(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
泌尿生殖器系疾患の治療用組成物であって、
担体と、
ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも一つのポリペプチド、
とを備え、少なくとも一つのポリペプチドは前記群におけるいずれかのアミノ酸配列から形成される二量体を含み、前記担体は、前記少なくとも一つのポリペプチドを担持し、泌尿生殖器系疾患は泌尿器系及び／又は生殖器系の炎症及び／又は感染症である泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２】
前記二量体は、ＫＰＶ二量体である、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）が、前記少なくとも一つのポリペプチドのＣ末端に位置される、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項４】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）は、少なくとも一つのＤ型のアミノ酸を含む、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項５】
前記少なくとも一つのポリペプチドは、Ｎ−アセチル化されている請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項６】
前記泌尿生殖器系疾患の部位に担体を適用するためのアプリケータを備えている、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項７】
さらに、前記アプリケータの一部が、膣、尿管、あるいは直腸への挿入用である、請求項６記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項８】
前記泌尿生殖器系疾患は、感染症あるいは炎症、あるいはその双方である、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項９】
前記泌尿生殖器系疾患は、泌尿生殖器部位における細菌あるいは真菌の存在を包含する、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１０】
前記泌尿生殖器系疾患は、泌尿生殖器部位におけるウイルスの存在を包含する、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１１】
前記泌尿生殖器系疾患は、細菌感染、あるいは真菌感染、あるいはその双方によって生じている、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１２】
前記泌尿生殖器系疾患は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、あるいはこれらのいずれかの組合せにより生じている、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１３】
前記細菌は、グラム陽性細菌である、請求項９記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１４】
前記細菌は、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属である、請求項９記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１５】
前記細菌は、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである、請求項９記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１６】
前記真菌は、Ｃａｎｄｉｄａ属である、請求項９記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１７】
前記真菌は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓである、請求項９記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１８】
前記ウイルスは、ＨＩＶである、請求項１０記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項１９】
前記ウイルスは、ＨＳＶである、請求項１０記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２０】
前記泌尿生殖器系疾患は、女性の生殖用腔内あるいは外性器上、あるいは、それらの両方に位置される、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２１】
前記泌尿生殖器系疾患は、尿管に位置される、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２２】
前記泌尿生殖器系疾患は、陰茎に位置される、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２３】
前記泌尿生殖器系疾患は、直腸腔内、あるいは直腸領域上、あるいはそれらの双方に位置される、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２４】
前記泌尿生殖器系疾患は、膣炎を含む、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２５】
前記泌尿生殖器系疾患は、膀胱炎あるいは尿道炎を含む、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２６】
前記泌尿生殖器系疾患は、亀頭包皮炎を含む、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２７】
前記担体は、クリーム、軟膏、バルム剤、エアロゾルフォーム、エアロゾルスプレー、あるいは溶解性丸剤である、請求項１記載の泌尿生殖器系疾患の治療用組成物。
【請求項２８】
吸収体材料と、
ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも一つのポリペプチド、
とを備え、
少なくとも一つのポリペプチドは前記群におけるいずれかのアミノ酸配列から形成される二量体を含み、前記吸収体材料が、前記少なくとも一つのポリペプチドに付随される、タンポン。
【請求項２９】
前記二量体は、ＫＰＶ二量体である、請求項２８記載のタンポン。
【請求項３０】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）が、前記少なくとも一つのポリペプチドのＣ末端に位置される、請求項２８記載のタンポン。
【請求項３１】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）は、少なくとも一つのＤ型のアミノ酸を含む、請求項２８記載のタンポン。
【請求項３２】
前記少なくとも一つのポリペプチドは、Ｎ−アセチル化されている請求項２８記載のタンポン。
【請求項３３】
バリアと、  
前記バリアに付随する担体と、
ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも一つのポリペプチド、
とを備え、
少なくとも一つのポリペプチドは前記群におけるいずれかのアミノ酸配列から形成される二量体を含み、前記担体は、前記少なくとも一つのポリペプチドを担持する、避妊具。
【請求項３４】
前記二量体は、ＫＰＶ二量体である、請求項３３記載の避妊具。
【請求項３５】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）が、前記少なくとも一つのポリペプチドのＣ末端に位置される、請求項３３記載の避妊具。
【請求項３６】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ廻己列番号４）は、少なくとも一つのＤ型のアミノ酸を含む、請求項３３記載の避妊具。
【請求項３７】
前記少なくとも一つのポリペプチドは、Ｎ−アセチル化されている請求項３３記載の避妊具。
【請求項３８】
前記バリアは、コンドーム、ダイヤフラム、あるいはスポンジである、請求項３３記載の避妊具。
【請求項３９】
担体と、
ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも一つのポリペプチド、
とを備え、
少なくとも一つのポリペプチドは前記群におけるいずれかのアミノ酸配列から形成される二量体を含み、前記担体は、前記少なくとも一つのポリペプチドを担持する、坐剤。
【請求項４０】
前記二量体は、ＫＰＶ二量体である、請求項３９記載の坐剤。
【請求項４１】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）が、前記少なくとも一つのポリペプチドのＣ未端に位置される、請求項３９記載の坐剤。
【請求項４２】
前記アミノ酸配列ＫＰＶ（配列番号１）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）は、少なくとも一つのＤ型のアミノ酸を含む、請求項３９記載の坐剤。
【請求項４３】
前記少なくとも一つのポリペプチドは、Ｎ−アセチル化されている請求項３９記載の坐剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（先願）
本出願は、米国仮出願整理番号６０／１２６，２２３号で、アルファ−メラノサイト刺激ホルモンから誘導された抗菌性アミノ酸配列と題され、１９９９年３月２４日に出願された特許出願に対して優先権を主張する出願である。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
（発明の技術分野）
本発明は、泌尿生殖器系疾患のための治療分野に関する。
【０００３】
【従来の技術】
（発明の背景）
泌尿生殖器疾患や病気は一般に男性及び女性の両方を侵す。これらの疾患は、泌尿器系及び生殖器系の感染及び／又は炎症を含む。例えば、National Institute of Child Health and Human Development(NICHD)によれば、「ほとんどの女性は人生のうちで少なくとも一度は膣炎の状態になる。」（Vaginitis, National Institute of Child Health and Human Development Publications On-line,（最新更新日２０００年１月１２日）＜http://www.nichd.nih.giv/publications/pubs/vagl.htm＞。膣炎の原因は、細菌、真菌、またはウイルスの感染から、クリーム、スプレー、あるいは上述の領域に触れる衣服中の化学物質による刺激までの範囲にわたる。細菌あるいは真菌に感染した女性では、これらの感染源は、しばしば直腸領域で発生し、会陰部を移動して膣又は尿道まで到達する。
【０００４】
膣炎の一般的なタイプは、非常に多くの場合Candida albicansを原因とするカンジダ症又は酵母菌感染症である。Candida種は、個々人の肌や口、胃腸内に生息する標準的な細菌叢の一部である。Robbins Pathologic Basis of Disease 5th ed., Saunders Co., Philadelphia (1994)p.354.  それらは、女性の膣内にも少数生息している。それらは、膣や口腔などの暖かく湿った表面で、最も良好に増殖する。それらは、通常は非病原性であるが、環境の変化が起こると、例えば、閉経期や妊娠期の女性ホルモンの変化に対する応答によって、あるいはストレスに対する応答によって、それらは急速に増殖し、酵母菌感染の原因となる。これらの変化は、化学療法を行っている人や免疫抑制剤を使用している人、あるいはエイズで苦しむ人など、免疫抑制されたり、弱っている個体においても起こり得る。
【０００５】
カンジダ症に対する現在の治療薬は、例えば、硝酸ブトコナゾール(butoconazole nitrate)(Femstat)、クロトリマゾール(clotrimazole)(Gyne-Lotrimin他)、ミコナゾール(miconazole)(Monistat他)、及びチオコナゾール(tioconazole)(Vagistat)等の有効成分を含有する市販の薬剤を含む。これらの薬は膣内に局所的に塗布されて、Candidaの細胞壁を破壊する。他の同様な治療薬には、例えばフルコナゾール(fluconazole)(Diflucan)、テルコナゾール(terconazole)(Terazol)、及びケトコナゾール(ketoconazole)(Nizoral)などの同じグループの有効成分を含有する処方薬を含む。
【０００６】
膣炎は、一般にはCandidaに関連しているにも係らず、NICHDの前述のVaginitisによれば、生殖世代の女性では細菌性の膣炎が、実のところ最も一般的な膣感染である。膣内での細菌の急成長は、Candidaの場合と同様な細菌性膣炎を引き起こすが、これらの治療に用いられる薬剤は異なる。
【０００７】
その反面、男性もまた、亀頭及び包皮を含めたペニスがCandidaに感染する。亀頭包皮炎、亀頭及び包皮の不特定の感染は、Candidaのような真菌やstaphylococciのような化膿性細菌を含む、幅広い種類の微生物に起因する。Robbins Pathologic Basis of Disease 5th ed., Saunders Co., Philadelphia (1994)p.1008.
【０００８】
Staphylococciは、平常で身体の肌又は他の粘膜組織に存在するグラム陽性細菌である。Staphylococcus aureusは、特に、悪性の病原体で、皮膚の損傷から、心内膜炎、呼吸器感染、食中毒、毒性ショック症候群（toxic syock syndrome）に至る極めて多面的な病状及び疾患を引き起こす。女性では、高吸収性のタンポンを使用すると、S. aureusが、膣にコロニーを作り、毒性ショック症候群毒素（toxic shock syndrome toxin (TSST-1)）という名の毒素を分泌することが知られている。食品医薬品局によれば、今日報告されている毒性ショック症候群の約半分が、通常、若い女性において、月経期間中にタンポンを使用することに関連している。Tampons and Asbestos, Dioxin, & Toxic Shock Syndrome, FDA Center for Devices and Radiological Health (July 23, 1999), ＜http://www.fda.gov/cdrh/ocd/tamponsabs.html＞
【０００９】
S. aureus感染は、一般的にメチシリンを用いて治療される。メチシリンは大変効果的であるが、S. aureusの菌株のいくつかは、メチシリンに対する耐性を発達させてきており、僅かの抗生物質しか、これらのメチシリン耐性Staphylococcus aureus (MRSA)を首尾よく治療することができない。MRSAに対して一般的に使用されているこのような抗生物質の１つは、バンコマイシン(vancomycin)である。しかし、S. aureusの一菌株で、バンコマイシン（VISA）に対する感受性が減少しているものが、既に同定されている。Khurshid, M.A. et. al., Staphylococcus aureus with Reduced Susceptibility to Vancomuycin Illinois,1999 Morbidity and Mortality Weekly Report, 48(51): 1165-1167(2000).＜http://www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm4851al.htm＞抗生物質耐性菌株の出現は、細菌感染症と戦う別の方法の必要性を引き起こした。
【００１０】
細菌及び真菌による感染に加えて、ウイルス性の膣炎もまた一般的である。これらの感染は、多くは性交を介して伝染する。ウイルス性の膣炎は、herpes simplex virus(HSV)やhuman papillomavirus(HPV)による感染を含む。HSVウイルスは、例えば、感染の入り口部位である、生殖器領域で複製され、そしてまた生殖器に分布するニューロンに感染する。身体の免疫システムを避けるため、HSVウイルスはこれらのニューロン内に潜伏して生存することができ、例えば、ストレスや免疫抑制、放射（irradiation）やウイルス感染などの環境状態に応答して再活性化する。HSVに対する現在の治療薬は、例えばアシクロビル（acyclovir）、ファムシクロビル（famciclovir）、またはヴァラシクロビル（valacyclovir）等の薬剤を含む。
【００１１】
泌尿器系としては、米国医学協会（American Medical Association）によれば、尿路感染症（UTIs）は、医者に行くことを促す最も一般的な疾患である。Women's Health, Urinary Tract Infections: A Patient's Guide to Treatment, AMA Health Insight, On-Line Health Information for Everyone  (最新更新日、１９９８年１０月３０日)＜http://www.ama-assn.org/insight/ h#focus/ wom#hlth/uti/uti.htm＞これらの感染は、多くの場合Escherichia coliに起因するが、例えば上述のCandidaやStaphylococci等の微生物が関連することもあり得る。これらの感染は、尿道で始まり、膀胱まで到達して膀胱炎を引き起こす。そして結局は、尿管を通って腎臓まで到達することもでき、腎盂腎炎を引き起こす。男性及び女性のどちらの泌尿器系においてもこれらの微生物に感染することがある。
【００１２】
泌尿生殖器の疾患は、単一の原因に限定されないため、現在の治療薬では、特定の病原を治療するために異なる薬剤を必要とする。これらの病原がまず同定されなければならない。同定には時間を必要とするが、しかしそれ以上に、特定の感染性病原体又はその存在の欠如を決定するために、女性に対する婦人科学的実験を必要とする。
【００１３】
抗生物質及びその他の薬剤の利用の増加に伴い、微生物、例えばメチシリン耐性staphylococcus aureus等は、現在有効な薬剤に対する耐性を徐々に発達させてきている。それゆえ、感染性病原体の幅広いスペクトルに対抗できる新しい種類の薬剤に対する継続的な要望が存在する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
（発明の概略）
この発明は、泌尿生殖器系疾患を治療するためのシステムに向けられるものである。この発明の一つの側面は、泌尿生殖器系疾患の治療のための、ＫＰＶ（配列番号１）、ＭＥＨＦＲＷＧ（配列番号２）、ＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号３）、あるいはＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、一又はそれ以上のポリペプチドを含む治療システムを開示する。この一又はそれ以上のポリペプチドは、上記したいずれかのアミノ酸配列から形成される二量体とすることもできる。泌尿生殖器系疾患とは、感染、炎症、あるいはそれらの双方を含めることができる。本発明の一つの好ましい実施形態では、その泌尿生殖器系疾患は、膣、外陰部、尿管、ペニス、および／または直腸の感染および／または炎症を包含する。本発明の他の好ましい実施形態では、その一又はそれ以上のポリペプチドは、担体に溶解される。本発明の他の実施形態では、一又はそれ以上のポリペプチドは、毒性ショック症候群を回避するためタンポンに付随される。他の実施形態では、その一又はそれ以上のポリペプチドは、性行為感染症あるいは感染症を回避するための避妊具に付随される。他の好ましい実施形態では、一又はそれ以上のポリペプチドは、膣あるいは直腸への挿入用の坐剤に不随される。本発明の他の実施形態では、一又はそれ以上のポリペプチドは、圧注器のための液状担体に溶解される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
（発明の詳細な説明）
以下に引用する文献は、ここに、参照により、その全体が本明細書に記載されるかのごとくに、本明細書に一体化される。本明細書は、アルファ−メラノサイト刺激ホルモン（”α−ＭＳＨ”）および／またはその誘導体を用いる泌尿生殖器系疾患の治療のための方法とシステムとを提供する。α−ＭＳＨは古典的な、１３個のアミノ酸のペプチド（配列番号４）であり、より大きな前駆体分子であるプロピオメラノコルチンの翻訳後修飾によって生成される。α−ＭＳＨは、その１〜１３のアミノ酸の配列を、同様にプロピオメラノコルチンに由来するアドレノコルチコトロピックホルモン（”ＡＣＴＨ”）と共有している。α−ＭＳＨは、下垂体細胞、単核細胞、メラニン生成細胞、及びケラチン生成細胞を含む多くの細胞タイプによって分泌されていることが知られている。ラットの皮膚、ヒトの表皮、あるいは無傷の消化管や下垂体除去ラットの粘膜性障壁において見いだすことができる。例えば、Eberie, A. N., The Melanotrophhins, Karger, Basel, Switzerland(1998); Lipton, J. M., et. al., Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulator α-MSH, Immunol. Today 18, 140-145(1997); Thody, A. J., et. al., MSH Peptides are Present in Mammalian Skin, Peptides 4, 813-815(1983); Fox, J. A., et. al., Immunoreactive α-Melanocyte Stimulating Hormone, Its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact and Hypophysectomized Rats, Life. Sci. 18, 2127-2132(1981)参照。
【００１６】
α−ＭＳＨ及びその誘導体は、強力な解熱及び抗炎症特性を有することが知られているが、非常に低い毒性しか有していない。これらは、インビトロで宿主細胞の前駆炎症性の媒介体の生成を抑制することができ、また、炎症用の動物モデルにおいて局所的あるいは全身的な反応を抑制できる。α−ＭＳＨのコア配列（４−１０）（配列番号２）は、例えば、学習及び記憶的作用を有するが、解熱及び抗炎症活性をほとんど有していない。反対に、解熱及び抗炎症活性のための活性伝達配列（ａｃｔｉｖｅ ｍｅｓｓａｇｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、α−ＭＳＨのＣ末端配列にある。リジン−プロリン−バリン（”Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ”、あるいは”ＫＰＶ”）（配列番号１）にある。このトリペプチドは、インビトロ及びインビボで、その親分子と同等の活性を有している。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の抗炎症活性は、次の二つの特許に開示されており、参照により本明細書に一体化される。米国特許第５，０２８，５９２号（１９９１年７月２日発行、Ｌｉｐｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．に対して、解熱及び抗炎症性Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ組成物及びその使用として付与されている）、米国特許第５，１４７，０２３号（１９９２年１０月２０日発行、Ｌｉｐｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．に対して、解熱及び抗炎症性Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ組成物及びその使用として付与されている）；
【００１７】
さらに、Catania, A., et. al.,α-Melanocyte Stimulating Hormone in the Modulation of Host Reactions, Endocr. Rev. 14, 564-576(1993); Lipton, J. M., et. al., Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulator of α-MSH, Immunol. Today 18, 140-145(1997); Rajora, N., et. al.,α-MSH Production Receptors and Influence on Neopterin, in a Human Monocyte/macrophage Cell Line, J. Leukoc. Biol. 59, 248-253(1996); Star, R. A., et. al., Evidence of Autocrine Modulation of Macrophage Nitric Oxide Synthase by α-MSH, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92, 8015-8020(1995); Lipton, J.M., et.al., Anti-inflammatory Effects of the Neuropeptide α-MSH in Acute Chronic and Systemic inflammation, Ann. N.Y. Acad. Sci. 741, 137-148(1994); Fajora, N., et. al.,α-MSH Modulates Local and Circulating tumor Necrosis Factor α in Experimental Brain Inflammation, J. Neuroosci, 17, 2181-2186(1995);  Richards, D. B., et. al., Effect of a-MSH(11-13)(lysine-proline-valine) on Fever in the Rabbit, Peptides 5, 815-817(1984); Hiltz, M. E., et. al., Anti-inflammatory Activity of a COOH-terminal Fragment of the Neuropeptideα-MSH, FASEB J. 3, 2282-2284(1989)も参照してください。
【００１８】
その抗炎症作用及び解熱作用に加えて、本発明の一つの側面は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の抗細菌あるいは抗感染活性を包含する。以下に記載するように、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、例えば、細菌の活性の抑制、酵母の増殖の抑制、ヒト好中球による細菌の死滅を抑制することのない細菌の死滅、細菌の死滅を抑制することなく細菌感染に伴う炎症の治療、細菌におけるｃＡＭＰの蓄積の増加、およびウイルス性毒素の複製と発現の阻害、を含む、有意な抗感染用途を有している。
本発明の好ましい態様においては、これらの抗細菌あるいは抗感染活性は、そのＣ末端アミノ酸配列−ＫＰＶによく付随する。このトリペプチドは、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体とともに、ヒトの血漿中において通常の濃度であるピコモル濃度を含む、非常に広い範囲の濃度において有効性を有している。
【００１９】
背景技術の項で説明したように、泌尿生殖器系疾患は、一つの単独の原因によって引き起こされるものではない。複数の微生物と、細菌、カビ、ウイルスからの感染性材料が、単独であるいは組み合わされて、膣炎、外陰炎、尿道炎、亀頭包皮炎、カンジダ症、性感染性疾患及び毒性ショック症候群を含む多様な疾患を引き起こすことができる。これらの疾患を治療するには、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体が、その感染部位および／または炎症部位に対して、当該分野において公知の方法で局所的に適用される。例えば、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、リン酸緩衝塩、ヒアルロン酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、あるいはエタノールなどの溶液に溶解される。軟膏、クリーム、ゲル、溶解性丸剤（ｐｉｌｌ）、エアゾールスプレー、坐剤、圧注用液剤、および／またはタンポン用の吸収体などの一般的な担体が、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を泌尿生殖器系疾患の治療のための有効成分として担持することができる。これらの担体は、感染部位および／または炎症部位に対して、シリンジやシリンジ状装置、バンデージ、カテーテル、プランジャー付きチューブ、スパチュラや他のタイプの平面状のアプリケータ、コンドーム、スポンジ、ダイヤフラム、タンポンアプリケータ、及び指などによって適用される。
【００２０】
さらに、本発明の好ましい態様は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を液体を基剤とする担体に溶解する。溶解したα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を担持するこの担体は、その後、加圧されたキャニスターに保存される。加圧されたキャニスターから放出バルブあるいはその他のメカニズムによってその担体を放出するとき、エアゾール性の泡が形成され、シリンジあるいはシリンジ状の装置内に捕捉される。その後、そのシリンジは、部分的に膣に挿入され、その内容物は、膣腔に伝達される。そのシリンジあるいはシリンジ状装置とその開口部は、尿道や直腸等の他の泌尿生殖系器官に挿入するのに適応するように、異なるサイズ、形、長さに成形することができる。
【００２１】
本発明の他の好ましい態様は、担体を含有する坐剤である。ゲルやグリセリンなどの担体は、室温で固体あるいは半固体であるが、膣や直腸に挿入された際には、体温で溶融する。溶媒和したα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を担持する担体は、その担体が溶融するときに、泌尿生殖器系疾患部位に伝達される。
【００２２】
α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を外陰部、陰茎の亀頭及び包皮等の泌尿生殖器の外側領域へ伝達するには、その組成が当該分野において周知である、クリーム、軟膏、ゲル、スプレー、フォーム、あるいはバルム剤を局所的に適用することによって達成されうる。
【００２３】
本発明の他の側面においては、タンポンが、その製造プロセスにおいて、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体で処理されうる。タンポン中にα−ＭＳＨを含有することにより、毒性ショック症候群を引き起こす毒素（ＴＳＳＴ−１）を分泌するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ等の細菌の増殖を抑制する。タンポンの製造方法は、当該分野においてすでに周知である。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体でタンポンの吸収体材料を処理するには、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体の溶液中にその吸収体材料を浸漬することによって実施されうる。その吸収体材料は、その後乾燥されうる。あるいは、α−ＭＳＨが、乾燥した粉末としてタンポンの吸収体材料に対して吹き付けられるようにすることもできる。
【００２４】
本発明の他のアスペクトにおいては、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、コンドーム、ダイヤフラム、スポンジ、あるいは妊娠や性行為感染症を防止するために使用される他の防護タイプメカニズム等の避妊具を用いることにより、感染部位に伝達されうる。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、コンドームに使用される潤滑剤や、ダイヤフラムとともに使用されるゲルやフォーム、及びコンドーム、ダイヤフラム、及びスポンジとともに使用される他の殺精子液剤に、溶解されうる。
【００２５】
本発明の他のアスペクトにおいては、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、圧注器に使用される液剤に溶解することもできる。その液体は、感染および／または炎症を治療するために、バギナに対して圧注器によって伝達されうる。
【００２６】
以下の実施例は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の感染に対抗するための可能性及び適用法を開示するものである。この開示において使用されるが、充分には記載されない、細菌学、分子生物学、及び細胞培養における方法は、既に、科学文献において充分に報告されてきている。これらの方法は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００２７】
以下の実施例で使用するペプチドは、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、（４―１０）（配列番号００２）、（６−１３）（配列番号００３），及び（１１−１３）（配列番号１）、これらのＮ−アセチル化及びＣ−アミド化されたすべての配列、及びＡＣＴＨ（１−３９）と（１８−３９）（ＣＬＩＰ）を含む。これらのペプチドは、固相ペプチド合成法により調製され、逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製された。いくつかの実施例は、Ｎアセチル化あるいはＣアミド化されたアミノ酸配列ＣＫＰＶ（配列番号８）の二量体（”ＫＰＶ二量体”）を含んでいる。図１６は、このＫＰＶ二量体の化学構造を示すものである。二量体は、上記したいすれかのポリペプチドのＮ末端にシステインを付加し、二つのポリペプチドのシステインにジスルフィド結合を形成させることによって形成することができる。ホモ二量体及びへトロ二量体の双方ともこの方法で形成される。
【００２８】
以下の実施例で開示される統計的な有意性は、分散値の一方向性分析、及びスチューデントテストを用いて分析した。確率値（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ）が０．０５より大きいときに有意であるとした。
【００２９】
【実施例】
（実施例１）
この実施例は、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓに対するα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の抗菌特性を示すものである。
【００３０】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）が、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｍａｇｇｉｏｒｅ ｄｉ Ｍｉｌａｎｏの細菌部門のコレクションから得られた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（１×１０6／ｍｌハンクスのバランスド塩溶液）が、濃度範囲が１０-15〜１０-4Ｍのα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）あるいはＫＰＶ二量体の存在下あるいは非存在下において３７℃で２時間培養された。細胞は、その後、冷たい蒸留水で洗浄され、ＨＢＳＳで１００細菌／ｍｌにまで希釈された。その１ｍｌが、血液寒天プレートに付与され、３７℃で２４時間培養された。細菌の活性は、形成されたコロニーから評価された。他の実験群では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ成長因子であるウロキナーゼ５００単位が、その細菌（１０5／１００ｍｌ）と前記ペプチドとともに、振とう水浴中で３７℃で４時間培養された。
【００３１】
図１は、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）及びＫＰＶ二量体のすべてが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成を抑制したことを示している。このような抑制効果は、広い範囲の濃度にわたって起こっており、１０-12〜１０-4Ｍのペプチド濃度の範囲で有意（ｐ＞０．０１）であった。図２は、１０-6Ｍの濃度のα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）とα−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）とが、ウロキナーゼの成長促進効果と有意に対抗していることを示している。このように、α−ＭＳＨまたはその誘導体が、タンポンの使用に付随する毒性ショック症候群、膣炎、ＵＴＩｓ、尿道炎、亀頭包皮炎を引き起こす原因として知られているＳｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの増殖を抑制することができる。
【００３２】
（実施例２）
この実施例は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体のＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに対する抗真菌特性を示すものである。
【００３３】
臨床的に分離されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓも、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｍａｇｇｉｏｒｅ ｄｉ Ｍｉｌａｎｏの細菌部門のコレクションから得られた。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの培養は、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ アガースラントにおいて維持され、定期的にＳａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ アガー平板上に移されて、２８℃で４８時間培養された。定常増殖期の酵母を調製するために、アガー平板からコロニーを採取し、３０ｍｌのＳａｂｏｕｒａｕｄ−デキストロース ブロスに移して、３２℃で７２時間培養した。細胞は、１０分間１０００×ｇで遠心され、そのペレットが蒸留水で２回洗浄された。細胞が計数され、所望の濃度にハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁された。０．０１％のメチレンブルー除去によって決定される生菌活性は、９８％を超えていた。
【００３４】
ＨＢＳＳ中１×１０6／ｍｌの濃度において、これらの真菌は、１０-15〜１０-4Ｍの濃度範囲のα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）及びＫＰＶ二量体の存在下あるいは非存在下において、３７℃で２時間培養された。細胞は、その後、冷たい蒸留水で洗浄され、ＨＢＳＳで１００菌／ｍｌに希釈された。その後、１ｍｌが、血液寒天平板に付与され、３７℃で４８時間培養された。菌の活性は、形成されたコロニー数で評価された。
【００３５】
図３は、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）及びＫＰＶ二量体が、１０-12〜１０-4Ｍの濃度範囲において顕著に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成能を低下させた（ｐ＜０．０１ ｖｓ コントロール）ことを示す。したがって、このことは、α−ＭＳＨまたはその誘導体は、カンジダ症、膣炎、尿道炎、亀頭包皮炎を引き起こす原因として知られるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を抑制することを示している。
【００３６】
（実施例３）
この実施例は、確立された抗真菌剤であるフルコナゾール（ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）に対してα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の抗感染活性を比較するものである。
【００３７】
１０-6〜１０-4Ｍの濃度範囲の、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、（４−１０）（配列番号２）、（６−１３）（配列番号３）、（１１−１３）（配列番号１）、ＡＣＴＨ（１−３９）、（１８−３９）及びフルコナゾールについて、実施例２と同様の方法を用いてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して試験が行われた。
図４は、フルコナゾールに比較して、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）、（６−１３）（配列番号３）、（１１−１３）（配列番号１）が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して非常に有効であった。これらの抑制活性は、同じモル濃度のフルコナゾールに近似していた。反対に、行動的な作用（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ）があるもののほとんど抗炎症活性を有していないα−ＭＳＨのコア配列（４−１０）（配列番号２）は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）のおおよそ５０％抑制を示した。かかる抑制効果は、実質的なものではあるが（ｐ＜０．０１ｖｓ コントロール）、ＫＰＶシグナル配列を備えるα−ＭＳＨ断片、すなわち、α−ＭＳＨ（６−１３）（配列番号３）、及び（１１−１３）（配列番号１）（ｐ＜０．０１）もしくは、その親分子であるα−ＭＳＨ（１−１３）（ｐ＜０．０５）よりは、有意に強力ではなかった。
図４は、また、ＡＣＴＨ（１−３９）とそのＡＣＴＨ断片（１８−３９）が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生菌活性を低下させなかったことを示している。図示されていない、１０-4Ｍの高濃度においても、ＡＣＴＨペプチドは、有効でないようであった。
したがって、この実施例は、α−ＭＳＨまたはその誘導体が、Ｃａｎｄｉｄａの増殖を抑制することについて、フルコナゾールと同程度に有効であることを示している。
【００３８】
（実施例４）
この実施例は、α−ＭＳＨおよびその誘導体が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖及び芽管（ｇｅｒｍ ｔｕｂｅ）形成を抑制することを示すものである。芽管形成は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染における病因の実質的な部分である。この病因は、宿主の外皮あるいは内皮細胞への粘着を起こし、楕円状の出芽胞子から、例えば、芽管、擬菌糸、及び菌糸等の各種糸状体へと形態的な変化を起こす。Gow, N.A., Germ Tube Growth of Candida albicans, Curr. Topics Med. Myco. 8, 43-55(1997)
【００３９】
定常期培養からのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓは、蒸留水で２回洗浄され、ＨＢＳＳに懸濁されて２×１０6／ｍｌの最終濃度とされた。菌糸の成長は、１０％の不活性化されたウマ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ペイズリー、グレイト ブリテイン）を、継続的に振盪しながら３７℃で４５分間培養した酵母菌に添加することによって誘導された。ウマ血清は、その後、ＨＢＳＳで２回洗浄して除去され、さらに、１０-6Ｍ濃度のα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、（６−１３）（配列番号３）、あるいは（１１−１３）（配列番号１）の存在下に、さらに６０分間の培養が、３７℃で振盪しながら継続された。糸状体細胞の数は、ヘモサイトメータを利用して、光学顕微鏡下で測定された。
実験は、繰り返し数３回で行われ、少なくとも２００細胞が計数された。顕微鏡写真が、Ａｘｉｏｓｋｏｐ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡に装着したＭＣ１００カメラで撮影された。
【００４０】
図５Ａ〜５Ｄは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓとα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）あるいは（１１−１３）（配列番号１）とを培養することが、ウマ血清により誘導される芽管形成を抑制したことを示している。α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）が糸状体細胞の数を２８〜３２％低下させる一方、、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）は、５４〜５８％低下させた。図示されていないが、α−ＭＳＨ（６−１３）（配列番号３）は、同様に、糸状体細胞数を約５０％低下させた。したがって、この実施例は、α−ＭＳＨあるいはその誘導体が、その芽管形成を抑制することにより、Ｃａｎｄｉｄａの病因の一態様を抑制できることを示している。
【００４１】
（実施例５）
病原体の死滅が低下されることは、感染期間中に、コルチコステロイド類及び他の非ステロイド系抗炎症剤を用いる治療の悲惨な結果である。Stevens,D.L., Could Nonstroidal Anti-inflammatory Drugs(NSAIDs) Enhance Progression of Bacterial Infections to Toxic Shock Syndorome?,Clin.Infect.Dis. 21, 977-80(1997);Capsoni,F., et al., Effect of Corticostroids on Neutrophil Function: Inhibition of Antibody-dependent Cell-Mediated Cytotoxity(ADCC),J.Immunophamacol.5,217-30(1983). この実施例は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体が、これらの感染と戦うヒト好中球細胞の能力を包含することなく、感染原因菌の増殖を抑制することを示すものである。さらに、この実施例は、α−ＭＳＨまたはその誘導体は、実際に、これらの原因菌を殺す好中球細胞の能力を増強することを示すものである。
【００４２】
健康なボランティアからの静脈血（２０ｍｌ）が、ヘパリンで抗凝集化された。好中球細胞は、その後、デキストラン沈降分離を用いて分離され、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ., セントルイス、ミズーリ、ＵＳＡ）を用いて遠心分離された。赤血球が、低浸透圧ショックで溶菌されて、細胞懸濁液の少なくとも９７％を好中球である液が得られた。トリパンブルー除去により評価される細胞の活性は、９８％を超えていた。好中球は、実験のためのＨＢＳＳ中に再懸濁された。
【００４３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（１×１０6）は、３７℃で、３０分間振盪水浴中でヒトＡＢ血清でオプソニンを作用された。これらは、次いで、好中球とともに、培地のみ、あるいは培地と１０-15〜１０-4Ｍの濃度範囲のα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）あるいは（１１−１３）（配列番号１）の存在下で、３７℃、２時間振盪水浴中で培養された。培養後、増殖を停止させるために、氷上に培養チューブを載置し、菌体外有機体は、４℃で１０００×ｇの遠心分離を２回することにより洗浄された。２．５％のデオキシコール酸ナトリウム溶液が、その懸濁液に添加され、そのチューブを５分間振盪した。冷たい蒸留水が、その後、添加されて、１０6細胞／ｍｌの懸濁液が得られた。ＨＢＳＳによる二回の一連の１００分の１希釈が、１００細胞／ｍｌの最終懸濁液を得るのに行われた。１ｍｌがその後、血液寒天平板に付与され、３７℃で４８時間培養された。コロニー形成単位は、繰り返し数を３として行う各実験での培養期間の最後において計数された。
【００４４】
図６は、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）及び（１１−１３）（配列番号１）が実際に、１０-12〜１０-4Ｍの濃度範囲で投与された際、好中球によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの殺傷を増強する（ｐ＜０．０１）ことを示している。また、かかる殺傷の増強は、ヒト血漿中に見いだされるα−ＭＳＨの濃度に等しいピコモル濃度を含む広い濃度範囲にわたって生じていたことを示している。
したがって、この実施例は、カンジダ症、膣炎、尿道炎、亀頭包皮炎、あるいは痔核にも適用されるα−ＭＳＨまたはその誘導体は、同時に、感染症と炎症に対して対抗することができることを示している。
【００４５】
（実施例６）
この実施例は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体が、一般的な抗菌特性、特に、抗真菌活性を発揮する細胞のメカニズムを示唆するものである。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（１０6／ｍｌ）、トルエン／エタノールで透過性とされ、３７℃で１０-6Ｍのα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）、（１１−１３）（配列番号１）あるいは、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（細胞内ｃＡＭＰを増大させるさせる薬剤として知られている）の存在下あるいは非存在下で、連続振盪培養された。氷冷したエタノールを添加することにより、３分後に反応を停止させた。ｃＡＭＰレベルは、商業的に入手可能な酵素イムノアッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ユナイテッドキングダム）を用いて、製造者の指示書に従い、液相法による抽出後に、繰り返し数を２として測定された。関連する実験で、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、強力なアデニルシクラーゼ阻害剤であるジデオキシアデノシン（ｄｄＡｄｏ、Ｓｉｇｍａ）に対して、２５，５０及び１００×１０-5Ｍの濃度において２時間曝され、次いで、α−ＭＳＨまたはその誘導体にさらに２時間曝された。フォルスコリンとｄｄＡｄｏの、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのコロニー形成能力に対する効果は、実施例２において記載した方法により決定した。
【００４６】
図７は、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）及び（１１−１３）（配列番号１）が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるｃＡＭＰ含有量を増大させたことを示す。このｃＡＭＰの増加は、等モルのフォルスコリンによって誘導されるのと同じオーダーの強度であった。図８は、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）及び（１１−１３）（配列番号１）に加えて、フォルスコリンも、コントロールに対してＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を有意に阻害した（ｐ＜０．０１）ことを示す。図９は、ｄｄＡｄｏが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に対して、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）及び（１１−１３）（配列番号１）の効果を逆転させる能力を有していることを示している。
【００４７】
この実施例は、α−ＭＳＨおよびその誘導体が、ｍＲＮＡとタンパク合成を阻害するｃＡＭＰレベルの増大によって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及び他の微生物の増殖を阻害するらしいことを示している。参照例、Bhattacharya A et.al.,Effect of Cyclic AMP on RNA and Protein Synthesis in Candida albicans, Biochem.Biophysics.Res.Commun.,77:1483−44(1977)
【００４８】
（実施例７）
この実施例は、α−ＭＳＨまたはその誘導体がヒト細胞においてウイルスの増殖を阻害する能力について示すものである。特に、α−ＭＳＨは、ＨＩＶ−１に慢性的に感染したヒト単核細胞において、ＨＩＶ−１の複製と発現を阻害した。
【００４９】
慢性的にＨＩＶ−１ウイルスに感染した前駆単核細胞のＵ１細胞系列は、単核細胞における潜在的ＨＩＶ感染のインビトロモデルである。これらの細胞は、２個のＨＩＶのプロウイルスコピーを保有しており、ＨＩＶの構成的発現は非常に低い。しかしながら、ＲＮＡの転写、ｐ２４抗原、あるいは逆転写酵素の放出によって測定されるウイルスの複製は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＰＭＡあるいは細胞密集等の異なる刺激によって活性化される。
【００５０】
α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体のＨＩＶ複製における効果を評価するには、これらの細胞が、完全培養培地（１０ｍＭのＨｅｐｅｓが添加されたＲＰＭＩ １６４０）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｏｃｈ）、１０％熱不活性化ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に、対数増殖期に維持された。試験的な実験が、はじめに実施され、最適な細胞密度、刺激源濃度が決定され、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原生成の反応速度がかかる培養条件を用いて決定された。使用前には、細胞は、ＨＢＳＳで３回洗浄され、細胞外のウイルスが取り除かれた。 その後、細胞は、２×１０5／ｍｌ（最終体積１ｍｌ）の濃度で、培地のみとともに、あるいは、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｄ，ＵＫ）が追加されて、１０-15〜１０-4Ｍの濃度のα−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）あるいは（１１−１３）（配列番号１）の存在下あるいは非存在下に、２４ウェル−フラット−ボトムド プレートに載置された。
【００５１】
さらなる実験において、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号４）のみを、１０-5Ｍで、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１０（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）、ＰＭＡ（１ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、あるいは密集状態によって刺激されたＵ１細胞に添加された。密集状態は、ＵＩ細胞を、２×１０5／ｍｌで植菌し、それらを、培地を変えることなく７日間、３７℃、５％ＣＯ2で維持することにより達成した。サイトカインあるいはＰＭＡで活性化した細胞培養は、４８時間のみ維持した。上澄み液を遠心分離により除去し、そして、商業的にＣｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎｃ．ｉｎ Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ，ＵＳＡから商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットを用いてｐ２４抗原を測定した。逆転写酵素の放出も、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎから商業的に入手可能なキットである、ＥＬＩＳＡ Ｒｅｔｒｏｓｙｓ ＲＴ ａｓｓａｙ を用いて測定された。これらの実験においては、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）は、第１日目において添加され、各条件はいずれも繰り返し数を３として実験された。
【００５２】
図１０は、α−ＭＳＨ（１−１３）（配列番号４）と（１１−１３）（配列番号１）とは、広い範囲の濃度でＴＮＦ−αで刺激したＵ１細胞からのｐ２４抗原の放出を有意に阻害したことを示している。双方のペプチドにおいて最も有効な濃度は、１０-5Ｍであり、それぞれ、５２．７％及び５６．０％の阻害を示した。図１１は、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）も、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＰＭＡ及び密集状態によって誘導されたＵ１細胞からのｐ２４抗原と逆転写酵素の放出を阻害したことを示している。加えて、図１２は、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）は、ＰＭＡで刺激したＵ１細胞における、ノーザンブロット分析により測定されるものとしての、スプライスされたあるいはスプライスされていないＨＩＶ−１ＲＮＡの双方の転写も阻害したことを示している。
したがって、この実施例は、α−ＭＳＨまたはその誘導体が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０経路を媒介するウイルス遺伝子の転写を阻害できることを示している。
【００５３】
（実施例８）
この実施例は、さらに、α−ＭＳＨがウイルスの複製と活性化を阻害する能力について示す。特に、Ｕ１細胞中のα−ＭＳＨに対する中和抗体の添加が、ｐ２４抗原を実質的に増大させた。
【００５４】
Ｕ１細胞は、実施例７と同様に培養された。Ｕ１細胞によって合成される内在性のα−ＭＳＨが、培地で１：２５０に希釈された精製ウサギ抗α−ＭＳＨ抗体（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｍａｌｍｏ，Ｓｗｅｄｅｎ）の親和性によって阻害された。コントロール抗体は、同じ希釈率のウサギＩｇＧとした。抗α−ＭＳＨあるいはコントロール抗体により処理された細胞（２×１０5／ｍｌ）が、培地あるいはＰＭＡ（１ｎｇ／ｍｌ）とともに培養された。３７℃における４８時間の培養後、上清が分離され、ｐ２４抗原の放出について測定された。先と同様にして培養されたＵ１細胞の密集実験においては、抗α−ＭＳＨあるいはコントロール抗体が、第１日目に添加され、上清が、第７日目に採取された。
【００５５】
図１３は、休止状態、ＰＭＡ誘導あるいは密集化されたＵ１細胞におけるα−ＭＳＨの阻害は、有意に、ｐ２４抗原の放出を増大させたことを示している。この実施例は、ウイルスの複製が、α−ＭＳＨによって影響を受けることを強く示唆している。
【００５６】
（実施例９）
この実施例は、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体が、ウイルスの複製と発現を阻害するするメカニズムについて示す。特に、α−ＭＳＨあるいはその誘導体が、ＴＮＦ−αで誘導したＮＦ−κＢ活性化と結合を阻害した。
【００５７】
ＮＦ−κＢ活性のレベルを決定するために、核抽出物が、１０-5Ｍのα−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）の存在下あるいは非存在下でＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）で４時間刺激した２０×１０6個のＵ１細胞（完全培地中２×１０5／ｍｌ）から調製された。細胞は、冷たいＰＢＳで１回洗浄され、そして、バッファＡ（１０ｍＭＨｅｐｅｓ ＰＨ７．９、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭＤＴＴ）で１回洗浄され、遠心分離され、バッファＡに０．１％のＮＰ−４０を添加した中で氷上で１０分間培養された。その後、上清が除去され、核ペレットが、１５μｌのバッファＣ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ＰＨ７．９、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．４２ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２５％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、及び０．５ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁され、１５分間氷上で培養され、混合され、その後、遠心分離された。上清は、７５μｌの修飾バッファＤ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ＰＨ７．９、０．０５ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、及び０．５ｍＭ ＤＴＴ）で希釈され、−８０℃で保存された。結合反応は、バッファＡ（１２ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ ７．８、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍＭＤＴＴ）に、１０％グリセロール、２μｇ／ｍｌ仔牛血清アルブミン、及び１μｇ／ｍｌの一重鎖ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えた中で、１０μｇの核抽出タンパク質と、32Ｐでラベルした０．５ｎｇのＮＦ−κＢ（３００００ｃｐｍ／μｌ）あるいはＡＰＩコンセンサスとを用いて室温で１５分間実施された。これらの実験で使用したＮＦ−κＢのためのオリゴヌクレオチドは、＋ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＧＧ ＧＧＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＣＡ ＴＧ、及び−ＧＡＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＧであった。いずれのオリゴヌクレオチドも、その相補鎖とアニールされ、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐ−γ−ＡＴＰでエンドラベルされた。特異的なバンドを検出するために、核抽出物は、ラベルしたプローブとインキュベートするのに先だって、最初に、５分間、ラベルしていない１００倍過剰のプローブとインキュベートされた。混合物は、その後、１×ＴＢＥ中の５％（３０：１）のアクリルアミドゲルに負荷された。ゲルは、乾燥され、オートラジオグラフされた。
【００５８】
図１４は、ＴＮＦ−αが、顕著に、ＮＦ−κＢ結合活性を増強するが、１０-5Ｍのα−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）とともに培養すると、有意に、ＮＦ−κＢの活性を低下させることを示す。しかしながら、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）は休止状態の細胞においてＮＦ−ｋＢの活性を変化させることはなかった。このことは、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体は、ＮＦ−κＢ結合の制御を介してウイルスの複製と発現とを阻害することを示唆する。
【００５９】
ウイルスの複製は、しばしば、感染された細胞の活性化状態に依存し、しばしば、ウイルスと宿主因子との相互作用によって制御される。かかる宿主因子には、ＴＮＦ−αやインターロイキン等の他のサイトカインを含みうる。ＨＩＶ−１感染と活性化に類似して、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ウイルスも、宿主のサイトカインに応答して、潜伏状態からから再活性化されるようになる。例えば、ＩＬ−１やＩＬ−３でなく、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６は、ＨＳＶ感染を再活性化することが示されている。抗ＩＬ−６抗体によるＩＬ−６の中和は、有意に、ＨＳＶ再活性化を阻害するが、インターフェロンα及びβの中和ではそうではなかった。
【００６０】
参照例：Baker, M., et. al., The Relationship between Interleukin-6 and Herpes Simplex Virus Type-1: Implications for Behavior and Immunopathology, Brain Behav. Immun. 13(3):201-11(1999); Noisakran S., e. al., Lymphocytes Delay Kinetics of HSV-1 Reactivation from in vitro Explants of Latent Infected Trigeminal Ganglia, J. Neuroimmunol. 95(1-2):126-35(1999); Walev, I., et. al., Enhancement by TNF-alpha of Reactivation and Replication of Latent Herpes Simplex Virus from Trigeminal Ganglia of Mice, Arch Virol. 140(6):987-92(1995); Domk-Optiz, I., et.al., Stimulation of Macrophages by Endotoxin Results in the Reactivation of a Persistent Herpes Simplex Virus Infection, Scand J. Immunol. 32(2):69-75(1990); Fauci, A. S., Host Factors in the Pathogenesis of HIV-induced Disease, Nature 384: 529(1996)
【００６１】
ＴＮＦ−α、あるいはＨＳＶを含むウイルス感染は、ＩκＢを標的とする破壊を引き起こし、変わりに、ＮＦ−κＢの核局在化を促進する。核局在化は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及び他のサイトカインを含む各種の炎症原因の転写のためのＤＮＡオペレータに対するＮＦ−κＢの結合を促進する。これらのサイトカインの発現は、再び、他のＨＳＶ感染細胞がＨＳＶウイルスを合成するのを再活性化する。参照例：Patel,A.,et al.,Herpes Simplex Type I Induction of Persistent NF-κB Nuclear Translocation Increases the Effeciency of Virus Replication, Virology 247(2):212-22(1998)
【００６２】
したがって、ＮＦ−κＢの結合を阻害することにより、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体は、ＨＳＶを再活性化しうる、より多くの炎症性サイトカインの発現を阻害する。この実施例と実施例７及び８は、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体がサイトカインや他のウイルス感染に応答して生じるＮＦ−κＢの結合を阻害することにより、ウイルスの複製、発現、及び再活性化を阻害することを示している。
【００６３】
（実施例１０）
この実施例は、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体が、急性感染されたヒト細胞においてウイルス複製を阻害する能力を示す。特に、α−ＭＳＨが、ＨＩＶ−１に急性感染されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）においてその複製と発現とを阻害した。
【００６４】
ＰＢＭＣｓは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心により通常のドナーにより分離された。単核細胞は、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配分離により分離され、１０6細胞／ｍｌの濃度で、２４ウェル組織培養プレートを用いて、７日間、完全培地ＲＰＭ１にＦＣＳを２０％添加した中でマクロファージ（ＭＤＭ）に分化させた。ＭＤＭは、モノサイトトロピックＨＩＶＢａ−１株（１：１０）で一晩感染させた。希釈していないウイルスストックは、１０7感染単位／ｍｌを有していた。２４時間後、ＭＤＭは、洗浄され、完全培地に再懸濁され、３週間の間、週に３回培地交換された。逆転写酵素の放出は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎから商業的に入手可能なキットである、ＥＬＩＳＡ Ｒｅｔｒｏｓｙｓ ＲＴ ａｓｓａｙ を用いて、感染後、週単位で測定した。１０-5Ｍのα−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）は、ＨＩＶ感染時に添加され、採取するまで毎日添加された。
【００６５】
図１５は、α−ＭＳＨが、急性感染されたＭＤＭにおいて逆転写酵素の放出を有意に阻害していることを示す。この阻害効果は、第６日目においてより明白であったが、第２１目においても依然として統計的に有意であった。
したがって、この実施例は、感染部位におけるウイルス感染がα−ＭＳＨ又はその誘導体により阻害されうることを示している。結果的に、一般的な性病、特にＨＩＶの性的な伝達は、性的接触中に使用されるコンドームやダイヤフラムやスポンジ等の避妊具とともにα−ＭＳＨ及び／又はその誘導体を伴うことにより、及び／又は、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体を含む、坐剤、クリーム、軟膏、ゲルあるいはエアロゾルフォームを性的接触後に適用することにより、阻害されうる。
【００６６】
（実施例１１）
この実施例は、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体の生物学的機能同等性について示すものである。
ここに記載される特定のアミノ酸配列は有効であるが、このペプチドの有効性を変えることなく、アミノ酸が置換され削除されうることは、当業者によく知られている。さらに、α−ＭＳＨ配列の安定化は、顕著にそのペプチドの活性を増大させること、及びＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に置換することは、そのペプチドの有効性を改善しあるいは減少させることが知られている。たとえば、安定したα−ＭＳＨの類似体である、[ＮＬｅ4，Ｄ−Ｐｈｅ7]−α−ＭＳＨ、この類似体は、メラニン生成細胞及びメラノーマ細胞に対して顕著な生物学的活性を有しているが、おおよそ、熱を低下させることにおいては、親ペプチドによりもおおよそ１０倍強力である。さらに、α−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）配列のＣ末端にアミノ酸を付加することにより、解熱作用を低下させあるいは増強することができる。１０−１３配列（配列番号５）を形成するように、グリシンを付加することにより、やや低下し、９−１３配列（配列番号６）は、ほとんど活性を排除する一方、８−１３配列（配列番号７）は、１１−１３配列（配列番号１）よりも強力である。Ａｃ−[Ｄ−Ｋ１１]−α−ＭＳＨ−ＮＨ２は、トリペプチドα−ＭＳＨ（１１−１３）（配列番号１）のＬ型と同じ通常の力価を有していることが知られている。しかしながら、Ｄ−プロリンでそのトリペプチドの１２番を置換することは、トリペプチドを不活性化する。
参照例：Holdeman,M.,et al.,Antipyretic Activity of Potent alfa-MSH Analog,Peptides 6,273-5(19835). Deeter.L.B.,et al.,Antipyretic Properties of Centrally Administrated alfa-MSH Fragments in the Rabbit,Peptides 9,1285-8(1989). Hiltz,M.E.,Anti-inflammatory Activity of alfa-MSH(11-13) Analogs: Influence of Alterations in Streochemistry, Peptides 12, 767-71(1991).
【００６７】
生物学的機能同等性は、類似したハイドロパティック値（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸で置換することよっても得られる。したがって、例えば、ハイドロパティック値がそれぞれ＋４．５及び＋３．８であるイソロイシンとロイシンは、ハイドロパティック値が＋４．２であるバリンと置換されうるし、また、同じような生物学的活性を有するタンパク質を得ることができる。また、その尺度の逆側においては、リジン（−３．９）は、アルギニン（−４．５）などと置換されうる。一般的に、アミノ酸は、置換されるアミノ酸と約＋／−１の範囲内のハイドロパティック値を有しているアミノ酸であれば、うまく置換されうるとされている。
さらに、かかる修飾されたα−ＭＳＨ及び／又はその誘導体の類似体は、図１６に示されるＫＰＶ二量体に例示されるように、二量体を形成することができる。
【００６８】
（実施例１２）
女性は、膣や、外陰部及び／又は尿管において不快な症状を経験する。医師による実験として、これらの領域から採取された細胞培養を含めることができる。感染あるいは炎症を含む不快な症状の原因を決定した後、医師は、適切な抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、あるいは抗炎症剤を処方する。加えて、治療には、軟膏、クリーム、ゲル、溶解性丸剤、エアロゾルスプレー、坐剤、圧注器用の液剤、あるいはタンポンの吸収体に担持されるα−ＭＳＨ及び／又はその誘導体の薬理学上の有効量の局所適用を含めることができる。局所的治療は、疾患が解消するまで医師の判断に基づいて、一回あるいは複数回にわたって適用される。
【００６９】
医師による判断において適切であれば、この実施例は、陰茎、精巣及び／又は尿管に不快症状のある男性にも適用される。加えて、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体の局所適用は、医師の処方によらない市販の医薬品として達成される。
【００７０】
この実施例１〜１２は、α−ＭＳＨ及び／又はその誘導体の抗感染活性とその使用を開示するものである。これらのデータは、単なる例示であって、これらの実施例により本発明を制限しようとするものではない。上記実施例を変更することは本発明の精神に反するものではない。さらに、これらの実施例は、それ自身あるいは互いに組合わされて適用されうる。
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、S. aureusの増殖に対するα−MSH及び／又はその誘導体の抑制効果を示す。
【図２】  図２は、ウロキナーゼで誘導されたS. aureusの増殖に対するα−MSH及び／又はその誘導体の効果を示す。
【図３】  図３は、C. albicansの成長に対するα−MSH及び／又はその誘導体の抑制効果を示す。
【図４】  図４は、フルコナゾールを含有するα−MSH及び／又はその誘導体抗菌活性を比較する。
【図５】  図５（A）から（D）は、C. albicansの芽管の形成に対するα−MSH及び／又はその誘導体の抑制効果を示す。
【図６】  図６は、C. albicansに対するα−MSH及び／又はその誘導体の増加した好中球の殺菌効果を示す。
【図７】
【図８】
【図９】  図７，８及び９は、α−MSH及び／又はその誘導体がC. albicansの増殖を抑制する機構を示す。
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】  図１０から図１３は、慢性的に感染した細胞内での、ウイルスの複製、発現に対するα−MSH及び／又はその誘導体の抑制効果を示す。
【図１４】  図１４は、α−MSH及び／又はその誘導体が、ウイルスの複製、発現、再活性化を抑制する機構を示す。
【図１５】  図１５は、急性感染した細胞内でのウイルスの複製、発現に対するα−MSH及び／又はその誘導体の抑制効果を示す。
【図１６】  図１６は、本発明の一形態とともに利用されるKPV二量体の一形態の化学構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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