(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮型紫外損傷エンドヌクレアーゼ（Ｕｖｅ１ｐ）をコードする天然に存在しない核酸分子であって、該短縮型Ｕｖｅ１ｐは、配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列からなる、天然に存在しない核酸分子。
【請求項２】
安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐをコードする、請求項１に記載の天然に存在しない核酸分子であって、該安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、天然に存在しない核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子がベクター分子中に含まれる、請求項１に記載の天然に存在しない核酸分子。
【請求項４】
精製された安定な短縮型ＵＶ損傷エンドヌクレアーゼ（Ｕｖｅ１ｐ）であって、ここで該Ｕｖｅ１ｐは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる、精製された安定な短縮型ＵＶ損傷エンドヌクレアーゼ（Ｕｖｅ１ｐ）。
【請求項５】
アミノ末端で共有結合した、配列番号８に示されるアミノ酸配列により同定されるポリペプチドをさらに含む、請求項４に記載の精製された安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐ。
【請求項６】
ゆがんだ構造により特徴付けられる二本鎖ＤＮＡ分子の切断のための方法であって、ここで該ゆがんだ構造は、ヌクレオチドの紫外線照射損傷、光生成物、無塩基部位、ミスマッチのヌクレオチド対合、白金二付加物、インターカレート化分子、またはアルキル化により生じ、該方法は、ゆがんだ構造により特徴付けられたＤＮＡ分子を以下：
配列番号４に示されるアミノ酸配列により同定される安定な短縮型エンドヌクレアーゼ；または配列番号６に示されるアミノ酸配列により同定される安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐからなる群より選択された広範に特異的なＤＮＡ損傷エンドヌクレアーゼと、該エンドヌクレアーゼの酵素活性を可能にする条件下で接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府による研究支援の承認）
本発明は、少なくとも部分的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（助成金番号ＣＡ  ５５８９６，ＡＲ  ４２６８７  およびＣＡ  ７３０４１）、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの基金を用いて行われた。従って、合衆国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明の分野は、ＤＮＡ修復酵素の領域である。詳細には、本発明は、安定な紫外ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドフラグメントの同定、それらのヌクレオチド配列、および組換え宿主細胞、ならびにそれらを産生するための方法およびＤＮＡ修復プロセスにおけるそれらの使用のための方法に関する。
【０００３】
紫外照射（ＵＶ）への細胞の曝露は、細胞死、変異および腫瘍性の形質転換を含む多くの有害な作用を生じる。研究により、これらの有害な作用のいくつかは、バイピリミジンＤＮＡ光生成物の２つの主要なクラス、シクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）および（６−４）光生成物（６−４  ＰＰ）の形成に起因することが示される。（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら［１９９５］ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、２４〜３１頁、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
【０００４】
生物体は、細胞のＤＮＡからＣＰＤおよび６−４ＰＰを除去するためのいくつかの異なる経路を進化させている（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら［１９９５］前出；Ｂｒａｓｈら［１９９１］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８  １０１２４〜１０１２８）。これらの経路は、ＣＰＤおよび６−４  ＰＰに対して高度に特異的かまたは非特異的であり得る、直接の逆転修復経路および種々の除去修復経路を含む。例えば、ＣＰＤまたは６−４ＰＰのいずれかに対して特異的なＤＮＡホトリアーゼは、種々の種において見い出されており、そして光生成物の塩基をそのもともとの非損傷状態に戻し修復する（Ｒｕｂｅｒｔ，Ｃ．Ｓ．［１９７５］Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５Ａ：７３〜８７；Ｋｉｍら［１９９４］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８５３５〜８５４０；Ｓａｎｃａｒ，Ｇ．Ｂ．［１９９０］Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２３６：１４７〜１６０）。除去修復は、伝統的に、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路またはヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路のいずれかに分けられている。これらは、別のセットのタンパク質により媒介されるが、両方ともＤＮＡ切開、損傷部位除去、ギャップ充填および連結反応からなる（Ｓａｎｃａｒ，Ａ［１９９４］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５４〜１９５６０；Ｓａｎｃａｒ，Ａ．およびＴａｎｇ，Ｍ．Ｓ．［１９９３］Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５７：９０５〜９２１）。ＣＰＤに特異的なＢＥＲ  Ｎ−グリコシラーゼ／ＡＰリアーゼは、ＣＰＤ  ５’ピリミジンのＮ−グリコシド結合を切断し、次いでβ−リアーゼ機構を介して無塩基部位でリン酸ジエステル骨格を切断し、そしてＴ４ファージ感染したＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むいくつかの種で見出されている（Ｎａｋａｂｅｐｐｕ，Ｙら［１９８２］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２５５６〜２５６２；Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｈ．ら［１９８２］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４６５〜１３４７４；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｋ．Ｋ．ら［１９９２］Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：７２５〜７２８）。ＮＥＲは、広範に分布している損傷部位非特異的修復経路である。これは損傷部位から上流および下流の２重切開反応を介してＤＮＡ損傷除去を調整する。これにより、損傷を含むオリゴヌクレオチドが解離され、そしてギャップ充填および連結反応が続く（ＳａｎｃａｒおよびＴａｎｇ［１９９３］前出）。
【０００５】
近年、直接作用するヌクレアーゼにより開始される代替的な除去修復経路（これは、光生成物部位のすぐ５’側にＣＰＤまたは６〜４ＰＰを含有するＤＮＡを認識し、そして切断する）が、記載されている（Ｂｏｗｍａｎ，Ｋ．Ｋ．ら［１９９４］Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３０２６〜３０３２；Ｆｒｅｙｅｒ，Ｇ．Ａ．ら［１９９５］Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４５７２〜４５７７；Ｄｏｅｔｓｃｈ，Ｐ．Ｗ．［１９９５］Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３８４〜３８６；Ｄａｖｅｙ，Ｓら［１９９７］Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１００２〜１００８；Ｙａｊｉｍａ，Ｈら［１９９５］ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：２３９３〜２３９９；Ｙｏｎｅｍａｓｕ，Ｒら［１９９７］Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１５５３〜１５５８；Ｔａｋａｏ，Ｍら［１９９６］Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１２６７〜１２７１）。開始する酵素は、ＵＶ損傷エンドヌクレアーゼ（ＵＶＤＥ、ここでＵｖｅ１ｐと名付ける）と名付けられている。ＵＶＤＥの相同体は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて見出されている（Ｙａｊｉｍａら［１９９５］前出、Ｙｏｎｅｍａｓｕら［１９９７］前出；Ｔａｋａｏら［１９９６］前出）。これらの３つの種由来のＵｖｅ１ｐは、クローニングされ、配列決定され、そしてＥ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ、およびヒト細胞のＵＶ感受性株に導入された場合、増大したＵＶ耐性を付与する（Ｙａｊｉｍａら［１９９５］前出；Ｔａｋａｏら［１９９６］前出）。Ｓ．ｐｏｍｂｅにおいて、Ｕｖｅ１ｐはｕｖｅ１＋遺伝子によりコードされる。しかし、部分的に精製された完全長のおよびいくらか短縮型ＵＶＤＥ誘導体の明らかに不安定な性質により、ＵＶＤＥ酵素は、比較的弱く特徴付けられ、そして用途が限定されている（Ｔａｋａｏら［１９９６］前出）。
【０００６】
世界中での皮膚癌の増加および広範な発生数により、そして種々の型の部分的に精製された完全長のおよび短縮型ＵＶＤＥ誘導体の報告された固有の不安定性に起因して、安定なＵＶＤ産物の単離および精製の必要性が（特に皮膚の手入れおよび医薬用処方物における使用のため）長期にわたって存在している。
【０００７】
（発明の要旨）
精製された安定なＵＶＤＥ（Ｕｖｅ１ｐ）である、高いレベルの活性を保持するポリペプチドフラグメント（特にＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅの酵素由来のもの）を提供することが本発明の目的である。特定の実施態様では、このポリペプチドフラグメントは、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｕｖｅ１＋遺伝子産物のＮ末端領域の２２８アミノ酸欠失を含むΔ２２８−ＵＶＤＥである；第２の特定の実施態様は、融合タンパク質ＧＳＴ−Δ２８８−ＵＶＤＥである。Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＧＳＴ完全長ＵＶＤＥをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１に示される。完全長ＧＳＴ−ＵＶＤＥの推定アミノ酸配列は、配列番号２に示される。Δ２２８−ＵＶＤＥをコードするＤＮＡ配列は、配列番号３に示される。Δ２２８−ＵＶＤＥの推定アミノ酸配列は、配列番号４に示される。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥのＤＮＡコード配列および推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６に示される。短縮型ＵＶＤＥタンパク質もまた本発明に包含される。ここでこの短縮は配列番号２に関して約１００位〜約２５０位であり、そして短縮型タンパク質は、実質的に純粋な形態で安定である。
【０００８】
このようなポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子ならびにこのような核酸またはポリペプチドのフラグメントを含む組換え細胞、組換え組織および組換え動物、このポリペプチドフラグメントに対する抗体、このポリペプチドフラグメントを用いるアッセイ、このポリペプチドフラグメントを含む薬学的および／または化粧用の調製物、ならびに前述すべてに関する方法もまた本発明の範囲内である。
【０００９】
本発明の詳細に例証された実施態様は、Δ２２８−ＵＶＤＥをコードする単離されるか、濃縮されるか、または精製された核酸分子である。別の例証された実施態様は、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥをコードする単離されるか、濃縮されるか、または精製された核酸分子である。
【００１０】
詳細に例証された実施態様では、単離された核酸は、配列番号３または配列番号５に示される核酸配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、Δ２２８−ＵＶＤＥまたはＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥをコードする核酸分子を含む組換え細胞を包含する。この組換え核酸は、配列番号３もしくは配列番号５に示される配列、同義のコード配列、または配列番号３または配列番号５の機能的誘導体を含み得る。このような細胞において、Δ２２８−ＵＶＤＥコード配列は、一般に、異種プロモーターを含む異種の調節エレメント（それは、通常、天然の状態では、ＵＶＤＥポリペプチドのコード配列に転写可能に結合していない）の制御下で発現される。
【００１２】
なお別の局面では、本発明は、Δ２２８−ＵＶＤＥまたはＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥをコードするヌクレオチド配列、ならびに宿主細胞において転写そして引き続くタンパク質合成を開始するのに有効な転写制御配列および翻訳制御配列を含む核酸ベクターに関する。ＧＳＴの完全長または短縮型誘導体が発現される場合、このＧＳＴタンパク質は、望ましくは、例えば、トロンビンを用いて、プロテアーゼ切断により取り出される（アフィニティー精製後）。
【００１３】
Δ２２８−ＵＶＤＥと名付けられたポリペプチドを単離し、濃縮しまたは精製する方法を提供することが、本発明のなお別の局面である。
【００１４】
なお別の局面では、本発明は、ＵＶＤＥポリペプチドフラグメントに対する特異的な結合親和性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）の特徴を持つ。「特異的な結合親和性」とは、抗体が、特定の条件下で、ＵＶＤＥポリペプチドに対して、他のポリペプチドに対して結合するより大きい親和性で結合することを意味する。
【００１５】
ＵＶＤＥポリペプチドフラグメントに対して特異的な結合親和性を有する抗体は、免疫複合体が形成するような条件下で、サンプルをこの抗体に接触させることによりこのサンプル中の、短縮型ＵＶＤＥポリペプチドの存在および／または量を検出する方法、ならびにＵＶＤＥポリペプチドに対して結合体化した抗体の存在および／または量を検出する方法において用いられ得る。このような方法を実施するためのキットは、抗体の結合パートナーおよび標識（例えば、放射性同位元素）の結合体または当該分野で周知の他の検出手段を有する第１の容器を含むように構築され得る。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、ＵＶＤＥポリペプチドフラグメントに対する特異的な結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマにより特徴付けられる。「ハイブリドーマ」とは、抗体、例えば、Δ２２８−ＵＶＤＥ特異的抗体を分泌し得る不死化された細胞株を意味する。好ましい実施態様では、ＵＶＤＥ特異的抗体は、Δ２２８−ＵＶＤＥに特異的に結合し得るアミノ酸の配列を含む。あるいは、ＧＳＴタグ特異的抗体または標識されたリガンドは、特にエクスビボ処方物中の、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥポリペプチドの存在を決定するかまたは定量するために用いられ得る。
【００１７】
本発明はさらに、構造的ゆがみを有する位置でＤＮＡ分子を切断するための方法を提供する。ここでＤＮＡは、本発明の安定な短縮型ＵＶＤＥタンパク質により、ゆがみの近傍で切断される。構造的ゆがみは、二本鎖ＤＮＡ分子におけるゆがみの部位でのミスマッチから、ＵＶ損傷から、あるいは化学反応（例えば、アルキル化剤または脱プリン剤での化学反応）に起因する、またはＵＶ照射、電離放射線、もしくは他の照射損傷による損傷に起因するＤＮＡに対する他の損傷から生じ得る。安定な短縮型ＵＶＤＥタンパク質は、インビトロ反応のために実質的に純粋な形態で供給され得るか、またはインビボ反応のために供給され得る。これには、局所適用のための組成物（軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ、ｓａｌｖｅ）クリーム、ローション、液体または経皮パッチの形態）、内部服用のための薬学的組成物（腹腔内注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射または筋肉内注射により投与される）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の安定な短縮型ＵＶＤＥ誘導体は、広範な種々のミスマッチおよびＤＮＡ損傷を修復する。ヌクレオチド誤対合（ミスマッチ）に起因するか、またはＤＮＡ損傷に起因する構造的ゆがみを有する二本鎖ＤＮＡ分子の本発明の安定な短縮型ＵＶＤＥ誘導体による切断は、構造的ゆがみについての比較的単純なアッセイにおいて有利に用いられ得る。このアッセイでは試験分子（すなわち、損傷、ミスマッチまたは他の構造的ゆがみについてスクリーニングされている二本鎖ＤＮＡ分子）の切断が、検出されるべきである。
【００１８】
本発明はさらに、構造的ゆがみが存在する二本鎖ＤＮＡ分子を除去するための方法を提供する。構造的ゆがみは、正常なワトソン−クリック塩基対形成が乱されるような塩基対ミスマッチ、光生成物形成、ヌクレオチドのアルキル化を含むがこれらに限定されない異常、例えば、とりわけ、アクリフラビン、エチジウムハライドであり得る化合物のヌクレオチド間のインターカレート、または白金付加物（例えば、シスプラチン部分の白金付加物）に起因し得る。ＤＮＡはまた、とりわけ無塩基部位、イノシン、キサンチン、８−オキソグアニン残基を含み得る。本発明の方法は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来のＵＶＤＥ（Ｕｖｅ１ｐ）タンパク質（Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ＵＶＤＥの短縮型誘導体（約１００〜約２５０のＮ末端アミノ酸を欠失する））、Ｓ．ｐｏｍｂｅのΔ２２８−ＵＶＤＥ、または本明細書において示される（配列番号３６〜３９を参照のこと）Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓもしくはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓの酵素由来のＵＶＤＥ（Ｕｖｅ１ｐ）タンパク質を用いて使用され得る。詳細に例証された短縮型ＵＶＤＥ（Δ２２８）は、配列番号４に示される。構造的ゆがみを含むＤＮＡは、ゆがんだＤＮＡ分子の一方の鎖のエンドヌクレアーゼ的切断を可能にする条件下で上記のように酵素（または活性な短縮型誘導体）と接触させられる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本明細書において使用される略語は、以下を含む：ａａ、アミノ酸；ｂｐ、塩基対；ＢＥＲ、塩基切断修復；ｃＤＮＡ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ；ＣＰＤ、シクロブタンピリミジンダイマー；ＦＬ、全長；ＧＳＴ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；ＮＥＲ、ヌクレオチド切断修復；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＰＭＳＦ、フェニルメチルスルホニルフルオリド、６−４ＰＰ、(６−４）光生成物；ＵＶＤＥまたはＵｖｅ１ｐ、これらは、互換的に使用され、紫外線損傷エンドヌクレアーゼ；Δ２２８−ＵＶＤＥ、２２８Ｎ−末端アミノ酸を欠くＵＶＤＥ短縮産物。
【００２０】
核酸分子に関して「単離された」とは、互いに共有結合された１４、１７、２１またはそれより多いヌクレオチドのポリマーを意味し、天然の供給源から単離されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または化学合成されたＤＮＡもしくはＲＮＡが含まれる。本発明の単離された核酸分子は、天然には存在しない。用語「単離された」とは、天然に存在するか、または他の核酸分子が、その通常の細胞環境から取り出されたことをいう。核酸分子に関して用語「精製された」には、絶対的な純粋は、必要されない。そうではなく、精製されたとは、核酸が天然の環境におけるよりもさらに純粋であることをいう。
【００２１】
「核酸ベクター」とは、細胞にトランスフェクトまたは形質転換され得、そして独立してまたは宿主細胞ゲノム中で複製し得る一本鎖または二本鎖の環状核酸分子をいう。環状の二本鎖核酸分子は、そのクローニングベクターに含まれるヌクレオチド配列に基づいて適切な制限酵素を用いた処理によって直鎖状にされ得る。本発明の核酸分子は、制限酵素を用いてベクターを切断し、そして２つの片を一緒に連結することによってベクターに挿入され得る。この核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
【００２２】
多くの技術が原核生物または真核生物への組換え構築物の形質転換またはトランスフェクションを容易にするために当業者に利用可能である。用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、細胞性生物へ発現構築物を挿入する方法をいう。これらの方法は、種々の技術を包含する（例えば、高濃度の塩、電場または界面活性剤で細胞を処理して、宿主細胞を、目的の核酸分子の取り込み能を与えること、またはリポソーム媒介性トランスフェクションが使用され得る）。
【００２３】
用語「プロモーターエレメント」は、適切な細胞において、ベクターＤＮＡ部分のｍＲＮＡへの転写を可能にするベクターに取り込まれるヌクレオチド配列をいう。プロモーターエレメントは、Δ２２８−ＵＶＤＥまたはＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥの核酸分子の５’末端側に先行し、その結果、Δ２２８−ＵＶＤＥまたはＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥの配列が、ｍＲＮＡに転写される。転写増強配列もまた、プロモーターの上流領域に取り込まれ得る。ｍＲＮＡ分子が翻訳されて、組換え細胞内で所望のタンパク質が精製される。
【００２４】
当業者は、核酸ベクターが、プロモーターエレメントおよびΔ２２８−ＵＶＤＥまたはＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ核酸分子の他に、多くの他の核酸エレメントを含み得ることを認識する。これらの他の核酸エレメントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：複製起点、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナル、薬物耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、ならびに分泌シグナル、周辺質または他の局在化シグナルをコードする核酸配列、またはポリペプチド精製のために有用なシグナル。
【００２５】
本明細書において使用される「Δ２２８−ＵＶＤＥポリペプチド」は、配列番号４に与えられるか、またはそれにす示される配列に実質的に類似するアミノ酸配列を有する。実質的に類似する配列は、好ましくは、少なくとも８５％の同一性、そして最も好ましくは９９−１００％の同一性を、配列番号４に示した配列に対して有する。当業者は、いくつかの容易に利用可能なコンピュータプログラムを使用して、配列同一性を決定し得ることを理解する。ここでは、ギャップが導入されて、ミスマッチアミノ酸として処理される配列の整列を最適化し、そしてここで、配列番号４における配列を、参照配列として用いる。
【００２６】
本明細書において使用される「ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥポリペプチド」は、配列番号６に与えられるか、またはそれに示される配列に実質的に類似するアミノ酸配列を有する。実質的に類似する配列は、好ましくは、少なくとも８５％の同一性、そして最も好ましくは９９−１００％の同一性を、配列番号６に示した配列に対して有する。当業者は、いくつかの容易に利用可能なコンピュータプログラムを使用して、配列同一性を決定し得ることを理解する。ここでは、ギャップが導入されて、ミスマッチアミノ酸として処理される配列の整列を最適化し、そしてここで、配列番号６における配列を、参照配列として用いる。
【００２７】
ポリペプチドに関して「単離された」とは、互いに結合された６、１２、１８またはそれより多いアミノ酸のポリマーを意味し、これには、天然供給源から単離されたポリペプチドまたは化学合成されたポリペプチドが含まれる。本発明の単離されたポリペプチドは、純粋であるか、または天然に分離された状態で見出されないという意味で独特である。用語「単離された」の意味は、天然に存在する配列が、その通常の細胞環境から取り出されたことを示す。従って、この配列は、無細胞溶液中に存在し得るか、または異なる細胞環境に置かれ得る。この用語は、その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることは意味せず、それに天然に付随する物質が実質的にない（少なくとも約９０〜９５％純粋）であることを意味する。
【００２８】
ポリペプチドに関して用語「精製された」とは、絶対的な純粋（例えば、均質な調製物）を必要としない；その代わり、この用語は、そのポリペプチドがその天然環境よりも相対的により純粋であることを意味する。少なくとも２桁、好ましくは３桁、およびより好ましくは４桁または５桁の精製度が、短縮型ＵＶＤＥ含有組成物に存在するタンパク質および他の細胞組成物に関して、明示的に意図される。この物質は、好ましくは、機能的に有意なレベルの混入物を含まない（例えば、９０％、９５％または９９％純粋）。算出された比活性における増加に基づいて、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥは、それぞれ、２３０倍および３１０倍に精製されている。しかし、銀染ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの結果に基づけば、両方のタンパク質は、ほぼ均質に精製されているようである（図１を参照のこと）。
【００２９】
本明細書において使用される「ＵＶＤＥポリペプチドフラグメント」また「短縮型ＵＶＤＥ」は、配列番号２に示す全長アミノ酸配列よりも少ないアミノ酸配列を有する。また、本明細書において使用されるように、ＵＶＤＥおよびＵｖｅ１ｐは同義で使用される。
【００３０】
この状況において、「ＵＶＤＥ変異体ポリペプチド」は、ネイティブ配列または短縮型ネイティブ配列とは異なる、１つ以上のアミノ酸が変化、付加または欠失されたＵＶＤＥポリペプチドまたは短縮型ＵＶＤＥである。アミノ酸の変化は、保存的であってもよく、非保存的であってもよい。保存的とは、類似の特性（例えば、電荷、疎水性および構造）を有するアミノ酸へのアミノ酸の置換を意味する。本発明のＵＶＤＥ変異体ポリペプチドは、その有用な機能（すなわち、例えば、ＤＮＡからシクロブタンピリミジンダイマーおよび／または（６−４）光生成物を除去する能力ＤＮＡ）を維持し、そしてその酵素活性は、実質的に精製された形態において安定である。本発明の全長ＵＶＤＥタンパク質および短縮型誘導体は、以下に記載するように、二本鎖ＤＮＡについて広汎な種々のＤＮＡ損傷および障害を認識する。ＵＶＤＥおよび短縮型ＵＶＤＥのタンパク質は、損傷した（無塩基部位、光生成物、シスプラチン付加物および種々の他の異常（これはまた、ミスマッチ対合およびインターカレーション（例えば、とりわけアクリジン色素または臭化エチジウムによる）の位置の隣接部位およびその部位を含む）を含むがこれらに限定されない）二本鎖ＤＮＡ分子を切断するにおいて有用であり、そしてこれらのタンパク質（特に、本発明の安定な短縮誘導体）は、インビボおよび／またはインビトロで、本明細書において記載されるＤＮＡ障害を修復するために有用である。
【００３１】
異なる生物からのＵＶＤＥをコードする遺伝子の単離は、以前に記載されている(Ｙａｊｉｍａら［１９９５］前出；Ｔａｋａｏら［１９９６］前出）。これらの遺伝子は、外来ｃＤＮＡライブラリーを、修復欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株に導入すること、およびその形質転換体のＵＶ照射により補完された細胞について選択することによって、クローニングされる（Ｙａｊｉｍａら［１９９５］前出；Ｔａｋａｏら［１９９６］前出）。研究者らは、全長ＵＶＤＥを特徴付けしていない。なぜなら、ＵＶＤＥは、精製された場合、不安定になり、そしてその活性を失うからである (Ｔａｋａｏら［１９９６］前出）。この不安定性のため、治療剤としてのＵＶＤＥの使用は問題である。
【００３２】
ＵＶＤＥが種々の適用（ＤＮＡ損傷によって生じる疾患の処置および予防を含む）のために使用され得ることから、本発明者らは、安定なＵＶＤＥを見出すことを探索した。本発明者らは、全長ＵＶＤＥの活性は、ネイティブＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたは組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのいずれかの粗抽出物中に存在する場合、保存および凍結乾燥に対して相対的に安定であるようであることに気づいた (Ｔａｋａｏら［１９９６］前出もまた参照のこと）。本発明者らおよび他者は、酵素的に活性な、精製されたＵＶＤＥを良好な収率で得ることにおいてこれまで成功していなかった。本発明は、精製された全長ＵＶＤＥよりも優れた安定性および酵素活性を示す、Ｓ．ｐｏｍｂｅからのポリペプチドフラグメントの単離および精製を記載する。
【００３３】
Ｓ．ｐｏｍｂｅからの全長ｕｖｄｅ遺伝子を、当業者に公知の方法および本明細書に記載される方法を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡライブラリーから増幅した。Δ２２８−ＵＶＤＥ（これは、全長ＵＶＤＥの最初の２２８Ｎ末端アミノ酸の欠失を含む）を、本明細書に記載されるようにＰＣＲを用いて調製した。
【００３４】
増幅されたＵＶＤＥ遺伝子をコードするフラグメントを、酵母発現ベクターｐＹＥＸ４Ｔ−ｌ中にクローニングした。ｐＹＥＸ  ４Ｔ−１において、ＵＶＤＥに由来するポリペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）リーダー配列とともにインフレームで発現させて、ＵＶＤＥのＮ末端に連結されたＧＳＴの融合タンパク質を生成する。ＧＳＴリーダーのＤＮＡ配列を、配列番号７に示す。ＧＳＴリーダーの推定アミノ酸配列を、配列番号８に示す。適切な配向にＤＮＡフラグメントを含む適切なプラスミドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤＹ１５０細胞を、アルカリカチオン方法を用いて形質転換させる。(Ｉｔｏ、Ｈ．ら［１９９３］Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３−１６３）。陽性クローンを選択し、そしてタンパク質精製のために使用する。
【００３５】
全長ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥを、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離し、そして精製した。された。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥを発現する細胞の抽出物を、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに通す。そのカラムに結合したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥを、グルタチオンを用いて溶出する。さらに、Δ２２８−ＵＶＤＥを、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥをトロンビンで処理することにより、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥからＧＳＴリーダーを除去することによって生成する。アフィニティー精製からプールした画分から、５００ｍＬのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞あたり、およそ１．５ｍｇのほぼ均質もしくは均質なＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥのタンパク質が得られた。
【００３６】
ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定される場合、それぞれ、６８．７ｋＤａおよび４１．２ｋＤａという、そのタンパク質の大きさに対応する電気泳動の移動度を有する。(図１Ａ、レーン４−８；図１Ｂ、レーン３）。Δ２２８−ＵＶＤＥおよびＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥの粗調製物および精製された調製物の両方が、単一のシス−シンシクロブタンピリミジンダイマーがその配列の中心近くに埋め込まれて含まれているオリゴヌクレオチド基質(ＣＰＤ−３０マー）に対する酵素活性を維持した (図１Ｃ）。対照的に、精製された全長ＵＶＤＥは、酵素活性が迅速に消失する安定でない調製物をもたらした (図１Ｃ、レーン３）。さらに、精製されたＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥは、１０％グリセロール中で少なくとも６ヶ月間−８０℃で保存した場合、活性の実質的な喪失もなく安定である。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの調製物は、何回かの凍結融解に抵抗性である。驚くことに、精製されたＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの両方が、精製された全長ＵＶＤＥよりも安定であり、そしてより高い酵素活性を有する。
【００３７】
ＵＶＤＥの両方の短縮型 (ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥ）は、広いＮａＣｌ濃度範囲（５０−３００ｍＭ）にわたって高レベルの活性を有し、最適は約１００ｍＭである（図２）。オリゴデオキシヌクレオチド基質(ＣＰＤ−３０マー）の最適な切断は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍＭ  ＭｎＣｌ2の存在下で生じる。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの両方が、ｐＨ  ６．０−６．５でＣＰＤ−３０マーの最適な切断を示し、ここで、活性は、この範囲のいずれの側でも急激に減少する。このことは、ＧＳＴタグが、このタンパク質の折り畳みおよび活性に影響を与えないことを示す (図３）。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥについて算出されたｐＩ値は、それぞれ、６．８および７．５である。
【００３８】
最適なｐＨ、塩および二価カチオンの条件の下では、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥは、３０℃での最適温度を示すことが見出された(図４）。３７℃で、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの活性は、それぞれ、ほぼ８５％および６０％に減少し、そして６５℃では、ＵＶＤＥの両方の短縮型は、活性の有意な減少を示した。
【００３９】
均質なＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥについての反応速度パラメータを、ＣＰＤ−３０マー基質を用いて決定する。図５は、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ反応速度論を、Δ２２８−ＵＶＤＥを用いたＣＰＤ−３０マー切断反応に適用されることを示す。図５Ｂは、図５Ａでの反応速度論データのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。ＣＰＤ−３０マーについての見かけ上のＫmは、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥについて４９．１ｎＭ±７．９ｎＭ、およびΔ２２８−ＵＶＤＥについて７４．９ｎＭ±３．６ｎＭであると算出された。Ｖmax値（ｎＭ分-1）は、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥについて、それぞれ２．４±０．１３および３．９±０．１２であることが見い出された。代謝回転数 (Ｋcat）は、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥについて０．２１±０．０１分-1、およびΔ２２８−ＵＶＤＥについて０．９±０．０３分-1であった。
【００４０】
Ｕｖｅ１ｐは、ｃｉｓ−ｓｙｎ  ＣＰＤ（ｃｓ−ＣＰＤ）および６−４ＰＰの両方を認識し得ることが示されている(Ｂｏｗｍａｎら［１９９４］  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３０３６−３０３２；Ｙａｊｉｍａら［１９９５］  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：２３９３−２３９９）。この点は独特である。なぜなら、他のどの単一のポリペプチドエンドヌクレアーゼも、これらの両方のＵＶ光生成物を認識するとは知られていないからである。ＣＰＤおよび６−４ＰＰは、最も頻繁に生成する形態のＵＶ誘導損傷であるが、これらの２つの傷害によるＤＮＡにおいて誘導される構造的障害には顕著な相違が存在する。ｃｓ−ＣＰＤの二重鎖ＤＮＡへの取り込みは、ＤＮＡらせんの顕著な曲げまたは巻き戻しを起こさず(Ｒａｏら［１９８４］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７８９−４８０７；Ｗａｎｇら［１９９１］  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９０７２−９０７６；Ｍｉａｓｋｉｅｗｉｃｚら［１９９６）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：９１５６−９１６３；Ｊｉｎｇら［１９９８］前出；ＭｃＡｔｅｅｒら［１９９８］  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２：１０１３−１０３２；Ｋｉｍら［１００５］前出）、そしてこの二重鎖を、−１．５  ｋｃａｌ／ｍｏｌ不安定化させる(Ｊｉｎｇら［１９９８］  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３８４５−３８５３）。この比較的小さな構造障害によって、ＣＰＤ塩基は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合を形成するその能力のほとんどを維持することが可能となることが実証されている(Ｊｉｎｇら［１９９８］前出；Ｋｉｍら［１９９５］  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６２：４４−５０）。他方、ＮＭＲの研究は、６−４ＰＰがそのＤＮＡを、ｃｓ−ＣＰＤよりも大きな程度曲げ、そしてＤＮＡ二重鎖においておよそ６ｋｃａｌ／ｍｏｌの不安定化が存在し、これは、６−４ＰＰ  ＤＮＡ付加物の３’側における水素形成の喪失をもたらすことが示唆されている(Ｋｉｍら［１９９５］  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８：８４９−８５４）。Ｕｖｅ１ｐがそのような異なる構造障害を認識する能力は、このＵｖｅ１ｐが他の型のＤＮＡ損傷もまた認識し得ることを示唆する。
【００４１】
ＣＰＤは、ＤＮＡにおいて、４つの異なるアイソフォームで生じ得る。（シス−ｓｙｎ  Ｉ［ｃｓ  Ｉ］、シス−ｓｙｎ  ＩＩ［ｃｓ  ＩＩ］、トランス−ｓｙｎ  Ｉ［ｔｓ  Ｉ］、およびトランス−ｓｙｎ  ＩＩ［ｔｓ  ＩＩ］）（Ｋｈａｔｔａｋ，Ｍ．Ｎ．およびＷａｎｇ，Ｓ．Ｙ．［１９７２］Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２８：９４５−９５７）。ピリミジンダイマーは、二重鎖ＤＮＡにおいて主にｃｓ  Ｉ形態で存在し、一方、トランス−ｓｙｎ（ｔｓ）ダイマーは、主にＤＮＡの一本鎖領域に見出される。６−４ＰＰは、ピリミジンヌクレオチドの３’側に位置するシトシン（そしてずっと低い頻度でチミジン）の位置でアルカリ不安定性傷害である（Ｌｉｐｐｋｅら［１９８１］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３３８８−３３９２）。６４ＰＰは、日光に安定でなく、そして３１３ｎｍの光への曝露によってそれらのＤｅｗａｒ価の異性体へと変換される。本発明者らは、以下の一連のＵＶ光生成物についてのΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの特異性を調査した：ｃｓ−ＣＰＤ、ｔｓ  Ｉ−ＣＰＤ、ｔｓ  ＩＩ−ＣＰＤ、６−４ＰＰおよびＤｅｗａｒ異性体。本発明者らはまた、Ｕｖｅ１ｐが他の型の非ＵＶ光生成物のＤＮＡ傷害を認識し得る可能性を調査した。本発明者らは、白金−ＤＮＡ  ＧＧ二付加物（ｄｉａｄｄｕｃｔ）（Ｐｔ−ＧＧ）、ウラシル（Ｕ）、ジヒドロウラシル（ＤＨＵ）、８−オキソグアニン（８−ｏｘｏＧ）、無塩基性部位（ＡＰ部位）、イノシン（Ｉ）、およびキサンチン（Ｘｎ）を含む、種々の傷害を含むＤＮＡオリゴヌクレオチド基質に対するＵｖｅ１ｐの活性を記載する。この基質コレクションは、広範な範囲の種々のＤＮＡ構造のゆがみを誘導する塩基傷害を含む。
【００４２】
Ｓ．ｐｏｍｂｅから単離されたＵｖｅ１ｐは、ＵＶ光生成物のすぐ５’側の単一のＡＴＰ依存性切り出し事象を触媒し、そして３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基を含む末端を生成すると最初に記載された（Ｂｏｗｍａｎら［１９９４］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３０２６−３０３２）。精製されたＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、Δ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、ならびに組換えＧ−Ｕｖｅ１ｐおよび組換えＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの粗細胞溶解産物は、天然タンパク質について観察されるのと同様にＣＰＤのすぐ５’側に切り込みを生じる。この研究では、本発明者らは、５’末端および３’末端の両方で標識された二重鎖ＣＰＤ−３０マー（ｃｓ−ＣＰＤ−３０マー）を用いて、Ｕｖｅ１ｐが、２つの部位で基質を含有するＣＰＤを切断する能力を実証した（図６Ａ〜図６Ｂ）。一次産物（矢印ａ）は、形成され、そして損傷のすぐ５’側の切断によってもたらされる総産物の約９０％を占める。この第２の切り込み部位は、１ヌクレオチド上流に位置し、そして切断産物を生じた（矢印ｂ）。この切断産物は、形成される産物の残りの１０％を表した。この副産物は、５’末端標識基質または３’末端標識基質のいずれが調べられるかに依存して、一次産物よりも１ヌクレオチド短いかまたは長い。同じ切断パターンが、用いられた各々の異なるＵｖｅ１ｐ調製物において観察された：すなわち、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを発現する細胞の粗抽出物、親和性精製されたＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、およびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（それぞれ、図２Ａおよび図２Ｂ、レーン２、３、および４）、ならびにＧＳＴ−Ｕｖｅ１ｐを発現する細胞の抽出物。切断産物は、ｃｓ−ＣＰＤ−３０マー基質が緩衝液のみまたは精製されたＵｖｅ１ｐタンパク質と同じ様式で調製およびアフィニティー精製された精製組換えＧＳＴとともにインキュベートされる場合、観察されなかった（それぞれ、図６Ａ、図６Ｂ、レーン１およびレーン５）。このコントロールは、これらのＤＮＡ鎖切断産物が、微量の非特異的エンドヌクレアーゼ混入の存在の結果として形成される可能性を排除する。Ｕｖｅ１ｐは、二重鎖ｃｓ−ＣＰＤ含有オリゴヌクレオチド基質を認識し、そしてこの基質を２つの部位で切断する。９０％の産物を担う主な部位は損傷のすぐ５’側であり、そして２番目の部位（産物の残りの１０％を占める）は損傷部位の５’側１ヌクレオチドである。
【００４３】
Ｕｖｅ１ｐは、これらがオリゴヌクレオチド基質に取り込まれた場合、ＣＰＤおよび６−４ＰＰの両方を切断する（Ｂｏｗｍａｎら［１９９４］前出；Ｙａｊｉｍａら［１９９５］ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：２３９３−２３９９）。これらの傷害は、二重鎖ＤＮＡにおいて実質的に異なるゆがみを誘導する。天然のＵｖｅ１ｐがこれらの両方の損傷を認識する能力は、このエンドヌクレアーゼが同様に他の形態のＵＶ誘導性光損傷を認識するか否かを本発明者らが調査するのを促進する。ＵＶ誘導性二ピリミジン光生成物についての組換えΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの基質範囲を決定するために、種々のＵｖｅ１ｐ調製物を、種々の形態のＵＶ損傷を含む合成４９マーオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした（表１Ａ）。これらの実験において用いた基質は、５’末端が標識された二重鎖ｃｓ−ＣＰＤ−４９マー、ｔｓＩ−ＣＰＤ−４９マー、ｔｓＩＩ  ＣＰＤ−４９マー、６−４ＰＰ−４９マー、およびＤｅｗａｒ−４９マー（図８Ａ）であった。一般に、精製されたＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐおよびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐは、二ピリミジン光生成物基質の全てを、切断の部位および程度の両方に関して類似の様式で切断した。Ｇ−Ｕｖｅ１ｐおよびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの粗細胞溶解産物をこの基質とともにインキュベートした場合に観察される切断パターンは、あまり一貫していなかった。非常に低いレベルの産物が、これらの抽出物をＤｅｗａｒ異性体とともにインキュベートした場合に観察された。損傷した基質を緩衝液単独または精製した組換えＧＳＴとともにインキュベートした場合に、切断産物は検出されなかった。このことは、他のＤＮＡ修復タンパク質はいずれもこの基質の切断を担わなかったことを実証する。さらに、Ｕｖｅ１ｐと末端標識した非損傷基質（ＵＤ−３０マー）とのインキュベーションは、切断産物の形成を全くもたらさなかった。本発明者らは、Ｕｖｅ１ｐが、これらの５つのＵＶ誘導性二ピリミジン光生成物を類似の様式で認識および切断すること、ならびにこれらがこの酵素についての基質であることを結論付けた。このような驚くほど広範囲のＵＶ誘導性光生成物を認識し得る単一タンパク質エンドヌクレアーゼが記載されたのはこれが初めてである。
【００４４】
非ＵＶ光生成物二付加物を有するＤＮＡについての活性を調査するために、本発明者らは、Ｕｖｅ１ｐが白金−ＤＮＡ傷害を含むオリゴヌクレオチドを認識するか否かを調査した。シス−ジアミンジクロロ（Ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏ）白金（ＩＩ）（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）は、ＤＮＡ中に数種の一付加物（ｍｏｎｏａｄｄｕｃｔ）および二付加物を誘導する、広範に用いられる抗腫瘍薬物である。主な生物学的に関連する、形成される付加物の１つは、白金への、２つの隣接するグアニンのＮ−７の配位から生じて、鎖内架橋シス−［Ｐｔ（ＮＨ3）2｛ｄ（ＧｐＧ）−Ｎ７（１），−Ｎ７（２）｝］（シス−ＰＴ−ＧＧ）を形成する（図９）。１６位と１７位との間に単一白金鎖内架橋を有する５’末端標識二重鎖３２マーオリゴヌクレオチド（Ｐｔ−ＧＧ−３２マー）（表１Ａ）を、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐまたはΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐのいずれかとともにインキュベートし、そして反応産物を、ＤＮＡ配列決定型ゲルで可視とした（図９）。Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を用いて、Ｕｖｅ１ｐの切断の特異的部位を同定した。なぜなら、白金−ＤＮＡ二付加物は、この部位での二重鎖ＤＮＡの消化を終結または開始するからである（Ｒｏｙｅｒ−Ｐｏｋｏｒａら［１９８１］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：４５９５−４６０９；Ｔｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．およびＬｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．［１９８１］Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：４６２０−４６２２）。５’末端標識Ｐｔ−ＧＧ−３２マーとエキソヌクレアーゼＩＩＩとのインキュベーション（図９、レーン３）は、３’ヒドロキシル末端を有する５’末端標識オリゴヌクレオチドフラグメントを生成する。同じ基質のＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの配列決定（図９、レーン１）は、３’ホスホリル末端を有する５’末端標識フラグメントを生成し、このフラグメントは結果として、ＤＮＡ配列決定型ゲルにおいてエキソヌクレアーゼＩＩＩ産物よりも速く移動する。（ヒドラジンとの過剰反応に起因して、全てのヌクレオチドは、配列決定レーンにおいて強調される。）ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐは、Ｐｔ−ＧＧ−３２マーを２つの隣接部位でＧｐＧ付加位置に対して５’側で切断した（図９、レーン４、矢印ｃおよびｄ）。産物ｃ）およびｄ）は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ産物とともに移動し、このことにより、これらが３’ヒドロキシル末端を有することが確認される。ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ配列決定ラダーとの比較により（図９、レーン１）、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ媒介切断産物は、白金ＤＮＡ−ＧＧ二付加物に対して２ヌクレオチドおよび３ヌクレオチド５’側に位置する部位での切断によって生成されることが示される。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ媒介切断産物は、ホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析によって定量され、そして主な部位ｃ（矢印ｃ）での切断が、形成される総産物の約９０％を占め、一方、二次的な部位（矢印ｄ）での切断は残りの１０％を占めることが決定された。対照的に、Δ２２８−Ｕｖｅ１ｐは、Ｐｔ−ＧＧ−３２マーを主な部位ｃ（すなわち、損傷に対して２ヌクレオチド５’側）でのみ切断するようであった（図９、レ��ン５）。用いられるタンパク質の量および形成される産物の合計量が考慮される場合、Ｕｖｅ１ｐによるＰｔ−ＧＧ−３２マーの切断は、ＵＶ誘導性光生成物の切断よりも少なくとも１００倍効率が低いようである。効率におけるこの有意な減少にもかかわらず、Ｐｔ−ＧＧ−３２マーは、乏しい効率にもかかわらず、Ｕｖｅ１ｐについての基質であり、そしてより重要なことには、Ｕｖｅ１ｐは、非ＵＶ光生成物ダイマー傷害を認識し得、そして切断し得る。
【００４５】
Ｕｖｅ１ｐは、嵩高くないＤＮＡ損傷を含む基質に対して活性である。Ｕｖｅ１ｐが非ＵＶ光生成物ＤＮＡ二付加物を認識し、そして切断する能力は、本発明者らが他の型の塩基損傷がまた、この用途の広いエンドヌクレアーゼにより認識され得るか否かを調査するのを促した。これらの損傷としては、無塩基性部位（ＡＰ部位ｓ）、ウラシル（Ｕ）、ジヒドロウラシル（ＤＨＵ）、イノシン（Ｉ）、キサンチン（Ｘｎ）および８−オキソグアニン（８−ｏｘｏＧ）（スキーム１Ｃ）が挙げられた。これらの研究について、本発明者らは、分子の中心付近でかつ同じＤＮＡ配列状況において配置される損傷を有する３７マーオリゴヌクレオチド基質を利用した（表１Ｂ）。これらのオリゴヌクレオチドであるＡｐ−３７マー、Ｕ−３７マー、ＤＨＵ−３７マー、および８−ｏｘｏＧ−３７マーを、種々のＵｖｅ１ｐ調製物とともにインキュベートし、そしてこの反応産物を、ＤＮＡ配列決定型ゲルにおいて分析した。さらに、イノシンを含む３１マーオリゴヌクレオチド（Ｉ−３１マー）およびキサンチンを含む３１マーオリゴヌクレオチド（Ｘｎ−３１マー）をまた、潜在的Ｕｖｅ１ｐ基質として試験した（表１Ａ）。
【００４６】
無塩基性部位（ＡＰ部位）は、Ｎ−グリコシル結合の自然加水分解から、および損傷塩基のＤＮＡグリコシラーゼ媒介修復の中間体としてＤＮＡ中に生じる（Ｓａｋｕｍｉ，Ｋ．およびＳｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．［１９９０］Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２３６：１６１−１７２）。ＡＰエンドヌクレアーゼは、この部位に対して５’側を加水分解的に切断して、３’ヒドロキシル末端を生じる。ＡＰリアーゼは、β除去機構によって切断して、３’−αβ不飽和アルデヒドを残す（Ｓｐｉｅｒｉｎｇ，Ａ．Ｌ．およびＤｅｕｔｓｃｈ，Ｗ．Ａ．［１９８１］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３２２２−３２２８）。Ｕｖｅ１ｐがＡＰ部位を切断するか否かを決定するために、本発明者らは、アフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐおよびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、ならびにＧ残基を逆に配置したＡＰ部位を含む５’末端標識オリゴヌクレオチド基質（ＡＰ／Ｇ−３７マー）を有するＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを発現する細胞の粗抽出物をインキュベートした。この産物を、先のようにＤＮＡ配列決定型ゲルで分析した（それぞれ、図１０Ａ、レーン３、４および５）。Ｕｖｅ１ｐ調製物を用いてインキュベーションの間に形成される切断産物が、β−除去機構または加水分解性の切断に起因したか否かをＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩ（これは、関連したＡＰリアーゼ活性を有する）およびＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ（加水分解性のＡＰエンドヌクレアーゼ）を用いて決定した（それぞれ、図１０Ａ、レーン２および６）。Ｕｖｅ１ｐは、このオリゴヌクレオチド基質中のＡＰ部位を認識し、そしてこれをＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶと同様の様式で切断した。Ｕｖｅ１ｐタンパク質を、ＡＰ部位がアデノシン残基とは逆に配置されているオリゴヌクレオチド基質（ＡＰ／Ａ−３７マー）とともにインキュベートすることにより、形成される切断産物の量は、有意な変化がないこととなった。ＡＰ部位のＵｖｅ１ｐ認識をさらに試験するために、本発明者らは、非標識ｃｓ−ＣＰＤ−３０マーをＵｖｅ１ｐについての特異的競合者として用いた。精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを有する５’末端標識ＡＰ／Ｇ−３７マーの反応物への４０×非標識ＣＰＤ−３０マーの添加は、形成される産物量の約６０％の減少を生じた。４０×非標識非損傷３０マー（ＵＤ−３０マー）の添加は、観察される産物の量に何の影響も有なかった。Ｕｖｅ１ｐは、ＡＰ部位を認識し得、そして相補的塩基を変更することは、切断の程度に関してほとんどまたは全く効果を有さない。
【００４７】
ウラシル傷害は、シトシン残基の自然脱アミノによってＤＮＡ中に生じ得る。ジヒドロウラシルは、シトシンの脱アミノ、続いて無酸素条件下での電離放射線への曝露による環飽和によって形成されるピリミジン光生成物である（Ｄｉｚｄａｒｏｇｌｕら［１９９３］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１２１０５−１２１１１）。Ｕｖｅ１ｐがウラシルおよびジヒドロウラシルの傷害を認識するか否かを決定するために、本発明者らは、Ｕｖｅ１ｐの種々の調製物を、Ｇとは逆に配置されたウラシル残基およびＤＨＵ残基を含む３’末端標識３７マーオリゴヌクレオチド（Ｕ／Ｇ−３７マー、ＤＨＵ／Ｇ−３７マー）とともにインキュベートした。このセットの実験の結果を、表２にまとめる。精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐは、Ｕ／Ｇ−３７マーおよびＤＨＵ／Ｇ−３７マーを代表的なＵｖｅ１ｐ媒介様式で切断した：傷害の位置のすぐ５’側では主な産物が形成され、そしてさらに損傷した部位の１ヌクレオチド５’側では、副次的な産物が形成され、それぞれ、総Ｕｖｅ１ｐ媒介切断産物の９０％および１０％である。
【００４８】
複製によるウラシル傷害およびＤＨＵ傷害の存続は、損傷塩基とは逆のアデニン残基の取り込みをもたらし得る。ウラシルおよびＤＨＵがアデニン残基と塩基対合していた場合にＵｖｅ１ｐがこれらを認識することが等しく効率的であるか否かを調べるために、本発明者らは、基質Ｕ／Ａ−３７マーおよびＤＨＵ／Ａ−３７マーを構築した。これらの基質のＵｖｅ１ｐ切断の分析から得られた結果を、表２にまとめる。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを発現する細胞からの粗抽出物および精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐをＵ／Ａ−３７マーとともにインキュベートした場合、Ｕｖｅ１ｐ媒介切断産物は全く観察されなかった。精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐをＤＨＵ／Ａ−３７マーとともにインキュベートすることは、ＤＨＵ／Ｇ−３７マーとともにインキュベートすることよりも、観察されたＵｖｅ１ｐ媒介切断産物の量を４倍減少させた。Ｕｖｅ１ｐがこれらの基質の相補鎖（すなわち、Ｕ／Ａ−３７マー、ＤＨＵ／Ａ−３７マー、またはＵ／Ｇ−３７マー、ＤＨＵ／Ｇ−３７マー）を切断するか否かを決定するために、本発明者らは、これらの基質を用いて、相補鎖が３’末端標識されていたこと以外は類似の実験を行った。これらの基質を精製Ｕｖｅ１ｐタンパク質調製物とともにインキュベートした場合には、切断産物は全く観察されなかった。Ｕｖｅ１ｐは、ウラシルおよびＤＨＵがＧの逆に配置される場合（Ｕ／ＧまたはＤＨＵ／Ｇ）、これらを認識し、そして切断する。しかし、これらの傷害がＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合が保持される状態に置かれる場合（Ｕ／ＡまたはＤＨＵ／Ａ）、Ｕｖｅ１ｐが傷害を完全に認識することができないか（Ｕ／Ａ）、または切断の程度が有意に減少する（ＤＨＵ／Ｇ）かのいずれかである。
【００４９】
Ｕｖｅ１ｐは、ＡＰ部位、ウラシル傷害、およびＤＨＵ傷害を含むオリゴヌクレオチド基質を認識し、そして切断する。ＡＰ部位は、ウラシルまたはＤＨＵを含有するオリゴヌクレオチドよりも良好なＵｖｅ１ｐについての基質であるようである；Ｕｖｅ１ｐは、ＡＰ部位をウラシル含有基質よりも少なくとも１０倍効率的に、そしてＤＨＵ含有基質の２倍効率的に切断した。しかし、これらは全て、ＵＶ誘導性光生成物よりも乏しい基質である。種々の基質に対するＵｖｅ１ｐによる切断についての相対的効率のまとめについて表３を参照のこと。
【００５０】
さらに、Ｕｖｅ１ｐ調製物を、以下の基質とともにインキュベートして、これらの傷害がＵｖｅ１ｐによって切断され得るか否かを決定した：ＴまたはＣの反対側に配置されたイノシンおよびキサンチン（Ｉ／Ｔ−３１マー、Ｉ／Ｃ−３１マー、およびＸｎ／Ｔ−３１マー、Ｘｎ／Ｃ−３１マー）、ならびに４つ全ての塩基の反対側に配置された８−オキソグアニン（８−オキソＧ／Ｇ−３７マー、８−オキソＧ／Ａ−３７マー、８−オキソＧ／Ｔ３７マー、８−オキソＧ／Ｃ−３７マー）。これらの二重鎖基質のいずれかの鎖の切断は、全く観察されなかった。
【００５１】
本明細書中上記で考察されるように、ＣＰＤと６−４ＰＰとの間の実質的な構造の相違によって、損傷したＤＮＡ  Ｕｖｅ１ｐのどの特徴が認識されるかは明らかでなかった。１つの可能性は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合は、ＣＰＤおよび６−４ＰＰの両方における３’ピリミジンについて乱されることである（Ｊｉｎｇら［１９９８］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：３８４５−３８５３）。このことは、Ｕｖｅ１ｐが、その活性を二重鎖ＤＮＡ中の誤対合した（ｍｉｓｐａｉｒｅｄ）塩基へと標的化し得ることを示唆する。それゆえ、本発明者らは、精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐが、同じ隣接配列状況に埋め込まれた単一塩基の誤対合の全ての可能な組合せを含む二重鎖オリゴヌクレオチドを切断する能力について調べた。これらの研究について、本発明者らは、全ての可能なミスマッチの組合せを生成するように設計されたミスマッチを含有するオリゴヌクレオチド（一連のＸＹ−３１マー）のコレクションを利用した（表１Ｂ）。鎖ＧＸ、鎖ＡＸ、鎖ＴＸおよび鎖ＣＸを３’末端で標識し、次いで精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐとともにインキュベートする前に鎖ＧＹ、鎖ＡＹ、鎖ＴＹまたは鎖ＣＹへとアニーリングした。反応産物をＤＮＡ配列決定型ゲルで分析した（実施例を参照のこと）。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐが１２個の全ての可能な誤対合した組合せを切断する能力を、図７Ａ〜図７Ｄに示す。ＤＮＡ鎖の切断は、正常なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  Ｇ／Ｃ塩基対またはＡ／Ｔ塩基対を含有する二重鎖基質について全く観察されなかった。
【００５２】
ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ媒介ミスマッチ特異的ＤＮＡ切断の部位を、塩基特異的化学切断により得られたＤＮＡ配列決定ラダーの移動度に対してＤＮＡ鎖切断産物の電気泳動移動度を比較することによって、各場合において同定した。矢印ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、ミスマッチの部位のすぐ５’側（０位）、１ヌクレオチド５’側（−１位）、２ヌクレオチド５’側（−２位）のＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐによる切断に対応するＤＮＡ鎖切断産物を示す（図７Ａ〜Ｄ）。これらのＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ媒介エンドヌクレオチド分解性切断の部位は、ミスマッチ基質において５’末端標識したＧＸ鎖、ＡＸ鎖、ＴＸ鎖、およびＣＸ鎖を用いる同様の実験で確認された。さらに、非短縮全長ＧＦＬ−Ｕｖｅ１ｐ（粗細胞抽出液中）は、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐと同一の様式で*ＣＸ−ＡＹ−３１マーを認識し、そして切断した（図１１Ｂ）。各ミスマッチがＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐにより認識される好ましい切断部位および効率は、可変であり、そして酵素に対して提示される塩基誤対合のタイプに依存する。試験した配列状況では、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐは、＊Ｃ／Ｃ（アスタリスク−標識された鎖塩基）、*Ｃ／Ａ、および*Ｇ／Ｇの部位で強い切断を示し、*Ｇ／Ａ、*Ａ／Ｇおよび*Ｔ／Ｇの部位で中程度の切断を示し、そして*Ｇ／Ｔ、*Ａ／Ａ、*Ａ／Ｃ、*Ｃ／Ｔ、*Ｔ／Ｔおよび*Ｔ／Ｃの部位で弱い切断を示す。これらの切断程度の差異は、再現性があり、そして３つの別個の実験において観察された。これらの結果は、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ活性が、他（例えば、*Ｔ／Ｃ）よりも特定の塩基ミスマッチ組み合わせ（例えば、*Ｃ／Ａ）に対する優先性を有することを示す。しかし、これらの実験は、ミスマッチに隣接する配列による切断に対する効果を除外しない。
【００５３】
Ｕｖｅ１ｐは、光生成物部位に対してすぐ５’側でＣＰＤおよび６−４ＰＰを含むＤＮＡに切れ込みを入れて３’−ヒドロキシル基および５’ホスホリル基を含む産物を生成することが示されている（Ｂｏｗｍａｎら［１９９４］前出）。本発明者らは、塩基ミスマッチ含有基質のＵｖｅ１ｐ媒介切断後に同様の３’末端および５’末端が生成されるか否かを調べた。３’末端標識したオリゴ*ＣＸ／ＡＹ−３１マー（ＣＸ鎖を標識した、表１Ｂ）のＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ切断により生成されたＤＮＡ鎖切断産物を、基質ＤＮＡから５’末端ホスホリル基を除去するウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）でさらに処理した。塩基の誤対合部位に対するＵｖｅ１ｐ媒介ＤＮＡ切断の主要部位は、０位および−１位にあることが見出された（図１１Ａ、レーン２）。これらのＤＮＡ切断産物のＣＩＰ処理は、非ＣＩＰ処理ＤＮＡ切断産物に比較して遅れた電気泳動移動度を有する種を生じた。このことは、５’末端ホスホリル基の除去に対応する電荷の減少を示す（図１１Ａ、レーン２および３）。さらに、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ生成ＤＮＡ切断産物は、ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化に耐性であった。これは、５’末端がすでにホスホリル基を含む場合の予想された結果である（図１１Ａ、レーン４）。５’末端標識*ＣＸ／ＡＹ３１マー、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、およびα32Ｐ−ジデオキシＡＴＰ（ｄｄＡＴＰ）を用いる電気泳動移動度シフト分析は、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ生成ＤＮＡ切断産物の３’末端への単一のｄｄＡＭＰの付加を生じた。この分析は、３’ヒドロキシル末端の存在を示す。これらの結果は、単一塩基ミスマッチを含む基質のＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ媒介切断の産物の３’末端および５’末端がＣＰＤまたは６−４ＰＰを含む基質の切断後に生成された３’末端および５’末端と同一であることを示す。
【００５４】
観察されたＵｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ活性がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現系からの微量のエンドヌクレオチド分解性混入の結果ではないことを確認するために、および全長Ｕｖｅ１ｐもまたミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を可能にするか否かを決定するために、ＧＦＬ−ＵＶｅ１ｐ、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、およびＧＳＴタグ単独を過剰発現する細胞からの抽出物を、５’末端標識した*ＣＸ／ＡＹ−３１マーを切断するそれらの能力について試験した。ＧＦＬ−ＵＶｅ１ｐおよびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐはともに、０位、−１位、および−２位で塩基ミスマッチ含有基質を切断した（図１１Ｂ）。本発明者らはまた、粗ＧＦＬ−Ｕｖｅ１ｐ調製物および精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの両方と関連した弱い３’→５’エキソヌクレオチド分解活性を観察した。これは、Ｕｂｅ１ｐ媒介切断産物を１〜３ヌクレオチド短縮した（図１１Ｂ、レーン１および２）。これらの短い方の産物は、Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ活性によるさらなる切断に起因しない。なぜなら、それらは、３’末端標識基質を用いる同一の実験においては観察されないからである。ＧＳＴタグのトロンビン切断後に得られた精製Δ２２８−Ｕｖｅ１ｐもまた、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を保有した。対照的に、ＧＳＴタグのみを発現するベクターでトランスフェクトした細胞からの抽出物を試験した場合、ミスマッチ含有基質の切断は全く観察されなかった。従って、ＧＦＬ−Ｕｖｅ１ｐおよびそのより安定な短縮型のＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐはともに、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を保有した。
【００５５】
ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼおよびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ  ＵＶ光生成物エンドヌクレアーゼは、同様の特性を共有し、同じ基質について競合する。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐは、活性について二価カチオンを必要とし、そして１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍＭ  ＭｎＣｌ2の存在下でＵＶ光生成物に対する至適活性を示す。反応緩衝液から二価カチオンを除くと、５’末端標識*ＣＳ／ＡＹ−３１マーに対するＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ活性がなくなった。この同じ基質に対するＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ活性についての至適ｐＨは、６．５であることが見出された。これは、至適活性がＵＢ光生成物に対して観察された場合のｐＨに対応する。
【００５６】
ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性がＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐによって媒介されたことをさらに確認するために、ＣＰＤ−３０マーを用いて基質競合実験を行った。ＣＰＤ−３０マーは、中心に配置されたＵＶ光生成物（ＣＰＤ）を含む公知のＵｖｅ１ｐ基質である。漸増の未標識ＣＰＤ−３０マーの添加により、３’末端標識*ＣＸ／ＡＹ３１マー（Ｃ／Ａ誤対合）に対するＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ媒介ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性の有意な濃度依存性減少が生じた（図１２）。対照的に、漸増の非損傷オリゴＧＸ／ＣＹ−３１マー（Ｇ／Ｃ塩基対）は、中程度のみの阻害効果を有し、そして阻害は、添加したオリゴの量が増大しても増大しなかった。このことは、この濃度範囲内でのＵｖｅ１ｐへの非特異的結合を示す。同様の実験において、未標識ＣＰＤ−３０マーおよびＣＸ／ＡＹ−３１マー（Ｃ／Ａ誤対合）は共に、未標識ＧＸ／ＣＹ−３１マーに比較してより強力な３’末端標識*ＣＸ／ＡＹ−３１マー切断インヒビターであった。ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性に対するＣＰＤ−３０マーによる有効な競合は、塩基ミスマッチおよびＵＶ光生成物エンドヌクレアーゼ活性がともにＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐと関連することを示す。
【００５７】
Ｕｖｅ１ｐは、塩基ミスマッチを含む二重鎖の一方の鎖のみに切れ込みを入れる。Ｕｖｅ１ｐは、全ての可能な塩基ミスマッチ組み合わせを認識するので、本発明者らは、この酵素が同じ分子上で両鎖に切れ込みを入れて、ＤＮＡ二本鎖切断を生じるか否かを決定した。オリゴヌクレオチド（*ＣＸ／ＡＹ−４１マー）を、塩基誤対合をオリゴヌクレオチドの中心部に配置するように設計した。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを、標準条件下で３’末端標識した*ＣＳ／ＡＹ−４１マーとともにインキュベートし、そしてＤＮＡ鎖切断産物を未変性ゲルおよび変性ゲルの両方において分析した（図１３Ａ〜１３Ｂ）。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐが、２つの相補鎖上の塩基ミスマッチ部位の５’側に切れ込みを入れることによりＤＮＡ二重鎖切断を生じる場合には、得られる産物は、非変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した場合、制限酵素ＤｄｅＩ（これは、ミスマッチに隣接して切断する）により作製された産物と同様の電気泳動移動度を有する。対照的に、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐがいずれかの（しかし両方ではない）相補鎖に切れ込みを入れた場合、得られた産物は、未変性ゲル上で未切断の二重鎖*ＣＸ／ＡＹ−４１マーと共に移動する、一本の鎖切れ目を含む全長二重鎖である。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ処理*ＣＸ／ＡＹ−４１マーの未変性ゲル分析は、未処理二重鎖と同一の電気泳動移動度を有する産物を生成し、二本鎖切断により生成されたものに相当する産物は検出されなかった（図１３Ａ）。変性ゲル分析は、*ＣＸ／ＡＹ−４１マーまたはＣＸ／*ＧＹ−４１マーのいずれかの標識した鎖の一本鎖切断から生じるＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ生成ＤＮＡ鎖切断産物を明らかにした。未変性ゲル分析と共に、これらの結果は、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ基質集団内で、切れ目が、一方または他方の鎖で生じるが、両方の鎖では生じないことを示す（図１３Ｂ）。これらの結果は、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐが、塩基ミスマッチを含む２つの鎖の一方のみに切れ目を入れること、およびそれは、二重鎖ＤＮＡにおいて二重鎖切断を生じないことを示す。同様に、二本鎖切断は、他の構造的ゆがみを含むＤＮＡ分子では生じない。
【００５８】
理論によって縛られることを望まないが、ＧΔ２８８−Ｕｖｅ１ｐは、３’末端に対する鎖特異性を有すると考えられる。二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチした塩基は、塩基の両方とも、通常、それ自体損傷を受けていない点で損傷ＤＮＡとは異なり、しかも二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチした塩基は、ヌクレオチド配列において不適当な変化であり、それとして同定され、除去されなければならない。Ｕｖｅ１ｐがインビボでＭＭＲに関与する場合、誤対合において正しい塩基と正しくない塩基とをいかにして識別するのか。１つの可能性は、誤対合した塩基が３’末端または５’末端のいずれかに対して近位にあることが、Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を特定の鎖に対して標的化することである。例えば、ＤＮＡ合成において、鎖成長は、５’末端から３’末端へと進行しそして、合成鎖における新たに生じる塩基の誤った取り込みは、３’末端に対して近接して位置する。ミスマッチ修復タンパク質によるこのような塩基の除去の開始は、３’末端付近のＤＮＡ領域と会合し、続いてその鎖上に位置する誤対合した塩基を標的とすることを包含する。この可能性を調査するために、末端から種々の距離に位置するＣ／Ａ誤対合を含む、一連の３’末端標識したオリゴヌクレオチドを生成した（表１Ｂ）。３’末端から（Ｃ／Ａ誤対合の）Ｃの距離の関数としての、Ｃ含有鎖に切れ込みを入れるＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの能力を、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼ生成ＤＮＡ鎖切断産物を定量し、次いで変性ゲル分析を行うことによって評価した。ミスマッチ切断の最小レベルは、３’末端から１６ｂｐの距離でのＣについて観察され、そして３’末端から１６ｂｐの距離でＣについて最大まで漸増した。３’末端に対してＣがより近くに配置されること（１１ｂｐ）により、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性の減少が生じ、活性の完全な損失は３’末端から６ｂｐの距離で観察された。３’末端に対して最も近接して鎖上に位置するミスマッチした塩基が、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐによって優先的に切断される。
【００５９】
ｕｖｅ１ヌル変異体は、ミューテーター表現型を示す。本発明者らは、毒性アルギニンアナログであるＬ−カナバニンに耐性のコロニーを形成する能力によってアッセイされるように、ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+破壊変異体の自然変異率を調べた。Ｓ．ｐｏｍｂｅにおけるＬ−カナバニンの取り込みは、ｃａｎ１+遺伝子によってコードされるアルギニン透過酵素によって媒介される（Ｆａｎｔｅｓ、Ｐ．およびＣｒｅａｎｏｒ、Ｊ．［１９８４］Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：３２６５−３２７３）。ｃａｎ１+遺伝子における変異は、Ｌ−カナバニンの取り込みを除去し、変異体細胞は、Ｌ−カナバニンを補充した培地上にコロニーを形成し得、一方、野生型細胞はコロニーを形成し得なかった。本発明者らは、陰性コントロール（野生型、９７２）および陽性コントロールであるｐｍｓ１：：ｕｒａ４+の両方に対して、ｕｖｅ１：ｕｒａ４+破壊変異体（Ｓｐ３６２）におけるＣａｎ１+遺伝子座の自然変異誘発率を比較した（本明細書以下の実施例１１を参照のこと）。ｐｍｓ１遺伝子産物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭｕｔＬのホモログであり、そしてｐｍｓ１の欠損は、強い有糸分裂ミューテーター表現型および増大した減数分裂後分離を引き起こす（Ｓｃｈａｒら［１９９７］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４６：１２７５−１２８６）。
【００６０】
Ｌ−カナバニンに対する各酵母株の相対的感度を決定するために、対数中期培養物由来の２００個の細胞を、漸増濃度のＬ−カナバニンを補充したＰＭＡＬＵgプレート上にプレーティングした。株の各々は、Ｌ−カナバニンに対して等しく感受性であった。全ての株は、２．２μｇ／ｍｌまで（２．２μｇ／ｍｌの濃度を含む）のより低い濃度のＬ−カナバニンの存在下では生存していたが、これより高い濃度は、全ての株に対して毒性であった。しかし、２．２μｇ／ｍｌのＬ−カナバニンの存在下で増殖するコロニーは、より低い濃度の存在下で増殖するコロニーよりも直径が小さかった。
【００６１】
３つの株の各々の平均自然変異率を、ゆらぎ分析を用いて調べた。ＰＭＡＬＵgプレート上で増殖した単一コロニーを使用して、液体ＰＭＡＬＵg培養物を接種し、飽和まで増殖させた。７５μｇ／ｍｌのＬ−硫酸カナバニンを含むＰＭＡＬＵg上に、１０7個の細胞をプレートした。各株についての２４枚のプレート上のコロニーの数を、３０℃で８日のインキュベーションの後に数えた。ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+株およびｐｍｓ１：：ｕｒａ４+株はともに、野生型に比較して多くの数の耐性コロニーを示した。さらに、ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+についての値の範囲は、野生型またはｐｍｓ１：：ｕｒａ４+のいずれよりも広く、かつ高かった。これは、５０００より多くのコロニーを含むとしてスコア付けされた２つのコンフルエントなプレートを含んだ。平均変異率は、メジアン値を使用するメジアンの方法（ＬｅａおよびＣｏｌｕｓｏｎ［１９４３］Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．４９：２６４−２８４）を用いて概算した。計算された変異率は、１．５×１０-7（野生型）、９．７×１０-7（ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+）、および２．０×１０-6（ｐｍｓ１：：ｕｒａ４+）である。このことは、ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+変異体が、野生型より約６．５倍高く、そしてｐｍｓ１：：ｕｒａ４+より２倍低い自然変異率を有することを示す。結果の要旨については表４を参照のこと。従って、Ｕｖｅ１ｐの欠損は、Ｓ．ｐｏｍｐｅにおいて自然ミューテーター表現型を付与する。変異ゆらぎ分析では、ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+に比較して、ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+についての広範な変異体コロニーが観察された。このことは、ｕｖｅ１およびｐｍｓ１の除去に起因する変異に至る経路は、機構的に（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃａｌｌｙ）異なるようであることを示唆する。
【００６２】
Ｕｖｅ１ｐは全ての可能なＤＮＡ塩基誤対合の組み合わせを認識するという所見は、ＵＶ光生成物切断活性に加えて、それが、広範な基質特異性を有する多様なミスマッチエンドヌクレアーゼであることを示す。この点において、Ｕｖｅ１ｐはＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（Ｙａｏ、ＭおよびＫｏｗ、Ｙ．Ｗ．［１９９４］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１３９０−３１３９６）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびヒト「全タイプ」ミスマッチエンドヌクレアーゼ（Ｃｈａｎｇ、Ｄ．Ｙ．およびＬｕ、Ａ．Ｌ．［１９９１］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４７６１−４７６６；Ｙｅｈら［１９９１］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６４８０−６４８４）およびウシ胸腺トポイソメラーゼＩ（Ｙｅｈら［１９９１］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５４９８−１５５０４）（これらもまた、全ての可能な塩基ミスマッチの組み合わせを認識する）に類似する。これらの酵素は、種々の効率で１２個の塩基誤対合の各々で、そしてミスマッチの５’側（ヒト全タイプミスマッチエンドヌクレアーゼ）または３’側（Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ）のいずれかに対して、ＤＮＡに切れ込みを入れる。Ｕｖｅ１ｐは、*Ｃ／Ｃ誤対合および*Ｃ／Ａ誤対合に対する優先性を示し、これは、ヒト全タイプミスマッチエンドヌクレアーゼに類似の特性である（Ｙｅｈら［１９９１］前出）。対照的に、*Ｇ／Ｇ誤対合に対するＵｖｅ１ｐの強い優先性は、これまでに同定された全ての他のミスマッチエンドヌクレアーゼからＵｖｅ１ｐを識別する特性である。
【００６３】
ｕｖｅ１ヌル変体によって示されるＵｖｅ１ｐ媒介性ミスマッチ切断および偶発ミューテーターの表現型の生化学的性質は、Ｕｖｅ１ｐがインビボにおいてＭＭＲに関与することを示唆する。３’末端に最も近い誤対合を形成した塩基を有する鎖での切開を作製する優先性は、複製の間に、新たに誤って取り込まれた塩基を特異的に標的化し得る区別化戦略をもたらす。塩基のミスマッチ部位の５’側で、Ｕｖｅ１ｐによって生成された切開の後、Ｓ．ｐｏｍｂｅエキソヌクレアーゼＩ（Ｓｚａｎｋａｓｉ、Ｐ．およびＳｍｉｔｈ、Ｇ．Ｒ．［１９９５］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１１６６〜１１６９）またはＦＥＮ−１ホモログのＲａｄ２ｐ（Ａｌｌｅｖａ、Ｊ．Ｌ．およびＤｏｅｔｓｃｈ、Ｐ．Ｗ．［１９９８］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２６４５〜３６５０）によって媒介されるような５’から３’へのエクソヌクレアーゼ活性が続き得、再合成およびライゲーションが続き得る。
【００６４】
Ｓ．ｐｏｍｂｅは、少なくとも２つの異なるミスマッチ修復系を有し、Ｕｖｅ１ｐはこれらのいずれかにおいて役割を媒介するか、または第３の新規の現在未知の経路を代表する。提案される主要な経路は、Ｃ／Ｃミスマッチを認識せず、そして比較的長い（約１００ヌクレオチド）修復鎖を有する（Ｓｃｈａｒ、Ｐ．およびＫｏｈｌｉ、Ｊ．［１９９３］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３３：８２５〜８３５）。Ｕｖｅ１ｐは、Ｒａｄ２ｐ（ＦＥＮ−１ホモログ）ＤＮＡポリメラーゼδ、ＤＮＡリガーゼおよび補助因子を利用する比較的短い鎖の修復プロセスに関与すると考えられている（Ａｌｌｅｖａら、［１９９８］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３６４５〜３６５０）。これらの性質に基づくと、Ｕｖｅ１ｐは長い鎖のミスマッチ修復系に関与しないようである。第２に、おそらくより低頻度で使用される（代替的な）経路は、全ての可能な塩基ミスマッチの組み合わせを認識し、そして約１０ヌクレオチドの長さの鎖を修復する（ＳｃｈａｒおよびＫｏｈｌｉ［１９９３］前出）。代替的なミスマッチ修復のこれらの特徴は、Ｃ／Ｃミスマッチの認識および短い修復鎖に基づくＵｖｅ１ｐの修復の性質と一致する。
【００６５】
ＵＶ光生成物の修復とは異なり、ミスマッチ修復において、取り除かれる必要があるヌクレオチドを、どちらの塩基が示すのかは、明らかでない。このことは、Ｕｖｅ１ｐが二重鎖の３’末端近傍に存在するミスマッチ塩基を優先するという発明者らの知見によって説明し得、そしてこのことは、ＤＮＡ複製の間のリーディング鎖またはラギング鎖のいずれかの合成についてのミスマッチ修復を媒介するＵｖｅ１ｐと一致する。３’末端に最も近い塩基の鎖上に切開を作製することについての優先性は、新たに合成された誤って取り込まれた塩基を特異的に標的化する区別化戦略を示唆する。他方、Ｇ／Ｇ、Ｃ／Ｃミスマッチは、複製の間の、頻繁に生じる塩基の誤った取り込みではないが、これらはとりわけ、最も効率的にＵｖｅ１ｐによって切断される。Ｕｖｅ１ｐの第２の役割は、Ｇ／ＧおよびＣ／Ｃミスマッチが生じることが予測される相同組換え事象の結果として形成されるミスマッチ塩基の修正である。Ｕｖｅ１ｐの第３の役割は、複製の間のプライマー−鋳型のミスアラインメントの結果として生成される塩基のバルジおよびループの修復においてである。初期の研究は、Ｕｖｅ１ｐが小さなバルジに対する５’鎖切断を媒介することを示す。
【００６６】
Ｕｖｅ１ｐによって認識される損傷についての構造的な基礎は何であろうか。Ｕｖｅ１ｐを用いる以前の研究は、ＵＶ光によって誘導されるＤＮＡ損傷の修復におけるその役割に、もっぱら焦点をあて、この酵素がもっぱらＵＶ光生成物の修復において機能するという認識を生じ、それゆえ、以前のＵＶＤＥ（ＵＶ損傷エンドヌクレアーゼ）は、現在は、Ｕｖｅ１ｐである。この研究の結果は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ＤＮＡ修復におけるＵｖｅ１ｐのかなりより広い関与を明らかに示し、そして多くの他のタイプのＤＮＡ損傷が、この汎用性のある修復タンパク質によって認識されることを示す。例えば、本発明者らは、Ｕｖｅ１ｐがウラシル、ジヒドロウラシル、シスプラチン−誘導性付加物、および小さな塩基バルジを含むＤＮＡ基質を認識し、そして切開することを最近見出した。Ｕｖｅ１ｐによる基質認識の分子的基礎は、自明ではないが（理論に拘束されることを望まないが）、正常のワトソン−クリック塩基対合の破壊、およびＢ−ＤＮＡの深いほうの溝および浅いほうの溝の電気的特徴において予測される対応する変化に、一部起因すると考えられる。
【００６７】
ＣＰＤｓおよび６−４ＰＰａを含む、ＵＶ損傷を含んだＤＮＡの修復の開始に加えて、本発明のＵＶＤＥおよび短縮型ＵＶＤＥポリペプチド（Δ２２８−ＵＶＤＥおよび／またはＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ）もまた、以下の塩基対ミスマッチを含有するＤＮＡ二重鎖の切断を介して、修復を開始する：Ｃ／Ａ；Ｇ／Ａ；Ｇ／Ｇ；Ａ／Ａ；およびＣ／Ｔ。これらの実験を、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥを用いて行った。本発明者らはまた、Ｃ／ＡミスマッチがΔ２２８−ＵＶＤＥによって切断されることを確認した；Δ２２８−ＵＶＤＥはまた、他のミスマッチも認識するはずである。さらに、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの両方が、抗腫瘍剤シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（シスプラチンとしても公知）によって形成されるＧＧ−白金二付加物を含むオリゴヌクレオチドを、認識し、そして切断する。従って、ＵＶＤＥの基質特異性の範囲は、最初に考えられていたよりも、ずっと広い。ミスマッチ修復を開始する短縮型ＵＶＤＥポリペプチドの認識は、おそらく、実質的に精製された形態の、本明細書において例示される短縮型ＵＶＤＥポリペプチドの増加した安定性に、起因する。
【００６８】
日光への曝露に関連する皮膚癌は、世界中で最も一般的なヒトの癌である。日光への曝露に由来する初期のＤＮＡ損傷は、６−４ＰＰおよびＣＰＤである。ＵＶＤＥは、ＤＮＡ修復における欠損細胞を増強するので、本発明の安定な短縮ＵＶＤＥフラグメントは、日光感受性の個体および皮膚癌易発性個体（例えば、遺伝性疾患の色素性乾皮症）におけるＤＮＡ修復欠損の矯正のための有用な治療剤である。さらに、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥを、正常の個体における日光誘導性皮膚障害に対する保護剤として使用し得る。なぜなら、これらは、ＣＰＤおよび６−４Ｐｐおよび他のＤＮＡ損傷の現存するＤＮＡ修復レベルを増強し得るからである。
【００６９】
Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ＵＶＤＥタンパク質のホモログを、ＵＶＤＥアミノ酸配列：Ｎ．ｃｒａｓｓａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＢＡＡ７４５３９号）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第２４９７８２号）、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＦ１１４７８４．１号、メチル−ＣｐＧ結合エンドヌクレアーゼ）およびＴＩＧＲデータベースより見つけたＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ配列を使用して、配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ、ＴＩＧＲ）のＢＬＡＳＴ検索によって同定した。これらタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３６（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、配列番号３７（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、配列番号３８（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）および配列番号３９（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）において提供する。Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓのコード配列を、タンパク質が発現されるべき組換え宿主に従う遺伝子コードおよびコドン選択、またはＴＩＧＲデータベース（ｂｐ５４８２３とｂｐ６０９８１の間の領域内のＤ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓゲノム配列）において見出され得る天然のコード配列に従う遺伝子コードおよびコドン選択を使用して生成し得る。
【００７０】
前記のホモログにおいて最も保存されているＳ．ｐｏｍｂｅ  ＵＶＤＥタンパク質の領域は、配列番号２のアミノ酸４７４〜４８９、５３５〜５５３、５７８〜６１１、６４８〜６６７、７１１〜７３７および７５９〜７７５である。
【００７１】
本発明の安定な短縮型ＵＶＤＥ誘導体は、薬学的処方物の分野において十分理解されるように、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥを適切な生細胞へ送達し得る皮膚クリームの適用を介してか、またはその投与の経路に適切な組成物の他の投与経路を介して、シクロブタンピリミジン二量体または（６−４）光生成物またはＤＮＡミスマッチ、二本鎖ＤＮＡの構造中の無塩基部位または他の障害によって生じる疾患のための処置または予防のために有用である。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥまたはΔ２２８−ＵＶＤＥを、リポソーム中へ取り込み得、そしてリポソームを皮膚の表面に適用し得、それによってカプセル化されたＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥ産物が、皮膚の角質層外膜を横切り得、そして生皮膚細胞の内部へ送達し得る。リポソームを、当業者に公知の技術を使用して、調製し得る。好ましいリポソームは、ｐＨ感受性のリポソームである（細胞への取り込みを促進する）。ｐＨ感受性リポソームの調製は、Ｋｙｕｎｇ−Ｄａｌｌらに発行された米国特許第５，６４３，５９９号；およびＨｕａｎｇに発行された米国特許第４，９２５，６６１号に記載される。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥポリペプチドを、当業者に周知の任意の手順を使用して、リポソーム内に捕獲し得る。例えば、実施例およびＷａｓｓｅｆらに発行された米国特許第４，８６３，８７４号；Ｗｈｅａｔｌｅｙらに発行された米国特許第４，９２１，７５７号；Ｍａｒｔｉｎらに発行された米国特許第５，２２５，２１２号；ならびに／またはＹａｒｏｓｈに発行された米国特許第５，１９０，７６２号を参照のこと。
【００７２】
局所的投与に必要なリポソームの濃度は、培養標的皮膚細胞に対する、リポソーム内にカプセル化されたＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの生物学的効果を測定することによって決定され得る。一旦、皮膚細胞の内部に存在すると、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥまたはΔ２２８−ＵＶＤＥは、損傷ＤＮＡ分子中のＣＰＤまたは６−４Ｐｐを修復し、紫外光に曝露されることにより損傷した細胞の細胞生存を増加する。
【００７３】
ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、リポソーム内に捕獲されたＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの定量を可能とする。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの抗体もまた、皮膚細胞内での短縮型ＵＶＤＥポリペプチドの追跡を可能とする。
【００７４】
ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどが関与する酵素反応についての、クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準的な技術、ならびに種々の分離技術は、当業者にとって公知であり、そして一般に使用される。多数の標準的な技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｕ（編）（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１部；Ｗｕ（編）（１９７９）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（編）（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；ＳｃｈｌｅｉｆおよびＷｅｎｓｉｎｋ（１９８２）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；およびＳｅｔｌｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１〜４巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される。使用される省略および命名法は、当該分野において標準的であるものとみなされ、そして本明細書において引用されるもののような専門雑誌において一般に使用されるものとみなされる。
【００７５】
本願において引用される各参考文献を、本明細書において、本発明の開示と不一致を生じない程度で、参考として援用する。
【００７６】
以下の実施例は、説明の目的のために提供され、そして特許請求の範囲における本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者において生じる例示的な文献中の任意の改変が、本発明の範囲内にあることが、意図される。
【００７７】
（実施例）
（実施例１：株、酵素、プラスミドおよび遺伝子）
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をサブクローニングおよびプラスミド増殖のために使用した。タンパク質発現のために使用したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＹ１５０株、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＹＥＸ４Ｔ−１をＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）より購入した。
【００７８】
本研究において使用するＳ．ｐｏｍｂｅ株は、９７２、ｈ-s（Ｌｅｕｐｏｌｄ、Ｕ．［１９７０］Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４：１６９〜１７７）；ＰＲＳ３０１、ｈ-s  ｐｍｓ１：：ｕｒａ４+（Ｓｃｈａｒら、［１９９３］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４６：１２７５〜１２８６）；ＳＰ３０、ｈ-s  ａｄｅ６−２１０  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８（Ｄａｖｅｙら［１９９８］Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２７２１〜２７２８）を含む。Ｓｐ３６２（ｈ-s  ａｄｅ６−２１０  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８  ｕｖｅ１：：ｕｒａ４+）を、ｕｖｅ１+のヌクレオチド２１５（ＥｃｏＲＩ）〜１０４５（ＣｌａＩ）をｕｒａ４+遺伝子で置換したｐｇＵＶ２（Ｄａｖｅｙら、［１９９７］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１００５〜１００８）由来の直鎖状にしたゲノムｕｖｅ１+フラグメントで、Ｓｐ３０を形質転換することにより構築した。Ｓｐ３６２の抽出物は、ＣＰＤ−３０マーに対する検出可能なＵｖｅ１ｐ活性を含まなかった。培養物を、窒素源として塩化アンモニウムの代わりに３．７５ｇ／ｌのグルタミン酸塩を有し（Ｆａｎｔｅｓ、Ｐ．およびＣｒｅａｎｏｒ、Ｊ．［１９８４］Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：３２６５〜３２７３）、そして各１５０ｍｇ／ｌのアデニン、ロイシンおよびウラシルを補充した（ＰＭＡＬＵg）ｐｏｍｂｅ最少培地（ＰＭ）（Ｌｅｕｐｏｌｄ、Ｕ．［１９７０］前出）中で、増殖させた。固体培地を、２０ｇ／ｌの寒天の添加により調製した。硫酸Ｌ−カナバニンを培地への添加前に滅菌した。
【００７９】
精製したミスマッチ修復エンドヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（Ｙａｏ、Ｍ．およびＫｏｗ、Ｙ．Ｗ．［１９９７］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０７７４〜３０７７９）は、Ｙｏｋｅ  Ｗａｈ  Ｋｏｗ（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）からの贈与物であった。
【００８０】
（実施例２．Ｓ．ｐｏｍｂｅからのｕｖｄｅ（ｕｖｅ１）遺伝子の増幅）
ＡＴＣＣより購入したｃＤＮＡライブラリーを、センスプライマー：
【００８１】
【化１】
0004077157.tif 000002
（配列番号９）およびアンチセンスプライマー：
【００８２】
【化２】
0004077157.tif 000003
（配列番号１０）を使用して増幅した。目的の遺伝子フラグメントを以下の様式において増幅した。４００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｃＤＮＡライブラリー）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８５）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4および２００μＭのｄＮＴＰ中のＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の存在下で、上流および下流プライマー（３００ｎＭ）とともにインキュベートした。このＤＮＡを最初に９４℃で２分間変性した。９４℃１５秒の変性、４５℃３０秒のアニーリングおよび７２℃２分の伸長の３サイクルに、アニーリング温度として５０℃を使用する２０サイクルを続けた。全ての他のインキュベーション時間および温度は、同一であった。増幅を、７２℃７分間の最終プライマー伸長によって完了した。
【００８３】
（実施例３．Ｓ．ｐｏｍｂｅからのΔ２２８−ＵＶＤＥ遺伝子コードフラグメントの増幅）
ＰＣＲを使用して、Ｓ．ｐｏｍｂｅの全長ＵＶＤＥタンパク質のＮ末端部分より２２８アミノ酸の欠失を含むタンパク質産物をコードする、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｕｖｄｅの全長遺伝子の短縮型ＤＮＡフラグメントを生成した。ＰＣＲ反応において以下のプライマーを使用して、Δ２２８−ＵＶＤＥをコードする遺伝子フラグメントを増幅した：
センスプライマー
【００８４】
【化３】
0004077157.tif 000004
（配列番号１１）およびアンチセンスプライマー
【００８５】
【化４】
0004077157.tif 000005
（配列番号１２）。ＰＣＲ条件は、実施例２において記載されるものであった。
【００８６】
（実施例４．Δ２２８−ＵＶＤＥおよび全長ＵＶＤＥの精製）
増幅したＵＶＤＥ遺伝子コードフラグメントを、ｐＹＥＸ  ４Ｔ−１のＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ制限部位にクローニングした。Δ２２８−ＵＶＤＥ遺伝子コードフラグメントを、ｐＹＥＸ  ４Ｔ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ制限部位にクローニングした。ｐＹＥＸ  ４Ｔ−１ベクターにおいて、両方のタンパク質のコード領域は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）リーダー配列とともに同一フレーム内で発現させ、ＵＶＤＥのＮ末端に連結されたＧＳＴの融合タンパク質（ＣＵＰ１プロモーター（Ｗａｒｄら，１９９４）の制御下にある）を生成した。サブクローン化したプラスミドを制限分析によってその配向について調べ、次いでアルカリカチオン方法（Ｉｔｏら［１９８３］全出）を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＹ１５０細胞に形質転換した。単一の陽性クローンを拾い上げそして３０℃にて中間対数期まで増殖させた。中間対数期にある培養物を、０．５ｍＭ  ＣｕＳＯ4を用いて誘導した。細胞（５００ｍＬ）を誘導後２時間で回収し、そしてガラスビーズを用いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５％グリセロール（１０ｎｇ／ｍＬ  ペプスタチン、３ｎＮ  ロイペプチン、１４．５ｍＭベンズアミジン，および０．４ｍｇ／ｍＬアプロチニンの存在下）中で溶解した。次いで、細胞溶解物を、ＥＤＴＡを含まない緩衝液中で一晩透析した。全細胞ホモジネートを、４５，０００×ｇで２０分間遠心分離することによって、可溶性画分および不溶性画分に分離した。可溶性タンパク質（１２０ｍｇ）を、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−アフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に供した。全ての精製工程は４℃にて行い、そして他の型のＧＳＴ−タグ化タンパク質の精製のために利用されるストラテジー（Ｗａｒｄ，Ａ．Ｃ．ら［１９９４］Ｙｅａｓｔ  １０：４４１−４４９；Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．およびＳｐｅｉｃｈｅｒ，Ｄ．［１９９７］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊら編］６．６．１−６．６．２１頁，ＪｏｈｎおよびＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）と類似する。結合していないタンパク質を、３０ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５ｍＭ  ＰＭＳＦを用いて洗浄することにより除去した。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中の１０ｍＭグルタチオンを用いて溶出する（１００〜２００μＬの画分）か、または以前に記載された（ＨａｒｐｅｒおよびＳｐｅｉｃｈｅｒ，１９９７）ように、過剰のトロンビンを用いてカラム上で切断して、ＧＳＴタグを有さないΔ２２８−ＵＶＤＥを生成した。素通り画分、洗浄画分、溶出画分、およびトロンビン切断画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、精製の程度またはトロンビン切断によるＧＳＴタグの除去が示された（図１Ａ〜１Ｂ）。
【００８７】
（実施例５．ＧＳＴ調製）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＤＹ１５０）細胞を、いかなるインサートも伴わないｐＹｅｘ４Ｔ−１発現ベクター（すなわち、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］のみを発現する）で形質転換した。これらの培養物をＣｕＳＯ4で誘導し、そして細胞溶解物を、Ｕｖｅ１ｐタンパク質について記載されるように調製した。精製組換えＧＳＴを、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（上記を参照のこと）と同一の様式で、グルタチオンセファロースカラムでアフィニティー精製し、そしてＵｖｅ１ｐタンパク質調製物における可能性のある微量の混入エンドヌクレアーゼのコントロールとして、本研究において行われる全てのアッセイに含めた。
【００８８】
（実施例６．ＵＶＤＥ活性アッセイおよび反応条件の最適化）
粗製および精製した全長のＵＶＤＥ、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥを、オリゴデオキシヌクレオチド基質（ＣＰＤ−３０マー）（その配列の中央付近に組み込まれた単一のシス−シン  シクロブタンピリミジンダイマーを含有する）に対する活性について試験した。ＣＰＤ含有鎖の配列は、以下である：５’−ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＡＴ＾ＴＡＡＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴ−３’（配列番号１３）。ＣＰＤ含有ＤＮＡ分子は、Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．およびＴａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｓ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１１４３−１１１５１により記載されるように合成された。ＣＰＤ−３０マーは、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で５’末端標識された（Ｔａｂｏｒ，１９８９）。末端標識ＣＰＤ−３０マーとのＵＶＤＥ反応のために、約１０ｆｍｏｌの５’末端標識ＣＰＤ３０マーを、５〜１００ｎｇのΔ２２８−ＵＶＤＥまたはＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥと共に、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（１０〜２０μＬの反応容量）中で、３７℃にて１５分間インキュベートした。この反応産物を、以前に記載されたように（Ｄｏｅｔｓｃｈら，１９８５）２０％変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル（ＤＮＡ配列決定ゲル）で分析した。切断されていないＣＰＤ−３０マーおよび切断産物（１４−マー）に対応するＤＮＡ種を、ホスホルイメージャー分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４４５ＳＩ）およびオートラジオグラフィーによって分析しそして定量した。
【００８９】
他の実験において、種々のＵｖｅ１ｐ調製物との反応は、総容積２０μＬ中で実行し、そしてこれは、反応緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ６．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍＭ  ＭｎＣｌ2）ならびに末端標識オリゴヌクレオチド基質（１０〜３０ｆｍｏｌ）を含んだ。基質／緩衝液の混合液を、２０分間３７℃にてＵｖｅ１ｐと共にインキュベートした。Ｇ−Ｕｖｅ１ｐおよびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの場合、粗細胞溶解物（５μｇのタンパク質）を全てのアッセイに使用した。５０ｎｇのアフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（０．７５ｐｍｏｌ）およびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（１．２ｐｍｏｌ）を、全てのＵＶ誘導光生成物と共にインキュベートした。他の全てのアッセイについては、２μｇのアフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（３０ｐｍｏｌ）およびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（４８ｐｍｏｌ）を、基質と共にインキュベートした。２μｇのアフィニティー精製した組換えＧＳＴ（７２ｐｍｏｌ）を、Δ２２８−Ｕｖｅ１ｐの至適反応条件下で各基質と共にインキュベートし、Ｕｖｅ１ｐ調製物に存在し得る可能性のある混入ヌクレアーゼ活性のコントロール、およびＵｖｅ１ｐ切断反応の特異性を決定した。各オリゴヌクレオチド基質に特異的なＤＮＡ修復タンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩおよびＩＶ、Ｅ．ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエンドヌクレアーゼＩＩＩ様グリコシラーゼ［Ｎｔｇ］）をまた、Ｕｖｅ１ｐの特異的ＤＮＡ切断部位を測定する手段として、これらの個々の至適反応条件下でこれらの基質とインキュベートされる。反応産物は、以前に記載されるように（Ｄｏｅｔｓｃｈら［１９８５］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３２８５−３３０４）、２０％変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル（ＤＮＡ配列決定型ゲル）で分析した。切断された基質および切断されていない基質に対応するＤＮＡバンドを、ホスホルイメージャー分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４４５ＳＩ）およびオートラジオグラフィーによって分析しそして定量した。
【００９０】
（実施例７．ＤＮＡ損傷を含有するオリゴヌクレオチド）
本研究において基質として使用されるＤＮＡ損傷を含有するオリゴヌクレオチドを、表１Ａに示す。各々の損傷を受けた障害の構造を、図１に示す。３０マーｓｃ−ＣＰＤ含有オリゴヌクレオチド（ｃｓ−ＣＰＤ−３０マー）を、以前に記載された（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．［１９９３］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１１４３−１１１５１）ように調製した。ｃｓ−ＣＰＤ含有４９マーオリゴヌクレオチド（ｃｓ−ＣＰＤ−４９マー）、ｔｓ  Ｉ−ＣＰＤ（ｔｓＩ−ＣＰＤ−４９マー）、ｔｓ  ＩＩ−ＣＰＤ（ｔｓＩＩ−ＣＰＤ−４９マー）、６−４ＰＰ（６−４ＰＰ−４９マー）およびＤｅｗａｒアイソマー（Ｄｅｗａｒ−４９マー）を、以前に記載されたように合成した（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．およびＴａｙｌｏｒ，Ｊ−Ｓ．［１９９３］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１１４３−１１１５１）。白金−ＤＮＡ  ＧＧ二重付加物（ｄｉａｄｄｕｃｔ）（Ｐｔ−ＧＧ−３２マー）を含有するオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を、以前に記載されたように調製した（Ｎａｓｅｒら［１９８８］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：４３５７−４３６７）。ウラシル含有オリゴヌクレオチド（Ｕ−３７マー）、損傷していないオリゴヌクレオチドおよび全ての基質の相補鎖オリゴヌクレオチドを、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成した。ＤＨＵ含有オリゴヌクレオチド（ＤＨＵ−３７マー）を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）より合成した。イノシン含有オリゴヌクレオチド（Ｉ−３１マー）およびキサンチン含有オリゴヌクレオチド（Ｘｎ−３１マー）およびそれらの相補鎖は、Ｙｏｋｅ  Ｗａｈ  Ｋｏｗ博士（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から頂いた。８−オキソグアニン含有３７マー（８−オキソＧ−３７マー）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）により合成した。
【００９１】
標識したオリゴヌクレオチド基質を、以下のように調製した：ｃｓ−ＣＰＤ−３０マー、４９マーＵＶ光損傷含有オリゴヌクレオチドおよびＰｔ−ＧＧ−３２マーを、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で末端標識した（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．［１９８５］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ［Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ］，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。オリゴヌクレオチドであるＵ−３７マー、ＤＨＵ−３７マー、Ｉ−３１マー、Ｘｎ−３１マーおよび８−ｏｘｏＧ−３７マーは、末端トランスフェラーゼおよび［α32Ｐ］ｄｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を使用して、３’末端標識した（Ｔｕ，Ｃ．およびＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．［１９８０］Ｇｅｎｅ  １０：１７７−１８３）。末端標識二重鎖オリゴヌクレオチドを、２０％未変性ポリアクリルアミドゲル上でゲル精製した。このＤＮＡを、ｄｄＨ2Ｏ中に再懸濁し、そして、−２０℃にて保存した。
【００９２】
ＡＰ基質を、本明細書以下に記載されるように調製した。５’末端標識した二重鎖Ｕ−３７マー（２０〜５０ｐｍｏｌ）を、ＵＤＧ緩衝液（３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ，６ユニット）と共に３７℃にて３０分間インキュベートして、ＡＰ部位含有オリゴヌクレオチド（ＡＰ−３７マー）を作製した。このＤＮＡを、０．１％  ８−ヒドロキシキノリンを含むＨＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で平衡化したＰＣＩＡ（フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール、２９：１９：１、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて抽出し、そしてそのＡＰ部位含量について、０．１Ｍピペリジンで９０℃にて２０分間切断することにより評価した。
【００９３】
中央に埋め込まれたシス−シン  ＴＴシクロブタンピリミジンダイマーを含有する、ＣＰＤ−３０マーＵｖｅ１ｐ基質（本明細書およびＫａｕｒら［１９９８］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１１５９９−１１６０４を参照のこと）は、Ｊｏｈｎ−Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｔａｙｌｏｒ（Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から頂いた。ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）エンドヌクレアーゼ実験のための他の全てのオリゴヌクレオチド基質（表１）を、Ｏｐｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）またはＩＤＴ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成した。全てのオリゴヌクレオチドをゲル精製し、そして配列の確認のためにＤＮＡ配列分析に供した。オリゴヌクレオチドを、以前に記載された（Ｂｏｗｍａｎら［１９９４］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３０２６−３０３２）ように、５０μＣｉの［γ−32Ｐ］（Ａｍｅｒｓｈａｍ，３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いてポリヌクレオチドキナーゼで５’末端標識した。３’末端標識オリゴヌクレオチドを、以前に記載される（Ｂｏｗｍａｎら［１９９４］前出）ように、１０ｐｍｏｌの示されたオリゴヌクレオチドを、１０ユニットの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ，Ｐｒｏｍｅｇａ）および５０μＣｉの［α−32Ｐ］ｄｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とインキュベートすることによって調製した。
【００９４】
（実施例８．至適反応条件の確立）
ＣＰＤ−３０マーのＵＶＤＥ切断のための至適反応条件は、ＮａＣｌ濃度、二価陽イオン（ＭｎＣｌ2およびＭｇＣｌ2）濃度を変化させることによってか、または反応液中の反応緩衝液のｐＨを変化させることによって確立した。緩衝液（示されたｐＨ範囲で２０ｍＭ）は以下のとおりであった：クエン酸ナトリウム（ｐＨ３〜６）、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８）、および炭酸ナトリウム（ｐＨ９〜１０．６）。酵素活性に必要とされる至適温度は、ＵＶＤＥおよびＣＰＤ−３０マーを混合する前に特定の温度で１０分間、反応緩衝液中で酵素と基質とをプレインキュベーションすることにより決定した。この反応をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出により停止させ、そしてこの反応産物を、上記したようにＤＮＡ配列決定ゲル上で分析した。これらの実験から、以下の標準的な反応条件を確立した：２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＭｎＣｌ2、３０℃もしくは３７℃で２０分間。
【００９５】
（実施例９．反応速度論アッセイ）
酵素反応を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ６．５）中で、５ｎＭ  Δ２２８−ＵＶＤＥまたは１１．５ｎＭ  ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥを用いて行った。５’末端標識したＣＰＤ−３０マーの濃度を、３７℃、０〜３分間での１５μＬの最終反応容量で、２５〜２５０ｎＭで変化させた。酵素初速度（Ｖi）を、各基質濃度に対して、１秒当たりに形成された産物のｎＭとして測定した。見かけのＫm、Ｖmax、およびターンオーバー数（Ｋcat）を、３つの独立した実験からの平均データ（±標準偏差）のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ  Ｂｕｒｋプロットから測定した。
【００９６】
（実施例１０．Ｕｖｅ１ｐミスマッチ修復活性の分析）
ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを用いた反応を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ６．５）中で、約１００ｆｍｏｌの標識したオリゴヌクレオチド基質を、１００〜１５０ｎｇの精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐと、３７℃で２０分間インキュベートすることによって行った（１０〜２０μｌ最終容量）。ＧＦＬ−Ｕｖｅ１ｐの粗調製物を用いた反応を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１ｍＭ  ＭｎＣｌ2の２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．５）中で、２０〜３０μｇの細胞抽出物を適切な基質と共に、３７℃で２０分間インキュベートすることによって行った。これらの反応産物を、以前（Ｋａｕｒら［１９９８］前出）に記載されたように、等容量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）での抽出、エタノール沈殿、再懸濁および２０％変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミド（ＤＮＡ配列決定）ゲル上での分析によって処理した。非切断基質およびＵｖｅ１ｐ媒介ＤＮＡ鎖切断産物に対応するＤＮＡ種を、発光体画像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓモデル４４５ＳＩ）およびオートラジオグラフィーによって分析および定量化した。
【００９７】
ミスマッチ切断産物の末端分析を以下のように行った。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを、３’末端標識した*ＣＸ／ＡＹ−３１マーと共に、標準的な反応条件下、３７℃で２０分間インキュベートした。エタノール沈殿反応産物を、１０ユニットのウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）と共に３７℃で３０分間インキュベートするか、以前に記載（Ｂｏｗｍａｎら、［１９９４］前出）のように、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および５０ｐｍｏｌのＡＴＰと共にインキュベートするかの、いずれかを行った。反応産物を、Ｕｖｅ１ｐ活性アッセイについて上記したように２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。キナーゼ処理したＤＮＡ鎖の切断産物の未処理ＤＮＡ鎖の切断産物に対する電気泳動度における差異は、既存の５’−ホスホリル基の存在または非存在を示した（Ｂｏｗｍａｎら、［１９９４］前出）。
【００９８】
ミスマッチ切断産物の３’末端分析を以下のように行った。ＧＳＴΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ媒介ＤＮＡ鎖切断産物の３’末端の化学的性質を決定するために、５’末端標識した*ＣＸ／ＡＹ−３１マーを、上記のようにＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐと共にインキュベートした。次いで、エタノール沈殿し、再懸濁した反応産物を、以前に記載（Ｂｏｗｍａｎら、［１９９４］前出）のように、１０ユニットのＴｄＴおよびｄｄＡＴＰで処理した。サンプルを、５’末端分析について上記したようにポリアクリルアミドゲル上で、処理および分析した。
【００９９】
Ｕｖｅ１ｐ媒介ミスマッチ切断についての最適ｐＨを決定するために、１００ｆｍｏｌの３’末端標識した*ＣＸ／ＡＹ−３１マーを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍＭ  ＭｎＣｌ2を含む、異なるｐＨ範囲（ｐＨ３．０〜１０．６）の２０ｍＭの反応緩衝液中、約１００ｎｇのＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐと共にインキュベートした。この緩衝液は以下の通りであった：クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０〜６．０）、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．０）および炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０〜１０．６）。この反応産物を２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分析し、そして最適ｐＨを、ＣＰＤ−３０マーのＵｖｅ１ｐ切断について以前に記載されたように（Ｋａｕｒら、［１９９８］前出）算定した。
【０１００】
基質競合アッセイのために、末端標識した*ＣＸ／ＡＹ−３１マーを、３’末端標識したＣＸを非標識鎖ＡＹとアニーリングさせることによって生成した。非標識の非特異的（非ミスマッチ）競合ＧＸ／ＣＹ−３１マーを、鎖ＧＸを鎖ＣＹにアニーリングさせ、これは、Ｇ／Ｇ誤対合に代わってＣ／Ａ塩基対を有する二重鎖オリゴヌクレオチドを生じた。ＣＰＤ−３０マー（Ｕｖｅ１ｐに対するよく特徴付けられた基質）を、非標識の非特異的競合剤として使用した。３’末端末端標識した*ＣＸ／ＡＹ−３１マー（０．１ｐｍｏｌ）を、１００ｎｇの精製ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、および漸増量（０．１〜２．０ｐｍｏｌ）の特異的競合因子（ＣＰＤ−３０マー）または非特異的競合因子（ＧＸ／ＣＹ−３１マー）のいずれかと共にインキュベートした。競合反応を、上記したようように２０％変性ゲル上で、処理および分析した。非切断の*ＧＸ／ＧＹ−３１マーおよびＤＮＡ鎖切断産物に対応するＤＮＡ種を、発光体画像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓモデル４４５ＳＩ）によって定量化した。
【０１０１】
（実施例１１．カナバニン耐性による変異頻度アッセイ）
Ｌ−カナバニンの感受性を測定するために、１０ｍｌのＰＭＡＬＵgに、１００μｌの指示された飽和培養物を接種し、そして２５℃で対数増殖中期まで増殖させた。２００個の細胞を、種々の濃度のＬ−カナバニンサルフェート（０、０．０７５、０．２２、０．７５、２．２、７．５、２２および７５μｇ／ｍｌ）を含むＰＭＡＬＵgプレート上にプレートし、３０℃でインキュベートした。コロニーを４日後に計数し、そして生存度を、各株について、０ｇ／ｍｌプレートに対して正規化した。コロニー形成アッセイを、各株について、７５μｇ／ｍｌのＬ−カナバミンサルフェートを補完したＰＭＡＬＵgプレート上に、飽和培養物由来の１０7細胞をプレートすることによって行った。コロニーを３０℃での８日間のインキュベーション後に計数した。平均変異頻度を、ＬｅａおよびＣｏｕｌｓｏｎ（１９４３）Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．４９：２６４−２８４によって記載されるようにメジアンの方法を用いて算定した。
【０１０２】
【表１Ａ】
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【０１０３】
【表１Ｂ】
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【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
【表７】
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【０１１０】
【表８】
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【０１１１】
【表９】
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0004077157.tif 000017
【０１１２】
【表１０】
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【０１１３】
【表１１】
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【０１１４】
【表１２】
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【０１１５】
【表１３】
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【０１１６】
【表１４】
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【０１１７】
【表１５】
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【０１１８】
【表１６】
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【０１１９】
【化５】
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【０１２０】
【化６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜１Ｃは、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの精製および活性を示す。過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＹ１５０細胞からのＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥを、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。図１Ａは、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥの精製を示す。タンパク質を、銀染色した１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で可視化した。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー（サイズを→に示す）。レーン１：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの過剰発現細胞の粗抽出物からの０．５／ｇの可溶性タンパク質（カラムにロードした）。レーン２：アフィニティーカラムフロースルーからの０．５μｇの結合していないタンパク質。レーン３：カラム洗浄画分からの１．０μｇの結合していないタンパク質。レーン４−８：総タンパク質５ｎｇ、１５ｎｇ、６５ｎｇ、５５ｎｇおよび３５ｎｇにそれぞれ対応するグルタチオンを用いて溶出したアフィニティーカラムに結合したタンパク質からのカラム画分の等量(２０μＬ）ロード。図１Ｂは、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥをグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに再適用し、カラム上でトロンビン切断を行ってＧＳＴタグを除去した後のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(銀染した１２％ゲル）を例示する。レーンＭ：タンパク質分子量マーカーサイズを左に示す）。レーン１：１００ｎｇのＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(カラムロード）。レーン２：２５０ｎｇのトロンビン参照マーカー。レーン３：トロンビン切断後にカラムから溶出された２５０ｎｇのΔ２２８−ＵＶＤＥ。レーン４：トロンビン切断およびグルタチオンを用いた溶出の後にアフィニティーカラムに結合したままの４００ｎｇ(総タンパク質）のＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびＧＳＴ。矢印は、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(Ａ、６８．７  ｋＤａ）、Δ２２８−ＵＶＤＥ(Ｂ、４１．２  ｋＤａ）、トロンビン(Ｃ、３７  ｋＤａ）、およびＧＳＴ(Ｄ、２７．５  ｋＤａ）の位置を示す．図１Ｃは、ＣＰＤ３０マーに対するＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの調製物の活性を示す。ＣＰＤ−３０マーを、ＵＶＤＥの以下の調製物とともにインキュベートした：ベクター単独(レーン１）、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(レーン２）、ＦＬ−ＵＶＤＥ(レーン３）、アフィニティー精製したＧＳＴ単独(レーン４）、アフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(レーン５）およびアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ(レーン６）を含む過剰発現細胞の粗抽出物。ＣＰＤ部位のすぐ５’側のＣＰＤ−３０マーのＵＶＤＥ媒介性のＤＮＡ鎖切断に対応するオリゴヌクレオチド切断産物(１４マー）を、ＤＮＡ配列決定ゲル上で分析し、そしてオートラジオグラフィーおよびホスホルイメジャー分析に供した。
【図２】  図２は、ＵＶＤＥ活性に対する塩濃度の効果を示す。末端標識したＣＰＤ−３０マーにおけるＤＮＡ鎖切断アッセイを、１５０ｎｇのアフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(白丸）または４０ｎｇのアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ（黒丸）を、ｐＨ７．５および種々の濃度のＮａＣｌで、それ以外は標準的な反応条件下で２０分間行った(材料および方法）。ＤＮＡ鎖切断の程度を、ゲルのホスホルイメジャー分析で決定した。酵素活性を１００ｍＭ  ＮａＣｌで観察された切断されたＣＰＤ−３０マー（１００％と規定する）に対して、切断されたＣＰＤ−３０マーの百分率として表現する。
【図３】  図３は、ＵＶＤＥ活性に対するｐＨの効果を例示する。末端標識したＣＰＤ−３０マーに対するＤＮＡ鎖切断アッセイを、１５０ｎｇのアフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(白丸）または４０ｎｇのアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ(黒丸）を用いて、種々のｐＨ条件下で、それ以外は標準的な反応条件下で２０分間行った（本明細書に記載されるように）。ＤＮＡ鎖切断の程度を、ホスホルイメジャー分析から決定し、そして酵素活性をｐＨ６．５で観察された切断されたＣＰＤ−３０マー（１００％と規定する）に対して、切断されたＣＰＤ−３０マーの百分率として表現する。
【図４】  図４は、ＵＶＤＥ活性の温度依存性を示す。末端標識したＣＰＤ−３０マーに対するＤＮＡ鎖切断アッセイを、１５０ｎｇのアフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(白丸）または４０ｎｇのアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ(黒丸）を用いて、示された温度で、それ以外は標準的な反応条件下で２０分間行った（本明細書において以下の実施例を参照のこと）。ＤＮＡ鎖切断の程度を、ホスホルイメジャー分析から決定し、そして酵素活性を３０℃で観察された切断されたＣＰＤ−３０マー（１００％と規定する）に対して、切断されたＣＰＤ−３０マーの百分率として表現する。
【図５】  図５Ａ−５Ｂは、精製したΔ２２８−ＵＶＤＥによって切断されたＣＰＤ−３０マー切断の反応速度論的分析を例示する。Δ２２８−ＵＶＤＥ(５ｎＭ）を、漸増量の５’末端標識したＣＰＤ−３０マーと反応させ、そしてＤＮＡ鎖切断について、実施例に記載されるように分析した。図５Ａは、３つの別個の実験からの平均標準偏差を用いた反応速度(速度）対基質濃度のプロットである。示した曲線は、平均したデータのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ等式に最適合させた。図５Ｂは、反応速度データのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。
【図６】  図６Ａ−６Ｂは、基質を含むＣＰＤのＵｖｅ１ｐ切断の部位を示す。種々のＵｖｅ１ｐ調整物を、５’または３’を末端標識した (＊）ｃｓ−ＣＰＤ−３０マーと共にインキュベートした。ｃｓ−ＣＰＤ−３０マーのＵｖｅ１ｐ媒介性の鎖切断に対応する切断産物を、ＤＮＡ配列決定型のゲル上で可視化した。図６Ａ：５’末端標識したｃｓ−ＣＰＤ−３０マー二重鎖を、緩衝液単独(レーン１）、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを過剰発現する細胞の抽出物(５μｇ）（レーン２）、アフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン３）およびアフィニティー精製したΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(各々５０ｎｇ）(レーン４）ならびにアフィニティー精製したＧＳＴ単独（２μｇ）(レーン５）とともインキュベートした。図６Ｂ：３’末端標識したｃｓ−ＣＰＤ−３０マー二重鎖を、同じＵｖｅ１ｐ調製物とともにインキュベートした。レーンの順序は、図６Ａについてと同じである。矢印はａおよびｂは、一次切断部位および二次切断部位を示す。ｃｓ−ＣＰＤ−３０マーの部分を含む光生成物(Ｔ＾ＴはＣＰＤに対応する）を、この図の下に示す。単純化のために、相補鎖を示さない。
【図７】  図７Ａ−７Ｄは、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐが１２の異なる塩基ミスマッチの組合せを認識することを示す。３’末端標識したオリゴのシリーズＸ／Ｙ−３１マー（配列を下に示し、アスタリスクは、標識された鎖および標識された末端を示す）を利用して、１６の異なる塩基対および塩基誤対合の組合せについてＵｖｅ１ｐ切断活性を評価した。（表１Ｂ）。数字で示したレーンの上にアスタリスクで示される塩基誤対合は、精製されたＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（奇数レーン）または偽反応（偶数レーン）で処理した、Ｇシリーズ（図７Ａ）、Ａシリーズ（図７Ｂ）、Ｃシリーズ（図７Ｃ）およびＴシリーズ（図７Ｄ）について標識された鎖における塩基を示す。反応産物を、ＤＮＡ配列決定型のゲルで分析した。矢印は、そのミスマッチ部位の５’側直ぐ（矢印ａ）、１ヌクレオチド（矢印ｂ）および２ヌクレオチド（矢印ｃ）のＵｖｅ１ｐ切断部位を示す。ＧおよびＣ＋Ｔの塩基特異的化学切断ＤＮＡ配列決定ラダーを、ヌクレオチド位置マーカーとして、隣接するレーンにおいて流した。
【図８】  図８Ａ−８Ｅは、ビピリミジンＵＶ誘導光生成物に対するＵｖｅ１ｐ活性を示す。Ｕｖｅ１ｐが広範囲のＵＶ誘導光生成物を認識し得るか否かを決定するために、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン１）およびＧ−Ｕｖｅ１ｐ(レーン２）(各々５μｇ）、ならびにアフィニティー精製したΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン３）およびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン４）(各５０ｎｇ）を発現する細胞由来の粗抽出物を、以下の５’末端標識(＊）二重鎖オリゴヌクレオチド基質：(図８Ａ）ｃｓ−ＣＰＤ−４９マー、(図８Ｂ）６−４ＰＰ−４９マー、(図８Ｃ）ｔｓＩ−ＣＰＤ−４９マー、(図８Ｄ）ｔｓＩＩ−ＣＰＤ−４９マー、および(図８Ｅ）Ｄｅｗａｒ−４９ｍｅｒとともにインキュベートした。この配列の部分を含むＵＶ光生成物（Ｔ＾Ｔ）を、図の下に示す。矢印ａおよびｂは、Ｕｖｅ１ｐ媒介性切断によって形成された主な生成物および微量生成物を示す。矢印ｕｃは、切断されていない基質を示す。相補鎖の配列を省略する。
【図９】  図９は、白金−ＤＮＡ  ＧＧ二付加物含有基質に対するＵｖｅ１ｐ活性を示す。アフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン４）およびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(１−２μｇ）(レーン５）を、５’末端標識した二重鎖(＊）Ｐｔ−Ｇｇ−３２マーとともにインキュベートした。この基質もまた、緩衝液単独(レーン２）、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ(１５０単位(Ｐｒｏｍｅｇａ））(レーン３）およびアフィニティー精製したＧＳＴ(２、Ｌｇ）(レーン６）とともにインキュベートした。ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔのオリゴヌクレオチド配列決定(レーン１）を行って、切断部位を同定した。矢印ｃおよびｄは、それぞれ、主な切断部位および少数の切断部位を示す。基質の部分を含む白金−ＤＮＡ  ＧＧ二付加物を、この図の下に示す。相補鎖の配列を省略する。
【図１０】  図１０Ａは、Ｕｖｅ１ｐによる、ＡＰ部位を含むオリゴヌクレオチド基質の切断を示す。加水分解様式でＵｖｅ１ｐが無塩基部位を切断し得るか否かを調べるために、本発明者らは、５’末端標識した(＊）無塩基基質ＡＰ−３７マーを調製し、そしてこの基質と、緩衝液単独（レーン１）、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩ(ＡＰリアーゼ、レーン２）、アフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐおよびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(各々２μｇ）(レーン３および４）、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを過剰発現する細胞の抽出物(５μｇ）(レーン５）、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ(加水分解性ＡＰエンドヌクレアーゼ、レーン６）および精製した組換えＧＳＴ(２μｇ）(レーン７）とともにインキュベートした。図１０Ｂは、ＡＰ部位認識および切断の競合的阻害を実証する。精製された産物が、ＡＰ部位でのＵｖｅ１ｐ媒介性切断の結果であることを実証するために、ＡＰ−３７マーを、緩衝液単独(レーン１）、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ(レーン２）、およびアフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(２μｇ）(レーン３）と、１０×および４０×の標識していないｃｓ−ＣＰＤ−３０マー(それぞれ、レーン４および５）ならびに１０×および４０×の標識していないＵＤ−３７マー(それぞれ、レーン６および７）とともに、インキュベートした。矢印ａおよびｂは、それぞれ、一次および二次のＵｖｅ１ｐ媒介性切断産物を示す。矢印ｕｃは、切断されていない基質を示す。ＡＰ基質の配列の一部を、この図の下に示す。Ｓは、デオキシリボースに対応し、そしてｐは、ホスフェートに対応する。エンドヌクレアーゼＩＩＩ(ＥＩＩＩ）およびエンドヌクレアーゼＩＶ(ＥＩＶ）の切断部位の位置もまた示す。単純化のために、相補鎖を図から省略した。
【図１１】  図１１Ａ−１１Ｂは、全長Ｕｖｅ１ｐのＵｖｅ１ｐ生成ＤＮＡ鎖切断産物および活性を特徴付ける。図１１Ａ：＊ＣＸ／ＡＹ−３ｌマーを用いた、Ｕｖｅ１ｐ生成されたＤＮＡ切断産物の５'末端の分析。Ｃ／Ａミスマッチを有する３’末端標識したオリゴ (配列を下に示す）を、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐと反応させ、次いで、さらに、（＋）および（−）のレーンで示すようにＰＮＫまたはＣＩＰで処理した。レーン１は、緩衝液のみで処理した。矢印ａおよびｂは、Ｕｖｅ１ｐ切断の部位を示す。図１１Ｂ：全長Ｕｖｅ１ｐは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する。５’末端標識した二重鎖＊ＣＸ／ＡＹ−３ｌマーを、全長のＧＳＴ−タグ化Ｕｖｅ１ｐ(ＧＦＬ−Ｕｖｅ１ｐ）(レーン１）、短縮型Ｕｖｅ１ｐ(ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ）（レーン２）を過剰発現する細胞、ＧＳＴタグ単独 (レーン３）を発現する細胞の粗抽出物またはＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（これは、公知のミスマッチエンドヌクレアーゼ）(レーン４）のいずれかとともにインキュベートした。矢印は、ミスマッチ部位の５’側の直ぐ (矢印ａ）および１ヌクレオチドの切断部位を示す。矢印Ｖは、ミスマッチ部位の３’側のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ切断を示し、そしてこれを、位置の参照として使用した。矢印の下のバンド(アスタリスクで示す）は、Ｕｖｅ１ｐ調製物に存在する弱い５’から３’エキソヌクレアーゼ活性に起因して短縮された生成物に対応する。
【図１２】  図１２は、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼおよびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐＵＶ光生成物エンドヌクレアーゼが、同じ基質について競合することを示す。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを、３’−末端標識した二重鎖＊ＣＸ／ＡＹ−３ｌマー（表１）とともに、漸増量の標識されていない二重鎖ＣＰＤ−３０マー(四角）または二重鎖ＧＸ／ＣＹ−３１マー(三角）または二重鎖ＣＸ／ＡＹ−３１マー(丸）の存在下でインキュベートした。Ｕｖｅ１ｐ媒介性のＤＮＡ切断産物を、ＤＮＡ配列分析のためのゲル上で分析し、そして鎖切断の程度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ホスホルイメジャー）分析で定量した。Ｕｖｅ１ｐ活性を、任意の競合因子の非存在下で観察された切断(１００％活性として規定）と比較して観察された切断の百分率として表現する。誤差バーは、３つの別個に実験からの平均標準偏差を示す。
【図１３】  図１３Ａ−１３Ｂは、Ｕｖｅ１ｐが塩基ミスマッチを含む二重鎖の一方の鎖のみを切断することを示す。図１３Ａは、制限酵素ＤｄｅＩ(レーン１）、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン２）、または緩衝液(レーン３）とインキュベートされた３’−末端標識した＊ＣＸ／ＡＹ−４１マーを示す。この反応生成物をＤＮＡ二本鎖分解産物（矢印ｄｓｂ）について、以下に記載するように非変性ゲル上で分析した。矢印ｂおよびｃは、この基質に対するＵｖｅ１ｐについての一次切断部位を示す。図１３Ｂは、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（＋レーン）または緩衝液(−レーン）と共にインキュベートされ、そして変性ＤＮＡ配列決定型ゲル上で分析された３’末端標識した＊ＣＸ／ＡＹ−４１マーまたはＣＸ／＊ＡＹ−４１マーを示す。矢印ｂおよびｃは、ミスマッチ塩基（アスタリスク）位置に比して、主要なＵｖｅ１ｐ切断事象の位置を示す。Ｇ＋ＡおよびＣ＋Ｔの塩基特異的な配列決定ラダーを、ヌクレオチド位置マーカーとしてレーンの外側に包含させる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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