(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有する中温性キシラナーゼＩ。
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.5であり、ｐＨ3.5〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、作用最適温度は55℃である。
（e）温度安定性：55℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）。
0004039494.tif 000008
【請求項２】
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有する中温性キシラナーゼII。
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.8であり、ｐＨ3.0〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、55℃である。
（e）温度安定性、55℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）。
0004039494.tif 000009
【請求項３】
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有する中温性キシラナーゼIII。
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.5であり、ｐＨ2.5〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、50℃である。
（e）温度安定性：50℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）。
0004039494.tif 000010
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、キシラナーゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来する新規な中温性キシラナーゼに関する。
背景技術
キシランは、広く天然に存在する多糖の一つであり、高等植物細胞壁や周辺組織の主要な構成成分であるセルロース、リグニン、ヘミセルロース類、ペクチン類などの多糖のうち、ヘミセルロースとして分類される。その構造は、キシロースを単位とするβ−1,4−キシロシド結合により重合した主鎖を有する高分子多糖である。キシランは、天然には、構成糖がキシロースだけのホモキシラン以外に、アラビノースが分岐して主鎖に結合したアラビノキシランなどのヘテロキシランとしても存在する。
キシラナーゼは、キシランをキシロオリゴ糖、キシロビオース、最終的にはキシロースにまで分解する反応系を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式によって、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼなどに大別される。それらの作用様式の詳細まで比較すると、非常に多数の酵素が存在する。そのため、従来から、様々な作用様式を示すキシラナーゼが互いに補い合って相乗効果を発現することにより、植物組織中のキシランを分解するものと考えられている。
キシラナーゼは、キシランからのキシロオリゴ糖又はキシロースの製造や、バイオマス処理に利用されている。この他にも最近では、飼料用酵素、食品加工分野などで、キシラナーゼの応用が進んでおり、様々なキシラナーゼが研究開発されている。
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）は糖化力の強いセルラーゼを生産することが特徴であり、飼料用途やサイレージ用途での有用性が報告されている（例えば、特開平4-117244号公報、特開平7-236431号公報）。また、含有されているセルラーゼ成分についても報告されている（例えば、Agric. Biol. Chem., 52, 2493〜2501（1988）、同誌53, 3359〜3360（1989）、同誌54, 309〜317（1990））。更に、同菌の生産する粗酵素は、セルラーゼを生産すると同時にキシラナーゼをも生産しており、そのうちのある成分については報告がある（例えば、Agric. Biol. Chem., 51, 65〜74（1987）、同誌51, 3207〜3213（1987）、Report of National Institute of Bioscience and Human-Technolgy, 1, 37〜44（1993）、特公平1-21957号公報、特開平1-171484号公報、特開平1-71485号公報）。
しかし、これらの報告は、耐熱性のキシラナーゼやキシロオリゴシル転移酵素に関するものであり、中温性のキシラナーゼについては詳細には知られていなかった。
キシラナーゼを食品や飼料に応用する際には、中性ないし酸性領域で活性があり、至適温度が６０℃ぐらいまでの中温性のものが適当である。しかし、そのような中温性キシラナーゼは、これまで知られていなかった。
発明の開示
そこで本発明者らは、アクレモニウム・セルロリティカス由来のキシラナーゼ系を構成する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討した。その結果、酵素群に中温領域で至適活性のある新規有効成分を見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。本発明は、食品加工、飼料、サイレージなどの用途に有効な新規な中温性キシラナーゼを提供することを目的とするものである。
請求項１に記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）に由来し、下記の性質を有する中温性キシラナーゼＩを提供するものである。
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.5であり、ｐＨ3.5〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、作用最適温度は55℃である。
（e）温度安定性：55℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）。
0004039494.tif 000002
次に、請求項２に記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有する中温性キシラナーゼIIを提供するものである。
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.8であり、ｐＨ3.0〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、55℃である。
（e）温度安定性：55℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）。
0004039494.tif 000003
また、請求項３記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有する中温性キシラナーゼIIIを提供するものである。
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.5であり、ｐＨ2.5〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、50℃である。
（e）温度安定性：50℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）。
0004039494.tif 000004
【図面の簡単な説明】
図１は、本酵素の至適ｐＨを示す図である。ａは中温性キシラナーゼＩ、ｂは中温性キシラナーゼII、ｃは中温性キシラナーゼIIIのそれぞれ至適ｐＨを示す。
図２は、本酵素のｐＨ安定性を示す図である。ａは中温性キシラナーゼＩ、ｂは中温性キシラナーゼII、ｃは中温性キシラナーゼIIIのそれぞれ安定ｐＨ範囲を示す。
図３は、本酵素の作用最適温度を示す図である。ａは中温性キシラナーゼＩ、ｂは中温性キシラナーゼII、ｃは中温性キシラナーゼIIIのそれぞれ作用最適温度を示す。
図４は、本酵素の温度安定性を示す図である。ａは中温性キシラナーゼＩ、ｂは中温性キシラナーゼII、ｃは中温性キシラナーゼIIIのそれぞれ温度安定性を示す。
図５は、本酵素の分子量を測定した際のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の中温性キシラナーゼＩ〜IIIは、アクレモニウム・セルロリティカスが生産するキシラナーゼ系中に含まれる有効成分である。以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の中温性キシラナーゼを含むキシラナーゼ系を生産する微生物としては、アクレモニウム・セルロリティカスTN株、アクレモニウム・セルロリティカス株などがある。
前者のアクレモニウム・セルロリティカスTN株は、日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３の通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現在は、住所は変わらないが、住居表示が日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に変更されている。また、名称は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に改称されている。）に、Acremonium cellulolyticus TNとして国際寄託されており〔昭和５９年（１９８４年）１２月２０日に原寄託より移管されており〕、その受託番号は、微工研条寄第６８５号（FERM BP-685）である。なお、原寄託は、上記通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号  微工研菌寄第7894号として、昭和５９年１０月１３日になされている。
また、後者のアクレモニウム・セルロリティカス株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、Acremonium cellulolyticusとして国際寄託されており〔平成９年（１９９７年）２月１９日に原寄託より移管されており〕、その受託番号は、FERM BP-5826である。なお、原寄託は、上記通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号  微工研菌寄第P-6867号として、昭和５８年１月１２日になされている。
これらの微生物によるキシラナーゼ系の製造については、例えば、特公平1-21957号公報、特公平1-171484号公報に記載された方法に従って行えば良い。
通常は、キシラン、キシログルカン、セルロース、アビセル、フスマ、稲ワラ、バガスなどの植物性バイオマスを炭素源として、これに硝酸塩、アンモニウム塩或いはペプトン、酵母エキスなどの有機又は無機の窒素源と、少量の金属塩とを加えた液体培地を使用する。培養は、２０℃〜４０℃にて２〜１５日間程度、好気的に行う。
上記微生物の培養終了後、培養物を遠心分離等により除去して得た上清液（粗酵素液）を限外濾過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とするか、或いは濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
本発明の中温性キシラナーゼＩ〜IIIは、これら濃縮酵素又は粉末酵素を精製することにより得ることができる。
精製方法としては、常法、即ち硫安などによる塩析法、アルコールなどによる有機溶媒沈澱法、膜分離法、イオン交換体、疎水クロマトグラフ用担体、ゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法などを、単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
本発明によって得られる、高純度に精製された中温性キシラナーゼの性質は、下記の通りである。この酵素は、今までの文献等には知られていない新規酵素である。
中温性キシラナーゼＩ
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.5であり（図１ａ）、ｐＨ3.5〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である（図２ａ）。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、55℃である（図３ａ）。
（e）温度安定性：55℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）（図４ａ）。
0004039494.tif 000005
中温性キシラナーゼII
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.8であり（図１ｂ）、ｐＨ3.0〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である（図２ｂ）。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、55℃である（図３ｂ）。
（e）温度安定性：55℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）（図４ｂ）。
0004039494.tif 000006
中温性キシラナーゼIII
（a）作用：キシランを非特異的に加水分解し、主としてキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどを生成する。
（b）基質特異性：本酵素はキシランに作用する。
（c）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは3.5であり（図１ｃ）、ｐＨ2.5〜9.5（25℃、２時間）の範囲で安定である（図２ｃ）。
（d）作用最適温度：可溶性キシランを基質とした糖化活性では、50℃である（図３ｃ）。
（e）温度安定性：50℃以下で安定である（ｐＨ3.5、10分）（図４ｃ）。
0004039494.tif 000007
ここで当該酵素の活性測定法と１単位の定義については以下の通りとした。
・不溶性キシラン糖化活性
ｐＨ3.5、30℃で２％キシラン（Oat Spelts、シグマ社X-0627）懸濁液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と定義した。
・可溶性キシラン糖化活性
ｐＨ3.5、30℃で0.25％可溶性キシラン（Oat Spelts、シグマ社X-0627）溶液（不溶性キシランの煮沸液から不溶物を除去）に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と定義した。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより制限されるものではない。
実施例１（酵素原末の調製）
アクレモニウム属微生物由来のキシラナーゼ製剤を得るため、下記の手法により微生物の培養を行った。
培地は、すべて以下の組成よりなる培地を常法により加熱殺菌したものを用いた。
〔培地組成〕
セルロース４％、リン酸水素二カリウム1.2％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム0.6％、尿素0.2％、塩化カリウム0.16％、硫酸マグネシウム七水塩0.12％、硫酸亜鉛七水塩0.001％、硫酸マンガン七水塩0.001％、硫酸銅五水塩0.001％（ｐＨ4.0）。
上記培地500ｍｌに、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）TN株（FERM BP-685）を接種し、30℃で48時間撹拌しながら培養した。次に、この培養液をシードとして、15Ｌにスケールアップし、更にスケールアップを続けて、最終的に600Ｌタンク中の培養液量を300Ｌとし、通気撹拌培養を７日間行った。
得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により15Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライにより粉末化した。この方法で得られたキシラナーゼ製剤は5.0ｋｇであった。
実施例２（中温性キシラナーゼの精製）
実施例１で得られた原末を酢酸緩衝液（0.02Ｍ、ｐＨ5.5）に溶解し、不溶物を高速冷却遠心分離により除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料（粗酵素）として、以下に示した方法で精製した。
１）強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー：QAE−トヨパール550C（東ソー（株））に、粗酵素を吸着させ、酢酸緩衝液（0.02Ｍ、ｐＨ5.5）中にＮａＣｌを各０、0.04、0.15、0.5Ｍ含有せしめ、ステップワイズ溶出を行い、０Ｍ  ＮａＣｌで溶出されるキシラナーゼ活性画分を分取した。
２）弱塩基性イオン交換クロマトグラフィー：DEAE−トヨパール650S（東ソー（株））に、上記１）の分取画分を0.02Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ6.0）にて吸着させ、酢酸緩衝液（0.02Ｍ、ｐＨ5.5）中にＮａＣｌを各０、0.2Ｍを含有せしめ、ステップワイズ溶出を行い、０Ｍ  ＮａＣｌで溶出されるキシラナーゼ活性画分を分取した。
３）強酸性イオン交換クロマトグラフィー：Mono S（ファルマシア社）に、上記２）の分取画分を酢酸緩衝液（0.1Ｍ、ｐＨ3.5）で吸着させ、酢酸緩衝液（0.1Ｍ、ｐＨ3.5）中にＮａＣｌを０Ｍから0.05Ｍを含むリニアグラジエント溶出を行い、キシラナーゼ活性を示した画分を分取した。キシラナーゼ活性だけを示す２画分（ＦＩ、ＦII）を回収した。
４）ゲル濾過クロマトグラフィー：Superdex 75（ファルマシア社）に、上記３）の分取画分ＦＩを、酢酸緩衝液（0.05Ｍ、ｐＨ3.5）＋0.1Ｍ  ＮａＣｌを用いて通過させ、キシラナーゼ活性画分を分取した。溶出されたキシラナーゼ画分が精製キシラナーゼＩ（中温性キシラナーゼＩ）である。
５）ゲル濾過クロマトグラフィー：Superdex 75（ファルマシア社）に、上記３）の分取画分ＦIIを酢酸緩衝液（0.05Ｍ、ｐＨ3.5）＋0.1Ｍ  ＮａＣｌを用いて通過させ、キシラナーゼ活性画分を分取した。
最初に溶出されたキシラナーゼ画分が精製キシラナーゼII（中温性キシラナーゼII）である。２番目に溶出されたキシラナーゼ画分が精製キシラナーゼIII（中温性キシラナーゼIII）である。
以上の方法により、Native-及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、それぞれ単一の蛋白質染色バンドを示すまで高度に精製した。
実施例３
実施例２で得られた精製キシラナーゼＩ、II、IIIの30℃における至適ｐＨを調べるため、可溶性キシランを基質として糖化活性を測定した。結果を図１（それぞれ順に図１ａ、ｂ、ｃ）に示す。
図１に示した通り、これら酵素（精製キシラナーゼＩ、II、III）は、McIlvaine緩衝液で、それぞれｐＨ3.5、3.8、3.5のときに最大活性を示した。
また、これら酵素（精製キシラナーゼＩ、II、III）の25℃、２時間の処理条件におけるｐＨ安定性を図２（それぞれ順に図２ａ、ｂ、ｃ）に示す。
図２に示した通り、これら酵素（精製キシラナーゼＩ、II、III）は、それぞれｐＨ3.5〜9.5、3.0〜9.5、2.5〜9.5で安定であった。
実施例４
実施例２で得られた精製キシラナーゼＩ、II、IIIのそれぞれの作用最適温度を調べるため、可溶性キシランを基質とした糖化活性を測定した。結果を図３（それぞれ順に図３ａ、ｂ、ｃ）に示す。
図３より、各キシラナーゼ（精製キシラナーゼＩ、II、III）の作用最適温度は、それぞれ、55℃、55℃、50℃（いずれもｐＨ3.5）であった。
次に、本酵素の温度安定性をｐＨ3.5、10分間の処理条件で測定した。結果を図４（それぞれ順に図４ａ、ｂ、ｃ）に示す。
図４に示した通り、各キシラナーゼ（精製キシラナーゼＩ、II、III）は、それぞれ、55℃以下、55℃以下、50℃以下、で安定であった。
実施例５
実施例２で得られた精製キシラナーゼＩ、II、IIIのそれぞれの分子量を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。すなわち、12.5％ゲルを用いて20ｍＡの定電流で室温にて80分間通電した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を図５に示す。
図５より、これら酵素（精製キシラナーゼＩ、II、III）の分子量は、それぞれ約30,000、約25,500、約33,500と算出された。
なお、本実験に用いた標準サンプル（図５中、▲１▼〜▲６▼で示されている）の分子量は、以下の通りである。
▲１▼  ホスホリラーゼｂ（Phosphorylase b）          :97,400
▲２▼  血清アルブミン（Serum albumin）              :66,200
▲３▼  卵白アルブミン（Ovalbumin）                  :45,000
▲４▼  炭酸脱水酵素（Carbonic anhydrase）           :31,000
▲５▼  トリプシン・インヒビター（Trypsin inhibitor）:21,500
▲６▼  リゾチーム（Lysozyme）                       :14,400
本発明の酵素中温性キシラナーゼは、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス由来のキシラナーゼ系の主成分であり、その性質が初めて明らかになった。
本酵素（中温性キシラナーゼＩ、II、III）は、作用最適温度がそれぞれ、55℃、55℃、50℃（ｐＨ3.5）とほぼ中温を示し、また、中性ないし酸性領域で活性を有している。
産業上の利用可能性
本発明の酵素中温性キシラナーゼは、食品加工、飼料、サイレージなどの用途に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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