(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式(I)に示す構造単位を含み、且つ下記（１）及び（２）に示す性質を有するヘパリン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする虚血・再灌流障害抑制剤。
（１）ヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が80％以上である。
（２）標準血漿に6μg/mlの濃度で添加した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time;APTT）が50秒を越えない。
構造式(I)
【化１】
0004166851.tif 000003
【請求項２】
ヘパリン誘導体の有する性質（１）が下記の通りであることを特徴とする請求項１記載の虚血・再灌流障害抑制剤。
（１）ヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が85％以上である。
【請求項３】
冠動脈の虚血に伴う心筋組織障害を抑制するための薬剤であることを特徴とする請求項１又は２記載の虚血・再灌流障害抑制剤。
【請求項４】
経皮経管冠動脈形成術又は冠動脈バイパス術を行う際に使用される薬剤であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の虚血・再灌流障害抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は虚血に伴う生体組織の虚血障害及び／又は虚血後の再灌流に伴う生体組織の再灌流障害（これらの障害を総称して「虚血・再灌流障害」という）の抑制剤に関し、更に詳しくは、虚血及び／又は再灌流により誘起される心筋などの各種臓器の組織障害を抑制するための薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管中の血流の停止及びその後に再度血液を流すことで、血管内壁、各種臓器、生体組織に障害が起こることが広く知られている。例えば、虚血障害としては脳梗塞の際の虚血による脳組織の障害、心筋梗塞もしくは心臓疾患治療のための手術に伴う虚血による心筋の障害又は腎臓、肝臓もしくは肺臓などの各種臓器の手術の際の虚血による臓器もしくは生体組織の障害などが挙げられる。また、心臓の手術においては心臓及びその周辺の血流を停止し、再度血液を流した際（再灌流時）に血管内皮細胞及び心筋に対し重大な障害（再灌流障害）を生じるため、生命が危ぶまれる例が跡を絶たないことも知られている。
【０００３】
更に、近年、心筋梗塞や狭心症の治療として冠動脈インターベンションが行われるが、その一手法として経皮経管冠動脈形成術（percutaneous transluminal coronaryangioplasty;PTCA）が多用されている。当該手法は、心臓の冠状動脈の塞栓や狭窄部位を，カテーテルの先端に装着したバルーンを膨らませて開通させる手術であり、カテーテルは下肢などから経皮的に末梢動脈に導入され，血管内を伝わって冠状動脈まで挿入される。そしてバルーンを脹らませて開通させるが、虚血状態に陥っていた患部よりも血流の下流域にあたる部位において大量の血液の灌流が起こるため患部と同様の内皮細胞障害及び心筋障害が起こることが重大な問題点として指摘されている。
【０００４】
ところで、例えば心筋梗塞の治療薬として、従来は低分子化したヘパリンを使用する試みがなされている（特表平7-503496）が、この薬剤は当該低分子化ヘパリンの抗血液凝固活性によって血栓を溶解させて血流を再開させることからなる心筋梗塞の抑制を目的としている。
PTCA時のバルーンによって血管内皮が損傷し、術後数か月に過修復によってしばしば再狭窄が起こるが、このような血管内皮細胞の増殖を抑制することを目的としてヘパリンの誘導体である過ヨウ素酸酸化還元ヘパリンの使用が試みられており（WO92/17187）、当該ヘパリン誘導体に平滑筋増殖抑制作用があることが知られている。
【０００５】
一方、虚血・再灌流に伴う心筋の虚血・再灌流障害抑制剤として従来はグルタチオンの前駆体のメチルエステルや、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の使用が試みられているが、前者は必ずしも優れた効果を有するとはいえず、後者は優れた効果を発揮するがその生体内における安定性に問題があり、生体内において活性を維持するための工夫が必要であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
血流停止（虚血）と血流の再開（再灌流）に伴う生体組織の障害、特に心筋の障害が重大な問題であるにもかかわらず、それを回避するために使用でき、しかも容易に入手可能である有効な虚血・再灌流障害抑制剤は未だ見出されておらず、その開発が期待されている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討を繰り返した結果、特定のヘパリン誘導体が虚血・再潅流直後の組織障害を抑制する活性を有することを見出し、この知見に基づいて本発明に達した。
すなわち、本発明は下記構造式(I)に示す構造単位を含み、且つ下記（１）及び（２）に示す性質を有するヘパリン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む虚血・再潅流障害抑制剤を要旨とするものである。
（１）ヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が80％以上である。
（２）標準血漿に6μg/mlの濃度で添加した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time;APTT）が50秒を越えない。
構造式(I)
【０００８】
【化３】
0004166851.tif 000002
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下本発明の実施の形態をより詳述する。
本発明は虚血・再灌流障害抑制剤に係わるが、その有効成分は上記構造式(I)に示す構造単位、すなわちヘパリンの構成二糖中、一部のウロン酸が酸化的に開裂し、生じたアルデヒド基が還元された構造単位を含み、且つ下記（１）及び（２）に示す性質を有するヘパリン誘導体（以下NACヘパリンと記載することもある）又はその薬理学的に許容される塩である。
（１）ヘパリン誘導体のヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が80％以上である。
（２）標準血漿に6μg/mlの濃度で添加した際に活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）による凝固時間が50秒を越えない。
【００１０】
上記NACヘパリンを製造する方法としては、例えばWO92/17187記載の製造法、あるいは特開昭63-278901記載の方法に基づき、所望の特性を有するように反応条件を実験的に確認選定した変更を加えた製造法などが挙げられ、例えば以下の方法により製造することができる。
分子量約14,000程度のヘパリンの0.5〜10％、好ましくは1〜7％溶液に、例えば過ヨウ素酸塩や過酸化水素等の酸化剤、好ましくは過ヨウ素酸アルカリ金属塩、より好ましくは過ヨウ素酸ナトリウムを、0.01〜0.3M、好ましくは0.05〜0.2Mの濃度で加えて該ヘパリンを酸化処理し、ヘパリン骨格中の硫酸基の置換していないウロン酸残基の２位及び３位の炭素同志の結合を酸化的に開裂させる。当該酸化反応は、pH3〜7、好ましくはpH4〜5、温度0〜37℃、好ましくは0〜10℃、さらに好ましくは4℃前後で1日以上、好ましくは3日間の条件下で行われる。
【００１１】
上記酸化処理の後に、過剰の酸化剤、例えば過ヨウ素酸ナトリウムを100〜500mMのエチレングリコール或いはグリセリンにより処理して分解する。その後、必要に応じて蒸留水による透析を行ったり、更に凍結乾燥あるいはエタノール沈澱法などの方法を用いてヘパリンの過ヨウ素酸酸化生成物を得る。
【００１２】
前記酸化剤によってヘパリンを酸化処理した結果得られる酸化生成物はその構造中にアルデヒド基を有しているので、当該アルデヒド基を還元剤の存在下で還元処理する。還元処理の方法は、上記目的を達成する限り限定されないが、例えば0.1〜0.5M、好ましくは0.2Mの水素化ホウ素ナトリウムを含む、pH8.5〜9.5の1〜20％（W/V）、好ましくは5〜10％（W/V）の上記酸化生成物溶液を、例えば4℃で3時間反応させることにより行うことが好ましい。
【００１３】
反応終了後、反応液のpHを4〜5に調節することにより過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解し、次いで1〜2.5M、好ましくは2Mのアルカリ溶液（例えば水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、水酸化マグネシウム溶液、水酸化カルシウム溶液など）に再溶解してpH9〜10に調整し、蒸留水に対して透析することによりNACヘパリンの塩を得ることが可能である。
上記NACヘパリンをその薬理学的に許容される塩としてもよく、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩）及びアルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩）などが挙げられるが、アルカリ金属塩が好ましく、その中でもナトリウム塩が最も好ましい。
【００１４】
上記反応自体は公知であるが、本発明の虚血・再潅流障害剤の有効成分としての物性を有するヘパリン誘導体は、その反応条件を適宜調整することによって得ることが出来る。具体的にはNACヘパリンは、一般にヘパリン骨格と呼ばれるヘキスロン酸とグルコサミンの繰り返し構造中において、その中のウロン酸残基のうち、２位および３位に硫酸基を有さないウロン酸残基が、前記２位と３位の炭素原子間で開環、即ちそのピラノース環が開裂した構造を有するので、原料ヘパリンの特定位の炭素原子間結合が開裂する反応条件が選定される。また、NACヘパリンの中でも本発明薬剤の成分として有効なものは、NACヘパリンをヘパリン分解酵素により分解して生じる二糖を高速液体クロマトグラフィーで分析する方法によって求めた二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-tri(U,6,N)Sとも記載する）のモル％が少なくとも80%以上であることが必要であり、85％以上であることが好ましい。
【００１５】
更に、本発明薬剤の有効成分であるNACヘパリンは6μg/mlの濃度で標準血漿（健常人の血液より一般的な方法によって調整した血漿）に添加して測定された凝固時間である活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）が50秒を越えない特性を有するものである。
【００１６】
本発明の虚血・再灌流障害抑制剤は、虚血時に生体組織に起こる虚血障害及び虚血後の再灌流時に起こる再灌流障害を抑制するための薬剤を包含し、虚血に先立ちあるいはその直後に使用されることに特徴を有している。その為、例えばPTCA後の血管内皮細胞の増殖を抑制して再狭窄を防止するための薬剤のように、手術後長期間に渡って使用される薬剤とは明確に区別される。本発明の虚血・再灌流障害抑制剤は虚血時及び／又は虚血後の再灌流において発生するフリーラジカル（活性酸素など）によって起こる障害から組織を保護するために有効な薬剤であり、主に心臓、脳、肺臓、腎臓、肝臓の組織を保護するための薬剤として使用されるが、心臓又は脳へ適用することが好ましく、心臓への適用が最も好ましい。
【００１７】
具体的に心臓へ適用する薬剤としては、心臓及び周辺血管の手術時に手術前から手術後にかけて連続して投与して使用するための心筋虚血・再灌流障害抑制剤等が挙げられるが、これらに限定されず、脳梗塞時及びその治療時の血液の再灌流による脳の組織障害を抑制するための脳虚血・再灌流障害抑制剤としても使用することが可能である。本発明虚血・再灌流障害抑制剤は、優れた生体組織保護効果を有し、且つ抗血液凝固活性が低く、薬剤として投与した際に出血活性がないため、安全性が非常に高いことが特徴として挙げられる。
【００１８】
本発明虚血・再灌流障害抑制剤の剤型としてはNACヘパリンの前記のような作用を発揮しうる形態であれば限定はされない。特にヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ又はヤギなどの哺乳類の血管中に投与するために適した剤型が好ましい。この様な投与方法により投与が可能な剤型としては、例えば、注射用液剤及び点滴用液剤などが挙げられるが、アンプル、バイアル又は注射筒内に予め粉末として充填しておき、用時に溶解する形態であっても良い。この様な形態としては、例えば生理食塩水、マンニトール溶液、リンゲル液或いはリン酸緩衝液等の適当な溶媒を用いて使用時に溶解して投与できる剤型の製剤が挙げられ、このような製剤を溶解可能な容器を採用することが可能である。
【００１９】
本発明虚血・再灌流障害抑制剤におけるNACヘパリンの配合量並びに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重などの変化しうる要因に応じて個別的に決定されるべきものであり、特に限定はされないが、一般にNACヘパリンの臨床投与量として1日あたり概ね100μg/kg〜100mg/kg程度を例示することができる。また、上記製剤は、虚血及び再灌流を伴う手術、例えば各種バイパス手術、PTCA等の狭窄除去手術などの際に、その手術の直前から手術後少なくとも数時間の間、点滴して患者に投与し続けることが好ましい。
【００２０】
なお、本発明虚血・再灌流障害抑制剤の有効成分であるNACヘパリンは、後述の実施例において生体に対する毒性は見られなかった。一方、ヘパリンのマウス（雄、雌）における急性毒性試験によるLD50は、経口投与で5,000mg/kg以上、皮下又は腹腔内投与で2,500mg/kg以上、静注で1,000mg/kg以上であることが知られている。また、WO92/17187にも記載されている如く、NACヘパリンの抗血液凝固活性が通常のヘパリンに比して大幅に低下している。このことからも本発明虚血・再灌流障害抑制剤の安全性は高いということができる。
【００２１】
【実施例】
以下実施例により本発明をより詳述するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例により本発明が限定されるものではない。
なお、本発明のNACヘパリンの合成、同定及び活性評価は以下の試験例の方法に基づいて行った。
【００２２】
試験例１
［NACヘパリンの合成］
ヘパリンナトリウム塩（重量平均分子量：１３，７００Ｄａ、Syntex社製Lot  No.40210910:以下原料ヘパリンと記載する）を使用してNACヘパリンを合成した。
原料ヘパリン1.3gを、過ヨウ素酸ナトリウムの存在下で酸化した。この反応は、50mlの0.05Nの過ヨウ素酸ナトリウム、50mMの酢酸ナトリウムを含んだpH5の溶液中で、４℃、３日間酸化処理して行った。酸化処理後、過剰の過ヨウ素酸を最終濃度250mMのグリセリンを加えることで分解し、蒸留水に対して２日間透析し、その後凍結乾燥することにより1.2gの過ヨウ素酸酸化ヘパリンを得た。
【００２３】
この過ヨウ素酸酸化ヘパリンの生成時に生じたアルデヒド基は、30mlの0.2N水素化ホウ素ナトリウム、0.25N炭酸水素ナトリウム及び1.2gの該酸化ヘパリンを含むpH9の溶液を４℃、３時間反応させることで還元した。反応後のpHを氷酢酸で５に調節し、３０分間室温に放置することで過剰な水素化ホウ素ナトリウムを分解し、ふたたび5Nの水酸化ナトリウムでpHを9に調節した後、蒸留水への２日間の透析と凍結乾燥により、1.1gのNACヘパリンのナトリウム塩を得た。
【００２４】
試験例２
［酵素消化による二糖分析］
試験例１で得たNACヘパリンの二糖組成、すなわち構成二糖の硫酸基の位置の分析を、次のようにして行った。すなわち、NACヘパリンを酵素消化し、生成した不飽和二糖（前記構造式：(I)）を、不飽和二糖スタンダードを対照として、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析した（新生化学実験講座3、糖質II（東京化学同人刊、1991）、49−62頁に記載の「2・8グリコサミノグリカン分解酵素とHPLCを組み合わせた構造解析」参照）。不飽和二糖スタンダードとしては、例えば不飽和ヘパラン／ヘパリン・二糖ミックス（Ｈミックス）（生化学工業（株）製）などを使用することができる。
構造決定可能な各不飽和二糖のピーク面積を計算して、全面積に対するピーク面積をパーセントとして表した。
【００２５】
（１）NACヘパリンのヘパリン分解酵素による消化
新生化学実験講座3、糖質II  54-59頁に記載の方法により、ヘパリンあるいはNACヘパリン1.0mgを2mM酢酸カルシウムを含む20mM酢酸ナトリウム（pH7.0）220μlに溶解して、20mUのヘパリナーゼ、20mUのヘパリチナーゼI及びIIを加えて、37℃、２時間反応させた。
【００２６】
（２）HPLCによる分析
上記（１）による消化を行った後の溶液20μlを、HPLC（医理化、モデル852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（Dionex社、CarboPac  PA-1カラム4.0mm×250mm）を使用し、232nmでの吸光度を測定した。流速1ml/分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（50mM→2.5M）を用いる方法に準拠した（Kariya, et al.,Comp.Biochem.Physiol.,103B,473−479,(1992)）。その結果、ΔDiHS-tri(U,6,N)S含量は、原料ヘパリンで64.2%、NACヘパリンで89.7%となった。
【００２７】
試験例３
［分子量測定］
試験例１で得たNACヘパリンの3％溶液10μlをHPLCによるゲルろ過で分析した。カラムはTSKgel-（G4000＋G3000＋G2500）PWXL（東ソー、7.8mm×30cm）を用い、溶離液に0.2M塩化ナトリウムを使用して、1.0ml/分の流速で展開した。NACヘパリンの検出には、示差屈折計（島津製作所、AID-2A）を用いた。平均分子量はヘパリンの分子量標準品を対照にして求めた（Kaneda et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,220 ,108-112(1996)）。その結果、試験例１で得たNACヘパリンの分子量は約12,800であることが明らかになった。
【００２８】
試験例４
［NACヘパリンの活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）測定］
APTTの測定のため、健常人より3.2％クエン酸1/10容量で採血した。血液を1,000×g、10分間遠心分離し、得た血奬にNACヘパリンを6μg/mlとなるように添加し、その混合液100μlを測定用カップに入れ、37℃で1分間保温した。その後、あらかじめ37℃に保温しておいたアクチン（商品名：（株）ミドリ十字）100μlを添加し、さらに2分間保温した。次いで、37℃に保温しておいた0.02M  CaCl2溶液100μlを添加し、この時より凝固がおこるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A：アメルング社製）で測定した。その結果、試験例１で得たNACヘパリンのAPTTは42秒となった。対象として用いた上記試験例１で使用した原料ヘパリンのAPTTは300秒以上となった。
【００２９】
実施例１  本発明虚血・再灌流障害抑制剤の製造
試験例１によって調製したNACヘパリン（ΔDiHS-tri(U,6,N)S：89.7%、分子量：約12,800、標準血漿に6μg/ml濃度で添加した際のAPTT：42秒）を使用することにより本発明虚血・再灌流障害抑制剤を製造した。注射剤は、試験例１で製造したNACヘパリン50gを用い、このNACヘパリンを5mg/mlとなるようにマンニトール水溶液に溶解し、これを無菌濾過した後に、2mlずつアンプルに分注して製造した。液剤は、上記同様の製造法によって得たNACヘパリンを5μg/mlとなるように点滴用マンニトールに溶解した後に、無菌濾過して、点滴用液剤として500mlずつパックした。
【００３０】
実施例２  本発明虚血・再灌流障害抑制剤の虚血・再灌流時におけるに組織保護効果
虚血・再灌流時に本発明虚血・再灌流障害抑制剤の組織保護効果を成犬（10〜20Kg）の虚血・再灌流モデルにより確認した。
すなわち、生理食塩水（対照群）、5mg/mlの試験例１の原料ヘパリンを溶解したマンニトール溶液2ml（ヘパリン群）、及び上記実施例１で製造したNACヘパリンの注射剤（NACヘパリン群）を用意し、対照群（生理食塩水を静注、n=5）、ヘパリン群（2mg/kgを静注、n=5）、NACヘパリン群（2mg/kgを静注、n=5）の3群を以下の方法で、15匹の成犬に投与した。
【００３１】
初めにそれぞれの検体（各群５匹の成犬、３群）を左第VI肋間において開胸し、心臓の左室圧測定用の5Frミラーカテーテル（Millar、Mikro-Tip製）及び心臓の左室容積測定用の動物研究用5Frコンダクタンスカテーテル（Cordis,EuropaNV,Podeu製）を左室心尖部より挿入した後、冠動脈左前下行枝に咬合器を装着した。薬剤の投与は、左大腿動脈にシリコンカテーテルを留置して行った。咬合器による虚血は15分間行った。各項目の測定は薬剤投与前、投与5分後、閉塞15分後、再灌流15分後、再灌流60分後、再灌流120分後、再灌流180分後に行った。各時点における左室圧容積図を左室容積測定装置Sigma 5（Leycom製）により記録し、左室収縮性の指標であるEmax、血圧、心拍数を求めた。
【００３２】
また、各時点において採血を行い、一般凝固系（部分トロンボプラスチン時間（PT）、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）、血小板数、フィブリノーゲン量）、線溶系（プラスミノーゲン活性）及び内皮細胞障害系（NO2-/NO3-、エンドセリン-1量）を一般的手法を用いて測定した。特に、NO2-/NO3-の測定はCayman製のNO2-/NO3-測定キット、エンドセリン-1量の測定はIBL製のエンドセリン−１測定キットを使用した。
【００３３】
その結果、薬剤投与前と比較して、虚血時に内皮細胞の障害の度合を示すNO2-/NO3-の増加がコントロール群に観察され（+0.3）、ヘパリン群で変化がほとんど見られなかった（-0.1）のに対し、NACヘパリン群は大きく減少し（-0.5）、他の２群と比較して内皮細胞障害が少ないことが明らかとなった。特にNACヘパリン群の内皮細胞障害の低さは虚血直後に顕著であった。また、NACヘパリン群は、血圧や心拍数に影響はなく、更にNACヘパリン群においてAPTT、PT、フィブリノーゲン量及びエンドセリン−１量は大きな上昇はなく、血小板数、プラスミノーゲン活性の減少が見られなかったことから、血液凝固系への影響が低いことが明らかであり、虚血・再灌流障害抑制剤として使用した際の安全性の高さを裏付ける結果が得られた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、虚血・再灌流に伴って誘起される虚血障害及び／又は再灌流障害から組織を保護するための虚血・再灌流障害抑制剤が提供され、脳梗塞や心筋梗塞などの血流障害、血管閉塞を改善する手術、特にPTCAや血管バイパス手術の際に起こる虚血障害及び／又は再灌流障害を抑制することが可能となる。