(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子受容体関連（ＴＲＡＦ）分子に結合できるＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡであって、
（ａ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む本明細書でクローン１０と命名されたｃＤＮＡ；
（ｂ）配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；または
（ｃ）遺伝暗号の結果として、（ａ）または（ｂ）で定義されたＤＮＡに縮重され、かつＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２２〜５０１に結合できる生物学的に活性なタンパク質をコードするＤＮＡ
であるＤＮＡ。
【請求項２】
ＴＲＡＦ分子がＴＲＡＦ２である請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
【請求項３】
ＮＦ−κＢの活性もモジュレートするタンパク質をコードする請求の範囲第１項または第２項記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
真核生物宿主細胞で発現され得る請求の範囲第４項記載のベクター。
【請求項６】
原核生物宿主細胞で発現され得る請求の範囲第４項記載のベクター。
【請求項７】
請求の範囲第４項〜第６項のいずれかに記載のベクターを含む形質転換された真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞。
【請求項８】
ＴＲＡＦ２のアミノ酸２２２〜５０１間のＴＲＡＦ２タンパク質の少なくとも一部分と結合することができ、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のＤＮＡによってコードされるＮＩＫタンパク質。
【請求項９】
請求の範囲第８項記載のタンパク質の製造法であって、
前記タンパク質の発現に適切な条件下で請求の範囲第７項記載の形質転換された宿主細胞を増殖すること、必要な場合、前記タンパク質を得るために、転写後修飾を行うことおよび前記発現されたタンパク質を単離することからなる製造法。
【請求項１０】
請求の範囲第８項記載のＮＩＫタンパク質に対して特異的である抗体またはその活性フラグメントもしくは誘導体。
【請求項１１】
ＴＲＡＦ２に直接結合し得る請求の範囲第８項記載のタンパク質を単離して同定する方法であって、前記ＴＲＡＦ２をコードする配列が第一のハイブリッドベクターによって担持され、そしてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列が第二のハイブリッドベクターによって担持される酵母ツーハイブリッド法を適用することからなり、それらベクターが酵母宿主細胞を形質転換するために用いられ、形質転換された陽性細胞が単離され、続いて前記第二のハイブリッドベクターを抽出して前記ＴＲＡＦ２に結合するタンパク質をコードする配列を得る方法。
【請求項１２】
請求の範囲第８項記載のタンパク質に結合し得るリガンドをスクリーニングする方法であって、該タンパク質が結合しているアフィニティークロマトグラフィーのマトリックスを細胞抽出液と接触させて、リガンドを前記マトリックスに結合させることならびに前記リガンドを溶出、単離および分析することを含む方法。
【請求項１３】
請求の範囲第８項記載のタンパク質に結合し得るリガンドをコードするＤＮＡ配列をスクリーニングする方法であって、該タンパク質をコードする配列が第一のハイブリッドベクターによって担持され、そしてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列が第二のハイブリッドベクターに担持される酵母ツーハイブリッド法を適用すること、酵母宿主細胞を前記ベクターで形質転換すること、その正に形質転換された細胞を単離することおよび前記第二のハイブリッドベクターを抽出して前記リガンドをコードする配列を得ることからなる方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、ＴＲＡＦ２に結合することができるタンパク質類をコードするＤＮＡ配列類、これらＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質類、ならびに前記タンパク質が結合するＴＲＡＦ２もしくはほかの分子によって仲介されるＮＦ−κＢ誘発またはほかの活性に関連する病理学的な状態の治療もしくは予防を行う際の前記タンパク質類とＤＮＡ配列類の使用に関する。
発明の背景技術
腫瘍壊死因子／神経成長因子（ＴＮＦ／ＮＧＦ）受容体のスーパーファミリーは、そのメンバーの細胞外ドメイン間の構造の相同性によって定義される（Ｂａｚａｎ、１９９３；Ｂｅｕｔｌｅｒおよびｖａｎ  Ｈｕｆｆｅｌ、１９９４；Ｓｍｉｔｈら、１９９４）。２種の受容体、ｐ５５ＴＮＦ受容体とＦａｓ／ＡＰＯ１、を除いて、この受容体ファミリーの各種メンバーは、それらの細胞内ドメインに、構造の明確な類似性を示していない。それにもかかわらず、これら受容体には機能に大きな類似性があり、共通のシグナリング経路を共有していることを示している。この類似性の一例は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのいくつもの受容体が転写因子ＮＦ−κＢを活性化できることである。この共通の性能は、ＮＦ−κＢを活性化する細胞質タンパク質であるＴＮＦ受容体関連因子２（ＴＲＡＦ２）が、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体のいくつかの構造が類似していない細胞内ドメインに結合できることが原因であった。ＴＲＡＦ２がどんな機構で作用するのか、そして、ＴＲＡＦ２が配位結合する異なる受容体に対しＴＲＡＦ２がどのように応答するのか知られていない。
ＴＲＡＦ２は、ＴＲＡＦと称されるタンパク質類の最近報告されたファミリーのメンバーであり、このファミリーには、たとえばＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．，Ｗｏｎｇ，ｓ．ｃ．，Ｈｅｎｚｅｌ，Ｗ．Ｊ．およびＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：６８１〜６９２；公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９５／３３０５１）、ＴＲＡＦ３（Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．ら、（１９９５））およびＴＲＡＦ６（Ｃａｏら、１９９６ａ参照）として同定されたいくつものタンパク質が含まれている。ＴＲＡＦファミリーに属するすべてのタンパク質はそれらのＣ末端ドメインに高度のアミノ酸アイデンティティーを共有しているが、それらのＮ末端ドメインは関連がないかもしれない。ＴＲＡＦ２の模式図（図１）に示すように、この分子はそのＣ末端領域に１つのリングフィンガーモチーフと２つのＴＦIIIＡ様ジンクフィンガーモチーフを含有する。この分子のＣ末端の半分には「ＴＲＡＦドメイン」として知られる領域が含まれており、このドメインには、アミノ酸２６４〜３５８間に延びる潜在的なロイシンジッパー領域（Ｎ−ＴＲＡＦと称する）と、アミノ酸３５９〜５０１間のこのドメインのカルボキシ末端側の別の領域（Ｃ−ＴＲＡＦと称する）とが含まれ、その後者の領域は、ＴＲＡＦが受容体やほかのＴＲＡＦ分子に結合してホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することに関与する。
転写因子ＮＦ−κＢの活性化は、いくつかのＴＮＦ／ＮＧＦ受容体によって開始されついでＴＲＡＦ２によって仲介されるシグナリングカスケードの１つの発現である。ＮＦ−κＢは、がん遺伝子産物Ｒｅｌと相同性を有する二量体形成タンパク質のファミリーのメンバーからなり、二量体形態で転写因子として作用する。これらの因子はいたる所に存在し、同義遺伝子の発現の調節に参画している。ＮＦ−κＢは、Ｉｇκ軽鎖が発現する段階でＢ細胞中に構成要素として存在する因子として最初確認されたが、誘発性転写活性化因子としてその作用に関しておもに知られている。最もよく知られている場合では、ＮＦ−κＢは一次因子として振舞う、すなわちその活性の誘発は、ＮＦ−κＢ遺伝子を活性化する誘発性転写因子に依存してＮＦ−κＢを新たに合成するのではなく、不活性の形態で細胞内に存在する既存分子が活性化することによって行われる。ＮＦ−κＢの作用は非常に多面的である。これら多数の作用の大部分は、細胞外の刺激に応答して迅速に誘発されるという共通の特徴を共有する。ＮＦ−κＢ活性化因子の大部分は免疫防衛のインデューサーであり、ウイルスおよび細菌の成分、免疫応答を調節するサイトカイン類、紫外線などが含まれる。したがって、ＮＦ−κＢによって調節される遺伝子の多くは免疫防衛に寄与する（総説については、Ｂｌａｎｋら、１９９２；Ｇｒｉｌｌｉら、１９９３；ＢａｅｕｅｒｌｅおよびＨｅｎｋｅｌ、１９９４参照）。
ＮＦ−κＢによる調節の主要な特徴の１つは、この因子が細胞質の非ＤＮＡ結合形態で存在でき、誘発されて核に転位し、ＤＮＡと結合しついで転写を活性化することができるということである。ＮＦ−κＢタンパク質類のこの二重形態は、Ｉ−κＢ、赤血球タンパク質のアンキリン中に最初発見された繰返しドメインを含有するタンパク質のファミリー、によって調節される（ＧｉｌｍｏｒｅおよびＭｏｒｉｎ、１９９３）。ＮＦ−κＢ二量体を細胞質内に位置するよう強制し、二量体がＮＦ−κＢ結合ＤＮＡ配列と相互に作用して転写を活性化するのを防止するＩ−κＢ分子とＮＦ−κＢ二量体は刺激されていない形態で会合する。Ｉ−κＢがＮＦ−κＢ二量体から解離するステップは、その二量体の多くの誘発因子による活性化の決定的なステップである（ＤｉＤｏｎａｔｏら、１９９５）。この調節に関与するメカニズムの知識はまだ限られたものである。また、各種ＮＦ−κＢ誘発因子に対する応答性によって細胞特異性を決定する方法もほとんど分かっていない。
ＮＦ−κＢの誘発因子のうち最も有力なものの１つは、サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。２種類の異なるＴＮＦ受容体、ｐ５５受容体とｐ７５受容体、がある。それらの発現レベルは異なる細胞間で独立して変化する（Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅら、１９９５）。ｐ７５受容体は細胞に結合した形態のＴＮＦ（ＴＮＦはβ−膜貫通タンパク質および可溶性タンパク質として発現される）に優先的に応答するが、ｐ５５受容体は可溶性ＴＮＦ分子に対し同様に効果的に応答する（Ｇｒｅｌｌら、１９９５）。これら２つの受容体の細胞内ドメインは、構造的には関連がなく、異なる細胞質タンパク質類に結合する。それにもかかわらず、ＴＮＦの細胞致死作用とＮＦ−κＢの誘発を含むＴＮＦの作用の少なくとも一部は、両受容体によって誘発することができる。この特徴は細胞特異的である。ｐ５５受容体は、細胞致死作用またはＮＦ−κＢの活性化を、ＴＮＦに応答して前述の作用を示すすべての細胞中に誘発することができる。ｐ７５−Ｒは、いくつかの細胞でしかこのような作用を示すことができない。ほかの細胞は、高レベルでｐ７５−Ｒを発現するが、ｐ５５−Ｒの刺激に応答する場合のみこれらの作用の誘発を示す（Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅら、１９９５）。ＴＮＦ受容体以外の、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの各種のほかの受容体、すなわちＣＤ３０（ＭｃＤｏｎａｌｄら、１９９５）、ＣＤ４０（Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈら、１９９４；Ｌａｌｍａｎａｃｈ−Ｇｉｒａｒｄら、１９９３）、リンホトキシンβ受容体、およびＦａｓ／ＡＰＯ１（Ｒｅｎｓｉｎｇ−Ｅｈｌら、１９９５）も少数のタイプの細胞でＮＦ−κＢの活性化を誘発することができる。ＮＦ−κＢの活性化も効果的にトリガーするＩＬ−Ｉ型の受容体は、構造はＴＮＦ受容体類と全く類似していないにもかかわらず、ＴＮＦ受容体の作用の大部分を共有している。
これら各種受容体をトリガーすることによるＮＦ−κＢの活性化は、それが会合しているＩ−κＢ分子のリン酸化が誘発されることによって起こる。このリン酸化はＩ−κＢを分解させ、これによっておそらくそのプロテオソームが生成する。Ｉ−κＢをリン酸化するキナーゼの性質および受容体をトリガーすることによる活性化のメカニズムはまだ分かっていない。しかし、最近の２年間で、前記リン酸化の開始に関与すると思われる３種の受容体関連タンパク質のアイデンティティーについて、いくつかの知見が得られた（図２ａと６の線図参照）。ＴＲＡＦ２と呼ばれるタンパク質は、最初、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌと彼の同僚によってクローン化されたが（Ｒｏｔｈｅら、１９９４）、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの各種受容体によるＮＦ−κＢの活性化に中心的な役割を演じているようである。このタンパク質は、高レベルで発現されるとそれ自体でＮＦ−κＢの活性化をトリガーできるが、活性化されたｐ７５ＴＮＦ−Ｒ（Ｒｏｔｈｅら、１９９４）、リンホトキシンβ受容体（Ｍｏｓｉａｌｏｓら、１９９５）、ＣＤ４０（Ｒｏｔｈｅら、１９９５ａ）およびＣＤ−３０（未発表データ）に結合し、これらによるＮＦ−κＢの誘発を仲介する。ＴＲＡＦ２は、ｐ５５ＴＮＦ受容体にもＦａｓ／ＡＰＯ１にも結合しないが、ＴＲＡＤＤと称されるｐ５５受容体関連タンパク質に結合でき、そしてＴＲＡＤＤはＭＯＲＴ１（またはＦＡＤＤ、Ｂｏｌｄｉｎら、１９９５ｂおよび１９９６参照）と称されるＦａｓ／ＡＰＯ１関連タンパク質と結合する性能を有している。ＲＩＰと称されるほかの受容体相互作用タンパク質（Ｓｔａｎｇｅｒら、１９９５参照）も、ＦＡＳ／ＡＰＯ１、ＴＲＡＤＤ、ｐ５５ＴＮＦ受容体およびＭＯＲＴ−１のみならずＴＲＡＦ２と相互に作用することができる。したがって、ＲＩＰが細胞の細胞傷害性誘発（細胞死）と関連があるとはいえ、ＲＩＰがＴＲＡＦ２と相互に作用できることは、ＲＩＰがＮＦ−κＢの活性化に関与していることを示し、そしてＲＩＰはさらに、ＦＡＳ／ＡＰＯ１、ＭＯＲＴ−１、ｐ５５ＴＮＦ受容体およびＴＲＡＤＤとＴＲＡＦ２との、ＮＦ−κＢ活性化に至る経路における相互作用を増大する働きもするかもしれない。これらの関連によって、ｐ５５ＴＮＦ受容体とＦａｓ／ＡＰＯ１は明らかにＮＦ−κＢの活性化をトリガーすることができる（Ｈｓｕら、１９９５；Ｂｏｌｄｉｎら、１９９５；Ｃｈｉｎｎａｌｙａｎら、１９９５；Ｖａｒｆｏｌｏｍｅｅｖら、１９９６；Ｈｓｕら、１９９６）。ＩＬ−１受容体によるＮＦ−κＢの活性化のトリガリングは、ＴＲＡＦ２とは独立して起こり、ＩＲＡＫと称される最近クローン化されたＩＬ−１受容体関連タンパク質キナーゼを利用することができる（Ｃｒｏｓｔｏｎら、１９９５）。
ＴＲＡＦ２がどんなメカニズムによって作用するのか明らかでない。ＴＲＡＦ２に結合する細胞質分子がいくつも同定されている（Ｒｏｔｈｅら、１９９４；Ｒｏｔｈｅら、１９９５ｂ）。しかし、これらの分子の情報からは、それ自身が酵素活性を有さないＴＲＡＦ２がＩ−κＢのリン酸化をトリガーする方式について何の手がかりも得られない。また２種の前記ＴＮＦ受容体によるＮＦ−κＢの誘発について観察されたような、異なる受容体によってＴＲＡＦ２を活性化する細胞特異的パターンを規定するメカニズムについても全く情報がない。
各種のＴＲＡＦタンパク質について先に述べたことに加えて、ＴＲＡＦ２は、ｐ５５（ＣＤ１２０ａ）ＴＮＦ受容体およびｐ７５（ＣＤ１２０ｂ）ＴＮＦ受容体ならびにＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのほかのいくつかの受容体に前述のようなほかのアダプタータンパク質、たとえばＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体についていえばアダプタータンパク質ならびにアダプタータンパク質のＭＯＲＴ−１、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰ、を通じて直接または間接的に結合することに注目しなければならない。このように、ＴＲＡＦ２はＮＦ−κＢを活性化するのに非常に重要である（Ｗａｌｌａｃｈ、１９９６も参照）。しかし、ＴＲＡＦ３はＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのいくつかの受容体によるＮＦ−κＢの活性化を実際に阻害するが（Ｒｏｔｈｅら、１９９５ａ参照）、ＴＲＡＦ６はＩＬ−１によるＮＦ−κＢの誘発に必要である（Ｃａｏら、１９９６ａ参照）。
したがって、ＮＦ−κＢの活性化および細胞の生存力を維持するのにＮＦ−κＢの活性化が重要であることについて、この活性化に関与する各種の細胞内経路は、たとえば各種のＴＲＡＦタンパク質が直接または間接的にどのように関与しているか、これまで明確には解明されていない。
さらに、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの各種メンバー、およびそれらが関連する細胞内シグナリング経路（各種のアダプターを含む）について現在知られているように、メディエーター／モジュレータータンパク質（たとえば同時係属中で出願人が同じのイスラエル特許願第１１４６１５号、同第１１４９８６号、同第１１５３１９号、同第１１６５８８号内の簡単な総説と参考文献参照）、たとえばＴＮＦおよびＦＡＳ／ＡＰＯ１リガンドは、細胞に対して有益な作用と有害な作用の両方を有する。ＴＮＦは、腫瘍と感染因子に対する生物の防衛に関与し、そして腫瘍細胞とウイルス感染細胞の死滅を誘発し、顆粒球の抗菌活性を高めることによって、損傷からの回復に関与しているので、これらの場合、ＴＮＦによって誘発される細胞死滅は望ましいことである。しかし、過剰のＴＮＦは有害となることがあり、敗血症性ショック、無食欲、リウマチ性疾患、炎症および移植片対宿主反応などのいくつもの疾患に重大な病原となることが知られている。このような場合、ＴＮＦが誘発する細胞の死滅は望ましくない。たとえばＦＡＳ／ＡＰＯ１リガンドにも望ましい作用と有害な作用がある。このＦＡＳ／ＡＰＯ１リガンドは、その受容体を通じてＴ細胞の成熟中の自己反応性Ｔ細胞の死滅、すなわちＴ細胞の分化の過程で自己抗原を認識するＴ細胞の死滅、を誘発して自己免疫疾患を防止する。さらに、各種の悪性細胞およびＨＩＶ感染細胞は、その表面にＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体を担持しているので、そのリガンドによるこの受容体の活性化またはそのリガンドに特異的な抗体によって破壊され、その結果、細胞死（アポトーシス）の細胞内経路の活性化がこの受容体によって仲介される。しかし、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体は有害な作用、たとえば、肝細胞の破壊を伴う急性肝炎などの特定の疾患に観察される組織の非制御の死滅を仲介する。
上記のこと、すなわちＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体は一方では細胞死の経路を誘発することができ、他方では細胞生存の経路を（ＮＦ−κＢの誘発を通じて）誘発できることからみて、細胞内で、これら２つの相反する経路の間に、優れたバランスが存在することは明らかである。たとえば、がん細胞またはほかの感染細胞もしくは疾患細胞を最大限に破壊したい場合、ＮＦ−κＢを誘発することなく細胞死の経路だけを誘発するＴＮＦおよび／またはＦＡＳ／ＡＰＯ１リガンドを有することが望ましいであろう。逆に、たとえば、炎症、移植片対宿主反応、急性肝炎の場合のように細胞を保護したい場合、ＴＮＦおよび／またはＦＡＳ／ＡＰＯ１リガンドの細胞死滅の誘発を遮断し、代わりにＴＮＦおよび／またはＦＡＳ／ＡＰＯ１リガンドのＮＦ−κＢ誘発を増大したいであろう。さらに、特定の病理学的環境内では、ｐ７５ＴＮＦ受容体およびＩＬ−１受容体で仲介される細胞内シグナリング経路を遮断することが望ましいが別の環境では、これらの細胞内経路を強化することが望ましい。
発明の要約
本発明の目的は、腫瘍壊死因子受容体関連（ＴＲＡＦ）タンパク質に結合できる新規なタンパク質類およびそれらのすべてのイソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体を提供することである。ＴＲＡＦタンパク質類は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のいくつかおよびほかの上記受容体によって開始される転写因子ＮＦ−κＢの活性化のモジュレーションまたは仲介に関与しているので、本発明の新規なタンパク質類は、ＴＲＡＦタンパク質に結合することによって、各種リガンド（たとえばＴＮＦ、ＦＡＳリガンドなど）がそれら受容体に結合することによって開始される細胞内シグナリングプロセス、たとえばＴＲＡＦタンパク質と直接にまたは間接的に相互に作用することによるＮＦ−κＢ活性化のモジュレーション／仲介、に作用する（モジュレートするまたは仲介する）ことができる。
したがって、本発明の新規なタンパク質は、ＴＲＡＦタンパク質の細胞内生物学的活性（たとえばＴＲＡＦ２とＴＲＡＦ６によるＮＦ−κＢ活性化の誘発およびＴＲＡＦ３によるＮＦ−κＢ活性化の阻害）の直接のモジュレーター／メディエーターである。
本発明の新規なタンパク質は、その上に、ＴＲＡＦタンパク質と直接にまたは間接的に相互に作用することができるほかの各種タンパク質（たとえばＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体、ｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体、ＩＬ−１受容体およびこれら受容体に関連するタンパク質、たとえばＭＯＲＴ−１、ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ）の細胞内生物学的活性の間接的なモジュレーター／メディエーターである。
本発明のほかの目的は、上記新規のＴＲＡＦ結合タンパク質ならびにそのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体に対するアンタゴニスト（たとえば抗体、ペプチド、有機化合物またはいくつかのイソ型）であって、所望により、シグナリングプロセスを阻害するのに、またはより具体的に述べればＮＦ−κＢの活性化と細胞生存プロセスに対するその関与を阻害するのに利用できるアンタゴニストを提供することである。さらに、本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質またはこのタンパク質が結合するＴＲＡＦタンパク質（たとえばＴＲＡＦ３）がそれ自体ＮＦ−κＢの活性化を阻害する場合、所望により、シグナリングプロセスを活性化するか、またはより具体的に述べると、ＮＦ−κＢ活性化の阻害作用を遮断してＮＦ−κＢ活性化を高めるために、これらＴＲＡＦ結合タンパク質に対するアンタゴニストを提供することが目的である。
本発明のほかの目的は、上記の新規なＴＲＡＦ結合タンパク質類、そのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体を以下のことに使用することである。すなわち、ＴＲＡＦタンパク質の活性および／または上記受容体の活性の調節に関与できる別のタンパク質または因子、たとえばＴＲＡＦタンパク質類に結合してその活性に作用するほかのタンパク質、を単離して特徴付けすること；および／または前記新規なタンパク質類、類似体、フラグメントおよび誘導体が結合し、したがってこれらがその機能に関与する、前記シグナリングプロセスのさらに上流もしくは下流のほかの受容体もしくはほかの細胞タンパク質を単離し同定することに使用することである。
本発明のさらにほかの目的は、細胞中に導入して、新規なＴＲＡＦ結合タンパク質およびその可能なイソ型と結合もしくは相互に作用させることができ、そしてたとえばＮＦ−κＢが活性化する場合にＴＲＡＦタンパク質関連活性を阻害するよう作用し、所望の場合、ＮＦ−κＢの活性化を阻害できるか；またはＮＦ−κＢが活性化する場合に阻害性ＴＲＡＦ関連活性（たとえばＴＲＡＦ３）を阻害するよう作用し、所望の場合、ＮＦ−κＢの活性化を高めることができるインヒビターを提供することである。
さらに、本発明の目的は、前記新規なＴＲＡＦ結合タンパク質類、そのイソ型と類似体、フラグメントと誘導体を、それらに対するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を製造するための抗原として使用することである。これらの抗体は、たとえば、異なる起源、たとえば細胞抽出物または形質転換細胞系など、由来の新しいタンパク質を精製するために使用できる。
さらに、これらの抗体は診断用に使用することができる。たとえば、ＴＲＡＦタンパク質によって直接仲介されるか、または直接にもしくは間接的に作用してＴＲＡＦタンパク質との相互作用によって細胞内プロセスをモジュレートする／仲介する、ｐ５５ＴＮＦ受容体、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体もしくはほかの類縁受容体およびそれらの関連細胞タンパク質（たとえばＭＯＲＴ−１、ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ）によって仲介される細胞作用の異状機能に関連する疾患を同定するために使用できる。
本発明のほかの目的は、前記の新規なＴＲＡＦタンパク質類、そのイソ型もしくは類似体、フラグメントもしくは誘導体を含んでなる医薬組成物、および上記抗体またはほかのアンタゴニストを含んでなる医薬組成物を提供することである。
本発明によって、多数の新規なＴＲＡＦ結合タンパク質、とくにＴＲＡＦ２結合タンパク質が単離された。これらのＴＲＡＦ２結合タンパク質は、ＴＲＡＦ２に結合する高い特異性を有する（以下の実施例参照）ので、ＴＲＡＦ２の細胞内活性のモジュレータまたはメディエーターである。ＴＲＡＦ２は、細胞の生存に中心的に働くＮＦ−κＢの活性化にＴＲＡＦ２が直接関与する細胞の生存もしくは生存力に関連する経路である少なくとも１つの細胞内シグナリング経路のモジュレーションもしくは仲介に関与している。事実、ＮＩＫ（ＮＦ−κＢを誘発するキナーゼ）と称される、これら新しいタンパク質のうちの１つはＴＲＡＦ２と結合してＮＦ−κＢの活性を刺激する。ＮＩＫは数種のＭＡＰＫＫキナーゼと配列の類似性を共有するキナーゼである（以下参照）。さらに、ＴＲＡＦ２は、前記ｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体およびそれらの関連タンパク質のＭＯＲＴ−１、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰと直接または間接的に相互に作用できることによって、これらの受容体が原因であるＮＦ−κＢの誘発または活性化の活性のメディエーターまたはモジュレーターでもある。それ故、ＴＲＡＦ２は、これら受容体およびそれらの関連するタンパク質によって仲介される細胞生存経路（細胞死経路に対して逆の経路）のモジュレーター／メディエーターであり、これら受容体および／またはタンパク質とＴＲＡＦ２の間の相互作用の程度は、これら受容体の（それらのリガンドによって１度活性化された）活性の結果、すなわちそれら細胞が生存するかまたは死ぬかどうか、について重要な因子である。したがって、ＴＲＡＦ２に特異的に結合することによってＮＩＫのようなタンパク質がＴＲＡＦ２の活性をモジュレートしおよび／またはＴＲＡＦ２との相互作用によってそのモジュレートされる活性を有するので、本発明のタンパク質、たとえばＮＩＫ、はＴＲＡＦ２とＴＲＡＦ２が相互に作用するほかのタンパク質／受容体との間の上記相互作用で主要な役割を果たす。
ＴＲＡＦ結合タンパク質、たとえばＮＩＫを含むＴＲＡＦ２結合タンパク質、は単離され、次にツーハイブリッドシステムを用いてクローン化され、部分的におよび全体に配列決定されついで特徴付けされた。そして、以下に詳述するように、高度に特異的なＴＲＡＦ２結合タンパク質でありしたがって特異的なＴＲＡＦ２のモジュレーター／メディエーターのようである。
ＴＲＡＦタンパク質活性、たとえばＴＲＡＦ２活性、という用語は、本明細書を通じて使用する場合、とくにＮＦ−κＢの誘発／活性化に関するような細胞生存の経路のモジュレーション／仲介におけるＴＲＡＦタンパク質の活性を含むものとする。さらに、ＴＲＡＦ結合タンパク質の活性、とくにＴＲＡＦ２結合タンパク質の活性という用語は、本明細書を通じて使用する場合、これらタンパク質がＴＲＡＦ、とくにＴＲＡＦ２タンパク質に特異的に結合することによって、ＴＲＡＦの活性、とくにＴＲＡＦ２の活性をモジュレーション／仲介することを含むものとし、このモジュレーション／仲介には、細胞生存の経路のモジュレーション／仲介、とくにはＴＲＡＦタンパク質、とりわけＴＲＡＦ２が直接もしくは関節的に関与するＮＦ−κＢの活性化／誘発に関連するモジュレーション／仲介が含まれており、したがってＴＲＡＦ結合タンパク質またはＴＲＡＦ２結合タンパク質は、細胞の生存、とくにＮＦ−κＢの活性化／誘発に関与して、ＴＲＡＦ２（またはほかのＴＲＡＦタンパク質）が結合するかまたはＴＲＡＦ２（またはほかのＴＲＡＦタンパク質）が直接的もしくは間接的な様式で相互に作用する前記すべてのタンパク質および可能な多数のほかのタンパク質の間接的なモジュレーター／メディエーターと考えることができる。
したがって、本発明は、腫瘍壊死因子受容体関連（ＴＲＡＦ）分子に結合できるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供するものである。
本発明のＤＮＡ配列の一実施態様は、ＴＲＡＦ２に結合できるタンパク質をコードする配列である。
本発明のＤＮＡ配列のほかの実施態様は、ＴＲＡＦ２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基２２２〜５０１に結合できるタンパク質をコードする配列である。
本発明のＤＮＡ配列のほかの実施態様には、
（ａ）図３ａに示されるヌクレオチド配列からなる本明細書でクローン９と命名されたｃＤＮＡ配列；
（ｂ）図４に示されるヌクレオチド配列からなる本明細書でクローン１０と命名されたｃＤＮＡ配列；
（ｃ）図５ａに示されるヌクレオチド配列でからなる本明細書でクローン１５と命名されたｃＤＮＡ配列；
（ｄ）ＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２２〜５０１に結合できる生物学的に活性なタンパク質をコードする配列（ａ）〜（ｃ）のフラグメント；
（ｅ）中等度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）の配列とハイブリダイゼーションすることができ、かつＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２２〜５０１に結合できる生物学的に活性なタンパク質をコードするＤＮＡ配列；および
（ｆ）遺伝暗号の結果として、（ａ）〜（ｅ）で定義されたＤＮＡ配列に縮重され、かつＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２２〜５０１に結合できる生物学的に活性なタンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
上記本発明のＤＮＡ配列のさらにほかの実施態様には、
本明細書でｃＤＮＡクローン９および１５と命名されたものに含まれる配列から選択されるＤＮＡ配列；
ＮＦ−κＢの活性もモジュレートするタンパク質をコードするＤＮＡ配列；および
本明細書でｃＤＮＡクローン１０と命名されたものに含まれる配列から選択されるＤＮＡ配列が含まれる。
本発明の上記ＤＮＡ配列のさらなる好ましい実施態様は、タンパク質ＮＩＫ（キナーゼを誘発するＮＦ−κＢ）をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ配列である。
タンパク質ＮＩＫをコードする本発明の上記ＤＮＡ配列の実施態様には、
（ｉ）ＴＲＡＦ２に結合することができ、かつＮＦ−κＢの活性をモジュレートすることができるタンパク質ＮＩＫ、そのイソ型、フラグメントまたは類似体をコードするＤＮＡ配列。
（ｉｉ）（ａ）未変成ＮＩＫタンパク質のコード領域由来のｃＤＮＡ配列；
（ｂ）中等度のストリンジェント条件下で（ａ）の配列とハイブリダイゼーションすることができ、かつ生物学的に活性なＮＩＫをコードするＤＮＡ配列；および
（ｃ）遺伝暗号の結果として、（ａ）および（ｂ）に定義された配列に縮重され、かつ生物学的に活性なＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡ配列
からなる群より選ばれる上記（ｉ）に示すＤＮＡ配列；
（ｉｉｉ）図６に示される配列の少なくとも一部分からなり、かつ少なくとも１つの活性ＮＩＫタンパク質、イソ型、類似体もしくはフラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）に示すＤＮＡ配列；
（ｉｖ）図６に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を含んでなるＮＩＫタンパク質、イソ型、類似体またはフラグメントをコードする上記（ｉｉｉ）に示すＤＮＡ配列が含まれる。
別の態様で、本発明は、本発明の上記ＤＮＡのコード配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチド、そのタンパク質およびポリペプチドのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体であって、ただしＴＲＡＦ２、好ましくはＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２２〜５０１、に結合できるものを提供するものである。本発明によるこれらのタンパク質／ポリペプチドならびにそれらのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体の実施態様には、
（ａ）本明細書でクローン１０と命名されたクローンによってコードされるタンパク質であるタンパク質；
（ｂ）前記ＮＩＫタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体をコードする上記ＤＮＡ配列によってコードされるＮＩＫタンパク質、そのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体であるタンパク質、そのイソ型、フラグメント、類似体および誘導体；および
（ｃ）前記ＮＩＫタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体をコードする上記ＤＮＡ配列によってコードされるＮＩＫタンパク質、そのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体であって、前記タンパク質、イソ型、フラグメントおよび誘導体が図６に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を有するＮＩＫタンパク質、そのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体が含まれる。
さらに別の態様で、本発明は、原核生物細胞および真核生物細胞から選択される宿主細胞で発現され得る本発明の上記ＤＮＡ配列のいずれかを含んでなるベクターを提供するものであり、前記ベクターを含む形質転換された原核生物細胞と真核生物細胞を提供するものである。
また、本発明は、本発明の上記ＤＮＡ配列のいずれかによってコードされるタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体の製造法であって、前記タンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体の発現に適切な条件下で上記形質転換された宿主細胞を増殖すること、必要な場合、前記タンパク質、そのイソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体を得るために、転写後修飾を行うことおよび前記発現されたタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体を単離することからなる製造法を提供するものである。
別の態様で、本発明は、上記ＴＲＡＦ結合タンパク質、その類似体、イソ型、フラグメントまたは誘導体に対して特異的であるか、または上記ＮＩＫタンパク質、そのイソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体に対して特異的である抗体またはその活性フラグメントもしくは誘導体を提供するものである。
異なる態様で、本発明は以下のスクリーニング法、すなわち
（ｉ）そのイソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体を含む上記本発明のタンパク質に結合し得るリガンドをスクリーニングする方法であって、前記タンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは類似体が結合しているアフィニティークロマトグラフィーのマトリックスを細胞抽出液と接触させて、リガンドを前記マトリックスに結合させることならびに前記リガンドを溶出、単離および分析することからなる方法、
（ｉｉ）上記本発明のタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体に結合し得るリガンドスクリーニング方法であって、前記タンパク質、イソ型、類似体、誘導体またはフラグメントをコードする配列が第一のハイブリッドベクターによって担持され、そしてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列が第二のハイブリッドベクターに担持される酵母ツーハイブリッド法を適用すること、酵母宿主細胞を前記ベクターで形質転換すること、その正に形質転換された細胞を単離することおよび前記第二のハイブリッドベクターを抽出して前記リガンドをコードする配列を得ることからなる方法
を提供するものである。
同様に、ＴＲＡＦ２に直接結合し得る上記本発明のタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントを単離して同定する方法であって、前記ＴＲＡＦ２をコードする配列が第一のハイブリッドベクターによって担持され、そしてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列が第二のハイブリッドベクターによって担持される酵母ツーハイブリッド法を適用することからなり、それらベクターが酵母宿主細胞を形質転換するために用いられ、形質転換された陽性細胞が単離され、続いて前記第二のハイブリッドベクターを抽出して前記ＴＲＡＦ２に結合するタンパク質をコードする配列を得る方法も提供される。
本発明のさらに別の態様で、上記本発明のタンパク質、そのイソ型、類似体、フラグメントもしくは誘導体が結合するＴＲＡＦ２またはほかの分子によってモジュレートまたは仲介されるＮＦ−κＢの活性またはいずれかのほかの細胞内シグナリング活性を細胞内でモジュレートまたは仲介する方法であって、前記タンパク質、そのイソ型、類似体フラグメントもしくは誘導体の１またはそれより多くを、それらが細胞内に導入されるのに適切な形態で前記細胞中に導入するか、または前記タンパク質、そのイソ型、類似体、フラグメントもしくは誘導体の１またはそれより多くをコードするＤＮＡ配列を、前記細胞を担持する適切なベクターの形態で前記細胞中に導入することによって前記細胞を処理することからなり、前記ベクターは、前記配列が前記細胞内で発現される方法で前記配列を前記細胞内に挿入され得る方法が提供される。
ＴＲＡＦ２またはほかの分子によってモジュレートまたは仲介されるＮＦ−κＢの活性またはほかのいずれかの細胞内シグナリング活性を、細胞内でモジュレーション／仲介する上記方法の実施態様としては、
（ｉ）細胞前記処理が、前記タンパク質、イソ型、フラグメント、類似体または誘導体をコードするＤＮＡ配列を、この配列を担持する適切なベクターの形態で、前記細胞中に導入することからなり、前記ベクターは、前記配列が前記細胞内で発現される方法で、前記配列を前記細胞内に挿入できる上記方法。
（ｉｉ）前記細胞の前記処理が、動物ウイルスの組換えベクターで前記細胞をトランスフェクトすることによって行われる上記方法であって、
（ａ）処理される前記細胞の表面上の特定の細胞表面受容体に結合し得るウイルス表面タンパク質（リガンド）をコードする配列、ならびに前記細胞内で発現されると、ＴＲＡＦ２もしくはほかの前記分子によってモジュレーション／仲介されるＮＦ−κＢの活性またはほかのいずれかの細胞内シグナリング活性をモジュレーション／仲介できる本発明の前記タンパク質、イソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体から選択されるタンパク質をコードする第二の配列を担持する動物ウイルスの組換えベクターを構築する工程、および
（ｂ）前記細胞に（ａ）の前記ベクターを感染させる工程
からなる方法
があげられる。
さらに、本発明は、細胞に対してＴＲＡＦ２によってモジュレートされる／仲介される作用をモジュレートする方法であって、上記本発明の抗体またはその活性フラグメントもしくは誘導体で前記細胞を処理することからなり、前記処理が、前記抗体、その活性フラグメントまたは誘導体を含有する適切な組成物を前記細胞に適用することにより行われ、前記細胞のＴＲＡＦ２結合タンパク質またはその一部分が細胞外表面で暴露される場合、前記組成物は細胞外で利用されるよう配合され、そして前記ＴＲＡＦ２結合タンパク質が細胞内に存在する場合、前記組成物は細胞内で利用されるよう配合されている方法も提供するものである。
細胞に対してＴＲＡＦ２によって行われるモジュレーション／仲介作用をモジュレートする本発明のほかの方法としては、
（ｉ）ＴＲＡＦ２結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部分に対するアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列で前記細胞を処理することからなり、このＤＮＡ配列が本発明の上記ＤＮＡ配列のうちいずれかであり、前記オリゴヌクレオチド配列がＴＲＡＦ２結合タンパク質の発現を遮断することができる方法、
（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドの配列が上記組換えウイルスによって前記細胞に導入され、前記ウイルスの前記第二の配列が前記オリゴヌクレオチドの配列をコードする上記（ｉ）記載の方法。
（ｉｉｉ）上記本発明のＴＲＡＦ２結合タンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは類似体をコードする細胞ｍＲＮＡ配列と相互に作用することができるリボザイムの配列をコードするベクターが、前記細胞内で前記リボザイムの配列が発現される形態で前記細胞内に導入され、そして、前記リボザイムの配列が前記細胞内で発現されると、前記細胞ｍＲＮＡ配列と相互に作用して、前記ｍＲＮＡ配列を開裂し、前記ＴＲＡＦ２結合タンパク質の前記細胞内での発現を阻害するリボザイム法を適用することからなる方法
があげられる。
本発明の上記方法のすべてに対して、上記本発明のタンパク質、とくにはＮＩＫまたはＮＩＫのイソ型、類似体、フラグメントおよび誘導体のうちの少なくとも一つを使用できることに注目すべきである。
本発明の上記方法およびその実施態様に、本発明のタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントもしくは誘導体が結合するＴＲＡＦ２またはほかの分子によって仲介されるＮＦ−κＢの誘発またはほかのいずれかの活性に関連する病理学的な状態を予防または治療する方法であって、本発明のタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントもしくは誘導体；またはこれらをコードするＤＮＡ分子；または前記タンパク質、イソ型、類似体、フラグメントもしくは誘導体と、前記タンパク質、イソ型、類似体、フラグメントもしくは誘導体が結合するＴＲＡＦ２またはほかのいずれかの分子との相互作用を中断することができる分子の有効量を、必要としている患者に投与することからなる方法が含まれる。本発明のこの方法で、必要としている患者に投与される本発明の前記タンパク質は、とくにはクローン１０によってコードされるタンパク質、ＮＩＫ、ＮＩＫのイソ型、類似体、誘導体もしくはフラグメントまたはそれらをコードするＤＮＡ分子である。クローン１０によってコードされるタンパク質は、ＮＩＫのほかのフラグメントが行うようにＮＦ−κＢの誘発を阻害し、一方ＮＩＫはＮＦ−κＢの活性化を誘発する。
本発明のさらなる態様で、本発明のＴＲＡＦ２結合タンパク質、その生物学的に活性なフラグメント、類似体、誘導体またはそれらの混合物の少なくとも１種を活性成分として含有し、細胞に対するＴＲＡＦ２によるモジュレーション／仲介作用をモジュレートする医薬組成物が提供される。
本発明のほかの医薬組成物またはその実施態様としては、
（ｉ）細胞表面受容体に結合することができるタンパク質をコードし、かつ本発明のＴＲＡＦ２結合タンパク質、イソ型、活性フラグメントまたは類似体の少なくとも１種をコードする動物ウイルス組換えベクターを活性成分として含有する、細胞に対するＴＲＡＦ２によるモジュレーション／仲介作用をモジュレートする医薬組成物、
（ｉｉ）本発明のＴＲＡＦ２結合タンパク質のｍＲＮＡ配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を活性成分として含有する、細胞に対するＴＲＡＦ２によるモジュレーション／仲介作用をモジュレートする医薬組成物
があげられる。
上記医薬組成物の別の実施態様は、とくには、本発明のタンパク質、類似体、イソ型、フラグメントもしくは誘導体が結合するＴＲＡＦ２またはほかの分子によって仲介されるＮＦ−κＢの誘発またはほかのいずれかの活性に関連する病理学的な状態を予防もしくは治療するための医薬組成物であって、本発明のタンパク質、類似体、イソ型、フラグメントもしくは誘導体；またはそれらをコードするＤＮＡ分子；または前記タンパク質、類似体、イソ型、フラグメントもしくは誘導体と、前記タンパク質、類似体、イソ型、フラグメントもしくは誘導体が結合するＴＲＡＦ２またはほかのいずれかの分子との相互作用を中断することができる分子の有効量を含んでなる医薬組成物である。さらに別の特定の実施態様で、前記医薬組成物は、クローン１０によってコードされるタンパク質、ＮＩＫ、ＮＩＫのイソ型、類似体、誘導体もしくはフラグメント、またはそれらをコードするＤＮＡ分子を有効量含有する。
別の具体的実施態様で、本発明は、タンパク質ＮＩＫが結合するＴＲＡＦ２またはほかのいずれかの分子によって仲介されるＮＦ−κＢの誘発またはほかのいずれかの活性が関連する病理学的な状態を予防もしくは処理するための医薬組成物であって、ＮＩＫのタンパク質キナーゼ活性を妨害し得る分子を含有する医薬組成物が提供される。この組成物中の前記妨害分子は、有効量の、活性部位の残基内で突然変異したＮＩＫであり、この突然変異したＮＩＫは未変性のＮＩＫ、とくにＮＩＫのキナーゼ活性を妨害する働きをする。
ＮＦ−κＢの誘発に関連する１つの公知の状態（異状状態）はエイズであり、ほかのものとしては、たとえば自己免疫疾患および腫瘍があげられる。
本発明のさらにほかの態様と実施態様は、
（ｉ）ＴＲＡＦ２によってモジュレートされ／仲介される細胞活性をモジュレートすることができるリガンドを同定して製造する方法であって、
（ａ）ＴＲＡＦ２のアミノ酸残基２２１〜５０１を有するＴＲＡＦ２の少なくとも一部分を含有してなるポリペプチドに結合し得るリガンドをスクリーニングすること、
（ｂ）前記スクリーニング工程によって前記結合が可能であることが見出された、ＴＲＡＦ２またはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの受容体の一部分ではないリガンドを同定して特徴付けすることおよび
（ｃ）前記リガンドを、実質的に単離され精製された形態で製造すること
からなる方法、
（ｉｉ）本発明のタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体によってモジュレーション／仲介される細胞活性をモジュレートすることができるリガンドを同定して製造する方法であって、
（ａ）図６に示されるＮＩＫ配列の少なくとも一部分を含有してなるポリペプチドに結合し得るリガンドをスクリーニングすること、
（ｂ）前記スクリーニング工程によって前記結合が可能であることが見出された、ＴＲＡＦ２またはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの受容体の一部分ではないリガンドを同定して特徴付けすることおよび
（ｃ）前記リガンドを、実質的に単離され精製された形態で製造すること
からなる方法、
（ｉｉｉ）ＮＩＫによってモジュレートされ／仲介される細胞活性をモジュレートできるリガンドを同定して製造する方法であって、
（ａ）図６に示されるＮＩＫ配列の少なくとも一部分を含有してなるポリペプチドに結合し得るリガンドをスクリーニングすること、
（ｂ）前記スクリーニング工程によって前記結合が可能であることが見出された、ＴＲＡＦ２またはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの受容体の一部分ではないリガンドを同定して特徴付けすることおよび
（ｃ）前記リガンドを、実質的に単離され精製された形態で製造すること
からなる方法、
（ｉｖ）ＮＩＫによってモジュレートされ／仲介される細胞活性を直接または間接的にモジュレートすることができるリガンドを同定して製造する方法であって、
（ａ）ＮＩＫによってモジュレートされ／仲介される活性をモジュレートすることができる分子をスクリーニングすること、
（ｂ）前記分子を同定して特徴付けすることおよび
（ｃ）前記分子を、実質的に単離され精製された形態で製造すること
からなる方法、
（ｖ）本発明のタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体によってモジュレートされ／仲介される細胞活性を、直接または間接的にモジュレートし得る分子を同定して製造する方法であって、
（ａ）本発明のタンパク質、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体によってモジュレーション／仲介される活性をモジュレートすることができる分子をスクリーニングすること、
（ｂ）前記分子を同定して特徴付けすることおよび
（ｃ）前記分子を、実質的に単離され精製された形態で製造すること
からなる方法
があげられる。
また、本発明のほかの態様と実施態様が、以下の本発明の詳細な説明に基づいて提供される。
本明細書に記載されている以下の用語「細胞に対するＴＲＡＦ（またはＴＲＡＦ２）によるモジュレーション／仲介作用」およびそのほかの「モジュレーション／仲介」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの場合を含みそしてさらに阻害または促進／増大の作用も含むことに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＲＡＦ２分子の構造の線図を示す。
図２ａ〜ｂは、本発明の新しいＴＲＡＦ結合タンパク質（たとえばＮＩＫ）を含む、ＮＦ−κＢの活性化に関与するいくつかのタンパク質の図式線図を示し、（ａ）は部分図であり、そして（ｂ）はさらに完全な図である。
図３ａ〜ｂは、クローン９の５′末端のヌクレオチド配列（ａ）およびこれらヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列（ｂ）を示す。
図４は、クローン１０のヌクレオチド配列を示す。
図５ａ〜ｂは、クローン１５のヌクレオチド配列（ａ）およびこれらヌクレオチド配列でコードされた推定アミノ酸配列（ｂ）を示す。
図６は、ＮＩＫのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
図７は、タンパク質ＮＩＫの配列を、マウスタンパク質キナーゼｍＭＥＫＫ（マウスのＭＡＰＫキナーゼまたはＥＲＫキナーゼ）および多数のほかのキナーゼの配列と並べて示す。これらタンパク質キナーゼ内に保存されているモチーフＩ〜ＸＩに対応する領域には印を付してある。
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）分子に結合し得るタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびそのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質に関する。
好ましい実施態様で、本発明は、本明細書でクローン９、クローン１０およびクローン１５と命名され（それぞれ図３ａ、４および５ａに示す）、ＴＲＡＦ２に結合し得るタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列およびそれらＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質に関する。
さらに好ましい実施態様で、本発明は、ＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびＮＩＫタンパク質自体に関する。
上記のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列は新しい配列であり、これらは、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列のデータバンク「ＧＥＮＥＢＡＮＫ」または「ＰＲＯＴＥＩＮ  ＢＡＮＫ」に存在しない。
上記ＤＮＡ配列のフラグメント、および上記ＤＮＡ配列または上記ＤＮＡ配列の一部分と中等度のスリンジェント条件下でハイブリダイゼーションし得るＤＮＡ配列は、ＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２５〜５０１に結合できる生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードしている場合、本発明の範囲にある。
また、本発明は、遺伝暗号の結果、上記ＤＮＡ配列に縮重され、かつＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２５〜５０１に結合し得る生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。
ＴＲＡＦ２については、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のファミリーのいくつかのメンバーは、ＴＲＡＦ２と直接にまたは間接的に関連することによって転写因子ＮＦ−κＢを活性化するので、ＴＲＡＦ２はこれら受容体に対するアダプタータンパク質であり、またこれらＴＮＦ／ＮＧＦ受容体によるＮＦ−κＢ活性化活性の誘発のモジュレーター／メディエーターと考えることができる（図２ｂの図式参照）。別の受容体のＩＬ−１受容体はＴＲＡＦ２とは独立してＮＦ−κＢを活性化する。本発明の好ましいＴＲＡＦ２結合タンパク質の実施態様の１つはＮＩＫタンパク質であり、これは非常に特異的な方法でＮＩＫに結合してＮＦ−κＢ活性を刺激する。ＮＩＫは、いくつかのＭＡＰＫＫキナーゼ類と配列類似性を有するセリン／トレオニンキナーゼである（以下の実施例参照）。本発明によって製造され（実施例参照）、ＮＩＫのキナーゼ活性を欠いているＮＩＫ類似体または突然変異タンパク質は、これらの類似体／突然変異タンパク質が細胞内で発現されるとＮＦ−κＢの活性化を刺激することができない。さらに、かようなＮＩＫの類似体／突然変異タンパク質は、細胞内で発現されると、ＴＮＦおよびほかの誘発因子たとえば細菌のエンドトキシンＬＰＳ、ホルボルミリステートアセテート（ｆｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ）（タンパク質キナーゼＣアクチベーター）およびＨＴＬＶ−１タンパク質ＴＡＸによるＮＦ−κＢ誘発を遮断する。ＮＦ−κＢ活性のＴＮＦによる誘発は、２種のＴＮＦ受容体（ｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体）のどちらかを通じて行われるので、ＮＩＫの突然変異タンパク質／類似体は、これらの受容体を通じて行われるＮＦ−κＢの活性化の誘発を遮断するようである。さらに、ＴＮＦとＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体リガンドも、関連受容体であるＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体を通じてＮＦ−κＢ活性を誘発することができるが、この誘発は、ＮＩＫの突然変異タンパク質／類似体によって遮断される。さらに前記受容体はアダプタータンパク質のＴＲＡＤＤ、ＲＩＰおよびＭＯＲＴ１を有し、これらアダプタータンパク質はすべてＮＦ−κＢ活性を誘発することができるが、その誘発はＮＩＫの突然変異タンパク質／類似体で遮断される。さらに、かようなＮＩＫ突然変異タンパク質／類似体はＩＬ−１によるＮＦ−κＢの誘発（ＩＬ−１受容体を通じて機能する）も遮断した。したがって、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体およびＩＬ−１受容体に共通のＮＦ−κＢ誘発カスケードへのＮＩＫの参画が起こる。またＮＩＫは、Ｉ−κＢのリン酸化を直接高めることにより、おそらくＮＦ−κＢ活性化を誘発する直接的な方法でも作用するようである。このことは、キナーゼ活性を欠いている前記ＮＩＫの類似体／突然変異タンパク質（ドミナントネガティブ突然変異体とも称される）が、細胞内で発現されると、ＪｕｎキナーゼのＴＮＦによる誘発活性化を全く行わないという本願の観察結果に起因し、このことは、ＮＩＫが、Ｊｕｎのリン酸化に関与するＭＡＰキナーゼに影響せずに、特異的に作用してＩ−κＢのリン酸化を高めることを示している。
したがって、本発明は、生物学的に活性なＴＲＡＦ結合タンパク質、たとえばＮＩＫ、その類似体、フラグメントおよび誘導体のようなＴＲＡＦ２結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列；ならびにこれらによってコードされるタンパク質の類似体、フラグメントおよび誘導体に関する。これら類似体、フラグメントおよび誘導体は標準の方法（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）で製造され、その標準法では、ＤＮＡのコード配列中の１またはそれより多くのコドンを欠失することができ、別のコドンで付加もしくは置換を行うことができ、未変性タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸残基が変化しているコードされた類似体が得られる。容認できる類似体は、ほかの結合活性または酵素活性を仲介しまたは仲介せずに、ＴＲＡＦ２に結合できる性能を少なくとも保持している類似体であり、たとえば、ＴＲＡＦ２に結合するがシグナルを送らない類似体、すなわち、さらに下流のタンパク質もしくはほかの因子に結合しないかまたはシグナル依存性反応を触媒しない類似体である。このようにして、いわゆるドミナントネガティブ作用を有する類似体、すなわち、ＴＲＡＦ２との結合または上記のような結合に続くシグナリングを欠いている類似体を製造することができる。このような類似体を使って、同様に上記各種の受容体関連タンパク質（アダプター）の仲介によって行われる、ＣＤ４０、ｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体およびほかの類縁受容体の作用を、天然のＴＲＡＦ２結合タンパク質との競合によって阻害することができる。さらに、ＴＲＡＦ２の作用を高める働きをするいわゆるドミナントポジティブ類似体を製造することができる。これら類似体は、天然のＴＲＡＦ２結合タンパク質と同じかまたはより優れたＴＲＡＦ２結合特性とシグナリング特性を有している。本発明のクローンの生物学的に活性なフラグメントは、類似体の製造について先に述べたのと類似の方法で製造することができる。本発明のＤＮＡ配列の適切なフラグメントは、ＴＲＡＦ２と結合できる性能を保持するタンパク質またはポリペプチドをコードしているか、または上記のほかの結合活性または酵素活性を仲介できるフラグメントである。したがって、類似体について先に述べたドミナントネガティブ作用またはドミナントポジティブ作用を有する、本発明のコードされたタンパク質のフラグメントを製造することができる。同様に、類似体は、当該技術分野でよく知られているように、本発明のタンパク質、その類似体もしくはフラグメントの１またはそれより多くのアミノ酸残基の側基を標準の方法で修飾するか、または本発明のタンパク質、その類似体またはフラグメントを別の分子、たとえば抗体、酵素、受容体などに接合させることによって製造することができる。
ＴＲＡＦ結合タンパク質（たとえばＮＩＫのようなＴＲＡＦ２結合タンパク質）、イソ型、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードする本発明の前記ＤＮＡ配列には、本発明の実施態様として、未変性のＴＲＡＦ結合タンパク質のコード領域由来のｃＤＮＡ配列とハイブリダイゼーション可能なＤＮＡ配列が含まれ、そのハイブリダイゼーションは中等度のストリンジェント条件下で行われ、またハイブリダイズし得るＤＮＡ配列は生物学的に活性なＴＲＡＦ結合タンパク質をコードしている。したがってこれらのハイブリダイズし得るＤＮＡ配列は、未変性のＴＲＡＦ結合タンパク質のｃＤＮＡ配列（たとえばＮＩＫのｃＤＮＡ配列のようなＴＲＡＦ２結合タンパク質のｃＤＮＡ配列）に対し比較的高い相同性を有し、したがって、たとえば各種のＴＲＡＦ結合タンパク質のイソ型をコードする天然由来の配列またはＴＲＡＦ結合タンパク質（たとえばＮＩＫのようなＴＲＡＦ２結合タンパク質）の活性を有するタンパク質をコードするＴＲＡＦ結合タンパク質様配列のグループに属する、タンパク質をコードする天然由来の配列であるＴＲＡＦ結合タンパク質様配列に相当するＤＮＡ配列が含まれる。さらに、これらの配列には、たとえば、未変性ＴＲＡＦ結合タンパク質のｃＤＮＡ配列に類似しているがいくつもの所望の修飾がなされている非天然の合成で製造される配列が含まれる。したがって、このような合成の配列には、ＴＲＡＦ結合タンパク質（たとえばＮＩＫのようなＴＲＡＦ２結合タンパク質）の類似体、フラグメントおよび誘導体（これらはすべてＴＲＡＦ結合タンパク質の活性を有する）をコードする可能な配列のすべてが含まれている。
上記の各種の天然由来のＴＲＡＦ結合タンパク質様配列を得るため、各種の組織から、天然由来のＤＮＡもしくはＲＮＡの試料をスクリーニングして単離する標準法を、プローブとして天然のＴＲＡＦ結合タンパク質のｃＤＮＡもしくはその一部分を使用して採用できる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載の標準法参照）。
さらに、ＴＲＡＦ結合タンパク質（たとえば、ＮＩＫのようなＴＲＡＦ２結合タンパク質）の類似体、フラグメントまたは誘導体をコードする上記各種の合成ＴＲＡＦ結合タンパク質様配列を製造するため、かような類似体、フラグメントおよび誘導体の製造について以下に詳細に述べるいくつもの標準法を使用することができる。
ＴＲＡＦ結合タンパク質と「実質的に同等である」ポリペプチドまたはタンパク質としては、ＴＲＡＦ結合タンパク質のみならず、ＴＲＡＦ結合タンパク質の類似体であるポリペプチドまたはタンパク質がある。
ＴＲＡＦ結合タンパク質と実質的に同等である類似体は、ＴＲＡＦ結合タンパク質のアミノ酸配列の１またはそれより多くのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換、欠失および／または挿入されたポリペプチドであって、ただし、得られるタンパク質が、それが対応するＴＲＡＦ結合タンパク質と実質的に同じかまたはより高い生物活性を示すポリペプチドである。
ＴＲＡＦ結合タンパク質と実質的に同等にするため、ＴＲＡＦ結合タンパク質の配列の変化は、イソ型の場合のように、一般に比較的小さい。変化の数は１０を超えてもよいが、変化の数は好ましくは１０まで、より好ましくは５まで、そして最も好ましくは３までである。ＴＲＡＦ結合タンパク質と実質的に同等で可能性がある生物学的に活性なタンパク質を見出すためにあらゆる方法を使用できるが、１つの方法は、そのタンパク質をコードするＤＮＡに対して慣用の突然変異誘発法を使用する方法であり、いくつかの修飾を行うことができる。このようなクローンによって発現されたタンパク質は、ＴＲＡＦタンパク質（たとえばＴＲＡＦ２）に結合して、上記の細胞内経路をモジュレーション／仲介する際のＴＲＡＦタンパク質（たとえばＴＲＡＦ２）の活性をモジュレートする性能についてスクリーニングされることができる。
「保存的」変化は、そのタンパク質の活性の変化が予想されていない変化であり、そのタンパク質のサイズ、電荷または形状の実質的変化が予想されず、したがって、その生物学的特性の変化が予想されないので、通常第一にスクリーニングされる。
ＴＲＡＦ結合タンパク質の保存的置換体としては、ポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸で保存的に置換された類似体がある。このような置換体は、表ＩＡに示す下記リストにしたがって製造することが好ましく、合成されるポリペプチド分子が、ＴＲＡＦ結合タンパク質に特徴的な生物学的活性を維持しながら構造と機能の特性を改変するように日常的な実験で決定することができる。
0004180114.tif 000002
または、ＴＲＡＦ結合タンパク質の置換体の別のグループは、ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を除去して、その位置に、下記表ＩＢにしたがって異なる残基を挿入する場合の置換体である。ポリペプチドの場合に製造される置換体のタイプは、Ｓｃｈｕｌｚら、Ｇ．Ｅ．、タンパク質の構造の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１７９８の表１〜２およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．、タンパク質：構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓｕｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ  １９８３の図３〜９に示されているような異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸の変化の頻度の分析結果に基づいている。このような分析結果に基づいて、下記５つのグループのうちの１つのグループの範囲内で交換して、別の保存的置換体が形成される。
0004180114.tif 000003
上記括弧内の３種のアミノ酸残基は、タンパク質の構造に対して特別の役割をもっている。Ｇｌｙは側鎖がない唯一の残基であるから、その連鎖にフレキシビリティーを与える。しかしＧｌｙはα−ヘリカル以外の二次構造の生成を促進する傾向がある。Ｐｒｏは、特異な形態なので、連鎖をしっかりと束縛して、一般にβターン様構造を促進する傾向があるが、場合によっては、Ｃｙｓが、タンパク質が折りたたまれる際に重要なジスルフィド結合構造の生成に寄与することができる。Ｓｃｈｕｌｚら（前掲）は上記グループ１と２を併合していることに留意すべきである。またＴｙｒはその水素結合ポテンシャルのため、ＳｅｒおよびＴｈｒなどと有意に類似している。
たとえば、上記のような本発明の保存的アミノ酸置換体は、当該技術分野で知られているので、アミノ酸が置換された後、ポリペプチドの生物学的特性と構造上の特性を維持すると予想される。本発明の大部分の欠失と置換は、タンパク質またはポリペプチドの分子の特性を急激に変化させない欠失と置換である。「特徴」は、二次構造の変化、たとえばαヘリックスまたはβシートの変化、ならびに生物学的活性の変化、たとえばＴＲＡＦタンパク質との結合および／または細胞死に対するＴＲＡＦタンパク質の作用の仲介の変化の両者を規定する非包括的な方法で定義される。
本発明に用いるＴＲＡＦ結合タンパク質の類似体を得るため使用できるタンパク質のアミノ酸置換体の製造例には公知の方法のステップが含まれ、これらのステップは、たとえば、Ｍａｒｋらの米国特許第ＲＥ３３，６５３号、同第４，９５９，３１４号、同第４，５８８，５８５号および同第４，７３７，４６２号；Ｋｏｔｈｓらの米国特許第５，１１６，９４３号；Ｎａｍｅｎらの米国特許第４，９６５，１９５号；Ｃｈｏｎｇらの米国特許第４，８７９，１１１号；およびＬｅｅらの米国特許第５，０１７，６９１号に提供されており、またリシンで置換されたタンパク質類が米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）に提供されている。
ＴＲＡＦ結合タンパク質の活性を有意に変えない先に考察した保存的置換体に加えて、ＴＲＡＦ結合タンパク質の類似体の生物活性を増大させる、保存的置換体の変化またはあまり保存的ではなくてよりランダムな変化は本発明の範囲内にあるものとする。
置換または欠失の正確な作用を確認しなければならない場合、当業者は、置換、欠失などの作用が日常的な結合アッセイおよび細胞死アッセイによって評価されることが分かるであろう。このような標準の試験法を使用するスクリーニング法は過度の試験を必要としない。
これらの類似体は、遺伝子レベルで、一般にＴＲＡＦ結合タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発を行って前記類似体をコードするＤＮＡを産生させ、その後そのＤＮＡを合成し、ついでそのポリペプチドを、組換え細胞の培養で発現させて製造される。これら類似体は、一般に、天然由来のタンパク質と同じかまたは質が向上した生物活性を示す（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８７〜１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。
本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質、または同じポリペプチドをコードするが天然の配列と異なる別のヌクレオチド配列は、変化が遺伝子暗号の公知の縮重によって許されるため、ＴＲＡＦ結合タンパク質の初期に製造された類似体または未変性のバージョンをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法で製造することができる。部位特異的突然変異誘発法は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列；およびトラバースされる欠失結合部の両端に安定な二重らせんを形成するのに十分なサイズと配列複雑度を有するプライマー配列を提供するのに十分な数の隣接ヌクレオチドを使用することによって、類似体を製造することができる。一般に、長さが約２０〜２５個のヌクレオチドのプライマーが好ましく、その配列の各側の相補ヌクレオチドの約５〜１０個が変更される。一般に、部位特異的突然変異誘発法は、Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ、２：１８３（１９８３）のような刊行物によって例示されているように当該技術分野で公知である。なお上記刊行物の開示内容は本明細書に包含されるものである。
分かっているであろうが、部位特異的突然変異誘発法は、一般に１本鎖型および２本鎖型の両方で存在するファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発法に有用な代表的ベクターとしては、たとえば、Ｍｅｓｓｉｎｇらが、Ｔｈｉｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ａ．Ｗａｌｔｏｎ編Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）に開示しているようなＭ１３ファージなどのベクターがある。なおこの刊行物の開示内容は本明細書に包含されるものである。これらのファージは商業的に容易に入手することができ、かつこれらを使用することは当業者にとって一般に公知である。あるいは、１本鎖ファージの複製起点を含有するプラスミドベクター（Ｖｅｉｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：３、１９８７）を利用して１本鎖ＤＮＡを得ることができる。
一般に、前述の部位特異的突然変異誘発法は、まず、関連するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列の中に有する１本鎖ベクターを得ることによって実施される。所望の突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを、自動ＤＮＡ／オリゴヌクレオチド合成法によって合成する。このプライマーを次に１本鎖のタンパク質配列含有ベクターとともにアニールし、つぎに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素を作用させて突然変異保有鎖の合成を完了させる。したがって、突然変異配列と第二の連鎖は所望の突然変異を有している。つぎにこのヘテロ２本鎖ベクターを使用して、大腸菌ＪＭ１０１細胞のような適当な細胞を形質転換し、次に、突然変異配列が配置されている組換えベクターを含有するクローンを選択する。
このようなクローンが選択された後、突然変異したＴＲＡＦ結合タンパク質の配列を取り出して、適当なベクター、一般に、適当な宿主をトランスフェクトするのに使用されるタイプの輸送ベクターまたは発現ベクター中に入れる。
したがって、ＴＲＡＦ結合タンパク質をコードする遺伝子または核酸も、ＰＣＲ法および化学的オリゴヌクレオチド合成法などの公知のＤＮＡまたはＲＮＡの増幅法を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、検出し、入手しおよび／または修飾することができる。ＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラーゼ反応を繰り返すことによって、特定のＤＮＡ配列を増大させる（配列の数を増やす）ことができる。この反応は、クローン化のための置換反応として使用することができ、必要なのは核酸の配列が分かっていることだけである。ＰＣＲ法を実施するために、対象の配列に相補的はプライマーが設計される。そのプライマーを自動ＤＮＡ合成法で生成させる。プライマーは、遺伝子の一部分とハイブリダイズするよう設計することができるので、相補的な塩基対のミスマッチを許容し得る状態をつくることができる。これらミスマッチの領域が増幅されると、突然変異産物が合成されて新しい特性を有するペプチドが生成するに至る（すなわち部位特異的突然変異誘発）（たとえばＡｕｓｕｂｅｌ、前掲１６章参照）。また、逆転写酵素を用い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成法をＰＣＲ法と組み合わせることによって、ＲＮＡをクローニングせずにプロラクチン受容体の細胞外ドメインを合成するための出発物質として使用できる。
さらに、ＰＣＲプライマーは、増幅される遺伝子セグメントの両端に、新しい制限部位または終止コドンのようなほかの特徴を組み込むよう設計することができる。増幅される遺伝子配列の５′末端と３′末端に制限部位をこのように配置すると、ベクター中のほかの配列および／またはクローニングサイトを切断して、ＴＲＡＦ結合タンパク質またはそのフラグメントを特別に設計することができる。
ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを増幅するＰＣＲ法などの方法は当該技術分野でよく知られているので、過度の試験をせずに、本明細書に示す教示と案内に基づいて本発明に使用できる。ＤＮＡまたはＲＮＡの公知の増幅法としては、制限はないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法および類縁増幅法（たとえばＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号；Ｔａｂｏｒらの米国特許第４，７９５，６９９号と同第４，９２１，７９４号；Ｉｎｎｉｓの米国特許第５，１４２，０３３号；Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，１２２，４６４号；Ｉｎｎｉｓの米国特許第５，０９１，３１０号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらの米国特許第５，０６６，５８４号；Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第４，８８９，８１８号；Ｓｉｌｖｅｒらの米国特許第４，９９４，３７０号；Ｂｉｓｗａｓの米国特許第４，７６６，０６７号；Ｒｉｎｇｏｌｄの米国特許第４，６５６，１３４号；およびＩｎｎｉｓら編ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ参照）および２本鎖ＤＮＡ合成用の鋳型として、標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いるＲＮＡ仲介増幅法（Ｍａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号、商品名ＮＡＳＢＡ）；ならびにＤＮＡの増幅と抗体の標識化を組あわせて使用する免疫ＰＣＲ法（Ｒｕｚｉｃｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：４８７（１９９３）；Ｓａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１２０（１９９２）；Ｓａｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ９：１３７８（１９９１））がある。なおこれらの特許と文献の全内容は本明細書に包含するものである。
ＴＲＡＦ結合タンパク質（たとえば、ＮＩＫのようなＴＲＡＦ２結合タンパク質のいずれか）の生物学的に活性なフラグメントまたはそのイソ型は、ＴＲＡＦ結合タンパク質の類似体について先に述べたのと類似の方式で製造することができる。ＴＲＡＦ結合タンパク質の適切なフラグメントは、ＴＲＡＦ結合タンパク質の性能を担持し、かつＴＲＡＦ結合タンパク質またはＴＲＡＦタンパク質と直接にまたは間接的に関連するほかのタンパク質の生物活性を仲介できるフラグメントである。したがって、類似体について先に述べたように、ドミナントネガティブ作用またはドミナントポジティブ作用を有するＴＲＡＦ結合タンパク質のフラグメントを製造することができる。これらフラグメントは、本発明の類似体の特定のクラスを示し、すなわち完全なＴＲＡＦ結合タンパク質の配列由来の（たとえばＮＩＫのようなＴＲＡＦ２結合タンパク質のいずれか１つまたはそのイソ型の配列由来の）ＴＲＡＦ結合タンパク質の一部分と定義され、その各部分またはフラグメントは上記所望の活性をどれも有していることに注目すべきである。このようなフラグメントはたとえばペプチドである。
同様に、誘導体は、当該技術分野でよく知られているように、ＴＲＡＦ結合タンパク質、その類似体もしくはフラグメントの１またはそれより多くのアミノ酸残基の側基を、標準的な方法で修飾するか、またはＴＲＡＦ結合タンパク質、その類似体もしくはフラグメントを、ほかの分子たとえば抗体、酵素、受容体などに接合することによって製造することができる。したがって、「誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、残基の側鎖として存在する官能基またはＮ末端基もしくはＣ末端基から、当該技術分野で公知の方法によって製造することができて、本発明に含まれる誘導体を包含している。誘導体は炭水化物またはリン酸の残基のような化学的部分をもっていてもよいが、ただしその部分はＴＲＡＦ結合タンパク質と同じかまたはそれより高い生物活性を有している。
たとえば、誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル類；カルボキシル基と、アンモニアまたは第一級もしくは第二級のアミンとの反応によって生成するアミド類；アミノ酸残基とアシル部分（たとえばアルカノイル基または炭素還式アロイル基）とで形成されたＮ−アシル誘導体もしくは遊離アミノ基；または遊離ヒドキシル基（たとえばセリルもしくはトレオニルの残基）の遊離ヒドロキシＮ基とアシル部分で形成されるＯ−アシル誘導体がある。
用語「誘導体」には、１つのアミノ酸が、ほかの２０種の一般に存在している天然のアミノ酸に変化しない誘導体だけが含まれるものとする。
ＴＲＡＦ結合タンパク質はタンパク質またはポリペプチドであり、すなわちアミノ酸残基の配列である。本明細書の定義によってＴＲＡＦ結合タンパク質の全配列を有する大きな配列からなるポリペプチドは、付加物が本発明の基本的な新規の特性に影響しない限り、すなわち付加物がＴＲＡＦ結合タンパク質の生物活性を保持しもしくは増大するかまたはＴＲＡＦ結合タンパク質の生物活性を有するタンパク質もしくはポリペプチドを残すように開裂できるならば、前記ポリペプチドの範囲内に含まれるものとする。したがって、たとえば本発明は、ＴＲＡＦ結合タンパク質とほかのアミノ酸もしくはペプチドとの融合タンパク質を含むものとする。
上記のように、本発明の「ＴＲＡＦ結合」タンパク質は、細胞内でＴＲＡＦタンパク質と結合してその活性を仲介／モジュレートするタンパク質と解すべきである。個々の例は、とくに、すでに述べておりかつ以下に詳細に述べるように、ＴＲＡＦ２と、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーおよび／またはそれらに関連するアダプタータンパク質の各種メンバーとが相互に作用した後、ＴＲＡＦ２がＮＦ−κＢの活性の誘発に関与することについてとくに先に述べたように、ＴＲＡＦ２関連細胞内シグナリング活性をモジュレートまたは仲介できるＴＲＡＦ２結合タンパク質類である。このようなＴＲＡＦ結合タンパク質類の具体例は、ＮＩＫタンパク質とその各種類似体、フラグメントなどであり（実施例参照）、これらはＴＲＡＦ２に非常に特異的に結合しかつＮＦ−κＢの活性の誘発に直接作用するが、各種のＮＩＫドミナントネガティブ類似体／突然変異タンパク質はこの活性を遮断するようである。
上記修飾されたものはすべて、それらが、コードされたタンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの類似体と誘導体が、ＴＲＡＦ２の少なくともアミノ酸配列２２２〜５０１に結合する性能を保持しているならば、本発明の範囲内にある。
本発明のすべてのタンパク質とポリペプチドは、ＴＲＡＦ２に結合できることによって、ＴＲＡＦ２のシグナリングのメディエーターまたはモジュレーターと考えられる。したがって、本発明の前記分子は、たとえば、ＴＲＡＦ２リガンドが、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンホトキシンβ（ＬＴ−β）の受容体、ｐ５５ＴＮＦもしくはｐ７５ＴＮＦの受容体および上記のほかの受容体とアダプアタータンパク質と結合して、転写因子ＮＦ−κＢを活性化するシグナリングプロセスに役割をもっている。とくに興味深いのは、タンパク質ＮＩＫおよび本発明のクローン１０がコードする部分ＮＩＫのタンパク質である。ＮＩＫおよびこのクローン１０がコードするタンパク質（当初ＮＭＰＩと命名された）の配列を詳細に分析したところ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼ類に特徴的なＩ−ＸＩ保存モチーフに相当し、このタンパク質に１つの機能を割当てる、コードされたアミノ酸配列が開示された。
これらの新しいクローン、タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体は多数の実行可能な用途がある。たとえば以下の用途がある。
（ｉ）前記諸物質は、促進される機能が、ＴＲＡＦ２が誘発する作用が望ましい抗腫瘍または免疫刺激の用途などで望ましい場合、ＮＦ−κＢの活性、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ２が結合する受容体の機能をまねるかまたは増大するのに用いることができる。この場合、ＴＲＡＦ２または受容体の作用を高める本発明のタンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は、それ自体公知の標準法で細胞に導入することができる。たとえば、本発明のＤＮＡクローンがコードするタンパク質が細胞内にあって、ＴＲＡＦ２の作用が望ましい細胞内にのみ導入すべき場合、これらのタンパク質をその細胞に特異的に導入するシステムが必要である。これを実施する１つの方法は、たとえばそのＤＮＡに下記２種の遺伝子を挿入されたワクシニアウイルス由来の組換え動物ウイルスを調製することによって行う方法である。それら遺伝子は、細胞が特異的に発現する細胞表面タンパク質、たとえばある種の細胞（ＣＤ４リンパ球と類縁白血病）に特異的に結合するエイズ（ＨＩＶ）ウイルスｇｐ１２０タンパク質などに結合するリガンド、またはＴＲＡＦ２に結合する受容体を担持する細胞に特異的に結合しその結果、組換えウイルスベクターが前記細胞に結合できるようになるほかのリガンドをコードする遺伝子；および本発明のタンパク質をコードする遺伝子である。したがって、ウイルスの表面に細胞表面結合タンパク質が発現すると、そのウイルスは、特異的に、腫瘍細胞またはほかの受容体を有する細胞を標的として誘導され、続いて、前記タンパク質をコードする配列が前記ウイルスによって細胞中に導入され、細胞内で発現されると、これらの細胞内で望ましい免疫刺激作用をもたらす受容体またはＴＲＡＦ２の作用が増大される。このような組換え動物ウイルスは、標準の方法（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）で構築される。別の実現可能な方法は、細胞によって吸収され細胞内で発現できるオリゴヌクレオチドの形態で、コードされたタンパク質の配列を導入する方法である。
（ｉｉ）前記諸物質は、たとえばエイズ、敗血症性ショックまたは移植片対宿主拒絶反応のように組織が損傷していて、その細胞内で誘発されるシグナリングを遮断することが望ましい場合、ＮＦ−κＢ活性、ＴＲＡＦ２もしくはＴＲＡＦ２に結合する受容体の作用を阻害するのに使用できる。この状態の場合、たとえば、本発明のタンパク質に対するアンチセンスコード配列を有するオリゴヌクレオチドを、標準の方法で、細胞内に導入することができ、そのオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を効果的に遮断し、それらの発現を遮断して、望ましくない作用が阻害される。あるいは、以下のような別のオリゴヌクレオチドを使用できる。そのオリゴヌクレオチドは、ほかの分子がＴＲＡＦ２に結合するのを妨害する方式でＴＲＡＦ２に結合する性能を担持し、同時にＴＲＡＦ２の活性化またはモジュレーションを仲介しない。前記分子は、これらの特性を有しているので、ＴＲＡＦ２とその天然のリガンドとの相互作用を中断することが可能であり、したがって、たとえばＮＦ−κＢの活性化のようなＴＲＡＦ２によって仲介される作用を中断することができる阻害剤として作用する。このようなオリゴヌクレオチドは、上記の組換えウイルス法を用いて細胞内に導入することができる。なおそのウイルスが担持している第二の配列がそのオリゴヌクレオチドの配列である。
別の実行可能な方法は、本発明のタンパク質に対して特異的な抗体を用いて、それらの細胞内シグナリング活性を阻害する方法である。
望ましくない作用を阻害するさらに別の方法は、最近開発されたリボザイム法による方法である。リボザイムは、ＲＮＡを特異的に開裂する触媒ＲＮＡ分子である。リボザイムは、選択された標的ＲＮＡ、たとえば本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡを開裂するように製造することができる。かようなリボザイムは、本発明のタンパク質のｍＲＮＡに対して特異的な配列を有し、前記ｍＲＮＡと相互に作用し（相補的結合）ついでそのｍＲＮＡが開裂され、本発明のタンパク質の発現が減少し（または完全に発現せず）、発現減少のレベルは標的細胞内でのリボザイム発現のレベルに依存している。選択された細胞（たとえばＴＲＡＦ２結合タンパク質を保有する細胞）中にリボザイムを導入するのに、適切なベクターを使用することができ、たとえばプラスミドベクター、動物ウイルス（レトロウイルス）ベクターがこれらの目的に通常用いられる（ウイルスが、第二の配列として、選択されたリボザイム配列をコードするｃＤＮＡを有する場合は、上記（ｉ）も参照）（リボザイムに関する総説、方法などについては、Ｃｈｅｎら、１９９２；ＺｈａｏおよびＰｉｃｋ、１９９３参照）。
（ｉｉｉ）前記諸物質は、それらに結合できるほかのタンパク質、たとえばＴＲＡＦ２の下流に位置する、細胞内シグナリングプロセスに関与するほかのタンパク質を単離し、同定しついでクローン化するのに使用できる。たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、コードされたタンパク質を「バイト（ｂａｉｔ）」として用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのライブラリーから、クローンタンパク質に結合できるタンパク質をコードするほかの配列「プレイ（ｐｒｅｙ）」を単離し、クローン化しつぎに確認する酵素ツーハイブッリドシステムに用いることができる。同様の方式で、本発明のタンパク質が、ほかの細胞タンパク質、たとえば、受容体のＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーのほかの受容体に結合できるかどうかも決定することができる。
（ｉｖ）また、前記コードされたタンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は、同じクラスのほかのタンパク質、すなわちＴＲＡＦ２または機能が類似しているタンパク質に結合しかつ細胞内シグナリングプロセスに関与しているタンパク質を単離し、同定してクローン化するのに使用できる。この用途では、上記の酵母ツーハイブリッドシステムを使用できるし、または、非ストリンジェントのサザンハイブリダイゼーションとこれに続けて行うＰＣＲクローン化法を用いる新しく開発されたシステムを用いることができる（Ｗｉｌｋｓら、１９８９）。
（ｖ）本発明のコードされたタンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体を利用する別の方法は、これらのものが結合できるほかのタンパク質または因子、たとえばＴＲＡＦ２に類縁のタンパク質または細胞内シグナリングプロセスに関与しているほかのタンパク質もしくは因子を単離して同定するため、アフィニティークロマトグラフィー法に使用する方法である。この用途では、本発明のタンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は、アフィニティークロマトグラフィーのマトリックスに個々に結合され、つぎに、細胞内シグナリングプロセスに関与していると推測される細胞抽出液または単離されたタンパク質もしくは因子と接触させる。上記アフィニティークロマトグラフィーの手順に続いて、本発明のタンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体に結合するほかのタンパク質もしくは因子を溶出し、単離し、ついで特徴を決定することができる。
（ｖｉ）上記のように、本発明のタンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は、免疫原（抗原）として使用して、これに対する特異的な抗体を製造することもできる。また、これらの抗体は、本発明のタンパク質を、細胞抽出液、または本発明のタンパク質、その類似体もしくはフラグメントを産生する形質転換細胞系から精製するのに使用できる。さらにこれらの抗体は、本発明のタンパク質類が機能している受容体系が異常に作動していることに関連している疾患、たとえば活性が高いかまたは低いＴＲＡＦ２によって誘発される細胞作用を同定する診断を行うために用いることができる。したがって、このような疾患が、万一、本発明のタンパク質が関与している機能不全の細胞内シグナリングシステムに関連している場合、このような抗体類は重要な診断用具として役立つであろう。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、可溶性形態または結合形態で標識化することができる抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体およびそれらのフラグメント、たとえば抗原に結合できる、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠いているＦａｂフラグメントとＦ（ａｂ）′2フラグメントが含まれるものとする。
（ｖｉｉ）本発明に有用な抗体（抗体のフラグメントを含む）は、試料中の本発明のクローンを定量的にまたは定性的に検出するためまたは本発明のクローンを発現させる細胞の存在を検出するために用いることができる。これは、蛍光で標識した抗体を使用する免疫蛍光法を、光学顕微鏡法、フローサイトメトリーまたは蛍光測定法と組み合わせて用いて達成することができる。
本発明に有用な抗体（またはそのフラグメント）は、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法の場合のように、本発明のクローンのｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うため組織学的に利用できる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、組織学的試料片を患者から取り出し、つぎに本発明の標識化された抗体を前記試料片に加えて行うことができる。その抗体（またはフラグメント）は、標識化した抗体（またはフラグメント）を生物試料に塗布するかまたは上にのせて加えることが好ましい。このような方法を利用することによって、クローンの存在のみならずクローンの被検組織上の分布状態を同定することができる。本発明を用いれば、当業者は、広範囲の組織学的方法（たとえば染色法）は、このようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出を達成するために改変できることが容易に分かるであろう。
本発明のクローンのこのようなアッセイは、一般に、生物試料、たとえば、生物学的流体、組織抽出液、リンパ球もしくは白血球のような新たに収穫した細胞、または組織培養で培養した細胞を、コードされたタンパク質を同定できる、検出可能に標識化された抗体の存在下、インキュベートし、ついで当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかで、前記抗体を検出することからなる方法である。
（ｖｉｉｉ）また、本発明のコードされたタンパク質は、ほかの細胞内タンパク質に結合できる性能によって、いくつものほかのタンパク質の間接的なモジュレーターとしても使用できる。なお、上記ほかの細胞内タンパク質は、さらに別の細胞内タンパク質または膜貫通タンパク質の細胞内ドメインに直接結合する。
これらのほかの細胞内タンパク質または膜貫通タンパク質の細胞内ドメインを調節するため、本発明のタンパク質は、（ｉｉ）で述べたいくつもの方式で細胞内に導入することができる。
本発明のタンパク質の単離、同定および特徴付けは、公知の標準スクリーニング法のいずれかを使用することによって実施できることに注目すべきである。たとえば、これらスクリーニング法のうちの１つの酵母ツーハイブリッド法は、本発明のタンパク質を同定するために使用した。さらに、当該技術分野で公知のアフィニティークロマトグラフィー、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどのほかの方法を用いて、本発明のタンパク質を単離し、同定して特徴付けし、または本発明のタンパク質に結合できる追加のタンパク質、因子、受容体などを単離し、同定して特徴付けることができる。
さらに、本発明のタンパク質に結合することが発見されたタンパク質類は、それ自体を、本発明のタンパク質が先に述べられかつ以下に述べるように使用された方法と類似の方法で用いて、本発明のタンパク質が結合するタンパク質に結合できかつ関連シグナリングプロセス中のさらに下流で関与している因子を示す、ほかのタンパク質、因子などを単離し、同定して特徴付けることができる。
本発明のＤＮＡ配列とそのコードされたタンパク質は、標準の組換えＤＮＡ法（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）で製造することができ、この方法では、適切な真核生物もしくは原核生物の宿主細胞が、本発明のタンパク質類をコードする配列を含有する適当な真核生物もしくは原核生物のベクターによって形質転換される。したがって、本発明は、本発明のタンパク質類を産生させるための発現ベクターおよび形質転換された宿主に関する。上記のように、これらのタンパク質には、それらの生物学的に活性な類似体、フラグメントおよび誘導体も含まれているので、それらをコードするベクターには、これらタンパク質の類似体とフラグメントをコードするベクターも含まれ、そして形質転換された宿主には、かような類似体およびフラグメントを産生する宿主が含まれている。これらタンパク質の誘導体は、形質転換された宿主が産生するタンパク質またはその類似体またはフラグメントを標準法で修飾することによって製造される誘導体である。
また、本発明は，ＦＲＡＦ２が仲介する作用をモジュレーションする医薬組成物に関する。その医薬組成物は、活性成分として、以下のものを１またはそれより多く含有している。すなわち、（ｉ）適当な発現ベクター中にサブクローン化された本発明のＤＮＡ配列またはその一部分の１またはそれより多く；（ｉｉ）本発明のタンパク質、その生物学的に活性なフラグメント、類似体、誘導体またはそれらの混合物；（ｉｉｉ）本発明のタンパク質、その生物学的に活性なフラグメント、類似体または誘導体をコードする組換え動物ウイルスベクターである。
上記医薬組成物は、治療される疾患に対応して、患者に対して有益な量で、体重や医者が決定する考慮事項に基づいて投与される。
上記のように、本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質の特別の実施態様の１つは、ＴＲＡＦ２結合タンパク質のＮＩＫである。ＮＩＫは、ＴＲＡＦ２に特異的に結合するＴＲＡＦ２のメディエーター／モジュレーターであるので、ＮＦ−κＢが活性化する場合のＴＲＡＦ２の活性、ならびにＴＲＡＦ２がほかのタンパク質（たとえばｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ及びＴＲＡＤＤ）とは独立してまたはこれらとともに機能する方式の細胞生存経路でのＴＲＡＦ２の可能な役割を仲介／モジュレーションできるという発見に基づいて、所望どおりに、ＴＲＡＦ２−ＮＩＫの相互作用を促進または阻害できる薬物を設計することが重要である。たとえば、ＴＮＦによって誘発される細胞の細胞傷害性を高めたい場合は、ＴＲＡＦ２−ＮＩＫの相互作用を阻害することによって、またはＴＲＡＦ２および／またはＮＩＫを特異的に阻害することによって、ＮＦ−κＢの誘発を阻害することが望ましい。さらに、たとえば、ＴＮＦによって誘発される細胞の細胞傷害性を阻害したい場合は、ＴＲＡＦ２−ＮＩＫの相互作用を高めることによって、またはＴＲＡＦ２特異的および／またはＮＩＫ特異的のＮＦ−κＢ誘発を高めることによって、ＮＦ−κＢ誘発を高めることが望ましい。このような薬物が大きな助けになる疾病が多数ある。とくに（上記考察を参照）、以下の疾患、すなわち肝臓の急激な損傷が、Ｆａｓリガンドによる誘発の後にＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体が仲介する肝細胞の死を反映していると考えられる急性肝炎、糖尿病である。膵臓のβランゲルハンス細胞の死のような自己免疫誘発細胞死；移植片拒絶反応による細胞死（たとえば腎臓、心臓および肝臓）；多発性硬化症の場合の脳の希突起グリア細胞の死；およびエイズウイルスを増殖させてエイズ疾患を起こす、エイズに阻害されたＴ細胞の自殺がある。
このような症例の場合、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体が仲介する細胞の細胞傷害性（アポトーシス）経路を阻害し、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体が仲介する。ＴＲＡＦ２経由のＮＦ−κＢの誘発およびＴＲＡＦ２−ＮＩＫの相互作用を高めることが望ましい。これを実施する１つの方法は、細胞内のＮＩＫの量を増大するかまたはＴＲＡＦ２とＮＩＫの量を増大して、ＮＩＫまたはＴＲＡＦ２−ＮＩＫが仲介するＮＦ−κＢの活性化の誘発を高めて、ＮＦ−κＢの活性化と細胞生存率のレベルを高くするか；またはＦＡＳ／ＡＰＯ１とＴＲＡＦ２間（またはＴＲＡＦ２−ＮＩＫ間）の直接もしくは間接的な相互作用を高めて、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体と細胞の細胞傷害性メディエーター（たとえばＭＡＣＨ、図２ｂの図式参照）との相互作用を減らして、ＮＦ−κＢの活性化の誘発と細胞生存率を高める方法である。
逆に、たとえば、腫瘍および感染細胞の症例の場合（上記考察参照）、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体が仲介する細胞の細胞傷害性を高めて細胞死を増大することが望ましい。この症例の場合、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体−ＴＲＡＦ２（またはＴＲＡＦ２−ＮＩＫ）の相互作用を阻害しおよび／またはＮＩＫを直接阻害してＮＦ−κＢ活性の誘発を低下させることが望ましい。
ＮＩＫまたはその可能なイソ型、類似体もしくはフラグメントの１またはそれより多くは、ＮＩＫ自体またはＮＩＫ−ＴＲＡＦ２の相互作用の「天然の」阻害剤として、したがってＮＦ−κＢ活性化誘発の阻害剤として利用することができる。このような阻害剤は、上記特定の阻害剤として、たとえば、細胞死を増大するため、ＴＮＦもしくはＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体のリガンドの細胞の細胞傷害性作用を高めたい場合に使用される阻害剤として利用することができる。事実、以下に例示するように、本発明によって、各種のＮＩＫの類似体と突然変異タンパク質が単離されている。これらの物質は、キナーゼが欠失している類似体／突然変異タンパク質であり；そして、ＴＮＦ受容体、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体、これら受容体に関連するタンパク質のＴＲＡＤＤ、ＲＩＰおよびＭＯＲＴ１ならびにＩＬ−１受容体（その活性化はＮＩＫを通じて行われるがＴＲＡＦ２とは独立している）で仲介され、さらに細胞外トキシン（ＬＰＳ）、ホルボルミリステートアセテートおよびＨＴＬＶ−１タンパク質ＴＡＸでも仲介されるＮＦ−κＢ活性化の誘発を遮断することができる。さらに、ペプチド、有機化合物、抗体などのほかの物質をスクリーニングして、ＴＲＡＦ２−ＮＩＫ相互作用またはＮＩＫの活性を阻害することができる特定の薬物も得ることができる。
同様に、上記のような各種の場合にＮＦ−κＢの活性化を高めたい場合、たとえば、先に述べた各種の標準法によって、細胞内のＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ２の量を増大することができる（たとえば、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ２をコードするＤＮＡを細胞内に導入して発現を増大させるか、または細胞中に直接導入するためＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ２を含有する適切な配合物を調製するか、または当業者に公知のほかの方法を利用する）。さらに、ペプチド、有機化合物などのほかの物質をスクリーニングして、ＮＩＫの活性を高めるか、またはＴＲＡＦ２−ＮＩＫ相互作用を高めることができる特定の薬物を得ることもできる。
ＮＩＫ−ＴＲＡＦ２相互作用のペプチド阻害剤を設計してスクリーニングする方法の例に制限はないが、ＩＣＥまたはＩＣＥ様のプロテアーゼのペプチド阻害剤に関するこれまでの研究結果、ＩＣＥの基質特異性、およびペプチド合成を利用してエピトープを分析する方法に基づいている。ペプチドをＩＣＥによって効果的に開裂するのに最少限必要なことは、Ｐ1位置の、アスパラギン酸を強く好む開裂部位の左側に４種のアミノ酸が配置されることであり、Ｐ1位置の右側はメチルアミンで充分である（Ｓｌｅａｔｈら、１９９０；Ｈｏｗａｒｄら、１９９１；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９２）。さらに、蛍光原基質ペプチド（テトラペプチド）：アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ａ−（４−メチル−クマリル−７−アミド（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣと略す）は、ＦＡＳ−Ｒ刺激およびほかのアポトーシスのプロセス（ａｐｏｐｔｏｐｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ）の後、短時間で細胞内で開裂されることが見出されているポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の配列に相当し（Ｋａｕｔｍａｎｎ、１９８９；Ｋａｕｔｍａｎｎ、１９９３；Ｌａｚｅｂｎｉｋら、１９９４）、そしてＣＰＰ３２（ＣＥＤ３／ＩＣＥプロテアーゼのファミリーのメンバー）およびＭＡＣＨプロテアーゼ類によって効果的に開裂される。
その基質のＰ1位置のＡｓｐは重要のようであるから、第四番目のアミノ酸残基としてＡｓｐを有し、そして最初の３個の残基の位置に各種の組合わせのアミノ酸を有するテトラペプチドは、たとえばＧｅｙｓｅｎが開発した方法（Ｇｅｙｓｅｎ、１９８５；Ｇｅｙｓｅｎら、１９８７）を用いて、プロテアーゼの活性サイトに対する結合によって、迅速にスクリーニングすることができる。なおこの方法によって、固体支持体上の多種類のペプチド類が抗体との特異的な相互作用でスクリーニングされた。ＭＡＣＨプロテアーゼ類と特定のペプチドとの結合は、放射能標識化などの当業者にとって公知の各種検定法で検出できる。Ｇｅｙｓｅｎのこの方法は、各作業日毎に少なくとも４０００個のペプチドを試験できると報告された。
同様の方法で、ＴＲＡＦ２とＮＩＫ（またはほかのＴＲＡＦタンパク質とＴＲＡＦ結合タンパク質）の間の相互作用を決定する正確な結合領域すなわち相同の領域は解明することができ、つぎにこの相互作用を遮断する働きをするペプチド類、たとえば、ＴＲＡＦ２（すなわちＴＲＡＦ）に結合して天然のＮＩＫ（すなわちＴＲＡＦ結合タンパク質）と競合できる結合領域またはその領域に対する相補領域の配列と類似の配列を有する合成ペプチドをスクリーニングすることができる。
細胞内シグナリング経路のほかのメンバーのたとえば細胞死経路のＭＡＣＨプロテアーゼ類（プロテアーゼのＣＥＤ３／ＩＣＥファミリーのメンバー）が関与している生理的細胞死のプロセスを妨害することなく、ＴＲＡＦ２−ＮＩＫ（すなわちＴＲＡＦ−ＴＲＡＦ結合タンパク質）の相互作用を選択して阻害するペプチド阻害剤を設計することは有利なので、先に述べたようなアッセイのＴＲＡＦ２（すなわちＴＲＡＦ）またはＮＩＫ（すなわちＴＲＡＦ結合タンパク質）に結合するペプチドのプールを、さらに、蛍光原基質ペプチドとして合成して、かようなほかのタンパク質に対する選択的結合について試験して、ＴＲＡＦ２／ＮＩＫ（すなわちＴＲＡＦ／ＴＲＡＦ結合タンパク質）に対して特異的なペプチドだけを選択することができる。たとえば、ＴＲＡＦ２／ＮＩＫに対して特異的であると決定されているペプチドは、細胞透過性を増大し、そしてＴＲＡＦ２および／またはＮＩＫの活性を可逆的にまたは非可逆的に阻害すように修飾することができる。Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら（１９９４）は、テトラペプチド（アシルオキシ）メチルケトン：Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−［２，６−（ＣＦ3）2］ＰｈがＩＣＥの強力な不活性剤であると報告した。同様に、Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９９５）は、クロロメチルケトン基（非可逆的）またはアルデヒド基（可逆的）を有するテトラペプチドの阻害剤がＩＣＥを阻害すると報告した。さらにベンジルオキシカルボキシル−Ａｓｐ−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−２，６−ジクロロベンゼン（ＤＣＢ）がＩＣＥを阻害すると報告された（Ｍａｓｈｉｍａら、１９９５）。したがって、類似の方法で、たとえばＴＲＡＦ２またはＮＩＫに選択的に結合するテトラペプチドを、たとえば、アルデヒド基、クロロメチルケトン基、（アシルオキシ）メチルケトン基またはＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−ＤＣＢ基で修飾して、ＴＲＡＦ２／ＮＩＫの活性のペプチド阻害剤を創製することができる。さらに、透過性を改善するために、ペプチド類を、たとえば化学的に修飾するか誘導体化して、その細胞膜を横切るペプチドの透過性を向上させて、かようなペプチドの細胞膜を通過させて細胞質中に送る輸送を容易にすることができる。Ｍｕｒａｎｉｓｈｉら（１９９１）は、甲状腺刺激ホルモン放出因子をラウリン酸で誘導体化して細胞膜を透過する特性に優れた親油性のラウロイル誘導体を製造したと報告した。また、Ｚａｃｈａｒｉａら（１９９１）は、メチオニンを酸化してスルホキシドとし、ついで、そのペプチド結合をそのケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ2）で置換するとペプチドの細胞膜を通過する輸送が容易になったと報告した。これらは、当業者にはよく知られている修飾体と誘導体のごく一部である。
さらに、ＮＩＫ−ＴＲＡＦ２の相互作用および同様にＴＲＡＦタンパク質類とＴＲＡＦ結合タンパク質類の間の相互作用を阻害することによって、たとえばＮＩＫの活性を阻害することができる薬物もしくはペプチドの阻害剤は、細胞内へ入り易くする分子と接合もしくは複合させることができる。
米国特許第５，１４９，７８２号は、融合誘導ポリペプチド類、イオンチャネル形成ポリペプチド類、ほかの細胞膜ポリペプチド類および長鎖脂肪酸類、たとえばミリスチン酸、パルミチン酸などのような細胞膜混合剤（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｌｅｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を、細胞膜を横切って輸送される分子に接合させることを開示している。これらの細胞膜混合剤は、前記分子接合体を細胞膜の脂質二重層中に挿入して、接合体を細胞質中に入り易くする。
Ｌｏｗらの米国特許第５，１０８，９２１号は、限定はないが、タンパク質および核酸などの分子を、受容体が仲介するエンドサイトーシス活性の機構によって、細胞膜を貫通させて送達する利用可能な方法を概説している。これらの受容体系としては、ガラクトース、マンノース、マンノース６−リン酸、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、トランスコバラミン（ビタミンＢ12）、α−２マクログロブリン類、インスリンおよび上皮増殖因子（ＥＧＦ）のようなほかのペプチド増殖因子を認識する受容体系がある。Ｌｏｗらは、ビオチンおよび葉酸塩の受容体のような栄養受容体を、大部分の細胞の細胞膜表面上にビオチンおよび葉酸塩の受容体が多数位置し、そして関連する受容体が細胞膜貫通輸送プロセスを仲介するため、細胞膜を横切る輸送を促進するのに有利に使用できると教示している。したがって、細胞質中に送達される化合物とビオチンもしくは葉酸塩のようなリガンドとの間に形成された複合体は、ビオチンもしくは葉酸の受容体を有する細胞膜と接触して、受容体が仲介する細胞膜貫通機構を開始して、所望の化合物を細胞中に入れることができる。
ＩＣＥは、Ｐ2位置の自由な置換（Ｌｉｂｅｒａｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）に耐えられることが知られており、自由置換に対するこの耐性を利用して、ビオチンのタグを有する強力でかつ選択性が高い親和性標識が開発された（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９４）。その結果、テトラペプチド阻害剤のＰ2位置と場合によってはＮ末端に、たとえばビオチン分子を付加して修飾もしくは誘導体化を行って、これらペプチド阻害剤の細胞膜透過性を高めることができる。
さらに、所望のペプチドの配列をリーダーペプチド／シグナルペプチドの配列と融合させて「キメラペプチド」を調製すると、このような「キメラペプチド」を、細胞膜を横切って細胞質中に輸送することができることは当該技術分野では知られている。
ペプチドの当業者であれば分かるであろうが、本発明による、ＴＲＡＦ−ＴＲＡＦ結合タンパク質の相互作用、たとえばＴＲＡＦ２−ＮＩＫの相互作用のペプチド阻害剤には、ペプチド様（ｐｅｐｔｉｄｏ−ｍｉｍｅｔｉｃ）薬物または阻害剤が含まれ、これらのものは、たとえばＴＲＡＦ２−ＮＩＫに対する結合について迅速にスクリーニングされて、恐らく一層安定な阻害剤を設計できるであろう。
また、ペプチド阻害剤の細胞膜を横切る輸送を容易にしまたは高める上記方法と同じ方法は、ＴＲＡＦ結合タンパク質、たとえばＮＩＫ、その類似体、フラグメントもしくはそのイソ型自体およびその作用を細胞内で発揮するほかのペプチドとタンパク質にも適用できることが分かるであろう。
ここで記載される抗体に関しては、用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（anti-Id）抗体を意味し、酵素的切断に限らず、ペプチド合成法または組換え法のような既知の技法のうちのいずれかにより提供されるそのフラグメントと同様に、可溶性の形態または結合した形態で標識され得る。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清由来の不均一な抗体分子の群である。モノクローナル抗体は抗原に特異的な抗体の実質的に均一な群を含み、その群は実質的に同様のエピトープ結合部位を含む。モノクローナル抗体は当業者に知られている方法で得られればよい。たとえば、Kohler and Milstein，Nature，256：495-497（1975）；U.S.Patent No.4,376,110；Ausubel et al．，eds．，Harlow and Lane ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory（1988）；およびColligan et al．，eds．，Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc．and Wiley Interscience N.Y．，（1992-1996）を参照のこと。これらの参考文献の内容は、「参考文献」によりここに完全に取り入れられている。前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含むイムノグロブリンクラスおよびそれらのサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはin vitro、in situまたはin vivoで培養されてもよい。in vivoまたはin situにおける高力価のモノクローナル抗体の産生は近年好まれている産生方法である。
キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分の分子であり、たとえばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有する。キメラ抗体は適用の際の免疫原性を減少させるためにおもに用いられ、作製の際の収率を高めるために用いられる。たとえば、マウスモノクローナル抗体はハイブリドーマからの高収率を有するが、ヒトにおいては高い免疫原性を有する場合に、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体が用いられる。キメラ抗体およびそれらの製造法は当該分野で既知である（Cabilly et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3273-3277（1984）；Morrison et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6851-6855（1984）；Boulianne et al．，Nature 312:643-646（1984）；Cabilly et al．，European Patent Application 125023（published November 14,1984）；Neuberger et al．，Nature 314:268-270（1985）；Taniguchi et al．，European Patent Application 171496（published February 19,1985）；Morrison et al．，European Patent Application 173494（published March 5,1986）；Neuberger et al．，PCT Application WO 8601533，（published March 13,198 6）；Kudo et al．，European Patent Application 184187（published June 11，1986）；Sahagan et al．，J．Immunol．137:1066-1074（1986）；Robinson et al．，International Patent Application No.WO8702671（published May.7,1987）；Liu et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3439-3443（1987）；Sun et al．，Proc．Natl．Acad．Sci USA 84:214-218（1987）；Better et al．，Science 240:1041-1043（1988）；and Harlow and Lane，ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,supra．）。これらの参考文献は「参考文献」の欄によりここに完全に取り入れられている。
抗イディオタイプ（anti-Id）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に関連する特有の決定基を認識する抗体である。イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体、それに対して抗イディオタイプが作製される、を用いて、モノクローナル抗体のソースと同一の種および遺伝型を有する動物（たとえば、マウスの株）を免疫することにより作製することができる。免疫された動物は免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗−イディオタイプ抗体）を産生することにより免疫する抗体のイディオタイプ決定基に対する応答をするであろう。たとえばU.S.Patent No.4,699,880を参照のこと。これは「参考文献」の欄によりここに完全に取り入れられている。
抗イディオタイプ抗体は、さらなるほかの動物に免疫応答を誘導するための「免疫原」（いわゆる抗抗イディオタイプ抗体を産生する）として用いられてもよい。抗抗イディオタイプは抗イディオタイプを誘導するオリジナルのモノクローナル抗体とエピトープ的に同一であってもよい。このようにモノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有する抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能である。
したがって、本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体（たとえば、ＮＩＫ、そのイソ型、類似体、フラグメントあるいは誘導体）に対して産生されるモノクローナル抗体は、適切な動物、たとえばＢＡＬＢ／ｃマウス、において抗イディオタイプ抗体を誘導するために用いてもよい。前記免疫されたマウスからの脾細胞は、抗イディオタイプモノクローナル抗体を分泌する抗イディオタイプハイブリドーマを産生するために用いられる。さらに、抗イディオタイプモノクローナル抗体はキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリアーと結合することができ、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫するために用いられることができる。これらのマウスからの血清は、前記ＴＲＡＦ結合タンパク質、あるいはその類似体、フラグメントおよび誘導体のエピトープに特異的なオリジナルのモノクローナル抗体の結合特性を有する抗抗イディオタイプ抗体を含むであろう。
こうして、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、それら自身のイディオタイプエピトープ、または評価されるエピトープに構造的に類似する「イディオトープ」、たとえばＧＲＢプロテイン−α、を有する。
用語「抗体」は、完全な分子とそれらのフラグメントたとえば、抗原に結合できるＦａｂとＦ（ａｂ′）２の両者を含むものも意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントがなく、循環からより急速に取り除かれ、完全な抗体よりも組織結合特異性が少なくてもよい（Wahl et al．，J．Nucl．Med．24:316-325（1983））。
本発明に有用な抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２およびほかのフラグメントが、完全な抗体分子のためにここに記載されている方法にしたがって、ＴＲＡＦ結合タンパク質の検出および定量のために使用されてもよい。前記フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを産生するため）などの酵素を用いるタンパク質分解によって典型的に産生される。
抗体がある分子と特異的に反応してその分子と抗体とが結合できる場合は、抗体は分子に「結合できる」といわれる。用語「エピトープ」は、抗体に結合されるいずれかの分子の一部分であって、その抗体に認識され得る部分を含むことを意味する。エピトープまたは「抗原決定基」は、アミノ酸や糖の側鎖などの化学的に活性な表面分子基から通常なり、特定の三次元構造特性のみならず特定の電荷特性も有する。
「抗原」は、抗体に結合されることのできる分子またはその分子の一部分であり、抗原のエピトープに結合できる抗体を動物にさらに産生させることができる。抗原は１またはそれより多くのあるエピトープを有していてもよい。前述の特異的な反応は、抗原が高度な選択性様式で対応する抗体と反応するが、ほかの抗原によって引きおこされてもよいほかの多数の抗体とは反応しないことを示すよう意図されている。
本発明で有用な抗体のフラグメントを含む抗体は、サンプル中のＴＲＡＦ結合タンパク質（たとえばＮＩＫ）の定量的または定性的検出または本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質を発現する細胞の存在を検出するために用いてよい。これは、光学顕微鏡的、フローサイトメトリック的または蛍光定量的検出と組み合わされた、蛍光的に標識された抗体を用いる免疫蛍光法（以下参照）によって確立され得る。
本発明で有用な抗体（またはそのフラグメント）は、本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質のin situでの検出のために、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法のように、組織学的に使用されてもよい。in situ検出は患者から組織学的な試料を採取し、その試料に標識された本発明の抗体を提供することによって完成する。抗体（またはフラグメント）は好ましくは、標識抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに適用するかまたは上にかぶせることにより提供される。このような操作を用いると、ＴＲＡＦ結合タンパク質の存在のみならず、検査される組織でのその分布も測定され得る。本発明を用いると、広く様々な組織学的な方法（染色操作など）のいずれもが、そのin situ検出を達成するために修飾され得る、ということを当業者であれば容易に認めるであろう。
本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質のためのアッセイは典型的には、生物学的サンプル、たとえば生物学的液体、組織抽出物、リンパ球や白血球などの新鮮に得られた細胞または組織培地でインキュベートされた細胞など、をＴＲＡＦ結合タンパク質を同定することのできる検出可能な標識抗体の存在下でインキュベートし、当該分野でよく知られている多くの技法のうちのいずれかによりその抗体を検出することからなる。
生物学的サンプルはニトロセルロースのような固相支持体もしくは固相キャリヤー、または細胞、細胞の粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することのできるほかの固体支持体もしくは固体キャリヤーで処理されてもよい。支持体またはキャリヤーは適切な緩衝液で洗浄され、前記のように本発明の検出可能な標識抗体で処理してもよい。そののち、固相支持体またはキャリヤーを緩衝液で２度洗浄して結合していない抗体を除去してもよい。この固相支持体またはキャリヤーに結合した標識の量は従来の手段により検出すればよい。
「固相支持体」、「固相キャリヤー」、「固体支持体」、「固体キャリヤー」、「支持体」または「キャリヤー」は、抗原や抗体を結合することのできるいかなる支持体またはキャリヤーをも意味するものである。よく知られている支持体またはキャリヤーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、中性セルロースおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイガン（gabbros）およびマグネタイトがあげられる。キャリヤーの特性は、本発明の目的のためにはある程度まで可溶性であるかまたは不溶性であることができる。支持体の材料は事実上、結合される分子が抗原か抗体に結合できる限り、いかなる構造のコンフィグレーションであってもよい。このように、支持体またはキャリヤーのコンフィグレーションは、ビーズのような球状、試験管の内側表面またはロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。また、表面はシート、テストストリップなどのように平らであってもよい。好ましい支持体またはキャリヤーはポリスチレンビーズを含む。抗体または抗原を結合するためのほかの適するキャリヤーについては、当業者であればわかり、ルーチンの実験を用いることにより同一のものを確認できるであろう。
前述のようにして本発明で得られた多数の抗体の結合活性は、よく知られている方法により測定すればよい。当業者であればルーチンの実験を用いることにより各測定のための操作および最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
洗浄、撹拌、振とう、ろ過などのほかのステップは、通常のようにまたは特定の条件に対しては必要に応じてアッセイ追加してもよい。
本発明の抗体を検出可能となるように標識することのできる方法のうちの１つは、抗体に酵素を結合させ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いることである。この酵素は、のちに適切な基質にさらされると検出可能な、たとえば分光光度的、蛍光定量的または可視的手段により、化学的分子を産生するように基質と反応するであろう。抗体を検出可能にするために標識する際に用いることのできる酵素は、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがあげられる。検出は酵素用の色素基質を用いる色素法により行なうことができる。検出は、同様にして調製されたスタンダードと比較した基質に対する酵素反応の程度を視覚的に比較することにより行なってもよい。
検出は様々なほかの免疫測定法を用いて行なってもよい。たとえば、放射能で標識された抗体または抗体のフラグメントにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰアーゼを検出することができる。ＲＩＡについての好ましい記載は、Work，T．S.らによるLaboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company，NY（1978）に見られ、とくにChard,T.による“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques”というタイトルの章に言及されている。これは「参考文献」の欄によりここに取り入れられている。放射性アイソトープも、ｇカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いてまたはオートラジオグラフィーを用いて検出することができる。
本発明の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光的に標識された抗体が適切な波長の光にさらされると、その存在は蛍光により検出することができる。通常最もよく用いられている蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。
抗体は、152Ｅまたはランタニド系のほかのものなどの蛍光発光金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート基を用いて抗体に付着させることができる。
抗体は、化学発光化合物を結合させることにより検出可能に標識することもできる。化学発光が付された抗体の存在は、化学反応の過程のあいだに生ずる発光体の存在を検出することにより測定される。とくに有用な化学発光標識化合物の具体例は、ルミノール、イソルミノール、サーマティック  アクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキシレートエステルである。
同様に、バイオ発光化合物が本発明の抗体の標識に用いられてもよい。バイオ発光体は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的なシステムに見出されるタイプの化学発光体である。場合オ発光タンパク質の存在は、発光体の存在を検出することにより測定される。標識の目的のための重要なバイオ発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
本発明の抗体分子は「ツーサイト」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイとしても知られている、免疫的定量アッセイに利用するために適応させてもよい。典型的な免疫的定量アッセイでは、一定量の未標識抗体（または抗体のフラグメント）を固体支持体またはキャリヤーに結合させ、検出可能に標識した一定量の可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成された３成分の複合体を検出および／または定量する。
典型的で好まれる免疫定量アッセイは「フォーワード（forward）」アッセイであり、そこでは固相に結合した抗体がまず試験されるサンプルに接触し、２成分の固相抗体−抗原複合体の形成によりサンプルから抗原を抽出する。適切なインキュベーション期間ののち、固相支持体またはキャリヤーを洗浄して未反応の抗原を含む残った液体サンプルを除去し、未知の量の標識抗体（「レポーター分子」として働く）を含む溶液を接触させる。未標識抗体を介して固体支持体またはキャリヤーに結合した抗原と標識抗体とを複合体とするために２回目のインキュベーションをしたのち、固体の支持体またはキャリヤーを２回洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。
本発明の抗原を用いると有用なアッセイでもあるほかのタイプの「サンドイッチ」アッセイ、いわゆる「同時に（simultaneous）」および「リバース（reverse）」のアッセイ、が用いられる。同時のアッセイは、固体支持体またはキャリヤーに結合した抗体および標識抗体が試験されるサンプルに同時に加えられるので、１つのインキュベーションステップからなる。インキュベーションが完了すると、固体支持体またはキャリヤーを洗浄して残った液体サンプルおよび複合化されなかった標識抗体を除去する。固体支持体またはキャリヤーに結合した標識抗体の存在は、通常の「フォーワード」サンドイッチアッセイのようにして測定される。
「リバース」アッセイでは、標識抗体の溶液をまず液体サンプルに段階的に加え、つづいて固体支持体またはキャリヤーに結合する未標識の抗体を、適切なインキュベーションを行なったのちに加える。２回目のインキュベーションののちに、固相を通常の様式で洗浄し、試験されるサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液の残りからそれを解放する。固体支持体またはキャリヤーに連結した標識抗体は、「同時に」および「フォーワード」アッセイで行なうようにして測定される。
上記のように、本発明は、ＴＲＡＦ結合タンパク質をコードし、かつ特定の標的細胞（たとえばがん細胞）の表面タンパク質に結合してＴＲＡＦ結合タンパク質の配列の細胞中への挿入を誘導することができるウイルス表面タンパク質もコードする組換え動物ウイルスベクターを含んでなる医薬組成物に関する。本発明の別の医薬組成物は、活性成分として、（ａ）ＴＲＡＦ結合タンパク質の配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列または（ｂ）ＴＲＡＦ結合タンパク質−ＴＲＡＦの相互作用を遮断する薬物を含有している。
本発明の医薬組成物は、その意図する目的を達成するのに充分な量の活性成分を含有している。さらに、本発明の医薬組成物は、当業者にはよく知られているように医薬として使用することができる活性化合物を製剤に加工しやすくし、かつ製剤を必要としている患者に投与する製剤を安定化することができる添加剤を含む医薬として許容可能で適切な担体を含有していてもよい。
ＴＡＲＦ結合タンパク質およびそのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）またはインタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）は、異なる組織中で著しく異なるレベルで発現され、また明らかに、先に列挙した、出願人が本願と同じ同時係属中の諸特許願に示すような細胞内シグナリング経路に関与する各種のほかのタンパク質の発現と類似の方式で、異なるパターンのインタイプで発現されると考えられる。これらに差は、Ｆａｓ／ＡＰＯ１−リガンドとＴＮＦに対する応答の組織特異的特徴に寄与しているのかもしれない。ほかのＣＥＤ３／ＩＣＥ同族体（Ｗａｎｇら、１９９４；Ａｌｎｅｍｒｉら、１９９５）の場合のように、本発明の発明者らは、不完全なＣＥＤ３／ＩＣＥ領域（たとえばＭＡＣＨα３）を含有するＭＡＣＨイソ型が、同時に発現されるＮＡＣＨα１またはＭＡＣＨα２の活性に対して阻害作用を有していることがみられ、またＦａｓ／ＡＰＯｌとｐ５５−Ｒによる細胞死の誘発を遮断することもみられることをすでに（上記諸特許願で）報告した。細胞内でのかような阻害性イソ型の発現は、Ｆａｓ／ＡＰＯｌおよびＴＮＦで仲介される細胞障害作用に対する細胞の自己防衛の機構を構成している。ＭＡＣＨイソ型の広範囲の多様性は、ＣＥＤ３／ＩＣＥファミリーのほかのプロテアーゼのどれに見られる多様性も大きく超えているが、この多様性によって、活性ＭＡＣＨイソ型の機能のとくに微量の調節を行うことができるはずである。
本発明によれば、ＴＲＡＦ結合タンパク質のうちの１つの類似体／突然変異タンパク質、すなわちＴＲＡＦ２結合タンパク質ＮＩＫが単離された。これらのＮＩＫ類似体／突然変異タンパク質（上記および後記実施例参照）は、ＮＩＫで仲介されるＮＦ−κＢの活性化を阻害し、かつＴＮＦ受容体類、ＦＡＳ／ＡＰＯｌ受容体、それらの類縁タンパク質類、ＩＬ−１受容体およびほかの因子によって仲介されるＮＦ−κＢの活性化の誘発を阻害する。したがって、上記のように、ＴＲＡＦ結合タンパク質または場合によってはイソ型が、それらのＴＲＡＦタンパク質との相互作用とＴＲＡＦタンパク質の活性に対するそれらの影響、またはＴＲＡＦタンパク質によって仲介される細胞内シグナリングについて、異なる組織では異なる作用を持っている。
場合によっては、ＴＲＡＦ結合タンパク質のイソ型のいくつかは、ほかの機能を果たすことができる。たとえば、ＮＩＫまたはいくつかのＮＩＫの類似体もしくはイソ型は、たとえば、Ｆａｓ／ＡＰＯｌ受容体、およびＴＮＦ受容体のＴＲＡＦ２との相互作用を通じてのほかの非細胞障害作用またはＴＲＡＦ２とは全く無関係のほかの非細胞障害作用に関与している分子のドッキング部位として作用できる。
細胞死を起こすＦａｓ／ＡＰＯｌ受容体とＴＮＦ受容体の独特の性能およびほかの組織を損傷する活性をトリガーするＴＮＦ受容体の性能のため、これら受容体の機能が異常になると生物に対してとくに有害になる。実際に、これらの受容体が過剰に機能したり機能が不完全であると、各種の疾患の病的発現に寄与することが報告されている（Ｖａｓｓａｌｌ、１９９２；ＮａｇａｔａおよびＧｏｌｓｔｅｉｎ、１９９５）、これら受容体のシグナリング活性に関与している分子を同定し、これら分子の活性を仲介する方法を発見すれば、新しい治療法を誘導することができる。Ｆａｓ／ＡＰＯｌおよびＴＮＦが仲介するＮＦ−κＢの活性化における、ＴＲＡＦタンパク質類、たとえばＴＲＡＦ２の、したがってＴＲＡＦ−ＴＲＡＦに結合タンパク質たとえばＴＲＡＦ２−ＮＩＫの相互作用の重要な役割が推測されていることからみて、細胞を殺したい（ＮＦ−κＢの活性化を阻害することによって）場合、ＴＲＡＦ−ＴＲＡＦ結合タンパク質の相互作用を遮断することができて、かつ、逆に、細胞を保存したい場合、この相互作用を高めねばならない（ＮＦ−κＢの活性化を高めるため）薬物を設計することがとくに重要のようである。
また、本発明は、本発明のＴＲＡＦ結合タンパク質に結合して、そのＴＲＡＦ結合タンパク質の活性をモジュレーション／仲介できるタンパク質またはほかのリガンドに関する。このようなタンパク質またはリガンドは、上記方法のいずれかによって、スクリーニングし、単離しついで製造することができる。たとえば、本発明のＮＩＫタンパク質類に結合できるタンパク質を含む多数の新しいリガンドを単離することができる（このような新しいタンパク質／リガンドには、公知のＴＲＡＦ２と、ＮＩＫが実際にＩ−κＢと結合する場合のＩκＢは含まれない）。
先に詳しく述べたように、このような新しいＴＲＡＦ結合タンパク質に結合するタンパク質／リガンド、たとえばＮＩＫ結合タンパク質類は、たとえば、ＮＩＫ仲介活性、またはたとえばＴＲＡＦ２−ＮＩＫ相互作用によって仲介される活性の阻害剤または促進剤として作用できるので、上記のような各種の病理学的な状態などに重要な役割をもっている。このようなＴＲＡＦ結合タンパク質に結合するタンパク質／リガンドの別の機能は、たとえば、アフィニティークロマトグラフィーでＴＲＡＦ結合タンパク質を精製するのに用いる特別の薬剤として役立つことであろう。そしてこの場合、これらの新しい結合タンパク質／リガンドは、適切なクロマトグラフィーマトリックスに結合され、固体またはアフィニティ支持体／マトリックスが形成され、そのマトリックスを、ＴＲＡＦ結合タンパク質、たとえばＮＩＫを含有する溶液、抽出液などを通過させ、このようにしてＴＲＡＦ結合タンパク質の精製が容易になる。アフィニティークロマトグラフィーのかような方法は現在公知であり、かつ当該技術分野の一般的な標準法である。
さらに、本発明の上記ＴＲＡＦ結合タンパク質、類似体、フラグメント、イソ型および誘導体は、それらが結合する各種のＴＲＡＦタンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによって精製するために使用できる。たとえば、ＮＩＫ、その類似体、フラグメントおよび突然変異タンパク質のようなＴＲＡＦ２結合タンパク質（以下の実施例参照）は、ＴＲＡＦ２をアフィニティークロマトグラフィーで精製するために使用できる。したがって、ＮＩＫタンパク質と同じ方法で、本発明の類似体／突然変異タンパク質は、これらの方法および当業者には容易に分かるほかの同等の方法（本明細書で先に詳細に述べたような）を用いて単離され製造され（下記諸実施例参照）、ほかのＴＲＡＦ２結合タンパク質が同定されて製造される。このようなＴＲＡＦ結合タンパク質、たとえば、ＴＲＡＦ２結合タンパク質を同定して製造するこのような方法には、ＴＲＡＦ（たとえばＴＲＡＦ２）タンパク質またはその少なくとも特定の部分（たとえばＴＲＡＦ２のアミノ酸２２２−５０１の部分）を基質または「バイト」として用いて、ＴＲＡＦタンパク質に結合できるタンパク質またはほかのリガンドを得るスクリーニングステップ、およびこのステップに続いて、このようにして得られたタンパク質／リガンドを同定して特徴付けし、つぎに、このようなタンパク質／リガンドを実質的に単離され精製された形態で製造するステップが含まれる。これらのステップはすべて、当業者にとって公知であり、本明細書で先に詳細に説明されまた以下に詳細に述べる。
本発明を、ここで、下記実施例と添付図面によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
下記実施例で用いられる（ｉ）ツーハイブリッドスクリーニングおよびツーハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ発現試験法；（ｉｉ）タンパクの質類の誘発される発現、代謝標識化および免疫沈降；（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合；（ｉｖ）細胞障害性の評価；および（ｖ）ノーザン分析法と配列分析法およびそのほかの方法の手順は、ほかの細胞内シグナリングタンパク質と経路に関する本発明の発明者らの以前の刊行物に詳細に述べられていることに注目すべきである（たとえばＢｏｌｄｉｎら、１９９５ａ、１９９５ｂおよびＢｏｌｄｉｎら、１９９６参照）。また、これらの手順は、出願人が本出願の出願人と同じ同時係属出願中のイスラエル特許願第１１４６１５号、同第１１４９８６号、同第１１５３１９号、同第１１６５８８号、同第１１７９３２号および同第１２０３６７号および対応するＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０５２１号に詳細に記載されている。したがって、これら刊行物および特許願すべての全開示内容は全体を、少なくとも詳細な試験手順に関する限り本明細書に包含するものである。
実施例
材料および方法
ｉ）ｃＤＮＡライブラリー
ａ）Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリー
ヒトＢ細胞から構築し、オリゴｄＴをプライマーとして得たライブラリーを用いた（Durfeeら、1993）。ライブラリーのｃＤＮＡはＧＡＬ４活性化ドメインと融合した、ｐＡＣＴにもとづくベクターｐＳＥ1107（pACT based vector pSE 1107）のＸｈｏＩサイトに挿入した。
ｂ）λｇｔ10精巣ｃＤＮＡライブラリー
ヒト精巣由来のｃＤＮＡライブラリーを用いた。ライブラリーは、ランダムヘキサヌクレオチドをプライマーとして得た平均インサートサイズが200〜400bpのライブラリーである。
ii）酵母株
２つの酵母株を形質転換とスクリーニングのための宿主株として用いた：ＨＦ７ｃ株をツーハイブリッドスクリーニングに用い、ＳＦＹ526株をｂ−ガラクトシダーゼアッセイに用いた。両株は栄養要求性のマーカーｔｒｐ１とｌｅｕ２を有する。すなわち、これらの遺伝子の野生型（ＴＲＰ１、ＬＥＵ２）を有するプラスミドによって形質転換しないかぎり、これらの酵母株は、トリプトファンとロイシンを欠く最少合成培地では増殖できない。２つの酵母株は、ＧＡＬ４とＧＡＬ８０遺伝子に欠失変異を有する（それぞれｇａｌ４−542とｇａｌ80−538変異）。
ＳＦＹ526株とＨＦ７ｃ株はそれらの遺伝子型にｌａｃＺレポーターを有し、ＳＦＹ526株では、ＵＡＳとＧＡＬ１プロモーターのＴＡＴＡ部分が融合しており、またＨＦ７ｃ株ではＧＡＬ４の17塩基の共通配列の３コピーとＣＹＣ１プロモーターのＴＡＴＡ部分がｌａｃＺと融合している。ＧＡＬ１ＵＡＳとＧＡＬ４の17塩基の両方がＧＡＬ４の転写アクチベーターに応答する。さらにＨＦ７ｃ株はＵＡＳとＧＡＬ１プロモーターのＴＡＴＡ部分とが融合したＨＩＳ３レポーターを有する。
iii）ヒトＴＲＡＦ２のクローニング
ヒトＴＲＡＦ２はＰＣＲによってＨＬ60ｃＤＮＡライブラリー（ＴＲＡＦ２配列およびその他の詳細については、Rotheら、1994、Rotheら、1995a、Chengら、1996、Hsuら、1996およびWallach、1996参照）からクローニングした。用いたプライマーはａ）リンカーにＢａｍＨＩサイトを含み、最初のメチオニンのコドン（下線部）から始まり、ｈＴＲＡＦ２のコード配列に対応する30塩基の順方向のプライマー  ＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＧＴＧＡＣ、ｂ）そのリンカーにＳａｌＩ制限サイトとｈＴＲＡＦ２遺伝子の終止コドン（下線部）を含む32塩基の逆方向のプライマー  ＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＴＧであった。ＰＣＲプログラムは初期の変性段階２分間94℃、つづいて１分間94℃、１分間64℃、40秒間７２℃を30サイクルで構成した。増幅したヒトＴＲＡＦ２は、そののちＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとともにｐＧＢＴ９ベクターのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩサイトへ挿入した。
iv）Ｂ細胞ライブラリーのツーハイブリッドスクリーニング
ツーハイブリッドスクリーニングは、「バイト（bait）」として供給する特別な分子に会合する因子を同定するために用いられる技法（詳細は、前述の文献および特許出願を参照）である。本発明では、ベクターｐＧＢＴ９にクローニングされたＴＲＡＦ２をバイトとして用いた。ＴＲＡＦ２は酵母ＨＦ７ｃ株中でスクリーニングしたＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーとともに共発現（co-expressed）した。ＰＣＲでクローニングしたＴＲＡＦ２はＣＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合した組換え体であり、スクリーニングしたｃＤＮＡライブラリーをｐＳＥ1107ベクターのＧＡＬ４の活性化ドメインと融合させた。ＨＦ７ｃのレポーター遺伝子はＧＡＬ４転写アクチベーターに応答するＧＡＬ１プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）に融合したＨＩＳ３であった。ｐＧＢＴ９とｐＳＥ1107の両プラスミドを含む形質転換体をトリプトファンとロイシンを除いたプレート上の増殖で選別した。第２段階では、互いに相互作用するツーハイブリッドタンパク質を発現してＧＡＬ１−ＨＩＳ３を活性したポジティブクローンを、トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを欠くが、50mM  ３−アミノトリアゾール（３ＡＴ）を含むプレートから採取した。
ｖ）β−ガラクトシダーゼアッセイ
ツーハイブリッドスクリーニングから採取したポジティブクローンは、以下のClontech Laboratoriesのマニュアルで酵母細胞ＳＦＹ526でのlacZの発色試験に供した（詳細は前述の文献および特許出願参照）。簡単に述べると、形質転換体を直径約２mmに達するまで２〜４日間30℃で増殖させて、そののちワットマンフィルターに移した。細胞を浸透性にする（permeabilize）ためにフィルターに凍結／融解処理を行い、ついで0.33mg／ml Ｘ−ｇａｌと0.35mM β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（16.1mg／ml  Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、5.5mg／ml ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、0.75mg／ml  KCl、0.75mg／ml ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ｐＨ＝７）に浸した。コロニーはβ−ガラクトシダーゼの誘導の指標である青色の発色でモニターした。
vi）クローニングしたｃＤＮＡの発現
以下の２種の発現ベクターを構築した。
ａ）ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープと融合したクローン９、10または15のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含みｐＵＨＤ10−３にもとづくベクター（ｐUHD10−３  based vector）。
ｂ）クローニングしたＴＲＡＦ２の直前にＦＬＡＧオクタペプチド配列を導入した、ＦＬＡＧ／Ｂ６／ＴＲＡＦ２と呼す、ｐＵＨＤ10−３にもとづくベクター。
クローン９、10または15のＯＲＦを含む構築物を、標準的なカルシウム−リン酸法（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel，F．M．ら編の方法）を使って、ＨｅＬａ−Ｂｕｊａｒｄ細胞（これらの細胞については、Gossen，M.およびBujard，M.（1992）参照）に、単独でトランスフェクトしたかＦＬＡＧ／Ｂ６／ＴＲＡＦ２とコトランスフェクトした。
vii）ルシフェラーゼアッセイ
典型的には、5×105のトランスフェクトした細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、400μｌの抽出緩衝液（0.1Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4  ｐＨ＝7.8、１ｍＭ  ＤＴＴ）で再懸濁して集めた。細胞の溶解は３回の液体窒素中での凍結と融解により行った。細胞片は遠心分離（10,000×ｇで５分間）により除いた。ルシフェラーゼアッセイのために、50μｌの溶解物に、200μｌのルシフェラーゼ緩衝液（２５ｍＭ グリシルグリシン、15mM Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4  ｐＨ＝７．８、15mM ＭｇＳＯ4、４mM  ＥＧＴＡ、２mM ＡＴＰ、１mM ＤＴＴ）を加えた。続いて、0.2ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、25mM グリシルグリシン、１mM ＤＴＴの100μｌを反応液に加えた。ルシフェラーゼ活性は、10秒の積算にセットしたLumitron luminometerを用いて光放出を読むことにより決定した（さらに詳しくは、前述の文献および特許出願を参照）。
実施例１：新規クローン９、10および15のクローニング
Ｂ細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを、材料および方法（iv）に記載したようにツーハイブリッド技法を用いて、ＴＲＡＦ２と会合するタンパク質によりスクリーニングした。ＴＲＡＦ２およびそれと相互作用し得るタンパク質の両方を発現する変異体においてのみ、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、転写活性化ドメインがともに導入された。この結果、レポーター遺伝子、この場合はＵＡＳとＧＡＬ１プロモーターのＴＡＴＡ部分が融合したＨＩＳ３が活性化され、発現した。
スクリーニングにより、Ｔｒｐ−、Ｌｅｕ−、Ｈｉｓ−の３ＡＴプレートで増殖可能な、およそ2000コロニーを得た。ランダムに選別した165のポジティブクローンから調製したＤＮＡをｐＧＢＴ９ベクターにクローニングしたＴＲＡＦ２とともに、酵母ＳＦＹ526株の一過性のコトランスフェクションに供した。β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイは、材料および方法（v）に記載したように形質転換した酵母ＳＦＹ526のコロニーについて行った。生じた青色はＴＲＡＦ２と結合するタンパク質またはポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む酵母コロニーの指標となった。
ツーハイブリッドスクリーニングの結果、採取したクローンの３ＡＴプレートでの増殖能力や呈色試験で測定したＬａｃＺの誘導の能力を表Ｉにまとめる。調べたポジティブクローンのうち、２つは既知のタンパク質をコードするｃＤＮＡ、すなわち自己会合してホモ二量体を形成することができるＴＲＡＦ２自身、および細胞内ドメインがＴＲＡＦ２と結合すると示されたリンフォトキシンベータ受容体をコードするｃＤＮＡであった。３つのクローニングしたｃＤＮＡ（クローン９、10および15）は新規であった。
ポジティブクローンはさらに結合特異性試験で調べ、すなわち無関係なバイトとの相互作用について調べた。表２に示されるように、クローン９と10はＴＲＡＦ２とだけ反応し、調べたいくつかの無関係なタンパク質のどれとも結合しなかった。一方、クローン15はＭＯＲＴ１とも、またｐ55およびｐ75ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインとも結合しなかったが、ラミンとサイクリンＤとは弱く結合した。
クローン９、10および15と相互作用するＴＲＡＦ２分子の領域を限定するために、２つのさらなる構築物を作製した。１つの構築物は、ＴＲＡＦ２分子のＮ末端部分である、リングフィンガーモチーフとジンクフィンガーモチーフを含むアミノ酸１〜221からなる。２つ目の構築物はＴＲＡＦ２分子のＣ末端部分である、「ＴＲＡＦドメイン」をカバーする、アミノ酸222〜501と付加的な42アミノ酸のみを含む。これら２つの構築物はツーハイブリッド試験でバイトとして用いた。クローン９、10および15はＴＲＡＦ２分子のアミノ酸１〜221からなる構築物と相互作用しなかったが、それらは全てTRAF２分子の全長と結合するのと同じ効率で「ＴＲＡＦドメイン」からなるＣ末端構築物と結合したという結果がはっきりと示された。
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ｃＤＮＡクローン10に数度のＰＣＲ段階を適用して、ヒト組織のＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡをクローニングした。このタンパク質は、タンパク質キナーゼ領域を含んでいるという事実により「ＮＦ−κＢ誘発キナーゼ」にちなんでＮＩＫと称した（以下参照）。クローン10の配列は最初に解析したときには（ＰＣＲによるＮＩＫの獲得以前）、あるタンパク質、当初ＮＭＰＩと称したタンパク質をコードすることがわかったことに注意するべきである（同一出願人、同時係属中のイスラエル特許出願第117800号参照）。このＮＭＰＩまたはクローン10がコードするタンパク質はＳｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼを特徴付けるＩ〜ＸＩの保存モチーフに対応する配列を持つことがわかった。
実施例２：新規クローンの配列決定
３つの新規なｃＤＮＡクローン（クローン９、10および15）を精製し、大腸菌（E.Coli）内で増幅させ、それらのＤＮＡを配列解析に供した。３つのクローンすべてが部分的なｃＤＮＡクローンであることがわかった。
クローン９、10および15の総長は、それぞれおよそ2000、2700および1300塩基対であった。
図３と図５にクローン９および15の配列決定した部分を示し、図４にクローン10の全配列を示す。
図５ａ〜ｂに５′末端と３′末端の両方から配列決定したクローン15の全体のヌクレオチド配列（a）と前記配列がコードする推定されるアミノ酸（b）を示す。部分的なｃＤＮＡクローンであるクローン15は172アミノ酸の長さのタンパク質をコードすることがわかった。
クローン９とクローン15は部分的なクローンで、それらのコードＤＮＡ配列の５′末端の大部分を欠いている。図３ｂ、４ｂおよび５ｂに示した推定されるアミノ酸配列は、すべてそれぞれのクローンの最初のヌクレオチドから始まっている。
非常に綿密に解析したクローン１０の配列（部分的なｃＤＮＡクローン）は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼモチーフを含む、前述のNMPIと称するタンパク質をコードする。前述のクローン10を用いたＰＣＲから得られた全長のｃＤＮＡクローンにより先に述べた新規なＴＲＡＦ２結合キナーゼＮＩＫが明らかとなった。
ＮＩＫの全長のヌクレオチド配列とその推定されるアミノ酸配列を図６に示し、その中でヌクレオチド番号２３２にあるイニシエーターＡＴＧには下線をひき、ヌクレオチド番号3073にある終止コドンには星印を付けている。図６のすべて配列決定したＮＩＫクローンは、長さが4596ヌクレオチドでその中にＮＩＫをコードしている配列が含まれており、これは947アミノ酸残基のＮＩＫタンパク質をコードしている。
データバンクの調査により、ＮＩＫの新規アミノ酸配列がＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼとして役立つことが知られているいくつかのキナーゼのグループに対してとくに高い相同性を示すことが明らかになった。
図７には
マウスＭＥＫＫＫ（Ｓ１）
ＢＹＲ２（Ｓ２）、
Ｔｐ１−２（Ｓ３）、
ユーイング肉腫のがん遺伝子（Ｓ４）、
ＳＳ３（Ｓ５）、
（ＳＴＥ１１）（Ｓ６）、
（ＮＰＫ１）（Ｓ７）、
（ＢＣＫ１）（Ｓ８）および
（ＮＩＫ）（Ｓ９）
のアラインメントを示す。
これらのキナーゼのいくつかは突然変異型のときに有するがん遺伝子活性によって同定されてた。
実施例３：クローニングしたｃＤＮＡの発現とそれらのＴＲＡＦ２との共免疫沈降
材料および方法（iv）に記載したように、ＨＡエピトープと融合したクローン９、10および15のいずれかのＯＲＦを含んだ構築物とｐＵＨＤ10−３にもとづく発現ベクター中のＦＬＡＧで標識したＴＲＡＦ２でＨｅＬａ-Bujard細胞をトランスフェトした。細胞はそののち35Ｓ−メチオンニンと35Ｓ−システインを加えた10％仔ウシ血清添加ダルベッコの改良イーグル培養液（ＤＭＥＭ）で24時間増殖させた。培養時間の終わりに、放射免疫沈降緩衝液（10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ7.5、150mM ＮａＣｌ、１％  ノニデント（Nonident）Ｐ−40、１％  デオキシコラート（deoxycholate）、0.1％  ＳＤＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ml／５×105個）中で細胞溶解させ、溶解物を無関係のウサギ抗血清とプロテイン  Ｇ−セファロースビーズ（ファルマシア社、スェーデン）とのインキュベーションにより前処理（precleared）した。免疫沈降は、抗ＦLＡＧ（イーストマンコダック社より購入）または抗ＨＡ（クローン１２CA5  Field，J.ら（1988））モノクローナル抗体と溶解物のアリコートとを４℃で１時間インキュベートすることで行った。発現したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのあと、オートラジオグラフィーで分析した。
このような実験の結果により、部分的なｃＤＮＡクローン９、10および15がそれぞれ分子量およそ50〜65、45および26kDaのタンパク質をコードしていたことが証明された。
クローン15とＴＲＡＦ２との相互作用は検知できなかったが、全長のＮＩＫと同様のクローン９および10（ＮＩＫ）がコードするタンパク質はＴＲＡＦ２タンパク質と共免疫沈降した。ＴＲＡＦ２とこれら２つのクローンのどちらかひとつとコトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧまたは抗ＨＡ抗体のどちらかで免疫沈降し、のちに、前述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した細胞のサンプルは、それぞれのレーンで３つのバンド、すなわちクローン９または10のいずれかがコードするタンパク質に対応する１つのバンドと、ＴＲＡＦ２タンパク質に対応する４２および４４ｋＤａの１対の残り２つのバンドを示した。
実施例４：機能試験
ゲルシフト分析により、ＮＩＫはＮＦ−κＢを誘発することがわかった。典型的にはｐｃＤＮＡ３中のクローン10（10μｇ）（図７、レーン1）、ｐ75ＴＮＦ受容体のｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３（３μｇ）（図７、レーン３）または図７のレーン２のクローン10（10μｇ）およびｐ75ＴＮＦ受容体（３μｇ）の両方のいずれかで0.5〜１×106の293ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクトした。トランスフェクションのそれぞれでは、トランスフェクトされるＤＮＡの全量は、「空の（empty）」ｐｃＤＮＡ３ベクターを含み15μｇとした。対照として、15μｇのｐｃＤＮＡ３ベクター単独でトランスフェクトした293ＥＢＮＡ細胞を用いた（図７、レーン４）。細胞を10％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭで24時間増殖させたのちSchreiberら（Schreiber，E．ら（1989）によって回収し処理した。サンプルを５％ポリアクリルアミドゲルにかけた。プローブとしてＮＦ−κＢ結合サイトに対応する32Pで放射標識したオリゴヌクレオチドのセットを使って、ＮＦ−κＢをモニターした（プローブはＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴとＣＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣＡＡＴＧＧであった）。
表IVに示すように、ＮＩＫはＴＲＡＦ−２に比べてよりいっそう効果的にＮＦ−κＢを誘発した。一方、クローン10はこの効果を全く示さなかった。
レポーター遺伝子アッセイは以下のように行った。
293ＥＢＮＡ細胞をルシフェラーゼレポーター遺伝子と連結しているＨＩＶ  ＬＴＲを含むｐｃＤＮＡ３ベクターと、ｐ７５ＴＮＦ受容体のｃＤＮＡを単独で含むｐｃＤＮＡ３プラスミド、クローン１０ｃＤＮＡを単独で含むｐｃＤＮＡ３プラスミド、または表IVとＶにあげたｐｃＤＮＡ３プラスミドとｐ７５ＴＮＦ受容体のｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３プラスミドのいずれかとともにコトランスフェクトした。
表Ｖに示された結果は、
ａ）クローン10のトランスフェクションはＮＦ−κＢ誘発を活性化しないが、ＮＩＫは強く活性化したこと、ｂ）クローン10は活性サイトのリシンをアラニンに置換したＮＩＫ（ＮＩＫ*）と同様に、表IVの第１列に示したｃＤＮＡによるＮＦ−κＢ誘発を強く阻害したことを示している。
ＮＩＫの３′ＵＴＲの欠失（ＮＩＫ−３′ＵＴＲ）により、その発現は非常に増大し、その結果として、変異型において発現した場合、ＮＦ−κＢ誘発を妨げる能力も非常に増大した。
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実施例５：ＮＩＫの付加的な特徴
前記実施例２の特異性試験に加えて、さらにＮＩＫの結合特性についてのツーハイブリッド試験により、初期に単離されたＮＩＫの部分的なクローン（ＮＩＫ624〜947）はＴＲＡＦ２のＣ末端領域（Ｃ−ＴＲＡＦドメイン）と特異的に結合するが、対照的に、全長のＮＩＫはＣ−ＴＲＡＦドメインとその領域の上流（Ｎ−ＴＲＡＦドメイン）の両方と結合することが明らかになった。また、ＮＩＫはＴＲＡＦ３とは結合しない。さらに、ＴＲＡＦ２のＣ−ＴＲＡＦドメインとＴＲＡＦ３のＮ末端部分を含むキメラ分子は、部分的なＮＩＫ分子（ＮＩＫ624〜947）と結合できるが、全長のＮＩＫとは結合できず、ＴＲＡＦ２との全長のＮＩＫの結合にはＴＲＡＦ２のＣ−ＴＲＡＦドメインとＮ−ＴＲＡＦドメインの両方が必要であることが示される。
そのうえ、ＮＩＫは自己会合せず、またｐ55およびｐ75のＴＮＦ受容体、ＣＤ40受容体（ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの１つ）およびＦＡＳ／ＡＰＯ１（ＣＤ95受容体）の細胞内ドメインとも結合しない。ＮＩＫもまた、これらの受容体と結合する細胞内タンパク質、たとえば、ＴＲＡＤＤ、ＭＯＲＴ１およびＲＩＰなどと結合しない。これらの結果は、クローン９、10および15がコードするタンパク質の結合特異性に関する先に示した表IIに示した結果とに関連する。種々の受容体とタンパク質との種々の相互作用は図２ａと２ｂに概略的に示しているが、図２ｂがより完全に示している。
ノーザンブロット分析により、種々の組織で異なるレベルで発現するＮＩＫの単一の転写物が存在し、その転写物はクローニングしたＮＩＫｃＤＮＡと本質的に同じであるおよそ5000ヌクレオチドの大きさであることが明らかになった（前述のように、図６参照）。
さらに、クローン10がコードするタンパク質（当初ＮＭＰＩと称した）について先に述べたように、全長のＮＩＫタンパク質もまた、図７に示した配列アラインメントから生じるような、いくつかのＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）と同様のセリン／トレオニンタンパク質キナーゼモチーフを有している。
ＮＩＫキナーゼ活性のin vitroでの試験により、ＮＩＫは自己リン酸化することができるが、活性サイトのリシンおよび隣接するリシンをアラニンに置換すると自己リン酸化できない（ＮＩＫ類似体またはＮＩＫ  ＫＫ429−430ＡＡと称する突然変異タンパク質、429位および430位のリシンがアラニンに置換していることを示す）ことが明らかになった。これもまた実施例４で述べた前記結果に関連しており、ＮＩＫ*突然変異タンパク質について表IVに示している。
前記のように、293ＥＢＮＡ細胞内でのＮＩＫの過剰発現はＴＲＡＦ２の過剰発現よりいっそう大きな程度までＮＦ−κＢを誘発したが、部分的なＮＩＫ（ＮＩＫ624〜947）の過剰発現ではＮＦ−κＢ活性化はもたらされなかった。加えて、前述のＮＩＫ類似体／突然変異タンパク質であるＮＩＫ ＫＫ429−430ＡＡもまた、これらの細胞内で過剰発現してもＮＦ−κＢ活性化をもたらさなかった。このようにＮＩＫによるＮＦ−κＢの誘発は、ＮＩＫの完全なキナーゼ機能による。対照的に、キナーゼドメインをも有するＲＩＰ（図２ａ、ｂ参照）は、そのキナーゼ活性を変異によって完全に破壊してもなおＮＦ−κＢ活性化を誘発することができる。
ＮＩＫの過剰発現によるＮＦ−κＢの活性化はＴＮＦで細胞を処理することによって生じるものと区別できず、ＴＮＦまたはＴＲＡＦ２の過剰発現の場合、ＮＩＫで活性化されたＮＦ−κＢの主な成分はｐ50とｐ65であった。ＮＩＫ過剰発現によってＩκＢαの分解が起こり、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシノール（ＡＬＬＮ）でこの分解をブロックすると（ＴＮＦの場合と同様に）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでより遅く移動するＩκＢ分子の集積が起きる。このことはＩκＢαがリン酸化されたことを示す。
他の試験で、ｐ55およびｐ75ＴＮＦ受容体の過剰発現またはｐ55ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインをＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体の細胞内ドメインと置換したｐ55ＴＮＦ受容体の過剰発現によるのと同様に、ＴＮＦにより293−ＥＢＮＡ細胞でＮＦ−κＢを活性化することができることが明らかになった。ＮＦ−κＢはＴＲＡＦ２、ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰあるいはＭＯＲＴ１の過剰発現によっても活性化することができるが、ＭＯＲＴ１の「デスドメイン」の領域上流を欠くＭＯＲＴ１欠失変異体によっては活性化できない。前述のように、ＮＩＫ突然変異タンパク質ＮＩＫ ＫＫ429−430ＡＡや部分的ＮＩＫ（ＮＩＫ624〜947）ではなく全長のＮＩＫがＮＦ−κＢの活性化を誘発する。さらに、他の前述した因子、すなわち、受容体または結合タンパク質のいずれかとともに293−ＥＢＮＡ細胞でＮＩＫ ＫＫ429−430ＡＡ突然変異タンパク質またはＮＩＫ624〜947の発現により、これら因子のすべてによりＮＦ−κＢの活性化の誘発がブロックされ、ＮＩＫ活性は直接的にこのＮＦ−κＢの誘発にかかわっていることが示された。同様に、先にみられた不活性なＮＩＫ分子による阻害はより少ないＩκＢの分解（reduction）に関連している。
ＮＦ−κＢはＩＬ−１によっても活性化される（図２ｂ概略参照）。この効果は明らかにＴＲＡＦ２とは独立している（ＩＬ−１はＴＲＡＦ２とは結合しないし、ＩＬ−１の効果はＴＲＡＦ２のドミナントネガティブ変異体によって遮断されない）。しかしながら、このＩＬ−１の効果はＮＩＫ変異体の発現によって阻害される。加えて、293−ＥＢＮＡ細胞におけるｐ65 Ｒｅｌ相同体（homolgoue）の過剰発現によってみられるＮＦ−κＢ活性がキナーゼ欠損ＮＩＫ変異体の共発現により影響を受けない。このことは、ＮＩＫは直接的Ｒｅｌタンパク質の機能に影響を与えないが、これら受容体が誘発する活性化に関与する。
ＴＮＦの細胞傷害性活性（ＭＯＲＴ１関連プロテアーゼＭＡＣＨによって明らかに仲介される、図２ｂ参照）はいくつかのＮＦ−κＢを誘発し得る遺伝子による負の調節を受ける。ＮＦ−κＢに仲介される遺伝子の誘発とＭＡＣＨの活性化の拮抗する結果は、ＩＬ−１と同様にＴＮＦ自身がなぜＴＮＦ細胞傷害性に対して細胞の抵抗性を誘発し得るかを説明するかもしれない。これに一致して、293−ＥＢＮＡ細胞でのＮＩＫのドミナントネガティブ変異体の発現が、ＴＮＦによる細胞傷害に対する感受性を有意に高めること、および天然の（全長、野生型）ＮＩＫの過剰発現がＴＮＦによるまたはｐ55ＴＮＦ受容体（この受容体は、細胞で発現した場合に、いかなるＴＮＦも存在しなければ、自身の細胞で細胞傷害性を誘発し得る、「デスドメイン」を含む細胞内ドメインを有する。先に言及した本発明者の文献と同一出願人、同時係属中の出願参照）の過剰発現による細胞傷害を阻害したことも本発明にしたがってわかった。
実施例６：ＮＩＫの生物活性に関するさらなる機能試験
本発明にしたがって、（i）周知の細菌の内毒素、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、（ii）既知のタンパク質キナーゼＣアクチベータである周知のフォルボルミリステートアセテート、および（iii）ＨＴＬＶ−１タンパク質ＴＡＸを含む他の誘発因子による２９３−ＥＢＮＡ細胞でのＮＦ−κＢ活性化の誘発はＮＩＫのドミナントネガティブ変異体の発現により遮断されることができる、ということもわかった。
さらに、293−ＥＢＮＡ細胞でのＮＩＫのドミナントネガティブ変異体の発現は、ＪｕｎキナーゼのＴＮＦにより誘発される活性化には本質的に影響を与えないことがわかった。このことは、Ｊｕｎのリン酸化に関与するＭＡＰキナーゼに影響を与えずにＩκＢのリン酸化を増大するように、ＮＩＫが特異的におそらくは直接的な方法で作用することを示す。
前記のすべての観点から、ＮＩＫのキナーゼ活性が、ＮＦ−κＢの活性化に関与し、２つのＴＮＦ受容体、ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体およびＩＬ−１受容体に共通する、シグナリングカスケードの一部分であることがわかった。ＮＩＫはこのカスケードで特異的な役割をになうように思われる。ＴＲＡＦ２とのＮＩＫの結合は、ＴＮＦ受容体とＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体の両方によりＮＩＫが影響され得るようにはたらくかもしれない。ＭＡＰキナーゼカスケードとの類似性により、ＮＩＫがリン酸化されると、それが他のキナーゼをリン酸化し活性化する（またはＩκＢの直接的リン酸化により直接ＮＦ−κＢの活性化を誘発するかもしれない）ので、ＮＩＫは、ＴＲＡＦ２により刺激された受容体に補充されるキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫＫ）の基質として役立ち得る。ＩＬ−１で誘導されるＮＦ−κＢ活性化はＴＲＡＦ２とは独立しており、ゆえにＩＬ−１受容体によるＮＩＫの活性化は刺激後にＩＬ−１受容体に補充されるセリン／トレオニンキナーゼである他のタンパク質ＩＲＡＫ（Caoら、1996b）により、また、ＩＲＡＫに結合するＴＲＡＦ６（Caoら、1996a、に加えて図２ｂ概略参照）により仲介され得る。前述のように、ＮＩＫの標的、あるいはそれにより活性化されるキナーゼのカスケードの標的は、ＩκＢであろう。ＮＩＫはＴＲＡＦタンパク質または他のタンパク質に結合するサイトを作る、ＴＲＡＦタンパク質に結合する調節タンパク質、たとえばＴＡＮＫ−Ｉ／ＴＲＡＦ（ChengおよびBaltimore、1996、Rotheら、1996参照）もリン酸化することができる。
参考文献
0004180114.tif 000008
0004180114.tif 000009
0004180114.tif 000010
配列表
(1)一般情報：
(i)出願人：
(A)名称：イエダ  リサーチ  アンド  ディベロップメント  カンパニー  リミテッド
(B)街路：ワイツマン  インスティチュート  オブ  サイアンス
(C)都市：ピーオービー  95
(D)州：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号(ZIP)：76100
(G)電話：+972-8-9344093
(H)ファクシミリ：+972-8-9470739
(A)氏名：デビッド  ワラク
(B)街路：ボロチョフ  ストリート  24
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号(ZIP)：76406
(A)氏名：ニコライ  マリニン
(B)街路：ワイツマン  インスティチュート  オブ  サイアンス、ベイト  クローレ
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号(ZIP)：76100
(A)氏名：マーク  ボルディン
(B)街路：ワイツマン  インスティチュート  オブ  サイアンス、ベイト  クローレ
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号(ZIP)：76100
(A)氏名：アンドレイ  コバレンコ
(B)街路：ワイツマン  インスティチュート  オブ  サイアンス、ベイト  クローレ
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号(ZIP)：76100
(A)氏名：イゴール  メト
(B)街路：レビン  エプステイン  ストリート  60
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号(ZIP)：76462
(ii)発明の名称：ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）のモジュレーター、その製造法および使用
(iii)配列の数：１１
(iv)機械読取り可能形式：
(A)媒体の形式：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパティブル（compatible）
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、バージョン#1.30(EPO)
(v)現行の出願データ：
出願番号：ＰＣＴ／ＩＬ９７／００１１７
(vi)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国  117800
(B)出願日：1996年４月２日
(vi)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国  119133
(B)出願日：1996年８月26日
(2)配列番号１に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1906塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号１：
0004180114.tif 000011
(2)配列番号２に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：604アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２：
0004180114.tif 000012
0004180114.tif 000013
(2)配列番号３に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：2631塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号３：
0004180114.tif 000014
0004180114.tif 000015
(2)配列番号４に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1253塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号４：
0004180114.tif 000016
(2)配列番号５に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：417アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号５：
0004180114.tif 000017
0004180114.tif 000018
(2)配列番号６に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：4596塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号６：
0004180114.tif 000019
0004180114.tif 000020
0004180114.tif 000021
0004180114.tif 000022
(2)配列番号７に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：947アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号７：
0004180114.tif 000023
0004180114.tif 000024
0004180114.tif 000025
0004180114.tif 000026
(2)配列番号８に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：30塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)記載：／desc＝「オリゴヌクレオチドPCRプライマー」
(xi)配列：配列番号８：
0004180114.tif 000027
(2)配列番号９に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)記載：／desc＝「オリゴヌクレオチドPCRプライマー」
(xi)配列：配列番号９：
0004180114.tif 000028
(2)配列番号10に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)記載：／desc＝「オリゴヌクレオチドプローブ」
(xi)配列：配列番号10：
0004180114.tif 000029
(2)配列番号11に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)記載：／desc＝「オリゴヌクレオチドプローブ」
(xi)配列：配列番号11：
0004180114.tif 000030
【図１】
0004180114.tif 000031
【図２Ａ】
0004180114.tif 000032
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0004180114.tif 000035
【図３Ｃ】
0004180114.tif 000036
【図３Ｄ】
0004180114.tif 000037
【図４Ａ】
0004180114.tif 000038
【図４Ｂ】
0004180114.tif 000039
【図５Ａ】
0004180114.tif 000040
【図５Ｂ】
0004180114.tif 000041
【図６Ａ】
0004180114.tif 000042
【図６Ｂ】
0004180114.tif 000043
【図６Ｃ】
0004180114.tif 000044
【図６Ｄ】
0004180114.tif 000045
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図７Ｎ】
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【図７Ｏ】
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【図７Ｐ】
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【図７Ｑ】
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【図７Ｒ】
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【図７Ｓ】
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【図７Ｔ】
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【図７Ｕ】
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【図７Ｖ】
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【図７Ｗ】
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【図７Ｘ】
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【図７Ｙ】
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【図７Ｚ】
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【図７ＡＡ】
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【図７ＢＢ】
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