(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）総RNA又は核内RNAからランダムプライマーを用いた逆転写反応によりcDNAを合成するステップ、
（ｂ）ランダムプライマー、及び等温で鎖置換増幅を行うφ29DNAポリメラーゼ及びBstポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼを使用して約3Kb以上の核内RNA（一次転写産物）由来のcDNAを選択的に増幅するステップ、
（ｃ）増幅したcDNAに存在する遺伝子多型を検出するステップ、
（ｄ）ゲノムDNAの遺伝子多型がヘテロ接合型であるゲノム上の位置の各アレルからのcDNAの発現量を、該遺伝子多型に基づいて比較するステップ、
（ｅ）各アレルからのcDNAの発現量が有意に異なる場合に、比較に使用した遺伝子多型を選択するステップ、
を含む、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型の検索方法。
【請求項２】
DNAポリメラーゼがφ29DNAポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップ（c）及び（d）が、増幅したcDNAを標識し、遺伝子多型特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションを行い、その反応に基づいて各アレルからの発現量を比較することを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子多型が一塩基多型（SNP）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により検索された遺伝子多型を用いて、遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、表現型に関与する遺伝子多型の検索方法。
【請求項６】
表現型が、疾患の病態及び重症度、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、食品に対する応答性、化学物質に対する応答性、並びに環境因子に対する応答性からなる群より選択されるものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により検索された遺伝子多型を用いて、遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、遺伝子多型に関与する表現型の検索方法。
【請求項８】
表現型が、疾患の病態及び重症度、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、食品に対する応答性、化学物質に対する応答性、並びに環境因子に対する応答性からなる群より選択されるものである、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型の検索方法、及び表現型に関与する遺伝子多型の検索方法に関する。
【背景技術】  ゲノムの同じ位置にある同じ遺伝子であっても、それが異なるアレル上にある場合にその遺伝子発現量に差が見られる現象は、近年報告されている比較的新しい概念である（非特許文献１：Ｋｎｉｇｈｔ  ＪＣ．Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｍａｒ；２０（３）：１１３−６．ＰＭＩＤ：１５０４９３００、２００４年）。
アレル間で異なる発現を示す遺伝子というのは大きく分けて刷り込みを受ける遺伝子（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｇｅｎｅ）と刷り込みを受けない遺伝子（ｎｏｎ−ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｇｅｎｅ）の２種類がある。前者は、刷り込み（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）といって、ある細胞若しくは組織において、両親から片アレルずつ受け継いだ場合にどちらか一方が生理的にメチル化などの不活化を受けて発現が抑制されるという現象である。後者、すなわち刷り込みを受けない遺伝子（ｎｏｎ−ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｇｅｎｅ）においても、アレル間で異なる発現差が見られる場合がある。これは、遺伝子内若しくはそれに近接しているアレル間のゲノムの多型が、近傍の遺伝子の発現を調節するシス作用領域（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として働き、アレル間の遺伝子発現量の差を生み出すと考えられている。後者に見られる、ゲノムＤＮＡの配列の違いに起因するアレルごとの発現の変化は、世代を超えて引き継がれる性質と考えられ、個体間の遺伝子発現量の差、ひいては個人の体質の差、病態とそのリスク、また薬剤の応答性の違いに影響することが考えられる。
アレル間の遺伝子発現量の差を測定するには、同一細胞内において、すなわち同一環境条件下において測定するのが最も正確である。またアレル間の遺伝子発現量の差を測定する際に、あるＲＮＡがどちらのアレル由来であるかを同定できることが重要である。そのためには、アレルを区別できる多型（ＳＮＰ等）が、遺伝子の転写産物であるＲＮＡの配列上にも存在することが必要であり、それを測定することにより可能となる。このＲＮＡ上の多型（ＳＮＰ）を用いてアレル間の発現量の差を測るという報告はこれまでにいくつかある（非特許文献２〜４：Ｃｏｗｌｅｓ  ＣＲ，Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ＪＮ，Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  Ｄ，Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｏｖ；３２（３）：４３２−７．ＰＭＩＤ：１２４１０２３３、２００２年；Ｙａｎ  Ｈ，Ｙｕａｎ  Ｗ，Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ＶＥ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ．Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｕｇ  １６；２９７（５５８４）：１１４３．ＰＭＩＤ：１２１８３６２０、２００２年；Ｂｒａｙ  ＮＪ，Ｂｕｃｋｌａｎｄ  ＰＲ，Ｏｗｅｎ  ＭＪ，Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ  ＭＣ．Ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００３  Ｊｕｌ；１１３（２）：１４９−５３．Ｅｐｕｂ  Ｍａｙ  ０１．ＰＭＩＤ：１２７２８３１１、２００３年）。
これらの報告はいずれもＲＴ−ＰＣＲ法とダイレクト・シークエンス反応若しくは一塩基伸張反応を組み合わせたもの、すなわち、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、増幅した後、任意に選択した多型を個々にタイピングするものであり、多くの遺伝子を同時に測定できる技術ではない。
ＳＮＰタイピング用マイクロアレイを用いて多くの遺伝子を網羅的に解析した報告はこれまでに一報ある（Ｌｏ  ＨＳ，Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｈｕ  Ｙ，Ｙａｎｇ  ＨＨ，Ｇｅｒｅ  Ｓ，Ｂｕｅｔｏｗ  ＫＨ，Ｌｅｅ  ＭＰ．Ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．Ａｕｇ；１３（８）：１８５５−６２．ＰＭＩＤ：１２９０２３７９、２００３年）。ここではｐｏｌｙＴプライマーを用いた通常のＲＴ法によりｐｏｌｙＡのついたｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、通常のゲノムＤＮＡタイピングと同様のプロトコールで多数の特異的プライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ法によりサンプルを調製し、アレイにハイブリさせてそのシグナル比でアレルごとに異なるｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現量比を測定している。しかしながら、ｐｏｌｙＡのついた成熟型ｍＲＮＡでは、スプライシングをうけたあとのエキソンのみの配列であり、これは長さが短く評価できる多型（ＳＮＰ）も少ない。そのため、利用可能な多型（ＳＮＰ）が限定されてしまい、アレル毎に発現量に差がある遺伝子を見出すことは困難である。
一方、遺伝子の多型と特定の形質発現（例えば疾患、薬剤の効き方の違い）との関連性も着目されている。しかし、特定の遺伝子多型と形質発現との関連性を調べるには、例えばゲノム上のＳＮＰの場合には多数のＳＮＰ（２００４年１０月に報告されたＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ  ｂｕｉｌｄ１２３では約１０００万）を個々の形質ごとに調べる必要があり、すべてについて検討するのは困難である。
従って、アレル間で形質発現が異なる遺伝子を迅速かつ効率的に選択し、そのように選択された遺伝子の多型と形質発現との関連性を調べることができれば、疾患の原因や有効な治療法などを検討することができると考えられる。
【発明の開示】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型を迅速かつ効率的に検索する方法を提供することを目的とする。また本発明は、当該方法により検索された遺伝子多型を利用して、表現型に関与する遺伝子多型を検索する方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、核内ＲＮＡ上に存在する遺伝子多型を利用することによって、効率的にアレル間で発現量が異なる遺伝子を見出すことができると考え、そのための手法において、核内ＲＮＡを選択的に増幅することができるＤＮＡポリメラーゼを選択したところ、実際にアレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型（ＳＮＰ）を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）以下のステップを含む、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型の検索方法。
（ａ）総ＲＮＡ又は核内ＲＮＡからランダムプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成するステップ、
（ｂ）ランダムプライマー、及び等温で反応する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用して長い核内ＲＮＡ（一次転写産物）由来のｃＤＮＡを選択的に増幅するステップ、
（ｃ）増幅したｃＤＮＡに存在する遺伝子多型を検出するステップ、
（ｄ）ゲノムＤＮＡの遺伝子多型がヘテロ接合型であるゲノム上の位置の各アレルからのｃＤＮＡの発現量を、該遺伝子多型に基づいて比較するステップ、
（ｅ）各アレルからのｃＤＮＡの発現量が有意に異なる場合に、比較に使用した遺伝子多型を選択するステップ
上記検索方法において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。
またステップ（ｃ）及び（ｄ）は、増幅したｃＤＮＡを標識し、遺伝子多型特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションを行い、その反応に基づいて各アレルからの発現量を比較を比較することを含むことが好ましい。
上記検索方法において、遺伝子多型としては一塩基多型（ＳＮＰ）を用いることができる。
（２）上記検索方法により検索された遺伝子多型を用いて、遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、表現型に関与する遺伝子多型の検索方法。
上記検索方法において、表現型としては、疾患の病態及び重症度、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、食品に対する応答性、化学物質に対する応答性、並びに環境因子に対する応答性などが挙げられる。
（３）上記検索方法により検索された遺伝子多型を用いて、遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることを含む、遺伝子多型に関与する表現型の検索方法。
上記検索方法において、表現型としては、疾患の病態及び重症度、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、食品に対する応答性、化学物質に対する応答性、並びに環境因子に対する応答性などが挙げられる。
本発明により、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型を検索するための迅速かつ効率的な方法が提供される。また、そのようにして検索された遺伝子多型は、アレル間の発現量を識別することができるため、その遺伝子が関与する表現型について解析するための有効な手段となりうる。さらに、そのように検索された遺伝子多型と表現型（疾患リスクや薬剤応答性）との関係を見出すことができれば、疾患の原因や有効な治療法などを検討することができると考えられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅により得られたｃＤＮＡの電気泳動写真である。
図２は、リンパ球ＢＬ１３９５におけるｃＤＮＡとゲノムとのシグナル比の度数分布と、その遺伝子多型（プローブセット）の存在するゲノム上の遺伝子との位置関係を表す図である。
図３は、リンパ球ＢＬ２１２２におけるｃＤＮＡとゲノムとのシグナル比の度数分布と、その遺伝子多型（プローブセット）の存在するゲノム上の遺伝子との位置関係を表す図である。
図４は、発現解析用アレイＵ１３３ｐｌｕｓ２と１００Ｋアレイ（ＸｂａＩ  ５０Ｋ）でのｃＤＮＡ／ゲノムのシグナル比の比較を示す図である。
図５は、ＰＰＡＲγ遺伝子上のＳＮＰの位置を示す図である。
図６は、ダイレクト・シーケンス法を用いたＳＮＰの確認の概要を示す図である。
図７は、日本人３０人の抹消血リンパ球のＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量と遺伝子多型のタイピングとの相関を示す図である。
図８Ａ及びＢは、日本人３０人の抹消血リンパ球のＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量と遺伝子多型のタイピングの度数分布（Ａ）、及びハプロタイプＭとｍのアレルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年１２月１７日に出願された日本国特許出願第２００４−３６６６７１号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
１．アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型の検索
本発明は、アレル間で発現量が異なる遺伝子について研究するための手法を提供するものである。ここで、「アレル間で発現量が異なる遺伝子」とは、一方のアレルからの遺伝子発現量ともう一方のアレルからの遺伝子発現量が異なる遺伝子を指す。各アレルからの遺伝子の発現は、特定の遺伝子多型を指標として区別することができるが、全ての遺伝子多型がアレル間の発現量の違いを区別できるものではない。そこで、本発明においては、そのようなアレル間での発現量の違いを判定することができる遺伝子多型を、迅速かつ効率的に検索する手法を提供する。
（１）核内ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成と増幅
本方法においては、核内ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ここで「核内ＲＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡから転写された後、スプライシングを受けておらず、そのため細胞質には移行せず、まだ核内に存在している一次転写産物（ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）をいう。すなわち、核内ＲＮＡは、ゲノム上のエキソン及びイントロンの両方を含み、長い鎖長を有するものが多い（例えば、２００４年４月に報告されたＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ３４（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）の配列上にある２１８０４個の参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）では平均長８５，２８４ｂｐ、中央値２２，８５５ｂｐであり、５０００ｂｐより長いものは全体の約８４％を占める）。
アレル間の発現量の差を測定するには、遺伝子の転写産物であるＲＮＡ上に遺伝子多型が存在することが必要である。本発明者は、核内ＲＮＡはスプライシングを受けていないため鎖長が長く、アレル間の発現量が異なる遺伝子を識別することができる遺伝子多型も多く含まれると考えた。例えば、２００４年４月に報告されたＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ３４（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）の配列上にある２１８０４個の参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）では、ｍＲＮＡの平均長２，７５７ｂｐ、中央値２，３１６ｂｐであるのに対し、そのイントロンを含めたゲノム上の長さは平均長８５，２８４ｂｐ、中央値２２，８５５ｂｐであり、遺伝子多型の密度を考えなくても約４０倍程度の領域が評価できることになる。
核内ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためには、試料から核内ＲＮＡのみを抽出し、その核内ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法と、試料から総ＲＮＡを抽出し、総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、長い核内ＲＮＡに由来するｃＤＮＡのみを増幅する方法の２つの方法を使用することができる。
１つの方法においては、まず試料から核画分を抽出する。試料は、本方法を用いてアレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型を検索しようとするものに由来する試料であれば特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、微生物（真菌、細菌など）由来の試料、市販の細胞株、寄託されている細胞株などを用いることができる。試料は、哺乳動物、特にヒトに由来するものが好ましい。また試料の形態も特に限定されるものではなく、例えばヒト由来の試料の場合には、血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、腹腔液等の体液、細胞、組織等の形態の試料を使用することができる。
核画分の抽出は、当業者に公知の方法を使用して行うことができる。例えば、細胞をホモジナイザーによって破砕し、分画遠心法若しくは密度勾配遠心法によって核を分離することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．８  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｔｉｓｓｕｅ／ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５７７−３参照）。
次に、上記のように調製した核内ＲＮＡから、ランダムプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。ランダムプライマーの使用によって、試料中に存在する、あらゆる配列のＲＮＡ（核内ＲＮＡ）からｃＤＮＡを合成することができる。
続いて、逆転写したｃＤＮＡをランダムプライマーを用いて増幅する。核内ＲＮＡはスプライシングを受けていないため鎖長が長く、一般的に増幅に使用されるＤＮＡポリメラーゼでは増幅することができない。そこで、本方法においては、等温度の反応条件（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を行うＤＮＡポリメラーゼを使用する。上記の性質を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品名Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ）が挙げられる。このφ２９ＤＮＡポリメラーゼは、その増幅反応が非常に安定しているため、逆転写反応により合成したｃＤＮＡを精製過程を行うことなくそのままφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅反応に利用可能であり、またμｇオーダーの収量が得られることから、微量サンプルの精製による損失を気にすることなく臨床検体などのきわめて微量なサンプルからも増幅することができるため、本方法の実施に特に好ましい。その他、上記性質を有するものとしては、Ｂｓｔポリメラーゼも知られており、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂから発売されている（Ｌａｇｅ  ＪＭ，Ｌｅａｍｏｎ  ＪＨ，Ｐｅｊｏｖｉｃ  Ｔ，Ｈａｍａｎｎ  Ｓ，Ｌａｃｅｙ  Ｍ，Ｄｉｌｌｏｎ  Ｄ，Ｓｅｇｒａｖｅｓ  Ｒ，Ｖｏｓｓｂｒｉｎｃｋ  Ｂ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ，Ｐｉｎｋｅｌ  Ｄ，Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＤＧ，Ｃｏｓｔａ  Ｊ，Ｌｉｚａｒｄｉ  ＰＭ．Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｒａｙ−ＣＧＨ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００３  Ｆｅｂ；１３（２）：２９４−３０７．ＰＭＩＤ：１２５６６４０８）。
また、このようなＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを増幅する際にＤＮＡ断片の末端において反応を停止するため、末端付近は増幅率が著しく低下することとなるが、短いＤＮＡ断片の増幅の場合には、両末端間の距離が近いために断片全体の増幅率が低下し、結果として長いＤＮＡ断片、すなわちスプライシングを受けていない核内ＲＮＡが選択的に増幅されることとなる（Ｌａｇｅ  ＪＭ，Ｌｅａｍｏｎ  ＪＨ，Ｐｅｊｏｖｉｃ  Ｔ，Ｈａｍａｎｎ  Ｓ，Ｌａｃｅｙ  Ｍ，Ｄｉｌｌｏｎ  Ｄ，Ｓｅｇｒａｖｅｓ  Ｒ，Ｖｏｓｓｂｒｉｎｃｋ  Ｂ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ，Ｐｉｎｋｅｌ  Ｄ，Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＤＧ，Ｃｏｓｔａ  Ｊ，Ｌｉｚａｒｄｉ  ＰＭ．Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｒａｙ−ＣＧＨ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００３  Ｆｅｂ；１３（２）：２９４−３０７．ＰＭＩＤ：１２５６６４０８；Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ）。
従って、核内ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための別の方法として、試料から総ＲＮＡ（核内ＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む）を調製し、多様なＲＮＡ種からランダムプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、その後、鎖長の長いｃＤＮＡ（すなわち、長い核内ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）を選択的に増幅しうる上記のＤＮＡポリメラーゼ（例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて増幅することによって、核内ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを選択的に合成し増幅することができる。この核内ＲＮＡからのｃＤＮＡの増幅は、核内ＲＮＡのみを抽出する手順を省略することができるため、本方法の実施において好ましい。総ＲＮＡの抽出は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えばグアニジン／セシウム法、ＡＧＰＣ（酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム）法などを用いることができる。
（２）遺伝子多型とアレル発現量
続いて、各アレルに由来する遺伝子（増幅ｃＤＮＡ）の発現量を比較する。ここで、発現量の比較は、ヘテロ接合型のアレル間で行う。遺伝子多型がヘテロ接合型のアレルとは、ゲノムＤＮＡにおける２つのアレルにおいて各アレルが異なる遺伝子多型を有することを意味する。従って、ヘテロ接合型アレルを有する場合には、各アレルに由来する増幅ｃＤＮＡを区別することができる。そして、上記発現量に有意差があれば、その遺伝子多型はアレル間で発現量の異なる遺伝子を判定するための指標として選択することができる。
ここで、「遺伝子多型」又は「多型」とは、個体間における形質や形態の多様性を引き起こす遺伝子の差異をいい、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）、及びハプロタイプなどが含まれる。ＳＮＰとは、ある特定の遺伝子又は遺伝子群における一塩基の核酸の変異をいう。このようなＳＮＰは、個体間における形質や形態の多様性を引き起こすことがあることが知られている。また、ハプロタイプとは、連続した遺伝子領域又は遺伝子群中の複数箇所の変異部位におけるアレルの種類と数とによって表される多型を示す。ハプロタイプにおける組換え頻度は通常の組換え頻度よりも低く、遺伝的に保存される傾向がある。従って、多型と表現型との関連性を調べる場合には、個々の変異との関連性だけではなく、特定のハプロタイプとの関連性を調べることも重要であると考えられている。その他、遺伝子多型には、挿入／欠失型多型、繰返し配列の繰返し回数の違いによる多型、制限断片長多型などが含まれる。本方法においては、多数のＳＮＰ検出手法が存在すること、アレル間の区別を１塩基の違いで容易に行うことができることなどから、一塩基多型（ＳＮＰ）を利用することが好ましい。
利用可能な遺伝子多型は特に限定されるものではなく、遺伝子多型情報は公共のデータベースなどから容易に入手することができる。例えば、ヒト、マウスなどのＳＮＰ及びハプロタイプの情報は、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）より、またヒトＳＮＰの情報は、ＪＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊａ．ｈｔｍｌ）より入手することができる。その他の遺伝子多型情報は、当業者であれば容易に入手することができる。
遺伝子多型の検出及び遺伝子多型を含むアレルからの発現量の測定は、当技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。
例えば、遺伝子多型の検出及びアレルからの遺伝子発現量の測定は、一の遺伝子多型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識することができる。プローブは、遺伝子多型部位を含み、増幅したｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするものである限りいかなるものでもよく、具体的なプローブの設計は当技術分野で公知である。また、ハイブリダイゼーションの条件も、遺伝子多型を区別するのに十分な条件であればよく、例えば一の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件であり、このような条件は当業者に公知である。
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイ）として用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の遺伝子多型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の遺伝子多型に対応するプローブが固定されていてもよい。このようなＤＮＡチップを用いた遺伝子多型の検出は、例えば「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、村松正明及び那波宏之監修、秀潤社、２０００年、第１０章などに記載されている。
ＤＮＡチップを用いた遺伝子多型の検出の具体的な例として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  ａｒｒａｙを用いる方法について説明する。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  ａｒｒａｙは、２枚のアレイを含み、ゲノム上に存在する１００，０００個を超えるＳＮＰの検出を行うことができるアレイである。使用方法は、試料（ゲノム、ｃＤＮＡなど）を制限酵素（ＸｂａＩ若しくはＨｉｎｄＩＩＩ）で切断し、アダプターをつけて、そのアダプターに特異的な１種類のプライマー（ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩについてそれぞれ１種類ずつ）を用いてＰＣＲ反応により増幅し、ラベリングを行う。２枚のアレイは各ＳＮＰのアレルごとに相補的になるように設計されており、ハイブリダイゼーション後、シグナルに基づいて試料のＳＮＰを判定し、また各アレルの発現量をシグナル強度又はシグナル比に基づいて比較することができる。このＤＮＡチップの詳細については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｒｒａｙｓ／ｓｐｅｃｉｆｉｃ／１００ｋ．及びｈｔｍｌｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／Ｍａｐｐｉｎｇ＿１００Ｋ．ｐｄｆで公開されている製品情報及びデータシートを参照されたい。
また、遺伝子多型は、上述した以外にも、当業者に公知のあらゆる方法によって検出することができる。そのような方法としては、遺伝子多型に特異的なプライマーを用いる方法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、直接配列決定法、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法（ＴａｑＭａｎ法）等を用いることができる。
本方法においては、簡便かつ迅速に、できる限り多くの遺伝子多型の存在について検出することができるＤＮＡチップ（マイクロアレイ）を使用することが好ましい。
上述の通り、遺伝子多型の違いに基づいて、アレルごとの遺伝子発現量（シグナル強度）を調べ、各アレルからの遺伝子の発現量が有意に異なる場合に、その遺伝子多型を選択する。具体的には、発現量の低いアレルに対する発現量の高いアレルの発現量の比率を求め、その比率が少なくとも１．３、好ましくは少なくとも１．５である遺伝子多型を選択する。ここで、比率が１とは、両アレルからの遺伝子の発現量がほぼ等しいことを意味する。
上述のようにして、遺伝子多型を利用して各アレルの発現量を比較し、その結果、発現量に差異のある遺伝子多型は、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定するための遺伝子多型として選択することができる。このようにして選択した遺伝子多型は、以後、その遺伝子多型を検出することのみで、ある検体が発現量の多いアレルを有するか否かなどを調べることが可能となる。また、後述するように、アレル間で発現量が異なる遺伝子は、特定の表現型と関係する可能性があるため、このようにして選択された遺伝子多型を利用して、遺伝子の多型と表現型との関係を明らかにすることができる。
２．表現型に関与する遺伝子多型の検索方法
遺伝子多型は、個体間における形質や形態の多様性を引き起こす遺伝子の差異であるため、遺伝子多型と表現型とは何らかの関係を有する可能性がある。しかしながら、遺伝子多型は、ゲノム上に存在するＳＮＰだけでも少なくとも約１０００万（２００４年１０月に報告されたＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ  ｂｕｉｌｄ１２３）もあり、このような膨大な数のＳＮＰの中から特定の表現型に関与するものを選択することは困難である。一方、アレル間で発現量が異なる遺伝子は、特定の表現型と関係する可能性がある。従って、上記方法により検索された、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型は、他の遺伝子多型よりも表現型と関係している可能性が高いと考えられる。
そこで、本発明に係る表現型に関与する遺伝子多型の検索方法においては、上記方法により検索された遺伝子多型を用いて、遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることを特徴とする。ここで、表現型としては、疾患の存在（病態及び重症度）、疾患の発症リスク、薬剤に対する応答性、食品に対する応答性、化学物質に対する応答性、環境因子（例えば紫外線、温度等）などが挙げられる。
具体的には、本方法は、当技術分野で周知のアソシエーション（関連）法、罹患同胞対法などに基づいて行うことができる。例えば、アソシエーション法においては、特定の表現型を示す被験体と示さない被験体を用いて、上記検索方法において検索した遺伝子多型の出現頻度、又は遺伝子の発現量との関係を調べる。例えば、特定の遺伝子多型を有している頻度が、特定の表現型を示す被験体において有意に高い場合には、その遺伝子多型の差が、表現型に関与する遺伝子の発現量の量的調節に影響している、又は、遺伝子多型の遺伝暗号の変化によってアミノ酸に変化が生じ、タンパク質の性質が変わったために、それが表現型の発現に影響している、などと判断することができる。また、罹患同胞対法においては、同じ表現型（例えば疾患）を有する家系（兄弟姉妹）を比較して、表現型関連遺伝子の存在する染色体領域を特定する方法である。これらの方法は、例えば「先端のゲノム医学を知る」、中村祐輔著、羊土社、２０００年、第１章などに記載されている。
例えば、上記方法により検索された遺伝子多型を含む遺伝子は、同一個体内のアレル間で発現量に差があるので、そのアレルのタイプ（すなわち遺伝子多型の種類）により個体間での発現量が異なることが推測される。従って、多数の個体における遺伝子多型と発現量を測定し、個体間の発現量が遺伝子多型情報と相関することを確認することができる。
本方法により、表現型に関与する遺伝子多型を検索することができる。このように検索された遺伝子多型は、疾患の発症や発症リスクについて診断したり、薬剤の応答性を予め判定するために有用である。
また、本発明においては、上記方法により検索された遺伝子多型を用いて、遺伝子多型又は遺伝子の発現量と表現型との関係を調べることによって、遺伝子多型に関与する表現型を検索することもできる。
例えば、ある遺伝子によりコードされるタンパク質が有する「固有の性質」（例えば、ＰＰＡＲγが脂質代謝等に関与していることなど）により、その遺伝子上の遺伝子多型の違いにより表現型に違いがあることが推測される（例えば、ＰＰＡＲγについて、糖尿病などの脂質代謝に関わる表現型に関与することが推測される）。従って、実際に遺伝子多型と表現型とを評価（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）することにより（例えば、種々の個体における糖尿病薬アクトスの反応性を、ＰＰＡＲγの遺伝子多型のタイピング結果と比較してみる）、実際にその関与を確認することができる。
本発明者は、上述した方法を実施したところ、実際に、ヒトのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ又はＰＰＡＲＧ）遺伝子がアレル間で発現量が異なることを見出し、また、各アレルからの発現量の違いを判定することができる遺伝子多型を見つけることができた。
【実施例】  以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例においては、核内ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成及び増幅を行った。
ＥＢウイルスにて株化したリンパ球ＢＬ１３９５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９５７）及びＢＬ２１２２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９６７）の総ＲＮＡそれぞれ１μｇをＤＮＡａｓｅ処理をした後に逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ  ｅｎｚｙｍｅ）を用いて、添付プロトコールどおり逆転写して１本鎖ｃＤＮＡを作製した。得られた反応液２０μｌより１μｌを精製なしに、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより発売されている商品名Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉのプロトコールどおりのランダムプライマー及びｐｈｉ２９酵素の入った反応溶液に添加し、３０℃にて１６時間の反応を行い、それぞれ２．３４μｇ及び２．２７μｇの収量のｃＤＮＡを得た。
このようにして増幅したｃＤＮＡの電気泳動を行った結果を図１に示す。図１のレーン１及び２は、上述の通りｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製したｃＤＮＡを表す。
図１に示すように、１０Ｋｂ以上のところから約８Ｋｂのあたりを中心に約３Ｋｂまでスメアを引く像が得られた（図１のレーン１〜２）。これは、通常のｍＲＮＡから合成した場合のｃＤＮＡ長さの中央値が２，３１６ｂｐであることを考えると、長いｃＤＮＡだけが選択的に増幅されていることが示唆された。すなわち、ｐｈｉ２９酵素を用いることにより、鎖長の長い核内ＲＮＡからのｃＤＮＡを選択的に増幅できることが示された。
〔実施例２〕
本実施例においては、実施例１において調製した核内ＲＮＡからのｃＤＮＡを用いて、ＳＮＰのタイピングと遺伝子発現量について実験を行った。
（１）ｐｈｉ２９酵素を用いた核内ＲＮＡからのｃＤＮＡ増幅の確認
最初に、実施例１で増幅したｃＤＮＡを用いて、１００Ｋアレイのプロトコール（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）にしたがって２５０ｎｇから反応をスタートした。具体的には、実施例１に記載のようにｐｈｉ２９で増幅したｃＤＮＡと、同様にｐｈｉ２９で増幅したゲノムＤＮＡとを、通常の１００Ｋのプロトコールにしたがって増幅した後、そのシグナル強度の比（ｃＤＮＡのシグナル強度／ゲノムＤＮＡのシグナル強度）を取り、その度数分布を調べた。このようにしてシグナル強度の比を求めることにより、配列の差異が生み出す二次構造の差によってｐｈｉ２９によって増えやすい配列と増えにくい配列がある（増幅のバイアス）が、ｃＤＮＡのシグナル値をｐｈｉ２９で増幅したゲノムのシグナル値で割ることによって、こうした増幅のバイアスを除くことができる。
その結果、図２及び３に示すように、シグナル比の低いところにはノイズと思われる正規分布曲線に近い形があらわれ、そこでは遺伝子のない領域（図２及び３における棒グラフの薄いグレー）に存在する遺伝子多型に基づくシグナル（プローブセット）が多かった。一方、図２及び３の右側に上述の正規分布曲線から飛び出すようにシグナル比の強い部分が見られ（図２及び３中、矢印で示す部分）、そこでは遺伝子のある（ほとんどはイントロン由来の）領域に存在する遺伝子多型に基づくシグナル（プローブセット）が多かった。この度数分布の形及びプローブセットとゲノム上の遺伝子との位置関係から、このアッセイによって遺伝子（ｃＤＮＡ）由来のシグナルとノイズが分離出来ており、ｃＤＮＡとゲノムとのシグナル比の測定によって、シグナル比の高い部分を、発現遺伝子（主に核内ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）によるシグナルであると考えてよいことがわかった。
また通常の発現解析用アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０  ａｒｒａｙ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／ＨＧ＿ＤＳ．ｐｄｆ）を用いて通常のマイクロアレイで測定される遺伝子発現量と、上記のように解析したｃＤＮＡとゲノムＤＮＡのシグナル比に相関があるか確かめた。
具体的には、ＢＬ２１２２の総ＲＮＡを調製し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０  ａｒｒａｙを用いて通常のプロトコールどおりに解析した。約５４０００個のプローブセットの平均シグナル値を１００となるように全体を平均化した後、シグナルが高く発現量が高いと思われる遺伝子群（スコア１００以上）とシグナルが低く発現量が低いと思われる遺伝子群（１０以下）の２群について、その遺伝子のイントロンを含めたゲノム上領域内にある１００Ｋアレイ（ここではＸｂａＩ  ５０Ｋアレイ）のＳＮＰのプローブにおいて、上述の情報によって得られたｃＤＮＡ／ゲノムシグナル比を調べ、その頻度分布を見た。
その結果、図４のように発現の低い（Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０でスコア１０以下）ものは上記のノイズと思われる正規分布に近い形の部分にほとんどが入り、逆に発現の高い（Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０でスコア１００以上）ものは大部分が上記の右側のｃＤＮＡ由来のシグナルを捕らえられていると考えられる部分に入っていた。以上より、本実施例で測定したｃＤＮＡ／ゲノム比の値と実際の遺伝子発現量とには相関があり、ｐｈｉ２９により核内のスプライス前のイントロンを含む長い核内ＲＮＡをより選択に増幅できていると考えられた。
（２）アレル間における発現量の差異の検出
またＢＬ１３９５及びＢＬ２１２２（女性由来）において各２種類のアレル（Ａ，Ｂ）ごとに、上記（１）のようにｃＤＮＡとゲノムのシグナルの比を取ってアレルＡ及びアレルＢ由来のＲＮＡ（ｃＤＮＡ）量を測定し、さらにアレルＡとアレルＢの間で発現量の違いがどれだけあるのかを二つの比（アレルＡのｃＤＮＡ／ゲノム比とアレルＢのｃＤＮＡ／ゲノム比との比）をとった。ここで、比が１の場合には、両アレルの発現量が等しいといえる。その結果、生理的に刷り込みによる片側アレルの不活化が良く知られているＸ染色体においては、表１に示すように、他の常染色体（１．６９及び２．０１）に比較して統計的に有意にアレル間の発現差（４．２４及び５．０６）が見られた。
【表１】
0004111985.tif 000002
以上より、ｐｈｉ２９ポリメラーゼにより増幅されたｃＤＮＡにおいて、１００Ｋアレイ（５０Ｋ  ＸｂａＩアレイ）を試行してＳＮＰに基づいてアレルの発現量を調べることにより、アレル別の発現差を測定できることが確認された。
〔実施例３〕
本実施例においては、ＰＰＡＲＧ遺伝子のアレル間の発現差を調べた。
実施例２によってアレル間で発現差のあることが確認された遺伝子のうち、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ）を選択することができた。
１００Ｋアレイに含まれる５０Ｋ  ＸｂａＩアレイにはゲノム上のＰＰＡＲＧ遺伝子領域に合計７箇所のＳＮＰの位置にプローブセットが設計されている。実施例２で行ったリンパ球ＢＬ１３９５の解析では、上流に近い３００ｂｐ以内に近接したｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰデータベースＩＤ）の３つのＳＮＰがゲノムのタイピングで多型で（すなわち二つのアレルが区別可能で）あった。この３つのＳＮＰのＰＰＡＲＧ遺伝子上の位置を図５に示す。図５中、白抜きの星印が、ＰＰＡＲＧ遺伝子のアレル間の発現量の差異を判定することができるＳＮＰ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ  ＳＮＰ）である。
いずれの位置のＳＮＰについても両アレル間の発現比（アレルＡとアレルＢとのｃＤＮＡ／ゲノム比の比）は、表２に示すとおり４倍以上であった。
【表２】
0004111985.tif 000003
この３つのＳＮＰを含む領域をダイレクト・シーケンス法によりアレルの存在比を確認した。その概要は図６に示すが、例えばＢＬ１３９５のサンプルにおけるｒｓ１０５１０４１０の場合には、図のようにゲノムＤＮＡ（ｃ）においてはＡ／Ｃのヘテロであり、それはｐｈｉ２９で増幅されたゲノムＤＮＡにおいても変化はなかった。一方、ｐｈｉ２９で増幅されたｃＤＮＡ（ａ及びｂ）においてはアレルＡからのシグナルが低下しほぼアレルＣのみの波形になっている。すなわち、ゲノム上でｒｓ１０５１０４１０はＡ／Ｃのヘテロであるが、実際に発現される遺伝子においてはＣのアレルからの発現量が多いことがわかる。この結果は５０Ｋ  ＸｂａＩアレイの結果と一致していた。ＢＬ２１２２のリンパ球ではＰＰＡＲＧ遺伝子の発現は認められなかった。
またこの３つのＳＮＰについて、日本人３０人をダイレクト・シーケンス法によってタイピングし、抹消血リンパ球のＰＰＡＲＧ遺伝子の発現との相関を調べた。すなわち、上記３つのＳＮＰのタイプとＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量との関係について分析した。ＰＰＡＲＧ遺伝子の発現解析にはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社発現解析用アレイＣｏｄｅＬｉｎｋを通常のプロトコールどおりに使用し、各アレイの総プローブのシグナルを中央値が１となるように平均化した。
その結果、図７と図８Ａ（表と度数分布）に示すように、検体は、日本人３０人における存在頻度に応じて、ｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２においてそれぞれＣ型、Ａ型及びＡ型である存在頻度の低いアレル（ｍ）のホモ型、ｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２においてそれぞれＡ型、Ｇ型及びＧ型である存在頻度の高いアレル（Ｍ）のホモ型、並びにこれらのヘテロ型に分類することができた。存在頻度の低いアレルのホモ型（ｍｍ型とする。図７と図８Ａで網掛けで表示）ではそれ以外（ｍＭ及びＭＭ型とする）のものに比して発現値が高く（ｍｍの平均値１．５８に対しそれ以外０．８０）、特に発現の特に高い上位３検体のうち２検体でｍｍであった。
以上の結果から、これらのＳＮＰ（ハプロタイプ）の存在がＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量と相関し、個人のＰＰＡＲＧ活性、ＰＰＡＲＧとの関連が示唆される病気の診断、スクリーニング及びＰＰＡＲＧを標的とする薬剤の応答性を調べるためにこれらのＳＮＰタイピングが有効であることが示された。
またこれらの３０人の検体で３箇所のＳＮＰ（ｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２）においてメジャーアレルＭとマイナーアレルｍの組み合わせが全て一致すること（図７）より、３つのＳＮＰは完全に連鎖不均衡の状態にあってハプロタイプを形成し、図８Ｂに示すように二つのハプロタイプＭ及びｍが存在しハプロタイプｍがＰＰＡＲＧの発現量の高いほうであると考えられた（図７）。このハプロタイプ内及びそれと連鎖不均衡にある周辺のＳＮＰを調べることによっても上記の目的が達成できると考えられた。
以上から、本方法によって、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型を検索し、そのようにして検索された遺伝子多型は、遺伝子の発現量と関係し、そのため表現型にも影響を及ぼす可能性があることが示唆された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明により、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型を検索するための迅速かつ効率的な方法が提供される。また、そのようにして検索された遺伝子多型は、アレル間の発現量を識別することができるため、その遺伝子が関与する表現型について解析するための有効な手段となりうる。さらに、そのように検索された遺伝子多型と表現型（疾患リスクや薬剤応答性）との関係を見出すことができれば、疾患の原因や有効な治療法などを検討することができると考えられる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１〜３：ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの部分配列（配列番号３におけるｎはｇ又はｔを表わす）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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