(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ活性の低下によってＬ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌。
【請求項２】
前記Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼが、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有する請求項１記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】
請求項１または２に記載のエシェリヒア属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することを特徴とするＬ−システインの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−システインの製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な新エシェリヒア属細菌、及びそれを用いたＬ−システインの製造法に関する。Ｌ−システイン及びＬ−システインの誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。
【０００３】
Ｌ−システインの生合成について、エシェリヒア・コリ等の細菌では詳細に研究されており（Kredich, N. M. et al., J. Biol. Chem., 241, 4955-4965 (1966), Kredich, N. M. et al., 1987, Biosynthesis of Cysteine. In: Neidhardt, F.C., et al., (eds) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, Vol.1, American Society for Microbiology, Washington D.C., 419-428）、Ｌ−セリンから２段階の反応によりＬ−システインが生成することがわかっている。エシェリヒア・コリでは、第一の反応は、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化であり、セリンアセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「ＳＡＴ」ともいう）により触媒される。第二の反応は、上記反応により生成するＯ−アセチルセリンからＬ−システインが生成する反応であり、Ｏ−アセチルセリン（チオール）リアーゼにより触媒される。
【０００４】
ＳＡＴをコードする遺伝子（ｃｙｓＥ）は、エシェリヒア・コリにおいては、野生株及びＬ−システイン分泌変異株よりクローニングされている（Denk, D. and Bock, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。また、これらのｃｙｓＥの塩基配列が決定され、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が減少したＳＡＴは、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換されていたことが報告されている。さらに、上記変異とは異なる変異によりＬ−システインによるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴをコードするＤＮＡを用いて、Ｌ−システイン等を製造する方法が開示されている（WO 97/15673号国際公開パンフレット）。このＳＡＴは、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減したＳＡＴをコードする遺伝子を利用してＬ−システインを製造する技術が知られているが、未だ改良の余地が残されている。すなわち、本発明者は、エシェリヒア属細菌のＬ−システイン生合成について研究を行ったところ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴを保持するエシェリヒア属細菌は、Ｌ−システインの生産性が不安定であることを見出した。
本発明は、エシェリヒア属細菌を用いたＬ−システインの改良された製造法及びこの方法に用いるエシェリヒア属細菌を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記のＬ−システイン生産の不安定性は、細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ活性を低下させることにより安定化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌である。
前記エシェリヒア細菌としては、細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ（cystein desulfhydrase：以下、「ＣＤａｓｅ」ともいう）活性の低下によりＬ−システイン分解系が抑制されたエシェリヒア属細菌が挙げられる。
【０００８】
前記Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼとしては、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有するセリンアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０００９】
また本発明は、前記エシェリヒア属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することを特徴とするＬ−システインの製造法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられる。
【００１２】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴ（以下、「変異型ＳＡＴ」ともいう）を保持するものであり、Ｌ−システイン分解系が抑制されたエシェリヒア属細菌（以下、「Ｌ−システイン分解系抑制株」ともいう）に変異型ＳＡＴを保持させるか、あるいは変異型ＳＡＴを保持するエシェリヒア属細菌に、細胞中のＬ−システイン分解系が抑制されるような変異を生じさせることにより得ることができる。尚、「Ｌ−システイン分解系の抑制」とは、システインの分解に関与する酵素のうち少なくとも一つの活性が低下又は消失していることをいう。また、「フィードバック阻害の低減」とは、低減されたフィードバック阻害が残存している場合の他、フィードバック阻害が実質的に解除されている場合を含む。
前記Ｌ−システインの分解に関与する酵素としては、ＣＤａｓｅ及びシスタチオンβリアーゼが挙げられる。
ＣＤａｓｅ活性が低下又は消失した株（以下、「ＣＤａｓｅ活性低下株」ともいう）は、野生型ＣＤａｓｅを保持するエシェリヒア属細菌を変異処理し、Ｌ−システインを唯一の窒素源とする培地で生育できず、かつ、通常の窒素源を含む培地で生育できる変異株を選択することによって取得することができる。変異処理としては、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常の突然変異に用いられている変異剤による処理が挙げられる。得られた候補株のＣＤａｓｅ活性が低下していることは、候補株の菌体抽出液について、Kredichらの方法（J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)）等により、ＣＤａｓｅ活性を測定し、親株のＣＤａｓｅ活性と比較することにより確認することができる。
同様に、野生型シスタチオンβリアーゼを保持するエシェリヒア属細菌を変異処理し、シスタチオンβリアーゼ活性が低下又は消失している株を選択することにより、シスタチオンβリアーゼ活性低下株を取得することができる。
【００１３】
エシェリヒア属細菌に変異型ＳＡＴを保持させるには、野生型ＳＡＴを保持するエシェリヒア属細菌を変異処理し、変異型ＳＡＴを保持する変異株を選択するか、あるいは、変異型ＳＡＴをコードするＤＮＡ（以下、「変異型ｃｙｓＥ」ともいう）をエシェリヒア属細菌に導入することによって行うことができる。変異型ｃｙｓＥは、野生型ｃｙｓＥに、コードするＳＡＴがＬ−システインによるフィードバック阻害が解除されるような変異を導入することによって得られる。このような変異としては、コードされるＳＡＴのアセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないものであれば特に制限されないが、具体的には、野生型ＳＡＴの２５６位のメチオニン残基又はこのメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異が挙げられる。前記他のアミノ酸残基としては、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基及びロイシン残基を除く１７種類のアミノ酸残基が挙げられる。また、変異型ｃｙｓＥが有する変異としては、WO 97/15673号国際公開パンフレットに記載されている変異であってもよい。
【００１４】
本発明における変異型ＳＡＴとしては、上記のＬ−システインによるフィードバック阻害を低減する変異に加えて、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。そのような変異を有するＳＡＴにおいては、２５６位のメチオニン残基の位置が変わっている場合もあるが、そのような場合であっても、２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減した変異型ＳＡＴが取得され得る。
【００１５】
野生型ｃｙｓＥは、デンクらによって報告されている方法（Denk, D. and Bock, A., J. general Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、あるいはこの報告に記載されているｃｙｓＥの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、ｃｙｓＥを含むＤＮＡ断片を増幅することによって得られる。前記プライマーとして具体的には、配列番号１及び２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。参考として、配列番号５及び６に、デンクらによって報告されている野生型ｃｙｓＥの塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を示す。
【００１６】
得られたｃｙｓＥに所望の変異を導入する方法としては、部位特異的変異が挙げられる。部位特異的変異に用いるプライマーとしては、例えば、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。変異が導入されたｃｙｓＥ断片から変異が導入された部位を含む領域を切り出し、野生型ｃｙｓＥと、相当する領域を入れ換えることにより、変異型ｃｙｓＥを得ることができる。
【００１７】
上記のようにして得られる変異型ｃｙｓＥを含むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌に導入するには、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いることができる。その際、変異型ｃｙｓＥ遺伝子を自律複製可能なベクターに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主エシェリヒア属細菌に保持させてもよいが、変異型ｃｙｓＥ遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で宿主エシェリヒア属細菌の染色体に組み込んでもよい。
【００１８】
プロモーターとしては、ｃｙｓＥ固有のプロモーターを用いてもよいが、発現ベクターに含まれているプロモーターを用いて、これにｃｙｓＥコード領域を連結してもよい。発現ベクターとしては、pBluescriptII SK+（STRATAGENE社）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pUC系（宝酒造（株）等）、pPROK系（クロンテック製）、pKK233-2（クロンテック製）等、市販のベクターを使用することができる。
【００１９】
ｃｙｓＥを含む発現ベクターをエシェリヒア属細菌に導入するには、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等、エシェリヒア属細菌の形質転換に通常用いられている方法により行うことができる。
【００２０】
＜２＞Ｌ−システインの製造法
上記のようにして細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ活性が低下又は消失し、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−システインを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することにより、Ｌ−システインを効率よく、かつ、安定に製造することができる。尚、本発明の方法により製造されるＬ−システインには、還元型のシステインに加えてシスチンも含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物にはシスチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物も含まれる。
【００２１】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００２２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００２３】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００２４】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
＜１＞変異型ｃｙｓＥ遺伝子の及び該遺伝子導入用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリJM240（Hfr ProC47 Cys-54 supE42）から染色体ＤＮＡを常法により調製し、これを鋳型として用い、公知のｃｙｓＥの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチド（配列番号１、２）をプライマーとするＰＣＲによって、ｃｙｓＥを含むＤＮＡ断片を増幅した。プライマーは、増幅される配列がコード領域及びプロモーター配列を含むように設計した。ＰＣＲ反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、Taq DNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行なった。
【００２７】
増幅された１．２ｋｂのＤＮＡ断片について、EcoRVで切断したpBluescriptII SK+を用いてＴＡクローニングを行い、４．２ｋｂのプラスミドを得た。このプラスミドをｐＣＥと名付けた。得られたクローニング断片の塩基配列を決定し、野生型のｃｙｓＥと同一の塩基配列を含むことを確認した。
【００２８】
上記のようにして得られたｃｙｓＥに、コードされるＳＡＴの２５６位のメチオニン残基を他の１９種類のアミノ酸残基又は終止コドンに置換する変異を、配列番号３及び４に示す塩基配列を有する相補的なオリゴヌクレオチド対を用い、ｐＣＥを鋳型とする部位特異的変異により導入した。変異が導入されたｃｙｓＥの一部を含む断片とｐＣＥをPstIとBstEIIで消化し、生じた0.31kbの断片を入れ換え、変異型ｃｙｓＥを含むプラスミドを得た（図１）。得られたプラスミドについて塩基配列決定を行い、変異型ｃｙｓＥの目的の部位に変異が導入されたこと、及び目的部位以外の部位にミスマッチ変異が生じていないことを確認した。但し、２５６位のメチオニン残基をリジン残基に置換したものは、２２４位のセリン残基がプロリン残基に置換されるミスマッチ変異が生じていた。こうして得られたプラスミドのシリーズを総称してｐＣＥＭ２５６＊と名付けた。尚、「＊」はメチオニン残基以外のアミノ酸残基を表す記号を代表し、例えば、ｐＣＥＭ２５６Ａは、２５６位のメチオニン残基がアラニン残基に置換されたＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを含むプラスミドを表す。
【００２９】
プラスミドｐＣＥ及び上記のようにして得られたｐＣＥＭ２５６＊で、ｃｙｓＥ欠損株であるエシェリヒア・コリJM39（F+ cysＥ51 tfr-8）（Denk, D. and Bock, A., J. Gene. Microbiol, 133, 515-525(1987)）を形質転換し、得られた形質転換株をそれぞれJM39(pCE)及びJM39(pCEM256*)と名付けた。
【００３０】
アンピシリン 50mg/Lを含むＬＢ（Bacto-Tryptone 10g/L、Bacto-Yeast Extract 5g/L、NaCl 5g/L、pH7.0）プレート培地で３０℃、２４時間培養した各形質転換体１白金耳を、アンピシリン 50mg/Lを添加した下記液体培地（組成は下記のとおり）３ｍｌを入れた試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間培養した。培養は、各形質転換体について２連で行った。培養後、生育、ｐＨ及びシステイン蓄積量を調べた。生育は、培養液を0.1N HClで２６倍希釈し、５６２ｎｍにおける吸光度（OD562）を測定することにより調べた。Ｌ−システインの蓄積量は、沈澱したシスチンを溶かすため培養液をO.5N HClで希釈したものを、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）を用いるバイオアッセイ（Tsunoda, T. et al., Amino acids, 3, 7-13 (1961)）により、還元型システイン及びシスチンの総量として測定した。その結果を表１に示す。表中の「256th」は、２５６位のアミノ酸残基を示す。また、「stop」は、２５６位が終止コドンに置換されたことを示す。
【００３１】
野生型ｃｙｓＥを含むプラスミドを保持するJM39(pCE)に比べて、変異型ｃｙｓＥを含むプラスミドを保持するJM39(pCEM256*)では、２５６位のメチオニン残基がロイシン残基又はリジン残基に置換されたもの（JM39(pCEM256L、JM39(pCEM256K）を除いて、システイン蓄積量が大幅に増加したが、結果にばらつきがあり、システイン生産性は不安定であった。
【００３２】
（培地組成）
グルコース       30g/L
塩化アンモニウム 10g/L
KH2PO4            2g/L
MgSO4・7H2O        1g/L
FeSO4・7H2O       10mg/L
MnCl2・4H2O       10mg/L
CaCO3            20g/L
【００３３】
【表１】
0004151094.tif 000002
【００３４】
＜２＞ＣＤａｓｅ低下株の取得
エシェリヒア・コリJM39を、0.1mg/mlのＮＴＧ溶液中で１５分変異処理し、塩化アンモニウムをＬ−システイン（0.3g/L）に置換したＭ９培地（組成は下記のとおり）プレートでは生育できず、Ｌ−シテステイン0.1g/Lを含むＭ９培地で生育する変異株、39-8株を選択した。
【００３５】
（培地組成）
Na2HPO4           6g/L
KH2PO4            3g/L
NaCl              0.5g/L
MgSO4・7H2O        0.25g/L
CaCl2・4H2O        0.015mg/L
グルコース        4g/L
チアミン・HCl      0.001g/L
【００３６】
次に、得られたＬ−システイン非資化性株である39-8株のＣＤａｓｅ活性を次のようにして測定した。39-8株を、ＬＢ培地にＬ−システイン−ＨＣｌ1mg/mlを添加した培地で３７℃、８時間培養し、菌体を超音波処理し、30,000×ｇで３０分遠心し、上清を採取して粗酵素液とした。この粗酵素液について、Kredichらの方法（J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)）でＣＤａｓｅ活性を測定した。すなわち、0.1M Tris-HCl、5mM ピリドキサールリン酸、2mM Ｌ−システイン・ＨＣｌ、0.3ml粗酵素液からなる反応液1.5mlを３７℃で３０分反応させ、生成するピルビン酸を定量し、タンパク当たりの生成量をＣＤａｓｅ活性とした。結果を表２に示す。
39-8株のＣＤａｓｅ活性は、親株に比べて明らかに低下していた。
【００３７】
【表２】
0004151094.tif 000003
【００３８】
＜３＞ＣＤＡｓｅ低下株への変異型ｃｙｓＥ遺伝子の導入及びＬ−システインの生産
上記で得られたＣＤａｓｅ低下株である39-8株を、ｐＣＥ及びｐＣＥＭ２５６＊で形質転換した。得られた形質転換株をそれぞれ39-8(pCE)及び39-8(pCEM256*)と名付けた。これらの形質転換株を、アンピシリン 50mg/Lを含むＬＢプレート培地で３０℃、２４時間培養した各形質転換体１白金耳を、アンピシリン 50mg/Lを添加したＣ１培地（組成は下記のとおり）２０ｍｌを入れた坂口フラスコにそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養は、各形質転換体について２連で行った。培養後、生育、培養液のｐＨ、残糖、Ｌ−システインの蓄積量、及び対糖収率を調べた。生育及びＬ−システイン量は、前記と同様にして行った。結果を表３に示す。
【００３９】
また、JM39(pCE)及びJM39(pCEM256*)を上記と同様にして培養し、Ｌ−システインの蓄積量を調べた結果を表４に示す。この結果から、変異型ｃｙｓＥをＣＤａｓｅ低下株に導入することによって、Ｌ−システイン生産量が増加し、かつ、安定した生産性を示すことが明らかである。
【００４０】
【表３】
0004151094.tif 000004
【００４１】
【表４】
0004151094.tif 000005
【００４２】
２５６位のメチオニン残基をグルタミン酸残基に置換したＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを含むｐＣＥＭ２５６Ｅを保持する39-8株（E. coli 39-8(pCEM256  )、プライベートナンバー：ＡＪ１３３９１）は、平成９年１１月２０日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２７の受託番号のもとで寄託されている。
上記寄託菌株よりｐＣＥＭ２５６Ｅを取得し、部位特異的変異を導入することによって、２５６位のメチオニン残基を所望のアミノ酸残基に置換したＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを得ることができる。
【００４３】
＜４＞変異型ｃｙｓＥ遺伝子を導入したＣＤａｓｅ低下株のＳＡＴ活性の測定
39-8(pCE)及び39-8(pCEM256*)株を、アンピシリン 50mg/Lを添加したＣ１培地（組成は下記のとおり）２０ｍｌを入れた坂口フラスコに接種し、３０℃で４８時間振盪培養した後、集菌した。菌体を、氷冷した50mM Tris-HCl(pH7.5)で２回洗浄し、2mM ジチオスレイトールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。破砕物を30,000×ｇで３０分遠心し、上清を粗抽出液としてＳＡＴ活性の測定に用いた。
【００４４】
ＳＡＴ活性の測定は、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM Ｌ−セリン、0.1mM アセチル−ＣｏＡ及び粗酵素液を含む１ｍｌの反応液を３０℃で１５分反応させ、アセチル−ＣｏＡのチオエステル結合の開裂による232nmの吸光度の減少を測定することによって行った。前記反応液からＬ−セリンを除いたものをブランクとした。また、前記反応液にＬ−システイン10μMを加えて同様に反応を行い、Ｌ−システインによるフィードバック阻害の程度を調べた。尚、アセチル−ＣｏＡのε値は6.5×103M-1cm-1である。Ｌ−システインを添加しない場合のＳＡＴ比活性及びＬ−システインを加えたときの残存活性（％）を表５に示す。
【００４５】
２５６位のメチオニン残基を他のアミノ酸残基に置換したＳＡＴは、いずれもＬ−システインによるフィードバック阻害が低減されていた。尚、２５６位のメチオニン残基をロイシン残基又はリジン残基に置換したＳＡＴは、ＳＡＴ活性が認められなかった。
【００４６】
【表５】
0004151094.tif 000006
【００４７】
【発明の効果】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−システインを高効率かつ安定に生産する能力を有している。
【００４８】
【配列表】
0004151094.tif 000007
【００４９】
0004151094.tif 000008
【００５０】
0004151094.tif 000009
【００５１】
0004151094.tif 000010
【００５２】
0004151094.tif 000011
0004151094.tif 000012
0004151094.tif 000013
【００５３】
0004151094.tif 000014
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ｐＣＥＭ２５６＊の構築の概略を示す図。
【図１】
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