(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)に示すDNAを含むベクター。
(a) 配列番号１に示される塩基配列からなるDNA、又は配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(b) 配列番号３に示される塩基配列からなるDNA、又は配列番号３に示される塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号５に示される塩基配列からなるDNA、又は配列番号５に示される塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、フェレドキシン活性を有するタンパク質をコードするDNA
(d) 配列番号７に示される塩基配列からなるDNA、又は配列番号７に示される塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項２】
請求項１記載のベクターを含む微生物。
【請求項３】
放線菌である請求項２記載の微生物。
【請求項４】
放線菌が、テラバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属又はノカルディオイデス属に属するものである、請求項３記載の微生物。
【請求項５】
以下の(a)〜(d)のタンパク質複合体からなるジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能を有するタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニットとしての機能を有するタンパク質
(c) 配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、フェレドキシン活性を有するタンパク質
(d) 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
(d)のタンパク質が、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）TA421株由来のフェレドキシンレダクターゼ又はストレプトマイセス・セリカラ（Streptomyces coelicolor）A3(2)株由来のフェレドキシンレダクターゼにより置換されたものである、請求項５記載の酵素。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の微生物を培養し、得られる培養物からジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び／又は請求項５若しくは６記載のジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素とダイオキシン類とを接触させることを特徴とする、ダイオキシン類の分解方法。
【請求項９】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び／又は請求項５若しくは６記載のジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素を含有することを特徴とするダイオキシン類分解剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む微生物に関する。また本発明は、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素、及び該酵素の製造方法に関する。
本発明はまた、上記微生物及び／又は酵素を利用したダイオキシン類の分解方法に関する。
さらに本発明は、ジオキシゲナーゼ遺伝子のスクリーニングに用いるためのプライマーセット及びスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダイオキシン類は、ジベンゾフラン（以下「DF」という）及びジベンゾ-p-ジオキシン（以下「DD」という）のポリ塩素化誘導体と、コプラナーPCBの総称であり、高い毒性、変異原性を示す化学物質として知られている。ダイオキシン類は、燃焼やパルプ漂白の過程や農薬等の化学合成副産物として非意図的に生成し、低濃度であるが広く環境を汚染している。近年ダイオキシン類が低濃度において内分泌撹乱活性を有することが明らかにされつつあり、その汚染環境の修復技術の開発が急がれている。
【０００３】
微生物を用いた汚染環境修復技術、いわゆるバイオレメディエーションは、環境低付加型の浄化技術として注目されている。ダイオキシン類の微生物分解は、DF及びDDをモデル化合物として用いて研究されており、これまでにDF及びDD資化能を有するいくつかの細菌が既に報告されている（例えば、Fortnagel, P. et al., 1989, Naturwissenschaften. 76: 222-223；Hong, H.B. et al., 2000, Wat. Res. 34: 2404-2407；Ishiguro, T. et al., 2000, Environ. Technol. 21: 1309-1316；Kimura, N. et al., 2001, J. Biosci. Bioeng. 92: 138-143；Monna, L. et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59: 285-289；Strubel, V. et al., 1989, FEMS Microbiol. Lett. 49: 233-238；及びWittich, R. et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58: 1005-1010参照）。DF及びDD資化性細菌による分解第一段階は、芳香族炭化水素二酸素添加酵素（以下「ジオキシゲナーゼ」という）により触媒される。この酵素は、芳香族炭化水素の酸素添加活性を触媒する末端ジオキシゲナーゼとNAD(P)Hの還元力を伝達する電子伝達酵素により形成される。DF資化性細菌のジオキシゲナーゼは、ナフタレンやビフェニル等の芳香族炭化水素資化性細菌のジオキシゲナーゼと比べて基質特異性が特徴的である。すなわちDFを基質とした場合、ナフタレン及びビフェニルのジオキシゲナーゼは、次式Iに示すように、DFの[1,2]などの横の位置（lateral position）に酸素添加し、比較的安定なcis-ジヒドロジオール誘導体を生成する。
【０００４】
【化１】
0004162040.tif 000002
【０００５】
対照的に、DF及びDD資化性細菌に見出される活性は、次式IIに示すように、[4,4a]、すなわち核間位置（angular position）に特異的である。
【０００６】
【化２】
0004162040.tif 000003
【０００７】
核間ジオキシゲナーゼにより生成されるDF及びDDのヘミアセタール中間体は不安定であり、それぞれ自然にビフェニル及びジフェニルエーテルのトリヒドロキシ誘導体に変換され、エクストラジオールジオキシゲナーゼ、加水分解酵素等の働きにより、それぞれサリチル酸及びカテコールを経由して分解されていくと考えられている。
【０００８】
これまでに、DF及びDD資化性細菌由来のジオキシゲナーゼを情報化する遺伝子のクローニング例は２例のみである。すなわち、グラム陰性細菌のスフィンゴモナス・ウィティチ（Sphingomonas wittichii）RW1株（Armengaud, J. et al., 1998, J. Bacteriol. 180: 3954-3966）及びグラム陽性細菌のテラバクター・エスピーDBF63（Kasuga, K. et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 283: 195-204）である。RW1株のジオキシゲナーゼ（DxnA）酵素系は詳細な解析がなされている。多くのグラム陰性細菌のジオキシゲナーゼ遺伝子群がクラスター化されているのに対して、RW1株のDF及びDDに作用するジオキシゲナーゼ遺伝子群はゲノム上の離れた位置に情報化されている。また、多くの芳香族炭化水素代謝系の発現が制御されているのに対し、RW1株のそれは構成的発現であることから、これら基質の分解酵素遺伝子は発展途上の段階であることが伺える。グラム陽性細菌では、DF資化性放線菌（テラバクター・エスピーDBF63株）より、末端ジオキシゲナーゼコンポーネントのα及びβサブユニットをコードするdbfA1A2遺伝子が単離された（Kasuga, K. et al., 前掲）。DbfA1A2の活性発現に必要であると思われる電子伝達酵素遺伝子は見出されていないが、dbfA1A2遺伝子の形質転換大腸菌で、DFを2,2',3-トリヒドロキシビフェニルに変換する核間ジオキシゲナーゼ活性が検出された。活性発現に必要な電子伝達ユニットは宿主の大腸菌由来のものが代替されたものと思われる。更に、DBF63株の自然DF資化能欠損変異株は、dbfA1遺伝子を欠損することが示されている。これらの結果より、dbfA1A2遺伝子産物はDBF63株においてDF分解に関与していると思われる。一方で、カルバゾール資化性細菌、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）CA10はDF及びDDの資化能はないが、これらの基質の核間ジオキシゲナーゼ活性を示す。カルバゾール1,9a-ジオキシゲナーゼの末端ジオキシゲナーゼは、上記のDF資化性細菌由来のものと分子系統が大きく異なる。この酵素系は、DF及びDDの核間ジオキシゲナーゼ活性以外に、多様な芳香族炭化水素に対して酸素添加活性を示し、その基質特異性が低いことが特徴である。このような広い基質特異性を有する核間ジオキシゲナーゼは、多様な塩素置換誘導体を含むダイオキシン類のバイオレメディエーションにおいて有用であると思われ、その単離と解析に大きな関心が寄せられている。
【０００９】
これまでに、上記のような微生物を利用したダイオキシン類の分解処理方法について、カルバゾール資化性細菌の分解遺伝子を用いる方法（特開平10-257895号公報）や、カルバゾール資化性細菌又はジベンゾフラン資化性細菌を用いる方法（特開2002-000753号公報、特開2002-000754号公報）が公開されている。ダイオキシン類は多くの誘導体の集合体であり、完全な細菌分解の為には、基質特異性等に関してより多様な分解微生物と分解酵素が必要であると考えられる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子及びダイオキシン類の分解方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ジベンゾフラン資化性放線菌から新規なジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子を単離することに成功し、また該遺伝子がコードするジベンゾフランジオキシゲナーゼが多様な多環式及び複素環式芳香族炭化水素に対し広範な基質特異性を有するという知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（12）である。
【００１２】
（１）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能を有するタンパク質
上記遺伝子は、以下の(c)又は(d)のDNAを含むものであることが好ましい。
(c) 配列番号１に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
【００１３】
（２）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニットとしての機能を有するタンパク質
上記遺伝子は、以下の(c)又は(d)のDNAを含むものであることが好ましい。
(c) 配列番号３に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号３に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
【００１４】
（３）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、フェレドキシン活性を有するタンパク質
上記遺伝子は、以下の(c)又は(d)のDNAを含むものであることが好ましい。
(c) 配列番号５に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号５に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、フェレドキシン活性を有するタンパク質をコードするDNA
【００１５】
（４）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質
上記遺伝子は、以下の(c)又は(d)のDNAを含むものであることが好ましい。
(c) 配列番号７に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号７に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【００１６】
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子を含むベクター。
上記ベクターは、少なくとも上記（１）及び（２）の遺伝子を含むものであることが好ましい。
（６）上記（５）のベクターを含む微生物。
上記微生物は、放線菌であることが好ましく、放線菌としては、テラバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、又はノカルディオイデス属に属するものが挙げられる。
【００１７】
（７）以下の(a)〜(d)のタンパク質複合体からなるジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能を有するタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニットとしての機能を有するタンパク質
(c) 配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、フェレドキシン活性を有するタンパク質
(d) 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質
上記酵素においては、(c)及び／又は(d)のタンパク質が、該タンパク質以外のフェレドキシン活性及び／又はフェレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質により置換されたものであってもよい。
【００１８】
（８）上記（６）の微生物を培養し、得られる培養物からジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素の製造方法。
（９）上記（６）の微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び／又は上記（７）のジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素とダイオキシン類とを接触させることを特徴とする、ダイオキシン類の分解方法。
【００１９】
（10）上記（６）の微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び／又は上記（７）のジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素を含有することを特徴とするダイオキシン類分解剤。
（11）配列番号９に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット。
（12）ジベンゾフラン資化性放線菌からの総DNAを鋳型として上記（11）のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする、ジオキシゲナーゼ遺伝子のスクリーニング方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明を以下に詳細に説明する。
１．  ジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子
本発明者は、新規なジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子（以下「dfdA」ともいう）を単離するため、いくつかの土壌サンプルから、ロドコッカス、テラバクター及びミクロバクテリウム属を含む数種のジベンゾフラン資化性放線菌を単離し、分析した。
【００２１】
ジベンゾフランの核間ジオキシゲナーゼに関与する放線菌の遺伝子を、数種の既知ジオキシゲナーゼαサブユニット遺伝子において保存されている配列に基づいて設計した縮重PCRプライマーセットを用いてクローニングした。４種のジベンゾフラン資化性放線菌、すなわちテラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）YK1株及びYK3株（それぞれ、理化学研究所 微生物系統保存施設(JCM) 登録番号JCM 11555及びJCM 11556）、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）YK2株（JCM登録番号JCM 11554）、並びにミクロバクテリウム・エスピー（Microbacterium sp.）YK18株（JCM登録番号JCM 11553）から共通して１つのαサブユニット遺伝子（dfdA）の配列が増幅され、系統解析により、この配列は既知のジオキシゲナーゼαサブユニットとは異なるものであることが示された。
【００２２】
続いて、このdfdA遺伝子クラスターを含む約5.2kbのPstI断片を、巨大環状プラスミドpYK3を保持するテラバクター・エスピーYK3株からクローニングした。配列類似性検索を利用して、末端ジオキシゲナーゼのα及びβサブユニット、フェレドキシン並びにフェレドキシンレダクターゼ（それぞれdfdA1〜A4と称する）をコードする４つの推定遺伝子を同定した。
【００２３】
本発明者は、テラバクター・エスピーYK3株においてdfdA1遺伝子の転写がジベンゾフランにより誘導されることを証明した。またサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって、この種の核間ジオキシゲナーゼ遺伝子が、いくつかのジベンゾフラン資化性放線菌に存在することを明らかにした。dfdA1相同遺伝子は、テラバクター、ロドコッカス及びミクロバクテリウム属のジベンゾフラン資化能欠損変異株においては検出されなかったため、dfdA遺伝子産物が、テラバクター・エスピーYK3株だけでなく多様な放線菌においてジベンゾフラン分解の重要な機能を有しているといえる。以下に本発明のジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子について説明する。
【００２４】
配列番号１にジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニット遺伝子の塩基配列を、配列番号２にジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニットのアミノ酸配列を例示する。
但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。ジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能とは、ジオキシゲナーゼβサブユニットと複合体を形成し、基質との結合および酸素添加反応を触媒する活性を持つものを指す。この機能は、ジオキシゲナーゼβサブユニットと電子伝達酵素を共に発現させ、基質に分子状酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。
【００２５】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のジオキシゲナーゼαサブユニットとしての機能を有するタンパク質に含まれる。さらに具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列のN末端に「MEAT」が付加された変異体や、373番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異体も、本発明のタンパク質に含まれる。
また、配列番号３にジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニット遺伝子の塩基配列を、配列番号４にジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニットのアミノ酸配列を例示する。
【００２６】
上記αサブユニットの場合と同様に、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、ジベンゾフランジオキシゲナーゼのジオキシゲナーゼβサブユニットとしての機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。ジオキシゲナーゼβサブユニットとしての機能とは、ジオキシゲナーゼαサブユニットと複合体を形成し、基質との結合および酸素添加反応の触媒に寄与する機能を有するものを指す。この機能は、ジオキシゲナーゼαサブユニットと電子伝達酵素を共に発現させ、基質に分子状酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。具体的には、配列番号４に示されるアミノ酸配列の114番目のアスパラギン酸がグリシンに置換した変異体も、本発明のタンパク質に含まれる。
【００２７】
配列番号５にジベンゾフランジオキシゲナーゼのフェレドキシン遺伝子の塩基配列を、配列番号６にジベンゾフランジオキシゲナーゼのフェレドキシンのアミノ酸配列を例示する。
但し、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、フェレドキシン活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。フェレドキシン活性とは、電子伝達体としての機能を指す。この活性は、末端ジオキシゲナーゼ複合体、フェレドキシンレダクターゼと共に発現させ、基質に分子状酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。具体的には、配列番号６に示されるアミノ酸配列の68番目のトリプトファンがチロシンに置換した変異体も、本発明のタンパク質に含まれる。
【００２８】
配列番号７にジベンゾフランジオキシゲナーゼのフェレドキシンレダクターゼ遺伝子の塩基配列を、配列番号８にジベンゾフランジオキシゲナーゼのフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列を例示する。
但し、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、フェレドキシンレダクターゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。フェレドキシンレダクターゼ活性とは、NADHまたはNADPHとフェレドキシンの酸化還元反応を触媒する活性を指す。この活性は、末端ジオキシゲナーゼ複合体、フェレドキシンと共に発現させ、基質に分子状酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。具体的には、配列番号８に示されるアミノ酸配列の110番目のアラニンがプロリンに置換した変異体も、本発明のタンパク質に含まれる。
【００２９】
上記遺伝子は、テラバクター属、ロドコッカス属などのDF資化性放線菌から調製したDNAから、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより調製することができる。
また、一旦ジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列が確定すると、その後は化学合成によって、この遺伝子を得ることができる。また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K(TAKARA社製)やMutan-G(TAKARA社製)）などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入PCRやDNAシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入PCR及びDNAシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入PCRについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またDNAシャッフリングについてはStemmer, W. P. 1994, Nature, 370:389-391及びStemmer W. P., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10751を参照されたい。
【００３０】
変異した遺伝子により作製される組換えタンパク質が酵素活性を有するか否かは、変異タンパク質をジベンゾフランジオキシゲナーゼの他のサブユニットと共に発現させ、ジベンゾフランの変換活性を測定することにより確認することができる。
さらに、上記塩基配列からなるDNAの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれの機能又は活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が60％以上、好ましくは80％以上）を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が65℃であり、洗浄の条件が0.1%SDSを含む0.1×SSC中で65℃、10分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
【００３１】
分子系統解析によって、上記本発明のジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子（dfdA）の末端ジオキシゲナーゼコンポーネント（dfdA1及びA2）は新規な遺伝子であるが、電子伝達コンポーネント（dfdA3及びA4）は、ロドコッカス・エリスロポリス（R. erythropolis）TA421のビフェニルジオキシゲナーゼの対応物と同じクラスターに属することが示された。dfdA遺伝子をロドコッカス・エスピーYK2株のジベンゾフラン資化能欠損変異株YK2-RD2（dfdA1相同遺伝子を自然に欠損している）に導入した場合には、そのジベンゾフラン分解能が回復しており、ジベンゾフラン又はジベンゾ-p-ジオキシンを、それぞれビフェニル又はジフェニルエーテルのトリオール体へと変換する活性を示した。従って、DfdAが核間ジオキシゲナーゼ活性を有することが示された。また同形質転換株は、様々な芳香族炭化水素に酸素添加する活性を有しており、その基質特異性は従来のものと比べて広範であることが明らかになった。
【００３２】
２．ジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素
本発明のジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素（DfdA）は、ジオキシゲナーゼαサブユニット（DfdA1）、ジオキシゲナーゼβサブユニット（DfdA2）、フェレドキシン（DfdA3）及びフェレドキシンレダクターゼ（DfdA4）の４つのコンポーネントからなるタンパク質複合体であり、次式IIIに示す反応を触媒する。
【００３３】
【化３】
0004162040.tif 000004
【００３４】
DfdA酵素は、上記反応に示すように、ジベンゾフランなどの多環式及び複素環式芳香族炭化水素の4,4aの核間部位に酸素添加する。本DfdA酵素は、広範な基質特異性を示すものであり、ジベンゾフラン以外にも、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジベンゾチオフェン、キサンテン、フェノキサチン、フルオレンなどの多環式及び複素環式芳香族炭化水素、並びにカルバゾールなどの複素環式窒素化合物に対する酸素添加反応を触媒する。従って、本DfdA酵素により環境汚染物質であるダイオキシン類を分解することができる。
【００３５】
また、本発明者は、DfdA酵素のDfdA4コンポーネントがロドコッカス・エリスロポリスTA421株のものと類似したアミノ酸配列を有し、また、上記コンポーネントを欠損する組換え体を導入したロドコッカス・エスピーYK2-RD2株中で依然としてジベンゾフランジオキシゲナーゼ活性を示すことを確認（下記実施例７参照）しているため、DfdA4コンポーネントは、他のフェレドキシンレダクターゼ活性を示すタンパク質と置換可能であると考えられる。同様に、DfdA3コンポーネントもまた他のフェレドキシン活性を有するタンパク質と置換可能であると考えられる。
【００３６】
その他のフェレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質としては、当該活性を有するものであれば限定されるものではなく、例えばロドコッカス・エリスロポリスTA421株由来のフェレドキシンレダクターゼ、ストレプトマイセス・セリカラ（Streptomyces coelicolor）A3(2)株由来のフェレドキシンレダクターゼなどが挙げられる。
その他のフェレドキシン活性を有するタンパク質としては、当該活性を有するものであれば限定されるものではなく、例えば、スフィンゴモナス・ウィティチ（Sphingomonas wittichii）RW1株由来のフェレドキシンなどが挙げられる。
【００３７】
３．ジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子を含むベクター
本発明のベクターは、適当なベクターにジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子であるdfdA1-A2並びにdfdA3及びdfdA4又は場合によりその他のフェレドキシンをコードする遺伝子若しくはフェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子、並びにこれらの遺伝子を共発現させるのに必要な配列を連結（挿入）することにより得ることができる。共発現とは、２つの異なるタンパク質をコードする遺伝子が、同じか又は異なるプロモーターに作動可能に結合されており、同時に発現されることを意味する。したがって、共発現が可能であるならば、上記遺伝子を同一のベクターに組み込んでもよいし、又は、異なるベクターに組み込んでバイナリーベクターとして使用してもよい。
【００３８】
本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
プラスミド DNAとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばpK4, pRK401, pRF31等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばpRSET、pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。
【００３９】
宿主として放線菌を使用する場合には、以下のようなベクターを使用するのが特に好ましい：pK4 (Hashimoto, Y., et al., 1992, J. Gen. Microbiol. 138:1003-1010), pRF31 (Desomer, J. et al., 1990, Appl. Environ. Micribiol. 56:2818-2825)
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４０】
本発明のベクターに必要な遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４１】
ベクター中に導入する上記組み合わせの遺伝子の方向及び順序は、それぞれの遺伝子が発現され、発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれば、任意に配列及び選択してよい。この場合、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子は、dfdA1、dfdA2、dfdA3及びdfdA4の４種類を連結する必要があるが、その順序は任意でよく、方向も任意である。さらに、dfdA3又はdfdA4の代わりに他のフェレドキシン又はフェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子が連結されてもよく、またこれらの遺伝子は必ずしも隣接していなくてもよい。
DNA断片とベクター断片とを連結させるには、公知のDNAリガーゼを用いる。そして、DNA断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作製する。
【００４２】
４．本発明のベクターを含む微生物
本発明においては、上記ベクターを含む微生物として、天然にジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子をコードするDNAを含む微生物と、人為的に上記作製したベクターを導入した微生物が包含される。
天然にジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子をコードするDNAを含む微生物としては、限定するものではないが、テラバクター・エスピーYK1、YK3、YK6、YK7、YK14、YK17及びYK21株、テラバクター・エスピーDBF63株、ロドコッカス・エスピーYK2株並びにミクロバクテリウム・エスピーYK18株などが挙げられる。また、上記作製したベクターを導入した微生物は、以下の形質転換手法により作製することができる。形質転換に使用する宿主微生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、放線菌、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母などが挙げられる。
【００４３】
放線菌及び細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。放線菌としては、テラバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、ノカルディオイデス属などに属する放線菌が挙げられる。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH5αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターは、放線菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばロドコッカス・エスピーN-774株由来のアミダーゼ-ニトリルヒドラターゼプロモーター、ロドコッカス・エスピーYK2株由来のdfdBプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。放線菌及び細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４４】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
天然にジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNAを含む微生物にさらに本発明のベクターを導入してもよく、また複数のベクターを単一の微生物に導入してもよい。この操作によって、さらにジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素の活性が高められた微生物を作製することが可能である。
【００４５】
５．ジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素の製造
本発明において、目的のジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素（DfdA）は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
放線菌や細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４６】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類、そしてジベンゾフラン、ゲンチジン酸、サリチル酸等の芳香族炭化水素が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００４７】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30℃で６〜96時間行う。培養期間中、pHは約７に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００４８】
培養後、目的のDfdA酵素のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
目的のタンパク質が得られたか否かは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。さらに、目的タンパク質の理化学的性質又は機能を調べるため、種々の試験を行うことができる。試験項目としては、X線結晶解析、CDスペクトル解析、NMR解析等が挙げられる。
【００４９】
６．ダイオキシン類分解方法
本発明のダイオキシン類の分解方法は、上記の微生物及び／又は酵素を利用して行うことを特徴とするものであり、具体的には、上記微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び／又は上記単離した酵素とダイオキシン類とを接触させる方法である。
本発明において、分解対象となるダイオキシン類としては、限定されるものではないが、ハロゲン化芳香族化合物、例えば2,3,7,8-四塩素化ダイオキシン（TCDD）などのポリ塩素化ジベンゾ-ジオキシン（PCDDs）、ポリ塩素化ジベンゾフラン（PCDFs）、コプラナーＰＣＢ、及びポリ塩素化ビフェニル（PCB）類など；単環性及び多環性芳香族化合物、例えばキシレン、フェナントレン、ナフタレン、アントラセン、フルオレン、ビフェニル、ベンツピレンなどを例示することができる。「ダイオキシン類の分解」とは、ダイオキシン類に親水性を付与するような官能基を導入することを意味する。また、ダイオキシン類を環境及び動物等に対し安全な物質に変換できることが好ましい。
【００５０】
本発明のダイオキシン類分解方法の一例においては、本発明の微生物の培養菌体又は休止菌体を利用する。培養菌体は、上記「５．ジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素の製造」の項目に記載した培養条件により調製することができる。また、休止菌体は次のようにして調製することができる。まず、新鮮な培地に種菌を適当量、例えば0.5〜5容量％接種する。種菌としては、対数増殖期初期から定常期までのいずれかの状態の菌を用いればよく、好ましくは対数増殖期後期のものを用いる。種菌の量は必要に応じて増減することができる。その後、pH約７、約30℃にて１〜２日間往復又は回転振盪培養する。また、本方法で使用する培地としては、LB培地（1.0% ペプトン、0.5% 乾燥酵母エキス、1.0% NaClから成る）、又はMM3Y培地（10％のA及びB溶液、0.002％微量元素溶液、並びに0.005％乾燥酵母エキスから成る。A溶液は300 mM (NH4)2SO4、10mM MgSO4・7H2O、0.2 mM FeSO4・7H2O、1mM CaCl2・2H2O、及び0.5％ NaClを、B溶液は155 mM Na2HPO4・12H2O及び95 mM KH2PO4を、微量元素溶液は、0.01％ MoO3、0.07％ ZnSO4・5H2O、0.005％ CuSO4・5H2O、0.01％ H3BO3、0.01％ MnSO4・5H2O、0.01％ CoCl2・6H2O、及び0.01％ NiSO4・7H2Oをそれぞれ含有するもの）を用いるのが好適である。次いで、菌体を分離集菌し、洗浄することにより休止菌体が得られる。休止菌体とは、分裂能力を保持するが、一時的に分裂しない状態にある菌体を指す。集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある時に行うのが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液を使用してもよく、また、水を用いて菌体を洗浄することもできる。
【００５１】
培養菌体又は休止菌体は、適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液としてダイオキシン類分解剤とする。緩衝液としては種々の緩衝液を使用できる。緩衝液のpHは特に限定されないが、pH７付近が好適である。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌懸濁液の濃度は、600ナノメートルの濁度で１〜２が好適であり、必要に応じて増減できる。
また、本方法においては、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素を利用することも可能である。上述のように単離・精製したジベンゾフランジオキシゲナーゼ酵素を、適当な緩衝液、水等に懸濁して調製した酵素懸濁液としてダイオキシン類分解剤とする。酵素懸濁液の濃度は、当業者であればダイオキシン類の分解に適当な濃度を容易に決定することができ、特に限定されるものではない。
上記菌懸濁液又は酵素懸濁液としてのダイオキシン類分解剤は、その他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、限定されるものではないが、例えばダイオキシン類の分解を促進する界面活性剤、バイオサーファクタントなどが挙げられ、その添加量（濃度）は、該分解剤の作用対象、主成分（微生物及び／又は酵素）に応じて変更することができる。
【００５２】
上記ダイオキシン類分解剤は、散布、混合又は浸漬等により、ダイオキシン類を分解させる対象となるサンプルに作用させることができる。対象となるサンプルとしては、ダイオキシン類に汚染されたものであればどのようなものであってもよく、例えば限定するものではないが、廃棄物処理場及び不法投棄等によりダイオキシン類に汚染された土壌・底質等、ダイオキシン類を排出する施設に使用されているコンクリート等の石材、樹脂、木材等が挙げられる。
【００５３】
作用させる分解剤の量は、ダイオキシン類の汚染度、対象の種類等の条件を考慮して望ましい分解効果が得られるように選択しうる。
分解剤を作用させた後、分解の効果が望まれる時間、例えば約６時間〜14日にわたり、分解剤中の微生物又は酵素に適切な温度にて、サンプルを放置、混合、通気などする。本発明の微生物がDfdA酵素を産生するような条件は、25〜37℃、好ましくは30℃にて、pH７前後、好ましくはpH７である。本発明の酵素の活性に最適な条件は、25〜37℃、好ましくは30℃にて、pH７前後、好ましくはpH７である。
ダイオキシン類の分解率の測定は、ガスクロマトグラフィー（GC）、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析（GC/MS）などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。
【００５４】
ダイオキシン類の分解が確認された後は、分解剤に含まれる微生物又は酵素を、洗浄等により除去する。
微生物を利用したダイオキシン類分解方法の詳細に関しては、特開2001-224357号公報、特開2002-754号公報に開示されている方法も参照されたい。
本発明の微生物又は酵素を利用することにより、種々の汚染サンプル中に含まれるダイオキシン類を分解することができる。
【００５５】
７．プライマーセット
本発明のおいて、新規なジオキシゲナーゼ遺伝子を単離するために設計した縮重プライマーセットを以下に示す。
DOα-2：5’-TGYHSNTAYCAYGGNTGG-3’（配列番号９）
DOα-3：5’-TCNRCNGCNARYTTCCARTT-3’（配列番号１０）
ここで、オリゴヌクレオチド配列中の略字は、N＝A又はT又はG又はC、H＝A又はC又はT、Y＝C又はT、S＝G又はC、R＝A又はGを意味する。
【００５６】
上記プライマーセットは、数種の既知ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列をアライメントすることにより設計した。本発明者は、この縮重プライマーセットを用いることにより、DF資化性放線菌に由来する４種のジオキシゲナーゼ遺伝子を増幅することができたが、そのうちの３種が新規な遺伝子タイプであった。従って、上記プライマーセットは新規なジオキシゲナーゼ遺伝子のスクリーニングに利用可能である。本発明においては、配列番号９に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーとを組み合わせて用いることができる。
【００５７】
プライマーの合成法は、当技術分野で周知である。例えば、ホスホロアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。上記プライマーセットを用いることによって、ジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子に特異的な塩基配列を非常に効率よくスクリーニングすることができる。
新規なジオキシゲナーゼ遺伝子をスクリーニングするには、DF資化性放線菌の総DNAを慣例的な手法に従って調製し、その総DNAを鋳型として上記プライマーセットを用いてPCR反応を行う。PCR反応は、当技術分野で周知の条件により行うことができ、特に限定されるものではない。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
以下の実施例において使用した大部分の化学物質は、ナカライテスク及び和光純薬の最高純度のものである。DF及びDDは東京化成工業から購入した。生物変換試験に使用したDF、並びにフェノキサチン及び9-ヒドロキシフルオレンは、Aldrichから購入した。慣例的なクローニング実験に大腸菌JM109株を使用し、LB培地上で37℃にて培養した（Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York）。組換えプラスミド選択のために、アンピシリン、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド（X-gal）をそれぞれ最終濃度が100μg/ml、1mM及び40μg/mlとなるように培地に添加して使用した。固形培地に関しては、1.5〜2.5％寒天粉末又は精製寒天粉末（ナカライテスク）を添加した。最少培地（MM3Y）には、それぞれ10％のA及びB溶液、0.002％微量元素溶液、並びに0.005％乾燥酵母エキスを添加した。A溶液は、300 mM (NH4)2SO4、10mM MgSO4・7H2O、0.2 mM FeSO4・7H2O、1mM CaCl2・2H2O、及び0.5％ NaClを含有するものとした。B溶液は、155 mM Na2HPO4・12H2O及び95 mM KH2PO4を含有するものとした。微量元素溶液は、0.01％ MoO3、0.07％ ZnSO4・5H2O、0.005％ CuSO4・5H2O、0.01％ H3BO3、0.01％ MnSO4・5H2O、0.01％ CoCl2・6H2O、及び0.01％ NiSO4・7H2Oを含有するものとした。最少培地に添加した炭素源は、10mM グルコース、10mM コハク酸、1％グリセロール、3 mM サリチル酸、3 mM ゲンチジン酸、並びに0.05〜0.2％結晶DF及びDDである。
【００５９】
〔実施例１〕芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット遺伝子断片のPCR増幅
本実施例では、DF資化性放線菌に由来するジオキシゲナーゼ遺伝子断片を増幅するため、PCRを利用した。
最初に、DF資化性細菌株であるテラバクター・エスピーYK1株及びYK3株、ロドコッカス・エスピーYK2株、並びにミクロバクテリウム・エスピーYK18株を、日本の土壌サンプルから、DFを唯一の炭素及びエネルギー源として増殖可能なものを選択することにより単離した（Iida, T. et al., 2001, Biosci. Biotechnol. Biochem., 提出済）。簡単に説明すると、DFを添加したMM3Y培地に滅菌水で懸濁した土壌サンプルを加え、28℃で２〜４週間培養した。その後培養液の10％を新たに調製したDF添加MM3Y培地に移し、更に２〜４週間培養、これを必要に応じて数回繰り返した。培養液の濁度が上昇したものについて適宜希釈し、MM3Y寒天培地上に塗布した後、DFのエーテル溶液をスプレーすることにより寒天培地上にDF薄層を形成させた。数日間の培養によりDF薄層を分解して生育するコロニーを単離し、DF資化性細菌とした。
放線菌株からの全DNAは、Marmurらの方法（Marmur, J., 1961, J. Mol. Biol. 3: 208-218）に従って調製した。
【００６０】
続いて、ジオキシゲナーゼαサブユニット遺伝子用の縮重PCRプライマーセットを、数種の芳香族炭化水素ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列のアライメントより構築した。PCR増幅は、上記４種のDF資化性放線菌からの全DNAを用いて行った。具体的に説明すると、PCR反応は、ExTaq DNAポリメラーゼ（TAKARA）を製造業者の説明書に従って用いて行った。複数のコンポーネントからなるジオキシゲナーゼ遺伝子のαサブユニットのために設計した縮重PCRプライマーは以下の通りである。
【００６１】
DOα-2：5’-TGYHSNTAYCAYGGNTGG-3’（配列番号９：アミノ酸配列「C(P/S)YHGW」に対するものである）
DOα-3：5’-TCNRCNGCNARYTTCCARTT-3’（配列番号１０：アミノ酸配列「NWK(L/F)A(V/A)(E/D)」に対するものである）
【００６２】
反応条件は次の通りである。すなわち、94℃におけるインキュベーション８分の後、94℃にて20秒、50℃にて30秒、及び72℃にて40秒からなるサイクルを35サイクル行い、最後に72℃にてインキュベーションを５分行った。
各菌株からのPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、約0.3kb長のDNA断片を回収し、続いてpGEM-Tベクターに直接クローニングした。ランダムに選択した54クローン（YK1の13クローン、YK2の26クローン、YK3の11クローン、及びYK18の4クローン）のヌクレオチド配列を分析した。配列決定反応は、自動配列分析器（ABIシーケンサー377モデル）を用いて分析した。GENETYXソフトウエア（Software Development）をヌクレオチド分析に使用した。配列データをCLUSTAL Wパッケージ（Thompson, J. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680）を用いて並べた後、手動で適切な修正を加えた。各クローンの推定アミノ酸配列は、数種の芳香族炭化水素ジオキシゲナーゼαサブユニットと有意な配列相同性を示していた。
【００６３】
続いて、上記の配列の代表、すなわちYK1（クローンタイプE60及びE57）及びYK18株（クローンタイプ954及び955）から増幅した２種の配列、YK2株からの４種の配列（クローンタイプG26、G45、G25及びG24）、並びにYK3株からの１種の配列（クローンタイプE96）を４つの種に分類した。PCR増幅したクローンの推定アミノ酸配列に基づく系統樹を図１に示す。系統樹を推定するために使用したプログラムは、PHYLIPパッケージバージョン3.5c（Felsenstein et al., インターネットアドレスhttp://evolution.genetics.washington.edu/phylip.htmlより頒布）のものである。PROTDISTを使用して進化距離を算出した。系統樹は、プログラムNEIGHBORにより近隣結合（neighbor-joining）法により進化距離から構築した。図１中、括弧内に記載の名称は配列の由来する菌株名を表す。
【００６４】
αサブユニット遺伝子のクラスの１つは、４種の異なる株（クローンタイプ：YK1のE57、YK2のG45、YK3のE96及びYK18の955）から増幅した配列においてほぼ同一であった（図１のクラスターA）。これらの配列は、ヌクレオチド配列において99.5％以上の同一性を示した。タイプE96の推定アミノ酸配列は、大腸菌の3-フェニルプロピオン酸ジオキシゲナーゼの大サブユニット（Z37966）と53％の同一性を示し、培養されていない未同定細菌の推定ジオキシゲナーゼαサブユニット（AF268980）と52％の同一性を示した。もう１つのクラスの配列、すなわちYK1のタイプE60、YK2のタイプG26及びYK18のタイプ954（図１のクラスターB）は、DFの核間ジオキシゲナーゼコンポーネントの遺伝子としてテラバクター・エスピーDBF63株から単離されたdbfA1の配列（Kasuga, K. et al., 前掲）と同一であった。YK2株は、ジオキシゲナーゼ遺伝子の他のクラス、すなわちタイプG24及びG25を有していた（図１のクラスターC及びD）。タイプG24の推定アミノ酸配列は、培養されていない未同定細菌の推定ジオキシゲナーゼαサブユニット配列（AF268986）と57％の同一性、及びロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）BD2株のイソプロピルベンゼン2,3-ジオキシゲナーゼ（U24277）と53％の同一性を示しており、またタイプG25は、ロドコッカス・エリスロポリスTA421のビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットタンパク質（BphA1; D88021）と70％の同一性を示していた。
【００６５】
PCRによりクローニングしたジオキシゲナーゼαサブユニット遺伝子ライブラリーから１つの配列クラスター（タイプE57、G45、E96及び955；図１のクラスターA）を選択した。本発明者は、一つの同クラスターのジオキシゲナーゼαサブユニット遺伝子しか持たないと思われるテラバクター・エスピーYK3を、今後の解析対象として選択した。
【００６６】
〔実施例２〕テラバクター・エスピーYK3株におけるジオキシゲナーゼαサブユニット遺伝子をコードする環状プラスミドの同定
本実施例においては、まず、テラバクター・エスピーYK3株のDF資化能欠損変異株の単離を試みた。30℃のLB培地中で対数増殖期中期まで生育させたYK3株の培養液を37℃に移し、更に２日間培養した。その後培養液を希釈し、LB寒天培地に播いて、単一のコロニーを得た。そのうちの300コロニーのDF資化能を調べたところ、うち30コロニーは資化能を欠損していた。これらの変異株をYK3-TD株と称した。これらの変異株は、YK3株におけるDF分解の後期代謝中間体であるサリチル酸を資化する能力は保持していた。この結果は、YK3におけるDF初期分解が、プラスミドなどの37℃において不安定なDNA要素に依存していることを示唆している。
【００６７】
続いて、Sambrookらにより記載されている方法（Sambrook, J., 前掲）の変法に従って、YK3株からプラスミドDNAを単離した。細胞溶解を行うために、細胞ペレットを、37℃にて最大３時間にわたりリゾチーム（4mg/ml）で処理し、プラスミドDNA単離操作を行った。その後、TLN-100ローターを備えたBeckman超遠心分離機（Optima TL）を用いて100,000rpmにて４時間、塩化セシウム-臭化エチジウム密度勾配超遠心分離を行い、閉環状DNAに由来するDNA層を見出した。回収したDNA層より臭化エチジウムをブタノール抽出により除去し、精製プラスミドDNAをエタノール沈殿により回収した。本発明者は、このプラスミドをpYK3と称した。ClaI断片長分析により、pYK3プラスミドのサイズを約102kbと推定した。
【００６８】
熱ショックにより取得したYK3株のDF資化能欠損変異株（YK3-TD株）のうちの４株についてプラスミドpYK3の有無を調べたところ、全て欠損していることが判明した。また、精製pYK3プラスミドを鋳型としたジオキシゲナーゼαサブユニット増幅用プライマーによるPCRの結果、約0.3kbの増幅断片が認められ、それらの塩基配列はYK3の全DNAから増幅した配列とほぼ同一であった。これらの結果は、DFの分解第一段階に関与するジオキシゲナーゼ遺伝子がプラスミドpYK3上にコードされ、この酵素はクローンタイプE96のクラスのものであることを強く示唆していた。本発明者は、この新規なクラスのジオキシゲナーゼ遺伝子をdfdAと命名した。
【００６９】
〔実施例３〕ジオキシゲナーゼ（dfdA）遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列分析
本発明者は、PCR増幅遺伝子をプローブとして用いるハイブリダイゼーション実験により、pYK3の5.2kbのPstI断片のクローニング及びヌクレオチド配列決定分析を行った。
クローニングしたヌクレオチド配列において４つの推定オープンリーディングフレーム（ORF）を見出した。dfdA遺伝子クラスターの遺伝子配置を図２に示す。配列データベースに対するBLASTサーチにより、４つのORFの推定アミノ酸配列に対して相同性を示したタンパク質を表１に示す。
【００７０】
【表１】
0004162040.tif 000005
【００７１】
dfdA1と称するORF1の塩基配列（配列番号１）の一部は、縮重プライマーセットから生成されたPCR増幅産物と同一であった。dfdA1遺伝子は、474アミノ酸からなる53.1kDaのタンパク質をコードしており（配列番号２）、そのアミノ酸配列は、表１に示すように数種の芳香族炭化水素のジオキシゲナーゼαサブユニットと類似性を示している（38〜44％）。
dfdA2と称するORF2（配列番号３）は、179アミノ酸からなる21.1kDaタンパク質をコードしており（配列番号４）、表１に示す芳香環ジオキシゲナーゼの小サブユニットと類似性を示す（41〜43％）。
【００７２】
dfdA3と称するORF3（配列番号５）は、123アミノ酸からなる13.2kDaタンパク質をコードするものであり（配列番号６）、リスケ[2Fe-2S]タイプのクラスターのコンセンサスモチーフが推定アミノ酸配列中に認められた。表１に示す配列データベースにおいて見出された類似タンパク質は、dfdA3翻訳産物が2Fe-2Sタイプのフェレドキシンであることを示している。
【００７３】
dfdA4と称するORF4（配列番号７）は、407アミノ酸からなる43.2kDaのタンパク質をコードするものであり（配列番号８）、FAD結合（ADP結合）部位のためのコンセンサスアミノ酸配列（GXGX2GX3AX6G）を含有する。式中、Xは任意のアミノ酸を、それに続く数値は任意のアミノ酸残基数を示す。推定アミノ酸配列は、ロドコッカス・エリスロポリスTA421由来のビフェニルジオキシゲナーゼのフェレドキシンレダクターゼコンポーネント（BphA4）などの数種のフェレドキシンレダクターゼと類似性を示した（39〜59％）。
【００７４】
〔実施例４〕DF資化性放線菌におけるdfdA1相同遺伝子の分布
本実施例においては、DF資化性放線菌におけるdfdA1遺伝子の分布をサザンハイブリダイゼーション分析により調査した。テラバクター・エスピーYK3のdfdA1遺伝子のPCR増幅部分をプローブとして使用した。鋳型として、多様な放線菌、すなわち図３のパネルAに示す、テラバクター・エスピーYK1株（レーン１）、ロドコッカス・エスピーYK2株（レーン２）、テラバクター・エスピーYK3株（レーン３）及びミクロバクテリウム・エスピーYK18株（レーン４）、並びにロドコッカス・エスピーYK2株の自然DF資化能欠損変異株（YK2-RD1及び2株：レーン５及び６）、テラバクター・エスピーYK3株の自然DF資化能欠損変異株（YK3-TD1及び2株：レーン７及び８）及びミクロバクテリウム・エスピーYK18株の自然DF資化能欠損変異株（YK18-MD1及び2株：レーン９及び10）の全DNA、並びに精製プラスミドpYK3（レーン11）を使用した（図３、パネルA）。ミクロバクテリウム・エスピーYK18株の自然DF資化能欠損変異株（YK18-MD1及びMD2株）は、グルコース含有LB培地上で一晩培養したYK18株の単一コロニーより単離した。ロドコッカス・エスピーYK2株の自然DF資化能欠損変異株（YK2-RD1及びRD2株）は、LB培地での継代培養を一ヶ月にわたり４回行った培養液の単一コロニーより単離した。
【００７５】
本発明者が単離した数種のテラバクター株（YK6、YK7、YK14、YK17及びYK21株：それぞれレーン３、４、５、６及び７）、並びにMonnaら（Monna, L. et al.,前掲）により単離されたDBF63株（レーン８）もまた鋳型として使用した（図３、パネルB）。
サザンブロッティングは、Hybond-N+（Amersham Pharmacia Biotech）ナイロン膜を製造業者の推奨に従って用いて行った。DIG-High Prime、抗DIG-APコンジュゲート及びブロッキング試薬（Roche Diagnostics GmbH）をDIG標識プローブの調製及びハイブリダイゼーションシグナル検出のために使用した。電気泳動で精製したYK3のdfdA1遺伝子PCR増幅断片を鋳型の標識に使用した。高SDS濃度ハイブリダイゼーションバッファーをハイブリダイゼーション溶液として使用したが、これは7% SDS、50% 脱イオン化ホルムアミド、5×SSC（20×SSCは3M NaCl及び0.3M クエン酸ナトリウム, pH7.0からなる）、2％ブロッキング試薬、50mM リン酸ナトリウム（pH7.0）、並びに0.1％ N-ラウロイルサルコシンからなるものである。サザンハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行った。ハイブリダイゼーションシグナルは、CDP-Star化学発光基質（New England Biolabs）及びLAS-1000蛍光画像分析システム（Fuji Film）を用いて検出した。
【００７６】
検体DNAサンプルをPstIで消化し、アガロースゲル電気泳動により分析した。ハイブリダイゼーションシグナルは試験したDF資化性放線菌の全てにおいて認められた（図３、パネルAのレーン１〜４、及びパネルBの全レーン）。pYK3（パネルA、レーン11）及びYK3株の全DNA（パネルA、レーン３）からの交差反応バンドのサイズは同一であった（図３）。dfdA1遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは、ロドコッカス、テラバクター及びミクロバクテリウムの属を含む全てのDF資化能欠損変異株で検出されなかった（図３、パネルA、レーン５〜10）。
【００７７】
次に、YK3株のdfdA1遺伝子のORF領域に特異的なプライマーを使用して、テラバクター・エスピーYK1株、ロドコッカス・エスピーYK2株、ミクロバクテリウム・エスピーYK18株及びテラバクター・エスピーDBF63株の全DNAよりdfdA1相同遺伝子をPCRで増幅し、ヌクレオチド配列を決定した。
dfdA1遺伝子増幅用のPCRプライマーは以下の通りである。
【００７８】
dfdA1-5’：5’-GCAACAATGCTGACTGTGA-3’（配列番号１１）
dfdA1-3’：5’-AAGAACGCTCATCAGGATTCT-3’（配列番号１２）
サイクル条件は次の通りである。すなわち、94℃におけるインキュベーション８分の後、94℃にて20秒、56℃にて20秒、及び72℃にて60秒からなるサイクルを25サイクル行い、続いて72℃にてインキュベーションを５分行った。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動、QIAEX II DNA抽出キット（QIAGEN）を用いたゲル抽出を行って精製した。精製したPCR産物を、製造業者の指示に従ってpGEM-Tベクター（Promega）に直接クローニングした。
【００７９】
全PCRサンプルにおいて約1.45kbのDNA断片の増幅が認められ、それらをクローニングした。各細菌由来のクローンの600 bpの5’末端配列の比較によって、上記全ての遺伝子のヌクレオチド配列がほぼ同一であることが明らかになった。YK3配列間での差異は、YK1配列において１ヌクレオチド、YK18配列において２ヌクレオチド、並びにYK2及びDBF63配列において３ヌクレオチドである。この結果は、dfdA1遺伝子が多様なDF資化性放線菌において高度に保存されていることを示している。
【００８０】
〔実施例５〕dfdA1遺伝子の転写発現
テラバクター・エスピーYK3におけるdfdA1遺伝子の転写発現を、ノーザンハイブリダイゼーション分析により観察した。洗浄したLB増殖細胞を、10mMグルコース又は0.2％ DFのいずれかを添加したMM3Yに再懸濁した。30℃にて２時間又は６時間増殖させた後、全RNAを単離した。全RNAの単離は、Shermanらの変法（Sherman, F. et al., 1986, Methods in Yeast Genetics, Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, New York）に従ったが、シクロヘキシミド処理を行わずに実施した。
【００８１】
またノーザンブロッティングは、Hybond-N+（Amersham Pharmacia Biotech）ナイロン膜を製造業者の推奨に従って用いて行った。DIG-High Prime、抗DIG-APコンジュゲート及びブロッキング試薬（Roche Diagnostics GmbH）をDIG標識プローブの調製及びハイブリダイゼーションシグナル検出のために使用した。電気泳動で精製したYK3のdfdA1遺伝子PCR断片を鋳型の標識に使用した。高SDS濃度ハイブリダイゼーションバッファーをハイブリダイゼーション溶液として使用したが、これは7% SDS、50% 脱イオン化ホルムアミド、5×SSC（20×SSCは3M NaCl及び0.3M クエン酸ナトリウム, pH7.0からなる）、2％ブロッキング試薬、50mM リン酸ナトリウム（pH7.0）、並びに0.1％ N-ラウロイルサルコシンからなるものである。ノーザンハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行った。ハイブリダイゼーションシグナルは、CDP-Star化学発光基質（New England Biolabs）及びLAS-1000蛍光画像分析システム（Fuji Film）を用いて検出した。
【００８２】
上述した通り、dfdA1遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして使用して転写産物を検出し、DFにより誘導された細胞から単離した総RNAを分析した（図４、レーン４及び５）。６時間誘導後のシグナル強度（レーン５）は、２時間誘導後のもの（レーン４）よりも大きかった。グルコースによる誘導培養物から単離したRNA（レーン２及び３）、並びにLB培養細胞から単離したRNA（レーン１）ではハイブリダイゼーションシグナルは検出されなかった。この結果は、テラバクター・エスピーYK3株において、DFによりdfdA遺伝子クラスターの転写が誘導されることを示唆している。ハイブリダイズシグナル強度は23Sと16S のrRNA遺伝子（レーン４及び５）の間で最大となっていた。このことは、dfdA遺伝子クラスターの転写終結がdfdA3（転写mRNA長で約2.5kb）又はdfdA2（約2.0kb）の下流で起こることを示唆している。またこのことは、フェレドキシンレダクターゼをコードするdfdA4遺伝子がdfdA1の転写ユニットの一部ではないことを示している。
【００８３】
〔実施例６〕dfdAの異種生物発現及び分解基質特異性分析
DFとその他の単環式、多環式及び複素環式芳香族炭化水素に対するDfdAの分解特性を試験した。最初に、大腸菌を宿主としてdfdA遺伝子群の発現を試みた。pBluescriptII KS+のlacプロモーター下流にdfdA1-A4遺伝子を含有するNspV-PstI断片を連結した組換え体を導入した大腸菌について、アンピシリンを添加したLB培地で対数増殖期中期まで培養後、誘導基質であるIPTGとDFを加え、更に16時間培養した。培養上清を直接Waters HPLCシステム（Alliance PDA single system）で分析し、DF代謝産物の蓄積の有無を確認した。分析には、ガードカラム（Security Guard；Phenomenex）を備えたInertsil ODS-3カラム（粒子径5μm、長さ250mm、内径4.6mm；GL Science）用いて、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸（60:40:0.05）溶媒系にて流速1.0ml/分で行った。HPLCによる分析の結果、大腸菌形質転換株ではDFの水酸化活性は認められなかった。
【００８４】
続いて、放線菌であるロドコッカスを宿主としたdfdA遺伝子の発現を試みた。発現の宿主としてロドコッカス・エスピーYK2株のDF資化能欠損変異株であるロドコッカス・エスピーYK2-RD2株を選択した。この変異株はDF分解に関与する遺伝子群（少なくともdfdA1及びdfdB）が欠落しており、またDFをHPLCで検出可能な化合物に変換する活性も検出されなかった（図５、パネル２）ことから、dfdA遺伝子の異種発現の宿主として適当であると思われた。
【００８５】
dfdA1-A4遺伝子をコードする5.2kbのPstI断片を、大腸菌-ロドコッカスシャトルベクターpRK401中に導入した。大腸菌-ロドコッカスのシャトルベクターベクターpRK401は、pK4（Hashimoto, Y. et al., 1992, J. Gen. Microbiol. 138: 1003-1010）を改作して構築した。具体的に説明すると、ロドコッカス属のプラスミド複製領域を含有するpK4のSacI-SmaIの平滑末端化遺伝子断片を回収し、pHSG298の平滑末端化AflIII部位に導入してpRK401を得た。
【００８６】
このようにして得た構築物をエレクトロポレーションによりロドコッカス・エスピーYK2-RD2株に導入した。同時に、シャトルベクターベクターpRK401でYK2-RD2菌株を形質転換し、ネガティブコントロールとした。ロドコッカス・エスピーYK2-RD2株のコンピテント細胞は、Desomerらの方法（Desomer, J. et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56: 2818-2825）に従って調製した。Gene Pulser（BIO-RAD）及び2mm空隙（gapped）セルを用いてDNA導入を行うためのエレクトロポレーション条件は、コンデンサー25μF；パラレルレジスタ400Ω；初期電圧2.0kVとした。グルコース（10mM）及びカナマイシン（25μg/ml）を添加したLB培地を形質転換株の選択に使用した。形質転換株の持つプラスミドDNAの制限酵素切断パターンを確認した。両形質転換株の休止細胞を以下のようにして調製した。グルコースとカナマイシンを添加したLB培地上で増殖した細胞を集菌、洗浄し、MM3Y培地に懸濁して30℃にて４時間飢餓培養した。集菌、洗浄後、10％B溶液（10 mM リン酸バッファー, pH7.0）に懸濁し、600 nmにおける吸光度が約2.5となるように調整したものを休止細胞懸濁液とした。続いてこれに基質を加え、30℃・140rpmで12〜16時間振とうした。休止培養液中に蓄積した基質の変換産物はWaters HPLCシステムを用いて、休止培養上清を直接分析した。
【００８７】
分析結果を図５に示す。DFを基質とした休止培養上清の解析の結果、ネガティブコントロール株からは、DF未添加の休止培養上清の解析時に認められた２分前後のピーク（パネル１）以外は検出されなかった（パネル２のグレーのクロマトグラム）。対照的に、dfdA形質転換株のDF添加休止培養上清からは、保持時間4.39分に特異的なピークが観察された（パネル２の黒のクロマトグラム）。該ピークの200-360nmのUVスペクトル（パネル２のクロマトグラム内に挿入して示した）は、207.7、245.3及び283.0において最大スペクトルを有する2,2',3-トリヒドロキシビフェニルのものと類似点を示した。
【００８８】
この類似点を確認するため、ガスクロマトグラフ質量分析（GC/MS）を行った。GC/MS分析は、キャピラリーカラム（Hewlett-Packard HP-5MS、内径0.25mmで30 m、フィルムの厚さ0.25μm）を装着したGC/MS分析計（Shimadzu GCMS-QP5050A）で行った。休止培養液上清を6N HClを用いてpHが約2.0になるよう調整し、２倍量の酢酸エチルで２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで脱水後、蒸発乾固させ、10%体積の酢酸エチルに再溶解させたものを分析サンプルとした。1μlの抽出物をGC/MS分析にかけた。GC条件は、ヘリウム流速1.1ml/分、スプリットレスモードで行い、カラム槽温度を、100℃で５分保温後、10℃/分の速度で280℃まで昇温し10分間保温、更に300℃まで20℃/分の速度で昇温し2分間保温するプログラムで制御した。dfdA形質転換株のDF添加休止培養上清のGC/MS分析（図６、パネル１）の結果検出された15.4分のピークの分子イオンピーク（202）及びフラグメントパターンは、2,2',3-トリヒドロキシビフェニルのものと高い類似性を示した。この結果より、DfdAがDFの4,4a部位特異的に酸素添加する核間ジオキシゲナーゼ活性を有することが明かとなった。dfdA形質転換株の休止細胞はまた、いくつかの芳香族炭化水素をHPLCにより検出可能な化合物に変換した。この結果を表２に示す。
【００８９】
【表２】
0004162040.tif 000006
【００９０】
このうちのDD代謝産物は、スペクトル分析（図５、パネル３）及びGC/MS分析（図６、パネル２）により、2,2',3-トリヒドロキシジフェニルエーテルと同定した。カルバゾール、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン及びビフェニルについては、シャトルベクターpRK401形質転換株のネガティブコントロールでは検出されないピークが検出された（表２）。また、ジベンゾチオフェン、キサンテン、フェノキサチン及びフルオレンについても分解産物と思われるピークが見られたが、ネガティブコントロールにおいて、極微量（220nmクロマトグラムのピーク面積においてdfdA形質転換株の約1.19〜1.72％）ではあるが同じ保持時間を有するマイナーなピークを検出した。dfdA形質転換株によるフルオレンの代謝産物は、9-ヒドロキシフルオレンと極微量のフルオレン-9-オンと同定された。なおフルオレン-9-オンは、ネガティブコントロール株により効率的に9-ヒドロキシフルオレンに変換されたことから、フルオレンはDfdAにより9-ヒドロキシフルオレンに変換された後、ネガティブコントロール株で検出された活性の逆反応でフルオレン-9-オンに変換されたものと思われた。フルオレンの9位に水酸基を付加する反応は、既知の核間ジオキシゲナーゼについても報告されており（Kasuga, K. et al., 2001、前掲；Nojiri, H., et al., 1999, J. Bacteriol. 181: 3105-3113；Trenz, S.P. et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 789-795）、DfdAが同様の基質特異性を有することを示唆する。
【００９１】
〔実施例７〕DfdAサブユニットの欠失とDF変換活性
本実施例においては、DF変換活性についてdfdAの電子伝達サブユニット遺伝子の欠失が及ぼす影響を分析した。dfdA1〜A4を含有するPstI断片の３種のサブクローンをpRK401上に構築した。すなわち、(1) dfdA1、A2及びA3遺伝子を含むPstl-Sphl領域、(2) dfdA1、A2及びA3遺伝子を含有するSmaI領域、そして (3) dfdA1及びA2遺伝子を含有するPstl-ApaLI領域、各々をpRK401のマルチクローニングサイトに導入した（図７）。これらの組換え体をロドコッカス・エスピーYK2-RD2株に導入し、形質転換株のDF分解能をカナマイシン添加LBブロスにてアッセイした。培養上清中の2,2',3-トリヒドロキシビフェニルの存在をHPLCにより分析した。フェレドキシンレダクターゼ遺伝子欠失クローン、すなわちPstI-SphI及びSmaI断片の２種の形質転換株は、DFの2,2',3-トリヒドロキシビフェニルへの変換活性を有していた。対照的に、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼ両コンポーネント遺伝子を欠失したPstl-ApaLI領域のクローンによる形質転換株は、DFを2,2',3-トリヒドロキシビフェニルに変換しなかった。以上の結果は、DfdA複合酵素系におけるフェレドキシンレダクターゼコンポーネント（DfdA4）は、ロドコッカス・エスピーYK2-RD2株に存在する他の相同活性と置き換わりうるが、フェレドキシンコンポーネント（DfdA3）は、YK2-RD2株におけるDFの核間ジオキシゲナーゼ活性に必須であることを示唆している。
【００９２】
【発明の効果】
本発明により、新規なジベンゾフランジオキシゲナーゼ遺伝子が提供される。該遺伝子は、芳香族炭化水素に対し広範な基質特異性を示す酵素をコードするものであり、該酵素を利用して多種多様な芳香族炭化水素を分解することができる。従って本発明は、汚染環境のバイオレメディエーションの分野において、ダイオキシン類の酸化分解に有用である。
【００９３】
【配列表】
0004162040.tif 000007
0004162040.tif 000008
0004162040.tif 000009
0004162040.tif 000010
0004162040.tif 000011
0004162040.tif 000012
0004162040.tif 000013
0004162040.tif 000014
0004162040.tif 000015
0004162040.tif 000016
0004162040.tif 000017
0004162040.tif 000018
0004162040.tif 000019
0004162040.tif 000020
【００９４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号９〜１２：プライマー
Nは、A又はT又はG又はCを表し、HはA又はC又はTを表し、YはC又はTを表し、SはG又はCを表し、RはA又はGを表す。
【図面の簡単な説明】
【図１】テラバクター（YK1株及びYK3株）、ロドコッカス（YK2株）、並びにミクロバクテリウム（YK18株）に属する放線菌からPCR増幅したジオキシゲナーゼαサブユニット遺伝子の推定アミノ酸配列から、近隣結合法により作製した系統樹（Neighbor-joining tree）を示す図である。スケールバーは0.1アミノ酸置換／座位を示す。本発明において増幅したPCRクローンの名称を影付きの枠内に示す。
【図２】ジオキシゲナーゼ遺伝子を情報化するPstI-PstI遺伝子断片と、4つのジオキシゲナーゼサブユニット遺伝子の情報化部位及び転写方向を示す図である。
【図３】  dfdA1遺伝子をプローブとして用いて行った、数種のDF資化性放線菌及びそれらの変異株のサザンハイブリダイゼーション分析を示す図である。パネルA：レーン１（テラバクター・エスピーYK1）、レーン２（ロドコッカス・エスピーYK2）、レーン３（テラバクター・エスピーYK3）、レーン４（ミクロバクテリウム・エスピーYK18）、レーン５及び６（ロドコッカス・エスピーYK2のDF自然資化能欠損変異株YK2-RD1及び2）、レーン７及び８（テラバクター・エスピーYK3のDF自然資化能欠損変異株YK3-TD1及び2）、レーン９及び10（ミクロバクテリウム・エスピーYK18のDF自然資化能欠損変異株YK18-MD1及び2）、並びにレーン11（精製プラスミドpYK3）パネルB：レーン１、２、３、４、５、６及び７（テラバクター・エスピーYK1株、YK3株、YK6株、YK7株、YK14株、YK17株及びYK21株）、並びにレーン８（テラバクター・エスピーDBF63株）サイズマーカーを左側に示す。
【図４】  dfdA1遺伝子のコード領域をプローブとして用いて行った、テラバクター・エスピーYK3のノーザンハイブリダイゼーション分析を示す図である。全RNAを、LB培養細菌（レーン１）、２時間及び６時間におけるグルコース誘導培養細菌（レーン２及び３）、２時間及び６時間におけるジベンゾフラン誘導培養細菌（レーン４及び５）から抽出した。2μgの全RNAを各レーンに導入した。パネルA：EtBr染色した変性アガロースゲルを示すパネルB：ハイブリダイゼーションシグナルを示す。矢印はSSU rRNA遺伝子の位置を表す。
【図５】ジオキシゲナーゼ遺伝子またはシャトルベクターで形質転換した放線菌によるジベンゾフラン及びジベンゾ-p-ジオキシンの変換産物を、HPLCで分析した結果を示す図である。各パネルは二つのクロマトグラムを重ねて示している。グレーのものはシャトルベクターpRK401で形質転換した放線菌のもので、黒のものはジオキシゲナーゼ遺伝子で形質転換した放線菌での結果を示す。(1)は基質未添加、(2)はジベンゾフラン添加、(3)はジベンゾ-p-ジオキシン添加の各休止培養液上清の275nmのHPLCクロマトグラムを示す。クロマトグラム中の矢印と囲みは、最も多量蓄積した代謝産物のピークとそのUV吸収スペクトルを示す。
【図６】ジオキシゲナーゼ遺伝子で形質転換した放線菌による、ジベンゾフラン及びジベンゾ-p-ジオキシンの変換産物を、ガスクロマトグラフ質量分析計で分析した結果を示す図である。各パネル上段にガスクロマトグラム、下段にクロマトグラム中の矢印で示すピークの質量分析結果を示す。(1)はジベンゾフラン添加の、 (2)はジベンゾ-p-ジオキシン添加の各休止培養液上清の酢酸エチル抽出物の分析結果を示す。
【図７】  dfdA1〜A4遺伝子及びそれらの欠失誘導体のYK2-RD2形質転換株によるジベンゾフラン変換活性を示す図である。5211bpのPstI断片のヌクレオチド配列に見出される推定オープンリーディングフレームを矢印で示す。PstI断片（dfdA1-A4）、PstI-SphI断片（dfdA1-A3）、SmaI断片（dfdA1-A3）及びPstI-ApaLI断片（dfdA1-A2）をシャトルベクターpRK401にサブクローニングし、それらをロドコッカス・エスピーYK2-RD2株の形質転換に使用した。得られた形質転換株のHPLCアッセイによるDF変換活性の有無（＋又は−）を各クローンの右側に示す。制限酵素の略字は、A（ApaLI）、N（NspV）、P（PstI）、Sm（SmaI）、Sp（SphI）を表す。スケールバーは1.0kbヌクレオチド長を示す。
【図１】
0004162040.tif 000021
【図２】
0004162040.tif 000022
【図３】
0004162040.tif 000023
【図４】
0004162040.tif 000024
【図５】
0004162040.tif 000025
【図６】
0004162040.tif 000026
【図７】
0004162040.tif 000027