(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞発酵物からのエリトロポエチン結合タンパク質（ＥＢＰ）の精製方法であって、
ａ）発酵物から微生物細胞を集め、
ｂ）集めた微生物細胞に十分な量の溶解バッファーを添加して未精製ライセートを生成し、
ｃ）未精製ライセートから不溶性タンパク質を集め、
ｄ）不溶性タンパク質を可溶化バッファーで可溶化し、
ｅ）工程ｄ）の可溶化したタンパク質を好適な再生バッファーで再生することにより再生タンパク質を生成し、
ｆ）工程ｅ）の再生タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィ−基質と接触させ、
ｇ）疎水性相互作用クロマトグラフィ−基質から活性型ＥＢＰを溶出し、そして集め、
ｈ）工程ｇ）からの活性型ＥＢＰをサイズ排除クロマトグラフィ−基質と接触させ、そして、
ｉ）工程ｈ）のサイズ排除クロマトグラフィ−基質から活性型ＥＢＰを溶出し、そして集めること
により純粋なＥＢＰを生成する、
工程を含んでなる、上記精製方法。
【請求項２】
ｊ）工程ｉ）の生成物を場合によっては濃縮し、そして／または製薬学的に受容しうる担体中にダイアフィルトレーションし、
ｋ）場合によってはタンパク質生成物を滅菌する
工程をさらに含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物が大腸菌である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）の溶解溶液が、全体として０．３１となる溶液に、５１ｍｇの割合のフッ化フェニルメチルスルホニル、６００ｍｇの割合の卵白リゾチーム、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１２，５００ユニットの割合のベンゾナーゼを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌのＥＢＰ溶解バッファーである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
サイズ排除クロマトグラフィ−基質が高速サイズ排除クロマトグラフィ−基質である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
赤血球の生産及び成熟をもたらす血液学的プロセスは、腎臓で主として合成される糖タンパク質ホルモンのエリトロポエチン（ＥＰＯ）の制御下にある（Ｋｒａｎｔｚ、Ｓ．Ｂ．（１９９１）Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  ７７、４１９−４３４に概説される）。市販されているヒトＥＰＯは、組み換えＤＮＡ技術により製造され、組み換え体ヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）として知られている。ｒｈＥＰＯは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される場合、約３６，０００ダルトンの分子量を有する。タンパク質バックボーンの分子量は、１８，３９８ダルトンであり、これは、全体の分子が大量にグリコシル化されていることを示す。炭水化物残基は、インビボでの生物学的活性のために重要である。
多数の他の増殖因子と異なり、赤血球系細胞に対するＥＰＯの特異性は、安全で有効な治療タンパク質としてのその開発をもたらしている。ＥＰＯの医学的利点は、慢性腎不全、癌の化学療法及び自己前献血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｅｄｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ）に関係する貧血症の治療において十分に確立されている。ＥＰＯ治療の長期的性質のために、経口投与される「第二世代」の分子があることが望ましい。
ＥＰＯとそのレセプターの相互作用の構造的基礎を理解することは、経口貧血薬のような新薬の設計を促進する。薬剤の発見の伝統的な方法は、レセプター−リガンド相互作用の構造的基礎についての情報を利用して分子モデルを開発するしようと試みる合理的（ｒａｔｉｏｎａｌ）設計方法により補足されている。これらのモデルは、次に、治療に役立つ可能性がある分子を設計するために用いられる。これら２つの方法は相補的であり、治療標的の３次元構造に関する情報を得る能力に依存する。ＥＰＯ及びそのレセプターを製造する能力並びにタンパク質の機能に対する構造変化の影響を評価する能力は、仮説の分子モデルを試験するための手段を与え、薬剤設計の構造活性関係データベースの設立に寄与する。
ＥＰＯの生物学的作用は、細胞膜結合レセプターとの相互作用を通してある程度もたらされるようであり、レセプターは以前にクローン化されている（Ｊｏｎｅｓ、Ｓ．Ｓ．、Ｄ’Ａｎｄｒｅａ、Ａ．Ｄ．、Ｈａｉｎｅｓ、Ｌ．Ｌ．及びＷｏｎｇ、Ｇ．Ｇ．（１９９０）、Ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｂｌｏｏｄ  ７６、３１−３５；Ｎｏｇｕｃｈｉ、Ｃ．Ｔ．、Ｋｙｕｎｇ、Ｓ．Ｂ．、Ｃｈｉｎ、Ｋ．、Ｗａｄａ、Ｙ．、Ｓｃｈｅｃｔｅｒ、Ａ．Ｎ．及びＨａｎｋｉｎｓ、Ｗ．Ｄ．（１９９１）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ、Ｂｌｏｏｄ  ７８、２５４８−２５５６；Ｍａｏｕｃｈｅ、Ｌ．、Ｔｏｕｒｎａｍｉｌｅ  Ｃ．、Ｈａｔｔａｂ、Ｃ．、Ｂｏｆｆａ、Ｇ．、Ｃａｒｔｏｎ  Ｊ．−Ｐ．及びＣｈｒｅｔｅｉｎ、Ｓ．（１９９１）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  ７８、２５５７−２５６３］。現在、ＥＰＯレセプター（ＥＰＯＲ）とＥＰＯの結合の物理的性質にかなりの関心が持たれており、この型の相互作用の分析のための新しい技術は、ホルモン結合タンパク質とも呼ばれる可溶性レセプターの作製である（Ｌａｎｇｅｒ、Ｊ．Ａ．（１９９０）Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、４６−６６）。この方法は、レセプターの細胞外ドメインをコードする適当な発現ベクターを作製し、続いてそのタンパク質を生産し、精製することを含む。これらの可溶性レセプターフラグメントは、膜結合レセプターを可溶化するために必要な溶剤を含まない状態で用いることができるので、いったん活性型で得られると、多数のアッセイ形態において有用であり、ＮＭＲまたはＸ線結晶学のような生物物理学的研究において向上した有用性を有する。ＩＬ−１及びＩＬ−４を初めとするこの型のいくつかのレセプターフラグメントは、ホルモンの生物学的作用を中和するために働き、治療に役立つ可能性があると思われる（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｃ．Ｒ．及びＦａｎｓｌｏｗ、Ｗ．Ｃ．（１９９０）Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｌ−１  ａｎｄ  ＩＬ−４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ８、３２４−３２９）。
以前の報告は、真核細胞及びバクテリアにおけるタンパク質発現を利用するヒト及びネズミのＥＰＯ結合タンパク質（ＥＢＰ）の生産及び精製のための系の開発を略述しているが、限られた収量である（Ｈａｒｒｉｓ、Ｋ．Ｗ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｒ．Ａ．及びＷｉｎｋｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｃ．（１９９２）Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１５２０５−１５２０９；Ｙｅｔ、Ｍ．−Ｇ及びＪｏｎｅｓ、Ｓ．Ｓ．（１９９３）Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｏｒｍｓ  ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  ８２、１７１３−１７１９；Ｎａｇａｏ、Ｍ．、Ｍａｓｕｄａ、Ｓ．、Ａｂｅ、Ｓ．、Ｕｅｄａ、Ｍ．及びＳａｓａｋｉ、Ｒ．（１９９２）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８８、８８８−８９７）。
ＥＰＯレセプター活性化の機構は、２つのＥＰＯレセプター分子の二量化にあることが示唆されており、これは、シグナル変換の次の工程を生じる［Ｗａｔｏｗｉｃｈ、Ｓ．Ｓ．、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、Ａ．、Ｌｏｎｇｍｏｒｅ、Ｇ．Ｄ．、Ｈｉｌｔｏｎ、Ｄ．Ｊ．、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、及びＬｏｄｉｓｈ、Ｈ．Ｆ．、Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９、２１４０−２１４４（１９９２）］。可溶性ＥＰＯレセプター［Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄ．Ｌ．、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、Ｓ．Ａ．、ＭｃＭａｈｏｎ、Ｆ．、Ｂａｒｂｏｎｅ、Ｆ．、Ｋｒｏｏｎ、Ｄ．、Ｔｓａｏ、Ｅ．、Ｌｅｅ、Ｗ．Ｈ．、Ｍｕｌｃａｈｙ、Ｌ．Ｓ．及びＪｏｌｌｉｆｆｅ、Ｌ．Ｋ．、Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ７  １０４−１１３（１９９６）］は、構造決定及び生産の容易さに関係する利点を有するが、レセプターの二量化の前以て形成された鋳型ではないようである。ＥＰＯレセプターに結合し、これを活性化する可能性のあるペプチドまたは小分子の探索において、そのような前以て形成された二量化の鋳型は、そのような活性を有する分子の発見、検出及び記述のための非常に有益な道具である。レセプター−Ｉｇ融合分子の使用は、そのような鋳型を提供し、そしてアッセイ形態により、与えられた分子または化合物の非生産的及び生産的二量化複合体を検出する能力に関する情報を与える。
発明の要約
組み換え体宿主細胞の発酵からの非常に純粋なヒトＥＰＯ結合タンパク質（ＥＢＰ）の新規な製造方法が本明細書に開示される。記述される本発明の方法は、ＥＰＯ（リガンド）結合というＥＰＯレセプターの生物学的特性を保持する非常に純粋な非グリコシル化ＥＢＰを製造する。また、本発明の非常に純粋なＥＰＯは、擬似リガンド（ｌｉｇａｎｄ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）の設計、発見及び生成、リガンド結合のインヒビターの設計、発見及び生成、リガンド結合のアゴニスト、アンタゴニスト及び他のモジュレーターの設計、発見及び生成、並びにＥＢＰ−リガンド相互作用部位の正確な特性化を可能にする結晶構造の生成を初めとするがこれらに限定されない、多種多様な薬剤発見技術においても有用でもある。また、ＥＢＰ−リガンド相互作用部位の正確な特性化は、擬似リガンドの設計、発見及び生成、リガンド結合のインヒビターの設計、発見及び生成、並びにリガンド結合のアゴニスト、アンタゴニスト及び他のモジュレーターの設計、発見及び生成にも有用である。
ＥＢＰは、組み換え体宿主において融合タンパク質としても生産される。ＥＢＰ融合タンパク質は、さらなるアミノ酸配列に共有結合的に連結したＥＢＰアミノ酸配列を含んでなる。このさらなるアミノ酸配列は、ＥＢＰの検出、精製、定量、抗原性またはあらゆる他の所望される機能のための手段を与えることができる。特に、さらなるアミノ酸配列が免疫グロブリンの重鎖またはその一部である融合タンパク質としてＥＢＰを生産することができる。本発明のＥＢＰ−Ｉｇは、ＥＢＰ及びＩｇＧ重鎖分子のヒンジ領域を含むＩｇＧ重鎖の一部の融合タンパク質である。このＥＢＰ−Ｉｇも、擬似リガンドの設計、発見及び生成、リガンド結合のインヒビターの設計、発見及び生成、並びにリガンド結合のアゴニスト、アンタゴニスト及び他のモジュレーターの設計、発見及び生成を初めとするがこれらに限定されない、多種多様な薬剤発見技術において有用である。
そのような薬剤発見技術におけるＥＢＰ及びＥＢＰ−Ｉｇの使用方法も本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
図１．大腸菌におけるＥＢＰの発現のために用いるプラスミドベクターが示される。
図２  パネルＡ及びＢ．ＥＢＰの発現及び精製試験の試料の還元（パネルＡ）及び非還元（パネルＢ）１０−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥが示される。
図３、パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ：ＥＢＰの「活性」型の検出の実例が示される。
図４、パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ．ＨＩＣ及び分取サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後のＥＢＰの純度及び活性の実例が示される。
図５、パネルＡ及びＢ．Ｃ−４逆相ＨＰＬＣによるＥＰＯ−ＥＢＰ複合体の化学量論の実例が示される。
図６、パネルＡ及びＢ．固定されたＥＢＰに対する平衡ＥＰＯ結合及び質量スペクトル分析が示される。
図７、パネルＡ及びＢ．天然のＥＰＯレセプターを結合した細胞への［125Ｉ］ＥＰＯ結合に対するＥＢＰの競合が示される。
図８、パネルＡ及びＢ．異なるペプチドリガンドにより二量化されたＥＢＰタンパク質の架橋が、非還元条件（パネルＡ）及び還元条件（パネルＢ）下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示される。
発明の詳細な説明
本発明は、微生物発酵からのエリトロポエチン結合タンパク質（ＥＢＰ）の精製方法に関する。また、本発明は、ＥＢＰ自体、並びに薬剤の設計及び発見技術におけるその使用にも関する。本発明のＥＢＰは、エリトロポエチンに結合し、細胞結合レセプターとの相互作用にエリトロポエチンを利用できなくするので、治療に役立つものとしても有用である。
本発明は、融合タンパク質の形態のＥＢＰにも関する。ＥＢＰを融合タンパク質として組み換え体宿主細胞で生産することができ、またはＥＢＰを組み換え体宿主細胞から単離し、精製し、次に別のタンパク質もしくはペプチドと化学的に反応させてＥＢＰとそのタンパク質もしくはペプチドの間に共有結合を形成することができる。ＥＢＰ融合タンパク質は、さらなるアミノ酸配列に共有結合したＥＢＰアミノ酸配列を含んでなる。さらなるアミノ酸配列は、ＥＢＰの検出、精製、定量、結合、抗原性またはあらゆる他の所望される機能のための手段を与えることができる。特に、さらなるアミノ酸配列が免疫グロブリンの重鎖またはその一部である融合タンパク質としてＥＢＰを生産することができる。本発明のＥＢＰ−Ｉｇは、ＥＢＰ及びＩｇＧ重鎖分子のヒンジ領域を含むＩｇＧ重鎖の一部のそのような組み換え体として生産される融合タンパク質である。本発明のＥＢＰ−Ｉｇも、エリトロポエチンに結合し、細胞結合レセプターとの相互作用にエリトロポエチンを利用できなくするので、治療に役立つものとして有用である。ＥＢＰ−Ｉｇは、擬似リガンドの設計、発見及び生成、リガンド結合のインヒビターの設計、発見及び生成、並びにリガンド結合のアゴニスト、アンタゴニスト及び他のモジュレーターの設計、発見及び生成を初めとするがこれらに限定されない、多種多様な薬剤発見技術において有用である。
本明細書に用いられるＥＢＰという用語は、膜固定ドメイン及び細胞質ドメインのかなりの部分を欠くが、リガンド結合ドメイン及びエリトロポエチンを結合する能力を保持するＥＰＯレセプターの型をいう。本明細書に用いられるＥＢＰ−Ｉｇという用語は、ヒンジ領域を含む免疫グロブリン重鎖、並びに膜固定ドメイン及び細胞質ドメインのかなりの部分を欠くが、リガンド結合ドメイン及びエリトロポエチンを結合する能力を保持するＥＰＯレセプターの型であるＥＢＰを含んでなる組み換え体として生産される融合タンパク質をいう。本明細書に用いられる擬似ＥＰＯという用語は、ＥＰＯレセプターに結合し、ＥＰＯレセプターが介在するシグナル変換の次の工程をもたらす化合物をいう。
本発明の方法は、一般的に微生物発酵を用いる使用のために適している。酵母を含む真菌細胞及び大腸菌を含むバクテリア細胞を初めとするがこれらに限定されない多種多様な微生物細胞が本発明の方法における使用のために好適であることは、当業者にとって容易に明らかである。好ましい微生物発酵は、単離され、精製されるＥＢＰまたはＥＢＰ融合タンパク質をコードしているプラスミドを保有する細胞のバクテリア発酵である。好ましいバクテリア発酵は、単離され、精製されるＥＢＰまたはＥＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌の発酵である。大腸菌発酵以外のバクテリア発酵が本発明における使用のために好適であることは、当業者にとって容易に明らかである。利用するバクテリアの生育のために適したあらゆる液体培地中で微生物発酵を増大することができる。
本発明の方法により単離され、精製されるＥＢＰまたはＥＢＰ融合タンパク質をあらゆる好適なＥＢＰをコードするＤＮＡ配列から発現することができる。ＥＢＰをコードするＤＮＡ配列は、ＥＰＯレセプターをコードするＤＮＡに由来することができ、これはそれ自体、ＥＰＯレセプターを発現する細胞系または細胞型に由来する。
レセプター−Ｉｇ融合分子は、２つのレセプターサブユニットを二量化することができる分子の発見及び記述のために特によく適していると思われる。可溶性レセプター内またはこれに結合したエピトープに対する抗体を用いることにより、レセプター−Ｉｇ融合分子を置換することができ、これは、２つの可溶性レセプター分子の密接な会合を可能にする。この目的のために、化学結合により、または組み換え体として融合タンパク質を生産することにより、エピトープを可溶性レセプターに結合することができる。多種多様なエピトープが使用に適しており、ポリヒスチジンエピトープ、赤血球凝集素、グルタチオン、及びマルトース結合タンパク質を含むが、これらに限定されない。また、これらの系に本来備わっている柔軟性により、多量化複合体の検出及び分析も可能である。これらの系は、エリトロポエチンレセプターの使用に限定されず、シグナル伝達カスケードにおいて同種及び異種のレセプターの二量化並びに多量化の両方の方式を用いるレセプターにおいて同様に有用であると患われる。異種の多量化の場合、２種以上の可溶性レセプターまたは可溶性レセプター−Ｉｇ融合分子の混合物を利用することができる。レセプター−Ｉｇ融合タンパク質を用いることの他の利点は、タンパク質の再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程を必要としない哺乳類細胞発現及び分泌、組み換え体宿主細胞からの融合タンパク質のアフィニティー精製、並びに利用できる免疫グロブリン重鎖の既知の機能及び構造特性を含むが、これらに限定されない。
細胞当たり高コピー数または細胞当たり低コピー数であることができる各種プラスミドにＥＢＰをコードするＤＮＡ配列またはＥＢＰ−ＩｇをコードするＤＮＡ配列を含むことができる。また、これらのプラスミドは、実質的にあらゆる大きさのものであることができる。組み換え体宿主細胞においてＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇの発現をもたらすＥＢＰコードＤＮＡ配列またはＥＢＰ−ＩｇコードＤＮＡ配列を含有する実質的にあらゆるプラスミドを本発明の方法に用いることができることは、当業者にとって容易に明らかである。
適当なプロモーター及び他の適切な転写調節要素を含んでいる発現ベクターに分子クローニングし、そして原核生物または真核生物の宿主細胞に導入して組み換え体タンパク質を生産することにより、本明細書に記述される方法により得られるクローン化されたＥＢＰコードＤＮＡ及びＥＢＰ−ＩｇコードＤＮＡを組み換え体として発現することができる。そのような操作のための技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）に完全に記述されており、当該技術分野においてよく知られている。
発現ベクターは、適切な宿主におけるクローン化された遺伝子のコピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列として本明細書で定義される。大腸菌を初めとするバクテリア、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を初めとする真菌細胞、及び動物細胞のような各種宿主において真核生物の遺伝子を発現するためにそのようなベクターを用いることができる。
特別に設計されたベクターは、バクテリア−酵母またはバクテリアー動物細胞またはバクテリア−真菌細胞またはバクテリア−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自己複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の潜在能力及び活性のあるプロモーターを含まなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、高頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。発現ベクターは、クローニングベクター、修飾したクローニングベクター、特別に設計したプラスミドまたはウイルスを含むことができるが、これらに限定されない。
バクテリア細胞において組み換え体のＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇを発現するために各種バクテリア発現ベクターを用いることができる。組み換え体ＥＢＰ発現のために好適である可能性がある市販されているバクテリア発現ベクターは、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ、ｐＴｒｃＨｉｓ及びｐＴｒｘＦｕｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＦＬＡＧベクター（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ｐＰROＥＸTM−１（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、ｐＫＫベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＰL−Ｌａｍｂｄａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びｐＣａｌベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含むがこれらに限定されない。
酵母のような真菌細胞において組み換え体のＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇを発現するために各種真菌細胞発現ベクターを用いることができる。組み換え体のＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇ発現のために好適である可能性がある市販されている真菌細胞発現ベクターは、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＹＥＵｒａ３（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を含むが、これらに限定されない。
昆虫細胞において組み換え体のＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇを発現するために各種昆虫細胞発現ベクターを用いることができる。ＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇの組み換え体発現のために好適である可能性がある市販されている昆虫細胞発現ベクターは、ｐＢｌｕｅＢａｃII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、ｐＢａｃＰＡＫベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）及びｐＡｃベクター（ＰHARＭINGEN）を含むが、これらに限定されない。
哺乳類細胞において組み換え体のＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇを発現するために各種哺乳類発現ベクターを用いることができる。組み換え体のＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇ発現のために好適である可能性がある市販されている哺乳類発現ベクターは、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣｌｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）、１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）及びｐＥｅ１２（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）を含むが、これらに限定されない。発現のために好適である可能性があり、市販されている哺乳類種由来の細胞系は、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）及びＮＳ０（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）を含むが、これらに限定されない。
組み換え体宿主細胞における発現のためにＥＢＰまたはＥＢＰ−ＩｇをコードするＤＮＡを発現ベクターにクローン化することができる。組み換え体宿主細胞は、大腸菌のようなバクテリア、酵母のような真菌細胞、ショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系を含むがこれらに限定されない昆虫細胞、並びに哺乳類細胞及び細胞系を初めとするがこれらに限定されない、原核生物または真核生物のものであってもよい。
形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション及びエレクトロポレーションを初めとするがこれらに限定されない多数の技術のいずれによっても、発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを保有している細胞をクローンとして増殖し、ＥＢＰタンパク質を生産するかどうかを決定するために個々に分析する。ＥＢＰを発現する宿主細胞クローンの同定は、抗−ＥＢＰでの免疫学的反応性及び宿主細胞に付随するＥＢＰ活性の存在を初めとするがこれらに限定されない、いくつかの方法により実施することができる。同様に、ＥＢＰ融合タンパク質を発現する宿主細胞クローンの同定は、抗−ＥＢＰ抗体での免疫学的反応性及び宿主細胞に付随するＥＢＰ活性の存在、並びに融合タンパク質の非ＥＢＰ部分に特異的な抗体での免疫学的反応性、及び融合タンパク質の非ＥＢＰ部分の宿主細胞に付随する他の活性を初めとするがこれらに限定されない、いくつかの方法により実施することができる。
遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために１種以上のコドンを用いることができ、従って、一組の類似したＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによってもアミノ酸配列をコードすることができる。この組の一つのメンバーだけがＥＢＰ配列と同一であるが、これは、適切な条件下で、ミスマッチを含んだＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえＥＢＰ ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。別の条件下で、ミスマッチのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＥＢＰ ＤＮＡになおハイブリダイズすることができ、ＥＢＰをコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にする。
特定のアミノ酸をコードする各種コドンにかなりの量の重複があることが知られている。それ故、本発明は、同じアミノ酸の最終的な翻訳をコードする別のコドンを含むＥＢＰコードＤＮＡ配列にも関する。本明細書の目的のために、１個以上の置換されたコドンを保有する配列は、縮重変異体として定義される。また、本発明の範囲内に含まれるものは、発現されるタンパク質の根本的な物理特性を実質的に変えないＤＮＡ配列または翻訳タンパク質のいずれかの突然変異である。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リシンの代わりにアルギニン、またはグルタミンの代わりにアスパラギンの置換は、ポリペプチドの機能に変化を生じない可能性がある。さらに、当該技術分野でよく知られている技術を用いる部位特異的突然変異生成による天然に存在するグリコシル化部位の改変は、特定の部位でもはやグリコシル化されないタンパク質の生産をもたらすことができる。そのように修飾されたＥＢＰが本発明の範囲内のＥＢＰ変異体であることは、当業者にとって容易に明らかである。
天然に存在するペプチドの特性と異なる特性を有するペプチドをコードするように、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変することができることは知られている。ＤＮＡ配列を改変する方法は、部位特異的突然変異生成を含むが、これに制限されない。改変される特性の例は、基質に対する酵素またはリガンドに対するレセプターの親和性の変化を含むがこれらに限定されない。
本明細書に用いられる場合、ＥＢＰの「機能的誘導体」は、ＥＰＯ結合のＥＢＰ生物学的活性に実質的に類似した（機能または構造のいずれかの）生物学的活性を保有するタンパク質である。「機能的誘導体」という用語は、ＥＢＰの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「同族体」を含む、または「化学的誘導体」と考えられる。「フラグメント」という用語は、ＥＢＰのあらゆるポリペプチドサブセットをさすことを意味する。「変異体」という用語は、全ＥＢＰ分子またはそのフラグメントのいずれかに構造及び機能において実質的に類似した分子をさすことを意味する。両方の分子が実質的に類似した構造を有する場合、または両方の分子が類似した生物学的活性を有する場合、分子はＥＢＰに「実質的に類似する」。従って、２つの分子が実質的に類似した活性を有する場合、これらの分子の片方の構造がもう片方に見いだされない場合でさえ、またはこれら２つのアミノ酸配列が同一でない場合でさえ、これらは変異体であるとみなされる。「類似体」という用語は、全ＥＢＰ分子またはそのフラグメントのいずれかに機能において実質的に類似した分子をいう。
本明細書に用いられる場合、ＥＢＰ−Ｉｇの「機能的誘導体」は、ＥＰＯ結合というＥＢＰ−Ｉｇの生物学的活性に実質的に類似した（機能または構造のいずれかの）生物学的活性、及びＥＢＰリガンドが結合した時に二量体を形成する能力を保有するタンパク質である。「機能的誘導体」という用語は、ＥＢＰ−Ｉｇの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「同族体」を含む、または「化学的誘導体」と考えられる。「フラグメント」という用語は、ＥＢＰ−Ｉｇのあらゆるポリペプチドサブセットをさすことを意味する。「変異体」という用語は、全ＥＢＰ−Ｉｇ分子またはそのフラグメントのいずれかに構造及び機能において実質的に類似した分子をさすことを意味する。両方の分子が実質的に類似した構造を有する場合、または両方の分子が類似した生物学的活性を有する場合、分子はＥＢＰ−Ｉｇに「実質的に類似する」。従って、２つの分子が実質的に類似した活性を有する場合、これらの分子の片方の構造がもう片方に見いだされない場合でさえ、またはこれら２つのアミノ酸配列が同一でない場合でさえ、これらは変異体であるとみなされる。「類似体」という用語は、全ＥＢＰ−Ｉｇ分子またはそのフラグメントのいずれかに機能において実質的に類似した分子をいう。
本発明のＥＢＰ及びＥＢＰ−Ｉｇは、擬似リガンドの設計、発見及び生成、リガンド結合のインヒビターの設計、発見及び生成、リガンド結合のアゴニスト、アンタゴニスト及び他のモジュレーターの設計、発見及び生成、並びにＥＢＰ−リガンド相互作用部位の正確な特性化を可能にする結晶構造の生成を初めとするがこれらに限定されない、多種多様な薬剤発見技術において有用である。擬似ＥＰＯである化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質の有機分子であってもよい。本発明は、擬似ＥＰＯ及びインビボでＥＰＯのレセプターへの結合を調節する他の化合物を設計し、同定するための方法にも関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質の有機分子であってもよい。ＥＰＯレセプターをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはＥＰＯレセプタータンパク質の機能を高めるまたは減じることにより、化合物は調節することができる。各種アッセイにより、ＥＰＯレセプターをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはＥＰＯレセプタータンパク質の機能を調節する化合物を検出することができる。アッセイは、発現または機能に変化があるかどうかを測定するための簡単な「イエス／ノー」アッセイであってもよい。試験試料の発現または機能を標準試料の発現または機能のレベルと比較することにより、アッセイを定量的に実施してもよい。この方法により同定されるモジュレーターは、治療薬として有用である。
ＥＰＯレセプターに結合し、これを活性化する分子または化合物（擬似ＥＰＯ）を同定するための本発明の方法は、そのような活性を有する分子の設計、発見、検出及び特性化のために前以て形成された二量化鋳型を利用する。本明細書に用いられる前以て形成された二量化鋳型という用語は、十分に物理的に接近して拘束される２個以上の同種または異種の潜在的な結合ドメインを有する溶液中に存在する分子をいう。一般的に、レセプター−Ｉｇ融合分子の使用はそのような鋳型をもたらし、与えられた分子または化合物の非生産的及び生産的二量化複合体を生じる能力に関する情報を与える。生産的レセプター二量化複合体は、通例、シグナル変換及びそれに続く細胞の反応を引き出すことができる分子構造を有し、一方、非生産的レセプター二量化は、通例、シグナル変換及びその結果の次の細胞の反応を促進する特定のレセプター構造を欠いたレセプターの二量化をもたらす。レセプター−Ｉｇ融合物は、一般的に、組み換え技術により生産される、免疫グロブリン重鎖の一部に融合した与えられたレセプターの特定のリガンド結合ドメインに相当し、これは、次に自己結合して２つのレセプターリガンド結合ドメインを有する分子を生じる。ＥＢＰ−Ｉｇは、そのようなレセプター−Ｉｇ融合物の一つであり、生産的または非生産的ＥＰＯレセプター二量化を生じることができる分子及び化合物を同定するための有用な前以て形成された二量化鋳型である。生産的ＥＰＯレセプター二量化を生じる分子及び化合物は擬似ＥＰＯである可能性があり、一方、非生産的ＥＰＯレセプター二量化を生じる分子及び化合物はＥＰＯレセプターアンタゴニストである可能性がある。生産的ＥＰＯレセプター二量化複合体は、シグナル変換及び細胞増殖を引き出すことができる分子構造を有し、一方、非生産的レセプター二量化は、シグナル変換及びその結果の増殖を促進する特定のレセプター構造を欠いたレセプター二量化をもたらす。
製薬学的に受容しうる担体の混合によるような既知の方法に従って、ＥＢＰ、ＥＢＰのモジュレーター、ＥＢＰ−ＩＧのモジュレーター及び／またはＥＰＯレセプター活性のモジュレーターを含有する製薬学的に有用な組成物を調合することができる。そのような調合の担体及び方法の例は、Ｒｅｍｉｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見いだすことができる。有効な投与のために適した製薬学的に受容しうる組成物を形成するために、そのような組成物は、有効量のペプチドもしくはタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはモジュレーターを含む。
組み換え体宿主細胞におけるＥＢＰの発現の後に、ＥＢＰを回収して活性型のＥＢＰを生じることができる。ＥＢＰ発現プラスミドを保有している微生物細胞を発酵培地から集めて細胞ペーストまたはスラリーを生じる。遠心分離またはミクロ濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を初めとするがこれらに限定されない、液体培地から細胞を集めるためのあらゆる常法が適している。
集めた細胞を好適な溶解バッファーで溶解する。遠心分離またはミクロ濾過のような当該技術分野で知られている常法により、不溶性タンパク質を可溶性タンパク質から分離する。ＥＢＰは、細胞ライセートの可溶性及び不溶性タンパク質画分のいずれかまたは両方に存在する可能性がある。
以下に記述する系において生産されるＥＢＰは、不溶性タンパク質として蓄積し、次にこれを回収し、再生してこのタンパク質の活性型を得る。本発明は不溶性のＥＢＰタンパク質に限定されず、組み換え体宿主細胞において生産される可溶性のタンパク質も本発明の使用に適していることは、当業者にとって容易に明らかである。また、多種多様な発現ベクター及び宿主細胞を本発明で用いることができること、及び発現されるＥＢＰをシグナル配列を含むまたはこれを欠くように作製することができることも、当業者にとって容易に明らかである。さらに、シグナル配列を含む及び含まないＥＢＰを含んでなる発現されたＥＢＰの混合物からＥＢＰを精製するために本発明の精製方法を用いることができる。
不溶性タンパク質画分を集め、適当な可溶化バッファーで可溶化する。可溶化したタンパク質を上記のように再び不溶性タンパク質から分離し、可溶性ＥＢＰタンパク質画分を集める。当該技術分野で知られている常法により、適当な再生バッファー中で適当な時間の間インキュベーションすることにより、可溶化したタンパク質を巻き戻す。次に、巻き戻ったタンパク質を適当な疎水性相互作用クロマトグラフィー基質を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーに供する。適当な疎水性相互作用クロマトグラフィー基質の例は、オクチル−セファロース、ブチル−セファロース、フェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のようなアルキルもしくは芳香族置換のシリカもしくはポリマーに基づく樹脂；エチル−、プロピル−、ブチル−、フェニル−、ヘキシル−、オクチル、デシル−、ドデシル−、フェニルブチルアミン−もしくはフェニル置換ビーズ製アガロース（Ｓｕｐｌｅｃｏ）；またはフェニルもしくはブチルトヨパールを含むがこれらに限定されず、フェニル−トヨパール６５０Ｍが好ましい。適当な溶出バッファーを用いてタンパク質を疎水性相互作用カラムから溶出する。本明細書に記述される方法により測定される活性型ＥＢＰを含んでいる画分を集める。活性型ＥＢＰは、カラムから溶出される最初の主要なタンパク質ピークに主に見いだされる。活性型ＥＢＰを含んでいるカラム画分を集め、適当な高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）基質を用いるＨＰ−ＳＥＣに供する。適当なＨＰ−ＳＥＣ基質は、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）及びセファデックス型樹脂（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓｉｚｅｄ  Ｒｅｓｉｎｓ）を初めとする多孔性シリカ及びポリマーゲル濾過媒質；トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＨＷ、プロゲル（Ｐｒｏｇｅｌ）ＴＳＫ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を含むがこれらに限定されず、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ−２５０（ＢｉｏＲａｄ）またはＴｏｓｏＨａａｓ Ｇ３０００ＳＷが好ましい。ＥＢＰ活性を含むＨＰ−ＳＥＣカラムの画分を集め、これは、ＥＰＯを結合する非常に純粋なＥＢＰに相当する。この非常に純粋なＥＢＰは、本明細書に記述される用途のために適している。ＥＢＰの純度のレベルを変えることにより、本明細書に記述される用途のために適する可能性のあるＥＢＰが生じることは、当業者にとって容易に明らかである。
再生混合物からのＥＢＰの最初の回収は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて実施してもよい。好適なバッファー中の増加する塩濃度勾配を用いると、２つの主要なタンパク質の吸収ピークの溶出をもたらし、最初の主要なピークが、活性型ＥＢＰを含んでいる。好適な陰イオン交換媒質は、ＴＳＫ−５ｗ−ＤＥＡＥ、ＤＥＡＥセファロース、ＱＡＥセファロースまたはＤＥＡＥセファロースを初めとするＤＥＡＥまたはＱＡＥの機能的修飾を有する置換されたポリマーまたは非多孔性樹脂を含むがこれらに限定されず、ＤＥＡＥセファロースファーストフロー（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ）が好ましい。このようにして回収された活性型ＥＢＰを高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＦＣ）によりさらに精製することができる。
本明細書に記述される方法を用いる大腸菌で生産されたＥＢＰの再生は、持続するが、一時的なタンパク質再生中間体を同定し、これは、結局、活性型タンパク質に戻る。２４時間の再生混合物から精製される活性タンパク質は、リガンド結合測定において７日間再生されたものと同一であるようであり、これは、再生の期間に関係なく、タンパク質の単一の活性型のみがこれらの方法により精製されたという結論を支持する。ＨＰ−ＳＦＣ試験により、この中間体は、活性型のタンパク質の約二倍の質量のタンパク質に相当する保持時間を有し、活性型のタンパク質より大きい液体力学容量を有すると思われることが示されている。これは、二量体の再生中間体またはタンパク質の２つの予想されるドメインの片方のみが再生されて増加した液体力学容量をもたらしている中間体の関与を示すことができる。
本明細書に記述される可溶性リガンド結合ドメインは、ＥＰＯ反応性細胞系を投与量に依存して中和することにより検出されるように、ＥＰＯの増殖特性を中和する。本発明のＥＢＰ及びＥＢＰ−Ｉｇのような、ＥＰＯを中和する能力を有する分子は、赤白血病及び多血症のようなＥＰＯ反応性増殖性疾患の治療における用途を有する可能性がある。また、インビボでＥＰＯを中和するためにＥＢＰを用いることもできる。さらに、本発明のＥＢＰ−Ｉｇは、この分子の免疫グロブリン重鎖部分から生じる向上した薬理学的特性を有する可能性がある。
本発明の方法及び生成物により、薬剤の設計及び発見、治療に役立つものとして、そしてＮＭＲ及び結晶学による構造研究のためを含むがこれらに限定されない、各種の用途に適する可能性のある活性型の非グリコシル化ＥＢＰを生成できる。バクテリアにおけるタンパク質の生産は、異核ＮＭＲ試験のために必要である安定な炭素及び窒素アイソトープを容易に取り込むことができ、哺乳類細胞培養により生産される場合にタンパク質のグリコシル化により生じる異質性の潜在的複雑化要因を制限する。特に、本発明のＥＢＰの精製方法により、結晶増殖のために好適な純度であり、それにより結晶学研究を可能にするタンパク質が生成される。
本発明のＥＢＰ−Ｉｇを生成するために、ヒトエリトロポエチンレセプター（ＥＢＰ）のＮ末端の２２５アミノ酸をＩｇＧ１ヒト免疫グロブリン重鎖の一部に融合した。免疫グロブリン重鎖の部分は、重鎖のヒンジ領域を保持し、前以て形成された二量化鋳型であるＥＢＰ−Ｉｇ分子を生じる。免疫グロブリン重鎖の部分は、別の重鎖分子と共有結合のジスルフィド結合を形成する能力を保持しているので、ＥＢＰ−Ｉｇと称するこの分子は前以て形成された二量化鋳型であり、この場合、２つのＥＢＰ−Ｉｇ分子は、２つの免疫グロブリン重鎖分子のようにジスルフィド結合を介して共有結合的に二量化されるようになることができる。
本発明のＥＢＰ−Ｉｇは、ＥＢＰをコードするＤＮＡ及び免疫グロブリン重鎖分子の所望する部分をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドの構築により組み換え体として生産される。本発明のＥＢＰ−Ｉｇは、ＩｇＧ１クラスの免疫グロブリンの重鎖を利用するが、ＥＢＰ−Ｉｇの機能的同等物であるタンパク質を生成するために、他のクラスの免疫グロブリンの重鎖も本発明の方法における使用のために適していることは、当業者にとって容易に明らかである。本発明の方法における使用のために好適である他の免疫グロブリン重鎖分子は、免疫グロブリンＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥに由来する重鎖を含むが、これらに限定されない。
発現プラスミドを発現のために組み換え体宿主細胞に導入し、組み換え体として生産される生物学的に活性のあるタンパク質を宿主細胞から回収する。本発明のＥＢＰ−Ｉｇの発現のために各種発現プラスミドが好適であることは、当業者にとって容易に明らかである。ＥＢＰ−Ｉｇの好ましい発現プラスミドはｐＳＧ５及びｐＥｅ１２を含むが、これらに限定されない。
また、本発明のＥＢＰ−Ｉｇの発現のために各種宿主細胞が好適であることも、当業者にとって容易に明らかである。好ましい宿主細胞は、生物学的に活性のある組み換え体抗体分子またはそれらの一部を生産することができる細胞である。最も好ましい宿主細胞は哺乳類細胞であり、最も好ましい哺乳類細胞は、ＮＳ０細胞である。ＮＳ０細胞は、生物学的に活性のある組み換え体抗体分子を生産するそれらの能力が既知であるので、最も好ましい細胞である。さらに、ＮＳ０細胞は、免疫グロブリンの軽鎖を生産しない。他の哺乳類細胞が、本発明における使用のために好適であり、ＮＳ０、ＣＯＳ及びＣＨＣ細胞を含むがこれらに限定されないことは、当業者にとって容易に明らかである。
組み換え体宿主細胞により生産されるＥＢＰ−Ｉｇは、宿主細胞から、または宿主細胞によりＥＢＰ−Ｉｇが分泌された培養培地から精製される。本明細書に開示される薬剤発見方法における使用のために十分な純度のＥＢＰ−Ｉｇを得るために、多種多様な精製方法を利用することができる。組み換え体宿主細胞におけるＥＢＰ−Ｉｇの発現の後、ＥＢＰ−Ｉｇタンパク質を回収して活性型のＥＢＰ−Ｉｇを得ることができる。いくつかのＥＢＰ−Ｉｇの精製方法が利用でき、使用のために好適であり、ＥＢＰに対して本明細書に記述される精製方法を含む。組み換え体の供給源からＥＢＰを精製するために上に記述したように、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの各種組み合わせまたは個々の適用により、細胞ライセート及び抽出物から、またはコンディションド培養メディウムから組み換え体ＥＢＰ−Ｉｇを精製することができる。好ましい方法は、アフィニティークロマトグラフィーを用いることであり、プロテインＧ及びプロテインＡ／Ｇが最も好ましい。分子の免疫グロブリン重鎖部分のプロテインＧ及びプロテインＡ／Ｇに対する親和性のために、プロテインＧまたはプロテインＡ／Ｇが有用である。プロテインＡは有用であるが、ＥＢＰ−Ｉｇに対して、より低い容量を有することが見いだされた。
さらに、ＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇの免疫グロブリン重鎖部分に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて作製された免疫アフィニティーカラムの使用により、組み換え体のＥＢＰまたはＥＢＰ−Ｉｇを他の細胞タンパク質から分離することができる。
以下の実施例は、本発明を具体的に例示するために与えられるが、しかしながら、これらに本発明を限定しない。
実施例１
ＥＢＰバクテリア発現ベクターの構築
細胞周辺腔に発現を導くために、重複伸長ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ、Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｎｔ、Ｈ．Ｄ．、Ｈｏ、Ｓ．Ｎ．、Ｐｕｌｌｅｈ、Ｊ．Ｋ．、及びＰｅａｓｅ、Ｌ．Ｒ．（１９８９）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｇｅｎｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、Ｇｅｎｅ  ７７、６１−６８）により、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ、Ｓ−Ｐ．、Ｌｉｎ、Ｈ−Ｃ．、Ｗａｎｇ、Ｓ．Ｓ．、Ｃａｌｌａｗａｙ、Ｊ．、及びＷｉｌｃｏｘ、Ｇ．（１９８７）、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｒｗｉｎａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｐｅｌＢ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１６４、４３７９−１２；Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｈ．、Ｄｕｎｎ、Ｊ．Ｊ．、及びＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆ、Ｊ．Ｗ．（１９９０）Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９）を成熟ｈＥＰＯＲ（Ｊｏｎｅｓ、Ｓ．Ｓ．、Ｄ’Ａｎｄｒｅａ、Ａ．Ｄ．、Ｈａｉｎｅｓ、Ｌ．Ｌ．及びＷｏｎｇ、Ｇ．Ｇ．（１９９０）、Ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｂｌｏｏｄ  ７６、３１−３５）のＮ末端に融合した。２つの別個のＤＮＡフラグメント、ｐｅｌＢシグナル配列をコードするものと成熟ｈＥＰＯＲの細胞外ドメインのアミノ酸１−２２５をコードするものをＰＣＲにより作製した。ｐｅｌＢ ＰＣＲフラグメントの末端の１６ヌクレオチドをＥＢＰ ＰＣＲフラグメントの最初の１６ヌクレオチドと同一であるように設計し、その結果、これら２つのフラグメントを重複伸長ＰＣＲの鋳型として用いることができた。次のバクテリア発現プラスミドへのクローニングのために、重複伸長ＰＣＲに用いる５’及び３’のプライマーをそれぞれＮｄｅ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ制限部位を導入するように設計した。さらに、３’プライマーは、成熟ｈＥＰＯＲのアミノ酸２２６の代わりに終始コドンを導入した。ｐｅｌＢ−ＥＢＰ ＰＣＲフラグメントをＴ７プロモーター発現ベクターｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｄｅ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ部位に連結し、ＤＮＡシークエンシグによりその配列を確かめた。
バクテリア発現のために、ＩＰＴＧ誘導性のｌａｃプロモーターの制御下で染色体上にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを保有している大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｈ．、Ｄｕｎｎ、Ｊ．Ｊ．、及びＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆ、Ｊ．Ｗ．（１９９０）Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９）にｐＳＡＭ３と称する得られた構築物（図１）を形質転換した。ＥＢＰは、ｌａｃオペレーターの調節下のＴ７プロモーターから発現される。ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）及びアンピシリン耐性（ｂｌａ）をコードする遺伝子もプラスミドに存在する。典型的には、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＭ９ＺＢ培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．等、（１９９０）上記）で０．６ないし０．９のＯＤ600まで培養物を生育し、その時点で１ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導した。さらに２ないし３時間インキュベーション後、本明細書に記述されるように、細胞を集め、ＥＢＰを単離し、精製した。
発酵
プラスミドｐＳＡＭ３で形質転換した親の大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．等（１９９０）上記）（ＳＭ４と称する）をＯＤ600＝１．０培養物の８％グリセロールストック溶液としてＭ９ＺＢ ａｍｐ／ｃａｐ培地（リットル当たりのＭ９ＺＢ ａｍｐ／ｃａｐ培地：１０ｇ Ｎ−Ｚ−Ａｍｉｎｅ Ａ、１００ｍｌ １０ Ｘ Ｍ９最少塩類（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｓａｌｔｓ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）、５ｇ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、２％ Ｄ−グルコース、１００ｍｇ アンピシリン及び２５ｍｇクロラムフェニコール）中で維持した。高密度発酵を１０リットルの撹拌リットルタンクを備えたＣＦ−３０００ファーメンター（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）（Ｃｈｅｍａｐ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）で実施した。（リットル当たり）２０ｇ Ｎ−Ｚ−アミン Ａ、５ｇ ＮａＣｌ、１０ｇ Ｍ９最小塩類、０．１２ｇ ＭｇＳＯ4、０．２ｇグルコース、１００ｍｇ アンピシリン及び２５ｍｇクロラムフェニコールを含有する濃縮Ｍ９ＺＢ培地を調製し、０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉ−Ｐａｋ ４０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）装置を通して濾過し、ファーメンターにポンプで入れた。ｐＨ６．８で３７℃及び２０％溶存酸素で培地を平衡化した後、５０ｍｌの形質転換された大腸菌のグリセロールストック（上記参照）をファーメンターに接種した。誘導前に、グルコースの供給（１リットルの濃縮Ｍ９ＺＢ培地に対して４００ｇのグルコース）によりｐＨを維持した。２５．０のＯＤ600値が得られた時に、１ｍＭの最終濃度にＩＰＴＧを添加することによりタンパク質の過剰発現を誘導し、ＨＣｌの添加によりｐＨを６．１に下げた。誘導期を一晩続けた。集菌時に、ＯＤ600値は３６であり、４４５ｇの細胞ペーストが遠心分離により回収された。６．１の最終ｐＨは、倍加時間を非常に遅らせ、細胞増殖速度を制限するために必要な最終ｐＨは、正確なｐＨの制御及び厳密な調製により決まる。
構築された発現ベクターは、成熟ヒトエリトロポエチンレセプターの最初の２２５のＮ末端残基をコードし、ｐｅｌＢシグナル配列を含み、これは、発現タンパク質を大腸菌の細胞周辺腔へ導いて可溶性の正しく再生されたＥＢＰを生じると予想された。可溶性の細胞周辺腔タンパク質調製物及び生育培地のウェスタンブロット分析は、誘導後にこれらの調製物中に存在する低いレベルのタンパク質を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された培養物の煮沸抽出物は、ＩＰＴＧでの誘導を除いて同一条件下で生育した培養物には存在しない、誘導された培養物に存在する２種類の強いタンパク質バンドを示した。小さい方の種類の見かけの分子量は２７ｋＤａと概算され、一方、ゆっくり移動する方の種類は、約１．５ｋＤａ大きいようであった。分析規模での不溶性タンパク質の回収は、主にこれら２種類であると思われるタンパク質の調製物をもたらした。可溶化、再生及びＰＢＳへのバッファー交換後、このタンパク質のＮ末端配列分析は、２種類のタンパク質配列、ＥＰＯレセプターの成熟Ｎ末端配列に予想される最初の６アミノ酸に相当するもの、及びＮ末端のｐｅｌＢシグナル配列の最初の６アミノ酸を構成するもう一つのものを示した。これらのデータは一緒になって、この発現系が、両方とも不溶性でおそらく封入体に位置する２種類のタンパク質型、正しくプロセシングされたアミノ末端を有するＥＢＰに相当するものとコードしたｐｅｌＢシグナル配列を保持するものの生産をもたらすことを示す。ｐｅｌＢシグナル配列を欠いたプラスミドｐＳＡＭ３の変種は、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいてＥＳＰを発現しなかったので、シグナル配列は、この発現系におけるＥＢＰの生産のために必要であると思われる。ＥＢＰの高レベル生産のためにシグナル配列の存在を必要としない他のプラスミド構築物または他の大腸菌株を構築することができる。ｏｍｐＴシグナル配列を用いた別の構築物も、かなりの量の過剰発現された不溶性ＥＢＰを生成することが見られている。
シグナル配列が「付いた」及びシグナル配列が「はずれた」ＥＢＰの型の配分を変えるさらなる発酵を実施した。最初の制御された発酵試験は、より低い最終ｐＨを有するより多量のプロセシングされたＥＢＰを含む誘導培養物を明らかにした。続いて、完全にプロセシングされたＥＢＰの生産のための実験プロトコルを開発した。最終的な発酵方法は、注意深く制御された酸素レベル及びタンパク質発現の誘導時の培養物の調節されたｐＨの減少を特徴とする。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の際に約２７ｋＤａのみかけの分子量を有するタンパク質種の発現をもたらす（図２、パネルＡ、レーンＢ対レーンＣ）。パネルＡ（還元）試料は以下の通りであった：Ａ．Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＭＷＭ；Ｂ．誘導前；Ｃ．誘導後；Ｄ．再生混合物；Ｅ．ＨＩＣプール；Ｆ．ＨＰ−ＳＥＣプール（２．５μｇ）；Ｇ．ＨＰ−ＳＥＣプール（５μｇ）。パネルＢ（非還元）試料は以下の通りであった：Ａ．Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＭＷＭ；Ｂ．再生混合物；Ｃ．ＨＩＣプール；Ｄ．ＨＰ−ＳＥＣプール（２．５μｇ）；Ｅ．ＨＰ−ＳＥＣプール（５μｇ）。
上記のような「シグナル配列が付いた」及び「シグナル配列がプロセシングされた」物質の混合物として生じるＥＢＰを得るために、厳密性のより低い制御下での発酵を用いてもよい。これらの発酵から得られる不溶性ＥＢＰも、本明細書に記述される方法により再生、精製し、正しくプロセシングされたアミノ末端を有する活性型タンパク質を生じることができる。この再生及び精製は、プロセシングされていないシグナル配列を保持するタンパク質型の分離をもたらす。
実施例２
タンパク質の回収及びタンパク質の再生
不溶性タンパク質の高レベル発現が得られると、活性型タンパク質を得るための封入体の回収及び再生のための条件を探求した。組み換え体タンパク質の再生において考慮される多数の因子に基づいて条件を開発した［Ｍａｒｓｔｏｎ、Ｆ．Ａ．Ｏ．（１９８６）Ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２４０、１−１２；Ｌｉｇｈｔ、Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３、２９８−３０６；Ｓｃｈｅｉｎ、Ｃ．Ｈ．（１９９０）Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８、３０８−３１７］。封入体の回収のためには遠心分離が適切であることが分かり、この封入体は、３．５Ｍの濃度の尿素で最も望ましく可溶化されることが見いだされた。この濃度の尿素は、ＥＢＰの＞９０％を効果的に可溶化したが、不溶性画分のいくつかの混入タンパク質を残した。再生の条件に関する初期の実験は、この工程の後に高速−サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）を続けることができることを示唆した。ＨＰ−ＳＥＣの使用は、タンパク質の再生の経路が、正しく再生された活性生成物または様々な型のタンパク質凝集体のいずれかに向かって進む場合、分子の容積に基づいて区別する分析技術の使用が、再生プロトコールだけの効率を予想するはずであるという考えに基づいた。それ故、タンパク質の再生過程をＷａｔｅｒｓ ９９１検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ６２５ ＨＰＬＣシステムで高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定した。同様な分離を与えるＢｉｏＳｉｌ ＳＥＣ−２５０（７．８ ｘ ３００ｍｍ）（ＢｉｏＲａｄ）カラムまたはＧ−３０００ ＳＷＸＬ（７．８ ｘ ３００ｍｍ）カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｆｏｎｔｅ、ＰＡ）で周囲温度で分離を実施した。分析カラムを１ｍｌ／分の流速で１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌに平衡化し、２２０ｎｍで測定した。１０μｇの精製した組み換え体ヒトＥＰＯ（１．７ｍｇ／ｍｌ、比活性１２０ユニット／μｇ）を大量再生溶液の１００μｌアリコートへ添加し、これに続くＨＰ−ＳＥＣ分析により、ピーク移動分析で活性型のタンパク質を検出した。次に、このクロマトグラムをＥＰＯの非存在下で実施した大量再生溶液混合物の１００μｌアリコートのクロマトグラフィー分離と比較した。
上記の制御された発酵からの細胞ペーストの一部（７４．３ｇ）を５１ｍｇのフッ化フェニルメチルスルホニル、６００ｍｇの卵白リゾチーム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2及び１２，５００ユニットのベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有し、全体でＥＢＰ溶解バッファーと称する０．３１のＥＢＰ溶解バッファー（１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解した。この混合物を時々撹拌しながら室温で１．５時間インキュベートした。得られたライセートを１２，０００ ｘ ｇで４℃で１５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、０．３ｌのＴＥバッファー（ＴＥバッファー：１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ＮＰ−４０［タンパク質グレード、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ］）の添加後に、１分破砕の超音波処理の適用により分散させた。得られた懸濁液を８，０００ ｘ ｇで４℃で１５分間遠心分離した。上清を捨て、不溶性タンパク質を０．３ｌの水で洗浄した。ペレットを超音波処理（２０秒）により再懸濁した。不溶性タンパク質を遠心分離（１２，０００ ｘ ｇ、１５分、４℃）により回収した。回収されたタンパク質の湿重量は、洗浄上清をデカントした後で約３．５ｇであった。
不溶性タンパク質ペレットをタンパク質のグラム当たり９ｍｌの可溶化バッファーに再懸濁し（可溶化バッファー：０．１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．５、３．５Ｍ尿素、１０ｍＭリシン、１０ｍＭジチオトレイトール）、１２，０００ ｘ ｇで４℃で１５分間遠心分離した。尿素中におそらく存在するアミン反応性シアン酸塩のスカベンジャーとして作用するためにリシンを添加した［Ｍａｒｓｔｏｎ、Ｆ．Ａ．Ｏ．及びＨａｒｔｌｅｙ、Ｄ．Ｌ．（１９９０）Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２、２６４−２７６］。この時点で、都合のよい停止点として回収された上清を４℃で一晩インキュベートすることができ、または再生工程に続けることができる。可溶化されたタンパク質のＯＤ280を可溶化バッファーに対して測定し（２１．７Ａ．Ｕ．／ｍｌ）、３０ｍｌの可溶化タンパク質を再生バッファー（再生バッファー：０．０５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．５、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭリシン、２ｍＭ還元グルタチオン、０．２ｍＭ  酸化グルタチオン）で１０２０ｍｌに希釈し、４℃で保存した。再生混合物の最終ＯＤ280は、０．６４であった。
再生混合物を用いた２種類のＨＰ−ＳＥＣ実験、リガンドを添加するもの及び添加しないものを実施することにより、リガン結合活性の定性評価が可能であった（図３）。不溶性ＥＢＰを本明細書に記述されるように可溶化し、４℃で６日間インキュベートした（図３、パネルＡ及びＢ）。図３、パネルＡに示されるように、再生混合物のみを分析ＳＥＣカラムに注入した場合、吸収のピークは約９．５分で見られ、これは、約２５，０００ダルトンの標準検量分子量に相当する。この値は、ＥＢＰの予想される２４，７２４の分子量とよく一致する。この混合物に８．５μｇのＥＰＯを添加し、続いてクロマトグラフィーで分離すると、ＥＰＯ−ＥＢＰ複合体のピークが約８．１分で、そしてＥＰＯのピークが約８．５分で検出された（図３、パネルＢ、図３、パネルＡに示された実験に重ねた）。約９．５分の吸収ピークはほとんど完全になくなり、これは、ＥＰＯと相互作用してより大きいみかけの溶液相分子量を有する種を生じることができるＥＢＰ型の存在を示している。９．５分のピークのみがＥＰＯと相互作用するようであり、これは、単一の活性型種を示している。１０分より後に溶出するピークは、３，０００ダルトン未満の分子量に対応した。図３、パネルＣは、９．５分の溶出時間のピーク（ピーク２）により明白に示されるように、３．５Ｍ尿素変性剤溶液を０．１Ｍ尿素に希釈したすぐ後に、かなりの量の正しく再生されたタンパク質が見られることを示す。４℃で２４時間のインキュベーション後、図３、パネルＤに示されるように、９．５分（ピーク２）の活性タンパク質型及び８．２分（ピーク１）で溶出する種の両方で増加がみられた。これらの型の出現は、６−８分の保持時間を有するより高分子量のタンパク質型から、そして再生混合物中の不溶性タンパク質からであるようである。図３、パネルＡに示されるように、８．２分のタンパク質型は徐々に減少し、吸収は、活性タンパク質ピークに現れる。これらの実験は、再生混合物のアリコートにＥＰＯを添加した際に、Ｍr＝２５，０００のタンパク質の明らかな移動を生じる（図３、パネルＡ及びＢ）。Ｍr＝２５，０００のピークのみがＥＰＯの添加時に移動するようであり、これらの分析条件下での単一の活性型種の存在を示している。
再生混合物の時間にわたるＨＰ−ＳＥＣ試験は、Ｍr＝５２，０００の種が活性型のＭr＝２５，０００の種にゆっくりと転化するという結果を生じた（図３、パネルＡに比較した図３、パネルＣ、ピーク１及び２［６日の再生期間の後］）。再生溶液は、わずかに濁ったままであり、不透明な溶液を生じさせる不溶性のタンパク質が、最初の２４時間の再生の間にゆっくりと溶液に入り込み、さらなる活性型及び不活性型タンパク質種を生じさせると考えられた（図３、パネルＣ及びＤ）。この準安定性種は、持続することが観察され、そして非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験は、非常に長い再生工程の間に時間と共に何の違いも示さなかったので、これらはジスルフィド結合した種と関係しないと思われた。この試験は、４℃での持続したインキュベーションが、ピーク１で示される不活性物質からのさらなる活性生成物の蓄積をもたらすことを示唆し（図３、パネルＡ）、従って、再生工程は、典型的には５−７日間実施した（図３、パネルＣ対パネルＡ）。８．２分の分析ＨＰ−ＳＥＣ溶出時間を有するタンパク質（図３、ピーク１）を分取ＨＰ−ＳＥＣにより単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。還元及び非還元の両方の条件下でこのタンパク質は単量体であるようであった。このピークは、結局、数日の再生期間の後に９．５分のピーク（図３、ピーク２）に応じて減少するので（図３、パネルＡ）、この種は、再生中間体であるかもしれないことが示唆される。
実施例３
タンパク質の精製
６日の再生期間の後に、最終再生混合物を３７℃に温め、２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５中の３．５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4及びさらなる２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５の添加により１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4に調整した。１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の再生混合物の最終調整容量は、１．５リットルであった。この溶液の分析ＨＰ−ＳＥＣ分析は、再生混合物中のより高分子量の型が、ある程度、溶液から沈殿したことを示した。０．４５μｍのフィルターを通して濾過した後、この溶液を室温で８ｍｌ／分の流速でフェニル−トヨパールＴＳＫ ６５０Ｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）のカラム（５ｃｍ ｘ １６ｃｍ）に供した。このカラムを１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4／２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５（バッファーＡ）で先に平衡化した。カラム添加の完了時に、バッファーＡで洗浄することにより、カラム流出物の吸収（２８０ｎｍ）をベースラインまで下げた。カラムに結合したタンパク質を１００％バッファーＡから開始する２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５（バッファーＢ）の２０００ｍｌの直線勾配、続いて１０００ｍｌのバッファーＢで溶出した。８ｍｌ／分の流速を実験の間中維持した。２分間隔の画分を集めた。２つの主要なピークの吸収、すなわち、８０％バッファーＢ近くのもの及び約２００ｍｌの１００％バッファーＢの後のものが溶出された（図４Ａ）。これらのカラム画分（１００μｌ）の分析ＨＰ−ＳＥＣは、最初の吸収ピークが活性タンパク質を含むことを示し、画分８５−１０２をプールし、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ−１０膜）により濃縮した。回収された物質を次のクロマトグラフィー工程の前に０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。
回収されたプール（２２ｍｌ、６０ｍｇのタンパク質）をＰＢＳ、ｐＨ ７．５で平衡化したＢｉｏ−Ｓｉｌプレカラム（７．５ ｘ ２１．５ｍｍ）の付いたＢｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ−２５０カラム（２１．５ ｘ ６００ｍｍ、ＢｉｏＲａｄ）で４ｍｌ／分でＨＰ−ＳＥＣに供した。４．５ｍｌの注入を実施し、全プールを５回のクロマトグラフィー実験で分離した。１分の画分を集め、各実験からの活性画分（画分４０−４２）をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０装置（Ａｍｉｃｏｎ）で限外濾過により濃縮した（図４Ｂ）。回収されたプール（２３ｍｌ、２．０４ｍｇ／ｍｌ、４６ｍｇ）をＨＰ−ＳＥＣ ＥＰＯ結合分析（以下参照）により活性を、そして非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２参照）により純度を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレート、８４ ｘ ７０ ｘ １．０ｍｍ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）をクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
分析ＨＰ−ＳＥＣ時に、このタンパク質は、高分子量凝集物の痕跡なしに９．５分の溶出時間を有する単一種として現れる（図４、パネルＣ）。クロマトグラフィー分離の前に過剰のＥＰＯと混合すると、９．５分で見られたＥＢＰは、約８．２分の保持時間を有する複合体に転化される（図４、パネルＣに示される実験とかさねた図４、パネルＤ）。過剰より低いレベルでＥＰＯを添加した場合、８．５分のＥＰＯピークの完全な消失が見られ、８．２分の複合体のピークは残る。外見上均質なタンパク質への再生工程から、３３％の全体的な収率で、細胞湿重量１グラム当たり約０．６ｍｇの活性タンパク質の最終的なＥＢＰの回収収量が見られた。表１に、大腸菌からの再生されたＥＢＰの精製の結果が示される。
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実施例４
ＥＰＯ−ＥＰＢ複合体の調製及び化学量論測定
ＨＰ−ＳＥＣでＥＰＯ−ＥＢＰ複合体を単離し、そして以下に記述するようにＣ−４逆相クロマトグラフィーでこの混合物内のタンパク質の比率を見積もることにより、結合複合体のＥＢＰ及びＥＰＯの化学量論をさらに調べた。ＥＰＯ及びＥＢＰの検出器反応の標準曲線（図５、パネルＡ）を作製し、これは、各量の検体で３回の異なる分析試験で、誤差棒で示されるような低いレベルの反復誤差（１．０ Ｓ．Ｄ．）を有する直線の検出器反応を示した。図５、パネルＢは、Ｃ−４分析の前にＨＰ−ＳＥＣにより精製された２つの異なるロットのＥＰＯ−ＥＢＰ複合体の分析結果を含む。これらのデータは、本明細書に記述されるＨＰ−ＳＥＣデータと合わせて、ＥＰＯ−ＥＢＰ複合体の１：１の比率を示す。
以下のようにして複合体を得た。５ｍｇのＥＰＯ及び１２ｍｇのＥＢＰ（過剰のＥＢＰ）を含む溶液を上記の方法により分取ＨＰ−ＳＥＣに供した。最初に溶出するタンパク質ピーク（ＥＰＯ−ＥＢＰ複合体）を集め、Ｃ−４逆相ＨＰＬＣによる分析に供した。簡潔に言えば、４．６ ｘ ２５０ｍｍのカラム（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ、Ｃ４−ＡＰ、３００Ａ）を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水／アセトニトリル（８０％／２０％）で平衡化し、ＥＰＯ−ＥＢＰ複合体のアリコートを１ｍｌ／分の流速で注入した。５分洗浄した後、０．１％ＴＦＡを含む２０−１００％アセトニトリルの直線勾配を２０分にわたって用い、２２０ｎｍで実験を測定した。これらの条件下で、ＥＢＰ及びＥＰＯは、ベースライン分離で、それぞれ１４．１及び１５．１分で溶出する。各タンパク質の標準曲線を定め、これは、検出器反応が５０ないし５００ｐｍｏｌの範囲にわたって直線であることを示した。複合体の各タンパク質のピーク面積を標準曲線と比較して複合体のＥＰＯ及びＥＢＰの比率を決定した。
実施例５
アミノ酸分析並びにＮ−末端及びペプチドフラグメントのアミノ酸配列分析
４２０Ｈ加水分解機（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で標準的な技術により精製したＥＢＰの溶液のアミノ酸分析を実施し、内部標準を用いてアミノ酸含有量を概算した。これらのデータを用いて、アミノ酸分析のために用いたタンパク質溶液の吸収に基づいて、２８０ｎｍで５７，５００のＥＢＰのモル吸収係数（２．３吸収ユニット／ｍｇ）を算出した。次に、この値を用いてＥＢＰ濃度を概算した。最初は、４２，７６０の計算された吸収係数（Ｇｉｌｌ、Ｓ．Ｃ．及びｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ、Ｐ．Ｈ．（１９８９）Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２、３１９−３２６）を用いたが、後にこれは結合滴定実験で間違っていることが示された。
標準的な気相エドマン分解化学を用いて２０９０Ｅ連続微量シークエンシングシステム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｏｒｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）でＥＢＰのアミノ末端配列を決定した。反復収率は、８５％より高かった。
ペプチドマッピングのために、ＰＢＳ中約５０μｇのＥＢＰを３００μｌの０．０５Ｍ ＴＲＩＳバッファー、ｐＨ ８．５に添加した。この溶液に、水中１ｍｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）２μｌを添加し、この混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。２５μｌのトリフルオロ酢酸で消化をクエンチし、混合物を０．４５μｍの膜フィルターを通して濾過した。消化産物をＤｙｎａｍａｘ Ｃ−１８ ５ミクロン ３００Ａカラム（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）でＨＰＬＣにより分析し、１．０ｍｌ／分で、５０分にわたって０−４２％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、続いて１０分にわたって同じバッファーの４２−７０％の勾配で溶出した。２１５ｎｍの吸収ピークとして溶出する物質の画分を集め、スピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）で溶媒を留去した。これらのペプチドを上記のようにシークエンスした。
回収された物質の結合容量を測定し、タンパク質の同一性及び構造の完全性を確かめるために、いくつかのさらなる試験を実施した。これらは、Ｎ末端配列分析、ＴＯＦ質量分析法及びＥＢＰのリガンド結合容量を測定するために考案されたアッセイ形態を含んだ。Ｎ末端配列分析は、１０サイクルの間予想されるＮ末端配列のみを示し（上記参照）、タンパク質の同一性を確認した。いくつかの内部トリプシンペプチドの配列分析も、タンパク質の予想される直線配列及び１−２、３−４の成分（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）ジスルフィド結合パターンを確認した。
実施例６
質量分析法
回収されたタンパク質の質量を確認するために、シナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）基質及びウシカルボニックアンヒドラーゼ内部質量標準を用いて、ＬａｓｅｒＭＡＴ装置（Ｆｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で基質補助（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）レーザー−脱着イオン化ＴＯＦ質量分析法を実施した。図６、パネルＢにＥＢＰのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量スペクトルが示され、これは２４，７３２ダルトンの分子イオン（ＭＨ＋）を示す。カルボニックアンヒドラーゼイオン（ＣＡ＋）の質量中心を装置の基準化のために用いた。ＥＢＰ（ＭＨ２＋＋）及びカルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ＋＋）の二荷電イオンもこのスペクトルで明らかである。ＥＢＰの２４，７３２の質量中心分子量は、２４，７２４の計算される平均分子量によく類似し、タンパク質の同一性及び正しいカルボキシ末端欠失の両方を確証する。
実施例７
ＥＢＰビーズの調製及び平衡結合定数の測定（スキャッチャード分析）
上記の方法により製造されたＥＢＰは、１個の遊離ジスルフィドリル基を保有し、これをリガンドの溶液相結合に影響を及ぼさずに修飾することができる。平衡結合分析用にＥＢＰを固定化するために、この知識をＥＢＰのアガロースビーズへの共有結合的接着のために拡張した。スルホリンク（Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ）ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のヨードアセチル活性化化学は遊離チオールに特異的であり、この結合が容易に可逆的ではないことを保証する。ＥＢＰ−スルホリンクビーズを以下のようにして作製した。すなわち、スルホリンクゲル懸濁液（１０ｍｌ）を結合バッファー（４０ｍｌ：５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ８．３、５ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合し、ゲルを沈降させた。上清を除き、結合させるＥＢＰ（結合バッファー中０．３−１ｍｇ／ｍｌ）を洗浄したビーズに直接添加した。この混合物を室温で３０分間穏やかに揺すり、ビーズを室温で１時間沈降させた。上清を除いて保存し、ビーズを２０ｍｌの結合バッファーで２回洗浄した。これらの洗浄液を同様に保持した。次に、非結合部位をブロックするためにビーズを室温で３０分間２０ｍｌの０．０５Ｍシステインで処理した。最後に、ビーズを５０ｍｌの１Ｍ Ｎａｃｌ、次いで３０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、４℃で保存した。最初のＥＢＰ溶液のＯＤ280を反応上清及び２回の２０ｍｌ洗浄液に回収された全ＯＤ280と比較することにより、ビーズに共有結合したＥＢＰの量を測定した。典型的には、用いたＥＢＰの４０−６０％がビーズと結合したままである。
個々の反応チューブにＥＢＰビーズ（５０μｌ）を添加することにより、結合アッセイを開始した。０．３−３０ｎＭの［125Ｉ］ＥＰＯ（ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ、１００μＣｉ／μｇ）を含むチューブで全結合を測定した。非特異的結合の測定のために、対応する［125Ｉ］ＥＰＯ濃度の１０００倍過剰のレベルで非標識ＥＰＯを添加した。結合バッファー（ＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ）で各反応容量を５００μｌにした。これらのチューブを穏やかに揺らしながら室温で５時間（平衡の樹立のために適当であると実験的に決定された期間）インキュベートした。５時間後、各反応混合物をガラスウールを詰めた１ｍlのピペットチップに通した。チューブを１ｍlの洗浄バッファー（ＰＢＳ／５％ ＢＳＡ）で洗浄し、この容量及びさらに２回の１ｍｌ洗浄液をピペットチップに通し、遊離ＥＰＯ濃度の測定のために集めた。放射性標識の各濃度で過剰のコールドＥＰＯ実験から非特異的結合を測定し、全結合から引いて特異的結合を計算した。図６、パネルＡは平衡結合データを表し、挿入物は、パネルＡのデータセットの一次変換（スキャッチャード）であり、５ｎＭ±２のＫｄを示す。
実施例８
エリトロポエチンレセプター競合結合分析
精製されたＥＢＰの増加する量を一定量の［125Ｉ］ＥＰＯ及びＥＰＯＲ保有細胞に添加することにより、全細胞に基づく結合アッセイを実施した。過剰のＥＰＯ（１μＭ）の添加により非特異的結合を測定し、データ分析の前にこれを引いた。５回のアッセイから概算されたＩＣ50及びＫiは、それぞれ１．７±１ｎＭ及び０．９４±０．５ｎＭであると測定された。無傷の細胞表面ＥＰＯレセプターと［125Ｉ］ＥＰＯの結合に対するＥＢＰの競合により、約１、７ｎＭ±１のＩＣ50が得られた（図７、パネルＡ）。簡潔に言えば、この実験を以下のように実施した。ＴＦ−１細胞（Ｋｉｔａｍｕｒａ、Ｔ．、Ｔａｎｇｅ、Ｔ．、Ｔｅｒａｓｗａ、Ｔ．、Ｃｈｉｂａ、Ｓ．、Ｋｕｗａｋｉ、Ｔ．、Ｍｉｙａｇａｗａ、Ｋ．、Ｐｉａｏ、Ｙ．−Ｆ．、Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｋ．、Ｕｒａｂｅ、Ａ．及びＴａｋａｋｕ、Ｆ．（１９８９）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｎ  ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３  ｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０、３２３−３３４）をＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎仔血清、１％ Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン、０．１％ストレプトマイシン及び１ユニット／ｍｌのＩＬ−３（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で維持した。［125Ｉ］ＥＰＯを上記のようにＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。１段階レセプター結合アッセイ法を用いて競合結合試験を実施した。簡潔に言えば、対数増殖期の中間のＴＦ−１細胞を含む培地を遠心分離し、細胞ペレットを４ ｘ １０7細胞／ｍｌで結合バッファー（ＲＰＭＩ  １６４０、０．２％ ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。ＥＢＰからの競合の存在下または非存在下で、無傷の細胞に対するＥＰＯの結合をアッセイするために、４ ｘ １０6細胞、［125Ｉ］ＥＰＯ（典型的には８０ｐＭ）及びＥＢＰを混合し、これらを二重に１５０μＬの最終容量内に含んだ。インキュベーションを１．５ｍｌのポリプロピレンチューブ中１０℃で一晩実施した。インキュベーション期間の最後に、結合混合物の１２０μＬアリコートをＳａｒｓｔｅｄｔ ＲＩＡチューブ中の１０％ショ糖のクッション３００μＬ上に重ねた。細胞を微量遠心器で１分間ペレットにし、これらのチューブをすぐにドライアイス浴中に置いて中身をすばやく凍結した。チューブの底の先端を切り取ることにより、細胞及び結合したリガンドを集め、ガンマカウンターで放射能を定量するためにこれらを１２ ｘ ７５ｍｍ試験管に移した。Ｌｕｎｄｏｎ−２（Ｌｕｎｄｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃｈａｇｒｉｎ  Ｆａｌｌｓ、ＯＨ）をデータの編集整理のために用いた。
実施例９
細胞増殖中和アッセイ
ネズミのＥＰＯレセプターを発現するＥＰＯ依存性の系である細胞系ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲを増殖し、以前に記述されたように維持した（Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｍ．Ｐ．、Ｓｐｉｖａｋ、Ｊ．Ｌ．、ＭｃＭａｈｏｎ、Ｍ．、Ｗｅｉｃｈ、Ｎ．、Ｒａｐｐ、Ｕ．Ｒ．及びＭａｙ、Ｗ．Ｓ．１９９１．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒａｆ−１  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｆ−１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、１４９６４−１４９６９）。これらの細胞を１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清及び１０ユニット／ｍｌの組み換え体ヒトＥＰＯを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。増殖アッセイの阻害のために、ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞を定常期まで生育し、遠心分離し、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ＥＰＯ無し）で洗浄し、ＥＰＯを欠いた培地で一晩培養した。各アッセイ点を３重で９６ウェルのＵ底組織培養プレートでアッセイを設定した。各ウェルは、４ ｘ １０4細胞、０．５ユニット／ｍｌのＥＰＯ及び各量の（培地中の）ＥＢＰを０．２ｍｌの最終容量で含んだ。プレートを３７℃で約４８時間インキュベートし、その後、細胞を１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］チミジン（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｄｕｐｏｎｔ−ＮＥＮ）で３７℃で６時間パルス標識した。Ｔｏｍｔｅｃ細胞収集器（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いて細胞をガラス繊維フィルター上に集めた。ＬＫＢ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ １２０５シンチレーションカウンターを用いてシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）でフィルターをカウントした。本明細書に記述される可溶性リガンド結合ドメインは、ＥＰＯ反応性細胞系のＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲにおけるＥＰＯの増殖反応を投与量に依存して中和することにより検出されるように、ＥＰＯの増殖特性を中和した。図７、パネルＢに、ＥＰＯ依存性細胞増殖のＥＢＰによる阻害を示す。ＩＣ50は、５ｎＭ±１であると概算された。
本明細書に示される実施例は、一緒になって、本明細書に記述されるように製造される再生されたＥＢＰが非常に活性があり、ＣＨＯ細胞で生産されたＥＢＰの１ｎＭの平衡結合定数（Ｙｅｔ、Ｍ．−Ｇ及びＪｏｎｅｓ、Ｓ．Ｓ．（１９９３）Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｏｒｍｓ  ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  ８２、１７１３−１７１９）及び別のバクテリア発現系からの少量の正しく再生されたバクテリアで発現されたＥＢＰ−ＧＳＴ融合タンパク質（Ｈａｒｒｉｓ、Ｋ．Ｗ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｒ．Ａ．、及びＷｉｎｋｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｃ．（１９９２）Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１５２０５−１５２０９）とよく相関するが、高純度であること、融合タンパク質ではないこと、グリコシル化されていないこと、そして高収量で生産され、精製されることを初めとする利点を有することを示唆する。
実施例１０
ペプチド合成
一般的に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  モデル  ４３０Ａ及び４３１Ａペプチド合成機でメリフィールド固相ペプチド合成方法論を用いて、本明細書に記述される環式擬似ＥＰＯペプチドの全てを合成した。酸脱保護（５０％トリフルオロ酢酸／５０％ジクロロメタン）及び中和（５％ジイソプロピルエチルアミン／Ｎ−メチルピロリドン）工程後に、保護されたＢＯＣ（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ酸誘導体をヒドロキシルベンゾトリアゾールエステルとして結合した。全長のペプチド−樹脂が得られるまで、酸脱保護、中和及び結合工程を繰り返した。完成した樹脂に結合したペプチドを５０％ ＴＦＡで処理し、遊離Ｎ末端のペプチド−樹脂が得られた。側鎖の保護基を除去し、液体ＨＦ−アニソール（容量で１０％）で−６℃で９０分間処理することによりペプチドを樹脂から切断した。次に、冷エチルエーテで遊離ペプチドを沈殿した。残っているスカベンジャー（アニソール）を除くために、さらにエーテル洗浄を実施した。次に、乾燥したペプチド−樹脂を５０％ ＨＯＡｃに抽出し、水で希釈し、凍結乾燥した。この未精製ペプチドを０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリルに懸濁することによりシステインを酸化し、続いて１ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度に水で希釈し、澄んだ溶液（典型的には、３０−５０％ ＡｃＮ／水）が得られた。約８．０のｐＨが得られるまでこのペプチド溶液に固体の重炭酸アニモニウムを添加した。撹拌したペプチド溶液にフェリシアン化カリウムを淡黄色の溶液が持続するまで滴下しながら添加した。酸化生成物の形成に関してこのペプチド溶液を分析逆相ＨＰＬＣにより測定した。環式ペプチドは、典型的には、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラムで還元開始物質の後に溶出した。環化反応時間は、特定のペプチド配列により、ＲＴで２０分から１８時間まで変わった。精製前に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＡＧ ２−Ｘ８陰イオン交換樹脂（塩化物型）を黄色のペプチド溶液に添加して酸化剤（鉄）を除いた。陰イオン交換樹脂を濾過により除き、ペプチド溶液の容量に等しい水の容量で洗浄した。合わせた濾過液を分取ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８）に添加し、０．１％ ＴＦＡを含む水−アセトニトリル勾配を用いて９０−９５％純度の標的ペプチドを単離した。クロマトグラフィー中に顕著な直鎖ペプチドも得られた（典型的には、還元ペプチドが所望する環式ペプチドに接近して溶出した）場合、フェリシアン化カリウムでの酸化工程を繰り返して還元された（？）標的ペプチドの全体的な収量を最大にした。高純度の所望するペプチドを含んでいる分取クロマトグラフィーから集められた画分をプールし、凍結乾燥した。各合成の最終生成物を純度（通常、＞９５％）に関して分析ＨＰＬＣで、分子量に関してイオン−スプレー質量分析法で、そしてペプチド含有量に関してアミノ酸分析で特性化した。全ての環式ペプチド調製物は、エルマン試薬を用いると遊離スルフィドリル基に関して陰性であった。本明細書に開示される試験に用いるペプチドを表２に示す。
0004060361.tif 000003
ペプチドの競合結合アッセイを本明細書に記述するように実施した。個々のペプチドをＤＭＳＯに溶解して１ｍＭのストック溶液を調製した。全ての（２重の）反応チューブは、全部で５００μＬの結合バッファー（ＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ）中に５０μＬのＥＢＰビーズ、０．５ｎＭ［125Ｉ］ＥＰＯ［ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１００μＣｉ／μｇ）及び０−５００μＭのペプチドを含んだ。ＤＭＳＯに対するアッセイの感度の試験は、２５％までの濃度のＤＭＳＯ（Ｖ／Ｖ）が結合に対して有害な影響を及ぼさないことを示したので、全てのペプチドアッセイチューブでＤＭＳＯの最終濃度を検出できる影響のない値である２．５％に調整した。大過剰の非標識ＥＰＯ（１０００ｎＭ）を含有するチューブを含むことにより、各個々のアッセイで非特異的結合を測定した。ペプチドを添加しない最初のアッセイ点を各アッセイに含んで全結合を測定した。結合混合物を穏やかに揺らしながら室温で一晩インキュベートした。次に、ミクロ−カラム（Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｌｕｍｎ）（Ｉｓｏｌａｂ、Ｉｎｃ．）を用いてビーズを集め、３ｍｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ／５％ ＢＳＡ）で洗浄した。洗浄したビーズを含んでいるカラムを１２ ｘ ７５ｍｍのガラス管中に置き、結合した放射能レベルをガンマカウンターで測定した。非特異的結合を修正した後、結合した［125Ｉ］ＥＰＯの量をコントロール（全体＝１００％）結合のパーセンテージとして表し、ペプチド濃度に対してプロットした。ＩＣ50をＥＢＰビーズに対する［125Ｉ］ＥＰＯの結合を５０％減少する検体の濃度として定義した。
実施例１１
ＥＰＯ依存性細胞増殖アッセイ
天然のヒトＥＰＯレセプターを発現するＥＰＯ依存性の系である細胞系ＦＤＣ−Ｐ１／ｈＥＲを候補ペプチドの擬似ＥＰＯ活性を測定するために用いた。この細胞系はＥＰＯ依存性の細胞増殖を示し、アッセイを以下のように実施した。細胞を１０％熱不活性化ウシ胎仔血清及び１０ユニット／ｍｌの組み換え体ヒトＥＰＯを含んでいるＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で維持した。細胞増殖アッセイのために、細胞を定常期まで生育し、遠心分離し、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ＥＰＯ無し）で洗浄し、ＥＰＯを欠いた培地で２４時間培養した。
２４時間で細胞を数え、８００，０００細胞／ｍｌに再懸濁し、４０，０００細胞／ウェルで分配した。各ペプチドのストック溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を調製し、１ ｘ １０-10Ｍから１ ｘ １０-5Ｍの最終濃度に３重に分配し、０．２ｍｌの最終容量に調整した。０．１％（Ｖ／Ｖ、最大）未満の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞毒性または刺激作用を有さないことが示された。標準ＥＰＯ投与量反応曲線を各アッセイシリーズを用いて作製した。３７℃で４２時間（２回の細胞倍加）のインキュベーション後、１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］チミジンを添加し、インキュベーションを６時間続け、この時点で細胞を集め、カウントし、細胞増殖の尺度として［3Ｈ］チミジンの取り込みを評価した。結果を組み換え体ＥＰＯで得られた最大活性の半分を生じるために必要なペプチドの量として表し、これらを表３に示す。
実施例１２
擬似ＥＰＯペプチドによるＥＢＰの二量化
非水溶性の同一二官能基スルフィドリル反応性架橋試薬のＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−［２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いた試験のためにペプチドが介在するレセプターの二量化を安定化した。全ての反応及びコントロールは、最終濃度４．４％のＤＭＳＯ及び０．００７％ ＴＦＡを含み、ＤＰＤＰＢ（１．１ｍＭ）、４００μＭのペプチドリガンド、７５μｌのＰＢＳ、ｐＨ ７．５の存在下または非存在下でＥＢＰ（２２μＭ）をインキュベートした。これらの試料を室温で４時間インキュベートし、４℃で１２時間保存し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０−２０％勾配ゲル、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）により還元及び非還元条件下で分析した。二量体生成物の目視検出に基づいて、結果を陽性、弱く陽性、痕跡（ｔｒａｃｅ）または陰性として表３に示す。
実施例１３
ＥＢＰ−Ｉｇ発現ベクターの構築
ＩｇＧを保有するプラスミドｐＳＧ５２０９ＩｇＧ１［Ａｌｅｇｒｅ、Ｍ．Ｌ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｌ．Ｊ．、Ｘｕ、Ｄ．、Ｓａｔｔａｒ、Ｈ．Ａ．、Ｊｅｙｅｒａｊａｈ、Ｄ．Ｒ．、Ｋｏｗａｌｋｏｗｓｋｉ、Ｋ．、Ｔｈｉｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ、Ｊ．Ｒ．、Ｚｉｖｉｎ、Ｒ．Ａ．、Ｊｏｌｌｉｆｆｅ、Ｌ．Ｋ．、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ、Ｊ．Ａ．Ａ  ｎｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ”ｈｕｍａｎｉｚｅｄ”ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｔａｉｎｓ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７−１５４３（１９９４）］を制限酵素Ｐｓｔ１及びＢｓｉＨＫＡ１（ＢｓｉＨＫＡ１は、Ｐｓｔ１と合致するＤＮＡ末端を生じる）で消化してＩｇＧ１定常領域のＤＮＡフラグメントを単離した。単離したＩｇＧ１フラグメントを制限酵素Ｐｓｔ１で消化したプラスミドｐＳＧ５ｐ３５ｓｉｇにサブクローン化した。プラスミドｐＳＧ５ｐ３５ｓｉｇは、Ｂ７２．３シグナル配列［Ｗｈｉｔｔｌｅ、Ｎ．、Ａｄａｉｒ、Ｊ．、Ｌｌｏｙｄ、Ｃ．、Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｌ．、Ｄｅｖｉｎｅ、Ｊ．、Ｓｃｈｌｏｍ、Ｊ．、Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ、Ａ．、Ｃｏｌｃｈｅｒ、Ｄ．、Ｂｏｄｍｅｒ、Ｍ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＣＯＳ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  Ｂ７２．３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．１：４９９（１９８７）］を含む。ＩｇＧ１定常領域を正しい方向で保有しているバクテリアクローンを制限酵素消化分析により確かめた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）並びに末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー：５’ＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧ  ＣＣＣＣＣＧＣＣＧＡＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＣ［配列番号７］及び３’ＴＣＡＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣ  ＧＣＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧ［配列番号８］を用いてＥＢＰ ＤＮＡを増幅した。これらのプライマーは、ｐＳＧ５ｐ３５ｓｉｇプラスミドへのクローニングを容易にするために５’末端に設計されたＰｓｔ１制限酵素部位を有した。ＥＢＰ ＤＮＡを精製し、ＩｇＧ１からの定常領域を保有するプラスミドｐＳＧ５ｐ３５ｓｉｇに連結した。バクテリアへの形質転換後に、ＰＣＲを用いてＥＢＰを保有するクローンを同定し、選択したクローンからプラスミドＤＮＡを精製した。自動化ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡ配列を確かめた。
ｐＳＧ５ｐ３５中のＥＢＰ−Ｉｇ融合構築物（ＥＢＰ−Ｉｇ野生型と称する）を部位特異的突然変異生成により修飾してＩｇのヒンジ領域に３個の突然変異アミノ酸を含む第二の構築物を作製した。ＥＢＰ／Ｉｇ連結部のアミノ酸配列は、野生型構築物のＩｇヒンジの５’部分から読んでＳｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ［配列番号９］である。このアミノ酸配列をＳｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ［配列番号１０］に変え、得られた構築物をＥＢＰ−Ｉｇ ３Ｓと称した。
ｐＳＧ５ｐ３５ｓｉｇＥＢＰ−Ｉｇ構築物は、哺乳類細胞で一時的な発現が可能である。野生型または３Ｓ ＥＢＰ−Ｉｇのいずれかで形質転換された安定な細胞系を樹立するために、ＥＢＰ−Ｉｇ融合物をｐＳＧ５ｐ３５ｓｉｇプラスミド構築物からサブクローン化し、プラスミドｐＥＥ１２［Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ］に連結した。
ＮＳ０発現細胞系の樹立
ＥＢＰ−ヒトＩｇＧ１−ｐＥＥ１２構築物（３Ｓ突然変異体及び野生型）をＮＳ０マウス骨髄腫細胞にトランスフェクトすることにより、ＥＢＰ−Ｉｇ融合タンパク質を発現する安定に形質転換された細胞系を得た。優性選択マーカー遺伝子であるグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を用いて、トランスフェクトされた細胞の選択を実施した。
ＮＳ０マウス骨髄腫細胞系（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、Ｌｔｄ．）は、ＮＳ−１由来のサブクローンであり、細胞内軽鎖を発現しない。これらの細胞をグルタミン及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。トランスフェクションのための調製において、これらの細胞を対数増殖期の中間で集め、ＰＢＳで洗浄した。最終細胞ペレットを３．６ｍｌのＰＢＳで２．５ ｘ １０7細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。全工程の間、細胞を氷上で保持した。
トランスフェクトするＤＮＡ（ＥＢＰ−ＩｇＧ−３Ｓ、ＥＢＰ−ＩｇＧ−野生型）をトランスフェクションの前に制限消化により直鎖型に転化した。ＤＮＡ及びＮＳ０細胞を以下のように示した順序、すなわち、４８μｌ（３０μｇ）ＥＢＰ−ＩｇＧ−３Ｓ ＤＮＡ、３１２μｌ ｄｄ Ｈ2Ｏ、４０μｌ １０Ｘ ＰＢＳ及び４００μｌ ＮＳ０細胞または６８μ（４５μｇ）ＥＢＰ−ＩｇＧ−野生型ＤＮＡ、２９２μｌ ｄｄ水、４０μｌ １０Ｘ ＰＢＳ及び４００μｌ ＮＳ０細胞で０．４ｃｍのＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに合わせた。コントロールのキュベットは、４００μｌ １Ｘ ＰＢＳ及び４００μｌ ＮＳ０細胞を含んだ。
トランスフェクションをエレクトロポレーションにより以下のように実施した。すなわち、１Ｘ ＰＢＳバッファー中の細胞及びＤＮＡを短い高電圧パルスにさらし、ＤＮＡの導入を容易にする細胞膜内の一時的な微小孔の形成を誘導した。ＮＳ０細胞及びＤＮＡの懸濁液を穏やかに混合し、氷上で５分間インキュベートした。キュベットをＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ中に置き、３ｕＦ（電気容量）及び１．５Ｖ（電圧）の設定で２回の連続電気パルスを与えた。エレクトロポレーション後、キュベットを５分間氷に戻した。次に、この懸濁液を前以て温めた生育培地に希釈し、各ＤＮＡ構築物に対して（７）９６ウェルプレートに配分した。ＤＮＡを含まずにエレクトロポレーションを実施した細胞を含むコントロールプレートも同時に調製して自然突然変異体の存在を測定した。プレートを５％ＣＯ2の３７℃インキュベーター中に置いた。
ＧＳ遺伝子によりコードされるグルタミンシンチターゼは、グルタメートをグルタミンに転化する酵素である。ＮＳ０細胞は、不十分なレベルの内因性ＧＳ遺伝子発現のために、生育のためにグルタミンを必要とする。ＤＮＡ構築物において、この遺伝子は、ｐＥｅ１２ベクター上に位置する。ＧＳ遺伝子を取り込むトランスフェクト細胞は、グルタミンに非依存的になる。ＧＳ遺伝子をゲノムに組み込んでいない細胞は、グルタミン依存性のままであり、グルタミンを含まない培地で生存しない。エレクトロポレーションの約１８時間後に、全てのプレートにグルタミンを含まない選択培地を与え、認識できるコロニーが現れるまでインキュベートした。
トランスフェクションの約３週後に、識別でき肉眼で見えるコロニーが観察された。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＥＢＰ−Ｉｇ融合タンパク質の発現に関してこれらを選別した。このアッセイにおいて、マイクロタイタープレートをヤギ抗−ヒトＦｃポリクローナル抗体で被覆した。これらのウェルに組織培養試料を添加し、インキュベートして複合体を形成させた。次に、モノクローナル抗−ヒトＥＢＰ抗体を添加し、インキュベートし、続いて西洋わさびペルオキシダーゼに結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体を添加した。さらにインキュベーションした後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を検出のために添加した。ＥＢＰ−Ｉｇ発現に関して陽性の試験試料は、黄色ないし橙色の変化を示す。色の強度は、存在する特定のタンパク質の量に比例する。コロニーを含んでいるウェルからの組織培養上清を１：１０または１：４０希釈で選別した。最も多量の免疫グロブリンを生産している細胞を含むウェルを選別し、さらなる分析のために増やした。
顕著なＥＢＰ−Ｉｇを生産している細胞をさらに選択するために、９６時間の生育期間の後にタンパク質の生産を定量した。組織培養フラスコに１０ｍｌの選択培地中２ ｘ １０5細胞／ｍｌを接種し、３７℃、５％ ＣＯ2で９６時間インキュベートした。この期間の最後に、アリコートを取り、細胞濃度及び力価を測定した。生産の評価を９６時間当たりのμｇ／ｍｌとして計算した。２種の高生産体、３Ａ５（３Ｓ突然変異体）及び４Ｈ３（野生型）は、それぞれ、２９μｇ／ｍｌ及び２３μｇ／ｍｌの値を与えた。これらの２系統を増やし、凍結し、続いて限界希釈によりサブクローン化した。サブクローニングの約３週後に、単一細胞クローンを１：１００希釈でＥＬＩＳＡにより選別した。各系統に１つの高生産サブクローンを選択し、９６時間の生産に関して評価し、凍結した。ＥＬＩＳＡ値は、２８１μｇ／ｍｌ／９６時間（３Ａ５Ｇ１）及び１２３μｇ／μｌ／９６時間（４Ｈ３Ｈ１２）であった。
大規模生産のために、サブクローン３Ａ５Ｇ１（３Ｓ突然変異体）及び４Ｈ３Ｈ１２（野生型）からの細胞を８５０ｃｍ3のコーニングローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）に増やした。３Ａ５Ｇ１では、全部で２２のローラーボトルをＣＤＲ−３無血清培地中ボトル当たり４ ｘ １０7の細胞を接種した。細胞系４Ｈ３Ｈ１２では、全部で２３のボトルをＣＤＲ−３無血清培地中ボトル当たり４ ｘ １０7の細胞を接種した。ボトルを１０％ ＣＯ2で満たし、３７℃で１４日間インキュベートした。コンディションドメディウムを集め、遠心分離し、精製のための調製において滅菌濾過した。
実施例１４
ＥＢＰ−Ｉｇの精製
ＥＢＰ−Ｉｇ（３Ｓ突然変異体）を生産するＮＳ０細胞からのコンディションドメディウム（４．５リットル）をＰＢＳで１：２に希釈し、１．５リットルのバッチで、ＰＢＳで先に平衡化した１００ｍｌのプロテインＧカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にポンプで添加した。添加後に、カラムの出口でのＯＤ280がベースラインに戻るまでカラをＰＢＳで洗浄した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０を用いて結合したタンパク質をバッチ方式で溶出し、タンパク質を含有する画分をプールした。これらの画分のｐＨを１Ｍ ＴＲＩＳ塩基の添加により７．０に調整した。コンディションドメディウムの全容量を処理するためにこの工程を３回繰り返し、３回の実験からの物質をプールした。４．５リットルの開始物質からの全収量は、約４４０ｍｇ（約０．１ｍｇ／ｍｌ）であった。予備実験で、ＥＢＰ−Ｉｇに対するプロテインＡの低い容量が示されたので、プロテインＧをアフィニティー媒質として用いた。
実施例１５
ＥＢＰ−ＩｇフラッシュプレートＥＰＯ放射性リガンド結合アッセイ
本明細書に記述されるようなヒトＥＰＯレセプターのＮ末端の２２５アミノ酸及びＩｇ重鎖を機能的に連結した組み換え体遺伝子構築物を発現するように作製されたＮＳ０細胞のコンディションドメディウムからアフィニティークロマトグラフィーによりＥＢＰ−Ｉｇ融合タンパク質を精製した。ビオチン及びストレプトアビジンの相互作用は、アッセイプロトコールにおいて有用な試薬を捕捉し、効果的に固定するために頻繁に用いられており、ここでは、ＥＢＰ−Ｉｇを捕捉し、固定するための簡単な方法としてこれを用いている。まず、ＥＢＰ−Ｉｇをビオチンのアミン反応性誘導体で無作為に修飾してビオチニル化−ＥＢＰ−Ｉｇを生成する。ストレプトアビジンで被覆したプレートの使用により、シンチラントを染み込ませた被覆ウェル（Ｆｌａｓｈプレート、ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ）の表面にビオチニル化ＥＢＰ−Ｉｇを捕捉できる。リガンド結合ドメインに［125Ｉ］ＥＰＯが結合すると、特定の距離の要求が満たされ、放射性リガンドにより出されるエネルギーに反応してシンチラントは光を出すように誘導される。結合していない放射性リガンドは、放射性崩壊からのエネルギーがシンチラントから遠すぎるので、測定できるシグナルを生じない。生じた光の量を定量してリガンド結合の量を概算した。この特定のアッセイ形態は、パッカードトップカウントマイクロプレートシンチレーション（Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ）カウンターの多数ウェルプレート能力のために適していた。放射性リガンドとの競合結合により検出されるシグナルの量を減少することができる化合物、ペプチドまたはタンパク質を同定した。
ビオチニル化ＥＢＰ−Ｉｇ（３Ｓ突然変異体）を以下のように調製した。ＥＢＰ−Ｉｇ（３ｍｌ、ＯＤ280 ２．９）をセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）１０限外濾過装置を用いて５０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ ８．５に交換した。交換したタンパク質の最終容量は１．２ｍｌであった（ＯＤ280 ２．６、約２ｍｇの全タンパク質に相当する）。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）の４ｍｇ／ｍｌ溶液１０μｌを添加し、この反応混合物を暗闇で氷上に２時間置いた。セントリプレップ１０装置で反応バッファーをＰＢＳに交換することにより、未反応のビオチンを除き、タンパク質試薬を等分し、−７０℃で保存した。各個々の結合ウェル（２００μｌ）は、１μｇ／ｍｌの最終濃度のビオチニル化ＥＢＰ−Ｉｇ、０．５ｎＭの［125Ｉ］ＥＰＯ（ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１００μＣｉ／μｇ）及び（１００％ ＤＭＳＯ中の１０ｍＭストックからの）０−５００μＭの試験ペプチドを含んだ。全てのウェルを５％の最終ＤＭＳＯ濃度に調整した。全てのアッセイ点を３重に実施し、各実験で、非標識ＥＰＯの標準曲線を２０００、６２、１５、８、４及び０ｎＭの最終濃度で実施した。全ての添加を実施した後、これらのプレートを接着性表面封印剤で被覆し、室温で暗闇に一晩置いた。次の日に、検体によるシグナルのクエンチを制限するために全ての液体をウェルから吸引し、パッカードトップカウントマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  ＴＯＰＣＯＵＮＴ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）でプレートをカウントした。非特異的結合（ＮＳＢ）を２０００ｎＭ ＥＰＯのウェルの平均ＣＰＭとして、そして全結合（ＴＢ）を非標識ＥＰＯを添加しないウェルの平均として算出した。修正した全結合（ＣＴＢ）をＴＢ−ＮＳＢ＝ＣＴＢとして計算した。ＣＴＢを５０％まで減少する試験ペプチドの濃度をＩＣ50として報告した。典型的には、非標識ＥＰＯのＩＣ50値は、約２−７ｎＭであった。これらの結果を表３に示す。
実施例１６
蛍光偏光擬似ペプチドリガンド結合アッセイ
蛍光偏光（ＦＰ）は、２つの分子の会合または解離時に生じる分子の容積の変化に関する情報を与えることができる有用な技術である。顕著に大きい方の分子に対する親和性を有する小さい方の分子を蛍光で標識する場合、観察される蛍光偏光値は、結合時に著しく増加し、定量することができる。逆に、この複合体に非蛍光競合分子を添加する場合、蛍光偏光値の減少を予想することができる［Ｃｈｅｃｏｖｉｃｈ、Ｗ．Ｊ．、Ｂｏｌｇｅｒ、Ｒ．Ｅ．及びＢｕｒｋｅ、Ｔ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５、２５４−２５６（１９９５）］。３ｍｌのＰＢＳに可溶化した１０ｍｇのペプチドを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した１７．９ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート（１００μｌアリコートで添加した）で処理することにより、ＲＷＪ ６１７１８をフルオレセインレポーター基で標識した。ＲＷＪ ６１７１８は、単一のアミン（Ｎ末端）を含み、１：１の標識の取り込みが予想された。この混合物を氷上に置き、この溶液は、１．０ｍｌのＤＭＳＯの添加により透明になった。４℃で３４時間のインキュベーション後に、フルオレセイン標識したＲＷＪ ６１７１８を逆相ＨＰＬＣにより単離した。全反応混合物を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；移動相Ａ）で１：２に希釈し、Ｃ−１８逆相分取カラム（Ｖｙｄａｃ ＃２１８ｔｐ５４）に８ｍｌ／分でポンプで添加し、０−１００％の移動相Ｂ（０．７％ ＴＦＡを含有するアセトニトリル）の９０分の直線勾配で溶出した。５３０ｎｍで蛍光生成物を含んでいる画分を集め（励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３０ｎｍ）、凍結乾燥した。ＥＢＰ−Ｉｇの存在下でＦＰの変化を測定することにより、６０分近く（約６０％の移動相Ｂ）で溶出する高い蛍光のピークが所望する生成物であると決定した。
レセプターリガンドとしてフルオレセイン標識したＲＷＪ ６１７１８を用いた競合ＦＰアッセイを、蛍光偏光マイクロタイターシステム（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｊｏｌｌｅｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎ）を用いて以下のように確立した。各種濃度の試験ペプチド及びＥＢＰ−Ｉｇ（３Ｓ突然変異体、０．０２５ｍｇ／ｍｌ）を９０μｌのＰＢＳ中で室温で１時間インキュベートし、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒプレート９６ウェルプレートに分配した。各ウェルにフルオレセイン−ＲＷＪ ６１７１８を２．５μＭの最終濃度に添加し（０．１％ ＴＦＡ中１０μｌ）、続いて暗闇で室温でさらに１時間インキュベートした。８．０の装置電圧設定でミリ偏光（ｍｉｌｌｉＰｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（ｍＰ）の値を得た。標識したペプチド及びＰＢＳのみを含むウェルからベースラインのペプチド値を測定した。標識したペプチド及びＥＢＰ−Ｉｇのみを含む試験ウェルで全ｍＰの読み取りを測定した。ｍＰ値のペプチド濃度に依存する競合減少を測定し、ＩＣ50値を計算した。これらの結果を表３に示す。
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本明細書に記述される（表２）擬似ＥＰＯペプチド及びこれらの誘導体を、レセプターとの相互作用の形態を理解するために、そしてＥＰＯレセプターに結合し、活性化するリガンドを発見するための確固たる方法を樹立するために、多数の異なるアッセイ系で分析した。細胞増殖試験（表３）は、どのペプチドがＥＰＯレセプターを活性化する能力を有するかを示し、そしてＤＰＤＰＢ架橋試験は、溶液中でＥＢＰの二量化に必須であるペプチド決定基を特定した（図８）。ＥＢＰビーズでのレセプター−リガンド競合結合試験は面上に固定したレセプターを有し、従って、二量化が物理的に考えられず、与えられた競合物の単量体レセプターに対して作用する能力を測定するとみなされるかもしれない。逆に、各ＥＢＰ−Ｉｇ分子は２個のリガンド結合ドメインを含むので、リガンドに依存するレセプターの二量化を検出するための前以て形成された鋳型に相当する。異なるアッセイ形態で、放射性標識したＥＰＯ及びフルオレセイン−ＲＷＪ ６１７１８のように構造的に異なるリガンドを使用することは、競合物のレセプター結合特性の完全な概要に関する多様な情報を与える。例えば、ＲＷＪ ６１２３３は、細胞増殖試験において擬似ＥＰＯとして機能し、ＥＢＰ−ビーズ及びＥＢＰ−Ｉｇ結合アッセイの両方で同様なレベルで競合し、ＤＰＤＰＢ架橋試験及びフルオレセイン−ＲＷＪ ６１７１８を標識リガンドとして使用するＦＰ／ＥＢＰ−Ｉｇアッセイで陽性であった。基本的に、ＲＷＪ ６１２７９及びＲＷＪ ６１７１８のような増殖能力を有するペプチドは、アッセイ系の全てにおいて同様に作用する。
ＲＷＪ ６１１７７のような増殖能力のないペプチドは、架橋能力（レセプターの二量化）が不十分である可能性があり、ＦＰ−ＥＢＰ−Ｉｇアッセイでは不活性であるが、ＥＢＰビーズ及びＥＢＰ−Ｉｇ結合アッセイでは著しく異なる値（９０対５００μＭ）を与える。逆に、ＲＷＪ ６２０２１のような増殖能力はないが、いくらかの架橋能力を有するペプチドは、ＦＰ／ＥＢＰ−Ｉｇでは非常に効率のよい競合物として機能するが、ＥＢＰ−ビーズ及びＥＢＰ−Ｉｇ結合アッセイでは非常に不十分であり、競合物の作用が、標識したリガンドの性質により決まることを示す。
ＦＰに基づくアッセイでのように生産的及び非生産的二量化の両方を検出するために、各種リガンドと共にＥＢＰ−Ｉｇを用いることができ、そのようなものとして、レセプターアンタゴニスト及びアゴニストの発見及び記述のために特に有用である。これは、生産的及び非生産的二量化の両方を検出するために他のレセプター−Ｉｇ融合物を用いることができることを示唆する。他のそのようなレセプター−Ｉｇ融合物の例は、成長因子、サイトカイン、ニューロトロフィン、インターロイキン及びインターフェロンに結合するレセプターを含むが、これらに限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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