(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量Ｇ蛋白質Ｒab３に作用するＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応制御蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質Ｒab３ＧＥＰ。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞内の小胞輸送を制御する低分子量Ｇ蛋白質Ｒab３に特異的に作用するＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応制御蛋白質（ＧＥＰ）に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、生物個体の恒常性維持に必須な細胞内小胞輸送の分子機構の解明、あるいは、神経疾患等の診断または予防、治療薬の開発などに有用な蛋白質Ｒab３ＧＥＰに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物個体を構成する一般的な細胞には、小胞体、ゴルジ体、リソゾーム、エンドゾームなどの単位膜で囲まれた多数のオルガネラが存在し、それらの間の物質の移動は、多種類の小胞の正確な輸送（細胞内小胞輸送）によって達成されている。例えば、ホルモンや消化酵素、血漿蛋白質などの蛋白質は、リボソームで合成されて小胞体に移動し、小胞体から小胞に乗ってゴルジ体を経て分泌顆粒となり、最終的に細胞形質膜に運ばれ、融合して細胞外に分泌される。神経細胞においては、シナプス小胞の前駆体がゴルジ体で形成され、軸索の中の微小管に乗って運ばれ、シナプスで貯蔵される。プレシナプスが脱分極すると小胞がプレシナプス膜と融合し、その結果、神経伝達物質が放出される。一方、ホルモンや細胞増殖因子などの種々の細胞外物質が細胞膜受容体に結合すると、その結合体は細胞内に取り込まれてエンドソームを形成するが、この現象はエンドサイトーシスと呼ばれており、これも小胞輸送の一種である。また、エンベロープを有するウイルスが発芽する際にも、宿主細胞の細胞内小胞輸送が利用される。さらに、上皮細胞や内皮細胞、神経細胞のように非常によく発達した細胞極性を有している細胞では、極性化した細胞膜に特異的な膜蛋白質を運ぶのにも細胞内小胞輸送は必須である。このように、細胞内小胞輸送は極めて重要な細胞機能の一つであるが、その分子機構は完全には解明されていない。現時点で明らかになっている細胞内小胞輸送のメカニズムは以下のとおりである。
【０００３】
細胞内小胞輸送とは、基本的には、細胞内のある一つの膜系から芽が出て小胞が形成され (budding)、この小胞がほかの膜系に移動して結合し (targeting and docking)、融合(fusion)する現象のことである。そして、この一連の現象はＲabファミリーと呼ばれる一群の低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（Ｇ蛋白質）によって制御されている。Ｒabファミリーに属する蛋白質は現在までに３０種以上が知られているが、それらは細胞内の特異的な膜系にそれぞれ存在し、以下に示すようなような機構で細胞内小胞輸送を制御していることが明らかになりつつある。すなわち、静止状態の細胞ではＲabは不活性型であるＧＤＰ結合型としてＲabＧＤＩと複合型を形成し、細胞質に存在している。何らかの機構でこの複合体が解離すると、それぞれのＲabに特異的なＧＥＰが作用し、Ｒabは活性型であるＧＴＰ結合型に転換され、このＧＴＰ結合型Ｒabは、それぞれ特異的な標的蛋白質に結合する。おそらく、この標的蛋白質は膜に存在しており、その結果、発芽あるいは結合／融合が引き起こされると考えされている。これらの作用が終了すると、それぞれのＲabに特異的なＧＴＰase活性促進蛋白質（ＧＡＰ）によってＧＤＰ結合型に転換され、ＧＤＰ結合型は再びＲabＧＤＩと複合体を形成して細胞質に戻るという機構である。
【０００４】
一方、この発明の発明者等は、Ｒabファミリーに属する低分子量Ｇ蛋白質として、これまでにＲab３Ａを見出している(J. Biol. Chem., 263: 2879-2904, 1988)。そして、このＲab３Ａが、細胞内小胞輸送のうちでも、特にシナプスにおける神経伝達物質の放出に重要な役割を果していることを明らかにし (Int. rev. Cytol., 133 : 187-230, 1992)、さらには、その活性制御蛋白質であるＲabＧＤＩ（J. Biol. Chem., 265 : 2333-2337, 1990)およびＲab３Ａの標的蛋白質であるＲabphilin３Ａ（Mol. Cell. Biol., 13 : 2061-2068, 1993) を見出している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、細胞の重要な機能である細胞内小胞輸送については、これまでに低分子量Ｇ蛋白質Ｒabファミリーを中心としてその分子機構の概要が明らかにされ、特に、Ｒab３Ａについては、この発明者等による研究の成果として、活性制御蛋白質や標的蛋白質が特定されている。
【０００６】
しかしながら、細胞内小胞輸送の機構をより詳細に理解するためには、Ｒabファミリーに属する蛋白質にそれぞれ特異的なＧＥＰやＧＡＰを見出すことが不可欠であるが、すくなくともＲab３およびそのサブファミリー（Ｒab３Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄ）についてはＧＥＰおよびＧＡＰは同定されてはいない。とくにＧＥＰについては、これまでにＭss４(Nature, 361 : 464-467, 1993) およびＲab３ＡＧＲＦ(J. Biol. Chem., 267 : 22715-22718, 1992) が見出されているが、前者はＲab３サブファミリーに特異的ではなく、後者は産業上利用可能な形（すなわち、構造や性状を明らかにした状態）では単離同定されていない。
【０００７】
この発明は、以上のとおりの従来技術の現状に鑑みてなされたものであって、細胞内小胞輸送を制御する低分子量Ｇ蛋白質であるＲab３に特異的に作用する新規な蛋白質（Ｒab３ＧＥＰ）を、その構造（アミノ酸配列）および性状を明らかにして提供することを目的としている。
また、この発明は、このＲab３ＧＥＰの遺伝子工学的操作のための材料を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、低分子量Ｇ蛋白質Ｒab３に作用するＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応制御蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質Ｒab３ＧＥＰを提供する。
また、この発明は、配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する動物性蛋白質を提供する。
【０００９】
さらにこの発明は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列と、このｃＤＮＡ配列またはその一部配列がハイブリダイズするゲノムＤＮＡ配列をも提供する。
すなわち、この発明の蛋白質Ｒab３ＧＥＰは、脂質修飾を受けたＲab３Ａを基質として用い、複数のカラムクロマトグラフィーによってラット大脳シナプトゾーム可溶性画分より精製した蛋白質であり、SDS-PAGEにて約200KDa（ゲル濾過にて約270KDa）の分子量を有している。そして、この精製蛋白質の一部アミノ酸配列をプローブとしてラットｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡクローンを取得し、このｃＤＮＡのアミノ酸配列の解析の結果、この蛋白質Ｒab３ＧＥＰは配列番号１のアミノ酸配列を有することが確認された。
【００１０】
この発明のＲab３ＧＥＰは、従って、上記のｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、大腸菌等で発現させて取得することができる。また、上記のｃＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いることにより、ラット以外の動物のｃＤＮＡライブラリーから該当するｃＤＮＡを単離し、これを適当な宿主−ベクター系で発現させることにより、動物種に固有の蛋白質として取得することもできる。このようなラット以外の動物由来の蛋白質も配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質である。
【００１１】
この発明のｃＤＮＡ配列は、上記のとおりのラットｃＤＮＡおよびその他の動物由来のｃＤＮＡを含むものである。また、この発明のゲノムＤＮＡ配列は、全ての動物種のＤＮＡ配列を含むものである。
以下、実施例を示して、この発明の蛋白質Ｒab３ＧＥＰについてさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１：Ｒab３ＧＥＰの精製
８０匹のラットの大脳よりシナプトゾーム可溶性画分を調製した。この画分の半分（500 ml、蛋白質455 mg）を0.2 M NaClに調整し、0.2 M NaClを含むバッファーＡ（20 mM Tris/Cl: pH7.5および1 mM DTT）を充填したQ-Sepharose FFカラム(2.6 × 10 cm) に通し、0.5 M NaClを含むバッファーＡ350 mlで溶出し、各10mlの画分を回収した。脂質修飾したＲab３Ａからの[3Ｈ] ＧＤＰ分離を指標とする方法で分析した結果、画分５−19にＲab３ＧＥＰ活性が認められた。
【００１３】
これらの活性画分を回収し、NaClを加えて終濃度を2 M に調整した後、2 M NaClを含むバッファーＡを充填したphenyl-Sepharoseカラム(2.6 × 10 cm) に通し、バッファーＡにおけるNaClの360-ml直線勾配(2-0 M)、次いでバッファーＡ180 mlで溶出し、各6 mlの画分を回収した。上記と同様の方法により分析した結果、画分52−63にＲab３ＧＥＰ活性が認められた。
【００１４】
これらの活性画分(72 ml、蛋白質8.6 mg) を回収し、バッファーＢ(20 mM リン酸カリウム:pH7.8、1 mM DTT、0.6 % CHAPS および10 % グリセロール) を充填したhydroxyapatiteカラム(1.0 × 30 cm) に通し、バッファーＢにおけるリン酸カリウムの75-ml直線勾配(20-100 mM)、バッファーＢにおけるリン酸カリウムの75-ml直線勾配(100-300mM)、次いでバッファーＢにおけるリン酸カリウムの50-ml直線勾配(300-500mM)で溶出し、各2.5 mlの画分を回収した。分析の結果、画分46−54にＲab３ＧＥＰ活性が認められた。
【００１５】
これらの活性画分(22.5 ml、蛋白質2.2 mg) を回収し、等量のバッファーＣ(20 mM bis-Tris/Cl:pH5.5、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、0.6 % CHAPS および10 % グリセロール) と混合した後、このバッファーＣを充填したMono Q HR 10/10 カラムに通し、バッファーＣにおけるNaClの60-ml直線勾配(0.2-0.5 M)で溶出し、各1 mlの画分を回収した。分析の結果、画分24−33にＲab３ＧＥＰ活性が認められた。
【００１６】
これらの活性画分(10 ml、蛋白質0.44 mg)を回収し、約 2 mlに濃縮した後、バッファーＤ(20 mM Tris/Cl:pH7.5、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、0.6 % CHAPS、45 % sodium cholate、10 % グリセロールおよび0.15 M NaCl)を充填したSuperdex 200カラムに通し、同バッファーで溶出し、各2 mlの画分を回収した。分析の結果、画分26−30の蛋白質（分子量約200KDa）にＲab３ＧＥＰ活性が認められた（図１Ａ）。
【００１７】
これらの活性画分(10 ml、蛋白質45μg)を回収した。また、シナプトゾーム可溶性画分の残り半分も上記と同様の一連のカラムクロマトグラフィーに供した。このようにして得られた２回のSuperdex 200カラムクロマトグラフィーの活性画分を混合し、バッファーＢを充填したhydroxyapatiteカラムによる高速液体クロマトグラフィーを行い、バッファーＢにおけるリン酸カリウムの12.5-ml直線勾配(20-100 mM)、次いでバッファーＢにおけるリン酸カリウムの50-ml直線勾配(100-500mM)で溶出し、各1 mlの画分を回収した。分析の結果、画分29−33と画分34−38に各々のピークをもつ２つの蛋白質（分子量約200KDa）にＲab３ＧＥＰ活性が認められた（図１Ｂ）。第１のピーク(5 ml、蛋白質15.5μg)と第２のピーク(5 ml、蛋白質 7.5μg)を別々に回収し、各々、Ｒab３ＧＥＰＩおよびＲab３ＧＥＰIIとして-80 ℃で保存した。
【００１８】
精製したＲab３ＧＥＰIIのＲabに対する活性を検討した結果、このＲab３ＧＥＰIIは、他のＲabサブファミリー（Ｒab２、−５Ａ、−１０、−１１）には作用しなかった（図２Ａ）。また、このＲab３ＧＥＰIIは、Ｒab３Ａおよび−Ｃに作用し、Ｒab３Ｄには部分的に作用したが、Ｒab３Ｂにはほとんど不活性であった（図２Ｂ）。さらに、Ｒab３ＧＥＰIIは、脂質修飾したＲab３Ａには作用したが、脂質修飾を受けていないＲab３Ａには作用しなかった（図３Ａ）。これらのＲab３ＧＥＰIIの特性は、同じくＲab３Ａに対してＧＥＰ活性を有する蛋白質Ｍss４とは異なっていたが（図２および３）、Ｒab３ＧＥＰIIとＭss４は共に、Ｒab３ＡとＲabＧＤＩとの複合体には不活性であった（図３Ｂ）。なお、Ｒab３ＧＥＰＩも、Ｒab３ＧＥＰIIとほとんど同一の特性を有していた。
実施例２：Ｒab３ＧＥＰのペプチドマッピングとそのｃＤＮＡのクローニング
実施例１と同一の方法でで精製したＲab３ＧＥＰII（蛋白質20μｇ）およびＲab３ＧＥＰＩ（蛋白質10μｇ）を各々SDS-PAGE(6.5 % ポリアクリルアミドゲル)に供し、分子量約200KDaに対応する蛋白質バンドを切り出し、リシルエンドペプチダーゼで完全に消化した後、C18 逆相高速液体クロマトグラフィーに供し、得られた９個のペプチドの配列を決定した。また、Ｒab３ＧＥＰIIのＮ末アミノ酸配列を決定するため、精製Ｒab３ＧＥＰII（蛋白質 4μｇ) をSDS-PAGEにかけ、PVDF膜に転写した後、蛋白質のバンドを切り出し、ペプチドシークエンサーで配列を決定した。この部分配列からデザインしたオリゴヌクレオチドプローブを用いてラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、Ｒab３ＧＥＰIIのｃＤＮＡをクローニングした。そして、このｃＤＮＡの配列をＤＮＡシークエンサー(ABI375)を用いた公知の方法により決定し、この塩基配列からＲab３ＧＥＰIIのアミノ酸配列（配列番号１）を決定した。
【００１９】
コンピューターによるホモロジー検索の結果、このアミノ酸配列はC. elegansのｃＤＮＡ yk26g7.5 にコードされている蛋白質と35 %の相同性を示した。またヒトDENNの蛋白質とはほとんど同一の相同性を示したが、このヒトDENN蛋白質はＲab３ＧＥＰIIのＣ末端側約300のアミノ酸が欠如していた。
実施例３：組換えＲab３ＧＥＰの発現
Ｒab３ＧＥＰのｃＤＮＡをｐＣＶＭベクターに挿入し、この組換え体をＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。このトランスフェクタントを、バッファー(20 mM Tris/Cl:pH7.5、1 mM DTT、0.6 % CHAPS)で均質化し、遠心分離（100,000 g : １時間）した。上清（2 ml、蛋白質4.2 mg) を Mono Q PC 1.6/5カラムクロマトグラフィーにかけ、各々の画分のＲab３活性を測定し、活性画分を組換え体Ｒab３ＧＥＰとして用いた。
【００２０】
この組組換え体Ｒab３ＧＥＰの特性（脂質修飾したＲab３Ａの要求性、基質特異性、ＲabＧＤＩへの感受性）は、上記の精製Ｒab３ＧＥＰIIと同様であった。また、ノーザンブロットおよびウエスタンブロット分析の結果、Ｒab３ＧＥＰは試験したラットの全ての組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および睾丸）で発現し、特に、脳で最も多く発現することが確認された。
【００２１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、細胞内小胞輸送を制御する低分子量Ｇ蛋白質であるＲab３に特異的に作用する新規な蛋白質（Ｒab３ＧＥＰ）とこの蛋白質を産業的に利用するための遺伝子材料が提供される。この蛋白質は細胞の重要な機能である細胞内小胞輸送の分子機構解明に有用であるばかりか、神経疾患等の診断、予防および治療法の開発にも有用である。
【００２２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｒab３ＧＥＰの精製工程におけるカラムクロマトグラフィー（上段）と回収した画分に対するSDS-PAGEの結果（下段）であり、（Ａ）はSuperdex 200カラムクロマトグラフィー、（Ｂ）はhydroxyapatiteカラムクロマトグラフィー（●はＲab３ＧＥＰ活性の指標である[3Ｈ] ＧＤＰ結合、--- は280nm の吸光度を示す) の結果である。
【図２】Ｒab３ＧＥＰII（Ａ−１、Ｂ−１）およびＭss４（Ａ−２、Ｂ−２）の基質Ｒab３Ａ（●）、Ｒab２（△）、Ｒab５Ａ（○）、Ｒab１０（▲）、Ｒab１１（■）に対する特異性を示す結果である。
【図３】Ａは、Ｒab３ＧＥＰII（Ａ−１）およびＭss４（Ａ−２）の基質修飾の要求性を示した結果であり、脂質修飾したＲab３Ａ（●）と、脂質修飾していないＲab３Ａ（○）への活性を示している。Ｂは、Ｒab３ＧＥＰII（●）またはＭss４（▲）が存在する状態、あるいはＲab３ＧＥＰIIおよびＭss４が存在しない状態（○）でのＲab３ＡのＲabＧＤＩ感受性を測定した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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