(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの５'−及び３'−両末端に逆向きチミジン誘導体を結合させて得られる、安定なアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンチセンスヌクレオチドの作成に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンチセンスオリゴＤＮＡは特定のタンパク質の発現を抑える技術として高く評価されてきた。最も良く利用されるのはホスホロチオエイト骨格（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７７０６−７７１０，１９８７；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：７７９０−７７９４，１９８９）のものである。  しかし、ホスホロチオエイト骨格のオリゴヌクレオチドは細胞毒性が強いので、近年、いくつかの他のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作成が行われた。例えばＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，７３−７８，１９９７），Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：２７９６−２８２３，１９９８），Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（Ｓｙｎｅｌｅｔｔ，１３７−１４０，１９９４），Ｉｄｚｉａｋ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｐｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３４，５４１７−５４２０，１９９３）。  しかし、毒性のなさ、ヌクレアーゼ抵抗性、合成の容易さを全て満たすのは困難な課題であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、毒性が低く、ヌクレアーゼ抵抗性が高く、合成が容易なアンチセンスオリゴＤＮＡを合成することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
逆向きチミジン（Ｔ）修飾されたヌクレオチドを３’末端に持つＤＮＡ酵素は安定性が高い（Ｓｉｏｕｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６，９３７−９４７，２０００；Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５，１２６４−１２６９，１９９９）との知見はあるが、アンチセンス法に於いては応用されていなかった。そこで検討を重ね、３’末端、５’末端のいずれも逆向きＴで修飾された５’−、３’−逆向きＴと称するオリゴＤＮＡを合成し、その活性を調べた。
【０００５】
すなわち、本発明は、（１）合成が容易で、毒性が少なく、ヌクレアーゼ抵抗性が高いアンチセンスオリゴＤＮＡの合成からなる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図１は５’−、３’−逆向きＴ修飾オリゴＤＮＡの構造を、図２はその効果を増殖因子ミッドカインの発現抑制で調べたもの、図３はヌクレアーゼに対する安定性、図４は細胞毒性を調べたものである。
【０００７】
１．５’−、３’−逆向きＴオリゴＤＮＡの効果を判定した増殖因子ミッドカインについて説明する。  アンチセンスオリゴＤＮＡは特定のタンパク質の発現を抑える技術として高く評価されてきた。最も良く利用されるのはホスホロチオエイト骨格（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７７０６−７７１０，１９８７；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，：  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：７７９０−７７９４，１９８９）のものである。  しかし、ホスホロチオエイト骨格のオリゴヌクレオチドは細胞毒性が強いので、近年、いくつかの他のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作成が行われた。例えばＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，７３−７８，１９９７），Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：２７９６−２８２３，１９９８），Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（Ｓｙｎｅｌｅｔｔ，１３７−１４０，１９９４），Ｉｄｚｉａｋ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｐｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３４，５４１７−５４２０，１９９３）。しかし、毒性のなさ、ヌクレアーゼ抵抗性、合成の容易さを全て満たすのは困難な課題であった。  マウスＭＫのｍＲＮＡ（Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）あるいはヒトＭＫのｍＲＮＡ（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７６：７９２−７９７，１９９１）は既に報告されている。  このヌクレオチド１５−３２を基にＭＫの発現を抑えるアンチセンスヌクレオチドが設計されている（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：８４８６−８４９１，２００１）。
【０００８】
２．アンチセンスオリゴヌクレオチド配列によるＭＫの合成抑制の効果判定について説明する。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を持つ物質を、ＭＫを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるＭＫを免疫生化学的に定量する。ＭＫの免疫生化学的定量法としては酵素免疫法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９：１１７１−１１７５，１９９６）あるいはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティング（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５９；３９２−４０２，１９９３）そしてデンシトメーターによる定量が考えられる。
【０００９】
３．アンチセンスオリゴＤＮＡの細胞毒性の判定について説明する。細胞にアンチセンスオリゴＤＮＡを加え、細胞増殖測定キット（同仁化学）によって吸光度を測定することによる。
【００１０】
４．アンチセンスオリゴＤＮＡの安定性の判定について説明する。アンチセンスオリゴＤＮＡを血清と共に保温（３７℃）し、ポリアクリルアミド尿素変性ゲル電気泳動によってオリゴＤＮＡのサイズを調べることによる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１１】
（実施例１）アンチセンスオリゴＤＮＡの作成を行った。５’−、３’−逆向きアンチセンスＤＮＡ（配列番号１）、同リバースＤＮＡ（配列番号２）、同センスＤＮＡ（配列番号３）を設計した。
【００１２】
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【００１３】
ＤＮＡシンセサイザー、Ｅｘｐｄｉｔｅ８９００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により５’−、３’−逆向きオリゴＤＮＡ、アンチセンスＳオリゴＤＮＡを合成し、Ｗａｋｏｐａｋ  Ｈａｎｄｙ  ＯＤＳカラム（Ｗａｔｅｒｓ）にてＨｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ液体クロマト（ＨＰＬＣ）精製を行い、検討に用いた。コントロール配列として、アンチセンス部位に対応したセンスとリバースＤＮＡを同様に合成・精製して使用した。
【００１４】
（実施例２）５’−、３’−逆向きＴアンチセンスＤＮＡによるＭＫ産生の抑制を検討した。ＭＫを分泌しているマウス直腸癌細胞（ＣＭＴ−９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＣＬ−２２３）を３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）に３×１０５個／ディッシュ［ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％／ダルベッコ修飾最小必要培地（ＤＭＥＭ）］の細胞密度で正確にまき、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１晩前培養した。翌日、３７℃に加温したＩＴＳ−ヘパリン／ＤＭＥＭ（インスリン１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン５．５μｇ／ｍｌ、亜セレン酸６．７ｎｇ／ｍｌおよびヘパリン２０μｇ／ｍｌをそれぞれ最終濃度で含むＤＭＥＭ）にて洗浄し、同培地を１ｍｌを加え２時間培養した。あらかじめ、１ｍＭに濃度調整した５’−、３’−逆向きＴアンチセンスＤＮＡまたはコントロールＤＮＡを３０μｌとり、ＤＭＥＭ６３０μｌと混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｐｌｕｓ  ｋｉｔのｐｌｕｓ試薬を６０μｌ加え、室温で１５分反応させた。さらに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬２４μｌを加え、室温で１５分反応させ、アンチセンスＤＮＡ・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで５枚（５重アッセイ用）に投与可能な量である。続いてＣＭＴ−９３細胞に新鮮なＤＭＥＭ０．８ｍｌを満たし、前述のアンチセンスＤＮＡ・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、３時間トランスフェクションを行った。このとき、アンチセンスＤＮＡの投与濃度は５μＭとなる。１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ１ｍｌを加え、７時間、培養した。細胞をＤＭＥＭで洗浄し、ＩＴＳ−ヘパリン／ＤＭＥＭ１ｍｌを加え、さらに１６時間培養を続け、上清を回収した。回収した培養上清についてＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５％ゲル）の後、抗ＭＫ抗体を用いたウエスタンブロットを村松らの方法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）によって行った。その結果を図（図２Ａ）に示す。レーン１のアンチセンスＤＮＡ投与においてのみ、ＭＫに特異的なバンドの減弱を観察した。コントロール配列のリバースＤＮＡとセンスＤＮＡを投与しても、同細胞のＭＫ産生は抑制されなかった。これは、アンチセンスＤＮＡ投与により、ＣＭＴ−９３細胞のＭＫの産生・分泌量が減少したことを示している。また、各バンドの濃度をデンシトメータで測定したところ、アンチセンスＤＮＡ投与細胞のＭＫ産生量はセンスＤＮＡ投与細胞の９％にまで減少したことが分かった（図２Ｂ）。
【００１５】
（実施例３）アンチセンスＤＮＡを非熱処理５％ウシ血清と３７℃で所定の時間保ち、そのオリゴＤＮＡの大きさを７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電
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キュラー・プローブ社）で染色した。５’−、３’−逆向きＴオリゴＤＮＡは５’末端側の１個のヌクレオチドがはずれるだけで安定であり（Ａ）、３’−逆向きオリゴＤＮＡも安定であった。（Ｂ）。Ｓ−オリゴＤＮＡ（Ｃ）、非修飾オリゴＤＮＡ（Ｄ）はいずれも不安定であった。
【００１６】
（実施例４）アンチセンスオリゴＤＮＡのＣＭＴ−９３細胞への毒性を調べた。ＣＭＴ−９３細胞を２×１０５個ずつ２４穴プレートにまき、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで２４時間培養した。ここに０、５０、１００、２００μＭの５’−、３’−逆向きＴセンスＤＮＡ、Ｓ−オリゴセンスＤＮＡを加え、４８時間後残存する細胞数を細胞カウントキット（同仁化学）で測定した。高濃度のＳ−オリゴセンスＤＮＡは毒性を示した（Ｂ）が、高濃度の５’−、３’−逆向きＴセンスＤＮＡは毒性を示さなかった（Ａ）。
【００１７】
【発明の効果】
以上図示し説明したように本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド作成法により、安定性が高く、活性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成することができる。
【００１８】
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【００２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の５’−、３’−逆向きオリゴＤＮＡ構造式を示す。
【図２】この発明の一実施例に関わる、アンチセンスＤＮＡなどを投与したＣＭＴ−９３細胞のＭＫ産生抑制を示す。Ａはウエスタンブロットの図であり、ＢはＡで検出したＭＫに特異的なバンドの濃さをデンシトメータ解析によって数値化したグラフである。
【図３】この発明の一実施例に関わるアンチセンスＤＮＡの血清中における安定性を示したポリアクリルアミド電気泳動の写真である。
【図４】この発明の一実施例に関わる、ＣＭＴ−９３細胞への毒性を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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