(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αアミラーゼをコードする変異ＤＮＡ配列の発現産物であるαアミラーゼであって、前記変異ＤＮＡ配列がバシルス  リケニフォルミスのαアミラーゼから派生したものであり、Ｎ１８８ＴまたはＮ１８８Ｓの置換、およびＭ１５ＴまたはＭ１５Ｌの置換を有し、低ｐＨでの高められた活性を有することを特徴とするαアミラーゼ。
【請求項２】
Ｎ１８８Ｔの置換を有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のαアミラーゼ。
【請求項３】
Ｎ１８８Ｓの置換を有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のαアミラーゼ。
【請求項４】
メチオニンまたはトリプトファン残基の欠失または置換をさらに有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のαアミラーゼ。
【請求項５】
前記メチオニンまたはトリプトファン残基の欠失または置換が、Ｗ１３８またはＭ１９７の置換または欠失を含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載のαアミラーゼ。
【請求項６】
Ｖ１２８、Ｈ１３３、Ｓ１８７またはＡ２０９の欠失または置換をさらに有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のαアミラーゼ。
【請求項７】
Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、またはＭ１５Ｔ／Ｓ１８７Ｄ／Ｎ１８８Ｓの置換を有することを特徴とする請求項１記載のαアミラーゼ。
【請求項８】
前記メチオニンまたはトリプトファン残基の置換が、Ｗ１３８ＹまたはＭ１９７Ｔの置換を含むことを特徴とする請求の範囲第５項記載のαアミラーゼ。
【請求項９】
請求の範囲第１から第８項いずれか１項記載のαアミラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求の範囲第９項記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求の範囲第１０項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求の範囲第１項から第８項いずれか１項記載のαアミラーゼを含む洗剤組成物。
【請求項１３】
汚れた織物の洗濯または汚れた皿の洗浄において有用であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は変更された性能特性を有するαアミラーゼに向けられたものである。本発明はまた、異なったアミノ酸で置換されるかまたは欠失された少なくとも１つのアスパラギン残基を有する新規変異体αアミラーゼ酵素であって、そこにおいてその結果得られるαアミラーゼが、改変された低ｐＨデンプン加水分解性能、改変された安定性および改変された活性特性を示すものに向けられている。
発明の背景
αアミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．１）は、デンプン中の内部１，４グルコシド結合を、大まかにランダムに加水分解し、低分子量マルトデキストリンを生成する。αアミラーゼは、かなりの商業的価値があるものであり、デンプンの処理の最初の段階（液化）；アルコール生産；洗剤マトリックス中での洗浄剤；およびデンプンのり抜きのために織物産業において用いられている。αアミラーゼは、バシルスおよびアスペルギルスを含む幅広く多様な微生物によって生産され、最も商業的なアミラーゼはバシルス  リケニフォルミス、バシルス  アミロリケファシエンス、バシルス  スブチリス、またはバシルス  ステアロサーモフィラスなどの細菌給源から生産される。近年、商業的用途において好ましい酵素はバシルス  リケニフォルミスとなっているが、それはその熱安定性と、少なくとも中性および弱アルカリでの性能のためである。
一般に、デンプンからフルクトースへの処理は、４つの段階を含む：微粒子デンプンの液化、液化デンプンのデキストロースへの糖化、精製、フルクトースへの異性化である。デンプンの液化工程の目的は、デンプンポリマー微粒子の濃縮懸濁液を低粘度の可溶性短鎖長デキストリンに変換することである。この段階は、標準的な装置の簡便な取り扱いのため、およびグルコースまたは他の糖への十分な変換のために必要不可欠である。微粒子デンプンを液化するために、微粒子デンプンの温度を約７２℃より上に上げることにより微粒子をゼラチン化することが必要である。加熱工程は、不溶性デンプン微粒子を瞬時に破壊し水溶性デンプン溶液を生成する。可溶化デンプン溶液は続いてαアミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）により液化される。
通常の酵素的液化工程は、微粒子デンプンスラリーのｐＨを、バシルス  リケニフォルミスから派生されたαアミラーゼの至適ｐＨである６．０から６．５の間に、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムの添加により調整することに関している。水酸化カルシウムの添加はαアミラーゼを不活性化に対して安定化することが知られているカルシウムイオンを提供する利点を有している。αアミラーゼの添加の際に、懸濁液は、瞬時に温度を８０℃から１１５℃へ上げるためにスチームジェット（ｓｔｅａｍ  ｊｅｔ）を通して吹き込まれる。デンプンは即座にゼラチン化され、αアミラーゼの存在により、α（１、４）グリコシド結合のαアミラーゼによるランダムな加水分解を通して、容易に吹き込まれる液体マスへと脱ポリマー化される。
第２の液化工程のバリエーションにおいては、αアミラーゼは、デンプン懸濁液に添加され、懸濁液を８０−１００℃の温度に保持しデンプン微粒子を部分的に分解し、部分的に分解されたデンプン懸濁液は約１０５℃を超える温度でジェットに吹き込まれ、何れの残存微粒子構造をも完全にゼラチン化する。ゼラチン化されたデンプンを冷却した後、さらにデンプンを加水分解するために第２のαアミラーゼ添加が行われても良い。
第３のこの工程のバリエーションはドライミリング工程と呼ばれるものである。ドライミリングにおいては、全体の穀物が粉砕され水と組み合わされる。ジャームは付加的に浮遊分離またはそれに相当する技術によって除去される。その結果得られる混合物であって、デンプン、繊維、タンパク質およびその他の穀物の成分を含むものが、αアミラーゼを用いて液化される。この技術での一般的な実務は、ドライミリング工程を用いた場合に、より低い温度での酵素的液化を保証することである。一般に、低温液化はデンプンの可溶性デキストリンへの変換において高温液化と比較して効率的ではないと信じられている。
典型的には、ゼラチン化の後、デンプン溶液はαアミラーゼの存在下で１０−２０のＤＥが達成されるまで上昇された温度で保持されるが、通常１−３時間である。デキストロース相当（ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ：ＤＥ）は還元糖全体の濃度を測定するための産業上の規準であり、乾燥重量ベースでＤ−グルコースとして計算される。加水分解されていない微粒子デンプンは事実上ゼロのＤＥを有するが、一方でＤ−グルコースのＤＥは１００と定義されている。
αアミラーゼを含むデンプン溶液が保持され得る最大温度は、酵素が得られた微生物給源およびαアミラーゼ分子の分子構造に依存する。Ｂ．スブチリスまたはＢ．アミロリケファシエンスの野生型株によって生産されたαアミラーゼは、典型的には、それ以上の温度での過度に急速な熱不活性化のため約９０℃より高くない温度で用いられるが、一方でＢ．リケニフォルミスの野生型株によって生産されたαアミラーゼは、約１１０℃までの温度で用いられても良い。デンプンおよびカルシウムの存在は、αアミラーゼを不活性化に対して安定化されることが知られている。にもかかわらず、αアミラーゼは急速な失活を防ぐために約６より上のｐＨ値で用いられる。低温では、バシルス  リケニフォルミス由来のαアミラーゼはデンプン基質に対して５という低いｐＨ値で加水分解活性を示すことが知られている。しかしながら、この酵素が通常のジェット温度、例えば１０２℃から１０５℃でデンプン液化に用いられた場合は、急速すぎる失活を防止するためにｐＨは少なくともｐＨ５．７以上に維持されていなくてはならない。このｐＨ制限は、不幸なことに、処理の機会の狭い窓を提供しているが、それは６．０より上のｐＨ値は、マルチュロース等の好ましくない副産物という結果となるからである。故に、現実に、加水分解されたデンプンの良好な収量を成すために、液化ｐＨは５．９から６．０に維持されていなければならない。
液化ｐＨに関する別の問題点は、デンプン懸濁液のｐＨを、ウエットミリング工程から得られたコーンスターチ懸濁液のｐＨである約４から５．９−６．０に引き上げる必要があることである。このｐＨ調整は高価な酸中和物質の添加を要求し、さらに物質を除去するために最終デンプン変換生産物の付加的なイオン交換再生を要求する。さらに、液化の後の次の段階で、典型的には液化デンプンのグルコースへの糖化は４−４．５のｐＨを要求し、それ故、ｐＨは５．９−６．０から４−４．５へと下方に調整されねばならず、付加的な物質添加と再生段階が要求される。
液化に続いて、処理されたデンプンはグルコアミラーゼによってグルコースに糖化される。現在の工程の問題点は、不完全なデンプンの液化、例えばアミラーゼによるアミロースの不完全な加水分解等により、残存デンプンが糖化混合物中に存在する場合に生じる。残存デンプンはグルコアミラーゼ加水分解に対して非常に抵抗性である。それは収量ロスを示し、シロップの下流での濾過を妨害する。
付加的には、多くのαアミラーゼが、安定性のためにカルシウムの添加を要求することが知られている。このことはさらに液化のコストを増加させている。
米国特許第５３２２７７８号においては、ｐＨ４．０から６．０の間での液化を、硫酸水素またはその塩、アスコルビン酸またはその塩、エリトルビン酸（ｅｒｙｔｈｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）等の抗酸化剤、またはブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンまたはαトコフェロール等のフェノール系抗酸化剤を液化スラリーに添加することにより達成している。この特許に従っては、抗酸化剤は５ｍＭより高い濃度で添加されなければならない。
米国特許第５１８０６６９号においては、ｐＨ５．０から６．０の間での液化を、溶液を緩衝するために必要な量を超えて炭酸イオンを破砕されたデンプンスラリーに添加することにより達成している。炭酸イオンの添加により生じるｐＨ効果の増加により、スラリーは一般に、水素イオン給源、例えば塩酸または硫酸等の無機酸の添加によって中和される。
ＰＣＴ公報第ＷＯ９４／０２５９７号においては、改善された酸化安定性を有する変異体αアミラーゼが記載されており、そこにおいては１以上のメチオニンが、システインまたはメチオニンを除くアミノ酸によって置換されている。
ＰＣＴ公報第ＷＯ９４／１８３１４号においては、改善された酸化安定性を有する変異体αアミラーゼが記載されており、そこにおいては１以上のメチオニン、トリプトファン、システイン、ヒスチジンまたはチロシン残基が、酸化可能ではないアミノ酸によって置換されている。
ＰＣＴ公報第ＷＯ９１／００３５３号においてはバシルス  リケニフォルミスαアミラーゼについての、性能特性および液化に関連した問題は、αアミラーゼを特異的変異Ａｌａ−１１１−Ｔｈｒ、Ｈｉｓ−１３３−Ｔｙｒおよび／またはＴｈｒ−１４９−Ｉｌｅを有するように遺伝子操作することによってアプローチされている。
組換えＤＮＡ技術を用いた、どの残基がアミラーゼの触媒活性にとって重要なのかを探求するための、および／または、多様なアミラーゼまたはグリコシラーゼの活性中心内部の特定の残基を改変した場合の効果の探求のための研究は、数多くの研究者によって実行されてきた（Ｖｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１０７，ｐｐ．２６７−２７２（１９９０）；Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．３，ｐｐ．１８１−１９１（１９９０）；Ｔａｋａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１２０，ｐｐ．２８１−２８８（１９９２）；Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３１０，ｐｐ．２１６−２１８（１９９２）；Ｍａｔｕｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３３，ｐｐ．４５１−４５８（１９９２）；Ｓｏｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．２２４８０−２２４８４（１９９３）；Ｓｏｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｖｏｌ．２１、ｐｐ．１３７−１４６（１９９３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２５，ｐｐ．１４１−１５７（１９９４）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ｖｏｌ．２９，ｐｐ．１−３７（１９９３））。研究者はまたどの残基が熱安定性のために重要であるかを研究してきており（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６４，ｐｐ．１８９３３−１８９３８（１９８９）；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２２６，ｐｐ．２７７−２８３（１９９４））；そして１つのグループは、このような方法をバシルス  リケニフォルミスのアミラーゼにおいて様々なヒスチジン残基に変異を導入するために利用し、その根拠は、他の同様のバシルスアミラーゼと比較して熱安定性であることが知られているバシルス  リケニフォルミスアミラーゼは過剰のヒスチジンを有しており、そして、それ故、ヒスチジンの置換は酵素の熱安定性に影響しうることが提唱されているからである。この研究は、＋１３３位置でのヒスチジン残基および位置＋２０９のアラニン残基での安定化変異の同定という結果となった（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，ｐｐ．１５４８１−１５４８８（１９９０）；ＦＲ２  ６６５  １７８−Ａ１；Ｊｏｙｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１５７９−１５８３（１９９２））。
従来技術において成された進歩にもかかわらず、現在の実状より低いｐＨでの商業的液化を可能とする低ｐＨ値において十分効果的であるαアミラーゼに対する需要が存在する。同様に、この分野では、ドライミルされた穀物の高温での液化を可能とする方法に対する需要が存在する。さらに、この分野では、高価なカルシウムの添加に対する依存度が減少された、効果的なデンプン液化を可能とする方法に対する需要が存在する。付加的には、効果的な糖化を確実とするため、液化段階でのより完全なデンプンの加水分解を達成するためのより効果的な酵素に対する需要が存在する。市販の酵素は多くの状況下で安定性の問題、例えば、高アルカリ性および洗剤に関連した酸化剤（漂白剤）レベル等により受け入れ難いので、そのような条件下での改変された、好ましくは増加された性能特性を有するアミラーゼに対する需要がある。このように、増加された活性、熱安定性、ｐＨ安定性、酸化安定性またはカルシウム安定性等の、野生型またはプレカーサー酵素と比較した酵素活性の改変、維持、または増加とともに成されうる改変された性能特性が、好ましい。
発明の概要
本発明の目的は、改変された性能特性、例えばｐＨ安定性、アルカリ安定性、酸化安定性または酵素活性等を有するαアミラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、デンプン液化の間に、添加されたカルシウムイオンの不在下で増加された安定性を有するαアミラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、効率的な低ｐＨ液化において用いるための改変されたｐＨ安定性を有するαアミラーゼを提供することである。
本発明のまたさらなる目的は、ドライミルされた穀物の高温での効果的な液化を可能とするαアミラーゼを提供することである。
本発明のなおもさらなる目的は、高ｐＨ環境または酸化剤または漂白剤の存在下で有用であるαアミラーゼを提供することである。
本発明のなおもさらなる目的は、糖化の効率を増加させるための、デンプン分子のより完全な加水分解を達成するαアミラーゼを提供することである。
本発明に従って、αアミラーゼをコードしている変異ＤＮＡ配列の発現産物であるαアミラーゼが提供され、そこにおいてその変異ＤＮＡ配列は、１またはそれより多くの、αアミラーゼ残基の性能を改善する効果を有する残基の欠失または置換によってプレカーサーαアミラーゼから派生されている。
好ましくは、欠失または置換された残基はアスパラギン残基であり、最も好ましくは、バシルス  リケニフォルミスにおけるＮ１８８に相当する位置のものである。αアミラーゼの熱安定性の改変が望まれている場合は、アスパラギンの置換は、２０の天然に生じるアミノ酸の何れをも含む、他の何れのアミノ酸であってもよい。好ましくは、置換はバシルス  リケニフォルミスにおけるＮ１８８ＳおよびＮ１８８Ｔに相当する。また好ましくは、αアミラーゼはさらにメチオニンまたはトリプトファン残基の欠失または置換、特に、バシルス  リケニフォルミスにおけるＭ１５、Ｗ１３８、および／またはＭ１９７に相当する位置またはＶ１２８、Ｈ１３３、Ｓ１８７および／またはＡ２０９に相当する残基での欠失または置換を含んでいる。最も好ましい実施態様においては、αアミラーゼはバシルス  リケニフォルミスにおけるＭ１５Ｌ／Ｎ１８８ＳまたはＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓに相当する残基での置換を含んで提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼ由来の、Ａｓｎ１８８の特異的変異の際に有用な変異オリゴヌクレオチドをしめす。この、および続いてのオリゴヌクレオチド構築物を示す図においては、太字はオリゴヌクレオチドによって導入される塩基の変化を示し、下線はオリゴヌクレオチドによって導入された制限エンドヌクレアーゼサイトを示す。
図２は、変異オリゴヌクレオチドテンプレートのＰＣＲ処理に用いられたＰＣＲプライマーを示す。
図３は、バシルス  リケニフォルミス（ＮＣＩＢ８０６１）由来のαアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３３）および推定される翻訳産物のアミノ酸配列（配列番号４１）をＧｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．６３５−６４３（１９８６）に記載されたように示している。
図４は、バシルス  リケニフォルミス由来の成熟αアミラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
図５は、３つのバシルスαアミラーゼの１次構造のアライメントを示す。バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼ（Ａｍ−Ｌｉｃｈ）（配列番号３５）はＧｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．６３５−６４３（１９８６）によって記載されている；バシルス  アミロリケファシエンスのαアミラーゼ（Ａｍ−Ａｍｙｌｏ）（配列番号３６）は、Ｔａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５８，ｐｐ．１００７−１０１３（１９８３）によって記載されている；そしてバシルス  ステアロサーモフィラスαアミラーゼ（Ａｍ−Ｓｔｅａｒｏ）（配列番号３７）はＩｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．９８，ｐｐ．９５−１０３（１９８５）によって記載されている。
図６はプラスミドｐＨＰ１３を示しているが、そこにおいてＣｍRとはクロラムフェニコール耐性を意味し、ＥｍRとはエリスロマイシン耐性を意味し、Ｒｅｐ  ｐＴＡ１０６０とはプラスミドｐＴＡ１０６０からの複製開始点を意味する。
図７はｐＢＬａｐｒプラスミドを示すが、そこにおいてＢＬＡＡとはバシルス  リケニフォルミスαアミラーゼ遺伝子を意味し、ａｐｒＥとはａｐｒＥ遺伝子のプロモーターおよびシグナルペプチドをコードしている領域を意味し、ＡｍｐＲとはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を意味し、ＣＡＴとはｐＣ１９４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を意味する。
図８はバシルス  リケニフォルミスαアミラーゼの遺伝子を担持するｐＨＰ．ＢＬプラスミドを示す。
図９はバシルス  リケニフォルミスから派生されたαアミラーゼに対応する変異オリゴヌクレオチドを生産するために用いられたＰＣＲ法の図を示す。
図１０は、本発明に従った変異体酵素Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを、１０７℃、６０ｐｐｍカルシウム、ｐＨを変化させたデンプン液化において野生型バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼと比較した静力学的研究から派生されたグラフを示す。
図１１は、本発明に従った変異体酵素Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを、１０７℃、ｐＨ６．０、カルシウム濃度を変化させたデンプン液化において野生型バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼと比較した静力学的研究から派生されたグラフを示す。
図１２は、本発明に従った変異体酵素Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを、ｐＨ６．０、６０ｐｐｍカルシウム、温度を変化させたデンプン液化において野生型バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼと比較した静力学的研究から派生されたグラフを示す。
図１３は、バシルス  リケニフォルミス（配列番号３８）、バシルス  スブチリスａｐｒＥ（配列番号３９）およびｐＢＬａｐｒ中のバシルス  リケニフォルミス（配列番号４０）から派生されたαアミラーゼ中のシグナル配列−成熟タンパク質結合点を示す。
詳細な説明
「αアミラーゼ」とは、α（１、４）グリコシド結合で、例えばデンプン、アミロペクチンまたはアミロースポリマー中のものを分解すなわち加水分解する酵素的活性を意味する。ここで用いられるαアミラーゼには、天然に生産されるαアミラーゼ並びに組換体または変異体アミラーゼが含まれる。本発明において好ましいアミラーゼは、バシルス、特にバシルス  リケニフォルミス、バシルス  アミロリケファシエンス、またはバシルス  ステアロサーモフィラスから派生されたもの、およびアスペルギルス（すなわちＡ．ｏｒｙｚａｅおよびＡ．ｎｉｇｅｒ）等から派生された菌類αアミラーゼである。
「組換えαアミラーゼ」とは、αアミラーゼであって、そこにおいて天然αアミラーゼをコードしているＤＮＡ配列が、αアミラーゼ配列中に天然αアミラーゼと比較しての１またはそれより多くの置換、挿入、欠失をコードしている変異体ＤＮＡ配列を生産するために改変されているものを意味する。
「発現ベクター」とは、ＤＮＡ構築物であって、適当な宿主中での前記ＤＮＡの発現を実行することができる適当な制御配列に連結されたＤＮＡ配列を有するものである。このような制御配列には、転写を行うためのプロモーター、そのような転写を制御するための付加的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合サイトをコードしている配列および転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれてもよい。好ましいプロモーターはバシルス  スブチリスａｐｒＥプロモーターである。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的ゲノムインサートである。一旦適当な宿主に形質転換されると、ベクターは複製され宿主のゲノムと独立に機能しても良く、また、いくつかの場合には、ゲノムそれ自体の中に組み込まれても良い。本明細書では、プラスミドおよびベクターはしばしば相互交換可能に用いられるが、それはプラスミドは現在最も良く用いられているベクターの型であるからである。しかしながら、本発明は、相当の機能を果たし当業者に知られているような他の発現ベクターの型を含むように意図されている。
「宿主菌株」または「宿主細胞」とは、本発明に従ったαアミラーゼをコードしているＤＮＡを含む発現ベクターの好適な宿主を意味する。本発明において有用な宿主細胞は、一般に原核または真核宿主であり、本発明に従ったαアミラーゼの発現がそこにおいて成されうる何れの形質転換可能な細胞をも含む。特に、αアミラーゼが派生された種または属と同じ宿主菌株、例えばバシルス株が適切である。好ましくは、αアミラーゼ陰性バシルス株（遺伝子欠失）および／またはαアミラーゼおよびプロテアーゼ欠失バシルス株（ΔａｍｙＥ、Δａｐｒ、Δｎｐｒ）が用いられる。宿主細胞は、組換え遺伝子技術を用いて構築されたベクターで形質転換または移入される。そのような形質転換された宿主細胞は、αアミラーゼまたはその派生体（変異体）をコードしているベクターを複製すること、または所望のαアミラーゼの発現させることができる。
「液化」または「液化する」とは、それによりデンプンが短鎖長でより低粘度のデキストリンに変換される工程を意味する。一般にこの工程はαアミラーゼの添加と同時かまたはそれに続いてαアミラーゼの添加を行う、デンプンのゼラチン化に関する。
本発明に従っては、αアミラーゼが提供されているが、それはαアミラーゼをコードしている変異ＤＮＡ配列の発現産物であり、変異ＤＮＡ配列はプレカーサーαアミラーゼから１またはそれより多くのアスパラギン残基の欠失または置換によって派生されたものである。また提供されているのは、本発明により提供されたαアミラーゼの少なくとも１部を含むアミノ酸配列をコードしている核酸分子（ＤＮＡ）、ファージやベクターを含むそのようなＤＮＡを取り込んだ発現システム、そのようなＤＮＡで形質転換された宿主細胞、およびアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子に対応しているＤＮＡのアンチセンス鎖である。同様に、本発明には、宿主細胞中に形質転換された発現システム中に取り込まれているＤＮＡを発現させることによるαアミラーゼの生産のための方法が含まれる。本発明のαアミラーゼはデンプンの液化において、洗剤の成分として、食品加工において、織物処理において、またはαアミラーゼ活性が有用である何れの他の用途において用いられても良い。
本発明に従ったαアミラーゼはプレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列から派生されたアミノ酸配列を含む。プレカーサーαアミラーゼには、天然αアミラーゼおよび組換えαアミラーゼが含まれる。αアミラーゼ変異体のアミノ酸配列は、プレカーサーαアミラーゼアミノ酸配列から、プレカーサーアミノ酸配列の１またはそれより多くのアミノ酸を置換、欠失または挿入することにより派生されている。このような改変は一般に、プレカーサーαアミラーゼ酵素それ自身の操作というよりはむしろ、プレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列をコードしているプレカーサーＤＮＡ配列のものである。そのようなプレカーサーＤＮＡ配列の操作のために好適な方法には、ここにおいて、またここに参考文献として取り込まれている共通して所有されている米国特許第４７６００２５号、第５１８５２５８号に開示されている方法が含まれる。
本発明に従ったαアミラーゼは、プレカーサーアミラーゼから派生される。プレカーサーαアミラーゼは、αアミラーゼを生産可能な何れの給源によって生産されても良い。好適なαアミラーゼの給源は、原核または真核生物であり、菌類、細菌、植物または動物を含む。好ましくは、プレカーサーαアミラーゼはバシルスによって；より好ましくはバシルス  リケニフォルミス、バシルス  アミロリケファシエンスまたはバシルス  ステアロサーモフィラスによって生産されており；最も好ましくは、プレカーサーαアミラーゼはバシルス  リケニフォルミスから派生されている。
これまでに配列決定されたほとんど全ての、植物、哺乳類および細菌の範囲にあるエンドアミラーゼの間においてホモロジーが発見されている（Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．３５５−３６０（１９８６）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．ｖｏｌ．１２８，ｐｐ．４７０−４７６（１９８５）；Ｊａｎｅｃｅｋ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２２４，ｐｐ．５１９−５２４（１９９４））。あるバシルスアミラーゼには、図５に示されるように、特に高いホモロジーを有する４つの領域が存在するが、そこにおいて下線が引かれた部分が高ホモロジー領域を示している。配列アライメントもまた、バシルス  エンドアミラーゼの間の関係をマップするために用いられた（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｅｖｏｌ．，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．３５１−３６０（１９８７））。バシルス  ステアロサーモフィラスとバシルス  リケニフォルミスのアミラーゼの間の相対的配列ホモロジーは約６６％であり、バシルス  リケニフォルミスとバシルス  アミロリケファシエンスのアミラーゼの間では約８１％であると、Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐｐ．１８１−１９１（１９９０）によって決定された。配列ホモロジーも重要である一方、アミラーゼまたは他の酵素を比較することにおいて、構造的ホモロジーが重要であることが一般に認識されている。例えば、菌類アミラーゼと細菌アミラーゼとの間の構造的ホモロジーが示唆され、そしてそれ故に、菌類アミラーゼが本発明の範囲に含められている。
中でも、αアミラーゼ中のアスパラギン残基に相当する残基がここにおいて欠失または置換のために同定されている。このように、Ｎ１８８等の特定の残基がアミノ酸位置の番号（すなわち＋１８８）を意味しているが、それは図４に示されている成熟バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼ配列に割り当てられた番号を参照している。しかしながら、本発明は、バシルス  リケニフォルミスの特定の成熟αアミラーゼの変異に限定されるものではなく、バシルス  リケニフォルミス  αアミラーゼにおいて特に同定された残基に相当する位置のアミノ酸残基を含むプレカーサーαアミラーゼにも拡張している。プレカーサーαアミラーゼの残基は、もしそれがバシルス  リケニフォルミスαアミラーゼの特定の残基またはその残基の部分に相同（すなわち１次または３次構造の何れかで相当する位置にある）または類似（すなわち化学的または構造的に結合、反応または相互作用するための同じまたは同様の能力を有している）である場合には、バシルス  リケニフォルミス  αアミラーゼの残基に相当するものである。
１次構造においてホモロジーを達成するために、プレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列は直接、バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼの１次構造、および配列の知られている全てのαアミラーゼにおいて不変であることが知られている特定の残基のセットと比較される（例えば図７を参照されたい）。ブタ膵臓αアミラーゼについて報告されている結晶構造の３次分析により相当する残基を決定することもまた可能である（Ｂｕｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．３９０９−３９１６（１９８７）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３３，ｐｐ．６２８４−６２９４（１９９４）；Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２３５，ｐｐ．１５６０−１５８４（１９９４）；アスペルギルス  オリゼ由来のタカアミラーゼＡ（Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６９７−７０２（１９８４））およびＡ．ニガー由来の酸性αアミラーゼ（Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２９，ｐｐ．６２４４−６２４９（１９９０））は、前の２つの構造が類似であり、大麦αアミラーゼに関連している（Ｖａｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２３６，ｐｐ．３６８−３７１（１９９４）；Ｋａｄｚｉｏｌａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２３９，ｐｐ．１０４−１２１（１９９４））。刊行された予備的な研究があるが（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．３７９−３８１（１９９０）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ｖｏｌ．２９１，ｐｐ．２５５−２５７（１９９１）；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２２９，ｐｐ．２３５−２３８（１９９３）；Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３４，ｐｐ．１２８２−１２８３（１９９３））、バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼについては１つの刊行された構造があるのみである（Ｍａｃｈｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２４６，ｐｐ．５４５−５４９（１９９５））。しかしながら、数人の研究者が、グルカナーゼの間（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，ｖｏｌ．２５９，ｐｐ，１４５−１５２（１９８９））およびαアミラーゼおよび他のデンプン代謝酵素の内で（Ｊａｓｐｅｒｓｅｎ．Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１２，ｐｐ．７９１−８０５（１９９３）；ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｓｔａｒｋｅ，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．２３２−２３７（１９９３））共通の超２次構造、および酵素の間のαアミラーゼに類似の超２次構造とともに配列の類似性を予言している（Ｊａｎｅｃｋ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３１６，ｐｐ．２３−２６（１９９３）；Ｊａｎｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．５０９−５１４（１９９３））。バシルス  ステアロサーモフィラスの酵素の構造は、タカアミラーゼＡのそれをモデルとしている（Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．３，ｐｐ．１８１−１９��（１９９０））。図７に示された４つの高度に保存された領域は活性中心の部分と考えられている多くの残基を含んでおり（Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６９７−７０２（１９８４）；Ｂｕｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．３９０９−３９１６（１９８７）；Ｖｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１０７，ｐｐ．２６７−２７２（１９９０））、それにはバシルス  リケニフォルミスシステムの下でのＨｉｓ＋１０５、Ａｒｇ＋２２９、Ａｓｐ＋２３１、Ｈｉｓ＋２３５、Ｇｌｕ＋２６１およびＡｓｐ＋３２８が含まれている。
好ましくは、欠失または置換されるアスパラギン残基はバシルス  リケニフォルミスにおけるＮ１８８に相当する位置にある。αアミラーゼの熱安定性の改変が望まれている場合は、アスパラギン置換は、２０の天然アミノ酸の何れをも含む他の何れのアミノ酸でも良い。好ましくは、欠失または置換は、バシルス  リケニフォルミスにおけるＮ１８８ＴまたはＮ１８８Ｓに相当する。また好ましくは、αアミラーゼはさらにメチオニンまたはトリプトファン残基の欠失または置換を含んでいる。
本発明に従ったαアミラーゼは、αアミラーゼが通常用いられている用途での使用において有用である改変された性能特性を提供する望ましく予想外の結果を示した。例えば、本発明に従った、低ｐＨで改変された性能特性を示し、改善された熱安定性、改善されたｐＨ安定性、および／または改善された酸化剤安定性を含むαアミラーゼは、低ｐＨデンプン液化において有用である。促進された熱安定性は、それらを取り込んだ製品の貯蔵寿命の延長に有用である。促進された酸化安定性または改善された性能は洗浄製品において、特に、漂白剤、過ホウ酸、過炭酸、またはそのような洗浄製品において用いられている過酸の存在下でのαアミラーゼの貯蔵寿命を延長するために望ましい。これに対して、減少された熱安定性または酸化剤安定性は、アミロース分解活性の迅速で完全な消失が要求される産業工程において有用であろう。
本発明のαアミラーゼは、特にデンプン処理、および特にデンプン液化において有用である。商業的に好ましい液化工程の間に存在する条件は、特徴的に、αアミラーゼに改善された低ｐＨ性能、改善された熱安定性、および改善された酸化剤安定性を示すことを要求する、低ｐＨおよび高温および潜在的酸化条件を含んでいる。従って、本発明に従った、液化において特に有用であるαアミラーゼは、約６未満、好ましくは約５．５未満、最も好ましくは約５．０と５．５との間でのｐＨで改善された性能を示す。付加的には、本発明に従ったαアミラーゼは、約８０−１２０℃、好ましくは約１００−１１０℃の間の温度での増加された熱安定性、および酸化剤の存在下での増加された安定性を示すもので特に有用である。好ましくは、液化において用いられる本発明に従ったαアミラーゼは、アスパラギンの欠失または置換に加えて、さらに、バシルス  リケニフォルミスにおいてのＭ１５、Ｖ１２８、Ｈ１３３、Ｗ１３８、Ｓ１８７、Ｍ１９７および／またはＡ２０９に相当する１またはそれより多くの残基の欠失または置換を含む。より好ましい実施態様においては、デンプン液化において用いられる本発明のαアミラーゼは、位置Ｎ１８８に相当する欠失または置換を有する。最も好ましくは、アミラーゼはバシルス  リケニフォルミスにおいてのＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｓ１８７Ｄ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３ＹまたはＭ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖに相当する置換を有している。
液化において有用であることが当業者に知られている、例えば、抗酸化剤、カルシウム、イオン、塩、またはエンドグリコシダーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたは他のアミラーゼ酵素等その他の酵素を含む付加的な成分が、意図されている反応条件に応じて加えられても良い。例えば、本発明に従ったαアミラーゼと別の給源からのαアミラーゼを組み合わせることにより、特定の液化条件下での特定の利用を見いだした独特の作用特性を提供しうる。特に、本発明のαアミラーゼとバシルス  ステアロサーモフィラス由来のαアミラーゼの組合せは、５．５より下のｐＨ値で、相補的な作用パターンによる促進された液化を提供するであろうことが熟慮された。工程がドライミルされたデンプンのエタノール製品への液化に関与しているところの好ましい実施態様においては、バシルス  ステアロサーモフィラス由来のαアミラーゼと、バシルス  リケニフォルミスにおいてのＭ１５Ｔ／Ｎ１８８ＳまたはＭ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｓに相当する置換を有する本発明に従ったαアミラーゼを含む。
液化の間、デンプン、特にウェットミルまたはドライミルの何れかの工程由来の微粒子デンプンスラリーは本発明のαアミラーゼによって公知の液化技術に従って処理される。一般に、デンプン分解工程の第１の段階において、デンプンスラリーは比較的高い温度（約８０℃から約１１０℃の間）で加熱されることによりゼラチン化される。デンプンスラリーがゼラチン化された後、αアミラーゼを用いて液化される。
本発明の別の態様においては、液体、ゲル、または粒状の型で本発明に従ったαアミラーゼを含む洗剤組成物が提供されている。そのような洗剤組成物は、貯蔵寿命を改善するための増加された熱安定性、または、αアミラーゼが洗剤中に通常存在する漂白剤または過酸化合物に対する改善された耐性を有するような増加された酸化剤安定を有するところの本発明に従ったαアミラーゼの添加により、特に利益があるであろう。このように、本発明に従ったαアミラーゼは、公知の粉末化、液体またはゲル洗剤で約６．５から約１２．０の間のｐＨを有するものに有効に配合されうる。本発明の好ましい実施態様はさらに、例えばＭ１５、Ｍ１９７またはＷ１３８等の、それらの開示が参考文献として取り込まれている、共通して割り当てられている米国特許出願番号第０８／２８９３５１号および第０８／４０９７７１号に記載されているメチオニン残基またはトリプトファン残基の欠失または置換；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／００３５３に記載されているようなＭ１３３Ｙでの置換；またはＤｅＣｌｅｒｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６５，ｐｐ．１５４８１−１５４８８（１９９０）に記載されているＡ２０９での置換を含む。また好ましくは、洗剤組成物中で用いられる本発明に従ったαアミラーゼは、位置Ｎ１８８での欠失または置換を有している。本発明に従ったαアミラーゼを含む洗剤組成物はさらに、例えばエンドグリコシダーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、またはその他の酵素、特にバシルス  ステアロサーモフィラスから派生されたαアミラーゼ等の他の酵素を、分野で一般に知られている付加的な成分と同様に含んでいても良い。
本発明のαアミラーゼとプロテアーゼ酵素との組合せを含む本発明の実施態様は、好ましくは、ここに参考文献として取り込まれている米国Ｒｅ．３４６０６に記載されている酸化安定性プロテアーゼを、ＤＵＲＡＺＹＭ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＭＡＸＡＰＥＭ（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ）およびＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯｘＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）と同様に含んでいる。そのようなプロテアーゼ変異体（酸化安定性プロテアーゼ）、および、特にバシルス  アミロリケニフォルミス中のＭ２２２に相当する位置のメチオニンの置換を有するような変異体の生産方法は、米国Ｒｅ．３４６０６に記載されている。
本発明の付加的な実施態様は、本発明に従ったαアミラーゼをコードしているＤＮＡおよびそのようなＤＮＡを含む発現ベクターを含む。ＤＮＡ配列は、それらを、操作可能であるように発現ベクター中の発現制御配列に連結し、その発現ベクターを公知の技術に従って適当な宿主を形質転換するために用いることにより発現されてもよい。幅広く多様な宿主／発現ベクターの組合せが、本発明のＤＮＡ配列の発現において用いられる。有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列の部分、例えばこの目的のために有用なたくさんの公知のプラスミドおよびファージ等が含まれる。さらに、多様な発現制御配列の何れもが、一般にこれらのベクター中で用いられる。例えば、出願人はバシルス形質転換体のために好適な発現制御配列は、バシルス  スブチリスから派生されたａｐｒＥシグナルペプチドであることを見いだした。
多様な宿主細胞がまた、本発明のＤＮＡ配列の発現において有用である。これらの宿主には、良く知られた真核および原核宿主、例えばＥ．コリの株、シュードモナス、バシルス、ストレプトコッカス、多様な菌類、酵母および動物細胞等が含まれ得る。好ましくは宿主は、本発明のαアミラーゼを細胞外に発現し、精製および下流工程を達成する。本発明のαアミラーゼの発現および精製は、そのような工程を実行するための分野で認識された手段を通して実施される。
本発明に従った改善されたαアミラーゼは、野生型バシルスαアミラーゼと比較された場合にいくつかの重要な利点を提供する。例えば、１つの利点は、通常のデンプン液化方法に典型的である低ｐＨおよび高温度で見られた増加された活性である。別の利点は増加されたｐＨおよび酸化安定性でそれらを洗剤中で使用可能とするものである。別の利点はより完全なデンプン分子の加水分解がなされ、それにより工程の流れにおいて残存デンプンを減少させることである。さらに別の利点は、カルシウムイオンの不在下でのそれらの改善された安定性である。さらに別の利点は、本発明のαアミラーゼの同じタンパク質量の添加が、野生型バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼと比較して、比活性および過酷な条件下での安定性の両方の改善により、よりすぐれた性能を提供することである。換言すると、本発明に従ったアミラーゼの一般に改善された安定性のため、本発明の酵素の増加されたデンプンに対する比活性は、この変異体のより多くの潜在的性能の利益とさえ解釈される。野生型酵素が不活性化される条件下において、本発明の酵素のより多くはその増加された安定性により生き残るだけでなく、生き残ったものはその増加された比活性により、比例してより多くの活性を示す。
以下は、例として示されており、クレームの範囲の限定として解釈されるものではない。ここで用いられている略語、特に３文字または１文字のアミノ酸表記はＤａｌｅ，Ｊ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９８９），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｂに記載されている。
実施例
実施例１
プラスミドｐＨＰ．ＢＬの構築
図３に示されているαアミラーゼ遺伝子はバシルス  リケニフォルミスＮＣＩＢ８０６１ｌからクローン化された（Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．６３５−６４３（１９８６））。１．７２ｋｂの、シグナル配列の最後の３つの残基、成熟タンパク質の全体およびターミネーター領域をコードしているＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片を、Ｍ１３ｍｐ１８中にサブクローン化した。以下の型で、バシルス  アミロリケファシエンス  スブチリシン転写ターミネーターを含むように設計された合成オリゴヌクレオチドカセットを用いてＢｃｌＩおよびＳｓｔＩサイトの間に合成ターミネーターを付加した（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．７９１１−７９２５（１９８３））。
0004191244.tif 000002
ｐＢＬａｐｒプラスミドは、バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼを担持して構築された。図７に示されている通り、ｐＢＬａｐｒは、約６．１ｋｂのプラスミドで、ｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子およびｐＣ１９４からのクロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｐｒＥプロモーターおよびバシルス  リケニフォルミスαアミラーゼ（「ＢＬＡＡ」）をコードしている遺伝子を含んでいる。ａｐｒＥプロモーターは、バシルス  スブチリスのアルカリプロテアーゼのプロモーターおよびシグナル配列をコードしている６６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片から構築された。ＰｓｔＩサイトは除去され、ＳｆｉＩサイトをａｐｒ／ＢＬ接合部付近に付加した。ＢＬＡＡ遺伝子は、上記のように、１７２０ｂｐのＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片から成る。ここに記載された仕事において、ｐＢＬａｐｒは、成熟アミラーゼ遺伝子のコード配列の開始部分の５’末端に隣接したＳｆｉＩサイトとともに構築された。特に、ｐＢＬａｐｒ構築物の５’末端は、ｐＢＬａｐｒからＭ１３ＢＭ２０（Ｂｏｅｈｉｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中に、ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＩ断片上にサブクローン化され、以下の変異性オリゴヌクレオチドのためのコード鎖テンプレートが得られた。
0004191244.tif 000003
このプライマーは、この唯一の制限サイトの存在によって正しい型が検索されることを可能とする１つのＳｆｉＩサイト（下線によって表示）を導入した。ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＩ断片をｐＢＬａｐｒベクターに逆にサブクローン化することにより、ＳｆｉＩサイトを有するプラスミドのバーションが得られた。
プラスミドｐＨＰ１３（Ｈａｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．２０９，ｐｐ．３３５−３４２（１９８７））（図６）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しその結果得られたベクターをポリアクリルアミドゲル上で精製し、続いて溶出した。プラスミドｐＢＬａｐｒはＨｉｎｄＩＩＩ、Ａｓｐ７１８で消化され、別のＡｓｐ７１８、ＥｃｏＲＩとの保温において、ゲル精製された。２つのバンド、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８（１２０３ｂｐ）およびＡｓｐ７１８−ＥｃｏＲＩ（１２５３ｂｐ）がゲル精製され、ゲルから溶出させ、１３通りのライゲーションによりベクター中に連結され、プラスミドｐＨＰ．ＢＬを得たが、このプラスミドはαアミラーゼの発現において用いられた（図８）。
実施例２
アスパラギン１８８の置換を有しているαアミラーゼをコードしているプラスミドの構築
一連のＡｓｎ１８８（「Ｎ１８８」）の天然アミノ酸のそれぞれでの置換をコードしている変異性プライマーが合成され、図１に示されている（配列番号４−２２）。これらの変化を有するαアミラーゼ遺伝子はＰＣＲにより、図９にまとめられた手順に従って図２に示されたＰＣＲプライマー（配列番号２３−３２）を用いて生成された。
段階（１）：  変異性プライマーはＰＣＲプライマー、ＰＣＲ  Ａ＋およびＰＣＲ  Ｂ−のテンプレートとして用いられ、延長された（６１ｐｂ）二本鎖ＤＮＡが得られた。各々は異なった位置１８８でのアミノ酸置換を有しており、Ｎ１８８Ｍ以外の全ては異なった制限サイトを含んでいた。最初にＰＣＲプライマーは３５℃で５分間アニーリングされ、続いて１分間のｔａｃポリメラーゼによる７５℃でのＤＮＡ伸長を行った。二本鎖ＤＮＡは続いて９５℃で１分間融解され、アニーリングと伸長段階を続いて行った。融解、アニーリングおよび伸長は全体で３０サイクル続けられた。
段階（２）：  位置１８８の上流および下流のＤＮＡが別のＰＣＲ反応で作成された。テンプレートはｐＢＬａｐｒであり、ＰＣＲプライマーは、ＬＡＡｆｓ５（配列番号２７）およびＰＣＲ  Ａ−（配列番号２４）が上流用；およびＰＣＲ  Ｂ＋（配列番号２５）およびＰＣＲ  Ｃｌａ−ＳａｌＩ（配列番号２８）が下流ＤＮＡ用であった。ＤＮＡは９５℃で１分間融解され、４５℃で３分間アニーリングされ、６８℃で３分間伸長された。上流部分は２９０ｂｐで、下流部分は４９８ｂｐであった。この手順はｐｆｕポリメラーゼを用いて１８サイクル繰り返された。同じＰＣＲ手順が段階（３）および（４）において用いられた。
段階（３）：  段階（２）で記載されている上流部分のＤＮＡを段階（１）で記載された二本鎖変異性プライマーに取り付けた。プライマーＬＡＡｆｓ５（配列番号２７）およびＰＣＲ  Ｂ−（配列番号２６）が用いられた。プライマー設計の結果として、ＤＮＡの２つの断片の取り付けを可能とする、これらの配列の間の２４ｂｐのオーバーラップがある。
段階（４）：  段階（２）で記載された下流部分のＤＮＡおよび段階（３）の生成物が取り付けられ、最終生成物を得た。２つのＰＣＲ生産物の間の２４ｂｐのオーバーラップが取り付けを可能としている。用いられたプライマーはＬＡＡｆｓ５（配列番号２７）およびＰＣＲ  ＣｌａＩ−ＳａｌＩ（配列番号２８）。
段階（５）：  １８８サイトの上流および下流に固有の制限サイトＡｓｐ７１８およびＢｓｓＨＩＩがそれぞれ位置している。最終ＰＣＲ産物はＡｓｐ７１８およびＢｓｓＨＩＩで消化され、３３３ｂｐ断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離し、ｐＨＰ．ＢＬベクター中にサブクローン化し、ｐＨＰ．Ｎ１８８Ｘを得た。
変異はジデオキシ配列決定により確認した（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．７４，ｐｐ．５４６３−５４６７（１９７７））。
図３で用いられたＤＮＡ配列およびナンバリングシステムを参照すると、＋１８８のアミノ酸位置をコードしているコドンは塩基対８１２−８１４である。ＰＣＲプライマーＡ＋およびＡ−は塩基対７８４−８０７に相当する。ＰＣＲプライマーＢ＋およびＢ−は、塩基対８２１−８４４に相当する。ＰＣＲプライマーＬＡＡｆｓ５の５’末端は塩基対５１８に相当する。ＰＣＲプライマーＰＣＲ  ＣｌａＩ−ＳａｌＩの５’末端は塩基対１３１７に相当する。Ａｓｐ７１８サイトは塩基対７２４に相当する。ＢｓｓＨＩＩサイトは塩基対１０５３に相当する。
実施例３
Ｍ１５およびＮ１８８での変異をコードしているプラスミドの構築
アミノ酸１５のメチオニンを置換したスレオニンを有するｐＢＬａｐｒプラスミドを、米国特許出願第０８／１９４６６４号（ＰＣＴ公報第９４／１８３１４号）に従って構築した。このプラスミド（ｐＢＬａｐｒＭ１５Ｔ）をＳｆｉＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、４７７塩基対の断片をｐＨＰ．ＢＬ中にサブクローン化し、ｐＨＰ．Ｍ１５Ｔを作成した。上記の実施例１と類似した方法により、ｐＨＰ．Ｍ１５ＴをＡｓｐ７１８およびＢｓｓＨＩＩにより消化しゲル精製し、ゲルから溶出させた。Ａｓｐ７１８からＢｓｓＨＩＩ、およびｐＨＰ．Ｎ１８８Ｓ由来の断片を含む３３３塩基対の断片をｐＨＰ．Ｍ１５Ｔ中にサブクローン化し、プラスミドｐＨＰ．Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを得た。同様の方法により、プラスミドｐＢＬａｐｒＭ１５ＬおよびｐＨＰ．Ｎ１８８Ｙから始め、プラスミドｐＨＰ．Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｙが構築された。
実施例４
バシルス  スブチリスの形質転換、変異体αアミラーゼの発現および精製
αアミラーゼは、バシルス  スブチリス中で、実施例１−３に記載されたプラスミドにより形質転換された後に発現された。ｐＨＰ１３は、Ｅ．コリ中およびバシルス  スブチリス中で複製されうるプラスミドである。異なった変異体を含むプラスミドがＥ．コリＭＭ１８４株を用いて構築され、プラスミドを単離し、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．，ｖｏｉ．８１，ｐｐ．７４１−７４６（１９６１）に記載されているようにバシルス  スブチリス中に形質転換した。バシルス株は２つのプロテアーゼ（Δａｐｒ、Δｎｐｒ）（例えばＦｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５２６４３６６号を参照）および１つのアミラーゼ（ΔａｍｙＥ）（例えばＳｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．，ｖｏｌ．１５８，ｐｐ．４１１−４１８（１９８４）を参照）が欠失されている。Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｙを発現するバシルス株は、１％不溶性デンプンを含む寒天プレート上で、Ｍ１５Ｌを発現する株よりも大きなクリアーゾーン形成を示し、増加されたデンプン加水分解活性を示唆していた。形質転換後、ｓａｃＵ（Ｈｙ）変異（Ｈｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．，ｖｏｌ．１７０，ｐｐ．２９６−３００（１９８８））がＰＢＳ−１を介した移入（Ｈｏｃｈ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．１５１３−１５１５（１９８３））により導入された。
分泌されたアミラーゼは所定の手順でバシルス  スブチリスの培養から以下のように回収された：培養上清は、硫酸アンモニウムで２０％飽和に調整し、４℃で１時間撹拌した。遠心分離の後、その結果得られた上清を硫酸アンモニウムで７０％飽和に調整し、４℃で１時間撹拌した。上清の遠心分離の後、その結果得られた沈殿を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、５ｍＭ塩化カルシウムに再懸濁し、滅菌濾過した。
実施例５
αアミラーゼ活性の決定のためのアッセイ
可溶性基質アッセイ：比率アッセイは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ａｕｓｔ．）Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．によって供給されている終点アッセイキットを基にして発展させた。基質のバイアル（ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、ＢＰＮＰＧ７）を１０ｍｌの滅菌水に溶解させ、続いてアッセイバッファー（５０ｍＭリンゴ酸バッファー、ｐＨ６．７、５ｍＭ塩化カルシウム、０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１：４に希釈した。アッセイは、１０μｌのアミラーゼを７９０μｌのキュベット中の基質に２５℃で添加することにより行った。加水分解の比率は７５秒後の４１０ｎｍの吸光度の変化の比率として測定された。アッセイは０．２吸光単位／分まで直線的であった。
αアミラーゼタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７２，ｐ．２４８（１９７６）に基づきウシ血清アルブミン標準を用いる標準的なＢｉｏ−Ｒａｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。
デンプン加水分解アッセイ：デンプンに対するαアミラーゼ活性は、デンプンか沃素と青色の複合体を形成する能力、およびデンプンが短鎖長デキストリン分子に加水分解された場合にこの色が消失することに基づいたアッセイを通して決定した。αアミラーゼの活性は、デンプンの完全なデキストリン化を表す色変化を生じさせるために要した消化時間の観点から定義された。
使用された試薬は以下の通りである：
リン酸バッファー−リン酸二水素カリウム（３４０ｇ）および水酸化ナトリウム（２５．３ｇ）を水に溶解させ２１まで希釈した。バッファーを続いて室温まで冷却しｐＨを６．２±０．１に調整した。バッファーは２１まで定量フラスコ中で希釈した。
デンプン基質−１０グラム（乾燥基質）の可溶性リントナー（ｌｉｎｔｎｅｒ）デンプンを５０ｍｌの水に懸濁し、〜３００ｍｌの沸騰水中で洗浄した。懸濁液を再び沸点にし、恒常的に撹拌しながら５分間沸騰させた。デンプン溶液を恒常的に撹拌しながら室温まで冷却し、１２５ｍｌのリン酸バッファーを添加した。溶液は５００ｍｌまで水で希釈された。デンプン基質は毎日新鮮なものを調製した。
ストック沃素溶液−沃素結晶（５．５ｇ）および沃化カリウム（１１．０ｇ）を水中に溶解させ、定量的に２５０ｍｌまで希釈した。溶液は光をさけて保存された。
希釈沃素溶液−沃化カリウム（２０ｇ）および２ｍｌのストック沃素溶液を水中に溶解させ、定量的に５００ｍｌまで希釈した。この溶液は毎日新鮮に調製された。
酵素希釈溶液−塩化カルシウム（１１．１ｇ）を４ｌの水に溶解させた。全ての試薬に用いられた水は蒸留または脱塩されていた。
活性が決定されるべきαアミラーゼ試料は、酵素希釈溶液により１０−１５ＬＵ／ｍｌ（後に定義）の間に希釈された。多くの商業用αアミラーゼ調製物について、好ましい希釈は２０００倍と見いだされた。５ｍｌの希釈沃素溶液のアリコートを、１３ｘ１００ｍｍ試験管に調合し、１０ｍｌのデンプン基質を２３ｘ２００ｍｍ試験管に置いた。全ての試験管は３０℃のウォーターバス中に置いた。特別のαアミラーゼ色ディスク（カタログ番号６２０−ｓ５）を装備したＨｅｌｌｉｇｅ比較器が、リーディングを行うために用いられた。５ｍｌの希釈酵素（同様に３０℃）がデンプン基質と混合され、計時が開始された。適当な時間間隔、例えば反応の初期には１分間隔で、反応の後期には１５秒間隔で、１ｍｌの酵素−基質混合物のアリコートを、温度調節された希釈沃素溶液を含む試験管に移した。デンプン−沃素溶液は混合され、１３ｍｍの精密正方形チューブに移され、Ｈｅｌｌｉｇｅ比較器において標準αアミラーゼ色ディスクと色を比較された。終了点が近づいた時には、試料は０．２５分の間隔で採取された。
試料の色とディスクの色が一致するまでに要した時間は記録され、活性（ｇまたはｍｌあたりのリケフォン（ｌｉｑｕｅｆｏｎ））が以下の式によって計算された：
0004191244.tif 000004
ここにおいて、ＬＵ＝リケフォンユニット、
Ｖ＝酵素の容量（５ｍｌ）
ｔ＝デキストリン化時間（分）
Ｄ＝希釈ファクター：希釈酵素のｍｌまたはｇで割った希釈容積
実施例１−４のように調製された本発明に従った変異体αアミラーゼを、それらのデンプンおよび可溶性基質に対する比活性について試験した。その結果は、表１に示されている通り、本発明に従った変異体αアミラーゼは、両方の基質に対してＡＡ２０野生型αアミラーゼと比較してより優れた活性特性を提供することを示している。
0004191244.tif 000005
実施例６
デンプン液化条件−−液化されたデンプンのＤＥ（デキストロース相当）の決定
デンプン液化は、５０フィート、直径０．２４インチ（０．２１インチｉ．ｄ．）で、おおよそ直径１０インチのコイル−高さ５．５インチに屈曲されたステンレススチール管からなる反応器を用いて行った。コイルには、１１．５インチの、前面端部から４フィートに位置されたインライン静的ミキサー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  ＃Ｇ−０４６６９−６０）が装備されていた。コイルの後面端部には、約２０ｐｓｉの破壊圧力に設定されたＳｗａｇｅｌｏｋインライン調整可能圧力解放バリュー（ｖａｌｕｅ）（＃ＳＳ−４ＣＡ−３）が装備されている。デンプンスラリーはコイルに〜７０ｍｌ／分の比率でピストン計量ポンプで供給される。コイルは１０５．５℃に加熱されたグリセロールウォーターバス中に浸されて加熱される。バスの温度は循環ヒーター／温度制御器（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ７３０５）を用いて維持される。
パイロットスケールのデンプン液化は、典型的には、混合チャンバーの後ろの２．５ｌ遅延コイルおよびターミナルバック圧力バルブを備えたハイドロヒーターＭ１０３−Ｍスチームジェット（Ｈｙｄｒｏ−Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を用いて行われた。デンプンはＭｙｏｎｏポンプによってジェットに供給され、スチームは、９０−１００ｐｓｉに減少された１５０ｐｓｉスチームラインによって供給された。温度プローブは、ハイドロヒータージェットの約１０ｃｍ後でバック圧力バルブの約５ｃｍ前に設置されている。デンプンはジェットに約３５０ｍｌ／ｍｉｎで導入された。ジェット温度は１０５℃−１０７℃に保持された。デンプン試料は続いて、ジェットクッカーから９５℃の第２の段階の液化に移され、９０分間維持された。
微粒子デンプンはコーンウエットミラーにより得られ、２日間以内に使用された。デンプンは約３０−３５％乾燥固体の所望の固体レベルに脱塩水で希釈され、ｐＨは２．５％ＮａＯＨまたは６％ＨＣｌで必要に応じて調整された。ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏの形のカルシウムを添加した。典型的な液化条件は：
デンプン                      ３２％−３５％固体
カルシウム                    ４０−６０ｐｐｍ（３０ｐｐｍ添加）
ｐＨ                          ５．０−６．０
αアミラーゼ                  １２−１４ＬＵ／ｇの炭水化物（乾燥ベース）
デンプンの試料は反応器から９５℃の第２段階液化バスに移され９０分間保持された。デンプン液化の程度は、第２段階の液化の直後に、試料のデキストロース相当（ＤＥ）をＳｔａｎｄａｒｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｎ  Ｒｅｆｉｎｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，．第６版、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（１９８０）に記載された方法に従って測定された。
実施例７
Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓと野生型αアミラーゼの１０５．５℃での液化での比較
実施例１−４に示された通りに作成されたＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓの置換を有しているαアミラーゼをバシルス  リケニフォルミスから派生された野生型αアミラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から市販されている）と１０５．５℃での液化において比較した。表２に示されている通り、変異体酵素はデンプンのジェット液化において、特に低いｐＨにおいて、顕著に増加された性能を提供した。パイロットスケールでの、１０５．５℃での第１の段階の液化、および９５℃での第２の段階の液化を行った。アミラーゼは１２ＬＵ／炭水化物ｇ（乾燥ベース）で添加した。
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実施例８
Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓと野性型αアミラーゼの１０７℃での液化での比較
実施例１−４に示された通りに作成されたＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓの置換を有しているαアミラーゼをバシルス  リケニフォルミスから派生された野生型αアミラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から市販されている）と１０７℃での液化において比較した。表３に示されている通り、変異体酵素はデンプンのジェット液化において、特に低いｐＨにおいて、ＤＥ値で示されているように、液化工程の間に顕著に増加された性能を提供した。パイロットスケールでの、１０７℃での第１の段階の液化、および９５℃での第２の段階の液化を行った。アミラーゼは１２ＬＵ／炭水化物ｇ（乾燥ベース）で添加した。
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実施例９
変異体および野性型αアミラーゼについての液化の結果の静力学的分析
Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０とＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ変異体の相対的な液化性能を、静力学的設計の実験において幅広く探索した。”Ｘ−ＳＴＡＴ”プログラム、バージョン２．０（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ，Ｗｉｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｊｏｈｎ  ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２））を用いて、Ｂｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ階乗実験が設計された：第１の液化温度を１０６℃から１１０℃、液化ｐＨをｐＨ５．３からｐＨ６．０およびデンプン基質中の全体のカルシウムのレベルを３０ｐｐｍから９０ｐｐｍで変化させた。この実験に基づいて作成された表４および表５中のデータは、１５のパイロットスケール液化において、１２ＬＵ／ｇ乾燥固体基質のＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０またはＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ変異体をそれぞれ用いて作成されたものである。データは続いて２次関数モデルに適合された。Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ変異体に関しては、データは、等式ＤＥ＝８４２．４１＋２８．３７４ｘｐＨ−１７．５５７ｘ温度＋１．５００５ｘカルシウム濃度＋１．６２４３（ｐＨｘ温度）−０．０８１５０６（ｐＨｘカルシウム濃度）−０．００９２０９９（温度ｘカルシウム濃度）−１６．８４１（ｐＨ）2＋０．０３８３７９（温度）2−０．０００１２４（カルシウム濃度）2に適合され、回帰についての標準誤差約１．３１３および平均（Ｒ）2についての説明された変化（ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は９３．９９％であった。Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０に関しては、データは、等式ＤＥ＝−６５２．０＋（１３２．３５ｘｐＨ）＋（４．７１６ｘ温度）＋（１．３９８９ｘカルシウム濃度）−０．０５０５１５（ｐＨｘ温度）−０．０１９６０３（ｐＨｘカルシウム濃度）−０．０１１１１８（温度ｘカルシウム濃度）−１０．２０６（ｐＨ）2＋０．０２１０４（温度）2−０．０００５２２（カルシウム濃度）2に適合された。回帰についての標準誤差０．５７７２および平均（Ｒ）2についての説明された変化（ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は９８．６９％であり、これらの等式は計算されたＤＥ対ｐＨ、対カルシウム濃度、対温度をプロットする曲線を作るために用いられた。１０７℃および６０ｐｐｍＣａ＋でのこのデータの２次元での表示は図１０−１２にそれぞれ示されている。図１０−１２に示されている通り、変異体アミラーゼは低ｐＨ、低カルシウムレベルおよびより高い温度でのより効率的なデンプン液化を可能とすることにより野生型アミラーゼを凌いでいる。
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本発明は多様な好ましい実施態様の見地から記述されているが、当業者は、多様な変更、代用、省略および変化がその精神および範囲から離れることなく成されうるであろうことを理解するであろう。従って、本発明の範囲は以下のクレームの範囲のみによって、その相当するものを含めて限定されることが意図されている。
実施例１０
熱安定性についての付加的な変異体αアミラーゼの調製および試験
１またはそれより多くの位置Ｖ１２８Ｅ、Ｈ１３３Ｙ、Ｓ１８７Ｄおよび／またはＡ２０９Ｖでの置換を有する変異体αアミラーゼを、所望の変異を成すために適当なＰＣＲプライマーが提供されたことを除いて、およそ実施例１−４で提供されているように手順に従って調製された。アミラーゼは、野生型バシルス  リケニフォルミスαアミラーゼが１０８７ＬＵ／ｍｇタンパク質の比活性を示した点まで精製された。タンパク質濃度は、野生型酵素のモル吸光係数１４３．２５５Ｍ-1ｃｍ-1を用いて、２７８ｎｍでの吸収により決定された。
多様な変異体の熱失活率は以下の手順に従って測定された。アミラーゼストック溶液は２０ｍＭ酢酸アンモニウム、４ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ６．５中に幅広く透析された。安定性の測定のために、このストックは＞５０倍で、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．０中に、最終濃度は３０から５０μｇ／ｍｌとして希釈した。６つの１００μｌのアリコートをエッペンドルフチューブに入れ、８３℃のウオーターバス中に位置させた。エッペンドルフチューブは規則的で測定された３０秒から５分の間の間隔で除去され、不活性化を止めるために氷上に置かれた。水溶性基質を用いて、実施例５のように残存活性をアッセイした。活性の自然対数を保温時間に対してプロットし、直線の傾きから不活性化比率定数が得られた。多様な変異体の結果は表６に提供されている。
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実施例１１
変異体アミラーゼの低ｐＨ液化性能
Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８ＳまたはＭ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓの置換を含むαアミラーゼを、実施例１−４および１０に従って作成し、実施例６に従って液化の研究において比較した。液化は１０５．５℃で９５℃で９０分の第２の保温とともに、９４ｐｐｍのＳＯ2を１６ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）のアミラーゼとともに含んだ条件下で行った。結果は以下の表７において提供されている。
0004191244.tif 000011
実施例１２
変化しているカルシウムレベルでのＭ１５Ｔ／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８ＳおよびＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓの低ｐＨ液化性能
多様な置換を含むαアミラーゼを、実施例１−４および１０に従って作成し、実施例６に従って液化の研究において比較した。液化は１０５．５℃で、ｐＨ５．５０、９５ｐｐｍのＳＯ2を１６ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）のアミラーゼとともに含んだ条件下で行った。結果は以下の表８において提供されている。
0004191244.tif 000012
実施例１３
変化しているｐＨレベルでのＭ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖの低ｐＨ液化性能
多様な置換を含むαアミラーゼを、実施例１−４および１０に従って作成し、実施例６に従って液化の研究において比較した。液化は１０５．５℃で、９８ｐｐｍのＳＯ2を１６ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）のアミラーゼとともに含んだ条件下で行った。乾燥コーンスターチ（Ｃｌｉｎｔｏｎ  Ｂｒａｎｄ  １０６−Ｂ  Ｐｅａｒｌ  ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ、ＡＤＭ  Ｃｏｒｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｃｌｉｎｔｏｎ，Ｉｏｗａ）は脱塩水でスラリー化させ（〜２３ｋｇ、〜５０ｌ）、１６時間の水和が可能となった。結果は以下の表９において提供されている。
0004191244.tif 000013
実施例１４
野性型と比較して改善された変異体αアミラーゼの液化性能
Ｍ１５Ｔ／Ｓ１８７Ｄ／Ｎ１８８Ｓでの置換を含むαアミラーゼを、実施例１−４および１０に従って作成し、実施例６に従って液化の研究において野生型と比較した。乾燥コーンスターチ（Ｃｌｉｎｔｏｎ  Ｂｒａｎｄ  １０６−Ｂ  Ｐｅａｒｌ  ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ、ＡＤＭ  Ｃｏｒｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｃｌｉｎｔｏｎ，Ｉｏｗａ）は脱塩水でスラリー化させ（〜２３ｋｇ、〜５０ｌ）、１６時間の水和が可能となった。液化は１０５．６℃で、等しいアミラーゼのタンパク質レベル、９．０μｇアミラーゼ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）（３．１ｍｇのアミラーゼ／１ｌの３５％乾燥固体デンプンスラリー）で行った。変異体αアミラーゼから得られる比活性の利益により、アミラーゼの活性は、野生型は１１ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）で、変異体は２４ＬＵ／ｇ炭水化物であった。測定された活性は、変異体アミラーゼがヘプタマルトースに対しては野生型の４１０％の、デンプンに対しては野生型の２１０％の活性の増加有していることを示していた。液化の結果は以下の表１０において提供されている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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