(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中に含まれる白金含有化合物の分析方法であって、
（１）白金含有化合物を含有する生体試料に、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供するための前処理を施すこと又は白金含有化合物を含有する生体試料をそのまま用いることによって、一次分析試料を調製する第一工程、
（２）第一工程により調製された一次分析試料を、固定相から移動相への白金含有化合物の溶解度の差が制御される逆相カラムであって有機溶媒−水系のイオンペア試薬添加移動相中の溶出力が有機溶媒の混合比を勾配的に増加させることにより制御される逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに供することによって、二次分析試料を分離する第二工程、
（３）第二工程により分離された二次分析試料を、酸素が１％（v/v）〜２０％（v/v）の割合で混合されたアルゴンガスをキャリアガスとして用い、かつ誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析(ICP-MS)に供することによって、当該二次分析試料中に含まれる白金含有化合物を白金元素として元素特異的に検出する第三工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
生体試料中に含まれる白金含有化合物が、[(1R,2R)-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N']プラチナム系化合物又は当該化合物の生体中での白金含有代謝物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体中での白金含有代謝物が白金元素にアミノ酸が配位してなる白金含有化合物であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
生体試料が、哺乳動物から採取された血清、血漿、尿、組織であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
第二工程において使用されるイオンペア試薬が、陽イオン分析用イオンペア試薬であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の方法。
【請求項６】
陽イオン分析用イオンペア試薬が炭素原子数が３〜２０個であるアルキル基を有するスルホン酸塩又は硫酸塩であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料中に含まれる白金含有化合物の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に接続して用いられる検出方法としては、紫外吸光光度計（UV）、示差屈折計（RI）、蛍光光度計（FP）、電気化学検出器（ECD）、赤外吸光光度計（IR）等が知られているが、いずれも定量下限が高く、元素別分析での特異性及び化学形態別分析での特異性等が乏しい。また、これらの検出方法と比較して、定量下限が低く、元素別分析での特異性を有する検出方法として、誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析（ICP-MS：以下、誘導結合プラズマ質量分析と記すこともある。）が知られている（特許文献１及び２参照）。しかしながら、生体試料中に含まれる白金含有化合物を分析する場合には、生体試料それ自身が複雑な混合物であるために分析成分の分離及び測定を妨害する物質が共存したり、また検出器に感じない程度の微量しか分析成分が含まれていない等の理由により、充分な感度が得られにくいという問題があった。例えば、生体試料中に含まれる白金含有化合物を、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに接続した誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）装置で単純な条件下で一般的に分析した例が知られているが、その定量下限は白金量として０．５ng程度であって、微量濃度の白金含有化合物を分析する方法としては未だ十分な感度が得られていなかった（非特許文献１参照）。
一方、放射性標識された白金含有化合物を、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに接続した放射能測定装置で分析することにより上記の前記定量下限（０．５ｎｇ程度）を上回る高感度で（定量下限０.２５ｎｇ程度）での分析を可能とする方法も知られているが、放射能標識化合物を取り扱う特別な施設や装置が必要なうえ、熟練者による高度な操作が必要とされている。このような理由から、より簡便にかつ高感度で生体試料から白金含有化合物を検出する方法が求められていた。
【０００３】
【特許文献１】
特開平６−２４２０７５号公報（２頁、２７行目）
【特許文献２】
特許公開２００１−１１４５２０号公報（４頁、３２行目）
【非特許文献１】
EARLY BIOTRANSFORMATIONS OF OXALIPLATIN AFTER  ITS INTRAVENOUS ADMINISTRATION TO CANCER PATIENTS, Drug Metabolism and Disposition, 28, 1379-1384 (2000)  P.1379〜1380
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、生体試料中の白金含有化合物を分析する方法において、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーと元素別分析での優れた特異性を兼ね備える手段である誘導結合プラズマ質量分析とを、高速液体クロマトグラフィーの移動相にイオンペア試薬を用いること、酸素が１％（v/v）〜２０％（v/v）の割合で混合されたアルゴンガスをキャリアガスとして用いること等の特定な条件下で上記の順で組み合わせて用いることにより、生体試料中に含まれる白金含有化合物が超高感度で分析可能になることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．生体試料中に含まれる白金含有化合物の分析方法であって、
（１）白金含有化合物を含有する生体試料に、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供するための前処理を施すこと又は白金含有化合物を含有する生体試料をそのまま用いることによって、一次分析試料を調製する第一工程、
（２）第一工程により調製された一次分析試料を、固定相から移動相への白金含有化合物の溶解度の差が制御される逆相カラムであって有機溶媒−水系のイオンペア試薬添加移動相中の溶出力が有機溶媒の混合比を勾配的に増加させることにより制御される逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに供することによって、二次分析試料を分離する第二工程、
（３）第二工程により分離された二次分析試料を、酸素が１％（v/v）〜２０％（v/v）の割合で混合されたアルゴンガスをキャリアガスとして用い、かつ誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析(ICP-MS)に供することによって、当該二次分析試料中に含まれる白金含有化合物を白金元素として元素特異的に検出する第三工程、
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記す。）；
２．生体試料中に含まれる白金含有化合物が、[(1R,2R)-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N']プラチナム系化合物又は当該化合物の生体中での白金含有代謝物であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．生体中での白金含有代謝物が白金元素にアミノ酸が配位してなる白金含有化合物であることを特徴とする前項２記載の方法；
４．生体試料が、哺乳動物から採取された血清、血漿、尿、組織であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
５．第二工程において使用されるイオンペア試薬が、陽イオン分析用イオンペア試薬であることを特徴とする前項１、２、３又は４記載の方法；及び
６．陽イオン分析用イオンペア試薬が炭素原子数が３〜２０個であるアルキル基を有するスルホン酸塩又は硫酸塩であることを特徴とする前項５記載の方法；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明方法において、生体試料中に含まれる白金含有化合物としては、例えば、[(1R,2R)-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N']プラチナム系化合物又は当該化合物の生体中での白金含有代謝物等を挙げることができる。更に具体的には、例えば式化１
【化１】
0004031380.tif 000002
で示されるジクロロ[(1R,2R)-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N']プラチナム（Dichloro[(1R,2R)-1,2-cyclohexanediamine-N,N']platinum）（以下、化合物（A）と記すこともある。）、式化２
【化２】
0004031380.tif 000003
で示されるシス[(1R,2R)-(1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N')ビス(ミリスタート)]プラチナム(ＩＩ)（cis[(1R,2R)-(1,2-cyclohexanediamine-N,N')bis(myristato)]platinum(ＩＩ)）（以下、化合物（Ｂ）と記すこともある。）等の[(1R,2R)-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N']プラチナム系化合物、さらに例えば、式化３から式化５
【化３】
0004031380.tif 000004
【化４】
0004031380.tif 000005
【化５】
0004031380.tif 000006
で示される白金元素にシステイン、メチオニン等のアミノ酸が配位してなる白金含有化合物が挙げられる。
【０００６】
生体試料としては、哺乳動物から採取された生体成分全般が挙げられ、例えば、血清、血漿、尿、組織等の生体成分を挙げることができる。
生体試料は、哺乳動物から通常の方法により入手される。例えば、血清、血漿の場合には哺乳動物から得られた血液を、必要に応じてヘパリン処理した後、遠心分離することによりそれぞれ分離した成分として得られる。また、尿、組織の場合は採取、切除等の方法によって得られる。
【０００７】
本発明方法において第一工程における生体試料を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供するための前処理としては、例えば、
（1）血清又は血漿を有機溶媒で抽出することにより、抽出上清を一次分析試料として得る方法、（2）血清を限外濾過することにより、限外濾過液を一次分析試料として得る方法、（３）組織に水を添加して得られた混合物をホモジナイズした後、得られたホモジネート又は尿を有機溶媒で抽出することにより、抽出上清を一次分析試料として得る方法、（４）尿を固相抽出することにより、抽出液を一次分析試料として得る方法等が挙げられる。
それぞれの生体成分からの抽出に用いられる有機溶媒としては、例えばメタノール、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられる。
【０００８】
次いで、第一工程における前処理を施すこと又は白金含有化合物を含有する生体試料をそのまま用いることによって調製された一次分析試料は、第二工程における高速液体クロマトグラフィーに供される。生体試料が尿の場合には、採取されたそのままの尿を一次分析試料として第二工程における高速液体クロマトグラフィーに供してもよい。
【０００９】
本発明方法における第二工程では、
固定相から移動相への白金含有化合物の溶解度の差が制御される逆相カラムであって、有機溶媒−水系のイオンペア試薬添加移動相の溶出力が有機溶媒の混合比を勾配的に増加させることにより制御される逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーが使用される。
【００１０】
第二工程において用いられる有機溶媒−水系のイオンペア試薬添加移動相において、有機溶媒−水系の移動相としては、通常、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで使用される有機溶媒及び水系の溶液全般を用いればよい。例えば有機溶媒としては、アセトニトリル、エタノール、テトラヒドロフラン、2−プロパノール、メタノール等を挙げることができ、また、水系の溶液としては、水、リン酸ナトリウム緩衝溶液、酢酸ナトリウム緩衝溶液、酢酸アンモニウム緩衝溶液等が挙げられる。
この場合、当該移動相中の有機溶媒の混合比（有機溶媒／水系）を勾配的に増加させることにより、カラムに保持された成分が順に溶出される。
【００１１】
第二工程において用いられる有機溶媒−水系のイオンペア試薬添加移動相において、イオンペア試薬としては、陽イオン分析用イオンペア試薬、陰イオン分析用イオンペア試薬等を挙げることができる。好ましくは、陽イオン分析用イオンペア試薬が挙げられる。
陽イオン分析用イオンペア試薬としては、例えば炭素原子数３〜２０個であるアルキル基を有するスルホン酸塩又は硫酸塩等を挙げることができる。具体的には、ペンタンスルホン酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム、ヘプタンスルホン酸ナトリウム、オクタンスルホン酸ナトリウム、ドデカンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
【００１２】
第二工程における逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーの条件は次のとおりである。
移動相中のイオンペア試薬の濃度は、通常、約5〜20mM程度である。有機溶媒の混合比（即ち、移動相全体に対する有機溶媒の混合割合）は、0〜100%であり、その混合割合は分離する化合物に応じて、適宜設定される。逆相カラムには、シリカにオクタデシル基、オクチル基等を化学結合させた固定相が充填された逆相カラムが用いられ、当該カラムの内径は、通常、約2〜5mmI.D.程度、長さは、通常、約50〜250mm程度である。移動相の流速は、通常、約0.1〜2mL/min.程度である。インジェクション量は、カラム径に応じて、適宜設定すればよい。
【００１３】
本発明方法における第三工程では、第二工程により分離された二次分析試料を、酸素が１％（v/v）〜２０％（v/v）の割合で混合されたアルゴンガスをキャリアガスとして用い、かつ誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析（ＩＣＰ-ＭＳ）に供すればよい。
【００１４】
第三工程における誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析（ICP-MS）において、元素をイオン化する方法として、例えば、アルゴンプラズマを発生させる方法等を挙げることができる。
【００１５】
上記の誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析（ICP-MS）の条件は次のとおりである。
酸素が１％（v/v）〜２０％（v/v）、好ましくは３％（v/v）〜１５％（v/v）の割合で混合されたアルゴンガスがキャリアガスとして用いられる。
キャリアガスは、ICP−MS装置への導入前にアルゴンガスと酸素ガスとを混合することにより調製される。
【００１６】
二次分析試料に含有される白金含有化合物を、二次分析試料を誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析方法（ICP-MS）に供することによって白金元素に由来するｍ/ｚ＝194,195,196を検出し、得られたピークの積分値を検量線と比較することにより白金量が定量される。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
分析条件
＜ＨＰＬＣ条件＞
移動相：１ｍＭヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液とメタノールとのグラジエント
（１）グラジエント条件Ａ（実施例１で使用）
0 min. 100/0, 10 min. 100/0, 20 min. 0/100, 35 min. 0/100,
36 min. 100/0, 50 min. 100/0（１ｍＭヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液／メタノール）
（２）グラジエント条件B (実施例2で使用)；
0 min. 100/0,  10 min. 100/0,  20 min. 80/20,  25 min. 75/25,
38 min. 70/30, 40 min. 56/44, 48min. 56/44, 62 min. 50/50, 64 min. 0/100, 90 min. 0/100（１ｍＭヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液／メタノール）
検出： ICP-MS（m/z=195（Pt））
カラム：ＯＤＳカラム
＜ICP-MS条件＞
ICP-MS：Agilent4500（Agilent社製）
プラズマ出力： 1.56 〜 1.60 kW
サンプリング位置： 7.5 〜 8.5 mm
アルゴンガス流量
プラズマガス： 約 16 L/min
補助ガス    ： 約 1.0 L/min
キャリアガス： 約 0.9 〜 1.1 L/min
キャリアガス中の酸素ガス導入量：５％（Ｖ/Ｖ）〜１０％（Ｖ/Ｖ）
ペリスタリックポンプ回転速度： 0.1 rps（ドレイン側のみ使用）
スプレーチャンバー（S/C）の温度 ：1〜2 ℃
通常導入ネブライザー（Sample Uptake約1.2 mL/min）
プラズマ点灯から測定開始までの安定化時間：40分以上
【００１８】
実施例１  （生体試料中に含まれる化合物（Ａ）の分析例：検出下限及び定量下限の算出）
白金含有化合物が投与されていないラット（即ち、ブランクラット）の血清（Crj:CD(SD)系雄性ラットの7週齢プール血清（オリエンタル酵母工業社製）をセントリフリーYM-30 （アミコン社製）に採取した後、4℃、2000×gで20分間遠心分離（HIMAC CR20B3、日立製作所社製）することにより、限外濾過液を得た。
得られた限外濾過液に化合物（Ａ）を、0、0.5、1、5、10、30及び50ng/mL（化合物（Ａ）の濃度で表示）の濃度となるように添加した。これ（１００μｌ）を上記のＨＰＬＣ条件に従った高速液体クロマトグラフィーに供することによって、二次分析試料を分離し、更に分離された二次分析試料を上記のＩＣＰ−ＭＳ条件に従って誘導結合プラズマ法によるイオン化手段を用いる質量分析に供することによって、当該二次分析試料中に含まれる白金含有化合物を白金元素として元素特異的に検出した。得られたチャート図を図２及び図３に示す。
得られたチャート図において化合物（Ａ）に相当するピークの積分値を用いて、検量線を作成した。その結果を図1に示す。図１から明らかなように0.5ng/mL〜50ng/mLの濃度範囲において直線性が確認された。定量下限は0.025ng of Ptであり、また、ノイズから計算した検出下限は0.0025ng of Ptであった。尚、検出下限及び定量下限は、以下のようにして求められた。
＜定量下限及び検出下限の算定方法＞
検出下限：検出下限をベースラインノイズ（N）に対して有意な差があるピークのシグナル（S）と定義し、ノイズの3倍の強度を持つシグナル（S=3N）を検出下限として次のように算出した。
図2（0.5ng eq. of化合物（Ａ）/mL、試料量100μL、0.025ng eq. of Pt）ではベースラインノイズが約4アバンダンスであり、化合物（Ａ）のシグナル強度が約108アバンダンスであることから、検出下限は、4×3×0.5(ng eq. of 化合物（Ａ）/mL)/108＝0.05ng eq. of 化合物（Ａ）/mL（試料量100μL、0.0025ng eq. of Pt）である。
上記0.05ng eq. of 化合物（Ａ）/mLを測定に用いたとき、検出器に導入された溶液全量中の化合物（Ａ）の量は0.05ng eq. of 化合物（Ａ）/mL×0.1mL=0.005ng eq. of 化合物（Ａ）であり、白金元素の量に換算すると0.005ng eq. of 化合物（Ａ）=0.005×195/380=0.0025ng eq. of Ptとなる。従って、検出下限は白金元素の量に換算して0.0025ngとなる。
定量下限：図2での定量下限値は、化合物（Ａ）の濃度として0.5ng/mL（試料量100μL）である。このとき検出器に導入した溶液全量中の化合物（Ａ）の量は0.5ng eq. of 化合物（Ａ）/mL×0.1mL=0.05ng eq. of 化合物（Ａ）であり、白金元素の量に換算すると0.05ng eq. of 化合物（Ａ）=0.05×195/380=0.025ng eq. of Ptとなる。従って、定量下限は白金元素の量として0.025ngとなる。
【００１９】
実施例２  （生体試料中に含まれる化合物（Ｂ）の分析例）
化合物（Ｂ）の凍結乾燥製剤（住友製薬株式会社社製）に、リピオドールを20mg/mLの濃度になるように添加して懸濁した。得られた懸濁液0.4mLに対して、ラット血清、イヌ血清又はヒト血清4mLを添加した後、得られた混合物を5日間、37℃、5rpmで回転振とうした。５日間後、4℃、3000 rpmで10分間遠心分離（HIMAC CR5DL及びHIMAC CF8DL、日立製作所社製）することにより、リピオドールと血清とを分離した。分離された血清は、直ちにセントリフリーYM-30 （アミコン社製）に採取した後、4℃、2000×gで20分間遠心分離（HIMAC CR20B3、日立製作所社製）することにより、限外濾過液を得た。得られた限外濾過液100uLを、一次分析試料として、実施例１と同様な条件及び方法により、生体試料中に含まれる白金含有化合物を超高感度で分析した。
尚、ラット血清はCrj:CD(SD)系雄性ラットの7週齢プール血清（オリエンタル酵母工業社製）を、イヌ血清は雄性ビーグル犬血清（オリエンタル酵母工業社製）を、ヒト血清は精度管理用凍結乾燥プール血清  登録商標  コンセーラ （日水製薬社製）を使用した。
分析の結果、化合物（Ａ）のメチオニン配位体（即ち、白金元素にメチオニンが配位してなる白金含有化合物）に相当するピークが検出され、その検出プロフィールを図4に示す。
【００２０】
実施例3  （生体試料中に含まれる化合物（Ｂ）の分析例）
化合物（Ｂ）の凍結乾燥製剤（住友製薬株式会社製）にリピオドールを2.5mg/mLの濃度になるように添加して懸濁した。得られた懸濁液をラット（Crj:CD(SD)系雄性ラット7週齢；（日本チャ−ルス・リバ−社製））に50mg/kg単回皮下投与した。
投与後2、6及び24時間目に、ラットをエ−テル麻酔させ、そして当該ラットの後大静脈より全血液を採取した。また投与後24時間までの尿も採取した。血液は氷冷下で約30分間放置した後、4℃、3000 rpmで10分間遠心分離（HIMAC CR5DL及びHIMAC CF8DL、日立製作所社製）することにより、血清を得た。得られた血清は、直ちにセントリフリーYM-30 （アミコン社製）に採取した後、4℃、2000×gで、20分間遠心分離（HIMAC CR20B3、日立製作所社製）することにより、限外濾過液を得た。得られた限外濾過液及び尿200uLを一次分析試料として下記の条件以外は実施例１と同様な条件及び方法により、生体試料中に含まれる白金含有化合物を超高感度で分析した。
分析の結果、化合物（Ａ）のメチオニン配位体（即ち、白金元素にメチオニンが配位してなる白金含有化合物）に相当するピークが検出され、その検出プロフィールを図５及び図６に示す。
＜分析条件＞
移動相：1mMヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液とメタノールとのグラジエント（0/100(v/v)〜100/0(v/v)）
カラム：ODSカラム
＜ＩＣＰ−ＭＳ条件＞
ＩＣＰ−ＭＳ：Agilent４５００（Agilent社製）
プラズマ出力：1.2〜1.6kW
サンプリング位置：0.75〜12.0mm
キャリアガス中の酸素ガス導入量：５％（Ｖ/Ｖ）〜１０％（Ｖ/Ｖ）
キャリアガス流量：0.75〜1.10L/min.
定量下限は0.025ng of Ptであった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明により、放射性標識化合物を取り扱う特別な設備や装置を必要とせず、熟練者による高度な操作も必要とされることなく、生体試料中に含まれる白金含有化合物が超高感度で分析可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】(a) 化合物（Ａ）添加検量線（0.5〜10 ng/mL）。
(b) 化合物（Ａ）添加検量線（0.5〜50 ng/mL）。
【図２】化合物（Ａ）添加検量線（0.5〜10ng/mL）。
【図３】化合物（Ａ）添加検量線（10〜50ng/mL）。
【図４】化合物（Ｂ）のin vitro反応生成物のLC-ICP-MS測定結果（ラット）。
【図５】化合物（Ｂ）投与後ラット血清限外濾過液のLC-ICP-MS測定結果（投与後2時間）。
【図６】化合物（Ｂ）投与後のラットのLC-ICP-MS測定結果（投与後24hr）。
【図１】
0004031380.tif 000007
【図２】
0004031380.tif 000008
【図３】
0004031380.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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