(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子状の多孔性担体上にヒト肝細胞を担持させたものを収容するバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させるラジアルフロー型肝細胞バイオリアクター中に維持された前記ヒト肝細胞にＣ型肝炎ウイルスを感染させ、引き続きバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させて前記ヒト肝細胞を培養し、それによって前記感染されたＣ型肝炎ウイルスを前記ヒト肝細胞中で増殖させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法であって、前記Ｃ型肝炎ウイルスの感染は、前記培養液中にＣ型肝炎ウイルスを添加することにより行われ、Ｃ型肝炎ウイルスを培養液に添加後、新鮮な培地を供給せずに、使用した培地を循環させ、次いで、培養液の流通を停止し、次いで、新鮮な培地を供給せずに、使用した培地を循環させて培養する工程をさらに含む、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項２】
粒子状の多孔性担体上にヒト肝細胞を担持させたものを収容するバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させるラジアルフロー型肝細胞バイオリアクター中に維持された前記ヒト肝細胞にＣ型肝炎ウイルスを感染させ、引き続きバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させて前記ヒト肝細胞を培養し、それによって前記感染されたＣ型肝炎ウイルスを前記ヒト肝細胞中で増殖させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法であって、前記Ｃ型肝炎ウイルスの感染は、前記培養液中にＣ型肝炎ウイルスを添加することにより行なわれ、Ｃ型肝炎ウイルスを培養液に添加する前に、新鮮な培地の供給速度及び酸素供給速度をそれまでの速度よりも大きくする、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルスを培養液に添加後、新鮮な培地を供給せずに、使用した培地を循環させ、次いで、培養液の流通を停止し、次いで、新鮮な培地を供給せずに、使用した培地を循環させて培養する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト肝細胞は樹立細胞株である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記樹立細胞株はＦＬＣ−４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６５）である請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＣＶは１９８９年にｃＤＮＡがクローニングされ、その後各種発現系を駆使してその構造及びプロセッシング機構が明らかにされてきた。その結果、非常に有効な診断系が開発され、我が国におけるＨＣＶによる輸血後肝炎は現時点ではほぼ制圧された。
以上のように、ＨＣＶの全容は明らかになりつつあるが、遺伝子レベルの研究が先行し、未だにウイルスの複製、粒子形成、変異等の生物学及び発癌機構の解明などの基礎的な研究は進んでおらず、ＨＣＶのワクチン、プロテアーゼ阻害剤、アンチセンス等の薬剤による治療法の開発も進展していない。これは、生体外におけるＨＣＶの増殖系が未だに存在しないことに起因する。ＨＣＶを培養肝細胞中で増殖させることは非常に困難なことであり、未だかつてこれに成功したという報告はない。従って、現在、上記の研究にはチンパンジーを用いるしか方法がない。しかし、これは非常に高価であり、個体差や再現性にも問題がある。また、動物愛護の点からもその利用には限界がある。このような背景から、臨床治験や動物実験に依存しない培養細胞を用いたＨＣＶ等の肝炎ウイルスの増殖系の確立が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、培養ヒト肝細胞を用いた、ＨＣＶの増殖方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究の結果、ヒト肝細胞を担持させた担体を収容した培養器に培養液を流通させるラジアルフロー型バイオリアクター内でヒト肝細胞を培養し、これにＨＣＶを感染させ、ヒト肝細胞の培養を継続することによりＨＣＶを増殖させることが可能であることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、粒子状の多孔性担体上にヒト肝細胞を担持させたものを収容するバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させるラジアルフロー型肝細胞バイオリアクター中に維持された前記ヒト肝細胞にＣ型肝炎ウイルスを感染させ、引き続きバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させて前記ヒト肝細胞を培養し、それによって前記感染されたＣ型肝炎ウイルスを前記ヒト肝細胞中で増殖させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法であって、前記Ｃ型肝炎ウイルスの感染は、前記培養液中にＣ型肝炎ウイルスを添加することにより行われ、Ｃ型肝炎ウイルスを培養液に添加後、新鮮な培地を供給せずに、使用した培地を循環させ、次いで、培養液の流通を停止し、次いで、新鮮な培地を供給せずに、使用した培地を循環させて培養する工程をさらに含む、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法に関する。また、本発明は、粒子状の多孔性担体上にヒト肝細胞を担持させたものを収容するバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させるラジアルフロー型肝細胞バイオリアクター中に維持された前記ヒト肝細胞にＣ型肝炎ウイルスを感染させ、引き続きバイオリアクター本体の周縁部から中心部に向けて培養液を流通させて前記ヒト肝細胞を培養し、それによって前記感染されたＣ型肝炎ウイルスを前記ヒト肝細胞中で増殖させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法であって、前記Ｃ型肝炎ウイルスの感染は、前記培養液中にＣ型肝炎ウイルスを添加することにより行なわれ、Ｃ型肝炎ウイルスを培養液に添加する前に、新鮮な培地の供給速度及び酸素供給速度をそれまでの速度よりも大きくする、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖方法に関する。
【０００６】
本発明の方法によれば、排出される培養液中に増殖されたＨＣＶを得ることができる。このように、本発明は、培養細胞を用いて、生体外でＨＣＶを効率良く増殖させる方法を初めて提供するものである。
従って、本発明は、従来治療に用いられてきたインターフェロンの効果予測はもちろん、ＨＣＶワクチンの開発、抗ＨＣＶ抗体の調製、プロテアーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤やアンチセンス薬剤等のＨＣＶの治療薬の開発等に大いに貢献するものである。
【０００８】
本発明で用いられる培養装置は、ラジアルフロー型バイオリアクターである。本発明の好ましいラジアルフロー型バイオリアクターの一例を図面に基づいて説明する。
図１には、本発明の好ましいラジアルフロー型バイオリアクターの一例が模式的に示されている。図１の上側の図はラジアルフロー型バイオリアクターの縦断面図であり、下側の図はラジアルフロー型バイオリアクターの横断面図である。ラジアルフロー型バイオリアクター１０は、円筒状のバイオリアクター本体（培養器）１２を含む。バイオリアクター本体１２の外周壁は多数の貫通孔を有する多孔性材料から成り、これらの貫通孔を通して培養液がバイオリアクター本体の外側から内側に流通できるようになっている。貫通孔の直径は、後述する担体粒子よりも小さく、かつ、バイオリアクター本体１２内に培養液を十分に供給できる大きさであり、通常２０〜８０μｍ程度が好ましい。断面がバイオリアクター本体１２と同心円状となるようにバイオリアクター本体１２のさらに外側を囲包する、円筒状のケーシング１４が設けられており、バイオリアクター本体１２の外周壁と、該ケーシング１４との間には、環状の培養液供給路１６が形成される。培養液供給路１６は、その底部において、培養液供給管１８と連通している。バイオリアクター本体１２の中心部には、培養液排出管２０が設けられている。培養液排出管２０の外周壁も、バイオリアクター本体１２と同様な大きさの貫通孔を多数有する多孔性材料から成り、培養液は流通できるが、担体は通過できない。
【０００９】
さらに、バイオリアクター本体１２の内部には、粒子状の多孔性担体２２が多数収容されている。多孔性担体の材料としては、特に限定されないが、好ましい例として球状の多孔性ガラスビーズを挙げることができる。多孔性担体の直径は、特に限定されないが０．１ｍｍ〜６ｍｍ程度が好ましく、特には０．３ｍｍ〜１．２ｍｍ程度が好ましい。また、担体中の孔径は特に限定されないが１０〜３００μｍ程度が好ましく、特には２０〜１２０μｍ程度が好ましい。また、担体粒子内の空隙率は、特に限定されないが３０〜７０％程度が好ましく、特には４０〜６０％程度が好ましい。このような多孔質ガラスビーズは、ドイツ国ショットグラスベック社（Ｓｃｈｏｔｔ Ｇｌａｓｓｗｅｒｋ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）からシラン（Ｓｉｒａｎ）の商品名で市販されており、この市販品を好ましく用いることができる。また、バイオリアクター本体１２内に収容される担体粒子の密度は、特に限定されないが、バイオリアクター本体内に粒子を重力下でできるだけ多量に注ぎ込むことが好ましい。
上記のラジアルフロー型バイオリアクターのサイズは特に限定されず、バイオリアクター本体１２内の容積は、通常、５ｍｌ〜数十リットル程度であるがこの範囲外でも差し支えない。
【００１０】
次に上記のようなラジアルフロー型バイオリアクターを用いた肝細胞の培養方法について説明する。培養液の流れは図１において矢印で示されている。すなわち、培養液は培養液供給管１８を通じてバイオリアクター本体１２の外周部にある培養液供給路１６に底部から供給される。培養液は、培養液供給路１６を上方に向かって流通するが、バイオリアクター本体１２の外壁に設けられている多数の貫通孔からバイオリアクター本体１２の内部に進入する。そして、バイオリアクター本体１２内を中心に向かって流れ、培養液排出管２０に設けられた多数の貫通孔から培養液排出管２０内に入り、培養液排出管２０内を上方に向かって移動し、培養液排出管２０の頂部からバイオリアクター本体１２の外部に排出される。なお、図１に示されるラジアルフロー型バイオリアクターでは、培養液は底部から供給されるが、バイオリアクター本体１２の外周部から中心部に向かって培養液が流れればよいので、培養液を培養液供給路１６の頂部から供給する構成としてもよい。また、排出された培養液の一部は再度循環させて培養液として供給することが好ましい。すなわち、培養液としては、新鮮な培養液と、リサイクルされた培養液の混合物を用いることが好ましい。これらの混合割合は、一日のグルコース消費量（ｇ／日）／酸素消費量（ｇ／日）比率が０．５〜１５、特には３〜１０程度になるように自動制御することが好ましい。
【００１１】
ここで使用される培養液は、肝細胞を培養し増殖させることができるものであればどのような組成のものでもよく、無機質、糖、アミノ酸、ペプチド、ビタミン類、有機酸、核酸、ｐＨ調整剤、酸素などの細胞の培養に必要な成分を含有するものであればよい。例えば、無機質としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏなどが挙げられ、アミノ酸、ペプチドとしては、Ｌ−アスパラギン塩酸塩、Ｌ−アラニン、アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタメート、グリシン、グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、インシュリンなどが挙げられ、糖としては、糖や糖アルコール、配糖体などが挙げられ、例えばＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、イノシトールなどが挙げられる。有機酸としては、遊離の酸又はエステルなどの有機酸誘導体が挙げられ、例えばコハク酸、コリン二酒石酸（ｃｈｏｌｉｎｅ ｂｉｔａｒｔｒａｔｅ）、葉酸、ピルビン酸ナトリウム、グリセロリン酸などが挙げられる。ビタミン類としては、塩酸ピリドキサール、リボフラビンなどが挙げられる。核酸としては、ウリジンなどが挙げられる。ｐＨ調整剤としては、ＮａＯＨ、炭酸ガス、ＮａＨＣＯ３などが挙げられる。
【００１２】
培養液としては、市販の培養液を用いることもできる。また、これに１〜３％程度の、ウシ胎児血清等の血清を添加したものも好ましく用いることができる。培養液中の酸素濃度及びｐＨを調整することが好ましい。培養液中の酸素濃度は排出培養液中の酸素濃度が、１ｐｐｍ以上となるように調整することが好ましい。すなわち、バイオリアクター本体（培養器）の容積１ｍｌ当たり、酸素供給量は０．０２５〜０．７５ｍｌ／分、特には０．０５〜０．５ｍｌ／分程度が好ましい。また、新鮮な培養液の供給速度は、特に限定されないが、バイオリアクター本体（培養器）の容積１ｍｌ当たり、通常、０．２５〜１００ｍｌ／日程度、好ましくは０．５〜５０ｍｌ／日程度である。また、培養液の循環速度は、特に限定されないが、バイオリアクター本体（培養器）の容積１ｍｌ当たり、通常、０．２５〜２．０Ｌ／日、好ましくは０．５〜１．０Ｌ／日程度である。培養液のｐＨは、水酸化ナトリウム溶液や二酸化炭素等を用いて約７．０に調整することが好ましい。さらに、培養液の温度は、約３７℃又はそれ以下に調整することが好ましい。
【００１３】
肝細胞は、上記した多孔性担体の表面及び多孔性担体中の孔の内部表面に付着して増殖する。増殖した肝細胞は、多孔性担体の表面及び孔の内部表面に担持され、さらに多孔性担体間の空隙にも充填される。肝細胞の多孔性担体への付着及び増殖は、培養液中に肝細胞を添加した、肝細胞浮遊液を上記培養液としてラジアルフロー型バイオリアクター内に供給することにより達成することができる。肝細胞浮遊液を培養液として供給すると、培養液が多孔性担体と接触しながら流通していく間に肝細胞が多孔性担体の表面又はその孔の内部表面に付着し、そこで増殖する。
培養開始時に培養液に添加する肝細胞の密度は、特に限定されないが、通常１０５〜１０９細胞／ｍｌ程度、好ましくは１０６〜１０７細胞／ｍｌ程度であり、また、培養液に添加する肝細胞の総数は、バイオリアクター本体の容積に応じて適宜選択されるが、例えばバイオリアクター本体１２内の容積が２００ｍｌの場合には通常１０７〜１０１０個程度、好ましくは１０８〜１０９個程度が適当である。なお、肝細胞を添加した培養液がバイオリアクター本体内に行き渡った後、３時間〜１２時間程度は、培養液の流通を止め、肝細胞のバイオリアクター本体からの流出を防いで肝細胞の担体上への付着を促進することが好ましい。
【００１４】
用いる肝細胞は、ヒト肝細胞であり、剖検等によりヒトの肝臓から採取したものを公知の平板培養法等により培養して増殖させたものであってもよいが、長期間にわたって確実にバイオリアクター内での増殖、維持を達成するためにヒト肝細胞の樹立細胞株を用いることが好ましい。ヒト肝細胞の樹立細胞株自体は公知であり、いずれの細胞株をも用いることができる。好ましい細胞株の例として、ＦＬＣ−４（米国特許第５，８０４，４４１号、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１６５の受託番号で生命工学工業技術研究所に寄託）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣより入手可能）、Ｈｕｈ７（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（ＪＣＲＢ）より入手可能）、ＦＬＣ−１、ＦＬＣ−２、ＦＬＣ−３、ＦＬＣ−５、ＦＬＣ−６及びＦＬＣ−７（これらＦＬＣシリーズの株細胞は、Ｋ．Ｆｕｊｉｓｅ，Ｓ．Ｎａｇａｍｏｒｉ，Ｈ．Ｋａｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ，８：１４２５，１９８８；永森静志，他、ＨＵＭＡＮ ＣＥＬＬ１（１）：１０６，１１５−１１８，１２０，１２３，１９８８；永森静志ほか、カレントテラピー１６：１５８−１６２，１９９８；Ｋａｗａｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３４：１０９−１１５，１９９８：及び、蓮村哲ほか．人工血液，５，３３−３７、１９９７等を参照）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明者が、複数種類の肝細胞株について、ＨＣＶの増殖性を比較検討したところ、ＦＬＣ−４細胞中でＨＣＶが最も良く増殖したので、ＦＬＣ−４細胞を用いることが好ましい。ＦＬＣ−４細胞中には、ＨＣＶのミニジーンＲＮＡを特異的に安定化させ翻訳効率を上昇させる何らかの宿主因子が存在すると考えられる。
【００１５】
肝細胞を供給後、通常５〜１５日間培養すると、肝細胞が十分に増殖して肝炎ウイルスを感染させるのに好ましい状態となる。肝細胞は、バイオリアクター本体内で約１０８細胞／ｍｌ以上にまで増殖する。バイオリアクター本体１２内の容積が２００ｍｌの場合に、肝細胞は総数で約２．９×１０１０まで増殖する。
肝細胞を増殖後、Ｃ型肝炎ウイルスを感染させる。本発明の方法によれば、異なる株系の複数のウイルスを同時に増殖させることも可能である。Ｃ型肝炎ウイルスの感染は、例えば慢性肝炎患者の血清を供給培養液中に含めて培養液として供給することにより行うことができる。Ｃ型肝炎ウイルスを含む培養液を、バイオリアクター本体内の肝細胞に直接添加することにより感染の可能性をより高めることができる。供給する肝炎患者血清の量としては、特に限定されないが、バイオリアクター本体の容積の１／５０〜１／１０程度が適当である。あるいは、Ｃ型肝炎ウイルスを肝細胞内で構築することができる、Ｃ型肝炎ウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンを注入することもできる。従って、本発明において「Ｃ型肝炎ウイルスを感染させる」ことには、完全なＣ型肝炎ウイルス粒子を感染させることのみならず、肝細胞内でＣ型肝炎ウイルスを構築できる核酸を発現する、感染性を有する組換えベクターを感染させることも包含される。なお、Ｃ型肝炎ウイルス含有培養液を供給した後、好ましくは２時間〜２４時間程度、さらに好ましくは２〜１０時間程度は、新たな培養液の供給及び培養液の循環を停止し、さらにその後好ましくは２時間〜４８時間程度、さらに好ましくは６〜４８時間程度は新たな培養液の供給を行わずにバイオリアクター本体１２の頂部から排出された培養液を再度バイオリアクター本体１２に培養液として供給することが好ましい。このようにすることによりＣ型肝炎ウイルスが感染する可能性を高めることができる。また、Ｃ型肝炎ウイルスを感染させる直前１５分間〜４時間程度、さらに好ましくは３０分間〜２時間程度、それまでの新鮮培地供給速度及び酸素供給速度を１．５倍〜４倍程度、さらに好ましくは１．５倍〜２．５倍程度に増加させて培養することが好ましい。このようにすることによりＣ型肝炎ウイルスが感染する可能性を高め、かつ細胞の状態を良好に保つことができる。また、肝細胞の培養開始後、酸素消費量がバイオリアクター本体の容積の半分のｐｐｍ±３０％（例えば、バイオリアクター本体内の容積が３０ｍｌの場合には１５ｐｐｍ±３０％）程度になった時点で培養温度を徐々に下げ、酸素消費量が安定した後上記のようにウイルスを感染させることがウイルス感染の確率を高める上で好ましい。この際、培養温度は２８℃〜３４℃が好ましく、さらに好ましくは２９℃〜３２℃程度である。また、ウイルス感染後の培養も、このような低温下で行うことが、ウイルス感染を持続し、細胞の状態を良好に保つ上で好ましい。
【００１６】
上記のＣ型肝炎ウイルス感染処理後、上記した条件で肝細胞の培養を続けることにより、Ｃ型肝炎ウイルスが肝細胞内で増殖し、感染後２〜３週間程度で培養液排出管２０から排出される培養液中にＣ型肝炎ウイルスが含まれるようになる。従って、排出される培養液からＣ型肝炎ウイルスを回収することによりＣ型肝炎ウイルスを分離することができる。培養液からのＣ型肝炎ウイルスの分離は、限外ろ過膜を用いたろ過や、遠心分離、ゲルろ過クロマトグラフィー等の常法により行うことができる。
本発明の方法により増殖されたウイルスは、ワクチンの開発や、抗肝炎ウイルス抗体を誘導するための免疫原として利用することができる。また、上記した培養肝細胞中でのＣ型肝炎ウイルスの増殖系は、Ｃ型肝炎ウイルスの回収のみならず、プロテアーゼ阻害剤やアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ等の肝炎治療薬の開発に利用することも可能である。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
（１） ラジアルフロー型バイオリアクター 図１に示す構造を有するラジアルフロー型バイオリアクターを準備した。バイオリアクター本体１２及び培養液排出管２０は、直径約４０μｍの貫通孔を有する多孔性の金属焼結材料から成るものであった。バイオリアクター本体１２内の容積は３０ｍｌであった。バイオリアクター本体１２内に充填した多孔性担体は、多孔性ガラスビーズ（商品名Ｓｉｒａｎ，ドイツ国Ｓｃｈｏｔｔ Ｇｌａｓｓｗｅｒｋ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）であった。このガラスビーズの直径は０．６ｍｍ、内部は蜂巣状に孔が空いており、空隙率は５０％、表面積は９０ｍ２／Ｌ−ｍａｔｒｉｘ、孔径は２０〜１２０μｍであった。このようなガラスビーズをバイオリアクター本体１２内に１８ｇ充填した。従って、細胞接着面積は１５００ｃｍ２／ｇ−ｍａｔｒｉｘであった。
【００１９】
（２） 培養システム 前記（１）のラジアルフロー型バイオリアクターを含む培養システムの概要を図２に模式的に示す。図２に示すシステムにおいて、新鮮な培養液は新鮮培養液貯蔵容器２４内に蓄えられており、ポンプ２６により培養液調整槽２８内に移送される。培養液調整槽２８には撹拌機３０が備えられており、ここで培養液の酸素濃度、二酸化炭素濃度及びｐＨが調整される。なお、培養液調整槽２８を載せている台３１には加熱手段が設けられており、培養液の温度を調整することができる。ＮａＯＨ貯蔵容器３２内には１Ｎ ＮａＯＨ溶液が蓄えられており、必要に応じてポンプ３４により培養液調整槽２８内に移送され、培養液のｐＨが調整される。一方、酸素ボンベ３６及び二酸化炭素ボンベ３８が流量コントローラー４０を介して培養液調整槽２８に接続されている。酸素ボンベ３６及び二酸化炭素ボンベ３８から、それぞれ酸素及び二酸化炭素が必要量だけ培養液調整槽２８に供給される。流量コントローラー４０はマイクロコンピューター４２に接続されており、該マイクロコンピュターにより、流量が２０分に一度の割合でチェックされ、制御される。培養液調整槽２８内で酸素濃度、二酸化炭素濃度及びｐＨが調整された培養液は、ポンプ４４によりラジアルフロー型バイオリアクター１０に底部から供給される。供給された培養液は、図１に基づいて説明したように、ラジアルフロー型バイオリアクター１０の培養液排出管の頂部から排出される。排出された培養液はポンプ４６により排出培養液貯蔵容器４８に蓄えられる。なお、図２に示す培養システムでは、排出された培養液を培地調整槽２８に戻す経路も設けられており、排出培養液の全部又は一部を、必要に応じて培養液として再度供給することも可能な構成となっている。なお、図示してはいないが、マイクロコンピューター４２は、各ポンプと接続され、また、バイオリアクター本体に供給される培養液を測定する図示しない酸素濃度計及び排出された培養液の酸素濃度を測定する図示しない酸素濃度計とも接続され、さらに培養液調整槽２８内に備えられた図示しないｐＨメーター及び温度計とも接続されており、培養液の酸素濃度、ｐＨ、温度、培養液の供給量はマイクロコンピューター４２により自動制御される。
【００２０】
（３） 肝細胞の播種及び培養 樹立肝細胞株である上記ＦＬＣ−４株を２×１０９個までフラスコ内で継代培養した。培養液をバイオリアクター本体内に流通させた後、フラスコ内で培養したＦＬＣ−４細胞を培養液に加え、バイオリアクター本体内に供給することにより肝細胞の播種を行った。播種後６時間は、ポンプ４４及び４６を停止して細胞のバイオリアクター本体内からの流出を防いだ。その後は、２５ｍｌ／日の流量で新鮮な培養液を供給した。また、培養液の循環速度は１０〜４０Ｌ／日であった。培養液のｐＨは７．０、温度は３７℃、酸素濃度は排出培養液中の酸素濃度が１〜６ｐｐｍとなるようにコンピューターにより自動制御した。
培養液は市販の次の組成（単位は全てｍｇ／Ｌ）を有するものである。
ＮａＣｌ                ６０００、      ＫＣｌ                    ４００、
ＭｇＣｌ２                １００、      ＭｇＳＯ４                  ９８、
ＮａＨ２ＰＯ４            １２５、      ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ        ０．８、
ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ        ０．０１、  ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ        ０．００１、
Ｄ−グルコース          ２０００、      Ｄ−マンノース            ５００、
Ｌ−アスパラギン塩酸塩    ２００、      Ｄ−ガラクトース          ２００、
Ｌ−アラニン                ２０、      アラニル−Ｌ−グルタミン  ５００、
Ｌ−アスパラギン酸          ２０、      Ｌ−グルタメート            ２０、
グリシン                    ３０、      グリシル−Ｌ−グルタミン  ５００、
Ｌ−イソロイシン          １０５、      Ｌ−リジン                １４６、
Ｌ−フェニルアラニン        ６７、      Ｌ−セリン                  ８０、
Ｌ−オルニチン            １００、      Ｌ−スレオニン              ９５、
Ｌ−トリプトファン          ２５、      Ｌ−チロシン                ６４、
Ｌ−バリン                  ９４、      コハク酸                  １０６、
ウリジン                      ５、      コリン二酒石酸              ２０、
葉酸                          ４、      イノシトール                ２０、
塩酸ピリドキサール            ４、      リボフラビン                ０．４、
ピルビン酸ナトリウム      １１０、      グリセロリン酸          １５００、
ＨＥＰＥＳ              １２００、      ＮａＨＣＯ３            １８００、
ヒトトランスフェリン          ５、      インシュリン                  ５、
フェノールレッド              ５。
これにウシ胎児血清を２％添加したものを用いた。培養液中の酸素やグルコース消費量の増加により、細胞の活動性が確認され、順調に酸素消費量の増大が認められた。なお、ここで、酸素消費量は、バイオリアクター本体１２に供給される培養液中の酸素濃度と、バイオリアクター本体１２の頂部から排出される培養液中の酸素濃度との差から求めた。また、グルコース消費量は、排出された培養液中のグルコース濃度を市販のグルコース濃度測定キットを用いて測定し、この濃度と供給培養液中のグルコース濃度との差から求めた。
【００２１】
（４） ＨＣＶの感染 リアクターによる培養開始７日目に酸素消費量が１５ｐｐｍに達し、この時点で培養温度を徐々に３２℃に下げた。細胞の酸素消費量が安定した培養開始９日目にＨＣＶの感染を行った。ＨＣＶの感染を行う前に培養液供給量び酸素供給量を２倍に増加させて１時間培養した。その後、ＨＣＶの感染を行った。ＨＣＶの感染は、慢性Ｃ型肝炎患者の血清（チンパンジーに対する感染価が５．５ＣＩＤ５０／ｍｌ）１ｍｌを１０ｍｌの培養液に溶解したものを培養液として、バイオリアクター本体頂部直後の培養液循環チューブから分枝し、バイオリアクター本体内に連通する図示しない管からバイオリアクター本体内に供給することにより行った。その後６時間にわたりポンプを停止した。次いで、循環ポンプ４４を起動させたが、バイオリアクター１０の頂部から排出された培養液の全量を培養液調製槽２８に戻し、新たな培地の供給を行うことなく２４時間培養した。その後、上記と同様にして（ただし、培養温度は２９〜３２℃）培養を継続した。
【００２２】
（５） 排出培養液中のＨＣＶの検出 ＨＣＶ感染処理後、上記した通常の条件で培養を再開してから毎日排出培養液中のＨＣＶを常法であるＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
ここで、逆転写に用いたプライマーの塩基配列は、
ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴであり、
また、ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列は、第１回目が
ＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴ、及び
ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴであり、第２回目が、
ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ、及び
ＧＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣであった。
また、ＰＣＲは、全量を５０μｌとし、変性工程を９４℃、４５秒間、アニーリング工程を５５℃、４５秒間、伸長工程を７０℃、６０秒間として３５サイクル行った。
その結果、感染処理後１〜２日は、ＨＣＶが検出されたが、その後検出されなくなり、１６日目から再度検出されるようになり、感染後１９日目に１０４〜１０５コピー／ｍｌと最大となった。
ＨＣＶ ＲＮＡは、感染後１００日間に至るまでずっと検出された。感染処理後１〜２日にＨＣＶが検出されたのは、添加したＨＣＶが流出してきたものが検出されたと考えられる。感染処理後３日目から検出されなくなったのは、添加したＨＣＶの流出が終了したものと考えられる。そして、１６日目以降に再度検出されるようになったのは、肝細胞に感染したＨＣＶが肝細胞中で増殖し、この増殖したＨＣＶが培養液中に放出されたものと考えられる。
【００２３】
（６） ＨＣＶの塩基配列 感染後２３日目に検出されたウイルスのＨＶＲ（超可変領域、ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）の塩基配列を調べたところ（次の表１参照）、バイオリアクターで９５％と大部分を占めたクローンはもともと患者血清中で５５〜６０％とメジャーなクローンＡｌと同一であった。
結果を表１に、輸血例及びチンパンジーの例と比較できるようにして示す。表１中の「ＲＦＢ（Ｒａｄｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）」が前記実験の結果を示している。なお、配列はアミノ酸の１文字表記の配列で示されている。
表１中の「クローン数」は、ドナー、チンパンジー、及びレシピエントの血清から回収もの、及びＲＡＤから回収されたクローン数を示す。血液提供者及びチンパンジーの血清から回収されたクローン数はアイザキらのデータによっている。
表１中の「Ｗ」は輸血後の週数を示し、「Ｄ」は感染後の日数を示す。表１中のアミノ酸配列の上の数字は、ＨＣＶのタンパク質におけるアミノ酸の位置を示し、ハイフンは最上段に記載されているアミノ酸と同じであることを示す。
【００２４】
【表１】
0004146124.tif 000002
【００２５】
実施例２
実施例１と条件を変えて同様な実験を行った。
（１） 血清添加培養液での培養系 バイオリアクターは実施例１と同じものを用いた。フラスコにて培養した１×１０９個のＦＬＣ４細胞を培地制御槽に播種した。２％血清添加培地（培養液）５０ｍｌ／日を用いて培養したところ、バイオリアクター内のＦＬＣ４細胞の酸素消費量は徐々に増加を始め、３０日目には２５ｐｐｍに（図３（Ａ）参照）、１０５日目には３５ｐｐｍに達した。経過中、バイオリアクター後方の溶存酸素濃度が１．０ｐｐｍ未満にならないように、培養温度を３７℃より徐々に低下させ（図３（Ａ）参照）、１０５日目には３０℃まで下げた。培養液中のアルブミン量は、低温培養でも経過中７５μｇ／ｍｌ以上であり、細胞の活動性は維持されていた。
培養における、温度（℃）、酸素濃度（ｐｐｍ）及びアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）の推移を図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）の白丸印（○）は温度（℃）を示し、黒丸印（●）は酸素濃度（ｐｐｍ）を示し、白四角印（□）はアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。温度（℃）、及び酸素濃度（ｐｐｍ）は左側の目盛りで示され、アルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。数値は図３（Ｃ）に示されているとおりである。
前記した実施例１（５）と同様の方法により、排出培養液中のＨＣＶの検出を行った。
その結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）の白丸印（○）はＲＮＡ力価（ｔｉｔｅｒ）を示し、白四角印（□）はＨＣＶ−コア蛋白質が陰性であることを示し、黒四角印（■）はＨＣＶ−コア蛋白質が陽性であることを示す。図３（Ｂ）の縦軸はＲＮＡ力価（ｌｏｇ１０コピー数／ｍｌ）であり、横軸は培養日数である。
図３（Ｃ）は、培養液中のＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、ＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）の推移を示す。図３（Ｃ）の黒丸印（●）はＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）を示し、白丸印（○）はＧＯＴ（ＩＵ／ｌ））を示し、白四角印（□）はＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）を示す。ＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）は左側の目盛りで示され、ＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。
【００２６】
（２） 無血清培養液での培養系 無血清培地（培養液）５０ｍｌ／日を用いてＦＬＣ４細胞をバイオリアクターで培養した。
結果を図４及び図５に示す。図５は、タイプ１ａの感染性クローンＲＮＡをバイオリアクターにトランスフェクションした場合（下記の（４）参照）のものである。
培養における、温度（℃）、酸素濃度（ｐｐｍ）及びアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）の推移を図４（Ａ）及び図５（Ａ）に示す。但し、図４（Ａ）にはアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）は示されていない。図４（Ａ）及び図５（Ａ）の白丸印（○）は温度（℃）を示し、黒丸印（●）は酸素濃度（ｐｐｍ）を示し、図５（Ａ）の白四角印（□）はアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。温度（℃）、及び酸素濃度（ｐｐｍ）は左側の目盛りで示され、アルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。数値は図４（Ｃ）又は図５（Ｃ）に示されているとおりである。
前記した実施例１（５）と同様の方法により、各排出培養液中のＨＣＶの検出を行った。
その結果を図４（Ｂ）及び図５（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）及び図５（Ｂ）の白丸印（○）はＲＮＡ力価（ｔｉｔｅｒ）を示し、白四角印（□）はＨＣＶ−コア蛋白質が陰性であることを示し、黒四角印（■）はＨＣＶ−コア蛋白質が陽性であることを示す。図４（Ｂ）及び図５（Ｂ）の縦軸はＲＮＡ力価（ｌｏｇ１０コピー数／ｍｌ）であり、横軸は培養日数である。
図４（Ｃ）及び図５（Ｃ）は、培養液中のＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、ＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）の推移を示す。図４（Ｃ）及び図５（Ｃ）の黒丸印（●）はＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）を示し、白丸印（○）はＧＯＴ（ＩＵ／ｌ））を示し、白四角印（□）はＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）を示す。ＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）は左側の目盛りで示され、ＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。
この培養系においては、培養温度は培養開始５日目に３５℃に下げて培養し、１００日以上の長期にわたり継代することなしに培養することができた（図５（Ａ）参照）。その間、細胞の酸素消費量は１５〜２０ｐｐｍで安定していた（図５（Ａ）参照）。
以上のように、ラジアルフロー型バイオリアクターを用いて３０〜３５℃の低温で培養することで、無血清培地または２％血清添加培地で、肝細胞癌由来細胞株を１００日以上の長期にわたり、継代することなしに培養することができ、その間、酸素消費量、グルコース消費量、アルブミン量等で示される肝細胞の活動性は保たれていた。
【００２７】
（３） 慢性肝炎患者血清による感染実験 実施例１の（４）と同様にして慢性肝炎患者血清を感染させ、実施例１（５）と同様にして排出培養液中のＨＣＶを検出した。その結果、感染後３日目にウイルスＲＮＡは一度陰性になったが、その後再び陽性化し、感染後１０日目に１０３〜１０４コピー／ｍｌと最大となった（図４（Ｂ）参照）。
このように、実施例１の場合と同様、接種後一度ＨＣＶＲＮＡは陰性になってから再び陽性化し増えてくることから、ウイルスが感染増殖しているものと考えられた。なお、実施例１及び２のいずれの感染実験でも、経過中ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ等肝障害の指標の上昇は認められなかった（図４（Ｃ）及び図５（Ｃ）参照）。
【００２８】
（４） 感染性クローンによるトランスフェクション実験 タイプ１ａの感染性クローンＲＮＡをバイオリアクターにトランスフェクションしたところ（図５参照）、ウイルスＲＮＡはトランスフェクション直後から徐々に減少し、４４日目には１０２コピー／ｍｌ未満にまでなったものの、その後５７日目に再び１０４コピー／ｍｌまで増加し（図５（Ｂ）参照）、１００日目まで約１０３〜１０４コピー／ｍｌと持続していた。なお、トランスフェクションは、感染性クローンＨ７７（Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ａｕｇ ５；９４（１６）：８７３８−４３）の１０μｇを、リポフェクチン法により、上記した患者血清の場合と同様に、一時的に循環を止めてトランスフェクションした。なお、リポフェクチン法によるトランスフェクションは具体的には次のように行った。
前述のＨ７７よりインビトロでＲＮＡを合成した１０ｕｇをＯｐｔｉＭＥＭ１ｍｌにリポフェクチン１５０ｕｌとともに混合し１５分間室温に放置した。その後、リアクター内をＯｐｔｉＭＥＭで十分満たした後、ＲＮＡを注入した。
また、培養上清中のコア蛋白も徐々に増加し、４４日目に最大になった（図５（Ｂ）参照）。コア蛋白は、免疫測定により定量した。より具体的に記載すると、沈殿試薬により培養液中のウイルス粒子を沈殿分画として収集後、それを分散試薬に分散させる。抗体試薬、および中和試薬で処理した後、ＨＣＶコア蛋白質がチューブ上の抗ＨＣＶコア蛋白質モノクローナル抗体に結合して、複合体を形成する。未反応物質を洗浄除去した後、ペルオキシダーゼ標識抗ＨＣＶコア蛋白質モノクローナル抗体を加えると、前述のチューブ上の複合体に結合する。未反応物質を洗浄除去した後、ＨＰＰＡ気質液を添加するとチューブ上に結合したペルオキシダーゼ酵素により蛍光物質が生成され、これを３２３ｎｍの励起光を照射し、生じた蛍光を４１０ｎｍで測定する。これをあらかじめ標準液より作製された検量線から濃度を算定する さらに、コア蛋白質の存在を確認するために、トランスフェクション後９６日目の培養液を２００倍に濃縮し、１０〜６０％（Ｗ／Ｗ）蔗糖勾配法にて分画して、それぞれの分画のＨＣＶ ＲＮＡとＨＣＶのコア蛋白質を測定した。
結果を図６に示す。図６の下段のグラフの白丸印（○）はＨＣＶ ＲＮＡの力価（ｌｏｇ１０コピー数／ｍｌ）を示し、黒丸印（●）はＨＣＶコア蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図６の上段のグラフの黒四角印（■）はコア蛋白質の密度（ｇ／ｍｌ）を示す。
この結果、密度勾配が約１．０７及び１．１８ｇ／ｍｌの２箇所でコア蛋白質の極大が測定され、コア蛋白質が２峰性の曲線であることがわかった。このことは、培養液中にウイルス粒子が存在していることを示すものである。
また、トランスフェクション後８、４４日目の培養液をＲＮａｓｅ処理した後にｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲでＨＣＶのＲＮＡが検出できたことから、ウイルス粒子内に保護されたＨＣＶ ＲＮＡの存在が示唆された（図７参照）。なお、このｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列は、フォワード側がＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴ，ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ、リバース側が，ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ、ＧＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣであった。
結果を図７として示す。図７は左側から、培養前日（−１日）の培養液、培養８日目の培養液、培養４４日目の培養液、対照としての血清、対照としてのＲＮＡであり、各々、ＲＮａｓｅ処理無し（ＲＮａｓｅ−）でｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ無し（ＲＴ−）、ＲＮａｓｅ処理無し（ＲＮａｓｅ−）でｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ有り（ＲＴ＋）、及びＲＮａｓｅ処理有り（ＲＮａｓｅ＋）でｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ有り（ＲＴ＋）の３つのレーンで構成されている。図７の上段の数字は培養日数を示し、＋−の表示の上の段はｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ処理の有無を有り（＋）、無し（−）で示し、下の段はＲＮａｓｅ処理の有無を有り（＋）、無し（−）で示している。図７の縦方向の数値は塩基数（ｍｅｒ）を示す。
さらに、トランスフェクション後１１０日目の細胞内にタグを用いたＲＴ ＰＣＲ法でマイナス鎖ＲＮＡを検出できたことから、細胞内にウイルス複製中間体の存在が示唆された（図８参照）。このＲＴ ＰＣＲは、具体的には次のように行った。このＲＴ  ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列は、逆転写反応に、ＴＣＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴ，ＰＣＲ反応にフォワード側が、ＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡ，リバース側が、ＣＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＴＡＡＡであった。
結果を図８に示す。図８のＭはマーカーを示し、レーン１のＮは細胞（−）で、ネガティブストランドＲＮＡ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）及びポジティブストランドＲＮＡ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）も存在していないコントロールを示し、レーン２の（−）ＲＮＡはネガティブストランドＲＮＡ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）を加えた場合を、レーン３の（＋）ＲＮＡはポジティブストランドＲＮＡ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）を加えた場合をそれぞれ示し、レーン４の細胞（Ｃｅｌｌ）はＲＦＢで培養したＨＣＶ感染細胞の場合を示す。図８の縦方向の数値は分子量を示す。この結果、培養された感染細胞中にネガティブストランドＲＮＡ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）の存在が認められた。
培養経過中のＨＶＲの塩基配列をもとの感染性クローンと比較したところ、２５、７１、１０６日目にそれぞれ１、２、２個の塩基の変異が認められたが、この培養経過を通して特定の塩基配列への収束、変異の蓄積などは認められなかった。結果を次の表２に示す。結果は、表２中の「ＲＦＢ（Ｒａｄｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）」の欄に示されている。なお、配列はアミノ酸の１文字表記の配列で示されている。
表２中の「クローン数」は、培養液中から回収されたクローン数を示す。
表２中の「Ｄ」は感染後の日数を示す。
表２中のアミノ酸配列の上の数字は、ＨＣＶのタンパク質におけるアミノ酸の位置を示し、ハイフンは最上段に記載されているアミノ酸と同じであることを示す。
【００２９】
【表２】
0004146124.tif 000003
【００３０】
以上のように、タイプ１ａの感染性クローンをバイオリアクターにトランスフェクションしたところ、１）ウイルスＲＮＡの再増加、２）コア蛋白質の増加、３）粒子内ウイルスＲＮＡの存在、４）細胞内ウイルス複製中間体の存在、５）塩基配列の変異、の５通りの方法でＨＣＶの複製を確認することに成功した。ウイルス増殖に伴う肝障害については、経過中明らかなＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨの上昇などは認められなかった（図５（Ｃ）参照）。
【００３１】
【発明の効果】
本発明は、生体外では培養が困難であるとされていた肝炎ウイルスの生体外での培養、増殖方法を初めて提供するものであり、肝炎ウイルスの研究のみならず、肝炎ウイルス感染症の治療、予防、及び機構を研究開発するための材料を提供するものである。より具体的には、ウイルス性肝炎の治療薬の研究開発に必須とされているウイルスを簡便な方法で提供することができる手段を提供するものである。
さらに、本発明の方法は、ウイルスの増殖の機構及び変異の機構を解明するためのウイルスの増殖方法を提供するものである。
このように本発明は、ウイルスの生態の研究のみならず、ウイルス感染症の治療、予防、処置の方法を研究開発ためのウイルスの必要な量を安定に供給する方法を提供するものである。
【００３２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Seishi NAGAMORI
<120> Method for Proliferating Hepatitis Cirus and Apparatus Therefor
<130> JA904421
<150> JP 11-233647
<151> 1999-08-20
<160> 5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> primer used for synthesizing cDNA of hepatitic C virus by reverse transcription
<400> 1
aacactactc ggctagcagt                  20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> primer used for amplifying by PCR hepatitic C virus cDNA
<400> 2
ctgtgaggaa ctactgtctt                  20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> primer used for amplifying by PCR hepatitic C virus cDNA
<400> 3
aacactactc ggctagcagt                  20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> primer used for amplifying by PCR hepatitic C virus cDNA
<400> 4
ttcacgcaga aagcgtctag                  20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> primer used for amplifying by PCR hepatitic C virus cDNA
<400> 5
gtgatccaag aaaggaccc                   19
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の方法に用いられる培養装置の例としてのラジアルフロー型バイオリアクターの縦断面及び横断面を示す図である。
【図２】  図２は、本発明の培養システムの例を模式的に示す図である。
【図３】  図３は、血清添加培養液を用いた培養系における、温度（℃）、酸素濃度（ｐｐｍ）及びアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）の推移（図３（Ａ））、排出培養液中のＨＣＶの検出の結果（図３（Ｂ））、及び培養液中のＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、ＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）の推移（図３（Ｃ））を示したものである。
図３（Ａ）の白丸印（○）は温度（℃）を示し、黒丸印（●）は酸素濃度（ｐｐｍ）を示し、白四角印（□）はアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。温度（℃）、及び酸素濃度（ｐｐｍ）は左側の目盛りで示され、アルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。
図３（Ｂ）の白丸印（○）はＲＮＡ力価（ｌｏｇ１０コピー数／ｍｌ）を示し、白四角印（□）はＨＣＶ−コア蛋白質が陰性であることを示し、黒四角印（■）はＨＣＶ−コア蛋白質が陽性であることを示し、横軸は培養日数である。
図３（Ｃ）の黒丸印（●）はＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）を示し、白丸印（○）はＧＯＴ（ＩＵ／ｌ））を示し、白四角印（□）はＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）を示す。ＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）は左側の目盛りで示され、ＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。
【図４】  図４は、無血清培養液を用いた培養系における、温度（℃）、及び酸素濃度（ｐｐｍ）の推移（図４（Ａ））、排出培養液中のＨＣＶの検出の結果（図４（Ｂ））、及び培養液中のＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、ＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）の推移（図４（Ｃ））を示したものである。
図４（Ａ）の白丸印（○）は温度（℃）を示し、黒丸印（●）は酸素濃度（ｐｐｍ）を示す。横軸は日数を示している。
図４（Ｂ）の白丸印（○）はＲＮＡ力価（ｌｏｇ１０コピー数／ｍｌ）を示し、白四角印（□）はＨＣＶ−コア蛋白質が陰性であることを示し、黒四角印（■）はＨＣＶ−コア蛋白質が陽性であることを示し、横軸は培養日数である。
図４（Ｃ）の黒丸印（●）はＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）を示し、白丸印（○）はＧＯＴ（ＩＵ／ｌ））を示し、白四角印（□）はＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）を示す。ＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）は左側の目盛りで示され、ＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。
【図５】  図５は、無血清培養液を用いた培養系で、培養時にタイプ１ａの感染性クローンＲＮＡをバイオリアクターにトランスフェクションした場合における、温度（℃）、酸素濃度（ｐｐｍ）及びアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）の推移（図５（Ａ））、排出培養液中のＨＣＶの検出の結果（図５（Ｂ））、及び培養液中のＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、ＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）の推移（図５（Ｃ））を示したものである。
図５（Ａ）の白丸印（○）は温度（℃）を示し、黒丸印（●）は酸素濃度（ｐｐｍ）を示し、白四角印（□）はアルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。温度（℃）、及び酸素濃度（ｐｐｍ）は左側の目盛りで示され、アルブミン濃度（μｇ／ｍｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。
図５（Ｂ）の白丸印（○）はＲＮＡ力価（ｌｏｇ１０コピー数／ｍｌ）を示し、白四角印（□）はＨＣＶ−コア蛋白質が陰性であることを示し、黒四角印（■）はＨＣＶ−コア蛋白質が陽性であることを示し、横軸は培養日数である。
図５（Ｃ）の黒丸印（●）はＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）を示し、白丸印（○）はＧＯＴ（ＩＵ／ｌ））を示し、白四角印（□）はＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）を示す。ＧＰＴ（ＩＵ／ｌ）、及びＧＯＴ（ＩＵ／ｌ）は左側の目盛りで示され、ＬＤＨ（ＩＵ／ｌ）は右側の目盛りで示されている。横軸は日数を示している。
【図６】  図６は、トランスフェクション後９６日目の培養液を蔗糖勾配法にて分画して、それぞれの分画のＨＣＶ ＲＮＡとＨＣＶのコア蛋白質を測定した結果を示す。図６の下段のグラフの白丸印（○）はＨＣＶ ＲＮＡの力価（ｌｏｇ１０コピー数／ｍｌ）を示し、黒丸印（●）はＨＣＶコア蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図６の上段のグラフの黒四角印（■）はコア蛋白質の密度（ｇ／ｍｌ）を示す。
【図７】  図７は、感染性クローンＨ７７をトランスフェクション後８、４４日目の培養液を、ＲＮａｓｅでの処理、及びｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ法で検出した結果を示す図である。図７は左側から、培養前日（−１日）の培養液、培養８日目の培養液、培養４４日目の培養液、対照としての血清、対照としてのＲＮＡであり、各々、ＲＮａｓｅ処理無し（ＲＮａｓｅ−）でｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ無し（ＲＴ−）、ＲＮａｓｅ処理無し（ＲＮａｓｅ−）でｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ有り（ＲＴ＋）、及びＲＮａｓｅ処理有り（ＲＮａｓｅ＋）でｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ有り（ＲＴ＋）の３つのレーンで構成されている。図７の上段の数字は培養日数を示し、＋−の表示の上の段はｎｅｓｔ−ＲＴ ＰＣＲ処理の有無を有り（＋）、無し（−）で示し、下の段はＲＮａｓｅ処理の有無を有り（＋）、無し（−）で示している。図７の縦方向の数値は塩基数（ｍｅｒ）を示す。
【図８】  図８は、感染性クローンＨ７７をトランスフェクションした後１１０日目の細胞内にタグを用いたストランド特異的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＴ−ＰＣＲ）法でマイナス鎖ＲＮＡを検出した結果を示す図である。図８のＭはマーカーを示し、レーン１のＮは細胞（−）で、ネガティブストランドＲＮＡ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）及びポジティブストランドＲＮＡ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）も存在していないコントロールを示し、レーン２の（−）ＲＮＡはネガティブストランドＲＮＡ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）を加えた場合を、レーン３の（＋）ＲＮＡはポジティブストランドＲＮＡ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）を加えた場合をそれぞれ示し、レーン４の細胞（Ｃｅｌｌ）はＲＦＢで培養したＨＣＶ感染細胞の場合を示す。図８の縦方向の数値は分子量を示す。
【図１】
0004146124.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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