(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
希薄液体媒体中に分散された少なくとも一の分析物を検出及び／又は定量する方法であって、以下のステップ：
（ａ）（ｉ）第一の支持体粒子と、前記第一の支持体粒子上に固定された前記分析物のための少なくとも一の第一の受容体とを含み、それが分散された任意の液体媒体から分離される能力を有する試薬（３）；及び（ｉｉ）アクセス可能な表面と、前記アクセス可能な表面に固定された、前記試薬（３）又は以下のステップ（ｂ）によって得られる中間複合体粒子を捕獲するための少なくとも一の第二の受容体（１０）とを有する第二の支持体を含む捕獲手段、とを準備し、
（ｂ）前記試薬（３）を、前記希薄液体媒体から得られる液体サンプルと接触させて、前記分析物と前記試薬とから中間複合体を粒子形態で得ること、
（ｃ）前記捕獲手段のアクセス可能な表面を、ステップ（ｂ）で前記分析物と反応しなかった前記試薬及び前記中間複合体粒子と接触させて、前記試薬（３）又は前記中間複合体粒子を前記第二の受容体に固定すること、
（ｄ）決定方法によって、前記第二の受容体上に固定された前記試薬（３）又は前記中間複合体粒子を検出及び／又は定量すること、
を含み、ここで、
（１）前記第二の受容体に固定された前記試薬（３）又は前記中間複合体粒子の量が前記ステップ（ｄ）の決定方法の感度限界と少なくとも等しくなるように、前記捕獲手段の前記アクセス可能な表面において、予め決定された量の固定された第二の受容体を含む限られた表面の少なくとも一の活性なゾーンが設計されており、
（２）前記ステップ（ｂ）において、前記希薄液体媒体とは異なる、その中に分散され且つ分離した形態の前記中間複合体粒子を含む中間液体媒体を得、
（３）前記ステップ（ｃ）において、その中に分散され且つ分離した形態の前記中間複合体粒子を含む中間液体媒体を、前記活性ゾーンの前記捕獲手段と接触させ、
（４）前記ステップ（ｃ）において、前記試薬（３）又は中間複合体粒子を分離するために物理的手段を適用して前記試薬（３）又は中間複合体粒子を分離して、前記活性なゾーンの単位表面積当りの前記試薬（３）又は前記中間複合体粒子の量を増大させて、前記固定された試薬（３）又は中間複合体粒子の堆積を濃縮し、分離した試薬（３）又は中間複合体粒子を任意選択で洗浄し、さらに前記物理的手段を停止することによって前記試薬（３）又は中間複合体粒子を溶離し、前記試薬（３）又は中間複合体粒子に関して濃縮された中間液体媒体を得ることを特徴とする、分析物を検出及び／又は定量する方法。
【請求項２】
前記試薬が、磁性体である前記第一の支持体粒子を含み、前記物理的手段が前記中間液体媒体に適用される磁場からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の支持体粒子が超常磁性体であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記磁場がＨＧＭＳ（高勾配磁性分離）技術によって適用されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬が前記第一の受容体と共役した前記第一の支持体粒子を含み、前記試薬はそれが分散されている任意の液体媒体から分離される能力を有し、ステップ（ｃ）において中間液体媒体中で、前記活性なゾーンの単位表面積当りの前記試薬又は中間複合体粒子の量を増大させるために、前記第二の支持体と関連付けて物理的手段が適用されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記試薬が標識でラベルされており、且つ前記方法が前記活性なゾーンに濃縮かつ固定された前記堆積物について前記標識を決定（検出及び／又は定量）するステップを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
トポグラフ的方法、磁気的方法、電気的方法、光学的方法、及び質量変位測定方法からなる群から選択される任意の方法によって、前記活性なゾーン内に濃縮された堆積物から前記分析物を決定（検出及び／又は定量）することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記トポグラフ的方法が原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）であり、前記磁気的方法が磁力顕微鏡法であり、前記電気的方法がキャパシタンス又は抵抗の変位の測定であり、前記光学的方法が屈折率の測定であり、前記質量変位測定方法が水晶微量天秤である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記アッセイ形式が直接的であって、前記第二の受容体が、前記第一の支持体、前記第一の受容体、及び前記分析物による前記中間複合体粒子に対するものであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記アッセイ形式が競合によるものであり、前記第二の受容体が、前記試薬に対するものであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、少なくとも一の分析物を液体媒体より単離する方法であって、後者が当該媒体中に分散されている方法に関する。
”単離する”又は”単離”とは一般に、当該分析物を分離することを可能にするいかなる技術をも意味すると理解されているが、これらはまた当該分析物を濃厚化又は濃縮することをも意味する。しかしながら、前出の定義と随意連帯し、分析物を含む液体媒体中の分析物の検出及び／又は定量の目的で、それを決定することを可能にするいかなる技術をも意味すると理解される。
”分析物”とは、単離されるいかなる物体をも意味し、特には生物学的物体を意味する。本発明で以下に考慮する分析物の範囲の中では、決定される、すなわち検出及び又は定量されるものとして、細胞、細胞小器官、ウイルス、細菌、抗体、抗体断片、抗原、ハプテン、レクチン、糖、リボデオキシリボ核酸、プロテイン（特にはＡ又はＧ）、ホルモン、ホルモン受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及び一般に全ての天然又は合成の分子若しくはマクロ分子、又は類縁体を挙げることができる。
ＦＲ−Ａ−２，６７９，６６０の資料によれば、少なくとも一の分析物、すなわち遊離しているか若しくは細胞表面に結合している抗原、又は細胞抗原若しくは組織抗原に向けられた抗体、例えば抗−赤血球抗体を単離する方法が知られている。
この方法によれば、遊離した支持体を分離した形状において、例えばこの場合にはフェライト微粒子を包含したポリマーを含む比較的大きいサイズの磁石粒子を一方において具備し、また他方では分析物の受容体、すなわち抗体又は抗原の何れかを呈しているか、あるいは物質、例えば抗−ヒト免疫グロブリン抗体を検出するものを具備する、少なくとも一の試薬が利用される。
アクセス可能な表面が限られた表面に少なくとも一の有益な又は活性なゾーンを具備していて、捕獲する物体用の少なくとも一の他の受容体、すなわち当該分析物用又は受容体用のものを呈している、容器の壁面またはウェルからなる、捕獲用の他の支持体もまた利用される。この、他の受容体は、抗体、又は抗原の何れかであり、例えば赤血球タイプのものがある。
この方法によれば、分析物とアクセス可能な表面とを結合させ、当該表面上において堆積物の形態で会合させ、当該他の受容体によって当該他の支持体上に固定化するため、当該他の支持体のアクセス可能な表面を、液体試料中に含まれている分析物と接触させる。
次に、検出の目的で、固定化された分析物に試薬を接触させるが、これは固定化された分析物との連合体を得て、当該他の支持体上に更に固定化して当該分析物の単離又は決定を行えるようにするためである。
よって上に定義した方法は、当該分析物用の受容体を形成する少なくとも一のリガンドが結合した、遊離した支持体を含む試薬を使用して行なわれる。
好ましくは、これらの粒子は磁石である。それらは二つの範疇、すなわち比較的大きい直径の粒子、例えば１又は２、３ミクロンのオーダーのもの、そして比較的小さい直径のもの、例えば２、３０ナノメートルのオーダーであってコロイド状のものに分類することができる。
比較的大きい直径の磁石粒子は、磁場内におかれると、当該磁場が最も高い部位の方向に向かって、またこの手段により媒体中から分離されるのに十分な速さで動く。
例として、ＥＰ−Ａ−０，１２５,９５５の資料に記載される粒子を挙げることができる。それらは第一鉄、及び第二鉄の塩を塩基性媒体中で沈殿させ、次いでメタノール中でシラン化反応させて得られる。それらの最終的な直径は０.１〜１.５μｍの間にあり、またそれらの密度は２.５ｇ／ｃｍ3である。同様に、ＥＰ−Ａ−０，１０６，８７３、ＥＰ−Ａ−０，５８５，８６８、及びＵＳ−Ｃ−５，３５６，７１３の資料に記載される粒子は、種々の重合法、又は代替として出願ＵＳ−Ｃ−４，２９７，３３７に記載される、磁性顔料が内部に分散された多孔性のガラスマトリックスを使用したものにより得られる。他の特許にもまた、小型の粒子を使用するものが記載されているが、ＵＳ−Ｃ−５，１６９，７５４の資料のように磁石の質量を増大させるために故意に凝集させてある。Ｐ．Ａ.Ｒｉｓｏｅｎらによる論文（Protein Expression and Purification,6（1995）,272-277）ではまた、磁性ゲルが記載されている。
磁場内に配置すると、これら比較的大きいサイズの粒子は当該磁場の最も強い方向へと向かって移動する。単純な永久磁石、又は例えばＥＰ−Ａ−０，３１７，２８６、又はＵＳ−Ｃ−５６５，６６５の資料の実施例に記載されるような同等の集合体を使用することができる。これらの粒子は細胞や分子の分離用のみならず、ＥＰ−Ａ−０，５２８，７０８の資料に記載される免疫アッセイにおいてもよく使用されるが、検出や定量用のシステムとしては使用されていない。
更に、それらの直径及び密度は重力の効果により非常に素早く沈殿するようになっているが、攪拌ストレス又は濃度勾配の創成による溶液の均一性の欠乏のため、使用することが難しい。
ようするに、比較的大きい粒子は使用が難しく、分析物の決定用には全く適さない。
比較的小さい直径の磁性粒子は実質上、単純な永久磁石により程よい期間内には引き付けられない：これらの粒子は特に、細胞の磁性分離用に広く使用されている。これらの粒子は”スーパー常磁性”粒子の名で当業者らに知られている。”スーパー常磁性”粒子は、その直径が小さすぎて複数の磁区からなることができない粒子を意味すると理解されている。それらは、高磁化率、及び飽和時には高磁化であるが、磁石の安定性がゼロか非常に低いことで特徴付けられる。これらの粒子は特に、細胞の磁性分離用に広く使用されている。例えば、出願ＵＳ−Ｃ−４，２３０，６８５に記載されるものは、アルブミン、プロテインＡ、及び直径が１５−２０ｎｍのＦｅ3Ｏ4粒子の混合物を乳化させて得られるが、これらはプロテインＡを利用して抗体を固定化することが可能である。ＵＳ−Ｃ−４，４５２，７７３の資料は、別のタイプの粒子を記載しているが、これは第一鉄及び第二鉄の塩を塩基性媒体中で、ポリサッカライドの存在下で沈殿させて得られる。これらの粒子は、抗体、オリゴヌクレオチド、レクチン、又は他の生体分子を、既知のグラフト方法によりポリサッカライドとカップリングさせて固定化することができる。それらの使用については、ＵＳ−Ｃ−５，５４３，２８９やＷＯ−Ａ−８８／０００６０の資料におけるようにしてしばしば行なわれていたり、例えばＦＲ−Ａ−２，７１０，４１０及びＦＲ−Ａ−２，７３２，１１６の資料に記載されるような特定の適用において使用されている。ＵＳ−Ｃ−４，７９５，６９８の資料には、例えばポリサッカライドを他の蛋白性ポリマーで置換した、改変モルデイ（Molday）法が記載されている。よって、粒子表面に存在する蛋白質は当業者らに知られるカップリングにより抗体を固定化する後の工程に供することができる。
これらの粒子には、局所的に磁場勾配を増大させることが可能な特別の集合体を使用することが必要である。この技術は、当業者らにはＨＧＭＳ（High Gradient Magnetic Separation）の名で知られていて、例えばＷＯ９６／０９４０９の資料に記載されている。これには、例えば繊維マトリックス又は金属微粒子を含んでいる容器からなる装置が使用されている。外部の磁場内に配置されると、この装置により当該繊維の表面に非常に高い場の勾配を得ることが可能になる。小さいサイズのスーパー常磁性粒子でさえも、繊維のネットワークが十分にマトリックスに近かければそのような装置上に保持することが可能である。そのような装置は例として、ＵＳ−Ｃ−４，３７５，４０７、ＵＳ−Ｃ−５，５４３，２８９、ＷＯ−Ａ−９６／２６７８２、ＷＯ−Ａ−９６／２６０１１、又はＵＳ−Ｃ−５，１８６，８２７の資料や、B.L.Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎらの発行物（CHEMTECH，March 1982，pp 172-179）等に記載されている。集合体にはまた、例えばMiltenyi Biotec（Bergisch Gladbach，Germany）のＭＡＣＳカラムの名で商業的に知られるものであってもよい。
これらの方法は、広く知られていて、水性の媒体より生物学的な細胞を単離及び濃縮するためのものとして売られている。実際、そのような適用においては数千もの粒子が、特定の分子認識反応を介して単一の細胞と反応するかもしれず、磁石の質量を増大させることによって、この成分を分離することが可能となる。一方ではその小さいサイズのために、粒子は溶液中に分散している非常に少量の分子としか特異的に反応しない。よって、これらは分離された形状のままであり、このために分析物の分離、濃縮、又は濃厚化には使用されていない。
更に分離後は、当該粒子はどのような方法の後の工程においてはむしろ不便なものと考えられている。ＵＳ−Ｃ−４，０１８，８８６の資料においてはそれらは故意に除去さえされている。ＦＲ−Ａ−２，７１０，４１０の資料では、分子認識反応を定量することを可能にする検出成分として、小型のスーパー常磁性粒子を使用している。この場合の、使用されている原理は、凝集物を生じる凝集反応である。更に、分離する成分を濃縮又は分離する手段としては当該粒子を使用しておらず、検出の手段としてのみ使用している。
まとめると、比較的小さい磁性粒子は、通常の方法、特に免疫アッセイにおいては分離、濃厚化、又は濃縮用の方法としては全く適切ではない。
WO-A-9609409の資料は、いわゆるMACS（Magentic Cell Sorting）法を記載しているが、これには分析物、例えば胎児の赤血球を濃厚化/濃縮するために、分析物と、磁性粒子を具備する試薬との間の複合体の形成が関与している。これらの細胞を次いでフローサイトメトリーにより分析したり、又は遺伝物質の供給源として使用したりしているが、例えば分析物と受容体との間の結合により支持体上に固定化してはいない。
DE-A-４，０３６，２８８の資料は、区別されることが可能な粒子に特異的に結合している一以上の分析物を検出及び定量することが可能な方法を記載している。
本発明の主題は、非常に希釈されているか、全く濃縮されていない、液体媒体中から分析物を単離することを可能にする方法である。より具体的には、分析物の決定に関しての本発明の主題は、高感度の検出及び／又は定量を可能にする方法である。
本発明によれば、一般的に：
−分析物を含んだ媒体より得た液体試料に試薬を接触させ、いまだ分離した形態で当該媒体中に分散された状態にある、当該支持体、当該受容体、及び当該分析物の複合体を具備した中間媒体を形成させ、
−当該他の支持体のアクセス可能な表面を、少なくとも一の捕獲用パートナー、すなわち前工程で反応しなかった試薬又は当該複合体と接触させ、当該捕獲用パートナーを当該アクセス可能な表面に結合させて、当該有益ゾーン内に濃縮した堆積物を得て、当該他の支持体上において当該他の受容体と当該受容体又は当該分析物とを結合することにより固定化させ、
−当該捕獲用パートナーの堆積物を、当該有益ゾーン内の単位表面当たりの当該パートナーの量を増大させることにより、当該有益ゾーン内で濃縮する。
他の支持体のアクセス可能な表面との接触における捕獲前又は捕獲中において、堆積物を濃縮させるいくつかの様式が考えられる。
捕獲用パートナーの堆積物は、捕獲用パートナーで濃厚化された別の試料を中間媒体から得ることにより濃縮される、当該他の試料はアクセス可能な表面と接触されられる。
捕獲用パートナーを含み、またアクセス可能な表面に適合している、限られた部分の液体の流れを確立し、当該流れを当該アクセス可能な表面と接触させる。
捕獲用パートナーを含む液体の流れを確立し、当該流れを当該アクセス可能な表面と接触させて、次いで後者と接触させてリサイクルする。
本発明を記載する前に、使用する用語の定義を行うことが適切である。
”リガンド”とは、化学的又は物理的な結合により分析物を有する複合体を形成することが可能な構成成分を意味すると理解される。
リガンドの例としては、抗体、抗体断片、抗原、ハプテン、レクチン、糖、リボ−及びデオキシリボ核酸、プロテイン特にはＡ又はＧ、ホルモン、ホルモン受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及び一般的には天然若しくは合成のリガンド、及びリガンドと競合する修飾済リガンド類縁体を挙げることができる。
”受容体”とは、上記したいかなるリガンドであって、吸着、共有結合、キレート化、分子認識等のいかなる手段によっても支持体上に固定化され、分析物を単独で、又は別のリガンドと共役して保持することが可能なものを意味すると理解される。
”支持体”とは、ポリマー、無機、又は金属製のいかなるタイプの支持体をも意味すると理解される。ポリマー製の支持体の例としては、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリブタジエン、ポリプロピレン等に基づく、単独の、又は共重合体の形態のプラスティック支持体が挙げられる。無機製の支持体の例としては、酸化ケイ素、ケイ素、雲母、ガラス、水晶等が挙げられる。金属製の支持体の例としては、金、銀、酸化チタン、酸化バナジウム等を挙げることができる。
支持体へのリガンドの固定化は、そのままの又は修飾した支持体への単純な吸着、又は支持体表面を改変することが可能な化学的若しくは物理的反応により、従って共有結合により受容体を結合させることにより、あるいは当業者らに知られる他の通常の手段により実施することができる。
”限られた表面”とは、化学的又は物理的手段により得られ、また例えばより小さい大きさの成分へと切断したり、自身の内側の輪郭へ向いた、初期の表面を限定する”マスク”を利用して覆ったり、又はＫｕｍａｒ  Ａ．ら（Langmuir（1994）,10,1498-1511）が記載したようにして、より小さい表面に基づいて分散させる化学的手段により、一定の面積の表面を減少させるようにデザインされたいかなる表面をも意味すると理解される。有益な又は活性なゾーンの表面の減少は大きさにおいて限定されない。マイクロ技術由来の方法により、例えばミクロ又はナノレベルの大きさの限られた表面を得ることのみならず、マイクロ又はナノレベルの容量を得、及び／又は限られた表面の有益なゾーンに対して運搬することが可能となる。
以下の記載において、”共役”という用語はリガンドと試薬の支持体との間の固定化により形成される物体に対して用いられる。”複合体”という用語は試薬、仮想的には共役しているものと分析物との間に形成される物体に対して用いられる。試薬の一部となるものが支持体であろうと、試薬自体及び複合体であろうと、それらは分離した形態で存在し、液体媒体中に分配又は分散していて、結果として粒子の形態をとっている。
”支持体”及び”他の支持体”という用語は、それらが実質的に同じ性質又は実質的に同じ機能を有している構成要素であることを意味する。”支持体”という用語は試薬に属する支持体に対して用いられ、”他の支持体”という用語は、そのアクセス可能な表面の少なくとも一部又はウィンドウが、一以上の限られた表面の有益なゾーンを含む支持体に対して用いられる。
”受容体”及び”他の受容体”という用語は、それぞれ当該支持体及び当該他の支持体上にそれぞれ固定されているリガンドに対して用いられる。
”粒子”とは、ポリマー製、無機製、又は金属製の支持体でできたいかなる粒子をも意味し、その上にリガンドをグラフトすることが可能なものである。特には、外来の物理的手段の作用、例えば磁石若しくは電気的なルート、又は重力の影響下若しくは遠心によって分離されうる粒子は、本発明の範囲内に含まれるものと見なされる。前出の定義の外に外れるものは、小型の、特にはスーパー常磁性粒子であって、重力影響下におけるその沈殿速度が熱的な攪拌未満であるが、それらが互いに組み合うか、又はいかなる物理的手段によっても分離することが可能なより大きな粒子状にそれらを組み立てることが可能な、どのような方法によっても凝集物を構成することが可能なものである。
ポリマー製粒子の例としては、ラテックス、又はより大型の粒子、又は磁性を帯びたものまたはそうでないもの等、エマルジョン中にて重合化することにより得られる粒子が挙げられる。
金属製の粒子の例としては、コロイド状の金、第一鉄、第二鉄、常磁性−、超常磁性粒子、天然若しくは合成のポリマーでコートされた、又はされていないものを挙げることができるが、その組成は鉄、又はコバルト、ニッケル等のそのほかの金属担体、又は合金、磁性を帯びたもの又はその逆のものの形態をとるものが含まれる。
無機製の粒子の例としては、シリカ若しくはケイ素、又は磁性を帯びたか又はその逆のものを挙げることができる。
外来の物理的手段により分離する方法の例としては、重力による沈殿、又は遠心、永久磁石、電磁石の作用による磁気引力、あるいは磁場勾配を増大することが可能な装置の使用、及び他の同等な技術によるものを挙げることができる。
”決定”とは、当該支持体のアクセス可能な表面の有益なゾーン内に濃縮される堆積物、即ち興味ある特定の産物、即ち複合体又は反応しなかった試薬の粒子の存在を検出、及び／又は定量することを可能にするいかなる方法をも意味すると理解される。
決定方法の例としては以下のものを挙げることが可能である：
−原子間力顕微鏡法、側面計測（profilometry）等のような局所的方法、
−例えばＦＲ−Ａ−２，７１０，４１０の資料において記載されるような磁力顕微鏡法や、第一鉄、第二鉄、常磁性の及び超常磁性の金属製成分に感受性のあるいかなる決定方法等の磁気的方法、
−例えば、ＥＰ−Ａ−９０  ４０２  ６１１の資料におけるキャパシタンスの変位についての測定、トンネル効果顕微鏡、抵抗測定等のなど電気的方法、
−例えば厚み、及び／又は屈折率の変位の検出（光学的薄膜、偏光解析法、表面プラズモン共鳴、表面音波等）、又は光強度の測定（一過性波、暗視野顕微鏡、光学近視野顕微鏡等）を可能にする光学的方法、
−質量変位の測定を可能にする方法（水晶微量天秤等）、
−及び、一般的に本願では引用されていないが同等であるいかなる技術。
本発明には、以下に定義する操作上の選択に依存して種々の態様が含まる。
濃縮工程においては、捕獲用パートナーの濃度レベルは、当該固定済捕獲用パートナーの量が多くとも当該他の支持体上の当該他の受容体の量と同じになるように決定される。そのため、例えばこの試薬は、受容体と共役し、自身が分散されるいかなる液体媒体からも当該液体媒体に適用される物理的手段の作用下で分離されうる能力を有する支持体の粒子を具備するものであり、この物理的手段は中間媒体の少なくとも一部に適用されて複合体粒子を分離するようにされ、このように分離されるこれらの複合体粒子は適宜洗浄され、物理的手段の適用を終了させることにより当該複合粒子は回収されるが、これは以下において当該有益なゾーン内に捕獲用パートナーに対して濃縮された堆積物を得るためである。例としては、この支持体の粒子は磁性を帯びたもの、特には超常磁性のものであり当該物理的手段は、例えばいわゆるＨＧＭＳ（High Gradient Magnetic Separation）技術により中間媒体に適用される磁場から成っている。
受容体、即ち試薬に属するもの、及び当該他の受容体、即ちアクセス可能な捕獲用表面に対するものには、同じリガンドが含まれ、それぞれが支持体及び他の支持体上に固定されている。
試薬が、受容体を共役した支持体の粒子を具備し、それらが分散されるいかなる液体媒体からもその液体媒体に適用される物理的手段の作用下で分離される能力を有する場合には、この物理的手段は、いかなる有益なゾーンにおいても当該堆積物を濃縮するために、好ましくは他の支持体、即ち捕獲用のものとの関係において適用される。
ある場合には、試薬は標識され、また分析物の処理は、他の支持体上の有益なゾーンにおいて濃縮固定される堆積物の標識を決定する工程を具備している。この試薬の標識は、通常、以下の方法の一つにより行なわれる、即ち：
−支持体自体に標識を構成させる；例えばコロイド状の金、
−標識を支持体に結合する、
−標識を受容体に結合する。
分析物は、有益なゾーン内に濃縮される堆積物より決定されるが、これは例えば原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などの局所的方法、例えば磁気力顕微鏡等の磁性的方法、例えばキャパシタンス変位の測定等の電気的方法、例えば屈折率の測定等の光学的方法、及び最後になるが例えば水晶微量天秤等の質量変位を測定する方法を含む群より選択されるいかなる方法によってもなされる。
より具体的には、有益なゾーンは当該他の支持体上に固定された堆積物の量が、単位表面当たりの粒子数で表したときに、少なくとも決定方法の感度の限界と等しいように設計される。
使用するアッセイ形式は捕獲用パートナーが当該分析物である直接的なもの、又は当該捕獲用パートナーが試薬である競合的なものの何れかである。
好ましくは、複合体を有する中間媒体を濃厚化して別の試料を得、当該他の試料を当該他の支持体のアクセス可能な表面と接触させる。
アクセス可能な捕獲用表面と他の試料とを接触させる種々の様式が考えられる：
−一定量の他の試料を後者のアクセス可能な表面に沈殿させる、
−又は比較的厚みが小さく,適宜リサイクルされる当該他の試料の流れを、このアクセス可能な表面と接触させるようにして起こさせる。
最後になるが、液体媒体には複数の種々の分析物を含ませてもよく、この場合には他の支持体のアクセス可能な捕獲用表面は、それぞれが異なった複数の他の受容体、それぞれが異なった複数の捕獲用パートナーを呈している、有益なゾーンを具備している。
本発明の方法は、いかなる細菌の特定の核酸物質（例えばリボソームＲＮＡ）にも適用することができ、得られる感度のため、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）などのいかなる酵素的増幅法をも避けることが可能になり、当該細菌のゲノム物質を検出するためにそれに適用することができる。実際に、得られる感度は細菌中に存在するリボソームＲＮＡの量に匹敵し、１０4〜１０5の分子のオーダーであり、これによってこの細菌の存在を、そのゲノムの全て又は一部を増幅することなく決定することが可能となる。
図の説明
図１は溶液中での複合体形成についての一般的な図を示す。
図２は複合体を分離するための装置の例について示す。
図３は捕獲用支持体の生物特異的、アクセス可能な表面を表す。図４は複合体を含む溶液の、生物特異的表面への堆積を示す。図５は複合体と、生物特異的表面の他の受容体との間の反応を表す。
図６及び図６ｂｉｓは、複合体の粒子を生物特異的表面上に集合させて、且つ固定化する二つの方法を模式的に表したものであり、一つは複合体の濃縮なしのものであり（図６）、もう一方は複合体の濃縮有のものである（図６ｂｉｓ）。
図７は、図６及び図６ｂｉｓの方法で得られるそれぞれ二つの曲線を示すものである。表面の単位当たりの検出粒子数をｙ軸に、そしてオリジナルの液体媒体中の分析物濃度をｘ軸に示してある。点線は、感度の限界を制定している。
図８は、複合体にアクセスすることが可能な表面であって、他の支持体に属している捕獲用支持体と呼ばれ、マスクの使用により制限されているものを示している。
図９及び図９ｂｉｓは、複合体の粒子についての、図８に示される限定された表面上への堆積を示すものであり、それぞれ磁石又は電磁石からなる濃縮方法を行わないもの及び行うものを示している。
図１０は、図４に示されるものと同等のシステムであって、図８に示される限定された表面を有し、磁石を加えたものを示す。
図１１は、磁場勾配により複合体の濃厚化の効果を示すものであり、ｙ軸の単位表面（μｍ2）当たりの粒子数の変位を、ｘ軸のＴＳＨ（分析物）濃度（Ｌｏｇ１０  ｎｇ／ｍｌ）の関数で示したものである。中黒の円は、０.０７ｍｌの一定容量で濃厚化なしのものを示し、中黒の四角は、ＨＧＭＳでの濃縮による容量が変位したものを示す。
図１２は、複合体と捕獲用支持体の生物特異的又はアクセス可能な表面の受容体との間の共役の形成反応中における磁石の添加効果を示す、４つの原子間力顕微鏡イメージを示すものである。左側の図は、磁石による濃縮で得られたもの、右側は濃縮なしのものを示す。
図１３は、単位表面（μｍ2）当たりの固定化された複合体粒子数の変位を、生物特異的表面の大きさ（ｍｍ2）（ｘ軸上）の関数で示したものである。
図１４は、単位表面（μｍ2）当たりの固定化された複合体粒子数の変位を、ｘ軸上に示されるオリジナルのＴＳＨの溶液濃度（ｐｇ／ｍｌ）の関数で示したものであり、右側の図（図１４ｂｉｓ）は、オリジナルの勾配を示すものである。
図１５は、単位表面（μｍ2）当たりの固定化された複合体粒子数を、生物特異的表面の大きさに従って、ｘ軸上に示されたオリジナルのＴＳＨ溶液濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数として示したものである。中黒の円はまず磁場勾配ＨＧＭＳにより濃厚化され、６４ｍｍ2の生物特異的表面上に濃縮されることなく固定化された複合体を示す。黒の×は、０.５ｍｍ2の生物特異的表面上へ濃縮されて固定化された、濃厚化複合体を示す。ｘ軸上の濃度はｌｏｇ１０（ｎｇ／ｍｌ）で示したものである。
図１６は、磁性粒子を使用した、出発試薬用の種々の濃縮方法を比較したものである。ｙ軸及びｘ軸は図１５に示したものと同じスケールである。中黒の円は、予め濃厚化、又は生物特異的表面上への捕獲時に濃縮を行わなかった場合の生物特異的表面へ固定化された複合体を示し、中黒のひし形は、ＨＧＭＳカラムへの濃厚化後に固定化された複合体を示し、更に黒の×は濃厚化後に濃縮したものを示す。
図１７は、コロイド状の金粒子を、試薬に属する支持体として使用した種々の濃厚化方法を比較したものである。μｍ2当たりの粒子数をｙ軸状に、ＴＨＳ濃度（Ｌｏｇ１０  ｎｇ／ｍｌ）をｘ軸上に示した。中黒のひし形は遠心による濃厚化後の計測を、そして中黒の円は遠心による濃厚化なしによる計測を示す。
図１８は、本発明の態様であって、競合によるハプテンのアッセイを示したもの、また図１９は予想される理論曲線であって、ｙ軸上に生物特異的表面の単位表面当たりに検出される粒子数を、そしてｘ軸上にオリジナルのハプテン濃度を表したものである。
図２０は、捕獲用支持体のアクセス可能な生体特異的表面であって、それぞれが異なった親和性受容体を有する有益なゾーンを複数含んでいるものを示す。
図２１は、本発明の別の態様を示すものである。
図２２は、本発明の別の態様を示すものである。
図２３及び図２４は、二つの濃縮手段と、例えば図２０に示される複数の有益なゾーンを含んだ生物特異的表面とを、図２２の態様に追加したものを示す。
図２５及び図２６は、本発明の別の態様を示すものである。これらは特に、自身の末端へ磁場ラインを閉じ込める性質を有する、いわゆる”ソフトな”磁性物質でできた鋭利部分を、磁石の表面に対して付加したものを示している。この部分、又は同等のものは図９ｂｉｓ、１０、１８、２１、２３、及び２４に記載される例、又は他の同等の構築物に関して、等しく付加することができる。
上述したように、本発明の特別な特徴は、非常に希釈されていても液体媒体より分析物を単離することを可能にする方法にある。単離方法は可変的であってもよく、理解を容易にするために一例をガイドとして示してある。この方法は、小型の磁性粒子を使用する利点を有している。図１はその例を示している。
特定の態様においては、使用する粒子１は、１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍの直径を有する。これらは、少なくとも一の単結晶の酸化鉄コアを具備するが、これは７〜１５ｎｍの直径を有し、自身が親水性ポリマー（支持体）の層で被覆されていて、金属製コアと、受容体を形成するリガンドとが接触するのを防いでいる。金属製コアは、大きさが与えられると超常磁性の性質を有する。このような懸濁物は数カ月間安定であり顕著な沈殿を生じない。このポリマーは有益には、当業者らに知られる方法によりリガンドの固定化又は移植に使用される。本願で使用されるポリマーは、デキストランRと呼ばれるポリサッカライドであり、１０，０００〜２，０００，０００の間、好ましくは４０，０００〜７０，０００の間のモル質量を有する。これは適宜、過ヨウ素酸塩により近接するアルコール基間で開裂させてアルデヒド基を与える酸化、又は臭化シアンでの酸化などの種々の方法、そして一般的には同等ないかなる方法でも活性化又は機能化させることが可能である。
リガンド２は上に定義したように、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、又は分析物へ結合する性質を有する他の生物学的物体のいかなるものの何れかである。リガンドは例えば、予め活性化されたポリマーの表面に、天然の又は意図的にリガンド内に付加されたリガンドに存在する第一級アミン官能基を介して粒子表面にカップリングされていてもよい。粒子／リガンド共役物３を図１に示す。
図１は、溶液中での複合体の形成についての一般的な概略図を示している。共役物３（試薬）を、分離する分析物４を含んだ媒体中に導入する。共役物と分析物との間の複合体５の形成に必要なインキュベーション時間後、溶液（中間媒体）を図２に示される構築物にかける。これは磁場の影響に反応する成分の分離の原理に基づく濃厚化装置の例である。これには、強磁性物質でできた繊維マトリックス、例えばスチール繊維７を収めている分離チャンバー６を含んでいる。このマトリックスは、適宜、US−C−４，３７５，４０７、又はＷＯ−Ａ−０７３８０の資料に記載されるポリマーでコートされていてもよい。分析物／試薬の複合体５を含んだ溶液を一以上の磁石８の磁場内に配置された繊維マトリックスに、調節可能且つ当該マトリックスへの複合体の保持を許容する流速でかける。このような装置により、初期容量が非常に大きく希釈された複合体を濃厚化することが可能になる。
外来成分及びキャリアの液体を除去した後、磁場を取り除き、濃縮された複合体を少量の液体で溶出させる。これを図３に示される生物特異的なアクセス可能な表面に堆積させる。これは分析物４に特異的な他の受容体１０が上部に固定された平坦支持体９を含む。
酸化ケイ素等の平坦支持体には既知の利点がある。例えば低粗面度、調節可能な大きさ、又は種々の機能化方法を挙げることができる。例えばアルコキシ又はクロロシランを付加すると、種々の方法（吸着、共有結合等）により受容体を固定化する目的で、官能基を表面に導入すること等が可能になる。しかしながら上述した他の支持体を使用することが可能である。
図４は、複合体５を含む溶液の堆積例を示す。これは磁場を除去して溶出され、溶出後生物特異的表面上に少量の容量で堆積する。
図５は、支持体９上での複合体５と受容体１０との間の反応の例を示す。
図６及び６ｂｉｓは、本発明の利点の一つを表している。図６はある数の粒子が、いわゆるワイドな生物特的表面上に濃縮されている。図６ｂｉｓは、図６の構築物上におけるより小さい大きさの生物特異的表面に同じ数の粒子が濃縮されている点での改良物を示している。
図７は図６及び図６ｂｉｓに示される構築物による、単位表面当たりの粒子数の増加を示す理論曲線を表している。感度の限界（点線）を示せば、感度の限界における改良が可能になり、よって溶液中での低濃度の粒子の検出が可能になる点で低減された表面を使用することが有利になる。
図８は、単一の有益な捕獲用ゾーンにより構成される生物特異的表面を限定することを目的とした例示的態様を示す。これは図４に示される生物特異的表面と同等であるが、その大きさは制御した大きさのマスク１１の使用により限定されている。
上述の記載と一致して、図９及び９ｂｉｓは、図８に表されている低減された表面への粒子の堆積についての特定の実施について表している。図９ｂｉｓは本発明の別の利点を表している。これは支持体下に磁石１２を配置することにより図９に示される方法を改良したものであって、複合体５を有益なゾーン１０上に濃縮することを意図したものである。
図１０は、図４に示されるものと同等のシステムであり、上記の発明を二つの点で改良したものである。即ちアクセス可能な表面が、マスク１１の付加により低減され、表面への粒子の濃縮又は閉じ込めが、磁石１２の付加により低減されているものである。
本発明に特異的な実施においては、粒子は原子間力顕微鏡法により検出及び定量される。この技術により粒子をあいまいさなく検出及び同定することが可能となるのみならず、画像プロセスソフトを使用して一定表面に存在する粒子数を提供することが可能になる。
この濃縮工程後、反応を原子間力顕微鏡法により検出又は定量するが、当業者らに知られる他の方法を使用してもよく、更に本発明の分野（field）の一部を形成する。
図１３は複数の生物特異的表面、又はそれぞれが異なる特異性を有する捕獲用の有益なゾーン（A，B，C等）を限定するための例示的態様を示す。それぞれの大きさは、制御された大きさのマスク１１を使用して限定した。
本発明の特異的態様において、図２２は溶液から分析物４又は複合体５を分離する手段を示したものである。入口及び出口を含む限定された高さのセルによって、分析物４又は複合体５を含んでいる試料を捕獲用表面の受容体１０と接触させることが可能になる。流速は当業者らに知られる手段により調節することができ、またセルの形態は層流又は乱流に適応させてもよい。
図２３及び２４はそれぞれ、図２２に示される態様の横断面及び上面図を示し、二つの濃縮手段、及びそれぞれが異なった親和性の受容体を有する複数の有益なゾーンを含む一の生物特異的表面を、図２０に示されるようにして加えたものである。例えば閉じ込めについての第一の手段は、溶液の流れを捕獲表面の活性ゾーン１３  Ａ，Ｂ，及びＣと接触して通る一定幅の通路１８へ閉じ込めるための”くさび”１７を利用することである。閉じ込めの第二手段は、可動磁石１２又はそれぞれが有益なゾーンに向いた複数の磁石を加えることである。
図２５及び２６は本発明の別の態様を表す。これらは特に、その底部２０において、自身の末端へ磁場ラインを向けて閉じ込める性質を有する、いわゆる”ソフトな”磁性物質でできた鋭利部分を、磁石の表面に対して付加したものを示している。この部分又は同等物は、図９ｂｉｓ、１０、１８、２１、２３及び２４に示される例による態様、又は他の同等な構築物に等しく加えることができる。上部１９は入口及び出口を有していて、試料中にある分析物４又は複合体５が捕獲用表面１３上の受容体１０と接触することが可能になっている。
本発明の実施についての更なる詳細は、以下の実施例に示す。
実施例
実施例１−抗−ＴＳＨ（甲状腺刺激性ホルモン、又は分析物）抗体のカップリングによる、生物特異的な限定された表面の製造
使用した支持体は、８×８ｍｍのシリコンプレートで、熱シリカでコートされているものからなる。可能性のある有機性汚染物質をまず、スルホクロム酸混合物中での洗浄により除去する。次いでプレートを、トルエン中の２％（ｖ／ｖ）アミノプロピルジメチルエトキシシラン溶液１ｍｌに浸漬する。このようにして表面に創出されたアミン基を、１ｍｌのスベリン酸ジスクシンイミド溶液（ジメチルスルホキシド中で１０ｍＭ）で活性化する。
捕獲用の抗−ＴＳＨ抗体を、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ含有のｐＨ７.４の５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で４０μｇ／ｍｌに希釈する。７０μｌを活性化したプレートに置く。室温にて１時間、カップリングを行う。次いでプレートを、０.５％のＴｗｅｅｎ２０R含有ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）中の０.１ｍｇ／ｍｌのアルブミン溶液７０μｌとともに３７℃で２時間インキュベーションして、望ましくない分子の吸着を避ける。
実施例２
磁性粒子（遊離支持体）の合成
この合成は、二三の修飾を除いて、US-C-４、４５２、７７３（Ｍｏｌｄａｙ）の資料に記載されるものである。
１４ｇのポリサッカライド  デキストランRＴ４０（Mw＝４０，０００、ファルマシア）を１４ｍｌの水に加え、デキストランを室温で溶解させる（溶液１）。３ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ（Mw＝２７０.３）及び１.３ｇのＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ（Mw=１９８.８１）を２０ｍｌの水に加えて溶液２を調製する。両方の溶液を、毎分２００−２５０回転に設定した攪拌モーター、ガラス攪拌器、及び７.５％（ｖ／ｖ）のＮＨ4ＯＨ溶液を含んだ滴下ロートを備えた、２５０ｍｌのジャケット付反応器内に導入する。室温で、ＮＨ4ＯＨ溶液を、攪拌しながら最終ｐＨが１０と１１の間になるまで一滴づつ加える。温度を６０分間、７０℃にし、次いで最終溶液を５リットルの蒸留水に対して、ｐＨが中性になるまで透析槽の交換を行って徹底的に透析する。次いでこの溶液を、最大の凝集物を除去する目的で、石英ウールで濾過し、次いで毎分６００回転で５分間の遠心を３回行う。過度なデキストランを除去するために、予め０.１５ｍのＮａＣｌ、０.０５％のＮａＨ3を含む０.１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝６.５）で平衡化した（３３×２.５）ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００  ＨＲゲルカラム（ファルマシア）に粒子をかける。デキストランでコートされて得られる超常磁性の粒子は、外側の直径が２０〜９００ｎｍあり、好ましくは３０〜１００ｎｍある。これらを+４℃で保存する。
粒子のアッセイは、４８３ｎｍでの光学密度を測定して行う。光学密度を、ドライ抽出により決定される溶液密度に関連づける補正直線を予め確立しておく。粒子の密度がわかると、それより単位容量当たりのその数を推論することができる。それは典型的には１５ｍｇ／ｍｌである。
鉄のアッセイは、バソフェナントロリンを使用したＡｖｏｌ,Ｅ.ら（Prep.Bioch．3/3:279，1973）の方法により実施する。鉄／バソフェナントロリンの複合体の光学密度は５３５ｎｍで測定する。補正曲線を、既知のモル濃度の鉄イオン（ＩＩ）の溶液に対してプロットする。粒子状の鉄の重量パーセントは、おおよそ５０（±１０）％である。
デキストランのアッセイは、Ｍｏｌｄａｙ，Ｒ．Ｓ．ら（FEBS lett.,170/2:232,1973）に記載される技術により実施する。ポリサッカライド及びフェノール−硫酸混合物との間に形成される複合体の光学密度を、４８７ｎｍで測定する。補正曲線は、遊離デキストランに対してプロットする。粒子状のデキストランの重量パーセントはおおよそ５０（±１０）％である。
実施例３
試薬を得るための、粒子／抗−ＴＳＨ抗体の共役物の製造
３.１）
抗−ＴＳＨ抗体の、実施例２の粒子への直接的カップリング
粒子を酢酸緩衝液（０.１Ｍ  ＣＨ3ＣＯＯＮａ、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝６.５）で透析する。０.１Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムの酢酸緩衝液による溶液中の５μｇ／ｍｌの粒子を加え、反応時間を４５分とし、遮光する。このように酸化される粒子を、カップリング緩衝液（０.２５Ｍリン酸塩、０.７５Ｍ  ＮａＣｌ）で透析し、抗−ＴＳＨ抗体を加える（ｍｇ単位粒子当たり１０〜１００μｇ）。カップリングは、一晩、３７℃で攪拌しながら行う。
次いで水素化ホウ素ナトリウム（０.１Ｍ、ｍｇ単位の粒子当たり１μmol）を室温で１５〜３０分間攪拌しながら添加して、イミン結合を還元する。混合物を０.１５Ｍ  ＮａＣｌ含有０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７.４）に対し最終的に透析する。
３.２）
ストレプトアビジンにカップリングした、商業的に入手可能な粒子の使用
３.２.１）
抗−ＴＳＨ抗体のビオチン化：
２ｍｇの抗−ＴＳＨ抗体をＰＢＳ緩衝液で透析し、次いで１時間、ビオチン−ＮＳＨ（Pierce）と室温で攪拌しながら接触させる（抗体の単位mol当たり２０molのビオチン）。過度のビオチンを除去するために、ビオチン化した抗体を再び透析する。
３.２.２）
ビオチン化抗体と粒子−ストレプトアビジンとのカップリング：
上述のようにして得られる２μｇのビオチン化抗体を、ストレプトアビジンにカップリングした１０11個の粒子を含む１００μｌの溶液に加える。この混合物を室温で１時間インキュベーションする。溶液を金属製マトリックスを含むカラムにかけ、形成された共役物の勾配磁性分離を行わせることにより、遊離抗体を除去する。このようなカラムには例えば、Miltenyi Biotec GmbH（Bergisch Gladbach，Germany）により販売されているものがある。また、対応する濃厚化技術がUS-C-４，３７５，４０７、US-C-５，５４３，２８９、ＷＯ−Ａ−９６／２６７８２、ＷＯ−Ａ−９６／２６０１１、US-C-５，１８６，８２７の資料、及びＢ．Ｌ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（Chemtech，March 1982，page 172-179）による刊行物に記載されている。カラムは、２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで共役物粒子を１００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで溶出する。約７０％（７×１０10粒子）の初期粒子をこのようにして共役形態で回収する。滴定曲線は、粒子当たり一乃至二の抗体が固定されていることを示している。
実施例４
試薬の分析物との接触、及び得られる中間媒体の濃厚化
実施例３で得られる１.６×１０10の共役物粒子を種々の容量で（０.１〜１００ｍｌ）、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎRで希釈する。６ｎｇのＴＳＨをそれぞれの溶液に加え、攪拌しながら２時間、３７℃でインキュベーションしてアッセイする。次いでそれぞれの溶液を実施例３のカラムにかけて濃厚化し、次いで遊離抗原を除去するために１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄する。粒子を回収するため、カラムを磁石より取り外す。粒子に関しての濃度が低すぎるので、３０μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎをいれて、除去する。次いで７０μｌを入れて回収する。
７０μｌのそれぞれの試料を実施例１で得たプレートに置く。この溶液を室温で１時間インキュベーションする。このプレートをついでＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで激しく洗浄し、次いで水で行う。
比較のため、上述と同様に１.６×１０10個の共役物（試薬）の粒子と種々の質量のＴＳＨとが混ざり、上述したものに匹敵する濃度幅が得られるようにした（０.０６〜８６ｎｇ／ｍｌ）一定の容量（７０μｌ）の溶液でアッセイを行う。この溶液はＨＧＭＳ技術によるカラムによる濃厚化は行っていないが、実施例１で得たプレートの上に直接堆積させ、上述のものと同様の条件下でインキュベーションする。
支持体上での特定の反応後の、超常磁性複合体粒子の濃縮された堆積物の検出は、原子間力顕微鏡法又はＡＦＭ（Autoprobe,Park Scientific Instrument）で実施する。試料を窒素で乾燥させて、空気接触モードで分析する（Ｓｉ3Ｎ4チップ、厚み＝６μｍ、剛性定数＝０.０１〜０.５Ｎ／ｍ）。１００−μｍのスキャナーを使用して、５×５μｍ2のスキャンを実行する。分析したそれぞれのゾーン上で検出される粒子数を画像プロセスソフトで計算し、得られた値をμｍ2当たりの粒子数で表現する。
結果を図１１に示す。等しいＴＳＨ濃度に対しては、ＨＧＭＳ技術による濃縮の場合には、単位表面当たりの粒子数の明確な増加が観察される。二つの方法に関しての検出限界（実施例７に示されるもの）を表２に示す。
実施例５
複合体粒子との接触時の、生物特異的、限定された表面との関係における磁石の適用
８×８ｍｍ2のシリカプレートを４枚、実施例１に記載されるようにして、その全表面について捕獲用抗−ＴＳＨ抗体で機能化及び共役化する。４枚の板のうち２枚を、希土類からなる磁石（直径６ｍｍ、高さ２５ｍｍ、Ｂ＝０.３２テスラ）の上に置き、他方の２枚をいずれかの磁場の作用の外に置く。１又は１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＳＨ及び同等の濃度の共役粒子（２×１０9）を含む７０μｌの溶液をこれらのプレートの上に置く。溶液を室温で１時間攪拌しながらインキュベーションし、共役粒子の非特異的吸着を制限するようにする。次いでこのプレートを実施例４に記載される原理によるＡＦＭにより分析し、結果を図１２の画像により示す。この特異的態様においては、小型の磁性粒子が使用されるが、分離距離が短いために、少量で使用してもやはり永久磁石による分離が可能になる。
磁石の上に置いた二つのプレートは、磁場の影響を受けないプレートの上のものと比較して顕著に大きい粒子密度を示す。バックのノイズ（溶液中にＴＳＨを含まないもの）は、両方の場合において同等であり、よって生物特異的表面における抗体／抗原反応の改良が、磁石の存在によるものであることが実証された。結果を表１に示す。
0004053092.tif 000002
実施例６
ＨＧＭＳカラムでの中間媒体の濃厚化、及びそれに続く生物特異的な限定された表面との関係における磁石の適用：生物特異的表面の大きさの影響
捕獲用の抗体又はリガンドを、増大する大きさの表面上の活性化シリカとカップリングさせる。この目的のため、１、１０、及び７０μｌに変動させた容量の抗体溶液をプレートの中心に置き、それぞれ１.８、１３、及び５６ｍｍ2の表面を覆う。最小の表面（０.５ｍｍ2）は、穴の開いたスクリーンを使用して作り、プレートの中心に置く。共役粒子（７.６×１０9）及びＴＳＨ（６０ｐｇ／ｍｌ）の溶液を１ｍｌでインキュベーションして、次いで実施例４に記載されるプロトコールによりＨＧＭＳカラムで精製する。実施例１の様にして得られるプレートを次いで磁石上に置き、精製済の溶液を置いてインキュベーションする。ＡＦＭによる分析により、μｍ2当たりの粒子数の定量が可能になる。
結果を図１３に示す。単位表面当たりに固定化された複合体粒子の数は、生物特異的表面が減少すると、即ち複合体粒子を表面の中心に磁石の影響下で濃縮すると増加する。複合体粒子が反応することができる表面が小さいほど、濃度効果は大きい。
実施例７
ＨＧＭＳカラムでの中間媒体の濃厚化、及びそれに続く生物特異的な限定された有益な表面との関係における磁石の適用：溶液中の抗原（分析物）の量の影響、及び当該方法の感度の限界の評価
捕獲用の抗体又はリガンドを、６４又は０.５ｍｍ2の表面の活性化シリカとカップリングさせる。共役粒子（アッセイ当たり８×１０9）及び抗原（分析物）を種々の濃度（０〜５００ｎｇ／ｍｌ）にした１ｍｌでインキュベーションし、次いで複合体粒子をＨＧＭＳカラムで濃厚化する。機能化したプレート、即ち自身の受容体とカップリングしたものをついで図９ｂｉｓ及び１０に示されるようにして磁石上に配置し、精製済の溶液をインキュベーションし、次いでＡＦＭで分析する。
図１５により再び、生物特異的な有益な表面の大きさが、磁化による濃縮又は閉じ込めの効果に与える影響を明確に実証することが可能である。同じＴＳＨの濃度の場合、円で密度が示される大型の表面（６４ｍｍ2）と比較して、×で密度が示される小型表面（０.５ｍｍ2）ではかなり高密度な複合体粒子が実際に観察される。
０.５ｍｍ2の有益な表面上の濃度の場合の結果を図１４に示す。計算によれば、得られる平坦域は、予想される理論値と一致する（図７、曲線６ｂｉｓ）。検出限界は、上記のように（実施例６）、一般的に受け入れられている統計的方法により計算する。１０個のブランク（抗原なし）を調製し、その平均剛性（ＭR）及び標準偏差（ＳＤR）を計算する。検出感度（ＬＯＤ）は、ＬＯＤ＝ＭR＋３.ＳＤＲで定義する。この値を補正曲線のもとのものの勾配上にプロットする。５×１０-3ｐｇ／ｍｌの検出限界、即ち１.２×１０5分子のＴＳＨが計算される（表２）。
結果の比較
図１６は、同じグラフ上に実施例４及び７の結果を表したものであり、これにより図１０の構築物により提供される感度の改善を実証することが可能になる。また以下の表２は、一方においては場の勾配によるカラム上での磁気濃厚化により、他方においては場の勾配によるカラム上の中間媒体の磁気濃縮化と小型の生物特異的表面上の複合体粒子の磁気濃厚化との連結効果により、ＴＳＨの検出感度の改善を示すことが可能となる。
0004053092.tif 000003
比較として、免疫分析用自動装置で得られる検出限界は、場合により２−３ｐｇ／ｍｌのオーダーである。よって、本発明の方法を使用して、おおよそ１００〜１０００のファクターでの感受性の増加が得られる。
実施例８
金−抗−ＴＳＨ抗体の共役粒子の合成
以下の例は、本発明の方法を使用して、非磁性で異なる性質の支持体の粒子に応用することが可能であることを示すものである。
−コロイド状の金溶液。コロイド状の金（粒径：１５ｎｍ、ポリサイエンス、ＯＤ520＝０.５２４）の溶液のｐＨを、０.２ＭのＫ2ＣＯ3溶液で７.２に調節する。コロイド状の金を次いで０.１μｍの膜で濾過する。
−リガンド溶液。抗−ＴＳＨ抗体を２ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９.００）で透析し、次いで存在するかもしれない凝集物を除去するため、使用直前に０.１μｍの膜で濾過し、２８０ｎｍでアッセイする。
−蛋白質／金の共役粒子の合成。抗体溶液を金溶液へ攪拌しながら、コロイド状の金の単位ｍｌ当たり８μｇの濃度で加える。１０分間のインキュベーション後、１００μｇ／ｍｌの濃度の最終的な共役粒子を得るため、ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度のウシ血清アルブミン（BSA）を付加してコロイド安定化を確実にする。溶液を濾過し（０.１μｍ）、次いで過剰な抗体を除去するためにＭＷＣＯ＝３００，０００のカットオフの膜で精製する。共役粒子をＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０.５％媒体中に取り、濾過する。これらはアジ化ナトリウム（０.０５％）の存在下で４℃で保存するが、これらは数カ月間保存が可能である。アジ化ナトリウムの代りに使用時に無菌化濾過をしてもよい。
実施例９
コロイド状金で標識した共役粒子によるＴＳＨのサンドイッチアッセイ：中間媒体の遠心による濃厚化の有無による方法の比較
濃厚化なし
実施例１で得られるプレート上に、０から５０ｎｇ／ｍｌの増大する濃度でＴＳＨを含む、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０.５％溶液の７０μｌを置き、３７℃で１時間インキュベーションする。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄後、共役粒子の溶液（ＯＤ520nm＝１.４）の７０μｌを３７℃で１時間インキュベーションする。次いでプレートを洗浄、乾燥し、ＡＦＭで分析する。単位表面当たりの複合体粒子数を計測する。
遠心による濃厚化あり
上述の共役粒子（試薬）の合成後、１００μｌの共役粒子（ＯＤ520nm＝１.４）、及び６ｎｇのＴＳＨを、０.１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有したＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０.５％の０.１〜１０ｍｌの種々の容量中でインキュベーションする。得られる溶液を一晩、３７℃で攪拌しながらインキュベーションする。抗原（分析物）なしの対照を調製する。インキュベーション後、最終容量を２，３０μｌにするため、洗浄及び膜濾過（ＭＷＣＯ＝１００，０００）により溶液を濃厚化する。次いで、これを実施例１のプレート上に置く。３７℃で１時間インキュベーションする。洗浄と分析は、上述のように行う。
結果を図１７に示す。複合粒子を濃縮すると、同等のＴＳＨ濃度でも明らかに感度が改善されるのがわかる。
実施例１０
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のカップリングによる生物特異的支持体（他の支持体及び受容体）の製造
シリカ表面をスルホクロム酸で洗浄し（２時間、１２０℃）、アミノプロピルジメチルエトキシシラン（無水トルエン中で２％）により、室温で２時間シラン処理する。アミン官能基と共有結合を形成することが可能な無水マレイン酸コメチルビニルエーテル共重合体（ＭＡＶＥ、Ｍｎ＝２０，０００）を次いで、アミンを含有する表面にグラフトする。１０ｍｌ無水ＤＭＳＯ当たり１ｍｇのＭＡＶＥを含む溶液を使用直前に調製する。アミンを含有する表面をこの溶液に浸漬し、攪拌しながら室温で１時間、トリエチルアミン（１％ｖ／ｖ）存在下でインキュベーションする。これらを次いでＤＭＳＯで洗浄し、窒素で乾燥する。
捕獲ＯＤＮ（１７塩基）の溶液を０.１Ｍのホウ酸ナトリウム、０.５Ｍ  ＮａＣｌ（５％）／ＤＭＳＯ（９５％）混合物中で８μＭの濃度にして調製する。５０μｌの溶液をプレート上に配置して３７℃で１時間インキュベーションする。次いで支持体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄する。次ぎに、非特異的相互作用を防止するため、５０μｌのＰＥＧ溶液を表面に置き、３０分間インキュベーションする。表面をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄する。このような表面を以後、”生物特異的表面”と呼ぶ。
実施例１１
磁性粒子／ＯＤＮビオチン検出共役物の製造
実施例１１ａ
ストレプトアビジン（イミュニコン）でコートした磁性粒子を１００μｌ、ビオチン化検出ＯＤＮ（２１塩基）の溶液（８.３７ｐｍｏｌ／μｌ）１００μｌへ加える。この溶液を３７℃で攪拌しながら１時間インキュベーションする。過剰なＯＤＮは、磁化／希釈工程を３回連続して除去し、共役物を最終的に１００μｌのＰＥＧ緩衝液へ取る。
実施例１１ｂ
ストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（１０11粒子、即ち５×１０12分子のストレプトアビジン、Miltenyi Biotec）の１００μｌを、８塩基のスペーサー鎖を有するビオチン化検出ＯＤＮ（２８塩基）（４×１０13分子）の溶液へ加える。この溶液を３７℃で攪拌しながら１時間インキュベーションする。過剰なＯＤＮは、ＨＧＭＳ分離カラムにかけて除去し、次いで１００μｌにする。
このようにして得られる二つの試薬を以後、”検出共役物”と呼ぶ。
実施例１２
実施例１１ａの検出共役物によるＤＮＡ標的（分析物）の捕獲
実施例１１ａに記載される検出共役物の溶液２０μｌをＰＥＧ緩衝液で希釈する。捕獲及び検出ＯＤＮに対してそれぞれ相補的な配列を有する標的（３７塩基、８.２３×１０13コピー／μｌ）を、１ｍｌの全量に望まれる量で加える。混合物を攪拌しながら３７℃で２時間インキュベーションする。形成される複合体をそのまま使用する。
実施例１３
実施例１１ａの検出共役物を利用した、標的（分析物）の濃縮。磁石の存在の影響。
生物特異的支持体を二つ用意する。更に１０12コピー／ｍｌで含有する試料を二つ、実施例１１ａに記載されるようにして検出共役物存在下でインキュベーションする。容器の底部に生物特異的支持体を配置する。これらの容器のうち一つを、希土類からなる磁石（直径６ｍｍ、高さ６ｍｍ、Ｂ＝０.３２テスラ）の上に配置する。磁性粒子とハイブリダイズした標的を含む溶液を容器内に配置し、１０分ごとにピペッティングして攪拌しながら１時間インキュベーションする。インキュベーション後、支持体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、及び０.１Ｍの炭酸アンモニウム緩衝液中で洗浄し、乾燥しないうちにＡＦＭにより空気接触モードで分析する。
生物特異的表面における４×４μｍの有益なゾーンにおいては、磁石なしでμｍ2当たり０.３個の粒子が検出され、磁石ありではμｍ2当たり８６個の粒子が検出される。
磁石なしでは標的は実質的に検出されず、一方磁石ありの場合には単層の粒子が得られるが、これはシグナルの飽和に対応している。
実施例１４
実施例１１ａの検出共役物を利用した標的（分析物）の濃縮。検出限界の決定。
生物特異的支持体を複数個用意する。１ｍｌのＰＥＧ緩衝液中に、増大する濃度の標的（０〜８×１０12標的／ｍｌ）を含むものを調製する。実施例１１ａに記載される検出共役物によるＤＮＡ標的の捕獲を、実施例１２のようにして行う。インキュベーション後、生物特異的支持体を、３７℃のインキュベーション温度で、実施例１２に記載される磁石上に配置する。検出共役物とハイブリダイズした標的を含む溶液１００μｌを、生物特異的支持体にかける。この溶液を３分間インキュベーションし、次いで上清を除去する。再び１００μｌをかけ、次いで粒子を再懸濁するために、滴下物（drop）をピペッティングして攪拌する。このプロトコールを繰り返して、溶液全てを支持体上に濃縮させる（１０×１００μｌ）。インキュベーション後、表面をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、及び０.１Ｍ炭酸アンモニウム緩衝液で洗浄し、乾燥しないうちにＡＦＭにより空気接触モードで分析する。粒子の密度は、最大磁化ゾーン内で測定する。画像上における粒子のカバーリングレベルは、画像プロセスソフトを使用して決定する。
感度の限界は、７×１０8標的／ｍｌ、即ち遠心することなく同じ支持体上で行うＥＬＯＳＡ（Enzym Linked Oligo Sorbent Assay）の通常の酵素テストにおけるＤＮＡ標的（８×１０10標的／ｍｌ）と比較すると１００倍の増加と見積もられる。
実施例１５
実施例１１ｂの検出共役物を利用した、標的（分析物）の濃縮。検出限界の決定。
実施例１１ｂに記載される検出共役物の溶液５０μｌを、ＰＥＧ緩衝液で希釈する。捕獲及び検出ＯＤＮにそれぞれ相補的な配列を有する標的（３７塩基）を、１ｍｌの全量に望ましい量で加える。この混合物を３７℃で一晩、攪拌しながらインキュベーションする。検出共役物−標的の複合体を次いで、最終容量を１００μｌにするために、実施例３に記載されるＨＧＭＳ分離カラムで精製する。
生物特異的支持体を複数用意する。これらを、実施例１３に記載される磁石上に３７℃のインキュベーション温度で配置する。検出共役物−標的の複合体の溶液を、１０分ごとにピペッティングして攪拌しながら３０分間インキュベーションする。インキュベーション後、表面をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで０.１ｍの炭酸アンモニウム緩衝液で洗浄し、乾燥しないうちにＡＦＭにより空気接触モードで分析する。
検出限界は、３×１０9コピー／ｍｌ、即ち遠心なしで同じ支持体で行うＥＬＯＳＡテストと比較して３０倍の増加と見積もられる。
実施例１６
表面での試薬の連続的インキュベーションに関しての、溶液内濃縮システムの比較
アッセイ１：標的を実施例１５に記載される溶液内で捕獲する。
アッセイ２：生物特異的支持体の調製後、１００μｌの標的溶液（０〜８×１０13標的／ｍｌ）を支持体（粒子）上でインキュベーションし、次いでこれをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄する。次ぎに、ビオチン化したＯＤＮの溶液１００μｌ（ＰＥＧ中に０.５μＭ）をインキュベーションする。最後に支持体を、実施例１３に記載される円筒状の磁石上に配置し、ストレプトアビジンでコートされた磁性粒子であって且つＰＥＧ緩衝液で二分の一に希釈された商業的に入手可能な溶液（Miltenyi Biotech）１００μｌを、１０分ごとに攪拌しながら３０分間インキュベーションする。
表面での連続システムにおける検出限界は、７.６×１０10標的／ｍｌと見積もられ、一方溶液内でのアッセイにおけるものは、実施例１５において３×１０9コピー/ｍｌと見積もられる。従って、標的のインキュベーション、及び溶液内の共役物のインキュベーションに関連しての増大ファクターは２５である。
実施例１７
磁性共役物の濃縮を利用したフロースルーセルの利点
このアッセイは、図２３及び２４に示される本発明を実施する別の方法を例示する。
ビオチン化した（陽性対照）又はビオチン化していない（陰性対照）抗−フェリチン抗体を、シリカ表面において、０.２μｌ／ｍｌの濃度で吸着させて生物特異的支持体を調製する。
アッセイ１：これらの支持体を、直径が０.５ｍｍであり先端が切り詰められた円錐を先端部に載せた上述の円筒状の磁石を含むセル内に配置する。ストレプトアビジン（Miltenyi Biotech）でコートされた３０μｌの磁性粒子を含み、１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ緩衝液で希釈された溶液（０.１ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれの支持体へ０.０１７ｍｌ／分の流速で注入する。このインキュベーション後、支持体を洗浄、乾燥し、ＡＦＭで分析する。
アッセイ２：平行して、セル外にあるこれら同じ生物的支持体でアッセイを行う。それぞれの支持体を、上に定義した円筒状の磁石上に配置する。ストレプトアビジン（Miltenyi Biotech）でコートされた３０μｌの磁性粒子を含み、６０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡ緩衝液で希釈された溶液を調製し、支持体上に配置し、次いで１０分ごとに攪拌しながら３０分間インキュベーションする。このインキュベーション後、支持体を洗浄、乾燥し、ＡＦＭにより分析して、粒子を覆うレベルを評価する。
ｉ）特定のシグナル（アッセイ１に対しては９７＋／−３、アッセイ２に対して６３＋／−１６）、及びii）シグナル／ノイズ比（アッセイ１に対しては１３９、アッセイ２に対しては３１）が、フロースルーセルを使用している時には顕著に改善されることが観察される。
まとめると、上に記載した実施例は本発明の一般的方法を具体化するものである。実施例７は、本発明により５ｆｇ／ｍｌもの低レベルのＴＳＨの分析物濃度、即ち１.２×１０5分子をも検出することが可能であることを示す。一の細菌には約１０4〜１０5分子のリボソームＲＮＡがある。実施例１０乃至１６は、同一又は異なった実行方法をＤＮＡ標的の検出に使用することが可能であることを示す。よって、同じタイプのもので実行すると、単位容量当たり１乃至１０の細菌を検出することが可能であることがわかる。核酸物質に適用される上記の濃縮方法に関連させると、本発明の方法の分析感度は従ってＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ等の増幅方法のものと同じオーダーである。
本発明の態様は、限定することなく数多くあり、その二三の例を挙げることができる：
本発明は、図１８に記載される方法例に従って、競合によるハプテンのアッセイに適用することができる。ハプテンは限られた表面上に固定される。アッセイ用のハプテン含有溶液（分析物）を、実施例３に記載される一のみの抗−ハプテン抗体（受容体）を有する共役粒子と、複合体粒子が形成されるのに十分な時間接触して配置する。複合体粒子を上述の方法のひとつにより分離し、受容体ハプテンを有する有益な表面上に濃縮する。予め溶液内でハプテンと反応させておいた共役粒子は、結合することができず、洗浄により除去される。反応させず、利用可能な抗体を有している共役粒子は、対照的に、上述の生物特異的な有益な表面の受容体ハプテンと反応し、上述の種々の方法のうち一つにより検出される。検出される共役粒子の数は、溶液内のハプテン濃度が増大すると図１９の理論曲線上に表現されるようにして減少する。
US-C-５，５４３，２８９又はUS-C-５，１６９，７５４の資料に記載されるように、細胞を磁性ソーティングにより溶液中より分離することができる。この操作に従えば、複合体粒子の生産を許容するものと同一の又は異なる受容体により、例えば図１０に記載される方法により、標識した分析物（細胞、酵母、細菌、ウイルス、又はファージ）を濃縮し、それを小型の生物特異的表面上に保持することが可能である。決定（検出及び／又は定量）は、例えば内因性又は外因性の蛍光標識、顕微鏡法等のいかなる適切な方法によっても行うことができるが、これには分離及び濃縮に供された粒子を使用することによる検出が含まれる。
特定の態様、特に同じ限定された表面で異なる親和性（多親和性）を有する複数のリガンドを結合し、及び／又は共役粒子を所望の位置で濃縮するようにしたものにより、本発明をマルチプルな検出に適用することが可能になる。一例が図２０に描かれているが、この場合、有益な表面は、それぞれが異なり、且つ３つの同定された地理的位置に配置される受容体を具備する３つの有益ゾーンＡ,Ｂ,及びＣを具備している。図２１に記載されるように特定の実行方法を使用し、共役粒子をその特定の受容体上に固定する。この方法は、内部で複合体粒子５の形成が起こる仕切１５を具備する装置１４を含む。この仕切は、機械的攪拌用のシステムを具備していてもよく、あるいは使用する粒子が磁石の場合には、磁場攪拌システムであってもよい。複合体粒子の形成に必要な十分な時間の後、これらをチャンネル１６経由で表面１７（単一、又は多親和性）と接触させる。高さの低いチャンネル１６は、当該表面の上側の溶液の高さを限定することを目的としていて、従って特異的受容体により捕獲される前に複合体粒子が移動しなくてはならない距離を限定している。複合体粒子／受容体反応の確率は、有益には限られた表面に溶液を再循環させることにより改善することが可能である。この装置には、ある位置からつぎの位置へ移動する（例えばゾーンＡからゾーンＢ、そしてゾーンＣへ）磁石１２の使用が記載されている。他の変形例によれば、単一の磁石は全表面を占領し、又は複数の磁石はそれぞれがゾーンＡ，Ｂ，又はＣに向いているが、これを除き本発明の方法を変更している。記載される装置は結果として分析物の多検出、又はライブラリー（例えばファージライブラリー）のスクリーニング用に使用することができる。
上記の装置は、ミクロ技術由来の技術により使用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６ｂｉｓ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９ｂｉｓ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１４ｂｉｓ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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