(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
ＭＡ（Ｓ）（Ｍ）（Ｓ）（Ｙ）（Ｓ）（Ｗ）（Ｔ）（Ｇ）（Ａ）−［△9ＮＳ５Ｂ］
（式中、
括弧内の任意のアミノ酸が選択的に欠失され、括弧内の０〜５個の任意のアミノ酸が選択的にアミノ酸と置換され、かつ△9ＮＳ５Ｂは配列番号２のアミノ酸１２〜５９３位のアミノ酸配列である。）
を含む組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰ。
【請求項２】
精製された形態の請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰ。
【請求項３】
括弧内の１〜５個のアミノ酸がアラニンにより置換されている、請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰ。
【請求項４】
括弧内の１〜５個のアミノ酸がヒスチジンにより置換されている、請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰ。
【請求項５】
△9ＮＳ５Ｂが、配列番号２に従う番号で、Ａｒｇ570→Ｈｉｓ、Ａｒｇ572→Ｈｉｓ、又はＴｒｐ573→Ｈｉｓの群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰ。
【請求項６】
前記Δ9ＮＳ５Ｂは、配列番号１の３４〜１７７９位の核酸配列によりコードされている、請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰをコードする発現可能なコード配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰをコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞から可溶性ＲＤＲＰ酵素を調製する方法において、前記方法は、酵素適合性バッファー中に非イオン性洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、及び宿主細胞壁加水分解酵素を含む溶解バッファー中で濃縮された宿主細胞を超音波処理する工程と、
超音波処理された細胞を凍結させ解凍して細胞溶解物を作製する工程と、
ＲＤＲＰ酵素が上清画分に保持されるように１０，０００〜２５，０００×ｇで遠心分離を行うことにより除去され得る粒子を該溶解物から除去する工程と、を含む方法。
【請求項８】
宿主細胞が大腸菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が大腸菌であり、宿主細胞壁加水分解酵素がリゾチームである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰをコードするＤＮＡを含む請求項１に記載の活性ＨＣＶ−ＲＤＲＰを発現可能な哺乳動物細胞系。
【請求項１１】
細胞系がＵ９３７、ｈｅｐＧ２、又はＰＫ１５の群より選択される、請求項１０に記載の哺乳動物細胞系。
【請求項１２】
組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰがＭＡ［ＮＳ５Ｂ］（［ＮＳ５Ｂ］）は配列番号２のアミノ酸２〜５９３位のアミノ酸配列である）であるアミノ酸配列から構成される、請求項１０に記載の哺乳動物細胞系。
【請求項１３】
同一細胞内に活性組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰの存在に依存して翻訳されるレポーター遺伝子をさらに含む、請求項１０に記載の哺乳動物細胞系。
【請求項１４】
レポーター遺伝子がレポーターをコードするＲＮＡのアンチセンスを含むメッセンジャーＲＮＡを発現する、請求項１３に記載の哺乳動物細胞系。
【請求項１５】
ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する阻害活性について化合物を試験する方法であって、
請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰにより触媒されるインビトロＲＮＡ合成反応中のＲＮＡ産物を測定する工程と、
前記化合物の存在下で合成されたＲＮＡ量と非存在下で合成されたＲＮＡ量とを比較し、化合物の存在下で合成されたＲＮＡ量が減少している場合、化合物がＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する阻害活性を有していると判断する工程と、
を含む方法。
【請求項１６】
被検化合物の存在下及び非存在下での対照酵素の活性を比較し、被検化合物により対照酵素が阻害される場合、組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する特異的効果が存在しないと判断する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インビボでの組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する阻害活性について化合物を試験する方法であって、
請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰをコードするＤＮＡを含む活性組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰを発現しうる哺乳動物細胞系を調製する工程と、
同一細胞内に活性組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰの存在に依存して翻訳されるレポーター遺伝子を該細胞系に形質転換し、それにより、レポーター細胞系が調製される工程と、
該レポーター細胞系を被検化合物の存在下又は非存在下でインキュベートして、それにより被検化合物による組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰの阻害によりレポーター遺伝子の翻訳が阻害される工程と、
を含む方法。
【請求項１８】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ、分泌アルカリフォスファターゼ、又は蛍光グリーンタンパク質の群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
レポーター遺伝子が転写されレポーターのアンチセンスをコードするメッセンジャーＲＮＡを生成し、組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰにより該メッセンジャーＲＮＡに対する相補ＲＮＡが合成されることにより、活性レポーターを生じるために翻訳可能なセンスメッセンジャーＲＮＡが生成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
レポーターの転写されたメッセンジャーＲＮＡが、レポーターアンチセンスコーディング領域の３’側に位置するＨＣＶ由来の内部リボソーム侵入部位をさらに含み、組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰにより該メッセンジャーＲＮＡに対する相補ＲＮＡが合成されることにより、センスメッセンジャーＲＮＡコーディング領域の５’側に内部リボソーム侵入部位を有するメッセンジャーＲＮＡが生成し、レポーターのキャップ構造非依存性の翻訳が提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
感染患者から取得された血清中のＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体を測定又は検出するための方法であって、
抗原−抗体複合体が形成されるように抗体を請求項１に記載の組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰと接触させる工程と、
抗原−抗体複合体を未結合の抗体又は前記組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰから分離する工程と、
抗原−抗体複合体を測定又は検出する工程、
とを含む方法。
【請求項２２】
組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰをゲル電気泳動により局在化し、ゲルをＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体を含む血清と接触させ、抗原−抗体複合体を標識された抗ヒト抗体により検出又は測定する、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本願は、１９９５年９月２７日出願の米国仮出願第６０／００４，３８３号に基づく優先権を主張するものである。
発明の分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関し、より詳細には、ＨＣＶゲノムによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）の発現及び精製、ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体、ならびに、慢性ＨＣＶ感染を診断するため、ＨＣＶに対して有効な抗ウイルス剤をスクリーニングするために、該酵素を使用する方法に関する。
発明の背景
ＨＣＶは、輸血後肝炎及び散発性非Ａ非Ｂ型肝炎の原因となる主要な作用因である（Alter, H.J.（1990）J. Gastro. Hepatol. 1: 78-94; Dienstag, J.L.（1983）Gastro 85: 439-462）。スクリーニング法が改善されているにもかかわらず、ＨＣＶは依然として、多数の国における急性ウイルス性肝炎の少なくとも２５％の原因となっている（Alter, H.J.（1990）前出; Dienstag, J.L.（1983）前出, Alter, M.J. et al.（1990a）J.A.M.A. 264: 2231-2235; Alter, M.J. et al（1992）N. Engl. J. Med. 327: 1899-1905; Alter, M.J. et al.（1990b）N. Engl. J. Med. 321: 1494-1500）。慢性感染した（そして感染性の）保菌者では、ＨＣＶ感染は潜伏性であることが多く、そのような保菌者では長期にわたり臨床的徴候が見られないことがある。急性感染は慢性感染（７０〜１００％）及び肝臓病（＞５０％）へと進行する確率が高いこと、世界中に分布していること、そしてワクチンが存在しないことから、ＨＣＶは罹病及び死亡の重大な原因となっている。
ＨＣＶは、エンベロープに包まれたウイルスであり、そのゲノムは９．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡ（センス（＋））で、単一のポリタンパク質をコードしている。該ポリタンパク質はタンパク分解によりプロセシングされ、少なくとも９種のタンパク質を生じる。ＨＣＶはペスティウイルス及びフラビウイルスに関連している（Choo, Q-L. et al.（1989）Science 244: 362-364; Choo, Q-L. et al.（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455）。既にＨＣＶに感染したことのあるチンパンジーの再感染により、防御免疫が一時的であるか、又は存在しないことが示唆されている（Farci, P. et al（1992）Science 258: 135-140）。さらに、最近のワクチン試験の結果から、有効なワクチンの開発は期待できないことが示されている（Houghton, M. et al.（1994）2nd Internat, Meeting on Hepatitis C（San Diego））。既存の抗ウイルス剤を用いた慢性ＨＣＶ感染の治療が試みられているが、治癒率は低く、重篤な副作用を生じている（Dienstag, J. L.（1983）前出）。
ＨＣＶゲノムのヌクレオチド配列はクローン化され、単一の読み取り枠が同定されている。ワクシニアウイルス発現系を用いて、いくつかの分解産物が仮同定されている（Lin, C. et al.（1994）J. Virol. 68: 5063-5073; Grakoui, A. et al.（1993）J. Virol. 67: 1385-1395）。コーディング領域の種々のセグメントから推定されたアミノ酸配列より合成された様々なペプチドに対して得られた抗体により、種々の推定分解産物が認識された。抗体反応性のペプチドの大きさがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定された（図１参照）。５Ｂと表された非構造タンパク質（ＮＳ５Ｂ）は、ＳＭＳＹ（Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）というアミノ末端配列を有することが示されている。ＮＳ５Ｂ領域は、６８ｋｄのタンパク質（ｐ６８）をコードしており、該タンパク質には、他のＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに見られる内部ＧＤＤ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）モチーフが含まれる（Koonin, E.V.（1991）J. Gen. Virol. 72: 2197-2206）。しかし、ＨＣＶ ｐ６８にはポリメラーゼ活性は検出されていない。実際、５Ｂタンパク質（ｐ６８）単独では活性を有するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素がコードされず、他のサブユニット、おそらくＮＳ５Ａ遺伝子産物が、触媒活性に必須であるという問題が生じている。これまでに、本発明者ら及び他の研究者らは、融合産物の精製を容易に行うことができるような既存の発現系、及び特異的分解を用いて、ＮＳ５Ｂコーディング領域を融合タンパク質として発現させようと試みているが、活性を有するポリメラーゼは得られていない。
発明の概要
本発明は、ＨＣＶの修飾されたＮＳ５Ｂコーディング領域を哺乳動物又は細菌の宿主細胞で発現させることにより得られる、ＲＤＲＰ活性を有するＨＣＶの組み換えタンパク質（ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ）を提供する。修飾には、アミノ末端にメチオニン残基を付加し、さらに選択的に、Ｎ末端メチオニンと未修飾のＮＳ５Ｂ遺伝子産物のＮ末端セリンとの間に１〜２０個の付随的なアミノ酸を挿入することが含まれる。修飾には、アミノ末端において最大９アミノ酸を欠失させ、アミノ末端メチオニンを提供することも含まれる。野生型ＨＣＶ−ＲＤＲＰの推定配列によると、２個のメチオニンが天然に存在する。したがって、修飾には、Ｎ末端に存在するアミノ酸をいずれかのメチオニンまで欠失させるか、あるいは、２個のメチオニンの中間点までを欠失させ、かつＮ末端メチオニンコドンを付加することが含まれる。記載された制限内であれば、欠失及び挿入の組み合わせも、考えられる。特異的なプロテアーゼ分解部位を形成するように、付加されたアミノ酸配列を工夫し、インビボ又はインビトロでの組み換えＨＣＶ−ＲＤＲＰ発現産物の翻訳後修飾が可能となるようにすることができる。このような転写後修飾は、Ｎ末端セリンを有する、ＮＳ５Ｂによりコードされたアミノ酸配列を、正確に作成するために用いることができる。精製を簡便、かつ容易にするため、アフィニティリガンド結合部位を形成するように、付加されたアミノ酸配列を工夫することもできる。本明細書において報告するデータは、野生型のプロセシングを受けたタンパク質の推定ＳＭＳＹ配列の代わりに、ＭＡＳＭＳＹ（配列番号６）というＮ末端配列を与える、Ｎ末端にＭＡ（Ｍｅｔ−Ａｌａ）ジペプチドを有するｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰで得られたものである。したがって、ＮＳ５Ｂのコーディング配列は、５’末端にメチオニンコドン（ＡＴＧ）を含み、さらに選択的に、他のアミノ酸に対するコドンを含むか又は欠失するように修飾される。酵素活性に対して生じうる有害な影響を回避するとともに人工的なエピトープの作出を回避するために、修飾は最少限であることが好ましい。ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰは、活性ＲＤＲＰを得るために大腸菌及び哺乳動物細胞で発現させることができる。大腸菌における活性ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの発現により、ポリメラーゼ活性には、ＨＣＶがコードする他のタンパク質は不要であることが示される。
本発明はさらに、可溶化された形態のｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ、及び活性を損なうことなく可溶化する方法を提供する。
本発明はまた、可溶化された形態のＨＣＶ−ＲＤＲＰを精製する方法を提供する。他の方法と組み合わされて使用される、一つの方法としては、アフィニティリガンドとしてｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体を使用したアフィニティクロマトグラフィーがある。他のアフィニティリガンドは、例えば、Wu, J. et al.（1994）Biochemistry 33:14825-14833、及び、Ohlmeyer, M.H.J. et al.（1993）Procl. Nat. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926に記載されているようなコンビナトリアル・ライブラリー（combinatorial library）法により得られる。
さらに、本発明は、ＨＣＶ−ＲＤＲＰに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、精製された酵素を抗原として用い、既知の方法により作製することができる。このような抗体は、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ又は野生型ＨＣＶ−ＲＤＲＰのいずれかに結合する。このような抗体が利用可能になることにより、ＨＣＶ−ＲＤＲＰの迅速な精製のためのアフィニティ標識クロマトグラフィー・マトリックスの調製が可能となる。また、抗体により、生物学的物質、例えばＨＣＶ感染患者の血清中のＨＣＶ−ＲＤＲＰを迅速に検出することも可能となる。
本発明はさらに、哺乳動物細胞にＨＣＶ−ＲＤＲＰを形質転換し、細胞内で酵素を発現させる方法を提供する。結果的に、本発明は、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰを発現する形質転換された哺乳動物細胞系も提供する。該細胞は、抗ウイルス候補化合物の、ＲＤＲＰ活性の阻害剤としての効果をアッセイするために有用である。
したがって、本発明はまた、インビボでＲＤＲＰ活性の阻害剤となりうる化合物をスクリーニングする方法も提供する。ポリメラーゼの阻害によりウイルス複製及びウイルス遺伝子産物の発現が阻害されるため、阻害活性を有する化合物は、抗ウイルス活性を有している可能性がある。感染細胞に侵入することができない化合物を排除することができるため、インビトロアッセイは有用である。注目すべき候補化合物の一つのクラスは、ヌクレオシド類似体である。これは、細胞内で修飾（リン酸化）された後、酵素の基質部位に結合するか、又は新たに合成されたＲＮＡ中に取り込まれ、ＨＣＶポリメラーゼの正常な機能、又は類似体を含むＲＮＡのさらなる複製を阻害する化合物である。アシクロビルは、ウイルスポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を阻害し、プライマー−鋳型機能を阻害（鎖終結）することにより、ＤＮＡウイルスの複製を阻害する、極めて有効かつ安全なヌクレオシド類似体の一例である。このような類似体は、ほとんどの場合、ヌクレオチド三リン酸の形態でのみ有効である。インビトロアッセイでは、化合物をヌクレオシド型又はヌクレオシド一リン酸型で投与し、細胞の内在代謝活性によりその型を活性な三リン酸型へと変換させるため、インビボアッセイで必要とされるような三リン酸型の化学合成の工程が不要であるという、便利な方法が提供される。
インビトロでＨＣＶ−ＲＤＲＰ活性を測定する方法もまた提供される。このようなアッセイは、酵素の同定、及び精製中の濃度測定を可能にするものである。さらに、該アッセイは、抗ウイルス剤候補として潜在的なＲＤＲＰ阻害剤をスクリーニングするための、付随的なインビトロの方法を提供する。
原則として、いかなる化合物も、ＲＤＲＰ阻害剤の候補として試験することができる。ある種の化合物クラスが、注目すべき候補と考えられる。これには、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、及びペプチドが含まれるが、これらに限定されない。平面的な多環芳香族性の特徴を有する化合物も、阻害剤としての可能性を有する。有効なＲＤＲＰ阻害剤として同定された化合物は、治療薬としての試験を受ける前に、毒性、生物学的利用率、副作用などについてさらにスクリーニングする必要があることが理解されるであろう。しかしながら、ＨＣＶ−ＲＤＲＰの阻害剤としての最初の同定は、抗ウイルス治療の開発における重要な第一段階である。ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの阻害剤は野生型ＨＣＶ−ＲＤＲＰも阻害するということも、認識されるであろう。
本発明の別の態様において、精製されたＨＣＶ−ＲＤＲＰ又はｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの存在により、ＨＣＶ感染患者の血清中に存在するＲＤＲＰ抗体を検出及び測定することが可能となる。このような抗体が少しでも存在するという事実は、それ自体が、本発明による精製ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの発現及び調製により可能となる発見である。感染血清中のＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する循環する抗体の存在は、感染細胞が溶解し、ＨＣＶ−ＲＤＲＰが細胞外液及び血流へと放出され、該細胞外液及び血流にて抗体反応を刺激しうるためであると考えられる。病気の重度が変動するにつれ、放出されるＨＣＶ−ＲＤＲＰ量、及びＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体の量も変動する。したがって、患者の血清中に存在するＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体の量は、感染の存在の指標のみならず、所定の時点における（病気の）重度の指標として使用することもできる。抗ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対するアッセイは、感染を診断する手段として、そして、経時的な、又は治療に応答した病気の経緯をモニターするための手段として使用され得る。抗ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対するアッセイは、本明細書に記載されたゲル分離法のような、様々な既知の方法により実施することができる。他の適切な方法には、ＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイが含まれる。抗体を捕捉するための固定化ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰを用いたサンドイッチ型アッセイでは、酵素、放射性同位元素、蛍光性分子、又は化学発光マーカーなどの適切なマーカーで標識された抗免疫グロブリン試薬が使用され得る。これらはすべて、当業者に理解されるであろう（Antibodies：A laboratory manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）pp. 553-611）。
【図面の簡単な説明】
図１  Ｃ型肝炎ウイルスゲノム及びポリタンパク質分解産物。ＨＣＶポリタンパク質の分解産物は、ワクシニアウイルス発現系を用いて仮同定されている。この系において発現され、プロセシングされた５Ｂタンパク質のアミノ末端は、ＳＭＳＹ（Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）である。出版されている報告では、５Ｂタンパク質がＲＮＡポリメラーゼ活性を有していることは示されていないが、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに見られるＧＤＤ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）モチーフが含まれている。５Ｂタンパク質単独では活性のあるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素がコードされず、他のサブユニット（おそらくＮＳ５Ａ遺伝子産物）が、触媒活性に必須であるという問題が生じていた。本研究の初期においては、本発明者らは、ＮＳ５Ｂによりコードされるタンパク質が単に他の必須因子が欠如していることが原因でＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を示さないのか、確認できていなかった。
図２  Ｔ７ポリメラーゼ駆動性Ｓｔｕｄｉｅｒベクターを用いた、大腸菌におけるｒ−ＨＣＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現。組み換え技術により作製されたＴ７ポリメラーゼ駆動性発現ベクターを含む大腸菌を、ＯＤ600が０．６に達するまで３７℃でインキュベートした。細胞サンプルを得、ＩＰＴＧを最終濃度１mMとなるよう添加した。ＩＰＴＧ誘導から１、２、及び３時間後にサンプルを回収した。完全な細胞を９５℃で１×サンプルバッファー中で溶解し、サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。写真は、クーマシーブルーで染色した代表的なゲルを示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は未誘導対照（０時間）、レーン３はＩＰＴＧ誘導から１時間後、レーン４はＩＰＴＧ誘導から２時間後、レーン５はＩＰＴＧ誘導から３時間後を示す。組み換えｒ−ＨＣＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、矢印（ＲＤＲＰ）で示されている。
図３  数人の慢性Ｃ型肝炎患者は、組み換えＨＣＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと反応する循環抗体を有している。ｒ−ＨＣＶ ＲＤＲＰを発現している細胞を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で加熱することにより溶解した。可溶性のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜へと転移し、イムネティクス・ミニブロッター・テンプレート（Immunetics Miniblotter template）（Hagedorn, et al. FEBS Lett.（1990）264: 59-62）を用いてヒト血清でイムノブロッティングを行った。イムノブロットを、二次抗ヒトホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗体、及び増幅化学発光法（ECL, Ambersham）を用いて発色させた。この写真は、イムノブロットを示す。レーン１では正常ヒト血清をプローブとして用い、レーン２（１：５００希釈）、レーン３（１：３００希釈）、及びレーン４（１：２００希釈）では、慢性Ｃ型肝炎患者の血清をプローブとして用いた。組み換えＨＣＶ ＲＤＲＰの位置（クーマシー染色及びポンソーＳ染色により可視化した）は、矢印で示されている。これらのレーン３及び４に見られる低分子量のバンドは、完全な大腸菌溶解物をイムノブロットで使用した際に見られた、ＲＤＲＰのタンパク分解断片を示す。
図４  非変性条件下でのＨＣＶ ＲＤＲＰの可溶化。標準的な方法を用いて、ｒ−ＨＣＶ ＲＤＲＰを発現している細胞を収集し、処理した。不溶性大腸菌ペレット（ペレット、陽性対照）、及びＲＤＲＰ発現ベクターを含む細胞又は含まない細胞（陰性対照）からの可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転移した。図３に概説されているようにして、ニトロセルロースに結合したタンパク質を、ウサギ免疫前血清及びウサギ抗ＲＤＲＰ血清をプローブとして検出した。ブロットをＥＣＬ系（Amersham）を用いて発色させた。写真は、イムノブロットを示す。レーン１、３、５、７、及び９では免疫前血清をプローブとして用い、レーン２、４、６、８、及び１０では免疫血清をプローブとして用いた。独立に調製された２つの可溶性タンパク質サンプル（ＩＰＴＣ添加＃１及び＃２、レーン３〜６）について検討した。
図５  酵素活性を有する組み換えｒ−ＨＣＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。精製された組み換えポリオウイルスＲＤＲＰ（約５０ng）、及びｒ−ＨＣＶ ＲＤＲＰを発現している大腸菌（ＨＣＶ ＲＤＲＰ溶解物）又はＲＤＲＰを発現していない対照細胞（対照溶解物）から得られた等量の可溶性タンパク質（約１μg）のポリ（Ｕ）ポリメラーゼ活性を示す。インキュベーションは、既述のようにして行い、３０分（１サンプル）及び６０分（２サンプルの平均）のインキュベーション後の、１５μlのインキュベーションから回収されたポリ（Ｕ）のＣＰＭを示した（J. Virol.（1986）58: 790-796）。
図６  部分的に精製された組み換えＨＣＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの酵素アッセイ。ｒ−ＨＣＶ ＲＤＲＰを発現している大腸菌の溶解液を調製し、図５と同様にして酵素アッセイを行った。示された実験においては、ＲＤＲＰが樹脂に結合できるようなｐＨ及びバッファーの条件下で、バッチ精製法でＤＥＡＥ樹脂を用いた。細胞溶解物（ＲＤＲＰ溶解物と示されている）、及び溶解物とほぼ同じ濃度にまで濃縮された、０．５MのＮａＣｌでＤＥＡＥ樹脂から溶出されたタンパク質（ＤＥＡＥバッチと示されている）から得られた等量のタンパク質をアッセイした。ＤＥＡＥ樹脂及び他の試験樹脂を用いたさらなる試験で、ＲＤＲＰ酵素活性の部分精製が、ウサギ抗血清を用いたイムノブロッティング及び図４に概説された方法により検出される、タンパク分解されていないＲＤＲＰの量の増加と相関することが示された。
図７  組み換えｒ−ＨＣＶ ＲＤＲＰのイムノアフィニティ精製。この写真複写物は、ウサギポリクローナルプロテインＡセファロースで精製された抗ＲＤＲＰ抗体を用いて調製されたイムノアフィニティカラムでの最初の結果を示す。出発物質は、組み換えｒ−ＨＣＶ ＲＤＲＰを発現している大腸菌から可溶化されたタンパク質であった。図は、異なる洗浄剤の条件でタンパク質が適用された２つの同一のカラムから溶出されたタンパク質のイムノブロットを示す。レーン１は、２０mMトリス（pH７．５）、１００mM ＫＣｌ、０．５mM ＥｄＴＡ、１mM ＤＴＴ、５％ グリセロール、及び０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化された組み換えＲＤＲＰと共に一晩混合された抗体／セファロースビーズから溶出されたタンパク質を示す。これらのビーズを、翌朝１０mMリン酸カリウムバッファー（pH７．２）で洗浄し、タンパク質を１００mMグリシン（pH２．５）で溶出した。溶出したタンパク質を１Mトリス（pH８．０）中に回収し、pHを再調整した。カラムから溶出したタンパク質を、図４と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングにより分析した。レーン２は、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の代わりに０．０５％ ＮＰ−４０を使用したこと以外は同一の出発物質と共に混合した同一のビーズから溶出したタンパク質を示す。ｒ−ＨＣＶ ＲＤＲＰの位置が示されている。
発明の詳細な説明
定義
「ＲＤＲＰ」とは、ＲＮＡ合成を触媒する酵素である、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを意味する。これにより合成されたＲＮＡはＲＮＡ鋳型と相補的な配列を有する。「ＨＣＶ−ＲＤＲＰ」はＣ型肝炎ウイルスのＲＤＲＰである。本明細書において開示される修飾されたＨＣＶ−ＲＤＲＰは、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰと称す。ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂと呼ばれる領域は、前記のワクシニアウイルス発現系を用い、ＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解産物として同定されている。ＮＳ５Ｂのヌクレオチド配列は配列番号１に含まれている。ＮＳ５Ｂ配列をコードする推定アミノ酸は、ヌクレオチド７から開始する。配列が５’末端で欠失している場合、残りの配列は、終止コドンは含まずに、残りのコーディング配列の最初と最後のヌクレオチド番号により表記される。例えば、ＮＳ５Ｂ34-1779とは、配列番号１のヌクレオチド３４〜１７７９を含むＮＳ５Ｂの一部を示す。
本明細書において例示されるｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰをコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。ＮＳ５Ｂによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２の第３のアミノ酸から開始する。ＮＳ５Ｂによりコードされる配列がＮ末端で欠失している場合、残りの配列は、△nＮＳ５Ｂと表記される。ここで、ｎはＮＳ５ＢのＮ末端から欠失したアミノ酸の数である。例えば、△9ＮＳ５Ｂは、配列番号２中のアミノ酸１２〜５９３の配列である。
記載されたように、本発明により、種々のｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ構築物が企図される。本発明に含まれる修飾コーディング配列は、以下のような一般配列を有する。
ＡＴＧ−ＮX−（ＮS）（ＮM）（ＮS）（ＮY）（ＮS）（ＮW）（ＮT）（ＮG）（ＮA）−［ＮＳ５Ｂ34-1779］
ここで、ＮXは０〜２０アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列であり、ＮSはセリンをコードするコドンであり、ＮMはメチオニンをコードするコドンであり、ＮYはチロシンをコードするコドンであり、ＮWはトリプトファンをコードするコドンであり、ＮTはトレオニンをコードするコドンであり、ＮGはグルタミン酸をコードするコドンであり、ＮAはアラニンをコードするコドンである。括弧内のコドンはいずれも、必要ならば、欠失してもよい。必要ならば、最大５個の括弧内のコドンを変異させることができる。「変異」という用語は、ＮＳ５Ｂ配列により本来コードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードするよう変化していることを意味する。例えば、既知のアラニン・スキャニング突然変異導入法により、個々のコドンをアラニンをコードするよう変化させることができる。アラニン・スキャニング突然変異導入法は、機能に負の影響を実質的に与えることなく、置換に耐性のアミノ酸部位を同定するための迅速かつ便利な方法を提供する。アラニン・スキャニングにより置換耐性であることが明らかになった部位は、他のアミノ酸置換に対しても耐性である可能性が高い。好ましい置換残基は、金属（例えばニッケル）カラム用のアフィニティリガンドとして機能する、一つ又は複数のヒスチジン残基である。ヒスチジンの存在により、カラムへの選択的な結合性が提供され、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの精製が促進される。定義されたとおり、［ＮＳ５Ｂ34-1779］とは、配列番号１の残りのヌクレオチド配列、終止コドンを含まないヌクレオチド３４〜１７７９を示す。前記の配列を作製する方法は、いずれの配列についても、ＮXがＧＣＴであり、ＮＳ５Ｂによりコードされる最初の９個のアミノ酸をコードする括弧内のコドンがいずれも欠失していない配列についての下記の方法と本質的に同様である。適切な発現ベクターへの挿入を容易にするため、所望の制限部位配列と組み合わせた所望の配列のためのプライマーを合成できることは明らかであろう。ベクターの選択は、宿主細胞、所望のプロモーター型、及び、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰと共発現させる付加配列の有無を含む、当該技術分野において既知の要因に基づく。反応条件、ＰＣＲ、ベクターの挿入、及び宿主細胞の培養は、以下に記載されるか、又は当技術分野において周知のものである。
ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対してさらなる修飾を行うことができる。Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを含まないＣ末端領域の約２５％の欠失を構築し（ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ−△Ｃ）、その活性を試験した。タンパク質は発現し、抗ＲＤＲＰ血清を用いたイムノブロッティングにより検出することができたが、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ−△Ｃを発現している大腸菌の溶解物は、ポリ（Ｕ）アッセイにおいても、鋳型としてグロビンｍＲＮＡを用いた場合にも、測定可能な活性を示さなかった。しかし、モデリング試験に基づくと、Ｃ末端に近いＮＳ５Ｂのアミノ酸５６５〜５７２（配列番号２の５６５〜５７４）の領域が、タンパク質表面に露出していると考えられる。部位特異的突然変異導入法を用いて、コード配列をＡｒｇ５７０→Ｈｉｓ、Ａｒｇ５７２→Ｈｉｓ、及びＴｒｙ５７３→Ｈｉｓへと変化させた（配列番号２の番号を用いた）。タンパク質の一端付近の表面領域に一つ又は複数の付加ヒスチジン残基をクラスター形成させることにより、酵素活性には実質的に影響を与えることなく、金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製が容易になる。現存のアミノ酸をヒスチジンに置換する突然変異導入のための部位となりうる他の推定表面領域には、配列番号２におけるアミノ酸４７〜５６、１５２〜１５９、１８３〜１８４、２１０〜２１５、２６９〜２７２、３８４〜３９１、及び４３９〜４４２が含まれる。
ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰは事実上いかなる宿主細胞型で発現させることもできるが、阻害剤試験のようなインビトロ試験において有用であるためには、酵素は可溶型であることが好ましい。細胞内で合成される場合には、酵素を可溶化する工程を実施しない限り、酵素は細胞溶解物中で不溶型で存在する。一般的には、宿主細胞を回収し、濃縮し、その後、例えば宿主細胞壁加水分解酵素の使用、超音波処理などの既知の方法により溶解し宿主細胞を破壊する。一般的には、細胞溶解により放出されるタンパク分解酵素から保護するため、プロテアーゼ阻害剤を添加する。非イオン性洗浄剤を使用することもできる。超音波処理された細胞及び細胞内複合体を、上記の成分の存在下、凍結させ、解凍させる。残存する粒子物質を１０，０００〜３５，０００×ｇで遠心分離することにより除去する。ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰは上清に残る。大腸菌において発現されたｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰを可溶化するための詳細なプロトコルは後述する。
当該技術分野において既知の技術及び手段により、酵素のさらなる精製が達成される。その方法には、これらに限定されないが、抗体アフィニティクロマトグラフィー、金属結合アフィニティクロマトグラフィー（付加ヒスチジン残基を有する修飾型酵素に特に適した方法である）が含まれ、さらに通常のイオン交換カラム、硫酸アンモニウムによる選択的な沈殿、及び本明細書に具体的に記載された方法に限定されない当該技術分野において既知の他の方法が含まれる。本明細書において「精製された形態」とは、可溶化細胞溶解物中で測定された活性よりも少なくとも４倍大きい特異的活性を有する酵素調製物を意味する。
ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を形成するための様々な既知の方法により作製することができる。ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰに対する抗体は、感染細胞のＨＣＶ−ＲＤＲＰにも結合する。このことは、抗体リガンドとしてｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰを用いて、ＨＣＶ感染患者の血清中にＨＣＶ−ＲＤＲＰ対する循環抗体を検出することができるという知見により示された。当該技術分野において周知のように、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの異なるエピトープに対して親和性を有する様々なモノクローナル抗体を選択することができる。酵素活性を阻害する抗体も存在する。抗体とアフィニティカラムとを結合させ、次に酵素を不活化しないような条件で溶出を行うことが容易にできるような適度な親和性を有する抗体も存在する。
ある種の目的、特にＨＣＶ−ＲＤＲＰ阻害剤のインビトロスクリーニング及び細胞培養物中でＨＣＶを増殖させることができる細胞系の樹立のためには、哺乳動物細胞が好ましい宿主細胞である。形質転換に使用される既知の細胞系はすべて、原則的に、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰを発現させるために形質転換することができる。好ましい細胞系は、ＨＣＶ、又はフラビウイルスなどの類似のウイルスが感染することが知られている組織に由来するものである。このような細胞系には、例えば、ヒトマクロファージ細胞系Ｕ９３７、ヒト肝臓由来ｈｅｐＧ２細胞、及びブタ腎臓細胞系ＰＫ１５が含まれる。最近発見されたＨＣＶ−ＲＮＡの３’末端近傍のセグメントは、ＨＣＶ−ＲＤＲＰを調節する（宿主がコードしている可能性がある）タンパク質又はペプチドとの相互作用部位である可能性が高い推定クローバー葉型二次構造を有する（Tanaka, T., et al.（1995）Biochem. Biophys. Res. Commun. 215: 744, 749）。このような調節は、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ及び野生型酵素の鋳型特異性又は触媒活性の変化という形をとる。調節タンパク質を通常発現している細胞におけるｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの発現は、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの発現がＨＣＶ感染細胞における発現の様式と極めて類似したインビボ細胞系を提供する。また、細胞中に活性ＨＣＶ−ＲＤＲＰが存在すると、ＨＣＶ複製のための「ジャンプ・スタート（jump start）」を提供することにより、感染により導入されたＨＣＶ、又は形質転換により導入されたゲノミックＨＣＶ ＲＮＡの複製を増強することができる。最も重要な点として、形質転換細胞におけるｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ活性を測定できることが、インビボでの酵素阻害能についてＨＣＶ−ＲＤＲＰの潜在的な阻害剤をスクリーニングするための重要な鍵となる。
インビトロのｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰによるＲＮＡ合成のアッセイにより、ポリ（Ａ）鋳型を用いるポリ（Ｕ）の合成及びグロビンｍＲＮＡ鋳型を用いるＲＮＡの合成を酵素が触媒できることが示されている。いずれの反応も、記載された反応条件下で、９０％を超えてプライマー依存性であった。酵素は、Ｍｇ++の非存在下では検出可能な活性を示さず、約２０mMのＭｇ++の存在下で最大の活性を示した。抗ウイルス活性を有する化合物をスクリーニングするための方法は、様々な化合物がインビトロでＲＤＲＰ酵素活性に対して及ぼす効果を試験することにより提供される。インビトロ法には、被検化合物の存在下及び非存在下で合成されたＲＮＡ量を比較することが含まれる。被検化合物の非存在下での対照反応と比較して、被検化合物の存在下での反応で合成されたＲＮＡの量が減少している場合、阻害効果が示唆される。
ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰを発現している安定的に形質転換された細胞系は、完全な哺乳動物細胞内でポリメラーゼを阻害する化合物をインビボスクリーニングするために、特に有用である。このような阻害剤は、感染細胞においてＨＣＶ複製の阻害剤となる可能性が高い。インビボ試験は、細胞毒性を有する化合物、及び充分量において細胞に侵入することができない化合物を選別除外しうるという点で有利である。また、さらに、実際の阻害剤の前駆体であり、細胞代謝過程により阻害剤へと変換される化合物を試験することも可能である。前駆体阻害剤の例としては、活性な阻害剤へと変換されるためにはリン酸化される必要があるヌクレオシド類似体、及び細胞内で加水分解を受け活性な阻害剤を形成するような結合により保護された活性基を有する化合物が含まれる。下記に示す一般構造を有する非ヌクレオシド類似体はｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ阻害剤の注目すべき候補と考えられる。
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式中、Ｒ1及びＲ2はアルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、又はハロ基であり、Ｒ3はアルキル基、アリール基、水酸基、又はアルコキシ基であり、ＸはＯ、ＮＲ3、Ｏ、ＣＨ2、又はＣＨＲ3である。一般的に、被検細胞は、発現するためにｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの作用を必要とするような、又はｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰが存在すると発現が増強されるようなレポーター構築物でさらに形質転換される。レポーター遺伝子は当該技術分野において周知であり、ルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ及び蛍光グリーンタンパク質（fluorescent green protein）を含むが、これらに限定されない。これらはすべて商業的に入手可能である。注目すべき方法は、レポーターのアンチセンス遺伝子、すなわちアンチセンスを発現するレポーター遺伝子型、又はレポーター遺伝子の（−）鎖メッセンジャーＲＮＡを使用するというものである。この場合、ＲＮＡ中のセンス（＋）鎖が作製され、活性なレポーターへと翻訳されるために、ＲＤＲＰの活性が必要となる。この系には、ＲＤＲＰが阻害される場合、活性ＨＣＶ−ＲＤＲＰの非存在下でのレポーター活性のバックグラウンドレベルが存在しないという利点がある。適切な（−）鎖レポーター遺伝子の構築の概略は後述する。
材料及び方法
材料  −  特に断りのない限り、化学物質はすべてフィッシャー（Fisher）から購入し、酵素はすべてギブコＢＲＬ（Gibco BRL）から購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑはパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）から購入した。他のＰＣＲ及びライゲーション用成分はすべてインビトロジェン（Invitrogen）から購入した。リゾチーム、抗生物質、及び染色済タンパク質標本はシグマ（Sigma）から購入した。ヌクレオチド及びポリ（Ａ）はファルマシア（Pharmacia）から購入した。［3Ｈ−］ＵＴＰはデュポンＮＥＮ（Dupont NEN）から購入した。オリゴ（Ｕ）はイー．エーレンフェルド（E. Ehrenfeld）氏（カリフォルニア大学，Irvine）の好意で贈られたものである。
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ領域のサブクローニング  −  ワクシニアウイルス発現試験により推定されたＮ末端（Lin, C. et al.（1994）前出; Grakoui, A. et al.（1993）前出）、及びＨＣＶポリタンパク質の読み取り枠の末端に基づくＣ末端（Choo, Q-L. et al.（1991）前出）に基づき、ＮＳ５Ｂ領域の増幅用のＰＣＲプライマーを設計した。鋳型は本来のプロトタイプＨＣＶ（１ａ型）クローン（ＣＤＣから得た）（Choo, Q-L. et al.（1989）,（1991）,前出）であった。以下のプライマー、５’−ＡＴＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＡＣ ＴＣＴ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＣＧ ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＡＧ Ｇ−３’（配列番号４）を使用して、Ｎ末端に最少の変化を有するＮＳ５Ｂ領域（ＳＭＳＹ配列番号７の代わりにＡＳＭＳＹ配列番号５）を増幅し、方向性をもってＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位でｐＥＴ−１１ａ（Novagen）へとクローン化した（Maniatis et al.（1982）Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York）。ＰＣＲ増幅された遺伝子には、５’末端にＮｈｅＩ部位、３’末端にＢａｍＨＩ部位が組み込まれていた。この構築物は、ワクシニアウイルス発現試験により推定された推定野生型ＮＳ５Ｂタンパク質のＳＭＳＹアミノ末端ではなく、ＭＡＳＭＳＹというアミノ末端配列を有する組み換えタンパク質の合成をもたらす。
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ＰＣＲ反応は、まず９４℃で２分間インキュベートし、次に９４℃１分、５５℃２分、及び７２℃３分を２０サイクル行った（コイ コーポレイション テンプサイクラー（Coy Corporation Tempcycler）II）。さらに７分間７２℃に維持した後、４℃に冷却することにより、反応を完了させた。増幅されたＤＮＡをフェノール／クロロフォルム抽出により精製し、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、フェノール／クロロフォルム抽出及びエタノール沈殿を用いて再精製した。
Ｔ４リガーゼを用いて、３：１比（挿入配列：ベクター）で、１４．５℃で一晩、挿入配列とベクターとを連結させた（Maniatis,前出）。連結された物質を用いて、ＣａＣｌ2法により大腸菌（インビトロジェンのTop10（登録商標））を形質転換した。アンピシリンプレート上でコロニーを選択し、単一コロニーから単離したプラスミドＤＮＡのミニプレップを、制限酵素分析を用いて特徴解析した。ミニプレパレーション法により得られたプラスミドＤＮＡを用いて、ＢＬ２１（λＤＥ３）大腸菌（ノバジェン（Novagen））を形質転換し、プラスミドを含有する生物をアンピシリンを用いて選択し、単一コロニー由来のプラスミドＤＮＡのミニプレパレーションを、制限酵素消化により解析した。
推定ＨＣＶ ＲＤＲＰの発現、精製、及び可溶化  −  上記のｐＥＴ−１１ａ−ＮＳ５Ｂ構築物を含有するＢＬ２１（λＤＥ３）大腸菌を一晩培養し（カルベニシリンを含むＭ９ＺＢ培地）、翌朝新鮮培地で２０倍に希釈した。培養培地のＯＤ600が０．６に達するまで、細胞を３７℃でインキュベートした。その後、ＩＰＴＧを添加して最終濃度を１mMにした。推定ＲＤＲＰの発現をサンプルバッファー中で９０℃で溶解した完全な細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析することにより追跡した。
非変性条件下でＲＤＲＰを可溶化するため、ＩＰＴＧ誘導の２時間後細胞を回収した。氷上で２０分間、２０mMトリス（pH７．５）、１００mM ＫＣｌ、０．５mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び３０μg/mlリゾチーム中で細胞を溶解することにより、ＲＤＲＰを可溶化した。サンプルを氷上で０．５インチのプローブ（パルスセッティング）を用いて５分間（Ultrasonics Inc. W-225,アウトプット−セッティング7）超音波処理し、遠心分離（１９，０００ｇ、４℃、３０分間）を行った。これらの調製物から得られた不溶性画分（ペレット）には、ＲＤＲＰが多く含まれていた。ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁し、９０℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＲＤＲＰマーカーとして使用した。しかし、以下のプロトコルに記載するように、活性な酵素は上清に観察された。
組み換えＲＤＲＰを可溶化する方法の概略
１．  ５ｇの大腸菌ペレットを解凍する。
２．  ５ｇのペレットを以下の溶液に再懸濁する。
４５ml  溶解バッファー
４０μl  １００mM ＰＭＳＦ（及び他のプロテアーゼ阻害剤）
１５０μl  リゾチーム（１０mg/ml）
溶解バッファー：
２０mMトリス（pH７．５）（４℃）
０．５mM ＥＤＴＡ
１００mM  ＫＣｌ
１mM  ＤＴＴ
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（又は０．１％ ＮＰ−４０）
１０．０％（ｖ／ｖ）グリセロール
３．  サンプルを氷上に２０分放置し、次に５分間超音波処理（パルスモード；６〜７の間のセッティング）する。超音波処理の間、混合する。
４．  瞬時の超音波処理（sonicating flash）後、溶解物を液体窒素中で凍結させる（溶解物を約１〜２分間液体窒素中に投入する）。
５．  ３７℃の水浴で溶解物を急速に解凍する。
６．  溶解物を１分間超音波処理する。
７．  超音波処理したサンプル混合物４５mlにつき５mlの溶解バッファーをさらに添加する。
８．  全超音波処理済サンプルを５０mlの画分（フィッシャー５０mlチューブ）に分割する。
９．  溶解物を、ベックマン（Beckman）Ｊ−１７ローター中、１２，５００rpm（又はソバール（Sorvall）ＳＳ−３４ローター中、１２，５００rpm）、２０分間の遠心分離にかける。
１０．  上清を清潔な（無菌の）５０mlフィッシャーチューブにとり、無菌タンパク質等級のグリセロールを最終濃度１０％（例えば、４０mlの上清に対し４．４４mlのグリセロール）で添加した。この溶液を４℃で保存し、酵素活性を有するＨＣＶ ＲＤＲＰの精製のための出発物質として使用した。
以下の工程を、単独で、又は組み合わせて用いることにより、さらに精製を行う。
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すべてのタンパク質精製工程と同様、バッファー、pH、及びその他の条件は、ＨＣＶ ＲＤＲＰの精製がより最適化されるよう修飾することができる。追加される最終精製工程（又はＦＰＬＣゲル濾過工程の代わりの工程）は、pH６．０でＭＥＳバッファーを用いたＭｏｎｏ−Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィー工程である（酵素の等電点は約８．８である）。すべての精製工程において、ＲＤＲＰアッセイを用いて酵素活性、総タンパク質量をモニターし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行う。
ウサギ抗ＨＣＶ ＲＤＲＰ血清  −  上記のようにしてペレット画分から可溶化されたＲＤＲＰを調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウサギを免疫するために用いた。動物を、既に詳細に開示されている方法（Harlow, E. and D. Lane（1988）Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 553-611）で、４〜５週の間隔で免疫した。
イムノブロッティング分析  −  イムノブロットは、既に開示されている方法に、二次ＨＲＰ結合抗体を増幅化学発光系（ＥＬＣ，アメルシャム（Amersham））と共に用いるという修飾を加えて行った。ウサギ血清を一次抗体として用いる場合には、二次抗体は抗ウサギ免疫グロブリンであった。ヒト血清をスクリーニングする場合には、二次抗体は抗ヒト免疫グロブリンであった。慢性Ｃ型肝炎に感染していることが証明されている患者由来の血清は、疾病の管理と予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）（アトランタ）のマイケル・ビーチ博士（Dr. Michael Beach）から提供された。
ポリ（Ｕ）ポリメラーゼアッセイ  −  可溶性画分中の酵素活性は、鋳型としてポリ（Ａ）、プライマーとしてオリゴ（Ｕ）を用いたポリ（Ｕ）ポリメラーゼアッセイにより測定した（Hey, T.D. et al.（1986）J. Virol. 58: 790-796）。サンプル（およそ２μl）を、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH８．０）、各５００μMのＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＧＴＰ、４mM ＤＴＴ、３mM ＭｇＡｃ2、ならびに６０μM ＺｎＣｌ2を含む５０μlのインキュベーション中でアッセイした。１５μMの濃度の［3Ｈ］ＵＴＰ（特異的活性：２７Ci/mol）も添加した。各インキュベーション中に、１μgのポリ（Ａ）、そしてプライマーとして０．５μgのオリゴ（Ｕ）を加えた。
インキュベーションを３０℃で３０〜６０分間行い、［3Ｈ］ポリ（Ｕ）をキャリヤＤＮＡの存在下、ＴＣＡで沈殿させ、ワットマン（Whatman）ＧＦ／Ｃフィルターで回収した。フィルターを０．１Mピロリン酸ナトリウム／１Ｎ塩酸及び９５％エタノールの各々で洗浄した。［3Ｈ］ポリ（Ｕ）は、液体シンチレーション分光光度測定法（LKB 1218 ラックベータ（RackBeta））により定量した。
リポフェクチンを用いた新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞の安定的形質転換
１日目（午後）
形質転換のため５０％のコンフルエンシー状態になるようにＢＨＫ細胞を６穴プレートに分割する。
２日目（午後４時以降）
滅菌チューブ中で以下の溶液を調製する。
（Ａ）５０μlミニプレップＤＮＡ＋５０μl無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）
（各２）
（Ｂ）６．２５μlリポフェクチン（ライフ テクノロジーズ（Life Technologies）, Gaithersburg, MD）＋９３．７５μl培地
（Ｃ）１２．５μlリポフェクチン＋８７．５μl培地
（Ｄ）６．２５μlリポフェクチン＋１９３．７５μl培地（モック形質転換）
（Ｅ）１２．５μlリポフェクチン＋１８７．５μl培地（モック形質転換）
ＡとＢ、及びＡとＣを穏和に混合し、室温で１５分間ＤＮＡとリポフェクチンを反応させる。この間、細胞を２mlのＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄する。ＤＮＡ／リポフェクチン複合体に１．８mlのＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加し、それを穏和に攪拌しながら細胞へと添加する。インキュベーター中に一晩細胞を放置する。
３日目（午前９時）
ＤＮＡ／リポフェクチンを取り出し、３mlの培地＋血清を細胞に添加する。細胞を３０〜４８時間インキュベートする。１：２０、１：５０、１：１００の細胞を、１０mlの６００μg/mlゲネチシンを含む培地＋血清で、１０cmのプレートに分割する。選別のため３〜７日間、コロニー形成のため１０〜１４日間放置する。形質転換効率を改善するため、リポフェクチンの代わりにスターバースト・デンドリマー（Starburst Dendrimer）（ライフ テクノロジーズ、Gaithersburg, MD）を用いても、同じプロトコルを適用できる。
選別後、クローンコロニーを２４穴プレートに播き、コンフルエンシー状態のウェルの培地のＲＤＲＰ活性をアッセイする。細胞は、６００μg/mlのゲネチシン中で維持する。
完全な細胞に侵入しＨＣＶ ＲＤＲＰを阻害する化合物を同定するための、安定的形質転換細胞のＨＣＶ ＲＤＲＰ発現の使用
形質転換細胞におけるＨＣＶ ＲＤＲＰの阻害剤候補の効果を決定するための最も直接的な方法は、細胞を化合物と共にインキュベートし十分に洗浄した後、細胞抽出物中のＲＤＲＰ活性を直接的に測定することである。これは、本明細書に記載のＲＤＲＰアッセイにより（ＨＣＶ鋳型を用いて）行うことができ、細胞系以外には新たな改良を必要としない。簡単に述べると、活性酵素を最大に発現する条件下で、そしてその後の酵素アッセイに十分な量で、細胞をインキュベートする。被検化合物をインキュベーション中に添加し、所望の時間に培地を除去し、細胞外被検化合物を除去するため細胞を十分に洗浄する。本明細書に記載の一般的な方法に従い、細胞抽出物をＲＤＲＰアッセイ用に調製する。この方法は比較的迅速に行われ、本発明者らの現在の方法にほんのわずかな変更（新しい細胞系）を必要とするのみである。阻害剤の動力学的研究（細胞内で阻害がどの程度の速度で生じるか）を完全な細胞で行う必要がある場合には、同じインキュベーションを２つ行う。この方法で考えられる唯一の問題点は、細胞には侵入しない化合物が、調製中に細胞溶解物へと混入してしまう可能性があることである。この起こりうる問題を回避するためには、至適な「洗浄」工程がどのようなものであるのかを決定することが必要である。この系の主要な利点は、精製ＲＤＲＰを用いて試験するには面倒な大きな修飾（ヌクレオシドのリン酸化）をする必要がある化合物を、迅速にスクリーニングできることである。より迅速なスクリーニングは、潜在的な阻害剤と共にインキュベートした細胞に、容易に測定できるレポーター分子（分泌アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼ等）もコードするＨＣＶ ＲＮＡ鋳型を発現するよう遺伝子操作されたプラスミドを、一過性形質転換することにより行いうる。このような系により、完全な細胞におけるＨＣＶ ＲＤＲＰ活性が測定される（阻害濃度は細胞の溶解などにより希釈されない）。ＲＤＲＰ活性が阻害される細胞を迅速にスクリーニングすることにより、多数の阻害剤候補を迅速にスクリーニングすることができる。
宿主細胞内で発現したｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの活性がレポーター遺伝子の発現に必要であるようなレポーター系が開発されている。ｍＲＮＡとして発現した際にＨＣＶ複製中間体と類似するような構造中にレポーターコーディング配列をアンチセンス型で保持するよう設計された構築物で、宿主細胞を形質転換する。ｍＲＮＡには、５’末端から始まり、キャップ部位、アンチセンス型、すなわち（−）鎖型のレポーターコーディング領域、同様に（−）鎖型のＨＣＶ内部リボソーム侵入部位（internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）因子、（＋）鎖型のリボザイム配列、及び（＋）鎖型のポリアデニル化部位が含まれる。このようなｍＲＮＡは、翻訳されると、レポーター遺伝子の（−）鎖によりコードされるナンセンスタンパク質を生じる。しかし、相補鎖がｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰにより合成されると、（＋）鎖のコーディング配列がレポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、蛍光グリーンタンパク質、分泌アルカリホスファターゼなど）として翻訳可能になる。相補鎖合成は細胞質で起こり、キャップ構造付加は宿主細胞核で起こるため、ＲＤＲＰにより生成された相補鎖には、キャップ構造を有する５’末端が欠けている。しかし、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ因子の存在により、キャップ非依存性翻訳が可能となる（ＩＲＥＳ因子は、相補鎖中の（＋）鎖コーディング配列の５’側に位置する）。リボザイムモチーフの機能は、ＲＤＲＰによる相補鎖合成の前に、（−）鎖の３’末端からポリ（Ａ）尾部を除去し、付随的にそれ自身が除去されることである。適切なリボザイムモチーフは、例えば、デルタ型肝炎ウイルスのＲ2８９ccにより提供される。取り込まれたＤＮＡから転写されるとき、ＲＮＡ中のレポーターは以下のように図示される。
0004191797.tif 000005
前述の構造への付加には、ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ活性を調節又は増強しうる二次構造を提供する、ＨＣＶ３’非翻訳領域の配列の提供が含まれる。ｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの作用により、レポーター遺伝子が発現し、蛍光、化学発光、又は色素生成反応のような容易に同定可能な反応の産物が生じる。このような反応産物の存在により、間接的に、宿主細胞で発現したｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰの活性が示され、したがって、インビボでのｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ活性に対する被検化合物の効果を観察するための手段が提供される。インビボでのｒ−ＨＣＶ−ＲＤＲＰ活性の阻害剤は、ＨＣＶに対する抗ウイルス剤となる可能性がある。
本発明を、具体的な実施態様及び実施例に関して詳細に開示してきたが、本明細書に記載された一つ又は複数の教示、原理、及び結果を、本発明の範囲に含まれる、当業者により適用される当該技術分野における知識と組み合わせることにより、さらなる実施態様、実施例、及び変更が行われうることが理解されるであろう。
配列表
（１）全体的情報：
（ｉ）  出願人：ハーゲドーン、カート  エイチ．（Hagedorn, Curt H.）
アル、レイノルダス  エイチ．（Al, Reinoldus H.）
（ii）  発明の名称：組み換えＣ型肝炎ウイルスＲＮＡレプリカーゼ
（iii） 配列の数：１０
（iv）  連絡先：
（Ａ）名宛人：グリーンリー、ウィナー  アンド  サリバン、ピー．シー．（Greenlee, Winner and Sullivan, P.C.）
（Ｂ）街路：5370 マンハッタン サークル（Manhattan Circle）、スウィート（Suite）201
（Ｃ）市：ボルダー（Boulder）
（Ｄ）州：コロラド
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）ＺＩＰ：80303
（ｖ）  コンピュータ可読形態：
（Ａ）媒体の型式：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換型
（Ｃ）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn  リリース＃１．０、バージョン＃１．３０
（vi）  最新の出願データ：
（Ａ）出願番号：米国
（Ｂ）出願日：1996年９月27日
（Ｃ）分類：
（vii） 先願のデータ：
（Ａ）出願番号：US 60/004383
（Ｂ）出願日：1995年９月27日
（viii）弁理士／代理人の情報：
（Ａ）名称：グリーンリー、ローランス  エル．（Lorance L.）
（Ｂ）登録番号：27,894
（Ｃ）参照／書類番号：76-95US
（ix）  遠隔通信情報：
（Ａ）電話：（303）499-8080
（Ｂ）テレファックス：（303）499-8089
（２）配列番号１に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：1788塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：該当なし
（ii）  配列の種類：cDNAないしmRNA
（iii） ハイポセチカル：No
（ix）  特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：CDS
（Ｂ）存在位置：1..1782
（xi）  配列の記載：配列番号１：
0004191797.tif 000006
0004191797.tif 000007
0004191797.tif 000008
0004191797.tif 000009
0004191797.tif 000010
（２）配列番号２に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：594アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列の記載：配列番号２：
0004191797.tif 000011
0004191797.tif 000012
0004191797.tif 000013
0004191797.tif 000014
（２）配列番号３に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明：/desc＝「オリゴヌクレオチドプライマー」
（iii） ハイポセチカル：No
（xi）  配列の記載：配列番号３：
0004191797.tif 000015
（２）配列番号４に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明：/desc＝「オリゴヌクレオチドプライマー」
（iii） ハイポセチカル：No
（xi）  配列の記載：配列番号４：
0004191797.tif 000016
（２）配列番号５に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：5アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：該当なし
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセチカル：No
（ｖ）  フラグメント型：N-末端
（xi）  配列の記載：配列番号５：
0004191797.tif 000017
（２）配列番号６に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：6アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：該当なし
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセチカル：No
（ｖ）  フラグメント型：N-末端
（xi）  配列の記載：配列番号６：
0004191797.tif 000018
（２）配列番号７に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：該当なし
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセチカル：No
（ｖ）  フラグメント型：N-末端
（xi）  配列の記載：配列番号７：
0004191797.tif 000019
（２）配列番号８に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：8アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：該当なし
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）  配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセチカル：Yes
（xi）  配列の記載：配列番号８：
0004191797.tif 000020
（２）配列番号９に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：104塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：該当なし
（ii）  配列の種類：他の核酸
（iii） ハイポセチカル：No
（ix）  特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：CDS
（Ｂ）存在位置：63..104
（xi）  配列の記載：配列番号９：
0004191797.tif 000021
（２）配列番号10に関する情報：
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：14アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：タンパク質
（xi）  配列の記載：配列番号10：
0004191797.tif 000022
【図１】
0004191797.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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