(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させ、且つ、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下で酵母を培養し、
培養物中からプレニルアルコールを回収する
プレニルアルコールの製造方法。
【請求項２】
エタノール存在下で培養することを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項３】
複数のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のうち、少なくとも１のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を除く他のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を破壊した酵母を用いることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項４】
エタノール分解能を有する酵母を用いることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項５】
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を低下させることで、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項６】
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項７】
スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項８】
エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチル-CoAとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレニルアルコールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な種々のテルペノイドの他、トコフェノール、カロチノイドをはじめとするビタミン類の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
【０００３】
従来、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みとしては、上述した代謝経路の酵素を強化したり、変異導入して酵素の特異性を改変するといった手法が取られてきた。しかしながら、グルコース等の炭素源からの変換率は著しく低く、殆どの炭素源はプレニルアルコールの生合成以外の代謝経路に使用されている。したがって、培地に含まれる炭素源をプレニルアルコールの生合成に効果的に使用できれば、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法として大いに期待できるが、現在そのような報告例はない。
【０００４】
すなわち、プレニルアルコールの生産性を向上させるため、簡易に且つ、十分な生産効率を達成できるプレニルアルコールの製造方法は確立されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させ、且つ、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法。
（２）エタノール存在下で培養することを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（３）複数のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のうち、少なくとも１のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を除く他のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を破壊した細胞を用いることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（４）エタノール分解能を有する細胞を用いることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（５）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を低下させることで、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（６）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（７）スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（８）エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、ピルビン酸カルボキシラーゼ［EC.6.4.1.1］活性を低下させ、且つ、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養することで、当該細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール及びゲラニルリナロール等を意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。
【０００８】
プレニルアルコールを合成する代謝経路では、図１に示すように、グルコースやエタノール等の炭素源から合成されたアセチル-CoAからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸が合成される。イソペンテニル二リン酸は、ペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸に異性化される。また、図１に示すように、１分子のジメチルアリル二リン酸と２分子のイソペンテニル二リン酸とが縮合反応してゲラニル二リン酸が合成され、更に１分子のイソペンテニル二リン酸が反応してファルネシル二リン酸が合成され、さらにこれに１分子のイソペンテニル二リン酸が反応してゲラニルゲラニル二リン酸が順次合成される。プレニルアルコールであるファルネソールとネロリドールはファルネシル二リン酸から合成され、また、ゲラニルゲラニオールはゲラニルゲラニル二リン酸から合成される。一方、ファルネシル二リン酸は、図１に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンに変換される。スクアレンは、ステロイドの前駆体物質であり、酵母やカビ類においては最終的にエルゴステロールに変換される。
【０００９】
さらに、図１に示すように、培地中の炭素源から合成されたアセチル-CoAは、上述した代謝経路とは別に、TCAサイクルの基質となり消費される。一方、TCAサイクルでは、ピルビン酸からピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の作用によって合成されたアセチル-CoAとオキサロ酢酸とからクエン酸が合成される。ピルビン酸は、グルコース等の炭素源から解糖系によって合成される。また、ピルビン酸は、ピルビン酸カルボキシラーゼの作用によってオキサロ酢酸になる。すなわち、ピルビン酸は、ピルビン酸カルボキシラーゼの作用によりオキサロ酢酸となるか、或いはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の作用によりアセチル-CoAとなる。なお、ピルビン酸カルボキシラーゼは、ピルビン酸に作用し、ピルビン酸からオキサロ酢酸を合成する。
【００１０】
なお、図１並びに以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；GGOH）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；GGPP）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；FPP, ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；IPP）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；DMAPP）
ファルネソール（farnesol；FOH）
ネロリドール（nerolidol；NOH）
【００１１】
本方法においては、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養する。ここでピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させる方法としては、
▲１▼ピルビン酸カルボキシラーゼの阻害剤を培地に添加する
▲２▼ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損株を用いる
▲３▼ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する
▲４▼ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する
方法が挙げられる。
【００１２】
▲１▼ピルビン酸カルボキシラーゼの阻害剤を培地に添加する
ピルビン酸カルボキシラーゼの阻害剤としては、例えば、ITP（J. Biol. Chem., 240, 3714-3723 (1965)）、o-phenanthroline（Biochem. J., 252, 501-507 (1988)）、chlorothricin（Eur. J. Biochem., 39, 591-600, (1973)）を使用することができる。これら阻害剤を単独で、或いは複数を混合して培地に添加し細胞を培養すればよい。
【００１３】
▲２▼ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損株を用いる方法
本発明において、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損株とは、生物によっては複数のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも１のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を除く他のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を破壊した株を意味する。例えば、サッカロミセス・セレビシエは、本来的に、PYC1及びPYC2と呼ばれる２つのピルビン酸カルボキシラーゼを有している。従って、例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損株としては、これらPYC1及びPYC2のうち一方のみを破壊したサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。なお、PYC1を欠損したサッカロミセス・セレビシエはATCC4004429として、PYC2を欠損したサッカロミセス・セレビシエはATCC4003358としてAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。
【００１４】
ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損株としては、既存の菌株を用いても良いし、野生型の菌株に対して新たに変異を導入して作出したものを用いても良い。ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損株は、通常の培地を用いて培養することができる。特に培地中には、エタノールを添加することが好ましい。エタノールを添加した培地によれば、プレニルアルコールの生産効率が更に向上することとなる。
【００１５】
また、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、プレニルアルコールの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンX-305、スパン85、アデカノール  LG-109 (旭電化製)、アデカノールLG-294(旭電化製)、アデカノールLG-295S (旭電化製)、アデカノールLG-297 (旭電化製)、アデカノールB-3009A (旭電化製)、アデカプロニックL-61 (旭電化製)
油脂濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)であり、界面活性剤濃度は0.005〜1%(w/v)、好ましくは0.05〜0.5%(w/v)であり、テルペノイド濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)である。
【００１６】
▲３▼ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる細胞におけるピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型細胞を調製し、当該変化型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、GAL1遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
【００１７】
また、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、細胞におけるピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入してなる変異型細胞を調製し、当該細胞を培養しても良い。
【００１８】
▲４▼ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法
また、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスRNAを用いる方法が挙げられる。すなわち、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のmRNAに対するアンチセンスRNAを転写する遺伝子を、細胞ゲノムに組み込み、当該アンチセンスRNAを過剰発現させることで、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のmRNAの翻訳が抑制される。アンチセンスRNAに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳類（マウス）、昆虫（ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Mizuno et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1966-1970; Aiba et al. (1987) J. Bacteriol, 169, 3007-3012; Green et al. (1986) Annu. Rev. Biochem., 55, 569-597; Harland et al. (1985) J. Cell. Biol., 101, 1094-1099; Coleman et al. (1984) Cell, 37, 429-36; Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 4313-4317; Hackett et al. (2000) Plant Physiol., 124, 1079-86）。
【００１９】
上記▲１▼〜▲４▼の方法において、使用可能な細胞は、特に限定されないが、特にエタノールを分解できる酵母を使用することが望ましい。エタノールを分解できる酵母としては、Pichia pastries、Pichia minuta及びPichia anomala等のPichia属の酵母、Candida kruisii及びCandida malotosa等のCandida属の酵母を例示することができる。
【００２０】
一方、本方法では、スクアレン合成酵素活性を低下させた条件下で細胞を培養する。スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、上述したピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させる場合と同様な方法を使用することができる。すなわち、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下としては、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法が挙げられる。
【００２１】
スクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、SQAD（特表平8-508245号公報）、BSM-187745（Toxi. Appl. Pharm. 145, 91-98 (1987)）、ER-27856（J. lipid. Res. 44, 128-135 (2002)）等の合成品の他、カビ類が生産するzaragozic acid（Nat. Prod. Rep. 11, 279-302 (1994)）を挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてSQADを使用した場合、SQADの添加量は、細胞を培養する培地中に5〜200mg/Lとすることが好ましい。
【００２２】
また、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、WO 02/053747に開示されている方法を、細胞に適用することができる。
【００２３】
以上のように、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下し、且つスクアレン合成酵素活性を低下させた条件下で細胞を培養することによって、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００２４】
本方法においては、プレニルアルコールを高収率で生産することができる。なお、プレニルアルコールを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、プレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
【００２５】
図１に示した代謝経路から判るように、ピルビン酸カルボキシラーゼは、培地中の炭素源から合成されたピルビン酸を基質として作用してオキサロ酢酸を合成する。したがって、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させた場合、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の作用によりピルビン酸からアセチル-CoAとなる反応がより強く進行することとなる。また、例えば、サッカロミセス・セレビシエのようにアルコール発酵を行う酵母では、ピルビン酸デカルボキシラーゼによりピルビン酸がエタノールになり、更に酢酸を経てアセチル-CoAになる反応も強く進行することとなる。
【００２６】
また、図１に示した代謝経路から判るように、ピルビン酸カルボキシラーゼは、ピルビン酸を基質として作用してオキサロ酢酸を合成する。したがって、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させた場合、オキサロ酢酸に変換されていたピルビン酸がアセチル-CoA合成に使用されるようになる。アセチル-CoAは、ピルビン酸カルボキシラーゼを活性化することが知られており（Biochem. 22, 5090-5096）、ピルビン酸カルボキシラーゼが存在するとピルビン酸より合成されたプレニルアルコールの原料でもあるアセチル-CoAにより活性化され、アセチル-CoAの原料であるピルビン酸が不足する状況になる。
【００２７】
一方、スクアレン合成酵素活性を低下させることによって、ファルネシル二リン酸を基質としたスクアレンの合成が阻害されることとになる。スクアレン合成酵素活性を低下させた場合、細胞においてエルゴステロール生合成が抑制されるため、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。エルゴステロールを含む培地を用いるか、エルゴステロールを培地に追添加することによって、エルゴステロール生合成阻害による細胞の生育阻害等を防止することができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてSQADを用いた場合、エルゴステロールの添加量は、1〜100mg/Lとすることが好ましい。
【００２８】
従って、本方法によれば、図１における代謝経路において、アセチル-CoAからのプレニルアルコールの生合成が強く進行し、プレニルアルコールの生産効率が向上することとなる。
【００２９】
一般に、アミノ酸を始めとする生育上極めて重要な一次代謝産物では、当該産物の合成反応に直接関与する遺伝子を強化又は抑制することによって、当該産物の生産性を向上させる試みが行われ成果を出している。しかしながら、プレニルアルコール等の二次代謝産物においては、その合成経路の強化又は抑制を行っても、原料物質が一次代謝産物等の合成に消費されることが多く、生産性を向上させることが困難である。すなわち、アセチル-CoAの生産を亢進しても、プレニルアルコールの生合成が強化される蓋然性は低いといえる。
【００３０】
さらに、アセチル-CoAは、脂肪酸合成代謝経路を始めとして様々な物質代謝経路に関与している。したがって、アセチル-CoAが関与する物質代謝経路のうち、如何なる経路を強化又は抑制すれば、プレニルアルコールの生産性を向上できるのかは全く予測ができない。
【００３１】
本発明においては、アセチル-CoAが関与する様々な代謝経路の中で、特にTCAサイクルにおけるアセチル-CoAの生産を亢進することで、プレニルアルコールの生産性を向上させることができることを実証した。
【００３２】
また、本方法においては、エタノールを添加した培地で細胞を培養することによって、プレニルアルコールの生産性をより向上させることができる。エタノールは酢酸に変換されアセチル-CoAの原料となる。ところが、エタノールはピルビン酸カルボキシラーゼの発現を促進することから、ピルビン酸がよりオキサロ酢酸合成に消費されてしまう。したがって、上述したように、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させることによって、細胞はエタノールの消費してアセチル-CoAを生産すると同時にピルビン酸からもアセチル-CoAが合成され、より効率的にプレニルアルコールの原料であるアセチル-CoAを生産することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明に係るプレニルアルコールの製造方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
〔実施例１〕
本例では、細胞として、一倍体のサッカロミセス・セレビシエ野生株（ATCC201388）、二倍体のサッカロミセス・セレビシエ（ATCC201390）、一倍体のサッカロミセス・セレビシエPYC1欠損株（ATCC4004429）、一倍体のサッカロミセス・セレビシエPYC2欠損株（ATCC4003358）及び二倍体のサッカロミセス・セレビシエPYC1欠損株（ATCC4034429）を使用した。
【００３５】
培地は以下のように調製した。すなわち、6%グルコース、1%大豆油、4mg/lエルゴステロール、0.1%アデカノールLG109（旭電化社製）を含有するYM培地（difico社製）に、20mg/lのSQAD（特表平8-508245号公報参照）を添加した。なお、SQAD以外の成分は混合した後にオートクレーブによって培地を滅菌した。SQAD溶液は、当該水溶液をフィルターによって滅菌したのち、十分に冷えた培地に添加した。また、1%エタノールを添加した培地と添加しない培地を準備した。
【００３６】
そして、両培地を用いて、上記５種類の菌株を30℃で8日間培養した。培養終了後、培養液2mlを採取し、これにメタノール1.2ml及びペンタン2mlを添加した。その後、培養液を十分に攪拌し、ペンタン相を成分分析に供した。成分分析は、以下の条件で行った。分析装置は、ヒューレットパッカード社製HP6890/5973 GC/MSシステムを用いた。
インレット温度：250℃
ディテクター温度：260℃
MSゾーン温度
MS Quad：150℃
MS Source：230℃
スキャンパラメーター
Low Mass：35
High Mass：200
Threshold：40
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：2μl
洗浄回数：メタノールで3回、ヘキサンで2回
スプリット比：1：20
カラム：ヒューレットパッカード社製HP-5MS(O.25mm×30M、フィルム厚O.25μm)キャリアーガス：1ヘリウム1.0ml/min
ソルベントディレイ：2min
オ一ブン昇温条件：l15℃、1.5分保持→70/分で250℃まで昇温、2分保持→70/分で300℃まで昇温、7分保持
ポストタイム：O
内部標準：1-ウンデカノール/エタノール溶液(1μl/ml)を各バイアルに10μ1添加
注入口ライナー：スプリット/スプリットレス ライナー
解析：TICを取り込んだ後、69マスをセレクションし1ウンデカノール(RT=3.39min)、ネロリドール(RT=3.86min)、ファルネソール(RT=4.23min)、ゲラニルゲラニオ一ル(RT=5.78min)のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
【００３７】
また、培養終了後、菌数を測定した。培養液100μlを生理食塩水で1〜20倍に希釈し、血球計(林理化学)で細胞数を計測した。0.06mm四方(最少グリット9つ分)の菌数を4平均し、以下の式から培養液1L当りの菌数を算出した。
菌数(109/培地1l)＝0.444×(0.06mm四方の菌体数)×希釈倍率
【００３８】
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0004175187.tif 000002
【００４０】
表１から判るように、サッカロミセス・セレビシエにおいて、PYC1及びPYC2のいずれか一方を欠損させることによりピルビン酸カルボキシラーゼ活性を低下させ、且つ、SQADを培地に添加することによりスクアレン合成酵素活性を低下させることによって、一倍体のサッカロミセス・セレビシエであるか二倍体のサッカロミセス・セレビシエであるかに拘わらず、プレニルアルコールの生産効率が向上している。さらに、培地にエタノールを添加することによって、プレニルアルコールの生産効率が更に向上していることが判る。
【００４１】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞におけるプレニルアルコール生合成経路を模式的に示す図である。
【図１】
0004175187.tif 000003