(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト22番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む約2.5Mb〜約1.5Mb領域と、非ヒト動物の生殖系列を経由して子孫伝達されうるSC20染色体ベクターが結合したものである、ここでSC20染色体ベクターは受託番号FERM BP-7583である細胞に保持されているものである、ヒト人工染色体。
【請求項２】
ヒト22番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域が、約2.5Mbの大きさである、請求項１に記載のヒト人工染色体。
【請求項３】
受託番号FERM BP-7582である細胞に保持されるΔHACである、請求項２に記載のヒト人工染色体。
【請求項４】
ヒト22番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域が、約1.5Mbの大きさである、請求項１に記載のヒト人工染色体。
【請求項５】
受託番号FERM BP-7581である細胞に保持されるΔΔHACである、請求項４に記載のヒト人工染色体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト人工染色体を保持する非ヒト動物。
【請求項７】
ΔHACまたはΔΔHACのいずれかを保持する、請求項６に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
哺乳動物である、請求項６または7に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
哺乳動物がマウスである、請求項８に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の非ヒト動物の作製方法であって、該方法が、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト人工染色体を非ヒト動物の胚性幹細胞（ES細胞）中にミクロセル法により導入すること、得られたES細胞を、該非ヒト動物の胚に注入すること、得られた注入胚を仮親に移植すること、該仮親からキメラ非ヒト動物を出産により得ること、該キメラ非ヒト動物を、該ヒト人工染色体についてスクリーニングすることを含む、上記方法。
【請求項１１】
前記スクリーニングされたキメラ非ヒト動物の子孫を作出し、該子孫を前記ヒト人工染色体についてスクリーニングすることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
非ヒト動物がヒト抗体免疫グロブリン重鎖およびλ鎖蛋白質を発現可能である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
非ヒト動物が哺乳動物である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物がマウスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト人工染色体を保持する非ヒト動物。
【請求項１６】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の非ヒト動物の子孫動物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト人工染色体を保持することを特徴とする前記子孫動物。
【請求項１７】
ヒト抗体免疫グロブリン重鎖およびλ軽鎖蛋白質を発現可能である、請求項１６に記載の子孫動物。
【請求項１８】
ヒト抗体免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖およびλ軽鎖蛋白質を発現可能である、請求項１６に記載の子孫動物。
【請求項１９】
マウスである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の子孫動物。
【請求項２０】
請求項６〜９、１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の子孫動物を、所望の抗原で免疫し、該動物から該抗原に対するヒトポリクローナル抗体を得ることを含む、抗体の作製方法。
【請求項２１】
ヒトポリクローナル抗体が動物の血液から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項９または１５に記載のマウス、あるいは請求項１９に記載の子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
【請求項２３】
請求項９または１５に記載のマウス、あるいは請求項１９に記載の子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマからヒト抗体遺伝子を単離し、該ヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
【請求項２４】
請求項９または１５に記載のマウス、あるいは請求項１９に記載の子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスのＢ細胞由来の抗体遺伝子をファージディスプレイ法により選抜し、選抜されたヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
【請求項２５】
再配列されていないヒト抗体重鎖遺伝子座、再配列されていないヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、および再配列されていないヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を保持し、少なくとも内因性抗体重鎖およびκ軽鎖の両アレルが破壊または不活性化されており、血清中にヒト抗体Ｉｇγアイソタイプを含むヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖およびヒト抗体λ軽鎖を発現する、ヒト抗体産生マウスであって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト人工染色体を保持し、ヒト抗体重鎖遺伝子座とヒト抗体λ軽鎖遺伝子座が該ヒト人工染色体に保持される、マウス。
【請求項２６】
ヒト抗体κ軽鎖の可変領域の少なくとも40％を保持するものである、請求項２５に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項２７】
ヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖、およびヒト抗体λ軽鎖のすべての可変領域を保持するものである、請求項２５に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項２８】
ヒト抗体重鎖遺伝子座およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座が、ΔHACまたはΔΔHAC上に保持されるものである、請求項２５に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項２９】
ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座が、ヒト由来の染色体断片上に保持されるものである、請求項２５に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項３０】
キメラマウスではないことを特徴とする、請求項２５に記載のヒト抗体産生マウス。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、染色体あるいはその断片を改変し、次世代に高効率で子孫伝達可能となるヒト人工染色体、該ヒト人工染色体を次世代に高効率で子孫伝達する非ヒト動物およびその子孫、該非ヒト動物またはその子孫からの抗体の作製方法、ならびにヒト抗体産生マウスに関する。
背景技術
染色体断片を含むミクロセルと分化多能性を有する細胞との融合により得られるハイブリッド細胞からキメラ動物を作製する技術（ＷＯ９７／０７６７１）の開発により、従来不可能であった長大な外来遺伝子を保持する非ヒト動物の作製が可能になった。
非ヒト動物に導入される染色体断片を改変することにより、（１）不要な遺伝子の除去、（２）所望の遺伝子の付加、（３）染色体断片の安定化等を行い得ることは有用である。ＷＯ９８／３７７５７には、非ヒト動物に導入される染色体断片の改変方法の概要ならびにニワトリ由来のＤＴ−４０細胞に保持されたヒト染色体にテロメア配列をターゲティングし、高効率で所望の欠失染色体を取得できたことが記載されている。また、マウスＥＳ細胞およびマウス個体において安定に保持され、かつ子孫伝達効率の高いヒト染色体断片について記載されている。さらに、ＷＯ００／１０３８３には、ヒト染色体上の所望の領域を安定な染色体断片（染色体ベクター）に転座させた、より安定なヒト人工染色体（Ｈｕｍａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；以下、ＨＡＣと略記することがある）の作製方法が記載されている。
近年、黒岩ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）は、メガベース（Ｍｂ）サイズの特定ヒト染色体領域をインサートとして保持するヒト人工染色体（ＨＡＣ）の作製に世界で初めて成功した。このＨＡＣ（λＨＡＣ）は、安定かつ子孫伝達可能なヒト１４番染色体由来のＳＣ２０断片を染色体ベクターとして用い、このベクターにヒト２２番染色体上のヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含む１０Ｍｂサイズの染色体領域をインサートとして転座しクローニングすることによって得られた人工染色体である。彼らは、このλＨＡＣがベクターとして用いたＳＣ２０断片とほぼ同等の安定性を持つことを示し、様々な不安定染色体由来の領域をＳＣ２０へ転座クローニングすることで安定化できる可能性を示した。さらに、このλＨＡＣをマウスへ導入し、安定にλＨＡＣを保持するキメラマウスの作出に成功した。
非ヒト動物における導入ヒト染色体の次世代への子孫伝達は、交配による均一な性質を持ったトランスクロモソミック動物（異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達された、非ヒト動物のことをいう。）の大量生産という点のみならず、導入ヒト染色体の生殖系列を介した構造・機能解析という点でも重要である。今まで、数種類のヒト染色体がマウスへ導入されてきたが、その子孫伝達能は導入ヒト染色体の構造に依存していると考えられる。子孫伝達のためには、第一にＥＳ細胞が高い効率で生殖細胞へ寄与しているキメラ率の高いキメラマウスを得ることが必須条件であるが、このキメラ率は導入染色体上にどのようなヒト遺伝子が存在しているのかという導入ヒト染色体の構造が関与していると考えられる。例えば、ヒト２番、１４番染色体断片を導入した場合には１００％キメラ率に近いキメラマウスが得られ、その子孫伝達効率も高い（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７，２０００）のに対して、ヒト２２番染色体断片を導入した場合には５０％以下の低キメラマウスがほとんどである。これは、ヒト２２番染色体上にはマウスの発生に悪影響を及ぼす有害なヒト遺伝子が存在していることに起因しているかもしれない。実際に、ヒト抗体Ｉｇλ遺伝子が存在するヒト２２番染色体上の２２ｑ１１領域には猫目症候群、ＤｉＧｅｏｒｇｅ症候群、ｄｅｒ２２症候群などの遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域が存在していることが報告されている（例えば、Ａ．Ｐｕｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９７：１００９０，２０００）。前述したように、これらの遺伝病領域を取り除き、ヒト２２番染色体上のＨＣＦ２遺伝子座からＬＩＦ遺伝子座までの１０ＭｂのみをＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングしてλＨＡＣを構築し、マウスへ導入した結果、λＨＡＣを保持するＥＳ細胞から誕生したキメラマウスのキメラ率はヒト２２番染色体全長を導入した場合と比較すると高まったことが報告されている。
このような状況下で、本発明者らは、従来のλＨＡＣに比してより効率的な子孫伝達を達成する目的で、さらなるヒト人工染色体の改良を試み、その子孫伝達効率の検討を行った。
すなわち、本発明は、ヒト２２番染色体あるいはその断片を改変し、次世代に高効率で子孫伝達可能であるヒト人工染色体、ならびに該ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物およびその子孫を提供することを目的とする。
本発明はまた、該非ヒト動物またはその子孫を用いてヒト抗体を作製する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒト２２番染色体を改変し、抗体λ軽鎖遺伝子（Ｉｇλ）領域を含む構造が明らかな２種類の領域を選出し、該選出領域の各々をヒト１４番染色体断片に転座させたヒト人工染色体を構築し、これらを保持する高キメラ率マウスを作出した。その結果、本発明者らは、該キメラマウスにおいて、該ヒト人工染色体が減数分裂を経て次世代の子孫へ高効率で伝達することを観察し、本発明を完成させた。
発明の開示
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明は、一の態様において、ヒト２２番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む約３．５Ｍｂ〜約１Ｍｂ領域と、非ヒト動物の生殖系列を経由して子孫伝達されうる別のヒト染色体由来の染色体断片が結合したものである、ヒト人工染色体を提供する。
その一の実施形態において、前記の別のヒト染色体由来の染色体断片は、安定でかつ子孫伝達可能な任意のヒト染色体断片であればいずれでもよく、例えば、ヒト１４番染色体断片、ヒト２１番染色体またはその断片、あるいはヒト１番染色体１ｐ２２領域を含むＳＡＣ（ｓｍａｌｌ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１１：１２４−１３６，２００１）など、好ましくはヒト１４番染色体断片、例えば、ヒト１４番染色体由来のＳＣ２０染色体ベクター（黒岩ら、前出）である。該ＳＣ２０染色体ベクターは、例えば、１４ｐ１２部位に位置するＲＮＲ２遺伝子座にｌｏｘＰ配列を相同組換えにより挿入することにより、所望の染色体断片をクローニングするために使用することができる（黒岩ら、前出）。ＳＣ２０染色体ベクターを保持するニワトリＤＴ−４０細胞（ＳＣ２０）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８３が与えられている。前記の別のヒト染色体由来の染色体断片は、ＷＯ９７／０７６７１に開示された方法により、好ましくは大きさが約２０Ｍｂ以下の種々のヒト染色体断片について該染色体断片を保持するキメラ非ヒト動物を作製し、前記キメラ非ヒト動物の子孫において前記ヒト染色体断片が安定に保持されるものを選抜することによっても取得することができる。前記ヒト２２番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域と、子孫伝達可能なヒト染色体断片との結合は、ｌｏｘＰ配列などの、部位特異的組換え配列を介した転座あるいは挿入により行われる。抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域が、後述の実施例において示される如く、テロメア配列とｌｏｘＰ配列を両端として切り出される場合には転座による結合が起こる。一方、両端にｌｏｘＰ配列を挿入することにより抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域が切り出される場合には、子孫伝達可能なヒト染色体断片上のｌｏｘＰ配列部位への挿入が起こる。
別の実施形態において、ヒト２２番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域は、約２．５Ｍｂ〜約１．５Ｍｂの大きさである。
別の実施形態において、ヒト２２番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域は、約２．５Ｍｂまたは約１．５Ｍｂの大きさである。このような大きさの該領域の具体例はそれぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８２であるニワトリＤＴ−４０細胞（ΔＨＡＣ）に保持されるΔＨＡＣ、および受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８１であるニワトリＤＴ−４０細胞（ΔΔＨＡＣ）に保持されるΔΔＨＡＣからなるヒト人工染色体である（後述の実施例参照）。
本発明はまた、別の態様において、上記の本発明ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物を提供する。本明細書中、非ヒト動物とは、ヒトを除く脊椎動物、好ましくは哺乳動物をいう。
その一の実施形態において、非ヒト動物は、ΔＨＡＣまたはΔΔＨＡＣのいずれかのヒト人工染色体を保持する。
その別の実施形態において、非ヒト動物が哺乳動物である。好ましい補乳動物は、マウスである。
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明ヒト人工染色体を非ヒト動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）中にミクロセル法により導入すること、得られたＥＳ細胞を該非ヒト動物の胚に注入すること、得られた注入胚を仮親に移植すること、該仮親からキメラ非ヒト動物を出産により得ること、該キメラ非ヒト動物を、該ヒト人工染色体についてスクリーニングすることを含む、非ヒト動物の作製方法を提供する。
ＥＳ細胞への導入に際して、ヒト人工染色体を保持するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を作製し、該ＣＨＯ細胞を介して該ヒト人工染色体をＥＳ細胞に導入してもよい。
その一の実施形態において、上記方法は、上記スクリーニングされたキメラ非ヒト動物の子孫を作出し、該子孫を上記ヒト染色体についてスクリーニングすることをさらに含む。
別の実施形態において、前記方法によって得られる非ヒト動物は、ヒト抗体免疫グロブリン重鎖およびλ鎖蛋白質を発現可能である。
また別の実施形態において、非ヒト動物が哺乳動物、好ましくはマウスである。
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明方法によって得ることができる、上記の本発明ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物を提供する。
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明非ヒト動物の子孫動物を提供する。子孫動物は、本発明ヒト人工染色体を保持することを特徴とする。
その一の実施形態において、子孫動物は、ヒト抗体免疫グロブリン重鎖およびλ軽鎖蛋白質を発現可能である。
別の実施形態において、子孫動物は、ヒト抗体免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖およびλ軽鎖蛋白質を発現可能である。
別の実施形態において、子孫動物はマウスである。
本発明はさらに、上記の本発明非ヒト動物、または上記の本発明子孫動物を、所望の抗原で免疫し、該動物から該抗原に対するヒトポリクローナル抗体を得ることを含む、抗体の作製方法を提供する。
その実施形態において、前記ヒトポリクローナル抗体は動物の血液から得られる。
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明マウス、あるいは上記の本発明子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法を提供する。
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明マウス、あるいは上記の本発明子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマからヒト抗体遺伝子を単離し、該ヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法を提供する。
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明マウス、あるいは上記の本発明子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスのＢ細胞由来の抗体遺伝子をファージディスプレイ法により選抜し、選抜されたヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法を提供する。
ここで上記発現のための方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載される方法）によって実施し得る。宿主としての動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、パン酵母細胞、ＳＦ９細胞等である。
本発明はさらに、別の態様において、血清中にヒト抗体Ｉｇγアイソタイプを含むヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖およびヒト抗体λ軽鎖を発現する、ヒト抗体産生マウスを提供する。当該ヒト抗体産生マウスは、再配列されていない、ヒト抗体重鎖遺伝子座、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を保持し、少なくとも内因性抗体重鎖およびκ軽鎖の両アレルが破壊または不活性化されている。
上記ヒト抗体産生マウスでは、Ｂ細胞の分化に伴いヒト抗体遺伝子の再配列による特定可変領域断片の連結（重鎖ではＶ−Ｄ−Ｊ、軽鎖ではＶ−Ｊ）が生じ、好ましくはＢ細胞の成熟に伴い抗体遺伝子の可変領域における体細胞変異を経た後、血清中に当該遺伝子産物であるヒト抗体が産生される。
すなわち、「再配列されていない」とは、抗体遺伝子座が、重鎖においてはＶ−Ｄ−Ｊ組換え、軽鎖においてはＶ−Ｊ組換えを起こしておらず、Ｂ細胞の分化に伴い重鎖においてはＶ−Ｄ−Ｊ組換え、軽鎖においてはＶ−Ｊ組換えを起こしうる状態で、マウスの未分化なＢ細胞に保持されていることをいう。
その一の実施形態において、上記ヒト抗体産生マウスは、ヒト抗体κ軽鎖の可変領域の少なくとも４０％を保持する。
別の実施形態において、上記ヒト抗体産生マウスは、ヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖、およびヒト抗体λ軽鎖のすべての可変領域を保持する。
また別の実施形態において、ヒト抗体重鎖遺伝子座、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座は、ヒト由来の染色体断片上に保持される。
さらに別の実施形態において、ヒト抗体重鎖遺伝子座およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座は、ΔＨＡＣまたはΔΔＨＡＣのいずれかのヒト人工染色体上に保持される。
さらに別の実施形態において、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座は、ヒト由来の染色体断片上に保持される。
さらに別の実施形態において、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座は、マウス染色体に挿入される。
さらにまた別の実施形態において、上記ヒト抗体産生マウスはキメラマウスではないことを特徴とし、好ましくは上記ヒト抗体重鎖遺伝子座、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を子孫伝達しうる。
１．  ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、およびトランスクロモソミック非ヒト動物の作製とその利用
本発明は、ヒト２２番染色体上のＩｇλ遺伝子を含む断片を、ヒト１４番染色体に由来する染色体断片に転座、クローニングした新規ヒト人工染色体の構築、該ヒト人工染色体のマウスでの子孫伝達および該ヒト人工染色体を保持するトランスクロモソミック非ヒト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物）の作製に関する。
本明細書中において、ヒト人工染色体とは、ヒト染色体上の所望の領域を安定な染色体断片（染色体ベクター）に転座させて作製された、人工染色体（ＨＡＣ：Ｈｕｍａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）をいう。また、トランスクロモソミック非ヒト動物とは、異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達された、ヒト以外の動物をいう。
ヒト人工染色体は、例えば、ｌｏｘＰ配列およびヒトテロメア配列をヒト染色体上の目的遺伝子領域の近傍に相同組換えにより挿入し、両配列に挟まれた目的遺伝子領域周辺のみを別の染色体断片（安定でかつ子孫伝達可能な染色体断片であることが望ましい；ヒト１４番染色体由来ＳＣ２０染色体ベクターなど）上の対応ｌｏｘＰ配列挿入部位に特異的に転座させることによって、目的遺伝子領域周辺のみをインサート（染色体インサート）として保持するヒト人工染色体として作製される（黒岩ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：１０８６，２０００）。
本発明者らは、ヒト人工染色体の作製において、マウスなどの被染色体導入動物の発生に悪影響を与えないように、悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を染色体インサート上から可能な限り除去することが望ましいと考えてきた。しかし、従来は、ヒト染色体の詳細な配列等の構造に関する情報がないか、または不足していたため、目的遺伝子の近傍に、例えば、ｌｏｘＰ配列およびヒトテロメア配列を挿入することが困難な場合があった。この場合、両配列に挟まれた領域には目的遺伝子以外にも、その他多くの遺伝子が含まれるので、これら余剰遺伝子がマウスなどに導入された場合に、発生に悪影響を及ぼすことが危惧された。さらにまた、目的遺伝子を含む染色体インサートのサイズと、被染色体導入動物のキメラ率および子孫伝達効率との関係が不明であった。
本発明者らは、Ｉｇλ遺伝子が存在するヒト２２番染色体の構造に関する情報（例えば、Ｉ．Ｄｕｎｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：４８９，１９９９）に基づき、ある特定サイズ範囲の、Ｉｇλ遺伝子含有染色体インサートについて、被染色体導入動物のキメラ率および子孫伝達効率がいずれも有意に上昇することを今回見出した。このように余剰遺伝子をヒト人工染色体から取り除くことによって、特定されたＩｇλ遺伝子領域周辺をインサートとして保持する新規ヒト人工染色体を作製することが可能となった。本明細書中、余剰遺伝子とは、被染色体導入動物の発生に悪影響を与える有害遺伝子を指し、例えば、遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域などである。本発明のヒト人工染色体は、従来のＩｇλ遺伝子領域周辺１０Ｍｂをインサートとして保持するλＨＡＣと比べて、その全体の大きさが縮小しており、また高い子孫伝達効率を有している。
このように、ヒト２２番染色体の改変により、マウスなどの発生に悪影響を与え得る有害遺伝子が除去され、特定の目的Ｉｇλ遺伝子領域のみをインサートとして保持するヒト人工染色体を作製できる。また、上記改変の結果、導入されるヒト人工染色体全体のサイズ縮小化をもたらすとともに、減数分裂時における異常染色体（この場合、導入ヒト人工染色体）の排除機構（例えば、Ｐ．Ｈｕｎｔら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４：２００７，１９９５）を回避できる。さらにまた、従来のλＨＡＣ（黒岩ら、前出）と比較して、導入ヒト人工染色体をヒト人工染色体導入動物（例えば、マウス）の子孫に伝達させることがより容易になるし、またヒト抗体重鎖・λ軽鎖全領域を保持するトランスクロモソミック非ヒト動物の作製をより効率的に行うことが可能である。
上記のようにして得られるトランスクロモソミック非ヒト動物を利用して、外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物を回収することにより、生物学的に活性な物質を製造することができる。具体的には、トランスクロモソミック非ヒト動物個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、その後、発現産物を動物の血液、腹水などから回収することができる。
また、トランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞あるいはそれを不死化したもの（例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブリドーマ）などを、外来染色体またはその断片上の遺伝子が発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物を培養物から回収することができる。
あるいはまた、これらトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものから抽出した外来染色体もしくはその断片、この外来染色体もしくはその断片を構成するＤＮＡ、またはトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものに保持された外来染色体もしくはその断片に由来するｃＤＮＡを、動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、パン酵母細胞、ＳＦ９細胞等）に導入し、該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物（例えば、特定の抗原特異的な抗体タンパク質等）を培養物から回収することができる。発現産物は遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィーなどの公知の方法に従って精製することができる。生物学的に活性な物質は、外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、例えば、抗体、特にヒト抗体などを挙げることができる。例えば、得られたトランスクロモソミック非ヒト動物の脾細胞あるいはそのハイブリドーマなどの不死化細胞から該染色体上のヒト抗体遺伝子をクローニングし、チャイニーハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）やミエローマ細胞に導入してヒト抗体を産生することができる（Ｌｙｎｅｔｔｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１１２１，１９９２；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９，１９９２；Ｂａｂｃｏｏｋら，ＰＮＡＳ，９３：７８４３，１９９６）。
ハイブリドーマを選抜することにより所望の抗体産生細胞を選抜するという従来の方法に加えて、近年開発されたファージディスプレイ法により、所望の抗体を選抜することも可能である（Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３，１９９４）。様々な特異性を持つヒト抗体をその表面に発現するファージライブラリーを得るためには、抗原未感作あるいは、特定の抗原を感作した本発明のトランスクロモソミック非ヒト動物の脾臓やリンパ組織由来のヒト免疫グロブリン遺伝子重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡを用いることができる。
以下に、子孫伝達効率の高いヒト人工染色体の作製方法について、さらに詳細に述べる。
望みのヒト染色体領域を含み、それを安定保持し、子孫伝達するような非ヒト動物を作製するためには、偶発的に生じた染色体断片ではなく、ヒト染色体を所望の部位で切断することにより、有害遺伝子を取り除いたり、所望の染色体断片のみを安定かつ子孫伝達可能な別の染色体につなげるなど、染色体を自在に加工する技術が望まれる。このような技術は、染色体工学と呼ばれ、これまで主にマウスＥＳ細胞中で内在性マウス染色体を部位特異的に切断したり（ＷＯ９８／５４３４８）、相同染色体間で組換え（転座）を起こさせることで特定の遺伝子領域を欠失・逆位・倍加させ、そのような改変染色体を有する変異マウスが作製されてきた（Ｒ．Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：７２０，１９９５）。本発明においても、この技術を利用できる。
ヒト染色体あるいはその断片を保持するＥＳ細胞が生殖細胞へ寄与するような高キメラ率の非ヒト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物）が得られた場合、次は導入ヒト染色体が減数分裂において除外されることなく、導入ヒト染色体を保持する精子あるいは卵子が形成されるかが問題である。前述したように、一般に、異常染色体は減数分裂時に除外される機構があると考えられており、導入ヒト染色体を保持する細胞は減数分裂において除外され、結果的に精子あるいは卵子に分化できない可能性が考えられる。これは減数分裂時には相同染色体間でのペアリングが必要であるが、導入ヒト染色体は１本しか存在しないので、基本的にはペアリングできないと考えられる。それ故に、導入ヒト染色体は減数分裂から除外される可能性がある。実際、富塚ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７）は、およそ５０Ｍｂ以上のヒト１４番染色体断片の導入は雄キメラマウスの不妊をもたらしたと報告している。一方、サイズが１０〜２０Ｍｂ前後と推定されるヒト２番、１４番染色体断片（ＳＣ２０）の子孫伝達では、減数分裂の通過のためには導入染色体のサイズが重要な因子であることが示唆された（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，，１６：１３３，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）。ＳＣ２０染色体ベクター（１０〜２０Ｍｂ）は子孫伝達可能であると共に、マウスＥＳ細胞および個体において高い安定性をもっている（Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，８：７１３−７２５，２０００）。このような子孫伝達可能かつマウス個体で安定な自然発生染色体断片は、ＷＯ９７／０７６７１およびＷＯ９８／３７７５７に記された方法で取得、選抜することができる。また、子孫伝達し、マウス個体で安定な自然発生ヒト染色体断片についてはＶｏｅｔらの報告（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１１：１２４−１３６，２００１）にも記載されている。さらに、キメラマウスにおいて安定に保持されるヒト１４番染色体（約１００Ｍｂ、Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７）や２１番染色体（約５０Ｍｂ、篠原ら、第４５回日本人類遺伝学会大会、２０００年１０月）を出発材料として、これを染色体工学的手法（Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）により１０〜２０Ｍｂ以下のサイズに縮小化することができる。本発明によれば、上記の手法を利用して導入染色体を特定のサイズ範囲に縮小することによって、マウス個体において安定かつ子孫伝達効率の高い人工染色体を得ることができる。
例えば、子孫伝達可能なＳＣ２０ベクターに特定サイズ範囲の目的遺伝子領域のみを転座、クローニングして構築されたＨＡＣは、ＳＣ２０断片のベクター効果によって子孫伝達することが可能となる。この場合、転座によってＳＣ２０の安定構造が変化すること、さらにＨＡＣ全体の大きさが元来のＳＣ２０ベクターよりも大きくなる可能性も考えられるので、転座させる染色体インサート（ヒト２２番染色体上の免疫グロブリンλ遺伝子を含む。）の大きさは、λＨＡＣ（１０Ｍｂ）よりも小さいサイズ、通常約３．５Ｍｂ〜約１Ｍｂ、好ましくは約３Ｍｂ〜約１．２Ｍｂ、さらに好ましくは約２．５Ｍｂ〜約１．５Ｍｂとしうる。前記転座させる染色体インサートのセントロメア側の端は、好ましくはＨＣＦ２遺伝子座であり、より好ましくはＡＰ０００５５３領域（Ｉ．Ｄｕｎｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：４８９，１９９９）である。このような厳密な染色体の改変のためには、ヒト２２番染色体のように改変すべき染色体の全配列の解明が大きく貢献する。すなわち、全ヒト染色体の配列が明らかとなれば、ヒト２２番染色体のみならず様々なヒト染色体上の目的遺伝子を含む周辺領域のみを厳密にＳＣ２０染色体ベクターへ転座、クローニングし、効率よく子孫伝達させることが可能になる。
上述したように、導入ヒト染色体のマウス等の非ヒト動物での子孫伝達を達成するためには、幾つかの障害があり、特にヒト２２番染色体上のＩｇλ遺伝子領域を効率良く子孫伝達させることは、困難であると考えられてきたが、本発明により、この課題が解決される。
具体的には、本発明により、ヒト２２番染色体上の抗体λ軽鎖遺伝子を含む２．５Ｍｂおよび１．５Ｍｂ領域をＳＣ２０染色体ベクターに転座、クローニングして得られたヒト人工染色体（ΔＨＡＣおよびΔΔＨＡＣ）を作製し、次いでΔＨＡＣおよびΔΔＨＡＣの各々をマウス個体へ導入し、キメラマウスにおけるキメラ率についてλＨＡＣ（黒岩ら、前出）と比較し、キメラ率の向上とヒト人工染色体の効率的な子孫伝達の達成を確認した。キメラ率は、キメラ動物におけるＥＳ細胞の寄与率を示すものであり、通常キメラ動物の体表面におけるＥＳ細胞に由来する体毛色の占める割合を視覚的に評価することにより決定されうる。以下に、この特定例について、具体的に説明する。
２．  ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣ、およびトランスクロモソミックマウスの作製とその利用
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含むヒト２２番染色体あるいはその断片は、周知の方法で取得しうる。すなわち、ミクロセル法によりヒト染色体あるいはその断片をマウスＡ９細胞にライブラリ化することができる（Ｋｏｉら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８０：４１３−４１８，１９８９）。得られたライブラリから、ＰＣＲ等によりヒト抗体λ軽鎖遺伝子特異的な配列を検出することにより、ヒト２２番染色体あるいはその断片を保持するクローンを選抜することができる。ヒト２２番染色体あるいはその断片は、その後の改変の便宜のため、さらにミクロセル法により好ましくはニワトリＤＴ−４０細胞（理研セルバンク：ＲＣＢ１４６４、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２１１１）に移入させることができる。
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子クラスターは２２番染色体上の２２ｑ１１．２に存在する（例えば、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：３６７，１９９５）。前述のλＨＡＣにおいては、ＨＣＦ２遺伝子座からＬＩＦ遺伝子座までの１０Ｍｂ領域が染色体インサートとして転座クローニングされていた。この１０Ｍｂインサートにおいて、Ｉｇλ遺伝子領域よりもテロメア側には７Ｍｂの、セントロメア側には１Ｍｂの余分な染色体領域が含まれている。そこで、まず７Ｍｂ領域を取り除くために、２２番染色体あるいは、その改変断片（ｌｏｘＰ配列がＨＣＦ２遺伝子座に挿入され、ＬＩＦ遺伝子座でテロメアトランケーションされている断片）をＩｇλ遺伝子領域の極く近傍かつテロメア側（約４００Ｋｂテロメア側）に存在するＡＰ０００３４４領域（Ｉ．Ｄｕｎｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：４８９，１９９９）でテロメアトランケーション（例えば、黒岩ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：３４４７，１９９８）することで切断する。次に、Ｉｇλ遺伝子領域の極く近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＰ０００５５３領域（Ｉ．Ｄｕｎｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：４８９，１９９９）にｌｏｘＰ配列を相同組換えにより挿入する。これらの改変により、ＨＣＦ２−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４断片（約２．５Ｍｂ）あるいはＡＰ０００５５３−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４断片（約１．５Ｍｂ）のみを染色体インサートとしてＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングできる。構築されたＨＡＣは従来の方法でマウスＥＳ細胞へ導入後、キメラマウスを作製できる。キメラマウスにおけるＨＡＣの保持を確認後、交配し、仔マウスを得る。得られた仔マウスにおいてＨＡＣの保持を確認することによって、ＨＡＣの子孫伝達を判定できる。
本発明により、ΔＨＡＣによるヒト抗体λ軽鎖遺伝子Ｉｇλ全領域の子孫伝達を介して、ヒト抗体重鎖遺伝子とλ軽鎖遺伝子を共に保持するトランスクロモソミック非ヒト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物）の効率のよい作出が可能になる。これは、医薬品の候補となり得るヒト抗体を産生する非ヒト動物として有用であると考えられる。ヒト血清中でλ軽鎖を含む抗体は約４０％を占めること、Ｖλ遺伝子断片の数（７０個）がＶκ鎖遺伝子（７６個）と同等数存在することなどから、ヒト抗体の多様性構築にはλ鎖を含む抗体が大きく寄与していると考えられている（Ｐｏｐｏｖ，ＡＶ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：１６１１，１９９９）。一方、現在世界で医薬品として用いられているヒト化抗体やヒト抗体の多くはその軽鎖がκ軽鎖から成っている。本発明のΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣトランスクロモソミックマウスはλ軽鎖を含むヒト抗体医薬開発に有用である。ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣトランスクロモソミックマウスは異種染色体断片の子孫伝達が可能であるので、交配により均一な形質を持ったトランスクロモソミックマウスの大量生産が可能になるだろう。さらに、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子を含む染色体断片を保持するマウス（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）、あるいはヒト抗体κ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウス（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：８４５−８５１，１９９６；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１５：１４６−１５６，１９９７）と該ΔＨＡＣまたはΔΔＨＡＣトランスクロモソミックマウスとを交配させることによって、ヒト抗体重鎖、κ軽鎖、およびλ軽鎖の全てから成るヒト抗体を産生するヒト抗体産生マウスを作製することも可能となる。ヒト重鎖、κ鎖、λ鎖を同時に発現するマウス系統についてはＮｉｃｈｏｌｓｏｎらの報告（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：６８９８，１９９９）がある。彼らはヒトＩｇ重鎖、κ鎖、λ鎖の一部をそれぞれ含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）を導入したトランスジェニックマウスと内在性Ｉｇ重鎖、κ鎖ノックアウトマウスの組み合わせによりヒト重鎖／κ鎖、ヒト重鎖／λ鎖分子を免疫グロブリンの主な成分とするマウスを構築した。しかし、当該マウス系統にて発現するヒト免疫グロブリンの多様性、分子構成は本来のヒトにおけるものと大きく異なる。例えば、▲１▼ヒトＩｇ重鎖ＹＡＣにはμ、δ定常領域のみが含まれ、該マウス系統においては他のアイソタイプ、特に最も大きな成分であるＩｇγアイソタイプが発現していない、▲２▼３種のＹＡＣに含まれている可変領域の数が少なく、該マウス系統で発現するヒト抗体の多様性も限定的であると想像される。
本明細書で開示されるヒトＩｇ重鎖、κ鎖、λ鎖を同時に発現するマウス系統においては、ヒトで発現している抗体の多様性、分子構成等がより忠実に再現される。例えば、▲１▼Ｉｇγアイソタイプ（４つのサブクラス全て）が発現している、▲２▼重鎖、λ鎖、κ鎖について全ての可変領域を含むため、ヒトにおけるのと同様な多様性が再現される。
これらのヒト抗体産生トランスクロモソミックマウスを適当な抗原により免疫し、その脾臓細胞とマウスミエローマを融合することにより得られる、ハイブリドーマ（安東・千葉，単クローン抗体実験操作入門，講談社サイエンティフィク，１９９１）をＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖およびλ軽鎖からなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。これらのヒトモノクローナル抗体は医薬品用抗体として用いることができる。
また、感染症などの治療用抗体医薬としては、モノクローナル抗体よりもポリクローナル抗体の方が治療効果は大きいと考えられる。さらに、ヒトポリクローナル抗体はいわゆるγグロブリン製剤として開発することもできる。本発明によって構築されるΔＨＡＣまたはΔΔＨＡＣを保持するＥＳ細胞からは、実際高キメラ率（約８０％〜１００％、好ましくは約８５％〜１００％）でキメラマウスが得られ、導入ヒト人工染色体は高効率で子孫伝達し、受精卵の段階から仔マウスとして生まれる全発生過程において保持され続けることが示された。マウス等の非ヒト動物に、それと異種の抗原を免疫することにより、大量の抗原特異的ヒトポリクローナル抗体（ヒトλ軽鎖含有抗体）を産生することができ、これは大量生産が難しいモノクローナル抗体に代わる抗体医薬として期待できる。
また、本発明のヒト人工染色体は、マウスのみならず他の非ヒト動物、例えば、ラット、ブタ等の哺乳類に導入しうる。マウス以外の動物種におけるＥＳ細胞あるいはＥＳ様細胞の樹立はラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６３：２８８，１９９４）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６：５６３，１９９４）において報告され、さらにメダカ、ニワトリ等でも試みられている（トランスジェニック動物、蛋白質核酸酵素、１９９５年１０月号増刊、共立出版）。これらのＥＳあるいはＥＳ様細胞を受容細胞として、ヒト人工染色体を移入すれば、マウスの場合と同様に、ヒト人工染色体あるいはその断片を保持し、該ヒト人工染色体上の遺伝子を発現する非ヒト動物が作製可能である。さらに、これらの非ヒト動物を利用して、ヒトλ軽鎖含有抗体の作製も可能である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００１−１４２３７１号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実施例１〜実施例１４において、ヒト２２番染色体上の抗体λ軽鎖遺伝子周辺領域２．５Ｍｂと１．５ＭｂをＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣの作製について説明する（図１）。さらには、作製された各ＨＡＣのマウス個体への導入およびＨＡＣのキメラマウス子孫への伝達について説明する。
〔実施例１〕  カセットベクターｐＴＥＬｈｉｓＤの作製
カセットベクターｐＴＥＬＰｕｒｏ（黒岩ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：１０８６−，２０００）を制限酵素ＮｏｔＩ（ベーリンガー）で切断し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ（東洋紡）を用いて７２℃、５分間で末端を平滑化した。平滑後、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造）を用いて６５℃、１時間で脱リン酸化した。その後、制限酵素ＢｇｌＩＩリンカー（宝酒造）を加え、ライゲーションキット（宝酒造）を用いてライゲーションを行った。これで、ｐＴＥＬＰｕｒｏプラスミド中のＰＧＫＰｕｒｏカセットがＢｇｌＩＩリンカーで置換されたプラスミドｐＴＥＬＢｇが作製された。このプラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、同様に脱リン酸化後、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）を用いてゲル濾過することで精製した。次にプラスミド＃１−１３２（京都大学  武田俊一教授より分与）から制限酵素ＢａｍＨＩで切り出したｈｉｓＤ断片を加え、同様にライゲーション反応を行った。これで、ｐＴＥＬＰｕｒｏプラスミド中のＰＧＫＰｕｒｏカセットがｈｉｓＤカセットに置換されたカセットベクターｐＴＥＬｈｉｓＤが作製された（図２）。
〔実施例２〕  ターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤｌＩの作製
ヒト２２番染色体上のＩｇλ遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約４００Ｋｂテロメア側）に位置するＡＰ０００３４４領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤλＩを以下のようにして作製した。まず、ＡＰ０００３４４ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
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0004115281.tif 000003
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１１分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩ（ベーリンガー）で切断し、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＥＬｈｉｓＤのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＡＰ０００３４４ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたＡＰ０００３４４ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤλＩとした（図３）。
〔実施例３〕  ターゲティングベクターｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇの作製
ヒト２２番染色体上のＩｇλ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＰ０００５５３領域にＣｒｅ組換え酵素の認識配列ｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクターｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇを以下のようにして作製した。まず、ＡＰ０００５５３ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１５分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＳａｌＩ（ベーリンガー）で切断しＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（予めＮｏｔＩ部位を欠失後、ＳａｃＩＩ部位にＳｒｆＩリンカーを挿入したもの）のＳａｌＩ部位にクローニングした（ｐＢＳ５５３）。次に，ｐＢＳ５５３を制限酵素ＨｐａＩ（ベーリンガー）で切断し脱リン酸化後、ＮｏｔＩリンカーをライゲーションにより挿入した（ｐＢＳ５５３Ｎ）。ｐＢＳ５５３Ｎを制限酵素ＮｏｔＩで切断し脱リン酸化後、カセットベクターｐｌｏｘＰＨｙｇから制限酵素ＮｏｔＩ（ベーリンガー）でｌｏｘＰを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションした。ＬｏｘＰ配列の方向がクローニングしたＡＰ０００５５３ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇとした（図４）。
〔実施例４〕  ニワトリＤＴ−４０細胞中でのヒト２２番染色体の部位特異的切断
ＷＯ９８／３７７５７に記載された方法で作製されたヒト２２番染色体全長を保持するニワトリＤＴ−４０細胞（クローン５２−１８）と既にＬＩＦ遺伝子座で切断済みのヒト２２番染色体断片を保持するＤＴ−４０細胞（クローンＨＦ３８）に上記実施例２で作製したターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤλＩをトランスフェクションし、ＡＰ０００３４４ゲノム領域にヒトテロメア配列を挿入することによって、その挿入部位で２２番染色体を切断することを試みた。
ニワトリＤＴ−４０細胞の培養は１０％ウシ胎児血清（ギブコ、以下ＦＢＳで記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で行った。約１０７個の細胞を無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で一回洗浄し、０．５ｍｌの無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、制限酵素ＳｒｆＩ（東洋紡）で線状化したターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤｌＩを２５−３０μｇ加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、５５０Ｖ、２５μＦの条件で電圧印加した。室温で１０分間静置後、２４時間培養した。２４時間後、ヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート１０枚に分注して約２週間の選択培養を行った。ヒスチジノール耐性クローンからＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧｅｎｔｒａＳｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出して、ＨＣＦ２（黒岩ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）、Ｉｇλ（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，，１６：１３３，１９９７）、Ｄ２２Ｓ１１７４，Ｄ２２Ｓ３１５，Ｄ２２Ｓ２７５（ＢＩＯＳ社）、そしてＬＩＦ（黒岩ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：３４４７−３４４８，１９９８）を検出するプライマーを用いたＰＣＲにより、ヒト２２番染色体がＡＰ０００３４４ゲノム領域で切断されていることを確認した。
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。５２−１８をトランスフェクションした場合、４８クローンをスクリーニングして１クローン（Ｔ３２）が目的のクローンであった。ＨＦ３８をトランスフェクションした場合、９６クローンをスクリーニングして２クローン（ＨＴ６９，ＨＴ７２）が目的のクローンであった。
さらに、ＡＰ０００３４４領域で２２番染色体の切断が起こっているか否かをＦＩＳＨ解析により、確認した。
ヒト２２番染色体がＡＰ０００３４４ゲノム領域で切断されていることを視覚的に判断するためにターゲティングベクター中のｈｉｓＤ耐性遺伝子を検出できるプローブを用いたＦＩＳＨ解析を行った。方法は黒岩ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：３４４７−３４４８，１９９８）に従った。ＣＯＴ１染色（ローダミン標識、赤色）により、全長のヒト２２番染色体と比較してＴ３２，ＨＴ６９，ＨＴ７２では、２２番染色体が断片化していることが分かる。さらに、ｈｉｓＤプローブ由来のシグナル（ＦＩＴＣ標識、黄色）がテロメア一端に検出された。このことはターゲティングベクターが挿入されたＡＰ０００３４４が２２番染色体断片のテロメア一端になっていることを示している。
以上の結果から、Ｔ３２，ＨＴ６９，ＨＴ７２において、ヒト２２番染色体がＡＰ０００３４４領域で切断されていると結論できた。
〔実施例５〕  ニワトリＤＴ−４０細胞中でのｌｏｘＰＨｙｇカセットのヒト２２番染色体上への部位特異的挿入
上記ＨＴ６９、７２においては、既にＨＣＦ２遺伝子座（Ｉｇλ遺伝子座よりも約１Ｍｂセントロメア側）にｌｏｘＰ配列が挿入されている。そこで、クローンＴ３２において、Ｉｇλ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＰ０００５５３領域に上記実施例３で作製したターゲティングベクターｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇをトランスフェクションし、ｌｏｘＰ配列の挿入を試みた。
上記と同様に、制限酵素ＳｒｆＩ（東洋紡）で線状化したターゲティングベクターｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇをクローンＴ３２にトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む培地で約２週間の選択培養を行った。ハイグロマイシンＢ耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１５分を３５サイクル行った。６９クローンをスクリーニングした結果、３クローン（５５３−２，６，１４）が相同組換え体として同定された。
〔実施例６〕  ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（ＨＣＦ２−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４）２．５ＭｂをＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔＨＡＣの構築
まず、最初に上記実施例４で得られたクローンＨＴ７２をＳＣ２０染色体ベクターを保持するＤＴ−４０細胞Ｒクローン（黒岩ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）と細胞融合することによって、ヒト２２番染色体断片と１４番染色体断片ＳＣ２０断片の両者を保持するＤＴ−４０ハイブリッドを作製した。
（１）  ヒト２２番染色体断片とＳＣ２０染色体ベクターの両者を保持するＤＴ−４０ハイブリッドの作製
ＲクローンはブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、ＨＴ７２クローンはハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。１〜２ｘ１０７個の両クローンを混合し遠心後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め３７℃で保温しておいた５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー）０．５ｍｌを静かに加え、約２分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間かけてゆっくり加え、続いて無血清ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍｌを約３分間かけて加え、３７℃で１０分間静置した。その後，１，２００ｒｐｍで５分間遠心し、血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２４〜４８時間培養した。その後、ブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍｌ）・ハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２４穴培養プレート５枚に分注し、３−４週間培養した。ダブル耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０染色体ベクター）、２２番染色体断片の２本が保持されていることを確認した。
ヒト１４番染色体検出用プライマー
0004115281.tif 000006
ヒト２２番染色体検出用プライマー
0004115281.tif 000007
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、６クローン（５６ＨＴ２，３，４，５，６，７）が陽性であった。さらに、ヒトＣＯＴ１  ＤＮＡをプローブに用いてＦＩＳＨ解析を行った結果、これらのクローンは全て２本のヒト染色体断片を独立した状態で保持していることが明らかとなった。以上の結果から、これらの６ハイブリッドクローンはヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０染色体ベクター）、２２番染色体断片の２本を保持していると判断できた。
（２）  ＤＴ−４０ハイブリッドクローン（５６ＨＴ２）におけるヒト２２番染色体領域（ＨＣＦ２−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４）２．５ＭｂのＳＣ２０染色体ベクターへの部位特異的転座
（２）−１  Ｃｒｅ組換え酵素安定発現ベクターｐＢＳ１８５Ｐｕｒｏの構築
黒岩ら（前出）の方法に従って、ヒト染色体間の部位特異的転座はＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いることによって行った。このシステムにおいても、今回のように非相同染色体間での組換え効率は非常に低いことが予想されるため、Ｃｒｅ酵素を一過性ではなく安定発現させることを考え、以下のような発現ベクターを構築した。
プラスミドＰＧＫＰｕｒｏ（ＷＨＩＴＥＨＥＡＤ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ，Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｗ．Ｌａｉｒｄから分与）中のＮｏｔＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に置換したプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩにて切り出したＰＧＫＰｕｒｏ断片をＣｒｅ組換え酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ギブコ）中のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした（ｐＢＳ１８５Ｐｕｒｏ）。
（２）−２  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いたＤＴ−４０ハイブリッドクローンにおけるヒト２２番染色体領域（ＨＣＦ２−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４）２．５ＭｂのＳＣ２０染色体ベクターへの部位特異的転座
上記と同様にして、制限酵素ＫｐｎＩ（ベーリンガー）で線状化したＣｒｅ組換え酵素安定発現ベクターｐＢＳ１８５Ｐｕｒｏを５６ＨＴ２ハイブリッドクローンにトランスフェクションし、２４穴プレートへ分注し、ピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）存在下で約２週間選択培養した。それぞれのウェルからゲノムを抽出し、以下の２組のプライマーを用いたネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを行い、ＳＣ２０染色体ベクターとヒト２２番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討した。
0004115281.tif 000008
0004115281.tif 000009
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。まず、第一のＰＣＲは、９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６１℃３０秒、７２℃１分をＰＧＫ−１とＧＦＰ−１をプライマーとして３５サイクル行った。この反応液の一部を鋳型として、９８℃１０秒、５９℃３０秒、７２℃３０秒をＰＧＫ−２とＧＦＰ−２をプライマーとして３５サイクル行った。ＰＣＲ陽性で転座が確認できたウェル中の細胞プールを１０７細胞数になるまで増やし、プールを５％ＦＢＳと１μｇ／ｍｌのプロピディアムアイオダイド（ＰＩ）を添加したＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）４ｍｌに懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン）により解析した。黒岩ら（前出）の報告にあるように、ｌｏｘＰ間での組換え転座が起こるとＧＦＰ遺伝子が再構築され発現するので転座を起こした細胞をＦＡＣＳで検出できる。ＧＦＰ陽性と思われる細胞画分のソーティングを２回繰り返した。毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で行った。その結果、ＧＦＰ陽性細胞を９８−９９％の純度で濃縮することができた。
次に、ＦＡＣＳでクローニングされたＧＦＰ陽性クローン（ΔＨ２１）において、期待通りｌｏｘＰ間で組換えが起こっていることを前記ＰＧＫ−２とＧＦＰ−２をプライマーとして用いたＰＣＲによって確認した。さらに、クローンΔＨ２１に対して、ヒト１４番染色体特異的プローブ（ローダミン標識）とヒト２２番染色体特異的プローブ（ＦＩＴＣ標識）を用いたＦＩＳＨ解析（黒岩ら、前出）を行った結果、確かにヒト２２番染色体領域がＳＣ２０染色体ベクター（ヒト１４番染色体断片）に転座した人工染色体の存在が確認された。
以上の結果から、クローンΔＨ２１において、ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（ＨＣＦ２−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４）２．５ＭｂがＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔＨＡＣが構築できたと結論付けた。
ΔＨＡＣを保持するニワトリＤＴ−４０細胞（ΔＨＡＣ）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８２が与えられた。
〔実施例７〕  ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（ＡＰ０００５５３−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４）１．５ＭｂをＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔΔＨＡＣの構築
上記ΔＨＡＣにおいては、Ｉｇλ−ＨＣＦ２間に約１Ｍｂの余分な領域がまだ残存している。そこで、厳密に余分な染色体領域を取り除き、Ｉｇλ遺伝子領域周辺のみを転座クローニングする目的で、ＡＰ０００５５３−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４領域１．５ＭｂをＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔΔＨＡＣを構築することを試みた。
まず、最初に実施例５で得られたクローン５５３−２をＲクローンと細胞融合することによって、ヒト２２番染色体断片と１４番染色体断片ＳＣ２０染色体ベクターの両者を保持するＤＴ−４０ハイブリッドを作製した。
（１）  ヒト２２番染色体断片とＳＣ２０染色体ベクターの両者を保持するＤＴ−４０ハイブリッドの作製
ＲクローンはブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、クローン５５３−２はハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。１〜２ｘ１０７個の両クローンを混合し遠心後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄する。残量培地を完全に取り除いた後に、予め３７℃で保温しておいた５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー）０．５ｍｌを静かに加え、約２分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間かけてゆっくり加え、続いて無血清ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍｌを約３分間かけて加え、３７℃で１０分間静置した。その後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心し、血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２４〜４８時間培養した。その後、ブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍｌ）・ハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２４穴培養プレート５枚に分注し、３〜４週間培養した。得られたハイブリッドクローン（例えば、クローン５５３Ｒ１）からゲノムＤＮＡを抽出して、実施例６と同じプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト１４番染色体断片、２２番染色体断片の２本が保持されていることを確認した。さらに、ヒトＣＯＴ１  ＤＮＡをプローブに用いてＦＩＳＨ解析を行い、２本のヒト染色体断片が独立した状態で存在していることを確認した。以上の実験から、ハイブリッドクローン５５３Ｒ１がヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０染色体ベクター）、２２番染色体断片の２本を保持していると結論付けた。
（２）  ＤＴ−４０ハイブリッドクローン（５５３Ｒ１）におけるヒト２２番染色体領域（ＡＰ０００５５３−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４）１．５ＭｂのＳＣ２０染色体ベクターへの部位特異的転座
上記と同様にして、制限酵素ＫｐｎＩ（ベーリンガー）で線状化したＣｒｅ組換え酵素安定発現ベクターｐＢＳ１８５Ｐｕｒｏを５５３Ｒ１ハイブリッドクローンにトランスフェクションし、１２穴プレートへ分注し、ピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）存在下で約２週間選択培養した。それぞれのウェルからゲノムを抽出し、以下の２組のプライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、ＳＣ２０染色体ベクターとヒト２２番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討した。
0004115281.tif 000010
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。まず、第一のＰＣＲは、９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６１℃３０秒、７２℃１分をＰＧＫ−１とＧＦＰ−１をプライマーとして３５サイクル行った。この反応液の一部を鋳型として、９８℃１０秒、５９℃３０秒、７２℃３０秒をＰＧＫ−２とＧＦＰ−２をプライマーとして３５サイクル行った。ＰＣＲ陽性で転座が確認できたウェル中の細胞プール（ＤＤＨ５，６の２プール）を１０７細胞数になるまで増やし、プールを５％ＦＢＳと１μｇ／ｍｌのプロピディアムアイオダイド（ＰＩ）を添加したＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）４ｍｌに懸濁し、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン）により解析した。ＧＦＰ陽性と思われる細胞画分のソーティングを２回繰り返した。毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で行った。その結果、ＧＦＰ陽性細胞を９８〜９９％の純度で濃縮することができた。
次に、ＦＡＣＳでクローニングされたＧＦＰ陽性クローン（ΔΔＨ５，６）において、期待通りｌｏｘＰ間で組換えが起こっていることを前記ＰＧＫ−２とＧＦＰ−２をプライマーとして用いたＰＣＲによって確認した。さらに、クローンΔΔＨ５，６に対して、ヒト１４番染色体特異的プローブ（ローダミン標識）とヒト２２番染色体特異的プローブ（ＦＩＴＣ標識）を用いたＦＩＳＨ解析（黒岩ら、前出）を行った結果、両クローン共に、確かにヒト２２番染色体領域がＳＣ２０染色体ベクター（ヒト１４番染色体断片）に転座した人工染色体の存在が確認された。
以上の結果から、２クローンΔΔＨ５，６において、ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（ＡＰ０００５５３−Ｉｇλ−ＡＰ０００３４４）１．５ＭｂがＳＣ２０染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔΔＨＡＣが構築できたと結論付けた。
ΔΔＨＡＣを保持するニワトリＤＴ−４０細胞（ΔΔＨＡＣ）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８１が与えられた。
〔実施例８〕  ΔＨＡＣ含有ＤＴ−４０ハイブリッド細胞とチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞との細胞融合
黒岩ら（前出）の報告にあるように、構築されたＨＡＣをマウスＥＳ細胞へ導入するために、まずＣＨＯ細胞への導入を試みた。しかしながら、ΔＨＡＣ含有ＤＴ−４０ハイブリッド細胞ΔＨ２１はミクロセル形成能が低く、ΔＨＡＣのミクロセル法によるＣＨＯ細胞への導入（ＷＯ００／１０３８３）は成功しなかった。そこで、新しい試みとして、ΔＨＡＣ含有ＤＴ−４０ハイブリッド細胞ΔＨ２１とＣＨＯ細胞との細胞融合によるΔＨＡＣのＣＨＯ細胞への導入を試みた。
１〜２ｘ１０７個のΔＨ２１クローンと１ｘ１０７個のＣＨＯ細胞とを混ぜ、遠心後、無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め３７℃で保温しておいた５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー）０．５ｍｌを静かに加え、約２分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地１ｍｌを１分間かけてゆっくり加え、続いて無血清ＤＭＥＭ培地９ｍｌを約３分間かけて加え、３７℃で１０分間静置した。その後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心し、血清を含むＦ１２培地（ギブコ）で２４時間培養した。その後、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）・ハイグロマイシンＢ（０．６ｍｇ／ｍｌ）含有ｆ１２培地に交換し、２４穴培養プレート３枚に分注し、３〜４週間培養した。
耐性クローンからゲノムを抽出し、上記実施例６と同様にＶＨ３とＩｇλ検出用プライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、２クローン（Ｄ１５，ΔＣ３０）がＰＣＲ陽性であった。さらに、これら２クローンに関して、上記実施例６と同様にしてヒト１４番染色体特異的プローブとヒト２２番染色体特異的プローブを用いた２重染色によるＦＩＳＨ解析を行い、ΔＨＡＣの存在を確認した。ＤＴ４０とＣＨＯの融合細胞であるが、ＤＴ４０由来の染色体はほとんど脱落しており、核型は野生型ＣＨＯ細胞とほぼ同じであった。このことから、ＤＴ４０細胞とＣＨＯ細胞との細胞融合によって、結果的にはΔＨＡＣを保持したＣＨＯクローンを得ることができた。ＤＴ４０クローンのミクロセル形成能が低い場合の代替法として有用である可能性が示された。
〔実施例９〕  ΔΔＨＡＣ含有ＤＴ−４０ハイブリッド細胞からのＣＨＯ細胞へのΔΔＨＡＣの導入
ΔΔＨＡＣ含有ＤＴ−４０ハイブリッドクローンΔΔＨ５，６のミクロセル形成能は悪くなかったので、黒岩ら（前出）の報告にあるように、ミクロセル法を用いた。
ＤＴ−４０ハイブリッドクローンΔΔＨ５，６をそれぞれＴ２２５フラスコ（スミロン）８本で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、さらに２４時間培養してミクロセルを形成させた。細胞を２４ｍｌの血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、予め１００μｇ／ｍｌのポリＬ−リジンでコートした遠心用２５ｃｍ２フラスコ１２本（コーニング）に２ｍｌずつ分注し、３７℃で１時間培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、１７００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。一方、約１０７個のＣＨＯ細胞をトリプシン処理によりはがし、無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。再度、ミクロセルを１７００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を除かずに先のＣＨＯ懸濁液５ｍｌを静かに重層した。遠心後、培養液を除去し、ＰＥＧ１５００溶液（ベーリンガー）０．５ｍｌを加え、約２分間ピペットで激しく攪拌した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを約３分間かけてゆっくり加え、３７℃で１０分間静置した。遠心後、１０％ＦＢＳ添加Ｆ１２培地（ギブコ）に細胞を懸濁し、２４穴培養プレート５−６枚に分注し、３７℃で２４時間培養した。その後、Ｇ４１８  ８００μｇ／ｍｌ含有Ｆ１２培地に交換し、３〜４週間選択培養した。
Ｇ４１８耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出してＩｇλとＶＨ３検出用プライマーおよびＰＧＫ−２、ＧＦＰ−２プライマーを用いて、前述と同様の条件でＰＣＲを行い、ΔΔＨＡＣを保持するＣＨＯクローンを同定した（例えば、ΔΔＣ１０，１３）。さらに、上記ＰＣＲで陽性だったクローンに対して、ヒト１４番染色体、２２番染色体特異的プローブを用いてＦＩＳＨ解析を行い、視覚的にΔΔＨＡＣの存在を確認した。これらの結果から、ΔΔＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞クローンが得られたと結論できた。
〔実施例１０〕  ＣＨＯ細胞からのΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣのマウスＥＳ細胞への移入
ΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣを保持するキメラマウスを作製するために、実施例８、実施例９で得られたΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へミクロセル法により導入した。
富塚ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞（Ｄ１５，ΔΔＣ１０，ΔΔＣ１３など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４  ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ  １０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ１０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。
その結果、Ｄ１５クローン（ΔＨＡＣ保持）からは１４クローン、ΔΔＣ１０（ΔΔＨＡＣ保持）からは８クローン、ΔΔＣ１３（ΔΔＨＡＣ保持）からは８クローンがＩｇλとＶＨ３検出用プライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、ヒトＣＯＴ１  ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、ＣＯＴ１プローブにより特異的に検出されるΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣの存在が確認された。
以上のことから、ΔＨＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が１４クローン、ΔΔＨＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が１６クローン得られたと結論付けた。
〔実施例１１〕  ヒト人工染色体ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣを保持するキメラマウスの作製
実施例１０で得られたＥＳ細胞クローンを用いて富塚らの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）、あるいは抗体重鎖ノックアウトマウス（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。野性型ＴＴ２Ｆ／ΔＨＡＣクローン（ＴΔ＃６、実施例１０で取得）を注入した４００個の胚を仮親に移植した結果、７匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。すなわち、ヒト人工染色体ΔＨＡＣを保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
上記と同様にして、実施例１０で得られた野性型ＴＴ２Ｆ／ΔΔＨＡＣクローン（ＴΔΔ＃２１）を注入した１８０個の胚を仮親に移植した結果、２匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。うち１匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％の個体であった。すなわち、ヒト人工染色体ΔΔＨＡＣを保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
〔実施例１２〕  ヒト人工染色体ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣを保持するＥＳ細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
実施例１１でＴＴ２Ｆ／ΔＨＡＣクローン（ＴΔ＃６）より作製されたキメラマウス（キメラ率約８５％）の尻尾から富塚らの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７）に記された方法でゲノムＤＮＡを調製し、ＩｇλおよびＶＨ３検出用プライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ΔＨＡＣの保持を検討した。その結果、２種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるΔＨＡＣの保持が確認された。また、キメラマウス（キメラ率約８５％）およびＴΔ＃６より作製された他のキメラマウス（キメラ率約９０％）より血清を採取し、ＥＬＩＳＡ法（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）によって、ヒトμ鎖およびヒトλ鎖タンパク質の発現を検討した。その結果、２匹のキメラマウス共に、ヒトμ鎖、λ鎖の両者が陽性であった。
同様に、ΔΔＨＡＣを保持するＥＳ細胞クローン（ＴΔΔ＃２１）由来のキメラマウス（キメラ率約１００％、実施例１１）の尻尾由来ＤＮＡにおいても上記２種のプライマー陽性であり、ΔΔＨＡＣの保持が確認された。さらには、上記同様のＥＬＩＳＡ解析により、該ΔΔＨＡＣ保持キメラマウス血清においてはヒトμ鎖、λ鎖両者が陽性であることが示される。
λＨＡＣを保持するＥＳ細胞から得られたλＨＡＣ保持キメラマウスのキメラ率は最高で約８０％であったが、ΔＨＡＣにおいては約８５％および９０％、ΔΔＨＡＣにおいては約１００％のキメラ率を有するキメラマウスが得られた。より高いキメラ率のキメラマウスの使用はより高い効率の導入染色体保持ＥＳ細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達をもたらすと考えられる。すなわちΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣの使用により、抗体免疫グロブリンλ鎖遺伝子を含むヒト２２番染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まることが期待される。
〔実施例１３〕  ヒト人工染色体ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣを保持するキメラマウスからの人工染色体子孫伝達
実施例１１でＴＴ２Ｆ／ΔＨＡＣクローン（ＴΔ＃６）より作製された雌キメラマウス（キメラ率約８５％）をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した１０匹の仔マウスのうち、４匹がＥＳ細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちΔＨＡＣを保持するＥＳ細胞株、ＴΔ＃６は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス４匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡについてＩｇλおよびＶＨ３検出用プライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ΔＨＡＣの保持を検討した結果、４匹全てにおいて２種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス子孫におけるΔＨＡＣの保持が確認された。さらに４匹中３匹の血清を採取し、ＥＬＩＳＡ法（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）によって、ヒトμ鎖およびヒトλ鎖の発現を検討した。その結果、調べた３匹全てにおいてヒトμ鎖、λ鎖の両者が陽性であった。実施例１１でＴＴ２Ｆ／ΔΔＨＡＣクローンより作製されるキメラマウスからのΔΔＨＡＣ子孫伝達も同様な方法で示される。
ΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣをそれぞれ保持し、子孫伝達するマウス系統における各ＨＡＣの安定保持を、尻尾より調製した繊維芽細胞のＦＩＳＨ解析等で検討する。その結果、当該マウス系統体細胞における各ＨＡＣの安定保持が示される。
また、ΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣを保持し子孫伝達するマウス系統において、ヒトＩｇλ鎖／重鎖からなる完全なヒト抗体分子の発現はＥＬＩＳＡ法等で確認される。さらにΔＨＡＣあるいはΔΔＨＡＣを保持し子孫伝達するマウス系統を内在性抗体重鎖、軽鎖κ遺伝子を欠損しているマウス系統と繰り返し交配し、各ＨＡＣを保持しかつ内在性抗体重鎖およびκ鎖遺伝子欠損についてホモであるマウス系統を得ることができる。これらのマウス系統においては主としてヒトＩｇ重鎖とλ鎖からなる完全なヒト抗体が産生される。
〔実施例１４〕  ヒト免疫グロブリン重鎖、軽鎖λ、軽鎖κを同時に発現するマウス系統の構築
ヒトＩｇ重鎖、軽鎖κ、軽鎖λを同時に産生し、かつヒトＩｇ重鎖と軽鎖κあるいは軽鎖λからなる分子を主成分とする抗体を産生するマウス系統は以下の（Ａ）、（Ｂ）系統間の交配により作製できる。
（Ａ）ΔＨＡＣを保持し子孫伝達するマウス系統、ＴＣ（ΔＨＡＣ）あるいはΔΔＨＡＣを保持し子孫伝達するマウス系統、ＴＣ（ΔΔＨＡＣ）（実施例１３参照）。
（Ｂ）内因性抗体重鎖、κ鎖遺伝子欠損についてホモ接合体かつ２番染色体断片Ｗ２３を保持し子孫伝達するマウス系統ＴＣ（Ｗ２３）／ΔＨ／Δκ（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）。
系統（Ａ）と系統（Ｂ）の交配により得られる仔マウスは、実施例１３および富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）に記載された方法で解析する。本交配により得られる仔マウスは全て内因性抗体重鎖欠損、κ鎖欠損についてヘテロ接合体であるが、そのうちΔＨＡＣ（あるいはΔΔＨＡＣ）を保持する個体とＷ２３断片を保持する個体を交配してさらに子孫を得る。最終的には内因性抗体重鎖欠損、κ鎖欠損について共にホモ接合体であり、かつΔＨＡＣ（あるいはΔΔＨＡＣ）およびＷ２３断片を同時に保持する個体（系統（Ｄ））を選抜する。
系統（Ｄ）におけるヒト免疫グロブリン重鎖、κ鎖、λ鎖の発現は富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）および（ＷＯ９８／３７７５７）に記載された方法で確認される。
〔実施例１５〕  ΔＨＡＣを保持し、かつ内因性Ｉｇ重鎖、κ鎖遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
実施例１３で作製されたＴＣ（ΔＨＡＣ）を、富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）に記載された内因性Ｉｇ重鎖、κ鎖ノックアウトマウス系統に戻し交配し、得られたマウス個体について、ＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法を用いて遺伝子型の解析を行った（実施例１２および富塚らの報告参照）。
その結果、ΔＨＡＣを保持し、内因性Ｉｇ重鎖ノックアウトについてホモ接合体、かつ内因性Ｉｇκ鎖ノックアウトについてホモ接合体である個体（以下、ＴＣ（ΔＨＡＣ）／ΔＨ／Δκと記す）を得た。
２匹のＴＣ（ΔＨＡＣ）／ΔＨ／Δκ個体（８週齢）の血清中におけるヒトＩｇ重鎖およびλ鎖タンパク質の発現を、黒岩らの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１０８６−，２０００）に記載されたＥＬＩＳＡ法にて解析した結果、それぞれ、ヒトＩｇμ鎖：４３０μｇ／ｍｌ、Ｉｇγ鎖：１８０μｇ／ｍｌ、Ｉｇλ鎖：３３０μｇ／ｍｌおよび、ヒトＩｇμ鎖：７２０μｇ／ｍｌ、Ｉｇγ鎖：３２０μｇ／ｍｌ、Ｉｇλ鎖：５２０μｇ／ｍｌであった。
〔実施例１６〕  ΔＨＡＣおよびヒトＩｇκ鎖遺伝子を含むヒト２番染色体断片を保持し、かつ内因性Ｉｇ重鎖、κ鎖遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）に記載の内因性Ｉｇ重鎖、κ鎖ノックアウトマウスの遺伝的背景にヒトＩｇκ鎖遺伝子を含むヒト２番染色体断片（ｈＣＦ（Ｗ２３））を保持するマウス系統（以下、ＴＣ（Ｗ２３）／ΔＨ／Δκと記す）と実施例１５で作製されたＴＣ（ΔＨＡＣ）／ΔＨ／Δκ系統を交配し、得られたマウス個体について、実施例１５と同様に遺伝子型の解析を行った。
その結果、ΔＨＡＣおよびｈＣＦ（Ｗ２３）を同時に保持し、内因性Ｉｇ重鎖ノックアウトについてホモ接合体、かつ内因性Ｉｇκ鎖ノックアウトについてホモ接合体である個体（以下、ＴＣ（ΔＨＡＣ）ＴＣ（Ｗ２３）／ΔＨ／Δκと記す）を得た。
さらに、ＴＣ（ΔＨＡＣ）／ＴＣ（Ｗ２３）／ΔＨ／Δκ個体の血清を、富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９７，７２２−７２７，２０００）および黒岩らの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１０８６−，２０００）に記載されたＥＬＩＳＡ法で解析することにより、ヒトＩｇμ鎖、γ鎖、λ鎖、κ鎖タンパク質の発現が検出される。
〔実施例１７〕  ΔＨＡＣおよびヒトＩｇκ鎖遺伝子を含む酵母人工染色体を保持し、かつ内因性Ｉｇ重鎖、κ鎖遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
Ｆｉｓｈｗｉｌｄらの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：８４５−８５１，１９９６）に記載された内因性Ｉｇ重鎖、κ鎖ノックアウトマウスの遺伝的背景にヒトＩｇκ鎖遺伝子を含むトランスジーン（ＫＣｏ５：ヒトκ軽鎖遺伝子の可変領域の約４０％を含む）を保持するマウス系統（米国Ｍｅｄａｒｅｘ社より入手。以下、ＫＣｏ５／ΔＨ／Δκと記す）と、実施例１５で作製されたＴＣ（ΔＨＡＣ）／ΔＨ／Δκ系統を交配して得られたマウス個体について、実施例１５と同様にＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法を用いて遺伝子型の解析を行った。
その結果、ΔＨＡＣおよびＫＣｏ５を同時に保持し、内因性Ｉｇ重鎖ノックアウトについてホモ接合体、かつ内因性Ｉｇκ鎖ノックアウトについてホモ接合体である個体（以下、ＴＣ（ΔＨＡＣ）／ＫＣｏ５／ΔＨ／Δκと記す）を得た。
なお、トランスジーンＫＣｏ５を構成する酵母人工染色体とプラスミドを保持する微生物は、米国ＡＴＣＣに寄託されている。受託番号は下記のとおりである。酵母人工染色体ｙ１７を保持する酵母：ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３８４２、プラスミドｐＫＶ４を保持する大腸菌：ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３８４３、プラスミドｐＫＣＩＢを保持する大腸菌：ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３８４４。
ＴＣ（ΔＨＡＣ）／ＫＣｏ５／ΔＨ／Δκ個体の血清を、実施例１６と同様にＥＬＩＳＡ法にて解析した結果、ヒトＩｇμ鎖、γ鎖、λ鎖、κ鎖タンパク質が検出された。また、測定した３個体におけるγ鎖の値の平均値はμ鎖の平均値よりも高かった。
〔実施例１８〕  ＴＣ（ΔＨＡＣ）／ΔＨ／Δκマウス系統における抗Ｇ−ＣＳＦ抗体産生
実施例１５で作製されたＴＣ（ΔＨＡＣ）／ΔＨ／Δκマウス２個体をヒトＧ−ＣＳＦにより免疫した。アジュバントとしてはＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ）を用いた。初回は計３７．５μｇのヒトＧ−ＣＳＦを３箇所に分けて皮下に免疫した。２回目および３回目は初回免疫後１４日目および３８日目に計１０μｇを初回免疫と同様に３箇所に分けて皮下に免疫した。初回免疫後４８日目の最終免疫は１０μｇのＧ−ＣＳＦをアジュバントなしで静注した。最終免疫より３日後に採血を行い、血清中の抗Ｇ−ＣＳＦヒトＩｇＧ抗体価およびヒトＩｇλ抗体価を黒岩らの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１０８６−，２０００）に記載されたＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果、２個体共に抗ヒトＧ−ＣＳＦヒトＩｇＧ抗体価およびヒトＩｇλ抗体価の上昇が観察された。
さらに、上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより得られる、ハイブリドーマ（安東、千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク、１９９１）をＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることにより、ヒトＩｇ重鎖および軽鎖λからなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
〔実施例１９〕  ＴＣ（ΔＨＡＣ）／ＴＣ（Ｗ２３）／ΔＨ／Δκマウス系統における抗Ｇ−ＣＳＦ抗体産生
実施例１５で作製されたＴＣ（ΔＨＡＣ）／ＴＣ（Ｗ２３）／ΔＨ／Δκマウス個体を、実施例１８と同様に、ヒトＧ−ＣＳＦにより免疫する。このマウスの血清中の抗Ｇ−ＣＳＦヒトＩｇＧ抗体価、ヒトＩｇλ抗体価およびヒトＩｇκ抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗ヒトＧ−ＣＳＦヒトＩｇＧ抗体価、ヒトＩｇλ抗体価およびヒトＩｇκ抗体価の上昇を確認する。
さらに、実施例１８と同様に、上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより、ヒトＩｇ重鎖および軽鎖λあるいは軽鎖κからなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
〔実施例２０〕  ＴＣ（ΔＨＡＣ）／ＫＣｏ５／ΔＨ／Δκマウス系統における抗Ｇ−ＣＳＦ抗体産生
実施例１５で作製されたＴＣ（ΔＨＡＣ）／ＫＣｏ５／ΔＨ／Δκマウス個体を、実施例１８と同様に、ヒトＧ−ＣＳＦにより免疫し、血清中の抗Ｇ−ＣＳＦヒトＩｇＧ抗体価、ヒトＩｇλ抗体価およびヒトＩｇκ抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果、抗ヒトＧ−ＣＳＦヒトＩｇＧ抗体価、ヒトＩｇλ抗体価およびヒトＩｇκ抗体価の上昇が確認された。
さらに、実施例１８と同様に、上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより、ヒトＩｇ重鎖および軽鎖λあるいは軽鎖κからなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、ヒト抗体重鎖およびλ軽鎖遺伝子全領域を保持し、かつ次世代へ高効率で子孫伝達可能なヒト人工染色体が提供される。また、本発明により、該ヒト人工染色体を高効率で次世代に子孫伝達する非ヒト動物およびその子孫が提供される。さらに本発明によりヒト抗体の作製が可能となる。
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト人工染色体ΔＨＡＣ、ΔΔＨＡＣの作製を示す。
図２は、カセットベクターｐＴＥＬｈｉｓＤを示す。
図３は、ターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤλＩを示す。
図４は、ターゲティングベクターｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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