(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ種子貯蔵タンパク質の発現を活性化する機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１または３のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１または３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
GCN4モチーフと結合する機能を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
イネ由来である、請求項１または２に記載のDNA。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のDNAまたは請求項４に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項６に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項６に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項９】
発現制御領域の下流に請求項１に記載のDNAが機能的に結合したDNA構築物、および請求項６に記載のタンパク質の標的配列を有する発現制御領域の下流に外来遺伝子が機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体。
【請求項１０】
標的配列がGCN4モチーフを含む配列である請求項９に記載の植物体。
【請求項１１】
GCN4モチーフが配列番号：８、１３、または１４のいずれかに記載の配列である請求項１０に記載の植物体。
【請求項１２】
標的配列がG/Cボックスを含む配列である請求項９に記載の植物体。
【請求項１３】
発現制御領域の下流に請求項１に記載のDNAが機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体、および請求項６に記載のタンパク質の標的配列を含む発現制御領域の下流に外来遺伝子が機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体を交配させることを特徴とする、請求項９から１２のいずれかに記載の植物体の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イネ種子貯蔵タンパク質の胚乳特異的発現に関わる新規転写因子、およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種子貯蔵タンパク質は、登熟期の種子のみで発現するタンパク質であり、それをコードする遺伝子の発現解析は、植物遺伝子の転写調節機構を調べる上で格好のモデルである (Goldberg, R.B. et al. Science 266: 605-614, 1994)。種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現調節は、プロモーター中の複数のシス因子が協調的に働くことによって行われることが知られている。転写因子の特定のシス調節因子への結合は、転写開始および組織・時期特異的発現における重要な構成要素となっている。種子貯蔵タンパク質の発現には、種子特異的な発現調節に関わる数種のシス調節因子が関与し、それぞれのシス調節因子を認識する転写因子が、結合ならびに集合することによって引き起こされるものと説明することができる。それゆえ、種子貯蔵タンパク質の発現の分子機構を理解するために、作物の貯蔵タンパク質遺伝子のシス調節因子、および転写因子の機能解析が行われてきた(Thomas T. L. Plant Cell 5:1401-1410, 1993; Morton R. L. et al. In Seed Development and Germination pp. 103-138, Marcel Dekker, Inc., 1995)。
【０００３】
しかしながら多くの研究にも拘らず、ほとんどの作物において、同種の形質転換植物を用いた解析では、遺伝子調節に不可欠シス調節因子を同定できておらず、いまだ遺伝子調節機構は明確には理解されていない。特に単子葉植物では、安定した同種の形質転換植物を用いたプロモーター解析が行われているのは、イネの種子貯蔵タンパク質グルテリンに限られている。一方、トウモロコシ、コムギおよびオオムギでは、粒子銃あるいはタバコ形質転換体を用いた解析が行われている(Muller M. and Knudsen S. Plant J. 6: 343-355, 1993; Albani D et al. Plant Cell 9: 171-184, 1997; Marzabal P. M. et al. Plant J. 16: 41-52, 1998)。
【０００４】
穀物の種子貯蔵タンパク質遺伝子の胚乳特異的発現は、数種のシス調節因子が協調的に働くことによって、制御されていることが示されている。多くの穀物の種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーターで保存されているProlamin box (TGTAAAG), GCN4モチーフ (TGA(G/C)TCA), AACAモチーフ(AACAAAA)およびACGTモチーフは、loss-of-function（機能欠損）およびgain-of-function（機能獲得）解析によって、胚乳特異的発現に関わるシス調節因子として特徴付けされた(Morton R. L. et al. In Seed Development and Germination pp. 103-138, Marcel Dekker, Inc., 1995)。
【０００５】
GCN4モチーフは種子貯蔵タンパク質遺伝子ばかりではなく、代謝に関わる遺伝子のプロモーターからも多く見出されている(Muller M. and Knudsen S. Plant J. 6: 343-355, 1993)。最近、イネグルテリン遺伝子のGCN4モチーフの多量体が、形質転換イネにおいて胚乳特異的発現を再現し、またGCN4モチーフの塩基置換や欠失によってプロモーター活性の著しい低下、発現パターンの変化が見出されたことから、GCN4モチーフが胚乳特異的発現に重要な役割を担っていることが証明された(Wu C. Y. et al. Plant J. 14: 673-683, 1998)。GCN4モチーフはしばしば数塩基を挟んでProlamin box (TGTAAAG)と連鎖しており、コムギのグルテニン、オオムギのホールデン、ライムギのセカリン、ソルガムのカフリン、ハトムギのcoixinなどほとんど全ての穀物のプロラミン遺伝子プロモーターに見出される2因子性endosperm boxの構成要素の一つとなっている。ほとんどのイネグルテリン遺伝子は、AACAモチーフが関与している。2つのモチーフの組み合わせ（GCN4モチーフとProlamin box、もしくはGCN4モチーフとAACAモチーフ）が必要であるが、胚乳特異的プロモーターとして十分に機能するためには、さらにモチーフが必須である(Takaiwa F. et al. Plant Mol. Biol. 30: 1207-1221, 1996; Yoshihara T. et al. FEBS Letts. 383: 213-218, 1996; Wu C. Y. et al. Plant J. (in press))。最近、イネグルテリン遺伝子(GluB1)において、胚乳特異的発現を再現できる最小プロモーターとして機能するためには、-197bpプロモーター領域に見出されるGCN4モチーフ、AACAモチーフおよびACGTモチーフの中の少なくとも３つが必須であることが示された (Wu C. Y. et al. Plant J. 14: 673-683, 1998; Wu C. Y. et al. Plant J. 23: 415-421, 2000) 。
【０００６】
トウモロコシのOpaque2(O2)はbZIP型の胚乳特異的転写因子であり、このO2はトウモロコシ22kDa  α-ゼイン遺伝子プロモーター中のACGTモチーフと結合し、転写を活性化させる(Schmidt R. J. et al. Plant Cell 4: 689-700, 1992)。O2は(Ga/tTGAPyPuTGPu)配列と結合して、b-32リボソーム不活化タンパク質遺伝子の胚乳特異的転写に関与していることも報告されていることから(Lohmer S. et al. EMBO J. 10: 617-624, 1991)、O2は幅広い結合能を有するものと考えられる。GCN4モチーフはO2によって認識され、O2との結合を介して転写が活性化されることが報告されている(Wu C. Y. et al. Plant J. 14: 673-683, 1998; Holdsworth M. J. et al. Plant Mol. Biol. 29: 711-720, 1995)。登熟期の種子では、核タンパク質が、コムギの低分子量グルテニン遺伝子(Vicente-Carbajos J. et al. Plant J. 13: 629-640, 1998)プロモーターおよびトウモロコシγ-ゼイン遺伝子プロモーター(Marzabal P. M. et al. Plant J. 16: 41-52, 1998)中に存在するGCN4モチーフ、およびProlamin boxと結合していることが、in vivo footprint解析により示された。また、in vitro DNaseI footprint解析により、イネ登熟期種子の核タンパク質およびGST-O2融合タンパク質が、イネグルテリン遺伝子プロモーターのGCN4モチーフを特異的に認識していることが示された(Wu C. Y. et al. Plant J. 14: 673-683, 1998; Kim S. Y. and Wu R. Nucl. Acids Res. 18: 6845-6852, 1990)。これらの知見から、穀物の種子にはO2様転写因子が存在し、GCN4モチーフを介して多くの種子貯蔵タンパク質遺伝子の胚乳特異的発現を制御しているものと考えられる。
【０００７】
最近、GCN4モチーフを認識する転写因子のcDNAクローンが、コムギ(Albani D et al. Plant Cell 9: 171-184, 1997)およびオオムギ(Vicente-Carbajos J et al. Plant J. 13: 629-640, 1998; Onate L. et al. J. Biol. Chem. 274: 9175-9182, 1999)において単離され、SPA、BLZ1およびBLZ2と名付けられた。これらの転写因子は、コムギの低分子量グルテニン、およびオオムギ  B1ホールデン遺伝子プロモーター中のGCN4モチーフを介して、種子貯蔵タンパク質遺伝子の転写を活性化させることが分かった。興味深いことにこれらの転写因子は、種子特異的に発現していた。O2のbZIPドメインと高い相同性を示す転写因子をコードするcDNA は、これまでにイネから単離されてはいるものの、GCN4モチーフを介して種子貯蔵タンパク質遺伝子の転写を活性化させるか否かは確かめられていない(Izawa T. et al. Plant Cell 6: 1277-1287, 1994; Nakase M. et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997)。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はGCN4モチーフとの結合を介してイネ種子貯蔵タンパク質の発現を制御する新規転写因子、およびそれをコードする遺伝子、並びに該遺伝子が導入された植物細胞および植物体、並びにそれらの製造および用途の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。上述したようにGCN4モチーフは、穀物の種子貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターで高度に保存されている配列であり、当該遺伝子の胚乳特異的発現において中心的な役割を担っている。このGCN4モチーフは、トウモロコシのOpaque2(O2)タンパク質と近縁なbZIP型転写因子群の認識配列である。そこで、本発明者らは、bZIP型転写因子をイネ種子から単離することにより、GCN4モチーフとの結合を介してイネ種子貯蔵タンパク質の発現を制御する転写因子を同定できるものと考えた。
【００１０】
まず本発明者らは、イネ種子由来のcDNAライブラリーのスクリーニングを行い、5種類のbZIP型転写因子をコードするcDNA (RISBZ1, RISBZ2, RISBZ3, RISBZ4, RISBZ5)を単離した。推定されるアミノ酸配列の相同性から、RISBZ2およびRISBZ3は、既知のRITA1(Izawa T. et al. Plant Cell 6: 1277-1287, 1994)およびREB(Nakase M. et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997)と同一なものであったが、残りのRISBZ1、RISBZ4、RISBZ5は新規なタンパク質をコードしていることが判明した。上記５種のタンパク質について、GCN4モチーフとの結合能を調べたところ、RISBZ1, RISBZ2, RISBZ3, RISBZ4, RISBZ5のいずれも、GCN4モチーフとの結合活性を有することが判明した。次に５種のタンパク質について、GCN4モチーフとの結合を介した転写活性化能を調べる実験を行った。その結果、RISBZ1だけがGCN4モチーフとの結合を介して転写を100倍以上活性化させることが判明した。また、酵母のGAL4 DNA結合ドメインを用いた解析により、RISBZ1のプロリンに富んだN末端側の27アミノ酸残基が、転写活性化ドメインとして機能していることが判明した。RISBZ1とその他のRISBZとの転写活性化能の違いは、7アミノ酸残基の変異(RISBZ2)、あるいは転写活性化ドメイン(RISBZ3, RISBZ4, RISBZ5)の欠失に主として起因するものだった。このことから、転写活性化ドメインの構造変異によって、RISBZ1と他のRISBZタンパク質との転写活性化能の差異が生じることが示唆された。また、RISBZ1はホモダイマーばかりでなく、他のRISBZタンパク質とヘテロダイマーも形成することが判明した。さらにRISBZ1の発現は、種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現より先行し、登熟期の種子のみで発現していることから、RISBZ1は種子貯蔵タンパク質の発現を制御している可能性が示唆された。次にRISBZ1遺伝子の発現を調べるために、該遺伝子のプロモーターが連結されたGUSレポーター遺伝子を導入したイネを作出した。このイネのGUS遺伝子の発現は糊粉層において強く発現していた。
【００１１】
以上のように本発明者らは、新規タンパク質RISBZ1、RISBZ4、RISBZ5が、実際にGCN4モチーフと結合することを示し、さらにRISBZ1がイネ種子貯蔵タンパク質遺伝子の胚乳特異的発現に関わる転写活性化因子であることを明らかにした。
【００１２】
また本発明者らは、本発明のRISBZ1をプロモーターの下流に結合させたDNA構築物、およびRISBZ1の標的配列を含むプロモーターの下流にレポーター遺伝子を結合させたDNA構築物を含む形質転換植物体を作出した。そして該形質転換植物体を用いることにより、レポーター遺伝子の発現を指標とした、RISBZ1の転写活性の測定に成功した。このことから、有用な高度付加価値のある外来遺伝子を、上記レポーター遺伝子の代わりにRISBZ1の標的配列を含むプロモーターの下流に結合させることによって、形質転換植物体細胞内で高度に発現させることが可能となった。
【００１３】
すなわち本発明は、GCN4モチーフとの結合を介してイネ種子貯蔵タンパク質の発現を調節する新規転写因子、およびそれをコードする遺伝子、並びに該遺伝子が導入された植物細胞および植物体、並びにそれらの製造および用途に関し、より具体的には、
〔１〕  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：２、５、または７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：１、３、４、または６のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（ｃ）配列番号：２、５、または７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２、５、または７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：１、３、４、または６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、５、または７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA、
〔２〕  GCN4モチーフと結合する機能、またはイネ種子貯蔵タンパク質の発現を活性化する機能を有するタンパク質をコードする、〔１〕に記載のDNA、
〔３〕  イネ由来である、〔１〕または〔２〕に記載のDNA、
〔４〕  〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
〔５〕  〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
〔６〕  植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードし、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAと90％以上の相同性を有するDNA、
〔７〕  植物細胞における内在性の〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするDNA、
〔８〕  〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター、
〔９〕  〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAまたは〔８〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
〔１０〕  〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質、
〔１１〕  〔９〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、〔１０〕に記載のタンパク質の製造方法、
〔１２〕  〔４〕から〔７〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター、
〔１３〕  〔１〕から〔７〕のいずれかに記載のDNAまたは〔８〕若しくは〔１２〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
〔１４〕  〔１３〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
〔１５〕  〔１４〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔１６〕  〔１４〕または〔１５〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔１７〕  〔１０〕に記載のタンパク質に結合する抗体、
〔１８〕  発現制御領域の下流に〔１〕に記載のDNAが機能的に結合したDNA構築物、および〔１０〕に記載のタンパク質の標的配列を有する発現制御領域の下流に外来遺伝子が機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体、
〔１９〕  標的配列がGCN4モチーフを含む配列である〔１８〕に記載の植物体、
〔２０〕  GCN4モチーフが配列番号：８、１３、または１４のいずれかに記載の配列である〔１９〕に記載の植物体、
〔２１〕  標的配列がG/Cボックスを含む配列である〔１８〕に記載の植物体、
〔２２〕  発現制御領域の下流に〔１〕に記載のDNAが機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体、および〔１０〕に記載のタンパク質の標的配列を含む発現制御領域の下流に外来遺伝子が機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体を交配させることを特徴とする、〔１８〕から〔２１〕のいずれかに記載の植物体の作出方法、を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、イネ由来のRISBZ1、RISBZ4、およびRISBZ5タンパク質をコードするDNAを提供する。RISBZ1のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該cDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：３に示す（配列番号：３に記載のゲノムDNAは、イントロンを含む、６つのエキソンからなる）。また、RISBZ4およびRISBZ5タンパク質のcDNAの塩基配列をそれぞれ配列番号：４および６に、RISBZ4およびRISBZ5タンパク質のcDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：５および７に示す。なお、本明細書において、本発明のRISBZ1、RISBZ4、RISBZ5をまとめて、RISBZと表記する。
【００１５】
本発明のRISBZタンパク質は、GCN4モチーフと結合する能力を有し、bZIP型の転写因子であると考えられる。その中でも、RISBZ1は、GCN4モチーフとの結合を介して転写を顕著に活性化する能力を有していた。RISBZ1遺伝子のプロモーターがイネ種子の糊粉層において活性化していたことから、RISBZ1は、イネ種子貯蔵タンパク質の発現を制御する転写活性化因子であると考えられる。
【００１６】
また、bZIP型転写因子はファミリーに属する様々な因子の組み合わせにより、多様なホモ／ヘテロ二量体を形成する。その結果、様々な機能を備えた制御因子が形成され、それらが遺伝子の転写を制御していることが報告されている。下記の実施例において、RISBZ2およびRISBZ3がRISBZ1とヘテロ二量体を形成することを示した。また、RISBZ4およびRISBZ5はRISBZ3のbZIPドメインと相同性が非常に高く（96%および82.7%）、これらの因子もRISBZ1とヘテロ二量体を形成する可能性が考えられる。これらの事実から、本発明のRISBZ4およびRISBZ5は、登熟ステージおよび組織に応じて、本発明のRISBZ1および他のRISBZメンバーとヘテロニ量体を形成し、様々な転写活性化能やDNA結合特性を備えた因子を形成することによって種子貯蔵タンパク質の発現を制御することが十分に考えられる。
【００１７】
従って、本発明のRISBZタンパク質をコードするDNA、あるいは該DNAの発現を制御する分子は、例えば、種子貯蔵タンパク質の発現を調節することに利用することが考えられる。種子貯蔵タンパク質の発現の調節は、産業上様々な利点を有する。例えば、胚乳中の種子貯蔵タンパク質を欠損させることにより、外来遺伝子産物を胚乳中に高度に集積させることが可能となる。一方、胚乳中に種子貯蔵タンパク質を高度に蓄積させることにより、より栄養価を高めた種子（例えば、コメ）を生産することが可能となる。
【００１８】
本発明のRISBZタンパク質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物細胞または組織からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１、３、４、６）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１、３、４、６）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物細胞または組織から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
【００１９】
本発明は、配列番号：２、５、７に記載のRISBZタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで「RISBZタンパク質と機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が配列番号：２、５、７に記載のRISBZタンパク質と同等の生物学的機能、例えば、GCN4モチーフと結合する機能、および／またはイネ種子貯蔵タンパク質の発現を調節する機能を有することを指す。イネ貯蔵タンパク質としては、例えばイネグルテリンを挙げることができる。
【００２０】
このようなDNAには、例えば、配列番号：２、５、７に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００２１】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のRISBZタンパク質（配列番号：２、５、７）をコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のRISBZタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。対象となるDNAの塩基の変異数は、アミノ酸レベルにおいて、典型的には、100アミノ酸以内、好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましくは20アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。
【００２２】
あるDNAがGCN4モチーフに結合する機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば当業者により一般的に行われているゲルシフトアッセイによって調べることができる。具体的には、次のような方法で行うことができる。まず被検DNAを、その遺伝子産物がGSTとの融合タンパク質を生成するようにベクターへ組み込み、該ベクターからの融合タンパク質を発現させる。発現産物をGSTを指標に精製し、GCN4モチーフを含む標識したDNAプローブと混合する。この混合液を、非変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により解析を行う。検出されたゲル上のバンドの位置から、結合活性を評価することができる。
【００２３】
また、あるDNAがイネ種子貯蔵タンパク質の発現を活性化する機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えばレポーターアッセイにより調べることができる。具体的には、次のような方法で行うことができる。まず、イネ種子貯蔵タンパク質のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結させたベクターを構築する。該ベクターと、被検DNAの遺伝子産物を発現するベクターとをレポーターアッセイ用の細胞へ導入し、レポーター遺伝子産物の活性を測定することにより、被検DNA遺伝子産物の転写活性の評価を行う。該レポーターアッセイに使用することができるイネ種子貯蔵タンパク質のプロモーターとしては、例えばイネグルテリン遺伝子プロモーターを挙げることができる。レポーター遺伝子としては、その発現を検出し得るものであれば特に制限はなく、当業者が一般的に各種アッセイ系に使用するレポーター遺伝子を用いることができる。好適なレポーター遺伝子としては、例えば、β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を挙げることができる。
【００２４】
配列番号：２、５、７に記載のRISBZタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、RISBZ遺伝子（配列番号：１、３、４、６）もしくはその一部をプローブとして、また該遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネなどからRISBZ遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるRISBZタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
【００２５】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4% SDS、0.5x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4% SDS、0.1x SSCの条件を用れば、より相同性の高いDNAの効率的な単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、RISBZタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２、５、７）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は、FASTA検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やBLAST検索により決定することができる。
【００２６】
本発明のDNAは、例えば、組み換えタンパク質の調製や上述したように、トランスジェニック植物の作出に利用することが可能である。
【００２７】
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
【００２８】
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００２９】
本発明のDNAを発現する形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
【００３０】
一方、本発明のDNAの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAの発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のタンパク質をコードするDNAの発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００３１】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, (1986) Proc.Natl.Acad.USA.83:5372)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(A.R.van der Krolら (1988) Nature 333:866)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００３２】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人,pp.319-347,1993)。
【００３３】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。配列の相補性は、上記した検索により決定することができる。
【００３４】
アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００３５】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, (1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。
【００３６】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett.228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子,(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191、 M.Koizumiら, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。例えば、RISBZ遺伝子（配列番号：１、３、４、６）のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。
【００３７】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.Kikuchi およびN.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、 菊池洋, (1992) 化学と生物 30:112)。
【００３８】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Tairaら, (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.GrosshansおよびR.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Tairaら (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyamaら Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３９】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7:R793, 1997; Curr. Biol. 6:810, 1996)。例えば、RISBZ遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、RISBZ遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からRISBZ変異体の形質を有する植物、例えば、種子における貯蔵タンパク質の発現量が改変された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した検索を利用して決定することができる。
【００４０】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするDNA」とは、該DNAを発現させることによって、植物体が本来持つ本発明の内在性遺伝子がコードするタンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコードするDNAのことを指す。例えば、本発明のタンパク質の転写活性化ドメインが欠失し、GCN4結合能を有するペプチド（例えば、配列番号:２のアミノ酸配列の1位から40位を欠失したペプチドまたはこれに対応する他のタンパク質のペプチド）をコードするDNAである。
【００４１】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。また、組織特異的な発現を保証するプロモーターを好適に用いることもできる。組織特異的プロモーターとしては、例えば、イネの種子において発現させる場合にはグルテリン遺伝子のプロモーター（Takaiwa,F.et al.,PlantMol.Biol.,17,875-885,1991）や本発明のRISBZ1のプロモーターが、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウなどの豆科作物やピーナツ、ゴマ、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワーなどの油糧用種子作物の種子において発現させる場合には、グリシニン遺伝子のプロモーターあるいは各作物の主要な貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーター、例えば、インゲンマメであればファゼオリン遺伝子のプロモーター（Murai,N.et al.,Science,222,476-482,1983）が、ナタネであればクルシフェリン遺伝子のプロモーター（Rodin,J.et al.,PlantMol.Biol.,20,559-563,1992）が挙げられる。また、ジャガイモの塊茎で発現させる場合には、パタチン遺伝子のプロモーター（Rocha-Sosa,M.et al.,EMBO J.,8,23-29,1989）が、サツマイモの塊根で発現させる場合には、スポラミン遺伝子のプロモーター（Hattori,T.and Nakamura,K.,Plant Mol.Biol.,11,417-426,1988）が、ホウレン草などの野菜の葉で発現させる場合には、リブロース-1,5-ビスリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター（Orozco,B.M.and Ogren,W.L.,PlantMol.Biol.,23,1129-1138,1993）が好適である。
【００４２】
本発明においてベクターの導入される植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００４３】
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Tokiら (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００４４】
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。本発明の植物体は、好ましくは単子葉植物であり、さらに好ましくはイネ科植物であり、最も好ましくはイネである。
【００４５】
また本発明は、本発明のRISBZ遺伝子を利用して、外来遺伝子産物を高度に発現させた植物体を提供する。本発明の該植物体は、発現制御領域の下流に本発明のDNAが機能的に結合したDNA構築物、および標的配列を有する発現制御領域の下流に外来遺伝子が機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する。
【００４６】
発現制御領域の下流に本発明のDNAもしくは外来遺伝子が「機能的に結合した」とは、発現制御領域に転写因子が結合することにより、本発明のDNAもしくは外来遺伝子の発現が誘導されるように、発現制御領域と本発明のDNAもしくは外来遺伝子が結合していることをいう。
【００４７】
標的配列とは、転写因子である本発明のRISBZタンパク質が結合するDNA配列をいい、好ましくはGCN4モチーフまたはG/Cボックスを含むDNA配列である。GCN4モチーフとしては、種々の遺伝子内に見られる以下のような配列を例示することができる。
・GCN4モチーフ（GCN4モチーフを含む遺伝子名）
GCTGAGTCATGA／配列番号：８ (GluB-1)
CATGAGTCACTT／配列番号：９ (GluA-1)
AGTGAGTCACTT／配列番号：１０ (GluA-3)
GGTGAGTCATAT／配列番号：１１ (LMWG)
GGTGAGTCATGT／配列番号：１２ (Hordein)
GATGAGTCATGC／配列番号：１３ (Gliadin)
AATGAGTCATCA／配列番号：１４ (Secalin)
【００４８】
標的配列として好ましいGCN4モチーフ配列としては、「GCTGAGTCATGA／配列番号：８」、「GATGAGTCATGC／配列番号：１３」および「AATGAGTCATCA／配列番号：１４」が例示される。G/Cボックスとして具体的には、配列「AGCCACGTCACA／配列番号：１５」が例示される。また、本発明の標的配列としては、上記のGCN4モチーフまたはG/Cボックスがタンデムに繰り返えされた配列も含まれ、好ましくはGCN4モチーフまたはG/Cボックスが4回タンデムに繰り返された配列を挙げることができる。
【００４９】
外来遺伝子としては、例えば、抗体、酵素、生理活性ペプチドをコードする遺伝子を挙げることができる。
【００５０】
さらに本発明は、本発明のRISBZ遺伝子を利用した、外来遺伝子産物を高度に発現させるための植物体の作出方法を提供する。該植物体の作出方法としては、例えば、「発現制御領域の下流に本発明のDNAが機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体」、および「本発明のタンパク質の標的配列を有する発現制御領域の下流に外来遺伝子が機能的に結合したDNA構築物をゲノム上に有する植物体」を交配させる方法が挙げられる。
【００５１】
上記「発現制御領域の下流に本発明のDNAが機能的に結合したDNA構築物」、および「標的配列を有する発現制御領域の下流に外来遺伝子が機能的に結合したDNA構築物」の植物ゲノムへの導入は、当業者によって一般的に行われている方法、例えば前記のアグロバクテリウムを用いた方法によって行うことができる。
【００５２】
また、植物体の交配は当業者によって一般的に行われる方法によって行うことができる。例えば、自殖を防ぐために、交配当日に剪穎法による除雄、あるいは交配当日に温湯除雄を行い花粉のみを不稔化し、花粉親の穂をゆすり受粉させる。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例１]   種子cDNAライブラリーからのbZIP型転写因子をコードするcDNAクローンの単離
イネ(Oryza sativa L. c.v. Mangetumochi)を水耕栽培し、14日目の葉および根を液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。登熟期の種子は圃場より採種した。
【００５４】
O2様タンパク質のbZIPドメイン内の保存性の高いアミノ酸配列(SNRESAおよびKVKMAED)を基に設計されたプライマーを用意し、これを用いてイネ種子より調製したpolyA+ mRNAを鋳型とする RT-PCR反応を行った。Poly(A)RNAは開花後6-16日(day after flowering; DAF)の種子より抽出し(Takaiwa F et al. Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1987)、プライマーとしてoligo(dT)20を用いてSuperscript reverse transcriptase (Gibco BRL, Paisly, UK)による逆転写反応を行って一本鎖cDNAの合成した。次いで、穀物の種子で発現しているbZIP型転写因子において保存性の高いアミノ酸配列に基づいて設計された1組のプライマー(5'-TCC AAC/T A/CGI GAA/G A/TCI GC-3'；  配列番号：１６、および5'-GTC CTC C/TGC CAT CTT CAC CTT-3'；  配列番号：１７)を用いてcDNAの増幅を試みた。一本鎖cDNAをPCR反応混合液(10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.01％(W/V)ゼラチン、200μM dNTPs、1μMプライマー)に溶解し、TaqIポリメラーゼを加え、サーマルサイクラー中で94℃、5分間保温後94℃、1分  →  40℃、1分  →  72℃、2分の反応を3サイクルの後、94℃、1分  →  55℃、1分  →  72℃、2分の反応を30サイクル継続することによりcDNAの合成と増幅を行った。増幅されたDNA断片はTAクローニングベクター(pCR2.1; Invitrogen)に繋いでクローン化した後に、ABI PRISM dye terminator sequence systemによってシーケンス反応を行い、得られた反応産物をABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer-Applied Biosystems)を用いて解析し、少なくとも50個のクローンの塩基配列を決定した。得られたデータはGENETYX、およびBLASTアルゴリズムを用いてそれぞれ塩基配列の解析およびデーターベース検索を行った。その結果、213bpのDNA断片が5種類得られたことが判った。これらの内2つはREB(Izawa T. et al. Plant Cell 6: 1277-1287, 1994)およびRITA1(Nakase M. et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997)のbZIPドメインの配列と同じであった。それぞれの断片に対応する完全長のcDNAを得るために高いストレンジェンシーの条件で、これら5種類の213bpのDNA断片をプロープに用いて、登熟期(6-16DAF)の種子のmRNAより作製したcDNAライブラリー(ZAPII; STRATAGENE)をスクリーニングした。DNA断片はランダムプライマー法(Amersham Pharmacia Biotech)により［α-32P］-dCTPを取こませプローブとした。プレハイブリダイゼーション液としては5x SSC 5x Denhard's 液、0.1%SDS 、50%ホルムアミド、100μg/mlサケ精子DNAの混合液を用いた。フィルターを55℃で2x SSC、0.1% SDSの混合液によって1回、0.1x SSC  0.1% SDSの混合液によって55℃で2回洗浄した。
【００５５】
その結果、得られたcDNAクローンはそれぞれ塩基配列の相同性に基づいて、RISBZ(rice seed b-Zipper)1（配列番号：１）, RISBZ2, RISBZ3, RISBZ4（配列番号：４）, RISBZ5（配列番号：６）と命名した。RISBZ2およびRISBZ3は既に種子および葉のcDNAライブラリーから単離されているREB(Izawa T. et al. Plant Cell 6: 1277-1287, 1994)およびRITA1(Nakase M. et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997)と同一であった。
【００５６】
[実施例２]   RISBZ cDNAの同定
新たに同定されたRISBZ cDNA(RISBZ1, RISBZ4, RISBZ5)について詳しい特徴付けを試みた。1742bp（poly(A)は除く）のRISBZ1 cDNAは最も長く、推定される分子量が46491Dalの436アミノ酸をコードする読み枠を含んでいた。RISBZ4およびRISBZ5はそれぞれ278および295アミノ酸をコードする読み枠が存在し、推定される分子量はそれぞれ29383Dalおよび31925Dalであった。
【００５７】
RISBZ1 mRNAのリーダー配列は245bであり、通常の場合よりも長い。興味深いことに、実際の開始コドンより上流のリーダー配列中から31アミノ酸をコードする小さな読み取り枠が見出された。同様な上流に位置する小さな読み取り枠(uORF)は、トウモロコシO2(Hartings H. et al. EMBO J. 8: 2795-2801, 1989)、コムギSPA(Albani D. et al. Plant Cell 9: 171-184, 1997)、オオムギBLZ1、およびBLZ2(Vicente-Carbojos J. et al. Plant J. 13: 629-640, 1998; Onate L. et al. J. Biol. Chem. 274: 9175-9182, 1999)からも見出されているが、これらは互いの相同性はほとんどない。トウモロコシO2mRNAのuORFは翻訳調節に関与していることが報告されている。uORFはRISBZ1 mRNAのみに存在し、他のRISBZ mRNAからは見出されなかった。
【００５８】
開始コドンを含む周辺の配列はGCAATGGである。この配列は単子葉植物から見出されている真核生物の翻訳開始配列c(a/c)(A/G)(A/C)cAUGGCGと一致していた。開始コドンとuORFは100bp離れていた。RISBZ1をコードする読み取り枠には2つの同じ終始コドン(TAG)コードされていた。終始コドンとpoly(A)までの長さは229bpであった。poly(A)が付加される位置から数えて-19〜-24の領域にポリアデニル化シグナル配列(AATATA)が見出された。
【００５９】
RISBZ1はイネ REB (Nakase M. et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997)、トウモロコシ OHP-1、OHP-2 (Pysh L. D. et al. Plant Cell 5: 227-236, 1993)、およびオオムギ BLZ1(Vicente-Carbojos J. et al. Plant J. 13: 629-640, 1998)(図１)と近縁であり、それぞれ48.2% （イネ REB）、45.7% （オオムギ  BLZ1）、46.6%（トウモロコシ  OHP1）のアミノ酸配列の相同性を示した。さらにこれらのbZIPドメインの保存性は高かった (73.7% 〜76.3%)。RISBZ4 および RISBZ5と、RITA1 (RISBZ3)とのアミノ酸レベルでの相同性はそれぞれ88.8%および47.6 %であった。一方、RISBZ4とRISBZ5との相同性は48.2%であった。RISBZ3、4および5はこれまでに報告されているO2様転写因子の中でユニークなグループを構成していた。さらに、種子cDNAライブラリーから単離された5つのRISBZ cDNA群はアミノ酸の相同性に基づいて2つに分類できた(図１)。また、RISBZ1、およびRISBZ2に見出されるNおよびC末端領域は、RISBZ3、RISBZ4、およびRISBZ5では欠失しており、その結果として100〜150アミノ酸ほどサイズが減少していた(図２)。
【００６０】
RISBZ1およびRISBZ2のアミノ末端はプロリンに富んでいたが、他のRISBZタンパク質ではこの領域が欠失していた(図２)。RISBZ1およびRISBZ2のN末端から数えて60番目のアミノ酸の周辺領域、およびbZIPドメインの上流に位置する中央の領域は酸性アミノ酸に富んでいた。これらの酸性アミノ酸およびプロリンに富んでいる配列は、他のO2様転写因子からも見出されている。
【００６１】
RISBZ1の領域207〜210からセリンに富んだ配列(SGSS)が見出され、カゼインカイネースIIの標的配列である可能性が考えられた(Hunter T. and Karin M. Cell 70: 375-387, 1992) (図２)。同様な配列(SSSS)はRISBZ2からも見出されたが、他のRISBZタンパク質ではこの配列が欠失していた(図２)。
【００６２】
これまでにトウモロコシのOpaque2(O2)タンパク質の細胞質から核への輸送にかかわる2つの核移行シグナル(NLSA: SV-40様モチーフ、 NLSB: 2因子性モチーフ)(Varagona M. J. et al. Plant Cell 4: 1213-1227, 1992)が同定されている。これらのモチーフの検索をRISBZ1に対して行った結果、O2と同じ位置(101〜135および232〜264)からNLSA およびNLSBと相同性を示す配列が見出された。
【００６３】
[実施例３]   RISBZ1遺伝子のゲノム構造
RISBZ1cDNAを基に設計されたプライマーを用いて、プロモーターおよびRISBZ1タンパク質をコードするゲノム領域を単離した。PCR反応は、RISBZ1 cDNAの配列に基づいて設計された2組みのオリゴヌクレオチド (RIS1f: 5'-ATGGGTTGCGTAGCCGTAGCT-3'／配列番号：１８、RELr5: 5'-TTGCTTGGCATGAGCATCTGT-3'／配列番号：１９)、および (RELf2: 5'-GAGGATCAGGCCCATAT-3'／配列番号：２０、RIS1r: 5'-TCGCTATATTAAGGGAGACCA-3'／配列番号：２１)をプライマーとして用い、イネゲノミックDNAを鋳型として、TAKARA LA Taq( TAKARA )を使用して行った。サーマルサイクラー中で98℃、10秒 → 56℃、30秒 → 68℃ 5分を30 サイクルのPCR反応を行いDNA断片を増幅した。RISBZ1遺伝子プロモーター領域をLiuら（25）の方法に基づいたthermal asymmetric interlaced (TAIL) PCRによって増幅した。3つのオリゴヌクレオチド(tail1: 5'-TGCTCCATTGCGCTCTCGGACGAG-3'／配列番号：２２, tail2: 5'-ATGAATTCGCGAGGGGTTTTCGA-3'／配列番号：２３, tail3: 5'-GTTTGGGAGAAATTCGATCAAATGC-3'／配列番号：２４)を特異的プライマーとして用いた。
【００６４】
その結果、RISBZ1遺伝子は6個のエキソンと5個のイントロンで構成されていることが判った(図３)。RISZ1遺伝子のエキソン/イントロンの構成はトウモロコシのO2 (Hartings H. et al EMBO J. 8: 2795-2801, 1989)、ソルガムのO2(Pirovano L. et al. Plant Mol. Biol. 24: 515-523, 1994)、ハトムギのO2(Vettore A. L. et al. Plant Mol. Biol. 36: 249-263, 1998)およびオオムギ のBLZ1(Vicente-Carbojos J. et al. Plant J. 13: 629-640, 1998)遺伝子と同じであった(図３)。
【００６５】
RISBZ1遺伝子の転写開始点をプライマーエクステンション解析によって決定した。プライマーエクステンション解析はSambrook et al.(Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., pp.7.79-7.83, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY))の方法に従った。すなわち、目的とする領域のすぐ下流の配列と相補的な30ntのオリゴヌクレオチドをT4キナーゼにより5'末端標識し、5'- ATGGTATGGTGTTCCTAGCACAGGTGTAGC -3'（配列番号：２５）からなるプライマーを作製した。このプライマーを用いて5μgのmRNAを鋳型とした逆転写反応（Superscript reverse transcriptase kit(Gibco BRL, Paisly, UK)）を行った。逆転写反応は、混合液(20 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 10 mM DTT, 500 μM dNTP, 105 cpmプライマー, 5μg mRNA, 200 unit Superscript revers transcriptase(Gibco BRL, Paisly, UK))を、42℃で50分反応させて行った。
【００６６】
その結果、開始コドンから数えて245nt 上流に転写開始点がマップされた。転写開始点から-30〜-35の位置にはTATAボックスが見出された。3つのACGTモチーフが転写開始点から数えて63bp、123 bpおよび198 bp上流に見出されたが、種子特異的発現にかかわるモチーフ（例えばGCN4およびAACAなど）は見出されなかった。一方、Dofドメインタンパク質の認識配列(AAAG)は数多く見出された。これらのモチーフがRISBZ1遺伝子の時期・組織特異的発現に関わっている可能性が考えられる。例えばACGTモチーフがRISBZ1タンパク質の標的配列であれば、RISBZ1遺伝子は自己調節(autoregulate)されている可能性がある。しかしながらRISBZ1プロモーター/GUSレポーター遺伝子および35S CaMV プロモーター/RISBZ1遺伝子をプロトブラストへ導入した結果、レポーター遺伝子の転写活性化は観察されなかった。このデータから、RISBZ1プロモーターにはRISBZ1タンパク質の標的配列配列は含まれていないことが示唆された。すなわち、RISBZ1プロモーターから見出されたACGTモチーフはRISBZ1の標的配列ではない。従って、RISBZ1遺伝子が自己調節されている可能性は低い。一方、Dofドメインを認識するRPBF (rice prolaimin box binding factor)遺伝子の過剰発現によって、RISBZ1プロモーター/GUSレポーター遺伝子の転写が活性化されたことから、Dofドメインタンパク質の認識配列はRISBZ1遺伝子の特異的発現にかかわっている可能性が示唆された。
【００６７】
[実施例４]   RISBZ mRNAの組織特異性
RISBZ遺伝子の発現を調査するためにノーザンブロット分析を試みた。高岩らの方法(Varagona M. J. et al. Plant Cell 4: 1213-1227, 1992)に依って、開花後5日目から30日目の種子(5, 10, 15, 20, および30 DAF)、ならびに根および実生から全RNAを抽出し、アガロースを用いて分画した後にメンブレンに転写した。プローブにはRISBZ cDNAのbZIPドメインコード域下流配列から3'非翻訳領域にわたる領域を用いた。使用したプローブの領域は次の通りである。
・RISBZ1 1388位から1742位までの354bp
・RISBZ2 1351位から1696位までの346bp
・RISBZ3 741位から1226位までの486bp
・RISBZ5 742位から1362位までの621bp
【００６８】
ハイブリダイゼーションは5x SSC 5x Denhard's液、0.1% SDS 、50% ホルムアミドの混合液中で45℃にて行った。フィルターを2x SSC、0.1% SDSの混合液、次いで0.1x SSC  0.1% SDSの混合液でそれぞれ2回づつ30分間洗浄した。
【００６９】
図４に示すように、RISBZ1遺伝子は種子でのみ発現していたおり、他の組織における発現は検出されなかった。RISBZ1 mRNAの蓄積量は開花後5日から10日(5 〜10 DAF)にかけて最も高かった。このような高いmRNA量は開花後15日まで続き、その後種子の登熟とともに低下した。RISBZ1遺伝子の発現はグルテリン遺伝子とは少し異なり、RISBZ1遺伝子の方が早く発現量のピークを迎えた。グルテリンmRNAは5 DAFから検出されはじめ15 DAFに蓄積量のピークを迎えたのち、徐々に減少した(図４)。この結果は、RISBZ1がグルテリン遺伝子の活性化因子として機能している可能性を示唆している。同様な発現パターンはトウモロコシのO2 (Hartings H. et al EMBO J. 8: 2795-2801, 1989), コムギのSPA (Albani D et al. Plant Cell 9: 171-184, 1997) およびオオムギの BLZ2 遺伝子(Onate L. et al. J. Biol. Chem. 274: 9175-9182, 1999)においても報告されている。
【００７０】
RISBZ2は今回調査した全ての組織で発現していた。RISBZ3および4は登熟過程後期の種子で特異的に発現していた(図４)。RISBZ3および4のmRNAは、20DAFまで徐々に増加したのちに減少した。RISBZ5は他のRISBZ遺伝子と比較して発現量が大変に低かった。mRNA量のピークは10DAFに迎えた。
【００７１】
[実施例５] 形質転換体におけるRISBZ1プロモーター/GUSレポーター遺伝子の発現
RISBZ1遺伝子の発現パターンをさらに調べるために、転写開始点から数えて-1674の位置から+213までの配列をGUS遺伝子の上流に繋いだ。このレポーター遺伝子を、アグロバクテリウムを用いてイネに導入した(図５A)。形質転換イネ(Oryza sativa L. c.v. kitaake)の作出は、具体的には次のようにして行った。PstIあるいはBamHIサイトが5'末端に付加されたプライマー(5'- AAAACTGCAGTTTTCTGA -3'／配列番号：２６、および5'- AATGGATCCGCGAGGGGTTTTCGAA -3'／配列番号：２７)を用いて、RISBZ1遺伝子の5'隣接域（-1674 〜+4および -1674 〜+213）をPCRで増幅した。PCR反応は、PCR反応混合液(10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.01%(x/v)ゼラチン、200μM dNTPs、1μM プライマー、鋳型DNA 0.5μg、2.5 unit Taq I ポリメラーゼ)を、94℃で1分／50℃で1分／72℃で2分を30サイクルで行った。PCR産物をPstIおよびBamHIで切断したのちにpBI201に繋ないだ後に, PstIおよびSacIで切断した。その結果、切り出されたRISBZ1プロモーター／GUS遺伝子を含むDNA断片を、バイナリーベクターp8cHmのSse8387IサイトおよびSacIサイトに繋いだ。p8cはCaMV35Sプロモーター／ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子をコードしている。形質転換の方法は後藤らの論文(Goto F. et al. Nature Biotech. 17: 282-286)の記述に従った。
【００７２】
レポータープラスミドの構築は次のようにして行った。Wuら(Wu C. Y. et al. Plant J. 14: 673-683, 1998)により構築された1x21bp、3x21bp、5x21bp GCN4モチーフ／GUS遺伝子をレポーターとして用いた。5'側に突出末端（ACGT）が付加された一組の互いに相補的な48bpのオリゴヌクレオチドを会合させて、正常型12bp GCN4モチーフ(GCTGAGTCATGA／配列番号：８)および変異型GCN4モチーフ(GCTTCCTCATGA／配列番号：２８)の4量体を作製した。これらの2本鎖のオリゴヌクレオチドを-46CaMV/GUSレポーター遺伝子のSalIおよびStuIサイトに挿入した。
【００７３】
また、イネカルスプロトプラストを用いたトランジェントアッセイの方法はWuらの論文の記述に従った。GUS活性の測定はJefferson(Jefferson R. A. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405, 1987)の方法に従い、glucuronide前駆体から生成された4-methyl-umbelliferoneの蛍光量を測定した。Bio Rad Kitを用いて、タンパク質濃度を測定した。標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いた。
【００７４】
図５Bに示すように、高いGUS活性が登熟期種子の糊粉層および副糊粉層で検出され、胚では認められなかった。根、葉および茎からのGUS活性は高感度の蛍光法による分析を行っても検出されなかった。以上の結果から、RISBZ1遺伝子の発現領域が糊粉層および副糊粉層に限られていることが示唆された。5'非翻訳領域およびuORFの機能を調べるために、転写開始点から数えて-1674の位置から+4までのuORFを含まない配列(図５A)によってGUS遺伝子を発現させた植物体とGUS活性を比較した。その結果、uORFの欠失によって発現部位の変化はなかった(図５B)が、5〜10倍のプロモーター活性の減少が引き起こされた(図５C)。これらのデータから、5'非翻訳領域は正の翻訳調節を担っている可能性が示唆され、トウモロコシO2においてuORFが翻訳の抑制因子として機能している(Lohmer S. et al. Plant Cell 5: 65-73)ことを示しているデータとは対照的な結果が得られた。
【００７５】
[実施例６]  ５種のRISBZタンパク質のGCN4モチーフへの結合を介した転写活性化能
5種のRISBZタンパク質のGCN4モチーフへの結合を介した転写活性化能を、トランジェントアッセイによって調べた。まず、エフェクターとしてCaMV35Sプロモーターの下流にそれぞれのRISBZタンパク質のコード配列を繋いだプラスミドを用意した。エフェクタープラスミドの作製は、次のようにして行った。N末端領域が欠失したRISBZ1をコードするプラスミドはPCRを用いて作製した。RISBZ1のN末端から数えて41、81、121および161番目のアミノ酸からC末端までの領域をコードするcDNAを増幅するように以下のプライマーを設計した。
【００７６】
・フォワードプライマー
RIS1-1: 5'- AACCATGGTGCTGGAGCGGTGCCCGT -3' （配列番号：２９）
RIS1-2: 5'- AACCATGGCGGCGGAGGCGGCGGCG -3' （配列番号：３０）
RIS1-3: 5'- CCCCATGGAGTACAACGCGATGC -3' （配列番号：３１）
RIS1-4: 5'- AACCATGGTTGGTTCCATCCTGAGT -3' （配列番号：３２）
RIS1-5: 5'- AACCATGGCTCATGCCAAGCAAGCT -3' （配列番号：３３）
RIS1-6: 5'- AACCATGGATGAAGAAGATAAAGTGAAG -3' （配列番号：３４）
・リバースプライマー
BRIS1R: 5'- TAGGATCCGCTCCTACTACTGAAGCT -3' （配列番号：３５）
【００７７】
これらのプライマーの5'末端にはNcoI、またはBamHIサイトを付加した。N末端領域の欠失により失われた翻訳開始コドンの代わりとして、NcoIサイトのATGを利用した。94℃で2分、94℃で1分／50℃で1分／72℃で2分を30サイクル、72℃で5分のPCR反応により増幅したcDNAをNcoIおよびBamHIで切断し、次いでアガロースゲルで精製した。得られたcDNAをpRT100(Topfer R. et al. Nucl. Acids Res. 15: 5890, 1987)に挿入した。
【００７８】
RISBZ1およびRISBZ2と、GAL4DNAドメイン（アミノ酸残基1〜147番目）との融合タンパク質をコードするプラスミドを構築した。先ず、RISBZ1およびRISBZ2の様々なN末端領域をコードするcDNA領域をPfu Taqポリメラーゼ(STRATAGENE)を用いたPCRで増幅するために、フォワードプライマーとBamHIサイト、終止コドンおよびSstIサイトが5'末端に付加されたリバースプライマーを用意した。各プライマーの塩基配列は以下の通りである。
【００７９】
・フォワードプライマー
RISBZ1-F1: 5'- AAGGATCCAATGGAGCACGTGTTCGCC -3' （配列番号：３６）
RISBZ1-F2: 5'- AAGGATCCGGCGGCGGAGGCGGCGCG -3' （配列番号：３７）
RISBZ1-F3: 5'- GCCGGATCCAGTTGGTTCCATCCTGAG -3' （配列番号：３８）
RISBZ1-F4: 5'- AAGGATCCTGATGAAGAAGATAAAGT -3' （配列番号：３９）
RISBZ1 F1-2: 5'- AAGGATCCAGGAGTAGATGACGTCGGC -3' （配列番号：４０）
RISBZ1 F1-3: 5'- AAGGATCCAGACGAGATCCCCGACCCGCT -3' （配列番号：４１）
・リバースプライマー
RISBZ1-R1: 5'- TAGAGCTCTACGCCGCCGGCATCGGGCT -3' （配列番号：４２）
RISBZ1-R2: 5'- TAGAGCTCTAAAGGATCATATTTCCCAT -3' （配列番号：４３）
RISBZ1 R1-1: 5'- TAGAGCTCTAGGCGGCCGCCGCCGGCTG -3' （配列番号：４４）
RISBZ1 R1-2: 5'- TAGAGCTCTACGGCGGCGGCGGAGCCCA -3' （配列番号：４５）
【００８０】
上記のプライマーを用いて、94℃で2分、94℃で1分／50℃で1分／72℃で1分、72℃で5分のPCR反応により、RISBZ1およびRISBZ2の様々なN末端領域をコードするcDNAを増幅し、BamHIおよびSacIで切断し2%アガロースゲルで精製した。得られたcDNAを同じ制限酵素で切断された35S-564ベクターのGAL4DNAドメインコード域下流に読み枠が合うように繋いだ。RISBZ1のN末端領域への変異の挿入にはPCRを利用した。cDNA配列を確認した後に、アミノ酸残基1〜57番目の領域をPCRで増幅した。得られた産物をGAL4DNAドメインコード域下流に読み枠が合うように繋いだ。
【００８１】
さらに、1および3個の12bpGCN4モチーフあるいは1および5個の21bpGCN4モチーフとGUS遺伝子を連結したレポータープラスミドも用意した。さらにネガティブコントロール実験では、4x変異型12bpGCN4モチーフ/GUSレポータープラスミドを用いた。変異型12bpGCN4モチーフは正常型とはRISBZ1およびO2の標的配列が変異している。これらのプラスミドを単独、あるいはレポータープラスミドやエフェクタープラスミドと組み合わせることによりカルスより調製したプロトプラストへ導入した後に、GUS活性を測定した。レポータープラスミドおよびエフェクタープラスミドをそれぞれ単独でプロトプラストへ導入しても低いレベルのGUS活性が観察されたに過ぎなかった。表１に示すようにエフェクタープラスミドとして導入された35S /RISBZ1 または35S /O2の存在下で、レポーター遺伝子の転写が活性化された。変異型12bpGCN4モチーフの下流のGUS遺伝子転写活性は、前述のエフェクタープラスミドの存在下でもバックグラウンドレベルであった。この結果から、RISBZ1遺伝子産物はGCN4モチーフを介してレポーター遺伝子を活性化させることが示された。RISBZ1による転写活性のレベルはO2よりも若干高く、また表２に示すように、GCN4モチーフのコピー数に乗じて上昇した。1〜12コピーの21bpGCN4モチーフについて調べた結果、9コピーまで直線的に転写活性のレベルが上昇した。しかしながら、35S CaMVプロモーターによって他のRISBZ遺伝子を発現させても、レポーター遺伝子の転写活性はRISBZ1やO2の場合と比較して1.4%以下のレベルしか検出されなかった。つまりRISBZ1タンパク質のみがGCN4モチーフの結合を介して転写を活性化させることが分かった。
【００８２】
【表１】
0004028956.tif 000002
【００８３】
4x12bp GCN4モチーフ/GUSレポーター遺伝子をエフェクタープラスミドと共にプロトプラストに導入して、GUS活性を測定した。3回の反復実験を行った。
【００８４】
【表２】
0004028956.tif 000003
【００８５】
レポーターとして1x12bp, 4x12bp, 1x21bp and 5x21bp GCN4 motif/GUS 遺伝子を用いた。RISBZ1 (+ RISBZ1)およびOpaque2(+ Opaque2)遺伝子の発現によって誘導されたGUS活性の値を示した。
【００８６】
[実施例７] RISBZ1タンパク質の結合サイト
本発明者らは以前にO2はグルテリン遺伝子GluB-1プロモーターの-165 〜-160 の領域にあるGCN4 モチーフ(TGAGTCA)を認識することを明らかにした(Wu C. Y. et al. Plant J. 14: 673-683, 1998)。メチレーション干渉実験によって、RISBZ1タンパク質のGluB-1遺伝子プロモーターにおける結合サイトを決定した。
【００８７】
GST-RISBZ1融合タンパク質の発現、および精製は次のようにして行った。RISBZ1から5のcDNAのコード域をそれぞれ適当な制限酵素サイトが5'末端に付加されたプライマー（RISBZ1；BamHI-平滑末端、RISBZ2；BamHI-XhoI 、RISBZ3；BamHI-SalI 、RISBZ4；BamHI-SalI、RISBZ5；BamHI-XhoI）を用いてPCR反応を行い増幅した。PCR産物を制限酵素処理した後に、pGEX-4T-3(Amersham Pharmacia Biotech)のクローニングサイトに連結した。GST- RISBZ融合タンパク質の発現の方法は鈴木らの論文(Suzuki A. et al. Plant Cell Physiol. 39: 555-559, 1998)の記述に従った。アフィニティー精製されたGST融合タンパク質を、binding buffer (20mM HEPES-KOH pH7.9, 50mM KCl, 1mM EDTA and 10% glycerol)に対して4時間透析した。その後直ちに、-80℃に保存した。
【００８８】
また、メチレーション干渉実験は、Weinbergerら(Weinberger J. et al. Nature 322: 846-849, 1986)の方法に従った。GluB1 5'隣接域（-245〜+18）をSalIおよびBamHIで切断し、fill-in反応によって、[α32P]dCTPをもちいて末端標識した。さらに、この標識された断片をジメチルサルフェート処理に依ってメチル化し、GST- RISBZ1と混合した後に保温した。非変性アクリルアミドゲル（5%、0.25x TBE）によって、GST- RISBZ1と複合体を形成したDNA断片としなかったものに分画した。それぞれのDNA断片を、DEAEセファロースカラムを用いて精製し、ピペリジンで切断したものを6%変性アクリルアミドゲルで分画した。
【００８９】
図６に示すように、GST-RISBZ1タンパク質はGluB-1プロモーターの-165 から-160にかけての グアニン残基だけをプロテクトし、プロテクトされたグアニン残基はO2の場合と一致した(Albani D et al. Plant Cell 9: 171-184, 1997)。-197 から+18までの配列にはACGTモチーフ(A/G hybrid box)が含まれている(-79〜-76)が、このモチーフのグアニン残基はプロテクトされなかった。
【００９０】
さらに、RISBZ1タンパク質によってGCN4 モチーフが認識されるか否かについて調査するために、ゲルシフト分析を次のようにして行った。
【００９１】
GluB1プロモーター領域（-175〜-155）の21ntの配列にTCGAを付加した相補的な1組みのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、fill-in反応によって、[α32P]dCTPをもちいて末端標識してプローブとした。変異型競合断片として、3塩基ずつずらして変異を加えた7組の相補的なオリゴヌクレオチドも合成し、アニーリングした。GST融合タンパク質を用いたゲルシフト分析の方法はWuら(Wu C. Y. et al. Plant J. 14: 673-683, 1998)および鈴木らの論文(Suzuki A. et al. Plant Cell Physiol. 39: 555-559, 1998)の記述に従った。標識されたプローブと0.5μgのGST- RISBZ融合タンパク質を混合し、室温で20分間保温した。競合実験ではこの混合液に100倍以上の分子量比の競合断片を加えた。この混合液を非変性アクリルアミドゲル（5%、0.25xTBE）を用いた電気泳動によって解析した。
【００９２】
GST-RISBZ1タンパク質はGCN4 モチーフを含む21 bpのDNA断片に結合することが、シフトバンドが検出されたことによって示された(図７B)。さらに、図７Aに示しているような3bpづつ変異が加えられた21 bpのDNA断片をコンペティターとして加えた実験を行った。GCN4 モチーフに変異が加えられたDNA断片をコンペティターとして加えた場合には、プローブとして加えられたDNA断片の結合を全くあるいはほとんど阻害しなかった(図７B-F)。一方、GCN4 モチーフの隣接配列に変異が加えられたDNA断片をコンペティターとして加えた場合にはシフトバンドが消失した(図７B-F)。従って、GCN4 モチーフの変異がRISBZ1タンパク質の結合に顕著に影響を及ぼすことから、RISBZ1タンパク質はGCN4 モチーフを特異的に認識することが明らかとなった。同様な実験は、他のRISBZタンパク質についても行い、これらもGCN4 モチーフを特異的に認識することが判った。図７B-Fから判るように、それぞれのタンパク質はGCN4 モチーフへの親和性がわずかに異なる。RISBZ2 およびRISBZ5において、GCN4 モチーフの隣接配列に変異が加えられたDNA断片をコンペティターとして加えた場合にシフトバンドが完全に消失しない(図７C, F)。
【００９３】
以上の結果から、RISBZタンパク質は、親和性は異なるが、GCN4 モチーフを特異的に認識することが明らかになった。
【００９４】
[実施例８]  RISBZ1のヘテロダイマー形成能
bZIP型転写因子であるRISBZ1は、他のRISBZタンパク質とヘテロダイマーを形成してGCN4様モチーフと結合し機能する可能性がある。RISBZ2およびRISBZ3とRISBZ1との間においてヘテロダイマーを形成するか否かを調査した。コムギ胚芽抽出液を用いて完全長RISBZ1タンパク質およびshort-form-RISBZ2 (sRISBZ2), -RISBZ3 (sRISBZ3)タンパク質を調製し(図８A)、DNA結合実験を試みた。in vitro翻訳は次のようにして行った。RISBZ1 cDNAのコード域、RISBZ2 cDNAおよびRISBZ3 cDNAのbZIPドメインコード域をNcoIサイトが5'末端に付加されたフォワードプライマーおよび終止コドンとBamHIサイトが付加されたリバースプライマーを用いて増幅した。プライマーの塩基配列は以下の通りである。
・RISBZ1, R1F：5'- AAACCATGGAGCACGTGTTCGCCGT -3'（配列番号：４６）、BRIS1r：5'- TAGGATCCGCTCCTACTACTGAAGCT -3'（配列番号：４７）
・sRISBZ2, dR2-1：5'- AAACCATGGAGGGAGAAGCTGAGACC -3'（配列番号：４８）、R2ra1：5'- AAAGGATCCTACATATCAGAAGCGGCGGGA -3'（配列番号：４９）
・sRISBZ3, dR3-1：5'- AAACCATGGATATAGAGGGCGGTCCA -3'（配列番号：５０）、R3ra1：5'- AAAGGATCCTACAGCCCGCCCAGGTGGCCG -3'（配列番号：５１）
【００９５】
PCR反応は、PCR反応混合液(10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.01％(W/V)ゼラチン、200μM dNTPs、1μMプライマー、鋳型DNA 0.5 mg、2.5 unit TaqIポリメラーゼ)を、94℃で1分／50℃で1分／72℃で2分を30サイクルで行った。
【００９６】
PCR産物をNcoIおよびBamHIで切断したのちにpET8c(Novagen)に繋いだプラスミドを構築した。これらのプラスミドを鋳型とした  in vitro 転写/翻訳 (TNT coupled wheat germ extract systems; Promega)反応によって全長RISBZ1およびtruncated form RISBZ2 (RISBZ2s)、 RISBZ3(RISBZ3s)を産生させた。ゲルシフト分析には反応後のコムギ胚芽抽出液 4μlを用いた。
【００９７】
21 bp GCN4モチーフに結合したホモダイマーとヘテロダイマーを区別するためにゲルシフト分析を行った。RISBZ1とsRISBZ2および sRISBZ3を前もって保温した後にプローブ（GCN4モチーフ）を反応させた結果、ホモダイマーに加えてヘテロダイマーがGCN4モチーフに結合することが示された(図８B)。すなわち、RISBZタンパク質は他のメンバーとヘテロダイマーを形成できることが分かった。
【００９８】
[実施例９]   RISBZ1タンパク質のN末端領域の転写活性化に対する関与
RISBZ1タンパク質の転写活性化ドメインを同定するためにトランジェントアッセイを行った。3コピーの21 bp GCN4モチーフとCaMV35Sのコアプロモーター配列が連結されたGUS遺伝子をレポーターとして用意した。CaMV35SプロモーターでRISBZ1タンパク質の様々なドメインを発現させ、これらがレポーター遺伝子を活性化させるか否かを調査した。
【００９９】
N末端から塩基性ドメインまでにかけて40アミノ酸づつ欠失させたRISBZ1タンパク質（配列番号：２のアミノ酸配列において41〜436、81〜436、121〜436、161〜436、201〜436番目および 235〜436番目のアミノ酸までの領域）をコードするエフェクタープラスミドのシリーズを作成した。完全長のRISBZ1タンパク質をコードするエフェクタープラスミドとレポータープラスミド（4コピーの12 bp GCN4モチーフとCaMV35Sのコアプロモーター配列が連結されたGUS遺伝子）をプロトプラストに導入すると、レポータープラスミドを単独で導入した場合よりも約30倍のGUS活性が検出された。このレポーター遺伝子の転写活性を100%とした場合、最初の40アミノ酸の欠失によってレポーター遺伝子の活性は20%まで低下する。さらに40アミノ酸づつ欠失させることによって、徐々に10%までレポーター遺伝子の活性が低下した。すなわち、主としてN末端から40アミノ酸までの領域が転写活性化に関わることが示唆された。
【０１００】
このN末端側の40アミノ酸とRISBZ1の転写活性化能との関わりをさらに調べるために、酵母の転写活性化因子GAL4のDNA結合ドメインと、RISBZ1タンパク質の様々な領域との融合タンパク質を発現させることによってgain-of-function解析を試みた。図９に示すように、CaMV35Sプロモーターの下流にGAL4-DNA結合ドメインとRISBZ1の各領域との融合タンパク質のコード配列を繋いだプラスミドをエフェクターに用いた。それぞれのエフェクタープラスミドとレポーター（9コピーのGAL4-DNA結合サイトとCaMV35Sのコアプロモーター配列が連結されたGUS遺伝子）をプロトプラストに導入した。
【０１０１】
GAL4-DNA結合ドメインとRISBZ1の1〜235番目のアミノ酸までの領域の融合タンパク質とこの融合タンパク質をC末端側からRISBZ1における 27番目のアミノ酸の位置まで段階的に欠失させたシリーズとの間で転写活性化能に大きな差異は見出されなかった(図９)。さらにRISBZ1の 20番目のアミノ酸の位置まで欠失させると活性化能は著しく低下した(図９)。また、RISBZ1のN末端側の8アミノ酸を欠失させた場合でもレポーターの転写活性は消失した。一方、RISBZ1の他の領域（配列番号：２のアミノ酸配列において27〜57番目、81〜234番目、161〜234番目および235〜436番目のアミノ酸までの領域）とGAL4-DNA結合ドメインの融合タンパク質はレポーター遺伝子の転写活性に影響を与えなかった。従って、RISBZ1タンパク質は酸性ドメインよりむしろN末端側の27アミノ酸に含まれるプロリンリッチドメインが転写の活性化に関与していることが示唆された。
【０１０２】
[実施例１０]  ドメインスワッピング実験による、RISBZ1と他のRISBZタンパク質ファミリーメンバーとの転写活性化能の違い
BISBZタンパク質ファミリーのメンバーはいずれも、GCN4 モチーフに対する同程度の親和性を備えているが、RISBZ1だけが転写活性化能を有する。このような差異をもたらす原因を明らかにするために、RISBZ1とRISBZ2 およびRISBZ3タンパク質との間でドメインスワッピング実験を行った。bZIPドメインより上流のN末端領域を、RISBZ1 (1〜299)とRISBZ2 (1〜229)およびRISBZ3(1〜137)との間で交換した。
【０１０３】
RISBZ1のN末端領域とRISBZ2およびRISBZ3のDNA結合ドメインの組み合わせでは、完全長のRISBZ1と比較しておよそ15%および38%の転写活性化能を示した。一方、RISBZ2およびRISBZ3のN末端領域をRISBZ1のDNA結合ドメインに連結させた場合には、RISBZ1のDNA結合ドメインだけで誘導される転写レベルをわずかに上回る程度にとどまった。
【０１０４】
これらの結果から、転写の活性化には主としてN末端領域が関わっていること示された。RISBZ2およびRISBZ3の転写活性化能が低い理由として、RISBZ1の転写活性化ドメインに相当する領域が進化の過程で欠失あるいは変異を起こした可能性が挙げられる。または、転写活性化ドメイン形成の過程にあるということも考えられる。RISBZ3に関してはRISBZ1から見出されたプロリンリッチドメインを完全に失っていることが原因として挙げられる。同様のことはRISBZ4および5についても当てはまる。他の解釈として、GCN4モチーフに対する親和性の差異によって転写活性化能の違いがもたらされるという解釈も考えられるが、ゲルシフト解析からこの可能性は否定されると考えられる。
【０１０５】
RISBZ1から見出されたプロリンリッチドメインは、RISBZ2においても高度に保存されているにも拘わらず、RISBZ2の転写活性化能はRISBZ1と比較してきわめて低かった。このドメインを含むRISBZ2のN末端側の27アミノ酸とGAL4-DNA結合ドメインを融合させたタンパク質をコードするエフェクタープラスミドとGCN4モチーフ-GUSレポーター遺伝子をプロトプラストに導入しても、GUS活性の上昇は観察されなかった。
【０１０６】
RISBZ1およびRISBZ2のN末端の27アミノ酸領域では変異が8個のアミノ酸に限られており、いづれの変異が転写活性化能の著しい差異をもたらしているのか同定することを試みた。RISBZ2と異なるRISBZ1の8個のアミノ酸を１つずつRISBZ2と一致するように置換させたタンパク質のN末端の40アミノ酸領域と、GAL4-DNA結合ドメインを融合させたタンパク質をコードするエフェクタープラスミドとGCN4モチーフ-GUSレポーター遺伝子を、プロトプラストに導入した。8種のエフェクターの中でRISBZ1のN末端側から7番目のアミノ酸を置換したタンパク質をコードするエフェクターを除いた全てが、レポーター遺伝子の転写を活性化させることができなかった。転写活性化能を喪失させた7つのアミノ酸置換はいずれもハイドロパシーパターンの変化を引き起こすことがKyte and Doolittleの計算式で予測された(図１０)。
【０１０７】
[実施例１１]   転写因子RISBZ1の育種的利用
活性化能を有している転写因子RISBZ1を育種的に利用できるか否かを調査した。該転写因子を種子中で特異的に過剰発現させるために、種子貯蔵タンパク質遺伝子のイネ13kDプロラミンプロモーターの制御下で過剰発現させた形質転換体イネを作出した。方法としてRISBZ1の翻訳開始点から上流-29のEcoRIサイトからpoly(A)結合サイトまでを含む領域をプロラミンプロモーター-652〜ATGより-13の領域を連結し、pGTV-Barのバイナリーベクターに挿入して、アグロバクテリアを介して、イネに遺伝子を導入した。28系統の独立した形質転換体を作出した。RISBZ1を過剰発現しているイネのスクリーニングは登熟期の種子からRNAを抽出し、RISBZ1のcDNAをプローブにして、ノーザンハイブリダイゼーションで行った（図１１）。このRISBZ1を高発現している系統を用いて、既に作出してあるRISBZ1の標的配列である21bpのGCN4モチーフを含む配列(5'- GTTTGTCATGGCTGAGTCATG -3'／配列番号：５２)を5個直列状に連結したものをミニマムプロモーター/GUSレポーターにつないでイネに遺伝子導入した形質転換体イネと交配した。
【０１０８】
その結果、GUSレポーター遺伝子のGUS活性は、RISBZ1の過剰発現により、発現レベルがコントロールの5×GCN4の系統(11〜14 nmol/min/mg protein)に比べて400倍以上(450〜750 nm/min/mg protein)に高まることが明らかになった（図１１）。これらの結果から、外来遺伝子をRISBZ1の標的配列の下流につなげれば、活性化能を有する転写因子の過剰発現により高度に転写を活性化できるものと推察できる。
【０１０９】
また、RISBZ1はグルテリン遺伝子のみならず他の貯蔵タンパク質遺伝子も活性化することができる。35S CaMVプロモーター/RISBZ1を、グルテリンプロモーター/GUS、グルテリンプロモーター(-980〜ATG)/GUS、および13Kプロラミンプロモーター(-652〜-29)/GUSと共に、イネプロトプロストにエレクトロポレーションで遺伝子導入し、一過的発現を調べた。
【０１１０】
その結果、RISBZ1はこれらのプロモーターのGCN4モチーフを含む標的配列に結合し、転写を活性化した。13kdプロラミンプロモーターに関してはバックグランドに比較して5〜10倍、グロブリン遺伝子に関しては20〜30倍転写を活性化していることが明らかになった。そこで、これらの遺伝子に関して、配列がRISBZ1によってどのように認識されているのかを、メチレーション干渉実験によって調べた。
【０１１１】
その結果、プロラミン遺伝子においては数ヶ所のGCN4モチーフ(TGACACA, GATGACTCA, TGACTCAC))がグロブリン遺伝子においては、GCN4モチーフとは異なる配列（GGTGACAC, GTATGTGGC, GATCCATGTCAC）が認識されていることが示された。そこでさらに、RISBZ1がどのような配列を特異的に認識するかG, A, C, G/C, A/G, C/A, GCN4, 22kD zein結合サイト、b-32結合サイトを含む12bpの4回の直列配列を-46 CaMV 35Sコアプロモーター／GUSのレポーター遺伝子につないで、一過的発現で認識を調べた。その結果RISBZ1は、G/C boxおよびGCN4モチーフをより優先的に認識していることが明らかになった（図１２）。
【０１１２】
さらに、多くの貯蔵タンパク質に見られるGCN4モチーフを用いて同様にRISBZ1による活性化能を調べた。その結果、GCN4モチーフのコア配列(TGAGTCA)の隣接配列が活性化能に影響を及ぼすこと、コムギのグリアジン遺伝子、およびライムギのセカリン遺伝子のGCN4モチーフが、活性化能が高いことが明らかになった（図１３）。
【０１１３】
【発明の効果】
本発明により、イネ種子貯蔵タンパク質の発現を調節する新規転写因子、および該転写因子をコードする遺伝子が提供された。転写活性化能を有する本発明のRISBZ1タンパク質を細胞内へ導入し過剰発現させることにより、該タンパク質によって制御を受ける多くの種子貯蔵タンパク質群の発現を高めることが期待できる。また本発明は、本発明の転写因子を利用した、有用な外来遺伝子（抗体、酵素等）を高度に発現させるための新しい遺伝子発現系を提供する。すなわち、転写因子との結合を容易にするため、転写因子の認識配列(GCN4モチーフ)を直列状に連結し、ある種の貯蔵タンパク質のプロモーターに導入することにより、この改変したプロモーターの制御下に位置する貯蔵タンパク質、および外来有用遺伝子の発現を高めることができる。これにより、胚乳中の種子貯蔵タンパク質が高度に蓄積し、より栄養価が高い種子（例えば、コメ）の生産、および有用タンパク質が高度に蓄積した種子の生産が大いに期待される。
【０１１４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  RISBZタンパク質およびO2様bZIPタンパク質のアミノ酸配列の相同性に基づいて作成された系統樹を表す。これらのタンパク質の類似性および進化的類縁関係を理解するために、全長のアミノ酸配列どうしの比較を行った。
【図２】  RISBZタンパク質およびO2様bZIPタンパク質のアミノ酸配列の比較を表す。50%以上保存されているアミノ酸を白抜きで示した。推定上の核移行シグナル(NLSA; SV40-like motif)(Varagona M. J. et al. Plant Cell 4: 1213-1227, 1992)およびセリンリッチリン酸化サイトは二重線および破線で示した。太線は塩基性ドメインを示し、この領域は2因子性の核移行シグナル(NLSB)構造も備えている。ロイシンリピートは下向きの矢印で示した。イネbZIPプローブの作成に用いたプライマーは右および左向きの矢印で示したアミノ酸配列を基に設計された。BLZ1(Vicente-Carbojos J. et al. Plant J. 13: 629-640, 1998)およびBLZ2(Onate L. et al. J. Biol. Chem. 274: 9175-9182, 1999)はオオムギ、O2(Hartings H. et al EMBO J. 8: 2795-2801, 1989)およびOHP1(Pysh L. D. et al. Plant Cell 5: 227-236, 1993)はトウモロコシ、SPAはコムギ(Albani D et al. Plant Cell 9: 171-184, 1997)、O2-sorgはソルガム(Pirovano L. et al. Plant Mol. Biol. 24: 515-523, 1994)、O2-coixはハトムギ (Vettore A. L. et al. Plant Mol. Biol. 36: 249-263, 1998)から単離されたO2様bZIPタンパク質を表す。
【図３】  O2様bZIPタンパク質をコードする遺伝子の構造を表す。オオムギのBLZ1 遺伝子およびトウモロコシ(O2) (Hartings H. et al. EMBO J. 8: 2795-2801, 1989)、ソルガム(O2-sorg)、ハトムギ(O2-coix)のOpaque2遺伝子のイントロン／エキソン領域の構造を示した。太線および細線はそれぞれエキソンおよびイントロンを示す。数字はエキソンおよびイントロンの塩基数を表している。
【図４】  RISBZ遺伝子の転写パターンを示すノーザンブロットの写真である。根、実生および登熟過程の種子(5, 10, 15, 20 および30 DAF)より抽出した全RNAについて、bZIPドメイン下流域の固有な塩基配列をプローブに用いたノーザンブロット分析を行った。転写パターンを比較するために、GluB-1遺伝子コード域をプローブに用いた実験も行った。対照として、25S rRNAのエチジウムブロマイドによる染色像を示した。
【図５】  形質転換イネにおけるRISBZ1プロモーター／GUSレポーター遺伝子の組織化学的解析結果を表す。
(A) RISBZ1プロモーター／GUSレポーター遺伝子の模式図である。(a)および(b)、RISBZ1遺伝子の転写開始点より数えて-1674〜+4番目の塩基までの配列およびuORFを含む-1674〜+213番目の塩基までの配列をそれぞれバイナリーベクター上のGUSレポーター遺伝子に繋いだ。(c)、GluB1プロモーター (-245 - +18)配列をプラスミドベクター上のGUSレポーター遺伝子と連結した。
(B) 登熟過程の種子におけるGUSレポーター遺伝子の発現を示す写真である。レポーター遺伝子が導入されたイネの種子(10DAF)を縦方向に切ったのちにX-gluc液に浸して37℃で保温した。ENは胚乳、EMは胚を表す。
(C)形質転換イネの種子抽出液のGUS活性を示すグラフである。解析には15DAFの種子を用いた。導入遺伝子のプロモーター構造はそれぞれ(A)の(a)および(b)に示した通りである。縦線は平均値を表す。MUは4-methylumbelliferoneを表す。
【図６】  GluB1プロモーター上のRISBZ1タンパク質結合サイトの同定のための、メチレーション干渉実験によるゲル泳動写真である。GluB1遺伝子のプロモーター断片(-245 〜 +18)のそれぞれの鎖(Top およびBottom)を片方ずつ標識した。それぞれの鎖を部分的にメチル化した後にGST-RISBZ1タンパク質と共に保温し、タンパク質と結合したプロモーター断片と結合しなかった断片をそれぞれ回収し、ピペリジンによって化学的に切断してから電気泳動した。ピペリジンによって切断されなかったサイト(＊印)がGCN4モチーフの中からのみ見出された。
【図７】  RISBZ1タンパク質のGCN4モチーフに対する結合能を調べたゲルシフト分析の泳動写真である。
(A)プローブおよびコンペティターとして用いたオリゴヌクレオチドの配列WILD: GluB-1プロモーター (-175 to -155)のGCN4モチーフを含む21 bpのDNA断片。M1-M7: 3bpずつ変異が加えられた21 bpのDNA断片のシリーズ。GCN4モチーフは線で囲んで示した。
(B)-(F) GST-RISBZ融合タンパク質をゲルシフト分析に用いた。プローブとして21 bpのDNA断片(WILD)を加えた。(B)GST-RISBZ1; (C)GST-RISBZ2; (D)GST-RISBZ3; (E)GST-RISBZ4; (F)GST-RISBZ5  コンペティターはプローブに対して100倍以上の化学量比になるように加えた。 レーン1：タンパク質なし、レーン2：コンペティターなし、レーン3-10：コンペティターあり（wild type (W)、およびM1-M7）
【図８】  RISBZ1と他のRISBZとのヘテロダイマー形成能を示す図である。
(A)in vitro転写／翻訳反応の鋳型として用いたベクターの構造を示す。ベクターはそれぞれ、完全長RISBZ1タンパク質、およびshort-form-RISBZ2 (sRISBZ2：218 to 329), -RISBZ3 (sRISBZ3： 126 to 237)タンパク質をコードする。
(B)DNA結合実験の結果を示すゲル泳動写真である。レーン2, 4, 6, および 8では、完全長またはshort-formタンパク質と結合したDNAの複合体が検出された。レーン3および7では、完全長RISBZ1タンパク質とshort-formタンパク質のヘテロダイマーと結合したDNAの複合体が検出された。
【図９】  トランジェント解析による転写活性化ドメインの同定結果を示す図である。
(A)レポーターおよびエフェクタープラスミドの構造を示す。9コピーのGAL4-DNA結合サイトとCaMV35Sのコアプロモーター配列が連結されたGUS遺伝子をレポーターとして用いた。エフェクタープラスミドはtruncated RISBZ1タンパク質のN末端側にGAL4 DNA結合ドメインが連結されたタンパク質をコードする。
(B)レポーターおよびエフェクタープラスミドを用いた時のGUS活性を示すグラフである。
【図１０】  RISBZ1および変異型RISBZ1タンパク質のN末端領域のハイドロパシーパターンを示す図である。Kyte and Doolittle (Kyte J. and Doolittle R. F. J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982)の計算式で求められたRISBZ1(WT)、および変異型RISBZ1(M1-8)タンパク質のハイドロパシーパターンを示した。正の数値は疎水性であることを表す。
【図１１】  GUS活性を指標としたRISBZ1の転写活性測定系の概略図、ノーザン解析の写真、およびGUS活性測定結果を示す図である。グラフの縦軸は、各転写因子の転写活性の強さの指標であるGUS活性を表す。
【図１２】  転写因子RISBZ1、Opaque2、SPA、およびRISBZ3(RITA1)の認識配列を調べた実験の結果を表す図である。グラフの縦軸は、各転写因子の転写活性の強さの指標であるGUS活性を表す。実験に使用した配列を下段に列記した。
【図１３】  種々の遺伝子由来のGCN4モチーフに対する本発明のRISBZ1の転写活性能を表す図である。グラフの縦軸は、各転写因子の転写活性の強さの指標であるGUS活性を表す。実験に使用したGCN4モチーフの塩基配列を下段に列記した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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