(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェルシュ菌に対して感染防御的な免疫応答を誘起し得る配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
別のアミノ酸配列と融合することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記別のアミノ酸配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含むことを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
別のタンパク質と複合することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
配列番号６をコードする配列番号５に示した配列の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号５を含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターで形質転換した細胞。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、請求項９に記載の細胞を培養し、該細胞またはその培地からポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドを医薬に許容可能なキャリヤと共に含有するワクチン組成物。
【請求項１２】
更にアジュバントも含有することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
アジュバントがフロイントの不完全アジュバントまたはアルミニウム塩であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項１５】
医薬の製造に用いられることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項５から７のいずれか１項に記載の核酸を含むウイルスベクターを含有するワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質または融合タンパク質を含む粘膜アジュバント。
【請求項１８】
非ヒト哺乳動物においてウェルシュ菌ε毒素に対して感染防御的な免疫応答を誘起する方法であって、該非ヒト哺乳動物に請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒツジ、仔ヒツジまたはヤギであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒト又は動物においてウェルシュ菌（Clostridium perfringens）ε毒素に対して防御的である免疫応答を誘発できる新規ペプチドに関する。本発明は、これらのペプチドの製造とそれらを含有する医薬製剤に関する。好適な薬剤は、ヒトと他の動物の両方におけるウェルシュ菌によって起る疾患状態の予防と治療を可能なものとする。
ウェルシュ菌は環境中に遍在しており、土壌中に見出され、有機物を腐敗させ、ヒトと動物の腸フローラの一部として見出された。ウェルシュ菌は、産生する毒素の型のスペクトルにより５種の生物型（Ａ〜Ｅ）の一つに帰属させることができる（McDonel,J.L.(1986)Toxins of Clostridium perfringens types A,B,C,D,and E.In Pharmacology of Bacterial Toxins,F.Dorner and J.Drews,eds.(Oxford:Pergamon Press),pp.477-517参照）。ε毒素は、ウェルシュ菌Ｂ型とＤ型によって産生されるが、Ａ型、Ｃ型又はＥ型では産生されない（Brooks,M.E.,Sterne,M.,and Warrack,G.H.(1975),Areassessment of the criteria used for type differentiation of Clostridia perfringens, J.Pathol.Bacteriol.74,185-195参照）。ウェルシュ菌Ｂ型とＤ型は、主にヤギ、ウシから分離され、まれにヒトから分離される限定された宿主範囲を有し（Smith,L.D.and williams,B.L.(1984),The pathogenic anaerobic bacteria(Springfield,Illinois: Charles C.Thomas)）、重篤で急速に致命的な腸性毒血症を引起す原因となる。子ヒツジのウェルシュ菌Ｂ型腸性毒血症感染は子ヒツジ赤痢を引起し、Ｄ型腸性毒血症は、ヒツジと子ヒツジにおける髄質様腎疾患を引起す。両方の場合とも、致死率は１００％でありうる。病気は感染性ではなく、腸の微生物バランスが崩れたとき、例えば抗生物質治療後又は食餌の変化によるときに、特発性罹病が起る。髄質様腎疾患は、過食による乏しい食餌から豊富な食餌への変化としばしば関連する（Bullen,J.J.(1970)Role of toxins in host-parasite relationships,In Microbial toxins volume 1,S.Ajl,S.Kadis,and T.C.Montie,eds.(New York: Academic Press),pp.233-276）。このような過食により、かなりの量の未消化の澱粉の豊富な食物が第一胃から小腸に移行する。これにより産生される栄養豊富な嫌気性環境により、回腸内容物１ｇ当り１０9ｃｆｕまでウェルシュ菌が増殖し、高濃度のε毒素が産生される（Bullen,J.J.and Scarisbrick,R(1957),Enterotoxaemia of sheep: experimental reproduction of the disease,J.Pathol.Bacteiol.73,494-509）。ウェルシュ菌腸性毒血症の予防用の数種のワクチンがある。それらのワクチンはホルムアルデヒド処理の細胞濾液又は全細胞培養液に基づく。それらのワクチンにより、動物において高度の防御が達成される（Stephen,J.and Pietrowski,R.A.(1986),Bacterial toxins(England: van Nostrand Reinhold(UK)Co.Ltd.）。しかし、製剤中のε毒素の免疫原性は変化が大きいと報告され、より一層規定され、変化のないワクチンが好ましい。該毒素上の単一のエピトープへの免疫は、精製ε毒素とウェルシュ菌感染に対する防御のために十分であることが示されている（Percival,D.A.,Shuttleworth,A.D.,Williamson,E.D.,and Kelly,D.C.(1990),Anti-idiotypic antibody-induced protectin against Clostridium perfringens type D,Infect.Immun.58,2487-2492）。
ε毒素は、ウェルシュ菌Ｂ型とＤ型により、３１１個のアミノ酸からなり、分子量３２，７００の比較的不活性のプロト毒素として産生される（Worthington,R.W.and Mulders,M.S.(1977),Physical changes in the epsilon prototoxin molecule of Clostridium perfringens during enzymatic activation,Infect.Immun.18,549-551）。プロト毒素のアミノ末端からの１３個又は１４個の塩基性アミノ酸のタンパク質分解的切断により、分子量３１，２００の成熟毒素が産生される（Worthington and Mulders,1977;Hunter,S.E.,Clark,I.N.,Kelly,D.C.,and Titball,R.W.,(1992),Cloning and nucleotide sequencing of the Clostridium perfringens epsilon-toxin gene and its expression in Escherichia coli,Infect.Immun.60,102-110）。活性化によりまた、ｐＩが８．０２（プロト毒素）から５．３６（十分に活性のある毒素）又は５．７４（部分的に活性化された毒素）への顕著なシフトとコンフォメーションの顕著な変化が起る（Worthington and Mulders,1977;Habeeb,A.F.,Lee,C.L.,and Atassi,M.Z.(1973)Conformational studies on modified proteins and peptides,VII.Conformation of epsilon-prototoxin and epsilon-toxin from Clostridium perfringens.Conformational changes associated with toxicity.Biochim.Biophys.Acta 322,245-250）。プロト毒素の活性化により、プロト毒素と成熟毒素の間の範囲の比活性を有する数種のイソ型が産生されるようなので複雑である（Habeeb,A.F.(1975)Studies on epsilon-prototoxin of Clostridium perfringens type D,Physicochemical and chemical properties of epsilon-prototoxin,Biochim.Biophys.Acta 412,62-69;Worthington and Mulders,1977）。より最近、毒素それ自体も数種のイソ型を有することが知見された（Hunterら，1992）。それ故、εプロト毒素の活性化は、多重のタンパク質分解的切断及び脱アミノ化やリン酸化のような翻訳後修飾を有する可能性のある多段階過程でありえ、不均一な成熟毒素が産生されうる（Hunterら，1992）。
通常、ε毒素は、ウェルシュ菌のＤ型株から得られ、メタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除、及び種々の型のイオン交換クロマトグラフィーをそれぞれ単独で、又は組合せて精製された（Verwoerd,D.W.(1960)Isolation van die protoksien van Clostidium welchii type D,J.S.Afr.Vet.Med.Assoc.31,195-203;Habeeb,A.F.(1969),Studies on epsilon-prototoxin of Clostridium perfringens type D.I.Purification methods: evidence for multiple forms of epsilon-prototoxin,Arch.Biochem.Biophys.130,430-440;Worthington,R.W.,Mulders,M.S.,and Van Rensburg,J.J.(1973),Clostridium perfringens type D epsilon prototoxin.Some Chemical,immunological and biological properties of a highly purified prototoxin,Onderstepoort.J.Vet.Res.40,143-149;Payne,D.W.,Williamson,E.D.,Havard,H.,Modi,N.,and Brown,J.(1994)Evaluation of a new cytotoxicity assay for Clostridium perfringens type D epsilon toxin,FEMS Microbiol.Lett.116,161-167）。
伝統的には、精製ε毒素の活性は、マウス致死性試験で測定されてきた（Habeeb,A.F.(1969)Studies on epsilon-prototoxin of Clostridium perfringens type D.I.Purificatin methods: evidence for multiple forms of epsilon-prototoxin,Arch.Biochem.Biophys.130,430-440;Worthington,R.W.,Mulders,M.S.,and Van Rensburg,J.J.(1973)Clostridium perfringens type D epsilon prototoxin.Some chemical,immunological and biological properties of a highly purified prototoxin,Onderstepoort.J.Vet.Res.40,143-149）。成熟毒素は高い毒性を有し、ＬＤ50は、静脈内投与のとき、マウスで１００ｎｇ未満である（Payne,D.W.,Williamson,E.D.,Havard,H.,Modi,N.,and Brown.J.(1994)Evaluatin of a new cytotoxicity assay for Clostridium perfringens type D epsilon toxin,FEMS Microbiol.Lett.116,161-167）。ε毒素活性の別のアッセイの基礎として、Madin Darbyイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞系がウェルシュ菌Ｄ型培養濾液に感受性であることが知見された（Knight,P.A.,Burnett,C.,Whitaker,A.M.,and Queminet,J.(1986)The titration of clostridial toxoids and antisera in cell culture,Develop.biol.Standard.64,129-136）。ウサギで観察される該毒素の致死効果と皮膚壊死効果及びその細胞変性活性は全て、ε毒素製剤の同じ実体によって起こされ、３種全ての活性は毒素中和試験で確実な指標であることが示された（Knight,P.A.,Queminet,J.,Blanchard,J.H.,and Tilleray,J.H.(1990)In vitro tests for the measurement of clostridial toxins,toxoids and antisera.II.Titration of Clostridium perfringens toxins and antitoxins in cell culture,Biologicals,18,263-270）。最近、ＭＤＣＫ細胞系の感受性に基づくウェルシュ菌Ｄ型ε毒素の活性の測定用の新規細胞毒性アッセイの開発が報告された（Payne,D.W.,Williamson,E.D.,Harvard,H.,Modi,N.,and Brown,J.(1994)Evaluation of a new cytotoxicity assay for Clostridium perfringens type D epsilon toxin,FEMS Microbiol.Lett.116,161-167）。５個のサンプルのうち４個で、精製ε毒素１５〜２２ｎｇ／ｍＬの範囲内のサンプルはＭＤＣＫ細胞の生存を５０％減少させるのに十分であり、８ｎｇ／ｍＬという少量で、ＭＤＣＫ細胞の生存を有意に減少させるのに十分であった（Payneら、1994）。
ε毒素をコードするｅｔｘ遺伝子は３．６Ｍｂクロモソームとは異なるエピソーム上に存在する（Canard,B.,Saint Joanis,B.,and Cole,S.T.(1992)Genomic diversity and organization of virulence genes in the pathogenic anaerobe Clostridium perfringens,Mol.Microbiol.6,1421-1429）。
該遺伝子はクローン化され、Ｂ型とＤ型の両方の配列が決定された。クローニングされた遺伝子ｅｔｘＢは分子量３２，９８１のタンパク質をコードしていた（Hunter,S.E.,Clarke,I.N.,Kelly,D.C.,and Titball,R.W.(1992)Cloning and nucleotide sequencing of the Clostridium perfringens epsilon-toxin gene and its expression in Escherichia coli,Infect.Immun.60,102-110）。配列決定された遺伝子も得られたタンパク質も、他のタンパク質と相同性を示さなかった。Ｂ型株とＤ型株からクローニングされたｅｔｘ遺伝子の配列の比較により、読取り枠で２個のヌクレオチドが異なり、その結果１個のアミノ酸の置換が起ることが示された（Havard,H.L.,Hunter,S.E.,and Titball,R.W.(1991)Comparison of the nucleotide sequence and development of a PCR test for the epsilon toxin gene of Clostridium perfringens type B and type D,FEMS Microbiol.Lett.76,77-81）。遺伝子のプロモーターは相同ではなく、異なる推定−１０配列と−３５配列を有した。このことにより、ウェルシュ菌のＢ株とＤ株の分類系を生み出すε特異的ＰＣＲプライマーの開発が可能となった。ｅｔｘプロモーターは、E.coliでクローン化遺伝子の発現を可能とした（Hunterら，1992）。ε毒素はシグナルペプチドが先にあり、ウェルシュ菌から分泌される天然タンパク質として及びE.coliのペリプラズム空間に蓄積する組換えタンパク質として得られる（Hunterら，1992;Bullen,J.J.and Batty,I.(1956)The effect of Clostridium welchii type D culture filtrates on the permeability of the mouse intestine,J.Pathol.Bacteriol.71,311-323）。E.coliで発現された組換え毒素は、天然毒素と同一の生化学的及び生物的性質を有することが示された。
動物の腸内で産生されるεプロト毒素は腸液に存在するタンパク質分解酵素で活性化される（Niilo,L.(1965)Bovine enterotoxaemia.III.Factors affecting the stability of the toxins of Clostridium perfringens types A,C and D,Can.Vet.J.6,38-42）。成熟毒素は腸の透過性を増大させ、血管内に入る（Bullen and Batty,1956;Bullen,J.J.(1970)Role of toxins in host-parasite relationships,In Microbial toxins volume 1.S.Ajl,S.Kadis,and T.C.Montie,eds.(New York: Academic Press),pp.233-276;Jansen,B.C.(1967)The production of a basic immunity against pulpy kidney disease,Onderstepoort.J.Vet.Res.34,65-80）。ε毒素の作用機作は不明であるが、幾つかの観察により、それは中枢神経系に作用することが示唆された。該毒素は、血管内皮を崩壊させて、脳の透過性バランスの広範な障害を急速に引起す（Finnie,J.W.(1984)Ultrastructural changes in the brain of mice given Clostridium perfringens type D epsilon toxin,J.Comp.Pathol.94,445-452;Buxton,D.(1976)Use of horseradish peroxidase to study the antagonism of Clostridium welchii(Cl.Perfringens)type D epsilon toxin in mice by the formalinized epsilon prototoxin,.Comp.Pathol.86,67-72）。変性変化が進行するにつれ、血清タンパク質、最後には赤血球が脈管構造から漏れ、アストロサイト末端足が裂け、浮腫が続いて起る（Buxton,D.and Morgan,K.T.(1967)Studies of the lesions produced in the brains of colostrum deprived lambs by Clostridium welchii(Clostridium perfringens)type D toxin,J.Comp.Path.86,435-447）。ε毒素で誘起される腸性毒血症の急性症状において、特徴的病巣が脳の特定の場所で起る（Hartley,1956;Buxton,1976;McDonel,1986）。化学修飾実験により、ε毒素の致死性のために、あるアミノ酸残基の重要性が示された。１個のトリプトファン（Sakurai,J.and Nagahama,M.(1985)Role of one tryptophan residue in the lethal activity of Clostridium perfringens epsilon toxin,Biochem.Biophys.Res.Commun.128,760-766）、１個のヒスチジン（Sakurai,J.and Nagahama,M.(1987)Carboxyl groups in Clostridium perfringens epsilon toxin,Microb.Pathog.3,469-474）、１個のチロシン（Sakurai,J.and Nagahama,M.(1987)The inactivation of Clostridium perfringens epsilon toxin by treatment with tetranitromethane and N-acetylimidazole,Toxicon 25,279-284）、及び３個又は４個のアスパラギン酸又はグルタミン酸（Sakurai,J.and Nagahama,M.(1987)Histidine residues in Clostridium perfringens epsilon toxin,FEMS Microbiology Letters 41,317-319）残基は、ε毒素の致死効果に必須であることが示された。８個のリシン残基も活性に重要であることが示されたが、活性部位に必須であるというよりも、恐らくコンフォメーション維持に関与する（Sakurai,J.and Nagahama,M.(1986)Amino groups in Clostridium perfringens epsilon prototoxin and epsilon toxin,Microb.Pathog.1,417-423）。
動物又はヒトに投与したときに、ウェルシュ菌ε毒素に対し防御抗体を誘導できるワクチンで使用するための新規ポリペプチドを提供し、それによってウェルシュ菌ε毒素感染に対する予防又は治療を提供することが本発明の目的である。
本発明は、ウェルシュ菌に対して防御的である免疫応答を起こさせることができるポリペプチドであって、ウェルシュ菌のε毒素又はその免疫原性フラグメントのアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、成熟毒素の残基１０６に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外のアミノ酸であることを特徴とする該ポリペプチドを提供する。
適切には、該ポリペプチドは、ウェルシュ菌のε毒素又はその免疫原性フラグメントのアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは９０％の相同性、最適には実質的に完全な相同性を有するアミノ酸配列を有する。
ウェルシュ菌ε毒素のアミノ酸配列は、図２のアミノ酸１−２８３（配列番号２）として後に示す。本発明のポリペプチドが配列番号２のポリペプチド又はその免疫原性フラグメントに相同である場合、いかなる変更されるアミノ酸も同類置換によって置換されることが好ましい。
“同類置換”ということは、アミノ酸を同一クラスの別のアミノ酸に置換することを意味する。クラスは以下のとおりである：
0004146516.tif 000002
当業者には周知のように、同類置換によってペプチドの１次構造を変えることは、該ペプチドの活性をあまり変えないかもしれない。というのは、配列に挿入されるアミノ酸の側鎖は同様の結合を形成することができるかもしれないし、置換されたアミノ酸の側鎖として接触できるかもしれないからである。置換が、ペプチドのコンフォメーションを決定するのに決定的である領域に起る場合でさえ、上記のことが当てはまる。
ポリペプチドの免疫原性を妨害しなければ、非同類置換も可能である。
本明細書で使用する“免疫原性フラグメント”という表現は、完全長の天然毒素より短いが、少なくとも１つの抗原決定基を含み、成熟毒素の残基１０６に対応する残基も含むポリペプチドを指す。適切には、該フラグメントは少なくとも１５個、より適切には少なくとも３０個、好ましくは少なくとも６０個のアミノ酸を含むものであろう。
特に、ポリペプチドは、ウェルシュ菌ε毒素のアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、成熟毒素の残基１０６に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外のアミノ酸であることを特徴とする該タンパク質を包含する。
最適には、タンパク質は、ウェルシュ菌ε毒素のアミノ酸配列を含み、成熟毒素の残基１０６に対応するアミノ酸残基はヒスチジン以外のアミノ酸であることを特徴とする。
好ましくは、位置１０６のアミノ酸は非塩基性アミノ酸、特に非極性アミノ酸、特にプロリンである。
本発明のポリペプチド又はタンパク質は、遺伝子的に無毒化（不活化）されているが、これは、本発明のポリペプチド又はタンパク質が、投与される動物において不所望の副作用を起こす可能性はより少ないことを意味する。これは、化学的無毒化方法を用いるよりも、毒素を不活化するためのずっと正確で定量的な方法である。
本発明は、上記アミノ酸配列を含むペプチド、即ちＮ−末端又はＣ−末端が拡張されたことを特徴とするアミノ酸配列を含むペプチドをも包含することも強調されるべきである。上記ペプチドの拡張は、ペプチドに更なる所望の性質、例えばより簡単な分離もしくは精製、又は免疫もしくは標識付けを増大もしくは付加することなどの性質を付与しうる。
特に、上記ポリペプチド又はタンパク質は、上記の更なる性質を付与する部分を更に含みうる融合タンパク質の一部を形成しうる。例えば、他の免疫又は標識付けを提供する目的のために本発明のタンパク質と融合した、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのアミノ酸配列又は非−ウェルシュ菌抗原性タンパク質も含まれうる。あるいは、本発明のポリペプチド又はタンパク質は、更なる所望の性質を付与する別のタンパク質との複合体の形態でありうる。
本発明のポリペプチドは合成で製造できるし、又はより適切には、組換えＤＮＡ技術を用いて得られる。それ故、本発明は、上記ポリペプチドをコードする核酸を更に提供する。
適切には、該核酸は、配列番号６をコードする配列番号５に示される配列の部分を含む。
このような核酸は、当分野で承知されているプロモーターの制御下にプラスミドなどの発現ベクターに挿入し得る。ベクターはシグナル配列、リーダー配列及びエンハンサーなどの、当分野で通常認められる他の構造を含み得、宿主細胞、例えば大腸菌などの原核細胞や真核細胞の形質転換に用いることができる。得られる形質転換細胞は培養可能であり、この培養から、即ち所望の産物が細胞から分泌されるかどうかに応じて細胞または培地から本発明のポリペプチドを回収し得る。
本発明はその更に別の構成において、哺乳動物においてウェルシュ菌ε毒素に対して感染防御的な免疫応答を誘起する方法も提供し、この方法は先に述べたポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む。
適当な哺乳動物にはヒト、並びにヒツジ、仔ヒツジ及びヤギなどの動物が含まれる。
本発明のポリペプチドは哺乳動物に、例えばワクチン組成物の形態で直接投与し得る。あるいは他の場合には、本発明のポリペプチドをコードする核酸を適当なワクチンベクター、例えば弱毒生ウイルスワクチン担体に、ベクターによるポリペプチドのｉｎ  ｓｉｔｕ発現を確実にする適当なプロモーター等の制御下に挿入ことも可能である。こうすれば、ベクターを哺乳動物に投与することによって所望の免疫応答を誘起できる。適当なベクターは、当業者には明らかであろう。その例としてＬｉｓｔｅｒ株などのワクシニアウイルスベクターや、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の弱毒株などの弱毒腸内微生物を挙げることができる。
本発明はその更に別の具体例において、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質を含有し、または代替物として前記ポリペプチドもしくはタンパク質を発現し得るベクターを含有するワクチン組成物を、好ましくは適当な投与単位の形態で提供する。本発明の組成物には場合によっては、感染防御を最適化する物質、例えばアジュバント及びキャリヤ、好ましくは医薬に許容可能なキャリヤ及びアジュバントも必要に応じて含有させる。典型的なアジュバントとしてフロイントの不完全または完全アジュバントやアルヒドロゲル（ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）を用い得るが、国際特許出願公開第９２／０３１６４号に開示されたものなど、他の適当な候補物を用いることも可能である。キャリヤの機能は食塩液が果たし得る。キャリヤは非経口投与、特に腹腔内投与に適したものとし得るが、場合によっては、例えば弱毒腸内微生物などの生ワクチンベクターの形態、または粘膜免疫応答を誘起するべく個体の気道に組成物を送達する上で有効である滴剤もしくはリポソームやマイクロカプセルなどのカプセル剤の形態での経口投与に適したものとすることも可能である。
マイクロカプセルは生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸をグリコール酸、もしくは反復単位（ＰＯＰ−ＰＯＥ）n〔式中ＰＯＰはポリオキシプロピレンであり、ＰＯＥはポリオキシエチレンである〕を有し得るブロックコポリマーと共に、または前記グリコール酸もしくはコポリマー無しで含有し得る。反復単位（ＰＯＰ−ＰＯＥ）nを有するブロックコポリマーが特に有用であり得る。
本発明のタンパク質及び融合タンパク質は粘膜アジュバントとして用い得る。このアジュバントは非ウェルシュ菌抗原タンパク質と同時投与可能であり、このような投与によって非ウェルシュ菌抗原タンパク質に対する粘膜免疫応答を増大させることができる。ε毒素が細胞表面の受容体に結合することは、Ｐａｙｎｅ等，１９９４において証明されている。
本発明を、単なる一例として示す以下の図及び配列を参照して説明する。
図面
図１は本発明の構築物を示す。
配列
配列番号１に、ウェルシュ菌ε毒素遺伝子の核酸配列、及び対応するアミノ酸配列を示す。アミノ酸−４５〜−１４はシグナル配列に相当する。アミノ酸−１３〜−１は、活性な成熟毒素をもたらすべくトリプシンにより除去されるプロトトキシンに相当する。アミノ酸１〜２８３は成熟毒素に相当する。
配列番号２には配列番号１のアミノ酸を示す。
配列番号３にはＳＤＭ１０中の突然変異ウェルシュ菌ε毒素遺伝子の核酸配列、及び対応するアミノ酸配列を示す。前記アミノ酸配列では、成熟毒素のアミノ酸１０６がプロリンによって置換されている。
配列番号４は配列番号３のアミノ酸に対応する。
配列番号５には、成熟タンパク質のアミノ酸１０６をコードする塩基（塩基４５１〜４５３）を記号ＮＮＮによって表わしたウェルシュ菌ε毒素遺伝子の核酸配列を示す。
配列番号６にはウェルシュ菌ε毒素の成熟毒素部分を示す。この部分のアミノ酸１０６は、該アミノ酸がヒスチジン以外であればいずれのアミノ酸であってもよいことを示す記号Ｘａａで表わしてある。
実施例１
突然変異体の作製
単一アミノ酸変更を有する突然変異体を、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を用いて構築した。ε毒素遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＫＳ＋／−中での部位特異的突然変異誘発に供し、突然変異遺伝子を前記ベクター中に配置した。突然変異遺伝子をｐＧＥＸ３ａ中へサブクローン化して、ε毒素をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合体として発現させ、またｐＴｒｃ９９Ａ中へサブクローン化して、ｔｒｃプロモーターの制御下にε毒素を高レベルで発現させた。これらの構築物を図１に示す。１０６位のヒスチジン残基をプロリンに変換する突然変異を起こした突然変異体を「ＳＤＭ１０」と呼称する。
実施例２
マウスの免疫感作
３０匹のマウスのグループを、εトキソイド、ｐＧＥＸｈ１ｈ２に発現させ、かつ精製したＧＳＴ−ε融合体、ｐＧＥＸｈ１ｈ２．１０に発現させ、かつ精製したＧＳＴ−ＳＤＭ１０融合体、またはｐＴｒｃＥＰ７．１０に発現させたＳＤＭ１０ペリプラズム調製物を伴った不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）の腹腔内投与によって免疫した。各用量はトキソイドの０．２７ｎＭに等しくした。二つの対照グループ、即ちＩＦＡ中の０．２７ｎＭ  ＧＳＴ（Ｓｉｇｍａ）で免疫したマウスのグループ及び免疫していないマウスのグループも含めた。第２１日及び第３５日にマウスを追加免疫した。第４８日に１グループ当たり１０匹のマウスから採血し、血清の組み換えε毒素及びウェルシュ菌８３４６由来ε毒素に対する力価を測定した。第５４日にマウスを６匹ずつグループ分けし、用量１０〜１０3ＬＤ50の組み換えε毒素をｉ．ｖ．投与することによって感作した。マウスを２４時間観察し、死亡時刻を記録した。
εトキソイド、ＧＳＴ−ε、ＧＳＴ−１０及びＳＤＭ１０で免役したマウスは、マウス１匹当たり１００  ＬＤ50までの用量の毒素での静脈内感作から完全に防御された。対照マウスは総て死亡した。
感作用量をマウス１匹当たり１０００  ＬＤ50に増加させたところ、トキソイドまたはＳＤＭ１０で免役したマウスで死亡したものは無かった。ＧＳＴ−１０及びＧＳＴ−εグループでは６匹中５匹のマウスが上記感作レベルを生き延びた。
即ち、本発明のポリペプチドはトキソイドと同様に感染防御性である。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：９８７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
存在位置：１３６．．４５６
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．９８７
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍｉｓｃ＿ｓｉｇｎａｌ
存在位置：１．．３２
配列
0004146516.tif 000003
0004146516.tif 000004
配列番号：２
配列の長さ：３２９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３
配列の長さ：９８７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
株名：ＮＣＴＣ  ８３４６
ゲノム内での位置
染色体／セグメント名：ε毒素遺伝子
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
存在位置：１３６．．９８７
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．９８７
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍｉｓｃ＿ｓｉｇｎａｌ
存在位置：１．．３２
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
存在位置：４５１．．４５３
配列
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配列番号：４
配列の長さ：３２９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ
存在位置：１０６
配列
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配列番号：５
配列の長さ：９８７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
存在位置：１３６．．９８７
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．９８７
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍｉｓｃ＿ｓｉｇｎａｌ
存在位置：１．．３２
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
存在位置：４５１．．４５３
配列
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配列番号：６
配列の長さ：２８３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ
存在位置：１０６
配列
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【図１】
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