(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子が膠原線維のフラグメントからなり、粒子の由来する天然の組織材料の分子構造と元の構造とを保存するのに十分に大きく、
膠原材料が非線維組織蛋白質、糖蛋白質、細胞成分および脂質または脂質残渣を実質的に含まず、かつ非細胞毒性である、
天然の組織材料から由来する膠原材料の粒子を分散した生物学的適合性担体媒体からなるインプラント組成物。
【請求項２】
膠原材料が、抗原性多糖類およびムコ多糖類を含まないか、または実質的に含まない請求項１による組成物。
【請求項３】
生物学的適合性媒体が、生理食塩水、デキストラン溶液もしくはグリセロールまたは非毒性抗原性粘着性多糖類である請求項１または２による組成物。
【請求項４】
膠原材料が、エラスチンの一部を含有する請求項１〜３のいずれか一つによる組成物。
【請求項５】
膠原材料が、架橋されている請求項１〜４のいずれか一つによる組成物。
【請求項６】
膠原材料の粒子の粒度が、５０〜５００ミクロンの範囲内である請求項１〜５のいずれか一つによる組成物。
【請求項７】
固体の濃度が、１０〜７０重量パーセントであり、組成物の粘稠度が、注射により投与されうるようなものである請求項１〜６のいずれか一つによる組成物。
【請求項８】
組成物が、糊状粘稠性である請求項１〜７のいずれか一つによる組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は膠原組織組成物に関する。
近年、創傷治療用および、一般使用や形成外科、特に、手術により引き起こされた損傷の改善回復用または、例えば、尿失禁の場合の尿道括約筋の生理学的不調の矯正のための組成物ならびに製剤の開発がしばしば注目されている。
【０００２】
ヒトまたは動物基原のいずれかの膠原をベースとする材料の供給に、多くの注目がなされている。特に、かなりの注目が、処理されて適合性を備える、すなわちヒトに用いたときに組織の拒絶反応を避ける、動物組織をベースとする製剤および材料の開発に向けられている。
【０００３】
本出願の発明者による初期の研究は、米国特許明細書第５３９７３５３号および欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−１８２８４２号中に反映されており、それらは、好ましくはシートの形態の、移植に適する膠原材料の製造法を開示している。拒絶されないように非抗原性であり、かつ永久移植を形成するために非再吸収性である膠原材料を製造するために設計されている。特に、これらの明細書中に記述された材料は、天然構造および天然組織の元の構造を保持しており；膠原の分子超構造は保持される。これらの材料は、実際問題として大いに満足のいくものであることが示され、一旦移植されるとそれら自体が再血管新生されることが可能であり、一方同時に、石灰化に抵抗性であることが特に示された。それらは特に耳、鼻および咽喉、整形外科的、婦人科的および泌尿器科的処置ならびにパラストマル（parastomal）切開創ヘルニアおよび鼠径ヘルニアを含む幅のあるヘルニア回復において有用である。
【０００４】
米国特許明細書第５３９７３５３号に記述の組成物は、しかし、例えば、０．７５ｍｍ厚さのような大スケール構造として開示されており、通常２５ｃｍ2〜５０ｃｍ2のサイズで変化するシートとして表される。これは、例えば回復手術の間のような特定な移植用途には有用であるが、軟組織を構築するのに通常用いるのに常に適しているわけではない。
【０００５】
例えば小型ざ瘡瘢痕の修復のため、およびしわを隆起させ平坦にするための整容手術および再建手術においては、組織移植用の別の形態の材料を用いるか、または所望の部位に注射もしくは導入されうる、いわゆる増強を用いることがしばしば望ましい。
【０００６】
様々ないわゆる注射可能なインプラント材料が、そのような目的のために開発されている。米国特許明細書第５５２３２９１号、第５６７６６９８号および第５７０５４８８号には、エラスチンおよび膠原および生体適合性担体からなる軟組織強化用の注射可能なインプラント組成物、またはそのような材料を含む柔軟なパウチが開示されている。しかし、これら米国明細書に開示されているような、そのような材料に伴う困難は、再吸収されやすいことであり、このことは、移植が限定された時間の間のみに効果的であることを意味する。そのうえ、そのような材料は血管新生を促進せず、すなわち、それらは移植後に周囲の健康的な組織によく溶け込まない。
【０００７】
さらに、例えば射創または機械もしくは乗物事故により生じた傷害および実際に続く切開傷害を修復するための創傷手術において、その組織が創傷領域から失われるという問題がしばしば存在する。これにより瘢痕が生じ、過形成されて醜くなり、身体機能を損なう。
【０００８】
瘢痕は、傷害に対する成体結合組織の生体応答から生じる。誕生後に新しい真皮を再生して、失われた／損傷を受けた組織を取りかえることにより（すなわち、正常な皮膚膠原構造を有する皮膚膠原線維で欠陥を連結すること）切開または傷害に応答する胎児組織とは異なり、同等な創傷は、再生されるよりもむしろ修復され、その創傷は瘢痕組織で満たされる。したがって、誕生後の連結組織は元の正常な皮膚構造を繰り返さない。修復工程の間、線維芽細胞（全ての結合組織を透過し、構造的な膠原を含む細胞外基質を産生する細胞）および小血管が創傷空間へ移動し、細胞質の肉芽組織を大いに形成し、その組織が、瘢痕組織で記述したように濃密で不規則に組織化された膠原腫瘤に変換される。
【０００９】
この特定な組織損失問題の一つの解決法は、いわゆる組織特有の（hystiotypic）皮膚の成長のためのマトリックス網目として実質的に機能する創傷の遺失組織領域内に３次元の膠原ゲルを貼りつけることである。この特定なゲルを形成するのに用いられる膠原は、完全に水溶性であり、貼りつけたときに、線維芽細胞および小血管に侵入され、水が押出され、もろいゲルが形成し、その中で膠原分子が重合して膠原細線維を形成する。最初の創傷の周囲の領域に遺失組織を再建することにおいて合理的に成功したが、膠原ゲルから形成した最初の３次元マトリックスは、身体の天然組織の正常なマトリックス構造を繰り返さず、ゲルそれ自体は本来の安定性を有さない。この本来の不安定性により、ゲルが身体に迅速に再吸収され、瘢痕様組織で置きかえられる。
【００１０】
瘢痕組織形成の問題を克服するための他の最近の提案には、形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）のような成長因子の作用を抑制するために、非常に困難な（かつ非常に高価な）モノクローナル抗体の使用が含まれている。
【００１１】
我々は、ここに、驚いたことに、創傷フィルターとして用いられうるか、または整容手術および再建手術で用いるための注射可能な形態で用いられうる膠原材料が、成形可能な形態で構築の線維フラグメントレベルにおいて存在すると保持され得る、明細書第５３９７３５３号に開示された大スケールの構造の特性となる、再吸収に対する抵抗性、石灰化、肉芽形成に対する抵抗性、および再小区画され（recellularized）かつ再血管新生化される能力を含む好ましい特性が維持されることを見出した。
【００１２】
したがって、おおまかには、本発明により、
粒子が膠原線維のフラグメントからなり、したがって、粒子の由来する天然の組織材料の分子構造と元の構造とを保存するのに十分に大きく、
膠原材料が非線維組織蛋白質、糖蛋白質、細胞成分および脂質または脂質残渣を実質的に含まず、かつ非細胞毒性である、
膠原材料の粒子を分散した生物学的適合性担体媒体からなるインプラント組成物が提供される。その材料が、抗原性多糖類およびムコ多糖類を含まないか、または実質的に含まないのが好ましい。生物学的適合性担体媒体は、例えば、生理食塩水またはデキストランもしくはヒアルロン酸溶液であってもよい。
【００１３】
そのような組成物は、粘稠度において非常に広く異なってもよい。例えば、生体的適合性媒体中の粒度および濃度が、明瞭な懸濁液を生じるようなものであるとき、これは粒子が大きすぎなければ注射可能である。より濃縮した濃厚な粘稠性組成物を、糊状創傷充填組成物として用いてもよい。
【００１４】
本発明の膠原材料の粒子が由来するそのような膠原材料は、ヒトまたは動物起源の膠原材料、好ましくはブタの皮膚から米国特許第５３９７３５３号明細書に開示の方法またはそれに類似の方法により製造することができる。出発材料次第で、組成物はエラスチンの一部を含有してもよい。そのとき、注意すれば大きい片から小さい片へ材料を縮小させることができ、それは滅菌の注射可能な組成物または滅菌の創傷重点パスタ剤に製剤化することができる。
【００１５】
適当な密度および流動学的物性（流量および成形後の形を保つ能力）を有する膠原パスタ剤を製造するために、適当な担体中の膠原粒子の懸濁液を製造し、制御可能な濃度の組成物を形成することができる。
【００１６】
しかし、出発材料のサイズ縮小は最初の材料の分子構造の崩壊を伴わないことを確実にするよう用心しなければならない。適当なサイズの粒子を供給する好ましい方法は、練磨または粉砕することにより、これは、適当な温度に冷却されてもよいボールミルまたはハンマーミル中で行うのが好ましい。粉砕は、乾燥した形態（１０％未満の含水率）で、または凍結水和された形態（２０〜８０％の含水率）で行ってもよい。
【００１７】
凍結水和された状態で粉砕された膠原は、アセトン抽出、凍結乾燥または空気流中で脱水してもよい。乾燥膠原粉末は、注射の前に、本質的に非水性、非毒性、生体適合性媒体、例えばグリセロール中で懸濁させてもよい。
【００１８】
例えば、リングノカインのような麻酔剤は組成物中に組みこまれてもよい。
膠原材料は、膠原溶解性酵素に抵抗性にし、したがって実質的に非再吸収され得ないために、例えばジイソシアネートを用いて、所望であれば、架橋されてもよい。
組成物を滅菌する好ましい方法は、ガンマ線照射である。
【００１９】
本発明による注射可能な組成物中の膠原材料の粒子の好ましい粒度は、５０〜５００ミクロンである。粒度分布は変化してもよく、しかし少なくとも５０％の粒子は平均粒子径の±３５％以内であるのが好ましい。注射可能な組成物中の固体の濃度は、１０〜７０％（ｗ／ｖ）の範囲であるのが好ましい。逆に、糊状創傷充填組成物においては、固体の濃度は通常８０％までである。
【００２０】
本発明の組成物の効力は、試験管内で確認される。分散された膠原線維フラグメント（粉砕膠原）が組織培養中のヒトまたはネズミ線維芽細胞にまかれたとき、線維芽細胞が膠原フラグメントに接着し、それらを凝集させて容易に扱うことのできる円盤状組織のような濃密組織を形成することが観察される。
【００２１】
さらに、生体内に注射されたとき、粉砕された膠原はすばやく線維芽細胞および小血管（膠原シートよりもずっとすばやく）により侵入され、新しい組織を形成し、その中で膠原線維フラグメントは、正常な皮膚膠原構造に類似した、互いに噛み合う膠原線維の中に組織化され、すなわち、再吸収されず、瘢痕組織を形成しない。
【００２２】
注射可能な組成物は、様々な臨床状態で用いることができる。例えば、尿道周囲注射により、尿失禁を制御、およびより詳細には固有括約筋欠損において制御することは、ルーメン口を減少させる。整容用適用には、眉毛隆起、唇増強のための膠原懸濁液の注射の使用と、顔の欠点、眉間しわ線およびざ瘡瘢痕を矯正することが含まれる。別の例として、関節炎の関節において、しばしば、線維状膠原マトリックスで支持されたクロンドロサイト（chrondrocyte）からなる平滑軟骨層の著しい損失および損傷が存在する。関節炎関節の炎症条件下に、軟骨層の膠原マトリックスを破壊するコラゲナーゼが産生されるという証拠がある。本発明による膠原懸濁液が関節に注射されると、コラゲナーゼ抵抗性マトリックスを産生することにおいて援助し、クロンドロサイトを支持し、損傷を修復するかもしれない。
【００２３】
別の臨床的シナリオは、皮膚の大きい面積、例えば、皮膚が非常に薄くなっている年長の患者の手または首の裏を処理する必要があるものである。多点注射系をこの目的のため用いてもよい。そのような系は、金属もしくはプラスチック材料の中空片中に備えられた多くの針を合わせてもよく、その入り口には膠原懸濁液がシリンジ、計量型ポンプ、ピストン蠕動ポンプもしくは他の適当なデバイスで供給される。
【００２４】
本発明の膠原組成物はまた、手術創傷において瘢痕形成を抑制する目的で用いられてもよい。粉砕された膠原材料は、縫合またはテープにより創傷を閉じる間または後すぐに、線維構造のフラグメントを創傷空間に導入するのに再び用いられる。慣習に全体的に反しているが、そのような処置は非常に有益であることが示されている。膠原材料フラグメントの新たに形成された創傷、すなわち切開空間への導入により、線維芽細胞と小血管が創傷の中から端へ移動するために膠原が豊富な部位の解剖的に「薄い」マトリックスを生じる。これは、線維芽細胞の挙動に対し深い影響を有する。というのも、そのような膠原が豊富な環境中において、創傷空間中、それらは肉芽組織を産生するシグナルを受け取らず、過剰な新しい膠原を合成するからである。換言すれば、瘢痕形成は大いに抑制される。この簡単な「機械的な」取り組み方は、ずっと簡単に適用でき、ずっと安価であるので、特にモノクローナル抗体を用いる先行技術とは異なっている。
【００２５】
粉砕した膠原を細かい針による注射での使用は、膠原材料を必要とされる部位へ導入するやり方のため、多少制限される。しかし、より広い範囲の膠原材料フラグメントのサイズを用いることができる粘稠な濃度の組成物は、注射可能な材料が適当でないような様々な状況で用いることができる。したがって、より広範囲または重篤な創傷の治療において、遺失組織を置き換え、瘢痕組織の形成を著しく減少させるために、膠原線維フラグメントを糊状組成物として創傷空間へ、適当なドレッシングまたは縫合もしくはテープにより閉鎖を適用する前に、導入してもよい。例えば、組成物は、胸部乳腺腫瘤摘出術の後の即座の再建用に用いてもよい。以下のこれらの外傷性化学傷害または熱傷、脚潰瘍で表されるものを含む皮膚損失の欠陥には、糊状組成物を用いて遺失真皮を適当な遮蔽物およびドレッシングで置き換えてもよい。
【００２６】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。
実施例１
滅菌条件下で、ブタの皮膚膠原のサンプルを小片（１〜３ｍｍ3）に切断し、１００％エタノールと無水アセトンを何回か交換して用いて脱水した。ボールミルを用いて、乾燥した膠原片をすりつぶして篩分けて、細かい白色粉末を製造した。篩い分けられた粉末膠原を滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で再脱水して、６０〜７０％（ｗ／ｖ）の濃度の膠原懸濁液を製造した。
【００２７】
実施例２
しみをつけたブタの膠原の小片を、液体窒素中で凍結させ、極低温ミル中ですりつぶした。すりつぶした膠原フラグメントを滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で懸濁させ、６０〜７０％（ｗ／ｖ）の濃度の膠原懸濁液を製造した。
【００２８】
実施例３
細胞／膠原生化学的相互作用を直接試験するために、篩分けられた粉末ブタ皮膚膠原を完全哺乳類細胞培地中で再脱水し、７０％（ｗ／ｖ）の濃度の膠原懸濁液を製造し、第１次ヒト包皮線維芽細胞または第１次ラット皮膚線維芽細胞のいずれかを、接種した。
膠原／線維芽細胞サンプルをコースター（costar）ウエル中に等分に分け、37℃、５〜７％（ｗ／ｖ）ＣＯ2飽和湿度でインキュベートした。２１日インキュベートした期間にわたって研究すると、ヒトおよびラットの両方の線維芽細胞は増殖し、ブタ膠原フラグメントへ移動して接着し、密に詰まった凝集塊または円盤状組織になった。
【００２９】
実施例４
生体内で作用を試験するために、膠原懸濁液を２１ゲージの針を通じて同質遺伝子型のＰＶＧ／Ｏｌａラットの背面部位に皮内に注射した（０．２ｍｌ／注射）。注射後１２ヶ月までの連続的な生検により、真皮下に位置する白色円盤状組織として、注射された膠原塊の損失または逆の宿主反応の明白な徴候もなく、注射された膠原の持続する肉眼的な存在が示された。初期の生検により、注射された膠原がその場に残存し、９日以内に完全に線維芽細胞および小血管で侵入されることが示された。結果として生じた組織構造は、膠原線維フラグメントは互いにかみあった膠原線維中に組織化され、正常な皮膚膠原に似た構造を有する組織を製造することを示した。
【００３０】
実施例５
滅菌条件下、米国特許第５３９７３５３号に記述の方法に従って製造されたブタ皮膚膠原のサンプルを小片に切断し（１〜３ｍｍ3）、液体窒素中で凍結させ、極低温ミル中ですりつぶした。すりつぶした膠原フラグメントを滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で懸濁させ、８０％ｗ／ｖの固体濃度を有する糊状組成物を製造した。
【００３１】
実施例６
ＰＧ／Ｏｌａラットの耳介の皮膚にポケットを作成し、膠原糊状組成物をスパチュラで挿入し、創傷を閉じ、噴霧ドレッシングで固定した。膠原挿入部位を毎月の間隔で組織構造試験のため生検した。６ヶ月間にわたって、盛り上がった皮膚の出っ張りとして持続する膠原移植は、周囲の宿主組織中に組みこまれ、有害効果は見られなかった。
【００３２】
実施例７
１ｍｌの膠原ペースト剤を「トロカール」または大きな穴の針によりＰＶＧ／Ｏｌａラットの背面に皮内に注射した。この「軟組織フィルター」は６ヶ月にわたって宿主有害効果は全くなしで持続した。
【００３３】
実施例８
全層切開皮膚創傷をＰＶＧ／Ｏｌａラットの背面に作成した。創傷を結節縫合を用いて閉じ、創傷表面上に押出されるまで膠原組成物の懸濁液を創傷に注射した。創傷を６、８、１０および１４日に組織構造試験のために生検し、それにより観察できる瘢痕組織の不在下に切開治癒の形跡で示された。
【００３４】
実施例９
培養において同質遺伝子型の線維芽細胞を予め接種しても、またはしなくても、膠原ペースト剤組成物を用いて、ＰＶＧ／Ｏｌａラットの１×１ｃｍ長さ−厚さの摘出皮膚創傷に満たし、第１ドレッシングとして半透過性膜（オプサイト（Opsite）登録商標）で覆った。その後の観察と組織構造により、移植された膠原組成物が、２８日以内に創傷端から移動した上皮で覆われ、効果的で持続性の皮膚の置換として作用することが示された。