(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼをコードする精製および単離したＤＮＡであって、当該ＤＮＡが、プラスミドｐＴＭ２２（ＡＴＣＣ受託番号６８６０１）が保有する哺乳類ｃＤＮＡ挿入体からなり、かつ配列番号：１９に記載の塩基配列、すなわち；
0004031027.tif 000159
0004031027.tif 000160
の塩基配列からなるＤＮＡである、ことを特徴とする精製および単離したＤＮＡ。
【請求項２】
変性コドンの手段によって調製されたＤＮＡであって、当該ＤＮＡが、請求項１に記載のＤＮＡによってコードされたポリペプチドをコードする、ことを特徴とする変性コドンの手段によって調製されたＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡの原核細胞または真核細胞での発現生成物である、ことを特徴とするポリペプチド生成物。
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、一般に、新規のクローニング方法、該方法により得られたDNA配列、該DNA配列の対応発現生成物およびそれに対する抗体、ならびにタンパク質活性に影響を及ぼす合成物のスクリーニング方法に関する。具体的には、本発明は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼポリペプチド(PDEs)とRAS-関連タンパク質をコードするＤＮＡの単離に特に有用な、新規の相補性スクリーニング方法に関する。さらに、これらDNAは、関連DNAに対するハイブリダイゼーションプローブ、および適当な宿主細胞を形質転換する際に用いるポリペプチド発現生成物を得る際に有用な価値のある物質を提供する。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題］
本発明が関係する事項とは、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼポリペプチド(PDEs)とRAS-関連タンパク質に関連する以下の事項である。
RAS遺伝子は、HarveyとKirstenによってネズミ肉腫ウィルスの形質転換因子として初めて発見された［Ellis et al., Nature, 292:506(1981)］。HarveyとKirstenのネズミ肉腫ウィルスの腫瘍遺伝子の細胞相同物（H-RASとK-RAS）は、RAS遺伝子の２つの要素を構成する［Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2112 (1983)］。第３番目の要素はN-RASである［Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2112 (1983)］。これら遺伝子は、RASにおけるポイント変異により非ガン性細胞をガン性細胞に形質転換できる遺伝子にすることから、腫瘍遺伝子として知られている［Tabin et al., Nature, 300:143 (1982); Reddy et al., Nature, 300:149 (1982);Taparowsky et al., Nature, 300:762 (1982)］。多くの腫瘍細胞が、かような変異体と共にRAS遺伝子を含んでいる［Capon et al., Nature, 302:33 (1983); Capon et al., Nature, 304:507 (1983); Shimizu et al., Nature, 304:497 (1983); Taparowsky et al., Cell, 34:581 (1983); Taparowsky et al., Nature, 300:762 (1982); Barbacid, Ann. Rev. Biochem., 56:779(1987)］。
我々のガンに関する理解におけるRAS腫瘍遺伝子の重要性にもかかわらず、RAS遺伝子の哺乳動物における機能は知られていない。RASタンパク質は、GTPとCDPに結合した小さなタンパク質（哺乳動物にて21,000ダルトン）である［Papageorge et al., J. Virol., 44:509 (1982)］。RASタンパク質はゆっくりとGTPを加水分解し、ある細胞タンパク質は、この作用を加速できる［McGrath et al., Nature, 310:644 (1984); Trahey et al., Science, 238:542 (1987)］。RASタンパク質はプラズマ細胞膜の内面に結合し［Willingham et al., Cell, 19:1005 (1080)］、そのカルボキシ末端にて複合共有結合修飾される［Hancock et al., Cell, 57:1167 (1989)］。H-RASの結晶構造は知られている［DeVos et al., Science, 239:888 (1988)］。
酵母Saccharomyces cerevisiaeは、哺乳動物のRAS腫瘍遺伝子と構造的および機能的相同性を有する２つの遺伝子、RAS1とRAS2を構成する［Powers et al., Cell, 36 :607 (1984); Kataoka et al., Cell, 40:19 (1985); Defeo-Jones et al., Science, 228:179 (1985); Dhar et al., Nucl. Acids Res., 12:3611 (1984)］。RAS1もRAS2双方共に、酵母プラスミドライブラリーからクローンされたものであり、それらがコードする領域の完全なヌクレオチド配列が決定されている［Powers et al., Cell, 36:607(1984); Defeo-Jones et al., Nature, 306:707 (1983)］。二つの遺伝子は、哺乳動物RASタンパク質の最初の80個のアミノ酸の位置を90％近くの同一性でコードし、次の80個のアミノ酸の位置を50％近くの同一性でコードする。酵母RAS1とRAS2タンパク質は、最初の180個の位置が90％近く同一性であり、互いにより相同である。この後、哺乳動物RASタンパク質が互いに分岐しはじめた位置とほとんど同一の位置で、二つの酵母RASタンパク質は突然分岐する。酵母RASタンパク質は、哺乳動物の遺伝子によりコードされたタンパク質と同様、Ａは脂肪族アミノ酸およびＸが末端アミノ酸を意味する、配列cysAAXで終止する［Barbacid, Ann Rev. Biochem., 56:779 (1987)］。哺乳動物RASタンパク質に対するモノクローナル抗体は、酵母細胞中にRASタンパク質を免疫沈降させる［Powers et al., Cell, 47:413 (1986)］。このように、酵母RASタンパク質は、哺乳動物RASタンパク質に見られるのと全く同じ全体構造や相互関係を有する。
RAS遺伝子はSchizosaccharomyces pombe, Dictyostelium discoidiemおよびDrosophila melanogasterを含む広範な真核性種において検出されている［Fukui et al., EMBO, 4:687 (1985); Reymond et al., Cell, 39:141 (1984); Shilo et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 78:6789 (1981);Neuman-Silberberg, Cell, 37:1027 (1984)］。進化に伴うRAS遺伝子の広範な分布は、単純真核生物におけるRASの研究が、哺乳動物におけるRASの典型的な細胞機能を解明することを示唆している。
S. cerevisiaeのRAS1およびRAS2の広範な遺伝子解析が実施されている。選択可能な生化学標識によって分裂したin vitro RAS遺伝子を構築し、それらを遺伝子置換によって、RAS染色体座に導入することによって、RAS1およびRAS2は、単独では必須遺伝子ではないことが決定された。しかしながら、二重ヘテロ接合体の二重RAS欠乏（ras1- ras2-）芽胞は、植物的成長を回復することができない。それ故、少なくともある種のRAS機能は、S. cerevisiaeの生育力のために必要とされる［Kataoka et al., Cell, 37:437 (1984)］。RAS1は染色体XV、ADE2からの7cMおよび、HIS3からの63cMに位置し、RAS2は染色体XIV、MET4からの2cMに位置することも決定されている［Kataoka et al., Cell, 37:437 (1984)］。
酵母中で発現された哺乳動物RASは、RAS1とRAS2の双方の損失の結果である表現型欠陥を訂正する機能を有する［Kataoka et al., Cell, 40:19 (1985)］。逆に、酵母RAS1は、脊椎動物細胞の中で機能することができる［De Feo-Jones et al., Science, 228:179 (1985)］。このように、酵母とヒトRASタンパク質との間には、異種宿主細胞の中で互いに機能するために構造の十分な保護がある。
19位のアミノ酸位置でグリシンの代わりにバリンをコードするミスセンス変異体、RAS2val19は、哺乳動物RAS遺伝子のある種の腫瘍変異体に見られる類と同程度の変異体を有する［Tabin et al., Nature, 300:143 (1982); Reddy et al., Nature, 300:149 (1982); Taparowsky et al., Nature, 300:762 (1982)］。この突然変異体を含む二倍体酵母細胞は、たとえ野性型RAS対立遺伝子を含んでいても、胞子形成はできない［Kataoka et al., Cell, 37:437 (1984)］。RAS2遺伝子の活性型（例えば、RAS2val19）が半数細胞にある時、酵母細胞はグリコーゲンを合成できず、Glにおいて生育ができず、栄養が欠乏次第直ちに死滅し、および熱ショックに対して急性感受性である［Toda et al., Cell, 40:27 (1985); Sass et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:9303 (1986)］。
RAS2val19を含むS. cerevisiae株は、酵母のcAMP経路を活性化するIACまたはbcy1突然変異体と著しく類似する増殖特性と生化学的特性を有する［Uno et al., J. Biol. Chem., 257: 14110 (1981)］。IAC変異体を保有する酵母株は、向上したアデニル酸シクラーゼ活性レベルを有している。bcy1-細胞には、cAMP依存タンパク質キナーゼの調製要素が欠落している［Uno et al., J. Biol. Chem., 257:14110 (1982); Toda et al., Mol. Cell. Biol., 7:1371 (1987)］。RAS機能が不完全な酵母株は、アデニル酸シクラーゼ欠乏酵母と類似の特性を示す［Toda et al., Cell, 40:27 (1985)］。bcy1-変異体は、ras1- ras2-酵母の死亡率を抑制する。これらの結果は、S. cerevisiae酵母において、cAMPシグナル経路におけるRASタンパク質機能を示唆している。
アデニリルシクラーゼは、RASタンパク質によって制御されることが示されている［Toda et al., Cell, 40:27 (1985)］。酵母またはヒトからののRASタンパク質は、in vitro生化学検定において、50倍のレベルにまでアデニリルシクラーゼを刺激する。RASタンパク質は、GTPと結合した時のみ、アデニリルシクラーゼを刺激するであろう［Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159 (1988)］。
熱ショックや欠乏に対する感受性も含んだRASの活性化による表現型は、主として、アデニリルシクラーゼを介してcAMPエフェクター経路の過剰発現もしくは非制御活性化の結果である［Kataoka et al., Cell, 37:437 (1984); Kataoka et al., Cell, 43:493 (1985); Toda et al., Cell, 40:27 (1985); Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159 (1988)］。
低親和性および高親和性cAMPフォスフォジエステラーゼをコードする二つのS. cerevisiae酵母遺伝子、PDE1とPDE2はそれぞれ単離されている［Sass et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:9303 (1986); Nikawa et al., Mol.Cell.Biol., 7:3629 (1987)］。これらの遺伝子は、活性RAS2val19遺伝子を保有する酵母細胞にて、それらの熱ショック感受性抑制能力に応じて酵母ゲノムライブラリーからクローンされた。PDE遺伝子（例えば、pde1- pde2-酵母）を欠いている細胞は、熱ショック感受性で、グリコーゲンの蓄積が不完全であり、酢酸炭素源で生育せず、さらに一搬的には、cAMPシグナル経路の活性化がために欠陥を有する［Nikawa et al., Mol.Cell.Biol., 7:3629 (1987)］。
遺伝子解析は、RASタンパク質が、アデニリルシクラーゼを刺激するのに加えて、S. cerevisiaeにあっては他の機能も有することを明瞭に示唆している［Toda et al., Japan Sci. Soc. Press., Tokyo/VNU Sci. Press. pp.253 (1987); Wigler et al., Cold Spring Harbor Symposium, LIII:649 (1988); Michael et al., EMBO, 8:3039 (1989)］。これら機能の正確な生化学的性質は不明である。S.pombeとXenopus laevis卵母細胞のような他のシステムに関する実験では、アデニリルシクラーゼのRAS刺激は、進化の段階において、広範に行き渡らないことを示した［Birchmeier et al., Cell, 43:615 (1985)］。RASは、哺乳動物内のアデニリルシクラーゼを刺激しそうにもない［Backner et al., Nature, 317:1 (1985)]。
フォスフォジエステラーゼ(PDEs)は、環状AMP(cAMP)からAMP、cGMPからGMPへの溶解に関わる酵素である。環状AMPは細胞と、カルシトニン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン、アドレナリン、卵胞刺激性ホルモン、グルカゴン、ロイトナイジングホルモン、リポトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、ノルアドレナリン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、およびバソプレッシンを含む、様々なホルモンや神経伝達物質への応答を介在する「第二メッセンジャー」である。
環状アデノシンモノフォスフェート(cAMP)の細胞濃度は、アデニリルシクラーゼによるcAMP産生率だけでなく、フォスフォジエステラーゼによるcAMP溶解率により制御される。ヒトにおいては、心理的機能、平滑筋弛緩、心臓の収縮性強度、ヒスタミンおよびその他の免疫反応性分子の放出、リンパ球増殖、及び血小板凝固を含む多くの重要な生理学的反応が、cAMPレベルによって制御される［Robinson et al., Cyclic AMP, Academic Press, New York and London (1971)］。このように、cAMPレベルの代替物である薬品や薬剤化合物により強く影響される疾病には、炎症（例えば、間接炎、喘息）、心不全、平滑筋痙攣、高血圧、凝血、血栓症及び心身症が含まれる。
様々な代謝過程の調節におけるcAMPの重要性に鑑み、フォスフォジエステラーゼの阻害、ならびにcAMP類似体の開発や評価に向けて多大の努力が払われてきた。細胞中のcAMPレベルの調節方法の一つとして、cAMPフォスフォジエステラーゼ活性の調節による方法がある。心不全、喘息、鬱病、および血栓症の治療に有効なある種の薬剤は、cAMPフォスフォジエステラーゼ阻害作用があることが判明した。一部で効率的な薬剤選抜手段が利用できないため、製薬業界は、適当な特異性のある薬剤を成功裏に知見するに到っていなかった。ほとんどの組織は、フォスフォジエステラーゼの多様なイソ体を含んでおり、粗組織抽出物の阻害を含んだ従来の方法に基づく薬剤選抜手段では、フォスフォジエステラーゼの全般作用型阻害剤以外のものを産生するとは思われない。テオフィリンのようなcAMPフォスフォジエステラーゼの全般作用型阻害剤は、多くの有害な副作用を有する。
上記したように、PDE阻害剤の研究は、特異性の高いPDE阻害剤の開発をその目標としている。このPDE阻害剤特異性の欠如は、実際には、特定のタイプの組織を含む様々なタイプの細胞の中の、単一の組織タイプに存在するPDEの数種の別個の分子形態の存在に一部起因するものである。これら様々な分子形態は、基質特性（cAMP対cGMP）、細胞間位置（可溶性対膜結合）、カルモジュリンに対する反応、そして場合によっては、様々な治療薬品による選択的阻害によって区別できる。PDEsに対して選択的に作用するであろう改良薬品は、好ましくない効果、例えば、心拍数の増加あるいは脂肪分解を改善せずに、環状ヌクレオチドの望ましい効果、例えば、気管支拡張、心筋収縮性の増大、抗炎症、を再生するものである。
PDE阻害剤としての有用性に関する薬品を選抜する手法、例えば、薬剤選抜手段は、PDE酵素の「動力学的純粋」調製物を必要とする。すなわち、ほとんどの組織は、細胞タイプに関しては、異成分から構成されており、その上、多くの細胞タイプは様々なPDEアイゾザイムを含んでいるため、全ホモジェネートあるいは全抽出物の使用は、個々のPDEイソ酵素に選択的な阻害剤を同定しそうにもない。
少なくとも五つの異なるPDEsの科が、基質特異性、動力学的特性、細胞の調節的制御、サイズ、場合によっては、選択的阻害剤による調整、などの特性に基づくことが記されている［Beavo, Adv. in Second Mess and Prot. Phosph. Res. 22:1-38 (1988)］。
この五つの科とは、
I    Ca2+/カルモジュリン−刺激
II   cGMP−刺激
III  cGMP−阻害
IV   cAMP−特異性
V    cGMP−特異性
各科には、密接に関連したPDEsの多数の形態がある。
Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Brevo, J. and Houslay, M.D., Eds.; John Wiley & Sons, New York (1990)の、第３〜15頁にあるBrevo, "Multiple Phosphodiesterases Isozymes Background, Nomenclature and Implications"を参照のこと。
Brevo, TIP, 11:150（1990）も参照のこと。
現在のところ、多種多様のPDE酵素が認識されており、ある種のPDEs特異性cGMPのみが、完全なcDNA配列情報の利用が可能である。すべてのPDEsの完全な構造上の情報の取得に関して、各PDEイソ酵素（の細胞性および亜細胞性分布）を同定し、起源を特定することは可能であろうし、またこれにより、厄介な副作用を伴わない、特定の疾病に対する治療薬としてのイソ酵素選択性PDE阻害剤も設計できるであろう。しかし、PDEイソ酵素のある種に見られる、不均一性、不安定性、およびその比較的少ない発生量は、これら酵素を精製し、特性を付与する際の大きな障害となっている。
哺乳類遺伝子のクローニングのための、数種類の方法が現在のところ利用できる。哺乳類遺伝子のクローニングの標準的な方法では、精製したタンパク質の取得、精製したタンパク質の部分的アミノ酸配列の決定、変性したオリゴヌクレオチドプローブを作成するための部分的アミノ酸配列の使用、および該タンパク質をコードするcDNAを得るために、これらプローブを用いたcDNAライブラリーのスクリーニングが必要とされる。
この標準的な方法は時間を浪費し、さらに、使用したプローブの変性のために、関心のあるタンパク質をコードする配列とは別の配列を同定することになる。多くの哺乳類遺伝子、例えば、網膜で発現したcGMPホスホジエステラーゼをコードする遺伝子が、この方法でクローニングされている［Ovchinnikov et al., FEBS, 223:169 (1987)］。
関心のあるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする第二の方法として、公知の遺伝子を、相同体を探すためのプローブとして用いる方法がある。この方法は、遺伝子あるいは遺伝子の科の相同性が十分であれば、非常に有用である。例えば、ラットの相同体をクローニングするために、Drosophila melanogasterdunceホスホジエステラーゼ遺伝子が用いられている。Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:3604 (1989);およびSwinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:5325 (1989)。ホスホジエステラーゼ遺伝子の一科のその他の遺伝子は、その科の遺伝子が初めてめクローニングされた時に一旦クローニングされているものの、ホスホジエステラーゼ遺伝子の別の科に属する遺伝子のヌクレオチド配列が、他の科の遺伝子を同定するために、別の科から誘導したプローブを用いて十分な相同性が認められるかどうかは、予め知見されているはずはなかった。
遺伝子をクローニングするためのその他の方法として、相補性として知られているものがある。多くの研究者が、他の酵母の対応遺伝子の変異／欠損と相補する能力による、酵母遺伝子の単離が報告している。例えば、McKnight et al., EMBO J., 4:2093 (1985)-Aspergillus nidulans gene encoding alcohol dehydrogenase isolated by its ability to complement an adhl mutation in S. cerevisiae; Sass et al., PNAS (USA), 83: 9303 (1986)-S. cerevisiae PDE2 gene isolated by its ability to complement a RASval19 allele in S. cerevisiae strain TK161-R2V; Nikawa et al., Mol. Cell. Biol., 7:3629 (1987)-S. cerevisiae PDE1 gene isolated by transforming S. cerevisiae strain TK161-R2V;およびWilson, Molec. Cell. Biol., 8:505 (1988)-S. cerevisiae SRA5 gene isolated by virtue of its ability to rescue a RAS+ sra 5-5 S. cerevisiae strain RW60-12Cを参照のこと。
酵母は、非酵母遺伝子を単離するためにも用いられてきた。例えば、Henikoff et al., Nature, 289:33 (1981)では、酵母変異体の相補性によるD. melanogaster遺伝子の単離が、また、Lee et al., Nature, 327:31 (1987)では、S. pombeのcdc２遺伝子の変異を相補する能力によるヒト遺伝子の単離が報告されている。発現ベクターには、ウィルス性（SV40）プロモーターを含んだものを採用している。
つい最近では、相補性スクリーニング法が、ホスホジエステラーゼ(PDEs)のあるタイプをコードする哺乳類cDNAを検出して、単離するために、本出願人によって用いられている。
Colicelli et al., PNAS (USA), 86:3599 (1989)は、Saccharomyces cerevisiae発現ベクターにおけるラット脳cDNAライブラリーの構築と、ヒトH-ras遺伝子の腫瘍形成変異体へのRAS2遺伝子類似体の変異形態である、RAS2val19の表現型効果を酵母内で抑制する機能を有する遺伝子の該ライブラリーからの単離を報告している。クローニングされ、DPD（dunce様ホスホジエステラーゼ）と称されたラット種cDNAは、酵母株TK161-R2Vに保有された活性化RAS2val19遺伝子と関連した増殖調節の欠如と相補する能力を有する。高親和性cAMP特異性ホスホジエストラーゼをコードする遺伝子は、D. melanogasterのdunce座によってコードされるcAMPホスホジエステラーゼと高い相同性を示す。
今日までに、わずかなPDE遺伝子しかクローニングされていない。クローニングされたもののほとんどが、ホスホジエステラーゼのcAMP−特異性科（cAMP-PDEs）に属している。
Davis, "Molecular Genetics of the Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase", pp. 227-241 in Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase: Structure, Regulation, and Drug Action, Brevo, J. and Houslay, M.D., Eds.; John Wiley & Sons, New York; 1990を参照のこと。また、例えば、Faura et al., PNAS (USA), 85:8076 (1988)-D. discoideum; Sass et al., supra-S. cerevisiae, PDE class IV, designated PDE2; Nikawa et al., supra-S. cerevisiae, PDE class IV, disignated PDE1; Wilson et al., supra-S. cerevisiae, designated SRA5; Chen et al., PNAS (USA), 83:9313 (1986)-D. melanogaster, designated dnc+; Ovchinnikov, et al., supra-bovine retina, designated cGMP PDE; Davis et al., supra-rat liver, designated rat dnc-1; Colicelli, et al., supra-rat brain designated DPD; Swinnen, et al., PNAS (USA), 86:5325 (1989)-rat testis, rat PDE1, PDE2, PDE3 and PDE4;およびLivi et al., Mol. Cell. Biol., 10:2678 (1990)-human monocyte, designated hPDE1も参照のこと。ウシ副腎cGMP刺激PDEの断片をコードするDNAのクローニングを報告したLeTrong et al., Biochemistry, 29:10280 (1990)、およびラット褐色細胞腫細胞からの「タイプII PDE」のクローニングを報告したThompson et al., FASEBJ., 5(6): A1592(Abstract No. 7092, 1991)も参照のこと。
このように、当該技術分野においては、既知および未知の機能双方に関する遺伝子の単離、免疫学的特異性が改善された薬剤への使用に好適で、動力学的に純粋な発現生成物、および動力学的に純粋なタンパク質調製物を必要としない薬剤選抜手段として有効な、改善されたクローニング手法が、引き続き必要とされているのである。
［課題を解決するための手段］
本発明は、微生物、特に、酵母において機能でき、さらに微生物において同定可能な形質代替および特性に関連する遺伝子欠陥を修飾、相補、および抑制できるタンパク質をコードする哺乳類遺伝子のクローニング方法に関する。本発明によって提供されるものは、本発明の方法によってクローニングされた哺乳類遺伝子、ならびに該遺伝子によってコードされた生成物、さらには、該コードされた生成物と免疫学的反応性を有する抗体である。
具体的には、本発明は、cAMPが関与する生化学的経路あるいはRASタンパク質（例えば、RAS-関連タンパク質）が関与する生化学的経路における遺伝子欠陥を修飾、相補、および抑制できるタンパク質をコードする哺乳類遺伝子を検出する方法、かようにクローニングされた遺伝子、RASタンパク質と相互作用するタンパク質、例えば、cAMPホスホジエステラーゼをコードする新規の哺乳類遺伝子を含む、クローニングされた哺乳類遺伝子によってコードされた生成物（核酸、タンパク質）、および細胞増殖および細胞維持の上で影響を与える他のタンパク質に関する。
本発明の方法は、微生物において機能し、遺伝子変換あるいは遺伝子欠陥を訂正するために、（変換微生物を）所定の方法で遺伝子的に変換し、あるいは遺伝子的に欠陥があり、結果として、（正常もしくは非変換微生物の表現型とより同等の表現型を生成する）遺伝子変換あるいは遺伝子欠陥に関連する同定可能な形質変換あるいは形質特性を修飾する、関心のある哺乳類遺伝子の検出に用いることができる。本発明の方法の実用において有用な変換微生物として、S. cerevisiae株TK161-R2V、10DABならびにSKN37、およびS. pombe株SP65がある。
本発明は、（酵母変異体もしくは哺乳類宿主細胞などの）遺伝子変換微生物において、遺伝子変換と関連のある形質変換を修飾できる哺乳類遺伝子の新規検出方法を提供する。この新規方法は、（a）遺伝子変換された微生物において、哺乳類cDNAを発現することができる発現ベクター（好ましいベクターは、cDNAと機能的に関連している内因性宿主細胞プロモーターDNA配列を含む）中に哺乳類cDNAを入れ、（b）遺伝子変換された微生物に発現ベクターを導入し、（c）適切な増殖条件下に、該発現ベクターを含む遺伝子変換された微生物を置き、および（d）微生物における遺伝子変換と関連する形質変換が修飾されている遺伝子変換された微生物を同定する、工程を含む。工程（d）で同定された微生物に挿入されたcDNAを単離する工程が、任意に含まれる。
哺乳類遺伝子をクローニングするこの方法の、cAMPホスホジエステラーゼおよび、RASタンパク質に相互作用を及ぼすタンパク質への使用に関しては詳細に記載したが、遺伝変換を訂正、相補あるいは補足するために適切に選択された変換微生物において機能し、結果として、関連する形質変換を訂正する、他の哺乳類遺伝子のクローニングならびに同定にも使用できる。
本発明にて記した酵母細胞の形質変換には、熱ショック感受性、窒素欠乏、標準量グリコーゲン不合成、酢酸塩での成長不全、および胞子不形成、が含まれる。
目下のところ好ましい形態は、cDNAを含む新規DNA配列であるが、ゲノミックDNA、ヌクレオチドから部分的あるいは全体的に化学合成により調製されたDNA、ならびに欠失あるいは変異を伴うDNAなどの他のDNA形態も、本発明の範疇にある。
本発明により提供されたDNA配列と、相同体あるいはプロモーター、オペレーター、レギュレーター等の異種発現調節DNA配列との会合は、本発明のタンパク質の生成のための転写に感受的で、そして、大量のポリペプチドならびにオリゴペプチドと関連するメッセンジャーRNAを形成するためのin vivoならびにin vitro転写を可能にする。現在のところ、本発明の実用において好ましいベクターは、プラスミドpADNS、pADANS、pAAUNおよびpAAUN-ATGである。
本発明によって特に提供されたものは、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼおよびその断片をコードする哺乳類DNA配列、ならびに米国特許商標庁ならびにブダペスト条約の規定に従い、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20582に、1991年４月15日に寄託された細菌プラスミドに挿入されている哺乳類DNAとして提出されたRASタンパク質関連DNA配列である。寄託の対象となった哺乳類PDE DNAsとは；
１．dunce様PDEをコードする、ラット脳cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68586）にあるプラスミドpRATDPD;
２．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68603）にあるプラスミドpJC44X;
３．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68600）にあるプラスミドpTM3;
４．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68602）にあるプラスミドpTM72;
５．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68595）にあるプラスミドpPDE21;
６．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68596）にあるプラスミドpGB18ARR;
７．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68594）にあるプラスミドpGB25;および
８．分類不可能な科のPDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68601）にあるプラスミドpTM22、である。
寄託の対象となった哺乳類RAS関連DNAsは；
９．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68599）にあるプラスミドpJC99;
10．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68598）にあるプラスミドpJC265;
11．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68597）にあるプラスミドpJC310;
12．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68593）にあるプラスミドpML5;
13．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68592）にあるプラスミドpATG16；および
14．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌（A.T.C.C.受託No.68591）にあるプラスミドpATG29、である。
本発明の関連で寄託された酵母発現プラスミドとは；
15．大腸菌（A.T.C.C.受託No.68590）にあるプラスミドpAAUN;
16．大腸菌（A.T.C.C.受託No.68589）にあるプラスミドpAAUN-ATG;
17．大腸菌（A.T.C.C.受託No.68587）にあるプラスミドpADANS;および
18．大腸菌（A.T.C.C.受託No.68588）にあるプラスミドpADNSである。
本発明の関連で寄託の対象となった酵母宿主細胞は；
19．S. pombe SP565（A.T.C.C.受託No.74047）；
20．S. cerevisiae SKN37（A.T.C.C.受託No.74048)；
21．S. cerevisiae 10DAB（A.T.C.C.受託No.74049）；および
22．S. cerevisiae TK161-R2V（A.T.C.C.受託No.74050）
である。
本発明の新規タンパク質生成物は、ホスホジエステラーゼタンパク質の一次構造配座（すなわち、アミノ酸配列）、ならびに非ホスホジエステラーゼタンパク質、そのペプチド断片、およびそのアミノ酸配列の複製を構築する合成ペプチドの一次構造配座を有するポリペプチドを含む。本発明のタンパク質、タンパク断片、および合成ペプチドは、治療、診断および予後への用途を含む様々な用途を計画しており、さらにこれらタンパク質に特異的に免疫反応性を示すモノクローナルおよびポリクローナル抗体の調製の基礎を提供するものである。好ましいタンパク質断片および合成ペプチドは、基質結合機能を有さないタンパク質の複製領域であり、そして、最も好ましくは、本発明のタンパク質と少なくとも一つの抗原性エピトープを共有する領域である。
本発明のDNAsの発現のための哺乳類宿主細胞の使用は、本発明の組み換え発現生成物に関する至適な生物学的活性を参照する必要に迫られるため、翻訳的修飾（例えば、先端削除、脂質化、糖タンパク質化、チロシン、セリン、もしくはスレオニン燐酸化）の後になるものと考えられる。
本発明によって、タンパク質およびその断片ならびにペプチドに対して高い免疫学的特異性で結合し、他のタンパク質とは共通しない、特に、ホスホジエステラーゼ独特のエピトープを認識する能力によって特徴付けられる、（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、および一本鎖抗体を含む）抗体基質も提供される。
本発明によって、正常、不正常あるいは変異形態のタンパク質、ならびに該タンパク質と関連する核酸（例えば、DNAおよびmRNA）の検出および／または定量化のための新規の手法も提供される。例えば、本発明の抗体は、流体および組織試料中のタンパク質の定量検出のための公知の免疫学的手法において採用されるであろうし、また本発明のDNAは、適切に標識付けされて、これらタンパク質をコードするmRNAの定量検出において用いられるであろう。
それ故、本発明の数々の態様は、（a）環状核酸ホスホジエストラーゼポリペプチドおよび後述するRAS-関連タンパク質をコードする新規核酸配列、および（b）以下の条件とほとんど同等あるいはそれ以上にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列とハイブリダイズし、本発明の特定のcDNAの最初の単離において使用されるDNA配列、ならびに（c）変性コドンを少なくとも一部用いた、同一物、あるいは対立性変異体、あるいは類似ポリペプチドをコードするDNA配列、を提供する。
対応して提供されるものは、該DNA配列を組み込んだウィルス性ベクターあるいは環状プラスミドDNAベクター、および該DNA配列およびベクターで形質転換あるいは形質変換された原核および真核宿主細胞、ならびに該宿主細胞の培養増殖時における該DNA配列によってコードされたタンパク質の組み換え生成のための新規手法、および該宿主細胞あるいは培養培地からのこれらタンパク質の単離である。
本発明は、さらに、酵母などの微生物において発現された該哺乳類遺伝子のタンパク質生成物の活性を変更または変換（すなわち、還元もしくは刺激）する要因を同定する方法に関する。かような要因の同定は、二種類のスクリーニング手段を用いて実行できる。一つは、哺乳類タンパク質の既知の酵素機能に関する生化学的分析法を基礎としたものであり、もう一つは、タンパク質の決定済機能もしくは未決定機能に関する形質分析法を基礎としたものである。前者の場合、コードされたタンパク質がホスホジエステラーゼであれば、例えば、ホスホジエステラーゼ活性を変換（すなわち、還元もしくは刺激）する化学要因に関する分析法を含む薬理学的選抜手段である。後者の場合、コードされたタンパク質がRASタンパク質と相互作用するのであれば、例えば、RASタンパク質と相互作用を還元もしくは刺激する要因に関する分析法を含む薬理学的選抜手段である。これら選抜手段は、全細胞調製物あるいは細胞抽出物のいずれを用いても使用でき、酵素精製を必要としない。
本発明の他の態様ならびに利点は、本発明の実施に関する数々の説明ならびに図面に関する解説を含む、以下の詳細な説明を考慮すれば明白になるであろう。
［実施例］
以下の実施例は、本発明の実例を例証するものである。
実施例１は、酵母における相補性による哺乳類遺伝子のクローニングと同定に関する。実施例２は、相補性によりクローニングされた哺乳類遺伝子を用いたハイブリダイゼーションによる哺乳類遺伝子のクローニングと同定に関する。実施例３は、相補性能力によりクローニングされた遺伝子の特性に関する。実施例４は、ヌクレオチド配列解析による、さらなるクローニングされた遺伝子の特性に関する。実施例５は、ホスホジエステラーゼ酵素活性を変換する要因のスクリーニングと同定に関する。
実施例１
酵母での相補性による哺乳類遺伝子のクローニング
最も一般的な態様での本発明の方法は以下の通りである。
0004031027.tif 000002
まず、哺乳類mRNAsのcDNAライブラリーは、周知の技術で作成された。このライブラリーは、二本鎖cDNAを発現ベクターにクローニングすることによって作成できる。cDNAは、すでにあるcDNAライブラリーから調製でき、あるいは組織もしくは細胞系の選択から精製されたmRNAの逆転写酵素により、標準的な手法を用いて調製できる。Watson et al., In: DNA Cloning, a Practical Approach, IRL Press Oxford (1984)。
このようにして得られたcDNAは、選択された宿主細胞、例えば、S. pombe SP565(ras1::Leu2/ras1::Leu2)(A.T.C.C.74047)，S. cerevisiae SKN37(cap::H1S3)(A.T.C.C.74048)，S. cerevisiae 10DAB (pde1-, pde2-)(A.T.C.C.74049)；およびS. cerevisiae TK161-R2V (RAS2val19)(A.T.C.C.74050)の様な変換酵母、にて次々にタンパク質に翻訳できるmRNAとして哺乳類cDNAを発現できる、発現ベクターにクローニングされる。
この目的で使用された発現ベクターは、以下の実施例に記しており、pAAUN(A.T.C.C. 68590)、pAAUN-ATG(A.T.C.C. 68589)、pADNS(A.T.C.C. 68587)およびpADANS(A.T.C.C. 68588)が含まれる。
好ましい発現ベクターは、そのベクターが導入される宿主細胞に特異的な転写プロモーター、たとえば、S. serevisiaeの発現に特異なプロモーターを含む。転写したmRNAは、cDNA挿入物のATGを「開始」コドンとして利用できるし、あるいはcDNA生成物を融合タンパク質として発現できる。
cDNAライブラリー（選択発現ベクターにてcDNA挿入物として存在する）は、適切な宿主細胞に導入される。この宿主細胞は、宿主細胞を、同定可能な形質変換、あるいは遺伝子変換に関連する異常性を引き起こす遺伝子変換を含む。宿主細胞は、酵母S. cerevisiaeあるいは哺乳類細胞のような、真核性微生物でもよい。
リチウム酢酸塩誘導形質転換のような周知の方法は、発現べクターを含むcDNAの導入に用いられる。以下の実施例では、酵母細胞の転写はリチウム酢酸塩によって行った。酵母細胞は濃厚な培置(YPD)、あるいは、適切な栄養補給を行った合成培置(SC)でも成長した。Mortimer et al., In: The Yeast,1:385(1969). Ito et al., J. Bacteriol., 153:163 (1983)。
選択された宿主細胞の遺伝子変換は、例えば、RASタンパク質により制御された代謝経路の欠陥を導くかもしれず、また、容易に識別できる関連表現型は、熱ショック、もしくは窒素欠乏に対する感受性、正常値のグリコーゲン合成不能、特定の炭素源での成長不能、胞子形成不能、交配不能、RASタンパク質に制御され、もしくは制御する経路における欠陥に関連するその他の特性に表れるかもしれない。例えば、遺伝子変換は、RAS2val19遺伝子の存在でありうる。このような変換を含む酵母は、哺乳類遺伝子の発現により克服されうる熱ショック感受性を示す。以下の実施例では、55℃を10分間、冷却、30℃で24〜48時間に維持して、前加熱したSC平板上でのレプリカ培養によって、熱ショック実験を行った。
その他の遺伝子変換した宿主細胞は、S. cerevisiaeのPDE1およびPDE2遺伝子の分裂、もしくは、S. pombeのras1の活性対立遺伝子の分裂または存在というような選択ができる。その他の宿主細胞での遺伝子変換は、哺乳類cDNA遺伝子の異る部分集合によって訂正可能であろう。
cDNA挿入物保有発現ベクターの導入後、宿主細胞は宿主細胞増殖に適した条件下に置かれた。表現型変換に応じて訂正されたそれら宿主細胞は、選択、さもなくば同定され、例えば、宿主細胞から単離されたDNAを用いた大腸菌の形質転換によって、宿主細胞が発現できる、哺乳類遺伝子が再現されうる。
以下の実施例での分離分析は、YPDで２〜３日間、酵母形質転換体を増殖させ、YPD平板に置き、YPD平板でレプリカ培養、SC-ロイシン（プラスミド選択）、およびYPD熱ショック平板によって行われた。大腸菌株HB101はプラズミド繁殖および単離に用い、SCS1株(Stratagene)はcDNAライブラリーの転写および維持のために用いられた。Mandel et al., Mol. Biol., 53:159 (1970); Hanahan J. Mol. Biol., 166:557 (1983)。
もし所望ならば、哺乳類遺伝子を単離して、配列決定ができる。あるいは、次工程での使用のために、遺伝子によりコードされたタンパク質を同定し、培養細胞中で発現することもできる。
下記Ａ、ＢおよびＣは、酵母での相補性による哺乳類遺伝子の単離、およびそれらの生化学的特性について記している。
Ａ．ホスホジエステラーゼをコードするラット脳cDNAの単離および生化学特性
ラット脳cDNAライブラリーが作成され、酵母発現ベクター、pADNSにクローニングされた。RNAは、公開された手順によって、Spraque-Dawleyラット脳から精製された。Chirgwin, et al., Biochem., 18:5294 (1979);Lizardi, Methods Enzymol., 96:24 (1983); Watson et al., In: DNA Cloning, a partical approach, IRL, Press Oxford (1984)。pADNSは、YEp213からのS. cerevisiae LEU2遺伝子を含む2.2kbpのHpaI-BglII断片［Sherman et al., Laboratory Manual for Methods in Yeast Genetics, Sherman, F., Fink, G.R.およびHicks, J.B., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1986)］、複製起源を含むS. cerevisiae２μプラスミドの1.6kpbのHpaI-HindIII断片、およびプラズミドpUC18からのアンピシリン耐性遺伝子を含む2.1kbpのSspI-EcoRI断片からなる。また、修飾したS. cerevisiaeアルコール脱水酵素(ADH1)プロモーターの1.5kbpのBamHI-HindIII断片［Bennetzen et al., J. Biol. Chem., 257:3018 (1982); Ammerer, Meth. Enzymol., 101:192 (1983)］、およびADH1終止配列を含む0.6kbpのHindIII-BamHI断片も含む。プロモーターと終止配列は、HindIIIとSacI部位の間に制限エンドヌクレアーゼ部位NotI，ScaIIおよびSfiIを含む、ポリリンカーにより分離される。
二本鎖cDNAが調製され、NotIリンカーに連結され、NotI制限酵素で開裂され、アルコール脱水酵素プロモーターとベクターの終止配列の間に位置するNotI部位にて、pADNSへクローニングされた。稀なNotI切断を用いたことにより、cDNAクローニングにおいては、通常用いられる制限部位メチル化酵素の必要性を回避した。cDNAsは、NotIリンカーオリゴヌクレチドに連結された。
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約1.5×105個の独立cDNA挿入体は、ライブラリーに、1.5kbpの平均サイズで含まれている。cDNA発現ライブラリーから調製されたDNAは、RAS2val19酵母株TK161-R2Vを形質転換するために用いられた。得られた50,000個のLeu+形質転換体は、その後、熱ショック感受性テストに供された。ただ一つの形質転換体のみが、発現型プラスミド保有という条件下で、熱ショック耐性を示した。pRATDPDで示されるプラスミドは、この形質転換体から単離され、2.17kbのNotI挿入体が、制限部位地図およびヌオクレチド配列により分析された。配列番号：３および配列番号：４は、挿入体のヌオクレチド塩基配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。配列解析は、チェインターミネーター法によって行った。Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74:5463 (1977); Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80:3963 (1983)。Genalignは、DPDおよびdunce配列を整列させるために用いた（GENELIGNはHugo Martinez博士により開発されたIntelliGenetics, Inc.が著作権を有するソフトウェアーである）。
562コドンの読み枠が見つかった。最初のATGは、コドン46に表れ、このコドンから始まるタンパク質は、約60kDaの推定分子量を持つ。このラット遺伝子は、RATDPDと称する。コンピューター解析データバンクを用いて、同様の配列調査が行われ、Drosophila melanogaster dunce遺伝子が見つかった。二つの遺伝子は、空白部無しに、80％のアミノ酸同一性にて、ラットDPD cDNAの中央に位置する252アミノ酸領域上にわたってタンパク質をコードする。dunce遺伝子は、高親和性cAMPホスホジエステラーゼをコードすることが示されている。
Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83:9313 (1986); Davis et al., J. Cell Biol., 90:101 (1981); Waleter et al., J. Neurosci., 4:494 (1984)。
大きな配列同一性領域の上流及び下流の配列が、cDNAクローニング法の人工産物ではなく、むしろ実際には、mRNAの領域に隣接することを立証するために、クローニングしたcDNAの構造と、別途調製されたオリゴdTプライマーで、全ラット脳ポリ(A)+RNAを逆転写して得られた第一鎖状cDNA集団に含まれるDPD cDNA構造とが比較された。同一領域に位置する配列と、コード鎖の5'または3'末端の近くの配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーの相補性ができた。クローニングされたpRATDPD DNAあるいは鋳型としての第一全鎖cDNA物質のいずれを用いる場合も、四つの異なるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が行われ、反応生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析された。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCRs)は、サーモサイクラー(Perkin Elmer, Cetus)にて、公開された手法に修正を加えた方法で行った。Saiki et al., Science, 239:487 (1988)。反応混合物は、template DNA（クローンDNA 1ng、あるいは第一全鎖cDNA１μｇ）、オリゴヌクレチドプライマー25pmoles、デオキシリボヌクレチド三燐酸200μM、Tris HCl(pH 8.4) 10mM、KCl 50mM、MgCl2 3mM、および0.01％(w/v)ゼラチンを含んでいた。
使用されたオリゴヌクレチドプライマーは、
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上付き数字は、pRATDPD配列番号：３における、対応位置を示す。プライマーＣ、Ｅ、およびＦは、非コード鎖配列である。30サイクル（94℃で1.5分、55℃で３分、および72℃で７分）を実施し、反応生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析された。
各事例において、予期できる長さの断片は、template DNAsのいずれかを用いて得られた。バンドの状態は、増幅DNA生成物中に認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼの開裂により確認した。さらに、各事例において、いずれかのtemplate源を用いて生成したプライマリーPCR生成物は、予期できる大きさの開裂生成物を産生した。この結果は、クローンニングしたcDNAの配列が、ラットmRNAの構造を忠実に反映していることを示すものである。
pRATDPD遺伝子生成物の生化学的特性を分析するために、pADNSもしくはpRATDPDで形質転換された10DAB酵母細胞の１リットル培養液から粗細胞抽出物を調製した。酵母株10DAB細胞は、pde1-およびpde2-であって、内因性環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の重要なレベルは持っていない。ホスホジエステラーゼ活性の検定は、以下のように、cAMPを基質として用いて行った。酵母細胞は、合成培養液(SC-ロイシン)１リットル中で、30℃で36時間培養された。細胞は回収され、緩衝液Ｃ（20mM MES (pH6.2), 0.1mM MgCl2, 0.1mM EGTA, 1mMβ−メルカプトエタノール）で洗浄され、50μl 1M PMSFと共に30ml緩衝液Ｃ中で再懸濁され、フレンチプレスで粉砕した。抽出物は、10分間、1,600gで遠心分離され、上清は、90分間、18,000g（４℃）で回転した。上清は、ホスホジエステラーゼ活性に関して、Collicelli et al., supra.により検定した。すべての反応物は、Tris-HCl(pH7.5)(100mM)、細胞抽出物(50μgタンパク質/ml）、5'-ヌクレオチターゼ(Sigma, 20ng/ml)および、10mM Mg2+（もし特に言及していなければ）、および指標環状ヌクレチド濃度を有していた。cGMP加水分解の検定には、1.5μM cGMPを用いた。阻害試験には、500μMまでの濃度で、cGMPの量を変化させる状態で、５μM cAMPを用いた。［3H］cAMPおよび［3H］cGMPは、NEN（New England Nuclear）から得た。反応物は、10分間30℃でインキュベートし、５×停止液（250mM EDTA, 25mM AMP, 100mM cAMP）で停止した。
対照抽出物(pADNSを有する10DAB)では、cAMPホスホジエステラーゼ活性は示されなかった。対照抽出物の結果は、０℃で行われた場合も、Mg2+が欠如している場合でも変化せず、抽出物を添加しない場合に匹敵するものであった。これら結果は、非形質転換対照株10DABには、検出可能なホスホジエステラーゼ活性の背景が存在しないことを示すものである。
これに対して、pRATDPDで形質転換した10AB酵母株で、相当量のホスホジエステラーゼ活性が見られた。得られた形質転換体におけるcAMP加水分解率は、cAMP濃濃度の機能として測定した。cAMPの推定kmは3.5μMであり、計算されたVmaxは、1.1nmol/min/mgである。
酵素の陽イオン選択性を確かめ、酵素活性を刺激するカルシウムおよびカルモジュリンの能力を決定するために、検定条件を変更した。これら検定においては、Mg2+同様、Mn2+も利用でき、１mM最終濃度のいずれの陽イオンであっても十分使用に供せる。カルシウム／カルモジュリンは、抽出物においては、測定したホスホジエステラーゼ活性を刺激することはできなかった。Beef Heartホスホジエステラーゼ（Boeringer Mannheim）を用いて並行して行った検定では、カルシウム／カルモジュリンの添加により、6.5倍の刺激が見られた。最後に、これら検定においては、cGMPホスホジエステラーゼ活性は検出されなかった。Beef Heartホスホジエステラーゼを、優性対照として、再度用いた。さらに、基質濃度の100倍量のcGMPは、cAMPホスホジエステラーゼ活性を阻害できなかった。
酵母中で発現したpRATDPD cDNA生成物の生化学的特性は、dunceのような、高親和性cAMP特異性ホスホジエステラーゼを示した。Davis et al., J. Cell. Biol., 90:101 (1981); Walter et al., J. Neurosci., 4 (1984)。加えて、ホスホジエステラーゼ活性は、カルシウム／カルモジュリンの存在によって刺激されなかった。この特性は、dunceと共通するものであり、他のホスホジエステラーゼとは異なるものである。Beavo, In Advances in second messenger and phosphoprotein research Greengard et al., eds., Raven Press (1988)。二つのタンパク質、pRATDPDとdunceには、類似した生化学的特性が見られる。しかしながら、pRATDPDは、先に記した高度保存核心領域以外に、dunceに対して非常に僅かの相同性(35％)しか示さないタンパク質生成物をコードすることも、注意すべきである。これら非保存配列は、この哺乳類dunce相同物の変換あるいは精製された機能に帰するものといえる。
配列番号：３に記したpRATDPDヌクレオチド配列は、46位でメチオニンコドンをコードし、推定分子量60kDaのタンパク質に対応する563位にまで延びる読取枠を形成する。しかしながら、同じ読取枠は、コード鎖の5'末端以外では開いている。現在のところ、46位のメチオニンコドンが、DPDタンパク質の開始コドンであるかどうかは、わからない。このコード配列は、三つの密接に近接する終止コドンによって中断されている。
しかしながら、得られた読取枠は、別の終止コドン、ポリアデニリル化コンセンサスシグナル、およびポリアデニン領域に続く、116コドン部分を残している。この3'読取枠は、他のdunce様ホスホジエステラーゼに、別の接合によって組み込まれる。
Ｂ．相補性によるヒト多形性神膠細胞cDNAsのクローニング
cDNAライブラリーは、NotIリンカーを用いて、λZAPに構築された。この実施例では、mRNAから誘導されたcDNAは、ヒト多形性神膠細胞系U118MGから精製された。λベクターからの挿入体は、二つの酵母発現ベクターpADNSおよびpPADANSに移された。プラスミドpPADANSは、転写されたmRNAが、アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質から誘導されたＮ末端部と哺乳類cDNA挿入体からの残余物を含む融合タンパク質の合成に関与するという点で、プラスミドpADNSと異なる。
構築された二つの哺乳類cDNA発現ライブラリーは、先の実施例のように、S. cerevisiae宿主TK161-R2Vの熱ショック感受性を訂正できるcDNAに関してスクリーニングされた。いくつかのcDNAsが単離され、そして配列の解析が行われた。挿入体として、プラスミドpJC44X、pJC99、pJC265およびpJC310を含んだ、四つの異なるcDNAsが知見され、それらDNA配列と推定アミノ酸配列を、配列番号：11および12、13および14、15および16、および17および18、にそれぞれ示した。
pJC44Xの挿入体は、ラットpRATDPD遺伝子と相同であることがコンピュータ解析により判明し、細胞分解物の生化学的分析によって、cAMPホスホジエステラーゼをコードしていることが実証された。pJC99、pJC265、およびpJC310への挿入体は、先に単離した遺伝子との相同性を示さなかった。
Ｃ．相補性によるヒト多形性神膠細胞ホスホジエステラーゼcDNAsのクローニング
前記したヒト多形性神膠細胞cDNA発現ライブラリーを、ホスホジエステラーゼ欠陥酵母株10DABの熱ショック感受性を訂正できるcDNAsに関して、スクリーニングを行った。単離されたいくつかのcDNAsは、ヌクレオチドおよび制限エンドヌクレアーゼ配列地図によって分析された。pTM22に挿入されたcDNAは、新規のヒト遺伝子をコードした。そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を、配列番号；19および20に示した。
pTM22のヌクレオチド配列のコンピューター解析から、挿入体は、ウシCa2+／カルモジュリン依存cAMPホスホジエステラーゼおよび実施例1Aに記したDPDホスホジエステラーゼのような、様々なcAMPホスホジエステラーゼとのタンパク質相同体を推定的にコードする。生化学的分析は、単離したDNAが、新規のcAMPホスホジエステラーゼをコードしていることを証明している。
pTM22挿入体と関連する配列が、ヒトの心臓において発現することが認められ、同様に、TM22の接合変異体が、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして、pTM22挿入体配列を用いたヒト心臓cDNAライブラリーから単離された。
プラスミドpTM22は、TK161-R2VのRASVal19酵母株の熱ショック感受性を訂正することはできなかった。このことは、pde1- pde2-酵母株10DABが、RASval19酵母株よりも、哺乳類cAMPホスホジエステラーゼクローンによる形質復帰体に対して、より感受的であることを示すものである。
pTM3およびpTM72と称されるプラスミドへの挿入体として単離された、いくつかの他のヒト多形性神膠細胞cDNAは、同様に特性決定された。これら二つの異なるcAMPホスホジエステラーゼcDNAsは、pRATDPD cDNA挿入体およびpJC44X cDNA挿入体と非常に関連するが、別異のものであることがわかった。これらヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を、配列番号：21および22(pTM3)、および23および24(pTM72)にそれぞれ示した。
細胞溶解物の生化学的分析は、pTM3、pTM72、pJC44XおよびpRATDPDのcDNAsが、ロリプラム感受性cAMPホスホジエステラーゼをコードすることを確認した。
Ｃ．pPDE cDNA発現物質の動力学的分析
pJC44X、pTM3、（L22 Metと称し、pTM22由来の1.7kb断片挿入体を含み、およびPDE活性をコードする）pTM22-様プラスミド、およびpAD72（TM22-様クローン）に挿入されたヒトcDNAsを発現する形質転換した約1010個のS. cerevisiae10DAB細胞を2.5ml PBSに再懸濁し、４℃で、ガラスビーズの存在する状態で、渦巻攪拌することにより粉砕した。５分間、12,000×ｇの遠心分離を経て得られた上清画分は、この研究における酵素源とした。
ホスホジエステラーゼ活性は、Davis et al., J. Cyc. Nuc. Res., 5:65-74 (1979)にある方法に若干の修正を加えて、決定した。インキュベーション混合物は、40mM Tris pH 8.0、１ml EGTA、５mM MgCl2、0.1mg/ml BSA、希釈酵母抽出物、［3H］cAMP、最終体積が0.25mlとなるように変化させた量の非標識付環状ヌクレオチドを含む。0.5M炭酸塩pH9.3、0.5M NaCl、および0.1％ SDSを含む0.25ml反応停止緩衝液を添加することで、反応を止めた。ヌクレオチド生成物および未反応基質は、ボロン塩カラム（８×33mm）で分離した。生成物は、ボロン塩カラムからソルビトールによって、トリチウム分析用シンチレーションガラス瓶に溶出した。初期速度の測定で表現されるすべての動力学的データは、適切に希釈された酵素の、様々な時間間隔でのインキュベーションによって決定される。ミカエリス−メンテン動力学モデルのラインウィーバー−バーク変換による動力学的データの分析は、試験を行った各酵素が単純動力学モデルであることを示す直線二重逆数プロットを描いた。環状ヌクレオチド濃度は、３×10-8から１×10-4[cAMP]に変化した。得られた結果を、下記表１に示した。
0004031027.tif 000005
Ｅ．酵母での相補性によるヒト多形性神膠細胞RAS-関連cDNAのクローニング
本実施例では、PDEsをコードしない四つのヒト多形性神膠細胞cDNAが単離された。それらは、遺伝子的に変換されたS. cerevisiaeとS. pombe酵母株の相補性により得られた。
クローンS46は、S. cerevisiae株RS60.15Bの相補性により選択された。この株は、RAS2、RAS2val19ala15の変異対立遺伝子を含み、この細胞は、高められた温度ではRAS機能が不完全になるため、36℃では生育できなくなる[Powers et al., Mol. Cell. Biol., 9:390-395 (1989)]。ヒト多形性神膠細胞ライブラリーからのヒトcDNAは、この欠陥を補足したものが選択される。このようにして見つかったものが、S46と称するcDNAである。そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を、配列番号：25および26に示した。その推定アミノ酸配列は、公知のタンパクキナーゼである、S6タンパクキナーゼをコードするXenopus leavis遺伝子との相同物である。
プラスミドpML5は、S. cerevisiae株SKN37における相補性により選択された。この株は、CAP, cap::HIS13の粉砕した対立遺伝子を含む。CAPは、機能未決定のタンパク質と関連するアデニリルシクラーゼをコードする。［Field et al., Cell, 61:319-327 (1990)］。この遺伝子粉砕の結果として、SKN37は、富アミノ酸培地で生育しなくなる［Gerst et al., Mol. Cell. Biol., 11:1248-1257 (1991)］。この欠陥を補完するヒトcDNAが選択された。このようにして見つかったものが、pML5である。そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を、配列番号：27および28に示した。そのコード能力に関しては、未だ明らかでない。
プラスミドpATG16とpATG29が、S. pombe二倍体株SP565での相補性によって選択された。この株は、ras1（ras1::LEU2）の粉砕とホモ接合する。結果として、この株は胞子形成不能となり［Fukui, et al., Cell, 44:329-336 (1986)］、この欠陥を補完するヒトcDNAが選択された。pATG16とpATG29の挿入体のDNA配列に関する情報を、配列番号：29および30、および31および32に、それぞれ示した。これら遺伝子は、未知の機能を持っている。S. pombeでのスクリーニングに用いたベクターは、S. cerevisiaeでのスクリーニングに用いたものとは異なる。このベクター、pAAUN-ATGは、S. pombe特異性プロモーター、adhプロモーターとして実用され、以下のようにして構築された。クローニングベクターpAAUNは、S. cerevisiae LEU2遺伝子をS. pombeからの1.8kbpのHindIII ura4断片と置換し、Viera et al., Methods in Enzymology, 153:3-11 (1987)から誘導したポリリンカー(PL)のSmaI部位にNotIリンカーを添加することにより、プラスミドpART1(McLeod et al., ENMO J., 6:729-736 (1987))から誘導された。pAAUNは、遺伝子発現のためのS. pombe adhプロモーター、およびDNA複製のためのARS領域を含む。プラスミドpAAUN-ATGは、Cold Spring Harbor LaboratoryのDavid Beachから得たプラスミドpART8およびpAAUNから誘導された。pAAUNのBamHI-EcoRV断片は、ポリリンカーのNdeI部位によって供給されるATG開始コドンを有するpART8のBamHIおよびEcoRV断片と置換された。
実施例２
相補性によりクローニングされた哺乳類遺伝子を用いたハイブリダイゼーションによる哺乳類遺伝子のクローニングと同定
本実施例は、実施例１に記した遺伝子、すなわち、酵母での相補性によりクローニングされた遺伝子から誘導された配列を有するプローブへのハイブリダイゼーションによる他の哺乳類遺伝子のクローニングならびに同定に関する。
低ストリンジェントおよび高ストリンジェントのハイブリダイゼーションを、標準濃度の６倍のクエン酸ナトリウム(SSC)、標準濃度の５倍のDenhatdt溶液、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.05mg/mlの変性サケ精子DNA、およびプローブを含む水溶液中で、65℃で、12〜16時間、同一条件下で行った。
ハイブリダイゼーションした後、ニトロセルロースフィルターを、５分間、室温にて、２×SSC、0.5％SDSで、そして、20分間、60℃にて、新鮮な２×SSC、0.5％SDSでインキュベートした。
高ストリンジェントなハイブリダイゼーションのみ、20分間、60℃にて、0.1×SSC、0.1％SDSで洗浄した。SSCの標準濃度は、0.15Mクエン酸ナトリウムおよび0.15M塩化ナトリウムであり、Denhatdt溶液の標準濃度は、0.2g/l Ficoll、0.2g/lポリビニル／ピロリドン、および0.2g/lウシ血清アルブミンである。
プラスミドpPDE7、pPDE10X invおよびpPDE2RRは、pRATDPD挿入体をプローブとして用いたヒト側頭葉cDNAライブラリーの低ストリンジェントなハイブリダイゼーションスクリーニングによって単離された。ヌクレオチド配列（配列番号：33、34および35、それぞれ）の比較では、その挿入体が、pPDE2RRの挿入体の推定アミノ酸配列を示した配列番号：36のpTM72にある挿入体と同じ遺伝子座と類似していることが示された。
プラスミドpGB14およびpGB18ARRも、同様の方法で得られた。DNA配列分析（配列番号：37および39、それぞれ）は、その配列が、pTM3およびpJC44Xにある挿入体と同じ遺伝子座と類似していることを示している。挿入体の推定アミノ酸配列を配列番号：38および40に、それぞれ示した。
プラスミドpGB25も、プローブとしてpRATDPD挿入体を用いた低ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって得られた。配列番号：41および42に示した、ヌクレオチドと推定アミノ酸配列から判断して、それは、PDE科IVの新規物質であることを示唆している。
pGB25のcDNA挿入体を、pPDE18およびpPDE21を得るために、プローブとして用いた。pPDE18（配列番号：41）は、pGB25（配列番号：43）と同じ遺伝子座を示し、pGB25 cDNAよりも多くの配列情報を持っている。pPDE21挿入体は、PDE科IVの四番目の物質である。そのDNAと推定アミノ酸配列を、配列番号：45および46に示した。
これらクローンの発現物質に関する生化学的データは、未だ得られていない。単に、配列関連性を基にして、クラスIVとした。
実施例３
相補能力によりクローニングした遺伝子の特性
本実施例は、遺伝子をクローニングするために当初用いた酵母株以外の酵母株の能力によって実施例１でクローニングした遺伝子の特性に、さらに関する。
例えば、10DAB細胞(pde1- pde2-)は、DPD発現プラスミド、pRATDPDで形質転換され、熱ショック感受性に関して分析された。ラットDPD遺伝子の発現は、実際のところ、宿主を熱ショック耐性にする。同様に、pJC44Xは、このpde1- pde2-酵母株形質的欠陥を訂正できた。
これに対して、pJC99、pJC265およびpJC310は、そのようにできなかった。このことは、後者の挿入体のcDNAsが、cAMPホスホジエステラーゼをコードしないことを示唆するものである。むしろ、これら遺伝子は、酵母株TK161-R2Vを補足する能力によって反映された活性化RASタンパク質を用いて、酵母の形質欠陥を訂正できると思われる、機能未決定のタンパク質をコードする。
以下の手順は、遺伝子的に変換された宿主で機能させるために、cDNAsが相補性（あるいは、相補性によってクローニングにされたDNAsへのハイブリダイゼーション）によってクローニングされる必要の無いようにするための方法である。換言すれば、以下の手順は、相補性手段による関連DNAsの最初の直接あるいは間接クローニングを含む必要のない、本発明による化学薬剤スクリーニング法を実証するものである。
Ａ．ウシ脳CaM-PDEをコードするcDNAの発現による酵母形質補完
（A.T.C.C.受託No. 68567の大腸菌が保有する）プラスミドpCAM-40は、61kDaのCa2+／カルモジュリン刺激環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼをコードする、ウシ脳cDNA挿入体を含んでいる。
酵母発現プラスミドpADNSおよびpADANSの挿入に適用される2.2kb cDNA断片は、ポリメラーゼ連鎖反応によるプラスミドpCAM-40から誘導された。要するに、以下のPCR増幅は、ベクター内のADH1プロモーターで適切に整列させるために、pCAM-40挿入体を変換するために採用された。
PCR反応において用いられた、あるオリゴヌクレオチドプライマー（オリゴＡ）は、
0004031027.tif 000006
塩基対位置100-116において、pCaM-40 cDNAクローンにアニールし、開始メチオニンコドンの前のHindIII部位を含む。
第二オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴＢ）は、
0004031027.tif 000007
520-538の位置にアニールするようにデザインされており、メチオニンコドンの前のHindIII部位の二つの塩基を含む。
第三オリゴヌクレオチドプライマーは、
0004031027.tif 000008
プラスミドの挿入体の3'の位置にアニールする。ある反応のために、templateとしてのpCAM-40と共に、オリゴＡとオリゴＣをプライマーとして用いた。この反応の核酸生成物は、全読取枠を含んでいた。template pCAM-40に関するオリゴＢとオリゴＣをプライマーとして用いた第二の反応では、カルモジュリン結合領域をコードするcDNA配列の部分が欠けた核酸生成物が産生された。これら増幅生成物は、HindIIIとNotIで分解され、さらにHindIII/NotIで分解した酵母発現ベクターpADNSとpADANSに連結された。挿入体を含むプラスミドクローンは、選択され、リチウム酢酸塩形質転換によって、S. cerevisiae株10DABに形質転換された。
形質転換された酵母は、アミノ酸ロイシンが欠けた合成培地（SC-ロイシン寒天）を入れた寒天プレート上の布に縞を形成し、３日間、30℃で生長させた。このプレートのレプリカとして、寒天プレートの３種類を作った。一つは、SC-ロイシン寒天レプリカ、一つは、室温でのYPD寒天レプリカ、そして、56℃に温められた三枚のYPD寒天レプリカである。三枚のYPD寒天レプリカは、56℃を、10、20および30分間維持させた。
これらレプリカは室温にまで冷却され、そしてすべてのプレートが30℃に置かれた。CaM-PDEを発現するように構築されたプラスミドで形質転換された酵母は、熱衝撃耐性であった。
具体的には、全読取枠を発現するようにデザインされた構築物と、末端を削除した（カルモジュリン結合部位ではなく、触媒部位を含む）タンパク質を発現するようにデザインされた構築物双方共に、pADNSもしくはpADANSのいずれでも、10DAB宿主細胞の熱ショック感受性形質、すなわち、56℃温度衝撃耐性を補完したのである。
Ｂ．発現生成物の生化学的分析
CaM-PDE発現生成物も、酵母から細胞を含まない抽出物を調製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ活性を測定することで評価した。この目的のために、形質転換した酵母の200ml培地は、１ml当たり約600万個の細胞密度の液体SC-ロイシンにて生育させた。細胞は遠心分離によって回収され、細胞ペレットは凍結された。抽出物は、氷上に凍結細胞を播き、１mlのPBSと等量のグラスビーズと共に細胞を混合し、酵母細胞を粉砕するために、渦巻攪拌し、および不溶性細胞滓を取り除くために、５分間、12,000×ｇで遠心分離することによって、調製された。50μlまでの酵母細胞抽出物は、10×75mmガラス試験管の中の、50mM Tris（pH8.0）、1.0ml EGTA、0.01mg/ml（ウシ血清アルブミン）、[3H]環状ヌクレオチド（４-10,000cpm/pmol）、および５mM MgCl2を含む、最終体積250μlにて、30℃にて、ホスホジエステラーゼ活性に関して検定を行った。インキュベーションは、0.5M炭酸ナトリウム(pH9.3)、１Ｍ塩化ナトリウム、および0.1％SDSの250μlを添加することで、終了した。ホスホジエステラーゼ反応の生成物は、BioRad Affi-Gel 601ホウ酸ゲルの８×33mmカラムでのクロマトグラフィーによって、環状ヌクレオチドから分離された。カラムは、0.25Mジカルボン酸ナトリウム(pH9.3)および0.5M塩化ナトリウムで平衡化した。反応物をカラムに適用した。分析用チューブを0.25Mジカルボン酸ナトリウム（pH9.3）および0.5M塩化ナトリウムで洗浄し、この洗浄液をカラムに適用した。ホウ酸カラムは、3.75mlの0.25Mジカルボン酸ナトリウム(pH9.3)および0.5M塩化ナトリウムで二回洗浄し、さらに0.5mlの50mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で洗浄した。生成物は、0.1Mソルビトールを含む2.5mlの50mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で溶出し、シンチレーション用ガラス瓶に回収した。溶出物は、4.5ml Ecoliteシンチレーションカクテルと共に混合し、液体シンチレーション分光測定法によって放射能測定した。
全読取枠を発現するようにデザインされた構築物と、末端を削除したタンパク質を発現するようにデザインされた構築物双方共に、pADNSもしくはpADANSのいずれでも、cAMP基質を用いた細胞抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ検定により決定したようにして、活性タンパク質を発現した。
Ｃ．ウシ副腎cGS-PDEをコードするcDNAの発現による酵母形質補完
ウシcGMP刺激環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(cGS-PDE)をコードする4.2kbのDNA断片を含むプラスミドp3CGS-5(A.T.C.C. 68597)は、プラスミドへの挿入での使用に適切な認識部位をもってして、cDNAの第一の147塩基を置換することによって、pADNSおよびpADANSへのクローニングに適用した。
オリゴヌクレオチドBS1の配列は、
0004031027.tif 000009
HindIII部位をコードし、cDNA挿入体の148-165の位置へアニールする。BS3と称するオリゴヌクレオチドは、
0004031027.tif 000010
唯一のNsiI部位の3'側に相当する835-855の位置へ、アニールする。HindIIIおよびNsiIでの分解を得たPCR-調製断片は、次に、HindIII-およびNsiI-分解p3CGS-5に連結され、これにより、ウシcDNAの当初の5'末端が置換された。この連結によって誘導されたプラスミドは、修飾cDNA挿入体を放出するために、HindIIIおよびNotIで分解された。挿入体は、そのHindIIIおよびNotI部位で、pADNSおよびpADANSへクローニングされた。これらプラスミドは、リチウム酢酸塩法によって酵母株10DABへ形質転換され、形質転換された細胞は増殖され、そして上記Ａで述べた高められた温度条件下に置かれた。双方の形質転換共に、10DAB宿主細胞の熱ショック感受性形質を補完する結果となった。
Ｄ．発現生成物の生化学的分析
cGS-PDEの発現も、酵母から細胞を含まない抽出物を調製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ活性を測定することにより評価した。この目的のために、形質転換した酵母の50ml培地は、１ml当たり約1000万個の細胞密度の液体SC-ロイシンにて生育させた。Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)。細胞は、遠心分離によって回収され、細胞ペレットは一度水洗いし、そして最終細胞ペレットは凍結した。抽出物を調製するために、氷上に凍結細胞を播き、１mlのPBSと等量のグラスビーズと共に細胞を混合し、酵母細胞を粉砕するために、渦巻攪拌し、および細胞滓を取り除くために、遠心分離した。上清は、上記Ｂにて述べたように、ホスホジエステラーゼ活性に関して検定された。
pADNSもしくはpADANSのいずれにある構築物も、cGMPを用いた細胞抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ検定により決定したようにして、活性タンパク質を発現した。
実施例４
ヌクレオチド配列解析によるクローニングされた遺伝子の特性
本実施例では、先の実施例で記した様々なヒトPDEクローンの科−類縁について述べる。これらクローンには、相補性により得られるものと、ハイブリダイゼーションにより得られるものの双方を含む。
0004031027.tif 000011
そのDNAの独特さは、本明細書でPDEクラスIV1と称する座から誘導されるpPDE21 cDNAで表される。プラスミドpTM3、pJC44X、pGB18ARR、およびpGB14 cDNAはすべて、本明細書でPDEクラスIV2と称する同じ遺伝子座から誘導される。この関連の証拠は、実際の配列同一性を実証した図１に示されている。
同様に、pTM22、pPDE7、pPDE10Xinv、pPDE2RR cDNAはすべて、本明細書でPDEクラスIV4と称する遺伝子座から誘導される。
この関連の証拠は、実際の配列同一性を実証した図２に示されている。
pGB25およびpPDE18のcDNAsは、本明細書でPDEクラスIV3と称する別異の遺伝子座から誘導される。この関連の証拠は、実際の配列同一性を実証した図３に示されている。
この関連を図示すると以下の通りである。
0004031027.tif 000012
ここにある座から誘導された配列は、細部にわたって同一ではない。これら配列のズレは、配列の誤り、ヒト個体の多様性、クローニング産生物、接合パターンの相違を含む多数の相違点からもたらされる。接合パターンの相違は、おそらくpTM3とpJC44X挿入体との大きな相違によるものであろう。
pJC44X挿入cDNAも、クローニング産生物を保有しているであろう。配列の誤りは、上記したクローニングだけでなく、公開されたPDE配列についても言える。自然に起こる配列の変化あるいは多様性も、観察結果によるものであろう。このことは、前出の座の生成物の推定アミノ酸配列を、不明確なものにする。従って、特許請求したヌクレオチド配列には、特許請求した特定の配列だけでなく、本願明細書で開示したクローニングされた関心のあるcDNAsと実質的に同じDNA配列も、請求したヌクレオチド配列に包含されることを望むものである。
PDE科IVクラス１〜４は、ラットDPDと関連のある遺伝子科を含む。この根拠は、この科の代表的なコードされたアミノ酸配列の類似性を基にするものである。
直示的には、PDE科IVにはちょうど４物質がある。つまり、用語「ヒトdunce PDEs」は、科IVのすべての物質、すなわち、Drosophila dunce PDEへのヌクレオチド配列相同性を示す遺伝子を指すものである。
遺伝子科の物質の部分集合のみが、前出の組織にて発現されるであろう。それ故、一つもしくは二、三の組織からクローニングされたcDNAsを研究することによって、遺伝子科を正確に見積もるという試みは、科の物質の総数を過小評価しかねる。しかしながら、ゲノミックDNAの分析は、この問題を回避する。ヒトゲノミックDNAは、並行して行われているPCR反応における基質として用いられており、それぞれが、科IV PDEsの様々な領域に対応する多くの異なるオリゴヌクレオチド対の一つを含んでいる。選ばれた領域は、進化過程において強く保存されていたもの、および／または、このヒト遺伝子科のすべての公知の物質中にあるものである。オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸配列を特定するコドンの完全な変性を果たす混合物に含まれていた。試験した大多数のオリゴヌクレオチド対は、長さの点においては不均一ではあるが、対応cDNAから生成したオリゴヌクレオチド対と常に同等もしくは長い、という数種の異なるPCR生成物を生成した。しかしながら、生成した二つのオリゴヌクレオチド対のみが、cDNAと同一長さのものを生成した。オリゴヌクレオチド対が長くなるほど、オリゴヌクレオチド対のプライミングの結果としての生成物の不均一集団は、二つの分離エクソンに位置する。二つのオリゴヌクレオチド対は、同じエクソンから抜けた同一長さの生成物を生成する。
分離したエクソンから実際にプライミングした不均一断片集団を確認するために、ヒト科IV PDEゲノミックDNAクローンを対照PCR反応の基質として用いた。これら実験において、これらクローンの各々が、ゲノミックDNAから得た不均一な生成物の一つと常に同じ長さの単一のPCR生成物を生成した。
あるエクソンからプライムしたオリゴヌクレオチド対を用いた反応の一つからの生成物をクローニングし、配列決定した。使用したオリゴヌクレオチドは、
0004031027.tif 000013
であって、Ｎは四つのヌクレオチドのいずれかであり、Ｙは、ＣあるいはＴであり、および、Ｒは、ＧもしくはＡである。
これらは、図４で囲んだ二つの保存領域で、四つの有力なアミノ酸配列、
配列番号：54および55に示したFKLLQ(E/G)EN、および
配列番号：56および57に示したDMVID(M/I)V
それぞれを特定する完全に変性したコドンに対応する。
これらプライマーを用いて、それぞれ公知のヒト科IV PDEsの内の一つのヌクレオチド配列に対応する四つの異なるPCRクローンを得た。各カテゴリーに該当するクローンの数は、以下の通りである。
0004031027.tif 000014
ヒト遺伝子それぞれが、（利用可能なゲノミッククローンのこの分析と一致している）単一コピーとして存在すると仮定すれば、四つのPCR生成物は、理想的には等頻度で得られるべきである。ここで得られるわずかに歪んだ頻度分布は、おそらく、PCRオリゴヌクレオチドとのズレによる、PCR反応におけるこれら生成物の生成での有効性の相違を反映したものであろう。しかしながら、四つの公知の遺伝子すべてが、最終PCR生成物において認められ、そして新規配列は同定されなかった。それ故、ヒトPDE科IVは、四つの物質すべてから構成されていると思われる。この方法がその科における新規物質を同定しておれば、PCRクローンはcDNAクローンを単離するためのプローブとして用いられていたであろう。しかしながら、この科IVには、図４の囲い部分のアミノ酸配列を特定するコドンにて分岐した他の物質を有している。
cDNA挿入体pTM22は、科IVの物質ではない遺伝子座を意味する。その証拠として、pTM22挿入体の推定アミノ酸配列がcAMPホスホジエステラーゼに期待される遺伝子的特徴を有している反面、この配列が、科IV、科Ｉ、Ca2+／カルモジュリン感受性PDEs、もしくは他の公知のPDE科の物質の配列と特に密接な関連がないことが挙げられる。
実施例５
酵素活性を変換する薬品のスクリーニングおよび同定
最も一般的な形態において、本発明の薬理学的スクリーニング方法は、同定可能な形質変換に関連する遺伝子変換で変換された微生物宿主細胞でのその存在あるいは発現が、形質変換の訂正に帰する、いかなる哺乳類タンパク質の活性も還元あるいは刺激する薬剤のスクリーニングを許容するものである。二つの一般的なスクリーニングが可能である。両方法とも、生細胞、あるいは細胞組織標本、あるいは細胞抽出物に適用できる。
Ａ．公知活性のタンパク質に影響を及ぼす薬剤の同定
第一タイプの薬理学的選抜は、哺乳類遺伝子が公知の部分をコードし、生化学的機能が検定できる時に、適用できる。哺乳類遺伝子は、すでに記したタイプの適切な宿主発現ベクターを利用することにより、微生物宿主においてまず発現される。全細胞あるいは宿主細胞のいずれでも使用できる。周知の方法、すなわち、細胞を粉砕し、その細胞性構成物を放出することによって、抽出物が調製された。精製哺乳類タンパク質の粗細胞抽出物は、薬剤の存在下で、公知の生化学的機能について検定され、そのタンパク質の効果が評価された。このようにして、哺乳類タンパク質の活性を阻害あるいは刺激する薬剤が同定された。
この種のタイプの手順は、哺乳類cAMPホスホジエステラーゼに関する選択された薬剤の効果を分析するために実行できる。例えば、内因性PDE1およびPDE2遺伝子双方を欠いた酵母株は、その中で、哺乳類cAMPホスホジエステラーゼをコードするcDNAが適切な発現ベクターに導入され、そして発現される、宿主細胞として使用できる。かよう宿主細胞には、内因性（背景）cAMPホスホジエステラーゼ活性が無いので、特に実用的である。［Colicelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 86:3599(1989)]。それ故、哺乳類酵素の活性は、粗細胞抽出物であっても、明確に検定できる。この手順は、ラットDPD遺伝子生成物の酵素活性が、薬理学的薬剤RolipramおよびR020 1724によって容易に阻害されるが、薬理学的薬剤テオフィリンによっては容易に阻害されない旨の実証を、以下において例示した。
先の実施例で記した遺伝子および細胞は、公知の酵素、ラットDPDホスホジエステラーゼの活性を阻害する化学薬品を同定するために用いることができる。公知の阻害化合物を試験するために、細胞を含まない抽出物を作成した。内因性ホスホジエストラーゼ(10DAB)、および先に記した発現ベクターからのラットDPDまたは酵母PDE2遺伝子の発現を欠く酵母細胞、が用いられた。１リットルの培養液が回収され、緩衝液Ｃ（20mM MES(pH6.2)/0.1mM MgCl2/0.1mM EGTA/1mM 2-メカプトエタノール）で洗浄され、1.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む緩衝液Ｃ中で再懸濁され、フレンチプレスで４℃で粉砕された。細胞抽出物は、100gで10分間、18000gで90分間で、不純物の除去が行われた。PDE活性は、50μgの細胞タンパク質/ml、100mM Tris (pH7.5)、10mM Mg++、５μM cAMP、5'-ヌクレオチダーゼ、および[3H]cAMPを含む反応混合液中で、公開された方法（Charbonneau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83:9308-9312 (1986); Tempel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80:1482-1486 (1983)］によって検定された。
AMPは、Bio RadのAG1-X8樹脂を用いて、cAMPから分離された。10分間の反応で、約104cpmが得られ、バックグラウンド（ホスホジエステラーゼ欠損−酵母あるいは非抽出物）では、約300cpmであった。阻害化合物の存在もしくは欠乏下における、シトソル画分が検定された。これらの検定では、アデノシン3',5'-環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)のホスホジエステラーゼ触媒加水分解によって生成された、アデノシン5'-モノホスフェート(AMP)の量を測定する。各抽出物に関して、公知の阻害剤の様々な濃度に対する阻害率を、表２に示した。
阻害率は、阻害剤の欠乏下での測定値に関連するホスホジエステラーゼ活性の低下を示す。Rolipramおよび関連化合物R0201724が、DPD活性の最も効果的な阻害剤であった。
0004031027.tif 000015
もちろん、この検定は、新規もしくは関連化学化合物のPDE活性阻害する能力、あるいはこの系内で発現した他のホスホジエステラーゼ活性に関する試験にも適用することができる。
明らかに、この検定形式は、検定可能な酵素活性が存在する、類似の方法でクローニングされ、そして発現された他の遺伝子にも適用できる。
上記の表に記してあるように、ホスホジエステラーゼ活性は、pL22MetおよびpJC44Xそれぞれに、0.04μMと1.0μM cAMPを用いて決定した。これらcAMPの濃度は、各酵素のKm以下になるように、特に選択されたものである。このように、EC50は、阻害定数あるいは各酵素のKiと極めて近似になる。全ての動力学的データは、酵素触媒作用の初期速度を示している。
0004031027.tif 000016
全形質転換宿主細胞のスクリーニングとして、以下の方法が適用された。酵母株10DABは、ヒト科IVホスホジエステラーゼ、つまり、cAMP特異性PDEを発現する発現ベクターpAD72で形質転換された。この形質転換酵母株は、30℃で、３日間、SC-ロイシン培地で培養された。これら培養液は、１ml当たり、約5000万個の細胞密度に達した。この培養液の一部（300μl）を採取し、4.8μlの10％DMSO、または適当な濃度のホスホジエステラーゼ阻害剤を含む10％DMSOと混合した。処理した培養液を、２時間、30℃で、インキュベートした後、３μl培養液の二つが取り除かれ、SCロイシン寒天平板に移された。その後、100μlの培養液を、処理済培養液から取り除き、12×75mmのガラス性試験管に移し、鉱油を含んだホットブロックで、50℃で、30分間インキュベートした。試験管を、ホットブロックから取り出し、室温下に置いた。３μlの培養液二つを取り除き、SCロイシン平板に移した。寒天平板は、30℃でインキュベートされ、種々の時間でのテストを行い、成長を観察した。
10％DMSOだけで処理された酵母は、50℃熱処理を経た生存細胞の数に僅かな減少が見られた。100μM Rolipramでは、約150,000個の生存細胞の内、10細胞以下にまで、Rolipramを使用した細胞の処理では、生存細胞数が減少した。100μMまでのMilrinoneでは、培養液には、観察すべき効果はなかった。
Ｂ．機能未特定タンパク質に影響する薬剤の同定
本実施例は、酵母で発現した、その機能が未だ特定されていないものであっても、コードした哺乳類タンパク質の機能に影響を与える化学化合物の同定のために用いられる遺伝子および上記した方法の使用に関する。
ホスホジエステラーゼ欠陥である10DAB細胞は、熱ショック感受性である。すでに議論したように、これら細胞がpRATDPDのcDNAを発現する能力を得た場合、それら細胞は熱ショック耐性になる。pRATDPDのcDNAを発現する10DAB細胞を、定常期で３日間、濃厚培地(YPD)に置いた。これら培地は、公知のホスホジエステラーゼ阻害剤である、最終濃度が100μMのRolipramで処理した。対照培地は、阻害剤処理を一切行わなかった。これら培地を、ガラス製試験管内で、50℃で30分間、熱ショックを与えた。各培地の１μlをプレートに置いた。
Rolipram処理した培地は、酵素機能の阻害を反映して、熱ショックに対してより感受性であった。
薬理学的第二タイプの選抜手段は、哺乳類遺伝子が機能未決定のタンパク質をコードし、それ故、生化学的活性を検定できない場合でも、適用することができる。この方法において試験される薬剤は、哺乳類タンパク質を発現する遺伝子的に変換された微生物宿主に直接に適用、あるいは導入される。哺乳類遺伝子もしくは遺伝子生成物を阻害できる薬剤は、変換した宿主での哺乳類タンパク質の発現により当初から訂正された形質を逆転させる能力によって同定される。
この手法は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、および宿主株としてのRAS2val19を含む酵母をコードする哺乳類cDNAsについて用いられてきた。ラットDPD遺伝子が熱ショック感受性宿主に導入されて発現した場合、宿主株は熱ショック耐性になる。現耐性細胞をRolipramでインキュベートした場合、それらは再度、熱ショック感受性となり、RolipramがラットDPD遺伝子生成物の活性を阻害していることを示す。この薬理学的選抜手段では、DPD遺伝子生成物の機能を判明させておく必要はない。これと同様の方法が、他の遺伝子を評価するために適用できる。
加えて、DPDホスホジエステラーゼ活性に依存する他の形質は、阻害薬剤の存在によって影響を受けると思われる。薬剤もしくは薬品の効果は、上記したように評価することができる。最後に、最も一般的な事例においては、酵母にて哺乳類cDNAsから発現した未知の機能を有するタンパク質のための阻害薬品は、同様の方法で見つけることができる。この方法は、タンパク質の発現の結果生じる形質にのみ依存しており、その機能に関する知見には依存していない。
例えば、チロシンキナーゼは、タンパク質の非常に大きく多様な上科を包含する。それらは、細胞生長の調節において重要である。あるチロシンキナーゼは、細胞中に偏在して発現される。他のチロシンキナーゼは、組織特異性分布を示す。そのようなチロシンキナーゼの真の特異的阻害剤は、不必要な副作用を呈することなく、特異性と所望の治療効果を備えることが期待されるのである。例えば、PDGF受容体チロシンキナーゼの特異的阻害剤は、アテローム性動脈硬化性血小板の成長阻止、もしくは傷形成の阻止が期待でき、ならびにCD4およびCD8 T-細胞受容体からのシグナルを媒介するlckチロシンキナーゼの特異的阻害剤は、細胞毒性を呈さずに、抗炎症性に関して期待がもてる。
酵母を、特異的チロシンキナーゼの阻害のための薬剤を薬理学的にスクリーニングするために用いることも可能であろう。Brugge et al., Mol. Cell. Biol., 7:2180-2187 (1987)は、酵母S. cerevisiaeでの鳥類v-src遺伝子の発現が、成長を阻害することを実証した。ウィルス性遺伝子は、哺乳類および鳥類細胞に偏在的に発現される細胞性src遺伝子と非常に似通ったチロシン特異性タンパク質キナーゼをコードする。もし、これが酵母で発現された活性型哺乳類チロシンキナーゼの一般的な特性であれば、薬理学的スクリーニングのための下記構想は、その有効性が期待される。
特異性哺乳類チロシンキナーゼcDNA遺伝子は、ガラクトース存在下およびグルコース欠乏下で導入できるGAL10プロモーターなどの導入可能な酵母プロモーターの制御下で、酵母シャトルベクターへ挿入することができる。酵母細胞へのこのベクターの導入は、かような条件下では、哺乳類チロシンキナーゼは細胞の損傷を発現するので、細胞の（グルコースが欠乏した状態で、ガラクトースを含む）導入培地での生長を不可能にする。チロシンキナーゼの阻害剤の存在下では、かような細胞は、導入培地で生長する。このことは、哺乳類チロシンキナーゼを阻害する薬理学的薬剤のための単純選抜手段を提供する。疑似物質としては、キナーゼの発現の誘導を妨げる薬剤を含む。かような疑似物質は、特異性抗体を用いた定量によって決定される、包含されるべき哺乳類キナーゼの不足によって区別できる。
本発明は、特に例示的な方法と物質に関して記述してきたが、当業者が上記詳細な説明を考慮すれば、本発明の修正と変更を想到するものと考えられる。従って、特許請求の範囲の欄に記載の限定のみが本発明に付加されるべきである。
【図面の簡単な説明】
図１［図１(A)、１(B)、１(C)および１(D)］は、プラスミドpJC44X、pTM3、pGB14およびpGB18ARRのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の比較配列である。
図２［図２(A)、２(B)、２(C)および２(D)］は、プラスミドpPDE2RR、pTM72、pPDE7およびpPDE 10x-INVのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の比較配列である。
図３は、プラスミドpPDE18およびpGB25のヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の比較配列である。
図４［図４(A)および４(B)］は、プラスミドpTM72(TM72、pRATDPD、pJC44X、pPDE18およびpPDE21の推定アミノ酸配列の比較配列である。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：ウィグレー、マイケル、エイチコリセリ、ジョン、ジェイ
(ii)発明の名称：相補性によるクローニングおよび関連方法
(iii)配列の数：57
(iv)連絡先住所：
(A)名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー  アンド  ビックネル
(B)番地：トゥー  ファースト  ナショナル  プラザ、20サウス  クラークストリート
(C)都市名：シカゴ
(D)州名：イリノイ
(E)国名：米国
(F)郵便番号：60603
(v)コンピューター読取形式：
(A)媒体：フロッピー  ディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換機
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテント  イン  リリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)現出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(vii)先行出願データ：
(A)出願番号：US 07/511,715
(B)出願日：20-4月-1990
(viii)弁護士／弁理士情報：
(A)氏名：ボーラン、マイケル  エフ
(B)登録番号：25447
(C)参照／事件番号：27805/30197
(ix)通信情報：
(A)電話：(312)346-5750
(B)ファックス：(312)984-9740
(C)テレックス：25-3856
(2)配列番号：１の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：10塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：１
0004031027.tif 000017
(2)配列番号：２の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：10塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：２
0004031027.tif 000018
(2)配列番号：３の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：2158塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..1688
(xi)配列：配列番号：３
0004031027.tif 000019
0004031027.tif 000020
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0004031027.tif 000023
(2)配列番号：４の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：562アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：４
0004031027.tif 000024
0004031027.tif 000025
0004031027.tif 000026
(2)配列番号：５の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：５
0004031027.tif 000027
(2)配列番号：６の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：５
0004031027.tif 000028
(2)配列番号：７の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：配列番号：７
0004031027.tif 000029
(2)配列番号：８の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：８
0004031027.tif 000030
(2)配列番号：９の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：配列番号：９
0004031027.tif 000031
(2)配列番号：10の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：配列番号：10
0004031027.tif 000032
(2)配列番号：11の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：2702塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：2..2701
(xi)配列：配列番号：11
0004031027.tif 000033
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(2)配列番号：12の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：900アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：12
0004031027.tif 000040
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(2)配列番号：13の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：1721塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：60..1274
(xi)配列：配列番号：13
0004031027.tif 000045
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(2)配列番号：14の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：405アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(iI)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：14
0004031027.tif 000049
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0004031027.tif 000051
(2)配列番号：15の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：1829塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：30..1421
(xi)配列：配列番号：15
0004031027.tif 000052
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(2)配列番号：16の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：464アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：16
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(2)配列番号：17の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：1299塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..1299
(xi)配列：配列番号：17
0004031027.tif 000059
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(2)配列番号：18の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：433アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：18
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(2)配列番号：19の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：3987塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：3..1498
(xi)配列：配列番号：19
0004031027.tif 000066
0004031027.tif 000067
0004031027.tif 000068
(2)配列番号：20の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：498アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：20
0004031027.tif 000069
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(2)配列番号：21の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：3131塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：misc＿features
(B)存在位置：1652
(D)他の情報：／注＝「リーディングフレーム中のこの残基における転換が起こり得る」
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：接合箇所（743..1648，1651..2661）
(xi)配列：配列番号：21
0004031027.tif 000072
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(2)配列番号：22の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：638アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：22
0004031027.tif 000078
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(2)配列番号：23の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：3186塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：139..2348
(xi)配列：配列番号：23
0004031027.tif 000082
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(2)配列番号：24の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：736アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：24
0004031027.tif 000089
0004031027.tif 000090
0004031027.tif 000091
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(2)配列番号：25の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：1276塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：2..504
(xi)配列：配列番号：25
0004031027.tif 000093
(2)配列番号：26の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：167アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：26
0004031027.tif 000094
(2)配列番号：27の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：2384塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：接合箇所（1..1539，1859..2383）
(xi)配列：配列番号：27
0004031027.tif 000095
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(2)配列番号：28の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：688アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：28
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(2)配列番号：29の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：1675塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：492..1330
(xi)配列：配列番号：29
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(2)配列番号：30の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：279アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：30
0004031027.tif 000109
0004031027.tif 000110
(2)配列番号：31の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：3073塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：3..1111
(xi)配列：配列番号：31
0004031027.tif 000111
0004031027.tif 000112
0004031027.tif 000113
0004031027.tif 000114
0004031027.tif 000115
(2)配列番号：32の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：369アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：32
0004031027.tif 000116
0004031027.tif 000117
0004031027.tif 000118
(2)配列番号：33の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：1811塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号：38
0004031027.tif 000119
(2)配列番号：34の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：1672塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号：34
0004031027.tif 000120
(2)配列番号：35の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：1649塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：210..1018
(xi)配列：配列番号：35
0004031027.tif 000121
0004031027.tif 000122
0004031027.tif 000123
(2)配列番号：36の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：269アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：36
0004031027.tif 000124
0004031027.tif 000125
(2)配列番号：37の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：609塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：2..606
(xi)配列：配列番号：37
0004031027.tif 000126
0004031027.tif 000127
(2)配列番号：38の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：201アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：38
0004031027.tif 000128
(2)配列番号：39の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：1230塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：3..1156
(xi)配列：配列番号：39
0004031027.tif 000129
0004031027.tif 000130
0004031027.tif 000131
(2)配列番号：40の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：384アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：40
0004031027.tif 000132
0004031027.tif 000133
(2)配列番号：41の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：798塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：3..798
(xi)配列：配列番号：41
0004031027.tif 000134
0004031027.tif 000135
0004031027.tif 000136
(2)配列番号：42の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：265アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：42
0004031027.tif 000137
0004031027.tif 000138
(2)配列番号：43の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：1902塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：97..1256
(xi)配列：配列番号：43
0004031027.tif 000139
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0004031027.tif 000141
0004031027.tif 000142
(2)配列番号：44の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：386アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：44
0004031027.tif 000143
0004031027.tif 000144
(2)配列番号：45の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：1155塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：95..762
(xi)配列：配列番号：45
0004031027.tif 000145
0004031027.tif 000146
(2)配列番号：46の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：222アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：46
0004031027.tif 000147
(2)配列番号：47の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：29塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：47
0004031027.tif 000148
(2)配列番号：48の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：31塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：48
0004031027.tif 000149
(2)配列番号：49の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：16塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(iv)アンチセンス：Yes
(xi)配列：配列番号：49
0004031027.tif 000150
(2)配列番号：50の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：29塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：50
0004031027.tif 000151
(2)配列番号：51の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：51
0004031027.tif 000152
(2)配列番号：52の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：52
0004031027.tif 000153
(2)配列番号：53の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の長さ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号：53
0004031027.tif 000154
(2)配列番号：54の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：54
0004031027.tif 000155
(2)配列番号：55の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：８アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：55
0004031027.tif 000156
(2)配列番号：56の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：７アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：56
0004031027.tif 000157
(2)配列番号：57の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ：７アミノ酸
(B)配列の長さ：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：57
0004031027.tif 000158
【図１（Ａ）】
0004031027.tif 000161
【図１（Ｂ）】
0004031027.tif 000162
【図１（Ｃ）】
0004031027.tif 000163
【図１（Ｄ）】
0004031027.tif 000164
【図２（Ａ）】
0004031027.tif 000165
【図２（Ｂ）】
0004031027.tif 000166
【図２（Ｃ）】
0004031027.tif 000167
【図２（Ｄ）】
0004031027.tif 000168
【図３】
0004031027.tif 000169
【図４（Ａ）】
0004031027.tif 000170
【図４（Ｂ）】
0004031027.tif 000171