(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子によってコーディングされるヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体の野生型蛋白質が突然変異した突然変異蛋白質をコーディングする遺伝子であって、
該突然変異蛋白質において、該野生型蛋白質のＡｓｎ−２２２を暗号化するコドンがロイシン、グルタミンまたはイソロイシンを暗号化するコドンに置換されていることを特徴とする遺伝子。
【請求項２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコーディングすることを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコーディングすることを特徴とする遺伝子。
【請求項４】
マウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の野生型蛋白質が突然変異した突然変異蛋白質をコーディングする遺伝子であって、
該突然変異蛋白質において、該野生型蛋白質のＡｓｎ−２２０を暗号化するコドンがロイシンまたはイソロイシンを暗号化するコドンに置換されていることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
請求項１の遺伝子とヒトＩＬ−１２ｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子との間にＩＲＥＳ(Internal ribosome entry site)を含む遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
請求項４の遺伝子とマウスＩＬ−１２ｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子との間にＩＲＥＳ(Internal ribosome entry site)を含む遺伝子コンストラクト。
【請求項７】
請求項５の遺伝子コンストラクトを含む発現ベクトル。
【請求項８】
遺伝子コンストラクトはヒトのＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２を暗号化するコドンがＬｅｕ−２２２に突然変異化された遺伝子を含むことを特徴とする請求項７記載の発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ（受託番号：ＫＣＴＣ ０９６９ＢＰ）。
【請求項９】
遺伝子コンストラクトはヒトのＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２を暗号化するコドンがＬｅｕ−２２２に突然変異化された遺伝子を含むことを特徴とする請求項７記載の発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５（受託番号：ＫＣＴＣ ０９７０ＢＰ）。
【請求項１０】
請求項６の遺伝子コンストラクトを含む発現ベクトル。
【請求項１１】
遺伝子コンストラクトはマウスのＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２０を暗号化するコドンがＬｅｕ−２２０に突然変異化された遺伝子を含むことを特徴とする請求項１０記載の発現ベクトルｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ（受託番号：ＫＣＴＣ ０７４５ＢＰ）。
【請求項１２】
請求項７または１０に記載の発現ベクトルを含んでいる、癌、ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、結核およびマラリアからなる群より選択される疾病の予防または治療のためのＤＮＡ免疫化用免疫増強剤。
【請求項１３】
ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共に投与する際、ＣＴＬ(cytotoxic T lymphocytes)細胞の加水分解能力を向上させることにより、免疫反応を増進させることを特徴とする請求項１２記載の免疫増強剤。
【請求項１４】
ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共に投与する際、Ｔヘルパー(T helper)細胞のインターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)の分泌を増加させることにより免疫反応を増進させることを特徴とする請求項１２記載の免疫増強剤。
【請求項１５】
ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共に投与する際、ＣＤ８＋細胞のインターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)の分泌を増加させることにより免疫反応を増進させることを特徴とする請求項１２記載の免疫増強剤。
【請求項１６】
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコーディングすることを特徴とする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、高い活性をもつヒトとマウスＩＬ−２を生産することが可能なＩＬ−１２ｐ４０小単位体突然変異遺伝子、前記突然変異遺伝子を含む発現ベクトル、及びこれをＤＮＡワクチン免疫増強剤として利用する用途に関し、より詳細には、活性型のＩＬ−１２の競争的阻害剤として作用するヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）アミノ酸に突然変異を誘発させることにより、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌は阻害し且つＩＬ−１２の免疫活性を有するＩｌ−１２ｐ７０の分泌は正常的に行われるようにしたＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子；前記突然変異遺伝子を含み、ＤＮＡ免疫化の増進に使用される発現ベクトル；前記突然変異遺伝子をＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ型肝炎、癌、インフルエンザ、結核、マラリアなど疾病のＤＮＡワクチン免疫化のための免疫増強剤及び長期的な免疫活性維持のための免疫増強剤として使用する用途に関する。
【０００１】
〔従来の技術〕
ＩＬ−１２は、適切な刺激が与えられた大食細胞(macrophage)、単核球(monocyte)のような抗原提供細胞(Antigen presenting cell、ＡＰＣ)によって分泌され、生体内で起る各種免疫反応を調節する役割をする。具体的に、ＩＬ−１２は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞とＮＫ細胞(natural killer cell)の分化、多様なサイトカイン(cytokine)生成の調節、Ｔｈ１細胞による免疫反応の上昇、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化、及び造血細胞(hematopoietic cell)の増殖などの広い分野にわたった機能を有するだけでなく(Hsieh, C. S., et al., Science, 260:547-549, 1993)、特にＣＴＬ細胞(cytotoxic T lymphocyte)とＮＫ細胞の加水分解能力(Robertson, M. J., and J. Ritz., Oncologist, 1:88-97, 1999; Trinchieri, G., Annu. Rev. Immunol., 13:251-276, 1995)を増進させることにより免疫反応を調節するのに重要な役割をする。これまでの報告によれば、エイズ（ＡＩＤＳ）患者の場合は生物学的活性を有するＩＬ−１２の合成が約５倍程度減少しており(Chehimi, J. et al., J. Exp. Med., 179:1361-1366, 1994)、且つＩＬ−１２受容体遺伝子が欠損したヒトの場合はマイコバクテリア(mycobacteria)に対する免疫性が相当減少している(de Jong, R. et., Science 280:1435-1438, 1998)ことが観察された。このようなＩＬ−１２の作用はウィルス、バクテリア及び多様な腫瘍に対する強力な生体内免疫反応を初期に誘導することができるため、これを用いた様々な治療剤の開発も活発に行われている趨勢である。
【０００２】
ＩＬ−１２が前記で提示したいろいろの細胞性免疫反応を必要とする疾病に効果的なワクチンまたは治療剤として使用できる別の理由は、ＩＬ−１２が生体内で記憶Ｔｈ１細胞(memory Th1)及び記憶ＣＴＬ細胞(memory CTL)の増殖に関わっているという仮設に基づいている(Stobie, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 97:8427-8432, 2000; Mortarini, R. et al, Cancer Res., 60:3559-3568, 2000; Mbawuike, I. N. et al., J. Infect. Dis., 180:1477-1486, 1999)。特に、多様な腫瘍の治療時に最も問題になっている転移または再発に焦点を合わせてみると、記憶免疫反応(memory immune response)の誘導は必須不可欠なものであると思われる。しかし、現在までＩＬ−１２がこのような効果を示すことに対する正確な機序は明らかになっていない。ところが、最近の幾つかの報告によれば、ＩＬ−１２によるＴヘルパー細胞１の分化過程中に増加するＩＦＮ−γが増殖抑制効果(antiproliferative effect)を示すことができるため、ＩＬ−１２がＣＤ４＋Ｔ細胞(T helper 1)のアポトーシス(apoptosis)を阻害することにより記憶免疫反応が誘導できるという機序が提示されている(Fuss, I. K. et al., Gastroenterology, 117:1078-1088, 1999; Marth, T. et al., J. Immunol. 162L7233-3240, 1999)。また、ＩＬ−１２によって増加するＩＦＮ−γがＣＤ８＋Ｔ細胞の強力且つ選択的な刺激に関与するＩＬ−１５の発現を刺激することができるので(Zhang, X. et al., Immunity 8:591-599, 1998)、記憶免疫反応が誘導できるものという仮設も提起されている。このような報告を根拠にすると、ＩＬ−１２は初期免疫反応だけでなく、記憶免疫反応にも関与することができるので、ワクチン免疫化に極めて有用に使用される可能性が提起されている。
【０００３】
ＩＬ−１２の生物学的活性形態はヘテロ二量体であって７０ｋＤａのＩＬ−１２ｐ７０であり、共有結合された２つの小単位体、即ちｐ３５小単位体とｐ４０小単位体から構成される。ｐ４０小単位体はＩＬ−６受容体と類似のアミノ酸序列を共有し、よって、サイトカイン受容体のスーパーファミリー(superfamily)に属する。一方、ｐ３５小単位体は、サイトカイン受容体のスーパーファミリーとは距離があるが、ＩＬ−６／顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(granulocyte colony stimulating factor:ＧＭ−ＣＳＦ)を含むサイトカインファミリー(Gearing, D. P., and Cosman, D., Cell, 66:9-10, 1991)と密接な関係を有する。
【０００４】
試験管内(in vitro)と生体内(in vivo)でＩＬ−１２ｐ７０の発現時、ｐ４０小単位体ＩＬ−１２ｐ４０は単量体(monomer)とホモ二量体(homodimer)の形態で共に大量分泌される(Mattner, F. et al., Eur. J. Immunol., 23:2202-2208, 1993; Heinzel, F. P. et al., Infect. Immun., 62:4244-4249, 1994)。一般に、ＩＬ−１２ｐ４０はＩＬ−１２ｐ７０より５〜９０倍以上分泌され、ＩＬ−１２の受容体にＩＬ−１２ｐ７０と競争的に結合することにより、ＩＬ−１２ｐ７０の活性を大きく阻害すると報告されている(Gillessen, S. et al., Eur. J. Immunol., 25:200-206, 1995; Ling, P. et al., J. Immunol., 154:116-127, 1995)。このような事実は、ＩＬ−１２ｐ４０の形質転換された鼠においてＴｈ１反応が減少する現象(Yoshimoto, T. et al., J. Immunol., 160:588-594, 1998)とＩＬ−１２ｐ４０を生成するように製造された筋芽細胞(myoblast)の利殖時に同種間の拒否現象が起らない現象(Kato, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 93:9085-9089, 1996)、ＩＬ−１２ｐ４０を発現するアデノウィルス(adenovirus)によってＩＬ−１２ｐ７０による腫瘍の減少が阻害される現象(Chen L. et al., J. Immunol., 159:351-359, 1997)などを含む様々な生体内実験結果によって裏付けられている。ところが、最近は同種異系抗原に特異的に反応するＴｈ１の発達を誘発するＩＬ−１２ｐ７０の活性に対するＩＬ−１２ｐ４０の肯定的効果を明かした報告もあり(Piccotti. J. R. et al., J. Immunol., 157:1951-1957, 1996)、大食細胞の走化性物質として作用するＩＬ−１２ｐ４０の新しい機能が本発明者によって明らかになったことがある(Ha, S. J. et al., J. Immunol., 163:2902-2908, 1999) 。
【０００５】
現在はＩＬ−１２ｐ７０の抗癌性効果を証明するために多様な生体内(in vivo)システムが確立された。ところが、ヒト組換えＩＬ−１２ｐ７０蛋白質を癌患者に直接投与する場合、死亡まで誘発しうる深刻な毒性を示すため(Robertson, M. J. and Ritz. J., Oncologist, 1:88-97, 1996; Cohen, J., Science, 270:908, 1995)、このような副作用を防止し且つ経済的にも効率のよい方法の模索から、ＩＬ−１２遺伝子を用いた遺伝子治療方面に多くの研究が行われることになったが、その結果、非常に効果的で毒性がないことが証明された(Rakhmilevich, A. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6291-6296, 1996; Tahara, H. et al., J. Immunol., 154:6466-6474, 1995; Lotze, M. T. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 795:440-454, 1996)。
【０００６】
ＩＬ−１２を用いた遺伝子治療のためには、ＩＬ−１２の生物学的活性型であるＩＬ−１２ｐ７０(Gubler, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4143-4147, 1991)の生産が必須的であり、よって、一つの細胞内でｐ３５とｐ４０小単位体のｃＤＮＡが同時に発現されることが要求される。ｐ３５小単位体とｐ４０小単位体を一つの細胞内で同時に発現させるために、これらを同一のプラスミド内に連続的に配列させ、ｐ３５とｐ４０遺伝子がそれぞれ発現されるように発現カセット(expression cassette)を用いる方法(Rakhmilevich, A. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6291-6296, 1996)、或いはＥＭＣＶ(encephalomyocarditis virus)のＩＲＥＳ(Internal ribosomal entry site)を用いて２つの遺伝子を同時に発現させる方法が利用されてきた。ところが、このような方法は、細胞内でＩＬ−１２ｐ７０を成功的に発現させることはできるが、上述したように過多な量のＩＬ−１２ｐ４０の持続的な発現によってＩＬ−１２ｐ７０の生物学的作用を妨害する可能性を除去することはできなかった。
【０００７】
これを克服するために、最近、抗体製造時に一般に用いられる蛋白質リンカー(linker)をコーディングしているＤＮＡ序列を用いてｐ３５小単位体とｐ４０小単位体を連結する方法が提示された(Lieschke, G. J. et al., Nat. Biotechnol., 15:35-40, 1997; Lode, H. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2475-2480, 1998; Lee, Y. L. et al., Human Gene Ther., 9:457-46534, 1998)。前記方法を用いて過量のＩＬ−１２ｐ４０によって、ＩＬ−１２ｐ７０の生物学的活性が阻害されることは防ぐことができたが、ｐ３５とｐ４０の両小単位体を連結させることにより誘発される構造の変化によって生成されたＩＬ−１２ｐ７０の活性度が５〜１００倍以上減少するという問題点のため、十分な効果を得ることができなかった。従って、ＩＬ−１２遺伝子を用いた癌または他の疾病に対する効率的な治療のためには、ＩＬ−１２ｐ４０が分泌されず且つ活性度が維持されるＩＬ−１２ｐ７０の生成を誘導する方法が必須的な課題として認識されている実状である。
【０００８】
糖鎖化(glycosylation)は蛋白質のフォールディング(folding)、分泌、構成、安定性及び生物学的活性において重要な役割を行うと知られてきた。ヒトＩＬ−１２のｐ３５小単位体とｐ４０小単位体はそれぞれ５６個と２２個の親油性信号序列を有するアミノ酸を含んで２１９個と３２８個のアミノ酸を発現するが、ｐ３５とｐ４０の小単位体内に存在する３個と４個のＮ−糖鎖化可能部分がヒトＩＬ−１２アミノ酸序列分析によって明らかになった(Podlasky, F. J. et al., Arch. Biochem. Biophys., 294:230-237, 1992)。Sternなどはトリフルオロメタンスルホン酸(trifluoromethane-sulfonic acid)または該当酵素Ｆ(glycosidase F)でヒトＩＬ−１２を処理した後、ＩＬ−１２ｐ３５とＩＬ−１２ｐ４０の分子量を調査した結果、それぞれ減少した分子量を示すことを報告した(Stern, A. S. et al., Arch. Biochem. Biophys., 294:230-237, 1992)。これはヒトＩＬ−１２のｐ３５小単位体とｐ４０小単位体が炭水化物を成分として有することを示すものである。同報告書において、ノイラミニダーゼ(neuraminidase)と内部α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ(endo-α-N-acetyl-galactosaminidase)を連続してＩＬ−１２ｐ３５に処理した際、ＩＬ−１２ｐ３５の分子量は減少するが、これに対し、ＩＬ−１２ｐ４０は同処理に影響されないという事実が証明された。これはＩＬ−１２ｐ３５にはＯ−結合による糖鎖が存在する一方、ＩＬ−１２ｐ４０はＯ−結合による糖鎖が存在しないということを意味する。また、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体の４つのＮ−糖鎖化可能部分のうち、Ａｓｎ−１３５とＡｓｎ−２２２アミノ酸に対するＮ−糖鎖化が分析されたが、Ａｓｎ−２２２部分に実際Ｎ−糖鎖化が起っていることが明らかになった。しかし、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体の残部、ヒトＩＬ−１２ｐ３５小単位体、及びマウスＩＬ−１２の両小単位体に対するＮ−糖鎖化有無は未だ明らかになっておらず、且つ糖鎖化部分及び糖鎖化可能部分がＩＬ−１２の合成、分泌、生物学的活性などに及ぼす効果は未だ糾明されていない。
【０００９】
一方、多数のウィルス性またはバクテリア性疾病の予防及び治療、癌生成抑制には体液性免疫反応(humoral immune response)よりは細胞性免疫反応の増加が要求されるため、ＩＬ−１２遺伝子を利用しようとする研究が活発に行われている。Ｃ型肝炎はウィルスが媒介する代表的な疾病であって、ＨＣＶの感染時に５０％以上が慢性疾患に進み、究極的に肝硬変または肝癌などの疾病を起こす主要原因になっている(Alter H. J. et al., N. Engl. J. Med., 321:1494-1500, 1989)。現在、α−インターフェロンがこれらに対する唯一の治療方法として一般化されているが、治療効果は僅か１０〜３０％程度に過ぎない(Weiland E. et al., J. Virol., 66:3677-3682, 1992)。従って、ＨＣＶに対する効果的なワクチンまたは治療剤の開発が至急要求される実状である。チンパンジーとヒトに対する臨床実験報告によれば、ＨＣＶは特異的な体液性免疫反応と細胞性免疫反応の両方とも起る可能性があり(Prince A. M. et al., J. Infect. Dis., 165:438-443, 1992) 、ＨＣＶの構造蛋白質であるＥ１とＥ２が保護免疫(protective immunity)の誘発に最も重要な抗原であると窮められた(Choo Q. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1294-1298, 1994)。また、最近は、前記ウィルスの除去のためには体液性免疫反応よりはＣＴＬを含んだ細胞媒介性免疫反応が必須的なものであると報告されたことがある(Cooper S. et al., Immunity, 10:439-449, 1999; Rinaldo C. et al., J. Virol., 69:5838-5842, 1995)。
【００１０】
このような細胞性免疫反応を誘導する方法として最近台頭している方法がＤＮＡ免疫方法である。ＤＮＡ免疫方法は、病原体の特定の成分をコーディングするＤＮＡを直接人体に注入して免疫化を達成するという点において、弱毒化されたか或いは死なされた病原体または病原体の一部成分を利用する従来の免疫方法とは区分されるし、免疫化蛋白質の実際的な生産がＤＮＡの注入された宿主内で行われるため、生菌または死菌を利用する場合に発生する虞のある感染の危険を除去することができるという長所がある。このようなＤＮＡ免疫方法によってインフルエンザウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウィルスなどの様々な種類の伝染性ウィルスに対して強力な免疫性を誘導することができるものと報告されている(Ulmer J. B. et al., Science, 259:1745-1749, 1993; Michel M. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5307-5311, 1995; Irwin M. J. et al., J. Virol., 68:5306-5044, 1994)。また、ＨＣＶのカプシド蛋白質(core)とＥ２蛋白質などにもこのようなＤＮＡ免疫方法を適用した結果、これらに対する特異的な免疫性を誘導したという報告があった(Major M. F. et al., J. Virol., 69:5798-5805, 1995; Tedeschi V. et al., Hepatology, 25:459-462, 1997)。
【００１１】
ところが、このようなＤＮＡ免疫方法は、免疫化蛋白質が生体内で発現される頻度が低いため、免疫性の低い抗原に対しては強い免疫反応が起せない限界性を有する。ＤＮＡ免疫方法の効果性を高めるために、幾つかのサイトカイン(cytokine)遺伝子または免疫細胞活性化に必要な補助刺激物質(costimulatory molecule)遺伝子のような補助因子(adjuvant)を使用し(Geissler M. et al., J. Immunol., 159:5107-5113, 1997; Iwasaki A. et al., J. Immunol., 158:4591-4601, 1997; Lee S. W. et al., J. Virol., 72:8430-8436, 1997)、或いはＨＣＶに対する免疫反応を効率よく誘導するためにＩＬ−１２を使用した例(Lasartte J. J. et al., J. Immunol., 162:270-5277, 1999)はあるが、ＩＬ−１２を用いて霊長類及びヒトを対象としたＤＮＡ免疫化においては肯定的な結果が報告されていない状況(Boyer J. et al., Keystone Symposium on DNA vaccines April, 12-17, 1998)である。
【００１２】
このような点に着目し、本発明者は、糖鎖化の調節によって活性型のＩＬ−１２ｐ７０を発現し且つＩＬ−１２による免疫活性を低下させるＩＬ−１２ｐ４０の分泌を最小化することが可能な遺伝子を製造するための研究を重ねた結果、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体の糖鎖化部分であるＡｓｎ−２２２アミノ酸とマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の糖鎖化可能部分であるＡｓｎ−２２０アミノ酸の突然変異化によって得た突然変異遺伝子が、活性型のＩＬ−１２ｐ７０の発現は増加させるが、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌は減少させるという事実を発見し、前記突然変異遺伝子を小動物モデルのマウスにＨＣＶ Ｅ２遺伝子と共にＤＮＡ免疫化した場合、最適の細胞媒介性免疫反応、特に長時間の経過後にもこのような免疫反応が持続的に誘導されるという事実から、本発明の突然変異遺伝子がＤＮＡワクチンの免疫増強剤として有用に使用できることを確認することにより、本発明を完成した。
【００１３】
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、ＩＬ−１２ｐ７０の受容体に対する競争的な結合によってＩＬ−１２ｐ７０の活性を阻害するＩＬ−１２ｐ４０の分泌を減少させるために、ヒトまたはマウスでＩＬ−１２ｐ４０の分泌に必須的な糖鎖化部分を突然変異化させることにより、Ｔｈ１細胞による免疫反応の増加またはＣＴＬ細胞の活性化のようなＩＬ−１２固有の役割を活性化させるＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子を含んだ発現ベクトルをＤＮＡワクチンとともにＤＮＡ免疫化することにより、抗原特異的な細胞性免疫反応を増進及び維持させる免疫増強剤として使用する用途を提供することにある。
【００１５】
〔課題を解決するための手段〕
上記目的を達成するために、本発明は、ヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０を暗号化する遺伝子において、その分泌に必須的な役割をするＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）部分を他のアミノ酸に置換させたヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異遺伝子を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記ヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異遺伝子、小単位体の同時発現のためのＩＲＥＳ序列を含む遺伝子コンストラクト及びこれを含む発現ベクトルを提供する。
【００１７】
また、本発明は、ＨＣＶの外被糖蛋白質２（Ｅ２）遺伝子を含み且つこれらを発現させ得るＤＮＡワクチンベクトル、Ａｓｎ−２２２（ヒト）とＡｓｎ−２２０（マウス）部分が突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子を含む遺伝子コンストラクト及びこれを含む発現ベクトルを提供する。
【００１８】
また、本発明は、前記遺伝子コンストラクトを免疫増強剤としてＤＮＡワクチン免疫化または遺伝子治療に利用する用途を提供する。
【００１９】
〔発明の実施の形態〕
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、序列番号１の塩基序列を有するヒトＩＬ−１２ｐ４０、または序列番号２の塩基序列を有するマウスＩＬ−１２ｐ４０を暗号化する遺伝子において、その分泌に必須的な役割をするＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）部分を他のアミノ酸に置換したヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異遺伝子を提供する。
【００２１】
マウスとヒトＩＬ−１２ｐ４０に対するアミノ酸序列の相同性を比較すると、ヒトＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２に該当するマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎがアミノ酸序列２２０に位置しており、その周辺のアミノ酸序列が非常に類似している（図１参照）。
【００２２】
具体的に、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体の２２２番目のＡｓｎ（Ａｓｎ−２２２）を指定するコドンＡＡＣはＣＵＣ、ＣＡＧ、ＡＵＡなどに変異されることができる。この際、それぞれに該当するアミノ酸はＬｅＵ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅである。特に、本発明の好適な実施例では、ｃＤＮＡ上でＡＡＣをＣＴＣまたはＣＡＧに変えることにより、ＡＡＣコドンがＣＵＣまたはＣＡＧコドンに置換され、結局Ａｓｎ−２２２アミノ酸がＬｅｕ−２２２またはＧｌｎ−２２２アミノ酸に置換され得る遺伝子（以下、「ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ」及び「ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ」と略称する）を提供する。
【００２３】
また、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体のＡｓｎ−２２２部位と相同性を有するマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体においても、２２０番目のＡｓｎ（Ａｓｎ−２２０）を指定するコドンＡＡＣはＣＵＣ、ＣＡＧ、ＡＵＡなどに変異できる。この際、それぞれに該当するアミノ酸はＬｅＵ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅである。特に、本発明の好適な実施例では、ｃＤＮＡ上でＡＡＣをＣＴＣに変えることにより、ＡＡＣコドンがＣＵＣコドンに置換され、結局Ａｓｎ−２２０アミノ酸がＬｅｕ−２２０アミノ酸に置換され得る遺伝子（以下、「ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ」と略称する）を提供する。
【００２４】
本発明の突然変異遺伝子ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ、ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ及びｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌは序列番号３、序列番号４及び序列番号５と記載されるアミノ酸序列をコーディングする。
【００２５】
また、本発明は、前記ヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異遺伝子、小単位体の同時発現のためのＩＲＥＳ序列を含む遺伝子コンストラクト及びこれを含む発現ベクトルを提供する。
【００２６】
まず、本発明は前記遺伝子を含むｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５、ｈｐ４０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子を提供する。ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５遺伝子及びｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子は、Ａｓｎ−２２２がＬｅｕ−２２２に突然変異化されたヒトのｐ４０小単位体遺伝子と共にｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子を含み、ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子はＡｓｎ−２２０部分がＬｅｕ−２２０に突然変異化されたマウスのｐ４０小単位体遺伝子とともにｐ３５単位体をコーディングする遺伝子を含み、それぞれの遺伝子はいずれも小単位体の同時発現のためのＩＲＥＳ序列を含む。ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５、ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子において、ＩＲＥＳはＥＭＣＶ(encephalomyocarditis)由来のものを使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。ＩＲＥＳ序列は前記２つの遺伝子の発現時にｐ４０小単位体とｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子の同時発現のために好ましい。
【００２７】
また、本発明は、前記で提供されたｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５、ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子をそれぞれ含む発現ベクトルとしてのｐＧＸ０−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５、ｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌを提供する。
【００２８】
本発明では、好適な実施例の一つとしてｐＴＶ２ ＤＮＡワクチンベクトル(Song, M. K. et al., J. Virol., 74:2920-2925, 2000)のアンピシリン抵抗性遺伝子(ampicillin resistant gene)の代りにカナマイシン抵抗性遺伝子(kanamycin resistant gene)を挿入させることにより、臨床実験可能に考案されたＤＮＡワクチンベクトルであるｐＧＸ０プラスミドの外来遺伝子挿入部位にｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５及びｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子を挿入した。また、ｐＴＶ２ ＤＮＡワクチンベクトルの外来遺伝子挿入部位にｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子を挿入した。ところが、前記発現ベクトルの製造に用いられたプラスミド以外にも様々な原核細胞用または真核細胞用ベクトルが知られているので、発現の目的に応じて前記プラスミド以外に他の発現ベクトルを容易に利用することが可能なのは当業者には明らかなことである。また、発現ベクトルの外来遺伝子挿入部位に挿入される遺伝子の大きさや塩基序列なども公知の技術によって様々に変化させることができる。
【００２９】
前記発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２ＬとｐＧＸ０−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５は２００１年２月２６日付で、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌは２０００年２月２９日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託された（受託番号：ＫＣＴＣ ０９６９ＢＰ、ＫＣＴＣ ０９０７０ＢＰ及びＫＣＴＣ ０７４５ＢＰ）。
【００３０】
ｐ３５小単位体とｐ４０小単位体の同時発現は生物学的に活性を有するＩＬ−１２ｐ７０を得るために必須的なので、本発明ではｈｐ３５及びｈｐ４０小単位体をそれぞれ発現するようにするｐＣＩＮ−ｈｐ３５及びｐＣＩＮ−ｈｐ４０以外にもＥＭＣＶのＩＲＥＳを用いたバイシストロニック発現ベクトル(Bicistronic Expression Vectors)のｐＧＸ０−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５及びｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０を製作した。ヒトＩＬ−１２の合成、分泌、及び特異的活性にＮ−糖鎖化が及ぼす影響を理解するために、まずｐ３５小単位体とｐ４０小単位体に存在する潜在的なＮ−糖鎖化部分のＡｓｎ残基を特定部位の突然変異誘発(site-directed mutagenesis)によって他のアミノ酸残基に置換し（図２参照）、突然変異蛋白質に対する野生型蛋白質の免疫ブロット結果（図３ａ、図３ｂ及び図３ｃ参照）、ｈｐ３５小単位体のＡｓｎ−１２７、−１４１、ｈｐ４０小単位体のＡｓｎ−２２２、−３０３の４つの部分が４−糖鎖化部分として利用されていることを確認することができる。
【００３１】
また、本発明者は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化(heterodimerization)及び分泌に及ぼすｈｐ３５またはｈｐ４０のＮ−糖鎖化効果を調査するために、それぞれの野生型遺伝子またはそのＮ−糖鎖化突然変異遺伝子を含むｈＩＬ−１２発現ベクトルで細胞を形質転換させた後、これから得た培養上澄液及び細胞破砕物を用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００３２】
その結果、ｈｐ３５のＡｓｎ−１２７はＩＬ−１２ｐ７０の細胞内ヘテロ二量体化だけでなく、その分泌の減少にも影響を与えていることが分る。ところが、ｈｐ３５のＡｓｎ−１４１は、野生型ｈｐ３５と比較したところ、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌に大きい影響を与えるとは思われなかった（表１参照）。
【００３３】
ｈｐ４０のＡｓｎ−１３５とＡｓｎ−２２２の突然変異は、ＩＬ−１２ｐ７０の分泌には影響を与えないが、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌を著しく減少させることが分った。特に、Ａｓｎ−２２２の場合、ｈｐ４０の分泌が野生型ｈｐ４０に比べて約１２％程度まで減少したことが分った。ｈｐ４０のＡｓｎ−１３５は免疫ブロット結果、Ｎ−糖鎖化が行われていない部分であるにもかかわらず、Ａｓｎ−１３５のアミノ酸から前記効果が観察されたが、これはＡｓｎ−１３５のアスパラギン（Ａｓｎ）がそれ自体でｈｐ４０の分泌に重要な部分になれることを意味する。Ａｓｎ−２２２のアミノ酸がグルタミン（Ｇｌｎ）以外にＬｅｕに代替された場合にも同一の分泌様相を示すことからみて、このような現像はＡｓｎ−２２２のＮ−糖鎖化の消失によるものと思われる（表１参照）。従って、Ａｓｎ−２２２におけるＮ−糖鎖化がヘテロ二量体ｈＩＬ−１２、ｈＩＬ−１２ｐ７０ではなくｈＩＬ−１２ｐ４０の単独分泌に要求されることが分った。
【００３４】
前記結果より、本発明者は、Ａｓｎ−２２２におけるＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌には要求されないが、ｈＩＬ−１２ｐ４０の分泌には必須的な役割をする一方、Ａｓｎ−１２７におけるｈｐ３５ Ｎ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体と分泌に重要な役割をすることを確認した。
【００３５】
本発明者は、ｈＩＬ−１２の糖鎖化が生物学的活性に及ぼす影響を調査するために、野生型ｈＩＬ−１２と潜在的Ｎ−糖鎖化部位の突然変異を含むその誘導体らのＩＦＮ−γ誘導能(induction ability)をＥＬＩＳＡで分析した。
【００３６】
その結果、ＩＦＮ−γ誘導能という面において野生型ｈｐ４０、またはＡｓｎ−１３５及び／またはＡｓｎ−２２２で突然変異されたｈｐ４０誘導体の遺伝子と野生型ｈｐ３５遺伝子を同時に形質転換させて得られた培養上澄液は、野生型または他のｈｐ４０突然変異体に比べて増加したＩＦＮ−γ誘導能を示した（表１参照）。また、前記２つの上澄液に野生型ｈｐ４０に比べて足りないｈｐ４０の量を補充して同一の実験を行った場合、増加されたＩＦＮ−γ誘導能が野生型とほぼ同一の水準に減少することを確認した（表１参照）。このような結果はｈＩＬ−１２ｐ７０の拮抗物質(antagonists)として知られているｈＩＬ−１２ｐ４０の水準がｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ及び／またはｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑを含む突然変異体の培養上澄内の他の突然変異体に比べて相対的に非常に低いためであることを提示し、Ａｓｎ−１３５及び／またはＡｓｎ−２２２の突然変異によって生成されたｈｐ７０が突然変異によってその活性が増加したのではないことを示している。
【００３７】
また、本発明者は、ｈｐ４０のＡｓｎ−２２２における糖鎖化がどのようにｈＩＬ−１２ｐ４０の分泌を減少させるかを調査するために、一定量の突然変異遺伝子を含む発現ベクトルを様々な量の野生型ｈｐ３５ ＤＮＡと共に細胞に同時形質感染させて培養した後、増幅したヒトＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡで測定した。
【００３８】
一般に、ｐ３５小単位体は単独で分泌されず、ｐ４０と結合してＩＬ−１２ｐ７０の形で分泌される一方、ｐ４０単位体は単量体(monomer)またはホモ二量体(homodimer)の形で分泌されるが、これはｐ３５小単位体ではなく、ｐ４０小単位体がＩＬ−１２ｐ７０の分泌において主要要素として作用することを暗示するものである。このような事実と一致するように、前記実験結果、ｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌量は野生型ｈｐ４０とｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ突然変異の全てで形質感染されたｈｐ３５ ＤＮＡの量に比例して増加した（表１参照）。このような結果は分泌欠陥(secretion defect)を有するｈｐ４０小単位体がｈｐ５小単位体と結合すると、ＩＬ−１２ｐ７０の形で分泌されることを示すもので、ｈｐ３５小単位体がｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌において別の作用をすることを暗示するものである。最近、ｈｐ４０内の形態的な変化(conformational change)がｈｐ３５との結合によるものであることを示す研究が報告され、ＩＬ−１２ｐ７０分泌におけるｈｐ３５小単位体の寄与可能性を提示したことがある(Yoon, C et al., EMBO J., 19:3530-3534, 2000)。前記研究と本発明の結果をまとめると、Ａｓｎ−２２２における糖鎖化を含むｈｐ４０がそれ自体では分泌に欠陥を有するが、ｈｐ３５との結合によるｈｐ４０部位の形態的な変化に起因してｈｐ７０の形で分泌できることが分る。
【００３９】
また、本発明者は、ｐ３５小単位体とｐ４０小単位体の一つの細胞内における同時発現を誘導することにより、ｐ４０の分泌をさらに減少させようとする目的と、使用されたベクトル内のサイトメガロウィルスプロモータ(cytomegalovirus promoter、ＣＭＶ)よりＩＲＥＳを用いた遺伝子の発現水準が低いという事実によってｐ４０遺伝子をＩＲＥＳの後ろに位置させることがより低いｐ４０の生成を誘導することによりその分泌量も低めようとする目的で、ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５とｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０コンストラクトを製造した。また、それぞれのプラスミドにおいてｈｐ４０遺伝子の代りにｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子が置換されているｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５とｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクトを製造した（表１参照）。ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５とｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５コンストラクトを比較してみると、後者においてｈｐ４０の分泌が約７％程度減少することが分かる。これはｈｐ３５コンストラクトとｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクトをそれぞれ電気穿孔した時にｈｐ４０の分泌が１２％程度であることを勘案すると、よりその分泌が減少したことを示す。即ち、ｈｐ３５コンストラクトとｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクトを電気穿孔した時には、２つのプラスミドが全て一つの細胞に形質転換されない場合が発生する可能性がある。従って、ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子単独で細胞に発現すると、ｈｐ７０分泌なしでｈｐ４０が少量分泌されるので、ｈｐ３５とｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子が同時に発現するｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５遺伝子よりｈｐ４０の分泌が多少高いものと推測することができる。また、ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５コンストラクトとｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０コンストラクトを比較すると、ＩＲＥＳの後ろにｈｐ４０遺伝子を配列させることによりその発現を低めた場合、ｈｐ７０の発現及び分泌はその差異が大きくないが、これに対し、ｈｐ４０の発現及び分泌は非常に減少したことを観察することができる。また、ｈｐ４０遺伝子の代りにｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子をｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０コンストラクトに導入してｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクトを製作した場合にはｈｐ４０の分泌水準が０.３程度にさらに減少することが分かる。本実験では結果的にｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクトがｈｐ７０の分泌水準を維持しながらｈｐ４０の分泌を最小化することが可能なコンストラクトであることを確認することができた。
【００４０】
しかも、本発明は、ＨＣＶ−１ｂのＥ２遺伝子を含み且つこれらを発現させることが可能なＤＮＡワクチンベクトル、及びＡｓｎ−２２２（ヒト）とＡｓｎ−２２０（マウス）部分が突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを提供する。
【００４１】
まず、本発明者は、本発明のｈＩＬ−１２突然変異遺伝子をＤＮＡワクチンのような遺伝子療法(gene therapy)に使用することができるかその可能性を調査するために、ｈｐ４０遺伝子のＡｓｎ−２２２に類似したマウスＩＬ−１２ｐ４０（ｍｐ４０）遺伝子の塩基序列を調査した。その結果、本発明者は、マウスｐ４０のＡｓｎ−２２０アミノ酸がヒトｐ４０のＡｓｎ−２２２と非常に類似の部分に存在し、現在までそのアミノ酸序列がＮ−糖鎖化されていると知られていないことを確認した（図１参照）。これにより、本発明者は、ｍｐ４０遺伝子の突然変異、即ちアミノ酸序列の２２０番目のＡｓｎを特定部位の突然変異誘発(site-directed mutagenesis)によってＬｅｕコドンに置換して、動物細胞に発現可能なマウスＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子の含まれたｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルを完成した。
【００４２】
また、本発明者は、ｐ４０とｐ３５小単位体をコーディングすると同時に、発現しながらＤＮＡ免疫化に使用することが可能なベクトルを製作するために、既に小動物でＤＮＡワクチンベクトルとして使用されたことのある真核細胞発現ベクトルのｐＴＶ２ベクトル(Lee et al., J. Virol., 72:8430-8436, 1998; Cho et al., Vaccine, 17:1136-1144, 1999)にｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０断片を挿入することにより、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを完成した。さらに、本発明者は、前記実験より、ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子がｈｐ７０の分泌を維持しながらｈｐ４０の分泌を最小化することが可能であるという事実を観察したため、これに基づいて、本発明のマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２０突然変異遺伝子を含みながらｐ３５を同時に発現させるベクトルとしてｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルを完成した。
【００４３】
前記ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルは韓国生命工学研究院遺伝子銀行に２０００年２月２９日付で寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ ０７４５ＢＰ）。
【００４４】
最後に、本発明者は、真核細胞にＨＣＶ−Ｅ２が発現しうるように、シミアンウィルス４０の複製開始点(simian virus 40 replication origin, SV40 ori)、サイトメガロウィルスプロモータ(cytomegalovirus promoter,ＣＭＶ)、アデノウィルス(adenovirus)の三重先導序列(tripartite leader sequence,ＴＰＬ)、多重クローニング序列(multiple cloning sequence,ＭＣＳ)、ＳＶ４０ポリアデニル化序列(polyadenylation sequence, polyＡ)及びアンピシリン抵抗性遺伝子(ampicilin resistance gene：ＡｍｐＲ)などから構成され、ＨＣＶ−Ｅ２遺伝子が多重クローニング序列内にクローニングされているｐＴＶ−２−ＨＣＶ−Ｅ２ ＤＮＡワクチンベクトルを製造した(Song M. K. et al., J. Virol., 74:2920-2925, 2000)（図４参照）。ここに使用されたＥ２遺伝子は疎水性アミノ残基(hydrophobic amino acid residue)を含むカルボキシル末端(carboxyl-terminal:Ｃ-terminal)部位を除去して蛋白質の分泌を容易にし、アミノシル末端(aminocyl-terminal:Ｎ-terminal)部位にヘルペスウィルス(Herpesvirus:ＨＳＶ)の外被糖蛋白質Ｄ（glycoprotein D:ｇＤ）の信号序列(signal sequence:ｓ)を連結させて蛋白質の発現及び細胞の分泌を効率化しようとした。
【００４５】
このように製作された発現ベクトルを用いてマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２０突然変異化によるＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１２ｐ７０の分泌様相を確認するために、前記ベクトルを細胞に形質転換させた後、細胞破砕物と細胞倍溶液を得てマウスＩＬ−１２の分泌量をＥＬＩＳＡ（Pharmigen社）で測定した。その結果、本発明のｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異体はＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１２ｐ７０の分泌及びその生物学的活性という側面からみて、ｈｐ４０のＡｓｎ−２２２突然変異体とほぼ類似の特性を示した（表１参照）。
【００４６】
最後に、本発明は、Ａｓｎ−２２２（ヒト）とＡｓｎ−２２０（マウス）部分が突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを免疫増強剤としてＤＮＡワクチン免疫化または遺伝子治療に利用する用度を提供する。
【００４７】
前記方法はＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ型肝炎、癌、インフルエンザ、結核、マラリアなど人体内の免疫力増加によって治癒できる疾病の予防及び治療に有用に使用することが可能である。
【００４８】
以前の報告によれば、ＨＣＶ−Ｅ２抗原（ｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ）を暗号化するプラスミドのＤＮＡ予防接種が接種してから３週後に抗原−特異的な体液性(antigen-specific humoral)及び細胞−媒介性免疫反応(cell-mediated immune response)を誘導するのに十分であることが確認された。このため、本発明者は、本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２遺伝子と比較して生体内抗原−特異的な免疫反応に効果的に影響を及ぼすことができるか、そしてそのような効果が何時まで持続的に維持できるかを調査するために、前記で製造された本発明のＤＮＡワクチンベクトルをマウスに追加接種した後、ＨＣＶ−Ｅ２特異的な抗体生成有無を精製されたｈＧＨ−Ｅ２蛋白質を用いてＥＬＩＳＡ法によって調査した。
【００４９】
その結果、ＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡワクチンは陰性対照群の水準より相当高い全身性(systemic)ＨＣＶ Ｅ２−特異的な全体ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ水準を誘導した。さらに、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子または野生型ｍＩＬ−１２遺伝子との同時注入はＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡワクチンが単独で投与された場合と比較して多少高い水準の全体ＩｇＧ水準を示した。ＩｇＧ１の水準もＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡの投与された群に比べて多少高い水準を示した。逆に、ＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ２ａの水準は野生型ｍＩＬ−１２投与群でやや増加し、ＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡ単独投与群と比較しては突然変異ｍＩＬ−１２投与群で相当増加した。しかも、Ｔｈ１免疫反応の間接的なインジケータ(Indicator)として一般に受け入れられているＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比は、ＩｇＧ２水準の様相が類似した突然変異ｍＩＬ−１２投与群で最も高かった（図５ａ、図５ｂ、図５ｃ及び図５ｄ参照）。このような結果は突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２投与群またはＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて体液性免疫反応においてＩｇＧ１からＩｇＧ２ａへのＩｇＧ小グループの転移に相当な影響を及ぼすことを示し、突然変異ＩＬ−１２遺伝子がＴｈ１形態の免疫反応を誘導することを暗示する。また、このような効果はＤＮＡ追加接種後０、３、６、１０週にもそのまま維持される様相を示した。
【００５０】
また、本発明者は、細胞−媒介性免疫反応の力価を評価するのに使用されてきたパラメータの一つであるＴｈ１免疫反応において本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の効果を調査するために脾臓細胞からＩＦＮ−γ発現を測定した。
【００５１】
その結果、サイトカイン遺伝子なしでＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡのみ投与された群はｈｇｈＥ２ｔ蛋白質の濃度に比例してＩＦＮ−γの水準が増加した反面、模造プラスミド(mock plasmid)接種群は増加しなかった。予想通り、野生型ｍＩＬ−１２投与群はＩＦＮ−γ誘導水準がＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べてより増強されたが、突然変異ｍＩＬ−１２投与群は野生型ｍＩＬ−１２投与群に比べて２〜３倍高いＩＦＮ−γ生産水準を示した（図６ａ、図６ｂ及び図６ｃ参照）。このような結果はｍＩＬ−１２ｐ７０が抗原−特異的なＴｈ１免疫反応を増加させる役割をし、ｍＩＬ−１２ｐ４０は生体内ＩＬ−１２Ｐ７０によるＴｈ１免疫反応の誘導を抑制する役割を果たすことを暗示するものである。このような効果はＤＮＡの追加接種後３週から現れ始め、１０週になっても同様の様相を示すが、これはｍＩＬ−１２ｐ７０がＴｈ１免疫反応を初期に誘導するだけでなく、このような免疫反応の持続にも関与することを暗示するものである。
【００５２】
上述したように、本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子がＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡ免疫化において長期間Ｔｈ１免疫反応に寄与することを確認した本発明者は、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の発現によって誘導されたＴｈ１免疫反応がＣＴＬ免疫反応及び主要細胞−媒介性免疫反応と連係されており、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子がＤＮＡ免疫化モデルでＣＴＬ活性の維持に関与するかを調査するために、追加接種後、多様な週齢でＤＮＡ免疫化マウスから得た脾臓細胞を用いてＣＴＬ分析を行った。
【００５３】
その結果、追加接種２週後、模造プラスミド投与群を除いた全てのグループで非常に強い抗原−特異的なＣＴＬ活性を示したが、ＨＣＶ Ｅ２単独投与群、野生型ｍＩＬ−１２投与群及び突然変異ｍＩＬ−１２投与群の間には殆ど差異をなかった。野生型ｍＩＬ−１２投与群はＣＴＬ反応が実験期間全体に亘ってＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて高かったが、これは増加したＣＴＬ形成にｍＩＬ−１２遺伝子が重要な役割を行うことを示す。興味深く、突然変異ｍＩＬ−１２投与群と他の２つの群（ＨＣＶ Ｅ２投与群及び野生型ｍＩＬ−１２投与群）間のＣＴＬ活性における差異は追加接種期間が長くなるほど時間経過に伴って段々著しくなった。特に、１０週後のＣＴＬ反応はＨＣＶ Ｅ２投与群及び野生型ｍＩＬ−１２投与群で非常に低かったが、これは抗原−特異的なＣＴＬの分泌量(frequency)が長期間後には相当減少するからである。一方、突然変異ｍＩＬ−１２投与群は抗原−特異的なＣＴＬ反応を維持しながら他の２つのグループより５〜１０倍高いＣＴＬ活性を示した（図７参照）。対照群として、ＣＴ２６−ｎｅｏ細胞をターゲット細胞として使用した場合には、すべてのグループでいずれの溶血現象(cell lysis)も観察されなかったが、これは前記で観察されたＣＴＬ活性がＨＣＶ Ｅ２−特異的であることを暗示するものである。
【００５４】
また、本発明者は、ＨＣＶ Ｅ２に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の生体内頻度を測定することにより、より正確にｍＩＬ−１２投与による抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び維持の効果を調査しようとした。このため、２つの免疫学的分析方法が使用されたが、その一つはＣＤ８＋Ｔ細胞内抗原特異的に反応してＩＦＮ−γを分泌する細胞の個数を測定する方法である。ＣＴＬ活性の増強が特定の抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌によって特異的に現れるかを調査するために、ＣＤ＋８Ｔ細胞を分離した後、ＰＥ(R-phycoerythrin)接合された抗−マウスＩＦＮ−γ抗体または対照群ＰＥ−接合されたイソタイプ−マッチド(isotype-matched)抗体を添加して細胞を二重染色し、染色された細胞をフローサイトメトリー装置(FACSCalibur flow cytometry)で分析してＩＦＮ−γの増加様相を観察した。
【００５５】
その結果、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子で同時免疫化されたマウスは、追加接種してから０、３、６、１０、１４週経過後にＨＣＶ Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群に比べてＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産細胞の分泌量が段々増加することが見られるが、これはＣＴＬ反応結果と同様の様相を示す。しかし、ＣＴＬ反応結果に比べて初期にもＨＣＶ Ｅ２単独群より野生型ｍＩＬ−１２投与群で高いＣＤ８＋Ｔ細胞頻度が高く、突然変異ｍＩＬ−１２群の抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が最も高かった。このような頻度の差異は追加接種後１４週目には著しくなり、ＨＶＤ Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群では抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が殆ど観察されないが、これに対し、突然変異ｍＩＬ−１２投与群ではこのような細胞の頻度数が多少減少するけれども維持されることを観察することができた（表２参照）。このような結果は突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の発現が長期間ＤＮＡ免疫化後ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産Ｔ細胞の分泌量を維持することを立証するものである。
【００５６】
抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を調査するための別の分析方法である限界希釈法(limiting dilution assay：ＬＤＡ)によってＨＣＶ Ｅ２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定した。即ち、限界希釈法はＤＮＡの追加接種が行われたマウスの脾臓細胞を多様な濃度に限界希釈した後、ＣＴＬ免疫反応観察での如く、Ｅ２を発現するＣＴ２６細胞を用いて前記のように希釈された脾臓細胞と共に培養した後、抗原特異的に刺激を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＴＬ活性を測定する方法である。その結果、限界希釈法によっても、細胞内ＩＦＮ−γ染色法から得られた結果と類似の結果が得られた。即ち、免疫化の初期に突然変異ｍＩＬ−１２投与群から最も高い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度が観察された。また、追加接種１４週後にも、ＨＣＶ Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群では、その頻度が非常に低くなるのに比べ、突然変異ｍＩＬ−１２投与群ではその頻度が持続的に維持されることが分かった（表２参照）。
【００５７】
また、本発明者はＤＮＡを追加接種せず１回接種した後、時期別にＨＣＶ Ｅ２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度変化も観察した。その結果、追加接種時より全般的に抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は多少減少したが、１回接種時にも突然変異ｍＩＬ−１２投与群から最も高いＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が観察された（表２参照）。
【００５８】
これより、本発明者は、細胞−媒介性免疫反応において、ＩＬ−１２ｐ７０自体の生体内役割はＴｈ１及びＣＴＬの活性を初期から誘導するだけでなく、長期間維持することである一方、ＩＬ−１２ｐ４０の役割は生体内拮抗物質としてＩＬ−１２ｐ７０を抑制することであることを確認した。
【００５９】
本発明の突然変異ＩＬ−１２遺伝子によって生体内で誘導されたＴｈ１及びＣＴＬ免疫反応を確認し、Ｔｈ１及びＣＴＬ免疫反応と防御的免疫反応の相関関係を調査するために、ＤＮＡ追加接種後１２週目にｈｇｈＥ２ｔを発現する腫瘍細胞のＣＴ２６−ｈｇｈＥ２５をマウスに投与した。そして、腫瘍注入２週後にマウスの血清からＨＣＶ Ｅ２特異的な全体ＩｇＧ及びその亜系列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗原の水準及びＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比率を調査した（図８ａ及び図８ｂ参照）。その結果、腫瘍注入前と同様に突然変異ｍＩＬ−１２投与群から最も高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率が観察されたが、これは腫瘍注入時にも突然変異ｍＩＬ−１２投与群でＴｈ１免疫反応が発生していることを意味する。
【００６０】
また、腫瘍注入後約３０日間腫瘍の大きさを測定した結果、野生型ｍＩＬ−１２で免疫化されたマウスのグループはｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ単独で免疫化されたグループに比べて、遅延した腫瘍成長を示した（図８ｃ参照 ）。また、このように腫瘍が注入されたマウスの生存率をグループ間に比較した場合にも、突然変異ｍＩＬ−１２で免疫化されたグループは約７０日間約９０％のマウスが生存していることを観察した。これに対し、Ｅ２単独で注入されたグループ、或いは野生型ｍＩＬ−１２が同時注入されたグループでは、生存率が２０〜３０％に止まった（図８ｄ参照）。従って、このような結果は本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子によって誘導されたＨＣＶ Ｅ２−特異的なＴｈ１及びＣＴＬ反応が変形された腫瘍細胞の発現に特異的な抗原のチャレンジに対する生体内防御を与えることを暗示する。
【００６１】
前記実験より、本発明者は本発明のＩＬ−１２ｐ４０の分泌に必須的なＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）を暗号化するコドンが突然変異化されたヒトまたはマウスのＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子が免疫増強剤としてＤＮＡワクチン免疫化または遺伝子治療に有用に使用できることを確認した。これにより、本発明は前記ヒトまたはマウスのＩＬ−１２のｐ４０小単位体突然変異遺伝子を有効成分とする、抗原−特異的な細胞性免疫反応を増進させて疾病を予防及び治療するためのＤＮＡ免疫化及び遺伝子治療用免疫増強剤を提供する。
【００６２】
前記免疫増強剤は、ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共に投与する場合、ＣＴＬ(cytotoxic T lymphocytes)細胞の加水分解能力を向上させ、Ｔヘルパー細胞のＩＦＮ−γの分泌を増加させ、ＣＤ８＋細胞のＩＦＮ−γの分泌を増加させることにより、免疫反応を増進させることができるという特徴を有する。
【００６３】
〔実施例〕
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００６４】
＜実施例１＞ヒトＩＬ−１２発現ベクトルの製作
＜１−１＞ヒトＩＬ−１２発現ベクトルの製作
ＰＭＡによって活性化されたヒトＢ細胞としてのＮＣ３７細胞から相補的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)(PCR System 2400, Perkin Elmer社)方法を用いて８２０ｂｐのヒトｐ３５小単位体と１０５０ｂｐのｐ４０小単位体のｃＤＮＡをクローニングし、ＰＣＲで増幅した。増幅されたｃＤＮＡはそれぞれ出発ベクトルのｐＳＫプラスミド(Stratagene社)に挿入(subcloning)したが、ｐ３５及びｐ４０小単位体遺伝子の両方ともｐＳＫのＳｍａI部分にそれぞれ挿入することにより、ｐＳＫ−ｈｐ３５とｐＳＫ−ｈｐ４０を製造した。
【００６５】
ｐ４０とｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子を共に発現するベクトル(bicistronic vector)を製作するために、まずＥＭＣＶのＩＲＥＳ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによって得た後、これをｐＳＫプラスミドのＳｍａIとＰｓｔI制限酵素部位に挿入してｐＳＫ−ＩＲＥＳベクトルを製造した。このベクトルをＥｃｏＲＶで切断し、ここにｐＳＫ−ｈｐ４０をＸｂａIとＢａｍＨIで処理して得たｐ４０ＤＮＡ断片の末端をＴ４ ＤＮＡ重合酵素で満たしてｐＳＫ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳを製作した。最後に、ｐＳＫ−ｈｐ３５に制限酵素ＮｃｏI、ＳａｃIを処理して得たｐ３５遺伝子ＤＮＡ断片をＮｃｏI、ＳａｃI処理されたｐＳＫ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳに挿入することにより、結果としてｐ４０、ＩＲＥＳ、ｐ３５遺伝子が順序通りに配列されたｐＳＫ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５プラスミドを製作した。
【００６６】
また、ｐＳＫ−ＩＲＥＳベクトルをＥｃｏＲＶで切断し、ここにｐＳＫ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５プラスミドをＮｃｏIとＮｏｔIで切断して得たｈｐ３５ ＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ重合酵素で満たして挿入することにより、ｐＳＫ−ｈｐ３５／ＩＲＥＳプラスミドを製作した。これをさらにＢａｍＨIとＮｃｏIで切断した部位に、ｐＳＫ−ｈｐ４０をＮｃｏIとＢａｍＨIで切断して得られるｈｐ４０断片を挿入することにより、ｐＳＫ−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０プラスミドを完成した。前記方法で製造したｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５遺伝子とｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０遺伝子をそれぞれｐＧＸ０ベクトルの制限酵素ＳｐｅI／ＮｏｔIとＸｈｏI／ＮｏｔI部分に挿入することにより、哺乳動物細胞に活性型のＩＬ−１２ｐ７０を発現することが可能なｐＧＸ０−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５及びｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０発現ベクトルを得た。ｐＧＸ０ベクトルは既存のＤＮＡワクチンベクトルであるｐＴＶ２ベクトル(Song, M. K. et al., J. Virol., 74:2920-2925, 2000)のアンピシリン抵抗性遺伝子内のＸｍｎI部位を切断して両側のブラント末端を作り、ここにＰＣＲによってｐＺＥｒＯ−２ベクトル(Invitrogen社)内のカナマイシン抵抗性遺伝子を挿入することにより完成した。
【００６７】
＜１−２＞ｐ４０小単位体発現ベクトルの製作
ｐ４０小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＣＩＮ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５ベクトルを制限酵素ＳａｃIIとＮｏｔIで切断してｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子を除去した後、Ｔ４ ＤＮＡ重合酵素を用いて末端部を満たすことにより自己結紮(self-ligation)し、これをｐＣＩＮ−ｈｐ４０と命名した。
【００６８】
＜１−３＞ｐ３５小単位体発現ベクトルの製作
ｐ３５小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＣＩＮ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５ベクトルをＮｃｏIで切断し、Ｔ４ ＤＮＡ重合酵素を満たした後、再び制限酵素ＮｏｔIで切断することによりｐ３５ ＤＮＡ断片を得てｐＣI−ｎｅｏベクトルのＸｈｏIとＮｏｔI制限酵素部分に挿入した。これをｐＣＩＮ−ｈｐ４０と命名した。
【００６９】
＜実施例２＞マウスＩＬ−１２発現ベクトルの製作
＜２−１＞マウスＩＬ−１２発現ベクトルの製作
ｐ４０小単位体とｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子を共に発現するベクトルを製作するために、まずＥＭＣＶのＩＲＥＳが含まれているｐＳＫ−ＩＲＥＳベクトルを制限酵素ＮｃｏIとＢａｍＨIで切断し、ここにマウスＩＬ−１２ｐ４０ ＰＣＲ生成物(Schoenhaut D. S. et al., J. Immunol., 148:3433-3440, 1999)を同一の制限酵素で切断して得たｐ４０ ＤＮＡ断片を挿入することにより、ｐＳＫ−ＩＲＥＳ／ｍｐ４０を製作した。次に、マウスＩＬ−１２ｐ３５生成物(Schoenhaut D. S. et al., J. Immunol., 148:3433-3440, 1992)をＢａｍＨIで処理し、Ｔ４ ＤＮＡ重合酵素を用いて末端を満たした断片を、ＣｌａI及びＴ４ ＤＮＡ重合酵素で処理されたｐＳＫ−ＩＲＥＳ／ｍｐ４０に挿入することにより、結果としてｐ３５、ＩＲＥＳ、ｐ４０遺伝子が順序通りに配列されたｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０プラスミドを製造した。前記の方法で製造したｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０遺伝子をｐＣＩ−ｎｅｏベクトル(Promega社)の制限酵素ＸｈｏIとＮｏｔI部分に挿入することにより、哺乳動物細胞に活性型のＩＬ−１２ｐ７０を発現することが可能なｐＣＩＮ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０発現ベクトルを得た。
【００７０】
＜２−２＞ ｐ４０小単位体発現ベクトルの製作
野生型マウスｐ４０小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを制限酵素ＮｃｏIとＳａｃIで切断して生成されたｐ４０断片を、同一の制限酵素で処理されたｐＧＥＸ−ＫＧベクトル（米国、Clontech社）に挿入した。このように生成されたｐＧＥＸ−ＫＧ−ｍｐ４０をＥｃｏＲｌとＮｏｔIを処理してＰＣＩ−ｎｅｏベクトルのＥｃｏＲIとＮｏｔI部分に挿入することにより、ｐＣＩＮ−ｍｐ４０発現ベクトルを得た。
【００７１】
＜２−３＞ ｐ３５小単位体発現ベクトルの製作
野生型マウスｐ３５小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを制限酵素ＸｈｏIとＥｃｏＲｌで切断して生成されたｐ３５断片を、同一の制限酵素で処理されたｐＣＩ−ｎｅｏベクトルのＸｈｏIとＥｃｏＲｌ制限酵素部分に挿入することにより、 ｐＣＩＮ−ｍｐ３５発現ベクトルを得た。
【００７２】
＜実施例３＞糖鎖化部分が突然変異されたＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−１２ｐ７０の製造
ヒトｐ３５小単位体とｐ４０小単位体のＮ糖鎖化部分として利用されるものと予想される７個のＡｓｎコドンは、特定部位の突然変異誘発(Site-directed mutagenesis)によって相関性のないコドンに代替された。ｈｐ３５とｈｐ４０小単位体のＮ−糖鎖化部分として予想される部位に対するグルタミン突然変異遺伝子のコンストラクトを製造するために、ハラグチ等(Haraguchi, et al., J. Immunol., 163:2092-2098, 1999)によって記述された方法でＰＣＲを用いてアミノ酸置換を行った。この際、突然変異化のための始発体としては、序列番号６と記載されるＴ７、序列番号７と記載されるＴ３、序列番号８で記載されるｈｐ４０−Ｎ１２５Ｑ（Ｓ）、序列番号９と記載されるｈｐ４０−Ｎ１２５Ｑ（ＡＳ）、序列番号１０と記載されるｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ（Ｓ）、序列番号１１と記載されるｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ（ＡＳ）、序列番号１２と記載されるｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ（Ｓ）、序列番号１３と記載されるｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ（ＡＳ）、序列番号１４と記載されるｈｐ４０−Ｎ３０３Ｑ（Ｓ）、序列番号１５と記載されるｈｐ４０−Ｎ３０３Ｑ（ＡＳ）、序列番号１６と記載されるｈｐ４０−Ｎ１２７Ｑ（Ｓ）、序列番号１７と記載されるｈｐ４０−Ｎ１２７Ｑ（ＡＳ）、序列番号１８と記載されるｈｐ４０−Ｎ１４１Ｑ（Ｓ）、序列番号１９と記載されるｈｐ４０−Ｎ１４１Ｑ（ＡＳ）、序列番号２０と記載されるｈｐ４０−Ｎ２５１Ｑ（Ｓ）、序列番号２１と記載されるｈｐ４０−Ｎ２５１Ｑ（ＡＳ）のヌクレオチドを合成して利用した（この際、ＳとＡＳはそれぞれセンス始発体とアンチセンス始発体を意味する。）
ｈｐ４０とｈｐ３５の単一グルタミン突然変異遺伝子コンストラクトを製造するために、前記実施例＜２−２＞ないし＜２−３＞で製造されたｐＣＩＮ−ｍｐ４０またはｐＣＩＮ−ｍｐ３５を鋳型(template)とし、Ｔ７始発体とそれぞれのセンス始発体を用いてＰＣＲを行った。これと同様に、Ｔ３始発体とそれぞれのアンチセンス始発体を用いてＰＣＲを行った。その結果、突然変異地点(mutational point)を含む共通部位(common site)を共有する２つのＰＣＲ断片が形成された。２ｎｄ ＰＣＲは前記断片の混合物を鋳型とし、フランキング始発体(flanking primer)を用いて行った。その結果として、これらの融合断片(fusion product)が形成された。前記断片をｐＣＩ−ｎｅｏベクトルに挿入した。これと同様に、二重及び三重突然変異遺伝子は単一または二重突然変異遺伝子をＰＣＲ鋳型として用いて製作された。突然変異遺伝子はＤＮＡ塩基序列分析によって確認した。
【００７３】
ｍｐ４０のＡｓｎ−２２０でＮ−糖鎖化欠陥(N-glycosylation defect)を含むマウスＩＬ−１２ｐ７０遺伝子コンストラクトを製造するために、前記実施例＜２−１＞で製造されたｐＣＩＮ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０内のｍｐ４０遺伝子部位をｍｐ４０−Ｎ２２２Ｌに置換した。ｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２２２Ｌを製造するためのｍｐ４０の突然変異化ではＳａｃI制限酵素部位を含む序列番号２２と記載されるｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ（Ｓ）及び序列番号２３と記載されるｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ（ＡＳ）のヌクレオチドを始発体として用いて前記の如くＰＣＲを行った。これより得られる、増幅された突然変異遺伝子は突然変異化後に生成される特定の制限酵素認識部位に対する制限酵素処理及びＤＮＡ塩基序列分析によって確認した。
【００７４】
図２は本発明に用いられたヒトＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−１２ｐ３５小単位体の正常遺伝子と変異遺伝子のアミノ酸構成を概略的に示す。Ｎ−糖鎖化可能部分はその位置のアスパラギン（Ａｓｎ）アミノ酸番号と共にＹ形態で表示し、各変異遺伝子において置換されたアミノ酸は四角形内に表示した。
【００７５】
＜実施例４＞ＩＬ−１２ｐ４０の単独分泌に対するヒトＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２のＮ−糖鎖化影響
熱で非活性化されたＦＢＳ(fetal bovine serum, GIBCO-BRL社)１０％を含有しているＤＭＥＭ倍地(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO-BRL社)で培養されたＣＯＳ−７細胞（ＡＴＴＣ）への形質転換は、電気穿孔法(electroporation, Biorad社)によって行われた。５×１０6個のＣＯＳ−７細胞を含む培養倍地約３００μｌ、前記実施例＜１−１＞のｐＣＩＮ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５または前記実施例３の突然変異ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミド２０μｇ、そしてアルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase)をコーディングすることにより対照区の役割を行うことが可能なｐＮＥＢ−ＳＥＡＰ(pNEB-Secreted Alkaline phosphatase, New England Biolabs)２μｇをキュベットに入れ、２５０Ｖ、９６０μＦの条件で電気穿孔法を行った。
【００７６】
電気穿孔法による形質転換後２４時間が経過すると、倍地は血清の添加されていないＣＨＯ−ＳＦＭII倍地（GIBCO-BRL社）１.５ｍｌに取り替え、実験種類によってツニカマイシン(tunicamycin:Sigma社)１μｇ／ｍｌを添加した。倍地交換２４時間後には細胞を収穫して遠心分離した後、上層液はＳＥＡＰ活性測定に使用され、ペレット(pellet)は２００μｌの細胞溶血液(cell lysis solution, Promega社)に懸濁させた。上層液とペレットに存在するＩＬ−１２ｐ７０とＩＬ−１２ｐ４０の水準はＥＬＩＳＡで測定された(R&D system社)。免疫ブロットのために培養上澄液と細胞破砕物をそれぞれ１０％及び１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(sodium dodecyl-sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis)で電気泳動し、これにより分離された蛋白質はナイロン膜(Amersham社)に電気移動(electrotransfer)した。膜に吸着した蛋白質はビオチン(biotin)の付着したヒトＩＬ−１２抗体(R&D system社)と、ＨＲＰ(Horseradish peroxidase)の付着した ストレプトアビジン(streptavidin, Pharmingen社)、及びＥＣＬキット(Amersham社)を用いて結果を得た。その結果を下記表１に示した。下記表１の数値はＥＬＩＳＡによって測定された野生型におけるＩＬ−１２ｐ７０とＩＬ−１２ｐ４０の発現程度を１００％としたときの相対的な発現量を示したものである。
【００７７】
【表１】
0004180826.tif 000002
【００７８】
ａ；ＤＮＡコンストラクトは総２０μｇがＣＯＳ−７細胞に電気穿孔法よる形質転換のために使用された。また、２つのＤＮＡコンストラクトの同時形質転換のためにはそれぞれ１０μｇのＤＮＡが使用された。
【００７９】
ｂ；ＩＬ−１２ｐ７０またはｐ４０の発現はＥＬＩＳＡで測定し、野生型ＩＬ−１２含有コンストラクトでｐ４０及びｐ７０の発現及び分泌水準を１００％として、これに対する相対的な比率で示した。
【００８０】
ｃ；それぞれの突然変異上澄液内に存在する同量のｐ７０をＩＦＮ−γ誘導能分析に使用した。誘導されたＩＦＮ−γの水準はＥＬＩＳＡで測定し、野生型ＩＬ−１２含有コンストラクトを用いた実験で誘導されたＩＦＮ−γ水準を１００％とし、これに対する相対的な比率で示した。
【００８１】
ｄ；ＩＬ−１２ｐ４０はＩＬ−１２ｐ７０のｐ４０部分でないＩＬ−１２ｐ４０の単量体または二量体ｐ４０形態を示す。
【００８２】
ｅ；ＩＬ−１２ｐ７０はＩＬ−１２ｐ３５とＩＬ−１２ｐ４０からなるヘテロ二量体を示す。
【００８３】
ｆ；２つのＤＮＡコンストラクトの同時形質転換にはプラスミド原形としてｐＣＩ−ｎｅoが使用された。
【００８４】
ｇ；＜１はＥＬＩＳＡの感知水準より低い量の蛋白質が検出されることを意味する。
【００８５】
ｈ；野生型ｈｐ４０またはｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ、ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ ＤＮＡをそれぞれｈｐ３５ ＤＮＡと同時に形質転換した後、上澄液から検出されるｐ７０の量を同一にしたとき、野生型ＤＮＡ形質転換時よりｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑとｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ ＤＮＡ形質転換時に上澄液から検出されるｐ４０の量が相対的に低いが、この上澄液に不足分のｈｐ４０（ｈｐ４０コンストラクトを形質転換して得た上澄液に存在するｈｐ４０）を添加してＩＦＮ−γ誘導能分析実験を行った場合を意味する。
【００８６】
ｉ；括弧内に表示された数字は同時に形質転換させたプラスミドｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑとｈｐ３５ ＤＮＡ量（μｇ）を意味する。形質転換時に総２０μｇのＤＮＡが利用されたが、不足分はｐＣＩ−ｎｅｏ ＤＮＡで補充された。
【００８７】
ｊ；ｈＩＬ−１２ｐ４０及びその突然変異型とｈＩＬ−１２ｐ３５の同時発現のために使用されたプラスミドの原形はｐＧＸ０ベクトルである。
【００８８】
ｋ；ｍＩＬ-１２ｐ４０及びその突然変異型とｍＩＬ−１２ｐ３５の同時発現のために使用されたプラスミドの原形はｐＴＶ２ベクトルである。
【００８９】
表１に示すように、ｐ３５のＡｓｎ−１４１とｐ４０のＡｓｎ−３０３糖鎖化可能部分の突然変異はＩＬ−１２ｐ７０またはＩＬ−１２ｐ４０の分泌に何の影響も及ぼさない一方、ｐ４０ Ａｓｎ−１３５の突然変異とｐ４０ Ａｓｎ−２２２糖鎖化部分の突然変異はＩＬ−１２ｐ４０の分泌のみを減少させることを確認した。特に、Ａｓｎ−２２２のアミノ酸はルシン（Ｌｅｕ）以外にグルタミン(Ｇｌｎ)に代替された時にも同一の分泌様相を示すことからみて、このような現象はＡｓｎ−２２２のＮ−糖鎖化の消失によるものと思われる。
【００９０】
図３ａは正常型ヒトＩＬ−１２ｐ３５遺伝子と糖鎖化可能部分突然変異遺伝子のＣＯＳ７細胞内形質転換後、細胞破砕物で行った免疫ブロット結果を示す。第１列と第２列はそれぞれｐＣＩ−ｎｅｏとｐＣＩＮ−ｈｐ３５で形質転換された細胞破砕物に対する結果であり、第３、４、５及び６列はｈｐ３５のＮ−糖鎖化可能部分に対する突然変異遺伝子を含む発現ベクトルとしてのｐＣＩＮ−ｈｐ３５−Ｎ１２７Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ３５−Ｎ１４１Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ３５−Ｎ２５１Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ３５−Ｎ１２７、２５１Ｑで形質転換された細胞破砕物に対する結果である。第２及び５列から分子量が約３３.２ｋＤａ程度のバンドが出たが、これはＮ−糖鎖化されたｐ３５小単位体に対する蛋白質を示すもので、ツニカマイシンによってｐ３５小単位体のＮ−糖鎖化を阻害させる時に現れる分子量２８ ｋＤａバンド（第７列）が第３及び４列で現れることからみて、Ａｓｎ−１２７及びＡｓｎ−１４１アミノ酸がＮ−糖鎖化される部分であると思われる。
【００９１】
図３ｂは正常型ヒトＩＬ−１２ｐ４０遺伝子と糖鎖化可能部分突然変異遺伝子のＣＯＳ７細胞内形質転換後、細胞破砕物で行った免疫ブロット結果を示す。第１列と第２列はそれぞれｐＣＩ−ｎｅｏとｐＣＩＮ−ｈｐ４０で形質転換された細胞破砕物に対する結果であり、第３、４、５及び６列はｈｐ４０のＮ−糖鎖化可能部分に対する突然変異遺伝子を含む発現ベクトルとしてのｐＣＩＮ−ｈｐ４０−Ｎ１２５Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ４０−Ｎ３０３Ｑで形質転換された細胞破砕物に対する結果であり、第７、８、９及び１０列は各Ｎ−糖鎖化可能部分に対する二重ないし三重突然変異化後にこれを用いて形質転換された細胞破砕物に対する結果であり、第１１列はｐＣＩＮ−ｈｐ４０で形質転換された細胞にＮ−糖鎖化を阻害させる試薬、例えばツニカマイシンを処理した細胞破砕物に対する結果である。
【００９２】
いろいろの報告によれば、ＩＬ−１２ｐ４０の免疫ブロット結果、３〜４個のバンドが分子量３６〜４５ｋＤａで現れると知られており、本実施例の第２列及び３列野生型ＩＬ−１２ｐ４０、或いはこれと共にＩＬ−１２ｐ３５を発現するようにした細胞破砕物からも３６、３７.５、４０、４３.１ｋＤａ程度の分子量でバンドが現われている。第１１列のツニカマイシンを処理した細胞破砕物では、前記３つのバンドがなくなり、３６ｋＤａのバンドのみが残ることからみて、このバンドはＮ−糖鎖化されていないｐ４０小単位体を示すものである。第３及び４列のＡｓｎ−１２５及びＡｓｎ−１３５突然変異はバンド様相が野生型とあまり相違せず、残りの第５及び６列のＡｓｎ−２２２、Ａｓｎ−３０３突然変異はバンド様相が変わっていることが分かるが、これは１３５、２２２、３０３位置のＡｓｎアミノ酸がＮ−糖鎖化部分として使用されていることを意味する。
【００９３】
図３ｃは野生型ヒトＩＬ−１２ｐ４０遺伝子と糖鎖化可能部分突然変異遺伝子のＣＯＳ７細胞内形質転換後、細胞培養上澄液で行った免疫ブロット結果を示す。各列に対する説明は図３ｂのそれと同一である。細胞破砕物の結果と同様に３〜４個のバンドが分子量３６〜４５ｋＤａで現われており、第３及び４列のＡｓｎ−１２５及びＡｓｎ−１３５突然変異はバンド様相が野生型とあまり相違しないが、残りの第５及び６列のＡｓｎ−２２２及びＡｓｎ−３０３突然変異はバンド様相が変わっていることが分かる。特に、Ａｓｎ−１３５とＡｓｎ−２２２アミノ酸突然変異の場合、細胞破砕物でとは異なり、細胞培養液に殆ど分泌されていないことが分かるが、これはＥＬＩＳＡによる定量化結果と一致する。
【００９４】
前記突然変異遺伝子を含む発現ベクトルのうちＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の糖鎖化可能部分Ａｓｎ−２２２がＬｅｕ−２２２に突然変異された遺伝子を含んでいる発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｐＧＸ０−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５は、韓国生命工学研究院遺伝子銀行に２００１年２月２９日付で寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ ０９６９ＢＰ及びＫＣＴＣ ０９７０ＢＰ）。
【００９５】
＜４−１＞ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化及び分泌に及ぼすｈｐ３５のＮ−糖鎖化効果
本発明者は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体(heterodimerization)及び分泌に及ぼすｈｐ３５のＮ−糖鎖化効果を調査するために、前述したように野生型ｈｐ３５遺伝子またはそのＮ−糖鎖化突然変異遺伝子を含むｈＩＬ−１２発現ベクトルで細胞を形質転換させた後、これから得た培養上澄液及び細胞破砕物を用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００９６】
その結果、前記表１に示すように、Ａｓｎ−１２７を除いてｈｐ３５の可能なＮ−糖鎖化残基の除去はｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化及び分泌に何の効果も及ぼさなかった。ところが、Ａｓｎ−１２７の糖鎖化はｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌を相当な程度に減少させたが、これは正常的な形質感染効率を示したｈｐ３５−Ｎ１２７Ｑ及びｈｐ３５−Ｎ１２７、１４１Ｑの発現水準がウェスタンブロット上で他の突然変異体の発現水準と類似しているからである。従って、このような結果はＡｓｎ−１４１のＮ−糖鎖化ではなくｈｐ３５のＡｓｎ−１２７のＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体と分泌に非常に重要な役割を行うことを示す。
【００９７】
＜４−２＞ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化及び分泌に及ぼすｈｐ４０のＮ−糖鎖化効果
また、本発明者は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体及び分泌に対するＮ−糖鎖化の効果を測定するために、前記実施例＜３−１＞と同一の方法で野生型ｈｐ３５遺伝子またはそのＮ−糖鎖化突然変異遺伝子を含むｈＩＬ−１２発現ベクトルで形質転換させた後、これにより得られる細胞の培養上澄液及び細胞破砕物内のｈＩＬ−１２ｐ７０及びｈＩＬ−１２ｐ４０の水準をＥＬＩＳＡで分析した。
【００９８】
その結果、前記表１に示すように、Ａｓｎ−１３５またはＡｓｎ−２２２の突然変異は、ｈＩＬ-１２ｐ７０の分泌に殆ど影響を及ぼさなかったが、これは前記突然変異体におけるｈＩＬ−１２ｐ７０の細胞外水準(extracellular level)が野生型ｈｐ４０と殆ど類似しているからである。より興味深いことは、Ａｓｎ−１３５及びＡｓｎ−２２２突然変異体においてｈＩＬ−１２ｐ４０の分泌が相当減少し、特にＡｓｎ−２２２突然変異体は野生型ｈｐ４０と比較して約１５％程度減少した分泌水準を示すものである。このような結果はＡｓｎ−２２２におけるＮ−糖鎖化がヘテロ二量体形態のｈＩＬ−１２、ｈＩＬ−１２ｐ７０ではなくｈＩＬ−１２ｐ４０が単独で分泌されるのに要求されることを示す。また、Ａｓｎ−１３５及び／又はＡｓｎ−２２２における突然変異体を含む二重及び三重突然変異体もｈＩＬ−１２ｐ７０ではなくｈＩＬ−１２ｐ４０より低い水準の分泌水準を示した。
【００９９】
これとは逆に、他の突然変異体は野生型ｈｐ４０と比較して細胞破砕物内ｈＩＬ−１２ｐ４０及びｈＩＬ−１２ｐ７０を同等な量だけ生産したが、Ａｓｎ−１２５及びＡｓｎ−３０３の突然変異体はｈＩＬ−１２ｐ４０及びｈＩＬ−１２ｐ７０の発現、ヘテロ二量体化、分泌において相当な差異を示した。
【０１００】
前記結果より、本発明者はＡｓｎ−２２２におけるＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌には要求されないが、ｈＩＬ−１２ｐ４０の分泌には必須的な役割を行う一方、Ａｓｎ−１２７におけるｈｐ３５ Ｎ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌に重要な役割を行うことを確認した。これはまたｈｐ３５のＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌に必須条件であるという以前の報告と一致する結果である(Carra, G. et al., J. Immunol., 164:4752-4761, 2000)
＜４−３＞ｈＩＬ−１２の糖鎖化が生物学的活性に及ぼす影響
本発明者は、ｈＩＬ−１２の糖鎖化が生物学的活性に及ぼす影響を調査するために、野生型ｈＩＬ−１２と潜在的Ｎ−糖鎖化部位の突然変異を含むその誘導体のＩＦＮ−γ誘導能(induction ability)を分析した。このため、野生型ｈＩＬ−１２とその突然変異体を１００ｎｇ／ｍｌずつ同量含む培養上澄液をヒトＰＢＬｓと共に培養した後、それぞれの培養上澄液内の誘導されたＩＦＮ−γ水準をＥＬＩＳＡで分析した。
【０１０１】
その結果、前記表１に示すように、ＩＦＮ−γ誘導能という面において野生型とその全ての誘導体との間に著しい差異は見えなかった。ところが、Ａｓｎ−１３５及び／またはＡｓｎ−２２２で突然変異されたｈｐ４０誘導体は、野生型または他のｈｐ４０突然変異体に比べてやや増加したＩＦＮ−γ誘導能を示した。このような結果は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の拮抗物質(antagonists)として知られているｈＩＬ−１２ｐ４０の水準がｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ及び／またはｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑを含む突然変異体の培養上澄液内で他の突然変異体に比べて相対的に非常に低いからである。
【０１０２】
＜実施例５＞糖鎖化部分が突然変異化されたＩＬ-１２ｐ７０の分泌におけるＩＬ−１２ｐ３５の役割
ｈｐ４０のＡｓｎ−２２２における糖鎖化がどのようにｈＩＬ−１２ｐ４０の分泌を減少させるかを調査するために、本発明者は一定量のｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ−発現プラスミドを様々な量の野生型ｈｐ３５ ＤＮＡと共に細胞に同時に形質感染させた。
【０１０３】
このため、ヒト抹消血単核細胞(human peripheral blood mononuclear cells, ＰＭＢＣ)は、フィコール・ハイパック(Ficoll-Hypaque, Sigma社)濃度差を用いた遠心分離で血液から分離し、１０％ＦＢＳとペニシリン(penicillin)／ストレプトマイシン(streptomycin)（GIBCO-BRL社）を含んだＲＰＭＩ−１６４０倍地（GIBCO-BRL社）に再び懸濁化した。ヒトＩＦＮ−γ増幅量測定のために４×１０5個のヒト抹消血リンパ球を１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２ｐ７０または突然変異蛋白質を含有する培養上澄液とともに１６時間培養した。
【０１０４】
一方、マウスＩＦＮ−γ増幅量を測定するためには６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓を確保した後、これより得た１×１０5個の脾臓細胞(splenocytes)を２４時間１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１２ｐ７０またはこれの突然変異誘導体を含む培養上澄液と共に培養した。増幅されたヒト及びマウスＩＦＮ−γの量はヒト及びマウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット(R&D systems社)を用いて測定された。その結果は表１に提示されている。表１の数値はＥＬＩＳＡによって測定された野生型におけるＩＦＮ−γの増幅量を１００％としたときの相対的な数値である。
【０１０５】
一般に、ｐ３５小単位体は単独で分泌されず、ｐ４０と結合されてＩＬ−１２ｐ７０の形で分泌される一方、ｐ４０小単位体は単量体(monomer)またはホモ二量体(homodimer)の形で分泌されるが、これはｐ３５小単位体ではなくｐ４０小単位体がＩＬ−１２ｐ７０の分泌において主要要素として作用することを暗示するものである。表１に示すように、ｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌量は、野生型ｈｐ４０とｈｐ−Ｎ２２２Ｑ突然変異の両方ともにおいて形質感染されたｈｐ３５ ＤＮＡの量に比例して増加した。このような結果は分泌結果(secretion defect)を有するｈｐ４０小単位体がｈｐ３５小単位体と結合しながらＩＬ−１２ｐ７０の形で分泌されることを示すもので、ｈｐ３５小単位体もｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌において別の作用を行うことを暗示するものである。最近、ｈｐ４０小単位体内の形態的な変化(conformational change)がｈｐ３５との結合によることを示す研究が報告され、ＩＬ-１２ｐ７０分泌においてｈｐ３５小単位体の寄与可能性を提示したことがある(Yoon, C et al., EMBO J., 19:3530-3534, 2000)。前記研究と本発明の結果より、本発明者はＡｓｎ−２２２における糖鎖化を含むｈｐ４０がそれ自体では分泌に欠陥を有するが、ｈｐ３５との結合によるｈｐ４０部位の形態的な変化に起因してｈｐ７０の形で分泌できることを確認した。
【０１０６】
＜実施例６＞マウスＩＬ−１２ｐ４０ Ａｓｎ−２２０糖鎖化部分の突然変異遺伝子含有発現ベクトル及びＨＣＶ−Ｅ２ ＤＮＡワクチンの製造
＜６−１＞ｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌの製造
本発明のｈＩＬ−１２突然変異遺伝子をＤＮＡワクチンのような遺伝子療法(gene therapy)に使用することができるかその可能性を調査するために、本発明者はｈｐ４０遺伝子のＡｓｎ−２２２と類似のマウスＩＬ−１２ｐ４０（ｍｐ４０）遺伝子の塩基序列を調査した。その結果、本発明者はマウスｐ４０のＡｓｎ−２２０アミノ酸がヒトｐ４０のＡｓｎ−２２２と非常に類似している部位に存在し、現在までそのアミノ酸序列がＮ−糖鎖化されていると知られていないことを確認した。これにより、本発明者はｍｐ４０遺伝子の突然変異、即ちアミノ酸序列の２２０番目のＡｓｎを特定部位の突然変異誘発(Site-directed mutagenesis)によってＬｅｕコドンに置換してｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌを製造した。この際、突然変異化のための始発体としてはｐ４０において序列番号２２及び序列番号２３と記載されるヌクレオチドを合成して利用した。前記突然変異は遺伝子の識別を容易にするためのＳａｃI制限酵素認識部位を含んでいる。このように製造された突然変異は、突然変異化後に生成される特定の制限酵素認識部位に対する制限酵素処理とＤＮＡ序列確認によって検証された。これにより、動物細胞に発現可能なマウスＩＬ-１２ｐ４０突然変異遺伝子の含まれたｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルを完成した。
【０１０７】
＜６−２＞ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルの製造
ｐ４０とｐ３５小単位体をコーディングすると共に発現しながらＤＮＡ免疫化に使用し得るベクトルを製作するために、既に小動物でＤＮＡワクチンベクトルとして使用されたことのある真核細胞発現ベクトルのｐＴＶ２ベクトル(Lee et al., J. Virol., 72:8430-8436, 1998; Cho et al., Vaccine, 17:1136-1144, 1999)を制限酵素Ａｓｐ７１８とＮｏｔIで切断し、ここにｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０を同一の酵素で切断して得たｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０断片を挿入することにより、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを完成した。さらに、マウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ２２０突然変異遺伝子を含みながらｐ３５を同時に発現させるベクトルの製造のために、まずｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルをＮｃｏIとＮｏｔIで切断し、ここにｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌを同一の酵素で切断して得た４０−Ｎ２２０Ｌ断片を挿入することにより、ｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−２２０Ｌベクトルを製作した。ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルをＥｃｏＲＶとＮｏｔIで切断してｍｐ４０断片を除去した後、ここにｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−２２０Ｌを同一の酵素で切断して得たｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ断片を挿入することにより、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルを完成した。
【０１０８】
前記ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルは韓国生命工学研究院遺伝子銀行に２０００年２月２９日付で寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ ０７４５ＢＰ）。
【０１０９】
＜６−３＞ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ベクトルの製造
本発明者は、真核細胞にＨＣＶ−Ｅ２蛋白質を発現することが可能なｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ ＤＮＡワクチンベクトルを製造した(Song M. K. et al., J. Virol., 74:2920-2925, 2000)。図５に示すように、ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ ＤＮＡワクチンベクトルはシミアンウィルス４０の複製開始点(simian virus 40 relication origin, SV40 ori)、サイトメガロウィルスプロモータ(cytomegalovirus promoter,ＣＭＶ)、アデノウィルス(adenovirus)の三重先導序列(tripartite leader sequence、ＴＰＬ)、多重クローニング序列(multiple cloning sequence,ＭＣＳ)、ＳＶ４０ポリアデニル化序列(polyadenylation sequence, polyＡ)及びアンピシリン抵抗性遺伝子(ampicilin resistance gene：ＡｍｐＲ)などから構成され、ＨＣＶ−Ｅ２遺伝子が多重クローニング序列内にクローニングされている。本発明に使用されたＥ２遺伝子は疎水性アミノ残基 (hydrophobic amino acid residue)を含むカルボキシル末端(carboxyl-terminal:Ｃ-terminal)部位を除去して蛋白質の分泌を容易にし、アミノシル末端(aminocyl-terminal:Ｎ-terminal)部位にヘルペスウィルス(Herpesvirus:ＨＳＶ)の外被糖蛋白質Ｄ(glycoprotein D:ｇＤ)の信号序列(signal sequence:ｓ)を連結させて蛋白質の発現及び細胞の分泌を効率化しようとした。
【０１１０】
＜６−４＞マウスＩＬ−１２ｐ４０ Ａｓｎ−２２０突然変異化によるＩＬ−１２ｐ４０及びＩｌ-１２ｐ７０の分泌様相確認
実施例４で使用された方法と同方法によって下記表１に示したベクトルをＣＯＳ−７細胞に形質転換させた後、細胞破砕物と細胞培養液を得てマウスＩＬ−１２ＥＬＩＳＡ(Pharmingen社)を行い、ＥＬＩＳＡによって測定された野生型におけるＩＬ−１２ｐ７０とｐ４０の発現程度を濃度で表１に示した。ｐＣＩ−ｎｅｏにおいて、＜１の数値はＥＬＩＳＡで検出されない範囲を意味する。
【０１１１】
表１に示すように、ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異体はＩＬ−１２ｐ４０及びＩｌ−１２ｐ７０の分泌及びその生物学的活性という側面からみて、ｈｐ４０のＡｓｎ−２２２突然変異体とほぼ類似の特性を示した。
【０１１２】
また、本発明者は前記ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異遺伝子がＤＮＡワクチンとして使用できるか或いはＴｈ１及びＣＴＬ免疫反応の誘導においてｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異遺伝子と野生型ｍｐ４０遺伝子の活性を比較するために、本発明のｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異遺伝子ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０（ｍＩＬ−１２ｗｔ）またはｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ（ｍＩＬ−１２ｍｕｔ）をｐＴＶ２ ＤＮＡワクチンベクトルに挿入してそれらの試験管内(in vitro)特性を観察した。その結果、表１に示したように、ｐＴＶ２ベクトル内ｍＩＬ−１２ｍｕｔ遺伝子ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異体はＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１２ｐ７０の分泌及びその生物学的活性という側面からみて、ｈｐ４０のＡｓｎ−２２２突然変異体とほぼ類似の特性を示した。
【０１１３】
＜実施例７＞抗原−特異的な体液性免疫反応に対する突然変異ＩＬ−１２の効果調査
以前の報告によれば、ＨＣＶ−Ｅ２抗原（ｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ）を暗号化するプラスミドのＤＮＡ予防接種が、接種してから３週後に抗原−特異的な体液性(antigen-specific humoral)及び細胞−媒介性免疫反応(cell-mediated immune response)を誘導するのに十分であることが確認された。このため、本発明者は本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２遺伝子と比較して生体内抗原−特異的な免疫反応に効果的に影響を及ぼすことができるかを調査するために、マウスを初期免疫化させた後、ｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔプラスミドと共にｐＴＶ−ｍＩＬ−１２ｍｕｔまたはｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔを４週後に追加接種した。
【０１１４】
具体的に、前記実施例６で製造された本発明の突然変異遺伝子を含んだ発現ベクトルによってＤＮＡワクチンによる免疫反応増進を調査するために、ｐＴＶ２、突然変異ｍＩＬ−１２または野生型ｍＩＬ−１２を有するｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ ＤＮＡ２００μｇを１００μｌの燐酸塩緩衝溶液(phosphate-buffered saline solution)に溶解させた後、生後約６〜８週年齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの前脛骨筋(anterior tibialis muscles)に注射した。最初ＤＮＡ注入してから４週経過後、同一の方法で同一量のＤＮＡを追加接種した。２回のＤＮＡ追加接種後約０、３、６、１０週が経過してマウスの眼球近くの血筋から採血して血清を分離し、ＨＣＶ−Ｅ２特異的な抗体生成有無を生成されたｈＧＨ−Ｅ２蛋白質を用いてＥＬＩＳＡ法によって調査した。使用されたＥ２蛋白質はＣＨＯ細胞株から発現されたｈｇｈ−Ｅ２蛋白質を利用した。９６−ウェルプレートにｈｇｈ−Ｅ２蛋白質を１００ｎｇずつコーティングした後、免疫されたマウスから得られた血清を適当に希釈して蛋白質と反応させた。その後、抗原特異的なＩｇＧにホースラディシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase、ＨＲＰ：Chemicon社)が接合された抗マウスｌｇＧ抗体を反応させた後、ＡＢＴＳ(Sigma社)を添加することにより、発色反応を行わせ、ＥＬＩＳＡ測定器(BioTek社)によって４５０ｎｍで分析した。また、Ｅ２蛋白質に対して形成された総ＩｇＧ抗体に対する亜系列のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの相対的比率を観察するために、抗マウスＩｇＧ抗体の代りにそれぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａに特異的に結合する抗マウスＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った。
【０１１５】
その結果、図５ａ、図５ｂ、図５ｃ及び図５ｄに示すように、ＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡワクチンは陰性対照群の水準より相当高い全身性(systemic)ＨＣＶ Ｅ２−特異的な全体ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの水準を誘導し、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子または野生型ｍＩＬ−１２遺伝子との同時注入はＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡワクチンが単独で投与された場合に比べて高い水準の全体ＩｇＧ水準を示した。ＩｇＧ１の水準はＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡが投与された群と比較して多少高い水準を示した。逆に、ＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ２ａの水準は野生型ｍＩＬ−１２投与群でやや増加し、ＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡ単独投与群に比べては突然変異ｍＩＬ−１２投与群で相当増加した。しかも、Ｔｈ１免疫反応の間接的なインジケータ(Indicator)として一般的に受け入れられているＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比はＩｇＧ２水準の様相が類似している突然変異ｍＩＬ−１２投与群で最も高かった。このような結果は突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２投与群またはＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて体液性免疫反応においてＩｇＧ１からＩｇＧ２ａへのＩｇＧ亜系列の転移に相当関与することを示し、突然変異ＩＬ−１２遺伝子がＴｈ１形態の免疫反応を誘導することを暗示する。
【０１１６】
＜実施例８＞免疫化されたマウスからの細胞性免疫反応調査
＜８−１＞突然変異ＩＬ−１２による抗原−特異的なＴｈ１免疫反応の誘導
本発明者は、細胞−媒介性免疫反応の力価評価に使用されてきたパラメータの一つであるＴｈ１免疫反応において本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の効果を調査するために、脾臓細胞からＩＦＮ−γ発現を測定した。このために、２回のＤＮＡ注入後約８週経過したマウスの脾臓から得た脾臓細胞（１×１０5）をＵ字底状の９６−ウェルプレートに添加した。その後、ＣＨＯ細胞から精製されたｈｇｈ−Ｅ２ｔ蛋白質１〜５μｇを各ウェルに添加し、細胞を３７℃、ＣＯ2培養器で３日間培養して活性化させた。これより細胞培養液を確保した後、これを上層液内に存在するＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって測定するために使用した。特定の抗原として活性化された後、誘導されたＵＦＮ−γは抗原−特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞から生産されるが、Ｔｈ１免疫反応のインジケータとして使用できる。
【０１１７】
図６に示すように、サイトカイン遺伝子なしでＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡのみ投与された群はｈｇｈＥ２ｔ蛋白質の濃度に比例してＩＦＮ−γ水準が増加した反面、模造プラスミド(mock plasmid)接種群は増加しなかった。予想通りに、野生型ｍＩＬ−１２投与群はＩＦＮ−γ誘導水準がＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べてより増強され、突然変異ｍＩＬ−１２投与群は野生型ｍＩＬ−１２投与群に比べて２〜３倍高いＩＦＮ−γ生産水準を示した。このような結果はｍＩＬ−１２ｐ７０が抗原−特異的なＴｈ１免疫反応を増加させる役割を果たし、ｍＩＬ−１２ｐ４０は生体内ＩＬ−１２ｐ７０によるＴｈ１免役反応の誘導を抑制する役割を果たすことを暗示するものである。接種されたグループ間のＩＦＮ−γ誘導水準は追加接種３週後から差異を示し、１０週以後にも類似の差異を示したが、これはｍＩＬ−１２ｐ７０がＴｈ１免役反応の誘導及び維持に関与することを暗示するものである。
【０１１８】
＜８−２＞突然変異ＩＬ−１２による抗原−特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞機能の長期間増強効果調査
上述したように、本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子がＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡ免役化において長期間Ｔｈ１免役反応に寄与することを確認した本発明者は、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の発現によって誘導されたＴｈ１免役反応がＣＴＬ免役反応及び主要細胞−媒介性免役反応と連係しており、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子がＤＮＡ免役化モデルでＣＴＬ活性の維持に影響を及ぼすかを調査するために、追加接種後様々な週齢においてＤＮＡ免役化マウスから得た脾臓細胞を用いてＣＴＬ分析を行った。
【０１１９】
このために、Ｓｏｎｇを含んだ本発明者によって製作されて既に報告されたＨＣＶ−Ｅ２発現細胞株のＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞(Song M. K. et al., J. Virol., 74:2920-2925, 2000)にマイトマイシン(mitomycin C、５００μｇ／ｍｌ)処理によって細胞分裂を抑制させ、これを２回のＤＮＡ注入後約２週が経過したマウスの脾臓から得た脾臓細胞とともに試験管内(in vitro)で約５日間活性化させた。これより得た効果器細胞(effect cell)の細胞毒性分析(cytotoxicity)を51Ｃｒで標識されたＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔまたはＣＴ２６−ｎｅｏのような互いに異なるターゲット細胞(target cell)を対象として行った。多様な数の効果器細胞を目的のＥ：Ｔ比率で三重にＵ字底状のウェルプレートにコーティングした。51Ｃｒで標識されたターゲット細胞（５×１０3）を前記ウェルプレートの各ウェルに添加した後、６時間３７℃で培養した。これから上層液を回収して使用し、反応後得られる51Ｃｒの放出をγ−測定器(γ-counter, Wallac, Turku, Finland)で測定することにより、ＣＴＬ免役反応を調査した。特定の溶血比率(percentage of specific lysis)は下記数式１によって計算した。この際、最小溶血(minimum lysis)はターゲット細胞を培養倍地のみで培養することにより収得し、最大溶血(maximum lysis)はターゲット細胞を１％ノニデットＰ４０(Nonidet-P40)に露出させることにより確保した。
【０１２０】
【数１】
0004180826.tif 000003
【０１２１】
その結果、図７に示すように、追加接種２週後、模造プラスミド投与群を除いた全てのグループで非常に強い抗原−特異的なＣＴＬ活性が観察されたが、ＨＣＶ Ｅ２単独投与群、野生型ｍＩＬ−１２投与群及び突然変異ｍＩＬ−１２投与群の間ではほぼ差異がなかった。野生型ｍＩＬ−１２投与群ではＣＴＬ反応が実験期間全体に亘ってＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて高く出たが、これは増加したＣＴＬ形成にｍＩＬ−１２遺伝子が重要な役割を行うことを示す。興味深く、突然変異ｍＩＬ−１２投与群と他の２つの群（ＨＣＶ Ｅ２投与群及び野生型ｍＩＬ−１２投与群）間のＣＴＬ活性における差異は、追加接種期間が長くなるほど時間経過に伴って段々著しくなった。特に、１０週後のＣＴＬ反応はＨＣＶ Ｅ２投与群及び野生型ｍＩＬ−１２投与群で非常に低かったが、これは抗原−特異的なＣＴＬの分泌量(frequency)が長期間後には相当減少するからである。一方、突然変異ｍＩＬ−１２投与群は抗原−特異的なＣＴＬ反応を維持しながら、異なる２つのグループより５〜１０倍高いＣＴＬ活性を示した。対照群として、ＣＴ２６−ｎｅｏ細胞をターゲット細胞として使用した場合には、全てのグループにおいていずれの溶血現象(cell lysis)も観察されなかったが、これは前記で観察されたＣＴＬ活性がＨＣＶ Ｅ２−特異的であることを暗示するものである。
【０１２２】
＜８−３＞免役化されたマウスのＣＤ８＋細胞における抗原−特異的ＩＦＮ−γ生成に対するフローサイトメトリー
ＣＴＬ活性の長期間増強が特定の抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌によって特異的に現れるか、及び生体内ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を確認するために、２回のＤＮＡ注入後約２週が経過したマウスの脾臓から得た脾臓細胞と、マイトマイシンＣ（５００μｇ／ｍｌ）の処理されたＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞を４０時間培養した。 磁気細胞分離装置(magnetic cell sorting:ＭＡＣＳ)によってＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した後、これを前記で培養されたＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞（１×１０6）と１０Ｕ／ｍｌ組換え型(recombinant)ＩＬ−１２を添加して４０時間培養した。この際、４μｌGlogiStop(Pharmingen社)を処理してＣＤ８＋Ｔ細胞から生成されるサイトカインの分泌を阻害させた後、細胞を３７℃で８時間さらに培養した。
【０１２３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を直接的に分離するために、活性化された脾臓細胞を抗−ＣＤ８マイクロビード(microbead, Miltenyi Biotec, Inc.社)と培養した後、ｍｉｎｉＭＡＣＳシステムのカラム(microbead, Miltenyi Biotec, Inc.社)を通過させ、残存するＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。非特異的染色を防止するために、細胞をＦｃ ＢｌｏｃｋTM（PharMingen社）とともに前培養した後ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)接合された抗ＣＤ８抗体で染色した。培養後、細胞をまずCytofix/CytopermTM(PharMingen社)で固定し透過させた後、ＰＥ(R-phycoerythrin)接合された抗−マウスＩＦＮ−γ抗体または対照群ＰＥ−接合されたイソタイプ−マッチド(iostype−matched)抗体を添加して細胞を二重染色した。染色された細胞はＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用するフローサイトメトリー(FACSCalibur flow cytometry, Becton Dickinson社)を用いて分析し、ＩＦＮ−γの増加様相を観察した。
【０１２４】
【表２】
0004180826.tif 000004
【０１２５】
ａ：６週〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに本発明の多様なプラスミドを４週間隔で１回または２回接種した。
【０１２６】
ｂ：各群の発現は次の通りである。グループI：ｐＴＶ２、グループII：ｐＴＶ２-ＨＣＶ−Ｅ２ｔ＋ｐＴＶ２、グループIII：ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ｔ＋ｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔ、グループIV：ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ｔ＋ｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔ。
【０１２７】
ｃ：生きているＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＳＣとＣＤ８図面を用いてゲーティング(gating)することにより選択し、生きているＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ８とＩＦＮ−γ図面を用いて再びゲーティングすることにより選択した後、この図面で、生きているＣＤ８＋Ｔ細胞のうちＩＦＮ−γを生成するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率をパーセントで計算した。この実験はグループ当たり２〜３匹のマウスを用いて行われた。
【０１２８】
ｄ：ＧＩマウスから得られた（平均溶血値＋３×標準偏差）値を超えるプレートのウェルを陽性(positive)として見なすことにより、限界希釈法を用いたＣＴＬ頻度計算を行い、反応細胞(responder cell)の各希釈時に陰性(negative)ウェルの個数を回帰曲線で分析することにより、１０7個の脾臓細胞当たりＣＴＬの頻度数を示した。この実験はグループ当たり２〜３匹のマウスを用いて行われた。
【０１２９】
表２に示すように、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子で同時免役化されたマウスは追加接種してから０、３、６、１０及び１４週経過後にＨＣＶ Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群に比べてＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産細胞の分泌量が全般的に増加していたが、これはＣＴＬ反応結果と一致するものである。このような差異は初期には微々であるが、段々大きくなり、１０週及び１４週目にはＨＣＶ Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群ではその頻度が殆ど観察されず、これに対し、突然変異ｍＩＬ−１２投与群ではその頻度がそのまま維持されることを観察することができる。また、ＤＮＡの追加接種なしで１回接種した時にもグループ間の様相は類似であった。このような結果は、発現された突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が初期及び長い期間ＤＮＡ免役化後ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産Ｔ細胞の頻度を維持することを立証するものである。これより、本発明者は、細胞−媒介性免役反応においてＩＬ−１２ｐ７０自体の生体内役割はＴｈ１及びＣＴＬの活性を長期間維持することであるが、これに対し、ＩＬ−１２ｐ４０の役割は生体内拮抗物質として作用してＩＬ−１２ｐ７０を抑制することであるという事実を確認した。
【０１３０】
＜８−４＞免役化されたマウスの脾臓細胞における抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度分析
他の抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を確認するための限界希釈法(limiting dilution assay:ＬＤＡ)によってＨＣＶ Ｅ２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の溶血能力を用いた抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定した(Kuzushima, K. et al., Blood, 94:3094-3100, 1999)。即ち、ＤＮＡの追加接種が行われたマウスの脾臓細胞を様々な濃度に限界希釈した後、Ｕ字底状の９６−ウェルプレートに希釈当たり２０個ずつのウェルとなるようにした。ＣＴＬ免役反応観察での如くＥ２を発現するＣＴ２６細胞をマイトマイシンＣ(mitomycin C, 500μｇ／ｍｌ)処理によって細胞分裂を抑制させ、希釈された脾臓細胞とともに約５日間活性化させた。ＣＴＬ頻度を測定するために、５日間活性化させた各ウェルの脾臓細胞の１／３と51Ｃｒで標識されたターゲット細胞（５×１０3）を前記ウェルプレートの各ウェルに添加した後、６時間３７℃で培養した。これより上層液を回収して使用し、反応後得られる51Ｃｒの放出をγ−測定器(γ-counter, Wallac, Turku, Finland)で測定することにより、ＣＴＬ免役反応を調査した。特定溶血の水準が最小溶血の平均値とその標準偏差の３倍を加算した値を超過する場合、陽性として見なしてＣＴＬの頻度を計算した(Kuzushima, K. et al., Blood, 94:3094-3100, 1999)。
【０１３１】
限界希釈法によっても細胞内ＩＦＮ−γ染色法で得られた結果と類似の結果が得られた。即ち、免役化初期にも突然変異ｍＩＬ−１２投与群から最も高い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度が観察されたが、このような頻度は追加接種１４週後にも持続的に維持されることが分かった（表２参照）。
【０１３２】
＜８−５＞突然変異ＩＬ−１２による防御的免役反応の増強分析
本発明の突然変異ＩＬ−１２遺伝子によって生体内で誘導されたＴｈ１及びＣＴＬ免役反応を確認し、Ｔｈ１及びＣＴＬ免役反応と防御的免役反応との相関関係を調査するためにｈｇｈＥ２ｔを発現する腫瘍細胞のＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔを、ＤＮＡ追加接種してから１２週が経過したマウスに投与し、これから２週後に血清より抗原特異的な全体ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率を決定したうえ、約３０日間腫瘍の大きさを測定した。具体的に、免役化後１２週が経過した０.１μｌの無血清倍地内１×１０6ＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの毛が剃られた背側に皮下注射した後、地域的腫瘍成長(local tumor growth)を３日毎にキャリパー(calipers)用いて腫瘍の直径と体積を測定することにより決定した。また、このマウスを約７０日間観察して生存率を決定した。
【０１３３】
図８ａ、図８ｂ及び図８ｃに示すように、突然変異ｍＩＬ−１２で免役化されたグループにおいて強力なＴｈ１免役反応が誘導された。また、野生型ｍＩＬ−１２で免役化されたマウスのグループはｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ単独で免役化されたグループに比べて、遅延した腫瘍成長を示した。突然変異ｍＩＬ−１２で免役化されたグループは相当遅延した腫瘍の成長を示し、対照群グループの大部分のマウスが腫瘍をもっており、５０余日内に全て死んだが、突然変異ｍＩＬ−１２グループでは７０余日まで約９０％のマウスが生きていた。このような結果は本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子によって誘導されたＨＣＶ Ｅ２−特異的なＴｈ１及びＣＴＬ反応が変形された腫瘍細胞発現特異抗原のチャレンジに対する生体内防御を与えることを暗示する。生体内腫瘍防御に対するＴｈ１及びＣＴＬ反応の相対的な効果を評価することが容易でないとしても、これはＥ２−特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及びＴｈ1細胞がＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞を直接死滅させることができ、試験管内Ｔｈ１及びＣＴＬ分析からそれぞれ観察されたようにＣＴＬｓの作用を補助するものと判断される。また、大食細胞(marcrophages)及びナチュラルキラー細胞(natural killer cell)上のＦｃγＲに強く結合するＩｇＧ２ａ抗体が抗体−依存性細胞−媒介性細胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytitoxicity)を媒介する。
【０１３４】
〔発明の効果〕
以上説明したように、本発明は、活性型のインタロイキン−１２（ＩＬ−１２）の競争的阻害剤として作用するヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）アミノ酸に突然変異を誘発させることにより、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌は阻害し且つＩＬ−１２の免役活性を有するＩＬ−１２ｐ７０の分泌は正常的に行われるようにしたＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子を提供する。本発明のＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子はＤＮＡワクチンを用いた免役化に共に使用する場合、初期及び長期間にわたって最適の細胞性免役反応を誘導することができるので、細胞性免役反応が必須不可欠なものと知られているＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ型肝炎、癌、インフルエンザ、結核、マラリアなどを予防及び治療するための遺伝子治療などに免役増強剤として使用できるという利点がある。
【配列表】
0004180826.tif 000005
0004180826.tif 000006
0004180826.tif 000007
0004180826.tif 000008
0004180826.tif 000009
0004180826.tif 000010
0004180826.tif 000011
0004180826.tif 000012
0004180826.tif 000013
0004180826.tif 000014
0004180826.tif 000015
0004180826.tif 000016
0004180826.tif 000017
0004180826.tif 000018
0004180826.tif 000019
0004180826.tif 000020
0004180826.tif 000021
0004180826.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトとマウスのＩＬ−１２ｐ４０アミノ酸序列の相同性を比較した図である。
【図２】  本発明で野生型ヒトＩＬ−１２のｐ４０小単位体とｐ３５小単位体、及び両小単位体のＮ−糖鎖化可能部分を突然変異化させた誘導体の蛋白質構成を示す図である。
【図３ａ】  本発明で野生型ヒトＩＬ−１２ｐ３５と糖鎖化部分突然変異に対して細胞破砕物(cell lysate)で行った免疫ブロット(immunoblot)結果である。
【図３ｂ】  本発明で野生型ヒトＩＬ−１２ｐ４０と糖鎖化部分突然変異に対して細胞破砕物で行った免疫ブロット結果である。
【図３ｃ】  本発明で野生型ヒトＩＬ−１２ｐ４０と糖鎖化部分突然変異に対して細胞培養上澄液(supernatant)で行った免疫ブロット結果である。
【図４】  Ｃ型肝炎ウイルス(Hepatitis C Virus、ＨＣＶ)の外被糖蛋白質２(Envelope glycoprotein 2、Ｅ２)遺伝子とマウスＩＬ−１２の正常または変異遺伝子を挿入させた本発明の発現ベクトルを示す図である。
【図５ａ】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ２に対する全体ＩｇＧ抗原力価を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図５ｂ】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ１抗原力価を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図５ｃ】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ２ａ抗原力価を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図５ｄ】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ２ａ抗原力価とＩｇＧ１抗原力価の比率（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図６ａ】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化し、３週後にマウスの脾臓からＨＣＶ Ｅ２蛋白質によって刺激を受けて脾臓の免疫細胞で生成されるＩＦ−Ｎ−γの生産水準を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図６ｂ】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化し、６週後にマウスの脾臓からＨＣＶ Ｅ２蛋白質によって刺激を受けて脾臓の免疫細胞で生成されるＩＦ−Ｎ−γの生産水準を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図６ｃ】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化し、１０週後にマウスの脾臓からＨＣＶ Ｅ２蛋白質によって刺激を受けて脾臓の免疫細胞で生成されるＩＦＮ−γの生産水準を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図７】  本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの脾臓から、免疫化した後多様な時期にｈｇｈＥ２ｔを発現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を用いてＨＣＶ Ｅ２に特異的なＣＴＬ反応を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス、
ａ：免疫化直後（０週目）、
ｂ：免疫化後３週経過、
ｃ：免疫化後６週経過、
ｄ：免疫化後１０週経過、
ｅ：免疫化後１４週経過、
ｆ：免疫化後１４週経過時、対照群（ＣＴ２６−ｎｅｏ細胞）。）
【図８】  図８ａは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスに、ｈｇｈＥ２ｔを発現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入し、２週後にマウスの血清からＨＣＶ Ｅ２に対する全体ＩｇＧ抗原とその亜系列ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの水準を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
図８ｂは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスにｈｇｈＥ２ｔを発現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入し、２週後にマウスの血清からＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ２ａ抗原力価とＩｇＧ１抗原力価の比率（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
図８ｃは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスにｈｇｈＥ２ｔを発現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入した後、腫瘍の体積変化を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
図８ｄは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスにｈｇｈＥ２ｔを発現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入した後、マウスの生存率を測定した結果である。
（ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２で免疫化されたマウス、
ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、
ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）
【図９】  ＩＬ−１２の生体内生物学的機能を示す模式図である。
（▲：ｐ３５、○：ｐ４０、
【数２】0004180826.tif 000023
は（ｐ４０）2、
【数３】0004180826.tif 000024
はＩＬ−１２（ｐ７０））
【図１】
0004180826.tif 000025
【図２】
0004180826.tif 000026
【図３ａ】
0004180826.tif 000027
【図３ｂ】
0004180826.tif 000028
【図３ｃ】
0004180826.tif 000029
【図４】
0004180826.tif 000030
【図５ａ】
0004180826.tif 000031
【図５ｂ】
0004180826.tif 000032
【図５ｃ】
0004180826.tif 000033
【図５ｄ】
0004180826.tif 000034
【図６】
0004180826.tif 000035
【図７】
0004180826.tif 000036
【図８】
0004180826.tif 000037
【図９】
0004180826.tif 000038