(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＴウイルスの遺伝子型を分類する方法であって、ＴＴウイルスの1984nt〜1987ntに位置するMesI部位、2001nt〜2006ntに位置する第１のNdeI部位、2014nt〜2019ntに位置する第２のNdeI部位、2033nt〜2038ntに位置する第１のPstI部位、2066nt〜2069ntに位置するNalIII部位及び／又は2072nt〜2077ntに位置する第２のPstI部位の有無を調べ、
(1)  前記MesI部位、第２のNdeI部位及びNalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(2)  前記第２のNdeI部位及びNalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(3)  前記第１のPstI部位を有し、前記第２のPstI部位を有するか又は有さず、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(4)  前記MesI部位並びに第１及び第２のPstI部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(5)  前記NalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(6)  前記第１のNdeI部位並びに前記第１及び第２のPstI部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(7)  前記した制限酵素部位を１つも有さないもの
の７つの遺伝子型のいずれかに分類することを含む、ＴＴウイルスの遺伝子型分類方法。
【請求項２】
核酸増幅法−ＲＦＬＰ法により行なう請求項１記載の方法。
【請求項３】
検体を先ずNdeI及びPstIでそれぞれ消化してＲＦＬＰ法を行なう第１の工程と、該第１の工程により前記(3)又は(6)の遺伝子型に分類された場合にはそれで終了し、前記(1)又は(2)の遺伝子型に分類されることが判明した場合にはさらにMesIで消化してＲＦＬＰ法を行なう第２の工程と、前記第１の工程により前記(4)、(5)又は(7)の遺伝子型に分類されることが判明した場合にはさらにNalIII及びMseIでそれぞれ消化してＲＦＬＰ法を行なう第３の工程を有する請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＴウイルス( 以下、「ＴＴＶ」 ということがある）の遺伝子型分類方法に関する。本発明は、ＴＴＶの感染経路の解明や、病態の解明等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ＴＴＶは、輸血後肝炎を起こすウイルスとして、１９９７年、Nishizawa らによって発見された新たな肝炎ウイルスである(Okamoto,H., Nishizawa,T., Kato,N., Ukita,M., Ikeda,H., Iizuka,H., Miyakawa,Y. and Mayumi,M., “Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology", JOURNAL Hepatol. Res. 10, 1-16 (1998)) 。このウイルスは、エンベロープを持たないDNA ウイルスで、糞便中に排泄され経口感染を起こすことが示唆されその感染率は比較的高いことが予測される。
【０００３】
一般に、ウイルスは変異を比較的起こしやすい。遺伝子を検出することが本質的であるが、遺伝子を検出する場合重要となるのが、その配列情報である。なぜなら、変異の存在する部分に不適切なプライマーやプローブを設定すると一般に、検出率が低下する。したがって、正確な診断には、より多くの遺伝情報が必要であり、また、より適切なプライマーやプローブの設定と測定系の開発が必要とされる。
【０００４】
ウイルスを分類する場合、遺伝子の相同性％を用いる場合があるがこの方法は、正確でない。最近の、分子生物学の進歩によって、いろいろな生物種間で遺伝子配列を比較分類する場合、塩基置換数から、系統樹を用いて系統的にウイルスを分類することが可能となった。しかしながら、そのためには、それぞれの配列を比較しalignment を作製し、配列間の塩基置換数を正確に推定することが必要である。塩基配列を比較し塩基置換数を推定する場合、一番大切なことは、多重置換が生じることである。たとえば、２つの遺伝子配列X 、Z のある対応する配列がG とT であったとすると、共通祖先の塩基、たとえば、A から、G(X)→ C→T(Z)となったのか、A から、G(X)→A →C →T(Z)という順番に多重置換したあとにT(Z)となったのか不明確である。この多重置換は相同性％のみの解析では補正できない。多重置換を補正する方法は現在は6-paramater 法が最も正確である。さらに、Bootstrap 解析を行うことで最も正確な系統樹を作製でき、正確なウイルスの分類を可能とする。ウイルスの分類は感染経路の解明や、病態の解明などに有用な技術である。
【０００５】
ＴＴＶは最近発見された新しいウイルスであるため、多数の株の遺伝子配列が知られているわけではなく、従って、その遺伝子型分類方法も提案されていない。特に、上記したBootstrap 解析に基づく分類方法は、全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＴＴＶの遺伝子型について、Bootstrap 解析に基づいて正確に分類することができる、ＴＴＶの遺伝子型の分類方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、３００例ものＴＴＶ検体を世界から集め、その特定の領域をＰＣＲにより増幅して塩基配列を決定し、それらをBootstrap 解析に基づいて厳密に比較することにより、ＴＴＶの遺伝子型を正確に分類する方法を考え出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＴＴウイルスの遺伝子型を分類する方法であって、ＴＴウイルスの1984nt〜1987ntに位置するMesI部位、2001nt〜2006ntに位置する第１のNdeI部位、2014nt〜2019ntに位置する第２のNdeI部位、2033nt〜2038ntに位置する第１のPstI部位、2066nt〜2069ntに位置するNalIII部位及び／又は2072nt〜2077ntに位置する第２のPstI部位の有無を調べ、
(1)  前記MesI部位、第２のNdeI部位及びNalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(2)  前記第２のNdeI部位及びNalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(3)  前記第１のPstI部位を有し、前記第２のPstI部位を有するか又は有さず、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(4)  前記MesI部位並びに第１及び第２のPstI部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(5)  前記NalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(6)  前記第１のNdeI部位並びに前記第１及び第２のPstI部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないもの、
(7)  前記した制限酵素部位を１つも有さないもの
の７つの遺伝子型のいずれかに分類することを含む、ＴＴウイルスの遺伝子型分類方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
上記のように、本発明の方法では、ＴＴＶの1984nt〜1987ntに位置するMesI部位、2001nt〜2006ntに位置する第１のNdeI部位、2014nt〜2019ntに位置する第２のNdeI部位、2033nt〜2038ntに位置する第１のPstI部位、2066nt〜2069ntに位置するNalIII部位及び／又は2072nt〜2077ntに位置する第２のPstI部位の有無に基づいてＴＴＶの遺伝子型を分類する。なお、上記した各塩基番号( 「nt」で表示）は、国立遺伝学研究所の遺伝子データベースDDBJにAccession No. AB008394で登録されている配列の5'末端を1nt として数えたものである。なお、MesI部位の塩基配列はTTAAであり、NdeI部位の塩基配列はCATATGであり、PstI部位の塩基配列はCTGCAGであり、NalIII部位の塩基配列はCATGである。
【００１０】
本発明の方法に従って分類される１つの遺伝子型( 本明細書では「G1a 型」 と呼ぶ）は、前記MesI部位、第２のNdeI部位及びNalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないものである。本発明の方法に従って分類される他の１つの遺伝子型( 本明細書では「G1b 型」 と呼ぶ）は、前記第２のNdeI部位及びNalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないものである。本発明の方法に従って分類される他の１つの遺伝子型( 本明細書では「G2型」 と呼ぶ）は、前記第１のPstI部位を有し、前記第２のPstI部位を有するか又は有さず、前記した他の制限酵素部位を有さないものである。本発明の方法に従って分類される他の１つの遺伝子型( 本明細書では「G3型」 と呼ぶ）は、前記MesI部位並びに第１及び第２のPstI部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないものである。本発明の方法に従って分類される他の１つの遺伝子型( 本明細書では「G4型」 と呼ぶ）は、前記NalIII部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないものである。本発明の方法に従って分類される他の１つの遺伝子型( 本明細書では「G5型」 と呼ぶ）は、前記第１のNdeI部位並びに前記第１及び第２のPstI部位を有し、前記した他の制限酵素部位を有さないものである。本発明の方法に従って分類される他の１つの遺伝子型( 本明細書では「G6型」 と呼ぶ）は、前記した制限酵素部位を１つも有さないものである。
【００１１】
上記した各型とその制限酵素部位の有無を表にまとめると下記表１に示す通りである。
【００１２】
【表１】
0004194147.tif 000002
＋：認識
−：認識せず
【００１３】
上記した分類法を組み合わせることにより、ＴＴＶをG1a 、G1b 、G2、G3、G4、G5及びG6の７つの型に分類することができる。もっとも、本発明は、ＴＴＶを必ずしも上記７つの型に分類する方法に限定されるものではなく、上記７つの型のいずれか１つとそれ以外、又は上記の７つの型のうち任意の複数の型とそれらに含まれない型とに分類する方法等も本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
本発明の分類方法は、上記６箇所の制限酵素部位の有無に基づくものであるので、上記４種類の制限酵素を用いたＲＦＬＰ( 制限酵素断片長多型) 法により好都合に行なうことができる。ＲＦＬＰ法は、制限酵素で消化後の核酸断片を電気泳動により分離し、臭化エチジウム等で染色してバンドの位置を調べ、その電気泳動パターンによって制限酵素部位の有無を調べる方法である。ＲＦＬＰ法自体はこの分野において周知である。
【００１５】
さらに、ＲＦＬＰを行なう前にＰＣＲ等の核酸増幅法により、調べるべき領域を増幅しておくことが感度の点から好ましい。ＰＣＲ自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されている。なお、上記のようにＴＴＶ遺伝子の基本的な塩基配列は公知であるので、本発明の方法において調べるべき領域を含む領域、好ましくは1912nt〜2186ntの領域を含む領域を増幅するようにプライマーを設定して容易にＰＣＲを行なうことができる。また、ＰＣＲは２回行ない、最初のＰＣＲで増幅された断片内の領域を２回目のＰＣＲで増幅することにより(nested PCR)、ＰＣＲの信頼性をより高めることができる。なお、ＰＣＲに用いるプライマーの例は下記実施例に記載されている。
【００１６】
なお、本発明の方法は、上記の制限酵素部位の有無を調べればよいので、必ずしもＲＦＬＰ法により行なう必要はない。例えば、1912nt〜2186ntの全塩基配列を調べ、その配列に基づいて上記の制限酵素部位の有無を調べることも可能である。
【００１７】
ＲＦＬＰ法により行なう場合、例えば次のように行なうと効率良く分類を行なうことができる。すなわち、核酸増幅法によりＴＴＶ遺伝子の調べるべき領域を増幅後の検体を先ずNdeI及びPstIでそれぞれ消化してＲＦＬＰ法を行なう。その電気泳動パターンよりG2及びG5は分類を特定することができる。G2及びG5以外の型である場合、G1a 及びG1b か、これら以外の型かはその電気泳動パターンから知ることができる。G1a かG1b であった場合には、次いで別途MesIで消化してＲＦＬＰ法を行なうことにより、G1a とG1b とを分類することができる。一方、NdeI及びPstIでそれぞれ消化してＲＦＬＰ法を行なった結果、G4、G6又はG3であった場合には、さらに別途NalIII及びMseIでそれぞれ消化し、ＲＦＬＰ法を行なうことにより、G4、G6及びG3を分類することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
(1)   TTV DNA の抽出
日本人、供血者、慢性肝炎患者合計300 例を用いてＴＴＶの検出を行った。
血清0.2 ｍｌから、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (製品名； Boehringer Mannheim) を用いて抽出し、DNA 溶液５０μl を得た。
【００２０】
(2)   ＰＣＲ
DNA 溶液25μl と配列番号２及び３のプライマーをそれぞれ10pmol用いてPCR を行った。条件は、変性95℃30秒、アニール60℃、４５秒、伸長72℃、４５秒で、合計50μl とし、1.25U EXTaq （商品名；宝酒造）を使用し、３５サイクルのＰＣＲを行った。さらに、ひきつづき、配列番号4 及び5 のプライマーをそれぞれ10pmol用いてPCR を行った。条件は、変性95℃30秒、アニール60℃、４５秒、伸長72℃、４５秒で、合計50μl とし、1.25U EXTaq （商品名；宝酒造）を使用し、３５サイクルのＰＣＲを行った。増幅産物は、電気泳動によって確認した。陽性率は、５１％であった。
【００２１】
陽性であった増幅産物は、マイクロスピンカラムＳ400 （商品名；ファルマシア）を用いて精製し、配列番号６、７のプライマー、BigDye terminator cycle sequencing kit（商品名；パーキンエルマー）、ABI377 autosequencer（商品名；パーキンエルマー）を用いてその塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列番号８以下に示す。なお、上記のＰＣＲにより増幅された領域は、ＴＴＶの1912nt〜2186ntの領域である。なお、配列番号８以下には、増幅領域から両端のプライマー部分を除いた1939nt〜2160ntの塩基配列を示す。
【００２２】
(3)   分子系統解析
得られた塩基配列を最も相同性の高くなるように並べ、６- パラメーター法（gojobori, et.al., J Mol Evol, 18, 414-423, 1982)により、遺伝学的距離を推定し、NJ methods (Saitou and Nei, Mol Biol Evol, 4, 406-425 ,1987)で系統解析を行った。さらに、最も信頼性の高い系統樹を得るために、bootstrap resampling tests( Felsenstein, Evolution, 39, 783-791, 1985)を1000回行った。その結果、上記のように７つの遺伝子型に分類することにより最も信頼性の高い系統樹が得られた。BOOTSTRAP 解析によって85.7％以上で他のTYPEと系統樹が分かれる事をあきらかにした（系統樹）。得られた系統樹を図１に示す。
【００２３】
実施例２
(1)   ＰＣＲ
日本人５５人から実施例1 と同様にして調製したDNA 溶液25μl と配列番号２及び３のプライマーをそれぞれ10pmol用いてPCR を行った。条件は、変性95℃30秒、アニール60℃、４５秒、伸長72℃、４５秒で、合計50μl とし、1.25U EXTaq （商品名；宝酒造）を使用し、３５サイクルのＰＣＲを行った。さらに、ひきつづき、配列番号１及び３のプライマーをそれぞれ10pmol用いてPCR を行った。条件は、変性95℃30秒、アニール60℃、４５秒、伸長72℃、４５秒で、合計50μl とし、1.25U EXTaq （商品名；宝酒造）を使用し、３５サイクルのＰＣＲを行った。増幅産物は、電気泳動によって確認した。陽性率は、５１％であった。なお、上記のＰＣＲにより増幅された領域は、ＴＴＶの1912nt〜2186ntの領域である。
【００２４】
(2)   ＲＦＬＰ
それぞれの制限酵素で切断後、電気泳動パターンによって型判定を行った。すなわち、ＰＣＲ産物２μl を、それぞれ、１０U の( 商品名；New England Biolabs) (商品名；New England Biolabs)それぞれの添付バッファーを用いて、３７℃、 (商品名；New England Biolabs)で、６５℃で３時間反応させ、0.5 μｇ/ ｍｌ、エチジウムブロマイドの３％アガロースゲルで電気泳動後、紫外線照射下で写真撮影を行い、上記のとうり検出バンドで各タイプに判定、分類した。
【００２５】
すなわち、上記方法により各制限酵素消化により得られるバンドの長さは下記表２に示す通りである。
【００２６】
【表２】
0004194147.tif 000003
各遺伝型での切断DNA 長（bp）
【００２７】
上記の方法により、未知の検体を分類する場合に、次のように行なうと効率が良いのでこの方法によった。すなわち、まず、配列番号１及び３のプライマーによるＰＣＲ増幅産物をNdeI, PstIでそれぞれ処理し、NdeIで消化して105+170bp ならG1a 又はG1b 、91+184bpならＧ５( 確定）、PstIで消化して127+148 bpならＧ２( 確定) である。これらのバンドが検出されない場合、さらに、新にNalIII, MseIで切断する。NalIIIで消化して159+116 bpならＧ４( 確定) 、275 bpならＧ６( 確定）、MseIで消化して73+202bpならG3( 確定）、275bp ならＧ２( 確定）である。また、上記のNdeI, PstI消化でG1a, G1bと判定された場合、MseIで新に切断し、73+202bpならG1a(確定）、275bp ならG1b(確定）と判定する。
【００２８】
(3)   結果
日本人５５例では、G1a 型  10例、G1b 型17例、G2型19例,G1a+1b 型、5 例、G3型、１例、G4型  １例、G5型  １例、G6型  １例であった。なお、G1a+1b型は、G1a 型及びG1b 型の２種類のウイルスに感染していた例である。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、ＴＴＶの遺伝子型を正確に分類する方法が提供された。本発明は、ＴＴＶの感染経路の解明や、病態の解明等に役立つ。
【００３０】
【配列表】
0004194147.tif 000004
【００３１】
0004194147.tif 000005
【００３２】
0004194147.tif 000006
【００３３】
0004194147.tif 000007
【００３４】
0004194147.tif 000008
【００３５】
0004194147.tif 000009
【００３６】
0004194147.tif 000010
【００３７】
0004194147.tif 000011
【００３８】
0004194147.tif 000012
【００３９】
0004194147.tif 000013
【００４０】
0004194147.tif 000014
【００４１】
0004194147.tif 000015
【００４２】
0004194147.tif 000016
【００４３】
0004194147.tif 000017
【００４４】
0004194147.tif 000018
【００４５】
0004194147.tif 000019
【００４６】
0004194147.tif 000020
【００４７】
0004194147.tif 000021
【００４８】
0004194147.tif 000022
【００４９】
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【００５０】
0004194147.tif 000024
【００５１】
0004194147.tif 000025
【００５２】
0004194147.tif 000026
【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
0004194147.tif 000040
【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
0004194147.tif 000072
【００９９】
0004194147.tif 000073
【０１００】
0004194147.tif 000074
【０１０１】
0004194147.tif 000075
【０１０２】
0004194147.tif 000076
【０１０３】
0004194147.tif 000077
【０１０４】
0004194147.tif 000078
【０１０５】
0004194147.tif 000079
【０１０６】
0004194147.tif 000080
【０１０７】
0004194147.tif 000081
【０１０８】
0004194147.tif 000082
【０１０９】
0004194147.tif 000083
【０１１０】
0004194147.tif 000084
【０１１１】
0004194147.tif 000085
【０１１２】
0004194147.tif 000086
【０１１３】
0004194147.tif 000087
【０１１４】
0004194147.tif 000088
【０１１５】
0004194147.tif 000089
【０１１６】
0004194147.tif 000090
【０１１７】
0004194147.tif 000091
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で作成された系統樹を示す図である。
【図１】
0004194147.tif 000092