(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を有するカテプシンＥ遺伝子の機能が欠損もしくは欠失しているアレルギー疾患、学習獲得障害もしくは記憶障害、闘争行動亢進解明またはストレスに対する生理機能解明モデルとしてのカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
請求項１に記載する遺伝子改変非ヒト哺乳動物において、前記遺伝子改変非ヒト哺乳動物が齧歯動物であることを特徴とするカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
請求項１または２に記載する遺伝子改変非ヒト哺乳動物において、前記遺伝子改変非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とするカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法において、
前記カテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物と同一動物種から単離したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとして使用して該動物種のゲノムライブラリーからクローニングすることによってカテプシンＥ遺伝子のゲノムクローンを採取する工程と、
前記工程で得られたカテプシンＥ遺伝子をその機能を不能にしてターゲテイングベクターに組み込んでＥＳ細胞に導入する工程と、
前記ＥＳ細胞を胚胞に注入する工程と、
前記胚胞を仮親に移植してキメラ非ヒト哺乳動物を産仔する工程と、
前記キメラ非ヒト哺乳動物を交配してカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物を産仔する工程と、
からなることを特徴とするカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物をアレルギー疾患、学習獲得障害もしくは記憶障害、闘争行動亢進解明またはストレスに対する生理機能解明のためのモデル動物として使用することを特徴とするカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、カテプシン遺伝子改変非ヒト哺乳動物に関するものである。更に詳細には、この発明は、特にカテプシンＥ関連遺伝子を欠損した遺伝子改変非ヒト哺乳動物ならびにその作製方法、その作製のためのターゲテイングベクターならびにその構築方法およびその使用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アスパラギン酸プロテアーゼは、高等動物から微生物に至るまで幅広く分布し、細胞内外のタンパク質代謝やプロセッシングなどの重要な生体機能を担っている。かかる高等動物のアスパラギン酸プロテアーゼの１つとして、細胞内エンドソーム／リソソーム系にカテプシンＤやカテプシンＥが存在している。アスパラギン酸プロテアーゼは、細胞内外のタンパク質代謝やプロセッシングに関与することから、その活性レベルの変化は血圧異常や胃かいよう、発がんなどのさまざまな病態につながると考えられてきた。
【０００３】
これらカテプシンのうち、カテプシンＤは、ペプシンファミリーのなかで最も知られている細胞内アスパラギン酸プロテアーゼであって、ほとんどすべての動物細胞に幅広く分布し、量的に最も多いリソソーム酵素で、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｔｙｒなどの疎水性ペプチド結合をよく分解することが知られている。
このカテプシンＤの機能は、その幅広い組織分布とヘモグロビンなどのタンパク質基質を用いたときの非特異的な分解様式から、リソソーム内でのタンパク質の非特異的終末分解に関与していると考えられてきた。しかし、カテプシンＤノックアウトマウスを用いた実験から、カテプシンＤは、タンパク質の非特異的終末分解よりも細胞の発育増殖に関与するようなタンパク質を限定的に分解することによって、その重要な生理機能を果たしていることが示唆された。
また、カテプシンＤの新しい機能として血管新生抑制因子産生能が報告された。ヒトの前立腺ガン細胞から細胞外に分泌されたカテプシンＤが、プラスミノーゲンから血管新生抑制因子アンジオスタチンを産生し、ガン細胞の増殖や転移を抑制するというものである。血管新生は、胎児や胎盤の形成、生後の組織成長、創傷治癒などにおいて生理的に非常に重要である一方、固形腫瘍の発育、関節リウマチ、糖尿病性網膜症を代表とする眼科疾患などの病態の進展と密接に関連していることが知られている。したがって、血管新生抑制剤は、ガンや関節リウマチなどの血管新生を伴った難治性疾患に対して有効な治療薬のなる可能性があることから、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において内在性の血管新生抑制因子を産生するプロテアーゼの臨床応用に向けた研究は大いに期待される。
【０００４】
他方、カテプシンＥは、カテプシンＤとは異なり、胃・腸管などの消化管上皮、リンパ系組織、泌尿器系組織、血液系細胞および皮膚に限定的に分布している細胞内アスパラギン酸プロテアーゼである。特に胃はすべての組織の中でカテプシンＥ含量が最も高く、カテプシンＤ含量よりも多くなっている。カテプシンＥの細胞内局在もカテプシンＤのそれとは明らかに異なり、組織・細胞特異性がある。赤血球や破骨細胞、近位尿細胞などでは、細胞膜に、ミクログリアやマクロファージでは、エンドソーム／リソソームシステムに、その他の多くの末梢組織では、小胞体やゴルジ体に存在する。これまでの研究から、カテプシンＥは、赤血球を除くほとんどの細胞で、エンドソーム／リソソームシステムに局在するときにのみ成熟型構造としてプロテアーゼ活性を発現することが明らかにされている。また、ミクログリアやマクロファージでは、インターフェロンγやリポ多糖など、何らかの刺激が細胞に加わって活性化されたとき、カテプシンＥはｍＲＮＡレベルでもタンパク質レベルでも著しい増大を示すことから、これらの細胞機能と密接に関与していることが示唆されている。
【０００５】
また、カテプシンＥは、若齢ラットの脳神経細胞にはほとんど検出されないが、老齢ラットではリポフスチンやＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）のＣ末端フラグメントを蓄積した神経細胞中に明らかにその存在を確認することができる。また、前脳虚血やカイニン酸を投与したラットの脳では、これらの刺激に対して脆弱な部位に依存する変性を受けた神経細胞とこれらの刺激に呼応して、集積した活性化ミクログリアにカテプシンＥの著しい発現増大が認められる。これらの結果は、カテプシンＥがニューロン死の実行過程において重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、このようなユニークな機能を有しているカテプシンＥの生理機能を解明するためにもノックアウトマウスなどの遺伝子改変非ヒト哺乳動物の開発が要請されている。
【０００６】
このように特にカテプシンＥ関連遺伝子をノックアウトしたノックアウトマウスなどの遺伝子改変非ヒト哺乳動物が開発できれば、カテプシンＥの生理的機能を直接明らかにすることができるとともに、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する様々な病態を解明ならびにかかる疾患の治療法の研究に大いに寄与することができる。またかかる遺伝子改変非ヒト哺乳動物は遺伝的背景が明確であることから実験動物モデルとして極めて有用である。
【０００７】
一般的に、実験動物は、系統として確立された動物、すなわち遺伝的にホモの状態の動物を用いることが望ましい。このような系統として確立されたホモの状態の動物では、遺伝的背景が詳細に調べられているため、かかる既知の遺伝的背景をもつ実験動物を用いた研究では、その実験動物に施した処置の効果のみを容易に特定することができることになる。一方、雑種動物においては種々の遺伝子がヘテロの状態で存在するため、その動物に対する処置の結果生じた効果が、その処置のみによって由来するものかまたは遺伝的背景に由来するものかを判別することが困難である。したがって、カテプシンＥ遺伝子が欠損した遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、様々な生理的機能に関与しているカテプシンＥの生理的機能を直接明らかにすることができるとともに、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する様々な疾患や病態の解明ならびにかかる疾患の治療法の研究に多大な役割を果たすことができるものと期待される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者は、カテプシンＥ関連遺伝子を欠損した遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製するために鋭意検討し研究した結果、カテプシンＥ関連遺伝子の塩基配列ならびにアミノ酸配列をより明確にすることができた。同時に、本発明者は、カテプシンＥ関連遺伝子の１部を利用した相同組換による遺伝子ターゲテイング法によってカテプシンＥ関連遺伝子を欠損したノックアウトマウスを作製することができることを見出して、この発明を完成するに至った。
【０００９】
したがって、この発明は、カテプシンＥ関連遺伝子を欠損した遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供することを１つの目的としている。
かかるカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、カテプシンＥ関連遺伝子の相同組換による遺伝子ターゲテイング法を利用することにより作製することができ、作製されたカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する様々な病態の解明ならびにかかる疾患の治療法の研究に極めて有用でありかつ遺伝的背景が明確である実験動物モデルとして利用することができる。
また、この遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、カテプシンＥがニューロン死の実行過程において重要な役割を果たしていることが示唆されていることから、このようなユニークな機能を持つカテプシンＥの生理機能を解明するためにも極めて大きな役割を有している。
【００１０】
この発明の別の目的は、カテプシンＥ関連遺伝子またはそのＤＮＡフラグメントを提供することである。
この発明によって提供されるカテプシンＥ関連遺伝子のより完全な塩基配列またはアミノ酸配列は、カテプシンＥ関連遺伝子の生理機能の解明に役立つと共に、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する病態や疾患の診断ならびに治療に有用な手段や道具の開発においても大きな役割を果たすことになる。
【００１１】
この発明の他の目的は、カテプシンＥ関連遺伝子のＤＮＡフラグメントを挿入して相同組換を行うために構築されるターゲテイングベクターを提供することである。
この発明に係るターゲテイングベクターは、このベクターに組み込まれた相同組換ＤＮＡフラグメントを介して相同組換を起こして所望の遺伝子の発現を抑えてその機能の発揮を不能にするものである。したがって、ターゲテイングベクターは、所望の機能を欠損したりもしくは改変した遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する上において中核的な要素である。したがって、このターゲテイングベクターの構成はこの発明の大きな目的の１つである。
【００１２】
この発明は、ターゲテイングベクターとして機能するプラスミドを提供することも別の目的としている。
この発明において、かかるプラスミドを適切に選別することは、ターゲテイングベクターとしての役割をより一層効率的に果たすことが可能になると共に、そのプラスミドが導入される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）との適合性を改善し向上させてより高い割合で相同組換を発生させることができることになる。
【００１３】
この発明の更に別の目的は、カテプシンＥ関連遺伝子を欠損した遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法を提供することである。
この発明の方法によって作製したカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、上述したように、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する様々な病態の解明ならびにかかる疾患の治療法の研究において大いに寄与することが期待されるとともに、その遺伝的背景が明確であることから実験動物モデルとしても極めて有用である。
【００１４】
この発明は、ターゲテイングベクターの構築方法を提供することも目的としている。上記のような極めて重要な役割を有するターゲテイングベクターの適切な構築方法を提供することは、その発明を実施する上で非常に重要である。したがって、この発明のターゲテイングベクターの構築方法は、ターゲテイングベクターをより一層適切でかつ効率よく構築することが可能である。
【００１５】
また、この発明は、この発明に係る遺伝子改変非ヒト哺乳動物ならびにこの発明に係る作製方法によって作製した遺伝子改変非ヒト哺乳動物を有用な目的に対して使用する使用方法を提供する。
この発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、アレルギーやアトピー様皮膚炎などに対して極めて高い感受性を示すことから、アレルギーやアトピー様皮膚炎などに対する標準的な実験モデル動物として使用することができるものと期待できる。この発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、アレルギーやアトピー様皮膚炎などの難治性疾患の発現機構の解明に対して重要な役割を果たして、ひいてはかかる疾患の病態の診断ならびに治療に大きく寄与するものと期待される。
【００１６】
更に、この発明は、この発明のカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物を学習獲得障害または記憶障害の診断、闘争行動亢進の診断、ストレス耐久性の診断に使用する使用方法を提供することを目的とする。この発明のカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、学習獲得障害または記憶障害が発現して、ヒトにおけるアルツハイマー様症状やボケ症状に類似した特異的な症状を呈することから、その発現機構を解明するのに寄与するものと期待できるとともに、アルツハイマー症などの原因究明ならびに診断、治療の一助になるものと期待できる。
【００１７】
同様に、この発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、闘争行動の亢進が認められたり、ストレスに対して極めて高い感受性を示すことから、闘争行動亢進の機能やその発現機構などの原因解明や、ストレスに対する感受性の生理的機構ならびに発現機能などの解明などに重要な役割を果たすものと期待できる。その結果、この発明に係る遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、闘争行動亢進の診断や治療またはストレスの診断や治癒などの診断方法や治療方法の開発に寄与することができる。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、１つの形態として、カテプシンＥ関連遺伝子の相同組換によってカテプシンＥ関連遺伝子を改変した遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。この発明の好ましい１つの態様として、遺伝子改変非ヒト哺乳動物としてカテプシンＥ関連遺伝子を欠損した齧歯動物、特にノックアウトマウスが提供される。
この発明に係るカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、上述したようなそのユニークな機能を有しているカテプシンＥの生理的機能を解明するのに極めて大きな役割を果たすことができる。かかるカテプシンＥの生理的機能が解明されると、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する様々な病態を解明ならびにかかる疾患の診断や治療法の研究に大いに寄与することができる。その上、この発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は遺伝的背景が明確であることから実験動物モデルとしても極めて有用である。
【００１９】
なお、本明細書において使用する用語「遺伝子改変」とは、他の遺伝子もしくはそのフラグメントが変更、削除、置換または挿入などされることにより相同組換されて、宿主本来の遺伝子が欠損もしくは欠失したりもしくは変化したりして、その遺伝子が発現しなくて、その遺伝子の生理的機能を果たすことができないことを意味している。
したがって、本明細書において使用する用語「遺伝子改変非ヒト哺乳動物」とは、他の遺伝子もしくはそのフラグメントが変更、削除、置換または挿入などの遺伝子改変手段により宿主である非ヒト哺乳動物、特にほ乳動物本来の遺伝子が欠損もしくは欠失したりまたは変化したりして、その遺伝子の発現が抑制され、その遺伝子の機能が不能になっている非ヒト哺乳動物を意味している。
そこで、本明細書において、カテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物もしくはその関連用語は、カテプシンＥ関連遺伝子に対して、変更、削除、挿入または置換などの遺伝子改変手段により、カテプシンＥ関連遺伝子の発現が抑制され、その機能が不能になっているカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物を意味している。
【００２０】
なお、本明細書では、遺伝子改変手段として使用する用語「変更」、「削除」、「挿入」および「置換」などの諸手段は、限定した意味で使用されているものではなく、またいずれかの手段に厳密に区別して使用する意図で用いる必要もなく、結果としていずれかの遺伝子改変手段によりカテプシンＥ関連遺伝子が改変されてカテプシンＥ関連遺伝子の発現が抑制され、その機能が不能になっていることを意味するものとして使用されているのである。しかしながら、上記手段は、一般的には、下記のような意味として使用しているものと理解することができる。
つまり、一般的には、ゲノムＤＮＡの「変更」とは、カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの1つまたはそれ以上の塩基が変更して、カテプシンＥ関連遺伝子の発現産物がカテプシンＥ関連分子として機能しないようにすることを意味し；「削除」とは、カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの１部または全部を欠失させることにより、カテプシンＥ関連遺伝子の発現産物がカテプシンＥ関連分子として機能しないかまたは存在しないようにすることを意味し；「置換」とは、カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの１部または全部をカテプシンＥ関連遺伝子とは関連しない別個の配列により置換し、カテプシンＥ関連遺伝子の発現産物がカテプシンＥ関連分子として機能しないかまたは存在しないようにすることを意味し；そして、「挿入」とは、カテプシンＥ関連遺伝子中に、それ以外の配列を有するＤＮＡを挿入することにより、当該カテプシンＥ関連遺伝子以外のＤＮＡを挿入したカテプシンＥ関連遺伝子の発現産物がカテプシンＥ関連分子として機能しないようにすることを意味する。
また、遺伝子の変更、削除、挿入または置換などの遺伝子改変手段は、２つまたはそれ以上の方法がカテプシンＥ関連遺伝子に対して同時に使用されていてもよい。また、カテプシンＥ関連遺伝子は、１つもしくは２つ以上の遺伝子について同時に改変を生じさせることもできる。
【００２１】
また、この発明は、別の形態として、配列表の配列番号１で示す特定の塩基配列または部分アミノ酸配列を有するカテプシンＥ関連遺伝子またはその部分配列を含むＤＮＡフラグメントを提供する。なお、この発明において、カテプシンＥ関連遺伝子の部分配列とは、カテプシンＥ関連遺伝子の転写調節領域から翻訳終止コドンまでの任意の部分配列をいう。
この発明は、好ましい態様として、相同組換の対象となる２箇所の相同組換領域を有するカテプシンＥ関連遺伝子またはその部分配列を含むＤＮＡフラグメントを提供する。また、この発明の好ましい態様として、上流側の５’側の第１相同組換領域と、下流側の３’側の第２相同組換領域とからなる２箇所の相同組換領域を有するカテプシンＥ関連遺伝子またはその部分配列を含むＤＮＡフラグメントが提供される。
【００２２】
更に、この発明は、好ましい態様として、第１相同組換領域が、カテプシンＥ関連遺伝子のエクソン１の上流に位置する約１．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントから構成されていて、制限酵素ＳｔｕＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとでそれぞれ切断される第１切断部位と第２切断部位との間の領域に位置しているカテプシンＥ関連遺伝子またはその部分配列を含むＤＮＡフラグメントを提供する。
その上、この発明は、好ましい態様として、前記第１相同組換領域が配列番号１の塩基番号１４３８番目の塩基から２６５６番目の塩基までの塩基配列を有するＤＮＡフラグメントから構成されるカテプシンＥ関連遺伝子またはそのＤＮＡフラグメントを提供する。
【００２３】
また、この発明は、好ましい態様として、第２相同組換領域が、カテプシンＥ関連遺伝子のエクソン４の下流に位置する約７．０ｋｂｐのＤＮＡフラグメントから構成されていて、制限酵素ＳcaＩで切断される第３切断部位の７６bp上流と制限酵素ＨｐａＩで切断される第４切断部位の５２bp下流との間の領域に位置しているカテプシンＥ関連遺伝子またはその部分配列を含むＤＮＡフラグメントを提供する。
更に、この発明の好ましい態様として、第２相同組換領域が配列番号１の塩基番号６４１７番目の塩基から１３５４８番目の塩基までの塩基配列を有するＤＮＡフラグメントから構成されている。
【００２４】
この発明において、そのＤＮＡフラグメントの構成が明らかなカテプシンＥ関連遺伝子またはそのＤＮＡフラグメントを提供することは、ユニークな機能を有しているカテプシンＥの生理的機能を解明するのに極めて大きな役割を果たすとともに、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する様々な病態を解明ならびにかかる疾患の診断や治療法の開発に大いに寄与することができる。その上、この発明のカテプシンＥ関連遺伝子およびそのＤＮＡフラグメントは遺伝的背景が明確であることから、実験動物モデルとしてのカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製に極めて有用である。
【００２５】
この発明は、別の形態として、第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントと、第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントとが挿入されているターゲテイングベクターを提供する。また、この発明の好ましい態様のターゲテイングベクターにおいて、第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントの塩基配列は第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントの塩基配列よりも短く構成されている。
【００２６】
この発明の好ましい態様として、ターゲテイングベクターにおいては、第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントが、好ましくはＰＧＫプロモーターなどのプロモーターが連結した陽性マーカー遺伝子を含む第１ＤＮＡ領域の５’側に連結されていて、また第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントが第１ＤＮＡ領域の３’側と、好ましくはＰＧＫプロモーターなどのプロモーターが連結した陰性マーカー遺伝子を含む第２ＤＮＡフラグメント領域の５’側との間に連結されている。
この発明のターゲテイングベクターの好ましい態様としては、陽性マーカー遺伝子がネオマイシントランスフェレース遺伝子であり、陰性マーカー遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子である。
【００２７】
この発明では、その好ましい態様として、第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントがエクソン５およびエクソン６を含んでいるターゲテイングベクターが提供される。また、別の好ましい態様として、ターゲテイングベクターにおいては、第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントと第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントとはプラスミドの所定位置にそれぞれ挿入されている。
【００２８】
この発明は、更に別の形態として、カテプシンＥ関連遺伝子の相同組換によってカテプシンＥ関連遺伝子が欠損した遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する方法を提供する。好ましい態様として、カテプシンＥ関連遺伝子が欠損したマウスが提供される。また、この発明の好ましい態様として、ターゲテイングベクターを用いて相同組換することによって遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する方法が提供される。
【００２９】
この発明は、更に別の形態として、カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムクローンを採取するクローニング工程と、ターゲテイングベクターを構築するターゲテイングベクター構築工程と、ターゲテイングベクターを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入して相同組換体を得る相同組換工程と、カテプシンＥ遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚胞へのＥＳ細胞注入工程と、キメラ非ヒト哺乳動物産仔工程と、遺伝子欠損非ヒト哺乳動物産仔工程とからなる遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法を提供する。この発明の好ましい態様においては、遺伝子改変非ヒト哺乳動物はカテプシンＥ遺伝子欠損マウスが対象である。
【００３０】
この発明の好ましい態様として、遺伝子改変非ヒト哺乳動物を遺伝子ターゲテイング法によって作製することからなる遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法が提供される。
この発明の好ましい態様として、ゲノムクローンが配列番号１で表される塩基配列を有するカテプシンＥ関連遺伝子またはそのＤＮＡフラグメントから採取されることからなる遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法が提供される。また、好ましい態様としては、クローニング工程において使用されるプローブは遺伝子改変非ヒト哺乳動物と同一動物種から単離したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。
【００３１】
この発明の好ましい態様としては、上記相同組換工程において、上記ターゲテイングベクターをエレクトロポレーションによって胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの全能性細胞に導入することからなる遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法が提供される。
また、この発明の好ましい態様では、上記相同組換体スクリーニング工程において、上記相同組換体を、好ましくは上記陽性マーカー遺伝子と上記陰性マーカー遺伝子とを用いて２重スクリーニングを行なうことからなる遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法が提供される。好ましい態様としては、上記陽性マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子であり、上記陰性マーカー遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子である。
【００３２】
また、この発明の好ましい態様として、前記ＥＳ細胞注入工程において、前記カテプシンＥ遺伝子欠損ＥＳ細胞をマイクロインジェクション法によって胚胞に注入することからなる遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法が提供される。更に、好ましい態様としては、胚胞として胚盤胞などが使用される。
【００３３】
更にまた、この発明の好ましい態様として、遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法は、産仔したキメラ非ヒト哺乳動物を交配してヘテロ非ヒト哺乳動物を産仔することからなる上記カテプシンＥ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物産仔工程を提供する。また、この好ましい態様として、上記作製方法は更に産仔したキメラ非ヒト哺乳動物のＤＮＡからＰＣＲ法によってカテプシンＥ遺伝子のへテロ型を確認する工程を更に有している。
【００３４】
この発明は、更に別の形態として、上記ターゲテイングベクターを使用してカテプシンＥ関連遺伝子の相同組換を行ってカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製するためのターゲテイングベクターの構築方法を提供する。この発明の構築方法によって、上記したような構成を有するターゲテイングベクターであって、カテプシンＥ関連遺伝子が改変された非ヒト哺乳動物を作製するのに好適なターゲテイングベクターを構築することが可能となる。
【００３５】
この発明は、更に別の形態として、上記カテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物をアレルギー、アトピー性皮膚炎などの疾患の診断、学習獲得障害、記憶障害ならびに闘争行動亢進などの診断およびストレス耐久性の診断などに使用することからなる遺伝子改変非ヒト哺乳動物の使用方法を提供する。この発明によって提供される遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、カテプシンＥ関連遺伝子を完全にもしくは実質的に完全に欠損していることから、カテプシンＥ関連遺伝子が関与していると考えられる疾患やその病態の解明に使用することができ、その結果、それら疾患の診断や治療に使用することができる。
【００３６】
【発明の実施の態様】
この発明に係るカテプシンＥ関連遺伝子は、図１に示すように、エクソン１ないしエクソン９からなる９個のエクソンを含んでいる。更に、このカテプシンＥ関連遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、エクソン１の５’上流側の領域において、制限酵素ＫｐｎＩとＳｔｕＩによる切断部位をそれぞれ１個所ならびにＨｉｎｄＩＩＩならびにＡｖａＩＩによる切断部位をそれぞれ２箇所有する。また、そのエクソン３とエクソン４のそれぞれの領域には、ＫｐｎＩによる切断部位をそれぞれ１箇所存在するとともに、エクソン３とエクソン４との間の領域には、ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位が存在する。更に、エクソン４の３’側下流のエクソン５との間の領域には、ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位が１箇所ならびにＳｔｕＩによる切断部位が３箇所存在する。エクソン５とエクソン６との間の領域には、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位がそれぞれ１箇所存在する。エクソン６とエクソン７との間の領域には、ＨｐａＩによる切断部位が１箇所存在する。
【００３７】
この発明のカテプシンＥ関連遺伝子またはそのＤＮＡフラグメントには、２個の相同組換領域があり、上記２個の相同組換領域のうち、第１相同組換領域が上流側の５’側に、第２相同組換領域が下流側の３’側に存在している。
この第１相同組換領域は、エクソン１の５’上流側に存在し、ＳｔｕＩによる切断部位とＨｉｎｄＩＩＩによる２箇所目の切断部位との間の領域を意味し、第２相同組換領域は、エクソン４とエクソン５との間のＳcaＩによる切断部位の７６bp上流とエクソン７の５’上流側のＨｐａＩによる切断部位の５２bp下流との間の領域を意味している。したがって、第２相同組換領域には、エクソン５と６と７の一部が含まれている。
【００３８】
また、この発明に係るカテプシンＥ関連遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、配列表の配列番号１で表される塩基配列ならびに部分アミノ酸配列を有している。更に詳細には、この発明に係るカテプシンＥ関連遺伝子の第１相同組換領域のＤＮＡフラグメントは、配列番号１の塩基番号１４３５番目の塩基から２６６１番目の塩基までの塩基配列を有している。
したがって、第１相同組換領域は、エクソン１の上流約１．２ｋｂｐからなる塩基配列から構成されている。他方、第２相同組換領域は、エクソン４の下流約７．０ｋｂｐからなる塩基配列から構成されている。
【００３９】
なお、本明細書の配列表においては、アミノ酸を３文字表記法で表しており、Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓはシステインを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｙはグリシンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンをそれぞれ意味している。
【００４０】
以下、この発明に係る遺伝子改変非ヒト哺乳動物について、この発明の１態様としてより詳細に説明することにする。またこの発明は下記態様に一切限定されるものではなく、下記態様はこの発明の具体例を単に例示する意図で記載しているものと理解することができる。
この発明に係る遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、特にカテプシンＥ関連遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト哺乳動物であって、カテプシンＥ関連遺伝子をコードする非ヒト哺乳動物の内在性遺伝子が改変されて不活性化され、カテプシンＥ関連遺伝子の発現機能を失っている非ヒト哺乳動物をいう。
また、この発明において、カテプシンＥ関連遺伝子が欠損した遺伝子改変非ヒト哺乳動物とは、上記したように、当該技術分野において周知の遺伝子操作によって遺伝子が改変されたマウスである。更に、この発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、その遺伝子改変非ヒト哺乳動物から抽出したＤＮＡに対してカテプシンＥ関連遺伝子の全長をプローブとして用いてサザンブロッティングをした場合、そのバンドパターンが、野生型マウスからのＤＮＡについてのサザンブロットと比較したときに検出可能なレベル以上の差異を示す非ヒト哺乳動物をいう。更に、この遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、カテプシンＥ関連遺伝子をヘテロに欠損していてもよいし、ホモに欠損していてもよい。しかしながら、この発明に係る遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、そのカテプシンＥ関連遺伝子をホモに欠損しているのが好ましい。
かかる非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラットなどの齧歯動物などが挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
なお、本明細書においては、この発明の説明をより簡潔にかつ具体的にするために、非ヒト哺乳動物がマウスの場合、つまり、カテプシンＥ関連遺伝子が改変されたマウスである場合を例にとって、カテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物について説明する。
【００４１】
この発明に係るカテプシンＥ関連遺伝子改変マウスは、一般的には、カテプシンＥ関連遺伝子を発現する機能を失った遺伝子改変マウスを作製することができる方法であればいかなる方法でも作製することができ、遺伝子ターゲテイング法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５：８０３−８９０，１９９３）などが例示される。また、遺伝子ターゲッティングとしては、遺伝子のノックアウト、条件的ジーンターゲティングなどが挙げられる。
【００４２】
上記したように、遺伝子ターゲッティング法はその原理は公知であって、この方法では、目的とするターゲット遺伝子が、宿主としてのマウスのゲノム上で相同組換によって特異的に改変され、その遺伝子本来の機能を欠失などして改変されることになる。
相同組換においては、導入される導入ＤＮＡが細胞中に導入されて、ターゲット遺伝子中の部分配列（ターゲット配列）と置換される。この場合、この導入ＤＮＡには、改変された配列と、ターゲット配列中の対応する部分と相同する相同配列とが包含されているので、この導入ＤＮＡは、ターゲット配列中の対応する部分とは異なる改変配列を有している。したがって、かかる導入ＤＮＡを細胞内に導入すると、該導入ＤＮＡが、その細胞が有する本来のターゲット配列と相同組換を起こして、該ターゲット配列と置換する。なお、ターゲット配列は、カテプシンＥ遺伝子の１部であっても、全部であってもよく、またカテプシンＥ遺伝子のゲノムＤＮＡのエクソンまたはイントロンに存在する配列であってもよい。
【００４３】
この発明において、遺伝子ターゲテイング法を実施するには、まず、その機能を改変させようとするカテプシンＥ遺伝子のゲノムＤＮＡを上記ターゲット配列に対応する配列として単離する。単離するゲノムＤＮＡは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の相同組換を行うためのターゲテイングベクターを構築するために使用するので、そのＥＳ細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離することが好ましい。このようにゲノムＤＮＡをそのＥＳ細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離することにより、ＥＳ細胞の相同組換を良好にかつ効率よく生じさせることができる。また、同一の動物種のうちでも同じ系統の動物種からゲノムＤＮＡを単離して使用すれば、ＥＳ細胞の相同組換をより一層良好にかつ効率よく生じさせることができる。
【００４４】
上記のようにして単離したゲノムＤＮＡまたはマウス由来のｃＤＮＡをプローブとして使用して、マウスゲノムライブラリーからスクリーニングすることによってマウスカテプシンＥ関連遺伝子のゲノムクローンを採取することができる。ｃＤＮＡプローブを使用する場合は、カテプシンＥ関連遺伝子のｃＤＮＡの全長を使用しても、その１部を使用してもよい。
【００４５】
かかるプローブに結合したカテプシンＥ関連遺伝子ゲノムＤＮＡは、制限酵素で切り出して、クローニング用ベクター中に挿入する。クローニング用ベクターとしては一般的にはプラスミドが使用され、かかるプラスミドとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣなどのいずれのプラスミドも用いることができるが、特に限定されるものではない。
【００４６】
この発明のターゲティングベクターは、その遺伝子を改変して機能不能にしたカテプシンＥ関連遺伝子によってＥＳ細胞中のカテプシンＥ関連遺伝子ゲノムＤＮＡを相同組換するために使用するものである。従って、この発明におけるカテプシンＥ関連遺伝子のターゲティングベクターは、その１部を改変することによって機能不能にしたカテプシンＥ関連遺伝子ゲノムＤＮＡフラグメントを含んでいる。カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡを挿入したプラスミドは、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でカテプシンＥ関連遺伝子ゲノムＤＮＡフラグメントを改変することによりターゲティングベクターとすることができる。
【００４７】
この発明に係るターゲティングベクターは、例えば、カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントを制限酵素処理により切り出して、カテプシンＥ関連遺伝子とは関連しないＤＮＡフラグメント、たとえば選択マーカー遺伝子ＤＮＡを予め挿入しているプラスミドの所定位置に挿入する方法、またはカテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントを、カテプシンＥ関連遺伝子とは関連しないＤＮＡフラグメント、たとえば選択マーカー遺伝子ＤＮＡなどと置換する方法などによって作製することができる。
このように、カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントをカテプシンＥ関連遺伝子とは関連しない選択マーカー遺伝子ＤＮＡなどのＤＮＡフラグメントを挿入もしくは置換することは、ターゲティングベクター中のＤＮＡによって相同組換された相同組換体を、選択マーカーなどを用いることによって、より一層容易にスクリーニングをすることができるようにするためである。
【００４８】
また、この発明において、後の工程での相同組換体のスクリーニングをより一層容易に行うことができるようにターゲティングベクターを構築するのがこのましい。そのためには、得られる相同組換体を、一般的には、２段階でスクリーニングを行うのが好ましい。この２段階のスクリーニングは、例えば、第１段階のスクリーニングを、ターゲティングベクターによって組換体内に導入した薬剤耐性遺伝子を用いて、培養中に細胞レベルでスクリーニングを行い、第２段階のスクリーニングを、第１段階のスクリーニングによって選択した組換体に対してＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などによってＤＮＡレベルでスクリーニングを行うのがこのましい。
【００４９】
かかる選択マーカー遺伝子としては、例えば、陽性選択用にはネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられ、陰性選択用にはチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子などが挙げられる。これらの選択マーカー遺伝子は、目的に応じて使用することができる。
【００５０】
上記選択マーカー遺伝子に連結されるプロモーターとしては、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1（ＰＧＫ−1）プロモーター、伸長因子２（ＥＦ−2）プロモーター、MC−1プロモーターなどを挙げることができる。かかるプロモーターとしては、ＥＳ細胞中で強い発現活性を有するプロモーターを使用するのがよい。そのプロモーター活性は、ターゲティングを行う遺伝子座やそのＤＮＡ領域などによって大きく影響されるため、一般的には、プロモーターは強力であればあるほどよく、ＰＧＫ−1プロモータを使用するのがより好ましい。
【００５１】
より具体的には、この発明のターゲティングベクターは、例えば、カテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡを制限酵素処理により切り出して、プラスミドの所定位置に挿入することによって作製することができる。
別の方法としては、この発明のターゲティングベクターは、例えば、単離したカテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡの１部を制限酵素処理により削除し、削除されたＤＮＡ領域の代わりにプロモーターを連結した選択マーカー遺伝子を挿入することにより、カテプシンＥ関連遺伝子のターゲティングベクターを作製することができる。
【００５２】
いずれの方法によっても、この発明に係るターゲティングベクターは、２個の相同組換領域ＤＮＡフラグメントがプラスミドの所定位置に存在していて、上流側に上記のような第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントが、下流側に第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントが挿入されている構成になっている。
更に詳細には、この発明のターゲティングベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏr遺伝子）などの陽性選択用マーカー遺伝子が位置する５’上流側に第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントが、また陽性選択用マーカー遺伝子の３’下流側端と、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）などの陰性選択用マーカー遺伝子の５’上流側端との間に第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントが位置するように構築するのがよい。
【００５３】
図１に示すように、この発明に係るターゲティングベクターは、上記のような構成からなるプラスミドに対して、２個の相同組換領域ＤＮＡフラグメントが挿入されているのがよく、上流側に上記のような第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントが、下流側に第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントが挿入されているのがよい。ブラスミドにＤＮＡフラグメントを挿入する方法は、当該技術分野においては慣用されている方法であって、いずれの方法を使用してもよい。
【００５４】
更に詳細には、この発明に係るターゲティングベクターは、プラスミドに挿入された上記プロモーター連結陽性マーカー遺伝子の５’側上流に上記第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントと、また上記陽性マーカー遺伝子の３’側下流でかつ上記プロモーター連結陰性マーカー遺伝子の５’側上流に上記第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントとが挿入された構成になっている。
【００５５】
更に詳細には、上記プロモーター連結陽性マーカー遺伝子の５’側上流に挿入された上記第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントは、カテプシンＥ関連遺伝子のエクソン１の上流において、制限酵素ＳｔｕＩで切断される第１切断部位と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断される第２切断部位との間の領域に位置するＤＮＡフラグメントであって、エクソン１の上流の約１．２ｋｂｐの塩基配列を有していて、配列番号１の塩基番号１４３８番目の塩基から２６５６番の塩基までの塩基配列を有している。
【００５６】
一方、上記プロモーター連結陽性マーカー遺伝子の３’側下流に挿入された上記第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントは、カテプシンＥ関連遺伝子のエクソン４の下流において、制限酵素ＳcaＩで切断される第３切断部位の７６bp上流と、制限酵素ＨｐａＩで切断される第４切断部位の５２bp下流との間の領域に位置するＤＮＡフラグメントであって、エクソン４の下流の約７．０ｋｂｐの塩基配列を有していて、配列番号１の塩基番号６４１７番目から１３５４８番目までの塩基までの塩基配列を有している。したがって、上記第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントは、エクソン５およびエクソン６を含んでいる。
【００５７】
図２を参照して、ターゲティングベクター作製の具体的な１例を以下に説明する。
まず、カテプシンＥ遺伝子またはそのフラグメントを制限酵素（例えばＨｉｎｄＩＩＩ）を用いて常法に従って切断した。このように切断されたフラグメントのうち、第１相同組換領域（ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断領域）を含むＤＮＡフラグメント（図中、ＳｈｏｒｔＡｒｍ（ショートアーム）と表している）をプラスミド、例えばｐＵＣ１１８中に常法に従って導入した。次に、ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断領域を制限酵素を用いて切り出して、この切断した部位を、第１のマーカー遺伝子、例えばＮｅｏ遺伝子を導入したプラスミド、例えばｐＰＧＫＮｅｏＥ／Ｅ５中に制限酵素を用いて導入して、ｐＮｅｏＨｓベクターを作製した。なお、上記第１マーカー遺伝子にはプロモーター、例えばＰＧＫなどが結合されている。
【００５８】
一方、カテプシンＥ遺伝子またはそのフラグメントにおいて、制限酵素ＳcaＩで切断される第３切断部位の７６bp上流と、制限酵素ＨｐａＩで切断される第４切断部位の５２bp下流との間の領域に相当する第２相同組換領域（プライマーにＲＶ−ＮｏｔＩ切断領域を含む）をＰＣＲ法を用いて増幅し（図中、ＬｏｎｇＡｒｍ（ロングアーム）と表している）、例えばｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにライゲーションして、ｐＴ７−ＲＶ−ＮｏｔＩベクターを作製した。
このようにして作製したベクターからＲＶ−ＮｏｔＩ切断部位を制限酵素を用いて切り出して、第１相同組換領域を組み込んだｐＮｅｏＨｓベクター中に導入してｐＮｅｏＳ＆Ｌベクターを作製した。このベクターにおいては、第１相同組換領域としてのＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位はＮｅｏ遺伝子の上流側に、第２相同組換領域としてのＲＶ−ＮｏｔＩ切断部位はＮｅｏ遺伝子の下流側に結合される。
【００５９】
更に、上記のようにしてＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＲＶ−ＮｏｔＩ切断部位とが導入されているｐＮｅｏＳ＆ＬベクターをＳａｌＩ−ＮｏｔＩで切断し、第２のマーカー遺伝子、例えばチミジンキナーセー遺伝子などが組み込まれているプラスミド、例えばｐＰＧＫＴｋ−ＳａｃＩＩ／Ｒなどに挿入して、ターゲテイングベクターとしてｐＮｅｏＣＥを作製することができる。この場合、上記第２マーカー遺伝子は、上記ＲＶ−ＮｏｔＩ切断部位の下流側、つまり３’側のＮｏｔＩ切断部位側に挿入されるようにする。なお、上記第２マーカー遺伝子にはプロモーター、例えばＰＧＫなどが結合されている。
【００６０】
次に、ターゲティングベクターによる相同組換について説明する。
この発明においては、上記のような構成を有するターゲティングベクターを使用して、相同組換を行って、カテプシンＥ関連遺伝子と同一または類似の塩基配列を有する改変したカテプシンＥ関連遺伝子を、カテプシンＥ関連遺伝子ゲノム上に人工的に組み換えることによって、ターゲテッド対向遺伝子を作製することができる（図１参照）。
【００６１】
ところで、遺伝子の相同組換が起こる頻度は10-6程度と非常に低いことが知られている。そのため、このような遺伝子の相同組換を受精卵を使用して行う場合には、目的とする相同組換体を得るためには、理論上106個以上の受精卵に対して組換操作を行う必要があるとともに、少なくとも数十ないし数百検体の組換体をスクリーニングする必要がある。したがって、このような膨大な数の受精卵を実際に使用して組換操作を行うことは実際には不可能であるので、受精卵と同様の多分化能を有しかつインビトロ（in vitro）で培養することが可能な全能性を有する細胞が使用されている。全能性を有する細胞としては、例えば、そのうちでも、マウス由来のＥＳ細胞が一般的には用いられていて、かかるマウス由来のＥＳ細胞としては、例えば、マウス由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）などが挙げられる。またＥＳ細胞としては、例えば、ＴＴ２細胞、ＡＢ−1細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞、Ｅ１４１細胞などが挙げられる。
なお、この発明においては、マウス由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を例にして説明するが、これに限定されるものではない。
【００６２】
上記のようにしてカテプシンＥ関連遺伝子を機能不能にしたＤＮＡフラグメントを組み込んだターゲティングベクターをＥＳ細胞中に導入する。かかるターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法などを使用することができるが、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。この導入方法によってターゲティングベクターをＥＳ細胞中に導入することによって、ＥＳ細胞中の目的とするカテプシンＥ関連遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメント（ターゲット配列）が、ターゲティングベクター中の機能不能にしたカテプシンＥ関連遺伝子ＤＮＡフラグメント（改変された配列）によって相同組換されて置換される。
【００６３】
次に、上記のようにして、カテプシンＥ関連遺伝子のターゲット配列がターゲティングベクター中の改変配列によって相同組換された細胞が選択される。
この相同組換細胞の選択は、目的とするカテプシンＥ関連遺伝子が確実にターゲティングされているかどうかを調べるため、第２段階のスクリーニング工程で行うのがよい。つまり、このような遺伝子組換細胞の選択は、例えば、Ｇ４１８を細胞培地に添加してＮｅｏr遺伝子を持たない非組換細胞を除去するとともに、ガンシクロビルを添加してＨＳＶ−ｔｋ遺伝子によって残存するランダムな組換細胞を除去することによって行うことができる。選択された遺伝子組換細胞のカテプシンＥ関連遺伝子は、そのコード配列中にＮｅｏr遺伝子が挿入された変異配列であり、カテプシンＥを産生することはできない。
【００６４】
上記のようにして遺伝子相同組換が生じたＥＳ細胞は、マウスの8細胞期または胚盤胞の初期胚に注入する。かかるＥＳ細胞を胚内に注入する方法としては、例えば、マイクロマニピュレーション法、凝集法などが挙げられるが、何らこれらに限定されるものではなく、目的を達成することができる方法であればいずれの方法も試用することができる。このようにして相同組換が生じたＥＳ細胞が注入された初期胚は、偽妊娠仮親の雌マウスの子宮に移植されて、キメラマウスが出産される。
なお、マウスの場合には、雌マウスに対してＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧなどのホルモン剤を使用することにより過排卵処理を施した後、雌マウスと雄マウスとを交配させる。受精から所定日経過した後、マウスの子宮から初期発生胚を回収し、回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組換ＥＳ細胞をインビトロで注入して、キメラ胚を作製することができる。
【００６５】
仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、去勢した雄マウスと交配することにより作製することができる。作製した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作成したキメラ胚を子宮内に移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするために、受精卵を採取する雌マウスと仮親になる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作製することが望ましい。
【００６６】
このようにして作製したキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来のキメラマウスを選択する。選択したＥＳ細胞移植胚由来のキメラマウスが成熟した後、他の適切な系統、例えば、純系マウス系統のマウスと交配させて産仔を得ることができる。
この次世代産仔において、キメラマウスの生殖細胞が上記相同組換体、すなわちカテプシンＥ関連遺伝子が欠損した細胞に由来する場合には、カテプシンＥ関連遺伝子の一方が改変されたヘテロ接合体であるヘテロ変異マウスとして得ることができる。このようなヘテロ接合体（＋／−）であるヘテロ変異マウス同士を交配させることによって、正常なカテプシンＥ遺伝子を有しないホモ接合体（−／−）であるホモ変異マウスとしてのトランスジェニックマウスを得ることができる。
【００６７】
なお、次世代産仔において、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標としてＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認することが可能である。しかしながら、次世代産仔にはＥＳ細胞由来の被毛色が現れることから、この次世代産仔の被毛色から確認することが簡単である。このように、胚内に移植された組換ＥＳ細胞が生殖系列に導入されたマウスを選択し、そのキメラマウスを繁殖することにより目的とする遺伝子を欠損する個体を得ることができる。このように得られたカテプシンＥ関連遺伝子欠損ヘテロ接合体マウス同士を交配することにより、目的とする遺伝子欠損ホモ接合体マウスを得ることができる。
【００６８】
以下、この発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、この発明は、下記実施例に何ら限定されるものではなく、下記実施例はこの発明をより理解できるように例示しているに過ぎないものと理解すべきである。
【実施例】
実施例１：カテプシンＥ遺伝子欠損マウスの作製
１２９／ＳｖマウスライブラリーからカテプシンＥ遺伝子をクローン化し、第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントとしてエクソン１の上流約１．２ｋｂｐと、第２相同組換ＤＮＡフラグメントとしてエクソン４の下流約７．０ｋｂｐとをネオマイシン耐性遺伝子の入ったプラスミドに挿入した。約１．２ｋｂｐの第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントと、約７．０ｋｂｐの第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントのゲノムは、ネオマイシン耐性遺伝子を挟む形で設計されていて、約７．０ｋｂｐのゲノムの下流にはチミジンキナーゼ遺伝子も挿入されていた。
このようにして得られたプラスミドをＥＳ細胞にエレクトロポレーション法で導入し相同組換を起こさせた。得られた相同組換体をＧ４１８とＧＡＮＣ（ガンシクロビル）とを用いて２重の選別を行って、目的とするカテプシンＥ遺伝子の欠損したＥＳ細胞を得た。つまり、この選別は、Ｇ４１８を細胞培地に添加してＮｅｏr遺伝子を持たない非組換細胞を除去し、さらにＧＡＮＣ（ガンシクロビル）を添加してＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が残存するランダムな組換細胞を除去することによって行った。選択された遺伝子組換細胞のカテプシンＥ遺伝子は、そのコード配列中にＮｅｏr遺伝子が挿入された変異配列であり、カテプシンＥを産生することはできない。
得られたカテプシンＥ遺伝子欠損ＥＳ細胞をＣＳ５７ＢＬ／６から採取した胚盤胞にマイクロインジェクション法によって注入し、仮親の子宮に移植した。
次に、生まれたキメラマウスの雄と、Ｃ５７ＢＬ／６の雌とを交配させ、ヘテロマウスを産仔した。産仔のへテロマウスの尾からＤＮＡを抽出し、カテプシンＥ遺伝子のへテロ型を確認した。
最後に、ヘテロマウスの雄と雌とを交配してカテプシンＥ遺伝子の完全欠損マウス（ホモ型）を作製した。
【００６９】
上記の方法において作製されたマウスがヘテロ接合子（＋／−）を有するかまたはホモ接合子（−／−）を有するかどうかの確認は、作製されたマウスの尻尾から抽出したＤＮＡをサザンブロット分析ならびにＰＣＲ法によって行った。確認に際しては、抽出したＤＮＡをＫｐｎＩで消化して、図１に示すプローブでハイブリダイゼーションした。サザンブロット分析の結果は図３に、ＰＣＲ法による結果は図４に示す。図中、（＋／＋）は野生型マウスを示し、図４中、Ｍはマーカーを示す。
【００７０】
実施例２：タ−ゲテイングベクターの構築
上記ターゲティングベクターは図２に示すようにして作製した。まず、第１相同組換領域ＤＮＡフラグメントを含むフラグメントとしてのショートアームは、カテプシンＥ遺伝子を制限酵素ＳｔｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断されるＳｔｕＩ（５’側）−ＨｉｎｄＩＩＩ（３’側）切断部位からなるＤＮＡフラグメントである。
他方、第２相同組換領域ＤＮＡフラグメントとしてのロングアーム（ＲＶ−ＮｏｔＩフラグメント）として、カテプシンＥ遺伝子における制限酵素ＳcaＩで切断される切断部位（第３切断部位）の７６bp上流と、制限酵素ＨｐａＩで切断される切断部位（第４切断部位）の５２bp下流との間の領域に位置するＤＮＡフラグメントをＺ−ｔａｑＰＣＲ法に従って増幅することによって得た。
【００７１】
また、上記ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を挿入したプラスミドｐＵＣ１１８をＳｔｕＩで消化し、その５‘末端側にＨｉｎｄＩＩＩリンカーを結合しＨｉｎｄＩＩＩで消化すると、ショートアームのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（３’側）フラグメントが得られ、このフラグメントはプラスミドｐＰＧＫＮｅｏＥ／Ｅ５に挿入されることにより、Ｎｅｏ遺伝子の５’側上流のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に上記ショートアームが導入されてｐＮｅｏＨｓが得られた。
【００７２】
増殖されたロングアームとしてのＲＶ−ＮｏｔＩフラグメントは、ｐＴ７ＢｌｕｅベクターにライゲーションされてｐＴ７−ＲＶ−ＮｏｔＩが得られた。得られたベクターをＲＶ−ＮｏｔＩで消化して、ＲＶ−ＮｏｔＩフラグメントを切り出した。
他方、上記ｐＮｅｏＨｓをＳｍａＩ−ＮｏｔＩで消化して、切り出したＲＶ−ＮｏｔＩフラグメントを、Ｎｅｏ遺伝子の３’側下流に結合して、ｐＮｅｏＳ＆Ｌを作製した。切り出したＲＶ−ＮｏｔＩフラグメントとＮｅｏ遺伝子との結合は、上記ｐＮｅｏＨｓのＳｍａＩ切断部位がＲＶ−ＮｏｔＩフラグメントのＲＶ切断部位と結合するように行った。
【００７３】
別のマーカー遺伝子として、つまり陰性マーカー遺伝子として、チミジンキナーゼ遺伝子を導入するために、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を導入したＰＧＫ結合プラスミドｐＰＧＫＴｋ−ＳａｃＩＩ／Ｒを作製した。このＰＧＫ結合プラスミドをＮｏｔＩとＳａｌＩで消化した。
同時に、上記ｐＮｅｏＳ＆ＬをＮｏｔＩとＳａｌＩで消化した。これによって、上記ｐＮｅｏＳ＆ＬのＲＶ−ＮｏｔＩフラグメントのＮｏｔＩ切断部位を上記チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）に結合させて、ｐＮｅｏＣＥをターゲテイングベクターとして作製した。
【００７４】
実施例３：血球解析
実施例１によって作製されたカテプシンＥ遺伝子欠損マウスから血液を採血し、採血した血液から血球の赤血球と、白血球と、血小板とを分離してクリーン環境下ならびに無菌環境下で血球解析を行った。対照マウスとして、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。クリーン環境下での血球数を比較した血球解析の結果を表１に、また無菌環境下での血球解析の結果を表２に示す。なお、この血球解析では有意差はいずれの場合にも認められなかった。また、血球解析はＥＬＩＳＡ法によって行った。以下の実施例においても同様にして行った。
【００７５】
【表１】
0004189474.tif 000002
【００７６】
【表２】
0004189474.tif 000003
【００７７】
実施例４：種類別白血球数解析
実施例１によって作製されたカテプシンＥ遺伝子欠損マウスと、対照マウスの血液の白血球を好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩球とに更に分離して、それらの数を解析した。クリーン環境下での種類別白血球数を比較した血球解析の結果を表３に、また無菌環境下での血球解析の結果を表４に示す。なお、表３中、クリーン環境下での好酸球数は１％有意水準で有意差があり、表４中、無菌環境下での単球数は５％有意水準で有意差があった。これらの結果はアトピー性疾患症状の特徴を表している。
【００７８】
【表３】
0004189474.tif 000004
【００７９】
【表４】
0004189474.tif 000005
【００８０】
実施例５：赤血球性状解析
実施例１によって作製されたカテプシンＥ遺伝子欠損マウスと、対照マウスとの赤血球性状を解析するために、ヘモグロビン量、ヘマトクリット値、平均赤血球容量、平均赤血球ヘモグロビン量ならびに平均赤血球ヘモグロビン濃度をクリーン環境下で測定した。その結果を表５に示す。この赤血球性状解析では有意差は認められなかった。
【００８１】
【表５】
0004189474.tif 000006
【００８２】
実施例６：血清学的解析
実施例１によって作製されたカテプシンＥ遺伝子欠損マウスと、対照マウスとの血清学的解析をクリーン環境下で行った。そのために、総タンパク質量、ＧＯＴ（アスパラギン酸アミノ基転位酵素で肝疾患、心筋梗塞の診断に使用）、ＧＰＴ（アラニンアミノ基転位酵素で心疾患時に遊離する）、血液尿素窒素量およびクレアチニンを測定した。その結果を表６に示す。この血清学的解析では有意差は認められなかった。
【００８３】
【表６】
0004189474.tif 000007
【００８４】
実施例７：種類別抗体量
クリーン環境下で育てた実施例１によって作製されたカテプシンＥ遺伝子欠損マウスと、対照マウスとについて種類別抗体の量を測定した。抗体としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭおよびＩｇＥの量を測定した。その結果は表７に示す。なお、ＩｇＥは１％有意水準で有意差が認められた。この結果は、アトピー性疾患症状の大きな特徴を表している。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
実施例８：脾細胞からのサイトカイン分泌量
クリーン環境下で育てた実施例１によって作製されたカテプシンＥ遺伝子欠損マウスと、対照マウスとについて脾細胞からのサイトカイン分泌量を測定した。抗体としては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌量を測定した。その結果は表８に示す。なお、ＩＬ−４とＩＬ−５とは１％有意水準で有意差が認められた。これらの結果は、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスでは、２種類のエフェクターT細胞のうちTh-2細胞への分化が著明に亢進し、液性免疫応答によるアレルギーを生起することを示している。
【００８７】
【表８】
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【００８８】
実施例９：ハプテン塗布による実験的アトピー性皮膚炎誘導実験
実施例１によって作製されたカテプシンＥ遺伝子欠損マウスと、対照マウスと、ＮＣ／Ｎｇａマウスについてハプテン塗布による実験的アトピー性皮膚炎誘導実験を行った。
実験は、ピクリルクロライドというハプテンをエタノール４、アセトン１の割合で混合した５％混合溶液を調製し、免疫誘導し、１週間後から５％混合液を実験マウスの背部に１回１５０μｌずつ３〜４日おきに局所塗布して、アトピー性皮膚炎の各症状を観察した。
実験期間中、下記５項目を観察し、各観察項目毎に４段階のスコアーで採点し、その合計点を比較した。観察した項目は、（１）発赤もしくは出血、（２）浮腫、（３）脱毛もしくは組織欠損、（４）皮膚乾燥および（５）発疹であり、各項目を、０（ゼロ）（観察されない）、１（軽度）、２（中等度）および３（重度）の４段階に分けて採点した。その結果を図５に示す。
【００８９】
図５の結果から、この発明に係るカテプシンＥ遺伝子欠損マウスは、アトピー性皮膚炎誘導実験における標準実験動物モデルとして使用することができることを示している。
また、対照マウスと、この発明のカテプシンＥ遺伝子欠損マウスとについて、１５週齢での皮膚における病理組織的解析結果を図６に示す。この病理組織的解析結果では、この発明のカテプシンＥ遺伝子欠損マウスにおいては、著しい表皮の肥厚と海綿状態が認められると共に、リンパ球の浸潤が認められた。これに対して、対照マウスにおいては、アトピー性皮膚炎による病理組織的変化は認められなかった。
【００９０】
図７は、上記実験において、ハプテンを５ヶ月間塗布した場合の実験マウスにおけるアトピー性皮膚炎による皮膚の病理学的解析結果を示す図である。図７から、対照マウスにおいては、リンパ球の１部浸潤が認められる。ＮＣ／Ｎｇａマウスでは、対照マウスに比べて、リンパ球の浸潤が顕著になっているとともに、表皮の肥厚が認められる。これに対して、この発明のカテプシンＥ遺伝子欠損マウスにおいては、リンパ球による膿瘍が形成されていると共に、痂皮の形成が認められた。
【００９１】
実施例１０：学習獲得障害および記憶障害についての実験
この発明のカテプシンＥ遺伝子欠損マウスに対して、試行性ステップ・スルー（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）型受動回避装置（明室と暗室の２つの部屋からなり、床はステンレス性のグリッドが装着され、暗室の床から電気刺激が印加されるようになっている）を用いた実験を行った。その結果、この発明のカテプシンＥ遺伝子欠損マウスは学習獲得障害および記憶障害をきたしているものと判断できる。
図８は、実験マウスとして、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスと対照マウスを明室に入れ、暗室に移動した時に、電気刺激（刺激間隔１秒間、刺激時間１０秒間）を印加して、学習獲得段階として、明室から暗室へ移動するまでの時間を反応潜時（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙ）として測定した。２４時間後、実験マウスを再度明室に入れ、反応潜時を測定した。この結果から明らかなように、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスは対照マウスに比べて、反応潜時が短く、学習獲得障害あるいは記憶障害が実現していることが分かる。カテプシンＥ遺伝子欠損マウスと対照マウスとの間には、自発運動の差が見られないことから、これらの結果は、特異的な症状を考えられ、ヒトにおけるアルツハイマー様症状やボケ症状に類似したものと考えられる。
【００９２】
実施例１１：闘争行動亢進についての実験
カテプシンＥ遺伝子欠損マウスと対照マウスとを１匹ずつ個別ケージに入れ３０日以上隔離飼育をした後、カテプシンＥ遺伝子欠損マウス同士と対照マウス同士とを１つのケージを入れて１０分間の闘争行動（ｆｉｇｈｔｉｎｇ ｅｐｉｓｏｄｅ：立ち上がりによる対峙行動、噛み付き行動、鳴声など）を観察し、闘争行動の開始時間（Ａ）、持続時間（Ｂ）および頻度（Ｃ）を測定した。図９から明らかなように、両者での闘争頻度は、有意差がないにも拘わらず、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスは対照マウスに比べて、闘争開始時間が短く、闘争持続時間が長いことが分かった。これらの症状は、ヒトにおける精神分裂様症状や鬱症状に類似したものである。
【００９３】
実施例１２：胃粘膜の状態の組織学的解析
２４週齢の正常マウスと、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスとを水槽に入れてストレスを加えて、分間経過して、それらのマウスの胃粘膜の状態を顕微鏡による組織学的解析を行なった。その結果、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスでは、好中球やリンパ球などの炎症性組織の浸潤が顕著であったとともに、出血も認められた。
【００９４】
実施例１３：塩酸負荷による潰瘍発生度合いの実験
２４週齢の正常マウスと、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスとに対して塩酸を負荷して胃潰瘍の発生度合いを比較した。その結果、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスでは、正常マウスに比べて、潰瘍の発生が明らかに起こりやすくなり、また重度化する傾向が見られた。
【００９５】
【発明の効果】
この発明に係るカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、カテプシンＥ関連遺伝子が関与する様々な病態の解明することにならびにかかる疾患の治療法の研究に極めて有用でありかつ遺伝的背景が明確である実験動物モデルとして利用することができる。
また、この発明のカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患ならびにその病態の解明に有用に利用することができる。更に、この発明のカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、学習獲得障害ならびに記憶障害および闘争行動亢進についての実験に実験動物モデルとして利用することが期待できることから、かかる機能の解明に多いに寄与することが期待できる。その上、この発明のカテプシンＥ関連遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、ストレスに対して極めて感受性が高いことから、ストレスに対する生理的機能の解明にも役立つものと期待できる。
【００９６】
この発明のカテプシンＥ遺伝子も、カテプシンＥ遺伝子欠損マウスなどのカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製するのに有用であり、ひいては作製されるカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、遺伝的背景が明確であることから、実験動物モデルとしてカテプシンＥ遺伝子関連の疾患や病態の研究に大いに寄与することができる。
【００９７】
この発明に係るターゲテイングベクターは、相同組換ＤＮＡフラグメントを介して相同組換を起こしてカテプシンＥ関連遺伝子の発現を抑えてその機能が不能なカテプシンＥ遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製するのに有用であり、カテプシンＥ遺伝子関連の疾患や病態の研究に多大な貢献をすることができる。
【００９８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】カテプシンＥ関連遺伝子の遺伝子地図。
【図２】ターゲテイングベクターの構築を説明するための説明図。
【図３】サザンブロット分析の結果を示す電気泳動図。
【図４】ＰＣＲ法による結果を示す電気泳動図。
【図５】ハプテン塗布によるアトピー性皮膚炎の各症状に対する観察結果の採点スコアーを示すグラフ。
【図６】この発明のカテプシンＥ遺伝子欠損マウスと対照マウスとにおける１５週齢での皮膚における病理組織的解析結果を示す図。
【図７】実験マウスに対する５ヶ月間のハプテン塗布によるアトピー性皮膚炎における皮膚の病理学的解析結果を示す図。
【図８】カテプシンＥ遺伝子欠損マウスと対照マウスに対する電気刺激（刺激間隔１秒間、刺激時間１０秒間）による学習獲得段階としての明室から暗室へ移動するまでの時間を反応潜時（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙ）として測定した結果を示す図。
【図９】カテプシンＥ遺伝子欠損マウスと対照マウスとの闘争行動（ｆｉｇｈｔｉｎｇｅｐｉｓｏｄｅ：立ち上がりによる対峙行動、噛み付き行動、鳴声など）の開始時間（Ａ）、持続時間（Ｂ）および頻度（Ｃ）を測定した結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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