(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のアルカリイオンをルミノフォリック部分及びイオノフォリック部分を有する化合物と接触させ、前記イオノフォリック部分がサンプル中に存在するアルカリイオンと反応し、そのことによって前記ルミノフォリック部分のルミネセンス特性が変化し、その後、前記ルミネセンスを測定し、テスト読み取りを利用して前記アルカリイオンを定量する、アルカリイオンの定量方法であって、利用される前記化合物が下記一般式Ｉで表されるモノアザ−クラウンエーテルであることを特徴とする、アルカリイオンの定量方法。
【化１】
0004065053.tif 000009
（式Ｉ中、Ｘはルミノフォリック部分であって、ｍは０、１、或いは２であり、ｒとｓは独立してそれぞれ０、１或いは２を意味する。）
【請求項２】
ナトリウムイオンの定量に、ｒ及びｓがそれぞれ１及び０である前記一般式Ｉで表されるモノアザ−クラウンエーテルを使用することを特徴とする、請求項１のアルカリイオンの定量方法。
【請求項３】
カリウムイオンの定量に、ｒとｓがそれぞれ２と１である前記一般式Ｉで表されるモノアザ−クラウンエーテルを使用することを特徴とする、請求項１のアルカリイオンの定量方法。
【請求項４】
前記一般式Ｉの前記ルミノフォリック部分Ｘが、下記一般式IIのアミノ−ナフタルイミド基、又は、下記一般式III のキサンテノン基であることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか１項のアルカリイオンの定量方法。
【化２】
0004065053.tif 000010
（式II中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6 のうちの一つは−ＮＨ−基であり、この基を介してＸは前記一般式Ｉの化合物の−（ＣＨ2）m−基と結合し、残りの置換基とＲ7 はそれぞれ独立して水素、親油性基或いは親水性基或いはポリマーと結合する反応性基である。）
【化３】
0004065053.tif 000011
（式III 中、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、 及びＲ15のうちの一つが、化学結合であり、これを介してＸは前記一般式Ｉの化合物のイオノフォリック部分に直接結合し（ｍ＝０）、残りの置換基は、−ＯＨ、−ＯＲ16（Ｒ16は親水性基或いは親油性基である）、−Ｏ−Ｒ17−Ｇ（Ｒ17は親水性基或いは親油性基であり、Ｇはポリマーと結合するための反応性基である）、或いは、−（ＣＨ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは０から１７である）である。）
【請求項５】
下記一般式Ｉで表されるモノアザ−クラウンエーテル。
【化４】
0004065053.tif 000012
（式Ｉ中、Ｘはルミノフォリック部分であり、ｍは０、１或いは２であり、ｒ及びｓはそれぞれ独立して０、１或いは２を意味する。）
【請求項６】
前記一般式ＩにおけるＸが、下記一般式IIで表されるアミノ−ナフタルイミド基、もしくは下記一般式III で表されるキサンテノン基である、請求項５記載のモノアザ−クラウンエーテル。
【化５】
0004065053.tif 000013
（式II中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ5 のうちの一つは−ＮＨ−基であり、この基を介してＸは前記一般式Ｉで表される化合物の−（ＣＨ2 ）m −基と結合し、残りの置換基とＲ7 はそれぞれ独立して水素、親油性基、親水性基、またはポリマーと結合する反応性基である。）
【化６】
0004065053.tif 000014
（式III 中、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、 及びＲ15のうちの一つが、化学結合であり、これを介してＸは前記一般式Ｉで表される化合物のイオノフォリック部分に直接結合し（ｍ＝０）、残りの置換基は、−ＯＨ、−ＯＲ16（ここで、Ｒ16は親水性基或いは親油性基である）、−Ｏ−Ｒ17−Ｇ（ここで、Ｒ17は親水性基或いは親油性基であり、Ｇはポリマーと結合するための反応性基である）、或いは、−（ＣＨ2 ）n−ＣＯＯＨ（ｎは０から１７の整数）である。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はサンプル中のアルカリイオンを定量する方法に関する。詳細には、サンプル中のアルカリイオンがルミノフォリック部分(Luminophoric moiety) とイオノフォリック部分(Ionophoric moiety) を有する化合物（＝ルミノフォア−イオノフォア）に接触し、イオノフォリック部分がアルカリイオンと反応し、そのことによってルミノフォリック部分のルミネセンス特性が変化し、その後ルミネセンスが測定され、テスト読み取りを利用してアルカリイオンの濃度或いは活量が推測される、即ちアルカリイオンが定量される方法に関する。本発明は、又、アルカリイオンを定量するためにルミノフォア−イオノフォアとして使用されることが可能なジアザ−クリプタンドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
このタイプの定量方法はいわゆる”ＰＥＴ効果”に基づく。この後者の用語はフォトンによって誘導されるイオノフォリック部分或いはイオノフォアからルミノフォリック部分或いはルミノフォアへの電子のそれぞれの移動（Photoinduced electron transfer＝ＰＥＴ）を意味し、この各々の移動はルミノフォアの（相対的）ルミネセンス強度及びルミネセンス減衰時間の減少をもたらす。しかし、吸収波長及び発光波長は、その過程において基本的に影響を受けずに保持される（J.  R.  Lakowicz, "Topics in  Fluorescence  Spectroscopy",Volume  4:"Probe Design and Chemical Sensing" ；Plenum Press、New York＆London（１９９４））。
【０００３】
イオンがイオノフォアと結合することによって、ＰＥＴ効果は部分的に或いは完全に抑制されるため、ルミノフォリック部分のルミネセンスは強くなる。よって、サンプル中のイオンの濃度或いは活量は例えばルミネセンス強度及び／又はルミネセンス減衰時間などのルミネセンス特性の変化を測定することにより推測され得る。
【０００４】
米国特許第Ａ５，５１６，９１１には、細胞内カルシウムを定量するための蛍光指示薬として、光学的指示薬として機能し得る蛍光置換基を有するものが公開されている。
【０００５】
米国特許第Ａ５，４３９，８２８には、ジアザ−クリプタンドをルミノフォア−イオノフォアとして利用した前記方法と同種の方法が記載されている。この方法においては、ジアザ−クリプタンドは、蛍光性クマリンとともにフルオロフォアとして機能化されていて、このジアザ−クリプタンドが、その構造に対応して、リチウム、ナトリウム及びカリウムイオンを選択するものである。このルミノフォア−イオノフォアは中性ｐＨのサンプルにおいて使用され得ること、および、そのような系において利用されるのがむしろ好ましいことが記述されている。
【０００６】
しかし、生理学的ｐＨ範囲において、蛍光シグナルは、サンプルのｐＨに大きく依存し、蛍光シグナルはｐＨの減少に伴って強くなり、特にｐＨ７．４以下に低下したところから顕著に強くなることが研究報告されている(Frank Kastenholz, Inaugural Dissertation, University of Cologne, 1993, Fig.32, p.54) 。このことは生物学的サンプルで行われる定量の正確性に影響を及ぼす。更に、用いられているクマリンが波長約３３６ｎｍに吸収を示すため、商用ＬＥＤによって励起することができないという欠点もある。
【０００７】
又、米国特許Ａ５，１６２，５２５に記述されるルミノフォア−イオノフォアも同様な欠点を有する。
【０００８】
Tetrahedron Letters, Volume 31, No.36, pp.5193-5196(1990) には、芳香族環に結合している２つの窒素原子を有するジアザ−クリプタンド、即ち、アリール窒素及びアニリン型窒素のそれぞれを有するジアザ−クリプタンドについて記載されている。しかし、出願人による研究では、このジアザ−クリプタンドが血液の生理学的濃度及び生理学的ｐＨ値（７．０−７．６）においてカリウムイオンを定量するのには適さないことが分かった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、従来のアルカリイオンの定量方法を改良すること、及び生理学的ｐＨ値の範囲においてルミネセンス特性がサンプルのｐＨ値に大幅に影響されることがなく、生物学的サンプルにおける定量に適しているルミノフォア−イオノフォアを提供することである。特に、生理学的濃度にあるアルカリイオンを定量するのに適している、即ち、ルミネセンスシグナルがアルカリイオン濃度に強い依存性を示すアルカリイオンの定量方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この目的は、前記の方法において、一般式Ｉのモノアザ−クラウンエーテルを化合物 (ルミノフォア−イオノフォア）として用いる場合に達成される。
【化７】
0004065053.tif 000002
ここで、Ｘはルミノフォリック部分であり、ｍは０、１、或いは２、ｒ及びｓはそれぞれ独立して０、１、或いは２を意味する。
【発明の実施の形態】
【００１１】
上記の一般式Ｉで示すモノアザ−クラウンエーテルは新規である。これらの新規ルミノフォア−イオノフォアは、生理学的ｐＨ値及び生理学的濃度においてアルカリイオンを定量するのに、非常に有益である。
【００１２】
一般式Ｉの本発明のモノアザ−クラウンエーテルは、１１０〜１８０ミリモル／リットルの濃度範囲にあるナトリウムイオンを定量するのに、及び１．５〜８．０ミリモル／リットルの濃度範囲にあるカリウムイオンを定量するのに特に有益である。
【００１３】
特定の理論との結びつきはないが、本発明のモノアザ−クラウンエーテルが有益な特性を示すのは、窒素が芳香族性窒素であるという事実によるものと考えられている。
【００１４】
ルミノフォリック部分Ｘは、イオノフォリック部分との組み合わせによってＰＥＴ効果を生じ得る全てのルミノフォリック部分を含むものである。非常に多数のルミノフォリック部分(moieties)が、イオノフォアとの組み合わせによってＰＥＴ効果をもたらすこと、或いは原則的にこの目的に適していることが文献からわかっている。これら周知のルミノフォリック部分を、一般式Ｉのベンゼン環と結合させることにより、新規化合物が得られる。新規化合物がＰＥＴ効果を有するか否かについては、当業者が実験で確かめることができる。結合は、窒素に対して、オルト位、２つのメタ位、パラ位、いずれでもよいが、中でもパラ位にの位置に結合するのが好ましい。
【００１５】
ＰＥＴ効果が起こるためには、イオノフォリック部分の電子ドナーがルミノフォリック部分の電子系から電気的に分離されていることが特に不可欠であることは、当業者に知られている。当技術分野においてよく知られているように、このようなイオノフォリック部分とルミノフォリック部分との電気的分離は、二つの部分をスぺーサー基（（ＣＨ2 ）m 鎖（ｍ＞０））、或いは、仮想スぺーサー（ｍ＝０）（例えば、ルミノフォリック部分の面をベンゼン環の面に対して回転させることによって）のいずれかによって分離することで達成され得る。従って、スペーサーの機能は、イオノフォリック部分の電子系がルミノフォリック部分の電子系と共役するのを妨害するものである。
尚、電子分離をしているかどうかは、例えば吸収波長及び発光波長に関して際立った変化がないことによって確認できる。
【００１６】
ナトリウムイオンの定量には、一般式Ｉのｒ及びｓがそれぞれ１及び０であるモノアザ−クラウンエーテルを用いるのが好ましい。
【００１７】
カリウムイオンの定量には、一般式Ｉのｒとｓがそれぞれ２と１であるモノアザ−クラウンエーテルを用いるのが好ましい。
【００１８】
一般式Ｉのルミノフォリック部分Ｘは、一般式IIのアミノ−ナフタルイミド基、或いは一般式III のキサンテノン基であることが好ましい。
【００１９】
【化８】
0004065053.tif 000003
【００２０】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ5 のうちの一つは−ＮＨ−基であり、この基によりＸは前記一般式Ｉで表される化合物の−（ＣＨ2 ）m −基に結合される。残りの置換基とＲ7 は、それぞれ独立して水素、親油性基、親水性基、またはポリマーと結合する反応性基である。
【００２１】
【化９】
0004065053.tif 000004
【００２２】
ここで、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、 Ｒ11、Ｒ12、 Ｒ13、Ｒ14、及びＲ15のうちの一つは化学結合であり、その化学結合によりＸが前記一般式Ｉの化合物のイオノフォリック部分と直接結合している（ｍ＝０）。残りの置換基は−ＯＨ、−ＯＲ16（Ｒ16は親水性基或いは親油性基である）、−Ｏ−Ｒ17−Ｇ（Ｒ17は親水性基或いは親油性基であり、Ｇはポリマーと結合するための反応性基である）、或いは−（ＣＨ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは０から１７である）である。
【００２３】
一般式IIにおいて、Ｒ3 或いはＲ4 が−ＮＨ−基であり、Ｒ3 或いはＲ4 を介して、ルミノフォリック部分が上記の一般式Ｉの−（ＣＨ2 ）m −基に結合しているのが好ましい。一般式III において、Ｒ12が化学結合であり、Ｒ12を介して、ルミノフォリック部分が上記の一般式Ｉのイオノフォリック部分（ｍ＝０）に直接結合しているのが好ましい。
【００２４】
好ましい親油性基としては、例えば炭素数２０までの置換又は無置換のアルキル基及びアルコキシル基が挙げられる。好ましい親水性基としては、例えば、少なくとも１つの水酸基及び／又は測定溶液のｐＨにおいて解離する官能基（例えば、カルボン酸、スルホン酸、及びリン酸など）を一つ以上有する炭素数１〜１７のアルキル基が挙げられる。
【００２５】
アミノ修飾されたポリマー(aminofunctionalized polymer: 例えば、アミノセルロース、及びアミノ修飾されたポリアクリルアミド(aminofunctionalized polymer) と結合する反応基としては、例えば米国特許第Ａ４，７７４，３３９号、表４に記載されているものが挙げられる。
【００２６】
４５０ｎｍ以上の波長の光により励起され得るルミノフォリック部分が好ましい。
【００２７】
アルカリイオンを定量するための本発明の化合物は、溶解状態でサンプル溶液に加えられてもよい。又、これらの化合物は、センサーを構成していてもよく、その場合は、例えば図６に記載されているようなハイドロゲルから形成されている層に含有させてもよい。
【００２８】
本発明は、更に一般式Ｉのモノアザ−クラウンエーテルにも関する。
【化１０】
0004065053.tif 000005
ここで、Ｘはルミノフォリック部分であり、特に前記のとおりＸは、一般式IIのアミノーナフタルイミド基、または、一般式III のキサンテノン基であるのが好ましい。また、ｍは０、１、或いは２、ｒ及びｓはそれぞれ独立して０、１、或いは２を意味する。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。実施例においては、本発明に用いられるのに好ましいモノアザ−クラウンエーテルの合成例と特性をいくつか示す。その他の化合物については、当業者はこれと類似した方法で合成することができる。
【００３０】
１．  本発明のモノアザ−クラウンエーテルの合成．
１．１．  本発明のモノアザ−クラウンエーテルのイオノフォリック部分の合成
本発明によるモノアザ−クラウンエーテルのイオノフォリック部分の合成経路の概要を以下に示す。
【００３１】
プロセスの概要
側鎖を有するモノアザクラウン（ラリアット構造) エーテルを、２つの主要な工程を経て合成した。アルキル化及び環化である。ジメチルホルムアミド中で、Ｋ2 ＣＯ3 の存在下、種々の鎖長（s=0,1,2 それぞれ）のクロロエチルアルコキシエーテルを用いて、２−ニトロフェノールＢ１をアルキル化した。その結果得られたニトロ化合物Ｂ２を水素化してアミンＢ３を得た。次いで、クロロエタノール中で、Ｋ2 ＣＯ3 を塩基として、アミノ基をアルキル化し、2-[N,N-bis(2- ヒドロキシエチラミノフェニール−アルコキシエチール−エーテルＢ４（s=0,1,2 それぞれ）を得た。これらのビス−ヒドロキシ化合物Ｂ４を、アルカリ金属の水酸化物を含有するジオキサン中で、エチルグリコールジクロロエチルエーテル（r=0,1,2 それぞれ）で環化し、ラリアット構造エーテルＢ５（r=0,1,2;s=0,1,2 それぞれ）を得た。これらのエーテルＢ５（フェニルアザクラウンエーテル）をホルミル化し、中間物質Ｂ６（r=0,1,2;s=0,1,2 のそれぞれ）を得た。
合成スキームを以下に示す。
【００３２】
【化１１】
0004065053.tif 000006
【００３３】
各反応ステップの説明
N,N-ビス(2- ヒドロキシエチル）-2- メトキシアリニンＢ４（s=0): 
４５２グラム（４モル）のｏ−アニシジンを１９３２グラム（２４モル）の２−クロロエタノールに溶解し、８０℃で１５分間加熱した。続いて、温度が１１０℃（発熱反応）未満に保持されるように、６０８グラム（４．４モル）のＫ2 ＣＯ3 を、徐々に加えた。混合液を９５℃で２２時間加熱し、その後冷却した。未反応の約８００ｍｌのクロロエタノールを蒸発させ、残留物を１リットルの水で希釈し、１リットルのクロロホルムで２回抽出した。抽出物を１．５リットルの水で５回洗浄し、Ｋ2 ＣＯ3 で乾燥した。溶媒を蒸発させ、４０４グラム（収率４８％）の褐色の油を得た。薄層クロマトグラムでは純度約９５％を示した。
1H NMR(CDCL3),δ( ppm):3.18(t,4H),3.50(t,4H),3.60(m,2H),3.82(s,3H),6.90(m,2H),7.10(m,1H),7.19(m,1H)
【００３４】
2-メトキシフェニルアザ-15-クラウン-5  Ｂ５(s=0,r=1)   ：
この工程は、J.P.Dix and F.Vogtle,, Chem. Ber.,113,457-470 (1980)の記載に基づいて行った。
２２１０ｍｌのジオキサンに４０３グラム（1.91モル）のＢ４（s=0)を溶解し、８０℃で２０分間加熱した。次いで、１６８グラム（4.20モル）の粉砕ＮａＯＨを３時間以内で徐々に加えた。３００ｍｌ（1.93モル）のビス（２−クロロエトキシエタン）を一回で加えると、温度は９５℃まで上がった。その後、反応混合液を９５℃で３０時間加熱した。高温の混合液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、２３４グラム（1.91モル）のＮａＣｌＯ4 を含む６４０ｍｌのメタノールで処理した。混合液を６０℃で３０分間攪拌し、約３００ｍｌまで濃縮した。８６０ｍｌの酢酸エチルを加え、室温で２０分間攪拌した。次いで混合液を室温で２時間放置した。
【００３５】
得られた沈殿物を濾過し、２００ｍｌの酢酸エチルで２回洗浄し、室温で３０分間乾燥すると、１９９グラムの軟質の白色粉末状のアザ−クラウンナトリウム過塩素酸塩錯体が得られた。この粉末を、６００ｍｌのジクロロメタン及び６００ｍｌの水との混合液に溶解し、その水相を４００ｍｌのジクロロメタンで再び抽出した。有機溶媒層を１つにして、６００ｍｌの脱イオン水で８回洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥した。ジクロロメタンを蒸発させると、100.4 グラムの褐色の油（収率１６％）が得られた。
1H NMR(CDCL3),δ(ppm):3.49(t,4H),3.68(t,16H),3.82(s,3H),6.88(m,3H),7.12(m,1H).
【００３６】
4-ホルミル-2- メトキシフェニルアザ-15-クラウン-5  Ｂ６（s=0,r=1)：
５００ｍｌの三つ口フラスコ内で、１００グラム（３０８ミリモル）のＢ５（s=0,r=1)を１４５ｍｌ（１８５０ミリモル）のジメチルホルムアミドに溶解し、−５℃に冷却した。滴下漏斗を使用して57.4ｍｌ（６１６ミリモル）のＰＯＣｌ3 を滴下して加えた。この時、フラスコ内部の温度が５℃を超えないようにした。次いで、室温で１６時間攪拌し、５００グラムの氷に注入し、Ｋ2 ＣＯ3 の飽和水溶液でｐＨ７に調整した。溶液を５００ｍｌのクロロホルムで２回抽出した。クロロホルム相を５００ｍｌの水で２回洗浄し、次いで、１００グラムのＭｇＳＯ4 で１時間乾燥した。溶媒を蒸発させると、８５グラムの薄黄色の油が得られた。薄黄色の油は、室温で一晩放置したところ、結晶化した。エチルアセテート／ヘキサン（１：４）で再結晶化し、５６グラムの薄オレンジ色の結晶（収率５１％）を得た。
1H NMR(CDCL3),δ(ppm):3.68(t,16H),3.78(t,4H),3.82(s,3H),7.05(m,1H),7.28(m,2H),9.78(s,1H).
【００３７】
１．２  本発明のモノアザ−クラウンエーテルの合成法
本発明のモノアザ−クラウンエーテルの合成方法を以下に示す。合成は、２つのルミノフォリック部分（アミノナフトールイミド及びキサンテノンそれぞれについて）について行った。以下に示す合成スキーム中、”Ｙ”はイオノフォリック部分を示す。
【００３８】
ルミノフォリック部分がアミノナフトールイミド基である場合の合成プロセスルミノフォリック部分とイオノフォリック部分との間のスペーサーとして１つのＣＨ2 基を有する本発明の化合物を合成するため、まず、化合物Ｃ１（即ち、前記合成スキームにおいてはＢ６であって、ＹはＢ５を表わす。）をオキシムＣ２に変換させ、Ｚｎの酢酸溶液を用いて還元し、アミンＣ３を得た。以下に概略的に示すように、Ｃ６とＣ７をＫ2 ＣＯ3 の存在下で、ジメチルホルムアミド中で反応させることによってアミノナフタルイミドＣ８を得、これとアミンＣ３を結合させ、本発明の化合物Ｃ９を合成した。
【００３９】
ルミノフォリック部分及びイオノフォリック部分間にスペーサーとして二つのＣＨ2 基を有する化合物を合成するために、まず最初に、化合物Ｃ１を酢酸アンモニウムの存在下で非常に多量のニトロメタンと反応させて化合物Ｃ４を得、更に化合物Ｃ４を、ＬｉＡｌＨ4 によってＴＨＦ中で還元し、アミンＣ５を得た。アミンＣ５とアミノナフタルイミドＣ８とを結合させ、化合物Ｃ１０を合成した。以下に合成スキームを示す。
【００４０】
【化１２】
0004065053.tif 000007
【００４１】
各反応ステップの説明
4-オキシミル-2- メトキシフェニルアザ-15-クラウン-5  Ｃ２（s=0,r=1)：
８０グラム（２２６ミリモル）のＢ６を含む５５０ｍｌのエタノールに、２０．４グラム（２９３ミリモル）のヒドロキシルアミン塩酸塩及び２０．４グラム（１４６ミリモル）のＫ2 ＣＯ3 を含む５５０ｍｌの水溶液を加えた。混合液を室温で１６時間、７０℃で３時間攪拌した。その後、エタノールを蒸発させ、残留物を５００ｍｌのクロロホルムと３００ｍｌの水との混合液に溶解した。水層を５００ｍｌのクロロホルムで抽出した。クロロホルム抽出液を１つにし、５００ｍｌの水で２回洗浄し、Ｋ2 ＳＯ4 で乾燥した。溶液を蒸発させ、８０．１グラムの黄色の油を得た（収率：９６％）。
【００４２】
4-アミノメチル-2- メトキシフェニルアザ-15-クラウン-5  Ｃ３（s=0,r=1)：
４５グラム（１２２ミリモル）のＣ２（s=0,r=2 それぞれ) を含む４５０ｍｌの酢酸に、冷却しながら、７８グラム（１１８０ミリモル）の亜鉛粉を徐々に加えた。この懸濁液を室温で１８時間、さらに７０℃で３時間攪拌し、濾過して２００ｍｌのエタノールで３回洗浄した。溶媒を蒸発させ、得られた油を３００ｍｌのクロロホルムと３００ｍｌの水の混合液に溶解し、６ＮのＫＯＨでｐH １２に調整した。水層を５００ｍｌのクロロホルムで洗浄し、Ｋ2 ＣＯ3 で乾燥した。溶媒を蒸発させると、３５．２グラムの茶色がかった黄色の油（収率７８％）が得られた。薄層クロマトグラフでは純度約７０％を示し、ニンヒドリンで処理するとスポットはブルーがかった赤色（bluishi-violet) に変わった。このアミンは、これ以上の精製を行うことなく、次の工程にそのまま使用した。
【００４３】
4-ニトロエチレニル-2- メトキシフェニルアザ-15-クラウン-5  Ｃ４（s=0,r=1)：
１００ｍｌの酢酸に、１８．８グラム（５０ミリモル）のＢ６（s=0,r=1)及び３８．５グラム（５００ミリモル）の酢酸アンモニウムを懸濁し、室温で１０分間攪拌した。次に、５９．４ｍｌ（１１００ミリモル）のニトロメタンを加えた。混合液を６０℃で５時間加熱し、次いで氷水に注入した。得られた結晶を濾過し、水で洗浄し、Ｐ2 Ｏ5 を使用して乾燥器で乾燥した。１１．９グラムの暗赤色の針状の生成物（収率６０％）が得られた。
1H NMR(CDCL3),δ(ppm):3.68(t,16H),3.78(t,4H),3.82(s,3H),6.88(m,1H),7.08(m,2H),7.45(d,1H),7.85(d,2H).
【００４４】
4-アミノエチル-2- メトキシフェニルアザ-15-クラウン-5  Ｃ５（s=0,r=1)：
５００ｍｌの三つ口フラスコ中の２００ｍｌテトラヒドロフランに、３．８グラム（１００ミリモル）のＬｉＡｌＨ4 を徐々に加えた。次いで４グラム（１０ミリモル）のＣ４（s=0,r=1 それぞれ）を含む５０ｍｌテトラヒドロフランを２時間内で滴下した。混合液を還流しながら４時間加熱し、次いで氷浴中で冷却した。未反応のＬｉＡｌＨ4 を分解するために、６ＮのＫＯＨを加えた。次いで、濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物を１５０ｍｌのクロロホルムに溶解し、１５０ｍｌの水で２回洗浄し、１５グラムのＫ2 ＣＯ3 で乾燥した。溶媒が蒸発すると、４．９グラムのオレンジ色の油（収率１２５％）が得られた。薄層クロマトグラフでは約８０％の純度を示し、ニンヒドリンで処理すると、スポットはブルーがかった赤色（bluish  violet) に変わった。このアミンは、これ以上精製することなく、そのまま使用した。
【００４５】
4-クロロ-N-(4-カルボキシフェニルメチル)-1,8-ナフタルイミド  Ｃ８：
４６．４グラム（２００ミリモル）の４- クロロ-1, ８- ナフタレン酸無水物Ｃ７、３０．２グラム（２００ミリモル）の４- アミノメチル安息香酸Ｃ６及び１３．８グラム（１００ミリモル）のＫ2 ＣＯ3 を、２リットルのジメチルホルムアミドに懸濁し、室温で１６時間、６０℃で６時間攪拌した。次に混合液を４リットルの水に注入し、６ＮのＨＣＩを用いてｐＨ４に調整した。得られた沈殿物はろ取し、６０℃で１８分間乾燥すると、３６グラムのオフホワイト色の粉末（収率５１％）が得られた。
【００４６】
4-｛4'-[4''-C-( アザ-15-クラウン-5)-3''-メトキシフェニルメチルアミノ]-1',-8'- ナフタルイミジルメチル｝- 安息香酸Ｃ９：
３．６８グラム（１０ミリモル）のＣ３、５．０５グラム（７０％、１０ミリモル）のＣ８（r=1,s=0 ) 、及び３．２５グラム（２５ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンを、２５ｍｌのＮ−メチルピロリジノンに懸濁し、１１０℃で１５時間加熱し、次いで冷却して、４７５ｍｌの２％酢酸中に注入した。得られた沈殿物をろ取し、１００ｍｌの水で２回洗浄し、Ｐ2 Ｏ5 を使用して乾燥器で１８時間乾燥すると、Ｃ３と生成物との混合物である４．６グラムの茶色がかった黄色の固体が得られた。
【００４７】
この固体を、加熱されたクロロホルム／メタノール（３：１）の混合液に溶解し、その後、濾過した。濾液を６０グラムのシリカゲル１００が充填されたカラムに注入し、クロロホルム／メタノール（３：１）で洗浄し、未反応のＣ３を除去した。その後、１％の酢酸を含むクロロホルム／メタノール（３：１）で溶出させると、０．５８グラム（収率８．５％）の所望の生成物が得られた。
1H NMR(D3CS(=0)CD3),δ(ppm):3.25(t,4H),3.50(t,16H),3.75(s,3H),4.15(t,1H),4.58(d,2H),5.25(s,2H),6.78(d,1H),6.88(m,2H),7.38(d,2H),7.55(m,2H),7.82(d,2H),8.20(d,2H),8.50(m,1H),8.80(d,1H).
Ｃ42Ｈ49Ｎ3 Ｏ13  計算値（ジアセテート）：C62.75;H6.14;N5.23. 、元素分析値：C62.37;H6.09;N5.12.
【００４８】
4-｛4'-[4''-C-( アザ-15-クラウン-5)-3''-メトキシフェニルメチルアミノ]-1',-8'- ナフタルイミジルメチル｝- 安息香酸  Ｃ１０：
１．８５グラム（５ミリモル）のＣ５、２．６２グラム（８０％、１０ミリモル）のＣ８（r=1,s=0 それぞれ) 、及び１．６３グラム（１２．５ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンを、１２．５ｍｌのＮ−メチルピロリジノンに懸濁し、１１０℃で１５時間加熱した。次に、冷却後、２３８ｍｌの２％の酢酸に注入した。その結果生じた沈殿物を濾過し、５０ｍｌの水で洗浄し、Ｐ2 Ｏ5 を用いて乾燥器で１８時間乾燥すると、Ｃ５と生成物との混合物である１．８グラムの茶色がかった黄色の固体が得られた。この固体を、１００ｍｌの加熱されたクロロホルム／メタノール（９：１）の混合液に溶解し、その後、濾過した。濾液を１８０グラムのシリカゲル１００が詰められたカラムに注入し、未反応のＣ５を除去し、１％の酢酸を含むクロロホルム／メタノール（９：１）で洗浄して、０．５２グラム（収率１４．９％）の所望の生成物を得た。
1H NMR(D3CS(=0)CD3),δ(ppm):2.90(t,2H),3.25(t,4H),3.50(t,16H),3.60(t,2H),3.75(s,3H),4.45(t,1H),5.25(s,2H),6.78(d,1H),6.88(d,1H),6.95(d,1H),7.25(m,2H),7.65(d,1H),7.80(d,2H),7.95(t,1H),8.25(d,1H),8.45(d,1H),8.75(d,1H).
ＦＡＢＭＳ（70eV, m-nitrobenzylalcohl dispersion  with  LiJ): 711(15%),(M+2Li-H);670(31%),(M-CO2-H+2Li);313(100%)(phenylaza-crown+Li)
【００４９】
ルミノフォリック部分がキサンテノン基である場合の合成プロセス
以下に、合成スキームを示す。
【００５０】
【化１３】
0004065053.tif 000008
【００５１】
8-[4'-C-( アザ-15-クラウン-5)-3'- メトキシフェニル]-2,3,7-トリヒドロキシ発光体-6- オン  Ｄ３(r=1,s=0):
６．５１グラム（２５ミリモル）のトリアセトキシベンゼンを含む６０ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）エタノール懸濁液に、５ｍｌの高濃度Ｈ2 ＳＯ4 を滴下し、１０分間攪拌した後、４．４２グラム（１２．５ミリモル）のＢ６(s=0.r=1) を一回で加えた。この懸濁液を８０℃で２２時間加熱した。その結果、エタノールのバルクは蒸発した。残留物を５０ｍｌの水で希釈し、２５％のテトラメチルアンモニウム水酸化物でｐＨ５に調整し、一晩放置した。液体をデカントし、赤色の固体を５０ｍｌの水で３回洗浄し、５０ｍｌのメタノールで３回こすった（trituration)。溶媒は蒸発させ、４．２グラム（３３．５％）の赤色の泡状の生成物が得られた。この生成物をこのまま次のステップで利用した。
【００５２】
8-[4'-C-( アザ-15-クラウン-5)-3'- メトキシフェニル]-2,3,7-トリ-t- ブトキシカルボニルメチル発光体-6- オン  Ｄ４(r=1,s=0):  
１．１４グラム（２ミリモル）のＤ３（r=1,s=0)、１．００グラム（６ミリモル）のヨウ化カリウム（ＫＪ）、１．７６グラム（９ミリモル）のＫ2 ＣＯ3 及び１．７６グラム（９ミリモル）のｔ−ブチルブロモアセテートを、１０ｍｌのジメチルフォルムアミドに懸濁し、１１０℃で１時間加熱した。混合液を冷却後、９０ｍｌの水で希釈した。この溶液を、８０ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、１６０ｍｌの水で３回洗浄し、Ｋ2 ＣＯ3 で乾燥した。溶液を蒸発させたところ、１．５グラムの濃い赤色のガム様の物質が得られた。粗生成物質を、シリカゲル１００でクロロホルム／メタノール（９：１）を用いて精製し、０．９５グラムの油を得た。
【００５３】
8-[4'-C-( アザ-15-クラウン-5)-3'- メトキシフェニル]-2,3,7-トリカーボキシメチルフロア-6- オン  Ｄ５: 
０．９３グラム（１．１ミリモル）のＤ３（ｒ＝１、ｓ＝０）を２．５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、０．５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた。この混合液を４０℃で４時間加熱した。その後、溶媒およびＴＦＡを蒸発させて、残留物を１０ｍｌのメタノールに溶解し、メタノールを蒸発させた。この操作を３回繰り返し、ＴＦＡを完全に除去したところ、０．８７グラムの赤色のガム様の物質が得られた。このガム様の物質は、以下に説明する固定化反応にそのまま利用した。
【００５４】
２．本発明によるモノアザ−クラウンエーテルの発光特性
図１〜図４に、所定のアルカリイオン濃度の関数として、セルロースに固定化された本発明の化合物の溶液中におけるルミネセンス特性を示した。表の縦軸はそれぞれの相対的ルミネセンス強度を示す。
【００５５】
図１に、本発明のモノアザ−クラウンエーテルＣ９の水溶液（2X10-5モル／リットル；３０ミリモル／リットル  トリス／ＨＣｌ緩衝液；ＣＯ2 −ｆｒｅｅ；ｐＨ＝７．４；３７℃）の相対的発光強度を示す。各々の水溶液のナトリウム濃度は、０，５０，１００，１５０，２００ミリモル／リットルである。横軸は波長（nm；水平座標）を示す。
励起スペクトル（左側）及び発光スペクトル（右側）は、市販されている蛍光分光光度計を使用して測定した。
【００５６】
図２は、アミノセルロース上に共有結合的に固定化された本発明のモノアザ−クラウンエーテルＣ９の相対的発光強度を示す。
セルロース繊維上への固定化は、以下のようにして行なった。
０．０３ミリモルのクラウンエーテルＣ９、０．０６グラム（０．３ミリモル）のＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル−１，３−カルボジイミド、０．４グラム（０．３ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシンイミド、及び５グラムの活性化されたセルロース（ＳＵ−Ａ−１，０２８，６７７、ＣＡ９９：１７７７２３ｈに記載された方法に基づいて製造されたもの）を２mlのジメチルホルムアミド中で２０時間懸濁した。セルロースをろ取し、５mlのジメチルホルムアミドで５回、５mlの水で１回、５mlの０．２ＮのＨＣｌで２回、５mlの水で１回、５mlの０．２ＮのＮａＯＨで２回、５mlの水で１０回、５mlのアセトンで２回、及び５mlのエーテルで２回洗浄し、室温で１６時間乾燥した。次に、セルロースをふるい分けした（２５μｍ）。
【００５７】
センサーディスクは以下の方法で製造した。
クラウンエーテルＣ９が固定化している０．２５グラムのアミノセルロース繊維（２５μｍに篩い分けしたもの）を９０％のエタノール水溶液中の４．７５グラムの１０％ハイドロゲルＤ４（Tyndale Plains-Hunter LTD. Ringoes, NJ 08551) 中に１６時間懸濁した。得られた均一の分散液をポリエステルホイル(Melinex  foil, ICI America)上に乾燥密度が１０μｍとなるように塗布した。このホイルを３％の活性炭で被覆し、１０％のハイドロゲルを乾燥密度で５μｍとし、直径２．５cmの小さなディスクを切りとった。このディスクを１６時間以上緩衝液中に放置し、活性化した。
【００５８】
センサーディスクの切り取り方法及び測定する方法は、M. J. P. Leiner and P. Hartmann, Sensors and actuators B, 11(1993), 281-189(" Theory and Practice in optical pH sensing ”) に記載されている方法に従った。
【００５９】
このようにして得られたセンサーディスクを用いた測定装置の概略を図６に示す。
図６において、Ｓはセンサーディスクの一部を意味する。セルロース繊維に固定化された化合物は、Ｉで示され、ハイドロゲル（Ｍ層）中に存在している。このＭ層はイオン透過性であり、キャリアＴに支持されている。キャリアＴは、励起光及び測定放射光を透過する透明なホイルである。
本発明では、化合物Ｉはイオン透過性マトリックスに直接共有結合で結合していてもよいし、物理的に溶解した状態でマトリックス中に存在していてもよい。測定に際しては、センサーディスクを光を通さないサーモスタット付きの通過セル(through-flow cell) に挿入し、異なった濃度のナトリウムイオンを有するサンプルＰに接触させた。
【００６０】
用いた光学的測定システムは、光源Ａとして青色のＬＥＤ、検出器としてのフォトダイオードＭ、波長を選択するための光学的フィルターＡ及びＦ、及び励起光をポリマーＭまで伝導するため及び放射光を電子信号処理用素子 (表示せず) のような光検知器Ｍまで伝導するための、繊維光学配置から構成されている。励起光の端において、干渉フィルター（４８０ｎｍにおいて最大透過度を示す）を利用し、照射光端において５２０ｎｍの遮断フィルターを利用した。
【００６１】
図２に、種々のナトリウムイオン濃度（１０、５０、１００、１２４、１４４、１６４、１８４、３００、５００、及び１０００ミリモル／リットル；横座標；対数目盛）に対する関数として、相対的ルミネセンス強度を示した。測定媒体は、３０ミリモル／リットルのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ＣＯ2 フリー；ｐＨ＝７．４；３７℃）であった。
【００６２】
図３に、モノアザ−クラウンエーテルＣ９の代わりにモノアザ−クラウンエーテルＣ１０を用いた場合の結果を示した。
【００６３】
図４に、本発明のモノアザ−クラウンエーテルＤ５の水溶液（2X10-5モル／リットル；３０ミリモル／リットル  トリス／ＨＣｌ緩衝液；ＣＯ2-−ｆｒｅｅ；ｐＨ＝７．４；３７℃）の相対的発光強度を示す。各々の水溶液のナトリウム濃度は、０，１００，２００ミリモル／リットルである。横軸は波長（nm）を示す。
【００６４】
図５に、モノアザ−クラウンエーテルＣ９の代わりにモノアザ−クラウンエーテルＦ５を用いて図２と同様にして得られたグラフを示す。ナトリウムイオン濃度は、１，５０，１００，１３８，１８２，３００ミリモル／リットルである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のモノアザ−クラウンエーテルの励起スペクトル強度および発光スペクトル強度のアルカリイオン濃度依存性を示すグラフの一例である。
【図２】本発明のモノアザ−クラウンエーテルを用いたセンサーディスクのルミネセンス特性とアルカリイオン濃度の相関を示すグラフの一例である。
【図３】本発明のモノアザ−クラウンエーテルを用いたセンサーディスクのルミネセンス特性とアルカリイオン濃度の相関を示すグラフの一例である。
【図４】本発明のモノアザ−クラウンエーテルの励起スペクトルおよび発光スペクトル強度のアルカリイオン濃度依存性を示すグラフの一例である。
【図５】本発明のモノアザ−クラウンエーテルを用いたセンサーディスクのルミネセンス特性とアルカリイオン濃度の相関を示すグラフの一例である。
【図６】本発明のモノアザ−クラウンエーテルを利用したセンサーディスクの構成の一例である。
【図１】
0004065053.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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