(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質に含まれる抗原を検出する方法であって、
支持体に固定された抗原及び／又は固定されていない抗原と、
標識としてのオリゴヌクレオチド鎖を有する、前記抗原に特異的に結合する抗体と、
を接触させて当該抗原と当該抗体を含有するオリゴヌクレオチド複合体を形成させる工程、及び
前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程、を含み、
前記オリゴヌクレオチド鎖は、アダプター部分を含み、少なくとも前記アダプター部分を介して前記抗体に固定され、
前記アダプター部分は、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種であって、
前記オリゴヌクレオチド複合体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、
前記検出工程は、
制限酵素、光照射、または活性酸素によって前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【請求項２】
被験物質に含まれ、複数の抗原を識別して検出する方法であって、
各抗原に特異的に結合する抗体と、当該抗体に結合するアダプター部位を有し、標的物質の種類に対応するオリゴヌクレオチド鎖を混合して、前記抗体と前記オリゴヌクレオチドとを含有するオリゴヌクレオチド複合体をそれぞれ形成させる工程と、
形成した前記オリゴヌクレオチド複合体をそれぞれ精製した後で混合する工程と、
支持体に固定された前記抗原及び／又は固定されていない前記抗原と、前記混合したオリゴヌクレオチド複合体とを接触させて当該抗原と当該抗原に特異的に結合する当該抗体を含む当該オリゴヌクレオチド複合体との複合体を形成させる工程と、
前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程、を含み、
前記アダプター部分は、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種であって、
前記オリゴヌクレオチド複合体が、当該オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有し、
前記検出工程が、
制限酵素、光照射、または活性酸素によって前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【請求項３】
抗原の検出用キットであって、
オリゴヌクレオチド鎖と、各抗原に特異的に結合する抗体とを含有し、
前記オリゴヌクレオチド鎖は、前記抗体に結合するアダプター部分を含み、
前記アダプター部分は、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種であって、
前記オリゴヌクレオチド鎖と前記抗体とが結合したオリゴヌクレオチド複合体は、制限酵素、光照射、または活性酸素によって前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、標的物質とそれに特異的に結合し得る物質との反応（例えば抗原抗体反応）を用いた標的物質の検出方法に関する。詳しくは、被験試料に含まれる複数種類の標的物質を識別して検出する方法に関する。
【背景技術】  モノクローナル抗体作製技術の確立により、特定の抗原に対して特異的に反応し得る抗体の入手が可能となり、抗原抗体反応の特異性を利用した抗原検出のアッセイ系の開発・改良が、研究・臨床等のいずれの分野においても不可欠なものとなっている。このようなアッセイ系では、一般に、抗原に反応させる抗体に特定の標識を施しておき、反応後に当該標識を検出することで抗原の検出に代えるというものである。また、検出感度をより高めるため、標識の種類や検出方法等の研究もこれまで種々頻繁に行われており、例えば、アビジン・ビオチンシステム、蛍光色素、ラジオアイソトープを使用する方法のほか、より検出感度を高めた方法として、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法（例えば「Ｔ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２５８，１２０−１２２（１９９２）」参照。）、Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法（例えば「今井浩三、鈴木朝子、日野田裕治，Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲを用いた微量抗原検出法，蛋白質  核酸  酵素，羊土社，１９９６年，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．５，ｐ．６１４−６１７」参照。）、オリゴヌクレオチドとＤＮＡデンドリマを使用しウエスタンブロット法を用いて検出する方法（例えば「特表２００１−５０３５１７号公報」参照。）などが挙げられる。
【発明の開示】
しかしながら、上記検出方法はいずれも、被験試料に含まれる複数種類の標的物質（抗原）のうち、特定の１種のみが検出対象となる方法であり、特定の２種以上の標的物質を一度に識別し検出できる方法はこれまで無かった。そのため、これら２種以上の標的物質をすべて検出しようとする場合は、その種類ごとに別々の検出系で行わなければならず、検出に要する時間や手間といった検出効率の点で問題があった。現実的に見ても、近年では、被験試料から多種多様な標的物質（バイオマーカー、原因物質、病原体など）の検出を要請されるケースが非常に多くなってきている。例えば、臨床検査の分野においては、癌の診断や抗癌剤の薬効評価、脳卒中や心筋梗塞の診断、及び感染症における病原体の特定等のケースがあり、食品や環境の分野においては、残留農薬や細菌による食品汚染物質の特定、及びダイオキシンやポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）等の環境汚染物質の特定等のケースがある。このため、一度の検査処理でそれらを同時に検出できる方法が切望されている。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、被験試料に含まれる複数種類の標的物質を一度に識別して検出することができる、標的物質の検出方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、被験試料に含まれる複数種類の標的物質のうち、検出しようとする２種以上の標的物質のそれぞれに特異的に結合し得る物質（結合物質）を用意し、各々の結合物質は標的物質の種類に対応して識別することができるように標識処理しておき、標的物質と結合物質との特異的結合反応により両物質の複合体を形成するようにすれば、その後の検出段階において各々の複合体に固有の標識を同時かつ明確に区別して検出すること（いわゆる同時多項目検出）ができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）被験試料に含まれる複数種類の標的物質を識別して検出する方法であって、
（ｉ）支持体に固定された標的物質及び／又は固定されていない標的物質と、当該標的物質の種類に対応して識別し得るように標識処理された結合物質とを接触させて当該標的物質と当該結合物質との複合体を形成させる工程（以下、標的物質−結合物質複合体の形成工程）、及び
（ｉｉ）前記複合体を形成した結合物質中の標識を検出する工程（以下、標識検出工程）
を含む、前記方法。
本発明の方法において、前記結合物質中の標識部分は、少なくともアダプター部分を介して当該結合物質に固定されたものであってもよい。当該アダプター部分としては、例えば、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。
本発明の方法において、前記結合物質としては、例えば、標識物質としてのオリゴヌクレオチド鎖との複合体（オリゴヌクレオチド複合体）を形成するものを挙げることができる。また前記標識処理としては、例えば、上記オリゴヌクレオチド鎖に施される下記（ｉ）〜（ｉｘ）の処理を挙げることができる。
（ｉ）制限酵素による切断部位を設ける処理
（ｉｉ）ＰＣＲで増幅可能な領域を設ける処理
（ｉｉｉ）放射性同位体元素を含有させる処理
（ｉｖ）蛍光色素を結合させる処理
（ｖ）酵素を結合させる処理
（ｖｉ）光照射による切断部位を設ける処理
（ｖｉｉ）活性酸素による切断部位を設ける処理
（ｖｉｉｉ）標識処理デンドリマを結合させる処理
（ｉｘ）塩基の種類において少なくとも１塩基の違いを設ける処理
さらに、前記標識を検出する工程としては、例えば、上記ＰＣＲにより増幅された産物を電気泳動により検出する工程を挙げることができる。
本発明の方法において、前記結合物質としては、例えば、標識物質としてのオリゴペプチド鎖との複合体（オリゴペプチド複合体）を形成するものを挙げることができる。また前記標識処理としては、例えば、上記オリゴペプチド鎖に施される下記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の処理を挙げることができる。
（ｉ）タンパク質分解酵素による切断部位を設ける処理
（ｉｉ）放射性同位体元素を含有させる処理
（ｉｉｉ）蛍光色素を結合させる処理
（ｉｖ）酵素を結合させる処理
（ｖ）光照射による切断部位を設ける処理
（ｖｉ）活性酸素による切断部位を設ける処理
（ｖｉｉ）標識処理デンドリマを結合させる処理
本発明の方法において、前記標的物質としては、例えば抗原が挙げられ、上記結合物質としては、例えば抗体が挙げられる。
（２）標的物質の種類に対応して識別し得るように標識処理された複数種類の結合物質を含む、標的物質の識別検出用キット。
【図面の簡単な説明】  図１は、制限酵素反応を利用して抗原を識別検出する一実施例を示す模式フロー図である。
図２は、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法を利用して抗原を識別検出する一実施例を示す模式フロー図である。
図３Ａは、フリーラジカルを利用して抗原を識別検出する一実施例を示す概略図である。
図３Ｂは、オリゴペプチド核酸鎖が複合化された抗体を用いて抗原を識別検出する一実施例を示す概略図である。
図４は、実施例１において複合抗体の検定を行ったときのアガロースゲル電気泳動後のバンドを示す写真である。
図５は、実施例１において複合抗体を用いた識別検出を行ったときのアガロースゲル電気泳動後のバンドを示す写真である。
図６は、実施例２におけるコスモアイＳＶ１２１０での測定結果を示すチャートである。なお、チャートにおけるピーク上の数字は、ピーク面積（オリゴヌクレオチド濃度）を示す値である。
図７は、アダプター部分を介してオリゴペプチド核酸鎖が複合化された抗体を用いて、抗原を識別検出する一実施例を示す概略図である。
図８は、実施例３においてＤＮＡシークエンサーＡＢＩ−３１００によりＧｅｎｅＳｃａｎ解析を行った結果を示すチャートである。
図９は、参考例１におけるＥＬＩＳＡ法での検出結果を示す図である。（ａ）は各ウェルでの発色の様子を示す写真であり、（ｂ）はＥＬＩＳＡリーダーでの測定結果を示すグラフである。
図１０は、参考例１における本発明の検出方法での検出結果（ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ−３１００によるＧｅｎｅＳｃａｎ解析の結果）を示すチャートである。
図１１は、図１０と同様に、参考例１における本発明の検出方法での検出結果（ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ−３１００によるＧｅｎｅＳｃａｎ解析の結果）を示すチャートである。
図１２は、参考例２における本発明の検出方法での検出結果（ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ−３１００によるＧｅｎｅＳｃａｎ解析の結果）を示すチャートである。
図１３は、図１２に示す検出結果のプロット、及びタンパク量（抗原量）と検出値（シグナル値）との相関を示すグラフである。
【符号の説明】
１：抗原、２：ウェルプレート、３：標識処理抗体、４：標識処理抗体、
５：ヌクレオチド鎖、６：ヌクレオチド鎖、７：制限酵素サイト、
８：制限酵素サイト、９：抗原−抗体複合体、１０：抗原−抗体複合体、
１１：ヌクレオチド断片、１２：ヌクレオチド断片、１３：標識処理抗体、
１４：標識処理抗体、１５：ヌクレオチド鎖、１６：ヌクレオチド鎖、
１７：抗原−抗体複合体、１８：抗原−抗体複合体、１９：Ｆプライマー、
２０：Ｒプライマー、２１：ヌクレオチド断片（ＰＣＲ産物）、
２２：ヌクレオチド断片（ＰＣＲ産物）
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の検出方法について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．本発明の概要
本発明の検出方法は、前述の通り、標的物質−結合物質複合体の形成工程と、標識検出工程とを含む方法であるが、まず以下の４つの実施形態により本発明の方法全体の概要を例示し、続いて各工程ごとに詳しく説明する。なお、以下の（１）〜（４）の例示は、いずれも、標的物質及び結合物質の一例として抗原及び抗体を用いて説明したものであるが、標的物質及び結合物質が抗原及び抗体以外の場合についても同様の説明を適用することができる。
（１）第１の実施形態は、図１の模式フロー図に示すように、まず、支持体となるウェルプレート２に、標的物質として複数種類（図１では４種類）の抗原１を固定し（図１（ａ））、これら抗原１に対する結合物質として、オリゴヌクレオチド複合抗体（標識処理抗体）３，４を添加する（図１（ｂ））。抗体３は、オリゴヌクレオチド鎖５と複合体を形成するものであり、抗体４は、オリゴヌクレオチド鎖６と複合体を形成するものである。抗体３，４は、いずれも、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖５，６中に共通の制限酵素サイト７，８（例えば、ＥｃｏＲＩ等）を有する。オリゴヌクレオチド鎖５，６の長さ（ヌクレオチド配列）は、それぞれ、制限酵素サイト７，８より末端部分の長さが互いに異なるように設計（又は選択）されている。図１では、抗体３の方がオリゴヌクレオチド鎖の長さが短い。
次いで、抗原抗体反応により、抗体３，４をそれぞれ特定の抗原に結合させ、抗原−抗体複合体９，１０を形成させる（図１（ｃ））。当該複合体を形成しなかった抗原は、洗浄により除去する（図１（ｄ））。
その後、制限酵素サイト７，８を切断する制限酵素を添加して反応させ、抗原−抗体複合体９，１０を形成する抗体３，４中のオリゴヌクレオチド鎖５，６のそれぞれから、長さの異なるヌクレオチド断片１１，１２を得る（図１（ｅ））。得られた断片の長さを、アガロースゲル等を用いた電気泳動法により識別検出する（図１（ｆ））。
図１（ｆ）では、ヌクレオチド断片１１，１２に対応する長さの異なる２種のバンドが検出されている。これにより、４種の抗原を含む被験試料中には、検出対象となる２種の抗原が含まれていたことが確認できる。
（２）第２の実施形態は、図２の模式フロー図に示すように、まず、支持体となるウェルプレート２に、標的物質として複数種類（図２では４種類）の抗原１を固定し（図２（ａ））、これら抗原１に対する結合物質として、オリゴヌクレオチド複合抗体（標識処理抗体）１３，１４を添加する（図２（ｂ））。抗体１３は、オリゴヌクレオチド鎖１５と複合体を形成するものであり、抗体１４は、オリゴヌクレオチド鎖１６と複合体を形成するものである。抗体１３，１４は、いずれも、そのオリゴヌクレオチド鎖１５，１６中に、共通のＰＣＲプライマー（Ｆプライマー１９、Ｒプライマー２０）が結合し得る配列を有する。オリゴヌクレオチド鎖１５，１６の長さ（ヌクレオチド配列）は、それぞれ、ＰＣＲ（Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ）により増幅される配列（ＰＣＲ産物）の長さが互いに異なるように設計（又は選択）されている。具体的には、図２（ｅ）（ｆ）に示すように、抗体１３中のオリゴヌクレオチド鎖１５からはαβ間の配列が増幅され、抗体１４中のオリゴヌクレオチド鎖１６からはγδ間の配列が増幅されることになり、αβ間の配列の方が短い。
次いで、抗原抗体反応により、抗体１３，１４をそれぞれ特定の抗原に結合させ、抗原−抗体複合体１７，１８を形成させる（図２（ｃ））。当該複合体を形成しなかった抗原は、洗浄により除去する（図２（ｄ））。
その後、ＰＣＲプライマー（Ｆプライマー１９、Ｒプライマー２０）を用いてＰＣＲ（Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ）を行い（図２（ｅ））、抗原−抗体複合体１７，１８を形成する抗体１３，１４中のオリゴヌクレオチド鎖１５，１６のそれぞれから、ＰＣＲ産物として、長さの異なるヌクレオチド断片２１（αβ間を増幅した断片）及び２２（γδ間を増幅した断片）を得る（図２（ｆ））。得られた断片の長さを、アガロースゲル等を用いた電気泳動法により識別検出する（図２（ｇ））。
図２（ｇ）では、ヌクレオチド断片２１，２２に対応する長さの異なる２種のバンドが検出されている。これにより、４種の抗原を含む被験試料中には、検出対象となる２種の抗原が含まれていたことが確認できる。
（３）第３の実施形態は、図３Ａの模式図（上）に示すように、特定の抗原に対し、当該抗原中の異なるエピトープをそれぞれ認識する抗体（抗体のセット）を準備する。具体的には、一方の抗体には、ＨＲＰやＮｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅや光増感剤等でスーパーオキシドやその他のフリーラジカルを産生し得る酵素又は化学物質を複合化させておく。他方の抗体には、スーパーオキシドやその他のフリーラジカルで開裂可能なクロスリンカー（例えばＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−４−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏａｔｅ（ＨＳＡＢ））を介してオリゴヌクレオチド鎖等を複合化させておく。ここで、他方の抗体中のオリゴヌクレオチド鎖等は、当該抗体が認識する抗原の種類に応じて異なる長さとなるように設計しておく。
まず、支持体（ウェルプレート等）に固定された及び／又は固定されていない複数種類の抗原（標的物質）に、準備しておいた抗体（結合物質）を添加する。
次いで、抗原抗体反応により、抗体をそれぞれ特定の抗原に結合させ、抗原抗体複合体を形成させる。当該複合体を形成しなかった抗原あるいは抗体は、検出目的に応じて、洗浄により除去するか、あるいは未洗浄のままにしておく。
次に、スーパーオキシドやその他のフリーラジカルを生成する試薬を添加する。その後、各抗原に対応した長さの異なるオリゴヌクレオチド鎖含有断片が得られる。得られた断片の長さを、アガロースゲルを用いた電気泳動法やマイクロチップ等により識別検出する。
また、この第３の実施形態を利用すれば、図３Ａの模式図（下）に示すように、複合体の形成反応を確認することもできる。当該形成反応としては、例えば、細胞膜受容体の二量体化、及び細胞内タンパク結合等が挙げられる。これにより、癌等の診断や発症機序の解明に現在又は将来必要と考えられる技術を提供できる。
なお、第３の実施形態では、検出環境は液相及び固相の別を問わない。
（４）第４の実施形態は、図３Ｂの模式図に示すように、まず、支持体（ウェルプレート等）に固定された及び／又は固定されていない複数種類の抗原（標的物質）に、結合物質としての抗体（標識処理抗体）を添加する。当該抗体は、オリゴペプチド鎖部分とオリゴヌクレオチド鎖部分とを連結したハイブリッド鎖が複合化された抗体である。オリゴペプチド鎖部分は、特定のタンパク質分解酵素により切断される部位を有するように設計し、オリゴヌクレオチド鎖部分は、上記抗体が認識する抗原の種類に応じて異なる長さとなるように設計しておく。次いで、抗原抗体反応により、標識処理抗体をそれぞれ特定の抗原に結合させ、抗原抗体複合体を形成させる。当該複合体を形成しなかった抗原あるいは標識抗体は、検出目的に応じて、洗浄により除去するか、あるいは未洗浄のままにしておく。
次に、形成した抗原抗体複合体を特異的に認識する抗体又は補体（Ｃ１等）であって上記特定のタンパク質分解酵素が複合化されたものを添加する。当該抗体又は補体が、抗原抗体複合体に結合すると、上記タンパク質分解酵素が、近在する抗原抗体複合体中のオリゴペプチド鎖部分を切断する。その結果、各抗原の種類に対応した長さの異なるオリゴヌクレオチド鎖含有断片が得られる。得られた断片の長さを、アガロースゲルを用いた電気泳動法やマイクロチップ等により識別検出する。
この第４の実施形態を利用すれば、公知のサンドウィッチ法とは異なり、目的の抗原に対する１種類のエピトープを認識する抗体で抗原を検出することができる。
なお、第４の実施形態では、検出環境は液相及び固相の別を問わない。
２．標的物質−結合物質複合体の形成工程
本発明の検出方法は、支持体に固定された複数種類の標的物質、及び／又は支持体に固定されていない複数種類の標的物質と、当該標的物質の種類に対応して識別し得るように標識処理された結合物質とを接触させて、当該標的物質と当該結合物質との複合体を形成させる工程を含む方法である。なお、上記「結合物質」とは、特定の標的物質と特異的に結合し得る物質を意味し、抗原（標的物質）に対する抗体などが例示できる。
（１）支持体
本発明において用い得る支持体としては、抗原等の標的物質を固定することができ、当該標的物質に、抗体等の結合物質（溶液）を接触させることができるものであればよく、限定はされない。このような支持体としては、通常、不溶性の材質及び形状等のものが用いられる。例えば、抗原抗体反応によるアッセイ系に用い得る支持体が好ましく、具体的には、マルチプラスチックウェルプレート、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、プラスチックチューブ、ナイロン膜、ニトロセルロース膜などが挙げられる。
（２）標的物質
本発明の方法において検出対象とする標的物質は、被験試料（詳しくは同一の被験試料）に含まれる複数種類の標的物質である。当該標的物質の個々の種類は限定されない。このような標的物質としては、例えば、各種タンパク質（抗体タンパク質も含む）、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド等）、多糖類、糖脂質、各種核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、及びその他低分子の化学合成物や生体成分等が挙げられ、なかでも、抗原となり得るもの（すなわち、抗体タンパク質が存在し得るもの又は作製可能なもの）が好ましい。なお、別の実施形態として、単一種類の標的物質を検出対象とし、標識処理された結合物質を複数種類用いて、標的物質がどの結合物質に対して特異的であるかを特定する（すなわち標的物質の種類を特定する）アッセイ系とすることもできる。
上記被験試料としては、例えば、生体成分（組織や血液）、食肉や野菜等の食品類、土壌や河川水、燃焼廃棄物等を挙げることができるが、限定はされない。
上記被験試料に含まれる標的物質の種類数は、複数（少なくとも２種類）であればよく限定はされないが、本発明の方法によれば、例えば、１０種類以上であっても特定の標的物質を明確に識別検出することができ、また５０種類以上であってもよいし、さらには１００種類以上であってもよい。
上記被験試料中の標的物質の濃度は、限定はされないが、本発明の方法によれば、例えば、被験試料１μＬあたり標的物質がｎｇオーダー以下の濃度であっても、特定の標的物質を明確に識別検出することができ、またｐｇオーダー以下であってもよいし、さらにはｆｇオーダー以下であってもよい。特に、識別処理された結合物質として、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の結合物質（後に詳述する）等を用いる場合は、より低い標的物質濃度であっても高い感度で識別検出することができ、中でも（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合物質を用いる場合が好ましい。
（ｉ）ＰＣＲで増幅可能な領域を有するオリゴヌクレオチド鎖との複合体を形成している結合物質
（ｉｉ）蛍光色素を結合させたオリゴヌクレオチド鎖又はオリゴペプチド鎖との複合体を形成している結合物質
（ｉｉｉ）放射性同位体元素を含有させるか又は放射性物質を結合させたオリゴヌクレオチド鎖又はオリゴペプチド鎖との複合体を形成している結合物質
（ｉｖ）標識処理デンドリマを結合させたオリゴヌクレオチド鎖又はオリゴペプチド鎖との複合体を形成している結合物質
本発明の方法においては、標的物質を支持体に固定しておいた上で標識処理された結合物質（溶液）と接触させ、これにより標的物質と結合物質との特異的結合反応を行うようにしてもよいし、標的物質を支持体等へ固定せずに当該反応を行うようにしてもよいし、又はこれらを組み合わせて行うようにしてもよく、限定はされない。
標的物質を支持体へ固定する方法としては、例えば、支持体表面に直接標的物質を固定する方法、標的物質に特異的に結合する抗体を予め支持体表面に結合させて固定しておき、その後、当該固定された抗体に標的物質を結合させることで、間接的に固定する方法等が挙げられるが、限定はされない。後者の間接的な固定方法の場合、標的物質となり得る多種多様な物質のうち検出対象となり得る物質を予め選抜しておくことができるので、検出感度や検出精度を高めることができる。なお、後者の固定方法において、後に用いる標識処理された結合物質も抗体である場合は、支持体に直接固定する抗体としては、通常、後に用いる抗体とは標的物質（抗原）に対して認識するエピトープが異なるものを用いる。
標的物質を支持体へ固定する場合は、標識処理された結合物質（溶液）と接触させる前に、常法に従い、ブロッキングを行うことが好ましい。上記直接固定の場合は当該固定後に、上記間接固定の場合は支持体への抗体固定の後かつ標的物質結合の前に、ブロッキングを行うことが望ましい。
（３）結合物質
本発明の方法では、結合物質として、標的物質の種類に対応して識別し得るように標識処理された結合物質を複数種類用いる。標識処理は、特定の標的物質に対応する特異的な結合物質ごとに１種類の標識処理が施されるようにし、後の検出段階において標識の数及びその種類の特定を行うことで、検出された標的物質の数及びその種類の特定を行うようにする。しかしこれには限定はされず、例えば、複数種の結合物質に同一の標識処理を施し、複数種の標的物質を包括的に検出することもできる。
本発明の方法で用い得る結合物質としては、例えば、特定の抗原物質に対して特異的に結合し得る抗体（抗体タンパク質）のほか、特定の標的遺伝子又は核酸分子に対してハイブリダイズし得る一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）、合成核酸）、特定の標的タンパク質等に対して特異的に結合し得る各種タンパク質（抗体を除く）、特定の糖脂質に対して特異的に結合し得るタンパク質（レクチン等）、及び特定の抗体に対して特異的に結合し得る抗原物質などが挙げられ、なかでも、抗体が好ましい。
結合物質が抗体である場合は、一般には、特定の単一種類の抗原（標的物質）ごとに特異性を有するモノクローナル抗体を用いるようにすることが好ましいが、限定はされない。例えば、特定の複数種の抗原に共通した特異性を有するモノクローナル抗体なども用いることができる。このような抗体を用いるアッセイ系によれば、複数種の抗原を単一の抗体によって包括的に検出することができる。
なお本発明の方法において、「支持体に固定された標的物質と標識処理された結合物質とを接触させる」とは、一般には、当該標的物質と当該標識処理され結合物質とを直接接触させて結合させることを意味する。しかし、本発明ではこれに限定はされず、より広義的に、支持体に固定された標的物質に、まず当該標的物質に特異性を有する１次的な結合物質（１次抗体など）を結合させ、次いで、この１次結合物質に対して特異性を有する結合物質として、前記の標識処理された結合物質を接触させることで、結果として前記標的物質と当該標識処理された結合物質とを間接的に結合させることも含む。この間接的な結合においては、上記１次結合物質には、さらに２次結合物質、３次結合物質、・・・ｎ次結合物質を結合させてもよく、その場合、標識処理された結合物質としてはｎ次結合物質と特異的に結合し得るものを用いればよい。なお、上記ｎは、１〜１１であり、好ましくは１又は２である。
本発明の方法に用いる結合物質は、標識物質としての各種核酸鎖及びペプチド鎖等と複合体を形成しているものが好ましい。結合物質が抗体の場合は、当該複合体は「複合抗体」と称する。上記核酸鎖及びペプチド鎖等としては、例えば、オリゴヌクレオチド鎖（ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖）、オリゴペプチド鎖、及びオリゴペプチド核酸鎖などが好ましく挙げられ、これらは天然物であっても合成物であってもよい。なかでも、オリゴヌクレオチド鎖との複合体を形成している結合物質（オリゴヌクレオチド複合体）は、塩基配列やオリゴヌクレオチド鎖長による識別化、蛍光色素の結合や放射性同位体元素の含有等による識別化、あるいはＰＣＲ増幅断片長による識別化など、より一層有用性・実用性の高い識別化が可能となる等の効果が得られるためより好ましく、合成されたオリゴヌクレオチド鎖との複合体を形成している結合物質がさらに好ましい。
上記各種核酸鎖やペプチド鎖等の長さは、特に限定はされない。
例えば、オリゴヌクレオチド鎖（ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖）の場合は、例えば、１００〜５，０００ｍｅｒであることが好ましく、より好ましくは１００〜１，０００ｍｅｒ、さらに好ましくは１００〜５００ｍｅｒである。オリゴヌクレオチド鎖の長さが上記範囲を満たす場合、結合物質との複合化が容易となり、複合化後の状態を安定化させるとともに、検出感度の向上や検出時間の短縮が図り得る等の効果が得られる。
オリゴペプチド鎖の場合は、例えば、１０〜１，０００アミノ酸残基であることが好ましく、より好ましくは１０〜５００アミノ酸残基、さらに好ましくは１０〜１００アミノ酸残基である。オリゴペプチド鎖の長さが上記範囲を満たす場合、結合物質との複合化が容易となり、複合化後の状態を安定化させるとともに、オリゴペプチド鎖への標識処理が容易となる等の効果が得られる。
オリゴペプチド核酸鎖の場合は、例えば、１０〜１００アミノ酸残基のオリゴペプチド鎖に１００〜５，０００ｍｅｒの核酸鎖（ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖）が連結したものが好ましく、より好ましくは核酸鎖部分が１００〜１，０００ｍｅｒであるもの、さらに好ましくは核酸鎖部分が１００〜５００ｍｅｒであるものである。オリゴペプチド核酸鎖の長さが上記範囲を満たす場合、結合物質との複合化が容易となり、複合化後の状態を安定化させるとともに、検出感度の向上や検出時間の短縮が図り得る等の効果が得られる。
上記オリゴヌクレオチド複合体は、例えば、標識部分としてのオリゴヌクレオチド鎖（ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖）の一端を、結合物質に共有結合させること等によって得られる。同様に、上記オリゴペプチド複合体及びオリゴペプチド核酸複合体は、例えば、標識部分としてのオリゴペプチド鎖又はオリゴペプチド核酸鎖の一端を、結合物質に共有結合させること等によって得られる。これら複合体の調製においては、オリゴヌクレオチド鎖、オリゴペプチド鎖及びオリゴペプチド核酸鎖は、例えば、１個又は２個以上のチオール基やアミノ基（置換基）又はビオチン（若しくはアビジン）等が化学的又は酵素的処理（好ましくは化学的処理）によって導入されていてもよい。これにより、結合物質との複合化が容易となり、複合化後の状態が一層安定化し、得られる複合体の収率を向上させるとともに、ひいては検出感度や検出効果を高める等の効果が得られる。
上記オリゴヌクレオチド複合体の調製方法としては、例えば、（ｉ）５’末端にアミノ基やチオール基を付加したオリゴヌクレオチド鎖を２価の架橋剤を用いて結合物質に固定する方法（Ｅ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ２３（３），ｐ５２２−５２９（１９９５））、及び（ｉｉ）予め結合物質及びオリゴヌクレオチド鎖をいずれもビオチン化しておき、当該結合物質とオリゴヌクレオチド鎖とを混合すると共にアビジンを添加することで、アビジンを介してオリゴヌクレオチド鎖を結合物質に固定する方法等が挙げられる。
上記オリゴペプチド複合体及びオリゴペプチド核酸複合体の調製方法としては、例えば、（ｉ）アミノ基やチオール基を有するオリゴペプチド鎖又はオリゴペプチド核酸鎖（以下、オリゴペプチド鎖等）、（ｉｉ）アミノ基やチオール基を付加したオリゴペプチド鎖等を、２価の架橋剤を用いて結合物質に固定する方法、及び（ｉｉｉ）予め結合物質及びオリゴペプチド鎖等をいずれもビオチン化しておき、当該結合物質とオリゴペプチド鎖等とを混合すると共にアビジンを添加することで、アビジンを介してオリゴペプチド鎖等を結合物質に固定する方法等が挙げられる。
また本発明においては、標識部分となるオリゴヌクレオチド鎖、オリゴペプチド鎖又はオリゴペプチド核酸を、少なくともアダプター部分を介して結合物質と複合化させることにより、上述した各種複合体を得ることもできる（図７（１）参照）。アダプター部分を介した固定により、当該複合体の構造安定性を一層高めることができ、得られる複合体の収率をより向上させるとともに、ひいては検出感度や検出効果を高める等の効果が得られる。上記アダプター部分としては、例えば、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質等の各種タンパク質が挙げられ、これらは、特に結合物質が抗体分子である場合に、当該抗体と容易にかつ安定して結合することができるため好ましい。
アダプター部分を含む複合体の調製方法としては、限定はされないが、（ｉ）まず、アダプター部分に標識部分となるオリゴヌクレオチド鎖等を結合させ、（ｉｉ）次いで、アダプター部分を結合物質に固定する方法が好ましい。
具体的には、上記（ｉ）においては、アダプター部分をアビジン修飾し、標識部分となるオリゴヌクレオチド鎖等をビオチン化して、両者を混合することにより、オリゴペプチド鎖等をアダプター部分に結合させる。あるいは、予めアダプター部分及びオリゴペプチド鎖等をいずれもビオチン化しておき、当該アダプター部分とオリゴペプチド鎖等とを混合すると共にアビジンを添加することで、アビジンを介してオリゴペプチド鎖等をアダプター部分に結合させることもできる。なお、前者の手法の場合、アダプター部分のアビジン修飾は、まずリンカー化合物をアダプター部分と結合反応させた後、当該化合物にアビジンを結合させてもよい。ここで使用されるアダプター部分がプロテインＡ、Ｇ又はＬ等の場合は、リンカー化合物として、例えば「Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）」等を好ましく用いることができる。
次に、上記（ｉｉ）においては、アダプター部分と結合物質とが結合反応性を有する場合は、上記（ｉ）で得られたアダプター部分／標識部分結合体と結合物質とを混合することで、オリゴヌクレオチド複合体等の各種複合体を得ることができる。また、アダプター部分と結合物質とが、もともと結合反応性を有しない場合は、例えば、両者をビオチン化しておきアビジン存在下で混合するなど、上記（ｉ）において採用し得る手法と同様の手法を用いて各種複合体を得ることができる。
以下の（３−１）及び（３−２）に、オリゴヌクレオチド複合体等及びオリゴペプチド複合体における標識処理について具体的に例示する。なお、これら例示はいずれも、標的物質及び結合物質の一例として抗原及び抗体を用いて説明したものであるが、標的物質及び結合物質が抗原及び抗体以外の場合についても同様の説明を適用することができる。
（３−１）オリゴヌクレオチド複合抗体における標識処理
オリゴヌクレオチド複合抗体の場合、標識処理は、オリゴヌクレオチド鎖そのものになされていてもよいし（例えば、下記（Ａ１）〜（Ａ３），（Ａ６），（Ａ７），（Ａ９）の処理等）、オリゴヌクレオチド鎖を介してなされていてもよく（例えば、下記（Ａ４），（Ａ５），（Ａ８）の処理等）、限定はされない。
オリゴヌクレオチド鎖に対してなされる上記標識処理としては、具体的には、下記（Ａ１）〜（Ａ９）から選ばれる少なくとも１つの処理が好ましく挙げられる。なかでも、（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ９）の処理が、標識処理が容易であり、検出感度が高い等の点でより好ましい。
（Ａ１）制限酵素による切断部位を設ける処理（図１参照）
（Ａ２）ＰＣＲで増幅可能な領域を設ける処理（図２参照）
（Ａ３）放射性同位体元素を含有させる処理
（Ａ４）蛍光色素を結合させる処理
（Ａ５）酵素を結合させる処理
（Ａ６）光照射による切断部位を設ける処理
（Ａ７）活性酸素による切断部位を設ける処理（図３Ａ参照）
（Ａ８）標識処理デンドリマを結合させる処理
（Ａ９）塩基の種類において少なくとも１塩基の違いを設ける処理
なお、オリゴペプチド核酸複合抗体の場合も、その核酸（オリゴヌクレオチド）部分に対して、上記オリゴヌクレオチド複合抗体の場合と同様の標識処理を施すことができる。各標識処理の実際についても、後述する具体的説明を、適宜同様に適用できる。
上記（Ａ１）の処理の場合は、例えば、図１に示すように他の抗体の標識とは該切断後に得られるオリゴヌクレオチド断片の長さが異なるようにするか、他の抗体の標識からは該切断後にオリゴヌクレオチド断片が得られないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
切断後の断片の長さが異なるようにすることは、具体的には、抗体に結合させるオリゴヌクレオチド鎖の長さは抗体間で実質的に同じであるが、制限酵素による切断部位の位置が互いに異なるように合成しておくか、又は、抗体に結合させるオリゴヌクレオチド鎖の長さ自体を抗体間で互いに異なるように合成しておくこと等により実施できる。切断後の断片の長さの相違差は、限定はされないが、良好な感度で識別検出できる点で、１０ｍｅｒ以上であることが好ましく、より好ましくは５０ｍｅｒ以上、さらに好ましくは１００ｍｅｒ以上である。
上記（Ａ２）の処理の場合は、例えば、図２に示すように、他の抗体の標識とは該ＰＣＲ産物として得られる断片の長さが異なるようにするか、他の抗体の標識からは該ＰＣＲ産物が得られないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
ＰＣＲ産物として得られる断片の長さが異なるようにすることは、具体的には、同一のプライマーを用いた場合であっても、プライマーの結合位置が異なり、ＰＣＲで増幅可能な領域の幅（長さ）が各抗体間で異なるように合成しておくこと等により実施できる。ＰＣＲ産物の断片の長さの相違差は、限定はされないが、良好な感度で識別検出できる点で、５ｍｅｒ以上であることが好ましく、より好ましくは１０ｍｅｒ以上、さらに好ましくは５０ｍｅｒ以上である。
上記（Ａ３）の処理の場合は、例えば、他の抗体の標識とは放射線種が異なるようにするか、他の抗体の標識においては放射線を放射しないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
放射性同位体元素を含有させる処理方法としては、例えば、オリゴヌクレオチド鎖を合成する際に放射性同位体元素を含有する核酸を使用したり、放射性同位体元素を含む修飾基（３２ＰＯ４、３５ＳＯ４）やＨ１２５Ｉ等でオリゴヌクレオチド鎖を直接標識する方法等が挙げられる。
具体的には、放射性同位体元素としては、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、５９Ｆ、１２５Ｉ等を用いることができ、なかでも、識別検出の感度を高める点では、β線を放出する放射性同位体元素（例えば３Ｈや１４Ｃ等）とγ線を放出する放射性同位体元素（例えば１２５Ｉ等）との組み合わせで用いることが好ましい。
上記（Ａ４）の処理の場合は、例えば、他の抗体の標識とは該蛍光色素の極大吸収波長が異なるようにするか、他の抗体の標識においては該蛍光色素を結合させないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
蛍光色素を結合させる処理方法としては、例えば、オリゴヌクレオチド鎖の官能基を蛍光色素で直接標識する方法等が挙げられる。
具体的には、蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（蛍光強度が異なるＥＧＦＰ等も含む）及びその誘導体（蛍光波長や励起波長が異なるＹＦＰやＢＦＰ等）等を用いることができ、なかでも、識別検出の感度を高める点では、ＦＩＴＣとＲＩＴＣの組み合わせや、ＧＦＰとその誘導体の組み合わせで用いることが好ましい。
上記（Ａ５）の処理の場合は、例えば、発色用基質と結合することで蛍光色素を生成させる酵素を用い、他の抗体の標識とは該酵素の種類を変え、蛍光色素の極大吸収波長が異なるようにするか、他の抗体の標識には該酵素を結合させないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
酵素を結合させる処理方法としては、例えば、サリチルヒドロキサミン化した酵素を、タンパク質架橋剤を介して、オリゴヌクレオチド鎖に結合させる方法等が挙げられる。
具体的には、上記酵素としては、アルカリホスファターゼ、各種ペルオキシダーゼ（ホースラディッシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼ）、ベータガラクトシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ等を用いることができ、なかでも、識別検出の感度を高める点では、発色法において増感剤であるＤＡＢとＴＭＢとを組み合わせて用いることが好ましい。
上記（Ａ６）の処理の場合は、例えば、他の抗体の標識とは切断可能な光の波長が異なるようにするか、他の抗体の標識と切断可能な光の波長が同じであっても切断後の断片の長さが異なるようにするなど異なる識別処理を施しておくようにするか、他の抗体の標識では光照射により切断しないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
具体的には、オリゴヌクレオチド鎖に、所定の波長光の照射で開裂（切断）可能なクロスリンカー（２価の架橋剤等）を付加した上で、このリンカーを介して、オリゴヌクレオチド鎖と抗体とを結合させるようにする。光照射で開裂可能なクロスリンカーとしては、例えば、オキシムエステル誘導体やカルバモイルオキシイミノ誘導体等を用いることができる。他の抗体の標識とは切断可能な光の波長が異なるようにする場合は、他の抗体におけるクロスリンカーとは開裂可能な波長が異なるクロスリンカーを用いるようにすること等で実施できる。この場合、クロスリンカーとしては、オキシムエステル誘導体とカルバモイルオキシイミノ誘導体との組み合わせで用いることが、良好な検出感度が得られる等の点で好ましい。また、他の抗体の標識と切断後の断片の長さが異なるようにする場合は、クロスリンカーを介して結合させるオリゴヌクレオチド鎖の長さが異なるようにしておくこと等で実施できる。切断後の断片の長さの相違差は、限定はされないが、良好な感度で識別検出できる点で、１０ｍｅｒ以上であることが好ましく、より好ましくは５０ｍｅｒ以上、さらに好ましくは１００ｍｅｒ以上である。そのほか、他の抗体の標識と切断後の断片に異なる標識処理を施しておく場合としては、クロスリンカーを介して結合させるオリゴヌクレオチド鎖に、上記（Ａ３）〜（Ａ５）及び下記（Ａ８）の処理を施しておくこと等で実施できる。
上記（Ａ７）の処理の場合は、例えば、他の抗体の標識とは切断後の断片の長さが異なるようにするなど異なる標識処理を施しておくようにするか、他の抗体の標識では活性酸素により切断しないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
具体的には、オリゴヌクレオチド鎖に、活性酸素との接触により開裂（切断）可能なクロスリンカー（２価の架橋剤等）を付加した上で、このリンカーを介して、オリゴヌクレオチド鎖と抗体とを結合させるようにする。活性酸素との接触により開裂可能なクロスリンカーとしては、例えば、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｉｍｉｄｅ−４−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏａｔｅ等のアジド系のクロスリンカーや、Ｓ−ニトロソアミン誘導体あるいはＮ−ニトロソアミン誘導体等を用いることができる。
他の抗体の標識と切断後の断片の長さが異なるようにする場合は、クロスリンカーを介して結合させるオリゴヌクレオチド鎖の長さが異なるようにしておくこと等で実施できる。切断後の断片の長さの相違差は、限定はされないが、良好な感度で識別検出できる点で、１０ｍｅｒ以上であることが好ましく、より好ましくは５０ｍｅｒ以上、さらに好ましくは１００ｍｅｒ以上である。そのほか、他の抗体の標識と切断後の断片に異なる標識処理を施しておく場合としては、クロスリンカーを介して結合させるオリゴヌクレオチド鎖に、上記（Ａ３）〜（Ａ５）及び下記（Ａ８）の処理を施しておくこと等で実施できる。
上記（Ａ８）の処理の場合は、例えば、オリゴヌクレオチドデンドリマ（ＤＮＡデンドリマ、ＲＮＡデンドリマ）等の各種デンドリマに、前述のように放射性同位体元素を含有させる、放射性物質を結合させる、蛍光色素を結合させる、又は酵素を結合させる等の標識処理を、１種又は２種以上施したデンドリマを用いる。そして、他の抗体の標識とはその種類や程度等が異なるようにするか、他の抗体の標識にはこのような標識処理デンドリマを結合させないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
デンドリマとは、それを構成する物質（例えば、オリゴヌクレオチドやＤＮＡ等）からなる樹木状多分岐高分子であり、中心（コア）から規則正しい枝分かれ骨格構造が３次元的に広がっているものをいう。デンドリマは、その枝分かれ部分どうしの間が決まった化学結合の繰り返し構造になっている。一般に、その繰り返し数は「世代」で表現され、世代が大きいほど大きく且つ球状に近い構造となる。
本発明においては、上記標識処理デンドリマと同様に、標識処理デンドロンも用いることができる。デンドロンとは、デンドリマと同様に樹木状多分岐高分子であるが、中心（フォーカルポイント）から一方向へのみ広がっている（伸びている）ものをいう。
デンドリマの合成方法としては、限定はされないが、コアから外側に向かって合成を進めるダイバージェント法、末端官能基から内側に向かって合成を進めるコンバージェント法、及び、これらを組み合わせた方法等が挙げられ、デンドロンにおいても同様の方法が挙げられる。デンドリマやデンドロンの合成経路は極めて秩序立っているため、前述したような標識処理物質等を、それら（デンドリマやデンドロン）の内外部を問わず、３次元的に所望の位置に導入することができる。
標識処理デンドリマを結合させる処理方法としては、例えば、抗体に結合しているオリゴヌクレオチド鎖に相補的に結合し得る配列領域（アーム）を、デンドリマの末端（最外層）に設けておき、所定の条件下でハイブリダイゼーションして結合させる方法や、抗体に結合しているオリゴヌクレオチド鎖の未結合末端にアミノ基やチオール基を付加しておき、２価の架橋剤を用いてデンドリマの末端と結合させる方法等が挙げられる。また、標識処理デンドロンを結合させる処理方法についても同様である。
上記（Ａ９）の処理の場合は、まず、各々の複合抗体に固定されているオリゴヌクレオチド鎖がそれぞれ同等の長さ（上記（Ａ１）や（Ａ２）の処理では違いが認識できない程度の長さ）であっても、塩基の種類が異なる箇所を１ヶ所以上設けておく。そして、この種類が異なる塩基を含むＰＣＲ増幅断片を、ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：ＡＢＩ−３１００）による解析や、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いたＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる解析等の１塩基の違いを認識できる解析手段を用いて、識別検出することができる。なお、各オリゴヌクレオチド鎖には、ＰＣＲによる増幅の前に鋳型となる所定の断片を遊離しておくため、制限酵素サイト（好ましくは同一の制限酵素による切断部位）を設けておくこともできる。当該処理の場合、標識のバリエーションは、「〔塩基の種類（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ等）〕×〔塩基の長さ（塩基数）〕」で算出される組合せまで可能であり、この処理は同時多項目検出に特に好適な処理と言える。上記バリエーションは、公知の各種変異導入法を用いたり、核酸合成の段階で塩基配列の設定に違いを設けることにより容易に設計できる。
（３−２）オリゴペプチド複合抗体における標識処理
オリゴペプチド複合抗体の場合、標識処理は、オリゴペプチド鎖そのものになされていてもよいし（例えば、下記（Ｂ１），（Ｂ２），（Ｂ５），（Ｂ６）の処理等）、オリゴペプチド鎖を介してなされていてもよく（例えば、下記（Ｂ３），（Ｂ４），（Ｂ７）の処理等）、限定はされない。
オリゴペプチド鎖に対してなされる上記標識処理としては、具体的には、下記（Ｂ１）〜（Ｂ７）から選ばれる少なくとも１つの処理が好ましく挙げられる。なかでも、（Ｂ１）の処理が、標識処理が容易であり、検出感度が高い等の点でより好ましい。
（Ｂ１）タンパク質分解酵素による切断部位を設ける処理
（Ｂ２）放射性同位体元素を含有させる処理
（Ｂ３）蛍光色素を結合させる処理
（Ｂ４）酵素を結合させる処理
（Ｂ５）光照射による切断部位を設ける処理
（Ｂ６）活性酸素による切断部位を設ける処理（図３Ａ参照）
（Ｂ７）標識処理デンドリマを結合させる処理
なお、オリゴペプチド核酸複合抗体の場合も、そのオリゴペプチド部分に対して、上記オリゴペプチド複合抗体の場合と同様の標識処理を施すことができる。各標識処理の実際についても、後述する具体的説明を、適宜同様に適用できる。
上記（Ｂ１）の処理の場合は、例えば、他の抗体の標識とは該切断後に得られるオリゴペプチド断片の長さが異なるようにするか、他の抗体の標識からは該切断後にオリゴペプチド断片が得られないようにするか、あるいは、これらを組み合わせて行うこと等により、識別検出することができる。
具体的には、切断後の断片の長さが異なるようにするには、抗体に結合させるオリゴペプチド鎖の長さは抗体間で実質的に同じであるが、制限酵素による切断部位の位置が互いに異なるように合成しておくか、又は、抗体に結合させるオリゴヌクレオチド鎖の長さ自体を抗体間で互いに異なるように合成しておくこと等により実施できる。切断後の断片の長さの相違差は、限定はされないが、良好な感度で識別検出できる点で、５アミノ酸残基以上であることが好ましく、より好ましくは１０アミノ酸残基以上、さらに好ましくは２０アミノ酸残基以上である。
上記（Ｂ２）の処理の場合は、例えば、前記（Ａ３）の場合と同様にして、識別検出することができる。
放射性同位体元素を含有させる処理方法としては、例えば、オリゴペプチド鎖を合成する際に放射性同位体元素を含有する核酸を使用したり、放射性同位体元素を含む修飾基（３２ＰＯ４、３５ＳＯ４）やＨ１２５Ｉ等でオリゴペプチド鎖を直接標識する方法等が挙げられる。
放射性同位体元素の具体的例示、及びその好ましい組み合わせについても、前記（Ａ３）の場合と同様であることが好ましい。
上記（Ｂ３）の処理の場合は、例えば、前記（Ａ４）の場合と同様にして、識別検出することができる。
蛍光色素を結合させる処理方法としては、例えば、オリゴペプチド鎖の官能基を蛍光色素で直接標識する方法等が挙げられる。
蛍光色素の具体的例示、及びその好ましい組み合わせについても、前記（Ａ４）の場合と同様であることが好ましい。
上記（Ｂ４）の処理の場合は、例えば、前記（Ａ５）の場合と同様にして、識別検出することができる。
酵素を結合させる処理方法としては、例えば、サリチルヒドロキサミン化した酵素を、タンパク質架橋剤を介して、オリゴペプチド鎖に結合させる方法等が挙げられる。
上記酵素の具体的例示、及び増感剤の好ましい組み合わせについても、前記（Ａ５）の場合と同様であることが好ましい。
上記（Ｂ５）の処理の場合は、例えば、前記（Ａ６）の場合と同様にして、識別検出することができる。
具体的には、オリゴペプチド鎖に、所定の波長光の照射で開裂（切断）可能なクロスリンカー（２価の架橋剤等）を付加した上で、このリンカーを介して、オリゴペプチド鎖と抗体とを結合させるようにする。光照射で開裂可能なクロスリンカーとしては、例えば、前記（Ａ６）の場合と同様のものを用いることができる。他の抗体の標識とは切断可能な光の波長が異なるようにする場合は、クロスリンカーの組み合わせも含め、前記（Ａ６）の場合と同様に実施できる。また、他の抗体の標識と切断後の断片の長さが異なるようにする場合も、前記（Ａ６）の場合と同様に実施できる。切断後の断片の長さの相違差は、限定はされず、適宜設定できる。そのほか、他の抗体の標識と切断後の断片に異なる標識処理を施しておく場合としては、クロスリンカーを介して結合させるオリゴペプチド鎖に、上記（Ｂ２）〜（Ｂ４）及び下記（Ｂ７）の処理を施しておくこと等で実施できる。
上記（Ｂ６）の処理の場合は、例えば、上記（Ａ７）の場合と同様にして、識別検出することができる。
具体的には、オリゴペプチド鎖に、活性酸素との接触により開裂（切断）可能なクロスリンカー（２価の架橋剤等）を付加した上で、このリンカーを介して、オリゴペプチド鎖と抗体とを結合させるようにする。活性酸素との接触により開裂可能なクロスリンカーとしては、例えば、前記（Ａ７）の場合と同様のものを用いることができる。他の抗体の標識と切断後の断片の長さが異なるようにする場合は、前記（Ａ７）の場合と同様に実施できる。切断後の断片の長さの相違差は、限定はされず、適宜設定できる。そのほか、他の抗体の標識と切断後の断片に異なる標識処理を施しておく場合としては、クロスリンカーを介して結合させるオリゴペプチド鎖に、上記（Ｂ２）〜（Ｂ４）及び下記（Ｂ７）の処理を施しておくこと等で実施できる。
上記（Ｂ７）の処理の場合は、例えば、前記（Ａ８）の場合と同様にして、識別検出することができる。また、標識処理デンドリマと同様に、標識処理デンドロンも用い得る点も同様である。
標識処理デンドリマを結合させる処理方法としては、例えば、抗体に結合しているオリゴペプチド鎖に相補的に結合し得る配列領域（アーム）を、デンドリマの末端（最外層）に設けておき、所定の条件下でハイブリダイゼーションして結合させる方法、及び、抗体に結合しているオリゴペプチド鎖の未結合末端にアミノ基やチオール基を付加しておき、２価の架橋剤を用いてデンドリマの末端と結合させる方法等が挙げられる。また、標識処理デンドロンを結合させる処理方法についても同様である。
（４）抗原抗体反応
前述したように、支持体に固定（コーティング）した標的物質に、標識処理された結合物質（溶液）を接触させるに際しては、一般には、予め公知のブロッキング液でブロッキング処理を施し、ＰＢＳ等の公知の洗浄液でよく洗浄しておく。その後、標識処理された結合物質を複数種含む溶液を適量添加し、室温で３０〜６０分間攪拌しながら、標的物質と結合物質との結合反応を行い両物質の複合体を形成させ、再度よく洗浄することが好ましい。
また、支持体等に固定していない標的物質に、標識処理された結合物質（溶液）を接触させるに際しては、一般には、標的物質を含む被験試料に対して適当な前処理を行い、標的物質以外の不純物を除去あるいは少なくしておくことが好ましい。
３．標識検出工程
本発明の検出方法は、標的物質−結合物質複合体を形成した結合物質中の標識を検出する工程を含む方法である。検出方法としては、具体的には、前述した結合物質の標識処理の種類（前記（Ａ１）〜（Ａ９）、（Ｂ１）〜（Ｂ７）等の標識処理）により異なるため、その種類ごとに以下に説明する。
（１）制限酵素による切断部位を設ける処理（（Ａ１）の処理）の場合
オリゴヌクレオチド複合体（ＤＮＡ複合体又はＲＮＡ複合体）を用いた場合、常法に従い、所定の制限酵素溶液を添加して、オリゴヌクレオチド鎖を切断する。得られた断片の長さは、アガロースゲル等を用いた電気泳動法により識別して検出することができる。また、図７（３）〜（５）に示すように、上記制限処理後の遊離断片を、蛍光標識した所定のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、得られた増幅断片について、ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：ＡＢＩ−３１００）を用いたＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアでの解析によりピーク位置及びその高さを同定することで、制限酵素処理後の遊離断片の長さを識別して検出することもできる。
上記検出において、抗原の量が少なかった場合など、制限酵素処理後の断片濃度が低いときは、必要に応じ、当該処理後の反応液をスピンカラム等で遠心沈降して濃縮することが好ましい。
なお、オリゴペプチド核酸複合体を用いた場合も、その核酸鎖（オリゴヌクレオチド鎖）部分に対して、上記同様の検出方法が採用できる。
（２）ＰＣＲで増幅可能な領域を設ける処理（（Ａ２）の処理）の場合
オリゴヌクレオチド複合体（ＤＮＡ複合体又はＲＮＡ複合体）を用いた場合、常法に従い、設計した所定のプライマー等を添加し、ＰＣＲにより（約５〜３０サイクル）特定の断片を増幅したＰＣＲ産物を得る。得られた増幅断片の長さは、アガロースゲル等を用いた電気泳動法により識別して検出することができる。また、上記所定のプライマーとして蛍光標識したプライマーを用い、得られた増幅断片について、ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：ＡＢＩ−３１００）を用いたＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアでの解析によりピーク位置及びその高さを同定することで、増幅断片の長さを識別して検出することもできる。
なお、オリゴペプチド核酸複合体を用いた場合も、その核酸鎖（オリゴヌクレオチド鎖）部分に対して、上記同様の検出方法が採用できる。
（３）タンパク質分解酵素による切断部位を設ける処理（（Ｂ１）の処理）の場合
オリゴヌペプチド複合体を用いた場合、常法に従い、所定のタンパク質分解酵素溶液を添加して、オリゴペプチド鎖を切断した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法により断片の長さを識別して検出する。標的物質の量が少なかった場合など、酵素処理後の断片濃度が低いときは、必要に応じ、当該処理後の反応液をスピンカラム等で遠心沈降して濃縮することが好ましい。
なお、オリゴペプチド核酸複合体を用いた場合も、そのオリゴペプチド鎖部分に対して、上記同様の検出方法が採用できる。
（４）蛍光色素を結合させる処理（（Ａ３）及び（Ｂ２）の処理）の場合
公知の蛍光光度計や蛍光顕微鏡等により、所定の蛍光波長を識別して検出する。
なお、本発明においては、半導体レーザー及び高感度フォトダイオード等を備えた測定モジュールデバイス（例えば、日立製作所社製、製品名：コスモアイ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：ＡＢＩ−３１００）を用いることもできる。当該デバイスは、微量のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチド等を短時間で分離・同定し、定量できることを特徴とするものである。当該デバイスを用いることにより、従来実現されていなかった、高速（短時間）かつ高感度で、しかも同時多項目の検出条件の識別検出をすることができる。具体的には、測定時間を１２０分以内（好ましくは６０分以内、より好ましくは３０分以内）とし、検出感度を１００〜１００，０００ｆｇ／ｍＬ（好ましくは１００〜１０，０００ｆｇ／ｍＬ、より好ましくは１００〜１，０００ｆｇ／ｍＬ）とし、検出可能標識数（１チップ当たり）を５種類以上（好ましくは１０種類以上、より好ましくは５０種類以上）とすることができる。
（５）酵素を結合させる処理（（Ａ４）及び（Ｂ３）の処理）の場合
公知のＥＬＩＳＡ法の常法に従い、発色用基質を添加して蛍光色素を生成させた後、蛍光色素の結合処理をした場合と同様の方法により、識別検出することができる。
（６）放射性同位体元素を含有させる処理（（Ａ５）及び（Ｂ４）の処理）の場合
公知の放射線量測定装置や公知のウエスタンブロット法の常法に従い、所定の放射線種を識別検出することができる。
（７）光照射による切断部位を設ける処理（（Ａ６）及び（Ｂ５）の処理）の場合
所定の波長光の照射を行い、オリゴヌクレオチド鎖やオリゴペプチド鎖等を切断（詳しくは、結合物質から分離）する。その後、得られた断片の長さを、例えば、アガロースゲル等を用いた電気泳動法やＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法により識別して検出する。標的物質の量が少なかった場合など、光照射処理後の断片濃度が低いときは、必要に応じ、当該処理後の反応液をスピンカラム等で遠心沈降して濃縮することが好ましい。また、上記切断後の断片は、上記（４）〜（６）の場合と同様にして識別検出することもできる。
（８）活性酸素による切断部位を設ける処理（（Ａ７）及び（Ｂ６）の処理）の場合
まず、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）及びＦｅ錯体等の、フリーラジカルを産生遊離させる試薬を添加することにより、活性酸素を生じさせる。この活性酸素が、オリゴヌクレオチド鎖やオリゴペプチド鎖等を切断する（詳しくは、結合物質から分離）。その後、得られた断片の長さを、例えば、アガロースゲル等を用いた電気泳動法やＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法により識別して検出する。標的物質の量が少なかった場合など、切断処理後の断片濃度が低いときは、必要に応じ、当該処理後の反応液をスピンカラム等で遠心沈降して濃縮することが好ましい。また、当該切断後、上記（４）〜（６）の場合と同様にして識別検出することができる。
（９）標識処理デンドリマを結合させる処理（（Ａ８）及び（Ｂ７）の処理）の場合
検出方法は、デンドリマに施された標識処理の種類により異なるが、具体的には、上述した各標識処理の場合の方法と同様の方法により識別検出できる。標識処理デンドロンを用いた場合についても同様である。
（１０）少なくとも１塩基の違いを設ける処理（（Ａ９）の処理）の場合
オリゴヌクレオチド複合体（ＤＮＡ複合体やＲＮＡ複合体）を用いた場合、まず、常法に従い、所定の制限酵素溶液を添加してオリゴヌクレオチド鎖を切断する。または、制限酵素処理により得られた遊離断片を鋳型として、所定のプライマーを用いたＰＣＲ（約５〜３０サイクル）により特定の断片を増幅したＰＣＲ産物を得る。あるいは、上記制限酵素処理は行わずに、オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチド鎖を直接鋳型として、所定のプライマーを用いたＰＣＲにより上記と同様にＰＣＲ産物を得る。その後、前述したＤＮＡシークエンサーによる解析やＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる解析等の１塩基の違いを認識できる解析手段により、ＰＣＲ後の増幅断片の塩基配列の違いに基づいて識別検出することができる。
なお、オリゴペプチド核酸複合体を用いた場合も、その核酸鎖（オリゴヌクレオチド鎖）部分に対して、上記同様の検出方法が採用できる。
（１１）なお、上記（１）〜（１０）の場合の標識検出工程では、適宜、公知の処理手段を組み合わせて行うことができる。当該処理手段としては、例えば、ウエスタンブロット法の常法に従い、スキャナーを用いて同定・定量する手段、及び、目的とする抗原を含む細胞や化合物等をフローサイトメトリーやセルソーターあるいは適当な支持体を用いて検出し分離・回収する手段等が挙げられる。
４．その他の工程
本発明の方法は、前述した各種工程以外に、さらに他の工程を含んでいてもよく、限定はされない。これら他の工程は、公知の手段・方法を用いて実施することができる。
５．識別検出用キット
本発明の標的物質の識別検出用キットは、構成成分として、標的物質の種類に対応して識別し得るように標識処理された複数種類の結合物質を含むキットである。当該結合物質の詳細については、上記本発明の検出方法における説明（具体的には前記「２．（３）」に記載の説明）が同様に適用できる。
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ非常に有用性が高いものである。
本発明のキットは、上記構成成分以外に他の構成成分を含んでいてもよい。他の構成成分としては、例えば、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、各種バッファ、滅菌水、エッペンドルフチューブ、フェノールクロロホルム、クロロホルム、エタノール、核酸共沈剤、各種ゲル（粉末）、フリーラジカル産生遊離試薬（ＨＲＰ及びＦｅ錯体等）、ブロッキング剤としてＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分、及び各種ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ、ＤＮＡインターカレーター等の蛍光試薬、光反応物質、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、並びに実験操作マニュアル（説明書）等のほか、必要に応じ、各種電気泳動装置やＰＣＲ等実験機器等も挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】＜ＰＣＲによる識別検出＞
１．複合抗体の調製及び検定
（１）オリゴヌクレオチド鎖の調製
１０１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合した配列番号１のプライマー（５−ＭＵＳＴａｇＲＩＢｉｏ）を使用し、３’プライマーとして、５’末端にＦＡＭが結合した配列番号２のプライマー（３−ＭＵＳＴａｇ１０１ＦＡＭ）を使用して、ＰＣＲにより行った。
２０３ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合した配列番号１のプライマー（５−ＭＵＳＴａｇＲＩＢｉｏ）を使用し、３’プライマーとして、５’末端にＦＡＭが結合した配列番号３のプライマー（３−ＭＵＳＴａｇ２０３ＦＡＭ）を使用して、ＰＣＲにより行った。
５−ＭＵＳＴａｇＲＩＢｉｏ：
Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号１）
３−ＭＵＳＴａｇ１０１ＦＡＭ：
ＦＡＭ−ＧＣＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＡＡ（配列番号２）
３−ＭＵＳＴａｇ２０３ＦＡＭ：
ＦＡＭ−ＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧ（配列番号３）
上記各ＰＣＲは、Ｐｉｎ１をインサートしたｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ社製）を鋳型ＤＮＡとし、ポリメラーゼとしてＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、下記の反応液組成及び反応条件で行った。
《反応液組成》
鋳型ＤＮＡ（１００μｇ／μＬ）：          １μＬ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：            ２．５ｕｎｉｔ
５’プライマー（２０μＭ）：              ２μＬ
３’プライマー（２０μＭ）：              ２μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：        ８μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ：                      １０μＬ
滅菌水：                                  適量（約７７μＬ）
合計：                                    １００μＬ
《反応条件》
「９５℃で１分間の熱変性・解離→５５℃で１分間のアニーリング→７２℃で３０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計３０サイクル。
上記各ＰＣＲ後の増幅産物は、ＰＣＲ後に遠心して得られた上清を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社製）又はＭｉｎｉｐｒｅｐカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてフィルター精製することにより、単一なオリゴヌクレオチドに精製した。
（２）ビオチン化抗体の調製
常法により、下記の２種のモノクローナル抗体を作製した。
１２ＣＡ５（抗ＨＡモノクローナル抗体）
９Ｅ１０（抗Ｍｙｃモノクローナル抗体）
次に、１２ＣＡ５と９Ｅ１０とを、それぞれ、抗体とＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）とのモル比が１：２０となるように混合し、室温で３０分間反応させた。各反応液を５ｍＬの脱塩カラムに通し、目的の抗体画分を回収して、２種のビオチン化抗体を得た。
（３）オリゴヌクレオチド複合抗体の調製
ビオチン化１２ＣＡ５には１０１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、ビオチン化９Ｅ１０には２０３ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、それぞれ、１：１のモル比で混合した。次いで、それぞれにおいて、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、ビオチン化抗体に対し１：１のモル比で添加し、室温で１５分間反応させた。これら反応液を、それぞれ、５ｍＬの脱塩カラムに通し、目的の画分を回収して、２種のオリゴヌクレオチド複合抗体を得た。
（４）抗原特異性及び識別検出能の検定
得られた２種の複合抗体について、抗原特異性（抗原抗体反応性）及び標識ごとの識別検出能を有することの確認を、以下のようにして行った。
まず、抗原としてＨＡ及びＭｙｃの合成ペプチドを用意し、ＥＬＩＳＡ法の常法に従って、これら合成ペプチドをそれぞれコーティングした９６穴プラスチックウェルプレートを用意した。次いで、５％ミルクｉｎ  ＰＢＳＴ溶液で一晩ブロッキングを行い、ＰＢＳでよく洗浄した後、各プレートのウェルに、先に調製した２種のオリゴヌクレオチド複合抗体を含む溶液を適量添加し、室温で１時間シェイキングしながら反応させた。
反応後、各プレートをＰＢＳで３回洗浄ずつ洗浄し、次いで、ＥｃｏＲＩ緩衝溶液で調製したＥｃｏＲＩ酵素溶液をウェルに添加して、３７℃で２時間反応させ、オリゴヌクレオチド複合抗体におけるオリゴヌクレオチド鎖を切断した。
その後、必要に応じスピンカラムで濃縮して回収した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後に検出されたバンドを図４に示した。
その結果、ＨＡコーティングプレートから回収されたオリゴヌクレオチド断片は約１００ｍｅｒであり、Ｍｙｃコーティングプレートから回収されたオリゴヌクレオチド断片は約２００ｍｅｒであることが確認された。
よって、１２ＣＡ５と１０１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドとの複合抗体が、ＨＡとのみ特異的に反応し、９Ｅ１０と２０３ｍｅｒのオリゴヌクレオチドとの複合抗体が、Ｍｙｃとのみ特異的に反応したことを、制限酵素処理後のオリゴヌクレオチド断片の長さの相違により識別検出できることが確認された。
２．複合抗体を用いた識別検出
調製した２種の複合抗体を用いて、「抗原抗体反応」及び「標識ごとの識別検出」を以下のようにして行った。
抗原−抗体反応サンドウィッチ法の常法に従い、支持体としての粒径１μｍの磁性ビーズ（ＢｉｏＬａｂｓ社製）に、９Ｅ１０（抗Ｍｙｃモノクローナル抗体）又は１２ＣＡ５（抗ＨＡモノクローナル抗体）を結合した抗体結合ビーズを準備した。抗原としては独自に作製したＨＡ−ＧＳＴ−Ｍｙｃの合成ペプチド（抗原溶液）を用いた。まず、３本のマイクロチューブ内で、９Ｅ１０結合ビーズと１２ＣＡ５結合ビーズとを、量比（粒子数比）で、それぞれ３：１、１：１、１：３となるように混合し、これらに抗原溶液を添加して、室温で３０分間インキュベーションした。これらをＰＢＳＴで３回よく洗浄し、それぞれに、２種のオリゴヌクレオチド複合抗体を含む溶液を適量添加し、室温で３０分間シェイキングしながら反応させた。その後、さらにＰＢＳＴで３回よく洗浄し、遠心して得られた残渣に、配列番号１のプライマー（５−ＭＵＳＴａｇＲＩＢｉｏ）及び２のプライマー（３−ＭＵＳＴａｇ１０１ＦＡＭ）並びに配列番号１のプライマー（５−ＭＵＳＴａｇＲＩＢｉｏ）及び３のプライマー（３−ＭＵＳＴａｇ２０３ＦＡＭ）を添加して（すなわち、配列番号１、２及び３のプライマーを添加して）、下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
《反応液組成》
鋳型ＤＮＡ（遠心後の残渣）：                  各チューブの残渣量
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：                ２．５ｕｎｉｔ
５’プライマー
５−ＭＵＳＴａｇＲＩＢｉｏ（２０μＭ）：    ４μＬ
３’プライマー
３−ＭＵＳＴａｇ１０１ＦＡＭ（２０μＭ）：  ２μＬ
３−ＭＵＳＴａｇ２０３ＦＡＭ（２０μＭ）：  ２μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：            ８μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ：                          １０μＬ
滅菌水：                                      適量（約７０μＬ）      
合計：                                        １００μＬ
《反応条件》
「９４℃で３０秒の熱変性・解離→６０℃で３０秒のアニーリング→７２℃で３０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計５サイクル。
ＰＣＲ後に遠心して得られた上清について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後に検出されたバンドを図５に示した。
その結果、いずれの量比のサンプルにおいても、約１００ｂｐ及び約２００ｂｐの断片のバンドが認められたことから、同一反応槽内においてオリゴヌクレオチド標識ごとに識別検出できることが確認できた。また、抗体結合ビーズの量比に対応した量の断片量が認められ、量比依存性（定量性）のある識別検出ができることも確認できた。
【実施例２】＜微量流体分析装置を使用した識別検出＞
１．複合抗体の調製
（１）オリゴヌクレオチド鎖の調製
３００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合した配列番号４のプライマー（５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０）を使用し、３’プライマーとして、５’末端にＦＡＭが結合した配列番号５のプライマー（３−ＭＵＳＴａｇ１１４０ＦＡＭ）を使用して、ＰＣＲにより行った。
５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合した配列番号４のプライマー（５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０）を使用し、３’プライマーとして、５’末端にＦＡＭが結合した配列番号６のプライマー（３−ＭＵＳＴａｇ１３４０ＦＡＭ）を使用して、ＰＣＲにより行った。
５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０：
Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡ（配列番号４）
３−ＭＵＳＴａｇ１１４０ＦＡＭ：
ＦＡＭ−ＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＡＧＧＡ（配列番号５）
３−ＭＵＳＴａｇ１３４０ＦＡＭ：
ＦＡＭ−ＣＧＣＧＣＴＴＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴ（配列番号６）
上記各ＰＣＲは、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ社製）を鋳型ＤＮＡとし、ポリメラーゼとしてＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、下記の反応液組成及び反応条件で行った。
《反応液組成》
鋳型ＤＮＡ（１００μｇ／μＬ）：          １μＬ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：            ２．５ｕｎｉｔ
５’プライマー（２０μＭ）：              ２μＬ
３’プライマー（２０μＭ）：              ２μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：        ８μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ：                      １０μＬ
滅菌水：                                  適量（約７７μＬ）
合計：                                    １００μＬ
《反応条件》
「９５℃で１分間の熱変性・解離→５５℃で１分間のアニーリング→７２℃で３０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計３０サイクル。
上記各ＰＣＲ後の増幅産物は、ＰＣＲ後に遠心して得られた上清を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社）にてフィルター精製することにより、単一なオリゴヌクレオチドに精製した。
（２）ビオチン化抗体の調製
実施例１の「１．の（２）」と同様にして、ビオチン化１２ＣＡ５及びビオチン化９Ｅ１０を調製した。
（３）オリゴヌクレオチド複合抗体の調製
ビオチン化１２ＣＡ５には３００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、ビオチン化９Ｅ１０には５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、それぞれ、１：１のモル比で混合した。次いで、それぞれにおいて、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、ビオチン化抗体に対し１：１のモル比で添加し、室温で１５分間反応させた。これら反応液を、それぞれ、５ｍＬの脱塩カラムに通し、目的の画分を回収して、２種のオリゴヌクレオチド複合抗体を得た。各オリゴヌクレオチド複合抗体はゲル濾過カラム（ＰＣ１２：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて分画し、２８０ｎｍおよび２１０ｎｍの同時検出系にてオリゴヌクレオチド複合抗体のみを得た。
２．複合抗体を用いた識別検出
調製した２種の複合抗体を用いて、「抗原抗体反応」及び「標識ごとの識別検出」を以下のようにして行った。
抗原−抗体反応サンドウィッチ法の常法に従い、支持体として粒径１μｍの磁性ビーズ（ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用い１２ＣＡ５あるいは９Ｅ１０を結合した抗体結合ビーズを準備した。抗原としてＨＡ−ＧＳＴ−Ｍｙｃの合成ペプチドを用いた。まず、１２ＣＡ５あるいは９Ｅ１０がそれぞれ結合している抗体結合ビーズとそれぞれ１、０．１、０．０１ｐｍｏｌ／μＬのＨＡ−ＧＳＴ−Ｍｙｃの合成ペプチドをマイクロチューブ内で混合し、室温で３０分間インキュベーションした。これをＰＢＳＴで３回よく洗浄し、２種（ＥｃｏＲＩ処理によりそれぞれ３００ｍｅｒ及び５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが遊離する）のオリゴヌクレオチド複合抗体を含む溶液を適量添加し、室温で３０分間シェイキングしながら反応させた。その後、適量のＥｃｏＲＩ溶液をそれぞれのマイクロチューブに添加して、３７℃で１５分間反応させ、オリゴヌクレオチド複合抗体におけるオリゴヌクレオチド鎖を切断し、遠心して得られた上清を、コスモアイＳＶ１２１０（日立製作所社製）で分析した。
その結果、ＥｃｏＲＩ処理により得られる、３００ｍｅｒ及び５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド断片の存在を示すピークが、それぞれ、抗原濃度依存的に認められた（図６参照）。
また、市販の核酸分析装置を用いた場合も、３００ｍｅｒ及び５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド断片の存在を、それぞれ、抗原濃度依存的（定量的）に検出できることが認められた。
【実施例３】＜ＰＣＲによる識別検出＞
１．アダプターを用いた複合抗体の調製
以下の手順により、抗体分子に、アダプター部分となる「プロテインＧ」を介して、オリゴヌクレオチド鎖を結合させた複合抗体を調製した。
（１）オリゴヌクレオチド鎖の調製
１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、５’末端にビオチンが結合した配列番号７のプライマー（５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０）を使用し、３’プライマーとして、配列番号８のプライマー（３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ１００）を使用して、ＰＣＲにより行った。
２００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、５’末端にビオチンが結合した配列番号７のプライマー（５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０）を使用し、３’プライマーとして、配列番号９のプライマー（３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ２００）を使用して、ＰＣＲにより行った。
３００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、５’末端にビオチンが結合した配列番号７のプライマー（５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０）を使用し、３’プライマーとして、配列番号１０のプライマー（３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ３００）を使用して、ＰＣＲにより行った。
４００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、５’末端にビオチンが結合した配列番号７のプライマー（５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０）を使用し、３’プライマーとして、配列番号１１のプライマー（ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ４００）を使用して、ＰＣＲにより行った。
５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの調製は、５’プライマーとして、５’末端にビオチンが結合した配列番号７のプライマー（５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０）を使用し、３’プライマーとして、配列番号１２のプライマー（３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ５００）を使用して、ＰＣＲにより行った。
５−ｐｃＤＮＡ３Ｂｉｏ８４０：
Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡ（配列番号７）
３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ１００：
ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ  ＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣ  ＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡ（配列番号８）
３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ２００：
ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ  ＴＣＣＴＣＡＴＴＴＴ  ＡＴＴＡＧＧＡＡＡＧ（配列番号９）
３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ３００：
ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ  ＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧ  ＣＴＡＴＴＧＴＣＴＴ（配列番号１０）
３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ４００：
ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ  ＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣ  ＴＴＡＡＴＧＣＧＣＣ（配列番号１１）
３−ｐＧＥＸ＋ＭＵＳＴ５００：
ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ  ＡＡＡＧＣＣＧＧＣＧ  ＡＡＣＧＴＧＧＣＧＡ（配列番号１２）
上記各ＰＣＲは、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を鋳型ＤＮＡとし、ポリメラーゼとしてＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、下記の反応液組成及び反応条件で行った。
《反応液組成》
鋳型ＤＮＡ（１００μｇ／μＬ）：          １μＬ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：            ２．５ｕｎｉｔ
５’プライマー（２０μＭ）：              ２μＬ
３’プライマー（２０μＭ）：              ２μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：        ８μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ：                      １０μＬ
滅菌水：                                  適量（約７７μＬ）
合計：                                    １００μＬ
《反応条件》
「９５℃で１分間の熱変性・解離→５５℃で１分間のアニーリング→７２℃で３０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計３０サイクル。
上記各ＰＣＲ後の増幅産物は、ＰＣＲ後に遠心して得られた上清を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社製）にてフィルター精製することにより、単一なオリゴヌクレオチドに精製した。
（２）プロテインＧ／アビジン結合体の調製
（ｉ）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ活性化プロテインＧの調製
５ｍｇのプロテインＧを、５００μＬの５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）に溶解した。次いで、５０μＬ  ＤＭＳＯに化学修飾剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｎｋｅｒ）としてのＳｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下「Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ」（ＰＩＥＲＣＥ  ５０ｍｇ，＃  ２２３２２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ：４３６．３７，Ｓｐａｃｅｒ  Ａｒｍ  Ｌｅｎｇｔｈ：１１．６Å；下記構造式（Ｉ）参照））を１ｍｇ溶解し、これを上記プロテインＧの溶液に添加した。
上記添加後の溶液を、室温で６０分間ゆっくりと攪拌して、プロテインＧとＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣとを反応させ結合させた。なお、当該結合は、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳエステル基とプロテインＧとの結合である。
0004111984.tif 000002
反応後に残った余分なＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを取り除くために、結合バッファーで平衡化した脱塩カラムを用いて、反応液を５００μＬずつの分画に分けた。各々の分画における溶出タンパク質（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ活性化プロテインＧ）の濃度を測定し、ピークの画分を採取した。
５ｋＤａ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｔｕｂｅを用いて、遠心によりＭａｌｅｉｍｉｄｅ活性化プロテインＧを濃縮し、溶液の最終容量を５００μＬに調整した。
（ｉｉ）アビジンとの結合
バッファー（１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．６），５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＮｅｕｔｒｏＡｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ  ５ｍｇ，＃３１００７，６０ｋＤａ）を溶解させた。この溶液に、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ活性化プロテインＧ溶液を添加した。当該添加は、プロテインＧとアビジンとのモル比（プロテインＧ：アビジン）が１：３程度となるよう、以下の量比に調整して行った。
プロテインＧ（２２ｋＤａ）：アビジン（６０ｋＤａ）＝１ｍｇ：１ｍｇ
混合後の溶液を、４℃で４時間以上（〜一晩）ゆっくりと攪拌しながら反応させた。
反応後の溶液を、ゲル濾過カラム（ＦＰＬＣ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＰＣ１２  ｃｏｌｕｍｎ））にかけ、プロテインＧ／アビジン結合体のうち、プロテインＧの１分子に対してアビジンが２又は３分子結合している結合体に相当する分子量の画分を採取した。
（３）複合抗体の調製
（ｉ）プロテインＧ／アビジン結合体とオリゴヌクレオチド鎖との結合
バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％  ｇｅｌａｔｉｎ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中に、上記（１）で精製して得られた各オリゴヌクレオチド鎖（ビオチン化オリゴ）と、上記（２）で得られたプロテインＧ／アビジン結合体とを、それぞれモル比（ビオチン化オリゴ：プロテインＧ／アビジン結合体）が１：２程度となるように混合した。混合溶液を、室温で３０分間以上攪拌しながら反応（ビオチン−アビジン結合反応）させ、オリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体を得た。
（ｉｉ）抗体の調製
常法により、下記の５種のモノクローナル抗体を作製した。
抗Ｉｎｔ６抗体（抗Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧモノクローナル抗体）
抗ＨＩＦ１α抗体（抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧモノクローナル抗体）
１２ＣＡ５（抗ＨＡモノクローナル抗体）
９Ｅ１０（抗Ｍｙｃモノクローナル抗体）
抗β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ抗体（抗β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅモノクローナル抗体）
（ｉｉｉ）抗体とアダプター部分との結合
バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％  ｇｅｌａｔｉｎ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中に、オリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体と、各種モノクローナル抗体とを、それぞれ１：１のモル比となるように混合し、攪拌しながら室温で１時間あるいは４℃で１２時間反応させた。具体的には、抗Ｉｎｔ６抗体（抗Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧモノクローナル抗体）は１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、抗ＨＩＦ１α抗体（抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧモノクローナル抗体）は２００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、１２ＣＡ５は３００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、９Ｅ１０は４００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、抗β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ抗体（抗β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅモノクローナル抗体）は５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合して、反応させた。各反応液を、それぞれ、５ｍＬの脱塩カラムに通し、目的の画分を回収して、５種のオリゴヌクレオチド複合抗体を
２．複合抗体を用いた識別検出
調製した５種の複合抗体を用いて、「抗原抗体反応」及び「標識ごとの識別検出」を以下のようにして行った。
ＥＬＩＳＡ法の常法に従い、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、５種の抗原（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ及びβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（各５０ｎｇ））を固着させた。ブロッキングは、５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  １００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）をウェルに添加し、室温で３０分間静置して行った。当該ウェルに、５種のオリゴヌクレオチド複合抗体を含む溶液を２０μＬ添加し、室温で３０分間シェイキングしながら反応させた。反応後、０．１％ＮＰ４０，１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で５回よく洗浄し、次いで、１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄したのち、適量のＥｃｏＲＩ溶液（１０ｕｎｉｔ／２０μＬ）をウェルに添加して、３７℃で３０分間反応させ、抗原と結合した複合抗体のオリゴヌクレオチド鎖を遊離させた。この遊離オリゴヌクレオチドを含む上清を回収した。
その後、この上清に（すなわち、遊離オリゴヌクレオチドを鋳型として）、配列番号１３のプライマー（５−Ｆｏｒｗ−３）、及びＦＡＭ色素にて蛍光標識した配列番号１４のプライマー（３−ｐＧＥＸ−ＦＡＭ）を添加して、下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
５−Ｆｏｒｗ−３：      ＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＴＡ（配列番号１３）
３−ｐＧＥＸ−ＦＡＭ：  ＦＡＭ−ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ      （配列番号１４）
《反応液組成》
ＥｃｏＲＩ処理後の上清：                  ５μＬ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：            ２．５ｕｎｉｔ
５’プライマー
５−Ｆｏｒｗ−３（２０ｍＭ）：          ２μＬ
３’プライマー
３−ｐＧＥＸ−ＦＡＭ（２０ｍＭ）：      ２μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）：                  ８μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ：                      １０μＬ
滅菌水：                                  適量（約７３μＬ）
合計：                                    １００μＬ
《反応条件》
「９５℃で５分間の熱変性・解離→５５℃で３０秒間のアニーリング→７２℃で３０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計１５サイクル。その後、１０μｌのホルムアミドに反応液を１μｌ溶解し、９５℃で５分間の熱変性。
ＰＣＲ後の反応液を遠心し、得られた上清について、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ−３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアによる解析を行い、各ピーク位置及びその高さの同定を行った。
その結果、各抗原（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ及びβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）に特異的に結合し得る複合抗体が有するオリゴヌクレオチド断片、すなわちオリゴ長が１００ｍｅｒ、２００ｍｅｒ、３００ｍｅｒ、４００ｍｅｒ及び５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド断片の存在を示すピークが確認された（図８参照）。
〔参考例１〕
＜本発明の検出法と従来のＥＬＩＳＡ法との検出感度の比較＞
１．ＥＬＩＳＡ法に用いる１次抗体の調製
常法に従い、マウス抗ＨＡ抗体及びマウス抗Ｍｙｃ抗体を調製した。
２．本発明の検出法に用いるオリゴヌクレオチド複合抗体の調製
実施例３の「１．」と同様の方法により、「２００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有する１２ＣＡ５複合抗体」（以下、複合抗体Ａ）を調製した。
具体的には、実施例３で使用した５種のオリゴヌクレオチド複合抗体のうち「１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有する複合抗体」の調製方法において、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有するオリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体と抗Ｉｎｔ６抗体（抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体）とを反応させる代わりに、２００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有するオリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体と抗Ｉｎｔ６抗体とを反応させた以外は、実施例３の「１．」と同様にして、前記複合抗体Ａを調製した。
３．抗原の固定
抗原としてはＨＡ−ＧＳＴ−Ｍｙｃの合成ペプチドを用いた。ＥＬＩＳＡ法の常法に従い、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、当該抗原を下記表に示す量で固着させた。ブロッキングは、５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）をウェルに添加し、室温で３０分間静置して行った。
0004111984.tif 000003
４．ＥＬＩＳＡによる検出
前記３．のブロッキング後、０．１％ＮＰ４０，Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄した。
１次抗体として、前記１．で調製したマウス抗ＨＡ抗体をプレートの０１列及び０２列の各ウェルに、マウス抗Ｍｙｃ抗体をプレートの０３列及び０４列の各ウェルに、それぞれ添加した。
０．１％ＮＰ４０，Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄し、ＨＲＰ標識山羊抗マウスＩｇＧを添加した。
０．１％ＮＰ４０，Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄し、基質を加えて静置した。その後、１％ＳＤＳで発色を停止した。
発色後のプレート（図９（ａ））の各ウェルについて、ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒ（４１５ｎｍ）を用いて測定した結果を図９（ｂ）に示す。この結果から、ＥＬＩＳＡ法での最大感度は抗原量４ｎｇ（Ｄの０１列のウェル）であることが確認された。
５．本発明の検出法による検出
前記３．のブロッキング後、０．１％ＮＰ４０，１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄した。
１次抗体として、前記１．で調製したマウス抗ＨＡ抗体をプレートの０１列及び０２列の各ウェルに、マウス抗Ｍｙｃ抗体をプレートの０３列及び０４列の各ウェルに、それぞれ添加した。
０．１％ＮＰ４０，Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄した後、前記２．で調製した複合抗体Ａを含む溶液を、プレートの０１列及び０２列の各ウェルに２０μＬずつ添加して、室温で３０分間シェイキングしながら反応させた。
反応後、０．１％ＮＰ４０，１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄し、次いで、１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した後、適量のＥｃｏＲＩ溶液（１０ｕｎｉｔ／２０μＬ）をウェルに添加して、３７℃で３０分間反応させ、抗原と結合した複合抗体Ａのオリゴヌクレオチド鎖を遊離させた。この遊離オリゴヌクレオチドを含む上清を回収した。
その後、この上清に（すなわち、遊離オリゴヌクレオチドを鋳型として）、配列番号１３のプライマー（５−Ｆｏｒｗ−３）、及びＦＡＭ色素にて蛍光標識した配列番号１４のプライマー（３−ｐＧＥＸ−ＦＡＭ）を添加して、実施例３の「２．」と同様の反応液組成及び反応条件（但しサイクル数は２０）でＰＣＲを行った。
５−Ｆｏｒｗ−３：      ＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＴＡ（配列番号１３）
３−ｐＧＥＸ−ＦＡＭ：  ＦＡＭ−ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ      （配列番号１４）
ＰＣＲ後の反応液を遠心し、得られた上清について、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ−３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアによる解析を行い、ピークの検出（ピーク位置及びその高さの同定）を行った。
その結果、図１０及び図１１に示すように、本発明の検出法であれば、少なくとも２５６ｆｇ（Ｂの０２列のウェル）の抗原量まで有効に検出できることが分かった。つまり、本発明の検出法（ＰＣＲ：２０サイクル）は、最大感度４ｎｇであったＥＬＩＳＡ法に比べ、検出感度が約１５，０００倍高いことが確認された。
〔参考例２〕
＜本発明の検出法における定量性＞
１．オリゴヌクレオチド複合抗体の調製
実施例３の「１．」と同様の方法により、「１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有する９Ｅ１０複合抗体」（以下、複合抗体Ｂ）を調製した。
具体的には、実施例３で使用した５種のオリゴヌクレオチド複合抗体のうち「４００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有する複合抗体」の調製方法において、４００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有するオリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体と９Ｅ１０（抗Ｍｙｃモノクローナル抗体）とを反応させる代わりに、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖を有するオリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体と９Ｅ１０とを反応させた以外は、実施例３の「１．」と同様にして、前記複合抗体Ｂを調製した。
２．抗原の固定
ＥＬＩＳＡ法の常法に従い、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、抗原としてのＭｙｃペプチドをそれぞれ異なる量で固着させた。具体的には、各ウェルに、５０ｎｇ、１２．５ｎｇ、３．１ｎｇ、７８０ｐｇ、１９０ｐｇ、４８．８ｐｇ、１２．２ｐｇ及び３ｐｇのＭｙｃをそれぞれ固着させた。さらに各ウェルには、Ｍｙｃ以外の抗原（下記表を参照）も併せて固着させた。
0004111984.tif 000004
ブロッキングは、５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を各ウェルに添加し、室温で３０分間静置して行った。
３．本発明の検出法による検出
ブロッキング後、０．１％ＮＰ４０，１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄した。
前記１．で調製した複合抗体Ｂを含む溶液を、各ウェルに２０μＬずつ添加して、室温で３０分間シェイキングしながら反応させた。
反応後、０．１％ＮＰ４０，１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で３回よく洗浄し、次いで、１００ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した後、適量のＥｃｏＲＩ溶液（１０ｕｎｉｔ／２０μＬ）を各ウェルに添加して、３７℃で３０分間反応させ、抗原と結合した複合抗体Ｂのオリゴヌクレオチド鎖を遊離させた。この遊離オリゴヌクレオチドを含む上清を回収した。
その後、この上清に（すなわち、遊離オリゴヌクレオチドを鋳型として）、配列番号１３のプライマー（５−Ｆｏｒｗ−３）、及びＦＡＭ色素にて蛍光標識した配列番号１４のプライマー（３−ｐＧＥＸ−ＦＡＭ）を添加して、実施例３の「２．」と同様の反応液組成及び反応条件（但しサイクル数は２０）でＰＣＲを行った。
５−Ｆｏｒｗ−３：      ＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＴＡ（配列番号１３）
３−ｐＧＥＸ−ＦＡＭ：  ＦＡＭ−ＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ      （配列番号１４）
ＰＣＲ後の反応液を遠心し、得られた上清について、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ−３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアによる解析を行い、ピークの検出（ピーク位置及びその高さの同定）を行った。その結果を図１２に示す。
得られた検出結果について、横軸を使用したタンパク量（抗原量：Ｍｙｃの量）、縦軸をシグナル値として、各値をプロットした（図１３）。なお、シグナル値が検出限界を超えたものについてはプロットしていない。その結果、各値は有意に相関しており、本発明の検出法によれば、抗原の種類数に関わらず、特定の抗原について定量的に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、被験試料に含まれる複数種類の標的物質を一度に識別して検出することができる、標的物質の検出方法を提供することができる。本発明の方法は、特に、癌の診断（早期発見による治癒率の向上）や抗癌剤の薬効評価、脳卒中や心筋梗塞の診断（早期診断による後遺症の低減）、及び感染症における病原体の特定等といったヒト臨床検査の分野や、家畜やペットの感染症、その他の疾患の診断、さらには残留農薬や細菌による食品汚染物質の特定、及びダイオキシンやＰＣＢ等の環境汚染物質の特定等といった食品や環境の分野において、検査又は診断効率や評価効率等を飛躍的に高めることができ、極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
【図１】
0004111984.tif 000005
【図２】
0004111984.tif 000006
【図３Ａ】
0004111984.tif 000007
【図３Ｂ】
0004111984.tif 000008
【図４】
0004111984.tif 000009
【図５】
0004111984.tif 000010
【図６】
0004111984.tif 000011
【図７】
0004111984.tif 000012
【図８】
0004111984.tif 000013
【図９】
0004111984.tif 000014
【図１０】
0004111984.tif 000015
【図１１】
0004111984.tif 000016
【図１２】
0004111984.tif 000017
【図１３】
0004111984.tif 000018
【配列表】
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