(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−層−タンパク質の製造方法において、
（ａ）  Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸：
（ｉ）  場合によりシグナルペプチドをコードする断片なしの、配列番号１中で位置１〜位置３６８４により示されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｉｉ）  遺伝的コードの縮重の範囲内で（ｉ）からの核酸に一致するヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）及び／又は（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸、
から選択される核酸で形質転換されたグラム陰性の原核性宿主細胞を準備し、
（ｂ）  この宿主細胞を、核酸の発現及びそれによりコードされたポリペプチドの産生を引き起こすような条件下で培養し、
（ｃ）  生じたポリペプチドをこの宿主細胞から得ることを特徴とする、Ｓ−層−タンパク質の製造方法。
【請求項２】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドを、組み立てられたＳ−層−構造の形で宿主細胞の内部から得る、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸が、ペプチド配列又はポリペプチド配列をコードする１つ以上の挿入体を含有する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
挿入体が、システイン基、複数の荷電アミノ酸又はＴｙｒ基を有する領域、ＤＮＡ結合性エピトープ、金属結合性エピトープ、免疫原性エピトープ、アレルゲン性エピトープ、抗原エピトープ、ストレプトアビジン、酵素、サイトカイン又は抗体結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列から選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
挿入体がストレプトアビジンをコードする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
挿入体がヘルペスウィルス、特にヘルペスウィルス６又はＦＭＤＶからの免疫原性エピトープをコードする、請求項５記載の方法。
【請求項８】
挿入体が酵素、例えばポリヒドロキシ酪酸シンターゼ又は細菌性ルシフェラーゼをコードする、請求項５記載の方法。
【請求項９】
挿入体がサイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン又は腫瘍壊死因子をコードする、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
挿入体が抗体結合性タンパク質、例えばプロテインＡ又はプロテインＧをコードする、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
挿入体がサイトカイン又はエンドトキシンと結合する抗原エピトープをコードする、請求項５記載の方法。
【請求項１２】
挿入体が金属結合性エピトープをコードする、請求項５記載の方法。
【請求項１３】
Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸の５′側に作動的に連結した形でグラム陽性シグナルペプチドをコードする核酸が配置されている、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
シグナルペプチドをコードする核酸が、
（ａ）  配列番号１で示されたヌクレオチド配列のシグナルペプチドをコードする断片、
（ｂ）  遺伝的コードの縮重の範囲内で（ａ）からの配列に一致するヌクレオチド配列及び／又は
（ｃ）  （ａ）及び／又は（ｂ）からの配列に少なくとも８０％が相同性のヌクレオチド配列を有する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
組換えＳ−層−タンパク質をコードし、かつ
（ｉ）  場合によりシグナルペプチドをコードする断片なしで、配列番号１の位置１〜３６８４で示されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｉｉ）  遺伝的コードの縮重の範囲内で（ｉ）からの核酸と一致するヌクレオチド配列を有する核酸、及び
（ｉｉｉ）  （ｉ）及び／又は（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸から選択され、その際、この核酸はＳ−層−タンパク質をコードする領域内で少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドをコードする挿入体を含有し、挿入部位が、配列番号１に示されたヌクレオチド配列の位置５８２、８７８、９１７、２５０４及び／又は２６４９に位置決めされている、核酸。
【請求項１６】
請求項１５記載の核酸の少なくとも１個の複製を含有するベクター。
【請求項１７】
請求項１５記載の核酸又は請求項１６記載のベクターで形質転換されていて、細胞がグラム陰性の原核細胞、特にＥ．ｃｏｌｉ細胞である細胞。
【請求項１８】
組換えＳ−層−構造体を含有する請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１５記載の核酸によりコードされた組換えＳ−層−タンパク質。
【請求項２０】
サブユニットとして請求項１９記載の少なくとも１つのタンパク質を含有する、組換えＳ−層−構造体。
【請求項２１】
サブユニットとしてさらに変更していないＳ−層−タンパク質を含有する、請求項２０記載のＳ−層−構造体。
【請求項２２】
複数の共有結合又は親和性結合により相互に結合された層を有する、請求項２０又は２１記載のＳ−層−構造体。
【請求項２３】
請求項１９記載のＳ−層−タンパク質又は請求項２０から２２までのいずれか１項記載のＳ−層−構造体のワクチン又はアジュバントとしての使用。
【請求項２４】
ワクチン又はアジュバントが、さらに、場合により膜内に免疫原性エピトープを含有するバクテリアゴーストを有する、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
請求項１９記載のＳ−層−タンパク質又は請求項２０から２２までのいずれか１項記載のＳ−層−構造体の、酵素リアクターとしての使用。
【請求項２６】
組換えＳ−層−タンパク質の製造方法において、
（ａ）  Ｓ−層タンパク質をコードする領域内にペプチド又はポリペプチドをコードする挿入体を含有するＳ−層−タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を準備し、
（ｂ）  この宿主細胞を、核酸の発現及びこの核酸によりコードされたポリペプチドの産生を引き起こす条件下で培養し、及び
（ｃ）  生じたポリペプチドを宿主細胞又は培養基から得ることを特徴とする、請求項１記載の組換えＳ−層−タンパク質の製造方法。
【請求項２７】
組換えＳ−層−タンパク質をコードする核酸が、
（ｉ）  場合によりシグナルペプチドをコードする断片なしの、配列番号１中で位置１〜３６８４により示されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｉｉ）  遺伝的コードの縮重の範囲内で（ｉ）からの核酸に一致するヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）及び／又は（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸、
から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞中に、さらに変更されていないＳ−層−タンパク質をコードするＳ−層−遺伝子が発現される、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
変更されていないＳ−層−タンパク質が、組換えＳ−層−タンパク質と相容性のＳ−層−構造体を構成することができる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞中で、組換えＳ−層−タンパク質と相容性のＳ−層−構造体を構成することができる変更されていないＳ−層−タンパク質をコードするさらなるＳ−層−遺伝子を発現しない、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項３１】
原核宿主細胞を使用する、請求項２６から３０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
グラム陽性宿主細胞を使用する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ステアロサーモフィラス菌を使用する、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、グラム陰性宿主細胞中でのＳ−層−タンパク質及び変更Ｓ−層−タンパク質の組換えによる製造方法に関する。
結晶性のバクテリア細胞表面層（Ｓ−層）は、多数の真性細菌（Eubakterien）及びたいていの古細菌（Archaebakterien）において、最も外側の細胞壁成分を形成する（Sleytr et al.（1988）, Crystalline Bacterial Cell Surface Layers, Springer Verlag Berlin; Messner and Sleytr, Adv. Mikrob. Physiol. 33（1992）, 213-275）。現在公知のＳ−層−タンパク質のたいていのものは４００００〜２２００００の範囲内の見掛けの分子量を有する同じタンパク質もしくは糖タンパク質から構成されている。Ｓ−層の成分は自己集合し、たいていの格子構造は傾斜対称（schrage Symmetrie）（ｐ２）、立方体対称（quadratische Symmetrie）（ｐ４）又は六角形対称（hexagonale Symmetrie）（ｐ６）を有する。バクテリアＳ−層の機能はなお完全には公知でないが、細胞表面に関するその位置決定に基づき、多孔性結晶性Ｓ−層が主に保護膜、モレキュラーシーブとして又は細胞付着の促進及び表面認識のために役立っている。
微生物からの多様なＳ−層−遺伝子についての遺伝的データ及び配列情報は公知である。この概要はPeyret et al., Mol. Mikrobiol. 9（1993）, 97-109に明らかにされている。このデータに関して明示的に参照される。ステアロサーモフィラス菌（B. stearothermophilus）ＰＶ７２のＳ−層−タンパク質をコードする遺伝子ｓｂｓＡの配列及びこれをクローニングする方法は、Kuen et al.（Gene 145（1994）, 115-120）に記載されている。
ステアロサーモフィラス菌ＰＶ７２は、グラム陽性細菌であり、これは六角形配置のＳ−層で覆われている。このＳ−層の主成分は１２８ｋｂ−タンパク質であり、このタンパク質は、全タンパク質成分の約１５％の割合で細胞中に存在する最多のタンパク質である。Ｓ−層−格子のタイプ、分子量及びＳ−層−成分のグリコシル化に関して区別されている多様な菌株のステアロサーモフィラス菌が特性決定されている（Messner and Sleytr（1992）, supra）。
ドイツ国特許出願第Ｐ４４２５５２７．６号明細書は、ステアロサーモフィラス菌からのＳ−層−遺伝子のシグナルペプチドをコードする断片、及びそれにより誘導されるアミノ酸配列を開示している。このシグナルペプチド及び成熟タンパク質の間の切断部位は、アミノ酸配列の位置３０と３１との間にある。シグナルペプチドをコードする核酸はタンパク質をコードする核酸と作動的に連結され、タンパク質の組換え製造のために、形質転換された宿主細胞を準備し、この宿主細胞を核酸が発現しかつそれによりコードされたポリペプチドを製造及び分泌させる条件下で培養し、及び生じたポリペプチドを培養基から得る方法を使用することができる。宿主細胞として有利に原核生物、特にバチルス（Bacillus）属のグラム陽性生物が挙げられる。
意外にも、Ｓ−層−タンパク質の組換え製造がグラム陽性の原核性宿主細胞中だけでなく、グラム陰性の原核性宿主細胞中でも可能であることが確認された。この場合、Ｓ−層−タンパク質は宿主細胞の内部で不規則の封入体の形ではなく、予想外に規則的な単一分子の層の形で存在する。
従って、本発明の対象は、Ｓ−層−タンパク質の組換え製造方法において、
（ａ）  （ｉ）場合によりシグナルペプチドをコードする断片なしの配列番号１で示された位置１〜３６８４のヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）（ｉ）からの核酸に遺伝的コードの同義性（Degeneration）の範囲内で一致するヌクレオチド配列を含む核酸、及び（ｉｉｉ）（ｉ）及び／又は（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸から選択されるＳ−層−タンパク質をコードする核酸を用いて形質転換されているグラム陰性の原核性宿主細胞を準備し、
（ｂ）  この宿主細胞を、核酸を発現しそれによりコードされるポリペプチドを産生するような条件下で培養し、及び
（ｃ）  生じたポリペプチドを宿主細胞から獲得することを特徴とするＳ−層−タンパク質の組換え製造方法である。
本発明の範囲内で「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という概念は、洗浄後に５５℃、有利に６０℃で、水性のNiedrigsalz緩衝液（例えば０．２ｘＳＳＣ）中でなおハイブリダイゼーションが生じることと解釈される（Sambrook et al.（1989）, Molecular Cloning. A Laboratory Manual参照）。
本発明による方法はグラム陰性の原核性宿主細胞中で実施される。この場合、意外にも細胞内に規則的なＳ−層−タンパク質構造が得られる。有利には、宿主細胞として、腸内細菌、特にＥ．ｃｏｌｉが使用される。特に有利なのはＥ．ｃｏｌｉ菌株ｐｏｐ２１３５であり、この菌株は１９９６年１月３１日にドイッチェン・ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ゲーエムベーハー（Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D 38124 Braunschwieg）に寄託番号ＤＳＭ１０５０９のもとで寄託されている。
本発明による方法は、組換えＳ−層−タンパク質の獲得のためにも使用することができる。このために、Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸を使用し、この核酸はペプチド配列又はポリペプチド配列をコードする１つ以上の挿入体を含有する。この挿入体は一方で少ないアミノ酸、例えば１〜２５個のアミノ酸を有するペプチドをコードすることができるにすぎない。他方ではこの挿入体は、Ｓ−層−タンパク質の能力を正確な折り畳み構造の形成のために失うことなしに、例えば１０００個までのアミノ酸、有利に５００個までのアミノ酸の大きなポリペプチドをコードすることもできる。挿入体の他に、組換えＳ−層−タンパク質はアミノ酸置換、特に挿入位置の範囲内での個々のアミノ酸の置換並びに個々のアミノ酸又は３０個までのアミノ酸の短いアミノ酸断片の欠失があることができる。
ポリペプチドをコードする配列の挿入部位として、有利に配列番号１に示されたヌクレオチド配列の位置１〜１２００及び２２００〜３０００の範囲である。特に有利な挿入部位は、位置５８２のＮｒｕＩ−切断部位、位置８７８のＰｖｕＩＩ−切断部位、位置９１７のＳｎａＢ−Ｉ−切断部位、位置２５０４のＰｖｕＩＩ−切断部位及び位置２６４９のＰｖｕＩＩ切断部位である。ストレプトアビジンをコードする核酸配列の挿入はすでに位置５８１のＮｒｕＩ−切断部位に示すことができる。
ペプチド又はポリペプチドをコードする挿入体は、有利に、システイン基、複数の荷電されたアミノ酸、例えばＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕを有する範囲、又はＴｙｒ基、ＤＮＡ結合エピトープ、抗原性、アレルギー性又は免疫原性エピトープ、金属結合エピトープ、ストレプトアビジン、酵素、サイトカイン又は抗体結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列から選択される。
Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸における挿入体の特に有利な例は、ストレプトアビジンをコードするヌクレオチド配列である。このように、ビオチン化された試薬の結合のため及び免疫による試験方法又はハイブリダイズ試験方法において検出するために適している汎用の担体分子を得ることができる。
挿入体のもう一つの有利な例は、抗原性アレルギー性又は免疫原性エピトープ、例えば病原性微生物、例えばバクテリア、菌類、寄生生物など及びウィルスからのエピトープ、又は植物からのエピトープ又は身体独自の物質、例えばサイトカインに対する並びにトキシン、特にエンドトキシンに対するエピトープである。免疫原性エピトープの特に有利な例は、ヘルペスウィルス、例えばヘルペスウィルス６又は仮性狂犬病ウィルス（Lomniczi et al., J. Virol. 49（1984）, 970-979）からのエピトープ、特に遺伝子ｇＢ、ｇＣ又は／及びｇＤ、又は口蹄疫ウィルスからのエピトープ、特にＶＰ１、ＶＰ２又は／及びＶＰ３をコードする遺伝子断片からのエピトープである。免疫原性エピトープは、抗体を媒介する免疫反応の発生を促進する又は／及び例えばＴ−細胞の刺激による細胞性免疫反応の発生を促進するように選択することができる。適当なアレルギー性エピトープの例は、シラカバ花粉アレルゲン、例えばＢｅｔ ｖ Ｉ（Ebner et al., J. Immunol. 150（1993）1047-1054）。さらに、血清又は体液から体内の又は体外の物質、例えばサイトカイン又はトキシンを結合することができるか又はフィルタリングすることができる抗原性エピトープが特に有利である。この種のエピトープはサイトカインレセプター又はトキシンレセプター又はサイトカイン又はトキシンに対する抗体の成分に含まれる。
他方で、この挿入体は酵素をコードすることもできる。特別な例は、ポリヒドロキシ酪酸の合成のための酵素、例えばＰＨＢ−シンターゼである。ＰＨＢ−シンターゼをＳ−層に組込むことにより、基質の供給の際に、ヒドロキシ酪酸は適当な条件下で分子状の紡糸ノズル
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を生じることができる。酵素のもう一つの有利な例は細菌性ルシフェラーゼである。酵素基質、アルデヒドの供給の際に及びＯ2の存在で分子状のレーザー（molekularer Laser）を得ることができる。
同様に、サイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン又は腫瘍壊死因子をコードする挿入体が有利である。この分子は例えば免疫原性エピトープと組み合わせてワクチンの製造のために使用することもできる。
最後に、抗体結合性タンパク質、例えばプロテイン−Ａ又はプロテイン−Ｇ又はＤＮＡ結合性エピトープ又は／及び金属結合性エピトープ、例えばロイシンジッパー、亜鉛フィンガーなどをコードする挿入体が有利である。
本発明により、最初に原形質中に固定化された組換えポリペプチドを天然の形で、例えば活性酵素の形で含有する細胞が準備される。１ｍ2あたり組換えＳ−層はこの方法で５００００〜２０００００、例えば約１０００００の組換え分子を固定化することができる。１ｋｇあたり組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞は３０００ｍ2までのＳ−層を含有することができる。
有利に、本発明による方法の場合、Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸は、グラム陽性細菌のシグナルペプチドをコードする核酸と作動的に連結した
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で使用するのが有利であり、つまりＳ−層−タンパク質をコードする核酸の５′側にシグナルペプチドをコードする核酸が配置されているのが有利である。つまり、意外にも、本発明により使用されたグラム陰性宿主細胞中で分解されないこの種のシグナルペプチド配列の存在がＳ−層−構造の安定性を改善することができると確認された。シグナルペプチドをコードする核酸が（ａ）  配列番号１で示されたヌクレオチド配列のシグナルペプチドをコードする断片、（ｂ）  遺伝子コードの同義性の範囲内で（ａ）からの配列に一致するヌクレオチド配列又は／及び（ｃ）  （ａ）又は／及び（ｂ）からの配列に対して少なくとも８０％、特に少なくとも９０％が相同のヌクレオチド配列を包含するのが特に有利である。
本発明のもう一つの対象は、（ｉ）  組換えＳ−層−タンパク質をコードする核酸であり、この核酸は場合によりシグナルペプチドをコードする断片なしの、配列番号１に示された位置１〜３６８４のヌクレオチド配列を有する核酸、（ｉｉ）  遺伝子コードの同義性の範囲内で（ｉ）からの核酸に一致するヌクレオチド配列を有する核酸、及び（ｉｉｉ）  （ｉ）又は／及び（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸から選択される。
配列番号１には、シグナルペプチドをコードする断片を含めたステアロサーモフィラス菌からのＳ−層−遺伝子ｓｂｓＡのコードするヌクレオチド配列が示されている。このシグナルペプチドをコードする断片は配列番号１に示されたヌクレオチド配列の１〜９０の位置にある。成熟ＳｂｓＡ−ポリペプチドをコードする断片は９１〜３６８４の位置にある。
ステアロサーモフィラス菌（B. stearothermophilus）のｓｂｓＡ−遺伝子は、３０個のアミノ酸を有するＮ−末端のシグナルペプチドを含めた合計で１２２８個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする（配列番号２）。シグナルペプチドと成熟タンパク質との間の切断部位は、アミノ酸配列の３０と３１との位置の間にある。シグナルペプチドは塩基性のアミノ末端ドメイン（疎水性ドメインに続く）を有する。
他のシグナルペプチドとの配列比較は、桿菌（Bazillen）の細胞外のタンパク質のシグナルペプチドと相同性を示した、例えばB. amyloliquefaciens（Vasantha et al., J. Bacteriol. 159（1984）, 811-819）のアルカリ性のホスファターゼ及び中性のホスファターゼ並びにB. sphaericus-Gen 125（Bowditch et al., J.Bacteriol. 171（1989）, 4178-4188）のシグナルペプチド及びB. brevis（Tsuboi et al., J. Bacteriol. 168（1986）, 365-373）ＯＷＰ−遺伝子と相同性を示した。
本発明のもう一つの対象は、少なくとも本発明による核酸の複製を含有する組換えベクターである。このベクターは有利に原核生物中で複製可能である。特に有利にこのベクターは原核性プラスミドである。
本発明のもう一つの対象は、本発明による核酸又は組換えベクターで形質転換された宿主細胞である。有利に、細胞はグラム陰性の原核生物、最も有利にＥ．ｃｏｌｉ−細胞である。本発明による細胞は、その内部に組換えＳ−層構造を含有することができる。細胞を核酸で形質転換させる方法は、一般的な公知技術（Sambrook et al., supra）であり、従って、詳説する必要はない。
本発明のなおもう一つの対象は、組換えＳ−層−タンパク質であり、このタンパク質は配列番号２中に示されたアミノ酸配列中に少なくともペプチド挿入体又は／及びポリペプチド挿入体を含有する。ペプチド挿入体及びポリペプチド挿入体の例はすでに詳説した。
本発明による組換えＳ−層−タンパク質分子から、サブユニットとして少なくとも１つの本発明による組換えＳ−層−タンパク質を含有する組換えＳ−層−構造体を組み立てることができる。さらに、本発明によるＳ−層−構造体は「希釈分子」として変更していないＳ−層−タンパク質も含有するのが有利である。変更していないＳ−層−タンパク質は全Ｓ−層−タンパク質に関して有利に１０〜９９％のモル比で存在する。
本発明によるＳ−層−構造体は複数の共有結合によるか又は親和性結合により相互に結合した層を包含できる。共有結合は例えばシステイン基の挿入により及び引き続くシステイン架橋の形成により導入することができる。親和性結合による結合は、例えば抗体−、抗原−、抗体−プロテインＡ−もしくは−プロテインＧ−又はストレプトアビジン−ビオチン−相互作用を含める。
組換えＳ−層−タンパク質を含有するＳ−層−構造体は、場合によりなお担体結合した形で製造することもできる。このために、個々の単位からペプチドグリカン担体の存在でＳ−層−構造体を再組立させ、その際、例えばペプチドグリカン層が生じ、この層の片側又は両側がＳ−層−構造体で被覆される。担体結合Ｓ−層−構造体のもう一つの製造方法は、Ｓ−層を２つの媒体、例えば水／空気の間の界面に生じさせ、この層を固相、例えばフィルター膜状に固定する
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ことである。
本発明による組換えＳ−層−タンパク質及びＳ−層−構造体は、多くの適用分野に適している。特に有利なのは、ワクチン又はアジュバントとしての使用であり、この場合、病原体の免疫原性エピトープ及び／又は身体自身の免疫を刺激するポリペプチド、例えばサイトカインを含有する組換えＳ−層−タンパク質が使用される。この適用の場合、組み換えＳ−層−タンパク質の精製が無条件に必要ではない。その代わりに、例えば場合によりその膜内に付加的に免疫原性エピトープを含有するバクテリアゴーストとの組合せで使用を行うことができる。
適当な「バクテリアゴースト」の製造は、例えば国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９１／００９６７に記載されており、これに関してこの明細書が参照される。この明細書には改質されたバクテリアが開示されており、このバクテリアは、グラム陰性バクテリアをバクテリオファージからの溶解性作用を有する膜タンパク質の遺伝子、溶解性作用を有するトキシン−放出タンパク質の遺伝子又は溶解性タンパク質をコードする一部の配列を含有する遺伝子で形質転換し、このバクテリアを培養し、このＬｙｓｅ−遺伝子を発現させ、生じたバクテリアゴーストを培養基から単離することにより得られる。
このバクテリアの膜に、欧州特許第０５１６６５５号明細書に記載されたように、組換えタンパク質が結合することができ、これはこのグラム陰性バクテリア中での組換えＤＮＡの発現により得られる。この組換えＤＮＡは第１のＤＮＡ配列を包含し、このＤＮＡ配列はα−ヘリックス構造を有し、１４〜２０このアミノ酸からなり、Ｎ−末端及びＣ−末端にそれぞれ２〜３０個の任意のアミノ酸が側面に並んでいてもよい疎水性の、溶解性に作用しない膜統合タンパク質ドメインをコードする。この第１のＤＮＡ配列と、所望の組換えタンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列は作動的に連結した状態にある。さらに、グラム陰性バクテリアは第３のＤＮＡ配列を含有し、この配列は第１及び第２のＤＮＡ配列とは別の制御下にあり、かつバクテリオファージからの溶解性作用の膜タンパク質又は溶解性作用のトキシン−放出タンパク質又はその溶解性作用の一部をコードする。この種の組換え、グラム陰性バクテリアの発現及び溶解により、いわゆる「バクテリアゴースト」が得られ、これは表面に結合した免疫原性エピトープを有する完全な表面構造を含有する。
このバクテリアゴーストを本発明による組換えＳ−層と組み合わせた場合、特に有利な特性を示すワクチン及びアジュバントを製造することができる。
組換えＳ−層−タンパク質及びＳ−層−構造体についてのもう一つの特に有利な使用は、酵素リアクターとしての使用である。このような酵素リアクターは例えば、内部に本発明による組換えＳ−層−構造体を含有する細胞により形成される。他方で、この酵素リアクターは、酵素リアクターは単離されかつ試験管内で再組立されたＳ−層−構造体から、又は多様なＳ−層−構造体の組合せから形成することもできる。
グラム陽性バクテリアのステアロサーモフィラス菌（B. Stearoterophilus）ＰＶ７２はＳｂｓＡの他にさらにもう一つのＳ−層−タンパク質（以後ＳｂｓＢと表す）を含有することが確認された。（Sara and Sleytr（1994）, J. Bacteriol. 176, 7182-7189）。適当な核酸プライマーの使用下での増幅により、ｓｂｓＢ−遺伝子を単離し、特性決定することができる。配列番号５において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の位置１〜９３にある断片を含めたステアロサーモフィラス菌からのＳ−層−遺伝子ｓｂｓＢのコードされるヌクレオチド配列を示した。配列番号６にはそれにより誘導されたアミノ酸配列を示した。ｓｂｓＢ−遺伝子は、３１個のアミノ酸を有するＮ−末端のシグナルペプチドを含めた合計で９２１個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする。
従って、本発明の対象は、Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸であり、この核酸は次のものから選択される：
（ｉ）  場合によりシグナルペプチドをコードする断片なしの配列番号５中の位置１〜２７６３に示されたヌクレオチド配列を含有する核酸、
（ｉｉ）  遺伝的コードの同義性の範囲内で（ｉ）からの核酸と一致するヌクレオチド配列を含有する核酸、及び
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は／及び（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する核酸。
ｓｂｓＡ−遺伝子の場合と同様に、ｓｂｓＢ−遺伝子の場合でも、Ｓ−層−タンパク質をコードする範囲内に少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドをコードする核酸挿入体を挿入することもできる。ｓｂｓＢ−遺伝子中での挿入体の有利な例に関しては、ｓｂｓＡ−遺伝子に関してすでに行った説明が参照される。
本発明のもう一つの対象は、場合により挿入体を有するｓｂｓＢ−遺伝子の少なくとも１つの複製を含有するベクターである。このベクターは真核生物、原核生物又は真核生物及び原核生物中で複製可能である。このベクターは宿主細胞のゲノムを統合可能なベクター又は染色体外で存在するベクターであることができる。有利に本発明のベクターはプラスミド、特に原核性のプラスミドである。
本発明のもう一つの対象は、ｓｂｓＢ−遺伝子で形質転換された宿主細胞であり、この場合、ｓｂｓＢ−遺伝子は場合により挿入体を含有することができる。この宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもあることができる。有利にこの細胞は原核生物である。グラム陽性生物、例えばバチルス属の生物も、グラム陰性生物、例えば腸内細菌、特にＥ．ｃｏｌｉ．も有利である。真核細胞及び原核細胞を核酸で形質転換する方法は公知であり、従って、さらに詳細に説明する必要はない。
さらに、本発明は前記したような核酸によりコードされるＳｂｓ−タンパク質、つまりＳ−層−タンパク質に関する。特に有利なのは、ｓｂｓＢ−配列内に１つ以上のペプチド挿入体又は／及びポリペプチド挿入体を含有する組換えＳｂｓ−タンパク質である。本発明によるポリペプチドのＳｂｓＢ−成分は、配列番号６で示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％、特に少なくとも９０％の相同性を示すのが特に有利である。
組換えＳｂｓＢ−Ｓ−層−タンパク質分子からも、組換えＳｂｓＡ−Ｓ−層−構造体に一致する組換えＳ−層−構造体を組み立てることもできる。この構造体には、有利に、変更していないＳ−層−タンパク質が、全Ｓ−層−タンパク質に関して１０〜９９％のモル割合で存在する。
本発明による組換えｓｂｓＢ−Ｓ−層−タンパク質及びＳ−層−構造体の適用も、ＳｂｓＡについて前記した適用と一致する。特に、この場合、ワクチン又はアジュバントとしてもしくは酵素リアクターとしての使用が注目に値する。
組換えＳ−層−タンパク質は、
（ａ）  Ｓ−層−タンパク質をコードする核酸（この核酸はＳ−層−タンパク質をコードする領域内にペプチド又はポリペプチドをコードする封入体を含有する）を含有する宿主細胞を準備し、
（ｂ）  この核酸の発現及びそれによりコードされたポリペプチドの製造を引き起こす条件下で、この宿主細胞を培養し、及び
（ｃ）  生じるポリペプチドを宿主細胞又は培養基から獲得する、
方法により得ることができる。
この方法の第１の有利な実施態様において、組換えＳｂｓＡ−Ｓ−層−タンパク質が製造され、つまり組換えＳ−層−タンパク質をコードする核酸は、
（ｉ）  場合により、シグナルペプチドをコードする断片なしの、配列番号１に示されたヌクレオチド配列の位置１〜３６８４を含有する核酸、
（ｉｉ）  遺伝子コードの同義性の範囲内で（ｉ）からの核酸と一致するヌクレオチド配列を含有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は／及び（ｉｉ）からの核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する核酸
から選択される。
第２の有利な実施態様において、組換えＳｂｓＢ−Ｓ−層−タンパク質が製造され、つまり組換えＳ−層−タンパク質をコードする核酸は、
（ｉ）  場合により、シグナルペプチドをコードする断片なしの、配列番号５に示されたヌクレオチド配列の位置１〜２７６３を含有する核酸、
（ｉｉ）  遺伝子コードの同義性の範囲内で（ｉ）からの核酸と一致するヌクレオチド配列を含有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は／及び（ｉｉ）からの核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する核酸
から選択される。
しかしながら、ステアロサーモフィラス菌からの組換えＳｂｓＡ及びＳｂｓＢ−Ｓ−層タンパク質の他に、他の生物（例えばPeyret et al.,（1993）, supra参照）からの組換えＳ−層−タンパク質を製造することもできる。
組換えＳ−層−タンパク質の製造は、一方で異種宿主細胞中で、つまり本来Ｓ−層−遺伝子を含有しない宿主細胞中で行うこともできる。このような異種宿主細胞の例はグラム陰性の原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ．である。
しかしながら、Ｓ−層−タンパク質の異種発現は、グラム陽性の原核生物、例えばB. subtilis中で行うこともできる。このため、天然の又は／及び組換えのＳ−層−遺伝子を含有する有利な統合ベクターが使用される。天然のシグナル配列を使用した場合、Ｓ−層−タンパク質の分泌は細胞上澄み液中に見られる。
しかしながら、同質の宿主細胞中での、つまり本来天然のＳ−層−遺伝子を含有する宿主細胞中での組換えＳ−層−タンパク質の製造が有利である。この同質の発現の実施形において、組換えＳ−層−遺伝子は宿主細胞中へ導入され、その結果、宿主細胞はさらに改質していないＳ−層−タンパク質をコードするＳ−層−遺伝子を発現することができる。組換えＳ−層−タンパク質と相容性のＳ−層−構造体を形成することができる改質していないＳ−層−タンパク質が有利である。同質の発現のこの実施形の例は、ステアロサーモフィラスＰＶ７２細胞であり、この細胞は完全に天然のｓｂｓＡ−遺伝子又は／及びｓｂｓＢ−遺伝子を含有し、組換えＳ−層−遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されている。
第２の実施形において、本来存在する完全なＳ−層−遺伝子を失活した宿主細胞中での同質の発現を行うことができる。この実施形において宿主細胞中では、改質されていないＳ−層−タンパク質をコードし、組換えＳ−層−タンパク質と相容性のＳ−層構造体を形成することができる他のＳ−層−遺伝子はもはや存在しない。この種の宿主細胞の特定の例は、本来のＳ−層−遺伝子と置き換えられる遺伝子、例えば同質の組換えにより組換えＳ−層−タンパク質をコードする遺伝子を導入されたステアロサーモフィラス菌ＰＶ７２細胞でる。この種の宿主細胞のもう一つの例は、天然のＳ−層−遺伝子が、例えば位置特異的な突然変異誘発又は／及び同質の組換えにより失活され、かつ組換えＳ−層−遺伝子を含有するベクターで形質転換されているステアロサーモフィラス菌−細胞である。
組換えＳ−層−遺伝子の同質の発現の場合、宿主細胞として通常グラム陽性の原核生物を使用する。宿主細胞として、高温で特定の合成培地（Schuster et al.,（1995）, Biotechnol. and Bioeng. 48: 66-77）で培養することができるステアロサーモフィラス菌ＰＶ７２が特に有利である。
さらに、本発明は次の実施例及び図面により詳説される。
配列番号１はステアロサーモフィラス菌（B. Stearothermophilus）のＳ−層−遺伝子ｓｂｓＡのコード断片の完全なヌクレオチド配列を表す。
配列番号２はそれにより誘導されるアミノ酸配列を表す。
配列番号３はプライマーＴ５−Ｘのヌクレオチド配列を表す。
配列番号４はプライマーＥのヌクレオチド配列を表す。
配列番号５はステアロサーモフィラス菌のＳ−層−遺伝子ｓｂｓＢのコード断片の完全なヌクレオチド配列を表す。
配列番号６はそれにより誘導されるアミノ酸配列を表す。
配列番号７はストレプトアビジン遺伝子の部分断片のヌクレオチド配列を表す。
配列番号８はプライマーＮＩＳ  ２ＡＧのヌクレオチド配列を表す。
配列番号９はプライマーＬＩＳ  Ｃ３のヌクレオチド配列を表す。
図１は組換えベクターｐＢＫ４を使用したｓｂｓＡの製造のためのＰＣＲ−断片を表す図である。
図２はＳｂｓＡ  Ｓ−層−タンパク質のアミノ酸配列中へのペプチド挿入を表す図である。
図３は組換えＳ−層−タンパク質中でのアミノ酸置換及びアミノ酸挿入を表す図である。
実施例：
１．菌株、培地及びプラスミド
バチルス・ステアロサーモフィラスＰＶ７２の菌株のグラム陽性バクテリアを、５８℃でＳＶＩＩＩ−培地中で（Bartelmus and Perschak, Z. Zuckerind. 7（1957）, 276-281）培養した。E. coli pop21 35菌株のバクアリア（endA, thi, hsdR, malT, cI857, λpR, malPQ）は、LB-培地中で培養した（Sambrook et al.,（1989）, supra）。形質転換体の分泌のために、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの最終濃度で培地に添加した。プラスミドｐＰＬｃＡＴ１０（λpR, bla, colE1）（Stanssens et al., Gene 36（1985）, 211-222）はクローニングベクターとして使用した。
２．  ＤＮＡ断片の操作
ＤＮＡの制限分析、アガロースゲル電気泳動及びＤＮＡ断片のクローニングは、Sambrook et al.,（1989）, supraに記載された標準方法により実施した。
コンピテント細胞の形質転換は、Bio-Rad Genepulsers（Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalif., USA）の使用下での製造元のプロトコルにより電気泳動により行った。
プラスミドＤＮＡは、Birnboim and Doly（Mucleich Acids Res.7（1979）, 1513-1523）の方法により単離した。染色体ＤＮＡはAusubel et al.,（Current Protocols in Molecular Biology（1987）, New York, John Wiley）に記載された方法により単離した。
制限エンドヌクレアーゼ及び他の酵素は、Boehringer Mannheim, New England Biolabs又はStratageneにより、製造元の規定に従って使用した。
３．  ＤＮＡ−配列決定
ベクターｐＰＬｃＡＴ１０中の遺伝子ｓｂｓＡの５′−領域及び３′−領域のＤＮＡ配列（シグナル配列をコードする領域を含めた）は、Sanger et al.のジデオキシチェインターミネーター法により測定される。配列決定のために使用されるプライマーは、すでに公開されているｓｂｓＡ−配列（Kuen et al., Gene 145（1994）, 115-120）をベースに構成された。
４．  ｓｂｓＡのＰＣＲ−増幅
ｓｂｓＡ−遺伝子のＰＣＲ−増幅は、１００μｌの反応容量中で実施し、その中にデオキシヌクレオチド２００μＭ、Ｐｆｕ−ポリメラーゼ（Stratagene）１Ｕ、Ｐｆｕ−反応緩衝液１×、それぞれオリゴヌクレオチドプライマー０．５μＭ及びステアロサーモフィラス菌からのゲノムＤＮＡ １００ｎｇをマトリックスとして存在した。この増幅はサーマルサイクラー（Biomed Thermocycler 60）中で３０サイクル以上実施した。各サイクルは９５℃で１．５分の変性工程、５６℃で１分及び５０℃で１分のアニーリング工程並びに７２℃で２分の伸張工程からなる。
プライマーとして配列表中の配列番号３として示されたプライマーＴ５−Ｘ（これはｓｂｓＡの５′−領域に隣接し、かつＸｂａＩ位置を含有する）、並びに配列表中の配列番号４に示されたプライマーＥ（これはｓｂｓＡ配列のトランスクリプションターミネーターの下流に位置する領域の２０個のヌクレオチドに隣接し、かつＢａｍＨＩ位置を含有する）が使用される。
このＰＣＲ増幅産物を０．８％のアガロースゲル上で電気泳動により分離し、クローニングのためのGene Clean（BIO101 La Jolla, Kalif., USA）のシステムを使用して精製した。
５．  ベクターｐＰＬｃＡＴ１０中のｓｂｓＡ−遺伝子のクローニング
３．７９ｋｂの長さを有するＰＣＲにより得られたｓｂｓＡ−遺伝子を精製し、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで分割した。生じたＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−断片をベクターｐＰＬｃＡＴ１０の相応する制限部位へクローニングし、その結果、ｓｂｓＡ−遺伝子は上流に位置するｐＬ−プロモーターの転写調節下におかれた。ｓｂｓＡ配列のＴＡＧ開始コドンはクローニング処置により再構築された。クローニングされたｓｂｓＡ配列はｓｂｓＡのＮ−末端シグナル配列を含有し、トランスクリプションターミネーターの後の２０ｎｔで終わる。ベクターＤＮＡとｓｂｓＡ断片との連結の後、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ｐｏｐ２１３５をエレクトロトランスフォーメーションにより形質転換した。生じるクローンをＤＮＡ制限分析した。ポジティブのクローンを配列決定し、５′−末端及び３′−末端での正確な配列移行が確認された。このクローンはｐＢＫ４として表される。
３．７９ｋｂのＸｂａＩ ｓｂｓＡ断片の図示及びプラスミドｐＢＫ４のマルチクローニング部位中での位置確認は図１に示した（省略形：ｔＴ：トランスクリプションターミネーター；ｏｒｉ：ＤＮＡ複製の起点；ａｍｐ：アンピシリン耐性）。
６．  Ｅ．ｃｏｌｉ中でのｓｂｓＡ遺伝子の組換え発現
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３５／ｐＢＫ４細胞を、２８℃で０．３の光学密度ＯＤ600に達するまで培養した。次いで、ｓｂｓＡの発現は２８℃の培養温度を４２℃に上昇させることにより誘導した。アリコート１．５ｍｌをｓｂｓＡ発現の誘導前並びに誘導後の１，２，３及び５時間後に取り出した。対照としてＥ．ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３５／ｐＰＬｃＡＴ１０（同じ条件下で培養）及びステアロサーモフィラス菌ＰＶ７２を使用した。
全ての試料からの上澄液及び細胞抽出物を、Ｓ−層−タンパク質の発現に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン−イムノブロッティングにより調査した。
ｐＢＫ４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞からの抽出物中に、野生型ＳｂｓＡタンパク質と同様の分子量を有する付加的な著しいタンパク質バンドが見られた。発現誘導後の５時間までの期間内にＳｂｓＡ自体の分解生成物は見られなかった。このことは、Ｓ−層−タンパク質ｓｂｓＡがＥ．ｃｏｌｉ中で安定であり、プロテアーゼにより分解されたと予想される。
ＳｂｓＡタンパク質に関する相対的量の濃度計による測定を実施した。誘導後の４時間の時点で、ｓｂｓＡタンパク質は全体の細胞性タンパク質に関して約１６％の割合で存在した。
Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生されたＳｂｓＡタンパク質は、ＳＤＳ−ゲル中で、ステアロサーモフィラス菌からの天然のＳｂｓＡタンパク質よりも若干ゆっくりと移行する。エドマン分解によるＳｂｓＡタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の測定のための試験はＮ末端の遮断に基づき成功しなかった。このことはＥ．ｃｏｌｉ中でシグナル配列が分解されなかったと予想される。
Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＢＫ４の全細胞抽出物及び培養上澄液のウェスタンブロット分析も、ステアロサーモフィラスからの野生型ＳｂｓＡタンパク質よりもいくらか高い分子量を有する唯一のｓｂｓＡ特異的タンパク質バンドを生じただけであった。
ウェスタンブロットについて、タンパク質はニトロセルロース膜上に転写され、ウサギからのＳｂｓＡに対する多クローン性抗血清と共にインキュベートした。この抗血清の製造は、Egelseer et al.（J.Bacteriol. 177（1995）, 1444-1451）に記載されている。結合したＳｂｓＡ特異的抗体の検出のために、ヤギ−アンチ−ウサギ−ＩｇＧ及びアルカリ性ホスファターゼからなる抱合体を使用した。
ｐＢＫ４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の上澄液から、ｓｂｓＡ−遺伝子−発現の誘導後にもＳｂｓＡタンパク質は検出されなかった。このことからＳｂｓＡは周囲の培地中へ輸送されないこと思われる。
７．  Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中のＳ−層−タンパク質ＳｂｓＡの局在化及び組織
Ｓ−層−タンパク質発現の誘導後の１，２，３及び５時間後に培養基から収穫されたＥ．ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３５／ｐＫＢ４からの細胞を、ｓｂｓＡの細胞内組織に関して調査した。２８℃で培養され誘導していない細胞及びステアロサーモフィラス菌ＰＶ７２の細胞を対照として試験した。
このため、両方の生物の全細胞は固定され、かつMessner et al.（Int. J. Syst. Bacteriol. 34（1984）, 202-210）の方法によりスプール樹脂（Spurrharz）中に固定されかつ埋め込まれた。引き続き、埋め込まれた試料の超薄切片を製造し、酢酸ウランで染色した。
誘導されていないＥ．ｃｏｌｉ細胞の細胞質は典型的な顆粒状構造を示し、この構造は懸濁液のＯＤの増加の場合でも変化しなかった。Ｓ−層−タンパク質発現の誘導の１時間後に収穫したＥ．ｃｏｌｉの縦断面は細胞質中に平行の層状の構造を示した。横断面からは、この構造が同心性の配置を示すと推測される。
層状の構造の割合は、ｓｂｓＡ−発現の誘導後の１及び２時間の間に明らかに上昇し、その後ほぼ一定に留まる。
Ｅ．ｃｏｌｉ中で組み換えて製造したｓｂｓＡタンパク質は、ＳｂｓＡ特異的抗体を用いてイムノゴールドマーキング（Immunogoldmarkierung）により検出することができた。この検出法を用いて同様に組換えにより製造されたＳｂｓＡタンパク質の整列構造が見つけられた。
この形態的データから、ＳｂｓＡタンパク質が不規則な封入体に凝集するのではなく、単分子のＳ−層−結晶を形成することは明らかである。Ｅ．ｃｏｌｉ中で組み立てられたＳｂｓＡ−Ｓ−層の注目される特徴は、一定の間隔での集中的配置である。シグナル配列の存在は、正確な組立を妨害しない。
８．  組換えｓｂｓＡ−Ｓ−層−遺伝子の製造
８．１  ６ｂｐの長さのＤＮＡ配列の挿入
ｓｂｓＡ遺伝子の位置特異的挿入変異誘発のために、改良したカナマイシンカセット（１．３ｋｂ）を使用し、このカセットはプラスミドｐＷＪＣ３（W.T. McAllister, New Yorkから得られる）のＳｍａＩによる切断により分離した。このカセットをａｂｓＡ遺伝子の５つの多様なブラント末端制限部位において連結た、つまりｂｐ５８２の位置（ｐＳＬ５８２）でのＮｒｕＩ部位で、ｐｂ９１７の位置（ｐＳＬ９１７）でのＳｎａＢＩ部位で及びｂｐ８７８の位置（ｐＳＬ８７８）、ｂｐ２５０４の位置（ｐＳＬ２５０４）及びｂｐ２６４９の位置（ｐＳＬ２６４９）でのそれぞれのＰｖｕＩＩ部位で連結した。カナマイシン耐性クローンの選択の後、このカセットを挿入部位からＡｐａＩを用いて切断することにより除去し、次いでＳ−層−プラスミドｐＢＫ４の再連結を行った。切断及び再連結法により、６ｂｐのＣＣＣＧＧＧ（ＡｐａＩ制限部位）の挿入体が残留した。このリンカー挿入システムは図２に図示されている。
生じた組換えＳ−層−遺伝子は、２個のアミノ酸だけ延長された変更ｓｂｓＡタンパク質をコードする。ｓｂｓＡタンパク質の一次構造における具体的変更を図３に示した。クローンｐＳＬ５８２において、この挿入はＳｂｓＡタンパク質のＮ−末端でのアミノ酸１９４と１９５との間にグリシン及びプロリンの組込を起こした。アミノ酸のアラニン及びアルギニンは、クローンｐＳＬ９１７において、アミノ酸３０６と３０７との間に組み込まれた。クローンｐＳＬ２６４９において、グリシン及びプロリンの挿入は、位置８８３と８８４とのアミノ酸の間に組み込まれた。アミノ酸２９３と２９４との間のアラニン及びプロリンの挿入はクローンｐＳＬ８７８において得られた。さらに、位置２９３でアラニンがグリシンに置き換えられた。クローンｐＳＬ２５０４においてアミノ酸のアラニン及びプロリンはアミノ酸８３５と８３６との間に組み込まれ、位置８３５のアラニンは、グリシンに置き換えられた。
挿入変異誘発により得られた全てのクローンは、Ｓ−層−タンパク質を合成する能力を有していた。
変更タンパク質がＳ−層−構造に集合する能力を検証するために、項目７で記載した手段に従って、誘導条件下で４時間培養された全細胞の超薄切片を製造した。この細胞質は平行の層状構造を有する全ての５種のクローンで満たされ、この構造は細胞極の湾曲を引き起こした。５つの調査した異なるクローンの場合に細胞質の形態上の差異は生じなかった。Ｅ．ｃｏｌｉ中での野生種−ＳｂｓＡタンパク質の組立の際と同様の層状構造（項目７）が正確に確認された。
８．３  ストレプトアビジンをコードするＤＮＡ配列の挿入
比較的大きなタンパク質配列をＳｂｓＡタンパク質中へ挿入することが許容できるかどうかを試験するために、ＡｐａＩリンカーを備えた、ストレプトアビジン（１６０個のアミノ酸）の一部をコードするＤＮＡ断片（配列番号７）を、実施例中で製造されたｓｂｓＡクローンのｐＳＬ５８２、ｐＳＬ８７８、ｐＳＬ９１７及びｐＳＬ２６４９遺伝子のＡｐａＩ制限部位中へ挿入した。ストレプトアビジン配列の挿入は、ｐＳＬ５８２においてコドン１９７で、ｐＳＬ８７８においてコドン２９５と２９６との間で、ｐＳＬ９１７においてコドン３０８と３０９との間でおよびｐＳＬ２６４９においてコドン８８６で行った。ＳｂｓＡ−ストレプトアビジン−融合タンパク質の発現は、全ての構成においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロットにより検出することができた。ＥＭ−分析により、Ｓ−層構造の自己組立が、コドン１９７において及びコドン２９５及び２９６の間で挿入物を有するこの融合タンパク質の場合に可能であることが確認された。
ＳｂｓＡ−ストレプトアビジン−融合タンパク質はモノマーとして単離することができ、均質なＳｂｓＡストレプトアビジン−Ｓ−層又は混合ＳｂｓＡストレプトアビジン／ＳｂｓＡ−Ｓ−層に再組立することができる。この融合タンパク質はビオチン化物質の結合及び酵素及び他の結合分子の結合能力の測定のために使用することができる。
８．３  ＢｅｔｖＩをコードするＤＮＡ配列の挿入
Ｂｅｔｖ１（１６１個のアミノ酸）（シラカバの主要花粉アレルゲン）の読み取り枠をコードするＤＮＡ配列（Ferreira et al., J. Biol. Chem. 268（1993）, 19574-19580）をｓｂｓＡ−クローンｐＳＬ８７８中のＡｐａＩ部位に挿入した。免疫学的に活性のＢｅｔｖ１ドメインを含有するＳｂｓＡ−Ｂｅｔｖ１−融合タンパク質の発現を検出することができた。
得られた融合タンパク質を治療の目的又は診断の目的で使用することができる。融合タンパク質を投与することにより、ＴH２−結合ＩｇＥ抗体反応をＢｅｔｖ１に対するＴH１−媒介反応へ変換することを試みることができた。このように花粉アレルギーの症状を抑制することができる。さらに、ＳｂｓＡ−Ｂｅｔｖ１融合タンパク質は、抗−Ｂｅｔｖ１−抗体濃縮の試験のために及び／又は抗−Ｂｅｔｖ１−ＩｇＥの高い濃度を減少させるために使用することができる。
８．４  仮性狂犬病ウイルス抗原をコードするＤＮＡ配列の挿入
仮性狂犬病ウイルスのｇＢエピトープＳｍａＢＢ（２５５個のアミノ酸）をコードするＤＮＡ配列（EMBL-配列：HEHSSGP2による配置に応じたヌクレオチド４８９−１２２４）を、ｎｔ３４８４によるｓｂｓＡ遺伝子のＳＳｐＩ部位（コドン１１６１と１１６２との間）中への挿入を実施した。ＳｂｓＡ−ＳｍａＢＢ融合タンパク質の発現を検出することができた。
この融合タンパク質はｇＢ特異的免疫反応の試験のために使用することができる。挿入した配列に相当するモノクローン性抗体を用いたウェスタンブロット分析は、組換えＳｂｓＡ−ＳｍａＢＢタンパク質中でのウイルス性ドメインの免疫学的活性を示した。
８．５  アルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus）Ｈ１６のＰＨＢ−シンターゼ（ＰｈｂＣ）をコードするＤＮＡ配列の挿入
Ｓ−層の表面上に酵素活性を有するポリペプチド構造の規則的配置は、生きている細胞内で固定した酵素の製造のために及び５９０個のアミノ酸の長さのＰＨＢシンターゼの場合、生体高分子用の分子機械（molekularen Maschine）の製造のために重要な目的である。
ｐｈｂＣ遺伝子は、プラスミドｐ４Ａ（Janes et al., Molecular characterisation of the poly-β-hydroxy-butyrate biosynthesis in Alcaligenes euthrophus H16. In:Novel Biodegradable Microbial Polymers（HRSG. Daves, E. A.）pp175-190（1990）, Kluver, Dordrecht）からＰＣＲにより１７７０ｎｔの長さのＤＮＡ断片（５９０個のアミノ酸の読み取り枠に相当）として単離され、ｓｂｓＡクローンｐＳＬ８７８のＡｐａＩ切断部位中に挿入され、この場合、プラスミドｐＳｂｓＡ−ＰｈｂＣが得られる。このプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞中で、約１９５ｋＤのＳｂｓＡ−ＰｈｂＣ誘導タンパク質の発現が検出することができた。ｐｈｂＣ遺伝子の２つのコピーを順番にｐＳＬ８７８のＡｐａＩ部位中へ挿入する場合、約２６０ｋＤの融合タンパク質の発現が検出することができた。
ＳｂｓＡ−ＰｈｂＣ構成の酵素活性の機能的試験のために、プラスミドｐＳｂｃＡ−ＰｈｂＣを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、プラスミドｐＵＭＳで同時形質転換し、これは
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のβ−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）及びアセトアセチル−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＰｈｂＢ）を含有する。同時形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞中でのポリ−β−ヒドロキシブチラート形成は、スダンブラックを用いた着色、ガスクロマトグラフィー及び電子顕微鏡により検出することができた。この検出は、ＳｂｓＡ−ＰｈｂＣ構成が酵素的に活性であり、酵素を細胞内Ｓ−層−マトリックス上で固定するための必要な例を表す。
８．６  細菌性ルシフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の挿入
Vibrio harveyiからの細菌性ルシフェラーゼの両方のサブユニットＬｕｘＢ及びＬｕｘＢからなる融合タンパク質ＬｕｘＡＢを含有する２０７０ｎｔの長さを有するモノシストロン性ＬｕｘＡＢ遺伝子は、プラスミドｐＴ７−ｍｕｔ３（Boylan et al., J. Biol. Chem. 264（1989）, 1915-1918）からＰＣＲにより単離し、例８．１で製造したクローンｐＳＬ８７８のＡｐａＩ部位に挿入し、その際プラスミドｐＢＫ８７８−ＬｕｘＡＢが得られた。このプラスミドを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞中で、約２０７ｋＤのＳｂｓＡ−ＰｈｂＣ融合タンパク質の発現を検出することができた。この融合タンパク質の酵素活性は、Boylan et al., Supraに記載された方法により示された。
９．  ｓｂｓＢ遺伝子の単離及び特性決定
ｓｂｓＢ遺伝子の単離のための基礎として、Ｎ−末端のアミノ酸配列及びＳｂｓＢタンパク質の３つの内部タンパク質の配列が用いられる。このペプチド配列から出発して、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを構築し、ＰＣＲのために使用した。このようにステアロサーモフィラス菌の染色体ＤＮＡからの１０７６ｂｐの長さのＰＣＲ断片を増幅し、クローニングし、配列決定した（配列番号５に示された配列の位置１００〜１１７６に相当）。
５′−側及び３′−側のｓｂｓＢ遺伝子の断片の増幅のために、逆ＰＣＲ法を適用し、多様なプライマーの組合せを用いて徐々にオーバーラップするＤＮＡ断片を得て、配列決定する。
完全なｓｂｓＢ遺伝子の増幅のために、ｓｂｓＢの５′領域を含有する、配列表に配列番号８として記載したプライマーＮＩＳ ２ＡＧ、並びにｓｂｓＢの３′領域を含有する、配列表に配列番号９として記載したプライマーＬＩＳ Ｃ３を使用した。
このように得られたＰＣＲ断片（これは５′−及び３′−ＢａｍＨＩ制限切断部位を含有する配列番号５中に示したヌクレオチド配列を含有する）を、例５に記載したようにベクターｐＰＬｃＡＴ１０中へクローニングし、その際、発現はラムダＰＬ−プロモータの制御下で行った。
５′側にＥｃｏＲＩ−切断部位及び３′側にＢａｍＨＩ切断部位を有するｓｂｓＢ−ＰＣＲ断片を、ベクターｐＵＣ１８中へクローニングし、その際、発現はｌａｃ−プロモータの制御下で行った。
ｓｂｓＢ発現の検証は、例６及び７に記載したように、ＳＤＳ−ゲル電気泳動及び電子顕微鏡により行った。
１０．  組換えｓｂｓＢ−Ｓ−層−遺伝子の製造
例８に記載したと同様に、組換えｓｂｓＢ遺伝子をり製造した。
例８．１に記載した方法に従って、６ｎｔ長さの、ＡｐａＩ−制限切断部位を含有するＤＮＡ配列を、多様な箇所でｓｂｓＢ−層−遺伝子中へ挿入する。このように、ｎｔ４０７（コドン１３６）、４８１（コドン１６１／１６２）及び１５８２（コドン５２８／５２９）でＡｐａＩ切断部位を有する組換えｓｂｓＢクローンｐＡＫ４０７、ｐＡＫ４８１及びｐＡＫ１５８２が得られた。この挿入変異誘導により得られたクローンはＳ−層タンパク質の合成及びＳ−層構造の形成を行う能力を有する。
例８．２に記載された方法と同様に、ストレプトアビジンをコードするＤＮＡ断片を、ｓｂｓＢクローンｐＡＫ４０７もしくはｐＡＫ４８１のＡｐａＩ制限部位中へ挿入した。
例８．４と同様に、ｇＢ−エピトープＳｍａＢＢをコードするＤＮＡ配列を、ｓｂｓＢクローンｐＡＫ４８１及びｐＡＫ１５８２のＡｐａＩ切断部位中へ挿入した。生じた組換えプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞中で、約１３０ｋＤのｓｂｓＢ−ＳｍａＢ誘導タンパク質の発現を検出することができた。ＳｍａＢＢの２個の複製がｐＡＫ４８１のＡｐａＩ切断部位中へ並んで挿入された場合、約１５７ｋＤの融合タンパク質の発現が検出された。融合タンパク質のＳｍａＢＢドメインは特異的抗体により認識された。
例８．６と同様に、ＬｕｘＡＢ配列がｐＡＫ４０７のＡｐａＩ切断部位中へ挿入された場合、１７５ｋＤのＳｂｓＢ−ＬｕｘＡＢ融合タンパク質が検出された。
１１．  Bacillus subtilis中でのｓｂｓＡ及びｓｂｓＢの異種発現
B. subtilis中のｓｂｓＡ及びｓｂｓＢの異種発現のために、組込ベクターｐＸ（Kim, L., Mogk, A. and Schumann W., Gene 181（1996）, 71-76: A xylose-inducible Bacillus subtilis integration vector and its application）を使用した。生じた組込発現ベクター中のＳ−層遺伝子はｘｙｌプロモーターの転写調節下にある。B. subtilisの染色体中に組み込まれたＳ−層遺伝子を有する形質転換体は、成長培地にキシロースを添加することにより誘導可能な、細胞の上澄液中での多量のＳ−層タンパク質の発現を示した。このことは、ｓｂｓＡ及びｓｂｓＢのシグナル配列がB. subtilis細胞により認識されたことを示す。
同様に、B. subtilis中での組込ｓｂｓＡ及びｓｂｓＢ層遺伝子の異種発現を達成することができる。
配列表
（１）  書誌的事項
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：Werner Lubitz
（Ｂ）番地：Schoenborngasse 12/7
（Ｃ）都市：Wien
（Ｅ）国：Austria
（Ｆ）郵便番号：１０８０
（Ａ）名称：Uwe Sleytr
（Ｂ）番地：Parhamerplatz 10
（Ｃ）都市：Wien
（Ｅ）国：Austria
（Ｆ）郵便番号：１１７０
（ｉｉ）発明の名称：Ｓ−層−タンパク質の組換え発現
（ｉｉｉ）配列の数：９
（ｉｖ）コンピュータ記録方式
（Ａ）記録媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：IBM PC互換機
（Ｃ）オペレーションシステム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30（EPA）
（２）配列番号１
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３６８７塩基対
（Ｂ）種類：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｖｉ）起源
（Ａ）生物名：Bacillus stearothermophilus
（Ｂ）株名：PV72
（ｖｉｉ）直接の起源
（Ｂ）クローン名：sbsA
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：CDS
（Ｂ）存在位置：1..3684
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：sig_peptide
（Ｂ）存在位置：1..90
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：mat_peptide
（Ｂ）存在位置：91..3684
（ｘｉ）配列：配列番号１
0004077878.tif 000006
0004077878.tif 000007
0004077878.tif 000008
0004077878.tif 000009
0004077878.tif 000010
（２）配列番号２
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１２２８塩基対
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列番号２
0004077878.tif 000011
0004077878.tif 000012
0004077878.tif 000013
0004077878.tif 000014
（２）配列番号３
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号３
0004077878.tif 000015
（２）配列番号４
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）種類：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号４
0004077878.tif 000016
（２）配列番号５
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２７６６塩基対
（Ｂ）種類：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｖｉ）起源
（Ａ）生物名：Bacillus stearothermophilus
（Ｂ）株名：PV72
（ｖｉｉ）直接の起源
（Ｂ）クローン名：sbsB
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：CDS
（Ｂ）存在位置：1..2763
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：sig_peptide
（Ｂ）存在位置：1..93
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：mat_peptide
（Ｂ）存在位置：94..2763
（ｘｉ）配列：配列番号５
0004077878.tif 000017
0004077878.tif 000018
0004077878.tif 000019
0004077878.tif 000020
（２）配列番号６
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：９２１塩基対
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列番号６
0004077878.tif 000021
0004077878.tif 000022
0004077878.tif 000023
（２）配列番号７
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４９８塩基対
（Ｂ）種類：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号７
0004077878.tif 000024
（２）配列番号８
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号８
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（２）配列番号９
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）種類：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号９
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【図１】
0004077878.tif 000027
【図２】
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【図３】
0004077878.tif 000029