(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列と、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列とを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡ（Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNA配列、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするDNA配列、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするDNA配列およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA配列を含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えDNAを除く）。
【請求項２】
前記Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムまたはコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアスパルトキナーゼであり、αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化した変異型アスパルトキナーゼである請求項１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３】
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列が、配列表配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質または配列表配列番号１２に示すアミノ酸配列において１もしくは２以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１または２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。
【請求項５】
L−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼを発現し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの細胞内活性が高められたコリネ型細菌（Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼを発現し、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌を除く）。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡが導入されたことにより形質転換された請求項５記載のコリネ型細菌。
【請求項７】
さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの細胞内活性が高められた請求項５または６記載のコリネ型細菌。
【請求項８】
請求項４記載の組換えＤＮＡが導入されたことにより形質転換された請求項７記載のコリネ型細菌。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸などの発酵生産に用いられているコリネ型細菌に遺伝子操作の手法を用いて改変を加え、該微生物を培養することによるＬ−リジンの製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
飼料添加物として用いられているＬ−リジンは通常、コリネ型細菌のＬ−リジン生産変異株を使って発酵法により生産されている。現在知られている種々のＬ−リジン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変異により作られている。
一方、コリネ型細菌において、菌体内で自律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベクタープラスミド（米国特許第4514502号参照）、遺伝子の菌体への導入方法（特開平2-207791号等）が開示されており、これらの技術を用いたＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシン生産菌育成の可能性が開示されている（米国特許第4452890号、及び米国特許第4442208号参照）。また、Ｌ−リジン生産菌育成に関しても、ベクタープラスミドにＬ−リジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、菌体内で増幅させる技術（特開昭56-160997号などがある）が知られている。
【０００３】
Ｌ−リジン生合成遺伝子としては、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（特開平7-75578）やジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)）のように、Ｌ−リジン生合成に関与する遺伝子をクローニングした例や、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-87788）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（特公平6-55149）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-62994）のように、遺伝子の増幅がＬ−リジン生産性に影響を与える例が知られている。
【０００４】
また、Ｌ−リジン生合成に関与する酵素のうち、野生型ではフィードバック阻害を受ける酵素について、フィードバック阻害が解除された変異を有する酵素遺伝子を導入してＬ−リジン生産性を向上させた例も知られている。このような遺伝子として具体的には、アスパルトキナーゼ遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレット）等が知られている。
【０００５】
上記のように、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増幅、あるいは変異遺伝子の導入によって、一定の成果が得られている。例えば、リジン及びスレオニンによる協奏阻害が解除された変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を保持するコリネ型細菌は、Ｌ−リジンを著量（約２５ｇ／Ｌ）生産する。但し、該細菌は、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を保持しない細菌と比較して生育速度が低下する。また、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子に加え、さらにジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入することによってＬ−リジン生産性が向上するとの報告（Applied and Environmental Microbiology 57(6), 1746-1752 (1991)）もある。但し、概細菌は、生育速度が一層低下する。
【０００６】
一方、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増強により生育の改善が図られた例は報告されていない。また、コリネ型細菌においては、Ｌ−リジン生合成遺伝子を複数個組み合わせ、生育を抑制せずにＬ−リジン収率の大幅な改善に成功した例は知られていないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、コリネ型細菌においてＬ-リジン生合成遺伝子を複数個組み合わせて増強し、生育を抑制せずにＬ−リジン収率を改善することを課題とする。
微生物を用いた物質の発酵生産を行なう場合、投入した原料に対する目的物質の収率と並んで、生産速度は極めて重要な因子であり、設備当りの生産速度を上げることにより目的物質を大幅に安価に製造することが出来る。そのため、発酵収率と生産速度を両立させることは工業的に極めて重要である。本発明は、コリネ型細菌を用いたＬ−リジンの発酵生産を行なうに当たり、以上の様な課題の解決方法を提示するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、コリネ型細菌において、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる協奏阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列と、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列とを併せて増強することにより、これらを単独で増強した場合と比べ、生育が改善され、Ｌ−リジン生産速度を向上させることができ、更にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を増強することにより、Ｌ−リジン生産速度を一層向上できることにある。
【０００９】
すなわち本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、及びジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡである。また、上記各ＤＮＡ配列に加えてホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列をさらに含む組換えＤＮＡを提供する。
【００１０】
また、本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼを保持し、さらにジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡが増強されたコリネ型細菌を提供する。さらに、このコリネ型細菌において、さらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡが増強されたコリネ型細菌を提供する。
【００１１】
さらに本発明は、上記のいずれかのコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供する。
以下、アスパルトキナーゼを「ＡＫ」、ＡＫをコードする遺伝子を「lysC」、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる協奏阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼを「変異型ＡＫ」、変異型ＡＫをコードする遺伝子を「変異型lysC」ともいう。また、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを「ＤＤＣ」、ＤＤＣをコードする遺伝子をlysA、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを「ＰＥＰＣ」、ＰＥＰＣをコードする遺伝子を「ppc」ともいう。
【００１２】
尚、本発明においてコリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属細菌、及び従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明に用いられるＬ−リジン生合成遺伝子の取得
本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子は、ＤＮＡ供与体である細菌から染色体ＤＮＡを調製し、プラスミドベクター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから所望の遺伝子を保持する株を選択し、選択された株からその遺伝子が挿入された組換えＤＮＡを回収することによって得られる。本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子のＤＮＡ供与体としては、所望のＬ−リジン生合成遺伝子がコリネ型細菌細胞中で機能する酵素タンパク質を発現するものであれば、特に制限されないが、コリネ型細菌が好ましい。
【００１４】
コリネ型細菌由来のlysC、lysA及びppc遺伝子は、いずれも配列が知られているので、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によって増幅することにより取得することができる。
以下に、本発明に用いる各Ｌ−リジン生合成遺伝子を取得する方法を例示する。
【００１５】
（１）変異型lysCの取得
変異型lysCを含むＤＮＡ断片は、ＡＫ活性に対するＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除された変異株から調製することができる（WO94/25605国際公開パンフレット）。このような変異株は、例えば、コリネ型細菌野生株に、通常の変異処理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異剤処理を施し、変異処理した細胞群の中から取得することができる。ＡＫ活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法を用いることができる。このような変異株として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）野生株ATCC13869株（現在の名称は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に変更されている）より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産菌AJ3445（FERM P-1944）が最も好ましいものとして挙げられる。
【００１６】
また、変異型lysCは、野生型lysCを含むプラスミドＤＮＡをインビトロ変異処理することによっても得られる。さらに、ＡＫのＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害を解除する変異が具体的に知られている（WO94/25605国際公開パンフレット）ので、この情報に基づいて部位特異的変異法等により、野生型lysCから調製することもできる。
【００１７】
コリネ型細菌からlysCを単離するには、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、lysCを増幅することによって行うことができる。
【００１８】
ＤＮＡプライマーとしては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991),5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にして、lysCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配列表配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有する23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により 指定された方法に従って行うことができる。
【００１９】
ＰＣＲ法により増幅されたlysCは、E. coli及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをE. coli細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。E. coli細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００２０】
また、これらのベクターにコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片を挿入すると、E. coli及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示した。
【００２１】
0004075087.tif 000002
【００２２】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２３】
E. coliにプラスミドを導入して形質転換するには D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
上記のようにしてＡＫ野生株からlysCを単離すれば野生型lysCが得られ、ＡＫ変異株からlysCを単離すれば変異型lysCが得られる。
【００２４】
野生型lysCを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を、配列表配列番号３に示す。この塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配列のみを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００２５】
本発明に用いる変異型lysCとしては、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解除されたＡＫをコードするものであれば特に制限されないが、野生型ＡＫのアミノ酸配列において、αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化する変異が挙げられる。ここで、野生型ＡＫのアミノ酸配列としては、具体的にはαサブユニットでは配列表配列番号５に示すアミノ酸配列が、βサブユニットでは配列表配列番号７に示すアミノ酸配列が挙げられる。
【００２６】
また、上記のアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基として好ましいものは、スレオニン残基、アルギニン残基、システイン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基及びバリン残基が挙げられる。
尚、置換されるアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫのアミノ酸配列がわずかに相異するものがあると予想される。このような酵素の活性に関与しない１又は２以上の位置での１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するＡＫも本発明に使用することができる。このような自然変異を有するＡＫをコードするＤＮＡは、ＡＫを保持する微生物細胞から、例えば配列表の配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを単離することによって、取得され得る。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは温度が完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ〜（Ｔｍ−３０）℃、好ましくはＴｍ〜（Ｔｍ−２０）℃の範囲で、かつ１×ＳＳＣ、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２７】
さらに、ＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、他の１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による人工変異を有するＡＫも使用できる。このような人工変異を有するＡＫをコードするlysCは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、あるいは挿入されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、このような変異を有するlysCは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、lysCを含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びlysCを含むＤＮＡを保持する微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。変異処理した後、変異処理されたＤＮＡ又は変異処理された微生物から、これらがコードし又は産生するＡＫがＡＫ活性を保持し、かつ、ＡＫのアミノ酸配列が変異したものを選択することによって、変異を導入することができる位置、又は変異が生じた位置を決定することができる。導入される変異の位置は、ＡＫ活性及びフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、特に制限されない。また、導入される変異の数は、タンパク質の立体構造における変異されるアミノ酸の位置や種類によっても異なり、ＡＫ活性及びフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、特に制限されないが、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１０個である。
【００２８】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株であるAJ12036株（FERM BP-734）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。
【００２９】
（２）lysAの取得
lysAを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
コリネ型細菌においては、lysAはargS（アルギニル−tRNAシンターゼ遺伝子）とともにオペロンを形成しており、argSの下流にlysAが存在している。lysAの発現は、argSの上流にあるプロモーターによって調節を受ける（Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362 (1993)参照）。これらの遺伝子の塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知であり（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号８（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)に記載されている塩基配列において塩基番号１１〜３３に相当する）及び配列番号９（Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)に記載の塩基配列において塩基番号１３７０〜１３９２に相当する）に示す塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたlysAを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００３０】
後記実施例では、lysAを増強するために、プロモーター、argS及びlysAを含むＤＮＡ断片を用いたが、argSは本発明に必須ではなく、lysAがプロモーターの直下に連結されたＤＮＡ断片を用いてもよい。
argS及びlysAを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号１０に示す。また、argSがコードするアミノ酸配列の一例を配列番号１１に、lysAがコードするアミノ酸配列の一例を配列番号１２に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号１２に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＣ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上の位置での１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工変異を有するlysAは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にして取得することができる。
【００３１】
（３）ppcの取得
ppcを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
ppc遺伝子は、コリネバクテリウム  グルタミカムにおいて既知であり（O'Regan, M., et al., Gene, 77, 237-251 (1989)）、これを基にしてPCR用プライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号１３及び１４に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたppcを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００３２】
ppcを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１５に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１６に示す。
本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号１６に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＰＥＰＣ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上の位置での１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工変異を有するppcは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にして取得することができる。
【００３３】
コリネ型細菌由来のppcは、gap（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）、pgk（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子）、及びtpi（トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子）とともにオペロンを形成しており、tpiの下流にppcが存在している。ppcの発現は、pgkの上流にあるプロモーターによって調節を受ける（Schwinde, J.W. et al., J. Bacteriol., 175(12), 3905-3908 (1993)参照）。したがって、前記lysAと同様に、ppcをpgk、tpiとともにＰＣＲにより増幅し、プロモーター、pgk、tpi及びppcを含むＤＮＡ断片を用いることができる。また、後記実施例に示すように、ＰＥＰＣのコード領域の上流に適当なプロモーターを連結したものを使用することもできる。このようなプロモーターとしては、lysCのプロモーター、E. coli由来のtacプロモーター、trcプロモーター等が挙げられる。
【００３４】
＜２＞本発明の組換えＤＮＡ及びコリネ型細菌
本発明の組換えＤＮＡは、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、及びジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡである。本発明のＤＮＡの好ましい態様は、上記各ＤＮＡ配列に加えてホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列をさらに含む組換えＤＮＡである。
【００３５】
また、本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ（変異型ＡＫ）を保持し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列（lysA）が増強されたものである。本発明のコリネ型細菌として好ましい態様は、さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列（ppc）が増強されたコリネ型細菌である。
ここでＤＮＡの「増強」とは、遺伝子のコピー数を高くする、プロモーターを強力なものを使用する、比活性の高い酵素をコードする遺伝子を使用する、あるいはこれらを組み合わせるなどして、そのＤＮＡによりコードされる酵素の細胞中の活性を高くすることをいう。
【００３６】
変異型ＡＫを保持するコリネ型細菌としては、突然変異によって変異型アスパルトキナーゼを産生するようになったものでもよく、また、変異型lysCを導入することによって形質転換されたものでもよい。
上記ＤＮＡを導入するコリネ型細菌の例としては、例えば次のようなＬ−リジン生産性野生株が挙げられる。
【００３７】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム    ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム      ATCC15806
コリネバクテリウム・カルナエ                ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミクム            ATCC13032
（ブレビバクテリウム・ディバリカタム）      ATCC14020
（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869
（コリネバクテリウム・リリウム）            ATCC15990
（ブレビバクテリウム・フラバム）            ATCC14067
コリネバクテリウム・メラセコーラ            ATCC17965
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム      ATCC14066
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム      ATCC14068
ブレビバクテリウム・ロゼウム                ATCC13825
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス          ATCC19240
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム      ATCC15354
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス      AJ12340(FERM BP-1539)
【００３８】
また、上記菌株以外にも、これらの菌株から誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、宿主として利用できる。この様な人工変異株としては次の様なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号）。
【００３９】
上記のような宿主においてＬ−リジン生合成遺伝子を増強するには、具体的な例としては、これらの遺伝子をプラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクター等を用いて宿主に導入する。その際、低コピー型のベクターを用いてもある程度の増強は期待できるが、マルチコピー型のベクターを用いることが好ましい。そのようなベクターとして、上記pAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148及びpAJ440等のプラスミドベクターが挙げられる。また、コリネ型細菌由来のトランスポゾンは、WO02/02627国際公開パンフレット、WO93/18151国際公開パンフレット、欧州特許公開0445385号、特開平6-46867号、Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994)、Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994)、Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)、Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995)、特開平7-107976号、特開平7-327680号等に記載されている。
【００４０】
尚、本発明において、変異型lysCは必ずしも増強されている必要はなく、前記したように染色体ＤＮＡ上のlysCに変異を有するもの、あるいは変異型lysCが染色体ＤＮＡに組み込まれたものでもよいが、プラスミドベクターを用いて導入されても差し支えない。一方、lysA及びppcは、効率よくＬ−リジンを生産させるためには増強されていることが好ましい。
【００４１】
lysC、lysA及びppcの各遺伝子の導入は、それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順次導入してもよく、単一のベクターを用いて２種類又は３種類の遺伝子を共に導入してもよい。別個のベクターを用いる場合には、遺伝子の導入の順序は問わないが、宿主での安定な分配保持機構を有し、互いに共存可能なベクターを用いることが好ましい。
【００４２】
変異型ＡＫを保持し、さらにlysAが増強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lysC、及びlysAを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを宿主コリネ型細菌に導入することによって、得られる。
また、変異型lysC及びlysAに加え、さらに、ppcが増強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lysC、lysA及びppcを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを宿主コリネ型細菌に導入することによって、得られる。また、変異型lysC、lysA及びppcが増強されたコリネ型細菌は、変異型lysC及びlysAが増強されたコリネ型細菌に、ppcを含みコリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを導入することによっても得られる。
【００４３】
上記のような組換えＤＮＡは、例えば、プラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクター等のベクターに、Ｌ−リジン生合成遺伝子の各々を挿入することによって得られる。
【００４４】
宿主への組換えＤＮＡの導入の方法は、プラスミドの場合、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によって行うことができる。トランスポゾンを用いた遺伝子の増幅は、プラスミドにトランスポゾンを搭載させて細胞内に導入し、トランスポゾンの転位を誘導することにより行なうことができる。
【００４５】
＜３＞Ｌ−リジンの製造法
上記のようにしてＬ−リジン生合成遺伝子が増強されたコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造することができる。
使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
【００４６】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４７】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−リジンの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００４８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型lysC遺伝子の取得
【００４９】
＜１＞野生型及び変異型lysCの取得、及びそれらを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株、及びATCC13869株より変異処理により得られたＬ−リジン生産性変異株AJ3445（FERM P-1944）を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。AJ3445株は、変異によりlysCがリジン及びスレオニンによる協奏阻害が実質的に解除されている（Journal of Biochemistry 68, 701-710 (1970)）。
【００５０】
染色体DNAよりPCR法（polymerase chain reaction；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によりlysCを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にしてlysCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有する23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成した。
【００５１】
PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。増幅された1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。
【００５２】
遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅されたlysC断片と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたlysC断片が接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13869株由来のlysCを有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リジン生産菌であるAJ3463由来のlysCを有するプラスミドをp399AK9と命名した。
【００５３】
p399AKYおよびp399AK9に、それぞれコリネバクテリウム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片（以下「Brevi.-ori」と記す）を導入し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なlysCを搭載したプラスミドを作製した。Brevi.-oriは、これを含み、エシェリヒア・コリと、コリネバクテリウム属細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターpHK4から調製した。pHK4は、pHC4をKpnI（宝酒造（株）製）及びBamHI（宝酒造（株）製）で切断し、Brevi.-ori断片を抽出し、同じくKpnI及びBamHIにて切断したpHSG298に接続することによって構築される（特開平5-7491号公報参照）。pHK4は、宿主にカナマイシン耐性を付与する。尚、pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB101は、エシェリヒア・コリ AJ13136と命名され、１９９５年８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5186として寄託されている。
【００５４】
pHK4を、制限酵素KpnI及びBamHIにて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-ori ＤＮＡ断片を同じくBamHIにて切断したp399AKY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能でかつlysC遺伝子を含むプラスミドを作製した。
【００５５】
p399AKY由来の野生型lysC遺伝子を含むプラスミドをp399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型lysC遺伝子を含むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399AK9B、p399AKYB構築の過程を図１に示す。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株であるAJ12036株（FERM BP-734）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。
【００５６】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型lysC及び変異型lysCの塩基配列の決定
野生型lysCを含むプラスミドp399AKY及び変異型lysCを含むプラ スミドp399AK9を各々の形質転換体から調製し、野生型及び変異型lysCの塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）によった。
【００５７】
p399AKYにコードされている野生型lysCの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。一方、p399AK9にコードされている変異型lysCの塩基配列は野生型lysCと比べ、配列番号３において１０５１番目のＧがＡに変化しているという１塩基の変異のみを有していた。コリネバクテリウム・グルタミカムのlysCは、同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていることが知られているが（Kalinowski,J et al;Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていると考えられる。
【００５８】
ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配列のみを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００５９】
一方、変異型lysC配列上の変異は、野生型ＡＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５、７）において、αサブユニットでは２７９番目のアラニン残基がスレオニン残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がスレオニン残基にというアミノ酸残基置換を起こしていることを意味する。
【００６０】
【実施例２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムlysAの取得
＜１＞lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロンのプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）を基にしてアルギニル−tRNAシンターゼ及びＤＤＣをコードする約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有する各々23merの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された３５７９ｂｐの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅されたlysAを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にして取得したATCC13869由来のlysAを有するプラスミドをp399LYSAと命名した。
【００６１】
更に、p399LYSAをKpnI（宝酒造(株)製）とBamHI（宝酒造(株)製）で切断することにより、lysAを含むＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片を、pHSG299をKpnIとBamHIで切断したものと連結した。得られたプラスミドをp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を図２示す。
得られたp299LYSAにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なlysAを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをKpnIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp299LYSAに接続し、コリネ型細菌中で自律複製可能でかつlysAを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpLYSABと命名した。pLYSAB構築の過程を図３に示す。
【００６２】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムlysAの塩基配列の決定
p299LYSAのプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。また、この塩基配列のうち、argSがコードするアミノ酸配列及びlysAがコードするアミノ酸配列を、各々配列番号１１及び１２に示す。
【００６３】
【実施例３】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムppcの取得
＜１＞ppcの取得
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRにより、ppcをＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（O'Regan, M., et al., Gene, 77, 237-251 (1989)）を基にしてＰＥＰＣをコードする約3.3kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号１３及び１４に記載の塩基配列を有する各々23merの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。
【００６４】
増幅された約３３００ｂｐの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素SalI（宝酒造(株)製）にて切断した。ppc遺伝子のクローン化用ベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399を制限酵素SalI（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅されたppcを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にして取得したATCC13869由来のppcを有するプラスミドpPCFを得た。
【００６５】
＜２＞ppc遺伝子とlysCプロモーターとの連結
上記のようにして得られたpPCFを制限酵素DraI（宝酒造(株)製）で切断し、ＰＥＰＣ構造遺伝子の上流約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を削除した後、自己連結して、プラスミドpPCFdsを得た。さらに、pPCFdsを制限酵素SalI（宝酒造(株)製）で切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。
【００６６】
一方、実施例１で得た野生型lysC遺伝子を含むプラスミドp399AKYBを制限酵素ApaLI及びPstI（いずれも宝酒造(株)製）で切断し、前記と同様にして切断面を平滑末端化した。得られる２つのＤＮＡ断片のうち短い方の断片は、Brevi.-oriとlysCのプロモーター部分を含んでいる。このＤＮＡ断片と上記のpPCFdsをSalIで切断後平滑末端化した断片とを、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて連結した。
【００６７】
ライゲーション反応液中のＤＮＡを、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869に電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）にて導入した。形質転換体の選択は、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含む完全培地にて行なった。形質転換体よりプラスミドＤＮＡを回収し、EcoRIで切断し、lysCプロモーターとppc構造遺伝子が順方向に連結したプラスミドを取得した。このプラスミドをpAKPFdsと命名した。pAKPFds構築の過程を図４に示す。以下、このlysCプロモーターが連結したppcを、「野生型高発現型ppc」という。
【００６８】
＜３＞野生型高発現型ppcのベクターへの挿入
上記で得られた野生型高発現型ppcを、Brevi.-ori以外のコリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な複製開始点を有するベクターに挿入するために、PCR法によって増幅した。プライマーには、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっているlysCの塩基配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にして合成したlysCプロモーター部分に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号１７）、及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっているppcの配列（O'Regan, M., et al., Gene, 77, 237-251 (1989)）を基にして合成したppc部分に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号１８）を用いた。これらのプライマーは、野生型高発現型ppcを含む約３１５０ｂｐの断片を増幅することができ、増幅されたDNA断片の末端を制限酵素KpnIによって切断できるように設計されている。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。
【００６９】
野生型高発現型ppcをコリネ型細菌型細菌に導入するためのベクターには、新規に構築したコリネ型細菌用クローニングベクターpVK7を用いた。pVK7は、以下のようにして、E. coli用ベクターであるpHSG299（Kmr；Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるpAM330を結合することによて構築した。pHSG299を一箇所切断酵素であるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したpAM330と接続した。pHSG299に対するpAM330の挿入方向により、生成した２種類のプラスミドをpVK6、pVK7と命名し、pVK7を以下の実験に用いた。pVK7は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。pVK6及びpVK7の構築の過程を図５に示す。
【００７０】
前記のPCRによって増幅された野生型高発現型ppcを含む約３１５０ｂｐの断片を、アガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素KpnI（宝酒造(株)製）にて切断した。このＤＮＡ断片を、制限酵素KpnIにて切断したpVK7と接続した。このプラスミドをpPwmと命名した。pPwm構築の過程を図６に示す。
【００７１】
【実施例４】
変異型lysC及びlysAを併せ持つプラスミドの作製
変異型lysC及びBrevi.-oriを有するプラスミドp399AK9Bと、lysAを有するプラスミドp299LYSAより、変異型lysC、lysAおよびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを作製した。p299LYSAを制限酵素BamHI（宝酒造(株)製）とKpnI（宝酒造(株)製）で切断した後、平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。このＤＮＡ断片を、p399AK9BをSalIで切断した後平滑末端化したものと接続した。こうして、変異型lysC及びlysAを有し、コリネ型細菌中で自律増殖可能なプラスミドを作製し、pCLと命名した。pCLの作製過程を図７に示す。
【００７２】
【比較例１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapA、dapB、ddhの取得
lysC、lysA及びppc以外のL−リジン生合成遺伝子として、dapA（ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子）、dapB（ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子）、ddh（ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）を、以下のようにして取得した。
【００７３】
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRによりdapAを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Nucleic Acids Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL accession No.X53993参照）を基にしてＤＤＰＳをコードする約1.5kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された１４１１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpCR1000（Invitrogen社製；Bio/Technology 9, 657-663 (1991)参照）を用い、増幅したdapA断片と接続した。DNAの接続はDNAライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpCR1000にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapA断片１４１１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のdapAを有するプラスミドをpCRDAPAと命名した。
【００７４】
E. coliJM109株にpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
作製したpCRDAPAにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なdapAを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みSmaIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をSmaIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをSmaIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくSmaIにて切断したpCRDAPAに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapAを含むプラスミドを作製した。このプラスミドをpDPSBと命名した。pDPSB（Kmr）の構築過程を図８に示す。
【００７５】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapBの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRによりdapBを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいて既知となっている配列（Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)参照）を基にしてＤＤＰＲをコードする約2.0kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号１９及び２０に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡ断片を合成した。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された２００１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpCR-Script（Invitrogen社製）を用い、増幅したdapB断片と接続した。この様にしてpCR-Scriptにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapB断片２００１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のdapBを有するプラスミドをpCRDAPBと命名した。E. coliJM109株にpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００７６】
更に、pCRDAPBをEcoRVとSphIで切断する事により、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を抽出した。この断片を、pHSG399をHincIIおよびSphIにて切断したものと連結したプラスミドを作成した。この作成したプラスミドをp399DPRと命名した。
【００７７】
作製したp399DPRにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なdapBを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて切断したp399DPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapBを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpDPRBと命名した。pDPRB構築の過程を図９に示す。
【００７８】
＜３＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムddhの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ddh遺伝子は、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のddh遺伝子の既知のヌクレオチド配列（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２３、２４）を用いたＰＣＲ法により、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム ATCC13869 の染色体ＤＮＡからddh遺伝子を増幅することによって得た。得られた増幅ＤＮＡ断片をEcoT22IとAvaIで切断し、末端を平滑化した後、pMW119のSmaI部位に挿入し、プラスミドpDDHを得た。
【００７９】
次に、pDDHをSalIとEcoRIにて切断し、平滑末端化した後、得られた断片をSmaIで切断したpUC18と連結した。こうして得られたプラスミドをpUC18DDHと命名した。
pUC18DDHにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なddhを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みPstIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHSG299のPstI部位に挿入した。このようにして作製したプラスミドをpPK4と命名した。次に、pUC18DDHをXbaIとKpnIで切断し、生じたddh断片をKpnIとXbaIで切断したpPK4に接続した。このようにして、コリネ型細菌中で自律複製可能で、かつ、ddhを含むプラスミドを作製し、このプラスミドをpPK4Dと命名した。pPK4D構築の過程を図１０に示す。
【００８０】
【比較例２】
変異型lysCと、dapA、dapB又はddhとを併せ持つプラスミドの作製
＜１＞変異型lysC及びdapAを併せ持つプラスミドの作製
dapAを有するプラスミドpCRDAPAと変異型lysC及びBrevi.-oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lysC、dapAおよびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを作製した。p399AK9BをSalIにて完全分解した後、平滑末端化し、EcoRIリンカーを接続する事によりSalI部位をEcoRI部位に改変したプラスミドを作製した。得られたプラスミドをp399AK9BSEと命名した。p399AK9BSEをEcoRIにて部分分解することよって変異型lysCとBrevi.−oriを一つのフラグメントとして切り出した。このフラグメントをpCRDAPAをEcoRIにて切断したものと連結した。得られたプラスミドをpCRCABと命名した。このプラスミドはE. coliとコリネ型細菌中で自律増殖可能で、かつ宿主にカナマイシン耐性を付与し、変異型lysCとdapAを併せ保持しているプラスミドである。pCRCABの作製過程を図１１に示す。
【００８１】
＜２＞変異型lysC及びdapBを併せ持つプラスミドの作製
変異型lysCを有するプラスミドp399AK9とdapBを有するプラスミドp399DPRより、変異型lysC、dapBを含むプラスミドを作製した。p399DPRをEcoRVとSphIで切断することにより、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIで切断した後平滑末端化し、更にSphIにて切断したものと結合し、変異型lysCとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。このプラスミドをp399AKDDPRと命名した。
【００８２】
次に、得られたp399AKDPRにBrevi.-oriを導入した。Brevi.-oriを含むプラスミドpHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて切断したp399AKDDPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysCおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pCBと命名した。pCBの構築の過程を図１２に示す。
【００８３】
＜３＞変異型lysC及びddhを併せ持つプラスミドの作製
ddhを含むプラスミドpUC18DDHと変異型lysC及びBrevi.-oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lysC、ddhおよびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを作製した。pUC18DDHを制限酵素EcoRI（宝酒造（株）製）にて切断し、平滑末端化し、この末端にSalIポリリンカーを接続し、EcoRI部位をSalI部位に改変した。このプラスミドをSalIで切断し、ddhを含むＤＮＡ断片を取得した。
【００８４】
次に、p399AK9Bを制限酵素SalIで切断し、上記ddhを含むＤＮＡ断片と接続した。こうして、変異型lysC、ddh及びBrevi.-oriを有し、コリネ型細菌中で自律増殖可能なプラスミドを作製し、pCDと命名した。pCDの構築の過程を図１３に示す。
【００８５】
【実施例５】
Ｌ−リジン生合成遺伝子を含むプラスミドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌への導入
上記のようにして作製されたＬ−リジン生合成遺伝子を有するプラスミドp399AK9B（Cmr）、pLYSAB（Cmr）、pPwm（Kmr）、pCRCAB（Kmr）、pCB（Cmr）、pCD（Cmr）、pCL（Cmr）をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌であるＡＪ１１０８２（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７０）に導入した。ＡＪ１１０８２株は、ＡＥＣ耐性の性質を有する。プラスミドの導入の方法は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によった。形質転換体の選択は各々のプラスミドが持つ薬剤耐性マーカーによった。クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合は５μg/mlのクロラムフェニコールを含む完全培地にて、また、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合には２５μg/mlのカナマイシンを含む完全培地にて形質転換体の選択を行なった。
【００８６】
得られた形質転換体のうち、変異型lysC及びlysAが増強された株（AJ11082/pCL）にpPwm（Kmr）を導入して、変異型lysC、lysA及びppcの３者が増強された株（AJ11082/pCL/pPwm）を得た。形質転換体の選択は、５μg/mlのクロラムフェニコールと２５μg/mlのカナマイシンを含む完全培地にて行なった。
【００８７】
【実施例６】
Ｌ−リジンの製造
実施例５で取得した各形質転換体をＬ−リジン生産培地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。
【００８８】
〔Ｌ−リジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。
【００８９】
グルコース              100 g
（ＮＨ4）2ＳＯ4          55 g
ＫＨ2ＰＯ4                1 g
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        1 g
ビオチン                500 μg
チアミン               2000 μg
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        0.01 g
ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        0.01 g
ニコチンアミド            5 mg
蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml
炭酸カルシウム           50 g
【００９０】
上記組成の培地に各種形質転換体及び親株を植菌し、31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養４０時間、７２時間後のＬ−リジン生成量を表に示す。表中、lysC*は変異型lysCを表す。
【００９１】
【表１】
0004075087.tif 000003
【００９２】
以上に示すように、変異型lysC、lysA又はppcを単独で増強した場合、及び変異型lysCと、dapA又はddhのいずれかとを組み合わせて増強した場合には、培養７２時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多いか同程度であるが、４０時間後では親株よりも生産量が少なく、すなわち短期間培養におけるＬ−リジン生産速度は低下した。特に、変異型lysCとddhとを組み合わせて増強した場合には、培養４０時間後、７２時間後ともに親株よりもＬ−リジン生産量が低下した。これに対し、変異型lysCとともにdapBを増強した株では、生育が改善され、短期間培養におけるＬ−リジン生産速度を回復させることができ、長期間培養でのＬ−リジン蓄積量も増加した。
【００９３】
一方、lysC*とlysAを組み合わせて増強した場合には、短期間培養におけるＬ−リジン生産速度が親株に比べて向上した上、長期間培養でのＬ−リジン蓄積量も飛躍的に向上した。さらに、変異型lysC、lysA及びppcの３者が増強された株では、Ｌ−リジン生産性が一層向上された。
【００９４】
【発明の効果】
本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジン生産量及びＬ−リジン生産速度を向上させることができる。
【００９５】
【配列表】
0004075087.tif 000004
【００９６】
0004075087.tif 000005
【００９７】
0004075087.tif 000006
0004075087.tif 000007
【００９８】
0004075087.tif 000008
0004075087.tif 000009
0004075087.tif 000010
0004075087.tif 000011
【００９９】
0004075087.tif 000012
0004075087.tif 000013
0004075087.tif 000014
【０１００】
0004075087.tif 000015
0004075087.tif 000016
0004075087.tif 000017
【０１０１】
0004075087.tif 000018
【０１０２】
0004075087.tif 000019
【０１０３】
0004075087.tif 000020
【０１０４】
0004075087.tif 000021
0004075087.tif 000022
0004075087.tif 000023
0004075087.tif 000024
0004075087.tif 000025
0004075087.tif 000026
0004075087.tif 000027
0004075087.tif 000028
【０１０５】
0004075087.tif 000029
0004075087.tif 000030
0004075087.tif 000031
【０１０６】
0004075087.tif 000032
0004075087.tif 000033
0004075087.tif 000034
【０１０７】
0004075087.tif 000035
【０１０８】
0004075087.tif 000036
【０１０９】
0004075087.tif 000037
0004075087.tif 000038
0004075087.tif 000039
0004075087.tif 000040
0004075087.tif 000041
0004075087.tif 000042
0004075087.tif 000043
【０１１０】
0004075087.tif 000044
0004075087.tif 000045
0004075087.tif 000046
0004075087.tif 000047
0004075087.tif 000048
【０１１１】
0004075087.tif 000049
【０１１２】
0004075087.tif 000050
【０１１３】
0004075087.tif 000051
【０１１４】
0004075087.tif 000052
【０１１５】
0004075087.tif 000053
【０１１６】
0004075087.tif 000054
【０１１７】
0004075087.tif 000055
【０１１８】
0004075087.tif 000056
【図面の簡単な説明】
【図１】  変異型lysCを有するプラスミドp399AK9B及びp399AKYB構築の過程を示す図。
【図２】  lysAを有するプラスミドp299LYSAの構築の過程を示す図。
【図３】  lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpLYSABの構築の過程を示す図。
【図４】  ＰＥＰＣ構造遺伝子を含むプラスミドpAKPFdsの構築の過程を示す図。
【図５】  新規なコリネ型細菌用クローニングベクターpVK6及びpVK7の構築の過程を示す図。
【図６】  野生型高発現型ppcを含むプラスミドpPwmの構築の過程を示す図。
【図７】  変異型lysC、lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCLの構築の過程を示す図。
【図８】  dapA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPSBの構築の過程を示す図。
【図９】  dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPRBの構築の過程を示す図。
【図１０】  ddh及びBrevi.ori-を有するプラスミドpPK4Dの構築の過程を示す図。
【図１１】  lysC、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCRCABの構築の過程を示す図。
【図１２】  変異型lysC、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCBの構築の過程を示す図。
【図１３】  変異型lysC及びddhを有するプラスミドpCDの構築の過程を示す図。
【図１】
0004075087.tif 000057
【図２】
0004075087.tif 000058
【図３】
0004075087.tif 000059
【図４】
0004075087.tif 000060
【図５】
0004075087.tif 000061
【図６】
0004075087.tif 000062
【図７】
0004075087.tif 000063
【図８】
0004075087.tif 000064
【図９】
0004075087.tif 000065
【図１０】
0004075087.tif 000066
【図１１】
0004075087.tif 000067
【図１２】
0004075087.tif 000068
【図１３】
0004075087.tif 000069