(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中に再構成した時に、
６５−４００ｍＭ  グリシン、
最高５０ｍＭ  ヒスチジン、
１５−６０ｍＭ  スクロース、
最高５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
最高５ｍＭ  ＣａＣｌ2、および
５０−１５００ＩＵ  組換え第ＶＩＩＩ因子／ｍｌ
を含んで成る、安定な、アルブミン−フリーの凍結乾燥された組換え第ＶＩＩＩ因子調製物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的に医薬組成物、そして詳細にはアルブミンを含まず（アルブミン−フリー）に安定化された、rFVIIIの凍結乾燥組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
第VIII因子は、血液凝固工程に必須な、よく知られている血漿タンパク質である。第VIII因子はヒト血漿から得ることができ、そして現在も得られているが、近年、血液産物に付随する汚染の可能性を避けるために、組換え供給源（rFVIII）から第VIII因子を製造するための努力がなされた。さらに、第VIII因子の組換え供給源は、凝固因子の供給をほとんど無制限に提供し、したがって供給材料として供与された血液血漿を使用することに付随する供給の限界を回避する。
【０００３】
rFVIII生成物の利点の１つは、rFVIII生成物がヒト血漿に由来するものではなく、したがってヒトの血漿源からの汚染の可能性を回避するので、ヒトの供給原材料を全く含まないと明記できる、rFVIIIの安定な組成物を開発することが、rFVIII製造における目標であった。しかし不幸なことには、rFVIIIは変性し易いタンパク質であり、そして他の多数の治療用タンパク質のように、保存中に不安定になる。このような不安定性を克服するために、通常、安定剤としてヒト血清アルブミンを生成物に含めることが行われてきた。アルブミンはrFVIIIのよい安定剤であることが判明し、そして市販されている多数の製品に使用されている。しかしrFVIIIの安定剤としてヒト アルブミンを使用することにより、組換え生成物が第一に有する利点の１つ（すなわち、ヒトに基づく任意の供給材料を回避する）を失う。
【０００４】
最近、緩衝イオンとして塩化ナトリウム、塩化カルシウムおよびヒスチジンを使用する、低および高イオン強度の両媒質中で第VIII因子用のアルブミン−フリー組成物が記載された。さらにリシンのような塩基性アミノ酸、およびマンニトール、スクロースまたはマルトースのような糖が使用された。治療的使用に要する、必要な等張性を保持しながら、アルブミン−フリー第VIII因子組成物の安定性を達成するために、約10％の糖がそのようなアルブミン−フリー組成物に使用された。例えば、米国特許第4,877,608号明細書(低イオン強度組成物)を参照にされたい。欧州特許第0314095号明細書は、高イオン強度および緩衝剤としてヒスチジンを有する別のアルブミン−フリー組成物を開示する。
【０００５】
608件の特許が液体溶液と関係しているが、生成物を調製するために必要な凍結乾燥サイクルを行うことができなければならない凍結乾燥生成物には関係していない。欧州特許第314095号は、比較的高い塩化ナトリウム量を含み、そして主に液体組成物中で使用されている。
【０００６】
第FVIII因子組成物に関する他の特許には、米国特許第5,399,670号明細書を含み、これはアルブミン含有凍結乾燥組成物中にアルギニンの使用を記載している。また、スクロースまたはグリシンを含まない組成物を記載している国際特許出願公開第95/01804号明細書、および低温殺菌条件下（60℃、少なくとも10時間）で、FVIIIを液体状態で安定化するために、少なくとも30重量％の糖をアミノ酸と組み合わせて使用することを示す、米国特許第4,440,679号および同第4,623,717号明細書(双方ともFernandesに付与)も参照にされたい。
【０００７】
上記の第FVIII因子組成物に加えて、第VIII因子の精製および／または安定化に関連する幾つかの他の特許がある。これらには、精製第VIII因子生成物を形成するために、ヘパリン−結合カラムの使用に続いてグリシンの添加を含む多段階製造法を包含する米国特許第5,288,853号明細書が含まれる。
【０００８】
米国特許第5,399,670号明細書は、凍結乾燥前に第VIII因子溶液にアルギニンを加えることが必要な、溶解性が増大した凍結乾燥された第VIII因子調製物の調製法を包含する。
米国特許第5,259,951号明細書は、イオン交換カラムを使用して、血漿から第VIII因子の多段階精製法を包含する。
【０００９】
米国特許第4,758,657号明細書は、第VIII:C因子を血漿から分離する多段階法を包含し、この方法では少なくとも１つの工程で第VIII:C因子を、疎水的相互作用マトリックスに吸着させることが必要である。
【００１０】
上記の特許に加えて、きわめて最近、本明細書に開示するrFVIIIの組成物に類似するような、第IX（FIX）因子の組成物を記載しているものがある。L.Bushら、血友病（Hemophilia）、第２巻、補追１、第64頁（1996年6月)の要約244を参照にされたい。FIXは活性なタンパク質溶解酵素に転換されるプロ−酵素である。一方FVIIIは、血液凝固を行う他の凝固因子と一緒に、コ−ファクターとして働く。FVIIIの分子量は約340,000ダルトンであり、一方FIXは約56,000−57,000の分子量を有する。FVIIIはタンパク質溶解プロセッシングに大変感受性があり、同時に凝固活性を失う。第VIII因子は本来、FIXよりも不安定であり、そして各因子の凍結乾燥濃縮物は、種々の温度での保存に関して安定性の差異が特記された。FVIIIとは異なり、FIXは12N末端グルタミン酸残基の独特なガンマカルボキシル化を含み、これは安定性の差異に関する可能性の基礎を提供する。したがって、FIXの組成物にはFVIIIの組成物を提案する必要がないだろう。
【００１１】
ファーマシューティカル リサーチ（Pharmaceutical Research)、第12巻、第６号、第831-837頁、1995年では、以下の開示に類似する安定化された組換えヒトインターロイキン−１レセプター拮抗薬の組成物を開示する。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
成功裏に凍結乾燥され、そして後に水中で迅速に再構成され得る、安定なrFVIII調製物を開発するための過去の、そして最近の努力にもかかわらず、今日までアルブミンのようなヒト生成物の使用を回避するだけでなく、適切な凍結乾燥および迅速な再構成および等張性の必要性に見合い、同時に医薬品に許容できる使用期限を持つ長期の安定性を有するrFVIIIを提供する組成物を提供することは困難であった。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことには、出願人は今回、そのような調製物が可能であることを見いだした。この組成物を開発する過程において、出願人は従来技術で緩衝剤として教示され、そして使用されてきたヒスチジンが、実際に凍結乾燥されたアルブミン−フリーの組成物を不安定化したことを見いだした。しかし出願人は、ヒスチジンの不安定化効果が、塩、グリシンおよびスクロースの新規組成物により効果的に克服でき、その組み合わせがrFVIIIの安定化に有益な効果があることを見いだした。またこの混合物は、凍結乾燥工程中の多回の凍結解凍サイクルを通してrFVIIIも保護し、そして凍結乾燥生成物の水を用いた迅速な再構成を提供する。この組成物は、本質的に非晶質である従来のほとんどの組成物とは異なり、結晶質および非晶質成分の両方を含む。本発明の組成物は、液体状態で少なくとも24時間、室温で安定である。本組成物の詳細およびその使用を、以下に記載する。
【００１４】
改良されたrFVIII組成物は、水中で迅速に再構成でき（30秒以内)、そして血友病を処置するために適する、医薬的に許容できるアルブミン−フリーの凍結乾燥生成物である。この凍結乾燥調製物は、塩、アミノ酸およびスクロースの新規混合物を含んで成る。この生成物は室温で安定であり、そして従来の組成物とは異なり、比較的低レベルの糖を含んで成る。
【００１５】
この組成物は、水を用いて再構成した時、以下の成分を含んで成る：
0004077055.tif 000002
好適な凍結乾燥組成物では、残りの水量は約１−３重量％、好ましくは約１重量％であるべきである。
【００１６】
本発明を導いた目的は、限外濾過／ダイアフィルトレーション、凍結塊の保存、凍結−解凍効果および凍結乾燥のような種々の工程段階を通して、rFVIIIに対する安定性（最小または潜在能力の約20％未満の損失）を提供するアルブミン−フリーの組成物を確認することであった。さらに、再構成した液体状態で安定性を有する、迅速に溶解する生成物が望まれた。最後に、短い凍結−乾燥サイクルで凍結乾燥できる、適切な使用期限を持つ医薬的に許容できる凍結乾燥生成物が望まれた。
【００１７】
タンパク質は凍結乾燥中には結晶化しない。乾燥工程の目標は、結晶の（または水を全く含まない）環境により引き起こされる化学的および／または構造的不安定性からタンパク質を保護するために、タンパク質水溶液を非晶質相に転換することである。したがって、タンパク質を安定化するための非晶質相(成分)を提供するためには、有意な量のアルブミン（最高１％）を含むことが普通である。全体的な目標に基づき、迅速な凍結乾燥を可能にする結晶質成分、およびrFVIIIを安定化するための非晶質成分の両方を有する組成物が開発された。本明細書で使用するように、非晶質成分を有する結晶質という表現は、組成物は少なくとも１つが結晶質であり、そして１つが非晶質である２つ以上の明らかな相を含んで成ることを意味する。固体は結晶質または非晶質状態で存在できる。結晶質物質は、定められた構造、化学量論的組成および融点を有することが特徴である。対照的に、非晶質物質は一定の明確な分子構造を持たず、そして粘弾性“ゴム”のような極度に高い粘性を持つ超−冷却液体、またはより硬質な脆性ガラスとして記載できる。マルトース、トレハロースおよびマルトトリオースのような他の糖を、非晶質成分の一員となるために含むことができる。マンニトールを、組成物の結晶質成分の一員となるように含むことができる。
【００１８】
医薬的に許容できるアルブミン−フリーのrFVIII組成物を確認するために使用した方法は、以下の通りであった：
（ａ）出発物質は、オルトゴナルクロマトグラフィーを使用して高度に精製されたrFVIIIであった。これらは明らかな様式および原理の下で操作され、そして典型的には連続して使用されるクロマトグラフィー法と定義される。結果として、タンパク質は、異なる、より効果的な精製法の適用を通して迅速に精製されることができる。これにより、2000IU/mgタンパク質より高い比活性を有する、少なくとも90％純粋（ゲル電気泳動による）である第VIII因子を得た。rFVIIIの理論的純度は主な論点であったが、約3500−5000IU/mgタンパク質であると思われる。
【００１９】
（ｂ）タンパク質は、限外濾過／ダイアフィルトーション（UF/DF）により配合し、そしてUF/DFを通した回収率、凍結−解凍に対する感受性および種々のインキューベーション温度下で、液体安定性を調査した。
【００２０】
（ｃ）可能性のある組成物を、さらにそれらの熱的挙動についてＤＳＣ（示差走査熱量計）により特性決定した。ガラス転移温度（Tg')、失透温度  （Td')および共融点温度(Te')を測定した。この情報は迅速に凍結乾燥  でき、そしてさらなる調査の目的である組成物を確認するために使用した。
【００２１】
（ｄ）導かれた組成物を、迅速な凍結乾燥サイクルを使用して凍結乾燥し、そして安定性の分析を、標準的および早めた保存温度下で行った。
【００２２】
（ｅ）安定な組成物は、40℃で種々の時間で保存された試料から容易に確認された。
【００２３】
本発明の組成物を導いた多数の実験結果の分析において、アミノ酸、塩および糖の混合物から成る成分のパネルを調査するために、多−可動（multi-variable)実験設計法およびプログラムを使用した。結果は、成分間の任意の相互作用を解析するために、洗練されたプログラムを使用して分析され、そしてデータの多−変動レスポンス−サーフェイス(response-surface)分析を行った。驚くべきことには、ヒスチジン（従来技術で、通常使用されている）は、実際にrFVIII組成物に対して不安定化効果を有した。これにより、組成物中に見いだされた種々の成分に関して、最終的に許容できる基準を厳密に調査する必要性が生まれた。
【００２４】
【実施例】
実施例１
凍結乾燥したrFVIIIの安定性に対する効果は、150mM NaCl、2.5mM CaCl2および165mM マンニトールを含んで成るrFVIII混合物中の、種々の量のヒスチジンを滴定することにより調査した。結果を以下に表す。
【００２５】
0004077055.tif 000003
上記のデータから分かるように、ヒスチジンの量を増加させると、再構成した凍結乾燥rFVIIIの有効性が、添加−依存様式で減少する。この結果は、ヒスチジンの添加が凍結乾燥状態のFVIIIの安定化に役立たないことを示唆している。
【００２６】
実施例２
高い、および低い糖組成中のrFVIIIの安定性。
【００２７】
組換え第VIII因子を２つの組成で調製した。不安定性は、40℃の早めた保存条件下で調査した。
【００２８】
高い糖組成物は、従来技術と同様に、水を用いて再構成した時に、50mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カルシウム、５mMのヒスチジンおよび10重量％のマルトースを含む非晶質組成物であった。
この開示された低い糖含有組成物は、タンパク質を安定化するために１％スクロース（30mM スクロース)の非晶質成分を有する結晶質であった。この組成物は、ＷＦＩを用いて再構成した時に、30mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カルシウム、20mMのヒスチジン、290mMのグリシンおよび約200IU/mlのrFVIIIを含んだ。この組成物を、図中の従来技術の組成物と比較し、ここでこの開示された低い糖のrFVIII組成物は、従来技術の高い糖の安定化生成物よりも、時間経過に伴い安定であることが分かる。
【００２９】
上記に与えた開示から、多くの変更態様が当業者には明らかであると思われる。したがって、上記の実施例は説明を目的とするだけであり、本発明の範囲は上記の請求項にのみ限定されることを意図する。
【００３０】
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
【００３１】
１．水中に再構成した時に、約
65−400mM グリシン、
最高50mM ヒスチジン、
15−60mM スクロース、
最高50mM NaCl、
最高５mM CaCl2、および
50−1500IU rFVIII/ml
を含んで成る、安定な、アルブミン−フリーの凍結乾燥されたrFVIII調製物。
【００３２】
２．水中に再構成した時に、約
290mM グリシン、
20mM ヒスチジン、
30mM スクロース、
30mM NaCl、
2.5mM CaCl2、および
50−1500IU rFVIII/ml
を含んで成る、安定な、アルブミン−フリーの凍結乾燥されたrFVIII調製物。
【００３３】
３．残の水含量が約１−３重量％である、上記１に記載の凍結乾燥された調製物。
【００３４】
４．残の水含量が約１重量％である、上記２に記載の凍結乾燥された調製物。
【図面の簡単な説明】
【図１】比較的低い糖含量（上曲線）を有する本開示の組成物と、比較的高い糖含量（下曲線）を有する従来技術で教示された組成物とを、40℃で、時間経過に伴う有効性を比較するグラフである。
【図１】
0004077055.tif 000004