(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）以下の配列Ａのアミノ酸残基位置１〜６５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（ｂ）配列Ａの位置１〜６５とそれに続く追加のアミノ酸配列からなり、当該追加のアミノ酸配列は、以下の配列Ｂの、アミノ酸残基位置６６から出発し、位置６６〜１３８の任意の位置までのアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
であって、前記ポリペプチドが、ＰｌA1又はＰｌA2に対する抗体と免疫反応するが、該抗体の両方とは免疫反応せず、かつグリコシル化されていないことを特徴とする単離された組換えポリペプチド。
0004053084.tif 000036
【請求項２】
前記ポリペプチドが、以下の配列(1)〜(6)からなる群から選択されるアミノ酸残基配列からなる請求項１に記載のポリペプチド。
0004053084.tif 000037
0004053084.tif 000038
【請求項３】
第二のポリペプチドに機能しうるように連結された第一のポリペプチドを含む、単離された組換え融合ポリペプチドであって、
前記第一のポリペプチドが、前記第二のポリペプチドにペプチド結合したポリペプチド又は蛋白のアミノ酸残基配列を示し、該ポリペプチド又は蛋白が、前記第二のポリペプチドの免疫学的結合特性に干渉せず、
前記第二のポリペプチドが、
（ａ）以下の配列Ａのアミノ酸残基位置１〜６５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（ｂ）配列Ａの位置１〜６５とそれに続く追加のアミノ酸配列からなり、当該追加のアミノ酸配列は、以下の配列Ｂの、アミノ酸残基位置６６から出発し、位置６６〜１３８の任意の位置までのアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
であって、前記ポリペプチドが、ＰｌA1又はＰｌA2に対する抗体と免疫反応するが、該抗体の両方とは免疫反応せず、かつグリコシル化されていないことを特徴とする、単離された組換え融合ポリペプチド。
0004053084.tif 000039
【請求項４】
前記第一のポリペプチドが、ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を有する請求項３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記第二のポリペプチドが、以下の配列(1)〜(6)からなる群から選択されるアミノ酸残基配列からなる請求項４に記載の融合ポリペプチド。
0004053084.tif 000040
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【請求項６】
天然のＧＰＩＩＩａのＰｌA1又はＰｌA2決定基と免疫的に反応するヒトの抗体の存在についてヒト抗体含有身体サンプルを分析する方法であって、以下の工程、
（ａ）前記身体サンプルを、
（ｉ）請求項１に記載の単離された組換えポリペプチド、又は
（ｉｉ）請求項３に記載の単離された組換え融合ポリペプチド、
のいずれかである抗原と混合して、水性免疫反応混合物を形成する工程、
（ｂ）前記水性免疫反応混合物を、存在している抗体が前記抗原と免疫的に反応して免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学的な分析条件下で維持する工程、及び
（ｃ）形成した前記免疫反応生成物の存在を検出し、それによって前記抗体の存在を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記決定基が、天然のＧＰＩＩＩａのＰｌA1決定基であり、前記抗原が、以下の配列(1)〜(5)の配列及びβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結された以下の配列(1)からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
0004053084.tif 000042
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【請求項８】
前記決定基が、天然のＧＰＩＩＩａのＰｌA2決定基であり、前記抗原が、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結された以下の配列(6)を有する請求項６に記載の方法。
0004053084.tif 000044
【請求項９】
検出が、以下の工程、
（ｉ）前記免疫反応生成物を、ヒト抗体と免疫反応する第二の抗体と混合して第二の混合物を形成する工程であって、前記第二の抗体が、機能しうるようにマーカーに連結されている工程、
（ｉｉ）前記第二の混合物を、前記第二の抗体が該ヒト抗体と免疫的に反応して第二の免疫反応生成物を形成するに十分な時間、生物学的分析条件下で維持する工程、及び、
（ｉｉｉ）前記第二の免疫反応生成物に固定されたマーカーの量を決定し、それによって天然のＧＰＩＩＩａのＰｌA1又はＰｌA2決定基と免疫反応するヒト抗体の存在を決定する工程、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
血小板ＧＰＩＩＩａのＰｌA1又はＰｌA2決定基に対するヒト抗体の存在について分析するための診断分析キットであって、以下の要素、
（ａ）（ｉ）請求項１に記載の単離された組換えポリペプチド、又は、
（ｉｉ）請求項３に記載の単離された組換え融合ポリペプチド、
のいずれかである抗原を含む容器であって、少なくとも１回の分析を実施するのに十分な量で存在する抗原を含む容器、及び
（ｂ）前記ヒト抗体と前記抗原との免疫反応を検出するための手段、
を含むことを特徴とする診断分析キット。
【請求項１１】
前記抗原が、以下の配列(1)〜(6)及び、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結されている以下の配列(1)又は(6)からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有する請求項１０に記載のキット。
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【請求項１２】
前記ヒト抗体の免疫反応を検出するための前記手段が、別の種からの標識結合抗ヒト抗体である請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＧＰＩＩＩａと呼ばれる血小板表面の糖蛋白に関し、より具体的には、ＧＰＩＩＩａ分子の部分であるＰｌAと呼ばれる三次構造依存性抗原、その調製および使用に関する。
従来技術
血小板抗原系、ＰｌAは、２種の臨床的症候群、新生児免疫異常血小板減少症（ＮＡＩＴ）および輸血後紫斑病（ＰＴＰ）と深く関わっている〔Aster，免疫性血小板減少症、Kunicki & George編、血小板の免疫学、387、フィラデルフィア、ペンシルバニア（1989）〕。ＮＡＩＴは、胎盤を通って移行した母体の血小板特異的抗体による血小板破壊の増加を伴う新生児の出血性疾患で、新生児１０００人に１人の頻度で発生すると算定される〔Blanchetteら、Curr．Stud．Hematol．Blood Tranf．，52:87（1986））。ＰＴＰは、輸血後の血小板不適合に対する抗体介在性血小板減少症である。白色人種ではＮＡＩＴおよびＰＴＰの最も一般的な原因はＰｌA1変態抗原（アロアンチゲン）である。
抗ＰｌA1抗体誘発の原因であるアロアンチゲン決定基は、血小板膜ＧＰＩＩＩａ上に存在する〔Kunickiら、Mol．Immunol．16:353（1979）〕。ＰｌA1およびＰｌA2表現型は、ＧＰＩＩＩａのｃＤＮＡ配列の塩基１９６にそれぞれチミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）が存在するかどうかによる〔Newmanら、J．Clin．Inmves.，83:1778（1989）〕。
Ｔ→Ｃの塩基変更は、成熟ＧＰＩＩＩａの残基３３におけるロイシン／プロリン多形性を生じる。ＧＰＩＩＩａのアミノ末端におけるロイシンからプロリンへの多形性が、ＰｌA1／ＰｌA2血小板変態型（アロタイプ）の原因で〔Goldbergら、Blood, 78:681（1989）〕、この多形性を有する合成直線状ペプチドは抗ＰｌA1抗体と反応しなかった〔Flugら、Blood, 77:1964（1991）〕。このことは、ロイシン33／プロリン33多形性は、全体的な折りたたみまたはＰｌA1エピトープの組み立てのための翻訳後プロセッシングに影響を及ぼしうることを提唱する。
要約
一つの特徴として、本発明は、ＰｌA1決定基を含むＧＰＩＩＩａアミノ酸残基配列をコードする、約１９５から８００ヌクレオチド塩基対を含む単離されたＤＮＡ分子に関する。好ましくは、該ＤＮＡ分子は、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８を有する。
本発明はまた、ＰｌA2決定基を含むＧＰＩＩＩａアミノ酸配列をコードする、約１９５から８００ヌクレオチド塩基対を含む単離されたＤＮＡ分子に関する。該ＤＮＡ分子は、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８を有する。
また別の特徴として、本発明は、血小板ＧＰＩＩＩａのＰｌA1またはＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列をコードする外来ＤＮＡセグメントに機能しうるように連結された発現ベクターを含む組換え分子に関し、該組換え分子は、宿主細胞を形質転換させたとき、天然の血小板ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基のいずれかを発現させる。組換え分子で使用する外来ＤＮＡは、好ましくは、上記で説明した単離されたＤＮＡ分子である。好ましい発現ベクターはλｇｔ２２である。
更に別の特徴として、本発明は、天然の血小板ＧＰＩＩＩａのＰｌA1またはＰｌA2決定基を含むポリペプチドの調製方法に関し、該方法は、配列番号：１に示した約残基１から約残基６５のアミノ酸残基配列をコードする外来ＤＮＡに機能しうるように連結させた発現ベクターを含む組換え分子で形質転換した宿主細胞を培養し、さらに、該ポリペプチドを発現させるために十分な時間、培養条件下で該形質転換宿主細胞を維持することを含む。好ましい宿主細胞は大腸菌（E．coli）である。好ましいベクターはλｇｔ２２で、好ましい外来ＤＮＡセグメントは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８を含む群から選ばれる。該ポリペプチドは融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
さらにまた、本発明は、配列番号：１のアミノ酸残基配列を含み、血小板ＧＰＩＩＩａの約６５から２６６アミノ酸残基を含み、該ポリペプチドが血小板ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基を示す単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、配列番号：３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９から成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する。
本発明はまた、第二のポリペプチドに機能しうるように連結した第一のポリペプチドを含む、天然の血小板ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基を免疫学的に模倣した融合ポリペプチドに関する。第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドにペプチド結合させた、免疫学的に不活性なポリペプチドまたは蛋白のアミノ酸残基配列である。第二のポリペプチドは、血小板ＧＰＩＩＩａの約６５から２６６アミノ酸残基（配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む）を含み、天然の血小板ＧＰＩＩＩａのＰｌA1またはＰｌA2決定基を表わしている。好ましい具体例では、第一のポリペプチドは、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を有し、第二のポリペプチドは、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９から成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する。
さらにまた別の局面では、本発明は、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応するヒトの抗体の存在について、ヒトの抗体含有身体サンプルを分析する方法に関する。該方法は以下の工程を含む：
（ａ）以下の（ｉ）または（ｉｉ）の抗原と人体サンプルを混合することによって免疫反応混合物水溶液を作成し、
（ｉ）ＧＰＩＩＩａの配列を有し、約６５から２６６アミノ酸残基を含有する単離ポリペプチド（該アミノ酸残基は、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を表わし、さらに配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む）または、
（ｉｉ）天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を表すＧＰＩＩＩａの約６５から２６６アミノ酸残基のアミノ酸残基配列を含み、さらに配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む融合ポリペプチド；
（ｂ）該免疫反応混合物水溶液を、存在する抗体が該抗原と免疫反応を起こして免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学的分析条件下で維持し；さらに
（ｃ）形成された免疫反応生成物の存在を検出し、それによって該抗体の存在を検出する。
該決定基が天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基である場合は、該抗原は、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結された配列番号：１１から成る群から選ばれる。
該決定基が天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基である場合は、該抗原は、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結された配列番号２１から成る群から選ばれる。
好ましい具体例では、検出は以下によって遂行される：
（ｉ）免疫反応生成物をヒト抗体と免疫反応を起こす第二の抗体（この第二の抗体は機能しうるようにマーカーに連結されている）と混合して第二の混合物を形成し；
（ｉｉ）該第二の抗体がヒト抗体と免疫反応を起こして第二の免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学的分析条件下で該第二の混合物を維持し；さらに
（ｉｉｉ）該第二の免疫反応生成物に結合したマーカー量を求め、それによって、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と反応するヒト抗体の存在を決定する。好ましくは、該マーカーは、放射性、酵素、ビオチン、蛍光および化学ルミネッセンス標識から成る群から選ばれ、該抗原は、ヒト体液サンプルと抗原を混合する前に固形支持体に結合されている。
更に別の特徴として、本発明は、以下の工程を含む血小板の型分けの方法に関する：
（ａ）供与者からの血小板を水溶液中で抗体と混合（この抗体はＧＰＩＩＩａのＰｌA1およびＰｌA2の両方とは結合しないが、いずれか一方と免疫反応を生じる）し、免疫反応混合物水溶液を形成し；
（ｂ）該免疫反応混合物水溶液を、該抗体が免疫反応を起こし免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学的反応条件下で維持し；さらに、
（ｃ）一切の免疫反応生成物の存在を検出し、それによって、当該ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基の一方または他方の存在および該血小板の型を検出する。
また別の好ましい具体例では、該抗体（ａ）はＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基と免疫的に反応するが、ＧＰＩＩＩａＰｌA2決定基と反応しないか、または、（ｂ）ＧＰＩＩＩａＰｌA2決定基とは免疫的に反応するが、ＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基とは反応しない。好ましくは該抗体は単クローン抗体である。
また別の特徴として、本発明は、以下のものを含む容器を含む血小板ＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基の型分けのためのキット形をした診断用分析系に関する。該容器は、血小板ＧＰＩＩＩａのＰｌA1またはＰｌA2決定基の１つと免疫的に反応するが両方の決定基とは反応しない抗体の少なくとも１回の分析に十分な量、および当該抗体と血小板の免疫反応を検出するための標識を含む。該診断系はさらに第二の容器を含むことができ、これは、血小板ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基の他方と免疫的に反応するが両決定基とは反応しない抗体を、少なくとも１回の分析に十分な量で含む。好ましくは、該標識は該抗体に連結されている。
さらにまた、本発明は、以下を含む、血小板ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基に対するヒト抗体の存在を調べるキット形の診断分析系に関する：
（ａ）以下の（ｉ）または（ｉｉ）の抗原を、少なくとも１回の分析を実施するために十分な量で含む容器：
（ｉ）ＧＰＩＩＩａの配列を有しており、さらに、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を有し配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む６５から２６６アミノ酸残基を含んでいる単離されたポリペプチド；
（ｉｉ）天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を有するＧＰＩＩＩａの約６５から２６６アミノ酸残基のアミノ酸残基配列含み、さらに配列番号１：のアミノ酸残基配列を含む融合ポリペプチド；
（ｂ）ヒト抗体と該抗原との免疫反応を検出するための手段。
好ましくは、該抗原は、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結された配列番号：１１または２１から成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を有し、該抗原は固形支持体に結合されている。ヒト抗体の免疫反応を検出する手段は、別の種から得られる標識に連結させた抗ヒト抗体である。
【図面の簡単な説明】
本明細書の１部を成す図面において；
図１は、λｇｔ２２発現ライブラリーの構築に用いた完全な長さの血小板ＧＰＩＩＩａのｃＤＮＡ（一番上の黒棒線）およびコードされた蛋白（灰色の長四角）を模式的に表している。コード蛋白のシグナル配列（黒四角）および膜通過ドメイン（白四角）も該灰色の長四角内に描かれている。抗ＰｌA1抗体を用いてλｇｔ２２発現ライブラリーから単離されたＧＰＩＩＩａｃＤＮＡの領域は、模式的に描かれたコード蛋白の下に棒線として描きこんだ。各ｃＤＮＡによってコードされる残基の数は、各棒線の右に示した。
図２は、抗ＰｌA1抗体と反応する、単離した最小発現クローンによってコードされるアミノ酸残基を単一文字コードで表している（配列番号：１１および１３）。該蛋白のシグナル配列には下線を施し、システイン（Ｃ）は箱内に示し、ロイシン33／プロリン33多形性はＬとＰの間の矢印で示し、フラッグら（Flugら、Blood, 77:1964（1991））が記載した、抗ＰｌA1抗体と反応しない１３残基の直線状ペプチドは、該配列の下に点線で示してある。
定義
アミノ酸残基配列：隣接する残基間のペプチド結合を介して結合した２個または２個以上の一続きのアミノ酸残基でペプチドまたはポリペプチドを形成する。アミノ酸残基配列は、その構成アミノ酸について便宜的に１文字または３文字の略語によって表される。アミノ酸について本明細書で用いられる略語は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）（２）で提供されたもので、以下の対照表で再現する：
0004053084.tif 000002
本明細書中のアミノ酸残基配列を構成する個々の残基はＬ型異性体である。また、アミノ酸残基配列は翻訳後修飾アミノ酸、例えばヒドロキシル化、グリコシル化アミノ酸残基、またはジスルフィド結合を介して連結された残基を含むことができる。さらに、アミノ酸残基配列は、１つまたは２つ以上の修飾アミノ酸または通常でないアミノ酸、例えば３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）（４）に挙げられたようなものを含むことができ、これらは、本明細書に参考文献として含まれている。アミノ酸残基配列は、その構成アミノ酸に対応して略号によって表されている。
抗体：リガンドに免疫学的に結合するポリペプチドまたは蛋白。抗体は（ここで用いられているように）、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントである。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦvとして当該技術分野で既知の分子部分が含まれる。典型的には、抗体は、サイズが約６から約３４Åの範囲のリガンドと、約１０4から１０10Ｍ-1の範囲で、さらに１０13Ｍ-1の高さの会合定数で結合する。抗体は広範囲のリガンドと結合する。リガンドは小分子（例えばステロイド、プロスタグランジン）、バイオポリマー（例えば核酸、蛋白および多糖体）および合成ポリマー（例えばポリプロピレン）を含む。“抗体結合部位”とは、抗原と特異的に結合する（免疫的に反応する）重鎖および軽鎖の可変および超可変領域を構成する抗体分子の構造部分である。“免疫的に反応する”という用語は、抗原決定基含有分子（抗原）と抗体結合部位を含む分子（例えば完全抗体分子またはその一部分）との間の結合を指すために本明細書では用いられている。“抗原決定基”とは、抗体結合部位によって免疫学的に結合される抗原の構造部分である。この用語はまた、“エピトープ”および“決定基”と互換的に用いられる。抗体は、抗原の単一のエピトープ（単クローン性）または複数のエピトープ（多クローン性）と結合することができる。ポリペプチドによって誘発される抗体は、しばしば、蛋白免疫原で生じる多クローン抗体と反応するエピトープより少ない数のエピトープと免疫的に反応する。そのようなポリペプチド誘発抗体は、ここではオリゴクローン抗体と呼ぶ。
融合蛋白またはポリペプチド：２つの異なる蛋白の各々から由来するアミノ酸残基配列を含む蛋白またはポリペプチド；それは、２つのコード配列が、それらの読み枠が読み枠にしたがった状態で結合した組換え遺伝子の発現によって形成される。少なくとも１つの完全な蛋白配列が発現物質に含まれる場合に融合蛋白は得られ、一方、融合ポリペプチドには蛋白の一部分のみが存在する。このタイプのハイブリッド遺伝子は、例えば分析が容易な蛋白で特定の遺伝子生成物を標識するために、インビトロで構築することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）のｌａｃＺと遺伝子を融合する場合、β−ガラクトシダーゼ活性またはその部分配列をもつ融合蛋白またはポリペプチドを得ることができる。また別に、細胞によってそれが分泌されるように、外来シグナルペプチドに蛋白を結合させることができる。にもかかわらず、上記の融合蛋白と融合ペプチドとの区別は、特定の融合蛋白が考察されている場合を除き、融合ポリペプチドという用語は、両方の種類の分子について本明細書では通常用いられる。
リガンド：特異的に特定の受容体（レセプター）分子と、通常、静電気力および／または水素結合を介して結合する構造領域を有する分子。具体的なレセプター分子は抗体結合部位である。
オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド／ＤＮＡセグメント：一本鎖または二本鎖ヌクレオチドポリマー。ここで用いられているように、これらの用語は、天然に生じる核酸、例えば、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、イノシン（Ｉ）の他、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２（ｐ）（１）に表されているような修飾塩基をを含むことができる。
ペプチド／ポリペプチド：少なくとも２つのアミノ酸残基を含むポリマーで、当該アミノ酸残基において、１つの残基のα−アミノ基と隣接する残基のα−カルボニル基との間のペプチド結合によって隣接する残基が連結されている。ポリペプチドの一次構造は、該ポリマーの一方の末端に第一アミン基を、他方の末端にカルボン酸基を有する。したがって、ポリペプチドは下記の式によって表すことができる：
0004053084.tif 000003
式中、Ｒは与えられたアミノ酸に特徴的な側鎖で、ｉはポリマーを構成するアミノ酸残基の数を示し、その数は２または２以上である。融合ポリペプチドの場合のように、ポリペプチドは１つまたは１つ以上の異なるアミノ酸残基配列を含むことができる。また、水溶液中のポリペプチドは、該溶液のｐＨにしたがい通常１つまたは１つ以上の双性イオン形をしている。
蛋白：およそ５０アミノ酸残基を含む単一のポリペプチドまたは一組の架橋ポリペプチド。蛋白は、同一のポリペプチド内または隣接ポリペプチド間で、例えばジスルフィド架橋を介する化学的架橋を有することができる。蛋白がグリコシル化されているとき、本明細書で考察されるＧＰＩＩＩａの場合のように、それは糖蛋白と呼ばれる。
レセプター：別の分子（リガンド）と特異的に結合する構造領域を有する、生物学的に活性を有する蛋白性分子。抗体結合部位はレセプターの１つのタイプである。
ベクター：細胞内で自律的に増殖できるＤＮＡ分子であって、それに対してＤＮＡセグメント（例えば遺伝子またはポリヌクレオチド）を機能しうるように連結でき、その結果結合されたセグメントの増殖を可能にする。発現ベクターは、該ＤＮＡセグメントが該ベクターのプロモーター配列の制御下にあるとき、適切に形質転換された宿主細胞中において、１つまたは１つ以上のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの発現を指令することができる。
発明の詳細な説明
Ａ．序
本発明に関する研究の結果は２つの重要な示唆を含んでいる。第一に、抗ＰｌA1およびＰｌA2抗体に対するアロアンチゲンエピトープは、成熟ＧＰＩＩＩａのアミノ末端６５残基に位置することがここで示されている。以前の研究は、ロイシン33／プロリン33アミノ酸多形性は２つのＰｌA1表現形の原因であるという証拠を提示した〔Newmanら、J．Clin．Invest.，83:1778（1989）；Goldbergerら、Blood, 78:681（1991）〕。しかしながら、該多形性の同定によっては、臨床的に問題となっているアロ抗体に対するエピトープは明らかでない。
蛋白分解法を用いることによってＰｌA1エピトープの位置についての矛盾する報告が存在する〔Newmanら、Mol．Immunol.， 22:719（1985）；Calvctteら、Biochem.J., 250:697（1988）；Beerら、J．Biol．Chem.，264:17564（1989）；Flugら、Blood, 77:1964（1991）〕。これらの証拠は、ＰｌA1エピトープは該多形性近傍に位置することを提案しているけれども、該多形性を含む合成ペプチドを利用する最近の研究では、該合成ペプチドは抗ＰｌA1抗体と結合することができず、抗ペプチド抗体は２種の表現形を区別することができないということが示された〔Flugら、Blood, 77:1964（1991）〕。ここに提示されたデータは、抗ＰｌA1およびＰｌA2抗体に対するエピトープは、ＧＰＩＩＩａのアミノ末端７ｋＤａに、さらに、ＰｌA表現形の原因である実際の多形性の３３残基内に存在することを示した。フラッグらのデータとともに本明細書に示したデータは、ＰｌA1およびＰｌA2エピトープは、非直線状でＧＰＩＩＩａ分子の折り畳みおよびそのＰｌA含有決定基に依存している；すなわちこれらのエピトープは三次構造依存性であることを示している。
本研究における第二の重要な発見は、ＰｌA1およびＰｌA2エピトープは、原核系で発現できるということである。ＰｌAエピトープの特徴を調べるために原核系を利用するということは、還元感受性エピトープの発現に必要なジスルフィド結合を保全することである〔Blanchetteら、Curr．Stud．Hematol．Blood Tranf．，52:87（1986）〕。
７つのシステインが、本研究で同定された血小板ＧＰＩＩＩａの小フラグメントに存在する（図２）が、これは、これら残基間の局在スルフヒドリル結合〔Calveteら、Biochem．J．，  273:63（1991）〕は、エピトープの組み立てに大きく関与し、システイン5−システイン435ジスルフィド結合は必要ではないことを示している。これらの結果は、最近ニューマンらによって提唱された〔Newmanら、Thromb．Haemostas, 66:111（1991）〕、ＰｌA1アロアンチゲンのモデルと一致する。さらに、生化学的研究によって提唱されるように〔Newmanら、Mol．Immunol．，  22:719（1985）〕、大腸菌でのＰｌA1エピトープ合成は、それはグリコシル化に左右されないことを証明した。ＰｌA1およびＰｌA2エピトープの小さな組換え模造物の大量生産の可能性は、これらエピトープに対するアロ抗体および血小板の型分けのための簡単な検出分析の開発を可能にする。
Ｂ．ＰｌA1およびＰｌA2エピトープを免疫学的に模倣するポリペプチド
血小板は、その原形質膜の表面に糖蛋白を発現している。これら糖蛋白の１つは、ＧＰＩＩＩａと呼ばれる８４．５キロダルトンの成熟糖蛋白である。
本発明は、天然のＧＰＩＩＩａのＰｌA1およびＰｌA2エピトープの結合領域穴（エピトープまたは決定基）を免疫学的に類似する単離ポリペプチドに関する。ここで用いられているように、“天然”という用語は、血小板上で発現するＰｌA1決定基の一次、二次および三次構造を指す。
ＧＰＩＩＩａはアロアンチゲンである；すなわち、それぞれの個体はＧＰＩＩＩａの異なる形態を発現する。ここで問題となっているアロアンチゲン決定基はＰｌAと命名されている。
ＧＰＩＩＩａの１形態は、該成熟糖蛋白のアミノ末端からアミノ酸残基３３位にロイシン（Ｌｅｕ）残基を有する。ＧＰＩＩＩａのこの形態の抗原決定基はＰｌA1決定基と呼ばれる。
発現されるＧＰＩＩＩａの第二のアロアンチゲン形は３３位のＬｅｕ残基の代わりにプロリン（Ｐｒｏ）残基を有する。ＧＰＩＩＩａのこの第二の形態のアロアンチゲン決定基はＰｌA2決定基と呼ばれる。
したがって、１つの具体例では、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を免疫学的に模倣するポリペプチドが目的とされる。本発明のポリペプチドは、抗天然ＰｌA1またはＰｌA2抗体と免疫的に反応するが両方とは反応しない。したがって、目的とするポリペプチドは、天然のＰｌA1エピトープのそれを十分に模倣する一次、二次および三次構造を有し、免疫学的に天然のエピトープを模倣；すなわち天然のエピトープと免疫的に反応する抗体と免疫的に反応する。目的とされる単離ポリペプチドは、したがって、天然のＰｌAエピトープ（決定基）の一方または他方を表わしていると判断される。適切なヒト抗体組成物の調製は以下で考察する。
天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を免疫学的に模倣する、目的とするポリペプチドは、ヒト血小板ＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列のＰｌA含有部分と同一または（以下に述べるように）保存的に置換されたアミノ酸残基配列を含む。目的とするポリペプチドは、アミノ酸残基の１位から約２６６位の、ＧＰＩＩＩａの“切り詰められた”アミノ酸残基配列を含み、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基の範囲であるアミノ酸残基配列を含む。目的とするポリペプチドは、ＧＰＩＩＩａ配列の約６５から約２６６アミノ酸残基を含む。特に好ましいポリペプチドは、成熟ＧＰＩＩＩａ配列のおよそ６５アミノ酸残基、すなわちＧＰＩＩＩａの１位から６５位を含むが、またアミノ末端の２６残基を含むＧＰＩＩＩａのシグナルペプチドの配列も含むことができる（すなわちポリペプチドはアミノ酸残基−２６位で始まる残基を含むことができる）。
意図するポリペプチドはまた、免疫学的に不活性な間隙充填（連結）アミノ酸残基配列、例えばβ−ガラクトシダーゼ配列（約１２００残基）、マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）配列（約１０５残基）またはｌａｃＺα遺伝子産物のαペプチド（約１０５残基）を、当該免疫学的に不活性な配列が該ポリペプチドの免疫学的結合特性を、本明細書で述べるように実質的に干渉しない限り（すなわち免疫学的に不活性である限り）含むことができる。さらにまた、“ベクター誘導”アミノ酸残基も、本明細書で考察されるように、意図するポリペプチドの一方の端または両端に含むことができる。
好ましいポリペプチドはＰｌA決定基を免疫学的に模倣し、ＧＰＩＩＩａの６５残基から２６６残基を含み、さらに、成熟蛋白のアミノ酸残基１位から６５位の、ＧＰＩＩＩａに存在するＰｌA1またはＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列を含む。
ＰｌA1決定基のアミノ酸残基配列を含む好ましいポリペプチドは、配列番号：７に示されている。本発明はまた、配列番号：７のアミノ酸残基配列を含む６５から約２６６残基を有するポリペプチドで、その残りの残基はＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列であるポリペプチドを意図する。
そのような単離ポリペプチドの典型例は、配列番号：３、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７および配列番号：１９に示したアミノ酸残基配列を含む。
ＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列を含む好ましいポリペプチドは配列番号：９に示されている。本発明はまた、配列番号：９のアミノ酸残基配列を含む、ＧＰＩＩＩａの６５から約２６６残基を有するポリペプチドを意図する。
そのような単離ポリペプチドの典型例は、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７および配列番号：２９に示したアミノ酸残基配列を含む。
好ましくは、本発明で意図されるポリペプチドは、例えば大腸菌（E．coli）のような原核宿主細胞で組換え体として発現される。したがって、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を免疫学的に模倣する好ましいポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするベクターで形質転換された大腸菌で発現される。この点についての好ましいポリペプチドは、配列番号：６に示したＤＮＡセグメント（これは配列番号：７のポリペプチドをコードする）を含む発現ベクターで形質転換された大腸菌で発現される。また別の好ましいポリペプチドは、配列番号：８に示したＤＮＡセグメント（このＤＮＡセグメントは配列番号：９のポリペプチドをコードする）を含む発現ベクターで形質転換された大腸菌で発現される。これらおよび他の発現ベクターを以下で極めて詳細に説明する。
本発明のまた別の局面は、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基を免疫学的に模倣する融合ポリペプチドである。他の場所で考察するように、ＰｌA1またはＰｌA2決定基を免疫学的に模倣する組換えポリペプチドはまた、また別の免疫学的に不活性な蛋白（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはマルトース結合蛋白）のアミノ酸配列の全体または一部に機能しうるように連結して、したがって融合ポリペプチドとして発現させることもできる。
ここで融合ポリペプチドと呼ぶ本題のポリペプチドは、免疫学的に不活性な蛋白の全体または一部分のアミノ酸残基配列を含む第二のアミノ酸残基配列に機能しうるように連結された、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列および三次構造を含む第一のアミノ酸残基配列を含む。アミノ酸残基配列は、該配列が１つまたは１つ以上の共有結合によって（例えば直接的ペプチド結合またはペプチド結合させた連結アミノ酸配列を介在させることによって）結合されているとき、第二のアミノ酸残基配列に“機能しうるように連結されている”と言う。通常、第一および第二のアミノ酸残基配列は、ベクターによって導入される１つまたはそれ以上の残基をもつペプチド結合させた第三のアミノ酸残基を介して共に連結されている。
好ましいＰｌA1融合ポリペプチドは、免疫学的に不活性な蛋白の全部または一部のアミノ酸残基配列のカルボキシ末端に機能しうるように連結したＰｌA1決定基のアミノ酸残基配列を含む。融合ポリペプチドの長さは、ＰｌA1決定基、免疫学的に不活性な蛋白、さらに場合によって存在する、付加的なベクター導入連結アミノ酸残基配列のそれぞれの長さによって決定される。
好ましい融合ポリペプチドは、ＰｌA1抗原のアミノ末端にβ−ガラクトシダーゼ蛋白の一部分を含む。意図される特定の融合ポリペプチドは、機能しうるように読み枠にしたがってＰｌAコードＤＮＡセグメントに繋ぎ合わせたλｇｔ２２ファージベクターを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換した大腸菌の発現産物である。該発現ＤＮＡは上記で考察したような目的のポリペプチドをコードする。
また別の好ましい融合ポリペプチドは、マルトース融合蛋白（ＭＢＰ）が目的のポリペプチドのアミノ末端に融合されている融合蛋白である。ＭＢＰ含有融合蛋白は、機能しうるように読み枠にしたがってＭＡＬTMｃ２またはＭＡＬTMｐ２プラスミドベクター（ニューイングランドバイオラブより入手可能）に繋ぎ合わされているＰｌAコードＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を用いて発現させることができる。ベクターＭＡＬTMｃ２またはＭＡＬTMｐ２から発現させた融合蛋白は、蛋白分解性血液因子Ｘａと反応させ、ＭＢＰ部分を除去し、本発明の低分子量のＰｌA決定基含有ポリペプチドを提供することができる。
本明細書で考察する本発明のいずれの単離ＤＮＡ配列も、本明細書で考察する上記のまたは他の発現ベクターの１つまたは他のものに、以下に述べるように連結させ、続いて適切な宿主を形質転換して目的の融合ポリペプチドの発現を得る。
典型的なベクター導入連結配列は、目的の融合ポリペプチドを発現させる組換え分子を構築させるために用いられるＤＮＡ分子のエンドヌクレアーゼ制限切断に利用されるヌクレオチド配列の発現によって形成される。したがって、例えば本明細書で考察する典型的なＰｌA1コードＤＮＡ配列は、ＳａｌＩ制限酵素認識部位に近接し、λｇｔ２２のＳａｌＩ部位でクローニングされる。このＳａｌＩ部位は該ベクターにおいてＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位に近接している。したがって、発現された融合ポリペプチドは、ＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基に加え、これら制限部位から発現されるアミノ酸残基を含んでいた。
分子生物学において習熟した者なら誰でも、いずれのポリペプチドも、ここで述べたように免疫学的に不活性である限り、さらに、発現物質の不溶化（ＳＤＳの非存在下で非拡散性）をもたらす、例えばシステインのような残基並びに例えばトリプトファンおよびフェニルアラニン等の残基を含まない限り、または他の方法でその免疫反応性を抑制しない限り、実質的にいずれのポリペプチドも連結配列として用いることができることは明白であろう。連結配列（本明細書では時にスペーシング配列ともいう）は、１残基からおよそ１２００残基を含むことができるが、後者は、融合ポリペプチドまたは融合蛋白がβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に連結されて発現される場合である。
典型的には、融合ポリペプチドを含む本題のポリペプチドは、大腸菌のような原核宿主によって発現されるときにはグリコシル化されない。しかしながら、本発明のポリペプチドは真核細胞によって製造することができ、その場合にはそれはグリコシル化されうる。また、本題のポリペプチドは、結果として得られる分子が所望の特性を表す限り、種々の変化、例えば挿入、欠失、対立遺伝子変種において存在しうるようなアミノ酸の保存的置換を含むことができる。本明細書でいう“所望の特性”とは、ここで述べたように、未変更ポリペプチドのそれと同一または類似の免疫反応特性を修飾ポリペプチドが有することを含む。
このポリペプチドがアミノ酸残基配列に保存的置換を含む場合は、該置換アミノ酸残基は、また別の生物学的に類似のアミノ酸残基によって置き換えられ、その結果、生じたポリペプチドは未置換のアミノ酸残基配列と組成的に異なるアミノ酸残基配列を有する。保存的置換の幾つかの具体例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような親水性残基の別の親水性残基への置換を含む。また、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン等の極性残基は、この群のまた別の種類と保存的に置換することができる。
また別の局面の保存的置換を含むポリペプチドは、置換アミノ酸残基が未置換の元のアミノ酸残基に置き換えられる場合に生じる。置換アミノ酸の例は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）（４）で見出すことができるが、これらは参考文献として本明細書に含まれている。本題のポリペプチドが、１つまたは１つ以上の保存的置換を除いて天然のアポ蛋白の配列に対応するアミノ酸残基配列を有するとき、好ましくは、天然のアポ蛋白のアミノ酸残基の約４０％未満、より好ましくは約２０％未満が該ポリペプチドにおいて置換されている。
周知のように、蛋白またはポリペプチドにプロリン残基が存在するとき、配列に捩れを生じ、これは一次構造だけでなく二次および三次構造の相違に繋がる。実際ＧＰＩＩＩａのロイシン33／プロリン33置換は、ＰｌA1およびＰｌA2アロアンチゲン決定基の間の相違をもたらす。このように、別の残基のために置き換えられたプロリン残基は保存的置換ではない。
本発明のポリペプチドは、当業者に既知のペプチド合成技術のいずれによっても合成することができる。利用可能な該技術のいくつかの要旨は、スチュアードとヤングの文献（J．M．Stuard & J．D．Young，“ペプチド固相合成”（“Solid Phase Peptide Synthesis”）W．H．Freeman，Co．，サンフランシスコ（1969））、マインホーファーの文献（J．Meinhofer，“ホルモン蛋白およびペプチド”（“Hormonal Proteins and Peptides”２巻、46ページ、アカデミックプレス（ニューヨーク）1983）および米国特許第４６３１２１１号で見出すことができるが、これらは参考文献として本明細書に含まれている。通常、これらの技術はメリフィールド（Merrifield，JACS，85:2149（1963））が記載したような固相技術を用いる。また別に、本題ポリペプチドは、２つの小さなポリペプチドを、例えばペプチド結合またはジスルフィド結合を介して直接共役反応によって製造することができる。
しかしながら目的のポリペプチドにおける７つのシステインの存在のために、本題ポリペプチドは、好ましくは、組換えＤＮＡ技術によって合成される。そのような組換え技術は、所望のポリペプチドが本例の場合のように比較的大きい場合（例えば長さが約５０残基より大）は特に好ましい。本題ポリペプチドを製造するために組換え技術が用いられる場合、所望のポリペプチドまたは該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡセグメントは、その後の発現のために予め選ばれたベクターに繋ぎ合わされる。
好ましい本題ポリペプチドは大腸菌によって発現される。したがって、大腸菌細胞によって行われる一切の翻訳後修飾を含む保存的に置換されたポリペプチドもまた意図されている。したがって、本題のポリペプチドは、ファージλｇｔ２２またはＭＡＬTMｃ２もしくはＭＡＬTMｐ２のようなベクターを含む組換え分子で形質転換された大腸菌によって発現させることができる。
Ｃ．ＤＮＡセグメント
本発明のＤＮＡセグメント（目的のＤＮＡセグメント）は前述の本題ポリペプチドをコードする。ＤＮＡセグメントは、下記で述べるようにポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）で作成した場合のように、高度な操作に利用可能な分断され“単離された”化学的物質種であるべきである。ここで考察するすべてのＤＮＡセグメントは、５’および３’の両末端を有する。
また別に、単離された本題のＤＮＡセグメントは、クローニングし、または続いて適切な宿主で発現させる場合のように、ベクターに機能しうるように繋ぎ合わせることができる。周知のように、該ＤＮＡセグメントは、本題ポリペプチドまたは本題融合ポリペプチドの発現のためにベクターに読み枠にしたがって共有結合させるとき、ベクターに“機能しうるように繋ぎ合わされる”。さらに、ＤＮＡセグメントが機能しうるように発現ベクターに繋ぎ合わされるとき、該ＤＮＡセグメントの発現がプロモーター配列の制御下にあるように、該プロモーター配列が存在する。機能しうるように繋ぎ合わされた本題ＤＮＡセグメントを含むベクターは下記で極めて詳細に考察する。
好ましい単離ＤＮＡセグメントは、本題ポリペプチド（例えば配列番号：７または配列番号：９のアミノ酸残基配列）をコードする少なくとも１９５塩基対（ｂｐ）のヌクレオチド配列を含む。ＰｌA1またはＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２または配列番号：４に示したようにＧＰＩＩＩａの約８００ヌクレオチド塩基対までを含むことができる。
１つの具体例では、本発明の単離ＤＮＡ分子は、ＰｌA1決定基を含むＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコードする約１９５から約８００ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）を含む。好ましくは、このＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列は、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７または配列番号：１９である。これらのアミノ酸残基配列をコードする単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６および配列番号：１８にそれぞれ示されている。
また別の具体例では、本発明の単離ＤＮＡ分子は、ＰｌA2決定基を含むＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコードする約１９５から約８００ヌクレオチド塩基対を含む。好ましくは、このＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列は、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９である。これらのアミノ酸残基配列をコードする単離ＤＮＡ分子は、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６および配列番号：２８にそれぞれ示されている。
本題の単離ＤＮＡセグメントまたは、以下で考察する組換えＤＮＡ分子としてベクターに繋ぎ合わされたそのセグメントは、ＰｌA1またはＰｌA2決定基のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基をコードするコドン、すなわちベクター導入残基または配列もまた含むことができる。これらの他のコドンおよび発現ポリペプチドのコードされたアミノ酸残基は、先に述べたスペーシング（連結）配列を構成する。
したがって、目的のポリペプチドは、本題の単離ＤＮＡセグメントによってコードすることができる。発現された融合ポリペプチドの場合のように、しばしば目的のポリペプチドの一部分はベクターによって与えられる。とはいえ、ベクターおよび制限部位の適切な選択によって、本発明の単離ＤＮＡセグメントは、スペーシングアミノ酸残基配列のない所望のポリペプチドをコードすることもできる。
本発明の単離ＤＮＡセグメントの全長は、少なくとも前述のＰｌA1またはＰｌA2決定基をコードする配列が存在する限り、殆どの場合選択の問題である。例えば、千から数千の塩基対が発現終止コドンの下流に存在しうる。同じように、ＰｌA1またはＰｌA2決定基発現開始コドンの上流に千から数千またはそれ以上の塩基対が存在しうる。ただし、本題ＤＮＡセグメントがＰｌA1またはＰｌA2決定基を、β−ｇａｌ遺伝子およびβ−ｇａｌ遺伝子の制御配列部分同様そこに含まれている、該発現読み枠が維持されていなければならない。
上記に述べたＤＮＡセグメントに匹敵する（相補的な）ＲＮＡセグメントもまた目的とされる。この具体例では、ＲＮＡセグメントはＲＮＡベクター（例えばウイルスＲＮＡ）に周知のように繋ぎ合わせることができる。
本題のＤＮＡセグメントは、化学的技術、例えば周知のホスホトリエステル法〔Matteuciら、JACS，103:3185（1981）〕で容易に合成することができる。ＤＮＡセグメントを化学的に合成することによって、鋳型のポリペプチドのアミノ酸残基または配列のどのような所望の置換、挿入または欠失も、該当する変更を該ＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列に施すことによって容易に提供することができる。
化学合成技術に加え、酵素的技術によっても本発明のＤＮＡセグメントを製造することができる。したがって、予め限定された認識配列でＤＮＡ分子を切断する制限酵素を、本題ポリペプチドをコードするより大きなＤＮＡ分子からＤＮＡフラグメントを単離するために用いることができる。典型的には、この方法で産生されるＤＮＡフラグメントは粘着“張り出し”末端を有し、それによって、一本鎖のヌクレオチド配列は該分子の二本鎖領域を越えて伸長する。そのような粘着末端の存在は平滑端ＤＮＡ分子よりしばしば好ましいが、平滑端ＤＮＡも、１つの平滑端および１つの張り出し末端を有するフラグメントの場合のように用いることができる。典型的に平滑端を提供する、比較的特異性の少ない酵素（例えばＤＮＡ分解酵素Ｉ（ＤＮアーゼＩ）も用いることができ、ここでも実際に用いた。続いて、単離ＤＮＡフラグメントを適切なベクターに機能しうるように繋ぎ（クローニングし）、それによって、目的ＤＮＡセグメントをベクターに取り入れることができる。
目的ポリペプチドをコードするＲＮＡセグメントを用いる場合はいつでも、該ＲＮＡセグメントを含むＲＮＡ分子は、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写される。続いて該ｃＤＮＡ分子を発現ベクターに繋ぎ、これで適切な宿主を形質転換し、所望の本題ポリペプチドを得ることができる。
上記のアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡセグメントに開始コドンおよび終止コドンを提供することができ、また開始および終止コドンの１つまたは両方をより大きなＤＮＡ分子（例えば該ＤＮＡセグメントに機能しうるように繋いだベクター）によって与えることができる。本発明の所望のポリペプチドは、開始および終止コドンを慎重に配置することによって生成することができる。例えば、ヌクレオチド配列は該セグメントの３’および５’末端の１つまたは両方に付与することができ、その結果、Ｎ−末端またはＣ−末端のアミノ酸残基配列を含むことによって、前述のエピトープアミノ酸残基配列より大きいポリペプチドが発現される。さらに、レギュレーター、プロモーターおよびオペレーター座位は、所望の場合、目的ＤＮＡセグメントの５’末端に与えられる。
標準的な化学的または酵素的合成技術に加え、このＤＮＡセグメントはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いて生成することができる。ＰＣＲでは、鋳型の核酸の特定部分に相補的なプライマー分子を用い、該標的に相補的な核酸領域を含むプライマーの伸長生成物を形成する反応によって、特異的なポリ核酸標的が転写される。鋳型と伸長プライマーを単離した後、各プライマーの伸長生成物は鋳型として機能し、特異的に相補的プライマー分子とアニーリングする。生じた伸長が開始された鋳型はさらに進行する伸長反応のための基質として機能する。これらの工程は繰り返され（好ましくは自動反復工程を用いて）、それによってプライマーがハイブリダイズする最初のポリ核酸標的は指数関数的に増幅される。ＰＣＲを行う方法は既に詳しく記載されている（例えば米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号参照、これらの記述は参考文献として本明細書に含まれている）。
標的ＤＮＡセグメントは、しばしば極めて少量しか存在しないので、ＰＣＲは標的ＤＮＡセグメントの十分な増幅をもたらし、標的セグメントの効率的なクローニングおよび発現を可能にする。
ＰＣＲは、各増幅段階で重合反応を開始するために正方向および逆方向の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー分子を用いるので、少なくとも標的ＤＮＡの一部分に相補的な正方向および逆方向のプライマー分子が必要とされる。さらに必要とされるものは、標的ＤＮＡセグメントに相補的なプライマー分子の領域に近接する、予め選択した制限酵素の認識部位をもつヌクレオチド配列を有するプライマー分子である。
該プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長生成物の合成を開始させるために十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの由来を含む多くの因子に左右される。例えば、鋳型配列の複雑さにもよるが、ポリヌクレオチドプライマーは、典型的には１５から２５、またはそれより多いヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドを含むことができる。ポリヌクレオチドプライマーでは８ヌクレオチドでも有効に使用できることが報告された〔Studierら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6917-21（1989）〕。短いプライマー分子では、十分に安定なハイブリダイゼーション複合体を形成し、プライマー伸長を開始させるためにより低い温度が一般に必要である。
用いられるプライマーは、増幅させる各配列の鎖に対して実質的に相補的であるように選択される。したがって、プライマーは、その対応する鋳型配列と非恣意的にハイブリダイズするために十分に相補的なヌクレオチドを含む。それゆえ、プライマー配列のハイブリダイズする領域は鋳型と正確に相補的でないかもしれない。
例えば、非相補的ポリヌクレオチドは、実質的にそのポリヌクレオチドと相補的なプライマー配列の残りの部分とともに、プライマーの５’末端に結合することができる。そのような非相補的なポリヌクレオチドは蛋白結合部位をコードするか、または該コドンの読み枠の調製を可能にする。また、プライマー配列が鋳型の鎖の配列と十分な相補性を有することを条件として、非相補的塩基をプライマー内に点在させ、ハイブリダイズする条件下で非恣意的ハイブリダイゼーション（イノシン塩基が非特異的なコード化用いられる場合のように）が生じることを可能にすることができる。プライマーの３’末端に正確に適合する３ヌクレオチドの小さなプライマーは、プライマー伸長生成物を特異的に開始させることができる〔Sommerら、Nuc．Acid Res.，17:6749（1989）〕。
好ましくは、効率を最大にするため一本鎖で提供されるが、二本鎖であってもよい。二本鎖のプライマーを用いる場合は、伸長生成物の調製に用いる前に、該プライマーをまず融解して鎖を単離する。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。
プライマーは種々の方法によって調製できるが、これらの方法は、デノーブ化学合成および天然の核酸配列（例えば遺伝子、対立形質遺伝子、イントロン、およびゲノム、プラスミドまたはベクターのコドン）からの核酸フラグメントの誘導を含む。フラグメントは、より大きな二本鎖核酸の制限エンドヌクレアーゼによる制限消化およびポリメラーゼと核酸鋳型を用いる重合合成のような方法によって得ることができる。ポリヌクレオチドのデノーブ化学合成は、一般に、本題ポリペプチドをコードする天然のＤＮＡ配列が既知のときに好ましく、適切ないずれの方法（例えば周知のホスホトリエステル法またはホスホジエステル法）によっても行うことができる（例えば以下を参照のこと：Narangら、Meth．Enzymol.，68:90（1979）；Itakuraら、Ann．Rev．Biochem.，53:323-56（1989）；Brownら、Meth．Enzymol.，68:109（1979）；および米国特許第4356270号、これらの記述は本明細書に参考文献として含まれている）。
核酸からのプライマー分子の誘導は、典型的には核酸をクローニングベクターとともに適切な宿主に導入し（ベクターの増殖はクローニングされる核酸の量を増加させる）、続いてクローニングされた核酸のフラグメントまたはサブフラグメントを単離することを含む。核酸フラグメントのサブクローニング技術についての記述は以下の文献に見出される：マニアーティス（Maniatis）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー研究所刊、390-401ページ、（1982）；米国特許第4416988号および4403036号（これらの記述は本明細書に参考文献として含まれている）。
本方法でハイブリダイズされる鋳型核酸配列はいずれの核酸含有サンプルにおいても用いることができるが、ただしサンプルは、純度および濃度に関して核酸ハイブリダイゼーション反応に適合する形態である必要がある。ハイブリダイゼーションに適した程度に核酸を単離することは一般に既知で、種々の手段で達成できる（例えば次の文献を参照〔マニアーティス（Maniatis）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー研究所刊、390-401ページ、（1982）；オースベル（Ausubel）ら、分子生物学の今日のプロトコール（Protocols in Molecular Biology），John Wiley & Sons刊、（1987）〕。
ハイブリダイゼーション反応は、プライマーがその相補的核酸鋳型にハイブリダイズすることができる、予め限定した条件下で実施される。ここで用いられている“ハイブリダイゼーション条件”とは、プライマーが鋳型配列とアニールし核酸二重合体を形成することができる、インキュベーションの時間、温度およびｐＨの指標の一組を指す。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えばハイブリダイズするプライマーの長さ、プライマーと鋳型との間の相補性の度合い、該ポリヌクレオチドのグアノシンおよびシチジン含量、所望するハイブリダイゼーションの厳密性およびハイブリダイゼーションの動態に影響を与えうる塩および付加的試薬の存在のような因子に左右される。与えられたハイブリダイゼーション反応混合物についてのハイブリダイゼーション条件の最適化のための方法は当業界で既知であるが、典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、ｐＨを４から９の間に緩衝させた溶液、温度は１８℃から７５℃、好ましくはおよそ３７℃からおよそ６５℃、より好ましくはおよそ５４℃、時間は０．５秒から２４時間、好ましくはおよそ２分を含む。
ハイブリダイゼーションは、周知のように均質または非均質形式で実施される。均質ハイブリダイゼーション反応は完全に溶液中で行われ、そに場合、ハイブリダイズされるべきプライマーおよび鋳型配列の両方が溶液中で溶解形で存在する。非均質反応は、反応媒体中で不溶性であるマトリックスの使用が必要で、該マトリックスにプライマーまたは鋳型のいずれかが結合されている。さらにまた、ｃＤＮＡ形成、ジデオキシ配列形成、およびプライマーハイブリダイゼーションが最初の工程であるプライマー伸長反応を用いる他の工程のために、単離ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡの逆転写が実施される均質ハイブリダイゼーション反応が意図される。
核酸含有鋳型配列が二本鎖（ｄｓ）形である場合、好ましくは、例えばハイブリダイゼーション反応の前に熱またはアルカリ処理でそれを変性させる。ｄｓＤＮＡの変性は、ハイブリダイズされるべきプライマーと混合する前に実施するか、またはプライマーとｄｓＤＮＡを混合した後に実施することができる。プライマー自体が二本鎖分子として提供される場合、混合前にそれを変性させるか、または鋳型を含むｄｓＤＮＡと一緒に変性させることができる。
プライマー伸長反応は適切ないずれの方法を用いても実施できる。好ましくは、プライマーの過剰分子（ゲノム核酸について、通常１０6：１（プライマー：鋳型））を鋳型鎖を含む緩衝液に混合する。高いモル過剰がこの方法の効率を高めるために好ましい。長さが約２０から２５ヌクレオチドのポリヌクレオチドプライマーについては、典型的な割合は、哺乳類ゲノムＤＮＡ１００ｎｇから５００ｎｇにつきまたはプラスミド１０から５０ｎｇにつき、５０ｎｇから１μｇの範囲、好ましくは２５０ｎｇである。
デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）もまたプライマー伸長反応混合物に、プライマー伸長生成物の合成を支援するために適切な量で混合される。当業者は用いる量を容易に決定できる。
典型的なプライマー伸長反応では、ハイブリダイゼーション混合物は、約９０−１００℃、約１から１０分、好ましくは約１から４分加熱される。この加熱時間後、溶液を室温まで冷却し、プライマー／鋳型のハイブリダイゼーションを可能にする。該冷却混合物に、プライマー伸長反応を誘導または触媒する適切な試薬を加える。合成反応は、室温から該誘導試薬がもはや効率よく機能できない温度以上で行うことができる。したがって、例えば誘導試薬としてＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合、ポリメラーゼが耐熱性でない限り、適切な温度は一般に約４０℃を越えない。
誘導試薬は、プライマー伸長生成物の合成を達成するいずれの化合物または系でもよい。この目的のための適切な試薬は、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、組換え修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および他のＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、並びにプライマー伸長反応を促進する他の酵素を含む。
耐熱性（熱好性）ＤＮＡポリメラーゼは、自動化温度サイクルのＰＣＲ形式でそれらは熱に安定であるという点で特に好ましい。代表的な耐熱性ポリメラーゼはバチルス・ステアロテルモヒルス（Bacillus stearothermophilus）（バイオラッド、リッチモンド、カリフォルニア）、テルムス・テルモヒルス（Thermus thermophilus）（FINZYNME，ATCC#27634）、テルムス・スペシーズ（Thermus species）（ATCC #31674）、テルムス・アクアチクス（Thermus aquatics）ＴＶ株１１５１Ｂ（ATCC#25105）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）（Bukhrashuiliら、Biochem．Biophys．Acta，1008:102（1989）；Elieら、Biochem．Biophys．Actz，951:261（1988））、テルムス・フィリホルミス（Thermus filiformis）（ATCC #43280）から単離されたＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・フラブス（Thermus flavus）（Molecular Biology Resources；ミルウォキー、ワイオミング）から単離されたポリメラーゼ、および“ベント”（”Vent”）ポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブ、ビバリー、マサチューセッツ）である。特に好ましいものはＴａｑＤＮＡポリメラーゼで、パーキンエルマーシータス（ノーウォーク、コネチカット）、プロメガ（マジソン、ワイオミング）およびストラタジーン（ラホイヤ、カリフォルニア）を含む種々のものから入手可能である。さらに、組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼであるＡｍｌｉＴａｑTMＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマーシータスから入手可能）も特に好ましい。
ＰＣＲは、典型的には以下の工程を反応混合物について反復することによって実施される：（１）加熱して変性一本鎖鋳型およびプライマーを形成し、（２）冷却して鋳型にプライマーをハイブリダイズさせ、（３）予め限定した条件を維持してプライマー伸長生成物を形成させる。特定の核酸配列をＰＣＲによって増幅させる方法およびシステムは米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号（これらは参考文献として本明細書に含まれる）、並びにＰＣＲ技法（PCR Technology），エルリッヒ（Erlich）編、ストックトンプレス（1989）；ファルーナ（Faloona）ら、Methods in Enzymol．155:335（1987）；ポリメラーゼ・チェーン・リアクション、エルリッヒら編、コールドスプリングハーバー研究室出版（1989）に記載されている。
増幅核酸生成物の検出には、周知の種々の技術のいずれも用いることができる。好ましい具体例では、増幅生成物は、分子量を基にゲル電気泳動によって単離され、該単離生成物は核酸に特異的な染色で可視化される。種々の核酸特異的染色が存在し、電気泳動で単離された核酸を可視化するに適しているが、臭化エチジウムが好ましい。
増幅核酸生成物を検出するまた別の方法は、ハイブリダイゼーションによる検出手段を含むが、これは該増幅生成物にハイブリダイズすることができる標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる。そのような検出手段の典型は、サザンブロット分析、インビトロ標識ポリリボヌクレオチドプローブを用いるリボヌクレアーゼ保護分析、および特定のヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法に類似するものを含む（例えばオーズベルらの文献を参照のこと；Ausubelら、今日の分子生物学のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、John Wiley & Sons、1987）。
特定の核酸配列の存在を検出するまた別の方法では、プライマー伸長反応で用いられたデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）が、プライマー伸長生成物を検出させる標識または指示団を含む。典型的には、そのような標識は、放射性原子、化学修飾ヌクレオチド塩基などである。適切な放射性標識は3Ｈ、14Ｃ、32Ｐおよび35Ｓなどである。
放射性標識ｄＮＴＰに代わるものは、化学的に修飾され、金属錯塩化剤、ビオチン含有基、蛍光化合物などを含むｄＮＴＰである。有用な金属錯塩化剤は、蛍光ランタニド金属およびβ−ジケトネートリガンドによって形成されるランタニドキレート化合物である。ランタニドは核酸に結合し、それによって蛍光ランタニド／核酸複合体が形成される（米国特許第4374120号、同4569790号、並びに国際特許出願公告公報EP139675号およびWO87/02708号（これらの記述は本明細書に参考文献として含まれている）を参照）。
ビオチンまたはアクリジンエステル標識オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとしてのそれらの使用は既に記載されている（米国特許第4707404号、国際特許出願公告公報ep212951号および欧州特許出願公告公報87636号参照）。オリゴヌクレオチドの有用な蛍光マーカーには、フルオレセイン、ローダミン、テキサス赤、ＮＢＤなどが含まれる。
ハイブリダイズしたプローブからハイブリッド非形成標識プローブを単離する技術は周知であり、典型的には、その化学的特性に基づく一本鎖核酸の二本鎖核酸からの単離を含む。しばしば、非均質的単離形式が用いられ、その場合ハイブリッド非形成プローブは、不溶性マトリックスに結合した標識ＤＮＡ二重合体から洗浄によって単離される。この技術の典型はサザンブロットで、この場合、マトリックスはニトロセルロース膜で標識は32Ｐである〔サザン（Southern），J．Mol．Biol．98:503（1975）〕。
Ｄ．組換えＤＮＡ分子
上記ＤＮＡセグメント（外来ＤＮＡセグメント）に機能しうるように連結されたベクターを含む組換えＤＮＡ分子もまた目的とされる。該組換えＤＮＡ分子（ＤＮＡ構築物）は、本発明のポリペプチドをコードする本題ＤＮＡセグメントの増幅および／または発現を促進することができる。
目的の組換えＤＮＡ分子は、天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列をコードする前述の単離ＤＮＡセグメントを含んでいる。好ましくは、該ＤＮＡセグメントは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８から成る群から選ばれる。
特に好ましい組換えＤＮＡ分子（これは適切な宿主細胞内で形質転換により増殖することができる）は、ＰｌA1決定基のアミノ酸残基配列をコードする配列番号：１０の本題ＤＮＡセグメントを含み、さらに、ＧＰＩＩＩａのリーダーアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド塩基配列を含む。配列番号：２０に示すまた別の好ましいＤＮＡセグメントはＰｌA2決定基をコードする。好ましくは、該ＤＮＡ構築物は、本題ポリペプチドをコードする約１９５から約８００塩基対のヌクレオチド配列を含む。
典型的には、本発明の組換えＤＮＡ分子は、上記のＰｌA1またはＰｌA2決定基と融合させた免疫学的に“不活性な”連結ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む。この点に関して典型的な配列は、β−ガラクトシダーゼまたはＭＢＰ分子部分をコードする。そのような組換えＤＮＡ分子は、読み枠にしたがって目的ＤＮＡセグメントを、β−ガラクトシダーゼまたＭＢＰ蛋白もしくはペプチドをコードする遺伝子を含むベクターに挿入することによって得ることができる。
目的の組換えＤＮＡ分子（ベクター）は環状化しても直線状にしてもよい。
本発明のまた別の局面は、融合ポリペプチドをコードする前述のＤＮＡセグメントに、機能しうるように連結された発現ベクターを含む組換えＤＮＡ分子に関する。該ベクター分子は、前述の免疫学的に不活性な蛋白のアミノ酸残基配列に機能しうるように連結された、前述の天然形ＰｌA1またはＰｌA2のアミノ酸残基配列を含む融合ポリペプチドの増幅および発現を可能にする。
したがって、本題融合ポリペプチドをコードする典型的なベクターは以下を含む：
（ａ）免疫学的に不活性な蛋白（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはＭＢＰ）の全体または部分のアミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列をコードするおよそ３６００ヌクレオチドを含む第一のヌクレオチド配列（これは、この第一のヌクレオチド配列に機能しうるように連結された第二のヌクレオチドを伴う）、および；
（ｂ）天然のＰｌA1またはＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列を含むＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコードする約１９５から約８００ヌクレオチドを含む第二のヌクレオチド配列。
好ましくは、第二のヌクレオチド配列は約２７５ヌクレオチドを含む。天然のＰｌA1決定基のアミノ酸残基配列を含む、ＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号：１０に示される。天然のＰｌA2決定基のアミノ酸残基配列を含む、ＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号：２０に示される。
目的の組換えＤＮＡ分子を形成するために、本発明のＤＮＡセグメントが機能しうるように連結されるベクターの選択は、所望される機能的特性、例えば転写効率、選択される形質転換宿主細胞内での発現効率、制限部位の位置（例えばＰＣＲ生成物がベクターで直接クローニングされる場合）などに左右される。しかしながら、本発明のベクターは、少なくとも、本題のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの複製を指令することができる。
好ましくは、選ばれるベクターは原核細胞レプリコン、すなわち自律的複製および形質転換原核宿主細胞内での染色体外組換えＤＮＡ分子の維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列を含む。そのようなレプリコンは当該技術分野で周知である。さらに、原核細胞レプリコンを含むベクターはまた、好ましくは、薬剤耐性遺伝子を含み、それによって、ベクターで形質転換された宿主は容易にスクリーニングすることができる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。糖代謝に基づくスクリーニング手段としてのβ−ガラクトシダーゼの使用もまた、本発明で意図されるものである。
原核細胞レプリコンを含むベクターは、好ましくは、本題ポリペプチドの遺伝子の転写を指令することができる原核細胞プロモーターを含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および、一本鎖ＤＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子への転写を促進するＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素（エレメント）である。細菌宿主に適合したプロモーター配列（例えばｔａｃプロモーター）は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を有するプラスミドベクターで提供される。そのようなベクタープラスミドの典型は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（バイオラッドラボラトリーズ（リッチモンド、カリフォルニア）より入手可能）；ｐＰＬ、ｐＵＲ、ｐＫＫ２２３（ファルマシア（ピスカタウェー、ニュージャージ）より入手可能）；ＭＡＬTMｃ２およびＭＡＬTMｐ２（ニューイングランドバイオラブ（ビバリー、マサチューセッツ）より入手可能）；およびλｇｔ２２（Promega Corp．,（マジソン、ウィスコンシン）より入手可能）である。λｇｔ２２ベクターが好ましい。
真核細胞に適合する発現ベクター（好ましくは脊椎動物細胞に適合するもの）もまた、前述の組換えＤＮＡ分子を形成するために用いることができる。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、幾つかの発売元から入手できる。典型的には、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のために好都合な制限部位を有する。そのようなベクターの典型例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）、ｐＢＰＶ−１ｐＭＬ２ｄ（インターナショナルバイオテクノロジー社）、およびｐＴＤＴ１（ATCC，#31255）である。真核細胞に適合するベクターで使用する好ましい薬剤耐性マーカーは、ネオマイシンホスホランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である〔サザンら、J．Mol．Appl．Genet．，1:327-341（1982）〕。
本発明の組換えＤＮＡを発現するレトロウイルスベクターもまた本発明が意図するものである。所望のＤＮＡ分子を発現させるレトロウイルスベクターの構築および使用は既に記載されている（ソーグら（Sorgeら、Mol．Cell．Biol．，4:1730-37（1984））の文献を参照）。
本ＤＮＡセグメントを相補的な粘着末端を介してベクターに機能しうるように連結するために、多くの方法が利用可能である。例えば、相補的なホモポリマー鎖を挿入されるべきＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに付加することができる。続いて、ベクターおよびＤＮＡセグメントを相補的なホモポリマー付加部の間で水素結合によってハイブリダイズさせ、組換え二重合体ＤＮＡ分子を形成する。また別に、１つまたは１つ以上の制限部位を含む合成リンカーを用い、本ＤＮＡセグメントをベクターに会合させることができる。
ＤＮＡセグメントをエンドヌクレアーゼ制限消化で調製するときは、突出３’一本鎖末端を除去し、さらに後退した３’末端を充填するＤＮＡポリメラーゼで処理して、それによって平滑端を有するＤＮＡセグメントを生成することができる。平滑端ＤＮＡセグメントを、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（これは平滑端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる）のような酵素の存在下で、極めて過剰モルのリンカー分子とともにインキュベートする。したがって、この反応生成物は、その中に制限部位を有するリンカー配列に末端で共有結合したＤＮＡセグメントである。続いて、これらのＤＮＡセグメントの制限部位は適切な制限酵素で切断され、この切断されたＤＮＡセグメントの末端と適合する末端を有する発現ベクターに該セグメントは連結される。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、インターナショナルバイオテクノロジー社（ニューヘブン、コネチカット）を含む多数の発売元から市販されている。
Ｅ．形質転換および精製
また、本発明で意図するものは、前述のＤＮＡセグメントを含む前述の組換えＤＮＡ分子で安定的に形質転換された細胞である。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもいずれでもよい。好ましい原核宿主細胞は大腸菌、例えば大腸菌Ｙ１０９０（ｒ-）株、Ｙ１０８９（ｒ-）株またはＬＥ３９２株（プロメガより入手可能）である。好ましい真核宿主細胞は、麦酒酵母菌（S．cerivisiae）のような酵母菌および哺乳類細胞、好ましくは脊椎動物細胞（例えばマウス、ラット、ヤギまたは霊長類細胞株からの細胞）、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
本発明の組換えＤＮＡ分子による適切な宿主細胞（例えば大腸菌Ｙ１０９０株）の形質転換は、用いられるベクターの種類に例によって依存する周知の方法によって達成される。原核細胞の形質転換に関しては、マニアーティスらの文献（Maniatisら、分子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー研究室、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1982））を参照し、脊椎動物細胞のレトロウイルスＲＮＡベクターによる形質転換に関しては、ソーグらの文献（Sorgeら、Mol．Cell．Biol．，4:1730-37（1984））を参照のこと。
首尾よく形質転換された細胞（すなわち本発明の組換えＤＮＡ分子で安定的に形質転換された細胞）は、周知の技術で同定することができる。例えば、安定的に形質転換された細胞はクローニングされ、単クローン性のコロニーを生じる。これらのコロニーからの細胞を採集して溶解し、そのＤＮＡ内容物を所望のＤＮＡセグメントの存在について、サザン（Southern，J．Mol．Biol．，98:503（1975））によって記載されたような方法を用いて調べる。
所望のＤＮＡセグメントの存在の直接分析に加え、形質転換の成功は、形質転換細胞が前述のポリペプチドを発現しているときは、周知の免疫学的方法で確認することができる。この方法では、形質転換されていると思われる細胞サンプルを、該ポリペプチドを発現するために十分な時間、適切な栄養培地中で培養を続ける。これらの細胞を採集し、目的のポリペプチドと免疫的に反応する（特異的に結合する）抗体を用い所望の抗原性について調べる。
本発明でまた意図されるものは、安定的に形質転換された宿主細胞培養である。形質転換宿主細胞の培養に有用な栄養培地は当該技術分野で周知であり、幾つかの販売元から得ることができる。哺乳類宿主細胞を用いるときは、“血清非含有”培地を使用するのが好ましい。
一旦安定的に形質転換された宿主細胞が識別されると、これらの細胞は、該ポリペプチドを発現させるために十分な時間、適切な培養条件下でこれらの細胞を維持（培養）することによって、目的のポリペプチドを発現（調製）するための方法に使用することができる。発現されたポリペプチドは、好ましくは培養細胞から単離（回収）される。
培養から発現蛋白を回収する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ゲルろ過、ゲルクロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーおよび関連技術が、培養から発現蛋白を単離するために用いることができる。さらに、免疫化学的方法（例えば免疫親和性、免疫吸着など）を、本明細書で述べる方法によって例証するように周知の方法を用いて実施することができる。
Ｆ．抗体および接種物
本発明の単離ポリペプチドは、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応する抗体の調製のための免疫原として用いることができる。本発明の単離ポリペプチドは、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1およびＰｌA2と実質的に同じ一次、二次および三次構造を有するので、産生された抗体は、該単離抗体および天然のＰｌA1またはＰｌA2抗原決定基の１つの両方と反応する（ただし決定基のもう一方とは反応しない）。
本発明の抗体は、典型的には本発明のポリペプチドを含む接種物で宿主哺乳動物を免疫し、抗体が生じるために十分な期間該宿主を維持し、それによって天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基について免疫特異性を有する哺乳類の抗体分子を誘発することによって製造される。続いて、抗体分子を該哺乳類から採集し、周知の技術、例えばＤＥＡＥセファデックスを用いてＩｇＧ分画を得ることによって所望の程度まで単離する。
“接種物”という言葉は、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応する抗体の調製のために用いる活性成分として、免疫原となりうる量の本発明の単独ポリペプチドまたは融合ポリペプチドとして含有する組成物水溶液を指すために本明細書では用いられている。接種物はしばしば抗体誘発促進のためにアジュバントを含む。
天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基に対して免疫特異性を有する抗体分子を製造するために接種物に使用される、適切な本発明の単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは以下に記載するようなものであり、それらは配列番号：３、７、１１、１３、１５、１７および１９のアミノ酸配列を含む。特に好ましい単離ポリペプチドは、配列番号：７および配列番号：１１のアミノ酸残基配列を含む。
天然のＧＰＩＩＩａＰｌA2決定基に対して免疫特異性を有する抗体分子を製造するために接種物に使用される、適切な本発明の単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは以下に記載するようなものであり、それらは配列番号：５、９、２１、２３、２５、２７および２９のアミノ酸配列を含む。特に好ましい単離ポリペプチドは、配列番号：９および配列番号：２１のアミノ酸残基配列を含む。
上記の抗体組成物はオリゴクローン性である。
天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基の一方のみと免疫的に反応するが、他のＧＰＩＩＩａまたは他の決定基、例えば融合ポリペプチドの他の部分の決定基とは免疫的に反応しない抗体分子を製造するために、免疫吸着法を用い、望ましくない免疫特異性を除去する。
免疫特異性を除去するための免疫吸着法は一般に周知で、典型的には先ず第一に所望の抗体分子を含む組成物を、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基含有ポリペプチドの一方または他方を結合させた固相と接触させ、免疫吸着混合物を形成させることを含む。該ポリペプチドは、好ましくはＧＰＩＩＩａの１から６５のアミノ酸残基のただ１つを含み、その結果他のＧＰＩＩＩａエピトープとの交叉反応を最小にする。
該免疫吸着混合物を免疫反応条件下で、免疫複合体が固相で形成される（すなわち固相結合免疫複合体が形成される）ために十分な時間維持する。その後、液相と固相を単離し、固相に免疫吸着された所望の抗体分子を有する固相を保有する。続いて、該免疫複合体の結合抗体を標準的な技術で該複合体から単離する。
固相に結合させた他方のＰｌA抗原を用いて上記の単離を繰り返せば、一方の決定基と反応するが他方とは反応しない抗体が液相で提供される。
好ましい抗体分子はオリゴクローン抗体、すなわち抗原上の限定された数のエピトープと免疫的に反応する抗体である。好ましいオリゴクローン抗体組成物は、天然のＧＰＩＩＩａ分子のアミノ末端の６５アミノ酸のエピトープ、すなわちＰｌA1またはＰｌA2決定基の一方または他方と免疫的に反応する。そのようなオリゴクローン抗体は、上記の免疫吸着技術を用いて、または前述のＰｌA決定基含有ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの１つで免疫することによって調製できる。
天然のＰｌA決定基に対する単クローン抗体（Ｍａｂ）もまた本発明で意図されるものである。“単クローン抗体組成物”という言葉は、特定の抗原と免疫的に反応することができるただ１種の抗体結合部位を有する抗体分子の集団をいう。したがって本Ｍａｂ組成物は、典型的には、それが免疫的に反応するいずれの抗原についてもただ１つの結合親和性を有する。本発明のＭａｂは、典型的には、ただ１種の抗体分子を分泌（生成）する単一細胞クローン（ハイブリドーマと呼ばれる）によって産生された抗体を含む。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマまたは他の自律永続細胞株とを融合させることによって形成される。そのような抗体は、最初コーラーとミルシュタインによって記載された（Kohler & Milstein，Nature，256:495-497（1975）、その記述は本明細書に参考文献として含まれる）。単クローン抗体調製についてのより最近の記載は米国特許第４８１８６７８号に見出されるが、その記述はまた本明細書に参考文献として含まれる。
そのように調製したハイブリドーマまたは他の細胞（下記）上清を、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1およびＧＰＩＩＩａＰｌA2決定基の両方、例えば抗体産生宿主細胞を誘発するために接種物において使用した単離ポリペプチドとの免疫反応性についてスクリーニングすることができる。一方の決定基とは免疫的に反応するが他方とは反応しない抗体を分泌する１つまたは１つ以上のハイブリドーマまたは他の細胞株を、例えばクローニングによって永続させる。
単クローン抗体はまた、キメラ抗体を製造する技術分野で習熟した者にとって周知の方法によって製造できる。これらの方法は、免疫グロブリンの可変領域（免疫グロブリン軽鎖の可変領域を構成する可変領域の一部分および免疫グロブリン重鎖の可変領域を構成する可変領域の一部分の両方を含む）の全体または一部分をコードする核酸の単離、高等操作および発現を含む。可変領域コード核酸の単離、操作並びに原核細胞および真核細胞でのその発現は以下の文献に記載されている：ロビンソン（Robinson）ら、国際特許公開公報WO89/0099号；ウィンター（Winter）ら、欧州特許出願公告公報第239400号；リーディング（Reading）米国特許第4714681号；キャビリー（Cabilly）ら、欧州特許出願公告公報第125023号；ソーグ（Sorge）ら、Mol．Cell Biol．，4:1730-1737（1984）；ベーア（Beher）ら、Science，240:1041-1043（1988）；スケラ（Skerra）ら、Science，240:1030-1041（1988）およびオーランディー（Orlandi）ら、Proc．Natl．Acad．Sci.USA，86:3833-3837（1989）。典型的には、該核酸は、予め選択された抗原（リガンド）に結合する免疫グロブリンの可変領域の全体または一部分をコードする。そのような核酸の起源は当業者にとって周知であるが、例えば、予め選択された抗原と結合する単クローン抗体を産生するハイブリドーマから得ることができ、また予め選択した抗原を複数の免疫グロブリン可変領域をコードする発現ライブラリーをスクリーニングするために、したがって核酸を単離するために用いることもできる。
本発明でまた意図されるものは、本発明の単クローン抗体を産生するハイブリドーマ細胞およびハイブリドーマ細胞を含む培養である。
そのように産生される抗体は、とりわけ、体サンプル中の血小板の型分けまたは血液サンプルのスクリーニングのために本発明の方法およびシステムで用いることができる。
活性成分としてペプチドを含む接種物の調製は当該技術分野でよく理解されている。典型的には、そのような接種物は、注射できるように（溶液または懸濁液のいずれかのような）調製される。注射の前に液体に溶解または懸濁させるために適した固体形もまた調製できる。該調製物はまた乳化物であってもよい。
周知のように、免疫原活性成分は、医薬的に許容され、さらに該活性成分と適合する水性賦形剤に溶解、懸濁または混合される。“医薬的に許容される”または“生理学的に耐えうる”という語は、宿主の哺乳類に投与したとき、典型的にはアレルギーまたは同様な不利な反応を生じない分子物質および組成物を指す。適切な賦形剤は、目的とする使用に左右されるが広範囲の形態をとることができ、例えば食塩を含む水溶液、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせである。さらに所望の場合は、該接種物は少量の補助物質、例えば湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、鉱物油、担体または接種物の有効性を強化するアジュバントを含むことができる。好ましい具体例は、活性成分として少なくともおよそ０．０１％からおよそ９９％の本発明の単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを、典型的には賦形剤１ミリリットル（ｍｌ）につき１０から２００μｇの活性成分の濃度で含む。
接種物はまた、免疫される哺乳動物の免疫反応の発生を促進させる抗原性担体に連結させた本発明の単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを含むことができる。有用な担体は当該技術分野で周知で、一般には蛋白自体である。そのような担体の典型例は、キーホールリンペットのヘモシアニン、エデスチン、チログロブリン、アルブミン（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、赤血球細胞（例えばヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ））、破傷風トキソイド、コレラトキソイドの他、ポリアミノ酸（例えばポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸））などである。
１つまたは１つ以上のアミノ酸残基を、それがポリペプチド上に予め存在しない場合は、該ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に付加して、担体へのポリペプチドの結合を助長させることができる。該ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に付加されたシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリマーを形成するために特に有用である。しかしながら、結合物を調製するために当該技術分野で周知の他の方法もまた用いることができる。典型的な付加連結方法は、マイケル付加反応生成物、グルタールアルデヒドのようなジアルデヒド〔Klipsteinら、J．Infect．Dis．，147:318-326（1983）〕などの使用、または、担体にアミド結合を形成するために水溶性カルボジイミドを使用する場合のようなカルボジイミド技術の使用を含む。
また当該技術分野で周知のように、単離ポリペプチドを仲介連結基の手段によってその担体に結合させることはしばしば利点を有する。上記に述べたように、グルタールアルデヒドはそのような連結基の１つである。しかしながら、システインを用いるときは、仲介連結基は好ましくはｍ−マレイミドベンキソイルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）である。
さらに、ＭＢＳは、エステル−アミド交換反応によって担体にまず付加することができる。その後、この付加に続いて、ブロックされたメルカプト基（例えばチオール酢酸、ＣＨ3ＣＯＳＨ）をマレイミド二重結合を越えて付加させることができる。該アシル遮断基の切断後、ジスルフィド結合は脱遮断連結基メルカプタンと該蛋白のシステイン残基のメルカプタンとの間で形成される。
抗原性担体は、免疫反応を高めまたは支援するため（免疫相乗作用）、または担体と一体となった接種物を使用することによって免疫反応のタイプを指令するために用いることができる。例えば以下の記載を参照のこと：ミリッヒ（Milich）ら、米国特許第４５９９２３１号、４５９９２３０号および４６８３１３６号並びにソーントン（Thornton）ら、米国特許第４８１８５２７号および４８８２１４５号。
免疫相乗作用の他の手段は、リポゾームおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）粒子の使用を含む。リポゾームの類のない多目的性はそのサイズ調整能、表面特性、脂質組成およびそれらが抗原を収容する方法にある。リポゾーム形成方法は当業界で既知である。例えば以下の文献を参照のこと：プレスコット（Prescott）編、細胞生物学における方法（Methods in Cell Biology)、１４巻、アカデミックプレス、ニューヨーク、（1976）３３ページから）。ＩＳＣＯＭ粒子では、ケージ様マトリックスがＱｕｉｌＡ（南アメリカの樹木の樹皮より抽出）で構成される。このマトリックスの表面との疎水性相互反応によって付加された抗原性蛋白またはペプチドによって強力な免疫反応が惹起される。
担体の選択は、免疫原の決定基部分より該免疫原の全体的な使用により依存し、さらに本発明に必ずしも含まれない基準に基づく。例えば、接種物は哺乳類宿主に使用されるので、周知のように、特定の哺乳類で不利な反応を生じない担体が選択される。
接種物は、慣用的に非経口的（注射による）に、例えば皮下または筋肉内に投与される。他の投与態様に適したまた別の製剤は、座薬および、いくつかの事例では経口製剤を含む。座薬については、慣用的な結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリッドを含むことができ、そのような座薬は、０．５％から１０％、好ましくは１−２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成できる。経口製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。該組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態をとり、１０−９５％、好ましくは２５−７０％の活性成分を含むことができる。
本発明の単離ポリペプチドは、中性形または塩として接種物に製剤化できる。医薬的に許容できる塩は酸付加塩（該蛋白または抗原の遊離アミノ基とともに形成される）を含むが、これらは、無機酸（例えば塩酸または燐酸）または酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で生成される。遊離カルボキシル基とともに生成される塩はまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロケインなどの有機塩基から調製できる。
該接種物は調剤形に適合した態様で、抗体産生免疫反応を誘発するために免疫原性を有しさらに効果的であるような量で投与される。所望の結果を達成するために投与されるべき接種物の分量は専門化の判定に左右され、さらに個々の哺乳類宿主に特有であるが、実験的宿主（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギなど）については周知である。
接種物はまた、賦形剤の一部分として前述のようにアジュバントを含むことができる。実験動物で使用されるフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）は、当該技術分野で周知である。明礬のような医薬的に許容できるアジュバントもまた使用できる。したがって、典型的な接種物は、約０．５ｍｇから約２．５ｍｇの明礬、または０．１％から１％のＡｌ（ＯＨ）3に吸着させた本発明の単離ポリペプチドの約５０から２００μｇを含む１ｍｌの燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。好ましい接種物は、２．５ｍｇの明礬担体に吸着させた１００μｇのポリペプチドを含む１ｍｌＰＢＳを含む。
該接種物の投与後、該接種物を与えられた哺乳類宿主は、該哺乳類の免疫系が免疫学的に反応するために十分な時間、典型的には周知のように２から８週間のオーダーでＰｌA含有免疫原と免疫的に反応する抗体の産生まで維持される。
本発明の単離ポリペプチド、融合ポリペプチド、および本発明の天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応する抗体は、血小板の型分けおよび天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応する抗体の検出のための診断方法および系に、後述のように用いることができる。
Ｇ．診断方法
天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基の１つと免疫学的に反応するが他方とは反応しない抗体を検出する方法、および血小板を型分けする方法も本発明の目的である。
血小板型分け方法は、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基の一方または他方を発現している血小板の性状を知るために用いられる。この方法は、供与者および受容者の血液をスクリーニングし、したがって血小板不適合の問題が発生する前にそれを明らかにするために（その結果ＰＴＰのような状態を避けることができる）用いることができる。
さらに、血小板型分け方法および、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫学的に反応する抗体を検出する方法は、ＮＡＩＴの場合のような出生時および妊娠中の血小板不適合の可能性を明らかにするために、予想される両親の血小板および血液を検査するために用いることができる。
したがって、ある具体例では、本発明は特異的ＧＰＩＩＩａＰｌAの存在を検出する方法を目的とする。天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基と免疫学的に反応する抗体の存在を患者で検出するために、抗体を含有する体サンプル、好ましくは体液サンプル（例えば患者の血液、血漿、血清、尿または唾液）を生物学的分析条件下で、天然のＧＰＩＩＩａ蛋白ＰｌA1またはＰｌA2決定基を発現し、ＧＰＩＩＩａ蛋白配列の約６５から約２６６アミノ酸残基をその中に含み、さらに配列番号：１のアミノ酸残基を包含する単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドである抗原と混合し、免疫反応混合物水溶液をつくる。この混合物を生物学的分析条件下で、抗体および抗原との間の免疫反応生成物（免疫複合体）の生成を可能にするために十分な時間維持する。続いて、複合体の存在、および好ましくは量を本明細書で述べるように検出することができる。複合体の存在は、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応する抗体を示唆する。
好ましくは、ＰｌA1決定基に対する抗体の検出のために、この方法で用いられる抗原は、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９および、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結された配列番号：７から成る群から選ばれる。上記の方法で天然のＧＰＩＩＩａＰｌA2決定基と免疫的に反応する抗体の存在を検出するために、好ましく用いられる抗原は、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９および、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しうるように連結された配列番号：９から成る群から選ばれる。
好ましい具体例では、単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドと患者の抗体との間で形成される免疫反応生成物の存在は、下記に極めて詳細に考察する特異的結合試薬を用いて検出される。標識した特異的結合試薬は、ここに記載するように特異的結合試薬および標識を含む。
例えば、まず免疫反応生成物を、標識した特異的結合試薬と混合して標識混合物をつくる。続いてこの標識混合物を、存在する免疫反応生成物が、標識された特異的結合試薬と結合し標識生成物を形成するために十分な時間、特異的結合に適した条件下で維持する。続いて、形成された標識生成物の存在、および好ましくは量が検出され、免疫反応生成物の存在または量が示される。
好ましい具体例では、本発明の方法は、ここで開示される系のように、免疫複合体が固相で形成され、検出される態様で実施される。
したがって、好ましい診断方法では、単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、固体マトリックスに結合され、固相を形成する。固体マトリックスへの固定方法は、当該技術分野で周知である。そのような方法は、吸着（これが好ましい）、該複合体に対する第二の抗体の使用（例えば該ポリペプチドに含まれるＧＰＩＩＩａのまた別の部分に対する抗体または、β−ガラクトシダーゼまたはその一部分が目的のポリペプチドに融合されている場合は、β−ガラクトシダーゼに対する抗体）を含む。共有結合による固定もまた意図される。特異的固体マトリックスは以下で極めて詳細に考察する。
特異的結合試薬が、該単離ポリペプチドと固相で免疫複合体を形成した抗体と複合体を形成することができる蛋白Ａまたは抗ヒトＩｇ（例えばＩｇＧまたはＩｇＭ）であることはさらに好ましい。最も好ましいものは、標識された特異的結合試薬の使用で、この場合、標識は放射性同位元素、酵素、ビオチンまたは蛍光マーカー（例えばランタニド）である。
この固相の具体例では、前述の組換え融合ポリペプチドを使用することが特に好ましい。また別の好ましい診断方法では、本発明の単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを前述のように固体マトリックスに固定し、さらに、該生物学的サンプルの希釈物を免疫複合体形成工程に付すが、この工程では、該固形支持体と生物学的サンプルの希釈物を接触させ、固相結合免疫複合体が形成されるために十分な時間、生物学的分析条件下で該接触を維持し、該固相および液相を単離して非結合物質を除去する。生物学的サンプルに存在する抗体は複数の結合手をもつので、続いて加えられる標識ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、固相ポリペプチドと可溶性標識分子との間でブリッジとして作用するサンプルの抗体によって該固相に付着する。固相における標識の存在は、サンプル中の特異的抗体の存在、好ましくは量を示す。当業者は希釈の範囲を決定し、それによって固相における標識抗原の濃度を決定することができる。
該生物学的サンプルを固相と接触させる前または同時に、生物学的サンプルおよび本発明の単離ポリペプチドを混合し、二価または多価の特異的抗体の架橋特性を利用して三分子複合体を固相上で形成させることができる。特に有用な標識として、本発明のビオチン化ポリペプチドが標識抗原が可能である。これによって酵素−ストレプトアビジンまたは酵素−アビジン複合体の添加とそれに続く適切な基質の添加によるその後の検出が可能になる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはウレアーゼのような酵素がしばしば用いられるが、これらおよび他のものは幾つかの適切な基質とともに市販されている。形成された複合体の直接検出を可能にするマーカーを用いる好ましい標識は、放射性同位元素（例えばヨウ素）またはユーロピウムのようなランタニドキレートを含む。別の具体例では、本発明は、以下の工程を含む血小板の型分け方法を目的とする：
（ａ）水溶液中で供与者の血小板を、ＧＰＩＩＩａＰｌA1およびＰｌA2決定基の一方または他方と免疫的に反応するが両方とは反応しない抗体と前述のように混合し、免疫反応混合物水溶液を形成し；
（ｂ）これらの混合された抗体が免疫的に反応し、免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学的分析条件下で該免疫反応混合物を維持し；さらに；
（ｃ）当該免疫反応生成物の存在を検出し、それによって、ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基の一方または他方の存在並びに血小板型を検出する。この分析で用いられる抗体は血小板供与者の種以外の動物種由来であることが好ましい。したがって、例えば該抗体はマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマなどから産生することができる。このように、混合された抗体と血小板との間の免疫反応の存在は、前述のように酵素または放射性元素のような標識を含む種特異的抗−抗体とのさらに別の免疫反応によって検出される。
より好ましくは、混合される抗ＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基抗体は、ここで考察するようにそれ自体の標識を含み、それによって、また別の免疫反応は必要とされない。最も好ましくは、これらの抗ＰｌA抗体は単クローン抗体で、アルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素標識を含む。
好ましい具体例では、この方法で用いられる抗体は、ＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基と免疫的に反応し、ＧＰＩＩＩａＰｌA2決定基とは反応しない。
また別の好ましい具体例では、この方法で用いられる抗体は、ＧＰＩＩＩａＰｌA2と免疫的に反応し、ＧＰＩＩＩａＰｌA1決定基とは反応しない。
好ましくは、両方の具体例で用いられる抗体は単クローン抗体である。
血小板型分け方法もまた本発明内に含まれる。前述のように、この血小板型分け方法では、種々の周知の非均質的および均質的なプロトコールを用いることができる。好ましくは、供与者からの血小板含有体サンプルは、抗ＰｌA1またはＰｌA2抗体と水性組成物中で混合され、免疫反応混合物を形成する。
上記で形成された免疫反応混合物は、該抗体が血小板上のそれらの抗原と免疫的に反応するために十分な時間、生物学的分析条件下で維持される。免疫複合体の形成は、特定の抗原を発現している血小板の存在を示し、その形成はここで考察されるいずれの手段によっても検出できる。
前述の免疫反応が生じる維持時間は、周知のように広範囲に変えることができる。典型的には、維持時間は約１分から約２時間の範囲で、典型的に用いられるのは約３０から約９０分である。
抗体分子は、無傷の抗体またはその結合部位含有（パラトープ含有）部分を含む。典型的なパラトープ含有部分は、周知のようにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦv部分である。さらに、抗体のＦc部分が存在する場合は、この部分は、パラープ含有部分とは異なる動物に固有のアミノ酸残基配列を有する。例えば、周知のようにヒトのＦc部分は、遺伝子工学技術を施した場合のように、マウスの結合部位を含む部分とともに存在させることが可能である。
本分析方法で用いられる“生物学的分析条件”は、分析されるサンプルの他、この分析で用いる抗体およびポリペプチドの生物学的活性を維持するために選択される。典型的に許容される“生物学的分析条件”は、約４℃から約４５℃の範囲、好ましくは約３７℃の温度；ｐＨ値は約５から約９の範囲、好ましくは約７；さらに、イオン強度は蒸留水のそれから約１Ｍの塩化ナトリウムのそれ、好ましくは生理学的食塩水のそれを含む。そのような条件を最適化する方法は当業者にとり既知である。
目的分析で形成される免疫複合体の存在または量を決定する態様は、該免疫複合体を識別するために望ましい方法によって左右される。例えば、該分析で用いられる抗体は血小板との免疫複合体の形成前または形成後に標識することができる。該標識免疫複合体は、それぞれの標識の検出に適した方法、例えば放射性標識が用いられているときは放射能検出によって、蛍光物が用いられているときは蛍光検出によって、ビオチン標識が用いられているときはアビジンとの反応によって、酵素標識が用いられているときは酵素基質の検出生成物への変換によるなどして定量化できる。また別に、未標識免疫複合体は、該免疫複合体と標識された物質（これは免疫複合体と特異的に反応するもので、例えば標識抗−抗体である）との間の免疫反応生成物の形成によって検出することができる。それによって標識は分析されるべき免疫複合体に付着し、これは検出を容易にすることができる。
Ｈ．診断系
キット形の診断系は、ここに記載する方法にしたがって少なくとも１回の分析に十分な量の中に、本発明の単離ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、または天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1もしくはＰｌA2決定基と免疫的に反応する本発明の抗体を別々に梱包した試薬として含む。典型的には梱包された試薬の使用についての指示もまた含まれる。
“使用についての指示”は典型的には試薬の濃度または少なくとも１種類の分析方法のパラメーター（例えば、混合されるべき試薬およびサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、緩衝液の条件など）を記載する重要な表示を含む。
好ましい具体例では、本発明の診断系はさらに標識または、上記の方法で調製された免疫反応生成物の形成を示すことができる表示手段を含む。
本明細書で用いられるように、“標識”および“表示手段”という用語は、複合体の存在を示すための検出可能なシグナルの産生に直接的または間接的に含まれる単一原子または分子を指す。いずれの標識または表示手段も抗体のような試薬物質、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに連結または取り込ませることができるが、また別々に用いることもできる。さらにこれらの原子または分子はまた別の試薬と連係させて用いてもよい。そのような標識は、それ自体臨床診断化学の分野で周知であるが、それらが別に新規な蛋白、方法および／または系を利用する限り本発明の部分を構成する。
該標識は、抗体または抗原を変性させることなくそれらと化学的に結合し、有用な免疫蛍光トレーサーであるフルオロクロム（染料）を形成することができる蛍光標識剤でもよい。適切な蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアナイト（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）、キレート−ランタニド結合物（例えばＥｕ、Ｔｂ、Ｓｍ）などである。免疫蛍光分析技術についての記載は以下の文献で見出される：デルカ（DeLuca）、“免疫蛍光分析”（“Immunofluorescence Analysis”）、手段としての抗体（Antibody as a Tool）より、Marchalonisら編、John Wiley & Sons，Ltd．，189-231ページ（1982）（本明細書には参考文献として含まれる））。
好ましい具体例では、該標識は酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（本明細書で実例として用いられている）、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどである。主たる標識がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場合、さらに別の試薬が、抗体−抗原複合体（免疫反応物）が形成された事実を可視化させるために要求される。ＨＲＰのためのそのような付加試薬は過酸化水素および酸化染料前駆体（例えばジアミノベンジン）を含む。ＨＲＰについて有用な付加試薬は、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
放射性元素はまた標識剤として有用である。典型的な放射性標識剤は、ガンマ線放射を起こす放射性元素である。それ自体でガンマ線を放出する、例えば124Ｉ、125Ｉ、128Ｉ、131Ｉおよび51Ｃｒのような元素は、ガンマ線放射性元素表示群の１つの種類を代表する。特に好ましいものは125Ｉである。有用な標識手段のまた別の群は、それ自体陽電子を放出する、例えば11Ｃ、18Ｆ、15Ｏおよび13Ｎのような元素である。そのように放出された陽電子は、動物の体内に存在する電子に衝突するときガンマ線を放出する。また有用なものは、ベータ線放出物質で、例えば111インジウム、3Ｈ、35Ｓ、14Ｃまたは32Ｐである。
また別の標識が当該技術分野で既に記載されており、本発明の診断系での使用に適している。例えば、分子対の間で見出される特異的な親和性を用いることができるが、その場合１つは特異的な結合剤に固定された標識として、他方は標識の存在を検出する手段として用いられる。典型的な分子対は、ビオチン：アビジン（この場合ビオチンは標識である）およびペルオキシダーゼ：抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）（この場合ペルオキシダーゼは標識である）である。
標識の連結、すなわちポリペプチドおよび蛋白の標識は当該技術分野で周知である。例えば、ハイブリドーマによって産生される抗体分子は、培養液中の成分として提供される、放射性同位元素を含有するアミノ酸の代謝的取り込みによって標識される。例えばガルファーらの文献（Galfreら、Meth．Enzymol．，73:3-46（1981））を参照のこと。活性化官能基を介する蛋白の共役またはカップリングの技術は特に応用できる。例えば以下の文献を参照のこと：オーラメアス（Aurameas）ら、Scand．J．Immunol．，８巻、増補7:7-23（1978）；ロドウェル（Rodwell）ら、Biotech．，3:889-894（1984）；米国特許第4493795号。
診断系はまた、好ましくは別々の容器として、特異的な結合剤を含むことができる。“特異的結合剤”は、試薬と選択的に結合する分子物質で、本発明の生成物と順序にしたがって反応するが、それ自体は本発明の蛋白発現生成物ではない。典型的な特異的結合剤は抗体分子、例えば抗ヒトＩｇＧもしくは抗ヒトＩｇＭ、補体蛋白もしくはそのフラグメント、蛋白Ａなどである。好ましくは、特異的結合剤は、これらの抗体が免疫反応生成物または免疫複合体の一部分として存在するとき、天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応する抗体と結合することができる。
好ましい具体例では、該特異的結合剤は標識される。しかし、該診断系が標識されていない特異的結合剤を含む場合、典型的には、該結合剤は増幅手段または試薬として用いられる。これらの具体例では、標識された特異的結合剤は、増幅手段が試薬物質含有複合体と結合するとき、該増幅手段に特異的に結合する。
本発明の診断キットは、例えば、“ＥＬＩＳＡ”形式で前述の方法において用いられ、体液サンプル（例えば血清、血漿または唾液）中の抗体の存在または量を検出することができる。“ＥＬＩＳＡ”は、サンプル中に存在する抗原または抗体の量を検出または定量するために、固相に結合させた抗体または抗原および酵素抗原または酵素抗体共役物を用いる酵素結合免疫吸着分析を指す。ＥＬＩＳＡ技術についての記載は以下の文献で見出される：サイツ（D．P．Sites）らの基礎および臨床免疫学（Basic and Clinical Immunology）、第４版、22章、レンジメディカルパブリケーション、ロサンジェルス、カリフォルニア（1982））；米国特許第3654090号、3850752号、4016043号（これらは全て本明細書に参考文献として含まれる）。
したがって好ましい具体例では、前述のように本発明の天然のＧＰＩＩＩａＰｌA1またはＰｌA2決定基と免疫的に反応する目的の単離ポリペプチド、融合ポリペプチドまたは抗体は、固形支持体を形成するために固体マトリックスに固定することができ、これは本題診断系に別々に梱包される。
有用な固体マトリックスは当該技術分野で周知である。そのような物質は、架橋デキストラン（ファルマシアファインケミカルズ（ピスカタウェー、ニュージャージー）からセファデックスの商標名で市販）；アガロース；直径およそ１ミクロンからおよそ５ミリメートルのポリスチレンビーズ（アボットラボラトリーズ（ノースシカゴ、イリノイ）から市販）；塩化ポリビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロン基材網状物（例えばシート、細片もしくはへら状物）；または、ポリスチレンもしくはポリビニルクロリドから製造された管、プレート、もしくはマイクロリットルプレートのくぼみを含む。
以下の実施例は本発明の特定の具体例を詳述するもので、いかなる場合にも本明細書および請求の範囲を制限するものではない。
Ｉ．結果
無作為に切断したＧＰＩＩＩａｃＤＮＡフラグメントを原核細胞発現ベクターλｇｔ２２に挿入して、血小板ＧＰＩＩＩａエピトープライブラリーを構築した。このライブラリーは、長さが平均１００−２００アミノ酸残基である、β−ガラクトシダーゼに融合させたＧＰＩＩＩａの無作為フラグメントを発現する。
このλｇｔ２２−ＧＰＩＩＩａエピトープライブラリーを、ＰｌA1エピトープを発現しているクローンのために精製抗ＰｌA1抗体を用いてスクリーニングした。患者番号１からの精製抗ＰｌA1抗体と反応する、それぞれ別個の５クローンを単離し、この組換えファージの各々のＤＮＡの配列分析によって、ＧＰＩＩＩａのアミノ末端に対するＰｌA1エピトープの位置を決定した（図１）。
多クローン抗ＧＰＩＩＩａ抗体を用いてλｇｔ２２−ＧＰＩＩＩａエピトープライブラリーをスクリーニングして、全ＧＰＩＩＩａ配列からのフラグメントを単離した。しかしながら、これらＧＰＩＩＩａの他の領域は、４人の患者の抗ＰｌA1抗体と反応しなかった。
ＰｌA1抗原を含む最小フラグメントは、成熟ＧＰＩＩＩａのアミノ末端６５残基および２６残基のシグナル配列を発現していた（図２）。得られた全てのクローンはこの領域が共通で、４人から得た精製抗ＰｌA1抗体と反応したが、これはＰｌA1エピトープはＧＰＩＩＩａのアミノ末端６５残基に位置することを示唆している。
成熟ＧＰＩＩＩａの残基３３は２つのＰｌA表現形に応答する〔Newmanら、J．Clin．Invest．，83:1778（1989）；Goldbergerら、Blood, 78:681（1991）〕。Ｔ→Ｃ196置換によってＧＰＩＩＩａのアミノ末端６５残基を発現しているλｇｔ２２クローンで、ＰｌA2（プロリン33）表現形を構築した。
プロリンでロイシン33を置換した結果、抗ＰｌA1抗体反応性は消失したが、多クローン抗ＧＰＩＩＩａ抗体との反応性は、ファージプラークとの免疫反応によって証明されたようにそのままであった。したがって、残基３３は、この７ＫＤａのＧＰＩＩＩａのアミノ末端フラグメントにおけるＰｌA1エピトープの形成に重要であった。
Ｊ．方法および材料
実施例１．抗ＰｌA1アロ抗体
４人のＰＴＰ罹患者の血漿（Dr．S．Schinke，San Jacinto（患者1）；Dr．G．Schmidt，シティオブホープ・メディカルセンター，Duarte（患者2）；Dr．V．Blanchette，小児病院、トロント（患者3および4）の好意により提供された血漿）由来の抗ＰｌA1アロ抗体を、ＣｎＢｒ−セファロース−４ＢＣＬ（ファルマシア、ピスカタウェー、ニュージャージー）に結合させた血小板糖蛋白複合体ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａを用いてアフィニティー精製を行った。
洗浄正常血小板を、１％のトリトンＸ−１００を含む等張のクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で３０分４℃で溶解し、その後１０００００×ｇで４℃６０分遠心した。上清をＣｎＢｒ−セファロース−４ＢＣＬに結合させたマウス抗ＧＰＩＩｂ単クローン抗体（2A9，Dr．V．Woods，カリフォルニア大学サンディエゴ分校により提供）とともに4℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、結合ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａをＰＢＳ（ｐＨ１０）中の１％オクタグルコピラノシド（ＯＰＧ）中の０．１Ｍジエチルアミンで溶出させ、直ちに１％ＯＰＧ含有０．ｌＭ燐酸緩衝液で透析した。この精製ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ−セファロースを血漿とともに４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、結合アロ抗体を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出させ、直ちに１Ｍトリス（ｐＨ９）で中和し、さらにＰＢＳで透析した。この抗体溶出液を抗原捕捉分析〔Woodsら、Blood,63:368（1984）〕で測定した。
実施例２．エピトープライブラリーの構築およびスクリーニング
完全な長さのＧＰＩＩＩａをコードする２．６ｋｂの二本鎖フラグメントを、制限酵素ＳｐｈＩおよびＳｐｅＩでプラスミドＢＳ３ａ〔O'Tooleら、Blood, 74:14（1989）〕を切断して単離し、続いてアガロースゲルから２．６ｋｂのバンドを精製した。続いてこの単離したバンドの５μｇを０．５ｎｇのＤＮアーゼＩで３７℃３０分、２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）および１．５ｍＭＭｎＣｌ2の０．５ｍｌ中で消化した。該反応混合物のフェノール：クロロホルム抽出によって反応を迅速に停止させる。
生じたＧＰＩＩＩａＤＮＡをエタノールで沈澱させた後、フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＳａｌＩリンカーＧＧＴＣＧＡＣＣ（ここに示した方向の配列のみ；配列番号：３０）に連結し、制限酵素ＳａｌＩで切断し、さらにＳａｌＩ消化脱燐酸λｇｔ２２（プログマ社、マジソン、ウィスコンシン）に連結した。続いて連結ＤＮＡのパッケージングを行い、未増幅ライブラリーの力価を大腸菌Ｙ１０９０で調べたところ、２×１０4（８４％の組換え）の総ファージ数を含んでいることが分かった。
実施例３．λｇｔ２２組換えファージのスクリーニング
５０００プラーク／プレートの組換えλｇｔ２２−ＧＰＩＩＩａエピトープライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０上に撒いた。ｌａｃＺ遺伝子をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）をヤングらの記載〔Youngら、Proc．Natl．Acad．Sci．，USA, 80:1194（1983）〕にしたがって飽和させた濾紙で誘発した。続いてこの濾紙をウサギ抗ＧＰＩＩＩａ多クローン抗体（λｇｔ２２感染大腸菌Ｙ１０９０溶解物で前処理吸収、正常ウサギ血清で前処理吸収）〔Loftusら、Science, 249:915（1990）〕または精製抗ＰｌA1抗体（１：１００希釈）のいずれかでスクリーニングした。
結合抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）または抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用い、発色性基質、ｏ−フェニレンジアミンで増幅して検出した。この精製した抗ＧＰＩＩＩａおよび抗ＰｌA1陽性ファージを、λｇｔ２２と組換えλｇｔ２２構築物の１：１混合物の１００から２００プラークを大腸菌Ｙ１０９０上に撒いてスクリーニングした。ｌａｃＺ遺伝子を誘発し、濾紙を小片に切り、前処理吸収抗ＧＰＩＩＩａ抗体、正常ウサギ血清、抗ＰｌA1抗体およびヒト血清でスクリーニングした。
実施例４．ＧＰＩＩＩａ挿入物の配列決定
組換えλｇｔ２２ＤＮＡを記載〔分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、サンブルック（Sambrook）ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版部（1989）〕にしたがって単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、標準的技術でプラスミドブルースクリプトＩＩＳＫ＋／一（ストラタジーン、ラホイヤ、カリフォルニア）でサブクローニングした。続いて、ジデオキシ配列決定法（Sangerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74:5463（1977）〕でＴ７およびＴ３プライマー（ストラテジーン）を用いて両方の鎖の配列を決定し、該ＤＮＡフラグメントの境界を求めた。最小の抗ＰｌA1陽性ＧＰＩＩＩａフラグメント（２９２ｂｐ）のプラスミドサブクローンの完全な配列を決定し、続いて突然変異誘発に用いた。
実施例５．インビトロ突然変異
オリゴヌクレオチド誘導突然変異は、プライマー伸長法〔Zollarら、Nuc．Acids Res．，10:6487（1982）〕および鎖選別法〔Kunkelら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:488（1985）〕（これは非変異鎖に対して強力な生物学的選別を提供する）を組み合わせて実施した。ＧＰＩＩＩａの塩基１９６のＴ→Ｃ単一変異を、オリゴヌクレオチドＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＣＡを用いて２９２ｂｐフラグメントに導入した。
期待の変異を有する挿入物をＮｃｉＩ部位の出現〔Newmanら、J．Clin．Invest．，83:1778（1989）〕でスクリーニングし、続いて、完全に配列決定を行った。
Ｔ→Ｃ置換をもつ挿入物を続いてλｇｔ２２にサブクローニングし、ＰｌA2エピトープ含有融合ポリペプチドを形成した。
実施例６．ＦｎフラグメントＭＢＰ融合蛋白の調製および単離
２つのＭＢＰコードプラスミド、ｐＭＡＬTMｐ２およびｐＭＡＬTMｃ２を、本融合蛋白を大腸菌で発現するためのベクターとして使用する。融合蛋白のＭＢＰ領域は、他の細胞性蛋白から該融合生成物を容易に精製することを可能にする。これらのベクターは周知の技術〔分子クローニング：実験室マニュアル、第2版、サンブルック（Sambrook）ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版部、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989）〕とその後で以下に記載する方法を行うことによって構築される。これらのベクターに先行するものについての多くの考察（すなわちベクターｐＰＲ７３４およびｐＩＨ８２１（制限地図、構築遺伝子およびコード配列、使用および使用手順を含む））は、分子生物学の今日的手法（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubelら編、Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience，ニューヨーク（1989）16.6.1-16.6.12ページ）で見出すことができる。
Ａ．ＭＢＰベクターの構築
典型的なＭＢＰベクターの構築は、前述のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントに含まれる、ＰｌA1の６５アミノ酸残基エピトープをコードする配列番号：２のＰｌA1コードＤＮＡを含むｃＤＮＡクローンを用いて以下の通りに行われる。このフラグメントは、所望のＰｌA1エピトープをコードするＤＮＡだけでなく、λｇｔ２２ポリリンカー領域のＤＮＡを含むが、それとともに５’末端にＥｃｏＲＩ部位を、３’末端にＮｏｔＩ部位を、さらにそれらの間にＳａｌＩおよびＸｂａＩ部位を有する。本明細書で考察されるＰｌA1またはＰｌA2エピトープをコードするまた別のｃＤＮＡクローンも同様に用いることができることは理解されるところであろう。
したがって、抗ＰｌA1陽性ＧＰＩＩＩａフラグメントを含む前述のλｇｔ２２ベクターをＳａｌＩで消化する。マルトース結合蛋白融合蛋白ベクターｐＭＡＬTMｃ２（ニューイングランドバイオラブ社、ビバーリー、マサチューセッツ）をＳａｌＩで消化し、ＳａｌＩ粘着末端を生成する。ＰｌA1コードＳａｌＩ−ＳａｌＩフラグメントをＤＮＡＴ４リガーゼを用いて該ベクターに繋ぎ、クローニングしたＰｌA1コード遺伝子フラグメントを機能しうるようにＭＢＰコード遺伝子フラグメントに連結させた、融合ポリペプチド形成構築物を作成する。得られた組換えＤＮＡ分子はＭＢＰ−ＰｌA1融合ポリペプチドを発現させることができる。
上記の操作の結果、発現融合ポリペプチドのカルボキシ末端はいくつかの非ＧＰＩＩＩａ残基配列を含んでいる。さらに、この後に詳しく考察するように、ｐＭＡＬTMｃ２ベクターのＳａｌＩ部位はポリリンカー領域の３’末端近くに位置している。したがって、ファクターＸａで切断したあとですら、生じた組換えポリペプチドは、該分子のアミノ末端にいくつかのベクター誘導残基を含んでいる。これらのベクター誘導残基は前述のＳａｌＩリンカー付加によって導入されたものにさらに付加される。
当業者には、ベクター誘導残基を排除するために該発現融合ポリペプチドを短くするまた別の周知の技術が利用できることは理解されよう。そのような操作の１つは、読み枠にしたがった５’平滑端ＰｌA1エピトープコードＤＮＡフラグメントを利用するもので、これをｐＭＡＬTMｃ２またはｐＭＡＬTMｐ２ベクターのＸｍｎＩ部位に挿入し、それによってファクターＸａでの切断後、ベクター誘導アミノ酸残基は組換えポリペプチドには存在しなくなる。また別の操作はＧＰＩＩＩａコード配列の３’末端に連結した読み枠にしたがった終止コドンを利用するもので、このコドン自体は、該ＤＮＡに挿入するために利用しうるさらに下流の制限部位に連結される。この操作により、組換えポリペプチドのカルボキシ末端からベクター誘導残基は除去される。
ベクターｐＭＡＬTMｃ２およびｐＭＡＬTMｐ２はニューイングランドバイオラブ（ビバーリー、マサチューセッツ）から入手する。ベクターは各々、ｌａｃＺにポリリンカーを介して連結したｍａｌＥを有する。ベクターｐＭＡＬTMｃ２はｍａｌＥシグナル（リーダー）配列２−２６（これは、存在すればペリプラズムへの融合蛋白の輸送を促進する）が欠失していることを除いて、ベクターｐＭＡＬTMｃ２はベクターｐＭＡＬTMｐ２と同一である。これらベクターの各々は、ｍａｌＥ遺伝子の上流にｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）を有する。ｔａｃプロモーターの直ぐ上流のｌａｃＩQサプレッサー遺伝子は、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）が発現誘発に用いられるまで発現活性を抑制することができる。残余のベクターの骨格はｐＫＫ２３３−２（ファルマシア、ピスカタウェー、ニュージャージー）のＡｖａｌ（充填連結）からＥｃｏＲＩ（充填連結）までの部分である。
マルトース結合蛋白融合発現系（ＭＢＰ発現系）の重要な構成成分は、アマンらによって先に報告された（Amannら、Gene，25:167-178（1983））プロモーター（ＰｔａｃＩＩ）、ガンらによって先に報告された（Guanら、Gene，67:21-30（1987））マルトース結合蛋白−ｌａｃＺα融合遺伝子、ブロシウスらによって先に報告された（Brosiusら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6929-6933（1984）ｒｒｎＢリボソーム転写ターミネーターで、ｐＭＡＬtmｐ２（ｐＩＨ８２１）およびｐＭＡＬtmｐ２（ｐＰＲ７３４）ベクター（ニューイングランドバイオラブ、ビバリー、マサチューセッツ）並びにｐＫＫ２２３−３およびｐＫＫ２３３−２（ファルマシア、ピスカタウェー、ニュージャージー）で市販されている。
ＭＢＰ発現系は場合によって、先にファラボーによって報告された（Farabaugh，Nature，274:765-769（1978））ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）をコードする遺伝子を含んでいる。発現ベクターにｌａｃＩ遺伝子が存在しない場合、ラムダリプレッサーを発現している細菌株、例えばＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９（ATCC#33323）およびＪＭ１１０（ATCC#47013）（Yanisch-Perronら、Gene，33:103（1985））を用いてトランス形式で提供することができる。これらの細菌株はストラテジーン（ラホイヤ、カルフォルニア）から市販されている。
この発現系の成分を含む個々の核酸フラグメントは、例えば、分子クローニング：実験室マニュアル（第2版、サンブルック（Sambrook）ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版部、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989））に記載されているような標準的な分子生物学の技術を用いて、機能しうるように一緒に繋ぎ合わせることができる。必要な場合には、種々の成分の読み枠を合成リンカー、種々の空白充填反応または種々のエキソヌクレオーシスを用いて調節することができる。さらに、読み枠における種々の欠失または調節を、ループ削除による変異または市販の突然変異キット（例えばバイオラッドラボラトリーズ（リッチモンド、カリフォルニア）製の突然変異キット）を用いて容易に行うことができる。
この発現系の必要な成分の各々はこれから詳細に述べる。アマンらによって先に報告された（Amannら、Gene，25:167-178（1983））ＰｔａｃＩＩプロモーターは、多数の入手可能なベクター、例えばＰＫＫ２２３−３（ファルマシア）、ＰＩＨ８２１およびｐＰＲ７３４（ニューイングランドバイオラブ、ビバリー、マサチューセッツ）、ＰｔａｃＩＩ（ATCC#37245）およびＰｔａｃ１２（ATCC#37138）（Amannら、Gene，25:167-178（1983））から単離することができる。例えば、ＰｔａｃＩＩプロモーターは、ＥｃｏＲＩおよＨｉｎｄＩＩＩまたはＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＰｔａｃＩＩから制限エンドヌクレアーゼ処理で単離することができる。
ガンらによって先に報告された（Guanら、Gene，67:21-30（1987））マルトース結合蛋白−ｌａｃＺα融合遺伝子（ＭａｌＥ−ｌａｃＺα）は、大腸菌（例えばＨＢ１０１（ATCC#33694）または野性型大腸菌Ｋ１２）の染色体から単離したＨｉｎｆＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメントにあるｍａｌＥ遺伝子を含んでいる。ｍａｌＥ遺伝子はデュープレーらによって配列が決定され（Duplayら、J．Biol．Chem．，259:10606-10613（1984））、したがってｍａｌＥ遺伝子に特異的なプローブは容易に合成され、標準的なクローニングプロトコールを用いてｍａｌＥ遺伝子を大腸菌から単離することが可能である。また別に、ｍａｌＥ遺伝子はセグメントとして化学的に合成することができ、これらのセグメントはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結され、ｍａｌＥ遺伝子を製造することができる。成熟マルトース結合蛋白（ｍａｌＥ遺伝子産物）は、デュプレーらの報告のように（Duplayら、J．Biol．Chem．，259:10606-10613（1984））、ｍａｌＥ遺伝子配列のコドン２８−３４２によってコードされる。該発現ベクターは、マルトース結合蛋白リーダー配列および成熟マルトース結合蛋白をコードするコドンを含むか（例えばｐＭＡＬtmｐ２の場合）、または成熟マルトース結合蛋白をコードするｍａｌＥ遺伝子の１部分のみ（例えばｐＭＡＬtmｃ２の場合）を含む。
マルトース結合蛋白−ｌａｃＺα融合遺伝子の残余部分は、ｌａｃ遺伝子の短いαペプチド（長さがおよそ１０７アミノ酸）をコードするｌａｃＺ遺伝子の一部分を含む。このｌａｃＺα遺伝子は、ヤニッシュ−ペロンら（Yanisch-Perronら、Gene，33:103-119（1985））が報告したプラスミドベクターｐＵＣ１９から単離できるが、さらに市販もされている。ｌａｃＺα遺伝子およびｍａｌＥ遺伝子は、有用な制限エンドヌクレアーゼ認識配列（この部分へクローニングすることによって挿入のためのブルー／ホワイトスクリーニングが可能になる）を含むポリリンカーを用いて繋ぎ合わせることができる。
ｒｒｎＢリボソーム転写ターミネーターは、ブロシウスらによって先に報告された（Brosiusら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6929-6933（1984）およびBrosiusら、Plasmid, 6:112-118（1981））。ｒｒｎＢリボソーム転写ターミネーターは、入手可能なベクター（例えば、ＰＥＡ３００（ATCC#37181）ＰＫＫ２２３−３およびＰＫＫ２３３−２（ファルマシア）並びにＰＩＨ８２１およびＰＰＲ７３４（ニューイングランドバイオラブ））から容易に単離できる。例えば、ｒｒｎＢリボソーム転写ターミネーターは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＫＫ２２３−３から単離できる。
ラムダリプレッサー蛋白をコードするｌａｃＩ遺伝子は、ファラボー（Farabaugh，Nature，274:765-769（1978））によって配列が決定された。さらに、ｌａｃＩ遺伝子は幾つかの入手可能なベクター（例えばｐブルースクリプトＩＩＨＫＳおよびｐブルースクリプトＳＫ（ストラテジーン）並びにｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９（ファルマシア））に含まれている。ｌａｃＩ遺伝子は、これらのベクターから制限エンドヌクレアーゼおよび標準的分子生物学技術を用いて単離できる。ｌａｃＩ遺伝子は、該発現ベクター内または該発現ベクターが増殖している細菌内に存在する。発現ベクター内のｍａｌＥおよびｌａｃＺ遺伝子の間に存在する複数のクローニング部位（ポリリンカー）を表１に示し、配列番号３２として配列リストに挙げた。
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制限エンドヌクレアーゼ切断部位は上の表のＤＮＡ配列の上に示され、各々の部位には下線が引かれている。融合蛋白のファクターＸａ切断のための４残基の認識部位は、表に示す最初の４つのコドンによってコードされる。１０個のアスパラギン残基をコードするＤＮＡがｍａｌＥ遺伝子および上記のポリリンカーを単離する。
上に記したように、複数のクローニング部位（ポリリンカー）は、ｍａｌＥとｌａｃＺ遺伝子との間に位置するファクターＸａ切断部位をコードする核酸セグメントを含む。このベクターによって産生されるマルトース結合蛋白融合蛋白はファクターＸａ切断部位で切断することができ、それによって、所望の蛋白の精製および究極の低分子量組換え体の産生を促進する。ここに述べるように、例えばＰｌA1またはＰｌA2をコードする外来遺伝子は表１に例示する１つまたは１つ以上の制限部位に挿入することができる。ＸｍｎＩ部位を用いられ、さらに発現融合蛋白がファクターＸａで切断されるときは、該ベクターのために、ＰｌA1またはＰｌA2ポリペプチドに対して何も付加されない。また別の部位を用いる場合は、およそ１５個までのベクター由来残基を付加することができるが、それはどの部位が用いられるかによる。
上記のように目的のＰｌA1またはＰｌA2ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドベクターが一旦調製されると、このベクターは標準的な技術にしたがい大腸菌を形質転換するために用いられる。形質転換可能ないずれの大腸菌も用いることができ、ＰＲ７２２またはＥＲ１４５１株（ニューイングランドバイオラブより入手可能）が特に適切である。生じた形質転換大腸菌を続いて培養増殖させる。
Ｂ．ＭＢＰ融合蛋白の発現
特定のＭＢＰ融合蛋白の動態を知るための小規模実験につて述べる。このプロトコールにより３つの粗抽出分画が得られる；低浸透圧ショック工程によって調製した全細胞粗抽出物、この粗抽出物からの不溶性物質およびペリプラズム分画である。
８０ｍｌの高栄養ブロス＋グルコースおよびアンピシリン（１リットル当たり、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、５ｇＮａＣｌ、１ｇグルコースを含み、高圧蒸気滅菌しアンピシリンを１００μｇ／ｌで添加）に、上記のようにして作成した融合プラスミドを含む形質転換大腸菌細胞を接種する。十分に通気して２×１０8細胞／ｍｌまで３７℃で増殖させる。１ｍｌのサンプルをとり微量遠心機で２分間遠心する（未誘発細胞）。上清を捨て、細胞を１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再浮遊させる。ヴォルテックスで攪拌し、氷上に静置する。
ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を残余の培養に加え、最終濃度を０．３ｍＭとする（例えばＨ2Ｏ中の０．１Ｍのストック溶液０．２４ｍｌ）。３７℃で２時間培養を継続する。１ｍｌのサンプルを取り、微量遠心機で２分間遠心する（誘発細胞）。上清を捨て、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液１５０μｌに再浮遊させる。ヴォルテックスで攪拌し再浮遊させ、氷上に静置する。
る。
培養を２つの部分標本に分け、細胞を４０００×ｇ１０分遠心して採集する。上清を捨て、５ｍｌの１０ｍＭ燐酸ナトリウム、３０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％のトゥイーン２０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ（シグマＥ４３７８）、ｐＨ７．０に一方のペレット（サンプルＡ）を再浮遊させる。他方のペレット（サンプルＢ）を１０ｍｌの３０ｍＭトリス−塩酸、２０％蔗糖、ｐＨ８．０（各々０．１ｇの湿潤重量の細胞について９ｍｌ）に再浮遊させる。
ドライアイス−エタノール浴でサンプルＡを凍結し（または２０℃でおよそ１８時間）、続いて冷水中で融解させる。サンプルを超音波処理し、ブラッドフォードアッセーまたは２８０ｎｍ（Ａ280）での吸収によって、それが最大となるまで蛋白の遊離を測定して細胞破壊をモニターする。９０００×ｇで２０分遠心する。上清を捨て（粗抽出１）氷上で保存する。ペレットを５ｍｌの１０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．２５％トゥイーン２０、３０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＥＧＴＡ、ｐＨ７．０に再浮遊させる。これは不溶性物質の懸濁物である（粗抽出２）。
ＥＤＴＡを１ｍＭのサンプルＢに加え、震盪または攪拌しながら室温で５−１０分インキュベートする。４℃で遠心し、上清をすべて除去し、ペレットを１０ｍｌの氷冷５ｍＭ硫酸マグネシウムに再浮遊させる。氷浴で１０分震盪または攪拌する。上清は冷浸透圧ショック液である。
５μｌの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を５μｌの粗抽出物１および２に加え、さらに１０μｌの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を１０μｌの冷浸透圧ショック液に加える。これらのサンプルを、未誘発および誘発サンプルとともに５分間煮沸する。微量遠心機で２分遠心する。２０μｌの未誘発および誘発細胞サンプル並びに全抽出サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加する。上記サンプルの１：５希釈を用いる全く同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルもまた用いることができる。続いてウェスタンブロットを実施し、抗ＭＢＰ血清またはクローニングしたＧＰＩＩＩａ部分に特異的な血清で展開し、所望のエピトープを含む抽出物を同定する。
Ｃ．ＭＢＰ融合蛋白の精製
（１）架橋アミロース樹脂の調製
３００ｍｌの樹脂用には、１０ｇのアミロース（シグマ、カタログ番号A-7043）、４０ｍｌのＨ2Ｏ、および１０００ｍｌビーカーに入れた攪拌バーを用意し、攪拌しながら５０℃に温める。換気フード中で６０ｍｌの５ＮＮａＯＨを加え、続いて激しく攪拌しながら３０ｍｌのエピクロルヒドリン（シグマ、カタログ番号E-4255）を加える。この懸濁物はゲル化に際して発熱するであろう。懸濁物が固体ゲルを形成し微かに黄色となるまで、約１０分攪拌を続ける。室温まで冷却し（約４５分から１時間）、続いてゲルを切って細片にし、１０００ｍｌのＨ2Ｏで３回洗浄する。ゲルをウェアリングミキサーに移し、約３から５秒間ゲルを砕く。１０００ｍｌの５０ｍＭグリセリン−塩酸、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ２．０で２回洗浄し、洗浄の間に微粒子を排除する。
水で３回洗浄し（微粒子は排除し続ける）、続いて１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．０で３回洗浄する。１０ｍＭの燐酸ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０にゲルを懸濁させ、４℃で保存する。樹脂上の非特異的部位を１０００ｍｌの３％無脂肪ドライミルクで４℃で一晩ブロックする。
（２）アフィニティークロマトグラフィー
以下はＭＢＰ融合蛋白の大規模精製のプロトコールである。
１リットルの高栄養ブロス、グルコースおよびアンピシリン（１リットルにつき１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキストラクト、５ｇＮａＣｌ、１ｇグルコース、加圧滅菌しアンピシリンを１００μｇ／ｍｌに加える）に、所望のＭＢＰ融合蛋白を発現しているプラスミドを含む形質転換大腸菌細胞を接種する。２×１０8細胞／ｍｌ（Ａ600は０．４）まで増殖させる。ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加える（例えば０．１Ｍのストック水溶液の８５ｍｇまたは３ｍｌ）。形質転換大腸菌細胞を発現が生じるために十分な時間（例えば１から３時間）３７℃でインキュベートする。
４０００×ｇで遠心して細胞を採集し、５０ｍｌの１０ｍＭ燐酸ナトリウム、３０ｍＭＮａＣｌ、０．２％トゥイーン２０、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＥＧＴＡ（シグマ、カタログ番号E-4378），ｐＨ７．０に再浮遊させる。この再浮遊サンプルをドライアイス−エタノール浴で凍結し（または約２０℃で１８時間）、冷水で融解させる。超音波処理し、ブラッドフォード分析またはＡ280を用いて蛋白遊離を測定し、それが最大に達するまで細胞破壊をモニターする。９０００×ｇ３０分遠心し、上清を採集し粗抽出物を形成する。
架橋アミロース樹脂をエーレンマイヤーフラスコに注ぎ入れ静置する。少なくとも等容量のカラム緩衝液＋０．２５％トゥイーン２０で数分樹脂を洗浄する（カラム緩衝液＝１０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。培養１リットルにつき約４０から２００ｍｌの樹脂をカラムに注ぎ入れ、カラムを同じ緩衝液の３カラム容量で洗浄する。
粗抽出物をカラム緩衝液＋０．２５％トゥイーン２０で１：５に希釈する。希釈粗抽出物を、〔１０×（カラム直径（ｃｍ））2〕ｍｌ／時間の流速で添加する。これは、２．５ｃｍカラムで約１ｍｌ／分である。粗抽出物の希釈は、蛋白濃度を約２．５ｍｇ／ｍｌに減少させることを目的とする。大雑把には、細胞湿潤重量１ｇは約１２０ｍｇ蛋白に当たる。
すべてのＭＢＰ融合ポリペプチドがカラムに結合したことを確信するために、粗抽出物を２回カラムに通すが、殆どの場合、結合能力のあるＭＢＰ融合ポリペプチドは全て第一回のカラム通過でカラムに結合する。融合ポリペプチドはまた、粗抽出物と樹脂を４℃で２から７６時間穏やかに攪拌しながらインキュベートすることによってバッチ式で樹脂に添加することができる。３カラム容量のカラム緩衝液＋０．２５％トゥイーン２０で洗浄し、続いてトゥイーン２０を含まない５カラム容量のカラム緩衝液で洗浄する。
融合ポリペプチドを１０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭマルトース、ｐＨ７．０で溶出させる。１０から２０分画（各々はカラム容量の１／５から１／１０である）を採集し、該分画を蛋白について、例えばブラッドフォード分析またはＡ280を用いて分析する（ＭＢＰ融合ポリペプチドを含む分画は容易に検出できる蛋白を有する）。ＭＢＰ融合ＰｌA1またはＰｌA2ポリペプチドは、カラムのボイドボリュームの後すぐに溶出する。蛋白含有分画をプールする。４×１００容量の１０ｍＭトリス−塩酸、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、マルトースを除去する。アミコン・セントリコンもしくはセントリプレップ濃縮器、アミコン攪拌付き細胞濃縮器または同等物で濃縮する。ＭＢＰドメインがファクターＸａでＰｌA1またはＰｌA2ポリペプチドから切断される場合、さらにアミロースアフィニティークロマトグラフィーでＭＢＰを除去する。その後、所望のＰｌA1またはＰｌA2ポリペプチドを、例えばＤＥＡＥ−セファロースまたはモノ−ＱＨＰＬＣクロマトグラフィーのような標準的手段で精製することができる。
本発明は明確さと理解のために実施例によって詳細に説明したが、ある種の明白な修飾は添付の請求の範囲内で実施されうるであろう。
配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：Ronald D．Bowditch
Robert McMillan
Mark H．Ginsberg
（ｉｉ）発明の名称：
血小板ＧＰＩＩＩａＰｌA1およびＰｌA2エピトープ、その製造および使用
（ｉｉｉ）配列の総数：３２
（ｉｖ）郵便物の宛先：
（Ａ）名宛人：Dressler，Goldsmith，Shore，Sutker & MIlnamow，Ltd．
（Ｂ）丁名：180 North Stetson Avenue
（Ｃ）町名：Chicago
（Ｄ）州名：イリノイ
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）ジップコード：６０６０１
（ｖ）コンピューター解読形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル
（Ｃ）演算システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフト：PatentIn Release #1.0，バージョン#1.25
（ｖｉ）現在の出願状況：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人情報：
（Ａ）氏名：Edward P．Gamson
（Ｂ）登録番号：２９３８１
（Ｃ）リファレンス／ドケット番号：ＳＣＲＦ２７６．０
（ｉｘ）通信に関する情報：
（Ａ）電話：（３１２）６１６−５４１８
（Ｂ）ファクシミリ：（３１２）６１６−５４６０
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｉｘ）特性：
（Ａ）名称／キー：修飾部位
（Ｂ）所在場所：３３
（Ｄ）他の情報：／標識＝Ｘａａ
／註＝“Ｘａａはロイシンまたはプロリンである”。
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１
0004053084.tif 000005
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：７９８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．７９８
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２
0004053084.tif 000006
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２６６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：３
0004053084.tif 000007
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：７９８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．７９８
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：４
0004053084.tif 000008
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２６６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：５
0004053084.tif 000009
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．１９５
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：６
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（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：７
0004053084.tif 000011
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．１９５
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：８
0004053084.tif 000012
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：９
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（２）配列番号：１０の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．２７３
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１０
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（２）配列番号：１１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：９１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１１
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（２）配列番号：１２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４１７
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１２
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（２）配列番号：１３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１３
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（２）配列番号：１４の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４４７
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１４
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（２）配列番号：１５の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１４９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１５
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（２）配列番号：１６の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４５０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４５０
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１６
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（２）配列番号：１７の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１５０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１７
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（２）配列番号：１８の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４９２
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１８
0004053084.tif 000022
（２）配列番号：１９の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ１６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１９
0004053084.tif 000023
（２）配列番号：２０の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．２７３
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２０
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（２）配列番号：２１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：９１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２１
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（２）配列番号：２２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４１７
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２２
0004053084.tif 000026
（２）配列番号：２３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２３
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（２）配列番号：２４の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４４７
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２４
0004053084.tif 000028
（２）配列番号：２５の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１４９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２５
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（２）配列番号：２６の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４５０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４５０
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２６
0004053084.tif 000030
（２）配列番号：２７の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１５０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２７
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（２）配列番号：２８の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）所在場所：１．．４９２
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２８
0004053084.tif 000032
（２）配列番号：２９の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：蛋白
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：２９
0004053084.tif 000033
（２）配列番号：３０の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：３０
GGTCGACC
（２）配列番号：３１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：３１
0004053084.tif 000034
（２）配列番号：３２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ｘｉ）実際の配列：配列番号：３３
0004053084.tif 000035
【図１】
0004053084.tif 000048
【図２】
0004053084.tif 000049