(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体サンプルにおける検体の濃度を定量するための電極片であって、
第一の片端、第二の片端及び前記第一の片端から離れた位置にある通気口を有する積層片であり、
少なくとも３つの電極が上に描かれている基部層と、
前記基部層よりも小さく形成されると共に、前記第一の片端と前記通気口との間に少なくとも３つの収容切取部を有し、前記第二の片端において、前記少なくとも３つの電極を含む前記基部層の一部分が露出されると共に、前記少なくとも３つの電極が前記少なくとも３つの収容切取部にて露出されるように前記基部層上に載せられた試薬収容層と、
前記第一の片端側に経路切取部を備え、前記経路切取部により規定される空間に、前記電極が露出された収容切取部が収まるように、前記試薬収容層の上に載せられた経路形成層と、
被覆と、
を備えた積層片と、
前記経路切取部により形成される閉鎖経路と、
前記少なくとも３つの収容切取部のうち、前記少なくとも３つの電極のうちの参照電極が露出された収容切取部内に置かれ、前記少なくとも３つの電極のうちの第一の作用電極及び第二の作用電極を機能させる第一の試薬と、
前記少なくとも３つの収容切取部のうち、前記第二の作用電極が露出された収容切取部内に置かれ、検体を基質とする酵素を含有している第二の試薬と、
前記少なくとも３つの収容切取部のうち、前記第一の作用電極が露出された収容切取部内に置かれ、前記酵素を含有しない第三の試薬と、
前記第二の片端にあり、前記閉鎖経路から隔離され、前記露出された基部層の一部分を含む導電接触部と、
を備えた電極片。
【請求項２】
前記第一の試薬と前記第三の試薬は同じ組成の試薬であることを特徴とする請求項１に記載の電極片。
【請求項３】
前記第一の試薬、前記第二の試薬及び前記第三の試薬が、レドックス媒介物を含有している、請求項１に記載の電極片。
【請求項４】
前記レドックス媒介物が少なくとも１つの金属錯体である、請求項３に記載の電極片。
【請求項５】
前記少なくとも１つのレドックス媒介物がフェリシアン化カリウム及び他の無機及び有機レドックス媒介物である、請求項３に記載の電極片。
【請求項６】
前記基部層が、前記少なくとも３つの電極を形成するために上に載せられた導電被膜を有する、請求項１に記載の電極片。
【請求項７】
前記導電被膜が金製である、請求項６に記載の電極片。
【請求項８】
前記導電被膜が金及び酸化スズを含む、請求項６に記載の電極片。
【請求項９】
前記基部層、前記試薬収容層、前記経路形成層及び前記被覆がプラスチック誘電性材料で作られている、請求項６に記載の電極片。
【請求項１０】
前記プラスチック材料が、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ナイロン、ポリウレタン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリエステル、アクリル、及びポリスチレンから成るグループから選択されている、請求項９に記載の電極片。
【請求項１１】
前記閉鎖経路が親水性である、請求項１に記載の電極片。
【請求項１２】
前記閉鎖経路が約１．４４マイクロリットルの容積を有する、請求項１に記載の電極片。
【請求項１３】
前記被覆が少なくとも１つの面において親水性の被膜を有する、請求項１に記載の電極片。
【請求項１４】
前記第一の試薬、前記第二の試薬及び前記第三の試薬が、更に、安定剤、結合剤、界面活性剤及び緩衝剤のうちの少なくとも１つを含んでいる、請求項３に記載の電極片。
【請求項１５】
前記安定剤がポリアルキレングリコールであり、前記結合剤がセルロース材料であり、前記界面活性剤がポリオキシエチレンエーテルである、請求項１４に記載の電極片。
【請求項１６】
前記安定剤がポリエチレングリコールであり、前記結合剤がメチルセルロースであり、前記界面活性剤がｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールであり、前記緩衝剤がクエン酸塩緩衝剤である、請求項１５に記載の電極片。
【請求項１７】
前記第一の試薬、前記第二の試薬及び前記第三の試薬が、約１ｗｔ％から約６．５ｗｔ％の前記レドックス媒介物と、約２．５ｗｔ％の前記安定剤と、約１ｗｔ％の前記結合剤と、約０.０３ｗｔ％の前記界面活性剤と、を前記緩衝剤中に含む出発成分を有する混合物から作られている、請求項１４に記載の電極片。
【請求項１８】
前記クエン酸塩緩衝剤が約０．０５Ｍである、請求項１７に記載の電極片。
【請求項１９】
前記経路形成層が、前記開放経路に沿った前記流体サンプルの流量を最適化するのに十分な厚さを有する、請求項１に記載の電極片。
【請求項２０】
前記の厚さが約０．００７インチ（０．１７７８ｍｍ）である、請求項１９に記載の電極片。
【請求項２１】
前記第一の試薬及び第三の試薬が、約１ｗｔ％の前記フェリシアン化カリウムと、約２．５ｗｔ％の前記ポリエチレングリコールと、約１ｗｔ％の前記メチルセルロースと、約０.０３ｗｔ％の前記ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールとを含む出発成分を有する混合物から作られており、前記クエン酸塩緩衝剤が約０．０５Ｍである、請求項１６に記載の電極片。
【請求項２２】
前記第二の試薬が、約６．５ｗｔ％の前記フェリシアン化カリウムと、約２．５ｗｔ％の前記ポリエチレングリコールと、約１ｗｔ％の前記メチルセルロースと、約０.０３ｗｔ％の前記ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールと、約１ｗｔ％の前記酵素と、を含む出発成分を有する混合物から作られており、前記クエン酸塩緩衝剤が約０．０５Ｍである、請求項１６に記載の電極片。
【請求項２３】
前記酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項２２に記載の電極片。
【請求項２４】
前記第一の作用電極の表面積が、前記第二の作用電極の表面積と実質上同じである、請求項１に記載の電極片。
【請求項２５】
請求項１に記載の電極片の使用方法であって、
前記流体サンプルを前記電極片の前記閉鎖経路内に入れることと、
前記参照電極と前記酵素を含有する前記第二の作用電極の間に電位差を与えることと、
前記第二の作用電極と前記参照電極との間に生じる第一の電流を測定して、該第一の電流を前記流体サンプル内の前記検体の濃度と関連付けることと、
前記第一の作用電極と前記参照電極の間における前記流体サンプルの抵抗値を測定することと、
前記抵抗値を第一方程式に適用して、前記流体サンプルのヘマトクリットレベルを決定することと、
前記サンプルにおけるヘマトクリットの存在による誤差を補正するための第二方程式を用いて、前記検体の補正された濃度を計算することと、を含む方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法において、更に、
前記参照電極と前記第一の作用電極の間に電位差を与えることと、
前記第一の作用電極と前記参照電極の間に生じる第二の電流を測定し、
前記第二の電流を前記第一の電流から差し引いて電流差を得、該電流差を前記流体サンプル中の前記検体の濃度と関連付けることと、を含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、更に、
前記流体サンプルが前記第一の作用電極、前記第二の作用電極及び前記参照電極に接し、前記第一の電流及び前記第二の電流を生成したとき、前記電流を測定する工程を開始させることを含む方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、更に、
前記第一の電流及び前記第二の電流のそれぞれについての電流値が安定状態に概ね達したときに、該第一の電流及び該第二の電流のそれぞれについての該電流値を読み取ることを含む方法。
【請求項２９】
前記電流を測定する工程が開始されてから約２０秒後に前記読み取りが行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
流体サンプル中の少なくとも１つの検体を検知する、あるいはその濃度を測定するための使い捨て電極片であって、
第一の基部層端及び第二の基部層端を有する絶縁基部層片と、
前記基部層片の１つの面に配置され、少なくとも３つの電気的に異なる導電経路が設けられた導電層と、
前記絶縁基部層片より小さく、前記導電層のかなりの部分を覆う第一の絶縁体であり、前記第一の基部層端から離れた位置にある少なくとも第一の切取部と第二の切取部とを有し、前記第二の切取部は前記少なくとも３つの導電経路のうち第一の経路の一定部分を電極として露出させており、前記第一の切取部は前記少なくとも３つの導電経路のうち第二及び第三の経路の一定部分を電極として露出させている第一の絶縁体と、
少なくとも２つの試薬材料であり、該少なくとも２つの試薬材料のうち第一の試薬材料は、検体を基質とする酵素を含有しない試薬材料であり、該少なくとも２つの試薬材料のうち第二の試薬材料は、前記酵素を含有する試薬であり、該第一の試薬材料が前記第一の切取部内に置かれ、該第二の試薬材料が前記第二の切取部内に置かれ、該第一の試薬材料は、前記少なくとも３つの導電経路のうち第二の経路上に置かれた部分と、前記少なくとも３つの導電経路のうち第三の経路上に置かれた部分と、が分離されている試薬材料と、
前記第一の絶縁体を覆う大きさを有し、該第一の絶縁体と空間的に同一の広がりを持つ第二の絶縁体であり、前記絶縁基部層片の第一の基部層端から一定距離だけ離れている該第一の絶縁体の一部分を露出させるよう構成された開口を有し、該一部分は該第一の絶縁体の前記少なくとも２つの切取部を含んでいる第二の絶縁体と、
流体サンプル経路を形成している前記第二の絶縁体を覆う大きさの、該第二の絶縁体と同一の広がりを持つ第三の絶縁体であり、前記第一の基部層端から離れた位置にある、前記第二の絶縁体の前記開口の少なくとも一部分を露出するよう構成された第三の絶縁体の通気口を有する第三の絶縁体とを備えている電極片。
【請求項３１】
前記流体サンプル経路が１．４４マイクロリットルの容積を有する、請求項３０に記載の電極片。
【請求項３２】
前記流体サンプル経路が親水性である、請求項３０に記載の電極片。
【請求項３３】
前記第一の試薬材料及び前記第二の試薬材料が、レドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤及び緩衝剤を含む出発成分を有する混合物である、請求項３０に記載の装置。
【請求項３４】
前記レドックス媒介物が、フェロセン、フェロセン誘導体及びフェリシアン化カリウムから成るグループから選択された少なくとも１つの金属錯体であり、前記安定剤がポリアルキレングリコールであり、前記結合剤がセルロース材料であり、前記界面活性剤がポリオキシエチレンエーテルであり、前記緩衝剤のｐＨが約５から約６である、請求項３３に記載の電極片。
【請求項３５】
前記媒介物がフェリシアン化カリウムであり、前記安定剤がポリエチレングリコールであり、前記結合剤がメチルセルロースであり、前記界面活性剤がｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールであり、前記緩衝剤がクエン酸塩緩衝剤である、請求項３４に記載の電極片。
【請求項３６】
前記第一の試薬材料が、約１ｗｔ％の前記フェリシアン化カリウムと、約２．５ｗｔ％の前記ポリエチレングリコールと、約１ｗｔ％の前記メチルセルロースと、約０．０３ｗｔ％の前記ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールと、を前記クエン酸塩緩衝剤中に含む出発成分を有する混合物から作られる、請求項３５に記載の電極片。
【請求項３７】
前記第二の試薬材料が、約６．５ｗｔ％の前記フェリシアン化カリウムと、約２．５ｗｔ％の前記ポリエチレングリコールと、約１ｗｔ％の前記メチルセルロースと、約０．０３ｗｔ％の前記ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールと、約１ｗｔ％の前記酵素と、を前記クエン酸塩緩衝剤中に含む出発成分を有する混合物から作られる、請求項３５に記載の電極片。
【請求項３８】
前記酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項３７に記載の電極片。
【請求項３９】
前記絶縁基部層片、前記第一の絶縁体、前記第二の絶縁体、及び前記第三の絶縁体が、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ナイロン、ポリウレタン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリエステル、アクリル、及びポリスチレンから成るグループから選択されたプラスチック材料で作られている、請求項３０に記載の電極片。
【請求項４０】
請求項１に記載の電極片を複数製造する方法であって、
第一端及び第二端を有する絶縁材料の基部層片を用意することと、
前記基部層片に、３つの導電経路からなる第一反復パターンを複数設けることと、
前記基部層片上に絶縁材料から成る第一の中間層を載せ、該第一の中間層は、３つの切取部からなる第二反復パターンを複数有し、各前記第二反復パターンの各切取部は、各前記第一反復パターンの前記３つの導電経路のそれぞれの電極部を露出させ、前記第二反復パターンは、前記基部層片の前記第一端から離れた位置にあり、前記第一の中間層は、前記基部層片の前記第二端と距離を置いて、各前記第一反復パターンの前記３つの導電経路のそれぞれの接触部を露出させる大きさにすることと、
各前記第二反復パターンの前記３つの切取部に試薬材料を置くことと、
前記試薬材料を乾燥させることと、
前記第一の中間層を覆い、前記第一の中間層と空間的に同一の広がりを持つ絶縁材料の第二の中間層を前記第一の中間層に載せ、該第二の中間層は、細長い切取部からなる第三反復パターンを複数有し、該細長い切取部のそれぞれは、前記第一の中間層の対応する前記第二反復パターンを露出させるようにすることと、
前記第二の中間層を覆い、前記第二の中間層と空間的に同一の広がりを持つ絶縁材料の最上層を載せ、該最上層は通気口からなる第四反復パターンを複数有し、該通気口のそれぞれは、前記細長い切取部における前記基部層片の前記第一端から最も離れた部分に対応する前記第三反復パターンの一部分を露出させるようにすることと、
前記使い捨てセンサの一つを形成する前記第一から第四反復パターン毎に、それぞれ分離することと、を含む方法。
【請求項４１】
前記試薬材料が凝固し、前記３つの導電経路からなる前記第一反復パターンのそれぞれの各前記電極部分に付着するのに十分な温度及び時間で、該試薬材料を乾燥させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記センサのそれぞれの前記第一端に沿って、該センサの横方向に所定の距離分切り取って、サンプル注入口を形成することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
流体サンプルにおける検体の濃度を定量するための電極片であって、
第一の片端、第二の片端及び前記第一の片端から離れた位置にある通気口を有する積層片であり、
少なくとも３つの電極が上に描かれている基部層と、
前記基部層よりも小さく形成されると共に、前記第一の片端と前記通気口との間に２つの収容切取部を有し、前記第二の片端において、前記少なくとも３つの電極を含む前記基部層の一部分が露出されると共に、前記少なくとも３つの電極が前記２つの収容切取部にて露出されるように前記基部層上に載せられた試薬収容層と、
前記第一の片端側に経路切取部を備え、前記経路切取部により規定される空間に、前記電極が露出された収容切取部が収まるように、前記試薬収容層の上に載せられた経路形成層と、
被覆と、
を備えた積層片と、
前記経路切取部により形成される閉鎖経路と、
前記２つの収容切取部のうち、前記少なくとも３つの電極のうちの第一の作用電極が露出された収容切取部内に置かれ、検体を基質とする酵素を含有しない第一の試薬と、
前記２つの収容切取部のうち、前記少なくとも３つの電極のうちの第二の作用電極が露出された収容切取部内に置かれ、前記酵素を含有している第二の試薬と、
前記第二の片端にあり、前記閉鎖経路から隔離され、前記露出された基部層の一部分を含む導電接触部と、
を備えた電極片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の属する技術分野
本発明は、概して、液体サンプル中の特定の成分即ち検体を定量化するために使用することが可能な電気化学センサに関する。特に、本発明は、新しい改良型の電気化学センサ及び電気化学センサを製造する新規で改善された方法に関する。より明確には、本発明は、製造が安価にできる使い捨て電気化学センサに関する。更に明確には、本発明は、干渉物及び変動する赤血球（ヘマトクリット）が存在する中で、正確な読取り値を与える使い捨て電気化学センサに関する。更に、一層明確には、本発明は、生理的流体中の検体の正確な定量のための電気化学分析を行うために使用することが可能な使い捨て電気化学センサに関する。
２．先行技術の説明
バイオセンサは、３０年以上もの間、周知の物となっている。それらは、流体中の種々の検体の濃度を定量するために使用される。特に、関心の的となっているのは、血糖の測定である。血糖濃度が、恒常性を維持するために極めて重要であることは周知である。人の血糖値、即ちグルコースレベルの変動を測定する製品は、国内の何百万という糖尿病患者の多数にとって、日常的必需品となっている。この疾患は、血液化学における危険な異常を引き起こす可能性があり、失明や腎不全の一因になると考えられていることから、大多数の糖尿病患者は、自ら周期的に検査を行い、通常はインスリン注射によって、自らのグルコースレベルを適宜調整する必要がある。血糖濃度が正常範囲を下回れば、患者は意識不明や血圧の低下といった死につながる危険性さえある状態に陥るおそれがある。一方、血糖濃度が正常範囲を超えて高くなった場合には、過剰な血糖が脂肪酸やコレステロールの合成につながり、更に糖尿病の場合には昏睡を引き起こす可能性もある。このため、血糖値の測定は、インスリン療法によって自らの血糖値をコントロールする糖尿病患者にとって、日々不可欠な事となっている。
インスリン依存性患者は、自らの血糖値を一日に４回程度チェックするよう医者から指示を受ける。通常の生活スタイルを頻繁なグルコースレベル測定の必要性に順応させるため、全血検査用試薬ストリップの開発に伴って、家での血糖値テストが可能となった。
【０００２】
血糖バイオセンサの一つのタイプは、グルコースが存在する際に酵素と電極との間で電子を往復させることによって測定可能な電流信号をもたらす媒介組成物と組み合わされた酵素電極である。最も一般的に使用される媒介物は、フェリシアン化カリウム、フェロセン及びその誘導体と、その他の金属錯体である。この第二のタイプの電極に基づく多くのセンサが開示されて来た。このタイプの装置の例は、以下の特許において開示されている。
【０００３】
米国特許第５，６２８，８９０号（１９９７年／カーター等）は、電極支持部と、該支持部上に配設された参照電極又は対極と、前記支持部上の前記参照電極又は対極から一定距離をおいて配設された作用電極と、前記参照電極及び作用電極を覆う密閉空間を規定すると共に、該密閉空間内にサンプルを受け入れるための開口を有する被覆層と、前記密閉空間において前記被覆層と前記支持部との間に介在した複数の網状層とを備えた電極片について開示している。この被覆層は、電極から一定距離をおいて設けられたサンプル付与開口を有する。作用電極は、自らの基質に関わる反応に対して触媒作用を及ぼすことが可能な酵素と、酵素触媒作用反応と作用電極との間で電子を運搬することが可能な媒介物とを含む。
【０００４】
この装置は、センサ読取り値に対するヘマトクリットの影響を少なくすることを提案している。その開示によれば、これは、網状層によって作り出されたサンプル溶液の薄い層との組み合わせにおいて、作用電極に対する参照電極の下流の間隔設定によって成し遂げられる。
【０００５】
米国特許第５，７０８，２４７号（１９９８年／マクアリー等）は、基質と、参照電極と、作用電極と、電気的接続を行うための手段とを備えた使い捨てグルコース検査ストリップについて開示している。前記作用電極は、導電性の基層と、この導電性基層を覆って設けられた被覆層とを有する。この被覆層は、網状組織を形成する疎水性と親水性のそれぞれの表面領域と、酵素と、媒介物とを有する充填材である。
【０００６】
米国特許第５，６８２，８８４号（１９９７年／ヒル等）は、スクリーン印刷を伴うストリップ電極について開示している。このストリップは、長尺の支持部を備え、この支持部は、該支持部に沿ってそれぞれ延在する第一及び第二導体を含む。液状混合物及び第一導体に接触するように配置された活性電極には、反応に触媒作用を及ぼすことが可能な酵素と電子媒介物とが堆積されている。参照電極は、混合物及び第二導体と接触するように配置されている。
【０００７】
米国特許第５，７５９，３６４号（１９９８年／チャールトン等）は、検体と反応して移動可能な電子を生成する電極を表面に備えた絶縁基板を有する電気化学バイオセンサについて開示している。この基板は、変形可能な素材からなる蓋と係合し、該蓋は、基板と係合した時、流体検査サンプルが流れ込むことができる毛細空間が形成されるように、平面によって囲まれる凹部領域を有する。蓋の基板に面した側は、高分子材料で覆われており、この高分子材料の働きによって、蓋が基板に接合されると共に、毛細空間の親水性の性質が増大される。
【０００８】
米国特許第５，７６２，７７０号（１９９８年／プリッチャード等）は、約９マイクロリットルの最小量血液サンプルを必要とする電気化学バイオセンサ検査ストリップについて開示している。この検査ストリップは、第一絶縁基板上に配設された、実質的に同じ大きさで同一の電気伝導性材料から成る作用電極及び対極を有する。これらの電極上には、試薬孔を形成する切取部を備えた第二絶縁基板が被せられている。この切取部は、作用電極よりも対極に対して、より小さい領域を露出させている。検体の分析用試薬は、試薬孔において露出した作用電極及び対極の領域を実質的にカバーする。界面活性剤を染み込ませた拡散網目が、試薬孔の上を覆うと共に、第二絶縁基板に付着されている。
【０００９】
米国特許第５，７５５，９５３号（１９９８年／ヘニング等）は、低減干渉バイオセンサについて開示している。この装置は、一般に、溶液中の興味の対象である検体の濃度を電気化学的に測定するために用いられる電極を備える。該装置は、微粒子炭素と共有結合されると共に、電極と密接に接触した状態でマトリクス内に保持されたペルオキシダーゼ酵素を含む。この開示によれば、周知の干渉物質に対してほとんど感度を示さない構成を提供しているのは、装置の酵素／微粒子炭素である。
【００１０】
米国特許第５，１２０，４２０号（１９９２年／ナンカイ等）は、主に炭素から作られた電極装置を有する基板と、絶縁層と、その上に積層された酵素層を備えた反応層と、スペーサと、カバーとを備えたバイオセンサについて開示している。前記スペーサは、サンプルを保持するための、入口と出口を備えた経路を形成する。
ヨーロッパ特許第０７３５３６３Ａ１（１９９６年／松下電器産業株式会社）は、複数の面を有する絶縁基板と、この絶縁基板の複数の面のうちの少なくとも２つの面上に形成された複数の電極装置であって、それぞれが作用電極と対極とを有する複数の電極装置と、絶縁基板の複数の面のうちの少なくとも２つの面上に設けられた複数の反応層であって、それぞれがオキシドレダクターゼを含む複数の反応層と、を備えたバイオセンサについて開示している。
米国特許第５，４３７，９９９号（１９９５年／ディーボルド等）は、高分解能で生体適合性を有する電極の製造方法について開示している。導電性材料が第一絶縁基板に取り付けられる。その後、第二絶縁基板が導電性材料に取り付けられ、フォトリソグラフィにてパターン形成されることで電極領域を画定させる。
国際公開公報第９９／１３０９９号（１９９９年／アボットラボラトリーズ）は、均一的に電極化された非作用領域と作用領域とを備えた多数の電極センサ片について開示している。
【００１１】
しかしながら、先行技術の装置には、種々の欠点がある。これらの欠点の一つは、同一の電位で酸化することが可能なサンプル流体中の他の物質によって引き起こされるバイオセンサ読取り値への干渉である。これらの中で一般的なものとしては、アスコルビン酸、尿酸、及びアセトアミノフェンが挙げられる。これら及びその他の干渉物質が酸化すると、それらの酸化によって生じた電流が、測定対象の血液検体の酸化から生じた電流に加えられ、測定対象の血液検体の酸化から生じた電流と区別できなくなってしまう。その結果、この誤差が、血液検体の定量化につながってしまう。
【００１２】
もう一つの欠点は、赤血球によってもたらされる干渉（ヘマトクリット影響）である。この干渉は、低いヘマトクリットレベルに対して見かけ上高い反応率をもたらしたり、逆に、高いヘマトクリットレベルに対して見かけ上低い反応率をもたらしたりする傾向がある。
【００１３】
先行技術装置の更なる欠点は、それらがより限定された直線範囲を有すると共に、相対的に多量のサンプル量を必要とすることである。更に、それらの装置は、読取り値が得られる前の定常応答が明らかになるまでに、比較的長い待ち時間を必要とする。これらの欠点のそれぞれは、個々に、あるいは一つ以上の他の欠点と組み合わされて、分析の間、間違った測定読取り値を生じさせる原因となる可能性がある。本発明の発明者によって行われた予備検査では、グルコース読取り値に対するヘマトクリットの影響を減じることを主張した先行技術は、低いグルコース濃度に限られると共に、低いグルコース濃度においてのみ作用することが示された。
【００１４】
正確なグルコース読取り値を得ることの重要性から、上述のような全ての欠点を伴わない、信頼性が高く、使用者にとって扱い易い電気化学センサを開発することは、大いに望ましいことであろう。従って、必要とされる物は、サンプル流体中に存在する酸化可能な物質によって引き起こされる干渉を最小限に留めるための干渉補正電極を組み込んだ電気化学センサである。更に、必要とされる物は、サンプル流体のヘマトクリットの影響を実質的に受けることなく反応する電気化学センサである。更に、その上必要とされる物は、先行技術によって従来必要とされてきた量よりも少ないサンプル量を必要とする電気化学センサである。尚、その上必要とされる物は、広範囲な直線測定範囲を有する電気化学センサ、即ち、減少された、又は極わずかな干渉影響を有すると共に、より広範囲なグルコース濃度に対して使用可能なセンサである。
発明の要約
本発明の一つの目的は、酵素と媒介物とを組み合わせた改良型電気化学センサを提供することである。本発明の更なる目的は、サンプル流体中に存在する酸化可能な物質によって引き起こされる干渉を最小限に抑えるための干渉補正電極を組み込んだ電気化学センサを提供することである。本発明の更なる目的は、その反応が、サンプル流体のヘマトクリットレベルに実質的に左右されない電気化学センサを提供することである。本発明の更に別の目的は、先行技術によって従来必要とされてきたよりも少量のサンプル量を必要とする電気化学センサを提供することである。本発明の更なる別の目的は、広範囲な直線測定範囲を有する電気化学センサを提供することである。
【００１５】
本発明は、これらの目的並びにその他の目的を、より少量のサンプル量を必要とし、サンプル中の酸化可能物質及び変動するヘマトクリットレベルからの干渉を埋め合わせる電気化学センサを提供することにより達成する。本発明は、長尺の積層体を備え、この積層体は、その一端に設けられた開口と該開口から離して配設された通気口との間で接続されたサンプル流体経路を有する。この流体経路内には、少なくとも二つの作用電極と一つの参照電極とが設けられている。二つの作用電極と一つの参照電極との配置は、電気化学センサから得られる結果の上で重要でない。作用電極及び参照電極は、それぞれ個別の導電性コンジットと電気的に接触している。この個別の導電性コンジットは、積層体の開口経路端と対向する端部にその末端を有すると共に、そこで読取り装置と電気的に接続されるため露出した状態となっている。
【００１６】
積層体は、プラスチック材料から成る基部絶縁層を有する。この基部絶縁層上には、幾つかの導電性コンジットが線引きされている。これらの導電性コンジットは、スクリーン印刷によって、又は蒸着によって、又は基部絶縁層に付着する導電層を提供する何らかの方法によって、絶縁層上に設けられても良い。導電性コンジットは、個々に絶縁層上に設けられても良いし、導電層を絶縁層上に設け、その後エッチング／スクライビング処理を行うことにより必要とされる数の導電性コンジットを設けても良い。エッチング処理は、化学的に行われても良いし、導電層に機械的に線を刻み付けることによって行われても良いし、レーザーを使用して導電層に線を刻み付けることによって個別の導電性コンジットを形成することで成し遂げられても良いし、あるいは本発明で必要とされる個別の導電性コンジットの間に絶縁をもたらす何らかの手段によって成し遂げられても良い。好ましい導電被膜として、金被膜又は酸化スズ／金被膜組成物が挙げられる。ここで、作用電極と参照電極の両方に対する導電性材料として、同一の電気伝導性物質（金被膜又は酸化スズ／金被膜）がスコーリング後に用いられるが、この材料自体は、参照電極として機能することはできないことが指摘されるべきである。参照電極を作用させるためには、電位が付与された際に、導電性材料側にレドックス反応（例えば、Ｆｅ（ＣＮ）63-＋ｅ-→Ｆｅ（ＣＮ）64-）が起こらなければならない。従って、参照電極として用いられる導電性材料に、レドックス媒介物が存在しなければならない。
【００１７】
積層体は、基部絶縁層及び導電性コンジット上に、少なくとも二つの作用電極と一つの参照電極用の切取部を有する第一中間絶縁層を備える。第一中間絶縁層は試薬収容層とも称される。切取部内に配設される（後述の）電極材料に対し、参照電極から作用電極を分離するように刻み目を付けるという条件で、作用電極の一つと参照電極とを、同一の切取部で共有させても良い。三つの切取部を用いる場合、各切取部は、それぞれ一つの導電性コンジットの小部分に対応すると共に、その小部分を露出させる。作用電極用の切取部は、実質的に同じ大きさである。参照電極用の切取部は、作用電極用の切取部と同じ大きさでも良いし、異なる大きさでも良い。全ての切取部の配置は、それらが上述のサンプル流体経路内に全て共存するようになされる。この第一中間絶縁層も又、絶縁誘電性材料、好ましくはプラスチックから作られ、その材料を機械的に、又はレーザーを用いてダイカットし、その後基部層に固定することによって形成されても良い。感圧接着剤等の接着剤を用いて、第一中間絶縁層を基部層に固定しても良い。接着は、又、第一中間層と基部層とを超音波接合することによって成し遂げられても良い。第一中間絶縁層は、又、基部層上に第一中間絶縁層をスクリーン印刷することによって形成されても良い。
【００１８】
第一中間層の厚さは、電気化学センサとして用いるのに十分な量の電極材料を充填するために十分な厚さでなければならない。各切取部は、電極材料を含む。この電極材料は、安定剤、結合剤、界面活性剤、及び緩衝剤のうちの少なくとも一つを備えたレドックス媒介物を有する。切取部の少なくとも一つは、又、自らの基質に関わる反応に対して触媒作用を及ぼすことが可能な酵素を含む。レドックス媒介物は、酵素触媒作用反応と作用電極との間で電子を運搬することが可能である。
【００１９】
又、積層体は、第一中間層上に、第二中間絶縁層を備える。この第二中間層は、同じくプラスチック絶縁材料から成ると共に、積層体のサンプル流体経路を形成する。第二中間層は経路形成層とも称される。それは、一端にＵ字形の切取部を備え、このＵ字形の切取部が、第一中間層の切取部を覆い、このＵ字形の切取部は、先述の積層体開口端に対応する開口端を有している。
【００２０】
本発明の積層体は、通気口を備えた最上層を有する。この通気口は、少なくともその一部が、第二中間絶縁層のＵ字形切取部の底部上を覆うように位置付けられている。この通気口により、サンプル流体が積層体の開口端から入り込んだ時、サンプル流体経路内の空気が逃がされる。サンプル流体は、通常、毛管現象によってサンプル流体経路を満たす。少量の状態では、毛管現象の程度は、毛管現象を起こしている流体と接触した表面の疎水性／親水性の性質に左右される。これは、物質のぬれ性としても知られている。毛管力は、親水性絶縁材料を用いて最上層を形成することによって、あるいは積層体の開口端と最上層の通気口との間のサンプル流体経路と向き合った最上層領域において、疎水性絶縁材料の一面の少なくとも一部を親水性の物質でコーティングすることによって、高めることができる。これは、最上層の一面全体を親水性物質でコートした後、第二中間層に接着しても良いと解釈されるべきである。
【００２１】
積層体の絶縁層は、いかなる誘電性材料から作られても良い。好ましい材料は、プラスチック材料である。誘電性材料として利用可能な組成物の例としては、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ナイロン、ポリウレタン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリエステル、アクリル、及びポリスチレンが挙げられる。
【００２２】
第一中間層に設ける切取部の数は、一つ、二つ、三つ、又はそれ以上のいずれであっても良い。切取部を一つだけ用いるためには、その単一の切取部によって、二つの導電性コンジットの一部が露出されなければならない。単一の切取部内の電極材料は、その中間にスコアリングにより刻み目を付けることによって、二つの部分に分けられる。つまり、その一方は、作用電極として作用し、もう一方は、参照電極として作用する。このような配置によって、二つ又は三つの切取部を設ける実施例の場合と比較して、より少量のサンプルを検査することが可能となる。しかしながら、この実施例は、干渉及びヘマトクリット補正という他の実施例の特性を欠く。
【００２３】
二つの切取部を備えた一つの実施例は、単一の切取部を有する実施例に代わるものである。それは、作用電極として働く一つの切取部と、参照電極として働くもう一つの切取部とを備える。二つの切取部を有する場合の別の実施例は、単一の切取部を設ける場合の特徴と、二つの切取部を設ける場合の特徴とを組み合わせたものである。電極材料を含んだ切取部の一方は、スコアリングにて刻み目を入れて二つの部分に分けられて、その一方は第一作用電極として働き、他方は参照電極として働く。第二の切取部は、第二作用電極として働く。このような設計は、本発明の好ましい実施例に代わる実施例である。この二つの切取部を備えた実施例は、干渉及びヘマトクリット補正特性を有するだけでなく、三つの切取部を備えた実施例の場合よりも、更に少量のサンプルを測定することが可能である。
【００２４】
三つの切取部を備えた実施例において、二つの切取部は、作用電極（Ｗ１，Ｗ２）のための材料を含み、残りの一つは、参照電極（Ｒ）のための材料を含む。更に、Ｗ２は、自らの基質に触媒作用を及ぼすことが可能な酵素を含む。三つの電極は、流体サンプルの抵抗を正確に測定することができるように、且つ起こり得るＷ２からのキャリー・オーバーを最小限に抑えることができるように位置付けられると共に、大きさを定められている。サンプル流体経路内の可能な電極配置は、積層体の開口端から通気口までの間に配置される電極配置順序として、Ｗ１−Ｗ２−Ｒ、Ｗ１−Ｒ−Ｗ２、Ｒ−Ｗ１−Ｗ２、Ｗ２−Ｗ１−Ｒ、Ｗ２−Ｒ−Ｗ１、Ｒ−Ｗ２−Ｗ１で表される順序のいずれであっても良い。好ましい配置は、Ｗ１−Ｒ−Ｗ２、つまり、サンプル流体が積層体の開口端から入り込んだ後、最初にＷ１を、その後Ｒを、更にその後Ｗ２を覆って行く配置であることが見い出されている。この好ましい配置によって、血液サンプルの抵抗の正確な測定が可能となる。これは、血液サンプルにおける抵抗とヘマトクリットレベルとの間の良好な相関関係のために必要である。
【００２５】
前述のように、２〜３例を挙げると、アスコルビン酸、尿酸、アセトアミノフェンといった酸化可能な干渉物は、電気化学バイオセンサの出力時に、不正確な読取り値をもたらす原因となる。本発明は、Ｗ２（第二作用電極）からの電流反応から、Ｗ１（第一作用電極）での電流反応を差し引いて、サンプル流体中の酵素濃度を算出することにより、上述の影響を打ち消す。これは、Ｗ１の表面面積を、Ｗ２の表面面積と実質的に等しく保つことによって成し遂げられる。同じく重要であるのは、Ｗ１及びＷ２に配設される試薬の組成である。試薬は、干渉の反応に対して最小の影響を及ぼすように構成されており、これも又、検体測定の正確性の一因となっている。
【００２６】
ヘマトクリット干渉は、二つの段階の処理を用いて減じられる。第一に、Ｗ１（第一作用電極）とＲ（参照電極）との間の抵抗（ｒ値）が測定される。そして、このｒ値は、サンプル流体中のヘマトクリットレベルを算出するために用いられる。以下の方程式はこの関係の一つの表示である。
【００２７】
ｒ＝ｋ1／（１−Ｈ）                              方程式（１）
この方程式（１）において、ｒはオーム又はキロオームで測定された抵抗値、Ｈはヘマトクリットレベル、そして、ｋ1は定数４．６（ｒがキロオームで測定された場合）を表す。
【００２８】
第二に、ヘマトクリットレベルの値が、上述のように得られた酵素濃度読取り値を数学的に補正するために用いられる。以下の方程式は、方程式（１）から算出されたヘマトクリットレベルを用いて行われる計算の１つを表す。
Ｃcorr＝Ｃmea／（ｋ2＋ｋ3Ｃmea＋（ｋ4＋ｋ5Ｃmea）（１−Ｈ））                                                    方程式（２）
この方程式（２）において、Ｃcorrは補正された検体濃度、Ｃmeaは測定された検体濃度、ｋ2は定数１．０３、ｋ3は定数−０．００３、ｋ4は定数−０．１、ｋ5は定数０．００５４、そして、Ｈは方程式（１）から算出されたヘマトクリットレベルを表す。
【００２９】
上の定数の値は、本発明の好ましい実施例のために設定されたものである。電極領域の表面面積及び試薬の処方を変更する際には、当業者は、補正グルコース濃度をより正確に定量するために、定数ｋ1〜ｋ5に対して新たな値を算出する必要があり得る。
【００３０】
本発明の全ての利点は、以下の詳細な説明、図面及び付随のクレームを検討することによって、より明確にされるであろう。
好ましい実施例の詳細な説明
本発明の好ましい実施例を、図１から６に示す。図１は、本発明のセンサ１０を示す。センサ１０は、積層体１００と、流体サンプル抽出端１１０と、電気接触端１２０と、通気口５２とを備える。流体サンプル抽出端１１０は、サンプル抽出端口１１４と通気口５２との間にサンプル流体経路１１２を備える。電気接触端１２０は、少なくとも３つの目立たない導電接触部１２２、１２４、１２６を備える。
【００３１】
図２では、積層体１００が、基部絶縁層２０と、第一中間層３０と、第二中間層４０と、最上層５０とから構成されている。全ての層は、誘電性材料、好ましくはプラスチックから作られる。好ましい誘電性材料の例としては、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ナイロン、ポリウレタン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリエステル、アクリル、ポリスチレンである。基部絶縁層２０は、導電層２１を有し、その上に第一導電コンジット２２と第二導電コンジット２４と第三導電コンジット２６とが描かれている。導電コンジット２２、２４、２６は、図２に示すように導電層２１にスクライビングまたはスコアリングを行うことにより形成されてもよいし、あるいは、導電コンジット２２、２４、２６を基部層２０上にシルクスクリーン捺染することにより形成されてもよい。導電層２１のスクライビングまたはスコアリングは、導電層２１を機械的に十分にスクライビングすることにより、３つの独立した導電コンジット２２、２４、２６を生成するものであってもよい。本発明の好ましいスクライビングまたはスコアリング法は、炭酸ガス（ＣＯ2）レーザか、ＹＡＧレーザか、エキシマレーザを用いて行われる。雑音信号を発生させることがある静電気の問題を回避するため、余分なスコアリング線２８（説明のためだけに拡大されていて実際の寸法にはなっていない）が基部層２０の外縁に沿って設けられていてもよい。なお、スコアリング線２８は、センサ１０を機能させるのに必要なものではない。導電層２１は、どんな導電材料からできていてもよいが、金または酸化スズ／金からなるのが好ましい。基部層２０に使用できる材料は、酸化スズ／金ポリエステルフィルム（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＭ−１）または金ポリエステルフィルム（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＭ−２）である。これらのフィルムは、カリフォルニア州カノガパークのコートールズパフォーマンスフィルムズ（Ｃｏｕｒｔａｕｌｄｓ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｆｉｌｍｓ）により販売されている。
【００３２】
第一中間層３０は、第一導電コンジット２２の一部を露出させる第一電極切取部３２と、第二導電コンジット２４の一部を露出させる第二電極切取部３４と、第三導電コンジット２６の一部を露出させる第三電極切取部３６とを有する。第一層３０は、プラスチック材料から作られ、好ましくは、ペンシルバニア州グレンロックのアドヒーシブリサーチ社（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）から購入可能な医療用片面テープから作られる。本発明に適用できるテープの厚さは、およそ０．００３−０．００５インチ（０．７６−０．１２７ｍｍ）である。そのようなテープとしては、Ａｒｃａｒｅ（登録商標）７８１５が好ましい。なぜなら、扱いやすい上に、十分な量の化学試薬を保持し、センサ１０のサンプル流体経路１１２を通じて好ましい血流速度（毛管現象）を促進する能力において非常に優れたパフォーマンスを示したためである。テープの使用は必ずしも必要ではない。上述のポリエステル製テープを使用するのと同じ結果を得るためには、プラスチックの絶縁層を、粘着剤で覆ってもよいし、また、基部層２０に超音波を使って接着してもよいし、あるいは、基部層２０上にシルクスクリーン捺染してもよい。
【００３３】
３つの切取部３２、３４、３６は、それぞれ、電極領域Ｗ１、Ｒ、Ｗ２を規定し、２つの作用電極と１つの参照電極とを形成する化学試薬を保持する。通常、電極領域Ｒには、参照電極を機能させるためにレドックス試薬または媒介物を積めなければならない。Ｒにレドックス試薬または媒介物が積められていないと、作用電極Ｗ１及びＷ２は機能しない。電極領域Ｗ１及びＲには、先に記載した抵抗測定を促進するために同じ化学試薬が積められるのが好ましい。試薬には、酸化型のレドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤が含まれるのが好ましい。通常、レドックス媒介物は、フェロセン、フェリシアン化カリウム、その他のフェロセン誘導体のうちの少なくとも１つである。また、安定剤は、ポリアルキレングリコールであり、結合剤はセルロース材料であり、界面活性剤はポリオキシエチレンエーテルであり、緩衝剤のｐＨは約５から約６である。特に好ましい安定剤は、ポリエチレングリコールであり、好ましい結合剤は、メチルセルロースであり、好ましい界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールであり、好ましい緩衝剤は、クエン酸塩緩衝剤である。電極領域Ｗ２には、電極領域Ｗ１及びＲに積められたのと同じ化学試薬が積められるのが好ましいが、さらに酵素及び媒介物が加えられる。酵素は、当該酵素の基質、或いは、酵素に対して触媒としての反応性を有する基質に関わる反応に対して触媒作用を及ぼすことができる。また、媒介物は、酵素触媒反応と作用電極との間で電子を運搬することができ、その結果、酵素または基質の活性及び混合物に対応した電流を生成させる。
【００３４】
第一層３０の切取部及び電極領域の位置は、サンプル流体の抵抗が正確に測定され、起こり得る電極領域Ｗ２から電極領域Ｗ１へのキャリー・オーバーが最小限に抑えられるように、互いに関連して、また、サンプル流体経路１１２でのサンプル流体の流れに関連して決められる。センサ１０の流体サンプル抽出端１１０を参照点として、電極領域は、Ｗ１−Ｗ２−Ｒ、Ｗ１−Ｒ−Ｗ２、Ｒ−Ｗ１−Ｗ２、Ｗ２−Ｗ１−Ｒ、Ｗ２−Ｒ−Ｗ１、Ｒ−Ｗ２−Ｗ１と配置することができる。好ましい配置は、Ｗ１−Ｒ−Ｗ２である。
【００３５】
第二中間層４０は、第二層センサ端４１に位置するＵ字型の経路切取部４２を有している。経路切取部４２の長さは、第二中間層４０を第一中間層３０上に重ねた時、電極領域Ｗ１、Ｗ２、Ｒが経路切取部４２により規定される空間内に収まる程のものにする。第二中間層４０の厚さは、サンプル流体経路１１２に流れ込むサンプル流体の速さにとって重要であることがわかった。サンプル流体経路１１２は、サンプル流体の毛管現象により満たされる。
【００３６】
第二中間層４０上に配置される最上層５０は、流体経路１１２内のサンプル流体が完全に電極領域Ｗ１、Ｗ２、Ｒを覆うように、センサ１０の流体サンプル抽出端１１０から離れて配置される通気口５２を備える。通気口５２は、第二中間層４０の経路切取部４２の底部にある程度その位置が合うよう最上層５０に設けられる。通気口５２は、第二中間層４０のＵ字型切取部４２の一部を露出させると共に、Ｕ字型切取部４２の底部と部分的に重なるのが好ましい。
試薬１及び２の調合
試薬１及び２は、酸化型のレドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤を含む。さらに、試薬２は酵素を含む。酸化型のレドックス媒介物であるフェリシアン化カリウムは、マトリクスにおいて安定していることがわかった。製剤に使われる量は、使用可能な直線範囲を得るのに十分でなければならない。酵素はまた、十分な活性、純度、安定性を有していなければならない。市販のグルコースオキシダーゼは、カリフォルニア州サンディエゴのバイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍｅ）からＣａｔ．Ｎｏ．Ｇ０３Ａとして購入可能であり、およそ２７０Ｕ／ｍｇ必要である。安定剤は、水に十分に溶けかつ媒介物と酵素の両方を安定化できなければならない。結合剤もまた、電極領域Ｗ１、Ｗ２、Ｒにおける試薬中の他の全ての化学製品を基部層２０の導電面／層２１に結合できなければならない。好ましい安定剤は、ポリエチレングリコール（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４３３８、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））である。好ましい結合剤は、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ６０  ＨＧ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６４６５５、ウィスコンシン州ミルウォーキーのフルカケミカル（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））である。緩衝剤溶液は、酵素による反応を最適化するために十分な緩衝力及びｐＨ値を有していなければならない。０．０５Ｍのクエン酸塩緩衝剤が好ましい。界面活性剤は、乾燥した化学試薬を迅速に溶解させると共に、中間層３０の切取部３２、３４、３６への試薬１及び２の注入を促進するのに必要である。界面活性剤の量及び種類は、先に記載した機能を確実に果たし、酵素への変性効果を避けるものが選ばれる。好ましい界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。試薬は以下のように調合される。
試薬１
ステップ１：クエン酸０．１５１２グラムとクエン酸ナトリウム１．２５８０グラムとを純水１００ｍｌに溶かすことにより、５０ｍＭのクエン酸塩緩衝剤を調合する。
【００３７】
ステップ２：ｍｅｔｈｏｃｅｌ１グラムをステップ１のクエン酸塩緩衝剤１００ｍｌに入れて１２時間かき混ぜることにより１％のｍｅｔｈｏｃｅｌ  ６０ＨＧ溶液を調合する。
ステップ３：ｍｅｔｈｏｃｅｌ溶液に１０％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．３ｍｌ加える。
【００３８】
ステップ４：ポリエチレングリコール２．５グラムをステップ３の溶液に加える。
ステップ５：かき混ぜながら、フェリシアン化カリウム１グラムをステップ４の溶液に加える。
試薬２
ステップ１−ステップ４：試薬１と同じステップ。
【００３９】
ステップ５：かき混ぜながら、フェリシアン化カリウム６．５グラムをステップ４の溶液に加える。
ステップ６：ステップ５の溶液にグルコースオキシダーゼ１．０グラムを加え、１０分間あるいは全ての固形物が完全に溶解するまでかき混ぜる。
電極の組み立て
コートールズパフォーマンスフィルムズから購入可能な金または酸化スズ／金ポリエステルフィルムの断片を、図２に示したような、センサ１０の基部層２０を形成するような形に切断する。金または酸化スズ／金ポリエステルフィルムのスコアリングを行うのにはＣＯ2レーザが使われる。図２に示したように、流体サンプル抽出端１１０の３つの電極と、３つの接触点１２２、１２４、１２６とが電気接触端１２０に形成されるように、フィルムにはレーザによりスコアリングがなされた。スコアリング線はとても細いが、３つの別個の導電体を形成するのに十分な太さである。余分なスコアリング線２８は、完成したセンサ１０から雑音信号生じさせ得る静電気の問題をなくすために基部層２０の外縁に沿って入れられるが、必ずしも必要ではない。
【００４０】
その後、片面粘着テープの断片を第一中間層３０を形成する寸法及び形になるように切断する。その際、テープが、基部層２０の導電層２１の大部分を覆う一方で、図１に示した小さな電気接触領域を露出させるようにする。ほぼ同じ大きさの３つの長方形、正方形、または、円形の切取部３２、３４、３６をＣＯ2レーザ（カリフォルニア州サンディエゴのシンラッド社（Ｓｙｎｒａｄ，Ｉｎｃ．）で購入可能な２５Ｗレーザ）で穴を開けることにより形成する。切取部３２、３４、３６は、化学試薬を入れる電極領域Ｗ１、Ｗ２、Ｒを規定する。切取部の寸法は、センサ１０の流体サンプル経路１１２を可能な限り短くするために、可能な限り小さくするのが好ましい。ただし、切取部は、適切に機能するのに十分な量の化学試薬を入れることができるものでなければならない。本発明での好ましい穴の大きさは、０．０３３インチ（０．８４ｍｍ）×０．０４３インチ（１．０９ｍｍ）程度である。図２に示したように、切取部３２、３４、３６は、０．０２８インチ（０．７１ｍｍ）程度の間隔を空けて互いに一直線に並んでいる。切取部が長方形に描かれているのは単に例証的な理由による。切取部の形はたいして重要な問題ではなく、重要なのは、切取部の大きさが電極を十分に機能させるのに十分な量の化学試薬を入れられるほど大きい一方で、サンプル経路を適切に小さくするのに十分なほど小さいということである。前述したように、切取部の形または切取部の表面積を変化させると、方程式１及び方程式２の定数ｋ1−ｋ5の変更が必要になり得る。先に延べたように、切取部３２、３４、３６に形成される電極の好ましい配置順は、Ｗ１（作用電極１）、Ｒ（参照電極）、Ｗ２（作用電極２）である。
【００４１】
０．４マイクロリットルの試薬１を電極領域Ｗ１及びＲに使用する。試薬１は、レドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤の混合物である。好ましい試薬１の混合物は、以下の成分を記載の割合（Ｗ／Ｗ％）で混合することにより生成される：フェリシアン化カリウム約１％、ポリエチレングリコール約２．５％、ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ６０  ＨＧ約１％、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００約０．０３％、クエン酸塩緩衝剤（ｐＨ５．７）約０．０５Ｍ。０．４マイクロリットルの試薬２を電極領域Ｗ２に使用する。試薬２は、試薬１の混合物に似た混合物であるが、酵素の基質に関わる反応に触媒作用を及ぼすことができる酵素が追加されたものである。好ましい酵素は、グルコースオキシダーゼである。好ましい試薬２の混合物は、以下の成分を以下の割合（Ｗ／Ｗ％）で混合することにより生成される：フェリシアン化カリウム約６．５％、ポリエチレングリコール約２．５％、ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ６０ＨＧ約１％、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００約０．０３％、クエン酸塩緩衝剤（ｐＨ５．７）約０．０５Ｍ、グルコースオキシダーゼ約１％。試薬を加えた後、装置を５５℃のオーブンで約２分間乾燥させた。乾燥後、アドヒーシブリサーチで購入可能な両面テープの断片でＵ字型経路４２を備えた第二中間層４０を作成した。そして第二中間層４０を第一中間層３０の上に重ねる。前述のように、第二中間層４０はスペーサの役割を果たし、流体サンプル抽出経路１１２の大きさを規定する。その幅及び長さは、比較的すばやく動く流体サンプルに合わせて最適化される。Ｕ字型経路４２の好ましい大きさは、幅０．０６３インチ（１．６０ｍｍ）程度、長さ０．２４８インチ（６．３０ｍｍ）程度である。
【００４２】
透明フィルム（３Ｍで購入可能なＣａｔ．ＮＯ．ＰＰ２２００またはＰＰ２５００）の断片で最上層５０を作成する。長方形の通気口５２を先に記載のＣＯ2レーザを使って形成する。通気口４２の好ましい大きさは、０．０７５インチ（１．９１ｍｍ）×０．０５９インチ（１．５０ｍｍ）程度である。通気口５２は、センサ１０の流体端１１０からおよそ０．１３０インチ（３．３ｍｍ）の箇所に位置している。最上層５０は、第２中間層４０上に位置を調整されて重ねられ、図１に示したセンサ１０の組み立てが完成される。
【００４３】
電極の組み立てについての上記の記述は、１つのセンサの組み立てについて記載しているが、その設計及び使用された材料は、図３Ａ−３Ｅに示したような各層の材料の一片から複数のセンサを製造する場合にも適用できるものである。この製造は、比較的大きな断片である基部層２０上に導電層２１を載せることから始められる。スコアリングを行うことで複数の線を導電層２１に入れるが、その際、図３Ａに示したような反復パターンが、前述した好ましいスクライビング法を用いて生成される。これにより、各パターンは、各センサの３つの導電パス２２、２４、２６を最終的に規定する。同様に、図３Ｂに示されている、反復パターンを示す複数の切取部３２、３４、３６が設けられた第一中間層３０の大きな断片は、完成した時に複数のセンサ１０が製造されるように基部層２０に合う大きさに生成される。各切取部の大きさ及び複数の電極領域Ｗ１、Ｒ、Ｗ２に配置された電極材は、先に開示したものと同様である。各切取部に試薬１及び２を入れて乾燥させた後、複数の細長い切取部４２を有する、図３Ｃに記した第二中間層４０の大きな断片を第一中間層３０上に重ねる。その際、第二中間層４０の各細長い切取部４２が第一中間層３０の対応する切取部３２、３４、３６を含むするようにする。図３Ｄに示したような反復パターンの複数の通気口５２を備える同様の大きさの最上層５０を第二中間層４０の上に重ねる。図３Ｅは複合層の平面図である。４つの層２０、３０、４０、５０によって作成された積層片は、積層片から切り出すことができる複数のセンサ１０を有している。積層片を流体サンプル抽出端２１０で線Ａ−Ａ'に沿って縦に切ると、複数のサンプル抽出孔１１４が形成され、電気接触端２２０で線Ｂ−Ｂ'に沿って縦に切ると、複数の導電接触部１２２、１２４、１２６が形成される。また、積層片を所定の間隔を置いて線Ｃ−Ｃ'に沿って切断すると、複数の個別のセンサ１０が形成される。図１に示したように、各センサ１０の流体サンプル抽出端１２０の成形は好みに応じて実行されてよい。積層片が切り出される順番が重要ではないことは当業者にとっては明らかであろう。例えば、積層片は、所定の間隔（Ｃ−Ｃ'）で切断されてからＡ−Ａ'及びＢ−Ｂ'に沿って切断されてもよい。
【００４４】
以下に、サンプル流体抵抗を測定することによるヘマトクリットレベルの変化の補正と、サンプル流体中に存在する酸化可能な種による干渉の影響の無効化とを含む、本発明に固有の特徴を示す例を表す。本発明の全てのセンサがマサチューセッツ州ウォルトハムのノブァバイオメディカル社（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により製造されたブレッドボードグルコースメータ上でテストされた。０．３５ボルトの電位が作用電極及び参照電極間に付与され、結果として生じた電流信号を、本発明の開示に基づいてグルコース濃度に変換した。その読取り値を、オハイオ州イエロースプリングズのイエロースプリングズインストルメンツ社（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）から購入可能なＹＳＩグルコースアナライザ（Ｍｏｄｅｌ  ２３００）を使って同じサンプルに対して得られた読取り値（対照読取り値）と比較した。
例１
ヘマトクリット補正の実証
本発明に独特の設計により、流体サンプルの抵抗を測定することが可能になる。これは、同じ試薬、すなわち試薬１、を参照電極Ｒ及び第一作用電極Ｗ１に加えることにより可能になる。試薬１に使用された化学試薬は抵抗を正確に測定するのに重要である。試薬１は、大量の塩またはグルコースオキシダーゼを含むべきではない。さもなければ、結果として生じる抵抗は正確ではなく、グルコースに依存してしまう。本発明を適切に機能させるためには、参照電極用のフェリシアン化カリウムのような媒介物を最小量にすることが不可欠である。
【００４５】
この場合は血液サンプルであるサンプル流体のＷ１及びＲ間の抵抗は、読取り装置（Ｎｏｖａグルコースメータ）が血液サンプルを感知してからどの程度の時間後であってもよいが、２０秒後に測定されるのが好ましい。血液サンプル全体を回転させ、様々な比率で血漿と赤血球とを混合することで、異なるヘマトクリットレベルの血液サンプルを準備した。ヘマトクリットレベルは、ミクロヘマトクリット遠心器で測定された。各種サンプルのグルコース濃度は、本発明のセンサ（Ｃmea）と、オハイオ州イエロースプリングズのイエロースプリングズインストルメンツ社（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）のＭｏｄｅｌ  ２３００のＹＳＩ血糖アナライザ（対照）とにより測定された。上述の方程式（１）及び（２）は、本発明のヘマトクリット補正機能を実証するために、本発明のセンサにより測定された補正後のグルコース濃度（Ｃcorr）の算出に用いられた。得られたデータを座標に示した。図４Ａ及び４Ｂは、様々なヘマトクリットレベルのサンプルのグルコースレベルが低い場合及び高い場合に、ＹＳＩ血糖アナライザを用いて得られた上記サンプルに関する読取り値と、Ｎｏｖａグルコースアナライザと共に本発明のセンサを用いて得られた読取り値との割合の相関関係を表す２つのグラフを示している。
例２
干渉を受けない特性の実証
本発明に独特の設計により、アスコルビン酸、アセトアミノフェン、尿酸、その他のサンプル中に存在する干渉物質などの酸化可能物質による干渉を排除することが可能になる。これは、Ｗ１から得られた反応をＷ２で得られた反応から減じることにより可能になり、以下の方程式により表される。
【００４６】
Ｉ＝Ｉｗ2−Ｉｗ1                                方程式（３）
このとき、Ｉｗ2は、Ｗ２（第二作用電極）における電流であり、
Ｉｗ1は、Ｗ１（第一作用電極）における電流であり、
Ｉは、Ｗ２及びＷ１との差分であると共に還元型の媒介物の酸化による電流を表し、サンプルのグルコース濃度に比例する。
【００４７】
Ｗ１及びＷ２の表面積が同じであるために、サンプル流体に存在し得る干渉は、各作用電極から比較的よく似た信号を発生させるはずである。Ｗ１及びＷ２に異なる試薬が使われていたとしても、干渉への反応には著しい違いは見られないことがわかった。従って、血液サンプルから得られた電気反応における違いは、サンプルに存在するグルコースによるものであった。このことは、通常及び高レベルのグルコース血液サンプルに、１ｍＭ及び５ｍＭのアスコルビン酸、アセトアミノフェン、尿酸を加えることによりテストされた。表１は、１００ｍｇ／ｄＬ及び３００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度を有する血液サンプル中に干渉物を加えた際の、本発明のセンサ及び（細片１、細片２、細片３、細片４で参照される）各種の市販のセンサで得られた読取り値の百分率反応変化を示す。
【００４８】
【表１】
0004060078.tif 000002
【００４９】
テストデータから、本発明のセンサから得られた読取り値が、１ｍＭ及び５ｍＭのアスコルビン酸及びアセトアミノフェンと、１ｍＭの尿酸によってほとんど変化しないことがわかる。細片４を除く全ての市販のセンサが、重大な干渉を受けている。細片４は５ｍＭのアスコルビン酸で「エラー」を出した。３００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度で、１ｍＭ及び５ｍＭのアスコルビン酸をサンプルに加えた際も、本発明のセンサは干渉を示さなかった（反応変化は５％未満である）。市販のセンサは、１ｍＭのアスコルビン酸を加えられたサンプルについて７％−１５％程度の反応増加を示し、５ｍＭのアスコルビン酸が加えられたサンプルについては「高」という読取り値を示した。細片４はまた、５ｍＭのアスコルビン酸が加えられたサンプルについて「エラー」を示した。アセトアミノフェン及び尿酸を含むサンプルでは、尿酸を含むサンプルにおける細片４を除いて、全ての市販の細片が、様々な度合いのエラーを示した。
例３
最小サンプル量特性の実証
本発明に独特の設計により、これまで可能であったよりもさらに少ないサンプルでの測定が可能になる。血液サンプルがセンサに付与され、サンプルは、流体サンプル抽出経路を通って通気口へと移動する。血糖の測定に必要な血液量は、経路の容量によって決められる。本発明のために計算された容量は、１．４４マイクロリットルである。センサ反応に対する量の影響をテストするために、異なる血液サンプル量がセンサに付与され、その結果として生じる濃度の読取り値を、量に対して座標に示した。テストデータを図５に示す。
【００５０】
本発明のセンサは、量が１．５マイクロリットルより多い場合、サンプル量に依存しない反応を示している。本発明のセンサは、１．０マイクロリットルという少ないサンプル量であっても相応の読取り値を示すことがわかった。これが可能であるのは、血液量がサンプル抽出経路全体を満たさなくても、Ｗ１及びＲに付与された試薬１、及びＷ２に入れられた試薬２の親水性によりサンプルが電極領域を覆うことができたためである。
例４
広い直線範囲及び精密さ特性の実証
静脈血のサンプルを集めて、いくつかの部分サンプルに分けた。各部分サンプルは、３５−１０００ｍｇ／ｄＬの範囲の異なるグルコース濃度を与えられた。これらの部分サンプルは、ＹＳＩグルコースアナライザで、その後、本発明のセンサでＮｏｖａグルコースメータを使用してそれぞれ測定された。本発明のセンサでは、電流反応と３５−１０００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度との間に直線関係が見られる。ＹＳＩメータ（対照）を使って得られた濃度値に対する濃度読取り値を座標に示した。それが図６である。
【００５１】
回帰係数０．９９８８は、ＹＳＩ血糖アナライザで得られた読取り値とほぼ完全に一致したことを示す。同じ部分サンプルを、４つの異なる市販のセンサを使って付属するメータでテストした。市販のセンサは、６００ｍｇ／ｄＬ程度までのみ直線的な反応を示した。５００−６００ｍｇ／ｄＬの範囲より上では、全ての市販のセンサがテスト結果として「高」を表示した。
【００５２】
本発明のセンサの精密さを、３５−１０００ｍｇ／ｄＬ程度の同じグルコースレベルの範囲で調べた。４つの異なる本発明のセンサ群を精密さの試験に使用した。概して、３５、１００、２００、５００、１０００ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルを含むサンプルについて、相対標準偏差は、それぞれ、およそ９．５％、５．０％、３．５％、２．９％、２．６％であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  積層体の開口端、通気口、電気接触点を示す本発明の透視図である。
【図２】  積層体をなす種々の層を示す本発明の分解透視図である。
【図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ】  複数の本発明のセンサを形成するためのパターンを示す本発明の積層片の一片の平面図である。
【図３Ｅ】  複数の本発明のセンサを形成するためのパターンを示す本発明の積層片の断片の平面図である。
【図４Ａ、４Ｂ】  通常の血糖濃度及び高血糖濃度における本発明の濃度反応についてのヘマトクリット影響を示すグラフである。
【図５】  本発明の濃度反応とサンプル量との相関図である。
【図６】  同じサンプルについての、本発明のセンサを使用した濃度読取り値とＹＳＩグルコースアナライザを使用して得られた濃度読取り値との相関曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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