(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を示す生理活性物質スルフォスチン
１）外観：白色粉末、
２）分子量：２７２、
３）分子式：Ｃ５Ｈ１３Ｎ４Ｏ５ＳＰ、
４）溶解性：水に可溶、低級アルコール、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルに不溶、
５）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：ｎ−ブタノール−酢酸−水（２：１：１）の展開溶媒で０．２８を示す、
６）紫外部吸収スペクトル：末端吸収を示す、
７）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤で測定したとき、以下の特性吸収帯（ｃｍ−１）を示す：３５１０、３３５５、３２５０、１６７２、１６５８、１６２４、１５４５、１３６５、１３０８、１２４０、１１８８、１１３０、１０６４、及び９２２、
８）水素核磁気共鳴スペクトル：重水中で測定したとき、以下のシグナルδ（ｐｐｍ）を示す：４．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８，１２．０Ｈｚ）、３．８２（１Ｈ，ｔｄｄ，Ｊ＝５．１，７．３，１３．０Ｈｚ）、３．７０（１Ｈ，ｔｄｄ，Ｊ＝５．１，６．７，１３．０Ｈｚ）、２．３９〜２．４４（１Ｈ，ｍ）、２．１０〜２．２８（１Ｈ，ｍ）、及び１．８９〜２．０３（２Ｈ，ｍ）、
９）炭素核磁気共鳴スペクトル：重水中で測定したとき、以下のシグナルδ（ｐｐｍ）を示す：２０．５、２４．２、４５．４、５１．３、及び１７２．４、
１０）リン核磁気共鳴スペクトル：重水中で測定したとき、以下のシグナルδ（ｐｐｍ）を示す：６．０１、
１１）比旋光度：［α］Ｄ ２８  −２１．５度（ｃ  ０．５２，Ｈ２Ｏ）、
１２）融点：２０３〜２０８℃（分解）、
１３）呈色反応：ニンヒドリン反応、ライドン・スミス反応に陽性。
【請求項２】
下記の理化学的性質を示す生理活性物質スルフォスチン
１）外観：白色粉末、
２）分子量：２７２、
３）分子式：Ｃ５Ｈ１３Ｎ４Ｏ５ＳＰ、
４）溶解性：水に可溶、低級アルコール、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルに不溶、
５）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：ｎ−ブタノール−酢酸−水（２：１：１）の展開溶媒で０．２８を示す、
６）紫外部吸収スペクトル：末端吸収を示す、
７）赤外部吸収スペクトル：添付の図１に示す臭化カリウム錠剤で測定したスペクトルを示す、
８）水素核磁気共鳴スペクトル：添付の図２に示す重水中で測定したスペクトルを示す、
９）炭素核磁気共鳴スペクトル：添付の図３に示す重水中で測定したスペクトルを示す、
１０）リン核磁気共鳴スペクトル：添付の図４に示す重水中で測定したスペクトルを示す、
１１）比旋光度：［α］Ｄ ２８  −２１．５度（ｃ  ０．５２，Ｈ２Ｏ）、
１２）融点：２０３〜２０８℃（分解）、
１３）呈色反応：ニンヒドリン反応、ライドン・スミス反応に陽性。
【請求項３】
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、請求項１又は２記載の生理活性物質スルフォスチンを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に生理活性物質スルフォスチンを生成蓄積せしめ、これを培養物から採取することを特徴とする生理活性物質スルフォスチンの製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の生理活性物質スルフォスチンを有効成分とするジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載の生理活性物質スルフォスチンを生産する能力を有するストレプトミセス・エスピーＭＫ２５１−４３Ｆ３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＫ２５１−４３Ｆ３)ＦＥＲＭ  ＢＰ６５７１菌株。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規生理活性物質スルフォスチン、その製造法及びその用途に関する。本発明の化合物は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害作用を有する。Ｔ細胞の表面に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶはＴ細胞の活性化に関与することが知られており（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１５，１８０−１８４（１９９４））、免疫系において重要な役割を果たしている。また、ジペプチジルペプチダーゼＩＶは血清中の成長ホルモン放出ホルモンの分解に関与している（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３，１５３３−１５４０（１９８９））。したがって本発明の化合物は、例えば免疫調節剤、ホルモン調節剤、抗ＨＩＶ薬、抗アレルギー薬、抗炎症薬、抗リウマチ薬などの医薬への生理活性物質としての使用が期待される。
背景技術
従来、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害作用を有する生理活性物質としては、ジプロチンＡ及びＢ（Ｊ．ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３７，４２２−４２５（１９８４））等が知られている。
しかし、これらの物質は同酵素に対する阻害作用が弱く、上記医薬用途のための生理活性物質として満足すべきものではなかった。したがってこれらの用途に適した新規化合物の出現が待たれていた。
発明の開示
そこで本発明者らは、微生物の代謝産物を広範囲に検索した結果、放線菌に属する一菌株が優れたジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害作用を有する生理活性物質スルフォスチンを産生することを見い出し、本発明を完成した。
本発明の生理活性物質スルフォスチンはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するスルフォスチン生産菌を培養し、培養物中に該生理活性物質を生成蓄積せしめ、これを培養物から採取することにより得られる。
発明を実施するための最良の形態
スルフォスチン生産菌の代表的なものとして、平成６年９月、微生物化学研究所において、新潟県佐渡郡羽茂町の土壌から分離したストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ２５１−４３Ｆ３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５７１号、工業技術院生命工学工業技術研究所、〒３０５−８５６６、日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号、１９９７年２月６日受託）が挙げられる。この菌株は、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。本菌株の菌学的及び生理学的性質を示すと次のとおりである。
１．形態的性質
ＭＫ２５１−４３Ｆ３株は分枝した基生菌糸かららせん形成能のある気菌糸を伸長する。その成熟した胞子鎖は、１０〜５０個又はそれ以上の卵円形の胞子を有しており、１個の胞子の大きさは、約０．６〜０．８ミクロン×約０．８〜０．９ミクロンである。胞子の表面は刺状〜毛状である。菌体に輪生技及び菌束糸は認められず、また胞子嚢及び運動性胞子も認められない。
２．各種培地における生育
培地上のコロニーの色については、一般的な日本語の色名の後に、［  ］内に色の標準としてコンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎａｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  の  ｃｏｌｏｒ  ｈａｒｍｏｎｙ  ｍａｎｕａｌ）を用いた色の表現を記載する。
（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
無色の発育上に、白〜茶白［３ｂａ、Ｐｅａｒｌ］の気菌糸をうっすらと着生する。溶解性色素は、認められない。
（２）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）
発育はうす黄［２ｃｂ、Ｉｖｏｒｙ  Ｔｉｎｔ］、気菌糸は着生せず、溶解性色素は、認められない。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４）（２７℃培養）
無色〜うす黄茶［２ｇｃ、Ｂａｍｂｏｏ］の発育上に、白〜茶白の気菌糸をわずかに着生する。溶解性色素は、認められない。
（４）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７）（２７℃培養）
発育は、無色〜うす黄［２ｃｂ、Ｉｖｏｒｙ  Ｔｉｎｔ］、気菌糸の着生が悪く、培養３週間後にわずかな白の気菌糸を部分的に着生する。溶解性色素は、認められない。
（５）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２）（２７℃培養）
無色〜うす黄［２ｇｃ、Ｂａｍｂｏｏ］の発育上に、白の気菌糸をわずかに着生する。溶解性色素は、認められない。
（６）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３）（２７℃培養）
無色〜うす黄［２ｃａ、Ｌｔ  Ｉｖｏｒｙ］の発育上に、うすピンク［５ｅｃ、Ｄｕｓｔｙ  Ｐｅａｃｈ］の気菌糸を着生し、溶解性色素は、認められない。
３．生理学的性質
（１）生育適温範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン  １．０％、酵母エキス  ０．２％、ひも寒天  ２．４％、ｐＨ７．０）を用い、１０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０℃の各温度で試験した結果、これらの温度のうち１０℃及び５０℃以外のいずれでも生育することがわかっている。生育至適温度は３０℃付近と考えられる。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
培養後５日目頃からスターチの加水分解が認められるようになり、その加水分解作用は、中程度である。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス（ＩＳＰ−培地１）、ペプトン・イースト・鉄寒天培地（ＩＳＰ−培地６）、チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７）、いずれも２７℃培養）
いずれの培地でも陰性である。
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ−培地９）、２７℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キジロース、ラムノース及びラフィノースを利用して発育する。イノシトールはおそらく利用する。Ｄ−フルクトース、シュクロース、Ｄ−マンニトールは利用しない。
（５）硝酸塩の還元反応（０．１％硝酸カリウム含有ペプトン水（ＩＳＰ培地−８）、２７℃培養）
陰性である。
（６）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃培養）
１５％単純ゼラチン培地の場合、２０℃での発育が悪く、再試験の必要を認めるが、液化は観察されなかった。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地の場合は、培養後１８日目頃からゼラチンの液化が始まるが、その作用は極めて弱い。ただし、この場合も再試験の必要がある。
（７）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（脱脂粉乳、３７℃培養）
培養後１０日目頃から凝固なしにペプトン化が始まり、その作用は、弱い〜中程度である。
以上の性質を要約すると、ＭＫ２５１−４３Ｆ３株は、分枝した基生菌糸かららせん形成能のある気菌糸を伸長し、成熟した胞子鎖に１０〜５０個の卵円形の胞子を有しており、その表面は刺状〜毛状である。種々の培地で、発育は無色〜うす黄を呈し、気菌糸は着生しない場合があるが、二、三の培地で白〜茶百〜うすピンクを呈する。溶解性色素は産生しない。生育至適温度は３０℃付近である。メラニン様色素の生成は陰性、スターチの水解性は中程度、蛋白分解力は再試験の必要があるが、弱い〜中程度である。なお、細胞壁に含まれる２，６−ジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型であった。菌体成分のメナキノンは、ＭＫ−９（Ｈ６）を主要に含み、ＭＫ−９（Ｈ８）も含有する。
これらの性質からＭＫ２５１−４３Ｆ３株は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属すると考えられる。近縁の既知菌種を検索すると、ストレプトミセス・フラベオルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）（文献  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８巻、第１１２頁、１９６８年）及びストレプトミセス・ファシクラテゥス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）（文献  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８巻、第１０８頁、１９６８年）が挙げられる。上記２種の保存菌株とＭＫ２５１−４３Ｆ３株とを実地に比較検討中であるが、現時点では、ＭＫ２５１−４３Ｆ３株をストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ２５１−４３Ｆ３とする。
なお、ＭＫ２５１−４３Ｆ３株は工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託申請し、１９９７年２月６日こ寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０６５号として受託され、１９９８年１１月１１日に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５７１号として国際寄託へ移管された。
本発明において用いられるストレプトミセス属に属する菌株は、他のストレプトミセス属の菌株と同様、その性状が変化しやすく、例えば、紫外線、Ｘ線又は薬品などを用いる人工的な変異手段で容易に変異し得るものであるが、どのような変異株であっても、本発明の生理活性物質スルフォスチンの生産能を有する限り、すべて本発明に使用することができる。
スルフォスチンを製造するためには、まず前記菌株を放線菌が利用し得る栄養源を含有する培地で好気的に培養する。栄養源としては、従来から放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。例えば炭素源としては、グルコース、フルクトース、グリセリン、シュクロース、デキストリン、ガラクトース、有機酸などを単独で又は組み合わせて用いることができる。
無機及び有機窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実油カス、カザミノ酸、バクトソイトン、ソリュブル・ベジタブル・プロティン、オートミールなどを単独で又は組み合わせて用いることができる。
その他必要に応じて、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マンガン、リン酸塩などの無機塩類を培地に加えることができる。さらに、有機物、例えばアミノ酸類、ビタミン類、核酸類や無機物を適当に培地に添加することができる。
培養法としては液体培養法、特に深部攪拌培養法が最も適している。培養温度は２０℃〜４５℃である。微酸性ないし微アルカリ性のｐＨで培養を行うことが望ましい。
液体培養では通常３〜８日間培養を行うとスルフォスチン物質が培養液中に生成蓄積される。培養菌体中のスルフォスチン物質の生成量が最大に達したときに培養を停止し、菌体と培養液をろ別し、菌体から目的物を精製単離する。菌体から本物質の精製単離には、微生物代謝生産物をその培養菌体から単離するために一般に用いられる分離精製方法が利用される。
例えば、培養液（１５Ｌ）は通常のろ過法でろ液と菌体部に分離する。得られたろ液部をあらかじめ脱気、水で平衡化した活性炭とともに２時間攪拌し、この混合物から通常のろ過法で活性炭未吸着画分を得る。得られた画分を減圧濃縮した後、１０等量のエタノールを加え、懸濁し、ろ過後、エタノール不溶画分を得る。さらに、エタノール不溶画分をメタノールで洗浄、減圧乾固し、メタノール不溶画分を得る。
メタノール不溶画分を、ｎ−ブタノール−酢酸−水（２：１：１）で展開する微結晶セルロースカラムクロマトグラフィー（フナセル、フナコシ社製）にかけ、活性画分を得る。この活性画分を減圧乾固、凍結乾燥した後、
ｎ−ブタノール−酢酸−水（３：１：１）で展開する微結晶セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ、活性画分を得る。この活性画分を減圧乾固、凍結乾燥し、粗物質を得る。この粗物質を０．２Ｎ重炭酸アンモニア水に溶かし、あらかじめ０．２Ｎ重炭酸アンモニア水で展開するＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製）にかけ、活性画分を得る。この活性画分を減圧乾固、凍結乾燥した後、０．０３Ｎ重炭酸アンモニア水に溶かし、あらかじめ０．０３Ｎ重炭酸アンモニア水で展開するショウデックスＩＥＣ  ＤＥＡＥ−８２５カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ファルマシア社製）にかけ、スルフォスチン（０．５ｍｇ）を得る。
上記のようにして得られた生理活性物質スルフォスチンの理化学的性質を下記に示す。
１）外観：白色粉末
２）分子量：２７２
３）分子式：Ｃ５Ｈ１３Ｎ４Ｏ５ＳＰ
４）溶解性：水に可溶、低級アルコール、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルに不溶、
５）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：ｎ−ブタノール−酢酸−水（２：１：１）の展開溶媒で０．２８を示す、
６）紫外部吸収スペクトル：末端吸収を示す、
７）赤外部吸収スペクトル：添付の図１に示す臭化カリウム錠剤で測定したスペクトルを示す、具体的には以下の特性吸収帯（ｃｍ−１）を示す：３５１０、３３５５、３２５０、１６７２、１６５８、１６２４、１５４５、１３６５、１３０８、１２４０、１１８８、１１３０、１０６４、及び９２２、
８）水素核磁気共鳴スペクトル：添付の図２に示す重水中で測定したスペクトルを示す、具体的には以下のシグナルδ（ｐｐｍ）を示す：４．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８，１２．０Ｈｚ）、３．８２（１Ｈ，ｔｄｄ，Ｊ＝５．１，７．３，１３．０Ｈｚ）、３．７０（１Ｈ，ｔｄｄ，Ｊ＝５．１，６．７，１３．０Ｈｚ）、２．３９〜２．４４（１Ｈ，ｍ）、２．１０〜２．２８（１Ｈ，ｍ）、及び１．８９〜２．０３（２Ｈ，ｍ）、
９）炭素核磁気共鳴スペクトル：添付の図３に示す重水中で測定したスペクトルを示す、具体的には以下のシグナルδ（ｐｐｍ）を示す：２０．５、２４．２、４５．４、５１．３、及び１７２．４、
１０）リン核磁気共鳴スペクトル：添付の図４に示す重水中で測定したスペクトルを示す、具体的には以下のシグナルδ（ｐｐｍ）を示す：６．０１、
１１）比旋光度：［α］Ｄ２８−２１．５度（ｃ  ０．５２，Ｈ２Ｏ）、
１２）融点：２０３〜２０８℃（分解）、
１３）呈色反応：ニンヒドリン反応、ライドン・スミス反応に陽性。
医薬品として使用する場合の製剤化及び投与方法としては従来公知の種々の方法を利用できる。投与方法としては注射、経口、直腸投与などが可能である。製剤形態としては注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、坐剤などの形態を採り得る。
製剤化の際にスルフォスチンに悪影響を与えない限り、医薬用に用いられる種種の補助剤、すなわち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等を必要に応じて使用することができる。製剤のスルフォスチン含量は製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一般的には製剤はスルフォスチンを０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜７０重量％含み、残りとしては通常医薬用に使用される担体その他の補助剤を含む。
スルフォスチンの投与量は症状等により異なるが、成人１人１日当たり０．０１〜８００ｍｇ程度である。連投を必要とする場合には１日当たり使用量を抑えることが好ましい。
以下に実験例を挙げて、スルフォスチンのジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害作用について述べる。
実験例１  ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性の測定
測定は文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２５８，５９１〜５９９（１９７２））に準じ、以下のように行った。３．２ｍＭ  グリシル・プロリル・β−ナフチルアミド（バッケム社、スイス）０．０２５ｍｌ及び０．１Ｍトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．１ｍｌに薬剤を加え、最終容量が０．２ｍｌとなるように水を添加して混合溶液を調製した。混合溶液を３７℃、１０分間加温し、ラット腎臓のホモジネートから硫酸アンモニウム分画により部分精製したジペプチジルペプチダーゼＩＶ溶液０．０２５ｍｌを上記混合溶液に加え、３７℃で、１時間反応させた。反応後、該反応液に１０％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（酸化エチレン付加量２０モル）及び０．２％ファーストガーネットＧＢＣ塩（シグマ社、米国）を含む０．５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７８）を０．１ｍｌ加えて反応を停止し、５２５ｎｍにおける吸光度（ａ）を測定した。同時に、検体を含まない緩衝液のみを用いた盲検の吸光度（ｂ）を測定し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害率を、計算式
［（ｂ−ａ）／ｂ］×１００
により計算した。この方法により測定した本発明化合物のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害活性値を表１に示す。
0004095772.tif 000002
このようにスルフォスチンはジペプチジルペプチダーゼＩＶに対して強い阻害作用を示し、そのＩＣ５０値は０．００８２μｇ／ｍｌであった。
産業上の利用の可能性
本発明の新規生理活性物質スルフォスチンは、例えば免疫調節剤、ホルモン調節剤、抗ＨＩＶ薬、抗アレルギー薬、抗炎症薬、抗リウマチ薬などの医薬に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１はスルフォスチンの臭化カリウム錠剤で測定した赤外吸収スペクトルである。
図２はスルフォスチンの重水中で測定した水素核磁気共鳴スペクトルである。
図３はスルフォスチンの重水中で測定した炭素核磁気共鳴スペクトルである。
図４はスルフォスチンの重水中で測定したリン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１】
0004095772.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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