(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５Ｒ−５，６，１５−トリヒドロキシ−７，９，１３−トランス−１１−シス−エイコサテトラエン酸、
１５Ｒ−５，１４，１５−トリヒドロキシ−６，１０，１２−トランス−８−シス−エイコサテトラエン酸、及び
１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸の群から選ばれた実質的に精製された少なくとも一種の１５−エピ−リポキシン化合物と、製薬上許容し得るキャリアーとを含む製薬組成物であり、患者における細胞の望ましくない増殖を防止するために使用される製薬組成物。
【請求項２】
上記１５−エピ−リポキシン化合物は、
５Ｓ，６Ｒ，１５Ｒ−５，６，１５−トリヒドロキシ−７，９，１３−トランス−１１−シス−エイコサテトラエン酸、
５Ｓ，１４Ｒ，１５Ｒ−５，１４，１５−トリヒドロキシ−６，１０，１２−トランス−８−シス−エイコサテトラエン酸、及び
１５Ｒ−１５−エピ−リポキシン化合物の群から選ばれる請求項１の製薬組成物。
【請求項３】
細胞が上皮細胞である、請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項４】
細胞が白血球である、請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項５】
細胞が内皮細胞である、請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項６】
細胞が繊維芽細胞である、請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項７】
細胞が癌様の成長をする、請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項８】
有効量のアセチルサリチル酸を更に含む、請求項１〜７いずれか１項に記載の製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
リポキシンは、リポキシゲナーゼ（ＬＯ）酵素系の作用によりアラキドン酸から誘導される生物学的に活性な一群のメディエーターである（Serhan,C.N.及びSamuelsson,B.（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5335）。ヒト細胞型での形成は、５−ＬＯ又は１５−ＬＯにより開始される（Serhan,C.N.（1991）J.Bioenerg.Biomembr.23:105）。単一細胞型は、ヒトの好中球−血小板と好酸球との細胞間のエイコサノイドの生合成中にナノグラムレベルでリポキシンを生成する（Serhan,C.N.及びSheppard,K.-A.（1990）J.Clin.Invest.85:772）。ＬＸは、種々の臓器系における細胞事象を調節する共役テトラエン含有エイコサノイドである。
リポキシンＡ4（ＬＸＡ4）及びリポキシンＢ4（ＬＸＢ4）は、２つの主要なリポキシンである。各々は、１０ｎＭで、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性を、赤白血病細胞の核において増大させる（Beckman,B.S.等（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA201:169）。各々は、ｎＭのレベルで、迅速な血管拡張を誘出する（Busija,D.W．等（1989）Am.J.Physiol.256:H468;Katoh,T.等（1992）Am.J.Physiol.263（Renal Fluid Electrolyte Physiol.32）:F436）。リポキシンの血管拡張効果は、文献的に周知である。例えば、マイクロモル量のＬＸＡ4の吸入による投与は、喘息患者における気管支収縮をブロックする（Chrisstie,P.E.等（1992）Am.Rev.Respir.Dis.145:1281）。
１０-10Ｍの範囲において、ＬＸＡ4は又、最適状態に及ばない濃度の顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）との組合せにおいても細胞増殖を刺激してミエロイド骨髄コロニー形成を誘導する（Stenke,L.等（1991）Biochem.Biophys.Res.Commun.180:255）。ＬＸＡ4は又、ヒトの単核細胞コロニー形成をも刺激する（Popov,G.K.等（1989）Bull.Exp.Biol.Med.107:93）。
ＬＸＡ4は、多形核白血球の走化性を阻止する（Lee,T.H.等（1991）Biochem.Biophys.Res.Commun.180:1416）。リポキシンの等モル量の組合せは、糸球体炎症における多形核好中球−メサンギウム細胞相互作用を調節することが見出されている（Brady,H.R.等（1990）Am.J.Physiol.809）。多形核好中球（ＰＭＮ）の活性化は糸球体炎症の初期ステージと関連する構造的及び機能的に異常なメディエーターの放出を含む（Wilson,C.B.及びDixon,F.J.（1986）（The Kidney,B.M.Brenner及びF.C.Rector編、ペンシルベニア、Philadelphia:Saunders,p.800-891））。
リポキシンは、ロイコトリエン（ＬＴ）に対するアンタゴニストとして作用する（これらは、炎症のメディエーターである）。ＬＸＡ4は、喘息患者におけるＬＴＣ4−誘導された気道の閉塞を調節する（Christie,P.E.等（1992）Am.Rev.Respir.Dis.145:1281）。ＬＸＡ4は、ＬＴＤ4−及びＬＴＢ4−媒介の炎症をモデル動物においてイン・ビボで阻止する（Badr,K.F.等（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.86:3438;Hedqvist,P.等（1989）Acta Physiol.Scand.137:571）。ＬＸＡ4（ｎＭ）に以前にさらしておくことは、ＬＴＤ4の腎臓での血管収縮作用をブロックする（Katoh,T.等（1992）Am.J.Physiol.263（Renal FluidElectrolyte Physiol.32）F436））。ロイコトリエン誘導された炎症は、例えば、関節炎、喘息、種々の型のショック、高血圧、腎臓病、アレルギー反応、及び心筋梗塞を含む循環系疾患において生じる。
リポキシンは、イン・ビボ投与して多くの病気を治療することのできる強力な低分子であるが、これらの分子は、イン・ビボでは短命である。天然のリポキシンと同じ生体活性を有するが、一層長いイン・ビボ半減期を有する化合物は、価値ある医薬であろう。
発明の要約
この発明は、実質的に精製された１５−エピ−リポキシン化合物を特徴とする。一具体例において、この１５−エピ−リポキシン化合物は、１５Ｒ−５，６，１５−トリヒドロキシ−７，９，１３−トランス−１１−シス−エイコサテトラエン酸であり、別の具体例においては、この酸は、５Ｓ、６Ｒ配置（１５−エピ−ＬＸＡ4）を有する。他の具体例においては、この１５−エピ−リポキシン化合物は、１５Ｒ−５，１４，１５−トリヒドロキシ−６，１０，１２−トランス−８−シス−エイコサテトラエン酸であり、この酸は、５Ｓ、１４Ｒ配置（１５−エピ−ＬＸＢ4）を有する。更に別の具体例においては、この１５−エピ−リポキシン化合物は、１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１５−ＨＥＴＥ）でありこの酸は、１５Ｒ配置を有する。
この発明は又、天然のリポキシンと同じか又は類似する活性領域を有するが、イン・ビボの異化作用に一層抵抗性である代謝変換領域を有するリポキシンアナログを特徴とする。それ故、本願に開示されているリポキシンアナログは、天然のリポキシンの生物学的活性を有するが、一層長い代謝半減期を有する。本願に開示されているリポキシンアナログのあるものは、更に、増大されたイン・ビボでの有効性（天然のリポキシンと比較して一層高いリポキシンレセプターに対する結合親和性又は増大された生体活性）を有している。
天然のリポキシンと同様に、本願に開示されている低分子は、高度に強力であり且つ生体適合性（即ち、非毒性）である。しかしながら、天然のリポキシンと異なって、リポキシンアナログは、代謝を阻止し、抵抗し又はゆっくりと受け、それ故、一層長い薬理学的活性を有する。更に、本願に開示している化合物は、天然のリポキシンより一層親油性であり、それ故、生物学的膜によって一層容易に取り込まれる。
更に、この発明は、ある種の細胞の望ましくない増殖を、それらの細胞を有効量の実質的に精製された１５−エピ−リポキシン化合物と接触させることに基づいて改善する方法を特徴とする。好適な具体例において、これらの細胞は、癌様の又は腫瘍性の成長をしている。更に好適な具体例において、これらの細胞は、上皮細胞、白血球、内皮細胞及び／又は繊維芽細胞よりなる群から選択される。この発明のある好適具体例においては、細胞をイン・ビボで接触させる。他の具体例においては、細胞をエキソ・ビボで接触させる。
この発明は又、患者における細胞増殖性疾患を、有効量の実質的に精製された１５−エピ−リポキシン化合物を投与することによって改善する方法をも特徴とする。
他の面において、この発明は、本発明の実質的に精製された１５−エピ−リポキシン化合物及び製薬上許容し得るキャリアーを有する製薬組成物を特徴とする。好適具体例において、１５−エピ−リポキシン化合物は、患者における望ましくない細胞増殖を阻止するのに有効な量である。他の具体例においては、この製薬組成物は、有効量のアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）を含有する。
この発明は、更に、これらのリポキシン化合物の診断及び研究用途にも関係する。この発明の更なる特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、ヒトの腫瘍細胞株（Ａ５４９細胞）肺胞II型上皮細胞におけるプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ（ＰＧＨＳ）及びリポキシゲナーゼ（ＬＯ）発現を示すグラフである。細胞を、Ｔ−７５ｃｍ2フラスコ内で、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で又は不在にて、３７℃で、２４時間生育させた。抽出した全ＲＮＡ（１μｇ）を取って、逆転写（ＲＴ）並びに、ＰＧＨＳ−１及び−２、１５−、１２−及び５−ＯＬ並びにグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に特異的なオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲに供した。放射性バンドをホスホルイメージャー分析により直接定量し、ＧＡＰＤＨの発現に標準化し、そしてＩＬ−１βにさらした後のｍＲＮＡレベルの倍増度として表した。図１Ａの挿入図は、ヒトの肺組織及び抹消血単球（ＰＢＭ）における１５−ＬＯｍＲＮＡの発現を示すものであり、ＮＤは、１５−ＬＯｍＲＮＡ発現が検出されなかったことを意味している。
図１Ｂは、３７℃で２０分間、［3Ｈ］−アラキドン酸（２０μＭ）にさらした透過性にしたＩＬ−１β処理したＡ５４９細胞（１．５×１０6細胞／ｍｌ）に由来する［3Ｈ］標識したモノヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィルを示すグラフである。生成物を抽出し、メタノール：Ｈ2Ｏ：酢酸（６５：３５：０．０１；ｖ／ｖ／ｖ）及びメタノール：酢酸（９９．９：０．１、ｖ／ｖ）の直線状勾配を用いるクロマトグラフィーにかけた（１．０ｍｌ／分の流量）。矢印は、合成の標準の同時クロマトグラフィーを示している。
図２Ａは、１５−ＨＥＴＥの生成を示すグラフである。Ａ５４９細胞（６×１０6細胞／フラスコ）をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、凍結融解にかけ（２サイクル）、ビヒクル（０．１％ｖ／ｖエタノール（ＥｔＯＨ））、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、チトクロームＰ４５０インヒビター（１７−オクタデシン酸（１７−ＯＤＹＡ）、５μＭ）又は５−ＬＯインヒビター（Ｒｅｖ−５９０１異性体５μＭ）に２０分間さらし、そしてアラキドン酸（２０μＭ）と共に３７℃で２０分間インキュベートした。幾つかの実験においては、インキュベーション前に細胞を熱変性した（１００℃、６０分間）。インキュベーションをメタノール（２容）の添加により停止し、生成物を、逆相（ＲＰ）−高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用に抽出した。データは、４〜６個の別々のフラスコの平均±ＳＥＭである。*、Ｐ＜０．０５及び**、Ｐ＜０．０１（処理物対対照）を示してある。
図２Ｂは、外因性起源からの１５−ＨＥＴＥ形成のタイムコースを示すグラフである。Ａ５４９細胞（１．５×１０6細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で又は不在において４８時間生育させ、そしてＡ23187（５μＭ）を伴って又は伴わないで４ｍｌのＨＢＳＳ中でインキュベートした（３７℃、３０分間）。１５−ＨＥＴＥレベルを、ＲＩＡにより測定した。結果は、二連で測定した３つの異なる実験の平均±ＳＥＭを表している。*、Ｐ＜０．０５（処理物対対照）を示してある。
図３は、ＡＳＡによりトリガーを引かれた１５−ＨＥＴＥの相対的キラリティーを示すグラフである。Ａ５４９細胞（１０7細胞／フラスコ）をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）に２４時間さらし、ビヒクル（０．１％ｖ／ｖエタノール）（□）又はＡＳＡ（■）で２０分間処理し、次いで、アラキドン酸（２０μＭ）及びＡ23187（５μＭ）を含むＨＢＳＳ中でインキュベートした（３７℃、３０分間）。生成物を、（図１Ｂのように）ＲＰ−ＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけ、そして１５−ＨＥＴＥを含む領域を集めてクロロホルムで抽出してジアゾメタンで処理した。キラル分析を、Bakerbond DNBPG（方法に詳述）を用いて行った。結果は、類似の結果を示す２つの別々の実験を表している。図３の挿入図は、ＡＳＡの存在下（塗りつぶした棒）又は不在におけるＡ５４９由来の１５Ｒと１５Ｓ−ＨＥＴＥの比を示している。
図４Ａは、上皮細胞−多形核好中球（ＰＭＮ）同時刺激からの生成物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフである。集密的Ａ５４９細胞をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）に２４時間さらし、ＡＳＡ（２０分間）で及びアラキドン酸（２０μＭ、６０秒間）で処理し、そして各々を、新たに単離したＰＭＮと共にインキュベートし（１：８のＡ５４９細胞：ＰＭＮ細胞比）、その後、４ｍｌのハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中でイオノホアＡ23187（５μＭ）で、３７℃で３０分間刺激した。生成物を、実施例５の方法の節に記載したようにして抽出して、ＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。クロマトグラムを３００ｎｍにてプロットしたが、これは、ｎ＝６の実験を示している。
図４Ｂは、図４Ａに記載した上皮細胞−ＰＭＮ同時刺激からの生成物のオンラインの紫外線（ＵＶ）スペクトルを示すグラフである。ピークＢの下に溶出している物質は、優勢に１５−エピ−ＬＸＢ4として同定された。
図４Ｃは、図４Ａに記載した上皮細胞−ＰＭＮ同時刺激からの生成物のオンラインのＵＶスペクトルを示すグラフである。図解したピークの下に溶出している物質は、優勢に１５−エピ−ＬＸＡ4として同定された。
図５Ａは、上皮細胞−ＰＭＮ同時刺激中にテトラエン含有リポキシン（リポキシンプラス１５−エピ−リポキシン）の形成を調節するＡＳＡを示すグラフである。Ａ５４９細胞を、アラキドン酸（２０μＭ、１分間）及び新たに単離したＰＭＮの添加（１：５のＡ５４９：ＰＭＮ細胞比）の前に、ＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ、２４時間）にさらし、ビヒクル（０．１％ｖ／ｖ）又はＡＳＡで処理した。同時刺激を、図４Ａにおけるようにして行った。結果は、３〜５の別々のドナーからの平均±ＳＥＭを表している。図５Ａの挿入図は、ＡＳＡの不在時（○）又は存在下（■）におけるＡ５４９細胞のＰＭＮを伴う同時インキュベーションにおけるテトラエン含有リポキシン（リポキシンプラス１５−エピ−リポキシン）の生成に対する細胞比の効果を示している。
図５Ｂは、図５Ａにおいて概説した条件に従う上皮細胞−ＰＭＮ同時刺激中のペプチドロイコトリエン（ＬＴＣ4プラスＬＴＤ4）の形成を調節するＡＳＡを示すグラフである。図５Ｂの挿入図は、ＡＳＡの不在時（○）又は存在下（■）におけるＡ５４９細胞のＰＭＮを伴う同時インキュベーションにおけるペプチドロイコトリエン（ＬＴＣ4プラスＬＴＤ4）の生成に対する細胞比の効果を示している。
図６Ａは、リポキシンＡ4（ＬＸＡ4）、リポキシンＢ4（ＬＸＢ4）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）及びビヒクル単独での、Ａ５４９細胞数に対する経時的処置の効果を示すグラフである。９６ウェルプレート中のＡ５４９細胞を、ビヒクル（０．１５％ＥｔＯＨ）又は等モル濃度（１０-6Ｍ）のＬＸＡ4、ＬＸＢ4又はＤＥＸで、最長で９６時間３７℃で処理した。示した間隔で、細胞を、３，（４，５−ジメチルチアゾイル−２−イル）２，５（ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）ＭＴＴアッセイ用に採取した。データは、四連で行った３〜７の実験の平均±ＳＥＭである。化合物対ビヒクルについて、*、Ｐ＜０．０５及び**、Ｐ＜０．００５を示してある。
図６Ｂは、Ａ５４９細胞濃度を変化させたときの、Ａ５４９細胞増殖の阻害パーセントに対するＬＸＡ4、ＬＸＢ4及びＤＥＸ処理の効果を示すグラフである。Ａ５４９細胞を、示した濃度にて、ＬＸＡ4、ＬＸＢ4又はＤＥＸに、３７℃で、７２時間さらした。結果は、四連で行った５〜８実験の平均±ＳＥＭである。結果は、ビヒクルに対する増殖の阻害パーセントとして表してある。化合物対ビヒクルについて、*、Ｐ＜０．０５**、Ｐ＜０．０２５及び***、Ｐ＜０．００５を示してある。
図７Ａは、Ａ５４９細胞をＬＸＡ4、ＬＸＢ4及びＤＥＸ（５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲で濃度を変える）の存在下で７２時間生育させる３Ｈ−チミジンの取込みで示した該細胞のＤＮＡ合成に対するＬＸＡ4、ＬＸＢ4及びＤＥＸの効果を示すグラフである。アッセイの２４時間前に、メチル［3Ｈ］チミジン（２μＣｉ／ｍｌ）を各ウェルに加えた。続いて、細胞を、ＤＰＢＳ2+（４℃）で４回洗い、０．２５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で溶解させ、そして放射能の取込みをモニターした。値は、四連で行った３つの異なる実験の平均±ＳＥＭを表している。結果は、ビヒクル単独に対する［3Ｈ］チミジンの取込みのパーセントとして表してある。化合物対ビヒクルについて、*、Ｐ＜０．０５及び**、Ｐ＜０．００５を示してある。
図７Ｂは、Ａ５４９細胞をＬＸＡ4、ＬＸＢ4及びＤＥＸ（１μＭ）の存在下で、１２ウェルの培養プレートに播種し、トリパン排除細胞を数えることにより７２時間の時点において細胞カウントを得た場合における、Ａ５４９細胞の阻害に対するＬＸＡ4、ＬＸＢ4及びＤＥＸの効果を示すグラフである。値は、３つの異なる実験の平均±ＳＥＭを表している。結果は、緩衝液に対する増殖阻害パーセントとして表してある。化合物対ビヒクルについて、*、Ｐ＜０．０５を示してある。
図８は、１５−エピ−リポキシン生成に対して提案される生化学的経路を示す図式である。ＡＳＡ−アセチル化ＰＧＨＳ−２及び／又はＰ４５０活性は、１５Ｒ−ＨＥＴＥに寄与する。上皮の１５Ｒ−ＨＥＴＥは、白血球５−ＬＯにより細胞間変換を受けて１５−エピ−５（６）−エポキシテトラエン中間体となり、これは、１５−エピ−ＬＸＡ4及び１５−エピ−ＬＸＢ4の両者に共通である。
発明の詳細な説明
ここで用いる場合、以下の語句を以下のように定義する：
「リポキシン化合物」は、天然のリポキシン化合物（リポキシンＡ4又はリポキシンＢ4）及び／又は／リポキシンアナログを意味する。
「リポキシンアナログ」は、「天然のリポキシン」の活性領域と同様に作用する「活性領域」を有するが、天然のリポキシンと異なる「代謝変換領域」を有する化合物を意味する。リポキシンアナログには、天然のリポキシンに構造的に類似する化合物、同じレセプター認識部位を共有する化合物、リポキシンと同じ又は類似のリポキシン代謝変換領域を共有する化合物、及びリポキシンのアナログであるとして技術的に認められる化合物が含まれる。リポキシンアナログには、リポキシンアナログ代謝産物が含まれる。ここに開示した化合物は、少なくとも１つの不斉中心を含むことができる。不斉炭素原子が存在する場合には、少なくとも１つの立体異性体が可能であり、すべての可能な異性体型は、示された構造表示内に含まれることを意図している。光学活性な（Ｒ）及び（Ｓ）異性体は、当業者に公知の慣用技術を用いて分離することができる。本発明は、可能なジアステレオ異性体並びにラセミ及び光学的に分割される異性体を包含することを意図している。
主題の発明で用いるのに好適なリポキシン化合物は、「１５−エピ−リポキシン化合物」である。ここで用いる場合、「１５−エピ−リポキシン化合物」は、１５炭素における絶対配置がＲであるリポキシン化合物である。
この用語「１５−エピ−リポキシン化合物」は、前駆体を包含することを意図している。用語「前駆体」は、イン・ビボ、エキソ・ビボ及び／又はイン・ビトロで変換して、この発明の１５−エピ−リポキシン化合物を形成することのできる化学的中間体をいうことを意図している。用語「前駆体」は又、イン・ビボでこの発明の１５−エピ−リポキシン化合物に変換されるプロドラッグをも企図している（例えば、R.B.Silverman,1992,「The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action」、Academic Press,第８章を参照されたい）。かかるプロドラッグの例には、イン・ビボ、エキソ・ビボ及び／又はイン・ビトロで、本発明の１５−エピ−リポキシン化合物に加水分解され得、或いは、変換され得る水酸化物のエステル及び／又はカルボキシル基及び／又は化合物が含まれるが、これらに限定されない。
用語「対応するリポキシン」及び「天然のリポキシン」は、天然のリポキシン又はリポキシン代謝産物をいう。アナログがリポキシン特異的なレセプターに対する活性を有する場合には、対応する又は天然のリポキシンは、そのレセプターに対する正常のリガンドである。例えば、アナログが、分化したＨＬ−６０細胞上のＬＸＡ4特異的レセプターに対する特異的活性を有するＬＸＡ4アナログである場合、対応するリポキシンは、ＬＸＡ4である。アナログが他の化合物（例えばロイコトリエン）に対するアンタゴニストとしての活性（これは、天然のリポキシンによって打ち消される）を有する場合には、その天然のリポキシンは、対応するリポキシンである。
用語「活性領域」は、イン・ビボでの細胞相互作用に関係する天然のリポキシン又はリポキシンアナログの領域を意味する。この活性領域は、細胞のリポキシンレセプターの、又は巨大分子若しくは巨大分子複合体（酵素及びその補因子を含む）の「認識部位」に結合することができる。好適なリポキシンＡ4アナログは、天然のリポキシンＡ4のＣ5〜Ｃ15を含む活性領域を有する。好適なリポキシンＢ4アナログは、天然のリポキシンＢ4のＣ5〜Ｃ14を含む活性領域を有する。
用語「認識部位」又はレセプターは、技術的に認められ、一般に、機能的巨大分子（ある群の細胞性メッセンジャー例えばホルモン、ロイコトリエン及びリポキシンは、これらのメッセンジャーに対する生化学的及び生理学的応答が開始される前に、先ずこの巨大分子と相互作用しなければならない）又は巨大分子の複合体をいうことを意図している。この出願で用いる場合には、レセプターは、無傷の若しくは透過性にした細胞において、又は組織（器官を含む）において単離することができる。レセプターは、生きた患者からのものであってもその患者中にあってもよく、又はクローン化することができる。レセプターは、正常に存在するものであっても、病気の状態により、傷害により又は人為的手段により誘導されるものであってもよい。この発明の化合物は、可逆的に、不可逆的に、競争的に、非競争的に、又は不競争的に（認識部位の天然基質に関して）結合することができる。
用語「代謝変換領域」は、一般に、リポキシン、リポキシンの代謝産物又はリポキシンアナログ（リポキシンアナログの代謝産物を含む）の部分であって、そこで、酵素又は酵素とその補因子が少なくとも一の代謝変換を行うことを試みる部分をいうことを意図している（該酵素又は酵素と補因子は、通常、リポキシンにて変換する）。この代謝変換領域は、変換を受け易くてよいか又は受け易くてはいけない。リポキシンの代謝変換領域の非制限的例は、Ｃ−１３，１４二重結合若しくはＣ−１５水酸基又はこれら両者を含むＬＸＡ4の部分である。
用語「検出可能な標識分子」には、検出可能な標識分子が結合する化合物又はレセプター認識部位を追跡し又は同定するのに用いられる蛍光性、燐光性及び放射性標識した分子が含まれる。この標識分子は、当分野で公知の幾つかの方法の何れかによって検出することができる。
用語「標識したリポキシンアナログ」は、更に、放射性同位体（例えば、トリチウム（3Ｈ）、ジューテリウム（2Ｈ）、炭素（14Ｃ）、これらに限らない）で標識した化合物、或いは、別の方法で（例えば、蛍光で）標識した化合物を包含することが理解される。この発明の化合物は、例えば、動力学的結合実験のために、代謝経路及び酵素的機構を更に解明するために、又は分析化学の分野で公知の方法による特性決定のために標識し又は誘導体化することができる。
用語「代謝を阻害する」は、天然のリポキシンを代謝する酵素活性をブロックし又は減少させることを意味する。このブロック又は減少は、共有結合により、不可逆的結合により、不可逆的結合の実質的効果を有する可逆結合により、又は酵素がその通常の様式で他のリポキシンアナログ（リポキシンアナログ代謝産物を含む）、リポキシン又はリポキシン代謝産物に作用することを阻止する任意の他の手段により生じ得る。
用語「代謝に抵抗する」は、リポキシンを代謝させる酵素の少なくとも１つによる少なくとも１つの代謝分解性変換を受けられないことを包含することを意図している。代謝に抵抗するＬＸＡ4アナログの２つの非制限的例は、１）１５−オキソ型に酸化することのできない構造、及び２）１５−オキソ型に酸化することはできるが１３，１４−ジヒドロ型への酵素的還元を受け易くない構造である。
用語「一層ゆっくり代謝を受ける」は、一層遅い反応動力学を有すること、又はリポキシンＡを代謝させる酵素の少なくとも１つによる代謝変換のシリーズの完結に一層の時間を要することを意味する。一層ゆっくり代謝を受けるＬＸＡ4アナログの非制限的例は、Ｃ−１５の水素化について、アナログがＣ−１６において立体的に障害を受けるので、ＬＸＡ4より一層高い遷移状態エネルギーを有する構造である。
用語「組織」は、無傷の細胞、血液、血液標品例えば血漿及び血清、骨、関節、筋肉，平滑筋及び臓器を包含することを意図している。
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素、又はフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを包含することを意味する。
用語「製薬上許容し得る塩」は、技術的に認められた製薬上許容し得る塩を包含することを意図している。これらの非毒性塩は、通常、生理的条件下で加水分解され、有機及び無機の塩基を包含する。塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、銅及びアルミニウム並びに第１、第２及び第３アミン、塩基性イオン交換樹脂、プリン、ピペラジン等が含まれる。この用語は、更に、低級炭化水素基例えばメチル、エチル及びプロピルのエステルを包含することを意図している。
用語「製薬組成物」は、少なくとも１種のリポキシンアナログ又は、その製薬上許容し得る塩を活性成分として含み、製薬上許容し得るキャリアー及び適宜他の成分をも含むことができる。これらの組成物は、経口投与、直腸投与、眼への投与、肺投与、鼻投与、皮膚投与、局所投与、非経口投与（皮下投与、筋肉投与及び静脈投与）又は吸入投与に適した組成物を包含する。如何なる特定の症例においても最も適当な経路は、治療される病気の性質及び重さ並びに活性成分の性質に依存するであろう。これらの組成物は、単位投薬形態で提供することができ且つ製薬分野で周知の方法の何れかによって調製することができる。投薬養生法は、治療応答を改善する目的に合わせて調節することができる。例えば、幾つかの分割された投薬を毎日投与することができ、又は投与量を経時的に減らすことができる。当業者は、通常、有効投薬量及び適当な養生法を決定することができる。リポキシンアナログの製薬組成物は又、リポキシン、リポキシンアナログ及び／又はリポキシン代謝産物（リポキシンアナログの代謝産物を含む）を含む組合せをもいうことができる。組合せの非制限的例は、リポキシンを代謝させる一の酵素を阻害し且つ適宜リポキシンレセプター認識部位との特異的活性を有するリポキシンアナログｘ、及びリポキシンレセプター認識部位との特異的活性を有し且つ適宜リポキシン代謝を阻害し若しくは抵抗する第２のリポキシンアナログｙを含む混合物である。この組合せは、ｘがりポキシンを代謝させる酵素の１つを阻害するので、少なくともｙについて一層長い組織半減期を生じる。従って、ｙにより媒介され又は打ち消されるリポキシン作用は、増大される。
用語「実質的に純粋な又は精製された」リポキシン化合物は、約２０％（乾燥重量）未満の他の生物学的巨大分子を有し、好ましくは約５％未満の他の生物学的巨大分子を有する天然の又は合成の化合物を包含するとして定義される（但し、水、緩衝剤及び他の低分子、特に５０００未満の分子量を有する分子は、存在してよい）。用語「精製された」は、ここで用いる場合、好ましくは、少なくとも８０％（乾燥重量）の、一層好ましくは９５〜９９重量％の範囲の、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％の同じ型の生物学的巨大分子の存在を意味する（但し、水、緩衝剤及び他の低分子、特に５０００未満の分子量を有する分子は、存在してよい）。用語「純粋な」は、ここで用いる場合、好ましくは、すぐ上の「精製された」と同じ数値限定を有する。「単離された」及び「精製された」は、本来の状態の天然物質も包含しないし、成分に分離された（例えば、アクリルアミドゲルにて）が、純粋な物質又は溶液（例えば、夾雑蛋白質又はクロマトグラフィーの試薬例えば変性剤及びポリマー例えばアクリルアミド又はアガロースがない）として得られていない天然物質も包含しない。
用語「患者」は、炎症、炎症性応答、血管収縮、ミエロイド抑制及び／又は望ましくない細胞増殖により引き起こされる病気にかかり易い生きた生物を包含することを意図している。患者の例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ及びマウスが含まれる。この用語患者は、更に、トランスジェニック種を包含することを意図している。
用語「細胞増殖性疾患」は、細胞の望ましくない増殖を含む病気を包含する。かかる病気の非制限的例には、腫瘍（例えば、脳、肺（小細胞及び非小細胞）、卵巣、前立腺、乳腺又は大腸の腫瘍）又は他の癌腫若しくは肉腫（例えば、白血病、リンパ腫）が含まれる。
用語「改善された」は、望ましくない細胞増殖及び／又は細胞増殖性疾患の治療、予防、制限及び／又は阻止を包含することを意図している。
リポキシン化合物
本発明は、実質的に純粋な１５−エピ−リポキシン化合物が患者における望ましくない細胞増殖を改善するという驚くべき発見に基づいている。本発明の１５−エピ−リポキシン化合物は、１５Ｒ−５，６，１５−トリヒドロキシ−７，９，１３−トランス−１１−シス−エイコサテトラエン酸を、５Ｓ、６Ｒ配置（１５−エピ−ＬＸＡ4）で含む。本発明の１５−エピ−リポキシン化合物は又、１５Ｒ−５，１４，１５−トリヒドロキシ−６，１０，１２−トランス−８−シス−エイコサテトラエン酸を、５Ｓ，１４Ｒ配置（１５−エピ−ＬＸＢ4）で含む。本発明の１５−エピ−リポキシンは、更に、１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸を含む（特に、１５Ｒ配置で）。
本発明は、リポキシンがイン・ビボである細胞により独特の様式で急速に代謝されるという驚くべき発見に基づいている。他のＬＯ誘導された生成物（例えば、ロイコトリエン）は、ω酸化とその後のβ酸化によって代謝される（Huwyler等（1992）Eur.J.Biochem.206,869-879）にもかかわらず、本発明は、リポキシンが、リポキシン分子のある部位に作用する一連の酸化及び還元反応により代謝されるという予想外の発見に基づいている。例えば、ＬＸＡ4代謝は、少なくとも部分的には、Ｃ−１５ヒドロキシルの酸化によって生じ、１５−オキソ−ＬＸＡ4を生成すること、Ｃ−１３，１４二重結合の還元が１３，１４−ジヒドロ−１５−オキソ−ＬＸＡ4を生じ、更なる還元が１３，１４−ジヒドロ−ＬＸＡ4を生じることが見出されている。ＬＸＢ4及びその天然の異性体においては、類似の酸化がＣ−５ヒドロキシルにおいて生じ、還元がＣ−６，７二重結合にて生じる。
従って、本発明は、リポキシン活性を有するが、イン・ビボでの脱水素及びその後の分解を阻止するように化学的に修飾されたリポキシンアナログを特徴とする。これらのアナログにおいて、天然のリポキシンのＣ−１〜Ｃ−１３部分は、保存され得、又は保存され得ない。Ｃ−１〜Ｃ−１３部分の変種は、異なるシス又はトランスジオメトリー並びに置換を含む。これらの開示した化合物は、以下で、構造の属（これは、更に、亜属に分割される）により表される。下記の２つのＲ基の各々に含まれる亜属は、ページの左にローマ数字により表示する。
「活性領域」及び「代謝変換領域」（これらの用語は、両方とも、本明細書中に規定されている）を含む本願のリポキシンは、一般に、下記の構造のものである：
0004060366.tif 000002
｛式中、Ｒ1は、
0004060366.tif 000003
であってよく、そしてＲ2は、
0004060366.tif 000004
であってよい｝。
一具体例において、この発明のリポキシンアナログは、下記の構造式Ｉを有する：
0004060366.tif 000005
｛式中、Ｘは、Ｒ1、ＯＲ1又はＳＲ1であり；
（ここに、Ｒ1は、
（i）水素；
（ii）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（iii）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（iv）７〜１２炭素原子のアラルキル；
（v）フェニル；
（vi）置換されたフェニル
0004060366.tif 000006
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、−ＳＯ3Ｈ及び水素よりなる群から選択され；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択される）
（vii）検出可能な標識分子；又は
（viii）２〜８炭素原子の直鎖又は分枝鎖アルケニルである）
式中、Ｑ1は、（Ｃ＝Ｏ）、ＳＯ2又は（ＣＮ）であり；
式中、Ｑ3は、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
式中、Ｒ2及びＲ3の一方は、水素であり、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）３〜６炭素原子のシクロアルキル；
（ｄ）２〜８炭素原子のアルケニル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｅ）ＲaＱ2Ｒb
（ここに、Ｑ2は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）であり；
式中、Ｒ4は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜６炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；
式中、Ｙ1又はＹ2は、−ＯＨ、メチル又は−ＳＨであり、そして式中、他方は、
（ａ）Ｈ
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３；そしてＺは、シアノ、ニトロ又はハロゲンである）；
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｄ）１〜４炭素原子のアルコキシであり；
或は、Ｙ1及びＹ2は、一緒になって
（ａ）＝Ｎ；又は
（ｂ）＝Ｏであり；
式中、Ｒ5は、
（ａ）１〜９炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｂ）−（ＣＨ2）n−Ｒi
（ここに、ｎ＝０〜４であり且つＲiは、
（i）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（ii）フェニル；又は
（iii）置換されたフェニル
0004060366.tif 000007
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、水素、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、メトキシ及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択し；そしてここに、Ｚii及びivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択する）である）；
（ｃ）−ＲaＱaＲb
（ここに、Ｑa＝−Ｏ−又は−Ｓ−；
ここに、Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
ここに、Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）；
（ｄ）−Ｃ（Ｒiii）（Ｒiv）−Ｒi
（ここに、Ｒiii及びＲivは、独立に、下記よりなる群から選択する
（i）Ｈ；
（ii）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０＋３、そして任意のＺは、ハロゲンよりなる群から独立に選択する））；
（ｅ）１〜８炭素原子及び１〜６ハロゲン原子のハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；
そして
式中、Ｒ6は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）ハロゲンである；但し、Ｃ−１位アミド、Ｃ−１位アルカノエート、及び製薬上許容し得る（５Ｓ，６Ｒ，１５Ｓ）−トリヒドロキシ−７Ｅ，９Ｅ，１１Ｚ，１３Ｅ−エイコサテトラエン酸（ＬＸＡ4）のＣ−１位塩を除く；又、ＬＸＡ4のＣ−５、Ｃ−６及びＣ−１５位アルカノエートを除く｝。
この発明の一具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造IIを有する：
0004060366.tif 000008
｛式中、Ｘは、Ｒ1、ＯＲ1又はＳＲ1であり；
（ここに、Ｒ1は
（i）水素；
（ii）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（iii）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（iv）７〜１２炭素原子のアラルキル；
（v）フェニル；
（vi）置換されたフェニル
0004060366.tif 000009
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、水素及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択され；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択される）
（vii）検出可能な標識分子例えば制限はしないが蛍光標識；又は
（viii）２〜８炭素原子の直鎖又は分枝鎖アルケニルである）
式中、Ｑ1は、（Ｃ＝Ｏ）、ＳＯ2又は（Ｃ＝Ｎ）であり；
式中、Ｑ3は、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
式中、Ｒ2及びＲ3の一方は、水素であり、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）３〜６炭素原子のシクロアルキル；
（ｄ）２〜８炭素原子のアルケニル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｅ）ＲaＱ2Ｒb
（ここに、Ｑ2は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）であり；
式中、Ｒ4は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜６炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；
式中、Ｙ1又はＹ2は、−ＯＨ、メチル、−Ｈ又は−ＳＨであり、そして式中、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３Ｚは、シアノ、ニトロ又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを含むハロゲンである）；
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｄ）１〜４炭素原子のアルコキシであり；
或は、Ｙ1及びＹ2は、一緒になって
（ａ）＝Ｎ；又は
（ｂ）＝Ｏであり；
式中、Ｒ5は、
（ａ）１〜９炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｂ）−（ＣＨ2）n−Ｒi
（ここに、ｎ＝０〜４であり且つＲiは、
（i）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（ii）フェニル；又は
（iii）置換されたフェニル
0004060366.tif 000010
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、水素、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、メトキシ及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択し；ここに、Ｚi及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択する）である）；
（ｃ）−ＲaＱaＲb
（ここに、Ｑa＝−Ｏ−又は−Ｓ−；そして
ここに、Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
ここに、Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）；
（ｄ）−Ｃ（Ｒiii）（Ｒiv）−Ｒi
（ここに、Ｒiii及びＲivは、独立に、下記よりなる群から選択する
（i）Ｈ；及び
（ii）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０＋３、任意のＺは、ハロゲンよりなる群から独立に選択する））；
（ｅ）１〜８炭素原子及び１〜６ハロゲン原子のハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）である｝。
この発明の一具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造IIIを有する：
0004060366.tif 000011
｛式中、Ｘは、Ｒ1、ＯＲ1又はＳＲ1であり；
（ここに、Ｒ1は
（i）水素；
（ii）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（iii）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（iv）７〜１２炭素原子のアラルキル；
（v）フェニル；
（vi）置換されたフェニル
0004060366.tif 000012
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、水素及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択され；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択される）
（vii）検出可能な標識分子；又は
（viii）２〜８炭素原子の直鎖又は分枝鎖アルケニルである）
式中、Ｑ1は、（Ｃ＝Ｏ）、ＳＯ2又は（Ｃ＝Ｎ）であり；
式中、Ｑ3は、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
式中、Ｒ2及びＲ3の一方は、水素であり、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）３〜６炭素原子のシクロアルキル；
（ｄ）２〜８炭素原子のアルケニル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｅ）ＲaＱ2Ｒb
（ここに、Ｑ2は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）であり；
式中、Ｒ4は、
（ａ）Ｈ；又は
（ｂ）１〜６炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；
式中、Ｙ1又はＹ2は、ヒドロキシル、メチル、水素又はチオールであり、そして式中、
他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３Ｚは、シアノ、ニトロ又はハロゲン［Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを含む］である）；
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｄ）１〜４炭素原子のアルコキシであり；
或は、Ｙ1及びＹ2は、一緒になって
（ａ）＝Ｎ；又は
（ｂ）＝Ｏであり；そして
式中、Ｒ5は、
（ａ）１〜９炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｂ）−（ＣＨ2）n−Ｒi
（ここに、ｎ＝０〜４であり且つＲiは、
（i）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（ii）フェニル；
（iii）置換されたフェニル
0004060366.tif 000013
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、水素、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、メトキシ及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択し；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択する）である）；
（ｃ）−ＲaＱaＲb
（ここに、Ｑa＝−Ｏ−又は−Ｓ−；
ここに、Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
ここに、Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）；又は
（ｄ）−Ｃ（Ｒiii）（Ｒiv）−Ｒi
（ここに、Ｒiii及びＲivは、独立に、下記よりなる群から選択する
（i）Ｈ；
（ii）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０＋３、Ｚは、ハロゲンよりなる群から独立に選択する））である｝。
この発明の他の具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造式IVを有する：
0004060366.tif 000014
｛式中、Ｘは、Ｒ1、ＯＲ1又はＳＲ1であり；
（ここに、Ｒ1は
（i）水素；
（ii）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（iii）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（iv）７〜１２炭素原子のアラルキル；
（v）フェニル；
（vi）置換されたフェニル
0004060366.tif 000015
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、メトキシ、水素及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択され；ここに、Ｚii及びＺｉivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択される）
（vii）検出可能な標識分子；又は
（viii）２〜８炭素原子の直鎖又は分枝鎖アルケニルである）
式中、Ｑ1は、（Ｃ＝Ｏ）、ＳＯ2又は（ＣＮ）であり；
式中、Ｑ3は、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
式中、Ｒ2及びＲ3の一方は、水素であり、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）３〜６炭素原子のシクロアルキル；
（ｄ）２〜８炭素原子のアルケニル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｅ）ＲaＱ2Ｒb
（ここに、Ｑ2は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）であり；
式中、Ｒ4は、
（ａ）Ｈ；又は
（ｂ）１〜６炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；
式中、Ｙ1又はＹ2は、−ＯＨ、メチル又は−ＳＨであり、そして式中、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３Ｚは、シアノ、ニトロ又はハロゲンである）；
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｄ）１〜４炭素原子のアルコキシであり；
或は、Ｙ1及びＹ2は、一緒になって
（ａ）＝Ｎ；又は
（ｂ）＝Ｏであり；
式中、Ｒ5は、
（ａ）１〜９炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｂ）−（ＣＨ2）n−Ｒi
（ここに、ｎ＝０〜４であり且つＲiは、
（i）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（ii）フェニル；又は
（iii）置換されたフェニル
0004060366.tif 000016
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、水素、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、メトキシ及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択し；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択する）である）；
（ｃ）ＲaＱaＲb
（ここに、Ｑa＝−Ｏ−又は−Ｓ−；
ここに、Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
ここに、Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）；
（ｄ）−Ｃ（Ｒiii）（Ｒiv）−Ｒi
（ここに、Ｒiii及びＲivは、独立に、下記よりなる群から選択する
（i）Ｈ；又は
（ii）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０＋３、そしてＺは、ハロゲンよりなる群から独立に選択する））；又は
（ｅ）１〜８炭素原子及び１〜６ハロゲン原子ののハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；
そして
Ｒ6は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｃ）ハロゲンである｝。
この発明の他の具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造式Ｖを有する：
0004060366.tif 000017
｛式中、Ｒ1は
（i）水素；
（ii）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（iii）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（iv）７〜１２炭素原子のアラルキル；
（v）フェニル；
（vi）置換されたフェニル
0004060366.tif 000018
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1、水素及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択され；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素及びヒドロキシルよりなる群から選択される）
（vii）検出可能な標識分子；又は
（viii）２〜８炭素原子の直鎖又は分枝鎖アルケニルである）
式中、ｎ＝１〜１０であり；
式中、Ｒ2、Ｒ3a及びＲ3bは、独立に、下記より選択し；
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）３〜６炭素原子のシクロアルキル；
（ｄ）２〜８炭素原子のアルケニル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｅ）ＲaＱ2Ｒb
（ここに、Ｑ2は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；そして
Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）であり；
式中、Ｙ1又はＹ2は、−ＯＨ、メチル、水素又は−ＳＨであり、そして式中、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３Ｚは、シアノ、ニトロ又はハロゲンである）；
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｄ）１〜４炭素原子のアルコキシであり；
或は、Ｙ1及びＹ2は、一緒になって
（ａ）＝Ｎ；又は
（ｂ）＝Ｏであり；
式中、Ｙ3又はＹ4は、−ＯＨ、メチル、水素又は−ＳＨであり、そして式中、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３任意のＺは、シアノ、ニトロ又はハロゲンである）；
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｄ）１〜４炭素原子のアルコキシであり；
或は、Ｙ3及びＹ4は、一緒になって
（ａ）＝Ｎ；又は
（ｂ）＝Ｏであり；
式中、Ｙ5又はＹ6は、−ＯＨ、メチル、水素又は−ＳＨであり、そして式中、他方は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３任意のＺは、シアノ、ニトロ又はハロゲンである）；
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｄ）１〜４炭素原子のアルコキシであり；
或は、Ｙ5及びＹ6は、一緒になって
（ａ）＝Ｎ；又は
（ｂ）＝Ｏであり；
式中、Ｒ5は、
（ａ）１〜９炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｂ）−（ＣＨ2）n−Ｒi
（ここに、ｎ＝０〜４であり且つＲiは、
（i）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（ii）フェニル；又は
（iii）置換されたフェニル
0004060366.tif 000019
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、水素、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択し；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素、メトキシ及びヒドロキシルよりなる群から選択する）である）；
（ｃ）ＲaＱaＲb
（ここに、Ｑa＝−Ｏ−又は−Ｓ−であり；そして
ここに、Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
ここに、Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）又は置換されたフェニルである）；
（ｄ）−Ｃ（Ｒiii）（Ｒiv）−Ｒi
（ここに、Ｒiii及びＲivは、独立に、下記よりなる群から選択する
（i）Ｈ；又は
（ii）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０＋３、そしてＺは、ハロゲンよりなる群から独立に選択する））；又は
（ｅ）１〜８炭素原子及び１〜６ハロゲン原子ののハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；但し、Ｃ−１位アミド、Ｃ−１位アルカノエート、及び製薬上許容し得る（５Ｓ、１４Ｒ、１５Ｓ）−トリヒドロキシ−６Ｅ、８Ｚ、１０Ｅ、１２Ｅ−エイコサテトラエン酸（ＬＸＢ4）のＣ−１位塩を除く；又、ＬＸＢ4のＣ−５、Ｃ−６及びＣ−５位アルカノエートを除く｝。
この発明の他の具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造式VIを有する：
0004060366.tif 000020
式中、Ｒaは、下記の群より選択し；
（ａ）Ｈ；又は
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル；
式中、Ｒbは、下記よりなる群から選択する：
0004060366.tif 000021
この発明の他の好適具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造式VIIを有する：
0004060366.tif 000022
式中、Ｒaは、下記の群より選択し；
（ａ）Ｈ；又は
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル；
式中、Ｒb及びＲcは、独立に、下記の群から選択する：
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ヒドロキシル、又はチオール；
（ｃ）メチル又はハロメチル（−ＣＦ3及び−ＣＨ2Ｆを含む）；
（ｄ）ハロゲン；
（ｅ）１〜３炭素原子のアルコキシ（メトキシを含む）；
式中、Ｒd及びＲeは、独立に、下記の群から選択し；
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ヒドロキシル、又はチオール；
（ｃ）メチル又はハロメチル（−ＣＦ3及び−ＣＨ2Ｆを含む）；
（ｄ）ハロゲン；
（ｅ）１〜３炭素原子のアルコキシ（メトキシを含む）；又は
（ｆ）２〜４炭素原子のアルキル又はハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
但し、Ｃ−１位アミド、Ｃ−１位アルカノエート、及び製薬上許容し得る（５Ｓ、６Ｒ、１５Ｓ）−トリヒドロキシ−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１３Ｅ−エイコサテトラエン酸（ＬＸＡ4）のＣ−１位塩；ＬＸＡ4のＣ−５、Ｃ−６及びＣ−１５位アルカノエートを除く。
この発明の他の好適具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造式VIIIを有する：
0004060366.tif 000023
式中、Ｒaは、下記の群より選択し；
（ａ）Ｈ；又は
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル；
式中、Ｒb及びＲcは、独立に、下記の群から選択する：
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ヒドロキシル、又はチオール；
（ｃ）ハロメチル（ＣＦ3を含む）；
（ｄ）ハロゲン；
（ｅ）１〜３炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｆ）１〜３炭素原子のアルコキシ；
式中、Ｒd及びＲeは、独立に、下記の群から選択する
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ヒドロキシル、又はチオール；
（ｃ）メチル又はハロメチル（−ＣＦ3及び−ＣＨ2Ｆを含む）；
（ｄ）ハロゲン；
（ｅ）１〜３炭素原子のアルコキシ（メトキシを含む）；又は
（ｆ）２〜４炭素原子のアルキル又はハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）。
この発明の他の好適具体例において、リポキシンアナログは、下記の構造式IXを有する：
0004060366.tif 000024
式中、Ｒaは、下記の群より選択し；
（ａ）Ｈ；又は
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル；
式中、Ｒb及びＲcは、独立に、下記の群から選択する：
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ヒドロキシル、又はチオール；
（ｃ）ハロメチル（ＣＦ3及びＣＨ2Ｆを含む）；
（ｄ）ハロゲン；
（ｅ）１〜３炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｆ）１〜３炭素原子のアルコキシ；そして
式中、Ｒ5は、
（ａ）１〜９炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｂ）−（ＣＨ2）n−Ｒi
（ここに、ｎ＝０〜４であり且つＲiは、
（i）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（ii）フェニル；又は
（iii）置換されたフェニル
0004060366.tif 000025
（ここに、Ｚi、Ｚiii及びＺvは、各々、独立に、水素、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1及び−ＳＯ3Ｈよりなる群から選択し；ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素、メトキシ及びヒドロキシルよりなる群から選択する）である）；
（ｃ）ＲaＱaＲb
（ここに、Ｑa＝−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
ここに、Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
ここに、Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）
又は置換されたフェニルである）；
（ｄ）−Ｃ（Ｒiii）（Ｒiv）−Ｒi
（ここに、Ｒiii及びＲivは、独立に、下記よりなる群から選択する
（i）Ｈ；又は
（ii）ＣＨaＺb（
ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０＋３、そしてＺは、ハロゲンよりなる群から独立に選択する））；又は
（ｅ）１〜８炭素原子及び１〜６ハロゲン原子ののハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）である。
この発明の他の好適具体例において、これらの化合物は、下記の構造式Ｘを有する：
0004060366.tif 000026
式中、Ｒaは、下記の群より選択し；
（ａ）Ｈ；又は
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
式中、Ｒb及びＲcは、独立に、下記の群から選択する：
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ヒドロキシル、又はチオール；
（ｃ）ハロメチル（例えば、ＣＦ3を含む）；
（ｄ）ハロゲン；
（ｅ）１〜３炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｆ）１〜３炭素原子のアルコキシ（メトキシを含む）；
この発明の他の好適具体例において、これらの化合物は、下記の構造式ＸＩを有する：
0004060366.tif 000027
式中、Ｒaは、
（i）水素；
（ii）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（iii）検出可能な標識分子であり；
式中、ｎ＝１〜１０；
式中、Ｙ2、Ｒ3a及びＲ3bは、独立に、下記より選択し；
（ａ）Ｈ；
（ｂ）１〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）３〜６炭素原子のシクロアルキル；
（ｄ）２〜８炭素原子のアルケニル（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｅ）ＲaＱ2Ｒb
（ここに、Ｑ2は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；そして
Ｒbは、０〜８炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）である）であり；
式中、Ｙ1は、−ＯＨ、メチル又は−ＳＨであり、
式中、Ｙ2は、
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３Ｚは、ハロゲンである）；又は
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；
式中、Ｙ3及びＹ5は、独立に、下記よりなる群から選択し；
（ａ）Ｈ；
（ｂ）ＣＨaＺb
（ここに、ａ＋ｂ＝３、ａ＝０〜３、ｂ＝０〜３任意のＺは、シアノ、ニトロ又はハロゲンである）；又は
（ｃ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
式中、Ｙ4及びＹ6は、独立に、下記よりなる群から選択し；
（ａ）Ｈ；
（ｂ）２〜４炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｃ）１〜４炭素原子のアルコキシ（直鎖又は分枝鎖）；又は
（ｄ）ヒドロキシル又はチオール；そして
式中、Ｒ5は、
（ａ）１〜９炭素原子のアルキル（直鎖又は分枝鎖）；
（ｂ）−（ＣＨ2）n−Ｒi
（ここに、ｎ＝０〜３であり且つＲiは、
（i）３〜１０炭素原子のシクロアルキル；
（ii）フェニル；又は
（iii）置換されたフェニル
0004060366.tif 000028
（ここに、Ｚii及びＺivは、各々、独立に、ハロゲン、メチル、水素、メトキシ及びヒドロキシルよりなる群から選択する）である）；
（ｃ）ＲaＱａＲb
（ここに、Ｑa＝−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
ここに、Ｒaは、０〜６炭素原子のアルキレン（直鎖又は分枝鎖）であり；
ここに、Ｒbは、
0004060366.tif 000029
（ｄ）１〜８炭素原子及び１〜６ハロゲン原子ののハロアルキル（直鎖又は分枝鎖）であり；但し、Ｃ−１位アミド、Ｃ−１位アルカノエート、及び製薬上許容し得る（５Ｓ、１４Ｒ、１５Ｓ）−トリヒドロキシ−６Ｅ、８Ｚ、１０Ｅ、１２Ｅ−エイコサテトラエン酸（ＬＸＢ4）のＣ−１位塩を除く；又、ＬＸＢ4のＣ−５、Ｃ−６及びＣ−５位アルカノエート（アセテート）を除く｝。
この発明の最も好適な具体例において、この発明の化合物は、下記の構造式を有する：
0004060366.tif 000030
0004060366.tif 000031
式中、Ｒ’は、Ｈ又はＣＨ3であり；
そして、式中、Ｃ*における置換基は、Ｒ配置である。
この発明の他の好適具体例において、この発明の化合物は、下記の構造式を有する：
0004060366.tif 000032
0004060366.tif 000033
リポキシン化合物の製造方法
好適な化合物を、特に下記の実施例１に記載のようにして製造することができる。この発明の他の化合物を、標準的な化学の方法例えば選択的水素化、Ｐｄ（０）−Ｃｕ（Ｉ）カップリング、ウィッチヒ型カップリング、シャープレスエポキシ化及び主な中間体のカップリング後の不斉還元（以下に及び文献に記載）を用いてこの発明の安定なＬＸアナログを生成するリポキシン（ＬＸ）及びプロスタグランジンアナログ合成用の合わせたストラテジーによって製造することができる（Webber,S.E.等（1988）Adv.Exp.Med.Biol.229:61;Raduchel,B.及びVorbruggen,H.（1985）Adv.Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res.14:263;及びNicolaou,K.C.等（1991）Angew Chem.Int.Ed.Engl.30:1100）。幾何学的変形物を、例えば米国特許第４，５７６，７５８号及びNicolaou,K.C.（1989）J.Org.Chem.54:5527に記載されたように達成することができる。
下記のように、図式Ｉ中の亜属１を含むＬＸアナログ化合物を、３つの主要なフラグメント（Ａ、Ｂ及びＣ）として製造し、次いで、それらを合わせて分子全体を形成することができる。
0004060366.tif 000034
前駆体フラグメント２のためのエポキシアルコールの合成を、水素、フェニル、ハロゲン又はメチルから選択する置換基Ｒ2、Ｒ3及びＲ4を用いて生じることができる。これらの各エポキシアルコールの各々は、３のようなフェニルウレタン誘導体に変換することができる。
0004060366.tif 000035
ＰｈＮＣＯ、ピリミジン及びＣＨ2Ｃｌ2を用い、その後、ＳＮ2オープニングによるルイス酸触媒を用いて、ビシナルジオールを、結合に必要な（Ｒ）配置においてはＣ−６に、やはり生物活性及び認識部位での結合のために確立された（Ｓ）配置においてはＣ−５に含む１，２−サイクリックカーボネートを与える。これらのアルコールを、次に、４のような前駆体Ａフラグメントを生成するように保護する。
0004060366.tif 000036
これらのＡフラグメントを、今や、Webber,S.E.等（1988）Adv.Exp.Med.Biol.229:61におけるように、フラグメントＢ中間体、ホスホニウムブロミド５と結合させて、グラム量で、結合されたＡ＋Ｂフラグメント生成物６を生成することができる。
0004060366.tif 000037
図式ＩのフラグメントＣ中間体を、Ａ−Ｂ結合物の調製と並行して生成する。これらのＣフラグメントにおいて、Ｙ1及び／又はＹ2の置換基は、メチル、メトキシ、水素、シアノ、ニトロ又はハロゲンである（特定の実施例３を参照されたい）。こうして、１５−メチルを有すること及び／又は例えば１６−メチル若しくは１６−フェノキシ誘導体は、これらの置換されたＬＸＡ4アナログが脱水素化を受け易くなくする。
従って、酵素的酸化及び／又は脱水素化に対する好適な抵抗性を有するＣフラグメントは、キー部位の保護とその後の臭素化により変換されて、フラグメントＣのビニルブロミド生成物例えば６ｂを与えることができ、これは、触媒量のＰ（Ｐｈ3）4及びＣｕＩを用いて６に結合されて属式ＩのＬＸＡ4アナログの完全な主鎖構造を生成する。この図式を、更に、下記の実施例により説明する。
0004060366.tif 000038
亜属式II及びIIIの範囲内のこの発明の化合物は、類似の方法で合成することができる。
属II及びIIIの化合物は、先ず、フラグメントＡの置換された化合物を個々に調製し、それらを、図式Ｉのように各々、個々に調製したフラグメントＢに結合させて７即ちＡ1＋Ｂ1フラグメント（示したように、Ｘ、Ｑ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4に固有の置換を有する）を生成することにより生成される。
0004060366.tif 000039
アセチレン性の基Ｃ−１４，１５及びω−Ｃ−２０末端置換を有するＣ1フラグメント８は、各々、構造６のプロスタグランジンアナログについて上記したように生成され、それらの対応するビニルブロミド生成物に変換されて（KCN JAC 1985,Webber）個々の置換されたフラグメントＣ1又は８種を生じ、これらは、触媒量のＰ（Ｐｈ3）4及びＣｕＩを用いて２０にカップリングして、アセチレン性のＬＸＡ4アナログクラスの結合された生成物を生成するのに適している。各々の最終生成物を、次いで、精製のために、迅速ダイオードアレイ検出を用いる勾配ＲＰ−ＨＰＬＣにかける（Enzymology中のSerhan,C.N.,Methodsにあるように）。ＬＸＡ4のＣ−１５〜Ｃ−２０における修飾の存在は、立体障害を与えることによりデヒドロゲナーゼ及びオキシダーゼによる代謝を変えることができ、Ｃ−１５〜ω末端置換を有する安定なプロスタグランジンアナログが製造されており、デヒドロゲナーゼによって代謝されない（Raduchel,B.及びVorbruggen,H.（1985）Adv.Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res.14:263及びVorbruggcn,H.等（Chemistry,Biochemistry,and Pharmacological Activity of Prostanoids（Roberts,S.M.,Scheinmann,F.編）Oxford:Pergamon Press））。
属式IVの範囲内のこの発明のシクロＬＸＡ4化合物は、下記の方法で作ることができる。
0004060366.tif 000040
このクラスの親化合物も又、同様の全合成ストラテジーにかけ、構造３０中の３つの主要なフラグメントＡ、Ｂ及びＣを割り当てる。フラグメントＡの前駆体を、Nicolaou,K.C.（1989）J.Org.Chem.54:5527において用いられた経路によって調製して、７−シス，１１−トランス−ＬＸＡ4メチルエステルの合成において１０を製造することができる。
0004060366.tif 000041
３０中のフラグメントＢは、前駆体１１又はサリゲニン−（［Ｏ−ヒドロキシベンジルアルコール）を介して（Vorbruggen等、p.353）で生成されたようにして得られる。このベンジルアルコール１１は、ＤＭＦ中でＮａＨの存在下で１０と（１：１で）反応して１２を与える。この鍵となる中間体を、ＢＳＴＦＡ中でシリル化し、その後、Ｃ前駆体用にデザインした個々のフラグメントとカップリングさせる。
0004060366.tif 000042
次いで、１３を、所定の個々のデザインのビニルブロミネートフラグメントＣに、ブロマイト前駆体を４．０当量のＡｇＮＯ3で処理し、次いで、７．０当量のＫＣＮ、ＥｔＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ2Ｏ（１：１：１）で処理する（０⇒２５℃、２〜４時間）ことにより結合させることができる。次いで、個々の生成物を、２〜３時間ＣＨ2Ｃｌ2中での選択的触媒による穏やかな水素化のためにリンドラー触媒にかけて、属IVに属する個々の化合物を与える。各々をＬｉＯＨ／ＴＨＦ中で鹸化して、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分離後に対応する遊離酸を与えることができる。
0004060366.tif 000043
これらの属IVの化合物の発明を、以下の、１５（±）メチル−シクロ−ＬＸＡ4メチルエステル及び対応する遊離酸の合成で、更に説明する。
属式Ｖの範囲内のこの発明の化合物は、下記の方法で作ることができる。ＬＸＢ4を用いて研究された幾つかの系は、天然の化合物中の幾つかの部位が生物活性に必要であることを示している（Serhan,C.N.（1991）J.Bioenerg.and Biomembr.23:105）。これらの部位は、Ｃ−１４アルコールを（Ｒ）配置で含み、Ｃ−８，９位にテトラエンの二重結合をシス配置で含む。更に、本発明を生じた代謝研究に基づいて、幾つかの鍵となる付加部位が、ＬＸＢ4の生物活性を保護するのに必要であるとして同定されている。これらは、Ｃ−１５アルコールをデヒドロゲナーゼ活性から保護すること（即ち、５−オキソ−ＬＸＢ4形成をブロックすること）；Δ８結合及び１４（Ｒ）アルコールの両方を維持すること；及びΔ６−７二重結合の還元及び生じた化合物のβ／ω酸化の阻止を含んでいる。
0004060366.tif 000044
こうして、属Ｖ（１４）は、生物活性に必要なＬＸＢ4の領域を保持するが、代謝分解に利用し得る領域が修飾されている。再び、レトロ合成分析は、１４でデザインされた３つのキーフラグメントＡ、Ｂ及びＣに対する優先性を与える。キー中間体のＬＸＢ4アナログクラスのメンバーを生成するカップリングは、ＬＸＡ4及びそのアナログについて概説した標準的技術即ち選択的水素化（８−シスジオメトリーを生成する）；ユニークな置換を有するＡ及びＢフラグメントを結合するためのＰｄ（０）−Ｃｎ（Ｉ）カップリング；必要な置換を有するＣフラグメントを結合するためのウィッチヒ型カップリング及び１４（Ｒ）ビシナルアルコールを生成するためのシャープレスエポキシ化を用いる（参考文献Nicolaou,K.C.等（1991）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:1100），参考文献Weber,S.E.等（1988）Adv.Exp.Med.Biol.229:61 Ed.Wong,P.K.及びSerhan,C.N.並びにこれらにおいて引用されたものを参照されたい）。こうして、ＬＸＡ4アナログ及び天然のＬＸＢ4の構造に対する類似のストラテジーを用いることにより、特定のアナログを得ることができる。
0004060366.tif 000045
Ｈ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、フェニル、ハロ置換されたフェニルであってよいＲ2、Ｒ6、Ｒ7に置換を有する１５のＡフラグメントを、標準的方法により、例えば１６（式中、増大する鎖長の＝ＣＨ2）から生成する。
0004060366.tif 000046
0004060366.tif 000047
化合物１６を、（Nicolaou,K.C.等（1991）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:1100-16）におけるようにしてトリメチルシリルアセチレン性中間体１７を介して、ビニルブロミド１５に変換する（１７をピナニル−９ＢＢＮにより、次いでｎ−ＢｕＮ4ＮＦによりＴＨＦ中で還元して１８を生じ、これを、必須部分例えばアルコールを保護した後に臭素化にかけて１５（フラグメントＡ）を与える）。
１４中のフラグメントＣは、示したようにＲ5置換を有する化合物１９から生成する。
0004060366.tif 000048
アセチレン性のアルコール１９を、次いで、ＬＡＨ中で還元し、その後シャープレス不斉エポキシ化にかけて２０を生成し、これを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離して、（＋）異性体を生じ、これを用いて必要なＬＸＢ4アナログのＣ−１４アルコールを（Ｒ）配置で生成し、化合物２０を、Ｒ4及びＲ5の置換基並びにアルコールの塩化メチレン中でのＰＣＣを用いる保護の後に対応するアルデヒド２１に変換する。（Nicolaou,K.C.等（1991）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:1100）
0004060366.tif 000049
ホスホニウム塩２２を、参考文献（Weber,S.E.等（1988）Adv.Exp.Med.Biol.229:61,Ed.Wong,P.K.及びSerhan,C.N.）におけるようにして調製することができ、ここで用いて、Ｒ4及びＲ5が置換を有するデザインされた置換を２３の基に有する２３を与えるウィッチヒ型カップリングにより、Ｂ−Ｃフラグメントカップリングを生じることができる。この２３のシスの二重結合は、Ｉ2を１４の親前駆体型を与える触媒として用いて異性化して、２４のようなトランス異性体を与えることができる。
0004060366.tif 000050
次いで、２４の１５へのカップリングを、Ｐｄ（０）−Ｃｕ（Ｉ）カップリングにより行って、１４のアセチレン性前駆体（２５で示す）を与える。選択的リンドラー触媒水素化の後に、個々のＬＸＢ4アナログを、テトラエン骨格を個々の生成物を単離する簡便な方法として用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、迅速ジオールアレイ検出を用いて、更に精製することができる（Serhan,C.N.（1990）Meth.Enzymol.187:167）。
有用性
この発明の化合物は、天然のＬＸの生物学的活性を有するが、分解に一層抵抗性であり、或いは天然のＬＸの分解を阻止する。それ故、これらの開示した化合物は、患者における不十分な又は不適当なＬＸ媒介の細胞応答と関連する多くの病気を治療し又は予防するための医薬としての有用性を有している。
開示した１５−エピ−リポキシン化合物の抗増殖効果に基づいて、この発明は、細胞を有効量の実質的に精製された１５−エピ−ＬＸ化合物と製薬上許容し得るキャリアーとを含む製薬組成物と接触させることにより、望ましくない細胞増殖を改善する方法を提供する。この細胞は、イン・ビボ及び／又はイン・ビトロで接触させることができる。或いは、細胞を、患者から取り出し；本発明の実質的に精製された１５−エピ−リポキシン化合物とエキソ・ビボで接触させ、そして患者に移植することができる。この発明は又、患者における細胞増殖性疾患を改善する方法であって、有効量の実質的に精製された１５−エピ−ＬＸ化合物を投与することを含む方法をも提供する。
有効量は、通常、標的細胞集団に対する十分な曝露を確実にするのに必要な量である。かかる量は、通常、１５−エピ−ＬＸ化合物の性質、投与の様式、望ましくない細胞増殖又は細胞増殖性疾患の重さ及び投薬養生法を決める際に当業者によって考慮される他の因子に依存する。
接触されるべき標的細胞は、癌様及び／又は腫瘍性の成長をするものであってよい。或いは、標的細胞は、再狭窄等の刺激に応答して異常細胞増殖をするものであってよく；及び／又は標的細胞は、元の細胞の遺伝的性質から変化させられた遺伝的性質を有する形質転換された細胞よりなるものであってよい。
好適な標的細胞には、上皮細胞、白血球、内皮細胞及び／又は繊維芽細胞が含まれる。
ＬＸの選択細胞に対する刺激作用に基づいて、この発明は又、骨髄抑制性疾患を有する患者を、その患者に有効量のＬＸアナログを含む製薬組成物を投与することにより治療する方法をも提供する。この有効量は、通常、標的細胞集団に対する十分な曝露を確実にするのに必要な量である。かかる量は、通常、アナログの性質、投与の様式、骨髄抑制の重さ及び投薬養生法を決める際に当業者によって考慮される他の因子に依存する。
細胞増殖性のＬＸアナログの治療用途も又、細胞を患者から取り出し、細胞成長をイン・ビトロで刺激し、そしてその促進された細胞標品を全部又は部分的に患者に戻すことを含む。刺激中に又は細胞標品の導入と共に、追加の治療剤（例えばサイトカイン例えばＧＭ−ＣＳＦ）を、適宜、ＬＸと共に用いることができる。
他の具体例においては、この発明の化合物を用いて、炎症又は炎症性応答を治療し又は予防する。ＬＸＡ4は、炎症のメディエーターである白血球の活性化を阻止する。ＬＸＡ4誘導される効果には、白血球の遊走の阻止、反応性酸素種の生成及び組織膨潤に関与するプロ炎症性メディエーターの形成が含まれる。（Raud,J.等（1991）Adv.Exp.Med.Biol.314:185.Cell-Cell Interactions in the Release of Inframmation Mediators vol.314）ＬＸＢ4は、マウス造血幹細胞を用いるイン・ビボアッセイで、下痢及び失調を防ぐ等の放射線防護作用を示す（Walken,T.L.Jr.,（1988）J.Radiat.Res.29:255）。
白血球媒介の炎症又は炎症性応答は、種々の形態の喘息及び関節炎を含む多様な病気を引き起こし又はそれらに寄与する。物理的外傷、放射線への曝露その他の物理的創傷に対する炎症性応答は、本発明の内に含まれる。
他の具体例においては、この発明の化合物を用いて、ロイコトリエンの作用を打ち消すことによって炎症を治療し又は予防する。ＬＸＡ4は、ＬＴＢ4誘導される炎症を阻止して、血漿の漏出及び白血球の遊走の両方を、ハムスターのほお袋でのイン・ビボアッセイにおいてブロックする。（Hedqvist,P.等（1989）Acta Physiol.Scand.137:571）血漿の漏出及び白血球の遊走は、傷の治癒と炎症の両方において鍵となる事象である。ＬＸＡ4は又、ＬＴＤ4誘導される腎臓の血流力学的作用を打ち消し、部分的に腎臓における血流力学の調節の原因であるメサンギウム細胞へのＬＴＤ4の結合をブロックする。（Badr.K.F.等（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:438）
この発明の化合物を投与して、スルフィドペプチドロイコトリエン例えばＬＴＤ4、ＬＴＣ4及びＬＴＢ4の作用を打ち消すことができる。ロイコトリエン媒介の血管収縮応答は、喘息、アナフィラキシー反応、アレルギー反応、ショック、炎症、リウマチ関節炎、痛風、乾癬、アレルギー性鼻炎、成人呼吸障害症候群、クローン病、エンドトキシンショック、外傷性ショック、出血性ショック、腸虚血性ショック、腎糸球体疾患、良性前立腺肥大、炎症性腸疾患、心筋虚血、心筋梗塞、循環系ショック、脳傷害、全身性エリテマトーデス、慢性腎臓病、心血管疾患及び高血圧症等の病気と関係している。
他の具体例においては、この発明の化合物を用いて、血管収縮応答又は症状を治療し又は予防する。ＬＸは、内皮依存性血管拡張（ＬＸＡ4）（Lefer,A.M.等（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8340）及び脳小動脈拡張を新生ブタにおいてイン・ビボで誘導する（ＬＸＡ4及びＬＸＢ4）（Busija,D.W.等（1989）Am.J.Physiol.256:468）。更に、ＬＸＡ4は、迅速な小動脈拡張を、ハムスターのほお袋においてイン・ビボで誘導し（Dahlen,S.-E.等（1987）Acta Physiol.Scand.130:643）、ラットの腎臓血流力学において誘導する（Badr,K.F.等（1987）Biochem.Biophys.Res.Commun.145:408）。
血管収縮性応答及び症状は、腎臓の血流力学的病気（糸球体の病気を含む）、心血管疾患（高血圧症、心筋梗塞、心筋虚血及び血管の病気を含む）、及び胃腸病等の病気及び症状を引き起こし、これらに寄与し又は関係する。
対応する天然のＬＸよりも長い組織半減期を有するものを同定するために、ＬＸアナログ又は他の化合物をスクリーニングする方法も又、この発明に包含される。この方法を用いて、化合物が天然のＬＸと比較して代謝を阻止し、これに抵抗し又はそれを一層ゆっくりと受けるかどうかを決定することができる。この方法は、ＬＸを代謝する少なくとも１種類の酵素を用意し、化合物をその酵素標品と接触させて、この化合物が酵素による代謝を阻止し、それに抵抗し又はそれを一層ゆっくりと受けるかどうか測定することによって行われる。ＬＸ認識部位を有する細胞例えば多形核好中球、末梢血液単球、及び分化したＨＬ−６０細胞は、酵素標品の適当な源中にある。ＬＸ認識部位は、自然に存在し得るし、又は人為的に誘導することができる（病状により又は怪我により）。人為的に誘導したＬＸＡ4認識部位の非制限的例は、分化したＨＬ−６０細胞におけるかかる部位の誘導である。
一具体例において、酵素の調製は、細胞を採取すること及び凍結融解による溶解を３回繰り返した後に超遠心分離して１００，０００ｇの上清を産出することを含んだ。無細胞の１００，０００ｇのペレットも又、用いることができる。更に、酵素標品は、天然のＬＸの代謝に関与しないが、自然にＬＸを代謝する酵素によって行われる変換に類似の又は等しいＬＸに対する変換を行う任意の酵素を含んでよい。適当な酵素の非制限的例は、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ、チトクロームＰ−４５０モノゲナーゼ（ヒトの白血球並びにラット及びヒトの肝ミクロソーム由来）である。
ＬＸ代謝産物の特性決定は、標準的技術例えば抽出、クロマトグラフィー及び定量的ＨＰＬＣとその後のトリメチルシリル誘導体化、Ｏ−メトキシム誘導体化及びガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析を含んだ。この具体例の実験の詳細は、下記の実施例１に記載する。
ＬＸアナログは又、ＬＸレセプター認識部位との結合活性について、例えばこの化合物をレセプター認識部位と接触させ、その化合物が結合するか及びどの程度結合するかを測定することによりスクリーニングすることもできる。動力学的結合アッセイの例には、相同的置換、競争的結合、等温線及び平衡結合アッセイが含まれる。
レセプター認識部位は、常態で存在し得又はそれは、病状により、怪我により又は人為的手段によって誘導され得る。例えば、レチノイン酸、ＰＭＡ又はＤＭＳＯを用いてＨＬ−６０細胞に分化を誘導することができる。分化したＨＬ−６０細胞は、ＬＸＡ4特異的レセプター認識部位を発現する。ＬＸ特異性についてスクリーニングすることのできる他の細胞の例には、ＰＭＮ、上皮細胞及び末梢血単球が含まれる。
競争するリガンドの選択は、認識部位の性質、天然基質の構造、当分野で公知の天然の基質の構造的又は機能的アナログ、及びかかる決定をする際に当業者によって考慮される他の因子に依存する。かかるリガンドは又、公知のレセプターのアンタゴニストをも包含する。この発明の化合物は、放射化学又は合成化学の分野で公知の標準的技術によって、2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ及び14Ｃを含むアイソトープで放射性標識することができる。
この方法の一具体例において、誘導されたＬＸＡ4認識部位の構造的特異性を、ＬＸＢ4、ＬＴＣ4、ＬＴＢ4及びトリヒドロキシヘプタン酸メチルエステルを用いて評価した。この具体例の実験の詳細は、下記の実施例２に記載してある。
更に、この発明の化合物を用いて、炎症又は傷害の発生モデルとして、特定の細胞型に対してある作用を発揮することができる。例えば、ＬＸＡ4は、細胞内のＣａ2+の流動化、脂質の再建及びヒトのＰＭＮにおける凝集を伴わない走化性を刺激する（Palmblad,J.等Biochem.Biophys.Res.Commun.（1987）145:168;Lee,T.H.等Clin.Sci.（1989）77:195;Nigam,S.等J.Cell.Physiol.（l990）143:512;Luscinskas,F.W.等（1990）Biochem.Pharmacol.39:355）。ＬＸＡ4は又、ＬＴＢ4とＦＭＬＰ誘導された応答例えばＩＰ3生成の両者をもブロックする。ＬＸＢ4は又、脂質の再建をも刺激する。ＬＸＡ4は、単離されたＰＫＣを活性化し又、脳脊髄中に見出されるＰＫＣのγ−亜種に特異的である。（Hansson,A.等Biochem.Biophys.Res.Commun.（1986）134:1215;Shearman,M.S.等FEBS Lett.（1989）245:167）；刊行物Nicolaou,K.C.等Angew.Chem.Int.Ed.Engl.（1991）30:1100及びそこにおいて引用された参考文献を明白に参考として本明細書中に援用する。
本発明を、更に、下記の実施例によって説明するが、これらを、更に制限するものと解すべきでない。背景を含むこの出願のすべての部分で引用されたすべての参考文献及び発行された特許の内容を、明白に参考として本明細書中に援用する。
実施例
実施例１：リポキシン類似体化合物の合成
0004060366.tif 000051
化合物１のメチルエステル前駆体の製造：
ベンゼン（1.5ml）への３−メチル−３−トリメチルシロキシ−１−ブロモ−１−オクテン（130mg、0.44ミリモル）の溶液に、ｎ−プロピルアミン（0.05ml、0.61ミリモル）およびＰｄ（ＰＰh3）4（20mg、0.02ミリモル）を加え、溶液を光から防護した。ついで、凍結融解法によって脱気し、室温で45分間攪拌した。（７Ｅ，９Ｅ，５Ｓ，６Ｒ）メチル５，６−ジ（tert−ブチルジメチルシロキシ）ドデカ−７，９−ジエン−１１−イノアート（183mg、0.44ミリモル）（化合物１２）およびヨウ化銅（14mg、0.07ミリモル）を加え、溶液を凍結融解法によってもう一度脱気した。混合物を室温で３時間攪拌し、ＮＨ4Ｃｌの飽和水溶液で失活させ、エーテルで抽出した。次いで、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、溶媒を蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ、３％エーテルヘキサン）により、純粋な化合物を無色の液体として得た（171mg、収率57％）。
ＴＨＦ（0.5ml）へのこの化合物（171mg、0.25ミリモル）の溶液に、ｎ−ＢｕＮ4Ｆ（0.9ml、0.90ミリモル）を加え、混合物を室温で攪拌した。反応を２時間で完了させ、その時点で水に注ぎ込み、エーテルで抽出した。エーテル抽出物を食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、溶媒を蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ、４％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）により、対応するラクトンのうちいくらかとともに、メチルエステル（24mg）を得た。ＨＰＬＣ保持時間：9.39分（ミクロソルブ逆相、4.6mmｘ25cm、Ｃ−18カラム、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ＝70：30、流量＝1ml／分、ＵＶ検出器＝300nmにて）。ＭｅＯＨ中でのＵＶ：λmax283、294、311nm。1Ｈ−ＮＭＲ（500MHz、ＣＤＣｌ3）:δ6.53（dd.15.2,10.9Hz,1H）、6.32（dd,J=15.1,11.OHz,1H）、6.17（d,J=15.9Hz,1H）、5.83（dd.J=17.5,2.1Hz,1H）、5.80（dd.J=15.2,6.7Hz,1H）、5.72（dd.J=17.0,2.1Hz,1H）、4.14（m,1H）、3.68-3.64（m,4H）、2.35-2.31（m,2H）、1.51-1.48（m,1H）、1.43-1.42（m,2H）、1.30-1.23（m,15H）、0.85（t,3H）、13Ｃ−ＮＭＲ（126MHz、ＣＤＣｌ3）:δ150.01、140.08、132.95、132.26、112.43、107.50、75.23、73.76、42.49、33.67、32.17、31.36、27.96、23.56、22.58、21.03、14.03。
化合物２のメチルエステル前駆体の製造：
化合物１のメチルエステル前駆体（ＣＨ2Ｃｌ2（１ml）中に３mg）の溶液をリンドラー触媒（１mg）と混合し、水素雰囲気下に置いた。混合物を暗中にて室温で攪拌し、その後、約80％の転換までＨＰＬＣに付した（１時間）。シーライト越しの濾過、溶媒の蒸発、およびＨＰＬＣによる分離によって、純粋なメチルエステルを得た。
ＨＰＬＣ保持時間：10.02分（ミクロソルブ逆相、10mmｘ25cm、Ｃ−18カラム、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ＝70：30、流量＝４ml／分、ＵＶ検出器＝300nmにて）。ＭｅＯＨ中でのＵＶ：ηmax287、301、315nm。
化合物３のメチルエステル前駆体の製造：
この化合物は、（３−シクロヘキシル−３−トリメチルシロキシ−１−ブロモ−１−オクテンからの）化合物１のメチルエステル前駆体の製造と同様にして製造した。この化合物の脱シリル化も、同様の方式で実施して、メチルエステルを得た。
ＨＰＬＣ保持時間：8.02分（ミクロソルブ逆相、4.6mmｘ25cm、Ｃ−18カラム、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ＝70：30、流量＝１ml／分、ＵＶ検出器＝300nmにて）。ＭｅＯＨ中でのＵＶ：λmax282、293、311nm。1Ｈ−ＮＭＲ（360MHz、ＣＤＣｌ3）:δ6.56（dd.15.4,10.9Hz,1H）、6.33（dd,J=15.2,10.9Hz,1H）、6.13（dd,J=15.8,6.5Hz,1H）、5.81（dd,J=15.2,6.4Hz,1H）、5.80（d,J=15.6Hz,1H）、5.73（dd,J=15.4,2.1Hz,1H）、4.15（br,1H）、3.93-3.90（m,1H）、3.67（br,1H）3.65（s,3H）、2.34（t,2H）、1.82-1.65（m,10H）、1.46-1.38（m,3H）、1.26-1.01（m,5H）。
化合物４のメチルエステル前駆体の製造：
化合物３のメチルエステル前駆体の選択的水素化、その後のＨＰＬＣ精製によって、化合物４のメチルエステル前駆体を得た。
ＨＰＬＣ保持時間；9.72分（ミクロソルブ逆相、10mmｘ25cm、Ｃ−18カラム、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ＝70：30、流量＝４ml／分、ＵＶ検出器＝300nmにて）。ＭｅＯＨ中でのＵＶ：λmax288、301、315nm。1Ｈ−ＮＭＲ（250MHz、Ｃ6Ｄ6）：δ6.66-6.89（m,2H）、5.95-6.24（m,4H）、5.55-5.66（m,2H）、3.82（m,1H）、3.73（m,1H）、3.41（m,1H）3.31（s,3H,ＯＣＨ3）、2.08（t,2H、ＣＨ2ＣＯＯ）、1.00-1.81（m,18H）。
このメチルエステルは、標準的手法を用いて、対応するアルコールに転換することができる。
15（Ｒ）−15−メチル−ＬＸＡ4および15（±）メチル−ＬＸＡ4の合成
Webber,S.E.et al.（1988）Adv.Exp.Med.Biol.229:61；Nicolaou,K.C.et al.（1991）Angew.Chem Int.Ed.Engl.30:1100；およびVorbruggen,H.et al.:"Chemistry,Biochemistry,and Pharmacological Activity of Prostanoids"（Roberts,S.M.,Schein mann,F.eds.）Oxford,Pergamon Pressのとおり、塩化ヘキサノイルによるビス（トリメチルシリル）アセチレンのフリーデル−クラフツのアシル化を用いて、アセチレン性ケトンａ約１ｇを製造し、（−）−ピナイル−９−ＢＢＮを用いて還元して、ＣＨ3Ｎ2中の（Ｓ）アルコールを得て、Ｃ−15でのメチルを生成する。
0004060366.tif 000052
これに代えて、Vorbruggen,H.et al.:"Chemistry,Biochemistry,and Pharmacolo gical Activity of Prostanoids"（Roberts,S.M.,Scheinmann,F.eds.）Oxford,Pergamon Pressのとおり、ＣＨ3ＭｇＢｒでケト基を処理して（60⇒70℃）、２，６−ルチジン（5.2ml）およびtert−ブチルジメチルシリルトリフラート（6.9ml）を順に加えて、０℃の乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（〜20ml）中でｂの15（±）メチル（２〜５ｇ）を得ることができる。この反応を１時間混合し、次いで、水性抽出のためにエーテル100mlで希釈し、ＭｇＳＯ4で乾燥する。
0004060366.tif 000053
次いで、生成物ｃをｄと結合するが、
0004060366.tif 000054
これは、Nicolaou,K.C.et al.（1991）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:1100；Nicolaou,K.C.et al.（1989）J.Org.Chem.54:5527およびWebber,S.B.et al.（1988）Adv.Exp.Med.Biol.229:61のとおりに生成する。図式ＩのフラグメントＡからの構造ｄを、ＥｔＯＨ：ＴＨＦ：Ｈ2Ｏ（１：１：１）を含有する4.0当量のＡｇＮＯ3、次いで7.0当量のＫＣＮに０〜25℃で２時間懸濁させて、Ｃ−メチルエステルで保護された１５−メチル−ＬＸＡ4類似体を生成し、これを濃縮し、ＴＨＦ中、４℃でＬｉＯＨ（２滴、0.1Ｍ）で12〜24時間けん化して、対応する遊離酸を得る。
16−ジメチル−ＬＸＡ4の合成
0004060366.tif 000055
この化合物は、類似の戦略を用い、上記のｄを上記を参照してｅと結合するか、ｆと結合して15−フェニル−ＬＸＡ4類似体を生成するか、またはｇと結合して17−ｍ−クロロフェノキシ−ＬＸＡ4類似体を生成することによって生成する。
0004060366.tif 000056
図式Ｉの適切なＣフラグメント（すなわちｅ、ｆ、ｇ、ｈ）は、それぞれ、対応する公知プロスタグランジン類似体についてRaduchel,BおよびVorbruggen,H.（1985）Adv.Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res.14:263に総説されたとおりに製造する。hでは、Ｒ＝Ｈ；Ｃｌ、メトキシまたはハロゲンである。
13，14−アセチレン性ＬＸＡ4および含ハロゲン類似体の合成
0004060366.tif 000057
図式IIのフラグメントから生成されたＡ2Ｂ2を用いて、対応するＣ2フラグメントを結合のために製造する。
構造ｊおよびｋを、Nicolaou,K.C.et al.（1989）J.Org.Chem.54:5527のとおりに生成し、Raduchel,BおよびVorbruggen,H.（1985）Adv.Prostaglandin Thrombox ane Leukotriene Res.14:263のとおりにメチル化し、７と結合して、これらのＬＸ類似体を得る。これらの材料を、ＲＰ−ＨＰＬＣに付して、上記を参照して精製してよい。
0004060366.tif 000058
14，15−アセチレン性ＬＸＡ4の合成
0004060366.tif 000059
設計された結合したＡ2B2フラグメントは、経路IIに示したフラグメントＡ1およびＢ1の結合から製造して、７または４の構造を上記のとおり実施して、フラグメントＣ2に結合することができる。Ｃ2フラグメントのｌの前駆体は、プロスタグランジン類似体についてのRaduchel,BおよびVorbruggen,H.（1985）Adv.Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res.14:263のとおりに製造することができる。
0004060366.tif 000060
前記［Nicolaou,K.C.et al（1989）J.Org.Chem.54:5527］で製造した前駆体ｍを、Ｍｅ2Ａｌを有するｌとともにベンゼン中で、1.2〜0.05当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4、0.16当量のＣｕＩ、ｎ−ＰｒＮＨ2に室温で２〜３時間加えて、ｎを得る。
0004060366.tif 000061
アルコール保護基ＴＢＤＭＳ＝Ｒを、10当量のＨＦ−ｐｙｒ、ＴＨＦ、０〜25℃（４時間）で除去した後、3.0当量のＥｔ3Ｎ、ＭｅＯＨ、25℃に15分間接触させて、ＬＸ類のＣ−１カルボキシルとＣ−５アルコールとの間に通常は形成される、酸で誘導されたδラクトンを開環する［Serhan,C.N.（1990）Meth.Enzymol.187:167およびNicolaou,K.C.et al.（1989）J.Org.Chem.54:5527］。５重量％のリンドラー触媒による穏やかな処理の後、抽出された材料は、ＴＨＦ中でのＬｉＯＨによるけん化に付して、標的分子の遊離酸を生成してよく、これを、Serhan,C.N.（1990）Meth.Enzymol.187:167のとおりに、ＲＰ−ＨＰＬＣ勾配移動相によって、更に精製に付すことができる。
15（±）メチル−シクロ−ＬＸＡ4の合成
0004060366.tif 000062
ＳｉＭｅ3誘導体としての化合物ｏは、アルゴンに富ませた雰囲気下の100ml入り丸底フラスコに、脱気したベンゼン（20ml）に溶かして入れることができる（〜１ml）。これに、3.0当量の臭化ビニルフラグメントを下記を参照して加える。このカップリング反応は、触媒量のＰｄ（ＰＰｈ3）4およびＣｕＩ中で実施し、高速走査ダイオードでＵＶの多さによって追跡する、ＲＰ−ＨＰＬＣにこの懸濁液のアリコートを注入することによって追跡できる。進行線は、23℃で１〜３時間進行し、その後、材料を酢酸エチル：Ｈ2Ｏ＝４：１v/vで抽出し、ロータリーエバポレーターによる蒸発によって濃縮する。メチルエステルは、ＬｉＯＨ／ＴＨＦ中でけん化して、定量的収量の遊離カルボン酸を得ることができる。その他の誘導体は、上記のとおり、例えばジメチルその他の誘導体を与えるよう置換しておいた、フラグメントＢの異なる部分とともにフラグメントＡを用いて製造できる。これは、容易に入手できるケトンｐを用い、ＣＨ3ＭｇＢｒで処理してｑを生成することによって得ることができ、これも、上記のとおり、Ｐｄ（Ｏ）−ＣｕＩカップリングのような慣用の手法を用いて、フラグメントＡに結合することができる。Ｃ−15からの鎖長の増大も得られる。
0004060366.tif 000063
５−メチル−ＬＸＢ4および４，４−ジメチル−ＬＸＢ4の合成
５−メチル−ＬＸＢ4は、５−オキソ−ＬＸＢ4形成を阻害または遷延する。上記に概略を示した一般的図式を用いて、Ａフラグメントを構成して、臭化ビニルのｒ前駆体に５−メチルを保有させることができ、これを、Ｐｄ（Ｏ）−ＣｕＩカップリングによって、結合したＢ＋Ｃフラグメントに結合する。
0004060366.tif 000064
臭化ビニルｒは、そのＣ−４の位置にジメチルまたは水素置換基のいずれかを有するｓから得ることができる。フラグメントＢ＋Ｃを含む保護された前駆体ｔは、参考文献［Nicolaou,K.C.et al.（1991）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:1100-16］に報告されたとおりに生成する。化合物ｔを、図示の臭化ビニルと結合することによってｓまたは28へと転換する。こうして、標的分子は、溶媒としてＥｔ2ＮＨを含む脱気した丸底フラスコに、Ｅｔ2ＮＨに1.2当量で注入したｔとともにｒを1.0当量（≒１ｇ）で加えることによって、生成することができる。Ｐｄ（Ｐｈ3Ｐ）4を0.02当量で加えて、ｓの８（9）含有アセチレン性前駆体メチルエステルを得る。
材料を抽出し、ＣＨ2Ｃｌ2中のキノリン（0.5当量）に懸濁させてロータリーエバポレーターでの蒸発に付し、リンドラー触媒（10％；25℃）およびＨ2気流を用いた水素化に付して、８位でのアセチレン性二重結合を選択的に還元する。５−メチル−ＬＸＢ4または４−ジメチル−ＬＸＢ4メチルエステルのメチルエステルのテトラエン成分の形成は、還元の完了（すなわち１〜３時間）を査定するためのＲＰ−ＨＰＬＣによって追跡することができる。次いで、生成物をＴＨＦ25μl中でのＬｉＯＨで処理し、０⇒24℃で８〜24時間Ｈ2Ｏを加えることによって、対応する遊離酸へとメチル♯エステルをけん化する。
実施例２：ヒト前骨髄球性白血病細胞および単球によるリポキシンＡ4の代謝：半減期検定
ＨＬ−60細胞は、米国基準株コレクション（Rockville,MD）から、その他の細胞培養試薬は、GIBCO（Grand Island,NY）から購入した。ベルセン（ＥＤＴＡ）は、Whittaker Bioproducts（Walkersville,MD）から購入した。合成11，12−アセチレン性ＬＸＡ4メチルエステルおよびＬＸ類は、Cascade Biochemical（Reading、英国）から、15（Ｓ）−15−ｍ−ＰＧＥ1、ＰＧＥ1および５−ＨＥＴＥは、Cayman Chemical Co.（Ann Arbor,MI）からであった。［11，12-3H］ＬＸＡ4は、注文によるトリチウム化（ＮＥＴ−259、ロット番号第0 2793-275号、New England Nuclear,Boston,MA）としてリンドラー触媒を用いて、11，12−アセチレン性ＬＸＡ4から製造した。トリチウム化した生成物は、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて単離した［Fiore et al.（1992）J.Biol.Chem.267:16168;Serhan,C.N.（1990）Meth.Enzymol.187:167］。メトキシアミンおよびＮＡＤは、Sigma Chemical Company（St.Louis,MO）から得た。二酸化マンガンおよびアダムス試薬は、Aldrich Chemical Co.（Milwaukee,WI）から得た。
ヒトＰＭＮは、健康な志願者から、ヘパリン添加した新鮮な静脈血の勾配遠心分離［Boyum,A.（1986）Scand.J.Clin.Lab.Invest.21:77］によって得た。ＨＬ−60細胞を、ペニシリン（100Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（100μ／ml）、ウシ胎児血清（10％）（Hyclone,Logan,UT）で強化したＲＰＭＩに播種し、プラスチック製250ml入りフラスコ内で温置した（５％ＣＯ2雰囲気で37℃）。５ｘ10-7個のＨＬ−60細胞を内容する個々のフラスコを、ホルボール12−ミリステート13−アセテート（ＰＭＡ）の存在下または不在下で温置し（10または16nM、24〜27時間）、Collins,S.J.（1978）Blood70:1233のとおり、付着をマクロファージ様表現型の誘導について追跡した。グルコース（１mg／ml）とともにＰＢＳを内容するプラスチックのペトリ皿で、37℃で１時間新鮮な単核球を平板培養した後、末梢血単球を得た［Goldyne,M.E.et al.（1984）J.Biol.Chem.259:8815］。付着しなかった細胞を除去し、付着した単核球を、ベルセン（７ml／プレート）を用いて静かに再懸濁させ、ＰＢＳで洗浄した。ＰＭＮ（＞98％）、付着単球（＞95％）およびＨＬ−60細胞を、温置のためＰＢＳに懸濁させつつ、光学顕微鏡によって計数し、それぞれの事例で＜２〜３％がトリパンブルーに対して透過性であった。いくつかの実験のために、ＰＭＡ（16nM）で24〜72時間処理したＨＬ−60細胞から、無細胞上清を調製した。採集した後、分化した細胞を洗浄し、次いで、凍結融解による溶解、および遠心分離（100,000ｇ、１時間）に付した。
エイコサノイドとの温置は、内標準としてのＰＧＢ2または５−ＨＥＴＥのいずれかを含有する冷メタノールで停止した（５−ＨＥＴＥは、15−オキソ−ＥＴＥを定量したときに用いた）。Sep-PakＣ18を用いて生成物を抽出し、Serhan,C.N.（1990）Meth.Enzymol.187:167のとおりに、定型的にクロマトグラフィーに付した。ＲＰ−ＨＰＬＣ系は、Altex Ultrasphere-ODSカラム（4.6mmｘ25cm）を装備したＬＫＢ勾配二重ポンプ、１ml／分の流量、メタノール／Ｈ2Ｏ／酢酸（65：35：0.01）、およびＬＴＢ4のω代謝物（すなわち20−ＣＯＯＨおよび20−ＯＨ−ＬＴＢ4）とＬＸＡ4とを定量するのに用いた線形勾配（20〜45分）でのメタノール／酢酸（99.99／0.1）による溶離（０〜20分）で構成した。内標準の復元は、平均が82.2、Ｓ．Ｄ．が7.9（ｎ＝13）であった。化合物I〜IVは、メタノール／Ｈ2Ｏ／酢酸（60：40：0.01、v/v/v）で3.0ml／分の流量で溶離するAltex Ultrasphere-ODSカラム（10mmｘ25cm）を用いて分離した100,000g上清による15−オキソ−ＥＴＥの形成［Agins,A.P.et al.（1987）Agents Actions 21:397;Xun,C-Q.et al.（1991）Biochem.J.279:553;およびSok,D-E.et al.（1988）Biochem.Biophys.Res.Commun.156:524参照］は、ＲＰ−ＨＰＬＣの後に、メタノール／Ｈ2Ｏ／酢酸（70：30：0.01、v/v/v）で溶離し、１ml／分の流量で280nmで追跡するＯＤＳカラム（4.6mmｘ25cm）を用いて定量した。単球由来の生成物も、メタノール／Ｈ2Ｏ／酢酸（60：40：0.01、v/v/v）および１ml／分の流量で溶離する、Hypersilカラム（５ＩＬ、４mmｘ300mm）を用いるクロマトグラフィーでクロマトグラフィーに付した。オンラインスペクトルは、ＨＰＬＣ3D ChemStationというソフトウエア（ＤＯＳシリーズ）を備えたダイオードアレー検出器（Hewlett-Packard 1040MシリーズII型）を用いて記録した。スペクトルは、1.28秒のサンプリング間隔で、４nmのステップ、Ｂw＝10nm、レンジ＝235〜360nmを用いて得た。
ＧＣ／ＭＳは、HPG1030AというワークステーションおよびGC5890を備えたHewlett-Packard 5971A質量選択的検出器四重極で実施した。カラムは、HPUltra２（架橋結合した５％フェニルメチルシリコーンガム相；25ｍｘ0.2mmｘ0.33μｍ）であり、注入は、ビス（ＴＭＳ）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）中でスプリットレスモードで実施した。温度のプログラムは、150℃で始動させ、10分で250℃に20分で325℃に達した。標準的飽和脂肪酸メチルエステル（Ｃ16〜Ｃ26）は、下記の保持時間を与えた（分：秒、ｎ＝６の平均）：Ｃ16、8.03；Ｃ18、9.77；Ｃ20、12.22；Ｃ22、16.11；Ｃ24、20.72；Ｃ26、23.62。これを用いて、Serhan,C.N.（1990）Meth.Enzymol.187:167のとおりに、それぞれのＬＸ由来代謝物のＣ値を算出した。ジアゾメタンを製造し、メチルエステル生成物をＢＳＴＦＡ（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）で処理して、Ｍｅ3Ｓｉ誘導体を得た。メチルエステルのＯ−メトキシム誘導体は、Kelly,R.W.およびAbel,M.H.（1983）Biomed.Mass Spectrom.10:276のとおりに製造した。接触水素化は、酸化白金IV（１〜２mg）を発泡水素流で飽和させることによって（２０分、室温）、メタノール（１ml）中でアダムス試薬（Aldrich,Milwaukee,WI）で実施した。抽出の後、材料をジアゾメタン、次いでＢＳＴＦＡで処理した（終夜；室温）。
結果
ＬＸＡ4の代謝：健康な供与者の末梢血からの無傷の好中球は、外来ＬＸＡ4を有意に代謝しなかったが、同じ供与者からの細胞は、ＬＸＡ4をω酸化によって急速に変換した。対照的に、単球／マクロファージ様の特徴を示すＰＭＡ処理ＨＬ−60細胞は、ＬＸＡ4を急速に変換した。接触の最初の60秒以内に、＞70％のＬＸＡ4が代謝された。ＰＭＡ処理の不在下では、無傷のＨＬ−60細胞（分化せず）も、それらの無細胞上清（100,000ｇ）もＬＸＡ4を変換しなかった（ｎ＝３）。
ＬＸＡ4とともに温置した分化したＨＬ−60細胞は、このエイコサノイドをいくつかの生成物に転換した。標識したＬＸＡ4は、トリチウムを有する４種類の主生成物（化合物Ｉ〜IVと称する）に変換され、これらを捕集して、更に分析した。
化合物Ｉ〜IVの構造：これらの化合物の構造的研究を可能にする量を得るために、ＲＰ−ＨＰＬＣでの保持時間を、境界を示す3H標識の溶出像を用いて確定し、いくつかの温置からプールした非標識試料をクロマトグラフィーに付し、これらの領域内から個別に捕集して、ＧＣ／ＭＳ分析に付した。ジアゾメタンおよびＢＳＴＦＡでの処理後に得られた生成物の、選ばれたイオン追跡は、化合物Ｉ〜IVは、それぞれ、ＬＸＡ4とは異なる保持時間を与えたものの、それぞれ、m/z２０３［−ＣＨ（ＯＳｉＭｅ3）−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＣＨ3］で卓越したイオンを示して、ＬＸＡ4の炭素１〜５番（カルボキシルの炭素が１番である）が修飾されなかったことを明らかにした。メチルエステル、すなわちＬＸＡ4のトリメチルシリル誘導体は、その電子衝撃スペクトルではm/z203（基本ピーク）および173で卓越イオンを、582でのその分子イオンとともに示した（Ｍ+４）。ＬＸＡ4のこの誘導体の診断値のその他のイオンは、m/z171（203-32）、409（Ｍ−173）、379（Ｍ−203）、482（Ｍ−100）および492（Ｍ−90）で観察される［Serhan,C.N.et al.（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5335;およびSerhan,C.N.（1990）Meth.Enzymol.187:167］。ＬＸ類が、概して、極めて弱い分子イオンピークを与えることが公知である［Serhan,C.N.et al.（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5335］のは注目に値する。にもかかわらず、Ｉ＆IIと標識された化合物も、m/z173（Ｍｅ3ＳｉＯ+＝ＣＨ−（ＣＨ2）3−ＣＨ3）で卓越イオンを有し、これらのＬＸＡ4誘導生成物の炭素15〜20番フラグメントが無傷であることを示すが、化合物IIIおよびIVでは、m/z173が明らかではなかった。したがって、化合物I〜IVがＬＸＡ4の代謝物であるとの結論は、それらの物理的特性（ＨＰＬＣおよびＧＣ／ＭＳ）、トリチウム標識を有するとの知見、およびＰＭＡで処理しなかったＨＬ−60細胞との温置でのこれらの生成物の不在を根拠とした。
次に、化合物IIIおよびIVに焦点を当てた。ＬＸＡ4の炭素15〜20番フラグメントでの構造的修飾を表わすようであったためである。ω酸化（炭素20番でのヒドロキシル化）は、一つの可能性であることから、誘導体形成後のＬＸＡ4のそれぞれの20−ＯＨおよび20−ＣＯＯＨに起因し得るイオン、すなわちm/z261および217（Ｍｅ3ＳｉＯ+＝ＣＨ−（ＣＨ2）4−ＣＨ2ＯＳｉＭｅ3およびＭｅ3ＳｉＯ+＝ＣＨ−（ＣＨ2）4−ＣＯ2Ｍｅ）を、得られたＧＣ−ＭＳデータ像で走査した。IIIまたはIVはいずれも、m/z261または217のいずれでも卓越イオンを示さず、これらの生成物が、ω酸化の結果であるとは思われなかった。
Ｍｅ3Ｓｉ誘導体、すなわち化合物IIIのメチルエステルの質量スペクトル（Ｃ値：24.3）を得た。そのスペクトルでの卓越イオンは、m/z203（基本ピーク、ＣＨ（ＯＳｉＭｅ3）−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨＣＨ3）、171（203-32；ＣＨ3ＯＨの排除）、215［（Ｍ−203）−90、トリメチルシラノール（Ｍｅ3ＳｉＯＨ）の排除］および99（Ｏ＝Ｃ−（ＣＨ2）4−ＣＨ3）で観察された。より低い強度のイオンは、ｍ/z508（Ｍ+）および418（Ｍ−90；Ｍｅ3ＳｉＯＨの欠如）であった。これらのイオンの存在は、3Ｈ標識した化合物IIIと同時溶出した材料が、ＬＸＡ4の15−オキソ誘導体であることを示唆した。このことは、いくつかの系統の証拠、すなわち、m/z173（Ｍｅ3ＳｉＯ+＝ＣＨ−（ＣＨ2）4−ＣＨ3）での卓越イオンの実質的欠如、m/z99（Ｏ＝Ｃ−（ＣＨ2）4−ＣＨ3）の存在、テトラエン発色団の不在、および335〜340nmのＵＶλmaxでの新たな発色団の出現によって裏付けられる。テトラエノン発色団は、プロスタグランジン転換［Anggard,E.and Samuelsson,B.（1964）J.Biol.Chem.239:4097］に用いられたとおりに、ＬＸＡ4をクロロホルム中でＭｎＯ2で処理することによって確認された。また接触水素化生成物の質量スペクトルは、m/z203（基本ピーク）、m/z99（66％）、m/z313（Ｍ−203またはＭ−ＣＨ（ＯＳｉＭｅ3）−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨＣＨ3；35％）およびm/z171（36％）での卓越イオンと、m/z173での卓越イオンの不在とともに、25.1というＣ値を与えた。より弱いイオンが、m/z516（Ｍ+）およびm/z426（Ｍ−90）に存在した。したがって、８amuの上方シフト、およびこの飽和誘導体のフラグメント化とは、対応する15−オキソ誘導体の生成と一致する。
このＬＸＡ4誘導生成物を更に検証するため、IIIと標識されたピークの下で溶出する材料のアリコートを、ジアゾメタンで処理し、次いで、メトキシム化し［Bergholte,J.M.et al.（1987）Arch.Biochem.Biophys.257:444のとおり］、ＢＳＴＦＡで処理した。そのスペクトル（Ｃ値25.4）は、m/z203（基本ピーク）、171（203-32；ＣＨ3ＯＨの欠如）および229［Ｍ−128またはＣＨ3Ｏ−Ｎ＝Ｃ−（ＣＨ2）4ＣＨ3−（２ｘ90）］での卓越イオンを示した。より低い強度のイオンが、m/z537（Ｍ+）、466（Ｍ−71、αｔ開裂イオンＭ−ＣＨ2（ＣＨ2）3ＣＨ3）、481（Ｍ−56またはＭ−ＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ3、マックラファーティー再配列イオン）、431［Ｍ−106（おそらくＣ7Ｈ5Ｎ+）の欠如］、401［Ｍ−136（Ｍｅ3ＳｉＯＨ＋ＣＨ3＋・ＯＣＨ3の排除）］および460（Ｍ−77、ＮＯＣＨ3＋ＭｅＯＨの排除）に存在した。やはり、アルコール含有Ｃ−15フラグメント（Ｍｅ3ＳｉＯ+−ＣＨ−（ＣＨ2）4−ＣＨ3）起源と思われるm/z173でのイオンは、そのスペクトルに実質的に不在であった。したがって、存在するイオンは、メチルエステル、すなわちＬＸＡ4の15−オキソ含有誘導体から生成されたＯ−メトキシム誘導体に一致する。まとめると、これらの異なる誘導体で観察された卓越イオンは、IIIと標識されたピークの下で溶出する材料が、ＬＸＡ4の15−オキソ生成物（すなわち15−オキソＬＸＡ4）であったことを示唆する。
化合物IVのメチルエステルであるＭｅ3Ｓｉ誘導体（Ｃ値26.0）の質量スペクトルは、m/z203（基本ピーク、ＣＨ（ＯＳｉＭｅ3）−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨＣＨ3）、171（203−32；ＣＨ3ＯＨの欠如）、99（Ｏ＝Ｃ−（ＣＨ2）4−ＣＨ3）および307（Ｍ−203またはＭ−ＣＨ（ＯＳｉＭｅ3）−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨＣＨ3）での卓越イオンを示した。より低い強度のイオンが、m/z510（Ｍ+）、420（Ｍ−90、トリメチルシラノールの欠如）および208（Ｍ−（99＋203））に存在した。そのＵＶスペクトルは、259、269および280nmに最大値を有する三重線の吸光を示し、共役トリエン発色団と整合する。これらのイオンの存在、およびＵＶスペクトルは、IVが、ＬＸＡ4のジヒドロ−15−オキソ代謝物であったことを示唆する。この基本構造は、炭素15番の位置のケト基に一致するm/z99でのイオンの存在と、炭素５および６番のアルコール基が無傷のままであることを示す基本ピークとしてのm/z203の存在とによって裏付けられた。加えて、トリエノン発色団（λcal＝310nm）の不在は、二重結合の欠如が、Δ13〜14位に存在して、観察されたトリエン発色団を与えたことを示す。まとめると、これらの結果は、化合物IVが13，14−ジヒドロ−15−オキソ−ＬＸＡ4であったことを示す。
メチルエステル、すなわち化合物IIのＭｅ3ＳｉＯ誘導体（Ｃ値−25.4）は、m/z203（基本ピーク；ＣＨ（ＯＳｉＭｅ3）−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨＣＨ3）、173（Ｍｅ3ＳｉＯ+＝ＣＨ−（ＣＨ2）4−ＣＨ3）、171（203−32）および508（Ｍ+）でピークを与えた。その分子イオンは、ＬＸＡ4誘導体より高い二つの質量単位であった。これらのイオン、および吸収：λmaxＭｅＯＨの259nm、269および282nmの三重線の帯域は、化合物IIが、ＬＸＡ4のジヒドロ誘導体であったことを示唆する。ＨＬ−60細胞からのメチルエステル、すなわち化合物ＩのＭｅ3ＳｉＯ誘導体は、ＧＣでは２種類の生成物を与えた。主要な方（Ｃ値＝25.0）は、ＬＸＡ4に類似するイオンをその質量スペクトルを与えたが、その分子イオンは、m/z586にあって、m/z555（Ｍ−31）および496（Ｍ−90）にもイオンが存在し、４個の二重結合のうち２個が還元されたことを示唆する（図示せず）。しかし、末梢血単球では同じ生成物が観察されず（上記参照）、したがって、ピークＩからのＨＬ−60細胞に由来する材料は、この実験ではそれ以上特性記述しなかった。Ｉ〜IVの構造は、ＬＸＡ4が、健全な白血球によるω酸化によっては代謝されず、ともに炭素15番のアルコールで脱水素され、また共役テトラエンからトリエン構造へと変換されることも示す。考え合わせると、これらの所見は、ＬＸＡ4は、ＮＡＤ依存性15−プロスタグランジン脱水素酵素（５−ＰＧＤＨ）、すなわち基質としてのプロスタノイドとの類似の反応を行なうことが公知である酵素［Anggard,E.and Samuelsson,B.（1964）J.Biol.Chem.239:4097、またHansen,H.S.（1976）Prostaglandins 12:647に総説］によって攻撃され得ることを示唆する。
15−ＰＤＧＨの活性は、ＨＬ−60細胞で誘導されることが最近示され［Xun,C-Q.et al.（1991）Biochem.J.279:553］、明らかに、基質としての15−ＨＥＴＥをＰＧＥ2に比して92％の効率で利用する［Agins,AP.et al,（1987）Agents Actions 21:397］。実際、ＰＭＡ処理したＨＬ−60細胞から調製した100,000ｇ上清は、15−ＨＥＴＥを15−オキソ−ＥＴＥに転換し、分化後の脱水素酵素活性の存在を示した。ＬＸＡ4は、15−ＨＥＴＥの触媒作用について競合し、ラインウィーバー−バークのプロットから算出したKi＝8.2±2.6μＭ（S.E.M.、ｎ＝６）を示した。ＬＸＡ4および15−ＨＥＴＥの等モル濃度では、ＬＸＡ4は、15−オキソ−ＥＴＥ形成をほぼ50％阻害した。100,000ｇ上清によるＬＸに対するＰＧＥ1に比しての相対的転換は、ＬＸＡ4、11−trans−ＬＸＡ4およびＬＸＢ4が転換されたが、15−メチル−ＰＧＥ1は転換されないことを示した。まとめると、これらの結果は、15−ＰＧＤＨ、または同等の酵素系に対しては、ＬＸＡ4＞11−trans−ＬＸＡ4＞ＬＸＢ4が基質であることを示唆する。
ＰＭＡは、単球−マクロファージ様細胞系統へのＨＬ−60細胞の分化を誘導する［Collins,S.J.（1987）Blood 70:1233］ことから、末梢血単球を温置して、ＬＸを代謝するかを決定した。ＬＸは、単球に対して強い作用を示し［Stenke,L.et al.（1991b）Biochem.Biophys.Res.Commun 180:255］、これらの細胞は、エイコサノイドをω酸化しない［Goldyne,M.E.et al.（1984）J.Biol.Chem 259:8815］。ＬＬＸＡ4は、無傷の単球（ｎ＝５）と透過性細胞（凍結融解またはサポニン処理、ｎ＝５）との双方の懸濁液を接触させたとき、15−オキソ−ＬＸＡ4、共役トリエンを有する生成物である13，14−ジヒドロ−ＬＸＡ4、および13，14−ジヒドロ−15−オキソーＬＸＡ4に転換された。分化したＨＬ−60と同様に、単球は、30分以内に急速にＬＸＡ4を転換した（＞60％）。無傷および透過性の単球の双方でのこれらの代謝物の形成に関する時間的関係は、同様であり、15−オキソ−ＬＸＡ4という代謝物は、過渡的中間体であることを示唆する。また3Ｈ−ＬＸＡ4（ｄ＝33）と温置した単球懸濁液では、13，14−ジヒドロ−15−オキソ−ＬＸＡ4および13，14−ジヒドロ−ＬＸＡ4が、それぞれ、放射性標識を有する主生成物であった。15．5〜17分で13，14−ジヒドロ−ＬＸＡ4の前に溶出する生成物が観察され、それが、トリエン発色団も示し、処理の際に起ったcis−trans異性化から生じた13，14−ジヒドロ−ＬＸＡ4の11−trans異性体であると思われたことは、注目に値する。未変性ＬＸＡ4の11−cis結合は、不安定であり、抽出や単離の際に全transへと容易に異性化する［Romano,M.and Serhan,C.N.（1992）Biochemistry 31:8269］。
実施例３：リポキシン受容体の類似体との結合親和性
ヒト前骨髄球性白血病細胞（ＨＬ−60）は、米国基準株コレクション（Rockville,MD）から購入した。ＲＰＭＩおよび細胞培養試薬は、GIBCO（Grand Island,NY）から得た。合成ＬＸＡ4、トリヒドロキシヘプタン酸（メチルエステル）、ＬＸＢ4、ＬＴＤ4、ＬＴＣ4およびＬＴＢ4は、Biomol（Plymouth Meeting,PA）から、ＳＫＦ104353は、Smith Kline and Frech Laboratoriesから得た。ＯＮＯ4057は、ＯＮＯPharmaceutical Co.,Ltd（大阪、日本国）から得た。［14，15−3Ｈ］ＬＴＢ4（32.8mCi／ミリモル）、［１−14Ｃ］アラキドン酸（50.2mCi／ミリモル）、32ＰγＡＴＰ（3,000mCi／ミリモル）、［9,10-3Ｈ（Ｎ）］パルミチン酸（30.0mCi／ミリモル）および［9,10−3Ｈ（Ｎ）］ミリスチン酸（30.7mCi／ミリモル）は、New England Nuclear（DuPont Co.,Boston,MA）から購入した。11，12−アセチレン性ＬＸＡ4は、Cascade Biochemical（Reading、英国）から得た。微量遠心分離管フィルター（0.45μm酢酸セルロース）は、PGC Scientific（Gaithersburg,MD）から、シリコーン［訳注：原文ではsilicon］油（ｄ＝1.05およびｄ＝0.963）は、それぞれ、Harwick Chemical Corp.（Akron,OH）およびThomas Scientific（Swedesboro,NJ）から購入した。ニトロブルーテトラゾリウム、ＰＭＡ、ＤＭＳＯ、プロテアーゼ、レチノイン酸およびアクチノマイシンＤは、Sigma（St.Louis,MO）から購入した。島活性化タンパク質（ＩＡＰ）は、LIST Biological Lab.,Inc．（Campbell,CA）から得た。プラスチック器具類、ワットマンＬＫ６ＤのＴＬＣプレートおよび溶媒（ＨＰＬＣ等級）は、Fisher（Springfield,NJ）から得た。
［11，12−3Ｈ］ＬＸＡ4の製造：11，12−アセチレン性ＬＸＡ4メチルエステルの滴定を、New England Nuclear（Boston,MA）による注文滴定サービス（ＮＥＴ−259：92−2326）の下で実施した。略述すると、11，12−アセチレン性メチルエステルを、［Nicolaou,K.C.et al.（1985）J.Am.Chem.Soc.107:7517］のとおりにＵＶ吸光および逆相ＨＰＬＣによって特性記述し、塩化メチレン中でトリチウム雰囲気に室温で接触させた。この温置を、リンドラー触媒（1.0mg、Fluka Chemicalsより）の存在下で〜１時間攪拌した。得られた混合物を、メタノール中に貯蔵し、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて単離した。トリチウム化した生成物を、光ダイオードアレー高速スペクトル検出器を備えた勾配ＨＰＬＣ系を用いて、メチルエステルとしてクロマトグラフィーに付した［Serhan,C.N.,Methods in Enzymoloty:Arachidonate Related Lipid Mediators:Murphy,R.C.,Fitzpatrick,F.（eds.）, Vol 187.Orlando,FL,Academic,（1990）p.167］。この混合物は、合成標準との同時溶出によって決定した限りで、［11，12−3Ｈ］ＬＸＡ4と［11，12−3Ｈ］−11−trans−ＬＸＡ4メチルエステルとをともに（〜１：３の比率）含有した。ＲＰ−ＨＰＬＣの後、［11，12−3Ｈ］ＬＸＡ4を含有する分画を捕集し、酢酸エチル中に抽出した。遊離酸は、ＬｉＯＨけん化によって製造した［Fiore,S.et al.（1992）J.Biol.Chem.267:16168］。これらの分画からの材料は、ＵＶ電子化学的検出ＨＰＬＣに注入したとき、合成ＬＸＡ4と同時溶離されたテトラエンを有する生成物を伴って、90％を超える放射能を示した。二つのＨＰＬＣ系で基準ＬＸＡ4の保持時間で溶出した材料を、結合実験用に採取した。［11，12−3Ｈ］ＬＸＡ4について算出した比活性は、40.5Ci／ミリモルであった。
細胞培養および分化：ＨＬ−60細胞を、100Ｕ／mlのペニシリン、100μg／mlのストレプトマイシン、および10％ウシ胎児血清（Hyclone,Logan,UT）で強化したＲＰＭＩに播種し、250ml入りフラスコ内で、5％ＣＯ2雰囲気で37℃で温置した。次いで、〜50ｘ106個／mlの細胞を内容する個々のフラスコに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（1.12体積％、120時間）、レチノイン酸（ＲＡ）（１μM、120時間）またはホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（20nM、４８時間）を与えた。結合検定を実施する前に、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まぬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で細胞を２回洗浄し、計数し、トリス緩衝液（10mM）、pH7.4に20ｘ106個／mlの細胞として懸濁させた［Fiore,S.et al.（1992）J.Biol.Chem.267:16168］。［Imaizumi,M.and Breitman,T.R.（1986）Blood 67:1273］のとおり、多形核の表現型の誘導を追跡するために、ニトロブルーテトラゾリウムによる還元を実施し、マクロファージ様表現型の誘導について細胞の付着を決定した［Collins,S.J.（1978）Blood 70:1233］。培養の第三継代に維持したヒト臍帯静脈の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、M.Gimbrone博士（Birmingham and Women's Hospital Department of Biology）から得た。
末梢血からのＰＭＮ、血小板およびＲＢＣの単離：健康な正常志願者の静脈穿刺後の新鮮なヘパリン添加した血液から、修正Boyum法［Boyum,A（1986）Scand.J.Clin.Lab.Invest.21:77］によって、ヒトＰＭＮを得た。ＰＢＳへの懸濁液を、ともに98％を超えてトリパンブルーを排除できる能力によって、細胞数および生存率について追跡した。赤血球は、ＰＢＳ中での３回の遠心分離（2,500rpm、21℃で10分間）後のヘパリン添加した血液10mlから得た。以前に記載されたとおり［Serhan,C.N.and Sheppard,K.-A.（1990）J.Clin.Invest.85:772］、酸性クエン酸デキストロース（９：１v/v）中で吸引した血液を用いて、血小板を単離した。
リガンドの結合：3Ｈ−ＬＸＡ4および3Ｈ−ＬＸＢ4の結合を、基本的にはFiore,S.et al.（1992）J.Biol.Chem.267:16168のとおりに実施した。細胞を10mMトリス緩衝液（pH7.4、Ｃａ2+2.5mM、Ｍｇ2+1.2mM）に懸濁させた後、アリコート（0.5ml）を3Ｈ−リガンドのみ（0.3nM）でか、または増加する濃度のホモリガンドその他の化合物（3〜300nM）の存在下で温置した（4℃で20分）。温置をシリコーン油（ｄ＝1.028）上で急速に遠心分離し（60秒、12,000ｇ）、細胞に付随する放射能を液体シンチレーション計数（Wallac 1409,Pharmacia,Piscataway,NJ）によって決定した。ＨＵＶＥＣ細胞との結合実験は、3.5ｘl05個／ウェルの細胞を有する12ウェルプレートで実施した。10分後に、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、細胞付随標識を、氷酢酸（0.5ml）を加えることによって回収した。これらの検定から得られた結果は、Ligandというプログラム（Elsevier-Biosoft,Cambridge、英国）を用いて、その後の分析に提出した。
ＰＬＤ活性：上記のとおり調製したヒトＰＭＮおよびＨＬ−60細胞（50ｘ106個／ml）を、3Ｈ−ミリスチン酸または3Ｈ−パルミチン酸（８μCi／50ｘ106個の細胞）とともにＰＢＳ中で37℃で40〜60分間温置した。細胞による取込みは、加えた標識の60〜80％にわたり、ＰＭＮおよびＨＬ−60の細胞の総リン脂質群に、それぞれ7.1±4.2％（ｎ＝10；平均±Ｓ．Ｄ．）および32.6±10.3％（ｎ＝６；平均±Ｓ．Ｄ．）が取り込まれた。温置は、37℃で実施した（10ｘ106個の細胞／ＰＢＳ１ml）。Billah,M.M.et al.（1989）J.Biol.Chem.264:17069のとおりに、ホスファチジルエタノール（ＰＥｔ）形成のための作用薬を、ＰＢＳ50μl中にか、または１：10（v/v）のＥｔＯＨ：ＰＢＳとして加えた。示した時間に、ここでは内標準として用いた１−14Ｃ−アラキドン酸（5,000ppm）を含有する、氷冷ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（２／５、v/v）3.5mlを加えることによって温置を停止して、抽出の復元を定量した。［Serhan,C.N.and Sheppard,K.-A.（1990）J.Clin.Invest.85:772］のとおりに修正BlighおよびDyer抽出を用いて、試料を抽出した。ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（８／２、v/v）50μl中に濃縮した有機相を、酢酸エチル／イソオクタン／酢酸／水（110／50／20／100、v/v/v/v）の有機相で50分間展開する線形Ｋ６ＤのＴＬＣプレート上にスポットした［Billah,M.M.et al.（1989）J.Biol.Chem.264:17069］。この系で、ホスファチジル酸（ＰＡ）はＲf＝0.1±0.04を、ＰＥｔはＲf＝0.1±0.04；ｎ：38±Ｓ．Ｄ．を与え、他のリン脂質（原点に留まった）または中性脂質（Ｒf＝0.75−0.90）から明確に分離された。脂質は、ヨウ素蒸気で可視化し、やはり各ＴＬＣプレートでスポットし、かつクロマトグラフィーに付した、基準標準との同時溶離によって特定した。ＰＡ、ＰＥｔおよび内標準に対応する領域を、掻き取り、液体シンチレーション計数によって定量した。3Ｈ−ミリスチン酸または3Ｈ−パルミチン酸標識に加え、［１−14Ｃ］アラキドン酸（0.25μCi／30ｘ106個のＰＭＮ）と32ＰγＡＴＰ（20μCi／50ｘ106個のＰＭＮ）とで標識した細胞を用いて、ＰＡおよびＰＥｔ生成のＬＸＡ4で刺激された形成を追跡した。これらの実験で、ＰＡは、溶媒系として酢酸エチル／イソオクタン／酢酸（45／15／10、v/v/v）を用いて分解し［Bocckino,S.B.et al.（1989）Anal.Biochem.180:24］、Ｒf＝0.46±0.03（ｎ＝15）を与えた。ＰＥｔ形成について表４および５に報告したすべての値は、作用薬のみの存在下で得られたdpmから、作用薬および0.5％ＥｔＯＨの存在下で測定したそれを減じることによって算出した。
ＬＸＡ4で誘導されたＰＬＤ活性に対するＩＡＰおよびスタウロスポリンの衝撃：記載のとおり（上記参照）実施されたＰＬＤ活性検定の前に、ＩＡＰまたはスタウロスポリンのいずれかに細胞を接触させた。ＰＭＮのＩＡＰ処理は、以前に記載のとおり［Nigam,S.et al.（1990）J.Cell Physiol.143:512］実施し、ＨＬ−60細胞は、ＩＡＰの存在または不在下で37℃で２時間温置した［Kanaho,Y.et al.（1992）J.Biol.Chem.267:23554］。アリコート（107個／0.5mlの細胞）を緩衝液0.4mlに加えた。次に、温置した細胞を、0.5％ＥｔＯＨの存在または不在下で、100μlの賦形剤（ＰＢＳ、ＥｔＯＨ、0.04％）またはＬＸＡ4のいずれか（10-7Ｍおよび10-9Ｍ）に接触させた。スタウロスポリン（100nM）は、ＬＸＡ4の添加以前に37℃で５分間、細胞懸濁液に加えた。
結果
合成［11，12−3Ｈ］ＬＸＡ4を製造した後、前骨髄細胞性細胞（ＨＬ−60）とのその特異的結合を、特性記述し、［14，15−3Ｈ］ＬＴＢ4の特異的結合との直接比較を実施した。定型的な表現型マーカーを追跡したとき、未処理ＨＬ−60細胞は、3Ｈ−ＬＸＡ4および3Ｈ−ＬＸＢ4のリガンドの双方に対する低レベルの特異的結合を示した。ＤＭＳＯ（1.12％）またはレチノイン酸（１μM）との５日間の接触によって誘導した分化は、両放射性リガンドに対する特異的結合の３〜５倍の増加を伴った。マクロファージ様表現型の特徴を示すＰＭＡ処理細胞、すなわち、プラスチックに付着するＮＢＴ陰性細胞［Imaizumi,M.and Breitman,T.R.（1986）Blood 67:1273；Collins,S.J.（1978）Blood 70:1233参照］も、3Ｈ−ＬＸＡ4および3Ｈ−ＬＸＢ4のリガンドの双方に対する特異的結合の外見へと導いた。４℃での3Ｈ−ＬＸＡ4との平衡結合には、10分で到達し、次の20分間は実質的に不変のままであった。
両3Ｈ−リガンドに対する特異的結合の誘導が、de novoの合成を要するか否かを査定するため、アクチノマイシンＤ（2μg／ml）をＰＭＡ温置とともに加えた。アクチノマイシンＤは、両標識エイコサノイドに対する特異的結合のＰＭＡで誘導される増大を阻害し、特異的結合部位のやはり阻害された外見とともにde novoのタンパク質合成の阻害を示唆する。プロテアーゼおよびグリコシダーゼ処理の衝撃を、3Ｈ−ＬＸＡ4の特異的結合について２種類の分化ＨＬ−60細胞およびヒトＰＭＮで査定した。プロテアーゼ処理は、特異的結合を低下させ、ＬＸＡ4の特異的結合部位のタンパク質成分を裏付ける追加の証拠を示した。
分化したＨＬ−60細胞、および［11，12−3Ｈ］ＬＸＡ4（0.1〜30nM）での等温結合検定からの結果は、［11，12−3Ｈ］ＬＸＡ4の特異的結合部位が、ＫD＝0.6±0.3nMを与えることを示した。ヒトＰＭＮによるＬＸＡ4特異的結合では、Scatchardプロットの非線形部分が観察された［Fiore,S.et al.（1992）J.Biol.Chem.267:16168］。ＨＬ−60細胞によるＬＴＢ4特異的結合で、ここで得られた結果、すなわちＫD＝0.12nMは、Harada［Xie,M.et al.（1991）J.Clin.Invest.88:45］が最近報告した値、すなわちＫD＝0.23nMと基本的に一致する。
3Ｈ−ＬＸＡ4のその特異的結合部位との相互作用を更に特性記述するために、分化したＨＬ−60細胞、ＬＸＡ4、ＬＸＢ4、ＬＴＢ4、ＬＴＣ4、およびロイコトリエン受容体拮抗薬SKF 104353［ＬＴＤ4拮抗薬；Harada,Y.（1990）Hiroshima J.Med-Sci.39；89］で、競合結合実験を実施し、ONO-4057［ＬＴＢ4拮抗薬；Gleason,J.G.et al.（1987）J.Med.Chem.30:959］は、競合リガンドの可能性があると査定された。ＬＸＢ4、ＬＴＢ4、またはトリヒドロキシヘプタン酸（メチルエステル）（300nM）は、いずれも、分化ＨＬ−60細胞との3Ｈ−ＬＸＡ4の特異的結合に代置できなかったが、ＬＴＣ4は、３の対数のモル数で過剰に加えたとき、特異的結合の〜30％の低下を生じた。ＬＸＡ4（300nM）が、分化ＨＬ−60細胞との3Ｈ−ＬＴＢ4（0.3nM）の結合に競合できなかったとの知見は、ＬＸＡ4とＬＴＢ4が、別個の分類群の特異的結合部位と作用し合うことを示唆する。ロイコトリエン受容体拮抗薬のSKF 104353およびONO-4057は、分化ＨＬ−60細胞による3Ｈ−ＬＸＡ4に入れ代らなかったが、SKF l04353およびＬＴＤ4は、ＨＵＶＥＣによる特異的な3Ｈ−ＬＸＡ4の結合と競合するのに効果的であった。ＨＵＶＥＣは、11,0±2.6nMというＫD、および2.5ｘ10-10ＭというＢmaxを3Ｈ−ＬＸＡ4に対して示し、ＬＴＤ4競合については、実質的に同一の値が算出された。3Ｈ−ＬＴＢ4の場合は、ＨＵＶＥＣは、ＬＴＢ4と特異的に結合しなかったが、この3Ｈ−リガンドでの非特異的な細胞の会合が明白であった（ｎ＝３；図示せず）。3Ｈ−ＬＸＡ4の特異的会合は、他のいくつかの調べた細胞型で明確ではなかった。ここで、洗浄血小板、ＲＢＣ類、β細胞（Raji）、またはＴ細胞（Jurkat）の培養細胞系は、いずれも、3Ｈ−ＬＸＡ4に対する特異的結合を示さなかった。考え合わせると、これらの結果は、ＬＸＡ4は、分化したＨＬ−60細胞の、いずれのロイコトリエン受容体拮抗薬（SKF 104353またはONO-4057）にも感受性ではない独自の結合部位と作用し合うことを示す。ＨＵＶＥＣでは、3Ｈ−ＬＸＡ4の特異的結合は、ＬＴＤ4とSKF 104353との双方に感受性であるが、ONO-4057にはそうではなく、この細胞型での3Ｈ−ＬＸＡ4の特異的結合は、推定されるＬＴＤ4受容体とのその相互作用を反映している可能性があることを示唆する。
ＬＸＡ4は、ヒト好中球でのホスファチジン酸形成を急速に刺激する［Nigan,S.et al.（1990）J.Cell Physiol.143:512］。3Ｈ−ＬＸＡ4の結合が、ＰＬＤ活性化をあたえるのかを決定するため、ＰＭＮとＨＬ−60との双方でＰＥｔおよびＰＡを追跡した。結果は、これらの細胞でＬＸＡ4は、類似の経時的応答でＰＬＤ活性を刺激することを示した。ＬＸＡ4（10-10Ｍ）に接触させたＰＭＮは、60秒以内にエタノール捕捉生成物のＰＥｔを急速に生成したが、それは、５分までには基線レベルへと減衰した。添加ＥｔＯＨの不在下では、ＰＥｔは、統計的有意レベルでは形成されなかった。ＰＥｔについては、ＰＭＮと分化ＨＬ−60細胞との双方で二相濃度依存性が得られた。見かけの最大応答は、〜10-9〜10-10Ｍの濃度範囲で認められ、活性の第二のピークが、10-7ＭのＬＸＡ4で観察された。10-8Ｍ未満では、走化性ペプチドのＦＭＬＰとＬＸＡ4との双方が、類似の強さという結果を示したが、何名かの供与者からのＰＭＮでは、ＦＭＬＰの方がやや強力であるようであった。他の生合成経路の寄与の可能性を評価するため、ＬＸＡ4で誘導されるＰＡ形成も、32ＰγＡＴＰと［１−14Ｃ］アラキドン酸との双方で標識したＰＭＮで調べた。32Ｐ標識ＰＡは、ＬＸＡ4（10-7Ｍ）への接触の30分後にのみ、統計的有意なレベルで明らかであったにすぎない。14Ｃアラキドン酸で標識された前駆体に由来する14Ｃ標識ＰＡの形成では、類似の結果が得られた。これらの知見は、ＬＸＡ4は、ＰＭＮでのＰＡ形成のその他の経路も刺激できるが、接触の30分後のみにすぎないことを示した。
ＬＸＡ4と温置した分化ＨＬ-60細胞（3Ｈ-ＬＸＡ4に対する特異的結合部位を発現）のみが、急速にＰＥｔを生成したにすぎず、それは30秒以内に明白であった。ＬＸＡ4と温置した未分化ＨＬ−60細胞（10-9Ｍ）は、ＰＥｔを急速に生成することがなかった。これらの細胞による濃度依存性も、ＬＸＡ4による二相応答を示し、10-9Ｍで見かけの最大値を与えた。次に、ＬＸＡ4を介したＰＬＤ活性化に関与する可能性があるシグナル導入事象を調べるため、ＰＭＮおよびＨＬ−60細胞をＩＡＰまたはスタウロスポリンのいずれかに接触させた。結果は、より低い濃度範囲（10-9〜10-10Ｍ）内で誘発されるＬＸＡ4介在性ＰＬＤ活性は、両細胞型でのＩＡＰ処理に感受性があり、同様に、より高いＬＸＡ4の濃度（10-7Ｍ）でのＰＬＤ活性は、スタウロスポリンによって阻害されたことを示す。したがって、10-8Ｍ未満の濃度の両細胞系では、ＬＸＡ4は、ＰＬＤ活性を誘発する特異的結合部位と急速に作用し合い、そのために、機能的応答を与えるが、μＭ未満のＬＸＡ4の濃度範囲内では、やはりＰＬＤの活性化へと導き得る追加の過程を刺激する可能性がある。
実施例４：リポキシンの生体活性の検定
好適なＬＸ類似体（化合物１〜８として上記に構造的に示す）のうちいくつかを、実施例１に記載したとおり、全合成によって製造した。ＨＰＬＣを経由するこれらの化合物の製造および単離の後、初めに、生物学的活性保持の有無を決定するために、好中球接着検定および上皮細胞移行検定［Nash,S.et al.（1987）J.Clin.Invest.80:1104-1113;Nash,S.et al.（1991）J.Clin.Invest.87:1474-1477;Parkos,C.A.et al.（1991）J.Clin.Invest.88:1605-1612;Parkos,C.A.et al.（1992）J.Cell.Biol.117:757-764;Madara,J.L.et al.（1992）J.Tiss.Cult.Meth.14:205-216に記載のとおり］を用いて評価した。
化合物１〜８（10-7〜10-10Ｍ）は、内皮細胞への好中球の接着、および上皮細胞でのそれらの移行を阻害することが見出された。アセチレン性前駆体（化合物１、３、５および７）は、それらのテトラエンの相手より物理的に安定であることが見出された。化合物７は、Ｃ15の位置でのアルコール基、またはこの系列での他の修飾がなく、検定では全く生物学的活性を示さなかった。したがって、ＬＸのＣ15位の置換基は、少なくともＬＸＡ4類似体の生物学的活性に必要であるように思われる。15−メチル−ＬＸＡ4（化合物２）も、ロイコトリエンＢ4が触発するヒト内皮細胞への多形核（ＰＭＮ）接着を、〜１ＭのＩＣ50で阻害することが判明した。ＬＸ類似体１〜８は、合成ＬＸＡ4より大きいか、またはそれに等しい効力で移動を阻害することが見出された。化合物７は、ＬＸＡ4または他の類似体が誘導する阻害の濃度範囲内では、基本的に不活性であることが見出された。これらの好中球含有生物検定での結果は、Ｃ15〜Ｃ20位に修飾を有するＬＸＡ4類似体は、それらの生物学的作用を保持し、ＰＭＮの移行および接着事象を阻害できることを示す。
化合物１〜８の「生体半減期」を、実施例２に記載のとおり、ホルボールエステル処理したヒト前骨髄細胞性白血病（ＨＬ−60）を用いて査定した。これらの細胞は、細胞温置への添加の５分以内に95％以上のＬＸＡ4を転換した。この系でＬＸＡ4は、15−オキソ−ＬＸＡ4へと急速に変換された。しかし、同じ検定で、15−メチル−ＬＸＡ4（化合物２）およびシクロヘキシル−ＬＸＡ4（化合物４）は、２時間までの時間で、温置媒体中で定量的に回収された。これらの結果は、炭素20位〜炭素15位での修飾は、白血球によるＬＸＡ4のそれ以上の代謝を妨げることを示す。
加えて、アセチレン性メチルエステルのＬＸＡ4（化合物１）の安定性は、抽出および逆相ＨＰＬＣ後に査定されたとおり、生体外での全血中での温置（37℃）の60分後に、基本的に無傷で回収された。考え合わせると、これらの結果は、ＬＸ類似体は、in vitroでも生物学的作用を保持し、それ以上の代謝に耐性であることを示す。
実施例５：細胞増殖に対する15−エピリポキシン類の効果
材料と方法
合成（５Ｓ，６Ｒ，15Ｒ）、−トリヒドロキシ−７，９，13-trans−11−cis−エイコサテトラエン酸塩：カルボキシメチルエステル（15−エピ−ＬＸＡ4メチルエステル）は、全有機合成によって製造されたもので、N.A.Petasis教授（Department of Chemistry,University of Southern California）の寄贈であった。15−エピ−ＬＸＡ4の遊離酸は、テトラヒドロフラン中でのＬｉＯＨ（0.1Ｍ）による15−エピ−ＬＸＡ4−メチルエステルの、４℃で24時間のけん化によって得た。合成エイコサノイドという参照試料は、Cascade Biochemical Limited（Reading,Berkshire、英国）から得た。５−ＬＯ（Rev 5901の異性体）およびシトクロムＰ450（17−オクタデカン酸、17−ＯＤＹＡ）活性の阻害剤は、Biomol（Plymouth Meeting,PA）から得た。放射能標識した（［32Ｐ］）ｄＣＴＰおよび（［3Ｈ］）アラキドン酸、ならびにメチルチミジンは、DuPont NEN（Boston,MA）から得た。イオノフォア（Ａ23187）、ＡＳＡ、３，（４，５−ジメチルチアゾイル−２−イル）２，５（ジフェニルテトラゾリウム＝ブロミド）（ＭＴＴ）およびグアニジニウムイソチオシアナートは、Sigma Chemical Co.（St.Louis,MO）から購入した。組換えヒトインターロイキン１β（ＩＬ−１β）は、R&D Systems（Mineapolis,MN）から得た。ＣａＣｌ2（0.6ｍＭ）とＭｇＣｌ2（1.0ｍＭ）とをともに含有するダルベッコリン酸緩衝食塩水（pH7.4）（ＤＰＢＳ2+）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、Bio Whittaker（Walkersville,MD）から得た。ハンクの均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）およびＦ−１２Ｋ栄養混合物は、Gibco Laboratories（Grand Island,NY）から得た。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等級の溶媒、および塩化セシウムは、JT Baker（Phillipsburg,NJ）から、購入し、ギ酸メチルは、Eastman Kodak Co（Rochester,NY）から、Sep-Pak C18カートリッジは、Waters Associates（Milford,MA）から得た。ジアゾメタンは、Aldrich Chemical Company（Milwaukee,WI）から購入したＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジンから製造した。Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）は、Pierce（Rockford,IL）から得た。第一鎖ｃＤＮＡ合成キットその他の分子生物学試薬は、Promega（Madison,WI）から得た。オリゴヌクレオチドプライマーは、Integrated DNA Technologies（Coralville,IA）から購入した。
細胞の単離および培養
ヒト肺癌からのヒトII型上皮Ａ549細胞、およびヒト皮膚繊維芽細胞（胸部）を、米国基準株コレクション（Rockville,MD）から入手した。Ａ549細胞系は、ヒト肺胞細胞癌腫が起源であり、容易に査定することができて、組織マクロファージの混入なしに培養で維持できたことから、有用な細胞系であった［Lieber,M.et al.（1976）「II型肺胞上皮細胞の特性を有するヒト肺癌腫からの連続的継代腫瘍細胞系（A continuous tumer-cell line from a human lung carcinoma with proper ties of type II alveolar epithelial cells）」、Int.J.Cancer］。繊維芽細胞は、それらの限られた生存率の枠内で用い、それらの継代数を記録した（結果は、３〜５代からの細胞について報告した）。上皮Ａ549細胞は、Ｔ−75cm2の組織培養フラスコ内に播種し、10％加熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン（50Ｕ／ml）およびストレプトマイシン（50ｇ／ml）で強化したＦ−１２Ｋ培地で維持した。ＡＳＡその他の投薬を少なくとも２週間受けなかった、健康な供与者からのヒトＰＭＮを、Ficoll-Hypaque勾配遠心分離およびデキストラン沈降によって入手し［Boyum,A.（1986）「ヒト血液からの単核細胞および顆粒球の単離：１ｇでの一回遠心分離による単核細胞の、および遠心分離と沈降との併用による顆粒球の単離（Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.Isolation of mononuclear cells by one centrifugation,and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1g）」、Scand.J.Clin.Lab.Invest.21（Suppl.97）:77-89］、pH7.4のＤＰＢＳ+に懸濁させた。Ａ549細胞およびＰＭＮの生存率は、トリパンブルーを排除できるそれらの能力によって決定し、それぞれ、95±２および97±１％であった。これらの値は、報告された温置の間、有意に変化することはなかった。
温置条件：
透過性にしたＡ549細胞（高速凍結融解サイクルによって調製）に関連する温置の際は、ＩＬ−１β処理した（１ng／ml、24時間）Ａ549細胞（1.5ｘ106個／ml）を、担体（0.1％ＥｔＯＨ）、ＡＳＡ（500Ｍで用い続けた）、５Ｍの17−ＯＤＹＡ、すなわちシトクロムＰ450の阻害剤［Muerhoff,A.S.et al.（1989）「ウサギ肺でのプロスタグランジン、ならびに脂肪酸のωおよび（ω−１）酸化：特異的阻害剤としての、アセチレン性脂肪酸の機序に基づく不活性化剤（Prostaglandin and fatty acid ω and（ω-1）-oxidation in rabbit lung:acetylenic fatty acid mechanism-based inactivators as specific inhibitors）」、J.Biol.Chem.244:749-756］、または５mMのRev 5901異性体、すなわち５−ＬＯ阻害剤のいずれかで前処理し、ドライアイス−アセトン浴中での高速凍結と室温での融解との二つのサイクルに付し（全サイクル＜20分）、ＤＰＢＳ2+４ml中でアラキドン酸（20Ｍ）とともに37℃で20分間温置した。放射能標識したアラキドン酸に関連する実験では、［3Ｈ］−アラキドン酸（0.25Ci／ml）＋非標識アラキドン酸（20Ｍ）の添加で、37℃で20分間の温置を開始した。
内在発生源からの15−ＨＥＴＥの生成に関連する時間的経過の実験（図２Ｂ参照）には、無傷のＡ549細胞を、ＩＬ−１β（１ng／ml）に48時間まで接触させ、次いで、担体（0.1％ＥｔＯＨを含有）またはＡＳＡで20分間処理した後、ＨＢＳＳ４ml中のイオノフォアＡ23187（５μＭ）を37℃で30分間加えた。
同時温置の実験では、密集Ａ549細胞を、ＩＬ−１β（１ng／ml、24時間）に接触させ、ＨＢＳＳ中で洗浄し、37℃で、担体のみか、またはＡＳＡで20分間、そしてアラキドン酸（20Ｍ）で60秒間処理した。同時温置は、Ａ549細胞の単層にＰＭＮを加えた後、ＨＢＳＳ４ml中のイオノフォアＡ23187（５μＭ）で37℃で30分間同時刺激することによって実施した。
エイコサノイド類の分析：
温置は、プロスタグランジンＢ2（200ng）を含有する２容の冷ＭｅＯＨで停止し、Sep-PakＣ18カートリッジを用いて、生成物を抽出した。ギ酸メチル分画中に溶出した材料を、Ｎ2流下で濃縮し、モデル8452の分光光度計（Hewlett.Packard Co.,Palo Alto,CA）で紫外吸光性材料を（メタノール中で）走査してから、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ系に注入した。この系は、二重ポンプ勾配（LKB,Bromma、スウェーデン国）、ダイオードアレー検出器（Hewlett-Packard 1040MシリーズII型）およびHPLC3D ChemStationというソフトウェアで構成された。採集されたＵＶデータは、300nmで再現して、共役テトラエンを、270nmでトリエンについて、また234nmでモノＨＥＴＥについて追跡した。ＵＶスペクトルはすべて、0.96秒のサンプリング間隔で、ステップ＝4nm、Ｂｗ＝10nm、およびレンジ＝220〜360nmを用いて得た。
Ａ549細胞からのモノヒドロキシエイコサノイド類（すなわち、５−、12−および15−ＨＥＴＥ）を、Ultrasphere-ODSカラム（５μｍ、4.6mmｘ25cm）（Beckman Instruments,Fullerton,CA）を用い、1.0ml／分の流量で、第一相（ｔ0〜20分）としてＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／酢酸（65：35：0.01；v/v/v）で、第二相（20〜45分）として線形勾配をＭｅＯＨ／酢酸（99.9：0.1；v/v）で溶出させて分析した。15−ＨＥＴＥのＲ−およびＳ−鏡像異性体を、Hawkinsら（1988）が報告したそれ［Hawkins et al.（1988）「キラル相高圧液体クロマトグラフィーによるヒドロキシエイコサテトラエン酸誘導体の鏡像異性体の分割（Resolution of enantiomers of hydroxyeicosatetraenoate derivatives by chiral phase high-pressure liquid chromatography）」、Anal.Biochem.173:456-462］に類似のキラルＨＰＬＣ系を用いて、分割かつ特定した。略述すると、15-ＨＥＴＥのピークの下で溶出するＲＰ−ＨＰＬＣ材料をクロロホルムで抽出し、エーテル性ジアゾメタン処理によってメチルエステルヘと転換した後、Bakerbond DNBPG（共有原子価）キラルカラム（５μm、4.6mmｘ25cm）（JT Baker,Phillipsburg,NJ）を用い、0.8ml／分の流量でｎ−ヘキサン／２−プロパノール（100：0.4；v/v）で溶出させて実施した。示したときは、内在発生源からの15−ＨＥＴＥの生成は、放射性免疫検定（ＲＩＡ）によって追跡した。抗体は、５−ＨＥＴＥについて50％Ｂ／Ｂ0での交差反応性が0.1％である15Ｓ−ＨＥＴＥ（PerSeptive Diagnostics,Cambridge,MA）に対して誘発した。
Ａ549細胞−ＰＭＮからのＬＸ類（ＬＸ類および15−エピ−ＬＸ類を包含）の分析には、0.6ml／分の流量でＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／酢酸（60：40：0.01；v/v/v）のアイソクラチック移動相で溶出させるWaters Bondapak Ｃ18（3.9ｘ300nm）カラム、または3ml／分の流量でＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／酢酸（65：35：0.01；v/v/v）で溶出させるAltex Ultrasphere ODSカラム（５μｍ、10mmｘ25cm）のいずれかを用いて、同時温置を実施した。Sep-Pakカートリッジ抽出物からのＭｅＯＨ分画中に溶出したペプチドロイコトリエン類（ＬＴＣ4およびＬＴＤ4）を、１ml／分でＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／酢酸（65：35：0.01；v/v/v）、pH5.7で溶出させるBeckman Ultrasphere-ODSカラムを用いて分割した。15Ｒ−ＨＥＴＥとのＰＭＮの温置を、ＭｅＯＨで停止し、Sep-Pak Ｃ18抽出生成物のギ酸メチル分画を、3ml／分の流量でＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／酢酸（65：35：0.01；v/v/v）で溶出させるAltex Ultrasphere ODSカラム（５μｍ、10mmｘ25cm）に注入した。300nmで吸光するピークの下の材料を、ＲＰ−ＨＰＬＣの後に個別に捕集し、Claria,J.and Serhan,C.N.（1995）「アスピリンは、ヒト上皮細胞−白血球相互作用による従来は記載されていない生体活性エイコサノイドを誘導する（Aspirin triggers previously undescribedbioactive eicosanoids by human endothelial cell-leukocyte interaction）」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9475-9479（引用により本明細書に明示的に組み込まれる）のとおり、5971Ａ質量選択的四重極検出器を備えたHewlett-Packard 5890 GCシリーズII型を用いたガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ-ＭＳ）によって分析した。
逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲ：
グアニジニウムイソチオシアナート−塩化セシウム法によって、総ＲＮＡをＡ549細胞から入手し、ＲＴによって、ｃＤＮＡを生成した。ＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２［それぞれ（5'-TGC CCA GCT CCT GGC CCG CCG CTT-3'（センス）、5'-GTG CAT CAA CAC AGG CGC CTC TTC-3'（アンチセンス））ならびに（5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA ATT GCT-3'（センス）および（5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3'（アンチセンス））］、15−ＬＯ［5'-ATG GGT CTC TAC CGC ATC CGC GTG TCC ACT-3'（センス）および5'-CAC CCA GCG GTA ACA AGG GAA CCT GAC CTC-3'（アンチセンス）］、12−ＬＯ［Funk,C.D.and FitzGerald,G.A.（1991）「ヒトの組織中のエイコサノイド形成酵素のｍＲＮＡ（Eicosanoid forming enzyme mRNA in human tissues）」、J.Biol.Chem.266:12508-12513］、［5'-AGT TCC TCA ATG GTG CCA AC-3'（センス）および5'-ACA GTG TTG GGG TTG GAG AG-3'（アンチセンス）］、ならびに５−ＬＯ［5'-GAA GAC CTG ATG TTT GGC TACC-3'（センス）および5'-AGG GTT CTC ATC TCC CGG-3'（アンチセンス）］の刊行された配列から、オリゴヌクレオチドプライマーを構成した。ＰＧＨＳ−１、ＰＧＨＳ−２およびＧＡＰＤＨの試料を、94℃で１分間の変性、58℃で２分間のアニーリング、および72℃で３分間の伸展の25サイクルの間に増幅した。5−、12−および15−ＬＯは、94℃（１分）、55℃（２分）および72℃（2.5分）で35サイクルの間に増幅した。ＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲル中での電気泳動によって分析し、それらの正体を、制限酵素分析によって追跡した。特異的なＰＣＲ増幅された標的を検出するために、0.5Ciの［32Ｐ］ｄＣＴＰ（3,000Ci／ミリモル）をＰＣＲ混合物に加え、生成物を、Image-Quantというプログラミング（Molecular Dynamics,San Lorenzo,CA）を用い、燐光造影装置（phosphorimager）によって定量した。
細胞増殖：
微量培養３，（４，５−ジメチルチアゾイル−２−イル）２，５（ジフェニル−テトラゾリウム＝ブロミド）（ＭＴＴ）検定［Marshan,N.J.,et al.（1995）「細胞の増殖と機能とを測定するための微量培養テトラゾリウム検定の使用の厳格な査定（A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assay to measure cell growth and function）、Growth Regul.5:69-84］を用いて、細胞増殖に対するＬＸその他のエイコサノイド類の作用を調べた。指数相の維持培養からのＡ549細胞および繊維芽細胞を、100μlの体積の培養液中で計数し、複製用96穴培養プレート内に分与した（〜2,000個／ウェル）。37℃で24時間の後、培養液を除去し、化合物（５〜1,000nM）または担体（培養液＋0.15％エタノール）のいずれかを含有する新鮮培養液（100μl）を、調べた各条件につき４個の複製体に加え、次いで、培養プレートを５％のＣＯ2雰囲気中、37℃で96まで温置した。この期間の終点で、ＨＢＳＳ中の直前に調製したＭＴＴ25μl（５mg／ml）をウェルに加え、プレートを37℃で４時間温置した。色素溶液を吸引し、ＨＢＳＳでウェルを１回洗浄し、細胞に摂取された色素を、イソプロピルアルコール：１規定ＨＣｌ（96：４、v/v）100μlに抽出し、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Menlo Park,CA）を用いて570nmで定量した。いくつかの実験では、細胞を12穴培養プレートで増殖させ、上記のとおり処理し、ノイバウエル血球計算盤を用いて計数した。生存率は、トリパンブルー排除検定を用いて定型的に査定した。Ａ549細胞および繊維芽細胞については、示した実験の範囲内では、ＭＴＴ値および細胞数に関して線形の関係が確立された（ｒ＝0.995、Ｐ＜0.005）。化合物（５〜1,000nM）または担体（0.1％ＥｔＯＨ）の存在下で72時間増殖させたＡ549細胞を、0.25規定ＮａＯＨで溶解し、ウシ血清アルブミンを標準として用いるBio-Rad（Richmond,CA）の微量検定法を適用することによって、細胞性タンパク質含量を決定した。休止Ａ549細胞での平均の細胞タンパク質含量は、46.6±1.5pg／細胞であった。
チミジン取込みおよびＤＮＡ合成：
Ａ549細胞（〜２ｘ104個／ml）を96穴プレートに播種し、24時間定着させ、化合物（５〜1,000nM）または担体（培養液＋0.1％エタノール）の存在下で更に72時間増殖させた。検定の24時間前に、２Ci／mlのメチル−［3Ｈ］チミジン（比活性6.7Ci／ミリモル）を各ウェルに加えた［Cybulsky et al.（1992）「エイコサノイド類は、糸球体上皮細胞における表皮増殖因子受容体の活性化と増殖とを高める」（Eicosanoids enhance epidermal growth factor receptor activation and proliferation in glomerular epithelial cells）、Am.J,Physiol.262（Renal Fluid Electrolyte Physiol.31）：F639-F646参照］。瞬間標識した後、各ウェルを冷ＤＰＢＳ2+で４回洗浄し、ＮａＯＨ（0.25規定）で細胞を溶解し、放射能を測定した。統計的解析にはスチューデントのｔ検定を用い、差は、Ｐ値（0.05）で有意であると見なした。
結果
エイコサノイドは、ＰＧＨＳまたはＬＯ酵素経路によるアラキドン酸の初期酸素化によって形成される［Samuelsson,B.et al.（1987）「ロイコトリエン類およびリポキシン類：構造、生合成および生物学的効果（Leukotrienes and Lipoxins:structures,biosynthesis,and biological effects）」、Science 237:1171-1176］。Ａ459細胞では、エイコサノイド生成酵素のいずれが存在し、かつ／またはサイトカインによって調節されるのかを査定するため、ＩＬ−１βの存在または不在下で増殖させたＡ549細胞からのＰＧＨＳ−１および−２、ならびに５−、12−および15−ＬＯのｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ＰＣＲ、次いで燐光造影装置での分析によって追跡した。図１Ａに示したとおり、ＰＧＨＳ−２についてのｍＲＮＡレベルは、ＩＬ−１βによるＡ549細胞の刺激の後、有意に上昇した（〜２倍）。対照的に、ＰＧＨＳ−１および５−ＬＯについてのｍＲＮＡレベルは、サイトカインへの細胞の接触後も有意に変化しなかった（図１Ａ）。Ａ549細胞は、サイトカイン誘導の前後に15−または12−ＬＯのいずれの発現も示し得なかった（図１Ａ）。Ａ549細胞における15−ＬＯｍＲＮＡの不在は、それぞれ、15−ＬＯｍＲＮＡの陽性および陰性の供給源であることが公知の、ヒト肺組織および末梢血単球のＲＮＡに並行してＲＴ−ＰＣＲを実施することによって、更に確認された［Funk,C.D.and FitzGerald,G.A.（1991）「ヒトの組織中のエイコサノイド形成酵素のｍＲＮＡ（Eicosanoid forming enzyme mRNA in human tissues）」、J.Biol.Chem.266:12508-12513参照］（図１Ａの挿図を参照されたい）。
気道上皮細胞が生産するモノヒドロキシ生成物の様相を特性記述するため、ＩＬ−１βで刺激したＡ549細胞（1.5ｘ106個／ml）を、透過性にさせ、アラキドン酸と温置し、形成された生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって抽出かつ分析した。クロマトグラフィー像は、合成15−ＨＥＴＥと同時溶出した、234nmで強いＵＶ吸光を有する主生成物の存在を明らかにした。また、［3Ｈ］−アラキドン酸をＩＬ−１β処理したＡ549細胞に加えたとき、放射能標識された材料が、15−ＨＥＴＥと同時溶出するピークの下で回収された（図１Ｂ）。これらの実験では、5−または12−ＨＥＴＥのいずれの形成も、一貫して観察されなかった。Ａ549細胞のＡＳＡ処理は、15−ＨＥＴＥの形成の顕著な増加へと導いたが、17−ＯＤＹＡ、すなわちＰ450によるエイコサノイド代謝の報告された阻害剤［Muerhoff,A.S.et al.（1989）「ウサギ肺でのプロスタグランジン、ならびに脂肪酸のωおよび（ω−１）酸化：特異的阻害剤としての、アセチレン性脂肪酸の機序に基づく不活性化剤（Prostaglandin and fatty acid ω and（ω-1）-oxidation in rabbit lung:acetylenic fatty acid mechanism-based inactivators as specific inhibitors）」、J.Biol.Chem.244：749-756］との透過性にさせたＡ549細胞の温置は、15−ＨＥＴＥの〜50％低下を招いた（図２Ａ）。17-ＯＤＹＡは、Ｐ450によるエイコサノイド代謝の強力な阻害剤であり、シクロオキシゲナーゼまたはＬＯのいずれの活性も選択的に阻害しない［Muerhoffら、および供給業者の支援資料参照］。５−ＬＯ阻害剤（Rev-5901異性体）は、Ａ549細胞が生産する15−ＨＥＴＥの量を、統計的有意な様式では変化させなかった。熱変性させたＡ549細胞は、15−ＨＥＴＥの量を〜90％減少させ、その形成における酵素的成分を示唆した。アラキドン酸塩の内在発生源からの15−ＨＥＴＥの生成は、ＩＬ−１β（１ng／ml）で24時間処理したＡ549細胞からも得られた（25.0±10.0ng／107個）。考え合わせると、これらの結果は、15−ＨＥＴＥが、Ａ549細胞が生成する主要なモノヒドロキシ生成物であることを示し、アセチル化されたＰＧＨＳ−２およびシトクロムＰ450が、それぞれ、この生合成に寄与することを示唆する。
アラキドン酸塩の内在発生源からの15−ＨＥＴＥの生成の時間的経過を調べるため、無傷のＡ549細胞を、48時間までＩＬ−１β（１ng／ml）に接触させ、細胞上清中に存在する免疫反応性15−ＨＥＴＥの量を、特異的ＲＩＡを用いて追跡した。休止状態では、Ａ549細胞は、有意レベルの免疫反応性15−ＨＥＴＥを生産した（19.1±10.5ng／107個、ｎ＝３、ｄ＝２）。これらの値は、ＩＬ−１βの不在下でのイオノフォアＡ23187（５Ｍ）の添加によって変化しなかった（図２Ｂ）。また、イオノフォア刺激の不在下では、Ａ549細胞への48時間までのＩＬ−１βの添加は、15−ＨＥＴＥの生成の増加を招かなかった（図２Ｂ）。極めて対照的に、ＩＬ−１βの添加＋Ａ549細胞のＡ23187による刺激は、15−ＨＥＴＥの生産の顕著な増大へと導いた（図２Ｂ）。最高レベルは、サイトカインへの接触の24時間に見出され、その後、15−ＨＥＴＥのレベルは低下した。
Ａ549細胞が生産する15−ＨＥＴＥにおけるアルコールの立体化学に関心が持たれたため、ＩＬ−１βで処理したＡ549細胞によって生成された15−ＨＥＴＥのＲおよびＳ鏡像異性体の個々の相対量を、キラル相ＨＰＬＣ分析［方法の項参照］を用いて調べた。ＰＧＨＳ−２は、シトクロムＰ450とともに、アラキドン酸をそれぞれ15−ＨＥＴＥへと転換できる15−ＬＯ以外の酵素である。ＡＳＡでアセチル化されたＰＧＨＳ−２に由来する15−ＨＥＴＥは、その炭素（Ｃ）−15のアルコール基を、主にＲ立体配置で有する［Holtzman,M.J.et al.（1992）「培養上皮細胞での薬理学的に明確なプロスタグランジンＨ合成酵素の同定（Identification of a pharmacologically distinct prostagalndin H synthase in cultured epithelial cells）」、J.Biol.Chem.267:21438-21445］。ここで、ＩＬ−１βで起動されたＡ549細胞が生産する15−ＨＥＴＥを、そのメチルエステルへと転換し、ＳＰ−ＨＰＬＣキラル分析に付した。活性化されたＡ549細胞からの15−ＨＥＴＥは、65％がＲ、35％がＳの立体配置にあった（図３）。ＡＳＡでのＡ549細胞の前処理（20分、37℃）は、15Ｒ−ＨＥＴＥの量の３倍の増加を招いたのに対し、15Ｓ−ＨＥＴＥの形成は、不変のままであった（図３）。ＡＳＡの存在下では、15Ｒ−ＨＥＴＥは、Ａ549細胞が生産した15−ＨＥＴＥ生成物の総量の85％を占めた。これらの結果は、ＡＳＡの存在下で、ＩＬ−１βで起動されたＡ549細胞によって生成された15−ＨＥＴＥの大部分が、Ｒ立体配置であったことを示す。
経細胞エイコサノイド生合成は、脂質メジエーターの増幅とともに、新たなメジエーターの生成の重要な手段である［Marcus,A.J.（1995）「結直腸癌に対する予防としてのアスピリン（Aspirin as prophylaxis against colorectal cancer）」、New Engl.J.Med.333:656-658］。ＡＳＡ処理後のヒト内皮細胞およびＰＭＮの同時刺激は、新たな分類群の生体活性エイコサノイドの形成を招く［Claria,J.and Sehan,C.N.（1995）「アスピリンは、ヒト上皮細胞−白血球相互作用による従来は記載されていない生体活性エイコサノイドを誘導する（Aspirin triggers previously undescribed bioactive eicosanoids by human endothelial cell-leukocyte interaction）」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9475-9479］。これらの新規エイコサノイド類は、15−エピ−ＬＸとして特定され、それらの生合成は、ＡＳＡで誘発された内皮由来の15Ｒ−ＨＥＴＥの、白血球による変換を伴う。これらの結果からして、経細胞生合成による新規エイコサノイドの形成は、上皮細胞−ＰＭＮ相互作用の際にも生じることがあり得る。この仮説を検証するため、密集Ａ549細胞を、ＩＬ−１β（１ng／ml、24時間）に接触させ、ＡＳＡで処理し、ＰＭＮで同時刺激した。図４Ａは、ＡＳＡに接触させた、刺激された細胞から得られた材料の代表的なＨＰＬＣ像を示し、300nmでプロットしたときに強いＵＶ吸光度を有する４種類の主生成物の存在を明らかにした。これらの生成物のオンラインでのスペクトル解析は、それらが、それぞれ、ＬＸの基本構造を示す、共役テトラエン含有発色団に特徴的な三重線の吸光帯域を示した（301nmでの最大値、ならびに288および316±２nmでの肩）（図４Ｂおよび４Ｃ）。
合成標準との同時溶出と、特徴的発色団の存在とに基づき、ＬＸＡ4および15−エピ−ＬＸＡ4をクロマトグラフィー像で特定した。これらの同時温置では、15−エピ−ＬＸＡ4は、検出されたＬＸＡ4の総量の〜88％を占めたが、それは、ＡＳＡに接触してＩＬ−１βで起動されたＡ549細胞によって生成された15−ＨＥＴＥの大部分が、主としてＲ立体配置であったという所見と一致する（図３、ならびに４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ参照）。このＲＰ−ＨＰＬＣ系では、15−エピ−11−trans−ＬＸＡ4およびＬＸＢ4が、11−trans-ＬＸＡ4および15−エピ−ＬＸＢ4と同じく同時溶出した（図示せず）。これらのＬＸ異性体は、ＨＰＬＣによってはそれ以上分割されず、像では、それぞれ、ピークＡおよびＢとして標識されたピークの下に示されている（図４Ａ）。ピークＡおよびＢの下の化合物は、ＯＴＭＳ、すなわちＧＣ−ＭＳでのメチルエステル誘導体として確かに分割された（下記に示す）。生成物は、〜８：２の比率でそれらの15Ｒエピマーに優勢に存在した（ｎ＝３）。化合物Ｃ（図４Ａ）は、従来特定されたＬＸ類のいずれとも同時溶出せず、15Ｒ−ＨＥＴＥとともに温置した活性化ＰＭＮからのＥＰ−ＨＰＬＣ像にも存在した（データ示さず、ｎ＝５）。化合物Ｃの下に溶出する材料は、内皮細胞−ＰＭＮ相互作用から最近単離された化合物IIIの物理的特性に適合した［Claria,J.and Serhan,C.N.（1995）「アスピリンは、ヒト上皮細胞−白血球相互作用による従来は記載されていない生体活性エイコサノイドを誘導する（Aspirin triggers previously undescribed bioactive eicosanoids by human endothelial cell-leukocyte interaction）」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9475-9479］。化合物Ｃの完全な立体化学は、決定待ちであるが、ＵＶスペクトルのデータ、およびクロマトグラフィーでの移動度は、それが7−cis−11−trans−ＬＸＡ4の15−エピマー形態であり得ることを示唆する［Nicolaou,K.C.et al.（1989）「ヒト好中球によって生成される新規7−cis−11−transリポキシンＡ4の特定：全合成、痙攣誘発活性、およびＬＸＡ4およびＢ4のその他の幾何学的異性体との比較（Identification of a novel 7-cis-11-translipoxin A4,generated by human neutrophils:total synthesis,spasmogenic activities and comparison with other geometric isomers of LXs A4 and B4）」、Biochim.Biophys.Acta 1003:44-63］。したがって、ＡＳＡ処理後の上皮（Ａ549細胞）−ＰＭＮ同時刺激の際に生成されるＬＸ類は、主として15−エピ−ＬＸであった（図４Ａ）。
ＬＸを生産できることに加え、Ａ549細胞との活性化ＰＭＮの同時温置も、ＡＳＡの不在下で、有意量（テトラエンを有するＬＸより〜８倍）のペプチドロイコトリエン（ｐＬＴ；ＬＴＣ4およびＬＴＤ4）を生成する（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの同時温置の際に生成されるＬＸおよびｐＬＴ双方の量は、個々の細胞の比に依存する（図５Ａおよび５Ｂの挿図）。ＰＭＮの添加前のＡＳＡへの気道上皮Ａ549の接触（20分）は、ＬＸの形成の増大、およびｐＬＴの減少へと導く（図５Ａおよび５Ｂ）。別個に温置したＰＭＮまたはＡ549細胞は、いずれも、ＡＳＡの存在または不在下で、検出できるレベルのＬＸまたはｐＬＴを生成しない（図５Ａおよび５Ｂ、ならびに示さなかったデータ）。考え合わせると、これらの結果は、Ａ549細胞−ＰＭＮ相互作用の際に、ＬＸとｐＬＴとは、双方とも、経細胞の経路に起源があることを示す。
ＬＸは、血管拡張剤であり、白血球の応答、例えば走化性、内皮細胞への接着、および上皮越しの移行を阻害する、強力な調節剤である［Serhan,C.N.（1994）「リポキシン生合成、および炎症および血管の事象におけるその影響（Lipoxin biosynthesis and its impact in inflammatory and vascular events）」、Biochim.Biophys.Acta 1212:1-25参照］。対照的に、ｐＬＴは、血管収縮剤と炎症推進との双方の作用を有するばかりでなく、繊維芽細胞、平滑筋および糸球体上皮細胞を包含するいくつかの細胞型の増殖を刺激する［Baud,L.et al.（1985）「ロイコトリエンＣ4は、ヒト糸球体上皮細胞に結合し、in vitroでのそれらの増殖を促進する（Leukotrien C4 binds to human glomerular epithelial cells and promotes their proliferation in vitro）」、J.Clin.Invest.76:374-377］。ＬＸは、ラットの腎血液動態におけるＬＴＤ4の血管収縮剤作用を逆転し、ＬＴＣ4で刺激される造血を阻害する［Serhan,C.N.（1994）「リポキシン生合成、および炎症および血管の事象におけるその影響（Lipoxin biosynthesis and its impact in inflammatory and vascular events）」、Biochim.Biophys.Acta 1212:1-25］。ＡＳＡは、15−エピ−ＬＸ形成を促進し、ｐＬＴ生合成を阻害する（図５Ａおよび５Ｂ）ため、これらのエイコサノイドは、ヒトの癌において、細胞増殖に対する逆調節作用を果たし、ＡＳＡの防護機序に寄与する可能性がある。そのため、これらのＬＯ生成物の上皮細胞増殖に対する効果（図６Ａおよび６Ｂ）を試験し、それらの作用を、可溶性微量培養テトラゾリウム（ＭＴＴ）検定［Alley,M.C.,et al.（1988）「微量培養を用いた、ヒト腫瘍細胞系のパネルによる薬物スクリーニングの実施可能性（Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay）」、Cancer Res.48:589-601］を用いて、充分に確立された阻害剤であるデキサメタゾンのそれと比較した。これらの実験は、これらの細胞が生産する主要ＬＸである15−エピ−ＬＸではなく、生物検定に充分な量で入手できる合成ＬＸＡ4およびＬＸＢ4で実施した。図６Ａおよび６Ｂに示したとおり、ＬＸＡ4およびＬＸＢ4は、Ａ549細胞の増殖を、時間（Ａ）および用量（Ｂ）に依存する様式で阻害した。ＬＸＡ4およびＬＸＢ4は、デキサメタゾン［１μM］と同様に、処理の72〜96時間後にＡ549細胞の増殖を阻害した（図６Ａ）。72時間後には、ＬＸＡ4は、これらの細胞でデキサメタゾンについて観察された抗増殖特性を共有した（図６Ａ）［Croxtall,J.D.and Flower,R.J.（1992）「リポコルテンＩは、Ａ549肺線癌細胞系のデキサメタゾンで誘導される増殖の停止を仲介する（Lipocortin I mediates dexamethasone-induced growth arrest of the A549 lung adenocarcinoma cell line）」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3571-3575参照］。ＬＸＡ4についての半最大阻害値（ＩＣ50）は、デキサメタゾンの〜7nMであるそれと比較して、〜80nMであった。0.5および１μMの濃度でのＬＸＢ4は、ＬＸＡ4またはデキサメタゾンのいずれより３倍も活性であった（図６Ｂ）。興味深いことに、ＬＸＡ4とＬＸＢ4とは、ともに、それぞれを連続３日間細胞に反復的に（すなわち24時間間隔で）加えたとき、Ａ549細胞の増殖を阻害する基本的に等しい効力を示し（データ示さず、ｎ＝３、ｄ＝４）、ＬＸがこれらの上皮細胞によって不活性化され得ることを示唆する。細胞の直接計数を用いた追加の実験（図７Ｂ）、および総細胞性タンパク質含量の測定（データ示さず、ｎ＝３、ｄ＝４）からの結果は、ＭＴＴ検定で得られたものと平行し、したがって、Ａ549細胞におけるＬＸの抗増殖作用を確認した。その上、3Ｈ−チミジン取込みによって決定した限りでのＤＮＡ合成の阻害が、Ａ549細胞を50nMもしくはそれ以上の濃度のＬＸＢ4またはデキサメタゾンに72時間接触させたときに生じた（図７Ａ）。化合物とのＡ549細胞の温置後は、トリパンブルー排除検定によって決定した限りでの細胞の生存率は、〜98％であることが見出され、これらの化合物が、これらの実験で用いた濃度範囲内では細胞に有害ではないことを示した。
ＬＸＡ4およびＬＸＢ4の15−ヒドロキシエピマー形態（それぞれ15−エピ−ＬＸＡ4および15−エピ−ＬＸＢ4）は、これらの細胞から単離されたＬＸの支配的形態であったが、下記の表１に示したとおり、やはり上皮細胞増殖の強力な阻害剤であると判明した。
0004060366.tif 000065
細胞（Ａ549細胞2,000個／ウェル）は、96穴プレートで増殖させ、担体（ＥｔＯＨ／Ｆ−１２Ｋ培溶液中に0.15体積％）、または等モル濃度（10-7Ｍ）のＬＸＡ4、15−エピ−ＬＸＡ4、ＬＸＢ4、15−エピ−ＬＸＢ4もしくはデキサメタゾンに37℃で72時間接触させた。値は、四重に実施した３〜７回の実験からの±ＳＥＭを表わし、細胞増殖の阻害の％として表現されている。*Ｐ値は、細胞のみと比較した限りでの統計的な差を意味する。&15−エピ−ＬＸＢ4についてはＰ＜0.001。
等モルレベル（100nM）では、15−エピ−ＬＸＡ4は、Ａ549細胞の増殖をＬＸＡ4と同様の程度にまで阻害した。一方、活性化されたＰＭＮによる15Ｒ−ＨＥＴＥの転換から単離し、Ａ549細胞に戻して加えた15−エピ−ＬＸＢ4は、ＬＸＢ4より強い抗増殖活性を示した（〜34％の増殖阻害に対して〜80％、Ｐ＜0.001；表１）。この化合物を、ＵＶ、ＨＰＬＣおよびＧＣ−ＭＳによって特性記述した（Ｃ値：23.3）。ＯＴＭＳメチルエステルについての特徴的イオンは、m/z173（基本ピーク）、203、289、379、および482での比較的卓越しないイオンであった（Ｍ+−100）［その量の不足のため、分子イオンを得ることはできなかった］。したがって、図４ＢでＢと標識されたピークの下の支配的材料は、15−エピ−ＬＸＢ4のそれと整合して、より短いＣ値を示し、ＬＸＢ4からＯＴＭＳ、すなわちＧＣ−ＭＳ分析でのメチルエステルとして分離された。15−エピ−ＬＸＢ4およびＬＸＢ4の質量スペクトルは、基本的に同一であった（示さず）が、それらのＣ値は、別個であった。Ｃとして示したピークの下で溶出する（15Ｒ−ＨＥＴＥと温置した活性化ＰＭＮから単離された）材料も、上皮細胞の増殖に対する穏やかな阻害作用を示した（18.2±２％の増殖阻害、ｎ＝３、ｄ＝４）。極めて対照的に、それぞれ10-6〜10-9Ｍで試験した15−エピ−trans−ＬＸＡ4、11−trans−ＬＸＢ4、８，９−アセチレン性ＬＸＢ4、ペプチドロイコトリエン（ＬＴＣ4およびＬＴＤ4）、ならびにＬＸ前駆体（15Ｓ−および15Ｒ-ＨＥＴＥ）は、Ａ549細胞の増殖を有意に阻害することができなかった（データ示さず、ｎ＝３〜５、ｄ＝４）。これらの結果は、ＬＸおよび15−エピ−ＬＸが、Ａ549細胞で細胞増殖を阻害する際に立体選択的作用を与えることを示す。ＬＸＡ4およびＬＸＢ4をヒト皮膚繊維芽細胞で試験して、それらがこの細胞型に対して抗増殖性であるか否かを決定した。100nMでは、ＬＸＡ4とＬＸＢ4とは、ともに、繊維芽細胞の増殖を阻害した。ＬＸＢ4は、38.0を示し（7.5％の阻害）、ＬＸＡ4は、10.7を示して（1.8％）、正の対照としてのデキサメタゾン（29.7（0.4％））と対比される（ｎ＝３）。
ヒト気道のＡ549細胞における活性シトクロムＰ450酵素系の存在［Vogel,et al.（1994）「形質転換性成長因子β１は、ヒト肺癌のＡ549細胞でのＴＣＤＤで誘導されるシトクロムＰ450IA1の発現を阻害する（Transforming growth factor-β1 in hibits TCDD-induced cytochrome P450IA1 expression in human lung cancer A549 cells）」、Arch.Toxicol.68:303-307］は、Ｐ450の阻害は、熱変性と同様に、これらの細胞での15−ＨＥＴＥ生成を阻害するという結果（図２Ａ）と相侯って、上皮細胞におけるこの酵素系も、15−ＨＥＴＥの生合成、および経細胞経路による15−エピ−リポキシンの生成に寄与することを示唆する（図８）。考え合わせると、これらの所見（図１〜４）は、気道上皮細胞−ＰＭＮ相互作用の際に、15−エピ−リポキシンの形成を始動できる（図８）二つの別個の酵素性経路（すなわち、ＡＳＡ−アセチル化ＰＧＨＳ−２およびシトクロムＰ450）の存在を確定する。また、ＡＳＡがＰ450酵素を誘導できることからして［Pankow,D.et al.（1994）「アセチルサリチル酸−それはシトクロムＰ450 2E1の誘導物質か（Acetylsalicylic acid-inducer of cytochrome P-450 2E1?）」、Arch.Toxicol.68:261-265］、これら二つの独立した経路は、共同で作用して、15−エピ−リポキシンを生成し得るという可能性があることに注目しなければならない。
等価のもの
当業者は、定型的実験以上のものを用いずに、本明細書に記載の特定の手順と等価の無数のものを認識するか、または確認できると思われる。そのような等価のものは、本発明の対象範囲内にあると見なされ、下記のクレームによって網羅される。
0004060366.tif 000066
0004060366.tif 000067
0004060366.tif 000068
0004060366.tif 000069
0004060366.tif 000070
【図１Ａ】
0004060366.tif 000071
【図１Ｂ】
0004060366.tif 000072
【図２Ａ】
0004060366.tif 000073
【図２Ｂ】
0004060366.tif 000074
【図３】
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【図４Ａ】
0004060366.tif 000076
【図４Ｂ】
0004060366.tif 000077
【図４Ｃ】
0004060366.tif 000078
【図５Ａ】
0004060366.tif 000079
【図５Ｂ】
0004060366.tif 000080
【図６Ａ】
0004060366.tif 000081
【図６Ｂ】
0004060366.tif 000082
【図７Ａ】
0004060366.tif 000083
【図７Ｂ】
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【図８】
0004060366.tif 000085