(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
ａ) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し；
ｂ) 上記カラムにＬ−ジヒドロオロト酸を含む試料溶液を装填し；
ｃ) クロマトグラフィーを実施し；
ｄ) Ｌ−ジヒドロオロト酸を、塩基水混合物を含有する溶離液で溶離すること;
より成り、この方法を約１.１ＭＰａないし約４０ＭＰａの圧力下で実施するクロマトグラフィーによるＬ−ジヒドロオロト酸を得るための方法。
【請求項２】
塩基が水酸化ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
圧力安定性陰イオン交換物質がアルカノール第四級アンモニウムで変性させた、ジビニルベンゼン／エチルビニルベンゼン重合体、またはジビニルベンゼンで架橋したポリビニルベンジルアンモニウム重合体、またはその混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
圧力が約４.１ＭＰａないし約５.５ＭＰａである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
塩基水混合物の溶離が、塩基濃度の時間勾配を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
塩基濃度の時間勾配が、直線状である請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｌ−ジヒドロオロト酸を導電率検出器によって検出する、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−ジヒドロオロト酸を含有する診断用検定の調製物を製造する方法であって、
次の工程：
ａ) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し；
ｂ) 上記カラムにＬ−ジヒドロオロト酸を含む試料溶液を装填し；
ｃ) クロマトグラフィーを実施し；そして
ｄ) Ｌ−ジヒドロオロト酸を、塩基水混合物を含有する溶離液で溶離すること；
より成り、この方法を約１.１ＭＰａないし約４０ＭＰａの圧力下で実施する方法。
【請求項９】
ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤の活性を測定するための方法であって、次の工程：
ａ）ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を細胞と共にインキュベートし；
ｂ）前記細胞から、細胞脂質を抽出し；
ｃ) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し；
ｄ) 上記カラムに前記細胞脂質を含む試料溶液を装填し；
ｅ) クロマトグラフィーを実施し；
ｆ) Ｌ−ジヒドロオロト酸を、塩基水混合物を含有する溶離液で溶離し、ここで前記カラムの操作圧力は、約１.１ＭＰａないし約４０ＭＰａであり；
ｇ） 前記Ｌ−ジヒドロオロト酸濃度を測定し；そして
ｈ） 前記Ｌ−ジヒドロオロト酸の測定濃度からジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼの
活性を決定する；
ことから成る上記方法。
【請求項１０】
ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ阻害剤が、Ｎ−４（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド、ブレキナール、Ｎ−（４−トリ−フルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロキシヘプタ−２−エン−６−イン−カルボキサミド、２−シアノ−３−シクロプロピル−３−ヒドロキシアクリル酸−（４−シアノフェニル）−アミドおよびＮ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトンアミドから選択される少なくとも一つの阻害剤である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、約１.１ＭＰａないし約４０ＭＰａの圧力下での塩基水混合物中の陰イオン交換物質上のクロマトグラフィーによってＬ−ジヒドロオロト酸（以下“Ｌ−ＤＨＯ”）を得るための方法に関する。この方法は、Ｎ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトンアミドおよび類似の化合物の試験管内および生体内活性を研究するために使用することができる。
【０００２】
Ｌ−ＤＨＯは、シリカゲルクロマトグラフィー手順後に化学的誘導体化および比色測定を行うことによって決定することができる［Kesner、L.、Aronson、F．L.、Silverman、M.、Chan、P.C.、Clin．Chem 21／3（1975）353］。もう１つの方法は、Ｌ−ＤＨＯを、ラットの肝臓から調製したＬ−ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（以下“ＤＨＯＤＨ”）によって酵素作用でオロト酸に変換し、化学的誘導体化後に、比色的変化によってオロテート（orotate）を検出する［Rogers、L.E.、Nicolaisen、K.、Experientia 28／10（1972）1259］。これらの方法の不利な点は、複雑な生理的溶液中のその他の物質の妨害である。その上、上述の手順は、面倒な試料調製のため非常に時間がかかり、そのため大規模な臨床研究における日常分析に対して適応できない。
【０００３】
Ｌ−ジヒドロオロト酸を得るための改良された分離および単離方法を提供するための努力の中で、このたび、これを、陰イオン交換物質上、圧力約１.１ＭＰａないし約４０ＭＰａでの塩基水混合物中のＬ−ＤＨＯのクロマトグラフィーによって達成できることが見出された。この方法は、細胞溶解産物、哺乳類血清およびヒト血清中のＬ−ＤＨＯの定量のために使用することができる。上記の方法は、高度に再現性があり、鋭敏であり、そして有効である。
【０００４】
特許請求の範囲で説明したとおり、本発明は、次の工程：
ａ) 圧力安定性陰イオン交換物質より成るカラムを用意し；
ｂ) このカラムにＬ−ジヒドロオロト酸を含む試料溶液を装填し；
ｃ) クロマトグラフィーを実施し；
ｄ) Ｌ−ジヒドロオロト酸を塩基水混合物を含む溶離液で溶離すること；
より成り、この方法を約１.１ＭＰａないし約４０ＭＰａの圧力下で実施する、クロマトグラフィー法によって目的を達成される。
【０００５】
圧力安定性陰イオン交換物質という用語は、例えばアルカノール第四級アンモニウムで変性させた、マクロポウラス
0004189124.tif 000002
ジビニルベンゼン／エチルビニルベンゼン重合体またはミクロポウラスのジビニルベンゼンで架橋したポリビニルベンジルアンモニウム重合体またはそれらの混合物類；または塩化ビニルベンジル／ジビニルベンゼンマクロポウラス重合体；または架橋ポリエチルイミノポリマー；またはプロピル−トリメチル−アンモニウムで変性させたシリカ；またはポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）トリメチルアンモニウムのような物質を意味する。
【０００６】
下記の製品が特に好ましい：
ディオネクス・コーポレーション（Dionex Corporation）、イドシュタイン（Idstein）、ドイツ、によって供給されるイオンパック（Ion Pac）ＡＳ１１、カーボパック（CarboPac）ＰＡ１またはカーボパックＭＡ１陰イオン交換カラム、
グロム（Grom）によって供給されるグロム−シル（ＧＲＯＭ−ＳＩＬ）、ストロング・アニオン（Strong Anion.）またはグロム−シル（ＧＲＯＭ−ＳＩＬ）、ウィーク・アニオン（Weak Anion.）、
クロムパック（Chrompack）によって供給されるＰ １０００ ＳＡＸ、イオノスファー（Ionospher）ＳＡまたはクロムパックＰＡ、
ハミルトン（Hamilton）によって供給されるＰＲＰ−Ｘ１００またはＲＣＸ−１０。
【０００７】
溶離液は、塩基水混合物を含む。適当な塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムまたは水酸化カルシウムのようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属から誘導される。塩基の濃度は、溶媒としての水に基づいて、１ミリモル／ｌないし約２００ミリモル／ｌ、好ましくは２ミリモル／ｌないし約１２０ミリモル／ｌ、特に好ましくは１００ミリモル／ｌである。
【０００８】
クロマトグラフィー手順中の温度は、約０℃ないし約５０℃、好ましくは約１５℃ないし約３０℃、特に好ましくは約１９℃ないし約２５℃である。クロマトグラフィー中の操作圧力は、事実上一定である。クロマトグラフィーは、異なる圧力を使用して実施することができ、例えばクロマトグラフィーは、約１.１ １０6Ｐａ（１.１ＭＰａ）ないし約４０ １０6Ｐａ（４０ＭＰａ）、特に４.１ＭＰａないし５.５ＭＰａの圧力下で実施することができる。溶離剤の流量は、約０.２ml／分ないし約３ml／分、好ましくは１ml／分である。
カラムの装填、クロマトグラフィー、およびＬ−ＤＨＯの溶離は、公知の一般的な技法によって行う。
【０００９】
適当な溶離は、その溶離が、好ましくは直線状の、塩基濃度の時間勾配を示すものである。この濃度勾配は、例えば、この溶離の最初の溶離には低塩基濃度（極限の場合にはゼロ）が存在することによって、そして溶離プロセス中塩基濃度を増大させることによって適用することができる。このようにして、血清または細胞溶解産物由来の試料中のＬ−ＤＨＯの特に有効な分離を達成することが可能である。好ましい塩基勾配は、ほぼ１％ＮａＯＨ（１００ミリモル／Ｌ）および９９％水（溶離の最初）から約６０％ＮａＯＨおよび４０％水（溶離の終わり）まで変化し、特に好ましい範囲は、約１％ＮａＯＨおよび９９％水（溶離の最初）から約１５％ＮａＯＨおよび７５％水（溶離の終わり）までである。塩基水勾配は、２.５分から約１４分までそして１４分から約２５分まで、直線状に変化させられ、ここでこの勾配の傾斜は、これらの２期間中で異なっている。
【００１０】
特に適する溶離は、この分離プロセスの最初に約１％という低塩基濃度を約２.５分の間使用することによって達成することができる。その結果、このカラムの生物学的マトリックスからの妨害物質のほとんどが溶離される。分析物の分離は、１４分の全分析時間内に勾配を約２３％の塩基までゆっくり増大させることによって達成することができる。次に、塩基濃度を４分内に約６０％まで増大させて、強く結合している物質を溶離する。６０％の塩基は、再平衡化が１％塩基水混合物によって行われるまで、６分以内の間適用されなくてはならない。次の分析は、全分析時間４５分の後に開始される。
【００１１】
塩基水勾配中の水は、脱イオン化され、そして脱気されなくてはならない。
本発明に従う分離法は、カラム法で行われる。温度（好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー中一定に保たれる）は、広い範囲内で変えることができる。好ましい温度範囲は、約−１０℃から約５０℃まで、特に約１５℃から約２５℃までである。
【００１２】
Ｌ−ＤＨＯの溶離は、勾配の開始の１０分ないし１２分後に起こる。溶離プロセスの操作時間は、１３分から２５分までである。Ｌ−ＤＨＯは、ダイオネクス・コオペレーション（Dionex Cooperation）からの型ＣＤ２０のような導電率検出器によって検出される。基準線シフトを最小にし、バックグラウンド導電率を低下させるために、ダイオネクス・コオペレーションからの型ＡＳＲＳ−１、４mmのような陰イオン自己再生抑制器を使用することができる。
【００１３】
本発明に従う方法は、特に分析用クロマトグラフィーに適するが、しかしまた、特に本発明に従う方法を分取高速液体クロマトグラフィーカラム（ＨＰＬＣ）システムを用いて実施するときは、分取クロマトグラフィーについて使用することもできる。“分取クロマトグラフィー”という用語は、純粋な生成物を、得ることを目的とし、単に分析するだけではない精製法を意味する。純粋な生成物の量は、広い範囲内で、例えば１mgから１０００ｇまで、好ましくは５０mgと５００mgとの間で、変動することができる。
【００１４】
本発明に従う方法は、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯ−ＤＨ）の阻害による細胞内または細胞外Ｌ−ＤＨＯ濃度の変化を検出するために使用することができる。酵素ＤＨＯ−ＤＨは、初めからのピリミジン合成中のＬ−ジヒドロオロト酸のオロト酸への変換の原因となるものである。ＤＨＯ−ＤＨの阻害によりＬ−ＤＨＯの蓄積が起こる。本発明に従う方法は、診断用検定の調製物のために使用することができる。本発明に従う方法は、ＤＨＯ−ＤＨ阻害剤の活性を決定するために使用することができる。ＤＨＯ−ＤＨ阻害剤は、例えばＮ−４−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキシルアミド、ブレキナール（Brequinar）、Ｎ−（４−トリ−フルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロキシヘプタ−２−エン−６−イン−カルボキサミド、２−シアノ−３−シクロプロピル−３−ヒドロキシアクリル酸−（４−シアノフェニル）−アミドまたはＮ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトンアミドである。本発明に従う方法は、植物、細胞系、動物およびヒトにおけるＬ−ＤＨＯ濃度を決定するために使用することができる。Ｌ−ＤＨＯ決定は、植物、哺乳類およびヒトにおけるＤＨＯ−ＤＨ阻害剤の活性を監視するために使用することができる。
本発明に従う方法を、以下の実施例において詳細に説明する。他に指示しないかぎり、百分率データは、重量に関連する。
【００１５】
実施例１
0004189124.tif 000003
【００１６】
１.２. クロマトグラフィー装置
ＨＰＬＣシステムは、下記の機器より成っていた：
【００１７】
【表１】
0004189124.tif 000004
ピーク（peek）物質を、これらの実験を通して使用した。
【００１８】
１.３. ＨＰＬＣ条件
クロマトグラフィー分離は、イオンパック（IonPac）ＡＧ１１ ５０×４mm Ｉ.Ｄ.プレカラム［粒径１３μm；Ｐ／Ｎ ０４４０７８、ダイオネクス］を装備した２５０×４mm Ｉ.Ｄ.イオンパックＡＳ１１陰イオン交換カラム［粒径１３μm；Ｐ／Ｎ ０４４０７６、ダイオネクス］を用いて実施した。さらに、陰イオントラップカラムＡＴＣ−１［Ｐ／Ｎ ０３７１５１、ダイオネクス］を勾配ポンプと注入バルブとの間に取り付けた。基準線シフトを最小にし、バックグラウンド導電率を低下させるために、３００ｍＡで作動するＡＳＲＳ−１抑制器を取り付けた。検出器の領域は、１０μＳにセットした。オートサンプラーを１４℃に冷却したが、分析自体は、室温で実施した。移動相は、１００ｍＭ ＮａＯＨ（Ａ）および脱イオンおよび脱気水（Ｂ）から成っていた。この系を使用すると下記の勾配を得た：
時間(分) Ａ(％) Ｂ(％)
0             1          99
2.5           1          99
14            23          77
18            60          40
24            60          40
26             1          99
45             1          99
流量は、１ml／分であり；操作時間は、４５分であった。
【００１９】
１.４. 標準および品質管理試料
標準原液は、１mgのＬ−ＤＨＯを１mlの水に溶解させることによって製造した。４００μlずつのアリコートを−２０℃で凍結させた。これらの溶液の安定性は、少なくとも４週間保証された。この原液の所定量を、細胞溶解産物およびヒトまたはラット血清に加えて、シグナルの増大とスパイクしたＬ−ＤＨＯ濃度との間の直線性を評価するために検定した。この方法の精密度および正確度は、シグナル／濃度直線性曲線の低、中および高濃度領域のＬ−ＤＨＯ含量をもつ品質管理（ＱＣ）試料を使用することによって調査した。
【００２０】
１.５．試料調製
１.５.１．細胞
ジャーカット細胞は、ＡＴＣＣ(ＴＩＢ １８２）によって得て、１.５.１.１.で説明するように培養した。
【００２１】
１.５.１.１．組織培養条件
ジャーカット細胞を５×１０5／mlで接種して、ＲＰＭＩ １６４０培地および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で２４時間成長させた。細胞を細胞溶解産物用の新しい培地中にプールして、細胞の量および死亡細胞の百分率をエオシンを用いる生体顕微鏡検査法によって計算した。２４時間後に細胞数は、１.６〜１.８倍に増加し、死亡細胞は７％よりも少なかった。Ｌ−ＤＨＯ決定用に採取したジャーカット細胞は、２４時間で増殖率１.６〜１.８倍および７％よりも少ない死亡細胞を有していた。
【００２２】
１.５.１.２．細胞溶解産物の製造
細胞を、所定の培地体積中に懸濁させて、試料の細胞密度を、エオシンを使用する生体顕微鏡検査法によって決定した。約１０×１０6の細胞を取り出して、３５０×ｇで５分の遠心分離によってペレット化し、上澄みを捨てた。この細胞ペレットを５００μlの１.２Ｍ ＨＣＬＯ4中に再懸濁させることによって細胞の溶解を行った。この混合物を２.０mlエッペンドルフ（Eppendorf）セーフ−ロックキャップ（safe-lock caps）中に移し、タンパク質を２分の高速遠心分離によって沈殿させた。上澄みを完全に取り出して、ガラスバイアル中に移し、５００μlのクロロホルムを添加した後、２分間渦動させる（vortexing）ことによって完全に混合した。１０℃で１０分間遠心分離（１５０２ｇ）した後、細胞脂質をクロロホルムによって抽出した。精製した上澄みを２mlエッペンドルフ−キャップ中に集めて、次に使用するまで−２０℃で貯蔵した。ＨＰＬＣ分析用には、１００μlのこの上澄みを３０μlの６Ｍ ＫＯＨで中和した。約５秒間震盪させた後、この試料を氷上で３０分間貯蔵した。その後これらを１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。透明な上澄みから２０μlをＨＰＬＣ分析のために使用した。
【００２３】
１.５.２．血清
タンパク質含量を減少させるために２００μlの血清をマイクロコン(Microcon）フィルター［１００００Ｄ、型１０、コード４２４０７、アミコン（Amicon）］に加えて、１３０００回転毎分（ｒｐｍ）で３０分間遠心分離した。貫流物（flow through）は、約１５０μlより成り、分析物Ｌ−ＤＨＯを含有する。この液体から２０μlをＨＰＬＣ分析のために使用した。
【００２４】
１.６．定量化
積分器は、分析物のピーク−高さを決定した。校正曲線は、異なる生物学的マトリックスにおける測定されたピーク高さ（ｙ）対分析物濃度をプロットすることによって得た。重みつき線形回帰（１／ｙ）は、標準試料ならびに品質対照におけるＬ−ＤＨＯ濃度を逆算するために使用した。共通相関係数（common correlation coefficient）Ｒは、重みづけ因子を使用する共分散モデルの分析に基づくＰＲＯＣ ＧＬＭによってもたらされた。
【００２５】
１.７．安定性
表１は、１つの試料の２〜３回の凍結／融解サイクル後の、細胞溶解産物および血清試料中での−２０℃での分析物の安定性データを示す。Ｌ−ＤＨＯは、ジャーカット細胞中での上記の条件下で、少なくとも４週間にわたって安定であった。数回の融解サイクル後に検出された、いくつかのラット血清試料および１つのヒト血清試料の濃度の１０％より多い増大は、説明できず、そしてそのような場合における正確度は、一般には１５％まで、そして最悪では２９％まで低下させ得ることを示す。これらの理由で、ラットおよびヒトの血清試料ではＬ−ＤＨＯは、少なくとも１週間だけは明確に安定であることだけは述べることができる。
【００２６】
【表２】
0004189124.tif 000005
【００２７】
試料がオートサンプラー内で実際の分析を待っているときの試料の状態を模倣するために、１４℃で１８時間の間の安定性を測定した。そのため、細胞溶解産物は、スパイクした後、分析の開始前に３０μlの６Ｍ ＫＯＨ／１００μl溶解産物で処理した。相応して、血清試料は、スパイクした後、１.５.２.に記載したように除タンパクした。
【００２８】
表２において見ることができるように、Ｌ−ＤＨＯ含量は、これらの条件下で細胞においては最大約７％までわずかに減少する。血清試料においては、分析物は、これらの条件下で安定である。これらの理由だけのために、非常に多くのＨＰＬＣ試料が調製されて、オートサンプラー中の滞在の最大長さは、１８時間未満であった。
【００２９】
【表３】
0004189124.tif 000006
【００３０】
１.８．選択性
スパイクしていないジャーカット細胞溶解産物を、５０μg Ｌ−ＤＨＯ／mlでスパイクした細胞溶解産物を使用した相当するクロマトグラムと比較すると、Ｌ−ＤＨＯと同一の保持時間である１１.９８３分に小さなピークがあることを示した。このピークがこれらの細胞中の分析物の自然含量の結果であることは、非常に可能性がある。さらに、細胞溶解産物をＫＯＨで処理したためにＬ−ＤＨＯピークが２つのピークに分裂することは、考えることができる。しかしながらＫＯＨ処理は、ＨＰＬＣ分析前に酸性細胞溶解産物を中和するために必須である。上記した条件下では、２番目のピーク高さ［保持時間（ＲＴ)＝１１.９５４分］の評価は、直線性および再現性に関して改良された結果を得るために使用できることが示された。
【００３１】
またラットおよびヒトの血清の場合にも、Ｌ−ＤＨＯと同一保持時間を持つ空試験値が見出された。これは、その有機体の自然Ｌ−ＤＨＯ含量を反映していることが考えられる。両方の種の少なくとも１０の異なる試料の測定は、自然Ｌ−ＤＨＯ含量が検出限度１μg／mlよりも低かったことを示している。
【００３２】
１.９．直線性
測定の直線性を、上記細胞系および上記の異なる血清試料についての５つの校正曲線に関して評価した。試料は、調製して、別々の５日に１.５〜１５０μg／ml（細胞溶解産物）および１〜３０μg／ml（血清試料）の範囲のＬ−ＤＨＯ濃度を使用して操作した。結果を表３〜５に示す。回帰線の決定のためにはピーク高さを使用した。それを基にして相当する異なる標準の濃度を、別の表に示すように逆算した。
【００３３】
【表４】
0004189124.tif 000007
【００３４】
【表５】
0004189124.tif 000008
【００３５】
【表６】
0004189124.tif 000009
【００３６】
これらの表で見ることができるように、各々の場合の直線性が証明された。これは、個々の相関係数“ｒ”に反映されており、この値は、すべての場合に＞０.９９である。別々の５日に得た濃度曲線に対する平均線形回帰線は、各表に記載され、勾配が最大変動６.７％で十分に再現性があったことを示している。
【００３７】
逆算した標準濃度は、平均で６.５％より小さいＣ.Ｖ.を示し、その値の高い正確度を示した。０.９９よりも高い共通相関係数Ｒは、この方法の非常に高い精密度および再現性を表す。
【００３８】
１.１０．定量化の限度
これらの結果に基づいて、ジャーカット細胞における定量化の限度は、１.５μg／mlである。ラットおよびヒト血清試料においては、１μg／mlのＬ−ＤＨＯを検出することができる。これらの濃度でスパイクした試料は、シグナル対ノイズ比、少なくとも１：３を示した。
【００３９】
１.１２．正確度および精密度
別々の５日の３つの異なる濃度でのＬ−ＤＨＯの反復測定の正確度および精密度を、表６〜８に要約する。
正確度は、加えたＬ−ＤＨＯ量に対する測定されたＬ−ＤＨＯ量の％差異（回収率）として表す。Ｃ.Ｖ.（％）として表された日内精密度は、１つの試料を１日に２回測定したときに得られた２つの値を使用して計算した。日間精密度もまた、Ｃ.Ｖ.（％）として表し、別々の５日の各対照試料の平均測定値を使用して計算した。
【００４０】
【表７】
0004189124.tif 000010
【００４１】
【表８】
0004189124.tif 000011
【００４２】
【表９】
0004189124.tif 000012
【００４３】
ここに示した結果は、ほとんどの場合において対照値は最大で＋／−１０％の変動で測定されたこと、およびそのためこの方法は非常に正確であることを示している。１つの場合にだけジャーカット細胞測定における回収率がこの値とは少し異なっていた（−１１.７％）。この効果は、１２％という高い日内変動によって説明することができる。ジャーカット細胞、ラットまたはヒト血清における日内精密度は、各々５％、７％および１０％よりも低かった。研究したすべてのマトリックスにおける日間精密度は、非常に低く、６.０％よりも小さいＣ.Ｖ.を有していた。これは、得られた結果が非常に再現性があり、精密であることを示す。
【００４４】
実施例２
２.１．組織培養条件：
− 血清を含まない培地の調製：イスコブ（Iscove）粉末培地［バイオクロム（Biochrom)］を、１８.９５ｇ ＮａＣｌ、１１.４３ｇ ＮａＨＣＯ3、７００mg ＫＣｌ、１０ml ３５％ＮａＯＨ溶液、および０.５ml １Ｍメルカプトエタノール溶液［リーデル・ド・ハーン］で補充した１０リットルの２度蒸留した水に溶解させ、無菌濾過した。１リットルの調製したイスコブ（Iscove）培地に、使用前に、３２mgヒトホロ−トランスフェリン、１ｇウシアルブミンおよび１.５ml脂質［シグマ］を加えた。
【００４５】
− 細胞培養：Ａ２０.２.Ｊ細胞を、対数細胞増殖での膨張培養において血清を含まない培地（３７℃、５％ＣＯ2）中で培養した。検定のために採取した細胞は、２４時間で２.２倍の増殖速度を有していた。死亡細胞の百分率は、＜８％であった（３）。
【００４６】
− ＥＰ−０５２９５００に記載されたようにして製造したＮ−（４−トリフルオロメチル）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−クロトンアミド（本明細書中ではこの後Ａ７７１７２６）での細胞の処理。Ａ７７１７２６を２回蒸留水（aqua bidest）(１０ｍＭ）に溶解させ、血清を含まない培地中でさらに希釈した。次に細胞に適当な量のＡ７７１７２６を与えて、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
【００４７】
２.２．ＤＨＯ測定のための細胞−溶解産物の調製：
調製した細胞を所定の培地体積および細胞密度において再懸濁させた。期待されたＤＨＯ含量に依って、１００〜５０００万個の間の細胞を取り出して、ペレット化し（５分、３５０×ｇ）、そして上澄みを捨てた。５００μｌの１.２Ｍ ＨＣｌＯ4を加えることによって細胞を溶解させた。溶解産物を２mlのエッペンドルフセーフ−ロック−キャップ内に移して、タンパク質を２分間の高速遠心分離によって沈殿させた。酸性化した溶解産物を完全に取り出して、ガラスバイアル内に移し、５００μlのクロロホルムを添加した後に、２分間渦動させることによって完全に混合した。１０分間の冷遠心分離（１５０２×ｇ；１０℃）に続いて細胞脂質を抽出した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定まで−２０℃で貯蔵するために、精製した上澄みを２mlのエッペンドルフキャップ内に集めた。
【００４８】
２.３．ＤＨＯのＨＰＬＣ測定：
クロマトグラフィー分離は、実施例１に記載したように実施した。導電率検出器の領域は、１０μＳにセットした。分析は、室温で実施した。移動相は、１００ｍＭ ＮａＯＨ（Ａ）および水（Ｂ）から成っていた。この系を使用して下記の勾配を得た：
時間(分) Ａ(％) Ｂ(％)
0            1           99
2.5          1           99
14            8           92
22            8           92
28           60           40
32           60           40
34            1           99
49            1           99
流量は、１ml／分であり；操作時間は、４９分であった。
【００４９】
２.４．結果
Ａ７７１７２６とともにインキュベートしたＡ２０.２.Ｊ細胞は、増加した細胞内ＤＨＯ量を有した（表９〜１１）。表９に示される結果は、ＤＨＯ−水準は、抽出された細胞の数と直接相関したことを証明する。
【表１０】
0004189124.tif 000013
Ａ２０.２.Ｊ細胞を、５μMのＡ７７１７２６でで処理し、２４時間培養(３７℃、５％ＣＯ2）してから、ＤＨＯ抽出のために調製した（ｎ＝３）。
【００５０】
細胞培養法を最適化し、そして最良の細胞／Ａ７７１７２６モル比を決定するために、変化する密度のＡ２０.２.Ｊ細胞をＡ７７１７２６（５μM）とともにインキュベートした。試料を異なる時点で回収して、ＤＨＯ−濃度を測定した（表１０）。ＤＨＯ−濃度が抽出された細胞の量と直接相関した（表９参照）という事実のため、後の実験のためにＤＨＯ−濃度をμg／mlで１０×１０6細胞まで補外した。ＤＨＯ−水準の最良の直線状の増加は、密度１×１０6細胞／mlで見出された。この細胞密度を使用して、Ａ７７１７２６とともにインキュベートした細胞における細胞内ＤＨＯ−水準の時間依存増加を研究した。検出できるＤＨＯ量は、薬剤濃度に関係無く、インキュベーションの１時間後に測定することができた（表１１）。直線状増加は、６時間後に測定されたＤＨＯの最大量で記録された（表１１）。この期間の後、それ以上のＤＨＯの増加はなく、飽和が観察された。
【００５１】
【表１１】
0004189124.tif 000014
種々の量のＡ２０.２.Ｊ−細胞を、上に示した期間、Ａ７７１７２６（５μM)とともにインキュベートして、その細胞内ＤＨＯ−濃度を各試料点で測定した。（＊すべての値を１０×１０6細胞まで補外した）(ｎ＝２）。
【００５２】
【表１２】
0004189124.tif 000015
１００万のＡ２０.２.Ｊ−細胞／mlを、変化する濃度のＡ７７１７２６とともにインキュベートして、異なる時点でそれらの細胞内ＤＨＯ−濃度を測定した。データは、１０００万細胞まで補外したμｇ／ml ＤＨＯ±ＳＤとして示した（０〜４時間＝ｎ＝２、７時間＝ｎ＝４）。
【００５３】
Ａ７７１７２６を用いたＡ２０.２.Ｊ腫瘍細胞のインキュベーションの結果、ＤＨＯ−ＤＨ阻害によるＬ−ＤＨＯの迅速な蓄積が起こった。細胞内Ｌ−ＤＨＯ−濃度は、細胞数と相関し、そして時間依存性であった。Ｌ−ＤＨＯの監視は、患者におけるＡ７７１７２６免疫調節活性に対する代理マーカーである。
【００５４】
実施例３
動物：体重１６０〜２００ｇのオスのウィスター−ルイス（Wistar-Lewis）ラット［モールガード・ブリーディング・センター社（Mollegaard Breading Center Ltd.）、エイビー（Ejby）、ＤＫ］。
【００５５】
アジュバント関節炎：この疾患は、ウィスター−ルイスラットの尾の基部に、０.１mlのフロイントアジュバント（１mlの重、白色パラフィン油中に懸濁させた６mgのスメグマ菌）［メルク（Merck）、ダームシュタット］を注射することによって誘発された。病理学的症状は、一般に、疾患誘発後１０ないし１４日で現れる。
【００５６】
薬剤処理：薬剤を１％カルボキシメチルセルロース（ＣＯＭＣ）中に懸濁させた。健康な動物（ｎ＝１８）およびアジュバント罹患（ｎ＝１８）ラット（病気の９日目）に、５日間１日に２回（７：３０時および１３：３０時）、すなわち時点：０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、５４時間、７２時間、７８時間、９６時間で、１０mg／kgのＮ−４−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド、本明細書中で以後レフルノミド（leflunomide）を経口的に与えた。（表１２参照）。０時間の時点で、罹患グループと罹患していないグループとの両方からの３匹の動物を犠牲にして、基準線水準を測定した。追加の３匹の健康な動物および３匹の罹患動物を５日間偽薬（ＣＯＭＣ単独）で処理した。
【００５７】
サンプリング：１グループ当たり３匹の動物を各サンプリング時点で犠牲にした。血清および脾細胞を３時間、７時間、２７時間、５１時間、７５時間、および９９時間で採取した（表１２参照）。７時間の値を除いて、試料は、最終の薬剤適用の３時間後に採取した。７時間の値は、２番目の投与の１時間後に採取した。偽薬で処理した動物からの試料は、０時間（ｎ＝３）および９９時間（ｎ＝３）の時点で採取した。
【００５８】
【表１３】
0004189124.tif 000016
【００５９】
試料の調製：
− 心臓穿刺によって集めた血液を４℃で３０分間貯蔵した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を分離して、エッペンドルフ−キャップ内に−２０℃で貯蔵した（３）。ＨＰＬＣ分析の前に、凍結した血清を融解させ、タンパク質を除去するために、２００μlの血清をマイクロコンフィルター［型１０、コード４２４０７、アミコン］に加え、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
【００６０】
− 脾臓を採取して（ｎ＝３)、Ｌ−ＤＨＯ分析のためにプールした。掻き裂き（ステンレス鋼ストレーナを通過させること）によって分離した細胞を０.１７ＭのＮＨ4Ｃｌで処理して赤血球を溶解させた。５０００万の脾臓細胞プログループ（pro group）のアリコートを製造して、遠心分離用のキャップ内に入れ、上澄みを捨てた。細胞ペレットに、不変混合下で、５００μlの１.２Ｍ ＨＣｌＯ4溶液を加えて細胞を溶解させ、２分間遠心分離した。酸性細胞溶解産物を完全にガラスバイアルに移し、５００μlのクロロホルムを加えて、渦動（Vortex)ミキサーで２分間混合した。細胞脂質を遠心分離（１０分、１５０２×ｇおよび１０℃）によって沈殿させた。上澄みを２mlのキャップに入れて、−２０℃で貯蔵した。
【００６１】
Ａ７７１７２６血清濃度の測定は、以下のように実施した：
血清試料を室温にして、渦動ミキサーを使用して完全に混合した。この血清をピペット（２００μl）でエッペンドルフキャップ内に移し、内標準（Ａ７７１７２６、４００μｌのアセトニトリル中２μg）を加えた。次にこれらのチューブを渦動ミキサー中で混合し、１０分間２５００ｒｐｍ（室温）で遠心分離した。ＨＰＬＣ分析用に、上澄み（４００μl）をバイアルに移し、水（４００μl）を加えて、混合した。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりであった：ハードウェアは、ＴＳＰ Ｐ２０００ポンプ、ＴＳＰ ＡＳ１０００オートサンプラー、ＴＳＰ ＳＰ４２７０積分器、およびＴＳＰ ＵＶ１００ ＵＶ−検出器より成っていた。検出は、２９２ｎｍ波長で行った。移動相は、６５０mlメタノール［クロマソルブ（CHROMASOLV）］、２,４２ｇ臭化テトラブチルアンモニウム、および３５０ml ０.０５Ｍ酢酸アンモニウムより成っていた。流量は、０.５ml／分であった。１cmの逆相（Ｒ２）ガードカラムを伴うクロンパック・スフェリソルブ（CHROMPACK Spherisorb）ＯＤＳ−２ １０cmカラムを使用した。１００μlをカラム内に注入し、操作時間は、７分間であった。
【００６２】
Ｌ−ＤＨＯ−濃度のＨＰＬＣ測定：クロマトグラフィー分離は、実施例１に記載したように実施した。導電率検出器の領域は、１０μＳにセットし；分析は、室温で実施した。移動相は、１００ｍＭ ＮａＯＨ（Ａ）および水（Ｂ）より成っていた。この系を使用して下記の勾配を得た：
血 清
時間(分) Ａ(％) Ｂ(％)
0             1          99
2.5           1          99
14            23          77
18            60          40
24            60          40
26             1          99
45             1          99
【００６３】
脾細胞
時間(分) Ａ(％) Ｂ(％)
0             1          99
2.5           1          99
14             8          92
22             8          92
28            60          40
32            60          40
34             1          99
49             1          99
流量は、１ml／分であった。
【００６４】
健康なラットおよび罹患ラットは、両者ともに、レフルノミドの経口投与後に、増加した細胞（表１３）および血清（表１４）Ｌ−ＤＨＯ濃度を有していた。この増加は、これらの動物において測定したＡ７７１７２７血清濃度と相関していた（表１５）。最初に、経口薬剤投与の３時間後に、Ａ７７１７２６は、アジュバント罹患ラットでは濃度約２６μg／ml、そして罹患していないラットでは３１μg／mlに達した。これらの値は、２回目の投薬の１時間後（７時間）にピークに達したが、罹患ラットおよび罹患していないラットの両方においてこの実験の間７ないし１２μg／mlの間の値まで下がった。罹患動物は、これらの濃度に達するのに５１時間かかり、一方罹患していないラットは、２７時間後にすでにそれに達していた（表１５）。Ａ７７１７２６血清濃度は、アジュバント罹患齧歯動物および罹患していない齧歯動物の血清中のＬ−ＤＨＯ−濃度と相関していた。実験の間約５μg／mlに平衡していたＬ−ＤＨＯ−血清濃度に反して、脾細胞中に見出されたＬ−ＤＨＯの量は、９９時間後に検出限度（１.５μg／ml）未満に下がった。
【００６５】
【表１４】
0004189124.tif 000017
動物は、上記のように、レフルノミドまたは偽薬で処理し、脾臓を取り出し（ｎ＝３）、プールした。プールした脾細胞を二重反復して検定した。ＤＬ＝検出限度（１.５μg／ml）；
【００６６】
【表１５】
0004189124.tif 000018
【００６７】
【表１６】
0004189124.tif 000019
動物は、上記のように、レフルノミドまたは偽薬で処理し、血液を採取して、調製し、そして検定した。Ｌ−ＤＨＯ血清濃度は各動物について各々測定した。
ＤＬ＝検出限度（１.５μg／ml）；
【００６８】
【表１７】
0004189124.tif 000020
【００６９】
【表１８】
0004189124.tif 000021
動物は、上記のように、レフルノミドまたは偽薬で処理し、血液を採取して、調製し、そして検定した。Ａ７７１７２６血清濃度は各動物について各々測定した；
【００７０】
経口適用したレフルノミドは、生体内で非常に急速にＡ７７１７２６に変換される。Ａ７７１７２６は、レフルノミドの活性な代謝産物である［米国特許第５,６７９,７０９号］。アジュバント罹患または罹患していないラットのいずれかをレフルノミドとともにインキュベートすると、それらの血清および脾細胞内にＬ−ＤＨＯの迅速な蓄積が起こった。Ｌ−ＤＨＯ濃度は、Ａ７７１７２６の血液血清濃度と相関していて、この結果生体内でのこの分子によるＤＨＯ−ＤＨの活発な抑制を証明した。ヒトの臨床研究においては、Ｌ−ＤＨＯ監視は、患者におけるレフルノミドの免疫調節活性に対する代理マーカーであることができる。