(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物であって、
0004053595.tif 000012
式中、Ｘ1はＯであり、Ｘ2は三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-であり、Ｘ3はＨまたはＯＨである、化合物。
【請求項２】
核酸配列を突然変異させるための方法であって、以下の式で表される化合物の存在下でテンプレート配列を複製することを含む、方法。
0004053595.tif 000013
式中、Ｘ1はＯ、Ｓ、Ｎ−アルキル、Ｎ+−ジアルキルまたはＮ−ベンジルであり、Ｘ2は三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-、二リン酸（Ｐ2Ｏ6）3-またはチオ三リン酸（Ｐ3Ｏ8Ｓ）4-であり、Ｘ3はＨ、ＮＨ2、ＦまたはＯＲ（ここでＲはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである）である。
【請求項３】
上記式中、Ｘ1はＯである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記式中、Ｘ2は三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-であり、Ｘ3はＨまたはＯＨである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
デオキシＰ三リン酸（ｄＰＴＰ）の存在下でテンプレート配列を複製し、１つまたはそれ以上のｄＰヌクレオチド残基を含む前記テンプレート配列の非同一な複製物を生成させるようにすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記テンプレート配列が、１つまたはそれ以上の付加的なヌクレオシド三リン酸類似体の存在下で複製される、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記テンプレート配列が、以下の構造を有する付加的な化合物の存在下で複製され、
0004053595.tif 000014
式中、Ｙ1はＯＨ、Ｏ−アルキル、ＮＨ2またはＮ（アルキル）2であり、Ｙ2はＨまたはＮＨ2であり、Ｙ3は三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-、二リン酸（Ｐ2Ｏ6）3-またはチオ三リン酸（Ｐ3Ｏ8Ｓ）4-であり、かつＹ4はＨ、ＮＨ2、ＦまたはＯＲ（ここでＲはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである）である、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記テンプレート配列が、付加的な８−オキソｄＧＴＰおよび／またはｄＫＴＰおよび／またはＯ2−エチルチミジン三リン酸の存在下で複製される、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
４つの正常なｄＮＴＰが存在する一方、それらの類似体が存在しない状態で、前記テンプレート配列の前記非同一な複製物を複製し、前記４つの正常なデオキシヌクレオチドのみを含む前記テンプレート配列のさらなる非同一な複製物を生成させるステップをさらに含む、請求項２から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記テンプレート配列の複製、および／またはその前記非同一な複製物の複製が、ＰＣＲによって行なわれる、請求項４から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記テンプレート配列が、前記４つの正常なデオキシヌクレオチドの付加的な存在下で複製される、請求項４から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記テンプレート配列が、１μＭから６００μＭのｄＰＴＰの存在下で複製される、請求項４から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記テンプレート配列が、付加的な１μＭから６００μＭの８−オキソｄＧＴＰの存在下で複製される、請求項４から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
以下の式で表される化合物を含む、請求項２から１３のいずれかに記載の方法を行なうためのキット。
0004053595.tif 000015
式中、Ｘ1はＯ、Ｓ、Ｎ−アルキル、Ｎ+−ジアルキルまたはＮ−ベンジルであり、Ｘ2は三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-、二リン酸（Ｐ2Ｏ6）3-またはチオ三リン酸（Ｐ3Ｏ8Ｓ）4-であり、Ｘ3はＨ、ＮＨ2、ＦまたはＯＲ（ここでＲはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである）である。
【請求項１５】
前記化合物がｄＰＴＰである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ポリメラーゼ連鎖反応を行なうための手段を含むテンプレート配列を複製するための手段を有する、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
４つの正常なデオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項１４から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
８−オキソｄＧＴＰおよび／またはｄＫＴＰおよび／またはＯ2エチルチミジン三リン酸をさらに含む、請求項１４から１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
インビトロでＤＮＡ配列を生成させるための方法であって、４つの正常なｄＮＴＰおよび以下の式で表される化合物を含む混合物を、適当な条件で、核酸のテンプレート鎖の存在下でＤＮＡポリメラーゼにより処理し、少なくとも１つの類似体を含むリボヌクレオチドの配列を生成させるようにすることを含む、方法。
0004053595.tif 000016
式中、Ｘ1はＯ、Ｓ、Ｎ−アルキル、Ｎ+−ジアルキルまたはＮ−ベンジルであり、Ｘ2は三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-、二リン酸（Ｐ2Ｏ6）3-またはチオ三リン酸（Ｐ3Ｏ8Ｓ）4-であり、Ｘ3はＨ、ＮＨ2、ＦまたはＯＲ（ここでＲはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである）である。
【請求項２０】
インビトロでＲＮＡ配列を生成させるための方法であって、４つの正常なｒＮＴＰおよび以下の式で表される化合物を含む混合物を、適当な条件において、核酸のテンプレート鎖の存在下でＲＮＡポリメラーゼによって処理し、少なくとも１つの類似体を含むリボヌクレオチドの配列を生成させるようにすることを含む、方法。
0004053595.tif 000017
式中、Ｘ1はＯ、Ｓ、Ｎ−アルキル、Ｎ+−ジアルキルまたはＮ−ベンジルであり、Ｘ2は三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-、二リン酸（Ｐ2Ｏ6）3-またはチオ三リン酸（Ｐ3Ｏ8Ｓ）4-であり、Ｘ3はＨ、ＮＨ2、ＦまたはＯＲ（ここでＲはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである）である。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、いくつかの新規な化合物、その新規な化合物にかかる核酸配列を突然変異させるための方法および本発明の方法を行なうためのキットに関する。
発明の背景
インビトロ位置指定突然変異誘発は、コードＤＮＡにおいて適当な塩基残基を変化させることによりタンパク質中の１種類のアミノ酸を置換することにかかるものであり、タンパク質工学における有力な方法であることがわかっている。この技術は典型的に、性質の変化した突然変異体を生成させる理論的根拠を与えるために、研究下のタンパク質の構造と機能の関係に関する情報を必要とする。対照的に、対象とするＤＮＡ領域のランダムな突然変異誘発と、適切なスクリーニングまたは選択処理法との組合せにより、構造に関する初期情報がなくても、改良されたまたは新しい機能を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質種を生成させるための代替的かつ一般的な方法が得られる。
大きなＤＮＡフラグメントの突然変異体を生成させるためのいくつかの方法が記載されており、これらはランダム配列合成オリゴヌクレオチドのプールの使用（Matteucci & Heyneker, Nucl. Acids Res. 1983 11, 3113; Wells et al. Gene 1985 34, 315; Nerr et al., DNA 1988 7, 127およびそこにおける参考文献）、標的配列の化学修飾（Kadonaga & Knowles, Nucl. Acids Res. 1985 13, 1733; Meyers et al, Science 1985 229, 242およびそこに記載の参考文献）または誤りがちのポリメラーゼを使用した塩基の誤った取込み（Lehtovaara et al, Protein Eng. 1988 2.63）を伴うものである。
合成オリゴヌクレオチドによるアプローチは、化学合成により影響を受けやすいＤＮＡの長さによって制約を受け、化学的アプローチは労力がかかることが多い。他のアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてランダム突然変異体を生成させる。そのような方法の１つは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの固有の誤り頻度に全面的に依存するものであり、１つの塩基対につき約０．５×１０-3の突然変異体をもたらす（Zhou, Nucl. Acids Res. l99l l9, 6052）。この方法を改良した変形例では、たとえば補因子マンガンの添加ならびに高濃度のマグネシウムおよび関連するデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTPs-Leung et al., Techniques 1989 1, 11参照）の使用により、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼで触媒されるＤＮＡ合成の忠実度をさらに低減する条件下で、対象とする標的配列が複製される。後者の処理法を用いて、１つの塩基対につき２０×１０-3のオーダーの突然変異頻度が主張されている。
ＰＣＲに基づくランダムな突然変異誘発に代わるアプローチは、４種の本来のヌクレオシドの５′−三リン酸エステルを部分的にまたは全体的に、両面性塩基対の可能性を示すヌクレオシド類似体の三リン酸エステルで置換することである。我々の知る限りでは、このアプローチはデオキシイノシン三リン酸−ｄＩＴＰ（Spee et al, Nucl. Acids Res. 1993 21, 777; Ikeda et al., J. Biol. Chem. 1992 267, 6291）を用いて試みられただけである。しかしながら、この類似体はＴａｑポリメラーゼには不十分な基質であり、４つの正常なｄＮＴＰのうちいずれかを置換えると、にＤＮＡ合成を持続させることができない。この結果、等しい濃度の３つのｄＮＴＰおよびｄＩＴＰを含むとともに、４番目のｄＮＴＰの濃度を制限した、４回の別個のＰＣＲ反応が必要である。次いで、４種の別個のＰＣＲ生成物がプールされクローン化される（上記のSpee et al．）。
上記の処理法の一般的な特徴は、突然変異体配列の収率が低く、かつ突然変異のパターンがトランジション（ピリミジン−ピリミジン置換またはプリン−プリン置換）に著しく偏るという点である。さらに、後者の２つの方法を用いると、かなりの割合で望ましくない塩基の付加または欠失が生ずる。
代替的なアプローチでは、トランジション突然変異を誘発させることが可能なピリミジンまたはプリンヌクレオシドの類似体の５′−三リン酸エステルと、トランスバージョン突然変異を引起こすことが可能な他の三リン酸エステル類似体とを組合せることにより、ＰＣＲによる効率のよいランダム突然変異誘発が可能になると考えられている。ヌクレオシド類似体Ｐ（Kong Thoo Lin & Brown, Nucl. Acids Res. 1989 17, 10373）およびＫ（Brown & Kong Thoo Lin, Carbohydrate Res. 1991 216, 129）（それぞれ図１に示される構造１および３）はこれまで既にオリゴヌクレオチドに組込まれてきており、図２のＰに関して示されるように両面性塩基対の可能性を示す。すなわち、Ｐはアデニンおよびグアニンとともに等しい安定性の塩基対を形成する。同様に、Ｋはチミンおよびシトシンとともに非常に類似した安定性の塩基対を形成する。さらに、これらの類似体を含むテンプレートＤＮＡは、ＰＣＲにおけるＴａｑポリメラーゼおよびＤＮＡ配列決定におけるＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）などのポリメラーゼによって認識される（Kong Thoo Lin & Brown, Nucleic Acids Res. 1992 20, 5149; Kamiya et al., Nucleosides & Nucleotides 1994 13, 1384; Brown & Kong Thoo Lin, Collect. Czech. Chem. Commun. （別刷），1990 55, 213）。本発明者は、図１の構造５として示される、８−オキソｄＧＴＰ（Pavlov et al, Biochemistry 1994 33, 4695）として省略される他の類似体、たとえば２′−デオキシ−８−ヒドロキシグアノシン５′−三リン酸が、トランスバージョン突然変異体を生成させるためにこの状況では有効であろうと考えた。
発明の概要
第１の局面において、本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。
0004053595.tif 000002
式中、Ｘ1＝Ｏ、Ｓ、Ｎ−アルキル、Ｎ+−ジアルキル、またはＮ−ベンジルであり、Ｘ2＝三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-、二リン酸（Ｐ2Ｏ6）3-、チオ三リン酸（Ｐ3Ｏ8Ｓ）4-、またはそれらの類似体であるが、Ｈではなく、さらにＸ3＝Ｈ、ＮＨ2、ＦまたはＯＲであり、ただしＲは任意の基であってよいが、好ましくはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである。
これらの化合物はこれまで合成されていなかった。好ましい実施例において、Ｘ2は三リン酸である。好都合には、Ｘ1はＯであり、好ましくはＸ3はＨまたはＯＨである。典型的には、ＲはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである。これまで合成されている（かつ本発明の範囲外である）化合物「ｄＰ」は上記の一般構造を有し、式中Ｘ1はＯであり、Ｘ2はＨであり（このためこの化合物は本発明の範囲内ではない）、Ｘ3はＯＨである。本発明の範囲内であり、その好ましい実施例を代表する新規な化合物は、ｄＰＴＰと名づけるｄＰの三リン酸エステルである。
本発明の化合物、特にｄＰＴＰは、先行技術からは予測できなかった予想外の特性（それらのいくつかは後に説明される）を有し、したがって本発明は自明ではない。本発明の化合物は（特にＸ3がＨまたはＯＨである場合に）ヌクレオシド三リン酸類似体として作用し得るため、幅広い可能な用途を有し、それらの用途のうち１つを以下に詳細に説明する。
本発明はまた、水素結合両面性プリンおよびピリミジンヌクレオシド三リン酸の合成ならびにＰＣＲに基づいたランダムな突然変異誘発におけるそれらの応用に関し、さらには簡単なクローニング方法によって単一の種がそれから得られるような画定されたもとのテンプレート配列に基づくポリヌクレオチドライブラリ（特に大きなライブラリ）の生成に関する。本発明は特に、（図１の）構造６に示されるタイプの新規な変性ピリミジンデオキシンヌクレオシド三リン酸を、好ましい実施例においては、（図１の）構造５および／または構造４に示されるタイプの類似体とともに、合成および使用することに関する。本発明は、既に公知の類似体８−オキソｄＧＴＰ（構造５、式中Ｒ′＝ＮＨ2）（Mo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992 89, 11021）に関連して、新規な三リン酸エステルｄＰＴＰ（図１の構造２であり、その合成は以下により詳細に説明される）の混合物を使用したＤＮＡ配列のランダムな突然変異誘発のためのＰＣＲに基づくシステムを用いて例証される。
したがって、本発明は、第２の局面において、先に規定した一般構造に従ったヌクレオチド類似体の存在下でテンプレート配列を複製し、それにより、ヌクレオチド類似体残基を含むテンプレート配列の、非同一な複製物を形成することを含む、核酸配列を突然変異させる方法を提供する。好ましい実施例において、ヌクレオチド類似体は６−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミド−［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン５′−三リン酸（デオキシＰ三リン酸またはｄＰＴＰとして省略される）である。
本発明の方法に用いるために、化合物の有用性を実質的に損なうことなく、ｄＰＴＰの構造をわずかに変形してもよいことが当業者には明らかであろう。したがって、このようにわずかに変形したｄＰＴＰの形態は、ｄＰＴＰの機能的に均等なものとして解することができ、それらの使用は先に規定した本発明の範囲内に入ると解釈される。このような変形した形態の具体例は図１の構造６に示され、式中ＸはＳ、Ｎ−アルキル（特にＮ−メチル、Ｎ−エチルまたはＮ−プロピル）、Ｎ+−ジアルキル（たとえばジメチル、ジエチルまたはジプロピル）またはＮ−ベンジル（ベンゼン環において置換基を有するかまたは有さないもの）とすることができる。類似体がＤＮＡの中に組込まれたときの位置Ｘにおける基は、かなり嵩張った基が都合よく収められるよう、二重らせんの主溝の中に突出するものと考えられる。ここに含まれる開示とともにLoakes & Brown（1995 Nucleosides and Nucleotides 14, 291）の刊行物に鑑みて、上記の変形および可能な他の変形が当業者には明らかとなるであろう。
この方法によって生成される「非同一な複製物」は、テンプレートから合成される（かつしたがってその複製であると考えられ得る）ＤＮＡ配列であるが、テンプレートに対して１つまたはそれ以上の突然変異を含むため、それと同一ではない。本発明によって達成される典型的な突然変異の頻度は１％から２０％の範囲であり、より特定的には２％から１０％であるが、ここに含まれる情報から当業者には、突然変異の頻度が所望のレベルの範囲になるよう調整可能である（これは本発明の利点である）ことが明らかであろう。しかしながら、多くの目的のためには突然変異の頻度の範囲は１％から２０％であることが好ましい。この範囲は、転写および／または翻訳の産物に顕著な変化が適当な確率で導入されるよう十分に高いものである一方、テンプレート配列の転写または翻訳の産物が有し得た所望の特性が不可避に損なわれるほど高くはないものである。
好ましくは、テンプレート配列は、酵素、望ましくは３，５′−エキソヌクレアーゼ「編集」機能を有さないＤＮＡポリメラーゼの使用を含む方法によって複製され、好都合には、典型的にはＴａｑポリメラーゼなどの耐熱性酵素を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実行によって複製される。好都合には、テンプレート配列は４つの正常なｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ）の付加的存在下で複製される。典型的にはｄＰＴＰは４つの正常なｄＮＴＰの大部分と実質的に等モル比で存在するであろう（しかしながら、後に説明するように、所望の突然変異の数および性質ならびに他の試薬が存在するかまたは存在しないかによって、相対的な濃度を有利に変更してもよい）。
好ましい実施例では、テンプレート配列は１つまたはそれ以上の付加的な類似体三リン酸エステルの存在下で複製される。望ましくは、このような付加的な類似体によりトランスバージョン突然変異が引起こされる。所望の類似体三リン酸エステルの適当な例には、ｄＫＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰ（上記）ならびにＯ2−エチルチミジン三リン酸が含まれる（Singer et al., 1989 Biochemistry 28, 1478-1483）。
テンプレート配列の非同一な複製物が得られると、ヌクレオチド類似体残基を置換し突然変異を「確立」するため、複製物は４つの正常なｄＮＴＰ（すなわちｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびＴＴＰ）が存在する一方それらの類似体が存在しない条件下で複製されることが望ましい。この第２段階の複製は、（たとえば、ベクターに挿入されているかまたはされていない非同一な複製物を、大腸菌または他の微生物などの適当な実験用生物に導入し、次いで、これらの生物が、導入されたＤＮＡにおけるｄＰＴＰ残基を本来のＤＮＡ修復機構によって置換することにより）インビボで行なってもよい。しかしながら、この第２段階の複製は好ましくはインビトロで行なわれ、好都合にはＰＣＲによって行なわれる。これにより、ＤＮＡ配列に導入しようとする突然変異の数およびタイプをさらに制御することが可能になり、（インビボでの第２段階の複製の実行と比較すると）宿主における修復酵素が、確立された突然変異に悪影響を及ぼすことが防がれる。本発明の方法は公知の先行技術の突然変異誘発法に勝るいくつかの利点を与えることが見い出されている。
第１に、点突然変異を保有する配列の頻度が高まり、この点突然変異は多くの研究目的のために、最も情報を与えるタイプのと突然変異である。第２に、この方法はわずかな頻度でのみ挿入および欠失の突然変異を引起こす。これは、重要である。なぜなら、このような突然変異はコード配列におけるフレームシフトを引起こし、よって一般的には望ましくないからである。さらに、所望のトランスバージョンおよびトランジション突然変異が高い割合でもたらされ、このようなトランジション突然変異のすべての可能なタイプを得ることができる。テンプレート配列を複製するためにＰＣＲを用いることは、突然変異の頻度の制御を可能にするため特に望ましい。驚くことに、発明者は、突然変異の頻度と行なわれるＰＣＲのサイクル数との間には実質的に線形の相関性があることを見い出した。この線形の相関性は約３０ＰＣＲサイクルまでの間持続し、より広い範囲に及び得る。さらに、デオキシヌクレオシド三リン酸（および／またはその類似体）の濃度を変更すると突然変異の頻度にさらなる影響が及ぼされる。
したがって、要約すると、本発明の方法にはこれまで示されたものとは多くの相違点があり、これらの相違点には、次のようなものが挙げられる。（ｉ）点突然変異を保有する高い頻度の配列をもたらすこと（ii）顕著な頻度で挿入および欠失を引起こさないこと（iii）比較的高い率でトランスバージョンおよびトランジション突然変異を引起こすこと（iv）すべての可能なタイプのトランジション突然変異およびいくつかのタイプのトランスバージョン突然変異を引起こし得ること（ｖ）単一のＤＮＡ増幅反応において効率のよい突然変異誘発を行なえること（vi）とりわけサイクル数、およびデオキシヌクレオシド三リン酸の割合により、増幅されたポリヌクレオチド生成における突然変異の積載量の制御を可能にすること、ならびに（vii）先行技術の方法を用いては問題があった（数キロベースまでの）非常に長い配列のランダム化に適していること。したがって、本発明に従ったヌクレオシド類似体の三リン酸エステル誘導体の、適当な混合物を用いることにより、ＤＮＡ配列のランダムな突然変異誘発を高度に制御できるようになり、この結果、既存の方法では効率よく達成できなかった、任意のＤＮＡにおけるヌクレオチド置換、および誘導されたポリペプチドにおける対応するアミノ酸置換が可能になる。
本発明の方法は、タンパク質工学において明らかな有用性を有する。また、ＲＮＡ分子の構造／機能の関係への関心は高まりつつある（たとえばBartel & Szostak 1993 Science 261, 1411-1418を参照）。
したがって、この方法は、変異した転写物（すなわちＲＮＡ）または翻訳物（すなわちポリペプチド）の合成に向けられる、ＤＮＡ配列のライブラリの構成に特に有用であろう。先行技術の方法に関連してこれまで提示された問題点に鑑みて、本発明は（数キロベースまたはそれ以上の）長い配列のライブラリの調製に特に有用であろう。このようなライブラリは他のランダムな突然変異誘発方法によっては生成できないものである。
さらなる局面において、本発明は、核酸配列に突然変異を引起こすためのキットを提供する。このキットは、ｄＰＴＰと、その存在下でテンプレート配列を複製してテンプレート配列の非同一な複製物に該類似体を組込むようにするための手段と、この方法を行なうための使用説明書とを含む。好都合には、テンプレート配列を複製するための手段はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なうための手段を含む。キットは８−オキソｄＧＴＰおよび／またはｄＫＴＰおよび／またはＯ2−エチルチミジン三リン酸をさらに有利に含み得る。
別の局面において、本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。
0004053595.tif 000003
式中、Ｙ1＝ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＮＨ2またはＮ（アルキル）2であり、Ｙ2＝Ｈ、またはＮＨ2であり、Ｙ3＝三リン酸（Ｐ3Ｏ9）4-、二リン酸（Ｐ2Ｏ6）3-、チオ三リン酸（Ｐ3Ｏ8Ｓ）4-またはそれらの類似体であるが、Ｈではなく、さらにＹ4＝Ｈ、ＮＨ2、ＦまたはＯＲであり、ただしＲは任意の基であってよいが、好ましくはＨ、メチル、アリルまたはアルカリールである。
好ましい実施例において、Ｙ1はＯＣＨ3であり、Ｙ3は三リン酸であり、さらにＹ4はＨまたはＯＨである。好ましい実施例の特定的な例は、ヌクレオチド類似体ｄＫＴＰである。本発明の化合物は、特にヌクレオチド類似体として、予期されなかった特性およびさまざまな応用の可能性を有する。化合物はたとえば、本発明の第２の局面に関連して先に説明したものに類似する、突然変異誘発法に用いることができ、その好ましい特徴は一般的にいずれの方法にも共通する。
さらなる局面において、本発明は、少なくとも１つの塩基類似体を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列をインビトロで生成させるための方法を提供し、この方法は、適当な条件において、４つの正常なｄＮＴＰ（またはｒＮＴＰ）および本発明による新規なヌクレオチド（またはリボヌクレオチド）三リン酸類似体を含む混合物を、テンプレート核酸鎖の存在下でＤＮＡ（またはＲＮＡ）ポリメラーゼによって処理し、それにより、少なくとも１つの類似体を含むヌクレオチド（またはリボヌクレオチド）の配列を形成するようにする。
次に、添付の図面を参照しつつ、例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。図面において、
図１は、さまざまな化合物１−６の構造式を示す図である。
図２は、アデニンおよびグアニンとのＰの塩基対合を概略的に示す図であり、塩基対合の両義性が有力なトランジション突然変異誘発効果の基礎を部分的になしている。
図３Ａおよび図３Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼによる、ｄＰＴＰ（Ａ）および８−オキソｄＧＴＰ（Ｂ）の、ＤＮＡへの取込みおよび伸長を示す、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の写真を示し、Ａ）ＰＣＲ反応混合物は、試料１においてｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰを含み、試料２においてｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ，ｄＰＴＰを含み、試料３においてｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ，ｄＰＴＰを含み、試料４においてｄＣＴＰ，ＴＴＰ，ｄＰＴＰを含み、試料５においてｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ，ｄＰＴＰを含み、試料６においてｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＰＴＰを含み、試料７においてｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＰＴＰを含み、試料８においてｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ，ｄＰＴＰを含んだ。ｄＰＴＰが１ｍＭであった試料４および７を除いて、すべてのｄＮＴＰは５００μＭであった。
Ｂ）ＰＣＲ反応混合物は、５００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰおよびＴＴＰを含んだ。試料１から４はそれぞれ５０μＭ，２５μＭ，１２．６μＭおよび６．２５μＭのｄＧＴＰを含有し、かつ５００μＭの８−オキソｄＧＴＰを含有した。試料５から８は同じようにｄＧＴＰの含有量を減らしていったが、８−オキソｄＧＴＰを含有しなかった。
図３Ｃは、４つの本来のｄＮＴＰ（レーン１から４）、等モル濃度の４つの正常なｄＮＴＰおよびｄＰＴＰ（レーン５から８）ならびに等モル濃度の４つの正常なｄＮＴＰ、ｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰ（レーン９から１２）の存在下での、異なるターゲット遺伝子のＰＣＲによる増幅を示す、ゲル電気泳動の写真である。テンプレートＤＮＡは、ヒトマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）（レーン１、５および９）、ヒトコネキシン３１（レーン２、６および１０）、ヒトコネキシン４３（レーン３、７および１１）またはヒトＣＤ３のζ鎖（レーン４、８および１２）であった。フラグメントのサイズはキロベースで図の横側に示される。すべてのフラグメントはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいてクローン化され、標準Ｔ３およびＴ７プライマーを用いてＤＮＡ増幅が行なわれた。
図４は、１２．５μＭ［32Ｐ］ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰおよびＴＴＰ（白四角）またはｄＰＴＰ（黒四角）の存在下でのＤＮＡ合成のタイムコースを示す。プライマーをつけられたＭ１３ｍＰ１８が、０．３ＵのＴａｑポリメラーゼの存在下でのＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いられた。図４Ｂおよび図４Ｃは、１２．５μＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰおよび［32Ｐ］ｄＣＴＰ、ならびに表示した濃度のｄＰＴＰ（Ｂ）およびＴＴＰ（Ｃ）の存在下における反応の最初の８０秒間のＤＮＡ合成速度を示す。
図５の上は、Ａに対向するｄＰＴＰ（Ａ）、Ａに対向するＴＴＰ（Ｂ）、Ｇに対向するｄＰＴＰ（Ｃ）およびＧに対向するｄＣＴＰ（Ｄ）のＴａｑポリメラーゼによる取込みに関する［ｄＮＴＰ］に対する初期速度のプロット図である。下は、実験で用いられたプライマーおよびテンプレートである（Seq ID No.3-5）。
図６は、ＰＣＲによる突然変異誘発の、異なったサイクルの後の標的ＤＮＡの突然変異の頻度を示す。４つの正常ｄＮＴＰおよび類似体が等モル量（５００μＭ）で用いられた。
図７は、ｄＰＴＰ、８−オキソｄＧＴＰおよびそれら２つの混合物によって引起こされた、突然変異のパターンを示す。異なった数のＰＣＲサイクル後に得られたデータはプールされ、図は、突然変異の総数のパーセンテージを表わす。
図８は、１２の個々のクローンの配列分析によって示されるように、標的ＤＮＡ配列ＭＨ２２（Griffiths et al., 1994 EMBO J. 13, 3245-3260）中のｄＰＴＰによって引起こされたすべての点突然変異および関係アミノ酸の置換をまとめて示す。表の上方にある数は、その標的配列に、特定のコドンが存在する回数を示す。白四角は特定のコドン内の単一の点突然変異を示す。黒丸は特定のコドン内の２つの点突然変異を示す。コドン内に３つの塩基置換が見い出された場合はなかった。影付区域の四角はサイレント突然変異を示す。
図９は、８つの独立したクローンの配列分析によって（図８の凡例として）示されるように、標的ＤＮＡ配列ＭＨ２２において８−オキソｄＧＴＰによって引起こされたすべて点突然変異および関係アミノ酸の置換をまとめて示すものである。*（Ｃ→Ａ）で示された点突然変異は通常、８−オキソｄＧＴＰの誤対合から生じることが予期されないものである。
図１０は、ｄＰＴＰ（丸）、８−オキソｄＧＴＰ（四角）およびそれら２つの組合せ（三角）によって引起こされるコドン変化を示す。黒い記号はコドン内の単一のヌクレオチド変化を示し、白い記号は同じコドン内の２つのヌクレオチド変化を示す。菱形は、予期されたものとは異なったヌクレオチド変化の存在を示す。アミノ酸はそれらの物理化学的な特性によって５つのクラスにグループ化され、これらのクラスとは、グリシン、非極性、極性、正に荷電および負に荷電である。星印は、研究された２つの標的遺伝子に存在していなかったコドンを示す。
図１１は、ＰＣＲ反応において４つの正常ｄＮＴＰと等モル量（５００μＭ）で用いられた場合の、ｄＰＴＰ（Ａ）、８−オキソｄＧＴＰ（Ｂ）およびそれら２つの混合物（Ｃ）によって引起こされた、標的ＤＮＡ配列ＭＨ２２（点線内、Seq ID No.1、アミノ酸配列はSeq ID No.2）における突然変異と、対応するアミノ酸の置換（点線の上）とを示す。各配列の５′−末端における最初の数は、類似体（１種または複数種）の存在下で許容されたＰＣＲサイクルの数を示す。２つ目の数は種々のクローンを特定する。
例１
ｄＰＴＰ，ｄＫＴＰおよび８−ｏｘｏｄＧＴＰの合成
ＰおよびＫの５′−三リン酸エステル誘導体はLudwigによって説明されている一般的な手順によって調製された（Ludwig, Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. 1981 16, 131）。８−オキソｄＧＴＰは（上記のMo et al.,）に記載のｄＧＴＰから調製された。陰イオン交換クロマトグラフィー（ＰおよびＫ）と、その後の逆相ＨＰＬＣ（Ｐ、Ｋおよび８−オキソＧ）とによる精製により三リン酸エステル試料が得られ、これは1Ｈ  ｎｍｒ、31Ｐ  ｎｍｒおよびＨＰＬＣによって純粋であると判断された。
Ｔａｑポリメラーゼのための基質としてのｄＰＴＰ，ｄＫＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰ
３５０塩基対のＤＮＡ配列を増幅するようＴａｑポリメラーゼおよび３０ｘ（９２℃、１分；５５℃、１．５分；７２℃、５分）のＰＣＲプログラムを用いると、ｄＰＴＰが完全にＴＴＰを置換し、４つの正常三リン酸エステルを用いて得られたものに匹敵する量の生成物が得られ（図３Ａ）、かつある程度ｄＣＴＰを置換することができるとわかった。対照的に、ｄＫＴＰはごく限られた程度でしかｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを置換することができなかった（しかしながら所望レベルの突然変異誘発を引起こすにはこのような低レベルの置換で十分であろう）。８−オキソｄＧＴＰが用いられた場合、正常なまたは制限した量のｄＧＴＰを用い、かつより高い濃度の８−オキソｄＧＴＰで補うことにより、ＤＮＡ中へのいくらかの取込みおよびその伸長を示すことができた。図３Ｂ（レーン１から４）は、５００μＭのｄＡＴＰ，ＴＴＰ，ｄＣＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰならびに（５０μＭから６．２５μＭまで）量を減らしていったｄＧＴＰを用いて得られたＰＣＲ生成物を示す。レーン５から８は、８−オキソｄＧＴＰが存在しないときに同じ条件を用いて得られたＰＣＲ生成物を示す。
Ｔａｑポリメラーゼによる、ｄＰＴＰの取込みの速度論
ＰＣＲに用いられる、酵素Ｔａｑポリメラーゼのための基質としてのｄＰＴＰの性能を評価するために、その取込み速度が分析され、ＴＴＰと比較された（これは、最初の実験により、その特性がこの本来の三リン酸エステルのものと最もよく似ていることが示されたからである）。図４Ａは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰにＴＴＰまたはｄＰＴＰを加えたものの存在下におけるＤＮＡ合成の速度を示す。ＤＮＡ合成は、７２℃において、プライマーをつけたＭ１３テンプレートを用いて［α−32Ｐ］ｄＣＴＰを取込むことにより測定された。ｄＰＴＰまたはＴＴＰのいずれかが存在した場合、取込みは初めの８０秒において線形的に増加した。異なった濃度の基質に関する取込み速度を計算するために、両三リン酸エステル誘導体が、線形の合成速度をもたらす区間上の時点が選択された（図４Ｂおよび図４Ｃ）。濃度が高い場合、ＤＮＡ合成の速度は時間とともに線形的に増加しなかったため、ｄＰＴＰには５０μＭより低い濃度を用いる必要があった（図４Ｂ）。ＴＴＰについては、経時的な取込み速度の、測定可能な差がでるようにするために、１．２５μＭ〜２５μＭの濃度が用いられた（図４Ｃ）。ＴＴＰおよびｄＰＴＰに関する見かけのＫm値は、直接的な線形プロット法によって実験データを解析することにより決定された（Eisenthal and Cornish-Bowden, 1974 J. Biochem. 139, 715）。これらの実験条件下でのｄＰＴＰに関する見かけのＫmは２２μＭであり、ＴＴＰについては９．２５μＭであった。したがって、ｄＰＴＰに関する値は、４つの本来のｄＮＴＰ［１４μＭ−１７μＭ］に関する文献（Kong et al. 1993）において報告されているものに好都合に匹敵する。
テンプレートのアデニンおよびグアニン残基に対するｄＰＴＰの挿入の、相対的な効率をそれぞれ比較するために、我々は、プライマーをつけた２つの合成オリゴヌクレオチドテンプレートのうち一方を用いて定常状態の速度論を決定するべく、Boosalis et al. （Boosalis et al., 1987 J. Biol. Chem. 262, 14689-14696）の処理法を採用した（図５）。各場合の32Ｐ標識プライマーは、２つの位置におけるｄＧＴＰの取込み、続いてｄＰＴＰ（テンプレート１および２）、ＴＴＰ（テンプレート１）またはｄＣＴＰ（テンプレート２）の取込みにより伸長された。ＰＡＧＥによって生成物を分離し、その後PhosphorImagerを用いて放射活性の定量化を行なうことにより、初期速度の決定が可能になった（Boosalis et al., 1987）。Ｔａｑポリメラーゼの伸長速度は非常に高いため、５５℃で速度論的パラメータが測定された。テンプレートに対する特定の三リン酸エステルの挿入についての速度（Ｖmax）および特定の挿入についてのＫm値（μＭ）は、ミカエリス・メンテンの式にあて嵌まる非線形回帰によって決定された。
ｖ対基質濃度［Ｓ］のプロットがそれぞれ図５Ａから図５Ｄにおいて４つの可能性ＰＡ、ＴＡ、ＰＧおよびＣＧに関して示され、速度論的パラメータおよび触媒効率（Ｖmax／Ｋm）は表１に示される。この結果は、Ｔａｑポリメラーゼによるその認識という点においてｄＰＴＰはＴＴＰと実質的に区別できないことを示す。さらにそれは、テンプレートのグアニン残基よりもアデニン残基に対向してほぼ３倍効率よく取込まれた。
８−オキソｄＧＴＰについてのＫm値は、ここに記載したものに類似した処理法を使用する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントを用いて報告されている（Purmal et al., 1994）。ＣおよびＡに対向する挿入に関する６３および５８μＭの値がそれぞれ３７℃で得られ、これらは、正常ｄＮＴＰに関するおよそ１μＭの平均値に匹敵する（Purmal et al., 1994 Nucl. Acids Res. 22, 3930-3935）。また、この類似体は熱安定性ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに対する基質となり、約１％の割合でＡ→Ｃトランスバージョンを引起こすことが示されている（Pavlov et al., 1994 Biochem. 33, 4695-4701）
0004053595.tif 000004
ｄＰＴＰ、８−オキソｄＧＴＰおよびそれらの混合物によって誘発された突然変異頻度
ｄＰＴＰまたは８−オキソｄＧＴＰがＤＮＡ合成反応に用いられた場合に生じる突然変異を調査するために、ＰＣＲ反応が設定され、ここに４つの正常ｄＮＴＰに等モル濃度でｄＰＴＰが添加された。ＤＮＡは種々のサイクル数で増幅され、組込まれた塩基の類似体を除去するため、増幅されたＤＮＡのアリコートが、４つの正常ｄＮＴＰのみを用いた第２のＰＣＲ増幅においてテンプレートとして用いられた。ＰＣＲ生成物はその後クローン化され、クローンのうちいくつかは配列決定された（この方法で、突然変異のパターンは大腸菌宿主のＤＮＡ修復メカニズムによって影響を受けなかった）。図６は、等モル濃度の４つの正常ｄＮＴＰおよびｄＰＴＰ（□）、または８−オキソｄＧＴＰ（◇）またはｄＰＴＰ＋８−オキソｄＧＴＰ（○）の存在下で増幅されたＤＮＡにおける、点突然変異の累積を示す。データは次の３つのことを意味する。すなわち、（ｉ）ＰＣＲの３０サイクル後には非常に高い突然変異頻度が得られ、これらの頻度は他の方法によって報告されているものよりも高い。（ii）１つのクローンあたりの突然変異の数はサイクル数によって調節可能である（図６）。（iii）２つの類似体の組合せが用いられた場合、突然変異収率は単独の場合よりも高い。
ｄＰＴＰ、８−オキソｄＧＴＰおよびそれらの混合物によって生成された突然変異パターン
ヌクレオシドｄＰおよび８−オキソｄＧの塩基対合の能力は異なるため（アデニンまたはグアニンとのｄＰ対合−（図２に示される上記のKong & Brown Nucl. Acids Res. 1989）およびアデニンまたはシトシンとの８−オキソｄＧ対合（上記のPavlov et al., Kuchino et al, Nature 1987 327, 77; Monya, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 90, 1122））、本発明者は２つの類似体三リン酸エステルおよびそれらの組合せによって生ずるヌクレオチド変化を分析した。この結果は図７に示され、配列決定されたすべての突然変異のパーセンテージとして表わされる。図は、ｄＰＴＰが４つのトランジション（Ａ→Ｇ，Ｔ→Ｃ，Ｇ→ＡおよびＣ→Ｔ）を引起こすことを示す。２つのトランジション（Ａ→ＧおよびＴ→Ｃ）は、他の２つのトランジション（Ｇ→ＡおよびＣ→Ｔ）よりも高い頻度で起こる。これは、テンプレート配列におけるアデニンに対向するｄＰＴＰの挿入が優先する結果として生ずる。（図２に示されるように）Ｐの両面性塩基対合の能力により、ｄＰＴＰの取込み時か、または取込み後のその複製のいずれかにおいて、トランジション突然変異が引起こされる。８−オキソｄＧＴＰは、いずれの鎖についてもＴＴＰの代わりに取込まれ、続いて、これまで観察されたようにｄＣＴＰの挿入を導く結果、２つのトランスバージョン（Ａ→ＣおよびＴ→Ｇ）を引起こす（Pavlov et al., Mo et al., and Kuchino et al., すべて上述したもの）。単一のＤＮＡ合成反応において両類似体を用いることにより、同等の頻度での２つの塩基類似体によって突然変異が引起こされる。さらに、いくつかの付加的な突然変異（たとえばＣ→Ｇ）が観察される。ｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰによって誘発される、それぞれのタイプのヌクレオチド変化は、突然変異体のアミノ酸配列に、結果として効果を及ぼす。ｄＰＴＰおよび等モル濃度の４つの正常ｄＮＴＰの存在下で得られた１２の突然変異体クローンの配列決定は、テスト配列中に存在する４３個のコドンのうち４０個が、代替的なものに突然変異したことを示した（図８）。８−オキソｄＧＴＰおよび等モル濃度の４つの正常ｄＮＴＰの存在下で得られた８つの突然変異体クローンの配列は、１８個のコドンが置換されたことを示した（図９）。注目すべきことは、両方の類似体がいずれも、ある点突然変異を引起し得る一方、他の突然変異は、ｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰの両方が存在することによってのみ引起こされ、そのことは、ヌクレオシド類似体の三リン酸エステル誘導体の適当な混合物の使用が、ランダムな突然変異をＤＮＡに導入するための有力な手法になることを示しているということである（図１１）。
図１１は、下記の等モルヌクレオチド混合物が用いられた場合の、一連の突然変異誘発実験の結果を示す。すなわちこれらの等モルヌクレオチド混合物とは、４つの正常ｄＮＴＰおよびｄＰＴＰ（図１１Ａ）と、４つの正常ｄＮＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰ（図１１Ｂ）と、４つの正常ｄＮＴＰ、ｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰ（図１１Ｃ）とである。第２の標的遺伝子に、同様な実験を行ない、同様な結果が得られた（データは図示せず）。図１１に示されるように、クローンの指定符号において点の前にある数の、種々のサイクル数でＤＮＡ増幅反応を行なった。データより、テストされた３つの実験条件下で、かなりの数の点突然変異が標的遺伝子に引起こされたが、ｄＰＴＰは８−オキソｄＧＴＰよりもはるかに効率の良い突然変異原であることが明らかになった。データはまた、ＤＮＡ増幅反応に用いられたサイクル数の関数として突然変異数が増加したことを明らかにしている。突然変異の頻度をＰＣＲサイクル数に対してプロットした場合（図６）、少なくとも３０サイクルまでは、８−オキソｄＧＴＰ、およびｄＰＴＰと８−オキソｄＧＴＰとの混合物に関する場合の両方において線形的な関係が明らかになった。ｄＰＴＰの場合、この関係は初めの２０サイクルについて線形的であった。より小さいサイクル数の場合、２つの三リン酸エステル類似体の組合せでは、ｄＰＴＰ単独によって引起こされたものよりも明らかに突然変異の総数が小さかったが、このような反応において生成されたＤＮＡにはｄＰ−誘発突然変異および８−オキソｄＧ誘発突然変異の両方が含まれた（以下参照）。
異なった数のＰＣＲサイクル後に配列決定されたクローンが別々のＰＣＲ反応物から得られたが、特定の位置における塩基が他のものよりより頻繁に突然変異されたことに注目すると興味深い。ただし、突然変異は明らかに遺伝子配列全体にわたって累積するようである。
クローン化挿入物において配列決定された塩基およびｄＰＴＰ、８−オキソｄＧＴＰおよびそれらの組合せによって引起こされた突然変異の合計数は表２に示される。ｄＰＴＰ、８−オキソｄＧＴＰおよびそれらの組合せによって引起こされた突然変異のパターンは図７に示される。したがって、ｄＰＴＰによって引起こされた突然変異のうち、４６．６％ではＡ→Ｇであり、３５．５％はＴ→Ｃであり、Ｇ→Ａは９．２％であり、Ｃ→Ｔは８％であった。主な突然変異事象（Ａ→ＧおよびＴ→Ｃトランジション）は、いずれの鎖においても、Ａに対向するｄＰＴＰの取込みが優先し、組込まれたＰとＧとがその後対になることから引起こされる。より短い伸長物では、いずれの鎖においても、Ｇに対向するｄＰＴＰの取込みおよびその後のＰとＡとの対合（Ｇ→ＡおよびＣ→Ｔトランジション）がさらに起こる。上記の４つのトランジションに加えて、配列決定された４０９３ｂｐから、１つのＴ→Ｇおよび２つのＡ→Ｔトランスバージョンが見い出された（図７参照）。
0004053595.tif 000005
８−オキソｄＧＴＰによって生成された突然変異体では、２つのタイプのトランスバージョン突然変異、すなわちＡ→Ｃ（38.8％）およびＴ→Ｇ（59％）が存在した。これらはいずれのテンプレート鎖においても、Ａに対向する８−オキソｄＧＴＰの誤った取込みにより誘導される（Shibutani et al., 1991 Nature 349, 431-434）。配列決定された５４６３ｂｐから１つのＣ→Ａトランスバージョンが見い出された。この突然変異は、テンプレートにおけるＣに対向する８−オキソｄＧＴＰの取込み、その後の複製時におけるテンプレート８−オキソｄＧに対向するｄＡＴＰの誤った取込みによって引起こされたと考えられる。８−オキソｄＧＴＰに関するこの突然変異原性のメカニズムは、８−オキソｄＧＴＰが完全にｄＧＴＰを置換したときに起こるとしてこれまで報告されている（Cheng et al., 1992 J. Biol. Chem. 267, 166-172）。ごく小数の付加的な突然変異も見い出され、これらは２つのＡ→Ｇトランジションおよび１つのＧ→Ａトランジションであった。
ｄＰＴＰおよび８−ｏｘｏｄＧＴＰをともに組合せることによって突然変異誘発されたクローンから、これらの条件下で観察された突然変異のパターンを図９に示す。２つの三リン酸エステル類似体の組合せから予期されたすべてのタイプのトランジションおよびトランスバーション突然変異が観察されたが、それらのそれぞれの頻度は、ｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰ突然変異の、組合せた頻度に基づいて予測されたものとはわずかに異なった。２つの類似体の混合物は、付加的な突然変異の頻度をさらに増加させた（１ｘ１０-3）。
配列決定された合計１３，３０７ｂｐについて両方の類似体を用いたところ、挿入および単一の２ヌクレオチド欠失は見い出されなかった。
ｄＰＴＰによって誘発された４つのトランジション突然変異および８−オキソｄＧＴＰによって誘発された２つのトランスバージョン突然変異の効果をコドンレベルでさらに分析した。図１０はこの分析結果を示す。図は、アミノ酸を５つのクラス、すなわちグリシン、非極性、極性、正に荷電および負に荷電に分類し、ｄＰＴＰ突然変異誘発（丸）、８−オキソｄＧＴＰ突然変異誘発（四角）およびそれらの組合せ（三角）から得られたコドン変化を示す。単一の塩基置換から生じたコドン変化は黒い記号で示され、二重置換によって生じたコドン変化は白い記号で示される。
ｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰによって誘発された突然変異における明らかな偏りにもかかわらず、これらの類似体またはそれらの組合せの使用により、広範なコドン変化の達成が可能になった。モデルテンプレートとして用いられた２つの遺伝子には、可能な６４個のコドンのうち５１個が含有された（いずれの遺伝子にも存在しないコドンは図１０において星印が記されている）。存在する５１個のコドンのうち５０個は、ｄＰＴＰ、８−ｏｘｏｄＧＴＰまたはそれらの組合せによって突然変異された。
データベースに１回以上見い出された２２４個のコドン変化のうち、４９個はサイレントであり、６６個は同じクラスの別のものにアミノ酸を変化させ、１０５個は異なったクラスのうちの１つにアミノ酸を変化させ、４個は終止コドンになった。
したがってこれらの結果は、ｄＰＴＰおよび／または８−オキソｄＧＴＰ突然変異誘発によって広範囲のアミノ酸置換を引起し得ることを示す。
実験の詳細
６−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミド−［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７オン５′−三リン酸，トリエチルアンモニウム塩（ｄＰＴＰ）（構造２）
５４ｍｇの０．２モルのＰヌクレオシド（上記のKong Thoo Lin & Brown 1989）を８０℃でＰ2Ｏ5によって真空下で一晩乾燥し、その後、アルゴン下で乾燥トリメチルホスフェート（０．５ｍＬ）中に懸濁した。氷浴中でフラスコを冷却し、塩化ホスホリル（２１μＬ）を攪拌しながら注入した。氷浴中で４５分間攪拌した後、ビス−トリブチルアンモニウムピロホスフェートの攪拌混合物（無水ＤＭＦ中で０．５Ｍ、１．０ｍＬ）（Ludwig & Eckstein J. Org. Chem. 198954, 631）、トリブチルアミン（０．２ｍＬ）および無水ＤＭＦ（０．４ｍＬ）を迅速に攪拌しながら氷中において加え、１０分後に、重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ７．５、０．１Ｍ、２０ｍＬ）を加えた。１時間後に試料を水（２０ｍＬ）で希釈し、０．０５Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム溶液を含有するセファデックスＡ２５のカラム（直径２５ｘ３３０ｍｍ）にかけた。カラムには、４℃で直線的な勾配の重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（０．０５−０．８Ｍの各々に対し１．５Ｌ）を流した。Ｐの５′三リン酸エステルは０．４８Ｍ以上０．５４Ｍ以下の緩衝液で溶出した。三リン酸エステルを含有するフラクションを合わせて蒸発させ、残渣をメタノールとともに蒸発させ、その後水（１０ｍＬ）中に溶解させた。生成物は、Waters 7.8 x 300mm C18セミ分取カラムおよび０．１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．５中の直接的な勾配の０−４．５％のアセトニトリルを２．５ｍＬ毎分の流速で用いる、逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。適当なフラクションを合わせて蒸発させ、残留緩衝液をメタノールとともに蒸発させて除去し、テトラキストリエチルアンモニウム塩として純粋な三リン酸エステルを得た。（ｐＨ７において２５３Ａ260、０．０６７ｍモル、３４％）δ（Ｄ2Ｏ）−９．５７（ｄ，γ−Ｐ），−１０．３４（ｄ，α−Ｐ），−２２．０２（ｔ，β−Ｐ）。ＨＰＬＣの保持時間は約１８．５分であった。
２−アミノ−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−６−メトキシアミノプリン５′−三リン酸、トリエチルアンモニウム塩．（ｄＫＴＰ）（構造４、ただしＲ′＝ＮＨ2）
２９．６ｍｇ（０．１モル）のＫヌクレオチド（上記のBrown & Kong Thoo Lin 1991）を８０℃でＰ2Ｏ5によって真空中で一晩乾燥させ、その後アルゴン下で乾燥トリメチルホスフェート（０．２５ｍＬ）中に懸濁した。氷浴中でフラスコを冷却し、塩化ホスホリル（１２μＬ）を攪拌しながら注入した。氷浴中で７０分間攪拌した後、ビス−トリブチルアンモニウムピロホスフェート（無水ＤＭＦにおいて０．５Ｍ、０．５ｍＬ）、トリブチルアミン（０．１ｍＬ）および無水ＤＭＦ（０．２ｍＬ）の、よく攪拌された混合物（上記のLudwing & Eckstein参照）を迅速に攪拌しながら加え、７．５分後に重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ７．５、０．１Ｍ、５ｍＬ）を加えた。１時間後に、試料を水（３０ｍＬ）で希釈し、０．０５Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ７．５）を含有するセファデックスＡ２５のカラム（直径２６×２２０ｍｍ）にかけた。カラムには、４℃おいて直線的な勾配の重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（０．０５−０．８Ｍの各々に対し１Ｌ）を流した。所望のＫの５′三リン酸エステルを０．５０Ｍ以上０．６８Ｍ以下の緩衝液で溶出した。三リン酸エステルを含有するフラクションを合わせて蒸発させ、その後、残渣をメタノールとともに蒸発させ、水中（１０ｍＬ）に溶解させた。生成物は、Waters 7.8 x 300mm C18セミ分取カラムおよび０，１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．５中の直線的な勾配の０−４．５％アセトニトリルを用いる、逆相ＨＰＬＣによってさらに精製された。適当なフラクションを合わせて蒸発させ、残留緩衝液をメタノールとともに蒸発させることにより除去し、テトラキストリエチルアンモニウム塩として純粋な三リン酸エステルを得た。（４４６Ａ260、ｐＨ７、０．０４３ｍモル，４３％）δ（Ｄ2Ｏ）−１０．３７（ｄ，γ−Ｐ），−１０．８９（ｄ，α−Ｐ），−２３．６２（ｔ，β−Ｐ）。ＨＰＬＣの保持時間は約１４．７分であった。
２′−デオキシ−８−ヒドロキシグアノシン５′−三リン酸，トリエチルアンモニウム塩（８−オキソｄＧＴＰ）（構造５、ただしＲ′＝ＮＨ2）
この化合物は本質的に（上記の）Mo et al. に従って調製された。したがって、３０ｍＭのアスコルビン酸と１００ｍＭの過酸化水素とを含有する１００ｍＭのリン酸ナトリウム（８ｍＬ）中ｄＧＴＰ（三ナトリウム二水和物、５８．４８ｍｇ、９６μモル）を３７℃で４時間、暗所にてインキュベートした。生成物は、Waters 19 x 300mm C18分取カラムおよび０．ｌＭの重炭酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．５中の直線的な勾配の０−１５％アセトニトリル（流速７．５ｍＬ／分）を用いて逆相ＨＰＬＣによって直接的に精製した。適当なフラクションを合わせて、蒸発させ、残留緩衝液をメタノールとともに蒸発させることにより除去し、テトラキストリエチルアンモニウム塩として純粋な三リン酸エステルを与えた。吸収スペクトルは、（上記の）Mo et al. およびWallace et al., （Nucl. Acids Res. 1994 22, 3930）によって説明されたものと同じであり、すなわち１２．３Ａ244、１０．３Ａ293、ｐＨ７、５．２μモル、５．４％であった。δ（Ｄ2Ｏ）−９．６８（ｄ，γ−Ｐ），−１０．４６（ｄ，α−Ｐ），−２２．４０（ｔ，β−Ｐ）。ＨＰＬＣの保持時間は約２７．９分、ｄＧＴＰは２６．０分であった。
以上には、この発明の範囲内である特定の新規な化合物（ｄＰＴＰ）の合成方法に関する詳細な説明を記載した。ここに含まれる開示によれば、当業者にはこの発明の範囲内である他の化合物の合成方法も明らかなはずである。たとえば、ｄＰのリボヌクレオチド均等物（ｒＰ）を調製するために、上記のジ−ｐ−トルオイル−２−デオキシリボシルクロリド化合物の代わりに、（溶解度を改善するために）トリアセチルリボフラノシルクロリドを用いて、（適当な出発原料を用いて）本質的に同じ合成経路を採用することができる。
突然変異誘発
突然変異誘発実験では、０．５μＭの適当なセンスおよびアンチセンスポリマー、２ｍＭのＭｇＣｌ2、10ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｇ／ｌのゼラチンならびにそれぞれ５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＰＴＰおよび／または８−オキソｄＧＴＰを含有する２０μｌの反応物において０．５μｌのAmpliTaqポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ，Applied Biosystems）を用いて、１０ｆモルのテンプレートＤＮＡを増幅した。さまざまなサイクル（９２℃で１分間、５５℃で１．５分間、７５℃で５分間）後、反応混合物にｄＰＴＰまたは８−オキソｄＧＴＰが加えられなかったことを除けば上記と同じ条件が用いられた第２のＰＣＲにおいて、増幅された１μｌの材料が用いられた。第２のＰＣＲの生成物はＢｓｔＥＩＩおよびＰｓｔＩで消化され、Ｍ１３ＶＨＰＣＲｌベクターにクローン化された（Jones et al., 1986 Nature 321, 522-525）。単ファージ分離物から調製された一本鎖ＤＮＡの配列分析は、製造者によるSequenase Version ２（United States Biochemicals, Cleveland,OH）を用いて行なわれた。
例２
触媒活性が改善された酵素のランダムな突然変異誘発および選択
分子進化に向けられたインビトロの実験における、突然変異誘発法の可能性を調査するために、モデルシステムとして酵素ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼを用いた。
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム環の加水分解を触媒し、かつ不活性生成物を生成させることにより、アンピシリンおよびセファロスポリンなどのβ−ラクタム抗生物質に対する細菌の耐性に寄与する。ＴＥＭ−１は、機能を改善するための非常に効率のよい化学的選択を適用することができるため、特に魅力的なモデルシステムである。このため、該モデルは、スクリーニング／選択法の不十分な分解能によって制限されることなく、突然変異誘発法自体の能力を評価できるようにする。
この実験では、ランダムな突然変異誘発および抗生物質の濃度を増加させていく選択を繰返すことにより、加水分解されにくい基質であるセフォタキシム［最小阻害濃度（ＭＩＣ）＝０．０２μｇ／ｍｌ］について、酵素ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼの加水分解活性を向上させることに着手した。１回目に選択された最良の突然変異体は、より高濃度の抗生物質の存在下で、２回目の突然変異誘発および選択に供される。選択圧力を漸進的に増加することにより、ＴＥＭ−１加水分解活性の効率が段階的に向上する。
プラスミドｐＢＲ３２２からの野生型ＴＥＭ−１遺伝子は、４つの正常ｄＮＴＰに加えてｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰの存在下で、ＰＣＴ増幅のためのテンプレートとして用いられた。生成された突然変異体のプールはベクターｐＢＣ  ＫＳ+においてクローン化され、突然変異体のライブラリは電気穿孔法によって大腸菌に導入された。その後、形質転換された細菌は、増加する濃度の抗生物質セフォタキシム上で平板培養された。０．０２μｇ／ｍｌのＭＩＣよりも高い濃度のセフォタキシム上で増殖する細菌は、この基質について、加水分解活性の向上したＴＥＭ−１の突然変異体を保持する。選択された突然変異体は配列決定法によって分析され、１回目の突然変異誘発および選択の結果は表３Ａに示される。独立した、４つの変異体のライブラリ（ｌｉｂＡ，ｌｉｂＢ，ｌｉｂＣおよびｌｉｂＤ）を生成させるために、異なったサイクル数の突然変異誘発ＰＣＴが用いられ、生成されたライブラリの各々は、選択されていないクローンの配列分析によって決定されるように、異なった頻度の突然変異（ｌｉｂＡについては０．３％、ｌｉｂＢについては０．３％、ｌｉｂＣについては１．８％、かつｌｉｂＤについては６．３％）を特徴とした。各ライブラリのアリコート（〜５ｘ１０4ｃｆｕ）は０．２μｇ／ｍｌのセフォタキシム（ＭＩＣの１０倍）上で平板培養され、３７℃で２４時間インキュベーションした後に平板を検査すると、いくつかのコロニー（＞５０コロニー／プレート）が現れた。表３Ａは、これらの平板上で増殖した、選択されたクローンの配列分析の結果を示す。星印はサイレント突然変異を示し、アミノ酸の番号付けはAmbler et al. （Biochem. J., 1991 266, 3186）に従う。下線付の残基はリーダーペプチドに属する。選択されたクローンのうち多くは、サイレントおよびコード突然変異の両方を引起こす、複数のヌクレオチド置換を含む。興味深いことに、特定の位置（たとえばＬ２１Ｐ、Ｖ２３Ａ、Ｇ２３８ＳおよびＥ２４０Ｇなどを参照）における突然変異は、個々に独立して生成されたライブラリにおいて数倍になることがわかった。
０．２μｇ／ｍｌのセフォタキシム上で増殖するコロニー数が多いことから、我々は、より高い濃度の抗生物質上で増殖し得る突然変異体を探し求めることにした。すべてのコロニーが平板からかき取られ、肉汁中で溶解し、各ライブラリからのアリコートが２μｇ／ｍｌのセフォタキシムを含有する培地で平板培養された。平板は３７℃で２４時間インキュベーションされ、その後コロニー増殖について検査された。選択されたクローンは配列決定され、結果は表３Ｂに示される。Ｇ２３８Ｓ突然変異を含んだものを除いてすべての突然変異体が配列決定された。唯一の例外は、Ｒ１６４Ｓ突然変異を含むクローンである。これらの突然変異はいずれも、セフォタキシム上での加水分解活性が向上したことを示すＴＥＭ−１β−ラクタマーゼの天然分離物において見い出されたものである。クローン６ａは、Ｇ２３８Ｓに加えてＲ２４１ＨおよびＤ２５２Ｇ突然変異を含む。その酵素活性と、単一の突然変異Ｇ２３８Ｓの酵素活性とを比較すると、＞２０μｇ／ｍｌ上で増殖するコロニーでは少なくとも１０倍高いことがわかった。
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これらの予備的結果は、三リン酸エステル類似体を用いたＰＣＴによるＤＮＡのランダムな突然変異誘発が、改良された性能を示す変異体をその中から選択することが可能なタンパク質突然変異体の大きなプールを生成させるために有効であることを示す。我々が提案する方法では、非常に効率のよい多数の突然変異体を生成させ、突然変異の頻度の制御を可能にする。このため、うまく平均のライブラリサイズ内に入る比較的少数の変異体（〜１０5）をスクリーニングすることにより、改良された触媒活性を有する酵素突然変異体を選択することが可能であった。さらに、突然変異の頻度が制御でき、１つの遺伝子について１以上のヌクレオチド置換を平均して導入できるため、突然変異がＴＥＭ−１加水分解活性の効率に協同作用を明らかに及ぼす三重突然変異体を、単一ステップの突然変異誘発および選択において分離することが可能になった。
考察
ここに記載したアプローチのさらなる開発を考える。第１に、単一により近い互変異性定数を示す、密に関連した類似体を生成させるｄＰＴＰの修飾は、４つの可能なトランジション突然変異すべての間での均衡性を調節するであろう。２つ目は、ｄＰＴＰ（または関連する）類似体および８−オキソｄＧＴＰの両方が組合せられて用いる実験における、トランジション対トランスバージョン突然変異の比に関する。ここに報告した実験では、類似体はいずれも５００μｍの濃度で用いられたが、ｄＰの取込みおよび／または伸長の速度を高めると、ｄＰ誘発突然変異の頻度は高まる。それらの速度論の違いを補償するようｄＰＴＰおよび８−オキソｄＧＴＰの濃度を調節した、突然変異誘発反応からは、同等の数のトランジションおよびトランスバージョンが得られるはずである。最後に、６つのトランスバージョン突然変異（Ｃ→Ｇ，Ｇ→Ｔ，Ｔ→Ａ，Ａ→Ｔ，Ｃ→ＡおよびＧ→Ｃ）はいずれもｄＮＴＰ混合物によって引起こされることはなく、さもなくばそれらは非常に低い頻度で引起こされることが明らかである。したがって、低頻度にもかかわらずＡ→Ｔトランスバージョンを誘発する、Ｏ2−エチルチミジン三リン酸などの他の類似体（Singer et al. 1989）を、トランスバージョン突然変異の範囲を拡張するために用いることができよう。
インビトロでの点突然変異誘発の後に選択を行なうことは、明らかにタンパク質進化の重要な局面を模倣することを目的としているが、タンパク質工学の本来の戦略は、遺伝子挿入、欠失、複製および組換えといったさまざまな他のプロセスにも等しく依存することが明らかである。インビトロでこれらの事象を再発生させ、タンパク質工学の可能性を活用することを目的とする手法が開発中である。このような手法の１つでは、ＤＮアーゼ処理によって得られる遺伝子フラグメントが、ランダムな組換えを促進するプロセスにおいてＰＣＲによって再度組立てられる（Stemmer, 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751）。このアプローチの有効性は、β−ラクタマーゼ突然変異体の工学にそれを応用することにより明らかに示されており、これらのうち１つは、大腸菌において発現されるときに、野生型酵素と比較して、最小阻害濃度における３２，０００倍の増加を示した（Stemmer 1994 Nature 370, 389-391）。しかしながら、野生型酵素と比較すると、改良した突然変異体の配列には５つの点突然変異しか含まれなかったことが興味深い。このことは、Stemmerのプロトコルにはかなりの割合の点突然変異誘発が伴い、少なくともβ−ラクタマーゼの例では、このような点突然変異が、真の組換えの不在下で酵素の突然変異にもっぱら寄与することを示している。それにもかかわらずこの結果は、点突然変異誘発がインビトロでのタンパク質工学に関する有力なアプローチであるという概念を強化し、点突然変異誘発を組合せた組換えが、一連の相同遺伝子から新しいタンパク質を作り出すために特別な可能性を有し得ること示唆する。
典型的に、これまでのＤＮＡ突然変異誘発プロトコルでは、比較的低い突然変異率しか得られなかった。しかしながら、ここに記載した処理法では、３０サイクルのＤＮＡ増幅後に５分の１に近いヌクレオチド置換の頻度をもたらし得る。これは明らかに、タンパク質工学にとっての最適突然変異積載量について収穫である。
効率のよいランダム突然変異誘発プロトコルの下限を、平均して１つの配列につき１つのアミノ酸変化を導入することに設定することができ、これは適当に最適状態を下回るものとしてもよいという提案は妥当なものと思われる。同時に起こる置換数が非常に大きいと、タンパク質の安定性が明らかに破壊される一方、いくつかのモデルシステムによる研究は、比較的少ないアミノ酸位置が機能および安定性に決定的に重要であることを示唆している。
たとえばＴ４リゾチームにおいて、（イニシエータメチオニン以外の）各アミノ酸を、１３種類の異なったアミノ酸で置換しても、半分より多くの位置がすべての置換を許容したことがわかった（Rennell et al., 1991 J. Mol. Biol. 222, 67-87）。さらに、２０１５個の突然変異のうち、深刻に有害なものは１７３個しかなく、これらは１６３個の位置のうち５３個に限られた（Rennell et al., 1991）さらに、λリプレッサーの研究により、タンパク質のコアにおける多くの置換が許容されることが示された（Lim et al., 1991 J. Mol. Biol. 219, 359-376）。
これらの研究は、多重ランダム突然変異の効果を直接的に取扱うものではないが、タンパク質機能が必ずしも損なわれるものではないことを示唆し、議論は、抗体遺伝子の体細胞高度突然変異の研究結果によって補強される。二次または三次応答において分離された抗体にはかなりの数の置換突然変異が含まれる（Berek & Milstein 1987 Immunol. Rev. 96, 23-41参照）。個々の置換の役割が分析される場合、ごくわずかな突然変異がアフィニティー突然変異の役割を果たしていることが明らかになった（たとえば抗ｐ−アゾフェニルアルソナート抗体における１９個のアミノ酸のうち３つ）（Sharon 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4814-4817）が、それでもＶＨおよびＶＬドメインは１０分の１に近い置換率を許容するようである。
ここに記載した処理法はタンパク質工学のための最適な突然変異積載量を実験で取り扱えるようにし得る。なぜなら、これは今回容易に制御可能となり、異なった数の置換を保有するタンパク質突然変異体のライブラリを構成することができるからである。これらの研究はタンパク質工学に関する突然変異誘発／選択アプローチの可能性の探究に役立つはずである。
最後に、この発明と、コンビナトリアルオリゴヌクレオチド化学との関連性について触れる。後者においては、一般的に配列含量の大きな（たとえば４n）多種多様の短い（ｎ）レパートリが合成され得る。実質的に、すべての可能な配列の異性体が形成され、対象とする配列を特定するよう、さまざまなフォーマットにおいて、有効な回数だけ選択を行なう必要がある。典型的に、本発明のアプローチでは、可変性の突然変異圧下で、既に機能的であるＤＮＡ配列が増幅され、その後生成物がクローン化される。ＰＣＲサイクル数に関連するものとして観察された突然変異の頻度は数十個のランダムに拾われたコロニーからのものであった。これらの突然変異頻度はおそらく、挿入物を保持するすべてのクローンに当てはまる。したがって、配列決定される突然変異体挿入物の数は、各増幅プロセスにおいて形成された合計のうちごく小さな部分になる。大きな合成レパートリとともに用いられるものに類似する慣用的な選択方法は、上記の問題に対するこの発明の利用可能性を明らかにするはずである。
配列リスト
（１）  一般的な情報
（ｉ）  出願人：
（Ａ）  名称：Medical Research Council
（Ｂ）  番地：20Park Crescent
（Ｃ）  都市：London
（Ｅ）  国名：United Kingdom
（Ｆ）  郵便番号：Ｗ１Ｎ  ４ＡＬ
（Ｇ）  電話番号：（０１７１）  ６３６  ５４２２
（Ｈ）  ファックス番号：（０１７１）  ３２３  １３３１
（ii）  発明の名称：核酸の突然変異誘発におけるまたはそれに関する改良
（iii）  配列数：５
（iv）  コンピュータによって読取り可能な形式：
（Ａ）  媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）  コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換性
（Ｃ）  オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）  ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30（EPO）
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関する情報
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２８５塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
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（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に関する情報
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：９５アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の数：
（Ｄ）  トポロジー：線状
（ii）  分子の型：ペプチド
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0004053595.tif 000008
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に関する情報
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0004053595.tif 000009
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に関する情報
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３０塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0004053595.tif 000010
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に関する情報
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３０塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：線状
（xi）  配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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