(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
照射光としてパルスレーザを用い、前記照射光を標本に走査させつつ照射して、前記標本で多光子吸収により発生する蛍光を検出し、前記標本の蛍光画像を表示するレーザ顕微鏡において、
前記照射光の光路中に配設され、前記蛍光画像の１画素を走査する１画素走査時間よりも短い時間周期で前記照射光の遮断と透過動作を行うシャッタ手段と、
前記シャッタ手段の動作によって、１画素毎の照射レーザパルス列のうち所定のパルス数を遮断するように制御する制御手段とを備え、
前記制御手段は、前記照射レーザパルスのピークパワーを一定にしたまま前記標本に照射される当該照射レーザパルスのパルス数を調整することにより、前記標本で発生する多光子励起蛍光量を変化させることを特徴とするレーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記制御手段は、前記１画素走査時間を複数の分割時間に区分し、前記シャッタ手段の動作によって、それぞれの前記分割時間毎の照射レーザパルス列のうち所定のパルス数を遮断するように制御する分割制御手段を有し、
前記分割時間毎のレーザ照射によって発生した前記分割時間毎の蛍光量から１画素毎の蛍光量を求めて前記蛍光画像を作成する画像作成手段を備えたことを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記照射光の光路中に配設され、前記照射光の光量を調整する調光手段を更に備えたことを特徴とする請求項１または２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記レーザ顕微鏡の対物レンズと前記照射光を走査させる走査手段との光路中に配設されたダイクロイックミラーと、
該ダイクロイックミラーを介して前記標本から発生する前記蛍光を検出する光電検出器と
を備えたことを特徴とする請求項１乃至３の内いずれか１の請求項に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記シャッタ手段は、音響光学素子または電気光学素子で構成される
ことを特徴とする請求項１乃至４の内いずれか１の請求項に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項６】
照射光としてパルスレーザを標本に走査させつつ照射し、前記パルスレーザの前記標本への照射に基づく多光子吸収によって励起される蛍光を検出し、前記標本の蛍光画像を表示するレーザ顕微鏡を用いた観察方法であって、
前記蛍光画像の１画素を走査する１画素走査時間よりも短い時間周期で前記照射光の遮断と透過を制御するシャッタ手段を動作させて、１画素毎の照射レーザパルス列のうち所定のパルス数を遮断し、前記照射レーザパルスのピークパワーを一定にしたまま前記標本に照射される当該照射レーザパルスのパルス数を調整することにより、前記標本で発生する多光子励起蛍光量を変化させることを特徴とする、レーザ顕微鏡を用いた観察方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はレーザ顕微鏡に関し、特に励起光に超短パルスレーザを使用した多光子レーザ励起顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物分野において、標本深部における明瞭な蛍光断層像が得られることから、多光子レーザ励起顕微鏡が多く利用されるようになってきている。一方、レーザ顕微鏡を用いて生細胞を観察する場合には、標本へのダメージを防ぐため、できるだけ標本に照射するレーザ光の光量を抑えて観察することが望ましい。
【０００３】
このような、レーザ光の光量を調整する方法としては、ＮＤフィルタを用いるのが一般的であり、特開２０００−１９４３２に開示されるように、照明光量の安定化と透過率の再現性を高める技術が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、多光子励起による蛍光が発生するためには、標本の蛍光物質に多光子が吸収されなければならない。一方、この多光子吸収遷移確率は小さいため、観測に必要な蛍光量を得るためにはレーザ光の光量を増加する必要がある。しかし、レーザ光の光量を増加した場合には、標本の蛍光物質が退色し易くなるため長時間の観察が困難となり、またレーザ光のエネルギによって標本がダメージを受ける恐れが大きくなる。
【０００５】
従って、多光子レーザ励起顕微鏡においては励起光としてのレーザ光線に、多光子吸収を起こすための高いビークパワーと、標本にダメージを与えない低い平均パワーとの両立が求められる。
【０００６】
ここで、ｎ光子励起蛍光量Ｆｎ、ｎ光子吸収遷移確率Ａｎ、励起光強度Ｉの間には式（１）に示す関係が成立する。
Ｆｎ  ∝Ａｎ  ∝Ｉｎ                    …（１）
即ち、励起光強度Ｉを２倍にすると、ｎ光子励起蛍光量Ｆｎと遷移確率Ａｎは２ｎ倍と増加するが、逆に励起光強度Ｉを１／２倍にすると、ｎ光子励起蛍光量Ｆｎと遷移確率Ａｎは１／２ｎ倍に減少する。
【０００７】
従って、標本である生細胞へのダメージを抑えるために、従来技術であるＮＤフィルタを用いた場合では、例えば、２光子励起ではレーザ光強度を５０％（＝１／２）に低下すれば、励起蛍光量は２５％（＝１／４）と大きく減衰してしまう。逆に、励起蛍光量を５０％にして観察するためには、２光子励起ではレーザ光強度を約７０％程度しか低下することができず、生細胞へのダメージが大きくなってしまうという問題がある。
【０００８】
本発明は、係る事情に鑑みてなされたものであって、蛍光量を必要以上に減ずることなく励起レーザ光強度を減ずることができ、生細胞へのダメージを最小限にして観察することが可能なレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解消するための本発明は、照射光の光路中に配設され、蛍光画像の１画素を走査する１画素走査時間よりも短い時間周期で照射光の遮断と透過動作を行うシャッタ手段と、シャッタ手段の動作によって、１画素毎の照射レーザパルス列のうち所定のパルス数を遮断するように制御する制御手段とを備え、前記制御手段は、前記照射レーザパルスのピークパワーを一定にしたまま前記標本に照射される当該照射レーザパルスのパルス数を調整することにより、前記標本で発生する多光子励起蛍光量を変化させるレーザ顕微鏡である。
【００１０】
また本発明は、上記記載の発明であるレーザ顕微鏡において、制御手段は、１画素走査時間を複数の分割時間に区分し、シャッタ手段の動作によって、それぞれの分割時間毎の照射レーザパルス列のうち所定のパルス数を遮断するように制御する分割制御手段を有し、分割時間毎のレーザ照射によって発生した前記分割時間毎の蛍光量から１画素毎の蛍光量を求めて蛍光画像を作成する画像作成手段を備えたレーザ顕微鏡である。
【００１１】
また本発明は、上記記載の発明であるレーザ顕微鏡において、照射光の光路中に配設され、照射光の光量を調整する調光手段を更に備えたレーザ顕微鏡である。
【００１２】
また本発明は、上記記載の発明であるレーザ顕微鏡において、レーザ顕微鏡の対物レンズと照射光を走査させる走査手段との光路中に配設されたダイクロイックミラーと、ダイクロイックミラーを介して標本から発生する蛍光を検出する光電検出器とを備えたレーザ顕微鏡である。
【００１３】
また本発明は、上記記載の発明であるレーザ顕微鏡において、シャッタ手段は、音響光学素子または電気光学素子で構成されるレーザ顕微鏡である。
また本発明は、蛍光画像の１画素を走査する１画素走査時間よりも短い時間周期で前記照射光の遮断と透過を制御するシャッタ手段を動作させて、１画素毎の照射レーザパルス列のうち所定のパルス数を遮断し、前記照射レーザパルスのピークパワーを一定にしたまま前記標本に照射される当該照射レーザパルスのパルス数を調整することにより、前記標本で発生する多光子励起蛍光量を変化させることを特徴とする、レーザ顕微鏡を用いた観察方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明に係るレーザ顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図である。
本発明に係るレーザ顕微鏡は、超短パルスレーザを出射するレーザ発振器１、レーザ光２の透過・遮断を行う高速シャッタ３、レーザ光２を走査させるためのレーザ走査装置４、標本５を観察するための対物レンズ６を備えた顕微鏡７、観察像を表示するためのモニタ８及びレーザ顕微鏡の動作を制御するコンピュータ９とで構成されている。
【００１５】
そして、レーザ走査装置４にはレーザ光２を走査させる機構であるガルバノメータミラー１０と、標本５で発生した蛍光を電気信号に変換する光電変換器１１とが設けられている。そして、コンピュータ９は、高速シャッタ３、ガルバノメータミラー１０及び光電変換器１１と信号線で接続されている。
【００１６】
尚、本実施の形態において使用するレーザ発振器１は、パルス幅が数十〜数百フェムト秒、パルスの繰り返し周波数が数十〜数百ＭＨｚのパルスレーザである。
【００１７】
次に、このように構成されたレーザ顕微鏡の動作について説明する。
レーザ発振器１から出射された超短パルスのレーザ光２は高速シャッタ３に入射する。高速シャッタ３はコンピュータ９からの指令に基づいて、所定のシーケンスでＯＮ−ＯＦＦスイッチング動作を行いレーザ光２のパルス列の一部を遮断する。
【００１８】
高速シャッタ３を通過したレーザ光２はレーザ走査装置４内のガルバノメータミラー１０によって進行方向を偏向され２次元平面上を走査するように制御される。そして、レーザ光２は顕微鏡７に入射し対物レンズ６によって標本５上を２次元に走査される。
【００１９】
標本５では、対物レンズ６の焦点位置で多光子吸収が起き、これによって蛍光が励起される。発生した蛍光は対物レンズ６を介してレーザ光２とは逆の光路を進み、ガルバノメータミラー１０によって偏向が解除された後、光電検出器１１に入射する。
【００２０】
光電検出器１１で変換された信号は、コンピュータ９に入力される。コンピュータ９は、ガルバノメータミラー１０の走査状態を表す信号と光電変換器１１からの信号とを対応付けて、標本５の蛍光像を構成し、モニタ８にその画像を表示する。
【００２１】
図２は、第１の実施形態のレーザ顕微鏡のパルス制御方法を示す図である。図１と同一機能をもつ部分には同一符号を付してその詳細の説明を省略する。
【００２２】
ここで、レーザ発振器１から出射されるレーザ光２のパルス幅１００ｆｓ（フェムト秒）、パルスの繰り返し周波数８０ＭＨｚとする。そして、ガルバノメータミラー１０のスキャンスピードを１画面当り１秒とし、コンピュータ９の１画面当りのデータ量を８００×６００＝４８０，０００画素とする。そうすると、ガルバノメータミラー１０の走査速度は１画素当り約２μｓとなり、したがって１画素当りのレーザパルス数は１６０パルスとなる。
【００２３】
いま、１画素当りのレーザパルス数Ｎによって発生する１画素当りのｎ光子励起蛍光量Ｆｎは、レーザ光のピークパワーＰｐ、パルス幅Δｔを用いて式（２）で表される。
Ｆｎ  ∝Ａｎ  ∝Ｐｐｎ×Δｔ×Ｎ                    …（２）
従って、高速シャッタ３がレーザ光２を遮断しない場合、上記条件の下で発生する１画素当りのｎ光子励起蛍光量Ｆｎは式（３）で表される。
Ｆｎ  ＝Ｐｐｎ×１００ｆｓ×１６０                    …（３）
ここで、高速シャッタ３がＯＮ−ＯＦＦ動作を繰り返して、レーザ光２を透過させる時間を前述の場合の１／２である１μｓとした場合、１画素当りのレーザパルス数は８０パルスとなるがレーザ光のピークパワーは変化しないため、この条件の下で発生する１画素当りのｎ光子励起蛍光量Ｆｎは式（４）で表される。
Ｆｎ  ＝Ｐｐｎ×１００ｆｓ×８０                    …（４）
式（３）と式（４）とを比較すると、高速シャッタ３がＯＮ−ＯＦＦスイッチングを行って、１画素当りのレーザパルス数を制御することで、ｎ光子励起蛍光量が１／２に変化している。つまり、シャッタのスイッチングを１画素ごとにコントロールすれば、高速シャッタ３のオープン時間に比例した蛍光量を得ることが可能となる。
【００２４】
尚、本実施の形態において、高速シャッタ３がレーザ光２の遮断と透過動作を繰り返しているが、この透過はレーザ光２を１００％透過するものでなくても良い。逆に、高速シャッタ３にレーザ光２の光量を調整する調光機能を持たせることにより、レーザ光のビークパワーＰｐを変化させながらレーザパルス数Ｎを制御することが可能となる。勿論、調光機能を高速シャッタ３とは別の装置を用いて構成しても良い。
【００２５】
ここで、本発明をまとめて説明すると以下のようになる。
一般に、パルスレーザを用いたレーザ顕微鏡において発生する蛍光量Ｆｎは式（２）で表される。即ち、レーザ光のピークパワーＰｐとレーザパルス数Ｎを変更することによって蛍光量Ｆｎを制御することが可能である。ここで、ｎ光子吸収遷移確率Ａｎは、レーザ光のピークパワーＰｐによって増減する。一方、標本がレーザ光から受けるダメージはレーザ光のエネルギ、即ち、ピークパワーＰｐの時間積分値に依存することになる。
【００２６】
従って、レーザ光のピークパワーＰｐを制御することによってｎ光子吸収遷移確率Ａｎを所定値に保持しつつ、レーザパルス数Ｎを変更することによって標本に与えるダメージを低減して蛍光観察を行うことが可能となる。
【００２７】
図３は、第１の実施形態のレーザ顕微鏡の他のパルス制御方法を示す図である。図１と同一機能をもつ部分には同一符号を付してその詳細の説明を省略する。
【００２８】
本実施の形態では、レーザ強度の変動による蛍光量の測定誤差をキャンセルするために、１画素のデータ取得を数回に分けて行い、取得蛍光量の平均値又は合計値をその画素のデータとするものである。
【００２９】
図１と同様に、レーザ発振器１から出射されるレーザ光２のパルス幅１００ｆｓ（フェムト秒）、パルスの繰り返し周波数８０ＭＨｚとする。そして、ガルバノメータミラー１０のスキャンスピードを１画面当り１秒とし、コンピュータ９の１画面当りのデータ量を８００×６００＝４８０，０００画素とする。そうすると、ガルバノメータミラー１０の走査速度は１画素当り約２μｓとなり、したがって１画素当りのレーザパルス数は１６０パルスとなる。
【００３０】
ここで、光電検出器１１のデータ蓄積時間を０．４μｓとすると１画素当りのデータ取得回数は５回となり、１回のデータ取得時間のレーザパルス数は３２パルスである。
【００３１】
１画素当りのｎ光子励起蛍光量Ｆｎは、レーザ光のピークパワーＰｐ、パルス幅Δｔ、１画素当りのデータ取得回数Ｄ、１回のデータ取得時間当りのレーザパルス数Ｎａを用いて式（５）で表される。
Ｆｎ  ∝Ｐｐｎ×Δｔ×Ｎａ×Ｄ                        …（５）
従って、高速シャッタ３がレーザ光２を遮断しない場合、上記条件の下で発生する１画素当りのｎ光子励起蛍光量Ｆｎは式（６）で表される。
Ｆｎ  ＝Ｐｐｎ×１００ｆｓ×３２×５                  …（６）
ここで、高速シャッタ３がＯＮ−ＯＦＦ動作を繰り返して、レーザ光２を透過させる時間を前述の場合の１／２である０．２μｓとした場合、１回のデータ取得時間当りのレーザパルス数は１６パルスとなるがレーザ光のピークパワーは変化しないため、この条件の下で発生する１画素当りのｎ光子励起蛍光量Ｆｎは式（７）で表される。
Ｆｎ  ＝Ｐｐｎ×１００ｆｓ×１６×５                  …（７）
式（６）と式（７）とを比較すると、高速シャッタ３がＯＮ−ＯＦＦスイッチングを行って、１回のデータ取得時間当りのレーザパルス数を制御することで、ｎ光子励起蛍光量Ｆｎが１／２に変化している。つまり、シャッタのスイッチングを１回のデータ取得時間ごとにコントロールすれば、高速シャッタ３のオープン時間に比例した蛍光量を得ることが可能となる。
【００３２】
そして、コンピュータ９は１画素についてＤ個のデータを取得し、これらのデータの平均値あるいは合計値をこの１画素のｎ光子励起蛍光量Ｆｎとして蛍光画像を作成してモニタ８に表示する。
【００３３】
図４は、本発明に係るレーザ顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図である。図１と同一機能をもつ部分には同一符号を付してその詳細の説明を省略する。
【００３４】
本実施の形態では、高速シャッタ３に音響光学素子、または電気光学素子を用い、駆動装置１５とスイッチング装置１６によってこれらの素子に回折または複屈折を発生させることで開閉動作を行うように構成されている。
【００３５】
ここで、駆動装置１５は高速シャッタ３に用いられる素子の種類に応じて構成される。例えば、音響光学素子を用いる場合は、駆動装置１５は搬送波信号源を使用し、電気光学素子を用いる場合は、駆動装置１５は電場を印加するための電圧源を使用する。
【００３６】
一方、コンピュータ９からは制御装置１７に対して、スキャンスピード、画素数、励起光強度等の指示情報が送信される。制御装置１７はこの指示情報に基づいて高速シャッタ３のスイッチング動作を決定してスイッチング装置の動作を制御する。
【００３７】
第２の実施の形態では、高速シャッタ３が機械的駆動部を用いない構成であるため高速な開閉動作を行うことが可能である。
【００３８】
尚、高速シャッタ３のＯＮ−ＯＦＦのタイミングは、１画素当りの走査時間より短いタイミングであれば良い。例えば、１０００ドット×５００ラインの画像データ１フレームを片道スキャンで１秒に１回取得する場合、１ラインあたりの走査時間は１ミリ秒、１ドットあたりでは１マイクロ秒になる。従って、高速シャッタ３が０．５マイクロ秒単位でＯＮ−ＯＦＦすれば、レーザ発振器１からのレーザ光２の強度を１／２にできる。
【００３９】
ここで、片道スキャンとは、レーザ光２が往復走査されている場合、片道（行き）だけで画素データを取得し、帰りはデータ取得を行わないとする方式のことをいう。
【００４０】
図５は、本発明に係るレーザ顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図である。図１と同一機能をもつ部分には同一符号を付してその詳細の説明を省略する。
【００４１】
本実施の形態では、標本５から発生した蛍光を、対物レンズ６とレーザ走査装置４の間に配置したダイクロイックミラー１９で分離して光電検出器２０で検出するように構成している。尚、この光電検出器２０は、像の共役位置に配置しても良く、また対物レンズ瞳の共役位置に配置しても良い。
【００４２】
第３の実施の形態によれば、微弱な蛍光を走査光学系を介さずに効率良く検出することができる。
【００４３】
以上説明したように、各実施の形態によればレーザ光を減衰しても効率的に多光子励起蛍光を得ることができ、ひいては生細胞にダメージを与えないようにレーザ光強度を落として蛍光観察をおこなうことが可能となる。
【００４４】
尚、上記実施形態には種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出され得る。例えば、実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
【００４５】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のレーザ顕微鏡によれば、レーザ光を減衰しても効率的に多光子励起蛍光を得ることができ、生細胞にダメージを与えないようにレーザ光強度を落として蛍光観察をおこなうことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るレーザ顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】第１の実施形態のレーザ顕微鏡のパルス制御方法を示す図。
【図３】第１の実施形態のレーザ顕微鏡の他のパルス制御方法を示す図。
【図４】本発明に係るレーザ顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。
【図５】本発明に係るレーザ顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図。
【符号の説明】
１…レーザ発振器
２…レーザ光
３…高速シャッタ
４…レーザ走査装置
５…標本
６…対物レンズ
７…顕微鏡
８…モニタ
９…コンピュータ
１０…ガルバノメータミラー
１１…光電検出器
１７…制御装置
１９…ダイクロイックミラー
２０…光電検出器
【図１】
0004175833.tif 000002
【図２】
0004175833.tif 000003
【図３】
0004175833.tif 000004
【図４】
0004175833.tif 000005
【図５】
0004175833.tif 000006