(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のピストンポンプおよび使い捨てチップを自動脱着可能な複数のノズルを装備した核酸・蛋白質精製装置において、複数区画に分画された容器に入れられた試料と試薬の複数の混合液を同時にチップ内に吸引・吐出することにより該混合液を混合するための機構と、該混合を実施しながら次に使用する試薬を複数区画に分画された別の容器に必要量もしくは必要数を分注するための機構を備えたことを特徴とする核酸・蛋白質精製装置。
【請求項２】
９６個のピストンポンプおよび９６本の使い捨てチップを自動脱着可能な９６本のノズルを装備した核酸・蛋白質精製装置において、９６の倍数に分画された容器に入れられた試料と試薬の複数の混合液を同時にチップ内に吸引・吐出することにより該混合液を混合するための機構と、該混合を実施しながら次に使用する試薬を９６の倍数に分画された別の容器に必要量もしくは必要数を分注する機構とを備えたことを特徴とする請求項１に記載の核酸・蛋白質精製装置。
【請求項３】
磁力を利用して吸引可能な粒子を使用した核酸・蛋白質の精製において、９６個の円筒形状の磁石を使用し、９６の倍数に分画された容器内の磁力を利用して吸引可能な粒子の懸濁液から上澄みを除去するための機構と、該磁石を介して該容器を加温もしく冷却可能な機構とを備えたことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸・蛋白質精製装置。
【請求項４】
複数のピストンポンプの駆動機構と、該駆動機構を上下に駆動するため機構とを備え、かつ該駆動機構の駆動方向に磁石、加温装置および冷却装置を備えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置。
【請求項５】
複数のピストンポンプの駆動機構と、該駆動機構を上下に駆動するための機構と、該ピストンポンプの真下にピストンポンプとほぼ同じレイアウトとなるように複数の磁石を配置させたプレートを備えてなり、該プレートの下部には加温および冷却可能な機構を備え、かつ該ピストンポンプと該プレートの間に試料の入った容器を搬送する機構を備えたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置を用いた核酸もしくは蛋白質の精製方法であって、複数のピストンポンプおよび使い捨てチップを自動脱着可能な複数のノズルを用いてチップ内に試薬を吸引そして吐出する際に、複数に分画された各区画内の底の垂直断面は傾斜し、底のほぼ中央にはチップ先端外径より小さい穴を設けた容器内に吐出することを特徴とする核酸もしくは蛋白質の精製方法。
【請求項７】
磁力を利用して吸引可能な粒子を使用する請求項６記載の核酸もしくは蛋白質の精製方法。
【請求項８】
磁力を利用して吸引可能な粒子と液体の懸濁液の混合する際に、該懸濁液を入れた容器を減圧することにより該懸濁液を混合し、かつ該容器内に大気圧以上の圧力をかけた状態で一定量の該溶液を吐出する請求項７記載の核酸もしくは蛋白質の精製方法。
【請求項９】
エアーポンプと電磁弁により、磁力を利用して吸引可能な粒子と液体の懸濁液の混合する際に、該懸濁液を入れた容器を減圧することにより該懸濁液を混合し、かつ該容器内に大気圧以上の圧力をかけた状態で一定量の該溶液を吐出する方法を実施できる機構を備えてなる請求項１〜５のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置を用いた核酸もしくは蛋白質の精製方法であって、複数のローラー式チューブポンプを用い、各ローラー式チューブポンプに内径が異なるチューブを取り付け、それぞれ試薬吸引口と試薬吐出口を共通にした状態で試薬の送液および分注を行うことを特徴とする核酸もしくは蛋白質の精製方法。
【請求項１１】
ローラーの正転および逆転を交互に繰り返しながら分注する請求項１０記載の核酸もしくは蛋白質の精製方法。
【請求項１２】
複数のローラー式チューブポンプを用い、各ローラー式チューブポンプに内径が異なるチューブを取り付け、それぞれ試薬吸引口と試薬吐出口を共通にした状態で試薬の送液および分注を行う方法またはローラーの正転および逆転を交互に繰り返しながら分注する方法を実施できる機構を備えてなる請求項１〜５のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置を用いた核酸の精製方法であって、磁力を利用して吸引可能な粒子を使用した核酸の精製において、
１）磁力を利用して吸引可能な粒子を細胞の培養液もしくは懸濁液に加え、第一の適当な条件下で、細胞を該粒子に吸着させ、磁力をかけて該粒子に吸着した細胞と上澄みとに分離し、上澄みを除去して、該粒子に吸着した細胞を集め、
２）細胞を該粒子から解離させ細胞を溶解する試薬を加え、
３）第二の適当な条件下で、目的とする核酸以外の夾雑物質を該粒子に吸着させ、磁力をかけて該粒子に吸着した核酸以外の夾雑物質と目的とする核酸を含む上澄みとに分離し、該上澄みを別の容器に移送し、
４）該上澄みに、磁力を利用して吸引可能な新たな粒子を加えて、さらに磁力によって分離する
ことを特徴とする上記精製方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法を実施可能なソフトウェアを組み込んでなる請求項１〜５のいずれかに記載の核酸・蛋白質精製装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルスやバクテリア等の微生物あるいは動植物組織などの生体試料から、ＤＮＡ・ＲＮＡなどの核酸もしくは酵素・抗体などの蛋白質を単離、精製するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸や蛋白質など生体成分の精製において、目的物質以外の夾雑物質を不溶化させたり、あるいは目的物質と他の夾雑物質との分子量の違いを利用して、目的とする物質のみを単離する方法は、当該技術分野においては一般的に行われている方法の一つである。実際には遠心分離やフィルター濾過、ゲルクロマトグラフィー等により目的物質とそれ以外の夾雑物質の分離が行われることになる。
これらの作業を自動化した装置が市販されているが、多サンプル処理および高速処理を十分に実施できるまでには至っていない。その原因の一つとして遠心分離機やフィルターの着脱機構など装備しなければならず、したがって装置の大型化、精製工数の増加する点が挙げられる。
【０００３】
上記のような問題点を解決するために、磁気的に吸引可能な粒子を用いて、核酸と夾雑物質を分離する方法が考案されている。この方法・試薬組成等については特許第２６８０４６２号公報に詳しく記載されており、遠心分離やフィルターを使用することなく、単一容器内での核酸の精製が可能になっている。すでに上記特許の原理を利用した核酸・蛋白質精製キットが市販されている（MagExtractor；東洋紡績製など）。
【０００４】
磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸や蛋白質など生体成分の精製は、一般に次の工程を複数回繰り返すことによって行われる。
（ａ）目的物質と夾雑物質が含まれる溶液を特定の容器に入れ、必要な試薬と磁気的に吸引可能な粒子を入れよく混合（撹拌）する。この時、目的物質のみが磁気的に吸引可能な粒子に特異的に結合する技術が確立されている。
（ｂ）該容器（外側）に磁石を近づけ、磁気的に吸引可能な粒子を容器内側の一部に集め、その上澄みと分離する（固・液分離）。精製途中ではこの上澄みは廃棄し、目的物質のみが磁気的に吸引可能な粒子に結合した状態で容器内に残る。
一般にはさらに別の試薬を加え、混合後、再度固・液分離を行い上澄みを廃棄する工程を数回繰り返す。
（ｃ）目的物質のみが磁気的に吸引可能な粒子から解離する試薬を加え、再度該容器に磁石を近づけ、磁気的に吸引可能な粒子を容器内側の一部に集め、その上澄みのみを別容器に回収することで目的物質の精製が可能になっている。
【０００５】
前記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を自動的に実施可能な核酸・蛋白質精製装置（ＭＦＸ−２０００；東洋紡績製など）も市販されている。この装置はピストンポンプと、その先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えている。一般的なピストンポンプとはシリンダー内をピストンが往復して送水する型のポンプであるが、当分野でも、ほぼ同じ原理を利用して、微量の試薬を分注（小分け）したり、液の出入れによって混合（撹拌）する。実際にはピストンポンプの先端に使い捨てチップを取り付けて行うため、試薬はチップ内でのみ吸引・吐出される（図１参照）。このような器具は「ピペットマン」と慣習的に呼ばれている。また、ピペットマンを用いたチップ内でのみ吸引・吐出の繰り返しによる混合または撹拌もピペッティングと慣習的に呼ばれている。ピペッティングとはピストン運動であるから、それを機械化すること容易であり、核酸・蛋白質精製装置への利用も容易である。
【０００６】
上記（ａ）での混合（撹拌）はピペッティングにより実施される。チップは使い捨て、かつ着脱可能であるため、試料間の汚染を防ぐのに都合が良い。上記（ｂ）、（ｃ）は液体を吐出させた状態でピストンポンプを停止させ容器外側に磁石を近づけることで、固・液分離が起こり、この状態で上澄みのみを吸引することで実施される。このように磁気的に吸引可能な粒子を用いて、核酸や蛋白質など生体成分を精製する方法において、ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構を利用することは非常に有効である。
【０００７】
一方、当該技術分野において多サンプル処理および高速処理に適した容器として、横１２個、縦８個の計９６個の穴を１個のプラスチック容器に設けた９６穴プレートがよく利用されている。穴の容量としては数μｌから数ｍｌのものが市販されている。９６穴プレートの利点は９６サンプルを片手で持ち運べる容器で同時にハンドリングできる点にある。当該技術分野においては、この容器のフォーマット（主に穴同士の縦横の間隔）に従ったサンプリング、抽出・精製、分析装置でなければ、事実上多サンプル処理および高速処理は不可能になっている。
一般的に分析用には穴の容量が数百μｌのものが用いられるが、抽出、精製用には回収量を上げるため、可能な限り穴の容量の大きなものが理想的である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製を、可能な限り穴の容量の大きい９６穴プレートで実施することできれば多サンプル処理および高速処理が可能になることは容易に予想される。また、その自動化についてもピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構を利用する方法が適当であると考えられるが、その実施にあたっては下記のような問題がある。
【０００９】
▲１▼分注方法
ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構により、磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製に必要な混合（撹拌）が簡単に行うことが可能なことは上述した通りである。従来の装置では、精製に必要な試薬の分注作業もピストンポンプと、その先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構で行われている。この方法はいわゆるチップ式分注と呼ばれており、非常に高精度な分注が可能なことが特徴として挙げあれる。一般的に、磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製に必要には、数十μｌから数百μｌの試薬分注を精度良く実施する必要があり、チップ式分注が適当とされている。
【００１０】
磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製に必要な試薬を、チップ式により分注するには、精製に必要な複数の試薬をそれぞれ別々の容器に入れておき、ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構が、精製に使用している９６穴プレートと試薬容器の間を必要回数往復しながら分注を行う（試薬容器で吸引、移動、９６穴プレートで吐出、・・・という作業の繰り返し）。あるいはピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構は固定されており、精製に使用している９６穴プレートと試薬容器が、該機構を中心に移動する機構も考えられる。いずれの場合も精製に使用している９６穴プレートと試薬容器の往復時間が無駄であり、その往復するスペース（空間）も処理量に応じて大きくなるため好ましくない。さらにチップ内に吸引された試薬が移動中に滴下し、サンプルを汚染するなど致命的な問題点も抱えている。また、分注と混合（撹拌）を同時に行うことができないため高速処理も不可能になっている。
【００１１】
▲２▼廃棄物
ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構を用いて、精製に必要な試薬の分注を実施すると試薬ごとにチップを交換・廃棄しなければならず、無駄な廃棄物の量が増えるので好ましくない。特に高速分注のために多連ノズルを装備しているケースも多いが、ノズルの数に比例してチップの使用量も増えるため好ましくない。
【００１２】
▲３▼固・液分離
磁気的に吸引可能な粒子の磁石による吸引を９６穴プレートで実施する場合の磁石の形態については、特許第２７０１８９１号公報に記載されているが、数ｍｌ（２．２ｍｌ）の穴の容積を持つ９６穴プレートでは、特許第２７０１８９１号公報に記載されている方法のように磁石を近づけるスペースはないので、このプレートでの効率良い固・液分離は実施不可能である。
さらに、磁力を利用して吸引可能な粒子を使用した核酸・蛋白質の精製では、固・液分離を行う前後、または途中で加温または冷却する必要があるが、従来の装置では一旦、プレートを加温、冷却機構部まで移動させるか、加温、冷却可能な別のプレートまで試料を移送する必要があり、装置も大型化し、試料のロスもあるため効率良い精製が不可能であった。
【００１３】
▲４▼磁気的に吸引可能な粒子を含む液体の混合（撹拌）、分注方法
通常、磁気的に吸引可能な粒子は酸化鉄などを含むため、該粒子を含む液体の中では非常に沈降しやすい性質を有する。この液体の比重を大きくすることで、沈降スピードを低下させたり、沈降後、再懸濁しやすくする方法が特開平１０−３１６６９６号公報に記載されている。この方法を用いることで、ピストンポンプと、その先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構を用いて、ある程度沈降した磁気的に吸引可能な粒子を含む液体を再懸濁（混合（撹拌））することが可能になっているが、数日間放置したような場合には、再懸濁が不可能な磁気的に吸引可能な粒子もあり、使用前に手動で再懸濁しておく必要がある。このような磁気的に吸引可能粒子では、特に断続運転の場合、ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構を用いた再懸濁の自動化は困難である。
【００１４】
▲５▼完全自動化
微生物や培養細胞などから９６穴プレートを用いて核酸・蛋白質の精製を行う場合には、予め微生物や培養細胞が浮遊する培養液を９６穴プレート用の専用の遠心分離機を用いて、遠心分離を行うか、フィルターを用いて上澄みを除去し、細胞のみのペレットの状態にしてから精製工程に移行する必要がある。そのためサンプリングから精製までの自動化は、ピストンポンプ及び使い捨てチップを自動脱着可能なノズル機構だけでの自動化は困難である。すなわち、遠心分離機、フィルター分離を行うための真空ポンプなどが必要となる。
【００１５】
▲６▼コンタミネーション防止
チップ内に液を吸引し、その液を吐出する方法で全量吸引するためには、実際に吸引する液量に加えて、若干の空気も吸わなければ、全量吸引は実現困難である（余剰吸引の必要性）。さらにそれを全量吐出する場合は、吸引した液量と若干の空気量に加えて、さらに若干の空気も吐出しなければ完全な全量吐出は困難である。吸引・吐出しようとする液体に界面活性剤のような泡立ちの原因となるような物質が含まれる場合に、これらを実施すると、余分に吸った空気や、余分に吐き出す空気のため、必ずチップ先端に泡が発生する。９６穴プレートのレイアウトに合うように複数のピストンポンプ及び使い捨てチップを脱着可能な複数のノズルを装備した場合は、縦横のチップ間隔は非常に狭いものとなり、この泡が隣のチップの泡と接触する可能性が非常に高いため、チップ間でコンタミネーションが起こり、正確な実験、分析を行うことができないという問題点がある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究した結果、複数区画に分画された容器に入れられた試料と試薬の複数の混合液を同時にチップ内に吸引・吐出することにより該混合液を混合するための機構と、該混合を実施しながら次に使用する試薬を複数区画に分画された別の容器に必要量もしくは必要数を分注するための機構を備えることにより解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）複数のピストンポンプおよび使い捨てチップを自動脱着可能な複数のノズルを装備した核酸・蛋白質精製装置において、複数区画に分画された容器に入れられた試料と試薬の複数の混合液を同時にチップ内に吸引・吐出することにより該混合液を混合するための機構と、該混合を実施しながら次に使用する試薬を複数区画に分画された別の容器に必要量もしくは必要数を分注するための機構を備えたことを特徴とする核酸・蛋白質精製装置。
（２）９６個のピストンポンプおよび９６本の使い捨てチップを自動脱着可能な９６本のノズルを装備した核酸・蛋白質精製装置において、９６の倍数に分画された容器に入れられた試料と試薬の複数の混合液を同時にチップ内に吸引・吐出することにより該混合液を混合するための機構と、該混合を実施しながら次に使用する試薬を９６の倍数に分画された別の容器に必要量もしくは必要数を分注する機構とを備えたことを特徴とする核酸・蛋白質精製装置。
（３）磁力を利用して吸引可能な粒子を使用した核酸・蛋白質の精製において、９６個の円筒形状の磁石を使用し、９６の倍数に分画された容器内の磁力を利用して吸引可能な粒子の懸濁液から上澄みを除去するための機構と、該磁石を介して該容器を加温もしく冷却可能な機構とを備えたことを特徴とする核酸・蛋白質精製装置。
（４）複数のピストンポンプの駆動機構と、該駆動機構を上下に駆動するため機構とを備え、かつ該駆動機構の駆動方向に磁石、加温装置および冷却装置を備えたことを特徴とする核酸・蛋白質精製装置。
（５）複数のピストンポンプの駆動機構と、該駆動機構を上下に駆動するための機構と、該ピストンポンプの真下にピストンポンプとほぼ同じレイアウトとなるように複数の磁石を配置させたプレートを備えてなり、該プレートの下部には加温および冷却可能な機構を備え、かつ該ピストンポンプと該プレートの間に試料の入った容器を搬送する機構を備えたことを特徴とする核酸・蛋白質精製装置。
（６）（１）〜（５）のいずれかの核酸・蛋白質精製装置を用いた核酸もしくは蛋白質の精製方法であって、複数のピストンポンプおよび使い捨てチップを自動脱着可能な複数のノズルを用いてチップ内に試薬を吸引そして吐出する際に、複数に分画された各区画内の底の垂直断面は傾斜し、底のほぼ中央にはチップ先端外径より小さい穴を設けた容器内に吐出することを特徴とする核酸もしくは蛋白質の精製方法。
（７）磁力を利用して吸引可能な粒子を使用する（６）の核酸もしくは蛋白質の精製方法。
（８）磁力を利用して吸引可能な粒子と液体の懸濁液の混合する際に、該懸濁液を入れた容器を減圧することにより該懸濁液を混合し、かつ該容器内に大気圧以上の圧力をかけた状態で一定量の該溶液を吐出する（７）の核酸もしくは蛋白質の精製方法。
（９）エアーポンプと電磁弁により（８）の方法を実施できる機構を備えてなる（１）〜（５）のいずれかの核酸・蛋白質精製装置。
（１０）（１）〜（５）のいずれかの核酸・蛋白質精製装置を用いた核酸もしくは蛋白質の精製方法であって、複数のローラー式チューブポンプを用い、各ローラー式チューブポンプに内径が異なるチューブを取り付け、それぞれ試薬吸引口と試薬吐出口を共通にした状態で試薬の送液および分注を行うことを特徴とする核酸もしくは蛋白質の精製方法。
（１１）ローラーの正転および逆転を交互に繰り返しながら分注する（１０）の核酸もしくは蛋白質の方法。
（１２）（１０）または（１１）の方法を実施できる機構を備えてなる（１）〜（５）のいずれかの核酸・蛋白質精製装置。
（１３）磁力を利用して吸引可能な粒子を使用した核酸の精製において、磁力を利用して吸引可能な粒子を細胞の培養液もしくは懸濁液に加え細胞を集めた後、細胞を溶解する試薬を加え、目的とする核酸以外の夾雑物質を該粒子に吸着させて取り除いた後、新たに磁力を利用して吸引可能な粒子を加えることを特徴とする核酸を精製する方法。
（１４）（１３）の方法を実施可能なソフトウェアを組み込んでなる（１）〜（５
のいずれかの核酸・蛋白質精製装置。
【００１８】
【発明の実施の形態】
（１）精製速度の改善
本発明においては、多サンプル処理および高速処理が可能な核酸・蛋白質精製装置を実現するにあたって、その一例として、図２のような機構、レイアウトを考案した。
磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製を、ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構を利用する場合、チップ内での液体の吸引と吐出の繰り返しによる混合（撹拌）が必須であるが、通常のこの混合（撹拌）時間は数分間である。第１の試薬による混合が終了すると、磁気的に吸引可能な粒子を磁石で集め、上澄みを廃棄し、第２の試薬を必要量・必要数だけ分注する。この分注時間も数分間である。
【００１９】
本発明では第１の試薬混合中に、分画された別の容器に第２に使用する試薬を必要量もしくは必要数を分注する機構を使用し、並列して分注しておくことで、混合と上澄み液廃棄が終了次第、直ちに別の容器から混合する容器に、ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構を利用して移送することができるようになる。これによって、数分間の分注時間を数秒程度で完了することができるようになり、磁気的に吸引可能な粒子を用いて多サンプルの核酸・蛋白質の精製を高速に行うことができる。
【００２０】
具体的には試料の入った９６穴プレートを図２の１３の位置に、別の９６穴プレートを１２の位置にセットする。図２の２３は水平移動が可能なステージであり、抽出用９６穴プレート１２及び１３はいずれも、ピストンポンプとその先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた混合（撹拌）機構であるピストンポンプ・ノズル１７の真下に位置することが可能である。ピストンポンプ・ノズル１７は駆動機構１８を利用してステージ２３の位置まで下降することができる。試薬の分注機構１９を備えることにより、ピストンポンプ・ノズル１７で１３の位置の９６穴プレートを混合（撹拌）中でも、分注機構１９で１２の位置に使用する試薬を分注しておくことができる。１３の位置での混合（撹拌）・上澄みを廃棄した後、ピストンポンプ・ノズル１７は一旦上昇し、抽出用９６穴プレート１２がピストンポンプ・ノズル１７の真下に移動する。ピストンポンプ・ノズル１７は下降し、予め分注された試薬をチップ内に吸引後、再上昇し、再度、抽出用９６穴プレート１３がピストンポンプ・ノズル１７の真下に移動する。ピストンポンプ・ノズル１７下降後、直ちに、抽出用９６穴プレート１３で次の試薬を用いた混合（撹拌）を開始することができる。このような並列処理によって、磁気的に吸引可能な粒子を用いて多サンプルの核酸・蛋白質の精製を高速に行うことができる。
【００２１】
（２）廃棄物の低減と分注精度の両立
分注機構１９は、混合（撹拌）するためのピストンポンプと、その先端に使い捨てチップを着脱可能なノズルを備えた機構（いわゆるチップ式分注）と同様のものであってもコンタミネーション防止の目的は達成できる。チップ式分注は分注精度の確保の面では都合が良いとされるが、上述したように、この方式では無駄な空間が発生するために装置が大型化するのと、チップの廃棄物が多く発生する点で好ましくない。
【００２２】
本発明においては、試薬容器（試薬ラック２２にセットすることができる）からチューブを伸ばし、チューブの途中に特殊な送液機構を設けチューブ先端から一定量の試薬を吐出することにより、チップを使用しない分注方法を改善することに成功した。一般に、チューブを使用した分注方法はペリスタリックポンプまたはローラー式チューブポンプを用いて実施される。磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製に必要な数μｌから数１０μｌの分注を精度良く行うために、流量のバラツキを最小限に抑えるためチューブを非常に細くする必要がある。しかしながら、これでは数１００μｌを分注する場合には、極端に分注速度が低下するため好ましくない。
【００２３】
本発明においては、複数のペリスタリックポンプまたはローラー式チューブポンプを用いて、それぞれ内径の異なるチューブを取り付け、各ポンプの試薬入口と出口を共通にする機構を見出した。図３にその具体例を示す。３１、３２はポンプを駆動させるローラー式チューブポンプであり、チューブをしごくためのローラーを回転させることができる。ローラーには、それぞれ内径の異なるチューブを取り付けてある。それぞれのチューブはコネクタ３４で１本になる。１００μｌ以下の液を分注する場合には、電磁弁３３を閉じ、ポンプ１での分注することで目標とする精度と速度を確保することができる。１００μｌ以上の場合は、電磁弁３３を開き、ローラー式チューブポンプ３１及び３２の両方により分注することでことで、目標とする精度と速度を確保できる。さらにポンプの駆動源であるモーターの回転を、正転から一定時間逆転させることにより、分注精度を確保しているのも本発明の解決方法の一つである。
【００２４】
（３）固・液分離
磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製を実施するには、実施する容器の外側に、磁石を近づけるスペースが必要である。容量の小さい９６穴プレートの場合は、図４（ａ）のようにそのスペースを十分に確保できる（奥まで差し込める）ので、該粒子の容器の底に集まることはない。従って上澄みを容器底から完全に吸引することができる。図４（ｂ）のように容量の大きい９６穴プレートの場合は、磁石を近づけるスペースが小さいため（奥まで差し込めない）、該粒子の一部は容器の底に残り、上澄みを容器底から完全に吸引しようとすると該粒子も吸引して廃棄してしまうので、精製収率が低下する。
【００２５】
本発明においては、図４（ｃ）に示すように９６穴プレートの各穴の真下に円筒状の磁石４３を９６個並べることにより、９６穴の各底の中心付近に粒子を残さないようにし、完全な上澄みの除去が可能になった。この方法は９６穴プレートの穴の容量に関係なく使用することができる。
さらに該円筒状磁石４３の下部に加温および冷却可能な機構を備えることで、磁石を介して、固、液分離の前後、または実施中にもプレート内の試料、試薬を加温・冷却することが可能になった。これにより装置の小型化が可能になり、さらに集められた粒子に効率良く熱が伝えられるため、時間短縮が可能であり、処理速度も向上する。
【００２６】
（４）磁気的に吸引可能な粒子を含む液体の混合（撹拌）、分注方法
具体例を図５に示す。上端に配管チューブを取付けることができ、下端には自由に開閉できる電磁弁５４を備えた容器５３に、磁気的に吸引可能な粒子を含む液体を入れ、下端は図２における分注機構１９に、上端は電磁弁５２を備えたエアーポンプ５１に接続する。電磁弁５４を開き、容器が負圧になるよう電磁弁５２を制御（容器内の空気を取り入れ、外部に排気する）し、エアーポンプ５１を動かすと、図２における分注機構１９の先端から取り込まれた空気が、容器５３の下端から吹出すため、沈降した磁気的に吸引可能な粒子のエアーによる混合（撹拌）（再懸濁）が可能になる。混合（撹拌）後、直ちに電磁弁５４を閉じ容器５３内が加圧されるよう電磁弁５２を制御し（外気を取り入れ、容器内に排気する）、エアーポンプ５１を動かすことによって、容器内は大気圧以上になり、この圧を一定にした状態で、電磁弁５４を一定時間開閉することにより、再懸濁された磁気的に吸引可能な粒子が一定量送液され、高精度な分注が可能になる。なお分注完了後、若干時間、再懸濁させることによって、分注ラインに磁気的に吸引可能な粒子が沈降するのを防ぎ、ラインの目詰まりを同時に防止することも可能になる。
【００２７】
（５）完全自動化
本発明においては、磁気的に吸引可能な粒子を２段階に分けて使用することにより、培養液の濃縮から夾雑物質のおおまかな除去を、第１の磁気的に吸引可能な粒子を用いて行い、第２の磁気的に吸引可能な粒子を用いて、目的物質のより高度な精製を行うことが可能になった。微生物や培養細胞などの培養液に磁気的に吸引可能な粒子を加え、ｐＨ、電気伝導度などを適当な条件にすることにより、第１の磁気的に吸引可能な粒子に細胞を吸着させることができる。この状態で上澄みを除去し、細胞を溶解する試薬を加える。さらに目的物質以外の夾雑物質と磁気的に吸引可能な粒子が吸着するような条件に変更し、上澄みを別の容器に移送する。この上澄みに第２の磁気的に吸引可能な粒子を再度加え精製することで、遠心分離などを行うことなく、全自動で磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製が可能になる。
【００２８】
（６）コンタミネーション防止
図６に、コンタミネーション防止のための機構の具体的な例を示す。複数のピストンポンプ、及び使い捨てチップを脱着可能な複数のノズルを装備した場合は、縦横のチップ間隔は非常に狭いものとなり、チップ内の液を吐き出す際に、発生する泡が隣のチップ６１の気泡と接触してしまう。本発明においてはチップ毎に区画化された容器内で吐き出すようにした。さらに区画化された容器の底の垂直断面は傾斜しており、そこの中心にはチップ先端外径よりも細い穴６４をあけている。吐き出す場合は、チップ先端を限りなく穴に近づけることで、非常に小さい泡であっても、この容器底とチップ先端を接触させることなく泡を消すことができる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を挙げることにより、本発明を具体的に説明する。
【００３０】
実施例１  多サンプル・高速処理
市販の９６穴ディープウェルプレート（コースタ社製）を用いて、同時に９６人のヒト血液を試料としてゲノムＤＮＡの精製を行った。この９６穴ディープウェルプレートの穴の容積が約２．２ｍｌである。精製に必要な試薬として、MagExtractor -Genome-（東洋紡績製）を用いた。ヒト血液を９６穴ディープウェルプレートに各０．１ｍｌずつ分注し、図２に示すような、本発明の装置１３の位置にセットした。試薬は試薬ラック２２にセットした。チップラック１４がピストンポンプ・ノズル１７の真下に来るようにステージ２３が移動し、駆動機構１８が下降することにより、ピストンポンプ・ノズル１７のノズルに９６本の使い捨てチップが装着される。ピストンポンプ・ノズル１７は上昇し、抽出用９６穴プレート１３が分注機構１９のほぼ真下に来るようステージ２３が移動する。試薬ラック２２から分注機構１９へ第１の試薬（溶解・吸着液）が送液され、分注機構１９にある分注ヘッドを、９６穴ディープウェルプレートの各穴上を移動させることにより、第１の試薬を９６穴ディープウェルプレートの各穴に必要量もしくは必要数分注させることができる。この第１の試薬の分注時間は３．５分である。
【００３１】
抽出用９６穴プレート１３がピストンポンプ・ノズル１７のほぼ真下に来るようステージ２３が移動後、ピストンポンプ・ノズル１７は下降し、ピストンポンプと連動して試薬と血液の混合（撹拌）が行われる。この混合（撹拌）は４分間行われる。この時、１２は分注機構１９の真下にあり、ピストンポンプ・ノズル１７による混合（撹拌）中に、第２の試薬（洗浄液）を分注することができる。第２の試薬の分注時間は３．５分であり、第１試薬による混合（撹拌）終了時には第２の試薬の分注は完了している。
【００３２】
駆動機構１８上昇後、抽出用９６穴プレート１２がピストンポンプ・ノズル１７のほぼ真下に来るようステージ２３が移動する。駆動機構１８下降後、予め分注された第２の試薬を吸引後、再上昇する。１３がピストンポンプ・ノズル１７のほぼ真下に来るようステージ２３が移動する。ピストンポンプ・ノズル１７下降後、第２の試薬による混合（撹拌）を即時実施することができる。MagExtractor？Genome-の場合、全部で６種の試薬を使用するが、本発明の方法、機構によれば、このように第２から第６までの試薬の分注は、前工程の混合（撹拌）中に、予め分注しておくことができるので、高速精製が可能になる。市販の核酸精製装置ＭＦＸ−２０００（東洋紡績製）では９６検体を処理するのに約１６時間を要したが、本発明においては９６検体を３０分間で処理可能であった。なお収量はいずれの場合も１．５〜１．６μｇの血液由来のゲノムＤＮＡを回収できた。純度においても２６０ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度の比は１．８前後であり、精製効率は同じであった。
【００３３】
実施例２  廃棄物量の低減
実施例１においてＭＦＸ−２０００（東洋紡績製）では９６人のヒト血液を試料としてゲノムＤＮＡの精製を行った場合、１ｍｌ容量の使い捨てチップを２８８本使用したが、本発明によれば９６本で精製可能であり、従来の１／３まで低減することが可能であった。
【００３４】
実施例３  分注精度の向上
市販のぺリスタポンプＲＰ−Ｍ５０（古江サイエンス製）を２台使用した。それぞれ図３のように配管し、ローラー式チューブポンプ３１には内径１ｍｍ、外径４ｍｍのシリコンチューブを取付け、ローラー式チューブポンプ３２には内径２ｍｍ、外径４ｍｍのシリコンチューブを取付けた。それぞれのポンプは独立してＯＮ／ＯＦＦ可能であり、ローラー式チューブポンプ３２側の配管には電磁弁３４を取り付けた。ローラー式チューブポンプ３１のみの運転で１０ｍｌ／分、ローラー式チューブポンプ３１および３２の同時運転で２５ｍｌ／分の流量が得られた。
【００３５】
１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液の分注を行い、分注精度を確認した。０．２ｍｌ以下の微量分注の場合はローラー式チューブポンプ３１のみの運転とし、電磁弁３４は閉じておく。１５０μｌずつ分注するのに正転時間５６２ミリ秒を要した。その時の分注のバラツキは±１０μｌ、ＣＶ値５．０％であった（ｎ＝８）。この時、ＲＰ−Ｍ５０に市販のマイクロリレー（オムロン製Ｇ６Ｅ−２７４ＰおよびＧ６Ｅ−１３４Ｐ）を使用し正転時間５６２ミリ秒直後に、逆転時間３０ミリ秒を行うようにしたところ、１％  ＳＤＳ溶液の分注精度はバラツキが±２μｌ、ＣＶ値２．５％であった（ｎ＝８）。チップ式分注が可能な市販の核酸精製装置ＭＦＸ−２０００（東洋紡績製）で、１％  ＳＤＳ溶液を１５０μｌずつ分注したところ、分注精度はバラツキは±７μｌ、ＣＶ値３．９％であった（ｎ＝８）。
【００３６】
実施例４  完全自動化・磁力を利用して吸引可能な粒子の再懸濁方法
市販の５０ｍｌ注射筒の出口に電磁弁５４を取付けた。市販の核酸精製キットMagExtractor？Plasmid-（東洋紡績製）に添付される磁性ビーズIIを、この注射筒に１５ｍｌ入れ、２週間放置した。磁性ビーズIIは完全に注射筒に沈降し、もはや市販の分注器（ピペットマンなど）を用いてチップ内にビーズを吸引することは不可能であった。
この状態で、注射筒の上部と電磁弁５２とエアーポンプ５１を配管した。電磁弁５２には３ポートあり、エアーポンプの給排気、外気、注射器内の空気を自由にコントロールすることができる。電磁弁５４を開き注射器内の空気を排気するようにすると、注射筒内は負圧になり、電磁弁５４より空気が取り込まれ磁性ビーズはバブリングにより撹拌される。電磁弁５４を閉じ、外気を注射器内に排気すると容器内は加圧され、電磁弁５４を開いた瞬間だけ再懸濁された磁性ビーズIIを吐出することができる。従来の方法によれば、装置を動かす度に、一時磁性ビーズIIを密閉容器に移しかえ、激しく振って再懸濁した後、装置に再びセットする必要があった。本発明によれば、電磁弁の切換は自動的に行うことが可能になるため、磁性ビーズIIのように非常に沈降しやすい、磁気を利用して吸引可能な粒子であっても、装置にセットしたまま再懸濁が可能になるため、核酸・蛋白質精製装置の無人での連続・断続運転が可能になった。
【００３７】
実施例５  完全自動化・遠心不要
プラスミドＤＮＡ  ｐＵＣ１８を保持する大腸菌ＪＭ１０９からプラスミドＤＮＡ  ｐＵＣ１８を全自動精製した。エタノール以外の試薬は、MagExtractor？Plasmid-（東洋紡績製）に添付される試薬を使用した。１ｍｌの培養液に、３００μｌのエタノール、３０μｌの磁性ビーズＩを加え混合する。磁石を用いて大腸菌が結合した磁性ビーズＩを集め、上澄みを廃棄する。続いて、再懸濁液、溶解液、中和液を１５０μｌずつ順に加える。磁石を用いてプラスミド以外のＤＮＡが結合した磁性ビーズＩを集め、上澄みを別容器に移す。さらに、上澄み液に５００μｌの吸着液と３０μｌの磁性ビーズIIを加え混合する。磁石を用いてプラスミドＤＮＡが結合した磁性ビーズIIを集め、上澄みを廃棄する。続いて、９００μｌの７０％エタノールを加え混合する。磁石を用いてプラスミドＤＮＡが結合した磁性ビーズIIを集め、上澄みを廃棄する。この操作を２回行う。そして、５０μｌの溶出液を加え混合する。磁石を用いて磁性ビーズIIを集め、プラスミドＤＮＡが含まれる上澄みを別容器に移した。
従来の方法では、遠心分離機もしくはフィルターを用いて大腸菌を集めた後、プラスミドＤＮＡの精製を行っていたが、本発明によれば磁石のみですべての工程を処理することができるので、大腸菌の濃縮からプラスミドの精製までの工程の全自動化が可能となった。
【００３８】
【発明の効果】
▲１▼精製速度の改善
市販の核酸精製装置ＭＦＸ−２０００（東洋紡績製）では９６検体を処理するのに２４検体ずつ４時間、合計約１６時間を要したが、本発明においては９６検体同時に３０分間で処理可能であり、多サンプル処理および高速処理が可能である。
【００３９】
▲２▼廃棄物量の低減
１試料あたり３〜８本の使ってチップを消費する従来の装置と比較して、本発明においては通常１本、最大でも２本のみ消費となるので廃棄物量を低減することができる。
【００４０】
▲３▼分注精度の向上
ぺリスタポンプ方式により、磁力を利用して吸引可能な粒子を使用した核酸・蛋白質の精製に必要な試薬の分注を行った結果、従来のように単独でモーター正転のみで分注した場合（Ａ）と、本発明のようモーター複数用い、正転・逆転を交互に行いながら分注した場合（Ｂ）、チップ式で分注した場合（Ｃ）の分注精度は、目標分注量が１５０μｌ、５００μｌの場合でそれぞれ表１に示す通りであり、チップ式分注の場合よりも高速・高精度分注が可能になった。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
▲４▼固・液分離方法の改善
本発明では９６個の円筒形磁石を利用することで、９６穴プレートでの磁気的に吸引可能な粒子を用いた核酸・蛋白質の精製が可能になった。特許第２７０１８９１号公報の記載に準じた、棒磁石を使用した方法に比べて、固・液分離後の上澄みに含まれる磁気的に吸引可能な粒子の含有量が３〜５％であったところが、０．５％以下に改善された。
固・液分離、上澄み除去後、磁気的に吸引可能な粒子の加温・乾燥を行った場合、プレートを８５℃の湯浴上に置いた際には、乾燥までに１５〜２０分を要したが、本発明のように、固・液分離、上澄み除去後、固・液分離に使用した円筒形磁石を８５℃に加温した場合には、５分で乾燥可能であり、精製時間の短縮が可能になった。
【００４３】
▲５▼完全自動化
磁力を利用して吸引可能な粒子を使用した核酸・蛋白質の精製を行う場合、磁力を利用して吸引可能な粒子の懸濁液は時間の経過とともに容器内に沈殿を生じ、一日以上保存した場合には、沈殿が強固になるため、もはやチップ式撹拌方法では混合することは困難であり、一旦別容器に移しかえ密栓して激しく振って混合する必要があった。装置の連続運転に支障がある。本発明の核酸・蛋白質精製装置を用いると、この磁力を利用して吸引可能な粒子の懸濁液を２週間以上放置した後でも、自動的に混合可能であり、装置の長期連続（断続）運転が可能になった。
また、従来の装置では、細胞を集めるために遠心分離などの前処理を要したのに対し、本発明においては、磁気的に吸引可能な粒子を２段階使用することで、細胞を集める工程から核酸・蛋白質の精製までを、磁力を利用して吸引可能な粒子のみで全自動で行うことが可能なった。
【００４４】
▲６▼コンタミネーション防止
本発明においては、９６穴プレートのフォーマットに従ってピストンポンプをレイアウトするような場合、すなわち縦横のチップ間隔が非常に狭い場合、しかも界面活性剤など泡立ちの原因となる成分を含むような試薬の全量吸引・全量吐出を行う場合であっても、チップ先端の気泡が隣接するチップの先端の気泡と接触することはなく、チップ先端に発生する極小さな気泡であっても取り除くことができるため、正確な分析が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の技術におけるピストンポンプの先端部における構造の例を示す図である。
【図２】本発明における核酸・蛋白質精製装置の一例を示す図である。
【図３】本発明における核酸・蛋白質精製装置を用いて、分注精度を高めるための方法の一例を示す図である。
【図４】本発明における核酸・蛋白質精製装置を用いて、固・液分離を行う方法の一例を示す図である。
【図５】本発明における核酸・蛋白質精製装置を用いて、磁気的に吸引可能な粒子を含む液体の混合及び分注の方法の一例を示す図である。
【図６】本発明における核酸・蛋白質精製装置において、コンタミネーションを防止するための機構の一例を示す図である。
【符号の説明】
１：ピストン
２：シリンダー
３：シール材
４：ノズル
５：使い捨てチップ
６：液体（試料・試薬）
１１：回収用９６穴プレート
１２：抽出用９６穴プレート
１３：抽出用９６穴プレート
１４：チップラック
１５：チップラック
１６：廃液容器
１７：ピストンポンプ・ノズル
１８：駆動機構
１９：分注機構
２０：加温・冷却機構
２１：磁石プレート
２２：試薬ラック
２３：ステージ
２４：磁性粒子撹拌・分注機構
３１：ローラー式チューブポンプ
３２：ローラー式チューブポンプ
３３：電磁弁
３４：コネクタ
４１：棒状磁石
４２：磁力を利用して吸引可能な粒子（底に粒子が残る）
４３：円筒状磁石
４４：磁力を利用して吸引可能な粒子（底に粒子は残らない）
５１：エアーポンプ
５２：電磁弁
５３：容器
５４：電磁弁
６１：チップ
６２：気泡
６３：廃液
６４：穴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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