(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒中または有機溶媒の混合物中でペプチドを高速溶液合成する方法であって、該方法が、以下の段階（ａ）−（ｄ）：
（ａ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミノ成分をアシル化する結合段階、
（ｂ）伸長中のペプチドに結合した永久保護基の存在下でも選択的に除去できる一時保護基を有している潜在アニオンを含むアミンである捕捉剤を使用して残留する活性化カルボキシル官能基を除去し、その際に伸長中のペプチドのＮ末端の脱保護が起こらない、消去段階、
（ｃ）１回または複数回の水性抽出段階、及び
（ｄ）伸長中のペプチドのＮ末端の脱保護及びそれに続く１回または複数回の水性抽出段階、
のサイクルを少なくとも１つ含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の有機溶媒中または有機溶媒の混合物中でペプチドを高速溶液合成する方法であって、該方法が、以下の段階（ｉ）−（ｉｉｉ）：
（ｉ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミノ成分をアシル化する結合段階、
（ｉｉ）捕捉剤を使用して残留する活性化カルボキシル官能基を除去し、その際に前記捕捉剤が伸長中のペプチドのＮ末端の脱保護にも使用される消去段階、及び
（ｉｉｉ）１回または複数回の水性抽出段階、
のサイクルを更に少なくとも１つ含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
段階（ａ）または（ｉ）で使用する試薬のモル量を、カルボキシル成分、結合用添加剤＞結合用試薬＞アミノ成分の順に減少させることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ａ）または（ｉ）でプレ活性化したカルボキシル成分を使用することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
捕捉用アミン中の潜在アニオンが、伸長中のペプチドのＮ末端に存在する一時保護基の置換活性と同様の置換活性を示す一時保護基を有していることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
一時保護基が水素化分解的に除去可能な基であり、永久保護基がアシドリシス的に除去可能な基であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
一時保護基がベンジル型の基であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｂ）の捕捉剤が潜在アニオンを含む第一級アミンであることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第一級アミンがＣ末端で保護されたアミノ酸誘導体であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アミノ酸がβ−アラニンまたはその誘導体であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
捕捉剤がベンジルβ−アラニネートまたはその塩であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、段階（ｉｉ）でポリアミンを捕捉剤として使用するサイクルを少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、段階（ｃ）で順次に塩基性、酸性及び塩基性の抽出を行うことを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で抽出を行うことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ｄ）で順次に塩基性及び中性の抽出を行なうことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で抽出を行うことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、段階（ｉｉｉ）で順次に塩基性及び中性の抽出を行うことを特徴とする請求項２から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で抽出を行うことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
最終サイクルが請求項２に記載のサイクルであり、該サイクルの段階（ｉ）でカルボキシル成分の保護基が伸長中のペプチドの永久保護基の置換活性と同様の置換活性を示し、段階（ｉｉ）の捕捉剤がポリアミンであることを特徴とする請求項２から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
有機溶媒または有機溶媒の混合物が、酢酸エチル、または、酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物、酢酸エチルと１−メチル−２−ピロリジノンとの混合物、酢酸エチルとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとの混合物もしくは酢酸エチルとテトラヒドロフランとの混合物であることを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
方法を０−５０℃の温度範囲内で行うことを特徴とする請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
方法を周囲温度で行うことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法を使用してペプチドを合成することを特徴とする分割及び混合の方法を使用するペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成方法。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法を使用してペプチドを合成することを特徴とするペプチドの全自動溶液合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、所望の配列の組立完了以前に伸長中のペプチドの単離を要せずにペプチドを高速溶液合成する新規な汎用性の方法に関する。
【０００２】
ペプチドは固体支持体上で合成されるかまたは溶液中で合成される。いずれの合成方法でも、結合段階と脱保護段階とを交互に繰り返し、精製は両段階間の合間処理として行われる。固相法では、固体支持体に結合したままで配列の組立を完了し、最後に配列を支持体から分離する。余剰試薬及び副生物は濾過によって除去する。固相合成の明らかな利点は、多少とも応用範囲が広く、全自動化が容易なことである。しかしながら、幾つかの深刻な欠点も有している。例えば、反応が拡散律速反応であること、使用される不均一条件下では一般に反応がかなり遅いこと、欠失配列が生じないように比較的大量の過剰試薬が必要なこと、である。更に、伸長中のペプチドの全部の反応性側鎖を保護しなければならない。不連続処理による精製を全く行わないので、非保護側鎖の存在に起因する副反応が生じて最終生成物中の不純物となる。固相法は大規模生産に応用するのが難しくまた試薬及び材料についてもコスト高である。
【０００３】
他方で、従来の溶液相合成法は容易に大規模生産に容易に応用でき、試薬及び材料についても廉価である。非保護側鎖の副反応によって生じた副生物は合間の精製によって除去できるので、通常は完全に保護されたアミノ酸は必要でない。しかしながら、溶液相合成法では配列特異的プロトコルが必要であり、完全配列の産生には極めて長時間を要する。双方の方法が上記のような欠点を有しているので、特にペプチドを大規模合成するためにこれらの従来方法の両者の利点を併せ持つ方法が要望されている。新しい方法には、高速で、大規模化が容易で、応用範囲が広いことが要求される。
【０００４】
溶液相合成では、アミノ成分に対する定量的な結合を確保するために、各結合段階で多少過剰な量の活性化カルボキシル成分を使用するのが好ましい。これによって最終生成物中に欠失配列が生じることを防止できる。通常は、残留する活性化カルボキシル成分が合間の水性処理中に破壊され除去されると想定されている。しかしながら、結合段階後に残留する（活性化）カルボキシル成分の除去が不完全であり、脱保護後に結合が生じるので、挿入ペプチド配列が最終ペプチドの不純物としてしばしば見出される。このような副反応の発生を回避するために、残留する活性化カルボキシル官能基を捕捉（ｓｃａｖｅｎｇｅ）（不活化）する捕捉段階を結合段階の直後に導入し得る。捕捉剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）として通常はアミンを使用する。捕捉剤としてポリアミンを使用すると、捕捉された化合物がそれぞれの極性に依存して、好ましくは酸性の水相に盛んに抽出され得る［例えば、Ｋｉｓｆａｌｕｄｙ，Ｌ．ら（１９７４）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９，１７８５−１７８６］。伸長中のペプチドが水相中に失われることを避けるために、この抽出は通常は脱保護段階の前に行う。しかしながらこの手順では多くの場合、捕捉された化合物の疎水性が原因で合間の精製が不完全であることが知見された。カルボキシル成分のアミノアシル部の固有疎水性は、残存しているアミノ保護基によって増強される。従って水性抽出が完全に有効ではない。
【０００５】
最近では、Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら［（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，４３２４−４３３８］が捕捉方法の改良を報告した。該方法では、ポリアミンを捕捉剤として使用することに加えて、アミノ保護基１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメトキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）を使用した。Ｂｓｍｏｃ官能基は塩基に対して極めて高い置換活性を有している。その結果として、ポリアミンを使用する単一段階で、残留する活性化カルボキシル官能基が捕捉され同時にＢｓｍｏｃ官能基が除去される。Ｂｓｍｏｃ官能基の使用は、１シリーズの段階で比較的短時間にペプチドの組立ができるので、高速連続溶液相技術を使用する（オリゴ）ペプチド製造方法の重要な改良であると記載されている。
【０００６】
高速連続溶液合成による新規なペプチド合成方法がここに知見された。該方法では、アミノ保護基（活性化カルボキシル成分のＮ末端保護基）を本質的に随意に選択できる捕捉剤を使用する。Ｃａｒｐｉｎｏの方法と対照的に、過剰量の活性化カルボキシル官能基の捕捉と同じ反応条件下ではＮ末端官能基の脱保護が必ずしも生じない。従って、本発明方法はＣａｒｐｉｎｏの方法よりもはるかに汎用性である。
【０００７】
本発明の新規な方法は、有機溶媒中または有機溶媒の混合物中でペプチドを高速溶液合成する方法であって、以下の段階（ａ）−（ｄ）：
（ａ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミノ成分をアシル化する結合段階、
（ｂ）捕捉剤を使用して残留する活性化カルボキシル官能基を除去し、該捕捉剤が伸長中のペプチドの脱保護にも使用される消去段階、
（ｃ）１回または複数回の水性抽出段階、及び、
（ｄ）場合によっては、１回または複数回の水性抽出段階の前に挿入される独立の脱保護段階、
の反復サイクルから成り、
方法が、残留する活性化カルボキシル官能基の捕捉剤として遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むアミンを使用する少なくとも１つの段階（ｂ）を含みこの段階を段階（ｂ′）と呼ぶことを特徴とする。
【０００８】
本発明方法の進行中に、最終ペプチド配列（即ち、本発明方法の最終生成物）が得られるまで伸長中のペプチドを単離する必要がない。従って、従来の溶液相法に比べて方法が有意に時間短縮され、大規模化が容易である。本発明方法によれば、ポリアミンを捕捉剤として使用する別の従来技術の方法のような疎水性の問題がないので、残留する活性化カルボキシル成分が極めて効率的に除去される。従って、高純度のペプチドが得られる。
【０００９】
好ましくは、本発明の段階（ａ）で使用される試薬のモル量は、カルボキシル成分、結合用添加剤＞結合用試薬＞アミノ成分の順に少なくなる。好ましくはまた、方法の段階（ａ）でプレ活性化カルボキシル成分を使用する。
【００１０】
別の好ましい実施態様では、段階（ｂ′）で潜在アニオンを含むアミンを捕捉剤として使用する。好ましくは、捕捉用アミン中の潜在アニオンは、伸長中のペプチドに結合した永久保護基の存在下でも選択的に除去され得る一時保護基を有している。特に好ましい実施態様では、捕捉用アミン中の潜在アニオンの保護基は、伸長中のペプチドのＮ末端に存在する一時保護基の置換活性と同様の置換活性を示す。このため、アニオンを生じる捕捉剤の脱保護と伸長中のペプチドのＮ末端脱保護とを単一処理段階で行うことができる。本発明方法では、伸長中のペプチドのＮ末端に存在しまた場合によっては捕捉剤中に存在する一時保護基が水素化分解的に除去可能な基であり、永久保護基がアシドリシス的に除去可能な基であるのが特に好ましい。好ましくは、該一時保護基がベンジル型の基、例えば、（置換）ベンジル基及びベンジルオキシカルボニル基である。好ましい捕捉剤は、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含む第一級アミン、特にＣ末端が保護されたアミノ酸誘導体である。捕捉用アミンは、カルボキシレート以外に、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェートまたはフェノレートなどを非限定例とする別のアニオン性官能基を含有してもよい。捕捉剤として使用し得る極めて好ましいアミノ酸は、β−アラニンまたはその誘導体（例えば、エステルまたはシリルエステル誘導体）である。最も好ましい捕捉剤はベンジルβ−アラニネートまたはその塩である。
本発明方法ではまた、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むアミンの代わりに、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むチオールを捕捉剤として使用し得る。捕捉剤は好ましくは、捕捉が必要な残留活性成分に対して２倍−６倍のモル過剰量で使用する。
【００１１】
本発明の捕捉剤を使用すると、捕捉された親水性化合物が得られる。このような化合物は脱保護段階後に塩基性水相に盛んに抽出され得る。脱保護（適当な場合）後には、捕捉された種に遊離アミノ官能基と遊離カルボキシル官能基との双方が存在するので親水性が増強される。従って、本発明方法によれば、捕捉された親水性化合物を盛んに抽出することができるので合間の精製が極めて有効である。更に、活性化されなかった余剰のカルボキシル成分が存在していても、該カルボキシル成分の一時的保護基が脱保護中に除去されているので、該カルボキシル成分は同時に反応混合物から抽出される。
【００１２】
本発明方法によれば、方法の少なくとも１つのサイクル、場合によっては複数のサイクルが、残留する活性化カルボキシル官能基の捕捉剤として遊離アニオンまたは潜在アニオンを使用する段階（ｂ′）を含む。しかしながら、本発明の別の実施態様によれば、方法が更に、段階（ｂ）で３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミンのようなポリアミンを捕捉剤として使用する１つまたは複数のサイクルを含む。
【００１３】
本発明の別の好ましい方法は、段階（ｂ）では脱保護が生じることなく（即ち、捕捉剤が消去だけを行うような環境、例えばＺ保護基及び捕捉剤として潜在アニオンを含むアミンを使用するような環境を選択する）、次段階（ｃ）で順次に塩基性、酸性及び塩基性の抽出を行う１つまたは複数のサイクルから成る。上記抽出は好ましくは、塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で行う。この方法は、脱保護と順次に行う塩基性抽出及び中性抽出とから成る後続段階（ｄ）を含む。これらの抽出は好ましくは、塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で行う。
【００１４】
別の好ましい本発明方法は、段階（ｂ）で消去及び脱保護の双方が行われ（例えば、Ｂｓｍｏｃ保護基及び捕捉剤としてポリアミンを使用する）、次段階（ｃ）で順次に塩基性抽出及び中性抽出を行う１つまたは複数のサイクルから成る。上記抽出は好ましくは、塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で行う。
【００１５】
また、最終サイクルの段階（ａ）でカルボキシル成分の保護基がアミノ成分の永久保護基の置換活性と同様の置換活性を示し、段階（ｂ）の捕捉剤がポリアミンから成る方法も好ましい。
【００１６】
本発明方法はペプチドの製造に常用されている幾つかの有機溶媒中で行うことができる。極めて好ましい有機溶媒は酢酸エチルである。また、酢酸エチルと別の有機溶媒との混合物、例えばジクロロメタン、１−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフランとの混合物も好ましい。本発明方法は、従来の溶液相ペプチド合成のこのような段階の使用温度として当業界で公知の温度で行うとよい。しかしながら好ましくは方法を０−５０℃の温度範囲内、特に周囲温度で行う。
【００１７】
本発明方法は、分割及び混合の方法を使用するペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成に極めて好適である。結合は個別に行われるが、個々の結合混合物を合わせて抽出及び脱保護を行う。
【００１８】
本発明方法は標準プロトコルを使用するので全自動化に極めて適している。本発明の新規な方法は高純度のオリゴ−及びポリペプチドの製造に好適に使用できる極めて効率的な方法である。
【００１９】
好適な本発明方法は、過剰量のカルボキシル成分をアミノ成分に結合させる方法であり、結合試薬及び所望の場合には添加剤を使用してカルボキシル官能基を予め活性化するかまたはｉｎ  ｓｉｔｕ活性化する。結合段階後に残留する活性化カルボキシル官能基は、反応混合物に捕捉剤を添加し、通常はその後に水性抽出を行うことによって捕捉される。捕捉後または捕捉中に、当業界で公知の適当な方法を使用して一時的保護基を除去し、通常はその後に、捕捉された化合物を水性抽出によって除去する。同時に、場合によっては存在する活性化されなかった余剰のカルボキシル成分の一時的保護基も脱保護中に除去され、また、別の水溶性試薬及び副生物は反応混合物から抽出される。
【００２０】
アミノ成分という用語は、遊離アミノ官能基を含む分子を意味する。より特定的にはアミノ成分は、遊離アミノ官能基を含み別の官能基が所望の結合反応を妨害しないように保護されている任意のアミン、アミノ酸またはオリゴペプチドでよい。使用されるアミノ酸またはオリゴペプチドのＣ末端官能基は、置換もしくは未置換のアミドとしてまたはエステルとして保護され得る。エステルの非限定例は、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル、フェンアシル、３−（３−メチル）ペンチル（Ｍｐｅ）、２−（２−フェニル）プロピル（Ｐｐ）、２−クロロトリチル（Ｃｌｔ）、ジフェニル（４−ピリジル）メチル（ＰｙＢｚｈ）、ジシクロプロピルメチル（Ｄｃｐｍ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、アリル（Ａｌｌ）、２−（トリメチルシリル）エチル（Ｔｍｓｅ）、４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］−アミノ｝ベンジル（Ｄｍａｂ）エステル及び酵素的に開裂可能なエステルである［Ｒｏｅｓｋｅ，Ｒ．Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ′，ｖｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０１−１３６；Ｍｐｅについては：Ｋａｒｌｏｓｔｒｏｍ，Ａ．ａｎｄ  Ｕｎｄｅｎ，Ａ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７，４３４３−４２４６；Ｐｐについては：Ｙｕｅ，Ｃ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４，３２３−３２６；Ｃｌｔについては：Ａｔｈａｎａｓｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．ら（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６，５６４５−５６４８；ＰｙＢｚｈについては：Ｍｅｒｇｌｅｒ，Ｍ．ら（２００１）Ｐ１５４，２ｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ＆  １７ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ；Ｄｃｐｍについては：Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０，７７１８−７７１９；Ｆｍについては：Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ，Ｆ．ら（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５，２１５−２１８；Ａｌｌについては：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ら（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２６，４９３−４９７；Ｔｍｓｅについては：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．（１９７７）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ６０，２７１１−２７１６；Ｄｍａｂについては：Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ら（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２０９−２２１０］。アミノ成分中の別の官能基を永久保護するためにはｔ−ブチル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好ましい。これらの官能基の非限定例として、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ側鎖の保護には−ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ及びＴｒｐ側鎖の保護にはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＨｉｓ側鎖の保護にはトリチル（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ側鎖の保護には２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）または２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）があ��［Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９８０）：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．２（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２８４；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）については：Ｆｒａｎｚｅｎ，Ｈ．ら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６９９−１７００；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）及びＧｌｎ（Ｔｒｔ）については：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２，７３９−７４２；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）については：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８，６０３１−６０３４；Ｐｍｃについては：Ｒａｍａｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８，２２８７−２２９０；Ｐｂｆについては：Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４，７８２９−７８３２］。
【００２１】
カルボキシル成分という用語は、遊離カルボキシル官能基を含む分子を意味する。より特定的には、カルボキシル成分は、遊離カルボキシル官能基を有しており別の官能基が所望の結合反応を妨害しないように保護されている任意のカルボン酸、アミノ酸またはオリゴペプチドでよい。好ましい実施態様では、使用されるアミノ酸またはオリゴペプチドのアミノ基がベンジルオキシカルボニル（Ｚ）官能基によって一時的に保護されている。官能基の別の非限定例は、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）官能基、オルトニトロベンゼンスルホニル（ｏ−ＮＢＳ）のようなアリールスルホニル型の官能基、及び、酵素的に開裂可能な官能基である［Ｇｅｉｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ，Ｋｏｎｉｇ，Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−９９；Ａｌｌｏｃについては：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ａｎｄ  Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ，Ｃ．（１９８４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．９６，４２６−４２７；アリールスルホニルについては：Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｔ．ら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８，５８３１−５８３４］。カルボキシル成分中の別の官能基を永久保護するためには、アミノ成分に関して上述したようなｔ−ブチル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好ましい。カルボキシル成分を、活性エステル、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル、ペンタフルオロフェニルまたは４−ニトロフェニルエステルとして、ハロゲン化物、Ｎ−カルボキシ無水物または対称無水物として予め活性化してもよい。あるいは、カルボキシル成分を、混合無水物として、または、結合試薬、例えばカルボジイミド、好ましくはＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ウロニウムまたはホスホニウム塩を使用し、場合によっては結合用添加剤、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＮＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｃｌ−ＨＯＢｔ）の存在下、及び、必要な場合には第三級アミンの存在下でｉｎ  ｓｉｔｕで活性化してもよい［Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．１（１９７９）（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｘｕ，Ｊ．−Ｃ．（２０００）Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１８，４５６−４６６］。
【００２２】
一時的保護基は当業界で公知の方法によって除去し得る（上記参照）。Ｚ官能基は、例えば水素ガスまたはホルミエートを水素供与体として用いた（標準）手順を使用する水素化分解によって除去し得る。この処理中に、ベンジル型保護基は完全に除去され、ｔ−ブチル型の保護基または同様の置換活性をもつ官能基は維持される。後者は、当業者に公知のアシドリシスによって除去し得る。
【００２３】
塩基性水性抽出という用語の意味は当業者に理解されるであろう。しかしながら、塩基性水性抽出は好ましくは、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの水溶液を使用し、所望の場合には塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で行う。活性水性抽出という用語は、酸性条件下でアミノ成分をプロトン化形態（アンモニウム）で抽出するかまたは塩基性条件下でカルボキシル成分を脱プロトン形態（カルボキシレート）で抽出するような処理を意味する。
【００２４】
本発明を以下の実施例でより詳細に説明するが、本発明がこれらの記載に限定されないことを理解されたい。
【００２５】
実施例１
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕ第１サイクル：２０℃の酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物中の４．３４ｇのＨ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕの撹拌溶液に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、７．７６ｇのＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、１．２１ｍｌの４−メチルモルホリン及び３．５１ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００２６】
保護されたジペプチドＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物で洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
【００２７】
第２サイクル：２０℃のジペプチドＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有機層に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、７．１８ｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、１．２１ｍｌの４−メチルモルホリン及び３．５１ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００２８】
保護されたトリペプチドＺ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物で洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
【００２９】
第３サイクル：２０℃のトリペプチドＨ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有機層に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、４．２１ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、１．２５ｍｌの３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミンを添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、３０％ＮａＣｌ及び水で抽出した。有機層を蒸発乾固し、残渣をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで研和し、乾燥すると、所望の保護されたテトラペプチドが出発物質Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを基準として９５％の収率で得られた。方法は６時間以内に終了した。
【００３０】
逆相ＨＰＬＣによる純度：９８．１％（２９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，５ミクロンのＣ１８カラム）。エレクトロスプレーＭＳによる同定：ｍ／ｚ４２５．４［Ｍ−Ｂｏｃ−３ｔＢｕ＋Ｈ］＋，４６９．４［Ｍ−４ｔＢｕ＋Ｈ］＋，５２５．４［Ｍ−３ｔＢｕ＋Ｈ］＋，５８１．４［Ｍ−２ｔＢｕ＋Ｈ］＋，６３７．４［Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ］＋，６９３．４［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．１６（ｓ，９Ｈ），１．４４（ｍ，２７Ｈ），２．５９（ｄｄ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），３．０９（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｄｄ，１Ｈ），３．６９−３．８６（ｍ，３Ｈ），４．４７（ｍ，１Ｈ），４．６７−４．７８（ｍ，２Ｈ），５．２０（ｂｓ，１Ｈ），６．６８（ｄ，１Ｈ），７．１２−７．３４（ｍ，７Ｈ）。
【００３１】
実施例２
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ
第１サイクル：２０℃の酢酸エチル中の１３００ｇのＨ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌの撹拌溶液に、１０１４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、２７５６ｇのＺ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、１３７８ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び１４９５ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１０５ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００３２】
保護されたジペプチドＺ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１５％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１５％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。個別の水相を酢酸エチルで再抽出した。
【００３３】
第２サイクル：２０℃のジペプチドＨ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層を集めて、１０１４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１９９３ｇのＺ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１３２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び７５４ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１０５ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００３４】
保護されたトリペプチドＺ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１５％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
【００３５】
第３サイクル：２０℃のトリペプチドＨ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層に、１０１４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１９９３ｇのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１３２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び７５４ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１０５ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３、５％ＫＨＳＯ４及び５％Ｎａ２ＣＯ３で抽出した。
【００３６】
保護されたトリペプチドＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３を添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３及び１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００３７】
第４−第７サイクル：これらのサイクルは、１９９３ｇのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨに代えて、Ｚ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（４４９７ｇの対応するジシクロヘキシルアンモニウム塩から遊離）、２２１８ｇのＺ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２５３８ｇのＺ−Ｔｒｐ−ＯＨ及び２１７２ｇのＺ−Ｈｉｓ−ＯＨをそれぞれ使用し、第３サイクルの手順に従って行った。しかしながら第５サイクル以後は捕捉段階中の４−メチルモルホリン及びベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩の量を倍加した。第５サイクルでは捕捉後の抽出を３５℃で行った。第７サイクルでは、結合温度を３℃とし、１０１４ｇの４−メチルヒドロキシベンゾトリアゾールに代えて２５６１ｇの６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを使用し、また、１時間の結合後に１３２ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を補充した。第７サイクルでも、水素化分解後の抽出を３５℃で行った。第７サイクルの終了後、有機層を蒸発乾固すると、所望の保護されたノナペプチドが出発物質Ｈ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌを基準として７３％の収率で得られた（即ち、各化学処理段階の平均収率９８％）。
【００３８】
逆相ＨＰＬＣによる純度：９０．６％（２９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，５ミクロンのＣ１８カラム）。エレクトロスプレーＭＳによる同定：ｍ／ｚ５４３．６［Ｍ−Ｂｏｃ−２ｔＢｕ＋２Ｈ］２＋，５７１．６［Ｍ−Ｂｏｃ−ｔＢｕ＋２Ｈ］２＋，５９９．６［Ｍ−Ｂｏｃ＋２Ｈ］２＋，６４９．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋，１２９８．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３９】
結論：不連続処理による中間体の単離を要せずに保護ペプチドを製造できた。第一実施例で得られた生成物の純度及び同定は、本発明方法を使用すると余剰の（活性化された）カルボキシル成分が処理の全段階で完全に除去されており挿入ペプチド配列が全く形成されなかったことを証明する。第二実施例の合成は更に、本発明方法による合成が大規模生産に容易に応用できることを証明する。双方の実施例で、生成物が比較的短時間のうちに高収率及び高純度で得られた。