(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中に電子と正に帯電したホールが形成されるように紫外線(ＵＶ)光を吸収できる粒子およびキャリアを含むＵＶ遮蔽組成物であって、粒子が、水性環境下でＵＶ光に曝露されると、電子および／または正に帯電したホールの粒子表面への移動を最小にするように適合され、該粒子がルミネッセンストラップ部位および／またはキラー部位を提供するために第２成分を組み込んだ酸化亜鉛または二酸化チタンのホスト格子を含み、第２成分が、３＋状態のマンガンまたは３＋状態のクロムであり、該粒子が平均的な主な粒子寸法１〜１００ｎｍを有することを特徴とするＵＶ遮蔽組成物。
【請求項２】
粒子が、３＋状態のマンガンイオンでドープされた二酸化チタンホスト格子を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
第２成分が約0.1〜１％の量で存在する請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
粒子寸法が１〜５０ｎｍである請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
粒子が外側コーティングを有する請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
外側コーティングがアルミニウム、ジルコニウムまたはケイ素の酸化物である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
粒子が二酸化チタンと第２成分の塩とを６００℃〜１０００℃の温度で焼成することにより得るものである請求項１〜６いずれかに記載の組成物。
【請求項８】
二酸化チタンがルチル型である請求項１〜７いずれかに記載の組成物。
【請求項９】
局所用途のための請求項１〜８いずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
化粧用に配合される請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
日焼け止め剤である請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
ＵＶＡ日焼け止め剤、ＵＶＢ日焼け止め剤または広域バンド日焼け止め剤を追加的に含有する請求項１０または１１記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８いずれかに記載のＵＶ遮蔽組成物を含むプラスチック組成物。
【請求項１４】
請求項１〜８いずれかに記載のＵＶ遮蔽組成物を含む顔料および染料組成物。
【請求項１５】
請求項１〜８いずれかに記載のＵＶ遮蔽組成物を含むコーティング組成物。
【請求項１６】
塗料である請求項１５に記載のコーティング組成物。
【請求項１７】
ＵＶ放射線を遮蔽してホストに対するＤＮＡ損失を少なくするために局所用途の日焼け止め剤組成物に用いるための請求項１〜８いずれかに記載の粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＵＶ遮蔽組成物、その調製法およびその使用に関する。本発明は、特に、例えば粒子酸化物を含む組成物、その調製およびその使用（例えば、塗料、プラスチックス、コーティング、顔料、染料および局所適用のための組成物、特に、例えば、日焼け止め剤）に関する。
【０００２】
日光への曝露に関する影響はよく知られている。例えば、塗装表面は、退色することがあり、ＵＶ−Ａ光およびＵＶ−Ｂ光への肌の曝露は、例えば、日焼け、早発の老化および皮膚ガンと成り得る。
【０００３】
市販の日焼け止め剤は、一般に、ＵＶ光反射および／または吸収できる成分を含有している。この成分としては、例えば、酸化亜鉛や二酸化チタンのような無機酸化物が挙げられる。
【０００４】
日焼け止め剤中の二酸化チタンは、一般には、「微粉化された」または「超微細な」（20〜50ｎｍ）粒子（いわゆるミクロ反射物）として配合されているので、レイリー則に従って光を散乱させ、それによって散乱光の強度は、波長の４乗に逆比例する。その結果として、それは、可視波長よりも長い波長の（290〜320ｎｍの波長の）ＵＶ−Ｂ光および（320〜400ｎｍの波長の）ＵＶ−Ａを散乱させて、肌に目に見えないものを残しながら、日焼けを予防する。
【０００５】
しかしながら、二酸化チタンは、ＵＶ光も有効に吸収して、酸化を開始させることがある超酸化物およびヒドロキシラジカルの形成を触媒作用する。ＴｉＯ2の結晶形（アナターゼおよびルチル）は、約385ｎｍおよび400ｎｍの光に相当する約3.23ｅＶおよび3.06ｅＶのバンドギャップエネルギーをそれぞれ有する半導体である（１ｅＶは、8066ｃｍ-1に相当する。）。
【０００６】
入射光子は、そのエネルギーが図１に示される半導体バンドギャップＥｇよりも大きければ二酸化チタンによって吸収される。結果として、原子価バンド（ｖｂ）からの電子が伝導バンド（ｃｄ）に活性化される（遷移〔１〕）。入射光子のエネルギーがＥｇよりも小さければ、電子がバンドギャップ内へ活性化されて、このエネルギー状態が禁制される必要があるため、入射光子は吸収されない。活性化されると、電子は、過剰のエネルギーが結晶格子へ熱として放射されることにより、伝導バンドの基部(bottom)へ緩和される（遷移〔２〕）。
【０００７】
電子は、活性化されると、原子価バンド中で正の粒子として作用するホールの後ろに残される。次いで、電子とホールが共に、二酸化チタンの周りを自由に移動する。電子とホールは、バンドギャップエネルギーと等しいエネルギーの光子を放射して、再結合する。しかし、電子／ホール対の寿命は、電子バンド構造の特定の性質により、事実上長い。そのため、電子とホールが表面に移動して吸収された種と反応するのに十分な時間がある（約１０-11ｓ）。
【０００８】
水性環境下では、電子は酸素と反応し、ホールはヒドロキシイオンまたは水と反応して、超酸化物とヒドロキシルラジカルを形成する。
TiO2 + hν → TiO2(e-/h+) → e・(cb) + h+(vb)
e-(cb) + O2 → O2・- → HO・2
h+(vb) + OH- → ・OH
【０００９】
これは、環境汚染物質の統合的な酸化、特にアナターゼ（より活性な形態）と関連して広く研究されている〔エイ・シュラファニら著、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー、（1996年）、100、第13655頁〜第13661頁〕。
【００１０】
そのような光子−酸化は、放射線照射された二酸化チタンの、生物学的分子を攻撃する能力を説明し得ることが提案されている。日焼け止め剤である二酸化チタン粒子は、しばしば、ヒドロキシラジカルをトラップでき、それによって表面反応を低減できる水和酸化物を形成するアルミナ、シリカおよびジルコニアのような化合物でコーティングされる。しかし、ＴｉＯ2／Ａｌ2Ｏ3およびＴｉＯ2／ＳｉＯ2の調製は、高い活性を示す〔シー・アンダーソンら著、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー、（1997年）、101、第2611頁〜第2616頁〕。
【００１１】
二酸化チタンはヒトの細胞に入ることがあるため、近年、ＤＮＡ損傷を発生させる放射線照射された二酸化チタンの能力も調査事項となっている。日焼け止めから抽出される粒状の二酸化チタンや純粋な酸化亜鉛は、ソーラーシミュレーターによる照射に曝露されると、生体外やヒト細胞内でＤＮＡ損傷を引き起こす〔アール・ダンフォードら著、ＦＥＢＳレター、（1997年）、418、第87頁〜第90頁〕。
【００１２】
本発明は、上述の問題を取り扱い、かつ通常の日焼け止め組成物よりも照射におけるＤＮＡ損傷をより生じさせ難いＵＶ遮蔽組成物を提供する。
【００１３】
従って、本発明は、中に電子と正に帯電したホールが形成されるように、ＵＶ光、特に波長が390ｎｍ以短のＵＶ光を吸収できる粒子を含むＵＶ遮蔽組成物であって、粒子が水性環境下でＵＶ光に曝露されると、粒子が電子および／または正に帯電したホールの粒子表面への移動を最小にするように適合されることを特徴とするＵＶ遮蔽組成物を提供する。この環境下では、ヒドロキシルラジカルの生成が実質上低減されると考えられる。すなわち、ヒドロキシルラジカルの生成が実質上予防できる。
【００１４】
電子および／または正に帯電したホールの粒子の表面への移動の最小化は、例えば、本発明の粒子またはＵＶ遮蔽組成物の存在下、光によってＤＮＡに加えられた鎖切断の数の低下を、従来の日焼け止め組成物に用いられる粒子と光、または光単独で処理したＤＮＡ中に観られる鎖切断の数と比較して調べることにより、試験することができる。
【００１５】
本発明の組成物は、塗料、プラスチックス、コーティング、顔料、染料のような用途に見出されることができ、特に局所適用のための組成物、特に日焼け止め剤での使用に好ましい。
【００１６】
粒子の平均的な主な粒子寸法は、一般に、約１〜200ｎｍ、例えば、約50〜150ｎｍ、好ましくは約１〜100ｎｍ、より好ましくは約１〜50ｎｍ、もっとも好ましくは約20〜50ｎｍである。例えば、日焼け止め剤中の粒子寸法は、好ましくは最終製品の着色を妨げないように選択されれう。このために、約50ｎｍ以下、例えば、特に約３〜20ｎｍ、好ましくは約３〜10ｎｍ、より好ましくは約３〜５ｎｍの粒子が好ましい。
【００１７】
粒子が実質上球形であれば、粒子寸法は、直径で表されるようになる。しかし、本発明は非球形の粒子も包含し、その場合、粒子寸法は最も大きな寸法をいう。
【００１８】
第１態様において、本発明は、ルミネッセンストラップ部位および／またはキラー部位を含有する粒子を含むＵＶ遮蔽組成物を提供する。ルミネッセンストラップ部位とキラー部位は、電子と正に帯電したホールをトラップして、移動を抑制するように設計された異質のイオンであると考えられる。
【００１９】
粒子は、例えば、還元された酸化亜鉛粒子、特に寸法が約100〜200ｎｍであるかまたはそれよりも小さな（例えば約20〜50ｎｍ）、還元された酸化亜鉛粒子であってよい。
【００２０】
そのような還元された酸化亜鉛粒子は、ＵＶ光、特に波長が390ｎｍ以短のＵＶ光を吸収し、かつ還元雰囲気においてＵＶを再発光する酸化亜鉛粒子を加熱して、ＵＶ光、特に波長が390ｎｍ以短のＵＶ光を吸収して、緑色に（約500ｎｍで）再発光する、還元された酸化亜鉛粒子を得ることにより、容易に入手できる。還元された酸化亜鉛粒子は、電子および／または正に帯電したホールの粒子表面への移動を最小化することと一致する、還元された酸化亜鉛を含有することから、粒子が水性環境下でＵＶ光に曝露されると、上述の通り、ヒドロキシルラジカルの生成が実質上低減されるであろうと考えられる。
【００２１】
酸化亜鉛は、好ましくは水素約10体積％および窒素約90体積％の雰囲気下、例えば、約800℃で約20分間加熱される。
【００２２】
還元された酸化亜鉛粒子は、吸収コア内に過剰のＺｎ2+イオンを有していると考えられる。これは、局在状態であるので、バンドギャップ内に存在し得る。遷移〔１〕および〔２〕が図１に示すように生じることがある。しかし、電子とホールは、次に、図２に示すような過剰のＺｎ2+状態に緩和することができる（遷移〔３〕）。従って、電子とホールは、粒子表面に移動できず、かつ吸収された種と反応できないようにトラップされ得る。その後、電子とホールは、エネルギーレベルの差に等しいエネルギーを有する光子の放出によって付随されるＺｎ2+状態で再結合され得る（遷移〔４〕）。
【００２３】
あるいは、本発明の粒子は、ルミネッセンストラップ部位および／またはキラー部位を提供するために第２成分を組み込んだホスト格子を含むことがある。ホスト格子は、好ましくは酸化物、特に例えばＴｉＯ2やＺｎＯ、または例えばリン酸塩、チタン酸塩、ケイ酸塩、アルミン酸塩、オキシケイ酸塩、タングステン酸塩およびモリブデン酸塩から選択され得る。第２成分は、例えば、イオン寸法のような基準に従って選択され得る。本発明での使用に好適な第２成分は、例えば、ニッケル、鉄、クロム、銅、錫、アルミニウム、鉛、銀、ジルコニウム、マンガン、亜鉛、コバルトおよびガリウムイオンから選択され得る。好ましくは、第２成分は、３＋状態の鉄、クロム、マンガンおよびガリウムイオンから選択される。本発明の好ましい粒子は、３＋状態のマンガンイオンでドープされた二酸化チタンホスト格子を含んでいる。
【００２４】
ホスト格子中の第２成分の最適な量は、慣例の実験によって決定できる。第２成分の量がＵＶ遮蔽組成物の使用に依存し得ることは、高く評価されるであろう。例えば、局所適用のためのＵＶ遮蔽組成物において、ホスト格子中の第２成分の量は、粒子が着色しない程度に低いことが望ましいことがある。３＋状態のマンガンイオンでドープされた二酸化チタンの場合、二酸化チタンホスト格子中、マンガン0.5％が、シミュレートされた日光によって与えられたＤＮＡ損傷の速度を低下させるのに有効であることが分かっている。しかし、0.1％程度の低い量（例えば、0.05％）または１％以上の高い量（例えば、５％または10％）も使用され得る。
【００２５】
ドーパントイオンを、通常、600℃〜1000℃での焼成技術によってホスト格子中に組み込むことができる。すなわち、例えば、この粒子は、ルミネッセンストラップ部位および／またはキラー部位を提供するためにホスト格子を第２成分と結合することにより、既知の方法で得ることができる。
【００２６】
この粒子に関する下方遷移のメカニズムは、還元された亜鉛粒子に関する上述の記載通りであると考えられる。
【００２７】
別の態様において、本発明は、金属酸化物のコーティングされたナノ粒子の母集団を含む粒子を含むＵＶ遮蔽組成物を提供する。金属酸化物は、好ましくは二酸化チタンである。コーティングは、一般には、広いバンドギャップ材料であり、好ましくはトリオクチルホスフィンオキサイド〔ＴＯＰＯ〕およびナトリウムヘキサメタホスフェート〔（ＮａＰＯ3）6〕から選択される表面活性剤である。ナノ粒子の寸法は、一般には、１〜10ｎｍ、好ましくは１〜５ｎｍである。
【００２８】
ナノ粒子はチタン塩、好ましくは塩化チタン（ＩＶ）をアルコールに溶解することによって得ることができることが分かった。アルコールは、一般にメタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールから選択される。好ましくは、アルコールは、メタノールまたはプロパノールである。アルコールの脱水特性は、水酸化物形態の形成を抑制するのに役立つ。界面活性剤は、チタンイオンと結合して表面層を形成するために添加される。一般には、チタンイオン：界面活性剤の比は１：１である。
【００２９】
次に、溶液のｐＨをモニターすると同時に、水酸化ナトリウムのアルコール溶液、好ましくは１Ｍメタノール溶液を、酸化物ナノ粒子が沈殿するまで滴下する。アルコールは蒸発するので、酸化物粒子が凝集する。粒子を洗浄して、過剰の界面活性剤を除去し、その後、残りのアルコールを蒸発させて二酸化チタンナノ粒子を粉末として残す。ナノ粒子の調製は、一般に、不活性雰囲気、好ましくは窒素またはアルゴン雰囲気下で行われる。その後、ナノ粒子の母集団を化合して、本発明のより大きな粒子を形成することができる。
【００３０】
ＵＶ光の吸収により、生成された電子とホールを、本発明の粒子内の特定のナノ粒子に閉じ込めて、それにより電子および／またはホールの粒子表面への移動を最小にすることができる。ナノ粒子は、電子とホールとの再結合速度を高めることができるという点で有益でもあることがある。電子とホールは、図３に示すようなバンドギャップと等しいエネルギーの光子の放出により再結合できる。
【００３１】
本発明の粒子は、無機または有機コーティングを有していてよい。例えば、粒子は、アルミニウム、ジルコニウムまたはケイ素のような元素の酸化物でコーティングされていてよい。金属酸化物の粒子は、ポリオール、アミン、アルカノールアミン、高分子有機ケイ素化合物（例えば、ＲＳｉ[ＯＳｉ(Ｍｅ)2ｘＯＲ']3；ここで、ＲはＣ1−Ｃ10アルキルであり、Ｒ'はメチルまたはエチルであり、ｘは４〜１２の整数である。）、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースのような親水性ポリマー、およびキサンタンガムまたは例えばＴＯＰＯのような界面活性剤などの１個以上の有機材料でコーティングされていてもよい。
【００３２】
上述の通り、本発明の組成物は、ＵＶ遮蔽が望まれる広範な用途に使用できるが、特に、局所適用に好ましい。局所適用のための組成物は、例えば、化粧用組成物、髪を保護するための組成物であってよく、好ましくは日焼け止め剤である。本発明の組成物は、ＵＶ光からの保護を提供する通常の組成物として用いることができる。
【００３３】
局所適用のための組成物において、金属酸化物は、好ましくは約0.5〜10重量％、好ましくは約３〜８重量％、より好ましくは約５〜７重量％の濃度で存在する。そのような組成物は、本発明の組成物を一以上含み得る。
【００３４】
局所適用のための組成物は、ローションの形態（例えば、濃縮ローション、ゲル、ヴィシキュラー分散液、クリーム、ミルク、粉末、固体スティック）であってよく、アエロゾルとして任意に梱包されて、フォームまたはスプレーの形態で提供できる。
【００３５】
組成物は、例えば、脂肪物質、有機溶媒、シリコーン、増粘剤、粘滑剤、例えば、のＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂまたは広域バンド日焼け止め剤、泡止め剤、保湿剤、香料、保存料、界面活性剤、フィラー、金属イオン封鎖剤、アニオン、カチオン、非イオンまたは両性ポリマーまたはそれらの混合物、推進剤、アルカリ化剤または酸性化剤、着色剤、および酸化鉄のような粒子寸法100ｎｍ〜20000ｎｍの金属酸化物顔料を含有していてよい。
【００３６】
有機溶媒は、低級アルコールおよびポリオール（例えば、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびソルビトール）から選択できる。
【００３７】
脂肪物質は、油またはワックスまたはそれらの混合物、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ワセリン、パラフィン、ラノリン、水素化ラノリンまたはアセチル化ラノリンから構成できる。
【００３８】
油は、動物性油、植物性油、鉱油または合成油、特に、水素化ヤシ油、水素化ひまし油、ワセリン油、パラフィン油、パーセリン油、シリコーン油およびイソパラフィンから選択されてよい。
【００３９】
ワックスは、動物性ワックス、化石ワックス、植物性ワックス、鉱物ワックスまたは合成ワックスから選択できる。そのようなワックスとしては、蜜蝋、カルナウバワックス、カンデリラ蝋、さとうきびワックスまたはうるし、地蝋、モンタンワックス、マイクロクリスタリンワックス、パラフィンまたはシリコーンワックスおよび樹脂が挙げられる。
【００４０】
脂肪酸エステルは、例えば、ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、Ｃ12−Ｃ15脂肪アルコール安息香酸エステル（ファインテックス(FINETEX)社製「フィンソルヴ(FINSOLV)ＴＮ」）、プロピレンオキサイド３モルを含有するオキシプロピレン酸化ミリスチンアルコール（ウィトコ(WHITCO)社製「ウィトコノール(WITOCONOL)ＡＰＭ」）カプリン酸およびカプリル酸トリグリセリド（ヒュルス(HULS)社製「ミグリオール(MIGLYOL)812」）である。
【００４１】
組成物は、架橋または非架橋アクリル酸ポリマー、特に、「カーボポル(CARBOPOL)」という商品名でグッドリッチ(GOODRICH)社から販売されている製品、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩のような誘導体、またはセチルステアリルアルコールとエチレンオキサイドを33モル含有するオキシエチレン化セチルステアリルアルコールとの混合物などの多官能性試薬を用いて架橋されたポリアクリル酸から選択され得る増粘剤も含有していてよい。
【００４２】
本発明の組成物が日焼け止め剤である場合、それは、溶媒または脂肪物質中の懸濁液または分散液、あるいはクリームまたはミルクのようなエマルション、軟膏、ゲル、固体スティックまたはエアロゾルフォームの形態であってよい。エマルションは、アニオン、非イオン、カチオンまたは両性界面活性剤も含有していてよい。これは、既知の方法で調製されるイオン性、非イオン性の両親媒性脂質のヴィシキュラー分散液の形態でも提供され得る。
【００４３】
別の観点において、本発明は、上記粒子をキャリヤーと会合することを含む、本発明の組成物を調製する方法を提供する。
【００４４】
もう１つの観点において、本発明は、ルミネッセンストラップ部位および／またはキラー部位を提供するために第２成分を組み込んだホスト格子を含む粒子を提供する。
【００４５】
更なる観点において、本発明は、金属酸化物のコーティングされたナノ粒子の母集団を含む粒子を提供する。
【００４６】
図１は、従来の日焼け止めに見出されるような二酸化チタンによるＵＶ光の光子の吸収を表している。
図２は、還元された酸化亜鉛粒子によるＵＶ光の光子の吸収を表している。
図３は、少なくとも２層コーティングされた二酸化チタンのナノ粒子を含む、本発明の粒子によるＵＶ光の吸収を表している。
図４は、放射線照射されたＴｉＯ2およびＺｎＯにより生じたプラスミドの緩和と、ＤＭＳＯおよびマンニトールによる抑制を示している。両方のパネルにおいて、Ｓ、ＬおよびＲは、スーパーコイル化されたプラスミド、直鎖プラスミドおよび緩和されたプラスミドの移動を表している。上方のパネルは、０分、20分、40分および60分における日光単独（１〜４レーン）および１％アナターゼによるイルミネーション後に見られるプラスミド緩和（レーン５〜８）、または同じ時間における１％ルチルＴｉＯ2（レーン９〜12）によるイルミネーション後に見られるプラスミド緩和を示している。レーン13〜18は、０分、５分、10分、20分、40分および60分における、日焼け止め剤ＳＮ８からのＴｉＯ2によるイルミネーションを表している。結果は、あらゆる試料に関して見出される典型的なものである。下方のパネルは、０分、10分、20分、40分および60分における、ＤＭＳＯを添加する前（レーン１〜５）または後（レーン６〜１０）の0.2％ＺｎＯによるイルミネーション；および200ｍＭＤＭＳＯ（レーン11〜16）または340ｍＭマンニトール（レーン17〜22）を添加後、０分、５分、10分、20分、40分および60分における、0.0125％日焼け止め剤ＴｉＯ2によるイルミネーションを表している。
【００４７】
図５は、放射線照射されたＴｉＯ2によって与えられた損傷およびＤＮＡ中の損傷の局在についてのカタラーゼの効果を表している。上方のパネルは、０分、20分、40分および60分における、日焼け止め剤ＴｉＯ2単独により照らされたプラスミドＤＮＡ（レーン１〜４）を、および同じ時間におけるカタラーゼ2.5単位／μＬ（0.1ｍｇ／ｍＬタンパク質）添加後のプラスミドＤＮＡ（レーン８〜11）を表している。レーン５〜７は、スーパーコイル化プラスミド、直鎖プラスミドおよび緩和されたプラスミドを表す。下方のパネルは、沸騰カタラーゼ（レーン１〜４）またはウシ血清アルブミン0.1ｍｇ／ｍＬ（レーン８〜11）を添加した後の、上記日焼け止め剤ＴｉＯ2によるイルミネーションを表している。右のパネルは、0.00125％日焼け止め剤ＴｉＯ2中およびシーケンス用ゲルについて分析された試料中で照らされた、５'−末端１個でラベルされた二重鎖ＤＮＡの426ｂｐフラグメントを示している。レーン１〜４は、０分、20分、40分および60分における、イルミネーションを表している。レーン５〜８は、分析前にN,N'-ジメチルエチレンジアミンにより90℃で３０分間処理した後の、同じ時間における、イルミネーションを表している。この試薬は、ＤＮＡからの多くの損傷された残渣に置き換えた後、糖−ホスフェート鎖を切断し、一貫した移動性を有する均一なホスホリル化末端を残し、それにより、発生した損傷のスペクトルを明らかにする。レーン９〜10は、ＧおよびＡジデオキシ・シーケンス標準を表している。
【００４８】
図６は、コメットアッセイにより明らかにされたヒト細胞に与えられた損傷を示す。Ａ列は、ガヴィトロンＲＸ３０光源からのＸ線を用いて得られたコメットを表している。照射速度は、8.9Ｇｙ／分であり、細胞は、０秒、15秒、30秒および60秒間、氷の上で露光され、示された５つの主な標準分類（１、分類０；２、分類Ｉ；３、分類II；４、分類III；５、分類IＶ）に分類されるコメットを与えた。列ＢおよびＣは、シミュレートされた日光を用いて得られたコメットの例（ＭＲＣ−５繊維芽細胞および日焼け止め剤ＴｉＯ2(0.0125％)）を表している。各露光において、100個の細胞に切れ目を入れ、標準（列Ａ）と比較することによりコメットを分類した。列Ｂは、非処理のもの（１）、日光のみで20分、４０分および60分間露光したもの（２〜４）、および暗所で60分間露光した場合のＴｉＯ2の効果（５）を表している。列Ｃは、ＴｉＯ2を用い０分、20分、40分および60分間露光したもの（１〜４）、およびＴｉＯ2と200ｍＭ  ＤＭＳＯを用いて60分間露光したもの（５）を表している。チャートには、５つの独立した実験からの結果をまとめている。Ｄは、日光のによって、数個の鎖切断および／またはアルカリにより化学変化しやすい部位を与えることを示し、Ｅは、ＴｉＯ2の包含がこの損傷を触媒作用することを示している。
【００４９】
図７は、通常の酸化亜鉛または本発明の酸化亜鉛の存在下、日光によりＤＮＡに与えられた鎖分裂の比較を示している。レーン１〜４は、０分、20分、40分、60分間日光で露光しただけのイルミネーションを表し、レーン５〜８は、通常のＺｎＯ（アルドリッチ社製）を用いて０分、10分、20分、40分、60分間露光したイルミネーションを表し、およびレーン９〜10は、還元ＺｎＯを用いて０分、20分、40分、60分間露光したイルミネーションを表している。
【００５０】
図８は、マンガンドープされた酸化チタンの存在下で照射されたＤＮＡの減成を表す。図には、290〜400ｎｍで６ｍＷ／ｃｍ2の合計強度のシミュレートされた日光を用いたイルミネーション中に見られたプラスミド当たりの鎖切断の数が表されている。光だけが顕著な損傷を与えた（●）。アナターゼ二酸化チタンを用いると、損傷が非常に激しくなるので、正確には定量できなかった。ルチル二酸化チタンを用いると、損傷はより少なくなったが（■）、初期において尺度を逸脱するほど未だ十分に激しかった。マンガンの存在は、この損傷をかなり低下させた。0.1％（塗りつぶし三角）および0.5％（×）マンガンは共に、非常に類似した効果を発揮し、受けた損傷の速度を約70％低下させたが、１％に増加すると（◆）非常に有益な効果を現し、用いた光照射では検知されない程度まで損傷を低減させた。
【００５１】
更に、以下の実施例は、図を参照して本発明を表す。
【００５２】
比較例
二酸化チタン調剤による化学的酸化
ＴｉＯ2試料は、有機溶媒（メチルシアニド、アセトン、クロロホルム）で洗浄することにより、売薬の日焼け止め剤から抽出し、そのアナターゼおよびルチル含量をＸ線回折法により決定した。アナターゼおよびルチル標準は、英国グリムズビーのチオキサイド・グループ・サーヴィシーズ・リミテッド(Tioxide Group Services Ltd.)から入手した。ＴｉＯ2濃度は、コーデル法[エム・コーデル著、(1959年)、アナリティカル・ケミストリー・オブ・チタニウム・メタル・アンド・コンパウンズ、インターサイエンス、ニューヨーク]に従い、純粋なＴｉＯ2（アルドリッチ社製）から作成された標準を用いて分析した。この複合体に関するモル吸光度は、404ｎｍで827Ｍ-1ｃｍ-1として分析した。照射されたＴｉＯ2によるフェノールの光酸化減成は、高圧液体クロマトグラフィーを用いてモニターして[エヌ・サーポーンら著、(1996年)、ジャーナル・オブ・フォトケミストリー・フォトバイオロジーＡ：ケム94、第191頁〜第203頁]、214ｎｍに設定したウォーターズ(Waters)441検出器とＨＰ3396Ａレコーダーを装備したウォーターズ501液体クロマトグラフフィーにおいて周囲温度でイソクラティック手順を用いて、その消滅を測定した。カラムは、ウォーターズμボンダパックＣ−１８逆相であり、移動相は、メタノール（ＢＤＨオミニソルヴ級）と蒸留／脱イオン水の50：50混合液であった。日焼け止め剤ＴｉＯ2はそれぞれ、フェノール58ｍＬ中、0.05重量％で（空気平衡された水性媒体中200μＭ、Ｐｈ5.5；ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるフェノールの停留時間は５分であった）、1000−Ｗ水銀／キセノンランプと365ｎｍ（±10ｎｍ）干渉フィルターを用い、310〜400ｎｍで約３２ｍＷｃｍ-2の光束を与えて照射された。
照射された分散体の適当なアリコート（１ｍＬ）を種々のインターバルで採取し、0.1μｍメンブランを通して濾過して、分析前にＴｉＯ2を除去した。
【００５３】
生体外でのＤＮＡのイルミネーション
日光シミュレーター[ジェイ・ノウランドら著、(1993年)、ＦＥＢＳレター324、第309頁〜第313頁]は、250Ｗのオゾンを含まないランプ、ＷＧ320フィルターおよび石英レンズから構成され、300〜400ｎｍで12Ｗｍ-2の見積もりフルエンスを得る。ＤＮＡは、[ティ・マニアティスら著、(1982年)、モレキュラー・クローニング：実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラバトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク]に従ってアガロースゲル上で調製および分析された、プラスミドｐブルースクリプトIIＳＫ+（ストレイタジーン(Stratagene)社製）であった。緩和した標準試料は、25ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ4.8中、70℃において20分間プラスミドを除プリンした後、50ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ2（Ｃａ2+は、エキソヌクレア−ゼを抑制するが、アプリン酸部位では分裂しない）、0.2ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８（EcoＲＩで切断することによる直鎖標準）中、37℃においてエキソヌクレアーゼIIIで切れ目を入れることにより作成した[エヌ・サーポーンら著、(1997年)、フォトケミストリー・フォトバイオロジーＡ104、１]。（Ｘ線回折により、100％アナターゼまたは100％ルチルであることが確認された）元のＴｉＯ2標準を、水２％ｗ／ｖ；ＺｎＯ（アルドリッチ社製、＜１μｍ）0.4％ｗ／ｖ中に懸濁させた。それら25μＬずつを、ｐＨ7.4のリン酸ナトリウム100ｍＭ中でプラスミド25μＬに添加し、氷の中に埋め込んだ真鍮ブロック上に配置したシリコーン処理済み顕微鏡用スライドグラス上で、液滴（50μＬ）として照射させた。ＴｉＯ２（７％ｗ／ｖ）のみを含有する日焼け止め剤は、ボルテックススターラーで水と混合して遠心分離した。白色ペレットは、クロロホルムとメタノールの混合液（１：１）で３回洗浄した後、メタノールだけで洗浄して乾燥させた。得られた粉末を、２％で水中に懸濁させたが、殆どすぐに固まり、分析値0.025％ｗ／ｖのＴｉＯ２含量を有する曇った上清が残った。これを、バッファー中で当体積のプラスミドＤＮＡと混合し、照射した。直接的な鎖切断は、スーパーコイル化されたプラスミドの緩和形への転化から分析された。
【００５４】
生体内でのＤＮＡのイルミネーション（コメットアッセイ）
ヒト細胞（ＭＲＣ−５繊維芽細胞）は、日焼け止め剤ＴｉＯ2（0.0125％ｗ／ｖ）を有するまたは有しない氷上で照射された。レンズは使わずに、解質層下で見られるのと同様の強度を得た[ノウランド、ジェイら著、(1993年)、ＦＥＢＳレター324、第309頁〜第313頁]。試料は、増加時間で採取し、氷上で保持して、同時に分析した。分析に関し、細胞は、低融点アガロース中に埋め込んで、１％トリトンＸ−100で溶解し、アルカリゲル電気泳動に付して、臭化エチジウムで染色し[ピー・ダブリュー・ドイッシュおよびアール・ピー・クニンガム著、(1990年)、ミューテイション・リサーチ13、第3285頁〜第3304頁]、５つの主な標準分類に従って分類した[ヴイ・ジェイ・マッケルヴェイ−マーティンら著、(1993年)、ミューテイション・リサーチ228、第47頁〜第63頁]。
【００５５】
照射されたＴｉＯからのヒドロキシルラジカルによる有機物質の酸化は、フェノールのような試験分子の酸化を追跡することにより、簡便に評価できる[エヌ・サーポーンら著、(1996年)、ジャーナル・オブ・フォトケミストリー・フォトバイオロジーＡ：ケム94、第191頁〜第203頁]。以下の表は、10個の異なる日焼け止め剤からのＴｉＯ2試料によるフェノールの酸化減成を、純ルチルおよび純アナターゼによって触媒作用された酸化と比較している。
【００５６】
【表１】
0004162857.tif 000002
ＳＮ１〜10は、売薬の日焼け止め剤である。
aＡｌ(ＯＨ)3も含有する。
bＺｎＯ  1.95％も含有する。
【００５７】
全ＴｉＯ2試料は、フェノールを酸化するが、活性は、単に結晶系に依存しない。最も活性な試料は、ＺｎＯも含有するＳＮ10である。
【００５８】
ヒドロキシルラジカルは、ＤＮＡに直接的な鎖切断を課し、そのような損傷を試験するために、スーパーコイル化されたプラスミドをシミュレートされた日光とＴｉＯ2を用いて照射した。図４は、プラスミドが最初に緩和形に、最後には鎖切断を表す直鎖形に転化することを示している。日光のみでは、非常に小さな効果を及ぼすが、アナターゼは、フォトケミカル比較と一致して、ルチルよりも活性である（表１および[エイ・シュクラファニおよびジェイ・エム・ヘルマン著、(1996年)、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー100、第13655頁〜第13661頁]）。日焼け止め剤から抽出されたＴｉＯ2も光活性であり、純ＺｎＯも同様である。日焼け止め剤のイルミネーションは、アナターゼやルチルのイルミネーションよりも非常に少ないＴｉＯ2を含有しており、これは、日焼け止め剤種が特に活性であることを暗示している。損傷は、停止剤であるジメチルスフォキシド（ＤＭＳＯ）とマンニトールにより抑制された。これは、損傷が実にヒドロキシルラジカルによって引き起こされることを暗示している。
【００５９】
図５は、損傷が、触媒により非常に顕著に抑制されたことを示している（上方パネル）が、熱−不活性化された触媒とウシ血清アルブミンが同様の効果を発揮することも示しており（下方パネル）、このことから、この限定された停止は、触媒活性よりもむしろタンパク質の存在によるものと考えられる。超酸化物ジスムターゼはいずれも、損傷を抑制しなかった（データは示さず）。このことから、鎖切断は、超酸化物（Ｏ2・-）、すなわちｅ-（ｃｂ）とＯ2との反応によって形成された活性酸素種では生じず、２個の・ＯＨラジカル間での反応による過酸化水素の中間体形成に依存しないことが分かる。むしろ、鎖切断は、ヒドロキシルラジカルによる直接攻撃によるものと考えられ、これは、ＴｉＯ2上に形成されたヒドロキシラジカルは粒子の表面に残るという示唆と一致する。末端ラベルされたＤＮＡに切り目を入れることにより、原則的に幾つかのグアニン残渣において、他の損傷が明らかとなった（右のパネル）が、全部ではない。明白には、ＤＮＡ損傷は、鎖切断に限定されない。
【００６０】
コメットアッセイ（図６）より、ヒト細胞中のＤＮＡも、ＴｉＯ2のエンドサートーシスと一致して、照射されたＴｉＯ2によって損傷を置けることが分かる。ＤＭＳＯによる抑制は、ヒドロキシルラジカルによって損傷が生じることも包含する。これらアッセイは、直接的な鎖切断とアルカリによって化学変化され易い部位を検出し、ＴｉＯ2に起因する損傷を明らかにする。
【００６１】
すなわち、照射された日焼け止め剤ＴｉＯ2およびＺｎＯは、生体外や培養されたヒト繊維芽細胞でＤＮＡに酸化損傷を引き起こす。これは、局所適用のための通常の組成物の使用において重要な意味を有する。65ＺｎＯを用いた放射線写真の研究からは、これが、ラットやウサギの皮膚、恐らく毛嚢を通過することが示唆されているが、皮膚の下で検出され（かつそれ故に皮膚を横切った形の）65Ｚｎの化学形は明らかではない。幾つかの報告は、ＺｎＯと顔料ＴｉＯ2がヒトの皮膚を通過するという可能性を高めており、最近の報告では、日焼け止め剤中の微小化ＴｉＯ2もその可能性があることを示唆されている[エム・エイチ・タンら著、オーストラス・ジャーナル・ダーマトール(Austalas. J. Dermatol)、(1996年)、37、第185頁〜第187頁]。従って、最近、迅速に高まっている皮膚ガンも低下させることから、日焼けを確かに予防する日焼け止め剤の運命と光化学特性を特徴付けることが重要である。
【００６２】
実施例１
還元された酸化亜鉛粒子の調製
使用された酸化亜鉛は、アルドリッチ社から供給された。これは、100〜200ｎｍの粒子寸法を有し、390ｎｍ以短のＵＶで吸収して、390ｎｍで再び放射する。これを、水素10体積％：窒素90体積％の雰囲気において、800℃で20分間加熱した。還元された酸化亜鉛が得られ、ＵＶ域で吸収し、500ｎｍで緑色光を発光することがわかった。
【００６３】
実施例２
通常または還元された酸化亜鉛の存在下で日光によりＤＮＡに与えられた鎖切断の比較
使用したＤＮＡは、ティ・マニアティスら著[モレキュラー・クローニング：実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラバトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1982年)]に従ってアガロースゲル上で調製および分析された、プラスミドｐブルースクリプトIIＳＫ+（ストレイタジーン社製）であった。これは、250ワットのオゾンを含まないランプ、ＷＧ320フィルターおよび石英レンズから構成される日光シミュレーター[ジェー・ノウランドら著、ＦＥＢＳレター、324(1993年)第309頁〜第313頁]を用い、生体外で照射され、300〜400ｎｍまたは12ワット・ｍ-2の見積もりフルエンスをもたらした。酸化亜鉛試料を水中に0.4％ｗ／ｖで懸濁した。各懸濁液25μＬを、ｐＨ7.4のリン酸ナトリウム100ｍＭ中でプラスミド25μＬ（ＤＮＡ２〜３μｇ）に添加し、氷中に埋め込まれた真鍮ブロック上に配置されたシリコーン処理済み顕微鏡用スライドガラス上で液滴として照射した。直接的な鎖切断を、（図７におけるＳとＲで印された）スーパーコイル化プラスミドの緩和形への転化から分析した。
【００６４】
照射された還元ＺｎＯ粒子は、汎用のＺｎＯ粒子よりもＤＮＡ損傷を非常に生成し難いことが観察された。
【００６５】
実施例３
マンガンドープされた二酸化チタンの調製
二酸化チタン（25ｇ）と硝酸マンガン(II）（0.8ｇ）を脱イオン水（100ｍL）中で混合した。得られた混合物を10分間超音波処理した後、煮沸乾燥させた。生成された材料を700℃で3時間焼成して、１％マンガンドープされた二酸化チタンを得た。異なるドーピング濃度の二酸化チタン粒子を、硝酸マンガン(II）の両を変えることにより、同じ方法で調製した。
（煮沸中にマンガン２＋から酸化された）マンガン３＋イオンは、二酸化チタンホスト格子の表面に組み込まれるものと考えられる。
【００６６】
実施例４
二酸化チタンホスト格子中のマンガンの割合を変えることの効果の評価
ＤＮＡに障害を与える別のマンガンドープされた二酸化チタン粒子の能力を、前記比較例において記載したプラズマ切れ目アッセイを用いて測定した。
図８は、シミュレートされた日光のみが、鎖切断の発生により明白になったように、ＤＮＡに顕著な障害を与えたことを示している。二酸化チタンホスト格子中のマンガンの割合が増加すると、鎖切断に関する障害が少なくなった。マンガン含量１％では、障害がほぼ予防されて、光単独によって課された障害よりも明らかに少なかった。
すなわち、そのような粒子は、この特定の形態の障害からＤＮＡを保護し得ると考えられる。粒子は、通常損傷を与えるとかんがえられる光の光子を吸収し、そのエネルギーを損傷を与えない方法に分配することができる。この粒子は、光励起されたキャリアートラッピングにより、またはホスト格子をｐ−型にするドーパントイオンによって作用することがある。これらの機構は、接続され得ると考えられる。20ｎｍ未満の粒子の場合、量子寸法効果が、レドックス電位をシフトすることにより助長されることもある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  従来の日焼け止めに見出されるような二酸化チタンによるＵＶ光の光子の吸収を表す。
【図２】  還元された酸化亜鉛粒子によるＵＶ光の光子の吸収を表す。
【図３】  少なくとも２層コーティングされた二酸化チタンのナノ粒子を含む、本発明の粒子によるＵＶ光の吸収を表す。
【図４】  放射線照射されたＴｉＯ２とＺｎＯおよびＤＭＳＯとマンニトールによる抑制により生じたプラスミドの緩和を表す。
【図５】  放射線照射されたＴｉＯ2によって与えられた損傷およびＤＮＡ中の損傷の局在についてのカタラーゼの効果を表す。
【図６Ａ】  コメットアッセイにより明らかにされたヒト細胞に与えられた損傷を示す。
【図６Ｂ】  シミュレートされた日光を用いて得られたコメットの例（ＭＲＣ−５繊維芽細胞および日焼け止め剤ＴｉＯ2(0.0125％)）を表す。
【図６Ｃ】  シミュレートされた日光を用いて得られたコメットの例（ＭＲＣ−５繊維芽細胞および日焼け止め剤ＴｉＯ2(0.0125％)）を表す。
【図６Ｄ】  ５つの独立した実験からの結果をまとめている。
【図６Ｅ】  ５つの独立した実験からの結果をまとめている。
【図７】  通常の酸化亜鉛または本発明の酸化亜鉛の存在下、日光によりＤＮＡに与えられた鎖分裂の比較を表す。
【図８】  マンガンドープされた酸化チタンの存在下で照射されたＤＮＡの減成を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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