(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなり、神経シナプス結合後部の構成分子ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０とＳ−ＳＣＡＭに結合するラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１。
【請求項２】
請求項１のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１をコードするラット遺伝子。
【請求項３】
請求項２のラット遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ断片。
【請求項４】
請求項３のＤＮＡ断片を保有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１に対する抗体。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基による置換がなされたアミノ酸配列からなり、神経シナプス結合後部の構成分子PSD-95／SAP90とS-SCAMに結合する蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、神経シナプス結合後部の構成分子ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90およびＳ−ＳＣＡＭに特異的に結合する蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１と、そのアイソフォームであるＭＡＧＵＩＮ−２に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用な新規の蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトをはじめとする多細胞生物の正常な機能維持には、秩序ある細胞接着とそれに引き続く細胞間の情報交換を支える細胞間結合の成立、さらにその細胞間結合を通じて受け渡しされる情報に基づいて引き起こされる細胞の分化といった一連の生命現象の時系制御が極めて重要である。
【０００３】
多細胞生物に認められる細胞間結合には多くの共通性が存在するが、一方で、細胞の種類による特異性も存在し、とくに神経シナプス結合は他の細胞間結合とは大きく異なる特徴を有している。第一に、神経シナプス結合は極性を有し、その前部と後部では構造が著しく異なる。前シナプス膜は神経伝達物質の放出に関わる構造を有するのに対し、後シナプス膜はpostsynaptic density(ＰＳＤ)と呼ばれる特異な細胞骨格構造を有している（Curr. Opin. Neurobiol. 3, 732-737, 1993; Trends Neurosci. 20, 264-268, 1997）。第二には、神経シナプス結合は一度成立した後にも神経刺激伝達に伴い結合の性状の変化（可塑性）を示すということである。この可塑性は、記憶・学習のメカニズムの基本を成す現象であると考えられており、正に神経シナプス結合を他の細胞間結合から際立たせる特徴である。可塑性のメカニズムの詳細は未だ明らかでないが、神経シナプス結合の前部に依存する前シナプス可塑性と、後部に依存する後シナプス可塑性の存在が知られている。いずれにしても神経シナプス結合の特徴的な構造が深く関与していることが予測され、この構造の解明が可塑性のメカニズム、さらには記憶・学習のメカニズム解明に必須であると考えられている。
【０００４】
効果的な神経伝達のためには、後シナプス膜において神経伝達物質受容体が正確な位置に存在することが必要である。最近の研究から、ＰＳＤにおいて様々な受容体の蓄積とクラスタリングに機能する幾つかの分子が同定されている。例えば、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90とそのアイソフォーム（isoforms）はＮＭＤＡ受容体およびＳhaker型Ｋ+チャネルに結合し（例えば、Neuron 9, 929-942, 1993）、またＧＲＩＰおよびHomerはＡＭＰＡ受容体と代謝性グルタミン酸受容体にそれぞれ結合する（Nature 386, 279-284, 1997; Nature 386, 284-288, 1997）ことが知られている。これら分子の共通の特徴は、それらが、蛋白質−蛋白質相互作用のためのモジュールＰＤＺドメインを有するということである（例えば、Trends Biochem. Sci. 20, 102-103, 1995; Trends Biochem. Sci. 20, 350, 1995; Curr. Biol. 6, 1385-1388, 1996; Neuron 17, 575-578, 1996）。
【０００５】
ＰＤＺドメインは最初、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90の約９０アミノ酸の繰り返しとして見出され、その後、３つの蛋白質［ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90、ショウジョウバエ（Drosophilia）のdiscs-large 腫瘍抑制蛋白質Ｄlg−Ａ、tight junction蛋白質ＺＯ−１）に含まれることからＰＤＺと命名された（Neuron 9, 929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268, 4580-4583, 1993; Cell 66, 451-464, 1991; J. Cell Biol. 121, 491-502, ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 7834-7838, 1993）。このＰＤＺドメインは様々な蛋白質のＣ末端配列に結合する。すなわち、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90の第１および第２のＰＤＺドメインはＮＭＤＡ受容体およびＳhaker型Ｋ+チャネルと結合する（Science 269, 1737-1740, 1995; Nature 378, 85-88, 1995）。第３のＰＤＺドメインはニューロリギン（neuroligin）と呼ばれる神経細胞接着分子の細胞質ドメインと結合する（Science 277, 1511-1515, 1997）。また、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90はＮ末端のディサルフィド結合を介してホモテトラマを形成する（Neuron 18, 803-814, 1997）。
【０００６】
ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90は、ＰＤＺドメインの他に１つのＳＨ３ドメインと１つのグアニル酸キナーゼ（ＧＫ）ドメインを有している。ＳＨ３ドメインはｓｒｃチロシンキナーゼのシグナル伝達モジュールとして規定されていたが、その後他の多くの蛋白質でも同定されている（Cell 80, 237-248, 1995）。ただし、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90におけるＳＨ３ドメインの機能は不明である。ＧＫドメインは酵母グアニル酸キナーゼと相同であり、様々な膜関連蛋白質に存在する。これらの蛋白質は特定の膜構造を維持していると考えられており、膜関連グアニル酸キナーゼ（membrane-associated guanylate kinase：ＭＡＧＵＫ）と命名されている（Mech. Dev. 44, 85-89, 1993; Curr. Biol. 6, 382-384, 1996）。
【０００７】
近年、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90のＧＫドメインと相互作用する分子が３つの研究グループによって同定され、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと命名されている（J. Cell Biol. 136, 669-678, 1997; J. Biol. Chem. 272, 11943-11951, 1997; Genes Cells 2, 415-424, 1997; J. Neurosci. 17, 5687-5696, 1997）。これらの分子のうち、ＳＡＰＡＰ（１，２）はこの出願の発明者らが見出した分子であり、既に特許出願している（特願平9-11714号、特願平9-11715号）。またこの出願の発明者らは、ＨＥＫ293細胞においては、このＳＡＰＡＰが細胞膜と強固に結合し、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90を細胞膜に移行させることを見出してもいる（J.  Biol.  Chem. 272, 11943-11951, 1997）。
【０００８】
そしてさらにこの出願の発明者らは、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与するＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する分子を見出している。このＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰ結合分子はＭＡＧＵＫの構造を有し、Ｎ末端のＧＫドメインと２つのＷＷドメインおよび６つのＰＤＺドメインを有し、ＧＫドメインを介してＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに結合し、ＰＤＺドメインを介してＮＭＤＡ受容体およびニューロリギン（neuroligin）に結合する。そして、この蛋白質はシナプス結合の受容体および細胞接着蛋白質を統合させることから、Ｓ−ＳＣＡＭ（synaptic scaffolding molecule）と命名され、既に特許出願されている（特願平10-302239号）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者らおよびその他の研究グループから提出された様々な知見により、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰはＰＳＤの中核的な蛋白質であると考えられ、そして、このＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに結合するＳ−ＳＣＡＭがＰＳＤ形成に重要な役割を果たしていることが明らかにされつつあるが、ＰＳＤ形成の全貌を解明するためには、Ｓ−ＳＣＡＭと相互作用する新規分子を特定することが不可欠である。
【００１０】
また、このような分子の同定とその機能の解明は、ヒトの記憶・学習といった高次脳機能の理解に大きな前進をもたらすばかりか、この分子あるいはこの分子の活性、作用に影響する様々な物質、化合物等は、中枢神経系の機能的または構造的障害を原因とする様々な神経疾患の原因解明、並びにそれら疾患の診断、予防および治療法等の開発に大きく寄与するものと期待される。
【００１１】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与する重要な役割を果たしているＳ−ＳＣＡＭに特異的に結合する未知分子を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決するものとして以下の(1)〜(9)の発明を提供する。
(1)  配列番号１のアミノ酸配列を有するラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１。
(2)  配列番号３のアミノ酸配列を有するラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−２。
(3)  前記発明(1)のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１、および請求項２のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−２をコードするラット遺伝子。
(4)  前記発明(3)の遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
(5)  前記発明(3)の遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
(6)  前記発明(4)または(5)のＤＮＡ断片を保有する組換えベクター。
(7)  前記発明(1)のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１に対する抗体。
(8)  配列番号１と相同のアミノ酸配列を有し、前記発明(1)のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１と同一の機能を有する動物性蛋白質。
(9)  配列番号３と相同のアミノ酸配列を有し、前記発明(2)のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−２と同一の機能を有する動物性蛋白質。
【００１３】
前記発明(1)の蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１は、yeast two-hybrid法を用いてＳ−ＳＣＡＭとの相互作用分子を探索した結果単離された新規の蛋白質分子であり、ＳＡＭドメイン、ＰＤＺドメインおよびＰＨドメインを有し、Ｃ末端にはＰＤＺに対する結合のコンセンサスモチーフを持っており、ＰＳＤ−９５とも結合する。また、前記発明(2)の蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−２はＭＡＧＵＩＮ−１のalternative splicing form（アイソフォーム）であり、ＰＤＺ結合モチーフを欠損している。
【００１４】
コンピューターによるホモロジー検索の結果、これらの蛋白質は新規蛋白質であることが確認されている。なお、ＭＡＧＵＩＮとは、"membrane-associated guanylate kinase-interacting protein"から命名した。
【００１５】
以下、この出願の前記発明(1)〜(9)について実施の形態を詳しく説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
発明(1)のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１は、配列番号２に塩基配列を示したｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号１のアミノ酸配列を有している。そして、このアミノ酸配列には、ＳＡＭドメイン（アミノ酸番号８−７５）、ＰＤＺドメイン（アミノ酸番号１５７−２９６）、ＰＨドメイン（アミノ酸番号５７２−６６７）、およびＰＤＺに対する結合のコンセンサスモチーフ（アミノ酸番号１０２９−１０３２）が含まれている。
【００１７】
発明(2)のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−２は、配列番号４に塩基配列を示したｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号２のアミノ酸配列を有している。そして、このアミノ酸配列には、ＳＡＭドメイン（アミノ酸番号８−７５）、ＰＤＺドメイン（アミノ酸番号１５７−２９６）、およびＰＨドメイン（アミノ酸番号５７２−６６７）が含まれている。
【００１８】
また、ノザン解析の結果、図１に示したように、ＭＡＧＵＩＮ−１はラットの脳でのみ発現していることが確認されている。
これらの蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１およびＭＡＧＵＩＮ−２（以下、「ＭＡＧＵＩＮｓ」と記載することがある）は公知の方法、すなわちラットの脳から単離する方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってＭＡＧＵＩＮｓを取得する場合には、発明(4)または(5)のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、ｃＤＮＡがコードするＭＡＧＵＩＮｓを大量に発現させることができる。
【００１９】
この発明の蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を挿入結合して組換えた発現ベクター（発明(6)）を作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ｃＤＮＡがコードしているＭＡＧＵＩＮｓを微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードするタンパク質部分のみを取得することもできる。
【００２０】
蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓを動物細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え（発明(6)）、動物細胞内に導入すれば、この発明のＭＡＧＵＩＮｓを動物細胞内で発現できる。
【００２１】
以上のとおりの方法によって得られるラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓは、例えば、この蛋白質を特異的に認識する抗体を作成するための抗原として使用することができる。
【００２２】
この発明のラット蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓには、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片もまた抗体を作製するための抗原として用いることができる。
【００２３】
発明(3)は、上記の蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓをコードするラットの遺伝子であって、例えば、発明(4)または(5)のｃＤＮＡもしくはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
【００２４】
発明(4)および(5)のｃＤＮＡは、それぞれ配列番号２および４で表される塩基配列を有することを特徴とするものであり、この発明の前記蛋白質ＭＡＧＵＩＮ−１およびＭＡＧＵＩＮ−２をそれぞれコードしている。蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓは少なくともラットの脳組織で発現しているので、配列番号２または４の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００２５】
一般に哺乳動物の遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２または４において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれる。
【００２６】
同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基による置換がなされている蛋白質も、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明に含まれる。
【００２７】
さらに、発明(4)および(5)のＤＮＡ断片には、配列番号２および４で表される塩基配列のアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。
【００２８】
発明(7)の抗体は、蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２９】
発明(8)および(9)の蛋白質は、各々、配列番号１および３と相同のアミノ酸配列を有し、発明(1)および(2)のＭＡＧＵＩＮｓと同一の機能を有するラット以外の動物蛋白質である。このような蛋白質は、例えば、発明(4)または(5)のｃＤＮＡをプローブとして様々な動物種のｃＤＮＡライブラリーから相同のｃＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡを微生物、動物細胞または植物細胞等で発現させることにより取得することができる。
【００３０】
以下、蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓを単離した方法およびその機能の解析結果等について詳しく説明する。
１．ＭＡＧＵＩＮｓの単離
公知の方法（J. Neurosci. 16, 2488-2494, 1996）に従い、ラット脳yeast two-hybridライブラリー（５×106クローン）を構築し、Ｓ−ＳＣＡＭのＰＤＺドメインを含むバイト（bait）を用いてスクリーニングした。その結果、34個のポジティブクローンが得られ、そのうち、22個が新規クローンであった。さらにノザン解析の結果、脳でのみ発現がみられる２個のクローンを得たが、そのうち１クローンは公知のヒト遺伝子のラットホモログであることが判明した。
【００３１】
残りの１クローンについて、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングと、そのラット脳ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、全配列を決定した。
２つのアイソフォームが得られ、各々、ＭＡＧＵＩＮ−１およびＭＡＧＵＩＮ−２と命名した。ＭＡＧＵＩＮ−１は、配列番号２に塩基配列を示したｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号１のアミノ酸配列を有している。そして、このアミノ酸配列には、ＳＡＭドメイン（アミノ酸番号８−７５）、ＰＤＺドメイン（アミノ酸番号１５７−２９６）、ＰＨドメイン（アミノ酸番号５７２−６６７）、およびＰＤＺに対する結合のコンセンサスモチーフ（アミノ酸番号１０２９−１０３２）が含まれている。ＭＡＧＵＩＮ−２は、配列番号４に塩基配列を示したｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号２のアミノ酸配列を有している。そして、このアミノ酸配列には、ＳＡＭドメイン（アミノ酸番号８−７５）、ＰＤＺドメイン（アミノ酸番号１５７−２９６）、およびＰＨドメイン（アミノ酸番号５７２−６６７）が含まれている。
２．ＭＡＧＵＩＮｓとＳ−ＳＣＡＭおよびＰＳＤ-95／ＳＡＰ90との結合
先ず、ＭＡＧＵＩＮｓとＳ−ＳＣＡＭとの結合を調べるため、Ｓ−ＳＣＡＭを発現するＣＯＳ細胞の抽出物と、ＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ−12（ＭＡＧＵＩＮ−１のＣ末端）またはＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ−16（ＭＡＧＵＩＮ−２のＣ末端）をインキュベートした。結果は図２に示したとおりであり、ＭＡＧＵＩＮ−１のＣ末端はＳ−ＳＣＡＭと結合したが、ＭＡＧＵＩＮ−２のＣ末端は結合しなかった。なお、図２のウェスタンブロット解析において、バンドの検出には抗Ｓ−ＳＣＡＭ抗体（J. Biol. Chem. 273, 21105-21110, 1998）を使用した。
【００３２】
Ｓ−ＳＣＡＭのＭＡＧＵＩＮ−１結合領域を調べるため、図３Ａに示した様々なＭyc標識Ｓ−ＳＣＡＭコンストラクトを作成し、ＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ−12（ＭＡＧＵＩＮ−１のＣ末端）とインキュベートした。結果は図３Ｂに示したとおりであり、４番目と５番目のＰＤＺドメインが両者の結合に関係していることが確認された。なお、図３Ｂのウェスタンブロット解析において、バンドの検出には抗Ｍycモノクローナル抗体９Ｅ10（ＡＴＣＣから入手）を使用した。
【００３３】
次に、pＢＴＭ116 ＭＡＧＵＩＮ−９（配列番号１の846-1032）をバイトとする逆yeast two-hybridスクリーニングによって、ＰＳＤ-95／ＳＡＰ90、ＰＳＤ93／chapsyn110およびＳＡＰ97の各々のＰＤＺドメインが得られた。このことから、ＭＡＧＵＩＮ−１はＳ−ＳＣＡＭのみならず、ＰＳＤ-95／ＳＡＰ90とそのアイソフォームにも結合することが確認された。また、図４Ａは、ＭＡＧＵＩＮ−１とＰＳＤ-95／ＳＡＰ90との共免疫沈降を調べたウェスタンブロット解析の結果である。ラットの粗シナプトゾーム画分のTriton X-100抽出物を抗ＰＳＤ-95／ＳＡＰ90血清または免疫前の血清とProtein Ｇ−セファロースビーズ上でインキュベートし、ビーズに結合した蛋白質を抗ＭＡＧＵＩＮ抗体によってイムノブロットした。抗ＭＡＧＵＩＮ抗体は、pＧex４Ｔ-1 ＭＡＧＵＩＮ−１（配列番号１の716−858）を免疫原として作成されたウサギ・ポリクローナル抗体である。図４Ａにおいて、レーン１はインキュベーション前の粗シナプトゾーム抽出物のサンプル、レーン２は免疫前の血清とインキュベートしたサンプル、レーン３は抗ＰＳＤ-95／ＳＡＰ90血清とインキュベートしたサンプルである。この図４Ａに示したように、ＭＡＧＵＩＮ−１はラットの粗シナプトゾーム画分のＰＳＤ-95／ＳＡＰ90と共免疫沈降した。さらに、図４Ｂは、ＭＡＧＵＩＮ−１とＰＳＤ-95／ＳＡＰ90のＰＤＺドメインとの結合を調べたウェスタンブロット解析の結果である。Ｍyc標識した様々なＰＳＤ-95／ＳＡＰ90を発現するＣＯＳ細胞抽出物と、グルタチオンビーズを結合したＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ−12（ＭＡＧＵＩＮ−１のＣ末端）またはＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ−16（ＭＡＧＵＩＮ−２のＣ末端）とをインキュベートし、ビーズに結合した蛋白質を抗Ｍyc抗体で検出した。レーン１−３は全長ＰＳＤ-95／ＳＡＰ90、レーン４−６はＰＳＤ-95／ＳＡＰ90のＰＤＺドメイン、レーン７−９はＳrcホモロジー３とＰＳＤ-95／ＳＡＰ90のＧＫドメインである。さらに、レーン１、４および７はインキュベーション前のサンプル、レーン２、５および８はＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ−12とのインキュベーション後のサンプル、レーン３、６および９はＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ−16とのインキュベーション後のサンプルである。この図４Ｂに示したように、ＭＡＧＵＩＮ−１がＰＳＤ-95／ＳＡＰ90のＰＤＺドメインと結合することが確認された。
３．ＭＡＧＵＩＮｓの組織および細胞分布
図１にも示したように、ノザン解析によって、ＭＡＧＵＩＮｓがラットの脳でのみ発現することが確認された。さらに、ラット脳細胞にける分布を調べたところ、ＭＡＧＵＩＮｓは主に、シナプス形質膜（synaptic plasma membrane：ＳＰＭ）およびＰＳＤ画分で発現することが確認された（図５Ａ）。また、ラットの海馬ニューロンでは、ＭＡＧＵＩＮｓは細胞体と神経突起に分布し、ＮＭＤＡＲ１と共存していることが確認された（図５Ｂ）。
【００３４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明の蛋白質ＭＡＧＵＩＮｓは神経シナプス結合後部におけるＰＳＤ形成に重要な役割を果たしている蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭに特異的に結合する新規な蛋白質であり、この蛋白質はヒトをはじめとする動物の神経系の発生や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用である。
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＡＧＵＩＮｓの組織分布を調べたノザン解析の結果である。
【図２】ＭＡＧＵＩＮｓとＳ−ＳＣＡＭとの結合を調べたウェスタンブロット解析の結果である。レーン１はインキュベーション前のサンプル、レーン２はＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ-12とインキュベートしたサンプル、レーン３はＧＳＴ−ＭＡＧＵＩＮ-16とインキュベートしたサンプルである。
【図３】Ａは、Ｓ−ＳＣＡＭのＭＡＧＵＩＮ−１結合ドメインを調べるのに作成した様々なＳ−ＳＣＡＭコンストラクト（ａ〜ｇ）の構成図であり、Ｂは、ウェスタンブロット解析の結果である。
【図４】Ａは、ＭＡＧＵＩＮ−１とＰＳＤ-90／ＳＡＰ90との共免疫沈降を調べたウェスタンブロット解析の結果である。ＢはＭＡＧＵＩＮ−１とＰＳＤ-90／ＳＡＰ90のＰＤＺドメインとの結合を調べたウェスタンブロット解析の結果である。
【図５】Ａは、ラット脳細胞におけるＭＡＧＵＩＮｓの分布を調べたウェスタンブロット分析の結果である。ラット脳の微細胞画分を抗ＭＡＧＵＩＮ抗体でイムノブロットした。レーン１はホモジネート画分、レーン２は核ペレット画分、レーン３は粗シナプトゾーム画分、レーン４はシナプトゾームサイトゾル画分、レーン５は粗シナプトゾームペレット画分、レーン６は粗シナプス小胞画分、レーン７は溶出したシナプトゾーム膜画分、レーン８はＳＰＭ画分、レーン９はＳＰＭの0.5％(W/V) Triton X-100可溶性画分、レーン１０はＳＰＭの0.5％(W/V) Triton X-100不可溶性画分、レーン１１はＳＰＭの1.0％(W/V) Triton X-100可溶性画分、レーン１２はＳＰＭの１％(W/V) Triton X-100不可溶性画分である。Ｂは、ラット海馬ニューロンにおけるＭＡＧＵＩＮｓの発現を示した顕微鏡写真である。海馬ニューロンをマウス抗ＭＡＧＵＩＮポリクローナル抗体で免疫染色した。スケールバーは10μmを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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