(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列からなる低分子ペプチド。
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓで表される新規なペプチド。
【請求項２】
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓで表される新規なペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
カルボキシペプチダーゼＲの活性を抑制する低分子ペプチドに関し、より詳しくは、脳梗塞、心筋梗塞、播種性血管内凝固症候群（DIC：disseminated intravascular coagulation)の治療に用い得る低分子ペプタイドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
補体活性化反応の過程で生成されるＣ３ａやＣ５ａ等のアナフィラトキシン不活化酵素として、発明者らが１９８９年に報告した（Campbell, W. and Okada, H. ； Biochim. Biophys. Res. Comm. 162: 933-939(1989)）カルボキシペプチダーゼＲ（CPR：Carboxypeptidase R)は前駆体のproCPRから炎症時や血液凝固時に活性化される。このproCPRはその後、スロンビン活性化線溶系（TAFI：Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor)としても報告されたカルボキシペプチダーゼと同一物質であることが判明した。従って、CPRはアナフィラトキシンやブラジキニン等の炎症性ペプチドを不活化する作用の他に、血栓溶解（線溶）阻止作用を持つことが明らかになった（図１参照）。
【０００３】
血栓症の治療には、プラスミノーゲン（Plasminogen）をプラスミン（plasmin）に活性化する組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA：Tissue plasminogen activator)が汎用されているが、CPRの活性が高まっている状態では、Plasminogenが結合するフィブリン（fibrin）分子のカルボキシ末端のリジンがCPRによって切除されるため、tPAを投与してもPlasminへの活性化が充分起こらなくなり、血栓溶解が大きく遅延してしまう（図１参照）。ポテトカルボキシダーゼ阻害因子(PCI：Potato carboxypeptidase inhibitor)でCPRの活性を抑制するとtPAの作用に相乗して、血栓溶解などの線溶反応を強力に促進する（図６のPCI＋T＋tPA＋TＭ)。しかし、PCIは３９個のアミノ酸からなるので、人体に投与するには分子量が大きいために抗体形成を誘導したりして、アナフィラキシーショックなどの副作用を惹起することが懸念される。従って、PCIのままでは医薬品への応用は容易でないと考えられ、PCIの活性に類似した作用を有する低分子ペプチドの出現が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事実に鑑みて、PCI活性を有する低分子ペプチドを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、PCI活性を有する低分子ペプチドの創製に成功した。
【０００６】
発明者らはCPRの阻害因子は血栓溶解に重要な役割を果たすと考え、CPRの阻害因子であるPotato carboxypeptidase inhibitor(PCI)の作用を解析したところ、血栓溶解にはTissue plasminogen activator(tPA)と共に、CPR阻害剤のPCIを作用させると極めて強力な線溶活性を発揮することを見出した（図６のPCI＋T＋tPA＋TＭ)。PCIは３９個のアミノ酸からなる因子である故、その構造を解析して９個のアミノ酸からなる低分子ペプチドの設計と合成を検討した結果、PCIと同様な作用を有するペプチドの開発に成功した。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明のカルボキシペプチダーゼＲの活性を抑制する低分子ペプチドを例示するが、本発明を限定するものではない。
本発明のペプチドは、化学的合成の方法を含む当該分野で周知の方法のいずれかにより合成される。例えば、直線状配列は市販の自動ペプチド合成機（例えば、Applied Biosystems,Inc.,により製造された合成機）を用いて合成される。ペプチドはアミノ酸又はアミノ酸アナログを用いて合成される。必要に応じてこれらのアミノ酸の活性基は、例えば、t-ブチルカルボネート（ｔ-BOC)基またはフルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)基を用いて保護される。アミノ酸及びアミノ酸アナログは商業的に購入可能か、又は当該分野で公知の方法を用いて合成することができる。固相法を用いて合成されたペプチドは、樹脂（4−メチルベンズヒドリルアミンMBHA)、4−（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチル、及び4−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチルーコポリ（スチレンー1%ジビニルベンゼン）（Wang樹脂を含む）に結合した型で作製され、これを周知の方法で切り出すことができる。このようにして合成されたペプチドは、高速液体クロマトグラフィーにより精製される。合成されたペプチドは精製することにより９９％を越える純度のものが得られる。
【０００８】
所望により、本発明のペプチド中に（Ｌ）アミノ酸に代えて（Ｄ）アミノ酸を含有させることができる。例えば、1以上の（Ｄ）アミノ酸の組み込みは、ペプチドに安定性を付与すると共に、体内での活性を長期間維持することができる。また、ペプチドのシステインをモノヨード酢酸処理するなどの化学修飾をしたアミノ酸を利用することもできる。
【０００９】
本発明のカルボキシペプチダーゼＲの活性を抑制する低分子ペプチドを脳梗塞、心筋梗塞、播種性血管内凝固症候群（DIC：disseminated intravascular coagulation) などの治療に利用するための組成物は、生理学的なキャリアと組み合わせることによって得ることができる。生理学的に受容可能なキャリアは当該分野で周知であり、そして生理学的緩衝化食塩水もしくは他の緩衝作用を有する水溶液、又は溶媒、あるいはグリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）、又は注射可能な有機エステルのような溶剤を含む。生理学的に受容可能なキャリアはペプタイドを安定化させるか、吸収を増大させる化合物をも含む。このような生理学的に受容可能な化合物は、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン等の糖類、アスコルビン酸、又はグルタチオン等の抗酸化剤、キレート剤、アルブミン等のタンパク質、あるいは他の安定化剤、又は賦形剤を含む。tPA等の他の生理活性物質を添加することも可能である。生理学的に受容可能なキャリアの選択は、投与経路、対象疾患によりそれぞれに組み合わせられる。また、(D)アミノ酸を含有させることなどにより、消化酵素による分解を防ぎ、経口投与も可能となる。
【００１０】
なお、本明細書中で使用するアミノ酸およびその誘導体の１文字略号および３文字略号は、以下の通りである。
A           Ala          アラニン
R           Arg          アルギニン
N           Asn          アスパラギン
D           Asp          アスパラギン酸
C           Cys          システイン
Q           Gln          グルタミン
E           Glu          グルタミン酸
G           Gly          グリシン
H           His          ヒスチジン
I            Ile          イソロイシン
L           Leu          ロイシン
K           Lys          リジン
M           Met         メチオニン
F            Phe         フェニルアラニン
P            Pro         プロリン
S            Ser          セリン
T            Thr         スレオニン
W           Trp         トリプトファン
Y            Tyr         チロシン
V            Val         バリン
【００１１】
（１）Potato carboxy-peptidase inhibitor(PCI)の構造の立体構造モデルを図２Ａに、アミノ酸配列（一次構造）を図２Ｂに示す。ジスルフィド結合を形成しているシステイン(Cys)間を線で結んである。CPRを特異的に抑制する作用を持つPCIの構造を、コンピュータグラフィックスなどを駆使してCPRとフィットさせ得ると考えられる場所を探索し、活性部位と想定される部位の解析を行った。図２Ａに示すようにLys10、Lys13及びArg32がPCIの分子表面上で接近して存在する部位が候補であると推定し、その３個の塩基性アミノ酸残基が重要な役割を果たしている可能性があると推定した。そこで、その部分を特徴づけるペプチドを設計したPCI-2とKPCI-Rを表１に示す。
【００１２】
表１に示すようにPCI-2KとPCI-Rのそれぞれのペプチドには１個のCys(C)を含んでいる。そこで、これらのペプチドをジスルフィド結合で結んだPCI-2K-Rを作成した（表１）。このPCI-2K-Rは図３に示すようにPCR活性に対してある程度の競合阻害を起こすことが判明した。ジスルフィド結合で結んだPCI-2K-Rの抑制作用はPCIに比較して高くなかった。しかし、少なくとも２個のリジンと１個のアルギニンが組み込まれることによりある程度の阻害効果を示したことより、最初に予測したLys10、Lys13及びArg32で構成される塩基性アミノ酸の３角形の配列が重要であろうとの推測が正しかったことを示唆している。
【００１３】
【表１】
0004085190.tif 000002
【００１４】
PCIのアミノ末端から10アミノ酸ずつのフレームで、１個ずつフレームをずらしたペプチドをニトロセルローズ上で合成し、各ペプチドがスポットされたニトロセルローズシートを10 ug/mlの濃度にしたproCPR溶液（PBS with 0.05% Tween20, 1% BSA）に入れて4℃でオーバーナイトした。シートを洗浄後、FITCで標識した10 ug/mlのanti-proCPR モノクローナル抗体（10G1) を作用させ、洗浄後、蛍光色素の発光でproCPRが結合したペプチドを検出した。その結果、図４ に表示した30種類のペプチドの内、右側に縦棒で示した９種のペプチドがproCPRとの結合性を示した。proCPRが結合性を示したのは、２個のＫ（リジン) を持つ全てのペプチドと１個のＲ(アルギニン）を持つペプチドの一部であった。
【００１５】
（２）上記の結果を踏まえ、PCI分子上における、Lys（リジン）とArg（アルギニン）のアミノ酸残基のアルファーカーボン間（Ｃα-Ｃα）およびカーボン・窒素原子間（C-N)の空間的は位置の解析を行った。そのPCIに付いての高次構造解析の結果に基づき、新たに、CPI-2KR (アミノ酸配列：Cys-Lys-Pro-Ala-Lys-Asn-Ala-Arg-Cys) を設計合成した(表１)。このペプチドは合成基質のhippuril-L-argineneを分解するCPRの活性に対して強力な阻害作用を持つだけでなく、図６及び図７ に示すごとく、Trombomodulin (TM) を添加した血漿の凝固線溶の遅延に対してもtPAと相乗して線溶を亢進させる作用を認めた。すなわち、血漿にカルシュウム、Thrombinと共に、Thrombomodulin (TM) を添加することでCPRが過剰に活性化され、CPRによる線溶阻害が起こり、この際にはtPAを作用させても線溶が遅延したままになる（図５）。このとき、PCIを加えておくとCPRが阻害されて、tPAが働けるようになるため線溶反応が起こる（図６)。実際の実験は、96穴プレートにあらかじめ、100 ulの反応液としたとき終濃度が3.3 NIH units/mlとなるThrombinと20 mM となるカルシウムの混合液を20 ul 入れておき、8 nM となるTMまたはTMを含まないバッファーコントロールを10 ulを加え、さらに、PCI や各濃度の被験サンプルまたはバッファーのみを20 ul 加えておく。これに1.0 (または０）ug/mlのtPAを添加したクエン酸血漿を加えて反応を開始する。経時的にOD420 nmの吸光度を測定して、フィブリンの形成と溶解を観察する実験系である。フィブリン形成で吸光度（濁度）が一旦上昇した後、線溶系の働きで吸光度の低下が30分過ぎから徐々に起こってくる。
【００１６】
TMを添加してなければ、tPAの作用により線溶系が強力に起こり、20分ほどで吸光度が殆ど完全に元の血漿レベルに低下する。tPAを加えなければ2時間後でも線溶が殆ど起こらないので、tPAの効果が強力に現れる（図５）。しかし、TMが添加されている場合には、tPAの働きが殆ど現れず、線溶は大きく遅延したままである（図５）。これに12 nmole/ml のPCIを加えておいたものでは、tPAの効果が強力に現れ、TMを加えなかった場合とほぼ同程度の線溶が起こる（図６）。CPI-2KRの種々の濃度を加えると、図６及び図７ に示すごとく、濃度依存的にTM添加で遅延した線溶がPCIの場合と同様にtPAと相乗効果を発揮して解除される。
【００１７】
図７の実験では、TMとtPAが添加してあるので、CPI-2KRがTMで活性化されるCPRを不活化するためにtPAが働けるようになったと考えられる。250 nmole/ml のCPI-2KRを作用させると、12 nmole/mlのPCIとほぼ同程度の線溶亢進作用を示している（図６）。
【００１８】
以上の結果を纏めると、ヒト血漿にカルシウムとThrombin (T) を加えるときに、Tissue plasminogen activator (tPA) を添加しておくと、線溶は極めて早く起こり、OD420 nm の吸収は30分で速やかに低下する。このとき、Thrombomodulin (TM)も添加しておくと、proCPRを強力に分解活性化してCPRを形成するT/TM complexが形成される。この様な状況では、フィブリンのカルボキシル基末端のリジンの切除がCPRによって起こり、plasminogenがフィブリンのリジンに結合できないためにtPA を添加してもplasminへの活性化が起こらずtPAによる線溶促進は全く認められない。このとき、250 nmole/ml の本発明ペプチドを添加しておくとCPRの作用を阻害してtPAによる線溶促進が顕著に起こる。その効果は、12 nmole/ml のPCIと同程度の効果である。分子量は約989であるので、250 nmole/mlは 0.25 mg/ml に相当し、ヒト循環血液量を６リットルとしたときには、血漿は３リットルになるので750 mg の投与で達しうるものであり、治療薬として投与可能な量と考えられる。
【００１９】
（３）CPI-2KR は両端にシステイン（Cys）を持っているので、その間でジスルフィド結合を起こさせて、リング状にしたものも作製した(表１のCPI-2KR-cycle)。しかし、リング状にしたものは、直鎖のCPI-2KRに比べて、CPR抑制作用はほとんど認められなかった（図８）ので、ペプチドの形状が、抑制作用を発揮するには不都合な形になった。
【００２０】
CPI-2KR は、ペプチド中に２個のLys（リジン）と１個のArg（アルギニン）を含むが、これ基をに、若干のアミノ酸置換やモノヨード酢酸等の化学修飾により、更に強力な活性を持ったペプチドに改変できると考えられる。また、Ｄアミノ酸を用いることにより、生体内や消化管内での分解を防いで長期に作用させたり、経口投与することも可能である。
【００２１】
（４）proCPRにCPI-2KR やPCIを作用させた後、標識したPCIとの結合性をブロックする作用の有無を以下のごとく検討した。96穴平底プレート(ELISA用) の各ウエルに10 ug/mlのproCPRを50 ulずつ入れて一晩４℃において吸着させた後、洗浄しBCAで１時間ブロック処理をした。プレートを洗浄後、500 ug/ml から２倍希釈系列のCPI-2KRまたはPCIを50 ulづつ入れて室温で１時間反応させた。この処理をした後、プレートを洗浄し、ビオチンで標識したPCIを100 ul 加えて２時間室温で反応させた後、プレートを洗浄し、結合したビオチン標識PCIをペルオキシダーゼ標識アビジンを加えて反応させた後、通常のELISA法に準じてOPDと過酸化水素でペルオキシダーゼ活性を発色により測定した。図９ にその結果を示しているが、PCIでは結合の競合阻害を起こしたが、CPI- 2KRでは高濃度での処理では、逆にPCIの結合を亢進していた。CPI-2KRはproCPRに作用して、proCPRの高次構造に変化を与え、PCIとの結合性を高める作用がある。このことはMichaelis-Mentonカイネティックス解析でCPI-2KRが混合型タイプの阻害活性を示した実験結果を得たこととも一致する。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のカルボキシペプチダーゼＲの活性を抑制する低分子ペプチドは、脳梗塞、心筋梗塞、播種性血管内凝固症候群（DIC：disseminated intravascular coagulation) などの治療に利用し得ると共に、tPAと併用する事により、tPAとの相乗効果で高い治療効果が期待できる。また、脳梗塞や心筋梗塞などの血栓が病因になる疾病の治療並びに予防にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】線溶系に対するCPR(TAF1a)の作用を示す図面
proCPRはThrombin(T)とThrombomodulin(TM)の複合体によって強力に活性化される。CPRが過剰にできてしまうと、フィブリン分子のC末端に露出したリジン(K)を切除してしまう。Kが除かれると、プラスミノーゲンがフィブリンに結合できなくなり、ティッシュプラスミノーゲンアクティベーター(tPA)によるプラスミンへの活性化が起こらない。そのためtPAが存在しても、線溶を起こせない。
【図２】ＡはPCIのリボン構造を示す図面、ＢはPCIの一次構造を示す図面
【図３】PCIとPCI-2K-Rの阻害作用を示す図面
【図４】proPCRに強く結合する位置を示す図面
【図５】血漿のフィブリン凝固とフィブリン溶解曲線を示す図面
血漿にCaと共にThrombin(T)を作用させると凝固反応で、フィブリンが析出する。２時間後でもフィブリンが析出したままで吸光度が高い。tPAをこれに加えれば直ちに線溶系が働いてフィブリン溶解が起こり３０分ほどで、元の血漿レベルに下がる。ところが、TMを血漿に更に添加しておいた時には、tPAが充分働けず、線溶反応（フィブリン溶解）が遅延する。
【図６】トロンボモジュリン添加で遅延したtPAによる線溶がPCIやCPI-2KRで回復することを示す図面
12nmole/mlのPCI又は250nmole/mlのCPI-2KRを添加しておくと、TMを添加しなかった場合に近いまでにtPAが働いて、線溶機能を発揮する。TとTMの複合体によって活性化されるCPRを抑制したためである。
【図７】CPI-2KRの濃度効果を示す図面
血漿とCaと共に、T、TM、tPAを作用させて凝固と線溶反応を追跡するとき、種々の濃度のCPI-2KRを添加したときの線溶亢進作用は15.6μg/ml以上で認められた。
【図８】CPI-2KR-cycleではtPAとの相乗効果を示さないことを示す図面
【図９】PCIとPCI-2KRによるproCPRへのビオチン結合PCIとの競合結合阻害性を示す図面
(A)PCIは競合阻害を起こすが、(B)CPI-2KRは高濃度ではproCPRのCPIの結合を亢進する(各初濃度は500μg/ml)。
（  以下余白  ）
【配列表】
0004085190.tif 000003
0004085190.tif 000004
【図１】
0004085190.tif 000005
【図２】
0004085190.tif 000006
【図３】
0004085190.tif 000007
【図４】
0004085190.tif 000008
【図５】
0004085190.tif 000009
【図６】
0004085190.tif 000010
【図７】
0004085190.tif 000011
【図８】
0004085190.tif 000012
【図９】
0004085190.tif 000013