(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス属、エンテロコッカス属、およびラクトバチルス属からなる群から選択される属に属する、ナイシン生産性の乳酸菌を、豆乳培地もしくはスキムミルク培地、またはこれらの組み合わせからなる培地で培養することを含んでなる、ナイシンの製造法。
【請求項２】
乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＩＦＯ  １２００７、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １９４３５、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２３６５５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  ８０１４  、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９１７、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＪＣＭ  １０５７、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＪＣＭ  １１４９、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＪＣＭ  １５５１である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
培地中の大豆固形分濃度が、８〜１２％である、請求項１に記載の製造法。
【請求項４】
培地中のスキムミルク濃度が、７〜１５％である、請求項１に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、飲料や食品の香味に影響を及ぼさず、低濃度の添加が可能で、安全かつ高い抗菌活性を有する乳酸菌発酵生産物の製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
乳酸菌のある種のものはバクテリオシンと呼ばれる抗菌活性物質を生産する。これらは発酵食品に含まれて、昔から食品の保存性を高めていることがよく知られており、長い食経験上からも安全性が評価されている。中でもナイシンは熱に安定で１００℃、１５分間の加熱でも分解せず、食品や飲料でも使用しやすく、通常のタンパク質分解酵素例えば胃の消化酵素で容易に分解されることがわかっており安全性が証明されている（森地敏樹ら編「バイオプリザベーション」（２０００）幸書房）。
【０００３】
バクテリオシンを生産する乳酸菌は、例えば、乳製品由来でナイシンを生産するLactococcucs lactis のグループが有名である。しかし、乳酸菌研究集談会編「乳酸菌の科学と技術」学会出版センター（1996）に記載されるように、乳酸菌は一般に独特の香味、例えば乳酸に代表される酸味やダイアセチルやアルデヒド等の異臭を生産して発酵物に呈する。これら香味は特定の発酵食品には重要な風味を形成するが、一方このような発酵物が含むバクテリオシンを飲料や惣菜等の食品の汚染菌抑制に使用のため添加すると、その風味やテクスチャーに影響を与える。また、これを避けるために、風味に影響のない低い添加量では、含まれるバクテリオシンの濃度は低く充分な抗菌活性は得られなかった。
【０００４】
このため、高い抗菌活性（以下「静菌活性」を含む意味で用いられる）を得て添加濃度を低くするため、特開平５−２６８９７５号に記載のような、コーンスティープリカーや酵母エキスの窒素源とバレイショ成分の糖源を組み合わせた培地による培養方法が提案されている。しかし、この発酵物は、例えばスープ等のような香味の濃厚な食品では欠点が現れにくいが、香味が濃厚でない清涼飲料等で期待する抗菌効果を得るための量を添加すると香味上の問題が発生し、依然として香味上の問題点は解決されていない。
【０００５】
一方、中野政弘編「発酵食品」光琳全書２１（１９６７）に記載されているように、豆乳を乳酸菌等で発酵させ、食品として利用する方法は良く知られ、いずれもその目的は、栄養的に改善したり、新しい乳製品風飲料や食品であった。前者の具体例としては、特開２００１−３４００５９号に記載の、生体に有用な大豆イソフラボンをアグリコンとする例がある。また、後者の具体例としては特開２００２−５１７２０号に、豆乳に乳酸菌の資化しやすい糖質や甘味料を加え、風味を改善した発酵豆乳の例がある。これら技術は、豆乳の乳酸菌発酵により香味的や栄養的に優れたものを生産する方法であり、これらの発酵物は本発明によるものとは利用目的が全く異なるものである。更に、使用している乳酸菌も、例えば乳酸菌研究集談会編「乳酸菌の科学と技術」学会出版センター（１９９６）や中野政弘編「発酵食品」光琳全書２１（１９６７）で記載されているように、Lactobacillus bulgaricusやStreptococcus属等でこれらはナイシン等のバクテリオシンを生産しない。
【０００６】
【発明の概要】
一般に乳酸菌の増殖に適した基本培地は、乳酸菌研究集談会編「乳酸菌の科学と技術」学会出版センター（１９９６）に記載されている脱脂乳、乳成分ホエータンパク質、トマト果汁、麦芽エキス、酵母エキスと糖の混合等多くのものが挙げられる。しかしこれらの培地はいずれも不快な香味成分を生じさせた。例えば、これらの培地を発酵させた培養液の上澄液についてブライドによる官能検査（パネル数８名）を実施したところ、いずれの培養液について全てのパネルがダイアセチル様の不快な香味を指摘し、しかも高い抗菌活性も得られなかった。
【０００７】
このような背景のもと本発明者等は、意外にも、Lactococcus lactis やEnterococcus faecalis などの乳酸球菌類および Lactobacillus plantarumなどの乳酸桿菌を、大豆抽出物を主成分とする培地やスキムミルクを含有する培地で培養したところ、ナイシン様の抗菌活性物質が高濃度で製造でき、かつ培養物が香味に影響を与えないことを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は、飲料や食品の香味に影響を及ぼさず、低濃度の添加が可能で、安全かつ高い抗菌活性を有する乳酸菌発酵生産物の製造方法の提供をその目的とする。
【０００９】
本発明による抗菌活性物質の製造法は、抗菌活性物質生産性の乳酸菌を大豆抽出物および／またはスキムミルクを含む培地で培養することを含んでなる方法である。
【００１０】
【発明の具体的説明】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１１】
１．乳酸菌
本発明に用いることのできる抗菌活性物質生産性の乳酸菌は、ナイシン等の抗菌活性物質を生産する乳酸菌であれば特に限定されるものではないが、例えば、森地敏樹ら編「バイオプリザベーション」（２０００）幸書房に記載のバクテリオシンを生産する属種の中から選抜することができる。乳酸菌は、例えば、対照区をＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ）やコーンスティープ培地（特開平５−２６８９７５号）とし、さらに試験区を豆乳培地やスキムミルク培地として試験菌を培養し、そのそれぞれの培養液をMayr-Harting.A.,et al.”Methods in Microbiology 7A.,Methods for studying Bacteriocins”(1976)p.327.  Academic Press.に基づいたペーパーディスク法を実施することにより選抜できる。ペーパーディスク法は、培養液５０μLをΦ６ｍｍのペーパーディスクに染み込ませ、このディスクをStaphylococcus aureus ＦＤＡ ２０９Ｐ（ＡＴＣＣ  ６５３８Ｐ）を指標菌にして接種した標準寒天培地（栄研）表面に乗せて３５℃、４８時間培養することによってコロニー周辺のハロー（増殖阻止円）を形成するか否かを調べることにより、およびそのハローの大きさが対照区より大きいか否かを調べることにより実施することができる。
【００１２】
抗菌活性物質生産性の乳酸菌の好ましい例としては、乳酸球菌のLactococcus lactis subsp. lactis IFO 12007、Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435、Enterococcus faecalis IFO 3938、Enterococcus faecalis ATCC 23655 、並びに乳酸桿菌のLactobacillus plantarum ATCC 8014 、Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus plantarum  JCM 1057、Lactobacillus plantarum  JCM 1149、Lactobacillus plantarum  JCM 1551が挙げられる。これらの菌株は、発酵研究所（ＩＦＯ）やアメリカンタイプカルチャコレクション（ＡＴＣＣ）および理化学研究所（ＪＣＭ）から容易に入手できる。
【００１３】
２．培地
培養に当たっては、大豆抽出物やスキムミルクを、単独であるいは組み合わせて、培地として使用することができる。
【００１４】
大豆抽出物を培地に使用する場合には、常法により得られるものでも市販されているもののいずれをも用いることができる。例えば、乾燥大豆や脱脂大豆をそのまま粉砕して水を加えたり或いは水浸漬して含水状態で摩砕したりしたものを濾過し、不溶性画分を除去したものや、市販されている無調製のもの（大豆成分以外のものを使用していないもの；例えば、豆乳）を培地として使用できる。
【００１５】
大豆抽出物の濃度は、大豆固形分２％以上、好ましくは４％以上、さらに好ましくは５％以上１５％以下、最も好ましくは８％以上１２％以下であることができる。ここで大豆固形分濃度は、日本農林規格（ＪＡＳ）で定義された、乾燥により水分を蒸発させて残った固形物残渣濃度で示す。
【００１６】
スキムミルクを培地に使用する場合には、常法により得られるものでも市販されているもののいずれをも用いることができる。例えば、粉体の脱脂乳をそのまま水に溶解させたものをスキムミルク培地として用いることができる。
【００１７】
スキムミルク培地の濃度は５％以上、２０％以下、さらに好ましくは７％以上１５％以下が望ましい。
【００１８】
必要であれば、乳酸菌の生育を助けるような成分を培地に添加してもよい。添加成分は飲食品に添加した場合にその香味を損なわなわず、かつ食品として安全な成分が好ましい。
【００１９】
３．培養条件
大豆抽出物を培地として用いる場合には、培地を通常の熱処理或いは濾過等で滅菌し、水を加え、必要な場合には、常法によりｐＨ調整する。ｐＨは乳酸菌の生育できる３以上９以下であればよく、好ましくは４以上８以下である。ｐＨ調整された培地に前培養した乳酸菌を添加し、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、より好ましくは２８〜３２℃で、６〜４８時間、好ましくは９〜４８時間、培養することによって抗菌活性の高い培養物を得ることができる。
【００２０】
スキムミルクを培地として用いる場合には、上記と同様に熱処理或いは濾過等で滅菌することができる。通常、スキムミルクは乳酸菌の生育に適しているのでｐＨは調整する必要はないが、必要に応じて、上記大豆抽出物の場合と同様にｐＨ調整すればよい。前培養した当該乳酸菌を準備した培地に添加し、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、より好ましくは２８〜３２℃で、６〜４８時間、好ましくは９〜４８時間、培養することによって抗菌活性の高い培養物を得ることができる。
【００２１】
培養の終了はいずれの培地を用いた場合でも、１０〜３６時間を目処とすることができ、この時点で抗菌活性物質濃度が最も高くなる。具体的には、抗菌活性物質濃度は１２，０００〜２０，０００Ｉ．Ｕ．／ｇ（ナイシン換算）になる。抗菌活性物質濃度の値がこの範囲内にある時点を培養終了の目安とすることができる。なお、培養物をベースにした飲食品の種類等によっては、例えば抗菌活性物質濃度としてより低い３０００〜１２０００Ｉ．Ｕ．／ｇ（ナイシン換算）であっても十分にその抗菌活性を発揮することができ、この場合には１０〜２４時間で培養を終了させることも可能である。
【００２２】
培養物は森地敏樹ら編「バイオプリザベーション」（２０００）幸書房）に記載のように耐熱性で、６０〜１２１℃の加熱処理や殺菌処理を行うことも可能であり、加熱することにより抗菌活性を保持したまま乳酸菌の増殖を停止させ培養を終了させることもできる。
【００２３】
４．培養物および抗菌活性物質並びにそれらの用途
本発明による培養物に含まれる抗菌活性物質は、優れた抗菌活性を有し、特に、飲料で問題となるBacillus 属やAlicyclobacillus 属やレトルト食品で問題となるBacillus 属やClostridium 属等の耐熱性芽胞性菌に対して優れた効果を有する。従って、本発明による培養物およびその上澄み液は飲食品への抗菌用添加物として、あるいは抗菌製剤として用いることができる。
【００２４】
培養物およびその上澄み液は、そのまま飲食品に添加しても、培養物中の抗菌活性物質のみを取り出して飲食品に添加してもよい。また、得られた培養物およびその上澄み液は、そのまま、あるいは抗菌活性物質のみを取り出して、抗菌製剤として提供することもできる。抗菌活性物質の単離・精製は、例えば、培養物を分取ＨＰＬＣに供することにより行うことができる。このような方法は周知であり、当業者であれば抗菌活性物質の分離・精製方法は自明であろう。抗菌活性物質の精製に当たっては、例えば、森地敏樹ら編「バイオプリザベーション」（２０００）幸書房を参照をすることができる。
【００２５】
本発明による方法により得られる培養物は抗菌活性物質濃度が高いことから、飲食品への添加に当たっては、例えば特開平５−２６８９７５号記載の従来の培養物の約１０分の１相当の量で抗菌効果を得ることができる。具体的には、ナイシン換算で１Ｉ．Ｕ／ｇ以上、好ましくは５〜３００Ｉ．Ｕ／ｇ、より好ましくは１〜１００Ｉ．Ｕ／ｇの抗菌活性となるように飲食品に添加することができる。ナイシン換算の抗菌活性（Ｉ．Ｕ．）は、抗菌活性物質であるナイシン標準物質（シグマ社製、４％含有）の活性、１ｍｇ／ｋｇ＝４０Ｉ．Ｕ／ｇに換算した値を用いた。ここで「Ｉ．Ｕ．」は抗菌活性を表す国際単位であり、International Unitの略である（森池敏樹ら編「バイオプリザベーション」（２０００）幸書房）。
【００２６】
本発明による培養物は使用対象によりそのまま懸濁した状態で、あるいは遠心分離などの固液分離を行い上澄液部分を回収して使用することができる。また、前述のように耐熱性であるのでさらにこれらに凍結乾燥やスプレードライ等の加工を施して使用することも可能である。
【００２７】
本発明による培養物が添加できる飲食品は特に限定されるものではないが、例えば、果汁飲料、野菜飲料、果汁と野菜の混合飲料、ニアウオーター飲料等の非アルコール飲料；麦酒、発泡酒、チューハイ、発泡性ワイン等のアルコール飲料；各種スープ、カレー、シチュー、和洋中華の各惣菜類、農水産加工食品、乳製品、食肉加工食品等の食品；マヨネーズ、ドレッシング、ソース、ケチャプ等の調味料が挙げられる。
【００２８】
本発明による培養物はほぼ無味無臭であるため、添加した飲料や食品の本来の風味に影響はないので、商品設計上の制限が小さくなり、商品開発の面でのメリットも大きい。即ち、飲食品本来が有する独特の風味を損なわない新しい発酵商品の設計が可能となる。
【００２９】
本発明による培養物はまた、抗菌活性物質濃度が高いので、重量比率でいえば、例えば１％以下、さらには０．１％程度の小さな添加率で使用することができる。更に、それ自体無味無臭に近いので添加対象となる飲料や食品に不快な香味や品質上の問題点を与える影響が小さい。例えば、果汁を用いた飲料の場合には、耐熱性芽胞菌による汚染を防ぐため必要に応じて加熱処理がなされているが、加熱により加熱臭が生じ、品質の低下が懸念される。この点、本発明による培養物を添加すれば抗菌効果と同時に加熱殺菌の低減や省略により品質の劣化防止という大きな効果が期待できる。
【００３０】
【実施例】
本発明を下記例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
豆乳培地（大豆固形分８％の市販豆乳（名酪）１Ｌ）、ＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ）、コーンスティープ培地（特開平５−２６８９７５号に記載の組成の培地：グルコース１％、マッシュドポテト１％、コーンスティープリカー１％、酵母エキス１％を含む１Ｌ培地）および１０％スキムミルク培地（ＤＩＦＣＯ、１Ｌ培地）それぞれに、Lactococcus lactis subsp. lactis IFO 12007を、前培養液の添加率が０．５ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で１２時間静置培養した。得られた培養液を８０℃、２０分間加熱処理後、遠心分離によって得られた上澄液をMayr-Harting.A. et al.,”Methods in Microbiology 7A.,Methods for studying Bacteriocins”(1976)p.327.  Academic Press.に基づいたペーパーディスク法、即ち、培養液５０μＬをΦ６ｍｍのペーパーディスクに染み込ませこれをよりStaphylococcus aureus  FDA 209P（ＡＴＣＣ  ６５３８Ｐ）を指標菌にして接種した標準寒天培地（栄研）表面に乗せて３５℃、４８時間培養し、これによって形成されるコロニー周辺のハロー（増殖阻止円）の大きさから、標準ナイシンの濃度とハローの大きさで検量線を書き、これに基づいてその抗菌活性物質濃度を、ナイシン（シグマ製）を対照として、ナイシン当りに換算したところ、スキムミルク培地で１２，０００Ｉ．Ｕ．／ｇの、豆乳培地で２０，０００Ｉ．Ｕ．／ｇの高い生産濃度を示した（表１）。
【００３２】
【表１】
0004101553.tif 000002
【００３３】
また他の乳酸菌株８種（Lactococcus lactis subsp. lactis  ATCC 19435、Enterococcus faecalis  IFO 3938、 Enterococcus faecalis  ATCC 23655、Lactobacillus plantarum ATCC 8014、Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus plantarum JCM 1057、Lactobacillus plantarum  JCM 1149、およびLactobacillus plantarum JCM 1551）についても同様の試験を行った。試験条件はコーンスティープ培地を用いなかったこと以外実施例１に準じた。結果は表２に記載の通りである。
【００３４】
【表２】
0004101553.tif 000003
【００３５】
いずれの菌株においても対照区のＭＲＳ培地に比べて１０％スキムミルク培地や豆乳培地を用いた場合により高い抗菌活性物質濃度を示した。
【００３６】
尚、表１と表２から明らかなようにいずれの菌株を用いた場合でも培地の種別では豆乳培地を用いた場合により高い濃度の抗菌活性物質が生産された。
【００３７】
実施例２
実施例１のLactococcus lactis subsp. lactis ＩＦＯ１２００７株を用いて、豆乳培地中の大豆固形分濃度：４％、５％、８％、１０％、１２％、１５％、或いはスキムミルク培地中のスキムミルク濃度：５％、７％、１０％、１５％、２０％と抗菌活性物質生産濃度との関係につき、試験を行った。該株を上記培地の種類と濃度を別々に設定し、３０℃、２４時間静置培養した。他の培養条件及び試験方法は実施例１に準じた。
【００３８】
その結果、豆乳培地中の大豆固形分濃度が８〜１２％の時に最大の抗菌活性物質生産濃度：２０，０００Ｉ．Ｕ．／ｇを示し（表３）、スキムミルク培地中のスキムミルク濃度が７〜１５％の時に最大の抗菌活性物質生産濃度：１２，０００Ｉ．Ｕ．／ｇを示した（表４）。
【００３９】
【表３】
0004101553.tif 000004
【００４０】
【表４】
0004101553.tif 000005
【００４１】
実施例３
実施例１で調製した乳酸菌株９種の豆乳培養物の上澄液をそれぞれ１ｗ／ｗ％で、オレンジ果汁に添加した添加区（添加区）と上澄液を添加しない対照区（対照区）を設け、ブラインドによる１２名のトライアングル試飲試験を行った。その結果、添加区と対照区とでオレンジ果汁の香味差を認めたのは各菌株ともコーンスティープリカー培地の培養物の上澄液を用いた場合であった。
【００４２】
一方、豆乳の発酵物を用いた場合にはオレンジ果汁の香味差はないと１０名以上が回答したことから、添加区と対照区とで有意な香味上の差は認められなかった。同様の実験を各乳酸菌株９種のスキムミルク培養物の上澄液で行ったところ、Enterococcusの２株の上澄液で差がないと回答したのが９名で、それ以外は１０名以上が差がないと回答した。これらも同様に有意な香味上の差は認めらなかった。
【００４３】
実施例４
実施例１で調製した乳酸菌株９種の豆乳培養物の上澄液をそれぞれ１ｗ／ｗ％で、オレンジ果汁に添加し、果汁の汚染菌として知られているAlicyclobacillus acidoterrestris DSM 3923を１０３細胞／ｍｌになるように接種し、４５℃で培養したところ３日後にはいずれの乳酸菌株の培養物の上澄液添加区でも生菌数は０細胞／ｍｌとなり抗菌効果を示した。しかし、上澄液を添加しなかった対照区ではいずれも１０８細胞／ｍｌに増殖していた。
【００４４】
実施例５
実施例１で調製した乳酸菌株９種のスキムミルクおよび豆乳の培養物をそれぞれ１ｗ／ｗ％、市販のレトルトカレーに添加し、これに汚染耐熱指標細菌であるBacillus coagulans 1106（日本缶詰協会分譲株）を１０４細胞／ｍｌになるように接種し、３５℃で培養したところ３日後にはいずれの乳酸菌株の培養物の上澄液添加区でも生菌数は０細胞／ｍｌとなり抗菌効果を示した。しかし、上澄液を添加しなかった対照区では１０９細胞／ｍｌに増殖していた。