(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡを有し、かつ耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号２の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物から耐熱性グルコキナーゼを採取することを特徴とする耐熱性グルコキナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子と、この遺伝子を含有する組換えベクター、組換えベクターによる形質転換体、並びにこの形質転換体による耐熱性グルコキナーゼの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルコキナーゼ[EC.2.7.1.2]は、生体内では解糖系の第一段階、すなわちＡＴＰの導入において重要な役割を果たす酵素である。一方、検査用組成物の必須成分として、グルコースを測定する場合、あるいはサンプル中のグルコースを消去する際、いずれにおいても産業上有用な酵素であり、各種検査試薬に用いられている。
【０００３】
グルコキナーゼがグルコースに対して非常に高い基質特異性を示すのに対し、同様な反応を触媒する酵素として知られているヘキソキナーゼ[EC.2.7.1.1]は、多種にわたる糖を基質とする異なる酵素である。さらに、これら2種の酵素は、アミノ酸配列の相同性が低いという点においても、全く異なるタンパク質である。
【０００４】
本発明者等は、好熱性微生物であるバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）より単離したグルコキナーゼが非常に安定であることを見いだし、その効率的な製造方法を提案した（特開昭５６-１２７０８６号公報参照）。
【０００５】
一方、グルコキナーゼ遺伝子を生体内で発現させる方法が、特開昭６０−１０２１９５号公報、特開昭６１−１２４３９０号公報、特開平１１−１２７８８０号公報、特表平１０-５１２７６２号公報、特開平６-２９２４８５号公報、特表平１０-５０７０８４号公報、特表平１０-５０５４９８号公報、特表平０８-５０８３９８号公報および再表９８／０１２３４３号公報などで開示されているが、これらのグルコキナーゼは安定性、基質親和性などの点において、本発明に記載される酵素とは異なるものである。またその発現方法は、酵素を単離精製して大量生産することには適さず、本発明において開示する方法とは異なるものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らが提案した上記の製造方法により、熱および保存安定性に優れたグルコキナーゼが得られ、その精製も容易に行うことが可能となった。しかしながら、上記方法において耐熱性グルコキナーゼを製造する場合には、通常５０℃〜６０℃の高温度で生産菌体を培養することにより得ているため、多量のエネルギーが必要であった。また、この微生物のグルコキナーゼ生産量が少量であるために、耐熱性グルコキナーゼの大量生産が困難であるという問題点は依然として未解決であった。
【０００７】
本発明は、好熱性微生物であるバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）に由来する耐熱性グルコキナーゼを遺伝子工学的に大量製造するための遺伝子操作材料と、この材料を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、このような課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記のバチルス・ステアロサーモフィラスが産生する耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を単離および構造決定することに成功し、さらに、耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組換えベクターを得、この組換えベクターをエシェリシア属に属する菌株などに含ませた該耐熱性グルコキナーゼ生産能を有する菌株を培地で培養すると、効率よく該耐熱性グルコキナーゼが生産されること等を見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明の第一は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子または配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子を要旨とするものである。
また、本発明の第二は、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡを有し、かつ耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子または配列番号２の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子を要旨とするものである。
さらに、本発明の第三は、第一または第二の発明の遺伝子を含有する組換えベクターを要旨とするものである。
本発明の第四は、第三の発明の組換えベクターを含む形質転換体を要旨とするものである。
本発明の第五は、第四の形質転換体を培地中で培養し、培養物から耐熱性グルコキナーゼを採取することを特徴とする耐熱性グルコキナーゼの製造方法を要旨とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明に係る耐熱性グルコキナーゼは、配列番号１に表したアミノ酸配列を有するタンパク質であり、さらにグルコキナーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列における１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も含むものである。
本発明の遺伝子は、上記アミノ酸配列をコードする遺伝子であって、具体的には、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡに代表される遺伝子であり、場合により、配列番号２の塩基配列における１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子である。
【００１１】
このような遺伝子は、例えば、配列番号２の一部配列を合成し、この合成ＤＮＡをプローブとしてＤＮＡライブラリーから単離する方法、配列番号２の両端部分の合成ＤＮＡをプライマーとし、染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって目的遺伝子を増幅する方法等によって取得することもできる。
【００１２】
本発明の耐熱性グルコキナーゼ遺伝子の供与微生物としては、好熱性バチルス属微生物が好ましく、中でもバチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)が好適であり、それらの具体例としては、UK-563(FERM P-7275)、ACTT-7953 (FERM P-4775)、ACTT-8005(FERM P-4776)、ACTT-10149(FERM P-4777)、NCA-1503(FERM P-4778)、SP-43(FERM P-12754)等が挙げられる。
【００１３】
本発明を完成するための上記バチルス属細菌からの耐熱性グルコキナーゼ遺伝子の単離、この遺伝子を含有する組換えＤＮＡおよび組換えＤＮＡによる形質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等は、公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）(Sambrook, J., et al.,コールドスプリングハーバー出版社, Cold Spring Harbor, 1989)に記載されている方法を組み合わせて行なうことができる。
【００１４】
ここで用いられるベクターとしては、市販のものでは、pUC19, pKK223-3, pPL-λなどが挙げられるが、pUC19など多コピーベクター由来のoriとtacプロモータを組み合わせて作製したベクターが好ましい。
【００１５】
また、用いられる宿主としては、大腸菌ＪＭ１０９, ＴＧ１, ＢＬ２１, Ｎ４８３０−１などが挙げられ、特にＴＧ１若しくはＢＬ２１が好ましい。
【００１６】
上記のようにして取得した形質転換体を用いて耐熱性グルコキナーゼを製造する方法としては、まず、形質転換体を培養し、集菌した形質転換体の菌体を超音波、あるいはリゾチーム等で溶菌し遠心分離した後、遠心上清を市販のイオン交換樹脂、アフィニティー樹脂等を用いて分取することにより製造できる。
【００１７】
なお、グルコキナーゼの活性測定法並びに活性表示法は以下の通りである。すなわち、活性測定はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）50mM、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）４mM、塩化マグネシウム２０mM、ＮＡＤＰ０．９ｍＭ、グルコース１２ｍＭ、グルコース６リン酸脱水素酵素（ロッシュダイアグノスティック社製）０．５ユニットを含む溶液1.0mlに酵素液10μlを混合し、３０℃にて３４０ｎｍにおける吸光度変化の初速度を測定することにより行った。また、酵素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μmolのＡＴＰが脱リン酸化されるのに要する酵素量を１ユニットとした。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。
実施例１：グルコキナーゼのＮ末端アミノ酸配列の解析
精製グルコキナーゼのＮ末端アミノ酸配列を、エドマン分解法により決定した。決定されたＮ末端アミノ酸配列は、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列の内、１から65で表される。
【００１９】
実施例２：ＤＮＡプライマーの作製
実施例１で判明した部分アミノ酸配列をコードするグルコキナーゼ遺伝子の塩基配列を予想した。この配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプローブには複数の形状があるが、本発明では、配列表の配列番号３および４で表される塩基配列を有するＧＫＤ１およびＧＫＵ１と命名したオリゴヌクレオチドを、外部機関（アマシャムファルマシア社）に合成依託して作成しオリゴヌクレオチドプライマーとした。
【００２０】
実施例３：バチルス・ステアロサーモフィラス染色体ＤＮＡライブラリーの作製好熱性バチルス属細菌バチルス・ステアロサーモフィラスUK-563(FERM P-7275)の菌体１gを公知の方法(Saito & Miura, Biochim.  Biophys., Acta, vol.72, p619, 1963)に従いリゾチーム（生化学工業社製）により溶菌後、ＳＤＳ含有アルカリ性緩衝液とフェノールでＤＮＡを抽出した。さらに、ＲＮＡをＲＮアーゼで分解して染色体ＤＮＡを1 mg精製した。
【００２１】
得られた染色体ＤＮＡのうち100μgを制限酵素Sau3AI（東洋紡社製）で部分分解して染色体ＤＮＡ断片80 μgを得た。それとは別にベクターpUC19 1μg（宝酒造社製）を制限酵素BamH I(東洋紡社製)で完全分解し、細菌由来のアルカリファスファターゼ（宝酒造社製）で処理してベクターＤＮＡ断片0.8μgを得た。得られた染色体ＤＮＡ断片0.28μgとベクターＤＮＡ断片0.1μgとをT4ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用い16℃、30分間連結反応を行い、組換え体ＤＮＡを得た。得られた組換え体を大腸菌JM109コンピテントセル200μg（東洋紡社製）に混合し、氷上で１時間静置した後、42℃、120秒間加温することにより、形質転換を行なった。
【００２２】
得られた形質転換体に1 mlのＬ培地を加え37℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを含むＬ寒天平板培地に塗抹したところアンピシリン耐性菌株が得られた。これら菌株をアンピシリン50μg/mlを含むＬ培地に植菌後一晩培養し、集菌後プラスミドをアルカリ-ＳＤＳ法により調製し、バチルス・ステアロサーモフィラス染色体ＤＮＡライブラリーとした。
【００２３】
実施例４：耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子の単離
実施例３で得た染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、グルコキナーゼ遺伝子がＮ末端部、およびＣ末端部それぞれ増幅されるような２種のプライマーの組み合わせ、すなわち実施例２で作成したプライマーＧＫＤ１とＭ１３−２０（宝酒造社製）の組み合わせおよび、実施例２で作成したプライマーＧＫＵ１とＭ１３−２０（宝酒造社製）の組み合わせを用い、ＰＣＲ法によりバチルス・ステアロサーモフィラスのグルコキナーゼをコードする遺伝子断片を増幅した。
【００２４】
ＰＣＲは以下に示す反応液組成および増幅条件にて行った。
＜反応液組成＞
Taq DNA ポリメラーゼ（サワディー社製）５U/１００μl 10倍濃度Taq DNA ポリメラーゼ用バッファー １０μl/１００μl 染色体ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ） 0.01
μg/100μl dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各0.2 mM プライマー 各１μM
＜増幅条件＞
(1) ９４℃、２分間（変性）
(2) ９４℃、４５秒間（変性）
(3) ５５℃、３０秒間（アニーリング）
(4) ７４℃、２分間（反応）
（上記(1)〜(4)のサイクルを計３０サイクル実施）
【００２５】
それぞれの増幅ＤＮＡ断片と、T-ベクターｐT７Ｂｌｕｅを混合し、T4ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用い16℃、30分間連結反応を行い、組換え体ＤＮＡを得た。得られた組換え体を大腸菌JM109コンピテントセル200μg（東洋紡社製）に混合し、氷上で１時間静置した後、42℃、120秒間加温することにより、形質転換を行なった。
【００２６】
得られた形質転換体に1 mlのＬ培地を加え37℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを含むＬ寒天平板培地に塗抹したところアンピシリン耐性菌株が得られた。生育したコロニーの中から白色のものについて、アンピシリン50μg/mlを含むＬ培地に植菌後一晩培養し、集菌後プラスミドをアルカリ-ＳＤＳ法により調製し、グルコキナーゼ構造遺伝子部分についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。
【００２７】
上記で決定したグルコキナーゼをコードする塩基配列を基に、グルコキナーゼをコードする遺伝子の全長が増幅されるように設計された２種のプライマー、ＧＫＤ２とＧＫＵ２を外部機関（アマシャムファルマシア社）に合成依託して作成しオリゴヌクレオチドプライマーとした。ＧＫＤ２の配列は、配列表の配列番号２で表される塩基配列の内、１から２１であり、またＧＫＵ２の配列は、配列表の配列番号２で表される塩基配列の内、９３２から９５４である。なおプライマーＧＫＤ２は、増幅断片のＮ端側に制限酵素ＮcｏＩによる切断部位が創出されるように、５’末端にCCを付加する設計とした。
【００２８】
実施例３で得た染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＧＫＤ２とＧＫＵ２を用い、ＰＣＲ法によりバチルス・ステアロサーモフィラスのグルコキナーゼをコードする遺伝子全長を増幅した。
【００２９】
ＰＣＲは以下に示す反応液組成および増幅条件にて行った。
＜反応液組成＞
Taq DNA ポリメラーゼ（サワディー社製） 5 U/100 μl 10倍濃度Taq DNA ポリメラーゼ用バッファー 10 μl/100μl 染色体ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ） 0.01 μg/100μl dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各0.2 mM プライマー 各１μM
＜増幅条件＞
(1) ９４℃、２分間（変性）
(2) ９４℃、４５秒間（変性）
(3) ５５℃、３０秒間（アニーリング）
(4) ７４℃、２分間（反応）
（上記(1)〜(4)のサイクルを計３０サイクル実施）
【００３０】
増幅ＤＮＡ断片と、T-ベクターｐT７ＢｌｕｅをT4ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用い１６℃、３０分間連結反応を行い、組換えＤＮＡを得た。得られた組換えDNAを大腸菌JM109コンピテントセル200μg（東洋紡社製）に混合し、氷上で１時間静置した後、42℃、120秒間加温することにより、形質転換を行なった。
【００３１】
得られた形質転換体に１mlのＬ培地を加え３７℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを含むＬ寒天平板培地に塗抹したところアンピシリン耐性菌株が得られた。生育したコロニーの中から白色のものについて、アンピシリン５０μg/mlを含むL培地に植菌後一晩培養し、集菌後プラスミドをアルカリ-ＳＤＳ法により調製し、グルコキナーゼ構造遺伝子部分についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。この塩基配列を、配列表の配列番号２に示す。
【００３２】
実施例５：発現用プラスミドベクターの作成
pKK223-3（アマシャムファルマシア社製）を、ＮaｅＩ（東洋紡社製）および、ＰｖｕＩ（東洋紡社製）認識部位で切断し、切断した直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離し、Tacプロモータを含むＤＮＡ断片を回収した。一方、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）を、ＥaｅＩ（（宝酒造社製）認識部位で切断し、T4ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）によって平滑末端化した後、ＰｖｕＩ（東洋紡社製）認識部位で切断し、切断した直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離し、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片を回収した。
【００３３】
上記のTacプロモータを含むＤＮＡ断片0.1μgとｏｒｉを含むＤＮＡ断片0.1μgを混合し、T4ファージ由来のDNAリガーゼ（宝酒造社製品）を用い16℃、30分間連結反応を行い、発現用プラスミドベクターｐＵＣtacを得た。
【００３４】
実施例６：組換えベクターの作製
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列の内、１から２５残基に対応するコドンを大腸菌において出現頻度の高いものに置き換えた、配列番号５で表される８５ｂｐのDNAを、外部機関（アマシャムファルマシア社）に依託し合成した。５’末端には、NcoI認識部位を導入するため、シトシンを２塩基付加した。
このDNA断片、および上記実施例４で得たグルコキナーゼ遺伝子を含むプラスミドを、グルコキナーゼ遺伝子のＮ末端部に位置するＮcｏＩ認識部位およびClaI認識部位で切断し、それぞれをアガロースゲル電気泳動で分離し、前者からは、グルコキナーゼ遺伝子N末端部を、また後者からはC末端部を含むＤＮＡ断片を回収した。
これらのＤＮＡ断片それぞれ0.1μgを混合し、T4ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製品）を用い16℃、30分間連結反応を行い、N末端部２５残基のコドンが大腸菌に至適化された耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドｐTVOGKを得た。
【００３５】
この組換えプラスミドｐTVOGKを、グルコキナーゼ遺伝子のＮ末端部に位置するＮcｏＩ認識部位で切断して直鎖状とし、T4ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）によって平滑末端化した後、さらにＣ末端下流に位置するHindIII認識部位で切断した。切断した直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離し、グルコキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。一方、上記実施例５で得た発現用プラスミドベクターｐＵＣtacを、ＳＤ配列下流５塩基に位置するEcoRI認識部位で切断して直鎖状とし、S1ヌクレアーゼ（宝酒造社製）によって平滑末端化した後、さらにマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位で切断した。切断した直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離し、Tacプロモータを含むＤＮＡ断片を回収した。
これら、グルコキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片0.1μgとベクタープラスミド断片0.1μgを混合し、T4ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製品）を用い16℃、30分間連結反応を行い、耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を含有する組換えベクターｐＵｔＯＧＫｓを得た。
【００３６】
これをプラスミドｐＵｔＯＧＫｓとして平成１２年１１月２９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号：FERM P-１８１３０）。図１はこの組換えベクターｐＵｔＯＧＫｓの作製概要図である。
【００３７】
実施例７：大腸菌での耐熱性グルコキナーゼの製造
実施例６で作成したｐＵｔＯＧＫｓを、カルシウム法で作製した大腸菌TG1コンピテントセル200μgに混合し、氷上で１時間静置後、42℃、120秒間加温し、形質転換を行なった。得られた形質転換体に１mlのＬ培地を加え37℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを50μg/ml含むＬ寒天平板に塗抹したところ、耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を含む形質転換大腸菌１００個のコロニーを得、これをTG1／ｐＵｔＯＧＫｓとした。
形質転換大腸菌TG1／ｐＵｔＯＧＫｓをアンピシリン50μg/mlを含むＬ培地300mlに植菌後、37℃にて一晩前培養を行なった。前培養液をアンピシリン50μg/mlを含むＬ培地２０リットルに植菌し、３７℃にて１０時間培養後イソプロピルβチオガラクトピラノシドを1mM加え、さらに１５時間培養した後集菌した。得られた菌体には、１００万ユニットのグルコキナーゼ活性が含まれていた。菌体を１０００mlの２５mMリン酸緩衝液（pH8.0）に懸濁後、超音波処理した。菌体破砕物を除いた上澄より、Blue-セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびDEAE-セファロースを用いたイオン交換クロマトグラフィーにてグルコキナーゼの精製を行なったところ、グルコキナーゼを３６万ユニット回収した。これは、バチルス・ステアロサーモフィラスUK-５６３(FERM P-７２７５)を２０リットル培養した場合に得られるグルコキナーゼの５０倍の酵素量である。
【００３８】
得られたグルコキナーゼの性質を調べたところ、６０℃、１時間処理後の残存活性は１００%、至適作用pHはpH8.0、グルコースに対するKmは０．１mMであった。これらの結果から、本発明の方法によって得られたグルコキナーゼが、バチルス・ステアロサーモフィラスUK-５６３(FERM P-７２７５)由来のグルコキナーゼと同じ性質を有するものであることが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、耐熱性グルコキナーゼを簡便な方法で大量に、しかも低コストで製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明における耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を含む組換えベクターの作製概念図である。
【配列表】
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【図１】
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