(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトインターフェロン−βであって、ロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、フェニルアラニン（１５）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）、フェニルアラニン（１５６）のアミノ酸のうち少なくとも１つが少なくとも１つの水酸基を有するアミノ酸に変換されたことを特徴とする組換えヒトインターフェロン−β。
【請求項２】
前記少なくとも１つの水酸基を有するアミノ酸は、セリン、チロシン、および／またはトレオニンであることを特徴とする請求項１に記載のインターフェロン−β。
【請求項３】
下記のアミノ酸配列を含み、Ｘａａ（５）、Ｘａａ（８）、Ｘａａ（１５）、Ｘａａ（４７）、Ｘａａ（５０）、Ｘａａ（１０６）、Ｘａａ（１１１）、Ｘａａ（１１６）、Ｘａａ（１２０）、Ｘａａ（１５６）のうち、少なくとも１つのアミノ酸がセリン、チロシン、またはトレオニンであり、その他のアミノ酸は、
Ｘａａ（５）はロイシン、Ｘａａ（８）はフェニルアラニン、
Ｘａａ（１５）はフェニルアラニン、Ｘａａ（４７）はロイシン、
Ｘａａ（５０）はフェニルアラニン、Ｘａａ（１０６）はロイシン、
Ｘａａ（１１１）はフェニルアラニン、Ｘａａ（１１６）はロイシン、
Ｘａａ（１２０）はロイシン、Ｘａａ（１５６）はフェニルアラニン
であることを特徴とする請求項１または２に記載のインターフェロン−β。
0004189035.tif 000025
【請求項４】
下記のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のインターフェロン−β。
0004189035.tif 000026
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のインターフェロン−βを医薬品の製造、またはインターフェロンレベルの測定に用いる方法。
【請求項６】
組換えヒトインターフェロン−βの遺伝子を含む微生物を利用して請求項１に記載の組換えヒトインターフェロン−βを製造する方法であって、微生物中の組換えヒトインターフェロン−βの遺伝子のロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、フェニルアラニン（１５）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）、フェニルアラニン（１５６）の遺伝子コードの少なくとも１つが、少なくとも１つの水酸基を有するアミノ酸の遺伝子コードに変換されたことを特徴とするインターフェロン−βの製造方法。
【請求項７】
微生物などを利用して請求項１に記載の組換えヒトインターフェロン−βを製造する方法であって、ロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、フェニルアラニン（１５）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）、フェニルアラニン（１５６）の遺伝子コードの少なくとも１つが、少なくとも１つの水酸基を有するアミノ酸の遺伝子コードに変換された組換えヒトインターフェロン−βの遺伝子が微生物の遺伝物質に挿入されたことを特徴とするインターフェロン−βの製造方法。
【請求項８】
組換えヒトインターフェロン−βの遺伝子を含む微生物を利用して請求項１に記載の組換えヒトインターフェロン−βを製造する方法であって、微生物中の組換えヒトインターフェロン−βの遺伝子のロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、フェニルアラニン（１５）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）、フェニルアラニン（１５６）の遺伝子コードの少なくとも１つが、セリン、チロシン、またはトレオニンの遺伝子コードに変換されたことを特徴とするインターフェロン−βの製造方法。
【請求項９】
微生物などを利用して請求項１に記載の組換えヒトインターフェロン−βを製造する方法であって、ロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、フェニルアラニン（１５）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）、フェニルアラニン（１５６）の遺伝子コードの少なくとも１つが、セリン、チロシン、またはトレオニンの遺伝子コードに変換された組換えヒトインターフェロン−βの遺伝子が微生物の遺伝物質に挿入されたことを特徴とするインターフェロン−βの製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、溶解性を向上させた組換えヒトインターフェロン−βに関する。
インターフェロン−βは受容体に結合することによって遺伝子の活性化を引き起こす調節タンパク質である。その結果として、細胞内における抗ウイルス性、抗増殖性、その他の生物学的活性を媒介する。
インターフェロンは、インターロイキンと同様にサイトカインの部類に属し、さらに異なるタイプに細分される。
タイプ１インターフェロン（−α、−β、−ω、−τ）
タイプ２インターフェロン（−γ）
ヒトインターフェロン−βは、分子量２２，０００ダルトン、アミノ酸残基１６６のタンパク質である。これは主にウイルスの攻撃を通じて繊維芽細胞で形成され、抗ウイルス性、抗増殖性、その他の生物学的活性を有する。ヒトインターフェロン−βのアミノ酸配列は、谷口ら（１９８０）によって「遺伝子」第１０版１１ページから１５ページに最初に発表された。これを図１に示す。
インターフェロン−βは、細菌の細胞またはほ乳類の細胞から遺伝子工学技術によって生産され、以前は多くの患者にとって不治の病であった多発性硬化症の治療に効果的に使用されている。しかし、タンパク質の非常に高い疎水性によって、組換えヒトインターフェロン−βの溶解性は非常に低く、組換えヒトインターフェロン−βの生産および取扱にとって問題となる。
本発明の目的は、水などの極性溶媒に対する溶解性を向上させた組換えヒトインターフェロン−βの誘導体を得ることにある。さらに、本発明の目的は、水などの極性溶媒に対する溶解性を向上させた組換えヒトインターフェロン−βの誘導体の製造方法および利用可能性を提示することにある。
この課題は、請求項１に記載された組換えヒトインターフェロン−β、請求項５に記載されたその利用方法、および請求項６または７に記載されたその製造方法によって解決される。
請求項１によれば、既知のヒトインターフェロンに含まれる、ロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、フェニルアラニン（１５）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）、フェニルアラニン（１５６）の１０個の疎水性のアミノ酸のうち少なくとも１つが親水性のアミノ酸に交換される。このように、本発明は、アミノ酸の個々の変換のみならず、個々の変換の全ての可能な組み合わせにも関係する。
上記のアミノ酸は、ヒトインターフェロン−β表面に本質的に位置し、表面のうちの比較的大きな部分を占める。それゆえ、これらのアミノ酸の交換は、組換えヒトインターフェロン−βの表面の親水性を大きく向上させ、このタンパク質の水などの極性溶媒への溶解性を向上させる。本発明の組換えヒトインターフェロン−βによれば、親水性が向上した結果として、生産時の取扱ばかりでなく、活性を有する物質を得るための加工時の取扱も非常に容易になる。
本発明の組換えヒトインターフェロン−βの誘導体は、従来から広く知られているように、大腸菌などの微生物に本発明のタンパク質の１つの遺伝子を注入して培養する方法によって生産される。これらの遺伝子工学的方法によって変化させられた微生物は、遺伝子工学では良く知られている、当該アミノ酸を親水性アミノ酸に変換する変異誘発方法によって生産される。
本発明のタンパク質は、例えば多発性硬化症の治療薬などの医薬品の製造だけでなく、試験管内で行われるいわゆるインビトロ（in vitro）実験による精密化学や、インターフェロンレベルの測定などに利用できる。これらのタンパク質の高い親水性によって、医薬品や精密化学分野での製造、運搬、保管、および応用が容易になる。
本発明によるタンパク質のさらなる有利な具体例は従属項によって与えられる。
セリン、チロシン、およびトレオニンはそれぞれ１つの水酸基を持っており、特に親水性の高いアミノ酸であるため、これらのアミノ酸への変換は特に好ましい。
セリンは小さいので、変換に伴うタンパク質の空間的配置の変化がわずかであり、特に変換に適している。
天然の組換えヒトインターフェロン−βのうち、変換可能なアミノ酸をＸａａで表したアミノ酸配列を図２に示す。上記１０個のアミノ酸が選択的にセリンに変換される。これらのアミノ酸が変換されると、組換えヒトインターフェロン−βの機能性および効力をほとんど損なうことなく、表面の親水性を非常に高くすることができる。
特に好ましい具体例を図３に示す。ここでは上記１０個のアミノ酸の全てがセリンに変換されているので、組換えヒトインターフェロン−βの表面の親水性は特に高くなる。
本発明の組換えヒトインターフェロン−βの誘導体の例は、以下の節で与えられる。
図１は、天然の組換えヒトインターフェロン−βを示す。
図２は、本発明による組換えヒトインターフェロン−βの誘導体を示す。
図３は、本発明による組換えヒトインターフェロン−βの誘導体を示す。
図４は、本発明によるインターフェロン−βを製造するための変異誘発のためのプライマーを示す。
上記したように、図１は、天然の組換えヒトインターフェロン−βを示す。この型は既知の分子生物学および生物工学の知識によって、現在すでに製造されうるものである。
図２は、少なくとも１つの水酸基を持つアミノ酸（好ましくはセリン、チロシン、および／またはトレオニン）に変換されうるアミノ酸をＸａａで表した天然の組換えヒトインターフェロン−βの配列を示す。本発明の組換えヒトインターフェロン−β誘導体の表面は、変換の結果、高い親水性を有する。
例証として、ロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、フェニルアラニン（１５）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）、フェニルアラニン（１５６）をセリンに変換した１０個のインターフェロン−βの誘導体を全て製造した。とりわけ、ロイシン（５）、フェニルアラニン（８）、ロイシン（４７）、フェニルアラニン（５０）、ロイシン（１０６）、フェニルアラニン（１１１）、ロイシン（１１６）、ロイシン（１２０）のアミノ酸を変換した誘導体と、これらの誘導体のシステイン（１７）をセリンに変換した誘導体は、比較可能な生物学的活性の効力が、天然のヒトインターフェロン−βに比べてすぐれていた。
図３は、以下のアミノ酸がセリンに変換された組換えヒトインターフェロン−βの例を示す：
この組換えヒトインターフェロン−β誘導体は、タンパク質表面の親水性が特に高いので、水への溶解性が特に高い。
例えば、４７、５０、１０６、１１１、１１６および１２０の位置のアミノ酸を全て変換した誘導体も、この例で用いたシステイン（１７）をセリンに変換した出発タンパク質と同様の活性を示した。
本発明の組換えヒトインターフェロン−βをコードする遺伝子は、よく知られた変異誘発方法によって製造される。
変異誘発はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の方法によって起こる。変異は、オリゴヌクレオチドの合成を通じて導入される。インターフェロン−β遺伝子を持つプラスミドＤＮＡが鋳型として働く。ＰＣＲ法によってプラスミド全体が複製される。ＰＣＲ断片は、ＰＣＲ混合物全体を制限酵素ＤｐｎＩで切断することによって選択される。この酵素はメチル化された領域のみを認識する。ＰＣＲによってインビトロに生産された断片はメチル化されていないので、鋳型ＤＮＡのみがＤｐｎＩによって切断される。ＤｐｎＩによる切断が成功した後、直鎖化された鋳型の長さを有する断片はそのまま残され、これが変異を媒介する。生産されたＰＣＲ断片は、クローニングされ、配列化される。
0004189035.tif 000002
ＰＣＲは、熱サイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチカンパニー）を用いて行われた。
“順”プライマーと“逆”プライマーの２つのプライマーがそれぞれのＰＣＲに必要である。２つのプライマーは互いに相補的であるが、それぞれ異なる鎖に逆向きに結合する。
図４は、左に示したアミノ酸をセリンに変換して本発明のインターフェロン−βを製造するための変異誘発に用いられたプライマーを示す。
最後の２つのプライマーは“逆”プライマー変異のみを含む。これらのプライマーによるＰＣＲは、先に挿入されていた５／８または１０６／１１１の変異を廃することなく、さらなる変異を導入する。野生型を鋳型に用いた場合、“逆”プライマーによって同時に４個の変異を導入することができる（５−１７、場合によっては１０６−１２０）。
シーケンスプロトコル
（1）一般データ
（i）申込者：
（A）名前：フラウンホッファー−ゲゼルシャフト  ツァー  フェーデルング  デア  アンゲバンテンフォルシュング  エー  ハー（Fraunhofer-Gesellschaft zur Forderung der angewandten Forschung e.V.）
（B）通り：レオンロードシュトラーゼ  ５４
（C）町村：ミュンヘン
（D）州：フライシュタート  バイエルン
（E）国：ドイツ連邦共和国
（F）郵便番号：８０６３６
（ii）発明の名称：溶解性を向上させたヒト組換えインターフェロン−β
（iii）配列の数：２２
（iv）コンピュータ読み取り可能な形式：
（A）データ担体：フロッピーディスク
（B）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：パテントイン（ＥＰＡ）
（2）配列識別番号１に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：１６６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：タンパク質
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス
（G）細胞型：繊維芽細胞
（xi）配列識別番号１の配列
0004189035.tif 000003
（2）配列識別番号２に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：１６６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：タンパク質
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス
（G）細胞型：繊維芽細胞
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：５
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはロイシン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：８
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはフェニルアラニン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：１５
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはフェニルアラニン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：４７
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはロイシン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：５０
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはフェニルアラニン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：１０６
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはロイシン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：１１１
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはフェニルアラニン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：１１６
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはロイシン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：１２０
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはロイシン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（ix）特徴
（A）名称／記号：特別
（B）位置：１５１
（C）その他のデータ／備考：Ｘａａはロイシン、セリン、チロシン、またはトレオニン
（xi）配列識別番号２の配列
0004189035.tif 000004
（2）配列識別番号３に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：１６６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：タンパク質
（iii）仮定：なし
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス
（G）細胞型：繊維芽細胞
（xi）配列識別番号３の配列
0004189035.tif 000005
（2）配列識別番号４に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号４の配列
0004189035.tif 000006
（2）配列識別番号５に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号５の配列
0004189035.tif 000007
（2）配列識別番号６に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号６の配列
0004189035.tif 000008
（2）配列識別番号７に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号７の配列
0004189035.tif 000009
（2）配列識別番号８に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号８の配列
0004189035.tif 000010
（2）配列識別番号９に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号９の配列
0004189035.tif 000011
（2）配列識別番号１０に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１０の配列
0004189035.tif 000012
（2）配列識別番号１１に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１１の配列
0004189035.tif 000013
（2）配列識別番号１２に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１２の配列
0004189035.tif 000014
（2）配列識別番号１３に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１３の配列
0004189035.tif 000015
（2）配列識別番号１４に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１４の配列
0004189035.tif 000016
（2）配列識別番号１５に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１５の配列
0004189035.tif 000017
（2）配列識別番号１６に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１６の配列
0004189035.tif 000018
（2）配列識別番号１７に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１７の配列
0004189035.tif 000019
（2）配列識別番号１８に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１８の配列
0004189035.tif 000020
（2）配列識別番号１９に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号１９の配列
0004189035.tif 000021
（2）配列識別番号２０に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号２０の配列
0004189035.tif 000022
（2）配列識別番号２１に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号２１の配列
0004189035.tif 000023
（2）配列識別番号２２に関するデータ
（i）配列パラメータ：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の型：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ
（xi）配列識別番号２２の配列
0004189035.tif 000024
【図１】
0004189035.tif 000027
【図２】
0004189035.tif 000028
【図３】
0004189035.tif 000029
【図４】
0004189035.tif 000030