(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示される配列のアミノ酸残基＋２８〜＋８８に少なくとも９０％同一性の配列を包含するｐ２７kip1アミノ酸配列を含んでなり、かつ、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害する単離又は組換え的に生産されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１、２または３に示される配列に同一の配列を含んでなるサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）の活性化を阻害しうる単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：１、２または３に示される配列の残基２８〜７９からなる単離ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが哺乳類のポリペプチドである請求項１〜３のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドがヒトのポリペプチドである請求項１〜３のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項１〜５のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが約２７ｋＤａの分子量を有する請求項１または２記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項９】
ヌクレオチド配列に操作可能に連結された転写調節配列を含んでなる請求項８記載の単離核酸。
【請求項１０】
転写調節配列が異種の転写調節配列である請求項９記載の単離核酸。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の単離核酸を含んでなる原核細胞または真核細胞中で複製可能な発現ベクター。
【請求項１２】
発現ベクターがウイルスベクターである請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
発現ベクターがプラスミドである請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを含み、かつ該発現ベクターが該ポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４記載の宿主細胞をポリペプチドの生産を可能にする条件下の適当な細胞培養培地で成長させ、それにより生産されるポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチドの生産方法。
【請求項１６】
（ｉ）細胞試料中のｐ２７kip1タンパク質レベルを測定し、そして（ｉｉ）対照の細胞について測定された野生型ｐ２７kip1タンパク質レベルと該細胞試料中のｐ２７kip1タンパク質レベルとを比較することを含んでなり、かつ、該野生型ｐ２７kip1タンパク質がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２（サイクリン依存性キナーゼ２）複合体の活性化を阻害し、そして配列番号：１、２および３の一つに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする細胞または細胞試料中のｐ２７kip1タンパク質の相対的な量を決定する方法。
【請求項１７】
（ｉ）細胞試料中のｐ２７kip1タンパク質レベルを測定し、そして（ｉｉ）該細胞試料中のｐ２７kip1タンパク質レベルを対照細胞について測定されたｐ２７kip1タンパク質レベルと比較することを含んでなり、かつ、該ｐ２７kip1タンパク質がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２（サイクリン依存性キナーゼ２）複合体の活性化を阻害し、そして配列番号：１、２および３の一つに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする患者に由来する細胞またはトランスホームされた細胞試料中のｐ２７kip1タンパク質の相対的な量の決定方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれかに記載のｐ２７kip1ポリペプチドと特異的な免疫反応性を有する単離抗体またはその断片。
【請求項１９】
抗体がモノクロナール抗体である請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
抗体が検出可能な標識で標識されている請求項１８記載の抗体。
【請求項２１】
ｐ２７kip1タンパク質がヒト起源である請求項１８記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれかに記載のｐ２７kip1タンパク質と特異的な免疫反応性を有するポリクローナル抗体の精製調製物またはその断片。
【請求項２３】
ｐ２７kip1タンパク質がヒト起源である請求項２２記載の調製物。
【請求項２４】
（ｉ）請求項１８〜２１のいずれかに記載の単離抗ｐ２７kip1抗体またはその断片、および（ｉｉ）ｐ２７kip1タンパク質との免疫複合体における抗ｐ２７kip1抗体を検出するための手段を含んでなるｐ２７kip1ポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項２５】
抗ｐ２７kip1抗体を検出するための手段が抗ｐ２７kip1抗体に結合された検出可能な標識である請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
抗ｐ２７kip1抗体を検出するための手段が抗ｐ２７kip1抗体と免疫反応性の第二抗体である請求項２４記載のキット。
【請求項２７】
抗ｐ２７kip1抗体が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３に示される配列から選ばれるｐ２７kip1アミノ酸配列に特異的な免疫反応性を有する請求項２４記載のキット。
【請求項２８】
ｐ２７kip1タンパク質がヒト起源である請求項２４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は国立予防衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの承認番号ＣＡ４８７１８の下に支持されて行われた。従って米国政府は発明に一定の権利を有する。
発明の背景
本出願を通じて種々の公開文献が引用される。これらの引用文献に関する完全な列記は明細書の最後、請求の範囲の直前にある。これらの公開文献の開示は本発明が関連する技術分野のより十分な説明のために、引用することにより本出願の内容となる。
細胞周期の間の進行は、正確な細胞複製のために必要な個別の仕事を分離する不可逆的な一系列のトランジシヨン（以下、本明細書では「遷移」ともいう）により区分される。これらの遷移は、特定の条件が満たされるまで細胞周期を抑制するシグナルにより負に調節される。例えば有糸分裂への突入は、不完全に複製されるＤＮＡ又はＤＮＡ損傷により阻害される（Ｗｅｉｎｅｒｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｗｅｌｌ，１９８８）。別のフィードバック経路は、有糸分裂紡錘体が欠陥性である場合にＭからＧ１への遷移を遅らせる（Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１：Ｌｉ  ＆  Ｍｕｒｒｙ，１９９１）。これらの細胞周期の進行に対する制限は、細胞分裂の間の遺伝情報の忠実度の保持に必須である（Ｈａｒｔｗｅｌｌ  ＆  Ｗｅｉｎｅｒｔ，１９８９）。他方Ｇ１からＳ基への遷移は細胞増殖を環境的指示に調和させ、その後、細胞周期進行へのチェックは細胞自律性となる傾向がある（Ｈｅａｒｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４；Ｐａｒｄｅｅ  １９７４，１９８９）。Ｇ１の間に細胞周期進行を制限する細胞外の影響の中に、細胞増殖を阻害するタンパク質、成長因子又はアミノ酸枯渇及び細胞−細胞接触がある。これらのシグナル経路の崩壊は、細胞応答を環境的調節から離し、抑制されない細胞増殖に導き得る。
細胞周期の相の間の遷移はサイクリン−依存性キナーゼ（Ｃｄｋｓ）の群により触媒される（Ｎｕｒｓｅ，１９９０；Ｈａｒｔｗｅｌｌ，１９９１）。いくつかの生物において、Ｇ２からＭへの遷移を調節する生理学的シグナルは有糸分裂Ｃｄｋ、Ｃｄｃ２を活性化する一系列の段階を標的とする。Ｃｄｃ２活性化はトレオニン−１６１上の酸化により正に調節され（Ｂｏｏｈｅｒ  ＆  Ｂｅａｃｈ，１９８６；Ｋｒｅｋ  ＆  Ｎｉｇｇ，１９９１；Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｔ  ａｌ．，１９９０；１９９２）、そしてチロシン−１５上のリン酸化により負に調節される（Ｇｏｕｌｄ  ＆  Ｎｕｒｓｅ，１９８９）。不完全なＤＮＡ複製はｔｙｒ−１５上の脱リン酸化を遅らせ（Ｄａｓｓｏ  ＆  Ｎｅｗｐｏｒｔ，１９９０；Ｓｍｙｔｈｅ  ＆  Ｎｅｗｐｏｒｔ，１９９２）、ｔｙｒ−１５をリン酸化不可能な残基に変換するＣｄｃ２における突然変異は致死的であり、未熟な有糸分裂を引き起こす（Ｇｏｕｌｄ  ＆  Ｎｕｒｓｅ，１９８９）。同様に、ｔｙｒ−１５ホスファターゼ、Ｃｄｃ２５の過剰発現（Ｅｎｏｃｈ  ＆  Ｎｕｒｓｅ，１９９０；Ｋｕｍａｇａｉ  ＆  Ｄｕｎｐｈｙ，１９９１）、又はｔｙｒ−１５キナーゼの消失（Ｌｕｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）は、有糸分裂が開始される前にＤＮＡ複製が完了している必要性を無視する。進行中のＤＮＡ複製により引き起こされる有糸分裂への妨害を完全に説明するためには、さらに別のレベルの調節がおそらく必要である（Ｓｏｒｇｅｒ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，１９９２；Ｈｅａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｔｕｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期の休止はＣｄｃ２の不活性化に関連付けることができる（Ｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗａｌｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）という証拠もあるが、これに関連するチロシンリン酸化の役割は疑問視されてきた（Ｂａｒｂｅｔ  ＆  Ｃａｒｒ，１９９３）。
Ｇ１期のからＳ期への遷移を阻害するシグナルがＣｄｋ活性化を妨害するといういくつかの証拠が、特に酵母において存在する。交配フェロモン（ｍａｔｉｎｇ  ｐｈｅｒｏｍｏｎ）アルファ因子はＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞周期をＧ１において休止させ（Ｒｅｉｄ  ＆  Ｈａｒｔｗｅｌｌ，１９７７）、これはＣＤＣ２８０キナーゼ活性の低下、ならびにＧ１サイクリン及びＣＤＣ２８を含む活性複合体の存在量の減少と関連する（Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＦＡＲ１タンパク質はアルファ因子で処理された細胞においてＧ１サイクリン−ＣＤＣ２８複合体に結合し、これはおそらく細胞周期休止に必要である（Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９９０；Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＣＤＣ２８キナーゼ活性の他の阻害剤が同定されたが、細胞周期進行を調節する生理学的シグナルへのそれらの関連性は未知である（Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ，１９９３；Ｄｕｎｐｈｙ  ＆  Ｎｅｗｐｏｒｔ，１９８９）。
哺乳類細胞は酵母のように、Ｇ１を通る進行及びＳ期への突入にサイクリン−依存性キナーゼを必要とする（Ｄ’Ｕｒｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｂｌｏｗ  ＆  Ｎｕｒｓｅ，１９９０；Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｆａｎｇ  ＆  Ｎｅｗｐｏｒｔ，１９９１；Ｐａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｄ及びＥ−型サイクリンの両方がＧ１からＳへの遷移に関して律速的であり、両方ともマイトジェン成長因子に関する細胞の要求を減少させるが、除去はしない（Ｏｈｔｓｕｂｏ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９３；Ｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。しかし、これらのサイクリン及びＣｄｋｓが細胞増殖を阻害する細胞外シグナルにより負に調節される方法に関する情報はほとんどない。
Ｇ１において細胞周期を妨害する２つのシグナル、細胞−細胞接触及びＴＧＦ−βがどのようにしてＧ１サイクリン−依存性キナーゼ、Ｃｄｋ２の活性に影響を与えるかが研究された（Ｐａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｅｌｌｅｄｇｅ  ＆  Ｓｐｏｔｓｗｏｏｄ，１９９１；Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｅｌｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。Ｍｖ１Ｌｕミンクの上皮細胞の細胞周期を高密度への成長によりＧ１において休止させることができる。これらの接触阻害細胞はサイクリンＥ及びＣｄｋ２の両方を発現するがサイクリンＥ−結合（又は会合）キナーゼ活性は存在しない（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｍｖ１Ｌｕ細胞がＴＧＦ−βの存在下で接触阻害から解放されてもやはりＳ期への突入は妨げられ、これは網膜芽腫（Ｒｂ）タンパク質のリン酸化の妨害と関連する（Ｌａｉｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。Ｃｄｋ２及びＣｄｋ４の両方がＲｂキナーゼとして関連付けられ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｈｉｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｅｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ａ；Ｄｏｗｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ＴＧＦ−α誘導細胞周期休止はＧ１の間のＣｄｋｓの阻害を含み得ることを示唆している（Ｈｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。これと一致して、ＴＧＦ−βによりＧ１後期において休止した細胞は、接触阻害細胞と同様にサイクリンＥ及びＣｄｋ２を発現するが、触媒的活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を含まない（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｃｄｋ４合成もＴＧＦ−βにより抑制される（Ｅｗｅｎｒｙ  ｓｌ．，１９９３ｂ）。Ｃｄｋ２の不活性はＣｄｋ４の不在と一緒になってこれらの細胞におけるＲｂリン酸化への妨害を説明することができる。
本明細書において、接触阻害及びＴＧＦ−β処理細胞は力価測定可能な程過剰の、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合してその活性化を妨げる２７ｋＤタンパク質を含むが、増殖細胞はそうではないことが示される。ｐ２７の阻害活性はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体により競合され得、ｐ２７及びサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４が成長阻害シグナルをＣｄｋ２に伝達する経路内で機能することができることを示唆している。
本発明はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合し、その活性化を阻害することができる単離２７ｋＤタンパク質を提供する。本発明はさらに、関連する組み換え核酸分子、宿主ベクター系及びそれを作出するための方法を提供する。最後に本発明はｐ２７機能に作用する、又はそれを模し、細胞増殖におけるｐ２７の調節的役割を有利に利用する薬剤を同定し、用いる方法を提供する。
発明の概略
本発明はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される約２７ｋＤの見掛けの分子量を有し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合してその活性化を阻害することができる単離タンパク質を提供する。
本発明はさらに本発明のタンパク質をコードする組み換え核酸分子を提供する。
本発明はさらに本発明の組み換え核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明はさらにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される約２７ｋＤの見掛けの分子量を有し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合してその活性化を阻害することができるタンパク質の製造のための宿主ベクター系を提供し、それは適した宿主中に本発明のベクターを含む。
本発明はさらにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される約２ｋＤの見掛けの分子量を有し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合してその活性化を阻害することができるタンパク質の製造法を提供し、それは本発明の宿主ベクター系をタンパク質の生産を可能にする条件下で成長させ、それにより生産されるタンパク質を回収することを含む。
本発明はさらに、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害することができるか否かの決定方法であって、（ａ）適した量のｐ２７タンパク質、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を適した条件下で接触させ；（ｂ）そのように接触させられたｐ２７、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を、ｐ２７タンパク質の不在下では活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を形成させうる条件に供し；（ｃ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を定量的に測定し；（ｄ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を薬剤の不在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量と比較することを含んでなり、薬剤の不在下におけるより多量の、薬剤の存在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体は、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害できることを示す測定方法も提供する。
本発明はさらに、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強することができるか否かの決定方法であって、（ａ）適した量のｐ２７タンパク質、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を適した条件下で接触させ；（ｂ）そのように接触させられたｐ２７、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を、ｐ２７タンパク質の不在下では活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を形成させる条件に供し；（ｃ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を定量的に測定し；（ｄ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を薬剤の不在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量と比較することを含んでなり、薬剤の不在下におけるより少量の、薬剤の存在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体は、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強できることを示す測定方法も提供する。
本発明はさらに高増殖性障害を有する患者の処置方法であって、患者に治療的有効量の、患者の高増殖性細胞におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強することができる薬剤を投与し、それにより患者を処置することを含んでなる方法も提供する。
本発明はさらに低増殖性障害を有する患者の処置の方法であって、患者に治療的有効量の、患者の低増殖性細胞におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害することができる薬剤を投与し、それにより患者を処置することを含んでなる方法も提供する。
本発明はさらに、患者の細胞におけるｐ２７タンパク質突然変異の存在に伴う患者の高増殖性障害の診断方法であって、患者の細胞における、高増殖性障害を伴うｐ２７タンパク質突然変異の存在を測定し、それにより患者における高増殖性障害を診断することを含んでなる方法も提供する。
本発明はさらに有効量の、適した宿主細胞に感染することができる組み換えウィルス及び製薬学的に許容しする担体を含む製薬学的組成物であって、該組み換えウィルスが本発明の核酸分子を含んでなる組成物も提供する。
最後に本発明は、患者の細胞におけるｐ２７タンパク質突然変異の存在に伴う高増殖性障害に苦しむ患者の処置方法であって、患者の処置に有効な量の本発明の製薬学的組成物を患者に投与することを含んでなる方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ
増殖中の細胞、及び成長休止細胞からの抽出物におけるサイクリンＥによるＣｄｋ２の活性化。サイクリンＥを、接触阻害細胞（０）及びＴＧＦ−βの存在下（０β１５）又は不在下（１５）において接触阻害から１５時間解放された細胞からの抽出物に加えた。１５時間細胞は本明細書において、それらが細胞周期を通って進行しており、Ｓ期に突入したことを示すために「増殖細胞」と呼ばれる。０．０５μｌのサイクリンＥはこれらの抽出物における生理学的量のサイクリンＥに相当する。挿入図は最高３回のサイクリンＥの生理学的量の滴定を示す。サイクリンＥの免疫沈降物をヒストンＨ１キナーゼ活性に関して検定し、結果をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量した。外因性サイクリンＥの不在下において観察されるリン酸化のバックグラウンド量を各試料から引き去った。
図１Ｂ
増殖中の細胞、及び成長休止細胞からの抽出物におけるサイクリンＥによるＣｄｋ２の活性化。接触阻害細胞（０）及びＴＧＦ−βの存在下（０β１５）又は不在下（１５）において接触阻害から１５時間解放された細胞から抽出物を調製した。種々の量のこれらの抽出物、及び抽出物の混合物に生理学的量のサイクリンＥを加えた。増殖中の細胞及び休止細胞からの抽出物は示されている割合で混合され、各混合物におけるタンパク質の合計量は７５μｇであった。用いられた各抽出物の量（μｇ）を示す。インキュベーションの後、サイクリンＥを免疫沈降させ、Ｈ１キナーゼ活性に関して検定した。結果をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量した。外因性サイクリンＥの不在下において観察されるリン酸化のバックグラウンド量を各試料から引き去った。
図２Ａ
Ｃｄｋ２阻害剤はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合する。示されている抽出物をＣｄｋ２−セファロースビーズ（Ｋ）、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２セファロースビーズ（ＥＫ）、又はブランクセファロースビーズ（０）と共にインキュベートした。Ｃｄｋ２ビーズは細胞抽出物中に存在するより２倍多いＣｄｋ２を含んだ。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２ビーズは細胞抽出物中に存在するより約６０倍多いサイクリンＥを含んだ。インキュベーションの後、各上澄み液の一部をウェスターンブロッティングにより分析し、サイクリンＥ又はＣＤＫ２のいずれもマトリックスから浸出しなかったことを確かめた。上澄み液の残りを、生理学的量の２倍のサイクリンＥを加えることによりＣｄｋ２活性化に関して検定した。サイクリンＥ免疫沈降物をＨ１キナーゼ活性に関して検定し、結果をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量した。Ｃｄｋ２ビーズによる阻害剤の部分的枯渇は、細胞抽出物とのインキュベーションの間のサイクリン−Ｃｄｋ２複合体の形成に帰すことができる。
図２Ｂ
Ｃｄｋ２阻害剤はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合する。接触阻害細胞（０）、ＴＧＦ−βの存在下（０β１５）又は不在下（１５）において接触阻害から１５時間解放された細胞の抽出物からＣｄｋ２を免疫沈降させた。各免疫沈降物の半分をサイクリンＥ及びＣＡＫと共にインキュベートし、他の半分をモック（ｍｏｃｋ）インキュベートした。各免疫沈降物を次いでヒストンＨ１キナーゼ活性に関して検定し、結果をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量した。ＣＡＫが加えられない場合、サイクリンＥは免疫沈降Ｃｄｋ２に対して非常に小さい活性化効果しか有していなかった。
図２Ｃ
Ｃｄｋ２阻害剤はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合する。成長休止細胞からの抽出物におけるサイクリンＥ活性へのキナーゼ不活性Ｃｄｋ２の影響。各抽出物を５倍過剰のサイクリンＥ（このライセートに関するサイクリンＥ閾値において）、０．５倍過剰のキナーゼ不活性Ｃｄｋ２（Ｃｄｋ２Ｋ）又は両者と共にインキュベートした。これらの割合は、加えられるサイクリンＥの大部分を封鎖せずに加えることができるＣｄｋ２の最大量の実験的決定法に基づいて選ばれた。サイクリンＥ免疫沈降物をＨ１キナーゼ活性に関して検討し、結果をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量した。
図３Ａ
サイクリンＢによるＣｄｋ２活性化。サイクリンＢ及びサイクリンＥを、ＴＧＦ−βの存在下（０β１５）又は不在下（１５）で接触阻害から１５時間解放された細胞からの抽出物に加えた。サイクリンの添加後、抽出物を分け、Ｃｄｋ２のＣ−末端又はＣｄｋ２のＣ−末端に向けられたいずれかの抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物をＨ１キナーゼ活性に関して検定し、生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。「内在性」と標識されている反応は、添加サイクリンを含まない。
図３Ｂ
サイクリンＢによるＣｄｋ２の活性化。サイクリンＢを、ＴＧＦ−βの存在下（０β１５）又は不在下（１５）で接触阻害から１５時間解放された細胞からの抽出物に加えた。各反応物の半分に精製ＣＡＫを補足した。Ｃｄｃ２のＣ−末端に向けられた抗体を用いてＣｄｃ２を免疫沈降させ、Ｈ１キナーゼ活性に関して検定した。結果をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量した。
図４Ａ
サイクリンＥ活性へのサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体の影響。接触阻害細胞（０）、ならびにＴＧＦ−βの存在下（０β１５）又は不在下（１５）で接触阻害から１５時間解放された細胞から抽出物を調製した。サイクリンＤ２、Ｃｄｋ４、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体、又は触媒的不活性Ｃｄｋ４（Ｃｄｋ４Ｋ）に結合したサイクリンＤ２を含む複合体を含む０．０５ミリリットルのＳｆ９細胞ライセートをこれらの抽出物に、生理学的量のサイクリンＥと共に加えた。これらの量のサイクリンＤ２及びＣｄｋ４はこれらのタンパク質の生理学的量に密接に対応する。サイクリンＥを免疫沈降させ、結合ヒストンＨ１キナーゼ活性に関して検定した。
図４Ｂ
サイクリンＥ活性へのサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体の影響。ＴＧＦ−βの存在下（０β１５）又は不在下（１５）で接触阻害から１５時間解放された細胞から抽出物を調製した。示されているサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体を含む０．０５ミリリットルのＳｆ９細胞ライセートをこれらの抽出物に、サイクリンＥの存在下又は不在下で加えた。サイクリンＥを免疫沈降させ、結合ヒストンＨ１キナーゼ活性に関して検定した。
図５Ａ
２７ｋＤサイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合タンパク質。接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞を、より低密度において再平板培養することにより休止から解放し、０及び１５時間において３５Ｓ−メチオニン標識細胞から抽出物を調製した。いくつかの培養物を１００ｐＭのＴＧＦ−βの存在下で１５時間インキュベートした（０β１５）。代謝的に標識されたこれらの抽出物を記載の通りに処理し、結合タンパク質を試料緩衝液中で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び続く蛍光光度法により分析した。分子量マーカーの移動を示す。３５Ｓ−メチオニン標識細胞抽出物をＣｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体と共にインキュベートし、結合タンパク質を試料緩衝液中で溶出させた。矢印は接触阻害及びＴＧＦ−β処理細胞からの抽出物においてサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体と特異的に結合した２７ｋＤタンパク質（ｐ２７）の移動を示す。
図５Ｂ
２７ｋＤサイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合タンパク質。代謝的に標識された接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞からの抽出物を、標準的条件に対して変化させた量のＣｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２と共にインキュベートし、結合タンパク質を以下に記載する通りに分析した。ｐ２７の存在が示されている（矢印）。
図５Ｃ
２７ｋＤサイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合タンパク質。サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２へのｐ２７の結合を妨げる。接触阻害細胞からの抽出物を４μｌのバキュロウィルス生産サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体と共に３０分間４℃において予備インキュベートしてからサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を加えた。
図５Ｄ
２７ｋＤサイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合タンパク質。Ｃｄｋ４免疫沈降物におけるｐ２７の回収。５Ｃからの上澄み液を抗−Ｃｄｋ４抗血清を用いて免疫沈降させ、免疫沈降物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。３４ｋＤにおける白い矢印は内在性ミンクＣｄｋ４タンパク質を示し、一方、黒い矢印はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体と結合したｐ２７を示す。
図６Ａ
ｐ２７及びＣｄｋ２阻害剤の熱安定性。ｐ２７結合は熱安定性であり、ｐ２７信号（ｃａｌｌ）は熱処理により増殖細胞抽出物から回収される。Ｍｖ１Ｌｕ細胞をＴＧＦ−β１と共に（０β１５）又は含まずに（１５）、接触阻害から１５時間解放した。細胞を３５Ｓ−メチオニンを用いて代謝的に標識した。Ｃｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体と共にインキュベートする前に、細胞抽出物に予備処理をしないか、あるいは１００℃で３分間加熱した。熱処理１５時間細胞抽出物におけるｐ２７の出現（矢印）に注意されたい。
図６Ｂ
ｐ２７及びＣｄｋ２阻害剤の熱安定性。Ｃｄｋ２阻害活性を熱処理により増殖細胞抽出物から回収することができる。サイクリンＥ結合キナーゼ活性を、非同調増殖細胞から抽出物において、ヒトサイクリンＥに対する抗体を用いた免疫沈降により測定した。ヒストンＨ１が基質であり、結果をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量した。１列−添加なし；２列−抽出物に生理学的量の３倍のサイクリンＥを補足した；３列−細胞抽出物に増殖細胞からの熱処理抽出物も加えた（方法を参照されたい）ことを除いて２列の場合と同じ。
図６Ｃ
ｐ２７及びＣｄｋ２阻害剤の熱安定性。Ｃｄｋ２阻害活性は熱安定性であった。接触阻害細胞（０）、ＴＧＦ−βの存在下で接触阻害から４８時間解放された細胞（０β４８）又は非同調増殖細胞（Ｅｘｐ）から抽出物を調製した。サイクリンＥ結合キナーゼ活性を外因性サイクリンＥを添加して、又は添加せずに測定した。示されている列の場合、増殖細胞抽出物を、未処理の、又は１００℃で５分間加熱された等量の非増殖細胞からの抽出物と混合した。
図７Ａ
精製ｐ２７によるサイクリンＥ−結合キナーゼ活性の阻害。代謝的に標識された接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞からの抽出物をＣｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティーカラム上のクロマトグラフィーにかけた。結合タンパク質を低ｐＨ緩衝液中で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２溶出物中に存在するｐ２７を示す（矢印）。
図７Ｂ
Ｃｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２カラムからの溶出物をアセトンを用いて沈降させ、再生させた（方法を参照されたい）。各溶出物の一部を増殖細胞からの抽出物に加えた。サイクリンＥを加え、サイクリンＥ結合ヒストンＨ１キナーゼ活性を測定した。サイクリンＥ結合Ｈ１キナーゼ活性を定量し、添加物を与えられない抽出物に対する％阻害としてプロットした。
図７Ｃ
再生溶出物をＣｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体と共にインキュベートした。ｐ２７（矢印）は再生の後にサイクリンＥ−Ｃｄｋ２に結合した。
図７Ｄ
サイクリンＥ−ｃｄｋ２カラムからの溶出物を１２％アクリルアミドゲル上で分別した。ゲルを示される通りに切片に切り、タンパク質を溶出させ、再生した。各ゲル切片から回収されるタンパク質の一部をサイクリンＥと共に、増殖Ｍｖ１Ｌｕ細胞から調製された抽出物に加えた。サイクリンＥ免疫沈降物をヒストンＨ１キナーゼ活性に関して検定した。
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄ
Ｋｉｐ１の精製、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２相互作用及び試験管内翻訳。
Ａ．休止Ｍｖ１Ｌｕ細胞からの熱−処理抽出物をサイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティークロマトグラフィーにかけた。溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色した。ｐ２７Kip1を矢印により示す。広いバンドはＣｄｋ２−ＨＡであり、６９ｋｄのバンドはブランクの列にも存在する汚染物である。Ｂ．代謝的に標識された休止Ｍｖ１Ｌｕ細胞からの抽出物を、予備免疫ウサギ血清（標準）又は抗−Ｃｄｋ２抗体を用いて沈降させた。Ｃ．パネルＢにおける通りに抗−Ｃｄｋ２抗体を用いた共沈降により（生体内ｐ２７）、あるいはパネルＡにおける通りにサイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティークロマトグラフィーにより（試験管内ｐ２７）得た代謝的−標識ｐ２７をＶ８プロテアーゼを用いて消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び蛍光光度法により現した。Ｄ．エンプティーベクター（ｖｅｃｔｏｒ）又はヒスチジン−標識マウスＫｉｐ１をコードするベクター（Ｋｉｐ１）を含む試験管内翻訳物をＮｉ++−ＮＴＡ−アガロースに結合させ、試料緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
図９Ａ及び９Ｂ
哺乳類Ｋｉｐ１配列及びＣｉｐ１／ＷＡＦ１との比較。Ａ．ミンク（ｍｋ）、マウス（ｍ）及びヒト（ｈ）からのＫｉｐ１  ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列。同一のアミノ酸を点により示す。利用できるミンク配列はＣ−末端において不完全である。精製Ｋｉｐ１から得られるペプチド配列に下線を引く。太い下線はＰＣＲのための縮重オリゴヌクレオチドの設計に役立つ２つの配列を示す。Ｂ．ヒトＫｉｐ１及びＣｉｐ１／ＷＡＦ１の間の配列の整列。両タンパク質の推定２分割核局在化シグナルに下線を引く。Ｋｉｐ１に存在するＣｄｃ２キナーゼ共通部位を太い棒により示す。
図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ及び１０Ｅ
試験管内におけるＫｉｐ１によるＣｄｋ阻害及びＫｉｐ１のＣｄｋ阻害ドメインの同定。バキュロウィルスサイクリンＥ及びＣｄｋ２（Ａ、Ｃ）又は示されているサイクリン／Ｃｄｋ組み合わせを含む細胞ライセートをヒストンＨ１キナーゼ活性（Ａ，Ｂ）及びＲｂキナーゼ活性（Ｃ、Ｄ）に関して、示されている濃度のＫｉｐ１の存在下で検定した。リン酸化された基質を含む代表的ゲルを示す（Ａ、Ｃ）。相対的リン酸化の量を定量し、Ｋｉｐ１を含まない反応において観察されるリン酸化のパーセンテージとしてプロットする。Ｅ．Ｃｉｐ１／ＷＡＦ１に最高相同性の領域を示すＫｉｐ１タンパク質の略図（陰影をつけた四角；図９Ｂも参照されたい）。棒及び数字はＣ−末端ヘキサヒスチジン標識を用いて製造され、Ｃｄｋ阻害アッセイにおいて用いられる種々のフラグメントの寸法及び位置を示す。これらのフラグメントの活性を全長Ｋｉｐ１の活性に対するパーセンテージとして示す。
図１１Ａ及び１１Ｂ
Ｋｉｐ１は試験管内でＣｄｋ２の活性化を阻害する。指数的に成長するＡ５４９細胞からの抽出物を、単独で、又はＫｉｐ１と一緒にバキュロウィルスにより発現されたヒスチジン−標識サイクリンＥと共にインキュベートした。次いでＮｉ++−ＮＴＡ−アガロースを用いてサイクリンＥ複合体を回収し、ヒストンＨ１キナーゼ活性に関して（Ａ）、及び抗−Ｃｄｋ２抗体を用いたウェスターンブロッティングにより（Ｂ）検定した。キナーゼ活性をｐｈｏｓｐｈｒｉｍａｇｅｒにより定量し、任意の単位として表した。ＢにおいてＣｄｋ２＊はＣｄｋ２の速移動形態（ｆａｓｔｅｒ  ｍｉｇｒａｔｉｎｇ  ｆｏｒｍ）を示し、それはＴｈｒ160においてリン酸化されたＣｄｋ２に対応する（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
図１２Ａ及び１２Ｂ
種々の組織及び細胞増殖状態におけるＫｉｐ１の発現パターン。示されているヒト組織からの（Ａ）、又は種々の増殖状態のＭｖ１Ｌｕ細胞からの（Ｂ）等量のポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いたＫｉｐ１ノザンブロット。後者のブロットをグリセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼプローブを用いて再ハイブリッド形成させた。
発明の詳細な説明
本発明はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される約２７ｋＤの見掛けの分子量を有し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合し、その活性化を阻害することができる単離タンパク質を提供する。
本発明において、２７ｋＤ分子量を得るために用いられるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、還元条件下で行われる。
１つの実施態様の場合、本発明の単離タンパク質は哺乳類タンパク質である。哺乳類タンパク質はネズミタンパク質であることができる。哺乳類タンパク質はヒトタンパク質であることもできる。哺乳類タンパク質はさらにミンクタンパク質であることができる。１つの実施態様の場合、ミンクタンパク質はＭｖ１Ｌｕ細胞から誘導され、表Ｉに示される部分的内部アミノ酸配列を有するミンクタンパク質である。
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本発明において、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される約２７ｋＤの見掛けの分子量を有し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合し、その活性化を阻害することができるタンパク質は同義的に「ｐ２７」、「ｐ２７タンパク質」、「阻害剤」、「ｐ２７Kip1」及び「Ｋｉｐ１」と呼ばれる。
本明細書で用いられる「単離された」は遊離の、又は他のいずれかのタンパク質を意味する。例えば単離タンパク質はニトロセルロース膜フラグメント及び緩衝液を含むことができる。
本明細書で用いられる「サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合することができる」は、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合することができるがＣｄｋ２のみには結合できないことを意味する。
サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化の阻害は、例えば（ａ）サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体のＣｄｋ２部分の部位−特異的リン酸化及び（ｂ）ヒストンキナーゼ活性に関するアッセイを用いて測定することができる。そのようなアッセイは下文においてより詳細に議論する。これらのアッセイは速度論的様式で（すなわちリン酸化の速度の測定により）、あるいは定性的又は定量的静止アッセイとして（すなわち選択される時点において行われる測定）行うことができる。当該技術分野における熟練者は、そのようなアッセイにおいて多様な酵素及び条件を用いることができることを知っているであろう。本発明の場合、等量のｐ２７及びサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を用いる速度論的様式アッセイにおいて、速度が少なくとも５０％阻害されたらｐ２７は複合体のＣｄｋ２部分の部位−特異的リン酸化の速度（１分当たりにリン酸化されるＣｄｋ２部分のモルにより表される）を阻害する。
本発明の単離２７ｋＤタンパク質は、例えば下文で説明する熱処理法により、及びサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体アフィニティー法により得ることができる。
本発明はさらにアミノ酸残基＋２８から、それを含んでアミノ酸残基＋８８までのｐ２７タンパク質の部分とのアミノ酸配列相同性を有する部分を含むタンパク質を提供する（図９Ｂに示す通り）。１つの実施態様の場合、タンパク質はアミノ酸残基＋２８から、それを含んでアミノ酸残基＋８８までのｐ２７タンパク質の部分において、少なくとも１つの四角で囲まれたアミノ酸残基との配列同一性を有する（図９Ｂに示す通り）。タンパク質は自然に存在する、又は組み換えタンパク質であることができる。１つの実施態様の場合、相同性の程度は３０％である。別の実施態様の場合、相同性の程度は４０％である。別の実施態様の場合、相同性の程度は４４％である。別の実施態様の場合、相同性の程度は５０％である。別の実施態様の場合、相同性の程度は９０％である。
本発明はさらに、本発明のタンパク質をコードする組み換え核酸分子を提供する。
本明細書で用いられる組み換え核酸分子は自然には存在せず、組み換え法の使用を介して得られる核酸分子である。
１つの実施態様の場合、核酸分子はＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子はｃＤＮＡ分子又はクローニングされたゲノムＤＮＡ分子であることができる。別の実施態様の場合、核酸分子はＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子であることができる。
本発明はさらに、本発明の組み換え核酸分子を含むベクターを提供する。１つの実施態様の場合、ベクターはプラスミドである。別の実施態様の場合、ベクターはウィルスである。
本発明に従い、本発明のタンパク質の発現のために多数のベクター系を用いることができる。例えば１つの種類のベクターは、ウシ乳頭腫ウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス、レトロウィルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭｏＭＬＶ）、セムリキ森林熱ウィルス又はＳＶ４０ウィルスなどの動物ウィルスから誘導されるＤＮＡ要素を利用する。さらに、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーの導入により、ＤＮＡをその染色体中に安定して組み込んだ細胞を選択することができる。マーカーは例えば栄養要求性宿主にプロトトロフ性を、殺生物剤耐性（例えば抗生物質）を、又は銅などの重金属に対する耐性を与えることができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接連鎖させることができ、あるいは共形質転換により同じ細胞中に導入することができる。ｍＲＮＡの最適合成のために追加の要素も必要であり得る。これらの要素はスプライシングのシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー及び停止シグナルを含むことができる。
本発明はさらに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される約２７ｋＤの見掛けの分子量を有し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合し、その活性化を阻害することができるタンパク質の製造のための宿主ベクター系を提供し、それは適した宿主中に本発明のベクターを含む。
１つの実施態様の場合、適した宿主はバクテリア細胞である。別の実施態様の場合、適した宿主は真核細胞である。真核細胞は昆虫細胞であることができる。昆虫細胞は例えばｓｆ９細胞を含む。
本発明はさらに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される約２７ｋＤの見掛けの分子量を有し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合し、その活性化を阻害することができるタンパク質の製造法を提供し、それは本発明の宿主ベクター系をタンパク質を生産させる条件下で成長させ、それにより生産されるタンパク質を回収することを含む。
宿主ベクター系の成長及び、そのようにして生産されるタンパク質の回収のための方法及び条件は、当該技術分野における熟練者に周知であり、用いられる特定のベクター及び宿主細胞に依存して変え、最適化することができる。そのような回収法は、例えばゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又はそれらの組み合わせを含む。
本発明はさらに、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害することができるか否かの決定方法であって、（ａ）適した量のｐ２７タンパク質、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を適した条件下で接触させ；（ｂ）そのように接触させられたｐ２７、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を、ｐ２７タンパク質の不在下では活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を形成させる条件に供し；（ｃ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を定量的に測定し；（ｄ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を薬剤の不在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量と比較することを含んでなり、薬剤の不在下におけるより多量の、薬剤の存在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体は、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害できることを示す方法も提供する。
本明細書で用いられる「薬剤」という用語はタンパク質及び非−タンパク質部分を含む。１つの実施態様の場合、薬剤は小分子である。別の実施態様の場合、薬剤はタンパク質である。薬剤は低分子量化合物のライブラリーから、又は植物もしくは他の生物からの抽出物のライブラリーから誘導されることができる。
本発明の場合、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害することができる薬剤は、ｐ２７タンパク質とサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の間の相互作用を妨害するが、ｐ２７タンパク質の不在下におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体のＣｄｋ２部分の部位−特異的リン酸化を妨害しない。
サイクリンＥは、Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に開示されているように、サイクリンＥをコードする核酸配列に基づく当該技術分野における熟練者に周知の方法を用いて得ることができる。Ｃｄｋ２はＥｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｐｏｔｔｓｗｏｏｄ（１９９１）に開示されているように、Ｃｄｋ２をコードする核酸配列に基づく当該技術分野における熟練者に周知の方法を用いて得ることができる。
本発明の方法に適したｐ２７タンパク質、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤の量は、当該技術分野における熟練者に周知の方法により決定されることができる。ｐ２７タンパク質、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤が接触させられる適した条件（すなわち薬剤によるｐ２７機能への影響の測定に適した条件）の例は、下文に示す。
ｐ２７タンパク質の不在下で活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の形成を可能にする条件の例も、下文に示す。
本明細書で用いられる「活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体」は、適した基質（例えばヒストンＨ１）を特異的にリン酸化することができるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を意味する。活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の例は、下文に示す。活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量は、その測定可能な活性と関連する。かくして活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量の定量的測定は、活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の基質がリン酸化される速度の測定により行うことができる。そのような方法は当該技術分野における熟練者に周知であり、例えばヒストンＨ１キナーゼアッセイを含む。
本発明の方法の場合、サイクリンＥ及びＣｄｋ２タンパク質は薬剤と接触させられる前に、別々のタンパク質として、あるいは複合体として存在することができる。
本発明はさらに、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強することができるか否かの決定方法であって、（ａ）適した量のｐ２７タンパク質、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を適した条件下で接触させ；（ｂ）そのように接触させられたｐ２７、サイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を、ｐ２７タンパク質の不在下では活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を形成させる条件に供し；（ｃ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を定量的に測定し；（ｄ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を薬剤の不在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量と比較することを含んでなり、薬剤の不在下におけるより少量の、薬剤の存在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体は、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強できることを示す方法も提供する。
本発明の場合、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強することができる薬剤は、ｐ２７タンパク質とサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の間の相互作用に影響を与えるが、ｐ２７タンパク質の不在下におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体のＣｄｋ２部分の部位−特異的リン酸化に影響を与えない。
本発明はさらに、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を模することができるか否かの決定方法であって、（ａ）適した量のサイクリンＥ、Ｃｄｋ２及び薬剤を、薬剤の不在下では活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を形成させる条件下で接触させ；（ｂ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を定量的に測定し；（ｃ）そのようにして形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量を薬剤の不在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量と比較することを含んでなり、薬剤の不在下におけるより少量の、薬剤の存在下で形成される活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体は、薬剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を模することができることを示す方法も提供する。
本発明はさらに、高増殖性障害を有する患者の処置方法であって、患者に治療的有効量の、患者の高増殖性細胞におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強することができる薬剤を投与し、それにより患者を処置することを含んでなる方法も提供する。
好ましい実施態様の場合、患者はヒトである。
高増殖性障害は、障害を有する患者に存在する細胞が異常な高速度で増殖し、その増殖の異常な高速度が障害の原因である障害である。１つの実施態様の場合、高増殖性障害は癌及び過形成から成る群より選ばれる。
薬剤の投与は当該技術分野における熟練者に既知の種の方法のいずれかを用いて達成する、又は行うことができる。１つの実施態様の場合、投与は静脈内投与を含む。別の実施態様の場合、投与は筋肉内投与を含む。さらに別の実施態様の場合、投与は皮下投与を含む。
薬剤の治療的有効量は当該技術分野における熟練者に周知の方法により決定することができる。
本発明はさらに、治療的有効量の、高増殖性障害に苦しむ患者の高増殖性細胞におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に増強することができる薬剤、ならびに製薬学的に許容し得る担体を含む製薬学的組成物を提供する。
製薬学的に許容し得る担体は当該技術分野における熟練者に周知であり、０．０１〜０．１Ｍ、及び好ましくは０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液、あるいは０．８％の食塩水を含むがこれらに限られるわけではない。さらに、そのような製薬学的に許容し得る担体は水性又は非−水性溶液、懸濁液及び乳液であることができる。非−水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理的食塩水及び緩衝媒体を含む水、アルコール性／水性溶液、乳液又は懸濁液を含む。
非経口的ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸添加リンガー液（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）又は固定油（ｆｉｘｅｄ  ｏｉｌｓ）を含む。静脈内ビヒクルは液及び栄養補充剤、リンガーデキストロースに基づくもののような電解質補充剤などを含む。防腐剤及び他の添加剤、例えば殺微生物剤、酸化防止剤、キレート形成剤、不活性気体なども存在することができる。
本発明はさらに、患者に治療的有効量の、患者の高増殖性細胞におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を模することができる薬剤を投与し、それにより患者を処置することを含む、高増殖性障害を有する患者の処置の方法を提供する。
本発明はさらに低増殖性障害を有する患者の処置の方法を提供し、それは患者に治療的有効量の、患者の低増殖性細胞におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害することができる薬剤を投与し、それにより患者を処置することを含む。
好ましい実施態様の場合、患者はヒトである。
低増殖性障害は、障害を有する患者に存在する細胞が異常な低速度で増殖し、その増殖の異常な低速度が障害の原因である障害である。１つの実施態様の場合、低増殖性障害は潰瘍である。低増殖性細胞の例は正常な組織及び臓器における末端分化細胞（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）であり、それは肝臓及び骨髄を除いて通常外傷に続く再生の能力がない。かくして本発明の方法、及びそれにより同定される薬剤は、それを必要としている患者における組織及び臓器修復の刺激において、ならびに多種多様な組織からの細胞の組織培養の確立において用途を有する。
薬剤の治療的有効量は当該技術分野における熟練者に周知の方法により決定することができる。
本発明はさらに治療的有効量の、低増殖性障害に苦しむ患者の低増殖性細胞中のサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害するｐ２７タンパク質の能力を特異的に阻害することができる薬剤、ならびに製薬学的に許容し得る担体を含む製薬学的組成物を提供する。
本発明はさらに、ｐ２７タンパク質に特異的に結合することができる部分的精製ポリクローナル抗体を得るための方法を提供し、その方法は（ａ）ｐ２７タンパク質を用いて患者を免疫化し、（ｂ）免疫化された患者から、ｐ２７タンパク質に特異的に結合することができる抗体を含む血清を回収し、（ｃ）血清に存在する抗体を部分的に精製し、それによりｐ２７タンパク質に特異的に結合することができる部分的精製ポリクローナル抗体を得ることを含む。
本明細書で用いられる部分的精製抗体は、ｐ２７タンパク質に特異的に結合する抗体を含み、抗体が誘導された血清が含むより少量のタンパク質不純物を含む組成物を意味する。タンパク質不純物は、ｐ２７タンパク質に特異的な抗体以外のタンパク質を意味する。例えば部分的精製抗体はＩｇＧ調剤であることができる。
患者から血清を回収する方法は当該技術分野における熟練者に周知である。抗体の部分的精製の方法も当該技術分野における熟練者に周知であり、例えば濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び沈降を含む。
本発明はさらに、本発明の方法により製造される部分的精製抗体を提供する。
本発明はさらにｐ２７タンパク質に特異的に結合することができる精製モノクローナル抗体を得るための方法を提供し、その方法は（ａ）ｐ２７タンパク質で患者を免疫化し、（ｂ）免疫化された患者からＢ細胞−含有細胞試料を回収し、（ｃ）そのようにして回収されたＢ細胞−含有細胞試料を骨髄腫細胞と、骨髄腫細胞がその中のＢ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成することを可能にする条件下で接触させ、（ｄ）得られる試料からｐ２７タンパク質に特異的に結合することができるモノクローナル抗体を生産することができるハイブリドーマ細胞を単離し、（ｅ）そのようにして単離されたハイブリドーマ細胞を、モノクローナル抗体の生産を可能にする条件下で成長させ、（ｆ）そのようにして生産されるモノクローナル抗体を回収し、それによりｐ２７タンパク質に特異的に結合することができる精製モノクローナル抗体を得ることを含む。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造法は、当該技術分野における熟練者に周知である。
本発明はさらに、本発明の方法の段階（ｄ）において製造されるハイブリドーマ細胞を提供する。
本発明はさらに、本発明の方法により製造される精製モノクローナル抗体を提供する。
本明細書で用いられる「精製モノクローナル抗体」は、他のいずれの抗体も含まないモノクローナル抗体を意味する。
本発明はさらに、ｐ２７タンパク質に特異的に結合することができ、検出可能なマーカーで標識されている抗体を提供する。
標識抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体であることができる。１つの実施態様の場合、標識抗体は精製標識抗体である。「抗体」という用語は、例えば自然に存在する、及び非−自然的に存在する抗体の両方を含む。特に「抗体」という用語はポリクローナル及びモノクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントを含む。さらに「抗体」という用語はキメラ抗体及び全合成抗体、ならびにそれらのフラグメントを含む。検出可能なマーカーは、例えば放射性又は蛍光性であることができる。抗体の標識の方法は当該技術分野において周知である。
本発明はさらに、試料中のｐ２７タンパク質の量を定量的に決定する方法を提供し、その方法は試料を本発明の抗体と、抗体が試料中に存在するｐ２７タンパク質と複合体を形成するのを可能にする条件下で接触させ、そのようにして形成される複合体の量を定量的に測定し、そのようにして決定される量を既知の標準と比較し、それにより試料中のｐ２７タンパク質の量を定量的に決定することを含む。
試料は、例えば細胞試料、組織試料又はタンパク質−含有液体試料であることができる。抗体がその抗原と複合体を形成するのを可能にする条件、及びそのようにして形成される複合体の存在を検出する方法は当該技術分野において周知である。
決定される試料中に存在するｐ２７タンパク質の量は、試料中のｐ２７タンパク質分子の実際の数又はｐ２７タンパク質のモル数である必要はないという意味で、絶対数である必要はない。むしろ測定される量は単にこの数と関連していれば良い。
本発明はさらに、細胞集団におけるｐ２７の発現量の定量的決定の方法、及び薬剤が細胞集団におけるｐ２７の発現量を増加又は減少させることができるか否かの決定の方法を提供する。薬剤が細胞集団におけるｐ２７の発現量を増加又は減少させることができるか否かを決定する方法は、（ａ）標準及び薬剤−処理細胞集団から細胞抽出物を調製し、（ｂ）細胞抽出物からｐ２７を単離し（例えばサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体固相アフィニティー吸着剤上におけるアフィニティークロマトグラフィー及びそれからの溶出により）、（ｃ）サイクリンＥ−Ｃｄｋ２キナーゼアッセイ（例えば下文に記載するヒストンＨ１アッセイ）を用いて標準及び薬剤−処理細胞抽出物におけるｐ２７阻害剤活性の量を定量する（例えば平行して）段階を含む。ｐ２７発現の増加を誘導する薬剤は、転写に依存する方法で処理細胞抽出物におけるｐ２７阻害剤活性の量を増加させるその能力により同定することができ、すなわちｐ２７阻害剤活性における増加は、細胞が転写の阻害剤（例えばアクチノマイシンＤ）をも用いて処理されると妨げられる。類似の方法で、ｐ２７の発現を減少させる薬剤を、転写に依存する方法で処理細胞抽出物におけるｐ２７阻害剤活性の量を減少させるその能力により同定することができる。
本発明はさらに、患者から得る細胞試料が異常な量のｐ２７タンパク質を有しているか否かを決定する方法を提供し、それは（ａ）患者から細胞試料を得、（ｂ）そのようにして得た試料におけるｐ２７タンパク質の量を定量的に測定し、（ｃ）そのようにして測定されたｐ２７タンパク質の量を既知の標準と比較し、それにより患者から得た細胞試料が異常な量のｐ２７タンパク質を有しているか否かを決定することを含む。
本発明はさらに、病気の患者から得る細胞試料におけるｐ２７タンパク質の量が病気と関連するか否かを決定する方法を提供し、それは患者から得た細胞試料が異常な量のｐ２７タンパク質を有しているか否かを測定することを含み、試料中の異常な量のｐ２７タンパク質は、病気の患者から得た細胞試料中のｐ２７タンパク質の量が病気と関連することを示す。
本発明はさらに試料中のｐ２７タンパク質の比活性の定量的決定の方法を提供し、それは（ｉ）サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害する試料中のｐ２７タンパク質の能力、及び（ｉｉ）試料中のｐ２７タンパク質の合計量を定量的に測定し、そのようにして決定されたｐ２７タンパク質の能力を、そのようにして決定されたｐ２７タンパク質の合計量で割り、それにより試料中のｐ２７タンパク質の比活性を定量的に決定することを含む。
本発明はさらに、本発明の方法を行うためのキットを提供する。１つの実施態様の場合、キットは適した量のｐ２７タンパク質、サイクリンＥ及びＣｄｋ２を含む。キットはさらに適した緩衝液、及びサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体活性の阻害剤としてのｐ２７を説明する添付文書を含むことができる。
本発明はさらに、患者の細胞におけるｐ２７タンパク質突然変異の存在に伴う患者の高増殖性障害の診断の方法を提供し、それは患者の細胞における、高増殖性障害を伴うｐ２７タンパク質突然変異の存在を測定し、それにより患者における高増殖性障害を診断することを含む。
本明細書で用いられる「診断する」という用語は、患者において高増殖性障害の存在を決定することを意味する。１つの実施態様の場合、「診断する」はさらに、患者における高増殖性障害の型を決定することを意味する。
本明細書で用いられる「ｐ２７タンパク質突然変異」は、ｐ２７タンパク質をコードする、又はその発現を調節するゲノムＤＮＡ配列における異常から生ずるｐ２７タンパク質の一次配列におけるいずれの異常であることもできる。例えばｐ２７タンパク質突然変異は点突然変異、ｐ２７タンパク質の一部の欠失突然変異、又はｐ２７タンパク質をコードする構造遺伝子における、又はその発現を調節する調節ＤＮＡ配列における異常から生ずる、全ｐ２７タンパク質の不在であることができる。
ｐ２７タンパク質突然変異の存在の決定は、当該技術分野における熟練者に周知の方法に従って行うことができる。そのような方法はｐ２７核酸プローブを用いた患者のＤＮＡ又はＲＮＡの精査を含む。そのような方法は患者からのタンパク質試料をｐ２７タンパク質の構造的異常又はそれから生ずる機能的異常に関して分析することも含む。
好ましい実施態様の場合、患者はヒトであり、高増殖性障害は癌である。
本発明はさらに、有効量の、適した宿主細胞に感染することができ、本発明の核酸分子を含む組み換えウィルス、ならびに製薬学的に許容し得る担体を含む製薬学的組成物を提供する。
「適した宿主細胞」は、健康な患者において通常ｐ２７タンパク質を生産するいずれかの細胞である。
製薬学的に許容し得る担体は当該技術分野における熟練者に周知であり、０．０１〜０．１Ｍ、及び好ましくは０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液、あるいは０．８％の生理的食塩水を含むがこれらに限られるわけではない。さらに、そのような製薬学的に許容し得る担体は水性又は非−水性溶液、懸濁液及び乳液であることができる。非−水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理的食塩水及び緩衝媒体を含む水、アルコール性／水性溶液、乳液又は懸濁液を含む。非経口的ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸添加リンガー液又は固定油を含む。静脈内ビヒクルは液及び栄養補充剤、リンガーデキストロースに基づくもののような電解質補充剤などを含む。防腐剤及び他の添加剤、例えば殺微生物剤、酸化防止剤、キレート形成剤、不活性気体なども存在することができる。
最後に本発明は患者に、患者の処置に有効量の本発明の製薬学的組成物を投与することを含む、患者の細胞におけるｐ２７タンパク質突然変異の存在に伴う高増殖性障害に苦しむ患者の処置の方法を提供する。
好ましい実施態様の場合、患者はヒトであり、高増殖性障害は癌である。
続く実験的詳細の部分の理解を容易にするために、頻繁に用いられているある種の方法及び／又は用語はＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）において最も良く説明されている。
続く実験的詳細を参照することにより、本発明をさらに良く理解できるが、当該技術分野における熟練者は、詳細に説明されている特定の実験は下文に続く請求に範囲により完全に記載されている本発明の単なる典型であることを容易に認識するであろう。
実験的詳細
Ｉ
概略
細胞−細胞接触及びＴＧＦ−βは、細胞周期をＧ１において休止させることができる。いずれかの機構により休止されられたＭｖ１Ｌｕミンク上皮細胞はＧ１サイクリン、サイクリンＥ及びその触媒サブユニットＣｄｋ２を含む活性複合体を集合させることができない。これらの成長阻害シグナルはＣｄｋ２の活性化に必要なサイクリンＥの閾量を上げることによりＣｄｋ２活性化を妨害する。休止細胞の場合、閾値は生理学的サイクリンＥ量より高く設定され、それはサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合する阻害剤により決定される。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合し、その活性化を妨げる２７ｋＤタンパク質は、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティークロマトグラフィーにより休止細胞から精製することができるが、増殖細胞からは精製できない。ｐ２７は増殖細胞に存在するが、それは封鎖され、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体との相互作用に利用できない。サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体はｐ２７にき競合的に結合し、その活性をダウンレギュレートし、それによりＣｄｋ２阻害を取り消す経路において作用することができ、Ｇ１を進行させることができる。
方法
細胞培養
指数的に成長するＭｖ１Ｌｕ細胞を１０％ウシ胎児血清の存在下で密集まで培養することにより、成長休止させた。トリプシン化により細胞を接触阻害から解放し、希薄状態で再播種した。ＴＧＦ−β（１００ｐＭ）を示されている時間に細胞に加えた。Ｓ期への細胞の突入を、ＤＮＡ中への125Ｉ−デオキシウリジン挿入により機械的手順で確かめた（Ｌａｉｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
組み換えタンパク質の製造
サイクリンＥ、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ２−ＨＡ及びＣｄｋ２ＫをＤｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）の方法により調製した。簡単に記載すると、密集Ｓｆ９細胞の１００ｍｍの平板に細胞当たり５〜２０ｐ．ｆ．ｕ．のｍ．ｏ．ｉ．で適したバキュロウィルスを感染させた。感染の４８時間後、細胞を集め、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイゼーション又は低張緩衝液中におけるカップホーン音波処理により溶解した。抽出物は超遠心により透明化し、−７０℃で保存する。サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｃｄｋ４及び触媒的不活性Ｃｄｋ４を含むバキュロウィルスベクターは、以前に記載されている（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
ｐ２７Kip-1の精製及びミクロシークエンシング
ミクロシークエンシング分析に十分な量でｐ２７を精製するために、精製案は出発材料として、接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞（〜２ｘ１０10細胞）の密集培養を含む２００個の１５−ｃｍの皿を用いた。細胞を３３ｍｌの低張抽出緩衝液中における音波処理により溶解し、細胞破片を２００，０００ｘｇにおける１時間の遠心により除去した。ライセートを１００℃に５分間加熱し、沈降材料を１００，０００ｘｇにおける１５分間の遠心により除去した。上澄み液を４ｘ  ＮＰ−４０ライシス緩衝液を用いてＮＰ−４０ライシス緩衝条件（Ｐｏｌｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に調節し、４℃において５ｍｌのアガロースを用いた連続する２回の３０分インキュベーション及び同じ条件下で５ｍｌのニッケル−ＮＴＡ−アガロースを用いた１回のインキュベーションにより予備浄化（ｐｒｅｃｌｅａｒｅｄ）した。
予備浄化されたライセートをアフィニティーカラムに４℃において２時間結合させた。このアフィニティーカラムは、ニッケル−ＮＴＡ−アガロースへの結合を可能にするヘキサヒスチジン配列でＮ−末端において標識されたバキュロウィルスサイクリンＥとの複合体の状態のバキュロウィルスＣｄｋ２を含むニッケル−ＮＴＡ−アガロースを含んだ。カラム室温において５０ｍｌのＮＰ−４０ライシス緩衝液で１回、及び５０ｍｌのＳＤＳ／ＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄した。結合タンパク質を６Ｍのグアニジウム塩酸塩を含む５ｍｌのＨｅｐｅｓ−緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いて溶出した。溶出物をＨｅｐｅｓ−緩衝溶液に対して終夜透析し、−２０℃において３０分間、４体積のアセトンを用いてタンパク質を沈降させた。沈降タンパク質を２０，０００ｘｇにおける１５分間の遠心により集め、ジチオトレイトールを含むＳＤＳ電気泳動試料緩衝液において可溶化し、１２％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。電気泳動の後、ゲルを３５Ｖにおいて、Ｔｒｉｓ／グリシン／メタノール転移緩衝液中で終夜、ニトロセルロース上にブロットした。
ニトロセルロース膜をＰｏｎｃｅａｕ染色を用いて染色し、タンパク質を検出した。このアッセイに従うと、フィルターは２種のタンパク質を含むのみであり、それらは互いに十分に分離され、それぞれ２７ｋｄ及び３４ｋｄであった。これらのタンパク質をｐ２７及びｐ３４cdk2と同定した。２つの別々の試料は類似の結果を与えた。これらの２つの試料におけるｐ２７の収量は、Ｐｏｎｃｅａｕ染色及びミクロシークエンシングから見積もってそれぞれ約０．３μｇ及び１μｇであった。
精製ｐ２７を含むニトロセルロースのタンパク質を切り出し、ミクロシークエンシング分析のための試料においてトリプシン消化に供した。トリプシン消化物のＨＰＬＣの後、以下のペプチドが配列決定された：
0004143119.tif 000003
これらの配列及び、１９９３年１２月３１日において入手できる最近の情報に従って、Ｇｅｎｂａｋ，ＥＭＢＬ  Ｄａｔａ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ，Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ又はＰＩＲデータベースに寄託されているタンパク質の配列の間に類似性は見いだされなかった。
ｐ２７  ｃＤＮＡを得るためのオリゴヌクレオチド
ｐ２７の全長ｃＤＮＡ配列を得るために用いられるオリゴヌクレオチドを表ＩＩに示す：
0004143119.tif 000004
ＣＡＫ
正確に記載されている通りにして（Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）Ｍｏｎｏ  Ｑ段階を介し、クセノプス（アメリカツメガエル）（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵抽出物からＣＡＫを精製し、１ｍｌ当たり１〜２単位の最終的濃度で用いた。
代謝的標識
１５０ｍｍの皿におけるＭｖ１Ｌｕ培養物を、１０％の透析ウシ胎児血清を補足したメチオニン−非含有培地中で３０分間インキュベートし、その後２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニン（Ｔｒａｎｓ  ３５Ｓ標識、ＩＣＮ）を含む同じ培地中で２時間インキュベートした。細胞をトリプシン化により集め、２０００ｇにおいて５分間遠心した。細胞ペレットを１０体積のＮＰ４０ライシス緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ４０、０．３ｍＭ  Ｎａ−オルトバナデート、５０ｍＭ  ＮａＦ、８０μＭ  ｂ−グリセロホスフェート、２０ｍＭ  Ｎａピロホスフェート、０．５ｍＭ  ＤＴＴ及びプロテアーゼ阻害剤）中において４℃で３０分間穏やかに撹拌することにより溶解し、ライセートを遠心（１０，０００ｇ、４℃において１５分間）により透明化した。結合反応の前に上澄み液をセファロースを用いて２回、及びタンパク質Ａ−セファロースを用いて１回浄化した。
Ｃｄｋ活性化アッセイ
示される量のバキュロウィルス発現組み換えサイクリン、Ｃｄｋ又はサイクリン−Ｃｄｋ複合体を、前記の通り低張緩衝液中における音波処理により調製された５０マイクログラムの抽出物に加えた（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）。すべての場合に外因性サイクリン及びＣｄｋは非分別Ｓｆ９細胞ライセートの形態で加えた。サイクリン及びＣｄｋは典型的に少なくとも１〜３％の合計細胞タンパク質を含む。非感染Ｓｆ９細胞ライセートをすべてのアッセイの場合に試験し、それは活性を有していない。３７℃において３０分後、反応物を０．５％  ＮＰ４０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌに調節し、示される抗体を用いて免疫沈降させた。続いて免疫沈降物を記載の通りにヒストンＨ１キナーゼ活性に関して検定した。サイクリンＥ活性に対するＤサイクリン及びＣｄｋ４の影響が調べられる実験の場合、すべてのサイクリン及びＣｄｋを細胞抽出物に一緒に加えた。抽出物の熱処理は、抽出物を１００℃において５分間インキュベートすることにより行った。凝固タンパク質を次いで微量遠心によりペレット化した。Ｃｄｋ２免疫沈降物がサイクリンＥによる活性化に関して調べられる実験の場合、ＣＤＫ２のＣ−末端に対する２０μｌの抗血清（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）をタンパク質Ａセファロースに吸着させ、ＮＰ４０  ＲＩＰＡ緩衝液中に洗い出した。続いて３００μｇの抽出物を抗−ＣＤＫ２セファロースと共に４℃において９０分間インキュベートした。沈降物をＮＰ４０  ＲＩＰＡ緩衝液で２回及び１０ｍＭのＡＴＰを含む緩衝液Ａで４回洗浄した。サイクリンＥ及びＣＡＫは下記の通りに加え、反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いてＨ１キナーゼ活性に関して検定した。
阻害剤枯渇
ヘマグルチニン標識Ｃｄｋ２（Ｃｄｋ２−ＨＡ）を含む１．２μｌのＳｆ９細胞ライセートを、１０ｍＭのＡＴＰを含む緩衝液Ａ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．５、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でサイクリンＥを含む１２μｌのライセートと混合することによりサイクリンＥ−Ｃｄｋ２セファロースを調製し、室温で３０分間インキュベートすることにより完全に形成させた。次いで集合反応物を２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５％  ＮＰ４０に調節した。Ｃｄｋ２−ＨＡ含有複合体を１２ＣＡ５モノクローナル抗体（ＢＡＢＣＯ）を用いて免疫沈降させ、タンパク質Ａ−セファロース上に集めた。サイクリンＥを省略する以外は同じ方法でＣｄｋ２セファロースを調製した。免疫沈降物をＮＰ４０  ＲＩＰＡ緩衝液（０．５％  ＮＰ４０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）を用いて２回、及び緩衝液Ａを用いて４回洗浄した。マトリックスを４つのアリコートに分け、３ｍＭ  ＡＴＰ、２０μｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ、４０ｍＭ  ホスホクレアチンを含む緩衝液Ａ中で１００μｇの細胞抽出物と共に、３７℃において４５分間インキュベートした。インキュベーションの後、上澄み液を集め、下記に示す組み換えサイクリンＥの添加によりＣｄｋ２活性化に関して検定した。この実験の実行における重要なパラメーターは、サイクリン、Ｃｄｋ又は複合体ビーズから細胞抽出物に漏れないことを保証することである。これは予測できず、実験が行われる毎にイムノブロッティングにより調べなければならない。
サイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合アッセイ
バキュロウィルスサイクリンＥと、インフルエンザウィルスヘマグルチニンエピトープＨＡ１を含むバキュロウィルスＣｄｋ２との複合体を以下に記載する通りに形成した。複合体をＮＰ４０−ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ＝７．４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．３ｍＭ  Ｎａ−オルトバナデート、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤）中で抗−ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５、Ｂａｂｃｏ）を用いて免疫沈降させ、タンパク質Ａ−セファロースに結合させた。タンパク質Ａ−セファロースに吸着したＣｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２を１０7細胞からの代謝的標識細胞ライセートと共に４℃で２時間インキュベートした。他に指示がなければ、ビーズはＳＤＳ−ＲＩＰＡ緩衝液で数回洗浄し、タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中の加熱により溶出させ、１２％ポリアクリルアミドゲル上で、続いて蛍光光度法により分析した。熱処理の場合、代謝的標識細胞ライセートを１００℃で３分間加熱し、沈降タンパク質を微量遠心により除去し、透明化ライセートをタンパク質Ａ−セファロース結合Ｃｄｋ２又はサイクリンＥＣｄｋ２複合体と共にインキュベートした。サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体を用いる結合アッセイの場合、タンパク質Ａ−セファロース結合Ｃｄｋ２又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２の添加の前に、代謝的標識細胞抽出物を４μｌのサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体と共に４℃で３０分間予備インキュベートした。セファロースビーズを除去した後、細胞抽出物をＣｄｋ４抗血清を用いて免疫沈降させ、免疫沈降物を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
ｐ２７のアフィニティー精製及び変性−再生実験
単独の、又はサイクリンＥとの複合体の状態のＨＡ−標識Ｃｄｋ２をタンパク質Ａセファロースビーズ上に固定化されたＨＡ抗体（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｏｒｉｅｎｔａｔａｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させ、代謝的標識細胞ライセートからのタンパク質の単離に用いた。結合タンパク質を０．１Ｍ  グリシン  ｐＨ２．８中でカラムから溶出させ、４体積の氷−冷アセトンを用いて沈降させ、−２０℃において２０分間保った。３０分間の微量遠心により集められた沈降物を冷アセトンで数回洗浄し、１ｘＨＢＢ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．７、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０５％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ）中の６Ｍ  塩化グアニジウム中に溶解した。再生のために（Ｋａｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）試料を１ｘＨＢＢ緩衝液に対して終夜透析し、キナーゼ阻害アッセイにおいて、又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２セファロースへの結合のために用いた。サイクリンＥ結合Ｈ１キナーゼ阻害アッセイの場合、指数的成長Ｍｖ１Ｌｕ細胞から調製されたライセートの１００，０００ｘｇ上澄み液からのアリコート（３７．５１１ｇのタンパク質）を、単独の、又は示される容量の再生溶出物の存在下における生理学的量のバキュロウィルスサイクリンＥと共に３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、試料をサイクリンＥ抗血清を用いて沈降させ、ヒストンＨ１キナーゼ活性に関して検定した。相対的サイクリンＥ−結合Ｈ１キナーゼ活性を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて定量した。
ゲル切片から溶出されたタンパク質の活性の検定のために、サイクリンＥ  Ｃｄｋ２−ＨＡアフィニティーカラム溶出物を分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に１２％ポリアクリルアミドゲル上で移動させた。試料の一部をクーマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）で染色された同じゲル上で移動させ、脱染し、蛍光光度法により検出した。ゲルを示される通りに切断し（１切片当たり０．５〜１ｃｍ）、記載されている通りにタンパク質をゲルから単離した（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。単離タンパク質を再生し、下記の通りにキナーゼ阻害アッセイのために用いた。
結果
非−増殖細胞はＣｄｋ２活性化の阻害剤を含む
接触阻害、ＴＧＦ−β休止、及び増殖細胞からの無細胞抽出物を用い、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を妨害する機構を研究した。これらの細胞抽出物に生理学的量のサイクリンＥを添加すると、免疫沈降可能なサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の量の増加を生ずる；しかし増殖細胞からの抽出物中で集合したサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体のみが、基質としてヒストンＨ１を用いて酵素的に活性であった（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；図１Ａも参照されたい）。従って細胞抽出物は、無損傷の細胞において観察されるＣｄｋ２活性化への妨害を反復する。
非−増殖細胞からの抽出物におけるＣｄｋ２活性化への妨害は、生理学的量より多量にサイクリンＥタンパク質を加えることにより克服することができた（図１Ａ）。サイクリンＥをＳｆ９細胞において、バキュロウィルス発現ベクターを用いて発現させ、Ｓｆ９抽出物におけるサイクリンＥの量をイムノブロッティングによりＭｖ１Ｌｕ細胞抽出物中のそれと比較した（示されていない）。図１Ａに示される実験の場合、０．０５μｌのＳｆ９ライセートはＭｖ１Ｌｕ細胞ライセートからの合計細胞タンパク質の５０μｇと同じ多量のサイクリンＥを含んだ。増殖細胞からの抽出物へのサイクリンＥ（Ｓｆ９ライセートの形態の）の添加は、サイクリンＥ−結合ヒストンＨ１キナーゼ活性を直線的に増加させた（増殖細胞は、接触阻害からの解放後１５時間において収穫し、その時点でそれらはＳ初期の状態であった）。対照的に、接触阻害又はＴＧＦ−β処理細胞からの抽出物中への生理学的量の３倍までのサイクリンＥの滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）は免疫沈降可能なサイクリンＥ−結合キナーゼ活性の増加を生じなかった。さらに多量のサイクリンＥが加えられると、サイクリンＥ−結合キナーゼ活性は検出できるようになり、比例して増加した。かくして非−増殖細胞からの抽出物は、Ｃｄｋ２の活性化に必要なサイクリンＥの閾値の上昇を示す。接触阻害細胞は、ＴＧＦ−βへの暴露によりＧ１において休止させられた細胞より高い閾値を有すると思われるが、両方の場合にサイクリンＥの必要度は、増殖細胞において達成されるサイクリンＥの生理学的量より実質的に大きかった。
非−増殖細胞からの抽出物においてＣｄｋ２を活性化するためには超−生理学的量のサイクリンＥが必要であった。これはＣｄｋ２又はサイクリンＥの低量により説明することができず、これらの細胞にＣｄｋ２活性化に必要な他の因子が不足しているとも思われなかった（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；以下を参照されたい）。１つの説明は、非−増殖細胞がＣｄｋ２活性化の滴定可能な阻害剤を含んでいたことであった。混合実験がこの結論を支持した。増殖細胞からの抽出物を接触阻害又はＴＧＦ−β処理細胞のいずれかからの抽出物と混合した。混合された抽出物に生理学的量のサイクリンＥを加え、次いでサイクリンＥ及び結合キナーゼをサイクリンに対する抗体を用いて免疫沈降させた。抗−Ｃｄｋ２抗血清を用いて同じ結果が得られた（示されていない）。混合抽出物において、サイクリンＥ−結合キナーゼ活性は増殖細胞のみの抽出物から回収される活性より低く減少していた（図１Ｂ）。かくして非−増殖細胞からの抽出物は過剰のＣｄｋ２活性化の阻害剤を含んでいた。接触阻害細胞からの抽出物が、ＴＧＦ−β処理細胞からの抽出物より高いサイクリンＥ活性化閾値及び混合実験における大きい阻害効果の両方を有したことに注意されたい。しかしＣｄｋ２阻害活性の存在量はＴＧＦ−βへの暴露の持続時間に依存する。例えばＧ１後期において開始して６時間、ＴＧＦ−βに暴露された細胞からの抽出物は、増殖細胞からの抽出物と混合された時にＣｄｋ２活性化を妨害するのに十分な阻害活性を含んでおらず（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、４８時間ＴＧＦ−βに暴露された細胞は１５時間暴露された細胞より多い阻害活性を有した（示されていない）。
Ｃｄｋ２阻害剤はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合する
非−増殖細胞からの抽出物に存在するＣｄｋ２活性化の阻害剤を、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティーマトリックスを用いて枯渇させることができた。インフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープで標識されたＣｄｋ２又はサイクリンＥのいずれかを発現するバキュロウィルスベクターに感染したＳｆ９細胞からの抽出物を混合することにより、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を形成した。いずれの抽出物も単独では有意なＨ１キナーゼ活性を含まないが、抽出物を混合すると多量の活性酵素を与える（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２（ＨＡ）複合体を、Ｃｄｋ２上のＨＡ標識に対して向けられたセファロース−結合モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。モノクローナル抗体ビーズのみを用いて標準免疫沈降を行った。細胞抽出物をサイクリンＥ−Ｃｄｋ２ビーズ又は標準ビーズのいずれかと共にインキュベートし、ペレット化の後、上澄み液を、内在性のＣｄｋ２を活性化する外因的に加えられたサイクリンＥの能力に関して検定した。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合タンパク質の枯渇の後、サイクリンＥは増殖及び非−増殖細胞からの抽出物においてほとんど同様にＣｄｋ２を活性化することができた（図２Ａ）。イムノブロッティングは、この案が細胞抽出物中のサイクリンＥ又はＣｄｋ２の量に影響を与えなかったことを示した（示されていない）。この実験において、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合タンパク質の枯渇のいくらかの刺激効果も増殖Ｇ１後期細胞からの抽出物において観察され、それらに完全に阻害剤がないわけではないことを示唆した（以下を参照されたい）。サイクリンＥ及びＣｄｋ２の触媒的不活性突然変異体を含む複合体も、細胞抽出物に直接加えられると阻害活性を封鎖することができた（図２Ｃを参照）。かくして阻害活性の取り消しは、加えられるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体によるリン酸化を必要としなかった。これらの実験は、Ｃｄｋ２活性化の阻害剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合することを示した。
平行して、Ｃｄｋ２のみを含むビーズが細胞抽出物からの阻害活性を枯渇することができなかったことが観察される（図２Ａ）。この実験は、阻害剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合するが、Ｃｄｋ２のみには結合しないことを示唆した。この考えを直接調べるために、増殖、接触阻害及びＴＧＦ−β処理細胞の抽出物からＣｄｋ２を免疫沈降させた。すべての場合、免疫沈降されたＣｄｋ２タンパク質は、サイクリンＥ及びｐ３４ｃｄｃ２活性化キナーゼ（ＣＡＫ）の両方の添加により活性化されることができた（図２Ｂ）。かくして非−増殖細胞のＣｄｋ２タンパク質は本質的に活性化不可能でも、活性化の阻害剤と緊密に結合しているものでもない。
Ｃｄｋ２阻害剤はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合できるが、Ｃｄｋ２に結合できないので、サイクリン−Ｃｄｋ複合体又はサイクリンのいずれかを認識すると思われる。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体は、阻害活性の除去においてサイクリンＥより有効であり、阻害剤が複合体と優先的に相互作用することを示唆した。サイクリンＥを非−増殖細胞抽出物に、Ｃｄｋ２の活性化に必要な閾値より低い量で加えた（図２Ｃ）。次いで、そのＡＴＰ結合部位の突然変異により触媒的不活性とされた外因性Ｃｄｋ２タンパク質（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）を抽出物に補足することにより、追加のサイクリン−Ｃｄｋ２複合体の集合を誘導した。余分のＣｄｋ２の不在下で、サイクリンＥ免疫沈降物においてキナーゼ活性は検出されなかった。抽出物に触媒的不活性Ｃｄｋ２が補足された場合、内在性Ｃｄｋ２の活性化の結果としてサイクリンＥはＨ１キナーゼ活性を回復した。かくしてＣｄｋ２活性化のためのサイクリンＥ閾値を、サイクリンＥの合計量を一定に保ちながら追加のサイクリン−Ｃｄｋ複合体を集合させることにより低くすることができた。
阻害剤は抗−ＣＡＫでもチロシンキナーゼでもない
以前の実験（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）は、非−増殖細胞からの抽出物において形成されるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体が必須トレオニン残基においてリン酸化されず（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、おそらくそれらの不活性性を説明していることを示した。これは、ＣＡＫが阻害剤の標的であるという可能性を起こさせた。これは最初、阻害剤がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に直接結合するので、ありそうにないことと思われた。この考えは、ＣＡＫ自身がＣｄｋタンパク質群の遠縁の１員であり（Ｆｅｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、従ってやはり阻害剤に結合し得るという最近の証拠に鑑みて、再考慮された。別の系における以前の研究は、サイクリンＢ−Ｃｄｃ２複合体の活性化がＣｄｋ２阻害剤により妨害されない（以下を参照されたい）ことを示した。従ってＣＡＫがサイクリンＢ−Ｃｄｃ２複合体の活性化にも必要である（Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）ことから、サイクリンＢ及びＣｄｃ２をＣＡＫ活性のアッセイに用いた。
Ｃｄｃ２は、増殖細胞又はＴＧＦ−β休止細胞のいずれかからの抽出物にサイクリンＢが加えられると、同様に活性化された（図３Ａ）。従ってＴＧＦ−β処理細胞からの抽出物に機能性ＣＡＫが存在した。これらの抽出物への精製ＣＡＫの添加は、追加のサイクリンＢ−Ｃｄｃ２複合体の活性化を触媒するので、これらの実験においてＣＡＫは制限要因であった（図３Ｂ）。さらに、加えられるＣＡＫの活性はＴＧＦ−β処理及び増殖細胞からの抽出物において類似であった（図３Ｂ）。かくして外因性ＣＡＫは阻害されなかった。標準実験は、このＣＡＫが、バキュロウィルスベクターから発現されるサイクリンＥ及びＣｄｋ２を含むＳｆ９細胞ライセートの混合によりサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体が集合させられた場合に、それらを活性化することができることを示した（Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；データは示されていない）。しかし、加えられたＣＡＫはＣｄｋ２の活性化に必要なサイクリンＥの閾量を変えなかった（示されていない）。かくして阻害剤はＣＡＫを妨害しなかったし、過剰のＣＡＫにより阻害剤の影響を克服することもできなかった。ＣＡＫの阻害はＣｄｋ２活性化に対する妨害の説明に十分でなかった。
チロシンリン酸化がＣｄｋ２活性の阻害に寄与しているか否かを決定するために、サイクリンＥを非−増殖細胞抽出物に閾値以下の量で加え、抗−サイクリンＥ抗体を用いてサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を免疫沈降させた。抗−ホスホチロシン抗体を用いたイムノブロッティングにより、不活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体においてＣｄｋ２のチロシンリン酸化は検出されなかった（示されていない）。正の標準として、ヒト細胞から免疫沈降させられたＣｄｃ２においてホスホチロシンは容易に検出された。
サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体はＣｄｋ２活性化を促進する
細胞がＧ１を通過する時、サイクリンＥ及びＣｄｋ２を含む活性複合体の形成の前に、Ｃｄｋ４及びＤ−型サイクリンの間の複合体が出現する（Ｓｈｅｒｒ，１９９３において考察）。接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞は有意な量のサイクリンＤ１又はＤ２を発現せず（示されていない）、Ｃｄｋ４合成はＴＧＦ−βへの暴露によりＧ１において休止されられた細胞において抑制される（Ｅｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３：Ｋ．Ｐ．ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．，非公開の観察；図５Ｄも参照されたい）。かくしてサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体の堆積はＧ１休止細胞において制限要因である。これらの観察は、サイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体がおそらく細胞周期進行の間のＣｄｋ２阻害剤の除去に役割を有し得ることを示唆した。実際にＥｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３ｂ）は最近、Ｃｄｋ４の構成性エピトープ発現がＣｄｋ２活性化及び細胞周期進行へのＴＧＦ−β妨害を無効にすることができることを示した。この現象は、非−増殖細胞からの抽出物へのサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体の復帰がＣｄｋ２活性化への妨害を克服できるか否かを問うことにより調べられた。
Ｃｄｋ４はＤ−型サイクリンのパートナーであり、サイクリンＥ、Ａ又はＢと活性複合体を形成しない。それは、昆虫細胞において共発現されると、Ｄ−型サイクリンのそれぞれと等しく十分に相互作用する。サイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体はヒストンＨ１に対する活性が劣っているが、基質としてＲｂタンパク質を用いた強い活性を示す（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｃｄｋ４とサイクリンＤ１、Ｄ２又はＤ３の間の複合体をバキュロウィルスベクターを用いたＳｆ９細胞の共−感染により集合させ、Ｓｆ９ライセートを増殖及び非−増殖Ｍｖ１Ｌｕ細胞からの抽出物に加えた。次いで閾値以下の量のサイクリンＥを加え、サイクリンＥに対する抗体を用いたサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の免疫沈降の後にＣｄｋ２の活性化を調べた。接触阻害及びＴＧＦ−β休止細胞からの抽出物にサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体を加えると、増殖細胞からの抽出物において観察される程度と同等の程度までサイクリンＥがＣｄｋ２を活性化することを可能にしたが、サブユニットのみではしなかった（図４Ａ）。滴定は、Ｃｄｋ２阻害剤の妨害に必要なサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の量が等量の増殖細胞からの抽出物に存在する量より少量であることを示した（示されていない）。対照的に、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体が増殖細胞からの抽出物に加えられた時、サイクリンＥの活性は増加しなかった。さらに、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体はＣＡＫ活性は有しておらず、それはＳｆ９細胞において発現されたタンパク質から集合したサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化の促進においてＣＡＫの代わりにそれを置換することができなかったからである（示されていない）。かくしてサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体はＣｄｋ２活性化の阻害を取り消させた。Ｓｆ９ライセートのイムノブロッティングにより見積もられる等量のサイクリンＤ１−Ｃｄｋ４及びサイクリンＤ３−Ｃｄｋ４複合体は、Ｃｄｋ２活性化のためのサイクリンＥ閾値を低下させるための有効性がずっと低かった（図４Ｂ）。サイクリンＤ１又はサイクリンＤ３−Ｃｄｋ４複合体がＣｄｋ２阻害剤を封鎖することができないのは、これらの複合体が細胞ライセートにおいて不安定である理由からではなかった（示されていない）。
全く驚くべきことに、Ｃｄｋ２阻害を取り消させるサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の能力はＣｄｋ４の触媒的活性を必要としなかった。サイクリンＤ２及び触媒的不活性突然変異体であるＣｄｋ４サブユニットの間に形成される複合体は、Ｃｄｋ２阻害剤の除去において触媒的活性サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体と同じに有効であった（図４Ａ）。触媒的活性又は不活性Ｃｄｋ４のいずれかを含む種々の量のサイクリンＤ２複合体を用いた滴定は、Ｃｄｋ２阻害の取り消しにおけるそれらの比活性が非常に類似していることを明らかにした（示されていない）。これは、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４が阻害剤を不活性化するためにそれをリン酸化しなければならない可能性を除外し、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４がＣＡＫとして機能することにより阻害剤を無視するいずれのモデルも排除した。従ってサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４は、Ｃｄｋ２阻害剤に直接結合し、それをＣｄｋ２から封鎖することによりＣｄｋ２阻害剤を除去すると思われる（以下を参照されたい）。
Ｃｄｋ２阻害剤は２７ｋｄタンパク質である
上記の観察は、（ｉ）機能性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２阻害剤は、接触阻害細胞又はＴＧＦ−βの存在下で接触阻害から解放された細胞からの抽出物中に存在するが、増殖細胞からの抽出物中には存在しないこと；（ｉｉ）この分子は、いずれかのサブユニットのみではなく、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体と選択的に結合すること；及び（ｉｉｉ）細胞抽出物を触媒的活性又は不活性サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体と共に予備インキュベーションすることによりそれを枯渇させることができることを示した。これらの性質を現し得る因子を同定するために、Ｍｖ１Ｌｕ細胞を３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識し、ライセートを、単独の、又は組み換えサイクリンＥとの複合体の状態の免疫吸着組み換えＣｄｋ２を含むセファロースビーズと共にインキュベートした。１％  ＳＤＳを含む緩衝液と共にビーズを加熱することにより溶出した変性３５Ｓ−標識タンパク質を、ゲル電気泳動及び蛍光光度法により視覚化した（図５Ａ）。すべての細胞ライセートは、接触阻害又はＴＧＦ−β阻害細胞の抽出物から回収されたが、Ｇ１後期細胞から回収されなかった２７ｋｄタンパク質を除いて、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２結合タンパク質の類似のパターンを与えた（図５Ａ）。ｐ２７と呼ばれるこのタンパク質はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を用いて単離されたが、Ｃｄｋ２のみを用いては単離されなかった（図５Ａ）。ｐ２７の回収は、それが最大に達するまで、用いられるサイクリンＥＣｄｋ２複合体に量に比例して増加し（図５Ｂ）、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体へのｐ２７の結合が飽和可能であることを示した。これは、Ｃｄｋ２阻害剤活性をサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体により枯渇させることができるという観察と一致した。予想通り、成長休止細胞からのサイクリンＥ免疫沈降物において化学量論的量のｐ２７も観察された（示されていない）。
組み換えサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体を与えられた細胞抽出物は、混合物をサイクリンＥ−Ｃｄｋ２−セファロースに吸着させると、もはやｐ２７を与えなかった（図５Ｃ）。サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４を与えられた試料からサイクリンＥ−Ｃｄｋ２−セファロースビーズを除去した後、予備浄化された上澄み液をＣｄｋ４抗体と共にインキュベートしてＣｄｋ４及びその結合タンパク質を回収した。これはｐ３４Ｃｄｋ４自身を与え、その量はＧ１後期の細胞からの抽出物において最高であり、ＴＧＦ−β処理細胞において最低であった（図５Ｄ）（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｅｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ｂ）。同じ抗血清を用い、Ｅｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３ｂ）は、部分的タンパク質分解消化を用いてこれが基準Ｍｖ１Ｌｕ  Ｃｄｋ４であることを確かめた。さらにこれらの免疫沈降物は、接触阻害及びＴＧＦ−β処理細胞からの試料において２７ｋＤタンパク質を含んだ（図５Ｄ）。Ｇ１後期細胞試料からのＣｄｋ４免疫沈降物においても、もっと少量のｐ２７が回収されたが、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティークロマトグラフィーによって同じ抽出物からｐ２７を回収することはできなかった。これはｐ２７が増殖細胞に存在するが、外因的に加えられるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体との相互作用に利用できない形態で存在することを示した（以下を参照されたい）。並べた比較は、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２ビーズ上で、又はＣｄｋ４を用いた共−沈降により精製されるｐ２７が同じ見掛けの分子量を有することを示した（示されていない）。
この因子の安定性を特性化するために行われた実験は、細胞抽出物の１００℃への短時間の加熱がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２に結合するｐ２７の能力（図６Ａ）、ならびに同様に阻害活性（図６Ｃ）の両方を保存することを示した。さらに、Ｇ１後期の細胞からの抽出物に適用すると、熱処理は予期に反してｐ２７（図６Ａ）及び付随して増加する量のＣｄｋ２阻害活性（図６Ｂ）の両方の出現を誘導した。これらの結果はｐ２７及び阻害活性が両方とも熱に安定であり、熱−感受性機構によりＧ１後期抽出物においてそれを再−活性化することができることを示した。予想通り、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体は熱処理ライセートからもｐ２７を封鎖することができた（示されていない）。
代謝的標識ＴＧＦ−β処理細胞からの抽出物をサイクリンＥ−Ｃｄｋ２−セファロース又は標準としてＣｄｋ２−セファロース上のクロマトグラフィーにかけた。洗浄後、ビーズを酸性緩衝液を用いて溶出させ、溶出物の一部をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。これはｐ２７が回収された主な標識種であり、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２ビーズからの溶出物中のみに存在することを示した（図７Ａ）。同じ溶出物からの試料をＣｄｋ２阻害剤の存在に関して検定し、この活性はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２ビーズからの溶出物中に存在したが、Ｃｄｋ２ビーズからの溶出物中には存在しなかった（図７Ｂ）。溶出物の残りをアセトン沈降により濃縮し、６Ｍ  グアニジウム塩酸塩中で変性させ、等張緩衝液に対する透析により再生させ、２回目のサイクリンＥ−Ｃｄｋ２セファロースへの結合に供した。１％  ＳＤＳを含む緩衝液中における煮沸によるこれらのビーズからの溶出は、唯一の標識バンドとしてｐ２７を与えた（図７Ｃ）。これらの結果は、ｐ２７及び阻害活性が１つであり、同じであるという可能性を強く支持した。この結論を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイクリンＥ−Ｃｄｋ２溶出物を分別し、分別されたタンパク質をゲル切片から抽出することにより直接確かめた。再生タンパク質を、サイクリンＥによるＣｄｋ２の活性化を阻害するそれらの能力に関して調べた（図７Ｄ）。ｐ２７を含むゲル切片から回収されたタンパク質はＣｄｋ２活性化を完全に阻害し、他のいずれのゲル切片からも別の阻害活性は回収されなかった。
議論
Ｇ１サイクリンであるサイクリンＥ（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｌｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｏｈｔｓｕｂｏ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９３）及びその触媒的サブユニットであるＣｄｋ２（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｄｕｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）を含む複合体の活性化を妨げる非−増殖細胞における阻害剤が同定された。この阻害活性は少なくとも部分的にｐ２７Kip1（Ｃｄｋ阻害タンパク質１）とも命名された２７ｋＤａのポリペプチドに帰し得る。阻害剤及びｐ２７Kip1は以下の性質を共有する：それらはサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合するが、Ｃｄｋ２のみには結合しない；それらは成長休止細胞からの抽出物においてのみ検出される；それらはサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体により封鎖されることができるが、いずれかの成分のみでは封鎖されることができない；それらは熱安定性である；それらは増殖細胞の抽出物において潜伏しているが、短時間の熱処理により露出することができる。さらに精製ｐ２７Kip1は、増殖細胞からの抽出物に加えられるとサイクリンＥによるＣｄｋ２活性化を阻害する。これらのデータは、ｐ２７Kip1が少なくともＣｄｋ２阻害剤の成分であることを強く示唆しているが、阻害がｐ２７Kip1のみによるのか否か、あるいはＰ２７Kip1がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に別のタンパク質を補充するのか否かは決定されていなかった。さらにｐ２７、ならびにサイクリンＥ及びＣｄｋ２が他の生物、例えばマウス及びヒトに存在することが決定された（データは示されていない）。
ｐ２７Kip1阻害の機構は、それを有糸分裂サイクリン−Ｃｄｃ２複合体の活性化を調節する経路から区別する特徴を有する。第１に、ｐ２７Kip1は触媒的ではなく、化学量論的に作用すると思われる。第２に、ｐ２７Kip1を含む不活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体においてＣｄｋ２のチロシンリン酸化は検出されず、ｐ２７Kip1がチロシンキナーゼ活性を有していないか、又はチロシンリン酸化を阻害することを示唆している。ｐ２７Kip1を含む複合体は、ｐ３４Ｃｄｃ２活性化キナーゼ、ＣＡＫにより有効にリン酸化されず、これはそれらの不活性性を説明するのに十分であり得る。ｐ２７Kip1はＴｈｒ１６０を脱リン酸化する可能性があるが、ホスファターゼの酵素活性が１００℃への加熱に対して安定であったら驚くべきことであろう。ｐ２７Kip1のサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体への結合がＴｈｒ１６０ドメインのコンホーメーションを変えることにより、又はＣＡＫを立体的に妨害することによりＴｈｒ１６０リン酸化を妨げるのが、より本当らしい。ｐ２７Kip1が他のタンパク質キナーゼの負の調節サブユニット又はドメインに類似して機能し、おそらくまさに、擬基質としてキナーゼ活性部位と相互作用したとしても驚くに当たらない。
ｐ２７Kip1に加え、ＦＡＲ１（Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ｐ４０（Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ，１９９３）、ｐ１６及びｐ２１（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；１９９３）ならびにＲｂ（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｄｏｗｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｅｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ａ）を含む、Ｇ１の間のＣｄｋ活性の調節剤の可能性のある他のものもサイクリン−Ｃｄｋ複合体に直接結合するということは、興味深いことである。これらの他のタンパク質のいずれもまだＣｄｋ活性を直接阻害することが示されていないが、それらの少なくともいくつかはこの機能を行うと思われる。直接のタンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｄｋ活性の他のもっと無差別のトランス−作用調節剤を含む細胞環境において、特定のサイクリン−Ｃｄｋ複合体への阻害シグナルに焦点を当てるための方法となり得る。
ｐ２７Kip1は成長阻害シグナルを細胞周期休止に連結させる
ｐ２７Kip1は、接触阻害又はＴＧＦ−βによりＧ１において休止した細胞において見いだされた。類似の活性が、血清−欠乏繊維芽細胞及びＩＬ−２誘導リンパ球を含む、特定の成長因子を奪われた種々の細胞型においてＣｄｋ２活性化を妨害することも見いだされた（未公開の観察）。ｐ２７Kip1又は機能的に類似のタンパク質によるＣｄｋ２活性化の阻害は、多様な細胞外及び細胞内シグナルがそれを通じて細胞増殖に調節を及ぼす一般的機構であり得る。
ｐ２７Kip1は、Ｃｄｋ２の活性化に必要なサイクリンＥの閾量を設定することにより細胞増殖を束縛する。これらのデータが示す通り、ｐ２７Kip1が化学量論的に作用するとしたら、細胞中のサイクリンＥの量が活性ｐ２７Kip1の量を超えるとすぐにＣｄｋ２活性化の閾値に達する。休止細胞の場合、この閾値は生理学的なサイクリンＥの量より高く設定され、結局不活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体が集合するのみである。サイクリンＡ−Ｃｄｋ２複合体を類似の調節に供することができ（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｆｉｒｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，準備中）、この複合体を活性化できないことも細胞周期休止に寄与してしかるべきである（Ｇｉｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９１：ＰａｃＪａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２：１９９３；Ｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
成長調節シグナルはいかにしてＰ２７Kip1の活性に連結されるのであろうか？最も簡単な考えは、成長細胞は多くのｐ２７Kip1を含まず、細胞増殖を阻害するシグナルがＰ２７Kip1合成又は安定化を誘導し、それによりその量を臨界的基本量以上に増加させることである。増殖細胞からの抽出物を熱処理に供すると非常に増加した量のｐ２７Kip1を潜伏プールから回収することができるので、このモデルは厳密に正しくはあり得ない。これらの抽出物にｐ２７Kip1の実質的プールが存在しなければならず、他の分子により封鎖されていなければならない。これは、ｐ２７Kip1が増殖細胞周期の間に正常な役割を果し、単に成長休止を誘導するシグナルに関する応答要素ではないことを意味する。従ってサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体と相互作用することができる「遊離の」ｐ２７Kip1の存在量は、やはりＰ２７Kip1に直接結合するサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体などの上流調節剤により調節され得る。これはサイクリンＥ−Ｃｄｋ２との結合を妨げ、少なくとも試験管内においてその機能的活性化を可能にする。ｐ２７活性が上流調節剤により支配されるという考えは、ｐ２７の全細胞量が休止細胞において増加することができるという可能性を排除するものではなく、これらの実験は増殖及び休止細胞におけるｐ２７の合計量を直接比較してはいない。
Ｄ−型サイクリンはそれ自身、成長阻害シグナルの標的である（Ｓｈｅｒｒ，１９９３において考察）。これらの合成は成長因子−欠乏（ｄｅｐｒｉｖｅｄ）細胞（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，印刷中）及び接触阻害細胞（非公開の観察）において急速に減少し、サイクリンＤ−Ｃｄｋ４量の減少に導く（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。Ｄ−型サイクリンの量はＴＧＦ−β妨害により大きく影響は受けないが、ＴＧＦ−βはＣｄｋ４の合成を減少させ、サイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体の正味の減少がやはり達成される（Ｅｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ｂ）。Ｃｄｋ４が制限要因であるＴＧＦ−β阻害細胞の場合、過剰のＣｄｋ４の発現は追加のサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体の形成に導き、ｐ２７Kip1を封鎖するはずである。事実、生体内におけるＣｄｋ４の強化された発現は、ＴＧＦ−βに暴露された細胞におけるＣｄｋ２活性化の妨害を取り消す（Ｅｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ｂ）。しかし試験管内におけるＴＧＦ−β処理細胞からの抽出物へのＣｄｋ４のみの添加は、ｐ２７Kip1とサイクリンＥ−Ｃｄｋ２の相互作用を取り消さない。昆虫細胞において生産される組み換えタンパク質の混合により試験管内で形成することができるサイクリンＥとＣｄｋ２の複合体と異なり、Ｄ−型サイクリン及びＣｄｋ４は、Ｓｆ９細胞が両成分をコードするバキュロウィルスに共感染しないと有効な集合しない（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。複合体形成におけるこれらの差の基礎となる理由は限定されていないが、すべての結果は本質的に一致しており、サイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体がｐ２７Kip1との相互作用によりサイクリンＥ−Ｃｄｋ２の上流で作用するという考えを支持している。これらの考えは無損傷の細胞において成された多くの観察に基づいているが、サイクリンＤ−Ｃｄｋ４、ｐ２７Kip1及びサイクリンＥ−Ｃｄｋ２を含む提案された経路は試験管内のみで直接調べられた。Ｃｄｋ２が追加の機構により調節されるであろうこと、及びサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４に加えて他の新規なＣｄｋ複合体がｐ２７Kip1の滴定に寄与し得ることが予想され得る。
サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の唯一の役割がＰ２７Kip1の滴定であるとは思われず、むしろ複合体の堆積はＧ１進行に必要な特定の基質のＣｄｋ４−媒介リン酸化を開始させると思われる。かくして触媒的不活性Ｃｄｋ４と複合化したサイクリンＤはｐ２７Kip1の封鎖には十分であるが、完全に生体内におけるすべての必須のＣｄｋ４の機能の代わりとなるとは思われない。
ｐ２７Kip1誘導細胞周期休止の１つの特徴は、細胞が不活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体を堆積することができることである。従って細胞周期休止からの回復は新しいサイクリンＥの合成及び新しいサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の集合を必要としない。むしろ細胞は細胞増殖が再び始まる時にこの不活性複合体の潜伏プールを利用することができる。これは、成長阻害シグナルが絶えた時にサイクリン合成を促進するシグナルが遷移的である、及び不在である状況下で必須であり得る。しかしこれまでのところ、不活性サイクリンＥ−Ｃｄｋ２ｐ２７Kip1複合体の再−活性化を可能にする条件は限定されていない。試験管内では、ｐ２７Kip1の滴定の後に集合するサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体のみが活性であり、生体内でも同様に同じことが当て嵌まり得る。
増殖細胞におけるｐ２７Kip1の存在は、その役割が細胞外シグナルに応答して細胞周期休止を誘導することに制限され得ないことを示唆している。それは、各有糸分裂周期の間にＧ１からＳへの遷移の遂行のためのサイクリンＥ閾値を設定することもできる。細胞融合実験は、哺乳類繊維芽細胞におけるＳ期への突入が、Ｇ１の間に継続的に堆積するアクチベータにより調節されることを示した（Ｆｏｕｍｉｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，１９７５；Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。単−、二−及び三−核細胞（ｍｏｎｏ−ｂｉ−  ａｎｄ  ｔｒｉ−ｎｕｃｌｅａｔｅ  ｃｅｌｌｓ）におけるＳ期突入の速度を比較することにより、このアクチベータの濃度ではなく、その量がＳ期の開始の決定に重要であることが結論された。これらの観察は、Ｃｄｋ２活性化の律速段階が濃度依存性であるべきサイクリン−Ｃｄｋ２複合体の集合ではなく、代わりにｐ２７Kip1などの化学量論的阻害剤の閾値を克服するのに十分な数の複合体の集合を含むモデルと一致する。ｐ２７Kip1阻害複合体から遊離のｐ２７Kip1及び活性サイクリン−Ｃｄｋ２への自然の崩壊は一次（指数的）速度論で起こり得、哺乳類細胞におけるＳ期突入に関して多くの場合に報告された一次速度定数の基となり得ることも指摘される（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｍａｒｔｉｎ，１９７３；Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。
Ｐ２７Kip1はＧ１進行の間の順序を強要し得る
サイクリン−Ｃｄｋ複合体は、細胞がＧ１を遷移する時に特定の順序で現れる（Ｓｈｅｒｒ，１９９３）。この一時的順序が正常なＧ１進行に必須であることが仮定されると、細胞は細胞周期休止からの回復の間の順序の復帰の問題を解決しなければならない。例えば接触阻害及びＴＧＦ−βはサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体の堆積を妨害するが、細胞周知の後期で作用するサイクリンＥ−及びサイクリンＡ−Ｃｄｋ２複合体の合成に影響を与えない。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２及びサイクリンＡ−Ｃｄｋ２複合体が細胞周期休止の間に活性なら、Ｃｄｋ作用の正常な順序が失われる。ｐ２７Kip1は、細胞周期休止の間にこれらの既存の複合体の活性化を妨げることにより、これが起こらないことを保証することができる。さらにｐ２７Kip1の活性自身がサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４により調節されるなら、これはサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体が集合し、その機能を遂行するまでＣｄｋ２を不活性なまま保持するための有効な機構となる。
ＩＩ
実験法
代謝的標識、免疫沈降及びペプチドマッピング
Ｍｖ１Ｌｕ細胞を接触阻害により同調化し、ＴＧＦ−ｂを用いて処理し、代謝的に標識し、溶解し、抗−Ｃｄｋ２抗体を用いて免疫沈降させるか、又はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティーカラム上のクロマトグラフィーにかけた。ペプチドマッピングのために、Ｃｄｋ２免疫沈降物及びサイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティーカラム溶出物に存在する２７ｋｄバンドをゲルから切断し、０．１μｇのＶ８プロテアーゼで消化し、１５〜２２．５％勾配ゲル上で分離した。
バキュロウィルスタンパク質
ヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡ（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）にＮ−末端においてヘキサヒスチジン配列を用いて標識した。このｃＤＮＡをバキュロウィルス転移ベクターｐＶＬ１３９２中にクローニングし、記載されている通りにＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）においてＳｆ９細胞中で発現させた。バキュロウィルスタンパク質はＤｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２の方法により調製した。
Ｋｉｐ１精製
２００の１５０ｍｍの皿の接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞（〜２ｘ１０10細胞）をトリプシン化により集め、低張緩衝液中で音波処理により溶解した。抽出物を遠心により透明化し、１００℃に５分間加熱し、遠心により透明化した。アガロース−予備浄化抽出物をＮｉ++−ＮＴＡ−アガロース上に固定化されたＨｉｓ−サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体に結合させた。特異的に結合したタンパク質を６Ｍのグアニジウム塩酸塩溶液を用いて溶出させ、１ｘＨＢＢ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐｈ７．７、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０５％  ＮＰ−４０及び１ｍＭ  ＤＴＴ）（Ｋａｅｌｉｎ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に対して終夜透析し、アセトン−沈降させた。
タンパク質配列分析
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別し、ニトロセルロース上にエレクトロブロッティングし、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ−染色２７ｋＤａバンドを切り出し、内部アミノ酸配列分析のために処理した（Ｔｅｍｐｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＨＰＬＣピーク画分（トリプシンバックグラウンドより高い）を自動化Ｅｄｍｏｎ分解及びマトリックス−補助レーザー脱着（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ−ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）の組み合わせにより分析した。質量分析（２％のアリコートについて）はモデルＬａｓｅｒＴｅｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置（Ｖｅｓｔｅｃ）、及びマトリックスとしてａ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いて行った。化学的配列決定（試料の９５％について）は、フェムトモルの量の分析に最適化されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７７Ａシークエネーターを用いて行った。
Ｋｉｐ１  ｃＤＮＡクローニング及びノザンブロット分析
プライマーとして縮重オリゴヌクレオチドを用い、鋳型として接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞からの全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。１対のプライマーの組み合わせ（図９Ａを参照されたい）は１３５ｂｐフラグメントを与え、それをＭｖ１Ｌｕ細胞から調製された１ＺＡＰＩＩ  ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに用いた。１ＥＸｌｏｘマウス胚ｃＤＮＡライブラリ（Ｎｏｖａｇｅｎ）からマウスＫｉｐ１  ｃＤＮＡを得、ｌｇｔ１１腎臓  ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からヒトＫｉｐ１  ｃＤＮＡを得た。ポリ（Ａ）+ＲＮＡブロットを、ランダムプライミングにより標識されたマウスＫｉｐ１  ｃＤＮＡのＰＣＲ−誘導フラグメントとハイブリッド形成させた。
試験管内翻訳
マウスＫｉｐ１  ｃＤＮＡのコード領域（ヌクレオチド１〜５９１）を含むＮｄｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントをｐＣＩＴＥ２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。この構築物はＣ−末端ヘキサヒスチジン配列及びＫｉｐ１のＮ−末端におけるベクターからの６つのアミノ酸を含む融合タンパク質をコードする。試験管内転写及び翻訳はＲｅｄ  Ｎｏｖａライセート（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて行った。
組み換えＫｉｐ１
全長コード領域を含むマウスＫｉｐ１  ｃＤＮＡの５９１ｂｐ  ＰＣＲ生成ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントをｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にサブクローニングし、Ｃ−末端ヘキサヒスチジン配列を有するＫｉｐ１をコードする構築物を得た。タンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）バクテリアにおいて発現させ、８Ｍ  ウレア、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  イミダゾールを含む溶液中における細胞の音波処理により精製し、遠心により透明化し、Ｎｉ++−ＮＴＡアガロースに４℃において１時間結合させた。カラムを０．５Ｍ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）及び２０％  グリセロール中の６Ｍ〜０．７５Ｍのウレア逆勾配を用いて洗浄し、２００ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて溶出させた。溶出物を１ｘＨＢＢ緩衝液に対して終夜透析し、使用まで−８０℃で保存した。
試験管内キナーゼ及びＣｄｋ２活性化アッセイ
バキュロウィルスにより発現されたサイクリン及びＣｄｋを含むＨ５昆虫細胞抽出物を組み換えＫｉｐ１と共に３７℃で３０分間インキュベートし、抗−ＨＡ抗体を用いて沈降させ、これらの複合体のヒストンＨ１キナーゼ活性を検定した（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｒｂキナーゼ反応はＭａｔｓｕｓｈｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に従って行った。ヒストンＨ１バンド及びＲｂバンドのリン酸化をＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。
指数的成長Ａ５４９細胞からの低張細胞抽出物をバキュロウィルスＨｉｓ−サイクリンＥタンパク質と共に、Ｋｉｐ１を含んで、又は含まずに３７℃において３０分間インキュベートした。次いで混合物を２０ｍＭ  イミダゾールを含む１ｘＮＰ４０  ＲＩＰＡ緩衝液中で１０倍に希釈し、Ｎｉ++−ＮＴＡ−アガロースと共に４℃で１時間インキュベートした。試料の一部を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させ、抗−Ｃｄｋ２抗体を用いてイムノブロッティングした（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
Ｋｉｐ１トランスフェクション及びフローサイトメトリー分析
マウスＫｉｐ１  ｃＤＮＡ（ヌクレオチド−８２〜＋５９１）をｐＣＭＶ５（Ａｔｔｉｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）中にサブクローニングした。Ｒ−１Ｂ細胞を、ネズミＣＤ１６  ｃＤＮＡを含む０．５μｇ／ｍｌのｐＣＥＸＶ−３及び３μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ５のみ、又は３μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ５−Ｋｉｐ１（Ａｔｔｉｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を用いてコトランスフェクションした。ＣＤ１６免疫染色細胞（Ｗｉｒｔｈｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＭｕｌｔｉｃｙｃｌｅソフトウェア（ＰＨＯＥＮＩＸ  ＦＬＯＷ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
結果
Ｋｉｐ１の精製及びクローニング
接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞からのライセートを１００℃に加熱し、不溶性材料を除いて浄化し、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティーカラムに結合させた。６Ｍ  グアニジウム塩酸塩を用いた溶出はカラムから遊離された組み換えＣｄｋ２及び２７ｋｄタンパク質Ｋｉｐ１を与えた。透析されたこの試料のアリコートはヒストンＨ１キナーゼアッセイにおいてサイクリンＥ−Ｃｄｋ２に対する強い阻害活性を有し、この活性はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル切片からＫｉｐ１と共溶出することが示された。２つの別の試料（それぞれ〜２ｘ１０10細胞）からのＫｉｐ１収量はそれぞれ０．３μｇ及び１μであった。
Ｋｉｐ１が生体内でＣｄｋ２と相互作用することを確かめるために、代謝的標識抽出物を抗−Ｃｄｋ２抗体を用いて接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞から免疫沈降させた（図８Ｂ）。沈降物はＣｄｋ２に加えて２７ｋｄバンドを含み、Ｖ８プロテアーゼを用いた制限消化の後にそのペプチド地図は、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２アフィニティークロマトグラフィーにより代謝的標識細胞から精製されたＫｉｐ１の地図と同一であった（図８Ｃ）。これらの結果は、試験管内におけるサイクリンＥ−Ｃｄｋ２への結合により精製されるＣｄｋ阻害剤が、休止細胞においてＣｄｋ２と結合しているというさらなる証拠を与えた。
自動化Ｅｄｍａｎ分解により種々のＫｉｐ１トリプシンペプチド配列を得、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるｃＤＮＡ増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計に用いた。逆転写Ｍｖ１Ｌｕ  ｍＲＮＡから増幅されたＰＣＲ産物を用いてＭｖ１Ｌｕ  ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。これは精製タンパク質から得られる配列をコードする１つの陽性のクローンを与えた（図９Ａ）。Ｋｉｐ１  ｃＤＮＡを用いたヒト腎臓及びマウス胚からのｃＤＮＡライブラリのスクリーニングは、高度に関連する配列のクローンを与えた。ヒト及びマウスＫｉｐ１  ｃＤＮＡは、好ましい翻訳開始関係のＡＴＧコドンで始まり、停止コドンに先行されたそれぞれ５９４及び５９１ｂｐの読み取り枠を有した（データは示していない）。これらの読み取り枠と比較すると、ミンククローンは不完全であり、ヌクレオチド５３４において終わっていた（図９Ａ）。
Ｋｉｐ１  ｃＤＮＡはヒトにおいて１９８アミノ酸（２２，２５７ダルトン）及びマウスにおいて１９７アミノ酸（２２，２０８ダルトン）の推定タンパク質をコードする。これらの値はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ミンクタンパク質の場合に得た２７ｋｄの値より小さい。この矛盾を解決するために、マウスＫｉｐ１配列をコードするｃＤＮＡを構築し、Ｃ−末端においてヘキサヒスチジン配列（〜１ｋｄ質量）で標識した。このｃＤＮＡの試験管内転写及び翻訳は、Ｎｉ++−ＮＴＡ−アガロースに特異的に結合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で２８ｋｄタンパク質として移動する生成物を与え（図８Ｃ）、クローニングされたｃＤＮＡが全−長Ｋｉｐ１をコードし、このタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でその算出分子質量よりいくぶん遅く移動することを確証した。
Ｋｉｐ１は高度に保存され、Ｃｉｐ１／ＷＡＦ１に関連している
推定ヒト、マウス及びミンクＫｉｐ１アミノ酸配列は高度に関連し、〜９０％の同一性を示す（図９Ａ）。Ｇｅｎｂａｎｋ検索は、Ｋｉｐ１がアミノ酸のレベルでＣｉｐ１／ＷＡＦ１のみに有意な相同性を示すことを明らかにした。類似性は大部分、タンパク質のＮ−末端半分における６０−アミノ酸セグメントに限られていた。この領域はＣｉｐ１／ＷＡＦ１における対応する領域と４４％同一であった（図９Ｂ）。Ｃｉｐ１／ＷＡＦ１と同様に、Ｋｉｐ１はＣ−末端の近くに推定２分割核局在化シグナル（Ｄｉｎｇｗａｌｌ  ａｎｄ  Ｌａｓｋｅｙ，１９９１）を有した（図９Ｂ）。しかしＣｉｐ１／ＷＡＦ１と異なり、Ｋｉｐ１配列はＮ−末端領域に推定亜鉛フィンガーモチーフを有しておらず、共通Ｃｄｃ２リン酸化部位を含む２３アミノ酸のＣ−末端拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を有する（図９Ｂ）。
Ｃｄｋ阻害活性
Ｃ−末端においてヘキサヒスチジンで標識された純粋な組み換えＫｉｐ１は、一次反応条件下で検定されると、ヒトサイクリンＡ−Ｃｄｋ２、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２及びサイクリンＢ１−Ｃｄｃ２複合体のヒストンＨ１キナーゼ活性を阻害したが（図１０Ａ及び１０Ｂ）、ベクターのみで形質転換されたバクテリアからのモック試料は阻害しなかった。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２は０．５ｎＭ  Ｋｉｐ１において半−最大に阻害された（図１０Ｂ）。サイクリンＡ−Ｃｄｋ２の完全な阻害は８倍高い濃度を必要とし、この濃度はサイクリンＢ１−Ｃｄｃ２の完全な妨害には不十分であった（図１０Ｂ）。サイクリンＥ−Ｃｄｋ２、サイクリンＡ−Ｃｄｋ２又はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体にＫｉｐ１を加えると、ＧＳＴ−Ｒｂ融合産物をリン酸化するこれらの能力を阻害した（図１０Ｃ及びＤ）。これらのアッセイにおいてＫｉｐ１による阻害に対するサイクリンＥ−Ｃｄｋ２及びサイクリンＡ−Ｃｄｋ２の相対的感受性は、ヒストンＨ１キナーゼアッセイにおけるそれらの感受性と平行していた（図１０Ｂ及び１０Ｄを比較されたい）。これらのアッセイでは約１０ｎＭのサイクリン及び１０ｎＭのＣｄｋを用いたが、サイクリン：Ｃｄｋ複合体の実際の濃度は未知である。
Ｃｄｋ阻害ドメイン
Ｋｉｐ１の阻害活性がＣｉｐ１／ＷＡＦ１への類似性の領域に存在するのか否かを研究した。Ｋｉｐ１におけるこの領域に対応する５２−アミノ酸ペプチド［Ｋｉｐ１（２８−７９）］（図１０Ｅ）を組み換えにより製造し、Ｃ−末端ヘキサヒスチジン標識を用いて精製した。このペプチドは、全長Ｋｉｐ１の力価に近い力価でサイクリンＡ−Ｃｄｋ２によるＲｂリン酸化を阻害し（図１０Ｅ）、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２又はサイクリンＤ２：Ｃｄｋ４をそれより低い効率で阻害した。Ｎ−末端における３つのアミノ酸又はＣ−末端における１５のアミノ酸が欠けたこのＫｉｐ１の領域の別形はＣｄｋ阻害剤としてずっと弱く、７つのＮ−末端アミノ酸の欠失は阻害活性をもたない生成物を与えた（図１０Ｅ）。Ｃｉｐ１／ＷＡＦへの配列類似性をほとんど持たないペプチドＫｉｐ１［（１０４−１５２）］はＣｄｋ阻害剤として不活性であった（図１０Ｅ）。
Ｋｉｐ１はＣｄｋ活性化を妨げる
Ｋｉｐ１は最初、休止細胞からの抽出物におけるその存在がＣｄｋ２を、Ｔｈｒ160におけるリン酸化による活性化に対して抵抗性としてしまう因子として同定された。Ｋｉｐ１がＣｄｋ活性化を妨害することができるか否かを決定するために、指数的成長細胞からの抽出物におけるサイクリンＥ−依存性Ｃｄｋ２活性化へのその影響を決定した（Ｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ａ５４９ヒト肺癌細胞抽出物をヒスチジン−標識サイクリンＥと共にインキュベートし、次いでそれを回収し、結合ヒストンＨ１キナーゼ活性に関して決定した（図１１Ａ）。細胞抽出物へのヒスチジン−標識Ｋｉｐ１の添加は、サイクリンＥ−結合キナーゼ活性の量を顕著に減少させた（図１１Ａ）。平行アッセイにおいて、回収されたサイクリンＥをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−Ｃｄｋ２抗体を用いたウェスターンブロッティングに供した。Ｋｉｐ１を与えられなかった細胞抽出物はＴｈｒ160においてリン酸化されたＣｄｋ２に対応する形態のサイクリンＥ−結合Ｃｄｋ２を与えた（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）（図１１Ｂ）。対照的に、Ｋｉｐ１を与えられた抽出物からのサイクリンＥ−結合Ｃｄｋ２は、独占的に不活性な形態にあった（図１１Ｂ）。これらの結果を合わせると、試験管内における活性前（ｐｒｅａｃｔｉｖｅ）サイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体へのＫｉｐ１の結合はＴｈｒ160リン酸化及びＣｄｋ２の活性化を妨げることが示唆された。
Ｋｉｐ１過剰発現は細胞のＳ期への突入を阻害する
ヒト発現ベクター中にサブクローニングされたマウスＫｉｐ１を、細胞集団の最高６５％が吸収する条件下でＭｖ１Ｌｕ中にトランスフェクションし、トランスフェクションされたプラスミドを遷移的に発現させた（Ａｔｔｉｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＤＮＡ中への125Ｉ−デオキシウリジン挿入の比率は、ベクターのみでトランスフェクションされた細胞と比較して、Ｋｉｐ１でトランスフェクションされた細胞において７０％減少した（表ＩＩＩ）。
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細胞周期分布への影響を決定するために、Ｋｉｐ１をＣＤ１６発現ベクター（Ｋｕｒｏｓａｋｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，１９８９）と共にコトランスフェクションし、それはＣＤ１６免疫蛍光に基づく、トランスフェクションされた細胞のフローサイトメトリー分離を可能にした。Ｋｉｐ１とコトランスフェクションされたＣＤ１６+集団は、ベクターのみでコトランスフェクションされたＣＤ１６+集団より、Ｇ１期において細胞の大きな割合を示し、Ｓ期において小さい割合を示し（表ＩＩＩ）、Ｋｉｐ１過剰発現がＳ期への細胞の突入を妨害したことを示唆した。トランスフェクションの後の細胞数は、Ｋｉｐ１が細胞死を引き起こさなかったことを示した（データは示されていない）。
休止及び増殖細胞におけるＫｉｐ１  ｍＲＮＡ分布及び量
種々のヒト組織における内在性Ｋｉｐ１  ｍＲＮＡ発現の量を、ノザンブロット分析により測定した。検出された唯一のｍＲＮＡは２．５ｋｂの種であり、調べたすべての組織において類似の量で存在したが、それは骨格筋においていくらか高く、肝臓及び腎臓においていくらか低かった（図１２Ａ）。指数的増殖及び接触阻害Ｍｖ１Ｌｕ細胞においてＫｉｐ１  ｍＲＮＡ量は類似であり、細胞が血清の存在下で低密度において平板培養されることにより接触阻害から解放された時、変化しなかった（図１２Ｂ）。接触阻害から解放された細胞へのＴＧＦ−ｂの添加もＫｉｐ１  ｍＲＮＡ量に影響しなかった（図１２Ｂ）。これらの結果は、細胞外非増殖シグナルによるＫｉｐ１の調節が転写後のレベルで起こることを示している。
議論
Ｃｄｋ阻害剤の１群
ヒトＫｉｐ１はマウス及びミンクにおいて高度に保存されている（〜９０％同一性）１９８アミノ酸のタンパク質をコードする。その最も他と異なる特徴はＮ−末端半分の６０−アミノ酸領域であり、それはＣｉｐ１／ＷＡＦ１に類似のアミノ酸配列を有する（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｃｉｐ１／ＷＡＦ１と同様に、Ｋｉｐ１はＣ−末端領域に核局在化シグナルの可能性のある領域を含む。Ｋｉｐ１においては、この領域は共通Ｃｄｃ２キナーゼ部位も含み、それはそれらの標的キナーゼによるフィードバック調節において役割を果たすことができる。
Ｋｉｐ１及びＣｉｐ１／ＷＡＦ１の間の構造的類似性は、種々の調節性を有する哺乳類Ｃｄｋ阻害剤の１群を限定する。Ｋｉｐ１は細胞外シグナルの作用に転写後的に含まれ（本研究）、指数的成長細胞におけるそのサイレント性は熱−不安定成分への結合と関連している。対照的にＣｉｐ１／ＷＡＦ１は、ｐ５３、セネッセンス及び細胞休止により転写的に調節される。Ｋｉｐ１及びＣｉｐ１／ＷＡＦ１は有糸分裂Ｃｄｋに対してよりＧ１  Ｃｄｋに対して有効である。しかしＫｉｐ１はサイクリンＡ−Ｃｄｋ２（又はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４）に対してよりサイクリンＥ−Ｃｄｋ２に対して有効であるが、類似のアッセイにおいてＣｉｐ１／ＷＡＦ１はサイクリンＡ−Ｃｄｋ２に対してより有効である（Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｋｉｐ１の有効性は、与えられるサイクリンＣｄｋ複合体に関するその結合アフィニティーにより限定されるらしい。
Ｃｉｐ１／ＷＡＦ１に類似のＫｉｐ１領域は、試験管内において５２−アミノ酸ペプチドとして調べられた時に、Ｃｄｋ活性を阻害するのに十分である。この５２アミノ酸セグメントは配列ＬＦＧＰＶＮを含み、それはＣｉｐ１／ＷＡＦ１への同一性の最長の非−中断長に対応し、興味深いことにＣＬＮ−ＣＤＣ２８との相互作用に必要な領域に位置するＦＡＲ１配列ＬＳＱＰＶＮに類似している（Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
２つのレベルにおけるＣｄｋ阻害
Ｋｉｐ１はＣｄｋ活性化の過程及び、無損傷の細胞において集合し、活性化されたサイクリン−Ｃｄｋ複合体のキナーゼ活性の両方を阻害することができる。Ｋｉｐ１は最初、休止細胞の抽出物におけるその存在が、休止細胞を、Ｔｈｒ160におけるリン酸化によりＣｄｋ２を活性化できなくする因子として同定された。実際に、組み換えＫｉｐ１は試験管内においてＣｄｋ２  Ｔｈｒ160リン酸化及び活性化を阻害する。Ｋｉｐ１はＣｄｋ−活性化キナーゼの阻害剤として作用することができたが、以前の結果はこの可能性に反対して議論される傾向があった。Ｃｄｋ２活性化及びＣｄｋ２活性の両方への、Ｋｉｐ１の二重効果は、Ｔｈｒ160がＣｄｋ２構造における基質−結合割れ目（ｃｌｅｆｔ）を閉じるループに位置する事実に関連し得る（ＤｅＢｏｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。この領域へのＫｉｐ１の結合がＴｈｒ160リン酸化及び活性化Ｃｄｋ２の触媒機能を妨げることは考えられる。
細胞周期における機能
サイクリンＥ−Ｃｄｋ２及びサイクリンＤ−Ｃｄｋ４はＧ１進行に関する律速要因である（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｏｈｔｓｕｂｏ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９３；Ｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。生体内におけるＫｉｐ１によるこれらのキナーゼの阻害は、細胞をその遷移に達し得なくする。Ｋｉｐ１トランスフェクションにより引き起こされるＤＮＡ合成の速度及びＳ期の細胞の割合の強い減少は、この可能性、及び細胞外成長阻害シグナルの媒介物としてのＫｉｐ１の役割と一致する。
接触阻害から解放された細胞がＳ期により近く移動する時、それらの抽出物が含むＫｉｐ１活性は漸進的により低量となり、この減少はＧ１初期におけるＴＧＦ−ｂの添加により妨げることができる。しかし本結果は、接触阻害細胞及びＴＧＦ−ｂ−処理細胞が増殖細胞の量と等しいＫｉｐ１  ｍＲＮＡ量を有することを示している。さらに増殖細胞からの抽出物は、それらが１００℃において遷移的に加熱されると活性Ｋｉｐ１を与える。これらの観察の１つの説明は、細胞がＧ１を通って進行する時にＫｉｐ１が熱−不安定成分への結合により漸進的に封鎖され、この過程がＴＧＦ−ｂにより妨げられ得ることである。マイトジェン及び抗マイトジェンは、サイレント化タンパク質へのその結合を調節することによりＫｉｐ１活性又は利用性を調節するのかも知れない。別の場合、Ｋｉｐ１は受動性レギュレーターであり、その均一な量が、Ｋｉｐ１への結合により課せられる閾値にＣｄｋの量が達した時のみに活性Ｃｄｋが利用できるようになることを保証し得るのかも知れない。後者の状況の場合、サイクリン又はＣｄｋタンパク質量へのマイトジェン及び抗マイトジェンのいくぶん小さい影響がその閾値の存在により増幅されるようになり得る。
引用文献
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配列表
配列番号：１
配列の長さ：１７８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：２
配列の長さ：１９７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３
配列の長さ：１９８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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