(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：A-X-NH-CH(R1)-CH(R2)-(CH2)n-N(R3)-[(CH2)m-NH]p-CO-(CH2)q-SH〔式中、Ａは５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基、９−アクリジニル基、又はクマリニル基を示し；Ｘは−ＳＯ2−又は−ＣＯ−を示し；Ｒ1及びＲ2は水素原子を示し；ｎは０〜２の整数を示し；Ｒ3は水素原子を示し；ｍは２〜４の整数を示し；ｐは０又は１を示し；ｑは２〜４の整数を示す〕で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ａが５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基であり、Ｘが−ＳＯ2−であり、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が水素原子であり、ｐが０である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｎ−２−[[[(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフチル)−スルホニル]アミノ]エチル]−３−メルカプトプロパナミド又はＮ−２−[[[(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフチル)−スルホニル]アミノ]プロピル]−３−メルカプトプロパナミド、あるいはそれらの塩である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むメタロ−β−ラクターマーゼの測定試薬。
【請求項５】
メタロ−β−ラクターマーゼの測定方法であって、下記の工程：(a)請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩をメタロ−β−ラクターマーゼ産生菌又はその抽出物に接触させる工程、及び(b) 上記化合物又はその塩がメタロ−β−ラクターマーゼに結合したことにより生じた蛍光を測定する工程を含む方法。
【請求項６】
微生物がメタロ−β−ラクターマーゼ産生菌であるか否かを判定する方法であって、下記の工程：(c)微生物又はその抽出物に請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を接触させる工程、及び(d)該接触により蛍光強度の増加が認められた場合には、該微生物がメタロ−β−ラクターマーゼ産生菌であると判定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術】
本発明は、耐性菌の産生するメタロ−β−ラクタマーゼの測定に有用な化合物又はその塩、及び該化合物を含むメタロ−β−ラクタマーゼ測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本のみならず国外の医療現場でも耐性菌による感染症が近年問題になっている。耐性菌としては、従来問題となっていたメチシリン耐性黄色ぶどう球菌（ＭＲＳＡ）以外に、メタロ−β−ラクタマーゼ（「ＭＢＬ」と呼ばれる場合もある）を産する緑膿菌などのグラム陰性桿菌が各地の医療機関から単離されている。メタロ−β−ラクタマーゼは第３世セフェム系だけでなく、イミネペムをはじめとするカルバネペム系β−ラクタム剤をも分解してしまうことから、最も危険なβ−ラクタマーゼであると考えられている。
【０００３】
感染症の治療に際しては起炎菌の同定が不可欠であり、起炎菌が耐性菌である場合には耐性機構の推定が治療方針を決めるにあたって必要となる。メタロ−β−ラクタマーゼを産出する耐性菌による感染が疑われる場合、産出されたメタロ−β−ラクタマーゼを簡便に検出できれば、適切な治療方法の選択が可能になる。そのような理由から、メタロ−β−ラクタマーゼを簡便かつ高選択的に高感度で検出する方法が求められている。
【０００４】
メタロ−β−ラクタマーゼはこれまで知られていたセリンを活性部位とするラクタマーゼと異なり、複核の亜鉛部位を活性部位として有している。本発明者らはこのＭＢＬのラクタム剤加水分解機構を解明し、さらに阻害剤を開発することによって、既存のβ−ラクタム剤との併用によってこの酵素を産生する細菌を克服することを目的とした研究を行い、チオール化合物が腸内細菌セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)由来のメタロ−β−ラクタマーゼに対して極めて高い拮抗阻害剤として作用することを見出し、この阻害剤を添加した培地によってメタロ−β−ラクタマーゼを検出する方法を開発した (Goto, M., et al., Biol. Pharm. Bull., 20, 1136-1140, 1997; Y. Arakawa et al., J. Clin. Microbiol., 38, 40-43, 2000)。しかし、この方法では、菌が繁殖するのに数日を要し、メタロ−β−ラクタマーゼ検出に要する時間が長いという欠点があった。メタロ−β−ラクタマーゼを産出する細菌の検出する他の方法としては、メタロ−β−ラクタマーゼの遺伝子をＰＣＲ法で検出する方法が知られているが、この方法も多大な時間と費用がかかるという欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、メタロ−β−ラクタマーゼを簡便かつ高選択的に、しかも高感度に測定するための手段を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、チオール基と蛍光発色団とをリンカーで結合した化合物がメタロ−β−ラクタマーゼに特異的に結合し、強い蛍光を発することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００６】
すなわち、本発明により、下記の一般式（Ｉ）：A-X-NH-CH(R1)-CH(R2)-(CH2)n-N(R3)-[(CH2)m-NH]p-CO-(CH2)q-SH〔式中、Ａは５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基、９−アクリジニル基、又はクマリニル基を示し；Ｘは−ＳＯ2−又は−ＣＯ−を示し；Ｒ1及びＲ2は水素原子を示し；ｎは０〜２の整数を示し；Ｒ3は水素原子を示し；ｎは０〜２の整数を示し；Ｒ3は水素原子、アルキル基、又はアラルキル基を示し；ｍは２〜４の整数を示し；ｐは０又は１を示し；ｑは２〜４の整数を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。
【０００７】
本発明の好ましい態様によれば、Ａが５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基であり、Ｘが−ＳＯ2−であり、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が水素原子であり、ｐが０である化合物又はその塩；及びＡが５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基であり、Ａが−ＳＯ2−であり、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が水素原子であり、ｐが０であり、ｑが２である上記の化合物又はその塩が提供される。
【０００８】
別の観点からは、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含むメタロ−β−ラクターマーゼの測定試薬；及びメタロ−β−ラクターマーゼの測定方法であって、下記の工程：(a)上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をメタロ−β−ラクターマーゼ産生菌又はその抽出物に接触させる工程、及び(b)上記化合物又はその塩がメタロ−β−ラクターマーゼに結合したことにより生じた蛍光を測定する工程を含む方法が本発明により提供される。また、微生物がメタロ−β−ラクターマーゼ産生菌であるか否かを判定する方法であって、(c)微生物又はその抽出物に上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を接触させる工程、及び(d)接触により蛍光強度の増加が認められた場合に該微生物がメタロ−β−ラクターマーゼ産生菌であると判定する工程を含む方法が本発明により提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
上記一般式（Ｉ）において、Ａは蛍光性発色団である２又は３環の芳香族基を示す。芳香族基を形成する環としては、例えば、ナフタレン環又はアントラセンなどのアリール環、又はアクリジン又はクロメンなどのヘテロアリール環のいずれであってもよい。Ａが示す芳香族基は環上に１又は２個以上の置換基を有していてもよい。置換基の種類は特に限定されないが、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基、置換若しくは無置換のアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを例示することができる。例えば、Ａがナフチル基である場合には、置換基としてジメチルアミノ基などの置換アミノ基を１個有する場合が好ましい。この例として、例えば、５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基を挙げることができる。アクリジニル基としては９−アクリジニル基が好ましい。クロメニル環上の２位の炭素原子にオキソ基が置換してクマリニル基となる場合も好ましく、例えば８−クマリニル基が好ましい。これらのうち、Ａが５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基である場合が最も好ましい。
【００１０】
Ｘは−ＳＯ2−又は−ＣＯ−を示すが、Ａがナフチル基である場合にはＸが−ＳＯ2−であることが好ましく、Ａがアクリジニル基又はクマリニル基である場合にはＸが−ＣＯ−であることが好ましい。
【００１１】
Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示すが、アルキル基としては炭素数１〜６程度の直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基が好ましい。より具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基などを例示することができる。Ｒ1及びＲ2が互いに結合してそれらが結合する２個の炭素原子とともに５〜７員の環を形成する場合、形成される環は非芳香族環又は芳香族環のいずれでもよい。芳香族環が形成される場合には、ベンゼン環が形成されることが好ましく、非芳香族環が形成される場合にはシクロヘキサン環が形成されることが好ましい。形成される環には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよいが、それらの例は上記のＡについて述べたものと同様である。これらのうち、Ｒ1及びＲ2がともに水素原子であることが好ましい。
【００１２】
Ｒ3は水素原子、アルキル基、又はアラルキル基を示すが、アルキル基は上記に例示したものと同様である。アラルキル基の例としては、例えば上記のアルキル基と単環性又は多環性アリール基との組み合わせからなるアラルキル基を挙げることができ、より具体的にはベンジル基、フェネチル基などを挙げることができる。Ｒ3は水素原子であることが好ましい。ｍは２〜４の整数を示すが、ｍが２であることが好ましい。ｐは０又は１を示すが、ｐが０であることが好ましい。ｑは２〜４の整数を示すがｑが２であることが好ましい。
【００１３】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物のうち特に好ましい化合物として、
(a)Ａが５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基であり、Ｘが−ＳＯ2−であり、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が水素原子であり、ｎが０であり、ｐが０であり、ｑが２である化合物〔化合物Ａ：Ｎ−２−[[[(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフチル)−スルホニル]アミノ]エチル]−３−メルカプトプロパナミド〕；及び
(b)Ａが５−ジメチルアミノ−１−ナフチル基であり、Ｘが−ＳＯ2−であり、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が水素原子であり、ｎが１であり、ｐが０であり、ｑが２である化合物〔化合物Ｂ：Ｎ−２−[[[(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフチル)−スルホニル]アミノ]プロピル]−３−メルカプトプロパナミド〕
を挙げることができるが、本発明の化合物はこれらの化合物に限定されることはない。
【００１４】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、上記(a)の化合物は、例えばダンシルエチレンジアミンと等モルの３−メルカプトプロピオン酸とを酢酸エチル中で縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて反応させることにより容易に製造することができる。その製造の具体例を本明細書の実施例に示した。上記(b)の化合物は、原料としてダンシルプロパンジアミンを用いて同様に製造できる。他の化合物も上記の製造方法に準じて容易に製造することが可能であり、当業者は原料化合物、試薬、反応条件を適宜選択することが可能である。
【００１５】
本発明の化合物は塩の形態で存在する場合もある。塩の種類は特に限定されず、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はマレイン酸塩、シュウ酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩などの有機酸塩を挙げることができ、塩基付加塩としてはナトリウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、ジメチルアミン塩などの有機アミン塩を例示することができる。また、本発明の化合物は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらもすべて本発明の範囲に包含される。さらに、本発明の化合物は１以上の不斉炭素を有する場合もあるが、光学活性体又はジアステレオ異性体などの純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、又はラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００１６】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の化合物又はその塩は、末端チオール基がメタロ−β−ラクタマーゼの活性部位である複核の亜鉛部位に結合することにより蛍光を発する性質を有しており、その結合はメタロ−β−ラクタマーゼに特異的である。特に、蛍光発色団として作用するＡの芳香族基とメタロ−β−ラクタマーゼの亜鉛部位に強固に結合するＳＨ基とが適当な長さのリンカーを介して結合しているために、本発明の化合物は、メタロ−β−ラクタマーゼに特異的に結合し、その結果として強い蛍光を発する性質を有している。従って、本発明の化合物又はその塩をメタロ−β−ラクタマーゼの測定用試薬として用いることができる。本明細書において「測定」という用語は、検出、定量などの概念を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００１７】
本発明の化合物又はその塩を含むメタロ−β−ラクタマーゼ測定用試薬には、通常の測定用試薬の調製に用いられる適宜の添加物を添加することができる。例えば、緩衝剤、pH調整剤、溶解補助剤、防腐剤などを添加して、固体又は溶液状の組成物の形態で調製されていてもよい。また、溶液状の組成物を凍結乾燥して固形の組成物として調製することもできる。
【００１８】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ測定用試薬の使用方法は特に限定されないが、感染症の患者から得られた生体組織から分離培養された起炎菌に対して適宜の量の試薬を接触させ、蛍光を測定することによりメタロ−β−ラクタマーゼを測定することができ、対照に比べて蛍光強度の増加が認められる場合には起炎菌中にメタロ−β−ラクタマーゼの存在を証明することができる。
【００１９】
本発明の試薬を用いたメタロ−β−ラクタマーゼの測定方法として、例えば、分離培養された菌体を冷凍粉砕し、遠心分離して上澄み液を採取してカラムでメタロ−β−ラクタマーゼを粗分離した後、緩衝液中で本発明の試薬と超音波等を用いて混合し、例えば励起波長２８０ｎｍ又は３４０ｎｍで蛍光強度を測定する方法を例示することができる。もっとも、本発明の試薬を用いたメタロ−β−ラクタマーゼの測定方法は上記の方法に限定されることはない。励起波長は試薬の種類に応じて適宜選択することが可能であり、通常は室温で２時間程度の反応時間で高選択的かつ高感度にメタロ−β−ラクタマーゼを測定することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００２１】
例１：Ｎ−２−[[[(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフチル)−スルホニル]アミノ]エチル]−３−メルカプトプロパナミド（化合物Ａ：実施例中「ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨ」と呼ぶ場合がある）の製造
ダンシルエチレンジアミン（３．９４ｇ）と３−メルカプトプロピオン酸（１．４３ｇ）とを酢酸エチル中で縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（２．７７ｇ）を用いて０℃で１８時間反応させた。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して２０％メタノール-クロロホルムで溶出して目的物を黄緑色の油状物として得た（収率７７％）。
元素分析値（クロロホルム0.25分子の溶媒和物）
Calcd. C, 50.37%; H, 5.86%; O, 11.67%; N, 10.22%; S, 15.39%
Found  C, 50.93%; H, 5.86%; N, 10.08%
1H-NMR (CDCl3) δ(ppm)  1.50, 2.29, 2.66, 2.89, 3.06, 3.32, 5.80, 6.20, 7.19, 7.52, 7.57, 8.23, 8.28, 8.55
IR  (cm-1) 2789, 2569, 1649, 1309
MS m/z=381 [M]+
【００２２】
例２：Ｎ−２−[[[(５−(ジメチルアミノ)−１−ナフチル)−スルホニル]アミノ]プロピル]−３−メルカプトプロパナミド（化合物Ｂ）の製造
ダンシルプロパンジアミン（３．０ｇ）と３−メルカプトプロピオン酸（１．０２ｇ）とを酢酸エチル中で縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０１ｇ）を用いて０℃で１８時間反応させた。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して２０％メタノール-クロロホルムで溶出して目的物を黄緑色の油状物として得た（収率６０％）。
元素分析値（クロロホルム0.5分子の溶媒和物）
Calcd. C, 48.81%; H, 5.65%; O, 10.54%; N, 9.23%; S, 14.09%
Found  C, 49.35%; H, 5.92%; N, 9.11%
1H-NMR (CDCl3) δ(ppm)  1.33, 1.49, 2.29, 2.59, 2.81, 2.85, 3.19, 5.89, 5.99, 7.11, 7.43, 7.49, 8.13, 8.24, 8.46
IR  (cm-1) 2789, 2569, 1643, 1309
MS m/z=395 [M]+I
【００２３】
例３：試験例
蛍光セル中２．７ｍＬの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４＋０．５Ｍ ＮａＣｌと１０％メタノールを含む）に１００μＭのＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨ（メタノール溶液）を３０μＬ加えて全量３ｍＬとした（ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨは測定溶液中１μＭ）。励起波長３４０ｎｍとし、３５０ｎｍから８００ｎｍにおける蛍光強度を日立製Ｆ−４５００型分光蛍光光度装置で測定した（２５℃、スリット幅５．０ｎｍ）。つぎにメタロ−β−ラクタマーゼを濃度が１μＭになるように加えて同一条件下で蛍光強度を測定した。図１に示されるように、メタロ−β−ラクタマーゼが存在する場合には、蛍光分析でのスペクトルのピーク強度がＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨのみ（ブランク）に比べて５倍程度高くなっており、ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨがメタロ−β−ラクタマーゼの測定試薬として有用であることが示された。
【００２４】
一方、ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨはアルブミンとは結合せず、アルブミンやカーボニックヒドラーゼと混合しても蛍光スペクトルに変化は認められなかった（図２）。また、ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨに替えて、末端にアミド基又はヒドロキシル基を結合した化合物はメタロ−β−ラクタマーゼと反応せず、蛍光スペクトルに変化は認められなかった。
【００２５】
例４：試験例
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２μＭ Ｚｎ（ＮＯ3）2を含む）で１ｇ／ｍＬに懸濁させた菌体液５ｍＬを超音波破砕し、７０００ｒｐｍで３０分間遠心した。この上澄を静かに採取して粗酵素液とした。これを陽イオン交換樹脂（ＳＰ−ＦＦ）ショートカラム（直径０．８ｃｍ×３ｃｍ）を用いて約１．５ｍＬ毎に分取した。約７ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２μＭ Ｚｎ（ＮＯ3）2を含む）を流した後、溶出液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２μＭ Ｚｎ（ＮＯ3）2と０．５Ｍ ＮａＣｌを含む）で流した（フラクションＮｏ．５より）。各分画は３１倍希釈して２８０ｎｍにおける吸光度をＵＶ分光光度計で測定し、酵素濃度を算出した（モル吸光係数を４９０００として計算した。例えばフラクションＮｏ．６では酵素濃度が１．４６×１０-4Ｍであった）。
【００２６】
ＵＶ用セルに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２μＭ Ｚｎ（ＮＯ3）2を含む）を３ｍＬ入れ、これに各フラクション０．１ｍＬを入れて混合し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定してフラクションＮｏ．に対して吸光度の値をプロットした（図３）。次に分光光度計を用いて粗酵素、フラクションＮｏ．６について励起波長２８０ｎｍ及び３４０ｎｍとして蛍光強度を測定した（２５℃、スリット幅５．０ｎｍ）。
【００２７】
▲１▼粗酵素
１００μＭのＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨ３０μＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌと１０％メタノールを含む）に加えて全量を３ｍＬとした（ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨは測定溶液中１μＭ）。粗酵素又はフラクションＮｏ．１を１０μＬ混合し、励起波長２８０ｎｍ、３４０ｎｍとしてそれぞれの蛍光強度を測定した（２５℃、スリット幅５．０ｎｍ）。結果を図４に示す。
【００２８】
▲２▼フラクションＮｏ．６
１００μＭのＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨ３０μＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌと１０％メタノールを含む）に加えて全量を３ｍＬとした（ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨは測定溶液中１μＭ）。フラクションＮｏ．６の５倍希釈液を１００μＬ混合し、励起波長２８０ｎｍ、３４０ｎｍとして蛍光強度を測定した（２５℃、スリット幅５．０ｎｍ）。結果を図５に示す。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の化合物又はその塩はメタロ−β−ラクタマーゼの選択的かつ高感度な測定用試薬として有用である。本発明の化合物をメタロ−β−ラクタマーゼ測定用試薬として用いることにより、メタロ−β−ラクタマーゼを短時間で、簡便かつ確実に測定でき、感染症の起炎菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であるか否かを迅速に決定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の測定試薬としてＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨを用いてメタロ−β−ラクタマーゼを測定した結果を示した図である。
【図２】  ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨとアルブミン又はカーボニックヒドラーゼとの反応を検討した結果を示した図である。
【図３】  菌体からメタロ−β−ラクタマーゼを調製する工程におけるフラクション回収の結果を示した図である。
【図４】  粗酵素とＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨとの反応を示した図である。
【図５】  試験例におけるフラクションＮｏ．６とＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨとの反応を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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