(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）第１ＤＮＡ結合ドメインと
（ii）第１蛋白質相互作用ドメイン
を有する融合蛋白質；
（ｂ）（ｉ）第２ＤＮＡ結合ドメインと
（ii）第１相互作用ドメインに結合する第２蛋白質相互作用ドメイン
を有する融合蛋白質；および
（ｃ）（ｉ）プロモータ、
（ii）プロモータの上流に位置し、第１ＤＮＡ結合ドメインに結合する第１オペレータ部位、および
（iii）プロモータおよび第１オペレータ部位の下流に位置し、第２ＤＮＡ結合ドメインに結合する第２オペレータ部位
に機能的に連結するレポータ遺伝子を有する核酸分子
を含む原核生物の宿主細胞であって、
上記第１相互作用ドメインの第２相互作用ドメインへの結合が、レポータ遺伝子の発現の変化によってシグナル伝達される宿主細胞。
【請求項２】
第１相互作用ドメインと第２相互作用ドメインの結合の抑制または増強を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１に記載の少なくとも１つの宿主細胞を提供し、
（ｂ）該少なくとも１つの宿主細胞を試験物質で処理し、次いで
（ｂ）レポータ遺伝子の発現の変化をスクリーニングする
ことを含み、
レポータ遺伝子の発現の変化の検出が第１相互作用ドメインと第２相互作用ドメインの結合の抑制または増強を示す方法。
【請求項３】
請求項１記載の細胞であって、
（ａ）第１ＤＮＡ結合ドメインがＡｒａＣ  ＤＮＡ結合ドメインであり、
（ｂ）第１オペレータ部位がＡｒａＣオペレータ部位であり、
（ｃ）第２ＤＮＡ結合ドメインがＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインであり、そして
（ｄ）第２オペレータ部位がＬｅｘＡオペレータ部位である、
細胞
【請求項４】
核酸分子がさらに、レポータ遺伝子に機能的に連結する１以上の第２オペレータ部位を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
レポータ遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、抗生物質耐性遺伝子、および毒性遺伝子をコードする核酸から選ばれる請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
細胞が細菌細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
細胞がＥ．coli細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
（ａ）第１ＤＮＡ−結合ドメインがＡｒａＣ  ＤＮＡ結合ドメインであり、
（ｂ）第１オペレータ部位がＡｒａＣオペレータ部位であり、
（ｃ）第２ＤＮＡ−結合ドメインがＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインであり、および
（ｄ）第２オペレータ部位がＬｅｘＡオペレータ部位である
請求項２に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子がさらに、レポータ遺伝子に機能的に連結する１以上の第２オペレータ部位を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
レポータ遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、抗生物質耐性遺伝子、および毒性遺伝子をコードする核酸から選ばれる請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が細菌細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
細胞がＥ．coli細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ＡｒａＣオペレータ部位；
（ｂ）プロモータ；および
（ｃ）ＬｅｘＡオペレータ部位
が上流から順に機能的に連結したレポーター遺伝子を有する核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むレポータベクター。
【請求項１５】
レポータ遺伝子に機能的に連結する１以上のＬｅｘＡオペレータ・ハーフ部位をさらに含む請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１６】
レポータ遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、抗生物質耐性遺伝子、および毒性遺伝子をコードする核酸から選ばれる請求項１３に記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸を含むレポータベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸を含むレポータベクター。
【請求項１９】
公知ドメインと相互作用する試験ドメインを含む細胞を検出する方法であって、
（１）各細胞が
（ａ）（ｉ）第１のＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）公知のドメインを有する融合タンパク質、
（ｂ）（ｉ）第１のＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）試験ドメインを有する融合タンパク質、および
（ｃ）（ｉ）プロモータ、（ｉｉ）プロモータの上流に位置する、第１のＤＮＡ結合ドメインに結合する第１のオペレータ部位、および（iii）レポータ遺伝子のプロモータの下流に位置する第２のＤＮＡ結合ドメインに結合する第２のオペレータ部位に機能的に結合したレポータ遺伝子を含む核酸、
を含む細胞のライブラリーを作り、
（２）公知ドメインと試験ドメインの相互作用をシグナル伝達する、レポータ遺伝子の発現の変化を示す細胞を検出する
ことを含む方法。
【請求項２０】
（ａ）第１のＤＮＡ結合ドメインがＡｒａＣ  ＤＮＡ結合ドメインであり、
（ｂ）第１のオペレータ部位がＡｒａＣオペレータ部位であり、
（ｃ）第２のＤＮＡ結合ドメインがＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインであり、そして
（ｄ）第２のオペレータ部位がＬｅｘＡオペレータである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子がさらに、レポータ遺伝子に機能的に連結する１以上の第２オペレータ部位を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
レポータ遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、抗生物質耐性遺伝子、および毒性遺伝子をコードする核酸から選ばれる請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が細菌細胞である請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
細胞がＥ．coli細胞である請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、蛋白質相互作用のアッセイ、融合蛋白質、および該蛋白質からなるように修飾された（modified）宿主細胞に関する。
背景技術
ホモおよびヘテロダイマー蛋白質複合体は、多くの細胞プロセスおよび種々の医療状況下の異常な蛋白質相互作用を仲介する〔Ｙanらの「Ｃancer-Ｒes.」（５５：３５６９−３５７５、１９９５年）〕。かかる複合体の研究は、病気を分子レベルで理解する努力および該複合体の小分子エフェクター（effectors）の探索に導く。かかるエフェクターは、蛋白質相互作用を調節しうるもので、かつ潜在的治療薬である〔Ｇibbs ＆ Ｏliffの「Ｃell」（７９：１９３−１９８、１９９４年）〕。かかるエフェクターは、種々の生化学および免疫学的インビトロ・アプローチを用いて同定されることがもっとも多い。しかしながら、医薬発見における遺伝学アプローチの利点は最近、増大する注目を受け入れている〔Ｌiuzziらの「Ｎature」（３７２：６９５−６９８、１９９４年）〕。これらの利点として、コストの有効性および簡易さの両方が含まれる。かかる遺伝学系のたった１つの、酵母−二ハイブリッド系（two hybrid system）は一般に、これら全ての診断基準を満たし、かつホモおよびヘテロダイマー蛋白質相互作用両方の検出に対しても同等に適する。酵母−二ハイブリッド系の他のユニークな特徴は、競合する相互作用による干渉もなく、所望の蛋白質−蛋白質相互作用を検出しうる能力である〔Ｆields & Ｓongの「Ｎature」（３４０：２４５−２４６、１９８９年）〕。かかる系は、蛋白質相互作用の分析および相互作用クローニングを介して相互作用する蛋白質の単離に首尾よく使用されている。再検討には、Ａllenらの「Ｔrends in Ｂiochem. Ｓci.」（２０：５１１−５１６、１９９５年）を参照。
酵母−二ハイブリッド系は非常に有用であることが分っているが、多くの制限にわずらわされる。酵母は多くの小分子に対し不透過性であり、酵母系における小分子の測定（evaluation）を完全にさまたげる〔Ｈigginsの「Ｃurr. Ｏpin. in Ｃell Ｂiol.」（５：６８４−６８７、１９９３年）〕。また酵母系は、相互作用する蛋白質の核限局化を必要とし、他の合併症に導くかもしれない。
これらの問題は可能性として、Ｅ．coli-二ハイブリッド系によって克服することができる。Ｅ．coli菌株は、超透過しうる〔ナカムラおよびスガヌマの「Ｊ．Ｂacteriol.」（１１０：３２９−３３５、１９７２年）〕。この超透過性を用いて、測定しうる小分子の数を最大限度にすることができる。加えて、Ｅ．coliは急速な増殖速度を有し、医薬スクリーニング中の作業をやり終えるのに必要な時間の短縮を可能ならしめる。さらに、Ｅ．coliを高頻度で形質転換することができ、相互作用クローニングを容易にする。
現在までのところ、たった１つのＥ．coli系は、酵母−二ハイブリッド系に類する性質を有すると思われるが、この系はＥ．coli蛋白質のホモダイマー化を検出することが示されているにすぎず、また該系が相互作用クローニングなどの主要二ハイブリッド適用に使用するのに十分に強固である（robust）ことを示す、出版された証拠はない〔Ｄoveらの「Ｎature」（３８６：６２７−６３０、１９９７年）〕。蛋白質相互作用を遺伝子的に検出する他のＥ．coli系も報告されている〔Ｄoerrらの「Ｂiochem.」（３０：９６５７−９６６４、１９９１年）；Ｍarchettiらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２４８：５４１−５５０、１９９５年）；Ｊappelli ＆ Ｂrennerの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２５９：５７５−５７８、１９９６年）〕。しかしながら、これらの系は、酵母−二ハイブリッド系と異なって、相互作用する蛋白質の少なくとも一方のホモダイマー化を要し、かつ所望の蛋白質−蛋白質相互作用の検出は、競合する他の相互作用による干渉を受け易い。当該分野では、さまざまな蛋白質相互作用を検出することができ、かつ相互作用クローニングに対して十分強固なＥ．coli．二ハイブリッド系によって、利益を得るだろう。
発明の概要
本発明は、Ｅ．coliおよび他の原核生物細胞におけるホモおよびヘテロダイマー蛋白質相互作用を検出することができる、二ハイブリッド系に関する。この系は、酵母−二ハイブリッド系と同じ用途、たとえば蛋白質相互作用を検出して分析したり、そのモジュレータ（modulators）を検出するときの相互作用クローニングに有用である。本発明は、原核生物の宿主細胞に関係し、該宿主細胞は、
(a)(i)第１ＤＮＡ−結合ドメインと
(ii)第１蛋白質−相互作用ドメイン
を有する融合蛋白質；
(b)(i)第２ＤＮＡ−結合ドメインと
(ii)第１相互作用ドメインに結合しうる第２蛋白質−相互作用ドメイン
を有する融合蛋白質；および
(c)(i)プロモータ、
(ii)プロモータの上流に位置し、第１ＤＮＡ−結合ドメインに結合しうる第１オペレータ部位、および
(iii)プロモータおよび第１オペレータ部位の下流に位置し、第２ＤＮＡ−結合ドメインに結合しうる第２オペレータ部位
に機能的に（operatively）連結するレポータ遺伝子を有する核酸分子
から成る。
第１相互作用ドメインの第２相互作用ドメインへの結合は、レポータ遺伝子の発現の変化（すなわち、減少調節）によってシグナル伝達される。本発明に鑑み、融合蛋白質は、結合部位間のＤＮＡ長さと共に、ループを形成する。このループは、多分ＤＮＡへの結合をさまたげることによって、ＲＮＡポリメラーゼの活性を外見上干渉する。
また本発明は、上記(c)に記載の核酸分子、および該核酸分子からなるベクターにも関係する。
さらに本発明は、第１相互作用ドメインと第２相互作用ドメインの結合の抑制または増強を検出する方法に関係し、該検出法は(a)後記請求の範囲１の細胞の培養物を試験物質で処理し、次いで(b)レポータ遺伝子の発現の増加または減少をそれぞれスクリーニングすることから成る。
さらに本発明は、相互作用クローニング法、すなわち、公知のドメインと相互作用する試験ドメインからなる細胞を検出する方法に関係し、該検出法は、
（１）(a)(i)第１ＤＮＡ−結合ドメインと
(ii)公知ドメイン
を有する融合蛋白質；
(b)(i)第２ＤＮＡ−結合ドメインと
(ii)試験ドメイン
を有する融合蛋白質；および
(c)(i)プロモータ、
(ii)プロモータの上流に位置し、第１ＤＮＡ−結合ドメインに結合しうる第１オペレータ部位、および
(iii)プロモータおよび第１オペレータ部位の下流に位置し、第２ＤＮＡ−結合ドメインに結合しうる第２オペレータ部位
に機能的に連絡するレポータ遺伝子を有する核酸分子
からなる細胞のライブラリーを産生し；
（２）公知ドメインと試験ドメインの相互作用をシグナル伝達する、レポータ遺伝子の発現の変化を示す細胞を検出する
ことから成る。
また本発明は、上記宿主細胞、核酸、ベクターおよび方法に対する数多くの好ましいバリエーションにも関係する。好ましい第１ＤＮＡ−結合ドメインはＡｒａＣからのもので、好ましい第１オペレータ部位はＡｒａＣオペレータである。好ましい第２ＤＮＡ−結合蛋白質はＬｅｘＡからのもので、好ましい第２オペレータ部位はＬｅｘＡハーフ−オペレータ部位である。別のバリエーションにおいて、核酸は１以上のＬｅｘＡオペレータ・ハーフ部位を有する。さらに１つの好ましいバリエーションにおいて、核酸はオペレータ部位間にＩＨＦなどの因子の結合部位を有し、該因子によって核酸は結合時に曲がるようになる。その他の選択については、以下に記載の詳細な説明で明らかである。
以下、E．Ｃoliについて説明するが、本発明は多くの細胞種を含むものである。本発明は、他の原核生物細胞にも適合しうる。
【図面の簡単な説明】
図１：遺伝子活性化の図形。（Ａ）酵母−二ハイブリッド系。（Ｂ）ファージＰ２２および４３４レプレッサ蛋白質に対して特異的なハイブリッド・オペレータを用いる、二ハイブリッド系の提案メカニズム。詳細は以下の説明事項を参照。ＸおよびＹは、ハイブリッド蛋白質の産生に用いた相互作用ドメインを表わし；Ａctiv：活性化ドメイン；ＤＮＡ：ＤＮＡ−結合ドメイン；op：オペレータ；ＲＮＡＰ：ＲＮＡポリメラーゼ。
図２：レポータ・プラスミドおよびハイブリッド蛋白質の顕著な特徴。（Ａ）プラスミドＰ３におけるlac Zレポータ遺伝子の上流の調節領域のヌクレオチド配列〔Reeder & Schleifの「Ｊ. Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）〕。プラスミドＰ３はＩ１−Ｉ１ ＡｒａＣオペレータを含有し、この実験でレポータ・プラスミドを作るのに用いた。ＬｅｘＡＯpおよびＩＨＦＯpの挿入のための制限部位が示されている。−３５および−１０は、プロモータ−近位Ｉ１部位の一部をおおうＡｒａＣ−依存ブロモータを示す。＋１は転写の開始を示す。Ｈind IIIおよびlac Z間のヌクレオチド配列については、Ｒeeder & Ｓchleifの「Ｊ. Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）参照。オリゴヌクレオチドＬｅｘＡOpおよびIHＦOpインサートのトップ・ストランド（top strands）が示されている。ボールド体配列（bold sequences）は、コンセンサス（consensus）ＬｅｘＡハーフ部位を示す。（Ｂ）ハイブリッド蛋白質の線状構造。野生型ＡｒａＣおよびＬｅｘＡの構造がトップに示されている。番号は、ハイブリッド作成に用いた原蛋白質の境界アミノ酸残基数を示す。Ｄim：ダイマー化ドメイン。‘ＤＮＡ’は図１で定義される。
図３：該E．coli二ハイブリッド系のメカニズムの要点を示す図形。詳細は本文参照。
図４：最初のアッセイ結果。（Ａ〜Ｅ）レポータ・プラスミドＰ３ＩＨＦ ＬｅｘＡＯpＸに関し；（Ｆ）レポータ・プラスミドＰ３ＩＨＦ ＬｅｘＡＯpmＨに関す。ａ：レポータ菌株単独；ｂ：ＡｒａＣ構成（construct）を持つレポータ菌株；Ｃ：ＡｒａＣおよびＬｅｘＡ構成を持つレポータ菌株。ハイブリッドペア（pairs）が示され、抑圧比を（  ）内に記す。ＡｒａＣおよびＬｅｘＡとは、これら蛋白質のＤＮＡ結合ドメインを指称し、ＡｒａＣ（wt）は野生型ＡｒａＣ、m ＦosはＩＶＭ ５４変異を持つＦosである。各菌株の４コロニーを検定し（Ｍaterials & Ｍethods）、抑圧比の計算に平均活性を用いた（本文参照）。実験の場合、４以上のコロニーを検定しても、抑圧比に重大な変化はなかった。縦軸は、ミラー（Ｍiller）単位のＬac Z活性を示す。
図５：ＬｅｘＡハイブリッドの細胞内レベルに対する抑制の依存。（Ａ）Jun-ＡｒａＣ/Ｆos-ＬｅｘＡ。（Ｂ）相互作用しない対照ハイブリッドペアＡｒａＣ/Ｆos-ＬｅｘＡ。各菌株の希釈した予備培養物のアリコートをＩＰＴＧおよびアンヒドロテトラシクリン（ＡT）で増殖させて、ＡｒａＣおよびＬｅｘＡ構成の発現をそれぞれ誘発した。ＩＰＴＧを１mＭで用いた。ＬｅｘＡハイブリッドの量は、以下に示す量のＡＴ（ng/ml）で滴定した。a：１６０、b：１２０、c：８０、d：４０、e：０。抑圧比の最大値を示す。
図６：ＬｅｘＡハイブリッドとのヘテロダイマー化によるダイマーＡｒａＣハイブリッドの分裂の図形。詳細については本文参照。
発明の詳細な説明
用語の定義
以下に示す定義は、特別な場合において他に限定されない限り、本明細書を通じて用いられる語句に適用される。
語句「原核生物宿主細胞」とは、エシェリキア属コリ（Ｅscherichia coli）、サルモネラ属（Salmonella）、クレブシェラ属（Ｋlebsiella）、シュードモナス属（Ｐseudomonus）、カウロバクター属（Ｃaulobacter）、リゾビウム属（Ｒhizobium）等といった属および種を指称する。
語句「第１ＤＮＡ−結合ドメイン」とは、レポータ遺伝子から上流の領域に挿入することができるオペレータに結合しうるポリペプチド配列を指称する。かかるドメインは、それらが得られる蛋白質のほとんどもしくは全てをまたはわずかにＤＮＡ結合に直接関係する部分のみを保持することができる。第１ＤＮＡ−結合ドメインの具体例は、ＡｒａＣ、その相同体（たとえばＲha Ｓ、Ｘyl Ｓ）または他のＤＮＡ結合蛋白質のいずれかから得ることができる。かかる蛋白質は、Ｒamosらの「Ｎucleic Ａcids Ｒes.」（１８：２１４９、１９９０年）に記載されている。
語句「第１オペレータ部位」とは、連合（associated）第１ＤＮＡ−結合ドメインに結合しうるヌクレオチド配列を指称する。かかる配列は、当該分野で公知であり、かつ組換えＤＮＡ技法によって挿入可能である。
語句「第２ＤＮＡ−結合ドメイン」とは、プロモータから下流の領域に挿入することができるオペレータに結合しうるポリペプチド配列を指称する。かかるドメインは、それらが得られる蛋白質のほとんどもしくは全てをまたはわずかにＤＮＡ結合に直接関係する部分のみを保持することができる。第２ＤＮＡ−結合ドメインの具体例は、ＬｅｘＡ、ファージ・ラムダ（lambda）ＣＩレプレッサ、ファージＰ２２および４３４のレプレッサ、または融合蛋白質としてＤＮＡに結合することができる他のＤＮＡ結合蛋白質のいずれかから得ることができる。
語句「第２オペレータ部位」とは、連合第２ＤＮＡ−結合ドメインに結合しうるヌクレオチド配列を指称する。かかる配列は当該分野で公知であり、かつ組換えＤＮＡ技法によって挿入可能である。具体的な配列は、ＬｅｘＡオペレータ部位であって、そのハーフ部位も含まれる。第２オペレータ部位は、プロモータとレポータ遺伝子の翻訳開始部位との間に位置し、転写部位と翻訳開始部位間の位置が好ましい。
語句「ＡｒａＣ結合ドメイン」とは、ＤＮＡに結合しうるＡｒａＣ蛋白質から得ることのできるポリペプチドを指称する。ＡｒａＣ結合ドメインは、標準の長さのＡｒａＣまたはＤＮＡ結合活性を保持するその天然もしくは修飾フラグメントであってよい。ＡｒａＣ結合ドメインの具体例は、
0004060372.tif 000002
の配列を有する。
語句「ＡｒａＣオペレータ部位」とは、ＡｒａＣに結合しうるヌクレオチド配列を指称する。ヌクレオチド配列の具体例として、
0004060372.tif 000003
が挙げられる。
語句「ＬｅｘＡ結合ドメイン」とは、ＤＮＡに結合しうるＬｅｘＡから得ることのできるポリペプチドを指称する。ＬｅｘＡ結合ドメインは、標準の長さのＬｅｘＡまたはＤＮＡ結合活性を保持するその天然もしくは修飾フラグメントであってよい。ＬｅｘＡ結合ドメインの具体例は、
0004060372.tif 000004
の配列を有する。
語句「ＬｅｘＡオペレータ部位」とは、ＬｅｘＡに結合しうるヌクレオチド配列を指称する。ＬｅｘＡオペレータは、コンセンサスおよび／またはノンコンセンサス（nonconsensus）ハーフ部位の１以上であってよく、該ハーフ部位は逆転繰返しで配位し（oriented）またはそうでなくてもよい。ヌクレオチド配列の具体例として、ＬｅｘＡオペレータ・ハーフ部位が挙げられ、これらは
0004060372.tif 000005
のコンセンサス配列（共通配列；consensus sequence）に合致することができる。
ＬｅｘＡオペレータの具体例としては、
0004060372.tif 000006
の、三重直接繰返しのＬｅｘＡ col Ｅ１オペレータ・ハーフ部位、
0004060372.tif 000007
の、ボールド体で示される３または４ｂｐスペーサーを持つ四重直接繰返しのＬｅｘＡコンセンサス・ハーフ部位、
0004060372.tif 000008
の、ボールド体で示される１６ｂｐスペーサーを持つ２つの標準の長さのコンセンサスＬｅｘＡ部位
が挙げられる。
語句「レポータ遺伝子」とは、その発現が測定できるシグナルを付与するいずれの遺伝子をも指称する。レポータ遺伝子の具体例としては、β−ガラクトシダーゼ用の遺伝子、抗生物質耐性遺伝子（たとえばクロラムフェニコール・トランスフェラーゼ）、および毒性遺伝子（たとえばＧＡＴＡ−１ＤＮＡ結合ドメイン、コリシン溶解遺伝子等）が挙げられる。その他種々のレポータ遺伝子が当業者にとって周知である。
語句「核酸分子が第１および第２オペレータ部位に曲がるようにすることができる因子」とは、ＤＮＡに結合し、かつヘリックス（helix）の直線軸の変形を起こす数多くの蛋白質のいずれかを指称する。因子の具体例は、ＩＨＦ、ＴＦ１、ＨＵ、ＣＡＰまたは固有的に曲がったＤＮＡ配列、たとえばＣ（Ａ）5-6Ｔ等である〔Ｇeidschekらの「Ｊ．Ｓtruc. Ｂiol.」（１０４：８４−９０、１９９０年）；Ｈodges-Garciaらの「Ｊ．Ｂiol. Ｃhem.」（２６４：１４６２１−１４６２３、１９８９年）；Ｗu & Ｃruthersの「Ｎature」（３０８：５０９−５１３、１９８４年）；Kahn & Ｃrothersの「ＰProc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（８９：６３４３０７、１９９２年）；Ｇoodmanらの「Ｎature」（３４１：２４４−２５１、１９８９年）；Ｇoodmanらの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci.」（８９：１１９１０−１１９１４、１９９２年）〕。連合した結合部位は、かかる結合が可能なヌクレオチド配列のいずれであってもよく、たとえばＩＨＦ用のコンセンサス結合部位、下記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列が挙げられる。
0004060372.tif 000009
調製の方法
遺伝子構成
本発明で用いる核酸は、組換え核酸法によって製造することができる。たとえば、Ｎellesらの「Ｊ．Ｂiol. Ｃhem.」（２６２：１０８５５、１９８７年）に記載の組換えＤＮＡ法を参照。かかる構成からなる菌株の具体例は、図面の説明の記載と同じである。
ＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡ、亜ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの組合せを含む、さまざまな源から得ることができる。ゲノムおよびｃＤＮＡは、多くの方法で得られる。所望配列に対しコードする細胞を単離し、ゲノムＤＮＡを分断し（たとえば１以上の制限エンドヌクレアーゼで処理して）、得られるフラグメントをクローン化し、所望配列に対し相補性のプローブ（probe）で同定し、所望活性に対しコードする配列の存在をスクリーニングすることができる。
ｃＤＮＡの場合、ｃＤＮＡをクローン化し、得られるクローンを所望領域に対しコードするｃＤＮＡのプローブでスクリーニングすることができる。所望クローンの単離に際し、ゲノムＤＮＡと実質的に同じ方法で、ｃＤＮＡを扱うことができる。
ＤＮＡ配列を発現するのに、適当な宿主によって認識される転写および翻訳シグナルが必要である。別法として、融合蛋白質のＤＮＡ配列と共に，ゲノムＤＮＡからのプロモータ領域を得ることができる。宿主細胞が融合蛋白質に関連する転写調節および翻訳開始シグナルを認識する程度まで、コード配列に隣接する５’領域を保有し、転写および翻訳調節に用いることができる。この領域は典型例として、転写および翻訳の開始を必然的に伴う配列を包含し、たとえばＴＡＴＡボックス、キャッピング（cappping）配列、ＣＡＡＴ配列等が挙げられる。典型例として、この領域は少なくとも約１５０塩基対（base pairs）長さ、より一般的には約２００ｂｐであって、めったに約１〜２ｋｂを越えない。
特にその転写末端調節配列、たとえばストップ・シグナルおよびポリアデニル化領域の場合にも、同様に非コード３’領域を保有してもよい。加えて、非コード３’領域はエンハンサー（enhancer）を含有してもよい。転写末端シグナルが宿主細胞において満足のいくように機能的でない場合、異なる遺伝子からの機能性３’領域を代用してもよい。この方法で、代用する３’領域の選択は、発現のために選んだ細胞系に左右されるだろう。
宿主の性質に基づき、広範囲の種々の転写および翻訳調節配列が使用されてよい。転写および翻訳調節配列はウイルス源（たとえばアデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウルス等）から得ることができ、この場合、調節シグナルは、宿主において高レベルの発現を有する遺伝子から得られる。別法として、哺乳類の発現産物（たとえばアクチン、コラーゲン、ミオシン等）からのプロモータを使用されてよい。転写開始調節シグナルは、遺伝子の発現を調整できるように、抑圧または活性化を考慮に入れて選定されてよい。かかる制御可能な調整法の１つは、発現が温度の変化によって抑圧または開始できるように、感温性の調節シグナルの使用である。他の制御可能な調整法は、特定の化学薬品に対して感受性の調節シグナルの使用である。
レポータまたはＤＮＡ結合ドメイン−相互作用ドメイン・キメラ遺伝子構成を形成するのに、ＤＮＡフラグメントを当該分野で公知の慣用技法に従って結紮（ligated）されてよい。かかる技法としては、スティッキー（sticky）末端フラグメントをブラント（blunt）末端に（あるいはその逆に）変換する制限酵素；スティッキー末端に充満して（to fill in）、ブラント末端を形成するポリメラーゼおよびヌクレオチド；望ましくない結紮を回避するアルカリ性ホスフアターゼ；およびフラグメントをつなぐリガーゼの使用が挙げられる。
ＤＮＡ結合ドメイン−相互作用ドメイン（たとえばＡｒａＣまたはＬｅｘＡおよびそれらの各融合パートナー）の構成は、共につないでシングルＤＮＡセグメントを形成してもよく、あるいはそれ自体でもしくはベクターと共に別個のセグメントとして維持してもよい。該構成は、それが宿主ゲノムに組込められるようになる場合の選択を考慮に入れて、遺伝子と共に形質転換により細胞の中に導入してもよい。通常、該構成は、宿主細胞によって認識される複製系を有するベクターの一部である。
発現ベクター
本発明の分子の産生の発現ビヒクルとしては、プラスミドまたは他のベクターが包含される。一般に、かかるベクターは、原核生物を含む種々の宿主において発現を可能にする対照配列を含有する。所望のコードおよび対照配列を含有する適当な発現ベクターは、当該分野で公知の標準組換えＤＮＡ技法を用いて作られてよく、該技法の多くは、Ｓambrookらの「Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual」（２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ＮＹ州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）に記載されている。
本発明が意図する発現ベクターは、少なくとも、レポータ遺伝子構成の複製並びにＤＮＡ結合ドメイン−相互作用ドメイン構成の複製および発現を指図することができる。１網のベクターは、動物ウイルス（たとえばウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはＳＶ４０）由来の自律的に複製する染色体外プラスミドを付与するＤＮＡ因子（elements）を利用する。第２網のベクターは、所望の遺伝子配列の宿主細胞染色体への組込みに依存する。
本発明で有用な発現ベクターは典型例として、複製の起点（origin）、発現すべきＤＮＡ配列に対して５’位（すなわち、上流）のプロモータ、および転写末端配列を含有する。複製の適当な起点としては、たとえば複製のＣol E１、pS Ｃ １０１、ＳＶ４０およびＭ１３起点が挙げられる。適当な末端配列としては、たとえばウシ成長ホルモン、ＳＶ４０、lac ZおよびＡc ＭＮＰＶ多面ポリアデニル化シグナルが挙げられる。適当なプロモータとしては、たとえばサイトメガロウイルス・プロモータ、lac Zプロモータ、gal １０プロモータおよびＡc ＭNPV多面プロモータが挙げられる。またプロモータ配列は、発現の調整を可能にするよう、誘発しうるもの〔たとえば成長培地における栄養分または他のインデューサー（誘発因子）の存在または非存在による〕であってもよい。１例は、ＩＰＴＧで誘発することができる、バクテリオファージ・ラムダplac ５から得られるlacオペロンである。
また発現ベクターは、所望産物の最適発現のための他の調節配列を包含してもよい。かかる配列としては、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列；発現産物の分泌を付与する分泌リーダー配列；ＤＮＡ配列の発現を増加調節するエンハンサー；制限エンドヌクレアーゼによる開裂の部位を付与する制限酵素認識配列が包含される。これらの物質の全ては、当該分野で公知であり、かつ商業上入手可能である。たとえば、オカヤマの「Ｍol. Ｃell. Ｂiol.」（３：２８０、１９８３年）参照。
また適当な発現ベクターは、形質転換した宿主細胞の表現型選択を可能にするマーキング（marking）配列を包含してもよい。かかるマーカ（marker）は、栄養素要求株宿主に対する原栄養体、有害化学薬品耐性（たとえば抗生物質耐性）等を付与しうる。選択しうるマーカ遺伝子は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結されるか、あるいは共トランスフェクションによって同じ細胞に導入されうるかのいずれかである。選択しうるマーカの具体例としては、ネオマイシン、アンピリシン、ヒグロマイシン耐性等が挙げられる。
使用する実際の発現ベクターの特性は、使用すべき宿主細胞に適合しなければならない。本発明のＤＮＡ配列を挿入しうる、適当な商業上入手しうる発現ベクターとしては、、ｐＳＰＯＲＴ、ｐブルースクリプト（Ｂluescript）II SK、バキュロウイルス発現ベクターｐブルーバック（Ｂlue Ｂac）、および原核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ IIが挙げられ、これらの全ては、ＣＡ州サンディエゴのインビトロゲン・コーポレーションから得ることができる。
宿主細胞
さらに本発明は、キメラ遺伝子構成およびレポータ・プラスミドの宿主に関係する。適当な宿主細胞としては、内因性活性が二ハイブリッド系の機能に干渉しない原核生物細胞が包含される。かかるE．coli菌株としては、ＭＣ１０６１、ＤＨ５ａ、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１が挙げられる。
発現ベクターは、当該分野で公知の種々の方法で宿主細胞に導入されてよい。たとえば、リン酸カルシウム沈殿法により、宿主細胞の発現ベクターによるトランスフェクションを実施することができる。しかしながら、発現ベクターを宿主細胞に導入する他の方法、たとえばエレクトロポレーション（electroporation）、リポソーム融合、核注入、およびウイルスまたはファージ感染も使用できる。発現ベクターを含有する宿主細胞は、当該分野で公知の多数の方法のいずれかで同定されてよい。
好ましい具体例の詳細な説明
本発明の特別な実施態様の詳細を以下に記載する。これらの実施態様は具体例であって、本発明の広範な適用性を説明するのに役立つ。
酵母−二ハイブリッド系は、ホモおよびヘテロダイマー蛋白質相互作用を検出および分析する、強力な遺伝子学的手段である。ここで、本発明者らは、蛋白質相互作用がレポータ遺伝子活性を抑圧する、機械学的に異なるE．coli二ハイブリッド系を記載する。該系は、２つのE．coli蛋白質のハイブリッド、活性剤蛋白質ＡｒａＣおよびレプレッサ蛋白質ＬｅｘＡを用いる。ＡｒａＣハイブリッドは単独で、lac Zを制御するara ＢＡＤプロモータの直接上流の高親和力オペレータから、lac Zレポータ遺伝子を活性化する。ＬｅｘＡハイブリッドは、この活性化を５０倍以下まで抑圧することができるが、該ハイブリッドが同質の相互作用モジュールを有し、かつレポータ・プラスミドがlac zの５’未翻訳リーダー（leader）におけるプロモータの下流のＬｅｘＡオペレータ部位のいくつかのらせん形転回（helical turns）を有する場合のみである。これらの要求は、抑圧が起ることを示唆するが、その理由は、オペレータ結合ヘテロダイマー・ハイブリッド間のＤＮＡループ（looping）が、該ループの内側のlac ZプロモータからＲＮＡポリメラーゼを除外するからである。ＤＮＡループに基づくメカニズムに一致して、オペレータ間に結合した蛋白質ＩＨＦを曲げるE．coli ＤＮＡによって、抑圧が増強される。ここに記載される結果から、E．coli二ハイブリッド系は、非常に有効な相互作用クローニングを可能ならしめ、かつ医薬の発見および細菌性蛋白質間の相互作用の分析に、特に有用であるという期待がもてることが示唆される。
物質および方法：
標準クローニングおよび免疫ブロッティング（immuno blotting）技法を用いる〔Ｓambrookらの「Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabortory Ｍanual」（２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ＮＹ州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）〕。Ｂio tek ＴＭ ＥＬ-３４０の９６−ウェル（well）ミクロプレート読み取り機にて３０℃で、基質としてクロロフェノールレッド−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ；Ｂoehringer Ｍannheim）を用い、９表示数値／サンプルの時間経過から、ミラー単位のＬac Z活性を計算する〔Ｍillerの「Ｅxperiments in molecular genetics」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ＮＹ州コールド・スプリング・ハーバー、１９７２年）；Ｍenzelの「Ａnal. Ｂiochem.」（１８１：４０−５０，１９８９年）〕。アッセイのため、発現および／またはレポータ・プラスミド含有のE．coli ＭＣ１０６１を、ミクロ滴定プレートのＬＢ−液体培地にて、インデューサー（ＩＰＴＧ、フィッシャー・ビオテク、アンヒドロテトラシクリン、アクロス）の存在下３７℃にて、少なくとも７世代にわたってＡ６００＝０．２−０．４まで増殖させる〔Ｍeissnerらの「Proc. Natl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（８４：４１７１−４１７５、１９８７年）〕。これらの条件下で、Ｌac Z活性は一般に、以前に報告されたものより約５倍低い、〔Ｂustos & Schleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）；Ｒeeder T．＆ Ｓchleif Ｒ．の「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）〕。菌株ＨＮ１０６９からのファージＰ１形質導入後、菌株ＴＲ３２１にてＨim Ｄ：：catを試験する〔Ｂustos ＆ Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）；Ｆlamm Ｅ．Ｌ．& Ｗeisberg Ｒ．Ａ．の「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（１８３：１１７−１２８、１９８５年）〕。
レポータ・プラスミドは、プラスミドＰ３（Ｃol E１、Ａmpr）（図２Ａ；Ｉ１）またはｐＭＳ４２１（ｐＳＣ １０１、Specr）をベースとする〔Ｃhurchward G.、Ｂelin D. &ナガミネ・Ｙ．の「Ｇene」（３１：１６５−１７１、１９８４年）〕。ＬｅｘＡおよびＩＨＦ部位（図２Ａ）はオリゴヌクレオチド・インサート（inserts）であって、この場合、変異体ＩＨＦ部位は、
0004060372.tif 000010
にある。ハイブリッド蛋白質構造の図２Ｂ参照。ara Ｃ構成は、ｐ１５Ａレプリコン（ＣmrまたはKmr；インビドロゲン）のＩＰＴＧ−誘発性ｐＳＥ ３８０ trp/lacプロモータの下にある〔Ｂustos & Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）〕。ＬｅｘＡDNA構成は、下流の第２ｐＳＥ３８０調節因子の下にあり、かつara Ｃ構成と縦に並んでいる。ＬｅｘＡDNAを要するアッセイは、菌株において、ｐＰ３−ベース・レポータ・プラスミド、ｐ１５Ａ−ベース・ハイブリッド構成およびlac Ｉqを運ぶｐＭＳ４２１を用いる。標準の長さのＬｅｘＡのハイブリッドによるアッセイのため、レポータ構成は、ｐＡＳＫ７５（Ｃol E１、Ａmpr）のアンヒドロテトラシクリン−誘発性tetプロモータの下のｐＭＳ４２１およびlex Ａ構成上にある〔Ｓherra Ａ．の「Ｇene」（１５１：１３１−１３５、１９９４年）〕。zip−ＡｒａＣDNA、zip−ＬｅｘＡDNA、ＡｒａＣDNAおよびＡｒａＣはそれぞれ、ｐＧＢ００９、ｐＧＢ００４、ｐＧＢ０２１ｂおよびｐＧＢ０２０から得られる〔Ｂustos & Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）〕。マウスc-fosおよびc-junはそれぞれ、１２６−２１８残基および２０８−３２４残基を有する〔Ｋouzarides Ｔ．& Ziff Ｅ．の「Ｎature」（３４０：５６８−５７１、１９８９年）〕。Ｆos変異ＩＶＭ５４については、Ｒyseck Ｒ．Ｐ．、Ｋovary Ｋ．＆ Ｂravo Ｒ．の「Ｏncogene」（５：１０９１−１０９３、１９９０年）参照。Ｅ６およびＥ６ＡＰドメインはそれぞれ、８−１５８残基および３５１−４５１残基である〔Ｈuibregtse Ｊ．Ｍ．、Ｓcheffner Ｍ．＆ Ｈowley Ｐ．の「ＥＭＢＯ Ｊ．」（１０：４１２９−４１３５、１９９１年）〕。
結果：
Ｅ．coli二ハイブリッド系におけるヘテロダイマーＥ．coli ＡｒａＣおよびＬｅｘＡハイブリッド蛋白質によるＬacレポータ遺伝子の活性化
Ｐtashneおよび共同研究者らは、モデルとしてバクテリオファージＰ２２および４３４のレプレッサ蛋白質を用い、細菌性二ハイブリッド系に向かう一般アプローチを記載した〔Ｈollisらの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（８５：５８３４−５８３８、１９８８）〕。これらのレプレッサのみがダイマーのそれらのオペレータに結合し、かつヘテロダイマー化することができるが、それらは互いにオペレータを認識しない。しかしながら、ヘテロダイマーはハイブリッド・オペレータと共にレプレッサとして行動することができ、この場合、各ハーフ部位はレプレッサの１つに対して特異的である（図１Ｂ）。これらの結果によれば、ハイブリッド・オペレータからの抑圧が、他の蛋白質がファージＰ２２および４３４レプレッサのダイマー化ドメインと交替するときに、該他の蛋白質の相互作用を示す、二ハイブリッド系が示唆される。
本発明者ら（以下、我々と云う）は、Ｅ．coli二ハイブリッド系における同様な活性化−アプローチのため、Ｅ．coli ＡｒａＣおよびＬｅｘＡ蛋白質を選んだ。ＡｒａＣは転写活性化体であって、ＡｒａＣ依存ara ＢＡＤプロモータ（図１Ｂ）の正に上流の、２つの縦並びハーフ部位Ｉ１およびＩ２のオペレータに、ダイマーとして結合する〔Ｓchleifの「Ｅscherichia coli and Ｓalmonella typhimurium. Ｃellular and Ｍolecular Ｂiology」（Ｎeidhardt編、ＡＳＭ・プレス、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１３００−１３０９、１９９６年）〕。ＬｅｘＡは転写レプレッサであって、２つの逆転ハーフ部位のオペレータに、ダイマーとして協同的に（cooperatively）結合する。酵母−二ハイブリッド系において、ＬｅｘＡを用いてＤＮＡ結合機能を付与する〔allenらの「Ｔrends in Ｂiochem. Ｓci.」（２０：５１１−５１６、１９９５年）〕。ＡｒａＣおよびＬｅｘＡは共に、zip-ＡｒａＣDNAおよびzip-ＬｅｘＡDNAハイブリッドを産生するため、自己連合（self-associating）異種蛋白質、たとえばｃ/ＥＢＰロイシン・ジッパー（zip）で機能的に（functionally）取り替えることができるダイマー化ドメインを有する〔Ｂustos & Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）。〕
間接証拠の数行に、ara ＢＡＤの活性化に必要なＡｒａＣ-ＲＮＡポリメラーゼ接触はわずかに、低親和力Ｉ２ハーフ部位に存在するダイマーのプロモータ−近位サブユニットを要しうることが示唆されている〔Schleifの「Ｅscherichia coli and Ｓalmonella Ｔy-phimurium Ｃellular and Ｍolecular Ｂiology」（Ｎeidhardt編、ＡSＭ・プレス、ワシントン、D.Ｃ．、１３００−１３０９、１９９６年）〕。他のダイマー・サブユニットがプロモーター遠位高親和力Ｉ１部位で結合するとき、Ｉ２を協同的にアクセスする。我々は、ＬｅｘＡハーフ部位（ＬｅｘＡＯp）がＡｒａＣ I１部位と交替するとき、Zip-ＡｒａＣDNA/zip-ＬｅｘＡDNAヘテロダイマーが、ハイブリッド・オペレータからのara ＢＡＤを活性化しうることを推論した（ara ＢＡＤ-lacレポータ・プラスミドおよびハイブリッドの構造については図２参照）。しかしながら、各ハイブリッドはホモダイマー化しうるが、ＬｅｘＡハイブリッド・ホモダイマーはハイブリッドＬｅｘＡＯp-I２オペレータに結合しうるべきでない。何故なら、その協同的結合に２つのＬｅｘＡハーフ部位を要するからである〔Ｂustos & Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）；Ｋim ＆ Ｌittleの「Ｓcience」（２５５：２０３−２０６、１９９２年）〕。同様に、ＡｒａＣハイブリッド・ホモダイマーもハイブリッド・オペレータに結合しうるべきでなく、それは低親和力Ｉ２ハーフ部位が自力でＡｒａＣに結合しないからである〔Ｒeeder Ｔ．＆ Ｓchleif Ｒ．の「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）〕。このように活性化は、ハイブリッドのzipドメインを介するヘテロダイマー化、次いでヘテロダイマーのＬｅｘＡＯp-I２ハイブリッドオペレータへの協同的結合を反映するものである。このアプローチは、ヘテロダイマーのＤＮＡ結合（たとえば、オペレータ・ハーフ部位間の４、１１または２２ｂｐの間隔）を最大限に活用する試みにも拘らず、うまくいかなかった。幾つかの場合では、ＡｒａＣハイブリッド単独によるlac遺伝子の低レベルの活性化は現実に、相互作用ＬｅｘＡハイブリッドの共同発現（coexpression）に際してかろうじて抑圧され、このことは我々に、ヘテロダイマー・サブユニットが実際には、間隔が接近したオペレータ・ハーフ部位へのお互いの結合を干渉しうるということを示した。また我々は、zip-ＬｅｘＡDNAおよびその部位をzip-Ｒha ＳDNAハイブリッドおよびＲha Ｓオペレータ・ハーフ部位と交換する種々の試みを行なったが、これもうまくいかなかった。Ｒha Ｓは、構造および機能が類似するＡｒａＣの相同体である〔Ｒamosらの「Ｎucleic Ａcids Ｒes.」（１８：２１４９−２１５２、１９９０年）参照〕。これらの結果から、I１２のＡｒａＣモノマーは、ara ＢＡＤプロモータの活性化に十分でないことが示唆される。
Ｅ．coli二ハイブリッド系におけるヘテロダイマーＥ．coli ＡｒａＣおよびＬｅｘＡハイブリッド蛋白質による活性化したlacレポータ遺伝子の抑圧：
我々は、新しいアプローチとして、ＡｒａＣハイブリッドによる初期活性化事態がＬｅｘＡＯpの相互作用ＬｅｘＡハイブリッド結合後に抑制される、抑圧系を組立てることを決定した。我々は、ＡｒａＣオペレータとして、ダイマーおよびモノマーＡｒａＣ分子、たとえばそれぞれ野生型ＡｒａＣおよびＡｒａＣDNAに結合できる高親和力Ｉ１−Ｉ１部位を用いた〔図２Ａ；Ｂustos ＆ Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）；Ｒeeder Ｔ．＆ Ｓschleif Ｒ．の「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）〕。Ｉ１−Ｉ１もダイマーおよびモノマーＡｒａＣ分子によってara ＢＡＤ-lacの活性化を仲介できるので〔Ｂustos & Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０、１９９３年）〕、我々は、ＡｒａＣDNAの融合パートナーが自己連合に失敗しても、ハイブリッド相互作用を調べることができると推論した。zip-ＡｒａＣDNAおよびzip-ＬｅｘＡDNAヘテロダイマー・サブユニットが間隔の接近したＬｅｘＡＯpおよびＡｒａＣオペレータ部位に同時に結合することができないかもしれないことから（上記参照）、我々のＥ．coli二ハイブリッド系に向けての活性化に基づくアプローチが失敗したかもしれないので、我々は、lac Zレポータ遺伝子の５’未翻訳リーダー内のプロモータの下流に、ＬｅｘＡＯpの幾つかのらせん形転回または少なくとも５０ｂｐを設けることによって、ＡｒａＣおよびＬｅｘＡオペレータの間隔を大きくした（図２Ａ）。我々は、Ｉ１−Ｉ１オペレータで結合したzip-ＡｒａＣDNAハイブリッドが相互作用に依存するように、ＬｅｘＡＯpでZip-ＬｅｘＡDNAの協同的結合を仲介するものと期待した。ＬｅｘＡハイブリッドのオペレータ結合は恐らく、オペレータ間のＤＮＡのループを必要とするだろうし、この結果、オペレータ部位はヘテロダイマー・サブユニットの同時結合のため、相互に十分に接近することになる。最後に、該アプローチにより、オペレータ間のＤＮＡのツイスト（twisting）は、ヘテロダイマー・サブユニットによる最適接近のため、相互に対応するオペレータを配置するのを助成することが仮定される（図３）。恐らく、オペレータ結合Ｌex Ａハイブリッドは活性化を干渉すると思われるが、それは、ＲＮＡＰの進行のブロック〔Ｅlledge & Ｄavisの「Ｇenes ＆ Ｄev.」（３：１８５−１９７、１９８９年）〕、ＤＮＡループの内側のプロモータからの除外〔図３；Ｍuellerらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２５７：２１−２９、１９９６年）；Ｃhoy & Ａdhyaの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（８９：１１２６４−１１２６８、１９９２年）；Ｈuoらの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（８５：５４４４−５４４８、１９８８年）〕、またはＡｒａＣ-ＲＮＡＰ接触の立体干渉による。
我々は、レポータ・プラスミド上のlac Z遺伝子の５’未翻訳リーダーのＸbalまたはＨind III部位のいずれかに、ＬｅｘＡＯpの３つの縦並びコピー（tandem copies）を挿入した（図２Ａ）。また我々は、Ｅ．coli IHＦ蛋白質のlambda Ｈ’部位〔ＩＨＦＯp；Ｙang ＆ Ｎashの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci.」（９１：１２１８３−１２１８７、１９９４年）〕を、Ｉ１−Ｉ１およびＬｅｘＡOp間のSac Ｉ部位に挿入した（図２Ａおよび３）。ＩＨＦはＤＮＡを曲げることにより、ＤＮＡループを増強することから〔Ｎashの「Ｔrends Ｂiochem. Ｓci.」（１５：２２２−２２７、１９９０年）；Ｐrattらの「Ｍol. Ｍicrobiol.」（２０：９１１−９１７、１９９６年）；Ｈooverらの「Ｃell」（６３：１１−２２、１９９０年）〕、我々は、我々の系のＩＨＦ仲介ＤＮＡループが抑圧を増強することを期待した。
ホモおよびヘテロダイマー蛋白質相互作用は抑圧を仲介することができる：
我々は、zip-ＡｒａＣDNA/zip-ＬｅｘＡDNAハイブリッドペア、およびＦosおよびＪunの相互作用ドメインがそれぞれ、ＡｒａＣDNAおよびＬｅｘＡDNAに融合した第２セットのハイブリッド（図２Ｂ）の両方を持つ、我々の全般的体系（general scheme）を試験した。c/ＥＢＰ zipドメインと異なり、Ｆosは自己連合（self-associate）しない〔Ｈalazonetisらの「Ｃell」（５５：９１７−９２４、１９９８年）〕。ハイブリッドペアによる抑圧は、ＡｒａＣハイブリッドのオリゴマー化状態が抑圧またはＩ１−Ｉ１の初期活性化事態に重要でないことの直接的証拠を提供するだろう。Ｊunの相互作用ドメインは、ＬｅｘＡDNAに融合すると、ダイマー化を仲介することができ、ＦosドメインはインビトロのＪun-ＬｅｘＡDNAダイマーを分裂させることができる〔Ｄoerrらの「Ｂiochem」（３０：９６５７−９６６４、１９９１年）〕。
我々は、Sac １に挿入したIHＦOpおよびＸbalのＬｅｘＡＯp（Ｐ３ＩＨＦＬexＡＯpＸ）を含有するレポータ・プラスミドと共にzip-ＬｅｘＡDNA/zip-ＡｒａＣDNAハイブリッドペアを用いるときに。我々のＬｅｘＡ-ＡｒａＣ系における抑圧を最も明確に証明することができる。図４Ａにおいて、我々は、このレポータ・プラスミドが単独で存在するとき、１６０ユニットのβ−ガラクトシダーゼを発現することに注目する。この基本的レベルの発現は、ＬexＯp非存在のレポータ・プラスミドによって注目される約４０ユニットの活性を実質的に越える〔下記表３；およびＲeederおよびＳchleifの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）参照〕。我々は、増強した発現がＬex Op部位と共に導入された偶然のプロモータによってなされた貢献を表わすものと確信する（下記参照）。基本的レベルの発現は、zip-ＡｒａＣDNAの存在下で６２０ユニットに上昇する。zip-ＬｅｘＡDNAおよびzip-ＡｒａＣDNA両方の存在下で、発現は２２０ユニットに降下し、これは抑圧を証明する。我々は、zip-ＡｒａＣDNAによって注目されるもの（６２０ユニット）から基本的レベルの発現（１６０ユニット）を引くと、４６０ユニットの値が得られ、これはＡｒａＣ-制御プロモータの活性から生じる発現を表わしていると確信する。同様に、zip-ＬｅｘＡDNAおよびzip-ＡｒａＣDNAを共同発現するときに見られる発現から基本的レベルを引くと、相互作用するペアによって注目される減少した残りの活性化を表わす値（６０ユニット）が得られる。我々は、これら２つの値の比率を抑圧係数として定義し、この場合、４６０/６０＝７．５である。図４Ｂにおいて、我々は、別の相互作用する融合ペアの、Ｊun-ＬｅｘＡDNAおよびＦos-ＡｒａＣDNAによっても抑圧が見られることを提示する。この場合、抑圧係数４．２が注目される。我々は、最適抑圧がキメラの相互作用蛋白質ドメイン、適切に配置したＤＮＡ結合部位、および結合部位が適切なＩＨＦを要することを、以下に証明する。
ＩＨＦは抑圧を増強することができる：
我々は、変異またはＩＨＦ結合部位の削除によってＩＨＦを取除くと、抑圧減少の注目により、抑圧にはＩＨＦが必要であることを提示することができる。下記表１において、Ｆｏｓ−ＡｒａＣDNA／Ｊｕｎ−ＬｅｘＡDNAおよびｚｉｐ−ＡｒａＣDNA／ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAハイブリッドペア両方による抑圧は、ＸｂａＩ部位にＬｅｘＡＯｐを含有するが、ＳａｃＩ部位にＩＨＦＯｐを欠くレポータ構成による係数２によって減少することが認められる（Ｐ３ＬｅｘＡＯｐＸ対Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐＸ）。驚くべきことに、ＬｅｘＯｐ部位をＨｉｎｄIII部位に置くと、ＩＨＦＯｐの存在は効果がない（表１；Ｐ３ＬｅｘＡＯｐＨ対Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐＨ）。一見したところ、抑圧を容易にするＩＨＦの能力は、我々の想定する抑圧ループの詳細な幾何学的配置；ＬｅｘＡＯｐがＸｂａＩにあるときの小さい１１７ｂｐループによる抑圧における助力に左右されるが、ＨｉｎｄIIIのＬｅｘＡＯｐによって形成される大きな１８０ｂｐループでは効果がない。
ＩＨＦＯｐオリゴヌクレオチド・インサートは、４０ｂｐの長さを有する。これはヘリックスのほぼ３．６転回に相当し［図２Ａ；Ｌｅｅ ＆ Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci.」（８６：４７６−４８０、１９８９年）］、ヘリックスの面（face）の相互作用ハイブリッドの相対位置の変化のために、ＩＨＦＯｐがＰ３ＬｅｘＡＯｐＸと共に抑圧を増強するという可能性を高める。ＩＨＦＯｐ（Ｍaterials ＆ Ｍethods）の長さを維持しながら、コンセンサスＩＨＦ結合部位からなる塩基に突然変異を起こさせると、両ハイブリッドペアによる抑圧は、ＩＨＦＯｐインサートなしで見られるものに類似する値まで減少する。さらに我々は、ＩＨＦのＨｉｍＤサブユニットを不活性化する染色体ｈｉｍＤ：：ｃａｔ変異を運ぶ（carrying）菌株において、Ｆｏｓ−ＡｒａＣDNA／Ｊｕｎ−ＬｅｘＡDNAおよびＰ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐＸによる抑圧が完全に除かれることを提示することができる（図４Ｂおよび４Ｃを比較）。
従って、これらの結果に基づき、ＩＨＦＯｐ部位がＳａｃＩに存在し、かつ菌株がｈｉｍＤ+であるときに、Ｐ３ＬｅｘＡＯｐＸによる最適抑圧が起る。ＩＨＦＯｐの除去は、ｚｉｐ−ＡｒａＣDNA／ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAによる抑圧を減少させ、この同じ操作または変異によるＨｉｍＤの除去は、Ｆｏｓ−ＡｒａＣDNA／Ｊｕｎ−ＬｅｘＡDNAによる抑圧を完全に排除する（詳細については下記参照）。我々は、ＩＨＦによる抑圧の増強が、ヘテロダイマーハイブリッドによる結合増大のため、空間的近接にＡｒａＣおよびＬｅｘＡオペレータ部位をもたらすのを助成するＤＮＡループ形成の結果であると確信する。
抑圧はハイブリッド相互作用を要する：
ｚｉｐおよびＪｕｎ／Ｆｏｓペアを用いる我々の実例のように、キメラ蛋白質パートナーの融合ドメインが相互作用しうるときに、十分な抑圧が注目されるだけである（図４Ａおよび表１）。相互作用しないペアが存在すると、抑圧は検出できない（たとえば、野生型ＡｒａＣまたはＡｒａＣDNAをｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAと組合せるとき、あるいはＡｒａＣDNAをＪｕｎ−ＬｅｘＡDNAと組合わせるとき；図４Ｄおよび表２）。Ｆｏｓ／Ｊｕｎヘテロダイマー化をブロックすることが以前に示されているＦｏｓＩＶＭ５４ポイント変異（point mutation）を用いる我々の実例のように（図４Ｅ）、普通に相互作用する蛋白質パートナー（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）が特異的な変異の導入によって、その相互作用が中断されるときも、抑圧はなくなる［Ｒyseckらの「Ｏncogene」（５：１０９１−１０９３、１９９０年）］。ウェスタン・ブロット（Ｗestern blot）分析では、種々のレポータ構成およびハイブリッドペアによって注目される抑圧レベルの差異がハイブリッド蛋白質レベルの変化に寄与することができ；このため、上記抑圧がＡｒａＣおよびＬｅｘＡ蛋白質の相対量の変化を単純には反映しないことを示すものは得られない。
バックグランドＬａｃレポータ活性の減少は抑圧を改善する：
表３Ａより、この実験のレポータ・プラスミドは、親プラスミドＰ３よりほぼ１０倍大きいバックグランド（ＡｒａＣ−非依存）ｌａｃ転写をもたらすことが認められる。ＬｅｘＡＯｐ配列の検査によって、各ＬｅｘＡハーフ部位は、ＡｒａＣ非依存ｌａｃ転写を促進するのに、−３５プロモータ様配列の下流で行動するかもしれない、想定される−１０Ｅ．coliプロモータ配列を含有することが明らかになる。我々は、中心のコンセンサスＬｅｘＡ結合部位を構成するＣＡＧトリヌクレオチドを元のままにしながら、Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐＨの想定される−１０配列を５’−ＡＣＣＡＧＴ−３’に変えて、−１０活性を除いた［Ｌewisらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２４１：５０７−５２３、１９９４年）］。この操作は、バックグランドＬａｃ活性を約２０倍も減少させた（２９０ミラー単位のＬａｃ活性は約１７ミラー単位に減少）。新しいレポータ・プラスミド（Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＯｐｍＨ）が抑圧の増加を可能ならしめることを証明するため、我々は、ｚｉｐ−ＡｒａＣDNA／ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNA相互作用ペアによる抑圧を検定した。以下に示す抑圧の改善が見られる：Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐＨによる５倍抑圧（表１）は、Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐｍＨによる約５０倍（表３Ｂおよび図４）に増加する。相互作用しないＡｒａＣDNA／Ｊｕｎ−ＬｅｘＡDNA、ＡｒａＣDNA／ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAおよびＡｒａＣ／ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAハイブリッドペアによる抑圧は、ごくわずかなままであった（表３Ｂ）。
ｚｉｐ−ＡｒａＣDNAおよび野生型ＡｒａＣは、Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐｍＨプラスミドと共に約１０００ミラー単位のＬａｃ活性を生じる。ｌａｃ上記バックグランドのこの６０倍活性化は、親プラスミドＰ３について報告の約１００倍活性に比べて優る［Ｒeeder ＆ Ｓchleifの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）］。従って、未修飾レポータ・プラスミドの場合に見られる低活性化は、これらのプラスミドに関連する。ＡｒａＣ−非依存Ｌａｃ活性の高バックグランドによる干渉を反映する。Ｐ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐｍＨによって証明されるように、この問題は、ＡｒａＣ−非依存バックグランドｌａｃ転写を減少させることによって除くことができる。
改善した二ハイブリッド系：
ＬｅｘＡＯｐｍにおけるノンコンセンサスＬｅｘＡ部位のＬｅｘＡに対する親和力は、知られていないが、ＬｅｘＡＯｐの親和力よりも小さいことが予測されている［Ｌewisらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２４１：５０７−５２３、１９９４年）］。ＬｅｘＡＯｐｍは、ｚｉｐ−ＡｒａＣDNA／ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAによる抑圧を改善するが（上記参照）、Ｆｏｓ−ＡｒａＣDNA／Ｊｕｎ−ＬｅｘＡDNA（示さず）による抑圧をほぼ完全になくしてしまう。これらの結果は、最もありそうなこととして、異質の融合ドメインがＬｅｘＡDNAのオペレータ親和力を変えることができるという事実を反映し［Ｇolemis ＆ Ｂrentの「Ｍol. Ｃell. Ｂiol.」（１２：３００６−３０１４、１９９２年）］、かつＪｕｎ−ＬｅｘＡDNAがｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAと比べ、ＬｅｘＡオペレータに対する親和力が低いことを示唆する。
これらの情報は、我々の系における抑圧が一般に、ＬｅｘＡオペレータの親和力を改善することによって、最大限度にされうることを示唆する。また、ＡｒａＣおよびＬｅｘＡ融合パートナーの反転または野生型ＬｅｘＡのＣ末端への融合も、ＬｅｘＡDNAに対する融合ドメインの抑制効果を最小限度にしうる［Ｇolemis ＆ Ｂrentの「Ｍol. Ｃell. Ｂiol.」（１２：３００６−３０１４、１９９２年）］。低い内因性プロモータ活性を持つ高親和力ＬｅｘＡオペレータは、抑圧シグナルを用いてバックグランドｌａｃ活性の干渉を最小限度にすべきである。また、ＬｅｘＡハイブリッドを過剰発現することによっても、抑圧を増強することができる。最後に、ＡｒａＣDNAは標準の長さのＡｒａＣと比べて、有効に活性化することが少ない［Ｂustos ＆ Ｓchleifの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９０：５６３８−５６４２、１９９３年）］。従って、標準の長さのＡｒａＣのハイブリッドは、大きな活性化シグナルを付与することにより、抑圧を改善しうる。
これらのパラメーターの処理操作がＦｏｓ／Ｊｕｎ相対作用ペアによる抑圧を改善するかどうかを試験するため、我々は以下の手順でレポータ・プラスミドＰ３ＩＨＦＬｅｘＡＯｐｉｍｐＸを作った。すなわち、ＬｅｘＡＯｐｍＸを、ＬｅｘＡに対して高い親和力［Ｌewisらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２４１：５０７−５２３、１９９４年）］および約１０ミラー単位の低い内因性プロモータ活性を有することが知られている、３つの縦並び直接繰返しｉｍｐＡＢ  ＬｅｘＡオペレータ・ハーフ部位と交換する。また我々は、アンヒドロテトラシクリン−強誘発性ｔｅｔプロモータ（Ｍaterials ＆ Ｍethods参照）から発現される、標準の長さのＬｅｘＡのＣ末端に、Ｊｕｎ〜標準の長さのＡｒａＣおよびＦｏｓを融合して、図２ＢのＪｕｎ−ＡｒａＣ／Ｆｏｓ−ＬｅｘＡハイブリッドペアを作った（Ｍaterials ＆ Ｍethods参照）。我々は、約１１倍の抑圧比を観察する。これは、Ｆｏｓ−ＡｒａＣDNA／Ｊｕｎ−ＬｅｘＡDNAハイブリッドペアの場合の我々の結果と比較して、抑圧の３倍改善レベルを構成する（表１および図５Ａを比較）。対照ハイブリッドペア（ＡｒａＣ／Ｆｏｓ−ＬｅｘＡ；図５Ｂ）では、重大な抑圧は全く注目されない。また図５Ａからは、ｔｅｔプロモータからのｆｏｓ−ｌｅｘＡの発現が減少すると、抑圧が減少することが認められる。これらの結果は、我々の方策が相互作用ドメインのいずれのペアを用いても、首尾よく抑圧を改善しうることを示唆する。また、ＡｒａＣおよびＬｅｘＡハイブリッドの相対量に対する抑圧の依存は、抑圧がヘテロダイマー化を反映することの、第３ラインの証拠を付与する。
相互作用クローニング：
我々の系は、酵母−二ハイブリッド系で相互作用するＨＰＶ  Ｅ６およびヒトＥ６ＡＰ蛋白質のドメイン間の相互作用を検出する［Ｈuibregtseらの「ＥＭＢＯ  Ｊ．」（１０：４１２９−４１３５、１９９１年）］。Ｅ６ＡＰ−ＡｒａＣDNAを誘発する０．５ｍＭ−ＩＰＴＧ、およびＥ６−ＬｅｘＡを誘発する５０ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラシクリンを用いて、我々は少なくとも３０倍の抑圧比を得る。相互作用しない対照ペアＡｒａＣDNA／Ｅ６−ＬｅｘＡを用いる場合、あるいはＰ３ＩＨＦＬｅｘＡｉｍｐＸレポータ・プラスミドからＬｅｘＡオペレータを除いたとき、抑圧は実質的にない（各場合の抑圧比は約１．５）。ＬａｃＺ指示薬Ｘ−ｇａｌを持つ固体培地において、Ｅ６ＡＰ−ＡｒａＣDNA／Ｅ６−ＬｅｘＡによる抑圧は淡青色コロニーを生成し、一方、対照の場合、暗青色コロニーが得られる。このシグナル差が相互作用クローニングに対して有効に利用できるかどうかを評価するため、我々は、ＢａｍＨ１Ｅ６フラグメントを、約１００倍モル過剰の総ＢａｍＨ１消化Ｅ．coli染色体ＤＮＡと混合した。混合物を、正しく配向したＥ６ＤＮＡがｌｅｘＡを組立てている（in frame）と予測される我々のＬｅｘＡ発現ベクターにおいて、ｌｅｘＡの３’末端でＢａｍＨ１部位に結紮した。Ｅ６ＡＰ−ＡｒａＣDNA構成を含有するレポータ菌株への形質転換後に、形質転換株の９５％以上は、Ｘ−ｇａｌ、０．５ｍＭ−ＩＰＴＧおよび５０ｎｇ／ｍｌのＡＴを持つ培地上で青色であった。残りの白色コロニーは多分に、ＬｅｘＡ−Ｅ６融合を有するか、あるいは低頻度で起ると思われるレポータ・プラスミドの損失から生成した。レポータ遺伝子を失ったコロニーのピックアップを避けるためおよびＬｅｘＡ−Ｅ６融合を持つコロニーを明確に単離しようとするために、我々は、最終的にゆっくりと青色に変わる１２の白色コロニーをピックアップした。ＬｅｘＡ−Ｅ６ハイブリッドを含有するコロニーをさらに豊富にするため、１２コロニー全てからのプラスミドＤＮＡをプールし、レポータ菌株に再度形質転換し、次いで上述の如く正確に平板培養した。形質転換株の大半は今、淡青色であり、１６のランダムに単離した淡青色の形質転換株のＰＣＲマッピングにより、全てはｌｅｘＡのうしろに正しく配向したＥ６ＡＰコード・フラグメントを含有することが認められた。これらの結果から、２００クローン中ほぼ１つのみが、正しく配向してｌｅｘＡに融合するＥ６−フラグメントを含有すると予想されるとき、簡単なプロトコルを用い、相互作用クローニングによって、ＡｒａＣ融合パートナーの特定の相互作用体（interactors）を有効に単離しうることが認められる。
考察
本明細書に記載のＥ．coli二ハイブリッド系は、ｌａｘＺレポータ遺伝子の抑圧を介して、ＡｒａＣおよびＬｅｘＡハイブリッドのヘテロダイマー化をシグナル伝達する。抑圧には明らかに二ハイブリッド相互作用が要せられるが、その理由は、同質でないハイブリッドペアが抑圧をひき起こさないため、およびわな（bait）としてＥ６ＡＰ−ＡｒａＣによる相互作用クローニングを用いることにより、ＬｅｘＡのうしろに融合するＥ６−スパイク（spiked）ＤＮＡライブラリーからＥ６を明確に単離することができるためである。また抑圧はＬｅｘＡ部位を要し、かつレポータ・プラスミドのＡｒａＣおよびＬｅｘＡオペレータ間のＩＨＦによってさらに増強することができ、これは、オペレータ−結合およびヘテロダイマーハイブリッド間のＤＮＡルーピング（looping）の関与を示唆する（図３）。大きな抑圧ループは、ＩＨＦに対して依存性が少なくあるべきであり、その理由は、大きなループほど曲げおよびツイストが容易であるためであり［Ｒippeらの「Ｔrends in Ｂiochem. Ｓci.」（２０：５００−５０６、１９９５年）；Ｗang ＆ Ｇiaeverの「Ｓcience」（２４０：３００−３０６、１９８８年）］、またＩＨＦはＰ３ＬｅｘＡＯｐＸ（約７７ｂｐの小さいループ寸法）により抑圧を増強するが、Ｐ３ＬｅｘＡＯｐＨ（約１４０ｂｐの大きいループ寸法）ではそうでないことが認められる（表１）。ＩＨＦ−仲介ＤＮＡルーピングは、他の細菌性位置でプロモータ活性を正常に調整する［Ｎashの「Ｔrends Ｂiochem. Ｓci.」（１５：２２２−２２７、１９９０年）；Ｐrattらの「Ｍol. Ｍicrobiol.」（２０：９１１−９１７、１９９６年）；Ｈooverらの「Ｃell」（６３：１１−２２、１９９０年）］。これらの異なる系におけるＩＨＦの関与は、ＩＨＦが独立モジュールとして機能することを示唆するものであり、よって、Ｅ．coli二ハイブリッド系の人工環境におけるその効果の理論的説明を付与する。
抑圧は、ループの内側のプロモータからのＲＮＡＰの除外を反映しうる［Ｍuellerらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２５７：２１−２９、１９９６年）；Ｃhoy ＆ Ａdhyaの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（８９：１１２６４−１１２６８、１９９２年）；Ｈuoらの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（８５：５４４４−５４４８、１９８８年）］。ｚｉｐ−ＡｒａＣDNA／ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAおよびＰ３レポータ・プラスミドによる２倍抑圧によって、抑圧の第２のメカニズムが示唆される（表１）。ダイマーＡｒａＣ分子は、モノマーＡｒａＣ分子と比べて、Ｉ１−Ｉ１からａｒａＢＡＤをより有効に活性化するので［Ｒeeder Ｔ．＆Ｓchleif Ｒ．の「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２３１：２０５−２１８、１９９３年）］、ｚｉｐ−ＬｅｘＡDNAは、ヘテロダイマー化を介してダイマーｚｉｐ−ＡｒａＣDNAを分裂させることにより、Ｐ３による抑圧を引き起すと思われる（図６）。この解釈に一致して、Ｆｏｓ−ＡｒａＣDNAはモノマーであり、Ｊｕｎ−ＬｅｘＡDNAはプラスミドＰ３といっしょに抑圧することができない（表１）。またハイブリッド相互作用−依存ＤＮＡルーピングは、ａｒａＢＡＤプロモータ領域のＤＮＡ結合を変えることによって抑圧を引き起しうるか［Ｎickerson ＆ Ａchbergerの「Ｊ．Ｂacteriol.」（１７７：５７５６−５７６１、１９９５年）］、あるいはＤＮＡ−結合ＡｒａＣまたはＲＮＡＰの活性化機能と共に、抑圧ループ［Ｃhatterjeeらの「Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ」（９４：２９５７−２９６２）］もしくはオペレータ−結合ＬｅｘＡハイブリッド［Ｅlledge ＆ Ｄavisの「Ｇenes ＆ Ｄev.」（３：１８５−１９７、１９８９年）］の物理的干渉を反映しうる。実際に、ＡｒａＣ−ＲＮＡＰ相互作用の幾何学的配置は、ＲＮＡＰα−サブユニットの関与のため、複雑となりそうである［Ｇiffard ＆ Ｂoothの「Ｍol. Ｇen. Ｇenet.」（２１４：１４８−１５２、１９８８年）］。ＡｒａＣ−α相互作用の関与は、何故我々が我々のＡｒａＣ／ＬｅｘＡハイブリッド・ヘテロダイマーで活性化を遂行できるのかを説明しうる。
Ｅ．coli二ハイブリッド系の一般的実用性：
この報告でのＡｒａＣDNAハイブリッドの全ては、ａｒａＢＡＤプロモータを活性化する能力を保有する。また我々は、ヒト乳頭腫ウイルスＥ２蛋白質［Ｍueller ＆ Ｓappの「Ｖirology」（２１９：２４７−２５６、１９９６年）］や真核生物ＤＰ１［Ｇirlingらの「Ｎature」（３５２：８３−８７、１９９３年）］およびＥ４７［Ｋadeschの「Ｃell Ｇrowth ＆ Ｄifferent.」（４：４９−５５、１９９３年）］蛋白質からの大きな融合パートナーによる活性化にも注目した。幾つかの融合パートナーは、活性化するＡｒａＣDNAの能力をなくすが、我々は概して、野生型ＡｒａＣまたはｚｉｐ−ＡｒａＣDNAのＮ末端への融合による良好な活性化に気付く。これらの知見は、活性化およびダイマー化ドメインへのＡｒａＣの機構（organization）に一致し［Ｅustanceらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２４２：３３０−３３８、１９９４年）］、かつ元のままの活性化機能を持つＡｒａＣハイブリッドがほとんどの融合パートナーによって得ることができることを示唆する。良好なＬｅｘＡオペレータ結合能力を持つハイブリッド蛋白質を生成するＬｅｘＡの適格性は、十分に立証されている［たとえば、Ａllenらの「Ｔrends in Ｂiochem. Ｓci.」（２０：５１１−５１６、１９９５年）］。
幾つかの真核生物蛋白質は、Ｅ．coliにおいて正確に折りたたむ（fold）ことができず［Ｃlelandの「Ｐrotein Ｆolding：in Ｖivo and in Ｖitro」（Ｊ．Ｃleland編（ＡＣＳ）、１−２１頁、１９９３年）］、これは潜在的な限界を表わす。我々は、当該系が原核生物蛋白質、Ｅ．coliから活性な形状で得ることができる真核生物蛋白質、およびＥ６／Ｅ６ＡＰ蛋白質ペアなどの真核生物蛋白質の小さい規定ドメインの場合に特に有用となると確信する。
機械学的に、当該系は、蛋白質相互作用がレポータ遺伝子活性化によって示される酵母−二ハイブリッド系とは基本的に異なるが、この酵母系と同様、ｚｉｐ／ｚｉｐおよびＦｏｓ／Ｊｕｎ蛋白質ペアで証明されるように、ホモおよびヘテロダイマー相互作用を検出することができる。これらの特徴は、これら２つの系と、主にホモダイマー相互作用を検出する他のＥ．coli系とを区別する［Ｄoerrらの「Ｂiochem.」（３０：９６５７−９６６４、１９９１年）；Ｍarchettiらの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２４８：５４１−５５０、１９９５年）；Ｊappelli ＆ Ｂrennerの「Ｊ．Ｍol. Ｂiol.」（２５９：５７５−５７８、１９９６年）］。ＡｒａＣおよびＬｅｘＡオペレータ間のＤＮＡループは、我々の二ハイブリッド系の有効性に寄与する基本要因となる。理論的に検討すれば［Ｒippeらの「Ｔrends in Ｂiochem. Ｓci.」（２０：５００−５０６、１９９５年）；Ｗang ＆ Ｇiaeverの「Ｓcience」（２４０：３００−３０６、１９８８年）］、ＤＮＡループのツイストおよび曲げは、ヘテロダイマー・サブユニットが密に隣接するハーフ部位に結合するのを妨げうる立体束縛を減少させることが示唆される。この融通性は、蛋白質ホモダイマー化を検出するＥ．coli系にない特徴である。
レポータ遺伝子活性における大相互作用−依存バリエーションの潜在能力は、酵母−二ハイブリッド系が広範に用いられている同じ適用に対する、当該系の基本的有用性を示唆する。これらの適用には、蛋白質相互作用ドメインのマッピングおよび’相互作用クローニング’が包含され、そして我々は、ここで、現代バージョンの系は、細菌性または酵母ゲノムから調製した小インサート・ライブラリーから相互作用体を単離するのに、多分適当であることを提示する。
ｌａｃレポータとその発現が毒性である遺伝子との交換［Ｗallの「Ｂio Ｔechniques」（２０：６９０−６９３、１９９６年）］、またはβ−ガラクトシダーゼの毒性基質の使用は、ＬｅｘＡに融合する大きな哺乳類インサート・ライブラリーからの、相互作用クローンの積極的な選択を可能ならしめるべきである。他の適用の、蛋白質相互作用の治療上活性な小分子モジュレータの高処理量スクリーニング［Ｇibbs ＆ Ｏliffの「Ｃell」（７９：１９３−１９８、１９９４年）］は、変異体Ｅ．coli菌株の急成長および透過性増加から利益をうることができる［Ｈigginsの「Ｃurr. Ｏpin. in Ｃell Ｂiol.」（５：６８４−６８７、１９９３年）；ナカムラおよびスガヌマの「Ｊ．Ｂacteriol.」（１１０：３２９−３３５、１９７２年）］。さらにＥ．coliは、酵母中の非核標的蛋白質の場合に問題のあった、ハイブリッド蛋白質の核限局化を要しない［Ａllenらの「Ｔrends in Ｂiochem. Ｓci.」（２０：５１１−５１６、１９９５年）を再検討］。本明細書に記載の系は、これとは機械学的に全く異なる他のＥ．coli系に対して有用な代用物であることが確信され、またその用途についても酵母−二ハイブリッド系と同様なものが提案される［Ｄoveらの「Ｎature」（３８６：６２７−６３０、１９９７年）］。
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本明細書で用いる略語の定義は、以下の通りである。
ＡＴ      アンヒドロテトラシクリン
ｂｐ      塩基対
ＣＰＲＧ  クロロフェノールレッド−β−Ｄガラクトピラノシド
ｃＤＮＡ  相補性ＤＮＡ
ＤＮＡ    デオキシリボ核酸
ＩＰＴＧ  イソプロピルチオガラクトシド
kb，kbp   キロ塩基対
ＭＵ      ミラー単位
ＲＮＡ    リボ核酸
ｗｔ      野生型
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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