(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレグネノロンを含有し、アルキルフェノール系化合物に起因する脳障害を改善することを特徴とするアルキルフェノール系化合物に起因する脳障害改善用治療剤。
【請求項２】
アルキルフェノール系化合物に起因する脳障害が、ＭＡＰ２（microtubule-associated protein ２）に作用して引き起こす脳障害であることを特徴とする請求項１記載のアルキルフェノール系化合物に起因する脳障害改善用治療剤。
【請求項３】
アルキルフェノール系化合物が、ノニルフェノールであることを特徴とする請求項１又は２記載のアルキルフェノール系化合物に起因する脳障害改善用治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳障害治療剤及び脳障害治療方法に係り、詳しくは、ステロイドを用いた脳障害治療剤及び脳障害治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ノニルフェノールやビスフェノールなどのアルキルフェノール系化合物は、広く界面活性剤やプラスチックの可塑剤として用いられるなど、日常の食生活や歯科材料などに含まれる物質であるが、女性ホルモン作用を有することから生体のホルモンバランスを撹乱し、生殖系の異常が生ずる可能性があるため、環境ホルモン・内分泌撹乱化学物質として昨今危険視されてきている物質である。さらに、最近ではこうした環境ホルモンは脳に働き、行動異常を惹起させることも報告され、環境ホルモンのもつ脳障害が注目され始めている。しかし、このような危険物質の脳に対する影響を保護する手段についての研究は殆ど行われておらず、このような危険物質に対する保護手段の開発が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アルキルフェノール系化合物による脳障害を改善する脳障害治療剤及び脳障害治療方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
女性ホルモンは一般に神経を含む多くの細胞質に存在する受容体に結合し、核移行と遺伝子転写調節による様々な細胞機構に影響を及ぼしているが、最近遺伝子転写に関与しない受容体機構が注目され始めている。それは細胞膜ステロイド受容体と細胞骨格チューブリン重合に関わるＭＡＰ２（microtubule-associated protein ２）に対する受容機構である。本発明者は、疼痛試験やチューブリン重合試験を通じて環境ホルモンとして認定されているアルキルフェノール系化学物質がこうした受容体機構に薬理学的効果を有することを見い出し、さらに神経ステロイドがその効果を抑制することを確認し、本発明を完成するに至った。さらにアルキルフェノール系化学物質の脳内投与により神経突起伸展障害や学習障害が生ずることを見い出し、こうした効果も神経ステロイドにより抑制されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
具体的には、本発明者は、環境ホルモンとして認定されているノニルフェノールに代表されるアルキルフェノール系化合物が、脳機能に及ぼす作用の分子機構の一つとして、神経細胞骨格系を担う微小管重合調節ＭＡＰ２受容体があることを同定した。このことはノニルフェノール等のアルキルフェノール系環境ホルモンを個体レベル、特に脳内投与することによっても観察された。すなわち、ＭＡＰ２を介する微小管重合促進作用は神経細胞の樹状突起伸展に反映されるが、本発明者はノニルフェノールを脳室内に投与することにより顕著に海馬錐体細胞の樹状突起伸展が阻害されることを確認した。海馬は学習・記憶に関与する重要な神経細胞が密集した脳領域であり、この海馬錐体細胞の樹状突起伸展阻害作用は神経連絡障害、すなわち学習、記憶障害に密接に関与することが明らかにされており、アルキルフェノール系環境ホルモンが学習、記憶障害に密接に関与するとの知見を得た。かかる効果は、ノニルフェノールを脳室内に投与したマウスによる学習行動をＳｔｅｐ−Ｔｈｒｏｕｇｈ法により検定したときにも学習障害が観察されたことからも裏付けられた。
【０００６】
かかる知見に基づき、本発明者は鋭意研究の結果、その治療薬のプロトタイプとして、ＭＡＰ２に作用し微小管重合を促進することがすでに報告されている神経ステロイドのプレグネノロン（臨床精神医学  30(7):723-728,2001、脳の科学、22:37-42,2000 37）を候補とし、プレグネノロン等の神経ステロイドがアルキルフェノール系環境ホルモンによる微小管重合抑制、海馬樹状突起伸展阻害、学習障害のいずれも改善することを確認した。
【０００７】
ここで、神経ステロイドは脳で合成される一連のホルモンであり、生殖器官で合成される女性ホルモンと同様にコレステロールから合成され、脳で特別の機能を果たしていることが明らかにされつつある。脳内で合成される主な神経ステロイドとしては、ペリフェラルベンゾジアゼピンレセプター（peripheral benzodiazepine receptor）を介してミトコンドリア内膜へ運ばれ、Ｐ４５０sccという酵素により変換される最初の化合物としてプレグネノロン（ＰＲＥＧ）があり、ＰＲＥＧから２系統に分かれて、３β−ＨＳＤという酵素により代謝され、ＰＲＥＧと拮抗的な作用がよく観察されるプロゲステロン（ＰＲＯＧ）や、Ｐ４５０c17により代謝され、ＰＲＥＧと酷似した神経系での生理活性を示すデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、ＰＲＯＧがさらに代謝されたアロプレグナノロンがある。その他、スルホトランスフェラーゼ（sulfotransferase）、スルホヒドロラーゼ（sulfohydrolase）等の酵素の代謝作用によりＰＲＥＧとＤＨＥＡが硫酸化されて生成されるＰＲＥＧ硫酸抱合体（ＰＲＥＧＳ）や、ＤＨＥＡ硫酸抱合体（ＤＨＥＡＳ）等がある。
【０００８】
すなわち本発明は、プレグネノロンを含有し、アルキルフェノール系化合物に起因する脳障害を改善することを特徴とするアルキルフェノール系化合物に起因する脳障害改善用治療剤（請求項１）や、アルキルフェノール系化合物に起因する脳障害が、ＭＡＰ２（microtubule-associated protein ２）に作用して引き起こす脳障害であることを特徴とする請求項１記載のアルキルフェノール系化合物に起因する脳障害改善用治療剤（請求項２）や、アルキルフェノール系化合物が、ノニルフェノールであることを特徴とする請求項１又は２記載のアルキルフェノール系化合物に起因する脳障害改善用治療剤（請求項３）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の脳障害治療剤は、アルキルフェノール系化合物に起因する脳障害を改善するステロイドを含有するものであれば特に制限されるものではなく、上記アルキルフェノール系化合物としては、環境ホルモン・内分泌撹乱化学物質として認定された化合物であって、神経ステロイドに類似する構造を有し、脳障害を引き起こすアルキルフェノール系化合物を好適に例示することができ、また、アルキルフェノール系化合物に起因する脳障害としては、ＭＡＰ２（microtubule-associated protein ２）に作用して引き起こされる脳障害、すなわち、神経細胞の樹状突起の伸展にかかわるＭＡＰ２を介する微小管重合作用をアルキルフェノール系化合物が阻害することにより生じる脳障害、特に、学習・記憶に関与する重要な神経細胞が密集した脳領域に存在する海馬錐体細胞の樹状突起の伸展を阻害することに起因する脳障害や、さらに、かかる海馬錐体細胞の樹状突起の伸展の阻害が誘引となって生じる学習、記憶障害等の神経連絡障害を挙げることができる。
【００１０】
上記アルキルフェノール系化合物は、フェノールの任意の位置に１又は２以上のアルキル基、アシル基、エステル基、オキソ基等を有するものであってもよく、ポリフェノールであってもよい。かかるフェノールの置換基のアルキル基としては、炭素数も問わず直鎖状のみならず側鎖を有するものであってもよく、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基や、これらの基に側鎖を有するもの等を挙げることができ、アシル基としては、ホルミル基、アセチル基等を、エステル基としては、ホルミルオキシ基、アセトキシ基等を挙げることができる。
【００１１】
このようなアルキルフェノール系化合物としては、具体的には、例えば、４−（ｎ−ノニル）フェノール、３−メチル−５−（ｎ−ノニル）フェノール、３−ホルミル−５−（ｎ−ノニル）フェノール、４−（ｎ−オクチル）フェノール、３−メチル−５−（ｎ−オクチル）フェノール、３−ホルミル−５−（ｎ−オクチル）フェノール、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン（ビスフェノールＡ）、４−ベンゾイルオキシフェノール等を例示することができる。
【００１２】
また、本発明の脳障害治療剤に含有されるステロイドは、アルキルフェノール系化合物に起因する脳障害を改善するものであれば、特に制限されるものではなく、ステロイドとしては、脳内で酵素によりコレステロールから代謝される神経ステロイドの他、かかる神経ステロイドに類似の構造を有する誘導体のステロイドも該当し、これらは天然物から抽出されたものであっても合成されたものであってもよい。神経ステロイドは脳においてはミトコンドリア内膜に運ばれたコレステロールから、式[１]に示すように合成される。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
かかる神経ステロイドとしては、ペリフェラルベンゾジアゼピンレセプター（peripheral benzodiazepine receptor）を介してミトコンドリア内膜へ運ばれるコレステロールが、最初にＰ４５０scc酵素により変換される化合物であるプレグネノロン（ＰＲＥＧ）があり、ＰＲＥＧから２系統に分かれて、３β−ＨＳＤ酵素により代謝され、ＰＲＥＧと拮抗的な作用を有するプロゲステロン（ＰＲＯＧ）や、Ｐ４５０c17酵素により代謝され、ＰＲＥＧと酷似した神経系での生理活性を示すデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、ＰＲＯＧがさらに５αレダクターゼ（5α-reductase）により代謝される５α−プレグナン−３，２０−ジオン（5α-pregnane-3,20-dion）や、さらに３α−ＨＯＲ酵素により代謝される３α−ヒドロオキシ−５α−プレグナン−２０−オン（3α-hydroxy-5α-pregnane-20-on）(３α，５α−ＴＨＰＲＯＧ)、アロプレグナノロン（allopregnanolone）が挙げられる。その他、スルホトランスフェラーゼ（sulfotransferase）、スルホヒドロラーゼ（sulfohydrolase）等の酵素の代謝作用によりＰＲＥＧとＤＨＥＡがそれぞれ硫酸化されて生成され、プレグネノロンの効果に拮抗するＰＲＥＧ硫酸抱合体（ＰＲＥＧＳ）や、ＤＨＥＡ硫酸抱合体（ＤＨＥＡＳ）等が挙げられる。また、これらの神経ステロイドに類似の構造を有する誘導体としては、ステリンや、ステリンに、メチル基やエチル基等のアルキル基、水酸基、ホルミル基やアセチル基等のアシル基、ホルミルオキシ基やアセトオキシ基等のエステル基、オキソ基等の置換基が結合したステロイド誘導体を挙げることができ、具体的には、テストステロン、ステリンや、エストロン、エストリオール、エストラジオール、エキリン、エキレニン、エストラン等を挙げることができる。これらのステロイドの中でもプレグネノロンは、ノニルフェノールが引き起こす脳障害を改善することができるため、特に好ましい。
【００１５】
本発明の脳障害治療剤としては、上記ステロイドの他、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００１６】
本発明のアルキルフェノール系化合物に起因する脳障害を治療する方法としては、上記脳障害治療剤を用いることによりこれを行うことができる。上記各種神経ステロイドが微小管重合の促進等のＭＡＰ２に対する受容体活性を有し、脳障害を治療することができる。脳障害治療剤の投与量等は、アルキルフェノール系化合物の種類や、脳障害治療剤に含まれる神経ステロイドの種類及び含有量等に応じて適宜決定することができる。
【００１７】
本発明の脳障害治療剤及び脳障害治療方法によれば、アルキルフェノール系化合物による脳障害、特に海馬錐体細胞の樹状突起の伸展阻害に対し優れた効能、効果を有し、かかる海馬錐体細胞の樹状突起の伸展阻害に起因する学習・記憶障害等を改善することができる。また、神経連絡に関わる受容体突起伸展は学習・記憶のみならずあらゆる高次脳機能の可塑性に関与することから、てんかん、精神分裂、鬱病、躁病の他、睡眠、食欲、視覚、聴覚、痛覚などの障害を改善することが可能である。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実験例１］
（ＭＡＰ２蛋白質で活性化される微小管重合活性の測定）
αチューブリン、βチューブリン及びＭＡＰ２蛋白質をマウス脳からＳｈｅｌａｎｓｋｉらの方法（１９７３）に従って精製した。次に、グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＴＰ）１ｍＭ、ＭＥＳ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ８０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １ｍＭを含む反応液を調製し、かかる反応液にαチューブリンとβチューブリンそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ、ＭＡＰ２蛋白質０．０５ｍｇ／ｍｌを加え、３７℃で保持した。時間の経過に伴う微小管の重合度を分光高度計により濁度を測定することにより測定した。なお、反応液のｐＨは６．７５であった。また、濁度の測定は、紫外可視分光光度計（UV-VIS spectrophotometer）（島津製作所製）を用い、３４５ｎｍの波長で行った。同様に、上記反応液に下記アルキルフェノール系化合物（４’−ノニルフェノール）１００ｎＭを加えたものについて、濁度の測定（重合度の測定）を行った。また、同様に、上記反応液に４’−ノニルフェノール１００ｎＭ及びプレグネノロン１００ｎＭを加えたものについて、濁度の測定（重合度の測定）を行った。
【００１９】
【化２】
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【００２０】
以上の結果を図１に示す。
図１から明らかなように、１００ｎＭの４’−ノニルフェノールを添加すると（白まる印）、対照標準（黒まる印）と比較して濁度に見られる重合度の減少が観察され、微小管の重合が抑制された。しかし、４’−ノニルフェノール１００ｎＭにさらにプレグネノロン１００ｎＭ加えたものについては（ひし形印）、４’−ノニルフェノール１００ｎＭのみを添加したもの（白まる印）と比較して濁度に見られる重合度の上昇が確認され、４’−ノニルフェノールによる微小管の重合抑制が改善された。
【００２１】
また、上記反応液に、プレグネノロン（ＳＩＧＭＡ社）を１００ｎＭ添加したもの、ビスフェノールＡを１００ｎＭ添加したもの、及びプレグネノロンとビスフェノールＡとをそれぞれ１００ｎＭ添加したものについての濁度の測定（重合度の測定）を、上記と同様の方法で行った。
その結果を図２に示す。
図２から明らかなように、１００ｎＭのプレグネノロンを反応液に添加すると（三角印）、対照標準（黒まる印）と比較して顕著な微小管重合の促進が観察された。また、１００ｎＭのビスフェノールＡの添加は単独で重合抑制を示さなかったが（白まる印）、プレグネノロンによる重合促進作用を抑制した（ひし形印）。従って、プレグネノロン含有の脳障害治療剤を用いる場合、脳障害治療薬の投与量等においてビスフェノールＡの存在を考慮する必要がある。
【００２２】
［実験例２］
（海馬細胞樹状突起伸展の確認）
胎生１７日胚のラット海馬は、トリプシン消化後、ダルベッコ改良型イーグル培養液（５％牛胎仔および馬血清を含む）に懸濁し、ポリオルニチンコートしたＬａｂ−Ｔｅｋチャンバーに１０5細胞／ｃｍ2の密度で５％ＣＯ2、３７℃の下で初代培養を行った。培養開始後２４時間で１ｍＭ  β−シトシンアラビノシドを添加しグリア細胞を死滅させ、その２４時間後にＭＡＰ２抗体による樹状突起の染色を行った。また、上記と同様にグリア細胞を死滅させた２４時間後に４’−ノニルフェノール（１μＭ）を添加し、その２４時間後にＭＡＰ２抗体による樹状突起の染色を行った。さらに、上記と同様にグリア細胞を死滅させた２４時間後に４’−ノニルフェノール（１μＭ）とプレグネノロン（１μＭ）を添加し、その２４時間後にＭＡＰ２抗体による樹状突起の染色を行った。
【００２３】
その結果を図３に示す。
図３（Ｂ）に示すように、対照標準（図３（Ａ））に比較して４’−ノニルフェノールを添加したものは、顕著に突起伸展が阻害された。また、図３（Ｃ）に示すように、４’−ノニルフェノールによるこの突起伸展阻害はプレグネノロンを添加することにより完全に改善された。
【００２４】
［実験例３］
０．１Ｍのリン酸バッファー溶液１０μｌをマウス側脳室内に投与し、２４時間後、４％パラフォルムアルデヒドで脳固定を行い、１００μｍの海馬切片を作製しゴルジ染色を行い、海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核（basal ganglia）の突起頻度に及ぼす影響を調べた。また、４’−ノニルフェノール（１０ｎｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸バッファー溶液１０μｌを用いて、同様にして、海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核の突起頻度に及ぼす影響を調べた。さらに、４’−ノニルフェノール（１０ｎｍｏｌ）及びプレグネノロン（１００ｎｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸バッファー溶液１０μｌを用いて、同様にして、海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核の突起頻度に及ぼす影響を調べた。
【００２５】
その結果を図４に示す。
図４（Ｂ）に示すように、対照標準（図４（Ａ））に比較して４’−ノニルフェノールの脳室内投与により、海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核の突起頻度の低下が認められた。また、図４（Ｃ）に示すように、プレグネノロンの併用により４’−ノニルフェノールによる突起頻度低下は改善された。
【００２６】
［実験例４］
０．１Ｍのリン酸バッファー溶液１０μｌをマウス側脳室内に投与し、Ｓｔｅｐ−Ｔｈｒｏｕｇｈ型学習効果実験を行った。具体的には、リン酸バッファー溶液投与３０分後に、明暗の２つのコンパートメントの明室にマウスを放置し、マウスが暗室に移動したときに床から２５Ｖの電撃刺激が与えられるようにして試行条件付けを行った。リン酸バッファー溶液投与２４時間後にあらためてこの試験を行い、暗室に入るまでの時間をもって学習機能と評価した。
また、４’−ノニルフェノール１０ｎｍｏｌを含むリン酸バッファー溶液１０μｌ、４’−ノニルフェノール１０ｎｍｏｌにさらに所定量のプレグネノロンを添加したリン酸バッファー溶液１０μｌ、及びプレグネノロン１００ｎｍｏｌ単独を含むリン酸バッファー溶液１０μｌを投与することによっても同様の実験を行った。
【００２７】
その結果を図５に示す。
図５に示すように、リン酸バッファー溶液投与によるマウス（対照標準）は約２５０秒経過後に暗室に移動したのに対し、４’−ノニルフェノール１０ｎｍｏｌを投与したマウスは約９０秒経過後に暗室に移動し、明らかな学習障害が観察された。また、４’−ノニルフェノールに加えてプレグネノロン１０ｎｍｏｌを投与したマウスの暗室への移動時間は１７０秒となり、学習障害の改善がみられた。さらに、４’−ノニルフェノールに加えてプレグネノロン１００ｎｍｏｌを投与した場合には、暗室への移動時間は２００秒となり、さらなる学習障害の改善がみられた。一方、プレグネノロン１００ｎｍｏｌ単独では、顕著な学習促進作用は観察されなかった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の脳障害治療剤及び脳障害治療方法によれば、アルキルフェノール系化合物による脳障害を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例に係る反応液の反応時間に対する吸光度（濁度）を表すグラフである。
【図２】実験例に係る反応液の反応時間に対する吸光度（濁度）を表すグラフである。
【図３】海馬細胞樹状突起伸展の状態を表す図である。
（Ａ）は対照標準の海馬細胞樹状突起伸展の状態を表す図である。
（Ｂ）は対照標準に４’−ノニルフェノールを添加した場合の海馬細胞樹状突起伸展の状態を表す図である。
（Ｃ）は対照標準に４’−ノニルフェノール及びプレグネノロンを添加した場合の海馬細胞樹状突起伸展の状態を表す図である。
【図４】海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核の突起頻度を表す図である。
（Ａ）は対照標準の海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核の突起頻度を表す図である。
（Ｂ）は対照標準に４’−ノニルフェノールを添加した場合の海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核の突起頻度を表す図である。
（Ｃ）は対照標準に４’−ノニルフェノール及びプレグネノロンを添加した場合の海馬ＣＡ１の錐体神経細胞の大脳基底核の突起頻度を表す図である。
【図５】Ｓｔｅｐ−Ｔｈｒｏｕｇｈ型学習効果実験において、マウスが暗室に移動するまでの時間を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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