(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリーを、ペプシン並びにトリプシン及び／又はキモトリプシンにより処理して得られる分解組成物であって、
Lys-Phe,Ala-Val-Leu,Thr-Lys-Tyr,Ile-Val-Tyr,Phe-Tyr,Ile-Met-Tyr,Gly-Leu-Tyr,Asp-Gly-Leu,Leu-Thr-Phe,Phe-Asn-Pheおよびそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一のものを含有し、かつ
アンジオテンシンＩ変換酵素に対する阻害を目的として用いられるものである、分解組成物。
【請求項２】
ペプシンとトリプシンとキモトリプシンとにより処理して得られる、請求項１に記載の分解組成物。
【請求項３】
ペプシンにより処理された後、トリプシン及び／又はキモトリプシンによって処理されたものである、請求項１又は２に記載の分解組成物。
【請求項４】
高血圧症の予防、改善又は治療を目的として用いられるものである、請求項１乃至３のいずれかに記載の分解組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質酵素分解組成物とそれを含有する食品組成物に関し、より詳細には、ローヤルゼリーの蛋白質分解酵素による分解組成物とそれを含有する食品組成物に関する。
本発明のローヤルゼリー分解組成物（以下、「本分解組成物」という。）は、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性にもとづく血圧降下作用を奏するので、本分解組成物やそれを含有する食品組成物は、高血圧の予防、改善等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
わが国における生活習慣病の重大な疾患の一つとされる高血圧症は、心筋梗塞といった心疾患や脳梗塞や脳閉塞といった脳血管疾患等のような重篤な疾患の原因となり得ることが知られている。このため高血圧症は、早期の改善が必要であり、軽症の段階から高血圧発症の予防をするのが望ましい。
高血圧症は、本態性高血圧症とニ次性高血圧症とに大まかに分類される。これら両者のうち高血圧症の約９０％を占める本態性高血圧症は、食品からの食塩の過剰摂取や、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン系やカリクレイン−キニン−プロスタグランジン系の調節不全、カテコラミン分泌過剰などの相互作用により発症する。また、生体内の血圧維持機構には、昇圧系であるレニン−アンジオテンシン系と降圧系であるカリクレイン−キニン系が深く関っているとされ、特にレニン−アンジオテンシン系において強力な昇圧物質であるアンジオテンシンＩＩの生成は、昇圧に関して最も重要な因子であるとされている。
【０００３】
従って、高血圧症の改善を図るためには、臨床学的及び食品化学的にもアンジオテンシンＩＩの生成とその作用を抑制することが重要である。このため、高血圧症の改善のためには、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換することでアンジオテンシンＩＩの直接的な生成を担うアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、「ＡＣＥ」という）の活性を阻害することが有力な方法のひとつとされている。このようなＡＣＥ活性阻害作用を有する降圧薬としては、たとえば、カプトプリルが市販に供されている。しかしながら、従来、降圧剤として市場に供されてきたこのような医薬品は、優れた薬効を奏する反面、多くの場合副作用等を有していて安全性に問題があり、当該疾患を日常の食生活のなかで予防、改善してゆくために使用することは困難であった。
一方、古来から栄養価が高く様々な効用をもたらすものとして珍重され、食されてきたものとしてローヤルゼリーがある。経験的には、ローヤルゼリーを摂取することにより高血圧症を予防、改善できると言われているが、その生理活性物質について解明した報告は少なく、当該報告の多くは１０−ヒドロキシデセン酸の活性を報告したものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明では、的確な血圧降下作用を奏し、かつ、たとえば機能性食品等として利用可能な安全性の高い食品用素材を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ローヤルゼリーを所定の蛋白質分解酵素で分解して得られた分解組成物が優れた血圧降下作用、とくにアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性、を奏することを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明の第１の態様によれば、ローヤルゼリーを、ペプシン並びにトリプシン及び／又はキモトリプシンにより処理して得られる分解組成物（本分解組成物）が提供される。なお、ここにいう「ペプシン並びにトリプシン及び／又はキモトリプシンにより処理」するとは、（１）ペプシンとトリプシンとによって処理すること、（２）ペプシンとキモトリプシンによって処理すること、（３）ペプシンとトリプシンとキモトリプシンとにより処理すること、の（１）、（２）及び（３）の全ての場合を含む概念である。
【０００６】
本発明の第２の態様によれば、上記第１の態様において、ペプシンとトリプシンとキモトリプシンとにより処理して得られる本分解組成物が提供される。
本発明の第３の態様によれば、上記第１又は２記載の態様において、ペプシンにより処理された後、トリプシン及び／又はキモトリプシンによって処理されたものである本分解組成物が提供される。
本発明の第４の態様によれば、上記第１乃至３のいずれかに記載の態様において、Lys-Phe,Ala-Val-Leu,Thr-Lys-Tyr,Ile-Val-Tyr, Phe-Tyr,Ile-Met-Tyr,Gly-Leu-Tyr,Asp-Gly-Leu,Leu-Thr-Phe,Phe-Asn-Pheおよびそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一のものを含有する本分解組成物が提供される。
【０００７】
本発明の第５の態様によれば、上記第１乃至４のいずれかに記載の態様において、アンジオテンシンＩ変換酵素に対する阻害を目的として用いられるものである本分解組成物が提供される。
本発明の第６の態様によれば、上記第１乃至５のいずれかに記載の態様において、高血圧症の予防、改善又は治療を目的として用いられるものである本分解組成物が提供される。
本発明の第７の態様によれば、上記第１乃至６のいずれかに記載の態様における本分解組成物を含有してなる食品組成物が提供される。
本発明の第８の態様によれば、上記第７の態様において、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を奏する量の本分解組成物を含有するものである、食品組成物が提供される。
【０００８】
なお、本明細書及び図面において、特に断りがない限り、「％」は重量％をいうものとする。  また、上記１０種のペプチドを示す式中の記号において、Ｔｙｒはチロシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ａｌａはアラニンを、Ｖａｌはバリンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｍｅｔはメチオニンを、Ｇｌｙはグリシンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｔｈｒはトレオニンを、そしてＡｓｎはアスパラギンを表す。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に係るローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）は、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害する性質を有していることから、アンジオテンシンＩ変換酵素の作用によって生じる疾患の予防および改善に用いる食品類（例えば、機能性食品）の有効成分として使用することができる。例えば、アンジオテンシンＩ変換酵素の機能が過剰に亢進しバランスが崩れることによって生じる疾患としては、現在わかっているものだけでも、高血圧症、またこれから誘発される冠動脈疾患や心筋梗塞といった心疾患、脳血管障害、腎障害等があり、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）は、これら疾患の予防および改善に用いることができる。
【００１０】
本発明によれば、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）は、ローヤルゼリーをペプシン、並びにトリプシンおよび/またはキモトリプシンで分解処理すること、即ち、前述の通り、（１）ローヤルゼリーをペプシンとトリプシンとによって処理すること、（２）ローヤルゼリーをペプシンとキモトリプシンによって処理すること、（３）ローヤルゼリーをペプシンとトリプシンとキモトリプシンとにより処理すること、のいずれかにより製することができる。分解処理に供するローヤルゼリーは、いかなるものであってもよく、女王蜂を育てるために蜜蜂が分泌するものを広く用いることができる。また、このようにして収集した生ローヤルゼリーをそのまま用いても良く、或いは、生ローヤルゼリーを適宜前処理して得た蛋白画分を用いても良い。当該前処理した蛋白画分としては、たとえば、生ローヤルゼリーを遠心分離、アルコール沈殿、硫安処理、加熱処理して採取した蛋白画分を好適に用いることができる。それ故、本発明において「ローヤルゼリー」と称するときは、上記生ローヤルゼリーそれ自体、およびこれから採取した蛋白画分のいずれをも包含するものと理解されるべきものである。
【００１１】
ローヤルゼリーの分解に供しうるペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンとしては、特に限定はなく、たとえば一般に市販されているものをいずれも用いることができる。ペプシンとしては、たとえば、豚、牛、羊等哺乳動物の胃粘膜由来のもの、トリプシンおよびキモトリプシンとしては、たとえば、豚、牛、羊等哺乳動物の膵臓、脾臓由来のものなどを、何れも好適に用いることができる。
【００１２】
ローヤルゼリーの上記蛋白質分解酵素による酵素処理は、常法にしたがい、例えば、水性溶媒中約１５℃から約５０℃、好ましくは約２０℃から約４５℃で、適宜実施することができる。
また、この際、反応液の液性は、使用する蛋白質分解酵素の種類に応じて、適宜調整することができる。例えば、蛋白質分解酵素として、ペプシンを用いた場合はｐＨ０．５から５で、トリプシン、キモトリプシンを用いた場合にはｐＨ６から１０で適宜実施することができる。
反応溶媒は、水性溶媒であれば、特に制限はなく、たとえば含水アルコールを適宜用いることができる。
【００１３】
また、当該酵素処理は、ペプシンによる分解処理と、トリプシン及び／又はキモトリプシンによる分解処理と、のいずれを先に行うようにしてもよいが、ペプシン分解処理の後にトリプシン及び/又はキモトリプシン分解処理を行うのがより好ましい。
さらに、トリプシン及び／又はキモトリプシンによる酵素処理は、トリプシン又はキモトリプシンのいずれか少なくとも一種を用いて行うことができるが、トリプシンとキモトリプシンとの両方を用いるようにすれば（即ち、この場合は、ペプシンとトリプシンとキモトリプシンとにより処理される。）、更に好ましい。
【００１４】
上記本発明によれば、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性にもとづく優れた血圧降下作用を奏するローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）を得ることができる。例えば、ローヤルゼリー自体はなんらアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示さないが、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物は、後記実施例に示すとおり、ペプシン単独処理して得られるローヤルゼリー分解組成物と対比して、約４倍強力な同酵素阻害活性を示すことができる。
【００１５】
さらに、酵素処理で使用するペプシン、トリプシン、キモトリプシンはそれぞれ異なるペプチド切断点をもつため、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）は、これら２乃至３種のプロテアーゼの併用によって生成する固有のペプチドを含有し、たとえば、後記実施例記載の反応条件にしたがえば、Lys-Phe,Ala-Val-Leu,Thr-Lys-Tyr,Ile-Val-Tyr, Phe-Tyr,Ile-Met-Tyr,Gly-Leu-Tyr,Asp-Gly-Leu,Leu-Thr-Phe,Phe-Asn-Phe等のジまたはトリペプチドを含むローヤルゼリー分解組成物として得ることができる。
【００１６】
後記実施例に示すとおり、これらのジペプチドまたはトリペプチドは各々優れたアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示す。しかし、これら活性成分の生成比および生成量或いはさらにこれら活性成分のうちの個々の成分の生成の有無は、使用原料の種類やその酵素反応条件によって変動しうるものであるから、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物は、これら１０種ペプチドを全て含むものには限定されない。即ち、その酵素処理条件を前記本発明の態様の範囲内で適宜選択して得られるものであって、かつアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示す有効成分を含むものは本発明の範囲に含まれるものであり、例えば、Lys-Phe,Ala-Val-Leu,Thr-Lys-Tyr,Ile-Val-Tyr, Phe-Tyr,Ile-Met-Tyr,Gly-Leu-Tyr,Asp-Gly-Leu,Leu-Thr-Phe,Phe-Asn-Pheからなる群から選ばれる少なくとも一種のペプチドを含むものは、すべて本発明の範囲に含まれるものである。
【００１７】
本発明のローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）としては、上記酵素処理で得られた溶液をそのまま用いることができ、或いはより好ましくは、上記酵素処理溶液を蛋白変性処理（例えば、熱処理）して蛋白質分解酵素を失活し、必要に応じてこれを乾燥粉末化（例えば、凍結乾燥）したものとして使用する。
また、その際、当該分解組成物に含まれるペプチドは、必要に応じて、生理的に許容しうる各種無機酸または有機酸との塩、例えば、塩酸塩等としておくこともできる。
【００１８】
本発明に係るローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等のような食品組成物として使用することができる。当該用途に使用するに際しては、本発明のローヤルゼリー分解組成物をそのままこれらの食品組成物として利用することができ、或いは、当該分解組成物を、例えば水、アルコール、ビタミン、ミネラル、でんぷん質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、脂肪酸、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、乳化剤、防腐剤、保存料、防カビ剤、殺菌剤、酸化防止剤のごとき食品に通常用いられる原料及び/又は素材の１または複数とともに配合して使用することもできる。
食品組成物の個々の使用形態に応じて溶液状、懸濁液状、シロップ状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状、粉末状、顆粒状、粒状、チュアブル状、或いはそれ以外の所望の形状で、必要に応じて成形して使用することもできる。
【００１９】
本発明に係るローヤルゼリー分解組成物の当該食品組成物への配合割合は、特に限定されず、当該食品組成物の使用目的、使用形態および使用量に応じ、適宜選択することができる。
なお、当該食品組成物が、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を奏する量の本分解組成物を含有するようにするには、通常、タンパク質由来の加水分解物量に換算して、食品組成物１００重量部あたり０．ｌから９０重量部の範囲内である。
【００２０】
また、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）を添加・配合して調製しうる食品組成物の具体的形態としては、例えば、飲料類（清涼飲料（コーヒー、ココア、ジュース、ミネラル飲料、茶飲料、緑茶、紅茶、烏龍茶等）、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、酒類（日本酒、洋酒、果実酒、はちみつ酒等）等）、スプレッド（カスタードクリーム、バタークリーム、ピーナツクリーム、チョコレートクリーム、チーズクリーム等）、ペースト（フルーツペースト、野菜ペースト、ゴマペースト、海藻ペースト等）、洋菓子（チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、エクレア、マフィン、ワッフル、ガム、グミ、ゼリー、キャンデー、クッキー、クラッカー、ビスケット、スナック菓子、ケーキ、プリン等）、和菓子（飴、煎餅、かりんとう、あられ、団子、おはぎ、大福、豆もち、餅、餡、饅頭、カステラ、あんみつ、羊かん等）、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シャーベット、かき氷等）、レトルト食品（カレー、牛丼、中華丼、雑炊、おかゆ、味噌汁、スープ、ミートソース、デミグラスソース、ミートボール、ハンバーグ、おでん種、赤飯、焼き鳥、茶碗蒸し等）、即席食品（即席ラーメン、即席うどん、即席そば、即席焼きそば、即席スパゲティ、即席ワンタン麺、即席しるこ、味噌汁の素、粉末スープの素、粉末ジュースの素、ホットケーキミックス等）、瓶詰・缶詰、ゼリー状食品（ゼリー、寒天、テリーヌ、ゼリー状飲料等）、調味料（食塩、天然塩、醤油、みりん、酢、砂糖、蜂蜜、味噌、ドレッシング、旨味調味料、複合調味料、ソース、マヨネーズ、ケチャップ、ふりかけ、天つゆ、麺つゆ、だしの素、中華スープの素、中華の素（麻婆豆腐の素、チンジャオロースの素）、ブイヨン、焼肉のたれ、冷しゃぶのたれ、カレールー、シチューのルー等）、養蜂産品（はちみつ、ローヤルゼリー、プロポリス、花粉荷（花粉だんご）、蜂の子等）、乳製品（牛乳、チーズ、ヨーグルト、生クリーム等）、加工果実（ジャム、マーマレード、シロップ漬、干し果実等）、加工野菜（野菜ジャム等）、穀類加工食品（麺、パスタ、パン、ビーフン等）、漬物（たくあん、奈良漬、キムチ漬、福神漬、らっきょう漬、白菜漬、からし漬、しば漬、浅漬け、ピクルス等）、漬物の素（即席漬けのもと、キムチ漬のもと等）、魚肉製品（かまぼこ、ちくわ、はんぺん等）、畜肉製品（ハム、ソーセージ、サラミ、ベーコン等）、珍味（さきするめ、さきタラ、ウニの塩辛、イカの塩辛、タコの塩辛、カワハギのみりんぼし、フグのみりんぼし、イカの薫製、コノワタの塩漬等）、乾物（味付け海苔等）、惣菜類（あえもの、揚げ物、炒め物、焼き物、煮物、酢の物等）、冷凍食品（エビフライ、コロッケ、春巻き、とんかつ、シューマイ、餃子、ハンバーグ、たこ焼き、今川焼き（回転焼き）、肉まん、あんまん等）、油脂食品（サラダオイル、マーガリン、バター）等を挙げることができる。さらに、本分解組成物を添加・配合して調製しうる食品組成物は、食品（飲料水を含む。）に添加するための食品添加用組成物として用いてもよい。
本発明のローヤルゼリー分解組成物を添加・配合して調製しうる食品組成物は、いわゆる健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）、病者用食品・病者用組合わせ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）又は高齢者用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）としてもよく、その場合であれば、素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセルとソフトカプセルとのいずれも含む。）、チュアブルタイプ、シロップタイプ等とすることもできる。  本発明に係るローヤルゼリー分解組成物を添加・配合した食品組成物の調製は、それ自体公知の方法で行うことができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を具体的に説明するために、実施例及び試験例を挙げる。しかしながら、本発明は、かかる実施例等によって何ら制限されるものではない。
【００２２】
実施例１
生ローヤルゼリー1.0ｇを10ｍｌの脱イオン水に溶解させ、ボルテックス（商標、Scientific  Industries社製）で攪拌した後、4℃、12,000rpmで20分間遠心分離を行なった。その上清を凍結乾燥したものを試料Ｎ-ＲＪ（Native Royal Jelly）とした。
Ｎ−ＲＪ 3ｇを30ｍｌの脱イオン水に溶解し、ボルテックスで攪拌後、その攪拌された液に20％塩酸を加えてpHを1.2に調整した。そのｐＨ１．２に調整された液に、対基質（Ｎ−ＲＪ 3ｇ）に0.4重量％となるようにペプシン（ブタ胃粘膜由来、ナカライテスク社製）12mgを加え、37℃で4時間インキュベートした。
【００２３】
その後、そのインキュベートされた液に、20％水酸化ナトリウム溶液を加えて、その溶液のｐＨを6.8に調整した。次いでｐＨを6.8に調整された溶液の上清３ｍｌを分取し、これを凍結乾燥させてローヤルゼリーのペプシン分解組成物を得た。
該溶液の残分に対基質0.2重量％となるようにキモトリプシン６ｍｇ及びトリプシン６ｍｇ（いずれもウシ脾臓由来、ベーリンガーマンハイム社製）を添加し、それを37℃で4時間インキュベートした。その37℃で4時間インキュベートされた溶液を98℃で15分間加熱処理し、その加熱処理された溶液を10,000rpmで15分間遠心分離した。その遠心分離された溶液の上清を凍結乾燥して、ローヤルゼリーのペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物（本分解組成物）を得た。
【００２４】
実施例２
実施例１の方法により得られたペプシン分解組成物およびペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物（本分解組成物）のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を、Lieberman変法（山本  節子、戸井田  一郎、岩井  和郎、日胸疾会誌１８（５）、ｐ２９７−３０３．、１９８０）に準じて測定した。
【００２５】
測定の実際は、まず上記のようにして得られた分解組成物（ペプシン分解組成物とペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物（本分解組成物）とのそれぞれ）を脱イオン水に溶解させて調製した分解組成物サンプル25μl及び前述のほう酸緩衝液（０．２Ｍほう酸、０．０５Ｍ四ほう酸ナトリウム、ｐＨ８．３）に溶解した25ｍＵウサギ肺由来アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ、シグマ社製）50μlを穏やかに混合し、37℃で5分間プレインキュベートした後、12.5ｍＭの擬似基質hippuryl−Ｌ−histidyl−Ｌ−leucine（ＨＨＬ、ペプチド研究社製）を50μｌを添加することによって反応を開始した。37℃で1時間インキュベートした後、0.5Ｍ塩酸125μｌの添加によって反応を停止した。次に、酢酸エチル750μｌを加える事によって、生成した馬尿酸を抽出し、228ｎｍでの吸光度を測定した。
そして阻害率ＩＣ（％）を、以下に示す式に従って算出した。
【００２６】
ＩＣ（％）＝｛（Ｃ−Ｂ）−（Ｓ−ＳＢ）／（Ｃ−Ｂ）｝×100      （式１）
（ただし、式中、
Ｃ：コントロールの吸光度
Ｂ：ブランクの吸光度
Ｓ：ペプチドサンプルの吸光度
ＳＢ：サンプルブランクの吸光度
である。）
なお、ここでコントロールとは分解組成物サンプルを加えず、正常活性を有するＡＣＥを用いて反応させたもの、ブランクとは分解組成物サンプルを加えず、失活させたＡＣＥを用いて反応させたもの、サンプルブランクとは分解組成物サンプルを加えて、失活させたＡＣＥを用いて反応させたもの、をそれぞれ意味する。
【００２７】
これらのコントロール、ブランク及びサンプルブランクについては、次のようにして測定した。
まずコントロールは、前述する分解組成物サンプルの反応において、脱イオン水に溶解した分解組成物サンプル25μlに代えて脱イオン水25μlを用いる以外は同様にして反応させ、得られた反応液から抽出した馬尿酸の吸光度（228ｎｍ）を測定した。
またブランクは、前述する分解組成物サンプルの反応において、脱イオン水に溶解した分解組成物サンプル25μlに代えて脱イオン水25μlを用いて、これを同様に25ｍＵのＡＣＥ50μlと混合し、37℃で5分間プレインキュベートした後、直ちに０．５Ｍ塩酸１２５μlを加えてＡＣＥを失活させる操作を行った。次いでこれに12.5ｍＭの擬似基質hippuryl−Ｌ−histidyl−Ｌ−leucine（ＨＨＬ、ペプチド研究社製）を50μｌを添加し、分解組成物サンプルの場合と同様にして反応させて、得られた反応液から抽出した馬尿酸の吸光度（228ｎｍ）を測定した。
そしてサンプルブランクは、分解組成物サンプル25μlを25ｍＵのＡＣＥ50μlと混合し、37℃で5分間プレインキュベートした後、直ちに０．５Ｍ塩酸１２５μlを加えてＡＣＥを失活させる操作を行った。次いでこれに12.5ｍＭの擬似基質hippuryl−Ｌ−histidyl−Ｌ−leucine（ＨＨＬ、ペプチド研究社製）を50μｌを添加し、分解組成物サンプルの場合と同様にして反応させて、得られた反応液から抽出した馬尿酸の吸光度（228ｎｍ）を測定した。
【００２８】
なお、上記反応条件で、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を50％阻害したとき（即ち、ＩＣ（％）＝５０のとき）の反応液中での分解組成物濃度をＩＣ50値として定義した。
ＩＣ50値の具体的な求め方は、各分解組成物それぞれについて、いくつか異なる濃度のサンプルで上記式１よりＩＣ（％）を得て、縦軸に阻害率ＩＣ（％）をとり、横軸に反応液中の分解組成物の濃度（μＭ）をとり、検量線を作成する。その検量線から５０％活性が阻害された分解組成物濃度を読みとり、その分解組成物のＩＣ50値とした。
また、Ｎ−ＲＪについても、上記と同様にＩＣ（％）を得て、縦軸に阻害率ＩＣ（％）をとり、横軸に反応液中の分解物の濃度（ｍｇ／ｍｌ）をとり、検量線を作成する。その検量線から、酵素阻害活性を測定した。
結果を、次の表１に示す。
【００２９】
表１  Ｎ−ＲＪおよびローヤルゼリー分解組成物のＩＣ50値
試  料 ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）
Ｎ−ＲＪ                  ＡＣＥ活性阻害なし
Ｎ―ＲＪ蛋白質画分            同上
ペプシン分解組成物          １．２４
ペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物
０．３５
【００３０】
表１から、Ｎ−ＲＪとその蛋白質画分（Ｎ−ＲＪをトリクロロ酢酸処理して採取した蛋白質画分）にはＡＣＥ阻害作用は全く認められないことが明らかとなった。一方、Ｎ−ＲＪをペプシンによる酵素処理することでＡＣＥ阻害作用が発現するが、ペプシン分解組成物をさらにトリプシンとキモトリプシンで酵素処理することで、ＡＣＥ阻害作用が著しく上昇することが判明した（ペプシン分解組成物と対比して、後者がほぼ４倍のＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０＝０．３５３ｍｇ／ｍｌ）を有している）。
【００３１】
実施例３
実施例１で得たペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物（本分解組成物）から、Superdex Peptide HR カラム（Bio-Rad社製、φ10ｍｍ×300ｍｍ）を用いたGPC（ゲル浸透クロマトグラフィー）-HPLCの高速液体クロマトグラフィーにより、ジペプチド及びトリペプチドの粗画分を分離した。この分離条件は以下の通りである。移動相には、0.1％トリフルオロ酢酸と30％アセトニトリルを含む含水有機溶媒（トリフルオロ酢酸とアセトニトリルと水との混合溶媒）を用い、流速0.3ml／分、35℃のカラム温度で分画を行ない、溶出は、220ｎｍでモニターし、約100分間実施した。このときの溶出曲線を図１に示す。図１の横軸は溶出時間（単位：分）を、縦軸は吸光度（220ｎｍ）を示す。ジペプチド及びトリペプチドを含む粗画分として、溶出時間が約５０〜７０分の画分を採取した（図１中、矢印Ａの範囲）。この粗画分に含まれるジペプチド及びトリペプチドの産生率は、最初のＮ−ＲＪサンプルの3.3％であった。
【００３２】
なお、上記採取画分（溶出時間が約５０〜７０分の画分）は、分子量マーカーとしてＧｌｙ−Ｇｌｙ（最小分子量マーカー）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ（最大分子量マーカー）、アンジオテンシンＩＩ（ＡＮＧＩＩ）を用いて、上記と同じ条件でＧＰＣ−ＨＰＬＣを行い、最小分子量マーカーであるＧｌｙ−Ｇｌｙから最大分子量マーカーであるＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐまでの全てのジペプチド及びトリペプチドが溶出する時間から決定した。この結果を検量曲線として図２に示す。図２の横軸は溶出時間（分）、縦軸は分子量の対数値（ｌｏｇ．Ｍ．Ｗ．）を示している。
【００３３】
さらにこのジペプチド及びトリペプチドを含む粗画分を、まず、ＯＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラム（ナカライテスク社製、φ4.6ｍｍ×250ｍｍ）を用い、ついで、ＯＤＳ−ＡＲＩＩカラム（ナカライテスク社製、φ4.6ｍｍ×250ｍｍ）を用いた2段階の逆相高速液体クロマトグラフにかけ、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドを単離した。この分離条件は以下の通りである。まず、ＯＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラムによる分離については、移動相には、アセトニトリル濃度が1から40％の濃度勾配となるようにアセトニトリル−水の混合溶媒を用い、流速0.3ｍｌ／分、常温のカラム温度で分画を行ない、溶出は、220ｎｍで状況をモニターしながら、約60分間実施した。次に、ＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムによる分離については、移動相は、0.1％トリフルオロ酢酸とアセトニトリル濃度が5から35％の濃度勾配となるようにアセトニトリル−水の混合溶媒を用い、流速0.3ｍｌ／分、常温のカラム温度で分画を行ない、溶出は、220ｎｍで状況をモニターしながら約60分間実施した
【００３４】
第１乃至第１０のペプチドの単離方法について以下詳述する。
まず、第１及び第２のペプチドの単離について説明する。上記ジペプチド及びトリペプチドを含む粗画分（図１、Ａ画分）を、前述の条件のもとＯＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラムを用いた高速液体クロマトグラフによって分画し、図３に示す溶出曲線を得た。図３中、▲及びそれを結ぶ点線は右軸であり、○及びそれを結ぶ実線は、左軸を示す。
この溶出成分のうち溶出時間３９分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図４に示す溶出曲線を得た。図４の各ピークについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その結果、溶出時間４８．３分の画分が第１のペプチドたるＬｙｓ−Ｐｈｅであることが判明し、溶出時間６０．５分の画分が第２のペプチドたるＡｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕであることが判明した。
【００３５】
次いで、第３、第４および第５のペプチドの単離について説明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間４３分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフにかけ、図５に示すような溶出曲線を得た。図５の各ピークについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その結果、溶出時間４６．７分の画分が第３のペプチドたるＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒであること、溶出時間５６．７分の画分が第４のペプチドたるＩｌｅ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒであること、溶出時間５９．７分の画分が第５のペプチドたるＰｈｅ−Ｔｙｒであることが判明した。
【００３６】
そして第６のペプチドの単離について説明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間４８分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフにかけ、図６に示すような溶出曲線を得た。図６の各ピークについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その結果、溶出時間５９．７分の画分が第６のペプチドたるＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒであることが判明した。
【００３７】
さらに、第７のペプチドの単離について説明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間５２分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図７に示すような溶出曲線を得た。図７の各ピークについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その結果、溶出時間６６．７分の画分が第７のペプチドたるＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕであることが判明した。
【００３８】
次いで、第８のペプチドの単離について説明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間６０分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図８に示すような溶出曲線を得た。図８の各ピークについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その結果、溶出時間７０．１分の画分が第８のペプチドたるＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅであることが判明した。
【００３９】
第９のペプチドの単離について説明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間６８分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図９に示すような溶出曲線を得た。図９の各ピークについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その結果、溶出時間７６．１分の画分が第９のペプチドたるＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅであることが判明した。
【００４０】
最後に、第１０のペプチドの単離について説明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間４６分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図１０に示すような溶出曲線を得た。図１０の各ピークについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その結果、溶出時間６０．１分の画分が第１０のペプチドたるＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであることが判明した。
なお、上記した高速液体クロマトグラフィー操作は、いずれも島津製作所社製ＬＣ−9ＡＨＰＬＣシステムを用いて行った。
以上のようにして、分解物（分解組成物）からペプチドの単離を高速クロマトグラフィーによって行い、第１〜１０のペプチドそれぞれの画分を採取した。
【００４１】
上記第１乃至第１０のペプチドの同定に用いた前記アミノ酸組成分析及び前記アミノ酸配列分析について簡単に説明しておく。
アミノ酸組成分析は、常法に従ってサンプルを６Ｎ塩酸で１１０℃で２４時間、加水分解した後、ＬＣ−１０Ａアミノ酸アナライザー（島津製作所社製）によって分析した。
アミノ酸配列分析は、ＰＰＳＱ−２１プロテインシーケンサー（島津製作所社製）を用いて、常法に従って自動エドマン分解法により分析を行った。これらの分析結果から、ペプチドの構造を決定した。
【００４２】
このようにして得た第１〜１０のペプチドのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性（ＩＣ50値）を実施例２記載の方法に準拠して求めた。結果は、次の表２に示すとおりである。
【００４３】
表２  第１〜１０のペプチドのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性（ＩＣ50値）
ペプチドの種類 ＩＣ50（μＭ）
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ                        １．７
Ｌｙｓ−Ｐｈｅ                    １２０
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ                ０．５
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ                ７．１
Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ                ２．３
Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ                １．８
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ                ８．８
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ                ２．２
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ                ２．７
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ                ６．９
【００４４】
処方例１
ドリンク剤：
（ドリンク剤１本分の組成）
実施例１で得たペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物        １．０ｇ
レモン果汁                                    ２０ｍｌ
プロポリス                                      ０．３ｇ
ビタミンＣ                                      ０．２ｇ
はちみつ                                      １３ｇ
上記の５成分を水に溶解させ、全量を１００ｍｌとした。
【００４５】
0004045401.tif 000002
上記の各成分を常法に従い充分に混合し、使用前にも充分攪拌して用いる。
【００４６】
0004045401.tif 000003
上記各原料を用いて、常法に従い飴を作成した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明に係るローヤルゼリー分解組成物は、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するとともに、その成分が主に比較的小さなペプチド分子であるため粘膜や皮膚等を経由して効率よく吸収される。さらに、ローヤルゼリーを蛋白質分解酵素によって分解して得られるものであるため、優れた安全性を有するという特徴を有する。
従って、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物それ自体および同組成物を添加・配合した食品組成物は、機能性食品等として、高血圧の予防や改善などを効率よくかつ安全に実現することができる。
また、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物および同組成物を添加・配合した食品組成物は、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害する性質を有しているので、アンジオテンシンＩ変換酵素の作用に基づく各種疾患、例えば、高血圧症、これから誘発される冠動脈疾患や心筋梗塞といった心疾患、脳血管障害、腎障害などの予防に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】加水分解物の試料（本分解組成物）を高速液体クロマトグラフィーにより分画する際の溶出曲線である。
【図２】加水分解物の試料（本分解組成物）を高速液体クロマトグラフィーにより分画する際の採取する画分の溶出時間を決定するためのグラフである。
【図３】ＯＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図４】第１及び第２のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図５】第３、第４および第５のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図６】第６のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図７】第７のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図８】第８のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図９】第９のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図１０】第１０のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶出曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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