(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造を有するp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物：
【化１】
0004162858.tif 000014
（式中、Xはp-ヒドロキシシンナモイル成分にAを結合し得るリンカー基であり、および下記からなる群から選ばれ、
【化２】
0004162858.tif 000015
Aは検出可能な標識である。）
【請求項２】
Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第1項記載の化合物。
【請求項３】
少なくとも１種の酵素を含む分析物依存性酵素活性化系を用い、前記酵素がオキシドリダクターゼであり、請求の範囲第1項記載の構造を有する検出可能な標識化基質を含むコンジュゲートと反応させて活性化コンジュゲートを生成させ、この活性化コンジュゲートはこの活性化コンジュゲートの少なくとも1種のレセプターが存在する場所へ実質的に共有的に付着しており、そのレセプターは上記分析物依存性酵素活性化系と反応性でなく、付着させた検出可能な標識が検出または定量可能なシグナルを直接または間接的に発生させることを特徴とするアッセイにおける分析物の検出または定量方法。
【請求項４】
Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
オキシドリダクターゼがパーオキシダーゼである請求の範囲第３項または第４項記載の方法。
【請求項６】
a) 固相上に分析物を固定させること；
b) 工程a)の生成物を酵素がオキシドリダクターゼである分析物依存性酵素活性化系と反応させること、この分析物依存性酵素活性化系が酵素にカップリングさせた特異性結合対の1員であるか或いは酵素であること；
c) 工程b)の生成物を請求の範囲第1項記載の構造を有するコンジュゲートと反応させて特異性結合対の第1員である活性化コンジュゲートを生成させること、この活性化コンジュゲートが、上記分析物依存性酵素活性化系と反応性でない固相表面上の特異性結合対の第2員に結合させることによって上記固相上に共有的に付着していること、付着させた検出可能な標識が検出または定量可能なシグナルを直接または間接的に発生させること；および
d) サンプル中の分析物の存在または不存在を工程c)で発生させたシグナルから検出または定量すること； を特徴とするサンプル中の分析物の存在または不存在を検出または定量するアッセイ法。
【請求項７】
Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第６項記載のアッセイ法。
【請求項８】
オキシドリダクターゼがパーオキシダーゼである請求の範囲第６〜７項のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項９】
a)分析物依存性酵素活性化系の少なくとも1成分である分析物(この分析物依存性酵素活性化系は、酵素にカップリングさせた特異性結合対の1員であるか或いは酵素であり、前記酵素がオキシドリダクターゼである)を請求の範囲第1項記載の構造を有するコンジュゲートと反応させて特異性結合対の第1員である活性化コンジュゲートを生成させること、この活性化コンジュゲートが、上記分析物依存性酵素活性化系と反応性でない固相表面上の特異性結合対の第2員に結合させることによって上記固相上に付着していること、付着した検出可能な標識が検出または定量可能なシグナルを直接または間接的に発生させること；および
b) サンプル中の上記分析物の存在または不存在を工程a)で発生させたシグナルから検出または定量すること； を特徴とするサンプル中の分析物の存在または不存在を検出または定量するアッセイ法。
【請求項１０】
Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第９項記載のアッセイ法。
【請求項１１】
オキシドリダクターゼがパーオキシダーゼである請求の範囲第９項又は第１０項に記載のアッセイ法。
【請求項１２】
パーオキシダーゼ酵素を検出可能な標識化フェノールと反応させることを含み、活性化させたコンジュゲートが請求の範囲第1項記載の構造を有することを特徴とする活性化コンジュゲートの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新規なパーオキシダーゼ基質に関し、さらに詳細には、触媒型レポーター付着(Catalyzed reporter deposition)のような種々の用途において使用し得るシンナモイル含有基質に関する。
【０００２】
（背景技術）
パーオキシダーゼは、その高交換率、良好な安定性と入手性故に、酵素系分析方法において広く使用されている。例えば、セイヨウワサビパーオキシダーゼ(HRP)(EC 1.11.1.7)は、多種の水素供与性基質の過酸化水素による酸化を触媒する。また、HRPは、触媒型レポーター付着用の好ましい酵素の1つである。
【０００３】
触媒型レポーター付着は、米国特許第5,196,306号および第5,583,001号の要旨を構成する新規なシグナル増幅方法である。この方法は、Bobrow et al. Journal of Immunological Methods, 125: 279-285 (1989)、およびBobrow et al. Journal of Immunological Methods, 137: 103-112 (1991)においても記載されている。
【０００４】
この方法は、分析物依存性酵素活性化系 ("ADEAS") を用いて追加のレポーター酵素の固相への付着を触媒し、シグナル増幅と改良されたアッセイ検出限界を与える。好ましい実施態様においては、HRPがADEASである。
【０００５】
ADEASは、ADEASに特異性の検出可能な標識化基質からなるコンジュゲートと反応する。ADEASと上記コンジュゲートが反応するとき、活性化コンジュゲートが形成されて、活性化コンジュゲートのレセプターを固定した場所に付着する。このレセプターは、上記分析物依存性酵素活性化系とは反応性でない。
【０００６】
コンジュゲート類は、通常のカップリングおよび標識化方法を用いて合成し得る。基質の選択は、使用するADEASによる。即ち、有用な合成基質と必要に応じてのレセプターを適切に設計するためには、各特異性酵素の触媒特性についての詳細な知識が要求される。開示されているコンジュゲートの例には、ビオチンチラミン、フルオレセインチラミン、NADP、ホスホリル化ビオチン等の置換フェノール類がある。
【０００７】
しかしながら、パーオキシダーゼ介在アッセイに適する基質を設計するに当っては、注意をもって行わなければならない。Guilbault et al., Analytical Chemistry, Vol.40, No.8, pages 1256-1263 (1968)は、パーオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびインバーターゼのような酸化性酵素の蛍光測定用の広範囲の基質を研究している。これらの研究者等は、側鎖に二重結合を含有する3,4-ジヒドロキシケイ皮酸は、酵素との反応を停止させるので、酸化性酵素の蛍光測定用の有用な基質ではなかったと報告している。
【０００８】
(発明の開示)
本発明は、下記の構造を有するp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物に関する：
【０００９】
【化６】
0004162858.tif 000002
【００１０】
（式中、Xはp-ヒドロキシシンナモイル成分にAを結合し得るリンカー基であり、Aは検出可能な標識である）。
【００１１】
もう1つの実施態様においては、本発明は、触媒型レポーター付着を用いてレポーターシグナルを増幅させるサンプル中の分析物の存在または不存在を検出または定量するアッセイ法における、そのようなシンナモイル含有化合物の使用に関する。
【００１２】
(発明を実施するための最良の形態)
用語“分析物依存性酵素活性化系(ADEAS)”は、(i) 少なくとも1種の酵素を、当業者において公知の任意の方法で、特異性結合対の1員にカップリングさせた酵素系、或いは (ii) 特異性結合対の1員にカップリングさせる必要のない分析物である場合の酵素を称する。この酵素は、それ自体または第2の酵素と一緒に、活性化コンジュゲートの生成を触媒し、次いで、この活性化コンジュゲートが活性化コンジュゲートのレセプターが存在する場所に付着する。
【００１３】
本明細書で使用する用語“増幅”は、ADEASにより活性化されたコンジュゲートの付着に基づくレポーターシグナルの増幅を意味する。
本明細書で使用する用語“コンジュゲート”は、後述するような単一酵素ADEASまたは多成分酵素ADEASコンジュゲートのいずれであれ、パーオキシダーゼ介在ADEASに特異性の検出可能な標識化シンナモイル含有基質を意味する。
【００１４】
用語“検出可能な標識化”は、基質をレポーターにカップリングさせるか、或いはレポーターが基質に後述するような異なる成分を導入する場合には特異性結合対の未標識第1員にカップリングさせ得ることを意味する。基質を特異性結合対の未標識1員に結合させる場合、レセプターに結合させた後、基質-特異性結合対複合体を結合対の第2員と反応させ、これをレポーターにカップリングさせる。また、基質-特異性結合対複合体を、付着させる前の特異性結合対の検出可能に標識した他の1員と前以て反応させてもよい。
【００１５】
用語“付着”は、後述するような特異性結合対の相互作用の形成によって生ずる活性化コンジュゲートのレセプターへの直接結合を意味する。
用語“レセプター”は、後述するような特異性結合対相互作用の形成により活性化コンジュゲートに結合する部位を意味する。
用語“活性化コンジュゲート”は、コンジュゲートがADEASに触発されてレセプターと結合することを意味する。
【００１６】
ADEASは、コンジュゲート(即ち、ADEASに特異性の検出可能に標識化した基質)の付着を、コンジュゲートの基質部分を活性化形(レセプターの存在する場所に共有結合する)に変えることによって触媒する。ADEASは、増幅を行うのに酵素カスケード反応または酵素循環によらない。むしろ、ADEASは、単一酵素または酵素混合物によりコンジュゲートを活性化する。コンジュゲートの付着は、分析物とADEASが反応しレセプターが活性化コンジュゲートに結合するのに利用できる場合にのみ生ずる。即ち、ADEAS、コンジュゲートおよびレセプターは、作動3要素を構成するよう選択される。分析物とADEASは、分析物が酵素(例えば、パーオキシダーゼ)である場合には同じものであり得、或いは異なるものであってもよい。
【００１７】
本発明は、新規なシンナモイル含有基質に関するが、従来、この基質は、そのようなシンナモイル含有基質が酵素との反応を抑制するものと予想されていたために、パーオキシダーゼ介在反応においては不適当な基質であると考えられていた。
【００１８】
本発明のシンナモイル含有基質と共に使用するのに適するADEASには、オキシドリダクターゼ類がある。さらに詳細には、パーオキシダーゼ類を挙げることができる。本発明の新規な基質において適し得る好ましいADEASは、セイヨウワサビパーオキシダーゼである。
【００１９】
驚くべきことに、また予想に反して、構造内にp-ヒドロキシシンナモイル成分を有する新規なコンジュゲートが、非シンナモイル含有コンジュゲートを用いて通常得られていた値の少なくとも10倍のレベルで触媒型レポーター付着の感度を著しく改善することを見出した。
本発明の新規なp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物は、下記の構造を有する：
【００２０】
【化７】
0004162858.tif 000003
【００２１】
（式中、Xはp-ヒドロキシシンナモイル成分にAを結合し得るリンカー基であり、Aは検出可能な標識である）。
【００２２】
上記リンカー基は、p-ヒドロキシシンナモイル成分に検出可能な標識を結合させ得る実質的任意のリンカー基であり得る。検出可能な標識に結合させた多くのリンカー基が、商業的に入手可能である。検出可能な標識に結合していないリンカー基の例には、下記のものがある：
【００２３】
【化８】
0004162858.tif 000004
【００２４】
検出可能な標識に結合させたリンカー基の例には、下記のものがある：
【００２５】
【化９】
0004162858.tif 000005
【００２６】
【化１０】
0004162858.tif 000006
【００２７】
広範囲のレポーターを、基質にカップリングさせてコンジュゲートを生成させるのに、或いは特異性結合対の1員にカップリングさせるのに利用できる。レセプターは、125Iのような放射活性アイトソープ、酵素類、蛍光原性物質、化学発光体、または電気化学物質であり得る。
【００２８】
本発明を実施するのに使用できるレポーター酵素の例には、ヒドロラーゼ類、リアーゼ類、オキシドリダクターゼ類、トランスフェラーゼ類、イソメラーゼ類およびリガーゼ類がある。幾つかの好ましい例は、ホスファターゼ類、エステラーゼ類、グルコシダーゼ類およびパーオキシダーゼ類である。特定の例には、アルカリホスファターゼ、リパーゼ類、ベータ-ガラクトシダーゼおよびセイヨウワサビパーオキシダーゼがある。上述したように、酵素をレポーターとして使用する場合、その酵素は、ADEASにおいて使用する酵素または酵素類と同じものまたは異なるものであってもよい。本発明は、ラジオアイソトープ標識コンジュゲートまたは酵素標識コンジュゲート等の付着を触媒するのに使用できる。
【００２９】
レポーターは、特異性結合対の1員である場合、免疫タイプまたは非免疫タイプであり得る。免疫特異性対の例は、抗原/抗体系またはハプテン/抗ハプテン系である。抗体成分は、ポリクローナル、モノクローナルまたはこれらの免疫反応性画分であれ、当業者において周知の慣用的方法によって調製できる。用語“免疫反応性抗体画分”または“免疫反応性画分”とは、抗体の結合領域を含有する画分を意味する。そのような画分は、Fc部分を除いた画分として定義されるFabタイプ画分、例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2画分であり得、或いはインタクト抗体の長鎖成分を結合しているジスルフィド結合の還元性開裂によって得られるいわゆる“ハーフ分子”画分であり得る。特異性結合対の抗原成分が免疫原性でない、例えば、ハプテンである場合、その成分は、担体部分に共有結合させて免疫原性を付与させ得る。
【００３０】
非免疫性結合対には、その2つの成分が互いに対して本質的な親和性を有するものの、抗体ではない系がある。非免疫性結合対には、ビオチン-アビチン、またはビオチン-ストレプトアビチン、葉酸-葉酸塩結合性タンパク質、相補性プローブ核酸等がある。
【００３１】
本発明の化合物は、後述の実施例において例示するような通常のカップリングおよび標識化方法を用いて合成できる。1つの方法は、下記の反応式に従ってp-ヒドロキシケイ皮酸を反応させることであり得る：
【００３２】
【化１１】
0004162858.tif 000007
【００３３】
次いで、得られたアミンをN-ヒドロキシスクシンイミドまたはイソシアネート成分と反応させて、最終のp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物を調製する。
上述したように、検出可能な標識を結合させた多くのリンカー基が商業的に入手可能である。これらの商業的に入手可能なリンカー基は、当業者において周知の通常のプロトコールを用いてp-ヒドロキシケイ皮酸と反応させ得る。
【００３４】
本発明の検出可能に標識したp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物(コンジュゲート)を活性化させると、レセプターが存在する場所に結合する。活性化コンジュゲートは、特異性結合対の相互作用(この場合、共有結合である)によりレセプターに結合する。外因性レセプターは、アッセイ内において起源のないレセプターを意味する。このレセプターは、本発明のコンジュゲートを反応混合物に加える前に支持体表面に固定し得る。内因性レセプターは、アッセイ内で起源するレセプターを意味する。本発明のコンジュゲートは、活性化させたとき、電子リッチ成分のような活性化フェノール成分に適するレセプターに結合するものと信じている。
【００３５】
もう1つの実施態様においては、本発明は、触媒型レポーター付着を用いてレポーターシグナルを増幅させる、サンプル中の分析物の存在または不存在を検出または定量するアッセイにおける上記検出可能に標識したシンナモイル含有化合物の使用に関する。イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイのような実質的に任意のアッセイフォーマットを使用できる。
多くの変形が可能であり、これらの変形は本発明の範囲内に属するものであることは、当業者にとって自明であろう。
【００３６】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、それに限定するものと解釈すべきではない。
【００３７】
実施例1
4-ヒドロキシケイ皮酸、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
【００３８】
【化１２】
0004162858.tif 000008
【００３９】
p-ヒドロキシケイ皮酸(5.0 g、30.5ミリモル)を暖めながらアセトニトリル(150 mL)に溶解し、次いでN-ヒドロキシスクシンイミド(4.0 g、35ミリモル)と1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(ジクロロメタン中1M、35 mL、35ミリモル)を加えた。得られた薄黄色溶液を１夜室温で攪拌し、濾過し、濾液を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、1:1酢酸エチル：ヘキサンで溶出させた。薄層クロマトグラフィーによる生成物含有画分をプールし、蒸発させて白色固形物(3.31 g、42％)を得た。1H NMR (DMSO-d6)δ7.9 (d、1H、ビニル)、7.7 (d、2H、フェニル3,5)、6.9 (d、2H、フェニル2,6)、6.7 (d、1H、ビニル)、2.8 (s、4H、スクシンイミドメチレン)。
【００４０】
実施例2
N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミン
【００４１】
【化１３】
0004162858.tif 000009
【００４２】
N-(2-アミノエチル)ビオチンアミドヒドロブロマイド(25 mg、0.068ミリモル)、トリエチルアミン(10μL、0.072ミリモル)および4-ヒドロキシケイ皮酸、スクシンイミジルエステル(18 mg、0.068ミリモル)をジメチルホルムアミド(DMF)(1 mL)に溶解し、室温で1夜攪拌した。反応混合物を、水中0〜100％メタノール直線勾配で30分に亘って溶出させるC18逆相クロマトグラフィーで精製した。22分での溶出ピークを集め、蒸発させて白色固形物22 mg (0.051ミリモル、75％)を得た。1H NMR (CD3OD)δ7.5 (d、1H、ビニル)、7.4 (d、2H、芳香族3,5)、6.8 (d、2H、芳香族2,6)、6.4 (d、1H、ビニル)、4.4 (m、1H、ビオチンメチン-NH)、4.2 (m、1H、ビオチンメチン-NH)、3.4 (m、4H、エタンジアミド)、3.1 (m、1H、ビオチンメチン-S)、2.8 (1H、ビオチンメチン-S)、2.6 (1H、ビオチンメチン-S)、2.2 (2H、ビオチンCH2-CO)、1.3〜1.7 (m、6H、ビオチン脂肪族)。
【００４３】
実施例3
N-ε-(2,4-ジニトロフェニル)-N-α-(4-ヒドロキシシンナモイル)-L-リジン
【化１４】
0004162858.tif 000010
N-ε-(2,4-ジニトロフェニル)-L-リジン(32 mg、0.09ミリモル)を0.2Mのホウ酸ナトリウム(3 mL) pH = 8中に懸濁させ、DMF(0.5 mL)中の4-ヒドロキシケイ皮酸、スクシンイミジルエステル(35 mg、0.13ミリモル)溶液を攪拌しながら小分割で加えた。得られた黄色懸濁液を室温で1夜攪拌し、粗反応混合物を、50 mMリン酸ナトリウム、pH = 3中の50〜100％メタノール直線勾配で15分に亘って溶出させるC18逆相クロマトグラフィーで精製した。約11分で溶出する主要ピークを数本の注射器からプールし、C8 sep-pakカートリッジ上で脱塩し、蒸発させて黄色固形物10 mg (0.02ミリモル、25％)を得た。1H NMR (CD3OD)δ8.9 (s、1H、DNP H-3)、8.2 (d、1H、DNP H-5)、7.4 (d、1H、ビニル)、7.3 (d、2H)、7.2 (d、1H、DNP H-6)、6.8 (d、2H、芳香族2,6)、6.4 (d、1H、ビニル)、4.5 (m、1H、リジンメチン)、3.5 (t、2H、CH2-NH)、2.1〜1.5 (m、6H、CH2)。
【００４４】
実施例4
DAPM-シンナメート
【００４５】
【化１５】
0004162858.tif 000011
【００４６】
N-(3-(2,4-ジニトロフェニル)アミノ)プロピル)-N-(3-アミノプロピル)メチルアミン、ジヒドロクロリド(DAMP)(45 mg、0.12ミリモル)、トリエチルアミン(35μL、0.25ミリモル)、および4-ヒドロキシケイ皮酸、スクシンイミジルエステル(35 mg、0.13ミリモル)をジメチルホルムアミド(DMF)(1 mL)に溶解し、室温で1夜攪拌した。反応混合物を真空蒸発させ、少量のメタノール/水に溶解し、水中0〜100％メタノール直線勾配で30分に亘って溶出させるC8逆相クロマトグラフィーで精製した。第1の主要ピークを集め、蒸発させて黄色固形物27 mg(0.06ミリモル、49％)を得た。1H NMR (CD3OD)δ8.9 (s、1H、DNP H-3)、8.2 (d、1H、DNP H-5)、7.4 (d、1H、ビニル)、7.3 (d、2H)、7.2 (d、1H、DNP H-6)、6.8 (d、2H、芳香族2,6)、6.4 (l、1H、ビニル)、3.6 (t、2H、CH2-NH)、3.4 (t、2H、CH2-NH)、3.3 (t、2H、CH2-NH)、3.2 (t、2H、CH2-NH)、2.9 (s、3H、メチル)、2.2〜1.9 (m、4H、CH2)。
【００４７】
実施例5
N-α-(4-ヒドロキシシンナモイル)-L-リジン
【００４８】
【化１６】
0004162858.tif 000012
【００４９】
N-ε-BOC-L-リジンヒドロクロリド(78 mg、0.32ミリモル)を0.2Mのホウ酸ナトリウム pH = 8中に懸濁させ、DMF(3 mL)中の4-ヒドロキシケイ皮酸、スクシンイミジルエステル(130 mg、0.50ミリモル)溶液を攪拌しながら小分割で加えた。得られた淡黄色溶液を室温で1夜攪拌し、粗反応混合物を、50 mMリン酸ナトリウム、pH = 3.5中の50〜100％メタノール直線勾配で30分に亘って溶出させるC18逆相クロマトグラフィーで精製した。約25分で溶出する主要ピークを数本の注射器からプールし、蒸発させてガラス状固形物を得、これをトリフルオロ酢酸：水(７:３)(10 mL)で２４時間攪拌しながら脱保護した。溶液を真空蒸発させ、トルエン(３x10 mL)からストリッピングし、エーテルで粉末化して純白でないガラス状固形物97 mg (0.24ミリモル、75％)を得た。
【００５０】
実施例6
N-ε-(5-(および-6)-カルボキシフルオレセイニル)-N-α-(4-ヒドロキシシンナモイル)-L-リジン
【００５１】
【化１７】
0004162858.tif 000013
【００５２】
N-α-(4-ヒドロキシシンナモイル)-L-リジン(24 mg、0，06ミリモル)を水(1 mL)に溶解し、pHを1N NaOHにより9〜10に調整した。5-(および-6)カルボキシフルオレセイン、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(39 mg、0.08ミリモル)を数回分割して固形物として加え、反応混合物を室温で1夜攪拌し、50 mMリン酸ナトリウム、pH = 3.5中の50〜100％メタノール直線勾配で30分に亘って溶出させるC18逆相クロマトグラフィーで精製した。主要ピークを数本の注射器からプールして、0.06ミリモル(100％)の所望生成物を含有する黄色溶液を得た。
【００５３】
実施例7
サイトメガルウィルス(CMV)早期抗原の検出
スライド上のCMV感染細胞(CMV感染させたMRC-5細胞を含む8ウェルスライド、Hemagen Diagnostics社)を、リン酸緩衝液(PBS)で2分間水和させた。抗CMV-セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲート(Ishikawa, E. et al., J. Immuunoassay, 4, 209-237, 1983の方法の変形法により調製)を、0.1Mトリス、0.15M NaCl、0.5％ミルクタンパク質、pH7.5中で希釈し、上記スライド上で37℃、30分間インキュベートした。次いで、スライドを0.1Mトリス、0.15M NaCl、0.05％ tween 20、pH7.5 (TNT) 緩衝液で2分間洗浄した。ビオチニル-チラミド(NEN Life Science Products社、NEL-700)を増幅希釈液(Amplification Diluent) (NEN Life Science Products社、NEL-700)中で2μg/mlに希釈し、スライドのウェルの１つに入れ、室温で10分間インキューベートした。N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミンを増幅希釈液中で0.2μg/mlに希釈し、スライドの第2のウェルに入れ、室温で10分間インキュベートした。スライドをTNT緩衝液で2回各2分間洗浄した。ストレプタビジン-フルオレセイン(NEN Life Science Products社、NEL-720)をTNT緩衝液中で1:500に希釈し、室温で30分間インキュベートした。スライドをTNT緩衝液で3回各5分間洗浄した。エバンスブルー(0.001％)をスライド上で1分間インキュベートし、スライドを脱イオン水で2回洗浄し、風乾させた。フェージング防止取りつけ媒体(anti-fade mounting media) (Vectashield)とスリップカバーを取り付けたのち、スライドを、Zeiss蛍光顕微鏡で200倍で画像化した。
【００５４】
結果：図2は、ビオチニル-チラミドよりも10倍低い濃度で本発明の基質、N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミンを用いることにより、明るいCMV感染核によって示されるようにはるかに優れた感度が得られることを示唆している。その感度は、ビオチニル-チラミド増幅によっては検出されなかった内因性パーオキシダーゼ活性がN-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミンの使用により明白に検出される程である。日常の実施においては、内因性パーオキシダーゼ不活化工程を用いるが、この工程を、本実施例においては、N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミンを使用して得られる優れた効果をさらに具体的に示すために用いなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  触媒型レポーター付着を用いてディテクターシグナルを増幅させたサイトメガロウィルス早期抗原の検出を示す。HRPがADEASであり、ビオチンチラミンがコンジュゲートであった。
【図２】  触媒型レポーター付着を用いてディテクターシグナルを増幅させたサイトメガロウィルス早期抗原の検出を示す。HRPがADEASであり、N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミンがコンジュゲートであった。このコンジュゲートは、ビオチンチラミンの10倍低い濃度で用いた。
【図１】
0004162858.tif 000016
【図２】
0004162858.tif 000017