(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
0004031045.tif 000029
（式中、Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ11（ここで、Ｒ11は直鎖Ｃ1〜Ｃ23基、又は分枝鎖Ｃ3〜Ｃ23基であり、前記直鎖Ｃ1〜Ｃ23基又は分枝鎖Ｃ3〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基は非置換又は置換であり、０〜６個の不飽和部位を有し、０〜５個の異種原子を含有するか、あるいは環状基又はアリール基を含有し、前記環状基又はアリール基は０〜５個の異種原子を含有する）であり、
Ｙ1は、Ｏ、ＮＨ、Ｓｅ又はＮＲ11（ここで、Ｒ11は先に定義したものと同じである）であり、
Ｙ2及びＹ3は、別々に、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ11（ここで、Ｒ11は先に定義したものと同じである）であり、
Ｚは、Ｈ、先に定義したＲ11、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はＲ10（ここで、Ｒ10は下記の構造式：
0004031045.tif 000030
（式中、Ｒ5〜Ｒ9は別々に、存在しないか、Ｈであるか、アミノ酸、直鎖Ｃ1〜Ｃ23基、又は分枝鎖Ｃ3〜Ｃ23基であり、前記直鎖Ｃ1〜Ｃ23基又は分枝鎖Ｃ3〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基は非置換又は置換であり、０〜６個の不飽和部位を有し、０〜５個の異種原子を含有するか、あるいは環状基又はアリール基を含有し、前記環状基又はアリール基は０〜５個の異種原子を含有し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、ＣＨ又はＣＲ11（ここで、Ｒ11は先に定義したものと同じである）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、又はＳｅであり、
Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｒ1は、Ｃ8Ｈ17、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25又はＣ14Ｈ29であり、
Ｒ2及びＲ3は別々に、Ｈ、直鎖Ｃ5〜Ｃ23基又は分枝鎖Ｃ5〜Ｃ23基であり、前記直鎖又は分枝鎖Ｃ5〜Ｃ23基がアルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基は非置換又は置換され、０〜６個の不飽和部位を有し、０〜５個の異種原子を含有するか、あるいは環状基又はアリール基を含有し、前記環状基又はアリール基が０〜５個の異種原子を含有し、
ｎは１〜１０であり、
ｐ1は２〜４であり、
ｐ2及びｐ3は別々に、１〜４であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである）で表される
四級窒素化合物。但し、当該化合物は、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンではなく、Ｘが存在しない場合、ＺはＲ10であり、かつ、ＡがＯである場合、Ｒ7及びＲ8は存在せず、かつ、Ｒ6は、Ｈ又は存在しないかのいずれでもない。
【請求項２】
Ｙ1はＯ、ＮＨ又はＳｅであり、
Ｙ2及びＹ3は別々に、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ2及びＲ3は別々に、Ｈ、Ｃ8Ｈ17、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25又はＣ14Ｈ29であり、
Ｙ1はＯであり、そして
Ｙ2及びＹ3は別々に、存在しないか又はＯであり、但し、Ｙ2はＯである場合、Ｒ2はＣ8Ｈ17、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25又はＣ14Ｈ29であり、Ｙ2は存在しない場合、Ｒ2はＨであり、Ｙ3はＯである場合、Ｒ3はＣ8Ｈ17、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25又はＣ14Ｈ29であり、そしてＹ3が存在しない場合、Ｒ3はＨである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＺはＲ10であり、
ＡはＯ又はＮであり、そして
ＴはＮ、Ｓ又はＯである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
ＧはＯ又はＮである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＺはＲ10であり、
ＧはＣＨであり、
Ｒ5はＨであり、そして
ＴはＯである、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙ1はＯであり、
Ｙ2及びＹ3は存在せず、
Ｒ2はＨであり、
ｐ1は２〜４であり、
ｐ2及びｐ3は１であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである、請求項１に記載の化合物。但し、当該化合物は、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでなく、かつ、Ｘが存在しない場合、ＺはＲ10であり、かつ、ＡがＯである場合、Ｒ7及びＲ8は存在せず、かつ、Ｒ6はＨ又は存在しないかのいずれでもない。
【請求項８】
ＸはＮＨ又はＳである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ｐ1は３又はそれ以上である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1はＣ14Ｈ29である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
ＺはＨであり、かつ、ＸはＯ及びＮＨから成る群から選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ｎは２〜６である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＸはＯである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｙ2は存在せず、
Ｙ1は、Ｏ、ＮＨ、Ｓｅ又はＮＲ11であり、そしてＹ3は、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ11であり、
Ｒ2はＨであり、
Ｒ3は、直鎖Ｃ5〜Ｃ23基又は分枝鎖Ｃ5〜Ｃ23基であり、前記直鎖又は分枝鎖Ｃ5〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基は非置換又は置換され、０〜６個の不飽和部位を有し、０〜５個の異種原子を含有するか、あるいは環状基又はアリール基を含有し、前記環状基又はアリール基が０〜５個の異種原子を含有し、
ｐ2は１である、請求項１に記載の化合物。但し、前記化合物は、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでなく、かつ、Ｘが存在しない場合、ＺはＲ10であり、かつ、ＡがＯである場合、Ｒ7及びＲ8は存在せず、かつ、Ｒ6はＨ又は存在しないかのいずれでもない。
【請求項１５】
ＸはＯ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、かつ、Ｙ1はＯ、ＮＨ、Ｓｅ又はＮＲ11であり、そしてＹ3は、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｙ1及びＹ3はＯである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
ｐ1及びｐ3は２である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ1及びＲ3はＣ10Ｈ21である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
ＺはＨであり、そしてＸはＯ及びＮＨから成る群から選択される、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ1及びＲ3はＣ12Ｈ25である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２１】
ＺはＨであり、ＸはＯ及びＮＨから成る群がら選択される、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｘは存在せず、かつ、Ｒ10はＮＨ−リジンアミドであり、かつ、ｎが３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｘは存在せず、かつ、Ｒ10はＮＨ−α（ベンジルオキシカルボニル）リジンアミドであり、かつ、ｎは３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｘは存在せず、かつ、Ｒ10はＮＨ−ε（カルボベンジルオキシ）リジンアミドであり、かつ、ｎは３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｘは存在せず、かつ、Ｒ10はＮＨ−グリシンアミドであり、かつ、ｎは３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｘは存在せず、かつ、Ｒ10はＮＨ−オルチニンアミドであり、かつ、ｎは３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｘは存在せず、かつ、Ｒ10はＮＨ−α（ベンジルオキシカルボニル）オルニチンアミドであり、かつ、ｎは３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｘは存在せず、かつ、Ｒ10はＮＨ−ε（カルボベンジルオキシ）オルニチンアミドであり、かつ、ｎは３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ1及びＲ3はＣ14Ｈ29である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項３０】
ＺはＨであり、Ｘは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｘは存在しないか又はＯであり、ＺはＨであり、かつ、ｎは２である、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｙ1はＯ、ＮＨ、Ｓｅ又はＮＲ11であり、そしてＹ2及びＹ3は別々に、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ11（ここで、Ｒ11は先に定義したものと同じである）であり、
Ｒ2及びＲ3は別々に、直鎖Ｃ5〜Ｃ23基又は分枝鎖Ｃ5〜Ｃ23基であり、前記直鎖又は分枝鎖Ｃ5〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基は非置換又は置換され、０〜６個の不飽和部位を有し、０〜５個の異種原子を含有するか、あるいは環状基又はアリール基を含有し、前記環状基又はアリール基が０〜５個の異種原子を含有し、
ｐ1、ｐ2及びｐ3は別々に、２〜４であり、
Ｗは製薬上許容可能な陰イオンである、請求項１に記載の化合物。但し、当該化合物は、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでなく、かつ、Ｘが存在しない場合、ＺはＲ10であり、かつ、ＡがＯである場合、Ｒ7及びＲ8は存在せず、かつ、Ｒ6はＨ又は存在しないかのいずれでもない。
【請求項３３】
ＸはＯ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、かつ、Ｙ1はＯ、ＮＨ、又はＳｅであり、そしてＹ2及びＹ3は別々に、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はＯである、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
ｐ1、ｐ2及びｐ3は２である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はＣ12Ｈ25である、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
ＺはＨであり、かつ、ＸはＯ及びＮＨから成る群から選択される、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はＣ10Ｈ21である、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３９】
ＺはＨであり、かつ、ＸはＯ及びＮＨから成る群から選択される、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はＣ8Ｈ17である、請求項３５に記載の化合物。
【請求項４１】
ＺはＨであり、かつ、ＸがＯ及びＮＨから成る群から選択される、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
ＸはＯであり、
ＺはＲ10であり、
ＡはＯ又はＮであり、そして
ＴはＮ、Ｓ又はＯである、請求項３３に記載の化合物。
【請求項４３】
ＧはＯ又はＮである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｘは存在せず、
ＺはＲ10であり、
ＧはＣＨであり、
Ｒ5はＨであり、そして
ＴはＯである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項４５】
細胞内に分子をデリバリーする方法であって、当該方法は、細胞を、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の陽イオン脂質の有効量を含む配合品と、接触させて、当該脂質との複合体を形成せしめるステップ、及び細胞を当該脂質複合体と接触させるステップを含み、ここで生物学的有効量の前記分子が前記細胞内に挿入され、かつ、前記細胞が、ネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタ又はウサギ動脈内、レンカ腫瘍又は皮下腫瘍アッセイから成る群から選択されるアッセイ法において存在する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、複合両親媒性脂質に関する。本発明は特に、四級アンモニウム基を含む陽イオン性複合脂質に関する。
発明の背景
陽イオン性脂質は、一般に１つ又はそれ以上の炭化水素又はアルキル基から成る親油性部位、及び少なくとも１つの正に荷電した極性先端基から成る親水性部位を有する両親媒性分子である。陽イオン性脂質は、正の実効電荷複合体を形成することにより細胞の形質膜を通して細胞質中への高分子の輸送を促すのに有用である。インビトロと同様にインビボで実行し得る方法はトランスフェクションとして公知であり、このような技法に用いられる陽イオン性脂質は、サイトフェクチンとして公知である。
トランスフェクション効率を統計学的有意程度に増強するサイトフェクチンが有益である。裸ＤＮＡを用いて得られるより２倍程度活性が増大すれば有益であるが、好ましくはトランスフェクション効率は５〜１０倍増大し、さらに好ましくはトランスフェクション効率は１０倍増強される。
典型的には、２つの両親媒性脂質種は組合せると、サイトフェクチン単独よりもトランスフェクション時に有効である定序脂質二重層から成る小胞を形成し得るということが判明しているため、サイトフェクチンは天然両イオン性脂質、例えばリン脂質と組合せされる。これらの小胞又はリポソームは、それらが、ポリヌクレオチド又は負に荷電したタンパク質のようなその他の陰イオン性分子と複合体を形成するのを可能にする表面の多数の正電荷を有する。ポリヌクレオチド／サイトフェクチン／中性脂質複合体の表面に残存する陽イオン性実効電荷は、細胞膜表面の主な負電荷と強力に相互作用し得る。
両親媒正特性の基本的特徴及び極性先端基とは別に、サイトフェクチンは親油性及び親水性部位にかなりの構造的多様性を有する。多数の異なるサイトフェクチン種が、トランスフェクションに用いるために合成されており、現在市販されている。このようなサイトフェクチンとしては、例えばリポフェクチンＴＭ、リポフェクチンＡＣＥＴＭ、リポフェクトＡＭＩＮＥＴＭ、トランスフィークタムＴＭ及びＤＯＴＡＰＴＭが挙げられる。有効なサイトフェクチンの構造的多様性は、サイトフェクチンの構造−機能−識別局面が細胞中での明確な用途に関して異なるという所見を、ある程度反映する。ＤＯＴＭＡ化合物と構造的に類似のサイトフェクチンを用いた経験は、トランスフェクション活性が部分的にトランスフェクトされる細胞型に依っていることを示す（Felgner et al. J. Biol. Chem.84:7413-7417, 1987; Wheeler et al. Biochem. Biophys. Acta, 印刷中）。特に、アンモニウム基のスペルミン置換から成る陽イオン性脂質は、いくつかの細胞株のトランスフェクションに関してＤＯＴＭＡより有効であることを立証した。この現象は、有効なトランスフェクションが陽イオン性脂質複合体と形質膜の構造的脂質二重層との受動融合だけでなく、細胞成分と個々の陽イオン性脂質種との間の特異的細胞特性及び相互作用にも依っていることを示唆する。
したがって、サイトフェクチン種の間の構造異体は、サイトフェクチンと細胞との多面的且つ複雑な相互作用のより高度の理解の、そして１つ又はそれ以上のこれらの相互作用の利点を得るための研究者の側の努力の指標である。
エプステイン（Epstein）に付された米国特許第５，０４９，３８６号に開示されたＤＯＴＭＡ、即ちＮ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムは、開発された最初の陽イオン性脂質の１つであって、この群の脂質は、新規の構造異体の開発において比較サイトフェクチン能力を評価する場合の参照化合物になっている。ＤＯＴＭＡ脂質は、分子のプロピル主鎖にエーテル結合された一対のＣ18炭化水素のと一緒に分子の陽イオン性部位を提供する四級窒素を有するプロパンアンモニウム基により特徴付けられている。四級窒素は、メチル基のような相対的に短いアルキル鎖により三置換化される。構造的に類似の陽イオン性脂質、１，２−ビス（オレオイロキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）はエーテル結合アルキル基よりむしろアシルを包含し、標的細胞によってより容易に代謝されると考えられる。陽イオン性脂質のいくつかの種類、例えばアルキル基又はアシル基により直接置換されるアンモニウム塩は、主に経済的理由から開発された（Roseに付された米国特許第５，２７９，８３３号）。他のものは、低毒性作用を提供するために努力して開発された。例えば、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンから合成された高生物適合性サイトフェクチン：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスフォコリン（Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, Cat. Nos. 890700-706）。
Felger他に付された米国特許第５，２６４，６１８号は、ホスホリパーゼＡのローゼンタール阻害剤（ＲＩ）（Rosenthal et al., J. Biol. Chem. 235:2202-2206,1960）及びそのジアシル−又はアルキル／アシル−種と構造的に類似したサイトフェクチンを開示する。ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンは、四級窒素と結合した次式：
0004031045.tif 000002
の置換基を有することを特徴とする。
ＲＩベースシリーズの化合物は、以下のパターンを有する頭文字語により公知である：ＤＯＲＩＥ（Ｃ18）；ＤＰＲＩＥ（Ｃ16）；及びＤＭＲＩＥ（Ｃ14）。これらの頭文字語は共通の基本的化学構造を意味する。例えば、ＤＭＲＩＥは１−プロパナミニウム，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−，ブロミド，（＋）−（ＣＡＳ登録：１４６６５９）；他のものは、それらの置換アルキル基で異なる。四級アンモニウム基に極性ヒドロキシエチル置換基を有するこれらのサイトフェクチンは、多くの場合においてＤＯＴＭＡ型化合物より有効なトランスフェクションを提供する。ＲＩサイトフェクチンのトランスフェクション効能に及ぼすヒドロキシアルキル部分の置換基及びアルキル鎖長の変動の作用の研究は、Felgner他において供されている（J. Biol. Chem. 269: 2550-2561, 1994）。この研究はさらに、最適ヒドロキシルアルキル鎖長が細胞型依存性であることを示した。
ＤＭＲＩＥのβＡＥ−ＤＭＲＩＥへの転換（Wheeler et al., Biochem. Biophys. Acta、印刷中）は、サイトフェクチン活性に有意の作用を及ぼすことが判明した。一級アルコールに隣接して四級窒素を有し、したがってｐＨ非依存性正電荷を付与するＤＭＲＩＥは、現在公知の最も高活性のサイトフェクチンの１つである。しかしながら、βＡＥ−ＤＭＲＩＥを生じるようＤＭＲＩＥ上のアルコールを一級アミン基に置換すると、ＤＭＲＩＥの場合とは構造的に全く別のＤＮＡ複合体を生成することが判明したが、βＡＥ−ＤＭＲＩＥはヘルパー補脂質の非存在下で有効に多数の細胞株をトランスフェクトし得る。サイトフェクチン骨格内での単一置換がトランスフェクション特性の顕著な変化を提供し得るという所見は、その他の変異例が遺伝子受渡しにおけるほぼ同様の改善をもたらし得ることを示唆する。
トランスフェクション関連の継続中の研究は、陽イオン性脂質が機能性分子の細胞の細胞質中への流入を促すだけでなく、さらに有益な能力：例えばリソソーム分解からの機能性分子の保護、核区画中への流入促進、又は細胞質酵素によるＲＮＡ転写産物の分解抑制さえ提供し得ることを示す。陽イオン性分子のこれらの機能は、特定の構造的特徴に関連すると考えられる。したがって、特定細胞型中への外来分子のトランスフェクションに特に適したサイトフェクチンが必要である。さらに、特定の細胞内機能を実行し得るサイトフェクチンを開発する必要がある。
発明の概要
本発明は、四級窒素を保有するという共通の特徴を有する新規の種類のサイトフェクチンを提供する。
本発明の一実施形態は、次式：
0004031045.tif 000003
（式中、Ｒは、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは各々が０〜５個の異種原子を含有する環状基又はアリール基であり、
Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＲ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、ＮＲ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ又は上記と同様のＲであり、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＮＨＲ、上記と同様のＲ、あるいはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド又はヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000004
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨ又はＣＲであり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであり、
ｎは、０〜１０であり、
ｍは、０〜４であり、
ｐとｑの合計は４である）
を有する化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
上記の構造の化合物の一実施形態では、
Ｘは存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ又はＲ（ここで、ＲはＨであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは各々が０〜５個の異種原子を含有する環状基又はアリール基である）であり、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＮＨ、上記と同様のＲ、あるいはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド又はヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤、あるいは以下の構造式：
0004031045.tif 000005
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含する）である。
好ましい実施形態では、ｎは１〜１０であり、ｍは２〜４である。別の好ましい実施形態では、ＸはＯである。さらに好ましい実施形態では、ｑは１、２又は３である。ＺはＨ及びＹは存在しないのが有益である。
本発明の別の実施形態は、次式：
0004031045.tif 000006
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は別々にＨ、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、
Ｘ1、Ｘ2及びＸ3は別々に、存在しないかあるいはＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ（ここでＲはＲ1、Ｒ2及びＲ3に関して上記記載したものと同様である）であり、
Ｒ4は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2又は以下の構造式：
0004031045.tif 000007
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨ又はＣＲ（ここで、Ｒは上記のＲ1、Ｒ2及びＲ3に関して記載されたものと同様である）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
ｍ、ｐ及びｑは別々に０〜４であり、
ｎは０〜１０であり、
Ｗは製薬上許容可能な陰イオンである）
の化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
前述の構造式の化合物の一実施形態では、Ｘ1、Ｘ2及びＸ3は別々に、存在しないかあるいはＯ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅである。
本発明の別の態様は、次式：
0004031045.tif 000008
（式中、Ｘは存在しないか、あるいはＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ（ここで、Ｒは下記と同様である）であり、
Ｙは存在しないか、あるいはＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ（ここで、Ｒは下記と同様である）であり、
Ｚは、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいはアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000009
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、ＣＨ又はＣＲであり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｒは、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、
ｎは０〜１０であり、
ｐは０〜４であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである）
の四級窒素化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
上記の構造式の化合物の一実施形態では、Ｘは存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、Ｙは存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅである。好ましい実施形態では、ＹはＯである。上記の構造式のさらに別の好ましい実施形態では、ｐは２である。
さらに別の好ましい実施形態、即ちＭＥＭＯ類の化合物では、ＲはＣ14Ｈ29である。好ましくは、上記の構造式では、ＺはＨであり、そしてＸは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。ＭＥＭＯ類のさらに好ましい化合物では、ｎは２〜６である。
本発明のさらに別の実施形態は、次式：
0004031045.tif 000010
（式中、Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1及びＲ2に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｙ1及びＹ2は別々に、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1及びＲ2に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｚは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいはアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000011
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、ＣＨ又はＣＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1及びＲ2に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｒ1及びＲ2は別々に、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、
ｎは０〜１０であり、
ｐ1及びｐ2は別々に、０〜４であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである）
を有するＤＥＸＯシリーズの化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
上記の構造式の化合物の一実施形態では、Ｘは存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、Ｙ1及びＹ2は別々に、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅである。さらに好ましいＤＥＸＯ化合物では、ｐ1及びｐ2は２である。
ＤＥＸＯシリーズの好ましい化合物は、ＲがＣ10Ｈ21であるＤＥＤＯ類の化合物である。ＤＥＤＯ類の好ましいものは、ＺがＨであり、Ｘが非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択されるものである。さらに好ましいＤＥＤＯ化合物では、ｎは２〜１０である。ＺはＨであり、ＸはＮＨであり、ｎは３であり、ｐ1及びｐ2は２であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＰＡ−ＤＥＤＯが、ネズミ肺アッセイでのＤＥＤＯ類の最も活性なものであるが、しかしこのアッセイにおけるその活性はＤＥＬＯ類のいくつかのものの活性ほど大きくない。
ＤＥＸＯシリーズのさらに好ましい実施形態は、ＲがＣ12Ｈ25であるＤＥＬＯ類の化合物である。ＤＥＬＯ類の有益なものは、ＺがＨであり、Ｘが非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択されるものである。さらに別の有益なＤＥＬＯ類化合物は、ｎが２〜１０であるものである。ＺはＨであり、ＸはＮＨであり、ｎは６であり、ｐ1及びｐ2は２であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＨＡ−ＤＥＬＯがネズミ肺アッセイで特に有効であり、比較した場合にＤＥＭＯ、ＤＥＬＯ、ＤＥＤＯ、ＴＥＬＯ及びＴＥＣＯ化合物より大きい活性を示す。ＸはＮＨであり、Ｚはグリシンアミドであり、ｎは３であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＧｌｙ−Ｐ−ＤＥＬＯも、ネズミ肺アッセイで有効であることが判明した。ＺはＨであり、ＸはＮＨであり、ｎは３であり、ｐ1及びｐ2は２であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＰＡ−ＤＥＬＯは、ブタ動脈内アッセイで有効であることが判明した。
ＤＥＸＯシリーズのさらに好ましい実施形態は、ＲがＣ14Ｈ29であるＤＥＭＯ類のものである。
ＤＥＭＯの好ましいものでは、ＺはＨであり、Ｘは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。ＤＥＭＯのさらに好ましいものでは、ｎは２〜１０である。ＺがＨであり、ＸはＮＨであり、ｎは３であり、ｐ1及びｐ2は２であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＰＡ−ＤＥＭＯは、ネズミ腹腔内アッセイで特に有効であることが判明した。
本発明のさらに別の実施形態は、次式：
0004031045.tif 000012
（式中、Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1、Ｒ2及びＲ3に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｙ1、Ｙ2及びＹ3は別々に、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｓｅ又はＮＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1、Ｒ2及びＲ3に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｚは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基、あるいはアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤、あるいは以下の構造式：
0004031045.tif 000013
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、ＣＨ又はＣＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1、Ｒ2及びＲ3に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は別々に、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、
ｎは０〜１０であり、
ｐ1、ｐ2及びｐ3は別々に、０〜４であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである）
を有するＴＥＸＯシリーズの化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
上記の構造式の化合物の一実施形態では、Ｘは存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3は別々に、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅである。
ＴＥＸＯシリーズの好ましいものでは、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はＯである。さらに別の好ましいＴＥＸＯ化合物では、ｐ1、ｐ2及びｐ3は２である。
ＴＥＸＯシリーズの好ましいものは、ＲがＣ12Ｈ25であるＴＥＬＯ類の化合物である。好ましいＴＥＬＯ類の化合物は、ＺがＨであり、Ｘが非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択されるものである。さらに別の好ましいＴＥＬＯ化合物では、ｎは２〜１０である。ＺはＨであり、ＸはＮＨであり、ｎは３であり、ｐ1、ｐ2及びｐ3は２であり、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はＯであるＰＡ−ＴＥＬＯは、レンカ（Renca）腫瘍アッセイに特に有効であることが判明した。
ＴＥＸＯシリーズのさらに別の好ましいものは、ＲがＣ10Ｈ21であるＴＥＤＯ類の化合物である。好ましいＴＥＤＯ化合物では、ＺはＨであり、Ｘは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。さらに別の好ましいＴＥＤＯ化合物は、ｎが２〜１０であるものである。
ＴＥＸＯシリーズのさらに別の好ましいものは、ＲがＣ8Ｈ17であるＴＥＣＯ類の化合物である。好ましいＴＥＣＯ化合物では、ＺはＨであり、Ｘは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。さらに別の好ましいＴＥＣＯ化合物は、ｎが２〜１０であるものである。
本発明はさらに、
（ａ）次式：
0004031045.tif 000014
（式中、Ｒは、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは各々が０〜５個の異種原子を含有する環状基又はアリール基であり、
Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＲ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、ＮＲ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ又は上記と同様のＲであり、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＮＨＲ、上記と同様のＲ、あるいはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド又はヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000015
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨ又はＣＲであり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであり、
ｎは、０〜１０であり、
ｍは、０〜４であり、
ｐとｑの合計は４である）
を有する化合物のいずれかの有効量を含み、前記化合物がローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物を含む処方物と分子を接触させて脂質と複合体を形成する工程と、
（ｂ）細胞を工程（ａ）で生成された脂質複合体と接触させる工程とを含み、それにより生物学的有効量の分子を細胞中に挿入する、細胞中への分子の送達のための方法を包含する。
上記の方法の好ましい一実施形態では、細胞中に送達される分子は陰イオン性分子を含む。
上記の方法のいくつかの実施形態では、処方物は１つ又はそれ以上の付加的脂質をさらに含む。好ましくは、付加的脂質は、中性脂質、リン脂質及びコレステロールから成る群から選択される。
上記の方法の一実施形態では、細胞はインビトロにある。上記の方法の別の実施形態では、細胞はインビボにある。
細胞がインビボにある方法の好ましい実施形態では、細胞は、ネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、及びブタ又はウサギ動脈内アッセイから成る群から選択されるアッセイで用いられる。
本発明の別の態様は、細胞中に分子を送達するための薬剤中での次式：
0004031045.tif 000016
（式中、Ｒは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは各々が０〜５個の異種原子を含有する環状式基又はアリール基であり、
Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＲ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、ＮＲ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ又は上記と同様のＲであり、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＮＨＲ、上記と同様のＲ、あるいはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド又はヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000017
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨ又はＣＲであり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであり、
ｎは、０〜１０であり、
ｍは、０〜４であり、
ｐとｑの合計は４である）
の化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物の使用である。
上記の使用の一実施形態では、細胞に送達される分子は陰イオン性分子である。一実施形態では、陰イオン性分子はｍＲＮＡである。別の実施形態では、陰イオン性分子はＤＮＡである。
別の実施形態では、薬剤は１つ又はそれ以上の付加的脂質をさらに含む。さらに別の実施形態では、付加的脂質は、中性脂質、リン脂質及びコレステロールから成る群から選択される。
上記の使用の一実施形態では、細胞はインビトロにある。上記の使用の別の実施形態では、細胞はインビボにある。さらに別の実施形態では、細胞は、ネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタ又はウサギ動脈内、レンカ（Renca）腫瘍又は皮下腫瘍アッセイから成る群から選択されるアッセイ中にある。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜Ｄは、脂質：ＤＯＰＥの種々の比率を有する処方物中の２つの細胞株、即ちＣＯＳ７及びＣ２Ｃ12細胞におけるＰＡ−ＤＥＭＯ及びＤＭＲＩＥのトランスフェクション効率を比較する。
図２は、ネズミ肺アッセイ系を用いた、インビボでのＤＥＭＯ、ＤＥＬＯ、ＤＥＤＯ、ＴＥＬＯ及びＴＥＣＯ類の多数の四級サイトフェクチンの活性を比較する。
図３は、四級窒素から種々の距離の一級アミンを有するＤＥＬＯ類の化合物のもののトランスフェクション効率を比較する。
図４は、ＤＥＸＯシリーズの化合物のものに関する本発明の四級サイトフェクチンの疎水性成分の鎖長の変動の作用を示す。
図５は、肺内アッセイ系における多数の誘導サイトフェクチンの活性を比較する。
図６は、腹腔内アッセイにおける本発明のサイトフェクチンのトランスフェクイション効率を比較する。
図７は、ブタ動脈内アッセイにおけるいくつかのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を比較する。
図８は、皮下レンカ（Renca）腫瘍モデルにおけるＤＮＡ単独に対するＰＡ−ＤＥＬＯ、ＰＡ−ＴＥＬＯ及びＨＰ−ＤＯＲＩＥのインビボでの活性を比較する。
図９は、代表例として［（３−アミノプロピル）−（ビス−（２−テトラデシロキシエチル）−メチルアンモニウムブロミド］（ＰＡ−ＤＥＭＯ）を用いた本発明の四級サイトフェクチンに関する基本的合成経路を説明するスキームＩを示す。
発明の詳細な説明
四級窒素化合物は、それらの特異的構造に起因する有益な特徴を有する有効なサイトフェクチンであることが発見された。これらの化合物は、細胞膜とより特異的に相互作用する能力を有するトランスフェクション剤を生成するために、そして高レベルのトランスフェクションを達成するために誘導される。それらは、細胞表面のキー受容体及び酵素を標的にするよう適合され得る構造を提供し、したがって分子認識における重要な因子の発見及び開発に用いるのに適している。これらの陽イオン性脂質のいくつかはさらに、特定の生物学的目的を達成するために細胞内に送達される物質に結合され得る。
本発明の陽イオン性脂質は、官能基がアルキルリンカーを介して付加される四級窒素を共有する。官能基は、（１）細胞標的部分を結合させ、又は（２）治療用分子をサイトフェクチンに結合させるために用いられるカルバモイル、カルボキシル、ウレイル、チオール、エステル、エーテル、チオウレイル、ホスホリル又はグアニジル基から成る。さらに又はあるいは、官能基は、サイトフェクチンの極性電荷密度を増大し、したがってトランスフェクションを増強する基を結合するためのリンカーとして用いられる。
構造：四級窒素
本発明の四級窒素化合物としては、ＭＥＸＯ、ＤＥＸＯ及びＴＥＸＯシリーズの化合物が挙げられる。ＭＥＸＯシリーズの化合物では、アルキルリンカーを介して四級窒素に連結される１つのエーテル、エステル、スルフィド、アミン又はセレニル結合炭化水素鎖が存在する。ＤＥＸＯシリーズの化合物は、アルキルリンカーを介して四級窒素に連結される２つのエーテル、エステル、スルフィド、アミン又はセレニル結合炭化水素鎖を有する。ＴＥＸＯシリーズの化合物では、アルキルリンカーを介して四級窒素に連結される３つのエーテル、エステル、スルフィド、アミン又はセレニル結合炭化水素鎖が存在する。各々の化合物は、いくつかの化合物類を含む。ＭＥＭＯ及びＤＥＭＯと呼ばれる化合物では、エーテル、エステル、スルフィド、アミド又はセレニル結合炭化水素鎖はＣ14Ｈ29である。ＤＥＤＯ及びＴＥＤＯと呼ばれる化合物では、エーテル、エステル、スルフィド、アミド又はセレニル結合炭化水素鎖はＣ10Ｈ21である。ＤＥＬＯ及びＴＥＬＯと呼ばれる化合物では、エーテル、エステル、スルフィド、アミド又はセレニル結合炭化水素鎖はＣ12Ｈ25である。ＴＥＣＯと呼ばれる化合物では、エーテル、エステル、スルフィド、アミド又はセレニル結合炭化水素鎖はＣ8Ｈ17である。
下記の表１は、特定化合物及びそれらの頭文字語の例を示す。表に示された略語は、一般式：
0004031045.tif 000018
を有するｐ＋ｑ＝３の化合物を意味する。
ＨＥ−ＭＥＭＯ      Ｒ＝Ｃ14Ｈ29、Ｘ＝ＯＨ、ｎ＝２、ｐ＝１
ＰＡ−ＭＥＭＯ      Ｒ＝Ｃ14Ｈ29、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝３、ｐ＝１
ＢＡ−ＭＥＭＯ      Ｒ＝Ｃ14Ｈ29、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝４、ｐ＝１
ＤＭＡ−ＤＥＤＯ    Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝Ｈ、ｎ＝１、ｐ＝２
ＨＥ−ＤＥＤＯ      Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＯＨ、ｎ＝２、ｐ＝２
ＥＡ−ＤＥＤＯ      Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝２、ｐ＝２
ＰＡ−ＤＥＤＯ      Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝３、ｐ＝２
ＢＡ−ＤＥＤＯ      Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝４、ｐ＝２
ＦＡ−ＤＥＤＯ      Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝５、ｐ＝２
ＤＭＡ−ＤＥＬＯ    Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝Ｈ、ｎ＝１、ｐ＝２
ＨＥ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＯＨ、ｎ＝２、ｐ＝２
ＥＡ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝２、ｐ＝２
ＰＡ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝３、ｐ＝２
ＢＡ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝４、ｐ＝２
ＦＡ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝５、ｐ＝２
ＨＡ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝６、ｐ＝２
ＰＭＵ−ＤＥＬＯ    Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＣＨ3、ｎ＝３、ｐ＝２
Ｌｙｓ−Ｐ−ＤＥＬＯ    Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ−リシンアミド、ｎ＝３、ｐ＝２
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｐ−ＤＥＬＯ    Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ−α（ベンジルオキシカルボニル）リシンアミド、ｎ＝３、ｐ＝２
Ｌｙｓ（ＣＢｚ）−Ｐ−ＤＥＬＯ    Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨε−（カルボベンジルオキシ）リシンアミド、ｎ＝３、ｐ＝２
Ｇｌｙ−Ｐ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ−グリシンアミド、ｎ＝３、ｐ＝２
Ｏｒｎ−Ｐ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ−オルニチンアミド、ｎ＝３、ｐ＝２
Ｂｏｃ−Ｏｒｎ−Ｐ−ＤＥＬＯ      Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ−α（ベンジルオキシカルボニル）オルニチンアミド、ｎ＝３、ｐ＝２
Ｏｒｎ−（ＣＢｚ）−Ｐ−ＤＥＬＯ  Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨε−（カルボベンジルオキシ）−オルニチンアミド、ｎ＝３、ｐ＝２
ＤＥＬＯｘ−Ｐｒｏ−Ａｍ    Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ｎ＝１、ｐ＝２
ＤＥＬＯｘ−Ａｒｇ−（ＮＯ2）−ＯＭｅ    Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝Ｃ（Ｏ）（ε−ニトロアルギニンエステル）αアミド、ｎ＝１、ｐ＝２
ＤＭＡ−ＤＥＭＯ      Ｒ＝Ｃ14Ｈ29、Ｘ＝Ｈ、ｎ＝１、ｐ＝２
ＨＥ−ＤＥＭＯ        Ｒ＝Ｃ14Ｈ29、Ｘ＝ＯＨ、ｎ＝２、ｐ＝２
ＰＡ−ＤＥＭＯ        Ｒ＝Ｃ14Ｈ29、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝３、ｐ＝２
ＨＥ−ＴＥＬＯ        Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＯＨ、ｎ＝２、ｐ＝３
ＰＡ−ＴＥＬＯ        Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝３、ｐ＝３
ＢＡ−ＴＥＬＯ        Ｒ＝Ｃ12Ｈ25、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝４、ｐ＝３
ＨＥ−ＴＥＤＯ        Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＯＨ、ｎ＝２、ｐ＝３
ＰＡ−ＴＥＤＯ        Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝３、ｐ＝３
ＢＡ−ＴＥＤＯ        Ｒ＝Ｃ10Ｈ21、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝４、ｐ＝３
ＨＥ−ＴＥＣＯ        Ｒ＝Ｃ8Ｈ17、Ｘ＝ＯＨ、ｎ＝２、ｐ＝３
ＰＡ−ＴＥＣＯ        Ｒ＝Ｃ8Ｈ17、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝３、ｐ＝３
ＢＡ−ＴＥＣＯ        Ｒ＝Ｃ8Ｈ17、Ｘ＝ＮＨ2、ｎ＝４、ｐ＝３
名称
表１の化合物を呼称するのに用いられる略語の系は、全体で用いられる命名法の系を例示する。略語ＨＥ、ＥＡ、ＢＡ、ＰＡ、ＦＡ、ＰＭＵ及びＤＭＡは、上記の一般構造式の（ＣＨ２）n−Ｘ置換基を示す。ＨＥ＝ヒドロキシエチル、ＥＡ＝エチルアミン、ＢＡ＝ブチルアミン、ＰＡ＝プロピルアミン、ＦＡ＝ペンチルアミン、ＰＭＵ＝プロピルメチルウレアそしてＤＭＡ＝ジメチルアミン。
さらに、略語ＭＥＭＯ、ＤＥＤＯ、ＤＥＬＯ、ＤＥＭＯ、ＴＥＬＯ、ＴＥＤＯ及びＴＥＣＯの最初の２文字は、上記の一般構造式中のｐ、即ち四級窒素に結合される（Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2）2）エーテルの数を定義する。したがって、ＭＥで始まる化合物では、ｐ＝１（即ち、化合物はモノエーテルである）。ＤＥで始まる化合物では、ｐ＝２（即ち、化合物はジエーテルである）。ＴＥで始まる化合物では、ｐ＝３（即ち、化合物はトリエーテルである）。
略語ＭＥＭＯ、ＤＥＤＯ、ＤＥＬＯ、ＤＥＭＯ、ＴＥＬＯ、ＴＥＤＯ及びＴＥＣＯの二番目の２文字は、上記の一般構造式で、エーテルを介して四級窒素に結合されるＲ基を同定する。したがって、ＭＯ化合物では、エーテル結合Ｒ基はミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）であり、ＬＯ化合物では、Ｒはラウリル（ｌａｕｒｙｌ）であり、ＤＯ化合物では、Ｒはデシル（ｄｅｃｙｌ）であり、ＣＯ化合物では、Ｒはカプリル（ｃａｐｒｙｌ）である。
本発明のサイトフェクチン：構造
本発明のいくつかの実施形態は、次式：
0004031045.tif 000019
（式中、Ｒは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは各々が０〜５個の異種原子を含有する環状基又はアリール基であり、
Ｘは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ又は上記と同様のＲであり、
Ｚは、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＮＨ、上記と同様のＲ、あるいはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド又はヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000020
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨ又はＣＲであり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであり、
ｎは、０〜１０であり、
ｍは、０〜４であり、
ｐとｑの合計は４である）
を有する化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
上記の構造式の好ましい実施形態では、ＸはＯである。さらに好ましい実施形態では、ｑは１、２又は３である。ＺがＨであり、Ｙが存在しないのが有益である。
本発明の別の実施形態は、次式：
0004031045.tif 000021
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は別々にＨであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、Ｘ1、Ｘ2及びＸ3は別々に、存在しないかあるいはＨ、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｒ4は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2又は以下の構造式：
0004031045.tif 000022
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨ又はＣＲ（ここで、Ｒは上記のＲ1、Ｒ2及びＲ3に関して記載されたものと同様である）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
ｍ、ｐ及びｑは別々に０〜４であり、
ｎは０〜１０であり、
Ｗは製薬上許容可能な陰イオンである）
の化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
化合物の別の実施形態は、次式：
0004031045.tif 000023
（式中、Ｘは存在しないか、あるいはＯ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙは存在しないか、あるいはＯ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｚは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいはアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000024
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、ＣＨ又はＣＲ（ここで、Ｒは下記と同様である）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｒは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、
ｎは０〜１０であり、
ｐは０〜４であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである）
の化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
上記の構造式の好ましい実施形態では、ＹはＯである。上記の構造式のさらに別の好ましい実施形態では、ｐは２である。
さらに別の好ましい実施形態、即ちＭＥＭＯ類の化合物では、ＲはＣ14Ｈ29である。好ましくは、上記の構造式では、ＺはＨであり、そしてＸは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。ＭＥＭＯ類のさらに好ましい化合物では、ｎは２〜６である。
本発明のさらに別の実施形態は、次式：
0004031045.tif 000025
（式中、Ｘは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙ1及びＹ2は別々に、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、Ｚは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいはアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤あるいは下記の構造式：
0004031045.tif 000026
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨ又はＣＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1及びＲ2に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｒ1及びＲ2は別々に、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、
ｎは０〜１０であり、
ｐ1及びｐ2は別々に、０〜４であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである）
を有するＤＥＸＯシリーズの化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
上記の構造式の好ましい実施形態では、ＹはＯである。さらに好ましいＤＥＸＯ化合物では、ｐ1及びｐ2は２である。
ＤＥＸＯシリーズの好ましい化合物は、ＲがＣ10Ｈ21であるＤＥＤＯ類である。ＤＥＤＯ類の好ましいものは、ＺがＨであり、Ｘが非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択されるものである。さらに好ましいＤＥＤＯ化合物では、ｎは２〜１０である。ＺはＨであり、ＸはＮＨであり、ｎは３であり、ｐ1及びｐ2は２であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＰＡ−ＤＥＤＯが、ネズミ肺アッセイでのＤＥＤＯ類の最も活性なものであるが、しかしこのアッセイにおけるその活性はＤＥＬＯ類のいくつかのものの活性ほど大きくない。
ＤＥＸＯシリーズのさらに好ましい実施形態は、ＲがＣ12Ｈ25であるＤＥＬＯ類の化合物である。ＤＥＬＯ類の有益なものは、ＺがＨであり、Ｘが非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択されるものである。
さらに別の有益なＤＥＬＯ類化合物は、ｎが２〜１０であるものである。ＺはＨであり、ＸはＮＨであり、ｎは６であり、ｐ1及びｐ2は２であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＨＡ−ＤＥＬＯがネズミ肺アッセイで特に有効であり、比較した場合にＤＥＭＯ、ＤＥＬＯ、ＤＥＤＯ、ＴＥＬＯ及びＴＥＣＯ化合物より大きい活性を示す。ＸはＮＨであり、Ｚはグリシンアミドであり、ｎは３であり、Ｙ1及びＹ2はＯであるＧｌｙ−Ｐ−ＤＥＬＯも、ネズミ肺アッセイで有効であることが判明した。ＺがＨであり、ＸがＮＨであり、ｎが３であり、ｐ1及びｐ2が２であり、Ｙ1及びＹ2がＯであるＰＡ−ＤＥＬＯは、ブタ動脈内アッセイで有効であることが判明した。
ＤＥＸＯシリーズのさらに好ましい実施形態は、ＲがＣ14Ｈ29であるＤＥＭＯ類のものである。ＤＥＭＯ類の好ましいものでは、ＺはＨであり、Ｘは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。ＤＥＭＯ類のさらに好ましいものでは、ｎは２〜１０である。ＺがＨであり、ＸがＮＨであり、ｎが３であり、ｐ1及びｐ2が２であり、Ｙ1及びＹ2がＯであるＰＡ−ＤＥＭＯは、ネズミ腹腔内アッセイで特に有効であることが判明した。
本発明のさらに別の実施形態は、次式：
0004031045.tif 000027
（式中、Ｘは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｙ1、Ｙ2及びＹ3は別々に、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ又はＳｅであり、
Ｚは、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基、あるいはアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはその他の生物活性剤又は製薬剤、あるいは以下の構造式：
0004031045.tif 000028
（式中、Ｒ5〜Ｒ10は別々に、存在しないか、Ｈであるか、不飽和の０〜６個の部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であるか、あるいは別々にアミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類、あるいはそれと化学的に結合するその他の生物活性剤又は製薬剤を包含し、
Ｇは、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、ＣＨ又はＣＲ（ここで、Ｒは下記のＲ1、Ｒ2及びＲ3に関して記載されるものと同様である）であり、
Ｔは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣであり、
Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ又はＣである）であり、
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は別々に、Ｈであるか、不飽和の０〜６部位を有し、０〜５個の異種原子を含有する直鎖、分枝鎖、非置換又は置換Ｃ1〜Ｃ23アルキル、アシル、アルケン又はヘテロアルキル基、あるいは環状基又はアリール基であり、
ｎは０〜１０であり、
ｐ1、ｐ2及びｐ3は別々に、０〜４であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである）
を有するＴＥＸＯシリーズの化合物であって、ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンでない化合物である。
ＴＥＸＯシリーズの好ましいものは、ＲがＣ12Ｈ25であるＴＥＬＯ類の化合物である。好ましいＴＥＬＯ類の化合物は、ＺがＨであり、Ｘが非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択されるものである。さらに別の好ましいＴＥＬＯ化合物では、ｎは２〜１０である。ＺがＨであり、ＸがＮＨであり、ｎが３であり、ｐ1、ｐ2及びｐ3が２であり、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3がＯであるＰＡ−ＴＥＬＯは、レンカ腫瘍アッセイに特に有効であることが判明した。
ＴＥＸＯシリーズのさらに別の好ましいものは、ＲがＣ10Ｈ21であるＴＥＤＯ類の化合物である。好ましいＴＥＤＯ化合物では、ＺはＨであり、Ｘは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。さらに別の好ましいＴＥＤＯ化合物は、ｎが２〜１０であるものである。
ＴＥＸＯシリーズのさらに好ましいものは、ＲがＣ8Ｈ17であるＴＥＣＯ類の化合物である。好ましいＴＥＣＯ化合物では、ＺはＨであり、Ｘは非存在、Ｏ及びＮＨから成る群から選択される。さらに別の好ましいＴＥＣＯ化合物は、ｎが２〜１０であるものである。
本発明はさらに、
（ａ）分子を請求の範囲第１項に記載の陽イオン性脂質のいずれかの有効量を含む処方物と接触させて脂質との複合体を生成する工程と、
（ｂ）細胞を工程（ａ）で生成された脂質複合体と接触させる工程とを含み、それにより生物学的有効量の分子を細胞中に挿入する、細胞中への分子の送達のための方法を包含する。
上記の方法の好ましい一実施形態では、細胞中に送達される分子は陰イオン性分子を含む。
上記の方法のいくつかの実施形態では、処方物はさらに１つ又はそれ以上の付加的脂質を含む。好ましくは、付加的脂質は、中性脂質、リン脂質及びコレステロールから成る群から選択される。
上記の方法の一実施形態では、細胞はインビトロにある。上記の方法の別の実施形態では、細胞はインビボにある。
細胞がインビトロにある方法の好ましい実施形態では、細胞は、ネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内及びブタ又はウサギ動脈内アッセイ、一般的皮下腫瘍又はレンカ腫瘍アッセイから成る群から選択されるアッセイで用いられる。
本明細書に記載されたサイトフェクチンのいずれも、本明細書に記載されたインビトロ、インビボ及び種々のトランスフェクションアッセイに用い得るよう意図される。これらの化合物はすべて、公知の出発物質から作られる。本発明の範囲内の種々の化合物が、実施例３、６〜１０に記載されたアッセイ、あるいはその他の標準トランスフェクションアッセイを用いて、当業者により活性に関してスクリーニングされ得る。
サイトフェクチン上の生物活性先端基
（ａ）標的種
本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物学的細胞標的活性を有する分子種を含み得る。この種のうち、サイトフェクチンは細胞受容体特異性分子を含む。典型的には、受容体特異性ペプチド又はアミノ酸がアミドとして結合される。本発明のサイトフェクチンに連結され得る好ましいペプチドの例としては、走化性ペプチド  メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン（Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）、及びｐＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓが挙げられる。本発明のサイトフェクチンに付加され得る細胞表面受容体へのその他の配位子は、ペプチド擬似アナログ；多数のウイルス付着及びインターナリゼーションペプチド、ラクトース並びにその他の二糖及び多糖類；アセチルコリンアナログ；並びに葉酸誘導体を包含する。
（ｂ）治療薬
本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物活性分子種を含み得る。本発明の化合物と結合し得る好ましい生物活性種の例は、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン  ｐグルタメート−ヒスチジン−プロリンである。
（ｃ）細胞及び細胞内標的
本発明のサイトフェクチンは、細胞膜又は細胞内標的と特異的に結合して所望の生理学的反応を実行し得る配位子を保有する末端基を含む。適切な配位子は、ウイルスエピトープ、ホルモン、酵素基質、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、炭水化物、補因子、薬剤、レクチン、オリゴヌクレオチド及び核酸を包含し得る。この基の中の好ましい種は、クロロキン及びその他のリソソーム親和性剤、核局在性ペプチド、コルチコステロイド及びウイルスペプチド又はタンパク質を包含するサイトフェクチンである。
トランスフェクション効率に影響を及ぼす群
本発明のサイトフェクチンは、それらのトランスフェクション効率に影響を及ぼす群と結合し得る。このような群は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖又は多糖類である。これらの構成単位をサイトフェクチンに付加するための通常的及び非通常的結合がともに意図される。さらに、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、生体中には一般に見出されない異常又は修飾アミノ酸を含み得る。このような異常又は修飾アミノ酸としては、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に列挙された修飾及び異常アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、このようなアミノ酸は天然には認められない合成アミノ酸であり得る。
反応スキーム及び製造方法
Ｂ．四級サイトフェクチンの合成
四級サイトフェクチン、特に［（３−アミノプロピル）−（ビス−（２−テトラデシロキシエチル）−メチルアンモニウムブロミド）］（ＰＡ−ＤＥＭＯ）の典型的合成を、スキーム１に示す。
スキーム１にしたがって、Ｎ−メチルジエタノールアミンのような適切なアミンアルコールを先ず脂肪酸スルホネートと反応させて、対応する脂肪酸エステルを生成する。次に、その結果生じた三級アミンを適切な反応を用いてアルキル化して、付加的アルキル鎖又は他の誘導部分に付加する。この合成は、実施例１でさらに詳細に開示される。
四級サイトフェクチンの合成は、特に含まれないことに留意すべきである。従来の合成工程及び容易に利用できる反応体は、三級アミン出発物質のアルコール部分のエステル又はエーテルを生成するのと、並びに官能基を最終的に四級アンモニウムになるものに付加するのに利用される。もちろん、従来の遮断又は保護工程が、適切な場合には、合成中に用い得るし、請求の範囲内のチオエーテル、チオエステル及びその他のアナログは、スキーム１の従来の修飾法により合成され得る。
上記の方法を用いて、相当期間でスクリーニングのための多数のサイトフェクチンを調製し得る。スクリーニングと一緒に用いた合成は、限定用途のための最も有効なサイトフェクチンを効率よく選択するのに使用し得る。
処方物
本発明の化合物は、インビトロ及びインビボで哺乳類細胞をトランスフェクトするための処方物中に用い得る。トランスフェクション用の処方物は当業者には公知であって、それらの製造方法、例えばFelgnerに付された米国特許第５，２６４，６１８号、Gebeyehu他に付された米国特許第5,334,761号及びFelgner et al., J.Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）と一緒に開示されている。本発明の陽イオン性脂質は、リン脂質のような両親媒性脂質と、並びにコレステロールのような中性脂質と組合されて脂質小胞を形成するが、これはリポソーム、単層板小胞、ミセル又は簡単な薄膜である。
本発明の陽イオン性脂質は、遺伝子治療を促進するのに特に有用である。この目的のための陽イオン性脂質の使用は、Nabel他（Human Gene Therapy 3:399-410,1992）が報告している。
陽イオン性リポソームの使用は、血管、全身循環、肺上皮細胞、脳組織及びカエル胚（Xenopus）の細胞中への、ポリヌクレオチド、高分子及び小分子の流入を促すのに有用であることが公知である。
本発明は特に、鳥類、哺乳類、魚類及び両生類を含めた脊椎動物のような生体への、ｍＲＮＡ又はＤＮＡの送達を促すための開示された陽イオン性脂質の使用を意図する。ヒト及び家畜への送達が特に意図される。
ポリヌクレオチドは、好ましくは免疫原性又は治療用ペプチド又はポリペプチドをコードする。したがって、本方法は、遺伝子治療と同様にポリヌクレオチドワクチン接種のために用い得る。本発明の陽イオン性脂質を用いてＤＮＡを宿主生物中に導入する場合、ＤＮＡは、コード領域、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ又はＳＶ４０プロモーター、リボソーム結合部位及びポリアデニール化部位のような適切なプロモーターに加えて、配列を含有し得る。
本発明のサイトフェクチンはインビトロで細胞をトランスフェクトするのに有用である、ということも注目される。本発明の範囲内の種々の化合物がインビボで多少組織特異性であるが、しかしほとんど又はすべてがインビトロでの培養細胞のトランスフェクションに有用である。本発明のあらゆる特定の候補サイトフェクチンに関しては、インビトロでの及び種々の組織内でのインビボでのその相対的トランスフェクション効率は、例えば実施例３、６〜１０に開示されたようなスクリーニングアッセイ又はその他の標準トランスフェクションアッセイを用いて容易に促進され得る。
実験手順
下記の化学反応は、本発明の陽イオン性脂質の合成のそれらの一般的適用に関して、開示される。時としては、反応は、開示された範囲内の各分子種に記載されたように適用できないことがある。これが起きる化合物は、当業者には容易に認識される。このような場合はすべて、当業者に公知の従来の修正により、即ち代替的な従来の試薬に変えるか、あるいは反応条件のルーチンの修正により首尾よく反応を実行し得る。あるいは、他の種類のサイトフェクチン、例えばFelgner et al., J. Biol. Chem. 84:7413-7417, 1987のＤＯＴＭＡ化合物の合成に関して本明細書中に引用された参考文献において、又は従来の化学文献において開示されたその他の反応は、本発明の化合物の調製に適用可能である。すべての合成方法において、出発物質はすべて公知であるか、又は公知の出発物質から容易に合成可能である。
本発明は以下の実施例を用いてさらに詳細に説明するが、開示された方法は本発明の範囲に網羅されるすべての陽イオン性脂質の調製に適用可能であり、実施例に限定されない。実施例に示した温度はすべて摂氏温度であって、未修正である。
実施例１
［（３−アミノプロピル）−（ビス−（２−テトラデシルオキシエチル）−メチルアンモニウムブロミド）］（ＰＡ−ＤＥＭＯ）の合成
この四級サイトフェクチンの合成は、スキーム１に示すように、Ｎ−メチルジエタノールアミンから、ＤＥＭＯＡを経て、γ−Ｐｈｔｈ−ＤＥＭＯへ、ＰＡ−ＤＥＭＯへ進行した。
ＤＥＭＯＡ
アルゴン大気下、乾燥容器に鉱油中６０％水酸化ナトリウム  １．１５ｇ（２９ｍｍｏｌ，２．２当量）を入れた。実験中は正のアルゴン圧を保持した。３ｘ１２ｍｌのドライヘキサンで粉末にすることにより鉱油を除去し、次に８０ｍｌの無水テトラヒドロフランを付加して、攪拌を開始した。無水テトラヒドロフラン  １５ｍｌに溶解したＮ−メチルジエタノールアミン（１．５５ｇ，１３ｍｍｏｌ）の溶液を磁気で攪拌された懸濁液に室温で滴下し、その後一晩還流した。無水テトラヒドロフラン  ２３ｍｌに溶解したテトラデシルメタンスルホネート（９．３７ｇ，３２ｍｍｏｌ，２．５当量）の溶液を添加し、反応液を３日間還流させた。次に反応混合物を冷却し、スラリーをセライトの０．７５ｃｍパッドを通して真空濾過した。反応容器及び濾過装置をテトラヒドロフラン  １００ｍｌで洗浄した。併合濾液をエバポレートして粗生物を得、これをエチルエーテル：ヘキサン（１０：９０〜１００：０）の段階勾配とともにシリカゲル（４．５ｘ３５ｃｍ床）を用いて精製した。アリコート薄層クロマトグラフィー（２：１  エーテル：ヘキサン）により、精製分画を確定した。これらの分画をプールし、エバポレートして、純エーテル中に再懸濁し、少量の硫酸マグネシウムで脱水した。０．２μｍＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、次にロータリーエバポレーターで高真空処理して、精製［ビス−（２−テトラデシルオキシエチル）−メチルアミン］（ＤＥＭＯＡ）（２．３０ｇ，３５％）を得た。
γ−Ｐｈｔｈ−ＤＥＭＯ
磁気攪拌器を装備したアルゴン大気下の乾燥容器にＤＥＭＯＡ  １．２９ｇ（２．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド  １．３６ｇ（５．１ｍｍｏｌ，２．０当量）及び無水ジメチルホルムアミド  ５ｍｌを入れた。容器にアルゴンを十分に流して、きっちり塞げ、磁気攪拌開始後、１１０℃に３日間加熱した。溶液を室温に冷却し、溶媒を粗生物から真空蒸留により除去した。ゴム状残渣を一夜高真空処理して、少量の混入溶媒を除去し、シリカゲル（３．５ｘ３３ｃｍ  床）及び９０：１０：０．２５：０．２５のクロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水によるイソクラチック溶離を用いて精製した。精製分画をプールし、エバポレートした。残渣を純クロロホルム中に再懸濁し、少量の硫酸マグネシウムで脱水して、０．２μｍ  ＰＴＦＥを通して濾過し、次にエバポレートして高真空処理し、精製［（３−フタリルアミノプロピル）−（ビス−（２−テトラデシルオキシエチル）−メチルアンモニウムブロミド］（γ−Ｐｈｔｈ−ＤＥＭＯ）  ７２７ｍｇ（３７％）を得た。
ＰＡ−ＤＥＭＯ
磁気攪拌器を装備した容器にγ−Ｐｈｔｈ−ＤＥＭＯ（７２０ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）、無水エタノール  １３ｍｌを入れて、フタレートを溶解するために攪拌を開始した。容器にアルゴンを十分流し、この間に１ｍｌ純無水ヒドラジン（３２ｍｍｏｌ，３５当量）を加えた。容器をきっちり塞ぎ、室温で一晩攪拌した。濃厚なスラリーを媒質ガラスフリットを通して濾過し、エタノール  ２５ｍｌを用いて容器及び濾過装置を洗浄した。併合濾液をエバポレートし、残渣をクロロホルム  １００ｍｌと０．２Ｎ  水酸化ナトリウム  ５０ｍｌで分液した。相を分離させ、水層をさらに２５ｍｌのクロロホルムで洗浄した。併合有機相を硫酸ナトリウムで一晩脱水した。濾紙を通して重力濾過して透明溶液を生じ、これをエバポレートして、蝋状固体を得て、これを最小容量の純クロロホルム中に再懸濁し、０．２μｍ  ＰＴＦＥを通して濾過し、エバポレートした後、高真空処理して、高純度精製物質［（３−アミノプロピル）−（ビス−（２−テトラデシルオキシエチル）−メチルアンモニウムブロミド］（ＰＡ−ＤＥＭＯ）を得た。ヘキサンから再結晶化することにより、さらなる精製をなし得る。
そのＲ１及びＲ２鎖に異なる数の炭素原子を有する四級サイトフェクチンは、先の合成スキーム中の対応するメタンスルホネートの置換により合成し得る、と理解される。例えば、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｃ12Ｈ25であるＤＥＸＯ類のサイトフェクチンを合成するために、ドデシルメタンスルホネートを、反応スキーム中のテトラデシルメタンスルホネートの代わりに用いる。
スキーム１の反応を用いたＭＥＸＯ又はＴＥＸＯの合成の反応は、それぞれ１個又は３個のアルコキシ基が窒素に結合された出発物質の使用を必要とするだけであると、さらに理解される。
実施例２
インビトロトランスフェクションに及ぼす処方物の作用：ＰＡ−ＤＥＭＯとＤＭＲＩＥとの比較
サイトフェクチン：クロロホルムに溶解した選択サイトフェクチンの溶液を重量対容量（ｗ／ｖ）ベースで調製した。陽イオン性脂質及び中性脂質（用いた場合）のアリコートを、１ｍｌの水性溶剤を用いて、再構成時に所望される相対的及び絶対的脂質濃度を提供するように計算した量で、滅菌バイアルに無菌的に移した。乾燥窒素流で大量のクロロホルムを除去し、バイアルを一晩高真空で処理して、残留溶媒をすべて除去した。
ＤＮＡ−脂質複合体：プラスミドＤＮＡ  ５ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）並びに乾燥した処方済みサイトフェクチン−中性脂質混合物をＯＰＴＩＭＥＭＴＭ（Gibco BRL）中に懸濁し、表に示したような所望の質量／モル比で９６ウエルプレート中で一緒に混合した。ＤＮＡ−脂質複合体を混合後２時間以内に細胞に付加した。
トランスフェクション
細胞株：以下、使用した細胞株は、アメリカンタイプ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ，Rockville, MD）から入手した：ＣＯＳ７サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；及びＣ２Ｃ12マウス筋原細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７７２）。
細胞はすべて、１：５〜１：１０で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とダルベッコモディファイドイーグル培地（Dulbecco's Modified Eagles medium）（ＤＭＥＭ）中で継代した。全細胞は、受け取りのものを１０回二重にして継代させることによって広げ、アリコートを凍結保存した。再拡張して、全細胞をトランスフェクション研究に用い、その後さらに１０回継代した。
トランスフェクションアッセイ：０日目に、１０％ＦＥＢＳ／９０％ＤＭＥＭ  １００μl中２０，０００個の細胞を９６ウエル培養プレート（Nunc）の各ウエル中に植え付け、５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で一晩培養した。１日目に、細胞が移動しないように注意深く培地を吸引し、血清無含有ＯＰＴＩＭＥＭＴＭ（Gibco BRL）中のＰＡ−ＤＥＭＯ／ｐＲＳＶ  ｌａｃＺ／ＤＯＰＥを１００μｌ付加した。ＤＭＲＩＥは、参照標準として用いた。ｌａｃＺ遺伝子は比色計でアッセイされる酵素β−ガラクトシダーゼをコードする。陽イオン性脂質：ＤＯＰＥ比は、各ウエルに関して変化した。４時間培養後、３０％ＦＢＳ／７０％ＯＰＴＩＭＥＭＴＭ  ５０μｌを各ウエルに付加した。２日目、各ウエルは１０％ＦＥＢＳ／９０％ＯＰＴＩＭＥＭＴＭ  １００μｌを受け取った。３日目、培地を取り出し、５０μｌの溶解緩衝液（２５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中の  ０．１％トリトン−Ｘ1００）を付加し、プレートを７０℃で少なくとも２０時間保存した。解氷後、ウェル媒体は、Felgner他（J. Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994）にしたがって、それらの含有物のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性に関してアッセイされた。
結果（図１ａ〜１ｄ）は、ＣＯＳ７細胞及びＣ２Ｃ12細胞中のβ−ｇａｌの全発現は、それぞれ７５：２５および５０：５０のＰＡ−ＤＥＭＯ：ＤＯＰＥ比で最適であったが、一方ピークβ−ｇａｌ発現は、ＰＡ−ＤＥＭＯのみを用いた場合に両細胞株に生じたことを示している。両細胞株における総β−ｇａｌ発現は、ＰＡ−ＤＥＭＯ：ＤＯＰＥ比が２５：７５の場合に有意に低減した。これらのインビトロアッセイでは、ＰＡ−ＤＥＭＯはＤＭＲＩＥに比べて勝るとも劣らなかった。これらの実験は、四級サイトフェクチンがインビトロでの細胞膜を通過するＤＮＡの効率のよい運搬と、その後の細胞内での遺伝子の機能的発現を促進することを示す。これらの試験を用いるスクリーニングアッセイは、トランスフェクション活性を実証するのに、そしてサイトフェクチン／補脂質比を最適にするのに有用である。
実施例３
肺内トランスフェクションアッセイ
成熟した（４〜１６週）メスＢＡＬＢ／ｃマウスをメトファンで軽く麻酔し、１００μｌのＵＳＰ食塩水又は水中の１３２μｇのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ＤＮＡ±陽イオン性脂質を、小型プラスチックカテーテル付きの使い捨て滅菌プラスチック製インシュリン注射器を用いて鼻腔内送達した。液体及び注射器はすべて、室温に平衡させ、１００μｌ容量のＤＮＡを１回送達するのに要する時間は１分未満であった。送達後２日又は３日して、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与してマウスを屠殺し、下記のように肺を抽出した。
肺を直ちに凍結し、−７８℃で保存した。試験管内にぴったり合った可逆ドリル及びビットを用いて１．５ｍｌ試験管内の０．４ｍｌ凍結溶解緩衝液上で研削することにより、凍結肺を個別に微細粉末に粉砕し、粉末を同一試験管中で、抽出するまで−７８℃で保存した。凍結粉末を解氷し、PromegaのＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号  Ｅ３９７Ａ）１００μｌを各々に付加した。標本を１５分間攪拌し、液体窒素と室温水浴を交互に用いて３回凍結−解氷し、１０，０００ｘｇで３分間遠心分離した。上清を別の１．５ｍｌ試験管に移し、さらに５００μｌの溶解緩衝液をペレットに付加後に、抽出工程を（凍結−解氷せずに）反復した。二度目の上清を最初の上清と結合させて、−７８℃で保存した。
使用した陽イオン性脂質を以下に示す：ＤＥＭＯ類の化合物から、上記の構造を有するＤＭＡ−ＤＥＭＯ、ＨＥ−ＤＥＭＯ及びＰＡ−ＤＥＭＯを試験した。ＤＥＬＯ類の化合物からは、上記の構造を有するＤＭＡ−ＤＥＬＯ、ＥＡ−ＤＥＬＯ、ＰＡ−ＤＥＬＯ、ＢＡ−ＤＥＬＯ、ＦＡ−ＤＥＬＯ及びＨＡ−ＤＥＬＯを試験した。ＤＥＤＯ類の化合物からは、上記の構造を有するＨＥ−ＤＥＤＯ、ＥＡ−ＤＥＤＯ、ＰＡ−ＤＥＤＯ、ＢＡ−ＤＥＤＯ及びＦＡ−ＤＥＤＯを試験した。ＴＥＬＯ類の化合物からは、ＨＥ−ＴＥＬＯ、ＰＡ−ＴＥＬＯ及びＢＡ−ＴＥＬＯを分析した。最後に、ＴＥＣＯ類の化合物からは、ＨＥ−ＴＥＣＯ、ＰＡ−ＴＥＣＯ及びＢＡ−ＴＥＣＯを試験した。ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ  Ｂｒを比較のために試験した。
Sankaran（Anal. Biochem., 200:180-186, 1992）の放射能分配方法により、又はＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を用いて、ＣＡＴアッセイを実施した。要するに、ＣＡＴ組織ホモジネートをエタノール／ドライアイス浴中で３回凍結−解氷して、破裂させた。遠心分離により細胞破屑を取り出し、タンパク質抽出物を14Ｃクロラムフェニコール及びアセチルＣｏＡと一緒にインキュベートした。クロラムフェニコールを酢酸エチルで抽出し、薄層クロマトグラフイーを実施して、転換された14Ｃクロラムフェニコールの％を抽出細胞タンパク質により確定した。細胞抽出物を２０分間インキュベートした２μｇのタンパク質に対して標定した。組織抽出物を、４時間インキュベートした２００μｇのタンパク質に対して標定した。
肺抽出物中にスパイクされた精製酵素（Sigma, St. Louis, MO）又はＥＬＩＳＡキットで提供された酵素を用いて、標準曲線を構築した。２つのＣＡＴアッセイ法は、同一組の抽出物からの標本当たり等価ｐｇのＣＡＴを生じた。
結果を図２に要約する。ＤＥＬＯ類の化合物のうち、ＨＡ−ＤＥＬＯが最も有効で、ＦＡ−ＤＥＬＯ、ＢＡ−ＤＥＬＯ及びＰＡ−ＤＥＬＯもＧＡＰ−ＤＬＲＩＥを用いて観察された値の少なくとも２０％の活性レベルを示した。ＤＥＤＯ類の化合物のうち、ＰＡ−ＤＥＤＯが最も有効で、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥを用いて観察された値の約３０％のトランスフェクション効率を示した。ＥＡ−ＤＥＤＯ、ＢＡ−ＤＥＤＯ及びＦＡ−ＤＥＤＯも有意の活性を示した。ＴＥＬＯ及びＴＥＣＯ類の化合物は、ネズミ肺アッセイ系では有効ではなかった。
実施例４
四級窒素と一級アミンとの間の距離の作用
上記のように、サイトフェクチンのトランスフェクション効率は構造の微妙な変化により影響される。図３に示した実験では、一級アミン基と四級窒素との間の間隔をＤＥＬＯ類の化合物のもので変えてトランスフェクション効率に及ぼす結果を、実施例３に記載した肺内アッセイで確定した。図３は、このような間隔差に起因するトランスフェクション効率の変動性を実証する。試験した間隔のうち、炭素６個の間隔が最良のトランスフェクション効率を提供した。
実施例５
アルキル鎖長の作用
本発明の四級サイトフェクチンの疎水性成分の鎖長の変化の作用を、実施例３に記載した肺内アッセイで分析した。図４は、ＤＥＸＯシリーズの化合物において、ＤＥＬＯ類の化合物（アルキル鎖長Ｃ12）はＤＥＤＯ（アルキル鎖長Ｃ10）又はＤＥＭＯ（アルキル鎖長Ｃ14）類よりも有意に大きい活性を示した。
実施例６
肺内アッセイにおける誘導サイトフェクチンの分析
いくつかの誘導サイトフェクチンの活性を、実施例３に記載した肺内アッセイで査定した。図５は、Ｇｌｙ−Ｐ−ＤＥＬＯが、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥを用いて得られた値の約７０％という最高レベルの活性を示した。ＰＡ−ＤＥＬＯ及びＯｒｎ−Ｐ−ＤＥＬＯは、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥを用いて得られた値の約３０％の活性レベルを提供した。残りの化合物は、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥを用いて達成された値の５〜１５％の活性レベルを提供した。誘導サイトフェクチンはすべて、ＤＭＲＩＥ  Ｂｒより有意に活性であった。したがって、図５は、誘導サイトフェクチンがＤＭＲＩＥ  Ｂｒに対してトランスフェクション効率の有益な増強を提供することを実証する。
実施例７
ＤＥＬＯ、ＤＥＭＯ及びＴＥＬＯ化合物の腹腔内腫瘍アッセイ分析
いくつかの四級アミンサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、ネズミ腹腔内モデルで比較した。５００μｌのＲＰＭＩ中の２００，０００個のネズミＢ１６腫瘍細胞を、０日目に、Ｃ５７／Ｂ１６マウスに腹腔内注射した。７〜１４日目に、ＤＮＡ／サイトフェクチン／食塩溶液をマウスに腹腔内注射した。図６に示した実験では、ＤＮＡ０．５ｍｇを、１．５ｍｌ食塩水中のＤＮＡ：サイトフェクチンのモル比１０：１で種々のサイトフェクチンと混合した。ＤＮＡ注射の２日後、腫瘍を収集し、抽出して、実施例３に上記記載したように、ＣＡＴ活性に関してアッセイした。図６は、ＤＥＬＯ、ＤＥＭＯ及びＴＥＬＯ類の化合物は有効なサイトフェクチンで、ＤＮＡ単独で達成されたよりも大きいトランスフェクション効率を生じた。試験した化合物のうち、ＰＡ−ＤＥＭＯが最高トランスフェクション効率を示した。
ここに報告された試験は、特許請求をなされた化合物がトランスフェクションにおいて活性であることを示すだけでなく、特定組織のトランスフェクションのためのサイトフェクチンを選択し、最適化する方法を示す。特定の最適構造はこのアッセイに関しては容易に明らかになるが、これらの結果は特異的組織であり、言い換えればこのアッセイにおいて準最適になされたサイトフェクチンでも他のアッセイ、例えばインビトロのトランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタ又はウサギ動脈内、一般的皮下腫瘍又はレンカ腫瘍アッセイで有益な活性を有する、と考えられる。
実施例８
筋肉内アッセイ
２８Ｇ  １／２針（Becton-Dickinson)、及び黄色エッペンドルフマイクロピペット先端からカットされたプラスチックカラーを備えた使い捨て滅菌プラスチック製インシュリン注射器を用いて、５０μｌのＵＳＰ食塩水中の５０μｇのルシフェラーゼ又はＣＡＴ  ＤＮＡ±サイトフェクチンを、拘束された覚醒マウスの四頭筋に注射した。カラー長を調整して、直径３ｍｍの大腿直筋の中心部に約２ｍｍの深さまで針孔貫通を制限した。注射液及び注射器を室温に平衡させ、５０μｌ容量の食塩水−ＤＮＡの１回の注射に要する時間は数秒であった。全四頭筋群（重量１４０〜１８０ｍｇ）を注射後の種々の時間に各マウス足から収集した。実施例３に記載したように、筋肉を凍結させ、溶解した。
自動マイクロプレート発光計（Dynatech Model ML2250）を用いて、節フェラーゼ活性をアッセイした。１００μｌのルシフェラーゼ基質を、発光計の注入系により２０μｌ抽出物に付加し、標本光単位を記録した。標本のルシフェラーゼ含量は、非注射筋肉抽出物の存在下で実施した精製ホタルルシフェラーゼの標準曲線を用いて相対光単位から算出した。注射筋肉抽出物中に存在するルシフェラーゼ活性は、非注射筋肉抽出物の場合より非常に高かった。
このアッセイは、特定組織に用いるための特定サイトフェクチンの構造を最適化するための別のスクリーニングアッセイを説明する。
実施例９
動脈内アッセイ
動脈遺伝子転移を、以下のように、ヨークシャーブタで実行した。動脈遺伝子転移を、Nabel, Science 249:1285-1288（1990）に記載されたように、各ブタの右及び左腸骨大腿骨動脈で実行した。要するに、麻酔後、右及び左腸骨大腿骨動脈を外科的技法により曝露し、二重バルーンカテーテル（ＵＳＣＩ）を各動脈に配置した。１分間に５００ｍｍＨｇまで近位バルーンを膨張させて動脈を損傷させた。次に、動脈の損傷領域で遺伝子転移を実行するために、カテーテルを再配置した。動脈セグメントを、試験されるサイトフェクチン、ベクターＤＮＡ及びｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Gibco/BRL）から成るベクター溶液で洗った。ＤＭＲＩＥを用いた実験に関しては、１００μｇのＤＮＡ及び３００μｇの脂質の混合物を滴注した。ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ及びＰＡ−ＤＥＬＯを用いた実験に関しては、１００μｇのＤＮＡ及び３００μｇの脂質の混合物を滴注した。ベクター溶液を、１５０ｍｍＨｇで２０分間、損傷部位中に滴注した。滴注後、カテーテルを除去し、動物を回復させた。トランスフェクションの４８時間後、動脈を取り出した。ガラス乳棒で組織を押し潰し、その後３回、凍結解氷した。標本を６５℃で１０分間インキュベートして、内因性アセチラーゼを不活性化した。タンパク質を抽出し、比色アッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いてそれらの濃度を確定した。各アッセイでは、４時間のインキュベーション時間を用いて、実施例３において上記記載されているような手順にしたがって、ＣＡＴ活性に関して、２００μｇの総タンパク質をアッセイした。
結果を図７に示す。ＰＡ−ＤＥＬＯは、ＤＮＡ単独、ＤＭＲＩＥ又はＧＡＰ−ＤＬＲＩＥよりも有意に大きい活性を示した。動脈内モデルにおいてＧＡＰ−ＤＬＲＩＥに対してＰＡ−ＤＥＬＯで観察されたより大きな活性は、ネズミ肺モデルで得られた結果と対照をなし、この場合、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥはＰＡ−ＤＥＬＯより活性であった（図２参照）。この結果は、それらが適用される細胞型に対するサイトフェクチンの感受性を強調する。
ブタ動脈及びアテローム硬化症ウサギ動脈中への遺伝子転移
ブタ動脈のリポソームトランスフェクションを、上記記載のように腸骨大腿骨動脈の麻酔、挿管及び滅菌曝露により実行した（Nabel et al., Science, 249:1285-1288, 1990）。二重バルーンカテーテルを腸骨大腿骨動脈中に挿入し、近位バルーンを５分間で５００ｍｍＨｇに膨張させた。バルーンをしぼませ、近位及び遠位バルーン間の中心間隙がヘパリン化食塩水で灌注されるように、カテーテルを進行させた。ＣＡＴ  ＤＮＡ溶液（ＣＡＴ  ＤＮＡ±サイトフェクチン）をカテーテルの中心間隙に２０分間滴注した。カテーテルを除去し、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分析した。陽イオン性脂質の存在下でＣＡＴ  ＤＮＡでトランスフェクトされた動脈は、ＤＮＡ単独に接触した動脈と比較して、ＣＡＴ遺伝子発現の有意の増大を示した。
アテローム硬化症ウサギ腸骨動脈のインビボ遺伝子転移を、Faxo他（Arteriosclerosis, 4:189-195, 1984）が記載した二重損傷モデルを用いて実行した。２回の血管形成術損傷完了後、カテーテルの末端保持注入口が損傷の近位端にくるように、血管形成バルーンをわずかに引き抜いた。損傷の遠位端に結紮を置き、損傷セグメントをヘパリン化食塩水で洗って、ＣＡＴ  ＤＮＡ±陽イオン性脂質リポソーム溶液を単離損傷セグメント中に２０分間滴注した。カテーテルを除去し、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分析した。陽イオン性脂質の存在下でＣＡＴ  ＤＮＡでトランスフェクトされた動脈は、ＤＮＡ単独に接触した動脈と比較して、ＣＡＴ遺伝子発現の有意の増大を示した。
実施例１０
一般的皮下腫瘍トランスフェクションアッセイ
特異的腫瘍型に適合性のマウス系統の横腹の皮下に腫瘍細胞の懸濁液を注入することにより、腫瘍を調製した。腫瘍を定期的に測定した。それらが一旦注射に適したサイズに達すると、球形腫瘍を想定して測定直径を基礎にして腫瘍容積を近似させた。処理される腫瘍の容積に等しい容積の食塩水中の、レポーター遺伝子をコードするプラスミドで評価されるサイトフェクチンの複合体を、次に、特定の腫瘍型に最適化した流速で注入した。適当な時間の後、腫瘍を収集し、凍結後、すり砕いた。レポーター遺伝子生成物を次に抽出して、発現された量を、使用される特定遺伝子生成物に適した抽出及びアッセイ条件を用いて確定した。この一般技法を用いて種々の腫瘍型を評価し、異なるレポーター遺伝子は腫瘍型に依っておよそ割り当てられた。レンカ腫瘍を含めたこのアッセイの特定の例を、下記の実施例１０に示した。
実施例１１
皮下レンカ腫瘍モデル
９０％ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ウシ胎仔血清中で、レンカ腫瘍を増殖させた。腫瘍を、約１０6個細胞／ｍＬ組織培地を含有する懸濁液  ７５μｌ中の腫瘍を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの一側に皮下注射した。腫瘍が直径４．５〜７ｍｍに達した時に、腫瘍の直径を測定し、球形腫瘍と想定して、個々の腫瘍の各々の容積を算出した。個々の腫瘍の各々に関して、腫瘍の算出容積と等しい容積の食塩水中サイトフェクチン／ＣＡＴプラスミド複合体を、２ｍＬ／分の速度で腫瘍に注入した。４８時間後、腫瘍を収集し、凍結し、すり砕いて、実施例３に記載したように、１．５ｍＬの抽出緩衝液で抽出した。実施例３に記載したように、ＣＡＴ活性を定量した。
図７は、レンカ腫瘍モデルにおけるＤＮＡ単独に対するＰＡ−ＤＥＬＯ、ＰＡ−ＴＥＬＯ及びＨＰ−ＤＯＲＩＥのインビボ活性を示す。このアッセイ系では、ＰＡ−ＴＥＬＯはＰＡ−ＤＥＬＯ又はＨＰ−ＤＯＲＩＥより有意に大きい、そしてＤＮＡ単独の活性の２倍以上のトランスフェクション効率を提供した。
これ以上の推敲なしに、前述の説明を用いて、当業者は本発明を十二分に利用し得ると考えられる。本発明は、本質的な特徴を有するその趣旨を逸脱しない限り、その他の特定の形態に含まれ得る。記載された実施形態は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は、それゆえに先の詳細によるよりも添付の請求の範囲に示されている。請求の範囲の合法的等価物の意味及び範囲内にある変更例はすべて、本発明の範囲内に含まれる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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