(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素がニトリルヒドラターゼである酵素触媒を凍結保存する際の充填方法であって、前記酵素触媒の温度を５℃以上２５℃以下にした後、１０Ｌ以上１０００Ｌ以下の内容量の容器に充填し凍結保存することを特徴とする酵素触媒の充填方法。
【請求項２】
前記酵素触媒が、精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化物のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物がニトリルヒドラターゼを生産する遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする請求項３または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子組換え大腸菌の宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  K−１２由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、同ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、同ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）または同ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素触媒の容器充填方法に関するものであり、例えばニトリルヒドラターゼ等の工業的に有用な酵素を産生する微生物の容器充填方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、酵素触媒を低温に保存することにより酵素触媒が失活しにくくなることはよく知られている。 しかしながら、容器に酵素触媒をいれた後凍結保存する際、その充填温度が酵素触媒の安定性に寄与することは知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、有用物質の工業的生産に利用できるような酵素触媒を凍結保存の容器に充填する際、酵素触媒を安定的に容器充填保存する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酵素触媒を容器に充填した後に凍結保存する際に、酵素触媒の温度を氷点以上２５℃以下にした後、容器に充填することを特徴とする酵素触媒の充填方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明で述べられている酵素触媒とは精製酵素、粗精製酵素、または酵素を含む微生物菌体、酵素または酵素を含む微生物の固定化物、酵素を含む微生物を含む培養液である。また、この酵素触媒を充填する前に熱処理した場合も本発明に含まれる。
ここで酵素としては、特に制限されるものではないが、例えばニトリルヒドラターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、トリプトファンシンターゼ等を挙げることができる。
さらに本発明の微生物は、目的とする酵素触媒を生産し菌体内に蓄積または菌体外に分泌する性質を有しており、この微生物には自然界より単離された微生物も遺伝子組換え微生物も含まれる。
【０００６】
本発明の微生物としては、例えばニトリルヒドラターゼを産生する微生物を挙げることができる。
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の具体例としては、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５、アクロモバクター・キセロシス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｅｒｏｓｉｓ）ＩＦＯ１２６６８等を挙げることができる。また該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も含まれる。ここでいう任意の宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の他、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、酵母や放線菌等が挙げられる。遺伝子組替え大腸菌の宿主としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  K―１２由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、同ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、同ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）、同ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）を挙げることができる。
【０００７】
また、組換えＤＮＡ技術を用いて該タンパク質の構成アミノ酸の1個または2個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、薬剤耐性、温度耐性等を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も本発明の微生物に含まれる。
本発明の微生物は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には３０〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させることにより得られる。
【０００８】
本発明による酵素または酵素を含む微生物の固定化物とは通常よく知られている、固定化酵素，固定化微生物の調整方法により調製される酵素または酵素を含む微生物の固定化物であり、その例としてはポリアクリルアミド、アルギン酸、κ―カラギーナンで固定化した酵素または酵素を含む微生物等が挙げられる。
【０００９】
本発明の充填方法は、酵素触媒を凍結保存用の容器に充填する際、酵素触媒の温度を氷点以上２５℃以下、望ましくは氷点以上２０℃以下、さらに望ましくは氷点以上１０℃以下、さらに望ましくは氷点以上５℃以下に酵素触媒温度にした後、容器に充填し凍結保存することにより、酵素触媒を安定的に容器充填保存することを特徴とする。
その容器の容量は特に問わないが、10Ｌ以上１０００Ｌ以下望ましくは20Ｌ以上１０００Ｌ以下、さらに望ましくは５0Ｌ以上１０００Ｌ以下であればより効果的である。また、その形状，材質は特に制限はない。
酵素触媒を凍結保存する温度は、氷点より低い温度であれば特に制限はない。
【００１０】
【実施例】
以下、実施例により本発明の充填方法を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
本実施例に使用する酵素触媒はニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株に導入され、三井化学株式会社が寄託しているＭＴ-１０８２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ―５７８５、特開平１１−２５３１６８参照）を用いた。
本菌株の培養は２ｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地５００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、上記菌株を一白金耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。また、この際、培養開始約１５時間後にＩＰＴＧを終濃度１００μmol/lになるよう添加し培養する。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、固形分率が約１５重量％となるよう湿菌体（以下菌体液）を得た。この一部をサンプリングし下記方法にて酵素活性測定した。その後、３０、２０，１０，５℃に菌体液を調製した後、１０Ｌのポリエチレン製の容器に９Ｌずつ充填し、‐２０℃の冷凍庫にて凍結させた。一週間後、各容器を１０℃の水に水浴させることにより溶解させ、各容器よりサンプリングその活性を測定した。次式、活性残存率（％）＝（凍結溶解後の活性／凍結前の活性）×１００にて活性残存率を求め，各充填温度での活性残存率を比較した。
【００１１】
0004053761.tif 000002
【００１２】
【表１】
0004053761.tif 000003
【００１３】
（酵素活性測定方法）
サンプリングした菌体液それぞれの、酵素活性を以下の手順で測定する。
各画分液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）により適当に希釈し、これに１重量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で１０分間反応させる。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をＨＰＬＣ分析により測定する。ＨＰＬＣカラムはＵＬＴＲＯＮ８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用する。アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出する。
【００１４】
【発明の効果】
本発明によれば、容器に有用物質の工業的生産に利用できるような酵素触媒を充填する際、充填温度を低温にした後に容器に充填し凍結保存することにより、酵素触媒を安定的に、即ち酵素の失活を抑制しつつ保存することが可能である。