(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルタクチンのＳＨ３ドメインに結合する、アミノ酸配列
PVKPPLPAKPWWLPPL（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７）からなるペプチド。
【請求項２】
コルタクチンのＳＨ３ドメインに結合する、アミノ酸配列
YPQFRPPVPPKPSLMQ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８）からなるペプチド。
【請求項３】
コルタクチンのＳＨ３ドメインに結合する、アミノ酸配列
VTRPPLPPKPGHMADF（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９）からなるペプチド。
【請求項４】
コルタクチンのＳＨ３ドメインに結合する、アミノ酸配列
VSLGLKPPVPPKPMQL（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７０）からなるペプチド。
【請求項５】
コルタクチンのＳＨ３ドメインに結合する、アミノ酸配列
YKPEVPARPIWLSEL（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１）からなるペプチド。
【請求項６】
コルタクチンのＳＨ３ドメインに結合する、アミノ酸配列
GAGAARPLVPKKPLFL（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２）からなるペプチド。
【請求項７】
インヒビターを選択することを希望する一種以上の候補化合物を第一分子及び第二分子と共に結合を誘発する条件下でインキュベートし、第一分子と第二分子との結合を阻害する一種以上の化合物を検出することよりなり、第二分子は請求項１〜６のいずれか１項に記載されるペプチドである、コルタクチンのＳＨ３ドメインを含む第一分子とコルタクチンのＳＨ３ドメインに結合する第二分子との間の結合の阻害剤を同定する方法。
【請求項８】
検出可能な標識が、ＳＨ３ドメインを含む第一分子、ＳＨ３ドメインに結合する第二分子、又は候補化合物に付着している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な標識が、蛍光、放射性同位体、又は重金属である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第一分子と第二分子との結合がウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより検出される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）候補化合物の存在下で、コルタクチンのＳＨ３ドメインを含む分子とリガンドとを、結合を誘発する条件下で接触せしめて、コルタクチンのＳＨ３ドメインを含む分子とリガンドとの間の結合の量を測定し；
（ｂ）工程（ａ）で測定した結合量を、候補化合物の不存在下でコルタクチンのＳＨ３ドメインを含む分子とリガンドの間で生じることが知られまたは確認した結合量と比較し、そして、工程（ａ）で測定した結合量と候補化合成物の不存在下でコルタクチンのＳＨ３ドメインを含む分子とリガンドの間で生じることが知られまたは確認した結合量とに相違があることは、該候補化合物がコルタクチンのＳＨ３ドメインを含む分子とリガンドとの結合に影響する化合物であることを示唆するものとする、
ことからなり、リガンドは請求項１〜６のいずれか１項に記載されるペプチドである、コルタクチンのＳＨ３ドメインを含む分子とコルタクチンのＳＨ３ドメインのリガンドとの結合に影響する化合物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
1.発明の分野
本発明は、広い範囲の結合特異性を有するSH3結合ペプチドに関連する。即ち、開示されたある種のSH3結合ペプチドは、異なるSH3結合ドメイン含有蛋白質に由来するSH3ドメインと、ほぼ同一の結合性により結合する。対照的に、他の種類のものは、特定のSH3ドメインにより高い程度の親和性により結合する。SH3結合ペプチドは、ファージによっても発現されるランダムペプチドライブラリーより得られる。このSH3ドメイン標的に結合するファージクローンの入手方法、および、それらに対応するヌクレオチド配列およびその結果である結合ペプチドのアミノ酸一次配列の決定方法に関して記載する。得られたSH3結合蛋白質は、細胞レベルで信号伝達経路を調節する方法、発癌蛋白質の活性を調節する方法、または、信号伝達系に関与する特異的なクラスのみならず幅広いクラスの蛋白質の活性を調節し得る薬剤を産成するための前駆化合物の提供を含むが、これらに限らない多くの用途において有用である。
2.発明の背景
2.1.  SrcおよびSH3ドメイン
真核細胞の信号伝達に関与するある種の蛋白質には、SH3ドメインと呼ばれる共通の配列モチーフが存在する。それは50-70アミノ酸長であり、一次構造は中程度に保存されており、かつ信号伝達系に関与する多数の蛋白質、および細胞骨格蛋白質において、1回から数回存在し得る。
pp60c-src蛋白質は、少なくとも9つの非受容体蛋白質チロシンキナーゼ(NR-PTKs)のファミリーに属する。このファミリーのメンバー蛋白質は、触媒および非触媒ドメインの配列を含む全体的な構造組成を共有する。Srcにおいては、14アミノ酸のミリスチル化シグナルがアミノ末端に位置し、それに続き、ファミリーのメンバーにおいて高度に保存されていないユニークな領域が存在する。高度に保存された60および100アミノ酸領域、即ち、各々Src相同性ドメイン(Src homology domein;以下SHという)3および2が、上述の領域に続く。SH2およびSH3ドメインは、様々な信号伝達経路における蛋白質-蛋白質相互作用を仲介する重要な役割を担っていることが示されている(Koch,C.A.ら,Science(1991)252:668-74)。Srcのカルボキシ末端側半分はPTK触媒ドメインを含み、かつカルボキシ末端付近には負に制御するチロシン(Y527)を含む。この残基のリン酸化(例えばCskによる)は、PTK活性を抑制する結果となる(Cooper,J.A.ら,Science(1986)231:1431-1434)。Y527→Fの変異は、PTK活性および癌化活性の上昇したSrcの形態を生ずる(Cartwright,C.A.ら,Cell(1987)49:83-91;Kmiecik,T.E.ら,Cell(1987)49:65-73;およびPiwicna-Worms,H.ら,Cell(1987)75-82)。
Src PTKおよび形質転換活性の上昇を生じるいくつかの変異が、Src SH2ドメイン(Seidel-Dugan,C.ら,Mol.Cell.Biol.(1992)12:1835-45;およびHirai,H.およびVarmus,H.E.Mol.Cell.Biol.(1990)10:1307-1318);およびSH3ドメイン(Seidel-Dugan,C.ら,上述;Hirai,H.およびVarmus,上述;Superti-Furga,G.ら,Embo.J.(1993)12:2625-34;およびPotts,W.M.ら,Oncogene Res.(1988)3:343-355)に位置するという事実は、これらのドメインが負に制御する役割を担うことを示唆する。特定の配列関係においてホスホチロシン残基がSH2ドメインに対する高い親和性を示すリガンドであることは、SH2ドメインがホスホリル化されたY527に結合することによりY527の仲介するPTK活性の抑制に寄与し、従ってキナーゼドメインを不活性化形態にロックするというモデルを示唆する(Matsuda,M.,Mayer,B.J.ら,Science(1990)248:1537-1539)。このモデルは、Srcのカルボキシ末端に対応するリン酸化ペプチドが、活性化型Src種には結合するが不活性化型Src種には結合しないという観察により支持される(Roussel,R.R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:10696-700;およびLiu,X.ら,Oncogene(1993)8:1119-1126)。SH3の仲介するSrc PTK活性の抑制機構は未だ不明である。pY527の仲介するSrc PTK活性の抑制には、SH2ドメインだけでなくSH3ドメインも関与するという根拠がある(Okada,M.,Howellら,J.Biol.Chem.(1993)268:18070-5;Murphy,S.M.ら,Mol.Cell.Biol.(1993)13:5290-300;およびSuperti-Furga,G.ら,上述)。これらの効果は、SH3の仲介する蛋白質-蛋白質相互作用の結果であると考えられているが、Src SH3ドメインがその負の調節効果をいかにして発揮しているかは不明である。Src SH3ドメインに対する高い親和性を有するリガンドの同定が、この問題の解決に寄与する可能性がある。
2.2.蛋白質チロシンキナーゼおよび免疫応答
Src関連チロシンキナーゼ類は、免疫機構(白血球、T細胞、B細胞およびナチュラルキラー細胞)および中枢神経機構(神経細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、小脳の一部、およびその他)の細胞種を含む多様な細胞種において発現される(Umemori,H.ら,Brain Res.Mol.Brain Res.(1992)Dec.16(3-4):303-310)。それらが、それらの細胞および組織に存在すること、および、それらが特異的な細胞表面受容体および免疫調節蛋白質(T細胞抗原受容体、CD14、CD2、CD4、CD40またはCD45といったもの)と相互作用することは、これらのキナーゼが中枢神経機構のみならず免疫機構における信号伝達経路においても重要な役割を担っていることを示唆する。例えば、Ren,C.L.ら,J Exp.Med.(1994)179(2):673-680(CD40を介する信号伝達はLynキナーゼの活性化を必要とする)、Donovan,J.A.およびKoretzky,G.A.,J.Am.Soc.Nephrol.(1993)4(4):976-985(CD45、免疫反応、および、LckおよびFynキナーゼの調節)、およびCarmo,A.M.ら,Eur.J.Immunol.(1993)23(9):2196-2201(CD2の細胞質ドメインとp56lckおよびp59fynとの物理学的結合)を参照。
例えば、Src様遺伝子であるHckおよびFgrの破壊されたマウスは、食作用活性が低下したマクロファージを有し、または、Listeria monocytogenesの感染に対する感受性の増加に特徴づけられる、新規の免疫疾患を示す(Lowell,C.A.ら,Genes Dev.(1994)8(4):387-398)。さらに、細菌性リポポリサッカライド(LPS)、が、TNF-alpha、IL-1、IL-6およびIL-8といったリンホカインの生成を誘導する際に、CD14関連p56lyn、p68hck、およびp59c-fgrを活性化することが示されている。上述の蛋白質チロシンキナーゼの阻害は、TNF-alphaおよびIL-1の産生を阻止する。
2.3.SH3結合ペプチド
上述のように、SH3ドメインが蛋白質-蛋白質相互作用の部位であると長い間考えられてきたが、どのSH3ドメインが実際に結合するかは不明のままである。SH3ドメインに対するリガンドを同定する試みにより、3BP1および2(Ren,R.,Mayerら,Science(1993)259:1157-61)、SOS(Olivier,J.P.ら,Cell(1993)73:179-91;およびRozakis-Adcock,M.ら,Nature(1993)363:83-5)、p85PI-3'キナーゼ(Xingquan,L.ら,Mol.Cell.Biol.(1993)13:5225-5232)、ダイナミン(Gout,l.ら,Cell(1993)75:25-36)、AFAP-110(Flynn,D.C.ら,Mol.Cell.Biol.(1993)13:7892-7900)、およびCD42(Barfod,E.T.ら,J.Biol.Chem.(1993)268:26059-26062)を含む複数のSH3結合蛋白質が単離された。これらの蛋白質は、プロリンに富む短いアミノ酸配列を有する傾向があり、そのいくつかは直接SH3への結合に関与すると考えられている。様々なコンセンサス配列が提唱されているが、異なるSH3結合蛋白質のプロリンに富む領域の間の類似性は、かなり低い傾向がある。さらに、コンセンサス配列を確立しようとする試みは、異なるSH3ドメインに結合する蛋白質からのデータの総合により複雑化しているようである。
従って、Cicchetti,P.ら(Science(1992)257:803-806)は、abl癌遺伝子産物のSH3ドメインと試験管内で結合し得る、2つの天然の蛋白質の単離および配列決定に関する研究を発表した。この研究者らは、SH3ドメインがそのような蛋白質の短いプロリンに富む領域に結合することを見出した。続いて、同じグループは、SH3結合蛋白質のSH3結合部位が「プロリン残基に富む9または10アミノ酸の配列」に位置するという、さらなる結果を開示した(Ren,R.ら、上述)。4種のSH3結合蛋白質のSH3結合部位の特性を総合したコンセンサス配列が提唱された。即ち、XPXXPPP\XP(SEQ ID NO:1)であり、ここでXは4種のSH3結合蛋白質間において保存されていないアミノ酸配列の位置を示し、Pはプロリンを示し、かつ\はPまたはLなどの疎水性アミノ酸残基を示す。
混成ランダムペプチドライブラリーのスクリーニングは、ストレプトアビジン(Devlin,J.J.ら,Science(1990)249:404-406;およびLam,K.ら,Nature(1991)354:82-84)、小胞体シャペロンBiP(Blond-Elguindi,S.ら,Cell(1993)75:717-728)、およびCaM(Dedman,J.R.ら,J.Biol.Chem.(1993)268:23025-23030)を含む種々のペプチドに対するリガンドのみならず、単クローン抗体(Scott,J.K.およびSmith,G.P.,Science(1990)249:386-390)およびポリクローン抗体(Kay,B.K.ら,Gene(1993)128:59-65)に対するペプチドエピトープを同定するために用いられてきている。
最近、Chen,J.K.ら(J.Am.Chem.Soc.(1993)115:12591-12592)は、フォスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI-3'キナーゼ)のSH3ドメインに対する、偏りのある混合ライブラリー(combinatorial library)より単離されたリガンドを記載した。「偏りのある」ライブラリーは、合成ペプチドの特定位置におけるアミノ酸残基が固定されている、即ちランダムな様式で多様化されないという点において、「ランダム」ライブラリーと区別される。実際、それらの研究者が記載しているように、「ランダム」混合ライブラリーのスクリーニングでは、PI-3'キナーゼSH3ドメインプローブに対する適切なリガンドを得られなかった。これらの不適切なリガンドの結合親和性は、Biosensor System(BIAcore)により測定された解離定数に基づくと、>100μMと弱かったと記載された。
さらに最近、Yuら(Yu,H.ら,Cell(1994)76:933-945)は、XXXPPXPXX(SEQ ID NO:2)(ここで、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を示す)の形の「偏りのある」合成ペプチドライブラリーを用い、SrcおよびPI-3'キナーゼSH3ドメインに結合する一連のペプチドを同定した。偏りは、「ランダム」ペプチドに対して示される特定のアミノ酸位置におけるプロリン残基の固定により達成された。上述のように、この偏りがない場合、開示された方法はSH3ドメイン結合ペプチドを同定できない。
13の結合ペプチドに基づき、コンセンサス配列が示唆された。即ち、RXLPPRPXX(SEQ ID NO:3)であり、ここでXは塩基性残基(R、KまたはHといった)である傾向がある。いくつかのSH3結合ペプチドの結合親和性は、8.7から30μMの範囲であると開示された。その一つのペプチドRKLPPPRPRR(SEQ ID NO:4)は7.6μMの結合親和性を有することが報告された。この値は、Grb2のN末端SH3ドメインに対するペプチドVPPPVPPRRR(SEQ ID NO:5)の結合親和性に好ましく匹敵する(Kraulis,P.J.,J.Appl.Crystallogr.(1991)24:946を参照)。彼らは方法の限界を認識し、上述のChenおよび共同研究者は、彼らの結果は「受容体のリガンド結合特性に関するいくつかの一般的知見がある場合におけるリガンド発見のための、偏りのある混合ライブラリーの利用を示す」(強調を加えた)と記載している。
上述のYuおよび共同研究者は、さらに、SH3結合部位コンセンサス配列XpφPpXP(SEQ ID NO:6)(ここでXは保存されていない残基を示し、φは疎水性残基を示し、Pはプロリン、pはプロリンである傾向がある残基を示す)を記載した。RXLPPRPXX(SEQ ID NO:7)(ここでXはシステイン以外の任意のアミノ酸を示す)のコンセンサスモチーフは、PI-3'キナーゼSH3ドメインのリガンドに対して提唱された。RXLPPLPRφ(SEQ ID NO:8)(ここでφは疎水性残基を示す)のコンセンサスモチーフは、Src SH3ドメインのリガンドに対して提唱された。それでもなお、9量体ペプチドに関して報告された解離定数は、約8-70μMの範囲でしかなく、ある種のSH3ドメインと他のSH3ドメインとの間の選択性は相対的に低く、KDは約4の係数しか異なっていなかった。
従って、部分的に事前に決定されたアミノ酸配列のセットに限定される、上述のような「偏りのある」混合ペプチドライブラリーに依存しないSrc SH3結合ペプチドの同定方法を確立する必要が残されている。実際、「ランダム」ペプチドライブラリーによるSH3結合ペプチドの単離は、これまでに首尾よく達成されたことがない。さらに、より高い結合親和性を有する特定のペプチドは、一般的なものであれ、特定のSH3ドメインにより選択的に結合するものであれ、まだ同定されていない。特定のSH3ドメインに特異的に結合するペプチドは、例えば特定のSH3ドメインを含む蛋白質の活性を調節する一方で、他のSH3ドメインを有するものに影響を与えたくないような場合に有用である。とはいえ、より無差別で一般的な結合ペプチドは、広い範囲のSH3ドメインを含む蛋白質を調節するために有用である。
本発明は、上述のようなSH3結合ペプチド、それらの同定方法、およびこのペプチドを含む組成物に関連する。特に、ランダムペプチドライブラリーより単離された、アミノ酸残基の特定の配列を含むペプチドが開示される。本発明においては、クローンは、SH3ドメインを含む蛋白質標的に対して強い結合親和性を示す、ファージディスプレイ法によるランダムペプチドライブラリーより単離された。これらの蛋白質標的のいくつかには、Abl、Src、Grb2、PLC-δ、PLC-γ、Ras GAP、Nck、およびp85 PI-3'キナーゼが含まれる。結合したファージのヌクレオチド配列より、挿入ペプチドのアミノ酸配列が推定される。望ましいアミノ酸配列を有する合成ペプチドは、標的蛋白質のSH3ドメインに結合することが示されている。特に、コアコンセンサス配列およびコア配列に隣接する付加的なアミノ酸残基を含む合成ペプチドは、特定の標的蛋白質SH3ドメインに特に効果的に結合する。本明細書に開示されているSH3結合ペプチドは、生体内における発癌蛋白質の調節の可能性を含む多くの用途に利用され得る。これらのペプチドはまた、信号伝達経路および発癌に関与する広範なクラスの蛋白質を調節する疑似ペプチド薬剤の産生のための有用な前駆体として利用される。
3.発明の概要
従って、Src相同性領域3(SH3)およびグルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)からなる細菌性融合蛋白質に結合するものを単離するため、3つのファージディスプレイ法によるランダムペプチドライブラリーがスクリーニングされた。単離体のDNA配列決定は、それらが8、22、または36アミノ酸長のランダム領域の内部に、コンセンサスモチーフRPLPPLP(SEQ ID NO:9)に類似した配列を含むことを示した。SH3結合ファージのpIII挿入配列に対応するペプチドを合成したところ、それらはSrcおよびYesのようなSrc関連蛋白質のSH3ドメインのGST融合体に結合したが、Grb2、Crk、Abl、PLCγ1のSH3ドメインには結合しなかった。合成されたペプチドはSrc SH3ドメインに非常によく結合し、かつ細胞溶解物における天然のSrc SH3相互作用の有効な競合物として作用する。例えば、これらのペプチドは、固定化されたSrc-GSTに対する結合において、約1-10μMのIC50により、細胞溶解物由来の放射能標識された蛋白質と競合し得る。コンセンサス配列RPLPPLP(SEQ ID NO:9)を有するペプチドを、Xenopus laevisの卵母細胞に注入した場合、プロゲステロンにより誘導される卵成熟の効率が促進された。これらの結果は、ファージディスプレイ法によるランダムペプチドライブラリーはSH3結合ペプチド配列の同定に有用であり、そのように同定されたペプチドが、生体内および試験管内において生物学的活性を発現することを示す。
したがって、本発明の目的は、ペプチドのいずれかの位置に式:R-2-L-P-5-6-P-8-9(SEQ ID NO:10)のアミノ酸配列を含む、少なくとも9および最大45アミノ酸残基を有し、SrcのSH3ドメインに対して結合親和性を示すペプチドを提供することである。ここで各々の番号は1つのアミノ酸残基を示し、即ち2はシステイン以外の任意のアミノ酸、5および6は疎水性アミノ酸残基、8はシステイン以外の任意のアミノ酸、9はシステイン以外の親水性アミノ酸であり、各文字は標準的な一文字表記で対応するアミノ酸を示し。但し、このペプチドは、R-P-L-P-P-L-P-T-Sであることはできない。本発明の特定の態様においては、ペプチドはYes、Fyn、Lyn、Lck、Hck、およびFgrを含むSrc関連蛋白質のSH3ドメインに対しても結合親和性を示す。
本発明は、式:10、10-11、10-11-12、10-11-12-13(SEQ ID NO:12)または10-11-12-13-14(SEQ ID NO:13)のC末端隣接アミノ酸配列をさらに含むSH3ドメイン結合ペプチドをも意図する。ここで、各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸を示し、10は9とペプチド結合により結合するものとする。さらに、式:1'、2'-1'、3'-2'-1'または4'-3'-2'-1'(SEQ ID NO:14)のN末端隣接アミノ酸配列をさらに含むペプチドも提供される。ここで、各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸を示し、1'はRとペプチド結合により結合するものとする。
従って、特定の態様においては、ペプチドのいずれかの位置に、式:3'-2'-1'-R-2-L-P-5-6-P-8-9-10(SEQ ID NO:15)のアミノ酸配列を含む、少なくとも13および最大45アミノ酸残基を有するペプチドが開示される。ここで、各番号はアミノ酸残基を示し、3'、2'、1'、2、8、および10は各々システイン以外の任意のアミノ酸、5および6は各々疎水性アミノ酸残基、および9はシステイン以外の親水性アミノ酸残基であり、各文字は標準的な一文字表記で対応するアミノ酸を示し、当該ペプチドは、SrcのSH3ドメインに対して結合親和性を示す。
本発明は、SH3ドメイン結合選択性または特異性の多様性を反映する新規のコンセンサス配列またはモチーフをも提供しようとする。本発明はまた、SH3結合ペプチドと第二の分子または化合物との複合物をも意図する。この第二の分子は、特定の蛋白質(またはその蛋白質を含む細胞)のSH3ドメイン領域へ輸送すべき任意の望ましい物質であろう。可能な標的細胞は、Src、Src関連蛋白質、および他のSH3ドメインを含む可能性のある蛋白質を発現する細胞であり、神経細胞、免疫細胞(例えばT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、およびその他)、破骨細胞、血小板、上皮細胞、およびその他を含むが、これらに限定されない。この方法により、SH3ドメインを有する蛋白質の生物学的活性の調節が達成され得る。
本発明の目的に合致する他の方法および組成物も、同様に開示される。特に、本発明のペプチドの有効量および担体(好ましくは薬理的に受容可能な担体)を含む組成物を投与することを含む、SrcまたはSrc関連蛋白質の活性を調節する方法が開示される。特定の態様においては、意図される方法は、SrcまたはSrc関連蛋白質の活性を阻害する結果となる。あるいは、その方法はSrcまたはSrc関連蛋白質を活性化する効果がある。
また他の態様においては、(a)SH3ドメインを含む固定化された標的蛋白質を提供し、(b)固定化された標的蛋白質をランダムペプチドライブラリーの一部試料とともにインキュベーションし、(c)非結合ライブラリーペプチドを固定化された標的蛋白質から洗い流し、(d)固定化された標的蛋白質に結合したペプチドを回収し、および(e)SH3ドメインに結合したペプチドの一次配列を決定することを含む、SH3ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法が開示される。
さらに、検出可能な標識または映像化試薬と複合体にしたSH3ドメイン結合ペプチドを含む組成物の有効量を投与することを含む、SrcまたはSrc関連蛋白質の発現されている細胞、組織、および器官を映像化する方法が開示される。
本発明の他の目的は、上述の開示および下記の好ましい態様の詳細な記載を考慮することにより、当該技術分野において通常の知識を有する者にとって明らかになるであろう。
本発明は、選択しようとする1つ以上の候補化合物を、第一分子および第二分子とともに、結合に適切な条件の下でインキュベーションし、第一分子の第二分子に対する結合に影響する1つ以上の候補化合物を検出することを含む、SH3ドメインを含む第一分子およびそのSH3ドメインに結合する第二分子の間の結合に影響する化合物を同定する検定法をも提供する。
上述のような検定法を実施するための、SH3ドメインを含む第一分子およびSH3ドメインに結合する第二分子を含むキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
図1は、ランダム36アミノ酸ペプチドライブラリー(TSAR-9;例えばSEQ ID NO:16)の作製の概要を示す。オリゴヌクレオチドは合成され(SEQ ID NOS:17-18)、二本鎖DNAに変換され、制限酵素により切断され(SEQ ID NOS:19-20)、かつM13ベクターm663にクローニングされた。オリゴヌクレオチドによりコードされるランダムペプチド領域は箱で示され(SEQ ID NO:16)、かつ成熟蛋白質IIIのN末端に位置する(SEQ ID NO:21)。SEQ ID NO:22は、シグナルペプチダーゼ切断部位に先立つ3アミノ酸を含む。
図2は、ランダム22アミノ酸ペプチドライブラリー(TSAR-12;例えばSEQ ID NO:23)の作製の概要を示す。オリゴヌクレオチドは合成され(SEQ ID NOS:24-25)、二本鎖DNAに変換され、制限酵素により切断され(SEQ ID NOS:26-27)、かつM13ベクターm663にクローニングされた。オリゴヌクレオチドによりコードされるランダムペプチド領域は箱で示され(SEQ ID NO:23)、かつ成熟蛋白質IIIのN末端に位置する(SEQ ID NO:28)。SEQ ID NO:29は、シグナルペプチダーゼ切断部位に先立つ3アミノ酸を含む。
図3は、ランダム8アミノ酸ペプチドライブラリー(R8C;SEQ ID NO:30)の作製の概要を示す。オリゴヌクレオチドは合成され(SEQ ID NOS:31-32)、二本鎖DNAに変換され、制限酵素により切断され(SEQ ID NOS:33-34)、かつM13ベクターm663にクローニングされた。ランダムペプチド領域(SEQ ID NO:30)は、隣接システイン残基に挟まれ、かつ成熟蛋白質IIIのN末端に位置する(SEQ ID NO:35)。
図4は、二重挿入R8C組み換え体の1つのクラスの可能な起源を示す(例えば、SEQ ID NO:36をコードする)。Xho I-Xba Iにより切断されたM13ベクターにクローニングされる前に、二本鎖オリゴヌクレオチド(例えばSEQ ID:37)は、頭部同士の向き合う方式でXba I部位に連結されたと考えられる。
図5は、本発明の方法により単離されたランダムペプチド組み換え体(SEQ ID NOS:38-61および106)および提示されたペプチド配列のリストを示す。アミノ酸配列は、コア配列を強調するよう並列されている。隣接配列は、コア配列のN末端およびC末端に続けて示されている。SEQ ID NOS:38-61は、SSCDHTLGLGWCGSRSTRQLPIPPTTTRPSRがSEQ ID NO:106であり、かつRPLPPLPがSEQ ID NO:9であることを除き、上から下へ順に示されている。T12.Src3.1はクラスIIリガンドである(6.14.5節を参照)。
図6は、多様なSH3ドメインに対する選択されたファージクローンの相対的結合親和性をグラフで示したものである。結果は、あるアミノ酸配列は一般的なSH3ドメイン結合を提供し、一方他のアミノ酸配列はSrcのSH3ドメインに対するより高い選択性を提供し得ることを示す。とはいえ、他のクローンもSrc SH3ドメインに好ましい結合を示す。
図7は、Src SH3選択ファージ挿入断片の示す合成ペプチド(SEQ ID NOS:9および62-70)の、バックグラウンドであるコアペプチドRPLPPLP(SEQ ID NO:9)および天然の蛋白質に由来するプロリンに富むペプチド断片に対する相対的GST結合(網掛けのない欄)を越える、Src SH3-GST融合標的への結合(網掛けの欄)を示す。結合したビオチニル化ペプチドは、ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼELISAにより検出された。各点は3回測定され、405nmにおける平均吸光度が示されている。エラーバーは標準偏差(SD)を示す。SEQ ID NOS:62-70は、RPLPPLPがSEQ ID NO:9であることを除き、上から下へ順に示されている。
図8は、種々の蛋白質由来のSH3ドメインに対する、選択されたペプチド(SEQ ID NOS:9および62-70)の相対的特異性を示す。特に、標的融合蛋白質であるSrc SH3-GST、Yes SH3-GST、Grb2-GST、Crk SH3-GST、Abl SH3-GST、PLCγ1 SH2SH3-GSTのSH3ドメインに対するペプチドの結合親和性が検査された。結合したビオチニル化ペプチドは、ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼにより検出された。各点は3回測定され、値はGSTバックグラウンドを越える平均シグナル(405nmにおける吸光度)であり、エラーバーは標準偏差(SD)を示す。平行線を付したバーは、ELISAシグナルの飽和を示す。SEQ ID NOS:62-70は、RPLPPLPがSEQ ID NO:9であることを除き、上から下へ順に示されている。
図9は、選択されたペプチドが、細胞溶解物由来蛋白質の固定化Src SH3-GSTまたはAbl SH3-GST標的融合蛋白質への結合を阻害することを示す、競合実験の結果を示す。
図10は、本発明のSH3ドメイン結合ペプチドVLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)が注入された卵母細胞における、プロゲステロンにより誘導される成熟の効率の上昇を示すグラフである。簡潔には、VI期の卵母細胞が調製され、かつ過去に記載された方法により注入された(Kay,B.K.,Methods in Cell Biol.(1991)36:663-669)。卵母細胞には、40nLの被検査ペプチド(100μM))または水が注入された。注入後に、卵母細胞は2μg/mLのプロゲステロン(Sigma,St.Louis,MO)中に置かれ、かつ1時間ごとに卵核胞崩壊(GVBD)が測定された。LAPPKPPLPEGEVはSEQ ID NO:70である。
図11は、本実験の特定のペプチド、即ちパネルA=VLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)、パネルB=GILAPPVPPRNTR(SEQ ID NO:63)、パネルC=RSTPRPLPPLPTTR(SEQ ID NO:67)が、SrcまたはSrc関連蛋白質を含むと考えられる細胞画分内部に局在することが示された蛍光実験の結果を示す。
図12は、偏りのあるペプチドライブラリーの作製の概要を示す。下記の実施例の節に記載されたように、オリゴヌクレオチドは合成され(SEQ ID NOS:162-163)、二本鎖DNAに変換され(SEQ ID NO:454)、制限酵素XhoIおよびXbaIにより切断され(SEQ ID NOS:455-456)、かつmBAXベクターにクローニングされた(SEQ ID NOS:457-458)。偏りのあるペプチド領域(SEQ ID NO:459)は、成熟pIII蛋白質のN末端に位置する。CTAGACGTGTCAGTはSEQ ID NO:162の一部分である。ACTGACACGTはSEQ ID NO:454の一部分である。TCGAGGCACAGはSEQ ID NO:454の一部分である。
図13は、成熟pIII蛋白質のN末端に位置する、mBAXベクターにおいてコードされるペプチド配列を示す。TCCTCGAGTATCGACATGCCTTAGACTGCTAGCACTATGTACAACATGCTTCATCGCAACGAGCCAはSEQ ID NO:460である。SSIDMP*TASTMYNM LHRNEPはSEQ ID NO:461である。GGTGGGAGGAAGTTGAGCCCGCCCGCCAACGACATGCCGCCCGCCCTCCTGAAGAGGTCTAGAはSEQ ID NO:462である。GGRKLSPPANDMPPALLKRSRはSEQ ID NO:463である。
図14は、種々のSH3ドメインに対するSH3選択ファージクローンの相対的結合を示す。各コンセンサスモチーフを示す2つのクローン(AおよびB)の、1μgの各固定化GST-SH3融合蛋白質に対する結合がアッセイされた。結合ファージは、抗ファージELISAにより検出された。各クローンにより提示されるペプチドの配列は、各々のコンセンサスモチーフとともに並列されている。不変のプロリン残基には下線を付してある。実線は特異的結合、破線は交差反応による結合である。値は、平均OD405±SD(N=3)である。
5.発明の詳細な説明
5.1.概論
本発明は、生理学的に有意な多数の蛋白質に存在することが見出されているSH3ドメインに対して結合親和性を示すペプチドに関連する。特に、Abl、Src、Grb2、PLC-δ、PLC-γ、Ras GAP、Nck、およびp85 PI-3'キナーゼを含むがこれらに限らないグループの蛋白質に見出されるCH3ドメインに対して、一般的な結合特性を示すペプチドが開示される。好ましいペプチドは、SrcのSH3ドメインに対して、特異的でないとしても選択的な結合親和性を示す。本明細書に記載されているように、本発明のペプチドは、コア配列、好ましくはコンセンサス配列、およびコア配列に隣接する付加的なアミノ酸残基を含む。これらのペプチドについての詳細は、同定方法を含め、下記に記載されている。
従って、本発明の特定の態様においては、ペプチドのいずれかの位置に、式:R-2-L-P-5-6-P-8-9(SEQ ID NO:10)に類似するアミノ酸配列を含む、少なくとも9および最大45アミノ酸残基を有するペプチドが提供される。上述の式においては、各数字はアミノ酸残基を示し、2はシステイン以外の任意のアミノ酸残基、5および6は各々疎水性アミノ酸残基、8はシステイン以外の任意のアミノ酸残基、および9はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を示す。また、上述の式において、各文字は標準的な一文字表記で対応するアミノ酸を示す。ペプチドが9量体である場合、ペプチドR-P-L-P-P-L-P-T-S(SEQ ID NO:11)は除外される。特に興味深いペプチドは、SrcおよびYes、Fyn、Lyn、Lck、Hck、およびFgrを含むSrc関連蛋白質のSH3ドメインに対して結合親和性を示すものである。好ましくは、本発明のペプチドは、SrcのSH3ドメインに対して結合親和性を示し、その結合親和性は、ペプチドRPLPPLP(SEQ ID NO:9)により示されるものに比べ、少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも4倍、最も好ましくは少なくとも約5倍以上である。また他の態様においては、ペプチドはSrcのSH3ドメインに対して、ペプチドRPLPPLP(SEQ ID NO:9)により示されるものに比べ、少なくとも10倍以上の結合親和性を示す。
特定の態様においては、示された位置におけるそれぞれのアミノ酸残基が、各々独立して下記の好ましい残基を有するペプチドが開示される。即ち、2はP、R、A、L、Q、EまたはS、より好ましくはPまたはRであり、5はP、M、IまたはL、より好ましくはPまたはMを示し、6はP、L、IまたはV、より好ましくはPまたはLであり、8はT、R、P、I、N、E、V、S、A、GまたはL、より好ましくはTまたはRであり、かつ9はT、R、S、HまたはD、より好ましくはTまたはRである。5および6においては疎水性アミノ酸残基が好ましいにもかかわらず、これらの位置に親水性アミノ酸残基を有するのが好ましい場合もある。特に、アミノ酸残基5はT、RまたはSであってよく、かつアミノ酸残基6はTまたはRであってよい。同様に、位置9においては親水性アミノ酸残基が好ましい一方で、ある場合にはPまたはAのような疎水性残基が望ましいであろう。
本発明は、最小で10、11、12、13、14、15またはそれより長いアミノ酸長を有する、SH3ドメイン結合ペプチドをも意図する。このようなペプチドは、R-2-L-P-5-6-P(SEQ ID NO:71)のコア配列の、C末端またはN末端または両方において隣接する付加的なアミノ酸残基を含む。従って、例えばそのようなペプチドは、C末端に隣接して、式:10、10-11、10-11-12、10-11-12-13(SEQ ID NO:12)または10-11-12-13-14(SEQ ID NO:13)のアミノ酸配列をさらに含むペプチドを含む。ここで、各数字はシステイン以外のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基10はアミノ酸残基9とペプチド結合により結合するものとする。この場合、特定の態様は、T、R、L、S、D、P、AまたはN、好ましくはTまたはRであるアミノ酸残基10、R、P、A、Q、SまたはT、好ましくはRまたはPであるアミノ酸残基11、P、S、RまたはT、好ましくはPまたはSであるアミノ酸残基12、P、S、R、F、HまたはT、好ましくはPまたはSであるアミノ酸残基13、およびS、R、GまたはT、好ましくはSまたはRであるアミノ酸残基14を含む。
さらに、式:1'、2'-1'、3'-2'-1'または4'-3'-2'-1'(SEQ ID NO:14)のN末端隣接アミノ酸配列をさらに含むペプチドも提供される。ここで、各数字はシステイン以外のアミノ酸残基を示し、1'はRとペプチド結合により結合するものとする。このような場合、アミノ酸残基1'がT、P、S、N、F、W、K、H、QまたはG、好ましくはTまたはP、アミノ酸残基2'がS、T、G、P、R、Q、L、AまたはH、好ましくはSまたはT、アミノ酸残基3'がR、S、P、G、A、V、YまたはL、好ましくはSまたはT、およびアミノ酸残基4'がR、S、V、T、G、LまたはF、好ましくはRまたはSであるような特定の態様が提供される。
特定の態様においては、ペプチドのいずれかの位置に、式:3'-2'-1'-R-2-L-P-5-6-P-8-9-10(SEQ ID NO:15)のアミノ酸配列を含む、少なくとも13および最大45アミノ酸残基を有するペプチドが開示される。ここで、各数字はアミノ酸残基を示し、3'、2'、1'、2、8、および10は各々システイン以外の任意のアミノ酸残基、5および6は各々疎水性アミノ酸残基、および9はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を示し、各文字は標準的な一文字表記で対応するアミノ酸を示す。当該ペプチドはSrcのSH3ドメインに対して結合親和性を示す。好ましい13量体は、PまたはMであるアミノ酸残基5、T、P、SまたはNであるアミノ酸残基1'、SまたはTであるアミノ酸残基2'、RまたはSであるアミノ酸残基3'、およびTまたはRであるアミノ酸残基10を有するものを含むが、これに限定されない。本明細書に記載する全てのSH3ドメイン結合ペプチドにおいては、親水性アミノ酸残基であるシステイン(C)の禁止は、7量体の「コア」配列、およびコアに隣接する最大合計(コア＋隣接配列)約20アミノ酸の付加的なアミノ酸残基を越えては適用されない。即ち、場合によるシステインの使用は絶対的に禁止されているわけではない。留意すべき点は、分子内ジスルフィド結合が形成され、環状構造が形成される可能性をできるだけ最小化することである。出願人は、少なくとも、結合の可能性のある約15アミノ酸残基長より短いペプチドについて、環状構造が好ましくないらしいことを見出した。コア配列を含む環状構造の形成に対する懸念は、ペプチドのサイズの増加に伴い減少する。おそらく、十分大きい構造は、環状であっても、重要なコア配列が多かれ少なかれ線状構造を呈することを許容するであろう。
特に、SH3ドメインに結合親和性を示す特異的なペプチドが開示される。これらは、ペプチドRSTPRPLPMLPTTR(SEQ ID NO:62)、RSTPRPLPPLPTTR(SEQ ID NO:67)、GILAPPVPPRNTR(SEQ ID NO:63)、VLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)、GPHRRLPPTPATR(SEQ ID NO:65)、およびANPSPATRPLPTR(SEQ ID NO:66)を含む。
ファージクローンも、SH3ドメイン結合に関連するアミノ酸配列とともに開示される。これらのファージクローンは、図5に同定されている。
本発明の他の態様においては、SH3ドメイン結合ペプチドとして、合計11、13、14、18、20、22、23、25、30、36、38または45のアミノ酸残基を有するものがも意図される。
本明細書で開示される本発明のペプチドは、液相合成、固相合成、形質転換宿主による蛋白質発現、天然由来、合成または半合成ポリペプチドからの切断、またはこれらの技術の複合を含むがこれらに限定されない、いずれかの実質的な方法により調製されるであろう。
SH3結合ペプチドは、ペプチドの標的分子の天然の機能または生物学的活性の促進(または、特定のペプチドまたはペプチドの標的分子(この場合にはSH3ドメインを有する蛋白質)の特性によっては抑制)を含む広い範囲の生物活性を示す。例えば、本発明の結合ペプチドの相互作用は、SH3ドメインを有する標的分子の発癌活性を制御する結果となる可能性がある。一方、もし標的分子が天然の結合標的またはリガンドを有すれば、本発明のペプチドは、天然の結合標的の生物活性に関連する、アンタゴニストまたはアゴニスト活性をも示すであろう。
従って、本明細書に一般的に記載されたSH3ドメイン結合ペプチドの有効量を投与することにより、SrcまたはSrc関連蛋白質チロシンキナーゼを活性化する方法を提供することが本発明の目的である。従って、例えばTNF-alphaおよびインターロイキン-1といった、ある種のリンホカインの生成の上昇により、免疫応答の強度は刺激され得る。当該技術分野において通常の知識を有する者に一般的に知られているように、特に持続性の感染、ウイルスまたは他の病原体、または悪性疾患に対する防御といった、ある種の条件下において、より強い免疫反応が機能するであろう。
さらに、本発明の特定の態様においては、本発明のペプチドおよび第二の化合物成分を含む複合化合物が意図される。第二の化合物は、ペプチド自体を含む広範な化合物より選択され得る。しかし典型的には、第二の化合物は、アミノ酸、本発明のSH3結合ペプチド以外のペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質(即ち、複合物が融合蛋白質)、核酸、ヌクレオシド、糖残基(即ち、任意の糖または糖質)、標識または映像化促進試薬(金属、同位体、放射性同位体、クロモフォア、フルオロフォア(FITC、TRITCその他)、および酵素基質を含む)、薬剤(合成、半合成、および天然の化合物を含む)、低分子(例えばビオチン、ホルモン、因子)および同種類のものを含むがそれらに限定されない、本発明のペプチド以外のものが選択される。
本発明のペプチドは、第二の化合物に直接的(例えば、アミン、イミン、アミド、エステル、アシルまたは他の炭素-炭素結合を形成する、アミンまたはカルボキシル基といった適切な官能基を通じ)、またはリンカー基(脂肪族または芳香族ポリハイドロキシ、ポリアミン、ポリカルボン酸基、ポリオレフィン、またはそれらの適切な混成)の介在を通じ間接的に複合物を形成し得る。さらに、本明細書で用いられる「複合」という用語は、イオン結合、分子親和力または他の結合が例示されるがこれらに限定されない非共有結合をも含むことが意図される。好ましくは、そのような他の非共有結合は、特定可能な、最も好ましくは単離可能な化学複合体を提供する。
本明細書にさらに記載されたように、本発明のペプチドは、SrcまたはSrc関連蛋白質を含むある種の細胞画分内部に局在することが示されている。従って、上述の複合物は、SH3ドメイン含有蛋白質を含む細胞、組織または器官への薬剤の導入のための輸送機構として利用され得る。
本発明は、SH3ドメイン、好ましくはSrc SH3ドメインに結合する領域を有するペプチドをコードするコドンまたはヌクレオチド配列を含む、核酸またはその相補物を含む、組み換え構築物の提供を意図することも指摘されるべきである。組み換え核酸は、DNAまたはRNAポリヌクレオチドであろう。
特定の態様においては、本発明は形質転換ベクターである組み換え構築物を意図する。そのようなベクターとしては、組み換えプラスミド、ファージまたは酵母人工染色体といった、宿主への導入後のヌクレオチド配列の転移または発現に有効であり、当該技術分野において通常の知識を有する者によく知られているものが含まれる。これらのベクターは、閉環状または線状であろう。意図されるベクターは、宿主染色体内部に導入され、または染色体の一部と置換されるもののみならず、宿主形質転換または感染の後に染色体外に存在するものをも含む。ベクターは、当業者によく知られた感染手法または技術の補助により、細胞へ導入されるであろう。例えば、これらの手法または技術は、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、リポソーム、またはLIPOFECTINまたはLIPOFECTAMINEとして知られる極性脂質試薬の利用などの形態をとるであろう。さらに本発明は、例えば注入により、望まれる核酸を宿主細胞に直接導入することを意図する。
また、目的のポリヌクレオチド配列を産生および/または対応するペプチド産物を発現することができる形質転換された宿主細胞も本発明の方法によって得られる。原核および真核宿主細胞を含む種々の宿主が考えられる。特に、細菌、ウィルス、酵母、動物、および植物細胞は潜在的に形質転換され得る宿主である。即ち、SH3ドメインに結合する領域を有するペプチドを産生(好ましくは分泌)し得る形質転換宿主細胞を得るための一つの方法が開示される。この方法は、(a)SH3ドメインに結合する領域を有する少なくとも1コピーのペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター(好ましくは分泌性発現ベクター)の提供、および(b)コンピテント宿主細胞へのこのベクターの導入からなる。
このように産生したペプチドは、次に細胞、組織、器官に導入され、または被験者中のSH3ドメイン含有タンパク質の生物化学活性を操作する目的で被験者に投与され得る。即ち本発明の特定の態様においては、SH3ドメイン結合ペプチドからなり、コア配列および周辺配列および担体を含む組成物が提供される。
また本発明によって考えられる組成物には、組成物の導入または投与を容易にするものから、それ自体が予防、診断および治療活性等の活性を有するものでもよい他の構成物が含まれ得る。このようなそれ自体の活性は本発明のペプチドの活性とは異なるか、またはそれを相補する。どのような場合にも、本発明の組成物にはヒトを含む哺乳類への投与に適した組成物が含まれる。好ましくは、本発明の組成物(必然的に担体を含む)は無菌であるが、その他は美容的、農学的または医薬的に受容可能であればよい。さらにその他の組成物は獣医学的用途に適用され得る。
これらの組成物(本明細書に記載する薬剤投与システムを含む)は、非経口、経口、腸内、局所的、または吸入によって種々の方法で投与されると考えられる。これらの組成物はまた、鼻腔内、眼内、または膣内投与され得る。さらに、本発明の組成物は固体、ゲル、液体、エアゾールまたは膏薬等のいくつかの形態を取り得る。
本発明の別の態様においては、SH3ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定法が提供される。この方法は、(a)SH3ドメインを含む固定化された標的タンパク質を提供し、(b)この標的タンパク質をファージディスプレイ法によるランダムペプチドライブラリー(8アミノ酸残基以上のランダム配列を有するペプチドを含むライブラリー)由来の一部画分と反応させ、(c)非結合ファージを固定化標的タンパク質から洗い流し、(d)固定化標的タンパク質に結合したファージを回収し、(e)上記の結合ファージの核酸に関連したヌクレオチド配列を決定し、SH3領域結合ペプチドに対応する一次配列を推定することからなる。好ましくは、本方法はさらに回収されたファージの力価を増幅し、反応、洗浄および回収の段階を繰り返してSH3ドメイン結合ペプチドの豊富なファージを提供ことからなる。
しかし本発明においては、ランダムその他のペプチドライブラリーを「提示」し得るいかなる他の方法も利用され得る。さらに本出願人の考えでは、より長いランダムペプチド配列(例えば6アミノ酸残基以上、好ましくは10アミノ酸残基以上、最も好ましくは12アミノ酸残基以上)はより大きな多様性を提供するのみならず、結合活性を与えるさらに高度の二次構造を提供する。ペプチドのランダムな領域が8量体以下である場合、好ましくは環化されるべきではない。
5.2.ランダムペプチドライブラリーの調製
好ましいランダムペプチドライブラリーの調製および解析は他に記載されている(例えば、TSAR-9として知られるファージディスプレイランダムペプチドライブラリーの調製の記載についてはKay,B.K.ら、Gene(1992)128:59-65、さらに以下参照)。特に、一定の長さの縮重オリゴヌクレオチドをバクテリオファージベクターにクローニングすることによって、M13ウィルス粒子の表面のpIIIタンパク質のアミノ末端に発現されるランダムペプチドの組み換えライブラリーが生成される(各粒子上に3から5コピーのpIII融合分子が存在する)。ファージディスプレイによっていくつかの利点が提供される。第一に、発現されたペプチドはウィルス粒子の表面に存在し、相互作用が可能である。第二に、組み換えウィルス粒子は安定である(即ち凍結され得、極端なpHにさらし得る)。第三に、ウィルスは増幅され得る。第四に、各ウィルス粒子は組み換えゲノムをコードするDNAを含む。その結果、これらのライブラリーは標的に結合するウィルス粒子を単離することによってスクリーニングされ得る。単離された粒子は一晩培養され、結合を引き起こした提示ペプチド配列がDNA配列決定法によって推定される。
これらのライブラリーは約108以上の異なる組み換え体を有し、発現されるペプチドのアミノ酸配列は実際にランダムであることが挿入断片のヌクレオチド配列決定から示唆された。これらのライブラリーは本明細書ではTSARライブラリーと呼称し、TSARとは完全に(Totally)合成的な(Synthetic)親和性(Affinity)試薬(Reagent)を意味する。TSARライブラリーの調製は以下でさらに記載される。
5.3. SH3結合クローンおよびその特性
結果的に、SH3ドメインに対して結合親和性を示す複数のペプチドが非制限ランダムペプチドライブラリーから単離された。さらに、開示された複数のペプチドが示す結合親和性の選択性は、異なるタンパク質由来のSH3ドメインに対して同程度の結合親和性を示すいくつかのペプチドについて異なり、その他のペプチドは特定のSH3ドメインに対してより多きな親和性を示す。
本方法によって単離された種々のペプチドのアミノ酸配列の一覧を図5に挙げる。この一覧表から明らかなように、SH3ドメイン結合ペプチドのいくつかのグループが3つの別個のランダムペプチドライブラリー(各々は異なる型のランダムペプチド挿入断片に基づき、ランダムペプチドは全てM13ウィルス粒子表面のpIIIタンパク質のアミノ末端に提示される)から単離された。10個のクローンがR8Cライブラリーから、7個のクローンがTSAR-12ライブラリーから、7個のクローンがTSAR-9ライブラリーから単離された。SH3ドメインに直接結合すると考えられる特定のアミノ酸残基を明確にし、ランダム挿入断片のその他のアミノ酸残基および周辺ウィルス配列、およびクローンの各グループに共通の相補部位アミノ酸残基を示すように配列を示す。また、各々の特定のクローンが各ライブラリーから得られる頻度を図5に示す。即ち、クローンT12.SRC3.1およびT12.SRC3.2は3つのライブラリーの中で際だって最も多く見られるクローンである。
興味深いことに、全ての結合ペプチドは、プロリンに富むアミノ酸残基モチーフを有する。このモチーフは結合を引き起こすと考えられ、各クローンはN末端にも挿入断片を含むにも関わらず、挿入断片のC末端に多く存在する。この観察結果の重要性は現在不明であるが、この結果はSH3ドメイン結合におけるC末端の周辺ウィルス配列の重要性を示唆し得る。
実際、コア配列RPLPPLP(SEQ ID NO:9)のみを有する合成ペプチドは、コア配列の周辺に付加的なアミノ酸残基を含む合成ペプチドよりも標的SH3ドメインにに対する結合性が低かった。即ち、RSTPRPLPMLPTTR(SEQ ID NO:62)、RSTPRPLPPLPTTR(SEQ ID NO:67)、GILAPPVPPRNTR(SEQ ID NO:63)、GPHRRLPPTPATR(SEQ ID NO:65)、およびVLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)、を有する13量体および14量体が調製され、RPLPPLP(SEQ ID NO:9)の7量体よりも顕著にSrcおよびYesのようなSH3ドメインに結合することが示された。ANPSPATRPLPTR(SEQ ID NO:66)の13量体は、コアコンセンサス配列と同様の結合親和性を有することが示された。各々の場合で、13量体は7量体の「コア」配列とそれを取り巻く付加的のアミノ酸残基からなり、これらの付加的なアミノ酸残基のいくつかは周辺ウィルス配列からなる。
即ち本発明の一つの態様においては、7量体コアにはRXLPφφP(SEQ ID NO:71)という配列のコンセンサスモチーフが含まれる。ここでRはアルギニン、Lはロイシン、Pはプロリン、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸、φは疎水性アミノ酸残基を表す。本出願人による「疎水性アミノ酸残基」とは、F、Y、W、V、A、I、L、PまたはMを含み、各文字は標準的な一文字表記で対応するアミノ酸残基を示す。
さらに、コア配列のC末端に2つの付加的なアミノ酸を含む好ましい9量体ペプチドは、配列RXLPφφPXψ(SEQ ID NO:10)という配列のコンセンサスモチーフを有すると考えられる。この好ましい9量体コンセンサスモチーフにおいては、文字ψはシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表す。本出願人による「親水性アミノ酸残基」とは、K、R、H、D、E、N、Q、T、SまたはCを含み、他の文字は前述で定義された通りである。本発明の目的のためには、グリシン(G)残基は親水性または疎水性アミノ酸残基のいずれとしても考えられる。一文字表記のBおよびZは各々NまたはD、QまたはEを表し、親水性アミノ酸残基と考えられる。
本発明の特定の13量体ペプチドは以下に挙げるものを含む。しかし、以下の13量体ペプチド全てが上述の好ましい9量体配列に厳密に対応または従うわけではないことに留意すべきである。そこで対応性の低いこれらのペプチド(斜体で示し、コンセンサス配列に対応しないアミノ酸残基は下線で示す)は、好ましい9量体コンセンサスモチーフに対応するペプチド(標準体で示す)に「類似している」と表現され得る。
0004060886.tif 000002
ここから、特に開示されないが好ましい9量体コンセンサスモチーフに従うか「類似している」他のペプチドは、当業者によって容易に想像され得、上に特に開示したものと等価であると考えられる。特に、位置1(Rの代わりにS、GおよびIが許容される)、位置3(Lの代わりにV、AおよびQが許容される)、位置4(Pの代わりにLが許容される)、位置5(疎水性アミノ酸残基の代わりに親水性アミノ酸残基S、RおよびTが許容される)、位置6(疎水性アミノ酸残基の代わりに親水性アミノ酸残基RおよびTが許容される)、位置7(Pの代わりにTおよびSが許容される)、および位置9(疎水性アミノ酸残基の代わりにPおよびAが許容される)における厳密性が観察された。
5.3.1.結合特異性
開示される結合ペプチドのいくつかは、あるSH3ドメインに対して別のSH3ドメインよりも大きい相対的結合親和性を有することが発見された。図8に、異なる標的SH3ドメインに対する上述の種々のペプチドの相対的結合親和性のグラフを示す。明らかなように、各々のペプチドの相対的結合親和性は次数の大きさで異なり得る。即ち、図8に示すように、T12.SRC3.3として同定されたファージクローンの関連配列を有するペプチドGPHRRLPPTPATR(SEQ IDD NO:65)は、一例としてSrc、Yes、Lck、Hck、Fgr、FynおよびLynを含むSrcファミリーSH3ドメインに特異的である。このSH3結合性ペプチドはPLCγまたはGrb2由来のSH3ドメインに対してはほとんど親和性を有さない。一方、本方法によって得られた最も多い結合クローンの一つであるファージクローンT12.SRC3.1の関連配列に対応するペプチドGILAPPVPPRNTR(SEQ ID NO:63)は、Src、PLCγおよびGrb2を含む広範なSH3ドメインに一般的に結合する。
また中間的なレベルのものでは、Src指向性のファージクローンT12.SRC3.6の関連配列に対応するペプチドVLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)を本発明は発見した。即ちこのペプチドは、Srcファミリーのメンバーに対して強い結合親和性を示し、Grb2タンパク質に対しては小さい結合親和性を示すが、PLCγドメインに対してはほとんど結合親和性を示さない。ファージクローンT12.SRC3.2の関連配列に対応するペプチドANPSPATRPLPTR(SEQ ID NO:66)もまた、GPHRRLPPTPATR(SEQ ID NO:65)と同様のSrcファミリー特異性を示す。ペプチドRSTPRPLPMLPTTR(R8C.YES3.5;SEQ ID NO:62)およびRSTPRPLPPLPTTR(代表的なコンセンサスモチーフ;SEQ ID NO:67)は、Src、Yesおよび他のSrc近縁タンパク質のSH3ドメインに対して非常に特異的である。
5.4.結合実験のさらなる説明
先ず、SrcおよびSrc近縁タンパク質のSH3ドメインに対するいくつかのペプチドの結合親和性が好ましいコアコンセンサス配列RPLPPLP(SEQ ID NO:9)またはRPLPMLP(SEQ ID NO:95;即ちRPLP(P/M)LP,SEQ ID NO:96)の存在によってのみ支配されるのではないことは明らかである。即ち、合成ペプチドRSTPRPLPMLPTTR(R8C.YES3.5;SEQ ID NO:62)およびRSTPRPLPPLPTTR(コンセンサス;SEQ ID NO:67)はSrc SH3に対して強い特異的結合親和性を示すが、検査された他の合成ペプチドもまた、7量体RPLPPLP(SEQ ID NO:9)と比較してSH3ドメインに対する強い結合親和性を示した。これらの他のペプチド、GILAPPVPPRNTR(SEQ ID NO:63)、VLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)、GPHRRLPPTPATR(SEQ ID NO:65)、およびANPSPATRPLPTR(SEQ ID NO:66)は、好ましいコアコンセンサス配列に厳密に従わないコア配列および周辺配列の変種を有する。即ちこれらの結果から、SH3ドメインに対する結合親和性は主にコア7量体配列の周辺のアミノ酸残基の性質によって支配されることが示唆される。
Src SH3によって選択されたペプチドの結合特性は、Src SH3によって選択されたファージによって提示された配列に対応するビオチニル化合成ペプチドを用いて決定された。これらのビオチニル化ペプチドと固定化Src SH3-GSTとの直接結合の検査が行われた。5つのライブラリー由来のペプチドの検査された各々は、Src SH3-GSTおよびYes SH3-GSTに対して背景値以上に結合した(図8)。さらに、好ましいコアコンセンサス配列RPLP(P/M)LP(SEQ ID NO:96)に対するあるペプチドの類似性と、Src SH3-GSTに対するそのペプチドの親和性との間に強い相関関係が観察された。クローンT12.SRC3.1(GILAPPVPPRNTR;SEQ ID NO:63)のコア配列は、より包括的なSH3ドメイン結合特性を提供すると考えられる。
種々のタンパク質由来のSH3ドメインに対する種々のファージクローンの相対的な結合度の比較実験から、これらのクローンがSrcおよびSrc近縁SH3ドメインに対して、他のタンパク質由来のSH3ドメインに対するよりも指向性であることが示された。
さらに、コンセンサス配列7量体RPLPPLP(SEQ ID NO:9)はSrc SH3-GSTに弱くしか結合しないが、Src SH3によって選択されたクローンの一つ(R8C.YES3.5)に挟まれた(N末端にRSTP(SEQ ID NO:97)、C末端にTTR)コンセンサス配列からなるペプチドは検査されたどのペプチドよりも有意に強く結合することが発見された。即ち以前に記載したように、RPLP(P/M)LP(SEQ ID NO:96)コアを取り巻く配列が、SH3結合の重要な構成因子であると考えられる。さらに、配列RSTPAPPVPPRTTR(SEQ ID NO:98)を有するか類似したペプチドは、種々のSH3ドメインに対して強いが包括的な結合を示すことが推測される。
同様に、Src Sh3結合モチーフの多くはランダムペプチドのC末端近傍、全てのクローンで保存された配列の隣りに位置することが観察される(図5)。例外的なクローンの多くは、保存された周辺配列を含むモチーフに類似の配列を有する。このように配列が一箇所に集まることは、結合モチーフがランダムペプチド上に分散して存在するという以前の結果(Kay,B.K.ら、Gene(1993)128:59-65)と対照的である。
ライブラリー由来のSrc SH3結合ペプチドの結合は、天然のタンパク質のプロリンに富む領域の結合と比較された。ヒトPI-3'キナーゼのSH3結合領域に対応するペプチド(KISPPTPKPRPPRPLPV;SEQ ID NO:69)およびヒトSOS1.20に対応するペプチド(GTVEPVPPPVPPRRRPESA;SEQ ID NO:68)、および細胞骨格タンパク質ビンクリンのプロリンに富む領域(LAPPKPPLPEGEV;SEQ ID NO:70)は、ライブラリー由来ペプチドよりもかなり弱くSrc SH3に結合した(図7)。
上述したように、結合の相対的特異性が検査された。即ち、異なるタンパク質由来の等量のSrc SH3-GST融合タンパク質に対する、Src SH3によって選択されたペプチドの相対的な結合度が決定された(図8)。ライブラリー由来ペプチドは全てSrcおよびYes SH3ドメインにほぼ同程度に良く結合したが、Grb2、Crk、AblまたはPLCγ1のSH3ドメインには特に結合しなかった(検査された中で最も類似していないペプチド、ペプチドT12.SRC3.1は例外であった)。即ち、SOS1由来のペプチドとは反対にライブラリー由来ペプチドは、Srcファミリーのメンバーに相対的に特異的なSH3結合性を示す。
次に、Src SH3ドメインに対する結合が、細胞抽出液中に見られるSH3と天然タンパク質との相互作用と同様の性質であるかどうかが決定された。即ち、放射線標識タンパク質がNIH 3T3細胞抽出液から調製され、グルタチオンセファロース上に固定化されたSrc SH3-GST上でクロマトグラフィー操作された。SDS-PAGEから、多数のタンパク質がこの方法でアフィニティー精製され得ることが示された。合成ペプチドは細胞抽出液由来の放射線標識タンパク質の固定化Src-GSTに対する結合と競合し得るため、非常に良くSrc SH3ドメインに結合する(IC50は1から10mM)(図9)。即ち、これらのペプチドは細胞タンパク質とSrc SH3との試験管内相互作用を効率的に阻害し得る。
さらに、構成的に活性なSrcをコードするmRNAを注入されたXenopus laevis卵は、水またはc-Src mRNAを注入された卵と比較して早い速度でプロゲステロンによって成熟を誘導される(Unger,T.F.およびSteele,R.E.Mol.Cell.Biol.(1992)12:5485-5498)。ライブラリー由来のSrc SH3結合ペプチドが生体内で生化学的効果を発揮する能力を調査するために、Xenopus laevis卵の成熟にペプチドが及ぼす影響が調べられた。第VI期の卵がペプチドを注入され、プロゲステロンを与えられ、生殖顆粒崩壊を計測された。図10は、卵がSH3結合ペプチド(クローンT12.SRC3.6(VLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64))由来の残基によって挟まれたRPLPPLP(SEQ ID NO:9)からなる)を注入された場合に成熟の早さが約1時間早まったことを示す。対照として水またはビンクリンのプロリンに富む断片に対応するペプチド(LAPPKPPLPEGEV;SEQ ID NO:70)を注入された場合、成熟の早さは変わらない。この効果の強度は、構成的に活性なSrcをコードするmRNAの注入で見られるものとほぼ同等である(例えば、Unger,T.F.およびSteele,R.E.,前出の図3参照)。この結果から、Src PTK活性に対するSrc SH3ドメインの阻害効果をライブラリー由来のSrc SH3結合ペプチドが効果的に緩和することが示唆される。このモデルは、Srcのキナーゼおよびトランスフォーム活性に対するSrc SH3ドメインの阻害効果を示した多数の実験と一致している(例えば、Okada,M.ら、前出;Murphy,S.M.ら、前出;およびSuperti-Furga,G.ら、前出参照)。
5.5. SH3結合ペプチドに基づく診断および治療試薬、およびそのさらなる利用法
上述ですでに示したように、本発明は本明細書に記載するSH3結合ペプチドに基づいた診断、予防、および治療試薬を提供することをも目的とする。
一つの態様においては、SH3ドメイン結合ペプチドおよび上記ペプチドに直接、間接、または複合体形成によって結合した検出可能な標識からなる診断試薬が、好ましくはキットの形式で提供される。上記のペプチドは、(i)配列RXLPφφP(SEQ ID NO:71)のコア配列モチーフ(Xはシステイン以外のアミノ酸を表し、φはF、Y、W、V、A、I、L、P、MまたはGを含む疎水性アミノ酸残基を表す。各文字は標準的な一文字表記で対応するアミノ酸残基を示す。)、(ii)上記のコア配列のC末端またはN末端、または両方に存在する2つ以上の付加的なアミノ酸残基からなる。
本発明の診断試薬は、試験管内または生体内の細胞、組織、または器官中の一般的なまたは特定の型のSH3ドメインの存在を検出するために利用され得る。生体内の用途には、診断試薬は好ましくは薬理的に受容可能な担体と混合され、腸内、腸管外、または個々の使途の必要により用いられる他の経路で投与される。
特定の態様においては例えば、本発明のSrc SH3ドメイン結合ペプチドおよび、脱抑制または「活性化」されたSrcの基質からなる、融合産物に基づいた試験が考えられる。例えば、Rous sarcomaウィルスの感染の恐れのある験体由来の筋生検が、有効量の融合産物によって処理され得る。その後に基質の転換量の解析によって、験体(特に哺乳類、例外的に鶏)におけるRous sarcomaウィルスの感染を検出し得ると考えられる。Srcの脱抑制または「活性化」を引き起こすレトロウィルスは、転換された大量の基質によって明らかになる、一般的に高レベルのSrcによって検出され得る。例えば、Paxton,W.G.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1994)200(1):260-267(Srcファミリーチロシンキナーゼの基質、アンジオテンシンII AT1受容体のりん酸化チロシンおよびセリン残基の検出)参照。その他の適当な基質はp68タンパク質である(Fumagalli,S.ら、Nature(1994)368(6474):871-874;Taylor,S.J.およびShalloway,.Ibid.867-871)。
また、本発明のSH3ドメイン結合ペプチドへの選択的結合によって酵素が単離され得る(例えばビオチン-ペプチド結合体)。タンパク質-ペプチド結合複合体の単離(例えばストレプトアビジンを含むカラムによる)後、慣用的な方法によって酵素活性が測定され、脱抑制または「活性化」された型の酵素の存在の指標とし得るタンパク質キナーゼ活性のレベルを決定する。Srcキナーゼの検出試験はKlinzおよびManess,Neuroprotocols(a companion to Neuroscience)(1992)1(3):224-231に記載されている。
さらに、本発明の診断試薬は、細胞、組織または器官、特にSH3ドメインを有するタンパク質を含むものの映像化試薬として利用され得る。例えば、神経細胞(例えばニューロン、その他の脳の領域)、破骨細胞、骨芽細胞、血小板、免疫細胞および他の分裂細胞は、SH3ドメインを有するタンパク質を発現または含むことが知られている。即ち、験体の身体中の生理的または生化学的な変化を検出するための連続的映像の基準線となる、身体の一部の映像が得られる。例えば、細胞レベルのSrcの状態の変化、または細胞内Srcの「活性化」型への変換が、本発明の診断または映像化試薬によって検出され得る。
このようにして、蛍光放射分子で標識されたSH3結合ペプチドによって、細胞骨格の映像が提供され得る。この映像は図11に示す。図11に見られるように、パネルA、BおよびCが示すのは、蛍光標識を含むように修飾されたSH3ドメイン結合ペプチドでNIH 3T3細胞繊維芽細胞を処理して得られた蛍光画像である。極めて対照的に、パネルDでは対照のビンクリンのプロリンに富む断片で細胞を処理しても薄い画像しか得られない。
他の態様においては、SH3ドメイン結合ペプチド-セイヨウワサビ免疫ペルオキシダーゼ複合体、または類似の免疫組織化学試薬が、組織、血清または体液中の特定の受容体分子を検出および定量するために用いられ得る。特に本発明は、免疫試験、サザンまたはノザン・ハイブリダイゼーション、および生体内試験に有用な診断試薬を提供する。即ち、本明細書に記載する診断試薬は試験管内または生体内の利用に適すると考えられる。
さらに、本発明の診断または映像化試薬は、検出可能な標識の性質による制限を受けない。つまり診断試薬には、一例として放射性同位体、蛍光標識、常磁性物質、重金属、または他の映像増強試薬のような標識が1つ以上含まれる。通常の当業者には、標識およびそれを取り込みまたは結合させて診断薬を作製するためのSH3ドメイン結合ペプチドにするための方法の範囲は良く知られていると考えられる。
さらなる態様においては、SH3ドメイン結合ペプチドおよび薬理的に受容可能な担体からなる薬剤組成物が提供される。本発明の特定の態様においては、薬剤組成物はSH3ドメインを含むタンパク質の活性の調節に有用である。「調節」という用語は、標的タンパク質の活性の阻害または増強を意味する。これに従って、SH3ドメイン結合ペプチドおよび薬理的に受容可能な担体からなる薬剤組成物が開示される。上記のペプチドは、(i)配列RXLPφφPXψ(SEQ ID NO:10)(Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を、φは疎水性アミノ酸残基を、ψはシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表す。各文字は標準的な一文字表記で対応するアミノ酸残基を示す。)の9量体配列モチーフ、およびこの9量体配列のN末端、C末端または両方に存在する付加的なアミノ酸残基(上記の9量体を含み、最大45アミノ酸残基)からなってもよい。好ましくは、このペプチドは9量体配列の周辺に少なくとも1、好ましくは少なくとも2、最も好ましくは少なくとも3個の付加的なアミノ酸を含む。
上述したように、本発明の治療または診断試薬には、適当な薬理的に受容可能な担体、希釈剤、およびアジュバントも含まれる。このような薬剤担体は、例えば水およびオイル(石油、動物、植物または合成の(例えばピーナッツオイル、サヤエンドウオイル、ミネラルオイル、ゴマ油その他))のような無菌の液体であり得る。薬剤組成物が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。液体担体としては、特に注射溶液として、塩溶液および水溶性ぶどう糖およびグリセロール溶液も用いられ得る。適当な薬剤補形薬には澱粉、グルコース、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールその他が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉、放出遅延製剤の形をとり得る。適当な薬剤担体はE.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
このような組成物には、験体への適切な投与形態を提供するために、適当量の担体と治療上有効量の活性化合物が含まれると考えられる。静脈内注射は非常に効果的な投与形態であるが、一例として筋内、腹腔内および皮下注射、および口内、鼻腔内、腸内および非経口投与を含む他の方法も利用され得る。
本発明の治療および診断試薬は、動物、より好ましくはヒト、犬、猫、馬、牛、豚、モルモット、マウスおよびラットを含む哺乳類の治療および/または診断に用いられる。それに応じて、本発明で考慮される他の方法には一例として、本発明のSH3ドメイン結合ペプチドの有効量を導入または投与することによる、哺乳類の骨再吸収の制御(即ち阻害または増強)の方法(例えばHall,T.J.,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1994)199(3):1237-44参照)、タンパク質チロシンキナーゼを介する信号伝達系路の遮断法、または細胞内のRNAのプロセシング、輸送または翻訳の制御法が含まれる(例えば、Taylor,S.J.およびShalloway,D.,前出参照)。
本発明の治療または診断試薬は、タンパク質、多糖または合成ポリマーのような可溶性巨大分子への結合によって修飾され得る。例えば、ペプチドはスチレン-マレイン酸共重合体(例えばMatsumuraおよびMaeda,Cancer Res.(1986)46:6387参照)、メタクリルアミド共重合体(KopececkおよびDuncan,J.Controlled Releas(1987)6:315)、またはポリエチレングリコール(PEG)(例えばHershfieldおよびBuckley,N.Engl.J.Med.(1987)316:589;Hoら、Drug Metab.Dispos.(1986)14:349;Chuaら、Ann.Intern.Me.(1988)109:114)に結合され得る。望ましい場合、試薬はさらに抗体、特に単クローン抗体への結合によって標的化される。そのような抗体には、一例としてキメラ、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーが含まれる。一つの態様においては、試薬が生体内で活性型で放出されるような分解可能な結合を介して、試薬が巨大分子に結合される。
他の態様においては、治療または診断試薬は顆粒、特にリポソーム中で投与され得る(例えばLanger,Science(1990)249:1527-1533;Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(Lopez-BeresteinおよびFidler編,Liss,New York)(1989)353-365;Lopez-Berestein,ibid.,317-327)。
さらに他の態様においては、治療または生体内診断試薬は放出調節系中で投与され得る。一つの態様においては、ポンプが用いられ得る(Langer,前出;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.(1987)14:201;Buchwaldら,Surgery(1980)88:507;Saudekら,N.Engl.J.Me.(1989)321:574参照)。またある態様では、ポリマー性材料が用いられ得る(Medical Applications of Controlled Release(LangerおよびWise編,CRC出版,Boca Raton,フロリダ)1974;Controlled Drug Bioavaiilability,Drug Product Design and Performance(SmolenおよびBall編,Wiley,ニューヨーク)1984;RanerおよびPeppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.(1983)23:61参照;また、Levyら、Science(1985)228:190;Duringら、Ann.Neurol.(1989)25:351;Howardら、J.Neurosurq(1989)71:105参照)。好ましい態様においては、放出制御系は治療標的の近傍に配置され得、全身投与の一部のみで十分である(例えばGoodson,Medical Applications of Contolled Release,前出(1984)2:115-138)。本発明の特異的な利点が、ペプチドが変性または会合のような問題を生じないことであることは、当業者によって認識されると考えられる。このような問題は中程度の温度に置かれたタンパク質に見られ、放出制御系の生体環境の多くは中程度の温度である。
他の放出制御系はLanger,Science(1990)249:1527-1533の総説に記述がある。
5.6. SH3ドメインを含むタンパク質とそのリガンドの結合に影響する化合物の同定
新薬の開発における共通の問題は、望ましい特性を有さない大量の化合物の背景の中から、望ましい特性を有する単一または少数の化合物を同定することである。この問題は、植物、動物または微生物原由来の天然産物である化合物の試験、および人口化合物の試験の両者において生ずる。典型的には、数百、または数千もの化合物がランダムにスクリーニングされる。このスクリーニングは、例えば何らかの酵素活性への化合物の効果、または受容体または他のタンパク質のような表示物質に対する化合物の結合能をモニターするような試験管内試験の利用によって行われる。
この一次スクリーニング試験を通過した化合物は、「開始」化合物として知られる。次にこれらの開始化合物は、最終的な動物およびヒトの生体内試験を含むさらなる試験を受けた。この試験によって、当初の試験管内試験において開始化合物が示した可能性は肯定または却下される(Remington's Pharmacentical Sciences,1990(A.R.Gennaro編Mack Publishing Co.,Easton,PA)第8章,60-62;EckerおよびCrooke,Bio/Technology(1995)13:351-360参照)。
当然、上述した第一段階の試験を構成する試験管内試験によって、新しい化合物を試験する必要性は常に存在する。また、それらの化合物の薬理活性を試験し得る新しい試験法の必要性も常に存在する。本発明の一つの目的は、SH3ドメインを含む蛋白質またはポリペプチドと、SH3ドメインのリガンドとの間の結合に、ある候補化合物が影響を与え得るかどうかを決定するそのような新しい試験法を提供することである。この結合に影響を与え得る化合物は、SH3ドメインを含む蛋白質またはポリペプチドの薬理活性を調節する手段として有用であると考えられる。本発明は、そのような試験に利用されるSH3ドメインの適当なリガンドを提供する。そのような試験は、SH3ドメインが一例としてコルタクチン、Nck、Abl、PLCγ、Src、p53bp2、Crk、YesおよびGrb2由来のSH3ドメインを含む場合に行われ得る。
本発明は、SH3ドメインおよびSH3ドメインのリガンドを含む分子の結合に影響を与える化合物の同定法を提供する。この結合への影響は、結合の総量または結合の親和性の増加または減少であり得る。好ましくは、この効果は阻害(結合の減少または喪失)である。
つまり、本発明はSH3ドメインを含む第一の分子と、SH3ドメインに結合する第二の分子との間の結合の阻害剤の同定法を提供する。この同定法は、結合の起きる条件下で第一の分子と第二の分子の阻害剤を選択することが期待される1つ以上の化合物を反応させ、第一の分子と第二の分子の結合を阻害する1つ以上の化合物を検出することからなる。
上に記載された方法の特定の態様においては、第二の分子は以下のようにして得られる。(i)SH3ドメインに結合するペプチドを得るためにSH3ドメインでペプチドライブラリーをスクリーニングし、(ii)段階(i)で得られたペプチドのコンセンサス配列を決定し、(iii)コンセンサス配列からなるペプチドを合成する。ここで、第二の分子はコンセンサス配列を含むペプチドからなる。
他の態様においては、第二の分子は以下のようにして得られる。(i)SH3ドメインに結合するペプチドを得るためにSH3ドメインでペプチドライブラリーをスクリーニングし、(ii)段階(i)で得られたペプチドのコンセンサス配列を決定し、(iii)段階(ii)のコンセンサス配列に類似のアミノ酸配列を同定するためにデータベースを検索し、(iv)段階(iii)で同定されたアミノ酸からなるペプチドを合成する。ここで、第二の分子は(iii)で同定されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる。
SH3ドメインに結合する第二の分子は例えば、ランダムまたは組み合わせペプチドまたは非ペプチドライブラリーのような、多様性ライブラリーの利用によって得られる。これらのライブラリーから、特異的にSH3ドメインに結合する分子がスクリーニングされ得る。当分野においては、例えば化学合成ライブラリー、組み換え(例えばファージディスプレイライブラリー)、および試験管内翻訳に基づくライブラリーのような、利用され得る多くのライブラリーが知られている。
化学的に合成されたライブラリーの例は、Foderら,1991,Science 251:767-773;Houghtenら,1991,Nature 354:84-86;Lamら,1991,Nature 354:82-84;Medynski,1994,Bio/Technology 12:709-710;Gallopら,1994,J.Medical Chemistry 37(9):1233-1251;Ohlmeyerら,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926;Erbら,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422-11426;Houghtenら,1992,Biotechniques 13:412;Jayawickremeら,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1614-1618;Salmonら,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11708-11712;PCT公開第WO 93/20242号;およびBrennerおよびLerner,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5381-5383に記載されている。
ファージディスプレイライブラリーの例はScott end Smith,1990,Science 249:386-390;Devlinら,1990,Science 249:404-406;Christian,R.B.ら,1992,J.Mol.Biol.227:711-718;Lenstra,1992,J.Immunol.Meth.152:149-157;Kayら,1993,Gene 128:59-65;および1994年8月18日の日付であるPCT公開第WO 94/18318号に記載されている。
試験管内翻訳に基づいたライブラリーは、1991年4月18日の日付であるPCT公開第WO 91/05058号;およびMattheakisら,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-9ワ26に記載されているものを含むがこれに限らない。
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー(例えば、Buninら,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4708-4712を参照)が使用のために適用されうる。ペプチドライブラリー(Simonら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9367-9371)もまた使用されうる。使用できる別のライブラリーの例は、ペプチドにおけるアミド官能基が完全にメチル化されて化学的に変化した化合物のライブラリーを産生するものであり、Ostreshら(1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11138-11142)に記載されている。
ライブラリーの検索は一般的に既知である様々な方法のいずれかによって達成されうる。例えば、以下に示したペプチドライブラリーの検索を開示する参考文献を参照のこと:ParmleyおよびSmith,1989,Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218;ScottおよびSmith,1990,Science 249:386-390;Fowlkesら,1992,BioTechniques 13:422-427;Oldenburgら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5393-5397;Yuら,1994,Cell 76:933-945;Staudtら,1988,Science 241:577-580;Bockら,1992,Nature 355:564-566;Tuerkら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6988-6992;Ellingtonら,1992,Nature 355:850-582;すべてLadnerらの米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号、および米国特許第5,198,346号;RebarおよびPabo,1993,Science 263:671-673;およびPCT公開第WO 94/18318号。
ある特定の態様においては、検索はライブラリーの構成因子を固相に固定化されたSH3ドメインと接触させ、SH3ドメインに結合するそれらのライブラリーの構成因子を回収することによって遂行されうる。「ふるい法(panning)」技術と呼ばれるそのような検索方法の例は、ParmleyおよびSmith,1988,Gene 73:305-318;Fowlkesら,1992,BioTechniques 13:422-427;PCT公開第WO 94/18318号;および以上に記載した参考文献に例として記載されている。
本発明の別の態様においては、SH3ドメインに特異的に結合する分子を同定するために、酵母内における相互作用タンパク質の選択のためのツーハイブリッド法(FieldsおよびSong,1989,Nature 340:245-246;Chienら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582)が使用可能である。
本発明の典型的な分析は少なくとも以下の組成物からなる:(1)SH3ドメインを含む分子(例えば、タンパク質またはポリペプチド);(2)SH3ドメインのリガンド;(3)SH3ドメインを持つタンパク質とリガンドとの結合に影響を与える能力をもつ疑いのある候補化合物。分析用成分はさらに(4)SH3ドメインを含むタンパク質とリガンドとの結合を検出する手段を含む。それらの手段は、例えばタンパク質、リガンド、または候補化合物に付着させた検出可能な標識である。
本発明の別の態様においては、本発明は、以下の工程を含み、SH3ドメインを含む分子とSH3ドメインのリガンドとの結合に影響を与える化合物を同定するための方法を供給する:
(a)候補化合物の存在下において結合に適切である条件下でSH3ドメインとリガンドを接触させること、およびSH3ドメインとリガンドとの結合量を測定すること:及び
(b)段階(a)における結合量と、候補化合物の非存在下で分子とリガンドの間に起こることが既知または決定されている結合の量を比較すること、すなわち段階(a)における結合量と、候補化合物の非存在下で分子とリガンドの間に起こることが既知または決定されている結合の量との差異は、候補化合物がSH3ドメインを含む分子とリガンドの結合に影響を与える化合物であることを示唆する。
本発明の分析のための、1個またはそれ以上の成分を含むキットが、1個またはそれ以上の容器で供給される。例えば、SH3ドメインを含む第一の分子およびSH3ドメインに結合する第二の分子である。
本発明のある態様においては、分析は、候補化合物の存在下および非存在下で、候補化合物によってその結合が破壊されたりまたは妨害されたりしない限り、リガンドのSH3ドメインをもつタンパク質への結合が起きるような条件下で、SH3ドメインをもつタンパク質またはポリペプチドがSH3ドメインのリガンドへ接触することを可能にすることを含む。候補化合物の存在下におけるSH3ドメインを有するタンパク質へのリガンドの結合量を検出すること、および、その結合量と候補化合物の非存在下におけるSH3ドメインを有するタンパク質またはポリペプチドへのリガンドの結合量を比較することによって、候補化合物が結合に影響を与えることによってSH3ドメインを有するタンパク質の活性の調節のために有用な鍵となる化合物であるか否かを決定することが可能である。候補化合物の効果は結合を増加させる効果、または減少させる効果のいずれであってもよい。
本発明における使用のために適している分析のひとつの形態は、SH3ドメインを有するタンパク質のマイクロタイタープレートの穴などの固形支持体への結合を含む。SH3ドメインを有するタンパク質またはポリペプチドのそのリガンドへの結合を穴内で可能にする条件を確実にするために、その穴は適した緩衝液およびその他の物質を含む。リガンドおよび候補化合物を次に穴に加える。リガンドは好ましくは標識する。例えば、ビオチン化または放射性物質で標識するか、または例えばアルカリホスファターゼなどの酵素と結合させる。適切な時間のインキュベーションの後、未結合のリガンドおよび化合物を除去するためにその穴を洗浄する。もし候補化合物が、SH3ドメインを有するタンパク質またはポリペプチドの標識されたリガンドへの結合を妨害しないならば、標識されたリガンドは穴内でSH3ドメインを有するタンパク質またはポリペプチドに結合すると考えられる。そのためこの結合は検出される。もし候補化合物がSH3ドメインを有するタンパク質またはポリペプチドと標識リガンドとの結合を妨害するならば、標識は穴に存在しないか、または、SH3ドメインを有するタンパク質またはポリペプチドおよび標識されたリガンドを含むが候補化合物を含まない対照の穴と比較してより少量が存在するはずである。勿論、候補化合物の存在がSH3ドメインを有するタンパク質またはポリペプチドと標識されたリガンドとの結合を上昇させる可能性もある。あるいは反対にに、分析は、リガンドを固相支持体に付着させて行うこともできる。
本発明は上記のような分析に使用するために適したSH3ドメインを結合する能力のあるリガンドを提供する。本発明により提供されたリガンドは以下の表1-13に開示されたSH3ドメイン結合アミノ酸配列および、それらのアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを含む。本発明はまた、以下の表1-13に開示されたSH3ドメイン結合アミノ酸配列をコードする核酸配列をも供給する。
6.  実施例
6.1  TSAR-9ライブラリーの調製
6.1.1 オリゴヌクレオチドの合成および構築
図1はオリゴヌクレオチドの構造式とTSAR-9ライブラリーの作製に用いた構築計画を示す。オリゴヌクレオチドはapplied Biosystems 380a合成機(Foster City,CA)によって合成し、全長のオリゴヌクレオチドはHPLCによって精製した。
一対のオリゴヌクレオチドの各々の5マイクログラムを、0.1% Triton X-100,2mM dNTP's,および20ユニットのTaqポリメラーゼを含む緩衝液(10mM Tris-HCl,pH8.3,15mM KCl,0.001%ゼラチン,1.5mM 塩化マグネシウム)内で混合した。この構築反応混合物は73℃で30秒インキュベーションし、次に30℃で30秒インキュベーションした;このサイクルは60回繰り返した。変性工程が使用されていないため、この構築反応はPCRではないことに注意すべきである。サーマルサイクリング装置(Ericomp,LaJolla,CA)において以下の計画によって補充(fill-in)反応が行われた:72℃30秒、30℃30秒、これの60回の繰り返し。低い方の温度は2組のオリゴヌクレオチドの組の間の6塩基の相補領域の再対合(アニーリング)を可能にする。反応産物はフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。90%以上のオリゴヌクレオチドが二重鎖合成オリゴヌクレオチドに変換されたことが明らかとなった。
10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTAを含む300μLの緩衝液(TE緩衝液)に再懸濁した後、オリゴヌクレオチド断片の末端を供給者の推奨に従ってXbaIおよびXhoI(New England BioLabs,Berverly,MA)によって開裂させた。断片は4%アガロースゲル電気泳動によって精製された。正しい大きさのバンドを取り出して電気溶出し、エタノール沈殿により濃縮化し、100μL TE緩衝液に再懸濁した。構築されたオリゴヌクレオチドの約5%が内部XhoIまたはXbaI部位を有すると期待されうる;しかし、全長を有する分子のみを構築計画のライゲーション工程に使用した。合成オリゴヌクレオチド断片の濃度は適切な定量されたマーカーとともに泳動し、臭化エチジウム染色したゲルにおける強度によって推算した。詳細を記載しなかったすべてのDNA操作は上記のManiatisに従って行った。
構築した酵素消化されたオリゴヌクレオチドがライゲーションされうることを示すために、合成DNA断片の自己ライゲーションの能力を調べた。消化された断片はT4 DNAリガーゼを含むライゲーション緩衝液内において18℃で一晩インキュベーションした。ライゲーション産物をアガロースゲル電気泳動により調べたところ、臭化エチジウム染色により鎖状多量体(concatamer)のバンドが見られた。5種類の異なる結合長の鎖状多量体のバンド(すなわち、2量体、3量体、4量体、5量体、6量体)が明白に認められ、合成DNA断片がライゲーションのための効果的な基質であることが示唆された。
6.1.2 ベクターの構築
TSARライブラリーを発現するための有用なM13由来のファージベクターの構築が近年記載されている(Fowikes,D.ら,BioTech.(1992)13:422-427)。TSAR-9ライブラリーを発現するために、Fowlkesにより記載されている様にM13由来のベクターM663を構築した。m663ベクターは、マチュアーなN末端に導入されXhoIおよびXbaI部位が隣接するようなすなわち詰め込み断片(stuffer fragment)として、c-myc-抗原決定基を有するpIII遺伝子を含む(Fowlkesの図Iも参照のこと)。
6.1.3.  TSAR-9ライブラリーの発現
合成されたオリゴヌクレオチドは、リガーゼと12℃で一晩インキュベーションすることにより、pIII遺伝子(Fowlkes)を有するXhoIおよびXbaIにより二重消化したm663 RF DNAへ連結反応(ライゲーション)した。さらに詳しく述べると、50ngのベクターDNAおよび5ngの消化された合成DNAを、T4 DNAリガーゼを含む50μLのライゲーション緩衝液(50mM Tris,pH8.0,10mM MgCl2,20mM DTT,0.1mM ATP)の中で混合した。12℃で一晩ライゲーション反応を行った後、DNAをエタノール沈殿によって濃縮化し、70%エタノールで洗浄した。連結されたDNAは電気穿孔法により大腸菌E.coli(DH5αF';GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)に導入した。
電気穿孔法処理された大腸菌の一部分をプレートに撒き、プラークの数を数え、て、108個の組換え体が産生されたことを確認した。組換えファージの1回の増幅のために、組換えベクターを有する大腸菌細胞のライブラリーを高密度(150mmペトリ皿に対して約400,000個)でプレートに撒いた。8時間後、組換えバクテリオファージは各々の皿を18時間SMG緩衝液(100mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH7.5,10mM MgCl2,0.05%ゼラチン)で洗浄することにより回収し、グリセロールを加えて50%にした後、-80℃で冷凍した。このように形成されたTSAR-9ライブラリーは約2ｘ1011pfu/mlの力価の働きを有した。
6.2.  TSAR-12ライブラリーの調製
図2はTSAR-12ライブラリーの作製に用いた合成オリゴヌクレオチドの構造式と構築計画を示す。図2に示したように、TSAR-12ライブラリーは上記の6.1節に記載したTSAR-9ライブラリーと物質的に同様に調製したが、以下の点は例外である:(1)変異型の、予期せぬオリゴヌクレオチド配列の各々、すなわちNNBは、長さにして54ヌクレオチドではなく30ヌクレオチドであった;(2)変異型の、予期せぬ配列の5'末端に含まれた制限酵素部位はXhoIおよびXbaIではなく、SalIおよびSpeIであった;(3)2本の鎖の再対合(アニーリング)を促進する3'末端の非変異型の配列は(5'から3'方向に)CCAGGTおよびGGTCCAではなく、GCGGTGおよびCGCCACであった。
上記6.1.1節に記載したようにして、dNTP'ｓおよびTaqポリメラーゼの存在下における多くの回数の再対合および鎖伸長反応を含む合成および精製の後、合成した二重鎖のオリゴヌクレオチド断片をSalIおよびSpeI制限酵素で消化し、T4 DNAリガーゼによってm663ベクター内に含まれているM13 pIII遺伝子をコードするヌクレオチド配列と連結反応を行い、第6.1.2および6.1.3節に記載するTSAR発現ベクターのライブラリーを産生した。連結されたDNAは次に大腸菌(DH5αF';GIBCO BRL,Gaitherburg,MD)に電気穿孔法により導入した。大腸菌の細胞のライブラリーは組換えファージの増幅のため、高密度に(150mmペトリ皿に対して約400,000個)プレートに撒いた。およそ8時間後、SMG緩衝液で18時間洗浄することで組換えバクテリオファージを回収し、グリセロールを加えて50%にした後、-80℃で冷凍した。
このように形成したTSAR-12ライブラリーは約2ｘ1011pfu/mLの力価の働きを有した。
6.3.  TSAR-9および-12ライブラリーの性質決定
第6.1および6.2節に記載した各々のTSARライブラリーにおいて挿入された合成オリゴヌクレオチドは潜在的に2036(約1047)および2020のコード複雑性を有し、約1014個の分子を各々の形質転換実験に使用したため、これらのTSARライブラリーの構成因子はユニークであると考えられる。プレートでの増幅の後、ライブラリーの溶液または保存物は一因子につき104コピー/mLを有する。
両方のライブラリーにおいてこれまでに性質決定された挿入されたオリゴヌクレオチド配列のきわめて少数(<10%)が欠失または挿入を示した。これは、使用した条件下でのオリゴヌクレオチドの構築の精度、およびある種の変異(すなわち、読み枠のずれ(フレームシフト)など)がファージ増殖のために必須のタンパク質であるpIIIとして許容されないという事実を反映していると思われる。
これらのライブラリーによって発現される変異型の予期せぬペプチドに、おそらくオリゴヌクレオチド合成の間の試験管内でまたは増殖するファージによる発現の間に生体内で生じる可能性があるコードの偏りがあるか否かを決定するために、以下のように挿入体の配列を決定した。
6.3.1.  TSAR-9ライブラリーの特性解析
TSAR-9ライブラリーから無作為に選択した23の単離体に挿入された合成オリゴヌクレオチド断片を調べた。大腸菌(DH5αF')細胞を含む1mlの2xYT肉汁に接種するために個々のプラークを使用し、培養は通気とともに37℃で一晩増殖させた。DNAは上述のManiatisに従って培養の上清から単離した。23の個々の単離体は、TSARSの発現に使用したm663ベクターのpIII遺伝子クローニング部位の89ヌクレオチド下流であるオリゴヌクレオチド5'-AGCGTAACGATCTCCCG(SEQ ID NO.99)をプライマーとしてSangerの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)74:5463-5467)に従って配列を決定した。
ヌクレオチド配列およびそれらのコードするアミノ酸配列はMacVector計算機プログラム(IBI,New Haven,CT)を用いて解析した。アミノ酸の頻度を求めるためにはMicrosoft EXCELプログラムを使用した。それらの解析は、発現したタンパク質のTSAR-9ライブラリーにおいて、大部分のアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンが予想された頻度で出現することを示した。注目すべき例外はグルタミンおよびトリプトファンであり、それらは各々、過大および過小の出現であった。
挿入配列内にTAG停止コドンが少数であったことに注目すべきで興味深い。すなわち、性質決定した約200個の単離体のうち僅か2個のみがTAG停止コドンを含んでいた。使用した構築計画から考えて、ファージ挿入配列のおよそ半分［1-(47/48)36］が少なくとも一つのTAG停止コドンを有することが予想された。しかしながら、バクテリアの宿主がsupEであるにも関わらず、TAGを持つファージの大部分はライブラリーから失われてしまったと考えられる。これは、抑圧の効果が100%未満であったことの結果であると考えられる。
挿入された二重鎖合成オリゴヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、固定されたPGをコードする中央部分を除いて一本の配列へと結びつけ、Microsoft EXCELプログラムを用いて各々のアミノ酸の使用頻度を決定した。これらの頻度はオリゴヌクレオチドの構築計画から期待される頻度と比較し、期待値から求めた分散を基線の上および下に棒の長さで表した。偏差の有意性を決定するためにカイ二乗解析を使用した。大多数のアミノ酸は期待された使用頻度で出現することが分かったが、注目すべき例外はグルタミンおよびトリプトファンが各々幾分過大および過小に出現している点であった。このように、不可変のPro-Glyを除いたいずれの位置においても、いずれのアミノ酸をも取りうるため、その配列は予想できないもの、または無作為なものである。
6.3.2.  TSAR-12ライブラリーの性質決定
TSAR-12ライブラリーに由来するおよそ10個の無作為に選んだ挿入オリゴヌクレオチドを上記第6.3.1節に記載したDNA配列決定により調べた。単離体はTSAR-12ライブラリーから無作為に選択し、TSAR-9ライブラリーの単離体の場合と同様に配列決定のための調製を行った。解析は、不可変のGlyを除いていずれの位置においても、いずれのアミノ酸をも取りうるため、その配列は予想できないもの、または無作為なものであることを示した。
6.4.  R8Cライブラリーの調製
図3を参照すると、2種類のオリゴヌクレオチドをApplied Biosystemsモデル380a装置において合成した。その配列は5'-TGACGTCTCGAGTTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGATCTAGAAGGATC-3'(SEQ ID NO:31)および5'-GATCCTTCTAGATCC-3'(SEQ ID NO:32)であり、NはデオキシヌクレオチドA,C,G,およびTが等モル比であり、KはGおよびTが等モル比である。50pmolの各々のオリゴヌクレオチドを、0.1μg/μLアセチル化BSAおよび10mM DTTとともに50μLのSequenase(登録商標)緩衝液(U.S.Biochemicals,Cleveland,OH)内で、42℃で5分、次に37℃で15分インキュベーションした。再対合反応(アニーリング)の後、10ユニットのSequenase(登録商標)(U.S.Biochemicals)および0.2mMの各dNTPを加え、37℃で15分インキュベーションした。次に試料を65℃で2時間加熱し、100ユニットのXhoIおよびXbaI(New England Biolabs,Beverly,MA)の両方で消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、15%非変性ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。構築され、消化された断片は連結反応前にゲル精製を行った。ベクターであるm663(Folkes,D.ら,Biotech.(1992)13:422-427)はXhoIおよびXbaIによる消化、仔ウシアルカリホスファターゼ(Boeringer Mannheim,Indianapolis,IN)処理、フェノール抽出により調製し、アガロースゲル電気泳動により精製した。連結反応にあたり、製造者に従い、T4 DNAリガーゼ(Boeringer Mannheim)を含む3mL内で、20μgのベクターを0.2μgの挿入配列と連結させた。フェノール抽出およびエタノール沈殿によるタンパク質および緩衝液の除去の後、連結したDNAを大腸菌XL1-Blue株(Stratagene,San Diego,CA)に電気穿孔導入し、プレート上で37℃,8時間培養した。組換えファージを回収するため、上層の寒天をスパーテルで回収し、等量の100mM NaCl,10mM MgCl2,および50mM Tris-HCl(pH7.5)と混合し、18-ゲージシリンジ針を2回通して破壊した。バクテリアの細胞は遠心により除去し、ファージ粒子はポリエチレングリコール沈澱により回収して25%グリセロール内において-70℃で保存した。ライブラリーは総数108個の組換え体および6ｘ1012pfu/mLの実勢力価を持つ。
ライブラリーの構成員はポリメラーゼ連鎖反応(Saikiら,Science(1988)239:487-491)によって挿入配列を調査した。ペトリ皿上の個々のプラークを滅菌した楊枝で触れ、その先端をF+大腸菌バクテリアとともに2xYTの中に入れて撹拌し、通気とともに37℃で一晩インキュベーションした。5マイクロリットルのファージ上清を、緩衝液(67mM Tris-HCl,pH8.8/10mM β-メルカプトエタノール/16.6mM硫酸アンモニウム/6.7mM EDTA/50μgウシ血清アルブミン/1mL)および0.1mMデオキシヌクレオチド三リン酸、および1.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼ(Boeringer Mannheim,Indianapolis,IN)を含む新しいチューブに、100pmolのオリゴヌクレオチドプライマーとともに移した。プライマーはm663の遺伝子IIIにおけるクローニング部位に隣接させた(5'-TTCACCTCGAAAGCAAGCTG-3'(SEQ ID NO:100)および5'-CCTCATAGTTAGCGTAACG-3'(SEQ ID NO:101))。構築反応は、94℃1分、56℃2分、および72℃3分でインキュベーションし、このサイクルを24回繰り返した。反応産物をNuSieve 2.0%アガロースゲル(FMC,Rockland,ME)における電気泳動で分離した。ゲル解析により、試験した20個のプラークに対して、その全てが組換え体であり、期待された大きさの単一の挿入配列を有していることが明らかとなった。
ライブラリーの標本の大きさを基に考えると、100%の組換え体が単一の挿入配列を持つことが予想された。しかしながら、R8Cライブラリーから単離されたSH3結合ファージの全てが二重の挿入配列を有していた。このようなファージはライブラリー内においては稀である(すなわち、<5%)と推定されるが、SH3結合ペプチドは直線上であることが必要であると思われたため、それらが我々のスクリーニング方法によって選択された。それらはおそらくライブラリーの産生の間に形成されたと思われるが、一つの筋書きとしては、挿入配列どうしが連結して頭部と頭部とで二量体を形成し、その後それらがベクターのXhoI接着末端との連結反応およびベクターのXbaI部位との不当な連結反応によってm663 DNAへとクローン化されたと思われる(図4を参照)。
6.5.  標的で覆ったマイクロタイター穴の調製
6.5.1.  GST-SH3融合タンパク質の調製
Src-GST融合タンパク質の調製はGene(1988)67:31においてSmithおよびJohnsonにより最初に記載された。この文献の開示は本明細書に参考文献として記載している。簡潔に述べると、Src,Grb2,Crk,Abl,またはPLCγのSH3ドメインを含むGST融合タンパク質を発現するpGEX(Pharmacia,Piscataway,NJ)由来の構築物をChanning Der博士(University of North Carolina,Chapel Hill)より得、YesのSH3ドメインを発現する構築物をMarius Sudol博士(Rockefeller University)より得た。GST-SH3融合タンパク質の産生のためのpGEXバクテリア発現ベクターの使用は当業者によく知られている。たとえば、Cicchetti,P.らによるScience(1992)257:803-806を参照せよ。簡潔に述べると、特定のSH3ドメインをコードする領域はpGEX-2TのBamHI部位にフレームをあわせて融合させることができる。このように、融合タンパク質は製造者の指示に従って調製し、SDS-ポリアクリルアミドゲルのクマシーブルー染色により定量した。マイクロタイターウェルは10.0mM NaHCO3,pH8.5中における5-20μgのGST-SH3融合タンパク質で覆い、100mM NaHCO3(pH8.5)1% BSAにより固定し、洗浄した。いずれの洗浄も5回の1XPBS,0.1% Tween 20,0.1% BSA(緩衝液A)を用いた。必要に応じて、それぞれの穴に結合したタンパク質の量を抗GST抗体を基にしたELISA(Pharmacia,Piscataway,NJ)、およびこの仕事の過程の間に単離されたGST結合ファージを用いて定量した。
6.5.2.  マイクロタイターウェルの塗布
バクテリアで発現させたSrc SH3グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(Src-GST)融合タンパク質は、グルタチオンアガロース4B(Pharmacia)を用いて製造者の指示に従ってバクテリアの破砕液から精製した。結合したSrc-GST融合タンパク質は、PBSに溶解した10mMグルタチオンによってグルタチオンアガロースから溶出させた。マイクロタイターウェルは次にSrc-GST融合タンパク質(1-10μg/穴、50mM NaHCO3,pH8.5に溶解させたもの)で4℃で一晩覆った。ファージの非特異的結合を阻止するために、100mM NaHCO3,pH8.5に溶解させた100μL 1% BSAをそれぞれの穴に添加し、室温で1時間インキュベーションした。次に穴を200μL PBS,0.1% Tween 20,0.1% BSA(緩衝液A)で5回洗浄した。
6.6.  Src-GST融合タンパク質を標的分子とするファージディスプレイ無作為ペプチドライブラリーの生物学的ふるい分けおよび解析
6.6.1.  Src-SH3結合ファージの単離
ライブラリーのスクリーニングは既に記載のように行った。Kay,B.K.ら、Gene(1993)128:59-65。簡潔に述べると、緩衝液A内の1x1011pfu TSAR 9,TSAR 12,またはR8CファージをSrc SH3-GSTで覆った穴中で2時間インキュベーションした。穴を洗浄し、結合したファージを100μLの50mMグリシン-HCl(pH2.2)により溶出し、新規の穴に移し、100mLの200mM NaHPO4(pH7.0)によって中和した。回収したファージは、20mLの2xYT内で1x109個の大腸菌DH5αF'株の細胞に感染させるために使用し、感染した細胞を一晩増殖させ、ファージ力価が1000から10,000倍に増幅する結果となった。増幅させたファージは、増幅工程を除いて上記のように更に2回ふるいに掛けた。3回目のふるいの後に回収した結合したファージは、クローンの解析のための単離されたプラークの産生のために、大腸菌DH5αF'株の層の上に低密度でプレートに撒いた。単離されたプラークは小培養を産生するために使用し、その培養からファージのストック及びＤＮＡを回収して、ファージ結合実験およびジデオキシ配列決定法(Sanger,F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)74:5463-5467)のために供した。クローンのSH3結合性は、等力価のファージをSrc SH3-GSTまたはGST単独で含む穴に添加し、そして各々の穴からの溶出粒子の数の力価測定により、または結合したファージの、抗ファージ抗体を基にしたELISA(Pharmacia)による検出により確認した。
実際に、単離されたファージクローンの、様々な異なるタンパク質に由来する様々なSH3ドメインへの結合能は上記に記載の方法によって調べ得る。様々な異なるタンパク質に由来するSH3ドメインを含むGST-SH3融合タンパク質をマイクロタイターウェルに結合させる。前述のファージストック(50μL)の一部を異なるGST-SH3融合タンパク質を含む穴に導入する。室温で1-2時間のインキュベーションの後、マイクロタイタープレートの液体内容物を除去し、穴を200μLの緩衝液Aで5回洗浄した。結合したファージは100μLの50mMグリシン(pH2.2)によって洗い出し、新しい穴に移し、100μLの200mM NaHPO4(pH7.0)によって中和する。ファージは10-3から10-6倍に希釈し、洗い出された試料におけるプラーク形成単位数を確認するため、その一部を大腸菌DH5αF'株の細胞層の上にプレートに撒く。これらの実験から、異なるSrc SH3結合クローンの、他のタンパク質に由来するSH3ドメインに対する相対的特異性が決定する。
6.6.2.  ファージELISAおよびヌクレオチド配列決定
単離体の様々な標的タンパク質への結合を評価するために、固相酵素免疫検定法(ELISA)をも行った。バクテリアの培養液をファージ単離体によって感染させ、2xYT中において37℃で一晩培養した。細胞は遠心により沈澱化させ、25mLの上清を、50μLのタンパク質を塗布(100mM NaHCO3,pH8.4に溶解して1mg/mLとしたもの;4℃で一晩または室温で2,3時間;ブロッキングは、100mM NaHCO3,pH8.4に溶解した1mg/mL BSA;およそ1時間)したマイクロタイタープレートの穴に添加した。ファージは穴内で25μLのPBS-0.1% Tween 20と室温で2時間インキュベーションする。次に穴を30分以上複数回洗浄した。各々の穴に、セイヨウワサビのペルオキシダーゼと結合させたポリクローナル抗ファージ抗体を50μL添加する。抗体はBSA-PBS-Tween 20によって1:3000の比に希釈して用いる;これはPharmacia(Piscataway,NJ;カタログ番号27-9402-01)より得た。30分後、穴をBSA-PBS-Tween 20によりおよそ20分間再度洗浄する。最後に発色のために、100μLのABTS試薬(Pharmacia,H2O2とともに)を各々の穴に加えた。プレートはプレート読みとり機(Molecular Devices,Menlo Park,CA)を用いて波長405nmで読み取る。
Src SH3結合クローン(または他のタンパク質のSH3ドメインに結合するファージクローン)の適切な断片のヌクレオチド配列は標準的な方法により決定した。Sanger,F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)74:5463-5467。M13 m666の遺伝子IIIクローニング部位の89ヌクレオチド下流であるオリゴプライマー5'-AGCGTAACGATCTAAA-3'(SEQ ID NO:102)を使用した。ヌクレオチド配列はMacVector計算機プログラム(IBI,New Haven,CT,USA)を用いて解析した。このヌクレオチド配列の情報から各々のSrc SH3結合ペプチドの一次配列を推定した。次にそれに対応する合成ペプチドを、隣接する配列を含めたり、または含まずに、当業者によく知られた技術により調製した。実際に、これらの合成ペプチドはSH3ドメイン標的に結合することが示されており、ファージの隣接するアミノ酸残基を持つ合成ペプチドはより高い結合親和性を示した。
6.7. 試験管内ペプチド結合検定
ペプチドはResearch Genetics(Birmingham,AL)、Chiron Mimotopes(Victoria,Australia)から入手、またはCytogen Corporation(Princeton,NJ)のJ.Mark Carter博士により慣用技術によって合成された。ペプチドの純度はHPLCおよび／または質量分析により調査した。ビオチン化されたペプチドはKSGSG(SEQ ID NO:103)またはGSGS(SEQ ID NO:104)を、ビオチンとペプチドのN末端の間のペプチドリンカー(スペーサー)として合成した。ファージの代わりに10μMのペプチドを使用した点を除いて、結合実験は上記のように行った。結合したビオチン化されたペプチドはアルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジン(Sigma Chemmical Co.,St.Louis,MO)により検出した。室温で1時間インキュベーションした後、穴を洗浄し、50mM NaCO3(pH9.8)に溶解させた3mMのp-ニトロフェニルホスフェート溶液(US Biochemicals,Cleveland,OH)、および50mM MgCl2を加え、色を発色させた。信号はELISAプレート読みとり機(Molecular Devices,Menlo Park,CA)により波長405nmで読み取った。結合実験は3回行った。その結果は図7および8に示した。
6.8.  細胞溶菌液のGST-SH3親和性沈澱のペプチド競合
HeLa細胞の培養を100μCi/mL以上の35S-メチオニンとともに一晩インキュベーションする。次に細胞を洗浄し、緩い洗剤で溶菌する。この放射性混合物の混合物を、グルタチオンと結合したセファロースビーズ(Pharmacia,Piscataway,NJ)上に固定されたSrc-GST融合タンパク質とともにインキュベーションする。数時間の混合の後、ビーズを低速遠心によって緩やかに沈澱させ、上清を捨てる。次にビーズを再懸濁し、PBS-0.1% Tween 20による懸濁液にして、沈澱させ、さらに数回洗浄する。最後に、2%ゲル溶液を試料に加え、100℃で3分間沸騰させる。後に、試料を遠心して上清を電気泳動のため10%ポリアクリルアミドSDSゲルに乗せる。タンパク質が分離した後、ゲルを固定し、乾燥させ、放射線写真のためにX線フィルムに露光させ、Molecular Dynamics社のPhosphorImagerにより探査するためにホスファープレート(phosphor plate)に露光させる。
Src SH3が35S-標識したタンパク質へ結合する能力は、外来性ペプチドとの競合性により調べる。溶菌液をグルタチオンを結合したセファロースビーズ上に固定したSrc-GST融合タンパク質とともにインキュベーションするときに、ファージディスプレイ挿入配列およびモチーフに対応した合成ペプチドを加える。負の対照であるペプチド(関連性のないペプチド配列)は阻害しない一方で、SH3結合ペプチドは標識化タンパク質の全部または一部の結合を阻害する。競合の量を定量すると、それは加えたSH3ドメイン結合ペプチドの量と相関する。
別法として、NIH 3T3細胞をDulbecco修飾イーグル培地(DME)+10%ウシ胎児血清(FCS)+80μCi/mL Tran35S標識(ICN)中において増殖させ、PBSで洗浄し、RIPA緩衝液で溶菌し、沈澱させた。1.5x106個の細胞に由来する上清を、100μgのグルタチオン-アガロース固定されたGSTにより前処理した。この上清を次に10μgのグルタチオン-アガロース固定されたGST-SH3融合タンパク質とともに、試験ペプチドを含めたり、または含めずに、最終体積250μLでインキュベーションした。沈澱させたビーズはRIPA,RIPA+1%デオキシコール酸+0.1% SDS,およびPBSの各々1mLで洗浄し、50μLのSDS-PAGE試料緩衝液に再懸濁し、煮沸し、SDS-PAGE(7.5%)にかけた。標識化タンパク質はphosphorimaging(Molecular Dynamics)により検出した。その結果は図9に表した。
6.9. 細胞溶菌液由来のPI-3'キナーゼのGST-SH3親和性沈澱のペプチドの競合
細胞溶菌液に由来するPI-3'キナーゼのSrcによる沈澱化をSH3結合ペプチドの存在下または非存在下で行うことが可能である。HeLa細胞を洗剤で溶菌し、タンパク質の混合物を、グルタチオンを結合したセファロースビーズ上に固定されたSrc-GST融合タンパク質とともに数時間インキュベーションする。数時間の混合の後、ビーズを低速遠心により緩やかに沈澱させ、上清を捨てる。ビーズは再懸濁し、PBS-0.1% Tween 20による懸濁液にして沈澱させ、さらに数回洗浄する。最後にSDS溶液を試料に加え、100℃で3分間煮沸する。次に、試料を遠心し、上清を電気泳動のため10%ポリアクリルアミドSDSゲルに乗せる。タンパク質が分離した後、ゲルをニトロセルロースまたはナイロンにブロットする(すなわち、ウエスタンブロット)。次にフィルターをPI-3'キナーゼ抗体(モノクローナルおよびポリクローナル抗体がUpstate Biotechnology Incorporated,Lake Placid,NYより入手可能である)および酵素を結合した二次抗体によりプローブ探査に付する。これによりPI-3'キナーゼの量を定量する。
Src SH3のPI-3'キナーゼへの結合能は外来性ペプチドとの競合により調べられる。溶菌液をグルタチオンを結合したセファロースビーズ上に固定したSrc-GST融合タンパク質とともにインキュベーションし、そのときに、ファージディスプレイ挿入配列およびモチーフに対応した合成ペプチドを加える。SH3タンパク質と比較して10倍および100倍のモル濃度の大量のペプチドを使用する。負の対照であるペプチド(関連性のないペプチド配列)は阻害しない一方で、SH3結合ペプチドはウエスタンブロットで検出されたPI-3'キナーゼの結合を阻害する。競合の量を定量すると、それは加えたSH3ドメイン結合ペプチドの量と相関する。
6.10. 各種タンパク質のSH3ドメインとSH3結合ペプチドとの生体内介合
細胞内での各種タンパク質のSH3ドメインとSH3結合ペプチドとの結合を証明するために、SH3結合ペプチドは標識され細胞内局在を調べる。例えばBar-Sagiら,Cell(1993)74:83-91は、細胞内で発現されたSH3ペプチドは細胞骨格に局在することを示した。即ち本発明のSH3ドメイン結合ペプチドは、細胞内標的シグナル(例えば細胞骨格への)として働き得る。つまり、ペプチドはビオチンで標識され、次に細胞内に注入される。または、SH3結合ペプチドと緑蛍光タンパク質(GFP,Chalfieら,Science(1994)263:802-805)とからなる融合タンパク質を発現する組み換えプラスミドを細胞内にトランスフェクションしても良い。次にビオチニル化ペプチドまたはGFP融合タンパク質の局在が、それぞれパラフォルムアルデヒド固定された細胞ではFITC標識されたストレプトアビジンで、生きた細胞内では直接蛍光によって検出される。SH3ドメイン結合ペプチドが細胞骨格に局在することからは、SH3結合ペプチドがSH3ドメインタンパク質に生体内で結合し得ることが示される。さらに、Srcに富むフォーカスの固着部位は、SH3結合ペプチドの細胞内局在部位でもあり得る。
即ち、NIH 3T3繊維芽細胞がフィブロネクチンでコートされたカバーグラスの上で試験管内培養された。37℃で2日間培養された後、細胞2%パラフォルムアルデヒド(pH7.5)の存在下で室温1時間固定された。カバーグラスはPBS-0.1% Tween20で数回洗浄され、固定液を除去された。次に、カバーグラスはアセトン(-20℃に冷却)に約20分浸され、風乾された。カバーグラスはBSA(1mg/ml)を含むPBS-0.1% Tween20で再度洗浄され、ビオチニル化された種々のペプチドとPBS-0.1% Tween20中で室温2時間インキュベーションされた。カバーグラスは洗浄され、次に1mg/mlストレプトアビジン-Cy3(Jackson Immunoresearch Co.,West Grove,PA)と室温1時間反応された。最後に、カバーグラスはPBS-0.1% Tween20で洗浄され、スライドガラス上でグリセロール溶液を積載され、Nikon Optiphot epifluorescence顕微鏡および60×油浸レンズを用いて観察された。
結果を図11に示す。パネルAはビオチン-架橋分子-VLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)結合体で染色された細胞を、パネルBはビオチン-架橋分子-GILAPPVPPRNTR(SEQ ID NO:63)結合体で染色された細胞を、パネルCは長いコンセンサスペプチド、ビオチン-架橋分子-RSTPRPLPPLPTTR(SEQ ID NO:67)で染色された細胞を、パネルDはビオチンに富むビンキュリンペプチド結合体、ビオチン-架橋分子-LAPPKPPLPEGEV(SEQ ID NO:70)で染色された細胞を示す。「架橋分子」配列はKSGSG(SEQ ID NO:103)である。図11に示すように、用いられたSH3ドメイン結合ペプチドは鮮明な蛍光像を示し、際だって対照的にパネルD(SH3非結合性ビンキュリン断片)の像は比較的暗い。これらの結果から、本発明のSH3ドメイン結合ペプチドが細胞内の標的タンパク質(例えばSrcおよびSrc近縁タンパク質)に局在し、その像を提供する能力が重ねて示された。
6.11. 卵母細胞におけるSH3結合ペプチドによるSrcの生体内での調節
Xenopus laevisの卵母細胞に調節不能化(deregulated)SrcをコードするmRNAが注入されると卵母細胞内に劇的な細胞生物学的および生化学的変化が起こる(Under,T.F.and Steele,R.E.,in Mol.Cell.Biol.(1992)12:5485-5498)。出願人は野生型および調節不能型Src mRNAをもたらすプラスミドを得た。これはDr.Robert Steele(University of Calfornia at Irvine)より入手できる。合成SH3結合ペプチドがSrc mRNAを前もって注入しておかれた卵母細胞に注入された。細胞骨格の状態は実体顕微鏡下で表層の色素顆粒の配置を観察することで視覚的に調べられた。いくつかのタンパク質のリン酸化状態は上記のUnger and Steeleに記載されたように抗リン酸化チロシン抗体(4G10;Upstate Biotechnoloorporated)を用いたウェスタンブロッティングによって調べられた。
6.12.  X.  laevisの卵母細胞のプロゲステロンによって誘導される成熟
成体の卵巣は外科的に取り出され、Ca2+除去OR2(82.5mM Nacl,2.5mM KCl,1.0mM MgCl2,1.0mM Na2HPO4,5.0mM HEPES,および3.8mM NaOH,pH7.6)に溶かされた0.1%D型コラーゲナーゼ(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)中に放置された。卵母細胞は次いで1.0mM CaCl2を含むOR2によって3-5回洗浄され、18℃で一晩OR2中で復帰させられた。ステージVIの卵母細胞に40nLの100mMペプチドまたは水が注入された。注入後2mg/mLのプロゲステロン(Sigma,St Louis,MO)を含むOR2中に卵母細胞はいれられ、20℃で放置された。卵母細胞は1時間毎に生殖顆粒の崩壊(germinal vesicle breakdown,GVBD)を数えられた。
図10はこの実験の結果を示している。グラフに示したようにSH3ドメイン結合ペプチドVLKRPLPIPPVTR(SEQ ID NO:64)を注入された卵母細胞は、水またはプロリンに富むヴィンキュリンペプチドLAPPKPPLPEGEV(SEQ ID NO:70)を注入された卵母細胞と比べて速い速度でプロゲステロンに誘導された生殖顆粒の崩壊が起こった。これらの結果は、脱抑制化されたまたは活性化型のSrc RNAを注入された卵母細胞が水または野生型のSrc mRNAを注入された卵母細胞と比べて速い速度で成熟したというUnger and Steele,前出の結果(Unger and Steeleの記事の図3Bを見よ)と同様のものである。
Src SH3ドメイン結合ペプチドを用いて得られたこの結果はこれらのペプチドが"細胞内の"Srcの生化学的活性を調節していることを示唆しており、特に、少なくとも本発明のSrc SH3ドメイン結合ペプチドのうちいくつかは、通常の状態では負に制御されているあるいは阻害されている"細胞内の"Srcの生化学的活性を正に制御することが示された。従って本発明のSH3ドメイン結合ペプチドの投与はSrcまたはSrc関連タンパク質の活性を調節する新規の方法を構成し得る。特にこれらのペプチドのうちのあるものはSrcファミリーのタンパク質を活性化することができる。
6.13  Srcを形質導入された細胞におけるSH3結合ペプチドによる生体内でのSrcの拮抗阻害
SH3結合ペプチドをコードする領域は動物細胞でそれらを発現させるベクターにクローニングされる。c-mycエピトープおよびSH3結合ペプチドをコードし、強力な構成的プロモーター(例えば、SV40、CMV、HSV TK、カルモジュリン)から転写される2部構成の遺伝子(bipartite gene)が構築される。ベクターは正常またはSrcを形質導入された細胞に形質転換(例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム、リポソーム、DEAEデキストリン)によって導入される。形質転換された細胞は2部構成の遺伝子を培養中に一時的に発現する。安定な形質転換細胞株を作るためにベクターが選択可能な標識(例えばネオマイシン耐性)を持つかまたは選択可能な標識(ネオマイシン耐性)を持つ過剰のプラスミドの存在下で形質転換が行われ、その標識について選択さる。形質転換された細胞は２部構成のタンパク質の発現を検出するために蛍光免疫染色される。ハイブリドーマ9E10はc-mycエピトープ(EQKLISEEDLN[SEQ ID NO:105];Mol.Cell.Biol.(1985)5:3610-3616のEvan,G.A.et al.を見よ)を分泌する。この抗体は2部構成のタンパク質が細胞内で発現し、幾つかの例ではＳＨ３ドメインを持つタンパク質に富んだ細胞内構造に局在することを示すための蛍光免疫実験に用いられる。
これらの実験にはいくつかの対照が用いられる。1つ目では細胞はSH3-結合ペプチドをコードする領域を持たないベクターで形質転換される。2つ目では正常な(形質導入されていない)細胞が形質転換される。3つ目ではSrc以外の癌遺伝子で形質導入された細胞が形質転換実験に用いられる。4つ目では細胞はc-mycエピトープを認識しない他のモノクロナール抗体によって染色される。
形質転換された細胞はSH3結合ペプチドを発現した結果である、細胞の形、振舞い、代謝におけるすべての変化について調べられる。細胞の形は形質転換の後数回に渡って位相差顕微鏡によって調べられ、とくに細胞の平坦さ、基質への接着および細胞の波打ち運動(cell ruffling)の程度が観察される。細胞分裂の速さ、細胞の移動、および接触阻害もまた何度も観察された。最後に、形質転換された細胞内のリン酸化されたチロシンの量がリン酸化アミノ酸解析および抗リン酸化チロシン抗体(4G10;Upstate Biotechnology Incorporated)を用いたウェスタンブロッティング実験によって定量される。
6.14  様々なSH3ドメインのリガンド選択性の違い
6.14.1.  PXXP(SEQ ID NO:161)によって偏向されたペプチドライブラリーの調製
6.1節および6.4節に記載され、またMethods in Enzymology,(1995)255:498-509にSparka,A.B.,et al.によって記載されたのと同様の手法を用いてオリゴヌクレオチド挿入物は図12に模式的に示されたように構築された。二つの合成オリゴヌクレオチド(5'-ctgtgcctcgagk(nnk)6cca(nnk)2cca(nnk)6tctagacgtgtcagt-3'(SEQ ID NO:162)および5'-actgacacgtctaga-3'(SEQ ID NO:163)、但しk=g+t、およびn=g+a+t+c)は対合させられ、Sequenase(Amersham,Arlington Heights,Il)によって空白を埋められた。挿入物は次いでXhoIおよびXbaIによって消化され、mBAXベクターの遺伝子IIIにつながれた。
mBAXベクターはM13mp18ベクターの遺伝子III(Messing,J.,1991,"cloning in M13 phage or how to use biology at its best,"Gene 100.3-12)にFowlkes et al.,1992,Biotechniques 13,422-427の方法でクローニング部位を作ることで作られた。mBAXベクターはsupEまたはsupFとして知られる抑圧tRNA遺伝子変異をもつE.coliにおいて抑圧される終止コドンTAGをコード領域に含むマウスのモノクロナール抗体7E11(図13を見よ)に対するエピトープをコードするペプチド配列を成熟したpIIIタンパク質のN端に提示している。mBAXゲノムにはこれ以外の終止コドンは含まれていない。bMAXベクターはβ-ガラクトシダーゼのα断片をも持っている。β-ガラクトシダーゼのω断片を発現している細菌細胞がα断片を発現しているバクテリオファージに感染すると透明なXGal基質は不溶性の青い沈澱に変換される。従って、このような細胞上のこのようなバクテリオファージのプラークは青く見える。
組換えmBAX分子は非組換え分子とmBAXの遺伝子III中のXhoI-XbaI断片内のTAGコドンによって容易に見分けられ得る。組換えDNAがランダムなペプチドをコードするオリゴヌクレオチドによってXho I - Xba I断片を置き換えることで作られたなら、組換え体は抑圧tRNA変異遺伝子を持っている細菌中(例えばDH5αF')でも持っていない細菌中(例えばJS5)でも生育し得る。一方、非組換えmBAX分子はそのような抑圧遺伝子を欠いた細菌(例えばJS5)のローンの上にはプラークを作ることができない。これはJＳ5においてはTAGコドンが終止コドンとして働き、翻訳の間に短縮したpIII分子を生じ、また、pIIIはM13ウイルス粒子にとって必須なタンパク質成分であるためプラークができないのである。
連結されたDNAはJS5 E.coliに電気穿孔法によって導入され、Sambrook,J.,Frisch,E,F.,& Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:Alaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY)(Sambrook et al.)に記載されたように組み替ファージが200枚の100mm 2xYT+0.8%アガープレート上で増殖させられた。結合するファージを親和性精製する際に兄弟クローンを回収することを減らすため、プレートを6つのほぼ同数の集団に分けることで6つの別個のライブラリー分画が調製された。それぞれの分画は後の全ての操作の間別々に処理された。ファージ粒子はそれぞれの分画から、100ml PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,4.3mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4)への拡散によって回収され、Sambrook et al.(1989,前出)と同様にポリエチレングリコール沈澱によって濃縮され、10ml PBS+10%グリセロールに懸濁された。ライブラリーの全体の複雑性はおよそ3x108であるから、それぞれの分画はおよそ5x107個の別個の組換え体を含む。出来たファージ提示ライブラリーはXが任意のアミノ酸を表すものとして、X6PXXPX6(SEQ ID NO:164)の形のペプチドを含む。
6.14.2.SH3-結合ファージの親和性精製
ライブラリーの検索はMethods in Enzymology,(1995)255:498-509においてSparks,A.B.,et al.によって記載されたように行われた。簡潔に示すと、ELISAマイクロタイタープレート被覆の穴は10μgの100mM NaHCO3(pH8.5)中のGST-SH3融合タンパク質によって3時間被覆され、Superblock(Pierce,Rockford,IL)によって1時間ブロックされた。それぞれのライブラリーからの約5x1011の感染性粒子が200μl PBS+0.1% Tween 20中に希釈され、GST-SH3-被覆穴の中で3時間置かれた。穴はPBS+0.1% Tween 20によって5回洗浄され、結合したファージは50mMグリシン-HCl(pH2.2)によって溶出された。回収されたファージは10m1 2xYT培地および100μlの飽和DH5αF' E.coli培養液中で増殖させられ、上記の通りにさらに2回親和性精製された。親和性精製されたファージは2xYT+0.8%アガープレートにクローンファージストックおよびDNAが得られるような単一プラークを生じるように植えられた。ファージの結合は等量のクローンファージストックを1μg GST-SH3またはGSTで被覆した穴の中に置くことで確認された。穴はPBS+0.1% Tween 20によって5回洗浄され、結合したファージは抗ファージELISAによって使用説明書(Pharmacia,Piscataway,NJ)に従って検出された。これらのクローンに提示されたペプチドの配列はファージ挿入物のDNA配列決定によって決定された。
6.14.3.  GST-SH3融合タンパク質の調製
Grb2 N末端(Grb2 N,aa 1-58)、Nck N末端(Nck N,aa 1-68)、Nck中央(Nck M,aa 101-166)、Nck C末端(Nck C,aa 191-257)、p53bp2(aa454-530)、またはSrc(aa 87-143)のSH3ドメインとGSTの融合物をコードした構築物は適切なcDNAをpGEX-2T(Pharmacia,Piscataway,NJ;pGEXベクターに関する一般的な参考文献はSmith,D.B.,& Johnson,K.S.(1988)Gene 67,31-40である)にPCRクローニングすることで作製された。構築物の信頼性はDNA配列決定によって確認された。Yes、コルタクチン、Crk、Abl、およびPLCγのSH3ドメインとGSTの融合物を発現するpGEX由来の構築物はそれぞれM.Sudol(Rockfeller University)、J.T.Parsons(University of Virginia at Charlottsville)、M.Matsuda(Tokyo,Japan)、A.M.Pendergast(Duke University)、およびS.Earp(University of North Carolina at Chapel Hill)の厚意により提供された。あるいはYes、コルタクチン、Crk、Abl、およびPLCγに対するGST-SH3融合タンパク質はこれらのタンパク質の配列の出版された情報を用いて、前にGrb2 N、Nck N、Nck M、Nck C、P53bp2、およびSrc、に対して為されたのと同様に調製され得た。Suen et al.,(1993)Mol.Cell.Biol.13,5500-5512(Grb2);Lehmann et al.,(1990)Nucleic Acids Res.18,1048(Nck);Iwabuchi et al.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,6098-6102(p53bp2);Takeya et al.,(1983)Cell 32,881-890(Src);Sudol et al.,(1988)Nucleic Acids Res.16,9876(Yes);Mu et al.,(1991)Mol.Cell.Biol.11,5113-5124(コルタクチン);Shtivelman et al.,(1986)Cell 47,277-284(Abl);Burgess et al.,(1990)Mol.Cell.Biol.10,4770-4777(PLCγ)を見よ。GST-SH3融合タンパク質はSmith,D.B.,&Johnson,K.S.(1988)Gene 67,31-40に記載されたように調製された。融合タンパク質の信頼性および純度はSDS-PAGEによって確認された。タンパク質濃度はBioRad protein assay(BioRad,Hercules,CA)を用いて決定された。
6.14.4.  SH3ドメイン結合ペプチドおよび共通配列
SH3ドメイン結合ペプチドの共通モチーフPXXP(SEQ ID NO:161)の全てあるいは一部を固定し、周辺配列をランダム化する第二世代または偏向ペプチドライブラリーの使用はSH3ドメインに選択的な結合を示す残基の配列をさらに定義した。
下記の表1−5は6.14.1節に記載された偏向ペプチドライブラリーがGST-SH3融合タンパク質によって検索されたときに得られた関連するアミノ酸配列のいくつかを示している。表1-5に挙げられたアミノ酸残基は固定した位置を示している。それぞれの一まとまりの表に示されているのは"共通"配列であり、新規の結合ペプチドから新たな特徴を拾い出すために含まれている。表1-5の共通配列中の記号"φ"は疎水性残基を示している。表1-5の共通配列中の記号xは任意のアミノ酸を示している。Nck SH3ドメイン結合クローンについてはNcKの中央のSH3ドメインを含むGST-SH3融合タンパク質が用いられた。
0004060886.tif 000003
0004060886.tif 000004
0004060886.tif 000005
0004060886.tif 000006
0004060886.tif 000007
表5に示された共通配列に加えて6.14.1節に記載されたPXXP(SEQ ID NO:161)
偏向ペプチドライブラリーから単離されたSrc SH3ドメイン結合ファージ由来の挿入物のアミノ酸配列はまた下の表6に示したように共通配列LXXRPLPXψP(SEQ ID NO:165)を示した。共通配列LXXRPLPXψP(SEQ ID NO:165)においてψは脂肪族のアミノ酸残基(Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ)を、Xは任意のアミノ酸を示す。
0004060886.tif 000008
表６においてはψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を、Xは任意のアミノ酸を示し、◆は仮想的なクラスllペプチド(6.14.5節参照)である。保存されたプロリン残基に下線が引かれている。
Src SH3ドメイン結合ファージ由来の挿入物のアミノ酸配列に由来し得るもう一つの共通配列はLX1X2RPLPX3ψPX4X5(SEQ ID NO:454)である。ここでψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を示し、およびX1,X2,X3,X4およびX5は任意のアミノ酸を示す。ただし、例外として
X3=P,ψ=L,X4=P,およびX5=Pならば、
X1=FのときX2はHまたはRではない
またはX1=SのときX2はR,H,A,N,T,G,V,M,またはWではない
またはX1=CのときX2はSまたはGではない
またはX1=RのときＸ2はTまたはFではない
またはX1=AのときX2はR,Q,N,S,またはLではない
またはX1=QのときX2はMではない
またはX1=LのときX2はRではない
またはX1=IのときX2はAではない
またはX1=PのときX2はP,W,またはRではない
またはX1=GのときX2はSまたはRではない
またはX1=TのときX2はTではない。
表1に示した共通配列に加えて6.14.1節に記載さ駐たPXXP(SEQ ID NO:161)で偏向されたペプチドライブラリーから単離されたコルタクチンＳＨ３ドメイン結合ファージからの挿入物のアミノ酸配列も下記の表7に示されるように+PPψPXKPXWL(SEQ ID NO:166)という共通配列をもつ。
0004060886.tif 000009
表7において+は塩基性アミノ酸残基(R,K)を、ψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を、Xは任意のアミノ酸を表す。固定されたプロリン残基に下線が引かれている。
表３に示した共通配列に加えて6.14.1節に記載されたPXXP(SEQ ID NO:161)で偏向されたペプチドライブラリーから単離されたAbl ＳＨ３ドメイン結合ファージからの挿入物のアミノ酸配列も下記の表8に示されるようにPPXθXPPPψP(SEQ ID NO:173)という共通配列を持つ。
0004060886.tif 000010
表8においてθは芳香族アミノ酸残基を、ψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を、Xは任意のアミノ酸を表す。固定されたプロリン残基に下線が引かれている。
†このクローンはランダムなペプチドをコードする配列中に３ヌクレオチドの欠失を含む。
6.14.1節に記載されたPXXP(SEQ ID NO:161)で偏向されたペプチドライブラリーから単離されたPLCγＳＨ３ドメイン結合ファージからの挿入物のアミノ酸配列も下記の表9に示されるようにPPVPPRPXXTL(SEQ ID NO:175)という共通配列を持つ。
0004060886.tif 000011
表9においてXは任意のアミノ酸を表す。保存されたプロリン残基に下線が引かれている。
6.14.1節に記載されたPXXP(SEQ ID NO:161)で偏向されたペプチドライブラリーはp53bp2由来のＳＨ３ドメインに特異的に結合するファージクローンを得るのにも用いられた。p53bp2 SH3ドメイン結合ファージによって発現されたペプチドのアミノ酸配列は下記の表10に示される。
0004060886.tif 000012
表10において+は塩基性アミノ酸残基(R,K)を、ψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を、Xは任意のアミノ酸を表す。保存されたプロリン残基に下線が引かれている。
6.14.1節に記載されたPXXP(SEQ ID NO:161)で偏向されたペプチドライブラリーはまたCrkタンパク質のN末端部分のＳＨ３ドメインに特異的に結合するファージクローンを得るのにも用いられた。Crk N末端SH3ドメイン結合ファージによって発現されたペプチドのアミノ酸配列は下記の表11に示される。
0004060886.tif 000013
表11においてψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を表す。保存されたプロリン残基に下線が引かれている。
本発明は、ψが脂肪族アミノ酸残基を表す、式:ψPψLPψK(SEQ ID NO:210)のアミノ酸配列を有するが、但し、WNERQPAPALPPKPPKPT(SEQ ID NO:456)のアミノ酸配列は含まない、CrkのSH3ドメインに結合する精製されたペプチドを提供する。
6.14.1節に記載されたPXXP(SEQ ID NO:161)で偏向されたペプチドライブラリーはまたYesタンパク質ＳＨ３ドメインに特異的に結合するファージクローンを得るのにも用いられた。Yes SH3ドメイン結合ファージによって発現されたペプチドのアミノ酸配列は下記の表12に示される。
0004060886.tif 000014
表12においてψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を表す。保存されたプロリン残基に下線が引かれている。
Yes SH3ドメイン結合ファージからの挿入物のアミノ酸配列に由来し得るもう一つの共通配列は
ψX1X2RPLPX3LPX4X5(SEQ ID NO:455)
ただしψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)をX1,X2,X3,X4およびX5は任意のアミノ酸を表す。ただし例外として
X3=P,X4=PおよびX5=Pならば、
ψ=Lのとき、
X1=FならX2はHまたはRではない
またはX1=SならX2はR,H,A,N,T.G,V,MまたはWではない
またはX1=CならX2はSまたはGではない
またはX1=RならX2はTまたはFではない
またはX1=AならばX2はR,Q,N,S,またはLではない
またはX1=QならX2はMではない
またはX1=LならX2はRではない
またはX1=IならX2はAではない
またはX1=PならX2はP,WまたはRではない
またはX1=GならX2はSまたはRではない
またはX1=TならX2はTではない
およびψ=Pのとき
X1=AならX2はRではない
またはX1=SならX2はRまたはYではない
またはX1=MならX2はSではない
またはX1=VならX2はGではない
またはX1=RならX2はSではない
またはX1=IならX2はRではない
およびψ=Aのとき
X1=AならX2はKではない
およびψ=Vのとき
X1=AならX2はCまたはQではない
またはX1=PならX2はPではない
およびψ=Iのとき
X1=GならX2はHではない
またはX1=TならX2はSではない
またはX1=RならX2はSではない。
本発明は式:ψX1X2RPLPX3LPX4X5(SEQ ID NO:455)(ここで、ψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を表し、X1,X2,X3,X4,およびX5は任意のアミノ酸を表す)のアミノ酸配列を含み、但し、AGDRPLPPLPYNPKS(SEQ ID NO:457)のアミノ酸配列を含まない、YesのSH3ドメインに結合する精製されたペプチドも提供する。
6.14.1節に記載されたPXXP(SEQ ID NO:161)で偏向されたペプチドライブラリーはまたGrb2タンパク質のN末端部分のＳＨ３ドメインに特異的に結合するファージクローンを得るのにも用いられた。Grb2 N末端SH3ドメイン結合ファージによって発現されたペプチドのアミノ酸配列は下記の表13に示される。これらの配列は異なるが関連した共通配列をもつ3つの配列の集団に整理され得る。3つの集団から全体として+θDXPLPXLP(SEQ ID NO:223)という共通配列が導かれ得る。
0004060886.tif 000015
表13においては+は塩基性アミノ酸残基(R,K)をθは芳香族アミノ酸残基を、Xは任意のアミノ酸を表す。固定されたプロリン残基に下線が引かれている。
6.14.5.  SH3リガンドの結合の方向
SH3ドメインに結合するペプチドリガンドは左手型ポリプロピリンII型(PPII)螺旋配座(Yu,H.,Chen,J.k.,Feng,S.,Dalgarno,D.C.,Brauer,A.W.,& Schreiber,S.L.(1994)Cell 76,933-45)をとると推測されることが示されている。SH3リガンドは偽対称的であり、従って2つの対向する方向のうちの一方から結合し得る(Feng,S.,Chen,J.K,Yu,H.,Simon,J.A,& Schreiber,S.L.(1994)Science 266,1241-7)(Feng et al.)。Feng et al.,前出,は一つまたはそれ以外の方向で結合するペプチドは異なる共通モチーフを持つことを示した。特にI型またはII型の方向から結合するリガンドはそれぞれ+pYPpYP(SEQ ID NO:244)またはYPpYPp+(SEQ ID NO:245)という共通部位に従う。ここで、大文字の位置はＳＨ３ドメインに接触し、特異的を与える保存された残基を表し、小文字の位置はプロリンであることが多い骨格残基を表す。
このモデルによればSrc,Yes,Abl,およびGrb2 NのSH3ドメインによって選択されたペプチドはI型の方向から結合し、一方、コルタクチン,P53bp2,PLCγ,およびCrk N SH3ドメインによって選択されたペプチドはII型の方向から結合すると予測される(表14を見よ)。興味深いことにこの仕事において同定されたSH3リガンド共通モチーフの殆どはFeng et al.,前出によって定義されたSH3結合核の周辺にさらに保存された残基を含む。さらに、これらの保存された残基はI型およびII型モチーフにおいてそれぞれSH3結合核のNおよびC末端に位置している。従って、それらはそれらの標的ＳＨ３ドメインの等価な領域と相互作用すると予測される(表14を見よ)。
0004060886.tif 000016
表14においてそれぞれのSH3リガンド共通モチーフはそのI型およびII型共通モチーフとの一致の度合に応じてI型またはII型と記された。それぞれのSH3リガンド共通モチーフにおける高度に(>90%)保存された位置は太字で示されており、それらはSH3に接触する残基であると解釈された。+は塩基性アミノ酸残基(K,R)を表し、ψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を表し、θは芳香族アミノ酸残基を表し、Xは任意のアミノ酸を表す。小文字のpはプロリンであることの多い残基を表す。
Src SH3ドメインはI型およびII型の両方に結合することができる(Feng et al.,前出)。I型ペプチドはPXXP(SEQ ID NO:161)ライブラリーから選択されたSrc SH3リガンドの中で多数を占めるが、1つのクローンは明らかにII型に共通部分に適合する(表6を見よ)。以前にSparks,AB.,Quilliam,L.A.,Thorn,J.M.,Der,C,J.,& Kay,B.K.(1994)J.Biol.Chem.269,23853-6およびYu,H.,Chen,J.K.,Feng,S.,Dalgarno,D,C.,Brauer,A.W.,& Schreiber,S.L.(1994)Cell 76,933-45がPPψPPR(SEQ ID NO:248)という共通配列をもつll型Src SH3リガンドを単離している。同様に、Grb2 N SH3ドメインはSOS由来のペプチドにII型共通配列PPψPPR(SEQ ID NO:248)によって結合することが示されているが(Rozakis-Adcock,M.,Fernley,R,Wade,J.,Pawson,T.,& Bowtell,D.(1993)Nature 363,83-5)、われわれはI型の共通部分に適合するGrb2 N SH3リガンドを単離した(表14を見よ)。従ってSrcおよびGrb2 NのSH3ドメインは両方とも明らかにI型およびII型のペプチドリガンドの両方に結合する能力を持っている。
6.14.6. SH3リガンドの結合特性
異なるＳＨ３リガンド間を区別するためにSH3ドメインの能力をさらに調べるため、我々は様々なペプチドリガンドを発現するファージのSH3ドメインのパネルに対する結合性を調べた。等しい力価のクローンファージストックが異なるGST-SH3融合タンパク質で被覆されたマイクロタイター穴の中に放置された。穴は数回洗浄され、結合したファージは抗ファージ抗体によって検出された(図14を見よ)。陽性のELISA信号は以前に解析されたSrc SH3結合クローンとともに得られたもの(Sparks,A.B.,Quilliam,L.A.,Thorn,J.M,Der,C.J.,& Kay,B.K.(1994)J.Biol.Chem.269,23853-6)と等価であり、5から75μMの範囲のSH3:ペプチド親和性を示す(Yu,H.,Chen,J.K.,Feng,S.,Dalgarno,D.C.,Brauer,A.W.,& Schreiber,S.L.(1994)Cell 76,933-945;Rickles,R.J.,Botfield,M.C.,Weng,Z.,Taylor,J.A.,Green,O.M.,Brugge,J.S.,& Zoller,M.J.(1994)EMBO J.13,5598-604)。Src,Yes,Crk,およびGrb2 N SH3ドメインは他のSH3ドメインによって選択されたいくつかのファージクローンと交差反応したが、Abl、コルタクチン、p53bp2、およびPLCγSH3ドメインは非常に高い特異性を示した。意義深いことに、220のうち33だけについて潜在的に交差反応し得る事例が観察された。このことはSH3の選択性が例外というよりは法則であることを示唆する。
交差反応のそれぞれの事例はペプチドの配列間の類似性および交差反応性のSH3ドメインのリガンド選択性によって説明され得る。例えば、Crk SH3は他のＳＨ２ドメインによって選択された3つのファージクローンと交差反応し、これらのクローンのそれぞれはCrk SH3にとって望ましいリガンドの共通モチーフに合うようなペプチドを同時に発現した。同様にSrc、Yes、およびGrb2のSH3ドメインと、この集団内の他のSH3ドメインによって選択されたクローンとの間に観察された交差反応性はこれらのSH3ドメインが同一の、プロリンに富む核を好むという事実の結果であり得る。最後に、SrcおよびYesのSH3ドメインはPLCγのSH3リガンドMPPPVPPRPPGTL(SEQ ID NO:176の一部)と交差反応したが、これはII型Src SH3結合配列PPVPPR(SEQ ID NO:249)を含んでいる。これらを合わせると、これらのデータは潜在的なリガンドの1次構造の些細な違いを識別するSH3ドメインの能力を示している。
6.15.  SH3ドメインに結合することが知られているタンパク質中の結合に関与するアミノ酸配列の決定のための共通配列の使用
SH3ドメインに結合することが知られているタンパク質は多くあるが、これらのタンパク質のどこがSH3ドメインに結合するのに関与する特異的な配列であるかは知られていない。上記の表1-13に示した共通配列はこれらのタンパク質のアミノ酸配列を含む(例えばGenBankのような)データベースを探してどの配列がこれらのタンパク質がSH3ドメインに結合するのに関与しているかを決定するために用いられ得る。これは数多くの既知のSH3ドメイン結合タンパク質について行われ、表1-13の共通配列に類似した配列が同定された。その結果は表15に示される。表15には比較のために数多くのタンパク質について以前にSH3ドメインへの結合に関与することが示されているアミノ酸配列も示される。
0004060886.tif 000017
0004060886.tif 000018
表15において+は塩基性アミノ酸残基(R,K)を表し、ψは脂肪族アミノ酸残基(A,V,L,I,P)を表し、θは芳香族アミノ酸残基を表し、Xは任意のアミノ酸を表す。*はそれぞれの対応するSH3ドメインに結合することが以前に示されたアミノ酸配列を表す。共通モチーフの最も高度に保存された残基と一致する配列内の残基は太字で示される。アミノ酸配列のそれぞれの名前はＳＨ３ドメイン結合タンパク質の名称およびそれが由来した生物種の略号を示す。示された配列の成熟したタンパク質中のアミノ酸の位置は括弧内に示される。より詳細にはそれぞれのタンパク質について挙げられた参考文献を見よ。
参考文献1はFlynn,D.C.,Leu,T.H.,Reynolds,A.B.,& Parsons,J.T.(1993)Mol.Cell.Biol.13,7892-7900である。
参考文献2はBarfod,E.T.,Zheng,Y.,Kuang,W,J.,Hart,M.J.,Evans,T.,Cerione,R.A.,& Ashkenazi,A.(1993)J Biol chem 268,26059-62である。
参考文献3はWeng,Z.,Thomas,S.M.,Rickles,R.J.,Taylor,J.A.,Brauer,A.W.,Seidel-Dugan,C.,Michael,W.M.,Dreyfuss,G.,& Brugge,J.S.(1994)Mol Cell Biol 14,4509-21である。
参考文献4はSudol,M.(1994)Oncogene 9,2145-52である。
参考文献5はGertler,F.B.,Comer,A.R.,Juang,J.L.,Ahern,S.M.m Clark,M.J.,Liebl,E.C.,& Hoffmann,F.M.(1995)Genes Dev 9,521-33である。
参考文献6はGout,I.,Dhand,R.,Hiles,I.D.,Fry,M.J.,Panayotou,G.,Das,P.,Truong,O.,Totty,N.F.,Hsuan,J.,Booker,G,W.& et al.(1993)Cell 75,25-36である。
参考文献7はRivero-Lezcano,O.M.,Sameshima,J.H.,Marcilla,A.,& Robbins,K.C.(1994)J Biol Chem 269,17363-6である。
参考文献8はOdai,H.,SASAki,K.,Iwamatsu,A.,HAnazono,Y.,Tanaka,T.,Mitani,K.,Yazaki,Y.& Hirai,H.(1995)J Biol Chem 270,10800-5である。
参考文献9はKapeller,R.,Prasad,K.V.,Janssen,O.,Hou,W.,Schaffhausen,B.S.,Rudd,C.E.,& Cantley,L.C.(1994)J Biol Chem 269,1927-33である。
参考文献10はWeng,Z.,Taylor,J.A.,Turner,C.E.,Brugge,J.S.,& Seidel-Dugan,C.(1993)J Biol Chem 268,14956-63である。
参考文献11はKarlsson,T.,Songyang,Z.,Landgren,E.,Lavergne,C.,Di-Fiore,P.P.,Anafi,M.,Pawson,T.,Cantley,L.C.,Claesson-Welsh,L.,& Welsh,M.(1995)Oncogene 10,1475-83である。
参考文献12はRen,R.,Mayer,B.J.,Cicchetti,P.,& Baltimore,D.)1993)Science 259,1157-61である。
参考文献13はRen,R.,Ye,Z.S.,& Baltimore,D.(1994)Genes Dev 8,783-95である。
参考文献14はKnudsen,B.S.,Feller,S.M.,& Hanafusa,H.(1994)J Biol Chem 269,32781-7である。
参考文献15はRozakis-Adcock,M.,Fernley,R.,Wade,J.,Pawson,T.,& Bowtell,D.(1993)Nature 363,83-5である。
参考文献16はMcPherson,P,S.,Czernik,A,J.,Chilcote,T,J.,Onofri,F.,Benfenati,F.,Greengard,P.,Schlessinger,J., & De-Camilli,P.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91,6486-90である。
表15に示された配列はSH3ドメインを含むタンパク質および上記5.6節に記載されたそれらのリガンドの結合に影響を与える成分の同定のための試験においてリガンドとして用いられ得る点で有用である。
6.16  SH3ドメインに結合することが知られていないタンパク質中のSH3ドメイン結合配列に類似する配列を同定するための共通配列の使用
上記表1-13に示された共通配列はSH3ドメインに結合することが知られていないタンパク質のアミノ酸配列を含む(例えばGenBankのような)データベースを調べるために用いられ得る。このようにして以前にSH3ドメインに結合するアミノ酸配列を含むとは考えられていなかった数多くのタンパク質がそのような配列を持つことが示された。これらのタンパク質の表1-13の共通モチーフのうちの一つまたはそれ以上に類似したアミノ酸配列の一部分が下記の表16に示される。表16に示されるタンパク質のＳＨ３ドメイン結合配列はSH3ドメインを含むタンパク質および上記5.6節に記載されたそれらのリガンドの結合に影響を与える成分の同定のための試験においてリガンドとして用いられ得る。
0004060886.tif 000019
0004060886.tif 000020
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表16においては位置および登録番号は登録名およびGenBAnkまたはSwiss Protデータベースにおける登録番号である。提示された配列のすぐ左の2つの番号は成熟したタンパク質内での提示された配列のアミノ酸の位置である。これらの2つの番号のうち最も左側の番号は成熟したタンパク質内での提示された配列の開始アミノ酸番号である。提示された配列のすぐ右の括弧内の番号は配列のSEQ ID NOである。表16の最も右側の8つのカラムは提示された配列および表6-15の共通モチーフのあいだの不一致を示す。左端のSrcカラムはI型モチーフであり、右端のSrcカラムはII型モチーフである。
通常の技術を有する者には本発明のその他の多くの態様として上記の望ましい態様以上のものを考え得るが、そのような他の態様は本発明の範囲及び意図の中に含まれる。何故なら本発明は本発明の説明として本明細書に記載された望ましい態様に限られるように意図されておらず、請求の範囲のみによって限定されるように意図されているからである。
また、数多くの参考文献が明細書を通じて引用されている。これらの参考文献の開示は全体として本明細書に参照により援用される。
【図１】
0004060886.tif 000024
【図２】
0004060886.tif 000025
【図３】
0004060886.tif 000026
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004060886.tif 000030
【図８】
0004060886.tif 000031
【図９】
0004060886.tif 000032
【図１０】
0004060886.tif 000033
【図１１Ａ】
0004060886.tif 000034
【図１１Ｂ】
0004060886.tif 000035
【図１１Ｃ】
0004060886.tif 000036
【図１１Ｄ】
0004060886.tif 000037
【図１２】
0004060886.tif 000038
【図１３】
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【図１４】
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【図１４Ａ】
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