(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを有効成分とする、リンクプロテイン結合剤。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸への結合能及びリンクプロテインへの結合能を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを有効成分とする、バーシカン結合剤。
（Ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸への結合能及びバーシカンへの結合能を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、(1)ヒアルロン酸とリンクプロテインの双方に結合する「バーシカンの部分ポリペプチド」及び(2)ヒアルロン酸とバーシカンの双方に結合する「リンクプロテインの部分ポリペプチド」に関する。また本発明は、(1)のポリペプチド、(2)のポリペプチド、及びヒアルロン酸の３者が相互に結合した会合体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
【０００３】
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
Ｇｕ−ＨＣｌ：グアニジン塩酸
ＨＡ：ヒアルロン酸
ｂ−ＨＡ：ビオチン化されたＨＡ
ＨＡＢＰ：ヒアルロン酸結合性タンパク質
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ
ｂ−ＨＡＢＰ：ビオチン化されたＨＡＢＰ
ＬＰ：リンクプロテイン
ｂ−ＬＰ：ビオチン化されたＬＰ
ＮＥＭ：Ｎ−エチルマレイミド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルホニルフルオリド
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
非特許文献１には、バーシカン（versican）は、アグリカン（aggrecan）ファミリーに属するラージ・コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである旨が記載されている。しかしバーシカンが、ＨＡ及びＬＰと結合して会合体を形成することは知られていない。
【非特許文献１】
J. Biol. Chem., 268(19) p14461-14469 (1993)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
バーシカン分子やＬＰ分子中に存在する「ＨＡ等への結合部分」が同定されれば、その部分ポリペプチドを用いてＨＡ等の結合剤に応用することができる。また、もしバーシカン分子中の当該部分、ＬＰ分子中の当該部分、及びＨＡとの３者が相互作用して会合体を形成することが明らかになれば、これら２つの部分ポリペプチドとＨＡとから構成される安定な３者会合体を提供することができ、新規な医用素材・材料として利用できる可能性がある。
【０００５】
本発明はかかる観点からなされたものであり、バーシカン分子中に存在する「ＨＡ及びＬＰに結合する部分」からなるポリペプチド、ＬＰ分子中に存在する「ＨＡ及びバーシカンに結合する部分」からなるポリペプチド、これらのポリペプチドとＨＡとの３者から構成される会合体を提供することを目的とする。また本発明は、バーシカン分子中に存在する「ＨＡ及びＬＰに結合する部分」からなるポリペプチドを有効成分とするＨＡ結合剤及びＬＰ結合剤、ＬＰ分子中に存在する「ＨＡ及びバーシカンに結合する部分」からなるポリペプチドを有効成分とするＨＡ結合剤及びバーシカン結合剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、バーシカン分子中に存在する「ＨＡ及びＬＰとの結合部分」及びＬＰ分子中に存在する「ＨＡ及びバーシカンとの結合部分」を同定し、これらの部分を有効成分とするＨＡ結合剤、ＬＰ結合剤及びバーシカン結合剤を提供するに至り、本発明を完成した。
【０００７】
また本発明者は、バーシカン分子中に存在する当該部分、ＬＰ分子中に存在する当該部分、及びＨＡが相互に作用して極めて安定な会合体を形成することを見出し、この会合体を提供するに至り、本発明を完成した。
【０００８】
さらに本発明者は、前記部分をコードするＤＮＡを提供するに至り、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド（以下、本発明ポリペプチド１という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡへの結合能及びＬＰへの結合能を有するポリペプチド。
【００１０】
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド（以下、本発明ポリペプチド２という）を提供する。
（Ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡへの結合能及びバーシカンへの結合能を有するポリペプチド。
【００１１】
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド（以下、本発明ポリペプチド３という）を提供する。
（Ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡへの結合能及びバーシカンへの結合能を有するポリペプチド。
【００１２】
以下、本発明ポリペプチド１〜３をまとめて「本発明ポリペプチド」という。
【００１３】
また本発明は、本発明ポリペプチド１、本発明ポリペプチド２、及びＨＡが相互に結合してなる会合体（以下、本発明会合体１という）を提供する。
【００１４】
また本発明は、本発明ポリペプチド１、本発明ポリペプチド３、及びＨＡが相互に結合してなる会合体（以下、本発明会合体２という）を提供する。
【００１５】
また本発明は、本発明ポリペプチド１を有効成分とするＨＡ結合剤（以下、本発明ＨＡ結合剤１という）、本発明ポリペプチド２を有効成分とするＨＡ結合剤（以下、本発明ＨＡ結合剤２という）及び本発明ポリペプチド３を有効成分とするＨＡ結合剤（以下、本発明ＨＡ結合剤３という）を提供する。以下、これらをまとめて「本発明ＨＡ結合剤」という。
【００１６】
また本発明は、本発明ポリペプチド１を有効成分とするＬＰ結合剤（以下、本発明ＬＰ結合剤という）を提供する。
【００１７】
また本発明は、本発明ポリペプチド２を有効成分とする、バーシカン結合剤（以下、本発明バーシカン結合剤１という）を提供する。
【００１８】
また本発明は、本発明ポリペプチド３を有効成分とする、バーシカン結合剤（以下、本発明バーシカン結合剤２という）を提供する。
【００１９】
さらに本発明は、本発明ポリペプチド１をコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡ１という）、本発明ポリペプチド２をコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡ２という）及び本発明ポリペプチド３をコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡ３という）を提供する。以下、これらをまとめて「本発明ＤＮＡ」という。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態によって詳説する。
＜１＞本発明ポリペプチド
本発明ポリペプチド１は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡへの結合能及びＬＰへの結合能を有するポリペプチド。
また本発明ポリペプチド２は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである。
（Ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡへの結合能及びバーシカンへの結合能を有するポリペプチド。
また本発明ポリペプチド３は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである。
（Ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡへの結合能及びバーシカンへの結合能を有するポリペプチド。
【００２１】
天然に存在するポリペプチドには、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないポリペプチドも、本発明ポリペプチドに包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドである。
【００２２】
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、本発明ポリペプチド１についてはＨＡ及びＬＰへのいずれの結合能をも失わない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を、本発明ポリペプチド２及び３についてはＨＡ及びバーシカンへのいずれの結合能をも失わない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数をそれぞれ示し、例えば６００アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００２３】
また本発明ポリペプチドは、上記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含んでいる限りにおいて他のポリペプチドやペプチドのアミノ酸配列を含んでいても良い。すなわち本発明ポリペプチドは、他のポリペプチドやペプチドとの融合ポリペプチドであっても良い。
【００２４】
例えば、上記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとマーカーペプチドとの融合ポリペプチド等も本発明ポリペプチドに包含される。このような本発明ポリペプチドは、精製を容易にすることができるというメリットがある。上記マーカーペプチドとしては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、His、FLAG、CBP（カルモジュリン結合ポリペプチド）、GST（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合ポリペプチドは、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Hisタグとの融合ポリペプチドについては磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融合ポリペプチドについては抗FLAG抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合ポリペプチドは、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００２５】
「ＨＡへの結合能」、「ＬＰへの結合能」及び「バーシカンへの結合能」は、公知のアッセイ方法に準じて検出することができる。その具体例は後述の実施例（「実施例（６）」及び「結果（３）」等）を参照されたい。このような方法によって「ＨＡへの結合能」、「ＬＰへの結合能」又は「バーシカンへの結合能」を保持しているアミノ酸の欠失、置換、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００２６】
本発明ポリペプチドの製造方法は特に限定されず、後述の本発明ＤＮＡを適当な細胞で発現させることによって製造することができる。また天然物から単離されたものや、化学合成等によって製造されたものについても当然に本発明ポリペプチドに包含される。本発明ＤＮＡを用いた本発明ポリペプチドの製造方法については後述する。
【００２７】
なお、リンクプロテイン・ファミリーのメンバーとして、現在ＬＰ−１、ＬＰ−２（Bral1）、ＬＰ−３及びＬＰ−４（Bral2）が知られている。本発明ポリペプチド２はＬＰ−１のＢ−Ｂ’ドメインの配列に対応し、本発明ポリペプチド３はＬＰ−２のＢ−Ｂ’ドメインの配列に対応する。しかし本発明ポリペプチドとしての思想はこれらに限定されるものではなく、リンクプロテイン・ファミリーに属する他のメンバーにおけるＢ−Ｂ’ドメインの配列に対応するポリペプチドであってもよい。以下に説明する本発明会合体、本発明ＨＡ結合剤、本発明ＬＰ結合剤、本発明バーシカン結合剤及び本発明ＤＮＡにおける「本発明ポリペプチド」という用語についても同様に解釈されたい。
＜２＞本発明会合体
本発明会合体１は、本発明ポリペプチド１、本発明ポリペプチド２、及びＨＡが相互に結合してなる会合体である。
【００２８】
本発明会合体２は、本発明ポリペプチド１、本発明ポリペプチド３、及びＨＡが相互に結合してなる会合体である。
【００２９】
本発明会合体の構成成分である、「本発明ポリペプチド１」、「本発明ポリペプチド２」及び「本発明ポリペプチド３」についての説明は、前記の通りである。
【００３０】
本発明会合体の構成成分である「ＨＡ」の由来等は特に限定されず、鶏冠、臍帯、ＨＡを産生する微生物等から分離、精製されたＨＡ等を用いることができる。また、高分子のものに限らず、低分子のものや、オリゴ糖サイズのものを用いることもできる。
【００３１】
本発明会合体は、「本発明ポリペプチド１」、「本発明ポリペプチド２及び／又は本発明ポリペプチド３」及び「ＨＡ」の３者を、生理的条件下で共存せしめることによって製造することができる。「共存」の状態は、分子同士が接触しうるものである限りにおいて特に限定されない。また「共存」させる方法も、これら３者を同時に共存させてもよく、いずれか２者を共存させた後、これに残りの１者を共存させてもよい。
【００３２】
本発明会合体は非常に安定であって、本発明者が調べた範囲では４ＭのGu-HCl以外の溶液では解離させることができなかった。
＜３＞本発明ＨＡ結合剤
本発明ＨＡ結合剤１は、本発明ポリペプチド１を有効成分とするＨＡ結合剤である。また本発明結合剤２は、本発明ポリペプチド２を有効成分とするＨＡ結合剤である。また本発明結合剤３は、本発明ポリペプチド３を有効成分とするＨＡ結合剤である。
本発明ＨＡ結合剤の有効成分である「本発明ポリペプチド１」、「本発明ポリペプチド２」及び「本発明ポリペプチド３」についての説明は、前記と同様である。本発明ＨＡ結合剤は、これらのポリペプチドをそのまま有効成分として用いることができる。
【００３３】
本発明ＨＡ結合剤は、本発明ポリペプチドが有するＨＡ結合能を、ＨＡ結合剤として応用したものである。本発明ＨＡ結合剤は、ＨＡと結合させる目的で使用することができ、これによってＨＡの検出・測定、ＨＡの精製、ＨＡの修飾等を行うことができる。
【００３４】
本発明ＨＡ結合剤の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化ポリペプチド形態のいずれであってもよい。また、ＨＡ結合能に影響を与えない限りにおいて他の成分（例えば、医薬的又は試薬的に許容される担体等）を含んでいてもよい。
＜４＞本発明ＬＰ結合剤
本発明ＬＰ結合剤は、本発明ポリペプチド１を有効成分とするＬＰ結合剤である。
本発明ＬＰ結合剤の有効成分である「本発明ポリペプチド１」についての説明は、前記と同様である。本発明ＬＰ結合剤は、このポリペプチドをそのまま有効成分として用いることができる。
【００３５】
本発明ＬＰ結合剤は、本発明ポリペプチド１が有するＬＰ結合能を、ＬＰ結合剤として応用したものである。ＬＰ結合剤は、ＬＰと結合させる目的で使用することができ、これによってＬＰの検出・測定、ＬＰの精製、ＬＰの修飾等を行うことができる。
【００３６】
本発明ＬＰ結合剤の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化ポリペプチド形態のいずれであってもよい。また、ＬＰ結合能に影響を与えない限りにおいて他の成分（例えば、医薬的又は試薬的に許容される担体等）を含んでいてもよい。
＜５＞本発明バーシカン結合剤
本発明バーシカン結合剤１は、本発明ポリペプチド２を有効成分とするバーシカン結合剤である。
【００３７】
本発明バーシカン結合剤２は、本発明ポリペプチド３を有効成分とするバーシカン結合剤である。
本発明バーシカン結合剤の有効成分である「本発明ポリペプチド２」及び「本発明ポリペプチド３」についての説明は、前記と同様である。本発明バーシカン結合剤は、これらのポリペプチドをそのまま有効成分として用いることができる。
【００３８】
本発明バーシカン結合剤は、本発明ポリペプチド２及び本発明ポリペプチド３が有するバーシカン結合能を、バーシカン結合剤として応用したものである。バーシカン結合剤は、バーシカンと結合させる目的で使用することができ、これによってバーシカンの検出・測定、バーシカンの精製、バーシカンの修飾等を行うことができる。
【００３９】
本発明バーシカン結合剤の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化ポリペプチド形態のいずれであってもよい。また、バーシカン結合能に影響を与えない限りにおいて他の成分（例えば、医薬的又は試薬的に許容される担体等）を含んでいてもよい。
＜６＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡ１は、本発明ポリペプチド１をコードするＤＮＡである。また本発明ＤＮＡ２は、本発明ポリペプチド２をコードするＤＮＡである。また本発明ＤＮＡ３は、本発明ポリペプチド３をコードするＤＮＡである。
【００４０】
また本発明ＤＮＡ１は、「（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを包含する。
【００４１】
同様に本発明ＤＮＡ２は、「（Ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを包含する。
【００４２】
同様に本発明ＤＮＡ３は、「（Ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを包含する。
【００４３】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mM HEPES（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００４４】
本発明ＤＮＡの製造方法も特に限定されないが、例えば後述の実施例に記載の方法を用いることが好ましい。
【００４５】
本発明ＤＮＡとして、遺伝暗号の縮重による種々の異なった塩基配列を有するＤＮＡが存在することは、当業者にとって容易に理解されるところである。なお、本発明ＤＮＡ１として最も好ましいＤＮＡは、配列番号１で示されるＤＮＡである。また本発明ＤＮＡ２として最も好ましいＤＮＡは、配列番号３で示されるＤＮＡである。また本発明ＤＮＡ３として最も好ましいＤＮＡは、配列番号７で示されるＤＮＡである。
【００４６】
また本発明は、「本発明ＤＮＡを保持するベクター」、「このベクターによって宿主が形質転換された形質転換体」及び「この形質転換体を生育させ、その生育物から本発明ポリペプチドを採取することを特徴とする、本発明ポリペプチドの製造方法」としての思想をも包含する。
【００４７】
ここにいうベクターは、発現ベクターであることが好ましい。このベクターは、本発明ＤＮＡを公知のベクターに組込むことによって調製することができる。本発明ＤＮＡの公知ベクターへの組込みは、本発明ＤＮＡとベクターとの連結が可能となるように、これら双方を制限酵素等によって処理し、必要に応じて平滑化や粘着末端の連結を行った後、本発明ＤＮＡとベクターとを連結することによって行うことができる。このベクターの製造方法は、例えば後述の実施例に記載の方法を用いることができる。
【００４８】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
＜１＞材料等
まず、本実施例において用いた物質等を説明する。なお、本実施例で用いたプライマーを表１にまとめて示した。
【００４９】
【表１】
0004180881.tif 000002
（１）発現ベクター
サイトメガロウイルス・プロモーター、ウサギ β-グロビンのスプライシング領域(O'Hare et al., 1981)、ヒト インターロイキン-２受容体のシグナルペプチド配列(LaFlamme et al., 1992)、FLAGのエピトープ・タグ(Kodak Scientific Imaging Systems社製)、Xa因子の切断領域、及びマウス ラミニンγ１鎖のセグメント(Sasaki et al., 1987)を含有する発現ベクターpBFX(Watanabe et al., 1997)を、哺乳類における発現に用いた。
【００５０】
３２５アミノ酸からなるヒト バーシカンＧ１ドメイン断片をコードするcDNA断片を作成するため、pfuDNAポリメラーゼ(Stratagene社製)、Xho Iリンカー領域を有するプライマーＦ１（配列番号９）、及びBam HIリンカー領域を有するプライマーＲ３（配列番号１６）用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００５１】
反応は、「９４℃で２０秒間−６０℃で３０秒間−７２℃で２分間」から構成されるステップを２５サイクル行った。ＰＣＲで増幅された、ヒト バーシカンＧ１ドメイン断片をコードするDNA断片を、pBFXのXho I及びBam HIサイトに挿入した。得られたプラスミド(VerW/pBFXと命名した)を、以下のバーシカン遺伝子構築の基本ベクターとして用いた。
【００５２】
pBluescript II SK(-) にサブクローニングされた「バーシカンＧ１ドメイン断片をコードするcDNA断片」（鋳型）と、表１に示したプライマーセットとを用いて、バーシカンのサブドメインの発現ベクターの構築に用いた。サブドメインをコードするＰＣＲ産物を、同様に、pBFXのXho I及びBam HIサイトに挿入した。全てのコンストラクトのヌクレオチド配列は、自動DNAシーケンサー(ABI PRISIM 310)を用いて確認した。
【００５３】
なお表１中の下線部は、Xho IまたはBam HIリンカー部位を示す。バーシカン及びリンクプロテイン・コンストラクトを調製するために、以下のプライマーの組み合わせを用いた。
【００５４】
VerW：Ｆ１（配列番号９）とＲ３（配列番号１６）
VermutAB：Ｆ１（配列番号９）とＲ２（配列番号１５）
VermutBB'：Ｆ２（配列番号１０）とＲ３（配列番号１６）
VermutA：Ｆ１（配列番号９）とＲ１（配列番号１４）
VermutB：Ｆ２（配列番号１０）とＲ２（配列番号１５）
VermutB'：Ｆ３（配列番号１１）とＲ３（配列番号１６）
RLP：Ｆ４（配列番号１２）とＲ４（配列番号１７）
LPBB'γ：Ｆ５（配列番号１３）とＲ５（配列番号１８）
ヒト軟骨のＬＰの発現コンストラクト、及びＬＰのB-B'はpBFXを用いて同様に調製した。全長のcDNA及びB-B'をコードする部分を調製するために、ExTaq ポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）を用い、前記と同様の反応プログラムでＰＣＲを行った。ＰＣＲで増幅された「ＬＰをコードするDNA断片」をpBFXのXho I及びBam HIサイトに挿入した。得られたプラスミドをLP/pBFXと命名した。「ＬＰのBB'」とラミニンγ鎖との融合タンパク質をコードする発現プラスミド(LPBB'γ/pBFX)は、前記と同様にＰＣＲによって調製した断片をpBFXに挿入することによって構築した。
（２）組換タンパク質の発現と精製
293細胞（ATCC CRL 1573）を、10％(v/v) ＦＢＳとペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's)中で培養した。〜70％コンフルエントに達した６つのウエルプレート中の細胞を、１ウエルあたり2μgの発現ベクターDNAと6μlのFuGENE 6 TMトランスフェクション試薬(Roche社製)を用いて、試薬の説明書に従ってトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントをスクリーニングするために、細胞を650μg/mlのG418(Life Technologies社製)存在下で１０日間培養し、トランスフェクタントのプールをさらにコンフルエントになるまで増殖させた。コンフルエントに達したディッシュ（直径15cm）１０枚分の細胞を用いて、組換タンパク質を調製した。この細胞を、無血清の順化培地(conditioned medium)中で３日間培養し、この順化培地を出発サンプルとして用いた。フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)(2mM)とＮＥＭ(10mM)を添加した後、サンプルを20,000 x ｇで60分間超遠心し、この上清を、平衡化バッファー(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.15M NaCl)で予め平衡化したanti-FLAG M2 カラム(1ml)にアプライした。カラムをこのバッファー(2ml)で３回洗浄した後、150μg/ml FLAGペプチドを含有するバッファー 5mlで溶出させた。Anti-FLAG M2 カラムからの溶出物を、10mM HEPES(pH 7.5)、0.15M NaCl、及び0.005％ 界面活性剤 P-20からなる溶液に対して透析し、SpeedVac(Savant社製)を用いて濃縮した。組換タンパク質を含有するフラクション（イムノブロット解析によってモニターした）をプールして、−８０℃で保存した。組換タンパク質の純度は、SDS-PAGEと銀染色によって評価した。
（３）天然バーシカンの調製
ネイティブなバーシカンは既報の方法で調製した(Schmalfeldt et al., 1998)。35gのマウスの脳を、４倍量の抽出バッファー(0.5M NaCl、50mM Tris(pH 7.5)、25mM EDTA、0.5％ Nonidet P-40、1mM PMSF、1μg/ml ペプスタチン及び1μg/ml ロイペプチンを含有する)を用いてWarning blender中でホモジナイズした。ホモジネートを４℃で５時間撹拌し、次いで100,000 x ｇで１時間遠心分離した。固体の硫酸アンモニウムを添加することによって、上清からタンパク質を分画沈殿した。最初の30％飽和のステップを経た後、上清中の硫酸アンモニウム濃度を60％に増加させることによって、バーシカンを含有するフラクションが沈殿した。４℃で一晩放置することによって完全に沈殿を形成させ、27,000 x ｇで45分間遠心分離することによって回収した。60％飽和での沈殿をバッファーＡ(50mM Tris-HCl(pH 6)、10mM EDTA、6M 尿素)で再溶解し、４℃で一晩、Ｑ−セファロース ＦＦ(Q-Sepharose FF)(ファルマシア社製)にバッチ吸着させた。吸着後の担体をカラムにつめ、0.3M NaClを含有するバッファーＡで洗浄した後、NaCl濃度を0.3Mから2Mまで段階的に上昇させることによって溶出させた。抗ＣＳ-αモノクローナル抗体を用いたスロットブロットにより同定されたバーシカン含有画分をプールし、蒸留水に対して十分に透析した。
（４）プロテオグリカン会合体の同定
予備試験として、ネイティブなバーシカン、ｂ−ＬＰ、及びＨＡを用いて、超遠心分離の最適条件を決定した。密度1.42mg/mlのCsClを用いてバーシカン画分がA1〜A3に分画されるとき、これらの分子は良好に分離された。
【００５５】
湿重量220mgのcmd/cmdマウスの軟骨を、５倍量の抽出バッファー（0.5M Gu-HCl、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、1mM PMSF、10mM NEM及び0.36mM ペプスタチンを含有する）中でホモジナイズした。ホモジネートを４℃で一晩撹拌し、キャップをしたポリカーボネートチューブ中で遠心分離(４℃下、10,000rpmで10分間)して清澄な溶液を得た。固体のCsClを添加して最初の密度を1.42mg/mlとし、遠心分離した(４℃下、10,000rpmで10分間)。遠心によって生じた浮遊皮膜を除去した後、この清澄な溶液をポリアロマーチューブに入れ、スイングローターを用いて10℃下、35,000rpmで96時間遠心分離した。
【００５６】
遠心後、チューブ中の溶液を底から６つに分画し(A1〜A6)、それぞれの画分をチューブに入れた。それぞれの分子を同定するため、組織を、4M Gu-HCl、Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、1mM PMSF、10mM NEM及び0.36mM ペプスタチンからなる溶液で抽出し、解離超遠心分離(dissociative ultracentrifugation)に付した。これらの分子は、ドットブロット及びイムノブロット解析によってモニターした。
（５）免疫沈降、イムノブロット、及びトランスブロット解析
ＬＰとＨＡのビオチン化は、既報の方法で行った(Yu and Toole, 1995)(Hoare et al., 1993)。
【００５７】
ネイティブなバーシカンとｂ−ＬＰを混合し、マイクロチューブ中、４℃で一晩インキュベートした。その後、サンプルをプロテインＡ セファロース(protein A Sepharose；ファルマシア社製)とともに４℃で30分間インキュベートすることによって処理し、次いで2μlの抗ＣＳ-αモノクローナル抗体を添加した。４℃で２時間インキュベートした後、10μlのプロテインＡセファロースゲル(50％ v/vスラリー)と共に４℃で２時間インキュベートすることによって免疫沈降を行った。ゲルを氷冷したバッファー(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、10mM NEM、1mM PMSF)で１０回洗浄し、7.5％ポリアクリルアミドゲルを用いて還元条件下で電気泳動し、ポリビニリデンジフルオリド(polyvinilidene difluoride；PVDF)膜に転写した。その膜を、５％スキムミルクを含有するTBS-T（20mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.05％ Tween20）中で１時間ブロッキングし、次いで2μg/mlのペルオキシダーゼ結合アビジンと共に、室温で１時間インキュベートした。反応は、ＥＣＬ(Amersham社製)によって可視化した。
【００５８】
サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって還元条件下又は非還元条件下で分離し、PVDF膜に電気的に転写した。この膜を、５％スキムミルクを含有するTBS-T中、室温で１時間ブロッキングした。イムノブロット解析するために、この膜を抗ＣＳ-α抗体(2000倍希釈)又は抗ＬＰ抗体(8A4；1000倍希釈)と共にインキュベートした。TBSTで３回洗浄した後、その膜をペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体(4,000倍希釈；Pierce)で処理した。TBSTで３回洗浄した後、ＥＣＬ(Amersham社製)で反応を可視化した。
【００５９】
トランスブロット解析するために、膜をブロッキングした後、25μg/mlのｂ−ＬＰ又は25μg/mlのｂ−ＨＡと共に室温で２時間インキュベートした。この膜を、2μg/mlのペルオキシダーゼ結合アビジン(Pierce社製)と共に１時間反応させ、TBSTで３回洗浄した後、ビオチン化したＬＰ又はＨＡと相互作用したタンパク質を検出するためにＥＣＬ(Amersham社製)で処理した。
（６）表面プラズモン共鳴結合試験
結合解析は、BIAcoreTM 1000を用いて行った。ＬＰ-相互作用のカイネティックスを調べる前に、コントロール試験として、種々の濃度の組換タンパク質をカルボキシメチル（ＣＭ）表面上にインジェクションすることによって、これらのタンパク質の非特異的結合や反応のベースライン（コントロール表面）を決定した。これらの「コントロール表面」における結果を、後の実験によって得られた結果から差し引くことによって、非特異的結合やサンプルの屈折率の変化による影響を除去することができる。組換ＬＰのＣＭ５センサーチップへの固定化、及び、ｂ−ＨＡのSAセンサーチップへの固定化は、150mM NaClを含有する10mM HEPES(pH 7.4)に溶解した「10μg/mlのrLP」及び「10μg/mlのb-HA」を、それぞれ10μl/分及び5μl/分の流速でフローセルにインジェクトすることによって行った。それぞれのフローセルに固定化する量は、サンプル溶液をインジェクションするボリュームを変化させることによってコントロールした。カイネティック試験においては、結合試験は、会合相及び解離相のいずれにおいても、25℃で、30〜50μl/分の一定の流速で行った。まず、ランニング・バッファー(10mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、及び0.005％界面活性剤 P-20)中の0.5〜3.0mMのタンパク質濃度のシリーズをフローセルにインジェクトし、共鳴単位(resonance unit)の変化を記録した。それぞれのランニングの後、センサーチップ表面の再生は、5mM HCl 15μlを２回インジェクションすることによって行った。速度定数の値は、メーカーから提供されたBIA evaluation 2.1 ソフトウエアを用いた非直線の回帰分析によって決定した。この方法は、(Karlsson, 1994) (Karlsson and Stahlberg, 1995)に詳述されている。
【００６０】
会合速度定数(ka)は、初期の会合時期におけるセンサーグラムの直線部分から算出した。解離定数(kd)は、サンプルのインジェクションが完了して約20秒後の初期の会合時期におけるセンサーグラムから算出した。見かけの平衡解離定数(KD)は、kd/ka比から算出した。カイネティック係数は、６〜10の独立した実験によって決定した。
【００６１】
３つの分子の相互作用を解析するために、３分子解析のためのコ・インジェクト・コマンド(co-inject command)を用いた。まず、ランニング・バッファー中の0.5〜3.0mMのタンパク質濃度のシリーズをフローセルにインジェクトし、共鳴単位(resonance unit)の変化を記録した。それぞれのランニングの後、センサーチップ表面の再生は、5mM HCl 15μl、10mM Gly-HCl(pH 3.0)、0.5M Gu-HCl、及び4M Gu-HClをそれぞれ２回インジェクションすることによって行った。
（７）免疫染色と、HABPによるHAの検出
マウスの組織を10％の緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、４μmの切片に薄切して、免疫染色を行った。軟骨の切片を調製するために、組織を0.5M EDTAで14日間脱灰した。抗体として、マウスのバーシカンに対する抗体（500倍希釈）、マウスのＬＰに対する抗体（100倍希釈）、及びマウスのアグリカンに対する抗体（500倍）を用いた。ＨＡの検出には、bHABP（100倍希釈）を用いた。
【００６２】
培養細胞の染色は以下の通り行った。N1511細胞(Kamiya et al., 2002)を、2.2mg/ml NaHCO3及び10％ FBSを添加したαＭＥＭ中で維持した。染色を行うために、トリプシンによって剥がした細胞を、前記の培地中でスライドグラス(Matsunami Glass Inc.)上に乗せた。免疫染色は、既報の方法(Watanabe and Yamada, 1999)で行った。
【００６３】
〜70％コンフルエントに達した６つのウエルプレート中の細胞を、１ウエルあたり1μgの発現ベクターDNAと3μlのTrans It Transfection試薬(Mirus Corporation)を用いて、試薬の説明書に従ってトランスフェクトした。細胞を48時間培養した後、培地を除去し、細胞をPBSで３回洗浄し、4％ パラホルムアルデヒドを用いて室温で15分間固定し、PBSで３回洗浄し、ビオチン化抗FLAG M2抗体(200倍希釈)又は抗ＣＳ-β抗体(2000倍希釈)を用いて室温、PBS中で１時間反応させた。
【００６４】
PBSで３回洗浄した後、スライドクラス上の細胞を、PBSに溶解したストレプトアビジン-FITC(1,000倍希釈) （FLAGを検出する場合）又はアレクサフルオロ・テキサス・レッド(Alexafluore texas red)(1,000倍希釈) （ＣＳ-βを検出する場合）を用いて室温で１時間処理した。最終的にこのスライドグラスをPBSで洗浄し、蒸留水中に浸漬させ、マウントした。蛍光は、オリンパス BX50顕微鏡(オリンパス社製)を用いて観察した。ＨＡの検出は、一次抗体及び二次抗体の代わりに、ｂ−ＨＡＢＰ(500倍希釈)及びストレプトアビジン-FITC(1000倍希釈)を用いて行った。
＜２＞結果
（１）天然バーシカンはＬＰに結合する
バーシカンはＨＡと相互作用することが報告されているが(LeBaron et al., 1992)、バーシカンとＬＰとの相互作用については報告されていない。そこでまず、免疫沈降法によって、ネイティブなバーシカンがＬＰに結合するか否かを調べた。
【００６５】
マウスの脳から精製したバーシカンを、ｂ−ＬＰと混合し、抗ＣＳ-α抗体を用いて免役沈降した。沈降物中におけるバーシカンの存在は、抗ＣＳ-α抗体を用いたイムノブロットによって確認した（図１Ａ；右）。沈降物を、ＨＲＰ結合アビジンを用いてトランスブロット解析したところ、ｂ−ＬＰが検出されたことから、ネイティブなバーシカンがＬＰに結合することが示された（図１Ａ；左）。コンドロイチナーゼＡＢＣ処理した、または処理しないバーシカンを、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、膜に転写した。イムノブロットを抗ＣＳ-α抗体を用いて行った結果、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理していないバーシカンはスメアなバンドとして検出されたが、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理したバーシカンはシャープなバンドとして検出された（図１Ｂ；レーン１及び２）。膜を、ｂ−ＬＰ、次いでＨＲＰ−アビジンで処理した結果、１本のバンドと、バーシカンと同じスメアなバンドが観察された（図１Ｂ；レーン３及び４）。トランスブロット解析の特異性は、FLAG-アグリカン G1-ラミニンγの融合組換タンパク質を用い、AgMut13をポジティブコントロールとして確認した（図１Ｂ；レーン５及び６）。これらの結果から、ＬＰは現に膜上でバーシカンと相互作用していることが示された。
（２）バーシカン、ＬＰ又はアグリカンの種々の組換ドメインと、ＬＰとＨＡとの相互作用
次に、ＬＰ、バーシカンのＧ１ドメイン、及びアグリカンの種々の組換ドメイン及びサブドメインを、Ｎ末端にFLAGタグを有し、かつ、Ｃ末端にラミニンγ鎖を有する融合タンパク質として発現させた。ラミニンγ鎖は、発現させたタンパク質の可溶化に必須である。ＬＰの全長は、ラミニンγを有しない形で可溶性のタンパク質として発現させた（図２）。約300μgのそれぞれの組換タンパク質は、250mlの無血清の順化培地から得た。それぞれの発現タンパク質は、抗FLAG M2抗体カラムクロマトグラフィーによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によって見かけ上単一となる程度にまで精製した（データは示さない）。
【００６６】
これらの発現は、抗FLAG M2抗体を用いたイムノブロットによって確認した（図３Ｂ）。全ての組換タンパク質は、単一のモノメリックなバンドを示した。ただしVermutBについては、さらにダイマーであると思われる移動度の小さいバンドが検出された。
【００６７】
これらの組換タンパク質を用い、ＬＰとの相互作用に関与するサブドメインを、トランスブロット解析によって決定した（図３Ｃ）。ｂ−ＬＰは、バーシカンＧ１ドメインの「Ｂ」及び「Ｂ'」サブドメインを含有する「VerW」及び「VermutBB'」に結合したが、VermutAB、VermutA、VermutB、VermutB'及びラミニンγには結合しなかった。これらの結果から、バーシカンＧ１ドメインの「Ｂ−Ｂ'」領域が、ＬＰとの相互作用に必須であることが示された。
【００６８】
これに対し、アグリカンＧ１ドメインの組換タンパク質について調べた結果、「Agmut13」及び「Agmut16」はＬＰに結合したが、Agmut12は結合しなかった。この結果から、アグリカンＧ１ドメインの「Ａサブドメイン」がＬＰと相互作用することが示された。驚くべきことに、ＬＰ及びLPBB'γは、いずれもＬＰに結合しなかった。
【００６９】
我々は、ＨＡとの相互作用に必要な「アグリカンＧ１ドメインの最小領域」がＢ−Ｂ'であることを決定している(Watanabe et al., 1997)。Ｂ−Ｂ'は、他のアグリカンファミリーのプロテオグリカンや、ＬＰにも保持されている。バーシカンＧ１ドメイン中の「Ｂ−Ｂ'」はＬＰと相互作用することから、そのＢ−Ｂ'領域が実際にＨＡと相互作用するか否かについて検討した。
【００７０】
ＨＡ−トランスブロット解析に付した結果、既に報告されている「Agmut12」及び「Agmut13」(Watanabe et al., 1997)のみならず、「VerW」、「VermutBB'」、「ＬＰ」及び「LPBB'」もＨＡに結合した（図３Ｄ）。これらの結果から、バーシカン、アグリカン及びＬＰの「Ｂ−Ｂ'」領域が、ＨＡとの相互作用に必須であることが示された。
（３）BIAcoreTM システムを用いた、ＬＰ-又はＨＡ-結合機能の解析
組換タンパク質と、ＬＰ及びＨＡとの相互作用のカイネティックスを調べるために、BIAcoreTM バイオセンサーシステムを用いた。表２は、カイネティックスに関する結果の概要を示す。「VerW」、「VermutBB'」、「Agmut13」及び「Agmut16」はチップ上の組換ＬＰに結合したが、VermutAB、VermutA、VermutB、VermutB'、及びＬＰは結合しなかった。この結果から、ＬＰ−トランスブロットによって得られた結果が再確認された。ＬＰとの会合及び解離に関して「VerW」と「VermutBB'」は同様の挙動を示したことから、バーシカンＧ１のＡサブドメインはＬＰとの相互作用に対してほとんど影響を与えないことが示された。「Agmut13」と「Agmut16」はいずれもＬＰと相互作用するが、「Agmut16」は「Agmut13」に比して会合速度が低く解離速度が高く、「Agmut13」は「Agmut16」よりも解離平衡定数(KD)が3.1倍高い。このことは、「Ｂ−Ｂ'」領域がＡサブドメインとＬＰとの相互作用を増強させることを示している。バーシカンとアグリカンのそれぞれのＧ１ドメイン(VerWとAgmut13)を比較した結果、アグリカンのＧ１ドメインのKDは〜2.8倍低かった。
【００７１】
次に、これらの組換タンパク質のＨＡ-相互作用のカイネティックスを調べた。「VerW」、「VermutBB'」、「ＬＰ」及び「LPBB'γ」はＨＡと相互作用したが、VermutAB、VermutA、VermutB及びVermutB'は相互作用せず（表３）、この結果はＨＡ-トランスブロットの結果と一致した。Ａサブドメインを欠いているVermutBB'は、VerWに比してＨＡとの会合速度が低くて解離速度が高く、その相互作用はKDで比較して〜17倍弱いものであった。これらの結果は、ＡサブドメインはＨＡ結合活性を有さず、「Ｂ−Ｂ'」領域とＨＡとの相互作用を増強させることを示している。これに対して、Ａドメインを欠いているLPBB'γは、全長のＬＰに比して、ＨＡに対する相互作用が若干弱いことが示された。ＨＡに対する相互作用は、「Agmut13」についてはKD＝1.41 x 10-7 Mであり、「AgMut12」についてはKD＝3.15 x 10-7 Mであった。これらの結果は、我々の先のデータを支持するものである。３つの分子がその「Ｂ−Ｂ'」領域でＨＡと相互作用したが、ＬＰ及びバーシカンのＨＡとの相互作用は、アグリカンＧ１のＨＡとの相互作用に比して、それぞれ〜２２倍、〜８倍強かった。
【００７２】
結合ドメインのサイズが、認識されるＨＡの長さに関連すると考えられたので、種々のサイズのＨＡオリゴ糖を用いて阻害実験を行った。ＬＰをＨＡ６とプレインキュベートしたところ、そのセンサーチップ上でのＨＡとの相互作用は約５０％減少した。またＨＡ８糖とプレインキュベートしたところ、ＨＡとの相互作用は完全に阻害された（図４Ａ）。同様の結果は、VerWをＨＡオリゴ糖とプレインキュベートした場合に見られた（図４Ｂ）。
【００７３】
【表２】
0004180881.tif 000003
【表３】
0004180881.tif 000004
（４）バーシカン、ＬＰ、及びＨＡは安定な会合体を形成する
アグリカン、ＨＡ、及びＬＰは互いに作用することによって安定な会合体を形成する。アグリカンＧ１ドメインは、そのＡサブドメインにおいてＬＰと相互作用するが、バーシカンＧ１は「Ｂ−Ｂ'」領域で相互作用する。
【００７４】
BIAcoreTM システムを用いて、バーシカンＧ１が、ＬＰとＨＡの両方と相互作用して安定な複合体を形成するのか、それともＨＡをめぐってＬＰと競合するのかを調べた。BIAcoreTM システムでは、これら３つの分子の定量的な測定はできないが、オーバーレイ・センサーグラムのパターンによって相互作用の程度を調べることができる。まず、固定化されたＨＡチップのフロー・セルにVerWをインジェクションし、次いでＬＰをインジェクションした。その結果、VerWはＨＡと会合し、ＬＰはさらにそのフロー・セルと会合した。このことは、ＬＰが、ＨＡ−VerW複合体、又はＨＡのなかでVerWが結合していない領域と相互作用していることを示している。３つの分子の相互作用は、4M Gu-HClを用いた場合を除いて、ストレプトアビジンとビオチンとを解離させる程度の溶液を２回インジェクションしても解離しないほど強力であった。VerWの代わりにVermutBB'を用いた場合、同様のパターンが観察された。これらの結果は、ＨＡ、ＬＰ、及びバーシカンの「Ｂ−Ｂ'」領域は、相互に作用して安定な複合体を形成することを示している。
（５）３つの分子は、大動脈や軟骨において共に局在する
次に、バーシカン、ＨＡ、及びＬＰが共に局在する組織を、免疫染色及びｂ−ＨＡＢＰを用いて探索した。バーシカンは４つのスプライス・バリアント（V0、V1、V2及びV3）からなる。
【００７５】
V3(タンパク質として発現されていない)を除く３つの全てのバリアント形態を認識するために、ＣＳ-αとＣＳ-βの混合物を用いた。その結果、３つの分子の共存は、大動脈外膜と、関節軟骨表層においてのみ観察された。４週令マウスの胸部大動脈において、バーシカンはその壁の層全体にわたって局在していたが、ＬＰとＨＡの双方は外膜に局在していた。バーシカンは、その組織をコンドロイチナーゼＡＢＣで前処理した場合にのみ検出された。２週令マウスの成長板軟骨(growth plate cartilage)において、バーシカンは、主として休止期の軟骨細胞のinterteritorial zoneにおいて染色された。ＬＰは、肥大した軟骨細胞の細胞周縁において強く染色され、interteritorial zoneでは中程度の染色が見られた。ＨＡは、細胞周縁に高度に沈着し、かつ、拡散した状態で局在していた。これに対してアグリカンは、主として肥大前の軟骨細胞及び肥大した軟骨細胞の細胞周縁において染色された。
【００７６】
これらの分子は脳で発現していることが知られている(Schmalfeldt et al., 1998)ので、胎児及び成体の脳におけるバーシカン、ＬＰ、及びＨＡの局在を調べた。バーシカンは脳梁及び大脳において染色が見られた。ＬＰは主として海馬において、ＨＡは拡散した状態で染色が見られた。これらは免疫組織学的な結果は、大動脈外膜及び関節軟骨表層においてはバーシカン、ＨＡ及びＬＰのプロテオグリカン会合体が存在するが、脳では存在しないことを示唆している。これらの組織に加え、従来の報告と同様(Bode-Lesniewska et al., 1996)、バーシカンは毛包、動脈、静脈、及び平滑筋において染色された（データは示さない）。
（６）in vivoにおいてバーシカンはプロテオグリカン会合体を形成する
次に、バーシカンが、これらの組織においてＨＡとＬＰと共にプロテオグリカン会合体を形成して沈着しているか否かを調べた。正常な軟骨は多量のアグリカンを含有しており、バーシカン会合体の同定が困難であることから、アグリカン遺伝子の天然のノックアウトである軟骨マトリクス欠乏マウス（cmd/cmd）の軟骨を用いることとした。Cmd軟骨中における３つの分子の局在を調べたところ、バーシカンとＬＰは主として軟骨原基の周辺部分に局在していたが、ＨＡは拡散して存在した。この結果は、これら３つの分子がcmd軟骨の周辺に共に局在していることを示している。プロテオグリカン会合体を同定するために、会合塩化セシウム密度勾配超遠心法を用いた(Faltz et al., 1979)。Cmd軟骨から0.5M Gu-HClを用いて抽出されたサンプルを、会合条件下で塩化セシウム密度勾配超遠心に付した。バーシカンの大部分はA1〜A3の画分に存在し、断片化したと思われるものがA6画分に存在した。ＬＰの主要な画分はA5〜A6であったが、A1〜A3画分にも存在した。ＨＡは全ての画分で観察された。4M Gu-HClで抽出されたサンプルを、解離条件下で遠心分離にかけたところ、バーシカンの大部分がA3画分に検出された。これに対して、ＬＰとＨＡの大部分はA5〜A6画分に存在した。さらに、バーシカンとＬＰの存在はイムノブロット解析によっても確認された。A1〜A3及びD1〜D3の画分を、コンドロイチナーゼＡＢＣで処理してイムノブロットにアプライしたところ、バーシカンのコアタンパク質が観察された。ＬＰはA1〜A3画で観察されたが、D1〜D3画分では観察されなかった。４週令マウスの大動脈の抽出物を超遠心解析に付した場合にも、同様の結果が得られた（データは示さない）。これらの結果は、マウスの大動脈及びcmd軟骨が、バーシカン、ＬＰ及びＨＡのプロテオグリカン会合体を含有していることを示している。
（７）ＬＰは、バーシカンの沈着及びプロテオグリカン会合体の形成を促進するプロテオグリカン会合体の生理学的な意義を探究するために、バーシカンの合成をデキサメタゾンと副甲状腺ホルモン(PTH)によって誘導できる「N1511細胞」(Kamiya et al., 2002)を用いた培養細胞系を使用した。
【００７７】
誘導後４８時間目に、細胞外マトリクスへのバーシカンの沈着が見られたが、内在性のＬＰは観察されなかった（データは示さない）。ヒトの組換Flag-LPを過剰発現させると、細胞のマトリクス中への沈着が見られた。興味深いことに、高いレベルでバーシカンの沈着が観察された。同様に、Flag(Flag-LPBB'γ)のタグが付された、ＬＰの「Ｂ−Ｂ'」部分の細胞内での過剰発現によって、バーシカンの沈着が増加した。バーシカンの沈着の増加を確認するために、イムノブロット解析を行った。細胞破砕した後に細胞外マトリクスのサンプルを抽出し、これをコンドロイチナーゼＡＢＣで処理してイムノブロットに付したところ、Flag-LP及びFlag-LPBB'γを過剰発現させたサンプルにおいて、バーシカンコアタンパク質の量の有意な増加が見られた。これらの効果を定量的に評価するために、ドット・ブロット解析を行った。等量のバーシカンが検出されるようにサンプルをブロットしたところ、Flag-LPBB'γの量はFlag-LPの量に比べて明らかに多かった。このことは、同レベルのバーシカンを沈着させるためには、Flag-LPBB'γのより高レベルの発現が必要であることを示している。以上の結果から、ＬＰの「Ｂ−Ｂ'」領域が、プロテオグリカン会合体を形成させることによってバーシカンの沈着を増加させ、マトリクス形成を促進すること、及び、この効果は全長のＬＰよりも強いことが示された。
【００７８】
【発明の効果】
本発明ポリペプチドは、本発明会合体の原料、本発明ＨＡ結合剤、本発明ＬＰ結合剤、本発明バーシカン結合剤等の素材とすることができ、極めて有用である。
【００７９】
本発明会合体は、医用素材・材料として利用できる可能性があることから極めて有用である。特に、バーシカン、ＬＰ及びＨＡからなる会合体が、大動脈外膜と関節軟骨表層に局在すること、及び生化学的に生体内において会合体を形成していることが明らかにされたことから、バーシカンのプロテオグリカン会合体が、拍動性脈圧や関節加重等に対する物理的抵抗力に寄与していることが示唆される。したがって本発明会合体は、大動脈瘤破裂の治療、中等大の血管の再生医学、変形性膝関節症等の関節破壊疾患の予防、症状緩解、治療等に応用できる可能性があり、極めて有用である。
【００８０】
また本発明ＨＡ結合剤、本発明ＬＰ結合剤及び本発明バーシカン結合剤は、ＨＡ、ＬＰ、バーシカンの検出・測定、精製、修飾等を行うことができ、極めて有用である。
【００８１】
本発明ＤＮＡは、本発明ポリペプチドの製造等に用いることができ、極めて有用である。
【００８２】
引用文献
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ネイティブなバーシカンの、ＬＰに対する結合活性を示す図である。Ａ：ネイティブなバーシカンとＬＰからなる複合体の免疫沈降を示す。ネイティブなバーシカンと、ｂ−ＬＰを混合し、抗ＣＳ-αモノクローナル抗体と共に免疫沈降した。サンプルを、還元条件下で7.5％（左の図）又は５％（右の図）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。膜上のサンプルを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合アビジン（左の図）又は抗ＣＳ-α抗体（右の図）を用いて検出した。
Ｂ：ＬＰ-トランスブロット解析の結果を示す。コンドロイチナーゼＡＢＣで処理した、又は処理していないバーシカンを、非還元条件下で、５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を抗ＣＳ-α抗体を用いてイムノブロットし(レーン１及び２)又はｂ−ＬＰで処理した後にＨＲＰ−アビジンで処理した（レーン３及び４）。組換タンパク質（Agmut13、レーン５及び７；VerW、レーン６及び８）についても同様に電気泳動し、膜に転写した。その膜を、抗FLAG M2抗体（レーン５及び６）又はｂ−ＬＰ及びＨＲＰ−アビジン（レーン７及び８）を用いてイムノブロットした。
【図２】  Ａ：バーシカン、ＬＰ及びアグリカンの種々の組換ドメインの模式図を示す。Ｎ末端にFLAG タグを有する組換ドメインを、マウスのラミニンγ鎖との融合タンパク質として発現させた。ラミニン鎖（単独）は、ネガティブ・コントロールとして用いた。
【図３】  バーシカン、ＬＰ及びアグリカンの種々の組換ドメインと、ＬＰ及びＨＡとの相互作用を示す図である。
Ｂ：抗FLAG M2抗体を用いたイムノブロット解析によって確認された、組換タンパク質の発現を示す図である。組換タンパク質は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(7.5％)によって分離した後、抗FLAG抗体を用いたイムノブロット解析に付した。
Ｃ：ｂ−ＬＰを用いたトランスブロット解析の結果を示す図である。
Ｄ：ＨＡを用いたトランスブロット解析の結果を示す図である。
【図４】  BIAcoreTM システムを用いた３つの分子の相互作用の解析結果を示す図である。
ｂ−ＨＡを、ＳＡセンサー・チップのフロー・セル上に固定化し、VerW及びＬＰ（図Ａ）、又はVerBB'及びＬＰ（図Ｂ）を、チップ表面に順にインジェクションした。３つの分子の相互作用は、4M Gu-HClを除いて、種々の溶液を２回インジェクションしても解離しないほど強いものであった。15μlの5mM HClをインジェクションした時のパターンを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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