(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・ツベルクロシス（M. tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボビス（M. bovis）、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（M. bovis BCG）およびマイコバクテリウム・アフリカナム（M. africanum）のいずれかの存在を検出するための、
配列：GGTAGCGCTGAGACATATCCTCCまたは該配列に相補的な配列、および
配列：CAGAACTCCACACCCCCGAAGまたは該配列に相補的な配列
からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブおよびヘルパープローブを含むプローブ混合物。
【請求項３】
ヘルパープローブが配列番号３または４で示されるオリゴヌクレオチド配列または該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである請求項２に記載のプローブ混合物。
【請求項４】
ヘルパープローブが配列番号５、６、７または８で示されるオリゴヌクレオチド配列または該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである請求項２に記載のプローブ混合物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、唾液、尿、血液および組織切片、食物、土壌および水などの試験試料中から目的生物［マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium Tuberculosis）複合体（ＴＢ複合体）］を検出しうる核酸プローブの設計と構築に関する。
発明の背景
ヌクレオチド［アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）などの塩基を含む］で形成されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の２つの一本鎖は、会合（ハイブリダイズ）して、相補的塩基間の水素結合によって２本鎖が互いに結合する２本鎖構造を形成しうる。一般に、ＡはＴまたはＵと水素結合を形成し、一方ＧはＣと水素結合を形成する。したがって、鎖のいずれの位置においても、代表的な塩基対、ＡＴもしくはＡＵ、ＴＡもしくはＵＡ、ＧＣ、またはＣＧが存在する。ＡＧ、ＧＵおよびその他の“ゆらぎ”または不適正塩基対が存在することもある。
第１の一本鎖の核酸が第２の一本鎖の核酸に対して充分な数の隣接する相補的塩基を含有し、その２本の鎖がそれらのハイブリダイゼーションが促進されるような条件下に置かれる場合に二本鎖の核酸が得られる。適当な条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成される。
一般に、プローブとは、検出しようとする核酸配列（標的配列）と、ある程度相補的である一本鎖の核酸配列である。プローブは放射性同位体、抗体または化学発光性部分などの検出可能な部分で標識されていてもよい。特定の核酸配列を検出するための操作としての核酸ハイブリダイゼーションの用途に関する背景が、コーネ（Kohne）の米国特許第４８５１３３０号および「非ウイルス生物の検出および／または定量用核酸プローブ」と題するホーガン（Hogan）らのＥＰＯ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９に記載されている。
ホーガンらの文献（前記）には、ＲＮＡを持つ生物を含む試料中の該生物の存在の測定法も記載されている。これらの方法は、一種またはそれ以上の非ウイルス生物または非ウイルス生物の群のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）にハイブリダイズするための充分な相補性をもつプローブを必要とする。そして、特定のハイブリダイゼーション条件下で混合物をインキュベートし、該プローブとすべての試験試料ｒＲＮＡとのハイブリダイゼーションをアッセイする。
ホーガンらの文献には、多数の非類縁関係の生物の存在下、または公知の系統分類学上最も近縁の生物の存在下においてさえも、特定の生物または生物群中の特別の標的ｒＲＮＡサブユニット配列のみを検出するプローブも記載されている。マイコバクテリウム・ツベルクロシス用の特殊なハイブリダイゼーションアッセイプローブが例示されている。このようなプローブ配列は、適当なハイブリダイゼーション緊縮条件下で、他の細菌種または感染媒介者由来の核酸と交差反応することはない。
発明の要約
本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（ＴＢ）を検出するための新規プローブを提供する。これらのプローブはマイコバクテリウム・ツベルクロシス複合体と公知の系統分類学上最も近縁の生物とを区別することができる。マイコバクテリウム・ツベルクロシス複合体は、次に挙げる種から構成される：マイコバクテリウム・ツベルクロシス（M. tuberculosis）,マイコバクテリウム・ボビス（M. bovis）,マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（M. bovis BCG）,マイコバクテリウム・アフリカナム（M. africanum）,マイコバクテリウム・ミクロチ（M. microti）。これらのプローブは、独特のｒＲＮＡおよびｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を検出し、マイコバクテリウム・ツベルクロシス複合体の検出および／または定量用アッセイに用いることができる。
ＴＢ複合体は、ヒトにおける罹病率および死亡率の高い生物体である。マイコバクテリウム・ツベルクロシスはヒトから単離される最も一般的なＴＢ複合体の病原体である。マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧは、感染した動物からヒトへ伝染する。マイコバクテリウム・アフリカナムは、熱帯地方であるアフリカにおいて肺結核の原因となり、マイコバクテリウム・ミクロチはまず最初に動物に感染する。
結核は伝染性が高く、したがって病気の迅速な診断が重要である。分離株がマイコバクテリウム・ツベルクロシス以外の種であるという確率は非常に小さいので、ほとんどの臨床研究所に対して、ＴＢ複合体のための分離株は十分に行き渡っている。さらに細菌の分化が必要な場合には、一連の生化学的試験を行って、ＴＢ複合体のメンバーについて種形成をする。
マイコバクテリアを同定する代表的方法においては、検体を酸耐性杆菌で汚染し、次いで培養し、生化学的試験を行う。これらの標準的方法を用いると、分離株を種形成するには２カ月という長期間を必要とする。本発明のＤＮＡプローブを用いることにより、培養物から単離されたＴＢ複合体を、より短い時間で同定することができる。
したがって、本発明の第１の局面は、他のマイコバクテリウム種からマイコバクテリウム・ツベルクロシスを区別しうるハイブリダイゼーションアッセイプローブであり、さらに詳しくは、該プローブは、大腸菌の２３ＳｒＲＮＡの第２７０塩基の等価物で開始する挿入領域における２３個の塩基または大腸菌の２３ＳｒＲＮＡの第１４１５塩基の等価物で開始する挿入領域における２１個の塩基に対応する位置でマイコバクテリウム・ツベルクロシス種のｒＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはそれらに相補的なオリゴヌクレオチドである；すなわち、配列（配列番号１）GGTAGCGCTGAGACATATCCTCCまたは（配列番号２）CAGAACTCCACACCCCCGAAGを含むオリゴヌクレオチドまたは本質的にその配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその配列からなるオリゴヌクレオチド、またはそれらに相補的なオリゴヌクレオチドであり、後述するように、それらはヘルパープローブを持つ場合と持たない場合がある。
“本質的にその配列からなる”とは、プローブが緊縮ハイブリダイゼーション条件下で所望の生物とハイブリダイズするかまたは他の類縁生物とハイブリダイズしないような精製された核酸として提供されることを意味する。このようなプローブは、このようなハイブリダイゼーションに影響を与えない他の核酸と結合してもよい。一般に、プローブのサイズは、好ましくは１５〜１００（最も好ましくは２０〜５０）塩基である。しかし、該プローブはベクターとして使用されてもよい。
本発明のその他の局面は、上記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしうるヌクレオチドポリマー、上記オリゴヌクレオチドと形成された核酸ハイブリッド、および実質的にそれらに相補的な核酸配列である。このようなハイブリッドは、ＴＢ複合体生物を特異的に検出しうるので有用である。
本発明のプローブは、細菌コロニーにおいて、マイコバクテリウム・ツベルクロシス複合体のすべての種および株に特有な特異的ｒＲＮＡ配列の存在の迅速かつ非従属的な同定法および定量法を提供する。
本発明のその他の特徴および利点は、次に述べる好ましい具体例の記載および請求の範囲から明らかとなろう。
好ましい具体例の記載
プローブ
我々は、マイコバクテリウム・ツベルクロシスから得られた特定のｒＲＮＡ配列と相補的なＤＮＡプローブを発見した。さらに、我々は、それらのプローブをマイコバクテリウム・ツベルクロシスを検出するための特異的アッセイに用いることに成功し、マイコバクテリウム・ツベルクロシス複合体のメンバーをそれらの公知であり、おそらく分類学または系統分類学上の最も近縁の生物から区別することができた。我々は、文献に発表された配列と我々が決定した配列の両方のｒＲＮＡ配列の比較分析を行うことによって、標的核酸の好適な可変領域を同定した。本明細書に記載の目的に用いうるコンピューターおよびコンピュータープログラムは市販のものが使用できる。各可変領域（たとえば、最小１０ヌクレオチドの長さ）における配列の進化は、大部分は、分岐進化であって収束進化ではないので、我々は自信を持って、標的生物とその系統分類学上の近縁生物間で異なる少数のｒＲＮＡ配列に基づくプローブを設計することができる。対象のプローブを設計するための同一試料において、標的生物と系統分類学上最も近縁の生物の間に充分な差異がみられた。
我々は次に述べるような、所望の特徴をもつプローブを設計するための有用なガイドラインを確立した。本明細書に記載するようなハイブリダイゼーション反応の範囲および特異性は、多数の因子によって影響を受けるので、１つまたはそれ以上のこれらの因子の取り扱い方が、特別のプローブの正確な感度および特異性を決定するだろう。種々のアッセイ条件（本明細書でさらに説明される）の重要性および影響は、当業者には公知である。
まず第１に、プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性は、アッセイ条件に適合するように選択すべきである。これは、ＡおよびＴを多く含む長い配列を避けること、Ｇ：Ｃ塩基対でハイブリッドを終結させること、および適当なＴｍをもつプローブを設計することによって達成される。その長さおよび％Ｇならびに％Ｃが最終アッセイの行われる温度よりも約２〜１０℃高い温度のＴｍ（melting temperature）を得られるように、プローブの開始点および終結点を選択すべきである。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対に比べて水素結合が多いため、より高い熱安定性を示すので、該プローブの塩基組成は重要である。したがって、Ｇ−Ｃ含量が、比較的多い相補的核酸を用いるハイブリダイゼーションは、比較的高温において安定である。
イオン強度およびインキュベーション温度などのプローブ使用時の条件もまたプローブの構築において考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増加するとハイブリダイゼーションが増加すること、およびイオン強度が増加するとハイブリッドの熱安定性が増加することが知られている。一方、ホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコール類などの水素結合を破断する化学試薬は、ハイブリダイゼーションの緊縮性を増加する。このような試薬による水素結合の不安定化によってＴｍは大きく低下される。一般に、約１０〜５０塩基の長さの合成オリゴヌクレオチドプローブに対する最適ハイブリダイゼーションは、得られる２重体の融解温度（Ｔｍ）より約５℃低い温度で起こる。最適温度以下の温度でインキュベーションを行うと、不適正塩基配列でハイブリダイズが生じ、したがって特異性が低くなる。
高緊縮条件下においてのみハイブリダイズするプローブを得ることが望ましい。高緊縮条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッドが形成される（すなわち、隣接する一連の相補的塩基において１７塩基のうち少なくとも約１４塩基が相補的なハイブリッド）；相補性が充分でないとハイブリッドが形成されない。したがって、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要とされた相補性の量は、アッセイ条件の緊縮性によって決定される。緊縮性は、標的核酸において形成されたハイブリッドと非標的核酸において形成されたハイブリッドの安定性の差異が最大となるように選択する。
第２に、プローブは、プローブ：非標的核酸のハイブリッドの安定性が最小となるように位置させるべきである。これは、非標的生物に対して完全に相補的である部分の長さを最小化すること、非標的配列に対して相同性のある領域がＧおよびＣが多く含まれるのを避けること、できるだけ多くの不適正配列（不安定化を増加させる）に、該プローブが広がるように位置させることによって達成される。プローブ配列が特定のタイプの生物のみを検出するのに有用であるかどうかは、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドの間の熱安定性の差異に大きく依存する。設計するプローブにおいて、これらのＴｍ値における差異はできるだけ大きくすべきである（たとえば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）。
標的核酸配列の長さ、すなわち、プローブ配列の長さもまた重要である。所望のハイブリダイゼーション特性をもつプローブが得られるような、位置および長さの異なる特定の領域由来の数個の配列が存在しうる場合がある。その他の場合、ひとつの配列は、わずか１塩基のみの差異で、もう一つの配列よりも非常に望ましいものとなる。完全には相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるけれども、通常第１に、最も長い区間の完全に相同な塩基配列によって、ハイブリッドの安定性が決定される。長さおよび塩基組成の異なるオリゴヌクレオチドプローブも使用できるけれども、本発明において好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、長さ約１０〜５０塩基であり、標的核酸に対して充分に相同なプローブである。
第３に、ハイブリダイゼーションを抑制する、強い内部構造を形成することが知られているｒＲＮＡの領域は余り好ましくない。同様に、広範な自己相補性をもつプローブはさけるべきである。
上記にて説明したように、ハイブリダイゼーションとは、２つの相補的な一本鎖の核酸が会合して水素結合した二本鎖を形成することである。該２つの鎖のうちの一つが完全にあるいは部分的に、あるハイブリッドに含まれるなら、それが新しいハイブリッドの形成に関与しにくいことは明白である。ｒＲＮＡの場合、その分子が非常に安定した分子内ハイブリッドを形成することが知られている。対象配列の実質的な部分が一本鎖であるようにプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および範囲を大きく増加することができる。標的配列がｒＲＮＡに対応するゲノム配列であり、２本鎖の形で自然に発生するならば、これもまたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の産物である。これらの２本鎖の標的は、当然プローブでのハイブリダイゼーションを阻止するものである。最後に、充分な自己相補性があるならば、分子内および分子間ハイブリッドがプローブ内に形成される。このような構造は、プローブ設計を注意深く行うことによって回避することができる。コンピュータープログラムを利用して、このタイプの相互作用を調べることができる。
標的生物に独特の配列を同定した後、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを生産する。この一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション反応におけるプローブとして適用する。シアノエチルホスホルアミダイト前駆体などを用いる自動固相化学合成などの幾つかのよく知られた方法のうちのいずれかによって、限定されたオリゴヌクレオチドを生産することができる［バロン（Barone）らの「Nucleic Acids Research」,１２,４０５１（１９８４年）参照］。もちろんその他の公知の合成ヌクレオチド構築方法を用いてもよい［サムブルック（Sambrook）らの「Molecular Cloning」,２,１１,第２版（１９８９年）参照］。
合成した後、選択されたオリゴヌクレオチドプローブを公知の方法のいずれかによって標識してもよい（前述のサムブルックらの文献を参照）。有用な標識は、放射性同位体および標識放射性のレポーター基である。放射性同位体標識としては、3Ｈ、35Ｓ、32Ｐ、125Ｉ、コバルトおよび14Ｃが挙げられる。ほとんどの同位体標識法において酵素が使用され、ニックトランスレーション、末端ラベリング、第２鎖合成および逆転写などの公知の方法を用いることができる。放射標識したプローブを用いる場合、オートラジオグラフィー、シンチレーション計数またはガンマ線計数によってハイブリダイゼーションを検出する。検出法は、ハイブリダイゼーションの条件と標識に用いた特定の放射性同位体に応じて選択する。
非同位体材料を用いて標識してもよく、それは配列の内部または配列の末端に導入される。修飾されたヌクレオチドを酵素的または化学的に結合してもよく、また、プローブの合成中または合成後に、たとえば非ヌクレオチドリンカーグループを用いてプローブの化学的修飾を行ってもよい。非同位体標識としては、蛍光分子、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたはその他のリガンドが挙げられる。現在のところ、我々はアクリジニウムエステルを好んで使用している。
特定のオリゴヌクレオチド配列の合成および精製に続いて、幾つかの操作を行って最終生成物の容認性を決定する。まず最初は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてサイズを決定する（前述のサムブルックらの文献を参照）。このような操作は公知である。ポリアクリルアミドゲル電気泳動に加えて、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）操作を行って、オリゴヌクレオチドのサイズと純度を決定してもよい。これらの操作もまた当業者には公知である。
熱安定性に影響を与える因子がプローブの特異性に影響を与え、それゆえにその因子を制御しなければならないことは当業者には理解されよう。したがって、オリゴヌクレオチド／標的のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を含めた融解プロフィールを決定すべきである。本発明の参考文献であるアーノルド（Arnold）らのＰＣＴ／ＵＳ８８／０３１９５（１９８８年９月２１日出願）“ホモジニアス・プロテクション・アッセイ（Homogeneous Protection Assay）”に好ましい方法が記載されている。ハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（ＨＰＡ）を用いてＴｍを測定するために、次に述べる技術を利用する。ラウリル硫酸リチウムを含有するコハク酸リチウム緩衝液中で、標的過剰にてプローブ：標的ハイブリッドを形成する。このハイブリッドのアリコートをハイブリダイゼーション緩衝液で希釈し、予想のＴｍ（代表的には５５℃）以下の温度から出発し、２〜５度ずつ上昇させて５分間インキュベートする。次いで、この溶液を弱アルカリ性のホウ酸塩緩衝液で希釈し、低温（５０℃など）で１０分間インキュベートする。これらの条件下、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルを加水分解するが、ハイブリダイズされたプローブに結合したアクリジニウムエステルは相対的に加水分解から保護される。残りの化学発光量はハイブリッドの量に比例しており、過酸化水素およびアルカリを加えてルミノメーターで測定する。温度に対する最大シグナルのパーセントとしてデータをプロットする（通常最低温からプロットする）。最大シグナルの５０％が残る温度をＴｍとする。
上記方法に加えて、当業者に公知の同位体法によってオリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドの融解温度を決定してもよい。熱安定性は種々の塩、界面活性剤および熱変性中に相対的なハイブリッド安定性をもたらすその他の溶質の濃度に依存するので、得られたハイブリッドのＴｍが、使用されるハイブリダイゼーション溶液に依存して変化することに注意すべきである（前述のサムブルックらの文献を参照）。
ハイブリダイゼーション率はＣ0ｔ1/2を決定することにより測定する。プローブがその標的にハイブリダイズする率は、プローブ領域における標的の２次構造の熱安定性の尺度である。ハイブリダイゼーション率の標準の測定値は、ヌクレオチドのモル数／リットル・回数・秒として測定されるＣ0ｔ1/2である。このように、標準のハイブリダイゼーション率は、その濃度におけるハイブリダイゼーションの半減期を決めるプローブの濃度である。この値は種々の量のプローブを一定量のハイブリッドに一定の時間ハイブリダイズすることによって決定される。たとえば、０.０５pmolの標的を０.００１２、０.０２５、０.０５、０.１および０.２pmolのプローブとともに３０分間インキュベートする。３０分後のハイブリッドの量を前記ＨＰＡにより測定する。次いで、プローブの濃度（ヌクレオチドのモル数／リットル）に対する最大リレイティブ・ライト・ユニット（Relative Light Units）のパーセントとしてシグナルをプロットする。ＲＬＵとは、ルミノメーターによって測定される、標識プローブから放出される光子量の測定値である。Ｃ0ｔ1/2は、ハイブリダイゼーション時間（秒）×最大ハイブリダイゼーションの５０％に対応する濃度からグラフを用いて割り出せる。これらの値は９.０×１０-6から９×１０-5の範囲であり、３.５×１０-5以下の値が好ましい。
本発明の参考文献であるコーネ（Kohne）およびカシアン（Kacian）の（ＥＰ８６３０４４２９.３、１９８６年６月１０日出願）に記載されているように、その他の核酸再会合法を用いることもできる。
次の実施例は、標的生物であるマイコバクテリウム・ツベルクロシスに独特のｒＲＮＡ配列またはその対応遺伝子に相補的な合成プローブ、およびハイブリダイゼーションアッセイにおけるその用途を述べたものである。
実施例：
１６ＳｒＲＮＡに相補的なプライマーを用いるシーケンシングによってマイコバクテリウム・ツベルクロシスに特異的なプローブを同定した。次の配列がマイコバクテリウム・ツベルクロシスを特徴づけるものであり、特異的にみられるものである；（配列番号１）GGTAGCGCTGAGACATATCCTCCおよび（配列番号２）ＣAGAACTCCACACCCCCGAAG。マイコバクテリウム・カンサシイ（M. kansasii）、マイコバクテリウム・アジアチカム（M. asiaticum）およびマイコバクテリウム・アビウム（M. avium）などの幾つかの系統分類学的に近い近縁生物を、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの該配列との比較のために用いた。配列番号１は塩基２３個の長さであり、大腸菌の第２７０〜２９３番目の塩基に対応するマイコバクテリウム・ツベルクロシスの２３ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする。配列番号２は塩基２１個の長さであり、大腸菌の第１４１５〜１４３６番目の塩基に対応するマイコバクテリウム・ツベルクロシスの２３ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする。該プローブのマイコバクテリウム・ツベルクロシスに対する反応性および特異性を説明するために、ハイブリダイゼーションアッセイを行った。まず始めに、該プローブを非ヌクレオチドリンカーを用いて合成し、次いで、１９８８年１０月５日出願のＥＰＯ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／０３３６１「核酸プローブのアクリジニウムエステル標識および精製」に記載されている化学発光性アクリジニウムエステルで標識した。ハイブリダイズしたプローブに結合したアクリジニウムエステルは相対的にアルカリ耐性があるが、まだハイブリダイズしていないプローブに結合したアクリジニウムエステルは弱アルカリ性条件下で非化学発光性にされている。したがって、アルカリ性緩衝液中でインキュベーションすることによってアクリジニウムエステル標識プローブのハイブリダイゼーションをアッセイすることが可能である。結果は、ルミノメーターで測定される、標識プローブから放出される光子の量を示す、ＲＬＵによって得られる。ハイブリダイゼーション、加水分解および検出条件は、アーノルドらの「Clin. Chem.」,３５,１５８８（１９８９年）に記載されている。
本発明の参考文献である、ホーガン（Hogen）らの米国特許第５０３０５５７号に記載されている“ヘルパープローブ”を用いることにより、核酸ハイブリダイゼーションが増強された。非標識ヘルパープローブの存在下、ＲＮＡがアクリジニウムエステル標識プローブにハイブリダイズされた。配列番号１のオリゴヌクレオチドに対応する該プローブは、
（配列番号３）CCGCTAACCA CGACACTTTC TGTACTGCCT CTCAGCCG
および
（配列番号４）CACAACCCCG CACACACAAC CCCTACCCGG TTACCC
のヘルパーを含む。
配列番号２のオリゴヌクレオチドに対応する該プローブは、
（配列番号５）TGATTCGTCA CGGGCGCCCA CACACGGGTA CGGGAATATC AACCC
（配列番号６）CTACTACCAG CCGAAGTTCC CACGCAGCCC
（配列番号７）GGAGTTGATC GATCCGGTTT TGGGTGGTTA GTACCGC
（配列番号８）GGGGTACGGG CCGTGTGTGT GCTCGCTAGA GGCTTTTCTT GGC
のヘルパーを含む。
次の実験では、ひとつのコロニーまたは＞１０8の生物から放出されたＲＮＡのアッセイを行った。本発明の参考文献であるマーフィー（Murphy）らのＥＰ８７３０６４１２（１９８７年４月２４日出願）に記載されている実験方法に準じて実験を行った。ＲＬＵ値が３００００ＲＬＵ以上の場合は正の反応であり、３００００以下の場合は負の反応である。
次のデータは、プローブが広範囲の系統分類学的に近縁の生物群と交差反応しなかったことを示す。これらの生物試料は、正の調節を与える非常に広い特異性をもつプローブによる試験も行った（全細菌に対して）。このプローブからの正のシグナルは試料を確認するのに充分な量である。
0004090498.tif 000002
0004090498.tif 000003
0004090498.tif 000004
0004090498.tif 000005
上記データにより、本明細書に記載した新規プローブがマイコバクテリウム・ツベルクロシス複合体のメンバーを公知の系統分類学上の最も近い近隣生物種から区別することができることが確認される。
その他の具体例は後記請求の範囲に記載する。
配列表
（1）一般的情報：
（i）特許出願人：フィリップ・ダブリュー・ハモンド
（ii）発明の名称：マイコバクテリウム・ツベルクロシス用核酸プローブ
（iii）配列の数：８
（iv）連絡先：
（A）名宛人：ライオン・アンド・ライオン
（B）通り：ウエスト・シックスス・ストリート番
（C）市：ロサンゼルス
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）ＺＩＰ：９００１７
（v）コンピューター解読書式：
（A）媒体型：３.５”ディスケット,１.４４Ｍｂストレージ
（B）コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２モデル５０Ｚまたは５５ＳＸ
（C）オペレーティング・システム：ＩＢＭ Ｐ.Ｃ.（Version３.３０）
（D）ソフトウェア：WordPerfect（Version５.０）
（vi）本出願のデータ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）前出願のデータ：
下記の出願を含めた前出願の合計数：なし
（A）出願番号：
（B）出願日：
（viii）弁理士／代理人情報：
（A）氏名：ウォーバーグ,リチャード・ジェイ
（B）登録番号：３２,３２７
（C）参照／整理番号：１９７／２６０
（ix）電話連絡先情報：
（A）電話番号：（２１３）４８９−１６００
（B）ファックス番号：（２１３）９５５−０４４０
（C）テレックス番号：６７−３５１０
（2）配列番号１の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２３
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号１
0004090498.tif 000006
（3）配列番号２の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２１
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号２
0004090498.tif 000007
（4）配列番号３の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号３
0004090498.tif 000008
（5）配列番号４の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３６
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号４
0004090498.tif 000009
（6）配列番号５の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：４５
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号５
0004090498.tif 000010
（7）配列番号６の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号６
0004090498.tif 000011
（8）配列番号７の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３７
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号７
0004090498.tif 000012
（9）配列番号８の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：４３
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列：配列番号８
0004090498.tif 000013