(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2の塩基配列を有する遺伝子(OSASA1D)、又は該遺伝子(OSASA1D)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つイネのアントラニル酸シンターゼの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)の上流に接続した、配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む選択マーカー。
【請求項２】
配列番号3のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号3のアミノ酸配列における１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つイネのアントラニル酸シンターゼの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)の上流に接続した、配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む選択マーカー。
【請求項３】
配列番号2の塩基配列を有する遺伝子(OSASA1D)、又は該遺伝子(OSASA1D)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つイネのアントラニル酸シンターゼの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む組換えプラスミド。
【請求項４】
配列番号3のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号3のアミノ酸配列における１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つイネのアントラニル酸シンターゼの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)の上流に接続した、配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む組換えプラスミド。
【請求項５】
請求項３又は４記載の組換えプラスミドにより植物細胞カルスを形質転換する工程(1)と、工程(1)で処理されたカルスからトリプトファン類縁化合物に対する耐性を有するカルスを選抜する工程(2)とを含む形質転換された植物細胞カルスの選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞カルスに対して特異的にトリプトファン類縁化合物に対する耐性等を導入でき、カルスの選抜に利用できる選択マーカーを有する組換えプラスミド、及び該組換えプラスミドで形質転換された植物細胞カルスの選抜方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、植物に各種機能等を付与するためにバイオテクノロジーが利用され、種々の形質転換植物が開発されている。また、このような形質転換植物の製造においては、その効率を高めるために形質転換細胞の選抜が不可欠であり、各種の選択マーカーの開発も進められている。しかし、このような選択マーカーは、植物の成長、作物の安全性、更には環境への影響等を考慮した場合、その種類においては形質転換細胞の選択時のみに発現し、植物の成長過程における各種器官組織においては発現しない方が良いことが多い。そこで、選択マーカーにおいては、その種類において、所望の組織において発現率が高く、他の組織においてはその発現率が極端に低いものが望まれている。
ところで、イネのアントラニル酸合成酵素αサブユニット遺伝子OSASA1をアミノ酸置換により改変したOSASA1D遺伝子が、トリプトファンによるフィードバック阻害に対して感受性が大きく低下しており、そのため、トリプトファンを蓄積すると同時にトリプトファンアナログに対して抵抗性を示すことが知られている。また、この特性を利用して、ユビキチンプロモーター等に連結したOSASA1D遺伝子が選択マーカーとして利用できることも知られている(国際公開パンフレットWO99／11800)。
しかし、ユビキチンプロモーターは、イネでは非常に強く働くこと、また、いつでもどの組織でも働くことから、必要としない場合でも植物体のトリプトファン含量を高め、時に、生育に影響する場合がある。
【０００３】
【発明が解決するための課題】
従って、本発明の目的は、植物細胞カルスに対して特異的に発現し、形質転換された植物細胞カルスを効率よく選抜することを可能にした組換えプラスミド、該プラスミドに用いる選択マーカーを提供することにある。
本発明の別の目的は、形質転換された植物細胞カルスを、カルス特異的に選択マーカーを発現させて効率よく選抜することができる選抜方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、先に報告されているOSASA1D遺伝子が、形質転換体の選抜時のみに発現しうるプロモーターについて鋭意検討した。その結果、イネキチナーゼ遺伝子の特定領域のプロモーター(PRO3)を連結したPRO3-OSASA1D遺伝子が植物細胞カルスのみで高い発現性を示し、他の組織では発現が極端に抑制され、しかも得られた形質転換カルスの5-メチルトリプトファン(5MT)抵抗性が35Sプロモーターと同程度の頻度で出現し、実際に形質転換された植物細胞カルスを効率良く選抜できることを見出し本発明を完成した。
即ち、本発明によれば、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子(OSASA1D)、又は該遺伝子(OSASA1D)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つイネのアントラニル酸シンターゼ(以下ASAという)の第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)の上流に接続した、配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む選択マーカーが提供される。
また本発明によれば、配列番号3のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号3のアミノ酸配列における１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つイネのASAの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)の上流に接続した、配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む選択マーカーが提供される。
更に本発明によれば、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子(OSASA1D)、又は該遺伝子(OSASA1D)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つイネのASAの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む組換えプラスミドが提供される。
更にまた本発明によれば、配列番号3のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号3のアミノ酸配列における１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つイネのASAの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子(A)と、該遺伝子(A)の上流に接続した、配列番号1の塩基配列を有するプロモーター(PRO3)、又は該プロモーター(PRO3)と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる活性を有するプロモーターとを含む組換えプラスミドが提供される。
また本発明によれば、前記組換えプラスミドにより植物細胞カルスを形質転換する工程(1)と、工程(1)で処理されたカルスからトリプトファン類縁化合物に対する耐性を有するカルスを選抜する工程(2)とを含む形質転換された植物細胞カルスの選抜方法が提供される。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の選択マーカーは、イネのASAの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子(A)と、該遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる特定のプロモーター遺伝子とを含み、植物細胞カルスにトリプトファン類縁化合物に対する耐性を効率良く付与できる。従って、本発明の選択マーカーは、形質転換された植物細胞カルスの選抜を効率良く実施しうるマーカーとして作用する遺伝子である。
本発明においてカルス特異的に発現するとは、遺伝子(A)を植物細胞カルスにおいて、同じ植物体の他の組織又は器官の少なくとも１種におけるよりも多く発現することを意味する。例えば、遺伝子(A)を植物細胞カルスにおいて、同じ植物体の任意の葉身等におけるよりも極めて多く発現させうることである。好ましくは、遺伝子(A)を公知の35Sプロモーターの下流に接続した遺伝子を選択マーカーとして用いた場合に比して、葉における遺伝子(A)の発現力が弱く、且つカルスにおける遺伝子(A)の発現力が該葉における発現力よりも高いことを意味する。
また、本発明においてフィードバック抑制に対して非感受性であるとは、フィードバック抑制を生じる割合が低いか、若しくは無いことを意味し、実質的にはトリプトファン類縁化合物に対して耐性を示すことを意味する。
【０００６】
本発明において前記遺伝子(A)は、上記特定作用を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されない。このような遺伝子(A)は、例えば、国際公開パンフレットWO99／11800に記載の方法等に基づいて、イネのcDNAライブラリーを用い、イネのASAの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子を調製し、該DNAの塩基配列の一部を改変して、トリプトファンによる酵素活性のフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードするDNAに改変する方法等により得ることができる。
このような改変は、例えば、文献「Plant Physiology」第110巻、51〜59頁、1996年に記載されるトリプトファンアナログ体に耐性を示す突然変異アラビドプシスの公知のASA遺伝子に関する報告を参考にしながら改変する方法等により行うことができる。この際、DNA配列の一部分の領域にある塩基配列を改変する一般的な方法としては、例えば、Kunkel法(「Methods in Enzymology」154巻、367号)又はオリゴヌクレオチド−ダイレクト デュアルアンバー法等が挙げられる。
【０００７】
本発明において、前記遺伝子(A)の具体例としては、例えば、配列番号2に示される塩基配列を有する遺伝子(OSASA1D)や、該OSASA1Dに対して相同性を示し、OSASA1Dと相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子等が挙げられるが、上記特定作用を有する遺伝子であればこれらに限定されない。
ここで、OSASA1Dに対して相同性を示すとは、OSASA1Dの塩基配列に対して通常60％以上、好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、更に好ましくは98％以上の相同性を示すことである。また、ストリンジェントな条件とは、OSASA1Dに対する特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であれば良い。例えば、相同性が高い2つの核酸同志、高い相同性を有するDNA同志がハイブリダイズすることを許すが、それより相同性が低い核酸同志がハイブリダイズすることを許さない条件等が挙げられる。
前記OSASA1Dは、国際公開パンフレットWO99／11800に記載の方法等に基づいて調製することができる他、後述する、特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に寄託番号FERM P-18768として2002年3月14日に寄託されている大腸菌Escherichia coli DH5α／p8C-PRO3-ASA1Dから常法により取得することもできる。
【０００８】
前記遺伝子(A)としては、配列番号3のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号3のアミノ酸配列における1個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子等を用いることもできる。
ここで、生理活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列中の1個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列でも、元のアミノ酸配列のタンパク質の生理活性が維持される場合があることは当該分野において周知である。従って、本発明における場合も、配列番号3のアミノ酸配列における1個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が、イネのASAの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質である場合には、該タンパク質をコードする遺伝子も遺伝子(A)として用いることができる。このようなタンパク質の選択は、国際公開パンフレットWO99／11800に記載の方法等に基づいて行うことができる。
【０００９】
本発明の選択マーカー及び組換えプラスミドは、前記遺伝子(A)の上流に、該遺伝子(A)を植物細胞カルス特異的に発現させるプロモーターを有する。該プロモーターは、配列番号1で示される塩基配列を有するPRO3、又はPRO3に対して相同性を示し、PRO3と相補的な塩基配列からなるDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つ遺伝子(A)をカルス特異的に発現させうるプロモーターである。
ここで、PRO3に対して相同性を示すとは、PRO3の塩基配列に対して通常60％以上、好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、更に好ましくは98％以上の相同性を示すことである。また、ストリンジェントな条件とは、PRO3に対する特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であれば良い。
PRO3は、イネのキチナーゼ遺伝子から常法に従って調製することができ、具体的には、Mol.Gen.Genet.241(1-2)1-10(1993)に記載の方法に基づいて、後述する実施例１に示す方法等により得ることができる。PRO3の塩基配列を含むDNAは、例えば、Mol.Gen.Genet.241(1-2)1-10(1993)に基づいて登録されたDDBJ／EMBL／GenBankデータベースに既に記載されている。しかし、該配列番号１に示す塩基配列が、前記遺伝子(A)を植物細胞カルスにおいて特異的に発現させうるプロモーターであることについては知られていない。
【００１０】
本発明において、遺伝子(A)と、該遺伝子(A)がカルス特異的に発現するPRO3等のプロモーターとの接続は常法により行うことができる他、後述の実施例１に示す方法等により行うことができる。そして、遺伝子(A)と該遺伝子(A)がカルス特異的に発現するPRO3等のプロモーターとを有する遺伝子断片、例えば、PRO3-OSASA1D断片を有するプラスミドは、例えば、35Sプロモーター、その下流に連結されたハイグロマイシン耐性を発現する配列(HPT)、NOS3ターミネーター、及びカナマイシン耐性を発現する遺伝子NPTIIを含む15kbサイズの公知のベクターplG121-HmをPmel及びSaclで切断した断片に、Pmel-Pacl-Notl-Sse83871-Asel-Saclの8カッター制限酵素サイトを有するポリリンカーを挿入し、プラスミドp8C-Hmを得、このプラスミドp8C-HmをSse8387l及びSaclで処理し、得られた切断部位にPRO3-OSASA1D断片を連結する方法等により得ることができる。このようにして得られたプラスミドp8C-PRO3-OSASA1Dを大腸菌に導入した菌株は、大腸菌Escherichia coli DH5α／p8C-PRO3-ASA1Dとして、特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に寄託番号FERM P-18768として2002年3月14日に寄託されている。
前記遺伝子(A)と該遺伝子(A)がカルス特異的に発現するPRO3等のプロモーターとを備えたカセットを有するプラスミドを調製するために用いるベクターは、上記のものに限定されず、DNAの導入方法等に応じて適宜選択することができる。
【００１１】
本発明の組換えプラスミドには、上記遺伝子(A)と該遺伝子(A)がカルス特異的に発現するPRO3等のプロモーターとを有する遺伝子断片の他に、植物体の所望組織等において発現させうる外来遺伝子を導入することができる。このような外来遺伝子は、植物体の種類、所望の生理活性等に応じて適宜選択することができ、また外来遺伝子のプロモーターやターミネーター等も所望の活性を勘案して適宜選択でき、これらの種類等は特に限定されない。そして、このような外来遺伝子を有する本発明の組換えプラスミドを植物細胞カルスに導入し、後述の本発明の選抜方法を行うことによって、形質転換されたカルスを効率よく選択することができる。しかも、本発明の選択マーカーに含まれる前記遺伝子(A)は、カルス特異的に発現するので、植物細胞カルスを成長させた際に外来遺伝子が発現する所望の植物組織や器官等においては、遺伝子(A)がほとんど発現していないか、全く発現していない所望の形質転換植物体を得ることができる。
【００１２】
本発明の植物細胞カルスの選抜方法は、まず、本発明の組換えプラスミドにより植物細胞カルスを形質転換する工程(1)を行う。
まず、植物細胞カルスの調製は、例えば、イネのカルスの場合以下の方法等により行うことができるがこれに限定されない。
イネの完熟種子から籾殻を除き、得られた外皮付きコメ種子をエタノール溶液で殺菌、次いで次亜塩素酸ナトリウムの希水溶液で殺菌し、さらに滅菌水で洗浄する。MS培地等にショ糖、植物ホルモンとしての2,4-D(2,4-diclorophenoxyacetic acid)、寒天等を加えてなる組成のカルス形成用培地に、外皮付きコメ種子を置く。28℃で1日当り15〜18時間にわたり、1500〜2500ルックスの太陽光を照射しながら30〜40日間培養すると、イネのカルスが形成される。そのカルスを種子から切取りカルスを得ることができる。
次いで、前記組換えプラスミドにより植物細胞カルスを形質転換するには、例えば、組換えプラスミドを、アグロバクテリウム法によりカルス細胞に導入するために、まず、宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)への組み込みを行う。組み込みは公知のエレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウィスカー法等により行うことができる。得られたアグロバクテリウム細菌を、例えば、細胞工学別冊(モデル植物の実験プロトコール、93〜98頁、1996年、秀潤社発行)等にしたがって、前記調製したイネの細胞カルスと共存培養することにより、本発明の組換えプラスミドの所望DNAをイネの細胞カルスに導入することができる。
【００１３】
本発明の選抜方法では、前記工程(1)で処理されたカルスからトリプトファン類縁化合物に対する耐性を有するカルスを選抜する工程(2)を行う。
工程(2)は、まず、工程(1)で処理されたカルスを、例えば、N6培地にショ糖、2,4-D、ゲルライト及び選抜薬剤としてトリプトファン類縁化合物を0.1〜0.2mM、好ましくは0.13〜0.18mMを添加してなる選抜用培地の上に均一に広げ、更に、暗所もしくは2000ルックスの光を1日当たり16時間程度照射しながら25〜28℃で20〜60日間、好ましくは25〜30日間培養する。
そして、トリプトファン類縁化合物に耐性を発現している細胞カルスを選抜することにより、本発明の組換えプラスミドで形質転換された植物細胞カルスを選抜することができる。このような選抜工程(2)は、培地を取り替え、複数回繰り返して行うこともできる。
【００１４】
本発明の選抜方法において用いる植物細胞カルスの植物の種類は特に限定されず、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ等の単子葉植物や、タバコ、ダイズ、ツタ、トマト、ハクサイ、キュウリ、レタス等の双子葉植物が挙げられる。
植物細胞カルス形成用の培地としては、例えば、MS培地、R2培地、N6培地等の無機塩成分及びビタミン類を含む植物組織培養用の培地に、植物ホルモン、炭素源を添加してなる培地等が挙げられる。そして、形質転換カルスを選抜するために培地に導入するトリプトファン類縁化合物としては、例えば、5-メチルトリプトファン(5MT)、4-メチルトリプトファン(4MT)、6-メチルトリプトファン(6MT)、7-メチルトリプトファン(7MT)、6-メチルアントラニル酸(6MA)、5-メチルアントラニル酸(5MA)、3-メチルアントラニル酸(3MA)、5-フルオロアントラニル酸(5FA)、6-フルオロアントラニル酸(6FA)等が挙げられ、他にトリプトファン類縁化合物の生合成中間体も使用できる。
植物細胞カルスの培養期間は特に限定されないが、形質転換植物を再生することが必要であるから、当該植物細胞が植物体再生能力を保有している期間内であることが望ましい。
【００１５】
植物細胞カルス中に導入された遺伝子(A)の存在は、例えば、PCR法によって確認できる。カルスからのDNAの抽出は、J.Sambrookらの方法(「Molecular Cloning」第2版, Cold Spring Habor Laboratory Press,1989年)に準じて実施できる。  PCR法を用いて解析する場合は、例えば、カルスから抽出されたDNAを、テンプレートとして用い本発明によるDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合してPCR法用反応液中に加えて増幅反応を行う。この増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。
増幅生成物を含む反応液を、例えば、アガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されるため、導入したDNA配列を含むと認められるDNA断片を確認することができる。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の選抜マーカー及び組換えプラスミドは、イネのASAの第1アイソザイムのαサブユニット活性を有するがトリプトファンによるフィードバック抑制に対して非感受性であるタンパク質をコードする遺伝子(A)と、該遺伝子(A)をカルス特異的に発現させる特定のプロモーター遺伝子とを含むので、植物細胞カルスにトリプトファン類縁化合物に対する耐性を効率良く付与でき、形質転換されたカルスの選抜を効率よく行うことができると共に、遺伝子(A)の発現を、植物細胞カルスを除く他の組織や器官等において充分に抑制することが可能であり、植物の成長、作物の安全性、更には環境への影響が極めて少ない安全な形質転換植物体の作成等に有用である。
また、本発明の選抜方法では、本発明のプラスミドを利用し、トリプトファン類縁化合物によって、該化合物に対して耐性を有する植物細胞カルスを選抜するので、効率よく、しかも容易に所望の形質転換カルスを選抜することができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、以下の実施例で行われる実験操作の手順は、特に記述しない限り、「Molecular Cloning」第2版（J. Sambrookら、Cold Spring Habor Labratory Press, 1989年発行）に記載される方法に従った。
【実施例１】
(1)Mol.Gen.Genet.241(1-2)1-10(1993)に記載される方法に従って、配列番号6に示すイネのキチナーゼ遺伝子核DNAクローンpRCG3を得た。これを鋳型にし、PRO3P5プライマー（5'-TTAAGCTTGGAAGGATATAGTAGTACTTG-3'、配列番号７）およびPRO3P3プライマー（5'-TACCCGGGCGGCCGGCAATGTGATG-3'、配列番号８）を用いて、アニーリング温度５５度、サイクル数３０回でＰＣＲを行ない、配列番号１に示す配列の３’末端側の約200bpの断片を得た。これを制限酵素HindIII（東洋紡績株式会社製）とSmaI（東洋紡績株式会社製）で処理した後、pUC119ベクター（宝酒造株式会社製）のHindIIIとSmaIサイト間にＤＮＡライゲーションキット（東洋紡績株式会社製）を用いて１２℃で一晩処理して連結し、プラスミドpRCG3PRO3Sを構築した。
次に、このpRCG3PRO3SをScaI（東洋紡績株式会社製）及びSacI（東洋紡績株式会社製）で処理して得られる断片と、pRCG3をEcoRI（東洋紡績株式会社製）及びScaIで処理して得られた、配列番号１に示す配列の５’末端側の約1.4kbの断片を、pBluescript IISK(+)ベクター（STRATAGENE社製）のEcoRIとSacIサイト間にＤＮＡライゲーションキット（東洋紡績株式会社製）を用いて１６℃で２時間処理して連結し、プラスミドSK-RCG3PROを構築した。
【００１８】
(2)一方、WO99/11800記載の方法に従い、イネのアントラニル酸合成酵素αサブユニット遺伝子OSASA1をアミノ酸置換により改変した、配列番号2で表わされる配列OSASA1D（DNA断片-β）をpBluescript IISK(+)プラスミドベクター（STRATAGENE社製）に導入したプラスミドであるpBluescript-DNA-D（特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に受託日1998年8月7日、受託番号FERM BP-6451にて国際寄託されている大腸菌XLI-Blue MRF'/pBluescript-DNA-D中に含まれる。）を得た。これをEcoRIで消化して得た断片を、pUC118ベクター（宝酒造株式会社製）のEcoRIサイトにサブクローニングし、プラスミドpUC118-OSASA1Dを得た。これをSpeI（東洋紡績株式会社製）で処理した後、T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）で３７℃で３０分間処理して末端を平滑化し、さらにSalI（宝酒造株式会社製）で切断し、前記プラスミドSK-RCG3PROをSalI及びSmaIで処理して生じたPRO3断片と連結して、プラスミドpUC118-PRO3-OSASA1Dを構築した。
【００１９】
(3)次に、このpUC118-PRO3-OSASA1DのEcoRI断片をpRL-nul1ベクター（ニッポンジーン社製）のEcoRIサイトにサブクローニングし、プラスミドpRL-PRO3-OSASA1Dを得た。これをPstI（東洋紡績株式会社製）及びSacIで処理して、配列番号１に示すプロモーター配列PRO3とその下流に連結された配列番号2に示すOSASA1Dとを含むPRO3-OSASA1D断片を得た。一方、35Sプロモーター、その下流に連結されたハイグロマイシン耐性を発現する配列（HPT）、NOS3ターミネーター、及びカナマイシン耐性を発現する遺伝子であるNPTIIを含む15kbサイズの公知のベクターpIG121-HmをPmeI及びSacIで切断した断片に、PmeI-PacI-NotI-Sse8387I-AseI-SacIの８カッター制限酵素サイトを有するポリリンカーを挿入し、プラスミドp8C-Hmを得た。このプラスミドp8C-HmをSse8387I（宝酒造株式会社製）及びSacIで処理し、上記PRO3-OSASA1D断片と、ＤＮＡライゲーションキット（東洋紡績株式会社製）を用いて１２℃で一晩処理して連結することにより、PRO3-OSASA1Dカセットを持ち、図1に示す制限酵素地図により表わされるプラスミドp8C-PRO3-OSASA1Dを調製した。このプラスミドを、大腸菌に導入した菌株は、Escherichia coli DH5α/p8C-PRO3-ASA1Dとして、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に寄託番号FERM P-18768として2002年3月１４日に寄託した。
なお、制限酵素反応は全て、酵素購入時に添付されていた反応バッファーを用いて、３７度で1.5時間から2時間行なった。また、DNA断片は全て、制限酵素反応後アガロースゲル電気泳動を行ない、アガロースゲルからのDNA回収キット（QIAGEN社製）を用いて精製したのち、連結反応に用いた。
【００２０】
(4)LB培地（バクトトリプトン10g/l、バクトイーストエクストラクト5g/l及びNaCl 0.5％を含む、pH7）の液体培地300mlに、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)EHA101(ATCC53487として公衆により利用可能)を移植し、30℃で16時間振とう培養した後、培養液を4℃で10分間冷却し、遠心分離により細菌の沈殿を得た。細菌の沈殿物に対し、氷冷した10％グリセロールで洗浄操作と遠心分離を3回繰返した後、沈殿物を10mlのグリセロールに溶解した。
そのうちの40μlをエッペンドルフチューブに移し、このチューブに上記プラスミドp8C-PRO3-OSASA1Dの溶解液（40ng）5μlを添加し、よく混合した。これらを氷上に3分間置いた後、エレクトロポレーション用のキュベット（電極間0.2cm）に移し、エレクトロポレーション装置（ジーン・パルサー（バイオラッド社製））で、電圧12.5kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値600Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。キュベット内にSOC培地（GIBCO BRL社製）を0.8ml添加し、懸濁液を2ml容の試験管に移し、30℃で1時間振とう培養を行った。この培養液を、LB培地にカナマイシン50mg/lを添加してなる寒天培地に塗布し、30℃で36時間培養して、生育してきたコロニーを組換えベクターが導入された形質転換アグロバクテリウムとして得た。
【００２１】
(5)イネ（品種名「日本晴」、完熟種子）を殺菌して、2N6培地（N6基本培地に、カサミノ酸2g/l及び2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)2mg/lを添加したもの）に置床し、3週間後に誘導されたカルスを新しい2N6培地に移し、さらに1週間培養した。
(6)上記(4)で調製したアグロバクテリウムをAA培地の無機塩組成にショ糖20g/l、2,4-D 2mg/l、カイネチン0.2mg/l及びアセトシリンゴン10mg/lを添加してなる液体培地30mlに懸濁し菌液を得た。この懸濁液を50mlのチューブに入れ、上記(5)で得たカルスを入れた後、5分間浸漬した。浸漬後、ペーパータオルで余分な菌液を除去した。N6培地の無機塩組成にショ糖30g/l、グルコース10g/l、2,4-D 2mg/l、カサミノ酸2g/l、ゲルライト2g/l及びアセトシリンゴン10mg/lを添加してなる固体培地に、上記の浸漬したカルスを置床した。24℃で3日間、暗黒下で培養し、イネのカルスへのアグロバクテリウムの感染を行った。感染終了後、カルスを滅菌水及び５００ml/lカルベニシリン溶液で洗浄し菌を除去した。
【００２２】
(7)N6基本培地に、500mg/lカルベニシリン及び表1に示す濃度の5-メチルトリプトファン（5-MT）又はハイグロマイシンを添加した選抜培地に、カルス小片を置床し、２８℃で3週間培養し1次選抜を行った。増殖してきたカルスを新しい選抜培地に置床し、２８℃で3週間培養し2次選抜を行った。ここで増殖の見られたカルスを、再分化培地（MS基本培地にベンジルアデニン(BA)2mg/l、ナフタレン酢酸(NAA)1mg/lを添加したもの）に移植し2週間培養したところ、緑色スポットが誘導された。これをさらにホルモン無添加培地で2週間培養して、シュートを形成させた。これをさらに、培養土の入ったカップに移し、閉鎖系温室（湿度60％、28℃）で生育させ、植物体を得た。選抜に供されたカルス数、選抜されたカルス数、及びそのうち再分化植物体を与えたカルス数を、それぞれ表1に示す。
【００２３】
(8)上記(7)で得られた植物体から葉を採取し、その葉50mgを1.5ml容のマイクロチューブに入れた。抽出バッファー（200mM Tris-HCl pH7.5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS）を0.3ml加え、これを磨砕した。30分間静置後15,000 rpmで10分間遠心分離した。得られた上精に等量のイソプロパノールを加え転倒撹拌し、15,000 rpmで10分間遠心分離した。得られたDNAの沈澱を70%エタノールでリンスした後、減圧下で乾燥した。100 μlの1/10TE緩衝液にDNAペレットを溶解し、DNA溶液とした。
【００２４】
(9)PCR用のプライマーとして、配列表の配列番号4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。これら2種類のオリゴヌクレオチドの各1μMをプライマーとして用い且つ上記(8)で得たDNA 5μlをテンプレートとして用い、これらを増幅用反応液（10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.0mM MgCl2、50mM KCl、0.01％ゼラチン、dNTPの各0.2mMの混合物及びTaqDNAポリメラーゼ2.5ユニットを含む）100μlに加え、増幅反応を行った。用いた増幅反応液は、PCRキット（PCR Amplification Kit（宝酒造株式会社製））で調製した。
増幅反応は、PCR反応装置（GeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社製））内で、変性94℃、1分、アニーリング60℃、30秒、伸張72℃、1分の3つの反応操作を30回繰り返すことによって実施した。得られた反応液を、常法によりアガロース電気泳動により分析し、OSASA1D配列の増幅によるDNA断片に由来するバンドの見られた個体を陽性個体として計数した。結果を表1に示す。上記(5)〜(9)の操作は、選抜用の薬剤濃度を変えて4回行った。表1においては、それぞれの実験結果を実験1〜4として示す。
【００２５】
【表１】
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この結果より、PRO3-OSASA1Dにより発現した5-MT耐性に基く選抜により、形質導入されたカルスを良好に選別しうることができ、特に5-MT濃度を0.15mMとした際に、エスケープ（形質導入されていない株でありながら選抜されたもの）の全く存在しない、特に良好な選抜が行えることが分かる。
【００２６】
【実施例２】
以下の手順により、5-MTにより選抜したカルス及び植物体におけるOSASA1Dの発現の有無を、ノーザンブロッティングにより確認した。なお、本実施例において、下記の略号の示す意味は、それぞれ以下の通りである:
変性溶液:4Mグアジニウムチオシアネート、25mM Na-クエン酸、100mM 2-メルカプトエタノール及び0.5％ラウリルサルコシルを含む水溶液。
DEPC水:脱イオン水にジエチルピロカーボネート0.1%を加え、4時間混合した後オートクレーブしたもの。
ブロッキングストック液:ブロッキング試薬（粉状スキムミルク）をバッファー1に10％(w/v)溶解し、オートクレーブしたもの。用時まで4℃で保存した。
20xSSC:3M塩化ナトリウム及び0.3Mクエン酸ナトリウムの水溶液。
ハイブリダイゼーションバッファー:50％脱イオン化ホルムアミド、5xSSC、0.1％（w/v)N-ラウロイルサルコシン、0.02％(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)及び2％ブロッキングストック液を含む水溶液。
バッファー1:0.1Mマレイン酸及び0.15M NaClを含み、NaOHによりpH7.5とし、オートクレーブしたもの。
洗浄バッファー:バッファー1に、さらにTween-20を0.3%(w/v)添加したもの。
バッファー2:ブロッキングストック液をバッファー1で1:10の記釈し、最終ブロッキング試薬濃度を1％としたもの。
バッファー3:0.1M Tris-HClに、0.1M NaCl及び50mM MgCl2を添加したもの（pH9.5)。
【００２７】
(1)実施例1(7)において、5-MT濃度0.15mMの培地により選抜して得たカルスからの植物体の成葉1.0g及びカルス1.0gを量り取り、乳鉢中で液体窒素により凍結させながら潰し、粉砕物を得た。変性溶液10mlを入れた遠心管に、この粉砕物を入れ、よく撹拌し、さらに1mlの2M NaOAcを加えてよく撹拌した。続いて、8mlの水飽和フェノールを加え、2.2mlのクロロホルムを加えよく混和した。混合物を表中に15分間放置した後、4℃、9000rpmで30分間遠心した。上清を注意深く取り、新しいチューブに移し同量のイソプロパノールを加えよく混和し、-20℃で30分間放置した。これを、4℃、11000rpmで10分間遠心し、上清をデカンテーションし、変性溶液1.4mlを加え、ペレットをよく溶解させた。得られた溶液を、2本のRNase Freeのエッペンドルフチューブに0.7mlずつ入れ、それぞれに0.7mlずつイソプロパノールを加え、よく混和した。これを-20℃で30分間放置した後、4℃、11000rpmで10分間遠心し、上清をデカンテーションし、0.3mlの70％エタノールを加え、チューブの内壁をよくリンスし、室温に10〜15分間放置した。これをさらに4℃、11000rpmで10分間遠心し、上清をデカンテーションし、37℃で5〜10分間放置して乾燥させた。これを0.2mlのDEPC水に混和させ、RNA溶液を得た。このRNA溶液を、3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS) 20mM及び5%脱イオンホルムアルデヒドを含むアガロースゲルに乗せ、100Vで2時間泳動した。泳動後、ゲルをトランスファー台に置き、ナイロンメンブラン（アマシャム・ファルマシア社製、商品名HybondN+）を重ね、常法によりRNAを転写し、メンブランを80℃で2時間インキュベートし、RNAを固定した。
【００２８】
(2)滅菌水45μｌ、プローブ溶液（OSASA1D配列の第242〜952塩基の断片を鋳型として調製したジゴキシゲニン標識RNA断片を200ng含む）5μlを混合し、65℃に10分間静置後、氷冷し、プローブ溶液を得た。
(3)ハイブリダイゼーションバッファー１５ml中に、上記(1)で得たRNA固定メンブランを入れ、そこに上記(2)で得たプローブ溶液全量を加え、均一に混合し、５０℃で一晩インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行った。続いてメンブランを、2xSSCで、室温で5分間洗浄する操作を2回繰返し、さらに、0.1％SDSを含む0.1xSSCで、68℃で15分間振とうし続けながら洗浄する操作を2回繰返した。洗浄したメンブランを、さらに洗浄バッファーで1〜5分間洗浄した。
抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ標識抗体Fabフラグメントを、バッファー2で、75mU/mlに希釈した。この標識抗体溶液20ml中に、メンブランを入れ、30分間インキュベートした。インキュベート終了後のメンブランに対し、洗浄バッファー100mlで15分間の洗浄を2回繰返し、さらにバッファー3 20ml中で2〜5分間平衡化した。
3-（4-メトキシスピロ（1,2-ジオキセタン-3,2'-（5'-クロロ）トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン）-4-イル）フェニルホスフェート二ナトリウム(CSPD)をバッファー3で1:100に希釈し、この基質溶液約10mlにメンブランを浸し室温で5分間インキュベートした。その後メンブランから余分な水分を落とし、ハイブリダイゼーションバッグに密封し、37℃で120分間インキューベートすることで、X線フィルムに露光した。試料としてカルス及び葉からのRNAを用いた際の結果を、それぞれ図2及び図3に示す。
図2及び図3のそれぞれにおいて、上段はX線フィルムにより撮影した結果であり、バンドの濃さがOSASA1Dの発現の強度を反映している。また、下段はポラロイドカメラにより撮影した結果であり、試料中の全てのrRNAを反映したバンドが現れている。
この結果より、PRO3-OSASA1Dが導入された株においては、カルスではOSASA1Dが発現しているが植物体では発現しないという、カルス特異的発現が見られることが分かる。
【００２９】
【比較例１】
プロモーターとしてのトウモロコシユビキチンプロモーター、及びその下流に連結したOSASA1Dを含むプラスミドであるpUB-OSASA1Dを、国際公開パンフレットWO99/11800に記載される通りに調製した。プラスミドp8C-PRO3-OSASA1Dの代わりにこのプラスミドpUB-OSASA1Dを用いた他は、実施例1(4)〜(7)と同様に操作してカルス及び植物体を得、これについて実施例2と同様に操作して、OSASA1Dの発現の有無を調べた。結果を図2及び図3に示す。この結果より、pUB-OSASA1Dが導入された株においては、カルス及び植物体の双方でOSASA1Dが発現していることが分かる。
【００３０】
【比較例２】
実施例１(1)で行ったのと同様に、pIG121-Hmベクターを制限酵素SacIで処理した。得られた断片に、常法により平滑末端処理を行い、さらに制限酵素XbaIで処理することにより、一方の末端が平滑でもう一方がXbaIの末端をもつ断片を得た。
一方、pBluescript-DNA-D上のOSASA1Dから、一方の末端を制限酵素SpeIサイトにし、もう一方の末端を平滑にしたOSASA1D断片を得た。これを前記pIG121-Hmベクターの断片と連結することにより、プラスミドp35S-OSASA1Dを作製した。プラスミドp8C-PRO3-OSASA1Dの代わりにこのプラスミドp35S-OSASA1Dを用いた他は、実施例1(4)〜(7)と同様に操作してカルス及び植物体を得、これについて実施例2と同様に操作して、OSASA1Dの発現の有無を調べた。結果を図2及び図3に示す。この結果より、p35S-OSASA1Dが導入された株においては、カルス及び植物体の双方でOSASA1Dが発現していることが分かる。
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において調製したプラスミドp8C-PRO3-OSASA1Dの制限酵素地図を示す概略図である。
【図２】実施例２、比較例２及び比較例３において、試料としてカルスを用いた場合のOSASA1Dの発現を反映したバンド（上段）及び試料中の全てのrRNAを反映したバンド（下段）を撮影したノーザンブロッティングの結果を示す泳動写真である。
【図３】実施例２、比較例２及び比較例３において、試料として葉を用いた場合のOSASA1Dの発現を反映したバンド（上段）及び試料中の全てのrRNAを反映したバンド（下段）を撮影したノーザンブロッティングの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
pPRO3:実施例２の結果を示すレーン
pUB:比較例１の結果を示すレーン
p35S:比較例２の結果を示すレーン
NB:対照
【図１】
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【図２】
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【図３】
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