(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の反応により得られる結果を蛍光物質の有無および/または種類により判定する装置であって、該反応に供する物質を担持している担体を光トラップにより捕捉した状態で、該反応に供する物質に所定の反応を行う装置において、
内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えた測定セルと、
前記測定セルの流路に、前記担体の懸濁液を搬送するための手段と、
前記担体を捕捉するための第一のレーザー光源と、
前記第一のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記担体を捕捉する第一の光学系と、
前記担体が担持する物質に所定の反応を行なわせるための反応液を、前記測定セルの流路に一定流速を維持して搬送するための手段と、
前記反応により得られる結果を判定するために、該結果を反映している蛍光物質を励起するための第二のレーザー光源と、
前記第二のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記蛍光物質を励起する第二の光学系と、
前記蛍光物質からの蛍光を集光する第三の光学系と、
集光した蛍光を検出する光検出器と、
前記光検出器が発生した識別信号から、前記反応の結果を解析する解析手段とを具備し、
前記測定セルの流路に、前記担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記担体が担持する物質に所定の反応を行なわせるための反応液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管、および搬送される液体に脈流を生じさせることなく液体の流れを制御する部材を具備する
ことを特徴とする判定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記測定セルの流路に、前記担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記担体が担持する物質に所定の反応を行なわせるための反応液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管を具備し、該配管が、測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐していることを特徴とする装置。
【請求項３】
塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸を付着させた担体を分析試料として用いる塩基配列決定装置であって、
内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えた測定セルと、
前記測定セルの流路に、分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段と、
前記核酸を付着させた担体を捕捉するための第一のレーザー光源と、
前記第一のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記核酸を付着させた担体を捕捉する第一の光学系と、
前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に一定流速を維持して搬送するための手段と、
前記酵素液により切断されたモノヌクレオチドの塩基を識別標識している蛍光物質を、切断順に励起するための第二のレーザー光源と、
前記第二のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記蛍光物質を切断順に励起する第二の光学系と、
前記核酸の塩基を識別標識している蛍光物質からの蛍光を、順次集光する第三の光学系と、
集光した蛍光を順次検出し、検出された蛍光に対応する識別信号を発生する光検出器と、
前記光検出器が発生した識別信号から、前記核酸の塩基配列を読み取る解析手段とを具備し、
前記測定セルの流路に、分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管、および搬送される液体に脈流を生じさせることなく液体の流れを制御する部材を具備する
ことを特徴とする塩基配列決定装置。
【請求項４】
請求項３に記載の装置であって、前記測定セルの流路に、分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管を具備し、該配管が、測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐していることを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の装置であって、
前記測定セルの流路内に照明光を照射するための光源と、
前記光源からの光を前記測定セルの流路内に照射し、前記担体に対して照明光を照射する光学系と、
前記照明光の下で、前記担体が、前記第一のレーザー光源により捕捉された画像を撮像するための光学系と、
前記担体が捕捉された画像を撮像する撮像手段とを更に具備することを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の塩基配列を読み取る塩基配列決定装置、および核酸の塩基配列を決定する方法に関する。より具体的に、本発明は、核酸を担持している担体をレーザー光により捕捉した状態で、核酸の塩基を末端から一つずつ切断する反応を行い、核酸の塩基を標識する蛍光物質の有無および/または種類により塩基配列を決定する装置および方法に関する。また、本発明の塩基配列決定装置は、反応に供する任意の物質を担持している担体をレーザー光により捕捉した状態で所定の反応を行い、該反応により得られる結果を蛍光物質の有無および/または種類により判定する装置として利用可能である。
【０００２】
【従来の技術】
従来よりＤＮＡやＲＮＡの核酸の塩基配列を決定する装置として、ゲル電気泳動装置、キャピラリー電気泳動装置などが知られている。ゲル電気泳動装置では、ゲルの泳動長を長くすれば原理的にいくらでも長い核酸の塩基配列を読み取ることができる。しかし、泳動長を長くすれば装置がそれだけ大掛かりになる、サンプルの準備に手間と時間がかかるなどの難点を有する。また、キャピラリー電気泳動装置は、一度に多量のサンプルを読み取ることができる点、また、サンプルの準備に手間があまりかからない点で優れているが、１回の測定で読み取ることができるのは600〜700塩基程度であり、長い核酸の塩基配列を読み取ることは難しい。
【０００３】
また、核酸の塩基配列決定は、従来ラジオアイソトープ(ＲＩ)、一般に32Ｐを用いて行われていた。ＲＩによる手法は、非常に高感度であるが、放射性廃棄物などの処理が面倒である上に、環境に対する配慮が必要になる。
【０００４】
一方、個々のＤＮＡや細胞などの内部構造を観察する方法として顕微分光測光法がある。この方法は、細胞に蛍光色素を加え、顕微鏡のプレパラート上で蛍光を観測して細胞組織の内部の状態や構造を測定するものである。この方法は、塩基配列を読み取ることを対象としていないし、読み取ることもできない。
【０００５】
また、流体中の生体細胞や微粒子の測定方法として、フローサイトメトリがよく用いられている。フローサイトメトリは、生物細胞やラテックス粒子などの微粒子を流体中で移送させながら、これらの対象物個々にレーザー光などの光を入射させる。次いで、複数の方向に置かれた受光器により、対象とする細胞や微粒子からの散乱光や蛍光を観測し、対象物の形状や内部構造などを測定する。この方法は、高速で流れる流体中で次々に、細胞や微粒子からの散乱光や蛍光を測定するが、微小な単一分子を検出することができず、塩基配列を読み取ることはできない。
【０００６】
９０年代に入り蛍光を用いた単一分子の検出・イメージングに関する研究が急増している。例えば、単一分子の検出法として、P.M.Goodwin et al., ACC.Chem.Res. 1996, 29, 607-613に記載される手法、および蛍光相関分光法（ＦＣＳ）などが挙げられる。蛍光相関分光法では、共焦点レーザー顕微鏡の視野の中で、蛍光標識したタンパク質や担体粒子を溶液中に浮遊させ、これらの微粒子のブラウン運動に基づく蛍光強度のゆらぎを解析する。これにより、対象とする微粒子などの数や大きさを計測することができる。この技術については、例えば、金城政孝「蛋白質 核酸 酵素」(1999) Vol.44, No.9, 1431-1437に詳しく論じられている。この方法では、微粒子の大きさや量についての情報しか得ることができない。
【０００７】
また、ＤＮＡが付着したラテックス粒子を流路内で光トラップにより捕捉し、付着したＤＮＡを伸長してその振る舞いや力を測定する試みも行われている（Steven B. Smith et al, Science (1996) Vol.271, 795-）。さらに、流路中に微粒子を搬送するシステムにおいて、レーザー光により個々の粒子を捕捉（トラップ）し、光照射のオン・オフによってトラップした微粒子の移動の動きを制御し、搬送される微粒子の移動の間隔を整える装置が提案されている（特開平5-296914）。このように微粒子を光トラップする方法では、レーザー光などにより微粒子を捕捉する手法については開示しているが、微粒子に付着させた蛍光物質を判別したり、蛍光物質の量を測定したりする方法については開示されていない。
【０００８】
また、新たな手法を用いて、塩基配列を決定する試みが行われている。すなわち、ＤＮＡの一方の鎖の末端からモノヌクレオチド（塩基）を１個ずつ切り離し、その順序を保持したままで基板の上に固定し、これを基板上で蛍光性誘導体に変換して、これをレーザー光で励起し、ビデオカメラで撮影して画像化する手法である。この技術については、石川満「蛋白質 核酸 酵素」(1999) Vol.44, No13, 2019-2023に詳しく述べられている。しかし、この手法は、基板上で各塩基を蛍光性誘導体に変換しなければならない。また、溶媒のない基板上で切り離された各塩基を順番を確実に保持しながら基板上に並ばせなくてはならず、基板の取扱いが大変難しい。
【０００９】
一般に、蛍光物質を用いて個々の所望の分子をラベルし、それを溶液中で検出・同定する場合、反応容器を用いて該容器内を洗浄液やサンプルを流す方法が使用される。しかし、反応容器内の流路を流れる蛍光標識分子の大きさは、流路の大きさ（管の内径もしくは幅）に比べて極端に小さく、これによる微弱な蛍光を個々毎に確実に同定・検出することは、これまで極めて困難であった。
【００１０】
一方、Kellerらにより、微小流路の中を流れる蛍光標識分子の蛍光を個々毎に検出し、これによりＤＮＡの塩基配列を決定する手法の原理が提案されている（Single-molecule fluoresence analysis in solution Appl.Spectroscopy, Vol.50, No.7, 1996, PP12A-32A）。この提案は、各塩基を蛍光色素で標識したＤＮＡをガラス微粒子に付着させたものをサンプルとして用い、このサンプルを微小流路の中を流しながら赤外レーザー光で捕捉し、この流路に分解酵素を流してＤＮＡの塩基を一つずつ切り離し、各塩基に付いた蛍光分子からの蛍光を検出する方法である。しかし、Kellerらは、着想のみにとどまり、実際にこの方法を具現化するために必要な構成については言及していない。
【００１１】
その後、Dorreらにより、Kellerらの提案を具体的にする試みが為されているが、その報告の中にも述べられているように、塩基配列を読み取るという最終目的を達成するに至っていない（Dorre K et al, Bioimaging 5, 139-152, 1997, Techniques for single molecule sequencing）。このようにこれまで、具体的にどのように微粒子を捕捉し、捕捉された微粒子を所定の位置に移動させ、蛍光を励起、測定するかについて報告されていない。また、どのような機構でサンプル溶液、分解酵素液、洗浄液などを搬入、搬出させるかについても、具体的に記載されたことがない。更に、どのように蛍光信号を処理し、塩基配列を読み取るかについても明確に記載されたことがない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、従来の電気泳動による分離操作を必要とする塩基配列決定法の問題点を改善した、新たな塩基配列決定法を具体的に実現する手段を提供することを目的とする。すなわち本発明は、無制限の長さの核酸を連続的かつ簡便に配列決定できる塩基配列決定装置および塩基配列決定方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、以下のように核酸の塩基配列を読み取る手段を提供する。まず、配列決定したい核酸分子の各塩基を蛍光物質で識別標識し、この核酸を担体に付着することにより分析試料を調製する。この分析試料を、測定セルの流路に導入し、レーザーにより担体を捕捉する。次いで、この状態で流路に分解酵素液を流し、核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する。切断されたモノヌクレオチドが、切断された順序を守って流路内を流れるような条件下で、モノヌクレオチドの塩基を標識している蛍光物質が発する蛍光を順次検出し、核酸の塩基配列を読み取る。
【００１４】
特に、サンプル溶液、酵素液、洗浄液などを迅速に測定セルの流路に搬送することができる手段であって、分解酵素により切断される核酸の塩基を、その切断順序を守って流路内を搬送させることができる手段について、本発明は提言している。
【００１５】
すなわち、本発明は以下に記載の手段により達成された。
【００１６】
（１）所定の反応により得られる結果を蛍光物質の有無および/または種類により判定する装置であって、該反応に供する物質を担持している担体を光トラップにより捕捉した状態で、該反応に供する物質に所定の反応を行う装置において、
内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えた測定セルと、
前記測定セルの流路に、前記担体の懸濁液を搬送するための手段と、
前記担体を捕捉するための第一のレーザー光源と、
前記第一のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記担体を捕捉する第一の光学系と、
前記担体が担持する物質に所定の反応を行なわせるための反応液を、前記測定セルの流路に一定流速を維持して搬送するための手段と、
前記反応により得られる結果を判定するために、該結果を反映している蛍光物質を励起するための第二のレーザー光源と、
前記第二のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記蛍光物質を励起する第二の光学系と、
前記蛍光物質からの蛍光を集光する第三の光学系と、
集光した蛍光を検出する光検出器と、
前記光検出器が発生した識別信号から、前記反応の結果を解析する解析手段とを具備することを特徴とする判定装置。
【００１７】
（２）（１）に記載の装置であって、前記測定セルの流路に、前記担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記担体が担持する物質に所定の反応を行なわせるための反応液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管、および搬送される液体に脈流を生じさせることなく液体の流れを制御する部材を具備することを特徴とする装置。
【００１８】
（３）（１）または（２）に記載の装置であって、前記測定セルの流路に、前記担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記担体が担持する物質に所定の反応を行なわせるための反応液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管を具備し、該配管が、測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐していることを特徴とする装置。
【００１９】
（４）塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸を付着させた担体を分析試料として用いる塩基配列決定装置であって、
内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えた測定セルと、
前記測定セルの流路に、分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段と、
前記核酸を付着させた担体を捕捉するための第一のレーザー光源と、
前記第一のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記核酸を付着させた担体を捕捉する第一の光学系と、
前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に一定流速を維持して搬送するための手段と、
前記酵素液により切断されたモノヌクレオチドの塩基を識別標識している蛍光物質を、切断順に励起するための第二のレーザー光源と、
前記第二のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記蛍光物質を切断順に励起する第二の光学系と、
前記核酸の塩基を識別標識している蛍光物質からの蛍光を、順次集光する第三の光学系と、
集光した蛍光を順次検出し、検出された蛍光に対応する識別信号を発生する光検出器と、
前記光検出器が発生した識別信号から、前記核酸の塩基配列を読み取る解析手段と
を具備することを特徴とする塩基配列決定装置。
【００２０】
（５）（４）に記載の装置であって、前記測定セルの流路に、分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管、および搬送される液体に脈流を生じさせることなく液体の流れを制御する部材を具備することを特徴とする装置。
【００２１】
（６）（４）または（５）に記載の装置であって、前記測定セルの流路に、分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段、および前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段が、何れも、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管を具備し、該配管が、測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐していることを特徴とする装置。
【００２２】
（７）（１）〜（６）の何れか１に記載の装置であって、
前記測定セルの流路内に照明光を照射するための光源と、
前記光源からの光を前記測定セルの流路内に照射し、前記担体に対して照明光を照射する光学系と、
前記照明光の下で、前記担体が、前記第一のレーザー光源により捕捉された画像を撮像するための光学系と、
前記担体が捕捉された画像を撮像する撮像手段と
を更に具備することを特徴とする装置。
【００２３】
（８）  分析試料として、塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸を付着させた担体を用い、測定セルとして、内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えたセルを用いた塩基配列決定方法であって、
分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を前記測定セルの流路に搬送する工程と、
前記核酸を付着させた担体を流路内でレーザートラップにより捕捉する工程と、
前記流路内に、核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を一定流速を維持して流す工程と、
前記酵素液により切断されたモノヌクレオチドの塩基を識別標識している蛍光物質を順に励起する工程と、
前記工程により励起された蛍光物質が放射する蛍光を順次検出し、検出された蛍光に対応する塩基配列を読み取る工程と
を具備することを特徴とする塩基配列決定方法。
【００２４】
（９）  前記核酸を付着させた担体がレーザートラップにより捕捉された画像を撮像する工程を更に具備することを特徴とする（８）に記載の塩基配列決定方法。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
＜分析試料＞
まず、本発明の塩基配列決定装置で塩基配列を読み取るために使用される分析試料について説明する。分析試料は、図１にその一例を示すとおり、「塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸を担体に付着させたもの」である。
【００２７】
本発明で使用される「担体」は、レーザー光により捕捉されるものであれば特に限定されない。担体としては、ガラス微粒子、ラテックス粒子、金コロイド粒子などの金属微粒子、磁気微粒子、あるいは生体細胞など、水不溶性の任意のものを使用することができる。また、レーザートラップされる担体粒子は、そのサイズが、一般には直径０.０１μｍ〜１０μｍ、好ましくは直径０.０５μｍ〜２μｍ、より好ましくは直径０.１μｍ〜１μｍのものが使用される。担体の一例として、直径１μｍのガラス微粒子を挙げることができる。直径１μｍのガラス微粒子として、より具体的には、Bangs Laboratories Inc社（米国）製のストレプトアビジンコートされたシリカビーズを使用することができる。
【００２８】
本発明において「蛍光物質」は、当該蛍光物質で標識されていることが検出可能なものであれば特に限定されない。例えば、ローダミングリーン（以下、ＲＧともいう）、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート（以下、ＴＭＲともいう）、Ｃｙ５（サイファイブ（登録商標）、アマシャム・ファルマシアバイオテック社）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アクリジンイエロー（Acridine Yellow）、テキサスレッド（Texas Red）を使用することができる。ただし、２種類以上の蛍光物質を利用して各塩基を識別標識する場合は、それぞれの蛍光物質が、その放射する波長の違いにより区別して検出される必要がある。
【００２９】
本発明において「塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸」は、具体例として、図１に示される一例、即ち４種類の塩基を４種類の蛍光物質で識別標識したＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない。すなわち、本発明において「核酸」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を指す。また、ここで「識別標識」とは、必ずしも４種類の塩基すべてを標識することを意図しておらず、蛍光標識されていない塩基の種類があってもよい。また、２種類もしくは３種類の異なる塩基種が、同一の蛍光物質で標識されていてもよい。
【００３０】
このような識別標識のバリエーションは、後述の具体的試料（図１６、１７、１９の試料）に例示される。例えば、１種類の蛍光物質を用いて核酸の４種類の塩基のうち１種類の塩基（例えばアデニン）のみを識別標識してもよい（図１６参照）。あるいは、放射波長の異なる２種類の蛍光物質を用いて、２種類の塩基をそれぞれ識別標識してもよい（図１７参照）。あるいは、放射波長の異なる２種類の蛍光物質を用いて、１種類の塩基を一方の蛍光物質で標識し、その他３種類の塩基を他方の蛍光物質で識別標識してもよい（図１９参照）。
【００３１】
「塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸」は、例えば、以下のとおり調製することができる。ここでは、２種類の蛍光物質を用いて核酸の塩基を識別標識した試料の調製例を述べる。
【００３２】
まず、担体に付着させる物質として、５’末端がビオチン標識され、各塩基が識別標識されたＤＮＡ１本鎖（もしくはＲＮＡ１本鎖）を調製する。すなわち、下記の反応溶液
｛50ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ8.5）、10ｍＭ KCl、15ｍＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、７ｍＭ ＭｇＳＯ4、0.005％ Triton X-100、10ｍＭ ２-Mercaptoethanol、１反応あたり１pmolのビオチン標識プライマー、各20μＭの蛍光標識した基質（例えば、ＲＧ−ｄＴＴＰ（代わりにＲＧ−ｄＵＴＰを使用してもよい）、ＲＧ−ｄＡＴＰ、ＴＭＲ−ｄＣＴＰ、ＴＭＲ−ｄＧＴＰ）｝
中に、ＤＮＡ１本鎖（鋳型となる鎖）、伸長酵素を加え、37℃で30分反応させて試料を調製する。この反応では、蛍光標識された４種類のモノヌクレオチドを基質として利用し、ＤＮＡ１本鎖（鋳型となる鎖）に相補的なＤＮＡ鎖（もしくは相補的なＲＮＡ鎖）の合成が起こる。ここで合成された相補的なＤＮＡ鎖（もしくは相補的なＲＮＡ鎖）が、実際の配列解析に使用される。以下、この相補的なＤＮＡ鎖（もしくは相補的なＲＮＡ鎖）を、試料ＤＮＡ（もしくは試料ＲＮＡ）と称し、試料として使用する。このようにして、５’末端がビオチン標識され、且つ各塩基が蛍光物質により識別標識された、所定の配列を有する試料ＤＮＡ（もしくは試料ＲＮＡ）が調製される。ただし、調製例で挙げた緩衝液の組成、反応温度等の条件は、この記載に限定されない。
【００３３】
次いで、調製された試料ＤＮＡ（もしくは試料ＲＮＡ）を、担体に付着させる反応を行なう。試料ＤＮＡ（もしくは試料ＲＮＡ）を担体に付着させる手段としては、図１に示されるアビジン・ビオチン反応によるものが挙げられる。しかし、このような付着機能を果たすものであればこれに限定されない。アビジン・ビオチン反応による付着は、上述のBangs Laboratories Inc社（米国）製のストレプトアビジンコートされたシリカビーズ（ガラス微粒子の表面にアビジンが固定化されたもの）を利用して、これに前述の試料ＤＮＡ（もしくは試料ＲＮＡ）を結合させることにより行われる。より詳細には、上記シリカビーズと上記試料ＤＮＡ（もしくは試料ＲＮＡ）とを、100 mM Tris-HCl（ｐＨ8.0）、1.0Ｍ LiCl、0.1％（v/v）Tween20の溶液に加え、室温で反応させて作製することができる。ただし緩衝液の組成、反応温度等の条件は、この記載に限定されない。このようにアビジンとビオチンの１対１の反応を利用して分析試料を作成すれば、担体１つに対して１本のＤＮＡ鎖（もしくはＲＮＡ鎖）を付着させることができる。
【００３４】
本発明の塩基配列決定装置に用いる、核酸の塩基を識別標識した分析試料は、このように公知の手法により調製することができる。分析試料の調製についてはZeno Foldes-Papp et al, Nucleosides & Nucleosides, 16(5&6), 781-787, 1997, Exonuclease degradation of DNA studied by fluorescence correlation spectroscopyの記載も参照されたい。
【００３５】
＜塩基配列決定装置＞
［第１の実施の形態］
以下、本発明の第１の実施の形態に係る塩基配列決定装置について、図２を参照して説明する。本実施の形態の装置には、１種類の蛍光物質を用いて核酸の塩基を識別標識した分析試料を使用する。
【００３６】
図２に示すように、本実施の形態の塩基配列決定装置は、下記の構成を具備する。
内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えた測定セル１；
前記測定セルの流路に、分析試料である核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段２；
前記核酸を付着させた担体を捕捉するための第一のレーザー光源３；
前記第一のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記核酸を付着させた担体を捕捉する第一の光学系４〜１０；
前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段２；
前記酵素液により切断されたモノヌクレオチドの塩基を識別標識している蛍光物質を、切断順に励起するための第二のレーザー光源１１；
前記第二のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記蛍光物質を切断順に励起する第二の光学系１２〜１４、および１０；
前記核酸の塩基を識別標識している蛍光物質からの蛍光を、順次集光する第三の光学系１０、１５〜１９；
集光した蛍光を順次検出し、検出された蛍光に対応する識別信号を発生する光検出器２０；
前記光検出器が発生した識別信号から、前記核酸の塩基配列を読み取る解析手段２１〜２３；
前記測定セルの流路内に照明光を照射するための光源２４；
前記光源からの光を前記測定セルの流路内に照射し、前記核酸を付着させた担体に対して照明光を照射する光学系２５、２６、１５、１０；
前記照明光の下で、分析試料である前記核酸を付着させた担体が、前記第一のレーザー光源により捕捉された画像を撮像するための光学系１０、１５、２７〜２９；
前記核酸を付着させた担体が捕捉された画像を撮像する撮像手段３０。
【００３７】
本発明の塩基配列決定装置は、共焦点レーザー顕微鏡を利用したものである。このように蛍光を検出するための光学系を共焦点光学系とすることにより、切断されたモノヌクレオチド一分子の塩基を順次解読することができる。
【００３８】
本発明の塩基配列決定装置は、核酸を担持させた担体をレーザー光により捕捉しながら、該核酸の塩基を末端から切断する反応を行い、該核酸の塩基配列を読み取るために使用することができる。このような使用に限定されず、本発明の塩基配列決定装置は、反応に供する物質を担持させた担体をレーザートラップにより捕捉し、所定の反応を行なわせ、該反応結果を得るために使用することもできる。所定の反応とは、該反応により得られる結果を蛍光物質の有無および/または種類により判定できるような任意の反応をいう。例えば、抗原を担持している担体に、蛍光標識された抗体を反応させることにより抗原抗体反応を行なってもよいし、１本鎖の核酸を担持している担体に、蛍光標識された１本鎖の核酸を反応させることにより、ハイブリダイゼーションの反応を行なってもよい。
【００３９】
以下、塩基配列決定装置の第一の実施の形態に係る各構成および動作について、先に挙げた構成の順に説明する。
【００４０】
≪測定セル≫
まず「内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えた測定セル１」について説明する。測定セルの一例を詳細に図３に示す。図３（ａ）は測定セルを示す斜視図、（ｂ）は（ａ）の測定セルを示す平面図、（ｃ）はＡ−Ａ線に沿う断面の一部を示す図である。
【００４１】
測定セル１は、まず、その内部に流路１ｃを備え、且つ光ビームを流路内へ透過させるための透明な面（１ｂの面）を備えている必要がある。この透明な面（１ｂの面）の側に対物レンズが配置されることになり、１ｂの側からレーザー光は入射する。
【００４２】
また測定セル１は、本発明の塩基配列決定装置に配置した際に、対物レンズの焦点が流路内に合わせられるような位置に流路を備えている必要がある。言い換えると、対物レンズの焦点が流路内に合わせられるように、光ビームを透過する表面部分１ｂの厚みを適宜設定する必要がある。更に、測定セル１において、流路内へと光ビームが導かれる際に光が透過する面は全て、光の屈折が起こらないように平坦である必要がある。
【００４３】
更に、本発明では、試料となる核酸の末端から順に切断されたモノヌクレオチドを、その順序を守って流路内を搬送することが必須であるため、流路の幅、深さを適切な微小サイズにする必要がある。
【００４４】
以上の要件をまとめると、測定セル１は、▲１▼流路へ入射する光、流路から出射する光が透過する面は全て透明であること、▲２▼流路へ入射する光、流路から出射する光が透過する面は均一の厚みを有する凹凸のない平板であること、▲３▼該平板は、対物レンズの焦点が流路内に合わせられる適切な厚みを有していること、▲４▼流路の幅、深さは微小であることが必要である。なお、本発明において、透明とは、入射する光に対してのことであり、ヒトの眼で見た透明とは必ずしも一致しない。
【００４５】
図３において測定セル１は、本体部分１ａとレーザー光が透過可能な透明な表面部分１ｂとから構成され、その間に流路１ｃが形成されている。なお、測定セルがこのような２つの部分から成る構成に限定されないことはいうまでもない。測定セル１のサイズとしては、特に限定されないが、おおよそ、流路の長さ方向１〜２５ｍｍ、流路の幅方向５〜１５ｍｍ、流路の深さ方向(厚み)０．３〜１ｍｍとすることができる。例えば、測定セル１のサイズは、流路の長さ方向約１０ｍｍ、流路の幅方向約５ｍｍ、流路の深さ方向(厚み)約１ｍｍとすることができる。
【００４６】
図３において本体部分１ａは、シリコンウエハから成り、この本体部分にエッチングなどにより流路１ｃ（溝）が形成されている。本体部分１ａの厚みは、好ましくは、０．２〜１ｍｍである。流路の幅は、好ましくは５〜１００μｍ、より好ましくは１０〜５０μｍ、流路の深さは、好ましくは５〜１００μｍ、より好ましくは１０〜５０μｍであり、例えば、流路の幅約５０μｍ、流路の深さ約５０μｍとすることができる。流路の長さは、好ましくは１〜２５ｍｍであり、例えば、約１０ｍｍとすることができる。なお、図３において、流路の両端部分は、シリコンウエハに貫通穴が設けてあり、この穴には、接続端子１ｄを介して溶液搬入・搬出用のチューブが接続されることになる。
【００４７】
図３において表面部分１ｂは、ガラスより成る透明の平板（ガラスカバー）となっている。表面部分１ｂは、上述のとおり、流路へ入射する光および流路から出射する光が透過するため、透明であること、および凹凸のない同一の厚みを有する平板であることが必要である。また、上述のとおり、表面部分１ｂの厚みは、対物レンズの焦点位置に影響を及ぼすため、０．１３〜０．２１ｍｍのものが好ましく、０．１６９〜０．１７１ｍｍのものがより好ましい。表面部分１ｂは、本体部分（シリコン部分）１ａと陽極接合などの方法で接合される。
【００４８】
また、測定セル１は、上述の流路を備えたセルに限定されず、ガラスキャピラリーのような微小な中空円筒状の測定セル、あるいは薄いシート状の測定セルを使用することもできる。
【００４９】
図３において、流路１ｃは一本の直線状の溝であり、この場合、先に流した溶液と異なる溶液を流す際には、一旦流路を緩衝液等で洗浄する必要がある。流路を適宜分岐させて増やすことにより、このような洗浄操作を効率よく行うこともできる。例えば、流路を分岐させて、Ｙ字型の流路を作製してもよい。
【００５０】
また、測定セルは、図４（測定セルの平面図）に示すような形状の流路、すなわち直線状であるが、流路の中央部において流路の幅および深さが共に狭小になっている形状の流路を有してもよい。この流路の狭小になっている部分に、担体捕捉用レーザーおよび励起用レーザーを照射する。狭小になっている部分の幅（図中Ｗ2で示す）および深さは、好ましくは５〜５０μｍである。狭小になっている流路部分の長さ（図中Ｌで示す）は、好ましくは１〜１０ｍｍである。また、流路の狭小でない部分の幅（図中Ｗ1で示す）および深さは、５〜２００μｍである。このように、流路の中央部においてのみ流路の幅および深さを狭くすることにより、溶液の搬送が困難な狭小な範囲を、最小限にすることができる。
【００５１】
≪溶液搬入・搬出機構≫
次に、「前記測定セルの流路に、分析試料である核酸を付着させた担体の懸濁液を搬送するための手段２」について説明する。該手段は、溶液搬入・搬出機構ともいい、その概略を図５に示す。
【００５２】
本発明においてこのような溶液搬入・搬出機構を設けた理由は、Dorreらの提案する電気浸透流（electro-osmotic flow：EOF）で溶液を搬送することに、以下の問題点を見出したからである。すなわち、電気浸透流で溶液を搬送する場合、高い電圧をかける必要がある。そのため、電気浸透流により長時間稼動したり、流速を高めたりすると、流路内に熱が発生し、特に酵素などのタンパク質の活性が低下したり、気泡が発生したりする恐れがある。従って、流路の周辺を冷やす等の対策が必要になる。特に反応部の流路が狭小であるほど、熱および気泡が発生し易くなる。
【００５３】
また、本発明のように溶液搬入・搬出機構を設け、重力またはポンプ駆動で溶液を搬送した場合、流路内の液体の流れは「層流」となり、流路の中心付近で最も流れが速く、流路の周辺にいくに従って流れが遅くなる流速分布を示す。しかし、電気浸透流では、流路内の液体は「プラグフロー」と呼ばれる流れになり、搬送される分子（モノヌクレオチド）の流れが、流路の中心部分に集中しないで、流路内の液体の流れの水平方向などにも分散してしまう可能性がある。このように、流路の周辺部分にモノヌクレオチドが分散すると、流路の中を流れてくるモノヌクレオチドの塩基を、共焦点領域で識別することが難しくなる。よって、このような問題点を考慮し、本発明では、以下で説明するような溶液搬入・搬出機構を設けることにした。
【００５４】
本発明において使用されるサンプル液（担体の懸濁液）は、担体が所定の濃度で懸濁されているものが好ましい。すなわち、サンプル液は、レーザートラップにより一つの担体が捕捉され易い適切な濃度に設定される。担体濃度が高すぎると、捕捉した担体の背後にもう一つの担体を捉えたり、一旦捕捉された担体が、後から流れてきた他の担体によりはじき飛ばされたりする可能性が高くなる。一方、担体濃度が低すぎると捕捉する可能性が低くなる。従って、0.01〜0.3重量％の担体を含む懸濁液が一般に使用される。例えば、ガラス微粒子がリン酸緩衝液に０.１重量％の濃度で懸濁されているものを使用することができる。
【００５５】
図５が示す溶液搬入・搬出機構において、測定セル１は、ホルダー１ｅに収容されている。測定セル１は、上述のとおりそのサイズが小さいため、ホルダー内に収容して取り扱う方が簡便である。このホルダー１ｅの両端に取り付けられた接合端子１ｄのそれぞれに、搬入用タンク２ａおよび搬出用タンク２ｃが、それぞれ搬入用チューブ２ｂおよび搬出用チューブ２ｄを介して接続されている。搬入用タンク２ａには、流路に搬送するための溶液が満たされている。溶液としては、サンプル液（担体懸濁液）、流路内洗浄液（緩衝液）、分解酵素液を含む緩衝液などが使用される。チューブ２ｂ、２ｄは、例えばテフロン材質のものを使用することができる。
【００５６】
搬入用タンク２ａから流路へのサンプル液等の搬入、搬出用タンク２ｃへの搬出に関しては、両タンクの上下の高さ位置を移動させることにより行うことができる。両タンクの高さ位置の制御により、溶液の流路への流量、流速を制御することができる。あるいは、ガス圧を用いてシリンジなどを直接駆動し、吸引、排出を行うことで、溶液の搬入、搬出を行うこともできる。この場合、ガス圧の制御により、溶液の流路への流量、流速を制御することができる。また、モーター駆動ポンプにより溶液の搬入、搬出を行うこともできる。
【００５７】
溶液の流路への流量および流速は、以下の点に注意して制御される必要がある。すなわち、本発明において流速が速すぎた場合、レーザートラップにより捕捉されている担体が逃げてしまうため、トラップされた状態から担体が逃げない程度の流速が上限となる。このように流速の上限は、担体をレーザートラップしている力（レーザー光の出力）との関係で設定される。また、流速が遅すぎた場合、切断されたモノヌクレオチドがブラウン運動により任意の方向に移動し、切断された順序にモノヌクレオチドが並ばなくなる可能性があるため、少なくともモノヌクレオチド分子のブラウン運動を制する程度の流速が必要となる。一般に、流速は０.５ｍｍ/ｓ〜１０ｍｍ/ｓに設定される。例えば、流速は１ｍｍ/ｓに設定される。
【００５８】
本発明において、塩基配列決定装置の構成を具現化するにあたり、溶液搬入・搬出機構に着目した。というのは、本発明の塩基配列決定装置の構成を具現化する際に、以下の問題を新たに見出したからである。すなわち、レーザーにより捕捉された状態（トラップ状態）にある担体が、液体の流速の急激な変化（脈流）により、トラップ状態を解除されてしまうという問題、並びに、分解酵素により切断されたモノヌクレオチドが、液体の流速の急激な変化により、その切断順序を守って流路内を搬送されなくなるという問題を見出した。なお、本発明の目的とする塩基配列の正確な読み取りのためには、核酸の末端から順に切断されたモノヌクレオチドを、その順序を守って測定セルの流路内を搬送することは最重要課題となる。よって、これらの問題を解決するため、測定セルの流路の幅、深さを微小にすることに加えて、流路内における溶液の搬送は、一定の流速を保持している必要があることに本発明者らは着目した。しかし、一般に流路の幅、深さ（内径）が、１ｍｍ以下になると、溶液の搬送は困難になる。よって、本発明者らは、このような微小な流路内にスムーズに溶液を搬送することができ、且つ一定の流速を保つことができる溶液搬入・搬出機構を構築する必要があるという考えに至った。
【００５９】
このような要件を満たす溶液搬入・搬出機構の一例として、図６および図７に具体的な構成を挙げる。すなわち、本発明において溶液搬入・搬出機構は、好ましくは、下記の二つの特徴を有する。
【００６０】
第一に、この機構は、微小な流路にスムーズに溶液を搬送するために、測定セルの流路へ各溶液を搬送するための配管を具備し、該配管が、測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐していることを特徴とする。本明細書において「配管」は、溶液を測定セルの流路へ導くための流路、および測定セルの流路から廃液として排出するための流路を形成する全ての管を意味する。
【００６１】
ここで測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐している前記配管は、微小な測定セルの流路に溶液を搬送することが困難であることを解決するために設けられたものであり、測定セルの流路への溶液の搬送を補助する意味を有する。廃液方向へ向かう配管は、測定セルの流路入口近くまで搬送された溶液を、一時的に廃液の方向に逃がすために機能する。一旦、廃液の方向に溶液を流し、その後、溶液の流れる流路を切り替えて測定セルの流路に溶液を導くことにより、測定セルの流路入口近くまでは、速やかに溶液を搬送することができる。なお、この廃液方向へ向かう配管は、配管内の空気を逃がすためにも機能し得る。
【００６２】
ここで流路入口近くとは、測定セルの流路への溶液の搬送を補助するという意味において、できるだけ測定セルの流路入口に近い方が好ましい。具体的には、測定セルの流路と「配管」とを連結する接続部分（例えば接続端子）から約１０ｍｍ以内のところに配管の分岐点が位置していることが好ましい。
【００６３】
第二に、溶液搬入・搬出機構は、流路を流れる溶液が一定の流速を保つために、搬送される液体に脈流を生じさせることなく、配管内を流れる液体の流れを制御する部材を具備することを特徴とする。「液体の流れを制御する部材」は、液体を流したり、その流れを止めたり、あるいは分岐した配管内を流れる液体の流路を切り替えたりたりして、液体の流れを制御することができる任意の部材である。一般に該部材としてバルブを使用することができる。
【００６４】
本発明において、流路内で一定流速の溶液の流れを維持するために（すなわち、溶液に脈流を生じさせることなく）、「液体の流れを制御する部材（バルブ）」について下記のとおり検討した。例えば、一般に使用されるソレノイドバルブは、入手しやすく、その動作をコンピュータにより容易に制御できる点で優れている。しかし、このソレノイドバルブを本発明における溶液搬入・搬出機構に使用すると、液体の流れを制御する動作を行った際に急激な体積変化を起こし、これにより、一定流速を保って流路に溶液を搬送することができない。よって、本発明では、分岐している配管において液体の流れる方向を切り替えたり等の、液体の流れを制御する動作を行った際に急激な体積変化を起こさないバルブを使用することが適切であることを見出した。即ち、液体の流れを制御する動作を行った際に、液体の流量を徐々に変化させるバルブ、例えば回転によって溶液の流れを制御するバルブ（具体的には擦り合わせバルブが好ましい）を使用することが適切であることを見出した。ただし、本発明において使用するバルブは、液体の流れを制御する動作を行った際に液体に脈流を生じさせることなく、一定流速の溶液の流れを維持することが可能なものであれば特に限定されない。すなわち、一定流速の溶液を流れを維持することにより、試料ＤＮＡ（もしくは試料ＲＮＡ）の末端から順に切断されたモノヌクレオチドが、その順序を守って流路内を搬送され得るものであれば、限定されない。
【００６５】
このような特徴を有する溶液搬入・搬出機構は、その一例を図６および図７に示すように、分岐した配管、バルブ、Ｔ型継ぎ手を具備し、これにより各溶液を効率よくスムーズに微小流路に搬入、搬出できるものである。更にこの機構は、溶液の搬送時に急激な体積変化を生じさせない（即ち、液体の脈流を引き起こさない）特定のバルブを使用することにより、一定の流速を維持することができるものである。
【００６６】
なお、本明細書において説明する溶液搬入・搬出機構は、任意の液体を、微小流路を備えたセルに搬入する際に利用できるものである。
【００６７】
以下、溶液搬入・搬出機構の具体的な例について図６を参照して詳細に説明する。ただし、本発明における溶液搬入・搬出機構は、一定流速を維持して微小な流路に溶液を搬送することができるものであれば、図６に示す例に限定されないことはいうまでもない。
【００６８】
図６に示す溶液搬入・搬出機構は、分解酵素導入シリンジ４４、サンプル導入シリンジ４５、緩衝液タンク（Buffer tank）４６、４７、バルブ１〜９、Ｔ型継ぎ手４８、４９、陰圧ポンプ５２、廃液タンク（Waste tank）５３、およびこれらを結ぶ配管より構成されている。
【００６９】
なお、図６において、溶液搬入・搬出機構の配管は、測定セル１の流路と、接続端子５０および５１を介して接続されている。このように、測定セルは、その流路の幅が非常に狭いため、サンプル液を流した後の洗浄に時間を要することを考慮し、接続端子５０および５１を介して交換可能な状態に設置しておくことが望ましい。以降の説明において、接続端子を境にして、測定セル内の流路と測定セル外の流路を、それぞれ「測定セルの流路」、「配管の流路」と区別して呼ぶ。配管は、例えばテフロンより構成されている。
【００７０】
図６に示す溶液搬入・搬出機構の各構成部分について説明する。
【００７１】
｛シリンジおよび緩衝液タンク｝
分解酵素導入シリンジ４４およびサンプル導入シリンジ４５から、それぞれ分解酵素液およびサンプル液が「配管の流路」に注入される。分解酵素導入シリンジ４４およびサンプル導入シリンジ４５には、分解酵素液およびサンプル液を希釈したり、溶液が流れる流路を洗浄したりするための緩衝液タンク４６および４７がそれぞれ設置されている。
【００７２】
なお、図６において、分解酵素液は、測定セルの流路内を左から右（バルブ４からバルブ２の方向）に搬送され、サンプル液は、測定セルの流路内を右から左（バルブ２からバルブ４の方向）に搬送される。図６に示す例に限定されず、分解酵素液、サンプル液をともに、測定セルの流路内を同一方向に向かって流れるように、各シリンジと緩衝液タンクを設置してもよい。ただし、分解酵素液が測定セルの流路内を流れる際には、その上流に、担体捕捉用レーザー（図中、Trap laser）が照射されており、それより下流に励起用レーザー（図中、Excitation laser）が照射されている必要がある。すなわち、まず流路の上流で、担体捕捉用レーザーに捕捉された担体（核酸を担持している）に分解酵素液が作用し、次いでこの作用により切断された標識ヌクレオチドが、流路の下流で励起用レーザーで励起される必要がある。
【００７３】
｛バルブおよびＴ型継ぎ手｝
溶液搬入・搬出機構の配管において、液体の流れる流路を塞いだり開放したり、あるいは分岐した配管において液体の流れる方向を選択したり等、溶液の流れを制御するために、バルブが設置されている。図６においてバルブ１〜９は、２方弁もしくは３方弁であり、図中、バルブに表示されているＮＯはNormal Open（通常開放）、ＮＣはNormal Close（通常遮断）、ＣＯＭはCommon（共通）を意味する。上述のとおり、好ましくは、バルブは脈流を起こさないものを使用する。
【００７４】
一方、Ｔ型継ぎ手は、一般に分岐した配管を形成するために使用される。図６においてＴ型継ぎ手４８、４９は、測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐した配管を形成するために機能する。すなわち、Ｔ型継ぎ手４８、４９を測定セルの流路のごく近くに設置して配管を分岐させて、測定セルの流路入口近くまで搬送された溶液を一時的に廃液タンクに逃がすことにより、測定セルの流路内に搬送したい溶液を、流路の入口近くまで迅速に導くことができる。これにより、溶液の搬送が困難である測定セルの流路への溶液の搬送を補助することができる。例えば、Ｔ型継ぎ手４８は、接続端子５０のできるだけ近くに位置させることが好ましく、例えば接続端子５０から約２０ｍｍ離れた位置に位置させることができる。同様に、Ｔ型継ぎ手４９は、接続端子５１のできるだけ近くに位置させることが好ましく、例えば接続端子５１から約２０ｍｍ離れた位置に位置させることができる。
【００７５】
ここで、「配管の流路」の内径はすべて、測定セルの流路幅（例えば５０μｍ）よりある程度広い幅を有していることが好ましい。このように、溶液の搬送をスムーズに行なうために、測定セルの流路幅よりも配管の流路幅を広くすることが好ましく、例えば流路幅を５０〜８００μｍ、好ましくは約２５０μｍとすることができる。一方、測定セルの流路の幅、深さは、本発明の塩基配列決定の目的に適うように、上述のとおり、例えば５０μｍと微小にする必要がある。
【００７６】
更に、図６に示す溶液搬入・搬出機構は、バルブ４およびバルブ２が設置されている箇所それぞれにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに配管は分岐している。バルブ４およびバルブ２の設置箇所においても、配管を分岐させ、溶液を一時的に廃液タンクに逃がすことにより、測定セルの流路内に搬送したい溶液を、該バルブまで迅速に導くことができる。これにより、測定セルの流路への溶液の搬送を補助することができる。
【００７７】
例えばバルブ４は、接続端子５０から約２００ｍｍ離れた位置に位置させ、バルブ２は、接続端子５１から約２００ｍｍ離れた位置に位置させることができる。なお、後述の図７のように、バルブ４８から廃液タンクに溶液を搬送する配管とバルブ４から廃液タンクに溶液を搬送する配管は、１本の配管で兼任させることもできる。同様に、バルブ４９から廃液タンクに溶液を搬送する配管とバルブ２から廃液タンクに溶液を搬送する配管も、１本の配管で兼任させることができる。
【００７８】
｛陰圧ポンプ｝
陰圧ポンプ５２は、吸引により溶液を廃液タンク５３に導くために機能する。ただし、陰圧ポンプを使用しないで、重力によって溶液を廃液タンクに導くこともできる。陰圧ポンプを使用した方が、微小な流路内を効率よく溶液を搬送できるが、ポンプの振動の影響を避けたい場合には、ポンプを使用せず重力によって溶液を搬送する。本発明では、測定セルの流路内にて担体がレーザーにより捕捉されたら、その後の操作は全て、振動を避けるためポンプを使用しない方が望ましい。
【００７９】
次に、溶液搬入・搬出機構により、各溶液（サンプル液、分解酵素液、緩衝液）を測定セルの流路内に搬入する動作について説明する。
【００８０】
各溶液は、好ましくは、流路に搬入する前に脱気処理しておく。
【００８１】
まず、測定セルの流路内にサンプル液を搬送し、次いで測定セルの流路内にて、サンプル液中に含有される担体を、担体捕捉用レーザー（Trap laser）により捕捉する。捕捉された担体以外の担体を、測定セルの流路内から押し流し、洗浄しておく。次いで、測定セルの流路内に分解酵素液を搬送し、担体が担持する核酸のモノヌクレオチドを末端から順に切断する。モノヌクレオチドを標識している蛍光物質を、励起用レーザー（Excitation laser）により励起し、蛍光物質の種類（即ち、塩基の種類）を読み取る。測定を終えたサンプル液等は、緩衝液を流すことにより廃液タンク５３へ搬出する。
【００８２】
以下、詳細に説明する。
【００８３】
Ａ）緩衝液の搬送
(Ａ−１)  バルブ８を開き、バルブ１をＮＣ側（ＣＯＭとＮＣが繋がる）にし、バルブ２をＮＯ側（ＣＯＭとＮＯが繋がる）にする。緩衝液タンク４７を上方へ押し上げ、重力により緩衝液を廃液タンクに導く。
【００８４】
(Ａ−２)  バルブ２をＮＣ側にし、バルブ５をＮＯ側にし、緩衝液タンク４７を上方へ押し上げることにより、緩衝液をＴ型継ぎ手４９を経由して廃液タンクに導く。このとき、バルブ５をＮＣ側にし、バルブ７をＮＣ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ５をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いても何れでもよい。(Ａ−１)、(Ａ−２)の操作により、Ｔ型継ぎ手４９まで溶液を迅速に導くことができる。
【００８５】
(Ａ−３)  バルブ５を閉じ、バルブ６を開放し、緩衝液タンク４７を上方へ押し上げることにより、測定セルの流路内に緩衝液を搬送する。測定セルの流路を流れた緩衝液は、開放されたバルブ６を通って廃液タンクに導かれる。このとき、バルブ６をＮＣ側にし、バルブ７をＮＯ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ６をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いても何れでもよい。
【００８６】
(Ａ−４)  バルブ９を開き、バルブ３をＮＣ側にし、バルブ４をＮＣ側にする。バルブ６をＮＯ側にし、緩衝液タンク４６を上方へ押し上げ、重力により緩衝液を廃液タンクに導く。このとき、バルブ６をＮＣ側にし、バルブ７をＮＯ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ６をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いても何れでもよい。
【００８７】
(Ａ−５)  バルブ４をＮＯ側にし、緩衝液タンク４６を上方へ押し上げ、重力により緩衝液を廃液タンクに導く。上記(Ａ−１)〜(Ａ−５)の操作により、すべての配管内が緩衝液で満たされる。
【００８８】
Ｂ）試料の投入
バルブ１をＮＯ側にし、バルブ２をＮＣ側にし、バルブ５を閉じる。バルブ６を開放し、シリンジ４５のピストンを押し込むことにより、サンプル液（例えばガラスビーズ懸濁液、粒子直径１μｍ、濃度0.1重量％）を測定セルの流路に導く。測定セルの流路を通ったサンプル液は、バルブ６をＮＣ側にし、バルブ７をＮＯ側にし、陰圧ポンプで吸引することにより廃液タンクに導く。なお、重力によりサンプル液を廃液タンクに導いてもよい。
【００８９】
Ｃ）捕捉された担体以外の担体の洗浄（Ｂ/Ｆ分離）
担体捕捉用レーザーにより担体を捕捉した後、バルブ１をＮＣ側にし、緩衝液タンク４７を上方へ押し上げ、緩衝液を測定セルの流路に導き、流路内の捕捉されなかった担体を洗い流す。このとき、バルブ６をＮＣ側にし、バルブ７をＮＯ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ６をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いてもよい。ただしポンプの使用は、その振動により、捕捉されている担体が、押し流されてしまう可能性があるため望ましくない。この操作により、レーザー光により捕捉された担体以外の担体は洗い流され、測定セルの流路内は洗浄される。
【００９０】
Ｄ）分解酵素液の搬送
バルブ９を閉じ、バルブ３をＮＯ側にし、バルブ４をＮＣ側にし、バルブ６を閉じる。バルブ５を開放し、シリンジ４４のピストンを押し込むことにより、分解酵素液を測定セルの流路に導く。測定セルの流路を通過した分解酵素液は、バルブ５をＮＣ側にし、バルブ７をＮＣ側にし、陰圧ポンプで吸引することにより廃液タンクに導いてもよいし、重力により廃液タンクに導いてもよい。ただしこの操作においても、ポンプの振動により、捕捉されている担体が押し流されてしまう可能性があるため、ポンプの使用は望ましくない。
【００９１】
Ｅ）流路の洗浄
分解酵素による核酸の各塩基の切断後、バルブ９を開き、バルブ３をＮＣ側にし、バルブ４をＮＣ側にし、バルブ６を閉じて、緩衝液タンク４６を上方へ押し上げ、緩衝液を測定セルの流路に導く。この操作により流路の洗浄を行なう。この洗浄操作は、バルブ５をＮＣ側にし、バルブ７をＮＣ側にして陰圧ポンプで吸引することにより効率よく行なうことができる。
【００９２】
次いで、溶液搬入・搬出機構の別の例について図７を参照して説明する。この具体例は、基本的には、図６に示す例と同じであり、同一の構成要素には同じ符号を付している。図７に示す溶液搬入・搬出機構は、分解酵素導入シリンジ４４、サンプル導入シリンジ４５、緩衝液タンク（Buffer tank）４６、４７、バルブ２１〜２５、Ｔ型継ぎ手４８、４９、５４、５５、陰圧ポンプ５２、廃液タンク（Waste tank）５３、およびこれらを結ぶ配管より構成されている。
【００９３】
図７に示す溶液搬入・搬出機構は、図６に示す例と同じく、分岐した配管、バルブ、Ｔ型継ぎ手を具備し、これにより各溶液を効率よくスムーズに微小流路に搬入、搬出できるものである。また同様に、この機構は、溶液の搬送時に急激な体積変化を生じさせない（即ち、液体の脈流を引き起こさない）特定のバルブを使用することにより、一定の流速を維持することができるものである。
【００９４】
また、図６に示す例と同様、Ｔ型継ぎ手４８、４９は、測定セルの流路入口近くにおいて、測定セルの流路へ向かう方向と廃液へ向かう方向とに分岐した配管を形成するために機能している。この分岐した配管を利用して、溶液を一時的に廃液タンクに逃がすことにより、測定セルの流路内に搬送したい溶液を、測定セルの流路入口近くまで迅速に導くことができる。これにより、溶液の搬送が困難である測定セルの流路への溶液の搬送を補助することができる。例えば、Ｔ型継ぎ手４８は接続端子５０から約２０ｍｍ離れた位置に位置させ、Ｔ型継ぎ手４９は接続端子５１から約２０ｍｍ離れた位置に位置させることができる。
【００９５】
また、図６に示す例と同様、測定セル外の配管の流路幅を、測定セル内の流路幅（例えば５０μｍ）より広くしておくことは、溶液をスムーズに搬送する上で好ましい。
【００９６】
以下に、図７に示す溶液搬入・搬出機構の動作について説明する。
【００９７】
Ａ）緩衝液の搬送
サンプル投入前に、下記の操作により、全ての流路内を緩衝液で満たしておく。
【００９８】
(Ａ−１)  バルブ２１を開き、バルブ２３をＮＯ側にする。緩衝液タンク４７を上方へ押し上げ、重力により緩衝液を廃液タンクに導く。このとき、バルブ２３をＮＣ側にし、バルブ２５をＮＣ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ２３をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いても何れでもよい。この操作により、Ｔ型継ぎ手４９まで溶液を迅速に導くことができる。
【００９９】
(Ａ−２)  バルブ２３を閉じ、バルブ２４をＮＣ側もしくはＮＯ側にし、緩衝液タンク４７を上方へ押し上げることにより、測定セルの流路内に緩衝液を搬送する。測定セルの流路を流れた緩衝液は、バルブ２４を通って廃液タンクに導かれる。このとき、バルブ２４をＮＣ側にし、バルブ２５をＮＯ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ２５をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いても何れでもよい。
【０１００】
(Ａ−３)  バルブ２２を開き、バルブ２４をＮＣ側もしくはＮＯ側にし、緩衝液タンク４６を上方へ押し上げ、重力により緩衝液を廃液タンクの方向に導く。このとき、バルブ２４をＮＣ側にし、バルブ２５をＮＯ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ２４をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いても何れでもよい。上記(Ａ−１)〜(Ａ−３)の操作により、すべての流路内が緩衝液で満たされる。
【０１０１】
Ｂ）試料の投入
バルブ２１を閉じ、バルブ２３を閉じ、バルブ２４を開放し、シリンジ４５のピストンを押し込むことにより、サンプル液（例えばガラスビーズ懸濁液、粒子直径１μｍ、濃度0.1重量％）を測定セルの流路に導く。測定セルの流路を通ったサンプル液は、バルブ２４をＮＣ側にし、バルブ２５をＮＯ側にし、陰圧ポンプで吸引することにより廃液タンクに導く。なお、重力によりサンプル液を廃液タンクに導いてもよい。
【０１０２】
Ｃ）捕捉された担体以外の担体の洗浄（Ｂ/Ｆ分離）
レーザー光により担体を捕捉した後、バルブ２１を開き、緩衝液タンク４７を上方へ押し上げ、緩衝液を測定セルの流路に導き、流路内の捕捉されなかった担体を洗い流す。このとき、バルブ２４をＮＣ側にし、バルブ２５をＮＯ側にして陰圧ポンプにより吸引してもよいし、バルブ２４をＮＯ側にして重力により廃液タンクに導いてもよい。ただしポンプの使用は、その振動により、捕捉されている担体が、押し流されてしまう可能性があるため望ましくない。この操作により、レーザー光により捕捉された担体以外の担体は洗い流され、測定セルの流路内は洗浄される。
【０１０３】
Ｄ）分解酵素液の搬送
バルブ２２を閉じ、バルブ２４を閉じ、バルブ２３を開放し、シリンジ４４のピストンを押し込むことにより、分解酵素液を測定セルの流路に導く。測定セルの流路を通過した分解酵素液は、バルブ２３をＮＣ側にし、バルブ２５をＮＣ側にし、陰圧ポンプで吸引することにより廃液タンクに導いてもよいし、重力により廃液タンクに導いてもよい。ただしこの操作においても、ポンプの振動により、捕捉されている担体が押し流されてしまう可能性があるため、ポンプの使用は望ましくない。
【０１０４】
Ｅ）流路の洗浄
分解酵素による核酸の各塩基の切断後、バルブ２２を開き、バルブ２４を閉じて、緩衝液タンク４６を上方へ押し上げ、緩衝液を測定セルの流路に導き、流路の洗浄を行なう。このとき、バルブ２３をＮＣ側にし、バルブ２５をＮＣ側にして陰圧ポンプで吸引することにより効率よく流路の洗浄を行なうことができる。
【０１０５】
≪担体捕捉用レーザー光源≫
次に、「前記核酸を付着させた担体を捕捉するための第一のレーザー光源３」について説明する。第一のレーザー光源から出射されるレーザー（以下、担体捕捉用レーザーともいう）は、捕捉したい担体のサイズに応じて、その種類および照射波長について適宜選択することができる。あるいは、担体捕捉用レーザーを選択した後に、そのレーザーにより捕捉される担体のサイズを選択してもよい。
【０１０６】
本発明において使用されるレーザーは、レーザートラップで慣用的に使用されるものであれば限定されず、一般に４８８ｎｍ（アルゴンレーザー）〜１０６４ｎｍ（Ｎｄ：ＹＡＧレーザー）のレーザーを使用することができる。例えば、波長８５５ｎｍのＣｒ．ＬｉＳＡＦレーザーを使用することができる。あるいは、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーなどの赤外の固体レーザーや色素レーザーなどを用いてもよい。好ましくは、波長７００ｎｍ以上の赤外域のレーザーを使用する。例えば、直径１μｍのガラス微粒子をレーザートラップにより捕捉するためには、８５５ｎｍの出力３００ｍＷのＣｒ．ＬｉＳＡＦレーザーを使用することができる。
【０１０７】
なお、レーザーの波長と捕捉される粒子サイズとの関係については、詳しくは、W.H.Wright, G.J.Sonek, and M.W. Berns, Appl.Phys. Lett., Vol.63 (6), 1993, Radiation trapping forces on microspheres with optical tweezersの記載を参照されたい。
【０１０８】
担体捕捉用レーザーの出力は、高ければそれだけ担体を捕捉する力が強くなり望ましいが、装置（対物レンズ）や分析試料、並びに核酸を構成する塩基を末端から切断する分解酵素に損傷を与えるという弊害がある。よって、出力はこのような弊害をもたらさない程度に高く（好ましくは２Ｗ以下に）設定される。一般に担体を捕捉するために100〜1000ｍＷのレーザー出力を使用する。
【０１０９】
≪第一の光学系≫
次いで、「前記第一のレーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記核酸を付着させた担体を捕捉する第一の光学系４〜１０」について説明する。該光学系は、コリメートレンズ４、ビームエキスパンダー５、レンズ６、ミラー７、レンズ８、ダイクロイックハーフミラー９、対物レンズ１０から構成される。これら光学系４〜１０は、担体捕捉用レーザーから出射される光ビームの光路上にこの順に配置されている。
【０１１０】
本発明の装置において、対物レンズによる集光光学系は、共焦点光学系となっており、対物レンズの開口数（ＮＡ）で決まる非常に狭い領域に、レーザー光がフォーカスされるようになっている。例えば、本発明の装置に使用される対物レンズの開口数（ＮＡ）は、０．９である。
【０１１１】
担体捕捉用レーザーの光ビームは、コリメートレンズ４により平行ビームとされ、ビームエキスパンダー５によりビーム直径を大きくする。その後、レンズ６でミラー７面上に集光させ、レンズ８で平行光にした後、ダイクロイックハーフミラー９により光路を曲げて対物レンズ１０に導かれる。対物レンズ１０を介した光ビームを測定セル１の流路内の所定の位置に集光させる。
【０１１２】
担体の流路内での捕捉位置は、ミラー７の角度を変えることにより、流路の長さ方向について調整することができる。また、対物レンズ１０の光軸方向の移動により、光軸方向についてその捕捉位置を制御することができる。このように調整・制御をして、流路内の所定の位置に担体捕捉用レーザを照射することが可能になる。ここで所定の位置は、塩基配列解析時には励起用レーザーとの位置関係で決められるものであるが、このことについては後述する。
【０１１３】
なお、担体捕捉用レーザーを照射して担体を捕捉する際には、流路内をサンプル液が流動していてもよいし、流動していなくてもよい。
【０１１４】
上述のようにして流路内に集光させた光ビームが、流路内を流れに沿って移動する担体を１個捕捉し得る。その様子を図８に示す。図８に示すとおり、担体捕捉用レーザーの光ビームは、対物レンズ１０により集光された後、測定セル１の表面部分１ｂを貫通して、流路１ｃ内の溶液の中央部分にフォーカスされ、担体の懸濁液を照射する。これにより、担体１個を流路内で捕捉する。
【０１１５】
≪酵素液搬送手段≫
次に、「前記核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を、前記測定セルの流路に搬送するための手段」について説明する。本実施の形態では、酵素液を流すための手段は、担体の懸濁液を搬送するための手段２と共用することができる。よって、溶液搬入・搬出機構に関する上記説明も参照されたい。
【０１１６】
ここで「末端から順に切断する」とは、試料となる核酸が５’末端の側で担体に付着している場合は、核酸を構成するモノヌクレオチドを３’末端から順に切断することを意味する。逆に、試料となる核酸が３’末端の側で担体に付着している場合、核酸を構成するモノヌクレオチドを５’末端から順に切断することを意味する。
【０１１７】
「酵素液」は、３’側からのみモノヌクレオチドを一つずつ切断するエキソヌクレアーゼ、あるいは５’側からのみモノヌクレオチドを一つずつ切断するエキソヌクレアーゼなど、適宜選択することができる。例えば、エキソヌクレアーゼＩ、Ｔ７ポリメラーゼを使用することができる。酵素液の有する酵素活性は、所望の分解反応を行う範囲内で適宜設定されるが、好ましくは、10〜200ｎＭの活性を有する酵素液を使用する。
【０１１８】
図５に示す溶液搬入・搬出機構において、酵素液は、搬入用タンク２ａから流路へ所定の流速で流され、流路から搬出用タンク２ｃへと排出される。上述のとおり、酵素液を流路に所定の流速で流すためには、両タンクの上下の高さ位置を制御したり、シリンジのガス圧を制御したりすることにより行うことができる。また、モーター駆動ポンプにより溶液の搬入、搬出を行うこともできる。
【０１１９】
先に説明したとおり、酵素液の搬送において、所定の流速を定常的に保つことは、末端から順に切断されたモノヌクレオチドを、その順序を守って流路内を搬送することが本発明で要求されているため、重要な意味を有する。本発明において流速が速すぎた場合、レーザートラップにより捕捉されている粒子が逃げてしまうため、トラップされた状態から粒子が逃げない程度の流速が上限となる。また、流速が遅すぎた場合、切断されたモノヌクレオチドがブラウン運動により任意の方向に移動し、切断された順序にモノヌクレオチドが並ばなくなる可能性があるため、少なくともモノヌクレオチド分子のブラウン運動を制する程度の流速が必要となる。核酸の塩基配列の解析精度を高めるためには、捕捉されている粒子が逃げない範囲において流速は速い方が好ましい。すなわち、流速は、粒子をレーザートラップしている力（レーザー出力）との関係で設定される。一般に、流速は一般に０.５ｍｍ/ｓ〜１０ｍｍ/ｓに設定される。例えば、流速は１ｍｍ/ｓに設定される。
【０１２０】
≪励起用レーザー光源≫
次に、「前記酵素液により切断されたモノヌクレオチドの塩基を識別標識している蛍光物質を、切断順に励起するための励起用レーザー光源１１」について説明する。励起用レーザーは、一般に可視域の波長を有しており、使用した蛍光物質を励起させる波長を有しているものを使用する。例えば、蛍光物質としてローダミングリーンを使用した場合には固体ブルーレーザー（473ｎｍ）を、ＴＭＲを使用した場合にはアルゴンレーザー（514.5ｎｍ）を使用する。
【０１２１】
なお、本実施の形態では励起用レーザー光源は１つであり、そのため当該レーザー光源により励起される１種類の蛍光物質のみを核酸塩基の標識のために使用することとなる。
【０１２２】
≪第二の光学系≫
続いて、「励起用レーザー光源からの光ビームを前記測定セルの流路内に集光し、前記蛍光物質を切断順に励起する第二の光学系１２〜１４、および１０」について説明する。該光学系は、コリメートレンズ１２、ビームエキスパンダー１３、ダイクロイックハーフミラー１４、対物レンズ１０から構成される。これら光学系１２〜１４、および１０は、レーザー光源１１から出射される光ビームの光路上にこの順に配置されている。
【０１２３】
励起用レーザー光源１１からの光ビームは、コリメートレンズ１２により平行ビームとされ、ビームエキスパンダー１３によりビーム直径を大きくした後、ダイクロイックハーフミラー１４により光路を曲げて対物レンズ１０に導かれる。対物レンズ１０を介した光ビームを、測定セル１の流路内の所定の位置に集光させる。
【０１２４】
励起用レーザーの流路内での照射位置は、ダイクロイックハーフミラー１４の角度を変えることにより、流路の長さ方向について調整することができる。また、対物レンズ１０の光軸方向の移動により、光軸方向についてその照射位置を制御することができる。このように調整・制御をして、流路内の所定の位置に励起用レーザを照射することが可能になる。
【０１２５】
よって本実施の形態では、上述の担体捕捉用レーザーの光ビームおよび励起用レーザーの光ビームの両方を、一つの対物レンズ１０で集光し、測定セル１の流路内にフォーカスさせる。
【０１２６】
本発明において塩基配列解析時には、担体捕捉用レーザーの光ビームと励起用レーザーの光ビームは、測定セルの流路内に所定の位置関係で照射されている必要がある。具体的には、塩基配列解析時に両ビームは、図９に示すような状態で流路内に照射されている必要がある。すなわち、溶液が流れている流路の上流で、担体捕捉用レーザーにより担体が捕捉され、その下流で励起用レーザーが照射されている必要がある。このような所定の位置関係により、担体に担持された核酸を構成するモノヌクレオチドを、切断された順に励起用レーザーの照射領域内に順次流入させ、次いでモノヌクレオチドの塩基を標識している蛍光物質を順次励起することが可能になる（図９参照）。
【０１２７】
従って、塩基配列解析時に上記所定の位置関係で両レーザービームが照射されるように、予め光ビームの光路を設定しておくか、あるいは、解析前に担体捕捉用レーザービームまたは励起用レーザービームの少なくとも一のビームを適切な位置に移動させることが必要である。図２に示される本実施の形態では、このような光ビームの光路の制御は、光ビームを照射するための光学系（具体的にはダイクロイックハーフミラー９またはダイクロイックハーフミラー１４）により行われる。
【０１２８】
塩基配列解析時の両レーザービームの所定の位置は、対物レンズ視野において両レーザーが離れた位置に位置していれば特に限定されないが、好ましくは両レーザーが対物レンズ視野内で最も離れた位置に（約２５μｍ離れて）位置することである。
【０１２９】
このように、本実施の形態では一つの対物レンズにて２つのレーザービームを所定の離れた位置に集光させることが可能である。しかし、本発明の塩基配列決定装置は、一つの対物レンズにて２つの光ビームを離れた位置に集光させる態様に限定されず、２つの対物レンズにて装置を組み立ててもよい（後述する第４の実施の形態および図１３を参照）。
【０１３０】
≪第三の光学系≫
次に、「前記核酸の塩基を識別標識している蛍光物質からの蛍光を順次集光する第三の光学系１０、１５〜１９」について説明する。該光学系は、対物レンズ１０、レンズ１５、アパーチャー１６、集光レンズ１７、Ｉｒカットフィルター１８、バンドパスフィルター１９から構成される。これら光学系１５〜１９は、蛍光物質から放射される蛍光の光路上にこの順に配置されている。なお図２において、対物レンズ１０と、集光された蛍光を検出する受光器２０とを結ぶ光学系を「測定用光学系」と称する。
【０１３１】
蛍光物質からの蛍光は、対物レンズ１０を通過し、レンズ１５によりアパーチャー１６に結像させ、その後集光レンズ１７により受光器２０の受光面にフォーカスさせる。受光器２０の受光面の前方に、Ｉｒカットフィルター１８、バンドパスフィルター１９を配置し、蛍光物質からの蛍光のみが受光器２０に届くようにする。Ｉｒカットフィルター１８は、測定セル１の壁面、およびミラー裏面などの光路途中の光学系による反射光などのノイズ光をカットする。バンドパスフィルター１９は、蛍光波長の光のみを効率的に通過させる。
【０１３２】
≪光検出器≫
次いで、「集光した蛍光を順次検出し、検出された蛍光に対応する識別信号を発生する光検出器２０」について説明する。光検出器２０には、アバランシェフォトダイオード、あるいは光電子増倍管等の微弱光検出器を用いることができる。光検出器２０は、切断されたモノヌクレオチドの順に、当該モノヌクレオチドの塩基の種類に対応する蛍光を検出する。そして検出された蛍光を、それに対応する識別信号に変換して、後述の解析手段へと伝達する。具体的には、光検出器２０で光電子に変換される。
【０１３３】
≪解析手段≫
最後に、「前記光検出器が発生した識別信号から、前記核酸の塩基配列を読み取る解析手段２１〜２３」について説明する。解析手段は、光検出器２０より得られた信号を信号処理部２１により処理し、その結果をコンピュータ２３のモニター画面上に表示する。具体的には、光検出器２０で光電子に変換された光信号は、信号処理部２１で波形整形などの処理を行った後、フォトンパルスとしてコンピュータ２３に導かれ、パルス数が計数され、コンピュータの画面上に表示される。信号制御部２２は、コンピュータに送られる最終情報を担体捕捉用レーザー光源にフィードバックして、担体のトラップを解除することができる。
【０１３４】
≪担体の捕捉状態を観察するための構成≫
図２に示す本実施の形態の塩基配列決定装置には、担体を捕捉した状態を撮影するために前記測定セルの流路内に照明光を照射するための光源２４、照明用光学系２５、２６、１５、１０が設置されている。図２において、光源２４はハロゲンランプであり、照明用光学系２５、２６、１５、１０は、レンズ２５、可動ミラー２６、レンズ１５、対物レンズ１０から構成される。光源２４からの照明光は、レンズ２５を通過して可動ミラー２６により測定セル方向へ屈曲し、レンズ１５を通過した後、対物レンズ１０にて分析試料に集光される。
【０１３５】
なお、本発明の装置においてこの光源および照明用光学系は必ずしも必要ではない。従って、使用しない時には、可動ミラー２６を移動することにより、必要に応じて測定用光学系から取り外してもよい。
【０１３６】
また、図２に示す本実施の形態の塩基配列決定装置には、前記照明光の下で、担体を捕捉した状態を撮影するための撮影用光学系１０、１５、２７〜２９、および撮像手段３０が設置されている。図２において撮影用光学系１０、１５、２７〜２９は、対物レンズ１０、レンズ１５、可動プリズム２７、バンドパスフィルター２８、レンズ２９から構成され、撮像手段３０は、ＣＣＤカメラである。照明光を照射された分析試料からの反射光は、対物レンズ１０、レンズを１５を通過した後、可動プリズム２７によりＣＣＤカメラ３０方向へ屈曲され、バンドパスフィルター２８で必要な波長の光だけを選択的に透過させ、レンズ２９を介して撮像手段（ＣＣＤカメラ）３０へ送られる。このように、撮影用光学系は、ＣＣＤカメラ３０で効率的に受光される波長の光を選択的に透過させ、テレビモニター上に画像化させる。
【０１３７】
なお、図２において撮影用光学系および照明用光学系は、測定セルの流路内の捕捉された担体を照射し撮像するため、可動プリズム２７により、測定用光学系と一致させることが必要である。また、本発明の装置においてこの撮影用光学系および撮像手段は必ずしも必要ではない。従って、担体を捕捉する時にのみ使用し、その他の時には、可動プリズム２７を移動することにより、必要に応じて測定用光学系から取り外してもよい。
【０１３８】
［第２の実施の形態］
次に、本発明の第２の実施の形態に係る塩基配列決定装置について、図１０を参照して説明する。
【０１３９】
第２の実施の形態の基本的な構成は、第１の実施の形態と同じである。図１０の第２の実施の形態において、図２に示す第１の実施の形態と同一な部分（符号１〜３０）に関しては同符号を付している。本実施の形態の装置には、２種類の蛍光物質を用いて核酸の塩基を識別標識した分析試料を使用する。
【０１４０】
そのため、本実施の形態では、励起用レーザー光源として、放射波長の異なる２種類のレーザー、例えばアルゴンイオンレーザー（波長 514.5ｎｍ）、固体ブルーレーザー（波長473ｎｍ）を用いる。従って、図１０における本実施の形態の装置には、励起用レーザー光源１１に加えて第二の励起用レーザー光源３１が設置されている。
【０１４１】
第二の励起用レーザー光源３１からの光ビームも、励起用レーザー光源１１からの光ビームと同様に、コリメートレンズ３２により平行ビームとされ、ビームエキスパンダー３３によりビーム直径を大きくされる。その後、ミラー３４、２つのダイクロイックハーフミラー３５および１４により光路を曲げて対物レンズ１０に導かれる。これら２つの励起用レーザー光源１１および３１からの光ビームは、ダイクロイックハーフミラー３５により一つの光路にまとめられ、対物レンズ１０に導かれる。
【０１４２】
このように、波長の異なる２種類のレーザーを用いることで、２種類の蛍光物質を励起することができる。２種類の蛍光物質としては、例えば、ローダミングリーン（ＲＧ）とテトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート（ＴＭＲ）を使用することができる。ローダミングリーンは、固体ブルーレーザー（473ｎｍ）により励起され、550ｎｍの波長の蛍光を放射し、一方、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネートは、アルゴンレーザー（514.5ｎｍ）により励起され、570ｎｍの波長の蛍光を放射する。２種類の蛍光物質を用いて異なる波長の蛍光を放射させることで、２種類の塩基を区別して検出することが可能になる。
【０１４３】
本実施の形態では、放射された異なる波長の蛍光を検出するために、測定用光学系も２系統とする必要がある。すなわち、２種類の蛍光物質からの蛍光を、ダイクロイックハーフミラー３６により、それぞれの蛍光物質の発光波長に合わせて透過光強度が最大になるように調整して光路を２分割する。２分割された光は、その一方は、バンドパスフィルター１９を通って、受光器２０にて受光される。受光器で光電子に変換された光信号は、信号処理部２１にて処理され、フォトンパルスとしてコンピュータ２３に送られ、パルスの数が計数される。もう一方の光も同様に、バンドパスフィルター３７を通って、受光器３８にて受光される。受光器２０からの信号は信号処理部３９にて処理され、コンピュータ２３に送られる。なお、信号制御部２２は、受け取った情報を担体捕捉用レーザー光源にフィードバックして、担体のトラップを解除することができる。
【０１４４】
このような２系統の測定用光学系の構成は、第１の実施の形態における１系統の測定用光学系と基本的には同じである。２つの受光器で測光する領域は同一の領域である。このようにして２つの光路について、それぞれ独立に蛍光を検出することができる。
【０１４５】
第２の実施の形態の装置は、以下の利点を有する。すなわち、１回の測定で同時に２種類の蛍光の位置を読み取ることができ、これに対応する塩基配列を読み取ることができる。従って、第１の実施の形態の装置と比べて、測定の回数を減らすとともに、測定精度を向上させることができる。
【０１４６】
なお、本発明の塩基配列決定装置は、３つの励起用レーザー光源を設置し、区別して検出され得る３種類の蛍光物質を用いて塩基を識別標識した核酸の塩基配列を決定することもできる。更に３つを超える励起用レーザー光源を設置した塩基配列決定装置も可能であり、このような装置も本発明の範囲に包含される。
【０１４７】
［第３の実施の形態］
次に、本発明の第３の実施の形態に係る塩基配列決定装置について、図１１を参照して説明する。
【０１４８】
第３の実施の形態の基本的な構成は、第１の実施の形態と同じである。図１１に示す第３の実施の形態において、図２に示す第１の実施の形態と同一な部分（符号１〜３０）に関しては同符号を付している。本実施の形態の装置には、第１の実施の形態と同様、１種類の蛍光物質を用いて核酸の塩基を識別標識した分析試料を使用する。
【０１４９】
本実施の形態では、流路を備えた測定セルとして、図１２に示すような全面透明な測定セル１’を使用する。図１２は、図３（ｃ）に対応する図であり、流路に沿って切断された断面図である。
【０１５０】
測定セル１’の構造は、図３に示す測定セル１と基本的に同じである。測定セル１が、レーザー光の透過する面のみが透明であるのに対し、ここで使用する測定セル１’は、全面が透明なセルである点で異なる。測定セル１’は、例えば、ガラス板、パイレックス、あるいはアクリル、塩化ビニル樹脂のような透明なプラスチック板から構成され得る。
【０１５１】
このような測定セル１’を使用することにより、担体粒子が捕捉された状態を観察するための撮影用光学系を、測定用光学系から分離させることができる。すなわち、図１１において、撮影用光学系４３、２８〜２９は、測定用光学系である対物レンズ１０から受光器２０までの光学系と分離されている。
【０１５２】
本実施の形態では、ハロゲンランプ２４による照明光と、担体捕捉用レーザー３による光ビームを、対物レンズ４３に通して拡大した後、バンドパスフィルター２８で必要な波長の光だけを選択的に透過させ、レンズ２９を介して撮像手段（ＣＣＤカメラ）３０で撮像する。
【０１５３】
また、本発明の塩基配列決定装置は、図１１に図示されるとおり、各光学系の動作に対応して開閉されるシャッターを備えていてもよい。具体的には、図１１において、担体捕捉用レーザーを光源３から測定セルへと導く第一の光学系、励起用レーザーを光源１１から測定セルへと導く第二の光学系、および対物レンズ１０から受光器２０までの測定用光学系のそれぞれに、順にシャッター４０、４１、４２が設置されている。
【０１５４】
このように、撮影用光学系を測定用光学系から分離させることにより、観察のための光学系の測定光への妨害を除去することができるとともに、透過光を観察することになるので、視野が明るくなり、担体粒子の搬送の様子や粒子捕捉の様子を明確に検知することができる。
【０１５５】
［第４の実施の形態］
次に、本発明の第４の実施の形態に係る塩基配列決定装置について、図１３を参照して説明する。
【０１５６】
第４の実施の形態の基本的な構成は、第１の実施の形態と同じである。図１３に示す第４の実施の形態において、図２に示す第１の実施の形態と同一な部分（符号１〜３０）に関しては同符号を付している。本実施の形態の装置には、第１の実施の形態と同様、１種類の蛍光物質を用いて核酸の塩基を識別標識した分析試料を使用する。
【０１５７】
本実施の形態では、第３の実施の形態に係る装置と同様、流路を備えた測定セルとして、図１２に示すような全面透明な測定セル１’を使用する。
【０１５８】
このような測定セル１’を使用することにより、担体粒子が捕捉された状態を観察するための撮影用光学系を、測定用光学系から分離させることができる。すなわち、図１３において、撮影用光学系４３、２８〜２９は、測定用光学系である対物レンズ１０から受光器２０までの光学系と分離されている。
【０１５９】
このように、撮影用光学系を測定用光学系から分離させることにより、観察のための光学系の測定光への妨害を除去することができるとともに、透過光を観察することになるので、視野が明るくなり、担体粒子の搬送の様子や粒子捕捉の様子を明確に検知することができる。
【０１６０】
更に、本実施の形態では、全面透明な測定セル１’を使用することにより、担体捕捉用レーザーを測定セルへと導く第一の光学系を、励起用レーザーを測定セルへと導く第二の光学系および測定用光学系から分離させることが可能になる。すなわち、図１３において、第一の光学系４〜９、４３は、第二の光学系１１〜１４、１０および測定用光学系１０、１４〜２０から分離されている。図１３において、担体捕捉用レーザーは、測定セルの上面から入射して流路内に集光し、励起用レーザーは、測定セルの下面から入射して流路内に集光する。
【０１６１】
このように、担体捕捉用レーザー（赤外光）と励起用レーザー（可視光）を、同一の光学系を共用して流路内に集光させないことにより、それぞれのレーザー光の焦点位置を合わせることが容易になる。一般に、赤外光と可視光とを、同一の光学系を通して同じ位置に焦点位置を合わせるためには補正光学系が必要とされる。しかし図１３のように、担体捕捉用レーザーと励起用レーザーとを別々の光学系を通すことにより、それぞれ独自に焦点位置を合わせることが可能になる。
【０１６２】
なお、上記全ての実施の形態に係る塩基配列決定装置の動作について、詳しくは以下の塩基配列決定方法の説明も参照されたい。
【０１６３】
＜塩基配列決定方法＞
次に、本発明の塩基配列決定方法について説明する。なお、本発明の塩基配列決定方法は、上述の装置を用いて行うことができる。上述の装置の構成も適宜参照されたい。
【０１６４】
本発明の塩基配列決定方法は、
分析試料として、塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸を付着させた担体を用い、測定セルとして、内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えたセルを用いた塩基配列決定方法であって、
１）分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を前記測定セルの流路に搬送する工程と、
２）前記核酸を付着させた担体を流路内でレーザートラップにより捕捉する工程と、
３）前記流路内に、核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を流す工程と、
４）前記酵素液により切断されたモノヌクレオチドの塩基を識別標識している蛍光物質を順に励起する工程と、
５）前記工程により励起された蛍光物質が放射する蛍光を順次検出し、検出された蛍光に対応する塩基配列を読み取る工程と
を具備する方法である。
【０１６５】
好ましい態様において、本発明の塩基配列決定方法は、
分析試料として、塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した核酸を付着させた担体を用い、測定セルとして、内部に流路を備え、光ビームを前記流路内へ透過させるための透明な面を備えたセルを用いた塩基配列決定方法であって、
１）分析試料である前記核酸を付着させた担体の懸濁液を前記測定セルの流路に搬送する工程と、
２-１）前記核酸を付着させた担体を流路内でレーザートラップにより捕捉する工程と、
２-２）前記工程により捕捉された担体に、蛍光物質で識別標識された核酸分子が付着していることを、励起光を照射することにより確認する工程と、
２-３）前記流路内において、前記担体を捕捉するためのレーザーの照射位置を、前記励起光の照射位置の上流に位置させる工程と、
３）前記流路内に、核酸を構成するモノヌクレオチドを末端から順に切断する酵素液を流す工程と、
４）前記酵素液により切断されたモノヌクレオチドの塩基を識別標識している蛍光物質を順に励起する工程と、
５）前記工程により励起された蛍光物質が放射する蛍光を順次検出し、検出された蛍光に対応する塩基配列を読み取る工程と
を具備する方法である。
【０１６６】
本発明の塩基配列決定方法で使用される分析試料および測定セルについては、上述の説明どおりである。以下、１）〜５）の各工程について順に説明する。塩基配列決定方法の全体の流れについては、図１４に示すフローチャート図も参照されたい。
【０１６７】
１）分析試料の搬送
分析試料（蛍光物質で塩基を識別標識した核酸を付着させた担体懸濁液）を、図５に示すような溶液搬入・搬出機構により測定セルに搬送する。
【０１６８】
２-１）担体の捕捉
担体捕捉用レーザーを点灯し、レーザートラップにより担体１個を捕捉する。担体１個が捕捉されたら、流路中に存在する捕捉されなかったその他の担体を緩衝液で洗い流しておくとよい。ここで、担体が１個捕捉された状態は、撮像手段（ＣＣＤカメラ）により確認することができる。
【０１６９】
２-２）捕捉した担体に、蛍光物質で識別標識された核酸分子が付着されていることを、下記のとおり確認することもできる。レーザートラップにより担体を捕捉した状態で、励起用レーザーを点灯する。このとき、励起用レーザーの光ビームは、担体捕捉用レーザーと同じ光路を通って捕捉された担体を照射する。これにより、担体が担持している核酸を標識している蛍光物質が励起される。
【０１７０】
次いで、蛍光物質から放射される蛍光の有無を測定する。放射される蛍光の信号は、電気信号（フォトンパルス）に変換されて検出される。蛍光測定の結果の一例を図１５に示す。ある閾値を予め決めておき、これよりもフォトンパルス数が多く測定された場合のみ、蛍光が検出されたと判断する。この閾値は、装置のバックグラウンドノイズなどを考慮して適宜設定され得る。
【０１７１】
フォトンパルス数が閾値より低く蛍光が検出されなかった場合（フローチャートで“ＮＯ”の場合）、担体に核酸分子が付着していないと判断される。このとき信号制御部にて司令を出し、担体捕捉用レーザーの照射を止め、担体のトラップを解除する。再び担体の懸濁液を測定セルに流し、蛍光測定にて蛍光が検出されるまで同様の動作を繰り返す。
【０１７２】
フォトンパルス数が閾値より高く蛍光が検出された場合（フローチャートで“ＹＥＳ”の場合）、担体に核酸分子が付着していると判断される。
【０１７３】
２-３）捕捉された担体に核酸分子が付着していることが確認されたら、同一の光路を通って担体を照射している担体捕捉用レーザーと励起用レーザーの照射位置を、塩基配列の解析に必要な所定の状態（図９に示す所定の状態）にする。すなわち、核酸塩基を１つずつ切断する分解酵素液を流路内に搬送する際、その上流で担体が捕捉されていて、その下流で励起用レーザーが照射されている状態をつくる。具体的には、励起用レーザービームと同じ光路上にあった担体捕捉用レーザービームを、光軸と垂直方向（流路の長さ方向）に移動させることにより所定の状態をつくることができる。あるいは、励起用レーザービームの光路を、担体捕捉用レーザービームの光路からずらすことにより、図９に示す所定の状態を作り出してもよい。
【０１７４】
ここで、担体捕捉用レーザーおよび/または励起用レーザービームを移動させる距離は、対物レンズ視野において両レーザーが離れた位置に位置していれば特に限定されないが、好ましくは両レーザーが対物レンズ視野内で最も離れた位置に位置するまで（約２５μｍ）移動させる。
【０１７５】
３）分解酵素の導入
塩基配列を解析するための所定の状態に両レーザービームが設定された後、溶液搬入・搬出機構により分解酵素を含む緩衝液を測定セルの流路に流す。分解酵素の導入により、担体に付着している核酸のモノヌクレオチドは、末端から順に切断される。
【０１７６】
分解酵素を含む緩衝液としては、100ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ7.5）、10ｍＭ MgCl2、2.5ｍＭ ＤＴＴを使用することができる。分解酵素は、10〜200ｎＭの活性を有するエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ポリメラーゼなどを使用することができる。この緩衝液中で室温で分解反応を行う。緩衝液の組成、温度等は、上記したものに限定されない。
【０１７７】
流速は、上述のとおり、切断されたモノヌクレオチドが、その切断順序を守って流路を流れていくことが可能な速度（下限）であって、担体がレーザートラップされた状態から逃げない速度（上限）であれば限定されない。例えば、約１ｍｍ/ｓにすることができる。
【０１７８】
なお、流路内に溶液を搬送する操作は、担体が流路内にて捕捉された後は脈流が生じないように行う必要がある。これは、脈流により、捕捉されている担体が押し流されないようにするためであり、切断された塩基がその順序を守って流路内を搬送されるようにするためである。
【０１７９】
４）蛍光発光
分解酵素により切断されたモノヌクレオチドの塩基は、上記流速の制御下において、流路内の励起用レーザーの照射位置（即ち、測定領域）に切断された順に流入する。これにより、塩基を識別標識している蛍光物質が順次励起され、このとき放射される蛍光が、順次対物レンズを介して測定用光学系に導かれる。
【０１８０】
５）塩基配列の読み取り
核酸の各塩基を識別標識している蛍光物質により、塩基配列が順次判読される。
【０１８１】
以下、核酸の塩基の種類と蛍光物質の種類とを対応付けて識別標識した具体例を挙げる。
【０１８２】
例えば図１６に、１種類の蛍光物質を用いてＤＮＡ塩基の１種類を識別標識した分析試料について、塩基配列の読み取り結果を示す。この分析試料は、本発明の第１の実施の形態の装置を用いて配列を読み取ることができる。
【０１８３】
図中、「○」は該塩基に蛍光物質による標識が有ることを、「×」は該塩基に蛍光物質による標識がないことを示す。試料ＤＮＡの４種類の塩基のうち、全アデニンを蛍光標識したものを試料１−１、全グアニンを蛍光標識したものを試料１−２、全チミンを蛍光標識したものを試料１−３とする。
【０１８４】
このように、単一の塩基のみを標識した場合、全塩基配列を読み取るためには最低３回の測定回数を必要とするが、その読み取り結果が示すとおり、ＤＮＡの塩基配列を読み取ることができる。
【０１８５】
また図１７に、２種類の蛍光物質を用いて２種類の塩基を識別標識した分析試料について、塩基配列の読み取り結果を示す。この分析試料は、本発明の第２の実施の形態の装置を用いて配列を読み取ることができる。
【０１８６】
図中、「○」は該塩基に蛍光物質Ａ（例えばＴＭＲ）による標識が有ることを、「●」は該塩基に蛍光物質Ｂ（例えばＲＧ）による標識が有ることを、「×」は該塩基に蛍光物質による標識がないことを示す。試料ＤＮＡの４種類の塩基のうち、アデニンおよびグアニンを２種類の蛍光物質Ａ、Ｂでそれぞれ識別標識したものを試料２−１、チミンおよびシトシンを２種類の蛍光物質Ａ、Ｂでそれぞれ識別標識したものを試料２−２とする。その読み取り結果をまとめて図１８に示す。
【０１８７】
このように２種類の蛍光物質を使用すると、１回の測定で同時に２種類の塩基の位置を検出することができ、全塩基配列を読み取るための測定回数を最低２回とすることができる。１種類の蛍光物質を使用した場合（図１６に示す例）と比較して短時間で配列決定を行うことが可能になる。
【０１８８】
また図１９に、２種類の蛍光物質を用いて、１種類の塩基とその他３種類の塩基とを識別標識した分析試料について、塩基配列の読み取り結果を示す。この分析試料は、本発明の第２の実施の形態の装置を用いて配列を読み取ることができる。
【０１８９】
図中、「○」は該塩基に蛍光物質Ａ（例えばＴＭＲ）による標識が有ることを、「●」は該塩基に蛍光物質Ｂ（例えばＲＧ）による標識が有ることを示す。試料ＤＮＡの４種類の塩基のうち、アデニンを蛍光物質Ａで標識し、その他の塩基（Ｇ、Ｔ、Ｃ）を蛍光物質Ｂで標識したものを試料３−１、グアニンを蛍光物質Ａで標識し、その他の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ）を蛍光物質Ｂで標識したものを試料３−２、チミンを蛍光物質Ａで標識し、その他の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ）を蛍光物質Ｂで標識したものを試料３−３とする。
【０１９０】
このように、２種類の蛍光物質を使用して４種類の塩基全てを識別標識すると、４種類の塩基全てについて蛍光が観測されるようになるので、測定の精度を向上させることができる。すなわち、図１６、図１７に示す例のように蛍光が観測されなかった塩基の数を、蛍光が検出されなかった時間の長さにより決定する必要がなくなる。
【０１９１】
なお本発明の方法は、１つの分析試料に対して、ＤＮＡ分子を変えて複数回の配列決定データを取得し、データの信頼性を高めることが望ましい。なお、核酸の塩基を識別標識するパターンは、図１６、図１７、および図１９に示す例に限定されず、適宜設定することができる。
【０１９２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、新規な塩基配列決定装置および塩基配列決定方法を提供する。本発明によれば、熟練を必要とせず簡単に、しかも短時間で核酸の塩基配列を読み取ることができる。また、本発明は、試料となる核酸の長さに原理的に制限がないという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の塩基配列決定に使用する分析試料を示す図。
【図２】  本発明の第１の実施の形態に係る塩基配列決定装置の構成を示す図。
【図３】  測定セルの構成を示す図。
【図４】  測定セルの別の例を示す図。
【図５】  溶液搬入・搬出機構の構成を示す図。
【図６】  溶液搬入・搬出機構の自動動作の例を示す図。
【図７】  溶液搬入・搬出機構の自動動作の例を示す図。
【図８】  測定セルの流路内で担体１個を捕えている様子を示す図。
【図９】  塩基配列解析時における測定セルの流路内の様子を示す図。
【図１０】  本発明の第２の実施の形態に係る塩基配列決定装置の構成を示す図。
【図１１】  本発明の第３の実施の形態に係る塩基配列決定装置の構成を示す図。
【図１２】  全面透明な測定セルの構成を示す図。
【図１３】  本発明の第４の実施の形態に係る塩基配列決定装置の構成を示す図。
【図１４】  本発明の塩基配列決定方法の流れを示すフローチャート図。
【図１５】  分析試料の蛍光の有無を測定した結果の一例を示す図。
【図１６】  ＤＮＡの塩基配列を解析した結果の一例を示す図。
【図１７】  ＤＮＡの塩基配列の解析した結果の一例を示す図。
【図１８】  図１７の測定結果を示す図。
【図１９】  ＤＮＡの塩基配列を解析した結果の一例を示す図。
【符号の説明】
１、１’…測定セル、１ａ、１ａ’…本体部分、１ｂ…表面部分、１ｃ、１ｃ’…流路、１ｄ、１ｄ’…接続端子、１ｅ…流路を備えた測定セルのホルダー、２…溶液搬入・搬出機構、２ａ…搬入用タンク、２ｂ…搬入用チューブ、２ｃ…搬出用タンク、２ｄ…搬出用チューブ、３…担体捕捉用レーザー光源、４…コリメートレンズ、５…ビームエキスパンダー、６…レンズ、７…ミラー、８…レンズ、９…ダイクロイックハーフミラー、１０…対物レンズ、１１…励起用レーザー光源、１２…コリメートレンズ、１３…ビームエキスパンダー、１４…ダイクロイックハーフミラー、１５…レンズ、１６…アパーチャー、１７…集光レンズ、１８…Ｉｒカットフィルター、１９…バンドパスフィルター、２０…受光器、２１…信号処理部、２２…信号制御部、２３…コンピュータ、２４…ハロゲンランプ、２５…レンズ、２６…可動ミラー、２７…可動プリズム、２８…バンドパスフィルター、２９…レンズ、３０…ＣＣＤカメラ、３１…第二の励起用レーザー光源、３２…コリメートレンズ、３３…ビームエキスパンダー、３４…ミラー、３５…ダイクロイックハーフミラー、３６…ダイクロイックハーフミラー、３７…バンドパスフィルター、３８…受光器、３９…信号処理部、４０…シャッター（１）、４１…シャッター（２）、４２…シャッター（３）、４３…対物レンズ、４４…分解酵素導入シリンジ、４５…試料導入シリンジ、４６…緩衝液タンク、４７…緩衝液タンク、４８…Ｔ型継ぎ手、４９…Ｔ型継ぎ手、５０…接続端子、５１…接続端子、５２…陰圧ポンプ、５３…廃液タンク、５４…Ｔ型継ぎ手、５５…Ｔ型継ぎ手
【図１】
0004094289.tif 000002
【図２】
0004094289.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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