(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のマンノースを測定する際に、予め検体中に含まれるグルコースをグルコースの２位酸化酵素を用いて除去することを特徴とするマンノースの定量法。
【請求項２】
グルコースの２位酸化酵素がピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボ−スオキシダーゼである請求項１に記載のマンノースの定量法。
【請求項３】
検体中に含まれるグルコースをグルコースの２位酸化酵素を用いて除去する際に、グルコースの１位酸化酵素を併用する請求項１又は２の方法。
【請求項４】
グルコースの１位酸化酵素がグルコースオキシダーゼである請求項３に記載のマンノースの定量法。
【請求項５】
検体中のマンノースの定量を、予めグルコースを除去した検体中のマンノースを、酵素を用いて順次マンノース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸に変換し、生成するグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いて検出し、定量する請求項１から４のいずれかの方法。
【請求項６】
検体中に含まれるグルコースを除去する際に、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼとグルコースオキシダーゼを併用することを特徴とするグルコースの除去方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピラノースオキシダーゼ、又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素又は、これとグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素を組み合わせてグルコースを除去する前処理法と、マンノースをグルコース誘導体として検出するマンノース測定法を組み合わせた、簡便なマンノース測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マンノースは生体内では、主に糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖合成に利用されており、糖タンパク質の生合成や分泌、さらには、糖タンパク質の機能発現に重要な役割を果たしている。マンノースは小腸からほとんど吸収されないので、生体内のマンノースは、主としてグルコース代謝系（即ち、グルコース→グルコース−６−リン酸→フルクトース−６−リン酸→マンノース−６−リン酸）から供給されている。また、マンノース−６−リン酸から合成されるＧＤＰ−マンノース（マンノース−６−リン酸→マンノース−１−リン酸→ＧＤＰ−マンノース）は、マンノース糖鎖合成のドナーとして、重要な役割を果たしている。
【０００３】
健常者血清中のマンノース濃度については、多くの報告があるが、平均値で１６〜８１μＭ、ＳＤの範囲では１１〜１４２μＭとされている（日本臨牀 53(増刊号) p579-581(1995)）。また、血清中のマンノース濃度は、糖尿病や真菌感染症で変動することが知られており、診断薬として期待されている。
【０００４】
糖尿病患者では、空腹時の血清マンノースは健常者の３〜５倍に上昇し、グルコースとよく相関することが知られている（防衛医科大学校雑誌 15(4) p217-223 (1990)、Clin. Chim. Acta 251 p91-103(1996)）。特に、ケトアシドーシスの症例においては約６７０μＭ（健常者平均値の５０倍）に達し、治療で約５０μＭにまで改善した（防衛医科大学校雑誌 15(4) p217-223(1990））。糖尿病の合併症では、網膜症の発症群で、血清マンノースが有意に高値だった（糖尿病 33(Sup.) p144(1990)、糖尿病 34(Sup.) p277(1991)）。白内障患者のレンズ中の糖鎖に含まれるマンノースの割合は、糖尿病群では非糖尿病群より高かった（防衛医科大学校雑誌 18(4) p308-315(1993））。妊娠糖尿病では、妊娠の初期、中期、後期を通じ、糖尿病群の血清マンノースは正常群より高く、妊娠初期のマンノース高値群で自然流産の頻度が高かった（糖尿病 33(9) p719-725(1990））などの報告がある。
【０００５】
また、免疫力の低下した患者で問題になる真菌症、特に、カンジダ症においては血清マンノースが１１０〜１，３１５μＭ（健常者平均値の６３倍）と、著しく上昇していたとの報告がある（日本臨牀 53(増刊号) p579-581(1995 ）、日本医事新報 No.3286 p46-48(1987））。
【０００６】
生化学検査のほとんどの項目は、生化学検査用の自動分析装置（汎用機）で測定されている。また、近年の医療費の高騰により、汎用機での自動測定に対応できない、即ち、特殊な分析装置を必要とし、人手が必要で人件費のかかる検査項目は、事実上、臨床応用が困難な状況にあると言える。これまで、マンノースの測定法として数多くの報告はあるが、何れも煩雑な操作を必要とするため、汎用機での測定は困難であった（Clin. Chem. 43(3) p533-538(1997)）。
【０００７】
最も信頼できるマンノースの測定法として、キャピラリィー・ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法（防衛医科大学校雑誌 15(4) p217-223(1990) ）やガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリィー（ＧＣ−ＭＳ）法（Clin. Chim. Acta 251 p91-103(1996 ））などの分離分析法が報告されているが、何れも、煩雑な前処理と高度なメンテナンス技術を要する特殊な装置を必要としていた。
【０００８】
また、酵素を用いたマンノースの測定法も幾つか報告されている。これらは、何れも、マンノースをヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）でリン酸化してマンノース−６−リン酸を生成させ、生成したマンノース−６−リン酸をマンノースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）でフルクトース−６−リン酸へ異性化し、さらに、フルクトース−６−リン酸をグルコースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）でグルコース−６−リン酸に異性化後、検体中のマンノース量に応じて生成したグルコース−６−リン酸を、補酵素の存在下にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）を用いて酸化し、この反応によって生じた補酵素の還元体を分光光度計で測定するものである（Clin. Chem. 30(2) p293-294(1984)）。
【０００９】
この酵素系でマンノースを測定する場合、ヘキソキナーゼはグルコースもリン酸化するため、多量のグルコース−６−リン酸を生じ、これがグルコース−６−リン酸脱水素酵素と反応することになる。特に、ヒト血清中においては、グルコース量はマンノース量の１００倍ぐらいに達するため、測定前に、効率的に除去しておく必要がある。Soyama等（Clin. Chem. 30(2) p293-294(1984)）と Akazawa等（J. Clin. Endocrinol. Metab. 62(5) p984-989(1986)）は、グルコースオキシダーゼを用いてグルコースを除去する方法を報告しているが、グルコースの除去が不完全であったり、長時間に反応するとマンノースまで反応してしまうという問題があった（Clin. Chem. 43(3) p533-538(1997)）。また、James等は、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２）を用いてグルコースを選択的にリン酸化し、生じたグルコース−６−リン酸をアニオン交換樹脂を充填した遠心型のミニカラムで吸着除去後、吸着されずに通過液中に回収されたマンノースを、前記の酵素を用いたマンノース測定法で検出している（Clin. Chem. 43(3) p533-538(1997)）が、煩雑な遠心操作を必要としていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このように、１液の中でグルコースを効率的に除去し、そのまま引続きマンノースを測定する簡便な方法は未だ完成しておらず、生化学検査用の汎用機に適用できていない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、検体中に存在するマンノースを、グルコースの誘導体として検出するマンノース測定法において、予め、検体をピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素、又は、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素とグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素を組み合わせて処理し、検体中に存在するグルコースを完全に除去してからマンノースを測定すれば、簡便にマンノースを定量できることを見いだし、本発明に至ったものである。
【００１２】
即ち、本発明は、
（１）検体中のマンノースを測定する際に、予め検体中に含まれるグルコースをグルコースの２位酸化酵素を用いて除去することを特徴とするマンノースの定量法
（２）グルコースの２位酸化酵素がピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼである（１）記載のマンノースの定量法
（３）検体中に含まれるグルコースをグルコースの２位酸化酵素を用いて除去する際に、グルコースの１位酸化酵素を併用する（１）又は（２）の方法
（４）グルコースの１位酸化酵素がグルコースオキシダーゼである（３）に記載のマンノースの定量法
（５）検体中のマンノースの定量を、予めグルコースを除去した検体中のマンノースを、酵素を用いて順次マンノース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸に変換し、生成するグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いて検出し、定量する（１）から（４）のいずれかの方法
（６）検体中に含まれるグルコースを除去する際に、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼとグルコースオキシダーゼを併用することを特徴とするグルコースの除去方法、
に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の検体とは、臨床的にマンノース濃度を測定する意義のあるものであれば何であってもよいが、特に、血清、血漿、尿、髄液などの体液があげられる。
【００１４】
本発明のグルコースを除去する方法とは、グルコースの２位酸化酵素、又は、グルコースの２位酸化酵素とグルコースの１位酸化酵素とを組み合わせてグルコースを効率的に完全に酸化し、マンノースの測定には妨害しないような物質に変換する方法である。本発明のグルコースの２位酸化酵素とは、酸素を電子受容体とするピラノースオキシダーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼや、酸素やＮＡＤ（Ｐ）以外のものを電子受容体とする脱水素酵素がある。ＮＡＤ（Ｐ）は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及び／又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のことを意味する。
本発明のグルコースの１位酸化酵素とは、酸素を電子受容体とするグルコースオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）を電子受容体とするグルコース脱水素酵素（EC1.1..1.47, EC1.1.1.118, EC1.1.1.119)や酸素やＮＡＤ（Ｐ）以外のものを電子受容体とするグルコース脱水素酵素（EC1.1.99.10)などがある。グルコースの除去に必要なそれぞれの酵素の量は、グルコースの２位酸化酵素については０．１〜５００単位／ｍＬ、好ましくは、１〜１０単位／ｍＬ濃度になるように添加すればよい。グルコースの１位酸化酵素ついては０．１〜５０００単位／ｍＬ、好ましくは、１〜１００単位／ｍＬ濃度になるように添加すればよい。
なお、グルコースの１位酸化酵素が脱水素酵素の場合には、０．１〜５００単位／ｍＬ好ましくは０．５〜１０単位／ｍＬ濃度になるように添加する。又、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素とグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素との相対活性比は通常１：１００〜１００：１、好ましくは１：１０〜１０：１であればよい。なお、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼとグルコースの１位酸化酵素として脱水素酵素を用いる場合の相対活性比は通常１：１０〜１００：１、好ましくは、１：１〜１０：１であればよい。
【００１５】
本発明のピラノースオキシダーゼとは、グルコースの２位を酸化する酵素で、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）の酵素委員会でＥＣ１．１．３．１０と分類されるものであれば何であってもよく、酵素の由来については特に限定されないが、グルコースと比較した場合のマンノースの相対反応性が１．５％以下で、グルコース除去の際に、実質上、マンノースと反応しないものが好ましい。具体的には、Polyporus obtusus由来のピラノースオキシダーゼがあげられる。
【００１６】
本発明のＬ−ソルボースオキシダーゼとは、Ｌ−ソルボースの５位を酸化する酵素で、かつグルコースの２位も効率よく酸化する性質があり、Ｉ．Ｕ．Ｂ．の酵素委員会でＥＣ１．１．３．１１と分類されるものであれば何であってもよく、酵素の由来については特に限定されないが、グルコースと比較した場合のマンノースの相対反応性が１．５％以下で、グルコース除去の際に、実質上、マンノースと反応しないものが好ましい。
【００１７】
本発明のグルコースオキシダーゼとは、グルコースの１位酸化酵素で、Ｉ．Ｕ．Ｂ．の酵素委員会でＥＣ１．１．３．４と分類されるものであれば何であってもよく、酵素の由来については特に限定されない。
【００１８】
本発明の検体中のマンノースを測定する方法としては、検体中に存在する物質のうちで、グルコース以外には反応する成分が実質的にない程度にマンノースに対して特異性の高い酵素を用いるマンノースの定量法が好ましい。マンノースに対して特異性の高い酵素を用いる方法であれば、マンノース酸化酵素単独でも、複数の酵素を組み合わせた系でもよく、公知の方法に従って行うことができる。複数の酵素を組み合わせるマンノースに特異的な方法としては、例えば、検体中のマンノースを、酵素を用いて順次マンノース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸に変換し、生成するグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）を用いる方法が使用できる（Clin. Chem. 30(2) p293-294(1984)）。ここでは、マンノースをリン酸化してマンノース−６−リン酸を生成させるためにはヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）を、マンノース−６−リン酸からフルクトース−６−リン酸への異性化にはマンノースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）を、フルクトース−６−リン酸からグルコース−６−リン酸への異性化にはグルコースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）を使用している。
【００１９】
マンノースを定量する方法としては、マンノースを変換する最終酵素としてマンノースデヒドロゲナーゼやグルコース−６−リン酸脱水素酵素などの脱水素酵素を用いて、これらの酵素反応の結果生じる補酵素の還元体、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）や還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）（両方を合わせてＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略す）の吸光度を直接測定したり、ジアホラーゼや１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト（1m−ＰＭＳ）の存在下にＮＡＤ（Ｐ）Ｈでテトラゾリウム塩類を還元し、生じたフォルマザンの吸光度を測定する高感度な方法が用いられる。さらに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのより高感度な測定法としては、1m−ＰＭＳなどの電子伝達体の存在下にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを溶存酸素で酸化し、スーパーオキシドラジカルや過酸化水素を発生させ、これらをルミノールやイソルミノールなどを用いる化学発光により測定する方法や、従来から汎用されている過酸化水素を高感度で測定する方法がある。また、微生物由来の生物発光酵素系で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法もまた使用できる。
【００２０】
【実施例】
以下に、参考例、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１  グルコース除去法の検討
健常者の血清を、３つの方法（表１）で処理後、残存するグルコースを液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）で定量し、グルコース残存割合を求めて比較した。微生物由来のグルコースオキシダーゼ（Ｇ１ＯＤ）（オリエンタル酵母（株）社製）を用いた「方法１」では、約３０％のグルコースが残存し、前処理法としては、不完全であった。一方、Polyporus obtusus 由来のピラノースオキシダーゼ（Ｇ２ＯＤ）（宝酒造（株）社製）を用いた「方法２」と、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤを組み合わせた「方法３」では、グルコースは完全に除去されていた。
【００２１】
0004039591.tif 000002
１）略号は、ＣＡＴ：カタラーゼ（シグマ社製）、Ｍ−Ｔ緩衝液：トリス−マレイン酸緩衝液。
２）方法３で、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤを蒸留水に変えたものを対象（１００％）とし、グルコースの残存割合を計算した。
【００２２】
なお、残存するグルコースの分析には、デガッサー（880-50）、カラムオーブン（860-CO）、移動相ポンプ（880-PU）からなる日本分光（株）のＨＰＬＣシステムを用いた。分画分子量３万の遠心限外濾過チューブ（Ultrafree-MC、ミリポア社）で除蛋白した反応液２０μＬを、８０℃に保温した糖分析用カラム（Waters Sugar Pak、ウォターズ社製）にチャージし、移動相として蒸留水を０．５ｍＬ／分の流速で流しグルコースを分離した。検出には、示差屈折率検出器（Shodex RI SE-51、昭和電工（株）製）を用い、ピークの解析には、クロマト・インテグレータ（D-2500、日立製作所（株）製）を用いた。
【００２３】
実施例２  血清中のマンノースの定量
患者血清を想定し、４００μＭのマンノースを添加した健常者血清を検体として、実施例１のグルコース除去法の「方法２」及び「方法３」で処理後、この反応液２６０μＬに、２５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μＬ、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）６．７ｍＭ、アデノシントリフォスフェイト（ＡＴＰ）１５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 を３０ｍＭ含む「補酵素溶液（ＮＡＭ）」２０μＬ、酵母由来のヘキソキナーゼ（ＨＫ、シグマ社製）、Leuconostoc mesenteroides由来のグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ、シグマ社製）、酵母由来のグルコースリン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ、シグマ社製）をそれぞれ５０Ｕずつ取り、４℃で１２，０００ｇ×１０分間遠心分離後、上清の硫酸アンモニウム溶液を取り除いた残査に２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）１ｍＬを加えて調製した「ＨＫ／Ｇ６ＰＤＨ／ＧＰＩ溶液」１５μＬ、酵母由来のマンノースリン酸イソメラーゼ（ＭＰＩ、シグマ社製）を１００Ｕ取り、４℃で１２，０００ｇ×１０分間遠心分離後、上清の硫酸アンモニウム溶液を取り除いた残査に２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）１ｍＬを加えて調製した「ＭＰＩ溶液」５μＬを加え、３７℃で１５分間反応させた。
【００２４】
検体中のマンノースに由来するグルコース−６−リン酸の酸化反応によって生じた補酵素の還元体ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計（JASCO V-530、日本分光（株）製）と記録計（JASCO RC-150、日本分光（株）製）で測定した。同時に、微量に存在する内因性フルクトースの影響を差し引くため検体ブランクとして、ＭＰＩ溶液を蒸留水に変え、検体と同様に処理した反応液の吸光度も測定した。マンノース濃度の計算は、標準液を検体としたときの標準液の吸光度差（標準液−標準液ブランク）をプロットした検量線に基づき、検体の吸光度差（検体−検体ブランク）から求めた。
【００２５】
Ｇ２ＯＤを用いた「方法２」と、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤを組み合わせた「方法３」で前処理した検体のマンノース値は、それぞれ、理論値の９６．０±０．５％（ｎ＝８）、９７．０±３．２％（ｎ＝２１）であった。何れの方法でも、ほぼ満足できる結果が得られ、どちらも血清マンノースの測定に利用できることが分かった。
【００２６】
実施例３  マンノース測定に影響する成分
マンノースの測定に干渉する物質を調べるため、マンノース４００μＭを添加した健常者血清に、各種血清成分を過剰となるように添加した。これらの血清を、実施例２に示した２つの方法で測定し、添加したマンノースの回収率を求めた。その結果を、表２にまとめた。アスコルビン酸、尿酸、ビリルビンとヘモグロビンは、いずれの測定法に対しても、ほとんど干渉しなかった。しかしながら、溶血は、両測定法に強く干渉した。一方、グルコースの添加は、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤで前処理した「方法３」では正確に測定できていたのに対し、Ｇ２ＯＤのみで前処理した「方法２」では、強く干渉し、添加したマンノースの約６０％しか回収できなかった。このことから、マンノース測定に干渉するグルコースの除去には、Ｇ１ＯＤとＧ２ＯＤの両者を組み合わせた方が、好ましいことが分かる。
【００２７】
0004039591.tif 000003
1)測定値は平均値±ＳＤ、括弧内は測定回数。
2)ビリルビン添加血清は、市販の標準血清「アナセラム−ＢＩＬ」（第一化学薬品社製）を健常者血清で希釈して調製した。
3)ヘパリン採血決液を、液体窒素で凍結後、融解して溶血し、ヘモグロビン濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように、この溶血液を健常者血清に添加して調製した。
【００２８】
実施例４  自動分析装置への適用検討
患者血清を想定し、４００μＭのマンノースを添加した健常者血清を、実施例１の「方法３」で前処理し、次のようにして測定した。ミクロセルに、血清３０μＬ、Ｇ１ＯＤ（１００Ｕ／ｍＬ）１０μＬ、Ｇ２ＯＤ（１００Ｕ／ｍＬ）  １０μＬ、ＣＡＴ（５００Ｕ／ｍＬ）  １０μＬ、 50mM Ｍ−Ｔ緩衝液（ｐＨ５．５） 200μＬを加えて攪拌してから、分光光度計の恒温装置付きセルホルダーにセットし、３７℃で５分間反応した。さらに、この反応液に、実施例２の「補酵素溶液（ＮＡＭ）」２０μＬ、「ＨＫ／Ｇ６ＰＤＨ／ＧＰＩ溶液」１５μＬ、２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μＬの割合で混合した「試薬混液」３３５μＬを加えてさらに２分間反応後、「ＭＰＩ溶液」５μＬを加え、３７℃で２０分間反応させた。
【００２９】
結果を図１に示した。図から明らかなように、「試薬混液」添加後の吸光度の上昇は無く、内因性のフルクトースはなく、且つ「方法３」によるグルコースの前処理は完全であることが分かる。また、「ＭＰＩ溶液」の添加により、血清に添加したマンノース＋内因性マンノースに相当する吸光度の増加がみられ、マンノースの定量が可能であることが分かった。このように、検体の入った同一のセルに、連続して試薬を添加するだけでマンノースの測定が可能であることが示され、このマンノース測定法は、広く臨床で使用されている生化学検査用の自動測定装置（汎用機）へ適用することができる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のグルコースの２位酸化酵素又は、これとグルコースの１位酸化酵素を組み合わせてグルコースを除去する前処理法は、マンノースをグルコース誘導体として検出するマンノース測定法に対し、測定を妨害する内因性グルコースの除去に有効であり、マンノースの生化学検査用の自動分析装置（汎用機）での測定を可能にした。
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】血清中のマンノース測定における反応のタイムコース
【図１】
0004039591.tif 000004