(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗真菌剤として作用するスピルリナ・プラテンシス粉末と、コンパニオン生物として作用する担子菌門から選択される真菌類と、からなる相利共生混合物に関連する、汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法であって、前記汚染真菌は不完全菌門又は子嚢菌門から選択される方法において、前記方法は、
前記スピルリナ・プラテンシス粉末と前記担子菌門から選択される真菌類との相利共生混合物を調製する工程と、
成長を制御するのに有効な量の前記相利共生混合物であってプレウロタス・プルモナリウス及びレンチニュラ・エドデスを含む同相利共生混合物を、園芸製品、担子菌の成長培地、農業製品及びその組み合わせからなる群から選択した対象場所又は前記対象場所に隣接した場所に適用する工程と、を含み、
前記対象場所は前記汚染真菌を含む、方法。
【請求項２】
前記方法は無菌状態にて完了する、請求項１に記載の汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法。
【請求項３】
前記調製工程がさらに、ｐＨ８．５の０．８４ｗ／ｖの炭酸水素ナトリウムを含む再水和溶液で前記混合物を再水和する工程を含み、前記再水和工程が１２時間にわたる、請求項１に記載の汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法。
【請求項４】
前記再水和工程を８ないし８０ワット／ｍ2の照明下で実施する、請求項３に記載の汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法。
【請求項５】
前記再水和溶液が０．０４〜０．２５ｗ／ｖの亜硫酸ナトリウムを含む、請求項３に記載の汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法。
【請求項６】
前記方法は、汚染真菌の成長速度を制御するために、可視光を使用する工程を更に含む、請求項１に記載の汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法。
【請求項７】
前記方法は、汚染真菌の成長速度を制御するために、可視光を使用する工程を更に含む、請求項２に記載の汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法。
【請求項８】
抗真菌剤として作用するスピルリナ・プラテンシス粉末と、コンパニオン生物として作用する担子菌門から選択される真菌類と、からなる相利共生混合物に関連する、汚染真菌の成長を制御、阻害及び抑制するための方法であって、前記汚染真菌は不完全菌門又は子嚢菌門から選択される方法において、前記方法は、
前記スピルリナ・プラテンシス粉末と前記担子菌門から選択される真菌類との相利共生混合物を調製する工程と、
成長を制御するのに有効な量の前記相利共生混合物を、園芸製品、担子菌の成長培地、農業製品及びその組み合わせからなる群から選択した対象場所又は前記対象場所に隣接した場所に適用する工程と、を含み、
前記対象場所は前記汚染真菌であるトリコデルマ・ビリデを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、処理したスピルリナ配合体を制御剤または阻止剤として使用して真菌の感染または蔓延を制御または阻止する生物学的制御方法に関する。
本発明はまた、処理したスピルリナ配合体を制御剤または阻止剤として使用して生物および動物、より詳細には、有害生物や有害生物に関連する疾患を生物学的に制御する方法に関する。
背景技術
スピルリナは、国際食品医薬品基準によりタンパク質源としてヒトおよび動物の摂取が許可されている。スピルリナはカロチノイド、ビタミン、ミネラルも含んでいる（Ｈａｙａｓｈｉ  ＆  Ｈａｙａｓｈｉ「藍藻類、スピルリナ  プラテンシスからのカルシウム  スピルラン、エンベロープ  ウイルスの複製インヒビタ」Ｊ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ（１９９６），５９，８３ｐ）。
上記論文および米国特許第５５８５３５４号（Ｈａｙａｓｈｉ等）から明らかなように、スピルリナが抗ウィルス活性を持つことも知られている。スピルリナを熱水抽出し、そこからカルシウム多糖類を精製することが開示されている。精製した抽出物はウィルス疾患の治療に有効であった。
米国特許第４８４５０８５号（Ｓｅｓｉｎ）には、ノストック種（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）由来の半合成化合物が抗真菌活性を有するものとして開示されている。しかし、この化合物は、菌糸状真菌に対してのみ最も有効であると開示されている。スピルリナなどの種からの二次代謝物は汚染防止剤としても使用されている（ＤＥ１９６４３２４（抄録））。
さらに、スピルリナは、例えば、血糖値の低下（糖尿病での）、血中コレステロールの低下、その他の生物活性を持つことが報告されている（ハヤシ等）。スピルリナの他の生物活性は、例えば、Ａｍｉｒａｎｉ（ケミカル  アブストラクト、９１：１６９１４２ｎ）、スピルリナからの制限酵素を開示している米国特許第４８８６７５６号（カワムラ）、スピルリナからの生理活性物質の製造法を開示しているＪ６３０３３９１（要約）に開示されている。
競合生物（有害生物または汚染体）の確立を妨害しまたはコンパニオン生物の成長を促進するための作用剤の使用が知られている。
しかし、現在、競合生物を阻止または抑制し、作用剤の遺伝子型を変えることなく、外部因子を介して、作用剤とコンパニオン生物との間の相利共生的関係を維持できる生物学的制御方法は存在しない。
本発明者らは、スピルリナが特に抗真菌剤（または殺真菌剤）であることを示唆する報告やスピルリナが農業上および園芸上の有害生物を生物学的に制御する作用剤として作用できることを示唆した報告は知らない。
本発明の目的は、処理したスピルリナ配合体を使用して、このような制御方法の不在を克服することである。本発明の一つの特色の別の目的は、可視光を排除することにより、作用剤の活性を調節することのできる改良された生物学的制御方法を提供することである。
発明の概要
本発明は、コンパニオン生物（抗真菌作用剤と相利共生関係になる対象パートナー）に関連する真菌汚染体の成長と作用を阻止および抑制するための生物学的制御方法であって、前記抗真菌作用剤が処理したスピルリナ配合体であり、前記方法が
処理したスピルリナ配合体を調製する工程と、
園芸製品、キノコの菌糸、農業製品およびそれらの組合せからなる群より選択した対象場所またはそれに隣接して前記配合体を施用する工程とを含み、
前記調製が、乾燥させたスピルリナを再水和し、培養物にストレスを与え、凍結乾燥して粉末にする工程を含む方法を提供する。
好ましくは、前記方法は作用剤の活性を調節するための手段を含み、この手段は可視光であり、その作用剤は液体培養物のスプレーとして施用される。
作用剤のクロロフィル緑の着色の強さを発明の調製物の使用寿命の指標として用いることが有利である。
本発明はまた、生物学的有害生物を阻止、抑制または除去するための生物学的制御方法であって、殺有害生物作用剤を使用し、前記作用剤は処理したスピルリナ配合体であり、前記方法は、
処理したスピルリナ配合体を調製し、そして
抑制、除去または制御すべき有害生物を含む流体；および有害生物の発生源またはこれに隣接し、または有害生物の知られている飛行経路に沿ったエサ場からなる群より選ばれた対象場所またはこれに隣接して前記配合体を施用する工程を含み、
前記の調製は乾燥させたスピルリナを再水和し、培養物にストレスを与えそして凍結乾燥して粉末にする工程を含む方法を提供する。
好ましくは、このような有害生物は甲殻類および昆虫であり、より詳細には、農業、園芸および医学の分野で有害生物とみなされる昆虫である。エサ場が有害生物の公知の誘引物質を含んでいることも好ましい。
発明を実施するための最良の形態
例示のためだけに、本発明の好ましい実施形態を一連の実施例を参照して詳述する。
真菌汚染体、コンパニオン生物および作用剤という用語は、好ましい実施形態の記載においてのみ下記の意味を有する。
真菌汚染体−分生子および子嚢を夫々形成する不完全菌門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ）および子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）。
コンパニオン生物−作用剤と相利共生関係になる対象パートナー。
作用剤−光合成能と窒素固定の両方の代謝活性を持つスピルリナ属のシアノバクテリア細胞の生存培養物。
次のものを使用して実験を行った。
真菌汚染体：
ボタンタケ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ）−トリコデルマ・ビリデ・カンタベリー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ）ＣＴＶ１。
真菌汚染体は、ニュージーランドのカンタベリー大学、動物学部から入手できる。
コンパニオン生物−坦子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）
プレウロタス・プルモナリウス・カンタベリー（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｉｕｓ  Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ）ＣＰＰ１（オイスターマシュルーム）またはレンチニュラ・エドデス・ウェスタン・バイオロジカルス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）Ｃ１０、Ｃ１３またはＣ４０（シイタケ）の中の一つ。
コンパニオン生物は、標準的な組織培養手法（Ｓｔａｍｅｎｔｓ  Ｐ、Ｇｒｏｗｉｎｇ  Ｇｏｕｒｍｅｔ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ、Ｔｅｎ  Ｓｐｅｅｄ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）で培養したが、ニュージーランドのカンタベリー大学、動物学部から入手できる。
作用剤：スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）（カリフォルニア州、Ｅａｒｔｈｒｉｓｅ  Ｆａｒｍｓ、大量培養施設）
配合体の調製：
乾燥させたスピルリナ・プラテンシスを０．８４ｗ／ｖの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．５）中で約１２時間、好ましくは照明下（８〜８０ワット／ｍ2）で再水和させた。
細菌の成長を阻止するために、再水和溶液はさらに随意に０．０４〜０．２５ｗ／ｖの亜硫酸ナトリウムを含むことができる。
栄養分の減少や部分的な乾燥により培養物にストレスを与え休眠期にする。
配合体を凍結乾燥させて無菌粉末が得られた。別法では、市販の乾燥したＳ．プラテンシス細胞（Ｅａｒｔｈｒｉｓｅ  Ｆａｒｍｓ）を利用した。
実験室の試験：
実施例１−コンパニオン生物の感染
プレウロタス・プルモナリウスの組織のサンプルをＰＤＡプレートで、２５℃で培養した。生じた菌苔が培地の表面積の約３分の２になったときに、各培養複製物に２．５％のトリコデルマ・ビリデの浸軟した菌糸と胞子の縣濁液を画線接種し、２５℃で５〜７日間インキュベートして、汚染体の胞子形成を確立した。汚染体の胞子形成は、特徴的な分生子の緑色の着色で可視的に示された。感染させたプレートをさらに対照群と被験群とに分けた。
作用剤による処理：
被験群を個々に、スピルリナ・プラテンシスで表面噴霧処理した（０．１、１および５％ｗ／ｖ）。
プレート全体の比較：
被験群と対照群の微生物集団の組成を毎日定性的に観察した。２〜５日以内に汚染体であるＴ．ビリデは対照群の培養物のプレートの表面を完全に覆ったが、被験群でのＴ．ビリデ感染の相対量はすべての被験濃度（０．１、１および５％ｗ／ｖ）の作用剤の存在下で経時的に低下した。
作用剤の施用約２４時間後に、汚染体の分生子の色は緑色からより濃い緑がかった褐色に変化した。４日以内に、汚染体の分生子は緑色の球状塊の外観を有するようになり、Ｐ．プルモナリウスの白色菌糸が急速に緑色の物質に侵入した。４８時間以上さらにインキュベートした後、培地および坦子菌の表面には汚染体の痕跡は可視的に認められず、Ｐ．プルモナリウスは完全に回復し、各試験プレートの表面に連続した菌苔を形成した。
光学および走査電子顕微鏡試験
作用剤による処理の前後に、Ｔ．ビリデで汚染されたＰ．プルモナリウス培養物を形態的に比較観察した。処理前には、Ｔ．ビリデの分生子柄の分岐パターンが認められ、フィアライドは特徴的な分岐構造に分化し、分生子の鎖で終端していた。処理１日後、分生子は表面に刻紋（オーナメンテーション）の全くまたはほとんどない球形構造の外観を有していた。５日目に菌糸および分生子の構造体は、細胞壁で仕切られていないように見える無定型の原形質塊に融合した。Ｐ．プルモナリウスの菌糸がこの塊に侵入していることが観察された。汚染体がコンパニオン生物であるＰ．プルモナリウスによって腐生代謝されていたと結論された。
坦子菌であるＬ．エドデスを使用して実験手順を繰り返したところ、上記と同様な一連の事象が観察された。
実施例２−汚染体の処理
２．５％のＴ．ビリデの浸軟した菌糸と胞子の縣濁液をＰＤＡプレートに画線接種し、２５℃で５〜７日間インキュベートした。胞子形成時に、各培養物複製プレートに、培地表面の１００％または５０％にわたって、１％ｗ／ｖの作用剤を噴霧した。
１００％の範囲に噴霧処理した培養複製物は噴霧３日以内に黒色となった。Ｔ．ビリデの分生子柄および分生子は乾燥した。生存胞子は生じず、汚染体の再成長は起こらなかった。
５０％の範囲に噴霧処理した培養複製物では、噴霧した領域と噴霧しなかった領域の間に明確な境界区分が認められた。噴霧した領域は１００％の範囲に噴霧した培養物で認められたものと同じように変性し、濃茶色または黒色になった。しかし、約５日後、境界は徐々になくなり、作用剤が噴霧しなかったところまで移動し、損傷を受けていなかった汚染体の菌糸を攻撃した。上記の観察はこの作用剤が他のシアノバクテリアと同様に移動能を有していることを示した。シアノバクテリアの移動速度は約２．５ｍｍ／日と推定された。
実施例３−共培養試験
Ａ）作用剤による前処理
Ｓ．プラテンシスの粉末５ｇを市販のキノコの菌糸（Ｐ．プルモナリウスおよびＬ．エドデス）と混合した。次いで、公知の方法で、作用剤／コンパニオン生物の混合物をピナス・ラジアータ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）成長培地の３ｋｇのプラスチック袋内で培養した（製造用袋栽培）。初回フラッシュ（子実体または「キノコ」の生成）までの時間と子実体の形と味を対照と比較して評価した。
処理したキノコの菌糸では、成長速度が１７％上昇し（すなわち、初回フラッシュまでの時間が１８日に比べ１５日）、収穫の収率は対照より１０％高かった。処理した菌糸から得られた子実体と対照との間には、形態的外観および味に差はなかった。
収率の上昇および初回フラッシュまでの時間の３日間の短縮の分析によって、シアノバクテリウムは坦子菌コンパニオン生物と相乗的相互作用を示すものと推論された。本発明者らは、シアノバクテリウムが坦子菌以外の細胞壁のキチン成分を分解することを示唆する。しかし、この提起された分解機構はまだ確認されていない。さらに、シアノバクテリアの滲出液は子実体の生成を促進するように思われる。
Ｂ）処理の際の光排除の効果
市販の食用坦子菌の栽培用製造袋を適切な環境条件下で下記の順序で発育させる。坦子菌の菌糸が成長して支持ネットワークを形成し、そこで成長基質が菌糸により結合されてポリテン袋を除去できるような安定したブロックを形成する。ブロック表面の菌糸被覆体は老化し、「バーキング」と呼ばれる密度の高い褐色のマットとして観察される。複数回のフラッシュ中に、老化した菌糸のマットの下で活性菌糸から子実体が形成される。
２３ｋｇのＰ．プルモナリウス製造ブロックに２．５％ｗ／ｖのＴ．ビリデの浸軟した菌糸と胞子の縣濁液を噴霧接種し、上記のように、照明した２５℃の成長室でインキュベートして、汚染体を胞子形成まで確立した。汚染された生成ブロックを、二組の五つの培養複製物を含む対照群と被験群とにさらに分けた。被験群の培養複製物には、１％ｗ／ｖの作用剤の表面噴霧処理を行った。
対照および被験群の双方の培養複製物をさらに約３日間、汚染体のＴ．ビリデの胞子形成および周辺の菌糸の成長が肉眼で見えなくなるまでインキュベートした。次いで、最初の組の対照群と被験群の培養複製物を取り出し、完全に暗くした２５℃の成長室に移し、残りの組の培養複製物は照明下でのインキュベーションを続けた。各微生物の相対量を毎日観察した。
光をあてて又はあてないでインキュベートした対照群は、成長基質の周囲に特徴的な老化菌糸マットである「バーキング」を形成しなかった。Ｔ．ビリデ分生子の緑色の強度および分布は、暗い成長室にセットした最初の組の対照群を移した日から２〜３日以内に汚染体が優勢になり坦子菌との競合を超えたことを示した。成長基質を検討したところ、活発に代謝しているＰ．プルモナリウムの菌糸はないことが判った。対照群の培養複製物の成長基質は坦子菌の菌糸が衰えるのにしたがってブロック構造の安定性を失った。
光をあてて又はあてないでインキュベートした被験群の培養複製物では、経時的に汚染体の相対量の顕著な減少が認められた。処理４〜５日以内に、Ｔ．ビリデの胞子形成は停止した。しかし、暗所でインキュベートした被験群では成長基質からの汚染体菌糸の消失がより遅かった（照明下でインキュベートした被験培養物と比べて約２〜４日遅れる）。作用剤の特徴的なクロロフィル緑色の着色がブロック上で認められ子実体の形成がおこった。
光を排除すると、作用剤の活発な成長が光合成代謝の停止により抑制されたときに、汚染体の細胞壁を分解するＳ．プラテンシスの毒性が上昇する点で有利であった。コンパニオン坦子菌は、汚染体およびシアノバクテリウムとの資源競合がチェックされ、損傷された汚染体の菌糸とおそらく光合成と窒素固定により生じるシアノバクテリアの浸出液が窒素源を提供することの両面の利益を受けた。
さらに、本発明者らは、成長室の光の強さを操作することによって、作用剤とコンパニオン生物の両方の活性に影響を与えることができることを発見した。完全な暗所では作用剤の光合成代謝活性が停止される。スピルリナ属は光合成し、窒素を固定する自己栄養生物であり、活性細胞から得られた浸出液は有機窒素および他のコンパニオン生物が使用する有機的に豊かな栄養分を提供できる。
実施例４−汚染体のＩｎ  Ｓｉｔｕ処理
坦子菌の子実体のＴ．ビリデ感染とリグノセルロース基質
市販の坦子菌の栽培物は、リグノセルロース成長基質とキノコの両者に影響を与えるスポット汚染体の真菌感染を受ける傾向がある。成長室はＴ．ビリデなどの真菌汚染体の分散および成長に対して理想的な通気および水分環境が提供されている。
本発明者らは、感染した子実体組織に作用剤の１％ｗ／ｖ縣濁液を噴霧施用してスポット感染を効果的に抑えた。坦子菌が活性な場合には、感染したコンパニオン組織を噴霧処理することにより、より迅速な反応が得られることが発見された。コンパニオン真菌は処理の２〜３日前に水を与えることにより活性化される。さらに、粉末を振りかけると、成長基質中の少量の感染を閉じ込めて処理できることが判った。
実施例５−蚊を制御するためのＩｎ  Ｓｉｔｕ処理
蚊の幼虫がいることが判っている約１０平方メートルの池で３回の試験を実施した。各試験で、１５グラムの粉末状の作用剤（または上記実施例の乾燥させたクリーム）を水の表面に散布した。１〜５日ですべての幼虫が死んだことが判った。幼虫がスピルリナを摂取したために起こったということ以外には、死亡を生じた機構は判らない。エクソキチナーゼが消化管の内側および後側を覆う栄養周囲膜（ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を消化したことが示唆される。この結果、幼虫は感染性物質により死亡をおこしやすくなる。
実施例６−ハエおよびスズメバチの処理
自然の状況でハエやスズメバチのいる地域で市販の油状基剤に作用剤を２５％ｖ／ｖ含むクリーム（エサとして）をおくことにより、スズメバチおよびハエに対する試験を１０回実施した。エサの近くで死んだハエやスズメバチが見つかった。
この機構は判らない。しかし、実施例５についての前記の仮の結論と同様な機構が働いてこのような昆虫を死亡させたことが示唆される。
この試験では他の昆虫誘引物を使用しなかったが、クリームの有効性を低下させることなく、他の昆虫誘引物をエサに添加できることが理解されよう。
本発明を好ましい実施形態としてのキノコの栽培に関連した生物学的制御方法に関して説明したが、本発明は他の果物および野菜の生産における感染の予防および処理に使用できることが理解されよう。