(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の間隔で各々分離した複数の凸部からなる島部を備えた水晶基板と、
生化学物質のＤＮＡに特有な塩基配列から構成されて各々の前記島部の上に固定された複数のＤＮＡ断片と
から構成され、
前記水晶基板の裏面に配置される下部電極および前記島部の上に配置される上部電極を含む共振周波数測定手段により前記島部の共振周波数が測定されるものである
ことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡチップにおいて、
前記島部上には金薄膜が形成され、
前記ＤＮＡ断片は、一端がＳＨ基に置換され、
前記ＳＨ基により前記ＤＮＡ断片が前記金薄膜に固定されている
ことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡチップにおいて、
前記島部は、前記水晶基板の表面を親水性にする親水処理を施した領域である  ことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡチップにおいて、
複数の前記島部上に、各々異なる塩基配列のＤＮＡ断片が固定されている
ことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項５】
所定の間隔で各々分離した複数の凸部からなる島部を備えた水晶基板を用意し、
各々の前記島部上に生化学物質のＤＮＡに特有な塩基配列から構成された所望のＤＮＡ断片を固定し、
前記水晶基板の裏面に配置される下部電極および前記島部の上に配置される上部電極を含む共振周波数測定手段により、前記ＤＮＡ断片が固定された各々前記島部の共振周波数を測定して前記島部各々の第１の測定周波数とし、
前記島部上に固定された前記ＤＮＡ断片を検体となるＤＮＡを含んだ溶液中に所定時間接触させた後で乾燥し、各々の前記島部の共振周波数を測定して前記島部各々の第２の測定周波数とし、
前記第２の測定周波数と第１の測定周波数との差により、前記検体となるＤＮＡの中より前記ＤＮＡ断片と同じ塩基配列を検出する
ことを特徴とするＤＮＡ検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の塩基配列を有するＤＮＡを検出するＤＮＡチップを用いたＤＮＡ検査方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、人の遺伝子構造がほぼ解明され、医療などの応用のために解明された遺伝子の持つ機能の調査，研究が本格化してきている。この遺伝子の機能解明のために、ＤＮＡチップが用いられている。
ＤＮＡは、Ａ（アデニン），Ｔ（チミン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン）の４つの塩基により形成された２本の分子鎖が、螺旋状に結合して形成されたものである。４つの塩基のうち、結合可能な組み合わせは、ＡとＴ、ＣとＧである。
【０００３】
ＤＮＡチップは、ガラスやシリコンなどの基板上に、高密度にＤＮＡ分子の断片を固定したものである。例えば、検体となるＤＮＡを被検者の血液から抽出し、抽出した溶液中のＤＮＡを１本鎖に分解した後、抽出した溶液をＤＮＡチップの表面に滴下し、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片との結合を調べて検体の種類を判定する。
【０００４】
現在、開発され一部実用化されているＤＮＡチップを用いた検出方式として、レーザを照射して蛍光を測定する蛍光検出方式がある。この方式では、検体となるＤＮＡに予め蛍光色素で標識をつけ、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に結合した検体ＤＮＡの有無を、レーザ光照射による蛍光色素の発光により検出している（非特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
原田  学，佐藤  高遠，米田  英克、「ＤＮＡチップの現状と展望」、応用物理、第６９巻、第１２号（２０００）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前述したような、従来の技術では、レーザ照射装置など大がかりな装置が必要となり、システムが高価なものとなる。また、定量的に検出することが容易ではなかった。
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、容易にＤＮＡの検査ができるようにすることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明のＤＮＡチップは、所定の間隔で各々分離した複数の凸部からなる島部を備えた水晶基板と、生化学物質のＤＮＡに特有な塩基配列から構成されて各々の島部の上に固定された複数のＤＮＡ断片とから構成されたものである。
このＤＮＡチップでは、各島部における共振周波数の変化により、各島部上に固定されているＤＮＡ断片に結合したＤＮＡの有無を検出する。
【０００８】
上記ＤＮＡチップにおいて、島部上に金薄膜を形成し、ＤＮＡ断片は、一端をＳＨ基に置換し、このＳＨ基によりＤＮＡ断片を金薄膜に固定すればよい。また、島部は、水晶基板の表面を親水性にする親水処理を施した領域であってもよい。また、上記ＤＮＡチップにおいて、複数の島部上に、各々異なる塩基配列のＤＮＡ断片が固定されているようにしてもよい。
【０００９】
また、本発明のＤＮＡ検査方法は、所定の間隔で各々分離した複数の凸部からなる島部を備えた水晶基板を用意し、各々の島部上に生化学物質のＤＮＡに特有な塩基配列から構成された所望のＤＮＡ断片を固定し、水晶基板の裏面に配置される下部電極および島部の上に配置される上部電極を含む共振周波数測定手段により、ＤＮＡ断片が固定された各々島部の共振周波数を測定して島部各々の第１の測定周波数とし、島部上に固定されたＤＮＡ断片を、検体となるＤＮＡを含んだ溶液中に所定時間接触させた後で乾燥し、各々の島部の共振周波数を測定して島部各々の第２の測定周波数とし、第２の測定周波数と第１の測定周波数との差により、検体となるＤＮＡの中よりＤＮＡ断片と同じ塩基配列を検出するようにしたものである。
このＤＮＡ検査方法によれば、各島部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各島部上に固定されているＤＮＡ断片に結合したＤＮＡの有無を検出する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。
図１は、本発明の実施の形態におけるＤＮＡチップの構成を示す断面図（ａ）と平面図（ｂ）である。このＤＮＡチップは、ＡＴカットの水晶基板１０１上に、直径１ｍｍ程度，高さ１０μｍ程度の複数の凸部（島部）１０２が、２ｍｍ間隔でマトリクス状に形成され、これら複数の凸部１０２上に形成された金薄膜１０３の表面に、所望とする複数のＤＮＡ断片１０４が各々固定されているものである。
【００１１】
凸部１０２の上へのＤＮＡ断片１０４の固定は、つぎに示すようにする。まず、所望とするＤＮＡ断片の一端がＳＨ基で置換された状態とする。次いで、ＳＨ基で一端が置換されたＤＮＡ断片が分散している溶媒中に、金薄膜１０３が各凸部１０２の表面に形成された水晶基板１０１を浸漬する。このことにより、金薄膜１０３の上にＳＨ基が引き寄せられて固着する。この結果、金薄膜１０３の表面にＳＨ基を介してＤＮＡ断片１０４が固定された状態となる。この後、水晶基板１０１は、純水で洗浄してから乾燥すればよい。
【００１２】
以下に、この実施の形態におけるＤＮＡ検査方法について説明する。
まず、ＤＮＡ断片１０４が固定されていない状態の水晶基板１０１の各凸部１０２の共振周波数（Ｆ0：基本振動数）を測定する。
つぎに、前述した方法により、所望のＤＮＡ断片１０４を各々異なる凸部１０２上に固定し、水晶基板１０１を純水で洗浄して乾燥した後、複数のＤＮＡ断片１０４が固定されている領域（島部）である各凸部１０２の共振周波数（Ｆ1：第１の測定周波数）を測定する。
【００１３】
ここで、各凸部１０２上においてＤＮＡ断片１０４が形成される領域の面積Ａ、凸部１０２部分の厚さｔ、水晶の密度ρ、共振周波数の変化ΔＦ、上記面積Ａの領域の上における質量変化Δｍ、とすると、これらの関係は、「−ΔＦ＝（Ｆ0・Δｍ）／（ρ・Ａ・ｔ）」で示される。したがって、各凸部１０２に固定されたＤＮＡ断片１０４によって、質量変化Δｍ1が生じ、共振周波数の変化（ΔＦ01＝Ｆ0−Ｆ1）として検出することができる。
【００１４】
つぎに、ＤＮＡの２重螺旋構造が解ける程度の温度とした状態で、検体となるＤＮＡを含んだ溶液中にＤＮＡ断片１０４が固定された水晶基板１０１を所定時間浸漬するなどにより、ＤＮＡ断片１０４部分を上記溶液に接触させる。この後、溶液温度を低下させてＤＮＡが螺旋構造をとる状態としてから水晶基板を溶液中より引き上げ、これを純水で洗浄して乾燥し、各凸部１０２の共振周波数（Ｆ2：第２の測定周波数）を測定する。
【００１５】
このとき、検体となるＤＮＡの塩基配列の中に、ＤＮＡ断片１０４と同じ塩基配列が存在すると、前述した水晶基板１０１の溶液に対する浸漬により、同じ塩基配列が存在するＤＮＡはＤＮＡ断片１０４に結合する。ＤＮＡ断片１０４に同じ塩基配列が存在するＤＮＡが結合した場合、このＤＮＡ断片１０４が固定されている凸部１０２上では、質量が増加（変化）したことになる。すなわち、検体となるＤＮＡと同じ塩基配列を有するＤＮＡ断片１０４が固定された凸部１０２における質量変化（Δｍ2）は、固定されたＤＮＡ断片１０４およびこのＤＮＡ断片１０４に結合したＤＮＡによるものである。
【００１６】
したがって、水晶基板１０１を上記ＤＮＡを含んだ溶液に浸漬する前後で、Ｆ1とＦ2との差があれば、質量変化（Δｍ1，Δｍ2）に差があることになる。よって、Ｆ1とＦ2とに差が発生した凸部１０２上において、先に固定してあったＤＮＡ断片１０４に検体中のＤＮＡが結合することによる質量の変化（増加）が発生したことが検出できる。
すなわち、ＤＮＡ断片同士の結合による質量増加が、凸部１０２毎の共振周波数の測定によりＦ1とＦ2との差として検出されるので、どの凸部１０２にＦ1とＦ2との差が生じたかを調べることにより、検体となるＤＮＡの中よりＤＮＡ断片１０４と同じ塩基配列を検出することが可能となる。
【００１７】
このように、基本振動数Ｆ0をもとに、Ｆ1とＦ2との差から、水晶基板１０１を上記ＤＮＡを含んだ溶液に浸漬する前後における各々の凸部１０２上の質量変化を検出し、各々の凸部１０２におけるＦ1とＦ2との差（質量変化）の有無により検体となるＤＮＡの中よりＤＮＡ断片１０４と同じ塩基配列を検出する。
また、凸部１０２上のＤＮＡ断片１０４に結合した検体のＤＮＡの質量は、Δｍ＝−（Ｆ2−Ｆ1）・（ρ・Ａ・ｔ）／Ｆ0により求めることができる。また、Ｆ0とＦ1の差から、各々の凸部１０２上に固定されているＤＮＡ断片１０４の質量も得られるので、１個のＤＮＡ断片の質量が判明していれば、凸部１０２上に固定されているＤＮＡ断片１０４の数も求めることができる。
【００１８】
ここで、凸部１０２の共振周波数の測定について簡単に説明する。図２に示すように、下部電極２０１上に水晶基板１０１を載置し、水晶基板１０１上に上部電極２０２が複数設けられた上部電極固定絶縁基板２０３を対向配置し、上部電極２０２の各々が、各凸部１０２上に配置された状態とする。なお、下部電極２０１は、水晶基板１０１の裏面全域にわたる大きさに形成され、上部電極２０２は、凸部１０２と同一の間隔で、上部電極固定絶縁基板２０３にマトリクス状に配置されている。
【００１９】
以上に説明したように下部電極２０１および上部電極２０２を配置したら、測定対象の凸部１０２上に配置されている上部電極２０２と下部電極２０１との間に、発振回路２０４より所定の周波数の信号を供給し、周波数カウンタ２０５により共振周波数を計測する。
【００２０】
また、図３に示すように、各上部電極２０２より各々配線を取り出し、切り替え器３０１により適宜切り替えながら、各凸部１０２の共振周波数を逐次測定するようにしてもよい。また、各々の凸部１０２上に、各々異なる塩基配列のＤＮＡ断片を固定し、複数種類の検体が同時に測定できるようにしてもよい。
【００２１】
なお、上述した実施の形態では、水晶基板上に、所定の間隔で各々分離した複数の凸部を備えるようにしたが、これに限るものではない。例えば、図４に示すように、水晶基板４０１の上に所定の間隔で各々分離した複数の凹部４０２を備え、各々の凹部４０２の底面上に金薄膜４０３を形成し、金薄膜４０３の表面にＤＮＡ断片１０４を固定するようにしてもよい。
【００２２】
ところで、上述した実施の形態では、水晶基板に金属膜を形成してこの上にＤＮＡ断片を固定するようにしたが、図５に示すように、水晶基板に直接ＤＮＡ断片を固定してもよい。
図５に示すＤＮＡチップは、ＡＴカットの水晶基板１０１上に、直径１ｍｍ程度の円形領域の親水処理部５０２が２ｍｍ間隔でマトリクス状に形成され、これら複数の親水処理部５０２の上に、所望とする複数のＤＮＡ断片１０４が各々固定されているものである。
【００２３】
親水処理部５０２上へのＤＮＡ断片１０４の固定は、親水処理がされた部分とＤＮＡは容易に結合することから、つぎに示すようにする。所望とするＤＮＡ断片が分散している溶媒中に、親水処理部５０２が形成された水晶基板１０１を浸漬する。このことにより、親水処理部５０２の上にＤＮＡ断片１０４が引き寄せられて固着する。この結果、親水処理部５０２の表面にＤＮＡ断片１０４が固定された状態となる。この後、水晶基板１０１は、純水で洗浄してから乾燥すればよい。
【００２４】
図５のＤＮＡチップにおいても、つぎに示すことにより、親水処理部５０２における水晶基板１０１の共振周波数を測定することができる。
まず、下部電極２０１上に水晶基板１０１を載置し、水晶基板１０１上に上部電極２０２が複数設けられた上部電極固定絶縁基板２０３を対向配置し、上部電極２０２の各々が、所定の間隔で各親水処理部５０２上に配置された状態とする。なお、下部電極２０１は、水晶基板１０１の裏面全域にわたる大きさに形成され、上部電極２０２は、親水処理部５０２と同一の間隔で、上部電極固定絶縁基板２０３にマトリクス状に配置されている。
【００２５】
以上に説明したように下部電極２０１および上部電極２０２を配置したら、測定対象の親水処理部５０２上に配置されている上部電極２０２と下部電極２０１との間に、発振回路２０４より所定の周波数の信号を供給し、周波数カウンタ２０５により共振周波数を計測する。
このようにして、親水処理部５０２の領域の共振周波数を測定し、また、親水処理部５０２におけるＤＮＡ断片１０４の有無およびＤＮＡ断片１０４に同じ塩基配列が存在する検体のＤＮＡが結合したの各々において共振周波数を測定すれば、前述と同様にＤＮＡの測定検査が行える。
【００２６】
ところで、図５に示す実施の形態においても、図１に示したように、水晶基板１０１に複数の凸部を設け、この凸部の上面に親水処理を施し、親水処理された凸部の上面にＤＮＡ断片を固定するようにしてもよい。また、隣り合う親水処理部５０２の間に溝を設け、親水処理部５０２と他の部分とに段差を設けるようにしてもよい。これらのように、段差を設けることで、ＤＮＡ断片が固定されている島部が、段差が無く平坦な状態より発振しやすい状態となる。
【００２７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、水晶基板上に複数の島部を形成し、各島部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各島部上に固定されているＤＮＡ断片に結合したＤＮＡの有無を検出するようにしたので、ＤＮＡの検査がより容易に行えるようになるというすぐれた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施の形態におけるＤＮＡチップの構成例を示す概略的な断面図（ａ）と平面図（ｂ）である。
【図２】  本発明の実施の形態におけるＤＮＡ検査方法を説明するための概略的な構成図である。
【図３】  本発明の他の形態におけるＤＮＡ検査方法を説明するための概略的な構成図である。
【図４】  本発明の他の形態におけるＤＮＡチップの構成例を示す概略的な断面図である。
【図５】  本発明の他の実施の形態におけるＤＮＡチップの構成例を示す概略的な断面図である。
【符号の説明】
１０１…水晶基板、１０２…凸部（島部）、１０３…金薄膜、１０４…ＤＮＡ断片。
【図１】
0004094922.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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