(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化されたタンパク質の基質を含むタンパク質のヒドロゲルであって、
前記アシル化されたタンパク質の基質は、二官能価の架橋試薬で架橋されて架橋されたタンパク質の基質を生じ、
前記架橋されたタンパク質の基質は、ゲル・ネットワークにおいてタンパク質の鎖に配座の再編成を誘起する極性有機溶媒で処理されると共に、
前記極性有機溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコール、Ｃ１−Ｃ４ケトン、及びＣ１−Ｃ４アルデヒドからなる群より選択される、タンパク質のヒドロゲル。
【請求項２】
前記二官能価の架橋試薬は、二官能価のアルデヒドである請求項１記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項３】
前記二官能価のアルデヒドは、
ＣＨＯ−（ＣＨ２）Ｘ−ＣＨＯ
からなる群より選択され、
Ｘは、２から８までの整数である請求項２記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項４】
前記二官能価の架橋試薬は、グルタルアルデヒドである請求項１記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項５】
前記アシル化されたタンパク質の基質は、バイオマスから誘導されるタンパク質を含む請求項１記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項６】
前記アシル化されたタンパク質の基質は、バイオマスから誘導されるタンパク質の濃縮物を含む請求項１記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項７】
前記アシル化されたタンパク質の基質は、バイオマスから誘導されるタンパク質の単離物を含む請求項１記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項８】
前記タンパク質の単離物は、魚のタンパク質の単離物である請求項７記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項９】
前記アシル化されたタンパク質の基質は、アシル化剤で処理されたタンパク質である請求項１記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項１０】
前記アシル化剤は、無水物である請求項９記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項１１】
前記アシル化剤は、テトラカルボン酸二無水物である請求項１０記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項１２】
前記アシル化剤は、エチレンジアミンテトラ酢酸二無水物である請求項１０記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項１３】
前記極性有機溶媒は、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びアセトンからなる群より選択される請求項１記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項１４】
前記極性有機溶媒は、エタノールを含む請求項１３記載のタンパク質のヒドロゲル。
【請求項１５】
魚のタンパク質の単離物を含み、
前記魚のタンパク質の単離物は、エチレンジアミンテトラ酢酸二無水物での処理によってアシル化されて、アシル化されたタンパク質を生じ、
前記アシル化されたタンパク質は、グルタルアルデヒドで架橋されて、架橋されたタンパク質の基質を生じ、
前記架橋されたタンパク質の基質は、ゲル・ネットワークにおいてタンパク質の鎖に配座の再編成を誘起する極性有機溶媒で処理されると共に、
前記極性有機溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコール、Ｃ１−Ｃ４ケトン、及びＣ１−Ｃ４アルデヒドからなる群より選択される、タンパク質のヒドロゲル。
【請求項１６】
タンパク質のヒドロゲルを製造する方法であって、
（ａ）アシル化剤でタンパク質を処理してアシル化されたタンパク質を得るステップ、
（ｂ）前記アシル化されたタンパク質を二官能価の架橋剤で架橋させて架橋されたタンパク質を得るステップ、及び
（ｃ）前記架橋されたタンパク質を、ゲル・ネットワークにおいてタンパク質の鎖に配座の再編成を誘起する極性有機溶媒で処理するステップ、を含むと共に、
前記極性有機溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコール、Ｃ１−Ｃ４ケトン、及びＣ１−Ｃ４アルデヒドからなる群より選択される、方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）において、前記タンパク質は、前記タンパク質内で１％から９８％までのリシンの残留物をアシル化するのに十分な量のアシル化剤で処理される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）において、前記タンパク質は、無水物で処理される請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）において、前記タンパク質は、テトラカルボン酸二無水物で処理される請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）において、前記タンパク質は、エチレンジアミンテトラ酢酸二無水物で処理される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、前記アシル化されたタンパク質は、ジアルデヒドで架橋される請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）において、前記ジアルデヒドは、
ＣＨＯ−（ＣＨ２）Ｘ−ＣＨＯ
からなる群より選択され、
Ｘは、２から８までの整数である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）において、前記ジアルデヒドは、グルタルアルデヒドである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）において、前記アシル化剤は、６５乃至１００℃の温度でｐＨ１２の水性のタンパク質溶液に加えられ、前記アシル化されたタンパク質を生じ、
ステップ（ｂ）において、架橋は、ステップ（ａ）の前記アシル化されたタンパク質の水性の溶液へのグルタルアルデヒドの添加によって果たされ、架橋されたタンパク質を生じ、
ステップ（ｃ）において、前記架橋されたタンパク質は、Ｃ１−Ｃ４アルコール、Ｃ１−Ｃ４ケトン、及びＣ１−Ｃ４アルデヒドからなる群より選択される極性有機溶媒で処理される請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）において、前記架橋されたタンパク質は、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびアセトンからなる群から選択される極性有機溶媒で処理される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）において、前記架橋されたタンパク質は、エタノールで処理される請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の技術分野］
この発明は、次の機関ＮＯＡＡ  ＮＡ８６ＲＧ００４７によって授与された米国政府の援助でなされた。
【０００２】
本発明は、タンパク質のヒドロゲルに関する。より具体的には、本発明は、単位質量当たり大量の水又は他の液体を吸収することが可能である化学的に変性したタンパク質のヒドロゲルに関する。
【０００３】
［参考文献の引用］
ここで議論する番号付けられた参考文献に対する完全な参考文献の引用は、請求項の直前にある参考文献一覧の節に含まれる。
【０００４】
［関連技術の説明］
１９７０年代前半に始まり今日に継続しているが、非生分解性の石油系重合体材料の継続的な広範囲の使用が重大な環境問題を提示してもよいという成長の意識がある。これらの問題は、一年に生産される非生分解性のプラスチックの巨大でまだ増大する容積を示す生産統計によって高められ、その莫大な部分は、結局、ごみ埋めたて地に埋葬される。これは、（ますます迅速な速度で消失している）固体の廃棄物処理に利用可能な空間の量に関して懸念を生じさせるだけでなく、埋め立てられたプラスチックからの有毒なモノマーおよびオリゴマーの浸出が地下水を汚染することになり、それによって人間及び動物に健康問題を引き起こすという同じ位重大な懸念もまた生じさせる。
【０００５】
人間の健康および環境に関する懸念に加えて、政治的及び経済的摩擦による大きく揺らぐ石油価格と組み合わせて、石油埋蔵量の世界中の枯渇は、石油から誘導される製品に対するより少ない依存は賢明であるかもしれないことを示す。従って、工業製品に対する代替の再生できる資源の開発は必要とされる。
【０００６】
非生分解性の石油系の製品に付随する、事実である及び／又は認められた経済的、環境的、および公衆衛生の懸念のために、工業製品に対する非石油系の環境的に安全な生分解性の再生できる源が必要とされる。次の参考文献によって明示されるように、いくつかのタイプの有用な製品は、出発原料の再生できる源から製造されてきた。
【０００７】
例えば、Ｍａｎｎ、米国特許第２，７２９，６２８号は、タンパク質をテレフタリル＝ジクロリドでアシル化することによって、長い鎖のポリペプチド、特に、魚、ピーナッツのタンパク質、大豆のタンパク質、カゼイン、卵のアルブミン、及び血液のアルブミンのような天然のタンパク質の固有の粘性を増加させる過程を記載している。ここで、タンパク質は、約０°から３０℃までの温度でＳｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ法を使用して、テレフタリル＝ジクロリドと反応する。
【０００８】
Ｙｏｕｎｇ等、米国特許第２，９２３，６９１号は、動物のタンパク質の重合を、動物接着剤としての使用に対するそれらの特性を改善するために、記述している。Ｙｏｕｎｇ等は、タンパク質を凝固させるか又は不溶化させることなく接着剤製品の粘度及びゼリー特性を変性させるために、動物接着剤のタンパク質にアルデヒドを導入する。ここで、Ｙｏｕｎｇ等は、最後の実行の動物接着剤の粘性およびゼリー強度を増加させることに興味を持っており、それは、劣った品質である傾向がある。Ｙｏｕｎｇ等によって記載されている過程は、二つのステップを含む。第一に、シアン酸塩をタンパク質材料と反応させる。第二に、ホルムアルデヒド又はグルコースのようなアルデヒドを、タンパク質材料に加える。
【０００９】
Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙに所属するＭｉｌｌｅｒへの二つの特許（米国特許第３，６８５，９９８及び３，７２０，７６５号）は、反芻動物用の改善されたタンパク質供給材料を記載している。Ｍｉｌｌｅｒの特許において、タンパク質の供給物を、タンパク質を含む供給材料を重合した不飽和カルボン酸又は無水物で処理することによって、皺胃および腸内ではなく第一胃中における消化の分解に対する耐性を有するようにする。例えば、タンパク質の飼料を、ポリ（無水マレイン酸）のようなポリ無水物で処理する。これは、タンパク質の飼料を、第一胃の流動媒体中で実質的に消化できなくするが、皺胃および腸の酸性媒体中ではまだ消化できるようにする。この様式において、飼料のタンパク質は、第一胃中の分解を余地として残し、その後の消化器における吸収に利用可能である。
【００１０】
Ｂａｔｔｉｓｔａに対する三つの特許の引用文献（米国特許第４，２６４，４９３、 ４，３４９，４７０、及び４，４１６，８１４号）は、水性の酸性溶液中にタンパク質を溶解させる、タンパク質を架橋する、及び１０パーセントを超過しない湿気の含有量まで溶液を空気乾燥させることによって、１００，０００を超過しない分子量を有する天然のタンパク質から形成されたタンパク質のヒドロゲル構造の形成を記載している。Ｂａｔｔｉｓｔａの特許は、ソフトコンタクトレンズ、眼科学的なフィルムなどのような透き通った製品の形成について十分に作成されている。
【００１１】
Ｂａｔｔｉｓｔａは、そこに記載する組成物をヒドロゲルと呼んでいるが、その用語は、“特定の最終製品の途用に対する有用な流動学的な制御特性を処理すると同時に、３０パーセント程度の低さから１，０００パーセント以上までに及ぶ広範囲の水の含有量にわたる水によって膨潤することが可能な約１００，０００以下の平均分子量を有する天然起源の架橋されたタンパク質重合体”を意味するとしてＢａｔｔｉｓｔａの引用文献内にとして定義されている（例えば、米国特許第４，２６４，４９３号、第１欄、１９−２７行目参照のこと）。Ｂａｔｔｉｓｔａによって記載されているヒドロゲルは、高吸水性であるようには設計されていない。むしろ、それらは、ソフトコンタクトレンズとして機能するように、光学的に透き通るおよび十分な機械的結着性を有するように設計されている。
【００１２】
Ｂａｔｔｉｓｔａの特許に記載されているタンパク質のヒドロゲル構造は、水中で透き通った溶液を形成する天然のタンパク質の原料で作られている。最初にタンパク質の原料を、ｐＨ３．５から約ｐＨ５．５までの酸性の水性溶液に溶解させる。次に、架橋剤を酸性のタンパク質溶液に加える。Ｂａｔｔｉｓｔａの好ましい架橋剤は、ホルマリン（３７パーセントホルムアルデヒド）である。しかしながら、Ｂａｔｔｉｓｔａは、グルタルアルデヒドを含む、使用してもよい他の適切な架橋剤を記載する。しかしながら、Ｂａｔｔｉｓｔａの特許は、タンパク質の出発原料のアシル−変性を記載してないことに注意しなければならない。また、Ｂａｔｔｉｓｔａの特許は、高吸水性のタンパク質のヒドロゲルも記載していない。Ｂａｔｔｉｓｔａの引用文献に記載されるタンパク質のヒドロゲルは、増加した湿潤強度の性能を有するように設計され、それによってソフトコンタクトレンズにおけるそれらの使用を可能とする。
【００１３】
合成のヒドロゲルに伴う（非生分解性のような）多くの不都合は、天然の重合体の源から誘導されるヒドロゲルを使用することによって克服され得る。Ｂａｔｔｉｓｔａによって記載されているもののような、化学的に架橋されたタンパク質のヒドロゲルに加えて、多くのタンパク質を、ゲルを形成するために熱的に導入することができる。任意のタイプの生体高分子のヒドロゲルに対する最も重大な必要条件は、ゲルが、再水和でその質量に対して大量の水を吸収する性能を有するべきであること、及びゲル材料それ自体が溶解に抵抗するべきであることである。
【００１４】
しかしながら、従来の熱的に導入されるタンパク質のヒドロゲルは、それらを脱水しておいた後、それらの原初のゲルの容積まで膨潤しない。この減少した膨潤の性能は、脱水したタンパク質で起こる静電的な疎水性相互作用と同様に、増加した水素結合に関係付けられる。熱的に導入されたタンパク質のヒドロゲルの膨潤の減少は、産業の適用可能性におけるそれらの範囲を制限する。
【００１５】
Ｄａｍｏｄａｒａｎ等への米国特許第５，８４７，０８９号は、高吸水性で、可逆的に膨潤可能で、生分解性で、陽イオンを束縛することが可能であるタンパク質のヒドロゲルを記載する。Ｄａｍｏｄａｒａｎ等に記載されているタンパク質のヒドロゲルは、タンパク質のヒドロゲルを形成するために、タンパク質をアシル化剤で処理する、及びアシル化されたタンパク質を二官能価の架橋剤で架橋することによって製造される。Ｄａｍｏｄａｒａｎ等の短所は、残留する架橋剤がゲル中に残り得ると共に、それによってゲルを、グルテルアルデヒドのような架橋剤からの残留物が問題であるいくつかのアプリケーションに対してあまり望ましくないようにすることである。
【００１６】
これを考慮して、高い吸収性で、生分解性で、可逆的に膨潤可能であると共に、このようなヒドロゲルを生産するために使用する残留する架橋剤が実質的にない、タンパク質のヒドロゲルに対して明らかな要求がある。本発明は、このようなタンパク質のヒドロゲルを提供する。
【００１７】
おそらく、再生できる生産材料の望ましい大部分は、農業のバイオマスである。大部分において、これは、米国で生産される莫大な量及び種類の農産物による。例えば、現在では、バイオマス（主としてトウモロコシ）を、燃料用エタノールを生産するために使用する。繊維のバイオマスは、紙および林産物産業で広く使用される。デンプンから誘導される製品もまた、食品産業におけるそれらの使用に加えて、包装産業のような、様々な産業のアプリケーションで広く利用される。
【００１８】
しかしながら、生体高分子中で、タンパク質は、おそらく、それらの産業のアプリケーションに関して最もアンダー利用されてアンダー評価されたものである。それは、主として、飼料中の機能性及び栄養性の成分としてのみ考えられる。食品でない産業のアプリケーションにおける構造要素としてのそれらの巨大な可能性は、大部分は未承認であり実現されてない。これは、タンパク質がより従来タイプのバイオマスに対していくつかの別個の利点を提供するので、残念である。
【００１９】
例えば、セルロース及び他の炭水化物のようなポリオール系の天然の重合体とは違って、タンパク質は、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、フェノール性、及びカルボキシル部位を含む、いくつかの反応性の側基を含む。これらの反応性基を、新規な重合体構造を生産するために化学的な変性及び架橋の部位として使用することができる。本発明は、このような新規な重合体構造、タンパク質系の生分解性の高吸水性ヒドロゲルに関する。
【００２０】
重合体の一般的な部類として、全てのタイプのヒドロゲルは、産業のアプリケーション、消費製品および環境的なアプリケーションにおいて高い容積の使用を見出す。このようなアプリケーションは、おむつ、月経の装置および産業用吸収剤を含む。ここで使用するとき、非制限的な用語“ヒドロゲル”は、水又はいくつかの他の液体で膨潤する、及びその構造内における液体の顕著な部分を保持する性能を示すが、液体に溶解しないと思われる任意の天然に生じる又は合成の材料に当てはまる。
【００２１】
いくつかの合成のヒドロゲル材料は、現在使用されている。これらは、ポリ（ヒドロキシルアルキルメタクリラート）、ポリアクリラート、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）及びその誘導体、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、並びにポリ（ビニルアルコール）のような合成のヒドロゲルを含む。
これらの合成のヒドロゲル重合体がいくつかの興味深い特性を示す一方、産業、消費者、及び環境のアプリケーションにおけるそれらの使用は、これらのゲルに通常存在する、残留する単量体およびオリゴマーの毒性のために、あまり望ましくない。さらに、これらの合成のヒドロゲルの不十分な生分解性もまた、上述の長期間の環境上の問題を提示する。
【００２２】
そして明らかに、可逆的な膨潤を示す、このようなヒドロゲルを生成するために使用される残留する架橋剤が実質的にない、生分解性の、高吸水性の、バイオマスから誘導されるヒドロゲルに対する要求が存在する。
【００２３】
［発明の要約］
上記の議論を考慮して、本発明の主要な目的は、高吸水性の、可逆的に膨潤可能な、生分解性の、二価の陽イオンを束縛することが可能な、タンパク質のヒドロゲルを提供する。また、タンパク質のヒドロゲルは、実質的に、このようなヒドロゲルを生成するために使用される残留する架橋剤がない。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、広範囲のタンパク質の出発原料から形成することができる、全体的に合成のヒドロゲルに対する置換として使用することができる、タンパク質のヒドロゲルを提供することである。
【００２５】
その最も単純な実施例において、本発明は、二官能価の架橋試薬で架橋しておいた、残留する架橋剤を除去するために極性有機溶媒で処理しておいた、アシル化されたタンパク質の基質を含むタンパク質のヒドロゲルに関する。
【００２６】
より具体的に、本発明は、アシル化されたタンパク質の基質を得るように、エチレンジアミンテトラ酢酸二無水物（ＥＤＴＡＤ）での処理によって、アシル化しておいた魚のタンパク質の単離物を含むタンパク質のヒドロゲルを含む。次に、アシル化されたタンパク質の基質は、生分解性の、高吸水性の、タンパク質のヒドロゲルを得るために、グルタルアルデヒドで架橋される。次に、架橋されたゲルは、極性有機溶媒(好ましくはエタノール)で処理される。
【００２７】
溶媒処理は、柔軟性、よって重合体のネットワークの緩和の速度および範囲を、水がそのネットワーク中に拡散すると、明らかに増加させる、ゲル・ネットワークにおいて、タンパク質の鎖に配座の再編成を誘起する。膨潤特性を改善することに加えて、エタノール処理は、次の利点を提供する。１）エタノールは、ゲルを脱水し、それによってゲルを乾燥させるための必要性を除去する。２）エタノールは、タンパク質のゲルから、特に魚のタンパク質のゲルから、低分子量の消臭性化合物を抽出し、それによって、いくつかの消費製品におけるその許容性を改善する。エタノールで処理した魚のタンパク質のヒドロゲルは、エタノール処理なしで作ったものと比較して魚の消臭性が完全にないことを発見した。３）また、エタノールは、ゲルに存在するかもしれないどんな残留する（発癌性であると信じられている）未反応のグルタルアルデヒドも抽出する。
【００２８】
本発明のタンパク質のヒドロゲルは、水中において、それらの乾燥重量の１００倍以上（及びしばしば２００倍以上）を吸収することが可能である。また、それらは、二価の陽イオンを封鎖することが可能である。
【００２９】
また、本発明は、すぐ上に記載したタンパク質のヒドロゲルを製造する方法を含む。その方法は、アシル化されたタンパク質の基質を得るためにアシル化剤でタンパク質を処理する、アシル化されたタンパク質の基質を二官能価の架橋剤で架橋する、及び、架橋された基質を極性有機溶媒（好ましくはエタノール）で処理してタンパク質のヒドロゲルを得るステップを含む。
【００３０】
より多くの詳細において、本発明は、熱の適用によって水性のタンパク質溶液内のタンパク質分子を解離する及び／又は変性する、次にタンパク質溶液にアシル化剤を加えてアシル化されたタンパク質を得るステップを含む、タンパク質のヒドロゲルを製造する方法を含む。次にアシル化されたタンパク質は、二官能価の架橋剤の添加によって架橋される。次に架橋された基質を、ゲル・ネットワーク中のタンパク質鎖において配座の再編成を誘起するために、極性有機溶媒(好ましくはエタノール)で処理して、タンパク質のヒドロゲルを得る。
【００３１】
本発明は、上述した特性を有するンパク質のヒドロゲルである。タンパク質のヒドロゲルが誘導されるタンパク質は、制限なしに、任意の植物または動物の源に由来し得る。好適なタンパク質の源は、その選択は大部分においてその存在量及び低コストからの誘導され、魚から誘導されたタンパク質である。
【００３２】
本発明のタンパク質のヒドロゲルは、それへの一つ又は複数のカルボキシル部位の添加によって、タンパク質の最初の化学的に変性するリシル残留物によって製造される。好ましくは、これは、ポリカルボン酸無水物でのリシル残留物のアシル化によってなされる。二官能価の架橋剤でのタンパク質の鎖の架橋及びタンパク質を極性溶媒で処理することがこれに続き、高吸水性の、ｐＨに敏感な、イオン強度に敏感な可逆的な膨潤を示す、残留する架橋剤が実質的にないタンパク質のヒドロゲルを得る。
【００３３】
また、本発明のタンパク質のヒドロゲルは、二価の陽イオンを強く束縛する。これは、タンパク質のヒドロゲルが陽イオン封鎖剤として機能することを可能にする。タンパク質のヒドロゲルを、地下水、流出する液体廃棄物の流れなどから二価の金属陽イオンおよび有機陽イオンを除去するために使用することができる。
【００３４】
操作において、液体の高い吸収又は二価の陽イオンの封鎖が望まれるいかなるところでも、タンパク質のヒドロゲルを使用することができる。タンパク質のヒドロゲルに対する潜在的な最終使用は、化粧品、おむつ、タンポン及び月経のガーゼ、産業用吸収材、流出ダム及びシーラー、地下水及び廃水の再生のアプリケーション、重金属イオン封鎖などを含む。
【００３５】
本発明の目的及び利点は、添付する図面と共に作成された本発明の好適な実施例の次の詳細な説明から、より十分に明らかになると思われる。
【００３６】
［発明の詳細な説明］
本発明の核心には、最初に、カルボキシル部位をタンパク質内のリシン残留物のｎ−ブチルアミノ側基に導入するためのタンパク質の化学変性である。次に、変性したタンパク質分子を、二官能価の架橋剤を使用して架橋してタンパク質のヒドロゲルを得る。次に、架橋されたタンパク質の基質を極性有機溶媒で処理して残留する架橋剤を除去し、実質的に残留する架橋剤がない生分解性の、高吸水性タンパク質のヒドロゲルを得る。
【００３７】
Ｄａｍｏｄａｒａｎ等への米国特許第５，８４７，０８９号に記載されたタンパク質のヒドロゲルの膨潤特性を、架橋されたゲルをエタノールで処理することによって、劇的に改善することができる。個々の作用のモード又は機構に制限されてない間には、ゲル・ネットワーク中でタンパク質の鎖においてエタノールで誘起される配座の再編成のために、この改善が明らかに起こる。水がネットワーク中に拡散すると、この転位は、明らかに柔軟性、よって重合体ネットワークの緩和の速度及び程度を増加させる。膨潤特性を改善することに加えて、エタノール処理は、いくつかのさらなる利点を提供する。架橋されたタンパク質の基質を極性有機溶媒で処理することは、ゲルを脱水する。これは、それを形成した後に、ゲルを乾燥させる必要性を除去する。
【００３８】
また、架橋された重合体の基質を処理することは、タンパク質のゲルから低分子量の消臭性化合物を抽出する。これは、ゲルを魚のタンパク質（又は動物のタンパク質）から形成するとき、特に有益であり、それは、消臭性を保持する傾向がある。この効果は、多数の消費製品における使用に対してゲルの商業的な許容性を大いに改善する。本発明によるエタノールで処理した魚のタンパク質のヒドロゲルは、エタノール処理なしで製造された魚のタンパク質のヒドロゲルと比較して魚の消臭性が完全にないことを見出した。
【００３９】
極性有機溶媒での処理は、ゲルからどんな残留する未反応の架橋試薬も抽出する。これは、（発癌性であることが疑われる）グルタルアルデヒを架橋剤として使用するとすれば、特に有益である。極性有機溶媒をもつ処理は、どんな残留するグルタルアルデヒドも除去する。
【００４０】
上記のように、タンパク質の出発原料を、制限無しに、任意の源、動物、野菜、又は微生物のから選択することができる。例えば、魚のタンパク質がその低いコストにより好ましい一方で、ここで記載するタンパク質のヒドロゲルを、他の脂肪種子のタンパク質、葉のタンパク質（例えばアルファルファ）、微生物のタンパク質、動物のタンパク質、及び食品処理廃棄物から回収されるタンパク質から製造することができる。タンパク質の単離物と同様に粗製のタンパク質濃縮物も、本発明において等しく良好に作用することになる。また、タンパク質のヒドロゲルは、一般には消費に対して意図されないので、出発原料は、食品級のものである必要はない。
【００４１】
好ましいタンパク質の源は、魚であり、それを水で抽出して魚のタンパク質の単離物を得る。新鮮な魚からの粗製の魚のタンパク質（ＦＰ）の単離を、ほかの場所に記載される（１）ような従来の様式で実行する。一般に、到着の新鮮な魚を、３枚におろし、乱切りし、１：９の肉対水の比で冷蔵した脱イオン水と混合する。次に、懸濁液を、ｐＨ１２まで調節し、３０分間攪拌する。懸濁液を濾過して、不溶な粒子を除去し、ろ液を水に対して透析して凍結乾燥させる。本発明において有用な極性有機溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコール（好ましい）、Ｃ１−Ｃ４ケトン（アセトンが好ましい）、及びＣ１−Ｃ４アルデヒド（臭気によりあまり好ましくない）を含む。本発明における使用に対する特に好ましい溶媒は、エタノール、アセトン、プロパノールおよびブタノールである。最も好ましい極性有機溶媒は、請求項に記載の発明を例示するために使用するつもりである、エタノールである。（本発明においてエタノールを使用する記載への制限は、簡潔さのためのみである。）
魚のタンパク質のさらなる単離を、どんな適切な様式でも成し遂げることができる。例えば、これを、魚のタンパク質の単離物（ＦＰＩ）得るために、抽出物内に溶解するタンパク質を沈殿させるための酸による処理によって成し遂げることができる。タンパク質は、通常、約ｐＨ４．５の溶液から沈殿することになる。望まれれば、ＦＰＩを、自由選択で、透析してもよく、又は（例えば再結晶によって）さらに精製してもよい。溶媒の蒸発又はクロマトグラフィーのような他の単離方法を、同じように成功して使用することができる。
【００４２】
また、本発明を、簡潔さおよび明瞭のみのために、任意のタイプのタンパク質で実行してもよい一方で、使用の残りは、（好ましいタンパク質である）上述のＦＰＩを使用して製造されるタンパク質のヒドロゲルの記載のようなものに制限することにする。
【００４３】
単離の後、次にＦＰＩを、カルボキシル基を含むアシル化剤で変性させる。アシル化剤は、ＦＰＩ内のリシン残留物のｎ−ブチルアミノ基と反応し、ＦＰＩ中にカルボキシル部位を導入するように作用する。好ましくは、アシル化剤は、ポリカルボン酸無水物、一無水物、二無水物、又はその組み合わせである。ここで使用するような、用語“無水物”は、前述のタイプの無水物のいずれをも意味することにする。本発明で使用することができる適切な二無水物は、例えば、ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、ジエチレン−トリアミン−ペンタ酢酸二無水物、及びエチレンジアミンテトラ酢酸二無水物（ＥＤＴＡＤ）を含む。ＥＤＴＡＤは、好ましいアシル化剤である。また、簡潔さのために、後に続く記載を、ＥＤＴＡＤのＦＰＩに対する添加に制限することにする。これは、簡潔さ及び明瞭さのみのためであり、どんな様式においても、ここで請求項に記載する本発明を、制限しないことが理解される。
【００４４】
ＦＰＩ中へのＥＤＴＡＤの導入は、ＦＰＩの水性溶液への固体のＥＤＴＡＤの段階的な添加によって行われる。しかしながら、ＥＤＴＡＤは、分子間又は分子内のどちらかでポリペプチドを架橋することが可能である二官能価の試薬であることを思い出さなければならない。ＥＤＴＡＤのタンパク質との反応に対する二つの可能な反応経路を以下に示し、ここでＰＲＯは、変性するタンパク質である。
【００４５】
【化１】
0004077628.tif 000002
反応Ｉ
【００４６】
【化２】
0004077628.tif 000003
反応ＩＩ
反応Ｉにおいて、ＥＤＴＡＤの一つの分子は、二つのリシル残留物と反応して、連鎖を形成する。ＥＤＴＡＤとのタンパク質の反応が、反応Ｉによって進行するとき、結果は、リシル残留物当たりたった一つのカルボキシル部位の組み込みである。さらに、反応Ｉがタンパク質分子のサブユニット間で起こるとすれば、分子内架橋は、変性したタンパク質の膨潤を減ずる場合もある。
【００４７】
反応ＩＩにおいて、ＥＤＴＡＤの一つの分子は、一つのリシル残留物及び一つの水分子で反応する。この反応において、リシル残留物当たり三つのカルボキシル部位がタンパク質に組み込まれ、連鎖は、形成されない。これは、タンパク質の構造を変性させることを援助する、変性したタンパク質の正味の陰イオンの電荷を大いに増加させる。連鎖が形成されないので、変性したタンパク質の膨潤可能性を減ずる。
【００４８】
ＥＤＴＡＤの二官能性に照らして、最大の吸収性を有するタンパク質のヒドロゲルを形成するために、ＥＤＴＡＤを、反応Ｉよりも反応ＩＩに有利である条件の下で、ＦＰＩに加えるべきである。反応Ｉよりも反応ＩＩに有利である条件は、タンパク質が希釈溶液に存在し、個々のタンパク質分子が部分的に解離する及び／又は変性し、それによってＥＤＴＡＤが二つのタンパク質分子と反応する可能性を減少させるというような条件である。反応を約５℃から約１００℃までの温度範囲で実行することができる。反応を、約ｐＨ８乃至ｐＨ１２の基本的条件の下で、周囲から約１００℃までの穏やかに上昇させた温度で行うことは好ましい。しかしながら、反応条件は、タンパク質の鎖の加水分解の低下を引き起こすほど、厳密であるべきではない。
【００４９】
反応ＩＩの機構によってタンパク質の反応を最適化するための好ましい反応プロトコルは、最初に、約６５℃の穏やかに上昇させた温度で、約ｐＨ１２の希釈水性溶液中でＦＰＩを温置することである。溶液中のＦＰＩの濃度は、約１パーセント程度にあるべきである。ＦＰＩを、６５℃でおおよそ３０分間温置するべきである。より長い温置時間は、アルカリ加水分解が起こらない限り、許容可能である。温置の周期は、ＦＰＩのタンパク質分子を解離させる及び／又は変性させることに役立つ。
【００５０】
また、約ｐＨ２以下の酸性の条件下で温置を行ってもよい。しかしながら、好ましいアシル化反応がアルカリ性溶液中で起こるので、アシル化反応の間における塩の形成を最小限にするために、温置もまたアルカリ性の条件下で行うことが好ましい。
【００５１】
温置の後に、溶液を室温まで冷却し、計算された量のＥＤＴＡＤを、連続的な攪拌と共に増分の量で加える。ＥＤＴＡＤの完全な添加の後に、反応混合を、好ましくは塩基（好ましくはＮａＯＨ）の添加によって１２．０のｐＨを維持すると同時に、３時間絶えず撹拌する。これを、商業的に利用可能なｐＨ−Ｓｔａｔ装置（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を自動的に使用して行うことができる。これらの条件下で、ＦＰＩのアルカリ加水分解は、ほどんど起こらないか又は全く起こらない。
【００５２】
反応の終わりにおいて、次にタンパク質溶液のｐＨを４．５に調整して、タンパク質を沈殿させる。懸濁液を１５分間１００００ｘｇで遠心分離する。タンパク質の沈降物を、ｐＨ４．５の水で洗浄し遠心分離する。次に、最終的なタンパク質の沈殿を、ｐＨ７．０の水に再び溶解させて凍結乾燥させる。アシル化の程度、即ちＥＤＴＡＤで変性させたリシル残留物の百分率を、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法（２）によって決定する。
【００５３】
最終的なゲルの製品の物理的特性を変調するために、アシル化の程度を変動させることができる。これを、加えられるＥＤＴＡＤ（又は他のアシル化剤）に対するタンパク質の比を変動させることによって、かなり容易に行うことができる。単位タンパク質当たり加えられたＥＤＴＡＤの量がより大きいほど、変性の程度はより大きい。
【００５４】
もちろん、反応条件は、反応Ｉが優勢であるように、当業者によって容易に調節され得る。例えば、短くした温置の周期、又は温置のステップの省略は、ＥＤＴＡＤをより濃縮したＦＰＩ溶液に加えるとき、完全に反応Ｉに有利にである傾向があることになる。ｐＨ９に近いアルカリ性でアシル化を行うことは、反応ＩＩの経路よりも反応Ｉの経路に有利である傾向がある。
【００５５】
二つの反応の相対速度を調節することは、最終的なタンパク質のヒドロゲルの特性を変化させることになる。反応ＩＩの最適化が、優れた膨潤性及びより大きな全体的な陰イオンの電荷を有するタンパク質のヒドロゲルを得る一方で、反応Ｉの最適化は、いくつかのアプリケーションにおいては望ましい、堅いあまり吸収性のないヒドロゲルを得る。二つの反応間の相互作用についての知識は、最終的なゲル製品の物理的特性を、種々様々の最終的なアプリケーションに適合するように調整することを可能にする。
【００５６】
反応Ｉの経路対反応ＩＩの経路による反応の比を、様々な変性した及び未変性のＦＰＩ試料の電気滴定によって決定することができる。次に、変性した試料の滴定曲線を、同じ反応条件に置いた未変性の試料と比較する。１０５ｇｍｏｌｅのタンパク質当たりのカルボキシル基の数を、ｐＨ２．０からタンパク質の等イオン点まで滴定の間に、タンパク質によって（又は消費されるＮａＯＨのモルの数によって）解離するＨ＋イオンのモルの数から計算する。天然の大豆のタンパク質及びｐＨ１２および６５℃に置いた大豆のタンパク質に対する滴定曲線は、本質的に同一であり（データを示してない）、ｐＨ１２の熱処理が、大豆のタンパク質のグルタミン及びアスパラギンの残留物の脱アミドに帰着しないことを説明する。おそらく、ＦＰＩは、同様に挙動する。これを知ると、これらの条件下で変性したＦＰＩのカルボキシル基の含有量におけるどんな増加も、ＦＰＩのリシル残留物におけるＥＤＴＡＤの組み込みによらなければならない。
【００５７】
また、以下十分に記載する架橋ステップが、タンパク質の鎖を架橋するために、タンパク質内のリシン残留物も利用することを思い出さなければならない。従って、変性の程度が、利用可能なリシン残留物の９０％を超えないことは好ましい。開始のタンパク質がリシン残留物において特に低いとすれば、変性のこの最大の程度もまた減少させるべきである。増加したカルボキシル部位の含有量の利点を得ために、開始のタンパク質のリシン残留物の最少の５０％をアシル化することは好ましい。
【００５８】
アシル化の後に、タンパク質溶液を脱イオン水に対して徹底的に透析して、反応において形成された塩（この場合には、主としてＥＤＴＡナトリウム）を除去する。透析した変性したタンパク質を、アシル化されたタンパク質を得るために自由選択で凍結乾燥してもよい。代わりに、タンパク質を、ｐＨを４．５まで低下させることによって、引き続き遠心分離によって、沈殿することができる。次に、タンパク質の沈殿物を、水およびｐＨ８乃至９に溶かすことができる。
【００５９】
ＥＤＴＡＤは、とりわけ、それが本質的に無毒なので、好ましいアシル化剤である。ＥＤＴＡＤの添加によってタンパク質中に導入される唯一の反応性基は、カルボキシル基である。上述のプロトコルによるタンパク質の単離物に加えるとき、どんな未反応のＥＤＴＡＤも、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）ナトリウムに変換されるように、水及びＮａＯＨと容易に反応することになる。ＥＤＴＡナトリウムは、“Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ”（ＧＲＡＳ）食品添加物であるので、変性したタンパク質に（もしあれば）残留する任意の残留量のＥＤＴＡナトリウムの毒性又は環境安全に関して心配がない。毒性のある残留する単量体を含む場合もある、ポリ（アクリラート）又はポリ（アクリルアミド）系のヒドロゲルとは違って、本タンパク質のヒドロゲルは、それがどんな残留する試薬を含むとしても、残留するＥＤＴＡナトリウムのみを含むかもしれない。
【００６０】
操作の任意の特定のモードに制限されない一方、ＥＤＴＡＤアシル化剤が、タンパク質のリシル残留物をもつ反応によって、アシル化剤におけるカルボン酸の置換基によって引き起こされる分子内の静電反発力を介してタンパク質分子の広範囲な変性を引き起こすことが信じられている。これは、魚のグロブリンの堅い球状構造を、ランダムコイルタイプのポリアニオン性重合体に変換すると信じられている。カルボン酸の部位がタンパク質の単離物に与える実質的なポリアニオン性の性質は、水の束縛用の多数の部位を提供すると、信じられている。
【００６１】
アシル化の後に、透析されて、自由選択で凍結乾燥され変性したタンパク質の単離物を、二官能価の架橋試薬を使用して架橋する。種々様々の適切な二官能価の架橋剤は、当技術において知られている。また、例えば二無水物のようなジアルデヒドは、リシン残留物と反応してポリペプチドの鎖の間に架橋を形成することになる。二官能価のアルデヒドは、優れた架橋試薬である。本発明において、限定なしで任意のタイプのジアルデヒドは、架橋試薬として作用することができる。好ましい二官能価の架橋試薬は定式がある二官能価のアルデヒドである。好ましい二官能価の架橋試薬は、式
ＯＣＨ−−（ＣＨ２）Ｘ−−ＣＨＯ
を有する二官能価のアルデヒドであり、ここでＸは、２から８までの整数である。同族体のこの小さい群内からの好ましい二官能価のアルデヒドは、グルタルアルデヒド（Ｘ＝３）である。
【００６２】
好ましくは、架橋を水性溶液中で実行する。ここで、架橋（分子内および分子間の連鎖の両方）を最大限にするために、比較的濃縮したタンパク質溶液を使用し、ｐＨは、約ｐＨ７乃至ｐＨ１０で維持する。例えば、ｐＨ９．０のアシル化されたＦＰＩの１０％の水性溶液には、適切な量のグルタルアルデヒドの２５％の水性溶液を加える。例えば、約１５０μｍの２５％のグルタルアルデヒド溶液を、１０ｍｌの１０％タンパク質溶液に加えるかもしれない。
【００６３】
次に、混合物を徹底的に撹拌し、室温で一晩中硬化させる。次に、硬化したゲルを、４０℃のオーブンで空気乾燥させる。
【００６４】
図１は、未変性の魚のタンパク質（ＦＰ）および８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰヒドロゲルの水の吸収量を示す。未変性のＦＰの平衡の水の吸収量は、約６ｇ／ｇゲルのみだったのに対して、８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰヒドロゲルの水の吸収量は、２４時間の膨潤後、約２００ｇ／ｇの平衡値に到達した。明らかに、タンパク質における各リシル残留物の三つのカルボキシル基の導入は、タンパク質ネットワークが大量の水を吸収することを可能とした。ヒドロゲルの膨潤の速度および程度は、水のゲル中への拡散の速度及び水の拡散に応じた重合体ネットワークの緩和の速度および程度によって支配される（５−７）。図１におけるデータは、乾燥した（ガラス状の）ゲルによる水の吸収量の割合が、最初の一時間の間に急速に増加してその後遅くなったことを示す。初期の急速な相は、重合体のネットワークへの水の拡散及び重合体のネットワークにおける帯電した基の水和に関係付けられるかもしれない。この相の間に、イオン性基を水和することに加えて、水は、ゲルネットワークにおける極性のタンパク質−タンパク質相互作用を分裂させる傾向があってもよい。これは、重合体ネットワークの緩和速度を高めるべきである。しかしながら、最初の一時間後、ヒドロゲルの膨潤の速度における減少は、グルタルアルデヒドとの架橋に先立ち、ｐＨ１２及び６５℃でそれを露出することによって、タンパク質を変性させたことを示し、ゲルネットワークにおける構造緩和のその速度は、真実のランダムコイル重合体と類似であるようにはみえない。以前に（１，４）、上記の変性の条件に対する大豆および魚のタンパク質の露出後でさえ、それらの条件をｐＨ９及び室温まで逆戻りさせたとき、タンパク質は、著しい量のα−へリックス及びβ−シートの構造を回復することが示されてきた。架橋されたタンパク質ネットワークにおけるこれらの折り畳まれた二次構造は、水がネットワーク中に拡散すると、ゲルネットワークの緩和を妨害するかもしれない。架橋されたタンパク質ネットワーク中のタンパク質の鎖が変性条件にさらされるとすれば、架橋によって課される立体的な束縛のために、変性を除去するとき、それらは、無秩序状態でままであってもよいことは可能性が高い。
【００６５】
この仮説を解明するために、グルタルアルデヒドとの架橋の後（及び乾燥の前）に、ゲルをエタノール中で懸濁した。浸透により、エタノールは、ゲル中へ浸透し、水は、ゲルからエタノール溶媒中へ拡散した。３時間の露出の後、ゲルは、その水の大部分を失い、乾燥した固体に崩壊した。乾燥したゲルを、ろ過によって除去し、数分間３５℃のオーブンで乾燥させてエタノールを除去し、その膨潤特性を研究した。
【００６６】
図２は、エタノール処理で調製した未変性−ＦＰ及び８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰのゲルの水の吸収量の割合を示す。未変性−ＦＰの場合には、平衡の水の吸収量は、エタノール処理なしのものよりも少なくとも２倍大きい約１５ｇ／ｇであった（図１）。同様に、８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰの平衡の水の吸収量は、エタノール処理なしのものよりも２倍より大きい４２５ｇ／ｇであった（図１）。
【００６７】
図３は、６０％ＥＤＴＡＤで変性させた大豆のタンパク質（６０％のＥＤＴＡＤ−ＳＰ）の水の吸収量に対するエタノール処理の効果を示す。魚のタンパク質の場合におけるように、また大豆のタンパク質のヒドロゲルのエタノール処理は、それの膨潤の速度および程度を著しく増加させた。これは、全てのタンパク質系のヒドロゲルの膨潤特性を、新鮮に架橋されたゲルをエタノールで処理することによって、劇的に改善することができることを示す。
【００６８】
図１及び２におけるデータの比較は、ゲルの膨潤の初期速度および程度の両方をエタノール処理によって著しく改善することを提案する。これは、おそらくゲルネットワークにおけるタンパク質のエタノールに誘起された変性による。エタノール処理がゲルネットワークにおけるタンパク質の構造変化を引き起こすかどうか決めるために、膨潤したゲルのＣＤスペクトルを分析した。
【００６９】
図４は、エタノール処理有り無しで調製した８０％のＥＤＴＡＤ−ＦＰの膨潤ゲルの遠ＵＶ−ＣＤスペクトルを示す。定性的に、エタノール処理を受けなかったゲルのＣＤスペクトルは、２３０ｎｍの主な負のトラフおよび２００ｎｍの正のピークを示した。この種のＣＤスペクトルは、タイプ−Ｉβ−回転において豊富なタンパク質だとされてきた（８−１１）。対照的には、エタノールで処理したゲルのＣＤスペクトルは、ヘリックス構造の典型である２０９−２１０ｎｍおよび２２１−２２３ｎｍの領域に二つの主な負のトラフを示した。水の吸収量の特性と膨潤したゲルのＣＤスペクトルの間の関係を定量的に解釈することは困難であるが、図４におけるデータは、エタノール処理が、ゲルネットワークにおけるタンパク質の配座の特性を変更し、これが、次にはゲルの水の吸収量特性に著しく強い影響を与えるという事実を強調する。
【００７０】
また、８０％のＥＤＴＡＤ−ＦＰゲルの膨潤特性におけるプロパノール、ブタノールおよびアセトン処理の効果も調査した。これらの溶媒で処理したゲルの平衡の膨潤の程度は、エタノールで処理したゲルよりもわずかに低かった。
【００７１】
図５Ａは、３６℃で０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰの膨潤特性におけるエタノール処理の効果を示す。エタノールで処理しなかったゲルの食塩水の吸収量は、約２４ｇ／ｇであったのに対して、エタノールで処理したゲルのものは、約３５ｇ／ｇであった。また、食塩水の吸収量の速度は、明らかに、エタノール処理なしのものよりもエタノール処理したゲルでより高かった。また、同様の挙動は、０．１５Ｍの食塩水の吸収量でも観察される（図５Ｂ）。エタノールで処理したゲルの食塩水の吸収量の速度および程度における改善は、ネットワークにおけるタンパク質の鎖の緩和の速度および程度における増加と関係付けられるに違いない。
【００７２】
図６は、８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰゲルによる平衡の水の吸収量における温度の効果を示す。平衡の水の吸収量の対数対温度の逆数は、５−４０℃の温度範囲で線形の挙動を示した、エタノールで処理したおよびエタノールで未処理のゲルの両方に対してプロットする。これらのプロットの傾斜は、同じであったと共に、水の吸収量に対するエンタルピー変化（ΔＨ）は、これらのゲルの両方に対して同じであることを提案する。このように、どんな与えられた温度でも水の吸収量の絶対量における正味の差は、ネットワークの構造的な柔軟性における差から発生するに違いない（即ち、関係付けられたエントロピー）。
【００７３】
次のプロトコルは、請求項記載の発明の完全な理解において援助するために、図説する目的にのみ提供される。例は、ここではどの様式でも請求項記載の発明を限定しないことが理解される。
【００７４】
｛材料｝
新鮮な大目玉のカワカマス（魚）を、地元の魚の養殖場から得た。エチレンジアミンテトラ酢酸二無水物（ＥＤＴＡＤ）及びブタノールを、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）からのものだった。グルタルアルデヒド（５０％の水性の溶液）およびプロパノールを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から得た。無水エチルアルコールを、Ａｐｐｅｒ  Ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｈｅｌｂｙｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から購入した。熱シール可能な水で濡らすことができる紙を、Ｂｏｌｍｅｔ  Ｉｎｃ．（Ｄａｙｖｉｌｌｅ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から得た。透析管（ｍ．ｗ．カットオフ６０００−８０００）、アセトン、及びエーテルを、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から得た。他のすべての化学薬品は、分析級のものだった。脱イオン水を、膨潤の研究に使用した。
【００７５】
｛タンパク質の決定｝
この研究で使用する変性する基が、タンパク質の濃度の決定に対する全ての  比色分析的な方法を妨げるので、タンパク質の濃度は、乾燥重量法(1)によって決定した。脱イオン水におけるタンパク質の原液の量られたアリコートを、真空オーブン中において１０５℃で一定の重量まで乾燥させた。タンパク質の濃度を％ｗ／ｖで表示した。
【００７６】
｛魚のタンパク質の変性｝
タンパク質のリシル残留物のＥＤＴＡＤとの化学的な変性を、他の場所で報告したようにして実行した（１）。水における一パーセントのタンパク質の溶液を、ｐＨ１２で調製して、６５℃で３０分間温置した。溶液を室温まで冷却し、計算した量のＥＤＴＡＤを、連続的な撹拌と共に増分の量で加えた。ＥＤＴＡＤの完全な添加の後、反応混合物を、ｐＨを１２に維持すると同時に、３時間絶えず撹拌した。 反応の終わりに、タンパク質の溶液のｐＨを４．５まで調節して、タンパク質を沈殿させた。その懸濁液を１５分間１０，０００ｇで遠心分離した。タンパク質の沈降物を、ｐＨ４．５の水で洗浄して遠心分離した。次に、最終的なタンパク質の沈殿物をｐＨ７．０の水に再び溶解させて凍結乾燥させた。アシル化の程度、即ちＥＤＴＡＤで変性させたリシル残留物の百分率を、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法（２）によって決定した。
【００７７】
｛架橋されたヒドロゲルの調製｝
ＥＤＴＡＤで変性させた魚のタンパク質の１０％分散物を、ｐＨ１０の脱イオン水に必要とされる量のタンパク質を溶解させることによって調製し、１５乃至２０分間、エッグビーターで均一に混合した。高い粘度のために、１０％のタンパク質の分散物は、厚い糊のように見えた。これに、既知の量の（またｐＨ１０に予め調節した）５０％グルタルアルデヒド溶液を加えたので、最終的な混合物におけるタンパク質のグルタルアルデヒドに対する比は、約１：０．０３５（ｗｔ／ｗｔ）であった。混合物を、エッグビーターを使用して約１５分間均一に混合して、室温で一晩中硬化することを可能にした。硬化したゲルを二つの等しい部分に分割した。一方の部分を、４０℃のオーブン中で乾燥させた。他方の部分を、３時間エタノール中に懸濁させ、その時間中にエタノールを少なくとも二回変化させた。エタノール処理は、タンパク質の変性及び架橋されたゲルの脱水の両方を引き起こした。エタノール処理の終わりに、ゲルを乾燥させた粒子の形態にした。粒子を、二時間４０℃のオーブン中でさらに乾燥させてエタノール及びどんな残留の水分も除去した。未変性の魚のタンパク質の対照ゲルを同じ様式で調製した。完全な乾燥の後、ゲルは、１．０ｍｍより小さい粒子の大きさにすりつぶして膨潤の研究に使用した。
【００７８】
｛膨潤の速度論｝
全ての上述のゲルに対する膨潤の研究を、３６℃で重量測定で行った。量られた量の乾燥させたゲルを、熱シールできるパウチにおいて三重反復で得て、脱イオン水中で膨潤することを可能にした。特定の時間間隔で、バッグを、ホルダーの底へ放出される水の適当な排水用のプラスチックのワイヤメッシュを含む試料ホルダーを装備した臨床の遠心分離機において２１４ｘｇで除去し、遠心分離した。膨潤したゲルの重量を直ちに決定した。パウチの湿気の重量の適切な制御を含んでいた。膨潤したゲルをもつ濡れたパウチを、一定の重量まで１０４℃のオーブン中で乾燥させた。ゲルの最終的な乾燥重量を、同じ様式で処理した等価な空のパウチの乾燥重量を差し引くことによって決定した。水の吸収量を、乾燥ゲルのｇ当たりの吸収された水のｇとして決定した。水の吸収量におけるイオン強度の効果を、０．１Ｍ及び０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中にゲルの試料を浸すことによって、上述のものと類似の様式で研究した。水の吸収量に対する温度の影響を、温度が制御された水浴において５−４０℃の範囲で研究した。
【００７９】
｛円二色性の測定｝
定量的なＣＤの測定を、コンピューター化された分光偏光計（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＧＡ）で行った。水中で膨潤しゲルを、０．８ｍｍの厚さのスペーサーによって分離された二つの石英の板（２．５×２．５ｃｍ）と密閉されたセルとの間に置いた。間にはさまれたゲルの遠ＵＶ  ＣＤスペクトルを、１９０−２４０ｎｍの範囲で記録した。各試料の二十回の走査を平均して、全てのスペクトルを適切な水の基線に対して補正した。試料をゲルの形態にしたので、スペクトルを、ゲル中におけるタンパク質の正確な濃度を要求するかもしれない楕円率モードの代わりに、ミリ度モードで記録した。
【００８０】
魚の筋肉から単離した粗製のタンパク質のリシンの含有量は、１０，０００の分子量当たり約９の残留物を含んでいた。１：０．２のタンパク質対ＥＤＴＡＤの重量比における粗製のタンパク質のＥＤＴＡＤとの反応は、魚のタンパク質における約８０％のリシル残留物のアシル化に帰着した（８０％ＭＦＰ）。１：０．２５（ｗ／ｗ）のタンパク質対ＥＤＴＡＤの比において、約９０％のリシル残留物をアシル化した（９０％ＭＦＰ）。
【００８１】
以前に、この研究で使用した反応条件の下で、ＥＤＴＡＤのタンパク質のリシル基との反応は、変性した各リシル残留物に対して約３個のカルボキシル基の導入に帰着したことを報告してきた（３，４）。
【００８２】
本発明は、ここで記載した特定の実施例、試薬、ステップ、又は方法に限定されず、添付した請求項の範囲内に入るような、それの全てのこのような形態を包含することが理解される。
【００８３】
｛参考文献一覧｝
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【図面の簡単な説明】
【図１】  未変性の魚のタンパク質（ＦＰ）（△）及び８０％ＥＤＴＡＤで変性させたＦＰのヒドロゲル（○）の水の吸収量を示すグラフである。
【図２】  エタノールで処理した未変性のＦＰ（△）およびエタノールで処理した８０％ＥＤＴＡＤで変性させたＦＰ（○）のゲルの水の吸収量の速度を図説するグラフである。
【図３】６０％のＥＤＴＡＤで変性させた大豆のタンパク質（ＳＰ）（△）およびエタノールで処理した６０％ＥＤＴＡＤで変性させた大豆のタンパク質（○）の水の吸収量に対するエタノール処理の効果を描くグラフである。
【図４】  エタノール処理（太線）で、およびエタノール処理なし（細線）で、調製した８０％のＥＤＴＡＤ−ＦＰの膨潤したゲルの遠ＵＶ−ＣＤスペクトルを示すグラフである。
【図５Ａ】  ３６℃で０．１Ｍ  ＮａＣｌ中における８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰのエタノール処理膨潤特性の効果を図説するグラフ（△＝ＥＤＴＡＤで変性させたＦＰ；○＝エタノールで処理したＥＤＴＡＤで変性させたＦＰ）である。
【図５Ｂ】  ３６℃で０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中における８０％ＥＤＴＡＤ−ＦＰのエタノール処理膨潤特性の効果を描くグラフ（△＝ＥＤＴＡＤで変性させたＦＰ；○＝エタノールで処理したＥＤＴＡＤで変性させたＦＰ）である。
【図６】  平衡の水の吸収量に対する温度の効果を示す、８０％ＥＤＴＡＤで変性させたＦＰ（△）およびエタノールで処理したＥＤＴＡＤで変性させたＦＰ（○）に関するｌｏｇ  ＭＳ（最大の膨潤）対１／Ｔのファントホッフプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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