(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトアミンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼおよび二価の金属に対するキレート剤を一の試薬として含有することを特徴とするケトアミンオキシダーゼ含有試薬。
【請求項２】
試薬が糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
二価の金属に対するキレート剤を共存させることを特徴とするケトアミンオキシダーゼおよびアスコルビン酸オキシダーゼを一の試薬として含有する試薬の保存時の安定化方法。
【請求項５】
試薬が糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化タンパク質を酵素を用いて測定する試薬に於いて、ケトアミンオキシダーゼを安定化する試薬及び安定化方法に関するものである。より詳細には、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンのごとき糖化タンパク質の定量に有効な、ケトアミンオキシダーゼの安定化試薬及び安定化方法に関するものである。本発明は臨床検査の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミン、フルクトサミン、1.5アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカーの測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）や免疫法で測定されてきたが、最近、大量検体を迅速に処理することか可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４等）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特許文献５）、糖化タンパク質割合の測定方法（特許文献６）を開発してきた。
【０００３】
一般に臨床検査の分野に広く使用されるために、また正確な測定値を保証する為には、試薬の製造初期性能はもちろんのこと、保存時の試薬の安定性が重要である。本発明者らはこれらの問題点を解決する目的で、ケトアミンオキシダーゼの安定化方法の検討を重ね、糖アルコール、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンによるケトアミンオキシダーゼの安定化方法を開発してきた（特許文献７）。但し最近の検討では、アスコルビン酸オキシダーゼ等の特殊な物質が共存する場合に、これらの安定化剤を添加してもケトアミンオキシダーゼの安定性が確保できないことが判明した。
アスコルビン酸オキシダーゼ等の特殊な物質が共存する場合のケトアミンオキシダーゼの安定化方法に関する安定化剤および安定化方法はこれまで知られていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平６−４６８４６号公報
【特許文献２】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献３】
ＷＯ９８／４８０４３号公報
【特許文献４】
ＷＯ９７／１３８７２号公報
【特許文献５】
特開２００１−５４３９８号公報
【特許文献６】
特開２００１−２０４４９５号公報
【特許文献７】
ＷＯ０２／０６１１１９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、本発明の課題は、安定なケトアミンオキシダーゼ含有試薬を提供すること及びケトアミンオキシダーゼを安定化する方法を提供することにある。さらに具体的には臨床生化学検査における安定なケトアミンオキシダーゼ試薬及び試薬中のケトアミンオキシダーゼの安定化方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明者は、如何にすれば効果的にケトアミンオキシダーゼ含有試薬を安定化できるか検討を行った。
本発明者らは鋭意検討した結果、ケトアミンオキシダーゼが不安定になる要素として、金属イオン、特に銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ニッケル、カドミウム、水銀等のイオンの共存が強く関与していることを突き止めた。これらの悪影響は例えば銅イオンを分子内に保持するアスコルビン酸オキシダーゼ等を添加した場合に強く観察された。通常では酵素が保持している金属が、共存するその他の酵素に影響を与えるとは考えにくく、極めて意外な発見であった。
【０００７】
そこで本発明者は、キレート剤を共存させ、金属イオンの悪影響を回避することを試みた。本発明のケトアミンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びキレート剤よりなる処方においては、この処方のケトアミンオキシダーゼ含有試薬が、液状−冷蔵保存にて、１年以上安定であること、さらに意外なことに、キレート剤の添加により銅イオンを分子内に保持するアスコルビン酸オキシダーゼの酵素活性の消失や不安定化がおこらないことを見出し本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬にキレート剤を共存させることにより、効率的にケトアミンオキシダーゼを安定化する試薬及びケトアミンオキシダーゼの安定化方法に関する。さらに詳しくは、臨床生化学検査における糖化蛋白質の測定に有用な試薬、及び安定化方法に関する。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の安定なケトアミンオキシダーゼ含有試薬及びケトアミンオキシダーゼを安定化する方法に関する。
(1)  ケトアミンオキシダーゼ及びキレート剤を含有する、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬。
(2)  ケトアミンオキシダーゼ、金属イオンを含有する物質及びキレート剤を含有する、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬。
(3)  金属イオンを含有する物質が、酵素である上記(2)記載の試薬。
(4)  試薬が、糖化タンパク質の定量に用いるものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の試薬。
(5)  糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである、上記(4)に記載の試薬。
(6)  キレート剤をケトアミンオキシダーゼと共存させることよりなるケトアミンオキシダーゼの安定化方法。
(7)  キレート剤をケトアミンオキシダーゼ及び金属イオンを含有する物質と共存させることよりなるケトアミンオキシダーゼの安定化方法。
(8)  金属イオンを含有する物質が、酵素である上記(6)又は(7)に記載の方法。
(9)  試薬が、糖化タンパク質の定量に用いるものである上記(6)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)  糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである上記(9)に記載の方法。
【００１０】
以下この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうるケトアミンオキシダーゼとしては糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに良好に作用し、過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼであればいかなる酵素を用いても良いが、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましい。
【００１１】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、カンジダ（Candida ）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。
【００１２】
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が挙げられる。
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；PCT/JP02/0072）が知られている。
【００１３】
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。
【００１４】
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開2001-20449号公報（糖化タンパク質割合測定方法）記載の方法にて測定し、37℃-1 分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義した。
【００１５】
本発明に使用しうるキレート剤としては、ケトアミンオキシダーゼの安定性を損なう金属イオンをキレートし、ケトアミンオキシダーゼの安定性を向上させるものであれば如何なる物質を用いても良い。好ましいキレート剤の例としてはエチレンジアミン４酢酸(EDTA)およびその塩、trans-1,2-diaminocyclohexane
-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, monohydrate (CyDTA),N,N-bis (2-hydroxyethyl)glycine (DHEG), 1,3-diamino-2-hydroxypropane
-N,N,N’,N’-tetraaceticacid (DPTA-OH), Diethylenetriamine
-N,N,N’,N’’,N’’-pentaacetic acid (DTPA), Ethylenediamine-N,N’-dipropionic acid, dihydrochloride (EDDP), Ethylenediamine-N,N’-bis (methylenephoephonic acid), hemihydrate (EDDPO),N-(2-Hydroxyethyl) ethylenediamine-N,N’,N’-triacetic acid (EDTA-OH), Ethylenediamine
-N,N,N’,N’-tetrakis (methylenephosphonic acid (EDTPO), O,O’-Bis(2-aminoethyl)ethleneglycol-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (GEDTA),
N’,N’-Bis(2-hydroxybenzyl)ethylenediamine-N,N-diacetic acid (HBED),
1,6-Hexamethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (HDTA), N-(2-Hydroxyethyl)iminodiacetic acid (HIDA),Iminodiacetic acid (IDA), 1,2-Diaminopropane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (Methyl-EDTA),
Nitrilotriacetic acid (NTA), Nitrilotripropionic acid (NTP),Nitrilotris(methylenephoshonic acid),trisodium salt (NTPO), Triethylenetetramine
-N,N,N’,N’’,N’’’,N’’’-hexaacetic acid (TTHA)
等が挙げられる。
【００１６】
EDTAの塩としては、２ナトリウム塩、３ナトリウム塩、４ナトリウム塩、２カリウム塩、３カリウム塩、２リチウム塩、２アンモニウム塩、等が挙げられる。
【００１７】
本発明に使用しうる金属イオンを含有する物質としてはケトアミンオキシダーゼの安定性を損なう金属イオンを含有していれば何れの物質も該当する。金属イオンとしては、例えば特に銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ニッケル、カドミウム、水銀等の金属イオンが悪影響を及ぼすことが知られている。
【００１８】
一方、特にケトアミンオキシダーゼを用いた試薬において特筆すべきことは、アスコルビン酸が少量混入するだけで、測定値に影響を受けることから、アスコルビン酸オキシダーゼを処方するケースが増えている。アスコルビン酸オキシダーゼは酵素１分子中に８個の銅を含み特にケトアミンオキシダーゼの不安定化を引き起こしやすい。同様な理由でアルコールデヒドロゲナーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を２個含む）、ヘキソースオキシダーゼ（酵素１分子に銅原子を１２個含む）、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ（酵素１分子に鉄原子を１個含む）、キサンチンデヒドロゲナーゼ（酵素１分子にモリブデン原子を２個含む）、アルデヒドオキシダーゼ（酵素１分子に鉄原子を８個、モリブデン原子を２個含む）、キサンチンオキシダーゼ（酵素１分子に鉄原子を８個、モリブデン原子を２個含む）、スクシネートデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、アミンオキシダーゼ（酵素１分子に銅原子を２個含む）、ザルコシンオキシダーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ジメチルグリシンオキシダーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ザルコシンデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ジメチルグリシンデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ウリカーゼ（（酵素に鉄若しくは銅原子を含む）、ナイトレートレダクターゼ（酵素１分子に銅原子を４個含む）、グルタチオンパーオキシダーゼ（酵素１分子にセレン原子を４個含む）、アミノペプチダーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を２個含む）、ジペプチダーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を１個含む）、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ酵素１分子に亜鉛原子を１個含む）、微生物由来メタロプロテアーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を含むことが多い。サーモリシン、プロナーゼ、など）、スーパーオキサイドジスムターゼ（酵素１分子に銅及び亜鉛原子を各１個含む）、クレアチニンアミドハイドロラーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を１個含む）、等も金属を含む酵素として挙げることが出来る。
【００１９】
本発明に使用しうるアスコルビン酸オキシダーゼとしては、被検液に含まれるアスコルビン酸に有効に作用するものであればいかなるものを用いても良いが、例えば植物又は微生物由来のアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。具体的な例を以下に示すがこれらは１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【００２０】
植物由来のアスコルビン酸オキシダーゼの例としては、キュウリ由来（アマノ社製、東洋紡社製）およびカボチャ由来（ロシュ社製、東洋紡社製）が挙げられる。
微生物由来のアスコルビン酸オキシダーゼの例としてはアクレモニウム（Acremonium）由来（旭化成社製）、微生物由来（アマノ社製）が挙げられる。
【００２１】
アスコルビン酸オキシダーゼの活性は下記の方法にて測定される。
＜＜アスコルビン酸オキシダーゼの活性測定法＞＞
＜保存基質溶液＞
Lアスコルビン酸（和光純薬社製）176mgとＥＤＴＡ（第一化学薬品社製）37mgを1mM塩酸100mlで溶解する。
＜反応試薬混合液＞
上記の保存基質溶液を0.45mMのEDTAを含む90mM  燐酸2カリウム−5mM燐酸1ナトリウム緩衝液で20倍に希釈する。
【００２２】
＜操作＞
上記の反応試薬混合液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に5分間反応の後に0.2N塩酸水溶液3.0mlを添加して反応を停止し、波長245nmの吸光度を測定する(As)。またブランクとして上記の反応液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、0.2N塩酸水溶液3.0mlを添加して反応を停止する。適当に希釈した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、波長245nmの吸光度を測定する(Ab)。この酵素作用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(Ab-As)より酵素活性を求める。30℃-1 分間に1μM のアスコルビン酸をデヒドロアスコルビン酸に酸化する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
【００２３】
【数１】
0004039664.tif 000002
【００２４】
10.0：ｐH1.0の条件でアスコルビン酸の245ｎｍに於けるミリモル分子吸光係数
5：反応時間（min）
4.01：反応液総量 (ml)
0.10：反応に供した酵素試料液量
Ｂ：酵素液の希釈倍率
【００２５】
また本発明はケトアミンオキシダーゼに限らずこれらの金属化合物により安定性を損なう全ての酵素に対して有効である。
【００２６】
本発明のケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて測定する対象である糖化蛋白質としては、例えば糖化アルブミン又は糖化ヘモグロビンが挙げられるが、測定対象となる糖化蛋白質は何らこれらに限定されるものではなく、何れの糖化蛋白質を測定しても良い。
【００２７】
本発明のケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて糖化タンパク質を測定するには糖化タンパク質をプロテアーゼ等により糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドレベルまで分解し、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬を作用させ、糖化アミノ酸を酸化し、生成するグルコソン又は過酸化水素を測定すれば良く、また減少する酸素を公知の方法で測定すればよい。使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。特に糖化タンパク質を測定する場合には、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良い
【００２８】
本発明のキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬については、キレート剤及びケトアミンオキシダーゼを同一試薬に含有するように組成を決定すれば良い。
【００２９】
また妨害物質の消去系を組み込む場合、例えば糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合は、第一試薬にケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。アスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む場合には、第１試薬のケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方すれば良い。
【００３０】
本発明に使用し得るキレート剤の濃度としては1μM〜500ｍMの濃度で使用すれば良く、好ましくは10μM〜200ｍM、最も好ましくは50μM〜100ｍMであるがこれ以外の量を用いても良い。本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼの濃度としては0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200 U/ml、最も好ましくは1.0〜100 U/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００３１】
金属イオンを含有する物質の濃度は、例えばアスコルビン酸オキシダーゼの場合には濃度としては0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200 U/ml、最も好ましくは1.0〜100 U/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００３２】
本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のプロテアーゼの濃度としては0.1U〜1MU/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは1U〜500KU/ml、最も好ましくは5U〜100KU/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００３３】
本発明のキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて被検液中の糖化タンパク質を測定する場合には、一定量の被検液0.1〜1000μl程度に、金属イオンの影響を消失させるに十分な量のキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば1.0〜5000μl程度を1〜60分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。この場合被検液はプロテアーゼ等によりアミノ酸、ペプチドレベルまで分解された処理液でも良く、また上記反応後にプロテアーゼ試薬を作用させ、定量を行っても良い。後者の場合には被検液中のフリーの糖化アミノ酸を消去することが出来る。
【００３４】
以上のことから、本発明に於けるキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬としては、キレート剤及びケトアミンオキシダーゼを含有するものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００３５】
また本発明を、電極等を用いた、例えば過酸化水素の定量に応用することも可能である。
さらに本発明に基づくキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００３６】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
実施例１
＜ケトアミンオキシダーゼの安定性に及ぼすキレート剤添加の効果＞
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
＜反応液組成Ａ＞
30mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml        ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
±10U/ml        アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製）
±0.5mM        ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
【００３７】
＜反応液組成Ｂ＞
30mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml        ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
±0.1mM        塩化銅（和光純薬社製）
±0.5mM        ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
アスコルビン酸オキシダーゼ、塩化銅又はＥＤＴＡの±は、これらの化合物を添加した場合と、添加しない場合とを示す。
【００３８】
＜方法＞
上記試薬を調製し、３７℃１週間保存した。保存後ケトアミンオキシダーゼの残存活性を測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0004039664.tif 000003
【００４０】
表1から分かるように、ケトアミンオキシダーゼが金属を含有する物質と共存すると、ケトアミンオキシダーゼの安定性が顕著に悪くなり、さらにキレート剤を添加することにより安定性が回復することが明白であった。
【００４１】
実施例２
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬の安定性に及ぼすキレート剤の濃度の影響＞
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
30mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml        ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
10U/ml        アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
0〜2mM        ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
1.3ｍM        TOOS(同人化学研究所社製)
【００４２】
＜発色試薬＞
150mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml        バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXXVII；シグマ社製）
5mM        4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
20U/ml        パーオキシダーゼ(シグマ社製)
【００４３】
＜反応手順＞
上記ケトアミンオキシダーゼ含有試薬180μlおよび試料（管理血清又はプール血清）9μlをセルに分注し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光(A0)した。続いて発色試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光し(A1)、試料の吸光度変化（ΔA=A1-A0）を求めた。一方、試料の代わりに蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定し、ブランク引きの試料の感度（ΔA-ブランクΔA）を求めた。
試薬を37℃−1週間保存し、測定の感度を求めた。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
0004039664.tif 000004
【００４５】
表２から分かるように、キレート剤を入れることにより試薬の安定性が向上していることが明白である。キレート剤の濃度は必要量入っていれば十分であることが判明した。
【００４６】
実施例３
＜キレート剤を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いた糖化アルブミンの測定試薬＞
【００４７】
＜R-1;ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
30mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml        ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
10U/ml        アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）若しくは（旭化成社製；微生物；アクレモニウム由来）
0.5mM        ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
1.3ｍM        TOOS(同人化学研究所社製)
【００４８】
＜R-2;発色試薬＞
150mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml        バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXXVII；シグマ社製）
5mM        4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
20U/ml        パーオキシダーゼ(シグマ社製)
【００４９】
<R-3  アルブミン測定試薬>  アルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和
光純薬社製)にて測定した。
【００５０】
＜ＨＰＬＣ法＞
グリコアルブミン計（ＧＡＡ−２０００；アークレイ社製）使用
【００５１】
＜試料＞  健常者血清５検体、患者血清５検体
【００５２】
＜反応手順＞
上記試薬は３７℃１週間保存した後に使用した。上記ケトアミンオキシダーゼ含有試薬180μlおよび試料9μlをセルに分注し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光した(A0)。続いて発色試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光し(A1)、
試料の吸光度変化（ΔA=A1-A0）を求めた。一方、試料の代わりに蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定し、ブランク引きの試料の感度（ΔA-ブランクΔA）を求めた。グリコアルブミン濃度は、濃度既知の管理血清と試料のブランク引き感度を比較することにより算出した。
【００５３】
一方アルブミンの測定はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)の用法用量に従って測定した。ＧＡ値はグリコアルブミン濃度をアルブミン濃度で除し、割合換算した。その結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
0004039664.tif 000005
【００５５】
表３から分かるように、ケトアミンオキシダーゼおよびキレート剤を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬は安定であり、３７℃１週間という過酷な条件で保存しても、ＨＰＬＣ法と値が一致し、正確にグリコアルブミンを測定していることが明白であった。さらに、カボチャ由来及び微生物；アクレモニウム由来アスコルビン酸オキシダーゼのどちらを用いても同様の結果が得られた。
【００５６】
実施例４
＜キレート剤を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いた糖化ヘモグロビンの測定＞
＜R1;ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
30mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml        ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
10U/ml        アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
0.5mM        ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
1.3ｍM        TOOS(同人化学研究所社製)
【００５７】
＜R2;プロテアーゼ試薬＞
150mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml        ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXIV；シグマ社製）
【００５８】
＜R3;発色試薬＞
150mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH8.0
5mM        4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
0.12%        TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml        ケトアミンオキシダーゼII（旭化成社製）
20U/ml        POD(シグマ社製)
【００５９】
＜試料＞  市販ヘモグロビン（シグマ社製）５０ｍｇ／ｍｌ
ＨｂＡ１ｃ値はHbA1c測定装置（アークレイ社製）にて測定した。
【００６０】
＜反応手順＞
試薬は上記R1試薬を３７℃1週間保存後測定した。上記R1試薬0.9mlおよび試料90μlを混合し、37℃10分反応を行う。続いて、分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液にR2試薬0.9mlを混合し、37℃-２時間反応させた。分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液189μlをセルに分注し555nmを測光した(A0)。続いてR3試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光した(A1)。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定した。また試料に検体及び糖化ヘモグロビン値既知の試料を用いて感度（感度ΔA=（A1-A0）-ブランクΔA ）を求め、糖化ヘモグロビン濃度を算出した。さらに糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で除し、糖化ヘモグロビン値を算出した。その結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
0004039664.tif 000006
【００６２】
表４から分かるように、ケトアミンオキシダーゼおよびキレート剤を含有することを特徴とするケトアミンオキシダーゼ含有試薬は安定であり、３７℃１週間という過酷な条件で保存しても、ＨＰＬＣ法と酵素法の値が一致し、正確にグリコヘモグロビンを測定していることが明白であった。
【００６３】
実施例５
＜ケトアミンオキシダーゼの安定性に及ぼすキレート剤種類の効果＞
＜ケトアミンオキシダーゼ試薬＞
30mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml        ケトアミンオキシダーゼ（旭化成社製）
10U/ml        アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製）
±0.5mM        キレート剤（和光純薬社製）（表５参照）
上記試薬を４５℃３日間保存し残存活性を測定した。結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
0004039664.tif 000007
【００６５】
表５から分かるように、ケトアミンオキシダーゼが金属を含有する物質と共存した場合の
安定性を確保する方法として、ＥＤＴＡ以外のキレート剤を用いても同様の効果が得られる
ことが判明した。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によるとケトアミンオキシダーゼ含有試薬において、保存中ケトアミンオキシダーゼの活性の低下を防ぎ、糖化タンパク質を正確かつ簡便に測定することができる。特に臨床検査の分野で有用である。