(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス状炭素のマトリックス中に黒鉛の結晶を一方向に配向させた黒鉛／ガラス状炭素複合材料からなり、その形状が薄片状のチップ型である電極と、
該電極上に形成された、少なくとも親水性高分子層と酵素を含む反応層とを具備する定量分析用炭素電極。
【請求項２】
前記反応層がさらに電子受容体を含む請求項１記載の定量分析用炭素電極。
【請求項３】
ガラス状炭素のマトリックス中に黒鉛の結晶を一方向に配向させた黒鉛／ガラス状炭素複合材料からなり、その形状が薄片状のチップ型である電極を作製し、
該電極上に少なくとも親水性高分子層と酵素を含む反応層を形成する各段階を具備する定量分析用炭素電極の製造方法。
【請求項４】
前記反応層がさらに電子受容体を含む請求項３記載の定量分析用炭素電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、試料液中の特定物質量を酵素活性を利用して電気化学的に迅速かつ高精度に測定することを可能にする炭素電極及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、試料液中の特定物質量を電気化学的方法により測定するための作用電極としては、水銀滴下電極、静止水銀電極、白金、金、金アマルガム、銅、炭素（グラッシーカーボン、カーボンファイバー、カーボンペースト、パイログラファイト）などが検討されてきたが、その中でもグラッシーカーボンの利用が主流になってきている。しかしながら、グラッシーカーボンは電流感度が低く、高い正電位で電解質を介して電位がかかると、電極表面の再現性が悪くなる。そのために適用できる電位範囲は＋1.0 Ｖ付近までであった。また酸化処理などの前処理の影響が大きく、測定の再現性に問題があった。
【０００３】
黒鉛は電位窓も広く、電極反応活性があり、生体を害する毒性もないので有用な電極材料であるが、機械的強度に乏しく、単独では組織内に電解液が浸透するので油や樹脂を含浸する必要があり、有機溶媒が僅かでも含まれる系では含浸物が溶出するので電気化学的特性のバラツキが多く、データの再現性が得られなかった。これにも関わらず黒鉛の結晶端面（エッジ面）は、電極反応活性に富み、電位窓が大きく、前処理も容易であり、経時劣化せず安定性が高く、溶出せず毒性がない、などの優れた性質を有し、この性質に基づき、不浸透性を示すガラス状炭素をマトリックスとして、黒鉛を一方向に配向させた黒鉛複合炭素材料とすることにより得られた黒鉛／ガラス状炭素複合炭素による電極は、油や樹脂の含浸を必要とせず、単独で不浸透性を持ち、機械的強度が大きい。
【０００４】
しかしながら、前記黒鉛／ガラス状炭素複合炭素による電極はその端面の活性の強さにより、酵素活性測定に不利な性質、すなわち、試料液中に含まれる測定を阻害する物質をも多量に電極表面に吸着してしまうという欠点を有していた。そこで、電極の特性を失うことなく、その阻害物質の影響を排除する方法について、高分子の透過性薄膜をその表面に被覆することで、阻害物質の濃度に影響されることなく、試料液中の特定物質量を酵素を用いて迅速かつ高精度に測定しうる方法について以下のような定量分析用炭素電極を提案した（特願平８−２１１３９５）。
【０００５】
この電極はガラス状炭素のマトリックス中に黒鉛の結晶を黒鉛結晶固有の電極反応を持つよう一方向に配向させた黒鉛／ガラス状炭素複合材料である炭素材料からなる円柱状の電極と、この電極の表面を被覆する透過性薄膜とから構成される酵素を利用した特定物質定量用炭素電極である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の形状では、測定に必要なサンプル量が１mlと比較的多くなり、また電極の使い捨てを考えた場合に小型化が困難であった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するため、ガラス状炭素のマトリックス中に黒鉛の結晶を一方向に配向させた黒鉛／ガラス状炭素複合材料である炭素材料を押し出して作成した棒状の炭素素材から薄片状のチップ電極を作成し、前記電極上に少なくとも親水性高分子層と酵素を含む反応層とを備えたものである。反応層にさらに電子伝達体を含むことにより、チップ化することで測定溶液の攪拌ができなくなったことにより起こる溶存酸素量の不足の影響を受けない。
【０００８】
すなわち、上述のような電子伝達体を用いる特定物質定量の原理は次のようである。例えば特定物質がグルコースの場合、基質であるグルコースが酸化酵素であるグルコースオキシダーゼによって酸化されると、酵素の活性中心が酸化型から還元型に変化し、これにより電子伝達体を還元し酵素自身は再度酸化型に戻る。そして作用極上での適当な印加電圧によって電子伝達体は電解され、その際に得られる酸化電流を測定することによりグルコース濃度が測定できる。
【０００９】
本発明における作用極に用いる黒鉛／ガラス状炭素複合材料は、材料構成の４０％以上９５％以下が不浸透性を持つガラス状炭素マトリックスで、黒鉛としてはキッシュ黒鉛、天然黒鉛の粉末が好ましい。ここでガラス状炭素とは、有機物を不活性雰囲気中または非酸化性雰囲気中で焼成する事で得られるガラス状の難黒鉛化性炭素で、具体的には有機高分子物質およびそのモノマー・オリゴマー類、タール・ピッチ類、乾留ピッチ類、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂の初期重合体類などの一種または二種以上の混合物から得られる炭素化物である。
【００１０】
本発明における黒鉛の結晶を一方向に配向させる方法は、次の如くして行うことができる。有機高分子物質と結晶性炭素微粉末を目的に応じて配合し、ヘンシェルミキサーなどで粉体分散を充分行う。ここに乾留ピッチを配合し、これに可塑剤、溶剤などを添加し、加圧ニーダーまたは二本ロールなどの高度に剪断力がかけられる混練機を用いて、十分に混合分散を施し、ペレタイザーにより顆粒化した後、スクリュー式やプランジャー式等の押し出し機により所望の直径に高速に押し出し成形して、押し出し方向に複合した黒鉛の結晶がよく配列するように配向操作を加えることにより生成形体が得られる。
【００１１】
次に、この成形体に延伸操作を加えつつ１８０℃に加熱されたエアー・オーブン中にて、１０時間処理して炭素前駆体（プリ・カーサー）材料とする。更に窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気中で昇温速度を制御しつつ１０００℃迄徐々に加熱して炭素化を終了させる。目的によっては、更に真空中またはアルゴン雰囲気中で２２００℃迄加熱処理を施し全体を緻密化すると共に純度を高める操作を加える。このようにして本発明でいう、黒鉛を一方向に配向させた棒状の黒鉛／ガラス状炭素複合材料を準備できる。この炭素材料をダイヤモンドホイール等の切断装置により薄片状に加工する。得られた薄片状の炭素電極を、ポリエチレンテレフタレート等の絶縁樹脂基板の上に絶縁性を有す接着剤により接合する。更に炭素電極の露出部分の面積を一定とするよう、絶縁被膜層を形成する。電極部分を構成した後、親水性高分子層を形成する。次に、酵素と電子伝達体との複合層を形成する。
【００１２】
ここで用いる親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロースや他のセルロース系、ビニルアルコール系、デンプン系、無水マレイン酸系、アクリルアミド系などを用いても良い。これらの親水性高分子を適当な濃度の溶液などとしたものを滴下、乾燥することにより、必要な膜厚の親水性高分子層を電極上に形成することができる。
【００１３】
また電子伝達体として使用できる材料としては、従来から使用されているものはいずれも使用でき、例えばフェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェロセン、フェナジンメトサルフェート、チオニン、ピロロキノリンキノン、ナフトキノン、メチレンブルーなどを挙げることができる。
本発明の炭素電極に使用できる酵素は、特に限定されるものではなく、従来の酵素センサにおいて使用されている酵素を単独であるいは併用して使用できる。具体的には、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、アルコールオキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、アミンオキシダーゼなどのオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ウレアーゼなどを使用できる。これらの酵素を利用して濃度を測定できる物質としては、使用する上述の酵素から適当に選択することにより種々の物質の濃度を測定できる。例えば代表的なものとしてはグルコース、コレステロール、乳酸、尿酸、アルコール、ＮＡＤＨ、ガラクトース、ピルビン酸、アミン、フルクトース、グルタミン酸などが挙げられるが、その他、酵素反応の基質となりうる物質であればいかなる物質も定量的に測定可能である。
【００１４】
次に実施例を示して、本発明の炭素電極の作製方法およびこれを用いた定量分析の結果を明らかにする。
【００１５】
【実施例】
本発明の第１の実施例として、グルコースセンサについて記述する。まず、黒鉛／ガラス状炭素複合材料の作製方法を説明する。ガラス状炭素源として、塩素化塩化ビニル樹脂３５重量部とフラン樹脂５０重量部、平均粒度２μｍの天然鱗状黒鉛粉末１５重量部、可塑剤としてのジアリルフタレートモノマー２０重量部を、ヘンシェルミキサーで混合・分散後、ミキシング用二本ロールで混練し、この混練物をスクリュー型押し出し機で押し出し、これを延伸操作を加えつつ１８０℃に加熱されたエアー・オーブン中にて、１０時間処理して炭素前駆体（プリ・カーサー）材料とする。更に窒素ガス雰囲気中で昇温速度を制御しつつ１０００℃迄徐々に加熱して炭素化を終了させる。更にアルゴン雰囲気中で１４００℃迄加熱処理を施し全体を緻密化すると共に純度を高める操作を加えることで、黒鉛を一方向に配向させた棒状の黒鉛／ガラス状炭素複合材料を準備できる。この炭素材料をダイヤモンドホイールにより薄片状に加工する。得られた薄片状の電極１０（図１の平面図および図２の断面図参照）の電極表面を２０００番手の炭化珪素製研磨紙により平滑化処理した後、得られた薄片状の炭素電極を、ポリエチレンテレフタレート製の絶縁樹脂基板１４の上に絶縁性を有す接着剤により接合する。リード１６を形成し、更に炭素電極の露出部分の面積を一定とするよう、絶縁被膜層１２を形成する。電極部分を構成した後、親水性高分子層を形成する。
【００１６】
親水性高分子としてカルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣと略す）の０．５wt％水溶液を電極上に滴下、乾燥した。次に酵素としてグルコースオキシダーゼと電子受容体としてのフェリシアン化カリウムをリン酸緩衝液に溶解した液を滴下、乾燥させて反応層を形成した。上記のように作成した電極を作用極とし、対極兼参照極に銀／塩化銀電極を用い、柳本製ボルタンメトリックアナライザーＰ１０００および東亜電波ｔ−ＹレコーダーＥＰＲ−１５１Ａを使用した２電極方式で測定を行った。グルコースオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．４  微生物由来、１０００Ｕ／ｌ）はシグマ社製、グルコースは和光純薬製のグルコース標準液を使用した。また、緩衝液は０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．８）を用いた。
【００１７】
次に測定に関して記す。上記のようにして作成した特定物質定量用炭素電極上にグルコース溶液をマイクロピペットで供給してから１分後に、電極系の対極を基準にして作用極にアノード方向へ６００mVのパルス電圧を印加し、５分後の電流値を測定したところ、図３に示すように、試料液中のグルコース濃度に比例した応答電流値が得られた。極めて良好な直線性を示したことより未知濃度のグルコースを試料とした場合にも得られた電流値からその濃度を迅速、かつ正確に測定できることがわかった。
【００１８】
本発明の第２の実施例としてのコレステロールセンサについて記述する。まず、黒鉛／ガラス状炭素複合材料の作製方法を説明する。ガラス状炭素源として、フラン樹脂６０重量部、乾留ピッチ２０重量部、平均粒度２μｍの天然鱗状黒鉛粉末２０重量部を、ヘンシェルミキサーで混合・分散後、ミキシング用二本ロールで混練し、この混練物をスクリュー型押し出し機で押し出し、これを延伸操作を加えつつ２００℃に加熱されたエアー・オーブン中にて、８時間処理して炭素前駆体（プリ・カーサー）材料とする。更に窒素ガス雰囲気中で昇温速度を制御しつつ１０００℃迄徐々に加熱して炭素化を終了させる。更に真空焼成炉留で１６００℃迄加熱処理を施し全体を緻密化すると共に純度を高める操作を加えることで、黒鉛を一方向に配向させた棒状の黒鉛／ガラス状炭素複合材料を準備できる。この炭素材料をダイヤモンドホイールにより薄片状に加工する。第１の実施例と同様に、得られた薄片状の電極１０の電極表面を２０００番手の炭化珪素製研磨紙により平滑化処理した後、得られた薄片状の炭素電極を、ポリエチレンテレフタレート製の絶縁樹脂基板１４の上に絶縁性を有す接着剤により接合する。リード１６を形成し、更に炭素電極の露出部分の面積を一定とするよう、絶縁被膜層１２を形成する。電極部分を構成した後、親水性高分子層を形成する。
【００１９】
親水性高分子としてＣＭＣの０．５wt％水溶液を電極上に滴下、乾燥した。次に酵素としてコレステロールオキシダーゼと電子受容体としてのフェリシアン化カリウムをリン酸緩衝液に溶解した液を滴下、乾燥させて反応層を形成した。上記のように作成した電極を作用極とし、対極兼参照極に銀／塩化銀電極を用い、柳本製ボルタンメトリックアナライザーＰ１０００および東亜電波ｔ−ＹレコーダーＥＰＲ−１５１Ａを使用した２電極方式で測定を行った。コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．６  微生物由来、１００Ｕ／ｌ）は東洋紡製、コレステロールは和光純薬製の遊離コレステロール標準液Ａ（２００mg／dl）を使用した。また、緩衝液は Triton Ｘ−１００を５ml／ｌになるように添加した０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．８）を用いた。
【００２０】
上記のように構成した作用極表面に試料液としてコレステロール標準液を滴下し、滴下３０分後に参照極を基準にして６００mVのパルス電位を印加し、５分後の電流値を測定値とした。添加された試料液中コレステロールは電極上の反応層に担持されたフェリシアン化カリウムと反応してフェロシアン化カリウムを生成する。そこで、前記パルス電位の印加により、生成したフェロシアン化カリウム濃度に比例した酸化電流が得られ、この電流値は基質であるコレステロールの濃度に対応する。
【００２１】
図４は、上記一連の反応で得られた電流値と、コレステロール濃度の関係を示すものであり、極めて良好な直線性を示した。このことより未知濃度のコレステロールを試料とした場合にも得られた電流値からその濃度を迅速、かつ正確に測定できることがわかった。
【００２２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、精度良く基質濃度を定量でき、かつ、小型化が容易なディスポーザブルタイプの定量分析用電極が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る特定物質定量用炭素電極の平面図である。
【図２】図１の電極の断面図である。
【図３】第１の実施例のグルコースの定量実験により得られた、グルコース濃度と電流値との関係について示すグラフである。
【図４】第２の実施例のコレステロールの定量実験により得られた、コレステロール濃度と電流値との関係について示すグラフである。
【符号の説明】
１０…作用極（端面）
１２…絶縁被覆膜
１４…絶縁樹脂基板
１６…作用極リード
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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