(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
勾配溶出をもたらす条件下でプリオン及びヘモグロビンを含有する溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それによりヘモグロビンからプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該ヘモグロビンを集めるようにする工程を含んでなり、ここで、ヘモグロビンを含有する溶出液画分がｐＨ約６．５〜約８．３において該陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出されることを特徴とする、プリオン及びヘモグロビンを含有する溶液からプリオンを除くための方法。
【請求項２】
陰イオン交換クロマトグラフィーカラムが陽イオン基で誘導されたシリカ、アルミナ、チタニナ、架橋デキストラン、アガロースおよび重合体よりなる群から選択される少なくとも１種の成分を含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
陽イオン基が第四級アンモニウム基である請求項２記載の方法。
【請求項４】
限外濾過膜を通して溶液を濾過する工程をさらに含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項５】
ヘモグロビンが哺乳類から得られる請求項１-４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
海綿状脳症は初老期痴呆をもたらし、典型的に致死的である中枢神経系の哺乳類の疾病である。これらの中にはヒト疾病クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー及びゲルストマン−ストラウスラー（Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ）−シェインケン（Ｓｃｈｅｉｎｋｅｎ）症候群、ヒツジ疾病スクレピー並びにウシ海綿状脳症がある。これらの疾病が共通の病原体（ａｇｅｎｔ）または一組の近縁の病原体により引き起こされるという強力な証拠があるが、現在、これらの病原体の性質は十分に特定されていない（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１５１５−１５２２（１９９１））。一連の増大する証拠から、宿主細胞タンパク質のプロテアーゼ耐性翻訳後修飾型が原因となる役割を果たすことが示唆されているが、この改変されたタンパク質だけが原因病原体であるかどうか、またはそれが原因病原体の必要な成分であるかどうかは知られていない。このタンパク質はプリオンタンパク質（以下、「ＰｒＰ」と称する）として示されており、海綿状脳症の感染性病原体はプリオンと呼ばれる。
それらは一般的に感染性ではないが、ある条件下で少なくともある海綿状脳症を動物から動物へ伝達することができ、そしてある場合には種から種へと渡すことができる証拠がある。例えば、１９７０年代にクロイツフェルト−ヤコブ病の一連の事例が、プールされた下垂体から精製されたヒト成長ホルモンでの処置を受けた個体で報告された（Ｂｒｏｗｎ等、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：７２８−７３１（１９８５））。ウシ海綿状脳症の最初の出現は汚染された飼料を介してヒツジスクレピーのウシへの伝達から生じたと考えられる。また、汚染されたヒツジ組織のマウスへの頭蓋内注入によりスクレピーのネズミモデルも開発されている。
組織または他の生物学的生成物中のプリオンの測定は、現在、当該生物学的材料の抽出物でのマウスまたはハムスターの感染を測定するアッセイによる。これらの疾病のインキュベーション期間は１年またはそれより長いことがあるので、そのような研究は実施するのが非常に長く且つ費用がかかる。
プリオン関連疾患の広範囲にわたる発生及び種間伝達の可能性は、哺乳類の組織から製品の多くを得るバイオテクノロジー産業にとって重大な意味を持つ（Ｄｉ  Ｍａｒｔｉｎｏ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２１：６１−６６（１９９３））。そのような製品の安全性についての懸念はプリオンの不活性化に関する研究につながっている。これらの研究からプリオンがウイルスまたはバクテリアのようなより一般的な病原体より不活性化に対して抵抗性であることが示される。従って、プリオンを含有する生物学的材料の汚染を除くためには比較的厳しい条件が必要とされる。高いプリオン力価の生物学的調製物を滅菌するために現在知られている唯一の方法は１３０℃またはそれ以上での長いオートクレーブ処理及び濃水酸化ナトリウム溶液での処理である。これらの方法はプリオンの日常的な不活性化のために推奨されている（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ８４：１６（１９８９））。また、６Ｍ尿素での処理と組み合わせた１００ｋＤカットオフの限外濾過がプリオン含有調製物の除染をもたらすことも報告されている（Ｐｏｃｃｈｉａｒｉ等、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．９８：１３１−１３５（１９８８））。プリオン活性を下げることができる他の方法は有機溶媒、洗剤、タンパク質変性剤、カオトロピック塩及びフェノールでの処理を含む（Ｍｉｌｌｓｏｎ等、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ及びＨａｄｌｏｗ、編集  Ｓｌｏｗ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、第II巻中、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ４０９−４２４（１９７９）；Ｐｒｕｓｉｎｅｒ等、ＰＮＡＳ  ７８：４６０６−４６１０（１９８１）；Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．５９：３９０−３９２（１９８３）；Ｗａｌｋｅｒ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ７３：６６１−６６５（１９８３）；Ｂｒｏｗｎ等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５３：１１４５−１１４８（１９８６））。
プリオン感染力を除くために必要な非常に厳しい条件は、有用な活性を有する生体分子を保護することを意図する方法と典型的に両立せず、多くの生体分子の変性をもたらし、それによりそれらの活性を本質的に破壊する。従って、望ましい生体分子の活性を弱めない条件下で生物学的材料からプリオンを除去するかまたはプリオンを不活性化するための方法が必要とされている。
発明の要約
本発明はプリオン及び少なくとも１種のさらなる生体分子を含有する溶液からプリオンを除くための方法に関する。
この方法は勾配溶出をもたらす条件下で溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それにより生体分子の少なくとも１種からプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該生体分子が集められるようにする工程を含む。
別の態様として、本発明はプリオン及びヘモグロビンを含有する溶液からプリオンを除くための方法を提供する。この方法は勾配溶出をもたらす条件下で溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通す工程を含んでなる。これはプリオンをヘモグロビンから分離し、プリオンはヘモグロビンを含有する画分と異なる画分に溶出する。
熱、強アルカリまたは酸化剤を使用せずに、穏やかな条件下で本発明の方法を実施することができる。従って、本発明は他の生体分子の活性を著しく変えずに、様々な他の生体分子の存在下でプリオンを含有する溶液の除染を可能にする。
発明の詳細な説明
ここで、本発明の方法の特徴及び他の詳細をより具体的に記述し、請求の範囲に示す。本発明の特定の態様は例示として示され、本発明の限定としてではないことが理解される。本発明の原理特徴を本発明の範囲からそれずに各種態様に用いることができる。
本発明はプリオンをスパイクしたウシヘモグロビン溶液を陰イオン交換カラムでクロマトグラフィー分離することにより、溶出されるヘモグロビン画分から意外にも高レベルのプリオン感染力が除かれるという発見に基づく。プリオン及び少なくとも１種の他の生体分子を含んでなる溶液からプリオンを除くための本発明の方法は、ｐＨ勾配溶出をもたらす条件下で溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通すことを含んでなる。このようにしてプリオンは生体分子の少なくとも１種から分離され、すなわち、生体分子の少なくとも１種はプリオンを含有する画分と異なる画分にカラムから溶出する。
本発明の目的のために、「プリオン」という用語は中枢神経系疾患の原因病原体であるタンパク質をさす。「原因病原体」という用語は当該疾患を引き起こすかまたは疾患を生じる系の必要な成分である病原体をさすと考えられる。プリオン関連疾患はヒト疾病クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー及びゲルストマン−ストラウスラー−シェインケン症候群、ヒツジ疾病スクレピー、ウシ海綿状脳症並びに伝達できるミンク脳症のような各種海綿状脳症を含む。プリオンは例えば翻訳後に修飾されたＰｒＰタンパク質のようなタンパク質であってもよく、またはそれはポリヌクレオチドのような情報分子と複合体を形成したタンパク質、例えば、翻訳後に修飾されたＰｒＰタンパク質と複合体を形成したポリデオキシ−リボヌクレオチドであってもよい。
本発明の目的のために、「生体分子」という用語は酵素、抗体、構造タンパク質及び輸送タンパク質のようなタンパク質、ポリペプチド、成長ホルモン、インシュリン及びステロイドホルモンのようなホルモン、ポリヌクレオチド、糖並びに脂質を初めとする生物学的起源のあらゆる分子をさす。本発明の目的のために、好ましい生体分子は実現されるかまたは可能性のある有用性を有するタンパク質、ポリペプチド及びポリヌクレオチドである。
陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを溶離に用いることができる好適なｐＨ勾配は、例えば、溶離剤のｐＨを時間の関数として連続的に変える連続的ｐＨ勾配を含む。連続的ｐＨ勾配の例は、ｐＨの変化が時間の一次関数である直線ｐＨ勾配である。溶離剤を作るために一緒に混合する異なるｐＨの２種またはそれ以上のバッファーを利用することにより連続的ｐＨ勾配を樹立することができる。溶離剤内のバッファーの比率、従って溶離剤のｐＨを時間の関数としてこのように連続的に変えることができる。バッファー混合工程の制御は典型的に流量調節器により制御され、それは適切なｐＨ勾配が生じるようにプログラムされる。
別の態様としてｐＨ勾配は、ｐＨの変化が時間に関して連続せず、１もしくはそれ以上の段階またはｐＨが急な変化を受ける時点を形成する段階的ｐＨ勾配であってもよい。溶離剤として最初のバッファーを異なるｐＨの第二のバッファーで単に置き換えることによりこれを達成することができる。本方法の好ましい態様として用いる勾配は段階的ｐＨ勾配である。
段階的ｐＨ勾配溶出を実施するための一つの方法として、異なるｐＨ値を有する一連のバッファーの各々を順次クロマトグラフィーカラムにかける。これらのバッファーを１０，０００ダルトンの脱パイロジェン化（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）膜を通すように濾過することが好ましい。溶液成分の溶出が一般的にｐＨにより決まり、イオン強度に著しく依存しないように、用いるバッファーは低イオン強度を有する１価のバッファーであるべきである。典型的に、約５０ｍＭまたはそれ未満のイオン強度を有するバッファーは好適に低イオン強度を有する。
本方法のために好適な陰イオン交換媒質の例は、ジエチルアミノエチルまたは第四級アミノエチル基のような陽イオン官能基で誘導化されている、シリカ、アルミナ、チタニア、架橋デキストラン、アガロースまたはポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチル−メタクリレートもしくはスチレンジビニルベンゼンのような誘導化重合体もしくは共重合体を含む。
好ましい態様として、陰イオン交換媒質はシリカゲルに基づく。この媒質はシリカゲルを熱水で処理して孔径を増し、次にゲルを（γ−グリシドキシ−プロピル）トリメトキシシランにさらして活性表面エポキシド基を生じることにより形成される。次に、誘導化シリカをＨＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2のような第三級アミンで処理して表面第四級アンモニウム基を形成する。
陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは例えば重力カラム、すなわち、移動相が重力の力の下で流れるカラムであってもよい。また、サンプルをカラム上に添加した後にカラムの入口に加圧した液体を入れることによるように、移動相をカラムの入口と出口の間の圧力差にさらしてもよい。好ましい態様として、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは高速液体クロマトグラフィーカラムである。
一つの態様として、溶液はプリオン及びウシヘモグロビンのようなヘモグロビンを含んでなる。この態様において、第一のバッファーは溶液をクロマトグラフィーカラムの媒質中に運び、媒質へのヘモグロビンの結合を促進する。次に、第二のバッファーはプリオンのような非ヘモグロビン成分を溶出するように媒質内のｐＨを調整する。次に、第三のバッファーはプリオンを実質的に含まないヘモグロビンを溶出する。ヘモグロビンの純度を保証するためにヘモグロビンを含有する溶離剤の最初と最後の部分、例えば最初の３％ないし４％及び最後の３％ないし４％を捨ててもよい。
好ましくは、第一バッファーはトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）溶液（濃度約２０ｍＭ、約８．４ないし約９．４の間の範囲のｐＨを有する）である。第二バッファーは第一バッファーと第三バッファーの混合物であり、第二バッファーは約８．２から約８．６までの範囲のｐＨを有する。第三バッファーはＴｒｉｓ溶液（濃度約５０ｍＭ、約６．５ないし約７．５の間の範囲のｐＨを有する）である。第四バッファーはＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ溶液（濃度約１．０Ｍ ＮａＣｌ及び約２０ｍＭ Ｔｒｉｓ；約８．４ないし約９．４、好ましくは約８．９から約９．１までの範囲のｐＨを有する）である。第二バッファーのｐＨが約８．２ないし８．４の間であることが特に好ましい。
用いるバッファーは典型的に約０℃から約５０℃までの範囲の温度である。好ましくは、バッファー温度は使用中約１２．４±１．０℃である。さらに、バッファーは典型的に約９℃ないし約１１℃の温度で保存される。
別の態様として、本方法は溶液を限外濾過膜に通すことをさらに含んでなる。この工程を陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前または後に実施することができる。好ましい態様として、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、溶液を１００，０００ダルトン膜のような限外濾過膜に圧力下で通す。この方法のために好適な限外濾過膜の例はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、カタログ番号ＣＤＵＦ ０５０ Ｈ１）及びＡ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ、モデル番号ＵＦＰ１００Ｅ５５）から入手できる１００，０００ダルトン膜を含む。
一つの態様として、溶液はウシ海綿状脳症の原因病原体であるプリオン及びもう一つのウシタンパク質を含んでなる。第二のウシタンパク質は例えば、ウシヘモグロビン、ウシ成長ホルモン、ウシ免疫グロブリン、ウシインシュリン、ウシ血清アルブミン、ウシアプロチニン、ウシトランスフェリン、ウシ血清、ウシトロンビンまたはウシフィブリノーゲンであってもよい。好ましい態様として、第二のウシタンパク質はウシヘモグロビンである。
別の態様として、溶液はスクレピー、クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインケン病のような海綿状脳症の原因病原体であるプリオン及びタンパク質またはホルモンのようなヒトまたは他の哺乳類の組織から得られた１種またはそれ以上のさらなる生体分子を含んでなる。好適なさらなる生体分子の例はヘモグロビン、インシュリン、成長ホルモン、ゴナドトロピン、ミエリン、コラーゲン、エラスチン、血清、血清アルブミン、ラクトアルブミン、抗体及び抗血清、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン及びトロンビン、エリトロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血小板活性化因子、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、インターフェロン、インターロイキン並びにサイトカインを含む。
ここで、本発明は以下の実施例にさらに具体的に記述される。
実施例
実施例１ 陰イオン交換クロマトグラフィーによるウシヘモグロビン溶液の精製
ウシヘモグロビン溶液の調製
米国特許出願番号第０８／４７３，４９７号に記述された方法に従ってウシヘモグロビン溶液を調製した。全ウシ血液のサンプルを集め、クエン酸ナトリウム抗凝血剤と混合してクエン酸血溶液を形成し、次に内毒素レベルに関して分析した。血液溶液サンプルを採取後約２℃の温度で保ち、次に大きな集合物及び粒子を除くために６００メッシュスクリーンで濾過した。
次に、大きな血液溶液屑を除くためにクエン血溶液を８００μｍ及び５０μｍのポリプロピレンフィルターに順次通した。
次に、赤血球からＢＳＡまたはＩｇＧのような細胞外血漿タンパク質を分離するために赤血球を洗浄した。赤血球を洗浄するために、血液溶液をダイアフィルトレーションタンク中に置き、次に１０ｋＤの限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている、カタログ番号ＣＤＵＦ ０５０ Ｇ１）を通して濾過した等容量の等張溶液で希釈した。等張溶液は注射用水（ＷＦＩ）中６．０ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム２水和物及び８．０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムからなった。
希釈された血液溶液を次に０．２μｍの中空繊維（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ  Ｋｒｏｓｆｌｏ  IIミクロフィルトレーションカートリッジ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／Ｍｉｃｒｏｇｏｎ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）ダイアフィルターを通したダイアフィルトレーションによりその最初の容量まで濃縮して戻した。同時に、濾過した等張溶液をダイアフィルターを通して濾過液が失われる速度に等しい速度で補充として連続的に添加した。ダイアフィルトレーション中、血漿溶質のような、溶液中の赤血球より著しく小さい血液成分は濾過液と共にダイアフィルターの壁を通過した。赤血球、血小板、及び白血球のような希釈された血液溶液のより大きい物体は連続的に添加された等張溶液で保持されて透析された血液溶液を形成した。
赤血球の洗浄中、希釈された血液溶液は処理効率を向上するために約２５ｐｓｉないし約３０ｐｓｉの間のダイアフィルターの入口の液体圧で約１０℃ないし２５℃の間の温度で保たれた。
ダイアフィルトレーション液の容量が等張溶液で希釈する前の血液溶液の容量の約６００％に等しくなった時に赤血球洗浄を終了した。
次に、透析された血液溶液を番号２８リングダム（ｒｉｎｇｄａｍ）を取り付けた、Ｓｈａｒｐｌｅｓ  Ｓｕｐｅｒ遠心機（モデル番号ＡＳ−１６、Ｓｈａｒｐｌｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）に１分当たり約４リットルの速度で連続的にポンプで入れた。透析された血液溶液を同時に入れながら遠心機は作動して赤血球を白血球及び血小板から分離した。作動中、遠心機は血液を重い赤血球相と軽い白血球相に分離するために十分な速度、典型的に約１５，０００ｒｐｍで回転した。赤血球相及び白血球相の画分を作動中に遠心機から別々に連続的に抜き取った。
分離後に、赤血球を溶解してヘモグロビンを含有する溶液を生じた。遠心機からの赤血球相の流れに斜めの赤血球相排出ラインの壁に対する細胞の衝突のために、遠心機からの抜き取り時に赤血球のかなりの部分は機械的に溶解され、それにより赤血球から赤血球相中にヘモグロビンを放出した。
溶解された赤血球相は次に赤血球相排出ラインを通って固定ミキサー（６素子（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）でＫｅｎｉｃｓ  １／２インチ、Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．）中へ流れた。赤血球相の固定ミキサーへの移動と同時に等容量のＷＦＩも固定ミキサー中に注入し、そこでＷＦＩを赤血球相と混合した。固定ミキサーへの赤血球相及びＷＦＩの流速は各々１分当たり約０．２５リットルである。
固定ミキサーで赤血球相をＷＦＩと混合することにより溶解赤血球コロイドが生じた。次に、これを非ヘモグロビン赤血球成分からヘモグロビンを分離するために適しているＳｈａｒｐｌｅｓ  Ｓｕｐｅｒ遠心機（モデル番号ＡＳ−１６）に移した。溶解赤血球コロイドを軽いヘモグロビン相と重い相に分離するために十分な速度で遠心機を回転させた。軽い相はヘモグロビンからなり、ヘモグロビンの密度にほぼ等しいかまたはそれ未満の密度を有する非ヘモグロビン成分も含んだ。
ヘモグロビン相を０．４５μｍペリコンカセット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）ミクロフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＶＬＰ ０００ Ｃ５）を通して遠心機からヘモグロビン精製の調製物として保持タンク中に連続的に排出した。次に、細胞ストロマを残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）と共にミクロフィルターから保持タンクへ戻した。ミクロフィルトレーション中、保持タンクの温度を１０℃またはそれ未満に保った。効率を向上するために、ミクロフィルター入口の液体圧が約１０ｐｓｉないし約２５ｐｓｉの初期圧力から増加した時にミクロ濾過を終了した。ヘモグロビンミクロフィルトレーション液をミクロフィルターからミクロフィルトレーションタンクへ移した。ミクロフィルトレーション液をこの段階で２つのサンプル、サンプルＡ及びＢに分けた。この時点でサンプルＡをさらに精製しなかった。
サンプルＢを次に１００ｋＤ限外フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＣＤＵＦ ０５０ Ｈ１）にポンプで通した。ミクロフィルトレーション液に含まれるヘモグロビンのかなりの部分及び水は限外フィルターを通過してヘモグロビン限外濾過液を形成し、一方、約１００ｋＤより大きい分子量のタンパク質のようなより大きいミクロフィルトレーション液成分は保持され、ミクロフィルトレーションタンクへ再循環して戻った。同時に、限外濾過液で失われた水の補充としてＷＦＩをミクロフィルトレーション液タンクへ連続的に添加した。ミクロフィルトレーション液タンク中のヘモグロビンの濃度が８グラム／リットル未満になるまで限外濾過を続けた。限外濾過工程中、ミクロフィルトレーション液タンクの内部温度を約１０℃に保った。
次に、ヘモグロビン限外濾過液を限外濾過タンクへ移し、３０ｋＤの限外フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＣＤＵＦ ０５０ Ｔ１）を通して再循環させて電解質、代謝中間体、水及び約３０ｋＤ未満の分子量のタンパク質のようなより小さい細胞成分を除いた。これにより１リットル当たり約１００グラムのヘモグロビンを含有する濃縮されたヘモグロビン溶液が生じた。サンプルＢの初期精製をこの時点で終了した。
陰イオン交換クロマトグラフィー媒質の調製
シリカゲルを７０℃で水中で（γ−グリシドキシ−プロピル）トリメトキシシランで処理し、表面エポキシド基で誘導化されたシリカを生じた。この誘導化シリカゲルを次にＮ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（ＯＨＣＨ2ＣＨ2）Ｎ（ＣＨ3）2で処理し、表面第四級アンモニウム基で誘導化されたシリカゲルを生じた。
スクレピー病原体でのサンプルのスパイク
本明細書に記述される研究に用いられるスクレピー病原体はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、Ｓｃｏｔｌａｎｄから認可された、ネズミに順応させたＭＥ−７株であった。この病原体の最初の供給源はサフォーク（Ｓｕｆｆｏｌｋ）種のヒツジの天然のスクレピー感染であった。これらのヒツジからの脳抽出物はＭｏｒｅｄｕｎ任意交配マウスを通して２継代接種、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎを通して９継代接種、Ｃ3Ｈマウスを通して１継代接種及びＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを通してさらに１継代接種を受けた。この研究に用いたスパイク材料は継代接種レベル１３であった。
サンプルＡ（１８０ｍＬ）を２０ｍＬ容量のスクレピー病原体でスパイクしてサンプルＡ’を生ぜしめた。サンプルＡ’のアリコートを「スパイク分析」アッセイでの使用のために保持し、残りをサンプルＢに対して上に記述したように１００ｋＤ限外フィルターを通した限外濾過に供した。今度はサンプルＡ”と称する得られた限外濾過液を実施例２に記述するようにスクレピー感染力に関してアッセイした。
サンプルＢの２０ｍＬアリコートを２ｍＬのスクレピー病原体でスパイクしてサンプルＢ’を生ぜしめた。サンプルＢ’のアリコートをコントロール「スパイク分析」アッセイでの使用のために保持した。スパイクされたサンプルの残りを陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによりヘモグロビンを精製するために、スパイクされたサンプルＢ’をクロマトグラフィーカラムに含まれる媒質上に添加した。カラムは８インチの内径及び２４インチの長さであった。カラム内の陰イオン交換媒質は上記のシリカに基づく媒質であった。
媒質へのヘモグロビン結合を促進するバッファーでカラムを前処理した。次に、サンプルＢ’を１分当たり１．７８リットルの流速でカラム中に注入した。次に、カラム内にｐＨ勾配を作ることにより、ヘモグロビン溶離剤を生じるように３種の異なるバッファーをカラムに連続して通すことでカラムを洗浄した。使用中の各バッファーの温度は約１２．４℃であった。カラムへの注入前にバッファーを１０ｋＤ限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＣＤＵＦ ０５０ Ｇ１）を通して前以て濾過した。カラムを通る各バッファーの流速は１分当たり３．５６リットルであった。
第一バッファー、２０ｍＭトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ、約８．４から約９．４までの範囲のｐＨ）は濃縮されたヘモグロビン溶液をカラム内の陰イオン交換媒質中に運んだ。次に、第一バッファーと第三バッファーの混合物で約８．３のｐＨを有する第二バッファーは、ヘモグロビンを保持しながら混入成分を溶出するようにカラム内のｐＨを調整した。第二バッファーでの平衡化は約３０分間続いた。第二バッファーからの溶離剤を廃液に捨てた。次に、第三バッファー、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（約６．５から約７．５までの範囲のｐＨ）はカラムからヘモグロビンを溶出した。ヘモグロビン溶離剤の最初と最後の３％ないし４％を捨てた。今度はサンプルＢ”と称する残りのヘモグロビン溶離剤を実施例２に記述するようにスクレピー感染力に関してアッセイした。
実施例２ ウシヘモグロビン調製物におけるプリオン除去方法の確認
方法確認を米国食品医薬品局グッドラボラトリープラクティス規定（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（２１ ＣＦＲ ５８）、英国ＧＬＰコンプライアンスプログラム（Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ）、日本ＧＬＰ基準及びグッドラボラトリープラクティスのＯＥＣＤ指針に従った方法により登録施設で実施した。
スクレピー感染力に関するインビボアッセイにより評価される溶液は１．ヘモグロビン溶液をスパイクするために用いたスクレピー病原体溶液、２．サンプルＡ’、３．サンプルＡ”、４．サンプルＢ’及び５．サンプルＢ”であった。
インビボアッセイ
スクレピー感染力のインビボアッセイを公表された方法（Ｃｈｅｓｅｂｒｏ、Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ：ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中、Ｆｉｅｌｄｓ、Ｋｎｉｐｅ、等、編集、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＴＤ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第８１章、ｐｐ．２３２５−２３３６（１９９０））に従ってＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤで実施した。この方法は目的の溶液のアリコートをマウスに頭蓋内接種し、スクレピー感染の臨床徴候に関してマウスを調べ、１年の間にわたって生存率を測定することを含む。
スクレピー感染力を以下の溶液：スパイク材料、サンプルＡ’（清澄化及び非清澄化）、サンプルＡ”、サンプルＢ’及びサンプルＢ”に関してアッセイした。これらの溶液の各々の一連の希釈物を示すように調製した：スパイク材料、希釈倍率１（未希釈）、１０-3、１０-4、１０-5、１０-6、１０-7及び１０-8；サンプルＡ’、非清澄化：希釈倍率１、清澄化：希釈倍率１、１０-1；サンプルＡ”、希釈倍率１、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4及び１０-5；サンプルＢ’、希釈倍率１及び１０-1；サンプルＢ”、希釈倍率１、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4及び１０-5。
メスのＣ５７ＢＬ／６マウスを１０または１５匹のマウスの組に分けた。一組の１５匹のコントロールマウスには接種せず、一方、一組の１５匹のビヒクルコントロールマウスには各々０．０２０ｍＬのビヒクルのみを接種した。残りの組の各々のマウスには各々研究下の溶液のいずれかの単一の希釈の０．０２ｍＬアリコートを接種した。
マウスをスクレピー感染の臨床徴候に関して３６５日間調べた。スクレピーの末期疾病段階の徴候は大きな音への感受性、尿失禁、荒れた毛、足取りの異常及び目の鈍さを含む。死亡または屠殺したマウスの脳組織の組織病理学的試験によりスクレピー感染を確認し、その場合、脳組織中の小腔の存在はスクレピーの診断を裏付けた。
結果
ウシヘモグロビンの全体的な精製方法は米国特許出願番号第０８／４７３，４７９号に開示されており、その中身は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。実施例１に記述したように、この方法の一部に従って２種のウシヘモグロビン溶液を調製したが、各場合で精製を全体の工程の異なる時点で停止した。サンプルＡをミクロフィルトレーション（０．４５μｍの孔径）工程を通して精製し、一方、サンプルＢをダイアフィルトレーション工程（１００ｋＤの公称分子量カットオフ）を通して精製した。
確認方法は感染したマウスの脳ホモジネート中に存在するネズミに順応させたＭＥ−７スクレピー病原体でスパイクされたサンプルの感染力に対する１００ｋＤ限外濾過工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程の効果を調べた。スクレピー病原体をウシ海綿状脳症の原因病原体のモデルとして用いた。用いた方法は現在プリオン感染力に対して利用できるアッセイの唯一の型であるマウスにおけるインビボアッセイであった。目的の精製工程前の２種のスパイクされたサンプルの感染力をコントロールとしてアッセイし、両方の場合で３６５日以内にコントロールマウスの１００％の死亡率をもたらし、かなり大部分のマウスはスクレピー感染と一致する脳形態の変化を示した。対照的に、続いて１００ｋＤ限外濾過または陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を受けたスパイクされたサンプルは、インビボアッセイにおいてスクレピー感染力の何の徴候も示さなかった。
インビボアッセイの結果を表に要約し、それは各試験群のマウスに対して、３６５日の研究で生存したマウスの数、研究中にスクレピーの臨床徴候を示したマウスの数、研究中に死亡するかまたは屠殺された数及び組織病理学的に確認されたスクレピーにかかった死亡マウスの数を示す。
データから１０-4の希釈倍率またはそれより多いスパイク材料を接種された２０匹のマウスのうち１９匹が、組織病理学により確認されたスクレピーにかかってスクレピーの臨床徴候を表したことが示される。おそらく接種エラーによりこの群の１匹の生存するマウスが説明される。
清澄化していない未希釈のサンプルＡ’で処理された全てのマウスは死亡したが、スクレピーの徴候は示さなかった。これらの死亡はこの不均一混合物内の固形物質の有毒作用に起因すると考えられる。清澄化したサンプルＡ’で処理された１０匹のマウスの各々はスクレピーの臨床徴候を示した後に死亡し、これらのうち９匹で、組織病理学によりスクレピーが確認された。この群の１匹のマウスでは、かなりの自己分解によりスクレピーの組織病理学的確認が妨げられた。対照的に、サンプルＡ”の希釈物を接種された９０匹のマウスのうち８６匹が研究で生存し、いずれもスクレピーの臨床徴候を示さず、死亡した４匹のマウスの脳は正常な組織病理を示した。
サンプルＢ’を接種された５匹のマウスのうちいずれも研究で生存せず、これらのうち４匹はスクレピーの臨床及び組織病理の両方の徴候を示した。サンプルＢ”の希釈物を９０匹のマウスに投与した。これらのうち８４匹は研究で生存し、死亡したマウスのいずれもスクレピーの臨床または組織病理徴候を示さなかった。
これらの結果はスクレピー病原体でスパイクしたヘモグロビン溶液を穏やかな条件下で除染できることを明確に示す。１００ｋＤ限外濾過またはｐＨ勾配溶出での陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製は、得られる溶液中のスクレピー感染力をインビボアッセイの検出限界以下に下げた。
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以下に、本発明の主要な態様は次のとおりである。
１．  ｐＨ勾配溶出をもたらす条件下でプリオン及びさらなるタンパク質を含んでなる溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それによりさらなるタンパク質からプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該タンパク質を集めるようにする工程を含んでなる、プリオン及びさらなるタンパク質を含んでなる溶液からプリオンを除くための方法。
２．  ｐＨ勾配が連続的勾配である前記１記載の方法。
３．  ｐＨ勾配が段階的勾配である前記１記載の方法。
４．  陰イオン交換クロマトグラフィー媒質が陰イオン基で誘導されたシリカ、アルミナ、チタニナ、架橋デキストラン、アガロースまたは重合体よりなる群から選択される少なくとも１種の成分を含んでなる前記１記載の方法。
５．  重合体がポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）である前記４記載の方法。
６．  陽イオン基が第四級アンモニウム基である前記４記載の方法。
７．  限外濾過膜を通して溶液を濾過する工程をさらに含んでなる前記１記載の方法。
８．  限外濾過膜が約１００Ｋｄの分子量カットオフを有する前記１記載の方法。
９．  タンパク質が哺乳類から得られる前記１記載の方法。
１０．  哺乳類がヒトもしくはウシ、ブタ、ヒツジまたはネズミ科の動物である前記９記載の方法。
１１．  タンパク質がヘモグロビンである前記１０記載の方法。
１２．  プリオンが海綿状脳症の原因病原体である前記１０記載の方法。
１３．  海綿状脳症がスクレピー、クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインケン症候群またはウシ海綿状脳症である前記１２記載の方法。
１４．  勾配溶出をもたらす条件下でプリオン及びヘモグロビンを含有する溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それによりヘモグロビンからプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該ヘモグロビンを集めるようにする工程を含んでなる、プリオン及びヘモグロビンを含有する溶液からプリオンを除くための方法。
１５．  ヘモグロビンがウシヘモグロビンである前記１４記載の方法。
１６．  プリオンがウシ海綿状脳症の原因病原体である前記１５記載の方法。
１７．  陰イオン交換クロマトグラフィー媒質がシリカを含んでなる前記１４記載の方法。
１８．  シリカが陽イオン基で機能化されている前記１７記載の方法。
１９．  陽イオン基が第四級アンモニウム基である前記１８記載の方法。