(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬であって、
カオトロピックイオンを含有することを特徴とする溶血試薬。
【請求項２】
請求項１記載の溶血試薬であって、さらに緩衝剤を含有し、ｐＨが５．０〜１０．０であることを特徴とする溶血試薬。
【請求項３】
請求項１または２記載の溶血試薬を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬及びこれを用いたヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は糖尿病診断の指標として広く利用されている。ＨｂＡ１ｃとは血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映する。
【０００３】
このＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられている。
【０００４】
液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、最近では、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００５】
しかし、安定型ＨｂＡ１ｃピークと不安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、特開昭６３−２９８０６３号公報では、赤血球および／または、ヘモグロビンを含む試料を、リン酸縮合体および／またはリン酸縮合体の塩を含む解離溶媒質と接触させて、不安定型ヘモグロビンをヘモグロビンとグルコースに解離して測定する方法が記載されている。しかしながら、この方法では、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不十分なため、測定精度が悪いという欠点があった。
【０００６】
また、液体クロマトグラフィー法でのヘモグロビン類の測定方法においては、アセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン（以下ＣＨｂという）などの修飾ヘモグロビンの影響を受けると言われ、ＡＨｂやＣＨｂのピークも安定型ＨｂＡ１ｃピーク付近に溶出するため、従来法によっては、短時間での分離が困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記ヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑み、従来法より安定型ＨｂＡ１ｃを精度良く分離可能な、また、さらに短時間に測定可能な溶血試薬及びこれを用いたヘモグロビン類の測定方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１記載の本発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬であって、カオトロピックイオンを含有することを特徴とする溶血試薬を提供する。
また、請求項２記載の本発明は、請求項１記載の溶血試薬であって、さらに緩衝剤を含有し、ｐＨが５．０〜１０．０であることを特徴とする溶血試薬を提供する。
また、請求項３記載の本発明は、請求項１または２記載の溶血試薬を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法を提供する。
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明における溶血試薬とは、赤血球より低張な水溶液であれば良い。
また、ここで言う溶血とは、赤血球膜が破れ、血色素などの内容物（例えば、ヘモグロビン類）が赤血球外に出ることである。
【００１０】
本発明におけるカオトロピックイオンとは、水溶液に解離して生じたイオンにより、水の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに起こる、水のエントロピー減少を抑制するもので、具体的には、陰イオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、またその他に尿素等が挙げられる。また、陽イオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
安定型ＨｂＡ１ｃの測定精度を向上させるためには、より好ましくは、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン等が挙げられる、陽イオンとしては、グアニジンイオン等が挙げられる。
【００１１】
上記カオトロピックイオンの溶血試薬中の濃度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましい、より好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。
０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下し、測定精度が悪くなる。また、３０００ｍＭよりも高くてもヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないので、測定精度は向上しない。
また、これらカオトロピックイオンは、単独でもまた、複数種混合して用いてもよい。
【００１２】
本発明の溶血試薬は、請求項２記載の如くカオトロピックイオンの他にさらに緩衝剤を含むｐＨ５．０〜１０．０の溶血試薬であることが好ましい。
上記緩衝剤としては無機酸、有機酸もしくはこれらの塩又は有機物が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等が挙げられる。
上記有機酸・有機物としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン、イミダゾール、ピリジン、カコジル酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン、ピロリン酸等が挙げられる。
【００１３】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。
上記アニリンまたはアニリン誘導体としては、ジメチルアニリン等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、等が挙げられる。
上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
【００１４】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００１５】
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。
【００１６】
上記無機酸、有機酸又はこれらの塩としては、単独でもまた、複数混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
【００１７】
上記緩衝剤の溶血試薬中の濃度は、水に溶解された状態で緩衝作用がある範囲であればよく、０．１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、好ましくは１〜５００ｍＭ、より好ましくは２〜２００ｍＭである。
【００１８】
請求項２記載の本発明の溶血試薬のｐＨは、ｐＨ５．０〜１０であり、好ましくはｐＨ５．５〜９．５であり、より好ましくは、６．０〜９．０である。ｐＨが５．０より低くても、また１０より高くても、ヘモグロビンが変性する。
【００１９】
上記溶血試薬には、以下の物質を添加してもよい。
（１）無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を添加してもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、また、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化ストロンチウム、水酸化セシウム、水酸化ニッケル、水酸化アルミニウム、水酸化カドミウム等が挙げられる。  これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。
これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０体積％であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度で用いるのが好ましい。
【００２０】
（４）界面活性剤として、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤等を添加してもよい。界面活性剤を用いることにより、溶血を効率よく行うだけでなく、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試薬の通過する流路等を洗浄する効果がある。
上記界面活性剤は、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セチルーステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独でもまた複数混合して用いてもよい。
【００２１】
これらの界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００２２】
請求項３の本発明は、上述の請求項１または２記載の溶血試薬を用いるヘモグロビン類の測定方法である。
【００２３】
本発明におけるカチオン交換液体クロマトグラフィーで用いられる溶離液は、上記緩衝剤と同様の無機酸、有機酸もしくはこれらの塩又は有機物を水溶液に溶解して用いられる。
【００２４】
上記無機酸としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等が挙げられる。
上記有機酸・有機物としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン、イミダゾール、ピリジン、カコジル酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン、ピロリン酸等が挙げられる。
【００２５】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。
上記アニリンまたはアニリン誘導体としては、ジメチルアニリン等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、等が挙げられる。
上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
【００２６】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００２７】
上記無機酸、有機酸又はこれらの塩としては、単独でもまた、複数混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
【００２８】
上記緩衝剤の溶離液中の濃度は、水に溶解された状態で緩衝作用がある範囲であればよく、０．１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、好ましくは１〜５００ｍＭ、より好ましくは２〜２００ｍＭである。
【００２９】
本発明に用いられる溶離液のｐＨは、通常ｐＨ４．０〜１３．５であり、好ましくはｐＨ４．５〜１２．０であり、より好ましくは、５．０〜１０．０である。ｐＨが４．０より低くても、また１３．５より高くても、ヘモグロビンが変性する。
上記溶離液中の緩衝剤としては、酸解離定数（ｐＫａ）が１．５〜６．８と６．８〜１３の両方にあるものを用いるのが良い。この場合、緩衝液組成として、複数の物質を含有している場合でも、それぞれの物質のｐＫａ値が１．５〜６．８と６．８〜１３の両方にあればよい。また一種類の物質でｐＫａ値が１．５〜６．８と６．８〜１３の両方にある緩衝液でも良い。
【００３０】
また、本発明の測定方法において、溶離液を測定途中で切り替えたり、グラディエント溶出、ステップアップグラディエント溶出を行ってもよい。
【００３１】
本発明のカチオン交換液体クロマトグラフィーにおいて用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００３２】
該カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００３３】
上記粒子の直径は、好ましくは０．１〜１０μｍ、より好ましくは０．２〜８μｍである。
また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００（％））として、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下である。
【００３４】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００３５】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００３６】
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。カラムのサイズは、内径０．１〜４ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものが好ましく、より好ましくは、内径０．３〜３ｍｍ、長さ７〜１８ｍｍである。
カラムサイズは、内径０．１ｍｍ、長さ５ｍｍより小さくなると作業性が悪く分離機能も悪くなる。また、内径４ｍｍ、長さ２００ｍｍより大きくなると使用する充填剤量が多くなるだけでなく、分離機能も悪くなる。
【００３７】
充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００３８】
上記カラムの素材としては、公知のステンレス等の金属、ガラス、ＰＥＥＫ等の樹脂などが用いられる。
また、カラムの充填剤とカラム本体が接する部位を、不活性な素材で被覆してもよく、その素材としては、例えばＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げられる。
【００３９】
上記測定に使用される液体クロマトグラフは、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００４０】
上記測定方法における、他の測定条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．２〜３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μｌ程度である。
【００４１】
【実施例】
次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）
〔充填剤１の調製：カルボキシル基〕
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及びメタクリル酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００４３】
〔カラムの充填〕
得られた充填剤１をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００４４】
〔ヘモグロビン類の測定〕
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
0004094776.tif 000002
【００４５】
（測定試料：Ａ）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌとなるよう添加した。これに、１５０倍量の溶血試薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）とカオトロピックイオンを生成する化合物として１００ｍＭグアニジン及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血試薬（ｐＨ７．５））を添加して溶血し、測定試料とした。
（測定試料Ｂ；ＡＨｂ）
健常人血１０ｍｌにフッ化ナトリウムを添加し（１０ｍｇ／ｍｌ）、さらに０．３重量％アセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させた。これに、１５０倍量の溶血試薬（０．１重量％トリトンＸ−１００と１００ｍＭグアニジン及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血試薬（ｐＨ７．５））を添加して溶血し、測定試料とした。
【００４６】
（測定結果）
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１、２に示す。図１は、試料Ａを測定した結果、図２は、試料Ｂを測定した結果を示す。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂを示す。図２では、ピーク４と６とが良好に分離されている。
また、上記測定試料Ａ、Ｂを５検体測定し安定型ＨｂＡ１ｃの測定精度（ＳＤ；標準偏差、ＣＶ；変動係数値）を求めた結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
0004094776.tif 000003
【００４８】
（実施例２）
溶血試薬に以下の試薬を用いたこと以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶血試薬（ｐＨ８．０）（０．１重量％トリトンＸ−１００と８０ｍＭチオシアン酸及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液）で測定試料Ａ、Ｂを溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
得られたクロマトグラムは図２と同様に良好であった。
【００４９】
（実施例３）
溶血試薬に以下の試薬を用いたこと以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶血試薬（ｐＨ８．０）（０．１重量％トリトンＸ−１００と４０ｍＭ過塩素酸及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液）で測定試料Ａ、Ｂを溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
得られたクロマトグラムは図２と同様に良好であった。
【００５０】
（実施例４）
溶血試薬に以下の試薬を用いたこと以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶血試薬（ｐＨ８．０）（０．１重量％トリトンＸ−１００と５０ｍＭ尿素及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液）で測定試料Ａ、Ｂを溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
得られたクロマトグラムは図２と同様に良好であった。
【００５１】
（実施例５）
〔充填剤２の調製及び充填：スルホン酸基〕
重合性単量体としてメタクリル酸のかわりに２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇを用いたこと以外は、実施例１と同様にし、充填剤を得た。また、カラムへの充填も実施例１と同様に行った。
【００５２】
〔ヘモグロビン類の測定〕
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。測定システムは、実施例１と同様のものを使用した。
0004094776.tif 000004
（測定試料）
溶血試薬に以下の試薬を用いヘモグロビンの測定を行った。
溶血試薬（ｐＨ８．０）（０．１重量％トリトンＸ−１００と６０ｍＭグアニジン及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液）で測定試料Ａ、Ｂを溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
得られたクロマトグラムは図２と同様に良好であった。
（比較例１）
溶離液を以下の溶離液としたこと及び溶血試薬を以下の試薬を用いたこと以外は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
0004094776.tif 000005
（測定試料）
溶血試薬（ｐＨ８．０）（０．１重量％トリトンＸ−１００と０．１重量％ポリリン酸及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液）で測定試料Ａ、Ｂを溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
（測定結果）
試料Ｂを測定して得られたクロマトグラムを図３に示したが、ピーク４と６の分離が悪かった。また、表２に示すように、実施例１〜５では、測定試料Ａ及びＢのＨｂＡ１ｃのＣＶ値は、ほぼ一致しているが、比較例１では、測定試料Ａに比べＢの分離が悪くＣＶ値が大きくなっており、測定試料ＡとＢの差が大きい結果となった。
【００５３】
【発明の効果】
請求項１記載の本発明の溶血試薬は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬であって、カオトロピックイオンを含有するので、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が良好となった。
請求項２記載の本発明の溶血試薬は、請求項１記載の溶血試薬であって、さらに緩衝剤を含有し、ｐＨが５．０〜１０．０であるので、ヘモグロビン類の分離を短時間に高精度に行うことが可能となった。
請求項３記載の本発明のヘモグロビン類の測定方法は、請求項１または２記載の溶血試薬を用いるので、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が良好となり、またはヘモグロビン類の分離を短時間に高精度に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料Ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料Ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料Ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１  ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
２  ＨｂＦのピーク
３  不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４  安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５  ＨｂＡ０のピーク
６  ＡＨｂのピーク
【図１】
0004094776.tif 000006
【図２】
0004094776.tif 000007
【図３】
0004094776.tif 000008