(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分にエタノールを添加することにより分取したエタノール不溶性画分からなる、白血病細胞増殖阻害活性を該細胞のミトコンドリア脱水素酵素活性の活性を指標として調べて評価される白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項２】
上記エタノール不溶性画分が、凍結乾燥に付すことにより得られた凍結乾燥物である請求項１記載の白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項３】
急性リンパ性白血病由来のジャーカット、Molt4株化細胞、および／またはRPMI8402株化細胞に対する細胞増殖阻害活性を、該細胞のミトコンドリア脱水素酵素活性の活性を指標として調べて評価される請求項１または２記載の白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項４】
大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程、該液体分にエタノールを添加することにより、エタノール不溶性画分を分取する工程を含み、急性リンパ性白血病由来のジャーカット、Molt4株化細胞、および／またはRPMI8402株化細胞に対する細胞増殖阻害活性を、該細胞のミトコンドリア脱水素酵素活性の活性を指標として調べて評価して白血病細胞増殖阻害活性を有することを確認する工程を含むことを特徴とする白血病細胞増殖阻害剤の製造方法。
【請求項５】
上記エタノール不溶性画分を、凍結乾燥に付して凍結乾燥物を分取する工程を含む請求項４記載の白血病細胞増殖阻害剤の製造方法。70100
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分に有機溶媒を添加することにより分取した、有機溶媒不溶性画分からなる白血病細胞増殖阻害剤、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白血病は、骨髄の白血球細胞が自立増殖する疾患、いわゆる血液のガンであって、貧血、白血球増多症、血小板減少症などを起こし、しばしば肝、脾、リンパ節などの他の臓器に二次的浸潤病巣（転移）又は二次的造血病巣を作ることが知られている。
【０００３】
このような白血病の治療薬としては、これまで、アミノプテリン、メトトレキセート、８−アザグアニン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、１−（２−テトラヒドロフリル）−５−フルオロウラシルなどの合成物質、マイトマイシンＣ、クロモマイシン、ブレオマイシンなどの抗生物質、インターフェロン、ＣＳＦ抑制物質、ＣＢＦ、ＴＮＦなどのバイオ製品が知られており、これらはいずれも白血病細胞に作用して、その増殖を阻害して壊死させ、疾病を治療するものである。しかしながら、その作用は、往々にして病態細胞のみでなく、周囲の正常細胞にもおよび新たな疾患を惹起することがある。また、これらの白血病治療薬は原料が入手しにくい上に、製造方法が煩雑であることから製造コストは不可避的に高くなってしまう。
【０００４】
これらの治療薬の他，細胞毒性を誘導することにより特定の細胞に対して細胞増殖阻害を惹起させるものとして、細胞増殖阻害剤が知られている。具体的には、トウアズキ（Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）の種子から分離されたレクチン蛋白質、ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）の果肉から抽出されたレクチン蛋白質、ヒノキ科植物から抽出されるヒノキチオールなどが知られている。この細胞毒性発現機構は非常に複雑であり、どのような物質がどのような細胞に対して細胞毒性を生じさせるかは、全く予測不可能であり、白血病細胞に対して有効な細胞増殖阻害剤を得ることは非常に困難であった。
これとは別に，平成１３年６月２１日付大分合同新聞には，所謂天然物である大麦焼酎蒸留粕を遠心分離し滅菌処理した上澄液が，胃ガン，肝臓ガンの細胞増殖を抑制する作用を有する旨記載されている。しかしながら当該刊行物には，白血病細胞について触れるところは全くない。
尚、特開2001-145472号公報には、大麦および大麦麹を原料に使用し，発酵及び蒸留を介して製造される焼酎の製造において副生する焼酎焼酎蒸留残液が脂肪肝抑制作用を有することが記載されている。具体的には、特開2001-145472号公報には、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分にアルカリを添加してアルカリ可溶性画分を分取し、該アルカリ可溶性画分を酸で中和して中性可溶性画分を得、該中性可溶性画分にエタノールを添加することにより脂肪肝抑制作用を有する組成物を得る旨記載されている。しかしながら、このような焼酎蒸留残液から白血病細胞に対して増殖抑制作用を有する白血病細胞増殖阻害剤を見出した例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大麦焼酎を製造する際に副生される大麦焼酎蒸留残液から、白血病細胞の増殖を効果的に阻害し、白血病治療に有効な白血病細胞増殖阻害剤を提供することを目的とするものである。即ち，本発明は、従来、白血病細胞増殖阻害剤として全く使用されることのなかった発酵残渣の一種である大麦焼酎蒸留残液から得られる優れた白血病細胞増殖阻害剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者らは、本発明の目的を達成すべく，後述する実施例１の試験例１に述べるように，大麦製の焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分に終濃度７５％になるようにエタノールを添加し、生じた沈殿を遠心分離によって固液分離することにより，多糖類を主たる成分とするエタノール不溶性画分を得、該エタノール不溶性画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物を得、該凍結乾燥物を急性リンパ性白血病由来の株化細胞に添加して培養を行ったところ、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標とする細胞増殖阻害活性は著しく高まり、該凍結乾燥物が該株化細胞に対して優れた細胞増殖阻害効果を有していることを見出した。
【０００７】
即ち，本発明者らは、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分に有機溶媒を添加することにより分取した、多糖類を主たる成分とする有機溶媒不溶性画分が優れた白血病細胞増殖阻害作用を有することを見出した。大麦焼酎蒸留残液についてのこの発見は、今までに全く例のない新事実であり、大麦焼酎蒸留残液を白血病細胞増殖阻害剤として使用できるという大麦焼酎蒸留残液の新規な用途を創出するものである。よって、本発明は、大麦焼酎蒸留残液について、白血病細胞増殖阻害剤としての用途を提供するものである。即ち、本発明は、大麦焼酎蒸留残液から分取した白血病細胞増殖阻害剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成すべく、実験を介して鋭意研究を重ねた結果、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分に有機溶媒を添加することにより分取した有機溶媒不溶性画分が多糖類を主たる成分として含有し、優れた白血病細胞増殖阻害作用を有することが判明した。本発明は当該判明した事実に基づくものであり、大麦焼酎蒸留残液について産業上利用できる新たな用途を提供するものである。即ち、本発明は、大麦焼酎蒸留残液から分画した白血病細胞増殖阻害作用を有する組成物（白血病細胞増殖阻害剤）及びその製造方法を提供する。
【０００９】
本発明の前記大麦焼酎蒸留残液から分画した白血病細胞増殖阻害作用を有する組成物は、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分にさらに有機溶媒を添加することにより分取した有機溶媒不溶性画分からなり、優れた白血病細胞増殖阻害作用を有するものである。
【００１０】
【実施態様例】
本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液は、代表的には、大麦又は精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹及び蒸麦中に含まれるでんぷんを該大麦麹の麹により糖化し、それらを酵母によるアルコール発酵に付して焼酎熟成もろみを得、得られた焼酎熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の単式蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、大麦焼酎の蒸留残液を意味する。
【００１１】
本発明において、大麦焼酎蒸留残液を得るに際して、大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌（Aspergilluskawachii）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Aspergillus awamorii）及び清酒製造等で使用する黄麹(Aspergillus  oryzae）などのAspergillus属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００１２】
本発明において、大麦焼酎の製造における蒸留工程で得られた大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る第1の工程は、大麦焼酎蒸留残液から原料大麦、あるいは大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣等のＳＳ分を除去することを目的として行うものである。この第1の工程における当該固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法によるか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いて本発明により実施できる本固液分離処理を行う。
第１の工程で得られた液体分に有機溶媒を添加することにより有機溶媒不溶性画分を分取する第２の工程においては、適宜の有機溶媒を所定の濃度まで添加する。この場合、有機溶媒はエタノールが至適であるが、これに限定されるものではない。有機溶媒の濃度は成分の生産効率に影響し、該有機溶媒の最適終濃度は、好ましくは5%以上、より好ましくは、30%乃至75%である。
【００１３】
このようにして得られる、本発明の白血病細胞増殖阻害剤は、そのまま経口的に投与する場合は勿論のこと、該白血病細胞増殖阻害剤を生理的食塩水等の適当な担体に分散せしめ，静脈注射により患者に投与することによっても所望の白血病細胞増殖阻害効果を得ることができる。従って，該白血病細胞増殖阻害剤は，骨髄性白血病の治療薬剤として使用することができる。
以下に本発明を完成するにあたり、本発明者らが行った実験について詳述する。本発明はそれらの実験において得られた知見に基づいて完成したものである。
【００１４】
本発明者らは、上述した従来技術に鑑みて、大麦焼酎蒸留残液が大麦由来のものであることから、該大麦焼酎蒸留残液に含まれる多糖類が白血病細胞増殖阻害作用を有するのではないかと推測して、実験を介して鋭意検討を行った。即ち、本発明者らは、大麦焼酎蒸留残液の液体分を凍結乾燥して得られた粉末が、白血病細胞増殖阻害効果を有するか否かを明らかにするために以下の実験１を行った。
【００１５】
以下の実験1に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（70%精白）を用いた。
【麹の製造】
大麦を40%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、大麦トンあたり1kgの種麹（白麹菌）を接種し、38℃、ＲＨ95%で24時間、32℃、ＲＨ92%で20時間保持することにより、大麦麹を製造した。
【蒸麦の製造】
大麦を40%（w/w）吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷することにより、蒸麦を製造した。
【００１６】
【大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造】
1次仕込みでは前述の方法で製造した大麦麹（大麦として3トン）に、水3.6キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg（湿重量）を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵（1段目の発酵）に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4キロリットル、前述の方法で製造した蒸麦（大麦として7トン）を加えて11日間の発酵（2段目の発酵）に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎10キロリットルと大麦焼酎蒸留残液15キロリットルを得た。得られた大麦焼酎蒸留残液を以下の実験に用いた。即ち、得られた大麦焼酎蒸留残液を遠心分離に付して上清の液体分を分取し、該液体分を凍結乾燥に付して液体分の凍結乾燥物を得、得られた凍結乾燥物を以下の実験に用いた。
【００１７】
前記大麦焼酎蒸留残液の液体分の凍結乾燥物が白血病細胞増殖阻害効果を有するか否かを明らかにするために以下の実験を行った。
即ち、急性リンパ性白血病由来のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）をＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％牛胎仔血清、１％グルタミン及び抗生物質としてストレプトマイシン及びペニシリンを含む）に接種し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養し、株化細胞を調製した。得られた株化細胞を２．２２×１０5個／ｍｌに濃度を調製した細胞懸濁液を、９６穴マイクロプレート上に９０μｌずつ６か所に分注し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で２４時間培養後、リン酸塩緩衝生理的食塩水（Ｃａイオン及びＭｇイオンを含まない。ｐＨ７．４）で２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した大麦焼酎蒸留残液の液体分の凍結乾燥物を５μｌずつ添加し、同条件下で更に４８時間培養した。また、前記したものと同じリン酸塩緩衝生理的食塩水を添加したものをコントロールとして用いた。４８時間培養した後の培養液１００μｌを採取し、セルティター（ｃｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６（プロメガ社製）により分析し、大麦焼酎蒸留残液の液体分凍結乾燥物の細胞株に対する細胞増殖阻害活性を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標として調べた。
【００１８】
得られた結果を表１に示す。表１から明らかなように、大麦焼酎蒸留残液の液体分凍結乾燥物は４８時間後において６８％までミトコンドリア脱水素酵素の活性を減少させる細胞増殖阻害活性を有することが判明した。
【００１９】
そこで、大麦焼酎蒸留残液から得られた液体分に含まれるどのような成分に白血病細胞増殖阻害作用が認められるかを明らかにするために以下の実験２を行った。すなわち、白血病細胞増殖阻害作用を有する成分は大麦由来の多糖類ではないかと推測し、多糖類の一般的な分画方法の１つとして知られているエタノール沈殿法を用いて、大麦焼酎蒸留残液の液体分を以下に示す方法でエタノール可溶性画分とエタノール不溶性画分に分画し、該エタノール可溶性画分と該エタノール不溶性画分の白血病細胞増殖阻害作用を検討した。
【００２０】
（エタノール可溶性画分とエタノール不溶性画分の取得）
以下の実験２に供する目的で、上記大麦焼酎蒸留残液の液体分から以下のようにしてエタノール可溶性画分とエタノール不溶性画分を得た。即ち、大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を1L得、該大麦焼酎蒸留残液の液体分1Lにエタノール3Lを加え、8000rpm、10minの条件で遠心分離してエタノール可溶性画分とエタノール不溶性画分を分取し、該エタノール可溶性画分を凍結乾燥に付すことによりエタノール可溶性画分の凍結乾燥物78.2ｇを得、該エタノール不溶性画分を凍結乾燥に付すことによりエタノール不溶性画分の凍結乾燥物4.8ｇを得、得られたエタノール可溶性画分の凍結乾燥物及びエタノール不溶性画分の凍結乾燥物を以下の実験２に用いた。
【００２１】
【実験２】
急性リンパ性白血病由来のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）をＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％牛胎仔血清、１％グルタミン及び抗生物質としてストレプトマイシン及びペニシリンを含む）に接種し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養し、株化細胞を調製した。得られた株化細胞を２．２２×１０5個／ｍｌに濃度を調製した細胞懸濁液を、９６穴マイクロプレート上に９０μｌずつ６か所に分注し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で２４時間培養後、リン酸塩緩衝生理的食塩水（Ｃａイオン及びＭｇイオンを含まない。ｐＨ７．４）で２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したエタノール可溶性画分の凍結乾燥物及びエタノール不溶性画分の凍結乾燥物を５μｌずつ添加し、同条件下でさらに４８時間培養した。また、前記したものと同じリン酸塩緩衝生理的食塩水を添加したものをコントロールとして用いた。４８時間培養した後の培養液１００μｌを採取し、セルティター（ｃｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６（プロメガ社製）により分析し、エタノール可溶性画分の凍結乾燥物及びエタノール不溶性画分の凍結乾燥物の上記細胞株に対する細胞増殖阻害活性を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標として調べた。
【００２２】
得られた結果をグラフとして表２に示す。表２から明らかなように、エタノール可溶性画分の凍結乾燥物は４８時間後において８３％までミトコンドリア脱水素酵素の活性を減少させる細胞増殖阻害活性を有したのに対して、エタノール不溶性画分の凍結乾燥物は４８時間後において２６％までミトコンドリア脱水素酵素の活性を減少させる細胞増殖阻害活性を示した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液の液体分から得たエタノール不溶性画分の凍結乾燥物は、急性リンパ性白血病由来の株化細胞に対して優れた細胞増殖阻害活性を有することが明らかになった。以上の実験結果から、大麦焼酎蒸留残液は白血病細胞増殖阻害に寄与する成分を含有し、該成分は前記大麦焼酎蒸留残液の液体分から得たエタノール不溶性画分に含まれていることが判明した。該エタノール不溶性画分は、成分分析の結果、多糖類50.6%、粗タンパク28.1%、有機酸13.4%、遊離糖類0.9%を含有し、該画分は多糖類を主たる成分として含有することが判った。
本発明は、以上の判明した事実に基づいて完成するに至ったものである。
【００２３】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。しかしながら、本発明は当該実施例によってなんら限定されるものではない。
【００２４】
【実施例１】
上述したと同様の手法で大麦焼酎を製造し、その蒸留工程で得られた大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液液体分5Ｌを得、該大麦焼酎蒸留残液液体分5Ｌに終濃度が 75(vol/vol)%になるようにエタノールを加え、8000rpm,10minの条件で遠心分離してエタノール不溶性画分を分取し、該エタノール不溶性画分を真空凍結乾燥機を用いて凍結乾燥に付し、凍結乾燥物18ｇを得た。得られた凍結乾燥物を粉砕し、灰白色で無味無臭の組成物を得た。
得られた組成物を以下の試験例1に供し、該組成物の白血病細胞増殖阻害作用を評価した。
【００２５】
【試験例１】
急性リンパ性白血病由来のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）をＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％牛胎仔血清、１％グルタミン及び抗生物質としてストレプトマイシン及びペニシリンを含む）に接種し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養し、株化細胞を調製した。得られた株化細胞を２．２２×１０5個／ｍｌに濃度を調製した細胞懸濁液を、９６穴マイクロプレート上に９０μｌずつ６か所に分注し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で２４時間培養後、リン酸塩緩衝生理的食塩水（Ｃａイオン及びＭｇイオンを含まない。ｐＨ７．４）で２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した本発明の前記組成物を５μｌずつ添加し、同条件下でさらに４８時間培養した。また、前記したものと同じリン酸塩緩衝生理的食塩水を添加したものをコントロールとして用いた。４８時間培養した後の培養液１００μｌを採取し、セルティター（ｃｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６（プロメガ社製）により分析し、本発明の組成物の該株化細胞に対する細胞増殖阻害活性を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標として調べた。
【００２６】
【評価１】
急性リンパ性白血病由来のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）株化細胞に対する細胞増殖阻害活性の指標としたミトコンドリア脱水素酵素の活性を表３に示す。表３から以下の事実が判明した。即ち、本発明の組成物は４８時間後において２６％までミトコンドリア脱水素酵素の活性を減少させる細胞増殖阻害活性を示し、本発明の組成物が白血病細胞に対して濃度依存的に増殖阻害活性を示すことが判明した。
【００２７】
【試験例２】
試験例１で使用したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）の代わりに、急性リンパ性白血病由来のＭｏｌｔ４を使用し、これをＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％牛胎仔血清、１％グルタミン及び抗生物質としてストレプトマイシン及びペニシリンを含む）に接種し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養し、株化細胞を調製した。得られた株化細胞を２．２２×１０5個／ｍｌに濃度を調製した細胞懸濁液を、９６穴マイクロプレート上に９０μｌずつ６か所に分注し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で２４時間培養後、リン酸塩緩衝生理的食塩水（Ｃａイオン及びＭｇイオンを含まない。ｐＨ７．４）で２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した本発明の前記組成物を５μｌずつ添加し、同条件下でさらに４８時間培養した。また、前記したものと同じリン酸塩緩衝生理的食塩水を添加したものをコントロールとして用いた。４８時間培養した後の培養液１００μｌを採取し、セルティター（ｃｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６（プロメガ社製）により分析し、本発明の組成物の該株化細胞に対する細胞増殖阻害活性を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標として調べた。
【００２８】
【評価２】
急性リンパ性白血病由来のＭｏｌｔ４株化細胞に対する細胞増殖阻害活性の指標としたミトコンドリア脱水素酵素の活性を表４に示す。表４から以下の事実が判明した。即ち、本発明の組成物は４８時間後において３８％までミトコンドリア脱水素酵素の活性を減少させる細胞増殖阻害活性を示し、本発明の組成物が白血病細胞に対して濃度依存的に増殖阻害活性を示すことが判明した。
【００２９】
【試験例３】
試験例１で使用したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）の代わりに、急性リンパ白血病由来のＲＰＭＩ８４０２を使用し、これをＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％牛胎仔血清、１％グルタミン及び抗生物質としてストレプトマイシン及びペニシリンを含む）に接種し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養し、株化細胞を調製した。得られた株化細胞を２．２２×１０5個／ｍｌに濃度を調製した細胞懸濁液を、９６穴マイクロプレート上に９０μｌずつ６か所に分注し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で２４時間培養後、リン酸塩緩衝生理的食塩水（Ｃａイオン及びＭｇイオンを含まない。ｐＨ７．４）で２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した本発明の前記組成物を５μｌずつ添加し、同条件下でさらに４８時間培養した。また、前記したものと同じリン酸塩緩衝生理的食塩水を添加したものをコントロールとして用いた。４８時間培養した後の培養液１００μｌを採取し、セルティター（ｃｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６（プロメガ社製）により分析し、本発明の組成物の該株化細胞に対する細胞増殖阻害活性を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標として調べた。
【００３０】
【評価３】
急性リンパ性白血病由来のＲＰＭＩ８４０２株化細胞に対する細胞増殖阻害活性の指標としたミトコンドリア脱水素酵素の活性を表５に示す。表５から以下の事実が判明した。即ち、本発明の組成物は４８時間後において１４％までミトコンドリア脱水素酵素の活性を減少させる細胞増殖阻害活性を示し、本発明の組成物が白血病細胞に対して濃度依存的に増殖阻害活性を示すことが判明した。
【００３１】
【発明の効果】
上述したように、本発明の白血病細胞増殖阻害剤は、非常に低濃度で異なる３種の白血病細胞に対して細胞増殖阻害活性を有するため、白血病の治療剤として好適である。
【００３２】
【表１】
0004140752.tif 000002
【００３３】
【表２】
0004140752.tif 000003
【００３４】
【表３】
0004140752.tif 000004
【００３５】
【表４】
0004140752.tif 000005
【００３６】
【表５】
0004140752.tif 000006