(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌体外毒素である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンを含む試料と、当該黄色ブドウ球菌エンテロトキシンに対する抗体を固定化した磁気ビーズとを結合させる第１の工程、有毒物質と有毒物質に対する抗体が結合した磁気ビーズに２次抗体を結合させる第２の工程、および、第２の工程にさらに蛍光ラベル化した抗体を結合させる第３の工程、および、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンに対する抗体が結合した磁気ビーズ／黄色ブドウ球菌エンテロトキシン／２次抗体／蛍光ラベル化した抗体の複合体をフローサイトメトリーによって検出する第４の工程を含むことを特徴とする乳および／または乳製品の有毒物質定性および／または定量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品中の有毒物質の検出方法に関するもので、詳しくは、微生物等による汚染の被害を受けやすい乳等に含まれる有毒な微量成分を簡便かつ迅速に分析する方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
食品製造においては、食品の安全を確保することを第一に考えなくてはならない。しかしながら、食品は、原料または製造中に様々な有害物質に汚染される可能性がある。有害物質としては、農薬や内分泌かく乱物質等の化学物質や食中毒をおこす微生物等である。微生物による食中毒には、食品に付着して増えた細菌を、食品と一緒に食べることにより発病する感染型の細菌性食中毒と食品中で大量に増えた細菌が毒素を作り、この毒素を食品と一緒に食べることにより発病する毒素型の細菌性食中毒がある。前者では、サルモネラ属菌や腸炎ビブリオ菌があり、後者では黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）による食中毒の発生件数が多い。
【０００３】
黄色ブドウ球菌は、自然界に広く分布し、ヒトや動物の皮膚、粘膜、腸管等にも定着する微生物である。その一部にエンテロトキシン（腸管毒）を産生するものがある。エンテロトキシンは、分子量27,000〜34,000の単純たん白質で、抗原特異性により、一般に、A〜Eの5種類の毒素型に分類されるが、近年、F〜K型が追加された。このエンテロトキシンが高度の下痢や食中毒等の原因となりうるため、黄色ブドウ球菌の検出や感染検査法に、黄色ブドウ球菌が有するエンテロトキシン遺伝子に着目した検出法(特開平03-49700、特開平05-317098)や、エンテロトキシン抗体を用いた酵素免疫学的測定法(特開平06-88824)などがある。
【０００４】
黄色ブドウ球菌による食中毒が発生するためには、まず、食品が汚染され、汚染食品内でエンテロトキシンが産生する菌量までに増殖しなければならない（菌数が少ない時には、エンテロトキシンは産生しない）。たとえ食品が黄色ブドウ球菌に汚染されても、菌自体は、70℃1〜2分間程度の加熱処理でほぼ完全に死滅するため、食品中の黄色ブドウ球菌を増やさないよう留意し、食品に十分の加熱を施すことで食中毒を予防することが可能である。
【０００５】
これに対し、エンテロトキシンは、100℃、40分間の加熱でも失活せず、胃酸や生体のタンパク分解酵素でも破壊されないことなどから、いったんエンテロトキシンが産生されたら、黄色ブドウ球菌を死滅させても食中毒を予防することはできない。そこで、食品の製造工程管理や製品の品質管理には、食品に対する黄色ブドウ球菌の汚染・増殖防止と同時に、産生されうる毒素にも十分配慮する必要がある。
【０００６】
乳および乳製品等は、食品の中でも最も微生物の汚染を受けやすく、微生物の生育に好適な食品のひとつとして知られている。これらの食品から、エンテロトキシンを検出する方法として、厚生労働省から通知された方法（「乳等からのエンテロトキシン検査方法」平成14年2月14日、食監発第0214002号）がある。これはトリクロロ酢酸（TCA）により抽出・濃縮を行う方法である（以下TCA法）。TCA法は、検体中のエンテロトキシンを高感度に検出できる一方で、操作が複雑で回収率や精度にばらつきが生じやすいことなどから、多検体を効率的に処理するのが困難である。また、サンドイッチ法のELISAや逆受身ラテックス凝集反応を利用した定性・定量用の市販キット(VIDAS Staph Enterotoxin(bioMerieux社)：Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins)(MERCK社)；RIDASCREEN SET A、B、C、D、E(Biopharm社))も知られているが、食品中に微量含まれる低濃度のエンテロトキシンの検出は不可能であることから、食品の総合衛生管理製造工程に組込み可能といえる迅速かつ高感度な毒素検出法は未だなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、乳等の食品中に含まれる有毒な微量成分、特に黄色ブドウ球菌エンテロトキシンの簡易・迅速な抽出・濃縮法と、その高感度かつ高精度な定性、定量分析方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するのに各方面から検討した結果、本発明者らは、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンの抽出・濃縮に免疫磁気ビーズを採用し、検出にフローサイトメーターを用いることで、既述の問題点を解決し、簡便な操作法で、迅速かつ高感度に黄色ブドウ球菌エンテロトキシンを定性、定量することができることをはじめて見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）有毒物質に対する抗体を固定化した磁気ビーズを用いることを特徴とする食品中の有毒物質定性および／または定量分析方法、
（２）有毒物質を蛍光ラベル化することを特徴とする（１）の定性および／または定量分析方法、
（３）定性および／または定量がフローサイトメーターによって行われることを特徴とする（１）又は（２）の定性および／または定量分析方法、
（４）有毒物質が菌体外毒素である（１）〜（３）のいずれか１つの定性および／または定量分析方法、
（５）菌体外毒素が黄色ブドウ球菌エンテロトキシンである（４）の定性および／または定量分析方法、
（６）食品が乳および／または乳製品である（１）〜（５）の定性および／または定量分析方法、
からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
検体中の有毒物質を捕捉するには、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を固定化した磁気ビーズを使用する。本発明に有用な磁気ビーズは、例えばDynabeads M-280 Tosylactivated(粒径2.8μm ± 0.2μm，2×109 個/ ml，Dynal社，オスロ，ノルウェー)が市販されている。捕捉する有毒物質がエンテロトキシンの場合、ここで用いる抗体としては、エンテロトキシンを認識できるものであれば、いずれも使用することができ、具体的には、羊抗エンテロトキシン抗体(1mg/ml PBS, Toxin Technology, Inc., Sarasota, FL, USA）、ウサギ抗エンテロトキシン抗体(1mg/ml PBS, Toxin Technology, Inc., Sarasota, FL, USA)なども使用が可能である
【００１１】
上記磁気ビーズに抗エンテロトキシン抗体を公知の方法により固定化し、次いで、検体と混合する。尚、検体が固体等の場合は、水や緩衝液に検体を混合し、ホモジナイズしたものを検体とすればよい。検体中に標的のエンテロトキシンが存在していれば、エンテロトキシンは磁気ビーズに捕捉される。すなわち、磁気ビーズに抗体が固定化されているため、食品中に含まれるエンテロトキシンが低濃度に微量しか含まれない場合でも、混合容器中で検体と磁気ビーズを攪拌することにより確実に抗体によって捕捉される。攪拌を停止した後、混合容器の外側に磁石を近づけることにより磁気ビーズを容器の壁面に集めることができる。その後、検体を吸引等により廃棄することにより磁気ビーズのみを回収することができる。従って、遠心分離により磁気ビーズを集めることは必ずしも必要ではなく、大容量の検体から、磁気ビーズを容易に回収することができる。回収した磁気ビーズは、洗浄し、次いで、蛍光色素で標識する。蛍光色素には、Cy3、Cy5等、フローサイトメーターでの定性・定量分析が可能な物質があげられる。蛍光標識の方法は、最終的にエンテロトキシンを蛍光ラベル化できれば、特に限定されないが、本発明においては、エンテロトキシンに特異的に結合する蛍光標識化した抗体を用いることが好ましい。このようにして標識されたエンテロトキシンは、フローサイトメーターで定性・定量分析される。
【００１２】
本発明は、最終的な定性・定量分析をフローサイトメーターで行うことから、複数の項目の試験にも可能である。具体的には、磁気ビーズ上の抗体を適宜変えることで、菌体外毒素に限らず、食品中の内分泌かく乱物質（いわゆる環境ホルモン）、残留農薬に加え、アレルギー物質のモニタリング、その他加工設備の洗浄度評価などにも使用することができる。
【００１３】
本発明の検体には、特に食品が好ましい。中でも乳、乳製品に最も適しているが、これらに限らず、あらゆる飲食品の適用が可能である。ここでいう乳、乳製品とは、乳等省令で示される乳および乳製品は勿論、これらを主原料とする食品を含めたものである。また、検体が固体の場合には、公知の細菌検査法に従って、検体を水等で適宜ホモジナイズし、定性・定量分析し易い形態に予め調整しておくことが望ましい。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
[実施例１]磁気ビーズへの抗体の固定化
磁気ビーズへの抗体固定化には、Dynabeads M-280 Tosylactivated(粒径2.8μm ± 0.2μm、2×109個／ml、Dynal社、オスロ、ノルウェー)0.5ml(1×109beads/ml)を用いた。抗体固定化は、磁気ビーズに添付の方法に沿って行った。即ち、0.1M Na-phosphate buffer(pH7.4)で2回洗浄し、0.1M Na-phosphate buffer(pH7.4)0.7mlに懸濁し、羊抗エンテロトキシンＢ抗体(1mg／ml、PBS、Toxin  Technology)0.3mlを添加、１夜室温でゆっくり振とうした。磁石により上清を除去し(タンパク量測定：85μg／ml)、0.1％BSA含有PBS(pH7.4)1mlで2回洗浄した。次いで0.1％BSA含有0.2M Tris-HCl（pH8.5）1mlに懸濁して20℃、20時間放置してブロッキングし、0.1％BSA含有PBS（pH7.4）1mlで1回洗浄した。これを0.1％BSA含有PBS(pH7.4)1mlに懸濁し、抗体固定化磁気ビーズを得た(≒5×108beads/ml)。
【００１６】
[実施例２]抗体固定化磁気ビーズを用いた毒素の検出
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ水溶液(100μg/ml, Toxin Technology, Inc., Sarasota, FL, USA)を0.05％Tween20含有PBSで希釈し、エンテロトキシン濃度0、0.01、0.1、1.0、10ng/mlの溶液各10mlを調製した。これに10μlの抗体固定化磁気ビーズ(5×108個/ml)を混合し、37℃でゆっくり1時間振とうして反応させた。磁気ビーズを磁石で集め、0.05％Tween20含有PBS1mlで2回洗浄した。洗浄後のビーズに200μlのウサギ抗エンテロトキシンＢ抗体(1mg/ml PBS, Toxin Technology, Inc., Sarasota, FL, USA)を添加して37℃でゆっくり1時間振とうして反応させた。この後、磁気ビーズを0.05％Tween20含有PBS1mlで2回洗浄し、洗浄後のビーズを200μlのCy5標識ヤギ抗ウサギIgG抗体溶液（1mg/ml, Chemicon International, Temecula, CA, USA）に懸濁して37℃で1時間反応させた。この溶液を混合し、50μlを950μlのPBS(孔径0.2μmのメンブランフィルターでろ過したもの)と混合してフローサイトメーター(optoflow社製Microcyte(オスロ，ノルウェー))による粒子数の測定を行った。
【００１７】
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBのPBS溶液10mlから抗エンテロトキシンB抗体磁気ビーズを用いて同毒素を回収し、蛍光色素で標識して、フローサイトメーターで検出した結果を図１に示す。ビーズのみをフローサイトメーターで測定した結果、ビーズのピークは、夾雑微粒子とは明らかに区別される位置に検出された。毒素未添加の場合にも、非特異的な蛍光標識2次抗体の結合による蛍光が13％の磁気ビーズから検出されたが、蛍光強度は非常に弱いものであった。エンテロトキシンB濃度0.01ng/mlでは、未添加に比べて若干、蛍光性磁気ビーズ数は39％まで増加した。0.1ng/mlでは61％の磁気ビーズが蛍光性となり、その蛍光強度も明らかに強いものが含まれていた。1ng/mlでは、100％の磁気ビーズが蛍光性となり、すべての磁気ビーズが強い蛍光を発していた。即ち、本法を用いることにより0.01ng/mlの濃度でもエンテロトキシンを検出することは可能であった（図２）。一般的に黄色ブドウ球菌エンテロトキシンは乳製品中に1.0ng/ml含まれていれば、ヒトは嘔吐などの症状を示すとされている。そこで、本法の検出限界は、食品汚染をモニタリングするのに十分な感度といえる。
【００１８】
[実施例３]生乳からのエンテロトキシンBの検出
生乳からの毒素の検出には、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢを所定の濃度添加・混合したもの各10mlを試料として用いた。これを、沸騰水中で2分間加熱後、急冷したものに抗体固定化磁気ビーズを上記と同様に添加し、検出を行った。この結果を図３に示す。本法を用いることにより0.01ng/mlの濃度でもエンテロトキシンを検出することは可能であり、食品中のエンテロトキシンBを定量することが可能であることが確認された（図４）。
【００１９】
【発明の効果】
以上、本発明により、食品中の有毒物質の定性・定量分析を、従来の複雑な操作を必要とせず、高感度に迅速かつ簡便に行うことができる。また、検体数にかかわらず短時間でその評価が可能なため、食品の総合衛生管理製造過程における危害分析の評価等のために、食品製造の現場にも導入することが可能である。
【００２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】  免疫磁気ビーズおよびフローサイトメーター法によるPBS中における黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBを示すグラフである。
【図２】  PBS中黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB濃度と総粒子中の蛍光粒子数の割合との関係を示すグラフである。
【図３】  免疫磁気ビーズおよびフローサイトメーター法による生乳からの黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBを示すグラフである。
【図４】  生乳中黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB濃度と総粒子中の蛍光粒子数の割合との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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