(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の蛋白質又は糖蛋白質の比生産速度が高い形質転換動物細胞を取得する方法であって、下記の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）目的の蛋白質又は糖蛋白質をコードする外来遺伝子と共にジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を有するベクターを用いて動物宿主細胞を形質転換する工程、
（２）形質転換動物細胞をあらかじめメソトレキセート（ＭＴＸ）を含まない培地で培養した後に、ＭＴＸ濃度を５０ｎＭの低濃度から高濃度へ３段階又は４段階で上昇させ、それぞれの濃度条件下でＭＴＸ耐性を獲得させるまで培養することで、テロメアタイプの細胞の割合を高める工程、
（３）フルオレセイン標識したＭＴＸを用いて蛍光標識化された細胞の蛍光強度が高い細胞を選別する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって取得された、テロメアタイプの形質転換動物宿主細胞。
【請求項３】
請求項２の形質転換動物宿主細胞を培養して、目的の蛋白質又は糖蛋白質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子組換えによって外来遺伝子が導入された宿主細胞によって、有用外来蛋白質を工業的に生産する際に、その生産効率が高い細胞株を効率良く製造し、かつ効率良くそれを選択する方法に関する。さらに、本発明は、その方法によって得られる宿主細胞、及びそれを用いた蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換えを用いて、糖鎖が付加される蛋白質を生産する場合、糖鎖を付加する能力を持つ真核生物細胞を宿主として用いる必要がある。糖鎖がその生理機能に重要である糖蛋白質の多くは、糖鎖の有無だけでなく、糖鎖の質が重要である。しかし、蛋白質に付加される糖鎖の質は宿主によって異なる。このため、例えばヒト由来の糖蛋白質を生産する場合、ヒトに近い質の糖鎖を付加できる高等動物細胞を宿主に用いる必要がある。高等動物細胞は、例えば酵母のような下等真核生物とは異なり、その細胞増殖が遅く培地も高価であるいという問題点を有している。これを補うため、高等動物細胞を宿主に用いる場合は、細胞当たり時間当たりの蛋白質の生産性、即ち比生産速度を向上させる必要がある。
【０００３】
比生産速度を向上させるには、当該遺伝子を強力なプロモーターに接続するという方法も提案されているが、それだけでなく当該遺伝子のコピー数を増加させる遺伝子増幅と言う手法が用いられる。遺伝子増幅は、阻害剤などの薬剤の添加に対して細胞が耐性を獲得する機構の一つとして、その耐性を担う遺伝子のコピー数が増加する場合があり、この現象を利用した手法である。動物細胞において遺伝子増幅が起こる場合、薬剤で選択圧をかけた遺伝子そのものだけでなく、その遺伝子の近傍に存在する他の遺伝子も同時に増幅されるので、結果として外来遺伝子も同時に増幅される。例えば、当該遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲという。）遺伝子を有するべクターを宿主動物細胞に導入した後、ＤＨＦＲの拮抗阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸという。）の存在下で培養すれば、ＤＨＦＲ遺伝子と共に当該遺伝子のコピー数が増加した細胞株が取得できることが知られている。
【０００４】
しかし、この遺伝子増幅は全ての細胞に同時に起こるのではなく、一部の細胞で様々なタイミングで起こるため、ある濃度のＭＴＸを含む培地で選択した細胞は、様々なコピー数の遺伝子を持つ細胞のへテロな集団となる。従って、目的蛋白質の生産性を最大とするためには、この細胞集団の中から、目的蛋白質の比生産速度が最も高い細胞（即ち、遺伝子のコピー数が最も高い細胞）をクローニングして株化することが望まれている。さらに、組換え蛋白質を工業生産する場合、とりわけ医薬品に供するために生産される場合には、厳しい品質管理が要求されるが、前記したヘテロな細胞集団を用いて生産すると、品質にバラツキが生じ品質管理が容易でないため、このクローニング作業が望まれていた。
しかしながら、比生産速度が最も高い細胞（即ち、遺伝子のコピー数が最も高い細胞）を効率よくクローニングするための指標が確立されておらず、形質転換体からのヘテロな細胞集団から目的の細胞をクローニングすることは困難であった。
【０００５】
ところで、形質転換された宿主細胞をいきなり高濃度の薬剤にさらせば、遺伝子増幅が起こる前に全ての細胞が死滅してしまう。このため、遺伝子増幅細胞を選択する薬剤の濃度は低い濃度から段階的に上昇させなければならないが、低い濃度から緩やかに上昇させることにすると、細胞の選択には時間を要することになる。逆に細胞の選択を比較的短時間で行うために、薬剤の濃度を急激に上昇させれば、全ての細胞が死滅するほど極端でない場合であっても遺伝子増幅以外の機構で耐性を獲得する細胞の出現頻度が高まる。この場合には薬剤耐性は獲得することができるが、遺伝子増幅はされていないのでその細胞の当該蛋白質比生産速度は低いままとなるは、より低くなる。例えば、ＤＨＦＲのＭＴＸに対する親和性が低下する変異やＭＴＸを取り込みにくくなる変異が生じた株の目的蛋白質の比生産速度は、遺伝子増幅によって同じＭＴＸ耐性レベルを獲得した株のそれに比べて低くなる。
【０００６】
このような薬剤による選択で得られた細胞は上記のようにへテロな細胞集団であるため、仮に薬剤耐性の獲得が一様であったとしても、薬剤耐性の獲得が遺伝子増幅のみにとるものではないので、目的の蛋白質の生産性の高い株を選別するためにはクローンを取得してそれぞれについて比生産速度の評価をしなければならなかった。しかし、当該蛋白質の比生産速度の評価は手作業であり、クローンの取得には１〜２ヶ月もの時間を要していた。
以上のことから、当該遺伝子が増幅した細胞を効率良く迅速に選別する手法が望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、遺伝子組換えによって外来遺伝子により形質転換された細胞の中から、目的の蛋白質の比生産速度が最も高い細胞（即ち、遺伝子のコピー数が最も高い細胞）を効率よくクローニングするための方法を確立すること望まれており、本発明は目的の蛋白質の比生産速度が最も高い細胞を選別するための指標を提供するものである。
また、本発明は、遺伝子増幅によって耐性を獲得する細胞を高頻度かつ短時間で得るＭＴＸ濃度上昇方法、及び、これによって得られた細胞群から最も高い目的蛋白質比生産速度を有する細胞を迅速に選別する方法、及び当該方法で選別された細胞を提供するものである。
【０００８】
ところで、外来遺伝子により形質転換された細胞の中から、目的の蛋白質の比生産速度が最も高い細胞（即ち、遺伝子のコピー数が最も高い細胞）を効率よくクローニングするための方法を確立するためには、当該外来遺伝子のコピー数に対応する指標を確立することが重要であると考えられる。そして、当該外来遺伝子は薬剤耐性に伴って増幅する遺伝子と共に増幅するのであるから、薬剤耐性に伴って増幅する遺伝子との対応関係を高信頼性で担保することができれば、薬剤耐性に伴って増幅する遺伝子のコピー数を当該外来遺伝子のコピー数の指標とすることができる。さらに、薬剤耐性に伴って増幅する遺伝子のコピー数を標識化することが可能であれば、これを「標識化が可能な遺伝子」とすることもできることになる。
しかしながら、前述してきたように外来遺伝子と薬剤耐性に伴って増幅する遺伝子との対応関係を高信頼性で担保することが大きな問題であった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、外来遺伝子と薬剤耐性に伴って増幅する遺伝子との対応関係を高信頼性で担保することができる方法について鋭意研究してきた結果、形質転換細胞の薬剤選択において、最初の選択の薬剤濃度を低く設定することによって、遺伝子増幅以外の機構で耐性を獲得する細胞の出現頻度を抑えられること、及び、このようにして選択したへテロな細胞集団について、蛍光標識した薬剤を細胞に取り込ませ、発する蛍光強度が高い細胞をフローサイトメーターで選別することによって、当該遺伝子が増幅された細胞を迅速に選択できることを見いだした。
【００１０】
本発明は、遺伝子組換えによって外来遺伝子が導入された宿主細胞において、導入した外来遺伝子が２コピー以上に増幅された細胞を、外来遺伝子のコピー数に対応した標識化をして、標識化された細胞の発する標識の強度を指標にして高いコピー数の外来遺伝子を持つ細胞を選別する方法に関する。
また、本発明は、外来遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有するベクターを用いて形質転換された宿主細胞の外来遺伝子の増幅を誘導して外来遺伝子が２コピー以上に増幅された遺伝子の増幅方法において、当該形質転換後の初めてのメソトレキセート（ＭＴＸ）を含む培地での培養の際に、当該培地におけるメソトレキセート（ＭＴＸ）濃度が低濃度であることを特徴とする外来遺伝子の増幅方法に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、前記した外来遺伝子の増幅方法により外来遺伝子が増幅された宿主細胞を、外来遺伝子のコピー数に対応した標識化をして、標識化された細胞の発する標識の強度を指標にして高いコピー数の外来遺伝子を持つ細胞を選別する方法に関する。
また、本発明はこれらの方法により得られる高いコピー数の外来遺伝子を持つ宿主細胞に関する。
そして、これらの宿主細胞は、高いコピー数の外来遺伝子を持っているので、本発明はこれらの宿主細胞を培養して外来遺伝子がコードする蛋白質又は糖蛋白質を効率よく製造する方法に関する。
さらに、本発明は、遺伝子組換えによって外来遺伝子が導入された宿主細胞における導入した外来遺伝子を増幅する方法において、外来遺伝子が増幅され目的の蛋白質の比生産速度の高い宿主細胞であることを、染色体のテロメア近傍において増幅が行われていることを指標とする外来遺伝子を増幅する方法に関する。
【００１２】
本発明者らは、外来遺伝子と薬剤耐性に伴って増幅する遺伝子との対応関係を高信頼性で担保できるかという問題を研究してきたところ、形質転換された細胞を比較的に低い薬剤濃度から徐々に高い濃度にして培養することにより、高頻度でかつ高信頼性でこの問題を解決できることを見出した。また、目的の蛋白質の比生産速度の高い宿主細胞は、染色体のテロメア近傍において増幅が行われていることを見出した。
【００１３】
本発明の方法を、例えば、薬剤耐性に関するものとしてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を例にしてより具体的に説明する。
ＤＨＦＲは、核酸の生合成に必須であり、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損する細胞は核酸を含まない培地で生育できない。ＤＨＦＲ遺伝子を欠損する細胞に遺伝子組換え技術によりＤＨＦＲ遺伝子を導入すると、形質転換により核酸要求性が回復した形質転換体を容易に選択することができるようになる。
しかし、メソトレキセート（ＭＴＸ）という薬剤は、生体内においてＤＨＦＲの作用を阻害するので、ＤＨＦＲ遺伝子が導入された形質転換体においても、ＭＴＸ存在下ではＭＴＸ耐性を獲得しないと生存することはできなくなる。
【００１４】
さらに具体的には、ＤＨＦＲ遺伝子を有する適当な発現べクターに発現させたい蛋白質の外来遺伝子を挿入し、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ細胞）などの宿主細胞にこのべクターをエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などの適当な方法を用いて導入して形質転換する。使用される宿主細胞は、例えばＣＨＯ  ＤＧ４４株のように、ＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているものが好ましい。しかし、ＤＨＦＲ欠損株が利用できない場合であっても、用いるべクターに例えばＧ−４１８などの薬剤に対する耐性遺伝子を更に挿入しておくことによって、薬剤耐性を指標に形質転換体を選択することもできる。
【００１５】
例えば、外来遺伝子としてヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子を、ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現べクターに挿入し、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ＤＧ４４株に導入し、ＩＭＤＭ培地（核酸含有）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養して形質転換体を得た。次いで、形質転換細胞をＩＭＤＭ培地（核酸不含）、１０％透析牛胎児血清を添加した培地で、形質転換体のみを選択した。
得られた形質転換体を図１に示すように、最初に５０ｎＭ、１００ｎＭのＭＴＸを含み、核酸を含まないＩＭＤＭ培地を用いて、初発細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌをその１０から１００倍程度に増加するまで培養した。その後、図１に示すように、ＭＴＸ濃度を穏やかに上昇させる系列から急激に上昇させる系列からなる１から５の５系列で、最終濃度１０００ｎＭまででＭＴＸの濃度上昇試験を行った。
【００１６】
それぞれの系列（パターン）における比増殖速度μ（ｈ−１）特許比生産速度ρ（１０−１６ｇ−ｈＧＭ−ＣＳＦ・ｃｅｌｌ・ｈ−１）を測定した結果を図２に示す。図２における黒丸印（●）は系列１（パターン１）の場合を示し、黒上三角印（▲）は系列２（パターン２）の場合を示し、黒四角印（■）は系列３（パターン３）の場合を示し、黒下三角印（▼）は系列４（パターン４）の場合を示し、黒菱形印（◆）は系列５（パターン５）の場合を示す。
系列１〜３はＭＴＸの濃度を穏やかに上昇させたものであり、この場合のものはＭＴＸの濃度を急激に上昇させた系列４及び５のものに比べて比生産速度の高い細胞が得られることがわかった。
【００１７】
さらに、本発明者らは、これらの各系列の各ステップにおける遺伝子増幅領域分布の解析を行った。その結果を図３に示す。図３の黒部分は増幅された遺伝子がテロメア近傍に位置しているもの（以下、テロメアタイプという。）を示し、灰色部分は増幅された遺伝子がテロメア近傍以外の領域にに位置しているもの（以下、他のタイプという。）を示し、白色部分は増幅された遺伝子が遺伝子中に見出せないもの（以下、シグナル無しタイプという。）を示している。
この結果、最初のステップでＭＴＸの濃度を５０ｎＭとしたグループ（系列１〜３）では、テロメアタイプが約７０％となり、シグナル無しタイプがほとんど消失してゆくのに対して、最初のステップでＭＴＸの濃度が１００ｎＭとしたグループ（系列４及び５）では、テロメアタイプが約４０％程度で他のタイプもほぼ同程度となり、シグナル無しタイプも約２０％残されることがわかった。
【００１８】
また、最初のステップでＭＴＸの濃度を５０ｎＭとしたグループ（系列１〜３）では、その後のＭＴＸの濃度上昇に余り関係無く増幅遺伝子の領域分布が決定されるのに対して、最初のステップでＭＴＸの濃度を１００ｎＭとしたグループ（系列４及び５）では、ＭＴＸの濃度上昇のパターンによりテロメアタイプと他のタイプの割合が変化することもわかった。
【００１９】
シグナル無しタイプの細胞は、遺伝子増幅が行われていないか、又は検出不可能な程度しか遺伝子増幅が行われていない細胞であると考えられる。テロメアタイプの細胞と他のタイプの細胞について、両者の相違を検討した。
パターン１とパターン４におけるＭＴＸ濃度上昇試験によって得られたテロメアタイプのクローン細胞１６個と他のタイプのクローン細胞１１個を用いて、これらの細胞の１０００ｎＭＭＴＸ存在下における比増殖速度と比生産速度を測定した。結果を次の表１に示す。
【００２０】
【表１】
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この結果より、テロメアタイプのクローン細胞は、他のタイプのクローン細胞に比べて比増殖速度は約１．５倍であり、比生産速度も約６倍大きいことがわかった。
また、テロメアタイプと他のタイプのクローン細胞を１株づつ取り出して、ＤＨＦＲ遺伝子とｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のコピー数を解析した結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
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これらの結果から、テロメアタイプの細胞はＤＨＦＲ遺伝子も蛋白質をコードする遺伝子も十分に増幅されているが、他のタイプの細胞は十分な増幅が行われていないにも拘わらず、ＭＴＸ耐性を獲得していることから薬剤耐性は遺伝子増幅以外の機構で獲得したものと考えられる。したがって、他のタイプの細胞は、テロメアタイプの細胞に比べてシグナル強度が非常に低いにもかかわらず、同程度のＭＴＸ耐性を獲得しており、プラスミドが染色体に組み込まれたものの、遺伝子増幅以外の機構でＭＴＸ耐性を得ている細胞と考えられる。
そして、いずれの系統（パターン）による培養においても最終的にはシグナル無しタイプの細胞はほとんど無くなるものの、遺伝子増幅操作の初期段階でＭＴＸ濃度を低く抑えた場合には、テロメアタイプの細胞が多く得られるのに対して、ＭＴＸ濃度を高くした場合には、他のタイプの細胞が多数混入することがわかった。
【００２２】
これらの結果から、遺伝子増幅においては、培養段階の途中のＭＴＸ濃度の上昇のさせかたよりも、最初に遺伝子が組み込まれる染色体位置が重要であることは判明した。そして、最初に遺伝子が組み込まれる染色体の位置は、最初の培養における薬剤の濃度に依存していることが判明した。
【００２３】
即ち、形質転換された細胞をＭＴＸを含む培地で培養すれば、ＤＨＦＲ遺伝子及び目的蛋白質の遺伝子が増幅されるが、初めて添加するＭＴＸの濃度が５０ｎＭより高ければ、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅以外の機構でＭＴＸ耐性を獲得する細胞の割合が増加し、また、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅によってＭＴＸ耐性を獲得した細胞であっても、その遺伝的な安定性が低い、即ち、非選択培地（核酸不含）で培養した場合に増幅遺伝子が容易に脱落する細胞株の割合が増加してしまう。これは、遺伝子増幅の際にはＤＨＦＲ遺伝子のコピー数が一気に増加するのではなく、細胞周期を重ねるうち次第に増加するため、初めて添加するＭＴＸの濃度が高い場合には、遺伝子増幅以外の耐性獲得機構、例えば、ＤＨＦＲ遺伝子が変異してＤＨＦＲ蛋白質のＭＴＸに対する親和性が低下する、あるいは、ＭＴＸを細胞内に取り込みにくくなるような変異が起こるなどの現象によってＭＴＸに対する耐性を獲得した株が、耐性獲得のために長い時間を必要とする遺伝子増幅細胞に比べ、優先的に生育するためであると考えられる。しかしながら、染色体中のコピー数が少ないため、高い耐性の割に、組換え蛋白質の生産性は低い（表１及び２参照）。
【００２４】
遺伝子増幅によってＭＴＸ耐性を獲得する細胞が生育できるようにするためには、初めて添加するＭＴＸの濃度を低く設定することが重要であり、これによってＤＨＦＲ遺伝子が、一旦ある程度のコピー数にまで増加すれば、その後はＭＴＸの濃度を一気に１０倍程度上げても遺伝子増幅による耐性獲得が可能であるため、遺伝子増幅以外の機構でＭＴＸ耐性を獲得する株が優先的に生育する頻度は極めて低くなる。
【００２５】
上記の方法で侍られた遺伝子増幅細胞には、最終的に培地に添加したＭＴＸに対してぎりぎりの耐性を与えるコピー数のＤＨＦＲ遺伝子を持つ株、余裕ある耐性を与える更に高いコピー数のＤＨＦＲ遺伝子を持つ株が含まれ、更に、低頻度ではあるが、遺伝子増幅以外の機構でＭＴＸ耐性を獲得した株が含まれている。従来は、このような細胞群からクローンを単離し、それぞれについて目的蛋白質の比生産速度を評価していた。しかし、目的蛋白質の比生産速度が高い株は目的蛋白質遺伝子のコピー数も高く、このような細胞はＤＨＦＲ遺伝子のコピー数も高く、即ち、細胞内のＤＨＦＲの量も多いことも明らかとなった。従って、ＤＨＦＲに特異的に結合する蛍光物質、例えばフルオレセイン標識したＭＴＸ（Ｆ−ＭＴＸ）で細胞内ＤＨＦＲを蛍光標識し、個々の細胞が発する蛍光強度を指標にして高い蛍光強度を持つ細胞を選別すれば、目的蛋白質の比生産速度が高い株を得ることができることになる。
【００２６】
そこで、遺伝子増幅した細胞及びそれ以外のクローン細胞を用いて、ＤＨＦＲ活性や組換え蛋白質の生産性と、蛍光標識したＭＴＸの蛍光強度の相関について検討を行った。
前記のＭＴＸ濃度上昇試験におけるパターン１とパターン４から得られたテロメアタイプのクローン細胞６個と他のタイプのクローン細胞７個について、ＤＨＦＲ活性とＦ−ＭＴＸ平均蛍光強度との関係を解析した。結果を図４に示す。
図４から分かるように、テロメアタイプの遺伝子が増幅されたクローン細胞（●）のＦ−ＭＴＸ平均蛍光強度は、他のタイプのクローン細胞（▲）よりも高い値を示し、蛍光強度とＤＨＦＲ活性の間には、直線関係が得られることが確認された。
【００２７】
また、ＤＨＦＲ高生産細胞株が目的蛋白質高生産株であることを確認するために、Ｆ−ＭＴＸ平均蛍光強度と比生産遠度の関係を解析した。その結果を図５に示し、両タイプクローン細胞における平均蛍光強度および非生産速度の平均値を表３に示す。
【００２８】
【表３】
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図５から分かるように、テロメアタイプのクローン細胞（●）と他のタイプのクローン細胞（▲）とは、それぞれことなる相関があることが確認された。
【００２９】
以上の結果から、比生産速度とＦ−ＭＴＸ蛍光強度の間にも相関関係があることが明らかとなった。そして、遺伝子が増幅されたテロメアタイプの細胞は、明らかにその他の耐性細胞と比較して高い蛍光強度を有しているため、これらの細胞をフローサイトメトリによって選別することが可能となる。
例えば、高い蛍光強度を持つ細胞を選別するには、短時間で膨大な数の細胞を選別可能な、図６に示すようなフローサイトメトリ（セルソーター）を用いて選別することができる。また、マイクロマニピュレーターを装備した蛍光顕微鏡を用いて高い蛍光強度を持つ細胞を採取しても良いし、光ピンセット機能を持つ共焦点レーザー顕微鏡を用いて選別することもできる。
【００３０】
以上のように本発明の方法によれば、薬剤選択の最初に加えるＭＴＸ濃度を低く押さえ、遺伝子増幅した細胞のみを選択的に効率よく出現させ、様々な細胞が存在する細胞群から、遺伝子増幅によって高頻度に染色体中のコピー数を増加した細胞を、迅速かつ膨大な数の細胞について選択を行えるフローサイトメトリなどをを用いることによって、高い比生産速度を有する遺伝子増幅細胞を従来のクローニングによる選択法に比べ迅速かつ簡便に取得することが可能となった。
【００３１】
即ち、本発明は、目的の外来遺伝子と標識化が可能な遺伝子との増幅において、標識化が可能な遺伝子を増幅する条件下において、両遺伝子の増幅を一定の相関を持って増幅することができるという新規な技術的思想を提供するものであり、係る本発明の技術的思想を具現化する手段は、使用する遺伝子や宿主細胞などの特性に応じて当業者が適宜実験的に設定することができ、本発明はこれらの具体的な手段にかかわらず本発明の前記した技術的思想に基づくものは全て包含している。そして、前記した本発明の技術的思想に基づいて遺伝子が増幅された細胞は、目的の外来遺伝子と標識化が可能な遺伝子とが高信頼性で相関を保っていることから、迅速かつ簡便な手段により遺伝子のコピー数に応じた細胞の選別をすることができるものであり、本発明は当該選別方法を包含するものでもある。次に本発明の実施の形態を例示するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３２】
本発明における薬剤選択の最初に加える薬剤の濃度としては、テロメアタイプの遺伝子導入細胞が選択的に出現する濃度であればよく、例えば薬剤がＭＴＸの場合では５０ｎＭ以下、好ましくは１〜５０ｎＭ、より好ましくは１０〜５０ｎＭである。
本発明における「標識化が可能な遺伝子」としては、薬剤耐性などにより増幅が可能な遺伝子であって、蛍光又は放射性同位元素などにより標識化でき得る遺伝子であればよい。ＤＨＦＲ遺伝子が本発明の好ましい例であるが、この遺伝子に限定されるものではない。
本発明の外来遺伝子としては、有用な蛋白質（糖蛋白質などの蛋白質誘導体を含む。）を製造することができる遺伝子であって前記した「標識化が可能な遺伝子」と共に増幅することができるものであればよい。好ましくは、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｔ−ＰＡなどの生理活性蛋白質をコードする遺伝子を例示することができる。
【００３３】
本発明における「コピー数に対応した標識化」としては、蛍光標識や放射性同位元素などによる標識を例示することができるが、これらに限定されるものではなく、遺伝子の数を定量化できる手段であれば標識物質を使用しない機器分析手段のようなようなものであってもよい。
本発明の宿主細胞としては、遺伝子導入が可能であればよいが、真核細胞のみならず原核細胞であってもよいが、動物細胞のような真核細胞が好ましい。
宿主細胞を形質転換するためのベクターとしては、発現ベクターが好ましいがこれに限定されるものではない。
【００３４】
また、本発明は前記した本発明の遺伝子増幅方法又は選別方法により、遺伝子が増幅された細胞及び選別された細胞を包含するものである。本発明の細胞は、目的の外来遺伝子が多数コピーされたものであり、当該コピー数としては好ましくは１０コピー以上、より好ましくは５０コピー以上であり、１００コピー以上であってもよい。また、本発明の細胞の特徴は細胞群中の細胞の均質性が優れている点が挙げられ、コピー数の高い細胞、より好ましくはコピー数の均一な細胞が高確率で細胞群中に存在していることである。
さらに、本発明は前記した本発明の細胞を使用して効率よく目的の蛋白質（糖蛋白質などの蛋白質誘導体を含む。）を製造する方法を提供するものである。前記したように本発明の細胞はコピー数の均一な細胞を主としているために、品質のむらが少ない蛋白質を効率的に製造することができる。
【００３５】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１（形質転換体の製造）
ＳＶ４０アリープロモーター及びマウスのｄｈｆｒ遺伝子を有するプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３７１４６）と、ＳＶ４０アリープロモーター及びｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有するプラスミドｐＣＤ−ｈＧＭ−ＣＳＦ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５７５９４）とから、図７に示すプラスミドを構築した。
構築されたプラスミドをＣＨＯ  ＤＧ４４株に導入し、形質転換された細胞をイスコフ培地（核酸＋）で１〜２日間培養した後、イスコフ培地（核酸−）に１×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種して、培地交換を４日ごとに行い、コロニーが形成されるまで培養を続けた。
【００３７】
実施例２（形質転換体のＭＴＸ存在下での培養）
実施例１で選択した細胞の遺伝子の増幅を所定のＭＴＸを含むイスコフ培地（核酸−）に、細胞を１×１０５（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の濃度で接種することによって行った。細胞がコンフルエントになった時、耐性を獲得したものとみなし、ＭＴＸ濃度をさらに上昇させた。ＭＴＸ濃度の上限を１０００ｎＭとし、緩やかに上昇させる系から急激に上昇させる系まで、図１に示すように５系列の上昇条件を設定した。
また、この実験においては、これらのＭＴＸ濃度上昇条件によって生じるいろいろな性質を有する細胞を集団として選択するために、濃度上昇各ステッフにおけるクローニング操作は一切行わず、細胞集団がどの様な挙動を示すかを解析した。
【００３８】
実施例３（細胞のクローニング）
９６穴マイクロプレートそれぞれに細胞を１個ずつとなるよう接種した（全量２００μＬ）。１個の細胞からのコロニーであることを確認し、古い培地をベンチメイトで吸引して捨てた後、０．２５％トリブシン溶液１００μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。
細胞がはがれて丸くなったら、新しい培地１００μＬを加えてよくビベッティングして、２４穴マイクロプレートに継代した（全量２ｍＬ）。コンフルエント後、古い培地をベンチメイトで吸引して捨て、０．２５％トリプシン溶液１ｍＬを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに、細胞がはがれて丸くなったら、新しい培地１ｍＬを加えてよくピベッティングして、継代（全量１０ｍＬ）てクローンを得た。
【００３９】
実施例４（ｈＧＭ−ＣＳＦ濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法））
培養上清中のｈＧＭ−ＣｓＦ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。
ヒツジ抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｐ−５２１）１ｍｇ／ＰＢＳからなる固層抗体５０μＬを０．０５Ｍリン酸緩衝液１０ｍＬに希釈し、９６穴プレート（greinerイミュロン６００）に各ウェル１００μＬずつ分注し、４℃で一夜インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄した後、ブロッキング溶液（プレート１枚あたり約７０ｍＬ）を各ウェルにいっぱいになる様に分注し、３７℃で２時間インキュベートした。
ＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄した後、酵母由来ｈＧＭ−ＣＳＦ（Genzyme RH-CSF-C）１μｇ／ＰＢＳ標準サンプルと適当な濃度に希釈した培養上澄みサンプルを、各ウェルに１００μＬずつ分注し、３７℃で２時間インキュベートした。
ＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄した後、ウサギ抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体（Genzume LP-174）１ｍｇ／ＰＢＳ１ｍＬからなる一次抗体２０μＬをＰＢＳ１０ｍＬに希釈したものを各ウェルに１００μＬずつ分注し、３７℃で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（BIOSOURCE社 65OO）からなる二次抗体２μＬを希釈液１０ｍＬで希釈し、各ウェルに１００μＬずつ分注し３７℃で２時間インキュベートした。
ＥＬＩＳＡ洗浄液で５回洗浄した後、基質（ｐ−ニトロフェニル  ホスフェート（Sigma N-9389）４錠を酵素反応基質溶液２０ｍＬに希釈し、各ウェルに５秒おきに２００μＬずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした。
反応停止液を各ウェルに５秒おきに１００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（東ソー  ＭＰＲ−Ａ４）でＡ４０５の測定を行った。
【００４０】
実施例５（遺伝子増幅領域の解析）
目的の遺伝子が染色体上のどの領域に存在するかを、蛍光 in situハイブリダイゼーシヨン（ＦＩＳＨ）法によって解析した。
Ｔ−フラスコ中の細胞が８０〜９０％程度のコンフルエントの状態になった時、古い培地をピペットで吸引して捨て、新しい培地３０ｍＬを加えた。次いで、コルセミド溶液６０μＬを加え、４〜５時間インキュベートした。
シェイクオフ（Shake-off）法により、Ｍ期の細胞を浮遊させ、９５×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を捨て、７５ｍＭＫＣｌ  １．５ｍＬに懸濁して、室温で２０分間細胞を膨張させた。
これに固定液を加えて、遠心分離し上清を捨てる操作を繰り返し、核膜を破壊した後、位相差顕微鏡で観察して、核のまわりに残さが残っていないことを確認した。
得られた標本にプローブ反応液８μＬ(スライド1枚当たり)とサケ精子ＤＮＡ溶液８μＬを混合し、エタノール沈殿させた。これに、精製したブローフにホルムアミド６．５μＬ(スライド1枚当たり)を加えて、さらに、２０％デキストラン硫酸溶液６．５μＬ(スライド1枚当たり)を加えた後、８０℃で変性し、エタノールを加えてインキュベートした。これにＴＮＢブロッキング溶液、ＦＴストック溶液及びＤＡＰＩ溶液を加えてスライドガラスにのせて、蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。
【００４１】
実施例６（コピー数の定量）
細胞内のＤＮＡは、RapidPrepＴＭ Micro Genomic DNA Isolation Kit(Pharmacia Biotech 27-5225-01)を用いて抽出した。プローブに用いるためのＤＮＡは、細胞に導入したブラスミドであるｐＳＶ２−ｄｈｆｒ／ｈＧＭ−ＣＳＦ中のｄｈｆｒ遺伝子のみをPrep-A-Gene DNA purification Kit(Bio-rad 732-6009)を用いて回収したものを使用した。コピー数の定量は、DIG-DNA Labeling and Detection Kit(Boehringer Mannheim 1093657)を用いて、ドットブロッティング（Dot Blotting）法によって行った。
【００４２】
実施例７（ＤＨＦＲ活性の測定）
１×１０７個の細胞を５００μＬのＰＢＳに懸濁し、超音波により細胞を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液とした。これに、ジヒドロ葉酸１００μＬ、ＭＴＸストック溶液、ＮＡＤＰＨ溶液１０μＬなどを加えて、分光光度計により、３４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４３】
実施例８（ＤＨＦＲ量の測定と細胞の選別）
ＭＴＸを含まない培地（核酸−）で細胞を培養して、ＤＨＦＲに結合しているＭＴＸを完全に流出させる。５×１０５個の細胞を取り、これにＦＩＴＣ標識したＭＴＸ（Ｆ−ＭＴＸ）溶液２００μＬ、イスコフ培地（核酸＋）２．５ｍＬを加えてインキュベートした。次いでイスコフ培地（核酸−）を用いて洗浄、インキュベートして余分のＦ−ＭＴＸを流出させた。トリプシン処理をした後、遠心分離して上清を捨て、ＰＢＳ１ｍＬに懸濁した。
これをフローサイトメーター（COULTER;EPICSELITE）を用いて励起波長４８８ｎｍでＤＨＦＲ量を測定した。同様な方法で、蛍光強度に応じて細胞を分離した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明は、目的の外来遺伝子のコピー数の多い宿主細胞を簡便でかつ高信頼性で選別氏得る方法を提供するものである。本発明の方法によれば、目的の外来遺伝子のコピー数が均一な宿主細胞を選択的に選別することができるので、遺伝子組換え手段による生理活性蛋白質などの蛋白質の製造において、その生産性を質的又は量的に改善することができる。
また、本発明の方法は薬剤耐性などによる外来遺伝子の増幅される染色体上の領域を明らかにするものであり、外来遺伝子の増幅のされかたの指標を提供するものであり、外来遺伝子の増幅方法に広く応用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＴＸ濃度の上昇試験における濃度の上昇条件を示したものである。
【図２】図２は、ＭＴＸ濃度の上昇条件と比生産速度の関係を示したものである。図中の黒丸（●）は上昇試験のパターン１の場合を示し、黒上三角（▲）は上昇試験のパターン２の場合を示し、黒四角（■）は上昇試験のパターン３の場合を示し、黒下三角（▼）は上昇試験のパターン４の場合を示し、黒菱形（◆）は上昇試験のパターン５の場合を示す。
【図３】図３は、ＭＴＸ濃度の各上昇条件における遺伝子増幅領域の分布を示す。図中の黒色部分はテロメアタイプを示し、灰色部分は他のタイプを示し、白色部分はシグナル無しタイプを示す。
【図４】図４は、Ｆ−ＭＴＸ平均蛍光強度とＤＨＦＲ活性の関係を示す。図中の黒丸（●）はテロメアタイプを示し、黒三角（▲）は他のタイプを示し、左端の黒丸は元の宿主細胞を示す。
【図５】図５は、Ｆ−ＭＴＸ平均蛍光強度と比生産速度（ρ）の関係を示す。図中の黒丸（●）はテロメアタイプを示し、黒三角（▲）は他のタイプを示し、左端の黒丸は元の宿主細胞を示す。
【図６】図６は、フローサイトメーターの模式図を示す。
【図７】図７は、形質転換に用いたプラスミドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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