(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物寄託番号FERM P-16524により寄託されたストレプトミセス・ミクロフラバスNo.2445株（Streptomyces microflavus No.2445）又はその変異株由来の式（Ｉ）で表される糖脂質AH-2445。
【化１】
式（Ｉ）
0004203161.tif 000007
（式中、ｎ、ｎ'、ｎ''及びｎ'''は整数で側鎖メチレン基の数を表す。メチレン基の総和Ｎ＝ｎ＋ｎ'＋ｎ''＋ｎ'''は、32〜56の範囲にある。）
【請求項２】
上記式（Ｉ）において、Ｎ＝45のとき、ｎ＝14、ｎ'＝13、ｎ''＝13及びｎ'''＝５である請求項１に記載の糖脂質AH-2445。
【請求項３】
下記（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）の物理化学的性質；
（１）
性状：無色な油状
分子量：1570
分子式：C81H150O28
比旋光度（0.1% メタノール中）：-19.1°
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：末端吸収
赤外線吸収スペクトル（全反射法）：3388, 2923, 2854, 1731, 1459, 1369, 1164, 1078, 1022 cm-1
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.18-1.54(m), 2.50-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.77-2.83(m), 3.17(dd), 3.24-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.86(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.48(m)
カーボン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
173.41(s), 172.50(s), 104.38(d), 103.97(d), 103.67(d), 103.41(d), 80.96(d), 80.48(d), 78.27(d), 78.21(d), 78.06(d), 77.90(d), 77.72(d), 75.31(d), 75.27(d), 75.20(d), 75.16(d), 71.95(d), 71.82(d), 71.62(d), 68.58(d), 65.20(t), 62.97(t), 62.88(t), 42.33(t), 42.21(t), 40.19(t), 36.10(t), 36.01(t), 35.90(t), 35.63(t), 35.34(t), 34.91(t), 31.05(t), 30.91(t), 30.86(t), 30.50(t), 30.30(t), 30.22(t), 30.15(t), 30.01(t), 29.85(t), 26.86(t), 26.38(t), 26.28(t), 26.02(t), 25.82(t), 23.56(q)
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.23
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.22
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）6.11分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（２）
性状：無色な油状
分子量：1724
分子式：C92H172O28
比旋光度（0.06% メタノール中）：-27.4°
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：213 nm
赤外線吸収スペクトル（全反射法）：3362, 2922, 2852, 1732, 1461, 1373, 1271, 1165, 1076 cm-1
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.18-1.54(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.77-2.83(m), 3.17(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.65-3.72(m), 3.83-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.29-4.39(m), 4.42-4.50(m)
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.26
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.21
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）17.70分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（３）
性状：無色な油状
分子量：1360
分子式：C66H120O28
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：210 nm
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.30-1.51(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.76-2.83(m), 3.16(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.50(m)
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.22
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5、上層）  Rf=0.20
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）4.46分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（４）
性状：無色な油状
分子量：1388
分子式：C68H124O28
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：210 nm
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.30-1.51(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.76-2.83(m), 3.16(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.50(m)
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.23
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.22
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）8.46分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（５）
性状：無色な油状
分子量：1416
分子式：C70H128O28
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：210 nm
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.30-1.51(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.76-2.83(m), 3.16(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.50(m)
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.23
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5、 上層）  Rf=0.21
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）12.86分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
を有し、かつ抗ウイルス活性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の糖脂質AH-2445。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の糖脂質AH-2445の製造方法であって、微生物寄託番号FERM P-16524により寄託されたストレプトミセス・ミクロフラバスNo.2445株（Streptomyces microflavus No.2445）又はその変異株を培養し、その培養物中に該AH-2445を蓄積させ、該培養物から目的物を分離採取することを特徴とする前記製造方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の糖脂質AH-2445を有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項６】
ヘルペスウイルス科、オルソミキソウイルス科及びレトロウイルス科に属するウイルスに対し抗ウイルス作用を有することを特徴とする請求項５に記載の抗ウイルス剤。
【請求項７】
単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、水痘・帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス及びヒト免疫不全ウイルスよりなる群から選択された少なくとも１種類のウイルスに対し抗ウイルス作用を有することを特徴とする請求項５に記載の抗ウイルス剤。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載の糖脂質AH-2445を産生する微生物寄託番号FERM P-16524により寄託されたストレプトミセス・ミクロフラバスNo.2445株（Streptomyces microflavus No.2445）又はその変異株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス感染症の治療剤として有用な抗ウイルス活性を有する新規糖脂質及びその製造方法並びにこれを産生する微生物に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
今日では多くの有益な抗ウイルス剤が開発され医療に広く利用されているが、耐性ウイルスの出現による効果の低下や他薬剤との併用による副作用など、いくつかの問題が生じ抗ウイルス剤の改良が必要な場合がある。例えば、単純ヘルペスウイルスに対し高い効果を有するアシクロビルは、チミジンキナーゼ欠損株、チミジンキナーゼ親和性変異株、ＤＮＡポリメラーゼ変異株といった耐性ウイルスの出現、あるいは難水溶性による吸収率の低下や抗HIV薬物相互作用のような問題が指摘されている（M. H. St. Clair, Antimicrob. Agents Chemother., 25, 191, 1984、E. Katz, Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 72, 296, 1991）。
【０００３】
本発明は、広く微生物の培養物を検索することにより、ウイルス感染症の治療剤として有用な新規な抗ウイルス活性物質を提供することを目的としている。
【０００４】
また、本発明の他の目的は、上記の新規抗ウイルス活性物質を製造する方法及び該抗ウイルス活性物質を有効成分とする抗ウイルス剤を提供することにある
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ストレプトミセス（Streptomyces）属に属する微生物の培養物中に、数種のウイルスに対して強い抗ウイルス活性を有する物質が産生、蓄積されることを発見した。その後、本発明者らは、この抗ウイルス活性物質を単離し、その物理化学的性質を調べた結果、特有の物理化学的性質を有する文献未記載の新規糖脂質（この新規糖脂質をAH-2445と命名した）であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
したがって、本発明は、上記AH-2445を産生するストレプトミセス属の微生物を培養し、この培養物からAH-2445を製造する方法を包含する。
【０００７】
また、本発明は、上記AH-2445を有効成分とする抗ウイルス剤を包含する。以下に、本発明について更に詳述する。
【０００８】
本発明は、ストレプトミセス属に属する微生物が産生する、数種のウイルスに対し増殖阻害活性を有する新規糖脂質AH-2445により特徴づけられる。
上記AH-2445は、高速液体クロマトグラフィーにより、Ａ1、Ａ2、II、III及びIVに分画され（図１参照）、それぞれ下記（１）〜（５）の物理化学的性質を有する。
（１）
性状：無色な油状
分子量：1570
分子式：C81H150O28
比旋光度（0.1% メタノール中）：-19.1°
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：末端吸収
赤外線吸収スペクトル（全反射法）：3388, 2923, 2854, 1731, 1459, 1369, 1164, 1078, 1022 cm-1
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.18-1.54(m), 2.50-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.77-2.83(m), 3.17(dd), 3.24-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.86(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.48(m)
カーボン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
173.41(s), 172.50(s), 104.38(d), 103.97(d), 103.67(d), 103.41(d), 80.96(d), 80.48(d), 78.27(d), 78.21(d), 78.06(d), 77.90(d), 77.72(d), 75.31(d), 75.27(d), 75.20(d), 75.16(d), 71.95(d), 71.82(d), 71.62(d), 68.58(d), 65.20(t), 62.97(t), 62.88(t), 42.33(t), 42.21(t), 40.19(t), 36.10(t), 36.01(t), 35.90(t), 35.63(t), 35.34(t), 34.91(t), 31.05(t), 30.91(t), 30.86(t), 30.50(t), 30.30(t), 30.22(t), 30.15(t), 30.01(t), 29.85(t), 26.86(t), 26.38(t), 26.28(t), 26.02(t), 25.82(t), 23.56(q)
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.23
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.22
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）6.11分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（２）
性状：無色な油状
分子量：1724
分子式：C92H172O28
比旋光度（0.06% メタノール中）：-27.4°
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：213 nm
赤外線吸収スペクトル（全反射法）：3362, 2922, 2852, 1732, 1461, 1373, 1271, 1165, 1076 cm-1
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.18-1.54(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.77-2.83(m), 3.17(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.65-3.72(m), 3.83-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.29-4.39(m), 4.42-4.50(m) 
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.26
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.21
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）17.70分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（３）
性状：無色な油状
分子量：1360
分子式：C66H120O28
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：210 nm
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.30-1.51(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.76-2.83(m), 3.16(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.50(m) 
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.22
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.20
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）4.46分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（４）
性状：無色な油状
分子量：1388
分子式：C68H124O28
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：210 nm
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.30-1.51(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.76-2.83(m), 3.16(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.50(m) 
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.23
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.22
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）8.46分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出
（５）
性状：無色な油状
分子量：1416
分子式：C70H128O28
紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：210 nm
プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）：ppm
1.14(d), 1.30-1.51(m), 2.45-2.54(m), 2.58-2.61(m), 2.76-2.83(m), 3.16(dd), 3.25-3.37(m), 3.44(m), 3.62-3.72(m), 3.82-3.85(m), 4.07-4.29(m), 4.30-4.39(m), 4.42-4.50(m) 
溶剤に対する溶解性：
可溶：水、メタノール
不溶：アセトン、クロロホルム
薄層クロマトグラフィー：下記の条件下において単一のスポットを与える。
ａ）キーゼル・ゲル60F254（メルク社製）、10%硫酸発色
ｂ）クロロホルム：メタノール：水（14:6:1）  Rf=0.23
ｃ）ノルマルブタノール：酢酸：水（4:1:5, 上層）  Rf=0.21
高速液体クロマトグラフィー：下記の条件下において保持時間（Rt）12.86分に単一のピークを与える。
ａ）マイティシルRP-18（メルク社製）カラム、90%メタノール移動相、0.8 ml/min流速、５μlサンプル量、ＵＶ210 nm検出。
【０００９】
上記AH-2445は、ストレプトミセス属に属し、上記AH-2445を産生し得る菌株を培養し、この菌株の培養物から分離採取することにより製造することができる。本発明で使用される上記菌株としては、例えば、ストレプトミセス・ミクロフラバス・No.2445株（以下、No.2445株と称することもある）が挙げられるが、本発明のAH-2445を産生するものであれば特に限定されない。したがって、上記No.2445株の他に、自然的又は人工的変異株、その他ストレプトミセス属に属する菌株等であって、AH-2445の産生能を有する微生物を使用することができる。
【００１０】
上記No.2445株は、本発明者らにより熊本県熊本市内の坪井川の河畔の土壌から初めて分離同定された、文献未記載の新規土壌放線菌株であり、微生物寄託番号FERM P-16524として、平成９年１１月１７日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に出願人により寄託されている。以下、上記No.2445株の菌学的性質を詳細に説明する。
【００１１】
上記No.2445株は、表１に示す培養特性を有する（表中、ISPはInternational Streptomyces Projectの略である）。すなわち、No.2445株は、イースト・麦芽寒天培地、シュークロース・硝酸塩寒天培地、スターチ・無機塩寒天培地、グリセリン・アスパラギン寒天培地、チロシン寒天培地で速やかに生育する。また、No.2445株は、気菌糸の形態がらせん状（spiral）、その色調が灰色（gray）、培地への拡散性色素が褐色であるなどの特徴を有する。
【００１２】
【表１】
ストレプトミセス・ミクロフラバス・No.2445株の培養特性
0004203161.tif 000002
【００１３】
また、No.2445株の菌学的性質のうち、生理学的性質は表２に示すとおりである。すなわち、生育温度範囲は28〜37℃であり、最適生育温度は28℃付近である。メラニンの生成、ミルクのペプトン化及びスターチの加水分解は陽性で、ゼラチンの液化、ミルクの凝固及びセルロースの分解は陰性である。また、No.2445株は、表３に示すようにセルロースを炭素源として利用しない特性を有する。
【００１４】
【表２】
ストレプトミセス・ミクロフラバス・No.2445株の生理学的性質
0004203161.tif 000003
【００１５】
【表３】
ストレプトミセス・ミクロフラバス・No.2445株の炭素源の利用性
0004203161.tif 000004
【００１６】
上記の菌学的性質を有するNo.2445株を、バージー（Bergey）のマニュアル第８版に準拠して考察すると、気菌糸の特徴的な色（gray）、特徴的な形態（spiral）、メラニン色素産生性（chromogenicity +）及び胞子表面の形状（smooth）のいわゆる[GY;S;C+;SM]に属する菌株29種のうち、糖の利用性等からストレプトミセス・グリセオスポレウス（Streptomyces griseosporeus）に近縁と考えられる。更に、バージーのシステマチックバクテリオロジー・マニュアル（Bergey' manual of Systematic Bacteriology、1989年版）によれば、該ストレプトミセス・グリセオスポレウスは、包括的にストレプトミセス・ミクロフラバス（Streptomyces microflavus）に類縁と考えられ、ストレプトミセス・ミクロフラバスで代表させることが勧められているので、本発明のNo.2445株は、ストレプトミセス・ミクロフラバスに近縁の１菌株と同定される。しかしながら、ストレプトミセス属又はストレプトミセス・ミクロフラバスに属する菌株であって、AH-2445の産生能を有するものは、これまで報告されていない。そこで、本発明者らは、これを新規菌株とし、ストレプトミセス・ミクロフラバスNo.2445株と命名し、前述したように工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００１７】
本発明におけるAH-2445は、該AH-2445を産生する菌株を、栄養源含有培地に接種し、培養することによって製造することができる。
上記栄養源としては、AH-2445を産生する菌株が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩等が使用される。上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロース、マルトース、スターチ、デキストリン、澱粉、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸等を挙げることができる。窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機窒素化合物、無機窒素化合物等を挙げることができる。塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩等の無機塩類を挙げることができる。これらは、それぞれ単独で使用されてもよく、適宜組み合わせて使用されてもよい。
【００１８】
上記栄養源培地には、更に必要に応じて、鉄塩、銅塩、コバルト塩等の重金属、ビタミン類、その他、菌の生育を助け、AH-2445の産生を促進する有機物、無機物等を適宜添加することができる。また、上記栄養源培地には、動、植、鉱物油等の消泡剤、界面活性剤等を添加することができる。
【００１９】
上記AH-2445を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、該菌株の発育に適し、しかもAH-2445を高率に生産する培養条件が選択される。上記菌株の培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的に有利に培養するためには、上記菌株の胞子懸濁液又は培養液を培地に接種し、振盪培養、通気攪拌培養等好気的条件下に培養が行われる。培養温度は、28〜37℃が用いられる、好ましくは、28℃付近が使用される。培地のｐＨは、通常6.0〜8.0であるが、ｐＨ７付近が好ましい。培養期間は、通常48時間〜96時間が好適である。
【００２０】
上述の培養方法したがって培養された培養物には、AH-2445が蓄積される。該培養物中のAH-2445は、代謝産物を分離採取する際に用いられる通常の方法により得ることができる。例えば、上記培養物から本発明のAH-2445を分離するには、培養物全体を酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ブタノール、メチルイソブチルケトン等の非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。上記分離は、培養物をろ過又は遠心分離により、菌体と培養液とを分離した後、菌体、培養液のそれぞれから行うこともできる。本発明においては、好ましくは、菌体と培養液をろ過して分離した後、培養液からブタノールを用いて、本願発明のAH-2445を含む画分を抽出する方法が取られる。
【００２１】
このようにして培養物中から分離されたAH-2445の粗抽出物は、必要に応じて更に精製される。上記精製には、抗生物質、蛋白質、糖、糖脂質、核酸など微生物の代謝産物を精製する際に用いられる一般的な方法、例えば、溶媒に対する溶解度の差、吸着担体への吸着力の差、ゲルろ過による分子サイズの差、有機溶媒中での分配の差を利用する方法等が、それぞれ単独で又は適宜組み合わせで、あるいは反復して使用される。
【００２２】
本発明においては、例えば、吸着カラムクロマトグラフィー法及び高速液体クロマトグラフィー法が使用される。吸着クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、Diaion HP-10、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂等が挙げられるが、好ましくは、Diaion HP-10及びシリカゲルが用いられ、その溶出溶媒として、例えば、クロロホルム、メタノール、ブタノール、酢酸、水等を挙げることができ、これらは２種以上併用することができる。Diaion HP-10を吸着体とする工程では、その溶出溶媒としては、100%メタノールを使用し、また、シリカゲルを吸着体とする工程では、クロロホルム、メタノール及び水の混液、又はノルマルブタノール、酢酸、水の混液を使用することが好ましい。
【００２３】
上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基等が結合した化学結合型シリカゲル、ポリスチレン系ポーラスポリマーゲル等を挙げることができ、溶出溶媒としては、例えば、アセトニトリル−水系の水溶性有機溶媒を使用することが好ましい。前述したように、高速液体クロマトグラフィーにより得られる新規なAH-2445は、I、II、III、IV、Ａ1及びＡ2に分画され、表４に示すようにいずれも単純ヘルペスウイルスに対し、強い抗ウイルス活性を有する（unitはウイルス増殖を50%阻害する薬剤（溶液）の希釈率を示す）。また、本発明のAH-2445は、インフルエンザウイルス、帯状疱疹ウイルス及びヒト免疫不全ウイルスに対しても抗ウイルス活性を有し、広い抗ウイルススペクトルを有するものである（図６、図７及び表５）。表５中、+++ (90〜100%)、+ (20〜30%)、+/- (5%)、- (0%)表示はCPEの出現程度を示す。
【００２４】
【表４】
AH-2445の高速液体クロマトグラフィー画分の単純ヘルペスウイルス増殖阻害活性
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【００２５】
【表５】
AH-2445A1の抗インフルエンザウイルス活性
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【００２６】
該新規抗ウイルス活性物資AH-2445は、広い抗ウイルススペクトルを有し、種々のウイルス感染症の治療剤として、単独で又は薬剤として投与可能な適当な担体、希釈液、又は安定剤を添加することにより、注射剤、経口剤、坐薬、点眼剤等の任意慣用の方法で医薬品に使用され得る。好ましくは、ヘルペスウイルス科、オルソミキソウイルス科及びレトロウイルス科に属するウイルス感染症の治療に用いられ、更に好ましくは、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス及びヒト免疫不全ウイルスによる感染症の治療に用いられる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によると、ストレプトミセス・ミクロフラバスNo.2445株が産生するAH-2445が提供される。本発明者らが発見・分離採取した上記AH-2445は、これまでに文献未記載の主要構成要素が糖脂質からなる新規抗ウイルス活性物質であり、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスインフルエンザウイルス及びヒト免疫不全ウイルスに対し、増殖阻害活性を示すものである。したがって、このAH-2445は、ウイルス感染症に対する医薬品として、有効に利用され治療効果が期待されるものである。
【００２８】
【実施例】
実施例１：抗ウイルス活性を有する糖脂質の抽出採取
水１リットルにつき、グルコース20g、スターチ30g、ペプトン５g、コーン・スティープ・リカー10g、大豆粉10g、塩化ナトリウム３g、炭酸カルシウム３gを含有する前培養用培地をｐＨ7.0に調整後、200 mlエルレンマイヤーフラスコ８本に、それぞれ50 ml分注し、120℃で15分間殺菌した。この培地に、ストレプトミセス・ミクロフラバスNo.2445株の斜面培地からそれぞれ１白金耳を接種し、28℃、48時間振盪培養（180回／分）を行った。この前培養液400 mlを、水１リットルにつき、グルコース50g、ペプトン５g、コーン・スティープ・リカー10g、炭酸カルシウム３gを含有するｐＨ7.0に調整した培地5.0リットルの入った10リットル容ガラス製ジャーファーメンター２バッチに移し、28℃で毎分3.5リットルの無菌空気を送り、350回転の攪拌で本培養を行った。96時間で培養をやめ、培養液（培養液のｐＨはほぼ中性）を遠心分離により菌体を除去し、上清7110 mlを得た。この上清の380倍希釈液は、単純ヘルペスウイルス１型のプラーク形成を50%減少させた。
【００２９】
得られた培養上清7110 mlを２規定塩酸でｐＨ７に調製した後、３分の１量のノルマルブタノールで３回抽出することにより有機層を得、これを減圧下にて濃縮し、粗抽出物とした。この粗抽出物をDiaion HP-10（商品名、三菱化成工業（株））カラム（2.7 x 23 cm）にかけ、水、80%メタノールで洗浄後、100%メタノールで抗ウイルス活性画分を溶出した。Diaion HP-10による分画は、28 ml／時間の流速で行った。次いで、上記抗ウイルス活性画分のSilica gel 60（商品名、メルク社）によるカラムクロマトグラフィーを２回繰り返し行った。１回目の分画は2.8 x 20 cmカラム、流速30 ml／時間、各画分15 mlの条件で、２回目の分画は1 x 20 cmカラム、流速28 ml／時間、各画分2.5 mlの条件で行った。いずれも溶媒は、クロロホルム：メタノール：水＝14：６：１の混液を用いた。更に、得られた抗ウイルス活性画分のμBondapak C18（Waters社製）カラム（19 x 300 mm）による分取ＨＰＬＣを行い、A1、A2、I、II、III及びIVの画分を得た。ＨＰＬＣ分画には、移動相90%エタノール、流速２ｍｌ／分及び検出ＵＶ210 nmの条件を用いた。また、高度に精製した標品を得る場合には、この分取ＨＰＬＣを繰り返し行った。図１は、分取ＨＰＬＣのクロマトパターンを示す。単純ヘルペスウイルス１型に対する抗ウイルス活性は、保持時間（Rt）が５〜７分（I）、7.72分（II）、9.07分（III）、11.10分（IV）、14.26分（A1）、18.55分（A2）のピークに認められた。
【００３０】
実験例２：AH-2445をメチル化剤又は酸処理して得られる分解脂肪鎖の抽出採取
AH-2445を少量のメタノールに溶解後、ジアゾメタンを添加し、室温で30分放置した。氷中、反応液に水を加え、反応を止め、減圧乾固後、ＯＤＳを用いたカラムクロマトグラフィを行い、化合物（１）と化合物（２）を得た（図５）。化合物（１）と化合物（２）にそれぞれ、１規定塩酸を加え、60℃で１時間反応後、同量のクロロホルムを加え、分配後、クロロホルム層と水層に分け、クロロホルム層から化合物（３）と化合物（４）、水層から糖（グルコース）を得た。さらに化合物（３）と化合物（４）を少量のメタノールに溶解後、ジアゾメタンを添加し、室温で30分間放置した。氷中、反応液に水を加え、反応を止め、減圧乾固後、化合物（５）と化合物（６）を得た。
【００３１】
実験例３：AH-2445及びその分解物のウイルス増殖阻害
（１）検体溶液をイーグルＭＥＭ培地に懸濁し、同じ培地を用いて段階希釈した液を、100 PFUの単純ヘルペスウイルス１型又は水痘・帯状疱疹ウイルスを感染させたVero細胞に加えた。感染３日後にプラーク数を計測し、検体液を加えない対照のプラーク数と比較した。
（２）10万倍希釈したインフルエンザウイルスＡ山形 0.2 mlをイヌ腎細胞に１時間吸着後、ウイルス液を吸引し、重炭酸及びグルタミン酸を含むダルベッコウ・イーグルＭＥＭ培地で段階希釈した検体溶液 3 mlを添加し、３日間培養後、ＣＰＥを観察した。
（３）CD4抗原遺伝子とLTR/βgal（long terminal repeat/βgalactosidase）遺伝子を組み込んだHeLa細胞（CD4-LTR/βgal indicator cells）に、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1 IIIB）を１時間吸着後、薬剤溶液を添加し、２日間培養後、X-Gal（5-ブロモ-４-クロロ-３-インドキシル-β-Ｄ-ガラクトース）で染色し、感染により青く染まった細胞を計数した（Maltinuclear Activation of a Galactosidase Indicator (MAGI) assay, J. Kimpton et al. J. Virol., 66, 2232, 1992）。また、ウイルス吸着前に細胞に薬剤溶液を添加した後、HIV-1 IIIBを１時間吸着後、２日間培養後、X-Galで染色し、感染により青く染まった細胞を計数した。
【図面の簡単な説明】
【図１】分取ＨＰＬＣによるAH-2445の分画パターンを示す図である。縦軸は210 nmにおける吸光度、横軸は保持時間（分）を示す。
【図２】メタノールに溶解したAH-2445 A1を全反射法により測定した赤外線吸収スペクトルの結果を示す図である。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（cm-1）を示す。
【図３】AH-2445 A1の重メタノール中でのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果を示す図である。縦軸はピーク強度、横軸は化学シフト（ppm）を示す。
【図４】AH-2445 A1の重メタノール中でのカーボン核磁気共鳴スペクトルの結果を示す図である。縦軸はピーク強度、横軸は化学シフト（ppm）を示す。
【図５】AH-2445 A1のジアゾメタンによるメチル化と酸加水分解を示す図である。
【図６】AH-2445 A1とAH-2445 A2のウイルス増即阻害効果を示す図である。縦軸はウイルス増殖阻害率（％）、横軸は薬剤濃度（μg/ml）を示す。−●−はA1の単純ヘルペスウイルス１型に対する増殖阻害率、−▲−はA2の単純ヘルペスウイルス１型に対する増殖阻害率、−■−はアシクロビルの単純ヘルペスウイルス１型に対する増殖阻害率、−○−は水痘帯状疱疹ウイルスに対する増殖阻害率を示す。
【図７】AH-2445 A1のヒト免疫不全ウイルス１型に対する増殖阻害効果を示す図である。縦軸はウイルス増殖阻害率（％）、横軸は薬剤濃度（μg/ml）を示す。−□−はウイルス吸着後に薬剤を添加したときのウイルス増殖阻害率、−■−は、ウイルス吸着前に薬剤を添加したときのウイルス増殖阻害率を示す。
【図８】図５に記載の化合物（６）のウイルス増殖阻害効果を示す図である。縦軸はウイルス増殖阻害率（％）、横軸は薬剤濃度（μg/ml）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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