(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
0004111349.tif 000039
で表されるアミド：
式中  Ｒ１は、任意的に１あるいは２以上の−ＯＨで置換され得る、飽和あるいは二重結合を１つ有する不飽和の、炭素原子数９〜２３の直鎖あるいは分岐鎖の炭化水素基であり；
式：
0004111349.tif 000040
の残基は、式：
0004111349.tif 000041
のグリコサミン残基であり、
式中  Ｐ、ＹおよびＺの１つは、
0004111349.tif 000042
で、
残りの基はＷを含めて、−Ｈあるいは−ＯＨであり；
グリコサミン残基中の−Ｈおよび−ＯＨの少なくとも一つは、アシル、ビカルボン酸のエミアシル、ジアルキルアミノアシル、アルキルスルホネート、アルキル、Ｏ−ホスフェートおよびＯ−サルフェートからなる群より選ばれる製薬的に許容しうる少なくとも１つの基で置換される。
【請求項２】
一般式（Ｉ）：
0004111349.tif 000043
で表されるアミド：
式中  Ｒ１は、隣接カルボニルとともに、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸およびω−ヒドロキシ−パルミチン酸からなる群より選ばれるモノカルボン酸のアシル基を形成し；
式：
0004111349.tif 000044
の残基は、式：
0004111349.tif 000045
のグリコサミン残基であり、
式中  Ｐ、ＹおよびＺの１つは、
0004111349.tif 000046
で、
残りの基はＷを含めて、−Ｈあるいは−ＯＨであり；
グリコサミン残基中の−Ｈおよび−ＯＨの少なくとも一つは、アシル、ビカルボン酸のエミアシル、ジアルキルアミノアシル、アルキルスルホネート、アルキル、Ｏ−ホスフェートおよびＯ−サルフェートからなる群より選ばれる製薬的に許容しうる少なくとも１つの基で置換される。
【請求項３】
Ｒ１は炭素原子１１〜１７を有する基である請求項１記載のアミド。
【請求項４】
前記アシルがアセチルあるいはベンゾイルである請求項１または２記載のアミド。
【請求項５】
前記ビカルボン酸のエミアシルがコハク酸あるいはグルタール酸のエミアシルである請求項１または２記載のアミド。
【請求項６】
前記アルキルスルホネートがメタンスルホネートあるいはｐ−トルエンスルホネートである請求項１または２記載のアミド。
【請求項７】
前記アルキルがメチルあるいはエチルである請求項１または２記載のアミド。
【請求項８】
前記グリコサミンがD-グルコサミン、L-アコサミン、D-マンノサミン、およびD-ガラクトサミンからなる群より選ばれる、請求項１または２記載のアミド。
【請求項９】
ＣＢ２末梢レセプターの変調に関連した、およびＣＢ２レセプターにより制御せられる免疫応答性細胞の顆粒減少および／または溶解現象に関連した人間ならびに動物の病気の治療のための医薬組成物の調製における、有効成分としての請求項１または２に記載のアミドの使用。
【請求項１０】
前記人間の病気が免疫系統の変調に関連したものである請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記人間の病気が多発性硬化症、菌萎縮性側索硬化症、および合併筋肉痙攣からなる群より選ばれる病因的自己免疫要素を有する病気である請求項９記載の使用。
【請求項１２】
前記人間の病気が関節の急性ならびに慢性炎症性疾患である請求項９記載の使用。
【請求項１３】
前記慢性炎症性疾患がリューマチ性関節炎である請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記人間の病気がウイルス性（ＨＩＶ）および細菌性脳髄膜炎、細菌性髄膜炎、サイトメガロウイルスによる髄膜炎ならびにＡＩＤＳ−痴呆複合症からなる群より選ばれる生物学的薬剤に起因する病気である請求項９記載の使用。
【請求項１５】
前記人間の病気が老人性痴呆、アルツハイマーおよびパーキンソン病および合併悪液質性症候からなる群より選ばれる慢性神経変性病である請求項９記載の使用。
【請求項１６】
前記人間の病気が痛覚変性を伴う病気である請求項９記載の使用。
【請求項１７】
前記人間の病気が大脳発作、ＴＩＡ，大脳ならびに脊髄外傷、てんかん、偏頭痛および舞踏病からなる群より選ばれるＥＡＡ興奮毒性を伴う病気である請求項９記載の使用。
【請求項１８】
前記人間の病気が脈管リモデリングに伴う心臓血管病状、アテローム性動脈硬化、あるいは心臓麻痺である請求項９記載の使用。
【請求項１９】
前記人間の病気が心臓血管、肺または眼のレベルの圧力変調をもたらす病気である請求項９記載の使用。
【請求項２０】
前記人間の病気が緑内障である請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
前記人間の病気が慢性気道閉塞である請求項９記載の使用。
【請求項２２】
前記人間の病気が喘息である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記人間の病気が嘔気である請求項９記載の使用。
【請求項２４】
有効成分として、治療有効量の請求項１または２に記載のアミドを、製薬的に許容しうる賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項２５】
前記有効成分が０．１〜２０ｍｇ／Ｋｇ／ｄｉｅ量で投与せられる請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
経口、非経口、局所的あるいは経皮的ルートで投与せられる請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記非経口ルートが静脈内、皮下、あるいは筋肉内ルートであり、前記組成物が注射可能な溶液あるいは懸濁液である請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記局所的ルートが眼科ルートであり、前記組成物が注入、ゲルあるいは軟膏の形態の目薬、固体、あるいは半固体の調合物である請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２９】
顆粒、粉剤、錠剤、糖衣剤あるいはカプセルの形態で経口的に投与せられる請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項３０】
クリーム、軟膏、ゲルあるいは硬膏の形態で皮膚または経皮的に投与され、前記有効成分が任意的に徐放性微粒子として含まれる請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項３１】
カンナビノイド末梢レセプターＣＢ２の変調に関連したあるいはＣＢ２レセプターで制御せられる免疫応答性細胞の顆粒減少および／または溶解現象に関連した人間ならびに動物の病気の治療に有用である請求項２４記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はカンナビノイドに対する末梢レセプターの変調に係る疾病の治療に有効な、モノならびにビカルボン酸のアミノアルコールとの新規アミドに関する。
従来技術
カンナビノイドは印度大麻（カンナビス  サテイバ）中に存在する、６０以上もの各種分子のものからなる特定一群の精神に影響を及ぼす化合物で、その最も代表的なものはカンナビノール、カンナビジオールおよびテトラヒドロ  カンナビノールの各種異性体である。カンナビスの治療的作用が知られていたのは中国で古代王朝までさかのぼり、既に５０００年も前にカンナビスは喘息、偏頭痛およびある種の婦人科疾患の治療に用いられていた。こういった利用は長年にわたり確立され、１８５０年頃にはカンナビス抽出液は米国局方に収められ、１９４７年まで同局方に収載されていた。
カンナビノイドは各種の系および／または器管に種々の効果を及ぼすことができ、その最も重要な作用効果は中枢神経系ならびに心臓脈管系で認められる。事実、それらは気分、記憶、運動機能調整ならびに認識に影響を及ぼすことができ、心博を増大しまた全身の動脈圧を変えることができる。またカンナビノイドが眼内圧を低下させ呼吸ならびに内分泌系に影響を及ぼすことも衆知である（エル  イー  ホリスター報告、ヘルス  アスペクト  オブ  カンナビス、ファルマコロジカル  レビュー  ３８巻、１〜２０頁、１９８６年  参照）。より近年にそれらが細胞ならびに体液の免疫反応を抑制し、抗炎症性を有することが見出された。（ライフサイエンス  ２６巻、１９９１〜１９９５頁、１９８０年、エー  ダブリュ  ウイルス等、カンナビクロメンの抗炎症性作用  参照）。
しかしながら、その関連した精神に影響を及ぼす効果で依存癖ならびに常用牲となる点および未だ充分には解明されていない種々の副作用（エル  イー  ホリスター  １９８６年  前述）のためカンナビスの治療的利用には論争のあるところである。
何世紀にもわたりカンナビスが広く使用されてきたにもかかわらず、カンナビノイドの作用メカニズムはごく最近まで判っていなかった。１９９０年になって始めて、松田ならびに共同研究者がカンナビノイドのレセプターを確認しクローンして、このものがＧ−プロテイン結合レセプターの上科の一員であることを発見し、またＣＢ１がＧ１に結合されアデニレート  シクラーゼ作用を抑制し、また分娩感受性Ｇ−プロテインに結合されＣａ2+の流れを制御することを見出した。該レセプターは主として脳内および神経細胞ライン中に、また僅かながら末梢レベルに位置することが見出され、従って、その位置の観点から中枢レセプター（ＣＢ１）と呼ばれている（松田等、ネーチャー  ３４６巻、５６１〜５６４頁、１９９０年、ストラクチャーオブ  カンナビノイド  レセプター  アンド  ファンクショナル  エクスプレッシオン  オブ  ザ  クローンド  ＣＤＮＡ）。レセプターの発見で特定の内生リガンドの存在が推定された。
事実、その後の研究で豚の脳から拮抗作用を示しうる、即ち競争的にカンナビノイド中枢レセプターに結合しうる物質が単離された。この物質は構造決定され、合成品との比較がなされアラキドン酸のアミド誘導体、より詳しくは、アラキドニル  エタノールアミドであることが見出され、後日このものはアナンドアミドと称せられるに至った。この分子の薬学的特徴は、幾分効力はおとるが、△９−ＴＨＣ（９位に二重結合をもつテトラヒドロ  カンナビノール）に類似の作用プロファイルをもち、その神経に影響を及ぼす作用によく似ていることが実証された。この立証によりアナンドアミドはカンナビノイドに対する中枢レセプターの内生リガンドであるとの結論に導かれた（シー  シー  フェルダー等、ＰＮＡＳ  ９０巻、７６５６〜７６６０頁、１９９３年；ピー  ビー  スミス等、Ｊ．ＰＥＴ  ２７０巻、２１９〜２２７頁  １９９４年）。
次の研究は、レセプターＣＢ１に結合する種々の物質の単離に向けられ、これら物質は一群のアミド化合物に分類され、エル  ハヌス等によりアナンドアミドと命名された（ジャーナル  オブ  ミディカル  ケミストリー  ３６巻、３０３２〜３０３４頁、１９９３年；カンナビノイド  レセプターに結合する脳内の２つの新規なる不飽和脂肪酸エタノールアミド）。アラキドン酸のエタノールアミド、但し、パルミチン酸のように脳内に内生的に存在する別の生化学的に重要な酸のエタノールアミドではないものがＣＢ１中枢レセプターを機能的に賦活しうることの発見は、ＣＢ１レセプターに親和力のある高度に不飽和な脂肪酸とエタノールアミンの他のアミドを確認することへと続いた。
その特殊分布が別のレセプター  サイトの存在を推定せしめることとなった。事実カンナビノイドに対する第２の別のレセプター、末梢レセプター（ＣＸ５あるいはＣＢ２）と称せられるものがクローンされた。
前記レセプターは脾臓およびマクロファージ／大単核細胞中には存在するが中枢レベルには存在しないので、このレセプターはカンナビノイドの神経に影響を及ぼすことのない効果を取りつぐことに役立つものとみなされた。（エス  ムンロ等、ネーチャー  ３６５巻、６１〜６５頁、１９９３年；カンナビノイドに対する末梢レセプターの分子特性化）。この点に関し、△９−ＴＨＣの免疫抑制効果を誘発する能力が証明された。最近の研究結果で△９−ＴＨＣがマクロファージの機能に影響を及ぼしうることが示された。△９−ＴＨＣにさらすとＴＮＦ−αの合成、放出、細胞毒性として測定される賦活マクロファージの細胞活性が低下する。またマクロファージはＴＮＦ−α以外にいくつかの細胞溶解分子を放出するので、△９−ＴＨＣに対するターゲットを表しうるとみなされている（ケー  フィッシャー  ステンガー等、Ｊ．ＰＥＴ  ２６７巻、１５５８〜１５６５頁、１９９３年、腫瘍壊死ファクターαの△９−テトラヒドロ  カンナビノール抑制）。全ての上記証拠並びに免疫系でのＣＢ２レセプターの差別的広範囲わたる局在は、前記レセプターが細菌ならびにビールス刺激を含んだ種々の性質の刺激に対する、免疫ならびに消炎作用を媒介するのに特殊な役割をはたすことを立証するものである。
アナンドアミド、ＣＢ１中枢レセプターの内因リーガントは中枢レセプターに対するよりも約３０倍低い親和力でもってＣＢ２レセプターに結合可能で、このことは前記レセプターに対する別の内因リガンドの存在を示唆する（エル  エルアイバーセン；ネーチャー  ３６５巻、１２〜１３頁、１９９３年）。
既に述べた如くカンナビノイドの鎮痛、制吐、鎮痙、ならびに抗緑内障剤としての利用、及び近年見出された抗炎症剤としての利用は、カンナビノイドにより不都合な副作用ならびに精神に影響を及ぼす効果、さらには常用癖ならびに薬物依存性が誘因されるため不適当である。（ダブリュ  エル  デューイ；カンナビノイド  ファルマコロジー  ３８巻（２）、１５１〜１７８頁、１９８６年）。
双方のカンナビノイド  レセプターに無差別にアゴニストとして作用しうるある種の化合物が最近開発された。例えば緑内障治療にジヒドロピロール−（１，２，３−ｄ，ｅ）−１，４−ベンゾオキサジン誘導体を使用すること（ＵＳＰ  ５１１２８２０；ダーヴエント  アブストラクト）および各種神経病、偏頭痛、てんかん、緑内障等の治療に免疫調整剤あるいはサイコトロピック剤として１，５−ジフェニル−ピラゾール誘導体を使用すること（欧州特許５７６３５７）が知られている。しかしながら、これら化合物はＣＢ１中枢およびＣＢ２末梢レセプター双方に働き、著しい精神影響作用、常用癖、習慣性をもたらす。
カンナビノイドがレセプターメカニズムにより、特に種々の作用効果を媒介するレセプターに作用すること、および２つの中枢ならびに末梢レセプターは同族性が少ないことの発見に鑑み、レセプター  サブタイプに選択的に作用し、天然ならびに合成カンナビノイドの場合の如く双方のレセプターに無差別的でなく作用する一群の薬剤の開発が重要であることは明白である。
カンナビノイド  レセプターにより媒介せられる薬理効果に関し今日まで実施せられた研究ではカンナビス誘導体の非精神影響作用効果は、ＣＢ２末梢レセプターにより媒介せられることを示している。また、ＣＢ２  レセプター位置測定では前記の非精神影響作用効果、即ち免疫系に及ぼす効果、抗炎症性、筋弛緩ならびに抗痛覚変性効果、および血圧上昇系への効果はかかるレセプターにより媒介せられることが立証されている。
上記の証拠は明らかに、カンナビノイド末梢レセプターに選択的に作用しうる化合物で、従って前記レセプターの変調に関係した疾病に有効であり、中枢レベルでの精神に影響を及ぼす作用がなく、そういった作用に関する副作用例えば習慣性、常用癖のないものを得ることが、治療の観点から非常に重要であることが判る。
発明の要約
本発明者らはモノおよびビカルボン酸のアミノアルコールとの新規アミド誘導体がカンナビノイド末梢レセプターＣＢ２に選択的に結合しそれを機能的に賦活しうることを見いだした。
本発明に係る新規アミド誘導体は一般式（１）
0004111349.tif 000002
で表され、式中R1は
１）炭素原子９〜２３、好ましくは１１〜１７の直鎖あるいは分岐鎖の、飽和あるいは二重結合１つを有する炭化水素残基、但し任意的に１あるいはそれ以上の-OH基で置換されうるもの；
２）式（II）
0004111349.tif 000003
で表される基、
式中R4は飽和あるいは二重結合１つを有する炭素原子８〜２２、好ましくは１０〜１６で、任意的に直鎖あるいは分岐鎖のC1〜C8のアルキル基および／または１あるいはそれ以上の-OH基を置換基として有しうる、直鎖の炭化水素基；
３）式（IV）で表される基
0004111349.tif 000004
式中R4は前述の通り、R7は-Hあるいは炭素数１〜２０の直鎖または分岐鎖のアルキル基
を表す。
一般式（Ｉ）で、式（III）の残基
0004111349.tif 000005
はアミノ酸（Ａ）あるいはグリコサミン（Ｂ）のアミン残基を表し；特に
Ａ）式（III）の残基は光学活性あるいは非活性アミノ酸の残基で、式中R2はそれが結合している窒素原子とでα−アミノ酸、任意的に-OH，-OPO3H2，-O-PO2H-O-CH2-CH(OH)-CH2-OH，-SHあるいはS-CH3で置換されうる脂肪族あるいはアリール脂肪族側鎖をなすものを形成するか；あるいはそれが結合している窒素原子とで脂肪族あるいはアリール脂肪族側鎖をなすβ−あるいはγ−アミノ酸を形成し；かかるアミノ酸の酸基は任意的にメチル化あるいはエチル化されうるものあとし；
R3は-Hあるいは-CH3である。か
Ｂ）式（III）の残基は  式
0004111349.tif 000006
で表されるグリコサミンの残基であり、式中Ｐ，ＹおよびＺの１つは-NH-あるいは-N(CH3)-で、他のものは、Ｗをも含めて-Hあるいは-OHである。
式（II）に於いて、式（Ｖ）の残基は
0004111349.tif 000007
前述の（III）と同じで、R5およびR6はR2およびR3と同じか、あるいは異なる。
（Ａ），（Ｂ）いずれにも属する式（III）及び（Ｖ）の残基はR2，R3，R5および/またはR6に、本発明化合物の水、アルコールおよび適当な有機溶媒に対する溶解性を大ならしめうる少なくとも１つの薬学的に許容し得る基を任意的に置換基として保有することができる。この薬学的に許容しうる基は好ましくはアシル（即ちアセチル、ベンゾイル）、ジカルボン酸（即ちコハク酸、グルタール酸）のエミアシル、アミノアシル、ジアルキルアミノアシル、アルキルスルホネート（即ちメタンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート）、アルキル（即ちメチル、エチル）、Ｏ−ホスフェートおよびＯ−サルフェートからなる群より選ばれる。
従って本発明の別の目的は上記誘導体をカンナビノイド末梢レセプターの変調に関連する哺乳動物の病気処置用の医薬組成物調製に有効成分として利用するにある。
本発明の他の目的は上述の新規化合物の製法ならびにかかるアミド誘導体、あるいはより溶解性の良好な形態および／または徐放性の形態のものの、治療有効量を含み、カンナビノイド末梢レセプターの変調に起因する病状の治療に使用せられる医薬組成物を提供するにある。
図面の説明
図１はＡ）ラッテ脾臓、Ｂ）ラッテ腹膜マストセル  カルチャー、Ｃ）ＲＢＬ−２Ｈ３セル  カルチャーでのポリメラーゼ  チェーン  反応（ＰＣＲ）により増幅されたカンナビノイド末梢レセプターの特殊なハイブリダイゼーションを示す。
図２は小脳の顆粒（図２Ａ）および小脳（図２Ｂ）でのin situハイブリダイゼーションにより検知された特異  mRNA-CB2カンナビノイド末梢セレプターを示す。
発明の詳細な説明
本発明に係るモノおよびビカルボン酸のアミノアルコールとの新規一群のアミド類でカンナビノイド末梢レセプターに選択的に作用するものの利点ならびに特徴、それらの製法、それらの医薬用途ならびにそれらを含む医薬組成物を以下詳細に述べる。
本発明に係るモノならびにカルボン酸のアミノアルコールとのアミドは下記一般式（Ｉ）で表される。
0004111349.tif 000008
式中R1がクラス（１）に属する場合、R1は隣接するカルボニルとで、モノカルボン酸好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸およびそれらのヒドロキシ置換同族体例えばω−ヒドロキシパルミチン酸、のアシル基を形成する。
R1がクラス（２）および（３）に属する場合、R4は２つの隣接カルボニルとでビカルボン酸好ましくはトラウマチン酸のアシル基を形成する。
一般式（Ｉ）のアミン部分に関して、式（III）の残基がクラス（Ａ）に属する場合、かかるアミノ酸は好ましくはグリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、セリンおよびシステインである。
一段式（Ｉ）の化合物の内、R1がクラス（１）に属し、R2がそれの結合している窒素原子とでアラニン、β−アラニン、グリシンのアミノアシル残基をなし、R3＝CH3のものは公知である（国際特許出願ＷＯ  ９３／２１９１３）．
さらにまた、（Ｉ）の化合物の内、R1が前述の通りで、式（III）および（Ｖ）の残基がクラス（Ａ）に属する多数のものが公知である（欧州特許５５２４０５；ケミカル  アブストラクト１１８，n194576 r，1993）．
これに反し、我々の知る限り、式（Ｉ）のアミドでR1が上述の通りであり、式（III）および（Ｖ）の残基がクラス（Ｂ）に示されているグリコサミン残基であるものは新規である。
しかしながら残基（III）がクラス（Ｂ）に属する２−デオキシ−２−［（３−ヒドロキシ−１−オキソテトラデシル）−アミノ］−α−Ｄ−グルコピラノースは公知である（ケミカル  アブストラクト１０４，n103706 e，1986）．
式（III）の残基がクラス（Ｂ）に属する場合、かかるグリコサミンは好ましくはＤ−グルコサミン、Ｌ−アコサミン、Ｄ−マンノサミン、Ｄ−ガラクトサミンである。
本発明に係る一般式（Ｉ）の新規アミドの製造法はR1-COOHの活性形のR1-CO-Xを式
0004111349.tif 000009
で表されるアミンと、水性塩基性媒体中あるいは塩基の存在下での有機溶媒中で、−２０℃〜６０℃、好ましくは−１０℃〜２０℃の温度で、１０分〜２４時間、好ましくは１〜３時間反応させるものである。
反応媒体を任意的に酸性化した後、所望生成物が情報により単離、精製せられる。上記の酸の活性形はアシルハライド、スクシンイミドエステル、アシルイソウレア、p−NO2-フェニルエステルあるいはメチルエステルであることができ、前記の塩基は好ましくはK2CO3，KOH，Et3NあるいはN-メチル−モルホリンである。
以下に本発明にかかるモノならびにビカルボン酸アミドの製造実施例を挙げる。
実施例１
Ｎ−パルミトイル−Ｌ−セリンの製造：
１．５８ｇのＬ−セリン（１５mmol）を１Ｍ K2CO3の６０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．７５ｇのパルミトイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化した。沈殿せる粗生成物をろ過して分離し、真空乾燥し、ｔ−ブチルメチルエーテル３０mlから結晶化させ、次に冷メタノール３０mlから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、メタノール５mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約８９％であった。
Ｎ−パルミトイル−Ｌ−セリンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000010
実施例２
Ｎ−ラウロイル−Ｌ−セリンの製造：
２４６−９一
１．５８ｇのＬ−セリン（１５mmol）を１Ｎ KOHの４０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．１９ｇのラウロイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化し、２０mlのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させた。粗生成物を３０mlの冷アセトニトリルから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、アセトニトリル５mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約８５％であった。
Ｎ−ラウロイル−Ｌ−セリンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000011
実施例３
Ｎ−オレオイル−Ｌ−セリンの製造：
１．５８ｇのＬ−セリン（１５mmol）を１Ｍ K2CO3の６０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して３．０１ｇのオレオイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化した。沈殿粗生成物をろ過して分離し、真空乾燥させ、シリカゲル  カラム  クロマトグラフィーで溶離液としてクロロホルム／メタノール／水／酢酸  90:10:0.5:0.1を用い精製した。精製物を含む溶離液フラクションを集め、減圧で蒸発させ、真空乾燥させた。。
反応収率は約８８％であった。
Ｎ−オレオイル−Ｌ−セリンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000012
実施例４
Ｎ−パルミトレイル−Ｌ−セリンの製造：
１．５８ｇのＬ−セリン（１５mmol）を１Ｍ K2CO3の６０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．７３ｇのパルミトレイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化し、２０mlのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を１５mlずつの水で２回洗い、有機相を減圧で蒸発させた。粗生成物をシリカゲル  カラム  クロマトグラフィーで溶離液としてクロロホルム／メタノール／水／酢酸  90:10:0.5:0.1を用い精製した。精製物を含む溶離液フラクションを集め、減圧で蒸発させ、真空乾燥させた。。
反応収率は約８７％であった。
Ｎ−パルミトレイル−Ｌ−セリンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000013
実施例５
Ｎ−ラウロイル−Ｌ−セリン  メチルエステルの製造：
２．３３ｇのＬ−セリンメチルエステル  塩酸塩（１５mmol）を４．０５ｇのトリエチルアミン（４０mmol）を加えたテトラヒドロフラン／水９：１の混液４０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．１９ｇのラウロイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で２時間、次いで室温で１夜攪拌し、真空蒸発乾固させた。この粗生成物を１Ｎ塩酸５０mlに懸濁させ、２０mlずつのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を集め、１５mlずつの水で２回洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させた。粗生成物を３０mlの冷ヘキサンから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、ヘキサン５mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約８７％であった。
Ｎ−ラウロイル−Ｌ−セリンメチルエステルの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000014
実施例６
Ｎ−パルミトイル−Ｌ−システインの製造：
１．８２ｇのＬ−システイン（１５mmol）を１Ｍ K2CO3の６０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．７５ｇのパルミトイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化した。沈殿せる粗生成物をろ過して分離し、真空乾燥し、ｔ−ブチルメチルエーテル３０mlから結晶化させ、次に冷メタノール３０mlから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、メタノール５mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約９２％であった。
Ｎ-パルミトイル−Ｌ−システインの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000015
実施例７
Ｎ−パルミトイル−グリシンの製造：
１．１３ｇのグリシン（１５mmol）を１Ｎ KOHの４０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．７５ｇのパルミトイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸牲化した。粗沈殿物をろ過して分離し、真空乾燥し、９５°冷エタノール６０mlから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、９５°エタノール５mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約７９％であった。
Ｎ−パルミトイル−グリシンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000016
実施例８
Ｎ−ラウロイル−グリシンの製造：
１．１３ｇのグリシン（１５mmol）を１Ｎ KOHの４０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．１９ｇのラウロイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化し、２０mlずつのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させた。。粗沈殿物を３０mlの冷アセトニトリルから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、アセトニトリル５mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約８３％であった。
Ｎ−ラウロイル−グリシンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000017
実施例９
Ｎ−ラウロイル−グリシン  メチルエステルの製造：
１．８８ｇのグリシン  メチルエステル  塩酸塩（１５mmol）を４．０５ｇのトリエチルアミン（４０mmol）を加えたテトラヒドロフラン／水９：１の混液４０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．１９ｇのラウロイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で２時間、次いで室温で１夜攪拌し、真空蒸発乾固させた。この粗生成物を１Ｎ塩酸５０mlに懸濁させ、２０mlずつのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を集め、１５mlずつの水で２回洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させた。粗生成物を３０mlの冷ヘキサンから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、ヘキサン５mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約８９％であった。
Ｎ−ラウロイル−グリシン  メチルエステルの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000018
実施例１０
Ｎ−パルミトイル−β−アラニンの製造：
１．３４ｇのβ−アラニン（１５mmol）を１Ｎ KOHの４０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．７５ｇのパルミトイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化し、２０mlずつのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を１５mlずつの水で２回洗い、有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させた。。粗生成物を３０mlのｔ−ブチル−メチル−エーテルから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、ｔ−ブチル−メチル−エーテル１０mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約９３％であった。
Ｎ−パルミトイル−β−アラニンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000019
実施例１１
Ｎ−パルミトイル−γ−アミノ酪酸の製造：
１．５５ｇのγ−アミノ酪酸（１５mmol）を１Ｎ KOHの４０mlに４℃で溶解した。この溶液に攪拌下、３０分を要して２．７５ｇのパルミトイルクロライド（１０mmol）を徐々に滴下した。得られた混合物を０℃で１夜攪拌し、その後６Ｎ塩酸で酸性化し、２０mlずつのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を１５mlずつの水で２回洗い、有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させた。。粗生成物を３０mlのｔ−ブチル−メチル−エーテルから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、ｔ−ブチル−メチル−エーテル１０mlで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約９０％であった。
Ｎ−パルミトイル−γ−アミノ酪酸の物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000020
実施例１２
Ｎ，Ｎ’−ビス−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル）−ノナンジアミドの製造：
４．６６ｇのＬ−セリン  メチルエステル塩酸塩（３０mmol）を８．１ｇのトリエチルアミン（８０mmol）と共に８０イソプロパノールに４℃で溶解した。この溶液にアゼラオイルクロライド（２．２５ｇ；１０mmol）を攪拌下、３０分を要して滴下した。得られた混合物を０℃で２時間、次いで室温で１夜攪拌し、真空下に蒸発乾固した。粗生成物を水３０mlに懸濁し、２０mlずつのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を１５mlずつの水で２回洗い、有機相を合わせ、真空蒸発させた。粗生成物を水５０mlに連続攪拌して懸濁し、１Ｍ NaOH２０mlを加えエステル基を加水分解した。３０分後、この溶液を４℃に冷却し、６Ｎ塩酸で酸性化した。沈殿粗生成物をろ過して分離し、アセトニトリル／水９：１冷却混液３０mlから結晶化させた。結晶をろ過して分離し、アセトニトリル（５ｍｌ）で２回洗浄し、真空乾燥させた。反応収率は約７５％であった。
Ｎ，Ｎ’−ビス−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル）−ノナンジアミドの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000021
実施例１３
Ｎ，Ｎ’−トランス−２−ドデセンジオイル−ジグリシンの製造：
２．２８ｇのトラウマチン酸（１０mmol）を２mlのピリジンと共に０℃で無水ジメチルフォルムアミド４０mlに溶解した。２．５３ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２２mmol）と４．１２ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（２０mmol）を加え、得られた混合物を０℃で２時間攪拌した。生成ウレアをろ過して除去しスクシンイミドエステルを含む溶液を再び０℃で攪拌し、２．２５ｇのグリシン（３０mmol）と３．０４ｇのトリエチルアミン（３０mmol）を加えた。
得られた混合物を室温で１夜攪拌し、真空下に蒸発乾固せしめた。残渣を水５０mlに溶解させ、溶液を６Ｎ塩酸で酸性化した。沈殿粗生成物をろ過して分離し、真空乾燥し、メタノール６０mlから結晶化させた。結晶をろ過して分離し、メタノール（５ml）で２回洗浄し、真空乾燥させた。反応収率は８０％であった。
Ｎ，Ｎ’−トランス−２−ドデセンジオイル−ジグリシンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000022
実施例１４
Ｎ−パルミトイル−Ｄ−グルコサミンの製造：
３．２３ｇのＤ−グルコサミン塩酸塩（１５mmol）を１Ｍ K2CO3の６０mlに４℃で溶解した。この溶液に２．７５ｇのパルミトイルクロライド（１０mmol）を攪拌下、３０分を要して滴下によりゆっくり加えた。得られた混合液を０℃で攪拌下、１夜保持し、６Ｎ塩酸で中性になるまで酸性化した。沈殿粗生成物をろ過して分離し、真空乾燥し、次いで加温エタノールで繰り返し洗い、ろ過し、真空乾燥した。。反応収率は約７８％であった。
Ｎ−パルミトイル−Ｄ−グルコサミンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000023
実施例１５
Ｎ−ラウロイル−Ｄ−グルコサミンの製造：
３．２３ｇのＤ−グルコサミン塩酸塩（１５mmol）を１Ｍ K2CO3の６０mlに４℃で溶解した。この溶液に２．１９ｇのラウロイルクロライド（１０mmol）を攪拌下、３０分を要して滴下によりゆっくり加えた。得られた混合液を０℃で攪拌下、１夜保持し、６Ｎ塩酸で中性になるまで酸性化した。沈殿粗生成物をろ過して分離し、真空乾燥し、次いで加温イソプロパノールで繰り返し洗い、ろ過し、真空乾燥した。。反応収率は約８５％であった。
Ｎ−ラウロイル−Ｄ−グルコサミンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000024
実施例１６
Ｎ−オレオイル−Ｄ−グルコサミンの製造：
３．２３ｇのＤ−グルコサミン塩酸塩（１５mmol）を１Ｍ K2CO3の６０mlに４℃で溶解した。この溶液に３．０１ｇのオレオイルクロライド（１０mmol）を攪拌下、３０分を要して滴下によりゆっくり加えた。得られた混合液を０℃で攪拌下、１夜保持し、６Ｎ塩酸で酸性化し、エチルアセテートで連続し抽出した。抽出液を蒸発乾固し、粗生成物を溶離液としてクロロホルム／メタノール／水／NH3(25%)85:15:1:0.5の混液を用い、シリカゲル  クロマトグラフィーで精製し、純粋生成物を含むフラクションを集め、蒸発乾固し、残渣を真空乾燥した。
反応収率は約８６％であった。
Ｎ−オレオイル−Ｄ−グルコサミンの物理化学的性質は下記の通りであった。
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実施例１７
Ｎ−ラウロイル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造：
１．９７ｇの４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（１５mmol）を３．１８ｇのNa2CO3（３０mmol）を含む水５０mlに４℃で溶解した。この溶液に２．１９ｇのラウロイルクロライド（１０mmol）を石油エーテル５０mlに溶かした液を攪拌下、３０分を要して滴下によりゆっくり加えた。得られた混合液を０℃で４時間攪拌し次いで室温で１夜攪拌した。得られ混合物を６Ｎ塩酸で酸性化し、５mlずつのエチルアセテートで３回抽出した。有機相を水１５mlで２回洗い、有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空蒸発させた。粗生成物を５０mlのシクロエサンから結晶化させた。結晶生成物をろ過して分離し、１０mlづつのシクロエサンで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約８５％であった。
Ｎ−ラウロイル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000026
実施例１８
Ｎ−パルミトイル−Ｄ−グルコサミン  テトラ−Ｏ−エミスクシネートの製造
４．１８ｇのＮ−パルミトイル−Ｄ−グルコサミン（１０mmol）を無水ピリジン４０mlに４℃で溶解した。この溶液に４．４ｇのスクシン酸無水物（４０mmol）を加え０℃で２時間攪拌し次いで４０℃で１夜攪拌した。この溶液を真空で乾燥させ、残渣を１Ｎ  ＨＣｌ  ２０mlにとり、５０mlづつのエチルアセテートで３回抽出し、有機相を１５mlづつの水で２回洗い、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で約５０mlに濃縮した。得られた溶液に石油エーテルを加え泥状にし、４℃に冷却した。得られた結晶生成物をろ過して分離し、１０mlづつの石油エーテルで２回洗い、真空乾燥させた。
反応収率は約９３％であった。
Ｎ−パルミトイル−Ｄ−グルコサミン  テトラ−Ｏ−エミスクシネートの物理化学的性質は下記の通りであった。
0004111349.tif 000027
既に述べた如く、本発明に係る一般式（Ｉ）で表されるモノならびにビカルボン酸のアミノアルコールおよびアミノエーテルとのアミド類はＣＢ２末梢レセプターに選択的に結合し、競争的アゴニストとして作用し、前記レセプターから公知の天然ならびに既に既知の合成カンナビノイドを移動させる。また、前記アミドはＣＢ２レセプターを機能的に賦活し、カンナビノイドの精神に影響を及ぼす作用のない生物学的効果を擬態しまたカンナビノイドの一種より高度のあるいはそれと匹敵しうるポテンシイで作用する。
出願人はまた驚くべきことにマストセルにＣＢ２カンナビノイド末梢レセプターが存在することを見いだした。従って本発明に係る新規化合物は同じマスト  セルに機能的作用を及ぼす。さらにまた、出願人は予期せぬことにＣＢ２カンナビノイド末梢レセプターがまた非免疫細胞あるいは組織に機能的に表れ、特に神経系で小脳の顆粒に機能的に表れ、ＣＢ２レセプターがまた非免疫細胞機能を調節しうることも見いだした。この極めて重要な点を以下に詳細に説明する。
Ａ）マストセルならびに非免疫細胞でのＣＢ２レセプターの確認：
ＣＢ２カンナビノイド末梢レセプターがマストセルならびに非免疫細胞（即ちニューロン）に存在することを証明するため、該レセプターにたいするメッセンジャーＲＮＡの存在を、ラット腹膜マストセルの初代培養液中、ラット充実性腫瘍（ラット  バソフィリック  リューケミア  ＲＢＬ）からの塩基好性肥満細胞ライン中，ならびにマウス小脳顆粒培養液中で、比較として前記レセプターの存在が確認されているラット脾臓ホモゲネート組織を用い、試験研究した。ポリメラーゼ  チェーン  反応およびin situハイブリダイゼーション法がもちいられた。
▲１▼  ポリメラーゼ  チェーン  反応（ＰＣＲ）により増幅されるカンナビノイド末梢レセプター  特殊ハイブリダイゼーション
組織ならびに細胞からの全mRNAの抽出
チュムチンキーおよびサッキィの方法（アナリチカル  バイオケミストリー162巻156−159，1987）に従い、ラット腹膜マストセル、ＲＢＬ−２Ｈ３セル、およびラット脾臓から全ＲＮＡを抽出した。
５Ｘ１０6マストセル、セルＲＢＬ−２Ｈ３、あるいは５０mgの脾臓をそれぞれグアナジニウム  イソティオシアネート  ５Ｍ（６００  μl）と共に１．５mlポリプロピレン管エッペンドルフ（安全ロック型、登録商標名）中でホモゲナイズした。各管に２Ｍ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５（６０μl）と、バッファートリス−HCl 1M，pH7.0に飽和したフェノール（６００μl）を加えた。これらサンプルを渦混合器（ヘイドルプン、タイプ  REAX 2000（登録商標名））で短時間攪拌し、次いでクロロフォルム−イソアミルアルコール（４９：１  ｖ／ｖ）（１２０μl）を加えた。渦混合器で１５秒かきまぜ氷中で１５分インキュベーションした後、サンプルを４℃で１５，０００xgで１５分  遠心分離し、６００μlの上部水性液を下部の有機相の界面と全く接触しないよう注意しながら取り出し、別の管に移した。尚有機相は捨てた。水性相にイソプロパノール（６００μl）を加え、振りまぜてから、該サンプルを−２０℃で少なくとも６０分インキュベートし、４℃で１５，０００xgで５分間遠心分離した。上澄液は捨てた。このペレットを８０％エタノールで、次に無水エタノールで洗い、濃縮乾固し、再び水（２０μl）に懸濁させた。このサンプル２μlを２６０nmの波長でＲＮＡ  濃度の分光光度計測定に、また１％でアガローズ  ゲル上でのエチジウム  ブロマイドによる視覚化試験に使用した。
ＣＢ２レセプターのポリメラーゼ  チェーン反応（ＰＣＲ）による逆転写ならびに増幅
上記サンプル各々から全ＲＮＡ１μgを取り出し、ミュアライン  モロニー白血病ウイールスの逆転写酵素と５０pmolの合成オリゴヌクレオチド  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１シーケンス  ５’−ＴＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧ−３’（カンナビノイド末梢レセプターについてのmRNAコード（ムンロ等ネーチャー365 61-65，1993）に対し補助的ならびに逆対応）を全容量２０μlで用いる、レオン等のＰＮＡＳ，91  3739-3743，1994記載の方法による逆転写に供した。３７℃で１時間反応させた後、水で転写生成物の容量を１００μlとし、その１／４をＰＣＲで増幅試験に供した。前記操作は５００μlの薄い壁の試験管に下記組成の溶液を１００μlまでいれたものの中で実施された。
50  mM  TRIS HCl，pH 8.3，25℃
75  mM  KCl
2.5  mM MgCl2
10  mM  DTT(ジチオトレイトール）
0.2  mM dATP,dCTP,dGTPおよびdTTP
50 pmol センス  プライマーSEQ ID NO:2（5’-TTTCACGGTGTGGACTCC-3’）
50 pmol アンチセンス  プライマーSEQ ID NO:3（5’-TAGGTAGGAGATCAAGCG-3’）
0.551 Taq Pol（Taq  ポリメラーゼ）2.T U/μl
（ポリメラーゼ  ストッフェル  フラグメント、セタス／パーキン・エルマー（登録商標名））
3%      フォルムアミド
プライマーはカンナビノイド末梢レセプターに特異的であった。ＰＣＲは下記手順に従いセタス／パーキン・エルマー（登録商標名）のモデル９６００装置中で３５熱サイクル実施された。
温度            時間
９５℃          １  分
５４℃          １  分
７２℃          １  分
反応が終了したら３０μlの反応液を増幅生成物を可視的ならしめるため１％アガロースゲル上で電気泳動させ、次に２つのＰＣＲプライマーへのインナープローベ  ハイブリダイゼーションのためナイロン  フィルター上で転写され不動化された。
インナー  オリゴヌクレオチドを用いての特殊ハイブリダイゼーション
放射性トレーサーでラベルされたカンナビノイド末梢レセプターの増幅シーケンスに補完的な合成オリゴヌクレオチドSEQ 1D NO:4を用いたハイブリダイゼーションで増幅生成物の正体を調べた。
SEQ 1D NO:4のシーケンスは下記の通りであった。
0004111349.tif 000028
放射性ラベリングは５pmolインナーオリゴヌクレオチドを用い３７℃で１時間下記の如く実施された。
33 pmol（α32P）-dATPニューイングランド  ヌクレアー）
20 U  ターミナル  デオキシヌクレオチド  トランスフェラーゼ（ＵＳバイオケミカル）
100 mM  ナトリウム  カコデイレート（pH 7.2）
2 mM  CoCl2
0.2 mM  2-メルカプトエタノール
最終容積  20  μｌ
ラベルされた生成物はセファデックスＧ−５０（登録商標名）カラムでのクロマトグラフィーにより精製され、ＰＣＲ増幅生成物にとってのフィルターを含むハイブリダイゼーション溶液に加えられた。ハイプリダイゼーションと洗浄はサムブルック、フリツシュおよびマニアチス（モレキュラ  クローニング、ア  ラボラトリー  マニェアルコールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス  １９８９に記載の如く標準条件下に実施された。
ハイブリダイズド  フィルターは、カンビノイド  末梢レセプター  メッセンジャーの増幅バンドの検出用オートラジオグラフ  フィルムに露出された。
▲２▼  mRNA−末梢カンナビノイド  レセプター  in situハイブリダイゼーション
成育雄マイス（２０−２２ｇ）の脳を２−メチル−ブタン中−８０℃で冷凍し、クリオスタットで薄片を作り、１２ｍｍ冠状セクションをポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上に融解固定した。全てのセクションを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定し、グレードの異なる一連のエタノール中で脱水した。なおこれはクロロホルム中での５分のインキュベーションと空気乾燥を含む。
ポリ−Ｌ−リジン被覆カバースリップ上で培養したマウス小脳顆粒（ビトロ−ＤＩＶ中１５日）は４％ＰＦＡ中で固定され、ＰＢＳで２回洗浄し、４℃で４８時間７０％エタノール中で透析され、より高濃度のエタノール中で脱水され空気乾燥せしめられた。ＣＢ２−特異的mRNAを検出するため、ムンロ等１９９３年、文献は前述）に従い合成オリゴヌクレオチド（４５mers）CB2（SEQ ID NO:4  5’-GGTGACGAGAGCTTTGTAGGTAGGTGGGTAGCACAGACATAGGTA-3が選ばれた。コントロール  セクションにはランダム  シーケンスが利用された。全てのオリゴヌクレオチドは  １０9cpm/mgの特異アクテイビテイになるようターミナル  デオキシヌクレオチジル−トランスフェラーゼ（ファルマキア）を用い35S-dATP(NEN)でテールされた。全てのセクションが湿潤室中１．５  １０７ｄｐｍ／ｍｌの標準溶液（＊）中４２℃で一夜ハイブリダイズされた。これらセクションを次に１Ｘ  ＳＳＣ／０．１％（＊＊）ＳＤＳ中５５℃で３０分間１回、次に順次１ＸＳＳＣ中５５℃で１５分間２回、０．１ＸＳＳＣで２５℃で３０分間、オートクレーブ水で２分間洗い、エタノールで脱水し、空気乾燥させた。スライドを次にフォトエマルジョン（イルフォード  Ｋ５  希釈１：１  水）に漬け、４℃で５週間露出させ、現像（イルフォード  フェニゾール）し、定着（イルフォード  ハイパム）させ、クレジル  バイオレットによりカウンターステインさせた。
標準液調整
（＊）  ハイブリダイゼーション  カクテル  フォルムアミド：５ml，５０％；ＳＳＣ  ２０ｘ：２ml，４ｘ；デンハード  ５０ｘ：０．２ml；１ｘラウリル−サカロジル  ２０％：０．５ml，１％；デストラン  サルフェート：１ｇ，１０％；２００mM  フオスフェート  バッファーpH７．０：１ml，２０mM，水−ＤＥＰＣ適量で１０mlに、０．４５μｍフィルターを用いてろ過、−２０℃で貯蔵。
（＊＊）  クエン酸ナトリウム溶液ＳＣＳ  ２０ｘ塩化ナトリウム  １７５．３ｇおよびクエン酸ナトリウム８８．２ｇを８００ml  ＤＥＰＣ−水に溶解；ＮａＯＨ  １０ＭをpH７．２にするため使用。オートクレーブ操作のためＤＥＰＣ−水適量を加え１０００mlにする。
オートラジオグラフィ検査でラット腹腔マストセルおよびカズンＲＢＬ−２Ｈ３セル、小脳顆粒および小脳が脾臓プレパレーションと同様に末梢カンナビノイドレセプターＣＢ２に特異的なｍＲＮＡを示すことが判った。この知見は図１および２に明示されている。図１は（Ａ）ラット脾臓、（Ｂ）ラット腹腔マストセル培養液および（Ｃ）ＲＢＬ−２ＨＳ細胞培養液で、ポリメラーゼ  チェーン反応（ＰＣＲ）により増幅されたカンナビノイド末梢レセプターの特異ハイブリダイゼーションを示している。図２は、特異的ｍＲＮＡ−ＣＢ２末梢カンナビノイドレセプターｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを示す。
Ｂ）  結合効力検定
レセプターが機能的に表れるか否か、また本発明目的をなすアミドが特異的ならびに競争的方法で、ＣＢ２レセプターに結合しうるか否かをチェックする目的で特異的結合効力検定を実施した。この際レセプターに親和力のあることが知られているカンナビノイドと、またＣＢ１レセプターの内生リガンドであるアナンドアミドと比較した。
ａ）  ＲＢＬ−２Ｈ３セルの血漿膜の調整
−８０℃で冷凍したＲＢＬ−２Ｈ３セル（１００×１０6）を、０．２５％ｗ／ｖのトリプシン  インヒビター  タイプII−Ｓ：ソイ  ビーン（シグマ社、登録商標名）を加えた  トリス−ＨＣＬバッファー液５０mM（pH７．４）の４mlと共に溶かした。セルをこのバッファーに再度懸濁させ物質化した。物質液を１，５００×ｇ，４℃で１０分間遠心分離した。得られた上澄液を集め、沈殿を先のバッファー４mlに再度懸濁させた。再懸濁した沈殿を物質化し、再び１，５００xg，４℃で５〜１０分間遠心分離に付した。得られた上澄液を前の上澄液と合わせ、５，０００xgで１０分遠心分離した。遠心分離の後、上澄液を集め、さらに４０，０００xg，４℃で３０分遠心分離した。得られた沈殿を上述のバッファー液０．５mlで脂肪酸フリーの１％牛血清アルブミンを加えたものに再度懸濁した。得られた懸濁液を４０，０００xg，４℃で３０分間遠心分離させた。得られた沈殿を集め、再度５０mMトリスＨＣＬ，１mMトリス−ＥＤＴＡ，３mM  ＭｇＣｌ2を含むバッファー液、pH７．４に懸濁させ、プロティック濃度約１μｇ／μｌのものとした。このプレパレーションをフレッシュで、あるいは−８０℃で冷凍して数日以内に用いた。
ｂ）  ＲＢＬ−２Ｈ３セル膜の調製に際しての結合効力検定条件
ラベル  レセプター  アゴニスト  ３Ｈ−ＷＩＮ  ５５，２１２−２（ニューイングランド  ヌクレアーにより販売されている比放射能  ４４Ci／mmol）の飽和曲線：シラン化プラスチック管に順次、最終容積０．５mlまでの結合バッファー（５０mM  トリスＨＣｌ，１mM  トリス−ＥＤＴＡ，３mM  ＭｇＣｌ2，０．５％  ｗ／ｖ牛血清アルブミン脂肪酸フリー）０．５から２０nM（最終）まで順次減少量の３Ｈ−ＷＩＮ  ５５，２１２−２および３０μｇのａ）で作られた膜プロテインを入れた。得られた結合混合物を下に３０℃で６０分インキュベートし、４０，０００xg，２０℃で１５分間遠心分離した。
遠心分離のあと、上澄液の一部を取り、膜に連合しないリーガントの濃度を計算した。上澄液を除き、沈殿を０．５％牛血清アルブミンを含む１ml  ＰＢＳ（フオスフェート  バッファー液）で洗い、エタノールと１％トライトンＸ−１００（登録商標名）（５０／５０  ｖ／ｖ）の混液５０μｌにとり、３７℃で２０分間インキュベートし、再度懸濁させた。
再懸濁物にシンチレーター液（３ml）を加えて混合し、β−カウンター中に５分間入れた。「非特異的結合」を標価するため、予めきめられた試験管に先ずラベルを付さないレセプター  アゴニスト  ＷＩＮ  ５５，２１２−２を最終濃度１５Ｍで入れ、次にラベルしたリガンドを入れた。この結合はＫｄ＝５〜１０nM，Ｂｍａｘ＝１００〜２５０pMを与える。
３Ｈ−ＷＩＮ  ５５，２１２−２結合転位
こういった競争のため３Ｈ−ＷＩＮ  ５５，２１２−２を３μＭの濃度で使用した。非放射性ＷＩＮ  ５５，２１２−２（１μＭ）が特異結合を抑制するのに用いられた。コンペテイター  ナビロン［３−（１，１−ジメチルヘプチル）−６，６ａ，７，８，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−９Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］−ピラン−９−オン］およびアナンドアミドが０．１％エタノールに溶かされ、他方本発明目的の化合物が０．１％  ＤＭＳＯに溶解せしめられた。
コンペテイターがラベル付リガンドより前に結合混合物に加えられた。いづれの場合にも参考特異結合の評価のために、エタノールおよびＤＭＳＯが全結合、特異結合およびコンペテイター不存在のものに同じ最終濃度で加えられた。
上述の結合効力検定で、レセプター圧出法が完全且つ機能的である証拠が得られた。第１表および第２表のデータから本発明に係るアミド誘導体はアナンドアミドおよびカンナビノイド  ナビロンと同様、レセプターに結合し、各々異なるポテンシーで合成放射性リガンド  ＷＩＮ  ５５，２１２−２と競争しうることが判る。
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Ｃ）  生物学的活動力分析
ＣＢ２  レセプター機能賦活に由来する生物学的活動力がＲＢＬ−２Ｈ３培養ならびにマウス小脳顆粒一次培養で評価した。特に特殊刺激により誘発せられる本発明アミドのセロトニン  リリースを抑制する能力がＲＢＬ培養で既知ポテンシーのカンナビノイドおよびアナンドアミドと比較して評価された。
本発明の実施例１、２、５−１１および１３−１８に記載のアミド誘導体の特異結合および／または作用効果が評価された。比較のため次のものが用いられた。天然カンナビノイドの内、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の３種の異性体△８ＴＨＣ，△９−ＴＨＣおよび１１−ノル−△８−ＴＨＣ−９；合成カンナビノイドの内ナビロンおよびＷＩＮ  ５５，２１２−２、ならびにＣＢ１内生リーガント、アナンドアミド。
またＣＢ２レセプターが興奮アミノ酸（ＥＡＡ）瞬発細胞死に対する保護である役割を果たすことが示された。
ＲＢＬ−２Ｈ３セル培養物の調製
ＲＢＬ−２Ｈ３セル培養が最低必須イーグルス  メディウム（ＭＥＭ）および４mMグルタミン、１００u/mlペニシリンならびに２０％下活性化胎児子牛血清（ＤＦＣＳ）の存在下にフラスコ（ファルコン、登録商標名）中、３７℃で５％ＣＯ2の雰囲気で実施された。
ＲＢＬ−２Ｈ３セル感作ならびに賦活
各試験で、セルを０．５mM  ＥＤＴＡを含むpH７．２のＰＢＳを有するフラスコから移し、５０mg/lのゲンタマイシンと１０％ＦＣＳを含む、ＲＰＭＩ−１６−４０メディウム（コード６５０４、シグマ社）の存在下ウェル中に、１００，０００セル／１００μメディウム／ウェルの濃度で接種した。さらに、接種中、前記セルに１μCi/ml  ３Ｈ−セロトニン（５−ヒドロキシ−トリプタミン  ５ＨＴ，２６．４Ci/mmol，ニューイングランド  ヌクレアー）を添加してセロトニンを負荷させ、次いで１８時間（３７℃、５％ＣＯ2）インキュベートした。３Ｈ−セロトニンの存在下での１８時間インキュベーションの後、培養媒体液を除き、セルをＤＮＰ（ＡＤＮＰ）に対するマウス  モノクロナール抗体（ＩｇＥ）０．３μg/mlを含むＰＩＰＥＳ（Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−エタンスルホニル）−ピペラジン、コード３７６８、シグマ社）−バッファー食塩水（１００μｌ／ウェル）、pH７．１の存在下に１時間（３７℃、５％ＣＯ2）感作した。感作媒体を除いた後、セルにジニトロフェニルと結合させた人間アルブミン０．１μg/ml（ＤＮＰ−ＨＳＡ）を含み、あるいは含まない（コントロール）さらに、天然あるいは合成カンナビノイドあるいは日本発明のアミド誘導体を含むＰＩＰＥＳ（１００μｌ／ウェル）pH７．１を３７℃、１５５分間加えて賦活させ、あるいは賦活させない（コントロール）処理を行った。インキュベーションの後、メデュウムを集め、遠心分離してＤＮＰ−ＨＳＡ−刺激され、あるいは刺激されないセルから放出された３Ｈ−セロトニン量を測定した。また平行して、セル中に存在する３Ｈ−セロトニン量を測定するため粘着セルをＰＢＳに１％トライトンＸ−１００（登録商標名）を加えた液（１００μｌ／ウェル）で溶解せしめた。いづれの場合にも、３Ｈ−セロトニンの量はキャンベラ  パッカード  １９００ＴＲ（登録商標名）のβ−カウンターを用い液体シンチログラフィーならびに放射能計数により測定した。
ＲＢＬ−２Ｈ３セル賦活中でのカンナビノイドあるいは本発明に係る誘導体の添加
ＤＮＰ感作セルでのＤＮＰ−ＨＳＡ−誘発３Ｈ−セロトニン放出に対する本発明のアミド誘導体（ＤＭＳＯストック溶液）およびカンナビノイドの、アナンドアミド（エタノール  ストック溶液）存在下あるいは不存在下の効果を評価した。この目的のため、アナンドアミドを添加しあるいは添加しないカンナビノイドあるいは本発明のアミド誘導体を所望濃度でセル賦活メジウム（ＰＩＰＥＳ±ＤＮＰ−ＨＳＡ）に加えた。いづれの場合にも、このメジウムを全最終濃度を一定に保ち（０．２％溶媒）つつ、３７℃に１５分間インキュベートした。
本発明のアミドは、０．２％ＤＭＳＯおよび０．１％無水エタノールにとかした。但し、Ｎ−パルミトイル−エタノールアミドは１％ＤＭＳＯと０．１％エタノールに溶かした。
ＲＢＬ−２Ｈ３セル賦活後の３Ｈ−セロトニン  ネット  リリースの量決定
各種サンプルでの３Ｈ−セロトニン放出量は、下記式で計算した。
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式中、ｄｐｍは毎分当たりの原子核崩壊を表す。
本発明のアミドの効力は、３Ｈ−セロトニン  ネット  リリースの％（即ちＤＮＰ−ＨＳＡ  不存在下でのリリース％を差引いた後の％）あるいは、３Ｈ−セロトニン  リリース抑制％として示された。
本発明のアミド誘導体ならびにカンナビノイドの機能的効力についての評価試験結果が第２表に示されている。これらのデータは天然カンナビノイドの△８−テトラヒドロカンナビノール（△８−ＴＨＣ）および△９−テトラヒドロカンナビノール（△９−ＴＨＣ）、合成カンナビノイドのナビロンおよびラベル付レセプター  アゴニスト  ＷＩＮ  ５５，２１２−２は、セロトニン  リリースとして測定されたＲＢＬセル免疫的賦活を濃度依存的に抑制しうることを示している。実施例１および７の化合物はマスト  セル賦活により誘発される効果を抑制し、カンナビノイドの１種より高度のあるいはそれに匹敵しうる効力を示す。
反対に、アナンドアミドはセロトニン  リリースに影響を及ぼすことは出来ず、この様に該レセプター機能賦活での特殊な構造的選択性を示している。
飽和カルボン酸から誘導せられる化合物はレセプター賦活の後より強力な作用効果を示し、このことは後段の比較試験結果により確認されたが、同試験においてはアシル部が飽和のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−ヘキサデカンアミドとアシル部に２つの二重結合のあるＮ−（２−ヒドロキシエチル）−リノレイルアミドの効果が報告されている。
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アナンドアミドと天然あるいは合成カンナビノイドを共にインキュベーションするとか、実施例７の誘導体と共にインキュベーションすると、第４表に示される如く本発明のアシルアミドならびにカンナビノイドのセロトニン  リリース抑制能力が減じる。
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第５表のデータは、アナンドアミドと天然あるいは合成カンナビノイドを共にインキュベーションするとか、本発明のアミド誘導体と共にインキュベーションするとアナンドアミドのポテンシーが減少し、アナンドアミドが末梢レセプターに競争的拮抗作用をもたらすことを示している。従って、第１表に示した如くアナンドアミドは末梢レセプターに結合親和力を有しているが、生物学的効果を誘発することができず、レセプターに対する争奪によりカンナビノイドの保護作用と機能的に拮抗する。
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末梢レセプターでのアナンドアミドの部分争奪拮抗作用は第６表に示される如く、完全態分子により働くもので、アナンドアミド代謝物によるものではない。
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第４、７および８表の試験結果は感受線維的特異性ならびに活性度は本発明のアミド誘導体のアシル部およびアミド部双方の性質に関連していることを示している。
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小脳顆粒培養でのカンナビノイド神経保護効果
顆粒培養物は分娩８−９日後のマウスバルブ−６小脳から得られた。この細胞をＥＢＭ＋２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２５ｍＭ  ＫＣｌおよび１０％牛胎児血清に懸濁し、ポリリジン培養基上に塗り、８−１０日培養し、次いでグルタメート（５００ｍＭ）に室温で５分間さらし、６０％の細胞を死に至らしめた。カンナビノイドおよびアナンドアミドをロック液に溶かし、培養物にグルタメート除去１５分からはじめ、１０分間加えた。化合物の洗いだし２４時間後に、生き残りの細胞数を比色法ＭＴＴで測定した。
カンナビノイドはグルタメートにより誘因せられる細胞死に保護作用を与える。これに反し、ＣＢ２カンナビノイド末梢レセプターを賦活し得ないアナンドアミドは第９表に示される如く全く保護作用を示さない。即ちアナンドアミドは１００μＭ迄無効であった。
さらにまた、第９表のデータはＣＢ２レセプターがニューロン培養でも機能的に出現し、細胞生存に保護的役割を果たすことができ、このことは変調時のＣＢ２レセプター能力が免疫系統細胞により間接的に媒介されることを示す。
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上記の実験データは、カンナビノイドの精神に影響を及ぼすことのない作用を媒介する、ＣＢ２末梢レセプターの選択的賦活での正確な構造−作用効果相関関係を立証するものである。
より正確に言えば、飽和アシル鎖を有する化合物はＣＢ２末梢レセプターに結合し非常に該レセプターを機能的に賦活することができる。これに反して、アシル鎖に１以上の二重結合を有する化合物はＣＢ２レセプターに対する親和力はあるが、該レセプターを機能的に賦活することができず、従って部分争奪性レセプター拮抗荊として作用する。
更に上記実験結果はマストセルがカンナビノイド末梢レセプターを表すこと、および本発明に係るアミド誘導体が天然あるいは合成カンナビノイドの１種より高度のあるいはそれに匹敵しうる親和力でＣＢ２レセプターの争奪拮抗剤として挙動することを示している。またそれらは機能的に前記レセプターを賦活する。
重要なことに出願人はまた非免疫細胞も機能的にカンナビノイド末梢レセプターＣＢ２を表し、例えばこれは小脳顆粒、小脳、心臓および肺中に認められることをも見いだした。
前記の結果は、治療上の観点から非常に興味深いものであり、事実本発明のアミドは、カンナビノイドが悪い意味で有効なあらゆる疾患の治療に適しており、ＣＢ２末梢レセプターにのみ作用し、習慣性とか常用癖のような望ましからざる作用といったＣＢ１中枢レセプターにより媒介される作用がない。
本発明に係るアミド誘導体が免疫系統ならびにいろいろ異なった生理学的作用を有するニューロンあるいは細胞、即ち心臓および肺臓に属する双方の細胞型を含む各種病毒についての防禦レスポンスを、ＣＢ２レセプターの選択的賦活を通じマストセル顆粒減少を変調することにより直接的あるいは間接的に制御なしうることは極めて重要である。多くの急性ならびに慢性病に関連した炎症プロセスでのマストセルの重要性は当業者衆知である。（オッテン  ユー当、PNAS 86，10059-10063,1989;マーシャル  ジェー  エス等、ザ  ジャーナル  オブ  インムノロジー  144,1866-92，1989;ビー  ヘンダーソン  オヨビエス  ブレーク、TIPS 13，145-152，1992;エム  シー  モルガンチ・コスマン等  TIPS 13，286-290,1992;エー  エス  ファウチ、サイエンス  262，1011-1018，1993;イーエー  フォルムコング等、インフラメーション  12，4:361-371，1988;ダブリュ  デイ  サイマン、エクスペリメント  メデイカル  バイオロジー288,81-82，1991;ジェー  エッチ  ギボン等メカニズム  オブ  デイジーズ 330，20:1431-1438，1994;ピー  テイー  コバネン、ヨーロッパ  ハート  ジャーナル14，補K,105-117，1993）
換言すれば、その特異性の故に、本発明のアミド誘導体はＣＢ２カンナビノイド末梢レセプターに選択的に結合し、それを機能的に賦活することができる。
従ってそれらはＣＢ２カンナビノイド末梢レセプターの変調に関連した病気の治療および例えばＣＢ２レセプターにより影響されるマストセル顆粒減少から生じる病気双方の重要な治療手段をなすものである。
従って、前記化合物の治療的応用はＣＢ２末梢レセプターの以上変調に関連した病気治療に有用であり、あるいは該レセプターを賦活してサイトカイン、ニューロカインあるいは酵素リリースに関連した細胞毒素あるいは前炎症性現象の逆変調に導く利点がある。
例えば
免疫系障害に関連した病気
多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および合併筋肉痙攣の如き、病因的自己免疫要素を有する病気
リューマチ性関節炎の如く関節の急性ならびに慢性炎症性疾患
ウィールス（ＨＩＶ）および細菌脳髄膜症、細菌性髄膜炎、サイトメガロウイルスによる髄膜炎ならびにＡＩＤＳ−痴呆複合症の如き、生物学的薬剤による病状
老人性痴呆、アルツハイマーおよびパーキンソンズ病および合併悪液質症候の如き慢性神経変性病状
痛覚変性を併う病気
ＥＡＡ興奮性毒性を伴う病気、例えば大脳発作、ＴＩＡ，大脳ならびに脊髄外傷、てんかん、偏頭痛および舞踏病等
脈管リモデリングと関連した心臓血管病状、即ちステント適用を含む血管形成術後の再狭窄アテローム性動脈硬化症および心臓麻痺
心臓疾患、肺および眼のレベルの圧力変調（過大圧）をもたらす病状、すなわち緑内障
喘息を含む慢性気道閉塞；嘔気、また医原性の嘔気
に有用である。
その効果の点から本発明に係るアミド誘導体は人間および動物の病気の治療のための医薬製造に好適である。
有効投与量は投与方法ならびに適用法、病気の程度に応じ変えられる。また患者の年齢、体重、健康状態によっても異なる。いづれにせよ、その使用量はすくなくとも３０日投与するとして０．１〜２０mg/kg/die好ましくは、０．３〜１０mg/kg/dieである。
有効成分として本発明に係るアミドを含む医薬組成物は製薬的に許容しうる賦形剤を含み、処置さるべき病気に最も好適な形で前記有効成分を投与できいづれにせよその有効成分をできるだけ生物学的に利用せしめうる。
特に一般的な静注、皮下注射ならびに筋肉内投与用の注射溶液あるいは懸濁液、目薬の形での眼病治療溶液、挿入形態の固体あるいは半固体調合物、ゲル、軟膏が意図される。経口用調合物に関しては、顆粒粉剤、錠剤、ピル、カプセルが好ましい。皮膚および経皮投与用としてはクリーム軟膏、ゲル、硬膏、尚、有効成分が除放性微粒子中に含まれることが好ましい。
実施例１９  注射用バイアル
各バイアル当たり下記を含む
実施例８の化合物                    ２０  ｍｇ
マンニトール                        １２  ｍｇ
ナトリウム  メタサルファイト        １．３ｍｇ
ベンジルアルコール                  ８０  ｍｇ
プロピレングリコール                ４００  ｍｇ
水酸化ナトリウム                  ｐＨ７にするに適量
注射可能フォーミュレーション用水  ２ｍｌにするに適量
実施例２０  錠剤
１錠当たり下記を含む
実施例１の化合物                        ５０  ｍｇ
二塩基性リン酸カルシウム二水和物    １３５．２ｍｇ
微粒状セルローズ                        ３６  ｍｇ
大豆澱粉                                ７．２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                １．８ｍｇ
水添植物油                              １．２ｍｇ
沈降シリカ                              ０．６ｍｇ
ヒドロキシプロピレン  エチルセルロース  ４．７ｍｇ
二酸化チタン                            ０．３ｍｇ
実施例２１  目薬
１瓶当たり下記を含む
実施例７の化合物          ２５  ｍｇ
ほう砂                    １５  ｍｇ
ほう酸                    ７５  ｍｇ
ポリソルベート８０        １５  ｍｇ
ラクトース                ８０  ｍｇ
フェノール                ３．９ｍｇ
ジナトリウム              エデテート  ５  ｍｇ
点滴可能のための水  ５ｍｌにするに適量
実施例２２  ソフト  カプセル
１カプセル当たり下記を含む
実施例１６の化合物            １００  ｍｇ
ピーナツオイル  Ｏ．Ｐ．  １００  ｍｇ
カプセルの組成：
ゼラチン  Ｏ．Ｐ．，グリセリン  Ｏ．Ｐ．．天然染料Ｅ１２
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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