(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物を投与した哺乳動物から単離した試料をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに付し、該阻害活性を有する化合物を投与しない対照と対比することを特徴とする、該化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を評価する方法。
【請求項２】
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに、硬膜剤を含むゼラチンまたはコラーゲンからなり、膜厚が１μｍ〜２０μｍである薄膜を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーとして、以下の工程を行う請求項１記載の方法：
（１）単離された試料をマトリックスメタロプロテアーゼ基質を含有する薄膜上に接触させる；
（２）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；
（３）得られた薄膜を染色し脱色する；および
（４）薄膜の色調を判定する。
【請求項４】
マトリックスメタロプロテアーゼ基質がゼラチンまたはコラーゲンである請求項３記載の方法。
【請求項５】
薄膜が硬膜剤を含有する請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
薄膜の厚さが１μｍ〜２０μｍである請求項３〜５までのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試料が２μｍ〜１０μｍの厚さの組織切片であり、インキュベートを２０℃〜５０℃で２〜１８時間行う請求項３〜６までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を評価する方法：
（１）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物を投与した哺乳動物から単離された試料をマトリックスメタロプロテアーゼ基質を含有する薄膜上に接触させる；
（２）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；
（３）得られた薄膜を染色し脱色する；および
（４）薄膜の色調を判定し、該阻害活性を有する化合物を投与しない対照と比較する。
【請求項９】
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する抗癌剤を投与した哺乳動物から単離した試料をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに付し、該阻害活性を有する化合物を投与しない対照と対比することを特徴とする、該化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を指標とする該抗癌剤の抗癌活性を評価する方法。
【請求項１０】
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物を投与した哺乳動物から単離した試料をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに付し、該阻害活性を有する化合物を投与しない対照と対比することを特徴とする、該化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を定量する方法。
【請求項１１】
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに、硬膜剤を含むゼラチンまたはコラーゲンからなり、膜厚が１μｍ〜２０μｍである薄膜を用いることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーとして、以下の工程を行う請求項１０記載の方法：
（１）単離された試料をマトリックスメタロプロテアーゼ基質を含有する薄膜上に接触させる；
（２）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；
（３）得られた薄膜を染色し脱色する；および
（４）薄膜の色調を判定し、対照と比較する。
【請求項１３】
マトリックスメタロプロテアーゼ基質がゼラチンまたはコラーゲンである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
薄膜が硬膜剤を含有する請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
薄膜の厚さが１μｍ〜２０μｍである請求項１２〜１４までのいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
試料が２μｍ〜１０μｍの厚さの組織切片であり、インキュベートを２０℃〜５０℃で２〜１８時間行う請求項１２〜１５までのいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を定量する方法：
（１）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物を投与した哺乳動物から単離された試料をマトリックスメタロプロテアーゼ基質を含有する薄膜上に接触させる；
（２）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；
（３）得られた薄膜を染色し脱色する、および
（４）薄膜の色調を判定し、該阻害活性を有する化合物を投与しない対照と比較する。
【請求項１８】
作成する試料の厚さが４〜８μｍであり、インキュベーション温度が３６〜３８℃であり、インキュベーション時間が４〜８時間である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する抗癌剤を投与した哺乳動物から単離した試料をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに付し、該阻害活性を有する化合物を投与しない対照と対比することを特徴とする、該化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を指標とする該抗癌剤の抗癌活性を定量する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける該活性を評価する方法、詳細にはｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーを用いることにより、該活性を評価する方法に関する。
発明の背景
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は腫瘍細胞自身あるいは腫瘍周囲の正常組織から分泌され、コラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白を２価のメタルイオン依存的に分解する酵素の総称である。特にＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）は癌の増殖に伴う血管新生や浸潤、転移に関わっていることが数多く報告されている。
マトリックスメタロプロテアーゼの測定方法として、基質の分解性の程度から酵素活性を測定するゼラチンザイモグラフィー法が知られているが、これは電気泳動が必須であるため、手法が煩雑であり、検出に長時間を要する。
電気泳動を行わない手法として、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．９，Ｊｕｌｙ，ｐｐ．９７４−９８０，１９９５では、蛍光性化合物が結合したカゼインまたはゼラチンをプロテアーゼ基質としてアガロースに含ませ、これをスライドグラス上に薄膜とし、次いでその薄膜表面に組織切片をのせ、インキュベートし、基質の消化を蛍光顕微鏡下に観察する、ザイモグラフィーの原理を利用した測定方法が提案されている。しかし、この方法ではアガロースの存在がプロテアーゼによる基質の消化性に影響を与え、再現性に乏しいという問題がある。
最近、本出願人は簡便かつ正確なプロテアーゼの測定方法として、プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含む、支持体表面に形成される薄膜に対してプロテアーゼを含む試料を接触させる工程を含む方法を提案し、一定の評価を得ている（ＷＯ９７／３２０３５）。例えば、第５回癌転移研究会総会（１９９６年）の講演要旨集には、この手法に基づくｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーを用い、組織細胞のゼラチナーゼ活性を検出し、プロテアーゼによる癌細胞の組織破壊の様相を観察することが、記載されている。なお、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーについてはＴｈｅ  ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，９７４−９８０，Ｖｏｌ．９（１９９５）等に記載されている。
また、Ｈ．Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９，４６７−４７３（１９９９）では同様に、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーを用い、ヒト甲状腺癌におけるＭＭＰ活性をＭＭＰ阻害剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて阻害することが記載されている。
従来技術
上記のようにＭＭＰ、特にＩＶ型コラゲナーゼは癌の増殖に伴う血管新生や浸潤、転移に関わっていると考えられているため、ＭＭＰの阻害剤は抗癌剤開発の立場からも注目され、現在いくつかの製薬メーカーによる臨床試験が行なわれている。
薬物治療は使用される薬物自体が有効で安全であることを前提として成り立っているが、その決め手となるのが薬効評価であり、薬効評価は動物実験などの非臨床試験、およびヒトを対象に行う臨床試験と大きく２つに大別できる。いかに非臨床試験で効果があり、作用機序がすばらしい薬物であっても、それが患者に使用して効果がなければ意味がない。そこで、ヒトにおいて薬物の効果を評価しようとするのが臨床試験である。
ＭＭＰ阻害剤の臨床試験における薬効評価の場合、本来、ＭＭＰが生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においてＴＩＭＰ−１、−２などの内因性の阻害物質によって制御されているため［Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｊｒ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．５，２１４５−５４（１９９１）］、ＭＭＰ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を正確に評価することは困難である。ＭＭＰを検出する方法として、ＭＭＰに対する特異的抗体を用いた免疫染色法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，５６，５００−５０５（１９９４））が知られているが、抗体はＭＭＰを単に抗原蛋白として認識するものであるため、この方法により、抗体に認識された抗原蛋白がＭＭＰ活性を有しているのか、あるいは阻害物質によりその活性が失活しているのかを判断することはできない。また、従来のゼラチンザイモグラフィー法では、電気泳動中に阻害物質がＭＭＰから離れるため、この方法によってもＭＭＰ阻害剤における阻害活性を正確に評価できない。
発明が解決しようとする課題
上記に鑑み、本発明者らはＭＭＰ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を確認する方法について研究を行った結果、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーを用いることで、ＭＭＰ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＭＰ阻害活性を簡便かつ迅速に評価できることを見出した。
課題を解決するための手段
すなわち本発明は第一の態様として、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物を投与した哺乳動物から単離した試料をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに付すことを特徴とする、該化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて評価する方法に関する。
詳細には、本発明は、硬膜剤を含むゼラチンまたはコラーゲンからなり、膜厚が１μｍ〜２０μｍである薄膜をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに用いることを特徴とする方法に関する。具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーとして、以下の工程を行う：
（１）単離された試料をマトリックスメタロプロテアーゼ基質を含有する薄膜上に接触させる；
（２）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；
（３）得られた薄膜を染色し脱色する；および
（４）薄膜の色調を判定する。
本発明の評価方法において、好ましくはマトリックスメタロプロテアーゼ基質がゼラチンまたはコラーゲンであり；薄膜が硬膜剤を含有するものであり；薄膜の厚さが１μｍ〜２０μｍであり；および／または試料が２μｍ〜１０μｍの厚さの組織切片、好ましくは凍結組織切片であり、インキュベートを２０℃〜５０℃、好ましくは３６〜３８℃で２〜１８時間行う方法である。
第二の態様として、本発明は、以下の工程を含むマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を評価する方法に関する：
（１）哺乳動物にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する該化合物を投与する；（２）該哺乳動物の組織または体液を単離して試料を作成する；（３）単離された試料をマトリックスメタロプロテアーゼ基質を含有する薄膜上に接触させる；（４）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；（５）得られた薄膜を染色し脱色する；および（６）薄膜の色調を判定する。
第三の態様として、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する抗癌剤を投与した哺乳動物から単離した試料をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに付すことを特徴とする、該化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を指標とする該抗癌剤の抗癌活性を評価する方法に関する。かかる本方法において、好ましくはマトリックスメタロプロテアーゼ基質がゼラチンまたはコラーゲンであり；薄膜が硬膜剤を含有するものであり；薄膜の厚さが１μｍ〜２０μｍであり；および／または試料が２μｍ〜１０μｍの厚さの組織切片、好ましくは凍結組織切片であり、インキュベートを２０℃〜５０℃、好ましくは３６〜３８℃で２〜１８時間行う方法である。
生体内にはＭＭＰに限らず、トリプシン等のゼラチンを分解する酵素が多く存在することが知られている。従って、本発明のような、基質にゼラチン等のＭＭＰ基質を用いたｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーによってＭＭＰ阻害剤の活性を選択的に測定することは困難であった。また、ＭＭＰ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を測定する方法は知られていない。
本明細書中、「ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィー」とは電気泳動を伴わないプロテアーゼ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定方法を意味し、本発明ではマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を有する化合物（ＭＭＰ阻害剤）を投与した哺乳動物から単離した試料をＭＭＰ基質を含有する薄膜上に接触させ、一定時間経過後に該ＭＭＰの基質を判定し、それにより「ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＭＰ阻害活性」について評価する。
「哺乳動物から単離した試料」における哺乳動物はＭＭＰ阻害剤を投与された高等脊椎動物であり、好ましくはヒトである。この方法によれば、被検対象物がこのような生体から単離された試料であるため、生体内においてＭＭＰ阻害剤の示しているｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＭＰ阻害活性を充分に反映させることができる。
「単離した試料」は哺乳動物の各種組織または体液由来のものであってよいが、それは哺乳動物に投与するＭＭＰ阻害剤の目的とする効能に依存する。例えばＭＭＰ阻害剤が抗癌剤であれば、試料は乳癌、子宮内膜癌、口腔癌、肺癌、胃癌、食道癌、尿路上皮癌、大腸癌、扁平上皮癌、脳腫瘍、甲状腺癌などの癌組織から手術や組織検査により分離・採取した癌組織由来となる。抗リウマチ剤を投与すれば、試料として慢性関節リウマチまたは関節炎における滑膜、滑液や骨組織を用い、抗心不全剤を投与すれば、心不全における心臓組織や滲出液を用いることとなろう。このように本発明は抗癌剤、抗リウマチ剤あるいは抗心不全剤の評価方法として利用することができる。
発明の実施の形態
詳細には、本発明方法における「ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィー」は：
（１）上記単離された試料をＭＭＰ基質を含有する薄膜上に接触させる；
（２）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；
（３）得られた薄膜を染色し脱色する；および
（４）薄膜の色調を判定する、工程を包含する。
以下、各工程についてさらに詳細に説明する。
（１）上記単離された試料をＭＭＰ基質を含有する薄膜上に接触させる；
「試料を薄膜上に接触させる」とは、摘出した組織を薄膜上に置くか、貼付するか、あるいは採取した体液を薄膜上に滴下することを意味する。
「単離された試料」は上記組織由来の、例えば液体窒素で急速凍結した試料から凍結切片作成装置を用いて厚さ２μｍ〜１０μｍ、好ましくは４μｍ〜８μｍに作成したものが挙げられる。または体液（例えば、血液、唾液、滑膜液等）を用いることもできる。また、慢性関節リウマチの患者から採取した滑膜液を試料として用いる場合には、滑膜液約５〜５０μｌ、好ましくは２０μｌ程度を薄膜上に滴下する。
「ＭＭＰ基質」とはＭＭＰにより分解される高分子化合物であり、例えばゼラチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチンまたはカゼインなどである。好ましくは、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンまたはカゼインであり、より好ましくはゼラチン、コラーゲンである。なお、ＭＭＰは、例えば鶴尾隆編「癌転移の分子機構」、ｐｐ．９２−１０７、メジカルビュー社、１９９３年発行に詳細に説明されており、例えば間質型コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）、およびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）などが挙げられるが、これらのプロテアーゼに限定されない。
「ＭＭＰ基質を含有する薄膜」とは支持体表面上に上記ＭＭＰ基質が単層または多重層として形成されたものである。詳細はＷＯ９７／３２０３５に記載されている。簡単に説明すれば、例えば薄膜厚が６μｍ〜２０μｍ、特に８μｍ〜１０μｍである単層または重層の薄膜が支持体上に調製されたものであり、該薄膜は均一な表面を有するものが好ましい。
本発明方法に用いる薄膜には硬膜剤を含有させることが好ましい。硬膜剤はＭＭＰ基質の薄膜の硬化を促進し、および／または形成後の薄膜の膨潤を防止する作用を付与する。硬膜剤の詳細はＷＯ９７／３２０３５に記載されている。硬膜剤としては例えばビニルスルホニル型硬膜剤等が挙げられる。硬膜剤の使用量は特に限定されないが、例えばゼラチンを用いる場合には、検出性能の点からゼラチン１００ｇに対して０．１〜２０ｍｍｏｌ、さらに好ましくは０．３〜１０ｍｍｏｌ程度を配合するのがよい。
また、薄膜を製造する際には上記成分に加え、染料、顔料、防腐剤、安定化剤などの成分を適宜配合してもよい。
「支持体」は、組織内のＭＭＰの存在を顕微鏡下に観察できるように透明または半透明のものであることが好ましい。このような透明または半透明の支持体としては、例えばガラスまたはポリエチレンテレフタレート、等からなる透明または半透明プラスチックフイルムなどがある。支持体の厚さは特に限定されないが、ガラスの場合にはスライドグラス程度の厚さのもの（例えば２〜３ｍｍ程度）が好ましく、ポリエチレンテレフタレートフイルムの場合には約１００〜２５０μｍ程度のものを用いることができる。
「薄膜および支持体」の調製は例えば水、またはアセトン、メタノール、エタノールもしくはそれらの混合溶媒などの有機溶媒に分散したＭＭＰ基質を支持体表面に塗布して乾燥する。塗布方法としては、当業者に周知のディップ塗布法、ローラー塗布法、カーテン塗布法、押し出し塗布法などを採用できる。ＭＭＰ基質としてゼラチンを用いる場合、ゼラチンの種類は特に限定されず、例えば牛骨アルカリ処理ゼラチン、豚皮膚酸処理ゼラチンなどを用いることができる。
（２）得られた試料−薄膜検体をインキュベートする；
「試料−薄膜検体」とは、例えば組織切片を薄膜に貼付するか、あるいは液体試料を薄膜上に滴下することによって薄膜とＭＭＰを含む試料とを接触させた後に得られる検体である。
「インキュベート」とは、２０℃〜５０℃、好ましくは３６℃〜３８℃の恒温槽に静置することを意味し、好ましくは薄膜が乾燥しないように湿潤容器内で行う。組織切片については３７℃において例えば１〜２４時間、好ましくは２〜１８時間、さらに好ましくは４〜８時間程度、液状試料については０．５〜１２時間、好ましくは１〜６時間程度インキュベートする。
試料中に、ＭＭＰ阻害剤によっても失活されないプロテアーゼが含まれる場合には、薄膜内のＭＭＰ基質がＭＭＰによって分解され、薄膜上に消化痕が形成される。
（３）得られた薄膜を染色し脱色する；
工程（２）の試料−薄膜検体を好ましくは染色液を用いて染色する。染色剤には酵素の基質が染色されるような染色剤、例えば、アミドブラック、クマジーブルー、ポンソー（和光純薬）、ビーブリッチスカーレット（Ｂｉｅｂｒｉｃｈ  Ｓｃａｒｌｅｔ）（アルドリッチ）がある。好ましくは０．５〜２％アミドブラック溶液を用いる。
次いで、染色された薄膜を適当な脱色剤、例えば、７０％メタノール−１０％酢酸溶液、水を用いて脱色する。
（４）薄膜の色調を判定する；
上記工程を施した薄膜は、ＭＭＰ基質の分解が見られた部分が染色されないので、ＭＭＰ基質分解の程度に応じて染色の度合いに濃淡（階調度）が生じる。そのような色調の変化を、肉眼や光学顕微鏡での観察、スライドスキャナー等を用いた定量的な解析、レーザー顕微鏡を用いた定量的な解析等によって判定する。染色されている部分は、ＭＭＰが投与されたＭＭＰ阻害剤の作用、あるいは別の理由によって失活した状態にあることを示す。失活状態がＭＭＰ阻害剤の作用なのか、あるいは別の理由であるのかは、ＭＭＰ阻害剤を投与しない対照と対比することで、容易に区別することができる。
本発明は、ＭＭＰ阻害剤が示すｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＭＰ阻害活性を評価する方法であって、最初の工程として哺乳動物にＭＭＰ阻害剤を投与する工程を含む本発明方法も包含する。これにより、臨床試験の際、被験者に投与したＭＭＰ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏ活性の評価を行うことができる。ＭＭＰ阻害剤を投与して、次工程を行う際には、投与後、通常３０分から４時間の間隔を設ける。
さらに、本発明はＭＭＰ阻害活性を有する抗癌剤を投与した哺乳動物から単離した試料をｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーに付すことを特徴とする、該化合物が示すｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＭＰ阻害活性を指標とする該抗癌剤の抗癌活性を評価する方法を包含する。抗癌剤の臨床試験における薬効評価は主として患者の延命効果や患者自身の自覚症状、癌の退縮／転移の有無、腫瘍マーカーの量等が基準とされる。しかし、これでは病巣部への薬物の移行性の良否やきめこまかな投与量の選定を行うのは困難である。よって、本発明の抗癌活性評価方法は臨床試験における薬剤の投与量、投与スケジュールの決定、薬剤が癌組織に到達したか否かの決定、あるいは適用対象の癌種選択に有益な手段を提供できる。
かかる本発明方法も上記詳述した各工程を行うことで実施される。
本発明方法によれば、試験した癌がＭＭＰ依存的であるか否かを確認することができ、より適切な処置手段を提供できる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の範囲の限定を意図するものでない。
実施例
実施例１
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィー法を用いたＭＭＰ阻害剤の活性評価
ＭＭＰ阻害剤：
ＭＭＰ阻害剤の被検化合物として、下記式（Ｉ）で表わされるＭＭＰ阻害活性を有する化合物ＢＰＨＡおよび式（ＩＩ）で表わされるＭＭＰ阻害活性を有さない化合物（−）ＢＰＨＡを用いた。
0004070409.tif 000002
0004070409.tif 000003
0004070409.tif 000004
プロテアーゼ活性測定用ゼラチン薄膜の製造：
豚皮膚酸処理ゼラチン１５ｇを純水１２３ｇに溶解し、これに硬膜剤として１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン（４％）１．２ｍｌを添加した。この溶液を、ゼラチン下塗りを施したポリエチレンテレフタレートフィルム上に乾燥膜厚が約７μｍになるよう均一に塗布し、乾燥してゼラチン薄膜とした。得られたゼラチン薄膜は使用時まで室温で保存した。
腫瘍および動物：
ＭＭＰ−２を多く産生することが知られているヒト肺癌細胞株Ｍａ４４［ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ５９，１２３１−３５（１９９９）］を用いた。１Ｘ１０５個のＭａ４４細胞をヌードマウス（６週令、雌、日本クレア）の腹腔内に移植した後１４日目にＢＰＨＡまたは（−）ＢＰＨＡを２００ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した。また対照群として、ビークル（０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％カルボキシメチルセルロース、０．９％ベンジルアルコール含有生理食塩水溶液）を同様に投与した。投薬２時間後、担癌マウスを剖検して腹壁および腸間膜に形成された腫瘍塊を摘出し、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーの実験に供した。
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィー：
腫瘍塊をＯＣＴ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＳＡＫＵＲＡ）に包埋した後、Ｍｉｃｒｏｔｏｎｅ／Ｃｒｙｏｓｔａｔ  ＴＩＳＳＵＥ  ＴＥＫ  ＩＩ（マイルス・三共）を用いて８μｍの厚さの凍結切片を作製した。その凍結切片を先に調製したゼラチン薄膜の上に丁寧に置いた後、乾燥しないように湿潤容器に入れ、そのまま３７℃インキュベーター中に静置した。３．５時間反応させた後、薄膜を取り出し、１％アミドブラック溶液（和光純薬）で１５分間染色を行なった。引き続いて脱色液（７０％メタノール、１０％酢酸）で１０分間脱色した。
薄膜上の腫瘍組織を光学顕微鏡で観察し、ゼラチンの分解が認められる部位を調べた。またその濃淡を定量的に測定するためにスライドスキャナー（ニコン３５ｍｍフィルムスキャナー：ＣＯＯＬＳＣＡＮ  ＩＩ）を用い、ソフトウエアＯｐｔｉｍａｓ  Ｖｅｒ．６（Ｏｐｔｉｍａｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で解析した。
ビークル投与マウス、（−）ＢＰＨＡ投与マウスおよびＢＰＨＡ投与マウスの腫瘍組織をＨ．Ｅ．（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色後、光学顕微鏡で観察した結果をそれぞれ図１上段の（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）に示す。これから、観察した組織には癌細胞が存在していることが分かる。
また、スライドスキャナーで観察した結果を上記と同様にそれぞれ（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）として図１下段に示す。これは、ビークル投与マウスおよび（−）ＢＰＨＡ（ＭＭＰ阻害作用を有さない化合物）投与マウスではゼラチンの分解が認められ、ＢＰＨＡ投与マウスではゼラチン分解がほとんど見られないことを示している。また、定量的な測定（各組織の輝度／各組識の面積）をソフトウエアＯｐｔｉｍａｓ  Ｖｅｒ．６を用いて行った結果は、ビークル投与マウス、（−）ＢＰＨＡ投与マウス、およびＢＰＨＡ投与マウスにおいて、４９．２、４０．１、および８．６を示した。
これらの結果は、動物実験においてＢＰＨＡが抗癌作用を示し、他方（−）ＢＰＨＡが抗癌作用を示さないという結果に符号するものであった［ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ５９，１２３１−３５（１９９９）］。
実施例２
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィー法を用いたＭＭＰ阻害剤の用量依存的活性の確認
ＢＰＨＡおよび（−）ＢＰＨＡを投与する代わりに、ＭＭＰ阻害活性を有することが証明されている式：
0004070409.tif 000005
で示されるＭＭＩ−１６６を０．２、２．０、２０．０、２００．０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与する以外は、実施例１と同様に処理し、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィー法の実験を行った。
ビークル投与マウスおよびＭＭＩ−１６６投与マウスの腫瘍組織のゼラチン分解活性に関する光学顕微鏡での観察結果およびスライドスキャナーの解析結果をそれぞれ図２下段および上段に示す。図２中、（ａ）はビークル投与マウス、（ｂ）は０．２ｍｇ／ｋｇ投与マウス、（ｃ）は２．０ｍｇ／ｋｇ投与マウス、（ｄ）は２０．０ｍｇ／ｋｇ投与マウス、および（ｅ）は２００．０ｍｇ／ｋｇｍｇ／ｋｇ投与マウスの結果である。ビークル投与マウスの腫瘍組織では腫瘍部位に一致してゼラチンの分解が認められた（図２ａ）。一方、ＭＭＩ−１６６投与マウスでは、最大投与量２００．０ｍｇ／ｋｇでゼラチン分解が完全に阻害され、２０．０、２．０ｍｇ／ｋｇと抑制の程度が軽度となり、０．２ｍｇ／ｋｇの投与量ではわずかに部分的な阻害が見られるという結果であった（図２ｅ−ｂ）。以上のように腫瘍組織で見られるゼラチン分解活性はＭＭＩ−１６６の用量に依存して阻害されることが明らかとなった。これらをソフトウエアＯｐｔｉｍａｓ  Ｖｅｒ．６を用いて定量的に測定した結果も、それぞれ５３．４、４１．３、２８．６、１３．７および５．３という値を示した。
以上の結果からＭＭＰ阻害活性を有する化合物が実際に腫瘍部位で認められるゼラチン分解活性を阻害するのに必要な投与量や投与スケジュールを決定するのに本法が有用であることが示唆された。
発明の効果
本発明方法を用いることで、ＭＭＰ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて確認することができる。これは、抗癌剤、抗リウマチ剤、抗心不全剤の臨床試験における薬効評価や作用機序の解明、特に薬剤投与量や投与スケジュールの決定に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ビークル投与マウス（Ａ）、（−）ＢＰＨＡ投与マウス（Ｂ）およびＢＰＨＡ投与マウス（Ｃ）における腫瘍部位のＨ．Ｅ．染色した生体組織像の光学顕微鏡での観察結果（上段）およびゼラチン分解性についてのｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーの結果（下段）を示す、図面に代わる写真である。
図２は、ビークル投与マウス（ａ）、ＭＭＩ−１６６を投与したそれぞれのマウス（ｂ−ｅ）における腫瘍部位のＨ．Ｅ．染色した生体組織像の光学顕微鏡での観察結果（下段）およびゼラチン分解活性についてのｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーの結果（上段）を示す、図面に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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