(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍患者から採取した末梢血リンパ球を培養液を用いて増殖する場合に、固相化した抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２を含む培養液中で増殖培養した自己由来リンパ球を主成分とするグリオブラストーマの静脈投与用術後再発予防剤。
【請求項２】
脳腫瘍患者から採取した末梢血リンパ球を培養液を用いて増殖する場合に、固相化した抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２を含む培養液中で培養を行うようにした、グリオブラストーマの術後再発を予防するための、静脈投与用末梢血活性化リンパ球の製造方法。
【請求項３】
脳腫瘍患者から採取した末梢血リンパ球を培養液を用いて増殖する場合に、固相化した抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２のほかに、さらに血清、蛋白質、アミノ酸、糖類、抗生物質のうち少なくとも１種を含む、当該増殖する場合に用いる培養液中で培養を行う、グリオブラストーマの術後再発予防するための、静脈投与用末梢血活性化リンパ球の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリオブラストーマの手術後における再発を防止することができる画期的な再発予防剤ならびにグリオブラストーマの術後再発予防するための、脳腫瘍患者から採取した静脈投与用末梢血活性化リンパ球の製造方法に関し、再発予防効果を格段に向上させることを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
一般に生体は、免疫系により腫瘍（癌）から身を守っている。  癌に対する免疫反応としては、ＮＫ細胞やＴ細胞を主体とする細胞性免疫が一般的に重要であると考えられている。  ＮＫ細胞は、その細胞表面のＮＫレセプターにより癌細胞を認識し、癌細胞の破壊排除を行なっていると考えられている。  一方、Ｔ細胞はＴ細胞レセプターにより癌細胞を認識し、破壊排除を行なっている。  特にキラーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ拘束性でありＭＨＣクラスＩを発現している細胞の癌に対しては破壊排除を行うが、ＭＨＣクラスＩを発現していない細胞、あるいは発現が非常に低い細胞、例えば、神経系の細胞に由来する癌に対してキラーＴ細胞は破壊排除を行なわないと考えられている。
【０００３】
これは、キラーＴ細胞がＭＨＣ中に補足されているウイルス等に由来するペプチドを認識して、この細胞を異物とみなし、排除するためである。  既にウイルス感染細胞は、ＭＨＣとキラーＴ細胞のコンビネーションにより破壊排除されることが一般的に知られている。  細胞の分類は、細胞の表面に発現している表面マーカーによりなされており、成熟したＴ細胞には、表面マーカーとしてＣＤ３を発現している。  成熟したＴ細胞は、ＣＤ３を表面マーカーとして発現するだけでなく、抗腫瘍活性を有するキラーＴ細胞はＣＤ８を、また各種の免疫系細胞の活性化に密接に関係しているヘルパーＴ細胞はＣＤ４を発現している。  また成熟したＴ細胞には、Ｔ細胞レセプターが発現しており、本レセプターは特定の抗原に対して親和性が高い。
【０００４】
またＴ細胞は、単一のＴ細胞レセプターのみを発現し、本レセプターを介して抗原独特の特異的なＴ細胞の活性化が行なわれている。  さらに、Ｔ細胞レセプターは、非常に多様性に富んでおり、しかも生体内には異なる多種類のＴ細胞が存在している。  また腫瘍には一般的にウイルス性の腫瘍と非ウイルス性の腫瘍とがあり、ウイルス性の腫瘍はＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝炎ウイルスによる肝臓癌やエプスタイン・バー・ウイルスによるバーキットリンフォーマや上咽頭癌、胃癌等が知られている。  また非ウイルス性の腫瘍としては、発癌性物質や紫外線接種による遺伝子変異によるもの、あるいは原因がはっきりしないものがあり、その種類はすべての腫瘍に及んでいる。
【０００５】
このうち悪性度が高く致死的なものとしては、脳腫瘍やスキルス性胃癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、腎臓癌、大腸癌、肝臓癌等のうち、ウイルス抗原あるいはウイルス遺伝子をもっていないものが挙げられる。  ウイルス性の腫瘍は、腫瘍にウイルス関連抗原が発現されており、これは生体にとって外来性のものであるため、活性化リンパ球によって有効であるが、外来性の抗原を発現しないような腫瘍では、活性化リンパ球が有効であるか否かは明らかでない。  さらに非ウイルス性の腫瘍のなかでも脳腫瘍については特に難しい問題が潜んでいる。  すなわち、脳には薬剤等が到達しずらく、免疫反応も脳独特なものであると考えれている。  実際に「脳血液関門」と呼ばれる概念があり、これにより脳は、他の臓器と隔離されていると考えられている。
【０００６】
脳腫瘍には、グリオーマ、メニンギオーマ、シュワノーマ等がある。  このうち特にグリオーマは、悪性脳腫瘍として知られている。  またグリオーマ自体にもいくつかの種類があり、そのうちグリオブラストーマやメドロブラストーマは、予後が悪く、グリオブラストーマ患者の術後の生存率は、１年で５０．１％、２年で２０．５％、３年で１１．４％、４年で８．７％と報告されている（ＣＡＮＣＥＲ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＡＮＤ  ＳＵＲＶＩＶＡＬ；ＪＡＰＡＮ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＳＯＣＩＥＴＩＥＳ  ＰＲＥＳＳ社；１９１−２０１頁参照）。
【０００７】
一方、ウイルス性の癌患者のリンパ球、特にＴ細胞、ＮＫ細胞をインターロイキン２で刺激したものが抗腫瘍活性を有することについては、ローゼンバーグらにより最初に報告されている〔Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９，１６７８（１９８８）〕。  またウイルス性癌患者自身から採取したリンパ球を抗ＣＤ３固相化抗体及びインターロイキン２で刺激増殖するようにした増殖刺激法についても、本発明者らにより提唱されている（特開平３−８００７６号公報参照）。  また鈴木らは、グリオブラストーマ患者にリンパ球を投与することを試みているが、本リンパ球投与の有効性を明らかにするに至っていない。  またオウグスト等は、液相での抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２でのリンパ球の活性化方法の報告（ＵＳ・ＰＡＴ：５４４３９８３）を、さらにスコッフは、腫瘍内浸潤細胞を固相化抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２での活性化方法を報告（ＷＯ  ９０／０４６３３）している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記増殖法により増殖させたリンパ球は、専らウイルス性の肝臓癌の術後再発予防に用いることを提唱したものであり、またローゼンバーグやオウグスト、スコッフらの報告は、リンパ球の由来、調製方法、活性化法や投与方法等が異なり、本発明におけるグリオブラストーマの術後再発予防に関するものではない。  したがってウイルス関連抗原を発現しないようなグリオブラストーマの術後再発予防手段として活性化リンパ球を適応すること、特に「脳血液関門」と呼ばれるようなバリアシステムを備える脳で発生する脳腫瘍の術後再発予防手段として活性化リンパ球を適応することは全く思いもつかないことである。  これまで脳腫瘍をはじめとした非ウイルス性腫瘍の術後再発予防手段としては、化学療法剤や放射線療法等の毒性あるいは副作用が強く、その使用容量が制限されてしまったりして効果が低いものしか知られておらず、画期的な手段が未だ開発されるに至っていない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明にあっては、上記した従来技術における課題を解決し、投薬効果や免疫反応においても一般的なウイルス性腫瘍とは全く異なるグリオブラストーマの術後再発抑制効果のきわめて高い再発予防剤・ならびにその調製方法を確立するに至ったものであり、具体的には、脳腫瘍患者から採取した末梢血リンパ球を培養液を用いて増殖する場合に、固相化した抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより増殖させた自己由来リンパ球を主成分とするグリオブラストーマの静脈投与用術後再発予防剤に関する。
【００１０】
【００１１】
【００１２】
さらに本発明は、脳腫瘍患者から採取した末梢血リンパ球を培養液を用いて増殖する場合に、固相化した抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２を含む培養液中で培養を行うようにしたグリオブラストーマの術後再発を予防するための末梢血活性化リンパ球の製造方法にも関する。さらに本発明は、脳腫瘍患者から採取したリンパ球を、培養液を用いて増殖する場合に、固相化した抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２のほかに、さらに血清、蛋白質、アミノ酸、糖類、抗生物質のうち少なくとも１種を含む培養液中で培養を行うようにした、グリオブラストーマの術後再発予防するための静脈投与用末梢血活性化リンパ球の製造方法にも関する。
【００１３】
脳腫瘍患者の静脈からヘパリン加採血等の凝集防止手段を施した採血方法により末梢血を規定量採取した後、遠心分離手法等によりリンパ球を分離させ、さらにこれを抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む固相化した培養液中において一定期間培養させてグリオブラストーマの術後再発予防剤を得る。  さらにグリオブラストーマの術後において一定期間を経て患者の体力が安定した時点で上記した再発予防剤を患者の末梢血管に注入して術後再発予防をはかる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の具体的な内容について、以下の実施例をもとに説明すると、本発明は脳腫瘍患者から採取したリンパ球を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより増殖させ、さらにこの増殖させた自己リンパ球を主成分とする再発予防剤を、グリオブラストーマの術後に患者に静脈から投与するようにしたグリオブラストーマの再発予防剤、ならびにその製造方法をもってその要旨とするものである。
【００１５】
末梢血は、凝集を防ぐ目的でヘパリン加採血あるいはクエン酸加採血などでおこなえるが、本方法に限定されない。  また末梢血からのリンパ球の分離は、本実施例においては、密度遠心分離により行っている。  この場合の密度遠心分離としては、フィコールハイパック、モノポリレゾルーション等が使用できる。しかしながら、本方法に限定されるものではない。
【００１６】
また、一回に採血する血液量としては、０．１〜５００ｍｌで行なうことができる。より好ましくは、１〜１００ｍｌで行なうことができる。  さらに好ましくは１０〜５０ｍｌで行なうこともできる。  本方法は、大量の血液あるいは少量の血液を材料として実施できるが、特に少量の血液の場合、患者の負担を最少限におさえることができるので有利である。  そのため、一回の採血量は、５０ｍｌ程度が好ましい。  一回の採血により数回分の投与に使用できる細胞が調製できるが、投与回数あるいは投与間隔に応じて適宜採血を行い、細胞を調製することができる。
【００１７】
つぎに、脳腫瘍患者から採取したリンパ球は、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で刺激増殖される。  この場合、抗ＣＤ３抗体を固相化する支持体としては、各種フラスコ、シャーレ、プレート、バッグが使用できる。  抗体の固相化方法は、非特異的吸着や化学結合による方法で行えるが、抗ＣＤ３抗体によりリンパ球が刺激できる固相化方法であればいずれの方法でも良い。  また実施例においては抗ＣＤ３抗体としてＯＫＴ−３（オルソ社）を使用しているが、ＣＤ３抗原を刺激できるものであれば、いずれの抗体（化合物）であってもよい。  さらにインターロイキン２は、リンパ球、特にＴ細胞を活性化できるものならば、どのようなものでも使用可能である。
【００１８】
インビトロでの細胞の培養は、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、各種無血清培地が使用できる。  さらに必要により本培地に、血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、抗生物質を添加してリンパ球の培養をおこなうと、増殖、活性化、培養操作性の点で、より一層有利である。  またインビトロで増殖させたリンパ球は、生理食塩水やリン酸緩衝液を代表例とする各種緩衝液に懸濁させて投与することもできる。  リンパ球は、１×１０（４乗）個／ｍｌから１×１０（８乗）個／ｍｌの細胞濃度で使用することができる。
【００１９】
より好ましくは、１×１０（６乗）個／ｍｌから１×１０（８乗）個／ｍｌの細胞濃度で使用することもできる。  なおこの場合、細胞懸濁液には、細胞の凝集や容器への吸着を防ぐ目的で、タンパク質等を添加することが望ましい。  またタンパク質としては、例えば、ヒトアルブミン等が使用できる。  ヒトアルブミンは、０．１Ｗ／Ｖ％から１０Ｗ／Ｖ％濃度で使用することができる。  さらに投与経路としては、便宜性の点から特に前記した静脈投与が推奨される。
【００２０】
投与時期については、手術前あるいは、手術後のいずれでも投与できるが、本実施例においては、手術後に投与を行っている。  投与には、固相化ＣＤ３抗体とインターロイキン２で刺激増殖させたリンパ球や、刺激後、適当な培養液中で拡大培養を行なったリンパ球が使用される。  拡大培養を行なう培養液中には、必要に応じてインターロイキン２を添加したものが使用できる。  また本発明は、リンパ球を固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより増殖させているが、必要により各種サイトカイン、増殖因子、あるいは適当な細胞を増殖させて調製したコンデション培地等を添加したり、特定の抗原で刺激することにより、リンパ球の増殖率をより一層向上させることもできる。
【００２１】
【実施例】
〔ＯＫＴ３抗体固相化フラスコの調製〕
５μｇ／ｍｌ濃度のＯＫＴ３抗体を含むＰＢＳ（−）溶液３０ｍｌを、底面積２２５ｃｍ（２乗）の培養フラスコ（住友ベークライト社製）に加え、底面が溶液で覆われる状態のまま室温にて２時間放置し、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製し、これを使用時まで摂氏４度の温度雰囲気下にて保管する。
【００２２】
〔リンパ球の調製〕
脳腫瘍患者の静脈よりヘパリン加末梢血として５０ｍｌ採血した。  これに等量のＲＰＭＩ１６４０培地を加え、予め数本の１５ｍｌの遠心管に分注しておいたリンホセパールＩ（免疫生物研究所製）に重層し、１８００ｒｐｍで１５分間遠心した。  遠心後、リンパ球層をピペットにより集め、ＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍｌと混和後、遠心分離を行なった（１８００ｒｐｍ、１０分間）。
【００２３】
上澄みを除去後、細胞ペレットを良くほぐし、これに培養液（カナマイシン６０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌ、グルタミン２ｍＭ、オキザロ酢酸１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、インスリン０．２Ｕ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地に、ヒト血清１０％およびインターロイキン２  ７００Ｕ／ｍｌを添加したもの）５０ｍｌを加え、細胞懸濁液を調製する。  前記「ＯＫＴ３抗体固相化フラスコの調製」で作製したＯＫＴ３固相化フラスコをＰＢＳ（−）により２回洗浄した。  洗浄後、上記細胞懸濁液をＯＫＴ３固相化フラスコに接種し、５％炭酸ガス、飽和湿度下、摂氏３７度で培養をおこなった。
【００２４】
さらに３日後に、これに培養液５０ｍｌを加え、４日後にさらに培養液１５０ｍｌを加え、懸濁後、フラスコ中の培養液１２５ｍｌを、新たなＯＫＴ３固相化フラスコ内に移し、培養を行なった。  ６日後に、フラスコ内の培養液約２５０ｍｌを、ＬＬ−７培養液（日研生物医学研究所製）７５０ｍｌに加え、ガス透過性培養バッグを用いて、５％炭酸ガス存在下、摂氏３７度にて培養させた。  さらに、８日目に１リットルの培養液を加え、これを２バッグのガス透過性培養バッグで培養した。  同様にして１０日目には４バッグで、１２日目には６バッグで、それぞれ培養をおこなった。  １４日目に細胞を遠心分離により集め、これを２％ヒトアルブミンを含む生理食塩水約２５０ｍｌに懸濁し、リンパ球懸濁液を調製した。
【００２５】
〔リンパ球の投与〕
前記した「リンパ球の調製」で調製したリンパ球懸濁液を、始めの１カ月間に静脈より３回投与し、以後１回／月の頻度で静脈より継続的に投与をおこなった。  初回投与は、術後３カ月から７カ月後に開始した。  一回の投与に約０．８×１０（１０乗）個から１．５×１０（１０乗）個のリンパ球を使用した。  ４名のグリオブラストーマ患者に投与を行って、経時的にその生存数を観察したところ、１名については術後１１カ月で死亡したものの、残り３名については、本出願時も生存しており（１９９６年１２月時点で２８カ月、３２カ月、３９カ月生存）、しかも驚くべきことに生存者については、社会復帰を果たしている。
【００２６】
グリオブラストーマ患者の統計的な１年生存率は、約５０％、２年生存率は約２０％、３年生存率は約１０％であることに鑑みれば、本発明の再発防止剤としての活性化自己リンパ球投与が、とくにグリオブラストーマの術後再発予防にきわめて有効であることを明かとした。  なお、本発明は、上記した実施例のみに限定されない。
【００２７】
【発明の効果】
本発明は上記した通り、脳腫瘍患者からから採取した末梢血リンパ球を培養液を用いて増殖する場合に、固相化した抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２を含む培養液中で培養した自己由来リンパ球を主成分とするグリオブラストーマの静脈投与用術後再発予防剤であるから、とりわけてグリオブラストーマ患者の術後再発予防に著効を発揮することができる。
【００２９】
さらに本発明の治療方法および治療剤は、術後再発予防のみならず、本リンパ球は、治療剤としても使用できる。  また、術後からの投与のみならず、術前からの投与により、より一層の効果を期待できる。  さらに本発明の調製自己リンパ球は、とくに手術後における再発予防を目的として投与しているが、手術しない場合においても使用により大きな効果が期待できる。
【００３０】
脳腫瘍患者からのリンパ球の採取については、患者の末梢血以外にも、リンパ節、胸腺、腫瘍内浸潤細胞などから採取することができる。患者由来のリンパ球であれば、この場合いずれの組織あるいは臓器由来のものであっても使用できる。さらに、本発明の製剤によって、グリオブラストーマ患者のクオリティーオブライフの改善ができる。