(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的リボ核酸配列を増幅する方法であって、
ａ）該標的リボ核酸配列を含む核酸配列、
ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモーター、及び該標的核酸とのみ十分に相補的であって、該標的リボ核酸配列の３’端にて又はその付近にて該標的核酸と複合体を形成する、該プロモーターの３’側に位置するプライマー、から成る核酸配列から構成される１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマー、
ＤＮＡポリメラーゼ、及び
該ＲＮＡポリメラーゼ、
から実質的に構成される混合物を、該標的リボ核酸配列を増幅させ得るに有効な温度及び溶液中にてインキュベートする工程：
ｂ）鋳型として該標的リボ核酸配列を用い、該標的リボ核酸配列と相補的なＲＮＡ配列の多数のコピーを産生する工程、
を含む方法。
【請求項２】
該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーが、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸張され、該標的リボ核酸配列の複合体を形成し得る少なくとも１つの非改変プロモーター−プライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーの少なくとも１つが、以後の処置から核酸伸張反応を防止又は減少させる改変ヌクレオチドをその３’端に含む改変プロモーター−プライマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーが、以後の処置から核酸伸張反応を防止又は減少させる改変ヌクレオチドをその３’端に含む１つ又はそれ以上の改変プロモーター−プライマーと、１つ又はそれ以上の非改変プロモーター−プライマーとを、増幅を行なうに有効な比率で含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーが、１つ又はそれ以上の改変プロモーター−プライマーと、１つ又はそれ以上の非改変プロモーター−プライマーとを、それぞれ約１５０：１から１：１の比率で含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーが、１つ又はそれ以上のリボヌクレオチド、３’ターミナル・ホスホロチオエートデオキシヌクレオチド、３’−ＲＳ、３’−アルカン−ジオール残基、又は３’−コルジセピンの付加によって改変されている、請求項３、４又は５に記載の方法。
【請求項７】
該混合物が、
該標的リボ核酸配列が関与する伸張反応をある箇所で停止させるような規定を該標的リボ核酸配列の５’端に創製させる物質であって、該温度及び該溶液中にて該標的リボ核酸配列の５’端と複合化できる、該標的リボ核酸配列の５’端と十分に相補的な核酸配列を含む物質、
をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該混合物が１つ又はそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該標的核酸が、該標的リボ核酸配列と該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーとの間に形成される複合体内に存在しないヌクレオチドをその３’端に含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該標的リボ核酸配列の３’端を化学的若しくは酵素学的分解又はプロセッシングにより生成させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該化学的若しくは酵素学的分解又はプロセッシングがエキソヌクレアーゼによる処理を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該混合物がＲＮアーゼＨ活性をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
該インキュベートが実質的に一定温度である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
該ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼから成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該混合物を、工程（ｂ）の後に核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて検定する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法に従い、標的リボ核酸配列を増幅するためのキットであって、
（ａ）ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモーター、及び標的リボ核酸配列とのみ十分に相補的であって、該標的リボ核酸配列の３’端又はその付近にて該標的核酸と複合体を形成する、該プロモーターに対して３’側に位置するプライマー、から成る単一の核酸配列から実質的に構成される１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーであって、改変プロモーター−プライマーと非改変プロモータープライマーとの両者を、増幅を行なうに有効な比率で含む該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマー、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｃ）該ＲＮＡポリメラーゼ、
を含むキット。
【請求項２１】
該ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
該逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素及びＭＭＬＶ逆転写酵素から成る群より選択される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
該ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージＴ７、Ｔ３又はＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項２０〜２２のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】
１つ又はそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
ｐＨ、イオン強度又は温度が有効に変更することなく、有効な増幅に必要な試薬を含む溶液、又は
該溶液、該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマー、該逆転写酵素、及び該ＲＮＡポリメラーゼを含む組成物、
をさらに含む、請求項２０〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーが３’ターミナル・ホスホロチオエートデオキシヌクレオチド、３’−ＲＳ、３’−アルカン−ジオール残基、又は３’−コルジセピンを含む、請求項２０〜２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
該１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマーが３’アルカン−ジオール残基を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
核酸ハイブリダイゼーション検定に適したプローブをさらに含む、請求項２０〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
該プロモータープライマーが配列番号１、６、１０及び１４から成る群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項３０】
該ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号４、５、８、９、１２、１３、１６及び１７から成る群より選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項３１】
該プローブが配列番号２、３、７、１１及び１５から成る群より選択される、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は特定の核酸配列、即ち「標的配列」のコピー数を増大させる（又は増幅の）技術分野に属する。標的配列は単独で、又は同種もしくは異種の核酸混合物中にある大量なもしくは少量の１成分として存在している場合がある。核酸の混合物は診断試験、環境試験用に、検索研究用に、クローニングなどの他の工程のための試薬もしくは材料の調製用に、又は他の目的から取り出される試料の中に見いだすことができる。
特定の核酸配列の選択的な増幅は、特異性を維持し、種々の研究操作の感度、簡便性、正確さ及び信頼度を増大させ、種々の目的で特定のオリゴヌクレオチドの豊富な供給源を提供しつつ、診断及び環境検定並びに他の使用の感度を増大させるうえで重要な価値を有している。
本発明は簡便に実施できることから、環境及び診断試験に使用するのに特に適している。
発明の背景
特定の核酸配列を検出及び／又は定量するのは、微生物を同定し分類し、感染症を診断し、遺伝子異常を発見し特性化し、癌に関連する遺伝子変化を同定し、疾患に対する遺伝子感受性を研究し、そして種々のタイプの処置に対する応答を測定するうえで益々重要になっている手法である。このような手法は食料品、環境試料、貯蔵種子、及び特定微生物の存在をモニターすることが必要である他のタイプの材料中の微生物を検出し定量するために広く使用できることも見いだされている。また、法廷科学、人類学、考古学及び生物学の分野への適用も見いだされており、ここでは核酸配列の関連性を調べ、犯罪容疑者を確定し、実父確定議論を解決し、系統樹及び系統発生樹を作成し、そして種々の生活形態の分類に役立たっている。
特定の核酸配列を検出し定量するための共通する方法は核酸ハイブリダイゼーションである。この方法は、相補的な又は実質的に相補的な配列を含有する２つの核酸ストランド（核酸鎖）が適当な条件下にて特異的に会合して２本鎖構造物を形成できる能力を基礎としている。特定の核酸配列（「標的配列」として知られる）を検出し及び／又は定量するため、その標的配列と相補的な配列を含有する標識したオリゴヌクレオチド（プローブとして知られる）を調製する。「スクリーニング」として普通に知られる工程では、このプローブを、標的配列を含有すると疑われる試料と混合し、ハイブリッド（雑種）形成に適した条件を作り出す。プローブは、標的配列が試料中に存在するならその標的配列とハイブリダイズする。次いで、種々の方法のいずれかにより、１本鎖プローブからプローブ−標的配列のハイブリッドを分離する。得られたハイブリッドの標識の量を測定し、試料中の標的配列の量の指標とする。
核酸ハイブリダイゼーション検定の感度はプローブの比活性、ハイブリダイゼーション反応の速度及び程度、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしないプローブとを分離するための方法の能力、及び検出できる標識の感度によって主として限定される。最良の条件下では、上記のような直接ハイブリダイゼーション法は約１×１０5から１×１０6標的分子を検出できる。しかし、最も感度の高い操作は臨床及び環境のルーチン試験に必要な多くの特徴、例えば迅速さ、簡便さ及び経済性を欠く場合がある。さらに、最も感度の高い操作の感度でさえも、多くの所望の適用にとって充分でない場合がある。
種々の成分間の相互作用、及びこのタイプの検定の成分工程の結果として、感度と特異性の間には殆ど常に、逆の関係が存在する。従って、検定感度を増大させる（例えばプローブの比活性を増大させる）ために採用する手段により、偽陽性の試験結果のパーセンテイジが高められる場合がある。この感度と特異性の関係はハイブリダイゼーション検定の感度を向上させるうえで重要な障壁である。この問題の１つの解決法は、増幅操作によって、存在する標的配列の量を特異的に増大させることであろう。試料中に残った配列にコードされている情報の有意な部分を増幅することなく、標的配列のユニーク部分を増幅できれば、特異性を損なうことなく、同時に感度を有効に増大させることができる。
「ポリメラーゼ鎖反応」又は「ＰＣＲ」と呼ばれる核酸配列を特異的に増幅する方法はMullisら［米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３２０２号、及び第４，８００，１５９号並びに欧州特許出願８６３０２２９８．４、８６３０２２９９．２及び８７３００２０３．４並びにMethods in Enzymology, 155巻，1987, 335-350頁を参照のこと］に記載されている。ＰＣＲ操作は、相補配列の各ストランドを鋳型として使用し、同時に起こるプライマー依存的な核酸合成の反復サイクルを利用するものである。ＰＣＲ操作では、相補的な両ストランドのコピーが合成される。ＰＣＲを簡便にするため、プログラム可能な温度サイクリング装置が必要である。
ＰＣＲ操作はＲＮＡ転写について適用されており、それはＰＣＲ反応に使用する１つのプライマーにプロモーター配列を組込み、次いで幾つかのサイクルのＰＣＲ操作による増幅の後に１本鎖ＲＮＡの転写のための鋳型として２本鎖ＤＮＡを使用することによって行われている［例えば、Murakawaら，DNA 7:287-295（1988）を参照］。
特定の核酸配列を増幅するための他の方法は、プライマーのハイブリダイゼーション、伸長工程及び変性工程の一連のサイクルを包含し、プロモーター配列含有プライマーを使用してプロモーター配列を含有する中間２本鎖ＤＮＡ分子を得ることである。２本鎖ＤＮＡは標的配列の多重ＲＮＡコピーを調製するために使用される。得られたＲＮＡコピーはさらなるコピーを調製するための標的配列として使用でき、それにより多くのサイクルを行うことができる。［例えば、Burgら，ＷＯ ８９／１０５０；Gingerasら，ＷＯ ８８／１０３１５（「転写増幅システム」又はＴＡＳと呼ばれることがある）；Kacian及びFultzに対するＥＰＯ出願第８９３１３１５４；Davey及びMalekに対するＥＰＯ出願第８８１１３９４８．９；MalekらのＷＯ９１／０２８１８を参照］
Walkerら，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.89:392-396（1992年6月）は従来技術とは認められないが、ＤＮＡ鋳型と共に使用するためのオリゴヌクレオチド誘導化増幅方法を開示しており、ここでは伸長反応、従って増幅を行うために、最初の標的配列を調製するための制限エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ／ＤＮＡ複合体に切れ目（ニック）を入れるための酵素を使用する。Beckerら，ＥＰＯ出願第８８３０６７１７．５は、プライマーを標的配列とハイブリダイズし、得られた二重らせん構造体を切断した後、伸長反応及び増幅を行う増幅方法を開示している；プライマーがハイブリダイゼーション領域を越えて伸長する場合、伸長の前に切断することが必要であり、そのプライマーは３’末端をブロックして、増幅前に起こる望ましくない伸長反応を防止しなければならない。Kramerらの米国特許第４，７８６，６００号には、ＲＮＡ標的配列における多数のコピーのプローブ配列をＱβレプリカーゼを使用して調製する方法が記載されている。UrdeaのＷＯ ９１／１０７４６にはＴ７プロモーター配列を組込むシグナル増幅方法が記載されている。
核酸を増幅する他の方法は、欧州特許公開３２０，３０８に記載されているリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）を包含し、ここでは少なくとも４つの別個のオリゴプローブを使用する；２つのオリゴプローブは同じ標的ストランドの対角の末端と適当な方向性をもってハイブリダイズし、その結果第３及び第４のオリゴプローブは第１及び第２のオリゴプローブとハイブリダイズし、連結させると、変性し検出できる結合プローブを形成させることができる。他の方法は１９９１年５月１５日公開のＥＰＯ公開第０ ４２７ ０７３ Ａ２に記載されているものであり、これは従来技術を構成しないが、ここでは、ヘアピンを形成でき、そのヘアピン内に機能的なプロモーター領域を有しているパリンドローム・プローブを標的配列とハイブリダイズさせ、次いでその標的配列とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドと連結させ、ＲＮＡ転写体を作成できるとしている。
他の方法もオリゴヌクレオチド合成及びクローニングを包含している。
発明の概要
本発明は、温度、pＨ又はイオン強度などの反応条件を改変する必要がなく、かつ多くの別個のプライマー又はプロモーター、又はポリメラーゼ以外の、ＲＮアーゼＨ活性をも有する場合のある酵素を添加する必要もなく、標的核酸配列の多重コピーを合成することを目的とする。
本発明は、臨床、環境、法廷及び類似の試料中の特定の核酸標的配列を検出し及び／又は定量するための検定の１成分として及び種々の用途のために、特定の標的配列のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのコピーを多数調製するために使用することができる。本発明はまた、クローニングのための核酸標的配列のＤＮＡ又はＲＮＡの多重コピーを調製するため、又はプローブを作成するため、又は配列決定のためのＲＮＡ又はＤＮＡコピーを調製するためにも使用することができる。
本発明は、核酸標的配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から実質的に構成される混合物を、標的配列の３’末端にて又はその付近にてハイブリダイズするほど充分に標的配列の３’末端と相補的である「複合性の」配列を有する「プロモーター−プライマー」として知られる１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチド（即ち、プライマー）とインキュベートすることを特徴とする。プロモーター−プライマーはさらに、複合性配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含有している。
「にて又はその付近にて」とは、標的自身の３’末端を単に指す意味であり、その標的は検出しようとするＲＮＡ又はＤＮＡ分子のすべてである必要はない。例えば、「標的」は巨大なＲＮＡ分子内であってもＲＮＡ分子の小さな中心部分であることができる。
「１つ又はそれ以上」とは、反応混合物に添加されるプロモーター−プライマーがおよそ同じ標的配列のおよそ同じ位置で結合できるほど充分に類似しており（同じストランドにおいて±約１０塩基）、本発明の増幅を進行させることができるものを意味する。これは混合物に他のオリゴヌクレオチド、例えばプロモーター−プライマーのハイブリダイゼーションに役立つ「ヘルパー」オリゴヌクレオチドを供与することを排除するものでない。
先に使用している「実質的に構成される」とは、混合物が必須の反応体及び試薬をすべて包含していることを意味する。しかし、このような混合物は、本発明の増幅に定量的に影響しない酵素又は他の置換物質を含有することができ、また混合物は同じ標的配列又は「ヘルパー」オリゴヌクレオチドのための他のプロモーター−プライマーをも含有することができる。「ヘルパー」オリゴヌクレオチドはプロモーター−プライマー、又はプローブなどの他の複合性核酸と標的配列との複合体形成を助ける核酸配列であり、これは標的配列の３’末端の実際の配列によって決められる。このようなヘルパーオリゴヌクレオチドはHoganら，米国特許第５，０３０，５５７号に記載されているハイブリダイゼーションヘルパーオリゴヌクレオチドと同じ態様で使用され、即ち標的核酸が有意な二次構造を有しているとしても、プロモーター−プライマーとその標的核酸との結合を助けることに基づき使用される。このようにヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するという点では類似しているが、ヘルパーオリゴヌクレオチドが上記の操作の効率に影響を与えることなく増幅プロトコールに使用できることは驚くべき事項であった。
プロモーター−プライマー及び標的配列を、プロモーター−プライマー／標的配列のハイブリッドが形成され、ＤＮＡ合成が開始され得るような条件下におく。この反応では、複合性配列と標的配列とのハイブリダイズ複合体の隣接する位置から標的配列の３’末端がＤＮＡ伸長反応にて伸長すると考えられている。プロモーター配列はこの伸長反応の鋳型であり、それが最初のＤＮＡ伸長産物を産生し、それにより２本鎖プロモーター配列が調製される。プロモーター−プライマーの３’末端はさらに、第２のＤＮＡ伸長反応のためのプライマーとしても役立つことができるが、その反応では標的配列を鋳型として使用し、２本鎖核酸複合体が形成される：その複合体はＲＮＡ標的配列を使用するとＤＮＡ／ＲＮＡ複合体であり、ＤＮＡ標的配列を使用すると、ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体である。
次いで、第１のＤＮＡ伸長産物は、プロモーター−プライマーのプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼによって使用され、標的配列の多重ＲＮＡコピーが調製される。標的配列を含有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体又はＲＮＡ単独の場合、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体又はＲＮＡを「読み取って」、１本鎖ＲＮＡを調製することができることは予想外なことであり、従ってそれは本発明に有効である。
好ましい態様では、プロモーター−プライマーは、その方向での核酸の伸長を抑制し禁止する３’末端における又はその付近に改変ヌクレオチドを含有できる改変を有する。意外にも、本発明は改変されるプロモーター−プライマーの３’末端を用いて実施することができるのであり、改変及び非改変プロモーター−プライマーの混合物（又は２つの異なって改変されたプロモーター−プライマー）を使用すれば、非改変又は改変プロモーター−プライマーを単独で使用するよりも増幅効率が高められ、従ってコピー数が増大することは特に驚くべき事項である。プライマー伸長を防止し又は減少させるこのような有用な改変を創製するための方法は当業者に知られている。
標的配列がＤＮＡ又はＲＮＡからなる場合、本発明は別の態様として化学的又は酵素的分解又はプロセッシングによって標的配列の３’末端を創製することが挙げられ、その結果、その標的配列の３’末端をプロモーター−プライマーのプロモーター領域に沿って伸長させることができる。このような創製は、例えばＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド（例えば、ＤＮＡプロモーター−プライマーとＲＮＡ標的とのハイブリッド）にＲＮアーゼを作用させること、エキソヌクレアーゼによる処理、及び特定の制限エンドヌクレアーゼ（例えばＤＮＡ標的について）又はリボチーム［ribozymes］（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ標的による）による消化によって行うことができる。
別の好ましい態様では、本発明は１つ又はそれ以上の「ヘルパー」オリゴヌクレオチドを反応組成物中に包含することを特徴とする。
別の好ましい態様では、伸長反応又は転写反応のいずれかを終止させるように、核酸の標的ストランドの５’末端を規定することができる。このような規定を行う方法は当業者に知られており、例えば核酸の適当な配列（例えば、オリゴヌクレオチド）を標的配列の５’末端に複合化し、又は標的配列の５’末端に改変を施すことが挙げられる。
本発明はさらに、標的配列、プロモーター−プライマー、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素、及び増幅を可能とするに充分な試薬及び緩衝液条件から実質的に構成される組成物をも提供する。別の態様では、プロモーター−プライマーは改変及び非改変３’末端の両者を包含する。本発明はまた、改変及び非改変プロモーター−プライマーの混合物及び／又は本発明に使用するのに適した異なるプロモーター−プライマーの混合物を包含する組成物をも提供する。
本発明の典型的な検定の１つの例では、増幅しようとする標的核酸の試料を、適当な緩衝液、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三リン酸、１つ又はそれ以上のプロモーター−プライマー、ジチオトレイトール、及びスペルミジンを含有する緩衝濃縮物と混合する。次いで、この反応物を１００℃付近でインキュベートし、二次構造を変性してもよい。（この工程は標的が１本鎖ＲＮＡであり、プロモーター−プライマーも１本鎖である場合は必要でない）室温にまで冷却した後、逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼを加え、得られた反応物を数分から数時間、酵素が活性である適当な一定温度、例えば３７℃−４２℃でインキュベートする。次いで、この反応物にプローブ溶液を添加し、６０℃で１０−３０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解する溶液を加え、その反応物を６０℃で５−１０分間インキュベートし、そしてArnoldら，ＰＣＴ ＵＳ８８／０２７４６に記載されているように残余の化学発光を発光測定器で測定する［これは、「ＨＰＡ」法と呼ばれる。この文献の記載は引用によって本明細書に包含される］。本発明方法の産物は多くの他の検定系、又は当業者に知られている他の用途に使用することができる。
本発明はさらに、本発明の成分を組み込んだキットに関し、それにより本発明が簡便に実施できる。このようなキットはさらに、本発明を他の操作の一部とすることのできる他の材料を包含することができ、多重ウエル技法に適用することもできる。
定義
本明細書に記載している以下の用語は、特に明記しない限り、次の意味を有している。
Ａ．核酸
「核酸」とはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか、及び配列として存在することができかつ本発明の実施を妨げないヌクレオチド同族体又は他の分子を意味する。
Ｂ．鋳型
「鋳型」とは、核酸ポリメラーゼによってコピーすることのできる核酸分子である。鋳型はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれでもよく、またポリメラーゼに応じて、１本鎖、２本鎖又は部分的な２本鎖のいずれであってもよい。合成されたコピーはその鋳型と相補的である。
Ｃ．プライマー
「プライマー」は鋳型と充分に相補的であるオリゴヌクレオチドであり、従ってプライマーは（ハイブリダイズする条件下、例えば厳格（ストリンジェント）な条件下でのハイブリダイゼーション又は水素結合によって）鋳型とハイブリダイズし、逆転写酵素などのＤＮＡポリメラーゼによる合成開始に適しているプライマー／鋳型複合体を生成させるが、これは、鋳型と相補的なその３’末端に結合する共有結合する塩基を添加することによって伸長される。得られたものはプライマー伸長産物である。知られている実質的にすべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）には、ＤＮＡの合成を開始するために、オリゴヌクレオチドが１本鎖の鋳型と複合化すること（プライミング）が必要である。適当な環境下では、プライマーはプロモーター−プライマーの一部であることができる。このようなプライマーは一般に１０−１００塩基長であり、好ましくは２０−５０塩基長である。
Ｄ．プロモーター又はプロモーター配列
「プロモーター」又は「プロモーター配列」は、核酸分子に結合するシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素（トランスクリプターゼ））に認識され、特定の部位でＲＮＡの転写を開始させる特定の核酸配列である。このような転写酵素は結合のために一般にプロモーターとその相補配列が２本鎖であることを要求する；しかし、鋳型部分は２本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写プロモートの効率を大幅に変動させることのできる種々の異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始させるなら、そのプロモーター配列は転写される配列の一部でない。従って、このようにして産生されるＲＮＡ転写体はプロモーター配列を包含しない。
Ｅ．プロモーター−プライマー
プロモーター−プライマーはプロモーター及びプライマーからなる。これは、標的核酸配列の３’末端にて又はその付近にて複合化するほど充分に標的核酸配列の３’末端と相補的であるオリゴヌクレオチドであり、このことはプロモーター−プライマーが標的配列の末端の充分近くで複合化することで、検定、試験、クローニング又は他の用途における増幅核酸の要求性に見合うほどに標的配列を充分に増幅できることを意味する。標的核酸配列の３’末端（３’ターミナルとしても知られている）から伸長する相補的な核酸配列を創製するための鋳型としてプロモーター−プライマーを使用し、一般に２本鎖のプロモーターが得られ、これはその２本鎖を破壊することのできる変性又は酵素活性を受ける。
ＤＮＡ−又はＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによっても、プロモーター−プライマーの相補領域に対して標的配列の５’側の部分を鋳型として使用することにより、標的核酸分子に対する相補的なストランド（鎖）が創製される。
プロモーター−プライマーの３’末端は、伸長反応の進行を禁止又は抑制するように改変又はブロックすることができる。改変及び非改変プロモーター−プライマーの両者からなるプロモーター−プライマーの溶液は本発明の目的では、同じ核酸配列から実質的に構成される。改変プロモーター−プライマーは非改変プロモーター−プライマーと異なるプロモーター又はそれと異なる認識配列を含有しない。これは、約１０塩基以内であり、改変及び非改変プロモーター−プライマーが同じＲＮＡポリメラーゼによって認識され、同じ標的配列を認識することを意味する（正確に同じ位置である必要は必ずしもない）。好ましい態様では、改変及び非改変プロモーター−プライマー又は改変プロモーター−プライマーの混合物は改変を除いて同一である。プロモーター−プライマーの３’末端は当業者に周知の手法によってブロックすることができる。このようなプロモーター−プライマーは一般に４０−１００塩基長であり、好ましくは４０−６０塩基である。
Ｆ．標的核酸配列、標的配列
「標的核酸配列」又は「標的配列」は増幅するのが望まれる核酸配列を有し、これは１本鎖又は２本鎖のいずれでもよく、増幅しようとする配列の５’又は３’付近に、増幅できる又は増幅できない他の配列を包含することができる。
標的核酸配列はプロモーター−プライマーが本発明を実施するとハイブリダイズする複合性配列を包含している。標的核酸配列が元来１本鎖である場合、この用語は（＋）又は（−）ストランドのいずれかを意味し、また標的配列に相補的な配列をも意味する。標的核酸配列が元来２本鎖である場合、この用語は（＋）及び（−）の両ストランドを意味する。
Ｇ．プラス（＋）及びマイナス（−）ストランド
核酸合成の議論は、核酸二重らせん構造の２つの相補的ストランドを指定してこの用語を使用すれば、大きく単純化され明瞭になる。従来は、タンパク質又は構造ＲＮＡの調製に使用される配列をコードしているストランドを「プラス」ストランドと、そしてその相補配列を「マイナス」ストランドと呼んでいた。現在では、多くの場合、両ストランドは機能的であり、一方を「プラス」、他方を「マイナス」と呼称することは恣意的にちがいないことが知られている。それにもかかわらず、これらの用語は核酸の配列方向性を示すのに非常に有用であり、本明細書ではこの目的に沿ってこれらを使用し、「プラス」ストランドとはプロモーター−プライマーと複合化する元の標的配列のストランドを示すものとして使用している。
Ｈ．ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」とはＤＮＡの鋳型から相補的なＤＮＡのコピーを合成する酵素である。例えば、Ｅ.coli由来のＤＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼがある。知られているすべてのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは合成を開始させるために相補的なプライマーを要求する。適当な条件下では、特定のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡの鋳型から相補的なＤＮＡのコピーを合成できることが知られている。
Ｉ．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」又は「転写酵素」は、（普通は２本鎖の）プロモーター配列を有する２本鎖又は部分的に２本鎖のＤＮＡ分子から多重ＲＮＡのコピーを合成する酵素である。本発明は１本鎖のプロモーター、及びそれを認識するＲＮＡポリメラーゼをも包含することに留意すべきである。ＲＮＡ分子（転写体）の合成はプロモーターの直ぐ下流にある特定の部位から始まって、ＲＮＡ分子の５’→３’の方向で行われる。転写酵素の例は、Ｅ.coli由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファージＴ７、Ｔ３及びＳＰ３である。本明細書にて説明するように、転写酵素の中には、適当な条件下にてＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ共重合体を鋳型として使用できるものがある。
Ｊ．ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」又は「逆転写酵素」は、ＲＮＡの鋳型から相補的なＤＮＡのコピーを合成する酵素である。知られているすべての逆転写酵素もＤＮＡの鋳型から相補的なＤＮＡのコピーを作成する能力を有しており、従ってこれはＲＮＡ−及びＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼの両者となる。ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの鋳型を用いて合成を開始するにはプライマーが必要である。
Ｋ．ＲＮアーゼ  Ｈ
「ＲＮアーゼ Ｈ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡ部分を分解する酵素である。ＲＮアーゼ Ｈはエンドヌクレアーゼであってもエキソヌクレアーゼであってもよい。殆どの逆転写酵素は通常、ポリメラーゼ活性に加えてＲＮアーゼ Ｈ活性を含有している。しかし、付随するポリメラーゼ活性のないＲＮアーゼ Ｈの他の供給源が利用可能である。この分解により、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重らせんからＲＮＡを分離することができる。あるいは、ＲＮアーゼ Ｈは、ＲＮＡの部分が融解分離し、又はＲＮＡの部分をほぐすことができるようにＲＮＡを種々の位置で切断することができ、あるいは生成されたＲＮＡ断片はＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして利用することができる。
Ｌ．ハイブリダイズ、複合化
「ハイブリダイズ」及び「複合化」なる用語は、ワトソン−クリック塩基対合に従って二重らせんを形成（又は複合化）するに充分に相補的であるヌクレオチド配列間に二重らせんを形成することを意味する。プロモーター−プライマー又はプライマーが標的（鋳型）と「ハイブリダイズ」する場合、このような複合体（ハイブリッド）は、ＤＮＡ合成を開始させるＤＮＡポリメラーゼが必要とするプライミング機能に役立つほど充分に安定である。
Ｍ．改変プライマー又はプロモーター−プライマー
プライマー又はプロモーター−プライマーの３’末端は改変し又はブロックして、伸長反応をその進行から防止し又は抑制することができる。改変及び非改変のメンバーを共に含有するプライマー又はプロモーター−プライマーは本発明の目的では実質的に同じ核酸配列から構成される。換言すれば、改変プライマー又はプロモーター−プライマーは、改変及び非改変オリゴヌクレオチドの両者が標的核酸配列の同じ位置（±約１０塩基）で効率的にハイブリダイズし、その標的配列の増幅を妨害しない点で、その特異性の意味から異なる複合性配列（プライマー）を含有していない。さらに、改変プロモーター−プライマーは非改変プロモーター−プライマーと異なる認識配列（プロモーター）を含有しない。これは、約１０塩基以内で、改変及び非改変プライマー又はプロモーター−プライマーが同じであり、同じＲＮＡポリメラーゼによって認識され、そして同じ標的配列を認識することを意味する（正確に同じ位置である必要は必ずしもない）。好ましい態様では、改変及び非改変プライマー又はプロモーター−プライマーは改変を除いて同一である。
プライマー又はプロモーター−プライマーの３’末端は当業者に周知の手法によって改変することができる。プロモーター−プライマーに施す適当な改変としては、リボヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド残基、（例えば、コルジセピン（cordycepin）［CO, Glen Research］）、３’，２’−ジデオキシヌクレオチド残基、ホスホロチオエート（phosphorothioates）などの改変ヌクレオチド、及びArnoldら，［ＰＣＴ  ＵＳ／８８／０３１７３］に記載されているような非ヌクレオチド結合（ＲＳ）、又はアルカン−ジオール改変［Wilkら，Nuc.Acids Res. 18:2065, 1990］（ＲＰ）の付加を挙げることができ、又はこの改変は標的核酸とは相補的でないプライミング配列に対して３’側の領域から単純に構成させることができる。他の有効な改変も同様に可能であることは当然である。
増幅反応には改変及び非改変オリゴヌクレオチドの混合物を使用することができ、ブロックされたオリゴヌクレオチドとブロックされていないオリゴヌクレオチドとの比率が２：１から１，０００：１のものを成功裏に使用することができる。別個の３’改変を有するオリゴヌクレオチドの混合物も使用できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、規定された３’末端を有する、即ち標的配列に対して３’側の配列は付加的に有しないが、標的配列に対して５’側配列を付加的に有する標的核酸及びプロモーター−プライマーを示すものである。
第２図は、標的配列の複合性領域に対して３’側の配列を付加的に有するＲＮＡ標的配列を示すものである。
第３図は、オリゴヌクレオチド上におけるアルカン・ジオール改変又はＲＰ（ジグザグ線）の模式図である。
発明の詳しい説明
本発明は特定の核酸標的配列を増幅するための方法、組成物及びキットを目的とする。このような増幅された標的配列は特定の核酸標的配列を検出し及び／又は定量するための検定に、又は特定の標的配列のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの大多数のコピー数を種々の用途のために生産するために有用である。
説明のために第１図を使用すると、本発明は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれであってもよい核酸標的配列２をオリゴヌクレオチド４で処理することを特徴とするものであり、そのオリゴヌクレオチド４はプロモーター６及びプライマー８を有するプロモーター−プライマーからなり、そのプライマー８は標的配列の３’末端９にて又はその付近にて複合化できる程に充分にその標的配列の３’末端９と相補的である。プロモーター−プライマー４は単一の核酸配列のみから実質的に構成され、増幅を行うために他のプロモーター−プライマーを反応混合物に導入する必要がない。本発明のプロモーター−プライマーに適するプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される（天然、合成により製造され、又は制限消化の産物として産生される）核酸配列であり、そのＲＮＡポリメラーゼがその配列に結合して転写過程を開始させ、それによりＲＮＡ転写体が産生される。プロモーター配列は、分解過程に対する付加的な安定性又は感受性、又は転写効率の増大を付与できる、ＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を越えて伸長するヌクレオチド塩基を要すれば包含することができる。既知の利用可能なポリメラーゼのためのプロモーター配列が特に適している。このようなプロモーターにはバクテリオファージＴ３、Ｔ７又はＳＰ６、又はＥ.coli由来のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものが包含される。
ある状況下では、「ヘルパー」オリゴヌクレオチドを混合物に導入するのが望ましい場合があり、そのヘルパーオリゴヌクレオチドはプロモーター−プライマーが標的配列と複合化するのを助ける。
プロモーター−プライマー４及び標的配列２は、プロモーター−プライマー／標的配列の複合体１１が形成され、ＤＮＡ合成が開始され得る条件下におく。従って、反応混合物を、ＤＮＡプライミング及び核酸合成条件などプロモーター−プライマー／標的配列の複合体が形成する条件下（リボヌクレオチド三リン酸及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を包含する条件）に、標的配列の多重コピーが産生されるに充分な時間インキュベートする。反応は、増幅反応の間に成分酵素などの反応成分の安定性を維持し、かつ反応条件の改変又は操作を要することなく起こるのが好都合である。従って、実質的に等温度であり、実質的に一定のイオン強度及びpＨを包含する条件下に反応を起こすことができる。換言すれば、反応条件は一定であるのが効率的であり、これは反応条件に影響を及ぼす程に温度、pＨ及びイオン濃度を顕著に意図的に変化させないことを意味する。反応混合物の成分は徐々に、又は一度に添加することができる。
反応を行う際には、プロモーター−プライマーのプロモーター配列を鋳型として使用し、伸長反応に適当なＤＮＡポリメラーゼによって標的配列の３’末端９を伸長させ、そのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ伸長産物１０を入手する。プロモーター−プライマーのプライマー領域の３’末端もまた、適当な逆転写酵素を使用して伸長反応にて伸長され、標的核酸配列に相補的なストランド１２が形成される。次いで、得られた２本鎖プロモーターを使用し、適当なＲＮＡポリメラーゼを結合させ、次いで得られた２本鎖標的核酸配列を使用し、１本鎖ＲＮＡの多重コピー（標的配列の（＋）ストランドに相補的である）を調製する。
標的配列がＲＮＡである場合は、プロモーター−プライマーの伸長のためのＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（即ち、逆転写酵素）でなければならない。さらに、標的配列がＤＮＡからなる場合、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでなければならない。しかし、既知のすべての逆転写酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有しているので、プロモーター−プライマーがＤＮＡであり標的配列がＲＮＡである場合などは、伸長反応を行うために逆転写酵素以外のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを加える必要は必ずしもない。適当な逆転写酵素にはＡＭＶ逆転写酵素及びＭＭＬＶ逆転写酵素などがある。
本発明に必要とされるＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであることができ、例えばＥ.coli由来のＲＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７、Ｔ３及びＳＰ６である；このようなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、標的配列がＲＮＡの場合に有効であるのは驚くべきことである。
標的配列がＤＮＡの場合、標的配列の３’末端は第１図に示すように、プロモーター−プライマーのプライマーの５’末端と好適に符号するよう規定しなければならない（即ち、標的配列はプライマーと複合化する領域を３’側に越えるヌクレオチドを有してはならない）。当然ながら、このような生成はＲＮＡ標的核酸配列上においても行うことができる。化学的又は酵素的分解又はプロセッシングによってこのように規定される核酸標的の３’末端を生成させることは当業者に理解される。
第２図に示しているように、ＲＮＡ標的配列１４上で増幅を驚くほどに起こすことができ、そのＲＮＡ標的配列は、プライマーと複合化した領域１１を３’側に越えて伸長するヌクレオチドのストランド１６を有する。
本発明の特徴はＤＮＡ又はＲＮＡいずれかの多重コピーを入手することができることである。
好ましい態様では、プロモーター−プライマーは、その末端からの（標的配列に沿った）伸長を防止し又は減少させる改変をその３’末端に有している。このような改変を作成する方法は当業者に知られている。そのように改変された３’末端を用いて増幅を行うことができることは驚くべきことであり、また、改変及び非改変プロモーター−プライマーの混合物を用いて増幅の効率が高められることも驚くべき事項である。例えば、改変プロモーター−プライマー約１５０に対し非改変プロモーター−プライマー１個の比率では、増幅の能率及び効能が大幅に高められることが見いだされた。しかし、この比率は反応条件及び試薬、例えばプロモーター−プライマー及び標的配列に応じて変動する。
別の態様では、本発明は、本発明を実施するのに必要である幾つかの又はすべての試薬、酵素及びプロモーター−プライマーからなるキットに関する。キットを構成する部材は別個のバイアル中にて供給することができ、又は要すれば一緒に混合することもできる。
実施例
序
以下の実施例は本発明のメカニズム及び利用性を説明するものである。しかし、これらは限定的なものではなく、そのように解すべきでない。
以下の実施例に使用している酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ［Bethesda Research Laboratories］から入手される鳥類骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、モロネイ（Moloney）ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、及びスーパースクリプト（Superscript）（ＲＮアーゼＨマイナスＭＭＬＶ ＲＴ、「ＭＭＬＶ ＳＣ ＲＴ」）である。同様の活性を有する他の酵素、及び他の供給元から得られる酵素も使用することができる。異なるプロモーター特異性を有する他のＲＮＡポリメラーゼも使用に適している場合がある。
特に明記しない限り、以下の実施例で使用している反応条件は、１００μl容量中、５０mＭ トリス-ＨＣlpＨ７．６、２５mＭ ＫＣl、１７．５mＭ ＭｇＣl2、５mＭ ジチオトレイトール、２mＭ スペルミジン三塩酸塩、６．５mＭ ｒＡＴＰ、２．５mＭ ｒＣＴＰ、６．５mＭ ｒＧＴＰ、２．５mＭ ｒＵＴＰ、０．２mＭ ｄＡＴＰ、０．２mＭ ｄＣＴＰ、０．２mＭ ｄＧＴＰ、０．２mＭ ｄＴＴＰ、０．３μＭ プロモーター−プライマー、ＭＭＬＶ逆転写酵素６００単位及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ４００単位、及び規定量の鋳型である。しかし、最善の反応条件は個々の用途及び環境の要求に応じて変動する；本明細書を参照すれば、このような条件は当業者に明らかである。使用しているオリゴヌクレオチド配列は例示であって限定的なものでなく、これらの標的配列及び他の標的配列について別の配列が使用できた。
実施例１
規定された３’末端を有する標的配列を使用して本発明を証明するため、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）５Ｓ ｒＲＮＡの３’末端に相補的な配列を含有するプロモーター−プライマー（配列番号１）を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＭＭＬＶ逆転写酵素の存在下にＲＮＡと４時間インキュベートした。反応物の試料を特定の時点に取り出し、Hogan［米国特許第５，０３０，５５７号、核酸ハイブリダイゼーションを増大させる手段］に記載されているヘルパー・プローブ（配列番号４，５）の存在下に、標的ＲＮＡと同じセンス（配列番号２，３）の２つのプローブとハイブリダイズさせて、その試料を分析した。
0004137996.tif 000002
実施例２
プロモーター−プライマー結合部位の３’側のヌクレオチドを含有する標的配列を用いて本発明が実施されることを証明するため、Ｅ.coli参照配列の６８３−７０３塩基に相当する、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）１６Ｓ ｒＲＮＡの２１塩基に相補的である配列を含有するプロモーター−プライマー（配列番号６）を、以下の酵素の存在下に（＋）センスＳ．ニューモニアｒＲＮＡ １ｆ molと共にインキュベートした。両センス（配列番号７）のアクリジニウム・エステル標識化プローブ、ヘルパープローブ（配列番号８、９）又はそれらの相補配列を用いて、反応物１０μlを検定した。別個の実験では、ハイブリダイゼーションの前に反応物の一部をＮaＯＨで加水分解した。
0004137996.tif 000003
得られた結果は、本発明の増幅が逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮアーゼ活性に左右され、また主要な産生産物は標的ＲＮＡに相補的なＲＮＡであることを示している。
実施例３
プロモーター−プライマーの３’末端の伸長が増幅に必要であるか否かを調べるため、Arnoldら［ＲＰ；ＰＣＴ ＵＳ ８８／０３１７３］又はWilkら［ＲＰ；Nucleic Acids Res. 18:2065, 1990の第３図］に記載されている標準的な化学を用いた３’改変により、又はコルジセピン（cordycepin）［CO, Glen Research］を用いて、プロモーター−プライマーを合成した。逆転写酵素による伸長に対するこれらの改変の効果を次の実験により試験した。Ｓ．ニューモニア１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的な配列（配列番号６）を有するプロモーター−プライマーを標的とハイブリダイズし、次いでＭＭＬＶ ＲＴの存在下に３０分間インキュベートした。伸長反応の終了時点に、ＲＮＡ及びｃＤＮＡを９５℃にて２分間変性し、ｒＲＮＡ（配列番号７）と同じセンスのプローブをヘルパープローブ（配列番号８、９）と共に用いるハイブリダイゼーション防護検定（hybridization protection assay）によって検定した。
0004137996.tif 000004
得られた結果は、３’改変が非改変プライマーと比較して、逆転写酵素による伸長を変化させることを示している。
実施例４
規定された３’末端を有する標的配列の増幅に３’末端の伸長が必要であるか否かを調べるため、Ureaplasma urealyticum ５Ｓ ｒＲＮＡ［配列番号１］の３’末端に相補的なプロモーター−プライマーの３’末端をＲＳで改変し、標的ＲＮＡ１ ｆ mol、ＭＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと共にそれをインキュベートした。実施例１に記載しているプローブによるハイブリダイゼーションでは、プロモーター−プライマーの効果的な伸長は増幅に必要でないことが示された。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼしか含有しない反応物では増幅が欠如していることが示されたので、逆転写酵素は必要であった。
0004137996.tif 000005
実施例５
プロモーター−プライマー結合部位の３’側に配列を含有する標的の増幅に対する３’改変の効果を調べるため、Ｓ．ニューモニア１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的な配列（配列番号１）を含有する３’ＲＳ、３’ＲＰ、又は３’コルジセピン改変を有するプロモーター−プライマーを合成した。改変及び非改変プロモーター−プライマーをＳ．ニューモニアｒＲＮＡ、ＭＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に３７℃にて４時間インキュベートした。標的ＲＮＡと同じセンスのプローブを用いて、反応物１０μlをを検定した。
0004137996.tif 000006
驚くべきことに、このデータはプロモーター−プライマーの３’末端への改変により、この増幅メカニズムにて観察されるシグナルが増大されたことを示している。
実施例６
産物における蓄積動力学を証明するため、非改変又は改変３’末端を有するプロモーター−プライマーを用いて、次の実験を行った。Ｍ．ツベルクロシス（M.tuberculosis）２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な配列を含有するプロモーター−プライマーをＭＭＬＶ ＲＴ及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下にM.tuberculosis ｒＲＮＡ１fmolと共にインキュベートした。指示した時点にて試料を取り出し、標的ＲＮＡと同じセンスのアクリジニウムエステル標識化プローブを用いて検定した。標的の無い反応から得られるＲＬＵのバックグランドを各データから差し引いた。
0004137996.tif 000007
このデータは、非改変及び３’ＲＳ改変プロモーター−プライマーが一次関数的に産物を蓄積し、３’ＲＰプロモーター−プライマーはむしろ指数関数的に産物を蓄積することを明らかに示している。この結果も予期できなかったことであり、これには実質的に一定の温度、pＨ及びイオン強度で起こるユニークな増幅メカニズムが関与している。
実施例７
この実施例では、種々のプロモーター−プライマーを、ＡＭＶ逆転写酵素６００単位及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ４００単位の存在下にＳ．ニューモニエｒＲＮＡと共に４時間インキュベートした。標的ＲＮＡと同じセンスのアクリジニウム−エステル標識化プローブを用いて、試料１０μlを検定した。
0004137996.tif 000008
このデータは、３’改変プロモーター−プライマーにより、非改変体よりも高いシグナルがＡＭＶ逆転写酵素によって得られることを示している。
実施例８
以下の実験は添加物（ＤＭＳＯ及びグリセロール）が本発明の増幅システムの効率（感度）を増大させることを証明するものである。改変又は非改変プロモーター−プライマー（配列番号６）をＳ．ニューモニエｒＲＮＡポリメラーゼにＭＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下に加え、それを３７℃にて４時間インキュベートした。標的ＲＮＡと同じセンスのアクリジニウム−エステル標識化プローブを用いて、試料１０μlを検定し、負の値を差し引いた。
0004137996.tif 000009
このデータは、非改変プロモーター−プライマーを用いた結果には添加物は殆ど効果を示さないが、３’改変プロモーター−プライマーでは有意にシグナルを増大させ、３’ＲＰ体では最も顕著な効果をもたらすことを示している。
実施例９
この実験では、１つ又は２つの３’リボシチジン残基と置き換えた１（リボ）又は２（ジリボ）３’ターミナル・デオキシシチジン、又は３’ターミナル・ホスホロチオエート（ＰＳ）デオキシヌクレオチドを用いて、Ｍ．ツベルクロシスの２３Ｓ ｒＲＮＡと相補的な配列を有するプロモーター−プライマー（配列番号１０）を合成した。これらの改変プロモーター−プライマーを使用し、５０mＭ トリス-ＨＣlpＨ８、２０mＭ ＭgＣl2、３５mＭ ＫＣl、それぞれ４mＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、及びそれぞれ１mＭのｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴｐ、１５mＭ Ｎ−アセチル−システイン、１０％グリセロール、１０％ＤＭＳＯ、ＭＭＬＶ逆転写酵素６００単位、及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ４００単位中、４２℃にて４時間、Ｍ．ツベルクロシスｒＲＮＡを増幅した。各反応物５μlを９５℃に２分間加熱し、ｒＲＮＡ標的（配列番号１１）と同じセンスのプローブ、ヘルパープローブ配列番号１２及び１３を用いて検定した。
0004137996.tif 000010
得られた結果は、１つ又は２つのリボヌクレオチドを３’末端に有する、又は３’ホスホロチオエート結合を有するプロモーター−プライマーが、非改変プロモーター−プライマーよりも良好な増幅をこのシステムにおいて与えることを示している。
実施例１０
逆転写酵素によってプロモーター−プライマーの伸長を改変するための別の方法は、非改変プロモーター−プライマーを、ブロックしたコルジセピン（cordycepin）改変プロモーター−プライマーと混合することである。プロモーター−プライマーの混合物を使用することにより、逆転写反応にて観察されるｃＤＮＡの産生が、他の３’改変にて認められるように有意に減少するであろう。以下の実験では、コルジセピンで改変するか又は改変していないＭ．ツベルクロシス１６ＳｒＲＮＡ（配列番号１４）に相補的な配列を有するプロモーター−プライマーを使用した。１０mＭ トリメチルアンモニウムクロライドが存在する以外は実施例９と同じ条件を使用し、Ｍ．ツベルクロシスｒＲＮＡ３ｔmol、ＭＭＬＶ逆転写酵素３００単位及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ２００単位と共にプロモーター−プライマーをインキュベートした。４２℃にて２時間インキュベートした後、標的ＲＮＡ（配列番号１５、ヘルパー番号１６、１７を含有）と同じセンスのプローブを用いて反応物２０μlを検定した。得られた結果は５回行った実験の平均である。
0004137996.tif 000011
改変及び非改変プロモーター−プライマーの混合物は理解できるように、完全に改変されたプロモーター−プライマーよりも良好に作動した。改変プロモーター−プライマーに対する非改変プロモーター−プライマーの比率を変動させると（例えば、１：１から１５０：１）、増幅の効率が効果的に増大した。最適な比率は、使用する試薬、標的配列、及びプロモーター−プライマーなどの反応条件に応じて変動する。特定の増幅に対して適切な条件を選択するのは、特別の実験を行うことなく当業者に容易に行われ得る。
別の実験にて、増幅により得られたシグナルを既知の標準シグナルと比較し、増幅の程度は２．６×１０5倍であると計算された。
実施例１１
この実験では、プロモーター−プライマーを改変せず、又はＲＰもしくはＣＯで改変する以外は、実施例１０に記載のようにして反応を行った。標的３０ｔmolを各反応物に加えた。種々の３’改変を有するプロモーター−プライマーの混合物により、有意な増幅が得られることが示されている。
0004137996.tif 000012
生成される非特異的産物の量は、改変プライマーを用いると非常に低くなることが示され、これは本発明の別の利点であることを証明するものである。
実施例１２
標的配列の相補的なコピーの数を経時的に増大させるには逆転写酵素とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが必要である。プロモーター−プライマーが標的の３’末端とハイブリダイズすると、Ｔ７プロモーター配列のコピー化により、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに認識されかつ標的配列のＲＮＡコピーを作成するのに利用できる２本鎖ＤＮＡプロモーターが得られる。３’改変プロモーター−プライマーを用いた結果は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成の鋳型としてＲＮＡを使用していることを示している。この仮定を確かめるため、合成オリゴヌクレオチドを作成した。第１のオリゴヌクレオチドは、３’標的結合配列に結合する５’ Ｔ７プロモーター配列を含有するＤＮＡプロモーター−プライマーであった。プロモーター配列のみを含有するもう１つのオリゴヌクレオチドも合成した。標的配列は、３’末端に結合するＴ７プロモーターのＤＮＡ相補配列を有する５’合成ＲＮＡ標的配列を含有するＲＮＡ：ＤＮＡキメラ分子から構成されるものであった。
この実験では、Ｔ７プロモーター及び標的結合配列、又はそのプロモーター配列のみを含有するプロモーター−プライマーとＲＮＡ−ＤＮＡキメラ標的の１０又は１ｆmolとをハイブリダイズし、ＲＮＡ標的ストランドを１本鎖のままにした。そのハイブリッドをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に、又はそれを加えずにインキュベートし、得られた産物をＲＮＡ標的配列と同じセンスのプローブとハイブリダイズした。
0004137996.tif 000013
このデータは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに基づくＲＮＡ転写の鋳型としてＲＮＡ断片を使用できることを示しており、このことは驚くべきことである。
実施例１３
次の実験は、逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下にＲＮＡを合成するためにＲＮＡストランドを使用できることを示している。この実験では、ＲＮＡ：ＤＮＡキメラ標的を、標的配列のみを含有する合成ＲＮＡ断片と比較した。
0004137996.tif 000014
本明細書に記載している本発明の態様はあらゆる意味において例示であり、限定的なものと考えるべきでなく、本発明の範囲は上記の記載ではなく添付の請求の範囲に示され、従って、この請求の範囲と等価の意義及び範疇に包含されるすべての変動も本発明に包含されると考える。
配列表
（１）  一般的情報
（i）  特許出願人：ダニエル・エル・カシアン
ダイアン・エル・マクオーリスター
シェロール・ホファ・マクドノーフ
ナニブシャン・ダッタグプタ
（ii）  発明の名称：核酸配列増幅方法、組成物及びキット
（iii）  配列の数：１７
（iv）  連絡先：
（Ａ）  名宛人：ライオン・アンド・ライオン
（Ｂ）  通り：ウエスト・シックスス・ストリート６１１番
（Ｃ）  市：ロサンジェルス
（Ｄ）  州：カリフォルニア
（Ｅ）  国：アメリカ合衆国
（Ｆ）  ＺＩＰ：９００１７
（v）  コンピューター解読書式
（Ａ）  媒体型：３．５”ディスケット、１．４４メガバイト ストーリジ
（Ｂ）  コンピューター：ＩＢＭ  適合
（Ｃ）  オペレーティング・システム：ＩＢＭ Ｐ．Ｃ．ＤＯＳ（バージョン５．０）
（Ｄ）  ソフトウエア：ワードパーフェクト（バージョン５．１）
（vi）  本出願のデータ：
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日：
（Ｃ）  分類：
（vi）  優先権主張出願のデータ：
下記出願に含まれる優先権主張出願総数：none
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日：
（viii）弁理士／代理人情報
（Ａ）  氏名：ワーバーグ，リチャード・ジェイ
（Ｂ）  登録番号：３２，３２７
（Ｃ）  参照／整理番号：
（ix）  電話連絡先情報：
（Ａ）  電話番号：（２１３）４８９−１６００
（Ｂ）  ファックス番号：（２１３）９５５−０４４０
（Ｃ）  テレックス：６７−３５１０
（２）  配列番号１の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：５３
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１：
0004137996.tif 000015
（２）  配列番号２の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３０
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号２：
0004137996.tif 000016
（３）  配列番号３の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３６
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号３：
0004137996.tif 000017
（４）  配列番号４の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３４
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号４：
0004137996.tif 000018
（５）  配列番号５の情報：
（i）配列の特徴
（Ａ）  長さ：２６
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号５：
0004137996.tif 000019
（６）  配列番号６の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：４８
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号６：
0004137996.tif 000020
（７）  配列番号７の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２２
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号７：
0004137996.tif 000021
（８）  配列番号８の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３９
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号８：
0004137996.tif 000022
（９）  配列番号９の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３６
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号９：
0004137996.tif 000023
（１０）  配列番号１０の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：４７
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１０：
0004137996.tif 000024
（１１）  配列番号１１の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２３
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号７：
0004137996.tif 000025
（１２）  配列番号１２の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３８
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１２：
0004137996.tif 000026
（１３）  配列番号１３の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：３６
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１３：
0004137996.tif 000027
（１４）  配列番号１４の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：５５
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１４：
0004137996.tif 000028
（１５）  配列番号１５の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２４
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１５：
0004137996.tif 000029
（１６）  配列番号１６の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２３
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１６：
0004137996.tif 000030
（１７）  配列番号１７の情報：
（i）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２０
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｃ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列：配列番号１７：
0004137996.tif 000031
【図１】
0004137996.tif 000032
【図２】
0004137996.tif 000033
【図３】
0004137996.tif 000034