(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンリガーゼ活性を特定の標的タンパク質の非存在下でアッセイする方法であって、
ａ）ユビキチンリガーゼ活性に有利な条件下で、
ｉ）タグ１−ユビキチン；
ｉｉ）Ｅ１；
ｉｉｉ）Ｅ２；および
ｉｖ）タグ２−Ｅ３
を合わせること、
ｂ）該タグ２−Ｅ３に結合したタグ１−ユビキチンの量を測定すること、
を含む方法。
【請求項２】
ａ）ｖ）候補のユビキチンリガーゼ調整因子
を合わせること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｅ２が、Ｕｂｃ５、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４およびＵｂｃＸからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｅ３がＲＩＮＧフィンガータンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質が、ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｅ３がキュリン（Cullin）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該キュリンが、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｅ３が、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せが、ＡＰＣ２／ＡＰＣ１１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２およびＲＯＣ２／ＣＵＬ５からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
タグ１が、標識または結合対のパートナーである、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該タグ１標識が蛍光標識である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該測定が発光を測定することによる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該タグ１の結合対のパートナーが、抗原、ビオチン、およびＣＢＰからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
該タグ１の結合対のパートナーが、間接標識により標識される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該間接標識が、蛍光標識または標識酵素を用いるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該測定が発光を測定することによる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該標識酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
該標識酵素を、蛍光生成物を産生する標識酵素基質と反応させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該測定が発光を測定することによる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該抗原がＦＬＡＧである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
該結合対のパートナーがＦＬＡＧであり、かつ該間接標識が抗ＦＬＡＧを介するものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
該タグ１がＦＬＡＧである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
該タグ１がＦＬＡＧである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
該タグ２が表面基質結合分子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
該タグ２の表面基質結合分子がＨｉｓ−タグである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該アッセイを、ニッケルを含む表面基質を含むマルチウェルプレート中で実施する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ａ）ｖ）タグ３−ユビキチン
を合わせること、
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
タグ３が、タグ１とのＦＲＥＴ対の第２メンバーであるか、またはタグ１のクエンチ剤（quencher）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該測定が蛍光放射を測定することによる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該測定が蛍光放射スペクトルを測定することによる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該測定された蛍光放射スペクトルを、結合していないタグ３−およびタグ１−ユビキチンの蛍光放射スペクトルと比較することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該測定が、期間に渡って継続的であるか、またはタグ１−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびタグ２−Ｅ３を合わせることに続く特定の時点である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ユビキチン化調整因子を特定の標的タンパク質の非存在下で同定する方法であって、
ａ）ユビキチン化活性に有利な条件下で、
Ｉ）タグ１−ユビキチン；
ｉｉ）候補の調整因子；
ｉｉｉ）Ｅ１；
ｉｖ）Ｅ２；および
ｖ）タグ２−Ｅ３
を合わせること、
ｂ）該タグ２−Ｅ３に結合したタグ１−ユビキチンの量を測定すること、
を含む方法。
【請求項３４】
Ｅ２が、Ｕｂｃ５、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４およびＵｂｃＸからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｅ３がＲＩＮＧフィンガータンパク質を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質が、ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｅ３がキュリンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
該キュリンが、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｅ３が、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せが、ＡＰＣ２／ＡＰＣ１１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２およびＲＯＣ２／ＣＵＬ５からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ｃ）ユビキチン化活性に有利な条件下で、
ｉ）タグ１−ユビキチン；
ｉｉ）候補の調整因子
ｉｉｉ）Ｅ１；および
ｉｖ）タグ３−Ｅ２；
を合わせること、
ｄ）該タグ３−Ｅ２に結合したタグ１−ユビキチンの量を測定すること、
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
タグ１が、標識または結合対のパートナーである、請求項３３ないし請求項４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
該タグ１標識が蛍光標識である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該測定が発光を測定することによる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
該タグ１の結合対のパートナーが、抗原、ビオチン、およびＣＢＰからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
該タグ１の結合のパートナーが、間接標識により標識される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該間接標識が、蛍光標識または標識酵素を用いるものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該測定が発光を測定することによる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該標識酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
該標識酵素を、蛍光生成物を産生する標識酵素基質と反応させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該測定が発光を測定することによる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
該抗原がＦＬＡＧである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
該タグ１の結合対のパートナーがＦＬＡＧである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
該タグ１の結合対のパートナーがＦＬＡＧであり、かつ該間接標識が抗ＦＬＡＧを介するものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
該タグ１がＦＬＡＧである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
該タグ２が表面基質結合分子である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
該表面基質結合分子がＨｉｓ−タグである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
タグ１−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびタグ２−Ｅ３を合わせること、および測定を、ニッケルを含む表面基質を含むマルチウェルプレート中で実施する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
該タグ３が表面基質結合分子である、請求項４２に記載の方法。
【請求項６０】
該表面基質結合分子が、Ｈｉｓ−タグおよびＧＳＴ−タグからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ユビキチン化酵素活性を特定の標的タンパク質の非存在下でアッセイする方法であって、
ａ）ユビキチン化活性に有利な条件下で、
ｉ）タグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチン、但し、タグ１とタグ２がＦＲＥＴ対を構成するか、またはタグ１が蛍光標識であり、かつタグ２がタグ１のクエンチ剤である；
ｉｉ）Ｅ１；
ｉｉｉ）Ｅ２；および
ｉｖ）Ｅ３；
を合わせること、
ｂ）ユビキチン化の量または速度を測定すること、
を含む方法。
【請求項６２】
ａ）ユビキチン化活性に有利な条件下で、
ｖ）候補のユビキチン化調整因子
を合わせること、
をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ｅ２が、Ｕｂｃ５、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４およびＵｂｃＸからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
Ｅ３がＲＩＮＧフィンガータンパク質を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質が、ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
Ｅ３がキュリンを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
該キュリンが、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ｅ３が、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せが、ＡＰＣ２／ＡＰＣ１１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２およびＲＯＣ２／ＣＵＬ５からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該測定が蛍光放射スペクトルを測定することによる、請求項６１ないし請求項６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
該測定が、期間に渡って継続的であるか、またはタグ１−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびタグ２−Ｅ３を合わせることに続く特定の時点である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
該測定された蛍光放射スペクトルを、結合していないタグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチンの蛍光放射スペクトルと比較することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
該ユビキチンがタグ１,３−ユビキチンおよびタグ２,３−ユビキチンの形態であり、タグ３が結合対のメンバーである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
タグ３がＦＬＡＧである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
該Ｅ３がタグ４−Ｅ３の形態であり、タグ４が表面基質結合分子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
ユビキチン化調整因子を特定の標的タンパク質の非存在下で同定する方法であって、
ａ）ユビキチン化活性に有利な条件下で、
ｉ）タグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチン、但し、タグ１とタグ２がＦＲＥＴ対を構成するか、またはタグ１が蛍光標識であり、かつタグ２がタグ１のクエンチ剤である；
ｉｉ）Ｅ１；
ｉｉｉ）Ｅ２；
ｉｖ）Ｅ３；および
ｖ）候補のユビキチン化調整因子
を合わせること、
ｂ）ユビキチン化の量または速度を測定すること、
を含む方法。
【請求項７７】
Ｅ２が、Ｕｂｃ５、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４およびＵｂｃＸからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
Ｅ３がＲＩＮＧフィンガータンパク質を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質が、ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
Ｅ３がキュリンを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
該キュリンが、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
Ｅ３が、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せが、ＡＰＣ２／ＡＰＣ１１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２およびＲＯＣ２／ＣＵＬ５からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
該測定が蛍光放射スペクトルを測定することによる、請求項７６ないし請求項８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
該測定が、期間に渡って継続的であるか、またはタグ１−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびタグ２−Ｅ３を合わせることに続く特定の時点である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
該測定された蛍光放射スペクトルを、結合していないタグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチンの蛍光放射スペクトルと比較することをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
該ユビキチンがタグ１,３−ユビキチンおよびタグ２,３−ユビキチンの形態であり、タグ３が結合対のメンバーである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
タグ３がＦＬＡＧである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
該Ｅ３がタグ４−Ｅ３の形態であり、タグ４が表面基質結合分子である、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
タグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチン、但し、タグ１は蛍光標識であり、かつタグ２はタグ１とのＦＲＥＴ対の第２メンバーであるか、またはタグ２はタグ１のクエンチ剤である、
を含み、特定の標的タンパク質を含まない、ユビキチン化のアッセイで使用するための組成物。
【請求項９１】
Ｅ１、Ｅ２およびＥ３をさらに含む、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
該Ｅ２が、Ｕｂｃ５、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４およびＵｂｃＸからなる群から選択される、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
Ｅ３がＲＩＮＧフィンガータンパク質を含む、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９４】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質が、ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１からなる群から選択される、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
Ｅ３がキュリンを含む、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９６】
該キュリンが、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２からなる群から選択される、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
Ｅ３が、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せを含む、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９８】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せが、ＡＰＣ２／ＡＰＣ１１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２およびＲＯＣ２／ＣＵＬ５からなる群から選択される、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
候補のユビキチン化調整因子をさらに含む、請求項９１ないし請求項９８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１００】
候補のユビキチン化調整因子およびタグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチン、但し、タグ１は蛍光標識であり、かつタグ２はタグ１とのＦＲＥＴ対の第２メンバーであるか、またはタグ２はタグ１のクエンチ剤である、
を含み、特定の標的タンパク質を含まない、ユビキチン化調整因子のアッセイで使用するための組成物。
【請求項１０１】
Ｅ１、Ｅ２およびＥ３をさらに含む、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
該Ｅ２が、Ｕｂｃ５、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４およびＵｂｃＸからなる群から選択される、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
Ｅ３がＲＩＮＧフィンガータンパク質を含む、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０４】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質が、ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１からなる群から選択される、請求項１０３に記載の組成物。
【請求項１０５】
Ｅ３がキュリンを含む、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０６】
該キュリンが、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２からなる群から選択される、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
Ｅ３が、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せを含む、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０８】
該ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せが、ＡＰＣ２／ＡＰＣ１１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２およびＲＯＣ２／ＣＵＬ５からなる群から選択される、請求項１０７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はユビキチン化酵素の活性を測定するためのアッセイを対象としている。本発明は、ユビキチン化の調整因子を同定するためのアッセイも対象としている。
【０００２】
発明の背景
ユビキチンは、全真核細胞で発現される、高度に保存された７６アミノ酸のタンパク質である。多くの細胞内タンパク質のレベルは、ユビキチン依存性タンパク質分解プロセスによって調節されている。このプロセスには、標的タンパク質への共有結合によるユビキチンのライゲーションが含まれ、ポリユビキチン化された標的タンパク質を生じ、それは２６Ｓプロテオソームによって迅速に検出および分解される。
【０００３】
これらのタンパク質のユビキチン化は、酵素活性のカスケードによって媒介される。ユビキチンは最初にＡＴＰ依存的様式でユビキチン活性化酵素（Ｅ１）によって活性化される。ユビキチンのＣ末端は、Ｅ１と高エネルギーチオエステル結合を形成する。次いでユビキチンはユビキチン接着（conjugating）酵素（Ｅ２；ユビキチン運搬タンパク質とも呼ばれる）に渡され、この第２の酵素ともチオエステル結合を介して連結される。ユビキチンは最後にその標的タンパク質に連結され、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の誘導下で末端イソペプチド結合を形成する。このプロセスで、Ｅ３の活性によって各々が次のユビキチンに共有結合でライゲーションされたユビキチンの鎖が、標的タンパク質上に形成される。
【０００４】
ユビキチンライゲーションカスケードの成分は、かなりの注目を受けてきた（概説には、Weissman, Nature Reviews 2 : 169-178 (2001) を参照されたい）。Ｅ１およびＥ２は、構造的に関連があり、十分に特徴を明らかにされた酵素である。Ｅ２にはいくつかの種（哺乳動物では少なくとも２５種）があり、それらのいくつかが特定のＥ３酵素と好ましい対で作用し、異なる標的タンパク質への特異性をもたらす。Ｅ２の名称は種間で標準化されていないが、当分野の研究者はこの問題に取り組んできて、当業者は様々なＥ２タンパク質並びに種の相同体をを容易に同定できる（Haas and Siepmann, FASEB J. 11 : 1257-1268 (1997) 参照）。
【０００５】
Ｅ３酵素は、２種の別個の活性を有する：ユビキチンを基質に接着させ、イソペプチド結合を介してポリユビキチン鎖を形成させるユビキチンリガーゼ活性と、リガーゼと基質を物理的に一緒にする標的化活性である。異なるＥ３酵素の基質特異性は、ユビキチン依存性タンパク質分解プロセスの選択性の主な決定要素である。
【０００６】
いくつかのＥ３ユビキチンリガーゼは、リガーゼ活性を担う単一のサブユニットを有することが知られている。特徴を明らかにされたそのようなＥ３リガーゼには、ＨＥＣＴ（Ｅ６−ＡＰカルボキシ末端相同）ドメインタンパク質が含まれ、その代表例は、腫瘍抑制因子ｐ５３のユビキチンリガーゼとして機能し、子宮頸癌中の乳頭腫ウイルスによって活性化される、哺乳動物Ｅ６ＡＰ−Ｅ６複合体である（Huang et al., Science 286 : 1321-26 (1999)）。ＲＩＮＧドメインを有する単一サブユニットのユビキチンリガーゼには、Ｍｄｍ２が含まれ、それはＭｄｍ２自体、並びにｐ５３のユビキチンリガーゼとして作用することも示された。他のＲＩＮＧドメイン、単一サブユニットのＥ３リガーゼには、ＩＫＫ活性化に関連するＴＲＡＦ６；インシュリンおよびＥＧＦを標的とするＣｂｌ；ＤＣＣを標的とするＳｉｎａ／Ｓｉａｈ；造血（Ｂ、Ｔおよびマスト細胞）に関連するＩｔｃｈｙ；およびアポトーシス阻害因子に関連するＩＡＰが含まれる。
【０００７】
最もよく特徴を明らかにされたＥ３リガーゼは、ＡＰＣ（後期促進複合体）であり、それは後期への進行並びに有糸分裂からの脱出の両方に必要とされる、マルチサブユニットの複合体である（概説には、King et al., Science 274 : 1652-59 (1996) を参照)。ＡＰＣは、多数のタンパク質のユビキチン依存性タンパク質分解を促進することによって、細胞の後期を通る通過の調節において、非常に重要な役割を演じる。ＣＤＣ２キナーゼ活性を不活性化するための有糸分裂のＢ型サイクリンの分解に加えて、ＡＰＣは、姉妹染色体の分離および紡錘体の脱凝集のための他のタンパク質の分解にも必要とされる。ＡＰＣによって分解されることが知られているタンパク質の大部分は、それらをユビキチン化および続く分解へ標的化する「破壊ボックス」として知られる、保存された９アミノ酸モチーフを含有する。しかし、Ｇ１サイクリン、ＣＤＫ阻害因子、転写因子およびシグナル伝達媒介物を含むＧ１期中に分解されるタンパク質は、この保存されたアミノ酸モチーフを含有しない。代りに、基質のリン酸化が、ユビキチン化のためのＥ３リガーゼとの相互作用へ標的化する際に、重要な役割を演じていると考えられる（Hershko et al., Ann. Rev. Biochem. 67 : 429-75 (1998) 参照）。
【０００８】
真核生物では、Ｅ３リガーゼ活性を有する複合体のファミリーが、Ｇ１の進行の調節に重要な役割を演じている。ＳＣＦと呼ばれるこれらの複合体は、ＳＫＰ１、キュリン（Cullin）（少なくとも７個のファミリーのメンバーがある）、および基質に直接結合してＥ３複合体に基質をリクルートする、Ｆボックスタンパク質（それには数百種が知られている）の、少なくとも３サブユニットからなる。ＳＣＦと最近発見されたＲＩＮＧフィンガータンパク質ファミリーであるＲＯＣ／ＡＰＣ１１タンパク質との間の組合せの相互作用が、Ｅ３タンパク質複合体にリガーゼ活性を与える鍵となる要素であると示されてきた。特定のＲＯＣ／キュリンの組合せが、例えば、有糸分裂における姉妹染色体分離のタンパク質分解制御および終期からＧ１への脱出に関連するＡＰＣ１１−ＡＰＣ２（King et al., supra ; Koepp et al., Cell 97 : 431-34 (1999) 参照）や、ＮＦ−κＢ／ＩκＢ媒介転写調節におけるＩκＢαのタンパク質分解に関連するＲＯＣ１−キュリン１（Tan et al., Mol. Cell 3 (4) : 527-533 (1999) ; Laney et al., Cell 97 : 427-30 (1999)）の機能などの、特定の細胞の経路を調節できる。
【０００９】
Ｅ３複合体は、ユビキチン依存性タンパク質分解プロセスによるタンパク質分解のための選択の主な決定因子であるので、Ｅ３リガーゼ活性の調整因子は、細胞のシグナル伝達に関連する特定の分子を上方調節または下方調節するのに使用され得る。特定の細胞反応を上昇または低下させるシグナル伝達因子のそのような上方または下方調節によって、疾病プロセスを処置できる。この原理は、気道疾患および血管機能不全のためのホスホジエステラーゼ阻害因子、悪性転換のためのキナーゼ阻害因子、関節炎のような炎症症状のためのプロテオソーム阻害因子など、数々の治療剤の設計に使用されてきた。
【００１０】
細胞の調節におけるユビキチン化の重要性と、ユビキチン依存性タンパク質分解の異なるあり得る成分の幅広いアレイのために、Ｅ３リガーゼ活性をアッセイするための速くて簡単な手段への必要性がある。さらに、そのようなアッセイは、Ｅ３リガーゼの調整因子の同定に非常に有用である。従って、ユビキチンリガーゼ活性をアッセイする方法を提供することが本発明の目的であり、その方法はさらにユビキチンリガーゼ活性の調整因子の同定に使用され得る。
【００１１】
関連分野の説明
前出の Tan et al. は、ＲＯＣ１／Ｃｕｌ１が、標的タンパク質基質の非存在下でユビキチンの多量体化を触媒することを開示している。Ohta et al., Mol. Cell 3 (4) : 535-541 (1999) は、ＡＰＣ１１／ＡＰＣ２も、標的タンパク質基質の非存在下でユビキチンの多量体化を触媒し、そしてこの活性は適切なＥ２種の包含に依存することを開示している。Rolfe et al., 米国特許第５,９６８,７６１号は、標的調節タンパク質のユビキチン化阻害因子を同定するためのアッセイを開示している。
【００１２】
発明の概要
本発明は、ユビキチンリガーゼ活性のアッセイ方法と、ユビキチンリガーゼ活性を調整する物質のスクリーニング方法を提供する。ある態様では、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を合わせる段階およびＥ３に結合したユビキチンの量を測定する段階を含む、ユビキチンリガーゼ活性のアッセイ方法が提供される。この方法は、合わせる段階で、候補のユビキチンリガーゼ調整因子を合わせることをさらに含み得る。この方法は、ユビキチン化される特定の標的タンパク質を必要としない。好ましい実施態様では、ユビキチン自体以外のユビキチン化基質タンパク質は、特異的に排除される。
【００１３】
上記のアッセイのある実施態様では、ユビキチンはタグ１−ユビキチン形態である。他の実施態様では、Ｅ３はタグ２−Ｅ３形態である。これらの実施態様では、タグ１は標識または結合対のパートナーであり得る。ある実施態様では、タグ１は蛍光標識であり、その場合、Ｅ３に結合したユビキチン量の測定は、発光の測定によるものであり得る。
【００１４】
他の実施態様では、タグ１は、抗原、ビオチンおよびＣＢＰの群から選択される結合対のメンバーである。この後者の実施態様では、結合対のパートナーを、蛍光標識または標識酵素によるものであり得る間接標識によって、標識してもよい。標識酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたはグルコースオキシダーゼであり得る。間接標識が蛍光標識によるものである場合、Ｅ３に結合したユビキチン量の測定は、発光の測定によるものであり得る。間接標識が標識酵素によるものである場合、蛍光生成物を産生する基質と該酵素を反応させてもよく、その場合、Ｅ３に結合したユビキチン量の測定は、発光の測定によるものであり得る。上記方法のある実施態様では、タグ１はＦＬＡＧ抗原である。この実施態様では、間接標識は抗ＦＬＡＧによるものであり得る。
【００１５】
上記方法のある態様では、タグ２は表面結合分子であり、それはＨｉｓタグであり得る。この後者の場合では、アッセイは、ニッケルを含む表面基質を含むマルチウェルプレート中で実施され得る。
【００１６】
上記方法の別の実施態様では、タグ１が蛍光標識である場合、合わせる段階は、さらにタグ３−ユビキチンを合わせることを含む。タグ３は、タグ１とのＦＲＥＴ対の第２メンバーであってもよく、またはタグ１のクエンチ剤（quencher）であってもよい。この実施態様では、Ｅ３に結合したユビキチン量の測定は、蛍光放射の測定によるものであり得、それには蛍光放射スペクトルの測定が含まれてもよい。この最後の実施態様では、方法は、測定された蛍光放射スペクトルを、結合していないタグ１−およびタグ３−ユビキチンの蛍光放射スペクトルと比較することをさらに含み得る。Ｅ３に結合したユビキチン量の測定が蛍光放射スペクトルの測定によるものである場合、この測定は継続的であるか、または最初に材料を合わせることに続く特定の時点であってもよい。
【００１７】
発明の他の態様では、ユビキチン化酵素調整因子の同定方法が提供される。この方法は、タグ１−ユビキチン、候補の調整因子、Ｅ１、Ｅ２およびタグ２−Ｅ３を合わせること、およびタグ２−Ｅ３に結合したタグ１−ユビキチンの量を測定することを含む。他の実施態様では、この方法は、タグ１−ユビキチン、候補の調整因子、Ｅ１およびタグ２−Ｅ２を合わせること、およびタグ２−Ｅ２に結合したタグ１−ユビキチンの量を測定することをさらに含む。好ましい実施態様では、標的タンパク質（即ち、ユビキチン自体以外の基質タンパク質）は、方法中で特異的に排除される。
【００１８】
ユビキチン化酵素調整因子の同定方法の実施態様では、タグ１は標識または結合対のパートナーであり得る。タグ１が標識ならば、それは蛍光標識であり得、その場合、結合したタグ１−ユビキチンの量の測定は、発光の測定によるものであり得る。タグ１が結合対のパートナーであるならば、可能性のある結合対パートナー、選択可能な標識、およびその後の選択可能な測定は、実質的にユビキチンリガーゼ活性のアッセイ方法でタグ１について上記した通りである。
【００１９】
ユビキチン化酵素調整因子の上記同定方法では、タグ２およびタグ３は表面基質結合分子であり得る。そのような分子の選択可能なものおよび方法を実施する条件は、ユビキチンリガーゼ活性のアッセイ方法について記載した通りである。
【００２０】
発明の他の態様では、ユビキチン化酵素活性のアッセイ方法が提供される。この方法は、ユビキチン化が起こり得る条件下に、タグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を合わせること、およびユビキチン化の量または速度を測定することを含む。この実施態様では、タグ１とタグ２はＦＲＥＴ対を構成するか、またはタグ１は蛍光標識で、タグ２はタグ１のクエンチ剤である。ある実施態様では、方法は、候補のユビキチン化調整因子を他の成分と合わせることを含む。この方法の好ましい実施態様では、測定は、好ましくは継続的に、または成分を合わせることに続く特定の時点で、組合せからの蛍光放射スペクトルを測定することによるものである。。これらの測定を、結合していないタグ１およびタグ２ユビキチンの蛍光放射スペクトルと比較し得る。
【００２１】
ユビキチン化調整因子の同定方法も、本発明で提供される。この方法は、ユビキチン化が起こり得る条件下に、候補のユビキチン化調整因子、タグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を合わせること、およびユビキチン化の量または速度を測定することを含む。この実施態様では、タグ１とタグ２はＦＲＥＴ対を構成するか、またはタグ１は蛍光標識で、タグ２はタグ１のクエンチ剤である。ある実施態様では、方法は、候補のユビキチン化調整因子を他の成分と合わせることを含む。この方法の好ましい実施態様では、測定は、好ましくは継続的に、または成分を合わせることに続く特定の時点で、組合せからの蛍光放射スペクトルを測定することによるものである。これらの測定を、結合していないタグ１およびタグ２ユビキチンの蛍光放射スペクトルと比較し得る。
【００２２】
記載した後者の２つのアッセイでは、ユビキチンはタグ１,３−ユビキチンおよびタグ２,３−ユビキチンの形態であり得、タグ３は結合対のメンバー、好ましくはＦＬＡＧである。これらのアッセイの他の実施態様では、Ｅ３はタグ４−Ｅ３の形態であり得、タグ４は表面基質結合分子である。
【００２３】
発明のさらに他の態様では、ユビキチン化のアッセイで使用するための組成物が提供される。組成物はタグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチンを含み、タグ１とタグ２はＦＲＥＴ対を構成するか、またはタグ１は蛍光標識で、タグ２はタグ１のクエンチ剤である。ある実施態様では、組成物はさらにＥ１、Ｅ２およびＥ３を含む。好ましい実施態様では、組成物はさらに候補のユビキチン化調整因子を含む。さらに他の実施態様では、組成物は標的タンパク質を含む。
【００２４】
さらに、本発明で提供されるものは、ユビキチン化調整因子のアッセイで使用するための組成物である。組成物は、候補のユビキチン化調整因子、タグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチンを含み、タグ１とタグ２はＦＲＥＴ対を構成するか、またはタグ１は蛍光標識で、タグ２はタグ１のクエンチ剤である。ある実施態様では、組成物はさらにＥ１、Ｅ２およびＥ３を含む。ある実施態様では、組成物は標的タンパク質を含む。
【００２５】
上記アッセイおよび組成物の好ましい実施態様では、Ｅ２は、Ｕｂｃ５、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４およびＵｂｃＸからなる群から選択される。好ましい実施態様では、Ｅ３は、好ましくはＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１からなる群から選択されるＲＩＮＧフィンガータンパク質を含む。好ましい実施態様では、Ｅ３は、好ましくはＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２からなる群から選択されるキュリンを含む。好ましい実施態様では、Ｅ３は、好ましくはＡＰＣ１１／ＡＰＣ２、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２およびＲＯＣ２／ＣＵＬ５からなる群から選択されるＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せを含む。
【００２６】
発明の他の態様は、以下の発明の説明から当業者に明らかになるであろう。
【００２７】
図面の簡単な説明
図１は、ユビキチン活性化および接着アッセイにおける、蛍光標識ユビキチンの相対量を示す。これらの実験では、Ｅ２は、Ｈｉｓ−Ｕｂｃｈ５ｃである。
【００２８】
図２は、ユビキチン化酵素の様々な組合せから生じる、ユビキチンリガーゼ活性の相対量を示す。これらの実験では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＲＯＣ１およびキュリンＣｕｌ１を含む。
【００２９】
図３は、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を合わせるアッセイにおける、相対的なユビキチンリガーゼ活性を示す。図３Ａは、ＤＭＳＯの存在下および非存在下で様々な量のＥ１を使用して、相対的なユビキチンリガーゼ活性を示す。図３Ｂは、様々な量のユビキチンおよびＥ３を使用して、相対的なユビキチンリガーゼ活性を示す。
【００３０】
図４は、Ｆｌａｇ−ユビキチンおよびＨＲＰに接着した抗Ｆｌａｇ／抗マウス抗体およびルミノール蛍光ＨＲＰ基質を利用するユビキチンリガーゼ活性のアッセイにおける、蛍光標識のシグナル対ノイズ比を示す。シグナルは、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を含み、Ｅ３が特異的に反応容器表面基板に結合している反応組成物から測定される。バックグラウンドは、Ｅ３の非存在下でアッセイを実施した後に存在する蛍光の量として測定される。
【００３１】
図５は、２つの異なるＥ３酵素を用いてユビキチンリガーゼ活性を測定するアッセイにおける、２つのユビキチンリガーゼ活性調整因子の濃度依存的効果を示す。図５Ａは、Ｅ３ユビキチンリガーゼの成分としてＲＯＣ１／Ｃｕｌ１またはＲＯＣ２／Ｃｕｌ５のいずれかを含むアッセイにおける、ユビキチンリガーゼ活性の濃度依存的減少を示す。図５Ｂは、他の調整因子について、わずかに異なるユビキチンリガーゼ活性の濃度依存的減少のパターンを示す。
【００３２】
図６は、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３の組合せおよび酵素Ｅ１およびＥ２の組合せについて、２つの候補のユビキチンリガーゼ酵素調整因子の存在下および非存在下での、ユビキチンリガーゼ活性およびユビキチン接着活性の割合を示す。図６Ａは、Ｅ３にのみ影響する候補のユビキチン化酵素調整因子を示す。図６Ｂは、Ｅ３以外の酵素に影響する候補のユビキチン化酵素調整因子を示す。
【００３３】
図７は、ユビキチンリガーゼ活性およびユビキチン接着活性に対する、２つの候補のユビキチンリガーゼ調整因子の濃度依存的効果を示す。図７Ａは、ユビキチンリガーゼ活性（Ｅ１＋Ｅ２＋Ｅ３）に対する濃度依存的効果を有するが、ユビキチン接着活性（Ｅ１＋Ｅ２）に対する濃度依存的効果は有さず、従ってＥ３リガーゼにのみ影響する、候補の調整因子についての結果を示す。図７Ｂは、ユビキチン接着活性とユビキチンリガーゼ活性の両方に対する濃度依存的効果を有し、従ってＥ３リガーゼ以外の成分に影響する、候補の調整因子についての結果を示す。
【００３４】
図８Ａおよび８Ｂは、ウサギＥ１をコードする核酸配列およびウサギＥ１のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
図９Ａおよび８Ｂは、Ｅ２のＵｂｃ５ｃをコードする核酸配列およびＥ２のＵｂｃ５ｃのアミノ酸配列をそれぞれ示す。
図１０は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＡＰＣ１１のアミノ酸配列を示す。
図１１は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＲＯＣ１のアミノ酸配列を示す。
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＲＯＣ２をコードする核酸配列およびＲＯＣ２のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００３５】
図１３Ａおよび１３Ｂは、キュリンＣＵＬ５をコードする核酸配列およびＣＵＬ５のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
図１４Ａおよび１４Ｂは、キュリンＡＰＣ２をコードする核酸配列およびＡＰＣ２のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、ヒトユビキチン、Ｆｌａｇ−ユビキチン、およびＦｌａｇ−Ｃｙｓ−ユビキチンのアミノ酸配列をそれぞれ示す。配列のＦｌａｇおよびＦｌａｇ−Ｃｙｓ部分を太字で示す。
【００３６】
図１６Ａおよび１６Ｂは、ＦＲＥＴ発蛍光団で標識されたＦｌａｇ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ユビキチンの、Ｅ３−ユビキチン複合体へのＥ３リガーゼ依存的組込みを示す。ＨＰＬＣによる分離は、遊離のユビキチンおよびＥ３リガーゼに付着したユビキチンからの放射を示す。トレースは、ＩＡＥＤＡＮＳの最適励起波長である３３６ｎｍでの励起下で、下記の波長での蛍光放射を示す。図１６Ａは、Ｅ１およびＥ２のみとの組合せに続く、ＩＡＥＤＡＮＳ（４９０ｎｍ；大きいピーク）およびフルオレセイン（５１５ｎｍ；小さいピーク）で標識されたユビキチンの蛍光シグナルを示す。遊離のユビキチンは、高速液体クロマトグラフィーを使用して分離された。図１６Ｂは、Ｅ１およびＥ２およびＥ３（Ｒｏｃ１／Ｃｕｌ１）との組合せに続く、ＩＡＥＤＡＮＳ（４９０ｎｍ；各抽出量での大きいピーク）およびフルオレセイン（５１５ｎｍ；各抽出量での小さいピーク）で標識されたユビキチンの蛍光シグナルを示す。破線はタンパク質溶液の光学濃度を示し（右に目盛）、タンパク質濃度が非常に低いにも関わらず、発蛍光団の感度が高いことを明らかにしている。
【００３７】
図１７は、３３６ｎｍでの励起下で、ＦＲＥＴ供与体／受容体対であるＥＤＡＮとフルオレセインで標識された遊離ユビキチンの蛍光放射スペクトルを示す。破線は、遊離の標識化ユビキチン（反応物）の放射スペクトルを示し、一方実線は、Ｅ３に結合した標識化ユビキチン（生成物）の放射スペクトルを示す。遊離ユビキチンと比較して大幅に増加したＥ３結合ユビキチンの５１５：４９０ｎｍの放射比は、このＦＲＥＴ供与体／受容体対のＥＤＡＮＳ供与体からフルオレセイン受容体へのエネルギー移行を示す。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、ユビキチンリガーゼ活性のアッセイ方法を対象としている。広範な実施態様では、方法は、反応が起こった場所で直接ユビキチンリガーゼ活性を測定することを提供し、かくして標的タンパク質と、ライゲーションしていない物質からライゲーションした物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分離するなどの、続く分析の必要性を未然に除去する。このことにより、ユビキチン化活性調整因子のマルチウェルアレイ分析および高処理量スクリーニング技法が可能になる。さらに、本方法は、特定標的基質の事前の同定を要さずに、多くの異なるＥ３成分の組合せおよびＥ２／Ｅ３の組合せの分析を可能にする。
【００３９】
一般に、方法はユビキチンおよびユビキチンライゲーション酵素を合わせること、およびユビキチン化基質タンパク質にライゲーションしたユビキチンの量を測定することを含む。好ましい実施態様では、ユビキチン化基質タンパク質はユビキチン自体であり、測定されるものは、リガーゼ反応で産生されたポリユビキチン鎖である。従って、本明細書で使用するとき、「ユビキチン化基質タンパク質」は、ユビキチン化酵素の活性によってユビキチンが結合するタンパク質を意味し、「ユビキチン化」およびその文法的均等物は、基質タンパク質にユビキチンが結合することを意味する。
【００４０】
好ましい実施態様では、ユビキチンリガーゼ活性を測定するために、いかなる特定の標的タンパク質も使用されない。本明細書で「標的タンパク質」は、ユビキチン化酵素によってユビキチンがライゲーションされる、ユビキチン以外のタンパク質を意味する。この実施態様では、好ましくは、測定されるポリユビキチン鎖は、Ｅ３に結合している。他の好ましい実施態様では、測定されるポリユビキチン鎖は、Ｅ３に結合していても、いなくてもよい。
【００４１】
好ましい実施態様では、Ｅ３は、マルチウェルプレートのウェルのような反応容器の表面に付着している。この実施態様は、ライゲーションしていないユビキチンからのライゲーションしたユビキチンの分離を促進する。Ｅ３を反応容器の表面に付着させる手段は、後述する。この実施態様によって、ユビキチンリガーゼ反応およびライゲーションしたユビキチンの検出および測定が同一の容器内で起こることが可能になり、アッセイを高処理量スクリーニング適用に有用にする。
【００４２】
他の好ましい実施態様では、Ｅ３は溶液中で遊離している。この実施態様では、ユビキチン化活性は、後に詳述する蛍光共鳴エネルギー移行（ＦＲＥＴ）システムのような、ユビキチン化の程度によって変化するシグナルを産生するシステムを使用してモニターされる。
【００４３】
好ましい実施態様では、後にさらに説明するように、ユビキチンは直接または間接に標識され、標識の量が測定される。このことは、ライゲーションしたユビキチンの容易かつ迅速な検出および測定を可能にし、アッセイを高処理量スクリーニング適用に有用にする。ある好ましい実施態様では、後述のＦＲＥＴシステムにおいてのように、標識のシグナルはユビキチン化の程度に伴って変化する。当業者は、ユビキチン化を調整する物質のスクリーニングへの本発明の適用可能性を認めるであろう。
【００４４】
従って、本発明は、ユビキチンリガーゼ活性をアッセイするための、方法および組成物を提供する。本明細書で「ユビキチン」は、ユビキチンリガーゼ酵素によって他のポリペプチドにライゲーションされるポリペプチドを意味する。ユビキチンは、いかなる生物種由来でもあり得、好ましくは真核生物種由来である。好ましくは、ユビキチンは哺乳動物のものである。より好ましくは、ユビキチンはヒトユビキチンである。最も好ましい実施態様では、ユビキチンは、図１５Ａに記載のアミノ酸配列を有する。
【００４５】
好ましい実施態様では、ユビキチンが標的タンパク質にライゲーションすると、そのタンパク質は２６Ｓプロテオソームによる分解の標的にされる。
【００４６】
発明の好ましい実施態様は、７６アミノ酸のヒトユビキチンを利用する。他の実施態様は、さらに後述するように、ユビキチンの変異体を利用する。
【００４７】
天然産性の対立遺伝子、およびそのような７６アミノ酸ポリペプチドの人工変異体も、「ユビキチン」に包含される。好ましい実施態様では、ユビキチンは、ＡＴＣＣ受託番号Ｐ０２２４８に記載のアミノ酸配列を有し、これを出典明示により本明細書の一部とする。ＡＴＣＣ受託番号は、Ｇｅｎｂａｎｋで見出される。Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号の配列を、出典明示により本明細書の一部とする。Ｇｅｎｂａｎｋは当分野で周知であり、例えば、Benson, DA, et al., Nucleic Acids Research 26 : 1-7 (1998) および http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ を参照されたい。好ましくは、ユビキチンは、図１５Ａに記載のアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様では、ユビキチン変異体は、好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０％以上、さらにより好ましくは約８５％以上、最も好ましくは９０％以上の、図１５Ａに記載のアミノ酸配列に対する包括的アミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施態様では、配列同一性は約９３ないし９５または９８％ほどに高い。
【００４８】
他の好ましい実施態様では、ユビキチンタンパク質は、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９３％以上の、図１５Ａに記載のアミノ酸配列との包括的配列類似性を有する。いくつかの実施態様では、配列同一性は９３ないし９５または９８％ほどに高い。
【００４９】
技術上周知のように、タンパク質（または以下に考察するように核酸）が既知配列と配列同一性または類似性を有しているか否かを同定するために多数の異なるプログラムを使用することができる。配列同一性および／または類似性は技術上周知の標準的技法を用いて測定することができ、それらは、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981) の局所配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970) の配列同一性アラインメント、Pearson & Lipman, PNAS U.S.A., 85: 2444 (1988) の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI、中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:  387-395 (1984)に記載のＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、を非限定的に含み、好ましくはデフォルト設定を用い、または検定により使用する。好ましくは、ＦｓｔＤＢにより以下のパラメータに基づいてパーセント同一性を計算する：mismatch penalty 1; gap penalty 1; gap size penalty 0.33; joining penalty 30、"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,"Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc. である。
【００５０】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的対アラインメントを用いて関連配列から多重配列アラインメントを創成する。それはまた、アラインメント創成に使用される、クラスタリングの関係を示すツリーを描くことができる。ＰＩＬＥＵＰは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987) の漸進的アラインメント法の簡略化したものを用いる；この方法はHiggins & Sharp CABIOS 5: 151-153 (1989) 記載の方法と類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、a default gap weight 3.00, a default gap length weight 0.10, weighted end gaps を含む。
【００５１】
有用なアルゴリズムのもう１つの例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); および Karlin et al., PNAS U.S.A. 90: 5873-5787 (1993) に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html] から得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用するがその殆どはデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは以下の値で設定する：overlap span =1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11 である。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的数値であり、特定の配列の組成および興味の対象である配列を検索する特定のデータベースの組成に依存してプログラム自身により決定されるが、値は感度を上げるように調節することができる。
【００５２】
これに加えて有用なアルゴリズムは、Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402 に報告されているギャップドＢＬＡＳＴである。ギャップドＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２代替スコアを使用する。ここで閾値Ｔパラメータは９に設定し；２−ヒット法によりギャップのない伸長を開始し；ギャップ長ｋにコスト１０＋ｋを課し；Ｘｕを１６に設定し；Ｘｇをデータベース検索段階では４０に、そしてアルゴリズムのアウトプット段階では６７に設定する。ギャップドアラインメントは約２２ビットまでに相当するスコアで開始される。
【００５３】
パーセントアミノ酸配列同一性の値は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より長い」配列の総残基数で割って決定される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有する配列である（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップを無視する）。
【００５４】
アラインメントは、アラインメントを行う配列中へのギャップ導入を含んでもよい。加えて、図１５Ａに記載のアミノ酸配列より多いかまたは少ないアミノ酸を含有する配列については、ある実施態様では、配列同一性の割合は、アミノ酸総数に対する同一アミノ酸数に基づいて決定されると理解される。かくして、例えば、後で論じるように、ある実施態様では、図１５Ａに記載の配列より短い配列の配列同一性は、より短い配列中のアミノ酸数を用いて決定される。パーセント同一性の計算においては、相対的重みは、挿入、欠失、置換その他のような種々の配列変化の表出に起因するとはされない。
【００５５】
ある実施態様では、同一性のみがプラスのスコアを与えられ（＋１）、ギャップを含むあらゆる形の配列変化に「０」の値が与えられる。これにより、配列類似性計算について後述するような、重みをつけた目盛りまたはパラメータの必要性がなくなる。例えば、配列同一性の割合は、アミノ酸総数に対する同一アミノ酸数に基づいて決定されると理解される。例えば、パーセントアミノ酸配列同一性は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より短い」配列の総残基数で割り、１００を掛けて算出される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有する配列である
【００５６】
本発明のユビキチンタンパク質は、図１５Ａに記載のアミノ酸配列より短くても長くてもよい。従って、好ましい実施態様では、図１５Ａに記載のアミノ酸配列の部分または断片が、ユビキチンの定義に含まれる。本発明のある実施態様では、ユビキチンの断片は、それらがユビキチンリガーゼ酵素によって他のポリペプチドにライゲーションされるなら、ユビキチンタンパク質と見なされる。
【００５７】
さらに、より詳しく後で概説するように、例えばタグの付加、他の融合配列の付加、または付加的なコーディングおよび非コーディング配列の解明により、ユビキチンは、図１５Ａに記載のアミノ酸配列よりも長く作成できる。後述のように、ユビキチンペプチドのグリーン蛍光ペプチド（ＧＦＰ）のような蛍光ペプチドへの融合が、特に好ましい。
【００５８】
ユビキチンタンパク質は、本発明の他のタンパク質と同様に、好ましくは、組換え体である。「組換えタンパク質」は、組換え技法を用いて、即ち後述のように組換え核酸の発現を通して作成されるタンパク質である。好ましい実施態様では、本発明のユビキチンは、ＡＴＣＣ受託番号Ｍ２６８８０またはＡＢ００３７３０に記載の核酸、またはその断片の発現を通して作成される。最も好ましい実施態様では、核酸は、図１５Ａに記載のアミノ酸配列をコードする。組換えタンパク質は、少なくとも１つまたはそれ以上の特性によって、天然産生のタンパク質と区別される。例えば、このタンパク質は、野生型宿主中で通常会合しているタンパク質または化合物の一部または全てから単離または精製され、実質的に純粋であり得る。例えば、単離されたタンパク質は、自然状態では通常会合している物質の少なくとも一部を伴わないで、所定の試料中の総タンパク質重量の好ましくは少なくとも約０.５％、より好ましくは少なくとも５％を構成している。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質重量の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、そして特に好ましくは少なくとも約９０％を含む。この定義には、ある生物由来のタンパク質を異なる生物または宿主中で生産することが含まれる。あるいは、タンパク質がより増加した濃度レベルで作られるように誘導可能プロモーターもしくは高発現プロモーターを使用することにより、タンパク質を通常見られるよりも有意に高濃度で作ることができる。あるいは、以下に考察するように、該タンパク質は、エピトープタグの付加またはアミノ酸置換、挿入および欠失を含むような、自然界に通常見出されない形であり得る。
【００５９】
ここで用いられる「核酸」は、さらに定義するように、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはデオキシおよびリボヌクレオチドの両者を含む分子を表わし得る。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含み、センスおよびアンチセンス核酸を含む。このような核酸はまた、生理的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、リボース−リン酸主鎖に修飾を含んでいてもよい。
【００６０】
核酸は２本鎖、１本鎖であってよく、または２本鎖もしくは１本鎖の配列の両方の部分を含んでいてもよい。当業者により認識されるように、１本鎖（「ワトソン」）を描けばもう１つの鎖（「クリック」）の配列が規定され、ゆえに図１および３に示す配列は、該配列の相補鎖もまた含む。ここで「組換え核酸」という用語は、一般的に、核酸をエンドヌクレアーゼによって操作して、自然界には存在しない形状で、独創的にインビトロで形成した核酸を意味する。ゆえに、線状の形状で単離された核酸や、通常は結合していないＤＮＡ分子を連結することによりインビトロで形成した発現ベクターは、両者とも本発明のためには組換え体と考えられる。一旦組換え核酸が作成され宿主細胞または生物に再導入されれば、それは非組換え的に、即ち、インビトロの操作ではなく宿主のインビボの細胞機構を用いて複製すると理解される；しかしながら、そのような核酸は一旦組換え的に生産されれば、以後は非組換え的に複製しても、本発明のためにはなお組換え体と考えられる。
【００６１】
本願を通じて「ポリペプチド」および「タンパク質」の用語は互換的に使用され得、共有結合した少なくとも２つのアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。該タンパク質は、天然産生のアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造からなってもよい。従って本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、天然産生のアミノ酸と合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考えられる。また「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基が含まれる。その側鎖は（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のいずれであってもよい。好ましい態様では、該アミノ酸は（Ｓ）またはＬ配置である。天然産生ではない側鎖を用いる場合は、例えばインビボ分解を妨げるまたは遅延させるために非アミノ酸置換基を用いてもよい。
【００６２】
ある実施態様では、本発明は、例えば、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ３の変異体などのタンパク質変異体を含有する組成物を提供する。これらの変異体は置換、挿入または欠失変異体の３つの分類の１つまたはそれ以上に相当する。これらの変異体は通常、カセット式もしくはＰＣＲ式変異誘発または技術上周知の他の技術を用いて、本組成物のタンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発により、変異体をコードするＤＮＡを生産し、そして次いでＤＮＡを上に略述した組換え培養細胞中で発現させることにより調製する。しかしながら、約１００〜１５０残基までを有する変異タンパク質断片を、確立された技術を用いてインビトロ合成により調製することができる。アミノ酸配列変異体は変化が予め決定されているという特徴を有し、この特徴によって、これらの変異体は、タンパク質のアミノ酸配列に対する天然産生の対立遺伝子変異体または種間変異体から区別される。変異体は典型的に、天然産生の類似体と定性的に同じ生物活性を発揮するが、ただし、以下にさらに詳しく略述するように、変更された特性を有する変異体を選択することもできる。
【００６３】
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は予め決定されるが、変異自体は予め決定しておく必要はない。例えば、所定の部位における変異能を最適化するために、標的コドンまたは領域にランダム変異誘発を起こし、発現した変異体をスクリーニングして最適な所望の活性を有するものを探してもよい。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め定められた部位に置換変異を作成する技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマーによる変異誘発およびＰＣＲによる変異誘発がある。多数の変異体の迅速な産生は、類似の核酸配列の変異体が再び組合されて新しい変異体の組合せを生じさせる、遺伝子シャッフリング方法などの技法を使用してなし得る。そのような技法の例は、米国特許第５,６０５,７０３号；第５,８１１,２３８号；第５,８７３,４５８号；第５,８３０,６９６号；第５,９３９,２５０号；第５,７６３,２３９号；第５,９６５,４０８号；および第５,９４５,３２５号に見出される。これらの各々の全体を、出典明示により本明細書の一部とする。変異体のスクリーニングは、本発明のユビキチンリガーゼ活性アッセイを使用して行われる。
【００６４】
アミノ酸置換は典型的には単一の残基置換である；かなり大きな挿入も許容されるが、挿入は通常、約１〜２０アミノ酸の単位で行われよう。欠失は、より大きな場合もあるが、約１から約２０残基の範囲である。
【００６５】
最終誘導体に到達するために、置換、欠失、挿入またはそれらのいずれの組み合わせを用いてもよい。一般的に、これらの変化は、分子の変化を最小限にするために少数のアミノ酸について行われる。しかしながら、より大きな変化も一定の状況では許容される。タンパク質の特徴について小さな変化が望まれる場合は、置換は一般的に次のチャートに従ってなされる。
【表１】
チャートＩ
0004095805.tif 000002
【００６６】
機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、チャートＩに示したものより保存性の低い置換を選択することによってもたらされる。例えば、より大きく影響する置換を行うことができる：それらは、変化する区域のポリペプチド主鎖の構造、例えばアルファ−ヘリックス構造またはベータ−シート構造；標的部位での分子の電荷または疎水性；または側鎖の大きさである。一般的にポリペプチドの性質に最も大きな変化を生じると期待される置換は（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルに置換する（またはその逆）、（ｂ）システインまたはプロリンを他のいずれかの残基に置換する（またはその逆）、（ｃ）正電荷を持つ側鎖、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルを負電荷を持つ側鎖、例えばグルタミル、アスパルチルに置換する（またはその逆）、（ｄ）大きい側鎖を持つ残基、例えばフェニルアラニンを側鎖を持たない残基、例えばグリシンに置換する（またはその逆）、ものである。
【００６７】
変異体は典型的には天然産生の類似体と定性的に同じ生物活性を発揮し、同じ免疫応答を誘起するが、ただし、必要に応じてタンパク質の特性を変更するような変異体もまた選択される。あるいは、変異体をタンパク質の生物活性が変わるようにデザインすることができる。例えば、グリコシル化部位を変えたりまたは除去したりすることができる。
【００６８】
ポリペプチドの共有結合による修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合による修飾の１つのタイプは、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、ポリペプチドの選択された側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。以下に詳述するように、二官能性試薬による誘導体化は、例えば、スクリーニングアッセイの方法において使用する水不溶性の支持マトリックスまたは表面に、タンパク質を架橋するために有用である。一般的に用いられる架橋試薬としては、例えば、１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルのようなＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３,３'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸エステル）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、ビス−Ｎ−マレインイミド−１,８−オクタンのような二官能マレインイミドおよびメチル‐３−[（ｐ−アジドフェニル）ジチオ]プロピオンイミダートのような試薬が挙げられる。
【００６９】
他の修飾としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基からそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリシンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖の "−アミノ基のメチル化 [T.E. Creighton, Proteins:  Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００７０】
この発明の範囲内に含まれるポリペプチドの別のタイプの共有結合的修飾は、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変えることより成る。「天然のグリコシル化パターンを変える」とは、ここでの目的には、ポリペプチドの天然の配列の中に見出される１個もしくはそれ以上の炭水化物部分を取り除くこと、および／またはポリペプチドの天然の配列に存在しない１個またはそれ以上のグリコシル化部位を附加することを意味する。
【００７１】
ポリペプチドへのグリコシル化部位の附加はそのアミノ酸配列を変化させることにより達成される。例えば、その変化は、１個またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基をポリペプチドの天然配列に添加または置換することによって行われる（Ｏ−グリコシル部位）。アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して任意に変化させ得るが、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるであろうコドンを作成するように予め選択した塩基において、ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって変化させ得る。
【００７２】
ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させるもう１つの方法は、ポリペプチドにグリコシドを化学的もしくは酵素的にカップルさせることによる。このような方法は、技術上で、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０および Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) に記述されている。
【００７３】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的にもしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的となっているアミノ酸残基をコードするコドンを置換する変異により達成される。化学的脱グリコシル化の手法は技術上周知であり、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) およびEdge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981) に記述されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987) に記述されているように種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成できる。
【００７４】
もう１つのタイプのタンパク質の共有結合的修飾は、米国特許第４,６４０,８３５号、第４,４９６,６８９号、第４,３０１,１４４号、第４,６７０,４１７号、第４,７９１,１９２号または第４,１７９,３３７号に示されている方法で、ポリペプチドを種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン、の１つに結合させることを含む。
【００７５】
本発明のポリペプチドはまた、もう１つの、異種のポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合した第１のポリペプチドを含むキメラ分子を形成するように修飾し得る。ある実施態様では、そのようなキメラ分子は、ユビキチンポリペプチド（あるいは後に定義するように、Ｅ２またはＥ３）と、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは一般的に、ポリペプチドのアミノ−またはカルボキシル−末端に置かれる。ポリペプチドにそのようなエピトープタグが付いた形のものの存在は、タグポリペプチドに対する抗体によって検出することができる。また、エピトープタグを提供することにより、ポリペプチドが抗タグ抗体、またはエピトープタグに結合する別のタイプのアフィニティーマトリックスによる精製が容易になる。別の実施態様では、キメラ分子は、本明細書で開示されるポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含んでもよい。２価形態のキメラ分子について、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してなし得る。本発明の成分へのタグは、後で詳細に定義および記述される。
【００７６】
本発明は、ユビキチンリガーゼ活性のアッセイ方法を提供する。「ユビキチンリガーゼ」は、他のタンパク質へのユビキチンの共有結合を触媒する能力のあるユビキチン化酵素を意味する。本発明の好ましい実施態様には、ユビキチン化が起こり得る条件下で、ユビキチンと、ユビキチンリガーゼを含むユビキチン化酵素を合わせること、およびユビキチンリガーゼに結合したユビキチン（ポリユビキチン）の量を測定することが含まれる。好ましい実施態様では、ユビキチンリガーゼは、後に定義するＥ３ユビキチンリガーゼである。
【００７７】
本発明の実施態様には、ユビキチン化基質タンパク質にユビキチンを結合させることが含まれる。「ユビキチン化基質タンパク質」は、それに対してユビキチンリガーゼがユビキチンの共有結合を触媒できるタンパク質を意味し、標的タンパク質およびユビキチンを含む。好ましい実施態様では、ユビキチン化基質タンパク質はユビキチンであり、ユビキチンリガーゼは、ポリユビキチン鎖の形成を触媒する。好ましい実施態様では、ポリユビキチン鎖は、いかなる標的タンパク質も存在しなくても、ユビキチンリガーゼによって形成される。
【００７８】
ある態様では、発明はユビキチン化のアッセイ方法を提供する。これらのアッセイでは、異なるユビキチン化酵素の相互作用、個々のユビキチン化酵素の異なるサブユニットの相互作用、および候補のユビキチン化調整因子の影響を、観察および測定できる。
【００７９】
好ましい実施態様では、発明はユビキチンリガーゼ活性のアッセイ方法を対象としている。「ユビキチンリガーゼ活性」「ユビキチンライゲーション」およびそれらの文法的均等物は、基質タンパク質へのユビキチンの共有結合の触媒作用を意味する。好ましくは、各ユビキチンは、続くユビキチンポリペプチドがそれに結合して複数のユビキチン分子を含む鎖を形成するように、結合する。好ましい実施態様では、ユビキチンリガーゼ活性は、標的タンパク質の非存在下でも生じ、従って基質タンパク質はユビキチンである。
【００８０】
好ましい実施態様では、本発明はさらに、ユビキチン活性化活性のアッセイ方法を対象にしている。「ユビキチン活性化活性」「ユビキチン活性化」およびそれらの文法的均等物は、ユビキチンとＥ１が結合することを意味する。好ましくは、Ｅ１は、ユビキチンと高エネルギーチオールエステル結合を形成する。
【００８１】
好ましい実施態様では、本発明はユビキチン接着活性のアッセイ方法を提供する。「ユビキチン接着活性」「ユビキチン接着」およびそれらの文法的均等物は、活性化されたユビキチンがＥ２に結合することを意味する。当業者に認識されるように、Ｅ２−ユビキチン接着中の高エネルギーチオールエステル結合の存在のために、接着したユビキチンはＥ３の触媒活性が存在しなくても、低速度で他のユビキチンに結合し得る。従って、ユビキチン接着活性のアッセイで測定されるユビキチンのいくらかは、ポリユビキチンの形態である。
【００８２】
本発明は、ユビキチンを他の成分と合わせることを含む、方法および組成物を提供する。「合わせる」は、ユビキチンリガーゼ活性またはユビキチン化が生じる条件下で、容器中に様々な成分を添加することを意味する。好ましい実施態様では、容器は、９６ウェルプレートまたは他の市販のマルチウェルプレートのウェルである。別の好ましい実施態様では、容器は、ＦＡＣＳ機の反応容器である。本発明で有用な他の容器には、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明で有用なさらに他の容器は、当業者に明らかであろう。
【００８３】
成分の添加は、ユビキチンリガーゼ活性が得られやすい条件である限りは、連続的であるか、または予め決定した順序またはグループ分けであり得る。そのような条件は、当分野で周知であり、さらなる手引きは以下で提供される。
【００８４】
好ましい実施態様では、本発明の１つまたはそれ以上の成分は、タグを含む。「タグ」は、付着した分子、または付着した成分の同定または単離に有用な分子を意味する。タグを有する成分は、Ｘが成分であって「タグ−Ｘ」と表される。例えば、タグを含むユビキチンは、本明細書で「タグ−ユビキチン」と表される。好ましくは、タグは付着する成分に共有結合している。組合せの１成分以上がタグを有する場合、タグは同定のために、例えば「タグ１−ユビキチン」などと番号付けされる。成分は１つ以上のタグを含んでもよく、その場合各タグは、例えば「タグ１,２−ユビキチン」などと番号付けされる。好ましいタグには、標識、結合対のパートナー、および表面基質結合分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。当業者に明らかなように、タグがどのように使用されるかによって、多数の分子が１タイプのタグ以上の用途を見出す。
【００８５】
「標識」は、直接的（即ち、一次標識）または間接的（即ち、二次標識）に検出され得る分子を意味する；例えば、標識は、可視化および／または測定または他の方法で同定でき、そのためその有無が分かる。当業者に認識されるように、このことが成される様式は、標識に依存する。好ましい標識には、蛍光標識、標識酵素および放射性同位元素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８６】
「蛍光標識」は、それに内在する蛍光特性を介して検出され得るいかなる分子をも意味する。適する蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラサイト（Malacite）・グリーン、スチルベン、ルシファー・イエロー、カスケード・ブルー（登録商標）、テキサス・レッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、ＬＣレッド７０５およびオレゴン・グリーンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい光学染料は、1996 Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland に記載されており、出典明示により本明細書の一部とする。好ましい蛍光標識には、グリーン蛍光タンパク質 (ＧＦＰ；Chalfie, et al., Science 263 (5148) : 802-805 (Feb 11, 1994)；およびＥＧＦＰ；Clontech、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、ブルー蛍光タンパク質(ＢＦＰ；1. Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal (Quebec) Canada H3H 1J9 ; 2. Stauber, R. H. Biotechniques 24 (3) : 462-471 (1998) ; 3. Heim, R. and Tsien, R. Y. Curr. Biol. 6 : 178-182 (1996)）、強化イエロー蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ；1. Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303）、ルシフェラーゼ（Ichiki, et al., J. Immunol. 150 (12) : 5408-5417 (1993)）、β−ガラクトシダーゼ（Nolan, et al., Proc Natl Acad Sci USA 85 (8) : 2603-2607 (Apr 1988)）、およびレニーラ（Renilla）（ＷＯ９２／１５６７３；ＷＯ９５／０７４６３；ＷＯ９８／１４６０５；ＷＯ９８／２６２７７；ＷＯ９９／４９０１９；米国特許第５,２９２,６５８号；米国特許第５,４１８,１５５号；米国特許第５,６８３,８８８号；米国特許第５,７４１,６６８号；米国特許第５,７７７,０７９号；米国特許第５,８０４,３８７号；米国特許第５,８７４,３０４号；米国特許第５,８７６,９９５号；および米国特許第５,９２５,５５８号）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。上記で引用した全参照文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
【００８７】
いくつかの例では、多数の蛍光標識が採用される。好ましい実施態様では、少なくとも２つの蛍光標識が使用され、それは蛍光共鳴エネルギー移行（ＦＲＥＴ）対のメンバーである。ＦＲＥＴは、当分野で既知の現象であり、１つの蛍光染料の励起が、光子の放射なしで他の蛍光染料に移行される。ＦＲＥＴ対は、供与体発蛍光団と受容体発蛍光団からなる。供与体の蛍光放射スペクトルおよび受容体の蛍光吸収スペクトルは重ならなくてはならず、２分子は近接していなければならない。供与体の５０％が非活性化される（エネルギーを受容体に移行させる）供与体と受容体との間の距離は、Foerester 半径（Ｒ０）によって定義され、それは典型的には１０−１００Åである。ＦＲＥＴ対を含む蛍光放射スペクトルの変化を検出でき、近接している（即ち、相互に１００Å以内）数の変化を示す。このことは、典型的には、一方がＦＲＥＴ対供与体で標識され、他方がＦＲＥＴ対受容体で標識された２分子の結合または解離に起因し、そのような結合がＦＲＥＴ対を近くにもたらす。そのような分子の結合は、受容体の蛍光放射の増加および／または供与体の蛍光放射の減少の結果をもたらす。
【００８８】
本発明で有用なＦＲＥＴ対（供与体／受容体）には、ＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／ＬＣレッド６４０、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５.５およびフルオレセイン／ＬＣレッド７０５が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８９】
ＦＲＥＴの他の態様では、蛍光供与体分子および非蛍光受容体分子（「クエンチ剤」）を採用し得る。この適用では、供与体の蛍光放射は、クエンチ剤が供与体の近傍に置かれていない場合に増加し、クエンチ剤が供与体の近傍にもたらされると減少する。有用なクエンチ剤には、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ７およびＱＳＹ３３が含まれるが、これらに限定されるわけではない。有用な蛍光供与体／クエンチ剤対には、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、テキサス・レッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファー・イエロー／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬおよびフルオレセイン／ＱＳＹ７染料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００９０】
当業者は、ＦＲＥＴおよび蛍光クエンチによって、期間に渡って標識分子の結合をモニターすることが可能になり、結合反応のタイム・コースに関する継続的な情報が提供されることを認識するであろう。
【００９１】
ユビキチンが、その末端カルボキシル基によって、他のユビキチンのリジン残基を含む基質タンパク質のリジン残基にライゲーションされることを思い起こすのは重要である。従って、標識または他のタグの付着は、ユビキチンのこれらの活性基のいずれをも妨害しないべきである。標識の付着点を提供する発現の目的で、当分野で周知であり、本明細書に記載されている手段を通じて、アミノ酸をタンパク質配列に付加し得る。好ましい実施態様では、１つまたはそれ以上のアミノ酸を、タグ、好ましくは蛍光標識、が付着する成分の配列に付加する。好ましい実施態様では、蛍光標識が付着するアミノ酸は、システインである。
【００９２】
「標識酵素」は、検出可能な生成物を産生する標識酵素基質の存在下で反応し得る酵素を意味する。本発明における使用に適する標識酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼおよびグルコースオキシダーゼが含まれるが、それらに限定されるわけではない。そのような基質の使用方法は、当分野で周知である。標識酵素の存在は、一般的に、同定可能な生成物を産生する、標識酵素基質との反応の酵素の触媒作用を通じて解明される。そのような生成物は、テトラメチルベンゼジンとのホースラディッシュペルオキシダーゼの反応のように、不明瞭であり得、様々な色を有し得る。ルミノール（Pierce Chemical Co. から入手可能）などの、蛍光反応生成物を産生する他の標識酵素基質が開発されてきた。標識酵素基質を用いる標識酵素の同定方法は、当分野で周知であり、多数のキットが市販されている。様々な標識酵素使用の例と方法は、Savage et al., Previews 247 : 6-9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24 : 227-236 (1989) に記載されており、出典明示により全体を本明細書の一部とする。
【００９３】
「放射性同位元素」は、いかなる放射性分子をも意味する。本発明における使用に適する放射性同位元素には、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが含まれるが、これらに限定されるわけではない。標識としての放射性同位元素の使用は、当分野で周知である。
【００９４】
さらに、標識は、間接的に検出され得る。つまり、タグは、結合対のパートナーである。「結合対のパートナー」は、第１および第２部分の一方を意味し、該第１および第２部分は、相互に特異的な結合親和性を有する。本発明における使用に適する結合対には、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファー・イエロー／抗ルシファー・イエロー、およびローダミン／抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）、およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。他の適する結合対には、ＦＬＡＧペプチド [Hopp et al., BioTechnology, 6 : 1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド [Martin et al., Science, 255 : 192-194 (1992)]；チューブリンエピトープペプチド [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266 : 15163-15166 (1991)]；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 6393-6397 (1990)]、およびそれらに対する各々の抗体のようなポリペプチドが含まれる。一般的に、好ましい実施態様では、タグとして働く結合対のパートナーが小さいほど、ユビキチンライゲーションにおける立体配置を考慮することが重要になり得る。当業者に認識されるように、結合対のパートナーは、さらに後述するように、標識化以外の適用においても使用され得る。
【００９５】
当業者に認識されるように、１つの結合対のパートナーは、他の結合対のパートナーでもあり得る。例えば、抗原（第１部分）は、第１抗体（第２部分）に結合し得、それが今度は、第２抗体（第３部分）の抗原であり得る。第１部分と第３部分の間接的結合が、各々の結合対パートナーである第２部分の中継を介して可能になるような状況が、さらに認識されるであろう。
【００９６】
当業者に認識されるように、結合対のパートナーは、上記のように標識を含んでもよい。このことにより、標識を含む結合パートナーが結合するとタグが間接的に標識されるようになることが、さらに認識されるであろう。結合対のパートナーであるタグへの標識の付着は、ちょうど説明したように、本明細書で「間接標識」と表される。
【００９７】
「表面基質結合分子」またはその文法的均等物は、特定の表面基質に対する結合親和性を有する分子を意味し、その基質は一般的に、塗布、組込みまたは他の方法で表面に付着した結合対のメンバーである。適する表面基質結合分子およびそれらの表面基質には、ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグとニッケル基質；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグとその抗体基質（Pierce Chemical から入手可能）；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５基質 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8 : 2159-2165 (1988)]；ｃ−ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体基質 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5 : 3610-3616 (1985)]；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体基質 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6) : 547-553 (1990)] が含まれるが、それらに限定されるわけではない。一般に、本発明で有用な表面結合基質分子には、ニッケル基質に結合するポリヒスチジン構造（Ｈｉｓ−タグ）、抗体を含む表面基質に結合する抗原、アビジン基質に結合するハプテン（例えば、ビオチン）およびカルモジュリンを含む表面基質に結合するＣＢＰが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９８】
抗体を埋め込んだ基質の基板は、周知であり；Slinkin et al., Bioconi. Chem. 2 : 342-348 (1991) ; Torchilin et al., 前出 ; Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3 : 323-327 (1992) ; King et al., Cancer Res. 54 : 6176-6185 (1994) ; および Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5 : 220-235 (1994) を参照のこと（これらの全てを出典明示により本明細書の一部とする）。抗原を伴うタンパク質の付着または産生は、上記されている。
【００９９】
カルモジュリンを埋め込んだ基板は市販されていて、ＣＢＰを伴うタンパク質の産生は、Simcox et al., Strategies 8 : 40-43 (1995) に記載されており、その全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【０１００】
当業者に認識されるように、本発明のタグ−成分は様々な方法で作成でき、タグの形態に大きく左右される。発明の成分とタグは、好ましくは共有結合によって付着する。
【０１０１】
タグもポリペプチドである場合の、組換え手段によるタグ−ポリペプチドの産生は、後述する。ＦＬＡＧ標識タンパク質の産生は当分野で周知であり、そのような産生のためのキットは、市販されている（例えば、Kodak および Sigma から）。ＦＬＡＧ標識タンパク質の産生と使用は、例えば、先に言及したキットと共に提供される手引き書や、出典明示により全体を本明細書の一部とするWinston et al., Genes and Devel. 13 : 270-283 (1999) に見出される。
【０１０２】
標的分子および基質のビオチン化は周知であり、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、カルボン酸のビオチン化用の、アミン反応性物質およびチオール反応性物質を含む多数のビオチン化物質が既知である；出典明示により本明細書の一部とする、chapter 4, Molecular Probes Catalog, Haugland, 6th Ed. 1996 を参照されたい。ビオチン化された基質は、アビジンまたはストレプトアビジンを介してビオチン化された成分に付着できる。同様に、多数のハプテン化試薬も既知である（同上）。
【０１０３】
放射性同位元素でタンパク質を標識する方法は、当分野で既知である。例えば、そのような方法は、出典明示により全体を本明細書の一部とする、Ohta et al., Molec. Cell 3 : 535-541 (1999) に見出される。
【０１０４】
Ｈｉｓ−タグを有するタンパク質の組換え手段による産生は、周知であり、そのようなタンパク質を産生するためのキットは、市販されている。そのようなキットおよびその使用は、出典明示により本明細書の一部とする、Joanne Crowe らによる Quiagen の QIAexpress Handbook に記載されている。
【０１０５】
チオール、アミン、カルボキシルなどの化学反応基による標識の官能化は、当分野で一般的に知られている。好ましい実施態様では、タグは共有結合を促進するために、官能化される。
【０１０６】
共有結合によるタグの付着は、直接であっても、リンカーを介してもよい。ある実施態様では、リンカーは、分子の付着に使用される比較的短いカップリング部分である。カップリング部分は、発明の成分、例えばユビキチンの上に直接合成してもよく、タグの付着を促進する少なくとも１個の官能基を含有する。あるいは、カップリング部分は、少なくとも２個の官能基を有してもよく、例えば官能化したタグに官能化した成分を付着させるのに使用する。さらなる実施態様では、リンカーはポリマーである。この実施態様では、成分またはタグからポリマーへの共有結合による付着は、直接か、またはカップリング部分の使用を介して達成される。好ましい実施態様では、共有結合による付着は直接である。つまり、リンカーは使用されない。この実施態様では、成分は、官能化されたタグへの直接の付着に使用されるカルボン酸のような官能基を、好ましくは含有する。成分とタグは上記に挙げたものを含む多様な方法で付着し得ることを、理解すべきである。重要なのは、付着の様式が成分の機能性を有意に変更しないことである。例えば、タグ−ユビキチンでは、タグは、ユビキチンが他のユビキチンに共有結合されてポリユビキチン鎖を形成することを可能にするような様式で付着するべきである。当業者に認識されるように、標識とユビキチンの共有結合による付着に関する上記の説明は、実質的には本開示のいかなる２分子の付着にも等しく適用される。
【０１０７】
好ましい実施態様では、すでに一般的に概説したように、タグは、共有結合による付着を促進するために官能化される。従って、すべて本明細書に記載のように第２分子にタグを共有結合により付着させるために使用し得る、イソチオシアン酸基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシニミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルを含むがこれらに限定されるわけではない官能基を含有する、幅広いタグが市販されている。タグの官能基の選択は、上記概説のようにリンカーまたは本発明の成分のどちらかへの付着の部位に依存する。従って、例えば、ユビキチンのカルボン酸基の直接連結には、例えば当分野で既知の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を使用して、カルボジイミド化学を介するカップリングのために、アミノ修飾またはヒドラジン修飾タグが使用される（前出の Molecular Probes Catalog の Set 9 および Set 11 を参照されたい；the Pierce 1994 Catalog and Handbook, pages T-155 to T-200 も参照されたい。両方を出典明示により本明細書の一部とする）。ある実施態様では、本明細書に記載の多くのタグについて市販されているように、カルボジイミドを最初にタグに付着させる。
【０１０８】
好ましい実施態様では、ユビキチンは、タグ−ユビキチンの形態である。
【０１０９】
好ましい実施態様では、ユビキチンは、タグ−ユビキチンの形態であり、タグは結合対のパートナーである。好ましくは、この実施態様ではタグはＦＬＡＧであり、結合のパートナーは抗ＦＬＡＧである。好ましくは、この実施態様では、間接標識によって標識がＦＬＡＧに付着する。好ましくは、標識は標識酵素である。最も好ましくは、標識酵素は、蛍光標識酵素基質と反応するホースラディッシュペルオキシダーゼである。好ましくは、標識酵素基質はルミノールである。あるいは、標識は蛍光標識である。
【０１１０】
別の好ましい実施態様では、ユビキチンは、タグ−ユビキチンの形態であり、タグは蛍光標識である。特に好ましい実施態様では、ユビキチンは、タグ１−ユビキチンとタグ２−ユビキチンの形態であり、タグ１とタグ２は、ＦＲＥＴ対のメンバーである。別の好ましい実施態様では、ユビキチンは、タグ１−ユビキチンとタグ２−ユビキチンの形態であり、タグ１は蛍光標識であり、タグ２は蛍光標識のクエンチ剤である。これらの好ましい実施態様のいずれにおいても、タグ１−ユビキチンとタグ２−ユビキチンがユビキチンリガーゼの活性を通じて結合すると、タグ１とタグ２は、好ましくは相互に１００Å以内、より好ましくは７０Å以内、さらにより好ましくは５０Å以内、さらになお好ましくは４０Å以内にあり、好ましくは３０Å以内またはそれ以下にある場合もある。
【０１１１】
さらに別の好ましい実施態様では、ユビキチンは、タグ１,２−ユビキチンおよびタグ１,３−ユビキチンの形態であり、タグ１は結合対のメンバー、好ましくはＦＬＡＧであり、タグ２は蛍光標識であり、そしてタグ３は、タグ２とタグ３がＦＲＥＴ対のメンバーであるように蛍光標識であるか、またはタグ３がタグ２のクエンチ剤であるかのいずれかである。
【０１１２】
好ましい実施態様では、本明細書に記載の組換え技法を使用して１個またはそれ以上のアミノ酸がユビキチン配列に付加され、好ましくは蛍光標識またはクエンチ剤であるタグの付着点を提供する。好ましい実施態様では、１個またはそれ以上のアミノ酸は、ＣｙｓまたはＡｌａ−Ｃｙｓである。好ましくは、１個またはそれ以上のアミノ酸は、ユビキチンのＮ末端に付着する。好ましい実施態様では、１個またはそれ以上のアミノ酸は、ＦＬＡＧタグ配列とユビキチンとの間にある。好ましい実施態様では、タグ、好ましくは蛍光標識またはクエンチ剤は、付加されたシステインに付着する。
【０１１３】
本発明は、ユビキチンとＥ１を合わせることを含む方法と組成物を提供する。「Ｅ１」は、ユビキチン活性化酵素を意味する。好ましい実施態様では、Ｅ１には、後に定義するように、ユビキチンをＥ２に移行させる能力がある。好ましい実施態様では、Ｅ１は、ユビキチンに結合する。好ましい実施態様では、Ｅ１は、ユビキチンと高エネルギーチオエステル結合を形成し、かくしてユビキチンを「活性化」する。
【０１１４】
好ましい実施態様では、本発明で有用なＥ１タンパク質には、出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号Ａ３８５６４、Ｓ２３７７０、ＡＡＡ６１２４６、Ｐ２２３１４、ＣＡＡ４０２９６およびＢＡＡ３３１４４を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有するものが含まれる。好ましい実施態様では、Ｅ１は、図６Ｂに示されているか、または図６Ａに示す配列を含む核酸にコードされるアミノ酸配列を有する。好ましくはＥ１はヒトＥ１である。Ｅ１は、Affiniti Research Products (Exeter, U. K.）から市販されている。
【０１１５】
好ましい実施態様では、本発明のＥ１タンパク質を産生するために使用され得る核酸には、出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号Ｍ５８０２８、Ｘ５６９７６およびＡＢ０１２１９０によって開示されるものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい実施態様では、Ｅ１は、本質的に図６Ａに示す配列からなる配列を有する核酸にコードされる。用語「Ｅ１」にまた含まれる、引用されたＥ１タンパク質の変異体を、本明細書に記載のように作成できる。
【０１１６】
好ましい実施態様では、本発明の組成物はＥ２を含む。「Ｅ２」は、ユビキチン運搬酵素を意味する（ユビキチン接着酵素としても知られる）。好ましい実施態様では、ユビキチンはＥ１からＥ２へ移行される。好ましい実施態様では、移行によりＥ２とユビキチンとの間にチオールエステル結合が形成されるに至る。好ましい実施態様では、Ｅ２には、後に定義するように、ユビキチンをＥ３に移行させる能力がある。好ましい実施態様では、ユビキチン化基質タンパク質はユビキチンである。
【０１１７】
好ましい実施態様では、本発明でＥ２として使用され得るタンパク質には、出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号ＡＡＣ３７５３４、Ｐ４９４２７、ＣＡＡ８２５２５、ＡＡＡ５８４６６、ＡＡＣ４１７５０、Ｐ５１６６９、ＡＡＡ９１４６０、ＡＡＡ９１４６１、ＣＡＡ６３５３８、ＡＡＣ５０６３３、Ｐ２７９２４、ＡＡＢ３６０１７、Ｑ１６７６３、ＡＡＢ８６４３３、ＡＡＣ２６１４１、ＣＡＡ０４１５６、ＢＡＡ１１６７５、Ｑ１６７８１、ＮＰ００３３３３、ＢＡＢ１８６５２、ＡＡＨ００４６８、ＣＡＣ１６９５５、ＣＡＢ７６８６５、ＣＡＢ７６８６４、ＮＰ＿０５５３６、Ｏ００７６２、ＸＰ＿００９８０４、ＸＰ＿００９４８８、ＸＰ＿００６８２３、ＸＰ＿００６３４３、ＸＰ＿００５９３４、ＸＰ＿００２８６９、ＸＰ＿００３４００、ＸＰ＿００９３６５、ＸＰ＿０１０３６１、ＸＰ＿００４６９９、ＸＰ＿００４０１９、Ｏ１４９３３、Ｐ２７９２４、Ｐ５０５５０、Ｐ５２４８５、Ｐ５１６６８、Ｐ５１６６９、Ｐ４９４５９、Ｐ３７２８６、Ｐ２３５６７、Ｐ５６５５４、およびＣＡＢ４５８５３によって開示されるアミノ酸配列を有するものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。特に好ましいものは、また出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号ＮＰ００３３３１、ＮＰ００３３３０、ＮＰ００３３２９、Ｐ４９４２７、ＡＡＢ５３３６２、ＮＰ００８９５０、ＸＰ００９４８８およびＡＡＣ４１７５０に開示される配列である。当業者は、当分野で多数の異なるＥ２タンパク質およびアイソザイムが既知であり、Ｅ２がユビキチン接着活性を有するならば、本発明で使用され得ることを認識するであろう。また、用語「Ｅ２」に特に含まれるものは、Ｅ２の変異体であり、それは本明細書に記載のように作成できる。
【０１１８】
好ましい実施態様では、Ｅ２は、Ｕｂｃ５（Ｕｂｃｈ５、好ましくはＵｂｃｈ５ｃ）、Ｕｂｃ３（Ｕｂｃｈ３）、Ｕｂｃ４（Ｕｂｃｈ４）およびＵｂｃＸ（Ｕｂｃ１０、Ｕｂｃｈ１０）の１つである。好ましい実施態様では、Ｅ２は、Ｕｂｃ５ｃである。好ましい実施態様では、Ｅ２は、図７Ｂに示されているか、または本質的に図７Ａに示す配列からなる核酸にコードされるアミノ酸配列を有する。
【０１１９】
好ましい実施態様では、Ｅ２を作成するために使用され得る核酸配列には、出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号Ｌ２２０５、Ｚ２９３２８、Ｍ９２６７０、Ｌ４０１４６、Ｕ３９３１７、Ｕ３９３１８、Ｘ９２９６２、Ｕ５８５２２、Ｓ８１００３、ＡＦ０３１１４１、ＡＦ０７５５９９、ＡＪ０００５１９、ＸＭ００９４８８、ＮＭ００７０１９、Ｕ７３３７９、Ｌ４０１４６およびＤ８３００４によって開示される配列を有する核酸が含まれるが、これらに限定されるわけではない。上記のように、これらおよび他のＥ２をコードする核酸の変異体も、変異体Ｅ２タンパク質を作成するために使用され得る。
【０１２０】
好ましい実施態様では、Ｅ２を作成するために使用される核酸配列は、図７Ａに示す配列を含む。
【０１２１】
好ましい実施態様では、Ｅ２は、上記のようにタグを有し、本明細書で複合体は「タグ−Ｅ２」と表される。好ましいＥ２タグには、標識、結合対のパートナーおよび基質結合要素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。最も好ましい実施態様では、タグはＨｉｓ−タグまたはＧＳＴ−タグである。
【０１２２】
本発明は、Ｅ３を含む方法と組成物を提供する。「Ｅ３」は、ユビキチンリガーゼを意味し、上記定義のようにユビキチン依存性タンパク質分解のために、ユビキチン化基質タンパク質へユビキチンをライゲーションすることに関連する１またはそれ以上の成分を含む。好ましい実施態様では、Ｅ３はＲＩＮＧフィンガータンパク質およびキュリンを含む。好ましい実施態様では、ＲＩＮＧフィンガータンパク質には、ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい実施態様では、キュリンには、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５およびＡＰＣ２が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２３】
好ましい実施態様では、ＲＩＮＧフィンガータンパク質には、出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号ＡＡＤ３０１４７およびＡＡＤ３０１４６および６３２０１９６に開示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。より好ましい実施態様では、ＲＩＮＧフィンガータンパク質は、図８、図９および図１０Ｂに示すものからなる群から選択される配列を有する。
【０１２４】
好ましい実施態様では、キュリンには、出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号４５０３１６１、ＡＡＣ５０５４４、ＡＡＣ３６６８１、４５０３１６３、ＡＡＣ５１１９０、ＡＡＤ２３５８１、４５０３１６５、ＡＡＣ３６３０４、ＡＡＣ３６６８２、ＡＡＤ４５１９１、ＡＡＣ５０５４８、Ｑ１３６２０、４５０３１６７およびＡＡＦ０５７５１に開示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに、本発明の文脈では、ＲＩＮＧフィンガータンパク質およびキュリンの各々には、本明細書に記載のように、既知またはリストに挙げた配列の変異体が包含される。
【０１２５】
好ましい実施態様では、キュリンは、図１１Ｂまたは１２Ｂに示す配列を有する。
【０１２６】
Ｅ３タンパク質および変異体は、本明細書に記載のように作成し得る。好ましい実施態様では、ＲＩＮＧフィンガータンパク質を作成するのに使用される核酸には、ＡＴＣＣ受託番号ＡＦ１４２０５９、ＡＦ１４２０６０に開示される核酸配列およびＮＣ００１１３６の核酸４３３４９３から４３３９９０を有するものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい実施態様では、キュリンは、出典明示により本明細書の一部とする、ＡＴＣＣ受託番号ＮＭ００３５９２、Ｕ５８０８７、ＡＦ０６２５３６、ＡＦ１２６４０４、ＮＭ００３５９１、Ｕ８３４１０、ＮＭ００３５９０、ＡＢ０１４５１７、ＡＦ０６２５３７、ＡＦ０６４０８７、ＡＦ０７７１８８、Ｕ５８０９１、ＮＭ００３４７８、Ｘ８１８８２およびＡＦ１９１３３７２に開示の核酸配列を有するものが含むが、これらに限定されるわけではない核酸から作成される。上記のように、これらの配列の変異体も、本発明に包含される。
【０１２７】
好ましい実施態様では、ＲＯＣ２を産生するのに使用される核酸は、図１２Ａに記載の配列を含む。好ましい実施態様では、ＣＵＬ５を産生するのに使用される核酸は、図１３Ａに記載の核酸を含む。好ましい実施態様では、ＡＰＣ２を産生するのに使用される核酸は、図１４Ａに記載の配列を含む。
【０１２８】
好ましい実施態様では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せ、ＡＰＣ１１／ＡＰＣ２を含む。他の実施態様では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せ、ＲＯＣ１／ＣＵＬ１を含む。また好ましい実施態様では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せ、ＲＯＣ１／ＣＵＬ２を含む。さらに別の好ましい実施態様では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組合せ、ＲＯＣ２／ＣＵＬ５を含む。しかしながら、当業者は、Ｅ３成分のいかなる組合せも、本明細書に記載の発明で産生および使用し得ると認識するであろう。
【０１２９】
別の実施態様では、Ｅ３は、リガーゼＥ３−アルファ、Ｅ３Ａ（Ｅ６−ＡＰ）、ＨＥＲＣ２、ＳＭＵＲＦ１、ＴＲＡＦ６、ＭＤＭ２、Ｃｂｌ、Ｓｉｎａ／Ｓｉａｈ、Ｉｔｃｈｙ、ＩＡＰまたはＮＥＤＤ−４を含む。この実施態様では、リガーゼは、出典明示により本明細書の一部とするＡＴＣＣ受託番号ＡＡＣ３９８４５、Ｑ０５０８６、ＣＡＡ６６６５５、ＣＡＡ６６６５４、ＣＡＡ６６６５６、ＡＡＤ０８６５７、ＮＰ＿００２３８３、ＸＰ＿００６２８４、ＡＡＣ５１９７０、ＸＰ＿０１３０５０、ＢＡＢ３９３８９、Ｑ００９８７、ＡＡＦ０８２９８またはＰ４６９３４に開示されるアミノ酸配列を有する。
【０１３０】
上記のように、変異体も発明に包含される。この実施態様のＥ３を作成するための核酸には、ＡＴＣＣ受託番号ＡＦ０６１５５６、ＸＭ００６２８４、Ｕ７６２４７、ＸＭ０１３０５０、Ｘ８９８０３２、Ｘ９８０３１、Ｘ９８０３３、ＡＦ０７１１７２、Ｚ１２０２０、ＡＢ０５６６６３、ＡＦ１９９３６４およびＤ４２０５５に開示の配列およびそれらの変異体を有するものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３１】
Ｅ３は、ＳＫＰ１およびＦボックスタンパク質のような他の成分も含み得る。ＳＫＰ１のアミノ酸および核酸配列は、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＡＡＣ５０２４１およびＵ３３７６０に見出される。多数のＦボックスタンパク質が当分野で既知であり、それらのアミノ酸および核酸配列は、当業者によって様々な公知源から容易に得られる。
【０１３２】
好ましい実施態様では、Ｅ３成分は、本明細書に記載のように組換えにより産生される。
【０１３３】
好ましい実施態様では、Ｅ３成分は、同一の宿主細胞内で共発現される。共発現は、２またはそれ以上のＥ３成分をコードする核酸を含むベクターで細胞を形質転換すること、または所望のＥ３タンパク質複合体の単一成分を各々含む別個のベクターで細胞を形質転換することによって成される。好ましい実施態様では、実施例でより詳細に説明するように、ＲＩＮＧフィンガータンパク質およびキュリンが、一方または他方のポリペプチドをコードする核酸を各々含む２種のベクターで形質転換された、単一の宿主中で発現される。
【０１３４】
好ましい実施態様では、Ｅ３はタグを有し、その複合体は本明細書で「タグ−Ｅ３」と表される。好ましくは、タグはＥ３のただ１つの成分にのみ付着する。好ましいＥ３タグには、標識、結合対のパートナーおよび基質結合要素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。より好ましくは、タグは表面基質結合分子である。最も好ましくは、タグはＨｉｓ−タグまたはＧＳＴ−タグである。
【０１３５】
本発明のある実施態様では、ユビキチンおよびユビキチン化酵素およびそれらの成分を、クローニングし、発現させる。ゆえに、プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の縮重したプライマー配列を、ヒトまたは他の生物由来の他の関連するユビキチン化タンパク質を見つけ出すのに用いてもよい。当業者には理解されるように、特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、核酸配列の独特な領域を含む。当分野で一般的に知られるように、好ましいＰＣＲプライマーは、約１５ないし約３５ヌクレオチド長であり、約２０ないし約３０が好ましく、必要ならイノシンを含んでもよい。ＰＣＲ反応の条件は当分野で周知である。ゆえに、ここで引用された配列の中で配列にともなって提供されるものは、これらの配列の各部分であり、１５ヌクレオチドまたはそれ以上の独特の各部分が特に好ましいこともまた理解される。当業者は、日常的にヌクレオチド配列を所望の長さに合成したり切断することができる。
【０１３６】
一旦、プラスミドまたは他のベクターに含めたり、そこから直線状の核酸断片として切り出すなどして、その天然の供給源から単離すると、組換え核酸を、他の核酸を同定および単離するためのプローブとしてさらに用いることができる。それをまた、修飾された、または変異型の核酸およびタンパク質を作成するための「前駆」核酸として用いることができる。
【０１３７】
タンパク質をコードする本発明の核酸を用いて、種々の発現ベクターが作られる。発現ベクターは、自己複製的な染色体外ベクターでも宿主ゲノムに組み込まれるベクターでもよい。一般的に、これらの発現ベクターは、タンパク質をコードする核酸に機能し得るように結合された転写および翻訳の制御核酸を含む。「制御配列」という用語は、特定の宿主生物内で、機能し得るように結合されたコーディング配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボゾーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが知られている。
【０１３８】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に「機能し得るように結合されて」いる。例えば、前配列もしくは分泌リーダーに対するＤＮＡは、もしそれがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドに対するＤＮＡに機能し得るように結合されている；プロモーターまたはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響を与えるならば、コーディング配列に機能し得るように結合されている；または、リボゾーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するように位置しているならば、コーディング配列に機能し得るように結合されている。他の例として、機能し得るように結合されたとは、隣接するように、そして、分泌リーダー配列の場合は、隣接しかつ読み枠にあるように結合されたＤＮＡ配列を意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は都合のよい制限部位におけるライゲーションにより達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実施法に従って使用する。転写および翻訳制御核酸は、タンパク質の発現に使用する宿主細胞にとって一般的に適当であろう；例えば、Bacillus 由来の転写および翻訳の制御核酸配列は、Bacillus でタンパク質を発現させるために好ましく使用される。夥しい数の適当な発現ベクターおよび適切な制御配列が、様々な宿主細胞に関して技術上公知である。
【０１３９】
一般的に、転写および翻訳の制御核酸は、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列を非限定的に含む。好ましい実施態様では、制御配列はプロモーター並びに転写の開始および終結配列を含む。
【０１４０】
プロモーター配列は構成または誘導可能プロモーターをコードする。該プロモーターは天然産生のプロモーターでもハイブリッドプロモーターでもよい。１個より多くのプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターも技術上公知であり、本発明において有用である。
【０１４１】
加えて、発現ベクターは付加的エレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの複製システムを有し、これにより２種の生物で、例えば発現のために哺乳動物または昆虫の細胞で、そしてクローニングおよび増幅のために原核宿主で、維持することができる。さらに、発現ベクターを組込むために、発現ベクターは宿主細胞のゲノムと相同な配列を少なくとも１個、また好ましくは発現コンストラクトに隣接する２個の相同配列を含む。ベクターに取り入れるのに適当な相同配列を選択することにより、組込みベクターを宿主細胞の特定の座位を目指して組込ませ得る。組込みベクターの構築は技術上周知である。
【０１４２】
加えて、好ましい実施態様では、該発現ベクターは形質転換した宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は技術上周知であり、用いる宿主により異なる。
【０１４３】
好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８、両者とも特に出典明示により本明細書の一部とする、に一般的に記述されているレトロウイルスベクター系である。
【０１４４】
本発明のタンパク質は、タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、タンパク質の発現を誘導または誘起する適当な条件下で培養することによって生産される。タンパク質の発現に適当な条件は、発現ベクターと宿主細胞の選択によって異なるが、当業者は日常的な実験により容易に確かめることができる。例えば、発現ベクター中に構成プロモーターを使用している場合には、宿主細胞の生育および増殖を最適化することが要求されるだろうし、一方、誘導可能プロモーターを使用している場合には、誘導に適した生育条件が要求される。加えて、いくつかの実施態様では、収穫のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞での発現に用いられるバキュロウイルスシステムは、溶原性ウイルスであるので、収穫時期の選択は生成物の収量にとって極めて重要である。
【０１４５】
適当な宿主細胞としては、酵母、細菌、古細菌、真菌、並びに昆虫および哺乳動物細胞を含む動物細胞が含まれる。特に興味の持たれるのは、Drosophila melanogaster 細胞、Pichia pastoris および P. methanolica、Saccharomyces cerevisiae および他の酵母、E. coli、Bacillus subtilis、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｃ１２９細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｉ−５細胞、２９３細胞、ニューロスポラ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ細胞である。最大の関心は、Pichia pastoris および P. methanolica、E. coli、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞およびＨｉ−５細胞である。
【０１４６】
好ましい実施態様では、タンパク質は哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物の発現系もまた技術上公知であり、レトロウイルスシステムが含まれる。哺乳動物のプロモーターは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３'側）のタンパク質をコードする配列の転写を開始できる、いかなるＤＮＡでもよい。プロモーターは、通常コーディング配列の５'末端に近接して配置されている転写開始領域、および転写開始部位の２５〜３０塩基対上流を用いるＴＡＴＡボックスを有しているであろう。該ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を正しい部位から開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導すると考えられている。哺乳動物のプロモーターはまた、典型的にＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００塩基対以内に位置している上流のプロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含有しているであろう。上流のプロモーターエレメントは、転写開始速度を決定し、そしてどちら向きにも作用する。哺乳動物プロモーターで特に有用なのは哺乳動物ウイルスの遺伝子由来のプロモーターであるが、これはウイルスの遺伝子はしばしば高度に発現され、また宿主範囲が広いためである。例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスのＬＴＲプロモーター、アデノウイルスの主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスのプロモーター、およびＣＭＶのプロモーターが挙げられる。
【０１４７】
典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、転写終結コドンの３'側に位置する制御領域であり、従って、プロモーターエレメントと共にコーディング配列に隣接している。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、部位特異的な翻訳後切断およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としてはＳＶ４０由来のものが含まれる。
【０１４８】
外来性核酸を哺乳動物宿主およびその他の宿主中に導入する方法は技術上周知であり、用いる宿主細胞により異なるであろう。この技術としては、デキストラン仲介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ウイルス感染、ポリヌクレオチド（類）のリポソームへの封入、およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０１４９】
好ましい実施態様では、タンパク質は細菌のシステムで発現される。細菌の発現システムは技術上周知である。
【０１５０】
適当な細菌のプロモーターとしては、細菌のＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３'側）のタンパク質のコーディング配列の転写を開始できるいかなる核酸配列でもよい。細菌のプロモーターは転写開始領域を有し、これは通常コーディング配列の５'末端に隣接している。この転写開始領域は典型的に、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を含んでいる。代謝経路上の酵素をコード化する配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、乳糖および麦芽糖のような糖を代謝する酵素由来のプロモーター配列、およびトリプトファンのような物質の生合成にかかわる酵素由来の配列が挙げられる。
【０１５１】
バクテリオファージ由来のプロモーターも使用でき、技術上公知である。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターも有用である；例えば、ｔａｃプロモーターはｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌のプロモーターには、細菌起源でないが細菌のＲＮＡポリメラーゼを結合し転写を開始する能力のある天然産生のプロモーターを含めることができる。
【０１５２】
機能的プロモーター配列に加えて、効率の良いリボゾーム結合部位が望ましい。E. coliでは、リボゾーム結合部位はシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン、および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流にある３〜９ヌクレオチド長の配列を含む。
【０１５３】
発現ベクターも、細菌中のタンパク質の分泌を起こさせるシグナルペプチド配列を含有していてもよい。技術上周知のように、シグナル配列は典型的に、細胞からのタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸よりなるシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、成育培地中（グラム陽性細菌）、もしくは細胞の内膜と外膜の間に位置する周辺腔内（グラム陰性細菌）に分泌される。
【０１５４】
細菌の発現ベクターはまた、形質転換した細菌株の選択を可能にするために、選択マーカー遺伝子を含んでよい。適当な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝子を含む。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路上の遺伝子のような生合成遺伝子を含む。
【０１５５】
これらの成分は組み立てて発現ベクターに入れる。細菌用の発現ベクターは技術上周知であり、なかんずく Bacillus subtilis、E. coli、Streptococcus cremoris、および Streptococcus lividans 用のベクターが含まれる。
【０１５６】
細菌の発現ベクターは、塩化カルシウム処理、電気穿孔法、その他のような技術上周知の技術を用いて細菌宿主細胞に形質転換される。
【０１５７】
ある実施態様では、タンパク質は昆虫細胞中に生産される。昆虫細胞の形質転換用発現ベクター、特にバキュロウイルスに基づく発現ベクターは技術上周知である。
【０１５８】
好ましい実施態様では、タンパク質は酵母細胞中に生産される。酵母の発現システムは技術上周知であり、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans および C. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis および K. lactis、Pichia guillerimondii、Pichia methanolica および P. pastoris、Schizosaccharomyces pombe、並びに Yarrowia lipolytica 用の発現ベクターを含む。酵母での発現用に好ましいプロモーター配列としては、誘導性ＧＡＬ１、１０プロモーターおよびアルコール脱水素酵素、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、および酸ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母の選択マーカーとしては、ツニカマイシン耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および銅イオン存在下における酵母の生育を可能にするＣＵＰ１遺伝子が挙げられる。
【０１５９】
タンパク質は、当分野で周知の技術を用いて、融合タンパク質としても作成され得る。ゆえに、例えば、タンパク質を、発現の増加、または他の目的のために、融合タンパク質として作成し得る。例えば、タンパク質がペプチドであるとき、そのペプチドをコードする核酸は、発現の目的のために、他の核酸と連結され得る。同様に、本発明のタンパク質を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レッド蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ブルー蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、イエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などのような、タンパク質の標識と連結させることができる。
【０１６０】
好ましい実施態様では、タンパク質は発現後精製または単離される。タンパク質は、どのような他の成分が試料中に存在するかに依存して、当業者周知の種々の方法で単離または精製し得る。標準的な精製法としては、電気泳動的、分子的、免疫学的技法並びにイオン交換、疎水、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技法、並びにクロマトフォーカシングが挙げられる。例えば、ユビキチンタンパク質は、標準的な抗ユビキチン抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク質濃縮と組合わせた限外濾過およびダイア濾過技法も有用である。適当な精製技法の一般的手引書としては、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982）を参照のこと。必要な精製の程度はタンパク質の用途によって変わるであろう。場合によっては精製は不要であろう。
【０１６１】
一旦作成されると、ユビキチン化の調整因子をスクリーニングすることを含むがそれに限定されるわけではない数々の適用において、組成物は用途を見出す。「調整因子」は、ユビキチン化を増加または減少させられる化合物を意味する。当業者は、ユビキチン化の調整因子が酵素活性、酵素の基質との相互作用、ユビキチンと基質の間の相互作用、またはこれらの組合せに影響し得ることを認識するであろう。ユビキチンリガーゼ活性に特に影響する調整因子は、ユビキチンリガーゼ調整因子である。
【０１６２】
本明細書における「候補」「候補物質」「候補調整因子」または「候補ユビキチン化調整因子」または文法的均等物は、例えばタンパク質（本明細書では、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む）、小さい有機または無機分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどの、ユビキチン化調整因子活性について試験される、いかなる分子をも意味する。候補物質には、多くの化学的分類が包含される。好ましい実施態様では、候補物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含む有機分子、特に小さい有機分子であり、典型的には少なくともアミノ基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。候補物質はしばしば、１またはそれ以上の化学官能基で置換された環式炭素または複素環式構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含む。
【０１６３】
候補調整因子は、当業者に明らかなように、合成または天然化合物のライブラリーを含む多様な供給源から得られる。当業者に明らかなように、本発明は、多様な既知の組合わせの化学タイプのライブラリーを含む、いかなる候補調整因子のライブラリーをもスクリーニングするための、迅速で簡単な方法を提供する。
【０１６４】
好ましい実施態様では、候補調整因子は合成化合物である。ランダム化したオリゴヌクレオチドの発現を含む、例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現をはじめ、多様な有機化合物および生体分子のランダムな、また所定の合成には多くの手段が利用できる。例えば、酵素的方法と同様にランダムな化学的方法も含む新規化合物の生成方法について議論している、ＷＯ９４／２４３１４（出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。ＷＯ９４／２４３１４で議論されているように、本方法の利点の１つは、アッセイに先立ち候補調整因子の特徴付けを行う必要がないことである；ユビキチンリガーゼ活性を増加または減少させる候補調整因子のみが同定される。加えて、当分野で周知のように、試験された化学的部分を本質的に同定するために、スプリット（split）合成反応を使用するコードタグを実施し得る。
【０１６５】
あるいは、好ましい実施態様では、細菌、真菌、植物および動物の抽出物形態における天然化合物のライブラリーを利用する。これらは入手可能であるか、または容易に作製できる。
【０１６６】
さらに、天然の、または合成により作製したライブラリーおよび化合物は従来の化学的、物理的、生化学的手段により容易に修飾される。公知の薬理活性物質は、酵素的修飾を含む所定のまたはランダムな化学修飾を受けて構造類似体を形成し得る。
【０１６７】
好ましい実施態様では、候補調整因子には、タンパク質、核酸、化学部分が含まれる。
【０１６８】
好ましい実施態様では、候補調整因子は、上記定義のようなタンパク質である。好ましい実施態様では、候補調整因子は天然産生のタンパク質または天然産生のタンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質またはタンパク質性細胞抽出物のランダムなもしくは所定の消化物を含む、細胞抽出物を、以下にさらに詳述するように試験し得る。このように、任意の数のユビキチンリガーゼ組成物に対するスクリーニングのために、原核生物および真核生物のタンパク質ライブラリーを作成し得る。本実施態様において特に好ましいのは、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類タンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０１６９】
好ましい態様では、候補調整因子は、約２ないし約３０のアミノ酸のペプチドであり、約５ないし約３０のアミノ酸のものが好ましく、約８ないし約２０のアミノ酸からなるものが特に好ましい。該ペプチドは上記に概説したような天然産生のタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または「偏りのある」ランダムペプチドであってもよい。本明細書において「ランダム化された」または文法的均等語は、各核酸およびペプチドが、それぞれ本質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般に、これらのランダムペプチド（または以下に論じる核酸）は化学的に合成されるので、いかなる位置にいかなるヌクレオチドまたはアミノ酸をも組み込める。この合成法は、ランダム化されたタンパク質または核酸を生成させ、配列全長にわたって、あり得る組合せのすべてまたは大部分の形成を可能にし、ランダム化されたタンパク質性候補バイオ活性物質のライブラリーを形成するよう設計することができる。
【０１７０】
特定のユビキチンリガーゼ酵素との相互作用を可能にするために十分と見込まれる範囲の多様性を達成するために、ライブラリーはランダム化された物質の、構造的に十分多様な集団を提供すべきである。従って、相互作用ライブラリーは、構成員の少なくとも１つが、ユビキチンリガーゼ酵素と相互作用する構造を持つよう、十分大きくなければならない。相互作用ライブラリーに要求される絶対的なサイズを測るのは難しいが、自然が免疫応答でヒントを与えてくれる。即ち、多様な１０7ないし１０8個の異なる抗体は、生物が直面する大部分のあり得る抗原と相互作用するに十分な親和性を有する少なくとも１つの組合せを与える。また、公表されているインビトロ選択技術も、１０7ないし１０8のライブラリーサイズが、標的への親和性を有する構造を見出すに十分であることを示している。本明細書で一般に提案されるものなど７ないし２０アミノ酸長のペプチドのすべての組合せに関するライブラリーは、２０7（１０9）ないし２０20をコードする可能性を有する。従って、１０7ないし１０8の異なる分子のライブラリーについて、本方法では、理論的に完全な相互作用ライブラリーの「実働」サブセットをアミノ酸７個と見積り、形態サブセットを２０20ライブラリーと見積もる。このように好ましい態様では、主題の方法において少なくとも１０6、好ましくは１０7、より好ましくは少なくとも１０8、最も好ましくは少なくとも１０9個の異なる配列が同時に解析される。好ましい方法はライブラリーのサイズおよび多様性を最大にする。
【０１７１】
ある実施態様では、ライブラリーは完全にランダム化され、いかなる位置にも優先のまたは一定の配列は存在しない。好ましい実施態様では、ライブラリーには偏りがある。即ち、配列内のある位置では一定であるか、または限られた数の可能性から選択される。例えば、好ましい実施態様では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏りのある（小さいか、または大きい）残基、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンもしくはヒスチジンの作出などに対して、またはプリンに対してといった所定のクラス内でランダム化される。
【０１７２】
好ましい実施態様では、偏りは既知のクラスの分子に相互作用するペプチドまたは核酸に向かっている。例えば、候補調整因子がペプチドである場合、細胞内シグナリングの多くが、ポリペプチドの短い領域を介して実行され、小さいペプチドドメインを通じて他のポリペプチドと相互作用していることが知られている。例えば、ＨＩＶ−１エンベロープ細胞質ドメインは、細胞のカルモジュリンの作用を妨害することが以前に示されている。ハチ類のマストパラン毒と相同性を有するＦａｓの細胞質ドメインの領域は、死を誘導するアポトーシスの機能か、Ｇタンパク質誘導の機能を有する短いペプチド領域に限定できる。Xenopus に由来する天然のペプチドであるマガイニン（magainin）は、強力な抗腫瘍および抗微生物活性を持つことができる。タンパク質キナーゼＣアイソザイム（βＰＫＣ）の短いペプチド断片は、Xenopus の卵母細胞において、刺激に続くβＰＫＣの核移行を妨害することが示されてきた。そして、短いＳＨ−３の標的ペプチドは、ＳＨ−３タンパク質の特異的結合の偽基質として使用されてきた。この分野の文献は濃密であるので、これは勿論、生物学的活性を有する入手可能なペプチドの短いリストである。従って、細胞内シグナリングカスケードにおいて活性を有する可能性の有る小ペプチドについて、多くの先例がある。加えて、いかなる数の分子のアゴニストおよびアンタゴニストも、同様に候補調整因子の偏りのあるランダム化のベースとして使用し得る。
【０１７３】
従って、いくつかの分子またはタンパク質のドメインが、偏りのある、ランダム化された候補調整因子の生成の開始点として適している。共通の機能、構造または親和性を付与する多数の小さい分子ドメインが知られている。加えて、当分野で周知のように、弱いアミノ酸相同性の領域に、強い構造的相同性があり得る。いくつかのこれらの分子、ドメインおよび／または対応するコンセンサス配列が知られており、それには、ＳＨ−２ドメイン、ＳＨ−３ドメイン、プレクストリン（Preckstrin）、デスドメイン、プロテアーゼ切断／認識部位、酵素阻害因子、酵素の基質、Ｔｒａｆなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１７４】
好ましい実施態様では、候補調整因子は核酸である。候補調整因子に関して、本明細書で「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的均等物は、一緒に共有結合されている少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、下記で概説されている通り、別の主鎖を有し得る核酸類似体が含まれ、例えばホスホルアミド（Beaucage et al., Tetrahedoron 49 (10) :1925 (1993) およびそれに記載された参考文献、Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970)、 Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977)、 Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986)、 Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984)、 Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)、 および Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986))、 ホスホロチオエート (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437(1991)、および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989)、Ｏ−メチルホスホルアミダイト連鎖（Eckstein、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、Oxford University Press 参照）、およびペプチド核酸主鎖および連鎖（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114：1895（1992）、Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992), Nielsen, Nature, 365: 566 (1993)、Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996) 参照、これら全てを引用して説明の一部とする）が含まれる。他の類似核酸には、正の主鎖（Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995))、非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号および第４，４６９，８６３号、Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30: 423 (1991)、Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988), Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide, 13: 1597 (1994)、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、"Carbohydrate Modifications in Antisense Research"、Y.S. Sanghui および P. Dan Cook 編、２および３章、Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994)、Jeffs et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994)、Tetrahedron Lett.37: 743 (1996)) および非リボース主鎖、例えば米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号、およびＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、"Carbohydrate Modifications in Antisense Research"、Y.S. Sanghui および P. Dan Cook 編 ６および７章に記載のもの、を伴うものがある。また、１個またはそれ以上の炭素環状糖類を含む核酸も核酸の定義内に含まれる（Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176 参照）。いくつかの核酸類似体は、Rawls、C & E News June 2, 1997 page 35 に記載されている。これらの参考文献は全て引用して説明の一部とする。リボース−リン酸主鎖のこれらの修飾は、標識のような付加部分の付加を容易にするため、あるいは生理的環境における上記分子の安定性および半減期を増加するために行ってもよい。
【０１７５】
当業者に認識されるように、これらの核酸類似体は全て本発明で使用され得る。さらに、天然産生の核酸と類似体の混合物が作成され得る。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然産生の核酸と類似体の混合物も作成され得る。
【０１７６】
特に好ましいのは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、それにはペプチド核酸類似体が含まれる。これらの主鎖は、大きく荷電した天然産生の核酸のホスホジエステル主鎖とは対照的に、中性条件下では実質的に非イオン性である。
【０１７７】
核酸は、明記されている通り１本もしくは２本鎖であるか、または２本鎖もしくは１本鎖の両配列の部分を含み得る。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、その場合核酸はデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの任意の組合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組合わせを含む。ここで使用されている、「ヌクレオシド」の語は、ヌクレオチド並びにヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌクレオシドを包含する。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然産生類似構造を包含する。従って、例えば各々塩基を含む、ペプチド核酸の個々の単位は、本明細書ではヌクレオシドと称する。
【０１７８】
一般にタンパク質に関して上記したように、核酸候補調整因子は天然産生の核酸、ランダム核酸、または「偏りのある」ランダム核酸であってよい。例えば、タンパク質に関して先に概説したように原核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化物を用いてもよい。最終的な発現産物が核酸である場合、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１５、最も好ましくは少なくとも２１のヌクレオチド位置がランダム化される必要があり、ランダム化が完全でない場合、より多いほうが好ましい。同様に、少なくとも５、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７アミノ酸位置がランダム化される必要がある；再度、ランダム化が完全でない場合、より多いほうが好ましい。
【０１７９】
好ましい実施態様では、候補調整因子は、有機部分である。この実施態様では、ＷＯ９４／２４３１４に一般的に記載されているように、候補物質は、化学的に修飾され得る一連の基質から合成される。本明細書における「化学的に修飾される」には、酵素反応と同様に従来の化学反応が含まれる。一般的に、これらの基質にはアルキル基（アルカン、アルケン、アルキンおよびヘテロアルキルを含む）、アリル基（アレーンおよびヘテロアリルを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環式化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、ベータ−ラクタム、テトラサイクリン、エファロスポリン（ephalosporin）および炭水化物を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エコヂソン（ecodysone）などを含む）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラーレ、ピロリジジンおよびマイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子を有する化合物、アミノ酸およびヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。化学反応（酵素反応を含む）は、後に本発明を使用して試験できる新しい基質または候補物質を形成するような部分で実施し得る。
【０１８０】
当業者に明らかなように、１タイプ以上の候補調整因子を同時にスクリーニングすることが可能である。従って、使用される候補調整因子のライブラリーには、１タイプの物質（即ち、ペプチド）のみか、または複数のタイプ（ペプチドおよび有機物質）が含まれ得る。いくつかの候補の同時アッセイは、以下でさらに説明する。
【０１８１】
本発明は、いくつかの成分を合わせることを含む方法および組成物を提供する。好ましい実施態様では、好ましい組合せは、タグ−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３である。好ましくは、タグは、標識、結合対のパートナー、または基質結合分子である。より好ましくは、タグは、蛍光標識または結合対のパートナーである。好ましい実施態様では、タグは結合対のパートナーであり、ユビキチンは、間接標識により標識される。間接標識の実施態様では、好ましくは、標識は、蛍光標識または標識酵素である。標識酵素を含む実施態様では、好ましくは、その酵素の基質は、蛍光生成物を産生する。好ましい実施態様では、標識酵素基質はルミノールである。好ましい実施態様では、合わせることは、標的タンパク質と成分を合わせることを特に除外する。
【０１８２】
別の好ましい実施態様では、好ましい組合せは、タグ１−ユビキチン、タグ２−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３である。好ましくは、タグ１およびタグ２は、標識、好ましくは蛍光標識であり、最も好ましくは、タグ１およびタグ２はＦＲＥＴ対を構成する。
【０１８３】
好ましい実施態様では、好ましい組合せは、タグ１−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびタグ２−Ｅ３である。好ましくは、タグ１は、標識、結合対のパートナー、または基質結合分子であり、タグ２は、別の標識、結合対のパートナー、または基質結合分子である。より好ましくは、タグ１は、蛍光標識または結合対のメンバーである。タグ１が結合対のメンバーである場合、好ましくは、タグ１は、間接標識される。さらにより好ましくは、タグ−１は、標識酵素で間接標識される。好ましくは、酵素の存在を明らかにするために使用される標識酵素基質は、蛍光生成物を産生し、より好ましくはルミノールである。ここで説明した組合せでは、好ましくは、タグ２は、表面基質結合要素、より好ましくはＨｉｓ−タグである。
【０１８４】
好ましい実施態様では、好ましい組合せは、タグ１−ユビキチン、Ｅ１およびタグ２−Ｅ２である。この実施態様では、好ましくは、タグ１は、標識、結合対のパートナー、または基質結合分子であり、タグ２は、異なる標識、結合対のパートナー、または基質結合分子である。より好ましくは、タグ１は、標識または結合対のメンバーである。タグ１が結合対のメンバーである場合、好ましくは、タグ１は、間接標識される。好ましい実施態様では、タグ１標識（直接または間接）は、蛍光標識または標識酵素である。タグ１標識（直接または間接）が標識 酵素である場合、好ましくは、酵素の存在を明らかにするために使用される反応基質は、蛍光生成物を産生し、より好ましくはルミノールである。ここで説明した組合せでは、好ましくは、タグ２は、基質結合要素、より好ましくはＨｉｓ−タグである。
【０１８５】
好ましい実施態様では、発明の組成物は、標的タンパク質を含まない。この実施態様では、ユビキチンは、既に考察したように唯一のユビキチン化基質である。この実施態様は、組成物の部分として標的タンパク質の添加を要する従来のユビキチン化酵素アッセイの対極に位置する。異なるＥ３とＥ２の組合せ、およびＥ３サブユニットの組合せは、特定の標的タンパク質に特異的であるため、本アッセイは用途がかなり広く、組合せが対象とする特定の標的タンパク質を最初に同定することなく、そのような組合せの多様化を可能にする。
【０１８６】
本組成物の成分は、様々な量で合わせ得る。好ましい実施態様では、ユビキチンは、反応溶液１００μｌにつき２０ないし２００ｎｇ、最も好ましくは、反応溶液１００μｌにつき約１００ｎｇの最終濃度で合わせられる。
【０１８７】
好ましい実施態様では、Ｅ１は、反応溶液１００μｌにつき１ないし５０ｎｇ、より好ましくは反応溶液１００μｌにつき１ｎｇないし２０ｎｇ、最も好ましくは、反応溶液１００μｌにつき５ｎｇないし１０ｎｇの最終濃度で合わせられる。
【０１８８】
好ましい実施態様では、Ｅ２は、反応溶液１００μｌにつき１０ないし１００ｎｇ、より好ましくは、反応溶液１００μｌにつき１０−５０ｎｇの最終濃度で合わせられる。
【０１８９】
好ましい実施態様では、Ｅ３は、反応溶液１００μｌにつき１ｎｇないし５００ｎｇ、より好ましくは反応溶液１００μｌにつき５０ないし４００ｎｇ、さらにより好ましくは反応溶液１００μｌにつき１００ないし３００ｎｇ、最も好ましくは、反応溶液１００μｌにつき約１００ｎｇの最終濃度で合わせられる。
【０１９０】
本発明の成分は、ユビキチンリガーゼ活性および／またはユビキチン化活性に有利な反応条件下で合わせられる。一般的に、これは、生理的条件である。インキュベーションは最適活性を促進するいかなる温度でも実施し得、典型的には４℃から４０℃の間である。インキュベーション期間は、最適活性のために選択するが、迅速な高処理スクリーニングを促進するのに最適化してもよい。典型的には、０.５から１.５時間の間で十分である。
【０１９１】
様々な他の試薬を、組成物に含めてもよい。これらには、最適なユビキチン化酵素活性を促進するため、および／または非特異的あるいはバックグラウンドの相互作用を低減するために使用される、塩、溶媒、緩衝液、例えばアルブミンなどの中性タンパク質、界面活性剤などの試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗生物質などの、他の方法でアッセイの有効性を改善する試薬も、使用され得る。組成物は、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）も含む。
【０１９２】
ユビキチンリガーゼ活性を増進するか、候補の調整因子の効果の同定を最適にするいかなる順序でも、成分の混合物を添加し得る。好ましい実施態様では、ユビキチンが反応緩衝液中に提供され、続いてユビキチン化酵素が添加される。別の好ましい実施態様では、ユビキチンが反応緩衝液中に提供され、次いで候補の調整因子が添加され、続いてユビキチン化酵素が添加される。
【０１９３】
一旦合わせると、本発明の好ましい方法は、Ｅ３に結合したユビキチンの量を測定することを含む。組合せがＥ３を欠く別の好ましい実施態様では、本発明の好ましい方法は、Ｅ２に結合したユビキチンの量を測定することを含む。当業者に理解されるように、測定の方式は、ユビキチンに付着した特定のタグによって決まる。当業者に明らかなように、結合したユビキチンの量は、ユビキチン化酵素に直接結合した特定のユビキチンタンパク質だけでなく、ポリユビキチン鎖中の特定のユビキチンに結合したユビキチンタンパク質も包含する。
【０１９４】
好ましい実施態様では、ユビキチン化が測定される。
【０１９５】
好ましい実施態様では、ユビキチンに付着するタグは、蛍光標識である。好ましい実施態様では、ユビキチンに付着するタグは、酵素標識または酵素標識で間接的に標識される結合対のメンバーである。この後者の好ましい実施態様では、酵素標識基質は、蛍光反応生成物を産生する。これらの好ましい実施態様では、結合したユビキチンの量は、発光により測定される。
【０１９６】
本明細書で使用するとき、「発光」または「蛍光放射」は、蛍光標識からの光子の放射を意味する。ＦＲＥＴ対が使用される実施態様では、蛍光測定は、継続的にか、またはライゲーション反応中の時点で行われる。そのような測定のための装置は市販されており、そのような測定をなすために、当業者によって容易に使用される。
【０１９７】
結合したユビキチンを測定する他の方式は当分野で周知であり、本明細書で説明した各々の標識について、同業者によって容易に同定される。例えば、放射性同位元素標識は、シンチレーション計測によって、または写真乳剤への露光後に濃度測定することによって、あるいは PhosphorImager のような装置を使用することによって、測定され得る。同様に、濃度測定は、酵素標識が使用される場合、不明瞭な生成物を産生する酵素標識基質との反応に続いて、結合したユビキチンを測定するために使用され得る。
【０１９８】
本発明の好ましい方法では、Ｅ３は、表面基質に結合している。標識のユビキチンへの結合について上記したように、これは直接行われてもよい。このことは、タグが表面基質結合分子である場合、タグ−Ｅ３を使用しても達成され得る。
【０１９９】
本発明の他の好ましい方法では、Ｅ２は、Ｅ３の非存在下で、表面基質に結合している。標識のユビキチンへの結合について上記したように、これは直接行われてもよい。このことは、タグが表面基質結合分子である場合、タグ−Ｅ２を使用しても達成され得る。
【０２００】
直前に説明した２つの好ましい実施態様では、Ｅ３およびＥ２は、各々タグ−Ｅ３およびタグ−Ｅ２の形態であり、表面基質結合分子タグを介して表面基質に結合している。一般的に、いかなる基質結合分子も使用できる。好ましい実施態様では、タグはＨｉｓ−タグであり、表面基質はニッケルである。好ましい実施態様では、ニッケル表面基質は、９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレートのウェル上に存在する。そのようなマルチウェルプレートは、市販されている。表面基質への酵素の結合は、結合したユビキチンを結合していないユビキチンから分離するのを促進する。本実施態様では、結合していないユビキチンは、ライゲーション反応に続いて、容易に容器から洗浄される。当業者に認識されるように、いかなる基質結合要素およびそれが結合する表面基質を有する容器の使用も、結合したユビキチンと結合していないユビキチンの分離を促進するのに効果的である。
【０２０１】
別の実施態様では、Ｅ３またはＥ２は、直接か、または基質結合要素を介して、ビーズに結合されている。 ライゲーションに続いて、結合していないユビキチンからビーズを分離し、結合したユビキチンを測定し得る。好ましい実施態様では、Ｅ３またはＥ２はビーズに結合されており、使用する組成物にはタグ−ユビキチンが含まれ、タグは蛍光標識である。この実施態様では、結合したユビキチンを伴うビーズは、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）機を使用して分離され得る。そのような使用方法は、全体を本明細書の一部とする米国特許出願番号０９／０４７,１１９に記載されている。次いで結合したユビキチンの量を測定できる。
【０２０２】
他の実施態様では、いかなるユビキチン化酵素も基板に結合していない。好ましくは、この実施態様では、組成物は、タグ１−ユビキチン、タグ２−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を含む。好ましくは、タグ１およびタグ２は、標識、好ましくは蛍光標識であり、最も好ましくは、タグ１およびタグ２は、ＦＲＥＴ対を形成する。この実施態様では、ユビキチン化は、蛍光放射スペクトルを測定することによって測定される。この測定は、継続的であるか、または成分の組合せに続いて１回またはそれ以上の回数であってもよい。ライゲーションしていないユビキチンと比較した、組合せの蛍光放射スペクトルの変化が、ユビキチン化の量を示す。この実施態様では、ポリユビキチンの形成を通じて、および／またはタンパク質、好ましくは標的タンパク質の近くの場所に結合することにより、ＦＲＥＴ対の異なるメンバーを有するユビキチンが近傍にもたらされることから、蛍光放射スペクトルの変化がもたらされることを、当業者は認識するであろう。
【０２０３】
好ましい実施態様では、発明の組成物は、ユビキチン化調整因子を同定するために使用される。この実施態様では、組成物には、候補の調整因子が含まれる。好ましい実施態様では、測定されたＥ３へのタグ−ユビキチンの結合の量および／または速度を、組成物に候補の調整因子が存在しない場合のものと比較し、かくして、ユビキチンリガーゼ活性に対して効果のある調整因子の有無が判定される。この実施態様では、調整因子がユビキチン化を増強するか、阻害するかも判定される。
【０２０４】
好ましい実施態様では、候補の調整因子を含有する発明の組成物は、Ｅ３を欠き、Ｅ２へのユビキチン結合の量および／または速度が測定される。この実施態様は、Ｅ３と候補の調整因子の両方を欠く組成物中の、Ｅ２へのユビキチン結合の量および／または速度を比較する段階を含んでもよく、かくしてＥ３以外のユビキチン化酵素に対する候補の調整活性が判定される。好ましい実施態様では、候補の調整因子の存在および非存在下でＥ２に結合したユビキチンの量における差異の割合を、候補の調整因子の存在および非存在下でＥ３に結合した量における差異の割合と比較し、かくして酵素カスケード中で候補の調整因子の効果がある箇所を判定する。つまり、候補の調整因子がＥ３ユビキチンリガーゼ活性に影響するのか、またはＥ１ユビキチン活性化活性および／またはＥ２ユビキチン接着活性に影響するのかが判定される。
【０２０５】
他の好ましい実施態様では、発明の組成物は、ユビキチン化調整因子の同定に使用される。この実施態様では、組成物には、候補の調整因子が含まれる。タグ１およびタグ２がＦＲＥＴ対を形成する好ましい実施態様では、測定された（ポリユビキチンおよび／または標的タンパク質に結合したユビキチンとしての）基質タンパク質へのタグ１−ユビキチンおよびタグ２−ユビキチン結合の量および／または速度を、候補の調整因子の非存在下でのそのような量または速度と比較し、かくしてユビキチンリガーゼ活性に対する調整因子の効果の有無を判定する。この実施態様では、調整因子がユビキチン化を増強するか、阻害するかも判定される。
【０２０６】
好ましい実施態様では、多数のアッセイを、高処理量スクリーニングシステムにおいて同時に実施する。この実施態様では、９６ウェルプレートまたは他のマルチウェルプレートのウェルなどの多数の容器中で、多数のアッセイを実施してもよい。当業者に認識されるように、そのようなシステムを、多数の候補の調整因子、並びに／またはＥ３成分および／もしくはＥ２−Ｅ３対の多数の組合せのアッセイに適用し得る。好ましい実施態様では、本発明は、異なるＥ２−Ｅ３対および／または異なるＥ３成分の組合せのユビキチンリガーゼ活性を判定するための、高処理量スクリーニングシステム中で使用される。別の好ましい実施態様では、本発明は、個々の候補の調整因子の効果を同時に試験するための、高処理量スクリーニングシステム中で使用される。
【０２０７】
他の態様では、本発明は、混合物中でユビキチン化活性またはユビキチン化酵素活性をアッセイする方法を提供する。ユビキチン化が起こり得る条件下で、ユビキチンを細胞またはタンパク質の混合物、好ましくは細胞抽出物中に導入する。この実施態様では、ユビキチンはタグ１−ユビキチンおよびタグ２−２−ユビキチンの形態であり、タグ１とタグ２はＦＲＥＴ対を構成するか、タグ１は蛍光標識であり、かつタグ２はタグ１のクエンチ剤である。ユビキチン化活性が混合物または細胞中に存在するか否かを示すものとして、蛍光放射スペクトルを測定する。好ましい実施態様では、ユビキチンもまた、ＦＬＡＧなどの結合対のメンバーを含む。この後者の実施態様では、抗ＦＬＡＧ抗体で被覆した蛍光ビーズや、抗ＦＬＡＧ抗体を使用するアミノ沈殿、または固体支持体に付着した抗ＦＬＡＧ抗体を使用するような、多数の親和性をベースとする分離手段のいずれかを使用して、ユビキチン化に関わる成分を混合物から単離できる。細胞または混合物のユビキチンに結合した成分を分離する他の方法は、当業者にとって容易に分かる。この方法で分離される、ユビキチンが結合している成分には、Ｅ３および標的タンパク質が含まれる。当業者は、個々の同定または続く研究のためにこれらの成分を分離することは、ＨＰＬＣまたは電気泳動のような当分野で周知のいくつかの手段で成し得ることを認識するであろう。
【０２０８】
本発明で提供されるアッセイの段階は、順序を変えられることが、当業者に理解される。しかしながら、様々な選択可能なもの（成分、選択される特性または段階の順序）が本発明で提供されるが、選択可能なものは各々独立で提供され、各々他の本発明で提供される選択可能なものから個々に分けられることも理解される。さらに、アッセイの感度を上昇させることが当分野で明白かつ既知の段階は、本発明の範囲内にあると企図されている。例えば、付加的な洗浄段階、ブロッキング段階などがあり得る。
【０２０９】
以下の実施例は、上記の発明を使用する様式をより詳細に説明するのに役立ち、同時に発明の様々な態様を実行するために企図される最良の方式を記載する。これらの実施例はいかなる方法でも本発明の真の範囲を限定するために役立たず、むしろ例示説明の目的で提示されていることが理解される。本明細書で引用した全参照文献の全体を、出典明示により本明細書の一部とする。
【０２１０】
実施例
実施例１
Ｅ２、Ｅ３およびユビキチンの産生
Ｅ２の産生
Ｅ２（Ｕｂｃ５Ｃ）のオープン・リーディング・フレームをＰＣＲで増幅させ、ｐＧｅｘ−６Ｐ−１ E. Coli. 発現ベクター（Amersham Pharmacia）中に、ＧＳＴ−タグにインフレームで融合したＮ末端を伴うＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングした。
【０２１１】
材料と方法
プラスミドをＢＬ２１ ＤＥ３コンピテント E. coli (Stratagene, cat # 230132）に形質転換した。細胞を３７℃でＴＢ＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンおよび０.４％グルコース中でＯＤ６００約０.６まで増殖させ、３２０ｕＭ ＩＰＴＧの添加で誘導し、回収前にさらに３時間増殖させた。沈殿を冷ＰＢＳで１回洗浄し、約６倍量の溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％グリセロール、０.５Ｍ Ｎａｃｌ、２.５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＴＣＥＰプラス、コンプリート−ＥＤＴＡフリー・プロテアーゼ阻害剤錠剤（１錠／再懸濁細胞２５ｍｌ）、ｐＨ８.０）中で再懸濁した。懸濁液をホモジェナイズし、３ｘ３０秒超音波破砕し、次いで最終濃度０.５％でＮＰ４０を添加し、チューブを３０分間４℃で揺らした。２５ないし３０分間の１１０００ｒｐｍでの遠心分離に続いて、上清を、最初の培養量１００ｍｌにつきビーズ１ｍｌの割合の Glutathione Sepharose 4B (Amersham, cat # 170756-01）と共に、穏かに揺らしながら１ないし２時間、４℃でインキュベートした。ビーズを沈殿させ、１０ベッド量の溶解緩衝液で１回洗浄し、次いで１０ベッド量の Prescission Protease 緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｌｍＭ ＤＴＴ、０.１％ＮＰ−４０、ｐＨ７.０）で２回洗浄した。Prescission Protease (Amersham, product # 27-0843）をＧＳＴレジン１ｍｌにつき８０ｕｌ（１６０ユニット）の割合で添加し、４時間４℃でインキュベートした。切断されたＥ２タンパク質を含有する上清を採集し、レジンを１ベッド量の Prescission 緩衝液で２回洗浄した。３分画全部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、適切ならば貯蔵した。
【０２１２】
ユビキチンの産生
ユビキチンを、ＰＣＲによって、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてpFlag-Mac Expression Vector (Sigma）中にクローニングした。このことにより、E. Coli. 内のアミノ末端Ｆｌａｇ融合のユビキチンの発現に至る。
【０２１３】
材料と方法
タンパク質発現の誘導および細胞溶解は、上清を最初の培養１Ｌにつきビーズ１５ｍｌの割合でＦＬＡＧ親和性レジン (VWR, cat # IB 13020）に載せることを除いては、上記のＧＳＴ−Ｅ２の調整と同様であった。次いでレジンを１０ベッド量の溶解緩衝液で洗浄した。１００ｍＭ酢酸、１０％グリセロール、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭＥＤＴＡ、０.１％ＮＰ−４０、ｐＨ３.５を用いて、タンパク質をカラムから抽出した。ｐＨを中性にするための１／１０量の２Ｍ Ｔｒｉｓ、８０ｍＭ Ｂ−ＭＥ、ｐＨ９.０の入ったチューブに、抽出物を１ベッド量分画として採集した。抽出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、適切な分画を貯蔵し、４００倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％グリセロール、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０で透析した。
【０２１４】
Ｅ３の産生
Ｅ３複合体のコード領域もＰＣＲによって増幅され、Bac-to-Bac システム (GibcoBRL）を使用してバキュロウイルスを生成させた。Ｅ３は２個のサブユニットを含み、それらは同一のＨｉ−５昆虫細胞中の２つのバキュロウイルスによる共感染によって発現された。サブユニットの一方にはＨｉｓ−タグを付け、他方の会合するサブユニットにはタグを付けなかった。
【０２１５】
詳細な方法は、GibcoBRL による Bac to Bac Baculovirus Expression システムに従って行った。例えば、ＲＯＣ１を pFastBacHtb ベクター中にＮ末端のＨｉｓ６−タグと共にクローニングし、一方ＣＵＬ１を pFastBac1 ベクターに融合タグなしでクローニングした。転位およびＳＦ−９細胞への バクミド（Bacmid）ＤＮＡの形質転換の後、バキュロウイルスを回収し、増殖させ、タンパク質発現用にＨｉ−５細胞に共感染させるために使用した。
【０２１６】
材料と方法
細胞を回収し、冷ＰＢＳで１回洗浄し、約６倍量の溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０％グリセロール、０.５Ｍ Ｎａｃｌ、１５ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＴＣＥＰプラス、コンプリート−ＥＤＴＡフリー・プロテアーゼ阻害剤錠剤（１錠／再懸濁細胞２５ｍｌ）、ｐＨ８.０）中で再懸濁した。次いで懸濁液を３ｘ３０秒超音波破砕し、続いて最終濃度０.５％のＮＰ４０を添加し、３０分間４℃でインキュベートした。溶解液を遠心分離し、予め平衡化した（溶解緩衝液＋ＮＰ４０）Ni-NTA Agarose ビーズ（Qiagen, cat # 1000632）と共に上清を１ないし２時間インキュベートした。沈殿させたビーズを溶解緩衝液で２回洗浄し、１ないし２倍量の溶解緩衝液中で再懸濁し、抽出用に使い捨てカラムに移した。抽出は、溶解緩衝液＋２５０ｍＭイミダゾールのアリコート５Ｘ１ベッド量を使用して達成された。抽出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、適切な分画を貯蔵した。次いで脱塩カラムまたは遠心濃縮装置（大容量によく使用される）のどちらかを使用して、抽出貯蔵物を脱塩した。遠心装置を使用する場合、イミダゾールを含まない溶解緩衝液で抽出貯蔵物を１：１に希釈し、容積が半分に減るまで、適切な速度で回転させた。この時点で等量の新しい緩衝液を添加し、装置を再回転させた。これを全部で４回行い、３２倍の交換に至った。
【０２１７】
実施例２
ユビキチン接着アッセイ
Ｅ１＋Ｅ２のユビキチン接着活性を、E. coli. から精製したＦｌａｇ−ユビキチンと、E. coli. からＨｉｓ−Ｕｂｃｈ５ｃとして精製したＥ２、Ｕｂｃｈ５ｃを用いて、次のプロトコールを使用して測定した。
【０２１８】
材料と方法
次の方法を、ユビキチン接着を測定するアッセイに使用した。Nickel-substrate 96-well plate (Pierce Chemical) のウェルを１００μｌの１％カゼイン／リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で１時間、室温でブロックし、次いで２００μｌのＰＢＳＴ（０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ中）で３回洗浄した。各ウェルに以下のＦｌａｇ−ユビキチン（上記参照）反応溶液を添加した。
【表２】
0004095805.tif 000003
緩衝溶液を、ミリポア濾過水で最終体積８０μｌにし、続いて１０μｌのＤＭＳＯを添加した。
【０２１９】
次いで上記の溶液に、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７.５中のＥ１、Ｈｉｓ−Ｅ２を１０μｌ、および５％グリセロールを添加した。Ｈｉｓ−Ｅ２は上記の通り作成した。Ｅ１は購入した (Affiniti Research Products, Exeter, U. K.）。以下の量の各酵素をこれらのアッセイに使用した：５ｎｇ／ウェルのＥ１；２５ｎｌ／ウェルのＥ２。次いで反応を室温で１時間進行させた。
【０２２０】
ユビキチン接着反応に続いて、ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。酵素に結合したユビキチンの測定には、ＰＢＳＴ中のマウス抗Ｆｌａｇ（１：１０,０００）および抗マウスＩｇ−ＨＲＰ（１：１５,０００）１００ｕｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、続いて１００μｌのルミノール基質（１／５希釈）を添加した。次いで、各ウェルの発光を蛍光計で測定した。
【０２２１】
結果
ユビキチン活性化および接着活性
図１Ａは、上記のように、Ｅ１単独およびＥ１＋ｈｉｓ−Ｅ２について測定された発光を示す。
【０２２２】
実施例３
ユビキチンリガーゼアッセイ
Ｅ１＋Ｅ２＋Ｅ３のユビキチンリガーゼ活性を、E. coli. から精製したＦｌａｇ−ユビキチン、E. coli. からＧＳＴ−Ｕｂｃｈ５ｃとして精製し、ＧＳＴタグを除去したＥ２であるＵｂｃｈ５ｃ、およびバキュロウイルスの共感染によってＨｉ−５細胞から精製したＥ３であるＨｉｓ−ＲＯＣ／Ｃｕｌ１複合体を用いて、次のプロトコールを使用して測定した。このアッセイを、ユビキチンリガーゼ活性に対する候補の調整因子の効果を示すのにも使用した。
【０２２３】
材料と方法
Nickel-substrate 96-well plate (Pierce Chemical) のウェルを１００μｌの１％カゼイン／リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で１時間、室温でブロックし、次いで２００μｌのＰＢＳＴ（０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ中）で３回洗浄した。各ウェルに以下のＦｌａｇ−ユビキチン（上記参照）反応溶液を添加した。
【表３】
0004095805.tif 000004
緩衝溶液を、ミリポア濾過水で最終体積８０μｌにした。
【０２２４】
ユビキチンリガーゼ活性の調整因子の同定を対象にするアッセイには、ＤＭＳＯ中の候補の調整因子化合物１０μｌを、次いで溶液に添加した。候補の調整因子を添加しないならば、１０μｌのＤＭＳＯを溶液に添加した。
【０２２５】
次いで上記の溶液に、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７.５中のユビキチン化酵素１０μｌ、および５％グリセロールを添加した。Ｅ２−Ｕｂｃ５ｃおよびＥ３−ＨｉｓＲＯＣｌ／Ｃｕｌ１は上記の通り作成した。Ｅ１は購入した (Affiniti Research Products, Exeter, U. K.）。以下の量の各酵素をこれらのアッセイに使用した：５ｎｇ／ウェルのＥ１；２５ｎｌ／ウェルのＥ２；および１００ｎｇ／ウェルのＨｉｓ−Ｅ３。次いで反応を１時間室温で進行させた。
【０２２６】
ユビキチン化反応に続いて、ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。酵素に結合したユビキチンの測定には、ＰＢＳＴ中のマウス抗Ｆｌａｇ（１：１０,０００）および抗マウスＩｇ−ＨＲＰ（１：１５,０００）１００ｕｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、続いて１００μｌのルミノール基質（１／５希釈）を添加した。次いで、各ウェルの発光を蛍光計で測定した。
【０２２７】
結果
ユビキチンリガーゼ活性
図２は、いくつかの異なるユビキチン化酵素の組合せについて測定された発光を示す。これらの実験では、Ｅ３のみがＨｉｓ−Ｅ３の形態であった。発光の測定は、アッセイが、反応中に３種全部のユビキチン化酵素の存在を必要とするユビキチン化酵素カスケード全体の活性を特異的に測定することを示す。
【０２２８】
組成物成分の多様性
図３Ａは、上記方法において、ＤＭＳＯの存在下および非存在下でＥ１の量を変化させることの、ユビキチンリガーゼ活性に対する相対的効果を示す。他の組成物成分が上記詳述のまま保たれるとき、１００μｌの反応溶液につき約１０ｎｇの添加によって、最大のユビキチンリガーゼ活性が得られた。ＤＭＳＯの存在は、ユビキチン化酵素の活性に有意に影響しなかった。
【０２２９】
反応組成物のＥ３およびユビキチンの濃度を変化させることの相対的効果を、図３Ｂに示す。一般的に述べると、最大のユビキチンリガーゼ活性は、各ユビキチン濃度で１００μｌにつき２００ないし３００ｎｇのＥ３で得られ、一方ユビキチン濃度の上昇は、各Ｅ３の濃度で一般的にユビキチンリガーゼ活性を増加させた。
【０２３０】
１％のカゼインでウェルをブロックすることにより、ブロッキングしない場合や５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でのブロッキングに対して、シグナル対ノイズ比が改善されることも見出された。５％ＢＳＡあるいは１％カゼインでウェルを前処理するか、または何もせず、その後に、上記のようにＨｉｓ−Ｅ３以外の全成分を合わせ、生じる蛍光を測定した後、バックグラウンドを判定した。結果を図４に示す。
【０２３１】
ユビキチンリガーゼ活性の調整因子の同定
アッセイがユビキチンリガーゼ活性調整因子の同定に有用であることを示すために、いくつかの候補の調整因子を様々な濃度で上記のアッセイ成分と合わせた。図５は、２種の同定されたユビキチンリガーゼ活性の調整因子による結果を示す。調整因子は、Ｅ３成分としてＲＯＣ１／Ｃｕｌ１またはＲＯＣ２／Ｃｕｌ５のいずれかを含むユビキチン化酵素組成物のユビキチンリガーゼ活性を、用量依存的様式で低減させた。
【０２３２】
上記のように、Ｅ１、Ｅ２およびＨｉｓ−Ｅ３を含有するか、またはＥ１、Ｈｉｓ−Ｅ２を含有しＥ３を欠くかのいずれかの反応組成物に対するユビキチンリガーゼ活性調整因子の効果を比較することにより、調整因子がＥ３か、Ｅ３以外の酵素かどちらに影響するのかが示される。図６Ａでは、同定された調整因子はＥ３の存在下でユビキチンリガーゼ活性を減少させたが、Ｅ３の非存在下では活性を変化させず、このことは調整因子がＥ３リガーゼ活性に特異的に効果を有することを示している。対照的に、他の調整因子についての図６Ｂに示す結果は、この化合物はＥ３が存在するか否かに関わらず活性を減少させることを明らかにし、この調整因子がＥ３以外のユビキチン化酵素カスケードのメンバーに影響することを示している。
【０２３３】
実施例４
ライゲーションされたユビキチンのＦＲＥＴ分析
ユビキチンを調整し、ＥＤＡＮＳまたはフルオレセインのいずれかで標識し、これらの標識の各々の蛍光と、ＦＲＥＴ対としてのこれらの相互作用を測定して、標識されたユビキチンのＥ３への結合と、結合したユビキチンのＦＲＥＴ活性を示した。
【０２３４】
材料と方法
ＦＬＡＧ−Ｃｙｓ−ユビキチンを産生するためのプライマー
【化１】
0004095805.tif 000005
またはＦＬＡＧ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ユビキチンを産生するためのプライマー
【化２】
0004095805.tif 000006
のいずれかを使用して、部位特異的突然変異導入法によりＦＬＡＧ−ユビキチン配列にＣｙｓ残基を組込んで、ユビキチンを産生した。タンパク質を上記のように発現、精製した。
【０２３５】
フルオレセイン５−マレイミド（maleimide）（放射ピーク５１５ｎｍ）または１,５−イオドアセタミド（iodacetamide）ＥＤＡＮＳ (ＩＡＥＤＡＮＳ；放射ピーク４９０ｎｍ）のいずれかを、上記のように産生したユビキチンのシステイン上のチオール基と反応させて、チオエーテルを形成させた。標識化は、１ｍＭＴＣＥＰを含むＰＢＳ中で実施した。標識されたタンパク質を、ゲル濾過によって遊離の標識から分離した。
【０２３６】
ユビキチンリガーゼアッセイを、少しの修正を加えて実質的に上記の通りに実施した。反応ウェル中でニッケル基質を使用せず、従って全成分は溶液中で遊離であった。等量のフルオレセイン標識ユビキチンとＩＡＥＤＡＮＳ標識ユビキチンを使用した。反応は、１００−１５０μｌの量で、室温で２時間実施し、その後５０μｌの０.５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８で停止させた。
【０２３７】
反応に続いて、１ｍＭＴＣＥＰを含むＰＢＳ中、蛍光放射検出を用いる Superdex-75 HR 10/30 サイズ除去カラム上で、ＨＰＬＣによって生成物を分離した。より大きい分子量を区別するゲル濾過カラム（例えば、Superdex 200 HR 10/30）を、個々のライゲーション種を分離するために使用できる。
【０２３８】
結果
フルオレセイン標識ユビキチンとＩＡＥＤＡＮＳ標識ユビキチンは、ほぼ等量でＥ３に結合した。両発蛍光団で標識した遊離の（ライゲーションしていない）ユビキチンと、Ｅ３に結合したユビキチンからの蛍光放射スペクトル分析の比較によって、５１５ｎｍ対４９０ｎｍの放射比における顕著な増加が示された（図１７）。このことは、ライゲーションされたユビキチンにおいて、異なるユビキチン分子上の発蛍光団が、ＦＲＥＴが測定されるのに十分なほど近くにあることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ユビキチン活性化および接着アッセイにおける、蛍光で標識されたユビキチンの相対量を示す。
【図２】  ユビキチン化酵素の様々な組合せから生じる、ユビキチンリガーゼ活性の相対量を示す。
【図３】  ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を合わせるアッセイにおける、相対的なユビキチンリガーゼ活性を示す。
【図４】  Ｆｌａｇ−ユビキチンおよびＨＲＰに接着した抗Ｆｌａｇ／抗マウス抗体およびルミノール蛍光ＨＲＰ基質を利用するユビキチンリガーゼ活性のアッセイにおける、蛍光標識のシグナル対ノイズ比を示す。
【図５】  ２つの異なるＥ３酵素を用いてユビキチンリガーゼ活性を測定するアッセイにおける、２つのユビキチンリガーゼ活性調整因子の濃度依存的効果を示す。
【図６】  Ｅ１、Ｅ２およびＥ３の組合せおよび酵素Ｅ１およびＥ２の組合せについて、２つの候補のユビキチンリガーゼ酵素調整因子の存在下および非存在下での、ユビキチンリガーゼ活性およびユビキチン接着活性の割合を示す。
【図７】  ユビキチンリガーゼ活性およびユビキチン接着活性に対する、２つの候補のユビキチンリガーゼ調整因子の濃度依存的効果を示す。
【図８】  ウサギＥ１をコードする核酸配列およびウサギＥ１のアミノ酸配列を示す。
【図９】  Ｅ２のＵｂｃ５ｃをコードする核酸配列およびＥ２のＵｂｃ５ｃのアミノ酸配列を示す。
【図１０】  ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＡＰＣ１１のアミノ酸配列を示す。
【図１１】  ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＲＯＣ１のアミノ酸配列を示す。
【図１２】  ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＲＯＣ２をコードする核酸配列およびＲＯＣ２のアミノ酸配列を示す。
【図１３】  キュリンＣＵＬ５をコードする核酸配列およびＣＵＬ５のアミノ酸配列を示す。
【図１４】  キュリンＡＰＣ２をコードする核酸配列およびＡＰＣ２のアミノ酸配列を示す。
【図１５】  ヒトユビキチン、Ｆｌａｇ−ユビキチン、およびＦｌａｇ−Ｃｙｓ−ユビキチンのアミノ酸配列を示す。
【図１６】  ＦＲＥＴ発蛍光団で標識されたＦｌａｇ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ユビキチンの、Ｅ３−ユビキチン複合体へのＥ３依存的組込みを示す。
【図１７】  ３３６ｎｍでの励起下で、ＦＲＥＴ供与体／受容体対であるＥＤＡＮとフルオレセインで標識された遊離ユビキチンの蛍光放射スペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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