(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の1）〜5）の性質を示す炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類限定分解物複合体。
1）カゼイン類限定分解物の限定分解前のカゼイン類１分子当たり、鉄１〜1,000原子を含有すること、
2）カゼイン類限定分解物が、カゼイン類の蛋白分解酵素による酵素分解物であって、分子量15,000以上の分解物が全体の55％を越えないものであること、
3）乾燥粉体は、水に少なくとも15％溶解すること、
4）水溶液が、90℃、10分間の加熱によっても沈澱しないこと、
5）鉄独特の収斂味がないこと、
【請求項２】
炭酸及び／又は重炭酸、鉄及びカゼイン類の３者を反応させて得られる炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類複合体を、蛋白質分解酵素により分子量15,000以上の分解物が全体の55％を越えないように限定分解することを特徴とする請求の範囲１記載の炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類限定分解物複合体の製造法。
ただし、炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類複合体の調製時における鉄イオンのモル濃度は、炭酸及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下であって、カゼイン類のモル数は鉄イオンのモル数の１〜1/1,000である。
【請求項３】
i）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸、ii）鉄、iii）カゼイン類を蛋白質分解酵素により、分子量15,000以上の分解物が全体の55％を越えないように限定分解することにより得られるカゼイン類限定分解物の３者を混合して反応させ、これらの複合体を形成せしめることを特徴とする請求の範囲１記載の炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類限定分解物複合体の製造法。
ただし、３者の反応時における鉄イオンのモル濃度は、炭酸及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下であって、カゼイン類限定分解物は限定分解前のカゼイン類のモル数に換算して鉄イオンのモル数の１〜1/1,000である。
【請求項４】
請求の範囲２または３に記載の方法で得られた炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類限定分解物複合体の水溶液中に生成した沈澱を除去し、残存する炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類限定分解物複合体を採取することを特徴とする炭酸及び／又は重炭酸−鉄−カゼイン類限定分解物複合体の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、鉄−カゼイン類分解物複合体に関する。
また、本発明は、鉄−カゼイン類分解物複合体を製造する方法に関する。
本発明の鉄−カゼイン類分解物複合体は、耐熱性を有しており、加熱殺菌しても鉄独特の収斂味を呈さず、また、水に溶解した状態で存在するという特徴を有するので、貧血の予防又は治療や鉄強化を目的とした飲食品、医薬品、飼料等の原料として有用である。さらに、本発明の鉄−カゼイン類分解物複合体は、水に溶解した状態でも凝集を生じないので、製造工程での取扱いが容易で、かつ固形分のロスが少ないという利点があり、また、食感も良好である。
背景技術
日本人の鉄摂取量は、昭和50年以降、所要量の充足率100％前後を横ばいで推移しており、鉄分は食事上、気をつけて摂取しなければならない栄養素の一つといえる。また、世界的にみても、鉄分は不足しがちな栄養素とされている場合が多く、特に、貧血傾向の人や妊産婦向けの鉄強化食品や医薬品の供給が望まれている。しかし、一般に鉄強化に用いられる硫酸鉄やクエン酸鉄等の鉄塩は、飲食品等に添加すると鉄独特の収斂味を感じるという問題や胃腸の粘膜を傷める等の懸念から、その添加量には限界がある。また、有機鉄のヘム鉄も金属味や生臭味等の風味上の問題があり、飲食品等への添加には制約が多い。
また、鉄の吸収を促進する目的で、ミルクカゼイン、アミノ酸、あるいはカゼインホスホペプチド（特開昭59-162843号公報）を添加すること等が試みられている。しかし、これらの方法では、鉄独特の収斂味を無くすことはできないし、また、鉄独特の収斂味を無くす程に鉄の添加量を減らすこともできない。
本発明者らは、先に、鉄とカゼインとを結合させることにより、鉄独特の収斂味を弱めた鉄剤を開発した（特開平2-83400号公報）。しかし、この鉄とカゼインとを結合させた鉄カゼインは、耐熱性に乏しく、90℃10分間の加熱殺菌、120℃、２〜３秒間の加熱殺菌、あるいは、レトルト滅菌等の加熱処理を行うと、鉄独特の収斂味を呈するという欠点を有していた。この欠点は、鉄とカゼインとの結合が弱い為に加熱により鉄がカゼインから遊離し、水酸化鉄等が生成することによると考えられる。
そこで、本発明者らは、更に研究を進め、炭酸及び／又は重炭酸を用いることで鉄とカゼインとの結合性を強固にすることができることを見出し、鉄−カゼイン複合体を得ることに成功した（特開平9-77793号公報）。この鉄−カゼイン複合体は、耐熱性を有しており、加熱殺菌しても鉄独特の収斂味を呈さないという特徴を有するので、貧血の予防又は治療や鉄強化を目的とした飲食品、医薬品、飼料等の原料として有用なものであった。しかし、この鉄−カゼイン複合体は、水に溶解した状態で凝集する傾向にあり、製造工程での取扱いが難しく、かつ固形分をロスし易いという欠点があった。また、ザラツキが残る等の食感上の問題もあった。
発明の開示
本発明者らは、上記した鉄−カゼイン複合体の有する欠点を改善するべく、鋭意研究を進めていたところ、鉄−カゼイン類複合体を蛋白質分解酵素で加水分解するか、あるいは、カゼイン類を蛋白質分解酵素で加水分解して得られるカゼイン類限定分解物を用いて鉄−カゼイン類限定分解物複合体を製造すると、耐熱性を有し、加熱殺菌しても安定であり、鉄独特の収斂味を呈さず、水に溶解した状態でも凝集を生じないという特徴を有する鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、耐熱性を有し、加熱殺菌しても鉄独特の収斂味を呈さず、さらに水に溶解した状態でも凝集を生じないという特徴を有する鉄−カゼイン類限定分解物複合体を提供することを課題とする。また、本発明は、この鉄−カゼイン類限定分解物複合体を製造する方法を提供することを課題とする。
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、カゼイン類限定分解物の分解前のカゼイン類１分子当たり、鉄１〜1,000原子を含有し、乾燥粉体を水に溶解すると少なくとも15％が溶解し、水に溶解した状態でも凝集を生ぜず、90℃、10分間加熱しても沈澱が生ぜず、鉄独特の収斂味がない鉄−カゼイン類限定分解物複合体に関する。
なお、本発明においては、カゼイン類限定分解物の分解前のカゼイン類１分子当り、炭酸及び／又は重炭酸１分子以上含有することが望ましい。
本発明における前記複合体は、耐熱性を有し、加熱殺菌しても鉄独特の収斂味がなく、水に溶解した状態でも凝集せず、また90℃、10分間加熱しても沈澱を生じない。
本発明の前記鉄−カゼイン類限定分解物複合体は、次の２つの方法によって製造することができる。
すなわち、まず第１の方法は、鉄−カゼイン類複合体を形成し、そのカゼイン類を蛋白分解酵素で限定分解する方法である。
この方法で用いられる鉄−カゼイン類複合体は、1）炭酸、重炭酸又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）、及びカゼイン類を含む溶液（Ｃ溶液）の３溶液を同時に混合して調製したり、2）炭酸、重炭酸又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄及びカゼイン類を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合して調製したり、あるいは3）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸、及びカゼイン類を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合して調製したりすることができる。
この際、1）の方法では、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、ＡとＢとＣの混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、また、Ｃ溶液のカゼインのモル数は、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000に調整する。
また2）の方法では、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、またＢ溶液のカゼイン類のモル数は、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000に調整する。
さらに3）の方法では、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下として、Ａ溶液のカゼイン類のモル数は、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000に調整する。
また、第２の方法では、あらかじめカゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解してカゼイン類限定分解物を得、このカゼイン類限定分解物を用いて鉄−カゼイン類限定分解物複合体を製造する方法である。換言すると、i）炭酸、重炭酸又は炭酸及び重炭酸、ii）鉄、iii）カゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解することにより得られるカゼイン類限定分解物を、混合して３者を反応させ、これらの複合体を形成させることよりなる鉄−カゼイン類限定分解物複合体の製造法である。
前記第２の方法において前記３者の混合は、次の方法で行なうことができる。すなわち、
1）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）と、カゼイン類限定分解物を含む溶液（Ｃ溶液）とを同時に混合する。
2）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄及びカゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解することにより得られるカゼイン類限定分解物を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合する。
3）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸、及びカゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解することにより得られるカゼイン類限定分解物を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合する。
この際1）の方法では、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、ＡとＢとＣの混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、また、Ｃ溶液のカゼイン類限定分解物のモル数は、限定分解前のカゼイン類換算で、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000に調整する。
また、2）の方法では、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、またＢ溶液のカゼイン類分解物のモル数は、限定分解前のカゼイン類換算で、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000に調整する。
さらに3）の方法では、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、またＡ溶液のカゼイン類限定分解物のモル数は、限定分解前のカゼイン類換算で、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000に調整する。
このようにすると次の１）〜４）の性質を示す鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得ることができる。
1）カゼイン類分解物の分解前カゼイン類１分子当たり、鉄１〜1,000原子を含有すること、
なお、カゼイン類分解物の分解前カゼイン類１分子当り、炭酸及び／又は重炭酸１分子以上を含有することが望ましい。
2）乾燥粉体は、水に少なくとも15％溶解すること、
3）水溶液の90℃、10分間の加熱により沈澱しないこと、
4）鉄独特の収斂味がないこと、
本発明の耐熱性の鉄−カゼイン類限定分解物複合体、特に水溶液にして加熱（90℃、10分間）したときに沈澱が生じない該複合体は、原料としてカゼイン類酵素限定分解物を使用していることによる。この酵素分解は、蛋白質分解酵素により分解し、分子量15,000以上の分解物が全体の55％を越えないようにすることが望ましい。
本発明についてまず、その複合体の製造方法を示して、具体的に説明する。
第１の方法、すなわち、鉄−カゼイン類複合体を製造した後、この鉄−カゼイン類複合体を蛋白質分解酵素で限定分解し、鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る方法について説明する。
この方法を示すと次の（1）〜（3）の方法がある。
（1）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）と、カゼイン類を含む溶液（Ｃ溶液）とを同時に混合して鉄−カゼイン類複合体を製造する。但し、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、ＡとＢとＣの混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、Ｃ溶液のカゼイン類のモル数は、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000とする。そして、この鉄−カゼイン類複合体を蛋白質分解酵素で限定分解して、本発明の鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る。
（2）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄及びカゼイン類を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合して鉄−カゼイン類複合体を製造する。但し、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、またＢ溶液のカゼイン類のモル数は、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000とする。そして、この鉄−カゼイン類複合体を蛋白質分解酵素で限定分解して、本発明の鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る。
（3）炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸、及びカゼイン類を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合して鉄−カゼイン類複合体を製造する。但し、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、またＡ溶液のカゼイン類のモル数は、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000とする。そして、この鉄−カゼイン類複合体を蛋白質分解酵素で限定分解して、本発明の鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る。
次に、第２の方法、すなわち予めカゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解して得られたカゼイン類分解物を用いて鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る方法は、次の（1）〜（3）の方法がある。
（1）予めカゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解することにより得られるカゼイン分解物を用いて、炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）と、該カゼイン類限定分解物を含む溶液（Ｃ溶液）とを同時に混合して本発明の鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る。但し、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、ＡとＢとＣの混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、Ｃ溶液のカゼイン類酵素限定分解物のモル数は、限定分解前のカゼイン類換算で、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000とする。
（2）予めカゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解することにより得られるカゼイン分解物を用いて、炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄及び該カゼイン類限定分解物を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合して鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る。但し、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、Ｂ溶液のカゼイン類分解物のモル数は、限定分解前のカゼイン類換算で、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000とする。
（3）予めカゼイン類を蛋白質分解酵素で限定分解することにより得られるカゼイン類限定分解物を用いて、炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸、及び該カゼイン類限定分解物を含む溶液（Ａ溶液）と、鉄を含む溶液（Ｂ溶液）とを混合して鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得る。但し、Ｂ溶液の鉄イオンのモル濃度は、Ａ溶液と、Ｂ溶液が混合した溶液に溶解している炭酸イオン及び重炭酸イオンのモル濃度の1/3以下とし、またＡ溶液のカゼイン類限定分解物のモル数は、限定分解前のカゼイン類換算で、Ｂ溶液の鉄イオンのモル数の１〜1/1,000とする。
さらに、第３の方法として、前記第１又は第２の方法で得られた鉄−カゼイン限定分解物複合体の水溶液中に沈澱を生ずる場合は、この沈澱を除去して残液を採取すると鉄の大部分が水溶液に残留して水溶性の鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得ることができる。なお、この場合、カゼイン類限定分解物としては、分子量が15,000以上のカゼイン類分解物が、全体の55％を越えないような分解物とすることが望ましい。
また、沈澱を生成させるには、水溶液を冷却することが望ましく、この方法における冷却は、15℃以下、望ましくは10℃以下で３時間以上、さらに望ましくは５時間以上溶液を静置することによって行なう。また、沈澱の除去は、デカンテーション又は遠心分離で行なうと良い。このようにすると、70〜94％の水溶性鉄−カゼイン類限定分解物複合体が上澄みに残存し、工業的に有利に鉄−カゼイン類限定分解物複合体を得ることができる。
本発明で、鉄−カゼイン類複合体、あるいは鉄−カゼイン類限定分解物複合体を製造する際に使用する炭酸及び／又は重炭酸は、酸の形態で使用しても良く、水溶性塩の形態で使用してもよい。また、鉄は、水溶性塩の形態で通常使用される。
そして、本発明で、鉄−カゼイン類複合体、あるいは鉄−カゼイン類限定分解物複合体を製造するに際し、炭酸及び／又は重炭酸、鉄、及びカゼイン類又はカゼイン類限定分解物は、溶液として使用しても良いし、塩類等の固形状態で使用しても良い。また、固形状態の炭酸塩類及び／又は重炭酸塩類、鉄、及びカゼイン類及びカゼイン類限定分解物を同時に溶解して使用しても良い。
本発明で使用するカゼイン類としては、ヒトやウシ等の哺乳類の乳等の分泌液から分離されるカゼイン、酸カゼイン、カゼインナトリウム、乳酸カゼイン、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン等を例示することができる。これらのカゼイン類については、市販品もあるが、大量に分離する方法も多く知られており、それらの方法に従って生産されたものを使用しても良い。また、遺伝子組み換えの技術を利用して、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等に生産させたものを使用しても良い。なお、カゼイン類として、粗カゼインのようなα−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼインの混合物を用いる場合は、その構成比から平均分子量を求め、この値から溶解するカゼイン類のモル濃度を算出すれば良い。
本発明で使用する炭酸及び／又は重炭酸としては、炭酸水、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム等を例示することができる。
また、鉄としては、水溶性の鉄塩、例えば塩化第二鉄、硫酸第二鉄等の３価の鉄化合物、さらには、硝酸第一鉄、硫酸第一鉄、クエン酸鉄等の２価の鉄化合物を例示できる。また、pH調整剤として、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、塩酸、クエン酸、乳酸等を同時に使用しても構わない。ｐＨは通常２〜９に調整する。
本発明で、鉄−カゼイン類複合体を限定分解する際に使用する蛋白質分解酵素、あるいはカゼイン類を限定分解する際に使用する蛋白質分解酵素としては、動物由来のペプシン、トリプシン，キモトリプシン、キモシン、パンクレアチン等や植物由来のパパイン等を例示することができる。その他、微生物由来の蛋白質分解酵素を使用しても良いし、また、遺伝子組み換えの技術を利用して生産された蛋白質分解酵素を使用しても構わない。
なお、本発明の鉄−カゼイン類限定分解物複合体の溶解性は、この複合体を構成するカゼイン類分解物の分子量分布により大きく左右されるので、蛋白質分解酵素で限定分解を行うに際しては、その反応条件を十分に検討して実施する必要がある。因みに、本発明の鉄−カゼイン類限定分解物複合体を構成するカゼイン類分解物の分子量分布については、分子量が15,000以上のカゼイン類分解物が全体の55％を越えないようなカゼイン類分解物とすると良い。また、分子量が15,000以下で、かつ分子量が800以上のカゼイン類分解物が全体の20％以上を占めるカゼイン類分解物が好ましく、さらには、分子量が15,000以下で、かつ分子量が800以上のカゼイン類分解物が全体の50％以上を占めるカゼイン類分解物が好ましい。そして、分子量が15,000以上の分解物が全体の55％を越えず、かつ分子量800未満の分解物が34％を越えるものであっても、第３の発明の方法により、水溶性の鉄−カゼイン類分解物複合体を得ることができる。したがって、本発明でいうカゼイン類の限定分解とは、分子量が15,000以上のカゼイン類分解物が全体の55％を越えないようなカゼイン類の分解程度をいう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例３で得られた乳酸カゼイン限定分解物の分子量分布を示す。
第２図は、実施例４で得られた乳酸カゼイン限定分解物の分子量分布を示す。
第３図は、実施例５で得られた乳酸カゼイン限定分解物の分子量分布を示す。
第４図は、実施例６で得られた乳酸カゼイン限定分解物の分子量分布を示す。
第５図は、実施例７で得られた乳酸カゼイン限定分解物の分子量分布を示す。
第６図は、比較例１で得られた乳酸カゼイン分解物の分子量分布を示す。
第７図は、比較例２で得られた乳酸カゼイン分解物の分子量分布を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
（Ａ溶液）1,2000mmol重炭酸ナトリウムを含む水溶液1L
（Ｂ溶液）鉄濃度10mmolの塩化第二鉄を含む水溶液0.2L
（Ｃ溶液）0.1mmol乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を含む水溶液0.8L
但し、モル濃度の調整には平均分子量を用いた。また、平均分子量は、尿素−ソジウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）−電気泳動の結果から求めたα−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼインの構成比と各カゼインの理論的分子量より算出した。
Ｂ溶液（0.2L）とＣ溶液（0.8L）を混合して（Ｂ＋Ｃ）溶液（1L）を調製した後、Ａ溶液（1L）に、この（Ｂ＋Ｃ）溶液（1L）を加えて鉄−カゼイン複合体を生成させた。
次に、この鉄−カゼイン複合体を含む溶液を分子量5,000カットの限外濾過膜で脱塩処理し、鉄−カゼイン複合体中のカゼイン濃度が５％となるまで濃縮した後、重炭酸ナトリウムを添加してpHを8.0に調整して反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素としてトリプシン（PTN6.0S：ノボ・ノルディスク社製）をカゼイン1g当たり1,200Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを8.0に維持しながら、50℃でカゼインの限定分解を行った。この限定分解は、目視で反応溶液の濁りが無くなるまで行い、その時点で、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて終了した。このカゼインの限定分解に約７時間を要した。この反応溶液を透析した後、凍結乾燥して、鉄−カゼイン限定分解物複合体3.0gを得た。
この鉄−カゼイン限定分解物複合体について、その溶解性を調べた。すなわち、0.05molイミダゾール及び0.15mol食塩を含むpH7.5の液状食品を模倣した緩衝液（以下、模擬緩衝液と称する）に、鉄−カゼイン限定分解物複合体を15％濃度となるまで溶解した。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、凝集してダマになることなく完全に溶解し、濁りを生じなかった。
また、上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液について、その保存性を調べた。すなわち、鉄−カゼイン分解物複合体を溶解した模擬緩衝液中の鉄濃度が3.6mmolとなるまで希釈し、90℃で10分間加熱殺菌した後、５℃で保存した。その結果、保存後６ヶ月を経過しても、沈澱の形成は全く認められなかった。
実施例２
（Ａ溶液）1,200mmol重炭酸ナトリウムを含む水溶液1L
（Ｂ溶液）鉄濃度9mmolの硫酸第二鉄を含む水溶液0.2L
（Ｃ溶液）0.1mmol乳酸カゼイン（シグマ社製）を含む水溶液0.8L
モル濃度の調整は実施例１と同様に行った。
Ｂ溶液（0.2L）とＣ溶液（0.8L）を混合して（Ｂ＋Ｃ）溶液（1L）を調製した後、Ａ溶液（1L）に、この（Ｂ＋Ｃ）溶液（1L）を加えて鉄−カゼイン複合体を生成させた。次に、この鉄−カゼイン複合体を含む溶液を分子量5,000カットの限外濾過膜で脱塩処理し、鉄−カゼイン複合体中のカゼイン濃度が５％となるまで濃縮した後、重炭酸ナトリウムを添加してpHを8.0に調整して反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素としてパパイン（W-40：天野製薬製）をカゼイン1g当たり600Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを8.0に維持しながら、65℃でカゼインの限定分解を行った。この限定分解は、目視で反応溶液の濁りが無くなるまで行い、その時点で、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて終了した。カゼインの限定分解に約６時間を要した。なお、この反応溶液を透析した後、凍結乾燥して、鉄−カゼイン限定分解物複合体2.4gを得た。
上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体の溶解性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、凝集してダマになることなく完全に溶解し、全く濁りを生じなかった。
また、上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液の保存性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、保存後６ヶ月を経過しても、沈澱の形成は認められなかった。
試験例１
実施例１及び２の鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液について、官能評価試験を行った。すなわち、男10名及び女10名のパネラーに模擬緩衝液を対照とし、各鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液について収斂味を感じるか否かを判定させた。各パネラーには目隠しをし、外見による判断要因を与えないよう配慮した。また、一試料のための試験は、対照、試料の順に試験させ、一試料評価後、最低一日の間隔をあけて、次の試料を評価するための試験を実施した。さらに、試料評価の日間偏差をなくすため、各パネラー毎に試料評価の順番をランダム化した。なお、収斂味を感じる試料として、鉄濃度が3.6mmolとなるように硫酸第１鉄を溶解した模擬緩衝液についても、同様の官能評価試験を行った。その結果として、収斂味を感じたパネラーの人数を第１表に示す。
0004191261.tif 000002
これによると、実施例１及び２の鉄−カゼイン限定分解物複合体は、鉄独特の収斂味を全く示さないことが判る。
実施例３
（Ａ溶液）1,200mmol重炭酸ナトリウムを含む水溶液1L
（Ｂ溶液）鉄濃度10mmolの塩化第二鉄を含む水溶液0.2L
（Ｃ溶液）限定分解前の乳酸カゼイン換算で0.1mmolの乳酸カゼイン分解物を含む水溶液0.8L
モル濃度の調整は実施例１と同様に行った。
なお、Ｃ溶液を調製する際に使用する乳酸カゼイン分解物は、以下のようにして製造した。すなわち、乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を濃度が５％となるよう溶解した溶液に、重炭酸ナトリウムを添加してpHを8.0に調整した反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素であるトリプシン（PTN6.0S：ノボ・ノルディスク社製）をカゼイン1g当たり1,000Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを8.0に維持しながら、50℃で５時間の限定分解を行った後、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて限定分解を終了した。この反応溶液を凍結乾燥して、乳酸カゼイン分解物3.1gを得た。
この乳酸カゼイン分解物について、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量を測定した。すなわち、TSKgel 3000PWxl（300×7.8mm:東ソー製）を装着した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、0.1％トリフルオロ酢酸を含む55％アセトニトリルを溶媒として、0.3mL/分の流速で乳酸カゼイン分解物の溶液を通液し、溶出液の吸光度（210nm）を測定した。また、分子量が判明している標準蛋白質及びペプチドについても、それぞれ同様の操作を行い、溶出時間を測定した。標準蛋白質及びペプチドの分子量及び溶出時間を第２表に示す。
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この標準蛋白質及びペプチドの分子量と溶出時間の関係から、乳酸カゼイン分解物の分子量分布について、その吸光度と溶出時間の積分値により測定した。その結果を第１図に示す。これによると、分子量が800〜15,000の範囲の乳酸カゼイン分解物は全体の94％を占めていることが判る。
上記したＢ溶液（0.2L）とＣ溶液（0.8L）を混合して（Ｂ＋Ｃ）溶液（1L）を調製した後、Ａ溶液（1L）に、この（Ｂ＋Ｃ）溶液（1L）を加えて鉄−カゼイン限定分解物複合体を生成させた。そして、この鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液を透析した後、凍結乾燥して、鉄−カゼイン限定分解物複合体2.7gを得た。なお、鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液の透析外液をエバポレーターで濃縮して、鉄濃度を発光分光分析計（ＩＣＰ）で測定したところ、鉄は全く検出されなかった。したがって、全ての鉄が鉄−カゼイン限定分解物複合体の構成成分となったことが判る。
また、上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液の保存性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、保存後６ヶ月目においても、沈澱の形成は認められなかった。
実施例４
乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を濃度が５％となるよう溶解した水溶液に、重炭酸ナトリウムを添加してpHを8.0に調整した反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素としてパパイン（W-40：天野製薬製）をカゼイン1g当たり10Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを8.0に維持しながら、65℃で３時間の限定分解を行った後、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて限定分解を終了した。この反応溶液を凍結乾燥して、乳酸カゼイン分解物3.4gを得た。
この乳酸カゼイン分解物について、実施例３と同様にして分子量分布を測定した。その結果を第２図に示す。これによると、分子量が800〜15,000の範囲の乳酸カゼイン分解物は全体の45％を占めており、残りは分子量が15,000を越えていることが判る。
上記の乳酸カゼイン分解物を使用し、実施例３と同様にして鉄−カゼイン限定分解物複合体を製造した。そして、鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液の透析外液の鉄濃度を実施例３と同様にして測定したところ、鉄は全く検出されなかった。したがって、全ての鉄が鉄−カゼイン限定分解物複合体の構成成分となったことが判る。
上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体の溶解性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、ダマになることなく完全に溶解し、全く濁りを生じなかった。
また、この鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液の保存性について、実施例１と同様の方法により調べたところ、保存後６ヶ月目においても、沈澱の形成は認められなかった。
実施例５
乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を濃度が５％となるよう溶解した水溶液に、重炭酸ナトリウムを添加してpHを8.0に調整した反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素であるブロメラインＦ（天野製薬製）をカゼイン1g当たり1,000Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを8.0に維持しながら、65℃で５時間の限定分解を行った後、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて限定分解を終了した。この反応溶液を凍結乾燥して、乳酸カゼイン分解物3.0gを得た。
この乳酸カゼイン分解物について、実施例３と同様にして分子量分布を測定した。その結果を第３図に示す。これによると、分子量が800〜15,000の範囲の乳酸カゼイン分解物は全体の80％を占めていることが判る。
上記の乳酸カゼイン分解物を使用し、実施例３と同様にして鉄−カゼイン限定分解物複合体を製造した。そして、鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液の透析外液の鉄濃度を実施例３と同様にして測定したところ、鉄は全く検出されなかった。したがって、全ての鉄が鉄−カゼイン限定分解物複合体の構成成分となったことが判る。
上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体の溶解性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、ダマになることなく完全に溶解し、全く濁りを生じなかった。
また、この鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液の保存性について、実施例１と同様の方法により調べたところ、保存後６ヶ月目においても、沈澱の形成は認められなかった。
実施例６
乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を濃度が５％となるよう溶解した水溶液に、重炭酸ナトリウムを添加してpHを8.0に調整した反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素としてプロテアーゼＰ（天野製薬製）をカゼイン1g当たり10Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを8.0に維持しながら、45℃で５時間の限定分解を行った後、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて限定分解を終了した。この反応溶液を凍結乾燥して、乳酸カゼイン分解物3.1gを得た。
この乳酸カゼイン分解物について、実施例３と同様にして分子量分布を測定した。その結果を第４図に示す。これによると、分子量が800〜15,000の範囲の乳酸カゼイン分解物は全体の80％を占めており、また、分子量が15,000を越えている乳酸カゼイン分解物は全体の２％を占めており、さらに、分子量が800未満の乳酸カゼイン分解物は全体の18％を占めていることが判る。
上記の乳酸カゼイン分解物を使用し、実施例３と同様にして鉄−カゼイン限定分解物複合体を製造した。そして、鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液の透析外液の鉄濃度を実施例３と同様にして測定したところ、鉄は全く検出されなかった。したがって、全ての鉄が鉄−カゼイン限定分解物複合体の構成成分となったことが判る。
上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体の溶解性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、ダマになることなく完全に溶解し、全く濁りを生じなかった。
また、この鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液の保存性について、実施例１と同様の方法により調べたところ、保存後６ヶ月目においても、沈澱の形成は殆ど認められなかった。
実施例７
乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を濃度が５％となるよう溶解した水溶液に、重炭酸ナトリウムを添加してpHを7.0に調整した反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素であるサカナーゼ（科研ファルマより購入）をカゼイン1g当たり1,000Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを7.0に維持しながら、50℃で１時間の限定分解を行った後、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて限定分解を終了した。この反応溶液を凍結乾燥して、乳酸カゼイン分解物2.8gを得た。
この乳酸カゼイン分解物について、実施例３と同様にして分子量分布を測定した。その結果を第５図に示す。これによると、分子量が800〜15,000の範囲の乳酸カゼイン分解物は全体の66％を占めており、残りは分子量が800未満であることが判る。
上記の乳酸カゼイン分解物を使用し、実施例３と同様にして鉄−カゼイン限定分解物複合体を製造した。そして、鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液の透析外液の鉄濃度を実施例３と同様にして測定したところ、鉄は全く検出されなかった。したがって、全ての鉄が鉄−カゼイン限定分解物複合体の構成成分となったことが判る。
上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体の溶解性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、ダマになることなく完全に溶解し、全く濁りを生じなかった。
また、この鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液の保存性について、実施例１と同様の方法により調べたところ、保存後６ヶ月目においても、沈澱の形成は殆ど認められなかった。
試験例２
実施例３〜７の鉄−カゼイン限定分解物複合体を溶解した模擬緩衝液について、試験例１と同様に官能評価試験を行った。その結果として、収斂味を感じたパネラーの人数を第３表に示す。
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これによると、実施例３〜７の鉄−カゼイン限定分解物複合体は、鉄独特の収斂味を全く示さないことが判る。
試験例３
ビタミンＣとしてアスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムを6.2mg/100g含む生理的リン酸緩衝液（pH7.2）に、鉄濃度が20mg/100mLとなるよう実施例１の鉄−カゼイン限定分解物複合体（本発明群１）、実施例３の鉄−カゼイン限定分解物複合体（本発明群２）又は硫酸第１鉄（対照群１）を溶解し、90℃で10分間加熱殺菌した試験試料を調製した。また、ビタミンＣとしてアスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムを6.2mg/100g含む生理的リン酸緩衝液（pH7.2）を90℃で10分間加熱殺菌した試験試料（対照群２）も調製した。
離乳直後の21日齢ウィスター系雌ラット（日本チャールスリバー製）のうち、体重が45〜50gのものを選んで除鉄食（鉄含量が0.25mg/100gの飼料、オリエンタル酵母製）を２週間投与し、血中ヘモグロビン値が7g/100mL以下の貧血ラットを作成した。このラットを１群８〜11匹とし、その後も除鉄食を投与し続けながら各試験試料を1mL/日、６週間、強制経口（ゾンデ）投与した。そして、試験試料の投与を開始して６週間目に、各ラットの尾静脈より採血し、自動血球計測装置（東亜医用電子製）でヘモグロビン値を測定した。その結果を第４表に示す。
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これによると、鉄剤として使用されている硫酸第一鉄よりも、実施例１及び３の鉄−カゼイン限定分解物複合体は、貧血に対する治療効果が優れていることが判る。
比較例１
乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を濃度が５％となるよう溶解した水溶液に、重炭酸ナトリウムを添加してpHを8.0に調整した反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素であるパパイン（W-40：天野製薬製）をカゼイン1g当たり10Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを8.0に維持しながら、65℃で30分の限定分解を行った後、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて限定分解を終了した。この反応溶液を凍結乾燥して、乳酸カゼイン分解物3.6gを得た。
この乳酸カゼイン分解物について、実施例３と同様にして分子量分布を測定した。その結果を第６図に示す。これによると、分子量が800〜15,000の範囲の乳酸カゼイン分解物は全体の30％を占めており、残りは分子量が15,000を越えていることが判る。
上記の乳酸カゼイン分解物を使用し、実施例３と同様にして鉄−カゼイン分解物複合体を製造した。そして、鉄−カゼイン分解物複合体を含む溶液の透析外液の鉄濃度を実施例３と同様にして測定したところ、鉄は全く検出されなかった。したがって、全ての鉄が鉄−カゼイン分解物複合体の構成成分となったことが判る。
また、この鉄−カゼイン分解物複合体を溶解した模擬緩衝液中の鉄濃度が3.6mmolとなるまで希釈し、90℃で10分間加熱殺菌した後、５℃に保持して沈澱の形成を観察したところ、４時間後に沈澱の形成が認められた。
比較例２
乳酸カゼイン（ニュージーランド・デイリーボード社製）を濃度が５％となるよう溶解した水溶液に、重炭酸ナトリウムを添加してpHを7.0に調整した反応溶液を調製した。そして、この反応溶液に蛋白質分解酵素であるサカナーゼ（科研ファルマより購入）をカゼイン1g当たり1,000Uの割合で添加し、水酸化ナトリウムを添加してpHを7.0に維持しながら、50℃で５時間の限定分解を行った後、反応溶液を85℃で20分間保持することにより酵素活性を失活させて限定分解を終了した。この反応溶液を凍結乾燥して、乳酸カゼイン分解物2.5gを得た。
この乳酸カゼイン分解物について、実施例３と同様にして分子量分布を測定した。その結果を第７図に示す。これによると、分子量が800〜15,000の範囲の乳酸カゼイン分解物は全体の39％を占めており、残りは分子量が800未満であることが判る。
上記の乳酸カゼイン分解物を使用し、実施例３と同様にして鉄−カゼイン分解物複合体を製造した。そして、この鉄−カゼイン分解物複合体を模擬緩衝液にて鉄濃度が3.6mmolとなるまで希釈し、90℃で10分間加熱殺菌した後、５℃に保持して沈澱の形成を観察したところ、２時間後に沈澱の形成が認められた。
実施例３〜７及び比較例１〜２にあるように、鉄−カゼイン分解物複合体の溶解性を良好なものとするには、分子量が15,000を越えるカゼイン分解物の割合が全体の55％を越えず、かつ分子量が800未満のカゼイン分解物の割合が全体の34％を越えないようなカゼイン分解物であることが重要であり、分子量が大きいカゼイン分解物や分子量が小さいカゼイン分解物の割合が多過ぎると、溶解性の良好な鉄−カゼイン分解物複合体の形成が悪くなることが判る。
比較例３
比較例２の上澄みと沈澱の鉄含量をＩＣＰで測定したところ、第５表に示すように、殆どの鉄が上澄みに存在していることが判った。そこで、沈澱を工業的な手法により除去することができれば、実用化が可能である。
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そこで、沈澱を工業的な手法により除去する方法を種々検討したところ、以下の方法により実用化が可能であることが明らかとなった。すなわち、鉄−カゼイン限定分解物複合体を製造した後、この複合体を含む溶液を15℃以下、望ましくは10℃以下とし、３時間、望ましくは５時間以上静置することで沈澱を醸成し、その後、デカンテーション又は遠心分離等の処理により沈澱を除去する。この処理により、鉄の収率として70〜94％の水溶性鉄−カゼイン限定分解物複合体を上澄み中に得ることができた。
実施例８
比較例３と同様の方法により得られた乳酸カゼイン分解物2.5gと、この方法で限定分解物時の酵素量を1,000から2,000Uに増量して乳酸カゼイン分解物2.5gを得た。なお、それぞれの乳酸カゼイン分解物中に含まれる分子量800未満の分解物の割合は、全体の39％及び54％であった。
これらの乳酸カゼイン分解物を使用し、実施例３と同様にして、鉄−カゼイン限定分解物複合体を製造した。そして、この鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液を10℃で５時間静置し、沈澱を醸成し、その後、デカンテーションして上澄みのみを回収した。
上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体の溶解性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、ダマになることなく完全に溶解し、全く濁りを生じなかった。
なお、この鉄−カゼイン限定分解物複合体を含む溶液を3.6mM/lの鉄濃度となるまで希釈し、90℃で10分間加熱殺菌した。殺菌後、５℃の温度で保存し、沈澱の形成を観察したが、６ヵ月を経ても沈澱は観察されなかった。
実施例９
1.2Lの水に840mgの炭酸水素ナトリウムを添加し、よく混合する。次に、実施例３で得た乳酸カゼイン分解物480mgを添加し混和する。この溶液に、さらに278mgの硫酸第一鉄７水和物物を添加し、よく混和した。そして、この水溶液を90℃で10分間加熱殺菌したところ、透明で濁りがなく、また、鉄による金属味は全く認められなかった。
上記の鉄−カゼイン限定分解物複合体の溶解性について、実施例１と同様の方法により調べた。その結果、この鉄−カゼイン限定分解物複合体は、ダマになることなく完全に溶解し、全く濁りを生じなかった。
実施例１０
実施例９の方法で調製した水溶液10Lにエリスリトール500g、果糖ぶどう糖液糖500g、乳酸40gを添加した。さらに、グレープフルーツフレーバー６gを添加し、100mlづつガラス瓶に充填し、80℃で30分間加熱殺菌した。この溶液中に鉄が5ml/100ml含まれていた。そして、この溶液を37℃で１ヵ月間保存しても、沈澱は認められず、透明で濁りがなく、また、鉄による金属味は全く認められなかった。
産業上の利用可能性
本発明の鉄−カゼイン類限定分解物複合体は、耐熱性を有しており、加熱殺菌しても鉄独特の収斂味を呈さず、水に溶解した状態で存在するという特徴を有するので、貧血の予防又は治療や鉄の強化を目的とした飲食品、医薬品、飼料等の原料として有用である。また、本発明の鉄−カゼイン類分解物複合体は、水に溶解した状態でも凝集して沈澱を生じないという特徴を有するので、製造工程での取扱いが容易で、かつ固形分のロスが少ないという利点がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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