(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ
【化１】
0004089978.tif 000007
で示されるアラビノヌクレオチドの製造方法において、一般式ＩＩ
【化２】
0004089978.tif 000008
で示されるアラビノヌクレオシドを、一般式ＩＩＩ
【化３】
0004089978.tif 000009
〔式中、
Ｙは水素原子又はニトロ基を表し、
Ｚは２個の水素原子又は２個のアルカリ金属原子を表す〕で示されるアリールホスフェートの存在で、プソイドモナス・トリフォリー（ＩＡＭ１３０９）を使用して発酵させることを特徴とする、一般式Ｉのアラビノヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
発酵を水溶性亜鉛（ＩＩ）塩の存在で行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
発酵を休止細胞法の条件下で行う、請求項１又は請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般式Ｉ
0004089978.tif 000002
〔式中Ｘは水素原子又は弗素原子を表す〕で示されるアラビノヌクレオチドの製造方法に関しており、該方法は、一般式ＩＩ
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〔式中Ｘは前記のものを表す〕で示されるアラビノヌクレオシドを、一般式III
0004089978.tif 000004
〔式中Ｙは水素原子又はニトロ基を表し、Ｚは２個の水素原子又は２個のアルカリ金属原子を表す〕で示されるアリールホスフェートの存在で、ヌクレオシドをホスホリル化する能力のある微生物と一緒に発酵させることを特徴としている。
一般式Ｉのアラビノヌクレオチド、すなわち９−（５−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９−Ｈ−プリン−６−アミン〔＝ビダラビンホスフェート（Vidarabinphosphat）〕及び２−フルオル−９−（５−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン〔＝フルダラビンホスフェート（Fludarabinphosphat）〕は、周知のように、シクロスタティックな（Cyclostatisch）抗ウイルス作用によって優れている薬理学的有効物質である（ヨーロッパ特許出願公開第３１７，７２８号明細書及びＷＯ９２０９６０４）。
これらの化合物は、公知方法によれば、相応のヌクレオシドのホスホリル化によって製造される（Bull．of th．Chem．Soc．Japan  ４２，１９６９，３５０５〜３５０８）。この方法の場合には極めて不純化した粗製生成物が得られ、その精製は極めてコスト高であり、損失が大きい。
本発明方法は、これらの物質を比較的単純に、公知方法で可能であるよりも著しく純粋な形で合成することを可能にする。
この事実は当業者にとって意外である。コージ・ミツギ等の研究（Agr．Biol Chem．２８，１９６４、５８６−６００）から、ヌクレオシドであるイノシンを微生物学的にホスホリル化しうることは、ずっと以前から公知であるけれども、一般式ＩＩのヌクレオシドのホルホリル化の際には著しく不利な生成物が得られることを予想せざるを得なかった。これは特に２つの理由からである：
コージ・ミツギ等の研究から、イノシンのホスホリル化の際にはしばしば異性体ヌクレオチドの混合物が得られることが知られている。従って、一般式ＩＩのヌクレオシドのホスホリル化の際にも、異性体混合物が同じ程度で、そうでない場合にはそれどころか強化された程度で得られることを予想することができた。
アデノシンが身体の物質代謝において脱アミノ化及び酸化により分解されることは公知であり
0004089978.tif 000005
従って一般式ＩＩのアデニン誘導体の微生物学反応の際には、これらの化合物の分解が少なくとも部分的に同様に起こることが危惧された。
コージ・ミツギ等によっても記載された微生物プソイドモナス・トリフォリー（Pseudomonas trifolii）〔ＤＳＭ−同定サービス（Identifikationsdienst）の研究によるＩＡＭ１３０９、このものはパントエアグロメランス（Pantoeaagglomerans）として分類されている〕を用いる特別の実験のように、一般式ＩＩのヌクレオシドのホスホリル化の際には前記の危惧された欠点は生じないで、反応はイノシンの反応よりもなお有利にさえ進行するように見える。
本発明方法は、被検された微生物プソイドモナス・トリフォリー（ＩＡＭ１３０９）を用いて行われうるのみならず、コージ・ミツギ等によってヌクレオシドのホスホリル化のために適当と記載されている他の微生物を用いてもたぶん実施されうる。これは例えば次の微生物である：
プソイドモナス・トリフォリー  ＩＡＭ１５４３及びＩＡＭ１５５５
プソイドモナス・ペルルルディア（ｐｅｒｌｕｒｄｉａ）  ＩＡＭ１５８９、ＩＡＭ１６００、ＩＡＭ１６１０及びＩＡＭ１６２７
プソイドモナス・メラノゲヌム（Melanogenum）Ｆ−１１
アルカリゲネス・ビスコ・ラクティス（Alcaligenes visco lactis）  ＡＴＣＣ９０３９及びＩＦＭ  ＡＮ−１４
アクロモバクチル・スペルフィシアリス（Achromobacter superficialis）  ＩＡＭ１４３３
フラボバクテリウム・ラクティス（Flavobacterium lactis）  ＩＦＭ  Ｆ１０１
フラボバクテリウム・フスクム（fuscum）  ＩＡＭ１１８１
フラボバクテリウム・フラベセンス（flavescens）  ＩＦＯ３０８５
フラボバクテリウム・ブレーベ（breve）  ＩＦＭ  Ｓ−１５
セラキナ・マルセセンス（Marcescens）  ＩＡＭ１０２２、ＩＡＭ１０６５、ＩＡＭ１０６７、ＩＡＭ１１０４、ＩＡＭ１１３５、ＩＡＭ１１６１、ＩＡＭ１２０５、ＩＡＭ１２２３、ＩＡＭ１７０３
またこの出版物に挙げられている他の微生物も用いることができる。
本発明方法は、一般式ＩＩの極めてコスト高でしか製造できないアラビノヌクレオシドの十分なホスホリル化を達成するためには、大過剰のホスフェート供与体の存在で実施されなければならない。適当なホスフェート供与体は就中アリールホスフェート、すなわちフェニルホスフェート又はｐ−ニトロフェニルホスフェートである。通常は反応されるヌクレオシド１ｍｏｌ当たりホスフェート供与体２〜５ｍｏｌを使用する。
細菌中に生じるプロテアーゼは、大抵、亜鉛タンパク質でありかつその活性を発現するためには大抵マグネシウムイオンを必要とするアルカリ性プロテアーゼであるので、水溶性亜鉛塩、例えば硫酸亜鉛二水和物０．２〜４．０％の存在で又は場合によっては水溶性マグネシウム塩、例えば硫酸マグネシウム七水和物０．０１〜０．３％の存在で実施するのが有利である。
本発明方法は、前記の条件は別として、細菌培養物による基質の発酵の際に通常使用される同一条件下で実施されうる。細菌培養物を適当な培地で培養し、基質及び助剤を加え、最大の基質変化が達成されるまで、培養物を撹拌及び通気下で発酵させる。
この方法を使用する場合には、一般に、方法生成物が発酵培地から分離され難い発酵ブイヨンが得られる。
従って一般には、休止細胞（resting-cell）法の条件下で行うのが有利である、と思われる。この目的のために細菌培養物を常用の培地で培養し、細菌を遠心分離によって分離し、洗浄し、凍結乾燥し（培養物を貯蔵可能にするため）、等張緩衝液中に再懸濁し、基質及び助剤を加え、最大基質変化が達成されるまで、２０〜４０℃で発酵させる。このような条件下では反応混合物の後処理は困難ではなく、細胞物質を遠心分離し、上澄みを濃縮し、容易に分離可能の出発物質によって不純化されていてもよい、沈殿した方法生成物を濾取する。
次の実施例は、本発明方法を説明するために役立つ：
例１
ａ）ペプトン  １％
酵母抽出物  ０．２％
硫酸マグネシウム七水和物  ０．１％及び
寒天  １．５％
を含有する、ｐＨ７．０に調節されたペトリ皿に、プソイドモナス・トリフォリー（Pseudomonas trifolii）ＩＡＭ１３０９の乾燥培養物を接種し、３０℃で１６時間インキュベートする。
ｂ）ペプトン  １％
酵母抽出物  ０．２％
硫酸マグネシウム七水和物  ０．１％
を含有する、ｐＨ７に調節された培地１ｌを含む２ｌエルレンマイヤーフラスコに、ａ）により製造した予備培養物を穴
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によって接種しかつ３０℃で１６時間毎分１８０の回転数でインキュベートする。次に細胞を１０℃で１５分間毎分６０００回転数で遠心分離し、０．０２％の塩化カリウム水溶液２００ｍｌで洗浄し、０．０２％塩化カリウム水溶液２０ｍｌ中に懸濁し、−２０℃で凍結しかつ２０時間凍結乾燥する。使用するためには、凍結乾燥した細胞を室温で保管する。
ｃ）ねじ付きフラスコでｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液０．５Ｍ中に、１ｌ当たり
２−フルオル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン  ２．０ｇ、硫酸亜鉛二水和物  ０．１２ｇ
例１ｂにより製造した凍結乾燥したプソイドモナス・トリフォリー  ＩＡＭ１３０９培養物１・０ｇ及び二ナトリウム−ｐ−ニトロフェニルホスフェート８．０ｇ
を導入し、反応混合物を４０℃で４０時間毎分６０回転で撹拌する。
次に細胞を毎分８０００回転で遠心分離し、上澄みを分配蒸発器（Rationsverdampfer）で最高５０℃で初めの容積の１／２０に濃縮し、分離された粗製生成物を濾取し、水で洗浄し、１００℃及び１００００Ｐａで２４時間乾燥する。
得られた粗製生成物のＨＰＬＣ分析によれば、この実験の場合には、２−フルオル−９−（５−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン  約５０％が形成された。
例２
例１ｃの条件下で、しかし二ナトリウム−ｐ−ニトロフェニルホスフェート８ｇ／ｌの代わりに１６ｇ／ｌを加えて２−フルオル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン２．０ｇ／ｌを、４０℃で４０時間毎分６０回転で撹拌する。反応混合物の後処理は、例１ｃに記載したように行い、２−フルオル−９−（５−ｏ−ホスホノ−β−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン約６０％が得られる。
例３
例１ｃの条件下で、しかし二ナトリウム−ｐ−ニトロフェニルホスフェート８ｇ／ｌの代わりに４０ｇ／ｌを加えて、２−フルオル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン２．０ｇ／ｌを４０℃で１００時間毎分６０回転で撹拌する。反応混合物の後処理を例１ｃで記載したように行う。２−フルオル−９−（５−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９−Ｈ−プリン−６−アミン約８５％が得られる。
例４
例１ｃの条件下で、二ナトリウムフェニルホスフェート８ｇ／ｌの代わりに２０ｇ／ｌを加えて２−フルオル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９−Ｈ−プリン−６−アミン２．０ｇ／ｌを４０℃で１００時間毎分６０回転で撹拌する。反応混合物の後処理は例１ｃで記載したように行う。２−フルオル−９−（５−ｏ−ホスホノ−β−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン約５０％が得られる。
例５
例４の条件下で、二ナトリウムフェニルホスフェート２０ｇ／ｌの代わりに３０ｇ／ｌを加えて、２−フルオル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン２．０ｇ／ｌを反応させ、後処理する。２−フルオル−９−（５−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９−Ｈ−プリン−６−アミン６０％が得られる。
例６
例４の条件下で、二ナトリウムフェニルホスフェート２０ｇ／ｌの代わりに４０ｇ／ｌを加えて、２−フルオル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−アミン２．０ｇ／ｌを反応させ、後処理する。２−フルオル−９−（５−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−９−Ｈ−プリン−６−アミン７０％が得られる。