(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体部分から多帯域データを取得するための多帯域収集装置、
（b）前記多帯域データを処理し、前記染色体又は染色体部分の着色・バンディング合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するプロセッサ、及び
（c）前記染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置、からなる、染色体を表示するための装置であって、
前記染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せによって彩色され、前記染色体又は染色体部分の各々についての独特のバンディング・パターンを得るために、染色体バンディング技術を用いてバンディングされ、
前記着色・バンディング合成画像は、前記染色体又は染色体部分を、前記染色体又は染色体部分の各々に一つずつ付与された識別できる独特の色により示すものであり、前記独特の色の各々は、前記染色体又は染色体部分の各々の前記バンディング・パターンに応じた輝度パターンが付与されて、前記染色体又は染色体部分の各々における前記独特の色と前記バンディング・パターンとが重なり合うようになった
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
（a）細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体部分から多帯域データを取得するための多帯域収集装置、
（b）前記多帯域データを処理し、前記染色体又は染色体部分の色・形状合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するプロセッサ、及び
（c）前記染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置、からなる、染色体を表示するための装置であって、
前記染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せによって彩色され、前記染色体又は染色体部分の各々についての独特のバンディング・パターン及び形状を得るために、染色体バンディング技術を用いてバンディングされ、
前記色・形状合成画像は、前記染色体又は染色体部分を、前記染色体又は染色体部分の各々に一つずつ付与された識別できる独特の色により示すものであり、
前記染色体又は染色体部分の各々には、前記独特の形状が付与されて前記染色体又は染色体部分の各々における前記独特の色及び前記独特の形状が重なり合うようになった
ことを特徴とする装置。
【請求項３】
（a）染色体又は染色体部分から多帯域データを取得するための多帯域収集装置、
（b）前記多帯域データを処理し、前記染色体又は染色体部分の着色・バンディング合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するプロセッサ、及び
（c）前記染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置、
からなる、染色体を表示するための装置であって、
前記染色体又は染色体部分は一つの色で示され、この色は、交互に明暗がある縞状のバンディング・パターンを含み、前記色及び前記バンディング・パターンが、染色体識別における前記染色体部を示すようになった
ことを特徴とする装置。
【請求項４】
（a）染色体又は染色体部分から多帯域データを取得するための多帯域収集装置、
（b）前記多帯域データを処理し、前記染色体又は染色体部分の色・形状合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するプロセッサ、及び
（c）前記染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置、
からなる、染色体を表示するための装置であって、
前記染色体又は染色体部分は、バンディングされていない状態で前記染色体又は染色体部分の識別を示す一つの色で提示され、前記染色体又は染色体部分は、染色体バンディング技術を用いてバンディングされたとき、該染色体又は染色体部分の形状に類似する形状にされる
ことを特徴とする装置。
【請求項５】
（a）染色体又は染色体部分から多帯域データを取得するための多帯域収集装置、
（b）前記多帯域データを処理し、前記染色体又は染色体部分の着色・バンディング合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するプロセッサ、及び
（c）前記染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置、
からなる、染色体を表示するための装置であって、
前記着色・バンディング合成画像は、前記染色体又は染色体部分のカラー画像とバンディングされた単色画像とを含むものである
ことを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、本来の位置で彩色された染色体の、カラー（スペクトル）核型への分類に関し、このような分類を行うために、特に、顕著な基準スペクトルを識別するための方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
蛍光染料（すなわち、蛍光プローブ、発蛍光団、蛍光色素、これらすべてをこの明細書では互換的に用いる）を用いることは、組織及び細胞を分析するための最も強力な、そして一般的な道具の一つである。したがって、蛍光顕微鏡検査法は、光学顕微鏡検査法に用いられる最も重要な実験方法の一つである（「蛍光分光分析法の原理」［Lakowicz（1983）Principles of fluorescence spectroscopy，Plenum Press，New York，London］を参照）。
【０００３】
蛍光プローブの能力は、主に、特性染料が結び付くことが可能な生物学的構造の素晴らしい多種多様性によるものである（「生体医学における蛍光の応用」［Waggoner（1986）Applications of f1uorescence in the biomedical sciences, Eds. Taylor et al., New York： Alan R. Liss, Inc．pp．3-28］を参照）。蛍光プローブの詳細な論評については、「生物学の技術シリーズ、生物学的活動に対する蛍光及び発光性プローブ」［Mason（editor）（1993）F1uorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Biological Techniques Series， edited by Sattelle， Academic Press Limited，London］及び「蛍光顕微鏡検査法入門」［Ploem and Tanke（1987）Introduction to Fluorescence Microscopy, Oxford University Press, Royal Microscopical Society］）を参照すべきである。
【０００４】
新しく、より洗練された多色の蛍光染料分子の急速な開発は、これら染料の可能性をフルに利用可能な、より進んだ蛍光結像技術を絶えず必要としている。蛍光染料が今日の研究のやり方に革命的な衝撃をもたらしたことへの論議については、「光学顕微鏡検査法の新しいビジョン」［Tay1or et al.（1992） The New Vision of Light Microscopy， American Scientist， Vol．80， pp．322-335］を参照すべきである。
【０００５】
多数の蛍光プローブの検出が有意義な利点となる重要な例としては、FISH（蛍光in situ ハイブリダイゼーション）がある。FISHは、染色体レベルで遺伝子を分析し、遺伝子及び染色体の増幅、欠失、転座、配置替え、その他の起こり得る遺伝子欠陥を見つけるために用いられる（「成長遺伝学とホルモン9」［Emanuel（1993）Growth Genetics and Hormones 9， pp．6-2］を参照）。
【０００６】
多くの癌及び先天性異常を含む特定の病気及び疾患は、いくつかの遺伝子の不良（すなわち突然変異）によって起こる遺伝子障害である。多くの他の病気も、遺伝子の要素、すなわち、遺伝子欠陥が存在するためであると知られている、又は信じられている。遺伝子欠陥は、単独では病気を引き起こさないが、病気の発生に寄与する、又は、後に病気になる可能性を増すものである。この現象は、本技術において多因子の病気及び遺伝子的疾病素質として知られている。
【０００７】
明らかな遺伝子欠陥と既知の病気との相関関係は、医者が決定的な診断を行い、多くの病気を早期に発見し処置することを可能とする。遺伝カウンセリングは、その可能性がある親や、その危険性がある人々が持つ、将来における潜在的に重大な医学的問題の可能性を示し、それを阻止する注意を喚起することができる。
【０００８】
８，０００以上もの遺伝子障害が確認されたが、その多くは同義遺伝子障害に関連している。染色体が遺伝情報のキャリアであることが発見された後、科学者は、特定の疾患に責任がある染色体が持つ、目に見える欠陥を記録することが可能であると理論的に考えた。
【０００９】
1960年代に、分裂中期の染色体スプレッドの顕微鏡検査法に基づく分類めために着色技術が開発された。過去数十年間、染色体のバンディング・パターンの視覚的分析は、人間の遺伝子障害を、分裂中期染色体の観察された構造的な異常へ関連づけるために用いられている。染色体は、それらの長さに沿った特有の明暗のバンドを明らかにするために、通常、ギームザ染色（Gバンディング）を施した後に明視野顕微鏡検査法によって、又は、蛍光染色（R−バンディング）の後に蛍光顕微鏡検査法によって調べられる。患者のバンディング・パターンを正常染色体のパターンに注意深く比較することによって、奇形及び遺伝病を起こす転座（染色体間又は染色体内における遺伝物質の交換）、欠失（染色体又はその断片が欠けている）、付加、逆位等の異常が明らかになる。しかしながら、従来の染色体バンディング技術には分解能に限界がある。
【００１０】
蛍光in situ ハイブリダイゼーション（FISH）は、複数の補足的な技術の改良を受けて、過去25年間に渡って発展したものである。この技術は、染色体上に遺伝子の正確な位置をマップし、染色体の、従来の染色によっては目に見えない非常に小さな遺伝子欠陥をも検出する良い道具を開発したいという、細胞遺伝学者の願望によって生まれたものである。
【００１１】
ヒト・ゲノム・プロジェクト（HGP）、人間のすべての遺伝子を識別しマップする大胆なイニシアティブは、FISHに興味を示し、必要なDNAプローブの開発を早めた。現行のFISH技術は、強力な免疫プローブの同時の開発、顕微鏡検査法及び分光分析法のための優秀な蛍光染料の多種多様な増加、そして蛍光顕微鏡検査法に用いられる対物レンズ、照明装置及びフィルタの劇的な改良によって可能になった。
【００１２】
FISHの性能及び実用性は、多くの要因による。（1）FISHは、単に、単離した染色体及び核に用いられるばかりでなく、固定パラフィンに埋め込まれた組織内における細胞全体にも用いられる。（2）比較的小さな欠陥を検出できる（より小さな欠陥を検出するようにと、性能は常に改善されている）。（3）比較的速く結果を提供できる。（4）適度なコストは、大部分の臨床検査室や研究所でそれが用いられることを可能にする。（5）種々のプローブ及び試料タイプに使用できるように改良が可能である。（6）高い特定性及び感度が、（7）短時間、通常２時間ほどで達成可能である。
【００１３】
多くのFISHの用途において必要なことは、単に、細胞遺伝学者が、顕微鏡のアイピースを介して、又はモニタ上の画像において、蛍光ラべルが存在するか否かを測定するだけである。幾分複雑な試料については、１又は２色のラベルを単純にカウントするだけでよい。しかしながら、デジタル画像を処理し、それらから数値データを抽出する能力は、FISH技術に新しい巨大な機能を加えるものである。
【００１４】
適切な結像方法によって、かなり不明瞭なFISH画像の明瞭度が向上するため、標識された染色体及び遺伝子座が明確に確認可能となる。容易に達成可能な実験条件下で、標識サイト数は自動的に計測可能である。また、各標識サイトの輝度が測定され、例えば、特定の遺伝子の存在数を明らかにするDNA量が計算される。
【００１５】
上記で論じたように、FISHは、標識したプローブの位置、各染色体上の標識サイト数及び各サイトにおける標識の輝度（遺伝物質の量）についての情報を提供する。動原体（反復DNA）プローブ及び染色体ペイントは、目標に定められた各染色体を標識し、コピー数を数えるために用いられる。遺伝子座特定プローブは、遺伝物質の小さな領域の位置をマップするために用いられる。これらのタイプのプローブは、そのままの細胞分裂間期核及び分裂中期の染色体スプレッドに用いることが可能で、視覚的に又は適当なアルゴリズムによって自動的に計数可能であり、特定の染色体、染色体分裂片、又は遺伝子があまりに多い又はあまりにも少ないために起こる遺伝病を識別するために決まって用いられる。
【００１６】
いくつかの癌の非常に早期の段階においては、細胞が明らかに異常であると確認されるかなり以前に、特定の遺伝子の数が増加することがある。この現象は、遺伝子増幅としてこの技術分野で知られているが、遺伝子座特定プローブを用いることによって、均一に染色された領域（HSR）そして／又は二重の微細な染色体として探知可能である。癌細胞における染色体異常を検出するためにFISHを用い、その病気の発達段階を指摘することによって、病期に応じて有効度が異なる多くの治療方法から、最適な治療を選択することができる。
【００１７】
染色体を（例えば、音波破砕によって）物理的に、又は（例えば、エンドヌクレアーゼによって）酵素的に切り刻み、（例えば、流動細胞計算法を用いて）単離し、分裂片全てに対してプローブのセットを生成することによって、一つの特定な染色体の全面に一様に標識することが可能である。染色体ペイントとしても知られている染色体プローブの全体は、ターゲット染色体のすべてのコピーに蛍光標識する。染色体彩色の一つの重要な用途は、特徴的に特定の癌の早期に起こる、二つの染色体間における遺伝物質の転座を検出することにある。しかしながら、他の染色体異常も検出可能である。
【００１８】
例えば、もし染色体Aが緑のペイントで標識され、染色体Bが赤のペイントで標識されたなら、AからBへの遺伝物質の転座は、赤色領域に隣接した緑色領域として現われる（また、逆も同様である）。
【００１９】
通常、正常な染色体から生成された染色体ペイントが、異常な（患者の）染色体上の欠失又は転座を検出するために用いられる。逆方向の染色体彩色は、異常な染色体から生成されたプローブを、その異常な染色体に物質を寄付した種々の正常な染色体からDNAを識別するために用いる。
【００２０】
本発明の方法は、下記の例に実証されるように、一回の交雑処理そして一回の短い測定によって、ヒト核型（すなわち、ゲノム）を構成する２４の異なる染色体を各々が異なる色に彩色し、同時に検出して識別し、カラーのヒト核型を有意義に表示することを可能にする。
【００２１】
染色体ペイントを標識するために用いる多色蛍光染料における注目すべき改善は、少数の基本的な蛍光染料を種々に組合せて用いる組合せ蛍光戦略（例えば、組合せによる標識化や組合せによる交雑）の導入にある。組合せ標識の詳細については、「組合せ蛍光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる  in situ ハイブリダイゼーションによる七つの異なるDNAプローブの同時の視覚化」［Ried et a1., （1992） Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy. Proc. Natl． Acad． Sci．USA 89、1388-1392］及び「遺伝子診断における蛍光  in situ ハイブリダイゼーション」［Ried（Jan．1994） F1uoreszenz in situ Hybridizierung in der genetischen Diagnostik, Facu1ty of theoretical medicine， Ruprecht-Karls University Heidelberg］を参照。組合せ交雑の詳細については、「比較ゲノム  in situ ハイブリダイゼーションによる染色体の完全な、そして部分的な増加及び減少の検出」［du-Manoir et a1. （1993） Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization Hum. Genet． 90, 590-610］を参照。
【００２２】
ビオチン又はジゴキシゲニン等のハプテンが酵素反応を用いてDNAに取り入れられる間接的な方法を含み、FISH分析に用いるためにDNAプローブを標識する多数の方法が利用可能である。分裂中期の染色体スフレッドヘ、又は細胞分裂間期の核への交雑後、免疫学的方法を用いることによってハイブリッドを蛍光標識する。最近では、蛍光染料は、直接的にプローブに取り入れられ、中間ステップを用いることなく検出される。標準的なFISHの染料には、フルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド及びカスケード・ブルーが含まれ、マルチプローブFISH分析は、異なるプローブを、異なるハプテン又は蛍光染料又はそれらの組合せで標識することによって達成される。これは、この技術において組合せプローブとして知られる（「組合せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いるin situ ハイブリダイゼーションによる七つの異なるDNAプローブの同時の視覚化」［Ried et a1., （1992） Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial f1uorwscence and digital imaging microscopy． Proc． Natl． Acad． Sci． USA89, 1388-1392；and， Ried（Jan.1994） F1uoreszenz in situ Hybridizierung in der genetischen Diagnostik， Facu1ty of theoretical medicine， Ruprecht-Karls University Heidelberg］を参照）。択一的に、任意のプローブのプールを、各々が異なる発蛍光団で標識されたサブ・プールに分け、これらサブ・プールを、同様の交雑結果が得られるように再編成する。この方法は、本技術において組合せ交雑として知られている（「比較ゲノムin situ ハイブリダイゼーションによる染色体の完全な、そして部分的な増加及び減少の検出」［du-Manoir et a1. （1993） Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization． Hum. Genet． 90， 590-610］を参照）。これらの両分類戦略により、組合せプローブが得られる。したがって、この明細書、特に請求項において、用語「発蛍光団の組合せ」又は「組合せ蛍光戦略」が用いられた場合、それは上記に説明したように、組合せ標識及び組合せ交雑の両方に言及するものである。
【００２３】
染色体彩色及び核型作成、染色体多色バンディング及び比較ゲノム交雑に対する組合せ発蛍光団の使用については、1996年4月22日に出願された米国特許出願第08／635，820号及び雑誌『サイエンス』「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」［E， Schroeck et a1. （1996） Multico1or spectral karyotypinp of human chromosomes． Science， 273， 494-497］に詳細に説明されている。
【００２４】
『サイエンス』に説明された主な進歩は、蛍光in situ ハイブリダイゼーション（FISH）後、スペクトル結像による全ゲノム走査によって、各ヒト染色体に対する被定義発光スペクトルの瞬間的な視覚化が可能になることである。スペクトルのコンピュータによる分離（分類）によって、スペクトル的に重なり合う染色体特定DNAプローブが確認可能となり、すべてのヒト染色体が同時に識別される。
【００２５】
このスペクトル結像によるアプローチは、フーリエ分光分析法、電荷結合素子（CCD）結像及び光学顕微鏡検査法を組み合わせ、可視及び近赤外のスペクトル範囲において試料のすべてのポイントにおける発光スペクトルを同時に測定するもので、スペクトル的に重なり合う多数のプローブの使用を可能にする。このアプローチは、（多くの異なる波長において測定される各ピクセルの輝度シーケンスから識別される）個々のスペクトルの測定に基づいており、多数の発蛍光団の識別が容易になる。蛍光色素の識別が、少数の狭帯域蛍光色素特定光学フィルタを介した蛍光輝度の測定に基づく従来の蛍光外顕微鏡検査法（epif1uorescence microscopy）［Speicher et a1. （1996） Nature Genetics 12：368-375を参照］とは対照的に、スペクトル核型分析を用いることで、放射光線のスペクトル内における発光光子に存在する利用可能な全情報を分析に用いることが可能になる。
【００２６】
スペクトル的に重なり合う発蛍光団を識別（分類）するためのスペクトルに基づく方法は、各蛍光色素の発光スペクトルに測定可能な一貫した違いがあるという条件で、多数の蛍光色素に容易に拡張できる。
【００２７】
また、分裂中期の試料における各々のヒト染色体の同時識別、すなわちスペクトル核型分析として言及されるアプローチについても報告がある。この目的に対して、流れに沿って分類したヒト染色体から重合酵素連鎖反応（PCR）によって生成した染色体特定複合ライブラリを、五つの異なる発蛍光団又はその組合せに共役したヌクレオチドで直接的に標識する。次に、２４の染色体すべてを含む複合フローブ・セットを分裂中期の染色体に交雑し、染色体特定標識を抑制交雑によって達成する。特に、複合ライブラリにおける反復シーケンスは、標識のないヒトCot-1DNAを過剰に加えることによって阻止する。
【００２８】
この交雑は、RGB表示及び分類色の両方で示される。スペクトル結像の後、表示色によって、ヒト染色体のすべてが容易に視覚化でき、各ピクセルにおけるスペクトル測定に基づき、染色体分類アルゴリズムを適用し、ヒト染色体のすべての核型をスペクトル的に作成する。最も重要な分析アルゴリズムの一つとしては、画像内の多数の異なるスペクトルを識別し分類色で強調表示するスペクトルに基づく分類アルゴリズムがある。ヒト染色体のすべてに対して、それらのスペクトルに基づき特定の分類色を割当てることが可能になる。このアルゴリズムは、各染色体の（参照）スペクトルが既に測定されコンピュータ内の参照ライブラリに保存されていることを想定している。画像の各ピクセルヘの分類色の割り当ては、その任意のピクセルにおけるスペクトルに最も類似する基準スペクトルに割り当てられている分類色に応じて行われる。式１に示す最少平方誤差アルゴリズムが、
0004121287.tif 000002
すべてのピクセルに対して計算される。ここで、Ix,y（λ）は、ピクセル座標x，yにおける正規化スペクトルであり、In（λ）は、各染色体（n＝1、2…、23、24）の正規化基準スペクトルを表す。すべての基準スペクトルに対するSx,y,nの値を計算した後、最小値が選択され、そのピクセルに最も類似する基準スペクトルに割り当てられている分類色に応じて人工の分類色が割り当てられる。
【００２９】
染色体異常のスクリーニング方法としてのスペクトル核型分析の可能性を、以前、従来のバンディング方法、又は染色体彩色プローブによるFISHを行ったことがある多数の研究室からの臨床試料を分析することによって、さらに調査した。例外なく、Ｇバンディングとスペクトル核型分析は一貫した結果を示した。あるケースでは、ギームザ・バンディングは、染色体異常を完全に解釈するに十分ではなかった。これらのケースに対しては、スペクトル核型分析による染色体異常の診断を、従来の二色FISH分析で確認した。この報告のために分析された識別可能な最小の異常は、相互転座が従来のバンディング分析によっては識別することができない転座t（1；11）（q44；p15．3）であった。相互転座の一因となった染色体物質の起源を正確に分類できた。染色体1及び11上の転座セグメントを、染色体1q及び11Pに対する副末端小粒（subtelomere）特定コスミド・プローブによって確認した。用いたプローブの位置に基づいて、変質の大きさを＞1，500kbpであると推定した。第二のケースでは、バンディング分析は、染色体4のセグメントの染色体12への転座を示唆したが、スペクトル核型分析は、追加の染色体物質の起源を、染色体4からのものであるとはっきりと識別し分類した。スペクトル核型分析の感度の限界を測定するために、染色体16及び17を伴う（分裂中期及び前中期の染色体において識別が不可能な）超顕微鏡的な転座のケースを調べた。このt（16；17）は、以前、コスミド・プローブを用いるFISHで実証され、染色質の相互交換はおよそ500kbpと概算されたものである。この患者からの分裂中期染色体で行ったスペクトル核型分析は、既知のt（16；17）を識別することに失敗した。これは、現在利用可能な彩色プローブによる分裂中期の染色体分析の感度の限界が500から1，500kbpであることを示唆する。
【００３０】
スペクトル核型分析は、従来のバンディング分析を補完するために用いることができるアプローチであるということを証明するために、先にGバンディングされた染色体に対する交雑をも行った。恐らく、Gバンディングのために必要なトリプシン消化が原因で、先にGバンディングされていない分裂中期のものと比較して、信号輝度が僅かに減少した。信号輝度の損失はおよそ10％であり、これは、露光時間を延ばすことによって容易に補正することが可能である。Gバンディングされなかった染色体に比較して、先にGバンディングされた染色体の縁には、ノイズが僅かに増したことが観察された。しかしながら、分裂中期の分類は容易に達成することが可能である。
【００３１】
したがって、上記のアプローチによれば、第一に、単一の正常な核型の染色体を、従来の染色体バンディング技術（例えばGバンディング又はR-バンディング）によって識別する。第二に、同じ染色体を、上記に説明したように染色体ペイントで交雑する。第三に、以前に染色体バンディングによって測定したように、染色体タイプ（例えば1-22、ヒト男性のX及びY）に属性があるピクセルを特徴づける平均的なスペクトルを計算し、その結果として生じるスペクトル（例えば、ヒトに対しでは24）によって、基準スペクトルのライブラリを形成する。第四に、その後、これらの基準スペクトルを、新しい核型のピクセルをそれらの染色体に分類するために用いる。
【００３２】
しかしながら、実験的な観察によれば、このアプローチが常に成功するとは限らない。ある場合には、新しい核型を適切に分類することは不可能である。これは、腫瘍細胞の核型等の、異常な核型を分析するときに、特に顕著である。これは、次の理由の一つ、又はそれ以上に起因するものと考えられる。第一に、交雑効率の違い。第二に、異なる源からの染色体は、交雑、発光等に対して、一貫して異なる反応を示すこと。そして第三に、各測定に対して測定装置が同一に較正されないこと。
【００３３】
しかしながら、さらに、基準スペクトルを核型分析に用いるとき、それら基準スペクトルが得られた染色体に対して、最良の分類結果が得られるということが観察された。言い換えれば、用いる基準スペクトルが内部スペクトルであるときに最良の結果が達成可能である。しかし、上記に説明したように、これは、分類の前に、従来の染色体バンディング技術を介して染色体を識別することを必要とする。これは、次の理由から、分類方法の使用範囲を限定するものである。（i）この方法は自動化が容易でない。（ii）染色体の従来のバンディング・パターンの分析のために、高度な教育を受けた細胞遺伝学者か必要である。そして（iii）腫瘍細胞核型等の異常な核型について多くの場合、従来のバンディング・パターンは情報が有益でなく、したがって確証が得られない。
【００３４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、染色体の分類のために、より顕著な基準スペクトルを識別するための方法に関し、これらの基準スペクトルは、各々の核型から得られたスペクトル情報から、各々の核型に対してほぼ自動的に計算されるものである。換言すれば、本発明の方法は、染色体分類のために、内部基準スペクトルを、各核型に対してほぼ自動的に計算、識別して、分類のために内部基準スペクトルを用いることによって、従来の技術における上記の制限を克服するものである。
【００３５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、本来の位置で彩色した染色体をカラー（スペクトル）核型に分類するための方法と、このような分類を行うために顕著な内部基準スペクトルを識別するための方法とを提供する。
【００３６】
下記の本発明の実施例における特徴によれば、細胞のL個の染色体又は染色体部分の分類のために、L内部基準ベクトルを見いだすための方法が提供される。L個の染色体又は染色体部分を、K個の異なる発蛍光団又はその組合せで彩色するが、この場合、L個の染色体又は染色体部分のK個の基本染色体又は染色体部分を、各々、K個の異なる発蛍光団の一つで彩色し、L個の染色体又は染色体部分の残りのL-K個のを、各々、K個の異なる発蛍光団の異なる組合せで彩色する。この方法は、（a）L個の染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対する第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いるステップと、（b）K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別し、これらのピクセルを基本ピクセルと定義することによって、基本ピクセルのK個の基本クラスを得るステップと、（c）K個の基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用いて、K内部基準ベクトルであるK個の基本ベクトルを得るステップと、（d）これらのK個の基本ベクトルを、残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するために用いるステップと、（e）残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを、残りのL-K個の内部基準ベクトルを計算するために用いることによって、すべてのL内部基準ベクトルを見いだすステップとからなる。
【００３７】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、細胞のL個の染色体又は染色体部分を分類するための方法が提供される。L個の染色体又は染色体部分は、K個の異なる発蛍光団又はその組合せで彩色されるが、この場合、L個の染色体又は染色体部分のK個の基本染色体又は染色体部分を、各々、K個の異なる発蛍光団の一つで彩色し、L個の染色体又は染色体部分の残りのL-K個のを、各々、K個の異なる発蛍光団の異なる組合せで彩色する。この方法は、（a）L内部基準ベクトルを見いだすステップと、（b）ピクセルの各々をL分類クラスの一つに分類するためにL個の基準ベクトルを用いるステップとからなる。尚、L内部基準ベクトルを見いだすステップにおいては、（i）L個の染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対する第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用い、（ii）K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別し、これらのピクセルを基本ピクセルとして定義し、基本ピクセルのK個の基本クラスを得、（iii）K内部基準ベクトルであるK個の基本ベクトルを得るために、K個の基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用い、（iv）残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するためにK個の基本ベクトルを用い、そして（v）残りのL-K個の内部基準ベクトルを計算するために、残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを用いることによって、すべてのL内部基準ベクトルを見いだす。
【００３８】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、細胞のL個の染色体又は染色体部分を分類するための方法が提供される。L個の染色体又は染色体部分は、K個の異なる発蛍光団又はその組合せで彩色されるが、この場合、L個の染色体又は染色体部分のK個の基本染色体又は染色体部分を、各々、K個の異なる発蛍光団の一つで彩色し、L個の染色体又は染色体部分の残りのL-K個のを、各々、K個の異なる発蛍光団の異なる組合せで彩色する。この方法は、（a）L個の染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対する第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いるステップと、（b）K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別し、これらのピクセルを基本ピクセルと定義し、基本ピクセルのK個の基本クラスを得るステップと、（c）K内部基準ベクトルであるK個の基本ベクトルを得るために、K個の基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用いるステップと、（d）これらのK個の基本ベクトルを用いて、残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するステップとからなる。
【００３９】
また、好適実施例における特徴によれば、この方法は、さらに、分類したピクセルの各クラスに特有な人工色を付与するステップからなる。さらに、好適実施例における特徴によれば、細胞のL個の染色体又は染色体部分を分類するための方法が提供される。L個の染色体又は染色体部分は、K個の異なる発蛍光団又はその組合せで彩色されるが、この場合、L個の染色体又は染色体部分のK個の基本染色体又は染色体部分を、各々、K個の異なる発蛍光団の一つで彩色し、L個の染色体又は染色体部分の残りのL-K個のを、各々、K個の異なる発蛍光団の異なる組合せで彩色する。この方法は、（a）L個の染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対する第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いるステップと、（b）K個の基本染色体又は染色体の一蔀の各々に属するピクセルを識別し、これらのピクセルを基本ピクセルとして定義し、基本ピクセルのK個の基本クラスを得るステップと、（c）K内部基準ベクトルであるK個の基本ベクトルを得るために、K個の基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用いるステップと、（d）K個の基本ベクトルを用いて、残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するステップとからなる。
【００４０】
さらに、好適実施例における特徴によれば、細胞の染色体又は染色体部分を分類するための方法が提供される。染色体又は染色体部分を、異なる発蛍光団又はその組合せで彩色するため、染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色される。この方法は、（a）染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対する第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いるステップと、（b）基本染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別し、これらのピクセルを基本ピクセルとして定義し、基本ピクセルの基本クラスを得るステップと、（c）これらの基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用いて、基本的な内部基準ベクトルである基本ベクトルを得るステップと、（d）これらの基本的な内部基準ベクトルを用いて、他の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するステップとからなる。
【００４１】
さらに、好適実施例における特徴によれば、L個の基準ベクトルを用いてL分類クラスの一つへ各ピクセルを分類するこの方法は、L個の染色体又は染色体部分に属するピクセルの各々に対してバイナリ・ベクトルを見いだす線形分解アルゴリズムを用いて行われる。
【００４２】
さらに、好適実施例における特徴によれば、上記の染色体の分類方法を用いる染色体異常の検出方法が提供される。
【００４３】
さらに、好適実施例における特徴によれば、多周波数帯収集装置は、一つのフィルタ・キューブと組み合わせたスペクトル映像装置と、複数のフィルタ・キューブと発光及び励起フィルタを含む装置とからなるグループから選択される。
【００４４】
さらに、好適実施例における特徴によれば、第一のベクトルの各々はN項目を含み、Nは3から150の範囲から選ばれる整数である。
さらに、好適実施例における特徴によれば、第一のベクトルの各々はスペクトルを表す。
さらに、好適実施例における特徴によれば、第一のベクトルの各々は正規化される。
【００４５】
さらに、好適実施例における特徴によれば、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルの識別は、（a）L個の染色体又は染色体部分の従来のバンディング・パターンを用いて、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別すること、（b）RGBアルゴリズムを用いてK個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別すること、そして（c）ライブラリからK外部基本ベクトルを用いて、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別することからなるグループから選択される一つの方法によって行われる。
【００４６】
さらに、好適実施例における特徴によれば、K個の基本ベクトルの各々は、基本クラスの一つに属する複数の基本ピクセルの平均である。
【００４７】
さらに、好適実施例における特徴によれば、ライブラリから外部基本ベクトルを用いる、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルの識別は次のように行う。（a）L個の染色体又は染色体部分の各ピクセルに対して分解Kベクトルを定義するために線形分解アルゴリズムを用い、（b）分解Kベクトルの各々を変換バイナリKベクトルに変換するために高カットオフ値を用い、そして（c）変換バイナリKベクートルの各々をK被定義バイナリKベクトルに比較し、K個の異なる発蛍光団の各々を定義することによって、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別する。
【００４８】
さらに、好適実施例における特徴によれば、上記の細胞はヒトのものである。
【００４９】
さらに、好適実施例における特徴によれば、残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルの識別、及び残りのL-K個の内部基準ベクトルの計算は、次のように行う。（a）L個の染色体又は染色体部分の各ピクセルに対して分解Kベクトルを定義するために線形分解アルゴリズムを用い、（b）分解Kベクトルの各々を変換バイナリKベクトルに変換するために低カットオフ値又は低カットオフ範囲を用い、そして（c）変換バイナリKベクトルの各々をK-L被定義バイナリKベクトルに比較し、K個の異なる発蛍光団の組合せの各々を定義することによって、L-K染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別する。
【００５０】
さらに、好適実施例における特徴によれば、細胞のすべての染色体又は一部の染色体の画像からなるディスプレイが提供される。染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色され、画像は、染色体又は染色体部分を異なる特有な色で示す。この場合、染色体又は染色体部分の各々は、一つの異なる独特な色が付与される。
【００５１】
さらに、好適実施例における特徴によれば、細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体部分の合成画像からなるディスプレイが提供される。染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色され、染色体又は染色体部分の各々に対して独特なバンディング・パターン（陰影）を得るために、染色体バンディング技術を用いてバンディングが行われる。画像は染色体又は染色体部分を独特な色で示すが、この場合、染色体又は染色体部分の各々は一つの独特な色が付与され、さらに、これらの独特な色の各々は、染色体又は染色体部分の各々のバンディング・パターンに応じて輝度パターンが付与される。したがって、染色体又は染色体部分の各々の独特な色とバンディング・パターンとは重なり合う。
【００５２】
さらに、好適実施例における特徴によれば、細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体部分の合成画像からなるディスプレイが提供される、染色体又は染色体部分の各々ぱ、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色され、染色体又は染色体部分の各々に対して独特なバンディング・パターン及び形状を得るために、染色体バンディング技術を用いてバンディングが行われる。画像は染色体又は染色体部分を独特な色で示すが、この場合、染色体又は染色体部分の各々は一つの独特な色が付与され、さらに、染色体又は染色体部分の各々は独特な形状が付与される。このため、染色体又は染色体部分の各々の独特な色と形状とは重なり合う。
【００５３】
さらに、好適実施例における特徴によれば、染色体又は染色体部分の合成画像からなるディスプレイが提供される。染色体又は染色体部分は色で示され、この色は、交互に明暗が縞状のバンディング・パターンを含む。これらの色及びバンディング・パターンは、染色体識別の染色体部分を示すものである。
【００５４】
さらに、好適実施例における特徴によれば、染色体又は染色体部分の画像からなるディスプレイが提供される、染色体又は染色体部分はカラーで示されるが、この色は、染色体又は染色体部分の識別を示唆するものである。染色体又は染色体部分は、染色体バンディング技術を用いてバンディングを行ったとき、その形状に類似する形になる。
【００５５】
さらに、好適実施例における特徴によれば、染色体又は染色体部分の合成画像からなるディスプレイが提供される。この合成画像は、染色体又は染色体部分のカラー画像と縞状画像とを含む。
【００５６】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、染色体を表示するための装置が提供される。この装置は、（a）細胞のすべての染色体又は染色体部分の画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するためのアルゴリズムで補われた多周波数帯収集装置と、（b）染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置とからなる。染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色され、画像は、異なる独特な色で染色体又は染色体部分を示す。この場合、染色体又は染色体部分の各々は、一つの異なる独特な色が付与される。
【００５７】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、染色体を表示するための装置が提供される。この装置は、（a）細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体部分の合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するためのアルゴリズムで補われた多周波数帯収集装置と、（b）染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置とからなる。染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色され、染色体又は染色体部分の各々に対する特有のバンディング・パターンを得るために、染色体バンディング技術を用いてバンディングされる。画像は染色体又は染色体部分を独特な色で示す。この場合、染色体又は染色体部分の各々は一つの独特な色が付与されるが、これらの独特な色の各々は、染色体又は染色体部分の各々のバンディング・パターンに応じて輝度パターンを得る。その結果、染色体又は染色体部分の各々の独特な色とバンディング・パターンとは重なり合う。
【００５８】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、染色体を表示するための装置が提供される。この装置は、（a）細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体部分の画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するためのアルゴリズムで補われた多周波数帯収集装置と、（b）染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置とからなる。染色体又は染色体部分の各々は、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色され、染色体又は染色体部分の各々に対する独特なバンディング・パターン及び形状を得るために、染色体バンディング技術を用いてバンディングされる。画像は染色体又は染色体部分を独特な色で示す。染色体又は染色体部分の各々は一つの独特な色を得ると共に、染色体又は染色体部分の各々は独特な形状を得る。その結果、染色体又は染色体部分の各々の独特な色と形状とは重なり合う。
【００５９】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、染色体を表示するための装置が提供される。この装置は、（a）染色体又は染色体部分の合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するためのアルゴリズムで補われた多周波数帯収集装置と、（b）染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置とからなる。染色体又は染色体部分はカラーで表示されるが、この色は明暗が交互にある縞状のバンディング・パターンを含む。これらの色とバンディング・パターンとは、染色体識別の染色体部分を示すものである。
【００６０】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、染色体を表示するための装置が提供される。この装置は、（a）染色体又は染色体部分の画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するためのアルゴリズムで補われた多周波数帯収集装置と、（b）染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置とからなる。染色体又は染色体部分はカラーで表示されるが、この色は染色体又は染色体部分の識別を示唆するものである。染色体又は染色体部分は、染色体バンディング技術を用いてバンディングされるとき、その形状に類似するように形成される。
【００６１】
さらに、本発明の下記の実施例における特徴によれば、染色体を表示するための装置が提供される。この装置は、（a）染色体又は染色体部分の合成画像を視覚的なプレゼンテーション装置に提供するためのアルゴリズムで補われた多周波数帯収集装置と、（b）染色体又は染色体部分を表示するための視覚的なプレゼンテーション装置とからなり、合成画像は染色体又は染色体部分のカラー画像と縞状画像とを含む。
【００６２】
本発明は、ピクセル分類のために、より有効な内部基準ベクトルを用いる染色体の分類方法を提供することによって、現在既知である方法の欠点を克服するものである。この方法は容易に自動化が可能であり、この方法を用いることによって、未熟な細胞遺伝学者でも、スペクトル及び空間的な情報を含む明瞭な、そして有益な核型を得ることが可能である。
【００６３】
【発明の実施の形態】
本発明は、本来の位置で彩色した染色体を、染色体異常の検出に使用可能なカラー（スペクトル）核型に分類するための方法に関する。このような分類のために、本発明は、特に、顕著な内部基準スペクトルを識別するための方法に関し、内部基準スペクトルを、より良い分類結果が得られるように用いる。
【００６４】
本発明による染色体の分類方法の原理及び作用を、図面を参照しながら説明する。
【００６５】
スペクトル結像は、物体のすべてのポイント（ピクセル）から発光するスペクトルの測定を可能にする技術である。スペクトル映像装置（結像分光計としてもここに言及する）は、その視野に置かれた物体のすべてのポイントからの発光スペクトルを測定し、後の検索及び分析のためにメモリに保存する計測器である。スペクトル画像は、スペクトル映像装置によって測定された物体のスペクトルのコレクションであり、通常、二次元が画像（x及びy）で一次元がスペクトル軸（λ）である三次元空間に輝度関数として定義され整理される。ゆえに、スペクトル画像は、通常、データの「立方体」すなわち「スペクトル・キューブ」として言及される。
【００６６】
各ピクセルのスペクトルは、Nが映像装置のスペクトル範囲とスペクトル解像度とに依存する整数で表されるNベクトルである。
【００６７】
従来の技術には、スペクトル画像（すなわち、スペクトル・キューブ）を測定するための色々な方法がある。これらの方法に従ってデザインされた装置は、典型的に、集光光学素子、分散要素（例えば、格子又はプリズム）、フィルタ（例えば、AOTF又はLCTF）又は干渉計、集束光学素子、そして検出器の二次元アレイ（通常、可視域におけるCCD、そして赤外線域における他タイプの検出器）を含む。
【００６８】
各々の方法には、利点と欠点とがあるが、1995年2月21日に出願されたカビブ氏らの米国特許出願第08／392，019号、一すなわち1996年7月23日に発行された現在の米国特許第5，539，517号及び顕微鏡検査法のジャーナル［Vo1. 182， pp． 133-140, 1996］に示されるように、特別なタイプの三角形の干渉計に基づくスペクトル映像装置には、以前のスペクトル映像装置にない、感度の良さと、コンパクトで安定性が良いという利点がある。しかしながら、各ピクセルに対するNベクトルは、使用する発蛍光団に全てが調和するように適当に選択した励起フィルタと、それらに組み合わせた狭帯域の、そして／又は広帯域の発光フィルタとを用いても得ることが可能である。したがって、ピクセルの各々に対して各発光フィルタを用いて、輝度値を得ることができ、これらの値が、各ピクセルに対するNベクトルを構成する。この場合、Nは、使用する発光フィルタの数に等しい。単一の励起フィルタを、すべての発光フィルタに組み合わせて用いない限り、このベクトルを、低解像度スペクトル・ベクトルと考えることはできないが、フィルタと発蛍光団とを注意深く選択することによって、発蛍光団の識別を可能にするNベクトルを得ることができる。したがって、ここに説明する分類手順は、これらのベクトルにも適用できる。
【００６９】
主に狭帯域フィルタを用いる染色体の分類方法が、「組合せマルチ・フラワー FlSHによるヒト染色体の核型分析」（Speicher R． M., Ballard S．G． and Ward C．D.（1996）Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-f1our FISH， Nature genetics，12：368-375）に開示されている。このケースでは、励起フィルタの数が６であるため、測定されたNベクトルは、事実６ベクトルである。
【００７０】
米国特許第5，539，517号に開示された発明によるスペクトル映像装置は、イスラエルのアプライド・スペクトラル・イメージング社（Applied Spectral Imaging Ltd., Industrial Park， Migdal Haemek， Israel）によって開発されたもので、下記にスペクトラキューブとして言及する。この計測器は、Nが可視域において約30から50、通常40に等しいNベクトルを提供する。
【００７１】
スペクトル画像測定の重要性は、物体を形成する物質の成分についての情報がその発光スペクトルから得られるという事実にある。したがって、さもなければ見る、又は識別することができない現象をマッピングし視覚化するために用いることができる。カラー画像が白黒画像後の次のステップであるように、スペクトル画像はカラー画像に続く次のステップである。二つの異なるタイプの樹木の葉、又は若い葉と古い葉との間の緑色の色合いに違いがあるように、テキサス・レッド及びローダミン等の二つの蛍光染料は、肉眼には同じ色のように見えるが、10ナノメートルの解像度を持つスペクトルグラフによれば十分に識別可能である。ギムザで染色された白血球等の複雑な生物学系は、白色光の透過による顕微鏡を介した眼には、異なるレベルの輝度にある紫、青、そして赤色の領域から構成された構造を持つ物体として写る。肉眼で認知される色は、単に三色、赤、緑及び青（RGB）の組合せから構成されるため、細胞中の、色によって分類可能な異なる領域の数は限られている。同じ細胞の各ポイントに対して、スペクトル映像装置は、そのポイントに存在する化学物質に依存するスペクトル又は他のベクトルを測定するもので、そのスペクトルは、カラー画像のように単に三色からなるのではなく、（スペクトル解像度に応じて）50程度のデータを含む波長の関数である。したがって、肉眼では同色に属すると認識されてしまうようなピクセル間の小さなスペクトル差又は移行も、スペクトル映像装置には識別可能であるため、肉眼に比べ、スペクトル映像装置を用いることで、細胞内のより多くの生物学的構造又は構成要素が分類及び識別可能である。
【００７２】
例えば、X・F・ワン氏及びB・ハーマン氏によって編集された蛍光結像分光分析法及び顕微鏡検査法（Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy， edited by X. F. Wang and B. Herman， Vo1. 137 pp．87-124, 1996, John Wiley & Sons）においては、壁が核の一部と認知される単純カラー画像とは正反対に、スペクトル画像では、核壁が核の他の部分からはっきりと区別されて示されている（同書115べ一ジ 図４．１０ｄを参照）。
【００７３】
E．シュロエク氏らのヒト染色体の多色スペクトル核型分析（E． Schroeck et al. （1996） Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science, 273， 494-497）においては、米国特許第5，539，517号に開示されたスペクトル映像装置を、蛍光in situ ハイブリダイゼーション（FISH）技術と組合せて用い、組合せ彩色染色体（人間及び動物）を分析する方法が示されている。これによれば、核型分析及び染色体異常の検出及び特徴づけが可能である。
【００７４】
この技術（上記「発明の背景」及び下記「例」においても説明）によれば、各染色体は、多数の染料のセットの中から選んだ蛍光染料の異なる組合せを含む相補的なDNA物質で交雑されるため、分裂中期スプレッドの各染色体は、その表面上に、異なる蛍光スペクトルをほぼ均一に発光する。通常、各染色体を、五つの染料のセットから選択した最大で四つの染料（例えば、一つ、二つ、三つ又は四つの染料）からの異なる組合せで標識することで、各染色体に対して一つずつ、２４の異なる蛍光スペクトルをもたらすことができる。これは、（２４の異なるスペクトル、すなわち染料の２４の組合せを必要とする）ヒト染色体、（２４とは数が異なる）ネズミ及びサル染色体、健康な、又は病んだ（例えば、癌性の）細胞に対して行われる。この方法を用いることで、転座のスペクトルが明らかに周囲の染色体とは異なり際立つため、瞬時に、そして確実に転座を検出及び識別することができる。他方、染色体の分類のために今日広く用いられているＧバンディング技術によって得られる情報は、この目的においてそれほど有効ではない。
【００７５】
この明細書においては、用語「スプレッド」及び「核型」を、染色体の視覚化を指すために取り替えて用いる。多くの場合、用語「スプレッド」を、染色体の対として配置する前の染色体を示すために用い、用語「核型」を、このような配置後の染色体を示すために用いるが、識別する染色体のセットに言及するこれらの用語の同一な意味を限定することを意図するものではない。
【００７６】
しかしながら、上記「発明の背景」の箇所で説明したように、この分類方法は、正常な核型から得た普遍的な基準スペクトルに基づくもので、その後の他の核型における染色体の分類に用いられるものである。上記に説明したように、ある場合においては新しい核型は適切に分類されない、又は部分的に分類されるため、このアプローチが常に成功するというわけではない。
【００７７】
最良の分類結果が、内部基準スペクトルを用いることによって得られるため、本発明は、内部基準スペクトルを計算するための方法を提供することに向けられている。この計算は、従来の技術における染色体の標準分類技術（例えば、Ｇバンディング又はＲバンディング）を用いる前分類（pre-c1assification）からは独立している。
【００７８】
したがって、本発明によれば、細胞のL個の染色体又は染色体部分の分類のためのL個の内部基準ベクトルを見いだすための方法が提供される。ここで用いられる、また請求項で用いられる用語「染色体又は染色体部分」は、細胞内に存在するL種類又はLタイプの染色体から得られる染色体又は染色体部分、またはそれらの染色体の部分又はサブセットを意味する。しかしながら、各タイプには通常二つのコピーが存在する。病的なケース（例えば、腫瘍）においては、二つのコピーよりも多い、又は少ない染色体のタイプが存在する染色体異常が現れる。この場合、染色体部分又は全部が、例えば、重複又は欠損している。人間の細胞が選択され、すべての染色体を分析した場合、Lは、男性で２４、そして女性で２３である。
【００７９】
しかしながら、本発明は、細胞の染色体のサブセットを分析することも意図している。したがって「L」は、分析すべき細胞を特徴づける染色体の数よりも小さな整数であってもよい。さらに、この方法によれば、L個の染色体又は染色体部分は、K個、例えば、5つの異なる発蛍光団又はその組合せで彩色される。この場合、L個の染色体又は染色体部分のK個の基本染色体又は染色体部分は、各々、K個の異なる発蛍光団の一つで彩色され、L個の染色体又は染色体部分の残りのL-K個の個、例えば、男性については１９は、各々、K個の異なる発蛍光団の異なる組合せで彩色される。例えば、組合せ標識又は組合せ交雑等の組合せ標識アプローチを用いて染色体を彩色する。組合せ交雑を選択することが好ましい。
【００８０】
L個の染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対して第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いる、その後、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別し、それらのピクセルを基本ピクセルとして定義し、基本ピクセルからなるK個の基本クラスを得る。K個の基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを、K個の内部基準ベクトルであるK個の基本ベクトルを得るために用いる。その後、これらのK個の基本ベクトルを、残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するために用いる。最終的に、残りのL-K個の個の染色体又は染色体部分に属するこれらのピクセルを、残りのL-K個の内部基準ベクトルを計算するために用いることによって、L［K+（L-K）］個の内部基準ベクトルのすべてを見いだす。
【００８１】
ほとんどの用途においてKは５であるが、タイプ、スペクトル特性、分析される染色体又は染色体部分の数Lに応じて、発蛍光団の他の組合せも適用可能である。
【００８２】
本発明の好適実施例によれば、上記の方法は、細胞のL個の染色体又は染色体部分の分類のために用いられる。このため、上記に説明したように、K個の異なる発蛍光団又はその組合せで染色体を彩色する。染色体の分類のために、上記に説明したように、L個の内部基準ヘクトルを見いだし、ピクセルの各々をL個の分類クラスの一つに分類するために用いる。
【００８３】
本発明の好適実施例においては、分類後のピクセルのクラスには、各々、特有な人工色が付与される。L個の基準ベクトルを用いてピクセルの各々をL分類クラスの一つに分類する処理を、L個の染色体又は染色体部分に属するピクセルの各々に対してバイナリ・ベクトルを見いだす線形分解アルゴリズムを用いて行うことが好ましい。このことについては、下記の「例」の箇所でさらに詳しく説明する。この染色体の分類方法は、染色体異常の検出に用いることができる。
【００８４】
本発明の実施例における下記の特徴によれば、細胞のL個の染色体又は染色体部分を分類するための方法が提供される。L個の染色体又は染色体部分を、K個の異なる発蛍光団又はその組合せで彩色するとき、L個の染色体又は染色体部分のK個の基本染色体又は染色体部分を、各々、K個の異なる発蛍光団の一つで彩色し、L個の染色体又は染色体部分の残りのL-K個を、各々、K個の異なる発蛍光団からなる異なる組合せで彩色する。この方法は、（a）L個の染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対して第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いるステップ、（b）K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別し、それらのピクセルを基本ピクセルとして定義し、基本ピクセルのK個の基本クラスを得るステップ、（c）K個の基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用いて、K個の内部基準ベクトルであるK個の基本ベクトルを得るステップ、そして（d）残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するためにK個の基本ベクトルを用いるステップからなる。
【００８５】
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法は、分類したピクセルのクラスの各々に対して特有な人工色を与えるステップからなる。
【００８６】
また、本発明による染色体の分類は、基本ピクセルに基づく分類によって行うこともできる。この場合、内部基準ベクトルを識別するステップは省略される。この実施例によれば、上記に説明したように、K個の異なる発蛍光団又はそれらの組合せで彩色した細胞のL個の染色体又は染色体部分を分類するための方法が提供される。この方法は、（a）L個の染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対して第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いるステップ、（b）K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別し、それらのピクセルを基本ピクセルとして定義し、基本ピクセルのK個の基本クラスを得るステップ、（c）K個の基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用いてK内部基準ベクトルであるK個の基本ベクトルを得るステップ、そして（d）残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するためにK個の基本ベクトルを用いるステップからなる。
【００８７】
下記例３において説明するが、ある場合には、基本染色体又は染色体部分、したがって基本ピクセル及び基準ベクトルは、一つ以上の発蛍光団に関わる。ゆえに、本発明によれば、細胞内の染色体又は染色体部分を分類するための方法が提供される。染色体又は染色体部分を、異なる発蛍光団又はその組合せで彩色するが、染色体又は染色体部分の各々を、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色する。この方法は、（a）染色体又は染色体部分の各々の各ピクセルに対して第一のベクトルを測定するために多周波数帯収集装置を用いるステップ、（b）基本染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別し、それらのピクセルを基本ピクセルとして定義し、基本ピクセルの基本クラスを得るステップ、（c）基本クラスの各々から少なくとも一つの基本ピクセルを用い、基本的な内部基準ベクトルである基本ベクトルを得るステップ、そして（d）他の染色体又は染色体部分に属するピクセルを識別するために、基本的な内部基準ベクトルを用いるステップからなる。
【００８８】
多周波数帯収集装置は、上記に説明したように、一つのフィルタ・キューブと組み合わせたスペクトル映像装置、または複数のフィルタ・キューブと発光及び励起フィルタを含む装置であることが好ましい。
【００８９】
さらに、上記の第一のベクトルの各々はN項目を含むことが好ましい。下記の「例」の個所で詳細に述べるが、Nは、3から150の範囲で選ばれた整数であって、正規化されることが好ましい。また、第一のベクトルの各々がスペクトルを表すことが好ましい。
【００９０】
本発明の好適実施例においては、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルの識別は、L個の染色体又は染色体部分の従来のバンディング・パターンを用いて、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別する等の、又はRGBアルゴリズムを用いて、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別する等の方法によって行う。択一的に、ライブラリからのK外部基本ベクトルを用いて、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別してもよい。どの場合も、K個の基本ベクトルの各々は、基本クラスの一つに属する複数の基本ピクセルの平均である。
【００９１】
本発明のもう一つの好適実施例においては、ライブラリからの外部基本ベクトルを用いての、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルの識別を次のように行う。（a）L個の染色体又は染色体部分の各ピクセルに対して分解Kベクトルを定義するために線形分解アルゴリズムを用い、（b）分解Kベクトルの各々を変換バイナリKベクトルに変えるために高カットオフ値を用い、そして（c）変換バイナリKベクトルの各々をK被定義バイナリKベクトルに比較し、K個の異なる発蛍光団の各々を定義することによって、K個の基本染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別する。
【００９２】
本発明のもう一つの好適実施例においては、残りのL-K個の染色体又は染色体部分に属するピクセルの識別、そして残りのL-K個の内部基準ベクトルの計算を次のように行う。（a）L個の染色体又は染色体部分の各ピクセルに対して分解Kベクトルを定義するために線形分解アルゴリズムを用い、（b）分解Kベクトルの各々を変換バイナリKベクトルに変換するために低カットオフ値又は低カットオフ範囲を用い、そして（c）変換バイナリKベクトルの各々をL-K被定義バイナリKベクトルに比較し、K個の異なる発蛍光団の組合せの各々を定義することによって、L-K染色体又は染色体部分の各々に属するピクセルを識別する。
【００９３】
さらに、本発明によれば、カラーの染色体核型が提供される。このようなカラーの核型としては、細胞のすべての染色体又は染色体部分の画像を含むディスプレイがある。染色体又は染色体部分の各々を、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色することによって、画像は、異なる特有な色で、染色体又は染色体部分を示すことが可能である。この場合、染色体又は染色体部分の各々は、異なる独特な色が付与される。ここで用いる用語「ディスプレイ」は、写真、印刷物、スクリーン・ディスプレイ又はモニタ・ディスプレイ等の視覚的なプレゼンテーションに言及するが、これらに限定されるものではない。
本発明のもう一つのカラー核型としては、細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体部分の合成画像を含むディスプレイがある。染色体又は染色体部分の各々を、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色し、染色体バンディング技術を用いてバンディングを行い、染色体又は染色体部分の各々に対して独特なバンディング・パターンを得る。画像は染色体又は染色体部分を特有な色で示す。この場合、染色体又は染色体部分の各々は、一つの特有な色が付与され、さらに、特有な色の各々が、染色体又は染色体部分の各々のバンディング・パターンに応じた輝度パターンを得る。このため、染色体又は染色体部分の各々の特有な色とバンディング・パターンとの両方が重複する。
【００９４】
本発明のもう一つのカラー核型としては、細胞の少なくともいくつかの染色体又は染色体の一郡の合成画像を含むディスプレイがある。染色体又は染色体部分の各々を、異なる発蛍光団又は発蛍光団の組合せで彩色し、染色体バンディング技術を用いてバンディングを行い、染色体又は染色体部分の各々に対する独特なバンディング・パターン及び形状を得る。画像は、染色体又は染色体部分を特有な色で示す。この場合、染色体又は染色体部分の各々は、一つの特有な色が付与される。さらに、染色体又は染色体部分の各々は独特な形状が与えられる。このため、染色体又は染色体部分の各々の特有な色と形状との両方が重複する。
【００９５】
また、本発明によれば、染色体又は染色体部分の合成画像を含むディスプレイが提供される。染色体又は染色体部分が、明暗の縞模様からなるバンディング・パターンを含みカラーで提示される。この場合、色及び縞模様の両方が、各々、染色体識別において染色体部分（すなわち、染色体番号そして／又は領域）を示す。
【００９６】
さらに、本発明によれば、染色体又は染色体部分の画像を含むディスプレイが提供される。染色体又は染色体部分は、染色体又は染色体部分の識別を示唆する色で示される。この場合、染色体バンディング技術（例えば、Gバンディング、Rバンディング（DAPI）など）を用いてバンディングを行うと、染色体又は染色体部分は、その形状（輪郭）に類似する形になる。
【００９７】
さらに、本発明によれば、染色体又は染色体部分の合成画像を含むディスプレイが提供される。この合成画像は、染色体又は染色体部分のカラー画像及び縞状画像の重なりを含む。
【００９８】
ピクセル分類のために内部基準ベクトルを用いる染色体の分類の導入によって、本発明の方法には、従来の技術による方法に優る大きな利点が生じた。通常、内部基準ベクトルを用いる方が良い結果が得られる。本発明のもう一つの利点は、この方法は容易に自動化が可能であるということである。したがって、この方法を用いることによって、熟練した細胞遺伝学者でなくとも、スペクトルの情報及び立体的な情報を含む明瞭な、そして有益な核型を得ることが可能になる。
【００９９】
さて、次の例を参照するが、これらの例は、限定せずに、上記の説明と共に本発明を説明するものである。
【０１００】
例１
測定すべき染色体の準備
多色FISHの出現は、基本研究及び遺伝子の診断における分子細胞遺伝学の応用を広げた。すべての既存の多色FISH技術は、発光スペクトルが光学フィルタで分離され得る蛍光プローブを用いることを必要とする（「組合せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いるin situ ハイブリダイゼーションによる七つの異なるDNAプローブの同時の視覚化」［Ried et a1., (1992） Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy Proc． Natl． Acad． Sci． USA89, 1388-1392； and， Ried（Jan． 1994） Fluoreszenz in situ Hybridizierung in der genetischen Diagnostik， Faculty of theoretical medicine， Ruprecht-Karls University Heidelberg］を参照）。この必要性は、任意の試料において識別可能な染料の数を限定するものである。
【０１０１】
染色体を分類し、それによって染色体異常を検出するという目的で、多数のスペクトル的に重なり合う標識プローブを（単一で、また、組合せで）測定し分析するためにスペクトラキューブ・システムを用いる、FlSHのための新規なアプローチが、最近紹介された（「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」 E．Schroeck et a1. （1996） Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes． Science， 273， 494-497を参照）。
【０１０２】
この新規なアプローチによれば、生物学的試料のすべてのポイントにおいて正確なスペクトル・データを同時に測定可能なフーリエ分光分析法、CCD結像及び光学顕微鏡検査法の組合せであるスペクトル生体結像検査法が、ヒト染色体のすべてのタイプ（すなわち、２４種）の、交雑に基づく多色の出現を視覚化し、ヒトの核型カラー・マップ（カラー・スペクトル核型）を生成するために用いられている。
【０１０３】
現時点において好ましい染料及びそれらの組合せを下記に説明するが、これらの染料及び組合せは、本発明による染色体の分類方法を行うために用いられるものである。
【０１０４】
組合せ交雑アプローチに従って五つの発蛍光団のセットから選択した4以下の異なる発蛍光団（表1，aからe）の異なる組合せで各々を標識した24の染色体ペイント（1から22，X及びY、表1）（異なる発蛍光団及びそれらのスペクトルの特徴については表3を、24の染色体ペイントを得るために、表1にリストアップした発蛍光団を割当てることについては表2を参照）を、リエド氏らの著書（「組合せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いるin situ ハイブリダイゼーションによる七つの異なるDNAプローブの同時の視覚化」［Ried et a1., (1992） Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy Proc． Natl． Acad． Sci． USA89, 1388-1392］を参照）で説明されているように、準備した少数の無関係の男性の白血球の有糸分裂染色体スプレッドに同時に交雑した。
【０１０５】
交雑した染色体を、スペクトラキューブ・システムに接続した逆蛍光顕微鏡を介して視検し、分析した。
【０１０６】
同様に、他の発蛍光団、発蛍光団の他の組合せ、そして異なる標識化アプローチ（例えば、組合せ標識）を用いることができることは同業者には明白である。したがって、下記の表1及び表2にリストした情報は、単に説明のためのものであり、本発明の範囲を、リストした発蛍光団、発蛍光団の組合せ、そして／又は標識化技術に限定する意図は全くない。
【０１０７】
表１
0004121287.tif 000003
１  アマーシャム（Amersham）から。
【０１０８】
表２
0004121287.tif 000004
【０１０９】
例２
測定装置
図１は、1995年2月21日に出願されたカビブ氏らの米国特許出願第08／392，019号、すなわち1996年7月23日に発行された現在の米国特許第5，539，517号に開示された従来の技術による結像分光計の主構成要素を示すブロック図である。この結像分光計は、その構造が本発明の方法を行うのに非常に適しており、高いスペクトル解像度（波長に応じて約4から14nm）及び空間解像度（約30／Mμm，Mは顕微鏡又は前部光学素子の有効拡大率）を持つ。
【０１１０】
したがって、図１の従来の結像分光計は、20と符号が付いた採光光学系、ブロック22で示された一次元スキャナ、ブロック24で示された光路差（0PD）発生器又は干渉計、ブロック26で示された一次元又は二次元検出アレイ及びブロック28で示されたシグナル・プロセッサ及びディスプレイを含む。
【０１１１】
システム20における重要な要素は、0PD発生器又は干渉計24であり、それは、分析される情景の各ピクセルから放射された光のスペクトル輝度の一次結合の所定セットに対応する被変調光を出力するものである。干渉計からの出力は検出アレイに集束される。したがって、すべての必要な光学的位相差は、スペクトルの再構築に必要なすべての情報を得るために、視野のすべてのピクセルに対して同時に走査される。情景内のすべてのピクセルのスペクトルは、結像情報と共に同時に集められるため、リアルタイムでの画像分析を可能にする。
【０１１２】
米国特許第5，539，517号による装置は多種多様の構成が可能である。特に、用いられる干渉計は、米国特許第5，539，517号の関連する図面に示されるように、他の鏡と組み合わせてもよい。
【０１１３】
したがって、米国特許第5，539，517号によれば、別タイプの干渉計を用いることも可能である。これらには、次のものが含まれる。
【０１１４】
（1）光を変調するために0PDが変えられる可動タイプ干渉計、すなわち、スキャン厚があるファブリ-ベロ干渉計、（2）採光光学系及びスキャナから光線を受け二つの光路に光線を分けるビーム・スプリッタを含むマイケルソン型干渉計、（3）オプションとして、上記の米国特許（その図１４を参照）に述べられた、四つの鏡とビーム・スプリッタとを持つ干渉計等の、他の光学的手段と結合されるサグナック干渉計（この干渉計内では、0PDは、入ってくる光の入射角に応じて変化する）。
【０１１５】
図２は、OPDが入射光の入射角に応じて変化する干渉計を利用して米国特許第5，539，517号に従って構成された結像分光計を示す。光軸に対して小さな角度で干渉計に入る光線は、この角度に対し直線的にかなり変化する0PDを生じる。
【０１１６】
図２の干渉計においては、すべてのピクセルの源30からのすべての光は、採光光学系31によって一直線にされた後、メカニカルスキャナ32によって走査される。光は、ビーム・スプリッタ33を介して第一の反射鏡34へ、そして第二の反射鏡35へ通される。この第二の反射鏡35への光は、反射してビーム・スプリッタ33そして集束レンズ36を介して検出器37（例えば、CCD）のアレイヘ送られる。この光線は、ビーム・スプリッタ33によって反射された光線に、次に第二の反射鏡35によって反射された光線に、最後に第一の反射鏡34によって反射された光線に干渉する。
【０１１７】
一回の走査の最後には、すべてのピクセルがすべての0PDを介して測定されてしまうため、情景の各ピクセルのスペクトルはフーリエ変換によって再構築されることが可能である。光軸に平行な光線は補正され、光軸に対して角度（θ）にある光線は、ビーム・スプリッタ33の厚さ、屈折率及び角度θの関数である0PDを生じる。小さな角度において0PDはθに比例する。適切な逆変換を適用することによって、また、注意深いブックキーピングを行うことによって、すべてのピクセルのスペクトルが計算される。
【０１１８】
図２の構成においては、角度β（図２ではβ＝45度）にあるビーム・スプリッタ上に入射する光線は、干渉計を0PD＝0で通り抜けるが、一般の角度β-θで入射する光線は、方程式2で与えられる0PDを生じる。
0004121287.tif 000005
この式において、θは、光軸からの光線の角距又は中央位置に対する干渉計の回転角度であり、tはビーム・スプリッタの厚みであり、nはビーム・スプリッタの屈折率である。
【０１１９】
方程式2から、中央位置に対する正及び負の両角度を走査することによって、すべてのピクセルに対する両面の干渉写真が得られることが明らかであり、このことは、位相誤差を消去する助けとなり、フーリエ変換の計算により正確な結果が得られることになる。走査振幅は、達成可能な最大OPDを決めるため、測定されたスペクトル解像度に影響を与える。角度ステップの大きさが0PDステップを決定するが、0PDステップは、逆に、システム感度の良い最も短い波長によって規定される。事実、試料採取の定理（「干渉分光分析法の原理」［Chamberlain（1979） The principles of interferometric spectroscopy， John Wiley and Sons， pp．53-55］を参照）によれば、この0PDステップは、システム感度の良い最も短い波長の半分よりも小さくなければならない。
【０１２０】
考慮すべきもう一つのパラメータは、マトリクスにおける検出器要素の限られた大きさである。集束光学素子を介して、この要素は、干渉計内に有限のOPDを生じ、干渉写真に直角関数を巻き込む効果がある。このことは、結果として、短い波長におけるシステム感度の減少を引き起こし、要素によって生じる0PD以下の波長に対してはゼロに落ちてしまう。この理由のため、変調伝達関数（MTF）の条件が満足していることを保証しなくてはならない。すなわち、干渉計内に検出器要素によって生じるOPDは、この計測器の感度を満たす最短波長よりも小さくなくてはならない。
【０１２１】
したがって、米国特許第5，539，517号に開示された発明に従って構成された結像分光計は、ただ単に、視野内のすべてのピクセルから来る光の輝度のみを測るものではなく、予め定められた波長範囲内の各ピクセルのスペクトルをも測るものである。また、どの時点においても、視野内の各ピクセルによって発せられた光が全てより良く利用されるため、先に説明したように、フレーム時間をかなり減少し分光計の感度をかなり増加するものである。このような結像分光計は、種々のタイプの干渉計、採光光学系及び集束システムを含んでもよく、そのため、医学的診断及び治療や生物学の研究における用途、また、地質学や農業における調査等のための遠隔測定を含む多種多様な用途に用いられ得るものである。
【０１２２】
上記のように、米国特許第5，539，517号に開示された発明による結像分光計は、イスラエル共和国にあるスペクトラル・ダイアグノスティクス社（Spectral Diagnostics Ltd.； Industrial Park， Migdal Haemek， Israel）によって開発されたもので、ここにスペクトラキューブ（SpectraCubeTM）として言及する。
【０１２３】
顕微鏡に光学的に接続されたスペクトラキューブ・システムを、本発明による染色体の分類方法を行うために用いる。スベクトラキューブ・システムには、下記の表3にリストアップした性能がある。
【０１２４】
0004121287.tif 000006
【０１２５】
ここでは、従来の技術であるスベクトラキューブ・システムを、上記に説明したように本来の位置で彩色した分裂中期の染色体のすべてのピクセルのスペクトル・データ（この場合はスペクトル）のNベクトルを得るために用いる。しかし、先に説明したように、スペクトル映像装置、すなわちフィルタ（例えば、超音波光学チューナブル・フィルタ（AOTF）又は液晶チューナブル・フィルタ（LCTF））及び分散要素（例えば、格子又はプリズム）に基づくスペクトル映像装置を含み、視野内に置かれた物体のすべてのポイントから発光するスペクトルを測定し、後の検索及び分析のためにメモリに保存する計測器、または他のスペクトル・データ又は多周波数帯収集装置（例えば、「組合せマルチ・フラワー F1SHによるヒト染色体の核型分析」（Speicher R. M., Ballard S. G. and Ward C.D.（1996） Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-flour FISH, Nature genetics, 12：368-375）の開示に従う装置）を、必要なスペクトル・データを得るために用いることができる。したがって、本発明の範囲を、スペクトル・データ収集装置の特定なタイプ、又は特定なタイプのスペクトル映像装置を用いるように限定しないことを意図している。
【０１２６】
例３
染色体の分類のための内部基準ベクトルの識別
１．定義及びスペクトル・データの前処理
スペクトルを、各成分又は項目が選択波長における光の輝度を表すNサイズ・ベクトルであると表すことができる。スペクトルの成分数（N）は、スペクトル範囲（例えば、可視光線の範囲、400-750nm）と、測定装置のスペクトル解像度とに依存するものであり、例えば、400nmから700nmのスペクトル範囲に均一に分布する2nmのスペクトル解像度では、スペクトルを151ベクトルによって表すことができる。
【０１２７】
したがって、用語「スペクトル」（又はその複数形）がこの明細書及び下記の請求項で用いられるときは、それはスペクトルを表すNベクトルに言及する。ある場合には同等な用語として「スペクトル・ベクトル」を用いる。
【０１２８】
また、もう一つの用語「正規化スペクトル」も用いるが、正規化スペクトルは、オリジナルのスペクトルから、スペクトル全体の積分輝度によって、各値における輝度を除算して計算される。この手順は、正規化スペクトルが正確に１に等しいトータル積分輝度を持つことを保証する。これによって、輝度に関わらず、二つの異なるスペクトルのスペクトル形状を比較することが可能になる。多くの場合、スペクトルのクラス分けには、スペクトルの輝度というよりも、どちらかと言うとその形状の方が有効である。測定試料、標識化手順、又は測定光学素子に関連する不規性に起因する輝度の明暗効果を除くために正規化スペクトルを用いることが好ましい。
【０１２９】
さらに、ここに説明する数学的な処理の全てを、バックグラウンド減算処理の後に行うことが好ましい。バックグラウンド減算は、背景領域に位置する一つのピクセルのスペクトル、又は複数の、またはすべてのピクセルの平均スペクトルを、各ピクセルのスペクトルから減算する数理的な処理である。このため、すべてのピクセルと共通する背景蛍光信号が除かれ、信号の分類特定性が増す。さらに、背景ピクセルには、すべての波長においてスペクトルの輝度がゼロに近いという特徴があり、次の処理に進む前に、このようなピクセルを取り除いてしまうことが好ましい。したがって、染色体に関するピクセルだけを考慮することができる。
【０１３０】
２．外部基本スペクトル・ベクトルの識別
用語「基本」は、他の用語、スペクトル、ピクセル、染色体、集まり、クラス等に併せてここで用いるが、多くの場合、単一の発蛍光団を用いた場合に言及し、発蛍光団の組合せと対照するものである。この例においては、五つの発蛍光団を用いるため、五つの基本クラスがあり、各クラスは、各々、異なる発蛍光団に関連する。しかしながら、ある用途においては、基本的な特徴（例えば、染色体、ピクセル、クラスなど）は、一つ以上の発蛍光団が関わる特徴に言及するということに注意すべきである。この例においては、基本的な特徴は、単一の発蛍光団に関わる特徴に言及するが、本発明の範囲をこのようなケースに限定することを意図してはいない。したがって、上記に説明し、さらに下記に説明及び実証する線形分解は、一つ以上の発蛍光団によって彩色した基本染色体に属する基本クラスを形成する基本ピクセルを用いて行ってもよい。
上記例1の表1及び2に示すように、この例における基本的な五つの染色体は、染色体番号が2、8、14、17及び20であり、これらを、各々、Cy 5.5（e）、スペクトラム・グリーン（d）、テキサス・レッド（b）、Cy 5 TM（c）及びスペクトラム・オレンジで（a）で標識する。
【０１３１】
したがって、基本ピクセルどは、単一の発蛍光団で標識された遺伝物質を示すものであり、この場合は、上記に特定した染色体から生じた遺伝物質である。したがって、基本ピクセルには五つのクラスがある。
【０１３２】
ここに言及する基本スペクトル・ベクトルは、単一の発蛍光団で標識（例えば、彩色）した遺伝物質におけるピクセルのスペクトル・ベクトルである。したがって、この例においては、基本スペクトル・ベクトルには五つのクラスがあり、これらは、上記に特定した五つの染色体から得た遺伝物質を表わすピクセルのスペクトル・ベクトルがある。
【０１３３】
外部基本スペクトル・ベクトルは、通常、正常な男性の、事前に分類されたカラー（スペクトル）核型から得られる基本スペクトル・ベクトルである。
【０１３４】
分類すべき核型の内部基本スペクトル・ベクトルを見いだすために、本発明の方法に従って、染色体の分類を改善するために用いられる。さらに、下記の、本発明のもう一つの実施例によれば、内部基本基準ベクトルは、研究対象である核型から直接得られる。
【０１３５】
本発明によれば、外部基本スペクトル・ベクトルを識別するためのアプローチが提供される。
【０１３６】
1996年4月22日に出願された米国特許出願第08／635，820号及び雑誌『サイエンス』「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」［E, Schroeck et a1.（1996） Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science，273，494-497］に説明された従来の技術による染色体の分類方法を用いて得た男性の正常なカラー核型を示す図３ａから図３ｃを参照しながら、第一のアプローチを説明する。用いた発蛍光団の正確な種類及び組合せは、上記例1の表1及び2にリストされている。
【０１３７】
図３ａから図３ｃの核型は次のようにして得た。第一に、染色体を、上記表1及び2のように標識された染色体ペイントで、そしてRバンディングのためにDAPIで交雑した。第二に、図３ｂに示す核型の染色体を、従来の染色体Rバンディング技術によって識別した。第三に、染色体R-バンディングによって測定した24の染色体タイプ（すなわち、1-22，X及びY）のいずれかに属性があるピクセルを特徴づける平均正規化スペクトルを計算し、得られた24の平均正規化スペクトルを用い、基準スペクトルのライブラリを形成した。第四に、基準スペクトルを、その核型のピクセルの分類のために用いた。分類結果を図３ａに示す。その後、図３ｃに示すように、本技術で既に知られている順に染色体を配列した。
【０１３８】
分類のために、画像内の各ピクセルの正規化スペクトルを参照ライブラリの24の異なる基準スペクトルの一つ一つに比較し、基準スペクトルとの類似性（例えば、最少矩形誤差処理によって推測できる最小誤差）を測定した。この分類に従って、各ピクセルに、各々を区別する所定の人工色を付与した。各染色体が、異なる人工色（全体で24色）で彩色されるカラー核型を得た。
【０１３９】
先に述べたように、分類においては、いくつかのスペクトルを基準スペクトルとし、表示画像の各ピクセルを、それらの基準スペクトルの一つに最も類似するものとして、その分類に応じて、異なる所定の人工色で彩色する。
【０１４０】
分類には、種々のアルゴリズムが用いられる。例えば、方程式3から6を考察する。
0004121287.tif 000007
0004121287.tif 000008
0004121287.tif 000009
0004121287.tif 000010
【０１４１】
この場合、Imaxは画像の最大輝度であり、Gx,yは、ピクセル（座標x、y）がスクリーン上に表示される輝度であり、Ixy（λ）はそのスペクトルである。＜Ixy（λ）〉は３ｘ３の隣接ピクセルのグループにおけるIxy（λ）の平均である。さらに、Smaxのピーク輝度であり、Tmaxは＜Ixy（λ）＞のピーク輝度である。Rλは、相似性マップを計算するための基準スペクトルである。Rmaxは基準スペクトルRλのピーク輝度であり、そしてｎは測定波長の数である。
【０１４２】
択一的に、類似性の度合いを表すために下記の方程式7を用いてもよい。
【０１４３】
この場合、Ixy（λ）はピクセルx、yの正規化スペクトルであり、IR（λ）は正規化基準スペクトルであり、そしてNは波長の数である。この方程式においては、スペクトル間の類似性が増加するとSが減少する。また、その逆も同様である。極端な場合、スペクトルが全く同一であるとき、Sはゼロに等しい。
【０１４４】
K個の異なる基準スペクトルに関してこの計算を行うと、各ピクセルに対するSについての、K個の異なる値を得る．例えば、S1、S2、．．．Sk。これらの最小値が、基準スペクトルのいずれがピクセルのスペクトルに最も類似しているのかを示す。しかし、本技術に関わる者には明らかであるが、類似性を示すための他の方程式も既知であり、適用可能である。したがって、単純な最少矩形誤差距離アルゴリズム又は複雑な主成分分析を用いて分類を行ってもよい。
【０１４５】
このアプローチを用いることによって、この例においては五つの、外部基本スペクトル・ベクトルを識別することができる。注意すべきことは、外部基本スペクトル・ベクトルは、基本スペクトル・ベクトルを示す特定の基本ピクセルのものであってもよいし、好ましくは、基本ピクセルの一つのクラスの二つ以上の基本ピクセルのスペクトル・ベクトルの平均であってもよい。
【０１４６】
しかしながら、このような識別は、従来のバンディング技術（この場合、RバンディングのためにDAPI）を用いて、まず染色体を識別することに基づいている。したがって、このアプローチはあまり好ましくない。
【０１４７】
しかし、普遍的な実験手順を維持したい場合、本発明の方法のいくつかの実施例に関して説明するが、外部基準スペクトル・ベクトルの識別を、すべての染色体の分類を行う前に一度行わなければならない。
【０１４８】
さて、1996年4月22日に出願された米国特許出願第08／635,820号及び雑誌『サイエンス』「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」［E, Schroeck et a1.（1996） Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science，273，494-497］に説明されたもう一つの従来の技術による染色体の分類方法を用いて得た同じ男性の正常なカラー核型を示す図４ａ及び図４ｂを参照しながら、第二のアプローチを説明する。用いた発蛍光団の正確な種類及び組合せは、上記例1の表1及び2にリストされている。
【０１４９】
第二のアプローチにおいては、RGBアルゴリズムを用いて、CCDアレイのスペクトル範囲（例えば、400nmから760nm）にある光学信号を積分することによって、染色体のRGB画像を得た。この画像においては、赤（R）、緑（G）及び青（B）に対する三刺激応答関数に対応する三つの加重関数、｛Wr（λ）、Wg（λ）、Wb（λ）｝から、赤、緑及び青の輝度の組合せが、各ピクセルに付与される。
【０１５０】
この単純なアルゴリズムの力を例として図５に示す。｛Wr、Wg、Wb｝を、任意のスペクトルの「内部」に分布するガウス関数又は他の関数であると選択すると、この場合に表示される擬似色画像は、加重関数に対応するスペクトル領域内におけるデータだけを強調するため、これらの三領域におけるスペクトル差が、より明確に検出される。
【０１５１】
図６は、染色体の分類に対するRGBアルゴリズムの能力を示すものである。この場合、Wr、Wg、Wbは単純平方加重関数であり、Wr（赤）に対してはλ1＝640nm及びλ2＝750nm、Wg（緑）に対しではλ1＝555nm及びλ2＝640nm、そしてWb（青）に対してはλ1＝450nm及びλ2＝555nmである。単純加重関数Wr、Wg、Wbを積分して、右側に示す、染色体のRGB画像を生成する。
【０１５２】
所定の実験条件下と、RGB色に対して予め定めた加重関数下では、基本染色体、そして基本ピクセル、さらには、ほとんどの、又はすべての他の染色体は識別可能である。特に、実験条件、すなわち発蛍光団の種類及び組合せ、そしてRGB加重関数は、基本ピクセルに独特な色（すなわち基本的な色）が付与され、基本ピクセルが相互に、且つすべての他の（この場合19の）「非基本的な」染色体又はピクセルから明確に識区別されるように選択する。表４に、本例に対して選択した発蛍光団、基本染色体及び基本色を要約する。
【０１５３】
表４
0004121287.tif 000011
1    アマシャムから
【０１５４】
図７に、発蛍光団及び基本染色体を特定して、本例の実験的な処理を用いて得た五つの基本外部スペクトルを示す。
【０１５５】
上記の分類アプローチでは外部の参照ライブラリを生成する必要があるが、外部基本スペクトル・ベクトルの識別のためにRGBアプローチを用いることにより、従来のバンディング技術（例えば、R-バンディング）によって染色体を事前に識別する必要がなくなるため、上記の分類アプローチに優る利点が得られる。なぜなら、基本スペクトル・ベクトルを持つピクセルの各々が非常に明確に区別されるように、正確な実験手順（例えば、上記表1及び2の処理）、任意の加重関数、そして予め選択した三色の出力（例えば、RGB）を選択できるからである。下記にさらに詳細に説明するが、RGBアプローチを用いることによって、内部基本スペクトル・ベクトルを直接的に見いだし、その後、それらを、分類のためのすべての他の基準スペクトルを見いだすために用いることができる。
【０１５６】
３．内部基本スペクトル・ベクトルの識別
外部基本スペクトル・ベクトルを用いて、内部基本スペクトル・ベクトルを識別する処理を開始する。本発明においては、この目的のために線形分解アルゴリズムを用いる。
【０１５７】
この例では、画像における各ピクセルに対する分解係数に関する分解Kベクトル（この例では分解5ベクトル）を得るために、A、B、C、D及びEと定義した五つの外部基本スペクトル・ベクトルを用いて線形分解を行う。
【０１５８】
この数理的な処理中に、画像内の各ピクセルに対する五つの分解係数α、β、γ、δ及びεのセットが計算される。AからEの基本外部スペクトルの各々をその対応する係数で乗算し、その積であるスペクトル・ベクトルを加算したものが、そのピクセルのスペクトルとほぼ同じスペクトル（スペクトル・ベクトル）になるように係数を選択する。したがって、画像内のピクセルの各々を分解Kベクトル、この例においては、αからεの分解係数で構成される分解5ベクトルとして表すことができる。したがって、計算した分解5ベクトルに関して、内部基本ピクセルは、定義上、基本分解5ベクトルによって表されるものである。これらのベクトルは、K外部基本スペクトル・ベクトルを用いて定義されるため、ここでは、これらを外部基本分解Kベクトルと定義する。
【０１５９】
これは、必要な分解係数の数に対して数学的に説明することが可能である。Cjを係数ベクトルとする。この場合、J＝1、…、k（この例ではkは5に等しい）。
0004121287.tif 000012
ここで、I（λi）は特定なピクセルのスペクトルであり、そしてIj（λi）はベクトルである。
【０１６０】
実際は、ノイズがあるため、上記の方程式を正確に満たす係数のセットを得ることが不可能なこともある。このため、小さな残差を加えることが不可欠である。スベクトラキューブ・システムの信号対雑音比が高く、測定結果が良いため、この残差は比較的に小さいものである。
【０１６１】
本発明の方法によれば、内部基本ピクセルを識別するために線形分解係数α−εを用いるが、これら内部基本ピクセルは、定義上、ここに定義するA'からE’の内部基本スペクトル・ベクトルを持つ。
【０１６２】
さて、図８ａから８ｅを参照する。これは、各々、分解係数α−εの値（0−1.0）に対するピクセル数を表すプロットである。
【０１６３】
図８ａから８ｅに示すように、α−ε分解係数の各々のプロットの特徴は、谷を挟む二つのピークである。第一のピークは低分解係数値（例えば、0から0．3）を持つピクセルを表し、第二のピークは高分解係数値（例えば、0.3から1.0）を持つピクセルを表す。どの分解係数（α−ε）の第二のピークによって表されるピクセルも、その係数に関わる発蛍光団を含む可能性が高い。
【０１６４】
下記の表5に示すように、発蛍光団の成分（aからe）に基づいて、基本バイナリKベクトル定義することができる。この例では、内部基本スペクトル・ベクトルA’からE’の各々に対して基本バイナリ5ベクトルを定義することができる。この基本バイナリ5ベクトルと、五つの基本分解5ベクトルを基本バイナリ5ベクトルに変換するための高カットオフ値、例えば、およそ0．75を用いることによって、内部基本スペクトル・ベクトルA’からE’を持つ基本ピクセルを選択することができる。
【０１６５】
表５
0004121287.tif 000013
【０１６６】
高カットオフ値を選択するため、内部基本スペクトル・ベクトルを持つ内部基本ピクセルを正しく選択できる可能性は非常に高い。
【０１６７】
内部基本スペクトル・ベクトル（A’からE’）を持つ基本ピクセルを見いだした後、例えば、各基本クラスに属する基本ピクセルの基本スペクトル・ベクトルを個別に平均することによって、内部基準基本スペクトル・ベクトルを計算してもよい。択一的に、選択したピクセル（このケースでは5、各基本クラスに対して1）の内部基本スペクトル・ベクトルを、直接的に内部基準基本スペクトル・ベクトルとして用いてもよい。
【０１６８】
どの場合も、このように定義した内部基準基本スペクトル・ベクトルを、外部基本スペクトル・ベクトルに関して上記に説明したように本発明の方法に従って、画像内の各ピクセルに対する内部分解Kベクトル（例えば、5ベクトル）を計算するために用いる。
【０１６９】
線形分解アルゴリズムの数学的な説明を次に示す。実際、線形分解アルゴリズムの係数は次のように計算される。
【０１７０】
I（λi）は特定なピクセルのスペクトルであり、iは波長指標のインデックス、i＝1、…、Nで、Nはスペクトルにおける波長の合計数であり、K個の基本的な基準スペクトルのセットがIj（λi）、j＝1、…、Kで与えられると仮定する。K係数のセット、Cjを探す。
0004121287.tif 000014
ε（λi）は最小可能誤差である。
【０１７１】
方程式9がN波長λiの各々に対して成り立つことが重要である。また、この方程式は次のように書くこともできる。
0004121287.tif 000015
又は、すべてのN波長に渡って加算することによって、
0004121287.tif 000016
【０１７２】
さて、残差の平方は常に正であるため、Σε2（λi）が最小であるセットCjを探す。成分Cjの各々に対して、方程式11の右辺の偏導関数を求め、その値をゼロに設定することによって、この解を見つけることができる。結果として、K個の未知数Cjを持つK方程式のセットが得られる。これらの方程式を行列計算のフォーマットに書き表すことができ、方程式11の右辺の導関数∂／∂Cmから次式を得る。
0004121287.tif 000017
方程式12をゼロに設定し、配列を変えた後に次式を得る。
0004121287.tif 000018
さて、方程式13を行列形式（14）に書き変える。
0004121287.tif 000019
【０１７３】
方程式14をA・C＝Vとして書くこともできる。この場合、Aは対称的な行列であり、そのすべての要素は直接的に計算が可能である。逆行列A-1を見いだし、左からかけ算を行うことによって次式を得る。
0004121287.tif 000020
したがって、成分Cjが得られる。
【０１７４】
４．すべての内部基準スペクトル・ベクトルの識別
上記の通り、K、例えば5、内部基本スペクトル・ベクトルは、単一の発蛍光団aからeで標識した遺伝物質を示すピクセルを分類するための基準スペクトル・ベクトルとして用いることができる。しかしながら、完全な分類のためには、さらに、交雑のために用いるaからeの発蛍光団（表2参照）の組合せを表わす追加の基準スペクトル・ベクトルが必要である。
【０１７５】
したがって、本発明によるK内部基本スペクトル・ベクトルを、追加の必要な（この場合19の）内部基準スペクトル・ベクトルを持つピクセルを識別するために用いる。
【０１７６】
このため、表6に示すように、第一に、必要な基準スペクトル・ベクトルの各々を、関連する発蛍光団に応じてバイナリ5ベクトルとして定義する。基本バイナリ・ベクトルについては上記表4において既に定義している。
【０１７７】
表６  バイナリ・ベクトル
0004121287.tif 000021
【０１７８】
その後、図８ａから８ｅの存在プロットと、プロットの第一及び第二のピーク間の谷に位置する第二の、低い閾値（例えば、約O．3）又は閾値範囲（例えば、約0．25からO．35）を用いて、各ピクセルに関する新しい分解Kベクトルの各々を、変換バイナリKベクトルに変換する。この例においては、男性の核型については24の、そして女性の核型については23のタイプの変換バイナリ5ベクトルが期待できる。閾値範囲を用いる場合、いくつかのバイナリ5ベクトルは、一つ以上の分解係数に対する一つ以上のバイナリ成分（0又は1）が欠ける。これは、閾値範囲内の値が２進数（O又は1）に分類されないためである。
【０１７９】
カラー核型のプレゼンテーションのため、同一の変換バイナリKベクトルを持つピクセル毎に、上記表6の被定義バイナリ・ベクトルに関連した所定のパターンに応じて、識別人工色（男性については24の、女性については23の異なる色）が付与される。
【０１８０】
択一的に、同一の変換バイナリKベクトルを持つピクセルのいくつか、又は全てのスペクトル・ベクトルを平均して、24（又は女性については23）の内部基準スペクトル・ベクトルを得ることもできる。その後、これらの内部基準スペクトル・ベクトルを、例えば、方程式3から7について上記に説明したように分類に用いる。又は他の適当な分類処理（例えば、最小矩形誤差、主成分分析等）を行い、分類に用いる基準スペクトル・ベクトルのどれに最も類似するかに応じて、ピクセルのスペクトルをクラスに分類する。
【０１８１】
択一的に、同一の変換バイナリKベクトルを持つピクセルのいくつか、又はすべて分解Kベクトルを平均して、L（男性については24、女性については23）の内部基準ベクトルを得る。その後、これらを、方程式3‐7について上記に説明したように分類のために用いる。又は他の適当な分類処理（例えば、最小矩形誤差）を行い、分類に用いたL内部基準ベクトルのどれに最も類似しているかに応じて、ピクセルの分解Kベクトルをクラスに分類する。
【０１８２】
さて、図９ａに、正常な男性の、上記の分類による染色体スプレッドを示す。図９ｂは、同じスプレッドを、上記図４ａ及び４ｂに関して説明したようにRGBで示すものであり、図９ｃは、図９ａ及び９ｂの染色体のカラー核型を、分類染色体を右側に、そひてRGB染色体を左側に並べ合わせている。
【０１８３】
図９ａ及び９ｃを慎重に調べると、染色体に関するいくつかのピクセルが間違えて分類されている。他のいくつかは分類されていない、さらに、いくつかは黒色が付与されたために背景に重なって見えないことが分かる。その原因は、いくつかのピクセルが、どのクラスにも、すなわちバイナリ5ベクトルの24のタイプ（理論的には、さらに八つのこのようなベクトルがある）のどれにも分類されず、また、他のピクセルも誤ったクラスに間違えて分類されているためである。ある場合においては、バイナリ5ベクトルの24のタイプのいくつかは、非常に小さなビクセル数があるだけなので、アーチファクト（図示せず）を示唆する。
【０１８４】
この問題をさらに説明するために次のことを考察する。ピクセルとバイナリ5ベクトルとの関連表を計算する。各ピクセル（1、1からx、yO）を24のバイナリ5ベクトルの一つに関連させる（表5参照）。その後、1から24までのバイナリ5ベクトルのいずれかに関連するピクセルの全数を数える。その時、いくつかのベクトルは、関連するピクセルを極めて少数しか持たないことが分かる。また、いくつかのピクセルは、1から24までのバイナリ5ベクトルのいずれとも関連しない。これら両ケースは、上記に説明した、第二の閾値範囲の任意の選択に起因するアーチファクトである。
【０１８５】
４．スペクトルの空間的な自動セグメント化
この時点では、分類のために全スペクトル情報が既に利用されているが、空間的な情報については、未だ全く利用されていない。ピクセルの分布には分類情報が含まれることに注意すべきである。隣接するピクセルは、特定の染色体又はその一部分から得られた遺伝物質を示すピクセルの集まりに属する可能性が高いため、理論的には、それらを同様に分類すべきである。さらに、各細胞は、各々が独特な、例えば、大きさ（長さ）及び動原体の相対位置を持つ染色体の数に特徴がある。
【０１８６】
通常、良く展開された（重なり合う染色体が存在しない）正常なヒト核型に対する集まりの数は、46（各染色体に対して一つ）である。これらの集まりは、男性については24の、女性については23のクラスに分けられる。転座が生じると、集まりの合計数が増加する。ガン細胞においては、特に、何世代にも渡って増殖された場合、転座が原因で、集まりの数は百以上に到達することもある。
【０１８７】
画像内のピクセルの各々が（上記に説明したように、外部の、又は好ましくは内部の基本スペクトル・ベクトルと、第二のカット・オフ値とを用いて得られる）分解Kベクトルによって表されるため、クラスタ化処理を行うこともできる。
【０１８８】
このため、隣接するピクセルの分解Kベクトル間の変化をモニターし、これらの変化をクラスタ化に用いる。例えば、二つの隣接するピクセル間の（例えば、最小矩形誤差によって測定される）Kベクトルめ変化が所定閾値よりも低い場合、それらを一つの集まりにまとめる。また、二つの隣接するピクセル間の変化が所定閾値を超えると、それらを異なる集団に属すると見なす。クラスタ化処理の結果として、同様の分解Kベクトルを持つピクセルの集まりが生成される。同様に、ピクセルの正規化スペクトル・ベクトルを用いてクラスタ化を行ってもよい。実際、クラスタ化は分類の一つのタイプである。
【０１８９】
第三の閾値を用いて、識別した集まりの各々を、変換バイナリKベクトルに変換してもよい。それによって、表5の24の被定義バイナリKベクトルの一つに関連させる。換言すれば、もし24の被定義バイナリKベクトルの一つに関連する任意の集まりのピクセルの相対数が第三の閾値以上（例えば、およそ80％以上）ならば、その集まりはそのベクトルに関連があるとする。最適には、正常な核型は、24（男性）又は23（女性）のタイプのバイナリKベクトルに関連する46の集まりを持つべきである。したがって、男性については、1から22までのバイナリKベクトルの各々が、二つの集まりに関連することが期待され、第23番目及び第24番目のバイナリKベクトルは、各々、染色体X及びYから得た遺伝物質の集まりに関連することが期待される。
【０１９０】
さらに、本発明の方法によれば、分類のための内部基準ベクトルは、各々の特定のバイナリKベクトルに関連する集まりのピクセルのいくつか、又はすべてのスペクトルまたは分解Kベクトルを平均することによって得ることができる。
【０１９１】
これらの23又は24の平均ベクトルは、画像自体におけるピクセルから得たものであるため、この分析画像の分類には非常に適しており、従来のバンディングによる染色体の分類を用いる必要性が生じない。
【０１９２】
しかしながら、ある場合には、いくつかの集まりは分類されない。定義上、分類されない集まりは、集まりの分類のための閾値を超えるバイナリKベクトルに関わるビクセルのグループが欠けているため、ある場合には、いくつかのバイナリKベクトルは、それに関連する集まりを持たず、分類のためのいくつかの内部基準ベクトルが欠けている。
【０１９３】
分類されない集まりは、典型的に、用いた閾値範囲に起因して、少なくとも一つの（通常、一つの）分類されないバイナリ成分を含むため、24の被定義バイナリKベクトルのいずれにも関連しないピクセルを含む。定義上、非分類バイナリ成分は1又は0のいずれであってもよい。
【０１９４】
本発明の好適実施例においては、集まりに関連のない被定義バイナリKベクトルのすべてに対して、これらの二つの選択肢を調べて見ると、多くの場合、二つの選択肢の一つが、このようなベクトルにマッチするため、そのピクセルをそのベクトルに関連させる。
【０１９５】
この分析の後、上記に説明したクラスタ化処理を繰り返す。多くの場合、このステップに引き続いて、例えば、性別、転座のレベル、そして分析染色体スプレッド内に重複する染色体が存在するか、しないかに応じて、各被定義バイナリKベクトルを、少なくとも一つ、通常、二つ以上の集まりに関連させる。
【０１９６】
クラスタ化処理を繰り返した後、分類のための内部基準ベクトルを計算し直す。このため、特定のバイナリKベクトルに関連する集まりのいくつかの、又はすべてのスペクトル又は分解Kベクトルを平均することが好ましい。その後、このように得た基準ベクトルを、上記に説明したように分類のために用いる。
【０１９７】
しかしながら、稀なケースにおいては、再クラスタ化ステップの後も、被定義バイナリ5ベクトルの一つ以上が、いずれの集まりにも関連しないことがある。この場合、そのベクトルに関連する集まりを、従来の染色体バンディング技術（例えば、RバンディングのためのDAPI）を用いて識別することが可能である。
【０１９８】
さて、ほとんどの場合、各バイナリ5ベクトルは少なくとも一つの集まりに関連するため、内部基準ベクトルを計算し、分類を行うことが可能である。
【０１９９】
図９ａから明らかなように、さらに、ある場合には、分類後、いくつかの染色体は、異なる色のピクセルの集まりを示す。これらの集まりは、信頼できる転座、又は分類のアーチファクトのいずれかに起因する可能性がある。したがって、これらの集まりの各々を調べる必要がある。このため、調べる集まり内におけるピクセルの各々又はいくつかのスペクトル・ベクトルまたは分解Kベクトル間の類似度（好ましくはパーセントで）を、用いる関連基準ベクトルに対してモニターし、最もマッチするもの（例えば、約5）を表示し、オペレータがアーチファクトと転座との区別ができるようにする。
【０２００】
例４
スペクトル核型画像成分と従来のバンディング画像との重複
さて、図１０ａ及び１０ｂそして図１１ａ及び１１ｂを参照する。現在までに確立されているが、標識した分裂中期の染色体スプレッドから、又は一般的に、多数の染料で標識し他の物質から二つのデータ・セットを得ることが可能である。これらの一つが、Gバンド透過画像又はRバンド（DAPI）蛍光画像等の単色画像であり、その後者を図１０ａにネガ画像で示す。前者は、染色体特定プローブで標識化後に蛍光下で得たスペクトル画像等のマルチバンド画像であり、図１０ｂに示す。
【０２０１】
空間的な特徴を正規化する、又は強調するためのいくつかの手動の、そして／又は自動の前処理の後、Gバンド又はDAP1単色画像を表示するのが現在のやり方である。これらの画像は縞状画像としてここに言及する。これらの画像は、明るい背景上に暗い前景で、又はその逆に構成してもよい。
【０２０２】
マルチバンド画像が、例えば、スピーチャ氏らによって説明された画像捕捉技術（Speicher et al.（1996） Nature Genetics 12：368-375を参照）を用いて得た多くのスペクトル波長周波数帯から、又はより少ない周波数帯から構成されるかどうかに関わらず、それらのデータを視覚化するためのカラー画像を生成することは可能である。このようなカラー画像を作成するための種々の方法がある。最も単純な方法では、周波数帯のいくつかに色を割り当ててから、それらの層を重ね合わせてカラー画像を生成する。もう一つの方法においては、周波数帯の全セットについて、（各ピクセルに対して）適用した関数を用いて各色層を作り、それらの色層を重ね合わせる。それから、このカラー画像を、画像の向上技術を用いて手作業で、そして／又は自動的に強調してもよい。カラー画像の例としては、上記のRGB画像及び分類画像がある。説明のために、ここでは、カラー画像は、多数の染料で標識した物質の結像測定から得たデータを用いて生成するカラー画像に言及する。
【０２０３】
スペクトラキューブ・システム等の干渉計に基づくスペクトル映像装置を用いる、多数の蛍光染料で標識した分裂中期の染色体スプレッドの測定の場合は、縞状画像とカラー画像との空間的な特徴には重要な違いがあることが分かる。図１０ｂのカラー画像においては、染色体が濃く見え、多くの場合、動原体は検出が不可能である。これは、多分、例えば図１０ａに示すように、バンディングしてから観察すると、プローブ分子の一端が染色体に付着し、他端が緩くなって染色体の一般輪郭から突き出ているためであろう。
【０２０４】
ここに説明する考えは、縞状画像とカラー画像との両方を用いて合成カラー縞状画像を得ることによって、一方の画像では明らかにならない特徴を示すことにある。このようにして、縞状画像又はカラー画像による個別表示に優る基本的な利点が得られる。ユーザは、ユーザが何年もの間行ってきた分析のやり方で、染色体を直接的に、そして瞬時に見ることができ、さらに同時に、スペクトル・ベクトル分類に基づくカラー画像によって提供される、縞状画像にはない情報を得ることができる。画像は、縞状画像に対して必要な標識化処理と、スペクトル又はベクトルに基づく画像に対して必要な標識化処理が異なるため、同時に測定することはできないので、画像が完全に得られ、分析され、そして分類された後、ソフトウェアによってのみ重ね合わせを行うことができる。
【０２０５】
したがって、ここで説明する実施例においては、単色の縞状画像とカラー画像とを用いて合成カラー縞状画像を生成する。この考えを他の染料で標識した物質に適用することもできるが、下記に示す例は、染色体の分裂中期からのものである。
【０２０６】
画像を合成する前に、それらの画像の空間的な位置決めを行わなくてはならない。そうすることで、二つの画像におけるポイント間の対応を知ることができる。この場合、カラー画像のサイズを変え、回転させ、そして移動することによって、単色画像にマッチさせる。一般的に、この画像の位置合わせは、自動的に、手作業で、又は半自動的に行う。
【０２０７】
図１１ａ及び１１ｂは、本発明による合成画像を示す。図１１ａの合成画像を生成するために用いる方法においては、輝度すなわち輝度値を、（黒色の上に白色の）DAPI縞状画像から直接得ることができ、そして色合いを、カラー画像、この例ではRGB画像の対応するポイントから得る。図１１ｂを生成するために用いる方法における違いは、輝度値がDAPI縞状画像の逆数から生じることである。如何なるバンディング処理によってバンディングされた染色体の正又は負の単色画像をも択一的に用いることが可能であることは明らかである。現在、染色体彩色及びDAPI測定に用いる発蛍光団は、同じ測定装置、例えばスペクトラキューブ・システムを用いて測定することができるため、DAPIバンディングが好まれる。
【０２０８】
その結果、ユーザに（i）ユーザが見慣れた染色体形状、そして（ii）スペクトルと従来のバンディングとによる核型分析の重複情報が提供される。
【０２０９】
したがって、この実施例は、単色画像とカラー画像とを用いて合成画像を生成する。この考えを変容させたものとしては、中間画像の作成を省略し、単色の、そしてマルチバンドのデータの初期測定を用いて、直接的に合成画像を作成するやり方がある。しかしながら、例えば、カラー染色体に縞状染色体の形状（輪郭）が付与されても、合成染色体は縞状にならない等の、他の重ね合わせも本発明の範囲に含まれる。また、本発明の範囲は、縞状染色体とカラー染色体との位置合わせによる重ね合わせも含む。
【０２１０】
ここに説明した本発明による染色体の分類方法は、種々の用途に適用が可能である。下記にそのいくつかを詳細に説明する。下記に分子細胞遺伝学の分野における本発明による染色体の分類方法の用途を短く要約する。本発明による染色体の分類方法が診断の用途において重要な影響をもたらす細胞遺伝学の二つの主要な分野としては、（i）臨床細胞遺伝学及び（ii）腫瘍細胞遺伝学がある。
【０２１１】
第一に、本発明による染色体の分類方法を、米国特許出願第08／635，820号で説明されたように、例えば、ガン細胞、胎児細胞等における染色体異常を検出する診断目的のために用いることができる。臨床細胞遺伝学及び腫瘍細胞遺伝学においては、アメリカ合衆国だけでも、従来の染色体バンディング分析を用いておよそ400，000ケースの分析が毎年行われている。従来のバンディング分析に加えて、本発明の分類方法を用いる染色体彩色を行うこともできる。これは、従来のバンディングを用いるだけでは特徴づけることができないマーカー染色体を識別する手助けとなるものである。後天性染色体異常は、主に悪性変質に関係する。およそ、（i）血液性腫瘍と（ii）固形腫瘍との二つの悪性腫瘍が識別可能である。血液性悪性腫瘍からの細胞は人工的に容易に培養が可能であるため、それら腫瘍の染色体バンディング分析は、細胞遺伝学的な、そして遺伝学的な腫瘍研究における成功例の一つである。二つのよく知られた例として、慢性リンパ性白血病（CLL）におけるフィラデルフィア染色体及びバーキット・リンパ腫における特定染色体異常の識別がある。過去10年間で、血液性悪性腫瘍に関するこの他多くの腫瘍に特定な染色体異常が識別され、診断及び研究のツールとして用いられている。多くの場合、再発性染色体異常の記述から、分子レベルで悪性変質のメカニズムを識別することが可能である。残念なことに、固形腫瘍（乳房、結腸、脳、肺及びその他の腫瘍）の分野では、分かっていないことが多い。固形腫瘍の方が血液性悪性腫瘍よりもかなり罹患率が高いため、この矛盾は憂慮すべきことである。この矛盾は、主に、固形腫瘍細胞遺伝学に共通する技術的な困難が原因となっている。固形腫瘍細胞は、培養が難しく、染色体試料が低品質になり、高解像度の細胞遺伝学的な分析を妨げるため、腫瘍の発現及び発育に必ずしも関係がないこれら腫瘍の一般的な二次的な染色体異常の特徴が現れるためである。交雑に基づく染色体スクリーニング試験（すなわち、染色体彩色）は、測定方法におけるギャップを埋めることができるため、上記に説明したように必要性が高い。この点に関して、比較ゲノム交雑が部分的に助けとなるが、常に細胞混合物内の染色体異常の平均が表示されるため、構造的な染色体異常を検出することはできない。おそらく、交雑に基づく核型分析は、基礎研究においても、また診断試験においても、固形腫瘍における再発性染色体異常を描写するための方法として広範囲に用いられるようになるであろう。
【０２１２】
第二に、本発明による染色体の分類方法を、米国特許出願第08／635，820号で説明されたように、進化中に染色体の形態を変えた染色体の転位を検出し視覚化するために比較細胞遺伝学に用いることができる（「遺伝学における現在の意見と発達」J. Weinberg and R. Stanyon （1995） Current opinion in genetics and development 5, 792-797参照）。進化論的に関連のある種の研究及びモデル・システム（例えば、ヒトに対するモデル・システムとしてのネズミ）の研究においては、多くの場合、二つ以上の種の染色体が連鎖相似性に従って整列されて染色体を媒介とする遺伝子情報が見い出される比較ゲノム・マップを得ることが要求される。本発明による染色体の分類方法を用いることは、このような比較マップを得ることを容易にする。
【０２１３】
例えば、ヒトとネズミ、又はヒトとサルとの染色体比較マップを構築することを考察する。このためには、一つの種の染色体ペイントの完全なセット（例えば、ヒトのもの）を他の種の（この例ではネズミの）染色体スプレッドに同時に交雑し、上記に説明したように分類する。その結果、ヒト染色体ペイントで彩色したネズミの核型の画像が得られる。したがって、この二つの種の核型間での位置合わせが可能になる。実際、分析染色体の反復カラー・バンディング・パターンを生成するために異種間の交雑を用いることも可能であり、染色体異常の細胞遺伝学的な分析を支援することができる。このため、より少ない数の発蛍光団を用いてもよい。例えば、各々がネズミ染色体のおよそ2分の1を含み、識別可能な発蛍光団で標識された二つのネズミ・ペイントを用いて、ヒト染色体スプレッドに交雑した場合、二つのカラー・バンディングパターンを得ることが可能である。
【０２１４】
第三に、本発明による染色体の分類方法を、細胞分裂間期の、有糸分裂又は減数分裂中の細胞に適用することができる。例えば、この分類ナプローチを、細胞分裂間期染色体の三次元構成を検出するために用いてもよい。細胞分裂間期中にある染色体組織については、未だに分からないことが多いが、悪性細胞においては、細胞分裂間期中に染色体組織に変化が起こるのではないかと推測できる。したがって、本発明の分類アプローチは、種々の悪性腫瘍の早期発見を行う、悪性の病気の段階を定義する、また、それゆえに、診察患者等への治療をより適切に行えるという点で、大変価値が高いものである。三次元再構築手段（例えば、共焦点顕微鏡）に組み合わせて本発明の分類方法を用いることで、細胞分裂間期中の、有糸分裂又は減数分裂中の染色体組織の三次元情報を引き出すことが可能であることが分かる。
【０２１５】
第四に、多くの癌及び遺伝子障害は、染色体欠失、転座、他の転位及び大きな異常（例えば、遺伝子増幅）から起こる。本発明による染色体の分類方法を用いることによって、このような異常を検出する能力を向上できる。
【０２１６】
第五に、一般的な染色体異常の一つがダウン症候群に結び付いており、ダウン症が染色体21の三染色体性が原因で生じるという説は、かなり以前に確立されている。注意深い観察によって、染色体21（21q22）の特定の領域が、この一般的な徴候に常に関連している（すなわち、三染色体として現われる）ことか明らかになった。しかし、従来のG又はRバンディングによる核型作成技術によって測定したダウン症のヒト核型は、見かけ上正常である場合がある。この現象の説明として、これらの場合の三染色体性は、21q22染色体領域からの分裂片に見られるが、この分裂片は、従来のバンディング技術の解像度よりも小さなものであるため、とするものが広く受け入れられている。しかし、本発明の分類方法を用いることによって、これまで検出不可能であった（例えば、絨毛膜絨毛を介して、又は母親の末梢血液からの試料採取で得た）胚芽細胞内の染色体21の三染色体が検出可能であり、この危険性が高い女性たちへの、知識に基づいた遺伝子カウンセリングが可能になる。染色体13及び染色体18又はその分裂片が、極めて異常な子供の出生を引き起こす三染色体を生じるという報告もあるが、本発明の分類方法は、これらの破壊的な染色体13又は18の三染色体性の胎児期の診断のためにも同様に適用が可能である。
【０２１７】
第六に、本発明の分類方法は、急速に発展している、妊娠女性の血液から胚芽細胞を分離する技術と組み合わせて、染色体21の三染色体性及び他の頻度の少ない染色体異常を検出するのに危険性が少ない、胎児期の核型作成に対して非常に価値が高いものである。
【０２１８】
第七に、本発明の分類方法を、染色体の多色バンディング・パターンの生成（すなわち、バー・コード化、多色バンディング核型の作成）に用いることができる。染色体のバー・コード化に関する詳細については、C・ランゴア氏らの文献（C．Lengauer et al. （1993） Hum. Molec. Genet. 5，505-512）を参照のこと。ヒューマン・ゲノム・プロジェクト（HGP）の最初の目標がもうすぐ達成されようとしている。この目標は、ヒトのゲノムの物理的なマップを作成することである。この用語、物理的なマップとは、YACクローン又はBACクローン等の大きなインサートを媒介としてゲノム全体をクローン化すること、そして遺伝学的な、細胞遺伝学的な、そして物理的なマッピングによって、これらクローンのマッピングを行うことを示している。この目的のために、ヒトのDNAの二つの主要源として、ヒト染色体のすべてに対して重複するクローンを含む放射線ハイブリッド細胞ライン及びYACコンティグズが用いられた。このマップの完成によって、腫瘍を含む遺伝性又は後天性遺伝病に関する遺伝子を識別するのに必要な、ゲノム特定クローンにおけるほとんど全ての領域が検索可能になる。多数のYAC又はBACクローン又は放射線ハイブリッドとスペクトル結像とをFISHに組み合わせることによって、全ヒト染色体に対する多色バンディング・パターンを生成することができ、究極的に遺伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとをつなぐことが可能である。例として、放射線ハイブリッド・パネル（スタンフォード・パネル）を用いることを考察する（「放射線ハイブリッドに基づく遺伝学的なマッピング」［Barret J．H. （1992） Genetic mapping based on radiation hybrids． Genomics 13, 95-103］を参照）。スタンフォード・パネルの個々のパネルは、約5,000Kbpの平均分裂片サイズでDNA分裂片のセットを含んでおり、各パネルはヒトのゲノムの約20％をカバーする。このような五つのパネルから得られる蛍光プローブのコハイブリダイゼーション（cohybridization）によって、ゲノムの大部分をカバーし、ヒト染色体の全ての標識化を行うことができる。しかしながら、分裂片は個々のパネルにランダムに分布しているため、ヒトのゲノムを完全にカバーするためには、もっと多くのパネルが必要である（例えば、6から10個のパネル）。次の説明では、五個のパネルが用いられることを想定している。ヒトのシーケンスだけを排他的に増幅し標識化することを保証する、本技術においてAlu-PCR等のIRS-PCRアプローチとして知られる方法で、分散型反復シーケンス（IRS、例えばAluシーケンス）から得られたプライマーを用いて、例えば、dUTPによって共役された発蛍光団を直接的に含ませることによって、各パネルの染色体分裂片に、異なる発蛍光団（又は発蛍光団の異なる組合せ、例えば、組合せ標識又はハイブリダイゼーション戦略）で標識する。したがって、ヒト以外の核種からのDNAが増幅された、そして／又は標識された場合は、その核種のゲノムを特徴づける核種特定分散型反復シーケンス（lRS）を、適当なPCRプライマーを得るために用いる。個々のパネルの一つを個別に交雑することによって、ゲノムのおよそ20％の範囲及び5,OOOKbpの平均帯城サイズで、染色体スプレッドのバンディング・パターンが単一色で得られる。五つのハイブリッド・パネルにおける個々の染色体���裂片のランダムな重複があるため、分裂片の五つの異なるラベルが付けられたグループ（各グループが単一のパネルによって代表される）のコハイブリダイゼーションは、純粋色を持つ周波数帯、各々が二つ、三つ、四つ、そして五つの色の組合せを含む周波数帯を含むバンディング・パターンを生じる。全体として、31通りの色の組合せが可能であり、これらの組合せは、スペクトル結像を用いて識別可能である。染色体の多色高解像度バンディング・パターンの生成には、染色体彩色プローブ（すなわち、染色体ペイント）の使用に比べ、次の二つの明確な利点がある。染色体彩色は、転座等の染色体間の異常、又は均一染色領域、そしてマーカー染色体等の追加染色体物質又は二重の微細な染色体を検出するのに適したツールである。重度の異常が染色体の全長に影響を及ぼす場合は、欠失と重複等の染色体内の異常は検出可能であるが、この方法では、染色体の転位（逆位）については全く検出が不可能である。しかし、多色バンディング・パターンを用いれば、染色体間の、そして染色体内の異常が診断可能である。その理由は、それらの異常の影響が染色体バンドのシーケンスに現れるためである。予めマッピングされたDNA分裂片（例えば、YACクローンや放射線ハイブリッド細胞ライン）を用いる多色高解像度バンディング・パターンの一つの大きな利点は、遺伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとを統合できる可能性があるということである。各多色バンドは、シーケンスが標識された部位の特定のセットに特徴がある。それらの部位は、ゲノムにただ一度生じるPCR生成物からなる。統合された細胞遺伝学的な、そして遺伝学的なマップの有用性を次に説明する。例えば、腫瘍細胞から得た染色体における特定色バンドの欠如は、癌抑制遺伝子の損失を表す微小欠失を示す。このバンドに特定されるシーケンス目標部位（STS）の知識があれば、どんな大きなインサート・クローン・コレクションをもスクリーニングが可能になり、この例においては、削除された遺伝子を含む可能性がかなり高い複数の特定クローンを検索することができる。さて、大規模なシーケンス付けが進行中であり、これと発現標識部位（遺伝子を含むと知られる座位）とを統合することによって、交雑に基づく多色バンディング・パターンの価値は、さらに増加することが明らかである。このような多色バンディング・パターンは、容易に自動化が可能である。従来の染色体バンドに基づく細胞遺伝学的な診断の自動化は、相当な努力にも関わらず、これまでのところ成功していない。上記のアプローチは、ヒト染色体の交雑に基づくバンディング・パターンの生成のためだけではなく、他の哺乳類（例えば、ネズミ）及び非哺乳類の核種に対しても適用可能である。このことは、腫瘍を含む人問の病気の、動物モデルでの分析に特に有用である。放射線ハイブリッド・パネルの説明に類似するが、YACクローン、P1クローン、BACクローン等の個々の大きなインサート・クローンのセットのコハイブリダイゼーションによって、又は、所望の解像度に応じて、これらの源からのコンティグ（重複クローン）を用いることによって、ヒト染色体の全てに対して多色バンディング・パターンを得ることができる。さらに、放射線ハイブリッド・パネルの使用に類似するが、異なる発蛍光団で故意に重複クローンすなわちコンティグを標識することによって、多色バンディング・パターンを導入することができる。同業者には明らかであるが、染色体ブレークポイントすなわち染色体遺伝子欠失に関与するクローンの検索は、放射線ハイブリッド・パネルを用いるものよりも簡単で単純である。染色体多色バンディングの用途に適当な、染色体分裂片のもう一つの源は、染色体の顕微解剖によって得られる分裂片である。顕微解剖染色体分裂片は、本技術分野でよく知られる染色体スプレッドのマニュアル又はレーザ顕微操作によって生成できる。このように生成した分裂片は、通常、本技術でDOP-PCRとして知られる方法で、例えば、変性オリゴヌクレオチド・プライマー（DOP）を用いる、又は本技術でIRS-PCRとして知られる方法で分散型反復シーケンス（IRS、例えば、Aluシーケンス）から得たプライマーを用いる重合酵素連鎖反応によって増殖できる。さらに、染色体多色バンディングに用いるに適当な染色体分裂片のもう一つの源は、大きなDNA分裂片を生成するDNA制限法、そして大きなDNA分裂片を分離可能な電気泳動法によって生成された分裂片である。DNA制限によって大きなDNA分裂片を生成することに関しては、二つのアプローチが考えられる。第一のアプローチによれば、エンドヌクレアーゼ（例えば、頻繁に、又は稀に用いられるカッター）による部分消化が用いられるが、第二のアプローチによれば、稀なカッターであるエンドヌクレアーゼ（例えば、NotI）による完全消化が用いられる。完全消化は、独立した試験で全く同一の結果を得るために繰り返すことができるが、部分消化は性質的にランダムであるため、現在は後者が好まれる。大きなDNA分裂片が分離可能な電気泳動法は、本技術でよく知られており、これにはパルス・フィールド・ゲル電気泳動（PFGE）が含まれる。したがって、例えば、PFGE航路に沿った連続した領域からDNAを抽出し、各領域から抽出したDNAに、異なる発蛍光団を用いて標識し、このように形成したプローブを染色体にコハイブリダイゼーション化することで、上記に説明したような染色体の多色バンディング・パターンが得られる。本技術分野でよく知られるショ糖又はセシウム塩化物グラジエント等のグラジエント遠心分離によって、さらに、大きなDNA分裂片が得られる。しかし、これらのアプローチを用いることが、上記に説明したように遺伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとを統合する可能性を提供するものではないため、現在、これらのアプローチはあまり好まれない。
【０２１９】
蛍光in situ ハイブリダイゼーションと本発明による染色体の分類方法とに基づく染色体多色バンディング・パターンの生成（すなわち、多色バンディング核型）は、種々の実用的な用途に用いられる。これらの用途には、例えば、（i）例えば、特注のクローンセットを用いる染色体異常をスクリーニングすること、（ii）さもなければ検出が難しい末端小粒欠失をスクリーニングすること、（iii）出生前診断における染色体異数体をスクリーニングすること、（iv）再発性染色体ブレークポイントをスクリーニングすること、（v）多色比較ゲノム交雑を行うこと、（vii）腫瘍細胞の多パラメータ分析のために多色FISHを、細胞学的な、そして免疫組織化学的な染色の他の測定と組み合わせること、（viii）多色バンディング・パターンを従来のR又はGバンドと組み合わせること、（ix）細胞分裂間期細胞における遺伝学的な異常を直接的に分析すること、そして（x）放射線又は変異誘発物質にさらされた住民の染色体異常をスクリーニングすることが含まれる。
【０２２０】
本発明の方法の主要な利点は、ピクセルの分類のために内部基準ベクトルを用いる染色体の分類方法を導入した点にある。通常、内部基準ベクトルの方が良い結果が得られる。本発明のもう一つの利点は、この方法が容易に自動化できることにある。この方法を用いることによって、素人の、又は熟練していない細胞遺伝学者でも、スペクトル情報と空間的な情報とを含む明瞭で有益な核型を得ることができる。
【０２２１】
本発明は、限られた数の実施例に関して説明されたが、本発明について多くの変形、改良及び他の適用が行なわれ得ることは明らかである。
【０２２２】
一例として添付図面を参照して、本発明をここに説明する。
【図面の簡単な説明】
【図１】米国特許第5，539，517号に示された従来技術により製作された結像分光計の主構成要素を示すブロック図である。
【図２】米国特許第5，539，517号による結像分光計に用いられるサグナック干渉計を示す。
【図３ａ】  1996年4月22日に出願された米国特許出願第08／635，820号及び雑誌サイエンス（「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」E．Schroeck et a1.（1996） Multicolor spectral karyoty ping of human chromosomes， Science， 273， 494-497）に説明された、従来の技術における分類方法による人工色を用いて分類された染色体を示す。
【図３ｂ】  DAPIでRバンディングされた図３ａの染色体を示す。
【図３ｃ】図３ａの染色体の整列核型を示す。
【図４】  1996年4月22日に出願された米国特許出願第08／635，820号及び雑誌サイエンス（「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」F．Schroeck et a1. （1996） Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes， Science， 273， 494-497）に説明された、従来の技術による方法におけるRGBアルゴリズムを用いて分類した図３ａ−ｃの染色体をスプレッド及び核型として示す。
【図５】  RGBアルゴリズムのための加重関数Wb Wg Wrの例を示す。
【図６】染色体の分類のためにRGB画像を積分するステップを示す。この場合、Wb Wg Wrは単純平方加重関数である。
【図７】例示した実験的な手順を用いて得た五つの基本的な外部スペクトルを、発蛍光団及び基本染色体を特定して示す。
【図８】ピクセル数を表すプロットであり、各々、分解係数α−εとして値（0-1.0）を持つ。
【図９】正常な男性の染色体を示し、各々、同男性の染色体を、本発明の方法による分類で、RGBで、そして結合核型で示すものである。
【図１０】図４ａのスプレッドと同様に分析されたRGB染色体スプレッド、及び従来のRバンディング（DAPI）から得られる縞状パターンを示す。
【図１１】本発明に従って図１０ａ及び１０ｂを重ね合わせた二つの画像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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