(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端配列は配列番号：１に相当するが、１３番目のＭｅｔのＡｌａへの単一アミノ酸置換で異なり、Ｃ末端配列は配列番号：２に相当するが、４番目のＧｌｕのＬｙｓへの単一アミノ酸置換で異なり、該Ｎ末端配列は該Ｃ末端配列に直接連結している、配列番号：１７の３１アミノ酸残基からなる、重症筋無力症患者からのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する応答阻害ペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端配列は配列番号：２に相当するが、４番目のＧｌｕのＬｙｓへの単一アミノ酸置換で異なり、Ｃ末端配列は配列番号：１に相当するが、１３番目のＭｅｔのＡｌａへの単一アミノ酸置換で異なり、該Ｎ末端配列は該Ｃ末端配列に直接連結している、配列番号：１８の３１アミノ酸残基からなる、重症筋無力症患者からのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する応答阻害ペプチド。
【請求項３】
巨大分子担体に接合された請求項１または２記載の応答阻害ペプチド。
【請求項４】
蛋白担体に接合された請求項３記載の応答阻害ペプチド。
【請求項５】
蛋白担体は破傷風トキソイドである請求項４に記載された応答阻害ペプチド。
【請求項６】
巨大分子担体はアミノ酸のコポリマーである請求項３記載の応答阻害ペプチド。
【請求項７】
配列番号：１７のペプチドおよび医薬的に許容される賦形剤からなる重症筋無力症の処置のための医薬組成物。
【請求項８】
配列番号：１８のペプチドおよび医薬的に許容される賦形剤からなる重症筋無力症の処置のための医薬組成物。
【請求項９】
経口投与に適合された請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１または２記載の応答阻害ペプチドの重症筋無力症の処置のための医薬組成物の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は重症筋無力症（ＭＧ）患者の処置に有用な合成ペプチドならびにこれらのペプチド単独または巨大分子担体に付着させたペプチドからなる医薬組成物に関する。
発明の背景
自己免疫疾患は自己抗原に向けられた免疫応答を特徴とする。これらの応答は自己反応性Ｔリンパ球の持続的活性化によって維持される。Ｔリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上における自己主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子産物との複合体としての異種および／または自己抗原の認識に際して特異的に活性化される。
重症筋無力症（ＭＧ）は自己免疫疾患であり、その症状は神経筋接合部の後シナプス膜のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）に対する抗体誘発自己免疫攻撃によって引き起こされる。この抗体による攻撃は、アセチルコリン受容体の喪失を生じ、正常な神経筋伝達を危うくし、その結果、主として脳神経によって支配される筋肉の突発的な筋脆弱化および疲労を招来する。
Ｔリンパ球は、自己反応性過程において中心的役割を果たすと考えられるが、Ｔリンパ球がその調節的役割を発揮する、ＭＧの誘導および様々な臨床的表出を導く機構についてはほとんど理解されておらず、筋無力症患者の処置に特異的な治療法もない。現在、処置は、コリンエステラーゼ阻害剤たとえばピリドスチグミンおよびネオスチグミン、胸腺摘除術、コルチコステロイド、ならびに免疫抑制剤および血漿交換法によって行われている。
ＭＧは、ＡＣｈＲの決定基に特異的な抗体によって誘発される明確に定義された自己免疫疾患である。ヒトＭＨＣの特異的遺伝子，ＨＬＡ系は、この疾患に重大な関連があることが示されている。ＭＧ患者における高頻度のある種の主要組織適合抗原（ＨＬＡ-ＢＳ，ＤＲ３）は、Ｔ細胞のレベルで発現される可能性がある免疫調節の欠損を示唆している。
以前の研究において、本発明者らは、ヒトＡＣｈＲのα-サブユニットの配列を示す２つのペプチド（ｐ195-212およびｐ257-269）が、健康な対照に比較して、ＭＧ患者からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を有意に刺激することを見出した［Brocke,S.ら（1988）, J.Clin.Invest. 82: 1894-1900］。さらに、ＭＧ患者のＨＬＡ-ＤＲ型とこれらのペプチドに対する彼らの応答の間には相関が証明された。すなわち、ＨＬＡ-ＤＲ３を発現するすべての患者がｐ257-269に応答し、ＨＬＡ-ＤＲ５を発現する患者の83％がｐ195-212に応答した。
近交系マウス株を用いたこの研究の延長で、ヒトＡＣｈＲのα-サブユニットの配列ｐ195-212およびｐ259-271に、高度、中等度および軽度のレスポンダー株が同定された。さらに、電気ナマズ由来のＡＣｈＲで免疫したＳＪＬならびにＢＡＬＢ／ｃマウスからのリンパ節細胞はそれぞれｐ195-212およびｐ259-271に対し、免疫処置抗原に対するよりもむしろ良好に応答して増殖した［Brocke,S.ら（1990）, Immunol. 69: 495］。これらの結果はペプチドｐ195-212およびｐ259-271が免疫優性のマウスＴ細胞エピトープであることを指示している。
合成免疫ペプチドｐ195-212およびｐ259-271に特異的なＣ３Ｈ．ＳＷ起源の長期培養Ｔ細胞系およびクローンが本発明者らの実験室で樹立され、Brocke,S.ら（1990a）, Internat.Immunol. 2: 735-742に報告されている。この記載は引用により本明細書に導入される。これらの細胞系およびクローンを用いると、筋無力症性エピトープのＴ細胞認識過程の特徴を解明することができる。この方法を用いて、ｐ195-212に特異的なＴ細胞系およびクローンが、低（Ｃ３Ｈ．ＳＷ）および高（ＳＪＬ）レスポンダーマウス株のリンパ節細胞から樹立され、また、ｐ259-271に特異的なＴ細胞系およびクローンが、低（Ｃ３Ｈ．ＳＷ）および高（ＢＡＬＢ／ｃ）レスポンダーマウス株のリンパ節細胞から発生された。
最近、これらの細胞系の活性化細胞をネイティブな同系マウスに接種した場合に、ペプチド特異的抗体およびマウスアセチルコリン受容体に対する抗体が検出されると報告されている。さらに、神経筋伝達の損傷と一致する複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の低下が系統接種マウスに認められている。すなわちこれは、ＭＧ関連自己免疫表出のマウスモデルとして有効である。Kirshnerら（1994）, Cell.Immunol., 157: 11-28参照。この全内容は引用により本明細書に導入される。ＣＭＡＰはまたＭＧ患者の診断にも使用される。
欧州特許公告第432,691号には、無傷の生存抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面における主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびIIの遺伝子産物に対するＴ細胞エピトープであるペプチドの直接的結合の測定のためのアッセイが記載されている。このアッセイは標識ペプチドをＡＰＣとインキュベートし、ペプチドの標識に使用したリガンドと反応するプローブを添加して結合の程度をモニターすることからなる。このアッセイは自己免疫疾患および他の免疫学的障害に適している。このアッセイによって、ｐ195-212は、数種の異なるマウス株からの生存ＡＰＣ上のＭＨＣクラスII分子に直接結合することが証明された。このペプチドに観察された結合能力は、異なるマウス株の潜在的増殖能力と相関し、関連抗-Ｉ-Ａ抗体によって阻害されることが示された。さらにペプチドｐ195-212および／またはｐ259-271に増殖によって応答したＭＧ患者および健康対照からのＡＰＣはまた、ビオチンで標識した同じペプチドを結合することが示された。ペプチドをそれらのＭＨＣ産物への直接結合およびそれらのＴ細胞に対する刺激能によってスクリーニングできることは、疾患の病因におけるＭＧ関連エピトープの役割に光をあてることになるかもしれない。
自己免疫疾患に関連するペプチド抗原の配列のストレッチ内のアミノ酸置換によって得られるペプチド類縁体は、ＭＨＣ遺伝子産物に結合するが、特異的ヘルパーＴ細胞を刺激しないペプチドを導く可能性のあることが示唆されている。このようなペプチドはインビトロおよびインビボにおいてＴ細胞の反応性を競合的に阻害するために、すなわち相当する自己免疫疾患の処置に使用できる［Sakai,K.ら（1989）, PNAS 86: 9470；Urban, J.L.ら（1989）, Cell 59: 257；欧州特許公告第432,691号およびＰＣＴ出願公告ＷＯ92/04049号］。しかしながら、病原性ペプチドと効果的に競合し、したがって一般的に自己免疫疾患とくに重症筋無力症の防止または処置に有用なペプチド類縁体を得るために、置換されることができる病原性ペプチドのアミノ酸やどのようなアミノ酸が適当な置換基として有効なのかに関しての情報または指針については全く言及されていない。
発明の概要
本発明は、配列番号：１の式
0004065322.tif 000002
を有するペプチドｐ195-212および配列番号：２の式
0004065322.tif 000003
を有するペプチドｐ259-271からなる群より選択されるヒトアセチルコリン受容体αサブユニットの配列に相当する筋無力症原性ペプチドに対する、重症筋無力症患者からのＴリンパ球の増殖性応答を阻害できる少なくとも14個のアミノ酸残基の応答阻害ペプチドであって、２つの連結したアミノ酸配列からなり、第一のアミノ酸配列は少なくとも配列番号：１のアミノ酸残基200-208を含有し、第二のアミノ酸配列は少なくとも配列番号：２のアミノ酸残基262-266を含有しただし上記応答阻害ペプチドの両配列は配列番号：１および配列番号：２のそれぞれで１〜３個のアミノ酸置換によって配列番号：１および２とは異なり、上記置換は配列番号：１および配列番号：の筋無力症原性ペプチドに対する、重症筋無力症患者からのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する機能を有するように選択され、上記アミノ酸置換は非置換筋無力症原性ペプチドの相当する部分の容量、疎水性-親水性パターンおよび電荷を実質的に累積的に変化させない置換から選択される応答阻害ペプチドに関する。
本発明はさらに、重症筋無力症の処置用の医薬組成物および本発明のペプチド自体、その重合型または巨大分子担体への付着型を投与することからなる重症筋無力症の処置方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、様々な用量の筋無力症原性ペプチドｐ259-271ならびにその類縁体の266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspに対するＴ細胞系，ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271の増殖性応答を示すグラフである。
図２は様々な用量の阻害性ペプチド266Ａsp，262Ｌys，262Ａspおよびｐ195-212によるＴ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271のｐ259-271特異的増殖性応答の阻害を示すグラフである。
図３は、様々な用量のペプチド（抗原＝Ａｇ）ｐ259-271，266Ａsp，262Ｌysおよび262ＡspによるＴ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271のヘルパー活性の特異性を示すグラフである。
図４は様々な用量のペプチドｐ259-271単独または類縁体266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspとの併用によるＴ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271のヘルパー活性の阻害を示すグラフである。
図５はｐ259-271で免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の、様々な用量のｐ259-271，266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspによる増殖性応答を示すグラフである。
図６はｐ259-271で免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の、様々な用量のｐ259-271単独または262Ｌysとの併用に対する増殖性応答の阻害を示すグラフである。
図７は、Ｔ細胞系，ＴＣＳＪＬ195-212のｐ195-212特異的増殖性応答の、ｐ159-212およびその類縁体207Ａlaの混合物の２種の用量のによる阻害を示すグラフである。
図８Ａ〜Ｃは、それぞれ実施例１において合成された類縁体ｐ159-212，類縁体ｐ259-271および二元エピトープ類縁体の配列および配列番号を示す。
図９は実験的自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）誘発の、本発明の類縁体による防止を示す実験結果のグラフである。「筋無力症原性減衰」のプラス印（＋）側はＣＭＡＰの低下が測定さたことを指示する。マイナス印（−）はＣＭＡＰの減衰が認められなかったことを指示する。
図10は、Ｔ細胞系ＴＣＳＪＬ195-212の増殖性応答の、二元エピトープ類縁体207Ａla-262Ｌysおよび262Ｌys-207Ａlaによる阻害を示すグラフである。
図11はＴ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271の増殖性応答の二元エピトープ類縁体207Ａla-262Ｌysおよび262Ｌys-207Ａlaによる阻害を示すグラフである。
図12はｐ195-212ベースの類縁体207Ａla，207Ａla-262Ｌysおよび262Ｌys-207Ａlaによる、リンパ節細胞プライミングのインビボ阻害のグラフである。
図13はｐ259-271ベースの類縁体262Ｌys，207Ａla-262Ｌysおよび262Ｌys-207Ａlaによるリンパ節細胞のプライミングのインビボ阻害のグラフである。
図14はｐ195-212で免疫処置したＳＪＬマウスのリンパ節細胞の増殖の、262Ｌys-207Ａlaの経口投与による阻害を示すグラフである。
図15はｐ195-212で免疫処置したＳＪＬマウスのリンパ節細胞の増殖の、262Ｌys-207Ａlaの経口投与による阻害百分率を示すグラフである。
図16は、ｐ259-271で免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の増殖の262Ｌys-207Ａlaの経口投与による阻害百分率を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、適当なＭＨＣクラスII分子に高い親和性で結合するが、Ｔ細胞の更なる活性化は誘導しない、筋無力症原性ペプチドｐ195-212（配列番号：１）およびｐ259-271（配列番号：２）の類縁体に関する。このような類縁体の例は、この機能を同様に達成するさらに他のペプチドを同定するために本技術分野の通常の熟練者には誰でも追跡できる操作として提供される。本発明は、母体のペプチドｐ195-212およびｐ259-271に基づき様々な位置にアミノ酸置換を有するペプチドの設計および合成を基盤とするものである。適当に置換することにより、重症筋無力症の経過において筋無力症原性エピトープの作用に対するアンタゴニストである類縁体を同定することができる。適当なＭＨＣクラスII分子に高い親和性で結合するがＴ細胞の更なる活性化は誘導しない類縁体は、Ｔ細胞の活性化を引き起こすために同じＭＨＣクラスII分子に結合しなければならず、続いて重症筋無力症を起こす抗体の産生を導く筋無力症原性ペプチドと競合することになる。Ｔ細胞の増殖を惹起する筋無力症原性ペプチドと競合することによって、重症筋無力症の有害作用を緩和することができる。
Ｔ細胞エピトープとしての機能に最も重要な筋無力症原性エピトープ、ｐ195-212およびｐ259-271の部分は、配列番号：１のアミノ酸残基200-208および配列番号：２のアミノ酸残基262-266であると推定されてきた。したがって、変化はこれらのコア領域に行われることが好ましい。これらのコア領域の外部のアミノ酸残基は、適当なＭＨＣクラスII分子への結合機能には重要ではなく、したがってこれらのアミノ酸残基における変化がＴ細胞の更なる活性化を防止することは期待されない。したがって、これらを変化させる必要はないが、非コア領域アミノ酸残基に置換を行う場合には、置換の累積効果に関して本明細書に説明する指針を満足するように置換を選択しなければならない。
アミノ酸は、容量、疎水性-親水性パターンおよび電荷の順位に沿って分類できる。容量に関しては、本技術分野の熟練者には理解されているように、最大の容量をもつアミノ酸はＴrp，Ｔyr，Ｐhe，Ａrg，Ｌys，Ｉle，Ｌeu，ＭetおよびＨisであり、最小の容量のアミノ酸はＧly，Ａla，Ｓer，Ａsp，ＴhrおよびＰroであり、他はそれらの中間である。
疎水性-親水性パターンに関してはアミノ酸Ｇly，Ａla，Ｐhe，Ｖal，Ｌeu，Ｉle，Ｐro，ＭetおよびＴrpが疎水性であり、一方、残りのアミノ酸はすべて親水性である。親水性アミノ酸中、Ｓer，Ｔhr，ＧlnおよびＴyrは電荷をもたず、一方、Ａrg，Ｌys，ＨisおよびＡsnは正の電荷、ＡspおよびＧluは負の電荷を有する。
重症筋無力症患者からのＴリンパ球の、それに相当する筋無力症原性ペプチド配列番号：１または配列番号：２に対する増殖性応答の阻害の可能性を試験するペプチドの選択における重要事項は、置換を、非置換筋無力症原性ペプチドの相当部分の容量、疎水性-親水性パターンおよび電荷を実質的に累積的に変化させない置換から選択することである。すなわち、疎水性残基の親水性残基への置換またはその逆は総合的な効果が相当する非置換筋無力症原性ペプチドの容量、疎水性-親水性パターンおよび電荷を実質的に変化させない限り可能である。上述のように、これらの置換は配列番号：１の残基200-208および配列番号：２の残基262-266の重要なエピトープコア領域に行われるのが好ましい。
本発明の合成ペプチドは少なくとも14個のアミノ酸を有することが好ましく、好ましくは25〜31個のアミノ酸を有する。各類縁体は各コア領域に１〜３個の置換を有することが好ましい。
本発明の好ましい実施態様においては、置換（単数または複数）はコア領域の疎水性アミノ酸残基を、非置換ペプチドの容量を実質的に累積的に変化させないように選択される他の疎水性アミノ酸での置換が選択される。たとえば、ｐ200-208においては、疎水性アミノ酸は201Ｉle，205Ｐhe，206Ｖalおよび207Ｍetである。この好ましい実施態様においては、これらのそれぞれが任意の他の疎水性残基で置換できる。すなわち、たとえば207ＭetはＧly，Ａla，Ｐhe，Ｖal，Ｌeu，Ｉle，ＰroまたはＴrpで置換できる。Ａlaによる置換がとくに良好な結果を与えることが確立されている。同様に、ｐ262-266においては、263Ｌeu，264Ｉleおよび265Ｐroがすべて疎水性である。したがって、これらの１〜３個を、容量に関する累積効果が実質的でないように他の疎水性残基で置換することができる。すなわち、たとえば、265Ｐroは、Ｇly，Ａla，Ｐhe，Ｖal，Ｌeu，Ｉle，ＭetまたはＴrpで置換できる。
第二の実施態様においては、親水性非荷電残基が荷電または非荷電親水性残基によって置換される。ｐ200-208ペプチドにおける親水性の非荷電残基には202Ｔhr，203Ｔyrおよび208Ｇlnがある。ｐ262-266ペプチドにおいては266Ｓerが非荷電親水性残基である。したがってたとえば208ＧlnはＳer，Ｔhr，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，Ａsn，ＡspまたはＧluの任意の残基に、266Ｓerは、Ｔhr，Ｇln，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，Ａsn，ＡspまたはＧluにの任意の残基変化させることができる。この場合も、変化はすべての変化の累積効果が、非置換筋無力症原性ペプチドの相当する部分の容量、疎水性-親水性パターンおよび電荷を実質的に変化させないように選択されなければならない。この実施態様内での変化の特定の例は、208ＧlnのＡsnまたはＡspによる置換および266ＳerのＬysまたはＡsnによる置換である。
本発明の他の実施態様においては、荷電した親水性残基が荷電した（同一または逆の電荷）または非荷電の親水性残基によって置換される。ｐ200-208ペプチドでは、200Ａspが負に荷電した親水性残基であり、204Ｈisが正に荷電した親水性残基である。ｐ262-266においては、262Ｇluが負に荷電した親水性残基である。したがって、たとえば、200ＡspはＳer，Ｔhr，Ｇln，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，ＡsnまたはＧluで、262ＧluはＳer，Ｔhr，Ｇln，Ｔyr，Ａrg，Ｌys，Ｈis，ＡsnまたはＡspで置換することができる。特定の例としては、200ＡspのＬys（逆の電荷）または262ＧluのＳer（荷電の非荷電へ）による置換がある。262ＧluのＬys（負の荷電の正の荷電へ）による置換がとくに良好な結果を与えることが見出されている。この場合も、いずれの置換も、非置換筋無力症原性ペプチドの相当する部分の容量、疎水性-親水性パターンおよび電荷を累積的に実質的に変化させないように選択されなければならない。
最後に、さらに他の実施態様においては、親水性残基の疎水性残基への置換またはその逆も、累積効果が指針の範囲内である限り可能である。このような置換の例には、204ＨisのＧlyもしくは203ＴyrのＰheによる置換または262ＧluのＡlaによる置換がある。
ペプチド化学の技術分野における通常の熟練者には厳格な理論的考察により、９個のアミノ酸の短い与えられたペプチドの電荷、疎水性-親水性パターンおよび容量に対する累積効果がどうであるかは容易に認識できるものである。したがって煩雑な実験をしないで、適当なＭＨＣクラスII分子の結合でネイティブな筋無力症原性ペプチドと競合する機能を有するがＴ細胞の更なる活性化は誘導しない本発明の類縁体を同定するためにどのような置換を試みるかは決定できる。
ネイティブなペプチドへの置換のために使用されるアミノ酸には修飾されたペプチドたとえば、ノルロイシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキリジン、γ-カルボキシグルタミン酸等が包含されることを理解すべきである。
他の点で本明細書に提示された指針に従うその１〜３個を、本発明の類縁体に存在させることができる一部の特定の置換には以下の置換、すなわち200，Ａla→Ｌys；203，Ｔyr→Ｐhe；204，Ｈis→Ｇly；207，Ｍet→ＮＬeu；207，Ｍet→Ａla；208，Ｇln→Ａsp；208，Ｇln→Ａsn；262，Ｇlu→Ａsp；262，Ｇlu→Ｌys；262，Ｇlu→Ｓer；262，Ｇlu→Ａla；265，Ｐro→Ｌeu；265，Ｐro→Ｐhe；266，Ｓer→Ｌys；および266，Ｓer→Ａspからなる群より選択される。１〜３個の変化を除いて全ｐ195-212またはｐ259-272配列を包含する場合のこれらの類縁体の命名法は以下、位置ならびに置換残基のみの同定による。最も好ましい類縁体は、204Ｇly，207Ａla，262Ｌys，262Ｓer，265Ｌeuおよび265Ｐhe，すなわち、それぞれ配列番号：5，6，11，12，14および15である。
Ｔ細胞受容体相互作用に主として関与する親水性アミノ酸の置換は、Ｔ細胞の活性化の遮断に効果的であることが期待される。疎水性残基の置換は、類縁体-ＭＨＣ複合体の高い安定性に寄与することが考えられる。
筋無力症原性ペプチドの他の修飾も本発明によって意図されることを理解すべきである。すなわち、本発明のペプチドは、Ｔ細胞増殖応答および自己免疫疾患の防止または阻害に有用性を示すそのペプチドの機能の少なくとも一部を維持するその「化学的誘導体」を包含することを意図する。
本発明の「化学的誘導体」は正常にはペプチドの部分ではない化学残基をさらに含有する。ペプチドの共有結合的修飾が本発明の範囲内に包含される。このような修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を選ばれた側鎖または末端基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。多くのこのような化学的誘導体およびそれらを作成するための方法が本技術分野では周知である。
本発明の範囲にはさらに、本発明のペプチドの塩が包含される。本明細書において使用される「塩」の語は、ペプチド分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両者を意味する。カルボキシル基の塩は、本技術分野において既知の方法によって形成され、無機塩たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩等、および有機塩たとえばトリエタノールアミン、アルギニンもしくはリジン、ピペリジン、プロカイン等のアミンによって形成される塩を包含する。酸付加塩にはたとえば、鉱酸たとえば塩酸または硫酸との塩および有機酸たとえば酢酸またはシュウ酸との塩が包含される。このような化学誘導体は、安定性、溶解性等の関連でペプチドの製剤学的性質の修飾に使用することが好ましい。
本発明の類縁体が製造されたならば、相当する筋無力症原性ペプチドに対するＴ細胞の増殖性応答を阻害するその能力は、本明細書に記載するようなテストを用い、煩雑な実験によらず、本技術分野の熟練者によれば容易に決定できる。容易に実施できる一つのテストは、元のペプチドに対するある種のＴ細胞系およびクローンの増殖性応答をインビトロで阻害する置換ペプチドの能力について実施される。Ｔ細胞系およびクローンは、配列番号：１または配列番号：２の筋無力症原性エピトープに特異的に産生された細胞系およびクローンである。先に引用したBrockeら（1990a）およびKirshnerら（1994）参照。所望の活性を有する類縁体の選択のために実施できる他のテストは、母体ペプチドの存在下ペプチド特異的Ｂ細胞に支援を与えるＴ細胞系およびクローンの能力を阻害する置換ペプチドの能力について試験する。置換ペプチドはまた、ビオチン化後、関連株の抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII産物に直接結合し、母体の筋無力症原性ペプチドの結合を阻害するそれらの能力について試験される。
これらのインビトロ試験の１または２以上において陽性である置換ペプチドにはインビボ活性がかなり期待できる。インビボ動物試験においては、ネイティブマウスを筋無力症原性ペプチドで免疫し、このマウスに類縁体を様々な経路および用量スケジュールで共投与する。ついで、リンパ節細胞を筋無力症原性ペプチドに対するそれらの増殖能について分析することができる。さらに、これらのマウスの血清中の抗-ＡＣｈＲ抗体の力価を測定してインビボでのヘルパー細胞活性に対する類縁体の効果を記録することができる。これらのインビボアッセイの利点は、それらが疾患の誘発に対する類縁体の効果の評価を目的としたものではないものの、すべての類縁体の比較的短時間でのインビボスクリーニングを可能にすることである。
治療活性の最終的な証明として、このような活性は、マウスモデルにおいてインビボで直接測定できる。筋無力症原性Ｔ細胞系エピトープに特異的な一部のＴ細胞系およびクローンがマウスにおいて、ＭＧ-類似の自己免疫表出を誘導できることは以前に明らかにされている［Mozesら（1991）, "Abstract", 15th International Congress of Biochemistry, Jerusalem. p.20ならびにKirshnerら（1994）前出］。したがって、ネイティブマウスにこのようなクローンを注射して、その自己免疫応答の防止または寛解のために選ばれた置換ペプチドで処置することができる。ペプチドは、様々な経路、様々な投与量および様々な時間スケジュールでマウスに注射することができる。類縁体の薬物動態パラメーター、たとえば分布容量、抗原提示細胞への取り込みおよびクリアランスを測定するためには、類縁体のビオチン化誘導体を使用できる。様々な体液中の類縁体の可溶性分画の濃度は、アビジン被覆プレートおよび特異的抗-ペプチド抗体を使用するＥＬＩＳＡによって測定することができる。細胞結合類縁体は、蛍光染料接合アビジンまたはストレプトアビジンを用い、ＦＡＣＳによって分析できる。さらに処置マウスは、Ｔ細胞クローンによってマウスに誘発される自己免疫応答および疾患表出に対するペプチドの効果を測定するために、周期的に試験することができる。
したがって、本明細書の実施例に操作可能なことを示した好ましい実施態様に加えて、本明細書に提示された指針に従い、煩雑な実験によらないで、同じく操作可能な他の類縁体が本技術分野の通常の熟練者によれば決定できることは明らかである。
与えられた任意の重症筋無力症患者における与えられた任意のペプチドの治療効果が期待できるかどうかの評価も、比較的単純なインビボ試験で実施できる。適当なＭＨＣクラスII分子に高い親和性で結合するがＴ細胞の更なる活性化は誘導せず、したがってＭＧ患者に治療効果を有するペプチドの製造の最終ゴールを評価するために、ペプチドはビオチン化後、重症筋無力症患者の末梢血リンパ球における抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII産物に直接結合して母体の筋無力症原性エピトープの結合を阻害する能力について評価できる。このようなアッセイでは、それらの特異性を確証するために、健康な対照ドナーおよび対照ペプチドを使用する。
本発明の治療剤の好ましい形態は、多重エピトープ単一ペプチドである。すなわち、好ましい実施態様においては、２つの筋無力症原性ペプチドのそれぞれの類縁体は、たとえば化学的または生物工学的に合成して、互いに共有結合で、互いに直接隣接する単一ペプチドとして、またはそれらをアラニン残基の短い鎖を用いてもしくはカテプシンによる蛋白分解候補部位により連結して結合させる。このような部位については米国特許第5,126,249号および欧州特許第495,049号をたとえば参考されたい。これは、好ましい形態の２つの所望の類縁体への部位特異的蛋白分解を誘導することになる。二元縦列類縁体はそれらの部分である各類縁体としての活性と実質的に等しい活性を有し、したがって広範囲のＭＧ患者からのＴ細胞応答を阻害できる。
また、本発明の同一または異なる多数のペプチドは、ペプチドポリマー、たとえば0.1％グルタルアルデヒドのような適当な重合剤によるペプチドの重合型に形成させることができる［Audibertら（1981）, Nature 289: 593］。ポリマーは好ましくは５〜20個のペプチド残基を含有する。このようなペプチドポリマーはまた、ペプチドの架橋または巨大分子担体への多重ペプチドの付着によっても形成させることができる。さらに、処方は本発明の異なるペプチドの単なる混合物とすることもできる。
適当な巨大分子担体は、たとえば破傷風トキソイドのようなタンパク質、ならびに直鎖状または分岐状のアミノ酸コポリマー、たとえばＬ-アラニン、Ｌ-グルタミン酸およびＬ-リジンの直鎖状コポリマー、およびＬ-チロシン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-アラニンおよびＬ-リジン（Ｔ,Ｇ）-Ａ-Ｌのコポリマー、または多重鎖ポリ-ＤＬ-アラニンである［M.Sela（1969）, Science 166: 1365-1374］。担体との接合体はたとえば最初にペプチドを水溶性カルボジイミドたてば1-エチル-3-（3'-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とカップリングさせ、ついでLangbeheimら（1976）, Pro-Natl.Acad.Sci. USA 73: 4636-4640に記載されているように巨大分子担体との接合を実施することによって得られる。各接合体中のカップリングしたペプチドの含量はアミノ酸分析により担体単独の組成と比較して測定される。
本発明の好ましい実施態様によれば、１または２種以上の活性ペプチドを適当な大分子担体に付着させるかまたはグルタルアルデヒドの存在下に重合させることができる。
本発明の好ましい実施態様においては、207Ａlaおよび262Ｌysが、化学的リンカーもしくは連結配列を用いないで縦列に合成された。２つのペプチド、一つはＮ-末端配列が207Ａlaの配列でＣ末端配列が262Ｌysの配列のペプチド［207Ａla-262Ｌys（配列番号：17）］と他は類縁体の順序が逆のペプチド［262Ｌys-207Ａla（配列番号：18）］が合成された。二元エピトープ類縁体のいずれも、ｐ195-212またはｐ259-271特異的Ｔ細胞系のいずれの増殖性応答も刺激しなかった。他方、両二元類縁体ペプチドは後者の細胞系の筋無力症原性エピトープに対する増殖性応答を有意に阻害した。さらに、両二元類縁体は、いずれかの筋無力症原性エピトープに対するリンパ節細胞のインビボプライミングを阻害することができた。二元類縁体262Ｌys-207Ａlaは類縁体207Ａla-262Ｌysよりもｐ195-212特異的応答の阻害に有効であるように思われる。２つの二元類縁体のｐ259-271特異的応答の阻害における効果には有意差は認められなかった。
２つの二元ペプチド類縁体の阻害能はＭＧ患者のＰＢＬについて試験した。結果は、レスポンダーＭＧ患者22例中21例のＰＢＬのｐ195-212に対する応答がいずれの二元類縁体によっても阻害されることを示した。同様に、ｐ259-271に応答したＭＧ患者16例中14例のＰＢＬが262Ｌys-207Ａlaはまたは207Ａla-262Ｌysのいずれかによって阻害された。すなわち、試験したほとんどすべてのＰＢＬの筋無力症原性エピトープに対する応答の阻害に有効であるように思われた。
ペプチド、それらのポリマーまたは適当な巨大分子担体とのそれらの接合体はそれらの生物学的利用性を保証し、それらを処置用に適当にする形態で患者に投与することになる。２以上のペプチド類縁体が有意な阻害活性を有することが見出された場合には、これらの類縁体は、それらのペプチドの混合物を含有する製剤、なたは両類縁体を縦列に合成した単一ペプチドとして患者に投与することもある。個々の患者が両病原性ＭＧ関連ペプチド、すなわちｐ195-212およびｐ259-271に応答する場合には、最終的な処置には両ペプチドの適当な阻害類縁体を適当な形態に含有させることができる。
本発明はさらに、本発明の単一、縦列もしくは多重合成ペプチドの少なくとも１種、それらの適当な巨大分子担体との接合体またはそれらのポリマーと、所望により医薬的に許容される担体ととも含有する医薬組成物を包含する。
投与経路には、経口、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、吸入、腹腔内、経鼻、莢膜内、皮内、経皮または経腸を含めた他の既知経路が包含される。
本発明の組成物の投与用量範囲は、たとえばインビトロにおけるＴ細胞の増殖によって測定される筋無力症原性ペプチドに対する免疫応答が実質的に防止または阻害され、さらに疾患が有意に処置される所望の効果を産生するのに十分な量である。用量は、望ましくない交叉反応、全身的免疫抑制、アナフラキシー反応等のような有害な副作用を生じるような大量であってはならない。
免疫関連疾患の処置に使用する際の本発明のペプチドの有効用量は約１μｇ〜１００mg/kg体重の範囲である。投与される投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康度および体重、同時の処置があればその種類、処置回数、ならびに所望の効果の本質に依存する。
ヒトＡＣｈＲの配列の合成類縁体は、他の免疫応答に障害を与えることなく、ＭＧ患者の特異的抗原応答を阻害または抑制することを目的にするものである。このアプローチは、現在受け入れられているＭＧの処置は非特異的でかつ多重な有害副作用を有する免疫抑制剤であることから極めて重要である。
本発明を次に、以下の非限定的実施例によって例示する。
実施例
実施例１．ペプチドの調製
合成ペプチドｐ195-212およびｐ259-271ならびにそれらの類縁体，200Ｌys；203Ｐhe；204Ｇly；207Ａla；208Ａsp；208Ａsn；209Ｌys；262Ａsp；262Ｌys；262Ｓer；265Ａla；265Ｌeu；265Ｐheおよび266ＡspをMerrifieldの固相法［Merrifieldら（1963）J.Am.Chem.Soc. 85: 2149］により、市販の側鎖保護アミノ酸を用い、ペプチドシンセサイザーで合成する。アミノ酸は各工程において少なくとも99％の効率で添加する。保護基を除去し、ペプチドは無水ＨＦで樹脂から分離する。
ペプチドは酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルで抽出しＨＰＬＣで精製する。ペプチドの純度はＨＰＬＣおよびアミノ酸分析によって確認する。上記類縁体それぞれの配列および配列番号は図８Ａおよび８Ｂに示す。
上記ペプチドはすべて１個のみの置換を有するが、２または３個の置換を有し本明細書に提示した指針の目標を維持する他のペプチドも同様に合成できる。
２つの二元類縁体、一つはＮ-末端配列が207Ａlaの配列でＣ末端配列が262Ｌysの配列のペプチド（207Ａla-262Ｌysと命名）と類縁体の順序が逆の他の類縁体（262Ｌys-207Ａlaと命名）も同様に合成された。これらの二元類縁体の配列および配列番号は図８Ｃに示す。
実施例２．ペプチドｐ259-271に対するＴ細胞クローンのインビトロ増殖性応答の阻害
ｐ259-271に対して特異的なＴ細胞系およびクローンは，Brockeら（1990a）前出によって記載された方法に従い、高レスポンダーＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞から発生させ、ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271と命名されている［Mozes,E.ら（1991）前出；Kirshnerら（1994）前出も参照］。
Ｔ細胞系クローンの増殖性応答は、最終16時間の培養のためのインキュベーション後の細胞への、3Ｈ-チミジンの取り込みを測定することによって評価した。Ｔ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271の細胞（104細胞/ウエル）を、抗原提示細胞としてＢＡＬＢ/ｃマウスからの照射（3000rad）同種脾臓細胞（0.5×106細胞/ウエル）の存在下、様々な濃度（1，5，10，20μg/ウエル）のペプチドｐ259-271，266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspを添加して、インキュベートした。培養は、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、100Ｕ/mlのペニシリン，100μg/mlのストレプトマイシン，0.25μg/mlのフンギゾン，5×10-5Ｍの2-メルカプトエタノール，10ｍＭ ＨＥＰＲＳ緩衝液（強化培地）および10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した0.2mlのＲＰＭI1640中に48時間セットし、ついで一夜3Ｈ-チミジン（5Ｃi/mmolの0.5μl）でパルスした。同位元素の取り込みから16時間後に、細胞をろ紙上に収穫し、放射能を測定した。結果は、図１に示す（トリプリケートの平均ＣＰＭ±ＳＤで表示）。ペプチド266Ａspおよび262Ａspは試験したすべての用量でＴ細胞系の低い増殖性応答を誘導した（ｐ259-271で得られた応答のそれぞれ12％および34.3％まで）が262ＬysはＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271細胞系の増殖を全く刺激しなかった。
増殖性応答の阻害は、インビトロの増殖培養液中への置換ペプチドの添加量を増大させていって（25，50，75，100μg/ウエル）実施した。Ｔ細胞系ＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271の細胞（104細胞/ウエル）を照射同種脾臓細胞（0.5×106細胞/ウエル），ｐ259-271（1μg/ウエル），様々な用量の阻害ペプチド266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspならびにｐ195-212の存在下、48時間インキュベートした。次に3Ｈ-チミジン（5Ｃi/mmolの0.5μl）を加え、16時間後にプレートをろ紙上に収穫した。結果はｐ259-271特異的増殖性応答の阻害％として表示する。図２に示すように、262ＬysはＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271細胞系のｐ259-271に対する増殖性応答を93％まで阻害した。ペプチドｐ195-212はｐ259-271と同じＭＨＣ決定基に向けられているので、ペプチドｐ195-212もペプチドｐ259-271に特異的なＴ細胞の増殖の完全な阻害を示すことは驚くべきことではない。Brockeら（1990a）前出はｐ195-212がＴＣＳＷ259-271Ｔ細胞系の増殖性応答を阻害し、ｐ259-271がＴＣＳＷ195-212の特異的な増殖性応答を阻害することを報告している。
他の合成類縁体の増殖性応答についても同様な試験を行った。これら類縁体のすべてに関する結果を表１に示す。「刺激」はＴ細胞を刺激した類縁体であり、「阻害」は刺激を誘導することはできなかったが、筋無力症原性ペプチドの刺激活性を阻害できた類縁体であり、「作用なし」は筋無力症原性ペプチドに特異的なＴ細胞を刺激も阻害もしなかった類縁体を意味する。ｐ195-212の203Ｐhe類縁体は少なくとも、直接結合測定により、ｐ195-212が免疫優位なＳＪＬ株マウスの抗原提示細胞に結合する能力が明らかにされた。
0004065322.tif 000004
実施例３．インビトロ抗体産生アッセイ
抗体産生アッセイにおいて、合成ペプチド266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspがペプチド特異的Ｂ細胞と共同して働くＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271Ｔ細胞系を刺激する能力について検査した。20μgのｐ259-271で予め免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスの脾臓から精製したＢ細胞（0.5×106細胞/ウエル）を，正常の同種脾臓細胞（0.5×106細胞/ウエル），様々な用量の266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａsp（0.001，0.01，0.1，1および5μg/ウエル）ならびにＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271細胞系（104細胞/ウエル）を96-ウエルマイクロタイタープレート中で培養した。３時間インキュベートしたのち、培地（7.5％ＦＣＳ補充強化ＲＰＭＩ）を、抗原を含まない新鮮培地に交換し、４日後上清を収穫し、特異的抗-ｐ259-271抗体の存在について試験した（固相ＲＩＡによる）。結果はトリプリケートの平均ＣＰＭ±ＳＤで表示する。
図３から明らかなように、266Ａspの存在下には低抗体力価が得られたが、262Ａspにより刺激されたヘルパー活性は母体のペプチドの存在下に観察された活性と同様に効率的であった。これに反し、培養液に262Ｌysを添加した場合には抗体は検出できなかった。
Ｔ細胞ヘルパー活性の阻害は、インビトロ培養混合物中における試験置換ペプチドの添加用量を増加させていって実施した。20μgのｐ259-271で予め免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスの脾臓から精製したＢ細胞（0.5×106細胞/ウエル）を正常の同種脾臓細胞（0.5×106細胞/ウエル），様々な用量でのｐ259-271単独（0.001，0.01，0.1，1および5μg/ウエル）または266Ａsp，262Ｌysもしくは262Ａsp（各20μg）ならびにＴＣＢＡＬＢ/ｃ259-271細胞系（104細胞/ウエル）を96-ウエルマイクロタイタープレート中で培養した。３日間インキュベートしたのち、上記培地を新鮮な培地に交換し、４日後に上清を収穫し、特異的抗-ｐ259-271抗体の存在について試験した（固相ＲＩＡによる）。結果はトリプリケートの平均ＣＰＭ±ＳＤで表示する。図４から明らかなようにｐ259-271特異的抗体の産生は262Ｌysの存在により80％まで阻害された。
実施例４．ｐ259-271による免疫処置後のマウスリンパ節細胞の抗原特異的増殖性応答
ペプチド266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspが、より不均一なＴ細胞集団、すなわちリンパ節の増殖性応答を刺激するかまたは阻害するかを調べるため、以下の実験を行った。
ペプチド266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspが、ｐ259-271によって免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の増殖を刺激する能力を、母体のペプチドｐ259-271と比較した。ｐ259-271で免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスから得られたリンパ節細胞（0.5×106細胞/ウエル）を，１％正常マウス血清を含む強化培地中、様々な濃度（10，20，50，100μg/ウエル）のペプチドの存在下に96時間インキュベートした。ついで3Ｈ-チミジン（5Ｃi/mmolの0.5μl）を加えて16時間後にプレートをろ紙上に収穫した。結果はトリプリケートの平均ＣＰＭで表示する。図５から明らかなように、ペプチド266Ａspおよび262Ａspは細胞の低増殖性応答（ｐ259-271を用いて得られた応答のそれぞれ53.2％および32.3％まで）を誘導したが、262Ｌysはリンパ節細胞の増殖を刺激しなかった。
ｐ259-271で免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスのリンパ節細胞の増殖性応答の阻害は、病原性ペプチドｐ259-271と同時に反応混合物中にペプチド類縁体262Ｌysを添加して実施した。ｐ259-271で免疫処置したＢＡＬＢ/ｃマウスから得られたリンパ節細胞（0.5×106細胞/ウエル）を様々な濃度（1，5，10，20μg/ウエル）のｐ259-271および100μg/ウエルの262Ｌysの存在下に96時間インキュベートした。ついで3Ｈ-チミジン（5Ｃi/mmolの0.5μl）を加え、16時間後にプレートをろ紙上に収穫した。結果はトリプリケートの平均ＣＰＭで示す。図６から明らかなように、ペプチド262Ｌysはｐ259-271に対するリンパ節細胞の増殖性応答を64.7％まで阻害した。
実施例５．ペプチドｐ195-212に対するＴ細胞クローンのインビトロ増殖性応答の阻害
ｐ195-212に対して特異的なＴ細胞系およびクローンは、Brockeら（1990a）前出によって記載された方法により、高（ＳＪＬ）レスポンダーマウス株のリンパ節細胞から確立され、ＴＣＳＪＬ195-212細胞系と命名されたている［Mozes,E.ら（1991）前出；Kirshnerら（1994）前出も参照］。
Ｔ細胞系クローンの増殖性応答は、実施例２のプロトコールに従って評価し、表２の結果が得られた。
ｐ195-212ペプチド類縁体，207ＡlaはＴＣＳＪＬ195-212系細胞の増殖を刺激した。さらに、図７に示すように、207ＡlaはＴＣＳＪＬ195-212系細胞のｐ195-212に対する増殖性応答を99％以上阻害した。これは極めて本質的な阻害を示すものである。
実施例６．ヒトＴ細胞の筋無力症の病原性ペプチドに対する増殖の阻害
筋無力症の病原性ペプチドｐ259-271ならびにその類縁体266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａsp，同じくｐ195-212およびその類縁体207Ａlaの、ヒトＴ細胞系の増殖性応答に対する作用を評価した。
重症筋無力症患者および適当な対照ドナーの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を10％自己血清を含む強化培地0.2ml中様々な用量のペプチドｐ195-212およびその類縁体207Ａlaの存在下に96時間、マイクロタイタープレートでアッセイし、ついで一夜0.5μＣｉの3Ｈ-チミジンでパルスした。細胞を収穫し、放射能を測定した。増殖性応答の阻害はインキュベーション混合物中に病原性ペプチドｐ195-212と同時に様々な用量の207Ａlaを添加して行った。結果は、表２に刺激係数（ＳＩ）（カラム２および３），％阻害（カラム４）として示した。
ＭＧ患者のＰＢＬをそれらの増殖能について、ｐ195-212およびペプチド類縁体207Ａlaの存在下に試験した。さらに、ＰＢＬのｐ195-212特異的増殖性応答を阻害する類縁体207Ａlaの能力について試験すた。表２には、これらの試験での３例のＭＧ患者の応答をまとめる。この表から明らかなように患者ＥＫ，ＣＧおよびＭＲからのＰＢＬはｐ195-212に応答して増殖した（それぞれＳＩ＝6.3，4.3および3.6）が、類縁体に対しは試験したすべての濃度（20，50，100，200μg/ウエルに相当する10，25，50，100μＭ）で、増殖性応答は検出されなかった。さらに、類縁体は、すべての患者からのＰＢＬの増殖性応答を阻害剤：刺激剤比（Ｉ：Ｓ）1:1で77〜100％まで阻害することができた。
0004065322.tif 000005
ＭＧ患者のＰＢＬを、上述のように、様々な用量のｐ259-271ならびにその類縁体266Ａsp，262Ｌysおよび262Ａspの存在下に増殖能をアッセイした。さらに、ＰＢＬのｐ259-271特異的増殖性応答を阻害する様々な用量の類縁体の能力を試験した。これらの試験における３例のＭＧ患者の応答を表３にまとめる。この表から明らかなように、患者ＥＫ，ＣＧおよびＭＲからのＰＢＬはｐ259-271に応答して増殖した（それぞれＳＩ＝4.1，3.7および2.7）。さらに、各患者で、少なくとも１つの類縁体が、ＰＢＬのｐ259-271誘導増殖性応答を阻害することができた。
0004065322.tif 000006
40例のＭＧ患者に対する大規模な実験も類縁体207Ａla，204Ｇly，262Ｌysおよび262Ｓerを用いて実施した。この目的で試験された40例のＭＧ患者中、25例（63％）がｐ195-212に応答し、23例（58％）がｐ259-271に応答した。これらの患者の78％が筋無力症原性ペプチドのいずれかまたは両者に応答した。類縁体207Ａlaは24例のレスポンダーＭＧ患者の23例（96％）のＰＢＬの応答を阻害し、ペプチド類縁体204ＧlyはＭＧ患者24例（100％）のＰＢＬのｐ195-212に対する応答を阻害した。同様に試験した20例中、類縁体262Ｌysおよび262Ｓerによりそれぞれ19例および20例のＭＧ患者からのＰＢＬのｐ259-271に対する応答が阻害された。すなわちペプチド類縁体はほとんどすべてのレスポンダーＭＧ患者のＰＢＬの筋無力症原性ペプチドに対する応答の阻害に極めて有効であった。
２つの二元ペプチド類縁体の阻害能力についても、ＭＧ患者のＰＢＬに対して試験した。結果は、22例のレスポンダーＭＧ患者中11例のＰＢＬのｐ195-212に対する応答が、いずれかの二元類縁体で阻害された。ｐ259-271に対する応答は262Ｌys-207Ａlaまたは207Ａla-262Ｌysのいずれかによって阻害された。すなわち、両二元類縁体は試験したホトンドすべてのＭＧ患者のＰＢＬの筋無力症原性ペプチドに対する応答を阻害した。試験の結果は表４および５に示す。
0004065322.tif 000007
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実施例７．マウスにおける実験的ＭＧの誘導および処置
上述のように［Mozes（1991）およびKirshner（1994）］、ＳＪＬ起源のｐ195-212特異的Ｔ細胞系およびＢＡＬＢ／ｃ起源のｐ259-271Ｔ細胞系はいずれもネイティブな同種マウスへの接種によってＭＧ類似の表出を開始できる。このようなＭＧ類似の表出は、自己（マウス）ＡＣｈＲに対する自己抗体の産生および複合筋肉活性電位（ＣＭＡＰ）減衰によって証明されている。これは、活性化ペプチド特異的なＴ細胞系、ＴＣＳＪＬ195-212およびＴＣＢＡＬＢ／ｃ259-271またはそれらに由来するクローン（5〜10×106細胞）をネイティブな同種マウスの接種（ＰＢＳ中１〜４回1.v.）。
ペプチド類縁体が実験的ＭＧの誘導をそがいできるかどうかを明らかにするために、ＢＡＬＢ／ｃマウスの第１群10匹にはｐ259-271特異的細胞系を注射し、ＢＡＬＢ／ｃマウス第２群10匹にはＴ細胞系と同時に類縁体200μgの262Ｌysを注射した。Ｔ細胞系を注射した10匹のマウス中５匹ではＣＭＡＰの減衰が認められたが、ペプチド類縁体で処置された10匹のマウスでは１匹のマウスにＣＭＡＰの減衰が検出されたにすぎなかった。13匹の対照マウスでは、ＣＭＡＰの減衰は検出できなかった。すなわち、類縁体262Ｌysは実験的ＭＧの臨床的表出を阻害することが出来た。この実験の結果は図９のグラフに示す。
実施例８．ＭＨＣに対する類縁体の結合
本発明の目的は高原提示細胞上のＭＨＣクラスIIに効率的に結合するが特異的Ｔ細胞の増殖を刺激しないペプチド類縁体を設計することであるから、ペプチド類縁体の結合能力を、筋無力症原性ペプチドの場合と比較した。ビオチン化ペプチド類縁体207Ａla，204Ｇly，207Ａla-262Ｌysおよび262Ｌys-207Ａlaのマウスおよびヒト抗原提示細胞上のＭＨＣクラスIIに対する結合を分析した。
ペプチドのビオチン化
ペプチドｐ195-212および二元類縁体207Ａla-262Ｌysを含むそれに由来する類縁体のＮ末端ビオチン化は、0.1Ｎ重炭酸ナトリウム溶液中０℃で，ジメチルスルホキシド（5mg/ml）に溶解した２倍モル過剰のビオチン-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（Sigma Co, St.Louis, MO）によって実施した。ｐ259-271および二元類縁体262Ｌys-207Ａlaを含むそれに由来する類縁体のＮ末端ビオチン化は、0.1Ｎ重炭酸ナトリウム溶液中室温で，1-メチル-2-ピロリジン（5mg/ml）に溶解した２倍モル過剰のビオチン-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（Sigma）によって実施した。ビオチン残基とｐ259-271ベースのペプチドのＶal259の間のカプロイルスペーサーの付加はＭＨＣ-ペプチド相互作用のストレプトアビジンによる検出を可能にするために必要であった［Zismanら，Internat.Immunol. 6:683（1994）］。
ビオチン化ペプチドのヒト対象のＡＰＣへの直接結合
自己免疫疾患ＭＧの患者および健康ドナーのＡＰＣをFicoll-Hypaque密度遠心分離（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）後にFicoll分画から収集した。この分画の細胞は、ＦＩＴＣ接合-抗-ＣＤ14，抗-ＣＤ３14，および抗-Ｂ220（Sigma）による直接染色によって測定して、主として単球および顆粒球と10％未満のリンパ球からなり、結合実験にＡＰＣとして使用した。別に全血からFicoll-Hypaque密度遠心分離によってＰＢＬを単離し、洗浄し、ＲＰＭＩ1640中10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に懸濁し、ペトリ皿内において（5×107細胞/5ml/皿）37℃で１時間インキュベートした。ついで、非接着細胞を除去し、プレートをＲＰＭＩで３回洗浄し、氷上に置いた。接着した細胞をラバーポリースマンを用いて集め、結合実験にＡＰＣとして使用した。この分画の細胞も、ＦＩＴＣ接合-抗-ＣＤ14，抗-ＣＤ314，および抗-Ｂ220（Sigma）による直接染色で測定して10％未満のリンパ球を含有した。
ＡＰＣを、0.1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，高純度品，Amresco, OH; 以下ＰＢＳ/ＢＳＡという）含有リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ，ｐＨ＝7.4）の溶液で２回洗浄し、ビオチン化ペプチドまたはＰＢＳ/ＢＳＡ単独と５％ＣＯ2含有37℃のインキュベーター中で（1×106/サンプル）20時間インキュベートし次にフィコエリスリン（ＰＥ）-接合ストレプトアビジン（1:40, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）と、マウス脾臓接着細胞について記述したように［Zismanらanら（1994）前出；Mozesら，EMBO J., 8: 4049（1989）］４℃で30分間インキュべートした。各インキュベーション後に、細胞を上述の溶液により４℃で２回洗浄した。
蛍光シグナルを増幅するためには、伸長染色操作を使用した。このプロトコールでは、ＰＥ-ストレプトアビジンとのインキュベーションに続いてビオチン化抗-ストレプトアビジン（1:60, Vector Laboratories, Burlingamem CA）とのインキュベーションおよび２回目のＰＥ-ストレプトアビジンとのインキュベーションをいずれも４℃で30分間実施した。
ついで細胞を、ＦＡＣＳcanサイトメーターおよび溶解ソフトウエア、あるいはＦＡＣＳortサイトメーターとCELLQuestソフトウェア（Becton-Dickinson, Mountain View, CA）を用いてフローサイトメトリーによって分析した。各分析において、最低5,000個の細胞を検査した。死亡した細胞は前方または側角光スキャッターに基づいて除外した。結合データは、ビオチン化細胞の存在下または不存在下における細胞のＭＦＩ，平均蛍光強度で表した。別に、結合細胞の百分率を計算し、ビオチン化細胞の不存在下にインキュベートした細胞のバックグランドシグナル以上の正味の値で表示した。
同様の方法で、ビオチン化ペプチドの、ＳＪＬマウスのＭＨＣクラスIIに対する結合を測定した。
結果
いずれの種においても、類縁体207ＡlaのＭＨＣクラスIIに対する結合は類縁体204Ｇlyの場合より良好で、筋無力症エピトープｐ195-212の場合と少なくとも同等であった。二元類縁体262Ｌys-207ＡlaのＳＪＬマウスのＭＨＣクラスIIに対する結合の親和性はその逆配置の二元類縁体207Ａla-262Ｌysよりも10倍高いと計算された。さらに、二元類縁体262Ｌys-207Ａlaの結合パターンは筋無力症ペプチドＰ195-212の場合より均一であった。これらの結果は二元エピトープ類縁体には治療的価値のあることを指示している。
実施例９．二元エピトープ類縁体による増殖性応答の阻害
Ｔ細胞系ＴＣＳＪＬ195-212またはＴＣＢＡＬＢ／ｃ259-271の細胞（ウエルあたり104個）を、照射同種脾臓細胞（0.5×106），ｐ195-212またはｐ259-271（10μＭ）のいずれか、および各種濃度の二元エピトープ類縁体207Ａla-262Ｌysまたは262Ｌys-207Ａlaの存在下に48時間インキュベートした。ついで、3Ｈ-チミジンを加え、16時間後にプレートをろ紙上に収穫した。結果はｐ195-212またはｐ259-271特異的増殖性応答の阻害％として表示し、図10および11に示す。
ＴＣＢＡＬＢ／ｃ259-271細胞系のCon-A supに対する非特異的増殖性応答の阻害も試験した。207Ａla-262Ｌysはこの増殖性応答を100ｍＭの濃度で67.8％まで、150ｍＭの濃度で73％まで阻害した。262Ｌys-207Ａlaはこの増殖を非特異的に阻害しなかった。これらの結果は、二元類縁体262Ｌys-207Ａlaは、両ＴＣＳＪＬ195-212およびＴＣＢＡＬＢ／ｃ259-271Ｔ細胞系の増殖性応答を極めて効果的にかつ特異的に阻害することを指示している。
例10．リンパ節細胞のプライミングのインビボ阻害
ＳＪＬマウスの後肢足底に、ＣＦＡ中10μgのｐ199-212（100μl）を皮内に注射し同時にＰＢＳ（500μl）中コンペティターペプチドを静脈内に接種した。コンペティターペプチドは207Ａla，207Ａla-262Ｌysおよび262Ｌys-207Ａlaとした。マウスから得られたリンパ節細胞を各種濃度のｐ199-212の存在下に96時間インキュベートした。ついで、3Ｈ-チミジンを加え、16時間後に細胞を収穫し、放射能をカウントした。結果はｐ195-212特異的増殖性応答の阻害％として表示し、図12に示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスの後肢足底に、ＣＦＡ中10μgのｐ259-271（100μl）を皮内に注射し、同時にＰＢＳ500μl中類縁体262Ｌys，207Ａla-262Ｌysまたは262Ｌys-207Ａlaを静脈内接種した。マウスから得られたリンパ節細胞を各種濃度のｐ259-271の存在下に96時間インキュベートした。ついで、3Ｈ-チミジンを加え、16時間後に細胞を収穫し、放射能をカウントした。結果はｐ259-271特異的増殖性応答の阻害％として表示し、図13に示す。
実施例11．二元類縁体の経口的摂取によるリンパ節細胞の増殖の阻害
筋無力症原性Ｔ細胞エピトープ、すなわちｐ199-212およびｐ259-271に対するＴ細胞の増殖性応答の阻害における二元類縁体262Ｌys-207Ａlaの効果を評価するために、以下の実験を行った。
１）ＳＪＬマウスの後肢足底に、ＣＦＡ中10μgのｐ199-212（100μl）を皮内に注射し同時にＰＢＳ（500μl）中、二元類縁体205μg/マウスまたは500μg/マウスのいずれかを摂取させた。10日後、マウスを屠殺し、リンパ節細胞を様々な濃度のｐ195-212の存在下に96時間インキュベートした。ついで、3Ｈ-チミジンを加え、16時間後に細胞を収穫し、放射能をカウントした。図14は、異なる群におけるリンパ節細胞の増殖アッセイで得られた刺激係数を示す。図から明らかなように、ｐ195-212のみで免疫処置した群で得られた効率的な増殖はＰＢＳ中二元類縁体200μgを静脈内もしくは腹腔内注射、または類縁体500μgを摂取させた群で完全に阻害された。250μlを摂取させたマウス群でも同様に劇的な阻害が観察された。
図15は後者の実験で得られた阻害％を示す。図から明らかなように、二元類縁体500μgの経口投与は、筋無力症原性Ｔ細胞エピトープｐ195-212に対するリンパ節細胞の増殖を完全に阻害した。
２）図16はＢＡＬＢ／ｃマウスを第二の筋無力症原性ペプチドすなわちＣＦＡ中ｐ259-271（20μg/マウス）で免疫処置し、二元類縁体262Ｌys-207Ａlaを静脈内注射（ＰＢＳ中200μg/マウス）またはＰＢＳ中500μg/マウスを摂取させた実験の結果を示す。結果は異なる濃度の筋無力症原性エピトープ，ｐ259-271の存在下における増殖性応答の阻害％として図に表示する。図から明らかなように、二元類縁体の経口経路による投与は、静脈内注射と少なくとも同等の増殖阻害を示した。
誘発された実験的ＭＧの防止または治癒のために、ペプチド類縁体を、ａ）ペプチド特異的Ｔ細胞の接種前、ｂ）ペプチド特異的Ｔ細胞の接種と同時，ｃ）ペプチド特異的Ｔ細胞の接種後、ただし自己免疫応答の出現前、またはｄ）実験的ＭＧの発現後に投与した。自己免疫応答の重症度の低下はペプチドによる処置の適性を指示する。
雑誌文献もしくは抄録、公開されたもしくは相当する米国もしくは外国特許出願、もしくは発行された米国もしくは外国特許、または他の文献を含む本明細書に引用された参考文献はすべて、データのすべて、表、図、引用文献中の本文を含めてその全体が引用により、本明細書に導入される。さらに、本明細書に引用された参考文献内に引用された参考文献の全内容もすべて、引用によりに本明細書に導入される。
既知の方法工程、慣用の方法工程、既知方法または慣用方法は、本発明の任意の態様、説明または実施態様が関連技術に開示、教示または示唆されていることを、いかなる方法においても容認するものではない。
特定の実施態様の上述の説明は、本発明の一般的本質を完全に明らかにするものであるから、本技術分野の熟練者の知識の範囲内（本明細書に引用された参考文献の内容を含めて）において、煩雑な実験を行うことなく、本発明の一般的概念から逸脱することなく、特定の実施態様のような様々な適用に、修飾および／または適合が容易である。したがって、このような適合および修飾は、本明細書に提示された教示および指針に基づいて、家事された実施態様と均等の意味および範囲にあることが意図される。本明細書における語句は説明のためのものであって限定の目的で用いられるものではない。本出願におけるこのような語句は、本明細書に提示された教示および指針に基づき、本技術分野の通常の熟練者の知識を加味して、本技術分野の熟練者によって解釈されるべきであることを理解すべきである。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：18
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：２
配列の長さ：13
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：３
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配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：４
配列の長さ：18
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：５
配列の長さ：18
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：６
配列の長さ：18
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：７
配列の長さ：18
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：８
配列の長さ：18
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：９
配列の長さ：18
配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：10
配列の長さ：13
配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：11
配列の長さ：13
配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：12
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配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：13
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配列の型：アミノ酸
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配列：
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配列番号：14
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配列の型：アミノ酸
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配列：
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配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：16
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配列の型：アミノ酸
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配列：
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配列番号：17
配列の長さ：31
配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号：18
配列の長さ：31
配列の型：アミノ酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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