(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原あるいは抗体を感作した不溶性担体粒子を含む免疫学的測定試薬において、該感作粒子の懸濁液とモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体を含有する緩衝液とを含むことを特徴とする免疫学的凝集反応試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的凝集反応に基づく測定試薬における凝集反応試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗原抗体反応を利用した測定試薬として、抗原あるいは抗体を物理吸着あるいは共有結合により感作した不溶性担体粒子（以下、感作粒子と略す）が用いられている。この感作粒子と血清あるいは尿等の検体中の対応する抗体あるいは抗原との間における抗原抗体反応に基づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を観測することにより、検体中の対応する抗体あるいは抗原を測定する試薬が知られている。この感作粒子を用いる測定方法は検体中に含まれる微量の抗体あるいは抗原を迅速に、高精度でかつ簡便に測定できるため広く利用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、免疫学的凝集反応試薬を使用する医療の現場から、疾病をより早期に診断して早期に治療を開始するために、従来に増してより微量の抗体または抗原を測定することが求められている。
従来の免疫学的凝集反応の試薬の中にポリエチレングリコール、デキストランあるいはポリビニルピロリドン等の非イオン性の水溶性高分子を添加すると、試薬の測定感度が向上し、反応促進作用を示すことが知られている。しかしながら、分子量の大きい水溶性高分子を添加すると試薬の粘度が大きくなり検体との混合が素早く進まなかったり、自動測定機の試薬プローブでの計量や用手法のピペッティング時の計量が一定にならなかったりする。更にはそれら水溶性高分子と検体中の蛋白が反応したり、感作粒子同士が凝集したりして測定の特異性が劣る欠点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記欠点を解消し得る免疫学的凝集反応試薬を得るため鋭意研究してきた結果、感作粒子と緩衝液を含有して成る測定試薬において、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体を含むことにより、臨床的な診断においてその抗原抗体反応の特異性を損なわず、かつ感度が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、抗原あるいは抗体を感作した不溶性担体粒子を含む免疫学的測定試薬において、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体を含有することを特徴とする免疫学的凝集反応試薬である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体の分子量は、プルランを基準とするＧＰＣ法において１万から２００万程度のものが好ましく、３０万から１００万程度のものが特に好ましい。
【０００６】
本発明で使用するＮ−ビニルアシルアミドのアシル基としては、直鎖または分岐した炭素数１乃至５のアシル基、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、イソブチリル基等が好ましく、ホルミル基、アセチル基が特に好ましい。即ち、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミドが特に好ましい。
本発明のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体は、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミドの単独重合体、あるいはモルフォリノアクリルアミドとＮ−ビニルアシルアミドとの共重合体、あるいはモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミドと共重合可能な非イオン性重合性モノマーとの共重合体等を示す。モルフォリノアクリルアミドとＮ−ビニルアシルアミドとの共重合比は、１：９９モル％から９９：１モル％の任意の値をとり得る。共重合可能な非イオン性重合性モノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン等の水溶性モノマー類、あるいはメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、スチレン、酢酸ビニル、アクリロニトリル等の疎水性モノマー類が挙げられる。その共重合比はモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミドに対して水溶性モノマー類では、通常１〜９０モル％、好ましくは１〜５０モル％、更に好ましくは１〜３０モル％、疎水性モノマー類では、通常１〜５０モル％、好ましくは１〜２５モル％、更に好ましくは１〜１０モル％である。また、これら共重合可能なモノマーを複数組み合わせた３元以上の多元共重合体も採用できる。
【０００７】
これらモノマーを重合するには、一般的なラジカル重合を採用することで達成できる。即ち、攪拌可能な反応装置にモノマーと溶媒、開始剤を加え、窒素置換の後加熱することで重合が開始し、一定時間その温度を保つことで重合は完結する。必要に応じさらに温度を上げて重合を完結することも高重合度の重合体を得るには良い。得られた重合体は乾燥により固体として得られる。必要に応じて粉砕し粉末とすることができる。
【０００８】
重合の際に用いられる溶剤としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、酢酸エチル、トルエン、ベンゼン、メチルエチルケトン等の有機溶剤、あるいは水が用いられる。また、これらを混合して用いることもできる。水を用いると得られた重合体をそのまま使用することもできるので便利である。
【０００９】
重合開始剤としては、一般的にラジカル重合で用いられる過酸化物系、アゾ系のラジカル開始剤が用いられる。例えば、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素等の無機系過酸化物、ベンゾイルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、クメンパーオキサイド等の有機過酸化物系開始剤、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジハイドロクロライド、ジメチル  ２，２’−アゾビスブチレート、ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）等のアゾ系の開始剤が用いられる。また、過酸化物系の開始剤に還元剤を組み合わせたレドックス開始剤も採用できる。
【００１０】
重合する際の温度は、溶剤の種類、開始剤の種類によって異なるが、開始剤の１０時間半減期温度付近を採用するのが好ましい。一般的には、５０〜８０℃の温度が採用される。
モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体の使用量は、感作粒子が非特異的に凝集して特異性が低下しない程度であればよく、測定時の濃度として０．０１〜５％の範囲にある場合が好ましく、０．１〜２％の範囲が特に好ましい。
本発明の測定試薬は、一つの分散液状である必要は無く、複数の溶液および分散液で構成されていても良い。測定試薬が一つの分散液状の場合、検体と測定試薬を混合するだけで測定でき、測定試薬が複数の液からなる場合は、一定の操作手順に従って試薬の各部と検体とを混合して使用できる。測定試薬が複数に分かれている場合には、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体を添加して保存中に試薬の特性に変化が生じない様に構成成分を選べば良い。なお、測定試薬を一つの分散液状にする場合には、感作粒子を分散した液とモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体を添加した緩衝液の二液を調製し、使用直前に一液に混合すれば、保存中における感作担体粒子とモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体の非特異的な反応が完全に防止できるため好ましい。また、感作粒子の乾燥品および固体のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体をそれぞれ別個の測定試薬の一構成部品とすることも可能である。
【００１１】
続いて、本発明の凝集反応試薬を使用する免疫学的測定法について説明する。本発明において使用するモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体を緩衝液中で用いる場合は、緩衝液は種々の緩衝液が使用できるが、例えばリン酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液あるいはグッドの緩衝液などが好ましい。その濃度、ｐＨは特に限定されずに使用できるが、１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でｐＨ４〜９の範囲が好ましい。
感作粒子は抗原または抗体を不溶性担体粒子に感作して調製する。
【００１２】
不溶性担体粒子としては、感作、保存および測定を行う時に用いられる液体媒体、一般的には緩衝液に不溶性、即ち水に不溶性の粒子である。
これらの微粒子としてはすでに抗原抗体反応に使用されているものが種々知られており、本発明においてもこれらの公知の微粒子が特に限定されず使用できる。特に好ましく用いられるものを例示すると、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジルメタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクロレインの様な乳化重合法により得られる有機高分子ラテックスなどの有機高分子物質の微粒子、あるいはシリカ、シリカ−アルミナ、アルミナの様な無機酸化物あるいは各種酸化鉄の様な磁性微粒子、またはこれら無機酸化物などにシランカップリング処理などの操作で官能基を導入したり、無機微粒子を有機高分子で被覆した複合微粒子などがあり、生物由来の粒子としてはヒトＯ型赤血球、ヒツジ赤血球、ニワトリ赤血球などの生物由来の粒子などがある。
【００１３】
上記不溶性担体粒子の粒子径については、粒子径が大きい場合、凝集にともなう粒子径の変化量は大きいが凝集反応速度が遅く、粒子径が小さいとブラウン運動が活発で凝集反応速度は速いが一次粒子径が小さいために凝集反応にともなう粒子径の変化量が小さい。このために凝集反応に用いられる不溶性担体粒子の平均粒子径は１０μｍ以下、好ましくは０．０５〜５．０μｍ、特に好ましくは０．１〜１．０μｍの不溶性担体粒子が用いられる。
【００１４】
不溶性担体粒子に感作する抗原あるいは抗体としては、特に限定されず公知のものが使用できる。代表的なものは、例えば抗ヒトアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体、抗癌胎児性蛋白（ＣＥＡ）抗体、抗前立腺特異抗原（ＰＳＡ）抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト反応性蛋白（ＣＲＰ）抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗アルブミン抗体、抗イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体、抗イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体、抗イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）抗体、抗補体第三成分（Ｃ３）抗体、抗補体第四成分（Ｃ４）抗体、、変性ガンマグロブリン、抗ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）、抗ヒト絨毛性ゴナドロビン（ｈＣＧ）抗体、インスリン、抗インスリン抗体、梅毒トレポネーマ抗原、風疹抗原、抗ロタウィルス抗体等の公知の抗原あるいは抗体をあげることができる。
【００１５】
不溶性担体粒子に抗原あるいは抗体を感作する方法は、物理的吸着、化学的共有結合の形成のいずれでもよい。物理的吸着法による感作は、一般的に行われているように、不溶性担体粒子と抗原あるいは抗体を適当な緩衝液中で混合すれば良く、緩衝液の種類、濃度、ｐＨ、抗原あるいは抗体の濃度、あるいは感作時の温度、時間等の最適な条件を選べばよい。化学的共有結合の形成については、すでに多くの方法が提案されており、感作する抗原あるいは抗体の特性に合わせ公知の方法から感作方法を選択すれば良い。一般には分散媒中で抗体を必要に応じて架橋剤の存在下に不溶性担体粒子と混合すれば良い。架橋剤としてはグルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの公知のものが使用できる。さらに、抗原あるいは抗体を感作した後、抗原あるいは抗体のついていない不溶性担体粒子表面をブロックするため免疫学的に不活性な蛋白、例えば牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等を感作することも一般的に行われている。
【００１６】
不溶性担体粒子に抗原または抗体を感作する際の分散媒は特に限定されるものではなく公知のものが使用されるが、上記の架橋剤を使用する場合には分散媒中の成分が架橋剤と反応しない分散媒を用いる必要がある。感作する際の不溶性担体粒子の分散媒中の濃度は特に限定されるものではないが、一般には抗原または抗体と混合した時点で０．０５重量％以上、好ましくは０．２〜２．０重量％となるように選ぶのが好ましい。
【００１７】
本発明において、感作担体粒子を用いた免疫学的測定方法、即ち、抗体感作担体粒子上の抗原または抗体と被検体中の反応する抗体または抗原などとの間における抗原抗体反応に基づく凝集反応を観測する方法は、目視、光学的測定方法など公知の方法が特に限定されず使用できる。光学的測定方法には、一定波長の吸光度、濁度あるいは散乱光の変化または可視光の全波長による濁度の変化による方法などがある。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）  ＡＦＰの測定
（ａ）抗ＡＦＰ感作ラテックスの作成
平均粒径０．３２μｍのラテックスを５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．５）に１Ｗ／Ｖ％の濃度で分散し、抗ＡＦＰ血清（ヤギ、ＩｇＧ分画）を０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で同緩衝液に溶解したものを等量混合し、４℃で一晩静置した。さらに、上記溶液の半量の同緩衝液に溶解した５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）液を加え、室温で４時間ゆっくり振とうし、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で遠心洗浄を３回行い、最終的にラテックス濃度０．２５％となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に分散し、抗ＡＦＰ感作ラテックスを得た。
【００１９】
（ｂ）検体希釈用緩衝液
実施例１  ポリモルフォリノアクリルアミド
ポリモルフォリノアクリルアミド水溶液は、モルフォリノアクリルアミド８０ｇ、次亜リン酸ナトリウム２０ｍｇを２４０ｍｌの水に溶解し、過硫酸カリウム８０ｍｇを重合触媒として、常法により６５℃で８時間、８０℃で２時間重合して得られた。この重合体を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
実施例２  モルフォリノアクリルアミド：アクリルアミド共重合体
モルフォリノアクリルアミド：アクリルアミド共重合体は、モルフォリノアクリルアミド７０ｇ、アクリルアミド１０ｇと次亜リン酸ナトリウム２０ｍｇを２４０ｍｌの水に分散溶解し、実施例１の重合と同様にして得られた。この共重合体を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００２０】
実施例３  モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニルピロリドン共重合体
モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニルピロリドン共重合体は、モルフォリノアクリルアミド４０ｇ、酢酸ビニル１６．４ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン２．３６ｇを２４０ｍｌの水に分散溶解し、実施例１の重合と同様にして得られた。この共重合体を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
実施例４  モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニルホルムアミド共重合体
モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニルホルムアミド共重合体は、モルフォリノアクリルアミド４０ｇ、酢酸ビニル１６．４ｇ、Ｎ−ビニルホルムアミド２．３６ｇを２４０ｍｌの水に分散溶解し、実施例１の重合と同様にして得られた。この共重合体を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００２１】
実施例５  ポリＮ−ビニルホルムアミド
ポリＮ−ビニルホルムアミド（三菱化学（株）製）を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
実施例６  ポリＮ−ビニルアセトアミド
ポリＮ−ビニルアセトアミド（昭和電工（株）製）を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００２２】
比較例１
０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）。
比較例２
ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
比較例３
デキストラン（平均分子量２５００００）を１．０Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００２３】
（Ｃ）ＡＦＰの測定
感作ラテックスを用いたラテックス凝集法の測定は凝集による濁度即ち一定波長の吸光度の変化量を求めれば良い。ここでは生化学検査で汎用されている日立７１５０型自動分析装置を用いて測定した。その測定パラメータを示す。
検体                          １５μＬ
検体希釈用緩衝液（Ｒ−１）  ２５０μＬ
ラテックス懸濁液（Ｒ−２）    ８０μＬ
測定波長                    ７５０ｎｍ
測光ポイント                ２ポイントエンド（３５−５０ポイント）
日立７１５０型自動分析装置では、検体分注後、直ちに検体希釈用緩衝液が添加され、検体は希釈・混合される。その５分後、ラテックス懸濁液が添加され、３５ポイントから５０ポイントまでの濁度変化量（ΔＡｂｓ．（７５０ｎｍ））を求め、これを反応量とした。
この結果を以下に示す。
【００２４】
0004151771.tif 000002
【００２５】
（２）  抗梅毒トレポネーマ（ＴＰ）抗体の測定
（ａ） ＴＰ抗原感作ラテックスの作成
平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックスを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１Ｗ／Ｖ％の濃度で分散し、梅毒菌体破砕物（蛋白濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）を等量混合し、４℃で一晩ゆっくり振とうした。さらに、上記溶液の半量の同緩衝液に溶解した５％ＢＳＡ溶液を加え、室温で４時間ゆっくり振とうしブロッキングした。その後、０．０１％のノニルフェノール系界面活性剤を含む０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて遠心洗浄を３回行い、最終的にラテックス濃度０．１５％となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に分散し、ＴＰ感作ラテックスを得た。
【００２６】
（ｂ） 検体希釈用緩衝液
検体希釈用緩衝液として、（１）ＡＦＰの測定で用いた緩衝液を使用した。
（ｃ）抗ＴＰ抗体の測定
（１）ＡＦＰの測定と同じように日立７１５０型自動分析装置を用いて測定した。
この結果を以下に示す。
0004151771.tif 000003
【００２７】
（３）＜結果＞
実施例で示した通り、感作粒子の表面の抗原または抗体と、検体中の対応する抗体または抗原との間で、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体が相互に作用して凝集反応を起こしやすくし、その結果として抗原と抗体の反応が促進され、測定感度が向上したものと考えら、比較例の水溶液高分子と比べて優れた効果がある。