(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のＡ４１Ｌタンパク質を発現できないように遺伝子工学で処理されている組換えポックスウイルス。
【請求項２】
ケモカイン結合Ａ４１Ｌタンパク質を発現できない請求の範囲１に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３】
遺伝子工学で処理されたワクシニアウイルスである請求の範囲１または２に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項４】
治療または予防に用いるため医薬として許容される担体とともに、請求の範囲１−３のいずれか一つに記載の組換えポックスウイルスを含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
この発明は、新規なケモカイン結合タンパク質およびそのケモカイン結合フラグメントに関する。詳しくは、この発明は、上記タンパク質またはフラグメントの、例えば抗ウイルス薬または抗炎症薬としての医薬への使用、ならびにケモカイン類の検出方法および阻害方法に関する。
ケモカイン類は、白血球類の転送（trafficking）機能とエフェクター機能を調節しかつ炎症および病原体に対する宿主の防衛に重要な役割を演じている小型の分泌ポリペプチド類のファミリーである（D′SouzaおよびHarden １９９６年；Fauci １９９６年；Howard外１９９６年；Murphy １９９６年；PremackおよびSchall １９９６年；Baggiolini外１９９７年）。３０種を超えるケモカイン類が確認されており、保存システインの数と配置に基づいて少なくとも３種の構造グループに分類される。すなわちＣＣ（β）ケモカイン類、例えばＲＡＮＴＥＳ（for regulation-upon-activation, normal T cell expressed and secreted）およびマクロファージ炎症性タンパク質の（ＭＩＰ）−１α；ＣＸＣ（α）ケモカイン類、例えばインターロイキン−８（ＩＬ−８）および増殖関連癌遺伝子の（ＧＲＯ）−α；ならびにＣケモカインのリンホタクチン（C chemokine lymphotactin）である。これらの異なるケモカイン類は、放出されて特定の細胞型と作用する。すなわち、多くのＣＣケモカイン類は、単球または胸腺リンパ球に対する誘引物質であるが、多くのしかし全部ではないＣＸＣケモカイン類は好中球に対する誘引物質である。しかし、ケモカインの構造および他のリンパ球サブタイプに対する細胞特異性について規則はない。例えばＣケモカインのリホタクチンはＴ細胞に対して選択的であり、ＣＣケモカインのエオタキシン（eotaxin）は好酸球に対して特異的であり、そしてＣＸＣケモカイン類のＩＦＮ−γ誘導型タンパク質（ＩＰ−１０）およびＩＦＮ−γによって誘発されるモノカイン（Ｍｉｇ）は活性化されたＴ細胞を誘引する。
ケモカインの受容体（ＣＫＲ）は７膜貫通ドメインタンパク質であり、Ｇタンパク質と共役して信号を伝達する。大部分のＣＸＣケモカイン類は、単一のＣＫＲだけに高いアフィニティを有している（ＩＬ−８はＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２に結合する例外である）が、大部分のＣＣケモカイン類は２種以上のＣＫＲに結合する（Baggiolini外１９９７年）。
ケモカイン類の活性は、疾患を起こす過大な炎症を防ぐため、強く調節されている。動物モデルの抗体を中和することによるケモカイン類の阻害（Sekido外１９９３年）またはマウスケモカイン遺伝子の破壊（Cook外１９９５年）によって、ウイルス感染または他のプロセスが仲介する炎症において、ケモカイン類が生体内で重大な役割を演じていることが確認されている。細胞外結合ドメインだけを含有するサイトカイン受容体の可溶性バージョンを産生させることは、いくつかのサイトカイン類の活性を封鎖する生理学的な治療戦略を示す（Rose-JohnおよびHeinrich １９９４年）。しかし、ＣＫＲ類の７膜貫通ドメイン構造は、可溶性の抑制性ＣＫＲの構築を困難にするので、突然変異ケモカインアンタゴニスト、阻止ペプチド（blocking peptide）もしくは阻止抗体が、ケモカイン類の別のインヒビターとして評価中である（D′SouzaおよびHarden １９９６年；Howard外１９９６年）。
ＣＫＲは、ウイルスが侵入し感染するためにＣＤ４とともに必要な補助因子として作用することによって、ＨＩＶの伝播と播種に重要な役割を演じている（D′SouzaおよびHarden １９９６年；Fauci １９９６年）。ＣＸＣＲ４のＣＫＲは、Ｔ細胞系親和性ＨＩＶ分離株に対する補助因子であるが、ＣＣＲ５（およびＣＣＲ３）のＣＫＲは、マクロファージ親和性ＨＩＶ株による感染に関与している。生体内でＣＣＲ５が重要であることは、ＣＣＲ５遺伝子の突然変異体に対してホモ接合性（homozygous）の個体がＨＩＶの感染に対して耐性であるという知見によって裏付けられている。ケモカイン類または突然変異ケモカインアンタゴニスト類がＣＫＲに結合すると、ＨＩＶの感染を阻害するが、このことは、ＨＩＶ−ＣＫＲの相互作用を阻害することがＨＩＶに対する予防および治療の戦略として可能性があることを示している（D′SouzaおよびHarden １９９６年；Fauci １９９６年）。
ポックスウイルスは、細胞の細胞質内で複製し、そして転写とＤＮＡ複製のためのそれら自身の酵素を多数コードする一群の大型ＤＮＡウイルスである（Moss １９９６年）。ワクシニアウイルス（ＶＶ）は、最も集中的に研究されているポックスウイルスであり、天然痘を根絶するために使用された生ワクチンとして有名である（Fenner外１９８８年）。１９８２年以来、ＶＶは、発現ベクターとして、およびワクチンの研究にも広く使用されている（Moss １９９１年）。ＶＶ株Copenhagenのゲノムは配列が完全に決定されており、約２００個の遺伝子を含有している（Goebel外１９９０年）。そのゲノムの中心に近い遺伝子は、ポックスウイルス類間で最も高度に保存されており、その多くは、ウイルスの複製に必須のものである。対照的に、ゲノムの両端の方に位置している遺伝子は、異なるウイルス間で一層可変性であり、かつウイルスが複製するのに必須のものでないことが多い（Johnson外１９９３年）。これらの非必須ウイルス遺伝子のサブセットは、宿主免疫システムの特定の成分を阻害するのに重要であり、かつ多くはウイルスの毒性に影響する。したがって、ＶＶなどのポックスウイルス類は、インターフェロン類、補体、サイトカイン類、ケモカイン類、炎症および発熱の作用を阻害できるタンパク質を発現する（AlcamiおよびSmith １９９５年ａ；McFadden外１９９５年；Smith １９９６年；Spriggs １９９６年；Smith外１９９７年ｃ）。これらのタンパク質の多くは、感染した細胞から分泌されて、溶液中または細胞表面の宿主因子に結合する。多くの場合、上記ウイルスタンパク質と、特定のリガンドに対する細胞表面受容体の細胞外リガンド結合ドメインとの間にはアミノ酸の類似性がある。これらの場合、前記のウイルス遺伝子は進化中に、宿主から誘導されたようである。
可溶性ケモカイン結合タンパク質は、ポックスウイルス中に、すでに検出されている。第一に、粘液腫ウイルスＴ７タンパク質は、最初、可溶性ＩＦＮ−γＲとして確認されたが（Upton外１９９２年）、ヘパリン結合ドメインを通じてある範囲のケモカイン類に結合して、感染組織中への細胞の湿潤に影響する（Mossman外１９９６年；Lalani外１９９７年）。このタンパク質は、国際特許願公開第ＷＯ９６／３３７３０号に記載され、ＣＢＰ−１と呼ばれている。対照的に、ＶＶなどのオルトポックスウイルス類由来のＩＦＮ−γＲはケモカイン類に結合しない（Alcami外１９９８年）。第二に、ＶＶ株Listerは、感染細胞から分泌され、そしてヘパリン結合ドメインと異なるドメインを通じて、多種類のＣＣケモカイン類と結合するが（Graham外１９９７年；Smith外１９９７年ａ；Smith外１９９７年ｂ；Alcami外１９９８年）、ＣＸＣケモカイン類とは結合しない（Smith外１９９７年ａ；Smith外１９９７年ｂ；Alcami外１９９８年）可溶性の３５ｋＤａのタンパク質を発現することが実証された。このタンパク質はｖＣＫＢＰと呼称されている（Alcami外１９９８年）。また、このタンパク質は国際特許願公開第ＷＯ９７／１１７１４号にｐ３５として記載されている。非常に似ているタンパク質が、いくつかのしかしすべてではないＶＶ株、牛痘ウイルス、レポリポックスウイルス類、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）および粘液腫ウイルスによって産生され（Ｔ１タンパク質と呼ばれている）、ならびに痘瘡主要ウイルスによって、例えばインド１９６７年のタンパク質Ｇ５Ｒが産生されている（Shchelkunov外１９９４年）。他のＶＶ遺伝子はｖＣＫＢＰに対して一層遠縁のタンパク質をコードしている。ＶＶ株Copenhagenにおいて、これはＡ４１Ｌと呼ばれ（Goebel外１９９０年）そしてＶＶ株ＷＲでは元来ＳａｌＦ４Ｌと呼ばれたが（Howard外１９９１年）、ＳａｌＦ３Ｌと改名された（Smith外１９９１年）。それは以後、Ａ４１Ｌと呼ぶ、８個のシステイン残基のコ−アラインメント（CO-alignment）を含むＡ４１ＬとＳＦＶＴ１の関連が報告された（Howard外１９９１年）。また、Howard外１９９１年の報告は、炭水化物がアスパラギン残基を通じて連結する可能性がある部位、およびそのタンパク質に、小胞体膜を横切ってその細胞からトランスロケートさせる推定信号ペプチド（putative signal peptide）も報告した。他の著者は、Ａ４１Ｌと、ＶＶ Listerの３５ｋＤａのタンパク質と、ＳＦＶＴ１タンパク質との間に類似性はないと主張した（Martinez-Pomares外１９９５年）。配列が決定されている痘瘡主要ウイルスのすべての三つの株には、Harvey株において１６Ｌと呼ばれているＶＶ ＷＲ Ａ４１Ｌタンパク質（Aguado外１９９２年）、バングラデシュ−１９７５年株のＡ４４Ｌ（Massug外１９９４年）およびインド１９６７年株のＡ４６Ｌ（Shchelkunov外１９９４年）と比べてアミノ酸が９５％以上同一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がある。
Ａ４１ＬがｖＣＫＢＰに類似していることは、Ａ４１Ｌタンパク質が、ｖＣＫＢＰの場合と同様にケモカイン類と結合できることを示唆している（Alcami外１９９８年）。しかし、Alcami外（１９９８年）は、前記３５ｋＤａのタンパク質をコードする遺伝子が欠失したＶＶ ＷＲまたはＶＶ Listerに感染した細胞の上澄み液（Patel外１９９０年）が、ＭＩＰ−１α，ＲＡＮＴＥＳ，ＩＬ−８またはＧＲＯ−αに対して架橋できるタンパク質を含有していないと報告した（Alcami外１９９８年）。
遺伝子Ａ４１Ｌが、ＶＶの１６株および牛痘ウイルスの２株を含む試験されたオルトポックスウイルスの全株に感染した細胞から分泌される３０ｋＤａのタンパク質をコードしていることが発見されたのである。その上に、前記タンパク質は、配列データが入手できる痘瘡主要ウイルスの３株すべてから発現されると予測されている（Aguado外１９９２年；Massug外１９９４年；Shchelkunov １９９５年）。前記タンパク質は、Ｏ−およびＮ−連結の炭水化物を含有している。Ａ４１Ｌ遺伝子を欠いているＶＶ ＷＲ欠失突然変異体が構築され、野生型ウイルスおよび復帰ウイルスと同じ力価まで、細胞培養で複製することが分かった。表面プラスモンレゾーナンス（surface plasmon resonance）（ＢＩＡcore）にて、組換えバキュロウイルスが産生したＡ４１Ｌタンパク質を使用して、そのタンパク質が、ＣＸＣケモカイン類のＭｉｇとＩＰ−１０に結合するが、他のＣＸＣ，ＣＣまたはＣのケモカイン類とは結合しないことが発見されたのである。
この発明は、一つの側面で、Ａ４１Ｌタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントの有効量を、医薬として許容される担体とともに含有する医薬を提供するものである。
この発明は、特に、Ａ４１Ｌタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントの抗炎症薬としての使用に関する。Ａ４１Ｌタンパク質およびフラグメントは、ケモカイン類、特に、ＣＸＣケモカイン類とＩＦＮ−γ誘発ケモカイン類、例えばＭｉｇおよびＩＰ−１０が仲介する症状を治療するのに有用である。
また、この発明は、Ａ４１Ｌタンパク質またはケモカイン結合フラグメントの抗ウイルス薬としての使用に関する。Ａ４１Ｌタンパク質またはフラグメントは、細胞のケモカイン受容体を介して標的細胞の感染を仲介する、ＨＩＶなどの病原体の標的細胞に対する結合および／または標的細胞への感染を阻害する。
この明細書に記載する医薬は、治療および／または予防に有用である。
他の側面で、この発明は、遺伝子工学的に処理して、天然のＡ４１Ｌタンパク質を発現できないようにした組換えポックスウイルスを提供するものである。
上記組換えポックスウイルスは、例えば、Ａ４１Ｌ遺伝子のすべてまたは実質的な部分が欠失していることによってケモカイン結合Ａ４１Ｌタンパク質を発現できないことが好ましい。その組換えポックスウイルスは、例えば遺伝子工学的に処理されたワクシニアウイルスでもよい。ワクシニアウイルスのＭＶＡは、ワクチンに使用するため現在開発中であるが、この発明のこの側面に関連して特に重要である。ケモカイン結合Ａ４１Ｌタンパク質を発現できないように遺伝子工学的に処理されたＭＶＡは、天然のＡ４１Ｌタンパク質を発現する対抗物より安全でかつ免疫原性が低いという利点が予想される。
その外の側面で、この発明は、下記のステップ：
（a）  Ａ４１Ｌタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントであるケモカイン結合分子を準備し；
（b）  前記ケモカイン結合分子を試料と接触させ；
（c）  前記ケモカイン結合分子と、試料中のケモカインとの相互作用を検出する；
ステップを含んでなる検出方法を提供するものである。
したがって、この発明は、生物試料中の１種以上のケモカイン類の存在を検出するのに使用できる。そのケモカイン結合分子は、固体支持体上に有用に固定化できる。
他の側面で、この発明は、試料を、Ａ４１Ｌタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントであるケモカイン結合分子の有効量と接触させることを含んでなる、試料中の１種以上のケモカイン類の活性を阻害する方法を提供するものである。
さらに別の側面で、この発明は、この明細書に記載されている方法または医薬に使用する精製Ａ４１Ｌタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメント；およびこのような精製Ａ４１Ｌタンパク質またはフラグメントが入っているキットを提供するものである。
Ａ４１Ｌタンパク質のアミノ酸配列を図１に示す。図１に示したのは、ＶＶ ＷＲ Ａ４１Ｌタンパク質（受託番号Ｄ１１０７９）の配列である。比較のため、ＶＶ Lister由来のｖＣＫＢＰのアミノ酸配列（日本のＤＮＡデータベース、受託番号Ｄ００６１２）も示してある。
この発明は、ワクシニアウイルス類および痘瘡主要ウイルス類を含むポックスウイルス類由来および他のウイルスまたは非ウイルスの起源由来のＡ４１Ｌタンパク質（この明細書ではｖＣＫＢＰ−２とも呼称する）に関する。ウイルスＡ４１Ｌタンパク質は、図１に示すＡ４１Ｌのアミノ酸配列と約５０％以上の同一性を有し、または図１に示すＡ４１Ｌの配列と特に８０％以上、もしくは９０％以上、もしくは９５％以上のアミノ酸同一性を有すると考えられる。同じか類似のケモカイン結合性能を有するＡ４１Ｌタンパク質の細胞同族体は、図１に示す配列に対してアミノ酸の同一性がはるかに低く、例えば約２５％であると考えられる。
異なる生物由来のＡ４１Ｌタンパク質も、以下の共有特性によって確認できる。
−  分子内ジスルフィド結合を形成する、アミノ酸配列中の保存システイン残基。
−  ケモカイン結合特性。
−  類似した大きさ。
−  アミノ酸の同一性／類似性。アミノ酸が類似しているということは、アミノ酸残基の電荷および疎水性などの特性が類似していることを意味し、一つのアミノ酸が、他のアミノ酸の代わりに（そのタンパク質の構造に対して有意な影響を与えることなしに）保存的に置換されている場合、両者間に「類似性」がある。
−  酸性度；これらのタンパク質はすべて、適度に酸性である。このことはこれらタンパク質の機能と関連がある。というのはケモカイン類が塩基性タンパク質である傾向があるからである。ＶＶ ＷＲ由来のＡ４１Ｌタンパク質の等電点は５．４である。
この発明に用いるＡ４１Ｌタンパク質は、天然型または突然変異型で提供できる。公知の方法、特に遺伝子操作法を用いて、その天然タンパク質と比べ特性を変化させた該タンパク質の修飾バージョンを提供できる。所望の変化させる特性は、例えばケモカイン類に対する結合性を高めるため変化させる結合性能である。
また、この発明には、ケモカイン結合特性を有するＡ４１Ｌタンパク質のフラグメントの使用も含まれる。これらフラグメントはＡ４１Ｌタンパク質由来のペプチドである。このようなペプチドを使用することは、全タンパク質またはタンパク質の実質的部分を使用するより好ましい。というのは、例えば、ペプチドの免疫原性はタンパク質と比べて低いからである。このようなペプチドは、組換えＤＮＡ法および化学合成法を含む各種の方法で調製することができる。
この発明で使用するＡ４１Ｌタンパク質は、特に組換えタンパク質として、各種の発現系で、各種の方法で調製できる。かような発現系としては、例えばポックスウイルスまたは非ポックスウイルスの発現系がある。バキュロウイルスの発現系または哺乳類細胞系の発現系などの標準系を使用できる。
図１は、ＶＶ ＷＲ Ａ４１Ｌタンパク質およびＶＶ ListerのｖＣＫＢＰの配列を示す。
図２は、ＶＶ株ＷＲ由来のＡ４１ＬおよびＶＶ株ListerのｖＣＫＢＰのヒドロパシーのグラフを示す。
図３は、ｖΔＡ４１Ｌおよび野生型ウイルスと復帰ウイルスの分析結果を示す。
図４は、Ａ４１Ｌを発現するバキュロウイルスに感染した細胞由来の上澄み液中に、組換えＡ４１Ｌタンパク質が存在することを示す。
図５は、ウイルスに感染した細胞の上澄み液中にＡ４１Ｌが存在していることを示す。
図６は、各種ポックスウイルスに感染した細胞の上澄み液中の抗Ａ４１Ｌ抗体によって認識されるタンパク質の存在を示す。
図７は、Ａ４１ＬおよびｖＣＫＢＰの各種ケモカインとの結合を示すグラフである。
図８は、ＶＶ株ＷＲのＡ４１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列とフランキング配列を示す。
この発明を下記実施例でさらに説明するが、これら実施例はこの発明を例示することを目的とするものであり、あらゆる面でこの発明の範囲を限定するものではない。
実施例
材料と方法
細胞とウイルス
この試験に用いるオルトポックスウイルス株は外のところで述べられている（AlcamiおよびSmith １９９５年ｂ；Alcami外１９９８年）。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中のＢＳ−Ｃ−１細胞内でＶＶ株ＷＲを増殖させ、次いでこれらの細胞上で、すでに報告されているようにして力価を測定した（Mackettら１９８５年）。Ｄ９８０ＲとＣＶ−１の細胞は、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。
ケモカイン類
組換えヒトケモカイン類のＩＬ−８、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）−２、ＧＲＯ−α、血小板因子（ＰＦ）４、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）−１α、上皮好中球活性化タンパク質（ＥＮＡ）−７８、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、エオタキシン（eotaxin）およびリンホタクチン（lymphotactin）はPeprotechから購入し、ＧＲＯ−γとＩ−３０９はＲ＆Ｄ Systemsから購入し、そしてアナフィラトキシンＣ５ａはSigmaから購入した。
ＶＶ Ａ４１Ｌ欠失ウイルスとＶＶ Ａ４１Ｌ復帰ウイルスの構築
Ａ４１Ｌ遺伝子を欠いているＶＶ株ＷＲ突然変異体をトランジエント・ドミナント・セレクション（transient dominant selection）（FalknerおよびMoss １９９０年）によって構築するのに適しているプラスミドを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とＤＮＡクローン化によって組み立てた。Ａ４１Ｌ遺伝子の左側または右側に隣接するオリゴヌクレオチドを使用して、ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩ（左側）またはＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（右側）の制限酵素の末端部位を含有するＰＣＲ産物を生成させた。次に、これらのＰＣＲフラグメントを、その末端で、適当な制限酵素によって消化し、次いで同じ酵素で切断されたプラスミドｐＳＪＨ７中に逐次クローン化して（Hughes外１９９１年）、プラスミドｐΔＡ４１Ｌを生成させた。このプラスミドは、Ａ４１Ｌ ＯＲＦ（コドン１〜２０１）の９０％を欠いており、そしてＡ４１Ｌ遺伝子を囲む配列に対して遠位のＶＶｐ７．５Ｋプロモーター（MackettおよびSmith １９８２年）の制御下にあるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）グアニルホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子（Ecogpt）（BoyleおよびCoupar １９８８年）を含有していた。このプラスミドのＰＣＲ誘導領域の配列の忠実度は、Applied Biosystems Inc.の３７３蛍光自動ＤＮＡシークェンサーを利用して、ＤＮＡの配列を決定することによって確認した。次に、０．０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞で、ＶＶ株ＷＲに感染させたＣＶ−１細胞中に、プラスミドｐΔＡ４１Ｌをトランスフェクトした。２日後、その細胞中に存在するウイルスを収穫し、希釈し、用いて、報告されているように（FalknerおよびMoss１９８８年）、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）、キサンチンおよびヒポキサンチンの存在下、ＢＳ−Ｃ−１細胞の単層に感染させた。ＭＰＡの存在下でプラークが生成して、プラスミドｐΔＡ４１Ｌが、単一交差組換え事象によって組みこまれたためにEcogptを発現するウイルスを示した。ＭＰＡの存在下、ＢＳ−Ｃ−１細胞上で追加のプラーク精製を行った後、ＭＰＡ耐性ウイルス分離株を用いて、報告されているように（KerrおよびSmith １９９１年）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）の存在下、Ｄ９８０Ｒ細胞の単層に感染させた。生成したプラークは、Ecogptカセットとプラスミドの配列が組換えによって失われた結果、野生型またはＡ４１Ｌ失活突然変異体（ΔＡ４１Ｌ）になったウイルス分離株を示した。これらのことは、Ａ４１Ｌ遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドを用いＰＣＲによって識別した。プラークで精製した野生型ウイルス（ｖＡ４１Ｌ）と、同じＭＰＡ耐性中間ウイルス由来の欠失突然変異体（ｖΔＡ４１Ｌ）をプラークでさらに２回精製し、次に増幅し、次にさきに記載したように精製した（Mackett外１９８５年）。
Ａ４１Ｌ遺伝子がｖΔＡ４１Ｌ中に再挿入された復帰ウイルスを、プラスミドｐＡ４１Ｌを使用し、トランジエント・ドミナント・セレクション（FalknerおよびMoss１９９０年）で構築した。このプラスミドは、プラスミドｐＳＪＨ７のＳａｌＩ部位ＥｃｏＲＩ部位の間にクローン化された完全なＡ４１Ｌ遺伝子とフランキング配列を含有していた。ｐＡ４１Ｌを、ｖΔＡ４１Ｌを感染させたＣＶ−１細胞中に、トランスフェクトし、次いで、上記のようにしてＭＰＡ耐性ウイルスを単離した。次に、このようなウイルスを６−ＴＧの存在下、Ｄ９８０Ｒ細胞上にプレートし、次いで６−ＴＧ耐性ウイルスを、ＰＣＲによって（上記のようにして）、野生型Ａ４１Ｌゲノタイプについて検査した。さらにプラーク精製を行った後、このウイルスを増幅し精製してｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖと呼称した。
ウイルス分離株のゲノム分析
ウイルスのｖＡ４１Ｌ、ｖΔＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖをＢＳ−Ｃ−１細胞内で増殖させ、次いでＤＮＡを、先に述べたようにして精製されたウイルスコアから抽出した（Esposito外１９８１年）。次に、これらのＤＮＡ試料をＰＣＲとサザーンブロッティング（Southern １９７５年）によって分析した。ＰＣＲ分析では、Ａ４１Ｌ遺伝子座に隣接するオリゴヌクレオチドを用いて、野生型と突然変異体のＡ４１Ｌの対立遺伝子を識別した。サザーンブロット分析の場合、ウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、次いでナイロンフィルター（Hybond-N, Amersham）に移した。フィルターを、ｖΔＡ４１Ｌから削除されたＡ４１Ｌの領域内、またはその遺伝子の５′末端から左側隣接領域に延びる領域由来の、フルオレセインで標識されたＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させた。結合されたプローブを、ペルオキシダーゼ結合抗フルオレセイン抗体および強化化学発光（ＥＣＬ）試薬（Amersham）で検出した。
組換えバキュロウイルスからのＡ４１Ｌタンパク質の発現と精製
ＯＲＦの５′と３′それぞれに制限酵素部位ＨｉｎｄIIIとＸｈｏｌを導入したＡ４１Ｌ ＯＲＦを、オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅した。そのＤＮＡフラグメントを、同じ酵素で消化し、次にＨｉｎｄIIIとＸｈｏｌで切断されたｐＢＡＣ−１（Ｒ＆Ｄ Systems）中にクローン化し、プラスミドｐＡｃＡ４１Ｌｈｉｓを生成させて、Ａ４１Ｌ ＯＲＦを、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の多角体遺伝子プロモーターの下流に配置しそしてＣ末端において６個のヒスチジン残基に連結させた。プラスミドｐＡｃＡ４１Ｌｈｉｓを用いて、組換えバキュロウイルスを先に述べたようにして構築した（AlcamiおよびSmith １９９２年；Alcami外１９９８年）。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ）細胞に、生産者の説明にしたがって、精製された線状ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ（ＢａｃＰＡＫ６，Clontech）およびｐＡｃＡ４１Ｌｈｉｓをコトランスフェクトし（cotransfect）、次に組換えウイルスＡｃＡ４１Ｌｈｉｓを単離した。ＡｃＡ４１Ｌｈｉｓの高力価のストック（１０8ｐｆｕ／ｍｌ）を使用ストックから生成させて、１０％ＦＢＳを含有するＴＣ１００培地内で１０ｐｆｕ／細胞にて、Ｓｆ２１細胞に感染させた（プラスチックフラスコ中に２×１０5細胞／ｃｍ2で接種した）。３ｈｒ後、ウイルス接種物を除き、その細胞を洗い、次に血清なしのＴＣ１００で覆った。６０ｈｒ後、上澄み液を集め、４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離にかけて（Beckman ＧＰＲ遠心分離機のＧＨ−３．７ローター）、細胞の破片を除き、０．２μｍのフィルター（Nalgene）で濾過し、次いで、４℃で３０分間、２００００ｒｐｍで遠心分離にかけて（BeckmanＬ８−Ｍ超遠心分離機のＳＷ２８ローター）、ウイルス粒子をペレットにした。上澄み液を集め、２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）含有５００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析し、次に、Ｎｉ2+キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ｎｉ2+を予め加えたニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）樹脂（Qiagen）を、結合緩衝剤（２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７．９，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，５ｍＭイミダゾール）中で平衡させた後、前記上澄み液と混合した。得られたスラリーを連続して３ｈｒ回転させ、結合緩衝剤５０ｍｌで洗浄し、続いて２０ｍＭのイミダゾール含有の結合緩衝剤５０ｍｌで洗浄し、次にカラムに注入した。そのカラムを、さらに、イミダゾールの濃度を５０ｍＭまで増大した結合緩衝剤を（０．２ｍｌ／ｍｉｎの流量で）用いて洗浄した後、結合されたＡ４１Ｌｈｉｓタンパク質を、１２０ｍＭイミダゾールで溶離させた。画分の一部を、１０％ゲル上のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Laemmli １９７０年）で分析し、次にクマシーブルーで染色することによって可視化した。溶出されたＡ４１Ｌｈｉｓタンパク質を含有する画分を、プールし、５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７．０，２０ｍＭ  ＮａＣｌ中に透析してイミダゾールを除いて、試料を調製し、mono−Ｑアニオン交換体（Pharmacia）を用いる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（fast protein liquid chromatography）（ＦＰＬＣ）によってさらに精製し濃縮した。Ａ４１Ｌｈｉｓは、予想等電（ｐＩ）点が５．４であるので、ｐＨ７．０でmono−Ｑに容易に結合し、そして、２０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌの勾配液１０ｍｌでカラムを洗浄すると４００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。画分のタンパク質濃度は、ブラッドフォード検定法と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの既知濃度のＢＳＡ標準との比較によって測定した。
Ａ４１Ｌ単一特異性抗体を産生させるためのウサギの免疫感作
ニュージーランド白ウサギに、同容積のフロイントの完全アジュバントで乳化させた精製Ａ４１Ｌｈｉｓタンパク質８０μｇを筋肉内注射し、次にフロイントの不完全アジュバントに乳化させた同じ抗原２００μｇで、３週間の間隔をおいて３回、追加免疫を行った。免疫前血清と免疫血清の試料を、免疫感作前および最終免疫感作を行ってから２週間後に採取した。
イムノブロッティング
ＢＳ−Ｃ−１細胞を、３７℃で１．５ｈｒ、１０ｐｆｕ／細胞にて、指定のオルトポックスウイルスに感染させ、未結合のウイルスを洗い流した後、その細胞を、血清を含有しない最少必須培地（ＭＥＭ）内で１６ｈｒ、インキュベートした。次に、感染させた細胞由来の上澄み液を、先に述べたようにして調製した（AlcamiおよびSmith １９９５年ｂ）。あるいは、Ｓｆ２１細胞に、ＡｃＮＰＶまたはＡｃＡ４１Ｌｈｉｓを、１０ｐｆｕ／細胞で感染させ、３日後、上澄み液を収穫し、遠心分離（２０００ｘｇ、１０分間、４℃）によって透明にした。試料はすべて、１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質の電気泳動を行って、ニトロセルロース膜に移した後（Towbin外１９７９年）、そのブロットを、ウサギ抗Ａ４１Ｌ血清（１：２０００の比率で希釈）、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ接合体およびＥＣＬ試薬（Amersham）とともに、すでに報告されているように（ParkinsonおよびSmith １９９４年）および製造業者が指導しているようにして、逐次インキュベートした。
表面プラスモンレゾナンス（ＢＩＡcore分析）
ＢＩＡcoreのセンサーチップＣＭ５のカルボキシメチル化デキストランの表面を、４個のフローセルのうち３個を通じて、前記チップ上、５μｌ／ｍｉｎの流量の、５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と２００ｍＭのＮ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）で活性化した。その活性化されたチップの表面へのタンパク質のカップリングは、精製された、バキュロウイルス発現のＡ４１Ｌｈｉｓ（１０ｎｇ／μｌ）と３５Ｋｈｉｓ（１０ｎｇ／μｌ）を含有する１５ｍＭアセテートｐＨ４．０の３５μｌを、フローセル３と４それぞれを通じて、流量５μｌ／ｍｉｎで通過させることによって達成された。その次に、１Ｍエタノールアミン塩酸−ＮａＯＨ  ｐＨ８．５  ３５μｌを、５μｌ／ｍｉｎの流量で、ＮＨＳ／ＥＤＣで活性化されたフローセルを通じて通過させて、チップ表面を失活させた。各種の組換え化学誘引分子（例えば、アナフィラトキシンＣ５ａおよびＣＸＣ，ＣＣおよびＣのファミリー由来のケモカイン類）を、０．００５％のTween ２０を含有するＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）中１μＭの濃度で、チップ表面にカップリングされるＡ４１Ｈｉｓまたは３５ＫＨｉｓありまたはなしで、フローセル上を流量５μｌ／ｍｉｎで、ＣＭ５センサーチップ表面を横切って通過させた。前記化学誘引分子（分析対象物質）と表面にカップリングされたタンパク質（リガンド）との陽性の相互作用は、注入された分析対象物質がフローセルから溶出された後、最終ベースライン（応答単位）において増大することによって示された。分析対象物質を各々注入した後、センサーチップの表面を、５μｌ／ｍｉｎの流量の、０．１Ｍ  ＨＣｌの５μｌパルスで再生させて、結合している分析対象物質を、チップ表面にカップリングされたリガンドから取り去り、次に注入される化学誘引分子に対するチップ表面を調製した。
ウサギの皮膚モデルにＶＶが誘発した傷害の組織学的な検査
ＶＶのｖＡ４１Ｌ，ｖΔＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖをＰＢＳで希釈し、次いでこれらを、１０4，１０5または１０6ｐｆｕ／部位で、雌のニュージーランドの白ウサギ（体重１．５ｋｇ）の左と右の側腹部にそって、皮下注射し、注射してから３日後にこれらのウサギを殺した。感染に使用したウイルス類の力価をプラーク検定法で確認した。注射の部位に生成した病変部由来の生検組織試料を、ドライアイス上のイソペンタンバス中のO. C. T. Tissue−Tek（Bayer Diagnostics）を用いて凍結して、凍結切片を作製した。その凍結切片（１０μｍ厚）をスライドガラス（Horwell Superfrost）上に置いて、氷上で、２％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定してＰＢＣ中の０．１％Triton−Ｘ１００で膜透過性を与え、３７℃で５分間クエンチし、０．２％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび１ｍＭアジ化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のグルコースオキシダーゼ（０．５単位／ｍｌ）を用いて内因性ペルオキシダーゼを除き、ＰＢＳ（０．１％Triton含有）で３回洗浄し、次に５％の正常ウマ血清（Sigma）で３０分間ブロックした。その切片を、５％正常ウマ血清で１：１００の比率で希釈したマウスの抗ウサギＣＤ４３抗体（Serotec）で（１ｈｒ）、免疫染色（immunostain）して湿潤しているリンパ球（特にＴリンパ球、単球およびマクロファージ）を検出するか、または１：１０００の希釈率で希釈したマウス抗１４ｋモノクローナル抗体（ＭＡｂ  ５Ｂ４／２Ｆ２）（CzernyとMahnel １９９０年）で（１ｈｒ）免疫染色して、切片中のＶＶの存在を検出する。これらの切片を、０．１％Tritonを含有するＰＢＳ内で洗浄し（３回）、続いて、１：１００の比率で希釈したビオチニル化ウマ抗マウス二次抗体（Vector Laboratories）とともに３０分間インキベートし、先に述べたのと同様にして洗浄し、次にVectastain Elite ABC Reagent（Vector Laboratories）で３０分間処理した。５分間ずつ２回洗浄した後、免疫染色された切片を、色素原基質のジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）（Sigma）を、１０ｍＭイミダゾール中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いて可視化した。この基質は赤褐色の沈殿を生成し、続いて、（上記のようにして）さらに２回洗浄し次にＰＢＳでもう一回洗浄した。その切片を、クレージルバイオレットアセテート（１％）で対比染色（counterstain）し、７０％，８０％，９５％および無水のエタノールと濃度を上げたエタノールで脱水し、次いでＤＰＸ（ＢＤＨ Merck）を用いてカバーガラスを取り付けた。これらの切片の組織学的検査を、Zeiss Axiophot写真用顕微鏡を用い明るいフィールド照明下で行った。
試験結果
Ａ４１Ｌタンパク質は、Ｔ１／３５ｋＤａタンパクのファミリーに関連している
Ａ４１Ｌ遺伝子は、２１９個のアミノ酸残基を有する２５ｋＤａのタンパク質をコードしていると予測されていた（Goebel外１９９０年；Howard外１９９１年）。コンピューターによる分析によって、このタンパク質はＳＦＶＴ１タンパク質に関連していることが明らかにされた（Howard外１９９１年）。また上記Ａ４１Ｌ遺伝子の産物は、オルトポックスウイルス類およびListerを含むがＷＲを含まない各種のＶＶ株によって発現される、最近報告されたケモカイン結合タンパク質のｖＣＫＢＰと、２５％のアミノ酸同一性を共有している（Graham外１９９７年；Smith外１９９７年ａ；Alcami外１９９８年）。これらの類似性を、ＶＶ ＷＲ Ａ４１Ｌタンパク質とＶＶ ListerのｖＣＫＢＰ（Patel外１９９０年）を並べて、図１に示してある。またＡ４１Ｌは、痘瘡ウイルス株バングラディシュ１９７５年由来のＧ５Ｒタンパク質（Massung外１９９４年）およびＳＦＶＴ１タンパク質（Upton外１９８７年）にも関連している。ＶＶ株ＷＲのＡ４１Ｌタンパク質は、ＶＶ株コペンハーゲンのＡ４１Ｌタンパク質（Goebel外１９９０年）と９７．７％のアミノ酸同一性を有し、そして痘瘡ウイルス株Harveyの１６Ｌタンパク質（Aguado外１９９２年）と９７．７％のアミノ酸同一性を共有し、ならびに痘瘡ウイルス株バングラディシュ１９７５年由来のタンパク質Ａ４１Ｌ（Massung外１９９４年）および痘瘡ウイルス株インド１９６７年由来のタンパク質Ａ４６Ｌ（Shchelkunov外１９９４年）と類似の関連度を有している。８個のシステインの残基が保存されかつこれらのタンパク質の長さが類似していることに注目すべきである。Ａ４１Ｌ遺伝子の産物とｖＣＫＢＰの両者は、データベースの他の非ウイルスタンパク質の配列と有意な類似性がない。また、ＶＶ Ａ４１Ｌタンパク質とｖＣＫＢＰの間の関連は、これら二つのタンパク質の類似したヒドロパシィーのグラフ（図２）とそれらが酸性であること、ｐＩがＡ４１Ｌは５．４でｖＣＫＢＰは４．３であることによって示されている。
Ａ４１Ｌ遺伝子は、細胞培養においてウイルスが複製するのに必須の遺伝子ではない
痘瘡ウイルス株Harvey、インド−１９６７年とバングラディシュ−１９７５年およびＶＶ株のコペンハーゲンとＷＲのゲノムの配列分析結果は、ＶＶ ＷＲ Ａ４１Ｌタンパク質に均等のタンパク質が各ウイルス中に存在し、しかも高度に保存されていることを示した。このことは、Ａ４１Ｌタンパク質が、前記ウイルスに対して、重要な機能を持っている可能性があることを示唆している。このことをさらに探究するため、我々は、Ａ４１Ｌ遺伝子を欠いているＶＶ欠失突然変異体を製造することを試みた。Ａ４１Ｌタンパク質は、ＶＶ Listerおよびいくつかの他のＶＶ株のｖＣＫＢＰに関連があるから（Alcami外１９９８年）、ｖＣＫＢＰは、機能的に、Ａ４１Ｌ遺伝子の喪失を補償する可能性があった。この起こりうる面倒なことを避けるため、ＶＶ株ＷＲがｖＣＫＢＰを発現しないのでこの株を選択した。Ａ４１Ｌは保存されているにもかかわらず、生存可能な欠失突然変異体が単離された。
ｖΔＡ４１Ｌおよび野生型ウイルス（ｖＡ４１Ｌ）と復帰ウイルス（ｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖ）のゲノムの分析結果は、これらが予想されたゲノム構造を有していることを示した（図３）。クローン化されていないＷＲウイルス、ｖＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖ由来のＥｃｏＲＶで消化したＤＮＡは、１９９１ｂｐのフラグメントを提供したが、このフラグメントは、遺伝子の５′領域から左のフランキング配列中に延びるプローブ、およびｖΔＡ４１Ｌから削除されている領域内の遺伝子の３′末端の近くからのプローブで検出された。予想通りに、この３′プローブは、ｖΔＡ４１Ｌのいずれのフラグメントも検出せず、そして５′プローブは１３９１ｂｐの小さいフラグメントを検出したが、これはＡ４１ＬＯＲＦの大部分が喪失していることと一致している。ＯＲＦに隣接するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ分析を行うと、ＷＲ，ｖＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖのウイルスの区別できない大きさのフラグメントおよびｖΔＡ４１Ｌの６００ヌクレオチド小さいフラグメントが検出された（データは示されていない）。
細胞培養における、ｖＡ４１Ｌ，ｖΔＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖのウイルスの増殖は均等であった。各ウイルスによって、ＢＳ−Ｃ−１細胞に形成されたプラークは同じ大きさであり、そして１ｐｆｕ／細胞でＢＳ−Ｃ−１細胞に感染させた後２４ｈｒ（２４ｈｐｉ）に産生された細胞内ウイルスの収量は各ウイルスについて区別できなかった（データは示していない）。
Ａ４１Ｌタンパク質の発現と精製
バキュロウイルスからＡ４１Ｌタンパク質が発現されるのを実証するため、ＡｃＡ４１Ｌｈｉｓを感染させたＳｆ２１細胞の上澄み液中のタンパク質を、Ｈｉｓ（６）タグに対するモノクローナル抗体（Clontech）で免疫ブロットすることによって分析した（図４ａ）。この抗体は、ＡｃＡ４１Ｌｈｉｓが産生する３０ｋＤａのタンパク質を検出したが、ＡｃＮＰＶが産生する３０ｋＤａタンパク質を検出しなかった。このことは、Ａ４１Ｌタンパク質が、バキュロウイルスに感染した細胞から発現され分泌されたことを確証している。
Ａ４１Ｌｈｉｓタンパク質を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、バキュロウイルスに感染させたＳｆ２１細胞の上澄み液から精製した（図４ｂ）。Ａ４１Ｌｈｉｓは、クマシーブルーで染色することによって、細胞上澄み液中の支配的なタンパク質として検出された。Ａ４１Ｌｈｉｓタンパク質は、ニッケルカラムを、透明にした上澄み液を通過させることによって選択的に除去された。結合したＡ４１Ｌｈｉｓタンパク質は、イミダゾールの濃度を上昇させるとカラムから溶出され、６０ｍＭのイミダゾールで大部分のＡ４１Ｌｈｉｓタンパク質が溶出した。溶出されたタンパク質を、monoＱカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーとＦＰＬＣでさらに精製した。得られた精製タンパク質は、均質のようであるので（データは示していない）、ウサギの免疫化、および材料と方法の項で述べたＢＩＡcore２００の表面プラスモンレゾーナンス分析を行うために使用した。
Ａ４１Ｌタンパク質はＶＶに感染した細胞から分泌される
ＶＶのＡ４１Ｌタンパク質を確認して特性解析を行うため、ウサギを、精製されたＡ４１Ｌｈｉｓタンパク質で免疫化することによって抗体を産生させ、その抗体を、イムノブロッティングに使用して、ＶＶに感染させた細胞から産生されるＡ４１Ｌタンパク質を検出した（図４）。３０ｋＤａのタンパク質は、ＷＲ，ｖＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖに感染させた細胞の上澄み液中に検出されたがｖΔＡ４１Ｌに感染させた細胞の上澄み液中には検出されなかった（図５ａ）。感染中に、該タンパク質が産生されたことを確認するため、感染後、異なる時間に、または感染後にシトシンアラビノシド（ａｒａＣ）（ウイルスＤＮＡ複製の阻害剤であり、したがって中期および後期のタンパク質合成を阻害する）の存在下で、上澄み液を採取した（図５ｂ）。Ａ４１Ｌタンパク質は、２ｈｐｉという初期に、ａｒａＣの存在下で検出された。これは、このタンパク質が初期に発現されたことを示している。しかし、このタンパク質は、感染中、後期にも発現され、そのレベルは１６ｈｐｉまで増加し続けた。その初期と後期の発現は、ポックスウイルスの発現ベクターとして広く使われている初期／後期のｐ７．５プロモーター（Smith １９９１年）から発現されるｖＣＫＢＰの発現に類似している。Ａ４１Ｌタンパク質は、ツニカマイシンまたはモネンシンの存在下で合成されると大きさが小さくなり、Ｎ−連結およびＯ−連結の炭水化物を含有している（図５ｃ）。
Ａ４１Ｌタンパク質はオルトポックスウイルス中に保存されている
オルトポックスウイルスゲノムのＤＮＡ配列データは、Ａ４１Ｌ遺伝子が高度に保存されていることを示した。このことは、ＶＶの１６種の株および牛痘ウイルスの２種の株を感染させた細胞由来の上澄み液のイムノブロッティングによって、さらに検査した（図６）。そのデータは、これらのウイルスがすべて、類似した大きさのタンパク質を発現するが異なるレベルで発現することを示している。なおこのタンパク質は抗Ａ４１Ｌ抗体によって認識される。
Ａ４１Ｌタンパク質は、ＣＸＣケモカイン類のＭｉｇとＩＰ−１０に結合する
Ａ４１Ｌタンパク質がｖＣＫＢＰに類似していることは、Ａ４１Ｌタンパク質が、ｖＣＫＢＰと同様に、ケモカイン類に結合できることを示唆している。しかし、ＶＶ ＷＲに感染させた細胞由来の上澄み液は、ヒトＣＣケモカイン類のＭＩＰ−１αもしくはＲＡＮＴＥＳまたはヒトＣＸＣケモカイン類のＧＲＯ−αおよびＩＬ−８に結合するタンパク質を含有していないことを示した。Ａ４１Ｌタンパク質がその試験に含めなかった他のケモカイン類と結合するかどうかを確認するため、精製されたＡ４１Ｌｈｉｓと３５Ｋｈｉｓ（ｖＣＫＢＰ）のタンパク質を、ＢＩＡcore２００システム（Pharmacia）の別個のフローセル内の、ＮＨＳで活性化されたカルボキシメチル化セルロースＣＭ５のバイオセンサーチップ上に、ＥＤＣを介して化学的に架橋結合させた。次に、そのチップ表面を、エタノールアミン塩酸を使用して失活させて、未結合のタンパク質を除去した。各種の組換えヒト化学誘引タンパク質（６種のＣＣケモカイン類、８種のＣＸＣケモカイン類、Ｃケモカインのリンホタクチンおよび補体Ｃ５ａアナフィラトキシンを含む）を、全フローセルのチップ表面を横切って逐次通過させた。各化学誘引タンパク質を、横切って通過させた後、塩酸（０．１Ｍ）を使用してチップ表面を再生させた。予想どおりに、ＣＣケモカイン類のＭＩＰ−１αとＭＣＰ−１は、Ａ４１Ｌまたは対照と比較して、ｖＣＫＢＰに対し陽性の信号を与えた（図７ｂ）。このことは、これらＣＣケモカインがｖＣＫＢＰに結合するがＡ４１Ｌには結合しないことを確証している。ｖＣＫＢＰまたはＡ４１Ｌは、ＣＸＣケモカインのＩＬ−８とＮＡＰ−２に対し非特異的な結合をすることが観察されたが、ＭｉｇとＩＰ−１０はＡ４１Ｌと特異的に結合した（図７ａ）。試験された他のケモカイン類：ＮＡＰ−２，ＧＲＯ−α，ＧＲＯ−γ，ＰＦ４，ＳＤＦ−１α，ＥＮＡ−７８，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＣＰ−２，エオタキシン，Ｉ−３０９，リンホタクチン，およびアナフィラトキシンＣ５ａはすべて、Ａ４１Ｌが結合しなかった（データは示していない）。
Ａ４１Ｌタンパク質は、感染したウサギの皮膚中に細胞が湿潤するのを阻害する
Ａ４１Ｌタンパク質が、ＶＶに感染する宿主の応答を左右するかどうかを確認するため、ウイルスのｖＡ４１Ｌ，ｖΔＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖ（１０4ｐｆｕ）をウサギの皮下に注射し、３日後に、その病変部を検査した。Ａ４１Ｌを発現しないウイルス（ｖΔＡ４１Ｌ）によって誘発された病変部と、Ａ４１Ｌを発現するウイルス（ｖＡ４１ＬとｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖ）によって誘発される病変部の間に、細胞浸潤とウイルス抗原に明白な差があった。ｖΔＡ４１Ｌを感染させた病変部を、抗ウサギＣＤ４３抗体を用いて免疫染色（immunostain）したところ、浸潤する細胞をほとんど示さなかったｖＡ４１ＬとｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖと比べて、皮膚の下部血管領域のＣＤ４３+細胞の強い浸潤（赤褐色に染色された）が明らかになった。抗１４ｋモノクローナル抗体による免疫染色によって明らかになった、真皮と表皮に存在するＶＶ抗原の量は、ｖＡ４１ＬおよびｖＡ４１Ｌ−ｒｅｖによって起こった病変部の方がｖΔＡ４１Ｌによる病変部より広範囲にわたっていた（赤褐色に染色された）。このことは、Ａ４１Ｌタンパク質が、生体内で抗ウイルス免疫応答中（恐らくＩＰ−１０やＭｉｇに結合して阻害することによって）、単球、マクロファージおよびＴリンパ球の浸潤を下方調節できるので、皮膚の病変部を通じてウイルスを大きく散在させる（dissemination）ことができることを示している。これは、免疫浸潤に直面したときに、ウイルスが広がるのを減らすはたらきをしたｖΔＡ４１Ｌと対照的である。
考  察
ここで、我々は、ＶＶ遺伝子Ａ４１Ｌがコードするタンパク質の特性解析を行う。この遺伝子産物は、試験された１８株のオルトポックスウイルスすべてが発現する３０ｋＤａの分泌糖タンパク質であり、またその遺伝子は３株の痘瘡ウイルス中に高度に保存されている。このように保存されているにもかかわらず、そのタンパク質はＶＶが複製するのに必要ではなく細胞培養中に広がる。それにもかかわらず、Ａ４１Ｌタンパク質はＣＸＣケモカインのＭｉｇとＩＰ−１０に結合するが、他の１５種のＣＣケモカインとＣＸＣケモカインには結合しない。この点については、Ａ４１Ｌタンパク質は、新たに確認されたｖＣＫＢＰよりケモカイン選択性がはるかに大きく、かつ試験されたすべてのＣＣケモカイン類に無差別に結合する構造の類似性をｖＣＫＢＰと共有している（Alcami外１９９８年）。以後、Ａ４１Ｌタンパク質はｖＣＫＢＰ−２と呼び、ＶＶ株Listerの３５ｋＤａのタンパク質をｖＣＫＢＰ−１と呼ぶ。
ＩＰ−１０とＭｉｇはＣＸＣケモカイン類のサブグループの代表例である（総説についてはFarber １９９７年を参照のこと）。これらのケモカインは、他のＣＸＣケモカインより互いに一層密接に関連しており（アミノ酸の同一性は３７％）、そして、角化細胞、内皮細胞、リンパ球、単球および好中球によるこれらケモカインの発現はＩＦＮ−γによって誘発される（LusterおよびRavetch １９８７年ｂ；LusterおよびRavetch １９８７年ａ；Farber １９９３年；Cassatella外１９９７年）。また、ＩＰ−１０とＭｉｇは、好中球を誘引しないが、代わりに、単球と活性化されたＴリンパ球の遊走を刺激するという点で、他のＣＸＣケモカイン類と異なっている（Taub外１９９３年）。ＩＰ−１０とＭｉｇをコードする遺伝子は、染色体４の、他のＣＸＣケモカイン類遺伝子のクラスターから離れた遺伝子座に、近接して存在している（LeeおよびFarber １９９６年）。ＩＰ−１０とＭｉｇの両者には、７膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体（ＣＸＣＲ３）が結合する。そして、この受容体は、いくつもの他のＣＫＲより高い選択性を示してＩＰ−１０とＭｉｇを特異的に認識するが他のＣＸＣとＣＣのケモカイン類を認識しない（Loetscher外１９９６年）。また、ＣＸＣＲ３は、Ｔ細胞が活性化された後にしか、Ｔ細胞で発現されないという点で選択性を示している（Loetscher外１９９６年）。この特異的発現は、選択的ＩＦＮ−γ依存性漸増（selective IFN-γ-dependent recruitment）またはＭｉｇとＩＰ−１０によるエフェクターＴリンパ球の浸潤を示唆している。これらのケモカイン類は、結核様らいの遅延型過敏症（ＤＴＨ）の皮膚病変部におけるかような細胞の漸増（recruitment）（Kaplan外１９８７年）；皮膚リーシュマニア症（Kaplan外１９８７年）；及び乾癬のような自己免疫炎症疾患（Gottlieb外１９８８年；Gottlieb １９９０年）に関与しているといわれており、これらの場合、ＩＰ−１０の高い発現レベルが検出された。ＭｉｇとＩＰ−１０は、ウイルスまたは原虫が感染した後の活性化Ｔ細胞の漸増に関与しており（Amichay外１９９６年；AsensioおよびCampbell １９９７年；Cheret外１９９７年；Narumi外１９９７年）、そしていくつかの場合は、例えばＣ型肝炎ウイルスによる慢性感染症の病状に関与している（Narumi外１９９７年）。ＩＰ−１０が疾患の原因になっていると思われる他の疾患は、成人型呼吸窮迫症候群（Abdullah外１９９７年）；ライム病（Ebnet外１９９６年）；アテローム性動脈硬化症と再狭窄（Wang外１９９６年）；乳癌細胞の移動、浸潤および転移（Youngs外１９９７年）；皮膚Ｔ細胞のリンパ腫（Sarris外１９９６年）；および糸球体の疾患と関連がある尿細管間質性腎炎（Tang外１９９７年）である。また、ＩＰ−１０とＭｉｇは、骨髄移植を行った後に有害になることがある造血前駆細胞の産生も抑制する（Schwartz外１９９７年）。
ＭｉｇとＩＰ−１０の可溶性でかつ選択的な阻害剤として、ｖＣＫＢＰ−２は、これらのケモカインが誘発する過大な炎症反応と組織の損傷を抑制する選択的薬剤として、薬学上重要な新規な化合物の代表的なものである。ｖＣＫＢＰ−２またはこれから誘導される分子を投与することによって、これらケモカインが誘発する疾患を予防または軽減することができる。その上に、ｖＣＫＢＰ−２がＭｉｇやＩＰ−１０と複合体を形成する両者の構造上の相互作用の研究は、これらケモカインと細胞受容体ＣＸＣＲ３との相互作用について価値ある情報を提供することができる。この情報は、ＭｉｇやＩＰ−１０とＣＸＣＲ３との相互作用を遮断する小さな阻害剤を設計するのに役立つであろう。ＣＸＣＲ３は膜に結合していて、かつケモカイン結合活性を保持する可溶性の誘導体分子を欠いているため、ＣＸＣＲ３を操作することによって上記の目的を達成することは容易ではない。
ｖＣＫＢＰ−２の特異性は、このタンパク質を発現するＶＶなどのオルトポックスウイルスの生物学に関連して興味深い。また、いくつものオルトポックスウイルスは、ＣＣケモカイン類に結合するタンパク質（ｖＣＫＢＰ−１）を発現するので、ＣＣケモカインによって誘引される単球などの細胞の漸増、例えばエオタキシンによって誘引される好酸球の漸増が制限される（Graham外１９９７年；Smith外１９９７年ａ；Alcami外１９９８年）。しかし、オルトポックスウイルスは、好中球の漸増を阻害する（ＭｉｇやＩＰ−１０に特異的なｃＣＫＢＰ−２とは異なる）ＣＸＣケモカイン結合タンパク質を発現しない。このことは、活性化Ｔ細胞、単球およびマクロファージの漸増が、ＶＶの感染の抑制と排除（clearance）を行うのに、好中球の漸増より重要であることを示唆していると考えられる。あるいは、ＶＶが、好中球の正常な機能を遮断する別の機構をもっている可能性がある。
ここで、我々は、ｖＣＫＢＰ−２が、ウサギの皮膚のＶＶ感染部位に対する炎症細胞の漸増、およびウイルス抗原の量で示されるウイルスの複製と蔓延の程度に、大きく影響することを示す。このことは、ＶＶの感染がＭｉｇやＩＰ−１０の発現を誘発する（Amichay外１９９６年）とか、組換えＶＶからのＭｉｇとＩＰ−１０の発現によってＶＶのビルレンス（virulence）が低下した（Ramshaw外１９９７年）という観察結果と一致している。また、Ａ４１Ｌ遺伝子を除くと、ＶＶ ＭＶＡのようなＶＶ株の免疫原性と安全性を増大するようである。なお、このＶＶ ＭＶＡは、各種の癌ならびにある範囲の病原体、例えばマラリア、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する組換え治療用ワクチンとして開発されている安全な免疫原性ＶＶ株である。
要約すると、我々は、ポックスウイルスが発現する新規なタンパク質であって、ＣＸＣケモカインのＭｉｇとＩＰ−１０に結合して、感染に対する宿主の応答を妨害するタンパク質を確認したのである。ｖＣＫＢＰ−２と呼ばれるこの分子は、過大なＭｉｇとＩＰ−１０の活性で誘発される疾病およびＣＸＣＲ３に結合する病原体によって誘発される感染症の阻害剤としての治療力をもっている。この分子は、これらのケモカインを検出するために、キットに入れる有用な薬剤であり、コード遺伝子を操作することによって、一層免疫原性の高いポックスウイルスベースのワクチンを構築することができる。
参考文献
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図面の説明文
図１．ＶＶ ＷＲ Ａ４１Ｌタンパク質（Smith外１９９１年）、および米国ウイスコンシン州所在のGenetics Computer Group Inc.のＰＩＬＥＵＰおよびＰＲＥＴＴＹＰＬＯＴのプログラム（Devereux外１９８４年）を使用して創製されたＶＶ Lister由来のｖＣＫＢＰ（Patel外１９９０年）のアミノ酸配列の配列。箱枠内のアミノ酸は、上記の両タンパク質内に保存されている。Ｎ末端のシグナルペプチドの後の８個の保存されたシステイン残基は・印でマークしてある。
図２．ＶＶ ＷＲ Ａ４１Ｌ（Smith外１９９１年）、およびＧＣＧパッケージ（Devereux外１９８４年）で創製されたｖＣＫＢＰタンパク質（Patel外１９９０年）の疎水性のプロット。ｖＣＫＢＰの対の垂直線の間の領域は、Ａ４１Ｌタンパク質にはない領域を示す。
図３．組換えウイルスゲノムのサザーンブロット分析の結果。（a）ウイルスゲノムの予想構造を示す線図。異なるウイルスのＡ４１Ｌ遺伝子に延びているＥｃｏＲＶのフラグメントの大きさと、サザーンブロッティングに使われる二つのプローブの位置。（b）サザーンブロット。ウイルスＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶで消化し、０．８％アガロースゲル上を泳動させ、ナイロンフィルターに移し、次いで、上記（a）に示した領域由来のフルオレセインで標識されたＤＮＡプローブでプローブした。結合したプローブを、材料と方法の項で説明したようにして検出した。上記二つのプローブで検出されたヌクリオチドのバンドの大きさを示してある。
図４．Ａ４１Ｌタンパク質の発現と精製。（a）イムノブロット。ＡｃＡ４１Ｌｈｉｓ（クローン１と２）を感染させたＳｆ２１細胞の上澄み液中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）によって分割し、ニトロセルロースに移し、次いでＡ４１Ｌタンパク質に対するウサギ抗血清でプローブした。（b）ニッケル−キレートアフィニティークロマトグラフィーによるＡ４１Ｌｈｉｓタンパク質の精製を示す、クマーシーで染色されたゲル。粗上澄み液中に存在するタンパク質を、ニッケルカラムに加えた後のフロースルー（flowthrough）中に存在するタンパク質およびイミダゾールの濃度を増大した際に溶出するタンパク質と比較している。タンパク質分子量のマーカーの大きさはｋＤａで示してある。
図５．ＶＶ ＷＲが産生したＡ４１Ｌタンパク質の特性解析結果を示すイムノブロット。（a）ＢＳ−Ｃ−１細胞に、指定のウイルスを１０ｐｆｕ／細胞で感染させるかまたはモック（mock）感染させて、上澄み液を１６ｈｐｉで調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分離してニトロセルロースに移した後、得られたブロットをＡ４１Ｌタンパク質に対するウサギ抗血清とともにインキュベートし、結合した抗体を、材料と方法の項で説明したようにして検出した。（b）Ａ４１Ｌタンパク質は、感染中の初期と後期に産生される。細胞は、指定の期間、ＷＲウイルスに感染させるか、または４０μｇ／ｍｌのａｒａＣの存在下で感染させるかまたはモック感染をさせた。上澄み液を調製し、（a）のようにして分析した。（c）Ａ４１Ｌタンパク質はＮ−連結炭水化物とＯ−連結炭水化物を含有している。細胞は、モネンシン（１μＭ）またはツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、１６ｈｒ、ＷＲウイルスに感染させた。上澄み液を調製して（a）のようにして分析した。タンパク質分子量のマーカーの大きさはｋＤａで示してある。
図６．Ａ４１Ｌタンパク質はオルトポックスウイルス中に保存されている。ＢＳ−Ｃ−１細胞に指定のウイルスを感染させるかまたはモック感染をさせ、次いで材料と方法の項に記載したようにして、上澄み液を１６ｈｐｉで調製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分析し、ニトロセルロースに移し、次いでＡ４１Ｌタンパク質に対するウサギ抗血清でプローブした。結合した抗体を材料と方法の項に記載したようにして検出した。タンパク質分子量のマーカーの大きさはｋＤａで示してある。
図７．ＢＩＡcore２０００分析。精製されたＡ４１Ｌｈｉｓタンパク質またはｖＣＫＢＰタンパク質を別個のフローセルに固定化して、指定された被分析ケモカインの結合性を材料と方法の項に記載したようにして分析した。対照は、チップ表面にタンパク質が結合されていない第三のフローセルを示す。a）ＣＸＣケモカイン類。b）ＣＣケモカイン類。センサーグラム（sensorgram）を示してある。
図８．ＶＶ株ＷＲ Ａ４１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列とフランキング配列（Smith外１９９１年）。Ａ４１Ｌ遺伝子のコード領域は、１２１位から始まり７８０位で終了している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図８】
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