(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボバクテリウム リュテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）に属する細菌から得ることのできるＬ−ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子、あるいは該遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ホモグルタミン酸の生産能が欠損したフラボバクテリウム リュテセンスの突然変異体の該生産能を回復しうる機能を有する改変体を含んでなり、さらに、
該Ｌ−ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子が、Ｌ−リジン：２−オキソグルタール酸 ６−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質およびピペリジン−６−カルボン酸 デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質全体をコードするＤＮＡであり、さらに
該Ｌ−リジン：２−オキソグルタレート ６−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが配列番号：１の塩基８０１〜塩基２２７６までの連続する塩基配列を含んでなるＤＮＡであり、一方
該ピペリジン−６−カルボン酸 デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号：２の塩基２８５５〜塩基４３８７まで連続する塩基配列を含んでなるＤＮＡである、
ことを特徴とする単離された純粋なＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号：１の塩基配列または配列番号：１の塩基５４５〜塩基２６５８までの連続する塩基配列からなる請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号：２の塩基配列または配列番号：２の塩基２０７７〜塩基４５７８までの連続する塩基配列からなる請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡを担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド。
【請求項５】
前記ＤＮＡが配列番号：１の塩基５４５〜塩基２６５８までの連続する塩基配列および／または配列番号：２の塩基２０７７〜塩基４５７８までの連続する塩基配列からなる請求項４記載の組換えプラスミド。
【請求項６】
フラボバクテリウム リュテセンスＩＦＯ ３０８４（ｐＣＦ２１３）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９７）から得ることのできる請求項４記載の組換えプラスミド。
【請求項７】
宿主としてフラボバクテリウム属に属する細菌を請求項４記載の組換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
【請求項８】
請求項４に記載の組換えプラスミドで形質転換することにより得ることのできる形質転換体を培地で培養し、培養中または培養後に、増殖した形質転換体をＬ−リジンまたは１−ピペリジン−６−カルボン酸と接触させ、Ｌ−ホモグルタミン酸に変換し、こうして生産されたＬ−ホモグルタミン酸を回収することを特徴とするＬ−ホモグルタミン酸の生産方法。
【請求項９】
形質転換体が請求項７に記載の形質転換体である、請求項８記載のＬ−ホモグルタミン酸の生産方法。
【請求項１０】
形質転換体がフラボバクテリウム リュテセンスＩＦＯ ３０８４（ｐＣＦ２１３）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９７）から得ることのできる組換えプラスミドで宿主フラボバクテリウム属に属する細菌を形質転換したものである請求項８記載のＬ−ホモグルタミン酸の生産方法。
【請求項１１】
請求項1に記載のＤＮＡがコードするタンパク質。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子操作に関し、より具体的には、Ｌ−ホモグルタミン酸（またはＬ−２−アミノアジピン酸もしくはＬ−α−アミノアジピン酸とも称されている）の生産に関与する遺伝子を含むＤＮＡ、ならびにそれらを使用するＬ−ホモグルタミン酸（以下、単にホモグルタミン酸という）の生産系に関する。
背景技術
ホモグルタミン酸は、細菌であるコレラ  ビブリオ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｂｒｉｏ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）をはじめとする植物体、カエルの胚など、生物界に広く見いだされている。真菌類などにおいてはリジン生合成の中間体として、そしてβ−ラクタム系抗生物質の生合成においては前駆体としての位置を占めている。また、ホモグルタミン酸は、メトトレキセート誘導体（ＷＯ  ９２／０９４３６）を始めとする各種医薬品の合成中間体としても有用である。
ところで、ホモグルタミン酸の化学合成による製造は光学分割や多段階反応を必要とすることから、コスト的に有効な手段とはなっていない。一方、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を用いて、Ｌ−リジンから製造する方法（特開平６−１８１７８７号公報）が知られている。また本発明者らの一部も、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を用いて、Ｌ−リジンからホモグルタミン酸を製造する方法を提案した（ＷＯ  ９６／３１６１６）。しかしながら、これらの微生物を用いる方法においても、さらに効率よくホモグルタミン酸を製造できる方法が切望されている。
そこで、本発明者らは、上記いずれかの微生物におけるホモグルタミン酸の生産系を、例えば遺伝子操作により増強することを目差した。かような操作に際し、参考にしうる情報について概観すると、例えば、セファマイシンＣの生合成経路の研究の一端として、セファマイシンＣ生産菌であるストレプトマイセス  クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）のＬ−リジンからα−アミノアジピン酸（または、ホモグルタミン酸）への変換に関与するリジン−６−アミノトランスフェラーゼや、△−１−ピペリジン−６−カルボン酸デヒドロゲナーゼの存在、また、前者については、該酵素をコードする遺伝子の存在位置等が確認されている（Ｆｕｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９７）３２７，５９−６４）。
また、Ｌ−リジンのバイオアッセイに用いられているフラボバクテリウム  リュテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｃｕｍから再同定された）ＩＦＯ  ３０８４について、下記のような経路を触媒する２−オキソグルタール酸  ６−アミノトランスフェラーゼ［またはリジン６−アミノトランスフェラーゼ（以下、ＬＡＴともいう）］が存在することが知られている（Ｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７（１９６８），４１０２−４１０９，同４１１０−４１１９）。
0004162383.tif 000002
上記バイオアッセイでは、ピペリジン−６−カルボン酸（以下、Ｐ６Ｃともいう）をｏ−アミノベンズアルデヒドと反応させて得られる生成物の吸光度が測定されている。また、Ｌ−リジンの別のバイオアッセイでは、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＬ−リジン６−デヒドロゲナーゼ活性が利用されている（Ｍｉｓｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ，，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１０５（１９８９），１００２−１００８）。
上記ＩＦＯ  ３０８４株は、上記のごとくＬ−リジンのバイオアッセイに常用されており、使用方法も確立されている。したがって、該ＩＦＯ  ３０８４株がＬＡＴに加えて、Ｐ６Ｃ（または、生体内では量的に平衡状態にあるといわれる２−アミノアジピン酸セミアルデヒド）のデヒドロゲナーゼ（以下、単にデヒドロゲナーゼともいう）活性タンパク質をコードする遺伝子を有するなら、本発明の目的、すなわち、ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を提供するとの目的に沿った遺伝子クローニング用の候補菌となり得るであろう。
発明の開示
本発明者らは、フラボバクテリウム  リュテセンスのリジン−６−アミノトランスフェラーゼ（ＬＡＴ）遺伝子（ｌａｔ）および、場合によって、Ｐ６Ｃに対するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のクローニングを試みてきた。しかし、かようなクローニング方法として、常用されている他の細菌のアミノトランスフェラーゼとのＤＮＡコンセンサス配列から目的の遺伝子を取得する方法や精製されたタンパク質のアミノ酸配列を決定した結果から得られる情報を利用する方法などは、初期の研究では、いずれも失敗に帰した。
ところが、意外なことに、本発明者が、最終的に選択した宿主−ベクター系を使用すれば、ショットガンクローニングにより、少なくともホモグルタミン酸の生産に関与しうる遺伝子、より具体的にはＰ６Ｃに対するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がクローニングできることを見い出した。また、かような遺伝子と一定の相同性（または同一性）を有する改変体も同様に機能することも見い出した。
一方、上記Ｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７（１９６８）、４１１０−４１１９には、アクロモバクター  リクウダム（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｏｒ ｌｉｑｕｉｄｕｍ）（＝Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｓｃｅｎｃｅ）から分子量１１６，０００の結晶ＬＡＴの取得方法が記載されており、そしてＹａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７（１９８０）、１３９５−１４０２にはフラボバクテリウム  リュテセンスからのＬＡＴがＡ、Ｂ１、Ｂ２およびＣの４つの非同一性サブユニットから構成されていることも記載されている。これらの記述に基づき、精製されたＬＡＴタンパク質のアミノ酸配列決定から得られた情報を利用して、ＬＡＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする初期の研究は失敗に帰した。しかし、これらの先行技術文献に記載されている方法とは全く異なる方法を用い、フラボバクテリウム  リュテセンスからＬＡＴ活性を有するタンパク質を精製し、得られたタンパク質のアミノ酸配列決定を行い、それらの配列情報を利用して目的の遺伝子のクローニングを行ったところ、ＬＡＴをコードする遺伝子（ｌａｔ）をクローニングすることに成功した。本発明は上記の知見に基づくものである。
したがって、本発明によれば、フラボバクテリウム  リュテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）に属する細菌から得ることのできるホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子、あるいは該遺伝子にストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホモグルタミン酸の生産能を欠損した突然変異体の該生産能を回復しうる機能を有する改変体を含んでなる単離された純粋なＤＮＡが提供される。
より具体的には、上記ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子は、ＬＡＴ活性を有するタンパク質およびデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を一部にまたは全体としてコードするＤＮＡあるいは、それらの改変体である。
本発明は、上記ＤＮＡを担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド、さらには、該組換えプラスミドで形質転換した形質転換体、さらには該形質転換体を使用するホモグルタミン酸の生産方法にも関する。
発明の具体的な態様
本発明に従う遺伝子の起源としては、例えば、フラボバクテリウム  リュテセンス（以下、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓともいう）を宿主として発現しうるホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を提供しうるものであれば、自然突然変異株を包含するＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓの如何なる菌株であってもよい。しかし、入手容易であり、培養等の好適な取り扱い条件が確立されている、上記ＩＦＯ  ３０８４株を好ましいものとして挙げることができる。
本発明にいう、ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子とは、Ｌ−リジンからＰ６Ｃ（ＬＡＴ活性）またはＰ６Ｃと化学的に平衡関係にある２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒドを経てホモグルタミン酸に至る（デヒドロゲナーゼ活性）２段階の変換系に関与しうるいずれかの遺伝子を意味する。まず最初に、後者の変換系であるデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の具体的なものとしては、本発明者らが以下のような戦略に基づいて確立した宿主−ベクター系を使用して得ることのできるものが挙げられる。
Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓの遺伝子操作を行うためには、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓの適当な宿主−ベクター系の確立が必要であるが、これには次の３つの課題を解決する必要がある。
（１）  Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ内で自律複製するレプリコンを得る。
（２）  Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ内で発現し、かつ機能する薬剤耐性マーカーを得る。
（３）  Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ内へのＤＮＡ導入法を確立する。
上記（１）および（２）の課題は、幸運なことに、最近Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ社より発売された、広範囲のグラム陰性細菌で自律複製し、カナマイシン、クロラムフェニコール耐性を有するｐＢＢＲ１２２が使用できることを見い出して解決できた。上記（３）の課題解決には、まず、上記プラスミドｐＢＢＲ１２２のＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ内への導入法が確立されることが前提になる。ところが、エレクトロポーレーション法によるＥ．ｃｏｌｉへのＤＮＡ導入法をもとに検討した結果、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬプレートにＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓのコロニーが生え、これを液体培養してアルカリＳＤＳ法によってプラスミドを抽出したところｐＢＢＲ１２２は安定にＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓに保持されていることを確認できた。こうして、上記（３）の課題も解決できた。この宿主−ベクター系は、他のバクテリアを宿主にした場合には、（ａ）形質転換効率が非常に高く、（ｂ）適当な大きさのＤＮＡ断片をｐＢＢＲ１２２に挿入できることそれ自体は知られていたが（Ｊ．Ｂａｃ．１７８（１９９６），１０５３−１０６０）、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓでも前述の（ａ）、（ｂ）が可能なことを明らかにし、さらに取得した遺伝子のＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ内での増幅を可能にしたばかりでなく、Ｐ６Ｃに対するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をショットガンクローニングによって取得することも可能にした。さらに操作を容易にすべくｐＢＢＲ１２２のクロラムフェニコール耐性遺伝子の代わりにｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトを導入したｐＣＦ７０４を作成し、これを以後ベクターとして用いた。
次に、取得または増幅した遺伝子を評価する系を確立するため、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４にＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）により突然変異を誘発させ、エオジンＹを含むＭＥＭプレート（ｐＨ７．０）を用いてスクリーニングした。
こうして取得した、ホモグルタミン酸を全く生産しない第一変異株とわずかしか生産しない第二および第三変異株を取得した。このホモグルタミン酸を全く生産しない第一変異株には野生型株と同等のｌａｔ活性が確認され、わずかしか生産しない第二および第三変異株にはｌａｔ活性がわずかしか確認されなかった。すなわち、第一変異株はｌａｔ以外のホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子に何等かの傷害を受けており、一方第二および第三変異株には少なくともｌａｔに何等かの傷害を受けている可能性がある。
次に、野生型株のゲノムＤＮＡをＳａｕＩＩＩＡＩで部分消化し、その６−８Ｋｂｐ断片をｐＣＦ７０４のＢａｍＨＩ部位に挿入したＤＮＡライブラリーを作成した。これらを上記第一、第二および第三変異株にそれぞれ導入し、ホモグルタミン酸生産能を回復する株をスクリーニングした。この際、変異株のスクリーニングに使用したエオジンＹを含むＭＥＭプレート（ｐＨ７．０）で黒くなるコロニーを拾い、ＴＬＣでホモグルタミン酸生産能を確認するという方法を用いた。なお、これらの変異株の代表的なものとし、第二変異株（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｉｕｔｅｓｃｅｎｓ  ２ｎｄ  ｍｕｔａｎｔ）は、平成１０年７月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８７４が付され、そして第一変異株（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  １ｓｔ  ｍｕｔａｎｔ）は、平成１１年６月１０日付で同研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４１９が付されて、それぞれ保管されている。これらのＦＥＲＭ  Ｐ−１６８７４株およびＦＥＲＭ  Ｐ−１７４１９株は、その後、平成１１年７月２６日付で同研究所のブタペスト条約上の国際寄託当局に寄託が移管され、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８およびＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９９の受託番号で国際寄託されている。
この結果、第一変異株のホモグルタミン酸の生産性を相補するプラスミドを有する株および第二変異株のホモグルタミン酸の生産性を部分的に相補するプラスミドを有する株がそれぞれ得られた。しかし、これらの株、特に第二変異株を相補する株のプラスミドは欠失が起きやすいらしく、安定なプラスミドを取得するためのさらなるスクリーニングが必要であった。制限酵素処理によるＤＮＡフラグメント解析の結果、こうして得られた第一変異株を相補し、第二変異株を部分的に相補するｐＣＦ１１１と命名したプラスミドとｐＣＦ２１３と命名したプラスミドは見かけ上全く同一のプラスミドであった。
一方、ｐＣＦ１１１およびｐＣＦ２１３を第一、第二および第三変異株にそれぞれ再形質転換し、ホモグルタミン酸生産能をＴＬＣで調べた。この結果両プラスミドとも第一変異株を相補したが、第二および第三変異株は部分的に相補しただけであった。
かような相補試験に基づき、ホモグルタミン酸の生産性が欠損した変異株のホモグルタミン酸生産能を十分に回復するプラスミドには、本発明に従う少なくともホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子、より具体的にはｌａｔ以外のいずれかの遺伝子が存在することになる。
したがって、限定されるものでないが、本発明にいう「Ｌ−ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子の一つとしては、プラスミドｐＣＦ２１３のインサート部分に含まれており、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。例えば、この遺伝子は配列番号：２に示される配列中に存在する。
一方、前者の変換に関与する、すなわち本発明に従うＬＡＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、次のようにしてクローニングできる。
一定の培養条件下にてＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓを培養して取得した菌体を破砕した後、破砕液を遠心分離して菌体破砕物を除去し、こうして得られる細胞抽出液から、超遠心処理、硫酸アンモニウム沈殿、脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、等を経て、目的のタンパク質を単離精製する。
精製されたタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の解析結果から、ＤＮＡプライマーを設計し、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ（ＩＦＯ  ３０８４）株のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をもとにさらにＰＣＲを行い、該ＤＮＡ断片の両外側の周辺領域を取得する。こうして、本発明の目的とするタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
したがって、Ｌ−ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子のもう一つとして、ＬＡＴ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供可能になる。すなわち、本発明のもう一つの遺伝子としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列のコーティング領域を構成する配列を有するものを挙げることができる。なお、対応する精製されたタンパク質のＮ末端は、配列番号：１に記載されるとおりＳｅｒであるが、その上流の遺伝子にコードされるＭｅｔまでのアミノ酸配列は、翻訳後にプロセッシングを受けて除かれるものと考えられる。
さらに、本発明にいうホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を含んでなるＤＮＡには、上記のデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とＬＡＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ１個以上含まれているＤＮＡも包含される。
加えて、本発明にいう遺伝子には、上記両遺伝子の改変体であって、それぞれ両遺伝子に対して、一定のハイブリダイゼーション条件下、例えば、６０℃で２×ＳＳＣ（標準クエン酸食塩水）中、好ましくは６０℃で０．５×ＳＳＣ中、特に好ましくは６０℃で０．２×ＳＳＣ中のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつホモグルタミン酸の生産能が欠損した。Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓの突然異変体の該生産能を回復しうる機能を有する改変体も包含される。
より具体的には、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の改変体は、配列番号：２における塩基２８５５〜塩基４３８７の塩基配列と少なくとも７０％の同一性を示すものであり、また、ＬＡＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の改変体は、配列番号：１における塩基５４５〜塩基２６５８の塩基配列（コーディング領域）と少なくとも５０％、好ましくは７０％、さらに好ましくは９５％の同一性を示すものである。
このような改変体は、上記両配列の、それぞれ、５′末端もしくは３′末端または途中において塩基が除去または付加されたもの、あるいは塩基の一部が他の塩基により置換されているものを含む。この塩基の一部が他の塩基により置換されている改変体には、同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重に伴い、上記両遺伝子と異なる塩基配列を有するものも含まれる。
遺伝暗号の縮重に伴うもの以外の塩基の置換は、それぞれ、上記両遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を参照し、各アミノ酸に由来する側鎖の類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基準に、タンパク質全体として類似の形状を有するように、行うのがよい。こうして、改変体は、上記両遺伝子と同等の機能、すなわち、ホモグルタミン酸の生産能が欠損したＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓの突然変異体の該生産能を回復しうる機能を有するものが、相当高い確率で得られるであろう。
本発明に従う改変体は、上記両遺伝子の塩基配列またはそれらによってコードされる推定アミノ酸配列を参考に、核酸合成機を用いて合成するか、あるいは、自体既知の点突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により作成することができる。
本発明によれば、上記のような遺伝子または改変体を担持する、組換えプラスミドも提供することができる。かようなプラスミドは、上記遺伝子または改変体以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等を含む自律複製性であることができる。さらに、プラスミドは、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列を含め、組込み型プラスミドであることもできる。例示として、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡを担持する自律複製性の組換えプラスミドとしては、プラスミドｐＢＢＲ１２２や、ｐＢＢＲ１２２の特定の部位にマルチクローニング部位を挿入するかまたは該部位もしくは領域をマルチクローニング部位で置換し、そのマルチクローニング部位を介して上記遺伝子や改変体を挿入したものが挙げられる。このようなプラスミドの具体的なものとしては、本明細書でプラスミドｐＣＦ１１１およびｐＣＦ２１３と称するものを挙げることができる。ｐＣＦ２１３は、平成１０年３月１１日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６９９が付され、その後、上述のようにブタペスト上の国際寄託へ移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９７が付されたＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４（ｐＣＦ２１３）から、それ自体既知のプラスミド単離法により得ることができる。ＬＡＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡを担持する組換えプラスミド、および両遺伝子を含むＤＮＡを担持する組換えプラスミドも、上記ｐＣＦ２１３と同様に作成することができる。
本発明によれば、さらに、宿主としてフラボバクテリウム属に属する細菌を、上記組換えプラスミドで形質転換して得られる形質転換体も提供される。フラボバクテリウム属に属する宿主細菌は、本発明の目的に沿う限り、如何なる種の如何なる株であってもよいが、好ましいものとしては、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４およびＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＳＰ．７−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５７）を挙げることができる。
したがって、上記形質転換体の具体的な一例としては、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４およびＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＳＰ．７−１をｐＣＦ２１３で形質転換したものを挙げることができ、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４（ｐＣＦ２１３）は、上記ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９７で生命工学工業技術研究所の国際寄託当局に寄託されている。
本発明によれば、また、上記形質転換体を用いるホモグルタミン酸の生産方法が提供される。かような方法では、培地で培養中に増殖した形質転換体を、出発原料、Ｌ−リジンまたは場合により、Ｐ６Ｃ（もしくは２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒド）と接触させるか、あるいは増殖した形質転換体またはその処理菌体（例えば、有機溶媒処理物、菌体抽出物、固定化処理物）と接触させ、出発原料をホモグルタミン酸に変換する。
培地の炭素源としては、形質転換体の利用可能なものであれば如何なるものも使用でき、宿主として、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓを用いた場合には、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコール、フマル酸、クエン酸等の有機酸を使用でき、これらの炭素源の培地への添加量は、通常、０．１〜１０重量％（以下、％と略称する）程度とすることが望ましい。
培地の窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸アンモニウム塩やフマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸アンモニウム塩ないし、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物等の天然窒素源を使用でき、これらの窒素源の培地への添加量は、通常、０．１〜１０％程度とすることが望ましい。
また、無機塩類としては、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸アルカリ金属塩や塩化カリウム、塩化ナトリウム、等の塩化アルカリ金属塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金属塩を使用でき、これらの無機塩類の培地への添加量は、通常、０．００１〜１％程度とすることが望ましい。
これらのうち、通常の細菌用の増殖培地を用いた液体培養が好ましく、炭素源としてはグルコース、マルトース、澱粉などが、窒素源としては硫酸アンモニウム、ペプトン、酵母エキス、大豆粉などが特に有効である。その他に、無機塩としてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、食塩などが通常用いられる。
微生物の培養は、上記の培地で２０〜４０℃、好ましくは２８〜３７℃でｐＨは５〜９、好ましくは６〜８で好気的条件下で実施すればよい。
培養中に、上記により増殖した形質転換体と出発原料の接触は、予め培地に出発原料を加えておくか、または培養中に出発原料を適宜加えることにより行う。また、培養終了後に、集菌した菌体または処理菌体と出発原料を培地または適当な緩衝液中で、必要により適当な補酵素等を加え、反応器中で撹拌または振盪するか、固定された菌体上に出発原料含有物を流動させることにより、上記接触を行うことができる。
培養中に形質転換体とＬ−リジンを接触させる場合を例に、さらに具体的に説明すると次のとおりである。培地に形質転換体を接種した後、例えば、２０〜４０℃で１２〜１２０時間培養することにより、形質転換体である微生物を１ｍｌ中に１０６〜１０１０個含む菌株培養液を得、その培養液に原料化合物であるＬ−リジンを通常、最終濃度が０．５〜３０ｍｇ／ｍｌになるように水または補助溶剤に溶解して加えるか、または溶解せずにそのまま添加し、通常、２０〜４０℃で１８時間〜７日、好ましくは１８時間〜５日反応させ、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等を用いた各種イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰ２０などの吸着クロマトグラフィー、溶媒や温度を利用しての沈殿化や結晶化等の通常の精製手段によりホモグルタミン酸を得ることができる。
添加するＬ−リジンの形状及び添加時期については特に制限されるものではないが、溶解性などの点から一塩酸塩として用いるのが好ましく、培養開始時の添加でもよく培養途中１〜５日目にも添加してもよい。
本発明によれば、Ｌ−リジンをホモグルタミン酸に変換するホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を含むＤＮＡが提供される。このＤＮＡは、ホモグルタミン酸の微生物学的な生産方法において有用である。また、本発明によれば、ホモグルタミン酸を効率よく生産しうる形質転換体およびその使用によるホモグルタミン酸の生産方法も提供される。
以下、具体例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの具体例は本発明の理解を容易にするために提供するものであって、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。
実施例１：デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子のクローニング等
１．ホモグルタミン酸非生産株の取得
Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株をＬ培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、グルコース０．１％、ｐＨ７．２）３ｍｌに植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその１００μｌをＬ培地５０ｍｌに植菌し、３２℃で４．５時間振盪培養した。この培養液から菌体を５０００×ｇ、１０分間の遠心分離で集菌し、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で一回洗浄し、０．２Ｍリン酸バッハァー（ｐＨ６．０）６ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液に８０ｍｇ／ｍｌ  ＮＴＧを５０μｌ加え、３２℃で２０分間振盪培養した。この培養液から集菌した菌体を０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で一回洗浄し、全量をＬ培地５０ｍｌに植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。この培養液を５００μｌずつ分注し、これに６０％グリセロール溶液５００μｌを加えてよく混合し、−７０℃で凍結保存したものを変異株保存液とした。
この変異株保存液を０．８５％ＮａＣｌで１０６倍希釈し、８ｃｍシャーレのＭＥＭ寒天培地ｐＨ７．２（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、リジン−ＨＣｌ  １．０％、メチレンブルー０．００６％、エオジンＹ０．０４％、寒天１．５％、ｐＨ７．２）に１００μｌずつ塗布し、３２℃で三日間培養した。生えてきたコロニーのうち白色を呈しているコロニーをスクリーニング培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％、リジン−ＨＣｌ  １．０％、ｐＨ７．２）１ｍｌに植菌し、３２℃で二日間振盪培養した。この培養液３μｌをシリカゲルＴＬＣプレートの各レーンに滴下し乾燥させた。このプレートをブタノール：酢酸：水（３：１：１）からなる溶媒系で展開し、ニンヒドリン発色して各クレーン毎にホモグルタミン酸の有無を調べた。このようにして変異株の中から全くホモグルタミン酸を生産しない第一変異株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９９）と、ほんのわずかだけホモグルタミン酸を生産する第二変異株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）、第三変異株を分離した。Ｌ−リジンからホモグルタミン酸への変換能（またはホモグルタミン酸の生産性）をＴＬＣ分析により調べた結果を図１に示す。なお図１中ホモグルタミン酸はＨＧと表示されている（他の図においても同様）。また、これらの変換株におけるｌａｔ活性の測定結果を図２に示す。
２．宿主−ベクター系、形質転換系の構築
Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株をＬ培地３ｍｌに植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその１００μｌをＬ培地５０ｍｌに植菌し、３２℃で４．５時間振盪培養した。この培養液から菌体を５０００×ｇ、１０分間の遠心分離で集菌し、１０％グリセロール溶液で一回洗浄し、１０％グリセロール溶液３ｍｌに懸濁した。この懸濁液を２００μｌずつ分注し、−７０℃で凍結保存したものをエレクトロセル保存液とした。この保存液を氷上で融解し、Ｂｒｏａｄ  Ｈｏｓｔ  Ｒａｎｇｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＢＢＲ１２２（Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ社）２００μｇ／ｍｌ  ＴＥ溶液１μｌを加えた。これを０．２ｃｍのエレクトロキュベット（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｕｖｅｔｔｅ）（ＢＩＯＲＡＤ社）に入れ、ジーンパルサー（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）ＩＩ（ＢＩＯＲＡＤ社）を用い２．４ＫＶ、２００Ω、２５μＦの条件で一回電気パルスをかけた。このセルをファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに入れ、氷冷したＬ培地１ｍｌを加え、３２℃で２時間振盪培養した。この培養液をカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬ寒天培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、グルコース０．１％、寒天１．５％、ｐＨ７．２）に塗布し、３２℃で三日間培養した。２．４×１０５個の形質転換株を得た。
３．プラスミドｐＣＦ７０４の構築
末端にＥｃｏＲＩサイトとＮｃｏＩサイトを付着したプライマーを合成（ファルマシア社）し、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ファルマシア社）とＰＣＲサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ）ＰＥＲＳＯＮＡＬ（ＴａＫａＲａ社）を用い、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトとその周辺領域９５ｂｐを増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｃｏＩで消化し、ｐＢＢＲ１２２のＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩサイトにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（ＴａＫａＲａ社）を用いて連結反応した。この反応液でＥ．ｃｏｌｉコンピテント細胞ＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ社）を形質転換して得た形質転換株からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＣＦ７０４を調製した。
４．プラスミドｐＣＦ２１３の構築
Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株のゲノムＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｋｉｔに従って抽出精製した。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｕＩＩＩＡＩで部分分解し、その６〜８Ｋｂｐ断片をアガロースゲルから切り出し、ウルトラフリーＣ３ユニット０．４５μｍ（ミリポア社）を用いてＤＮＡを回収精製しＴＥ溶液に溶解したものをインサートＤＮＡ溶液とした。一方、ｐＣＦ７０４を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化した。これとインサートＤＮＡ溶液とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（ＴａＫａＲａ社）を用いて連結反応したものをＤＮＡライブラリーとした。
このＤＮＡライブラリーを第二変異株のエレクトロセル保存液に加え、電気パルスをかけた。このセルをＦａｌｃｏｎチューブに入れ、氷冷したＬ培地１ｍｌを加え、３２℃で２時間振盪培養した。この培養液全量をカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌＬ培地に植菌し３２℃で二日間振盪培養した。この培養液を５００μｌずつ分注し、これに６０％グリセロール溶液５００μｌを加えてよく混合し、−７０℃で凍結保存したものを相補株保存液とした。
この相補株保存液を０．８５％ＮａＣｌで１０３倍希釈し、８ｃｍシャーレのＭＥＭ寒天培地ｐＨ７．０（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、リジン−ＨＣｌ  １．０％、メチレンブルー０．００６％、エオジンＹ０．０４％、寒天１．５％、ｐＨ７．０）に１００μｌずつ塗布し、３２℃で三日間培養した。一面に生えてきた菌体のうち黒色を呈している部分を相補株混合菌体とした。この相補株混合菌体をスクリーニング培地３ｍｌに植菌し、３２℃で二日間振盪培養した。この培養液３μｌをシリカゲルＴＬＣプレートの各レーンに滴下し乾燥させた。このプレートをブタノール：酢酸：水（３：１：１）からなる溶媒系で展開し、ニンヒドリン発色により各レーン毎にホモグルタミン酸の有無を調べた。このようにしてホモグルタミン酸生産能を回復している相補株混合菌体を選び、さらにシングルコロニーに分離し、ホモグルタミン酸生産能を回復している株を選び、これらを相補株とした。これらの相補株をからＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いて調製した一つのプラスミドをｐＣＦ２１３とした。ｐＣＦ２１３には約６．５ＫｂｐのインサートＤＮＡが挿入されていた。なお、別途得られたプラスミドｐＣＥ１１１の各変異株に対する相補性と共に、上記ｐＣＦ２１３の相補性を調べた結果を、図３に示す。
５．ｐＣＦ２１３によるホモグルタミン酸生産能の向上
ｐＣＦ７０４で野生型Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株を形質転換した株をＷｉｌｄ  ｐＣＦ７０４株、ｐＣＦ２１３で形質転換した株をＷｉｌｄ  ｐＣＦ２１３株とした。両者をカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むスクリーニング培地３ｍｌに植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその１００μｌを生産培地（ポリペプトン１．５％、酵母エキス０．５％、リジン−ＨＣｌ  ２．０％、ｐＨ無調整）２５ｍｌに植菌し、３２℃で２４時間、４８時間、７２時間それぞれ振盪培養した。この培養液の上清中のホモグルタミン酸量をＨＰＬＣで測定した。すなわち培養液をアミノ酸総濃度で１０００ｍｇ／Ｌ程度になるよう蒸留水で希釈し、５０μｌを試験管に移し減圧乾固した。ここにフェニルイソチオシアネートとトリエチルアミンとエタノールと蒸留水を１対１対７対２で混合した溶液を５０μｌ加え、撹拌溶解、１０分間室温においた後減圧乾固した。これＨＰＬＣの移動相Ａ溶液５００μｌに溶解、５μｌをインジェクトした。ＨＰＬＣ条件を下記に示した。
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳ  ４．６ＩＤ×５０ｍｍ
移動相：Ａ溶液  １４０ｍＭ  酢酸ナトリウム−０．０５％  トリエ
チルアミンを氷酢酸でｐＨを６．２に調整した溶液
１０００対アセトニトリル４０
Ｂ溶液  ７０％アセトニトリル
流速：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出条件：流速一定のグラジエント、０分から７分までＢ溶液２％か
ら４０％へのリニアグラジエント、７分以降Ｂ溶液１００％
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：４０℃
この条件でホモグルタミン酸の保持時間は１．３ｍｉｎ、リジンは７．７ｍｉｎであった。
この結果図４に示したように野生型ｐＣＦ２１３株は野生型ｐＣＦ７０４株の１．５培のホモグルタミン酸生産能を有する。
６．ｐＣＦ２１３インサート領域の遺伝子塩基配列の決定
ｐＣＦ２１３インサート領域についてＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７ＸＬ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いプライマーウォーキング法により塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号：２に示した。
決定された塩基配列をもとにＢｉｂｂらの方法（Ｇｅｎｅ，３０，１５７（１９８４））に従ってオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を調べた。その結果図５に示したＯＲＦを見いだした。
７．ｐＣＦ２１３インサート領域のＮｏｔＩ部位約２．５Ｋｂｐの解析
ｐＣＦ２１３インサート領域のうち制限酵素ＮｏｔＩ部位約２．５Ｋｂｐ（配列番号：２の塩基配列２０７７−４５７８位）について解析を行った。このＮｏｔＩ部位約２．５Ｋｂｐをアガロースゲルから切り出し、ウルトラフリーＣ３ユニット０．４５μｍ（ミリポア社）を用いてＤＮＡを回収精製しＴＥ溶液に溶解し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）に従って末端を平滑化たものをインサートＤＮＡ溶液とした。一方、ｐＣＦ７０４を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化し、アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化した。これとインサートＤＮＡ溶液とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １（ＴａＫａＲａ社）を用いて連結反応した。この反応液でＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株を形質転換して得た形質転換株から、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＣＦ２３５を調製した。
ｐＣＦ２３５で形質転換した第一変異株をスクリーニング培地３ｍｌに植菌し、３２℃で二日間振盪培養した。この培養液３μｌをシリカゲルＴＬＣプレートの各レーンに滴下し乾燥させた。このプレートをブタノール：酢酸：水（３：１：１）からなる溶媒系で展開し、ニンヒドリン発色して各レーン毎にホモグルタミン酸の有無を調べた。この結果ｐＣＦ２３５で形質転換した第一変異株はホモグルタミン酸生産能を回復した。
なお、ｐＣＦ２３５に組み込んだＤＮＡ配列約２．５Ｋｂｐには、配列番号：２の塩基配列２８５５番目のＡＴＧから始まり４３８７番目のＴＡＡで終わる５１０アミノ酸をコードするＯＲＦが存在した。このアミノ酸配列をＢＬＡＳＴによるホモロジーサーチにかけた結果、種々のアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い相同性を示し、さらに最近データベースに登録されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのピペリジン−６−カルボン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（Ｊ．Ｂａｃ，，Ｖｏｌ．１８０，Ｎｏ，１７，４７５３−４７５６（１９９８））と全域にわたり高い相同性を示した。ｐＣＦ２３５で形質転換した第一変異株がホモグルタミン酸生産能を回復したこと、および野生型ｐＣＦ２１３株のホモグルタミン酸生産能が向上したことを考え合わせると、このＯＲＦがコードする蛋白質はピペリジン−６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するものとみなせる。
実施例２：ＬＡＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のクロー
ニング等
１．ＬＡＴ活性測定
リジン−ＨＣｌ  ７３ｍｇ、２−ケトグルダール酸５９ｍを、０．５ｍＭピリドキサル  リン酸を含む０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）１ｍｌに溶かし、これを反応溶液とした。酵素溶液２６０μｌに反応溶液２８．７５μｌを加え、３２℃に１時間置いた。エタノールに溶かした５％トリクロロ酢酸１５１．８μｌを加えて反応を止め、それを遠心した上清６０μｌに４ｍＭ  Ｏ−アミノベンズアルデヒドを含む０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）９０μｌを加え３７℃に１時間置いた。これのＡ４６５を測定し、相対的にＡ４６５が高いフラクションをＬＡＴ活性画分とした。
２．菌株の培養
Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株を３２℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその５０ｍｌを３０ｌジャーのｆｌａｖｏ−Ｍ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．６％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％、ＮＨ４Ｃｌ  ０．１％、ＮａＣｌ  ０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、リジン−ＨＣｌ  ０．５％、シリコーンＫＭ７５  ０．００５％、ＭｇＳＯ４  ０．０２５％、ＣａＣｌ２  ０．００１５％、ｐＨ７．２）１０Ｌに植菌し、１７時間通気撹拌培養した。得られた培養液５Ｌを遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）して菌体を集め、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。これを同緩衝液に懸濁し、菌体を超音波破砕した。遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）により菌体破砕物を除き、細胞抽出液を得た。これを超遠心処理（１６，０００×ｇ、９０分間）してその上清画分を以下に述べる精製操作に供した。
３．酵素の精製
以下に示す精製操作は、特に断らない限り、全て４℃にて行った。
（１）硫酸アンモニウム分画
実施例１で得た上清画分６００ｍｌを硫酸アンモニウム沈殿により精製した。３０％飽和から８０％飽和の画分にて生じた沈殿を遠心分離（１，０００×ｇ、３０分間）して集め、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。
（２）脱塩
透析した酵素溶液１０ｍｌをＰＤ１０カラム（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４本に付し０．５ｍＭピリドキサル  リン酸を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し、脱塩した。
（３）ＱＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＬ５５０Ｃカラムクロマトグラフィー
脱塩した酵素溶液を予め０．５ｍＭピリドキサル  リン酸を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＬ５５０Ｃ（ＴＯＳＯＨ）カラム（φ５．５×６．０ｃｍ）に付した。同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液を用いた２ｌの塩化ナトリウムリニアグラジエント（０〜１．０Ｍ）で溶出し、ＬＡＴ活性画分を集めた。
（４）Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＲＬ６５０Ｓカラムクロマトグラフィー
ＬＡＴ活性画分に１Ｍ硫酸アンモニウムを加え、これを予め０．５ｍＭピリドキサル  リン酸と１Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＲＬ６５０Ｓ（ＴＯＳＯＨ）カラム（φ５．５×３．０ｃｍ）に付した。同緩衝液を用いた１２００ｍｌの硫酸アンモニウムグラジエント（０．８〜０Ｍ）で溶出し、ＬＡＴ活性画分を集めた。
（５）限外ろ過
１５０ｍｌのＬＡＴ活性画分をＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＵＰ−２０で限外ろ過し、１５ｍｌとした。この濃縮液２．５ｍｌをＰＤ１０カラム（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に付し０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出、脱塩した。
（６）ＡＫＴＡ  ＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラムクロマトグラフィー
脱塩した酵素溶液３．５ｍｌを予め０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳシステムのＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラム（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に付した。同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液を用いた４０ｍｌの塩化ナトリウムリニアグラジエント（０〜０．４Ｍ）で溶出し、ＬＡＴ活性画分を集めた。さらにこのＬＡＴ活性画分５ｍｌをＰＤ１０カラムで脱塩し、再度ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳシステムのＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラムに付し、ＬＡＴ活性画分を集めた。各各画分と相対的ＬＡＴ活性の関係を図６に示す。
（７）電気泳動
ＬＡＴ活性画分をマルチゲル４／２０および１０／２０第一化学薬品（株）に付し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図７に示した。ＬＡＴ活性画分にはＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分子量１０００００付近、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量５５０００付近のバンドが確認された。このＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量５５０００付近のバンドをＰｈａｓｔＴｒａｎｓｆｅｒ（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりＰＶＤＦ膜にブロッティングした。
４．Ｎ末端アミノ酸配列解析
ブロッティングしたバンドのＮ末端アミノ酸配列解析をＨＰ  Ｇ１００５Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ）を用いエドマン分解法により行った。この結果Ｎ末端アミノ酸配列は
0004162383.tif 000003
であることが明らかになった。これに基ついて
0004162383.tif 000004
というＤＮＡプライマーをデザインし、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ＫＩＴ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は９４℃３０秒→５５℃２分→７２℃１分の３０サイクルとした。この結果、上記末端とその上流領域を含む約４００ｂｐのＰＣＲ増幅断片が得られた。このシークエンスをもとにその周辺領域をさらにＰＣＲを用いて取得した。すなわちＦ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩとＳａｌＩでそれぞれ消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（ＴａＫａＲａ社）を用いてそれぞれ自己連結反応したものをテンプレートＤＮＡとした。このテンプレートＤＮＡに対し、
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というＤＮＡプライマーをデザインし、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は９８℃２０秒→６８℃６分の３０サイクルとした。この結果ＰｓｔＩテンプレートから約２Ｋｂｐ、ＳａｌＩテンプレートから約８ＫｂｐのＰＣＲ増幅断片が得られた。これらのＰＣＲ増幅断片についてＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７ＸＬ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いプライマーウォーキング法により塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。
５．プラスミドｐＣＦ３０１、ｐＣＦ３３５の構築
配列表：１の５４５塩基と２６５８塩基のＰｓｔＩ部位をそれぞれＫｐｎＩ、ＳａｃＩに改変したＤＮＡプライマー
0004162383.tif 000006
を作成し、これを用いてＰＣＲ反応を行いｌａｔ遺伝子領域を増幅した。この増幅断片約２．１Ｋｂｐを制限酵素ＫｐｎＩ、ＳａｃＩで消化したものをインサートＤＮＡ溶液とした。一方、ｐＣＦ７０４を制限酵素ＫｐｎＩ、ＳａｃＩで消化し、これとインサートＤＮＡ溶液とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（ＴａＫａＲａ社）を用いて連結反応したプラスミドをｐＣＦ３０１とした。さらにｐＣＦ３０１を制限酵素ＫｐｎＩ、ＳａｃＩで消化し、その約２．１Ｋｂｐ断片をアガロースゲルから切り出し、これとｐＣＦ２３５を制限酵素ＫｐｎＩ、ＳａｃＩで消化したものとを連結反応したプラスミドをｐＣＦ３３５とした。
６．プラスミドｐＣＦ３０１によるｌａｔ活性の相補
ｐＣＦ７０４で第二変異株を形質転換した株を２ｎｄ  ｐＣＦ７０４株、ｐＣＦ３０１で第二変異株を形質転換した株を２ｎｄ  ｐＣＦ３０１株とした。これらの株を３２℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその３０μｌを遠沈管の生産培地（ポリペプトン１．５％、酵母エキス０．５％、リジン−ＨＣｌ  ２．０％、ｐＨ無調整）３ｍｌに植菌し、１７時間通気撹拌培養した。得られた培養液１ｍｌを遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）して菌体を集め、０．５ｍＭピリドキサル  リン酸を含む０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）１０ｍｌで洗浄した。これを同緩衝液１ｍｌに懸濁し、菌体を超音波破砕した。遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）により菌体破砕物を除き、細胞抽出液を得た。この抽出液のｌａｔ活性を測定した。この結果を図８に示す。ｐＣＦ３０１は第二変異株のｌａｔ変異を相補した。
７．ｐＣＦ３３５によるホモグルタミン酸生産能の向上
ｐＣＦ７０４で野生型Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株を形質転換した株を野生型ｐＣＦ７０４株、プラスミドｐＣＦ３０１、ｐＣＦ３３５で形質転換した株を野生型ｐＣＦ３０１株、野生型ｐＣＦ３３５株とした。これらの株ををカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むスクリーニング培地３ｍｌに植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその１００μｌを生産培地（ポリペプトン１．５％、酵母エキス０．５％、リジン−ＨＣｌ  ２．０％、ｐＨ無調整）２５ｍｌに植菌し、３２℃で２４時間、４８時間、７２時間それぞれ振盪培養した。この培養液の上清中のホモグルタミン酸量をＨＰＬＣで測定した。すなわち培養液をアミノ酸総濃度で１０００ｍｇ／Ｌ程度になるよう蒸留水で希釈し、５０μｌを試験管に移し減圧乾固した。ここにフェニルイソチオシアネートとトリエチルアミンとエタノールと蒸留水を１対１対７対２で混合した溶液を５０μｌ加え、攪拌溶解、１０分間室温においた後減圧乾固した。これＨＰＬＣの移動相Ａ溶液５００μｌに溶解、５μｌをインジェクトした。ＨＰＬＣ条件は、実施例１の５に記載したとおりである。
この結果、図９に示すように野生型ｐＣＦ３３５株は野生型ｐＣＦ７０４株の約２倍のホモグルタミン酸生産能を有していた。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  の変異株によるホモグルタミン酸生産の薄層クロマトグラフィーによる分析結果を示す図である。Ｓｔは、標準のホモグルタミン酸（ＨＧ）であり、レーン１〜４は第一変異株、レーン５〜７は第二変異株、レーン８〜１０は第三変異株、レーン１１は野生型株、レーン１２および１３はプラスミドｐＣＦ７０４を有する第一変異株の分析結果を、それぞれ示す。
図２は、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  の変異株のリジン６−アミノトランスフェラーゼ（ＬＡＴ）活性のグラフ表示である。Ｗｉｌｄは野生型株、１ｓｔは第一変異株、２ｎｄは第二変異株、３ｒｄは第三変異株のＬＡＴ活性を示す。
図３は、プラスミドｐＣＦ２１３によるホモグルタミン酸生産性欠損変異株のホモグルタミン酸生産性の相補性を示す薄層クロマトグラフィーによる分析の結果を示す。
ＨＧはホモグルタミン酸の移動位置を、ＬｙｓはＬ−リジンの移動位置を示し、そしてＳｔはホモグルタミン酸標準物質の、１ｓｔ  ｐＣＦ２１３、２ｎｄ  ｐＣＦ２１３および３ｒｄ  ｐＣＦ２１３は、それぞれｐＣＦ２１３を有する第一、第二および第三変異株の培養物の、Ｗｉｌｄ  ｐＣＦ２１３およびＷｉｌｄ  ｐＣＦ７０４は、それぞれｐＣＦ２１３およびｐＣＦ７０４を有する野生型株の培養物の、１ｓｔ  ｐＣＦ７０４および２ｎｄ  ｐＣＦ７０４は、それぞれｐＣＦ７０４を有する第一および第二変異株の培養物の、ならびに１ｓｔ  ｐＣＦ１１１はｐＣＦ１１１を有する第一変異株の培養物のＴＬＣ分析結果である。
図４は、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４（ｐＣＦ２１３）（図中、ｐＣＦ２１３と表示）および  Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４（ｐＣＦ７０４）（図中、ｐＣＦ７０４と表示）の経時的なホモグルタミン酸の生産性を示すグラフである。
図５は、ｐＣＦ２１３インサート領域の塩基配列に基づき見い出されたＯＲＦの存在位置を示す図である。
図６は、実施例２の３（６）におけるＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラム処理による溶出画分と相対的ＬＡＴ活性の関係を示すグラフである。
図７は、実施例２の３（７）における、ＬＡＴ活性画分をマルチゲル４／２０および１０／２０に対し、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ（Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）を行った結果を示す図に代わる写真である。図中、Ｍは分子量マーカーであり、Ｃは、実施例２の３（５）で得られた限外ろ過液、数字はそれぞれ画分番号を示す。
図８は、各種プラスミドによるホモグルタミン酸生産性欠損変異株および野生型株における相対的ＬＡＴ活性を示すグラフである。
図９は、各種プラスミドで形質転換した  Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ３０８４株の経時的なホモグルタミン酸の生産性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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