(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示す配列からなる、プロサポジン由来のペプチド。
【請求項２】
医薬の製造に使用するための、請求項１記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項３】
医薬が医薬組成物である、請求項２記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項４】
神経障害痛を軽減する活性を有する、請求項２または３記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項５】
神経障害痛が末梢神経疾患を原因とするものである、請求項４記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項６】
末梢神経疾患が、神経腫；神経圧迫；神経挫滅、神経伸張および不完全神経離断；単発神経障害および多発神経障害からなる群より選択される、請求項５記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項７】
単発神経障害または多発神経障害が糖尿病を原因とするものである、請求項６記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項８】
神経突起の成長を刺激する、神経細胞死を抑制する、有髄化を促進するまたは脱髄を抑制する活性を有する、請求項２または３記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項９】
知覚または運動神経障害を抑制する活性を有する、請求項２または３記載のプロサポジン由来のペプチド。
【請求項１０】
製薬上許容される担体中に、請求項１記載のプロサポジン由来のペプチドを含有する組成物。
【請求項１１】
制御放出製剤の請求項10の組成物。
【請求項１２】
リポソーム形態の請求項10の組成物。
【請求項１３】
凍結乾燥形態の請求項10の組成物。
【請求項１４】
単位用量形態の請求項10の組成物。
【請求項１５】
静脈内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、脳脊髄内、局所、経口、経皮、経粘膜および経鼻からなる群より選択される経路により投与するために製剤化された、請求項10〜14のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
神経障害痛を治療するための医薬の製造における、配列番号２に示す配列からなるプロサポジン由来のペプチドの使用。
【請求項１７】
医薬が医薬組成物である、請求項16記載の使用。
【請求項１８】
神経障害痛が末梢神経疾患を原因とするものである、請求項16記載の使用。
【請求項１９】
末梢神経疾患が、神経腫；神経圧迫；神経挫滅、神経伸張および不完全神経離断；単発神経障害および多発神経障害からなる群より選択される、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
単発神経障害または多発神経障害が糖尿病を原因とするものである、請求項19記載の使用。
【請求項２１】
神経突起の成長を刺激する、神経細胞死を抑制する、有髄化を促進するまたは脱髄を抑制するための医薬の製造における、配列番号２に示す配列からなるプロサポジン由来のペプチドの使用。
【請求項２２】
医薬が医薬組成物である、請求項21記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的には疼痛治療法の分野に関し、より具体的には、神経障害痛の治療のためのプロサポジン由来のペプチドの使用に関する。
背景の情報
神経障害痛は神経の損傷の結果として生じる。組織の損傷に起因する即時の痛みとは対照的に、神経障害痛は外傷性損傷の数日後または数か月後に発症することがある。さらに、組織の損傷に起因する痛みは通常組織の修復の間に限定されるのに対し、神経障害痛は長期間続いたり、または慢性化することが多い。その上、神経障害痛は自発的にまたは正常ならば痛くない刺激の結果として発生することもある。
神経障害痛の臨床原因は広範にわたり、外傷および疾病の両方が含まれる。例えば、外傷性神経圧迫（nerve compression）または挫滅（crush）および脳または脊髄の外傷性損傷が神経障害痛の一般的原因である。さらに、最も強い外傷性神経損傷は神経腫の形成の原因ともなり、この場合、痛みは異所神経再生の結果発生する。その他、ガン関連神経障害痛は腫瘍の増殖によって隣接する神経、脳または脊髄が圧迫されて痛みをともなうことに起因する。神経障害痛はまた、糖尿病またはアルコール症などの疾病にも関係がある。
残念ながら、神経障害痛は利用可能な薬剤療法に抵抗性であることが多い。その上、現行の治療法は、例えば、認識の変化、鎮静、悪心、そして麻薬の場合では嗜癖といった、深刻な副作用を有する。神経障害痛に苦しむ多くの被検者は、老年者であるか、またはそれとは別の医学症状があり、利用可能な薬剤療法に関係する副作用に対する許容度に特に限界がある。許容できない副作用の生成をともなわない神経障害痛の緩和の点における現行の治療法の不十分性は、慢性の痛みに苦しむ被検者のうつ的または自殺性向として表れることも多い。
神経障害痛の軽減方法は外傷または疾病による痛みに苦しむ多くの人々のQOL（Quality of Life）を改善することになる。しかし、現状では、鎮静および嗜癖などの望ましくない副作用をともなわないで神経障害痛を緩和する有効な薬剤はない。したがって、望ましくない副作用を生じることなく神経障害痛を軽減する方法が必要とされている。本発明はこの必要性を満足し、そして同時にこれに関連する利点も提供する。
発明の要約
本発明は、被検者に有効量のプロサポジンの活性断片を投与することにより、被検者の神経障害痛を軽減する方法を提供する。例えば、本発明は、アミノ酸配列、Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu（配列番号１）またはThr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr（配列番号２）を有するプロサポジンの活性断片の有効量を投与することにより、被検者における末梢神経、脊髄後根神経節、脊髄、脳幹、視床または皮質の疾患が原因となる神経障害痛を軽減する方法を提供する。さらに、本発明は被検者に有効量のプロサポジンの活性断片を投与することにより、被検者の神経障害痛を予防する方法を提供する。本発明はまた、プロサポジン由来のペプチドを提供し、神経突起の成長を刺激する、神経細胞死を抑制する、有髄化を促進するおよび神経脱髄を抑制するためのこれらのペプチドの使用を提供する。さらに、抑制有効量のプロサポジンの活性断片を含む組成物とニューロン細胞とを接触させることにより、知覚または運動神経障害を抑制する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、Chungモデルラットにおける、プロサポジン由来の22量体のペプチド（配列番号１）のボーラス（bolus）注射前（０時）およびその後各時間の触覚異痛（allodynia）の閾値を示す。
図２は、Chungモデルラットにおける、プロサポジン由来の14量体のペプチド（配列番号２）のボーラス注射前（０時）およびその後各時間の触覚異痛（allodynia）の閾値を示す。
図３は、糖尿病ラットにおける、プロサポジン由来の14量体のペプチド（配列番号２）または生理食塩水の腹腔内投与後の、0.5％ホルマリンに応答した後退り（flinch）の合計を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、被検者に有効量のプロサポジンの活性断片を投与することにより、被検者の神経障害痛を軽減する方法を提供する。ここで開示されるように、本発明の方法は被検者の神経障害痛を投与後30分以内に軽減することができる。これらの方法は、末梢神経、脊髄後根神経節、脊髄、脳幹、視床または皮質の疾患が原因となる神経障害痛を軽減するのに有用である。
本発明において有用なペプチドの１つは、当初４つのスフィンゴリピド活性化蛋白質の前駆体として同定された517アミノ酸タンパク質である、プロサポジンから誘導される（Kishimotoら、J.Lipid Res.,33:1255-1267（1992））。プロサポジン中の縦列に隣接した４つのドメインはリソソーム中でタンパク質分解プロセシングされ、サポジンＡ、Ｂ、ＣおよびＤを生成し、これらはリソソーム加水分解酵素によるグリコスフィンゴリピドの加水分解を活性化する（O’Brien and Kishimoto,FASEB J.,5:301-308（1991））。
プロセシングされていない形態のプロサポジンはヒトおよびラットの脳内に高濃度で見られ、これらはニューロン細胞の表面膜内に局在している。胚の発生中、プロサポジンｍＲＮＡは脳および脊髄後根神経節に豊富にある。さらに、プロサポジンはガングリオシドに高親和性で結合し、これが神経突起の成長を刺激し、またガングリオシドのミセルから膜への移行を促進する。
プロサポジンの神経栄養性活性はニューロン細胞集団中の局在性と一致している（O’Brienら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 91:9593-9596（1994）；Sanoら、Biochem.Biophys Res.Commun.,204:994-1000（1994））。プロサポジンはin vitroおよびin vivoで運動神経突起の成長を刺激し、またニューロン分化のマーカーの１つであるコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を増大させる。その上、プロサポジンは神経芽腫細胞における細胞死を抑制する（O’Brienら、上出、1994；O’Brienら、FASEB J.9:681-685（1995））。
プロサポジンの神経栄養性活性は80アミノ酸ドメインのサポシンＣに局在している。サポシンＣドメインの第８番から第29番までのアミノ酸に相当する22量体のペプチド（配列番号１）は神経突起の成長およびコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を刺激し、神経芽腫細胞における細胞死を抑制する（O’Brienら、上出、1995））。
プロサポジンまたはプロサポジン由来の22量体のペプチド（配列番号１）は、例えば、神経突起の成長を促進することによって、運動ニューロンの機能をモジュレートすることができる。しかし、本発明以前には、プロサポジンまたはプロサポジンのペプチド断片が知覚ニューロン機能に影響を与えることができるかどうかは知られていなかった。さらに、運動神経突起の成長を刺激する際の、プロサポジンまたはプロサポジン由来のペプチドの神経栄養性活性は24から48時間後になってようやく明らかになる（例えば、O’Brienら、上出、1994、参照）。プロサポジンまたはプロサポジン由来のペプチドの神経栄養性活性がもっと短期間に発生することは証明されていなかった。
対照的に、本発明は、知覚および運動ニューロン成分の両者が関与する、神経障害痛の軽減方法を提供する。さらに、本発明の方法は、プロサポジンまたはプロサポジン由来のペプチドの神経栄養性活性のために必要とされることが以前証明された、時間または日数ではなく、分単位での神経障害痛の軽減に有効である。
神経障害痛の軽減における本発明の方法の有効性は、よく知られている末梢神経障害のChungラットモデルを使用して証明された。Chungラットモデルにおいて、左脊髄神経L-5およびL-6の脊髄神経部分結紮は、患部の左足部上の軽い圧力に対する長期間の過敏症をもたらす。この過敏症は、Kim and Chung,Pain 50:355-363（1992）に記載されているように、カウザルギー（causalgia）の神経障害症状を有するヒトが経験する痛みと同様のものである。
プロサポジンの活性断片を投与する前は、Chungモデルラットは、影響を受けた足が圧力に応答して引き下げられるまでの閾値が3.0から4.0gだった（Von  Frey hairs）（図１参照）。プロサポジンの活性断片（プロサポジン由来の22量体；配列番号１）の投与後は、患部の足が引き下げられるまでの圧力に対するより大きな許容性によって証明されるように、神経障害痛は軽減された。図１に示されるように、プロサポジンの活性断片の効力は投与後15分以内に発生し、３時間持続した。この迅速な神経障害痛の緩和は、プロサポジンおよびプロサポジンに由来するペプチドに関する既に報告された遅延型の神経栄養性効力と厳然とした対照をなしている。
プロサポジン由来のペプチド（配列番号２）などのプロサポジンの活性断片は、痛みの強い糖尿病性神経障害のラットモデルにおいても痛みを軽減した。実施例IIIに記載するように、ペプチド（配列番号２）は、選択的β細胞毒素、ストレプトゾトシン（streptozotocin）によって誘発された短期間のインスリン欠乏性糖尿病のラットにおいて、異痛を減少させた。このように、本発明のプロサポジンの活性断片またはプロサポジン由来のペプチドは、Chungラットモデルによって例証されたような機械的な痛み、および糖尿病ラットにおける痛みの減少のためのこれらのペプチドの使用によって例証されたような代謝性の痛みを含む、各種の型の神経障害痛を軽減するために使用することができる。
ここで使用する用語「神経障害痛」は神経の損傷の結果として生じる痛みを意味する。神経障害痛は、皮膚の小神経または筋若しくは結合組織中の小神経が関与する急性の組織損傷に起因する痛みである、侵害受容性痛とは区別される。侵害受容機構が関与する痛みは通常組織修復の期間に限定され、一般的には、Myers,Regional Anesthesia 20:173-184（1995）に記載されているように、有効な鎮痛薬またはオピオイドによって軽減される。
神経障害痛は典型的には長期間持続するかまたは慢性であり、最初の急性組織損傷の数日または数か月後に発症することも多い。神経障害痛は、正常では痛みのない刺激に対する痛みをともなう応答である異痛とともに、持続性で、自発性の痛みが関与することがある。神経障害痛はまた、ピンプリック（pin prick）などの通常ならば軽微な痛みの刺激に対する過剰応答である、痛覚過敏にも特徴がある。侵害受容性痛とは異なって、神経障害痛は一般的にオピオイド療法に抵抗性である（Myers、上出、1995）。
本発明の方法は、末梢神経、脊髄後根神経節、脊髄、脳幹、視床または皮質の疾患が原因となる神経障害痛を軽減するのに有用である。ここで使用する用語「疾患」は神経障害痛をもたらすいかなる外傷、損傷、疾病または症状をも意味する。
本発明の方法は、発症要因にかかわらず、神経障害痛を軽減するのに有用である。例えば、本発明の方法を、神経腫；神経圧迫；神経挫滅、神経伸張または不完全神経離断；単発神経障害または多発神経障害などの末梢神経疾患が原因となる神経障害痛を軽減するのに使用することができる。また、本発明の方法を、脊髄後根神経節圧迫；脊髄の炎症；脊髄の挫傷、腫瘍若しくは片側切断；脳幹、視床または皮質の腫瘍；または脳幹、視床または皮質への外傷、などの疾患が原因となる神経障害痛を軽減するのに使用することもできる（例えば、表１参照）
本発明の方法は、例えば、神経の外傷性損傷の直後、特に神経全体がひどく挫滅または離断された場合に、発症し得る神経腫が原因となる神経障害痛を軽減するのに有用となり得る。神経腫においては、正常ならば末梢神経を再生する神経突起の成長が、例えば瘢痕組織などの物理的閉塞によって異所性または誤誘導される。こうして、再生中の神経繊維がある状況下でからみあい、この中で機械的および物理的因子が異常な電気生理学的活性および痛みをもたらす（Myers,上出、1995）。例えば、切断神経腫は、幻想痛を引き起こしたり、または四肢プロテーゼの使用をきっかけとする痛みを引き起こすことがある。ここで開示されるように、こうした神経障害痛を、本発明の方法にしたがったプロサポジンの活性断片の投与によって軽減することができる。
0004138006.tif 000002
神経圧迫の結果としての神経障害痛もあり、これも本発明の方法を使用して治療することができる。神経圧迫は外傷性神経挫滅の場合と同様に急激であるか、または主神経束に近接した腫瘍の増殖または瘢痕の形成にしたがって長期化したり緩和したりする場合がある。圧迫神経障害は神経への血流が変化した結果として生じ、強い虚血を引き起こし、その後、神経損傷を生じさせることもある（Myers,上出、1995）。
本発明の方法にしたがったプロサポジンの活性断片の投与は、単発神経障害または多発神経障害に起因する神経障害痛を軽減することもできる。ここで使用する神経障害とは末梢神経系における機能的障害または病的変化であり、臨床上は、知覚または運動ニューロンの異常として特徴づけられる。単発神経障害という用語は、１つの末梢神経が影響を受けることを意味し、他方、多発神経障害という用語は、いくつかの末梢神経が影響を受けることを意味する。
神経障害の発症原因は既知のものと未知のものがある（例えば、Myers,上出、1995；Galer,Neurology 45（suppl 9）:S17-S25（1995）；Stevens and Lowe,Pathology,Times Mirror International Publishers Limited,London（1995）参照）。既知の発症原因として、ある疾病または中毒症状の合併症が含まれる；例えば、糖尿病は神経障害の原因となる最も一般的な代謝疾患である。本発明の方法は、例えば、糖尿病、照射、虚血または脈管炎が原因となる単発神経障害の神経障害痛を軽減する。本発明の方法は、例えば、ポリオ後症候群、糖尿病、アルコール、アミロイド、毒物、ＨＩＶ、甲状腺機能低下症、尿毒症、ビタミン欠乏症、化学療法、ｄｄＣまたはファブリー病が原因となる多発神経障害の神経障害痛もまた軽減する（表１参照）。本発明の方法はポリオ後筋肉痛を軽減するのに特に有用である。本発明の方法は発症原因が未知の神経障害痛を軽減することもできる。
ここに開示するように、プロサポジンの活性断片もまた、神経障害痛の軽減、あるいは神経突起の成長の刺激、神経細胞死の抑制、有髄化の促進若しくは脱髄の抑制、または知覚神経障害の抑制において有用である。ここで使用する用語「プロサポジンの活性断片」とは、プロサポジンのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有し、かつ神経障害痛の軽減、あるいは神経突起の成長の刺激、神経細胞死の抑制、有髄化の促進若しくは脱髄の抑制、または知覚若しくは運動神経障害の抑制活性を有するペプチドを意味する。
ここで使用する、神経障害痛の軽減とは、神経障害痛の程度（severity）を減じることを意味する。ヒト被検者において、プロサポジンの活性断片が神経障害痛の程度を減少させることによって、被検者の苦しみを軽減させ、QOL（quality of life）を改善する。以下にさらに記載するように、プロサポジンの活性断片は、十分確立された神経障害痛の多数の動物モデルのいずれにおいても、神経障害痛を軽減することができる（Bennett,Muscle & Nerve 16:1040-1048（1993）も参照されたい）。ここで使用する用語「プロサポジンの活性断片」は「プロサポジン由来のペプチド」と同義である。
プロサポジンの活性断片は、好ましくはサポジンＣの第18番から第29番までのアミノ酸に相当するアミノ酸配列、Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu（配列番号３）を含有する。より好ましくは、プロサポジンの活性断片は、サポジンＣの第８番から第29番までのアミノ酸に相当するアミノ酸配列、Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu（配列番号１）、またはサポジンＣの第16から第29番までのアミノ酸に相当するが、第２番がリジンからD-アラニンへの置換、第８番がリジンからアラニンへの置換、第11番のリジンの欠失、およびC-末端へのチロシン残基の付加という改変を受けたアミノ酸配列、Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr（配列番号２）である（表２参照）。こうした改変は、以下に記載するように、ペプチドの安定性または血液脳関門を通過する取り込みを増大させるのに有用である。ここで使用する場合、D-アラニンをD-AlaまたはXで表示することがある。
プロサポジンの活性断片は約12アミノ酸からサポジンＣの全長である約80アミノ酸までとすることができる。好ましくは、プロサポジンの活性断片は約12アミノ酸から約40アミノ酸まで、より好ましくは約14アミノ酸から約22アミノ酸までである。
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ヒト被検者の神経障害痛を軽減するのに使用するためには、配列番号１または配列番号２などのヒトプロサポジンの活性断片が好ましい。しかし、別の哺乳類のプロサポジンから誘導された活性断片もまた、本発明の方法にしたがって神経障害痛を軽減するのに有用である。したがって、例えば、配列番号４から７などのマウスプロサポジン、ラットプロサポジン、モルモットプロサポジンまたはウシプロサポジンの活性断片もまた、被検者の神経障害痛を軽減するのに有用となり得る。
サポジンＣの第８番から第29番までのアミノ酸に相当する、ヒトプロサポジンの活性断片（配列番号１）のアミノ酸配列は、表３に示すように、他の種間でかなり保存されている。特に、隣接するアスパラギン（N）残基はヒト、マウス、ラット、モルモットおよびウシプロサポジン間で保存されている。その上、この２つのアスパラギン残基からN-末端方向に３から４残基目にロイシン（L）残基が保存され、また２つのアスパラギン残基からC-末端方向に２から８残基目に１以上の荷電残基（アスパラギン酸（D）、リジン（K）、グルタミン酸（E）またはアルギニン（R））が保存されている。表３中、これらのよく保存されている残基に下線をつけている。
0004138006.tif 000004
前記した十分に保存された隣接するアスパラギン残基、ロイシン残基および荷電残基は、神経障害性疼痛の軽減若しくは神経突起成長の刺激、神経細胞の壊死の抑制、有髄化の促進若しくは脱髄化の抑制、または運動性神経障害の抑制の際、プロサポシンの活性断片の活性にとって重要であり得る。例えば、実施例Ｉに記載したように、末梢神経障害性のChungラットモデルで見られる苦しい異痛を軽減するプロサポシン由来２２量体（配列番号１）またはプロサポシン由来１４量体（配列番号２）がプロサポシンの活性断片である（図１および２参照）。対照的に、第一の保存されたアスパラギンの代わりにアスパラギン酸残基（Ｄ）を有することで配列番号１とは区別される変異型２２量体（配列番号８）（表４参照）は、Chungラットを用いてアッセイされたように、神経障害性疼痛の軽減における活性を欠く（実施例Ｉ参照）。
また、神経障害性疼痛の軽減におけるペプチドの活性もまた、神経栄養的活性と相関し得る。例えば、プロサポシン由来２２量体（配列番号１）およびプロサポシン由来１４量体（配列番号２）は神経障害性疼痛を軽減し、神経栄養的活性を有する。
0004138006.tif 000005
さらに、変異型２２量体（配列番号８）は前記したように、神経障害性疼痛の軽減において不活性であり、神経栄養的活性を欠き、さらにこのことは神経障害性疼痛の軽減における活性が神経栄養的活性と相関することを示すものである。第二の保存されたアスパラギン残基が置換された変異型１４量体ペプチドＭ−１（配列番号９）は神経栄養的活性を欠き、このことは配列番号９のペプチドもまた神経障害性疼痛の軽減において不活性であることを示している。保存されたロイシン残基が置換された変異型１４量体ペプチドＭ−２（配列番号１０）は神経栄養的活性を欠き、このことは配列番号１０のペプチドが神経障害性疼痛の軽減において不活性であることを示している。対照的に、前記した隣接するアスパラギン、ロイシンおよび荷電残基が保存されたプロサポシン由来１２量体ペプチド（配列番号３）は神経栄養性因子としての活性を有する。従って、プロサポシン由来１２量体ペプチド（配列番号３）も、本発明の方法によって神経障害性疼痛を軽減することができる。
プロサポシン由来ペプチドおよびその神経栄養的類似体は、抹消神経系または中枢神経系に対して、毒性の、外傷性の、虚血性の、変性の、又は遺伝性の損傷の後の機能的回復の促進において重要な医薬用途を有する。加えて、これらのペプチドは有髄化の促進または脱髄化の抑制を行い、それによって脱髄化疾病の影響を打ち消すことができる。さらに、このようなペプチドはニューロンの成長を促進し、ニューロン組織中でプログラムされた細胞の壊死を抑制する。本発明の活性な神経栄養性およびミエリン栄養性ペプチドは、約１２または１４〜約５０個の間のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号２で示される非自然発生のプロサポシン配列を含む。例えば、本発明の活性な神経栄養性およびミエリン栄養性ペプチドは、１４〜約５０個の間のアミノ酸を有し、配列番号２で示される非自然発生のプロサポシン配列を含む。
本発明のもう１つの実施態様では、ニューロン細胞に有効量の神経突起派生物すなわち約１２〜約５０個のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号２に示されるペプチドを含むミエリン促進ペプチドを投与することによって、分化したまたは未分化のニューロン細胞において神経突起の成長を刺激する、神経細胞の壊死を抑制する、または有髄化を促進する方法を提供する。神経突起の成長を刺激し、神経細胞の壊死を抑制し、有髄化を促進する、または脱髄化を抑制するための本発明の方法では、例えば１４〜約５０個のアミノ酸を有し、配列番号２で示されるペプチドを含むペプチドの有効量を使用することができる。
このようないずれのペプチドの、神経突起成長の刺激、神経細胞の壊死の抑制、有髄化の促進または脱髄化の抑制の能力も、実施例ＩＶ〜ＶＩＩに記載した手順を用いて当業者により容易に測定できる。これらのペプチドの有髄化の促進及び脱髄化の抑制の能力をアッセイする方法は、以下の実施例ＶＩおよびＶＩＩに示す。
また、本発明は、ニューロン細胞と、有効抑制量のプロサポシン活性断片を含む組成物とを接触させることにより、知覚神経障害を抑制する方法を提供する。本発明は、例えば、ニューロン細胞と、配列番号１または配列番号２に示される配列を有するペプチドの有効抑制量を含む組成物とを接触させることにより、知覚神経障害を抑制する方法を提供する。
本明細書の実施例Ｘに記載したように、プロサポシン由来ペプチドは知覚神経障害の抑制において有用であり得る。タキソール投与によって知覚神経障害を誘発したマウスモデルでは、通常、温度知覚の欠損が見られる。しかしながら、１００μg/kgの配列番号１のペプチドを与えたタキソール処理マウスでは、温度知覚の欠損が抑制された。これらの結果により、プロサポシン由来ペプチドが知覚および運動性ニューロン双方に対する神経栄養性因子であり得ることが示唆される。
また、本発明の方法において有用なペプチドは、例えば、配列番号１１〜１９（表５参照）であってよい。例えば、サイトカイン類および増殖因子を伴うプロサポシン由来２２量体ペプチド配列番号１の配列は、hCNTF、hIL-6、hIL-2、hIL-3、hIL1-γ、エリスロポイエチン（hEPO）、ヒト白血球阻害因子（hLIF）、hIL-1β鎖およびオンコスタチン−Ｍ（hONC-M）を始めとする多くのヒト（h）サイトカイン類と同様の配列を示す。配列番号１１〜１９は、プロサポシン配列番号１の活性断片同様、２つのアスパラギン残基を含み、これらは隣接しているか、または１アミノ酸離れている。さらに、プロサポシン（２２量体；配列番号１）の活性断片に見られるのと同様に、該サイトカイン由来ペプチド配列は、２つのアスパラギン残基からＮ末端に向かって３〜４残基目にロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）残基を含有し、２つのアスパラギン残基からＣ末端に向かって２〜８残基目に１以上の荷電残基（アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアルギニン（Ｒ））を含んでよい。これらの残基の各々は、表５において下線で示されている。
サイトカイン受容体結合モデル（SprangおよびBazan, Curr. Opin. Struct.Biol., 3:816（1993））は、多くのサイトカインに共通する４重ヘリックス束構造の進化的保存を強調してきた。プロサポシン由来配列（配列番号１）に関連するサイトカインまたは増殖因子配列の各々は、サイトカインのヘリックスＡとＢ（ＡＢループ）の間、またはヘリックスＣ内に位置する。
0004138006.tif 000006
構造的に関連するサイトカインおよび増殖因子由来ペプチド配列番号１１〜１９もまた、神経障害性疼痛を軽減する方法に有用であり得る。ペプチド配列番号１１〜１９は、例えば、実施例Ｉに記載のChungラットモデル；Waiiら，Pain 7:103-113（1979）; BennettおよびXie, Pain 33:87-107（1988）; Lekanら，Soc. Neurosci. Abstr. 18:287（1992）若しくはPalacekら，Soc. Neurosci.Abstr. 18:287（1992）によって述べられた実施例ＩＩＩのアッセイに記載されているような糖尿病性神経障害のモデル、又は神経障害性疼痛に関する他のアッセイを用いて、神経障害性疼痛の軽減の活性に関してアッセイすることができる。
また、サイトカインおよび増殖因子由来ペプチド配列番号１１〜１９は神経突起成長の刺激、神経細胞の壊死の抑制、有髄化の促進、若しくは脱髄化の抑制の方法においても、又は知覚若しくは運動神経障害を抑制する方法においても有用であり得る。約１４〜約５０個の間のアミノ酸を有し、配列番号１１〜１９のうちの１つに含まれる活性神経栄養性領域を含むペプチドは、実施例ＩＶに記載したように、神経突起成長を刺激する能力に関してアッセイすることができ、または実施例Ｖに記載したように、神経細胞の壊死を抑制する能力に関してアッセイすることができ、または実施例ＶＩに記載したように、有髄化を促進する能力に関してアッセイすることができ、または実施例ＶＩＩに記載されたように、脱髄化を抑制する能力に関してアッセイすることができ、または実施例Ｘに記載されたごとくに知覚神経障害を抑制する能力に関してアッセイすることができる。
プロサポシンの活性断片、すなわち神経障害性疼痛の軽減において有用なペプチドは、例えば、多くの神経障害性疼痛の動物モデルの一つを用いて、ランダムペプチドまたは対象のペプチドの大きなコレクションまたはライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。このような対象のペプチドは、例えば、プロサポシンの活性断片（配列番号１）に関連するアミノ酸配列を有するサイトカインおよび増殖因子由来ペプチド配列番号１１〜１９であってよい。対象のペプチドはまた、例えば、配列番号１中において見られる位置に相当する位置に保存されたアスパラギン残基、ロイシン／イソロイシン残基および１以上の荷電残基を有するが、また配列番号１のアミノ酸とは異なる１以上のアミノ酸を有することにより、配列番号１に関連するアミノ酸配列を有するペプチドの集団であってよい。
ペプチドライブラリーとしては、例えば、ペプチドおよびペプチド疑似分子を含むタグ付き化学ライブラリーが挙げられる。また、ペプチドライブラリーは、ファージ展示技術によって作出されたものも含む。ファージ展示技術は、ファージ表面でのペプチド分子の発現、並びにそれによりタンパク質リガンドがそれをコードする核酸と関連する、あるいは関連する可能性がある他の方法論を含む。発現させるペプチドの集団を多様化するベクターおよび方法を始めとする、ファージ展示ライブラリーの作製法は、当該技術分野で十分公知である（例えば、SmithおよびScott, Methods Enxymol. 217:228-257（1993）; ScottおよびSmith, Science 249:386-390（1990）；およびHuse, WO91/07141およびWO91/07149参照）。これらまたは他の十分に公知の方法を使用して、展示されたペプチドを切断し、次いで本明細書で記載したような神経障害性疼痛の軽減、もしくは他の神経栄養性またはミエリン栄養性活性における活性に関してアッセイすることができるファージ展示ライブラリーを作製することができる。所望により、ペプチド集団は活性に関してアッセイすることができ、また該ペプチド集団から活性のあるペプチドを単離するために活性のある集団を細分し、さらにアッセイを繰り返すことが可能である。本発明に有用なペプチドを作製する他の方法としては、例えば、配列番号１および配列番号２のようなプロサポシン活性断片のアミノ酸配列に基づく合理的設計および変異誘発が挙げられる。
本明細書に開示されているように、プロサポシン活性断片すなわち神経障害性疼痛の軽減において有用なペプチドは、しっかりと樹立された多くの神経障害性疼痛の動物モデル（Bennett，同上，1993）の何れにおいても、神経障害性疼痛を軽減する活性によって同定可能である。例えば、プロサポシンの活性断片は、ラットにおける分節脊髄神経結紮によって作出された抹消神経障害の実験モデルを用いて同定することができる。Chungラットモデルは、末梢神経の損傷によるカウザルギーまたは灼熱痛を有するヒト患者の症状に匹敵するものである（KimおよびChung,同上，1992）。KimおよびChungの外科的手法は、冒された脚の有害な熱および機械的異痛に対する長期にわたる痛覚過敏症を作出する。実施例Ｉに記載したように、ChumgおよびKimによって開発された手法に従う脊髄神経結紮を有するラットは、神経障害性疼痛の軽減に使用するためのプロサポシン活性断片を同定するのに有用である。
また、プロサポシン活性断片すなわち神経障害性疼痛の軽減において有用なペプチドは、痛みを伴う糖尿病性神経障害のラットモデルにおける神経障害性疼痛を軽減する活性により同定することもできる。また、温度刺激、機械的刺激および化学的な有害刺激に対する痛覚過敏症も、ストレプトゾトシンのような選択性β細胞毒によって誘発された短期インスリン欠損性糖尿病を患う糖尿病ラットで報告されている（Calcuttら，Pain 68:293-299（1996））。このようなラットモデルは、その痛みが軽い接触や痛覚過敏によって喚起される一時的な痛みを始めとする多様な異常型知覚を示すと考えられる糖尿病患者で明らかにされた代表的な痛みである。ストレプトゾトシンまたは他の選択性β細胞毒で処理されたラットを、対象のペプチド断片で処理することができ、続いて０．５％ホルマリンのような有害刺激に対する応答を測定する。その応答の低下により、プロサポシン活性断片すなわち神経障害性疼痛の軽減において有用なペプチドを同定することができる。
また、プロサポシン活性断片すなわち神経障害性疼痛の軽減において有用なペプチドは、Wallらの神経腫モデルを用いて同定することもできる。この十分に認識された神経障害性疼痛のモデルは、健全な手足における切断または神経横切断に続いて見られるヒトの症状を再現している（Wallら，同上，1979）。前記したように、神経腫は、損なわれた神経突起新芽が成長するため、神経横切断の後に容易に生じる。
また、慢性狭窄損傷モデルを用いて、プロサポシン活性断片すなわち神経障害性疼痛の軽減において有用なペプチドを同定することもできる。BennettおよびXie（同上，1988）の慢性狭窄損傷モデルは、ヒトで見られるものような疼痛疾病を作り出す抹消神経障害のラットモデルである。Bennettモデルでは、ラットの座骨神経の周囲に収縮性の結紮糸を緩く結び、該狭窄から離れた神経の変性を起こすことにより神経損傷を作り出す。異痛および痛覚過敏は、一時的疼痛に加えて該狭窄損傷により作出される。
また、神経障害性疼痛の霊長類モデルも、プロサポシン活性断片すなわち神経障害性疼痛の軽減において有用なペプチドを同定するために使用することができる（例えば、Lekanら,同上,1992; Palacekら,同上,1992参照）。
本明細書で用いられる際、「ペプチド」という用語は、プロサポシン活性断片、プロサポシン由来ペプチドまたは本発明の方法において有用なペプチドに関して用いられる場合、本明細書に記載したように、その化合物が神経障害性疼痛を軽減する能力、もしくは他の神経栄養性またはミエリン栄養性活性を保持しているという条件で、自然発生するアミノ酸、非自然発生アミノ酸または化学的に修飾されたアミノ酸を含む化合物を意味する。また、プロサポシン由来ペプチドは、プロサポシン由来ペプチドの構造を模倣する非アミノ酸化学構造であり、かつ活性を保持するペプチド疑似体であってもよい。このような疑似体は一般的に、プロサポシン由来ペプチド対応物で見られる同様の空間的な配置における大きさ、電荷または疎水性のような同様の物理的特性を示すものとして特徴付けられる。ペプチド疑似体の具体例としては、例えば、炭素−炭素結合または当該技術分野で十分公知の他の結合によって１以上のアミノ酸との間のアミド結合が置換されている化合物がある（例えば、Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS,Washington（1995）参照）。
本明細書で用いられる際、「アミノ酸」という用語は、他にもあるが、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸を始めとする２０種の自然発生アミノ酸のうちの１つをいう。また、アミノ酸という用語は、アミノ酸類似体を始めとする化学的に修飾されたアミノ酸のような化合物、ノルロイシンのように通常はタンパク質に組み込まれていない自然発生アミノ酸、およびその化合物がペプチド内で置換されてもその生物学的活性を保持する限りにおいて、当該技術分野でアミノ酸の特性として公知の特性を有する化学的に合成された化合物をいう。例えば、グルタミンは、本明細書に記載したように、神経障害性疼痛の軽減における活性、もしくは他の神経栄養的またはミエリン栄養的活性を保持するプロサポシン活性断片内で置換されてもよいという条件で、アスパラギンのアミノ酸類似体であり得る。アミノ酸およびアミノ酸類似体の他の例は、GrossおよびMeienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York（1983）に挙げられている。また、アミノ酸は、実質的にはアミノ酸と同様の官能基の空間的配置を示すが、必ずしもアミノ酸のα−アミノおよびα−カルボキシル基特性の双方を持たなくてもよいという構造であるアミノ酸疑似体であってもよい。
プロサポシン活性断片すなわち本発明で有用なペプチドは、当該技術分野で十分公知の方法を用いて単離または合成することができる。このような方法には、ペプチドの生産のための組換えＤＮＡ法および化学的合成法が含まれる。適切な宿主細胞中でのペプチドをコードする核酸配列の発現を通じて該ペプチドを生産する組換え法は、当該技術分野で十分に公知であり、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版,第１〜３巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（1989）に記載されている。
また、プロサポシン活性断片すなわち本発明で有用なペプチドは、例えば、Merrifieldら，J. Am. Chem. Soc.85:2149（1964）の固相ペプチド合成法により、化学的合成によって生産することもできる。また、当該技術分野で十分に公知の標準的な溶液法を使用して、本発明で有用なペプチドを合成することもできる（例えば、Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag,Berlin（1984）およびBodanszky, Peptide Chemistry, Springer-Verlag,Berlin（1993）参照）。新たに合成されたペプチドは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製でき、次いで例えば、質量分析法またはアミノ酸配列分析を用いて特性付けることができる。
プロサポシンの活性断片は、その生物学的機能を損なうことなく、限られた修飾をすることができることが理解される。従って、神経障害性疼痛を軽減するその能力を損なわないプロサポシン活性断片の修飾は、プロサポシン活性断片の定義内にある。修飾には、例えば、アミノ酸残基の付加、欠失または置換；アミノ酸構造または機能を模倣する化合物の置換；およびアミノ基またはアセチル基のような化学部分の付加が含まれる。神経障害性疼痛の軽減における修飾ペプチドの活性は、前記したものまたは実施例Ｉで例示したアッセイのような神経障害性疼痛の動物モデルを用いてアッセイすることができる。
プロサポシン活性断片の特に有用な修飾は、例えば安定性の増強を付与するものである。例えば、１以上のアミノ酸の組み込み、またはリシンの置換若しくは欠失によって、ペプチドの分解を防護することによりプロサポシン活性断片の安定性を増強することができる。例えば、本明細書に記載したように、プロサポシン由来１４量体配列番号２は、サポシンＣのアミノ酸１６〜２９に由来するアミノ酸配列を有するが、３個の各々の自然発生リシンの置換または欠失およびＣ−末端チロシン残基の付加によって修飾されている。特に、プロサポシン由来１４量体配列番号２は、２位でのリシンに代わるＤ−アラニンの置換、８位でのリシンに代わるアラニンの置換おび１１位でのリシンの欠失を有する。２位でのＤ−アラニン置換は、当該技術分野で十分に公知であるが、ペプチドをエンドプロテアーゼ分解から防護することにより安定性の増強を与える（例えば、Partridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, New York（1991）の247頁を参照）。リシン残基の置換または欠失は、当該技術分野で十分に公知であるが、トリプシン様プロテアーゼに対する抵抗性の増強を与える（Partridge，同上,1991）。これらの置換は安定性を増強し、従ってペプチド配列番号２の生物学的利用能を増強するが、神経障害性疼痛の軽減における活性には影響を及ぼさない。
また、有用な修飾は、親脂性を増強するまたは水素結合を減少させる修飾のような、ペプチドの血液脳関門の通過を促進するものであってもよい。例えば、プロサポシン由来ペプチド（配列番号２）のＣ末端に付加されたチロシン残基は、疎水性および血液脳関門に対する透過性を増強する（例えば、Banksら,Peptides 13:1289-1294（1992）およびPardridge，同上，1991参照）。また例えば、生物学的安定性が増強されるか、または血液脳関門に対する透過性が増強されたキメラペプチド性医薬も、本発明の方法に有用であり得る。
当業者ならば、例えば実施例ＩＩに記載したように、in vivoでプロサポシン活性断片の血液脳関門を通過する能力を容易にアッセイすることができる。さらに、プロサポシン活性断片を、例えば、Bowmanら，Ann. Neurol. 14:396-402（1983）またはTakahuraら，Adv. Pharmacol. 22:137-165（1992）に記載されたように、脳微細血管内皮細胞培養系に基づく血液脳関門のin vitroモデルを用いて、その血液脳関門を通過する能力に関して試験することができる。
本明細書で用いる場合、「有効量」という用語は、神経障害性疼痛を軽減するため、または神経障害性疼痛を予防するために有用なプロサポシン活性断片の量を意味する。１日当たり全身投与される有効量は被験体の体重に依存する。好ましくは、１日当たり全身投与される有効量は約０．１μg/kg〜約１０００μg/kgである。さらに好ましくは、１日当たり全身投与される有効量は約１０μg/kg〜約１００μg/kgである。痛みを軽減するまたは予防するためのペプチドの有効量は、例えば、実施例Ｉに記載したアッセイまたは霊長類におけるアッセイ（Lekanら,同上，1992およびPalacekら,同上，1992）を始めとする前記したものを始めとする当業者に十分公知の方法を用いて経験的に決定することができる。
細胞増殖培地中での神経栄養的またはミエリン栄養的活性のための本発明のペプチドの典型的な最小量は、少なくとも約５ng/mlである。これ以上の量の本発明のペプチドは、in vitro用途に使用することができる。典型的には、０．１μg/kg〜約１０μg/kgの範囲の濃度の本発明のペプチドを用いることができる。特定の組織の処理のための有効量は、実施例ＩＶおよびＶＩで示されるように決定することができる。
本発明のペプチドを細胞に直接投与することにより、神経細胞をin vivoまたはex vivoで処理することができる。これは、例えば、特定の細胞型に適した増殖培地中で細胞を培養し、次いで該培地へペプチドを添加することにより行うことができる。処理される神経細胞がin vivo、典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳類に属する場合、本発明のペプチドは、以下に記載するいくつかの技術のうちの１つによって投与してもよい。
本明細書で用いる場合、「被験体」とは脊椎動物、好ましくは哺乳類、特にはヒトを意味する。
本発明は、有効量のプロサポシン活性断片を静脈内、筋肉内、皮膚内、皮下、頭蓋内、脳脊髄内、局所、経口、経皮、経粘膜、または鼻腔内投与することにより、痛みを軽減する、神経突起成長を刺激する、神経細胞の壊死を抑制する、有髄化を促進する、および脱髄化を抑制する方法、並びに知覚性または運動性神経障害を抑制する方法を提供する。十分に公知の種の医薬的に許容される担体をプロサポシン活性断片と共に投与することができる。このような担体としては、例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
好ましくは、有効量のプロサポシン活性断片を被験体の血流中に直接注射する。実施例ＩＩに記載したように、アミノ酸１２でバリンに代わるチロシンの置換を有するプロサポシン由来２２量体配列番号１のアミノ酸１２〜２９からなるヨウ素化されたプロサポシン１８量体Try-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu（配列番号２０）（ＷＭ＝２０００）は血液脳関門を通過し、中枢神経系に入ったので、例えば、プロサポシン活性断片の静脈注射を用いて、抹消または中枢神経系に対して該活性断片を投与することができる。脳による取り込みは、血液脳関門を通過するであろうおよそのサイズのペプチドに関する範囲中央の値である、およそ０．０３％であった（Banksら,同上,1992）。
プロサポシン活性断片が胃腸内での分解に対して安定であり、かつ、容易に吸収されるように修飾されることを条件に、経口投与がしばしば好ましいとされる。例えば、１以上のＤ−アミノ酸の置換は、本発明に有用なプロサポシン由来ペプチドの安定性を増強させる。
また、直接的な頭蓋注射または脳脊髄液への注射によって、有効量のプロサポシン活性断片を被験体の中枢神経系へ導入することもできる。さらに、有効量のプロサポシン活性断片を、直接注射投与または局所適用によって、または全身投与によって、抹消神経組織へ投与することができる。静脈内、筋肉内、皮膚内、皮下、頭蓋内、硬膜外、局所、経口、経皮、経粘膜および鼻腔内投与を始めとする種々の従来の投与法も熟慮される。
また、プロサポシン活性断片を徐放形態で投与することもできる。プロサポシン活性断片の徐放は、該活性断片の投与を繰り返す必要なく長期にわたって神経障害性疼痛を軽減するという利点を有する。
徐放は、例えば、水、イムノビーズ、マイクロポンプまたはプロサポシンの活性断片の緩慢な放出を制御するために提供される他の材料のごとき徐放性材を用いて達成できる。かかる放出制御材料は当該技術分野で周知であり、商業的供給元から入手できる（Alza Corp., Palo Alto CA; Depotech, La Jolla CA;Paroll, Ann. Rev. Immunol. 13:399-415（1995）も参照）。さらに、ポリ乳酸、ガラクチン酸、再生コラーゲン、多層リポソームまたは他の従来の貯蔵処方のごときプロサポシンの活性断片を用いて処方することができる生腐食性または生分解性材料を移植して、プロサポシンの活性断片を徐々に放出させることができる。また点滴ポンプ、マトリックスエントラップメント系および経皮送達装置の使用も本発明において考慮される。
また、プロサポシンの活性断片を有利にもミセルまたはリポソーム中に封入することもできる。リポソーム封入技術は周知である。リポソームは、標的組織に結合することができる受容体、リガンドまたは抗体により、神経組織のごとき特定の組織を標的とすることができる。これら処方の調製は当該技術分野で周知である（例えば、Pardridge，前掲，1991並びにRadinおよびMetz, Meth.Enzymol. 98:613-618（1983）参照）。
本発明のペプチド組成物は、患者に投与される１日用量に等しい用量で、注射可能な組成物または局所的調剤にごとき単位剤形で封入および投与でき、所望により放出制御処方に調製することができる。単位剤形は、例えば、ＰＢＳ中に、または凍結乾燥形態で本発明の有効組成物の１日用量を含有する中隔封入（septum sealed）バイアルであってもよい。神経疾病の治療には、本発明のペプチドの適当な１日全身用量は、その脊椎動物の体重に基づき、約０．１〜約１，０００μg/kgまでの用量も考慮されるが、約１０〜約１００μg/kgの範囲内である。かくして、典型的な７０kgのヒトでは、全身用量は１日につき約７〜７０，０００μgの間、好ましくは１日につき約７００〜約７，０００μgの間とし得る。局所投与される材料の１日用量はおよそ全身用量より小さいオーダーであろう。経口投与も考慮される。
また本発明は、プロサポシンの活性断片を発現および分泌するように遺伝的に修飾された細胞を患者に移植することによって、患者の神経障害性疼痛を軽減する方法を提供する。移植はプロサポシンの活性断片の連続供給源を提供し、かくして神経障害性疼痛の軽減を持続させる。長期にわたるまたは慢性神経障害性疼痛に苦しむ患者の場合、かかる方法はプロサポシンの活性断片の繰り返し投与の必要性をなくする、または減じるという利点を有する。
当該技術分野で周知な方法を用いて、細胞をプロサポシンの活性断片をコードする核酸を含有する発現ベクターで容易にトランスフェクトすることができる（Chang, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Boca Raton（1995））。トランスフェクトされた細胞は、例えば脳への移植の後で、プロサポシンの活性断片を発現および分泌し、かくして、神経障害性疼痛を軽減する。かかる方法は、鎮痛特性を有する物質を分泌する細胞の移植に関して記載されたごとくに神経障害性疼痛を軽減するために有用であり得る（例えば、CzechおよびSagen, Prog.Neurobiol. 46:507-529（1995）参照）。
細胞は、移植した際に生存可能で、プロサポシンの活性断片を発現および分泌するように修飾可能な何れの細胞であってもよい。実際には、該細胞は患者と免疫学的に適合すべきである。例えば、特に有用な細胞は治療される患者から単離された細胞である。何故なら、かかる細胞は患者と免疫学的に適合するからである。
また、治療される患者以外の供給源に由来する細胞も、例えば、マイクロカプセル化または免疫抑制を用いて免疫拒絶を防護すれば有用であり得る。有用なマイクロカプセル化膜材料としては、アルギン酸−ポリ−Ｌ−リシンアルギン酸塩およびアガロースが挙げられる（例えば、Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, CRC Press, Boca Raton（1993）; TaiおよびSun, FASEB J. 7:1061（1993）; Liuら，Hum. Gene Ther. 4:291（1993）;およびTaniguchiら、Transplant. Proc. 24:2977（1992）参照）。例えば、疼痛の軽減は、ラット脊髄クモ膜下腔に移植されたポリマー封入細胞を用いて達成されている[Wangら、Soc. Neurosci. Abstr. 17:235（1991）]。
ヒト患者の治療のためには、該細胞はヒト細胞であり得るが、非ヒト哺乳類細胞も有用であり得る。特に、ヒト繊維芽細胞、筋肉細胞、神経膠細胞、ニューロン前駆体細胞またはニューロンは、発現ベクターでトランスフェクトして配列番号１のごときプロサポシンの活性断片を発現、分泌させることができる。一次（primary）繊維芽細胞は、例えば、治療される患者の皮膚生検から得て、標準的な組織培養条件の下で維持することができる。また、一次筋肉細胞も移植に有用であり得る。神経移植に関する考察は、例えば、Chang，前掲，1995に記載されている。
中枢神経系に由来する細胞は、かかる細胞の生存がその本来の環境中で増強されるので、中枢神経系への移植に特に有用であり得る。ニューロン前駆体細胞は、ニューロン前駆体細胞が培養下で増殖でき、発現ベクターでトランスフェクトでき、かつそれが組み込まれる個体へ導入できるので、本発明の方法において特に有用である。増殖してニューロンおよび神経膠細胞へと分化可能なニューロン前駆体細胞の単離は、Renfranzら，Cell 66:713-729（1991）に記載されている。
ex vivoにて細胞をトランスフェクトする方法は、当該技術分野で周知である（Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H.Freeman & Co., New York（1990））。繊維芽細胞、筋肉細胞、神経膠細胞またはニューロン前駆体細胞のごとき分裂し続けている細胞のトランスフェクションには、レトロウイルスベクターが好ましい。ニューロンのごとき分裂終了細胞への発現ベクターのトランスフェクションには、複製−欠損単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）ベクターが有用である（Duringら，Soc. Neurosci. Abstr. 17:140（1991）; Sableら，Soc. Neurosci. Abstr. 17:570（1991））。
プロサポシンの活性断片をコードする核酸は、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを始めとする、当該技術分野で十分公知の種々のプロモーターの１つの制御下で発現させることができる。例えば、Chang，前掲，1995を参照。高レベルの発現に特に有用な構成的プロモーターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復配列（MLV-LTR）、サイトメガロウイルス即時型（CMV-IE）またはサルウイルス４０初期領域（SV40）がある。
プロサポシンの活性断片をコードする核酸配列は本明細書に記載されている。例えば、配列番号１をコードする核酸配列は、5’-TGTGAATTCCTGGTGAAGGAGGTGACCAAGCTGATTGACAACAACAAGACTGAGAAAGAAATACTC-3’（配列番号２１）である（Dewjiら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8652-8656（1987））。例えば、配列番号１のペプチドの分泌を指示するためには、β−ラクタマーゼのシグナル配列のごときシグナル配列をコードする核酸を、Simonら，J. Cell Biol. 104:1165（1987）に記載されたごとくに、配列番号２１に機能可能なように連結することができる。
さらに本発明は、有効量のプロサポシンの活性断片を患者に投与することにより、患者の神経障害性疼痛を予防する方法を提供する。神経障害性疼痛を予防する方法は、痛みを伴う事象に先立って、例えばその結果神経障害性疼痛が生じることが知られている化学療法または手術に先だって適用する場合に有用である。
以下に示す実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定しようとするものではない。
実施例Ｉ
Chungのラットモデルにおける神経障害性疼痛の軽減
本実施例は抹消神経障害性疼痛のChungの実験モデルにおけるプロサポシンの活性断片の濃縮塊（bolus）髄腔内注射の効果を記載するものである。
３種のペプチドの各々を化学合成によって純粋な形で得、滅菌ＰＢＳに溶解させ、中性ｐＨに緩衝化した。
KimおよびChung，前掲，1992により従前に記載された外科手法を体重１２０〜１５０グラムの雄のSprague-Dawleyラットに施して、異痛状態を誘導した。簡単に説明すると、ハロタンも用いてラットに麻酔をかけ、続いて左Ｌ−５およびＬ−６脊髄神経を隣接する脊柱から単離し、次いで背根神経節に対して遠位に６．０シルク縫合糸で連結した。術後回復期間１０〜１４日後に、脊髄カテーテルを導入した。第二の手術の５日後に、大後頭孔を通して挿入された脊髄カテーテルに連結したギア駆動型マイクロインジェクションシリンジを用いて髄腔内薬剤投与を達成した。試験の前に、ラットを透明なプラスチックワイヤーメッシュケージに入れ、順化させた。
脚の引っ込めについての５０％機械的閾値を評価するため、ボン・フライ毛（von Frey hair）をフットパッドを避けて後脚に適用した。対数的力の増加に応じて湾曲するようにした各々のボン・フライ毛を脚に対して垂直に十分な力で押し当て、およそ６〜８秒の間わずかな曲げを生じさせた。脚が鋭敏に引っ込められれば、陽性反応を示したことになる。各々の点につき、各々の時点について記録された最大刺激および最小刺激を含む６個のデータを回収した。得られた反応パターンを表にし、５０％反応閾値を算定した。グラフは単回の髄腔内濃縮塊注射として与えられた表示用量のペプチドに対する応答を示している。Ｘ軸は、その時点でフットパッドにおける圧力に対する過敏性が測定された投与後の時間を示す。
プロサポシンの活性断片の注射に先立ち、外科的に障害を起こさせたラットは全て触覚異痛症を示した。図１で時間ゼロ時点に示されたごとくに、測定閾値はペプチドの不在化で３．０〜４．０gより小さかった。０．７または０．０７μgのプロサポシン由来２２量体ペプチド（配列番号１）の髄腔内注射は、用量に依存する様式で異痛を抑制した。ラットは冒された脚を引っ込めるまでは力の増強に耐えるので、力の閾値の上昇により異痛の軽減が明らかとなる。
顕著な効果は注射後１５分で観察された。最大効果は注射後１２０分で認められた。最高用量のプロサポシン由来２２量体ペプチド（配列番号１）を注射したラットは、検定された最終時間（１８０分）時点まで異痛の顕著な軽減を示し続けた。０．００７μgプロサポシン由来２２量体ペプチド（配列番号１）を注射したラットは、異痛の有意な軽減は示さなかった。鎮静のごとき有意な副作用は何れの濃度でも認められなかった。
また、Chungのラットモデルにおけるプロサポシン由来１４量体ペプチド（配列番号２；表１参照）の異痛を軽減する能力も調べた。図２に示すごとくに、プロサポシンの活性断片（配列番号２）は異痛の軽減に効果的であった。プロサポシン由来１４量体ペプチド（配列番号２）の効果のピークは、注射後１５〜３０分で認められ、６０分までに注射前の値に戻った（図２）。処理されたプロサポシン由来１４量体ペプチド（配列番号２）の何れの濃度でも副作用は認められなかった。
また、アスパラギンの代わりにアスパラギン酸残基を含有することでプロサポシン由来２２量体ペプチド（配列番号１）とは異なる、変異型２２量体ペプチド（配列番号８）（表４参照）もChungのラットモデルで異痛の軽減における活性に関して試験した。１７．５μgの変異型２２量体ペプチド（配列番号８）の注射後、Chungのラットの異痛反応に変化は認められなかった。
また、Chungのモデルに従って導入された外科的病変の結果として痛みを経験していない正常ラットにもプロサポシンの活性断片（配列番号１）を注射し、BennettおよびXie,前掲，1988によって開発された手法の従い、熱刺激に対するそれらの応答に関して試験した。簡単に説明すると、ラットが冒された脚を熱源から引っ込めるまでの時間がホットプレート潜伏時間と定義され、熱刺激によって引き起こされた痛みに対する耐性の尺度となる。
髄腔内カテーテルを正常な雄Spraque Dawleyラット内に挿入した。この手術の５日後に、ラットにプロサポシンの活性断片（配列番号１）の髄腔内注射を行った。ラットをホットプレート上（５２．５℃）で試験し、ホットプレート応答潜伏時間を注射の前に、また注射後１８０分までの種々の時点で測定した。ホットプレート応答潜伏時間の有意な増加は認められなかった。かくして、プロサポシン由来ペプチド配列番号１は正常な動物における痛みの認知には影響を及ぼさない。
実施例ＩＩ
プロサポシン由来ペプチドの中枢神経系によるin vivoでの取り込み
本実施例に記載された結果は、プロサポシン由来ペプチドが血液脳関門を通過することを示すものである。
１２位にてバリンに代わり置換されたチロシンを有するサポシンＣのアミノ酸１２〜２９からなる１８量体ペプチド（配列番号２０）は、Applied Biosystems Model 430ペプチド合成装置で化学的に合成した。次いで、該ペプチドをラクトペルオキシダーゼ法により放射性ヨウ素で処理し、２０×１０6cpmで放射性標識されたペプチドをラットの耳介に注射した。１時間および２４時間後にこの動物を犠牲にし、次いで脳から血液を除去するために等張食塩水で心臓を灌流した。
ペプチド取り込みのパーセンテージを求めるため、次いでガンマカウンターで脳を計測した。さらに、脳をホモジナイズし、デキストラン遠心分離の後、毛細管が豊富な画分（ペレット）と実質脳の画分（上清）とに分画した（Trigueroら,J. Neurochem. 54:1882-1888（1990））。この方法により血管中の放射性標識ペプチドと脳中の放射性標識ペプチドとを識別することが可能になる。２４時間後、注射されたペプチド（配列番号２０）の０．０１７％が脳の全域で、標識の７５％が実質組織の画分で、また２５％が毛細管画分で検出された。１時間後では、注射された用量の０．０３％が脳の全域に存在していた。
また、配列番号２のプロサポシン由来ペプチドでも以下のごとくに血液脳関門を通過する能力に関して検定した。雌のSprague-Dawlsyラットにメトキシフルランで麻酔をかけ、およそ２０μgの配列番号２のペプチド（３．２×１０8cpm）を尾の静脈に注射した。４０分後、このラットをエーテル麻酔により犠牲にし、次いで約２５０mlのＰＢＳで心臓灌流を行った。表６に示したごとくに、脳、肝臓および血中のペプチドの総量を、注射した物質のパーセンテージとして算出した。脳内の存在位置を求めるために、Triguero, J. Neurochem. 54:1882（1990）の毛細管除去法を用いて脳組織を実質組織画分と脳毛細管画分に分離した。分画の結果、脳内に存在する配列番号２のペプチドの８７％が脳の実質組織に局在化し、１３％が脳の毛細管に見られることが示された。
0004138006.tif 000007
配列番号２での処理３時間後にラットを犠牲にする同様の実験では、ペプチドの０．０６％が脳内に存在し、内８５％が実質組織に存在することが明らかになった。これらの結果は、少なくともいくらかの配列番号２のプロサポシン由来ペプチドが血液脳関門を通過し、導管内皮（血管）よりもむしろ脳の実質組織中に集中したことを示している。血液脳関門を通過したペプチドのパーセンテージは、Banks，前掲，1992に示されたごとき該関門を通過するペプチドの範囲中央内である。
脳、肝臓および血中の完全な（intact）物質のパーセンテージを求めるため、該組織から単離した放射性標識物質（配列番号２）を高速液体クロマトグラフィーによって分析した。組織ホモジネートの処理中の分解に関して正規化（normalize）するために、配列番号２のペプチドを組織ホモジネートに添加した。ペプチド物質の添加に伴い観察される分解の程度を用いて、組織処理中の分解について正規化した。正規化の後、結果は以下のようになった：配列番号２では、脳内では約６０％が完全、肝臓内では約８０％が完全、血中では約４０％が完全であった。第二の実験では、配列番号２のペプチドでは、脳内で約６８％が完全であった。これらの結果は、配列番号２のペプチドは血液脳関門を通過し、かつ多くが脳内で完全な状態であることを示唆するものである。
実施例ＩＩＩ
糖尿病ラットにおける神経障害性疼痛の軽減
本実施例は糖尿病性神経障害のラットモデルにおける、配列番号２の配列を有するペプチドの腹腔内投与の効果を記載する。
Calcuttら，Pain 68:293-299（1996）に記載されたごとくに、ストレプトゾトシン（５０mg/kg体重、新たに０．９％滅菌食塩水に溶解）の単回を腹腔内注射して膵臓β細胞を除去し、インスリン欠損を誘導することによりラットを糖尿病にした。２日後に血中グルコースレベルを測定することにより、ストレプトゾトシンを注射したラットで糖尿病を確認した。ラットの糖尿病の研究において一般に許容されている非絶食性高血糖症の定義に従い、１４mmol/l以下の血中グルコース濃度を有するストレプトゾトシン注射ラットは以降の研究から除外した。
糖尿病ラットおよび対照ラットの双方を８週時点で、異痛の指標としての有害な化学的ホルマリンに対する挙動応答を分析することにより研究した（Calcuttら，前掲，1996）。簡単に説明すると、ラットに、右後脚の背面に新たに調製されたホルマリン（滅菌生理食塩水中０．５％溶液５０μl）の皮下注射を受けさせる。このホルマリン濃度は対照ラットに最大より低い挙動反応を誘発し、第Ｑ期および第２期の間に、糖尿病ラットにおける高血糖症の検出を可能にする（Calcuttら，Eur. J. Pharmacol. 285:189-197（1995）。動物を脚の連続的な視覚化が可能なように構成された観察チャンバーへ移した。次の６０分間、１分間の間のしりごみ（flinch）回数を、各々の動物の処理群を知らない観察者により５分間隔で計数した。糖尿病ラットの研究に関して従前に定義されたごとくに、第１期はしりごみの初期測定値として（注射後１〜２および５〜６分）、第Ｑ（静止）期は１０〜１１、１５〜１６および２０〜２１分時点で測定された測定値として、また第２期は注射後に続く全ての測定値として定義された（例えば、Malmbergら，Neurosci. Lett.161:45-48（1993）参照）。その期の間の測定時点でのしりごみを合計することにより、各々の期での活性の比較を行った。従前に報告されたごとくに、糖尿病ラットは異常なしりごみ反応を示した。
配列番号２のペプチドは化学的合成によって純粋な形で得られ、滅菌ＰＢＳに溶解させ、中性ｐＨに緩衝化した。糖尿病ラットを各々４匹ずつ２つの群に分け、それぞれ生理食塩水または配列番号２のペプチドを投与した。０．５％ホルマリンでの処理２時間前に、腹腔内投与を用いて、該糖尿病ラットを生理食塩水または２００μg/kgの配列番号２のペプチドで処理した。図３に示したごとくに、配列番号２の投与は、第１期での異常なしりごみ応答を完全に妨げ、第２期における応答を７０％まで改善した。かくして、配列番号２のペプチドの非経口投与は、痛みを伴う糖尿病性神経障害のラットモデルにおいてホルマリン注射に由来する痛みを軽減した。
実施例ＩＶ
in vitroでの神経突起成長の刺激
本実施例は、in vitroの神経突起成長の刺激において、配列番号２の配列を有するペプチドの使用を記載する。
NS20Y神経芽腫細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ中で増殖させる。トリプシンを用いて細胞を除去し、次いで３０mmシャーレ中のカバーガラス上にプレートする。２０〜２４時間後、配列番号２を有するペプチド、０、０．５、１、２、４または８ng/kgまたはスクランブルされた（scrambled）対照ペプチドと共に０．５％ウシ胎児血清を含有する２mlＤＭＥＭで培地を置換した。細胞をさらに２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄し、ボーイン（Bouin）の溶液（ピクリン酸／ホルマリン／酢酸１５：５：１飽和水溶液）で３０分間固定する。固定液をＰＢＳで除去した後、神経突起の成長を位相差顕微鏡下で計測（score）する。ある細胞径に等しい、もしくはそれより大きいと明確に定義された１以上の神経突起を示す細胞を、神経突起成長に関する陽性として計測する。各シャーレの異なる位置で少なくとも２００細胞を計数して、２連で検定した各ペプチドを含む細胞を有する神経突起のパーセンテージを求める。
配列番号２で示されるペプチドは、同じアミノ酸を異なる順番で有するスクランブルされた対照ペプチドに比べ、NS20Y細胞における神経突起の成長を有意に増強する。神経突起成長の増強は、０．５ng/mlほどの少量のペプチドを用いても明白である。
実施例Ｖ
in vitroでの神経細胞の壊死の抑制
本実施例は、in vitroでの神経細胞の壊死の抑制における配列番号２の配列を有するペプチドの使用を記載する。
NS20Y細胞を実施例ＩＶに記載したごとくにプレートし、カバーグラス上で０．５％ウシ胎児血清中、８ng/mlの配列番号２として示される配列を有するペプチドもしくはスクランブルされた対照ペプチドの存在下または不在下で２日間増殖させる。培地を除去し、ＰＢＳ中０．２％のトリパンブルーを各ウェルに加える。死細胞はトリパンブルー色素でブルーに染まり、これを各ウェルの４領域について４００細胞を数える倒立顕微鏡上での総数のパーセンテージとして計測する。２連の平均誤差は±５％である。配列番号２として示されるペプチドは、トリパンブルー陽性（死）細胞の数を実質的に減少させる。このことは、配列番号２を有するペプチドがプログラムされた細胞の壊死を抑制することができることを示すものである。
実施例ＶＩ
ex vivoでの有髄化アッセイ
本実施例は、ex vivoでの神経突起成長の刺激および有髄化の促進における、配列番号２の配列を有するペプチドの使用を記載する。
新生マウス小脳外植片は、Satomi, Zool. Sci. 9:127-137（1992）に従い調製する。神経突起成長および有髄化は、通常新生マウス小脳がニューロン分化および有髄化の開始を経験する期間である培養２２日にわたって認められた。該外植片の調製後２日目に、配列番号２の配列を有するペプチドを３つの外植片に１０μg/mlの濃度で加え、またスクランブルした対照ペプチドを３つの外植片に１０μg/mlの濃度で加える。ビデオカメラを装備した明視野顕微鏡下で、３つの対照外植片および３つの処理外植片における神経突起成長並びに有髄化を評価する。第８日目に、ペプチドを含む培養物を対照培養物よりも薄く、より広く広げる。第１５日目、配列番号２のペプチドで処理した培養物は外植片の周辺部に長い映像を有する多くの細胞を含む。かかる映像は対照培養物では存在しないか、またはあまり顕著でない。配列番号２のペプチドで処理した培養物は、２２日の時点で皮質下の白質に、対照外植片に比べて顕著に有髄化された軸索を含む。かくして、本発明のペプチドはex vivoでの小脳分化において有髄化を誘導する。
実施例ＶＩＩ
脱髄化の抑制
シュワン細胞の壊死の減少は脱髄化の抑制と相関する。シュワン細胞は拡張性（extensive）のミエリン鞘を含む。培養中のシュワン細胞への配列番号２で示されるペプチドの添加は、用量に依存する様式でシュワン細胞の壊死を低減し、これは対照混合ペプチドでは見られなかった。かくして、配列番号２の配列を有する本発明のペプチドは脱髄化を抑制することができる。
実施例ＶＩＩＩ
外傷性虚血性ＣＮＳ病変部の治療
脊髄に外傷性病変部を有するヒトに、滅菌生理食塩水溶液、もしくは病変部にペプチドの緩慢な連続的放出を可能にする補給形態での、配列番号２で示されるペプチド約１００μg/mlの脳脊髄内注射または直接注射を施す。改善は手足の運動の増加のごとき運動神経機能の増加によって評価する。治療はさらなる改善が生じなくなるまで繰り返される。
実施例ＩＸ
脱髄化障害の治療
初期段階ＭＳで診断された患者に、実施例ＶＩＩＩと同様の用量範囲を用いた脳脊髄液への直接の静脈注射により、配列番号２で示される配列を有するペプチドを与える。投与は毎日もしくは毎週繰り返し、筋力、筋骨格の協調および有髄化（ＭＲＩによって測定されるようなもの）における改善を観察する。
実施例Ｘ
知覚神経障害の治療
知覚神経障害を誘発させるためにタキソール（taxol）をマウスに投与した。タキソール処理マウスに１００μg/kg、２００μg/kgまたは１mg/kgの配列番号２のロサポシン由来ペプチドを投与した。熱知覚の欠損を、知覚神経障害の指標としてHargreaves知覚試験装置を用いて測定した。投与された配列番号２のペプチドの３種の用量は各々、タキソール処理マウスにおける熱知覚の欠損の抑制において効果的であった。また、配列番号１のプロサポシン由来２２量体ペプチドも同様に検定し、タキソール処理マウスにおける熱知覚の欠損の抑制において効果的であることがわかった。これらの結果は、配列番号１および配列番号２のごときプロサポシン由来ペプチドを用いて知覚神経障害を効果的に抑制することができることを示している。
以上、実施例を参照して本発明を説明したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の改変をなし得ることを理解すべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
配列表
（１）一般情報:
（i）出願人:リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
（ii）発明の名称:プロサポジン由来のペプチドを使用する神経障害痛の軽減方法
（iii）配列の数：２１
（iv）通信先：
（A）名宛人：キャンベル アンド フローレス
（B）通り名：４３７０ ラ ホヤ ビレッジ ドライブ、スイート７００
（C）市名：サンディエゴ
（D）州名：カリフォルニア
（E）国名：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：９２１２２
（v）コンピューター読取り可能形式：
（A）媒体の型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換機
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0、Version #1.25
（vi）本出願のデータ：
（A）出願番号：
（B）出願日：１９９７年３月５日
（C）分類：
（viii）代理人の情報：
（A）名前：キャンベル、キャサリン Ａ．
（B）登録番号：３１，８１５
（C）参照／文書番号：ＦＰ−ＵＤ ２４７４
（ix）テレコミュニケーション情報：
（A）電話：（６１９）５３５−９００１
（B）テレファックス：（６１９）５３５−８９４９
（２）配列番号：１：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000008
（２）配列番号：２：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１４アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴：
（A）配列の特徴を表す記号：peptide
（B）存在位置：２
（D）その他の情報：/note＝“XaaはＤ−アラニン”
（xi）配列：
0004138006.tif 000009
（２）配列番号：３：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000010
（２）配列番号：４：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000011
（２）配列番号：５：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２１アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000012
（２）配列番号：６：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000013
（２）配列番号：７：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000014
（２）配列番号：８：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000015
（２）配列番号：９：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１４アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000016
（２）配列番号：１０：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１４アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000017
（２）配列番号：１１：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000018
（２）配列番号：１２：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１５アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000019
（２）配列番号：１３：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１７アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000020
（２）配列番号：１４：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000021
（２）配列番号：１５：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１３アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000022
（２）配列番号：１６：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１７アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000023
（２）配列番号：１７：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１８アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000024
（２）配列番号：１８：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１５アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000025
（２）配列番号：１９：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１８アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000026
（２）配列番号：２０：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：１８アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000027
（２）配列番号：２１：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：６６塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0004138006.tif 000028
【図１】
0004138006.tif 000029
【図２】
0004138006.tif 000030
【図３】
0004138006.tif 000031