(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的有効量の下記一般式（１）で示されるカルボスチリル誘導体：
【化１】
0004045376.tif 000007
［式中、Ｒは、フェニル環上に置換基として低級アルコキシ基を有していても良いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３位および４位の炭素−炭素結合は、単結合または二重結合である］またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする心筋梗塞を有する患者における心筋梗塞サイズ減少剤。
【請求項２】
前記カルボスチリル誘導体が、３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたはその薬学的に許容される塩である請求項１に記載の心筋梗塞サイズ減少剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、虚血性心疾患を患っている被験者における梗塞のサイズを減少させる医薬に関し、該医薬は、活性成分としてカルボスチリル誘導体を使用する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｉ．カルボスチリル類
下記一般式（１）で示されるカルボスチリル誘導体：
【０００３】
【化２】
0004045376.tif 000002
【０００４】
［式中、Ｒは、必要に応じてフェニル環上に置換基として低級アルコキシ基を有していても良いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３位および４位の炭素−炭素結合は、単結合または二重結合である］およびその塩は、当分野で周知である（米国特許第4,415,572号は、その全体が本明細書中に参考として援用されている）。
【０００５】
これらのカルボスチリル類は、モデル系において、心拍数または心筋酸素消費に殆ど影響を及ぼすことなく心筋収縮性を増強する経口的変力剤であり（フェルドマン(Feldman)ら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N. Engl. J. Med.、329: 149-155 (1993))、うっ血性心不全の患者の治療に有用である（米国特許第4,415,572号；およびホリ(Hori)ら、ジャパニーズ・サーキュレーション・ジャーナル(Jpn. Circ. J.)、50:659-666 (1986)）ことが見い出されている。
【０００６】
幾つかの研究は、上記カルボスチリル類が、うっ血性心不全患者において血行力学指数および運動能力を改善することを実証している（イノウエ(Inoue)ら、ハート・ベッセルズ(Heart Vessels)、2: 166-171 (1986)；ササヤマ(Sasayama)ら、ハート・ベッセルズ(Heart Vessels)、2: 23-28 (1986)；およびフェルドマン(Feldman)ら、Am. Heart J.、116: 771-777 (1988)）。
【０００７】
さらに、日本および米国の両国におけるマルチセンター・ランダム化プラシーボ統制試験(multi-center randomized placebo-controlled trials)は、これらのカルボスチリル類が、うっ血性心不全の患者における生活の質を改善し、死のリスクを減少させたことを実証している（OPC-8212マルチセンター・リサーチ・グループ、Cardiovasc. Drugs Ther.、4: 419-425 (1990)；フェルドマン(Feldman)ら、Am. J. Cardiol.、68: 1203-1210 (1991)；およびフェルドマン(Feldman)ら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N. Engl. J. Med.、329: 149-155 (1993)）。
【０００８】
これらカルボスチリル類の変力特性に関連する作用のメカニズムは、カリウム電流の減少（イイジマ(Iijima)ら、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・テラピューティックス(J. Pharmacol. Exp. Ther.、240: 657-662 (1987))）、ホスホジエステラーゼの穏やかな阻害、および内向きのカルシウム電流(inward calcium current)の増加（ヤタニ(Yatani)ら、J. Cardiovasc. Pharmacol.、13: 812-819 (1989)；およびタイラ(Taira)ら、アルツナイミッテルフォルシュング(Arzneimittelforschung)、34: 347-355 (1984)）を含む。
【０００９】
しかしながら、死亡率を減少させるのに最も有効であるカルボスチリル類の投与量（１日に60mg）は、血行力学効果を全くか殆ど示さなかったので、この薬剤は、その陽性変力作用(positive inotropic effect)よりも他のメカニズムを介して死亡率を減少するかもしれないことを意味する（フェルドマン(Feldman)ら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N. Engl. J. Med.、329: 149-155 (1993)；およびパッカー(Packer)、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N. Engl. J. Med.、329: 201-202 (1993)）。
【００１０】
上記カルボスチリル類は、リポ多糖で刺激した末梢血単核細胞(PBMC)によるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含む種々のサイトカインの産生を、用量依存的に阻害することも公知である（マルヤマ(Maruyama)ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commu.、195: 1264-1271 (1993))；およびマツモリ(Matsumori)ら、Circul.、89: 955-958 (1994)）。
【００１１】
さらに、それらは、ＣＦＵ−Ｃの減少に関連する可逆的好中球減少症を誘発できる（フェルドマン(Feldman)ら、Am. Heart J. 、116: 771-777 (1988)；OPC-8212マルチセンター・リサーチ・グループ、Cardiovasc. Drugs、Ther.、4: 419-425 (1990)；フェルドマン(Feldman)ら、Am. J. Cardiol.、68: 1203-1210 (1991)；およびフェルドマン(Feldman)ら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N. Engl. J. Med.、329: 149-155 (1993)）。
【００１２】
加えて、上記カルボスチリル類は、アポトーシス（プログラムされた細胞死）の制御、並びに癌の治療、腫瘍転移の阻害およびＲＮＡウイルス複製の阻害に有用であることが見い出されている（１９９３年４月３０日に出願された米国特許出願第 07/989, 028号、該出願はヨーロッパ特許公開0552373に対応し、それぞれがその全体として本明細書中に参考として援用されている；ナカイ(Nakai)ら、Jpn. J. Cancer Res.、アブストラクト、およびProc. Jpn. Cancer Assoc.、581ページ (1993)；およびマルヤマ(Maruyama)ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commu.、195: 1264-1271 (1993)）。
【００１３】
上記カルボスチリル類は、ＤＮＡウイルス複製の阻害にも有用であり、抗ＲＮＡウイルス化合物とともに使用されるときＲＮＡウイルス複製の阻害に相乗効果を示す（米国特許出願第 08/283,707号、１９９４年８月１日；および１９９５年７月２８日に出願されたPCT/US95/09141）。
【００１４】
さらに、上記カルボスチリル類は、哺乳動物細胞において、ヌクレオシドおよびヌクレオベース(nucleobase)輸送、例えば、アデノシンを用量依存的に阻害するのに有用であり、またヌクレオシド・アナローグとくにＡＺＴのリン酸化を増強するのに有用であることが見い出されている（米国特許出願No. 08/283,707、１９９４年８月１日；および１９９５年７月２８日に出願されたPCT/US95/09141）。他方、別のヌクレオシド輸送阻害剤であるジピリダモール(dipyridamole)は高濃度（治療的範囲外）でのみ（10-100 μM）アデノシン輸送を阻害する（ショルティセック(Scholtissek)ら、Biochem. Biophys. Acta、158: 435-447 (1968)；およびプレイグマン(Plagemann)ら、J. Membr. Biol.、81: 255-262 (1984)）。
【００１５】
ジピリダモールは、細胞内へのアデノシン輸送の阻害により、アデノシン存在部位に限局化されたアデノシン濃度の増加(localized increase)を引起こすと提案されている（プレイグマン(Plagemann)ら、Biochem. Biophys. Acta、947: 405-443 (1988)）。アデノシンは、アデニル酸シクラーゼの活性化により或いはホスホジエステラーゼの阻害により、心筋細胞中のｃＡＭＰの増加（フォックス(Fox)ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Ann. Rev. Biochem.)、47: 655-686 (1978)；およびタケヤマ(Takeyama)ら、Drug Res.、34: 364-370 (1984)）、細胞表面膜上の特異的なアデノシン・レセプターへのその結合により、冠状動脈の拡張（フォックス(Fox)ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Ann. Rev. Biochem.)、47: 655-686 (1978)）、脳血流量の増加（ハイスタッド(Heistad)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー(Am. J. Physiol.))、240: 775-780 (1981)）、ＴＮＦ−α産生の減少（パーメリー(Parmely)ら、ジャーナル・オブ・イミュノロジー(J. Immunol.)、151: 389-396 (1993)）、および血小板凝集の減少（ダウィッキ(Dawicki)ら、バイオケミカル・ファーマコロジー(Biochem. Pharmacol.)、34: 3965-3972 (1985)）を誘発することが知られている。
【００１６】
カルボスチリル類によって引起こされるアデノシン輸送の阻害は、それらの作用の他の新しい側面とのリンクをもたらすと信じられている。即ち、上記カルボスチリル類は、アデノシン輸送を阻害することによりアデノシンの血中濃度を増加させ、こうして、うっ血性心疾患における（フェルドマン(Feldman)ら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N. Engl. J. Med.、329: 149-155 (1993)；およびパッカー(Packer)、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N. Engl. J. Med.、329: 201-202 (1993)）、或いはＴＮＦ−α産生の減少における（マルヤマ(Maruyama)ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commu.、195: 1264-1271 (1993)；およびマツモリら、Circul.、89: 955-958 (1994)）、ベスナリノンの治療的利点のいくつかを説明するかもしれない。
【００１７】
II．虚血性心疾患
心室の機能障害は、慢性心不全および虚血性心疾患の患者で起こるが、これら２つの心疾患の病態生理学は全く異なる。即ち、慢性心不全では、筋フィラメントのＣａ2+に対する反応性は、交感神経調節の機能障害、並びにレニン−アンギオテンシンシステムおよびサイトカインシステムの機能障害により、低下する。他方、虚血性心疾患では、細胞の嫌気的代謝が、可逆的および非可逆的な細胞障害を生み出し、心室の機能障害をもたらす。嫌気的心筋代謝は、主として、冠血流量調節障害に起因する。
【００１８】
カルボスチリル類は、虚血領域の冠血流量を増加させることが見い出され、それは、大動脈血圧の増大および冠状動脈拡張作用によると仮定される（マルヤマ(Maruyama)ら、J. Cardiovasc. Pharmacol.、8: 161-169 (1986)）。しかしながら、大動脈血圧の増大は、冠血流量の増加を引き起こし得、酸素要求量の増大を引き起こすかもしれない。これは、冠状血管拡張の有利な効果を鈍らせるかもしれない。
【００１９】
しかしながら、カルボスチリル類はまた、心拍数または収縮期血圧に変化を生じることなく運動誘発性虚血の改善を生み出し、虚血の進行をブロックすることが見い出されている（キノシタ(Kinoshita)ら、Respir. Circ.、36: 1199-1203 (1988)）。心筋虚血の範囲は血流依存性であるので、冠血流量の増加は心筋虚血の減弱化を意味するかもしれないが、梗塞のサイズは冠状血管拡張能力によっては決定されない。これは、心筋虚血の間、冠状動脈が完全に閉塞するからである。心筋梗塞の進行は、ＡＴＰ枯渇(ATP depletion)の速度と虚血の際の側副流の程度により、また血小板と好中球の活性化、Ｃａ2+とカテコラミンの過負荷、および酸素により誘導されたフリーラジカル産生による。従って、冠状血管拡張による心筋虚血の減弱化は、必ずしも梗塞サイズの限定を意味しない。
【００２０】
カルボスチリル類はまた、冠状動脈疾患を有する患者において、運動中のＳＴ低下(ST depression)を改善することが示されている（キノシタ(Kinoshita)ら、上記文献）。心電図のＳＴ−Ｔレベルは、Ｃａ2+、Ｋ+、Ｈ+およびＮａ+の細胞内および細胞外バランス、心臓自体の回旋運動(rotation of heart)、心室壁運動、および虚血の存在により変化する（ノーブル(Noble)ら、Cardiovasc. Res.、12: 13-17 (1978)）。従って、カルボスチリル類が心筋虚血を改善できるという示唆は、そこには全くない。カルボスチリル類によって引起こされる冠状血管拡張により虚血領域の心筋機能が改善されるとしても、虚血の減弱化が梗塞サイズの減少を示すわけではない。これは、心筋壊死が複数の冠血流量非依存性の病因(multiple coronary blood flow-independent pathogenesis)によるためである。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、虚血性心疾患を有する患者において心筋梗塞サイズを減少させる方法を提供することである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明では、カルボスチリル類が、心筋虚血を減弱化し、心筋梗塞サイズを減少することが、思いがけなくも発見された。これは驚くべきことである。なぜなら、カルボスチリル類は、陽性変力剤(positive inotropic agent)として分類されており、陽性変力剤は虚血性障害を拡大することが知られているからである（ブレイクロック(Blaiklogk)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー・カーディオロジー(J. Mol. Cell. Cardiol.)、10: 499-509 (1987)）。
【００２３】
本発明の上記目的は、下記の発明の詳細な説明より明らかになるが、以下の一般式（１）で示されるカルボスチリル誘導体：
【００２４】
【化３】
0004045376.tif 000003
【００２５】
［式中、Ｒは、フェニル環上に置換基として低級アルコキシ基を有していても良いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３位および４位の炭素−炭素結合は、単結合または二重結合である］、およびその塩を使用することによって達成される。
【００２６】
【発明の実施の形態】
一般式（１）において、フェニル環上に置換基として低級アルコシキ基を有していても良いベンゾイル基は、フェニル環を置換する１〜３個の直鎖状または分岐状Ｃ1-6アルコキシ基を有していても良いベンゾイル基、例えば、ベンゾイル、２−メトキシベンゾイル、３−メトキシベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、２−エトキシベンゾイル、３−エトキシベンゾイル、４−エトキシベンゾイル、４−イソブトキシベンゾイル、４−ヘキシルオキシベンゾイル、３，４−ジメトキシベンゾイル、３，４−ジエトキシベンゾイル、３，４，５−トリメトキシベンゾイル、２，５−ジメトキシベンゾイル、などを含む。
【００２７】
本発明の活性成分化合物（１）のうちでも、３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリン、即ち、ベスナリノン(vesnarinone)が最も好ましい。
【００２８】
上記のカルボスチリル類は、慣用されている酸と容易に塩を形成する。そのような酸として、無機酸、例えば、硫酸、硝酸、塩酸および臭化水素酸；および有機酸、例えば、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、エタンスルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸および安息香酸が挙げられる。これらの塩も、本発明において、一般式（１）で示される遊離の化合物と同じように活性成分として使用できる。
【００２９】
一般式（１）の化合物およびその塩は、一般に、それ自体慣用されている薬学的製剤に剤型化できる。そのような製剤は、慣用されている充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調製される。これらの薬学的製剤は、治療の目的に応じて選択される種々の投与形態を有することができ、それらの代表例は、錠剤、丸剤、粉末剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（溶液、懸濁液など）、および眼用溶液である。
【００３０】
錠剤の製造のために、この分野でこれまでに周知の広範囲の担体が使用できる。従って、例えば、ビヒクルまたは賦形剤、例えば、ラクトース、スクロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロースおよびケイ酸；結合剤、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、シェラック、メチルセルロース、リン酸カルシウムおよびポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末(powdered laminaran)、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプンおよびラクトース；崩壊阻害剤、例えば、スクロース、ステアリン、カカオ脂および硬化油；吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム；湿潤剤または保湿剤、例えば、グリセロールおよびデンプン；吸着剤、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイダルシリカ；および滑沢剤、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末およびポリエチレングリコールが使用できる。必要ならば、錠剤は、さらに慣用されているコーティングを施して、例えば、糖衣錠、ゼラチンコーティング錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、または二層錠もしくは多層錠としても良い。
【００３１】
丸剤の製造のために、この分野で周知の広範囲の担体が使用できる。その例は、ビヒクルまたは賦形剤、例えば、グルコース、ラクトース、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリンおよびタルク；結合剤、例えば、アラビアゴム末、トラガカントガム末、ゼラチンおよびエタノール；および崩壊剤、例えば、ラミナランおよびカンテンである。
【００３２】
坐剤の製造のために、広範囲の公知の担体が使用できる。例として、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール類、高級アルコールエステル類、ゼラチンおよび半合成グリセリド類が挙げられる。
【００３３】
注射剤を調製する際には、溶液または懸濁液は好ましくは滅菌され、好ましくは血液と等張であり、また、そのような投与形態を調製するために、当分野で慣用されている全ての希釈剤を使用できる。従って、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシル化(polyoxylated)イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。この場合、薬学的製剤は、塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセロールを、等張溶液を与えるのに十分な量で含んでいても良い。慣用されている溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤または局所麻酔剤などを加えることが可能である。
【００３４】
さらに、必要ならば、薬学的製剤は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料など、並びに他の薬剤を含んでいても良い。
【００３５】
本発明で使用されるこれらの薬学的製剤中の活性成分化合物の割合は、限定されず、広い範囲から適当に選択すれば良い。しかしながら、一般に、その割合は、約１．０〜約７０重量％、好ましくは約１．０〜約３０重量％の範囲内から選択することが推奨される。
【００３６】
本発明の薬学的製剤の投与経路も限定されず、投与形態、患者の年齢、性別および他の要因、並びに治療されるべき疾患の重篤度により選択される。従って、例えば、それらが錠剤、丸剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤またはカプセル剤の形態で提供されるとき、製剤は経口的に投与される。注射可能な溶液剤は、単独で又はグルコース、アミノ酸などを含有する非経口的注入のための慣用されている液体と混合して、静脈内に投与される。必要ならば、これらの溶液剤は、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内経路により投与されても良い。坐剤は、直腸に投与され、眼用溶液は点眼ローションである。
【００３７】
上記の薬学的製剤の投与量は、投与方法、患者の年齢、性別および他の背景要因、疾患の重篤度などに依存するが、一般に、１日当り体重１キログラム当り、化合物（１）を活性成分として約０．５〜３０ｍｇ投与することが推奨される。各投与単位に含まれるべき活性成分の量は、約１０〜１０００ｍｇである。
【００３８】
【実施例】
投与形態例１
３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリン                                  １５０ｇ
アビセル(Avicel)  （商標、旭化成工業株式会社）                    ４０ｇ
コーンスターチ                                                    ３０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                                            ２ｇ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース                                １０ｇ
ポリエチレングリコール６０００                                      ３ｇ
ヒマシ油                                                          ４０ｇ
メタノール                                                        ４０ｇ
上記活性成分、アビセル、コーンスターチおよびステアリン酸マグネシウムを混合し、共にすりつぶし、得られる混合物を糖衣錠用Ｒ１０ｍｍパンチ(dragee R10 punch)で圧縮成型する。このようにして得られる錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール６０００、ヒマシ油およびメタノールからなるフィルムコーティング組成物でコートして、フィルムコーティング錠とする。
【００３９】
投与形態例２
３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリン                                  １５０ｇ
クエン酸                                                            １ｇ
ラクトース                                                    ３３．５ｇ
リン酸二カルシウム                                                ７０ｇ
プルロニック  Ｆ−６８(Pluronic F-68)                             ３０ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム                                            １５ｇ
ポリビニルピロリドン                                              １５ｇ
ポリエチレングリコール（カルボワックス１５００(Carbowax 1500)） ４．５ｇ
ポリエチレングリコール（カルボワックス６０００(Carbowax 6000)）   ４５ｇ
コーンスターチ                                                    ３０ｇ
乾燥ラウリル硫酸ナトリウム                                          ３ｇ
乾燥ステアリン酸マグネシウム                                        ３ｇ
エタノール                                                          適量
上記の活性成分、クエン酸、ラクトース、リン酸二カルシウム、プルロニック F-68およびラウリル硫酸ナトリウムを混合する。
【００４０】
No. 60スクリーンを用いてサイズ選択した後、混合物を、ポリビニルピロリドン、カルボワックス１５００およびカルボワツクス６０００を含むアルコール溶液を使用する湿式法によって造粒化する。必要ならば、アルコールを添加して、粉末をペースト様の塊にする。次に、コーンスターチを加えて、均一な顆粒が形成されるまで混合を続ける。続いて、混合物を、No.10スクリーンに通して、トレイに入れ、１００℃に維持したオーブン中で１２〜１４時間乾燥する。乾燥された顆粒を、No.16スクリーンで篩いにかけ、次に、乾燥ラウリル硫酸ナトリウムと乾燥ステアリン酸マグネシウムを加え、混合した後、混合物を錠剤機を用いて所望のサイズと形状に圧縮する。
【００４１】
上述のコアを、ニス剤で処理し、水分吸収を防ぐためにタルクを振りかけ、こうしてコート下層を作る。ニス剤コーティングは、内服使用(internal use)に十分な回数だけ繰り返す。錠剤は、さらなるアンダーコート層と平滑なコーティングを施こして、完全に丸く滑らかにする。着色コーティングは、所望の着色が得られるまで行なう。乾燥の後、コートされた錠剤を磨いて、均一に磨かれた錠剤とする。
【００４２】
下記の実施例は、例示のみを目的として示すもので、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００４３】
実施例１
血中アデノシン濃度に対するベスナリノンの効果
体重１５〜２０ｋｇのモングレル(Mongrel)犬を、ペントバルビタール・ナトリウム３０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与して麻酔した。続いて、それらの気管を送管し、酸素を混合した室内空気で換気した。次に、それらの胸部を、左第５肋間隙で開胸し、それらの心臓を心膜クレイドル(pericardial cradle)中で吊した。各動物の左前下行枝冠状動脈（left anterior descending coronary artery; ＬＡＤ）にカニューレ挿管し、体外バイパス・チューブにより左頸動脈を介して血液を灌流させた。
【００４４】
冠灌流圧（ＣＰＰ）を、冠状動脈カニューレの先端でモニターした。
【００４５】
灌流された領域の冠状動脈血流量（ＣＢＦ）を、バイパス・チューブに取付けた電磁流量プローブで測定した。
【００４６】
小さく短い採集用チューブ（直径１．０ｍｍおよび長さ７．０ｃｍ）を、灌流領域の中心付近の小冠状静脈に挿入して冠静脈血(coronary blood)を採取した。排出された冠静脈血を、左心房のレベルに置かれた貯槽に集め、頸静脈に戻した。
【００４７】
血中乳酸(lactate)濃度を、酵素アッセイ（バーグメイヤー(Bergmeyer)、メソッズ・オブ・エンザイマティック・アナリシス(Methods of Enzymatic Analysis)、アカデミック・プレス(Academic Press)、ニューヨーク (1963)、266〜270ページ）で測定し、乳酸濃度の冠動静脈較差(coronary arteriovenous difference)に１００を乗じ、動脈乳酸濃度で除して算出される乳酸抽出比を計算した。
【００４８】
犬の状態をモニターするために、それらの血圧をＡＰ−６４１Ｇ血圧増幅器（日本光電）を用いて測定し、それらの全身血(systemic blood)をＡＢＬ３００ガス・アナライザー（ラジオメーター(Radiometer)、コペンハーゲン）を用いて、ｐＨおよびＰＯ2を含む血液ガス分析を行った。
【００４９】
灌流チューブの量的狭窄を生み出す閉塞物を使用して、冠血流量を対照時の３３％と６０％に減少させる狭窄程度を決定した。この手順の後、この閉塞物を取付けると、安定な低灌流(hypoperfusion)が１０分間生じ、冠状動脈クランプの開始２０分後に全ての変数の測定を行った。
【００５０】
上記測定の後、ベスナリノンのビヒクル（１．０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）をＬＡＤ内に５分間注入し、上記の血行力学および代謝に関するパラメーターの全てを測定した。即ち、注入ポンプを用いて、ベスナリノン０．５４ｍｇ／ｍｌを注入速度０．２〜０．５ｍｌ／分でＬＡＤに注入し、１５μｇ／ｍｌを達成した。上記の血行力学および代謝パラメーターの全てを、注入から５分後および１０分後に再度測定した。
【００５１】
赤血球によるアデノシン取込みとアデノシン分解の両方をブロックするために０．０２％（ｗ／ｖ）ジピリダモール０．５ｍｌおよび、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ中２’−デオキシコフォルマイシン(2'-deoxycoformycin)０．１ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌを含むシリンジに、血液１．０ｍｌを取り出して、アデノシンの血中濃度を測定した。遠心分離（３０００×ｇ）の後、上清を集め、そのアデノシン濃度をラジオイムノアッセイで測定した。
具体的には、血漿１００μｌ中のアデノシンを、無水コハク酸４０ｍｇおよびトリエチルアミン０．４ｍｇを含むジオキサン１００μｌでスクシニル化した。４℃で２０分間インキュベーションした後、混合物を、希釈した抗−アデノシン血清（ヤマサ醤油、千葉、日本）１００μｌおよび０．５ｐｍｏｌのアデノシン２’，３’−Ｏ−ジスクシニル−３［125Ｉ］ヨードチロシンメチルエステル１００μｌで希釈した。混合物を、冷水浴（４℃）中に１８時間維持し、第二抗体溶液（ヒツジ抗ウサギＩｇＧ）（ヤマサ醤油、千葉、日本）抗血清５００μｌを加えた。４℃で６０分間インキュベーションした後、未反応物質を３０００ｒｐｍ（２，５００×ｇ）で４℃にて２０分間遠心分離して除去した。チューブに残っている放射能活性を、ガンマ・カンウンターを用いて計測した。この血液サンプリング手順の間のアデノシン分解は、無視できるものと報告されている（ヤマネ(Yamane)、ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.)、12: 501-519 (1991)；サトー(Sato)ら、Ann. Biochem.、121: 409-420 (1982)；ホリ(Hori)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー(Am. J. Physiol.)、250: 14509-14518 (1986)；およびキタカゼ(Kitakaze)ら、サーキュレーション・リサーチ(Circ. Res.)、60: 631-630 (1987)）。
【００５２】
特異的抗体を用いるこの方法は、アデノシンをわずか５．０ｐｍｏｌ／ｍｌでも検出するのに十分な感度を有するものであった。アッセイ内およびアッセイ間の変動率(coefficient of variance)は、それぞれ１．３〜３．１％および４．１〜４．９％であることが観察された。アデノシンを測定するためのこの高感度なラジオイムノアッセイは、アデノシンのＨＰＬＣ測定で通常行われるタンパク質除去を必要としない。代表的な犬についての結果を下記の表１に示す。
【００５３】
【表１】
0004045376.tif 000004
【００５４】
上記の表１に示されるように、ＣＰＰが９６から５３ｍｍＨｇに低下し、その結果ＣＢＦがベースライン流量の６０％に減少したとき、冠状静脈血の乳酸およびアデノシンの濃度は増加した。他方、冠状動脈血の乳酸濃度（１９．５ｍｇ／ｄｌ）およびアデノシン濃度（７．２ｐｍｏｌ／ｍｌ）は、本研究を通して、ＣＰＰの低下によっては変化しなかった。次いで、ＣＢＦは、一定に保たれていた。冠状低灌流の間のＤＭＳＯ注入は、ＣＰＰまたは冠状静脈血の乳酸およびアデノシン濃度にいかなる変化も生じなかった。
【００５５】
しかしながら、上記の表１に示されるように、ベスナリノン注入の間、冠状静脈血のアデノシン濃度は、冠状静脈血のＣＢＦおよび乳酸濃度が不変であるにもかかわらず、増加した。しかし、ＣＰＰは、アデノシンの冠状血管拡張作用により、低下（５３から５１ｍｍＨｇに）した。これらの結果は、ベスナリノンが虚血性心筋におけるアデノシン放出を増強することを示す。
【００５６】
実施例２
冠血流量に対するベスナリノンの効果
上記の犬の体外バイパス・チューブに取付けた閉塞物により、ＣＰＰを低下させて、ＣＢＦをコントロールＣＢＦの６０％に減少させた。低いＣＰＰが測定された後、ＣＰＰを低いレベルに一定に保つように閉塞物を調整した。全ての上記血行力学パラメーター、および代謝パラメーターについて冠状動脈血および静脈血を、低灌流の開始から１０分間後に測定した。これらの測定の後、ベスナリノンのビヒクル（１．０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ）をＬＡＤ内に注入し、上記の血行力学および代謝パラメーターの全てを、注入から５分後に測定した。次に、注入ポンプを用いて、ベスナリノン０．５４ｍｇ／ｍｌを、注入速度０．２〜０．５ｍｌ／分でＬＡＤ内に注入し、１５μｇ／ｍｌを達成した。血行力学および代謝パラメーターの全てを、注入から５分後および１０分後に再び測定した。代表的な犬に関する結果を下記の表２に示す。
【００５７】
【表２】
0004045376.tif 000005
【００５８】
上記の表２に示されるように、ＣＰＰが９３から５９ｍｍＨｇに低下し、その結果ＣＢＦがベースライン流量の６０％に減少したとき、冠状静脈血の乳酸濃度は増加したが、冠状動脈血の乳酸濃度は不変であった。次いで、ＣＰＰは一定に保たれていた。ＤＭＳＯは、冠状動脈血のＣＢＦまたは乳酸濃度を変化させなかった。しかしながら、ベスナリノンは、ＣＢＦを増加させ、冠状静脈血の乳酸濃度を減少させた。これらの結果は、ベスナリノンがＣＢＦを増加でき、即ち、虚血性心筋における冠状血管拡張がなされ、虚血の重篤度を減少させることを示す。
【００５９】
実施例３
ベスナリノンの梗塞サイズに対する効果
アデノシンを用いた灌流は、梗塞サイズを顕著に制限でき（オラフソン(Olafsson)、Circ.、76: 1135-1145 (1987)）、上述の実施例１で示されるように、ベスナリノンはアデノシンの血中濃度を増加できる。従って、ベスナリノンも梗塞サイズの減少を引き起こすかどうか決定するための試験を行った。
【００６０】
より詳細には、上記の犬のＬＡＤを剥離し、湿らせた臍帯テープ(umbilical tape)のストリップを閉塞を起こすために冠血管の周囲に通過させた。冠閉塞は、臍帯テープを小さなプラスチック・チューブ内に通しプラスチック・チューブに圧をかけることによりなされた。局所心筋血流量(regional blood flow)を測定するため、左房内にマイクロスフェア投与用のカテーテルを留置した。
【００６１】
局所的ＣＢＦを、マイクロスフェア法で測定したが、これは、モリ(Mori)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー(Am. J. Physiol.)、263: 141946-141957 (1992)に記載されるように、種類の異なる安定な重元素で標識した不活性プラスチックからなる放射能非活性なマイクロスフェア（セキスイ・プラスチック株式会社、東京、日本）を用いる。
【００６２】
より詳細には、ＢｒおよびＺｒで標識した、平均直径１５μｍを有するマイクロスフェアを使用した。比重は、Ｂｒに関しては１．３４、Ｚｒに関しては１．３６であった。マイクロスフェアを、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含む等張食塩水中に懸濁させ、凝集を防いだ。マイクロスフェアを５分間、超音波にかけ、その後、注入直前に５分間攪拌した。１．０ｍｌのマイクロスフェア懸濁液（２〜４×１０6個のスフェア）を、左房内に注入し、温かい（３７℃）食塩水５．０ｍｌで数回フラッシュした。マイクロスフェアを、冠閉塞の開始から８０分後に投与した。マイクロスフェア投与の直前に、参照となる血流サンプルを、大腿動脈から８．０ｍｌ／分の一定速度で２分間、取り出した。安定な重元素のＸ線蛍光を、ＰＷ１４８０波長分散スペクトロメーター（フィリツプス(Phillips Co., Ltd.)、アルメロ(Almelo)、オランダ）により測定した。マイクロスフェアを一次Ｘ線ビームで照射するとき、電子は、より低い軌道に落ち込み、各元素に特徴的なＸ線蛍光エネルギーレベルを伴った測定可能なエネルギーを発する。従って、単一混合物(single mixture)中の数種の標識化マイクロスフェアのＸ線蛍光を同定することが可能である。局所的ＣＢＦを、式：単位時間当りの流量＝（組織カウント数）×（参照流量）／（参照カウント数）に従って計算し、ｍｌ／分／ネットの重量ｇで示す。
【００６３】
コントロールとして、血行力学安定化から２０分後に、ＬＡＤを９０分間閉塞し、６時間再灌流した。注入ポンプを用いて、ベスナリノン０．９０ｍｇ／ｍｌを注入速度０．２〜０．５ｍｌ／分で、冠閉塞より２０分前に、および冠閉塞から９０分後に１時間再灌流する間に注入し、１５μｇ／ｍｌを達成した。
【００６４】
再灌流から６時間後に、ＬＡＤを再閉塞して自家血液で灌流しながら、エバンスブルー染料を全身静脈に注射して、心臓の解剖学的危険面積および非虚血面積を測定した。続いて、心臓を直ちに摘出し、幅６〜７ｍｍの連続横断切片にスライスした。非虚血面積を、青染料で同定し、虚血領域を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中１．０％（ｗ／ｖ）の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ；シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)）で、３７℃にて２０〜３０分間インキュベートした。ＴＴＣは、非梗塞心筋を赤レンガ色に染め、生きている組織に存在するデヒドロゲナーゼ酵素によるＴＴＣ減少に起因するホルマザン沈殿物(formazan precipitate)の存在を示す。梗塞サイズを、危険な状態にある面積のパーセンテージとして計算した。結果を、下記の表３に示す。
【００６５】
【表３】
0004045376.tif 000006
【００６６】
上記の表３に示されるように、虚血の際の側副血流量およびＤＭＳＯ群とベスナリノン群の危険面積は有意に変動しなかったが、梗塞サイズはベスナリノン投与により顕著に減少した。ベスナリノンのこの梗塞サイズ限定効果は、ベスナリノン処置された犬が８−スルホフェニルテオフィリン（8-sulfophenyltheophylline）（８−ＳＰＴ）２５μｇ／ｋｇ／分を冠状内注入した２０分後に、完全になくなった。８−ＳＰＴは、アデノシン・レセプター拮抗剤である。従って、ベスナリノンの梗塞サイズ限定効果は、虚血心臓におけるアデノシン放出の増大によって媒介されるかもしれない。
【００６７】
他方、ヌクレオシド輸送阻害剤であるジピリダモール１０μｇ／ｋｇ／分を注入速度０．２〜０．４ｍｌ／分で、冠閉塞より２０分前、および冠閉塞から９０分後に１時間再灌流する間に注入したとき、観察された梗塞サイズの減少は、有意に、より小さいものであった。
【００６８】
上記の結果は明らかに、変力剤であるベスナリノンが、梗塞サイズを予想外に著しく減少させることを示している。
【００６９】
虚血心臓でアデノシン放出を増大させることが知られているジピリダモールは、ベスナリノンに比し、梗塞サイズの減少効果が低かった。ジピリダモールは、ベスナリノンと同様にアデノシン・ヌクレオシド輸送阻害剤であるが、これらの結果は、ベスナリノンとジピリダモールの作用部位および組織親和性が異なることを示すように思われ、このことが、梗塞サイズ限定効果に関する能力の予想外の差違を説明するかもしれない。
【００７０】
本発明を、その具体的な実施態様を参照して詳細に述べたが、種々の変更および修飾が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく為され得ることは当業者に明らかである。