(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェリンを基質として発光能を有する酵素を触媒として用い、アデノシントリリン酸およびマグネシウムイオンの存在下で、コエンザイムＡと炭素数６以上の脂肪酸を反応させることを特徴とする脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項２】
脂肪酸が、炭素数６〜２４の脂肪酸である請求項１に記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項３】
脂肪酸が、炭素数１６〜２０の脂肪酸である請求項２に記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項４】
脂肪酸が、不飽和脂肪酸である請求項３に記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項５】
脂肪酸が、リノール酸である請求項４に記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項６】
脂肪酸が、リノレン酸である請求項４に記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項７】
脂肪酸が、アラキドン酸である請求項４に記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項８】
ホタル（Photinus pyralis）に由来するルシフェラーゼを触媒として用いる請求項１〜７のいずれかに記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【請求項９】
ゲンジボタル（Luciola cruciata）に由来するルシフェラーゼを触媒として用いる請求項１〜７のいずれかに記載の脂肪酸コエンザイムＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発光酵素を用いて脂肪酸とコエンザイムＡ（以下“ＣｏＡ”と称する）より脂肪酸コエンザイムＡ（以下“脂肪酸ＣｏＡ”と称する）を製造する方法に関する。詳細には、発光酵素であるルシフェラーゼを触媒として用い、アデノシントリリン酸（以下“ＡＴＰ”と称する）およびマグネシウムイオンの存在下で、脂肪酸とＣｏＡを反応させることにより脂肪酸ＣｏＡを製造する方法である。
【０００２】
【従来の技術】
脂肪酸ＣｏＡは、脂肪酸（Ｒ−ＣＯＯＨ）がＣｏＡの−ＳＨ基とエステル結合した化合物であり、
Ｒ−ＣＯ−Ｓ−ＣｏＡ
で表される。脂肪酸ＣｏＡは、生体内の脂肪酸合成系において重要な役割を果たしているため、脂肪酸の代謝系研究に必須である。脂肪酸ＣｏＡは、化学合成および酵素を用いた方法によって製造される。
化学合成法は、脂肪酸をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルとして活性化し、ＣｏＡと反応させるものである。しかし、炭素数が１８以上の脂肪酸の場合にはその疎水性のために親水性のＣｏＡとの反応が十分に進まない（特許文献１参照）。その結果、炭素鎖が長い脂肪酸ＣｏＡほど高価である。
一方、脂肪酸ＣｏＡ合成酵素は、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下において、脂肪酸とＣｏＡの反応を触媒する。その反応は
【化１】
0004175075.tif 000002
（ここで、ＡＭＰはアデノシンモノリン酸、ＰＰｉはピロリン酸である。）
現在まで、脂肪酸ＣｏＡの生成を触媒するＡＴＰ依存型の酵素には、脂肪酸炭素鎖長要求性が異なる４種の酵素がある。短鎖基質に特異性を有するアセチルＣｏＡシンテターゼ（EC6. 2. 1. 1）、中鎖基質に特異性を有するブチリルＣｏＡシンテターゼ（EC6. 2. 1. 2）、長鎖基質に特異性を有するアシルＣｏＡシンテターゼ（EC6. 2. 1. 3）と炭素鎖２２以上の極長鎖脂肪酸に基質特異性を示す極長鎖アシルＣｏＡシンテターゼである。しかし、上述の４酵素は、一般的な酵素ではないため入手が困難であり、当然大量生産もされていない。
このように、脂肪酸ＣｏＡを酵素を用いて合成することは容易ではない。そのため、簡易に安価で安定して脂肪酸ＣｏＡが供給されることが所望されている。
【０００３】
一方、発光酵素であるルシフェラーゼは酸化還元酵素（EC1. 13. 12. 7）に分類され、ＡＴＰ、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下に、ルシフェリンを発光基質として、発光反応を触媒する酵素であり、その反応は次で表される。
ルシフェリン + ATP ＋ O2 → オキシルシフェリン + AMP + PPi + CO2 + 光ルシフェラーゼは、これまで、鞘翅目（Coleoptera）のホタル科（Lampyridae）、ホタルモドキ科(Drilidae)、フェンゴデス科(Phengodidae)、ヒカリコメツキ科(Elateridae)に属する甲虫類から分離され同定されている。代表的なものは、ホタル由来のルシフェラーゼであり、北アメリカ産のホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼおよび日本産のゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼは遺伝子工学的に生産され、それぞれプロメガ社およびキッコーマン株式会社から販売されている。ルシフェラーゼは、食品工場等の汚染度をＡＴＰの量として測定する試薬として広く応用されている。また、研究試薬あるいはアミューズメント発光材料としても用いられている。
【０００４】
近年、ルシフェラーゼの遺伝子単離、組換えルシフェラーゼの発現、精製系が確立したことから、ルシフェラーゼの一次構造から三次構造まで決定され、その発光機序も解明されている(非特許文献１参照)。
ホタルルシフェラーゼによる発光反応が時間経過とともに、低下（阻害）すること、その発光阻害がＣｏＡを添加することにより、解除されることは古くから知られている（非特許文献２参照）。
１９８９年にはホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、植物由来のクマル酸−ＣｏＡ合成酵素のそれと弱い相同性(３４％)があることが報告されている（非特許文献３参照）。
１９９０年には、ラットの長鎖脂肪酸ＣｏＡ合成酵素とルシフェラーゼのアミノ酸配列の類似性が報告されている（非特許文献４参照）。
１９９１年、Ｔｏｈは、ＡＴＰおよびＣｏＡの関与する各種酵素と、ルシフェラーゼの構造比較を行い、部分的に相同性の高いアミノ酸配列と酵素の反応様式から、ＡＴＰおよびＣｏＡの関与する領域の存在を示唆している。(非特許文献５参照)。
このようにルシフェラーゼの部分的高次構造のモチーフと似ているものの報告がなされているが、ルシフェラーゼが脂肪酸とＣｏＡとの結合を触媒する脂肪酸ＣｏＡ合成酵素である事実はこれまで報告されていない。
現在までに単離されている鞘翅目由来のルシフェラーゼ遺伝子は、１２種以上になり、それらの遺伝子より推定されるルシフェラーゼ間での一次構造の相同性は５０〜９０％と幅があることが報告されている(非特許文献６参照)。
【０００５】
【特許文献１】
特開平６−３２１９７３号公報（第３頁３欄）
【非特許文献１】
Conti, E. 等、Structure(1996) 4:287-298
【非特許文献２】
Airth, R. L. 等、 Biochem. Biophys. Acta (1958) 27：519-532
【非特許文献３】
Schroder, J.、 Nucleic Acids Res. (1989) 17：460
【非特許文献４】
Suzuki, H 等、J. Biol. Chem. (1990) 265：8681-8685
【非特許文献５】
Toh, H.、 Protein Seq Data Anal. (1991) 4：111-117
【非特許文献６】
Ye. L. 等、Biochem. Biophys. Acta (1997) 1339：39-52
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高純度の脂肪酸ＣｏＡを簡易に安価で合成し、安定して供給する製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ホタルルシフェラーゼは、脂肪酸とＣｏＡの結合を触媒し、脂肪酸ＣｏＡ合成能を有することを見い出し、本発明を完成した。すなわち、ルシフェラーゼがＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下において脂肪酸とＣｏＡとの反応を触媒し脂肪酸ＣｏＡの生成を促進することを応用して脂肪酸ＣｏＡを製造するものである。
【０００８】
したがって、本発明は、ＡＴＰ、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下でルシフェリンを基質として発光能を有する酵素を触媒として用い、ＣｏＡおよび炭素数６以上の脂肪酸を、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下で反応させることを特徴とする脂肪酸ＣｏＡの製造方法である。
本発明で用いる脂肪酸は、炭素数が６以上であり、炭素数６〜２４のものが好ましい。特に炭素数１６〜２０の脂肪酸の場合には極めて高い変換率で脂肪酸ＣｏＡとすることができる。炭素数が１６〜２０の脂肪酸の内でも、不飽和結合を有するオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸の場合の変換率が特に高い。化学合成法によってこれらの不飽和脂肪酸ＣｏＡを製造する場合には、製造過程で不飽和結合が酸化されるため収率が低いが、本方法によれば極めて高収率で製造することができる。
【０００９】
本製造法において使用される酵素は、ＡＴＰ、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下でルシフェリンを基質として発光能を有するルシフェラーゼである。そのルシフェラーゼとして、ホタル科(Lampyridae)に属するPhotinus pyralis、Luciola cruciata、Luciola lateralis、Luciola mingrelica、Photuris pennsylvanica、Pyrocoelia miyako、Pyrocoelia rufa、Hotaria parvula、Hotaria unmunsana、Lampyris nocticula由来のもの、ヒカリコメツキ科（Elateridae）に属する Pyrophorus plagiophthalamus由来のもの、フェンゴデス科（Phengodidae）に属するPhrixothrix vivianii、Phrixothrix hirtus由来のものものが知られている。それらの遺伝子は単離され、アミノ酸配列も知られている。それを表１に示した。
【００１０】
【表１】
0004175075.tif 000003
【００１１】
ホタル（Photinus pyralis）に由来するルシフェラーゼ、およびゲンジボタル（Luciola cruciata）に由来するルシフェラーゼは、市場から自由に入手できる点で好ましい。ルシフェラーゼは天然のルシフェラーゼであっても、組換ルシフェラーゼであってもよい。
【００１２】
本発明の脂肪酸ＣｏＡの生成反応機構を図１に模式的に示した。ルシフェラーゼは、マグネシウムイオンの存在下で、脂肪酸とＡＴＰと反応し、活性な
[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]
となり、この複合体とＣｏＡが反応して脂肪酸ＣｏＡが生成し、ルシフェラーゼが再生される。
【００１３】
ルシフェラーゼの発光反応の機序を図２で示した。ルシフェラーゼは、マグネシウムイオンの存在下で、ルシフェリンとＡＴＰと反応し、活性な
[ルシフェラーゼ：ルシフェリン−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]
となり、これが酸化されて発光し、オキシルシフェリンが生成し、ルシフェラーゼが再生される。
【００１４】
脂肪酸ＣｏＡ生成反応で、[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]
が生成する点は、ルシフェラーゼの発光反応で[ルシフェラーゼ：ルシフェリン−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]が生成する点と類似している。しかし、前者の複合体はＣｏＡと反応して脂肪酸ＣｏＡを形成し、ルシフェラーゼが再生するのに対し、後者の複合体は酸化されてオキシルシフェリンを形成し、ルシフェラーゼが再生する点で全く相違している。
【００１５】
本発明の脂肪酸ＣｏＡ生成反応は、脂肪酸を基質として[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]を生成する全ての酵素によって触媒される。また、ルシフェリンを基質として[ルシフェラーゼ：ルシフェリン−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]を生成する酵素は、脂肪酸を基質として[ルシフェラーゼ：Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＡＭＰ複合体]を生成する。したがって、ルシフェリンを基質として発光能を有する酵素であれば、その由来を問わず、本発明の脂肪酸ＣｏＡの生成を触媒する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、ルシフェリンを基質として発光能を有する酵素を用いて、ＡＴＰ、マグネシウムイオンの存在下で脂肪酸とＣｏＡより脂肪酸ＣｏＡを合成する方法である。反応は通常の化学反応と同様に行うことができ、反応条件等は適宜変更することができる。
一般的には、反応容器に脂肪酸、ＡＴＰ、ＣｏＡおよびマグネシウム塩を入れる。ここにトリスバッファーを加えpＨを調整する。反応温度まで昇温または冷却したのち、ルシフェラーゼを添加することで反応を開始させる。反応は反応停止剤を添加することで終了させる。
本発明における脂肪酸は、直鎖脂肪酸でも分枝鎖脂肪酸でもよく、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸であってもよい。脂肪酸は、炭素数が６以上のものであり炭素数の上限はないが、炭素数が２４以下であることが好ましい。不飽和脂肪酸の二重結合の数に制限はないが、二重結合が１〜４であることが好ましい。三重結合をもつ不飽和脂肪酸であってもよい。適当な飽和脂肪酸を例示すれば、ヘキサン酸（カプロン酸）、オクタン酸（カプリル酸）、デカン酸（カプリン酸）、ドデカン酸（ラウリン酸）、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸（マルガリン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、エイコサン酸（アラキン酸）、ドコサン酸（ベヘン酸）、テトラコサン酸（リグノセリン酸）等である。分枝鎖飽和脂肪酸の例としては、１４−エチルヘキサデカン酸、２−ブチルテトラデカン酸、１７−メチルオクタデカン酸等が挙げられる。不飽和脂肪酸の例としては、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、ガンマ−リノレン酸、ビスホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアロール酸等である。
【００１７】
反応温度はルシフェラーゼが酵素活性を示す温度であればよく、２０〜４０℃であることが好ましい。反応溶液のpＨは、ルシフェラーゼが酵素活性を示す範囲であれば特に制限されるものではない。反応溶液のpＨは、好ましくは６.５〜９.０の範囲、より好ましくは７.０〜８.０の範囲である。
反応は、バッチ法であっても連続反応であってもよい。反応時間は温度、pＨ、原料の配合割合等によって適宜選択することが出来る。
【００１８】
反応原料の割合は、自由に調節できる。ＡＴＰおよびＣｏＡは、ルシフェラーゼに対し通常１００倍モル以上添加することが好ましい。脂肪酸のモル濃度はルシフェラーゼのモル濃度の５０倍以下とすることが望ましい。
【００１９】
反応生成物は定法によって分離精製することができる。生成物が脂肪酸ＣｏＡであることは、公知の方法により脂肪酸ＣｏＡの標準品と比較することにより確認できる。例えば薄層クロマトグラフにより行うことができる。本発明方法は副生物の産生が極めて少ないので、未反応原料を分離することによって目的物を簡単に精製することができる。
【００２０】
脂肪酸ＣｏＡの合成をホタル（Photinus pyralis）由来ルシフェラーゼおよびゲンジボタル（Luciola cruciata）由来ルシフェラーゼを代表例とし、実施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
実施例１  ホタルルシフェラーゼの基質特異性の確認
ホタルルシフェラーゼによる新規酵素反応の基質特異性を、有機酸である酢酸、プロピオン酸およびヘキサン酸、長鎖脂肪酸類であるパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、芳香族カルボン酸であるクマル酸、カフェイン酸、フェルラ酸を基質とし、薄層クロマト法（ＴＬＣ法）により確認した。
具体的には、ホタルルシフェラーゼによる反応に使用されるＡＴＰの32Ｐラベル体を用い、32ＰラベルＡＴＰより生成する32ＰラベルＡＭＰをＴＬＣにより分離を行い、ラジオアイソトープである32Ｐを検出することにより、反応をモニターした。
反応には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用いた。反応系の全量を２０μLとし、０.３３μCiの[α-32Ｐ]ＡＴＰ(3000Ci／mmol、５０mMトリシンバッファー(Tricine-buffer)１０mCi／mL：NEN Life Science Products社製)と１.２６μgのホタル（Photinus pyralis）由来の組換えルシフェラーゼ（QuantiLum Recombinant Luciferase、プロメガ社製）、それぞれの最終濃度が１００μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。基質には酢酸（和光純薬社製）、ｎ−プロピオン酸（和光純薬社製）、ｎ−ヘキサン酸（和光純薬社製）、ｐ−クマル酸（シグマ社製）、カフェイン酸（シグマ社製）、フェルラ酸（東京化成工業社製）、パルミチン酸（和光純薬社製）、オレイン酸（和光純薬社製）、リノール酸（和光純薬社製）、リノレン酸（日本油脂社製）、アラキドン酸（ナトリウム塩、シグマ社製）を使用し、各最終濃度が１０μMとなるように反応系に加えた。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、３０℃で３０分保温した。反応後、反応液の１μLを薄層（ＴＬＣ）プレート（Silica gel 60 Ｆ254、メルク社製）に供し、風乾により反応停止を行った。ＴＬＣプレートを展開溶媒として一回目に１,４−ジオキサン：５０mM酢酸＝４:１を用いて展開し、４０℃ホットプレート上で乾燥する。次に、展開プレートを展開溶媒１,４−ジオキサン：２５％アンモニア水：水＝３：２：１を用いて一回目の展開と同じ高さまで展開する。風乾したＴＬＣプレートをバイオイメージングプレート（フジフィルム社製）にて３０分間露光し、反応によりアデノシントリリン酸（32Ｐ−ＡＴＰ）から生成するアデノシンモノリン酸（32Ｐ−ＡＭＰ）についてラジオアイソトープ32Ｐ由来の画像を取得する。その画像解析には解析装置ＢＡＳ−２５００(フジフィルム社製)を用いた。生成するＡＭＰのＲｆ値（＝０.５１）は、ＡＭＰ標品（オリエンタル酵母社製）を同一ＴＬＣ条件にて展開し、ＵＶランプによりその蛍光で確認する。このＴＬＣ条件では、ＡＴＰおよびＡＤＰのＲｆ値は、それぞれ０.０７と０.１７であり、ＡＭＰと分離可能である。
その結果、短鎖カルボン酸であるプロピオン酸、芳香族カルボン酸であるクマル酸、カフェイン酸およびフェルラ酸からは、アデノシンモノリン酸（32Ｐ−ＡＭＰ）の生成は、顕著には検出されず、検出限界以下であった。短鎖カルボン酸であるヘキサン酸および長鎖脂肪酸であるオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸を基質とした場合のみ、アデノシンモノリン酸（32Ｐ−ＡＭＰ）の生成を確認した。
その生成比率を比較すると、以下のとおりであった。
【表２】
0004175075.tif 000004
すなわち、ホタルルシフェラーゼは、炭素数６以上の脂肪酸を基質として、マグネシウムイオンの存在下において、ＡＴＰ、ＣｏＡを用いた酵素反応を触媒する能力があることが、初めて明らかとなった。
一方、上記変換反応系において、ＣｏＡあるいは基質、マグネシウムイオンを添加しない条件での反応も行った。その結果、ルシフェラーゼ、ＣｏＡ、マグネシウムイオンおよび基質である炭素数６以上の脂肪酸の存在した場合にのみアデノシンモノリン酸（32Ｐ−ＡＭＰ）の生成を確認した。すなわち、後述するように、ホタルルシフェラーゼによる長鎖脂肪酸のＣｏＡ化変換反応には、ＡＴＰ、マグネシウムイオンとＣｏＡが必須であることが明らかとなった。
また、ＡＴＰに変えて、グアノシントリリン酸（ＧＴＰ）、チアミントリリン酸（ＴＴＰ）、シチジントリリン酸（ＣＴＰ）、イノシントリリン酸（ＩＴＰ）、ウリジントリリン酸（ＵＴＰ）を用いた場合にはこの反応が進行しないことを確認した。
【００２２】
実施例２  長鎖脂肪酸−14Ｃラベル体を用いた長鎖脂肪酸ＣｏＡの同定
14Ｃラベル体を用いて、オレイン酸ＣｏＡの同定を行った。
オレイン酸−14Ｃラベル体([１−14Ｃ]オレイン酸、１９７μCi／mg、トルエン溶液１００μCi／mL、アマシャムファルマシア社製)１８μLはアルゴンガス下で溶媒を除去後、１０.８mM ＮａＯＨ溶液６μLと水１８１.５μLを加えナトリウム塩としたものを使用した。酵素反応には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用いた。反応系の全量を２０μLとし、上記オレイン酸−14Ｃラベル体溶液２μLと１.２７μgのホタル組換えルシフェラーゼ（QuantiLum Recombinant Luciferase、プロメガ社製）、それぞれの最終濃度が２５０μM アデノシントリリン酸(東京化成社製)、２５０μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、３０℃で６０分行なった。反応の停止には２０μLのエタノールを添加し撹拌することで行なった。
反応停止後、反応液の２μLをＴＬＣプレート（Silica gel 60 Ｆ254、メルク社製）に供した。風乾の後、プレートを展開溶媒として１,４−ジオキサン：２５％アンモニア水：水＝３：２：０.５を用いて展開を行った。４０℃ホットプレート上で乾燥後、ＴＬＣプレートをバイオイメージングプレート（フジフィルム社製）にて５０時間露光し、ラジオアイソトープ14Ｃ由来の画像を取得し、その画像解析にはＢＡＳ−２５００(フジフィルム社製)を用いた。ルシフェラーゼとの反応の結果生成するオレイン酸ＣｏＡの確認は、オレイン酸ＣｏＡ標品（シグマ社製）を同一のＴＬＣ条件で展開し、ＵＶランプにより検出し、Ｒｆ値（０．５０）が同じであることで行った。その結果、脂肪酸のカルボキシル基のみへの反応が起きていることが明らかとなった。
また、ルシフェラーゼによるオレイン酸ＣｏＡ生成の必須因子確認のため、上記反応系においてルシフェラーゼ、ＡＴＰ、ＣｏＡまたは塩化マグネシウムを添加しない条件で同一反応を行った。反応生成物をＴＬＣにかけ、14Ｃ−オレイン酸ＣｏＡの生成量を測定した結果を表３に示す。
【表３】
0004175075.tif 000005
ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、ＣｏＡ、マグネシウムイオンおよび基質であるオレイン酸の存在した基本反応の場合にのみオレイン酸ＣｏＡの生成を確認した。すなわち、ホタルルシフェラーゼによる長鎖脂肪酸のＣｏＡ化変換反応には、ＡＴＰ、マグネシウムイオンとＣｏＡが必須であることが明らかとなった。この前述の32ＰラベルＡＴＰをもちいた実験結果と合致する。
【００２３】
実施例３  ＨＰＬＣによる脂肪酸ＣｏＡの分離法
基質である脂肪酸は、パルミチン酸（ナトリウム塩、関東化学社製）、オレイン酸（ナトリウム塩、アルドリッチ社製）、リノール酸（和光純薬社製）、リノレン酸（日本油脂社製）、アラキドン酸（ナトリウム塩、シグマ社製）を用いた。
酵素反応には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用いた。反応系の全量を４００μLとし、６.９１nmoleの各々の脂肪酸である基質と２５.４μgのホタル組換えルシフェラーゼ（QuantiLum Recombinant Luciferase、プロメガ社製）、最終濃度が２５０μM アデノシントリリン酸(東京化成工業社製)、２５０μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、３０℃で６０分行なった。
反応の停止は２６６.４μLのアセトニトリルを添加し撹拌することで行なった。反応停止後、反応液は遠心分離後（１０,０００回転、５分）、上清の５００μLをＨＰＬＣにインジェクトし、分離後、生成脂肪酸−ＣｏＡを分取し質量分析を行なった。
ＨＰＬＣの分析条件は、日本分光社製のJasco 1500 systemを用いた。カラムは資生堂社製のCapcell Pac C18 (4.6 × 150 mm)を使用した。検出には日本分光の多波長検出器 (MD-2010 plus)を用いた。溶出溶媒系は、アセトニトリルと２５mMリン酸二水素カリウム水溶液系を使用した。溶媒の流速は０.８mL／分で、溶出はアセトニトリル濃度４０％で５分間流したあと、７０％までのリニアグラディエントを１２分かけて行ない、その後７０％で８分流した。
開示した本クロマト条件では、それぞれの脂肪酸の溶出時間（分）は、パルミチン酸ＣｏＡ１９.１分、オレイン酸ＣｏＡ１８.４分、リノール酸ＣｏＡ１７.１分、リノレン酸ＣｏＡ１４.８分、アラキドン酸ＣｏＡ１６.２分であり、それぞれの脂肪酸ＣｏＡとも分離可能であった。すなわち、未反応脂肪酸、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、ＣｏＡ、ルシフェラーゼおよび脂肪酸ＣｏＡは完全に分離することが可能である。
溶出ピーク面積から生成脂肪酸ＣｏＡ量を決定し、脂肪酸からの変換効率を算出すると、それぞれパルミチン酸ＣｏＡ２７.８％、オレイン酸ＣｏＡ６６.７％、リノール酸ＣｏＡ９０.６％、リノレン酸ＣｏＡ９８.０％、アラキドン酸ＣｏＡ９８％以上であった。
【００２４】
実施例４  ＨＰＬＣで分離された脂肪酸ＣｏＡの質量分析
溶出主要ピークが脂肪酸ＣｏＡであることを再確認するため、それぞれの溶出主要ピークを、直接マススペクトル分析に供した。
マススペクトル分析には、MALDI-TOF-MS(AutoFLEX、ブルカー・ダルトニクス社製)を使用した。イオン化のためのマトリックスは、飽和３−ヒドロキシピコリン酸（アルドリッチ社製）を用い、リフレクターモードでネガティブ測定を行なった。
測定結果から、パルミチン酸ＣｏＡ、オレイン酸ＣｏＡ、リノール酸ＣｏＡ、リノレン酸ＣｏＡ、アラキドン酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］-は、それぞれ１００４.３４、１０３０.３５、１０２８.３４、１０２６.３２、１０５２.３４であり、実測値は、１００４.７７、１０３０.３９、１０２８.４２、１０２６.３９、１０５２.３８であった。すなわち、理論測定質量値と実測値が、ほぼ完全に一致することより、ホタルルシフェラーゼ反応により脂肪酸から生成した化合物は、脂肪酸ＣｏＡであることが明らかとなった。
また、この質量分析から、脂肪酸ＣｏＡ以外の分子種が検出されないことにより、ＨＰＬＣ分離画分の脂肪酸ＣｏＡの純度は、９８％以上と確認された。このことは、本反応では副生物が極めて少なく、目的とする脂肪酸ＣｏＡを高純度で製造できることの証拠である。
【００２５】
実施例５  脂肪酸ＣｏＡ製造最適化条件
１）ルシフェラーゼと脂肪酸濃度比の決定。
最適な酵素と基質濃度比を決定するために、ルシフェラーゼ濃度を一定にし、オレイン酸の濃度変化に伴うオレイン酸ＣｏＡの生成量を、前述のＨＰＬＣ条件で測定した。反応系の最終濃度は、０.２μMのルシフェラーゼ、２５０μMのＡＴＰ、２５０μMのＣｏＡ、５mM ＭｇＣｌ2 を含む５００μlの１００mMトリスバッファー(pＨ７.８)中において、オレイン酸の最終濃度を０.１、１、３、１０、３０、１００μMにし、３０℃で３０分反応させ、３３３μMのアセトニトリル（最終濃度４０％）を加え、反応を終了させる。反応液の５０μlをＨＰＬＣで分析し、生成したオレイン酸ＣｏＡのピーク面積をもとめた。その結果を表４に示した。
【表４】
0004175075.tif 000006
表から分かるように、オレイン酸濃度が１０μM以上になると、生成するオレイン酸ＣｏＡが減少する。このことから、最適な反応条件として、オレイン酸のモル濃度をルシフェラーゼのモル濃度の５０倍以下とすることが望ましい。
一方、ＡＴＰおよびＣｏＡを高濃度としても生成するオレイン酸ＣｏＡの生成量に影響がなかった。通常の場合、酵素のモル濃度の１００倍以上のＡＴＰおよびＣｏＡを添加すれば十分であった。
２）反応時間
１）の上記反応条件で、オレイン酸の濃度を１０μMとして、反応時間につい
て検討した。その結果を表５に示した。
【表５】
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この結果から、反応時間６０分までは、時間とともに直線的に反応が進行するが、１２０分以降は減少の傾向にある。すなわち、３０℃においては、反応時間６０分が最も適している。
【００２６】
実施例６  ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼの使用例
実施例１〜５で用いたホタル（Photinus pyralis）由来ルシフェラーゼにかえて、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼを用いて、同様の実験を行った。反応条件は、実施例１、実施例２および実施例５より明らかとなったものを用いた。
実施例６−１  ＴＬＣ法による32Ｐ−ＡＭＰの検出
実施例１に記載の反応条件で、それぞれの基質を用いて反応後、ＴＬＣ法によりアデノシンモノリン酸（32Ｐ−ＡＭＰ）の生成を確認した。その生成比率は表６に示すとおりであった。
【表６】
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脂肪酸の炭素鎖の長さおよび不飽和度が増加するにつれて、生成量が多いことが明らかとなった。この傾向は、ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼと同じである。
また、同時にホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼを用いて、リノレン酸を基質とした反応を行い、32Ｐ−ＡＭＰの生成活性を比較した。ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼを１００％とした場合、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼによる変換割合は、９７.４％であった。すなわち、ルシフェラーゼが由来する種の相違によって、32Ｐ−ＡＭＰ生成能力の差が殆ど無いことから、脂肪酸変換効率もほぼ同じであることが明らかとなった。
【００２７】
実施例６−２  質量分析法による脂肪酸ＣｏＡの同定
反応基質として適している長鎖脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸を、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、マグネシウムイオンの存在下でＣｏＡと反応させた。反応生成物をＨＰＬＣにかけ、それぞれの脂肪酸ＣｏＡを分取して質量分析法で同定した。脂肪酸ＣｏＡの合成および精製条件は実施例３と、質量分析法は実施例４と同じである。
すなわち、酵素反応系には１.５mLエッペンドルフ型チューブを用い、反応系の全量を４００μLとし、６.９１nmoleのオレイン酸（アルドリッチ社製）、リノール酸（和光純薬社製）、リノレン酸（日本油脂社製）またはアラキドン酸（シグマ社製）と２５.４μgのゲンジボタル（Luciola cruciata）由来の組換えルシフェラーゼ（比活性：６ｍ units／mg、和光純薬社製）、最終濃度が２５０μMアデノシントリリン酸(東京化成工業社製)、２５０μMコエンザイムＡ（和光純薬社製）、５mM塩化マグネシウム（和光純薬社製）、１００mMトリスバッファー（pＨ７.８、ナカライテスク社製）を含んでいる。酵素反応開始は、ルシフェラーゼ添加で行い、反応は３０℃で６０分行なった。反応の停止は、２６６.４μLのアセトニトリルを添加し撹拌することで行なった。反応停止後、反応液を遠心分離（１０,０００回転、５分）し、上清の５００μLを実施例３記載の条件でＨＰＬＣ処理した。クロマト上の１８.４分にオレイン酸ＣｏＡ、１７.１分にリノール酸ＣｏＡ、１４.８分にリノレン酸ＣｏＡ、１６.２分にアラキドン酸ＣｏＡの主ピークを検出した。主ピーク生成画分の脂肪酸ＣｏＡを分取し実施例４記載の質量分析を行なった。  その結果、オレイン酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］-は、１０３０.３５であり、測定値は、１０３０.３８であった。リノール酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］-は、１０２８.３４であり、測定値は、１０２８.３９であった。リノレン酸ＣｏＡの理論測定質量値［Ｍ−Ｈ］-は、１０２６.３２であり、測定値は、１０２６.４１であった。アラキドン酸ＣｏＡの理論測定質量値は、１０５２.３４であり、測定値は、１０５２.４２であった。測定実測値が、ほぼ完全に一致することからオレイン酸ＣｏＡ、リノール酸ＣｏＡ、リノレン酸ＣｏＡおよびアラキドン酸ＣｏＡと確認した。すなわち、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼにより、オレイン酸から生成した化合物はオレイン酸ＣｏＡであり、リノール酸から生成した化合物はリノール酸ＣｏＡであり、リノレン酸から生成した化合物はリノレン酸ＣｏＡであり、アラキドン酸から生成した化合物はアラキドン酸ＣｏＡであった。この結果から、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼは、ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼと同様に、長鎖脂肪酸ＣｏＡの合成能力があることが明らかとなった。
【００２８】
ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼを用いた場合とゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼを用いた場合の質量分析結果（実施例４および６）と、ＨＰＬＣの保持時間（実施例３および６）を表７に示した。
【表７】
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ＮＤ＝  測定未実施
保持時間は、実施例３と６で相違しなかった。
【００２９】
【発明の効果】
ルシフェラーゼを触媒として飽和及び不飽和脂肪酸とＣｏＡを反応させることにより、純度の高い脂肪酸ＣｏＡを高収率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ルシフェラーゼを触媒とした脂肪酸ＣｏＡの反応の模式図である。
【図２】ルシフェリンを基質とするルシフェラーゼによる発光反応の模式図である。
【図１】
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【図２】
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