(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する微生物由来の酵素であって、前記微生物はアスペルギルス・フミガタスであり、かつ下記（ａ）−（ｄ）の性質により特定される酵素。
（ａ）  至適ｐＨ：ｐＨ２．５−３．０
（ｂ）  分子量：４７ｋＤａ
（ｃ）  ｐＨ安定性：ｐＨ３−８で安定
（ｄ）  温度安定性：５０℃以下で安定
【請求項２】
配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有し、β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有するポリペプチドからなるポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるポリペプチド。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｆ）から選択されるポリヌクレオチドからなり、かつ、β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｅ）上記（ｃ）又は（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、
（ｆ）上記（ｃ）又は（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、
【請求項５】
配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターを導入させた形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を栄養培地に培養し、β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する酵素を生産せしめ、培養物より該酵素を採取することからなるβ−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する酵素の製造法。
【請求項９】
アスペルギルス・フミガタスを栄養培地に培養し、β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する酵素を生産せしめ、培養物より該酵素を採取することからなる請求項１に記載の酵素の製造法。
【請求項１０】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）に属する微生物を栄養培地に培養し、β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する酵素を生産せしめ、培養物より該酵素を採取することからなるβ−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する酵素の製造法。
【請求項１１】
栄養培地が、二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する作用を有する酵素の生産を誘導する、イソマルトース、マルトトリオース、マルトース、ゲントース、ゲンチビオース、ゲンチオリゴ糖、スクロース、トレハロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、ソルボース、マルチトール、アラビトール、ガラクチトール、又はエンサングルコサミンから選ばれる誘導物質を含有する請求項８〜１０のいずれかに記載のβ−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する酵素を含有する酵素組成物の製造法。
【請求項１２】
β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体を含有する材料に、請求項１記載の酵素を作用せしめることを特徴とする、当該材料の成分組成の改変法。
【請求項１３】
β−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体が香気成分前駆体又は色素成分前駆体である請求項１２記載の改変法。
【請求項１４】
アセチルグルコシド、又はマロニルグルコシドから選ばれるＯ−グリコシド修飾単糖配糖体を含有する材料に、当該修飾単糖配糖体より修飾単糖を遊離する作用を有する請求項１記載の酵素、又はペニシリウム・マルチカラー由来のβ−プリメベロシド、及び、それに類似するアグリコン側にグルコースを有するＯ−グリコシド二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する酵素を作用せしめることを特徴とする、当該材料の成分組成の改変法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、二糖配糖体、特にβ−プリメベロシド及び／又はその類似体、を二糖単位で切断する作用を有する酵素活性を含有する微生物由来の新規な酵素、当該酵素の製造方法、当該酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを導入した形質転換体、並びに当該酵素を用いた用途に関する。
背景技術
植物の香気成分であるゲラニオール、リナロール、ベンジルアルコール、２−フェニルアルコールやＣ１３−ノルテルペノイドアルコールなどのアルコール系香気は花、茶、果物、ワインなどの香気生成に重要な働きをなしている。
これらの香気成分のなかで、ベンジルアルコールや（Ｚ）−３−ヘキセノールの香気前駆体としてはβ−Ｄ−グルコピラノシド等の単糖配糖体が単離同定されている。
最近になって、花のような香気について重要な働きを果たすと考えられる、ゲラニオールやリナロール等のアルコール系香気前駆体として二糖配糖体のβ−プリメベロシド（β−ｐｒｉｍｅｖｅｒｏｓｉｄｅ、６−Ｏ−β−Ｄ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）あるいはその類似体の存在が確認された。また、その他の前述した他のアルコール系香気成分の前駆体としても二糖配糖体のβ−プリメベロシドとその類似体の存在が明らかになってきている。
さらに香気以外にも色素、薬理成分など生理活性物質の一部においても二糖配糖体β−プリメベロシドあるいはその類似体として存在していることが明らかになってきている。例えばソテツなどのマクロザミンはβ−プリメベロシダーゼによって二糖単位で切断され毒素が生成することが知られている。
一方、これらの香気成分や生理活性成分の前駆体に作用して二糖単位で切断する作用を有する酵素は茶葉などよりわずかに確認されているのみであり（特開平８−１４０６７５）、その利用に関してはほとんど研究されていない状況であった。最近になってからこれら二糖配糖体並びのその類似体が、従来知られていたグルコシダーゼでは十分にアグリコンが遊離されないことがわかり、本酵素の産業的利用が注目され始めている。従って、従来の茶葉などの給源に頼ることなく、工業的に大量に、更に安価に生産する方法の開発が強く望まれていた。
発明の開示
本発明者らは上記問題点を解決すべく微生物にその給源を求めて鋭意研究を行った。すなわち、上述のような作用を有する酵素を生産する微生物を広く自然界に求めスクリーニングを重ねた結果、β−プリメベロシド等の二糖配糖体の糖部分を二糖単位で切断する作用を有する酵素生産能を有する発酵培養法に適した微生物を見い出し、該酵素を単離精製し、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。さらに、糸状菌、酵母、細菌、放線菌等の多数の微生物に上述のような作用を有する酵素を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、二糖配糖体、特にβ−プリメベロシド及び／又はその類似体、を二糖単位で切断する作用を有する酵素活性を含有する微生物由来の新規な酵素、当該酵素の製造方法、当該酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを導入した形質転換体、並びに当該酵素を用いた用途に関する。
本発明の酵素は、既存のグルコシダーゼが基質として利用しがたい二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有することで特徴付けられる。本明細書においては、上記の活性を有する酵素を「ジグリコシダーゼ」と呼ぶ。本発明のジグリコシダーゼは、二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性のみならず、単糖配糖体のグリコシド結合を切断する活性も保持しており、さらには、既存のグルコシダーゼが基質として利用しがたい修飾単糖配糖体（例えば、アセチルグルコシド、マロニルグルコシド、メチルグルコシド、ホスホグルコシド、アミドグルコシド等）のグリコシド結合を切断する活性も有している。
本発明による、二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する微生物由来の酵素は、その理化学的性質や遺伝子配列の相同性から植物由来の酵素とは異なるものである。
次いで本発明について詳細に説明する。
なお、本発明において各種酵素活性測定は特に記載しないかぎり、以下に記載する方法により行った値で表示する。
▲１▼  二糖配糖体分解活性
活性の測定は自動化学分析装置（東芝社製、ＴＢＡ−３０Ｒ）を用いて行った。酵素サンプル３０μｌと二糖配糖体基質としてパラニトロフェニル（ｐＮＰ）プリメベロシドを２ｍＭに酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解せしめたもの２００μｌと混合し、４０℃、サイクルタイム２２．５ｓｅｃ．で９．７５分間反応させた後、炭酸ナトリウム２５０μｌを加え４１２ｎｍの吸光度を測定した。サンプル由来のブランクの測定は基質溶液の代わりに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて同様に測定した。
この条件下で吸光度を１上昇させる酵素量を１単位とした。
ここで用いたｐＮＰ−プリメベロシドは、例えばｐＮＰ−グルコシド（メルク社製）とキシロオリゴ糖（和光純薬社製）を酵素キシロシダーゼ（シグマ社製）を用いて反応させ、ｐＮＰ−グルコシドにキシロースをβ−１，６結合で１残基転移させることにより合成できる。
▲２▼  β−グルコシダーゼ活性
活性の測定は自動化学分析装置（東芝社製、ＴＢＡ−３０Ｒ）を用いて行った。酵素サンプル１０μｌと基質としてパラニトロフェニル（ｐＮＰ）グルコシド（メルク社製）を２ｍＭに酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解せしめたもの２００μｌと混合し、４０℃、サイクルタイム２２．５ｓｅｃ．で反応させた後、炭酸ナトリウム２５０μｌを加え４１２ｎｍの吸光度を測定した。サンプル由来のブランクの測定は基質溶液の代わりに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて同様に測定した。
この条件下で吸光度を１上昇させる酵素量を１単位とした。
本発明者らは、ジグリコシダーゼ生産能を有する微生物を得るため、広く自然界に給源を求め自然界から分離した数種の菌株が当該作用を有する酵素を生産することを見いだした。β−プリメベロシドに類似する二糖配糖体とは、アグリコン側にグルコースを有する二糖類であり、例えば、アピオフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、アラビノフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド等が挙げられる。
本発明のジグリコシダーゼを生産する微生物は、例えば以下のようにしてスクリーニングすることができる。即ち、土壌の懸濁液を、オイゲニルプリメベロシド等を唯一の炭素源として含有する分離用液体培地に接種することにより集積培養を行い、その培養液を同様の分離用平板寒天培地に塗布して、生育したコロニーを選択して拾う。これらの菌株を適当な液体培地で培養して、ｐＮＰ−プリメベロシド等から二糖を切り出し、ｐＮＰ遊離活性を有する菌株を選択することができる。
このようにして選択された菌株について、更にｐＮＰ−プリメベロシド等を基質として二糖遊離を指標としてジグリコシダーゼ産生微生物をスクリーニングすることができる。
本発明者らが分離した主な菌株について、その菌学的性質を、下記の▲１▼〜▲３▼の文献を参考にして同定した。
文献：
▲１▼Ｒａｐｅｒ，Ｋ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｅｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｉ．１９６５．”Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ”，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．
▲２▼Ｋｏｚａｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ．１９８９．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｎ  ｓｔｏｒｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｐｅｒｓ，Ｎｏ．１６１，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．
▲３▼Ａｌ−Ｍｕｓａｌｌａｍ，Ａ．１９８０．”Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｃｋ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ”，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，
以下、菌学的性質を記載する。
菌株Ａの同定
生育状態
▲１▼生育状態
・ツァペック寒天培地
コロニーの大きさは直径４８〜５０ｍｍ（２５℃、７日）、表面はビロード状〜粉状、菌糸は白色、分生子の形成はやや悪い、暗緑色（ｄｕｌｌ  ｇｒｅｅｎ）〜灰緑色（ｇｒａｙｉｓｈ  ｇｒｅｅｎ）、裏面は薄黄茶（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｂｒｏｗｎ）〜茶色（ｂｒｏｗｎ）。・麦芽エキス寒天培地
コロニーの大きさは直径７８〜８０ｍｍ（２５℃、７日）、表面はビロード状〜粉状、菌糸は白色、分生子の形成は非常に良好、暗緑色（ｄｕｌｌ  ｇｒｅｅｎ）〜灰緑色（ｇｒａｙｉｓｈ  ｇｒｅｅｎ）、裏面は無色〜黄白色（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｗｈｉｔｅ）。３７℃（３日）でのコロニーの大きさは直径７３〜７５ｍｍ。４５℃でもよく生育する。
▲２▼形態
・分生子頭：
密な円筒状、長さ４８〜１２８μｍ、直径１６〜５２μｍ、暗緑色（ｄｕｌｌ  ｇｒｅｅｎ）〜灰緑色（ｇｒａｙｉｓｈ  ｇｒｅｅｎ）。
・分生子柄：
基生菌糸より生じる、長さ１２５〜８００μｍ（多くは５００μｍ以下）、直径５〜１０μｍ、まっすぐ〜わずかに湾曲する、滑面。
・頂のう：
直径１０〜２５μｍ、フラスコ形、上部２／３にフィアライドを形成する      。
・メトレ：
形成しない。
・フィアライド：
５．６〜１２×２．４〜３．２μｍ
・分生子：
直径２．６〜３．６μｍ、球形〜亜球形、粗面。
・子のう胞子：
形成しない。
以上の結果より菌株Ａは、分生子形成細胞が単列（メトレを形成しない）、分生子頭が円筒状で暗緑色〜灰緑色、分生子が球形、子のう胞子を形成しないことから、アスペルギルス  フミガタスグループに属する。更に、分生子頭が密な円筒状で、しかもうなずくような形（ｎｏｄｄｉｎｇ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）にならない、分生子が粗面、多くの分生子柄が５００μｍ以下であることから、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）である。
菌株Ｂ、菌株Ｃ及び菌株Ｄの同定
▲１▼  生育状態
0004070177.tif 000002
▲２▼  形態（ツァペック寒天培地）
0004070177.tif 000003
以上の結果より菌株Ｂ、菌株Ｃ及び菌株Ｄは共に分生子形成細胞が複列（メトレとフィアライドを形成する）、分生子頭が球形で黒色系であることなどから、アスペルギルス  ニガーグループに属する。更に、ツァペック寒天培地でコロニーの直径が１４日で５ｃｍ以上になる、分生子の表面が粗面（ｖｅｒｒｕｃｏｓｅ）である、分生子が６μｍ以下で球形〜亜球形、暗灰褐色〜黒褐色である、分生子柄が６μｍ以下であることなどから、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ｖａｒ．ｎｉｇｅｒである。
更に本発明者らは、タイプカルチャーよりアスペルギルス属に属する菌株をランダムに選択してその菌株によるジグリコシダーゼの生産能を確認した。その結果、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＩＦＯ４４０７、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＩＡＭ２０２０、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＩＡＭ２０４６等にもその生産能が確認された。また、その他の様々な微生物においてもジグリコシダーゼ産生能のスクリーニングを行った。その結果、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属等の様々な微生物にジグリコシダーゼ活性を確認した。
本発明において利用できる菌種は、ジグリコシダーゼ産生能を有する菌種であれば何れも使用することができ、上述した菌種に限定されない。更に、本発明において利用できる生産方法としては、ジグリコシダーゼ生産能を有する菌種の突然変異株、あるいは組換えＤＮＡ法によりジグリコシダーゼを生産できるように改変された各種微生物、或いは各種細胞（例えば、酵母細胞、細菌細胞、高等植物細胞、動物細胞等）をも包含し、特に、ジグリコシダーゼを高生産できるように改変されたものが好ましい。ジグリコシダーゼ遺伝子を導入することで、ジグリコシダーゼ生産能を付与する場合にはホストとなる微生物にはジグリコシダーゼ生産能がなくてもよい。
上述した各種微生物などを用いてジグリコシダーゼを製造するためには、当該微生物の培養に適合した方法や条件を設定でき、これらの方法や条件は特に限定されない。例えば、上述した各種菌種の培養法としては液体培養、固体培養の何れでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養としては例えば、以下のようにして行うことができる。
使用できる培地としては、ジグリコシダーゼを生産する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。更に、ジグリコシダーゼを生産蓄積せしめるために培地に各種の誘導物質を添加することができる。誘導物質としては例えば糖類が使用でき、好ましくはゲントース（例えば、ゲントース＃８０、日本食品化工（株））、ゲンチビオース、ゲンチオリゴ糖（例えば、ゲンチオリゴ等、和光純薬工業（株））等が利用できる。これらの誘導物質の添加量は目的とするジグリコシダーゼの生産能が増大される量であれば特に限定されないが、好ましくは０．０１〜５％が添加される。
培地のｐＨは例えば約３〜８、好ましくは約５〜６程度に調製し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約３０℃程度で、１〜１５日間、好ましくは４〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。しかしながら、上述した各種の培養条件などは当然のことながら、培養する対象である微生物や細胞により適宜変更され、本発明のジグリコシダーゼが生産される条件であれば、その条件等は限定されない。
得られた培養液からジグリコシダーゼを単離精製するには、遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを組み合わせ、常法により処理して、精製したジグリコシダーゼを得ることができる。
本発明の酵素組成物は上述の微生物を培養した培養液そのままでも利用できる。もちろん本培養液は本発明の使用目的に応じてその精製度合いを適宜変更することができる。
以下、本発明の二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する微生物由来の酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターを導入した形質転換体、および、該形質転換体を用いて該酵素を製造する方法についてさらに説明する。
本発明の二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有する微生物由来の酵素としては、上述した製造法で得られるすべての酵素が含まれるが、特に、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、さらに、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましい。
本発明の酵素をコードする遺伝子としては、該酵素を産生する微生物から該遺伝子のクローニングによって取得することができる遺伝子や該遺伝子に相同性を有する遺伝子があげられる。相同性としては、少なくとも５０％以上の相同性を有する遺伝子、好ましくは８０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子をあげることができる。本発明の酵素をコードする遺伝子としては以下のようなポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が好ましい。
下記（ａ）〜（ｇ）から選択されるポリヌクレオチドからなり、かつ、二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド、
（ｇ）上記（ａ）〜（ｆ）の少なくともいずれか１つに記載のポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチド。
本発明の酵素をコードする遺伝子は、上述した本発明の酵素を産生する微生物から、例えば以下に記載するような方法で該遺伝子のクローニングを行うことによって取得することができる。まず、本発明の酵素を産生する微生物から上述の方法によって本発明の酵素を単離、精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。
部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製した酵素を直接常法に従ってエドマン分解法〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２５６巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン−シーケンサ４７６Ａ、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製等〕に供してもよいし、あるいはタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報を基に、本発明の酵素をコードする遺伝子をクローニングする。一般的に、ＰＣＲを用いる方法あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニングを行うことができる。
ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、モレキュラー  クローニング、ア  ラボラトリー  マニュアル〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）他著、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行〕に記載の方法を用いることができる。
また、ＰＣＲ法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。
まず、本発明の酵素を産生する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。ＰＣＲ法は、ＰＣＲテクノロジー〔ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）ＨＡ編集、ストックトンプレス社（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に本発明の酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の本発明の酵素遺伝子の一部を取得することができる。もちろん得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイゼーション法等を行うことによって本発明の酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
下記の実施例ではアスペルギルス  フミガタスＩＡＭ２０４６を用い、ＰＣＲ法を利用して、本発明の酵素をコードする遺伝子を決定した。アスペルギルス  フミガタス由来の本発明の酵素をコードする遺伝子の全塩基配列は、配列番号７に記載したものであり、これによってコードされるアミノ酸配列は配列番号８に記載したものであると決定された。なお、配列番号８に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号７に記載したもの以外に無数に存在するが、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。
配列番号８に記載のアミノ酸配列や配列番号７に記載の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる（参考文献：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第６０（１）巻、第１１５−１２７頁（１９８７））。
また、本発明の本発明の酵素遺伝子は、配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや該ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、該ポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチドもそれらがコードするポリペプチドが本発明の酵素活性を有する限り本発明に含まれる。
ここでいう「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。６×ＳＳＣ、１．０％ブロッキング剤、０．１％Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム、０．０２％ＳＤＳ。
アスペルギルス  フミガタスＩＡＭ２０４６を用いて全塩基配列が明らかにされた本発明の酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、他の本発明の酵素を産生する微生物のゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから、配列表７の本発明の酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することができる。
ハイブリダイゼーションは、上記に示したストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、本発明の酵素を産生する微生物から得たゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐあるいはジゴキシゲニンでラベルした各プローブを加えて、６８℃で一晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えたり、ハイブリダイズの温度を下げる（例えば４５℃）ことによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からＰＣＲ反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
得られた遺伝子が目的の本発明の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の本発明の酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較し、その遺伝子構造及び相同性から推定することもできる。また、得られた遺伝子のポリペプチドを製造し、本発明の酵素活性を測定することにより、目的の本発明の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうか確認することができる。
本発明の酵素遺伝子を用いて、本発明の酵素活性を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便宜である。
まず、目的の本発明の酵素遺伝子を含むベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、本発明の酵素活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
また、宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレップトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属等の細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属等の糸状菌が挙げられる．動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる。
発現の確認や発現産物の確認は、本発明の酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、本発明の酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
形質転換体の培養物から本発明の酵素を精製するには上述のように、遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことができる。
また、本発明により本発明の酵素の一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然の本発明の酵素のアミノ酸配列中に、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能である。これにより、本発明の酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ、基質特異性等の性質が少し異なった本発明の酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれら本発明の酵素を製造することが可能となる。
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、ＤＮＡを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザＵＳＡ、第７９巻、第１４０８〜１４１２頁（１９８２）〕、生化学的方法として、〔α−Ｓ〕ｄＮＴＰ存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第６４巻、第３１３〜３１９頁（１９８８）〕、ＰＣＲを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてＰＣＲを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２２４巻、第３４７〜３５３頁（１９９５）〕等を用いることができる。
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド  デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第２４号、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔アナリティカル  バイオケミストリー、第２００巻、第８１〜８８頁（１９９２）、ジーン、第１０２巻、第６７〜７０頁（１９９１）〕、ｄｕｔ（ｄＵＴＰａｓｅ）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザＵＳＡ、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９８５）〕、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド−ダイレクティッド  デュアル  アンバー（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｕａｌ  Ａｍｂｅｒ：ＯＤＡ）法、ジーン、第１５２巻、第２７１〜２７５頁（１９９５）、特開平７−２８９２６２号公報〕、ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平８−７０８７４号公報）、ＤＮＡ鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平８−１４０６８５号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法（ＵＳＰ５，５１２，４６３）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖ＤＮＡベクターと２種類のプライマーを用いたＰＣＲによる方法〔ジーン、第１０３巻、第７３〜７７頁（１９９１）〕、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法〔国際公開ＷＯ９８／０２５３５号公報〕等を用いることができる。
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップド  デュプレックス法を用いたＭｕｔａｎ（登録商標）−Ｇ（宝酒造社製）、クンケル法を用いたＭｕｔａｎ（登録商標）−Ｋ（宝酒造社製）、ＯＤＡ法を用いたＭｕｔａｎ（登録商標）−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス  フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼを用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ〔ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕等を用いることができ、また、ＰＣＲ法を利用するキットとして、ＴａＫａＲａ  ＬＡＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造社製）等を用いることができる。
このように、本発明により、本発明の酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、本発明の酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。
なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み込まれるものである。
次いで、本発明の酵素組成物を用いた各種の用途について述べる。
ジグリコシダーゼは、各種成分、例えば植物材料の香気、色、生理活性含有量等を増強したり、これらの成分の抽出効率を調節することに使用できる。従って、より香気の高い食物、飲料やより香りの高いスパイスや香料、香水などの製造に利用でき、更に前述の製造時における処理において適宜利用することにより、好ましくない香りの早期放出にも使用できる。また、色に関しては植物材料、食物、飲料の色合い改善、発色、あるいは色素の製造に利用できる。
更には、香気成分と同様に、品質上好ましくない色素前駆体の分解除去にも使用でき、生理活性に関しては生薬、ハーブ、その他植物性成分の薬理成分や有用生理活性成分の増強やあるいは好ましくない成分の分解除去に使用できる。
即ち、各種の二糖配糖体成分に本発明のジグリコシダーゼを作用させることによって前述の作用をもたらすことが可能である。
さらに、本発明のジグリコシダーゼを上記生理活性物質等と混合して投与する、あるいは、混合せずに同時または短時間の間隔で投与することにより、生理活性物質等のより効率的な体内吸収が可能になる。
本発明の対象とする二糖配糖体を含有する物としては、ジグリコシダーゼの作用を受けるものであればいかなるものであってもよく、例えば、食品、化粧品、医薬品、医薬部外品、農薬、飼料等であり、より具体的には各種香気を有する食品、トイレタリー製品、木工製品や畳などの植物性材料から作られる工業製品などの製造にも利用できる。
本発明のジグリコシダーゼが好ましく利用される対象としては、香気成分を有する食品が挙げられる。具体的に述べるとウーロン茶、ジャスミン茶等の製造において、例えば「萎調」の工程で使用したり、紅茶（ＣＴＣ法によるティーパック用紅茶など）の香気増強、ワインの香気増強に利用できる。また、化粧品の香気保持や香水の香気保持、医薬品における香気の改善や薬理効果の改善にも利用できる。
更に、色素の製造においても有用である。例えば、西洋茜からのルベリトリン酸からの染料アリザリンの抽出に用いることによって、従来よりも効率よく色素の抽出を行うことができる。
また、ジグリコシダーゼを利用して香気、色素、生理活性成分とプリメベロース等の二糖成分に作用させてその前駆体を製造することも可能である。これら成分は配糖化することにより安定性、保存性の改善や無毒化、薬理成分のＤＤＳ化も期待できる。
さらに、ジグリコシダーゼは既存のグルコシダーゼが基質として利用しがたいアセチルグルコシド、マロニルグルコシド、メチルグルコシド、ホスホグルコシド、アミドグルコシドといった修飾グルコシドを従来のグルコシダーゼより効率よく分解できる。この特性を利用して大豆中に含まれるイソフラボンのアセチルグルコシドやマロニルグルコシドをアグリコンフォームに変換させることにより、イソフラボンの吸収性や収率の改善を行える。
さらに、切り花等に本酵素溶液を吹きかけるか、あるいは、吸収させることで花の香りを増強させることも可能である。
ジグリコシダーゼの利用方法としては、その対象とするものの形態によりその添加方法、添加量、反応方法などを適宜変更することができる。
具体的な利用方法としては、香気前駆体を含有する植物抽出物あるいは醗酵産物に本発明のジグリコシダーゼを加えてインキュベートする。その条件は、本発明のジグリコシダーゼが香気、色素、生理活性成分前駆体に作用し香気、色素、生理活性成分を遊離できる条件であれば特に限定されないが、その条件については当業者が多大な労力を費やすことなく設定できる。この条件の基で、当該成分濃度を上昇させることができる。
また、本発明の酵素を植物中に存在する香気、色素、生理活性成分濃度の上昇にも利用できる。即ち、植物はこれら成分の前駆体を有しているため、植物に有効量の本発明のジグリコシダーゼを与え（遺伝子導入を含む）、当該植物中の前駆体が加水分解できる条件下で栽培することにより植物の香気、色素、生理活性成分を上昇させることができる。また、本発明の酵素組成物を利用することにより、対象となる植物中の香気、色素、生理活性成分等の生成時期を調節することができる。
なお、本発明のジグリコシダーゼの逆反応を利用することにより、各種配糖体の合成も可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。以下、本発明を実施例を用いて詳述するが本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に明記しない限り、本明細書において、％はｗ／ｖ％で示した。
実施例１
アスペルギルス  ニガーＩＦＯ４４０７ならびにアスペルギルス  ニガーＩＡＭ２０２０を前培養培地（組成；０．２％酵母エキス、０．５％ペプトン、２％グルコース、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．７）にて３０℃一晩振とう培養後、培養液を本培養培地（４％大豆粉、０．３％食塩、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％可溶性デンプン、１％赤ふすま、ｐＨ５．６）に１／１００量接種し６日間振とう培養し、培養液から菌体を除去して粗酵素液を得た。この酵素液について、ジグリコシダーゼ活性及びβ−グルコシダーゼ活性を測定した。
その結果、ＩＦＯ４４０７株でジグリコシダーゼ活性は０．１２９単位／ｍｌであり、β−グルコシダーゼ活性活性は４．３４単位／ｍＬ、またＩＡＭ２０２０株でジグリコシダーゼ活性は０．１５６単位／ｍｌであり、β−グルコシダーゼ活性は５．９７単位／ｍｌあった。
実施例２
実施例１に従って、アスペルギルス  フミガタスＩＡＭ２０４６株を同様に前培養し、培養液を本培養培地（２％大豆粉、０．３％食塩、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３％可溶性デンプン、０．５％ゲントース（日食社製）、ｐＨ５．６）に４日間培養し、粗酵素液を得た。その結果、ジグリコシダーゼ活性は０．１０６単位／ｍｌであり、β−グルコシダーゼ活性は０．３２０単位／ｍｌであった。
実施例３
アスペルギルス  フミガタスＩＡＭ２０４６株を用いてジグリコシダーゼ生産における誘導物質の影響について検討した。アスペルギルス  フミガタスＩＡＭ２０４６株を培地（２％大豆粉、０．３％食塩、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３％可溶性デンプン）に各種糖を０．１％加え６日間培養し、ジグリコシダーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。
0004070177.tif 000004
上記表より明らかなように、各種糖によりジグリコシダーゼの生産能が増大した。特にゲントース、ゲンチビオース、ゲンチオリゴ糖に特に高い誘導能が見られた。
更に、アスペルギルス  ニガーＩＦＯ４４０７及びアスペルギルス  ニガー  ＩＡＭ２０２０においても同様の効果が見られた。
実施例４
実施例１、２で得られた粗酵素液を分子量６，０００カットの限外ろ過膜で濃縮した。次いで、この濃縮液１ｍｌと２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で５ｍｇ／ｍｌに調製されたｐＮＰ−プリメベロシド溶液１ｍｌとを混合し、３７℃でインキュベートした。１、２、４、２４、４８時間後のサンプルをそれぞれ回収し、薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）にてプリメベロースの遊離を確認した。
その結果ＴＬＣで実施例１記載のアスペルギルス  ニガー２株及び実施例２記載のアスペルギルス  フミガタスの培養液のいずれにおいても二糖であるプリメベロースと同じ位置にスポットを観察できた。粗酵素濃縮液を熱処理（１００℃、１０分）し、同様の実験を行ったサンプルではこのようなスポットは観察されなかった。したがって、粗酵素濃縮液中にｐＮＰ−プリメベロシドからプリメベロースを二糖単位で遊離する酵素の存在が確認された。
実施例５
種々の微生物におけるジグリコシダーゼのスクリーニング
ａ）酵素サンプル調製法
スクリーニングを実施する微生物それぞれについて前培養、本培養を行った。液体培養の場合は得られた培養ブロスを１０，０００ｍｉｎ−１、１０ｍｉｎ．で遠心分離し、上清を酵素サンプルとした。固体培養の場合は、培養終了後の培地を水で抽出した浸液を酵素サンプルとした。
なお、細菌については菌体内酵素についても検討を行った。この場合は培養ブロスを遠心分離した後、沈殿として得られる菌体側を生理食塩水で洗浄し、菌体重量に対し１０倍量の１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁して超音波にて菌体を破砕した。その破砕液を１２，０００ｍｉｎ−１、２０ｍｉｎ．で遠心分離し、その上清を菌体内酵素サンプルとした。
培養に関する培地・培養条件を表１から表５に示した。
0004070177.tif 000005
上記組成を精製水に溶解し、１Ｍ塩酸、１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ５．７に調整した。培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
前培養  培養条件
振とう速度１４０ｍｉｎ−１、スラントより１エーゼ接種、１日以上培養、温度条件３０℃で培養した。酵母については温度条件を２５℃とした。
0004070177.tif 000006
上記組成を精製水に溶解し、１Ｍ塩酸、１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ５．６に調整した。培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
ゲントース＃８０の添加培地、不添加培地両方で培養を実施して検討した。
本培養  培養条件
振とう速度１４０ｍｉｎ−１、前培養ブロスより１ｍｌ接種、５日間培養、温度条件３０℃で培養した。酵母については温度条件を２５℃とした。
0004070177.tif 000007
上記組成を精製水に懸濁し、培地９ｍｌを培養試験管に分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
前培養  培養条件
振とう速度３００ｍｉｎ−１、スラントより１エーゼ接種、１から２日間培養、温度条件３０℃で培養した。
本培養  培地組成
フスマ５．０ｇを精製水１．５ｍｌに懸濁し、１００ｍｌ容三角フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
本培養  培養条件
前培養ブロスより１ｍｌ接種、３日間培養、温度条件３０℃で培養した。
抽出
水道水９０ｍｌを加え、８℃以下で一晩抽出する。
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上記組成を精製水に溶解し、培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
前培養  培養条件
振とう速度１４０ｍｉｎ−１、スラントより１エーゼ接種、１日以上培養、温度条件３０℃で培養した。
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上記組成を精製水に溶解し、１Ｍ塩酸、１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ７．０に調整した。培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
ゲントース＃８０の添加培地、不添加培地両方で培養を実施して検討した。
本培養  培養条件
振とう速度１４０ｍｉｎ−１、前培養ブロスより１ｍｌ接種、５日間培養、温度条件３０℃で培養した。
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上記組成を精製水に溶解し、培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
培養  培養条件
振とう速度１４０ｍｉｎ−１、スラントより１エーゼ接種、５日以上培養、温度条件２７℃で培養した。
0004070177.tif 000011
上記組成を精製水に溶解し、培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
本培養  培養条件
振とう速度１４０ｍｉｎ−１、前培養ブロスより１ｍｌ接種、６日間培養、温度条件２７℃で培養した。
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上記組成を精製水に溶解し、１Ｍ塩酸、１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ７．０に調整した。培地１０ｍｌを培養試験管に分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
前培養  培養条件
振とう速度３００ｍｉｎ−１、スラントより１エーゼ接種、２日間培養、温度条件３０℃で培養した。
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上記組成を精製水に溶解し、１Ｍ塩酸、１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ７．０に調整した。培地１０ｍｌを培養試験管に分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌して使用した。
本培養  培養条件
振とう速度１４０ｍｉｎ−１、前培養ブロスより１ｍｌ接種、１日間培養、温度条件３０℃で培養した。
ｂ）基質溶液調製法
ｐＮＰ−β−プリメベロシドを５ｍｇ／ｍｌとなるよう２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、これを基質溶液Ａとした。オイゲニル−β−プリメベロシドを１０ｍｇ／ｍｌとなるよう２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、これを基質溶液Ｂとした。
ｃ）酵素反応方法
基質溶液Ａをマイクロ遠沈管に１００μｌとり、酵素サンプル１００μｌを加え３７℃の恒温水槽中で９６時間酵素反応を行った。目的時間に達した後、１００℃、１０分間で本反応液を処理し、酵素反応を終了した。これを酵素反応終了液とした。
酵素サンプルの比較対照として、酵素反応前に酵素サンプルを１００℃、１０分間処理したサンプルも同様に反応を行った。酵素反応は基質溶液Ａ、基質溶液Ｂそれぞれについて実施した。基質溶液Ｂを用いる場合も、基質溶液Ａと同様に行った。
ｄ）薄層クロマトグラフィー
酵素反応終了液２０μｌをとりシリカゲルの薄層（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４［１．０５５５４］，メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）にスポットし、乾燥させた。これを酢酸エチル：酢酸：精製水＝３：１：１の割合で混合した展開溶媒にて２回展開した。展開終了後に薄層を風乾させた。
その後、硫酸：メタノール＝２０：８０の割合で混合した発色試薬を展開終了後の薄層全体に噴霧し、１０５℃、約１０分間の条件で発色させた。
発色後の薄層にプリメベロースのスポットが現れた酵素サンプルについて、プリメベロシダーゼが存在すると判定し、この生産菌をジグリコシダーゼ生産菌と判定した。
ｅ）ジグリコシダーゼ生産菌スクリーニング結果
以上の評価法によって見いだされたジグリコシダーゼ生産菌の一覧を表６示す。
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実施例６
アスペルギルス  フミガタス由来ジグリコシダーゼの精製
前培養としてブドウ糖ペプトン培地（酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、ブドウ糖２％、リン酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ５．７）にアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＩＡＭ２０４６を接種し、３０℃２４時間振盪培養した。前培養を本培地（ソーヤフラワー２％、塩化ナトリウム０．３％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、可溶性デンプン３％、ゲントース＃８０  １％、ｐＨ５．６）に１％接種し、３０℃、６日間振盪培養した。
濾紙ろ過により培養液から菌体を除き、ろ液８６００ｍｌを分子量６，０００カットの限外ろ過膜（ＡＩＰ−１０１０、旭化成製）で７１０ｍｌに濃縮した。濃縮液２００ｍｌを４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離し、上清１９２ｍｌに硫酸アンモニウム５５．９ｇ（５０％飽和）加え、４℃で一晩攪拌した。４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で得られた沈殿物を２０％飽和硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍｌに溶解し、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後の上清を回収した。この上清９．５ｍｌを、２０％飽和硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したフェニルセファロースカラム（１６ｘ１００ｍｍ、ファルマシア社製）に供し、２０％から０％の硫酸アンモニウム直線濃度勾配により吸着した蛋白質を遊離させた。活性ピークを回収し、１０ＤＧカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて２５ｍＭ  トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）にバッファー交換し、２５ｍＭ  トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）で平衡化した陰イオン交換Ｍｏｎｏ−Ｐカラム（５ｘ２００ｍｍ、ファルマシア社製）に供し、Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０、ファルマシア社製）で溶出し、ｐＨ８．３からｐＨ５．０のｐＨ直線濃度勾配により吸着した蛋白質を遊離させ、ジグリコシダーゼの精製酵素標品を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４７ｋＤａの単一バンドとして精製されていることが確認された。また、エンドグリコシダーゼＨ（ベーリンガーマンハイム（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ）社製）処理したところ、バンドの大きさの変化は確認されなかった。
実施例７
アスペルギルス  フミガタス由来のジグリコシダーゼの理化学的性質
至適ｐＨは以下のようにして測定した。２０ｍＭ第二クエン酸−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ２−５の各ｐＨに調製した２ｍＭ  ｐＮＰ−プリメベロシド溶液４００μｌを３７℃で５分間インキュベートした。次に酵素溶液９０μｌを加え３７℃で２０分間反応を行なった。０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５００μｌを加え反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定し活性測定を行なった。その結果、至適ｐＨは２．５−３．０であることが分かった。植物由来の同様の活性を有する酵素に比べｐＨ３というより低いｐＨで十分な化成を有することが分かった。
至適温度は以下のようにして測定した。２０ｍＭ第二クエン酸−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）で調製した２ｍＭ  ｐＮＰ−プリメベロシド溶液４００μｌに酵素溶液を９０μｌ加え３０−６５℃で２０分間反応を行なった。０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５００μｌを加え反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定し活性測定を行なった。植物由来の同様の酵素活性を有する酵素に比べ６０℃でも８０％の活性を有し、十分な活性が保持されていることが分かった。
ｐＨ安定性は以下のようにして測定した。ｐＨ２−５の第二クエン酸緩衝液、ｐＨ６−８のリン酸緩衝液、ｐＨ７−１０のグリシンＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液で精製酵素評品を１００倍希釈し３７℃で１時間処理した後、その９０μｌを２ｍＭ  ｐＮＰ−プリメベロシド溶液（ｐＨ２．５）４００μｌを３７℃で５分間インキュベートしたものに加え３７℃で２０分間反応を行なった。０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５００μｌを加え反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定し活性測定を行ない残存活性を求めた。その結果ｐＨ安定性はｐＨ８で１００％であり、ｐＨ３−８で安定であった。植物由来の類似の活性を有する酵素がｐＨ４−７で安定に比べ、より広いｐＨ範囲で安定である事が分かった。
熱安定性は精製評品を２０ｍＭグリシンＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８）で１００倍希釈し、３０−５５℃の各温度で１時間処理後、残存活性を測定し調べた。その結果、５０℃以下の温度で活性は安定であった。植物由来の類似の活性を有する酵素が４５℃以下で安定であるのに比べ、より広い温度範囲で安定である事が分かった。
他の微生物由来ジグリコシダーゼの理化学的特性
実施例５に示す同様の方法で産生を確認したジグリコシダーゼの理化学的特性を調べた。その結果、至適ｐＨは３−６、でｐＨ３以下で実用的な活性を有すること、至適温度は３０−６０℃で、６０℃以上でも実用的な活性を有すること、また、安定性においてはｐＨ３−８、５０℃以下で安定であることが分かった。このように、微生物由来ジグリコシダーゼは植物由来の類似の酵素に比べより広いｐＨと温度範囲で使用でき、しかも安定性に優れている。
実施例８
アスペルギルス  フミガタス由来のジグリコシダーゼをコードする遺伝子の単離  本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記載しない限り成書（例えば、モレキュラークローニング、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９８９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９））に従って行った。
ａ）染色体ＤＮＡの単離
ブドウ糖ペプトン培地（酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、ブドウ糖２％、リン酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ５．７）にアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｌｔｕｓ  ＩＡＭ２０４６）を接種し、３０℃、３日間振盪培養した。
Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ  Ｈｙｎｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ，８，１４３０−１４３９）の方法に従って、３００ｍｌのカルチャーから、１２．６ｍｇ／ｍｌの濃度の染色体ＤＮＡを０．２ｍｌ得た。
ｂ）部分アミノ酸配列決定実施例
実施例で得られたジグリコシダーゼの精製酵素標品をプロテインシークエンサー（ヒュレット  パッカード社製）に供し、配列番号１に示す２２残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に実施例で得られたジグリコシダーゼの精製酵素標品を還元カルボキシルメチル化後、リジルエンドペプチダーゼによる分解を行った。得られた分解物を逆相液体クロマトグラフィーに供し、分解されたペプチド画分の一つをプロテインシークエンサーに供し、配列番号２に示す２２残基の内部アミノ酸配列を決定した。
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ｃ）ＰＣＲによるＤＮＡプローブの作成
Ｎ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに、以下の４種の混合オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
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これらのプライマーとアスペルギルス  フミガタスの染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社）を用いてＰＣＲ反応を行った。
＜ＰＣＲ反応液＞
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得られた約０．２７ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐｕｃ１９（ＴＯＹＯＢＯ社）に、クローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見いだされた。本ＤＮＡ断片を遺伝子クローニングのためのＤＮＡプローブとした。
ｄ）遺伝子ライブラリーの作製
アスペルギルス  フミガタスよりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製）を用いてＰｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製した。次にＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、λＺＡＰＩＩベクター（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製）にライゲーションし、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製）を用いてパッケージングし遺伝子ライブラリーを得た。
ｅ）遺伝子ライブラリーのスクリーニング
上記ｃ）で得た０．２７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＩＧ−Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガーマンハイム（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ）社製）を用いて標識した。これをＤＮＡプローブとして、ｄ）で得た遺伝子ライブラリーをプラーク・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られた陽性プラークからファージを回収した後、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社のインストラクションに従い、インビボイクシジション（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｘｉｃｉｓｉｏｎ）法により、約１．７ｋｂｐのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＦＰｒｉを得た。
ｆ）塩基配列の決定
ジグリコシダーゼをコードする塩基配列を配列番号７に示す。また配列番号７によりコードされるアミノ酸配列を配列番号８に示す。このアミノ酸配列中には、ｂ）で決定したＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）および内部アミノ酸配列（配列番号２）が見出され、このＤＮＡ断片がジグリコシダーゼの遺伝子断片であることが確認された。
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この遺伝子のオープンリーディングフレームを配列番号９に示す。配列番号１０に示すように、全体が４８８アミノ酸のＰｒｅ体としてコードされており、うちＮ−末端の２２残基がＰｒｅ領域と推定され、残りの４６６残基が成熟体に対応する（配列番号８を参照）。
本発明は二糖配糖体に作用して該二糖配糖体より二糖単位で糖を遊離する活性を有するポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドに特に限定されるものではなく、該ポリペプチドからなる更に長いポリペプチド（例えば、Ｐｒｅ体）やそれをコードするヌクレオチドを含むものである。
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実施例９
β−プリメベロシダーゼの糸状菌での発現確認
ａ）発現カセットの構築
クローニングされた遺伝子がプリメベロシダーゼ遺伝子であるか否かを確認するために、得られたＤＮＡの発現を確認した。アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼを含むプラスミドｐＴＧ−Ｔａａ（Ｋａｔｏ  Ｍ，Ａｏｙａｍａ  Ａ，Ｎａｒｕｓｅ  Ｆ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ  Ｎ（１９９７）Ａｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡｎＣＰ，ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔａｋａ−ａｍｙｌａｓｅ  Ａｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＣＡＡＴ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔａａＧ２，ａｍｄＳ，ａｎｄ  ｇａｔＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５４：１１９−１２６）を鋳型とし、プライマーＴＡＡ５’
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とプライマーＴＰ３’
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でＰＣＲにて増幅しフラグメントを得た。
＜ＰＣＲ反応液＞
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また、ＤＮＡを含むプラスミドｐＡＦＰｒｉを鋳型としプライマーｄＰＣ５’
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とプライマーＰＣ３’
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でＰＣＲにて増幅しフラグメントを得た。
さらに各フラグメントを回収混合後、プライマーＴＡＡ５’とプライマーＰＣ３’でＰＣＲにて増幅しフラグメントを得た。このフラグメントはアスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼのプロモーターから成熟タンパク質Ｎ末５番目アミノ酸までと、β−プリメベロシダーゼ成熟タンパク質Ｎ末２８番目アミノ酸（グリシン）からＣ末端まで含む。得られたフラグメントの上流にはＳｓｅ８３８７Ｉを下流にはＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入してある。フラグメントを制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し回収した。
ターミネーター領域はｐＴＧ−Ｔａａを鋳型とし、プライマーＴＡＡＨ
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とプライマーＴＡＡ３’
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でＰＣＲにて増幅しフラグメントを得た。
得られたフラグメントの上流にはＨｉｎｄＩＩＩを下流にはＳｓｅ８３８７Ｉサイトを導入してある。フラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｓｅ８３８７Ｉで処理し回収した。
マーカー遺伝子であるオロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素（ｐｙｒ４）を含むプラスミドｐＴＧ１（Ｋａｔｏ  Ｍ（１９９７）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５４：１１９−１２６）を制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ処理、アルカリフォスファターぜ処理後、回収した。
この３つのフラグメントを連結したプラスミドｐＡＦＰｒｉＥ１（マーカー遺伝子の方向に対して順方向）とｐＡＦＰｒｉＥ２（逆方向）を得た。
ｂ）形質転換株の取得
オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素（ｐｙｒＧ）株であるアスペルギルス  ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ｇ１９１（Ｋａｔｏ  Ｍ（１９９７）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ２５４：１１９−１２６）を完全培地（２％モルトエキストラクト、０．１％ペプトン、２％グルコース、０．１％ウリジン、２μｇ／ｍｌ  ｐ−アミノ安息香酸、ｐＨ６．５）に接種し、３０℃１８時間振とう培養する。菌体をろ過により集菌し、プロトプラスト溶液（０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、３．７５ｍｇ／ｍｌ  Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４）に懸濁後、３０℃、１時間振とうする。ろ過によりプロトプラストを回収し、１５００ｒｐｍ、５分遠心分離により、プロトプラストを沈殿物として得た。この沈殿物を０．８Ｍ  ＮａＣｌ溶液に懸濁し、１５００ｒｐｍ、５分遠心分離により沈殿物を集めた。０．８Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液に再懸濁し、１５００ｒｐｍ、５分遠心分離により沈殿物を集めた。適当量の０．８Ｍ  ＮａＣｌ・５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液に懸濁し、プロトプラスト溶液を得た。次にこのプロトプラスト溶液５０μｌに、２０μｇのＤＮＡ溶液、１２．５μｌのＰＥＧ溶液（２５％ＰＥＧ６０００／５０ｍＭ  ＣａＣｌ２／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を加え混合後、氷上に２０分静置した。次に０．５ｍｌのＰＥＧを加え混合後、氷上に５分静置した。次に１ｍｌの０．８Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液を加え混合した。この混合液０．５ｍｌを、予め５０℃に保温しておいた１５ｍｌの２％アガーを含む再生培地（０．６％ＮａＮＯ３、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２Ｍソルビトール、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１％グルコース、２μｇ／ｍｌ  ｐ−アミノ安息香酸、ｐＨ６．５）と混合しシャーレで固化させ、３７℃で３日間培養した。
ｐＴＧ１、ｐＡＦＰｒｉＥ１、ｐＡＦＰｒｉＥ２のプラスミドＤＮＡについて行った。
プレート上に出現したコロニーについて単胞子分離した。ｐＴＧ１からは１５株、ｐＡＦＰｒｉＥ１からは２３株、ｐＡＦＰｒｉＥ２からは１３株の形質転換株を取得した。
ｃ）形質転換株の評価
形質転換株の評価はｐＴＧ１からは８株、ｐＡＦＰｒｉＥ１からは１８株、ｐＡＦＰｒｉＥ２からは１２株について行った。各形質転換株について酵素生産確認培地（１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＮａＮＯ３、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％マルトース、４μｇ／ｍｌ  ｐ−アミノ安息香酸、０．１％トレースエレメント溶液（Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））（Ｃｏｒｅ  ＤＪ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９６６，１１３巻、Ｐ．５１−５６）に接種し、３０℃９６時間振とう培養した。４８時間、７２時間、９６時間と培養液をサンプリングし、ろ過後のろ液について活性を観察した。ｐＴＧ１、ｐＡＦＰｒｉＥ２の形質転換株についていずれも酵素活性は確認されなかったが、ｐＡＦＰｒｉＥ１の形質転換株５株について酵素活性が確認された。
実施例１０
ハイブリダイゼーション法による植物遺伝子との比較
茶由来のジグリコシダーゼと類似の酵素の遺伝子をプローブとして、我々がジグリコシダーゼの存在を確認した微生物の染色体上に類似の構造を持つ遺伝子が存在するか否か調べた。茶由来のジグリコシダーゼと類似の酵素の遺伝子断片の調製は坂田・水谷らの報告（第７３回日本農芸化学化学会）と特願平１１−５６２９９を参照に行なった。
微生物の染色体の調製法は以下のように行なった。
酵母・カビ類からの染色体調製はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３  ｐｐ１４３０−１４３９（１９８３）に従って行なった。細菌の染色体ＤＮＡの調製は斎藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  Ｖｏｌ．７２、ｐｐ６１９−６２９、１９６３年）に従って行なった。放線菌の染色体ＤＮＡはＩｅｆｕｊｉらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６０、ｐｐ１３３１−１３３８、１９９６年）に従って調製した。
このように得られた各種染色体ＤＮＡ１０μｇをアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  アキュラタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌａｅｔｕｓ）、ペニシリウム  リラシナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｕｍ）、ペニシリウム  デカベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｃｅ）、ペニシリウム  マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌａｒ）、タラロマイセス  エマーソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、モルチェレラ  ベナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａ）、クリプトコッカス  アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ）、コリネバクテリウム  アンモニアジンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリア  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ミクロバクテリウム  アルボレセンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム  ルゴサルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｇｏｌｏｓｕｍ）の場合ＢａｍＨＩで、リゾプス  オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾムコール  プシラス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾムコール  ミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、アクチノプランス  ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）の場合、ＥｃｏＲＩで消化し１％アガロースゲルにて電気泳動した。またコントロールとしてプローブとして用いた茶由来のジグリコシダーゼと類似の酵素の遺伝子断片を同じゲルに電気泳動した。電気泳動後ＤＮＡをナイロンメンブランにブロットし、ＤＩＧシステムキット（ベーリンガーマンハイム社）を用いて添付の使用説明書に従い、前述の茶由来のジグリコシダーゼと類似の酵素の遺伝子断片ｐ（成熟植物プリメベロシダーゼ遺伝子の構造遺伝子部分）を標識したものをプローブとしてハイブリダイゼーションを行なった。その結果、ハイブリダイゼーション条件（５  ｘ  ＳＳＣ、１％ブロッキング剤、０．１％Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム、０．０２％ＳＤＳ、６８℃、一晩）、洗浄条件（６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温、５ｍｉｎ．ｘ２と６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４５℃、１５ｍｉｎ．ｘ２）で検出を行なったところ、植物遺伝子をブロットした位置にシグナルを得たが微生物ゲノムをブロットした他のいかなる部分にもシグナルを認めなかった。したがって、微生物のジグリコシダーゼ遺伝子は植物プリメベロシダーゼ遺伝子とは異なる構造を有すると考えられる。
一方、上記と同様の方法と条件によって、実施例８で得たアスベルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＩＡＭ２０２０由来の本発明のジグリコシダーゼ遺伝子をプローブとして、我々がジグリコシダーゼの存在を確認した微生物の染色体上に類似の構造を持つ遺伝子が存在するか否か調べた。その結果、これらの微生物においてシグナルを検出した。
さらに、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  アキュラタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、ペニシリウム  マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）、ペニシリウム  リラシナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｕｍ）、コリネバクテリウム  アンモニアジンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリア  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ではよりストリンジェンシーの厳しい条件の洗浄（５ｘＳＳＣ、室温、１０分と４ｘＳＳＣ、６８℃、３０分）においてもシグナルを検出できた。
実施例１１
イソフラボン配糖体におけるのジグリコシダーゼのイソフラボン分解活
イソフラボン配糖体には下表のようにグルコシドと修飾グルコシドであるアセチルグルコシド、マロニルグルコシドが存在する。ジグリコシダーゼによるアセチルタイプとマロニルグルコシドの分解活性、即ちアグリコン遊離活性を調べた。
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Ｒ１〜Ｒ３は、下の構造式に対応している。
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アセチルグリシチン（Ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｉｔｉｎ）、アセチルゲニスチン（Ａｃｅｔｙｌｇｅｎｉｓｔｉｎ）、アセチルダイジン（Ａｃｅｔｙｌｄａｉｄｚｉｎ）、マロニルグリシチン（Ｍａｌｏｎｙｌｇｌｙｃｉｔｉｎ）、マロニルゲニスチン（Ｍａｌｏｎｙｌｇｅｎｉｓｔｉｎ）、マロニルダイジン（Ｍａｌｏｎｙｌｄａｉｄｚｉｎ）（以上フジッコ株製品、ナカライテスク社販売）をアスベルギルス  フミガタス（Ａｓｐ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）或いはペニシリウム  マルチカラー（Ｐｅｎ．ｍｕｌｔｉｃｏｌａｒ）から調製したジグリコシダーゼ酵素液とアーモンド由来のグルコシダーゼ（シグマ社製）で以下の条件で反応させた。
各酵素を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で希釈して、それぞれの活性を１．８８ＡＵ／ｍｌとし、２ｍＭ  イソフラボン（１２．５μｌ）、２０ｍＭ酢酸緩衝液（８７．５μｌ）、酵素溶液（２５μｌ）を加え５５℃で反応を行なった。反応後１、３、６時間で２５μｌづつサンプリングを行ない、分取したサンプルにメタノール７５μｌ、水９００μｌを加えフィルター濾過（０．２μｍ）した後水で更に２．５倍希釈した。この１ｍｌをＨＰＬＣで解析した（ＨＰＬＣ条件、カラム：ＯＤＳ８０ＴＭ（東ソー）、溶離液：アセトニトリルと１０％酢酸の混合液。直線濃度勾配下で分離。）。
その結果、グルコシダーゼ（シグマ社）はどの修飾グルコシド基質もほとんど分解しなかったが両者のジグルコシダーゼはいずれの修飾グルコシドも効率よく分解し、アグリコンを遊離することが明らかになった。
実施例１２
香り成分前駆体であるオイゲニルプリメベロシドの調整
山茶花の新葉約２ｋｇを１００℃、１０分で熱水抽出し、抽出液をダイアイオンＨＰ２０（三菱化学社製）をつめたカラムに掛け、オイゲニルプリメベシドを吸着させた。カラムをベッドボリュームの約２倍の脱イオン水、２０％メタノールで洗浄した後、１００％メタノールで吸着したオイゲニルプリメベロシドを回収した。回収されたオイゲニルプリメベロシドを含むメタノール溶液をその後濃縮し、オイゲニルプリメベロシドを結晶化させ、ガラスフィルターにて回収した。
実施例４で得られた粗酵素濃縮液１ｍｌと２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で５ｍｇ／ｍｌに調製されたオイゲニルプリメベロシド溶液１ｍｌとを混合し、３７℃で２４時間でインキュベートし、香りの生成を官能試験（パネラー１０名）により調べた。その結果、アスペルギルス  ニガー２株及びアスペルギルス  フミガタスの両粗酵素濃縮液を用いた場合の全てにおいてオイゲノール特有の香り生成することが確認された。
粗酵素濃縮液を熱処理（１００℃、１０分）したものを用いた場合においては、オイゲノール特有の香りは感じられなかった。したがって、これら粗酵素抽出液にはオイゲニルプリメベロシド等の配糖体から香り成分であるアグリコンを遊離する作用がある事が判った。
実施例１３
精製酵素によるｐＮＰ−プリメベロシドからの二糖遊離
実施例６で得られた精製酵素液０．３ＡＵと前述のｐＮＰ−プリメベロシドを３７℃で２４時間インキュベートしＴＬＣ二糖遊離を調べた。その結果、プリメベロースと同じ位置にスポットが観察され二糖遊離が確認された。対象として行った熱処理した精製酵素液ではこのようなスポットは観察されなかった。したがって、精製された酵素は二糖配糖体から二糖を遊離する作用を有していることが判明した。
実施例１４
精製酵素によるオイゲニル−プリメベロシドからの二糖遊離と香気生成
実施例６で得られた精製酵素液０．３ＡＵと前述のｐＮＰ−プリメベロシドを３７℃で２４時間インキュベートしＴＬＣ二糖遊離を調べた。その結果、プリメベロースと同じ位置にスポットが観察され二糖遊離が確認された。また、反応液をガスクロマトグラフィーで分析したところオイゲニル−プリメベロシド配糖体のアグリコンであるオイゲノールの遊離が確認され、官能試験でもオイゲノールの遊離が認められた。熱失活した酵素液ではこれらは認められなかった。以上より精製された酵素はオイゲニル・プリメベロシドなど香り前駆体に作用し香気を生成することが明らかとなった。
実施例１５
色素配糖体からの二糖遊離
二糖配糖体色素としてルベリトリン酸を基質として二糖遊離を調べた。ルベリトリン酸は染色用の西洋茜根粉末（田中染色店販売）の水抽出物をＨＰ−２０カラムに吸着させ５０％メタノールで洗浄後、１００％メタノールで回収しエバポレーターで蒸発乾固させ回収した。回収したルベリトリン酸をリン酸緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに溶解した基質に０．３ＡＵの実施例４に示した粗酵素液または実施例６に示した精製酵素液を加え３７℃で２４時間インキュベートしたのち、反応液をＴＬＣで分析した。その結果粗酵素液及び精製酵素液で二糖プリメベロースとアグリコンであるアリザリンの遊離が認められた。
実施例１６
他の二糖配糖体の分解
実施例５に示した各種の微生物由来のジグリコシダーゼに関して各種二糖配糖体の分解能をＴＬＣを用いて調べた。その結果、ジグリコシダーゼはプリメベロシド配当体以外にナリンギンやルチン等のルチノース配糖体、ゲンチビオース配糖体、アラビノフラノシルグルコシド配糖体、アビオフラノシルグルコシド配糖体、などのプリメベロシド配糖体と類似の種々二糖配糖体に作用し、二糖を遊離し遊離アグリコンを産生することが判明した。
実施例１７
茶抽出液の香気改善
実施例４と６に示すアスペルギルス  フミガタス由来の酵素液を用いて緑茶、紅茶、ウーロン茶の香気成分の増強作用を調べた。茶抽出液に酵素１．８８ＡＵを加え５５℃で２４時間インキュベーションした後、香気の増強をガスクロマトグラフィーで前述の条件で調べた。その結果、１−ヘキサノール、３−ヘキセン−１−オール、ベンズアルデヒド、リナロール、メチルサリシアナート、ゲラニオール、ベンジルアルコールなどの香気成分が増強されていることが分かった。また官能試験でも香気が増強されていることが分かった。
実施例１８
果汁の香気改善
実施例４と５に示すアスペルギルス  フミガタスとペニシリウム  マルチカラー由来の酵素液を用いてグレープ、オレンジ、アップル、プルーン、ネクター等の果汁に１．８８ＡＵの酵素を加え３７℃で２４時間インキュベートし香気をガスクロマトグラフィーで分析した。その結果、リナロール等の香気成分の増強が認められた。また官能試験から酵素処理した果汁の香気改善が認められた。
実施例１９
ワインの香気改善
実施例４に示す各種粗酵素液を用いて赤ワインと白ワインに０．５ＡＵの酵素を加え３７℃で２４時間インキュベートして香気の改善を官能試験で調べた。その結果、両者で香気の改善が認められた。
実施例２０
実施例４と５で得られた各種粗酵素濃縮液１ｍｌとブドウ果汁（市販品：果汁１００％、濃縮還元）１ｍｌとを混合し３７℃にて一晩（１４時間）インキュベートし、香りを調べたところ、酵素剤の代わりに酢酸緩衝液を加えたものに比べ明らかに香りが増強された。またこの作用は粗酵素濃縮液を１００℃で１０分間加熱処理したものでは見いだせなかった。
実施例２１
実施例４で得られた粗酵素濃縮液１ｍｌと市販オレンジ果汁（還元濃縮液）１ｍｌとを混合し３７℃で２４時間でインキュベートし、香りの生成を官能試験により調べた。その結果、アスペルギルス  ニガー２株及びアスペルギルス  フミガタス両粗酵素濃縮液でオレンジ果汁の香りの増強効果が認められた。粗酵素濃縮液を熱処理（１００℃、１０分）したものではこのような効果は認められなかった。
実施例２２
ジグリコシダーゼによって、二糖単位での糖転移が起こるか否かを調べた。
実施例６の精製酵素を脱イオン水で希釈して活性を１．０ＡＵ／ｍｌとし、２．５％フェネチルアルコールを含むアセトニトリル（２００ｍｌ）、１０％プリメベロース含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（２５０μｌ）、そして酵素溶液（５０μｌ）を加え、５５℃で反応を行った。反応を６時間で終了させ、ジエチルエーテル５００μｌを加え、攪拌、遠心分離を行い、エーテル層に移行した遊離のアグリコンを除去した。水層をダイアイオンＨＰ−２０カラムに通し、純粋を通すことで遊離のプリメベロースを除去した。樹脂に吸着した二糖配糖体をメタノールによって溶出し、濃縮乾固させた。これを脱イオン水１００μｌに溶解し、２０μｌをＴＬＣプレートにスポットして、反応生成物を検出した（展開溶媒は、酢酸エチル：酢酸：脱イオン水＝３：１：１。展開後、酢酸：メタノール＝１：４液を噴霧し、１０５℃で１０分間放置した）。
その結果、β−プリメベロシダーゼは有機溶媒中において、ジグリコシドをフェネチルアルコールに転移させ、二糖配糖体を生成することが明らかになった。産業上の利用可能性
本発明により、新規な酵素である、β−プリメベロシド及び／又は類似する二糖配糖体を二糖単位で切断する、あるいは、修飾配糖体を分解する作用を有する酵素を微生物を給源として供給することができ、本発明の酵素組成物を用いることによって、各種食品、医薬品、医薬部外品などに広く使用できる。例えば食品などにおいてその香気、色素、生理活性成分を増強あるいは減弱することができる。
【配列表】
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