(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物、ならびに同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物にエタノールを加え生成された沈殿物である多糖体分画物で構成される、抗癌治療用、免疫機能増強用、造血機能増進用、及び酸化的損傷に対する生体防護用生薬組成物。
【請求項２】
多糖体分画物を得るための熱水抽出物の量が、生薬組成物の中の熱水抽出物の0.5〜3倍の量であることを特徴とする、請求項１に記載の生薬組成物。
【請求項３】
1) 同じ重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬からなる混合生薬材に前記生薬材総重量の5〜20倍量の水を加えた後、熱水抽出して熱水抽出物を準備する第1段階、
2) 前記第1段階と同じ熱水抽出物にエタノールを加え、得られた沈殿物を回収して多糖体分画物を得る第2段階、
3) 第1段階の熱水抽出物に第2段階の多糖体分画物を添加して混合組成物を得る第3段階からなる請求項1に記載の抗癌治療用、免疫機能増強用、造血機能増進用、及び酸化的損傷に対する生体防護用生薬組成物の製造方法。
【請求項４】
前記第1段階で準備した熱水抽出物の量に対して前記第2段階で多糖体分画物を得る為の熱水抽出物の量を0.5〜3倍とする、請求項３に記載の抗癌治療用、免疫機能増強用、造血機能増進用、及び酸化的損傷に対する生体防護用生薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗癌、免疫及び造血機能の増進及び酸化的損傷に対する生体防護用生薬組成物に関するものである。より詳細には、同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物、及び同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物にエタノールを加え生成された沈殿物である多糖体分画物で構成される生薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
癌治療は、手術、抗癌剤投与及び放射線照射等、癌細胞を直接殺す方法と、免疫療法のように癌細胞を除去する生体内免疫機能を活性化して治療する方法とに大別される。従来は、主に前者の直接殺す方法を使用していたが、最近は後者の免疫療法と併用療法を活用している。免疫療法に対して、最近免疫機能の作用機序が報告されたことによって、特に免疫調節物質を利用しようとする試みが多くなされている。免疫調節物質は、非特異的に生体内免疫細胞を刺激して生体免疫機能を増進させることによって、疾病要因に対する生体の防御力を増強させる。このような非特異的免疫調節物質として、死滅させた細菌体、化学合成物質(合成された核酸誘導体または配糖体)、生物製剤(サイトカインまたはホルモン)等を挙げることができ、これらを投与して生体免疫機能を増進させることによって抗癌効果を得ようとする研究が行なわれている。
【０００３】
しかし、これらの非特異的免疫調節物質の大部分が、毒性または副作用のために実際の臨床的適用には多くの限界を見せている。特に、免疫反応に関連した生体内因子(cytokines)が明らかにされることによって、この因子を遺伝工学的に大量生産して癌治療に利用しようとする研究が活溌に進められている。即ち、インターロイキン-2(interleukin-2)を始めとする免疫刺激剤、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)等による抗癌効果を得ようとしたが、これもまた激しい毒性の為に、非常に制限的に研究されている実情である。
【０００４】
一方、造血機能は、骨髄の血液母細胞から免疫細胞を含んだ色々な血液細胞を生成する機能であり、生体の免疫活性と密接な関係がある。特に、近来、血液母細胞から血液細胞に分化する各段階に作用する因子(cytokines)が報告され、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte colony - stimulating factor)のような造血細胞増殖誘導因子等を疾病治療に利用しようとする研究が活溌に行なわれてきた。しかし、これらの因子もまた効果を得るためには、大量に人体に投与しなければならず、その場合、大部分が深刻な毒性を示すため、一部の制限的な用途にだけ活用されている実情である。
【０００５】
一方、癌治療の為の抗癌剤療法または放射線療法実施時、造血系障害及び再生組織の損傷等の副作用が伴う。この副作用は、抗癌剤または放射線による生体組織の酸化的損傷に起因する。放射線から生体を防護できる物質に対する研究は、1949年チオール(thiol)基を含有したシステイン(cysteine)が放射線防護効果を示すという報告が出た後、アミノチオール(aminothiol)誘導体(特にWRシリーズ)に集中したが、アミノチオール誘導体の毒性のため実際応用には限界を見せた。その後、ジピリダモール(dipyridamole)、アデノシンモノリン酸(adenosine monophosphate)、デオキシスパーガリン(deoxyspergualin)等の化学合成剤を中心にその防護効果の研究がされたが、これらもまた自体の深刻な毒性の為に実際適用には限界を見せた。その次に、抗癌免疫活性調節物質として研究されてきたグルカン(glucan)等の多糖体とOK-432等の無毒化された細菌体等により免疫造血系を刺激することによって防護効果を得ようとする研究が試みられてきたが、やはり副作用のため実用化は非常に制限的であった。
【０００６】
また、近来には、免疫反応及び造血機能に関連した因子、即ちインターロイキン-1(interleukin-1)を始めとする免疫刺激剤、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte colony -stimulating factor)のような造血細胞増殖誘導剤、ホルモン等による放射線防護効果を得ようとしたが、やはり毒性の為に非常に制限的に試みられている。
【０００７】
以上、詳しく見たように、免疫機能の活性化による抗癌効果、免疫機能及び造血機能を増進させると同時に、抗癌治療の為の放射線照射等の副作用から生体を防護できる物質としてその安全性が保証された物質の確保が切実になっている。したがって、最近では天然物から副作用がない天然生理活性物質の開発研究が多数遂行されている。特に、放射線または化学物質だけではなく有害活性酸素または自由ラジカル等による酸化的生体損傷が老化、癌発生等の色々な疾病の原因であることが明らかにされるにしたがって、抗酸化物質を利用した疾病の予防及び治療研究が遂行されてきた。そして、これらの天然物から生体調節及び生体防御に効果がある生理活性物質の探索が活溌に進行され、健康補助食品や治療剤として産業化に至っている。
【０００８】
天然物からの免疫調節物質探索に対する研究は、天然植物素材または既存の漢方剤の効果検証を中心に遂行されていて、一部は実用化段階に来ている。放射線による造血機能障害改善の為の天然物の効能に関する研究としては、1988年フランスでエゾウコギの効能を検索した報告があり、主に日本、台湾、中国を中心に朝鮮人参、ツル人参、川キュウ、霊芝と幾つかの既存の漢方剤に対する研究が最近まで進行されてきた。
【０００９】
本発明者らは、放射線治療副作用克服物質を探索する過程で、放射線による障害は免疫機能障害、造血機能障害、再生組織の損傷等が複合的に起きる現象であることを考慮し、各々に有効な生薬材を検索した結果をパターンに全ての障害を同時に克服できる複合剤を得ようとした。その結果、当帰、川キュウ及び白芍薬を同じ重量比率で混合し熱水抽出し、既存の免疫増強剤より高い安全性を持った生薬抽出物を製造して特許出願したことがある(特許文献１参照)。しかし、上記の発明では、免疫機能及び造血機能で広範囲な効果を示しはするが、増進効果の程度が前記生薬抽出物を投与しない対照群と比べて2〜3倍程度で、抗癌免疫反応活性化には、微弱な効果を見せた。
【００１０】
【特許文献１】
大韓民国特許出願第2000-23772号
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、当帰、川キュウ及び白芍薬を利用して、既存の免疫及び造血機能増進に関する生物化学的製剤より優れた抗癌効果、免疫及び造血機能増進効果及び酸化的生体損傷抑制効果を示す生薬組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記生薬組成物を有効成分として含む製薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、前記生薬組成物を有効成分として含む機能性食品を提供することである。
【００１４】
【課題を解決する為の手段】
前記目的を達成するために、本発明は、同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物、及び同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物にエタノールを加え生成された沈殿物である多糖体分画物で構成される生薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、また、前記生薬組成物を有効成分として含む抗癌治療用、免疫機能増強用、造血機能増進用、酸化的損傷に対する生体防護用及び抗癌治療副作用防止用、製薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、また前記生薬組成物を含む機能性食品を提供する。
【００１７】
本発明は、また1) 同じ重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬からなる混合生薬材に前記生薬材総重量の5〜20倍量の水を加えた後、熱水抽出して熱水抽出物を準備する第1段階、2) 前記第1段階と同じ熱水抽出物にエタノールを加え得られた沈殿物を回収して多糖体分画物を第2段階、3) 第1段階の熱水抽出物に第2段階の多糖体分画物を添加して混合組成物を得る第3段階からなる生薬組成物の製造方法を提供する。
【００１８】
本発明者らは、同じ重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物に、抗癌効果、免疫機能及び造血機能増進そして酸化的損傷に対する生体防護機能を遂行するのに特に有効な成分が存在し、その成分を明らかにすることによって従来に比べてより高い抗癌効果等を持つ生薬組成物を開発できると考えた。
【００１９】
以上のことを鑑みて、同一重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物をメタノール分画、エタノール分画及びエタノール沈殿物の多糖体分画の成分分画に分離後、各種実験を遂行して、エタノール沈殿物の多糖体分画が抗癌効果、免疫機能及び造血機能増進効果において卓越していることを確認した。但し、酸化的損傷に対する生体防護機能面では、メタノール分画とエタノール分画に比べて多糖体分画の効果が多少不十分だった。
【００２０】
したがって、本発明等は、同じ重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物と、前記熱水抽出物にエタノールを加え生成された沈殿物の多糖体分画を組み合わせて多糖体分画の比率を増加させると、酸化的損傷に対する生体防護機能、造血機能増進効果だけではなく、抗癌効果及び免疫機能をより向上させられることを確認して本発明を完成した。
【００２１】
以下には、添付した図面を参照しながら、まず、同一重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物の成分分画別効果を示すことによって前記熱水抽出物にエタノール沈殿物の多糖体分画を混合して多糖体分画の比率を増加させると色々な効果を同時に具現できることを示した後、実際に熱水抽出物に多糖体分画を混合した本発明による生薬組成物に対して、実験例等を通してより詳細に説明する。
【００２２】
熱水抽出物の成分分画別効果
(1) 熱水抽出物の成分分画
食品原料として食品公典に記載されている生薬材3種、即ち当帰、川キュウ、白芍薬を陰乾、細切して同じ重量比率で混合した総重量の10倍量の蒸溜水を加え、8〜10時間薬湯器で抽出して熱水抽出物を準備した(熱水抽出物; W分画)。前記熱水抽出物にメタノールを加えメタノールに溶出する成分を集めたメタノール分画(M分画)、前記熱水抽出物にエタノールを加えエタノールに溶出する成分を集めたエタノール分画(E分画)及び前記熱水抽出液にエタノールを添加して最終的に80%エタノール水溶液条件で一晩中5〜15℃に放置した後、沈殿した多糖体分画を回収して多糖体分画(P分画)を準備した。
【００２３】
(2)各成分分画の効果
前記熱水抽出物の成分分画別に免疫細胞活性化効果と造血機能増進効果及び酸化的生体損傷に対する抑制効果を確認してみた。
【００２４】
１番目に、免疫細胞活性化効果を調べる。
脾臓免疫細胞を試験管内で培養する試験系に前記準備した熱水抽出物の成分分画別試料を添加して培養する時、免疫細胞が活性化されると細胞代謝が増幅され細胞が分裂するようになるために遺伝子(DNA)を複製するようになる。この時、培養液にDNAの前駆物質の一つであるチミジン(thymidine)に標識子の同位元素(H3)を付けたものを添加し、細胞が吸収した同位元素の量を測定して免疫細胞の活性化程度を算定出来る。即ち、下記の三重水素チミジン吸収分析法(H3-thymidine uptake assay)で測定する。詳細な試験法を下記に示す。
【００２５】
マウスの脾臓免疫細胞(リンパ球)を準備してマイクロプレート(96-well microplate)の各ウェル(well)に2×105個ずつ完全培地で稀釈して分注して、試料を添加した後、細胞培養器(CO2-培養器)で3日間培養した。培養後、ウェル当り1.5μCiの三重水素チミジン(3H-thymidine)を添加した後、4時間さらに培養して細胞収集器(cell harvester)で細胞を収集した。集めた細胞にシンチレーションカクテル(Scintillation cocktail)を3mlずつ入れ、β-シンチレーションカウンター(β-scintillation counter)で細胞が吸収した三重水素チミジン(3H-thymidine)量を1分当たりのカウント数(cpm)で測定した。
【００２６】
実験の結果、図1に見られるように、多糖体分画が最も顕著に免疫細胞を活性化させることが分かった。熱水抽出物より3倍以上高い効果を見せた。一方、メタノール分画とエタノール分画はほとんど効果が見られなかった。
【００２７】
2番目に、造血機能増進効果を調べる。
まず、造血前駆細胞(bone marrow stem cell)の増殖効果を調べる。
造血前駆細胞は、骨髄細胞の非付着性細胞で、単球/大食細胞、血小板、赤血球等に分化が可能である。この造血前駆細胞培養系に前記準備した熱水抽出物の成分分画別試料を添加培養した後、造血前駆細胞を培養上澄み液と共に回収し、血球計数板で細胞数を計数して前記試料の造血前駆細胞の増殖効果を確認した。その結果を図2に示した。
【００２８】
図2から分かるように、熱水抽出物の多糖体分画が最も顕著に増殖させる。熱水抽出物より2倍程度高い効果を示した。一方、メタノール分画とエタノール分画は、熱水抽出物より弱い効果を示した。
【００２９】
次に、骨髄間質細胞(bone marrow stromal cell)の増殖効果を調べる。
造血前駆細胞が色々な種類の成熟細胞に増殖分化する過程では、骨髄間質細胞(stromal cells)が分泌する多様な造血因子(蛋白質因子、サイトカイン等)が関与するだけではなく、造血前駆細胞周囲に存在する間質細胞(stromal cells)との接触作用がとても重要であると明らかにされている。したがって、造血機能調節において、造血微細環境内の間質細胞の役割が重要であると考えられる。
【００３０】
骨髄間質細胞培養系に前記準備した熱水抽出物の成分分画別試料を添加して骨髄間質細胞の増殖効果を確認した。まず、骨髄細胞を培養して培養皿に付着する間質細胞を分離した。分離された骨髄間質細胞を長期間培養しながら、一週間に一回ずつ培地の半分程度を新しい培地に交換した。この時、各試料を添加して2-3週間程度継続培養した後、増殖された間質細胞数を数えて増殖程度を測定した。その結果を図3に示した。図3から分かるように多糖体分画物が顕著な増殖効果を示した。前記熱水抽出物に比べて4倍以上の高い間質細胞増殖効果を示した。
【００３１】
３番目に、酸化的生体損傷に対する抑制効果を調べる。
前記熱水抽出物の各成分分画別試料を添加して4時間細胞培養器で培養した後、放射線または過酸化水素水で処理した後、細胞内DNA及び染色体の損傷程度を放射線対照群と比較検討した結果を図4と5及び図6と7に示した。図4と図5及び図6と図7から分かるように、細胞内DNA及び染色体損傷に対する抑制効果では、多糖体分画は、エタノール分画、メタノール分画、熱水抽出物に比べて試験モデルによって多少高いかまたは同じ水準の抑制効果を持つことが確認出来た。
【００３２】
また、放射線及び酸化的損傷による細胞膜の脂質及び蛋白質の過酸化抑制効果に対する熱水抽出物の成分分画別効果に対して図8〜図10に示した。
【００３３】
図8と図9から分かるように、多糖体分画はエタノール分画または熱水抽出物に比べて多少不充分な抑制効果を示した。
【００３４】
また、生体内で形成される自由ラジカルを消去して酸化的損傷を抑制できる効果に対して熱水抽出物の成分分画別に図11及び図12に示した。
【００３５】
図11と図12から分かるように、多糖体分画はエタノール分画またはメタノール分画に比べて不充分な自由ラジカル消去効果を示した。
【００３６】
以上、説明したように、抗癌効果、免疫機能及び造血機能増進効果面では、多糖体分画が、エタノール分画、メタノール分画及び熱水抽出物に比べて卓越した効果を示したが、酸化的損傷に対する生体防護機能面では、熱水抽出物が、全般的に若干高い効果を示した。したがって、熱水抽出物と多糖体分画を混合して多糖体分画の比率を増加させることによって、色々な効果を同時に具現可能である。
【００３７】
以下には、このように熱水抽出物と多糖体分画を混合して多糖体分画の比率を増加させた本発明による生薬組成物に対して詳細に説明する。
【００３８】
本発明による生薬組成物
本発明による生薬組成物は、同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物、及び同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物にエタノールを加え生成された沈殿物である多糖体分画物で構成される。
【００３９】
より詳細には、本発明による生薬組成物は、1) 同じ重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬からなる混合生薬材に前記生薬材総重量の5〜20倍量の水を加えた後、熱水抽出して熱水抽出物を準備する第1段階、2) 前記第1段階と同じ熱水抽出物にエタノールを加え得られた沈殿物を回収して多糖体分画物を得る第2段階、3) 第1段階の熱水抽出物に第2段階の多糖体分画物を添加して混合組成物を得る第3段階によって製造される。
【００４０】
この時、1段階の熱水抽は、8〜10時間薬湯器で煮て抽出することが好ましい。以後、ろ過した後、減圧濃縮器で濃縮して使用出来る。2段階のエタノールは、最終的に80%のエタノール水溶液になるようにすることが好ましく、これを一晩中5〜15℃に放置して沈殿させることが好ましい。
【００４１】
このようにして回収された多糖体分画物は、第1段階で準備された熱水抽出物と混合、凍結乾燥させ粉末に製造するか、エキス分のかたちで使用出来る。
【００４２】
この時、前記生薬組成物に含まれている多糖体分画物の総量は、前記熱水抽出物に含まれている多糖体分画物の量に対して1.5〜4倍の量であることが好ましい。したがって、前記第1段階で準備した熱水抽出物の量に対し、前記第2段階で多糖体分画物を得るための熱水抽出物の量は、0.5〜3倍にすることが好ましい。
【００４３】
本発明は、また前述した生薬組成物を有効成分として含む製薬組成物に関するものである。前記製薬組成物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で使用出来る。
【００４４】
即ち、本発明の製薬組成物は、実際臨床投与時に経口及び非経口の色々な剤形で投与出来る。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の稀釈剤または賦形剤を使用して製造される。経口投与の為の固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、蔗糖(sucrose)またはラクトース(lactose)、ゼラチン等を混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与の為の液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当する。よく使用される単純稀釈剤の水、リキッドパラフィン、この他にも色々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与の為の製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用できる。座薬の基剤には、ハードファット(witepsol)、マグロコール、ツイーン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用できる。
【００４５】
本発明の製薬組成物の有効用量は、30〜300mg/kg/日で、好ましくは80〜150 mg/kg/日である。また、一日に1〜3回に分けて投与できる。
【００４６】
本発明は、また前述した生薬組成物を有効成分として含む機能性食品に関するものである。前記機能性食品は、最終製品の商品性と消費者の嗜好にしたがって他の食品素材を添加出来る。
【００４７】
本発明に係る生薬組成物においては、（１）同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物、及び同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ及び白芍薬の熱水抽出物にエタノールを加え生成された沈殿物である多糖体分画物で構成される、抗癌、免疫及び造血機能増進及び酸化的損傷に対する生体防護用生薬組成物であることを特徴とする。
【００４８】
また、本発明に係る生薬組成物においては、（２）前記生薬組成物に含まれている多糖体分画物の総量は、前記熱水抽出物に含まれている多糖体分画物の量に対して、1.5〜4倍の量である、上記(1)記載の生薬組成物であることを特徴とする。
【００４９】
また、本発明に係る製薬組成物においては、（３）上記(1)記載の生薬組成物を有効成分として含む抗癌治療用製薬組成物であることを特徴とする。
【００５０】
また、本発明に係る製薬組成物においては、（４）上記(1)記載の生薬組成物を有効成分として含む免疫機能増強用製薬組成物であることを特徴とする。
【００５１】
また、本発明に係る製薬組成物においては、（５）上記(1)記載の生薬組成物を有効成分として含む造血機能増進用製薬組成物であることを特徴とする。
【００５２】
また、本発明に係る製薬組成物においては、（６）上記(1)記載の生薬組成物を有効成分として含む酸化的損傷に対する生体防護用製薬組成物であることを特徴とする。
【００５３】
また、本発明に係る製薬組成物においては、（７）上記(1)記載の生薬組成物を有効成分として含む抗癌治療副作用防止用製薬組成物であることを特徴とする。
【００５４】
また、本発明に係る機能性食品においては、（８）上記(1)記載の生薬組成物を含む抗癌治療用、免疫機能増強用、造血機能増進用、酸化的損傷に対する生体防護用、抗癌治療副作用防止用機能性食品であることを特徴とする。
【００５５】
また、本発明に係る方法においては、（９）1) 同じ重量比率の当帰、川キュウ及び白芍薬からなる混合生薬材に前記生薬材総重量の5〜20倍量の水を加えた後、熱水抽出して熱水抽出物を準備する第1段階、
2) 前記第1段階と同じ熱水抽出物にエタノールを加え、得られた沈殿物を回収して多糖体分画物を得る第2段階、
3) 第1段階の熱水抽出物に第2段階の多糖体分画物を添加して混合組成物を得る第3段階からなる生薬組成物の製造方法であることを特徴とする。
【００５６】
また、本発明に係る方法においては、（１０）前記第1段階で準備した熱水抽出物の量に対して前記第2段階で多糖体分画物を得る為の熱水抽出物の量を0.5〜3倍とする、上記(9)記載の生薬組成物の製造方法であることを特徴とする。
【００５７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好ましい実施例及び実験例に対して詳細に説明する。
【００５８】
【実施例】
生薬組成物の製造
食品原料として食品公典に記載されている生薬材3種、即ち当帰、川キュウ、白芍薬を陰乾、細切して同じ重量比率で混合した。総重量の10倍量の蒸溜水を加え8〜10時間薬湯器で抽出した後、ろ過した後、減圧濃縮器で濃縮した濃縮液の1/4〜2/3は、保管し、残り1/3〜3/4にエタノールを添加して最終的に80%エタノール水溶液条件で一晩中5〜15℃に放置した後、沈殿した多糖体分画を回収して、前段階で保管した折半の熱水抽出物濃縮液と混合して凍結乾燥させ粉末に製造するか、エキス分にする。下記の実験例では、前記濃縮液の1/2を保管し、残り1/2にエタノールを添加して最終的に80%エタノール水溶液条件で一晩中5〜15℃に放置した後、沈殿した多糖体分画を回収して、前段階で保管した1/2の熱水抽出物濃縮液と混合して凍結乾燥したものを蒸溜水に適正濃度で溶かして、無菌ろ過紙(Millipore membrane, 0.45μm)でろ過し、無菌状態にして試料として使用した。
【００５９】
以下の実験例では、「対照群」は本試料または分画物の代わりに生理食塩水を処理した群を意味する。対照群中で追加に放射線を処理した群は「放射線対照群」(Rで表示)、追加に過酸化水素水を処理した群は「過酸化水素水対照群」(Hで表示)、追加に四塩化炭素を処理した群は「四塩化炭素対照群」(Cで表示)、前記放射線または化学薬品を処理していない群は「正常対照群」(Nで表示)と称する。
【００６０】
[実験例 1] 抗癌効果及び免疫機能増強効果の確認
1)腫瘍生長の抑制効果 (Inhibition of tumor growth)
マウスに癌細胞移植後、実施例で製造した生薬組成物(以下、本試料とする)及び生理食塩水(以下、対照試料とする)を投与してマウスの寿命延長可否を確認した結果、本発明による生薬組成物に腫瘍生長抑制効果があることを確認した。
【００６１】
マウス(BDF1, 7週齢)に1×105個の黒色癌細胞(B16F0 melanoma cells)を腹腔注射した。癌細胞を腹腔に注射して移植した後、次の日から本試料及び対照試料を10日間腹腔注射した。その後、日時経過による生存マウスの数を毎日確認した。
【００６２】
その結果を図示した図13に見られるように癌細胞を移植したオスマウスでは、対照試料を投与した対照群の場合、21日目までに全てのマウスが死亡したのに比べて本試料を注射したマウスは、25日目まで生存することが見られ生存率が本試料を注射することによって約15%程度増加した。反面、メスマウスでは、対照試料を投与した対照群の場合、19日目で全てのマウスが死んだのに比べて本試料を注射したマウスは24日目まで約50%が生存し、26日目まで生存することにより生存率が約34%程度増加した(図14)。
【００６３】
したがって、本試料は癌細胞の生長を抑制することによって抗癌効果を示すことが分かる。
【００６４】
一方、本試料が直接的に癌細胞を殺害するかどうかを調べるために腫瘍細胞培養試験管に本試料を添加した後、生存腫瘍細胞を測定した。即ち、黒色腫瘍細胞(B16F0 melanoma)を準備してマイクロプレート(96-well microplate)の各ウェル(well)に5×104個ずつ完全培地で稀釈して分注し、本試料を添加した後、細胞培養器(CO2培養器)で培養した。培養一日後に各ウェルにMTT溶液を入れた後、4時間さらに培養した。この時、生きている細胞はMTTをホルマザン(Formazan)で変形させ細胞内に沈着させる。培養後、各ウェルに0.07N HClが含まれたイソプロパノール(isopropanol)を添加し、生きている細胞に沈着したホルマザンを遊離させた後、UV- 吸光計を利用して、その量を波長570nmで測定して生きている細胞の相対的な数を算定した。その結果、図15に見られるように試料を添加していない対照群の生存細胞数と本試料を添加した試験群の生存細胞数との差が無かった。即ち、本試料は癌細胞を直接的には殺害したり増殖させないことが分かった。
【００６５】
2)免疫機能増強効果
2.1)免疫細胞活性化効果(Lymphocyte proliferation)
脾臓免疫細胞を試験管内で培養する試験系に本試料及び同じ重量比率で混合された当帰、川キュウ、白芍薬の熱水抽出物とその分画物を添加して培養する時、免疫細胞が活性化すると細胞代謝が増幅され細胞が分裂するようになるため遺伝子(DNA)を複製するようになる。この時、培養液にDNAの前駆物質の一つであるチミジン(thymidine)に標識子の同位元素(H3)を付けたものを添加して細胞が吸収した同位元素の量を測定して免疫細胞の活性化程度を算定した。即ち、三重水素-チミジン吸収分析法(H3-thymidine uptake assay)で下記のように測定した。
【００６６】
マウスの脾臓免疫細胞(リンパ球)を準備してマイクロプレート(96-well microplate)の各ウェル(well)に2×105個ずつ完全培地で稀釈して分注し、各々に本試料、熱水抽出物を添加した後、細胞培養器(CO2-培養器)で3日間培養した後、ウェル当り1.5μCiの三重水素チミジン(3H-thymidine)を添加した後、4時間さらに培養して細胞収集器(cell harvester)で細胞を収集した。収集された細胞にシンチレーションカクテル(Scintillation cocktail)を3mlずつ入れβ-シンチレーションカウンター(β-scintillation counter)で細胞が吸収した三重水素チミジン(3H-thymidine)量を1分当りのカウント数(cpm)で測定した。
【００６７】
実験の結果、図1に見られるように本試料は前記熱水抽出物より2倍以上、対照群の10倍以上の顕著な免疫細胞活性化効果を見せた。
【００６８】
2.2)自然殺害細胞(NK細胞)活性増進による癌細胞殺害効果増進
癌細胞を除去するにあたり、非特異的で1次的な防御体系に属する自然殺害細胞(NK細胞)の癌細胞殺害能が本試料の投与によって増強されるかどうか調べた。
【００６９】
マウスの腹腔に本試料(1mg/mouse)を一日に一回ずつ3日間注射し、一日後にマウスを犠牲死させ分離した脾臓免疫細胞を作動細胞にして、下記のようにクロム遊離法(Chromiun Release Assay)で標的細胞(癌細胞)殺害能を測定した。
【００７０】
標的細胞として癌細胞(YAC-1細胞)2×106個に40μCi Na251CrO4を入れ37℃恒温槽で1時間標識(labelling)した。その後、準備した作動細胞の脾臓細胞とクロム(Cr51)が標識された標的細胞の癌細胞(YAC-1細胞)の比率が50：1及び100：1になるようにマイクロプレート(96-well microplate)の各ウェルに分注して培養した。4時間培養後、各ウェルの上澄み液100μlずつを取って試験管に分注し、癌細胞が殺害され培養液に遊離したクロムの量をガンマーカウンター(γ-counter)で1分当りカウント数(cpm)で測定した。各実験は3倍数で実施し、癌細胞殺害能(%)は下記の式によって計算した。
【００７１】
癌細胞殺害能(%)＝（ER-SR/MR-SR）×100    （数式１）
【００７２】
ここで、ER(experimental release)は、実験群から遊離した上澄み液の1分当りカウント数、SR(spontaneous release)は作動細胞が入っていない標的細胞対照群で自然的に遊離した上澄み液の1分当りカウント数であり、MR(maximal release)は標的細胞(2×104cells/well)に標識された放射能の90%以上とし、トリトン(triton)X-100 1%溶液を加えて得た。
【００７３】
実験の結果、図16に見られるように本試料を添加した群は、自然殺害(NK)細胞の癌細胞殺害能が本試料を添加していない群の1.5倍程度に増加した。
【００７４】
2.3)大食細胞(macrophage)活性増進による癌細胞殺害効果増進
活性化した大食細胞は、貪食作用だけではなく直接的に癌細胞を殺害出来る。本発明の生薬組成物により大食細胞が活性化され癌細胞を殺害できるかどうかを調べてみた。腹腔大食細胞を収集してマイクロプレート(96-well microplate)にウェル当り2×105個ずつ分注し、本試料を濃度別に添加して24時間培養した各ウェルを3回洗浄した後、培養された大食細胞を作動細胞にして標的癌細胞に対する殺害能を上記したクロム遊離法で測定した。
【００７５】
培養された大食細胞が入っているマイクロプレート(96-well microplate)の各ウェル(well)に標的細胞としてクロム(Cr51)で標識された癌細胞(YAC-1細胞)をウェル当り5×103個ずつ添加して作動細胞と標的細胞の比率(E:T ratio)が約40：1になるようにした。癌細胞(YAC-1細胞)を標的細胞として添加した後、24時間培養した後、各ウェルの上澄み液100μlずつを取って試験管に分注し、癌細胞が殺害され培養液に遊離されたCr51の量をガンマーカウンター(γ-counter)1分当りのカウント数(cpm)で測定した。各実験は、3倍数で実施し、癌細胞殺害能(%)は上記と同様な方法で(数式 1)によって計算した。
【００７６】
実験の結果、図17に見られるように大食細胞の癌細胞殺害能は、本試料を添加していない陰性対照群では、約10%だったが、本試料を添加した実験群では殺害能が約80%まで増加した。これは、陽性対照物質のリポポリサッカライド(lipopolysaccharide, LPS)とほぼ同じ効果を示した。
【００７７】
一方、本試料と共に培養した大食細胞は、添加した微細粒子を貪食する食作用も増強された(実験の結果は提示していない)。
【００７８】
2.4)T細胞活性増進による癌細胞殺害効果増進
癌細胞を殺害することにおいて、色々な免疫細胞を活性化させるとさらに多角的な面で癌細胞と対応するためには、非特異的方法ではない特異的免疫系を活性化させなければならず、細胞中には、これを担当する癌細胞を直接的に殺害できる細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell)が存在する。
【００７９】
本発明の生薬組成物により細胞毒性T細胞が活性化され癌細胞殺害効果が増進されるかどうかを調べるために、まず、マウスの免疫細胞を癌細胞で感作させる作業が必要である。このために、放射線照射で死んだ黒色癌細胞(B16F0 melanoma) 1×106 個をマウスの腹腔に注射した。癌細胞を注射する前に本試料(1mg/mouse)を腹腔に3日間1日1回ずつ3回腹腔注射した。一日後に、免疫細胞を感作させるために死んだ癌細胞を注射した。その後、二回本試料を腹腔注射した。癌細胞を注射した後、7日目にマウスを犠牲死させ癌細胞に感作された脾臓細胞を準備して癌細胞殺害能を上記のクロム遊離法で測定した。感作された脾臓免疫細胞を作動細胞にし、標的細胞としてクロムが標識された黒色癌細胞(B16F0 melanoma)数の比率が各々50：1そして100：1になるようマイクロプレート(96-well microplate)の各ウェル(well)に分注して一緒に培養した。培養4時間後、各ウェルの上澄み液100μlずつを取って試験管に分注し、癌細胞が殺害され培養液に遊離したCr51の量をガンマーカウンター(γ-counter)で1分当りカウント数(cpm)で測定した。各実験は、3倍数で実施し、癌細胞殺害能(%)は上記と同様の方法、数式 1によって計算した。
【００８０】
実験の結果、図18に見られるように本試料の投与により細胞毒性T細胞の癌細胞殺害能力が約2倍程度に増加した。
【００８１】
[実験例 2]造血機能増進効果及び酸化的損傷に対する造血免疫系回復促進効果
1)造血機能増進効果の確認
1.1)造血前駆細胞(骨髄間細胞; Bone marrow stem cells)の増殖効果
骨髄細胞培養系に各試料を添加して造血前駆細胞の増殖に及ぼす効果を確認した。骨髄細胞はマウスの大腿骨内部の骨髄を洗い出して分離した。骨髄細胞を培養すると、培養皿に付着する間質細胞(stromal cells)と付着しないで培養液内に分化増殖され出てくる非付着性細胞(nonadherent cells)を観察出来る。この非付着性細胞は、造血前駆細胞として間質細胞との接触作用を通して増殖し、単球/大食細胞、血小板、赤血球等に分化が可能である。この骨髄細胞培養系に各試料を添加して培養した後、非付着性造血前駆細胞を培養上澄み液と共に回収し、血球計数板で細胞数を計数して各試料の増殖効果を確認した。
【００８２】
図2に見られるように本試料は、熱水抽出物及び試料を添加していない対照群に比べて各々1.6倍、7倍程度の高い造血前駆細胞増殖効果を示した。
【００８３】
1.2)骨髄間質細胞(Bone marrow stromal cells)の増殖効果
造血前駆細胞が色々な種類の成熟細胞に増殖分化する過程には、間質細胞(stromal cells)が分泌する多様な造血因子(蛋白質因子、サイトカイン等)が関与するだけではなく、造血前駆細胞周囲に存在する間質細胞との接触作用が非常に重要であると明らかにされている。したがって、造血機能調節において、造血微細環境内の間質細胞の役割が重要であると思慮される。
【００８４】
骨髄間質細胞の培養系に各試料を添加して増殖効果を確認した。まず、骨髄細胞を培養して培養皿に付着する間質細胞を分離した。分離された骨髄間質細胞を長期間培養しながら、一週間に一回ずつ培地の半分程度を新しい培地に交換し、この時、各試料を添加して2-3週間程度継続培養した後、増殖された間質細胞数を数えて増殖程度を測定した。
【００８５】
その結果を図3に示した。本試料は、熱水抽出物及び試料を添加していない対照群に比べて2倍、8倍程度の高い骨髄間質細胞増殖効果を示した。
【００８６】
2)酸化的損傷に対する造血免疫系回復促進効果の確認
2.1)放射線処理後造血機能回復促進効果：血液細胞(免疫細胞)及び脾臓内免疫細胞の再生成促進効果
動物に放射線を照射させると血液細胞が急激に消失し、その後、日時経過にしたがって徐々に血液細胞数が回復するものと知られている。
【００８７】
本実験では、放射線(用量 5グレイ)を照射したマウスに本試料を投与した後、血液細胞及び脾臓リンパ球の数が回復する程度を分析した。本試料投与はマウスに放射線を照射する36時間及び12時間前に、そして照射後、30分及び24時間後に腹腔注射で行ない、以後隔日に3回腹腔注射を実施した。
【００８８】
血液細胞の分析は、放射線照射後、マウスの眼窩静脈から血液を取って動物血液細胞分析器を利用して実施した。
【００８９】
脾臓内免疫細胞(リンパ球)の亜群(subtype)別分析は、流速細胞分析器(flow cytometry)を利用して実施した。準備した脾臓免疫細胞を流速細胞分析培地(食塩水に0.1% 牛血清アルブミンと0.1% アジ化ナトリウムを添加したもの)で洗浄して各試験管に106個の細胞数で調整して分注した。細胞亜群別標識抗体の非特異的結合を防ぐために受容体(FcγR III/II)を封鎖するためにanti-CD16/CD32抗体を添加して4℃で5分間定置した。その後、各試験管に標識しようとする標識子に対するモノクローナル抗体を各々添加して4℃で40分間定置した。標識に使用したモノクローナル抗体は、B細胞に対しては抗-Ig M(anti-IgM)抗体、全体T細胞に対しては抗-Thy1.2(anti-Thy1.2)抗体、補助T細胞に対しては抗-CD4(anti-CD4)抗体、細胞毒性T細胞に対しては抗-CD8(anti-CD8)抗体を使用した。全て蛍光物質が付着したモノクローナル抗体を使用した。標識後、流速細胞分析培地で2回洗浄して流速細胞分析器(FACStar; CULTER, USA)で細胞表面標識子に結合したモノクローナル抗体の量を細胞当りで分析した。
【００９０】
その結果、図19と図20に見られるように放射線照射マウスに本試料を投与した群は、血液の総白血球数(図19)とリンパ球数(図20)が3週間後から放射線を照射していない正常対照群水準に回復し、試料は投与せず、放射線を照射した放射線照射対照群に比べて顕著に高く現れた。本試料により血液細胞数の回復が促進されたことが分かった。反面、放射線照射対照群は、約7週間後になって正常対照群水準に回復したことが分かる。
【００９１】
また、脾臓内免疫細胞(脾臓リンパ球)の各亜群別に回復程度を分析した結果、図21に見られるように放射線照射後、14日目に測定した場合、本試料投与群で全体脾臓リンパ球の数が放射線対照群に比べてずっと高く回復した。各免疫細胞亜群別に見るとB細胞はほとんど正常水準まで回復した反面、T細胞と該T細胞の各亜群は放射線対照群よりは高く回復したが、正常対照群の50%にみたない回復度を示した。放射線照射後、47日目に測定した場合には、図22に示したように放射線対照群と本試料投与群両方で全体脾臓リンパ球とB細胞の数が正常対照群まで回復したけれど、T細胞と該亜群の数は、放射線照射対照群で約50%水準まで回復し、本試料を投与したマウスでは約80%まで回復したことが確認出来た。
【００９２】
2.2)放射線処理後再生成された免疫細胞の機能回復増進効果の確認
2.2.1)再生成されたB細胞の機能回復増進効果
放射線(用量5グレイ)照射マウスで再生成されたB細胞の機能回復を本発明の組成物が促進させるかどうかを調べるために抗体生成細胞数を測定した。
【００９３】
本試料は、放射線照射36、12時間前と30分、24時間後に腹腔に注射した。その後、隔日で3回腹腔注射を実施した。放射線照射後、14日目と25日目 C57BL/6マウスに綿羊赤血球(sheep red blood cell(SRBC))を1×109cells/0.2mlずつ、尾の静脈に注射した。綿羊赤血球の注射後、満4日目にマウスの脾臓リンパ球を分離した。分離した全体リンパ球を数えて、7×106個/mlに調整して氷に入れて置き、綿羊赤血球は生理食塩水で3回洗浄後、培地に20%になるように懸濁させ氷に入れて置いた。上の二細胞を固定するために0.5%アガロース-RPMI溶液を45℃水槽(water bath)内に準備した。このように準備したリンパ球と綿羊赤血球、0.5%アガロース溶液を100μl、100μl、1600μlずつ加えて軽く混合後、準備した細胞培養皿に全量を注いでよく拡がるようにし、良く固まるように定置した。固まったことを確認した後、培養器に入れ2時間培養した後に補体(Guinea pig complement; GPC)を1:70に稀釈して各600μlずつ添加して、再び2時間さらに培養した。培養が終わった後、抗体生成免疫細胞周囲に抗原-抗体反応により生成された溶血プラーク(plaque)を観察してその数を数え、リンパ球の稀釈倍数を考慮して抗体生成細胞数(plaque forming cells(PFC)/spleen)に換算した。
【００９４】
その結果は、図23及び図24に見られるように、放射線照射対照群では、放射線照射後、14日目に(図23)B細胞の数が約60%程度回復(図21)したにもかかわらず、B細胞の機能即ち、抗体生成能は正常対照群の約4%程度に至らず、放射線照射後、25日目には(図24)B細胞の機能が正常対照群に比べて約41%水準にしか至らない。反面、本試料投与群では、放射線照射後、14日目と25日目に正常対照群の約20%と57%程度でB細胞機能の回復促進効果を示した。このような結果から、本生薬組成物は、放射線により減少したB細胞数の回復を促進させる作用をする(図21、図22)と同時にその機能の回復も増進させることが分かった。
【００９５】
2.2.2)再生成された補助T細胞(helper T cells)の機能回復増進効果
放射線(用量5グレイ)照射マウスで再生成された補助T細胞の機能回復を本発明の組成物が促進させるかどうかを調べるために同種異系(allogeneic)免疫細胞(allogeneic immune cells)の刺激に対するT細胞の反応(Mixed Lymphocyte Reaction; MLR)を測定した。
【００９６】
本試料の投与は、放射線照射36、12時間前と30分、24時間後に腹腔注射で行なった。その後、隔日で3回腹腔注射を実施した。放射線照射後、21日目と36日目マウス(C57BL/6; MHC type H-2b)を犠牲死させ脾臓免疫細胞を準備して反応細胞(responder cells)に使用した。刺激細胞(stimulator cells)には BALB/c(H-2d)マウスの脾臓免疫細胞をガンマー線(3,000rads)で照射して殺したものを使用した。上の二種類の準備した細胞をマイクロプレート(96-well microplate)の各ウェルに1×105個ずつ一緒に入れ、培養器で4日間培養した。収集する4時間前に4時間、2μCiの三重水素チミジン(3H-thymidine)を添加して細胞収集器(cell harvester)を利用して細胞を収集した。収集した細胞にシンチレーションカクテル(scintillation cocktail)を3mlずつ入れβ-シンチレーションカウンター(β-scintillation counter)で細胞が吸収した三重水素チミジン(3H-thymidine)量を1分当りのカウント数(cpm)で測定した。
【００９７】
その結果、図25及び図26に見られるように本試料を投与した群で、補助T細胞の機能が、試料を投与せず放射線を照射した放射線対照群に比べてさらに高く現れ、より速く回復した。この結果から本試料を投与することによって放射線照射後、約5週間後には(図26)補助T細胞の単位細胞当りの機能は、正常対照群水準に回復したことが分かった。
【００９８】
2.2.3)放射線照射後、現れる抗体生成パターンの変動(不均衡)を調整正常化する効果
放射線(用量5グレイ)照射マウスにT細胞依存性抗原注射後、抗体生成パターンの不均衡を本発明の組成物が調整できるかどうかを調べるために抗体種類別生産程度を測定した。
【００９９】
本試料は、放射線照射36、12時間前と30分、24時間後に腹腔に注射した。その後、隔日で3回腹腔注射を実施した。放射線照射後、1、2、3、5、8週に蛋白質抗原(DNP-KLH)を腹腔注射した後、7日目と14日に眼窩静脈から採血して血清を分離した。血清は、-70℃冷凍庫に保管しておき、血清内抗体の量をイライザ法(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)で測定した。マイクロプレート(microplate)のウェルに抗原をコーティングした後、血清を各ウェルに入れ血清内抗体が抗原と結合するようにした後、ペルオキシダーゼ結合塩素アンチマウスIgG(peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG)またはビオチン結合アンチマウスIgE(biotin conjugated anti-mouse IgE)を入れ結合させた。ビオチン- IgE(Biotin-IgE)のためにストレプタビジン結合馬ペルオキシダーゼ(streptavidin conjugated horse peroxidase)を入れビオチンとさらに一度結合をさせた。その後、基質(TMB substrate)を入れ発色させた後、反応停止液を入れイライザリーダー(reader)で波長450nm(reference wavelength 570nm)で吸光度を測定した。
【０１００】
その結果、図27及び図28に示したように放射線照射対照群では、正常対照群に比べてIgGの生産(図27)は減少したが、それに反してIgEの生産(図28)は増加することを確認でき、このような変動(不均衡)は本試料投与によってほとんど正常対照群の水準に調整され正常化されることが分かる。
【０１０１】
2.2.4)再生成された自然殺害細胞(NK細胞)の機能回復増進効果
放射線(用量5グレイ)照射マウスで再生成されたNK細胞の機能回復を本発明の組成物が促進させるかどうかを調べるために脾臓リンパ球を分離して癌細胞殺害能を前記クロム遊離法(2.2項参照)で測定した。
【０１０２】
本試料は、放射線照射36、12時間前と30分、24時間後に腹腔に注射した。その後、隔日で3回腹腔注射を実施した。放射線照射後、22、29、35、49日目マウスから取り出した脾臓細胞を比重遠心分離溶液(Ficoll-Hypaque溶液)を利用してリンパ球を分離した。このようにして得たリンパ球を完全培地に再浮遊させ作動細胞(effect cells)にし、標的細胞としてクロム(Cr51)で標識された癌細胞(YAC-1細胞)を準備(2×105/ml)した。作動細胞：標的細胞の比率が、6.5 : 1、12.5 : 1、25 : 1、50 : 1になるように各々0.1mlずつマイクロプレート(96 well microplate)の各ウェルに加えた後、培養器で4時間培養した。培養後、上澄み液0.1mlずつを取ってガンマーカウンター(γ-counter)で線量を測定した。実験は、3倍数で実施し、作動細胞：標的細胞の比率別に実施した各実験での癌細胞殺害能(% cytotoxicity)は上記と同様な方法で(数式 1)によって計算した。
【０１０３】
脾臓リンパ球全体の癌細胞殺害能を各個体別に比較するために、一定量の癌細胞を殺害するのに必要なリンパ球の数(LU: lytic unit)を算出した。ここで、1 LU10は標的細胞の10%を殺害させるのに必要な作動細胞の数と定義した。このLUは、用量-反応曲線(dose response curve)から直線回帰分析(linear regression analysis)方法で算出した。その後、リンパ球1×107個当りのLUの数を計算して脾臓リンパ球総数をかけて脾臓当りのLUの数を算出して個体間の癌細胞殺害能を比較した。
【０１０４】
その結果、図29に示したように放射線照射によってNK細胞の機能(癌細胞殺害能)が顕著に低下し、放射線照射後、長い間回復せず不充分であることが分かった。反面、本試料投与群の場合、低下したNK細胞の機能が顕著に回復し放射線対照群に比べて約2倍程度高いことが確認出来た。
【０１０５】
[実験例 3]酸化的生体損傷抑制効果の確認
1)細胞内DNA及び染色体損傷抑制効果
本発明の生薬組成物及び各試料を添加して細胞(リンパ球)を4時間細胞培養器で培養した後、放射線または過酸化水素水(H2O2)を処理した後、細胞内DNA及び染色体の損傷程度を放射線対照群と比較検討した。
【０１０６】
1.1)DNA損傷抑制効果
本発明の生薬組成物が放射線及び化学物質による酸化的損傷により起きる細胞内DNA鎖切断を防護できるかどうかを確認するために単細胞電気泳動法(Single Cell Gell Electrophoresis; Comet assay)を利用して観察した。
【０１０７】
まず、試験された細胞をアガロースゲルと混合して遊離スライド(slide)上に塗抹した後、細胞溶解溶液(lysis buffer)内で4℃で1時間溶解させた。このスライドを電気泳動した後、DNA染色溶液(ethidium bromide, 20μg/ml)で染色した。電気泳動によって移動したDNA破片の量をCCDカメラが付着した蛍光顕微鏡を使用してイメージ分析プログラム(Komet 4.0, Kinetic imaging, 社、英国)を通して分析した。DNA損傷程度は、DNA破片の移動距離(tail 長さ)と移動した部分(tail 内)のDNA破片(fragment)の量を数値化した値(tail moment)で示した。テールモーメント(tail moment)値が増加するほどDNA損傷程度が大きいことを意味する。
【０１０８】
実験の結果、本試料の投与で放射線(図4)及び過酸化水素水(図5)処理によって誘発された酸化的損傷によるDNA外鎖切断を効果的に抑制したことを(抑制率は、各々約49%及び37%)確認出来た。
【０１０９】
1.2)染色体損傷抑制効果
本発明の生薬組成物が、放射線及び化学物質による酸化的損傷により起きる染色体異常(aberration)を防護できるかどうかを確認するために、染色体損傷による細胞分裂中に形成される小核の頻度を測定した(小核試験; micronucleus test)。
【０１１０】
まず、本試料を添加して細胞(リンパ球)を4時間培養した後、放射線または過酸化水素水(H2O2)を処理した。細胞質の分化を防ぐためにサイトカラシンB(Cytochalasin B)を処理して24時間後に細胞を収穫し、顕微鏡検査用スライド標本を作り染色(Giemsa stain)した後、細胞核分裂が起きた細胞(binucleated cell)1000個内に形成された小核(micronucleus)を計数した。
【０１１１】
その結果、本生薬組成物が放射線(図6)及び過酸化水素水(図7)処理により誘発された酸化的損傷による染色体異常を効果的に抑制することを(抑制率は、各々約33%及び64%)確認できた。
【０１１２】
2)細胞内脂質及び蛋白質の酸化抑制効果
2.1)脂質の過酸化抑制効果
本発明の生薬組成物が、放射線及び化学物質による酸化的損傷にによって誘発される細胞膜の脂質過酸化(lipid peroxidation)を抑制できるかどうかを確認するために、マウス肝(liver)組織で脂質過酸化により生成されたマロンジアルデヒド(malondialdehyde)の量をTBA分析法(Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) assay)で測定した。
【０１１３】
放射線(8グレイ)照射36時間前、12時間前に本試料及び熱水抽出物の各分画物からなる各試料をマウス腹腔内に注射した。
【０１１４】
化学物質による酸化的損傷誘発の場合、四塩化炭素(CCl4)をコーンオイル(corn oil)と混ぜ、マウス腹腔内に注射し(0.5ml/kg)18時間程度絶食させ肝損傷を誘発させた。この場合、本試料及び熱水抽出物の各分画物からなる各試料の投与は、四塩化炭素処理27時間前及び3時間前に腹腔注射にした。
【０１１５】
マウスを犠牲死させ、肝(liver)を摘出して、一定量の肝組織を均質化させた。均質化させた肝組織を蛋白質量が3mgになるように摂取した後、そこに8.1%SDS(硫酸ドデシルナトリウム)0.2ml、20%酢酸(pH 3.0)1.5ml、0.8%TBA溶液1.5mlを入れ、良く混ぜた後、95℃で30分間湯煎した後、532nmで吸光度を測定した。標準液(1,1,3,3-テトラエトキシプロパン)を使用して求めた標準曲線(standard curve)を利用して検体内に生成されたマロンジアルデヒド(malondialdehyde)の量を計算して単位蛋白質含量当り濃度(nmol/mg 蛋白質)で示した。
【０１１６】
実験の結果、本試料が放射線(図8)及び四塩化炭素(図9)によって誘導された脂質過酸化を効果的に抑制することが(抑制率は、各々約31%及び36%)分かった。
【０１１７】
2.2)蛋白質の酸化抑制効果
本発明の生薬組成物が、放射線を含む酸化的損傷により誘導される蛋白質の酸化を抑制させられるかどうかを確認するためにマウス肝組織で蛋白質酸化によって生成されたカルボニルグループ(Carbonyl groups)の量を測定した。
【０１１８】
本試料及び熱水抽出物の各分画物からなる各試料の投与は、放射線(8グレイ)照射36時間前、12時間前にマウスに腹腔注射で行なった。マウス肝を摘出し、一定量の肝組織を均質化させた。均質化させた肝組織は、蛋白質量が4mgになるように摂取した後、そこに同量の容積の20%TCA(トリクロロ酢酸)溶液を入れ、蛋白質を沈殿させた後、10mM DNPH 500μlを入れ、1時間反応させた後、同量の容積の20%TCA溶液を入れ遠心分離させた。上澄み液を除去した後、エタノール-エチルアセタート混合溶液(1:1)1mlを入れパレット(pallet)を水洗した後、6M グアニジン・HCl 1.2mlを入れ再び遠心分離させた。上澄み液を取って分光光度計を利用して370nmで吸光度を測定した。
【０１１９】
実験の結果、本生薬組成物が放射線により誘導された蛋白質酸化を顕著に抑制して、放射線を照射していない正常対照群と同様な水準を維持することを確認した(図10)。カルボニルグループの濃度は、分子吸光係数(molar absorption coefficient)を22,000M-1cm-1を使用してnmolで換算し、カルボニルグループ/mg蛋白質(carbonyl group/mg protein)で示した。
【０１２０】
3)自由ラジカル(Free Radical)消去効果の確認
3.1)DPPHラジカル消去効果
本発明の生薬組成物が、生体内に生成された自由ラジカル(free radical)分子に電子を供与することによってラジカルの活性を消去する効果を調べるためにDPPH(1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル)(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)分子内ラジカルに対する電子供与能を測定した。
【０１２１】
実験でそれぞれ異なる濃度の本試料及び熱水抽出物の各分画物からなる各試料 0.2 mlに4×10-4M DPPH溶液1.8mlずつを加えた後、10秒間振湯して30分後、分光光度計(島津UV-1201、日本)を使用して517nmで吸光度を測定した。ここでDPPH分子内にある非共有電子(ラジカル)により溶液が紫色を帯びるが、試料が電子を供与するようになると電子が対を成し、この紫色が脱色される。この原理を利用した。試料の電子供与能(Electron donating abilities, EDA)を試料添加時(反応群)と非添加時(対照群)の吸光度減少差を百分率で示した。
【０１２２】
EDA(%) = (Ac-As)/Ac × 100
Ac : 試料を添加していない対照群の吸光度
As : 試料を添加した反応群の吸光度
【０１２３】
実験の結果、エタノール分画、メタノール分画と熱水抽出物が顕著に高い電子供与効果を示し、多糖体分画及び本生薬組成物も有意な効果を示すことを確認した(図11)。
【０１２４】
3.2)OHラジカル消去効果
本発明の生薬組成物が活性酸素種(reactive oxygen species)中で反応性が非常に強く、生体の酸化的損傷に最も主要な役割をするOHラジカル(hydroxyl radical)を消去する効果を調べるために、試験管内で過酸化水素水(H2O2)を処理して生成されるOHラジカルを消去する活性を測定した(2-デオキシリボース酸化法)。
【０１２５】
試験管で0.1mM FeSO4/EDTA溶液0.2ml、10mM 2-デオキシリボース0.2ml、本試料及び熱水抽出物の各分画物からなる各試料0.2mlと0.1M燐酸緩衝液(pH 7.4)1.2mlを加え、10mM H2O2 0.2mlを加え反応を開始させた。37℃水槽で4時間反応させた後、2.8%TCA(トリクロロ酢酸)溶液1mlを加え反応を中止させ、1%TBA(2-チオバルビツール酸)溶液1mlを加え95℃で10分間湯煎した後、冷却してUV-分光光度計を利用して532nmで吸光度を測定した。OHラジカル(Hydroxyl radical)消去活性は、試料添加区と無添加区の吸光度減少差を百分率で示した。
【０１２６】
OHラジカル消去活性(％) = {１- (As-Ao/Ac-Ao) }× 100
Ao : 試料とH2O2を添加していない陰性対照群の吸光度
Ac : 試料を添加していないH2O2処理対照群の吸光度
As : 試料を添加したH2O2処理群の吸光度
【０１２７】
実験の結果を図12に示した。本発明の生薬組成物が最も高い効果を示し、顕著にOHラジカルを消去することを確認した。
【０１２８】
[実験例 4]毒性検査
本試料の急性毒性検査結果、経口投与及び腹腔内注射時50%致死量が、共に体重kg当り2g以上であり、全く毒性効果を示さなかった。
【０１２９】
【発明の効果】
本発明の生薬組成物は、優れた抗癌効果、免疫及び造血機能増進効果及び酸化的生体損傷抑制効果を示し、抗癌剤及び放射線治療時に発生する免疫及び造血機能障害の回復促進及び酸化的損傷抑制を通した抗癌治療副作用防止のために応用出来、多様な退行性慢性疾病の予防及び老弱者の為の健康増進に広範囲に利用出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の免疫細胞活性と効果を示したグラフである。
【図２】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の造血前駆細胞の増殖効果による造血機能増進効果を示したグラフである。
【図３】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の骨髄間質細胞増殖効果による造血機能増進効果を示したグラフである。
【図４】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の放射線照射によるDNAの酸化的損傷に対する抑制効果を示したグラフである。
【図５】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の過酸化水素水によるDNAの酸化的損傷に対する抑制効果を示したグラフである。
【図６】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の放射線照射による酸化的損傷に対する各試料の抑制効果を示したグラフである。
【図７】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の過酸化水素水による酸化的損傷に対する各試料の抑制効果を示したグラフである。
【図８】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の放射線照射による脂質過酸化に対する抑制効果による、脂質の酸化的損傷に対する抑制効果を示したグラフである。
【図９】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の四塩化炭素による脂質過酸化に対する抑制効果による、脂質の酸化的損傷に対する抑制効果を示したグラフである。
【図１０】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料の放射線照射による蛋白質酸化に対する抑制効果による、蛋白質の酸化的損傷に対する抑制効果を示したグラフである。
【図１１】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料のDPPHラジカル消去効果を示したグラフである。
【図１２】  熱水抽出物の成分別分画物及び本試料のOHラジカル消去効果を示したグラフである。
【図１３】  本試料投与によるオスマウスでの腫瘍生長の抑制効果(寿命延長効果)を示したグラフである。
【図１４】  本試料投与によるメスマウスでの腫瘍生長の抑制効果(寿命延長効果)を示したグラフである。
【図１５】  本試料の癌細胞生長に対する影響を示したグラフである。
【図１６】  本試料のNK細胞活性化を通じた癌細胞殺害能による抗癌・免疫反応増強効果を示したグラフである。
【図１７】  本試料の大食細胞活性化を通じた癌細胞殺害能による抗癌・免疫反応増強効果を示したグラフである。
【図１８】  本試料の細胞毒性T細胞活性化を通じた癌細胞殺害能による抗癌・免疫反応増強効果を示したグラフである。
【図１９】  本試料の総白血球数再生成促進効果による血液細胞再生成促進効果を示したグラフである。
【図２０】  本試料のリンパ球(免疫細胞)再生成促進効果による免疫細胞再生成促進効果を示したグラフである。
【図２１】  放射線照射後、14日目の本試料による免疫細胞亜群別再生成促進効果を示したグラフである。
１：全体脾臓リンパ球        ２：Ｂ細胞
３：全体Ｔ細胞              ４：補助Ｔ細胞
５：細胞毒性Ｔ細胞
【図２２】  放射線照射後、47日目の本試料による免疫細胞亜群別再生成促進効果を示したグラフである。
１：全体脾臓リンパ球        ２：Ｂ細胞
３：全体Ｔ細胞              ４：補助Ｔ細胞
５：細胞毒性Ｔ細胞
【図２３】  放射線照射後、14日目の再生成されたB細胞の抗体生成能回復促進による、本試料の再生成されたB細胞の機能回復に対する促進効果を示したグラフである。
【図２４】  放射線照射後、25日目の再生成されたB細胞の抗体生成能回復促進による、本試料の再生成されたB細胞の機能回復に対する促進効果を示したグラフである。
【図２５】  放射線照射後、21日目の本試料の再生成されたT細胞の機能(同種異系細胞に対する反応)回復に対する促進効果を示したグラフである。
【図２６】  放射線照射後、36日目の本試料の再生成されたT細胞の機能(同種異系細胞に対する反応)回復に対する促進効果を示したグラフである。
【図２７】  本試料の放射線照射後、IgG生産減少に対する回復効果による抗体生成パターンの変動に対する調整効果を示したグラフである。
【図２８】  本試料の放射線照射後、IgE生産過剰に対する減少効果による抗体生成パターンの変動に対する調整効果を示したグラフである。
【図２９】  本試料の放射線照射後、再生成されたNK細胞の活性(癌細胞殺害能)の回復促進効果を示したグラフである。
【符号の説明】
Ｗ  熱水抽出物、Ｐ  多糖体分画、Ｍ  メタノール分画、Ｅ  エタノール分画、Ｒ  放射線対照群、Ｈ  過酸化水素水対照群、Ｃ  四塩化炭素対照群、Ｎ  正常対照群。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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