(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に組織トロンボプラスチンに血液凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有させて調製する複合因子測定試薬において、組織トロンボプラスチンの代わりに、ウサギ組織因子又はウシ組織因子のアミノ酸配列を実質的に有する組換え蛋白質とリン脂質で再構成させた再脂質化組織因子組成物を用い、血液凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有させるためにウシ血漿を用いた硫酸バリウム吸着血漿を用いることを特徴とする複合因子測定試薬。
【請求項２】
請求項１記載の組成物において、凝固反応を活性化するのに十分なカルシウムイオンを含む緩衝剤組成物を含有させ、前記組換え蛋白質が、ウシ組織因子のアミノ酸配列を実質的に有する組換え蛋白質である複合因子測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査の分野、とりわけ血液凝固能検査に用いられる検査用試薬に関するものであり、より具体的には、外因系凝固検査の複合因子測定用の試薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
複合因子測定試薬は、天然の源であるウサギ又はウシの脳由来の組織トロンボプラスチンに、凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有させて調製されている(Acta Med. Scad., suppl, 194, 1947)。一般に、凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンはウシ血漿を硫酸バリウム等で処理することにより得られる硫酸バリウム吸着血漿により供されている。一方、天然の組織トロンボプラスチンはウサギ又はウシの脳より抽出された粗製の組織トロンボプラスチンが利用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現在入手可能な複合因子測定試薬は、天然の源であるウサギ又はウシの脳由来の組織トロンボプラスチンに、凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有させて調製されている。天然のウサギ又はウシの脳より抽出された粗製の組織トロンボプラスチンを含んだ試薬では季節変動、ロット間変動が問題となる。また粗製の組織トロンボプラスチンを利用しているため、動物血液由来の他の凝固因子を不純物として含むため、測定目的の凝固因子に対して感度不足になったり、安定性が悪く不溶性物質が析出してくる等の問題があった。
【０００４】
さらに、天然の組織トロンボプラスチンでは、組織トロンボプラスチン自身の濁度が大きいため、試薬の濁りが大きく、光学的変化を検出手段に用いている凝固測定機器では、検体により正確な凝固時間が測定できない等の問題があった。この問題に対応するため、従来より、光学変化を検出するために用いている光源の波長に近い吸収スペクトルを有する色素を添加して、検出光量を減ずる工夫等がなされていたが、組織トロンボプラスチン自体の濁度のため完全ではなかった。すなわち、照射する光量の増減により、シグナルが変化するため、機器ごとに光量を厳密に調整しなければならない等の問題を解決するには至らなかった。
【０００５】
ところで、天然の組織トロンボプラスチンに代わるものとして、最近、遺伝子組換え技術により生産された組換え組織因子が入手できるようになり、それを利用したプロトロンビン時間測定試薬も既に知られている（特表平６−５０２６４９号公報）。また、ヒトの遺伝子組換え組織因子を利用した複合因子測定の報告例もある（機器・試薬１７、１００７−１０１２、１９９４）。しかし、複合因子測定試薬は用いる組織トロンボプラスチンの由来により、その特性が大きく異なるため、動物種を限定する必要があるばかりではなく、また、この報告例では、前述の課題を解決するには至っていない（機器・試薬１５、５９５−５９８、１９９０）。
本発明者らは鋭意研究した結果、ウサギ又はウシの遺伝子組換え組織因子を用いることにより、従来の複合因子測定試薬に比べて感度、再現性、安定性に優れた複合因子試薬が調製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明の目的は、安定性に優れ、光学的に澄明で沈殿物が生じず、しかも凝固因子に対して感度の高い複合因子測定試薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の発明の要旨は、
(1)実質的に組織トロンボプラスチンに血液凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有させて調製する複合因子測定試薬において、組織トロンボプラスチンの代わりに、ウサギ組織因子又はウシ組織因子のアミノ酸配列を実質的に有する組換え蛋白質とリン脂質で再構成させた再脂質化組織因子組成物を用い、血液凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有させるためにウシ血漿を用いた硫酸バリウム吸着血漿を用いることを特徴とする複合因子測定試薬；
(2)上記(1)記載の組成物において、凝固反応を活性化するのに十分なカルシウムイオンを含む緩衝剤組成物を含有させ、前記組換え蛋白質が、ウシ組織因子のアミノ酸配列を実質的に有する組換え蛋白質である複合因子測定試薬；
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、組換えウサギ又はウシ組織因子をリン脂質と再構成した再脂質化組織因子組成物に凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを加えた複合因子測定試薬に関するものである。
本発明で使用される組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子は、慣用の遺伝子工学的手法に準じて調製することができ、また市販されている組換えウサギ又はウシの組織因子蛋白質を使用してもよい(Pel-freez社カタログ、(1995)、Biochem., Biophys. Res. Commun., 181, 1145-1150, 1991)。遺伝子工学的手法により調製する場合、例えば、ウサギ組織因子又はウシ組織因子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体を培養後、その培養物（培養上清、培養細胞等）を慣用の蛋白質精製法に準じて精製することにより目的とする組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子を得ることができる。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００８】
なお、本発明で使用される組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子は、ウサギ組織因子又はウシ組織因子のアミノ酸配列を実質的に有し、当該組織因子活性を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、上記の遺伝子工学的手法において、ウサギ組織因子又はウシ組織因子をコードする遺伝子としては、ウサギ組織因子又はウシ組織因子のアミノ酸配列をコードする遺伝子；ウサギ組織因子又はウシ組織因子のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ当該組織因子活性を有するタンパク質をコードする遺伝子などが例示できる。上記のアミノ酸配列の置換、欠失及び／又は付加は、既に周知の技術である部位特異的突然変異誘発法等により実施することができ、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4662-5666, 1984; Nucleic Acid Res. 10, 6487-6500, 1982; WO85/00817; Nature 316, 601-605, 1985などに記載の方法に準じて行うことができる。なお、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により置換、欠失及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されることを意味する。
【０００９】
本発明において、組換え組織因子の再脂質化に使用されるリン脂質は、一般に１２〜２２の炭素原子を有する脂肪酸を含有するリン脂質であり、当該脂肪酸は飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸の何れであってもよい。好ましいリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンなどが例示される。これらのリン脂質は、天然物、合成品の何れであってもよく、また異なる脂肪酸を有するリン脂質であってもよい。これらのリン脂質は、所望する性状、特性などに応じて２種以上を混合して使用してもよく、好ましい組成の一例として、ホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン＝７：３の組成からなる混合物が挙げられる。
【００１０】
上記のリン脂質を用いた再脂質化組織因子の調製は常法に準じて行うことができる(Methods Enzymol., 222, p.177, 1993など参照)。例えば、組換えウサギ又はウシ組織因子蛋白質を、リン脂質組成物、１例としてホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン＝７：３のリポソームとを再構成することにより、再脂質化組織因子を調製することができる。なお、上記のリポソームは常法に準じて調製することができる。
組換え組織因子とリン脂質の比率は再脂質化組織因子を調製することができるものであれば特に限定されないが、組換え組織因子とリン脂質のモル比が約１：１０〜２×１０7の範囲、より好ましくは１：３，０００〜１５，０００の範囲で使用するのが好ましい。
【００１１】
本発明の複合因子測定試薬は、上記の再脂質化組織因子に凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを加えることにより調製することができる。凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンとしては、それぞれ精製品を使用してもよいが、通常は硫酸バリウム吸着血漿が使用される。
上記の硫酸バリウム吸着血漿は、ウシ血漿に約１０〜３０（Ｗ／Ｖ）％の硫酸バリウムを加えて室温で約２０分間混和した後、硫酸バリウムを除去することにより調製することができる。本吸着血漿は実質的に少なくとも凝固第ＩＩ、ＶＩＩ及びＸ因子を含まず、目的とする第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有するので、本吸着血漿は凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンの供給源として用いることができる。
【００１２】
上記の再脂質化組織因子と硫酸バリウム吸着血漿を適当な比で混合することにより、基本的な複合因子測定試薬が構成される。再脂質化組織因子と硫酸バリウム吸着血漿の混合比は従来の複合因子測定試薬の比率を参照することができる。そして、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、Ｇｌｙｃｉｎｅなどの群から選ばれるｐＨ５〜９、濃度約１０〜１００ｍＭで調製される緩衝液、さらには最終濃度約１〜２０ｍＭのカルシウムイオンを加えることもある。カルシウムイオン源としては、通常、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等から選ばれる。緩衝剤やカルシウムイオンの有無は、目的とする測定手法等により決定される。最終調製された試薬は、保存安定性を高めるため、通常凍結乾燥して保存され、使用時に精製水又は適当な緩衝液で溶解して使用する。
なお、本発明は上記の説明に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
組換えウサギ又はウシ組織因子０．２μｇと、予め調製しておいたホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン＝７：３のリポソーム０．２ｍｇとを０．２５％デオキシコール酸含有２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌ中で混合し、３７℃で１時間インキュベート後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液 １リットルで室温下、２４時間透析し、組織因子を再脂質化した(Methods Enzymol., 222, p.177, 1993)。
【００１４】
実施例２
ウシ血漿１００ｍｌに硫酸バリウム粉末２０ｇを混和し、室温で２０分間ゆっくりと撹拌した。５０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を集め硫酸バリウム吸着血漿を得た。吸着血漿中の第Ｖ因子活性は５０〜２００％、フィブリノゲン濃度は約１００〜２００ｍｇ／ｄｌであった。なお、凝固第ＩＩ、ＶＩＩ及びＸ因子活性は検出限界以下であった。
【００１５】
実施例３
再脂質化した組換えウサギ又はウシ組織因子の０．２μｇ（組織因子のみの蛋白量として）を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈後、最終２ｍｌとした。その中に吸着血漿１ｍｌを混合し、最終、４ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に調整し、本発明の複合因子測定試薬を得た。
調製された複合因子試薬（３試料）及び従来の天然型の試薬（３試料）を用いて、従来の天然型の試薬と同様の手法で正常域管理血漿と異常域管理血漿を測定したところ、表１に示すようにウサギ及びウシ組織因子共に、従来の試薬と同等の凝固時間を示し、従来の天然型と同等の活性を有することが確認できた。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
実施例４
本発明の試薬と従来の試薬をそれぞれ３試料調製し、それらの濁度の比較検討を行った。その結果を表２に示す。表２に示されるように、本発明の試薬は、従来の試薬に比べて６６０ｎｍでの吸光度が約７倍も低く、濁度が低いことがわかった。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
実施例５
本発明の試薬と従来の試薬とを用い、検体を散乱光量変化を検出原理とする凝固時間測定機器（コアグレックス７００、島津製作所製）で測定したときの初期の散乱光量と反応終了後の散乱光量をそれぞれ求め、散乱光量の比較検討を行った。その結果を表３に示す。表３に示されるように、従来の試薬は初期光量が本発明の方法に比べて、約７〜８倍高いばかりでなく、光量自体も調製ロット間で１．５倍近い変動が認められた。一方、本発明の方法では、初期の光量は低く、その調製ロット間のバラツキも少ない。しかも、凝固反応過程により生じる反応終点と初期光量の差は従来の方法と同等であり、初期光量に対するシグナルの割合が大きいことから（いわゆるＳ／Ｎ比が大きい）、反応に起因する光量変化を感度良く検出できることがわかった。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
実施例６
本発明の試薬と従来の試薬の安定性の比較検討を行った。その結果を表４に示す。表４に示されるように、従来の試薬では２５℃、１６時間で、活性が低下するのに対して、本発明の試薬は従来の試薬より約４倍も安定であることがわかった。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
実施例７
本発明の試薬と従来の試薬をそれぞれ２〜８℃で１０日間放置したときの不溶沈殿物の出現比較を行った。その結果を表５に示す。表５に示されるように、従来の試薬では３日間で沈殿が生じるのに対して、本発明の試薬では７日間でも沈殿は認められず従来の試薬より安定であることがわかった。
【００２４】
【表５】
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【００２５】
本発明の試薬と従来の試薬の異常血漿に対する感度比較を行った。その結果を表６に示す。感度の差が最も鋭敏に反映される第ＶＩＩ因子欠乏血漿を測定した結果、本発明のほうが正常血漿と凝固時間比を検討したところ、約１０倍も大きな値となり、明らかに異常検体に対する感度が高いことがわかった。
【００２６】
【表６】
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【００２７】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、感度、再現性、安定性に優れた試薬を得ることができ、特に濁度が低く澄明性が高いので、測定精度の著しい向上及び測定操作の簡便化を図ることができるという効果を奏する。