(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光細菌を多糖類、タンパク質、光硬化樹脂、ポリアクリルアミドのいずれかの高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として固定し、試料液を通水した時の発光細菌の発光量の減少から試料液中の毒性物質を検知することを特徴とする毒性物質検知方法。
【請求項２】
発光細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光細菌固定手段と、この発光細菌固定手段に試料液を連続的に導入する試料液導入手段と、発光細菌の発光量を測定する光検出手段と、この測定データを処理し発光量に応じた出力を行なうデータ処理手段とを備え、前記発光細菌固定手段は、発光細菌を高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として固定し、この薄膜状固定化膜を、試料液が連続的に導入されるフローセル内に配設してなるものとすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項３】
請求項２に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセル内に配設してなる薄膜状固定化膜は、微孔性親水性膜と光透過性膜との間に挟持されてなり、前記試料液は前記微孔性親水性膜側に導入されてなるものとすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項４】
請求項３に記載の毒性物質検知装置において、前記微孔性親水性膜はそのポアサイズが０．２〜１．０μｍからなるニトロセルロース製の膜とし、前記光透過性膜は透明軟質塩化ビニル製の膜とすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項に記載の毒性物質検知装置において、前記高分子ゲル化剤は、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、寒天のいずれかの多糖類，コラーゲン、ゼラチンのいずれかのタンパク質，光硬化樹脂，ポリアクリルアミドの内のいずれかとすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項６】
請求項２ないし４のいずれか１項に記載の毒性物質検知装置において、前記高分子ゲル化剤は、その分子量が８万〜１１万からなるアルギン酸ナトリウムとすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項７】
請求項３に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセルは、前記微孔性親水性膜と光透過性膜との間に挟持された薄膜状固定化膜と、この薄膜状固定化膜をそれぞれシール部材を介して保持する上部ケースおよび下部ケースとからなり、前記微孔性親水性膜を上部ケース側に配設し、かつ上部ケースと前記微孔性親水性膜との間の空間に前記試料液を導入してなるものとすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項８】
請求項７に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセルにおける上部ケースと微孔性親水性膜との間の空間に、試料液の導入によって前記微孔性親水性膜表面に付着した汚れを回転または攪拌運動によって除去するための洗浄用ボールを配設してなることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項９】
請求項７または８に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセルにおける下部ケースに、前記薄膜状固定化膜の光透過性膜と対向して光検出器を配設してなることを特徴とする毒性物質検知装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、上下水道の各処理プロセスの処理水や河川水、湖沼水などの環境水または廃棄物埋立処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工場排水などを対象として、水中の毒性物質をモニタリングすることを目的としたバイオセンサを応用した水質の検知方法と検知装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境中には６〜１０万種といわれる人為的に合成された化学物質に加え、非意図的な生成物質であるトリハロメタンなどの消毒副生成物やダイオキシン類などの燃焼副生成物、あるいは環境中での変化体など数多くの化学物質が存在している。上下水処理プロセスの処理水や廃棄物処分場の浸出水などこれらの化学物質に汚染された水を、オゾンや生物、活性炭などによって処理を進めていく過程において、各処理プロセスで水中の毒性が除去されているか監視することが重要となってきている。このような処理プロセス中の毒性は、その評価結果を処理プロセスにフィードバックする必要があり、迅速かつ簡便に毒性を検出することが強く要望されている。
【０００３】
一方、発光細菌は自ら発光する微生物であり、毒性物質に曝されダメージを受けると、発光量が減少するという特徴を持っている。生物のこの発光現象は生物発光と呼ばれ、原生生物、菌類、細菌などの微生物にみられる。
【０００４】
発光細菌における発光反応は、以下のようなサイクルで進行すると考えられている。はじめ(1)の反応において発光基質ルシフェリンに相当する物質であるFMN（フラビンモノヌクレオチド）がフラビン還元酵素によりFMNH2に還元される。このときNADH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は電子供与体として働く。ついで(2)式のようにFMNH2がルシフェラーゼと結合したFMNH2−ルシフェラーゼ複合体が生成し、この複合体が酸素と反応するとフラビン中間体１が生成する。このフラビン中間体１が(3)式のようにR-CHO（直鎖飽和アルデヒド）と反応するとフラビン中間体２が生じ、(4)式のように直鎖飽和アルデヒドがR-COOH（直鎖飽和カルボン酸）に酸化されると同時に、フラビン中間体２が基底状態(フラビン中間体３)に移行するため、このときの遷移エネルギーが光量子として490nmの波長の光が放出される。最後に(5)式のようにフラビン中間体3はFMNとルシフェラーゼに分解し、FMNは再びフラビン還元酵素によりFMNH2に還元される。このようなルシフェラーゼによる発光反応は一般的に(6)式のようにまとめられる。
(1)NADH＋FMN＋H+→NAD+＋FMNH2
(2)FMNH2＋ルシフェラーゼ＋O2→フラビン中間体１
(3)フラビン中間体１＋R-CHO→フラビン中間体２
(4)フラビン中間体２→フラビン中間体３＋R-COOH＋ｈν
(5)フラビン中間体３→FMN＋H2O＋ルシフェラーゼ
(6)FMNH2＋O2＋R-CHO→FMN＋H2O＋R-COOH＋ｈν
こうした発光反応は、発光細菌の呼吸とカップリングして起こり、発光細菌では呼吸によって得られたエネルギーによってATP（アデノシン5'-三リン酸）が生産され、生産されたATPはその加水分解により生じるエネルギーによって生体の高分子の生合成やその他エネルギーが必要な反応に使用される。しかし、発光反応ではエネルギーは光として放出されるだけでATPの生産は行われない。このような過程で発光細菌が何らかの有害物質に曝露されると、生物発光が阻害され発光量が減少する。
【０００５】
発光細菌を用いその発光量の減少から試料中の毒性物質を検知する試験法は、Ｂｕｌｉｃｈ，Ａ．Ａ．により開発され（Ｂｕｌｉｃｈ，Ａ．Ａ．：Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｖｏｌ．１，ｐ５７−７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９８６）参照）、MICROTOXという商品名で装置化されている。この装置に用いられている発光微生物は海洋性発光細菌であるＶｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ（ビブリオ・フィシェリ）である。試料中の毒性物質は、その濃度に比例して発光細菌の発光量を減少させるため、発光量を毒性物質の指標として用いることができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来の毒性物質検知装置においては、発光細菌は使い捨てであるために、測定毎に新たに発光細菌を補充しなければならず、多量の試料液を測定する場合、発光細菌を含む試薬の費用が高くなり経済的ではない。また試料液中への発光細菌試薬の分注、発光量の測定がすべて手動であるため、測定者の熟練を要し、多量の試料液を測定する場合には測定者の負担が大きくなり、測定者のミスが多くなりやすい。そのため、この装置は試料液の連続的な毒性検知には不適当であった。
【０００７】
この発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたもので、この発明の課題は、上記の発光細菌の使い捨てを止め、測定者のミスの防止を図るために、発光細菌を固定化し、測定を自動化することにより、水中の毒性物質を連続的に安定して自動的に測定可能な毒性物質検知方法と装置を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前述の課題を解決するために、この発明の毒性物質検知方法は、発光細菌を多糖類、タンパク質、光硬化樹脂、ポリアクリルアミドのいずれかの高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として固定し、試料液を通水した時の発光細菌の発光量の減少から試料液中の毒性物質を検知することとする（請求項１の発明）。
【００１０】
上記請求項１の発明によれば、発光細菌の発光量を測定することにより、自動で連続的に安定して試料液中の毒性物質を測定できる。
【００１３】
また、装置の性能・寿命上の観点から、下記請求項２の発明が好ましい。即ち、発光細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光細菌固定手段と、この発光細菌固定手段に試料液を連続的に導入する試料液導入手段と、発光細菌の発光量を測定する光検出手段と、この測定データを処理し発光量に応じた出力を行なうデータ処理手段とを備え、前記発光細菌固定手段は、発光細菌を高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として固定し、この薄膜状固定化膜を、試料液が連続的に導入されるフローセル内に配設してなるものとする（請求項２の発明）。
【００１４】
前記請求項２の発明の場合では、薄膜状に固定された発光細菌全体に略均等に酸素や栄養分を浸透させることができるので、発光細菌の発光量の低下を防止し、発光細菌を長期間保持できる。
【００１５】
さらに、前記薄膜状固定化膜の実施態様としては、下記請求項３ないし４の発明が好ましい。即ち、請求項２に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセル内に配設してなる薄膜状固定化膜は、微孔性親水性膜と光透過性膜との間に挟持されてなり、前記試料液は前記微孔性親水性膜側に導入されてなるものとする（請求項３の発明）。また、請求項３に記載の毒性物質検知装置において、前記微孔性親水性膜はそのポアサイズが０．２〜１．０μｍからなるニトロセルロース製の膜とし、前記光透過性膜は透明軟質塩化ビニル製の膜とするものとする（請求項４の発明）。請求項３ないし４の発明については、後に詳述する。
【００１６】
また、前記高分子ゲル化剤の実施態様としては、下記請求項５ないし６の発明が好ましい。即ち、請求項２ないし４のいずれか１項に記載の毒性物質検知装置において、前記高分子ゲル化剤は、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、寒天のいずれかの多糖類，コラーゲン、ゼラチンのいずれかのタンパク質，光硬化樹脂，ポリアクリルアミドの内のいずれかとする（請求項５の発明）。さらに、請求項２ないし４のいずれかに記載の毒性物質検知装置において、前記高分子ゲル化剤は、その分子量が８万〜１１万からなるアルギン酸ナトリウムとする（請求項６の発明）。前記請求項５ないし６の発明についても、後に詳述する。
【００１７】
また、前記フローセルの実施態様としては、下記請求項７ないし９の発明が好ましい。即ち、前記請求項３に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセルは、前記微孔性親水性膜と光透過性膜との間に挟持された薄膜状固定化膜と、この薄膜状固定化膜をそれぞれシール部材を介して保持する上部ケースおよび下部ケースとからなり、前記微孔性親水性膜を上部ケース側に配設し、かつ上部ケースと前記微孔性親水性膜との間の空間に前記試料液を導入してなるものとする（請求項７の発明）。これにより、薄膜状固定化膜を備えたフローセルの構成が簡略化され、かつ測定の安定化を図ることができる。
【００１８】
また、薄膜状固定化膜の前記微孔性親水性膜の表面に付着し、発光細菌の活性を維持するための栄養成分や試料水中に含まれる有機物を基質とする雑菌などに由来する汚れを取り除く観点から、下記請求項８の発明が好ましい。即ち、請求項７に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセルにおける上部ケースと微孔性親水性膜との間の空間に、試料液の導入によって前記微孔性親水性膜表面に付着した汚れを回転または攪拌運動によって除去するための洗浄用ボールを配設してなるものとする。
【００１９】
さらに、前記請求項７または８に記載の毒性物質検知装置において、前記フローセルにおける下部ケースに、前記薄膜状固定化膜の光透過性膜と対向して光検出器を配設してなるものとする（請求項９の発明）。これにより、フローセルと光検出器との組合せ構造がシンプルとなり、また測定精度の向上を図ることができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
図面に基づき、本発明の実施の形態について以下にのべる。
【００２１】
図１は、毒性物質検知装置の参考例を示す模式的構成図で、発光細菌を高分子ゲル化剤でビーズ状小塊に固定し、複数個の前記ビーズ状小塊をカラム中に充填してなる構成図である。
【００２２】
図１において、発光細菌を固定化したビーズ状小塊６ａを円筒形石英ガラス管のようなカラム６ｂに充填し、通水手段のポンプ１４により連続的に試料液をカラム６ｂに通水し、光電子増倍管などの光検出器１３によって固定化発光細菌の発光量を測定し、このデータを処理するコンピュータ１６に伝送する。この処理データから毒性物質の量を検知することができる。この際、微小発光量を測定するために、発光細菌を充填したカラムと光検出器とは、外界から光が入らないように暗箱１５に収められる。この装置のカラムは、例えば円筒形石英ガラス管のような光が透過できる材料を用いて、その内部に固定化発光細菌を充填し保持できる構造を有する。
【００２３】
この毒性物質検知装置を用い、毒性物質注入時の発光強度の時間経過を測定した結果の一例を図９に示す。ここでは毒性物質試料液として２０ｍｇ／Ｌのフェノールを注入した。図９から明らかなように、フェノールを注入すると発光量の低下が認められ、１５分間曝露後の発光量は、初期値から約４０％低下している。次に試料液からフェノールを除去すると発光量が上昇し、発光細菌の発光が毒性物質の除去により復帰していることがわかる。このように前記図１に示した実施例により、固定化発光細菌を用いて連続的に水中の毒性物質を検知することができることが確認された。
【００２４】
次に、発光細菌を高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として固定する実施例について述べる。
【００２５】
まず、発光細菌の薄膜状固定化膜の構成について述べる。図２に薄膜状固定化膜の斜視図、図３に側断面図を示す。図２および３に示すように、薄膜状固定化膜６は、発光細菌１が微孔性親水性膜３と光透過性膜４との間に挟み込まれ、両面テープ２によって前記２つの膜が接着された構造を有し、発光細菌１は、後に詳述する高分子ゲル化剤によって固定されている。試料液および栄養成分や空気中の酸素が微孔性親水性膜３に接触し、薄膜状固定化膜内部の発光細菌へ浸透し供給される。発光細菌１の発光は、光透過性膜２を透過し、図示しない後述する光検出器で捉えられる。
【００２６】
上記薄膜状固定化膜６を構成する各部材の最適化に関して検討した結果について、以下に述べる。まず、微孔性親水性膜３について述べる。親水性を有する微孔性膜は、発光細菌を吸引ろ過しまた固定化後には発光細菌が漏出しないようなポアサイズ０．２〜１．０μｍであることが望ましい。また、試料や栄養成分、酸素などが透過できるような親水性の材料であることが望ましい。このような材料としては、ニトロセルロース、親水性ポリ塩化ビニリデンクロライド、ポリカーボネート等が使用できる。
【００２７】
一般に細菌の捕捉に用いられる膜材料のポアサイズは、０．２μｍ、０．４５μｍ、１．０μｍのものが用いられる。ポアサイズ０．２μｍの膜は、発光細菌を吸引ろ過するときに目詰まりを起こしやすく、菌体を多く固定することが比較的困難であり、また、ポアサイズ１．０μｍの膜は、発光細菌が漏出する恐れがあるので、ポアサイズ０．４５μｍが最適である。
【００２８】
一方、材質面ではポリカーボネート製の膜は破断しやすく扱いにくく、また親水性ポリビニリデンクロライド製の膜はニトロセルロース製の膜よりも約半分の菌体量しかろ過できないため、親水性を有する微孔性膜としては、ニトロセルロースが最適である。
【００２９】
次に、前記光透過性膜２について述べる。光透過性膜としては、ガラスや石英などの無機材料、透明軟質塩化ビニルやポリカーボネートなどの有機材料が使用できる。上記の内、ガラスや石英などの無機材料は、固定化膜の製膜時やセンサ装着時の操作性の面から割れやすい性質を持つので、この観点から有機材料が好ましい。種々の有機材料の中で、透明または半透明の材質とその評価結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
光透過性膜は円形の親水性を有する微孔性膜と両面テープを介して張り合わせるため、光透過性材料を打抜きポンチなどを用い所定のサイズで円形に切断する必要がある。そのため、材質は軟質のものが適している。このことから、表１に示すように、光透過性材料として透明軟質塩化ビニルと低密度ポリエチレンの２種類を選択し、これらの材料のうち発光細菌が放出する波長490nmの光を吸収するかどうかの確認を行った。使用する材質のシートの厚さは標準品で厚さが最も薄い0.1μｍとした。
【００３２】
これらのシートを分光光度計にて吸収波長のスキャンを行った結果、低密度ポリエチレンの490nmでの光の吸収は0.18であったが、透明軟質塩化ビニルでは0.046でありこの波長の光をほとんど吸収しなかった。従って、発光細菌固定化膜に用いる光透過性材料としては、透明軟質塩化ビニルが好適である。
【００３３】
次に、前記高分子ゲル化剤について述べる。前述のように、薄膜状固定化膜またはビーズ状小塊において、発光細菌の流動を防ぐために高分子ゲル化剤で発光細菌をゲル化し固定する。ゲル化材料としては、アルギン酸ナトリウムの他に多糖類のカラギーナン、寒天や、タンパク質のコラーゲン、ゼラチンなどが使用でき、また、高分子材料の光硬化樹脂やポリアクリルアミドなども使用できる。
【００３４】
上記の内、アルギン酸ナトリウムは、塩化カルシウム溶液を添加するのみでゲル化し、他のゲル化剤のように加熱や紫外線照射などの操作が不要であるため、ゲル化材料として好適である。しかし、アルギン酸ナトリウムゲルの硬さが硬すぎると菌体は保持できるが酸素や栄養分の透過性が悪くなり、逆に柔らかすぎると透過性はよくなるが菌体を保持できないことが考えられる。
【００３５】
そこでアルギン酸ナトリウムの分子量(重合度)に関して、下記のような種々のアルギン酸ナトリウムについて評価を行なった。その結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
アルギン酸ナトリウムは君津化学工業製を用いた。アルギン酸ナトリウム溶液の粘度は分子量(重合度)に応じて増大しゲルの硬さも増大する。アルギン酸ナトリウムをピペットで吸い上げるなどの操作には粘度の小さいものが適している。分子量(重合度)の異なるアルギン酸ナトリウムを用いて発光細菌をビーズ状に固定化し、ロータリーシェイカーで振とうしてゲルが崩れないか否かの確認を行った。培養した発光細菌を遠心分離し、得られた菌体ペレットを各アルギン酸ナトリウムの１％溶液に懸濁した。この発光細菌／アルギン酸懸濁液を２％塩化カルシウム溶液に滴下し発光細菌固定化ビーズを作成した。得られたビーズを６穴のポリスチレン製マイクロプレートにいれ、培地を添加し２日間振とうした。
【００３８】
この結果、No.2およびNo.3,No.4ではビーズの形状が保持されていたが、No.1ではビーズが崩壊した。No.1は検討したアルギン酸ナトリウムの中で最も粘度が低くゲルが柔らかいため崩壊したと考えられる。表２の結果から、発光細菌の流動を防ぐアルギン酸ナトリウムは１％の粘度が３２０cP以上であり、分子量が約８万〜11万のものが適していることがわかった。
【００３９】
発光細菌を固定化したビーズの発光量を冷却型CCDカメラ(LAS-1000,富士フィルム社製)を用い、露出時間10秒で観察したところNo.3が最も発光量が高く、ビーズ内の発光細菌への物質の透過性が良好であると考えられる。他のアルギン酸ナトリウムではNo.3の約40から60％の発光量であった。上記により、発光細菌を固定化するアルギン酸ナトリウムとして１％溶液の粘度が500〜600cPで分子量約１０万のものが最適である。
【００４０】
これらの検討結果を総合すると、本発明の発光細菌の薄膜状固定化膜においては、発光細菌を固定する親水性を有する微孔性膜としては、ポアサイズが０．４５μｍのニトロセルロース製の膜、光透過性膜としては、透明塩化ビニル製のシート、発光細菌の流動を防ぐ高分子ゲル化剤としては、１％溶液の粘度が500〜600cPであり分子量約１０万のアルギン酸ナトリウムが最適である。
【００４１】
次に、上記薄膜状固定化膜の作成方法について述べる。図４は、薄膜状固定化膜の作成工程の一例を示す。まず、図４（ａ）に示すように、両面テープ２の片面に発光細菌ろ過用の微孔性親水性膜３をあらかじめ接着し、微孔性親水性膜側から吸引しながら発光細菌１の培養液を滴下し発光細菌１をろ過する。
【００４２】
続いて、図４（ｂ）に示すように、ろ過した発光細菌上に発光細菌の流動を防ぐため、高分子ゲル化剤としてのアルギン酸ナトリウム溶液５を滴下する。なお、ゲル化材料としては、前述のように、アルギン酸ナトリウムのほかに多糖類のカラギーナン、寒天など、またタンパク質のコラーゲン、ゼラチンなど、さらに、高分子材料の光硬化樹脂やポリアクリルアミドなども使用できる。
【００４３】
続いて、図４（ｃ）に示すように、両面テープ２上に光透過性膜４を張り合わせ、アルギン酸ナトリウムをゲル化するため、塩化カルシウム溶液に浸漬する。
【００４４】
上記により作成した発光細菌の固定化膜を、高感度CCDカメラで撮影した画像を図８に示す。発光細菌の固定化膜をルミノイメージアナライザー（富士フィルム製）で撮影したところ、発光細菌による発光が観察できた。
【００４５】
次に、上記薄膜状固定化膜を用いたフローセルの構成や毒性物質検知装置の構成について述べる。図５は、フローセルの構成の一例を示す側断面図である。図５に示すフローセル１２は、フローセルの下部ケース１１に、ガスケット９、固定化膜支持用のガラス板８、薄膜状固定化膜６を順に積層し、薄膜状固定化膜６の上部から、Ｏリング７を介して、上部ケース１０を押圧して締め付け一体化したものとして構成される。試料および栄養成分は、空気とともに、上部ケース１０の図示下方１０ａから注入され、上方１０ｂから排出される。
【００４６】
次に、上記フローセル１２を用いた毒性物質検知装置の模式的構成の一例を図６に示す。図６において、試料液はポンプ１４により発光細菌の活性を維持するための栄養成分とともに下方から上方に向かって通水される。また、このとき発光細菌が消費する酸素量が律速になり発光量が低下しないようにするため、エアポンプによりエアが送られる。発光細菌による発光量は、光電子増倍管などの光検出器１３によって検出し、電圧値として出力され、コンピュータ１６により記録される。また、フローセル１２および光検出器１３は外界から光が入らないように暗箱１５に収める。
【００４７】
次に、フローセルの上記図５とは異なる実施例について、図７により説明する。図７は、図５に対応する側断面図を示す。図７に示すフローセル１２は、薄膜状固定化膜６を固定化膜支持用のガラス板８の上部に配置し、上下２個のＯリング７で挟み込み、また上部ケース１０および下部ケース１１により挟み込むことにより、入口１０ａ，出口１０ｂのシールされた試料液の流路を形成する。このとき、図５と同様に、薄膜状固定化膜６の微孔性親水性膜側は前記流路側に面し、発光細菌へ試料液、栄養成分、酸素が浸透し供給される。光透過性膜側はガラス板側に面する。発光細菌固定化膜からの発光細菌による発光量は、光電子増倍管などの下部ケース１１に挿入された光検出器１３によって検出され、電圧値として出力される。
【００４８】
また、図７に示すフローセル１２は、前記上部ケースと微孔性親水性膜との間の流路空間に、試料液の導入によって前記微孔性親水性膜表面に付着した汚れを回転または攪拌運動によって除去するための洗浄用ボール２０が複数個設けられる。連続的に測定を行っていると、前述のように、発光細菌の活性を維持するための栄養成分や試料水中に含まれる有機物を基質とする雑菌などに由来する汚れが薄膜状固定化膜６の微孔性親水性膜の表面に付着し、発光細菌に供給されるべき栄養成分や酸素が雑菌によって消費されるため、発光量が減少する。
【００４９】
この汚れを取り除き長時間安定に有害物質の検知を可能にするため、フローセル内部に直径約３ｍｍの洗浄用ボール２０を配設した。この洗浄用ボール２０はフローセル内でエアポンプによるエアリフトと自重による沈降を繰り返し、洗浄用ボールの回転運動または撹拌運動により、微孔性親水性膜の表面に付着した汚れを掻きだし、１０ｂから排出する機能を有する。
【００５０】
次に、前記の毒性物質検知装置を用い、毒性物質注入時の発光強度の時間経過を測定した結果について述べる。先に、図９に基づき、参考例としての図１のビーズ状小塊をカラムに充填した装置を用いた測定結果について述べた。図１０は、図９に示した発光強度の出力（Intensity）を、相対値の変化に変換した結果を示す。フェノール暴露直前の出力を１００％として示すが、前述のように、フェノール暴露１５分間後に、相対出力は、約４０％低下している。
【００５１】
図１１は、薄膜状固定化膜を備えるフローセルを用いて発光強度の時間経過を測定した結果の一例を示す。経過時間のスケールは図１０とは異なるものの、図１０と同様に、発光強度の相対出力（％）の変化で示す。発光細菌の薄膜状固定化膜をセンサ部に取り付け、発光量が安定化したところで、最終暴露濃度が20mg/Lになるようにフェノール溶液を30分間注入したところ、図１０と同様に、電圧値が低下し発光量の低下が認められた。また、フェノール溶液を除去すると、出力が上昇し発光量が復帰し、繰り返し測定が可能であることが確認された。
【００５２】
次に、洗浄用ボールによる発光量維持の効果に関する検証実験を行なった結果を、図１２に示す。図１２においては、発光強度の出力は電圧値（Ｖ）で示し、また、横軸は、経過時間を時間（ｈ）で示す。図１２において、出力履歴Ａは洗浄用ボール有りのデータ、Ｂは洗浄用ボールなしのデータを示す。出力履歴のモードに関して、主に、出力履歴Ａをベースに以下に述べる。
【００５３】
まず、薄膜状固定化膜をフローセルに取り付け、発光細菌の活性維持に必要な栄養成分を含む溶液を連続的に通水すると、発光量が上昇する。その理由は、固定化された発光細菌の活性が上昇し、増殖をはじめるためと考えられる。その後、発光量が低下するが、その理由は、固定化膜中の発光細菌の個数が増えすぎたため、栄養分や酸素が不足し、発光細菌の活性の低下や死滅が起こるためと考えられる。
【００５４】
洗浄用ボールを用いたＡの場合、所定経過時間後は、発光量の変化が少なくなり、出力の準安定化状態が得られる。これは固定化膜中の発光細菌の増殖と死滅のバランスが保たれた状態が得られたためと考えられる。洗浄用ボールを用いないＢの場合には、発光量が低下したままで、準安定化状態は得られない。
【００５５】
上記のように、洗浄用ボールを用いた場合、発光量が洗浄用ボールを用いないものに比べて、少なくとも４倍以上の期間、固定化膜からの発光量を維持することができ、汚れの影響を受けずに、長期間安定に有害物質の検知が可能であることが判明した。
【００５６】
【発明の効果】
上記のとおり、この発明によれば、発光細菌を多糖類またはタンパク質などの高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として固定し、試料液を通水した時の発光細菌の発光量の減少から試料液中の毒性物質を検知することとし、また、上記検知方法を実施するための装置としては、発光細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光細菌固定手段と、この発光細菌固定手段に試料液を連続的に導入する試料液導入手段と、発光細菌の発光量を測定する光検出手段と、この測定データを処理し発光量に応じた出力を行なうデータ処理手段とを備え、前記発光細菌固定手段は、発光細菌を高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として固定し、この薄膜状固定化膜を、試料液が連続的に導入されるフローセル内に配設してなるものとしたので、発光細菌の使い捨てや測定者のミス等の従来の問題を解消し、水中の毒性物質を連続的にかつ安定して自動測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  毒性物質検知装置の参考例を示す模式的構成図
【図２】  本発明に関わる薄膜状固定化膜の斜視図
【図３】  図２の薄膜状固定化膜の側断面図
【図４】  本発明に関わる薄膜状固定化膜の作成工程の一例を示す図
【図５】  本発明に関わるフローセルの構成の一例を示す側断面図
【図６】  図５のフローセルを用いた毒性物質検知装置の模式的構成の一例を示す図
【図７】  図５とは異なるフローセルの構成の一例を示す側断面図
【図８】  薄膜状固定化膜における発光細菌による発光の一例の撮像図
【図９】  図１の装置により毒性物質注入時の発光強度の時間経過を測定した結果の一例を示す図
【図１０】  図９の測定結果の発光強度を相対出力で示す図
【図１１】  図５の装置により毒性物質注入時の発光強度の時間経過を測定した結果の一例を示す図
【図１２】  洗浄用ボールによる発光量維持の効果に関する検証結果を示す図
【符号の説明】
１：発光細菌、２：両面テープ、３：微孔性親水性膜、４：光透過性膜、６：薄膜状固定化膜、６ａ：ビーズ状小塊、６ｂ：カラム、７：Ｏリング、８：ガラス板、９：ガスケット、１０：上部ケース、１１：下部ケース、１２：フローセル、２０：洗浄用ボール。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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