(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノシル１−リン酸を使用して、グアノシン二リン酸をリサイクルしながら、受容体をマンノシル基でグリコシル化する方法であって、
（１）単一容器内の水性媒質中に以下の(i) 〜（v)の成分を混合して水性反応媒質を形成する工程；及び
（２）前記水性反応媒質を、前記受容体がグリコシル化されるのに十分な時間、５〜１０のｐＨ及び０〜４０℃の温度に維持する工程、
を含む方法。
（ｉ）マンノシル−１−リン酸；
（ii）ＧＴＰの存在下で（ｉ）のマンノシル−１−リン酸からのＧＤＰ−マンノシルの形成を触媒するＧＤＰ−マンノシルピロホスホリラーゼ；
（iii)マンノシルトランスフェラーゼ；
（iv）（iii)のマンノシルトランスフェラーゼのための受容体；及び
（ｖ）(a) ＧＤＰ、ＧＴＰ又はその両方、(b) リン酸供与体、及び(c) 該リン酸供与体からのリン酸基をＧＤＰに転移してＧＴＰを形成するキナーゼを含むグアノシン二リン酸サイクル系。
〔（ii）、（iii)及び（ｖ）の各々の酵素は触媒量で存在する。〕
【請求項２】
グリコシル化された受容体を回収する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記マンノシルトランスフェラーゼが、α1,2-マンノシルトランスフェラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記マンノシル−１−リン酸が、ヘキソキナーゼによって触媒されるマンノース及びＡＴＰの反応からその場で調製される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記マンノシルトランスフェラーゼが、前記水性反応媒質に分散可能でありかつ実質的に天然酵素のトランスメンブラン領域のない組換えα1,2-マンノシルトランスフェラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記組換えα1,2-マンノシルトランスフェラーゼが、ATCC寄託番号 77379に存在する外因性 DNAによってコードされる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記pH値が６．５〜８．５であり、前記温度が１５〜３５℃である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
マンノシル１−リン酸を使用して、グアノシン二リン酸をリサイクルしながら、受容体をマンノシル基でグリコシル化する方法であって、
（１）単一容器内の水性媒質中に以下の(i) 〜（v)の成分を混合して水性反応媒質を形成する工程；及び
（２）前記水性反応媒質を、前記受容体がグリコシル化されるのに十分な時間、pH６．５〜８．５及び温度１５〜３５℃に維持する工程、
を含む方法。
（ｉ）マンノシル−１−リン酸；
（ii）ＧＴＰの存在下で（ｉ）のマンノシル−１−リン酸からのＧＤＰ−マンノシルの形成を触媒するＧＤＰ−マンノシルピロホスホリラーゼ；
（iii)前記水性反応媒質に分散可能でありかつ実質的に天然酵素のトランスメンブラン領域のない組換えα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ；
（iv）（iii)の前記マンノシルトランスフェラーゼのための受容体；及び
（ｖ）(a) ＧＤＰ、ＧＴＰ又はその両方、(b) リン酸供与体、及び(c) 該リン酸供与体からのリン酸基をＧＤＰに転移してＧＴＰを形成するキナーゼを含むグアノシン二リン酸サイクル系。
〔（ii）、（iii)及び（ｖ）の各々の酵素は触媒量で存在する。〕
【請求項９】
グリコシル化された受容体を回収する工程を更に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えα1,2-マンノシルトランスフェラーゼが、ATCC寄託番号 77379に存在する外因性 DNAによってコードされる、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、オリゴサッカライド合成に関し、特に、ＧＤＰ−マンノース(GDP-Man) の再生を伴う、受容体分子へのマンノシル基の酵素触媒転移に関する。
【０００２】
【従来の技術】
より数多くのグリコシルトランスフェラーゼ酵素が熟練した研究者に入手可能になるに従い、最近、当該技術分野において、オリゴサッカライド含有分子の設計された酵素合成が注目されるようになって来た。例えば、米国特許第 5,180,674号及び１９９１年３月１８日に出願され、許可された米国特許出願第 07/670,701 号を参照のこと。
事実、セノ(Seno)らの米国特許第 4,569,909号は、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン４−エピメラーゼを使用して、UDP-GlcNAcを、UDP-GlcNAc及びUDP-GalNAcの平衡混合物にエピマー化することを教示している。その混合物から、酵素活性を停止するために沸騰しまた変性した酵素を除去した後、粗製のUDP-GalNAc調製品が得られた。この調製品は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ａ−トランスフェラーゼと呼ばれる）とともに使用することによって、Ｏ型赤血球細胞をＡ型赤血球細胞に変換した。
セノらは、大規模に調製しかつ貯蔵することが比較的困難な化合物であるUDP-GlcNAcとの各反応を初めた。セノらは、またUDP-GalNAc又は他の糖結合ヌクレオチドがリサイクルされる再生工程の着想をしなかった。
【０００３】
糖ヌクレオチド依存グリコシルトランスフェラーゼに基づくオリゴサッカライドの合成は、複数の保護及び脱保護工程なしに、温和な条件下で領域選択的又は立体選択的に進行する。この分野を外観するために、トゥーン(Toone) らのTetrahedron, 45:5365 (1989) 、デビット(David) らの Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 49:175 (1991) 、ドルエックハマー(Drueckhammer)らのSynthesis, 7:499 (1991) 、及びイチカワ (Ichikawa) らのAnal. Biochem., 202:215 (1992)を参照されたい。しかしながら、グリコシルトランスフェラーゼは、取得することが困難であり（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、唯一の商業的に入手可能なものである）、酵素合成には、大規模な方法に対しては、糖ヌクレオチド再生が必要である。ウォン（Wong) らのJ. Org. Chem., 47:5416 (1982);イチカワらの J. Am. Chem. Soc., 113:4698 (1991) 、イチカワらの J. Am. Chem. Soc., 113:6300 (1991);  ウォンらの J. Org. Chem., 57:4343 (1992)、及びイチカワらの J. Am. Chem. Soc., 114:9293 (1992) を参照された。
５０より多くのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が細菌、酵母及び哺乳動物細胞からクローン化され、配列特定されており、ジーンバンク(IntelliGenetics Inc.)に資料として提供されている。これらの配列が利用可能であるので、研究者は大量にグリコシルトランスフェラーゼを過剰発現させ、オリゴサッカライド合成にそれらを使用することができる。哺乳類のグリコシルトランスフェラーゼに対する供与体の基質として共通に使用されている８種類の糖ヌクレオチドの内、５種類のもの（即ち、UDP-Glc 、UDP-Gal 、GDP-Fuc 、CMP-NeuAc 及びUDP-グルクロン酸）は、大規模工程に利用できる再生系を有する。ウォンらのPure & Appl. Chem., 64:1197-1202 (1992) を参照。
【０００４】
GDP-Man、UDP-GlcNAc及びUDP-GalNAcの再生は立証されていないが、これらの糖ヌクレオチドの再生に要求される酵素について報告されている。ハイドラス(Heidlas) ら、Acc. Chem. Res., 25:307-314 (1992); ウォンらのPure & Appl. Chem., 64:1197-1202 (1992) 参照。複合オリゴサッカライド及びグリコペプチドの合成のためのグリコシルトランスフェラーゼに基づく酵素操作を発展させる努力の一部が、α1,2-マンノシルトランスフェラーゼ(ManT)の可溶性触媒領域の過剰産生及び特異性研究として開示されている（ルイス(Lewis) ら、Glycobiology, 2:77 (1992))。マンノース含有オリゴサッカライド及びグリコペプチドの合成に、グアノシン−5'−ジホスホマンノース(GDP-Man) の再生と結合してこの酵素を適用することが、以下に開示され、かつ本件発明者及びその同僚によってウォンら、Pure & Appl. Chem., 65(4):803-809 (1993)及びウォンら、 J. Org. Chem., 58:3985-3990 (1992) に開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、単一容器内で、マンノシル−１−リン酸を使用して、グアノシン二リン酸をリサイクルしながら、受容体をマンノシル基でグリコシル化する方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、マンノシル基を受容体に転移する酵素的方法を企図する。グリコシル基の転移は、グリコシル化と呼ばれ、マンノシル基の転移はマンノシル化と呼ばれる。ここで企図する方法は、また、グリコシル転移で形成された GDPをリサイクルして更なる量の GTPを形成し、それによって GDP-Manを再生する。
【０００７】
企図する方法によれば、単一容器内の水性媒質中に以下の成分を混合することによって水性反応媒質を形成する：
（ｉ）マンノシル（マンノース）−１−リン酸(Man-1-P);
（ii） GTPの存在下で（ｉ）のマンノシル−１−リン酸からの GDP-Manの形成を触媒する GDP-Manピロホスホリラーゼ；
（iii)マンノシルトランスフェラーゼ；
（iv）（iii)のマンノシルトランスフェラーゼのための受容体；及び
（ｖ）(a) グアノシン二リン酸(GDP) 、 GTP又はその両方、(b) リン酸供与体、及び(c) 該リン酸供与体からのリン酸基を GDPに転移して GTPを形成するキナーゼを含むグアノシン二リン酸リサイクル系。
〔（ii）、（iii)及び（ｖ）の各々の酵素は触媒量で存在する。〕
（ii）、（iii)及び（ｖ）の各々の酵素は触媒量で存在する。このようにして形成した水性反応媒質は、前記受容体がグリコシル化されるのに十分な時間、pH約５〜約１０、温度約０〜約４０℃に維持される。好ましくは、形成したグリコシル化受容体を回収する。
また、ここでは、組換え水分散性α1,2-マンノシルトランスフェラーゼ、その単離 DNA、その単離 DNAを含有する発現ベクター（例えば、pManflag20) 、及びそのベクターを含む形質転換された大腸菌(E. coli.)を企図する。
【０００８】
略語
本明細書で議論する種々のサッカライドは、通常使用されるそれらの略語で議論されることが多い。それら略語及びサッカライド名をモノサッカライドとして以下に掲げた。
ＧａｌＮＡｃ        ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｇｌｃ              ＝グルコース
ＧｌｃＮＡｃ        ＝Ｎ−アセチルグルコサミン
Ｍａｎ              ＝マンノース
Ｍａｎ−１−Ｐ      ＝マンノース−１−リン酸
Ｍａｎ−６−Ｐ      ＝マンノース−６−リン酸
【０００９】
本発明は、適切なグリコシルトランスフェラーゼによってマンノシル(Man) 基を受容体に転移する、酵素触媒グリコシル転移法を企図する。マンノースは、グリコシルトランスフェラーゼによってその受容体と共に認識される供与体分子としての１−ＧＤＰ誘導体を経由して転移される。
本発明の方法は、単一容器（ワンポット）中に各酵素及び各反応体を含有する水性反応媒質を利用して、転移反応を行う。好ましい方法によれば、以下の成分を水性緩衝液と共に単一容器中で混合することによって水性反応媒質を形成する：
（ｉ） Man-1-P ;
（ii）ＧＴＰの存在下で（ｉ）の Man-1-Pからの GDP-Manの形成を触媒する GDP-Manピロホスホリラーゼ；
（iii)マンノシルトランスフェラーゼ；
（iv）（iii)のマンノシルトランスフェラーゼのための受容体；及び
（ｖ）(a)  GDP、 GTP又はその両方、(b) リン酸供与体、及び(c) 該リン酸供与体からのリン酸基を GDPに転移して GTPを形成するキナーゼを含むグアノシン二リン酸リサイクル系。
（ii）、（iii)及び（ｖ）の各々の酵素は触媒量で存在する。
このようにして形成した水性反応媒質を、約５〜約１０のｐＨ値、約０〜約４０℃の温度に受容体がグリコシル化されるのに十分な時間維持する。
マンノース−１−リン酸（マンノピラノシル−１−リン酸、又はマンノシル−１−リン酸（ Man-1-P））は、公知の化合物であり、文献に記載された多数の調製法のいずれか１つから得られるか又はミズーリ州セントルイスのシグマ化学社から市販されている。
【００１０】
必要な Man-1-Pは、それ自身、公知のように、ホスホマンノムターゼを経由して、 Man-6-Pからその場で形成させることができることは明記すべきである。 Man-1-Pがこのようにして形成した場合には、その濃度は、少なくとも反応の始めにおいては溶液において相対的に低く、 Man-1-Pの全濃度は、 Man-1-P及び Man-6-Pの両者の濃度として考えられる。
Man-6-Pは、それ自身、周知のように、マンノースに対するヘキソキナーゼ及び ATPの反応によってその場で形成することができる。従って、 Man-1-P及び Man-6-Pの両者がその場で形成する場合には、 Man-1-Pの量は、マンノース及び Man-1-P及び Man-6-Pの全量と見なされる。
従って、水性反応混合物は、Man 、 ATP、ヘキソキナーゼ、 Man-6-P及びホスホマンノムターゼ、並びにここで議論する他の酵素及び化学的成分を含むことができる。
GTP及び Man-1-Pから GDP-Manを形成するピロホスホリラーゼは、水性反応媒質中に存在してもよい。以下で更に詳細に説明するように、凍結乾燥したサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞は、必要な酵素、即ち、 GDP-Manピロホスホリラーゼ(EC 2.7.7.22) の便利な入手源である。
前記セノらの特許第 4,569,909号は、UDP-GlcNAc及びUDP-GalNAcの平衡混合物にピロリン酸ナトリウム及びUDP-GlcNAcピロホスホリラーゼを添加することによってUDP-GlcNAcを分解することを教示している。エピメラーゼが存在しかつ活性であるときにUDP-GlcNAcを損失させると、平衡が逆転し、所望のUDP-GalNAcが除去されてしまうので、この添加は、エピメラーゼ酵素を失活及び析出させる沸騰段階後に行われた。
【００１１】
本発明の方法においては、ピロリン酸を添加せず、その場で形成させ、そして好ましくは分解し、 GDP／ GTPをリサイクルするのに異なるピロホスホリラーゼを使用して、UDP-糖又は対応する GDP-Manを分解することよりも、むしろ更に多くの GDP-Manを製造する。
使用するマンノシルトランスフェラーゼ（Man-T)は、転移されるマンノシル基と、そのマンノシル基が転移されるべき受容体とに対して特異性である。天然の糖結合を形成するマンノシルトランスフェラーゼ酵素は公知であり、単離されている。所望の特定のマンノシルトランスフェラーゼは、文献に議論されているようにして調製され、また細胞全体又は細胞抽出物を利用できるので、精製する必要はない。幾つかの代表的な酵素を以下に例示する。ここで議論するα1,2-ManTは、特に好ましい。
利用される受容体は、広範囲のオリゴサッカライド、グリコプロテイン又はグリコペプチドのいずれでもよい。特定の受容体の選択は、使用するマンノシルトランスフェラーゼによって大きく支配されている。殆どの場合、グリコシルトランスフェラーゼの特異性は、非還元末端糖のみによって、又は約１〜４個の隣接する糖との関係で、決定される。従って、熟練者が一旦使用する所定のマンノシルトランスフェラーゼに対する構造要件を満たす受容体を提供したならば、その受容体がトランスフェラーゼによって作用される水性反応媒質における最少の溶解性を有する限り、糖含有受容体の何れかの末端に向かう残りの糖又は他の構成基は転移反応には関連しない。
【００１２】
種々の受容体と幾つかのマンノシルトランスフェラーゼとの反応によって形成する代表的な非還元末端構造は、Academic Press（カリフォルニア州サン・ジエゴ）発行の「Enzyme Nomenclature 」に記載されており、他の構造は、ルイスらの J. Biol. Chem., 266(13):8255-8261 (1991) のような文献に見出すことができ、また、これらの酵素の幾つかに対する一般名又はEC名とともに、以下の表１に示す。
【００１３】
【表１】
0004053097.tif 000002
0004053097.tif 000003
【００１４】
水性反応媒質中の最後の成分は、グアノシン二リン酸／グアノシン三リン酸(GDP/GTP) リサイクル（再生）系である。この系は、 GDP-Manから受容体へのグリコシル転移で形成される GDPをリサイクルし、 GTPを再生し、そして、その再生物を使用して、次いで、転移されるより多くの GDP-Manを形成する。 GDP/GTPリサイクル又は再生系は、３つの基本的な成分を含有する：(a)  GDP、 GTP又はその両方、(b) リン酸供与体、及び (c)リン酸供与体からのリン酸基を GDPに転移するためのキナーゼ。
GDP及び GTPのいずれか又は両方は、 GDPが GTPに転化される限り存在することができ、グリコシル転移反応後に GDPが再び形成される。 GDPと GTPは相互転換して再使用されるので、両方についての量というよりむしろその一方又は他方の総量が通常議論される。
再生系のリン酸供与体はリン酸化された化合物であり、そのリン酸基は GDPをリン酸化して GTPを形成するのに使用することができる。リン酸供与体を選択する上での唯一の限定は、リン酸供与体のリン酸化型も脱リン酸化型も、グリコシル化された受容体サッカライドの形成に関連するいずれの反応をも実質的に妨害しないということだけである。好ましいリン酸供与体は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びアセチルリン酸（ＡｃＯＰ）である。特に好ましいリン酸供与体はＰＥＰであり、それはリン酸転移の後にピルビン酸（ＰＹＲ）を形成する。
【００１５】
本発明に従って使用する個々のキナーゼの選択は、使用するリン酸供与体に依存する。リン酸供与体としてアセチルリン酸を使用する場合には、キナーゼはアセテートキナーゼ（ＥＣ 2.7.2.1）である。リン酸供与体としてＰＥＰを使用する場合には、キナーゼはピルビン酸キナーゼ（ＰＫ；ＥＣ2.7.1.40）である。当業者に周知であるように、他のキナーゼが他のリン酸供与体と共に使用できる。キナーゼは市販されている（ミズーリ州セントルイスのシグマ化学社；インディアナ州インディアナポリスのベーリンガーマンハイム社）。
上記の方法で利用する各酵素は、更にこの後に議論するように、触媒量で存在する。
マンノシル−１−リン酸及び GTPからの GDP-Manの酵素触媒形成は、無機のピロリン酸も生ずる。特に好ましい態様においては、水性反応混合物中に触媒量で存在してもよい無機のピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ；ＥＣ 3.6.1.1）によって、形成した無機のピロリン酸（ＰＰｉ）を触媒的に無機のリン酸（Ｐｉ）に分解する。水性反応混合物中でのＰＰｉの存在は幾つかの酵素を阻害し得る。
【００１６】
本発明の方法の概略的な流れを以下のスキーム１に例示し、一般化した受容体をＲ−ＯＨに対するマンノシル転移を示す。最少量で存在してもよい３つの酵素をＥ1 〜Ｅ3 で示し、以下のスキーム中に特定した。より平明なものとするため、無機ピロリン酸の生成及びそのＰＰａｓｅによる消費は示していない。しかし、ＰＰａｓｅを存在させることは好ましく、以下のスキームＩＶに示す。
【００１７】
【化１】
0004053097.tif 000004
【００１８】
本明細書で使用する“触媒量”とは、速度が制限されることなしに酵素の基質が生成物に転化するのを触媒するのに少なくとも十分なその酵素の量を意味する。特定の酵素の触媒量は、温度、時間及びｐＨ値の如き反応条件のほか、その酵素の基質の濃度に従って変動する。予め選択した基質濃度及び反応条件下での所定の酵素についての触媒量の決定手段は当業者に周知である。
混合とは、各々の成分を他の各々の成分と好適な水性緩衝媒質（溶媒）中で混合して反応混合物又は水性反応媒質を形成することを含む。水性反応媒質は、好ましくは種々の成分の溶液又は分散液である。使用する酵素がフリーであって固体支持体と結合していないことも好ましい。かくして、好ましい実施においては、水性反応媒質は実質的に均質である。
使用する温度は、約０℃から第１の酵素が変性する温度の範囲であり得、容易に決定することができる。通常は、この方法は１０℃〜約４０℃の温度で行われる。好ましくは、温度は約１５℃〜約３５℃、より好ましくは約２０℃〜約３０℃である。周囲大気圧が好ましく使用される。
【００１９】
ｐＨ値は約5.０〜約１0.０の範囲であり得る。好ましくは、ｐＨ値は約6.５〜約8.５であり、より好ましくは約7.０〜約7.５である。ｐＨ値は水性溶媒中において緩衝液によって維持される。緩衝液は、Ｍｇ+2又はＭｎ+2の如き酵素補因子に結合するキレート化剤を含まず、水性溶媒から効率よく除去されるものである。ＥＤＴＡの如きキレート化剤は存在してもよく、存在するのが好ましい。
緩衝液の選択は、望ましいレベルでｐＨを維持するその緩衝液の能力に基づく。ｐＨ値が約7.５である場合、有用な緩衝液はＨＥＰＥＳである。ｐＨ値が約7.０〜9.０である場合、トリス−ＨＣｌも使用できる。
水性反応媒質のモル浸透圧濃度及びイオン組成は、活性型にある反応混合物の諸成分を溶解し、かつ、該反応混合物に含有される酵素に補因子を供給するよう設計され選択される。緩衝液を含む水性溶媒のモル浸透圧濃度は、好ましくは約１００mOsm〜約３００mOsmである。
反応を実質的に阻害しない少量（例えば、約２５容量％まで）の有機溶媒も、受容体の溶解性を増大させるために存在してもよい。適した溶媒には、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、アセトン及びアセトニトリルがある。ここで例示するような、組換えα1,2-ManTによって許容されるような特定量の有機溶媒を以下で議論する。トリトンＸ−１００、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（カルビオケム社）、ＭＥＧＡ−８、−９又は−１０（カルビオケム社）、ＣＨＡＰＳ又はＣＨＡＰＳＯ（カルビオケム社）又はツィーン−２０の如き酵素を変性しない可溶化洗浄剤も、酵素及び受容体の溶解性を向上させるために存在してもよいが、水性反応媒質はかかる洗浄剤を含まない方が好ましい。
【００２０】
グリコシル化反応の反応時間及び条件は、ｐＨ値、反応温度、反応成分、それらの量、及び目的とするグリコシル化体量の如き数パラメーターと共に変化する。周囲室温（例えば、約２２℃）での典型的な反応時間は、最小限の反応だけを望む場合の約１時間から受容体を実質的に使い尽くして最終的な生成物の形成を望む場合の約３日〜約７日の範囲である。
本発明のグリコシル化法に使用する種々の反応体の濃度又は量は、温度及びｐＨ値の如き反応条件及びグリコシル化する受容体の量を含む数多くの要因に依存する。このグリコシル化法は、触媒量の酵素の存在下で GDPの再生を利用するので、該方法はマンノシル−１−リン酸、リン酸供与体及び受容体の濃度又は量によって制限される。本発明の方法に従って使用できる反応体の濃度についての上限は、それら反応体の溶解性によって決まる。
好ましい態様においては、出発マンノシル−１−リン酸の濃度によって制限される。かかる態様によれば、総 GDP、リン酸供与体、受容体及び酵素の濃度は、出発マンノシル−１−リン酸が実質的に消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。
【００２１】
例として、マンノシル−１−リン酸が約５０ｍＭのときは、他の非酵素反応体の好ましい濃度は、受容体については約５０ｍＭ、総 GDPについては約５μＭであり、リン酸供与体については約５０ｍＭである。これら反応体濃度対モノサッカライドリン酸濃度の比率は、好ましくは、受容体については約0.９〜1.２：１、 GDPについては約１０〜１００：１であり、リン酸供与体については約1.０〜４：１である。
このグリコシル化（マンノシル化）法は、更に、好ましくはグリコシル化された受容体を単離又は回収することを含む。単離はグリコシル化された受容体を反応混合物から回収することを含む。グリコシル化された受容体を回収する手段には、周知のように、ゲル濾過、カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、抽出、沈澱等がある。
好ましい態様においては、単離及び回収は、反応混合液を凍結乾燥して該反応混合液の容量を減らし、次いでメタノール抽出によって未反応受容体を除去する。凍結乾燥及び抽出した反応混合物は、シリカゲルカラムに付し、当業者には直ちに決定できるような適当な溶媒により、カラムからグリコシル化された受容体化合物を溶出する。グリコシル化された受容体は、次いで更に通常の周知の技術によって精製し、単離する。
【００２２】
グリコシル化された受容体は単離（回収）する必要はないが、該水性反応混合液での他の合成工程において、又は該グリコシル化された受容体生成物がそれ自体予め回収されていない別の反応混合液において使用できるということは理解されるべきである。例えば、本発明の方法を利用して、GlcNAcトランスフェラーゼ酵素GlcNAcT-III (EC 2.4.1.144)でのように、Ｍａｎ含有化合物にGlcNAc基を結合するマンノシドを形成する場合、単にUDP-GlcNAc及びGlcNAcT-III を反応混合物に添加して、所望の誘導体を調製することが有利となり得る。
他の態様においては、水性反応媒質中に存在する他の物質から酵素を変性、分離し、次いで、次工程で必要な成分を添加するのが有用であり得る。この変性及び分離は、水性反応媒質を、酵素を変性するのに十分な時間、例えば、約５〜１０分間煮沸し、続いて、遠心分離して得られた析出物をその上清から分離することによって行うことができる。次いで、その上清を上記した次反応に使用する。
【００２３】
水分散性酵素活性グリコリピドα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ（α1,2-ManT）、その単離された DNA、その DNAを含む誘導性発現ベクター、及びその発現ベクターを含む形質転換された大腸菌もまた企図される。
天然酵母（サッカロミセス・セレビジエ）α1,2-ManT〔ハウスラー(Hausler) ら、Glycobiology, 2:77-84 (1992)〕は、水性媒質において直ちに溶解しない膜結合タンパク質である。この天然酵素は、 GDP-ManからＯ結合ジマンノシルタンパク質の非還元末端マンノース残基にマンノースを転移する。
企図する組換えα1,2-ManTは、天然酵素又はその天然配列を含有する組換え体に対して使用されるように、トリトンX-100 のような上記界面活性剤の不存在下で水性反応媒質中で分散性である。企図する組換えα1,2-ManTは、酵素的に活性であり、 GDP-Manから非還元末端マンノシル基にマンノースを転移する。
企図する組換えα1,2-ManTは、天然酵素の活性部位を含み、実質的に膜通過領域（トランスメンブラン領域）を有さない。特に好ましい組換え酵素は、天然酵素の約位置３１から位置４４２までのアミノ酸残基配列を含む〔ルイスら、 J. Biol. Chem., 266:8255-8261 (1992) 及びハウスラーら、Glycobiology, 2:77-84 (1992)〕。
【００２４】
企図する酵素をコードする単離された DNAもまた企図する。好ましい単離された DNAは、以下で詳細に説明するプライマーManflag5（配列番号：１）及びManflag3（配列番号：２）を使用するＰＣＲを経て得られた。これらのプライマーは、２種類の異なる制限酵素認識配列、Xba I 及びSal I を含み、これらの認識配列は、ベクターのompAシグナル配列及びα1,2-ManTコード配列と一緒のフレームにある。プライマーManflag3は、またフレーム停止シグナルを含む。
企図する組換えα1,2-ManTは、好ましくは、大腸菌の細胞周辺腔で発現される。このような発現に対して設計されたかかる発現ベクターもまた好ましい。複製起点、発現調整配列、開始コドン及び細胞周辺腔シグナル配列を有する一つのこのようなIPTG誘導ベクターは、コネチカット州ニュー・ヘブンにあるBiotech Inc.から記号pFlag として入手可能である。企図するα1,2-ManTをコードする遺伝子は、ＰＣＲ誘導制限部位を使用してベクターに直ちに挿入され、外因性α1,2-ManT遺伝子を有する誘導性組換え DNAベクターを形成する。一つのかかる組換えベクターは、pManflag20として示す。
【００２５】
外因性α1,2-ManT遺伝子含有発現ベクターで形質転換した大腸菌もまた企図される。このようにして形質転換した大腸菌XL1-Blue株（カリフォルニア州サン・ジエゴにあるStratagene Co.）は、企図する形質転換体の例である。pManflag20で形質転換した大腸菌XL1-Blue細菌は、メリーランド州(20852) ロックビル、パークローン・ドライブ12301 にあるThe American Type Culture Collectionに1993年３月24日に寄託し、ATCC寄託番号77379 を有し、この寄託は、1993年９月14日にブダペスト条約に基づく寄託に変更された。
上記寄託は、寄託期間が寄託の日から３０年又は寄託機関における寄託の最新の請求後５年又はこの米国出願から米国特許になった場合の米国特許の有効期間の何れか長い期間となるべきブダペスト条約の要件に合致するようになされたものである。細胞は、寄託機関において生存しなくなった場合には、補充され、米国出願から特許が発行した時に公衆に利用可能になされる。
以下で説明するように、酵素的に活性なα1,2-マンノシルトランスフェラーゼは、細胞をM9-Ca 培地で成育する場合には、約０.01mM 未満のIPTG濃度で誘導可能であり、好ましい濃度は約０.005M IPTGである。
たった一つの他のトランスフェラーゼ、即ち、可溶性ガラクトシルトランスフェラーゼが、相対的に低生物学的活性ではあるが、大腸菌から発現されることが報告されている〔アオキ(Aoki)ら、EMBO J., 9(10):3171-3178 (1990) 〕に過ぎないので、酵素的に活性なタンパク質が大腸菌から発現できることは驚くべきことであった。他のトランスフェラーゼは、大腸菌で発現したが、これらの発現した酵素は、酵素的に活性ではなかった。即ち、ここで発現したα1,2-ManTは、 GDP-Manから受容体にマンノースを転移し（酵素的に活性である）、一方、一つの例外として、大腸菌で発現したグルコシルトランスフェラーゼはそのグリコシル基を転移しなかった（酵素的に不活性である）。
【００２６】
結果
酵母（サッカロミセス・セレビジエ）中のα1,2-マンノシルトランスフェラーゼ（α1,2-ManT）は、 GDP-Manから、Ｏ結合ジマンノシルタンパク質の末端マンノース残基にマンノースを転移する膜結合酵素である〔ルイスら、Glycobiology, 2:77 (1992) 〕。この ManT は、哺乳類のゴルジ装置の公知のグルコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼと同様に〔ジョジアッシ(Joziasse)、Glycobiology, 2:271 (1992)〕、短いＮ−末端領域及びそれに続く膜通過領域及び大きな触媒領域を含む。
多くのグルコシルトランスフェラーゼの触媒領域が膜結合酵素よりも安定でかつ同様に活性であることが示されている〔ポールスン(Paulson) ら、 J. Biol. Chem., 264:17615 (1989) 〕ので、大腸菌における過剰発現のための、マンノシルトランスフェラーゼの触媒領域をコードする遺伝子を有する分泌ベクターを構成した。グルコシルトランスフェラーゼの殆どは、CHO 細胞で発現した〔ジョジアッシ、Glycobiology, 2:271 (1992)〕。大腸菌中のグルコシルトランスフェラーゼの触媒領域の発現のための唯一の例は、低酵素活性を有するβ−ガラクトシルトランスフェラーゼである。アオキら、EMBO J., 9:3171 (1990)参照。大腸菌において他の酵素活性グルコシルトランスフェラーゼを発現させる他の試みは成功しなかった。ある種のＯ結合モノマンノシルペプチドは、マンノース及びマンノビオースよりも組換え酵素に対する基質として優れている。
【００２７】
マンノシルトランスフェラーゼの過剰発現及び精製
サッカロミセス・セレビジエからのα1,2-ManTのタンパク質配列３１〜４４２をコードする遺伝子を、ウォンらの J. Org. Chem., 58:3985-3990 (1993) に記載された２種類の消化プライマーを使用して、ＰＣＲ法よってクローン化した。5'末端からの5'プライマー、Manflag5は、Xba I 認識配列に結合された塩基ATATT を含んでした。このXba I 認識配列は、それ自体Ｎ−末端アミノ酸残基位置３１で始まるタンパク質の配列に対応する１８の塩基に連結していた。5'末端からの3'プライマー、Manflag3は、Sal I 認識部位に連結した配列GCGCを含んでいた。このSal I 認識部位は、２つの停止コドン(TTATTA)に連結し、この２つの停止コドンは、Ｃ−末端アミノ酸残基位置４４２及びタンパク質の上流をコードする１８の塩基に連結していた。これらの２種のプライマーを以下に示す。
Manflag5：
5'ATATTTCTAGAAGAACTCAGCAATATATT       （配列番号：１）
Manflag3：
5'GCGCGTCGACTTATTACTCACGGAATTTTTTCCA  （配列番号：２）
α1,2-ManT遺伝子に対応するＰＣＲ挿入物（１．４ kb)は、Xba I 及びSal I で消化し、ベクターpFlag （コネチカット州ニュー・ヘブンにあるInternational Biotech Inc.から購入）に結合して、プラスミドpManflag20を構成した。このプラスミドを、酵素の過剰生産のために、大腸菌XL1-Blue株〔マニアティス(Maniatis)ら、A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989)及び
ローズ(Rose)ら、Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course, Cold Spring Harbor Lab., New York (1990)〕に形質転換した。
【００２８】
大腸菌で発現したα1,2-ManTの活性は、培地条件に依存することが分かった。細胞を、インジューサ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG））濃度が１mM（標準濃度）で、温度３７℃において、LB培地又はM9培地で培養したところ、マンノシルトランスフェラーゼ活性は培地中で検出できなかった。これとは対照的に、細胞を、非常に低濃度のIPTG（＜0.01mM) の存在下で、M9-Ca 培地〔タカギら、Biotechnology, 6:948 (1988) 〕において３０℃で成育したところ、有意量のα1,2-ManT活性が検出された。
後の結果から、これらの条件において、組換えタンパク質が適切に折り畳まれ、大腸菌の細胞周辺腔に分泌されたことが分かった〔シブイ(Shibui)ら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 37:352 (1992) 及びスイン(Hsuing)ら、Biotechnology, 4:991 (1986) 〕。IPTGの最適な濃度は、約0.005 mMであることが分かった。この濃度においては、１リットルの培地から0.7 〜0.8 単位（１単位は、１分当たり３０℃において、 GDP-Manからメチルα−Ｄ−マンノピラノシドへ1.0 μmol のマンノースを転移する〕のα1,2-ManTが得られた。
殆どの活性酵素は細胞周辺腔で分泌されるので、組換えタンパク質の精製は極めて容易である。細胞周辺腔フラクションを以下で述べるようにして調製した後、そのフラクションを直接合成目的に使用することができる。ただし、少量のホスファターゼ活性がこのフラクションにも見出された。酵素的マンノシル化反応の間における糖ヌクレオチドの分解を防止するために、100 mMの ATP（スケープゴートとして作用する）、1 mMのテオフィリン〔メタエ(Metaye)ら、Biochem. Pharmacol., 37:4263 (1988) 〕及び1 mMの2,3-ジメルカプトプロパノール〔コットレル(Cottrell)ら、Biochem. J., 283:299 (1992) 〕を含む阻止液（約１％容量）を添加した。
スペロース（Superose) カラムクロマトグラフィーの後、 ManT の精製を、モノキュー(Mono Q)カラム上でFPLCによって行い、約１単位／mgの特異活性を有するタンパク質を得た。タンパク質の純度は、 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価したところ、８５％より多くのものが分子量５０ kDaであることが評価された。
【００２９】
酵素安定性
組換え酵素は、２０℃の緩衝液（100 mMのトリス−HCl 及び5 mMのMgCl2 緩衝液、pH７．４）において５日後、９０％より多くの活性を保持した。しかしながら、高温（３７℃）においては、この酵素は、約４時間の半減期を示した。このオリゴサッカライド合成は、２５〜３０℃で行った。
【００３０】
有機溶媒の効果
この実験において受容体として使用されるＯ−グリコペプチドの幾つかを溶解するのに、低濃度の有機溶媒が必要であるので、マンノシル転移反応に与える有機溶媒の効果を検討した。酵素は、３０％までのメタノール及び２０％までのアセトン−緩衝液に寛容である。トランスフェラーゼは、１０％ DMF−緩衝液においては約８０％の活性を維持し、１０％アセトニトリル−緩衝液においては、約５０％の活性を維持するが、これらの有機溶剤の濃度が２０％まで増大すると、活性を９５％失う。従って、分析及び合成において必要である場合には、１０％アセトン又は２５％までのメタノール−緩衝液を利用する。
【００３１】
基質特異性
天然α1,2-マンノシルトランスフェラーゼに関する従前の研究から、この酵素は、α−メチルマンノピラノシド及びマンノビオースにマンノースを転移することが分かった。〔レール(Lehle) ら、Biochem. Biophys. Aca., 350:225 (1974); ユング(Jung)ら、Eur. J. Biochem., 37:1 (1973);  バクジンスキ(Babczinski)ら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 54:1119 (1973)〕。この研究において調製した組換え体の活性領域は、また類似する基質特異性を有する（以下の表２参照）。
従って、この組換え酵素は、基質としてα−メチルマンノピラノシド（化合物１）、マンノース（化合物２）及び Manα１→２ ManαOMe （化合物３）を受容し、それぞれKm値は５７、１９３及び２８mMである。比較のため、天然酵素に関するマンノースのKm値は、100 mMであった〔レールら、Biochem. Biophys. Aca., 350:225 (1974); ユングら、Eur. J. Biochem., 37:1 (1973);  バクジンスキら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 54:1119 (1973)〕。６−デオキシ− ManαOMe （化合物４）、６−アジド−６−デオキシ− ManαOMe （化合物５）及び６−アミノ−６−デオキシ− ManαOMe （化合物６）のようなＣ−6 変性α−メチルマンノピラノシドは、乏しい基質である。p-ニトロフェニルα−メチルマンノピラノシド及び２位にＳ−形態を有する他のモノサッカライド、例えばD-アルトロース、D-イドース、D-タロース、D-アラビノース及びD-キシロースは基質ではない。マンノシダーゼ阻害剤、１−デオキシマノジリマイシン(1-deoxymannojirimycin) 〔フルクトース二リン酸アルドラーゼ触媒縮合及び触媒的分子内還元アミノ化によって合成される（カジモト(Kajimoto)ら、J. Am. Chem. Soc., 113:6187 (1991)）〕は、基質でもなく、α1,2-ManTの阻害剤でもない。
【００３２】
【表２】
0004053097.tif 000005
ｂ：分析した他の許容できない基質は、以下で議論する。
上記化合物（７）〜（１１）は、以下の通りである。
【００３３】
【化２】
0004053097.tif 000006
【００３４】
O-マンノシルペプチドが、この酵素の良基質であることが判った。例えば、Cbz-Thr(α-Man)-Val-OMe （化合物７）は、受容体としてはMan αOMe に匹敵するが、Ｋm 値はより低い。N-末端の脱保護化した化合物８及びより長いペプチド類似体９もまた良基質である。興味深いことに、ペプチド配列Tyr-Thr-Val を有するO-グリコペプチド化合物10（タナー(Tanner)、Eur. J. Biochem., 196:185 (1991)) のα1,2-ManTに対するＫm 値は0.7mM である。この値は、化合物７の値よりも10倍小さく、Man αOMe （化合物１）の値よりも80倍小さい。この結果は、O-マンノシルペプチド中のあるペプチド配列がα1,2-ManTにとって好ましいことを示唆している。
オリゴマンノースは、酵母及び哺乳動物細胞中のN-連鎖及びO-連鎖糖タンパク質のバックボーン構造成分である。そのようなオリゴ糖は、成長するオリゴ糖鎖に高度に順序立てられた単糖類単位の付加により構築される。
サッカロミセス・セレビジエ中のO-結合炭水化物鎖の生合成に関する最近の研究は、天然α1,2-マンノシルトランスフェラーゼが、第三のマンノースを生育するO-結合炭水化物に転移させる役割を有することを示唆している（ハウスラーら、Proc. Natl. Acad. Sci., 89:6846 (1992)) 。しかし、化合物７と11の速度論データを比較すると、α1,2-ManTの組換え活性ドメインは、ジマンノシルグリコペプチド上よりもモノマンノシルO-グリコペプチド上で、より活性があると思われる。この観察結果の理由については未だ明らかではない。
実施例で用いたC-6 変性α- メチル- マンノピラノシドを、化合物１から合成した（以下のスキームII）。従って、０℃でピリジン中で化合物１をトシル化し、続いて置換し還元して、各々化合物12、５及び６を得た。化合物１の6-ヒドロキシル基を臭素化し、続いてアセチル化して、化合物14を得た。化合物14をBu3SnHで還元し、続いて脱保護化して、6-デオキシ誘導体である化合物４を得た。
【００３５】
【化３】
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【００３６】
以下のスキームIII に示すように、表２の中のO-マンノシルペプチドを化学的に調製し、ペプチド鎖を化学的あるいは酵素的に伸長した。シルバートリフルオロメタンスルホネートの存在下で、テトラアセチル-O-D- マンノピラノシルブロマイドを用いて、ペプチドCbz-Thr-Val-OMe のグリコシル化によりO-グリコペプチド化合物16を合成した（ガレッグ(Garegg)ら、Acta Chem. Scand., B33 (1979);シュルテイス−レイマン(Shultheiss-Reimann)ら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 22:62 (1983) 、及びハネシアン（Hanessian)ら、Carbohydrate Res., 53:C13 (1977)) 。Boc-Tyr(Bzl)-OH からの標準ペプチドカップリング反応により、化合物17から化合物10を合成した。化合物16を０℃でNaOMe/MeOH中で脱アシル化して、化合物７を得た。ズブチリシン変異体8397の80%DMF(v/v) 溶液を触媒とし、化合物７をH-Gly-Ala-NH2 とカップリングして、化合物９を合成した（ツォング(Zhong) ら、J. Am. Chem. Soc., 113:683 (1991))。このプロテアーゼはDMF 中で使用する目的で展開され、O-及びN-グリコペプチドの合成に有効な触媒であることが証明されている。
【００３７】
【化４】
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【００３８】
GDP-Man の再生を伴う、マンノースを含むオリゴ糖とグリコペプチドの合成特に好ましいマンノシルトランスフェラーゼを触媒とするサイクリックマンノシル化工程を、以下のスキームIVに示す。このグリコシル化工程の生成物である化合物３と11を、スキームの下に示す。番号を付した酵素の説明を、スキームの下に記した。
【００３９】
【化５】
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【００４０】
従って、該多酵素系は、本研究所では３段階でマンノースから合成したマンノース1-リン酸塩(Man-1-P) から開始した（シム(Sin) ら、J. Am. Chem. Soc.,掲載予定) 。マンノース1-リン酸塩を、酵母細胞からのGDP-マンノースピロホスホリラーゼ(EC. 2.7.7.22)を触媒として、GTP と反応させた。GDP-マンノースピロホスホリラーゼは、無細胞抽出液中よりも、凍結乾燥細胞中でより安定であった。EDTA(5mM) を反応液に添加して（サイモン(Simon) ら、J. Org. Chem., 55:1834 (1990))、GDP-Man を形成しても（カビブ(Cabib) ら、J. Biol. Chem., 206:779 (1954)、ウッド(Wood)、J. Biol. Chem., 239:3119 (1964))、生成したGDP-マンノースの減成は観察されなかった。GDP-Man はManTにより消費され、マンノースを含むオリゴ糖またはグリコペプチド（スキームIVでは一括して受容体-OH と記載した）が得られ、放出されたGDP は、ピルビン酸キナーゼ(PK EC 2.7.7.9) とホスホエノールピルビン酸塩(PEP) により、GTP に再変換された。無機ピロホスファターゼ(EC 3.6.1.1)により、反応から得られたピロリン酸塩(PPi) を加水分解してリン酸塩(Pi)とし、平衡をシフトさせ、阻害を回避した。
【００４１】
化合物３の代わりに、糖脂質3-α- マンノシルトランスフェラーゼをここで用いてMan α1 →3Man-OMeを形成することも可能であったということに注意すべきである。同様に、6-α- または6-β- マンノシルトランスフェラーゼを用いて、対応するMan α1 →6Man-OMeまたはMan β1 →6Man-OMeを形成することも可能であった。もちろん、単離した天然α1,2-Man-T (EC 2.4.1.131)を用いることも可能であった。
典型的なCbz-Thr(α-Man1,2 αMan)-Val-OMe（化合物11）の合成として、Cbz-Thr(α-Man)-Val-OMe （受容体、化合物７、100mg,95mM) 、マンノース1-リン酸塩(60mg,100mM)、GDP(9mg,10mM) 、PEP(47mg,100mM) 、ピルビン酸キナーゼPK(50U) 、乾燥酵母細胞(50mg)、α1,2-ManT(0.4U)、及び無機ピロホスファターゼ(1U)を含む反応混合物(2mL、100mM のトリス、pH 7.5、5%のアセトン、10mMのMgCl2 、10mMのMnCl2 、5mM のEDTA、5mM のNaN3、1mM のATP 、0.01mMのテオフィリン、0.03mMの2,3-ジメルカプトプロパノール、及び0.05mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド）を、室温で60時間軽く攪拌し、遠心分離した。上澄みを凍結乾燥し、メタノールで抽出した。メタノールを除去した後、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3:CH3OH:H2O = 6:3:0.5 v/v/v) で精製し、Cbz-Thr(α-Man1 →2 αMan)-Val-OMe（化合物11、31mg）を、消費したCbz-Thr(α-Man)-Val-OMe に基づいて、合計収率41% で得た。二糖化合物３を同様の方法で、39% の収率で調製した。
【００４２】
【実施例】
概要
販売元から試薬グレードとして全ての化学薬品を購入した。高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を、２台のP-500 ポンプ、GP-250グラジエントプログラマー、シングルパスのUV-1モニターからなるPharmacia システムで測定した。UV−可視スペクトルをBeckman DU-70 スペクトロメーターで測定した。SDS-PAGEをPharmacia Phast システムで行った。1H及び13C NMR スペクトルをBruker AMX-500スペクトロメーターで測定した。高解像度質量分析(HRMS)を高速原子衝撃法(FAB) を用いたVG ZAB-ZSE質量分析計で測定した。薄層クロマトグラフィーは、蛍光指示薬を用いたBaker Si250FシリカゲルTLC プレートで行った。カラムクロマトグラフィーは、グレード62、60-200メッシュ、150 Åのシリカゲルで行った。ピルビン酸キナーゼや無機ピロフォスファターゼ等の酵素を、Sigma 社から購入した。ベクターpFlag-1 を、International Biotech.社（コネチカット州ニューヘブン）から購入した。
【００４３】
酵母DNA からのα-1,2- マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅
１μL(0.5 μg)の酵母（サッカロミセス・セレビジエ）DNA （マニアティスらのMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989) 、ローズらのMethods in Yeast Genetics: A Laboratory Course, Cold Spring Harbor, New York (1990))、400nmol のプライマーManflag5とManflag3、200mM の異なるdNTP、50mMのKCl 、10mMのトリス-HCl(pH 8.3)、2mM のMgCl2 、0.01% のトリトン X-100、及び２単位のテルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus) DNA ポリメラーゼを含む100mL の反応混合物中で、ウォンらのJ. Org. Chem., 58:3985-3990 (1993)に記載のようにして、PCR 増幅を行った。反応を100 μL の鉱物油でオーバーレイし、30サイクルの増幅にかけた。
【００４４】
α-1,2- マンノシルトランスフェラーゼ発現ベクターの構築
PCR 増幅から得たDNA をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールにより-70 ℃、30分間で沈殿させた。沈殿DNA を遠心分離し、70% のエタノールで洗浄した。DNA ペレット（約500 μｇ）を制限酵素緩衝液で溶解し、Xba I とSaI I （各々40U)により37℃、２時間で消化した。消化DNA をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により回収した。このDNA を50μL のTE緩衝液(pH 7.7)で再溶解し、0.7%のアガロースゲルで精製した。1.4kb に対応するDNA バンドをアガロースゲルから分離し、Gene Clean Kit (Bio-101 社、サン・ディエゴ）で精製し、挿入断片として用いた。
40単位のXba I とSaI I によるpFlag-1 DNA (1mg) の消化から調製したベクターを、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により回収し、挿入断片調製で記載したようにアガロースゲルで更に精製した。挿入断片をベクターに結合し、大腸菌XL1-Blue株に形質転換し、100mg/mLのアンピシリンを含むLB寒天平板上に塗布した。
【００４５】
ポジティブクローンのスクリーニング
宿主菌株大腸菌は酵母α-1,2- マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を含まないので、該遺伝子を含むポジティブクローンのみが、プライマーManflag5とManflag3を用いた場合に、1.4kb のPCR 増幅生成物を示す。そこで、PCR 法をスクリーニングに用いた。
平板から33のコロニーを無作為抽出し、50μL の細胞溶菌緩衝液(1% のトリトン X-100と2mM のEDTAを含むトリス-HCl、pH 8.5) で溶菌した。熱湯で５分間加熱し、溶液をPCR 増幅のためのDNA 鋳型源として用いた。PCR 増幅の手順は、３μL の細胞溶菌溶液を酵母DNA の替わりに用いたことを除けば、α-1,2- マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅で記載した手順と同じであった。３つのポジティブクローンが確認された。得られたα-1,2- マンノシルトランスフェラーゼ発現ベクターをpManflag20と呼ぶ。
【００４６】
形質転換した大腸菌株の生育
１mMのCaCl2 と100 μg/mLのアンピシリンを含むM9-CA 培地(Na2O4・7H2O,12.8g、KH2PO4,3.0g 、NaCl,0.5g 、NH4Cl,1.0g、工業グレードのカサミノ(casamino)酸,20.0g、水,1L)上で、形質転換した大腸菌株を、37℃で中間対数期(OD600 0.5-0.6) まで生育させ、次に0.005mM のIPTGを用いて12時間、30℃で振とうして誘導した。
【００４７】
大腸菌細胞周辺腔からのα1,2-ManT調製
本調製は次の公知文献の手順に従って行った。（レールらのBiochem. Biophys. Acta., 350:225 (1974) 、ユングらのEur. J. Biochem., 37:1 (1973) 、バクジンスキらのBiochem. Biophys. Res. Commun., 54:1119 (1973)参照。)
簡潔に述べると、全ての工程を４℃で行った。5Lの生育大腸菌からの培養物を、重力加速度10,000×g で10分間遠心分離した。細胞ペレットを200mL の20% のショ糖、10mMのトリス-HCl(pH 7.6)中で再懸濁した。懸濁液に4mL のEDTA(0.5M)を添加し、試料を氷上で30分間温置した後、４℃で５分間遠心分離した。上澄みを除去した後、ペレットを20mLの冷蒸留水で再懸濁した。懸濁液を氷上で30分間温置した後、５分間遠心分離した。上澄み（ペリプラズムフラクション）を慎重に除去し、１mLの２M トリス-HCl、100mM のCaCl2 溶液を、ゆっくりと上澄みに添加した。氷上で10分間温置した後、懸濁液を５分間遠心分離し、沈殿を放出させた。上澄みを、100mM のトリス-HCl(pH 7.6)に対して０℃で８時間透析した。活性測定から、得られたペリプラズムフラクション(20mL)が、約3.7 単位のManT活性を有することが示された。
【００４８】
α-1,2- マンノシルトランスフェラーゼの活性測定
GDP-Man(14C)(10mM,10mL) 、α- メチルマンノピラノシド(500mM,10 μL)、及び酵素溶液(10 μL)を、50mMのHEPES(pH 7.2) 、0.1%のトリトン、及び10mMのMnCl2 を含む緩衝液中で混合した。混合液を30.0℃で１時間温置した。溶液にQAE-Sephadex(400μL)を添加して、未反応GDP-マンノースを除去した。遠心分離により樹脂を除去した後、溶液の放射能を10mLのシンチレーション流体中で計測した。コントロールとして、受容体又は酵素を除外して行った。
【００４９】
酵素安定性の研究
0.5mM のジチオトレイトールを含む、100mM のトリス-HCl緩衝液、5mM のMgCl2 、pH 7.4中で、酵素を室温に温置した。異なる時間間隔で10μL のアリコートを取り出し、上述のようにマンノシルトランスフェラーゼ活性を測定した。
【００５０】
有機溶媒の影響の研究
GDP-Man(14C)(10mM,10μL)とメチルマンノピラノシド(500mM,10 μL)を、所定量の有機溶媒と水に混合し、所望の有機溶媒濃度を得た。次に、酵素(10 μL)を混合液に添加した。溶液を30.0℃で１時間温置した。酵素活性を、酵素測定の項に記載したように測定した。
【００５１】
基質特異性と酵素速度論
150mM の基質、3.3mM のGDP-Man 、過剰生産されたα-1,2-ManT 、50mMのHEPES(pH 7.2) 、0.1%のトリトン、及び10mMのMnCl2 を含む30μL の測定溶液中で、基質特異性を決定した。混合液を30℃で１時間温置し、生成物の形成を放射能測定により決定した。速度論研究のために様々な受容体濃度で、酵素測定に記載したように初速度を測定した。データのラインウィーバー・バークプロットから、Km及びVmaxを決定した。
【００５２】
GDP-マンノースピロホスホリラーゼ
酵母（サッカロミセス・セレビジエ）を、1%のショ糖を追加したYMブロス（酵母抽出物,3g 、麦芽抽出物,3g 、バクト(Bacto) ペプトン,5g 、バクト(Bacto) デキストロースの蒸留水溶液10g/L 、pH 6.2）中で生育させた。細胞集団を30℃で36時間振とう(250rpm)して生育させ、重力加速度8,000 ×g(４℃) で20分間遠心分離して細胞を回収した。細胞をトリス-HCl緩衝液(100mM、pH 7.5で、5mM のMgCl2 と１mMのメルカプトエタノールを含む）で一度洗浄し、凍結乾燥して、GDP-マンノースピロホスホリラーゼ源として用いた。
【００５３】
化合物合成
メチル2,3,4-トリ-O- アセチル-6- ブロモ-6- デオキシ- α-D- マンノピラノ
シド（化合物14）
メチル- α-D- マンノピラノシド(2.0g,10.3mmol) とNBS(3.66g,20.6mmol) の、0-5 ℃の冷却DMF(100mL)溶液に、トリフェニルフォスフィン(5.4g,20.6mmol) を分け入れ、混合物を50℃で２時間加熱した。冷却後、MeOH(5mL) を滴下し、混合物を濃縮した。残さをAc2O(20mL)とピリジン(30mL)でアセチル化した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、トルエン−EtOAc(10:1) を用いて精製し、化合物14(1.74g,44%) を得た。
1H NMR (500MHz,CDCl3):δ2.00, 2.07, 2.15(s,3H,3 ×OAc), 3.41-3.49(m,2H,H-6), 3.46(s,3H,OMe), 3.98(ddd,1H,J=3.0,8.0,9.5Hz,H-5), 4.74(d,1H,J=1.65Hz,H-1), 5.19(t,1H,J=9.92Hz,H-4), 5.23(dd,1H,J=1.70,3.42Hz,H-2), 5.33(dd,1H,J=3.42,9.97Hz,H-3)
13C ｛1H｝NMR (CDCl2):δ20.60, 20.69, 20.79, 31.32, 55.31, 68.64, 68.77, 69.41, 69.89, 98.35, 169.77, 169.96
C13H19O8BrCs+ (M+ Na+ ) 514.9318としてHRMSで計算し、実測値514.9318を得た。
【００５４】
メチル-6- デオキシ- α-D- マンノピラノシド（化合物４）
Bu3SnH(1.97g,6.77mmol;1.82mL) のトルエン(40mL)溶液を、緩やかに20分にわたって還流している化合物14(1.70g,4.42mmol)のトルエン(40mL)溶液に滴下し、混合物を10時間還流した。冷却後、混合物を濃縮し、残さをトルエン−EtOAc(30:1) を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで分離し、メチル2,3,4-トリ-O- アセチル-6- デオキシ- α-D- マンノピラノシドを得た。この化合物(700mg,2.30mmol)とメタノリックMeONa(1mL,0.3M溶液) のMeOH(30mL)溶液を、室温で２時間攪拌した。Dowex 50W-X8を添加して混合物を中和し、樹脂を濾過し、濾液を濃縮して化合物４(327mg, 収率80%)を得た。
1H NMR (500MHz,CD3OD):δ1.26(d,3H,J=6.5Hz,H-6), 3.33(s,3H,OMe), 3.37(m,1H), 3.51-3.55(m,1H), 3.59(dd,1H,J=3.5,9.5Hz), 3.76(dd,1H,J=2.0,3.5Hz), 4.54(d,1H,J=1.5Hz,H-1)
13C ｛1H｝NMR (CD3OD):δ18.01, 55.12, 69.67, 72.25, 72.44, 73.90, 102.83
C7H14O5Na + (M+ Na+ ) 201.0739としてHRMSで計算し、実測値201.0745を得た。
【００５５】
6-トシル-ManαOMe （化合物12）
α- メチルマンノピラノシド(1.5g,7.8mmol)を20mLのドライピリジンに溶解し、０℃に冷却した。次にトシルクロリド(2.0g,10.3mmol) をゆっくりと添加した。反応物を０℃で８時間攪拌し続けた。溶媒を真空中で除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィー (ヘキサン／EtOAc=1/4 で溶出) で分離し、化合物12(2.02g, 収率74%)を得た。
1H NMR (500MHz,CDCl3):δ2.42(s,3H), 3.28(s,3H), 3.70-3.75(m,3H), 4.25-4.34(m,3H), 4.65(s,1H), 7.26-7.33(m,2H), 7.78-7.80(m,2H)
13C ｛1H｝NMR (CDCl3):δ21.00, 55.01, 66.95, 69.58, 69.97, 70.45, 71.58, 128.01, 129.83, 129.98, 132.60, 145.00
【００５６】
6-アジド-6- デオキシ-ManαOMe （化合物５）
6-トシル-ManαOMe 化合物12(100mg,0.28mmol)を10mLの溶媒（アセトン／水=3/2）に溶解した。アジ化ナトリウム(56mg,0.86mmol) を添加した。反応物をN2中で12時間還流した。次に溶媒を真空中で除去し、残さを50mLのメタノールで抽出し、シリカゲルクロマトグラフィー (CHCl3/MeOH/H2O=6/3/0.5で溶出) で分離し、化合物５(55mg,収率86%)を得た。
1H NMR (500MHz,CD3OD):δ3.30(s,3H), 3.32(m,2H), 3.46-3.54(m,3H), 3.70(dd,1H,J=2.0,3.5Hz), 4.54(d,1H,J=2.0Hz)
13C ｛1H｝NMR (CD3OD):δ52.92, 55.30, 69.45, 71.90, 72.33, 73.78, 102.80
C7H13N3O5Na + (M+ Na + ) 242.0753 としてHRMSで計算し、実測値242.0761を得た。
【００５７】
6-アミノ-6- デオキシ-ManαOMe （化合物６）
化合物５(24mg)を、Pd/Cの存在下で2mL のメタノール中で水添分解して、化合物６(18mg,収率85%)を得た。
1H NMR (500MHz,D2O):δ2.7(dd,1H,J=7.0,13.5Hz), 2.90(dd,1H,J=3.0,13.5Hz), 3.28(s,3H), 3.32-3.33(m,1H), 3.35(t,1H,J=2.5Hz), 3.55(dd,1H,J=3.5,9.0Hz), 3.68(dd,1H,J=2.0,3.5Hz), 4.53(d,1H,J=1.5Hz)
13C ｛1H｝NMR (D2O):δ43.61, 55.30, 69.98, 72.01, 72.40, 102.81
C7H5N1O5Na + (M+ Na + ) 216.0848としてHRMSで計算し、実測値216.0853を得た。
【００５８】
Cbz-Thr(α- テトラアセチル-Man)-Val-OMe （化合物16）
2,3,4,6-トリアセチル-D- マンノピラノシルブロマイド(2.40mg,5.84mmol) のドライジクロロメタン(30mL)溶液に、Cbz-Thr-Val-OMe(2.00g,5.67mmol) とシルバートリフレート(2.92g,11.4mmol)を、-20 ℃で添加した。懸濁液を-20 ℃で４時間攪拌し、セライトのベッドを通して濾過した。濾液を水で２度、飽和炭酸水素ナトリウムで２度洗浄した。有機層を無水MgSO4 で乾燥し、真空中で濃縮し、残さをシリカゲルクロマトグラフィー (EtOAc/ヘキサン=2/1で溶出) で分離し、化合物16を白色固体として(2.8g,収率72%)得た。
1H NMR (500MHz,CDCl3):δ0.86(dd,6H,J=4.5,7.0Hz), 1.20(d,3H,J=1.0Hz), 1.91(s,3H), 1.98(s,3H), 2.01(s,3H), 2.02(s,3H), 2.12(m,1H), 3.67(s,3H), 4.05-4.07(m,2H), 4.18-4.20(m,1H), 4.33(t,2H,J=3.5Hz), 4.44-4.45(m,1H), 5.00(s,1H), 5.08(s,2H), 5.16-5.24(m,3H), 5.81(d,1H,NH,J=7.5Hz), 6.82(d,1H,NH,J=8.5Hz), 7.25-7.32(m,5H)
13C ｛1H｝NMR (CDCl3):δ16.53, 17.74, 18.71, 20.40, 20.53, 20.58, 30.65, 51.82, 57.31, 58.15, 62.35, 66.69, 67.10, 68.78, 68.83, 69.05, 76.18, 98.85, 127.40, 128.40, 135.81, 156.12, 168.71, 169.40, 170.43, 171.75
C32H44N2O15Cs + (M+ Cs + ) 829.1796 としてHRMSで計算し、実測値829.1796を得た。
【００５９】
Cbz-Thr(α-Man)-Val-OMe （化合物７）
Cbz-Thr(α- テトラアセチル-Man)-Val-OMe(化合物16) (200mg,0.28mmol)のドライメタノール20mL溶液に、MeONa の1%ドライメタノール（約500mL)溶液を0 ℃で添加し、pH 10.0 とした。溶液を0 ℃で1.5 時間攪拌した。次にDowex H + を反応物に添加し、pH 4.0とした。濾過後、溶媒を真空中で除去し、化合物７を無色液体として(132mg, 収率87%)得た。
1H NMR (500MHz,D2O):δ0.85(dd,6H,J=4.0,7.0Hz), 1.21(d,3H,J=6.5Hz), 2.04-2.07(m,1H), 3.26-3.54(m,2H), 3.62(s,3H), 3.64-3.68(m,2H), 3.69-3.74(m,2H), 4.10(m,1H), 4.24-4.29(m,2H), 5.02(s,2H), 7.19(d,1H,NH,J=3.0Hz), 7.20-7.28(m,5H), 8.10(d,1H,NH,J=8.5Hz)
13C ｛1H｝NMR (D2O):δ18.52, 18.91, 19.36, 31.70, 48.66, 48.82, 49.00, 49.17, 49.33, 52.61, 59.19, 60.45, 62.80, 67.83, 68.50, 71.94, 72.26, 74.89, 77.13, 103.01, 128.82, 129.98, 129.41, 137.92, 158.50, 172.58, 173.26
C24H36N2O11Cs + (M+ Cs + ) 661.1373 としてHRMSで計算し、実測値661.1392を得た。
【００６０】
Thr(α-Man)-Val-OMe （化合物８）
Cbz-Thr(α-Man)-Val-OMe 化合物７(156mg) を、トリフルオロ酢酸(30mL)とPd/Cの存在下で10mLのメタノール中で水添分解し、化合物８(130mg, 収率87%)を得た。
1H NMR (500MHz,D2O):δ0.72(dd,6H,J=2.5,7.0Hz), 1.22(d,3H,J=6.5Hz), 2.00(m,1H), 3.40(t,1H,J=4.5Hz), 3.48-3.52(m,2H), 3.55(s,3H), 3.64(m,2H), 3.91(d,1H,J=4.0Hz), 4.68(d,1H,J=1.5Hz)
13C ｛1H｝NMR (D2O):δ17.42, 17.97, 18.27, 30.00, 52.95, 57.13, 58.86, 61.09, 66.83, 70.04, 70.43, 73.49, 75.25, 101.75, 167.96, 173.56
C16H30N2O9Cs + (M+ Cs + ) 527.1006としてHRMSで計算し、実測値527.1016を得た。
【００６１】
Cbz-Thr(α-Man)-Val-Gly-Ala-NH2 （化合物９）
化合物７(20mg,0.038mmol)、Gly-Ala-NH2(60mg,0.24mmol)、及び3.0mg のズブチリシン8397を、2.0mL のジメチルホルムアミド(DMF) と水の7:3 混合液（トリエチルアミンを用いてpH 8.5-9.0に調整）に添加し、室温で2.5 時間温置した。溶媒を除去した後、グリコペプチドである化合物９(12mg,43%)をHPLCで単離した。
1H NMR (500MHz,CD3OD):δ0.87(d,3H,J=3.0Hz), 1.18(d,3H,J=6.0Hz), 1.28(d,3H,J=7.0Hz), 1.97(m,1H), 3.21(q,1H,J=1.5Hz), 3.51(m,2H), 3.61-3.64(m,3H), 3.74(m,1H), 3.83(d,2H,J=3.5Hz), 4.02(d,1H,J=7.0Hz), 4.20(s,2H), 5.02(s,3H), 7.20-7.31(m,5H)
13C ｛1H｝NMR (D2O):δ16.81, 17.84, 17.90, 30.51, 35.91, 49.40, 54.20, 59.30, 59.84, 61.10, 67.00, 67.62, 70.41, 70.51, 73.30, 76.10, 101.40, 115.60, 127.80, 128.30, 128.60, 129.01, 130.7, 136.50, 154.60, 172.20, 172.41, 174.48, 174.84
C28H43N5O12Cs + (M+ Cs + ) 774.1963 としてHRMSで計算し、実測値774.1958を得た。
【００６２】
Boc-Tyr-Thr(α-Man)-Val-OMe （化合物10）
104mg のBoc-Tyr(Bzl)-OH 、167mg のH-Thr(α- テトラアセチル-Man)-Val-OMe （化合物14を水添分解して合成) 、50mLのトリメチルアミン、及び44mgの1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの、ドライ塩化メチレン２mL溶液に、63mgの1-(3-(ジメチルアミノ) プロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリドを0 ℃で添加した。反応物を0 ℃で12時間攪拌した。次に混合物を減圧乾燥により蒸発させた。ヘキサン／EtOAc(1/4,v/v)を用いたシリカゲルカラムで精製し、138mg(収率65%)のBoc-Tyr(Bzl)-Thr( α- テトラアセチル-Man)-Val-OMe を得た。この化合物を脱アシルし、化合物７及び８の調製で記載のように水添分解して、合計収率82% で化合物10を得た。
1H NMR (500MHz,CD3OD):δ0.85(dd,6H,J=1.5,7.0Hz,Val 2CH3), 1.15(d,3H,J=6.5Hz,Thr CH3), 1.28(s,9H,Boc), 2.05(m,1H,Val CH), 2.64(dd,1H,J=9.5,13.5Hz,Tyr CH2Ph), 3.20(m,1H), 3.51(m,2H), 3.59(dd,2H,J=5.0,9.0Hz), 3.63(s,3H,Val OCH3), 3.68(m,1H), 3.71(d,1H,J=2.5Hz), 3.73(d,1H,J=1.5Hz), 4.11(dd,1H,J=4.0,6.5Hz), 4.20(t,1H,J=4.5Hz), 4.23(d,1H,J=6.5Hz), 4.45(d,1H,J=4.0Hz,Man C1-H), 6.58(d,2H,J=8.5Hz,Tyr Ph), 6.95(d,2H,J=8.0Hz,Tyr Ph)
13C ｛1H｝NMR (CD3OD):δ18.56, 18.71, 19.41, 28.69, 31.79, 38.07, 52.65, 57.66, 58.13, 59.24, 62.92, 68.67, 72.01, 72.33, 75.01, 76.76, 103.02, 116.23, 129.23, 131.36, 157.28, 171.78, 173.36, 174.79
C30H47N3O13Cs + (M+ Cs + ) 790.2163 としてHRMSで計算し、実測値790.1253を得た。
【００６３】
Man α1,2ManαOMe （化合物３）
α- メチルD-マンノピラノシド(0.4g,20mM) 、Man-1-P(約1.5g, 約50mM) 、PEP(1.0g,42.7mM)、GDP(30mg,1mM) 、乾燥酵母細胞(0.4g)、ピルビン酸キナーゼPK(300U)、組み換えα1,2-ManT(1.2U)、無機ピロホスファターゼ(2U)を含む反応混合物(100mL、100mM のトリス、pH 7.5、10mMのMgCl2 、10mMのMnCl2 、5mM のEDTA、5mM のNaN3、1mM のATP 、0.01mMのテオフィリン、及び0.03mMの2,3-ジメルカプトプロパノール）を室温で72時間軽く攪拌し、遠心分離した。上澄みを凍結乾燥し、メタノールで抽出した。メタノールを除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3:CH3OH:H2O=6:3:0.5,v/v/v)で精製し、消費したα- メチルD-マンノピラノシドに基づいて合計収率38% でMan α1,2ManαOMe （化合物３）(96mg)を得た。
1H NMR (D2O): δ3.41(s,3H), 3.60-3.80(m,6H), 3.86(dd,1H,J=3.5,10Hz), 3.88(dd,1H,J=3.5,10Hz), 3.90(d,1H,d,J=1.5Hz), 3.92(d,1H,J=1Hz), 3.97(dd,1H,J=2,3.5Hz), 4.08(dd,1H,J=2,3.5Hz), 5.02(d,1H,d,J=2Hz), 5.04(d,1H,d,J=2.0Hz)
13C ｛1H｝NMR (D2O):δ54.90, 61.01, 61.24, 66.98, 67.03, 70.02, 70.29, 70.37, 72.63, 73.40, 78.62, 99.40, 102.43
C13H24O11Na + (M+ Na + ) 379.1216 としてHRMSで計算し、実測値379.1220を得た。
【００６４】
Cbz-Thr(αMan α1,2Man)-Val-OMe （化合物11）
合成の手順は前記の通りである。
1H NMR (500MHz,D2O):δ0.83(m,6H), 1.21(d,3H,J=4.5Hz), 2.04(m,1H), 3.55-3.62(m,15H), 4.05(m,1H), 4.16(m,1H), 4.24(m,1H), 5.00(s,2H), 7.16-7.27(m,5H)
13C ｛1H｝NMR (D2O):δ17.63, 17.68, 18.41, 30.10, 52.88, 58.68, 61.14, 61.21, 66.91, 67.19, 67.52, 70.03, 70.13, 70.47, 73.30, 76.47, 79.31, 99.84, 102.40, 127.87, 127.92, 128.60, 129.00, 172.82, 173.80
C30H46N2O16Cs + (M+ Cs + ) 823.1902 としてHRMSで計算し、実測値823.1928を得た。
【００６５】
以上の記述は説明のための例であり、本発明はこれに限定されるものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく変更をすることは可能であり、かつ当業者には容易に自明なものとなるであろう。
【００６６】
配  列  表
（１）一般情報
(i)   発明者：チー・ヒュイ・ウォン
(ii)  発明の名称： GDP−マンノースの再生を伴うマンノシル基の転移法
(iii) 配列の数：２
(iv)  連絡住所
(A) 連絡先：ドレスラー・ゴールドスミス・ショアー・アンド・ミル
ナモウ・リミテッド
(B) 通り：１８０ノース・ステッソン、スイート４７００
(C) 都市：シカゴ
(D) 州：イリノイ州
(E) 国：アメリカ合衆国
(F) ジップコード：６０６１１
(v)   コンピューター読取り可能形式
(A) 媒体の型：フロッピーディスク
(B) コンピューター：IBM PC  互換性
(C) オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS
(D) ソフトウェア：PatentIn Release #1.0 、Version #1.25
(vi)  最新出願データ
(A) 出願番号：
(B) 出願日：
(C) 分類：
(vii) 代理人／エージェント情報
(A) 名前：エドワード・ピー・ガムソン
(B) 登録番号：29,381
(viii)通信情報
(A) 電話：(312)616-5400
(B) テレファックス：(312)616-5460
【００６７】
（２）配列番号：１の情報
(i)   配列の特徴
(A) 長さ：２９塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：二本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)  配列の種類： DNA（ゲノム）
(iii) 配列番号：１の配列
ATATTTCTAG AAGAACTCAG CAATATATT
【００６８】
（２）配列番号：２の情報
(i)   配列の特徴
(A) 長さ：３４塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：二本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)  配列の種類： DNA（ゲノム）
(iii) 配列番号：２の配列
GCGCGTCGAC TTATTACTCA CGGAATTTTT TCCA