(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的にアミノ基を有さず、グアニジル基を有する化合物を担体に固定化したことを特徴とするイオン化する化合物用分離剤。
【請求項２】
アミノ基を有する化合物を結合した担体のアミノ基をグアニジル基で置換したことを特徴とするイオン化する化合物用の分離剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イオン化する化合物用の分離剤およびその製造方法に関する。さらに詳細には、再現性よく製造でき、寿命が長く、保持容量の大きいイオン化する化合物用の分離剤およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、イオン交換体を粒子状にしてカラムに充填したりあるいは膜状にして溶液を通過させてカチオンおよびアニオン類を選択的に分離精製することが工業的に広く行われている。イオン交換現象をクロマトグラフィーによる分離に応用するものとしてアミノ酸分析計がある。アミノ酸分析計の開発は蛋白質化学の発展に大きく寄与し、さらには核酸分析計、糖分析計等も装置として市販されるようになっている。これらの分析計において分離用充填剤として広く用いられているのは、合成有機高分子であり、昨今の高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣという）で広く用いられているシリカゲルに代表される無機系高分子を基剤としたものではない。このため、理論段数を高めて分離能を向上させることが難しかった。
【０００３】
シリカゲルを基剤として表面を処理した充填剤は、理論段数が高く、分離し易く、取り扱いも容易なため、広く使用されるようになってきた。このため、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣともいう）の初期に広く使用された合成高分子系充填剤は、用いられることが少なくなった。しかしながら、シリカゲル系充填剤の表面修飾基の種類は少なく、オクタデシルシリル基で化学修飾した充填剤がイオン交換現象を用いた分離の５０％以上で使用されているといわれている。しかしながら、この充填剤は表面が疎水性であり、それ以外の選択性がないため、とりわけ極性化合物の分離条件設定には、困難な工夫をせざるを得ない。
イオン化する化合物の分離は、従来イオン交換樹脂を詰めた大容量のイオン交換カラム、あるいは逆相液体クロマトグラフィーが用いられてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
液体クロマトグラフィーの分離条件設定を容易とするためには、選択性のある、取り扱い易い充填剤の開発が必要である。本発明者らが先に開発したグアニジル基をシリカゲルに結合した充填剤は、従来のイオン交換体のように化学的にイオン交換容量とイオン強度に着目して合成されたものではない。グアニジル基結合充填剤は、生体内のイオン交換機能を模した充填剤であり、とりわけ生体成分の分離精製に特徴を発揮することを期待して開発されたものである。さらに、環境問題および必要試料量を少なくするという問題を解決するためには、カラムサイズを小さくする必要があり、このために、物理的強度の高いシリカゲルを支持体とする充填剤をも合成した。
イオン化する化合物の分離は、従来主としてイオン交換樹脂を詰めた大容量のイオン交換カラム、あるいは逆相液体クロマトグラフィーが用いられてきた。大容量のイオン交換カラムでは、必要溶離液が多く、分析時間が長いだけでなく、注入に必要な試料も多量に必要とし、普及している逆相液体クロマトグラフィーに比べて理論的および経済的利点が少ない。さらに従来のシリカゲルを基剤としたイオン交換充填剤は寿命が短いだけでなく、イオン交換基に特徴がないため普及しておらず、逆相液体クロマトグラフィーにとって変わられた。他方、逆相液体クロマトグラフィーでイオンまたはイオン化する化合物の分離には緩衝液だけでなく、イオン対試薬を加える必要がある。イオン対試薬を溶離液に加えると送液装置の保守が大変であるだけでなく、さらに多量の有機溶媒をも溶離液に加える必要がある。さらに溶離液の組成の種類が多いほど最適な溶離液を求めるのが難しくなる。
従来の大容量イオン交換カラムおよびシリカゲルを基材としたイオン交換体の問題点や逆相液体クロマトグラフィーの問題点を解決すべく、開発された本イオン交換体はイオン交換の特性とシリカゲル基材充填剤の特性を備え、イオン化する化合物だけを選択的かつ迅速に分離できる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、実質的にアミノ基を有さず、グアニジル基を有する化合物を担体に固定化したことを特徴とするイオン化する化合物用の分離剤を提供する。
さらに本発明は、アミノ基を有する化合物を結合した担体のアミノ基をグアニジル基で置換したことを特徴とするイオン化する化合物用の分離剤の製造方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
先に提案したグアニジル基（特願平８−３３５１３２号）と従来のイオン交換基とをグアニジル基に対応するアニオン交換基に限定して化学式で比較すると次のように表される。
プロピルアミノ基                −（ＣＨ2）3ＮＨ2
ジエチルアミノエチル基          −（ＣＨ2）2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ3）2
トリメチルアンモニウム基        −ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）3
トリエチルアンモニウム基        −ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ3）3
グアニジル基                    −ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2
このグアニジル基は他のイオン交換基と異なり、３個の窒素原子を有しており、蛋白質構成のアミノ酸の一つであるアルギニンの置換基である。このグアニジル基はアニオン交換能をもち、蛋白質のアニオン交換能を担っていると考えられる。この特性を生かしたのが、本発明で使用されるグアニジル基結合充填剤である。この充填剤は有機合成高分子を原料にしてもあるいはシリカゲルを原料にしても合成することができる。しかしながら、有機合成高分子を原料にしたものは化学的に安定であるが物理的に不安定で高理論段数のあるカラムを得ることは難しい。しかし多量処理に適した充填剤である。シリカゲルを原料にして合成したものは物理的強度が高いので高速液体クロマトグラフィー用充填剤として適している。
【０００７】
本発明で使用される担体に結合するアミノ基を有する化合物としては、アルキルアミン、アルキルジアミン、アルキルポリアミン、ω−アミノカルボン酸が例示される。これらの類似物としては、アルキル基の中間部が炭素原子の代わりに、Ｎ、ＳまたはＯで結合されたものであってもよい。上記化合物の炭素原子数は、１〜２２、好ましく２〜１２、さらに好ましくは３〜８である。少なくとも一端にアミノ基を有する化合物がより好ましく使用される。
これらの化合物をより具体的に例示すると次のとおりである。
プロピルアミノシラン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ヘキサメチレンジアミン、２−メチル−１，５−ペンタンジアミン、β−アラニン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン等。
【０００８】
本発明で使用されるアミノ基を有する化合物を固定化する担体としては、無機系担体としてシリカ、シリカゲル、多孔性アルミナ、有機系担体としてポリスチレンゲル、ポリスチレン水酸基ゲル、メタアクリレートゲル、エチレングリコール、デンプン、ビニルアルコール等が例示される。これらの担体は、あらかじめアミノ基を有する化合物を固定化したものであってもよく、市販品として容易に入手できる。それらを次に例示する。
シリカゲルとして、“Spherisorb  Si”(フェーズ・セパレーション社製）、“ＹＭＣ GEL Silicagel 60”（山村化学社製）、多孔性アルミナとして、“Aumina Alox 60”(ナーゲル社製）、“LiChrosorb Alox T”（メルク社製）、シリカゲル担体にアミノ基を有する化合物を固定化したものとして、“マイクロボンダスフェアーＮＨ2”（ウォーターズ社製）、“ＹＭＣーＧＥＬ  ＮＨ2”（山村化学社製）、“Zorbax ＮＨ2”(Du Pont社製）、シリカゲル担体にアミノ／シアノ基を有する化合物を固定したものとして、“Partisil 5 PAC”（ワットマン社製）、シリカゲル担体にヒドロキシル基を有する化合物を固定化したものとして、“LiChrosorb DIOL”（メルク社製）、シリカゲル担体にポリアミンを有する化合物を固定化したものとして、“ＹＭＣ−GEL PA”(山村化学社製)等の無機系担体が例示される。
有機系担体としては、ポリスチレンゲルとして、“日立ゲル 3010,3011,3019”（日立社製）、“MCI GEL GHP 20P”（三菱化学社製）、“Shodex polymer pak D”(昭和電工社製)、 “TSK gel LS 110,111”（東ソー社製）、メタアクリレートゲルとして、“Shodex RS pak DE 613”(昭和電工社製）、“TSK GEL LS 120,130,140” (東ソー社製）、エチレングリコールとして、“TSK GEL LS 160”(東ソー社製）、デンプンとして、“TSK GEL LS170”(東ソー社製)、ビニルアルコール系として、“Asahipak GS 220 〜 620”(旭化成社製）、その他の有機系ポーラスポリマーとして、“MCI GEL LQA 32S”(三菱化学社製、-(CH2)6NH2)等が例示される。これらの担体は、分離剤の用途に応じ適宜選択使用できる。
【０００９】
本発明のグアニジル基含有化合物を担体に固定化した分離剤の製造法の一例を次に説明する。
有機系担体、例えばポリビニルアルコールを担体とする場合の分離剤の製造法は次のとおりである。ポリビニルアルコールにポリアミンを結合した担体に、イソチオ尿素硫酸塩を加えてアミノ基をグアニジル基に変え、ついで硫酸根を水酸化ナトリウム水溶液で除くことにより、グアニジル含有化合物を担体に固定化した分離剤を得ることができる。
無機系担体、例えばシリカゲルを担体とする場合の分離剤の製造法は次のとおりである。シリカゲルを担体とした場合には、まずシリカゲルにプロピルアミノ基を結合させる。ついでＯ−メチルイソ尿素亜硫酸塩水溶液中にプロピルアミノ基を結合したシリカゲル担体を加えてアミノ基をグアニジル基に変え、引き続き亜硫酸根を水酸化ナトリウム水溶液で除くことにより、グアニジル基含有化合物を担体に固定化した分離剤を得ることができる。
【００１０】
従来担体として、多糖類から作られるセルロース、アガロース、セファデックス等、石油化学製品で球状、細管状や網状にしたポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン等に代表される柔らかな有機高分子系、およびシリカ、アルミナ、チタニア等に代表される無機高分子系のものが使用されてきた。これらの担体はそのまま吸着濾過剤として、あるいは液体クロマトグラフィー用充填剤として使われている。また、これら担体の表面を天然高分子の蛋白質、多糖類、あるいは合成高分子のシリコーンゴム、カーボワックス、ポリシロキサン等で表面処理して担体の特性を変え、適用範囲を広げる試みもなされてきた。
これらの担体の特性を高めるために、表面を低分子化合物で化学処理する方法も、分離剤として、例えばクロマトグラフィー用充填剤用として広く採用されてきた。すなわち、天然高分子で表面処理する場合には、天然高分子がたとえ安定に供給されたとしても、その品質、純度が一定でないため、再現性のある充填剤を得ることが難しい。しかし、低分子化合物を用いて、化学反応により担体の表面処理を行う場合には、品質管理が容易であり、品質、特性の安定した製品を市場に供給することができる。
【００１１】
グアニジル基によるイオン交換においては、アニオンの交換であり、海水中に多く含まれているクロルイオン、フッ素イオン、ブロムイオン、硝酸イオン、硫酸イオン等の各種無機イオン、植物中に多く含まれているシュウ酸、りんご酸、クエン酸、マレイン酸等の有機イオンのみならず、溶けることによりアニオンになる各種有機化合物等を金属イオン、アミン等のカチオンおよび多環芳香族化合物、糖類等の中性化合物から選択的に吸着する機能を有する。とりわけ、生体内酸性代謝物や酸性薬物（アニオン性）の分離精製に適している充填剤であり、生体内のアニオン交換反応を調べるのに適した充填剤である。
本発明のグアニジル基を担体に固定化した分離剤は、プロタミンのような天然高分子を固定化した分離剤に比して、品質、特性の安定した製品を市場に供給することができる。さらに、用途に応じて適宜担体を選択することにより、酸や塩基にも耐える製品とすることができ、広い用途に適応した分離剤を提供できることとなる。とりわけ生化学の分野での応用が広く期待できる。
【００１２】
以下本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
製造例１ ポリビニルアルコール系グアニジノカラムの製造
Asahipak NH2P-50(長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ）にＳ−メチルイソチオ尿素硫酸塩水溶液（１６．４ｇ／リットル）を８０℃で３リットル流した。その後、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１００ミリリットルで洗浄し、硫酸イオンを除いた。さらに、洗浄液が中性になるまで水洗し、分析用カラムとした。
【００１３】
製造例２  グアニジル基結合シリカゲルカラムの製造
アミノプロピルシリカゲル１０ｇをＯ−メチルイソチオ尿素硫酸塩２．８ｇを溶かした水１００ミリリットルに加え、８０℃で２日間加熱した。濾紙で濾過した後、１ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１リットルで洗浄し、亜流酸イオンを除いた。さらに、濾液が中性になるまで水洗した後、アセトンで過剰の水を除き、風乾した。
合成したグアニジル基結合シリカゲルを通常通りにカラムに充填し、ＨＰＬＣ用充填カラムとした。
【００１４】
実施例１  核酸のイオン交換液体クロマトグラフィー
製造例２で得られた長さ１０ｃｍ、内径２ｍｍのグアニジノ結合シリカゲルカラムに、５０ｍＭ、ｐＨ２．０のリン酸ナトリウム緩衝液を下記条件で通液した。結果を図１に示す。
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出：紫外部吸収２６０ｎｍ
従来の核酸の分離分析の場合には、イオン交換樹脂を詰めた大容量のイオン交換カラムを使用して低流速で分析する方法、および逆相液体クロマトグラフィーを使い、有機溶媒に界面活性剤を加えた溶離液を使用する方法があった。本発明の分離剤を使用すると、有機溶媒や界面活性剤を使用することなく、リン酸緩衝液だけで分離することができ、かつ分析速度も比較的速いという利点を奏する。
【００１５】
実施例２  酸性薬物のイオン交換液体クロマトグラフィー
製造例２で得られた長さ１５ｃｍ、内径２ｍｍのグアニジノ結合シリカゲルカラムに、５０ｍＭ、ｐＨ５．５のリン酸ナトリウム緩衝液を下記条件で通液した。結果を図２に示す。図中のピーク番号１、２、３、４および５はそれぞれ次の成分を示す。
１：Diazepam      ２：Sulfamethoxazole      ３：Benzoic acid
４：Furosemide    ５：Warfarin
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６０℃
検出：紫外部吸収２３０ｎｍ
従来酸性薬物の高速液体クロマトグラフィーにおいては、逆相液体クロマトグラフィーが使用され、溶離液としては有機溶媒に界面活性剤を加えたものが使用されていた。本発明の分離剤を使用すると、有機溶媒や界面活性剤を使用することなく、リン酸緩衝液だけで分離することができ、かつ分析速度も比較的速いという利点を奏する。また実施例１および２において、溶離液量は、従来のカラムを使った場合に比して１／５であった。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、品質が安定であり、かつ寿命の長いイオン化する化合物用の分離剤が提供される。さらに本発明によれば、溶離液として有機溶媒や活性剤を使用する必要がないので、廃液処理が容易である分離剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸の分離結果を示すグラフである。
【図２】酸性薬物の分離結果を示すグラフである。
【図１】
0004070904.tif 000002
【図２】
0004070904.tif 000003