(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達系におけるＳＴＡＴタンパク質の機能を抑制するタンパク質であって、実質的に純粋であり且つ次の特徴（１）〜（３）の全てを有するタンパク質。
（１）ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ６により誘導される。
（２）ｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を阻害する。
（３）ＳＨ２領域を含有する、次の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号１の２１２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１の２１２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
該タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
該ＤＮＡが、配列番号１の塩基配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
サイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングする方法にして、サンプル材料を請求項１又は２に記載のタンパク質に接触させ、サンプル試料中に含まれる物質による該タンパク質の活性化又は活性阻害を指標として、サイトカインレギュレーター作用を有する物質を検出することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のタンパク質に結合するモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項３又は４に記載のＤＮＡを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質導入された微生物又は細胞。
【請求項９】
サイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングする方法にして、サンプル材料を請求項８に記載の形質導入された微生物又は細胞に接触させ、サンプル試料中に含まれる物質による、上記形質導入された微生物又は細胞中の該組み換え体ＤＮＡがコードするタンパク質の活性化又は活性阻害を指標として、サイトカインレギュレーター作用を有する物質を検出することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、哺乳類のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達系におけるＳＴＡＴタンパク質の機能を抑制するタンパク質及びそのタンパク質をコードするＤＮＡに関する。このタンパク質はＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ６により誘導され、ｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を阻害し、ＳＨ２領域を有することを特徴とする。本発明のタンパク質を用いることにより、新規なサイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングすることができる。また、本発明は、上記タンパク質の生合成を抑制するアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ；上記タンパク質に結合しうるモノクローナル抗体；上記ＤＮＡにハイブリダイズしうるプローブＤＮＡ及びＲＮＡ；上記ＤＮＡを複製可能なベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ；及びその形質導入体に関する。更に本発明の形質導入体も、新規なサイトカインレギュレーター作用を有する物質のスクリーニングに用いることができる。
従来技術
細胞間の情報伝達を担う蛋白性の化学物質は総称してサイトカインと呼ばれている。このようなサイトカインとしてインターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子等多くの物質が見出されている。サイトカインの特徴は糖蛋白であり、標的細胞の表面に特徴的な受容体が発現し、サイトカインの持つ細胞増殖、分化などの生理活性は、この受容体分子とサイトカインが結合することによって初めて発揮されるといわれている。
このような面からサイトカインの細胞内における情報伝達の仕組みを解明し、その制御機構をあきらかにすることは、新たな医薬の開発あるいは治療法の開発につながる可能性があり、きわめて重要な意義を有している。最近サイトカインの情報伝達機構も次第に明らかにされつつある。ほとんどのサイトカイン受容体（Cytokine receptor）は、２個又は３個のポリペプチド鎖、すなわち、リガンド特異的受容体鎖及び種々のサイトカインで共通に使用されるシグナル伝達体より構成されている［FASEB J. 6, 3387-3396（1992）；Cell 69, 1121-1132（1992）］。これらの受容体系の性質は、サイトカインの機能的重複性を説明するものである。例えば、竹田氏ら（Molecular Medicine vol.33臨時増刊号、免疫1996〜97、ii）によると、サイトカイン受容体の細胞質内の部分には、チロシンのリン酸化活性を有するＪＡＫキナーゼ（Janus kinase）が結合している。そして、リガンドであるサイトカインの結合によって受容体は複合体を形成し、それに伴ってＪＡＫキナーゼが接近し、ＪＡＫキナーゼが活性化される。その結果、接近した２個のＪＡＫキナーゼ自体及びサイトカイン受容体がリン酸化される。
このような状態になると細胞内のＳＴＡＴ（Signal transducer and activator of transcription）タンパク質が受容体に結合し、細胞膜のサイトカインからの情報を細胞核内の遺伝子に伝達する。ｇｐ１３０は、ＩＬ−６（interleukin-6）、ＩＬ−１１（interleukin-11）、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor）などの受容体を構成するタンパク質であり、サイトカインが受容体に結合すると、ＪＡＫキナーゼが活性化され、ｇｐ１３０がリン酸化されることが知られている。ＳＴＡＴはリン酸化されたｇｐ１３０に結合し、その結果、シグナル伝達が起る。
ＳＴＡＴタンパク質は最近見出されたタンパク質で、現在ＳＴＡＴ１からＳＴＡＴ６まで６種類のタンパク質が知られている。ＳＴＡＴタンパク質から細胞核内遺伝子への情報伝達は、前記のようなリガンド、即ちサイトカインの受容体への結合によってＪＡＫキナーゼが活性化され、ＳＴＡＴタンパク質のチロシン残基のリン酸化が起り、リン酸化されたＳＴＡＴタンパク質は同一または異なった種類のＳＴＡＴタンパク質とホモダイマーあるいはヘテロダイマーを形成し、サイトカインの情報を細胞核内の遺伝子に伝達するようになる。このようにしてＳＴＡＴが活性化され、標的遺伝子まで移動すると遺伝子の特定の場所に結合し、ＲＮＡの合成が開始され、それに伴って新たなタンパク質が生合成される。
リガンドを結合した受容体成分のホモ又はヘテロ２量体（リガンド-受容体複合体、即ち、リガンドの結合した受容体によって形成された複合体）の形成は、サイトカインによって開始されるユニークなカスケード［Cell 80, 213-223（1995）］であるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化［Science 264, 1415-1421（1994）；Nature 377, 591-594（1995）；Cell 84, 331-334（1996）］を誘導し、続いて標的遺伝子の活性化を誘導する。しかし、ＳＴＡＴファミリーのタンパク質によって直接その発現が誘導されるターゲットについては、ほとんど知られていない。サイトカインの特徴のひとつは、その活性の一時的な短時間の発現であって、このことはサイトカインシグナル伝達にネガティブフィードバック制御（negative feedback regulation）が存在することを示唆している。サイトカインシグナル伝達のネガティブフィードバック制御としては次の数例がいままでに知られているにすぎない：
（ｉ）チロシンリン酸化ＩＬ−３受容体β鎖及びエリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）と結合するチロシンホスファターゼ（ＳＨＰ−１）［Cell 85, 15（1996）；Mol.Cell. Biol. 13, 7577-7586（1993）；Cell 80, 729-738（1995）］及び
（ii）ＥＰＯ−ＲのＳＴＡＴ５結合サイトに結合するＣＩＳ［EMBO J. 14, 2816-2826（1995）；同誌15, 2425-2433（1996）］。
このようにＳＴＡＴの標的遺伝子及びサイトカインのシグナルをネガティブに制御するフィードバック機構にはいまだ不明な点が多い。
従って、本発明者らは、このようにＳＴＡＴのシグナルを制御している新規な遺伝子のタンパク質を単離し、サイトカインシグナルをネガティヴに制御する新規なフィードバック機構を解明しようと試みた。
即ち、本発明の課題は、ＳＴＡＴのシグナルを制御している新規なタンパク質を見出し、これを医療の分野で利用する方法を提供することにある。さらに本発明の課題は、ＳＴＡＴの標的遺伝子、即ち、ＳＴＡＴにより発現が誘導される遺伝子の発現により生合成され、ＳＴＡＴ機能を抑制するタンパク質を提供し、これを医療の分野で利用する方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、このような課題を解決するために、ＳＴＡＴのシグナルを規制している遺伝子の単離及びその機能解析を試みた。すなわち、従来知られている、ＳＴＡＴ１〜６間のシグナル伝達に重要な領域であるＳＨ２（src homology-2）領域内で高度に保存されているアミノ酸配列ＧＴＦＬＬＲＦＳ（三文字略記ではGly-Thr-Phe-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser）（この部位は、ＳＨ２領域のリン酸化チロシン認識部位である）に対するモノクローナル抗体を作製し、マウス胸腺（murinethymus）ｃＤＮＡライブラリーの３００万プラークのファージクローンをスクリーニングしたところ、従来知られているＳＴＡＴ３等の遺伝子を除いて約２０種の未知の遺伝子を得た。
このうち５種の遺伝子の全長塩基配列を決定したところ、２種のＳＨ２領域を有する遺伝子を得た。このうち１種の遺伝子の発現するタンパク質は、後に公知のＣＩＳタンパク質（Cytokine inducible SH2-containing Protein：サイトカインによって誘導されるSH2含有タンパク質）であることが判明した。他の１種の遺伝子が発現するタンパク質は、２１２個のアミノ酸よりなり、Ｃ末側にＳＨ２領域、Ｎ末側にセリンが８個並ぶ領域を持ったタンパク質だった。その後の研究から、このタンパク質は通常、ｇｐ１３０を介する刺激により誘導されるが、特にチロシンリン酸化を受けないドミナントネガティブ型ＳＴＡＴ３（アミノ酸配列において７０５番のチロシンをフェニールアラニンに置換したＳＴＡＴ３遺伝子）を形質導入した細胞においては、上記の新規遺伝子の発現は誘導されないことがノーザンブロッティング（nothern blotting）で確認された。そして、この遺伝子に基づくアミノ酸配列を解析したところ、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有することが判明した。本発明者らは、この遺伝子のコードするタンパク質をＳＩＩＳ−１（“STAT-induced inhibitor of STAT-function-1”の略）と命名した。更に、因子依存性の細胞系を用いた解析からＳＩＩＳ−１はＳＴＡＴ６でも誘導されることが明らかとなり、抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体によるイムノブロットを行った結果、ｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を阻害する性質を有することが判明した。
即ち、本発明の主な目的は、以下のタンパク質を提供することにある。哺乳類のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達等におけるＳＴＡＴタンパク質の機能を抑制するタンパク質であって、実質的に純粋であり、且つ次の特徴を有するタンパク質。
（１）ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ６によって誘導される。
（２）ｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を阻害する。
（３）ＳＨ２領域を有する。
また、本発明は、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、特に配列表配列番号１で示される塩基配列をもつＤＮＡを提供することにある。
又、本発明の他の１つの目的は、これらのタンパク質にサンプル物質を添加し、ＳＩＩＳ−１タンパク質の活成化又は活成阻害作用によって或る物質の医薬あるいは診断薬としての有用性をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明の更に他の１つの目的は、これらのタンパク質の発現を抑制するアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質に対するモノクローナル抗体、あるいは上記のＤＮＡにハイブリダイブしうるＤＮＡ及びＲＮＡプローブを提供することにある。
本発明の更に他の１つの目的は、ＳＩＩＳ−１をコードする遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡ及びそのＤＮＡによる形質導入体を提供することにある。
本発明の更に他の１つの目的は、形質導入体を用いたスクリーニング方法を提供することにある。
本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴並びに諸利益は、添付の配列表及び図面を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、本願発明である新規なＳＴＡＴ機能抑制タンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡ塩基配列である。
【図面の簡単な説明】
図面において：
図１は、ＳＩＩＳ−１  ｃＤＮＡのヌクレオチド及びそれから推定されるアミノ酸配列であり、図中、＊は停止コドン、アンダーラインはＳＨ２領域のアミノ酸配列を示し；
図２は、ＳＩＩＳ−１，ＣＩＳ，ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ６のＳＨ２領域の配列を示し，図中、＊はＣＩＳとＳＩＩＳ−１で同一のアミノ酸配列、アンダーラインはリン酸化チロシン認識部位を示し；
図３は、マウスの種々の組織におけるＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡの発現の状態を示し、図中、Ｈは心臓、Ｂは脳、Ｓは脾臓、Ｌｕは肺、Ｌは肝臓、Ｓｍは骨格筋、Ｋは腎臓、Ｔｅは精巣を示し；
図４は、因子依存性細胞におけるＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡの誘導の状態を示し；
図５は、野生型ＳＴＡＴ３又はドミナントネガティブ型ＳＴＡＴ３を形質導入したＭ１細胞中におけるＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡの発現の状態を示し；
図６は、野生型及び変異型ＳＩＩＳ−１遺伝子で形質導入したＭ１形質導入株のＬＩＦによる誘導後の生存率を示し；
図７は、野生型及び変異型ＳＩＩＳ−１遺伝子で形質導入したＭ１形質導入株のＬＩＦによる誘導後１日目の［3Ｈ］チミジン取り込み量を示し；
図８（ａ）は、母Ｍ１細胞のＬＩＦによる誘導後３日のメイ−グルンワルド−ギムサ染色結果を示し、
図８（ｂ）は、Ｍ１−ＮＥＯ細胞のＬＩＦによる誘導後３日のメイン−グルンワルド−ギムサ染色結果を示し；
図８（ｃ）は、変異型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）遺伝子で形質導入したＭ１形質導入株のＬＩＦによる誘導後３日のメイ−グルンワルド−ギムサ染色結果を示し；
図８（ｄ）は、野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）遺伝子で形質導入したＭ１形質導入株のＬＩＦによる誘導後３日のメイ−グルンワルド−ギムサ染色結果を示し；
図９は、野生型及び変異型ＳＩＩＳ−１遺伝子で形質導入したＭ１形質導入株のｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のＩＬ−６誘導によって起るチロシンリン酸化の状態を示す。
発明の詳細な説明
本発明によれば、ＳＴＡＴタンパク質の機能を抑制する新規なタンパク質及びそのアミノ酸をコードする遺伝子ＤＮＡが提供される。
次に、本発明の理解を容易にするために、本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．哺乳類のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達系におけるＳＴＡＴタンパク質の機能を抑制するタンパク質であって、実質的に純粋であり且つ次の特徴を有するタンパク質。
（１）ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ６により誘導される。
（２）ｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を阻害する。
（３）ＳＨ２領域を有する。
２．該タンパク質が、配列番号１の２１２個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列と少なくとも４０％の相同性を有するアミノ酸配列の少なくとも１５０個の連続したアミノ酸からなる配列を包含することを特徴とする前項１に記載のタンパク質。
３．該タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する前項２に記載のタンパク質。
４．前項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
５．該ＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する前項４に記載のＤＮＡ。
６．サイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングする方法にして、サンプル材料を前項１〜３のいずれかに記載のタンパク質に接触させ、サンプル試料中に含まれる物質による該タンパク質の活性化又は活性阻害を指標として、サイトカインレギュレーター作用を有する物質を検出することを特徴とするスクリーニング方法。
７．前項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の生合成を抑制するアンチセンスＤＮＡ。
８．前項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の生合成を抑制するアンチセンスＲＮＡ。
９．前項１〜３のいずれかに記載のタンパク質に結合しうるモノクローナル抗体。
１０．前項４又は５に記載のＤＮＡにハイブリダイズしうるプローブＤＮＡ。
１１．前項４又は５に記載のＤＮＡにハイブリダイズしうるプローブＲＮＡ。
１２．前項４又は５に記載のＤＮＡを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体ＤＮＡ。
１３．前項１２に記載の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質導入された微生物又は細胞。
１４．サイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングする方法にして、サンプル材料を前項１３に記載の形質導入された微生物又は細胞に接触させ、サンプル試料中に含まれる物質による、上記形質導入された微生物又は細胞中の該組み換え体ＤＮＡがコードするタンパク質の活性化又は活性阻害を指標として、サイトカインレギュレーター作用を有する物質を検出することを特徴とするスクリーニング方法。
以下、本発明について具体的に説明する。
尚、本発明において、ＤＮＡ塩基配列中のＡはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。
また、本発明において、アミノ酸配列中のＡはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシン、Ｖはバリンである。
本発明者らは、ＳＨ２領域を含有し、ＳＴＡＴ３によって誘導することができ、ＳＴＡＴ３の機能を阻害するタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。本発明者らは、ＳＴＡＴファミリーの新規メンバーをクローニングする目的でＳＴＡＴ３の有するリン酸化チロシン認識サイトであるＳＨ２領域の一部アミノ酸配列であるＧＴＦＬＬＲＦＳ［Science 267, 1347-1349（1995）］に対するモノクローナル抗体を調製した。そして、この抗体を用いてマウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、２０個の未知の遺伝子を単離した。このうち２個はＳＨ２領域を含んでいた。このうちの１個は公知のＣＩＳ［EMBO J. 14, 2816-2826（1995）］と同定され、他の１個が新規な遺伝子であることが判明した。そして、本発明者らは、この遺伝子のコードするタンパク質をＳＩＩＳ−１と命名した。
ＳＩＩＳ−１のｃＤＮＡは、２１２個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするシングルオープンリーディングフレームを持ち、その配列の中間（コドン79-167番）にＳＨ２領域を含有している。ＳＩＩＳ−１中には、ＳＨ３領域のような他のコンセンサスモチーフは見出されなかった（図１参照、図中、＊は停止コドン、アンダーラインはＳＨ２領域のアミノ酸配列を示す）。このＳＩＩＳ−１のＳＨ２領域は、ＣＩＳのそれとわずかな相同性（アミノ酸の相同性が３６％）を示したが、ＳＨ２領域内のリン酸化チロシン認識部位［Cell 77, 63-71（1994）；Science 264, 95-98（1994）；Science 265, 1701-1706（1994）］を除くと、ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ６のアミノ酸配列との有意な相同性は見出されなかった（図２参照、図中、＊はＣＩＳとＳＩＩＳ−１で同一のアミノ酸配列、アンダーラインはリン酸化チロシン認識部位を示す）。
本発明者らはマウスの種々の組織におけるＳＩＩＳ−１遺伝子の発現を検討した。その結果、図３から明らかなように、ＳＩＩＳ−１のｍＲＮＡは、偏在的に発現するが、肺、脾臓及び精巣で強く、他の組織で弱いことが判明した。
又、本発明者らは、いくつかの因子依存性の細胞系においてＳＩＩＳ−１の誘導の可能性について検討した。
ハイブリドーマＭＨ６０細胞（myeloma MH60 cell）及びミエロイド ロイケミアＭ１細胞（murine myeloid leukemia Ｍ１ cells；以下、屡々“Ｍ１”と略す）においては、いずれもＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）で処理することによりＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡが発現した（図４参照）。又、ＩＬ−４依存性細胞（ＣＴ４Ｓ細胞）［J. Immunol. 142, 800-807（1989）］及びＣ−ＣＳＦ（granulocyte colony-stimulating factor）依存性細胞（ＮＦＳ６０細胞）は、それぞれＩＬ−４又はＧ−ＣＳＦに応答してＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡを発現した。この結果から、ＳＩＩＳ−１は、ＳＴＡＴ３を活性化するＩＬ−６及びＧ−ＣＳＦ［Blood 84, 1760-1764（1994）］のみによって誘導されるばかりではなく、ＳＴＡＴ６を活性化するサイトカインのＩＬ−４［Science 265, 1701-1706（1994）］によっても誘導されることが判明した。これらの知見と一致して、ＳＩＩＳ−１遺伝子のプロモーター領域は、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ６結合部位［Cell 77, 63-71（1994）, EMBO J.14, 2527-2535（1995）］を含んでいることが本発明者らによって見出されている。
更に、本発明者らは、野生型ＳＴＡＴ３を形質導入したＭ１細胞（以下、屡々、「Ｍ１−ＳＴＡＴ３」と略す）及びＹ７０５Ｆ［ＪＡＫキナーゼによってリン酸化されるチロシン残基（７０５番）がフェニルアラニンで置換されたＳＴＡＴ３のドミナントネガティブ（dominant negative）型の遺伝子（即ち、野生型に対して優性に存在する不活性型変異）］を形質導入したＭ１細胞（以下、屡々、「Ｍ１−Ｙ７０５Ｆ」と略す）におけるＳＩＩＳ−１の誘導について検討した。
この試験において、ネオマイシン耐性遺伝子のみを含む誘導Ｍ１細胞（以下、屡々、「Ｍ１−Ｎｅｏ」と略す）が対照として用いられた。ＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡは対照のＭ１−Ｎｅｏ細胞よりもＭ１−ＳＴＡＴ３細胞でＬＩＦによってより強く誘導されたが、Ｍ１−Ｙ７０５Ｆ細胞ではＳＩＩＳ−１の誘導は観察されなかった（図５を参照）。この結果は、ＳＩＩＳ−１の遺伝子は、ＳＴＡＴ３の標的遺伝子のひとつであり、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路によって誘導されることを示している。
次に、本発明者らは、ｇｐ１３０によって伝達されるシグナルの経路に及ぼすＳＩＩＳ−１の影響を検討した。野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋），又はＳＨ２領域及びＣ−末端領域を欠く変異型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）を常に発現するＭ１形質導入株（クローン）を確立した。図６に示すように、Ｍ１−Ｎｅｏ及び変異型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）クローンは、母細胞のＭ１細胞で実証されているように、ＬＩＦ処理によって成長の停止及び細胞死に至り、クロマチンの凝縮及びapoptotic bodiesの発現のようなアポトーシスの特徴を示した（図８（ａ）〜（ｃ）参照）。反対に、野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）クローンは、ＬＩＦで刺激しても成長の停止を示さなかった（図６、７、８（ｄ）参照）。これらの結果は、ＳＩＩＳ−１がｇｐ１３０で伝達されるシグナルの経路をブロックすること、及びＳＩＩＳ−１のＳＨ２領域がこのブロック遮断に必須であることを示すものであった。
更に、本発明者らは、ＳＩＩＳ−１が、ｇｐ１３０で伝達されるシグナルの経路を阻害するメカニズムについて検討した。即ち、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒで各細胞を刺激後［Science 267, 1349-1353（1995）；Blood 86, 1243-1254（1995）］，各細胞のｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を調べた。図９に示すようにｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化は、コントロールのＭ１−Ｎｅｏ細胞及び変異型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）クローンと比較して野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）クローンでは激減した。
上記実験結果から、本発明において、本発明者らが単離精製及びクローニングに成功したタンパク質は、ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ６で誘導され、ｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を阻害するＳＨ２領域含有タンパク質ＳＩＩＳ−１であることが明らかとなった。
ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル経路のネガティブフィードバック制御に関与していることが知られているＣＩＳ［EMBO J. 14, 2816-2826（1995）、同誌15, 2425-2433（1996）］は、ＥＰＯ受容体のＳＴＡＴ５結合領域と直接結合してＳＴＡＴ５機能を阻害する。しかし、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路におけるＳＩＩＳ−１による阻害メカニズムは、ＣＩＳと全く相違する。ＳＩＩＳ−１は、ＳＴＡＴ３及びシグナルを伝達する受容体成分のｇｐ１３０のチロシンリン酸化を減少させる。
ｇｐ１３０のチロシンリン酸化は、ＳＴＡＴ３結合領域でのＳＩＩＳ−１との結合のために必要であると考えられるので、ＳＩＩＳ−１が、ｇｐ１３０との結合においてＳＴＡＴ３と拮抗すると考えることは不適切である。ＳＩＩＳ−１は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル経路をＣＩＳよりも早い段階、即ち、ＪＡＫキナーゼとの結合を経てブロックすると考えられる。
その他の興味ある点は、ＳＩＩＳ−１は、全てのＳＴＡＴによって誘導されるのではないということであり、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の一般的阻害剤とは区別される。
本発明のＳＩＩＳ−１ｃＤＮＡは種々の細胞を用いて調整することができるが、市販の動物細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いることが好ましい。又、ＤＮＡの精製方法としては、ＳＨ２領域における保存性の高いアミノ酸配列（ＧＴＦＬＬＲＦＳ）に対するモノクローナル抗体を従来の方法で作成し、市販の免疫スクリーニングキットに準じて行なうのが好ましい。
本発明のタンパク質は、実質的に純粋であり、且つ上記のＳＩＩＳ−１としての機能を有するタンパク質であれば特に限定されず、配列番号１に記載のアミノ酸配列のみならず、配列番号１のアミノ酸配列の部分配列又は配列番号１のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を含有する配列である。本発明における部分配列とは連続した少なくとも１５０個のアミノ酸からなるものであり、ＳＨ２領域を含むことが必須である。更にこの配列は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％の相同性を有するものである。本発明における相同性を有する配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と少くとも４０％の相同性を有し、且つ、ＳＩＩＳ−１と同様に哺乳類のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達系におけるＳＴＡＴ機能を抑制する活性を有するものである。このような相同性を有する配列は、アミノ酸の置換、削除又は挿入によって得られ、上記の変化は、自然又は人為的な突然変異によって生じることがある。
本発明のタンパク質の特徴の１つは、ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ６で誘導されることである。この特徴は得られたタンパク質からも確認することが可能である。或るタンパク質のアミノ酸配列が既知なら、その遺伝子配列はデータベースから検索できる。アミノ酸配列が未知ならば、タンパク質からアミノ酸配列を決定し、その配列情報から遺伝子をクローニングしてタンパク質のｍＲＮＡを特異的に検出するプローブをデザインすることは可能である。或るタンパク質のｍＲＮＡがＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ６で誘導されたかどうかは、例えば実施例４のようなノーザンブロッティングによって確認することができる。ＳＴＡＴ３を形質導入したＭ１細胞でそのｍＲＮＡが誘導され、ＳＴＡＴ３のドミナントネガティブを形質導入したＭ１細胞で誘導されなければ、そのタンパク質はＳＴＡＴ３で誘導されたものと結論することができる。
本発明のＤＮＡは、上記のＳＩＩＳ−１としての機能を有するタンパク質をコードする塩基配列であれば特に限定されず、配列番号１に記載の塩基配列のみならず、配列番号１のアミノ酸配列と少くとも４０％の相同性を有する配列番号１のアミノ酸配列の部分配列を包含する配列をコードする塩基配列をも含むものである。ＳＩＩＳ−１としての機能を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、配列番号１の塩基配列の部分配列及び部分配列を含有する塩基配列も本願発明に含まれる。
本発明は、前述したＳＩＩＳ−１タンパク質を用いた、新規なサイトカインレギュレーター作用を有する物質のスクリーニング方法である。このスクリーニング方法によれば、新規なサイトカインレギュレーター作用、即ち、ＳＩＩＳ−１作用の阻害もしくはＳＩＩＳ−１様作用又はＳＩＩＳ−１活性作用を有する新薬のスクリーニングが可能となると考えられる。
本発現のタンパク質を用いたサイトカインレギュレーター作用を有する物質のスクリーニング方法としては、特に限定されないが、例えば、タンパク質を用いて測定のための系を構築し、スクリーニングを行うことができる。具体的には、ＳＩＩＳ−１によって活成が阻害される物質等をスクリーニングすることが可能である。
ＳＩＩＳ−１阻害作用、もしくはＳＩＩＳ−１様作用又はＳＩＩＳ−１活性化作用を有する物質のスクリーニングに使うことができるサンプル物質は、細胞毒性を持つ物質以外であれば特に限定されない。例えば、高分子であっても、経口投与可能な低分子化合物であってもスクリーニングに用いることができる。例えば、スクリーニングによって得られた低分子の経口投与可能な化合物は、ＳＩＩＳ−１作用阻害剤もしくはＳＩＩＳ−１様作用又はＳＩＩＳ−１活性化作用を有する新規薬剤として用いることができる。
また、本発明はＳＴＡＴ機能抑制タンパク質の生合成を抑制するアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡである。本発明のＳＩＩＳ−１をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、Ｇ−ＣＳＦ（先天性・特発性好中球減少症や骨髄移植時やガン化学療法による好中球減少症の治療に用いられる）やＩＬ−６（血小板減少症やガン化学療法による血小板減少症の治療薬として開発中）と同様に、内因性あるいは投与サイトカインの作用増強薬として使用可能である。
本発明のＳＩＩＳ−１をコードするＤＮＡの塩基配列をもとに、ＳＩＩＳ−１に特異的なアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを設計することは容易であり、更に、野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）を利用すれば、そのアンチセンスの効果を確認することが可能である。具体的には、ＬＩＦ存在下で培養した野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）をトランスフェクトした細胞にアンチセンスを作用させた場合、細胞の増殖阻害、ＤＮＡ合成阻害、アポトーシスが見られ、且つ、抗ＳＩＩＳ−１抗体を用いた通常のウェスタンブロット法などでＳＩＩＳ−１タンパク質の発現阻害が観察されれば、アンチセンスの有効性を証明することができる。
更に、本発明はＳＴＡＴ機能抑制タンパク質に対するモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は診断目的に使用することができる。
本発明のモノクローナル抗体を取得する方法は特に限定されないが、単離されたＳＩＩＳ−１タンパク質を用いて、従来から用いられているモノクローナル抗体の製造方法、例えば細胞融合法に基づき取得することができる。抗体の製造に用いられるアミノ酸配列は特に限定されないが、６アミノ酸残基以上のものが用いられる。このような抗体を用いれば、細胞や組織中のＳＩＩＳ−１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡやＲＩＡ、またはウェスタンブロット系を構築することができる。このような検出系は、診断目的に使用することができる。
本発明はＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡ特異的なプローブＤＮＡ及びＲＮＡに関する。ＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡ特異的なプローブを用いて細胞や組織のＳＩＩＳ−１発現を検出することが可能なので、本発明のプローブを用いて診断的アッセイを行なうことができる。プローブとして用いられるＤＮＡは本発明のＳＩＩＳ−１の塩基配列をもとに、周知の塩基対の法則（ＡとＴが対になり、ＣとＧが対になる）によって設計することが容易であり、従って、本発明のプローブは本発明のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能な塩基配列であれば特に限定されない。具体的には配列番号１に開示されたＳＩＩＳ−１をコードする全長ｃＤＮＡ又はその部分配列を用いることができる。プローブを用いた診断的アッセイの方法としては、実施例に記載されているようなハイブリダイゼイション法、例えば、ノーザンハイブリダイゼイションなどの方法が用いられる。
本発明における組換え体ＤＮＡを調製するために用いられる発現ベクターは特に限定されないが、通常用いられる発現ベクターを利用することができる。本発明の組換え体ＤＮＡの具体的な例としてｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）が挙げられる。ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）は、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳのクローニング部位にＳＩＩＳ−１遺伝子を挿入したものである。ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）は本発明のＳＩＩＳ−１遺伝子を原料に、実施例１にに示した方法により構築することができる。具体的には、ＳＩＩＳ−１  ｃＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＰｖｕＩＩで消化後、ブラントエンド化し、ベクターｐＥＦ−ＢＯＳのブラントエンド化したＸｂａＩサイトに挿入することにより構築することができる。又、本発明の組換え体ＤＮＡは公知の宿主に導入することが好ましい。
本発明に用いられる宿主細胞としての微生物又は細胞は特に限定されないが、本発明の組換え体ＤＮＡが発現し、ＳＩＩＳ−１の生合成が可能な宿主細胞が用いられる。例えば、上記したｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）をＭ１細胞にエレクトロポレーション法で形質導入することができる。本発明の形質導入された細胞は、上記の新規なサイトカインレギュレーター作用を有する物質のスクリーニングに用いることができる。又、形質導入した本発明の組換え体ＤＮＡを細胞によって発現させ、生合成されたタンパク質を抽出し、上記の新規なサイトカインレギュレーター作用を有する物質のスクリーニング又は本発明のタンパク質に結合しうるモノクローナル抗体を製造する際に用いることが可能である。
本発明は、ＳＩＩＳ−１をコードするＤＮＡにより形質導入された微生物又は細胞を用いた、新規なサイトカインレギュレーター作用を有する物質のスクリーニング方法である。このスクリーニング方法によっても、上記のタンパク質を用いたスクリーニング方法と同様に新規なサイトカインレギュレーター作用、即ち、ＳＩＩＳ−１作用の阻害もしくはＳＩＩＳ−１様作用又はＳＩＩＳ−１活性作用を有する新薬のスクリーニングが可能となると考えられる。
本発明の形質導入体を用いたサイトカインレギュレーター作用を有する物質のスクリーニング方法としては、特に限定されないが、例えば、ＳＩＩＳ−１を形質導入した培養細胞に種々の物質を添加し、細胞死などの変化を観察することによりサイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングする方法が挙げられる。具体的には、野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）クローンをＬＩＦ存在下で培養し、種々の物質を投与した時、細胞の死滅が観察され、染色後の細胞の顕微鏡下の観察によりクロマチンの凝縮等のアポトーシスが見られた場合は、ＳＩＩＳ−１作用を阻害する化合物の発見を意味する。又、ＬＩＦ存在下で培養しているＭ１細胞又はＭ１−Ｎｅｏ細胞の細胞死滅を延期または阻害する物質は、ＳＩＩＳ−１様作用又はＳＩＩＳ−１活性化作用を有する物質と考えられるので、上記の培養細胞も新薬のスクリーニングに使用することができる。更に、ＳＩＩＳ−１を形質導入した培養細胞を種々の物質の存在下で培養し、その後、抗ｇｐ１３０又は抗ＳＴＡＴ３抗体と共にウェスタンブロット法を用い、サイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングする方法も挙げられる。具体的には、ＩＬ−６などで刺激後、ＳＩＩＳ−１をクローニングした培養細胞を種々の物質の存在下で培養し、その細胞の抽出物を抗ｇｐ１３０又は抗ＳＴＡＴ３抗体と反応させて免疫沈降物を得、その後、抗リン酸チロシンモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なう。ｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化の促進はＳＩＩＳ−１の阻害を意味し、このような作用を有する物質のスクリーニングに使用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、参考例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの参考例及び実施例によって何ら限定されるものではない。
参考例１  細胞培養
細胞培養は、以下の方法及びこの方法に準じて行なわれた。
ミエロイドロイケミアＭ１細胞（Myeloid leukemia M1 cells）はイーグル最小基本培地（Eagle's minimal essential medium）に、通常用いられる濃度の２倍のアミノ酸及びビタミンならびに１０％（ｖ／ｖ）子牛血清（ＦＣＳ）を補給した培地で培養した。
ＩＬ−６依存性ミエローマＭＨ６０細胞はＩＬ−６（５ｎｇ／ｍｌ）と１０％ＦＣＳを補給したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
ＩＬ−２／ＩＬ−４依存性ＣＴ４Ｓ細胞はＩＬ−４（１０Ｕ／ｍｌ）と１０％ＦＣＳを補給したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
ＩＬ−３依存性ミエロイドＮＦＳ６０細胞は１０％ＦＣＳとＩＬ−３源としてＷＥＨＩ−３Ｂ（マウスのmyelomonocyte）を培養した１０％コンディション培地を補給したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
ＳＴＡＴ３のドミナントネガティブ型を常に発現するＭ１セルライン［Ｍ１−Ｙ７０５Ｆ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3963-3966（1996）］は、２５０μｇ／ｍｌ  Geneticin（米国、GIBCO BRL社製）の存在下で通常のＭ１細胞と同様に培養した。
実施例１
本発明の新規タンパク質ＳＩＩＳ−１の調製方法
（１）ＳＴＡＴのＳＨ２領域に対するモノクローナル抗体の精製
ＳＴＡＴのＳＨ２領域に存在するＳＴＡＴファミリーメンバー間で高度に保存されているアミノ酸配列ＧＴＦＬＬＲＦＳ（３文字略記ではGly-Thr-Phe-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser）に対するモノクローナル抗体を合成した。即ち、ＳＴＡＴ３のＳＨ２領域のアミノ酸６００番から６１７番に相当する合成オリゴペプチドＴＫＰＰＧＴＦＬＬＲＦＳＥＳＳＫＥＧ（３文字略記ではThr-Lys-Pro-Pro-Gly-Thr-Phe-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Glu-Ser-Ser-Lys-Glu-Gly）をキーホールリムペット ヘモシアニンに結合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。このマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8-653を融合して合成オリゴペプチドＧＴＦＬＬＲＦＳ（ＦｍｏｃでＮ末端を保護したもの）に反応性のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＦＬ−２３８を確立した。ハイブリドーマを用いて得られたモノクローナル抗体をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
（２）ＳＩＩＳ−１ｃＤＮＡの単離
上記（１）で精製したＧＴＦＬＬＲＦＳのモチーフに対するモノクローナル抗体を用い、ＳＴＡＴのＳＨ２領域を有するｃＤＮＡをPicoBlue免疫スクリーニングキット（米国、Stratagene Cloning Systems社製）を用いてマウス胸腺ｃＤＮＡライブラリー（LambdaZAP，米国、Stratagene Cloning Systems社製）から単離した。具体的には、マウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーである３００万プラークのファージ遺伝子を免疫スクリーニングキットの方法に従ってスクリーニングし、従来より知られているＳＴＡＴ３等の遺伝子を除いて約２０種の未知の遺伝子を得た。
このうち、５種の遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。このうち、２種の遺伝子がＳＨ２領域を有していた。この１種は公知のＣＩＳタンパク質をコードする遺伝子であり、他の１種は２１２個のアミノ酸からなり、Ｃ末端側にＳＨ領域、Ｎ末端側のセリンが８個並んだ領域をもった新規タンパク質をコードする遺伝子であった。そして、これをＳＩＩＳ−１（“STAT-induced inhibitor of STAT function-1”の略）と命名した。
（３）ＳＩＩＳ−１発現ベクターの構築
上記（２）で単離したＳＩＩＳ−１  ｃＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＰｖｕＩＩで消化し、得られた制限酵素断片をブラントエンド化し、哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳのブラントエンド化したＸｂａＩサイトに挿入した。以下、構築したＳＩＩＳ−１発現ベクターをｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）とする。
ＳＨ２領域を欠損した変異型ＳＩＩＳ−１を構築するために、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）を制限酵素ＢｓｓＨＩＩで消化し、生じた３６０ｂｐの断片を除去した。得られたＳＨ２領域及びＣ末端の領域を欠損したＳＩＩＳ−１発現ベクター（即ち、ＳＩＩＳ−１変異ベクター）を、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）とした。
上記で構築したＰＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）又はｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）のいずれか一方の発現ベクターとネオマイシン耐性遺伝子をコードするｐＳＶ２ Ｎｅｏとを２０：１の比率で混ぜ、Ｍ１細胞にエレクトロポレーション法で形質導入した。ネオマイシン耐性を指標とし、形質導入体（クローン）をGeneticin（米国、GIBCO BRL社製）７５０μｇ／ｍｌを含む成長培地中で選択した。
実施例２
マウスの種々の組織におけるＳＩＩＳ−１の発現
放射線標識した全長ＳＩＩＳ−１ｃＤＮＡをプローブとして用い、マウスＮＴＮブロット膜（米国、CLONTECH社製）とハイブリダイゼイションを行った。尚、対照として市販のβ−アクチンのプローブを用いた。結果を図３に示す。図中、Ｈは心臓、Ｂは脳、Ｓは脾臓、Ｌｕは肺、Ｌは肝臓、Ｓｍは骨格筋、Ｋは腎臓、Ｔｅは精巣を示す。
その結果、ＳＩＩＳ−１のｍＲＮＡは、偏在的に発現するが、肺、脾臓及び精巣で強く、他の組織で弱いことが判明した。
実施例３
因子依存性の細胞系におけるＳＩＩＳ−１の誘導の可能性の検討
ＭＨ６０細胞とＭ１細胞はそれぞれＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）及びｓＩＬ−６Ｒ（５ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。ＩＬ−４依存性のＣＴ４Ｓ細胞はＩＬ−４（１０Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ依存性のＮＦＳ６０細胞はＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）でそれぞれ刺激された。
Ｍ１細胞を除くその他の細胞は、１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４時間培養して培地中の因子を除去し、その後、各サイトカインを加えた培地で図に示された時間（分）培養することにより刺激した。Ｍ１細胞は参考例１に記載の方法で培養後、サイトカインを加えた培地で図に示された時間（分）培養することにより刺激した。
サイトカインにより刺激された細胞から、Ｉｓｏ−Ｇｅｎ（日本国、Nippon Gene社製）を用いて細胞質ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ（５μｇ／ｍｌ）をアガロースゲル電気泳動し、ナイロン膜（Hybond+、英国、Amerasham社製）に移した。この膜を放射性標識したＳＩＩＳ−１プローブ並びに市販のβ−アクチンプローブ及びｃ−ｍｙｃプローブを用いてそれぞれハイブリダイゼイションを行なった。その結果を図４に示した。
図４に示すように、ＭＨ６０細胞及びＭ１細胞はいずれも、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒによる処理後６０〜１２０分の間にＳＩＩＳ−１のｍＲＮＡの発現がピークに達した。ＣＴ４Ｓ細胞及びＮＦＳ６０細胞は、それぞれＩＬ−４及びＧ−ＣＳＦに応答してＳＩＩＳ−１のｍＲＮＡを発現した。この結果から、ＳＩＩＳ−１は、ＳＴＡＴ３を活性化するＩＬ−６及びＧ−ＣＳＦのみによって誘導されるばかりではなく、ＳＴＡＴ６を活性化するサイトカインのＩＬ−４によっても誘導されることが判明した。
実施例４
野生型ＳＴＡＴ３遺伝子又はＹ７０５Ｆ遺伝子でトランスフェクトしたＭ１細胞中でのＳＩＩＳ−１の誘導についての検討
野生型ＳＴＡＴ３遺伝子ををトランスフェクトしたＭ１細胞（以下、屡々、Ｍ１−ＳＴＡＴ３と呼ぶ）、及びＳＴＡＴ３の７０５番目のＴｙｒ（Ｙ）（ＪＡＫキナーゼによってリン酸化されるチロシン残基）がポイントミューテーションによってＰｈｅ（Ｆ）に置換されたドミナントネガティブ型遺伝子をトランスフェクトしたＭ１細胞（以下、屡々、Ｍ１−Ｙ７０５Ｆと呼ぶ）を用いた。対照としてネオマイシン耐性遺伝子のみをトランスフェクトしたＭ１細胞（以下、屡々、Ｍ１−Ｎｅｏと呼ぶ）を用いた。それぞれの細胞を、図５に示す種々の期間、実施例３と同様の方法で１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦで刺激し、全ＲＮＡを抽出し、ＳＩＩＳ−１及びβ−アクチンプローブでノーザンブロッティングを行なった。その結果を図５に示した。
ＳＩＩＳ−１のｍＲＮＡは、対照のＭ１−Ｎｅｏ細胞よりもＭ１−ＳＴＡＴ３細胞でＬＩＦによってより強く誘導されたが、Ｍ１−Ｙ７０５Ｆ細胞における誘導は観察されなかった。この結果から、ＳＩＩＳ−１遺伝子は、ＳＴＡＴ３の標的遺伝子のひとつであり、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路によって誘導されることを示している。
実施例５
ｇｐ１３０によって伝達されるシグナルの経路におけるＳＩＩＳ−１の影響についての検討
実施例１に記載した方法により得られた野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）発現Ｍ１形質導入株，変異型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）発現Ｍ１形質導入株、母Ｍ１細胞及びＭ１−Ｎｅｏを用いて実験を行なった。
各細胞株をＬＩＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）含有培地に植え付け（０日目）、１日〜４日間培養した。細胞の生存率（viability）を０，１，３及び４日目に「細胞免疫実験操作法」（p.15〜16；Barbara B. Mishell et al.編、理工学社刊、1982）記載の方法に従って測定した結果を図６に示した。
各細胞の１日目の［3Ｈ］−チミジン取り込み量を「続生化学実験講座５免疫生化学法」（p.198；日本生化学会編、東京化学同人、1986）に記載の方法に従って測定し、図７に示した。
又、上記の条件で３日間培養した各細胞のメイ−グルンワルド−ギムサ（May-Grunwald-Giemsa）染色を行ない、光学顕微鏡を用いて観察した。その結果を図８に示した。
図６，７，８（ａ）〜（ｄ）において、Ｍ１は母Ｍ１細胞、ＮｅｏはＭ１−Ｎｅｏ、ＳＨ（−）はＳＨ２領域欠損変異型ＳＩＩＳ−１発現Ｍ１細胞、ＳＨ（＋）は野生型ＳＩＩＳ−１発現Ｍ１細胞を示す。
図６に示すように、Ｍ１−Ｎｅｏ及びＳＨ−は、母細胞のＭ１細胞で実証されているように、ＬＩＦ処理後成長の停止及び細胞死を引き起こした。この死滅細胞は、クロマチンの凝縮及びapoptotic bodiesの発現（図８（ａ）（ｂ）（ｃ）参照）のようなアポトーシスの特徴を示した。反対に、ＳＨ＋は、ＬＩＦで刺激しても成長の停止を示さなかった（図６、７及び８（ｄ）参照）。これらの結果は、ＳＩＩＳ−１がｇｐ１３０で伝達されるシグナルの経路をブロックすること、及びＳＩＩＳ−１のＳＨ２領域がこのブロック遮断に必須であることを示した。
実施例６
ＳＩＩＳ−１によるｇｐ１３０で伝達されるシグナルの経路の阻害メカニズムについての検討
実施例１に記載した方法により得られた野生型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ＋）発現Ｍ１形質導入株，変異型ＳＩＩＳ−１（ＳＨ−）発現Ｍ１形質導入株及びＭ１−Ｎｅｏを用いて実験を行なった。
各細胞（５×１０7細胞）をＩＬ−６（１μｇ／ｍｌ）とｓＩＬ−６Ｒ（１μｇ／ｍｌ）で５分間処理した。対照として、処理を行わない細胞（処理時間：０分）を用いた。その後、タンパク質分解酵素阻害剤を含む細胞溶解緩衝液（０．５％ Nonidet P-40，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  １ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4）に溶解した。各細胞溶解物を抗ｇｐ−１３０抗体（米国、Upstate Biotechnology社製）または抗ＳＴＡＴ３抗体と反応させ、得られた免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離した免疫沈降物を抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体（4G10，米国、Upstate Biotechnology社製）で免疫ブロットした。結合した抗体はchemiluminescence system（英国、Amersham社製）で視覚化して確認した。その結果を図９に示した。
図９において、抗ｇｐ１３０抗体で得た免疫沈降物、抗ＳＴＡＴ３抗体で得た免疫沈澱物をそれぞれ抗リン酸化チロシンモノクロナール抗体でイムノブロットした結果を示す。図９に示すようにｇｐ１３０及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化は、コントロールのＭ１−Ｎｅｏ及びＳＨ−にくらべてＳＨ＋では、激減した。
上記の実施例１〜６により明らかとなった本発明のＳＩＩＳ−１の性質と公知のＣＩＳの性質の対比を表１に示した。
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産業上の利用可能性
本発明のＳＩＩＳ−１タンパク質や形質導入体を用いると、新規なサイトカインレギュレーター作用を有する物質をスクリーニングにすることができる。また、本発明で開示されたＳＩＩＳ−１の塩基配列情報をもとに、ＳＩＩＳ−１特異的なアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡを設計することができる。サイトカインレギュレーター作用を有する物質やＳＩＩＳ−１のアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡは、薬効を持つ内因性あるいは投与サイトカインの作用増強薬として使用可能である。
本発明のＳＩＩＳ−１特異的なモノクローナル抗体を用いれば、細胞や組織中のＳＩＩＳ−１蛋白を検出するＥＬＩＳＡやＲＩＡ、またはウェスタンブロット系を構築することができる。また、ＳＩＩＳ−１  ｍＲＮＡに特異的なプローブＤＮＡおよびＲＮＡを用いて細胞や組織のＳＩＩＳ−１発現を検出することが可能である。このような検出系は、診断目的に使用され得る。
配列表
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１０８７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源：マウス胸腺
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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