルタチオンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着させた。カラムを洗浄後、トロンビンを含むＢｕｆｆｅｒでカラムを満たし、室温で２時間プロテアーゼ処理を行って、ＧＳＴタグを融合蛋白質から切り離した。ＧＳＴタグを除いた組換えＥ２−３−Ａｓｐ及びＥ２−３−Ａｓｎをカラムから溶出させ、更に、この溶出液にＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｂを加え混合し、遠心分離することによって、溶出液中のトロンビンを除き、２種の組換えＥ２−３試料（ＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｐ、ＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｎ）を得た。
（１４）組換え蛋白質の催涙成分生成酵素活性
融合蛋白質試料であるＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｐ、ＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｎ並びに、ＧＳＴタグを取り除いた組換えＥ２−３試料である、ＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｐ、ＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｎの４試料について催涙成分生成酵素活性を測定した。
その結果、融合蛋白質試料であるＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｐ及びＧＳＴ−Ｅ２−３−Ａｓｎでは、催涙成分生成酵素活性が検出された。一方、Ｅ２−３遺伝子を導入しなかった発現プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔで作製した形質転換体（ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ／ｐＧＥＸ−４Ｔ−ＧＳＴ）を培養し、グルタチオンセファロースカラム処理をしても催涙成分生成酵素活性は検出されなかった。また、試料の代わりにリン酸Ｂｕｆｆｅｒを使ったＢｌａｎｋでも、催涙成分生成酵素活性が無かった。図９にグルタチオンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムからの溶出液を５０００倍に希釈した試料で行った活性測定結果を示す。
以上の結果から、Ｅ２−３のＮ末端に、ＧＳＴ（分子量約２７０００）のような大きな蛋白質が結合した融合蛋白質でも、催涙成分生成酵素活性を有することが確認できた。
また、ＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｐ及びＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｎにも催涙成分生成酵素活性が検出されたので、ブラッドフォード法で蛋白質を定量し、比活性を算出した。
その結果、ＲＣ−Ｅ２−３−ＡｓｐとＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｎの比活性には、差が無いことがわかった。また、天然のＥ２−３と組換えで得たＥ２−３の比活性も同レベルであることがわかった。
試料名                    比活性（ａｒｅａ／ｍｇ）
ＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｐ              ４．４×１０8
ＲＣ−Ｅ２−３−Ａｓｎ              ４．１×１０8
天然体  Ｅ２−３                    ２．５×１０8
産業上の利用可能性
本発明は、タマネギを破砕又は切断した時に発生する催涙成分を生成させる活性を有する催涙成分生成酵素のアイソザイム、その蛋白質又はポリペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ等に係り、本発明によれば、１）従来方法では精製することが困難であったＥ２酵素の３種のアイソザイム（Ｅ２−１、Ｅ２−２、Ｅ２−３）を単離し、提供することができる、２）これらのアイソザイムのアミノ酸配列を提供することができる、３）これらのアイソザイムをコードする塩基配列を提供することができる、４）上記アミノ酸配列及びこれをコードするＤＮＡは、例えば、破砕又は切断時に発生する催涙成分量を低減させたタマネギ品種の開発において、交配に供する材料を選抜する指標などとして有用である、５）上記ＤＮＡから得られる情報は、当該酵素の発現量を抑制するために必要なアンチセンスヌクレオチドの設計に有用である、６）催涙成分生成酵素を遺伝子組換え技術により効率的に作り出すことが可能となる、７）涙欠乏症（ドライアイ）などの治療に役立つ催涙成分を効率的に生産することを実現化できる、という格別の効果を奏する。
寄託された微生物への言及
寄託機関の名称及びあて名：独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センタ−（あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
寄託した日付：２００１年７月２５日
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７５
微生物の表示：Ｅ２−３−１
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｍｏｎｏ  Ｐでの溶出パターンを示す。
図２は、アイソザイムの至適ｐＨを示す。
図３は、アイソザイムの至適温度を示す。
図４は、７３７塩基から成る全長の塩基配列及びＥ２のアミノ酸配列を示す。
図５は、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切り出された６７３塩基から成るＥ２−３−１の塩基及び１６０個のアミノ酸配列を示す。
図６は、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切り出された６７３塩基から成るＥ２−３−２の塩基及び１６０個のアミノ酸配列を示す。
図７は、Ｅ２−３−１及びＥ２−３−２のｃＤＮＡの作製及びサブクローニングの手順を示す。
図８は、発現プラスミドの構築と形質転換体の作製手順を示す。  図９は、グルタチオンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムからの溶出液を５０００倍に希釈した試料で行った活性測定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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