(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する大腸菌群（ｃｏｌｉｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の早い検出及び計数を容易にするならし培地であって、該ならし培地が、
ｉ）ゼラチン、カゼイン又は動物のペプトンと、イースト抽出液とを含むブイヨンに大腸菌群の培養物を接種するステップと、
ii）前記接種された大腸菌群の培養物が増殖の指数増殖期内である間、前記ブイヨンをインキュベートするステップと、
iii）前記ブイヨンから前記接種された大腸菌群の培養物を除去するステップと、
iv）ステップiii）の前記ブイヨンに炭水化物及び塩を加えてならし培地を供するステップと、
を含む方法により調製されることを特徴とするならし培地。
【請求項２】
ステップiv）の前記ならし培地が脱水されて乾燥した再水和可能な粉体を供することを特徴とする請求項１に記載のならし培地。
【請求項３】
前記ステップｉ）において使用する大腸菌群と、前記サンプル中に存在する大腸菌群が同じ又は異なる培養物である、請求項１又は２記載のならし培地。
【請求項４】
前記サンプル中に存在する大腸菌群の培養物が、大腸菌（Escherichia coli）、セラチア・リクエファシエンス（Serratia liquefaciens）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazaki）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、サルモネラ（Salmonella）種、及びヤェルシニア（Yersinia）種からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載のならし培地。
【請求項５】
自己支持性防水性基体及び透明なカバーシートを含むサンプル中の大腸菌群の増殖を検出及び計数するための装置であって、請求項３に記載のならし培養培地が前記自己支持性防水性基体上に被覆されることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
本発明は広く、サンプル中の微生物の存在を測定するために用いられる製品及び方法に関し、特に大腸菌群の迅速な増殖及び検出を許容する製品及び方法に用いられ得るならし培養培地に関する。
背景
サンプル中の微生物の存在及び数を測定するための標準的な方法は時間を浪費し、単調で、激しい労力をも要する。典型的には、技術者は試薬及び栄養素を調製し、栄養素を寒天に混合し、この混合物を加熱し、この混合物をペトリ皿に注ぎ、この寒天をゲルにして、テストサンプルを得て、このテストサンプルを希釈し、この希釈したサンプルのアリコートを寒天に加え、この接種されたプレートを24〜48時間インキュベートして最後にペトリ皿内に増殖している微生物のコロニーの数を計数しなければならない。調製時間を削減し、バクテリアのような微生物のより早期のより迅速な検出及び計数を許容する製品及び方法が、この分野において研究している人々により明らかに歓迎されるであろう。
先の調製時間を大きく単純化する製品の１つの例はハンセンら（Hansen et al.）の米国特許第4,565,783号に記載される微生物を増殖させるための乾燥培養装置である薄膜である。ハンセンらにより報告される典型的な薄膜装置において、ゲル化剤及び微生物成長栄養素を含む冷水可溶性乾燥粉体が防水基体上に被覆される。指示染料及び粉末状ゲル化剤を含むアクリレート接着剤で表面が被覆された透明なリードスルーカバーシートが前記被覆された基体に付着される。サンプル中の大腸菌群を数えるためのハンセンらの報告を基礎とした乾燥培養培地装置である薄膜はPETRIFILMプレートとして市販されている（Catalog No.6400，3M，St.Paul，MN）。
薄膜である乾燥培養プレート装置が用いられる場合、予め決定された量の水性のサンプルがその被覆された基体に接触して典型的におかれ、水性のサンプルは、その後微生物増殖を維持することができるゲル化された培地を形成する可溶性乾燥粉体を水和する。増殖期間の間、カバーシートに接着された指示染料は生きている微生物の存在下で反応して、この培養装置上で増殖する微生物のコロニーの視覚化を許容する検出可能な応答を与える。
乾燥薄膜であるハンセンらの乾燥プレート装置は、使用者が増殖培地、寒天及び他の試薬を加熱して混合し、その後この混合物をペトリ皿に加えてプレートに注ぐ必要がないので、慣用的ゲル化寒天培地／ペトリ皿システムより極めて簡単に用いられる。更に、ハンセンらの装置はコンパクトで容易に処理され、それゆえ使用者に容易で安全である。ハンセンらの薄膜プレートのいくつかのバリエーション及び／又は改良も報告されている。例えば、ヒルら（Hill et al.）の英国特許出願2 171 419 AはPETRIFILMプレート上で乳酸菌を選択的に増殖させるための特定の希釈溶液の使用を報告し、ネルソンら（Nelson et al.）の米国特許第5,089,413号は好気性細菌を増殖させるのに適合された改良された薄膜装置を報告し、スズキら（Suzuki et al.）の米国特許第5,147,80１号は防水性基体上に湿った親水性層又はシートを含む改良された薄膜装置を報告し、そしてネルソンら（Nelson et al.）の米国特許第5,232,838号は装置上での大量のサンプルの使用を許容するための水ベースの接着剤を組み込む薄膜フィルム装置を報告する。
薄膜であるハンセンらの乾燥培養プレート及び関連する装置は慣用的なタイプの培養システムを超える多くの利点があるにもかかわらず、接種された薄膜プレートは微生物の数が測定され得る前に24〜48時間、まだインキュベートされなければならない。早期に微生物、特にバクテリアの存在を検出して数を測定する能力が、多くの状況において非常に必要とされ、極めて価値があるものであり得る。
例えば、選択されたサンプルにおけるバクテリアの早期の検出及び迅速な計数が食品工業において重要である。現在、24〜48時間のインキュベーション時間後のサンプルにおけるバクテリアの計数は加工業者に食物製品の配給を遅れさせ、大量の汚染された食物製品の製造を許容し得る。食物製品におけるバクテリアの早期の検出は、汚染又は汚染していないことがより早期に確立され得るであろうから、加工業者により迅速な配給のために食物製品を放出するであろう。更に、加工業者は大量の汚染された食物製品を捨てる必要なくバクテリアの汚染の源を突きとめて正すことができるであろう。これにより、24〜48時間未満におけるバクテリアの汚染の検出及び計数が食物製品製造者に極めて利点となろう。病原体の大腸菌O157：H7（不十分に調理された地上の動物の肉を食べることにより引きおこされる1993食物毒化大発生（1993 food poisoning outbreak）に関連した病原体）の増殖のラグ相期間を縮めるためのOXYRASE膜フラクションの使用を報告するPhebus et al．，Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology，１：249〜260（1993）を参照のこと。
食品工業は早期に微生物の汚染を測定することにより明らかに利益を得るであろうが、他の工業も迅速に微生物を検出及び／又は計数する機会を歓迎するであろう。微生物の早期の検出及び迅速な計数を許容する製品及び方法のための必要性が存在する。
発明の概要
本発明はグラム陽性及びグラム陰性バクテリア及び真菌のような種々の微生物の早期の検出及び計数又は迅速な計数を許容する製品及び方法を提供することにより、先に言及される現在の製品及び方法の欠点を克服する。本発明の１つの実施形態は、培地内で増殖するこのような微生物の早期の検出及び迅速な計数を容易にするならし培養培地であろう。このならし培地は、完全な微生物細胞を除去するためにろ過する前に増殖の微生物の指数増殖期の間の生存能力のある微生物と共にインキュベートされるゼラチン、カゼイン及び動物のペプトン並びにイースト抽出液を含むろ過されたブイヨンである。このならし培地も微生物の増殖を維持するための炭水化物及び塩、並びに増殖する微生物の検出及び計数を補助する指示体を含む。
特に好ましいならし培地はゼラチンの膵臓の消化物７〜14ｇ、イースト抽出液６〜18ｇ及び塩化ナトリウム５〜10ｇ並びに約7.0のpHにおける水の１リッター当り約20ｇのラクトース、2.5ｇのフェノールレッド、３ｇの胆汁酸塩及び10ｇのグアーガムを含む。
本発明の培養培地は、ブイヨン、寒天、又はPETRIFILMプレートのような薄膜フィルム装置において用いられ得る。PETRIFILMプレートにおいて用いられる場合、ならし培養培地は自己支持性防水性基体の表面上に被覆され、その後培地が乾燥される。ならし培地が薄膜上で乾燥状態で用いられる場合、培地は、ゼラチン、カゼイン及び動物のペプトン並びにイースト抽出液を（微生物の指数増殖期の間の）生存可能な微生物と共に最初にインキュベートし、その後このブイヨンをろ過して、完全な細胞並びにラクトース、他の塩、ガム（gum）もしくはゲル化剤及び増殖中の微生物の存在下において色の変化を許容して微生物の視覚的検出を許容する指示体を除去することにより調製されたろ過されたブイヨンを好ましくは含む。好ましい乾燥ならし培地が再び水和される時、先に記載された培養培地の構成物は先に記載の好ましい液体培養培地内である同じ濃度である。
本発明の他の実施形態は、サンプル中の微生物の存在を検出する及び計数するための方法である。この方法を実施するために、大腸菌群のような微生物を含むサンプルのアリコートは、ｉ）ゼラチン、カゼイン及び動物のペプトン並びにイースト抽出液からなるブイヨンに微生物の培養物を接種するステップであって、前記ブイヨン内で増殖する前記微生物の培養物が前記サンプル中の微生物と同じ又は異なるステップと、ii）接種された微生物が増殖の指数増殖期に達するよう前記ブイヨンをインキュベートするステップと、iii）前記ブイヨンから微生物を除去するステップと、iv）ステップiii）の前記ブイヨンに炭水化物及び塩を加えるステップと、を含む方法により調製されたならし培地に添加される。その後サンプル中に存在し得る微生物はならし培地の存在下において増殖され、これらの微生物の存在は、増殖する微生物が培地中の栄養素を代謝する時に色を変化させる指示体の色変化を検出することにより測定され得る。
この方法を用いると、約４〜14時間の範囲においてサンプル中の微生物の検出及び計数が可能である。培養培地中で増殖する微生物の検出及び計数は視覚的又は器具を用いて行われ得る。適切な器具は、1993年５月14日に出願された特許出願通し番号08／061,678号の包袋継続である1994年12月15日に出願された米国特許出願通し番号08／357,761号；1993年12月17日に出願された特許出願通し番号08／168,681号及び1994年３月11日に出願された特許出願通し番号08／240,846号に記載される。
本発明の更に他の実施形態はサンプル中の微生物を検出するための装置である。好ましい装置は自己支持性防水性基体及び透明なカバーシートを含む。本ならし培地は自己支持性防水性基体上に被覆され、その後乾燥される。その後、乾燥プレートはサンプルを接種され、装置上で増殖する微生物の検出が、装置内の添加された指示体が約４〜14時間の範囲において選択された微生物の代謝物の存在下で色を変化させる時に（視覚的又は器具を用いてのいずれかで）直ちに行われる。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明のならし培養培地を含む装置を示す。
図２〜８はならし培養培地中で増殖する異なるバクテリアの24時間における読み出しの百分率として、読み出し時間における改良を示す。
詳細な記載
本発明はサンプル中の大腸菌群のような微生物の存在を迅速に検出及び／又は計数するのに用いられ得る製品及び方法を提供する（大腸菌群はラクトース発酵グラム陰性桿菌を含む）。種々の製品及び方法がサンプル中の微生物を検出するのに用いられているが、約４〜14時間の範囲における検出及び／又は計数は慣用の製品又は方法の検出時間よりかなり短い。
ほとんどのサンプル中の微生物の早期の検出及び計数又は迅速な計数は種々の理由のため問題のあるものであった。大抵の場合、サンプル中の微生物は圧迫されており、最適なレベルまで増殖しない。最適な増殖を提供する（及びこれにより早期の検出を許容する）ために、圧迫された微生物は誘導されたストレスから回復するため
の期間が供されなければならない。本発明は迅速な回復を許容して微生物の増殖を加速させると確信される培地を提供する。薄膜培養プレート装置において用いる場合、好ましい培地は市販される周知の試薬及び栄養素を含む。これらの試薬及び栄養素は、Acumedia Manufacturers，Inc．，Baltimore，MDから利用できるラクトース、塩化ナトリウム、消化ゼラチン及び胆汁酸塩を含む。培地は、Rhone-Poulenc，Inc．，Kreuzlinger，Switzerlandから市販されるグアーガムのようなゲル化剤、Sigma-Aldrich Corp．，Milwaukee，WIから市販されるフェノールレッドのような指示体、及びAMRESCO，Solon，OHから市販されるトリフェニルテトラゾリウムクロライドも含む。好ましい試薬及び材料は計量されて慣用的無菌方法を用いて脱イオン水中で混合される。
本ならし培養培地は増殖する微生物の検出を補助するための指示体も含み得る。例えば適切な指示体はフェノールレッドのようなpH指示体である。フェノールレッドは酸の存在下において赤から黄色に色を変化させる周知の指示体である。微生物のコロニーが、フェノールレッドを含む培地中で増殖する時、コロニーは指示体と反応する代謝性酸を産生し、コロニーの周囲に黄色の領域を形成する。他の周知の市販の指示体は、必要に応じてフェノールレッドの代わりに用いられ得る。代わりの指示体は、これらに限定されないが、増殖中の微生物又は微生物の代謝物と典型的に反応することができる及び／又はこれらの存在下において典型的に反応することができる比色、蛍光及び紫外線基質並びに酵素基質を含む。種々の適切な指示体又はプローブはMolecular Probes，Inc．，Eugene，ORにより提供されるHaugland，Handbook OF Fluorescent Probes and Research Chemicals，5th ed．，1992に記載される。
図１は、本発明の培地と共に用いるのに適した薄膜培養装置を示す。簡単に言うと、この装置はこれらのタイプの培養培地を製造して用いる典型的な方法を記載する目的のために本出願において引用により組み込まれる米国特許第4,565,783号に広く記載される。
この薄膜培養培地10は自己支持性防水性基体12を有する基材を含む。基体12は、好ましくは、ポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレンのような水を吸収しない防水性材料から作られる比較的堅い材料である。他の適切な防水性材料は防水性ポリエチレンコーティングを含む紙のような基体を含む。基体12の上面は、その後基体12上に乾燥培地14を供するために乾燥された培養培地14の層で被覆される。あるいは、接着剤の層が粉体として適用され得る培養培地を維持するように作用する基体12上に被覆され得る。この接着剤は前記被覆された基体を通して基体の表面上で増殖しているバクテリアのコロニーを見るを許容するのに水和された時に十分に透明であるべきである。この接着剤は、前記基体が接着剤内の培地を完全に埋め込まないで乾燥培養培地に均一に被覆されるのを許容する厚さにおいて基体上に被覆されるべきである。
本発明の液体培養培地が乾燥形態において、又は乾燥粉体として用いられるなら、試薬、栄養素及び指示体は乾燥される。本発明の培養培地は液体中の本質的に全ての水が蒸発するまで約220°Ｆにおいてオーブン中で液体培地を加熱することにより直ちに乾燥され得る。しかしながら水が蒸発した後にこの培地が加熱されるなら、培地は分解し始める。
発泡体内に円形の穴を有する発泡体スペーサ16は基体12の培地が被覆された表面に接着される。基体12の周囲を覆う発泡体スペーサはサンプルが接種されるべき領域を規定し、基体からの漏出からサンプルを防ぐ作用をする。代わりの実施形態において、装置はサンプル含有発泡体層を含み得ない。この装置において、特定の量のサンプルは培地のみの構成物により基体上に含まれる。
カバーシート20は発泡体スペーサ16の上側表面の一端に付着される。カバーシート20は、好ましくは、基材上に存在するバクテリアコロニーの計数を容易にするために透明なフィルム又はシートから作られる。更に、カバーシート20は、好ましくは構成物の汚染及び劣化の危険を避けるためにバクテリア及び水蒸気に対し不透過性である。カバーシート20として用いるために好ましい材料は二軸延伸ポリプロピレンである。
使用において、接種物の主な量、典型的には水性の接種物の約１ミリリッターがカバーシート20を引き戻して基体12の中央部に水性テストサンプル又は水を加えることにより図１に示す装置に添加される。その後カバーシート20を基体12上に再び戻して接種物を基体上に平らに広げる。これを行うための便利な道具は基体12の特定の領域に接種物を制限するのにも用いられる加重円形テンプレートである。接種物が基体12上に接触して広げられる時、基体12上の培養培地は水和して増殖支持性栄養素ゲルを形成する。その後接種された装置は主な時間インキュベートされ、その後基体上で増殖しているバクテリアのコロニーの数が透明なカバーシート20を通して計数され得る。
薄膜装置上における本発明のならし培養培地の使用は先に記載されるが、当業者はこのならし培養培地が当該技術で周知である他の培養装置において用いられ得ることを認めるであろう。例えば、ならし培地はブイヨンとして用いられ得、及び懸濁液において微生物を増殖させるのに用いられ得、又はならし培地は周知の寒天プレート上でバクテリアを増殖させるのに用いられ得る。
以下の実施例は本発明の実施に関連する更なる詳細及び実施形態を提供することを意図したものである。これらの実施例は、実例の目的のために供され、添付の請求の範囲において規定される本発明の範囲に限定すると解釈されるべきでない。
実施例１−ならし培養培地におけるバクテリアの調製及び増殖
本実施例は微生物のより迅速な増殖を容易にするための培地構成物の改良と、それによるより早い検出の容易化を記載する。
ならし培地を作るために、次の構成物を２リッターの脱イオン水を加えてpHを約7.0に調整して出来た混合物を15分間、約250℃で滅菌した。
28ｇのゼラチンの膵臓消化物（Acumedia）
12ｇのイースト抽出液（Acumedia）
20ｇの塩化ナトリウム
大腸菌149，ATCCアクセス番号55535の培養物（イソプチカーゼソーイブイヨン中で培養された接種物１ml）を先に記載のブイヨンに静置培養物として加えた。出来た培養物を620nmにおける吸収により増殖を監視しながら数時間、35℃でインキュベートした。
時間０，２，４，５及び８時間（図２〜４）又は時間０及び２時間（図５〜８）のいずれかにおいて、ブイヨンの400mlアリコートを除去してこの除去されたアリコートを減圧ろ過によりろ過滅菌（0.2μｍ）した。次の付加的な構成物をこのろ過されたブイヨンに加えてこの混合物のpHを7.0に調節してならし培地を得た。
８ｇラクトース（図２〜４、Acumedia）又は
８ｇグルコース（図５〜８、Sigma-Aldrich）
1.0ｇフェノールレッド（Sigma-Aldrich）
1.2ｇ胆汁酸塩（Acumedia）
４ｇグアーガム（Rhone-Poulenc）
薄膜乾燥培養プレートを次のようにラクトース含有又はグルコース含有ならし培地のいずれかから調製した。このならし培地をポリエステル基体上に被覆して約220°Ｆにおいて乾燥させた。薄スタイロフォームダムをこの乾燥ブイヨン上にかぶせてポリエステル基体上にウェルとして供した。その後、このポリエステル基体／スタイロフォームダムを、先に約150mgのトリフェニルテトラゾリウムクロライド（AMERESCO）を含む共重合イソオクチルアクリレート／アクリル酸接着剤（98重量％のイソオクチルアクリレート及び２重量％のアクリル酸コモノマーのコポリマー）が一つの面上に被覆され、その後粉体が付加的なグアーガムと共に接着剤を覆って被覆されているポリプロピレンシートで被覆した。
テストするための種々のバクテリア（図２−セラチア・リクエファシエンス（Serratia liquefaciens）、図３−エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazaki）、図４及び８−エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、図５−サルモネラ種（Salmonella sp.）、図６−ヤェルシニア種（Yersinia sp.）、及び図７−大腸菌、全ての株は3M，St．Paul，MNにおいて凍結懸濁液として維持された）を、35℃で一晩トリプチカーゼソーイブイヨン内で増殖させ、その後薄膜プレートに添加する前にリン酸緩衝塩類溶液に約１億倍（10−８）に希釈した。その後、この薄膜プレートに接種（１ml）して、インキュベートし、増殖しているバクテリアによる酸形成に寄与する（時間を経た）増殖ゾーンのために検査した。観察された黄色増殖ゾーンは、24時間における対照薄膜プレート上で見られる結果と相関関係があり、24時間の結果の百分率として表した。
図２〜８にグラフ化されたこれらのデータは、対照（時間０に取り出し、その後ラクトース、グルコース、フェノールレッド、胆汁酸塩及びグアーガムにより薄膜培養プレート培地内に作られたブイヨンアリコート）と比較して、１〜２時間早期の検出がならし培地を用いて可能であり、最終バクテリアコロニー数の４時間までのより迅速な検出及び計数がならし培地を用いて可能であることを示す。図２〜４にグラフ化されたデータは、ブイヨンの最適な開始コンディショニング時間が約２〜５時間の間であることも示唆する。約８時間を超える開始コンディショニングは、対照と比較してより遅い検出及び計数を供することが一貫して観察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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