(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化する能力を有するバチルス・パミルス（Bacillus pumilus）又はバチルス・レンタス（Bacillus lentus）に属する細菌を含有することを特徴とする硫化物発生抑制剤。
【請求項２】
細菌が担体に担持されているものである請求項１記載の硫化物発生抑制剤。
【請求項３】
担体が火成岩である請求項２記載の硫化物発生抑制剤。
【請求項４】
細菌が、バチルス・パミルス Ａ−１株、バチルス・レンタス Ａ−２株、バチルス・レンタス Ａ−３株又はバチルス・パミルス Ａ−４株であることを特徴とする請求項１、２及び３のいずれか１項記載の硫化物発生抑制剤。
【請求項５】
水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化する能力を有するバチルス・パミルス（Bacillus pumilus）又はバチルス・レンタス（Bacillus lentus）に属する細菌を含有することを特徴とする硫化物含有汚泥浄化剤。
【請求項６】
バチルス属細菌が担体に担持されているものである請求項５記載の硫化物含有汚泥浄化剤。
【請求項７】
水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化する能力を有するバチルス・パミルス（Bacillus pumilus）又はバチルス・レンタス（Bacillus lentus）に属する細菌を含有することを特徴とする魚介類の養殖場の底質改善剤。
【請求項８】
細菌が担体に担持されているものである請求項７記載の魚介類の養殖場の底質改善剤。
【請求項９】
請求項１、２、３及び４のいずれか１項記載の硫化物発生抑制剤を養殖場に投入し、養殖を行うことを特徴とする魚介類の養殖方法。
【請求項１０】
地下排水槽中に、請求項１、２、３及び４のいずれか１項記載の硫化物発生抑制剤を投入することを特徴とする悪臭防止方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は車海老やハマチ、ヒラメ等の魚介類養殖時の水槽中や高層ビル等の地下排水槽中の硫化物含有汚泥等の汚濁物質、異臭物質の発生を低減させることができる硫化物発生抑制剤、並びにこれを用いる魚介類の養殖方法、地下排水槽の悪臭防止方法及び環境浄化方法に関するものである。
背景技術
従来から、瀬戸内海や九州沿岸、沖縄等の海岸地域では、様々な種類の魚介類の養殖が行われている。中でも、車海老、ハマチ、ヒラメ等の養殖場は多数存在し、そこで育成された魚介類は市場へ大量に出荷されている。
魚介類を養殖する際には、水温や飼料量等の環境要因に留意する必要がある。これらが悪化すると、その生存率が低下してしまうためである。中でも、現在非常に問題となっているのは養殖場内の硫化物であり、これらは主に硫化物の金属塩と硫化水素からなっている。前者は養殖場の底砂に堆積しているヘドロ状の黒色物質であり、魚介類の生存数を減少させる原因となっている。また、後者は水槽内の異臭の発生原因となっており、加えて生物の呼吸阻害作用や水中の溶存酸素を消費する作用も有している。
硫化物の発生機序は、次のように考えられている。まず、２通りの生成経路によって、硫化水素が生成するのである。すなわち、飼料等から溶け出したタンパク質に含まれている含硫アミノ酸から脱硫が起こり硫化水素が生成する場合と、硫酸イオンの異化的還元から生じる場合とがあり、これらの反応には多岐にわたる細菌が関与している。次いで、生成した硫化水素は底質中の鉄塩等と反応する。こうして生成した硫化物の金属塩が、ヘドロ状になり、堆積するものと考えられている。このような硫化物の堆積に対しては、現状でも種々の対策が構じられている。
例えば、サンドポンプによる底泥の引き上げ固定化、過酸化カルシウムの散布（年間３００ｔ以上）等が実施されているが、汚濁の進行を止める効果は認められず、コスト面での負担も大きいため、好適な方法とはいえない。また、これらの底泥に対応し分解を行う微生物製剤も現在いくつか市販されているが、使用しても十分な効果は認められない。
一方、養殖場だけではなく、高層ビルの地下排水槽等においても、硫化物が発生する場合があり、これも、ビルから排出されるガス中の異臭成分となっている。異臭を防ぐための対策として、微生物製剤等も市販されているものの、有意な効果は認められていない。
従って、本発明の目的は、養殖場や高層ビルの地下排水槽等の硫化物の発生し易い環境において、硫化物の発生を抑制し、このような環境を浄化し、異臭を防止し、更には魚介類の生産性向上等を図れる硫化物発生抑制剤を提供することにある。
発明の開示
斯かる実情に鑑み本発明者は鋭意研究を行った結果、驚くべきことに水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化し得るバチルス（Bacillus）属細菌が臭気のみならず、汚泥等の硫化物の発生を抑制し、上記環境を改善し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化する能力を有するバチルス（Bacillus）属細菌を含有することを特徴とする硫化物発生抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化する能力を有するバチルス（Bacillus）属細菌を含有することを特徴とする硫化物含有汚泥浄化剤を提供するものである。
また、本発明は、水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化する能力を有するバチルス（Bacillus）属細菌を含有することを特徴とする魚介類の養殖場の底質改善剤を提供するものである。
また、本発明は、前記の硫化物発生抑制剤を養殖場に投入し、養殖を行うことを特徴とする魚介類の養殖方法を提供するものである。
更に、本発明は、地下排水槽中に前記の硫化物発生抑制剤を投入することを特徴とする悪臭防止方法を提供するものである。
更にまた、本発明は、前記の硫化物発生抑制剤を環境に使用することを特徴とする環境浄化方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いるバチルス属細菌は、水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質を資化する能力を有するものであれば特に限定されず用いることができる。ここで、水溶性ペプチド又は水溶性タンパク質は、魚介類の養殖飼料、排水中の糞便等様々な物質に含まれる。
このようなバチルス属（Bacillus）細菌のうちバチルス・パミルス（Bacillus pumilus）が又はバチルス・レンタス（Bacillus lentus）硫化物発生抑制のために好ましく、更にバチルス属細菌がバチルス・パミルス  Ａ−１株、バチルス・レンタス  Ａ−２株、バチルス・レンタス  Ａ−３株及びバチルス・パミルス  Ａ−４株から選ばれる１種又は２種以上が好ましい。これら４種のバチルス（Bacillus）属細菌は、大分県別府湾海底汚泥及び東京湾横浜沖海水から分離した約３０種の微生物の中からスクリーニングされたものである。スクリーニングの指標には、海老用配合飼料（エビアン、協和発酵製）の水溶性タンパク質を抽出し、寒天で固化した培地での増殖度を用いた。こうして得られた細菌群の中から病原性の少ない属を選定し、上記４菌株を得た。なお、Ａ−１株はＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８０号（原寄託日１９９７年３月２１日）として、Ａ−４株はＦＥＲＭ  ＢＰ−６２８１号（原寄託日１９９７年３月２１日）として、Ａ−２株はＦＥＲＭ  ＢＰ−６２７８号（１９９８年３月３日）として、Ａ−３株はＦＥＲＭ  ＢＰ−６２７９号（１９９８年３月３日）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒305-0046  日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブダペスト条約に基づいて寄託されている。
これら４種の菌学的性質の試験を下記の方法により行った。結果を表１、表２及び表３に示す。
（試験方法）
（１）まず、「医学細菌同定の手引き」第３版（Cowan and Steels p57, 近代出版）に従い、グラム染色等を行い、加えて、「新細菌培地学講座下巻」第２版（p156, 近代出版）に従い好塩性試験を行った（表１）。
（２）次に、細菌生化学性状研究用のキット（アピ２０  ＮＥ，日本ビオメリュー・バイテック製）を用いて、前記４種の菌株の生化学的性状を調べた。
（３）更に、バチルス生化学性状研究用のキット（アピ５０  ＣＨＢ，日本ビオメリュー・バイテック製）を用いて、前記４種の菌株の生化学的性状を調べた。まず、各菌株を寒天培地上で培養した後、コロニーをかきとり、滅菌生理食塩水１mlに浮遊させ、濃厚な菌浮遊液を調製する。これを更に滅菌生理食塩水で希釈し、アピ５０ＣＨＢ培地（組成は下記に示す）に接種する。この細菌接種培地を炭素源（５０種）のはいっているマイクロチューブに入れ、３０℃にて培養を行い、２４、４８時間経過後、各チューブの色の変化から陽性、陰性の判定をした。その結果を表３に示す。
（アピ５０  ＣＨＢ培地組成）
0004201844.tif 000002
（試験結果）
0004201844.tif 000003
0004201844.tif 000004
0004201844.tif 000005
硫化物発生の抑制を目的として上記の菌株を使用する場合は、培養後の細菌をそのまま投入してもよいが、細菌を担体に担持したものを投入する方が好ましい場合が多い。例えば、養殖場内の硫化物は底砂に堆積しているので、菌体を底まで沈める必要があり、これは担体を使用することにより容易に達成できる。
ここで用いる担体は、特に限定されないが、ゼオライト、麦飯石、活性炭、火成岩、サンゴ石等が菌体の保持能の点で好ましく、特に火成岩が経済性の面で好ましい。担体中の菌体数は、用いる環境、コスト及び効果を考慮して適宜決定すればよいが、一般的に１０6〜１０9cfu／ｇ程度が好ましく、特に１０8cfu／ｇ程度が好ましい。
養殖場、地下排水槽等へ投入する前記バチルス属細菌の濃度も適宜決定すればよいが、１０7cfu／ｍ2〜２×１０11cfu／ｍ2、特に１０9cfu／ｍ2〜２×１０10cfu／ｍ2程度の濃度となるよう投入することが好ましい。
一方、担体に担持させて、養殖場、地下排水槽等へ投入する場合の担体の量は、担体中の菌体数を１０8cfu／ｇとして、０．１ｇ／ｍ2〜２×１０3ｇ／ｍ2程度、特に１０ｇ／ｍ2〜２００ｇ／ｍ2程度で良好な効果が得られる。更に、固定化された菌株の活性は、３０日程度でなくなってしまうので、３０日毎程度の間隔で繰り返し担体を投与することが好ましい。
本発明では硫化物の発生抑制剤として、バチルス（Bacillus）属細菌を使用しているため、微生物を添加する水槽等の水温によって、菌の活性が変化すると考えられる。すなわち魚介類養殖時の水槽等は、通常屋外に開放系で設置され、その水温は外気温に依存するため、本発明の菌株は夏期（水温３０℃程度）に活性が高く、冬季には活性が低くなってしまう。しかしながら、冬季には硫化物の発生過程において関与している細菌群の活性も低いため硫化物の発生も少なく、更に、魚介類の養殖は水温の高い時期に行うものであるので、特に問題はない。
また、本発明の硫化物発生抑制剤は、硫化物含有汚泥浄化剤として用いることができ、例えば養殖場や地下排水槽のみならず、種々の環境下で用い、環境を改善することができる。すなわち、湖、池、下水設備から家庭用の鑑賞用水槽まで幅広い環境下で用いることができる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：菌株のスクリーニング
（１）底泥資化細菌の分離
大分県別府湾海底汚泥を２０℃、１８日間静置後、平板培地（乾燥ブイヨン（日水製薬製）に塩化ナトリウム（３％）、寒天（１．５％）を加えたもの、pH８．０））に塗抹し、２８℃、３日間培養し、優占菌株１０株を分離した。更に、東京湾横浜沖海水から特定の化合物を資化する能力を有する細菌１９株を分離した。
次に、車海老養殖用飼料（エビアン、協和発酵製）を粉砕処理し、人工海水に懸濁後、得られた２９株を接種した。増殖が確認できた株を、更に車海老養殖用飼料（エビアン、協和発酵製）の水溶性タンパク質を抽出し、寒天で固化した平板培地（組成は以下に示す）に塗抹し、増殖を確認した。
（培地組成）
0004201844.tif 000006
この結果から、次の４株の細菌を選定した。
バチルス・パミルス  Ａ−１株
バチルス・レンタス  Ａ−２株
バチルス・レンタス  Ａ−３株
バチルス・パミルス  Ａ−４株
実施例２：硫化水素分解能試験
１ＬコルベンにＡ−１株及びＡ−４株をそれぞれ１×１０8cfu／ｇ、並びにＡ−２株及びＡ−３株をそれぞれ１×１０7cfu／ｇを火成岩に担持した組成物１００ｇ、３％ＮａＣｌ  ９０ml、車海老飼料可溶成分抽出液（５ｗ／ｖ％）１０mlをを加え、２８℃で２時間静置後、ヘッドスペースに硫化水素ガスを充填して密栓し、ヘッドスペースの硫化水素濃度の経時変化を検知管を用いて測定した。なお、対照区には、あらかじめオートクレーブ滅菌した前記組成物を使用した。
その結果、表４に示す如く、実験区においては、対照区に比べて、明らかに硫化水素ガス濃度が低下し、Ａ−１株〜Ａ−４株が硫化水素ガス分解能を有することが判明した。
0004201844.tif 000007
実施例３：微生物固定化担体による海老養殖池の堆積物分解試験
（試験内容）
山口県宇部車海老養殖場養殖池において、養殖池の底砂に微生物を固定化した担体を混合して車海老の飼育を行い、生育状況を観察した。また、このとき、検知管を用いて養殖池の硫化水素ガス量の測定も行った。
（１）養殖池：２ｍ×２ｍ×１ｍ  ４ｔ野外池
（２）車海老：約１０００匹／池
（３）微生物固定化用担体の選定
担体として適しており、比較的安価であること等から火成岩（パルサンド２．５〜３．５mm）を用いることとした。
（４）微生物
Ａ−１株及びＡ−４株を、
担体に対して約１０7cfu／ｇで固定化
（５）担体の散布方法：対照区は開始時に無固定担体を１kg／池散布した。
実験区は開始時に固定化担体を１kg／池、２９日経過後に同量、４５日経過後に同量散布した。
（試験結果）
試験開始から５５日経過した時点で、対照区の底質はほぼ全体が黒変し異臭が認められた。
一方、微生物固定化担体を散布した実験区では、底質の一部が黒変しているのみで、臭気もわずかであった。養殖池の水を抜く前に分析用のサンプルを採水し、その後底泥の見えるまで水を落とした結果、対照区は池全体の底の砂の表面が硫化物にて黒変しており、日中は底砂に潜る性質を有する車海老が、底砂の表面に認められた。５５日経過時の海老生存匹数を表５に、同時期に採取した養殖池の底質の分析結果を表６に示す。また、このときに検知管で測定した硫化水素ガス量を表７に示す。なお、Ａ−２株及びＡ−３株を用いた試験でも同様の結果を得た。
0004201844.tif 000008
0004201844.tif 000009
0004201844.tif 000010
実施例４：地下排水槽内の悪臭発生抑制試験
東京都国立市ヤクルト中央研究所内の地下排水槽内に、微生物を添加し、悪臭の発生抑制効果を調査した。
（１）排水槽：３．７５×１．５×１ｍ
（２）添加微生物：Ａ−１株及びＡ−４株を排水槽内の初期濃度が約１０4cfu/mlになるように添加した。
（３）悪臭発生状況の評価方法：微生物を添加する前の排水槽を対照区とし、発生する悪臭を１週間ごとに官能評価した。次に、同一の排水槽へ、微生物を前述した濃度になるように１週間毎に添加し、そのつど悪臭の発生状況を官能評価した。官能評価は以下の６段階臭気強度表示法に従って評価した。
0004201844.tif 000011
（４）試験結果
悪臭の発生状況を表９に示す。対照区と比べ実験区ではある程度悪臭の発生が抑制されていた。また、Ａ−２株及びＡ−３株を用いた実験でも同様の結果を得た。
0004201844.tif 000012
実施例５：微生物の魚類による急性毒性試験
（１）試験概要：ヒメダカによる２４ｈ、４８ｈＬＣ５０*をＪＩＳＫ０１０２  ７１に準拠した方法で測定した。
＊：ＬＣ５０：Median Lethal Concentration供試魚の５０％が致死する濃度、TLmと同じ。
（２）試料：Ａ−１株又はＡ−４株
（３）試験操作：対象微生物の濃度が１０3、１０5、１０7cfu／mlとなるように試験液を作製後、これらの試験水中で供試魚を４８時間飼育し各試験水における魚の死亡数を経時的に計数した。
（４）供試魚：ヒメダカ（平均体長２．５cm、平均体重０．２５ｇ、東京都八王子市吉田養魚場より入手）
（５）試験条件
▲１▼試験方法：止水式
▲２▼供試魚数：１試験水当たり７匹
▲３▼試験水量：３Ｌ
▲４▼試験水温：２２℃±２℃
▲５▼照明    ：１０時間／日
▲６▼水槽    ：円形ガラス水槽
▲７▼希釈水  ：水道水（脱塩素したもの）
（６）試験結果
▲１▼ＬＣ５０：供試微生物のヒメダカによる２４時間及び４８時間ＬＣ５０はいずれも１０7cfu／ml以上であった。
▲２▼濃度と死亡率：各試験濃度における経過時間ごとの死亡率を表１０に示した。また、Ａ−２株及びＡ−３株を用いた試験でも同様の結果を得た。
0004201844.tif 000013
産業上の利用可能性
本発明の硫化物発生抑制剤を用いれば、各種魚介類養殖時の水槽中や地下排水槽中の硫化物含有汚泥等の汚濁物質や異臭物質の発生を抑制することができる。