(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号１に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の塩基番号１８２の部位を含む配列を増幅し、得られた増幅産物を分析することにより該塩基がＡかＣかを決定することを含む心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法。
【請求項２】
試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号１に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の塩基番号１８２の部位を含む配列を増幅し、得られた増幅産物を分析することにより該部位がＡかＣかを決定すること、及び配列表の配列番号２の開始コドンの上流側の配列を増幅し、増幅産物を分析してＣＣＧＣＣＡＧＣＣを繰り返し単位とするvariable number of tandem repeat多型の繰り返し数を決定することを含む心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法。
【請求項３】
配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１５塩基の配列またはこれに相補的な配列からなる、請求項１または２記載の方法においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１６塩基の配列を増幅するための、少なくとも１５塩基の配列からなる請求項１または２記載の方法においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１または２記載の方法においてプライマーとして使用される配列番号３または４の配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１６塩基の配列を増幅するための、配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）またはその上流域の配列の連続する少なくとも１５塩基の配列、または配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）またはその下流域の配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に相補的な配列からなる、請求項１または２記載の方法においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項２記載の方法においてプライマーとして使用される配列番号５または６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２の配列または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の一部であってＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位のvariable number of tandem repeat多型部分を含んで連続する配列を増幅するための、配列番号２の配列もしくは配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列またはそれらの上流領域の配列の連続する少なくとも１５塩基の配列、または配列番号２の配列もしくは配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列またはそれらの下流領域の配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に相補的な配列からなる請求項２記載の方法においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上が基板に固定化されている請求項１または２に記載の方法に使用されるＤＮＡチップ。
【請求項１０】
少なくとも、請求項３〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上、及び／または請求項９に記載のＤＮＡチップを含む請求項１または２に記載の方法に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は心筋梗塞の遺伝的要因を検出するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
心筋梗塞の発病には、いくつかの遺伝的因子と生活習慣等の非遺伝的因子とが関わっていると考えられるが、その発病のメカニズムは解明されていない。
従って、心筋梗塞を発病する可能性の高い遺伝的因子が明らかになれば、発病のメカニズムの解明に大きな役割を果たすと共に、その遺伝的因子の判定により心筋梗塞に罹患する可能性の高い患者に対し、生活習慣等の非遺伝的因子を最小限とする指導を行い、発病の危険性を著しく低下させ得ると考えられる。
本発明の発明者は、１０個のエキソンを有するヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ構造（Gene Bank D84115）を解明しているが（T.Nakayama et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 221, 803-806 (1996))、さらにその機能を研究する過程で、プロスタサイクリン遺伝子における多型が、心筋梗塞の発症に関連することを見出し、本発明を完成させた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型の分析により心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
第１に、本発明は、下記の方法に関する。
（１）  ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子における多型を分析することからなる心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法。
（２）  試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号１に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の塩基番号１８２の部位を含む配列を増幅し、得られた増幅産物を分析することにより該塩基がＡかＣかを決定することを含む（１）の方法。
（３）  試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号２の開始コドン（塩基番号５０１〜５０３）の上流側の配列（塩基番号１〜６００、好ましくは塩基番号３００〜５００）を増幅し、増幅産物を分析してＣＣＧＣＣＡＧＣＣを繰り返し単位とするＶＮＴＲ多型の繰り返し数を決定することを含む（１）の方法。
（４）  試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号１に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の塩基番号１８２の部位を含む配列を増幅し、得られた増幅産物を分析することにより該部位がＡかＣかを決定すること、及び配列表の配列番号２の塩基番号５０１〜５０３の開始コドンの上流側の配列（塩基番号１〜６００、好ましくは塩基番号３００〜５００）を増幅し、増幅産物を分析してＣＣＧＣＣＡＧＣＣを繰り返し単位とするＶＮＴＲ多型の繰り返し数を決定することを含む（１）の方法。
【０００５】
第二に、本発明は下記のプローブ及びプライマーに関する。
（５）  配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列にハイブリダイズし得る（１）、（２）または（４）の方法においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチド。
（６）  配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列を増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）、（２）または（４）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
（７）  配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列を、１塩基または数塩基の置換、欠失、付加を導入することにより、１８２の部位の塩基がＡまたはＣのいずれか一方である場合にのみ特定の制限酵素による認識配列が生じるように増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）、（２）または（４）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
（８）  （１）〜（４）の方法に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーとして機能する一組のオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの一方が配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する配列にハイブリダイズすることができ、他方が配列番号１の配列の他の部分にハイブリダイズすることができる一組のオリゴヌクレオチド。
（９）  配列番号２の配列または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の一部であって、ＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位のＶＮＴＲ多型部分を含んで連続する配列を増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）、（３）または（４）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
さらに、本発明は、少なくとも、（５）のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上が基板に固定化されている（１）〜（４）の方法に使用されるＤＮＡチップに関する。
また、本発明は、少なくとも、（５）〜（９）のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上、及び／または（１０）のＤＮＡチップを含む（１）〜（４）の方法に使用されるキットに関する。
なお、上記において、オリゴヌクレオチドは適宜標識されたものであってもよい。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、「心筋梗塞の遺伝的要因を判定する」とは、被験者が心筋梗塞の発症の危険性が高いことを示す対立遺伝子型を有するか否かを判定することを意味する。
上記、本発明の判定方法において、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子（以下、場合よりＰＧＩＳ遺伝子と記す）における多型を分析するとは、ＰＧＩＳ遺伝子のゲノムＤＮＡのエキソンまたはイントロン、ＰＧＩＳ遺伝子の上流側（例えば、塩基番号１〜５００）等における多型を分析するこという。
多型の分析は、例えば多型を含む部分の配列を増幅し、対立遺伝子型を分析することからなる。また、ゲノムＤＮＡの分析であっても、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの分析であってもよい。
本発明において使用される試料は、任意の生物学的試料、例えば血液、毛髪、組織片、尿等であり得る。
多型は、例えばSingle nucleotide polymorphism（ＳＮＰ）多型、variable number of tandem repeat（ＶＮＴＲ）多型等であり得る。
【０００７】
（増幅）
多型を含む部分の増幅は、例えばＰＣＲによって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＲＣＲ等で行ってもよい。
プライマーの選択は、例えば、多型部分を含む１０塩基以上の配列を増幅するように行い得る。増幅される配列は、ＳＮＰの場合には１０〜１００塩基、好ましくは１０〜５０塩基であり得る。ＶＮＴＲ多型の場合には、繰り返し単位を構成するヌクレオチドの数及び最大繰り返し数によるが、例えば２０〜３００塩基であり得る。
また、プライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるように、フォワードプライマー（以下、Ｆプライマーと記す）またはリバースプライマー（以下、Ｒプライマーと記す）の一方が多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。
プライマーは必要に応じて蛍光，ＲＩ等の適当な手段により標識され得る。
【０００８】
（多型の分析）
多型の分析は、公知の方法を適宜選択して行い得る。分析方法の例を下記に示す。
ａ．ハイブリダイゼーション
多型の分析は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。
プローブは、必要に応じて、蛍光，ＲＩ等の適当な手段により標識され得る。
プローブは、例えば多型部分を含む１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。ＳＮＰの分析の場合には、１０〜５０塩基の配列を有するのが好ましい。また、ＳＮＰの分析の場合、多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにプローブを選択するのが好ましい。
本発明において、ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。
プローブの一端を基板上に固定化してなるＤＮＡチップを用いてもよい。
【０００９】
ｂ．制限酵素断片長多型を利用する方法
多型の分析は、制限断片長多型を利用して行うこともできる。この方法は、多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって、制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する方法である。
ｃ．配列決定
多型の分析を、増幅産物の配列決定により行ってもよい。
配列決定は、例えばジデオキシ法、Maxam-Gilbert法等の公知の方法により行い得る。
ｄ．変性勾配ゲル電気泳動
試料ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を変性勾配ゲル電気泳動にかけることにより分析することもできる。
ｅ．その他
ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法、Allele Specific PCR法等を多型の分析に使用することもできる。
【００１０】
本発明は、上記多型の分析方法により分析した結果を、所望により他の多型分析、及び／または他の検査結果と合わせて、心筋梗塞に罹患する可能性を判断することを含む心筋梗塞の診断方法にも関する。該方法において、いくつかのヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型分析を組み合わせて利用することも有効である。
また、本発明は上記診断方法による診断の結果、さらに精密な検査を行うこと、心筋梗塞の治療を行うこと、及び／または食餌内容等の生活習慣の改善を指導することを含む心筋梗塞の予防または治療方法にも関する。
【００１１】
上記本発明の方法の実施態様の一つとして、上記方法において、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８におけるＳＮＰ、具体的には配列番号１の配列の塩基番号１８２の部位におけるＳＮＰを検出することを含む方法が挙げられる。なお、配列番号１の配列において、エキソン８は塩基番号９０〜２７１の部分である。
該方法においては、プライマーとして、配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列を増幅するためのＦプライマーまたはＲプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド、またはＦプライマーとＲプライマーからなる一組のプライマーであって、ＦプライマーまたはＲプライマーの一方が配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列にハイブリダイズし、他方が配列番号１の配列の他の部分の少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば２０〜２５塩基の配列にハイブリダイズする一組のプライマーを使用することができる。
この場合、ＰＣＲ条件は、例えば下記のものであり得る。
プライマー濃度：０．１〜１．０μＭ
ＭｇＣｌ２濃度：０．７〜１．５μＭ
ｄＮＴＰ濃度：各１００〜２００μＭ
至適酵素量：０．５〜２．５Ｕ／５０μｌ
鋳型ゲノムＤＮＡ量：５０〜５００ｎｇ
サイクル数：２５〜３５サイクル
denature温度：約９４℃
denature時間：２０〜３０秒
annealing温度：５５〜６５℃
annealing時間：２０〜６０秒間
extension温度：７２〜７５℃
extension時間：２０〜１８０秒間
アガロースゲル濃度：０．４〜２．０％
【００１２】
上記プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列の一部に相補的な配列を有していてもよく、また、上記プライマーとして機能し得る限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
上記方法においては、プローブとして配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用することができる。
該オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列の目的とする部位と相補的な配列を有していてもよく、またプローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。このプローブは、一端を各々基板に固定してなるＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型（即ちｍがＡまたはＣ）に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。ＤＮＡチップには、本発明で検出できる多型と異なる多型を分析するためのプローブも共に固定され得る。
【００１３】
上記本発明の方法の他の実施態様としては、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の開始コドンから１〜約１００塩基上流の範囲に存在するＣＣＧＣＣＡＧＣＣを繰り返し単位とするＶＮＴＲ多型を分析することを含む方法が挙げられる。ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の上流側の配列は、配列番号２に示される。配列番号２において、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の開始コドンは塩基番号５０１〜５０３である。
該方法に使用されるプライマーとしては、配列番号２の配列または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の一部であって、該配列に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の上流のＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位のＶＮＴＲ多型部分を含んで連続する配列を増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る上記方法に使用されるオリゴヌクレオチドを使用することができる。
該プライマーは配列番号２の配列または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の一部に相補的な配列を有していてもよく、また、上記プライマーとして機能し得る限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
上記方法においては、プローブとして配列番号２または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の多型部分を含んで連続する５０塩基以上、好ましくは５０〜２００塩基の配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用することができる。
これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の多型を含む部分の配列に相補的な配列を有していてもよく、また、プローブとして機能し得る限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
各繰り返し数の配列に対応する全てまたは一部のオリゴヌクレオチドからなる一組のプローブセットを使用することもできる。また、該プローブセットを構成する各プローブの一端が基板に固定されているＤＮＡチップとして用いることもできる。ＤＮＡチップには、上記のエキソン８のＳＮＰを検出するためのプローブが共に固定されていてもよい。また、本発明で検出できる多型と異なる多型を分析するためのプローブが共に固定されていてもよい。
【００１４】
本発明は、上記で説明したプライマーと、上記プローブとしてのオリゴヌクレオチド及び／または上記ＤＮＡチップを含む心筋梗塞診断用キットにも関する。
キットは、さらに制限断片長多型法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識のための手段、緩衝液等、本発明の方法を実施するのに必要な他の要素を含んでいてもよい。
なお、本発明に使用されるプライマー及びプローブは市販のＤＮＡ合成機等により合成することができる。また、本発明において、ハイブリダイゼーションは、Sambrook，J．Fritsch，E.F.，Maniatis T.（1989）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkの記載を参考に行うことができる。また、ＰＣＲ法は、下記の文献を参考に行うことができる：PCR Technology，J.A．Ehrlich編，Stockholm Press，New York（1989）; Molecular Methods for Virus Detection，D.L．Wiedbrauk及びD.H．Farkas編，Academic Press，New York(1995)．Nucleic Acid Hybridisation，B.D．Hames及びS.J．Higgins編，IRL Press，Oxford，Washington DC(1985)）。
本明細書において、塩基番号は添付の配列表に基づく。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１
エキソン８の多型と心筋梗塞との関連について、心筋梗塞と診断された患者１２２名（ＭＩ群）及び年齢を一致させた健常人１５５名（non-ＭＩ群）を年齢を一致させて選択した。
各被験者の末梢血を採取し、標準方法（例えばSambrook，J．Fritsch，E.F.，Maniatis T.（1989）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkに記載）により、ゲノムＤＮＡを抽出し、下記に示す方法によりプロスタサイクリン遺伝子のエキソン８の多型部位を増幅した。
200ngの上記ゲノムＤＮＡ、下記の配列を有する濃度19pmol/μｌのＦプライマー溶液及びＲプライマー溶液各々0.8μｌ、ヌクレオチド三リン酸（Takara社製造）各々２５mM、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２４μl、TaqＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）０．２Ｕ／４０μl、水２５．０μl及び１０倍緩衝液（Takara社製）４μlの混合物計４０μｌの系にて、ＰＣＲ装置（PerkinElmer GeneAmp9700）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、続いて９８℃２５秒間、６３℃１分間、７２℃１分間のサイクルを３０サイクル、その後、７２℃で１０分間の後、４℃に保温とした。
【００１６】
プライマー配列
Ｆプライマー：TGGCATATGAGCAGGTGAAGGG（配列番号：３）
Ｒプライマー：CCACGTCGCAGGTTGAATTGT（配列番号：４）
得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製し、dry upペレットにした後、制限酵素溶液（１０ｘ緩衝液（第一化学）５μl、水４４μl及び制限酵素BsmAI１（第一化学）１μlと反応させ、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。
制限酵素BsmAIの認識配列はGAGACであり、上記配列番号１の配列の塩基番号１８２の部位の塩基がＡである場合は切断され、Ｃである場合は切断されない。
上記の方法により、各試料を分析したところ、下記の表に示す結果が得られた。表中、Ａは上記配列番号１の配列の塩基番号１８２の部位がＡである遺伝子型を意味し、Ｃは、該塩基がＣである遺伝子型を意味する。なお、被験者は全て日本人である。
【００１７】
【表１】
0004111481.tif 000002
【００１８】
これを対立遺伝子頻度として下記の表に示した。
【００１９】
【表２】
0004111481.tif 000003
【００２０】
上記の結果をχ2解析により分析したところ、対立遺伝子と表現型とは統計学的に有意な相関を有していた（ｐ値＝０．００７６）。
従って、配列番号１の塩基番号１８２がＣである場合に心筋梗塞の発症の危険性が高いと判定することができる。
【００２１】
実施例２：
ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン１の上流側に存在するＶＮＴＲ多型を調べるために、心筋梗塞と診断された患者１１０名（ＭＩ群）及び年齢を一致させた健常者１３４名（non-ＭＩ群）を年齢を一致させて選択した。各患者の抹消血白血球から実施例１と同様の標準的な方法により、下記に示す方法によりヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン１の上流側の約２００塩基を増幅した。プライマーとしては、下記の配列を有するプライマーを使用した。
Ｆプライマー：5'-ACATTTTCCCCCAGGCCTGAGCTGC-3'（配列番号：５）
Ｒプライマー：5'-CGGCTCAGTAGCAGCAGCAGCAACAGT-3'（配列番号：６）
【００２２】
50ngの上記ゲノムＤＮＡ、３２Ｐで標識した上記配列を有するＦプライマー0.125pmol、未標識のＲプライマー0.125pmol、ヌクレオチド三リン酸（Takara社製）各々２５mM、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２４μl、TaqＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）０．２Ｕ／４０μl、水２５．０μl及び１０倍緩衝液（Takara社製）４μlの混合物を調製し、ＰＣＲ装置（PerkinElmer GeneAmp9700）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃で３分間、続いて９８℃２５秒間、６８℃９０秒間、７２℃の２Ｓｔｅｐサイクルを３０サイクル、その後、７２℃で１０分間の後、４℃に保温とした。
増幅された断片をpCRＴＭ2.1（Invitrogen)にサブクローニングした後、ジデオキシ法によりＤＮＡシーケンシングを行い、これを標準とした。各群のサンプル及び標準のプラスミドクローンを増幅した後、同時に６％ポリアクリルアミドシーケンシングゲルにて電気泳動する事により遺伝子型を決定した。なお、７タンデムリピートアレルＰＣＲ産物の大きさは３１７ｂｐであり、３タンデムリピートアレルＰＣＲ産物の大きさは２８１ｂｐであった。
non−ＭＩ群及びＭＩ群のタンデムリピート数を下記に示す。なお、被験者は全て日本人である。
【００２３】
【表３】
0004111481.tif 000004
【００２４】
これを対立遺伝子頻度として下記の表に示した。
【００２５】
【表４】
0004111481.tif 000005
【００２６】
上記の結果をχ2解析により分析したところ、対立遺伝子と表現型とは統計学的に有意な相関を有していた（ｐ値＝０．０３７５）。従って、繰り返し数が少ない場合に心筋梗塞発症の危険性が高いと考えられ、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の上記ＶＮＴＲ多型は心筋梗塞の遺伝的要因の判定に利用できることが明らかである。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の方法により、心筋梗塞の遺伝的要素を有するか否かが判定でき、これにより心筋梗塞の危険性を予測することができる。さらに、その結果に基づき、食餌内容等の生活習慣の改善により心筋梗塞の環境的要因を最低限に押さえる指導を行い、心筋梗塞の予防または治療を行うことができる。
【配列表】
0004111481.tif 000006
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