(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(1)〜(14)の微生物から成る群より選択される1以上の指標微生物を多成分系有機液体混合物の存在下で培養し、該指標微生物が生育可能か否かを評価することを含む多成分系有機液体混合物の毒性の評価方法。
(1)シュードモナス・プチダ(FERM P-9228)
(2)クレブシエラ・ニューモニア(IFO 3318)
(3)エスシェリキア・コーリ(IFO 3806)
(4)コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(IFO 12072)
(5)エスシェリキア・コーリ(IFO 03548)
(6)プロテウス・ウバラム(IFO 3167)
(7)コクリア・ロゼア(IFO 03764)
(8)スタフィロコッカス・アウレウス(IFO 03183)
(9)エンテロコッカス・ファエシウム(IFO 3826)
(10)コリネバクテリウム・フラベスセンス(IAM1642)
(11)コリネバクテリウム・ハイドロカルボオキシダンス(ATCC21767)
(12)コリネバクテリウム・ヘルカラス(ATCC13868)
(13)クロモバクテリウム・クロコラタミ(IFO 3758)
(14)コリネバクテリウム・グルタミカム(JCM1318)
【請求項２】
指標微生物として異なる生育限界logP値を有する微生物を複数用いる請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
指標微生物の生育可能か否かの評価に基づき、該指標微生物の生育限界logP値を多成分系有機液体混合物の毒性指標値として評価することを特徴とする、請求項１記載の評価方法。
【請求項４】
以下の(1)〜(14)の微生物から成る群より選択される1以上の指標微生物を含む、多成分系有機液体混合物の毒性評価用キット。
(1)シュードモナス・プチダ(FERM P-9228)
(2)クレブシエラ・ニューモニア(IFO 3318)
(3)エスシェリキア・コーリ(IFO 3806)
(4)コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(IFO 12072)
(5)エスシェリキア・コーリ(IFO 03548)
(6)プロテウス・ウバラム(IFO 3167)
(7)コクリア・ロゼア(IFO 03764)
(8)スタフィロコッカス・アウレウス(IFO 03183)
(9)エンテロコッカス・ファエシウム(IFO 3826)
(10)コリネバクテリウム・フラベスセンス(IAM1642)
(11)コリネバクテリウム・ハイドロカルボオキシダンス(ATCC21767)
(12)コリネバクテリウム・ヘルカラス(ATCC13868)
(13)クロモバクテリウム・クロコラタミ(IFO 3758)
(14)コリネバクテリウム・グルタミカム(JCM1318)
【請求項５】
指標微生物として異なる生育限界logP値を有する微生物を複数含む、請求項４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多成分の有機成分を含有する液体混合物の微生物等に対する毒性を定量的に評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機溶媒耐性菌は炭化水素類、石油製品類又は有機溶媒の存在下で脂溶性物質等の微生物反応が可能で、新しい微生物反応系（二相系又は微水系）を提供するものと考えられている。該反応系を促進させるには、微生物の溶媒耐性と有機溶媒の毒性を把握することが必要である。
【０００３】
各種の有機溶媒が微生物に対してどの程度の毒性を有しているのか、また、微生物はどのような耐性を有しているか、これらの課題に対してこれまで定量的に把握することができなかった。すなわち、これらの有機溶媒の毒性の強さを示す指標が存在していなかった。このようななか、１９８９年にトルエン耐性菌IH-2000株の発見により、微生物への毒性指標として有機溶媒の物性定数logＰ値の概念が導入され、その有機溶媒の毒性（溶媒毒性指標値）表示法が確立された（例えば、非特許文献１参照。）。従って、有機溶媒を用いる微生物反応を行う上で、その有機溶媒のlogＰ値を把握することは非常に重要である。
【０００４】
logＰ値とは水-オクタノールの二相系における分配比を対数で表した物性値である。このlogＰ値は水へのなじみを示す指標であり、この値が大きいほど油に溶けやすい。一般に、単一系有機溶媒のlogＰ値の測定法としては、以下のような（i）計算により求める方法、及び（ii）実験により求める方法が知られている。
【０００５】
（i）計算により求める方法
logＰ値は溶質分子を構成している各成分の疎水性の和として表わされ置換基Xを基準物質（H）に導入して化合物において疎水性置換基定数πxは次式で表される。
【数１】
0004181838.tif 000002
logＰは物質を構成している置換基のπxの総和と基準物質の分配係数の対数（logＰH）値との和として表される。
【０００６】
【数２】
0004181838.tif 000003
ここで、logＰ又はπ値は実験的に求めることが望ましいが、分配に影響を与える構成因子（例えば、環化、枝分かれ、多重結合、置換基などの疎水性）に関する疎水性フラグメント定数（hydrophobic fragmental constant f）を定め、logＰ＝ΣfからlogP を算出することができる（Nys. G.G., Rekker, R.f., chim. Themp., 5, 521, 1973：  R. F. Rekker, The hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, NewYork, 1977）
【０００７】
（ii）実験により求める方法（Flask shaking法）
有機溶媒（例えば、n-オクタノール）と水との間における物質の濃度比を求めることによって決定する。相手の相で予め飽和しておいた有機溶媒と水とをそれぞれ一定体積ずつとり、マイヤー中に入れる。通常はいずれかの相に予め物質を溶解しておき、平衡後の両相の濃度をしかるべき方法（通常は比色法）で定量し、分配係数Pを求める。このとき、物質濃度を変化させて測定し、濃度によってPの値が変わらない領域での値を採用する（寺田  弘、化学の領域、増刊122号、p73、1979）。
【０００８】
一般的な有機溶媒のlogＰ値を以下の表１に例示する。
【表１】
0004181838.tif 000004
【０００９】
ところで、微生物反応において使用される有機溶媒系は必ずしも単一系ではなく、例えばステロイドホルモン類等の微生物変換は多成分系混合溶媒中で行なわれる場合もあり、原油や灯油中の微生物脱硫は各種炭化水素類の混合物中で行なわれている。したがって、多成分系混合溶媒のlogＰ値を把握することは、反応を上手に行う為に反応溶媒の選択や反応系の制御に重要である。さらに微生物の選択や探索上でも大変有用である。しかしながら、現在、これらの毒性指標であるlogＰ値の測定は、単一溶媒系では上記のような方法により可能であるが、石油製品や混合有機溶媒のような多成分系有機液体混合物のlogＰ値の実測定は現状ではほとんど不可能であり、計算値データも報告されていない。
従って、混合有機溶媒や石油製品等のような多成分系有機液体混合物の毒性やlogＰ値を定量的に且つ簡便に評価できる方法が求められていた。
【００１０】
【非特許文献１】
井上明、掘越弘毅、「ネイチャー」(Inoue A.、Horikoshi K. Nature), 338, p.264-266  (1989)
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、石油製品や混合有機溶媒のような多成分系有機液体混合物の微生物等に対する毒性を簡便に且つ定量的に評価する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは各種微生物の溶媒耐性を溶媒毒性指標値を用いて検討している中で、それぞれの微生物はその微生物に固有の溶媒耐性度（生育限界logＰ値）を有しているとの知見を得た。そこで、本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、固有の生育限界logＰ値を有する有機溶媒耐性微生物を取得、選定し、この微生物を指標微生物として利用することにより、多成分系有機液体混合物の毒性を定量的に且つ簡便に評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）指標微生物として特定の生育限界logＰ値を有する微生物を用い、該指標微生物を多成分系有機液体混合物の存在下で培養し、該指標微生物が生育可能かどうかを評価することを含む多成分系有機液体混合物の毒性の評価方法。
（２）指標微生物として異なる生育限界logＰ値を有する微生物を複数用いる前記（１）記載の評価方法。
（３）前記多成分系有機液体混合物の毒性をlogＰ値として評価する前記（１）又は（２）記載の評価方法。
（４）生育限界logＰ値が２．０〜７．０である微生物を指標微生物として用いる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法。
（５）指標微生物が、シュードモナス（Pseudomonas）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、プロテウス（Proteus）属、バチルス（Bacillus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ストレプトコッカス（Storeptococcus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アルテロモナス（Alteromonas）属、マイクロコッカス（Micrococcus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、カンジダ（Candida）属、ピッチア（Pichia）属、ハンゼニュラ（Hansenula）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、クロエッケラ（Kloekera）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、又はトルロプシス（Tolulopsis）属に属する微生物である前記（４）記載の評価方法。
（６）指標微生物として異なる生育限界logＰ値を有する微生物を複数含む、多成分系有機液体混合物の毒性評価用キット。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の方法について詳細に説明する。
本発明は、微生物はそれぞれの微生物に固有の生育限界logＰ値（有機溶媒耐性度）を有するという本発明者等が見出した特性を利用するものであり、この特性を利用することにより、従来は定量が極めて困難であった多成分系有機液体混合物の毒性やlogＰを容易に且つ正確に評価することができる。
【００１５】
微生物はそれぞれの微生物に固有の生育限界logＰ値を有する。「生育限界logＰ値」とは微生物の有機溶媒等に対する耐性度又は抵抗性を表す指標であり、その微生物が生育又は生存することのできるlogＰの下限値のことをいう。生育限界logＰ値が小さい微生物ほど、有機溶媒等に対する耐性や抵抗性が強い微生物であるといえる。
【００１６】
本発明で用いることのできる微生物としては特に限定されるものではなく、例えば細菌、酵母、カビ等何れのものでも用いることができる。
【００１７】
細菌としては、例えばシュードモナス（Pseudomonas）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、プロテウス（Proteus）属、バチルス（Bacillus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ストレプトコッカス（Storeptococcus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アルテロモナス（Alteromonas）属、マイクロコッカス（Micrococcus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属又はラクトバチルス（Lactobacillus）属等に属する細菌が挙げられる。また、酵母としては、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、カンジダ（Candida）属、ピッチア（Pichia）属、ハンゼニュラ（Hansenula）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、クロエッケラ（Kloekera）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属又はトルロプシス（Tolulopsis）属等に属する酵母が挙げられる。
【００１８】
また、有機溶媒に耐性（抵抗性）を有する微生物が好ましく、特に生育限界logＰ値が２．０〜７．０である有機溶媒耐性微生物が好ましい。
【００１９】
特定の生育限界logＰ値を有する有機溶媒耐性微生物は、例えば、自然界に存在する微生物から公知のスクリーニング技術により得ることもできるし、或いは、公知の遺伝子工学技術又は突然変異等により有機溶媒耐性微生物を得ることもできる。また、微生物保存機関に寄託された公知菌株（標準株）からも有機溶媒耐性菌を得ることもできる。
【００２０】
本発明の方法では上述の微生物を多成分系有機液体混合物の毒性を評価するための指標微生物として用い、これを多成分系有機液体混合物の存在下で培養し、その指標微生物が当該多成分系有機液体混合物の存在下で生育可能かどうかを観察・評価する。
【００２１】
本明細書でいう多成分系有機液体混合物とは、２種以上の有機物成分を含有する液状の混合物のことをいう。このような多成分系有機液体混合物としては、例えば、２種以上の有機溶媒を含有する混合溶媒、多種多用な炭化水素類等を含む原油や灯油、潤滑油等の石油製品類、サラダ油やオリーブ油等の食用油・油脂類等が挙げられる。また、本発明の方法で適用できる多成分系有機液体混合物としては、均一な溶液の形態のものに限られるものではなく、エマルジョンや２相以上に相分離したような不均一系のものや、水を含有するものも適用することができる。
【００２２】
本発明では、毒性(logP値)を測定しようとする多成分系有機液体混合物の存在下で特定の生育限界logＰ値を有する指標微生物の培養操作を行い、その指標微生物が多成分系有機液体混合物の存在下で生育可能かどうかを観察・評価する。
【００２３】
培養方法としては、通常の微生物培養と同様にして行なうことができ、例えば、液内培養又は平板寒天培養を用いて、指標微生物を接種し、そこに毒性を評価しようとする測定試料（多成分系有機液体混合物）を指標微生物が浸る程度に添加する。また、微生物の栄養源として資化可能なもの、例えば、マルトース、グリセロール、グルコース、フルクトース等の単糖類、少糖類等の炭素源、さらに塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス等の有機窒素源、その他りん酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等の無機塩類等を培地構成成分として添加してもよい。その他の培養条件としては、pHは通常３〜１０、好ましくは６〜８で、温度は１０〜５０℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で２〜７日間とする。
【００２４】
上述のようにして特定の生育限界logＰ値を有する指標微生物を、毒性やlogＰ値を測定しようとする多成分系有機液体混合物の存在下で培養したときに、当該多成分系有機液体混合物存在下で指標微生物が生育可能かどうかを視覚的に確認して評価し、その指標微生物が生育可能と判断されれば当該多成分系有機液体混合物の毒性指標logＰ値はその指標微生物の生育限界logＰ値よりも大きい値であると推測・評価できる。逆に、その指標微生物が生育不可能な場合は、該多成分系有機液体混合物の毒性指標logＰ値はその指標微生物の生育限界logＰ値よりも小さい値であると推測・評価できる。
【００２５】
また、例えば以下の表２に示すような、異なる生育限界logＰ値を有する指標微生物を複数（２つ以上）選択して用いることにより、多成分系有機液体混合物の毒性指標logＰ値をより正確に評価することができる。
【００２６】
【表２】
0004181838.tif 000005
【００２７】
上の表２に示したような、異なる生育限界logＰ値を有する指標微生物を複数選択して用いて、それぞれの指標微生物について毒性を評価しようとする多成分系有機液体混合物の存在下で先に述べたような培養操作を行い、各指標微生物が生育可能かどうか観察・評価する。例えば、表２の指標微生物を用いて培養試験を行った結果、下記の表３に示すように生育限界logＰ値が4.5以下であるNo.1〜No.11の指標微生物は生育可能であるが、生育限界logＰ値が4.8以上であるNo.12〜No.19の指標微生物は生育不可能であることが確認された場合、この多成分系有機液体混合物の毒性指標logＰ値は、生育可能微生物群と生育不可能微生物群との境界の生育限界logＰ値である4.5に相当すると評価することができる。
【００２８】
【表３】
0004181838.tif 000006
【００２９】
このように、異なる生育限界logＰ値を有する指標微生物を複数選択して用いて試験することにより、多成分系有機液体混合物の毒性をlogＰ値として正確に且つ簡便に評価することができる。また、このような異なる生育限界logＰ値を有する指標微生物を複数含むキットとすることもできる。
【００３０】
本発明の方法により、従来は困難であった混合有機溶媒、原油や石油製品等の多成分系有機液体混合物の毒性指標logＰ値を簡便に且つ正確に定量することが可能となる。また、本発明の方法は、二相系、微水系バイオリアクターにおける溶媒の選択、殺菌剤、抗菌剤等の選択においても有用である。
【００３１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００３２】
本実施例では指標微生物として下記表４に示す微生物を用いた。
【表４】
0004181838.tif 000007
【００３３】
（実施例１）混合有機溶媒のlogＰ値の評価
p-キシレン、デカン及びノナンを種々の比率で含む３成分混合有機溶媒のlogＰ値を評価した。表４に示す各指標微生物について、表記有機溶媒を各々の指定濃度（％ v/v）になるような混合有機溶媒に調製し、該指標微生物を寒天平板上に各々塗布したのち、上記混合有機溶媒を寒天平板上に注入した。混合有機溶媒が拡散しないように施したのち、30℃の恒温槽にて３〜５日間培養した。培養終了後、各指標微生物の生育しているか否かを視覚的に確認し、３成分混合有機溶媒のlogＰ値を評価した。その結果を以下の表５に示す。
【００３４】
【表５】
0004181838.tif 000008
【００３５】
（実施例２）
多成分系混合有機液体混合物試料として原油（アラビアンミディアム、アタカ原油）、ガソリン、食用油（サラダ油）を用い、これらのlogＰ値を評価した。指標微生物としては表４に示す微生物のうち生育限界logＰ値が2.9〜5.1のものを用いた。実施例１と同様にして、各有機液体混合物試料の存在下で各指標微生物を培養し、培養後の生育度を視覚的に確認した。その結果を表６に示す。
【００３６】
【表６】
0004181838.tif 000009
【００３７】
上記表６の結果より、アラビアンミディアム及び食用油のlogＰ値は5.1以上であることがわかった。また、アタカ原油及びサラダ油のlogＰ値はそれぞれ4.5及び3.1であった。
【００３８】
（実施例３）
下記に示す多成分系有機液体混合物を試料として用いた。
油脂類
サラダ油
オリーブ油
オリーブ油（エキストラバージン）
潤滑油
ギア−潤滑油
エンジンオイル
石油製品
ガソリン（レギュラー）
灯油
原油
アラビアンミディアム原油
アラビアンライト原油
オマーン原油
アタカ原油
カタールマリーン原油
アタカ原油
ミリーライト原油
阿賀北沖原油
【００３９】
実施例２で用いたのと同様の指標微生物及び上記各多成分系有機液体混合物を用いて実施例２と同様に培養して各指標微生物の生育度について確認し、上記各多成分系有機液体混合物のlogＰ値を評価した。その結果を以下の表７に示す。
【００４０】
【表７】
0004181838.tif 000010
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、多成分系の混合有機溶媒、油脂類、潤滑油、石油製品類及び原油等の多成分系有機液体混合物の毒性を容易に且つ定量的に推定することが可能となった。これらの知見は抗菌性の潤滑油や食用油などの設計、微水系バイオリアクターの反応溶媒の選択や反応系の制御、微生物反応系の評価などに有用である。