(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（１）
【化１】
0004192218.tif 000017
で示される新規ダイオキシン類縁化合物。
【請求項２】
化学式（２）
【化２】
0004192218.tif 000018
で示される新規ダイオキシン類縁化合物。
【請求項３】
ダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子を検索する方法であって、一般式（３）
【化３】
0004192218.tif 000019
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｍは０〜４の整数を表し、Ｒ1は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を基質とし、検索対象となる生物、酵素または酵素遺伝子を作用させ、代謝物の蛍光発光を指標とすることを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索方法。
【請求項４】
前記一般式（３）で示されるダイオキシン類縁化合物が、化学式（１）
【化４】
0004192218.tif 000020
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする請求項３に記載の検索方法。
【請求項５】
ダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子を検索する方法であって、一般式（４）
【化５】
0004192218.tif 000021
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｎは０〜４の整数を表し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を基質とし、検索対象となる生物、酵素、酵素遺伝子を作用させ、代謝物の蛍光発光を指標とすることを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索方法。
【請求項６】
前記一般式（４）で示されるダイオキシン類縁化合物が化学式（２）
【化６】
0004192218.tif 000022
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする請求項５に記載の検索方法。
【請求項７】
一般式（３）
【化７】
0004192218.tif 000023
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｍは０〜４の整数を表し、Ｒ1は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を含むことを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索用キット。
【請求項８】
前記一般式（３）で示されるダイオキシン類縁化合物が化学式（１）
【化８】
0004192218.tif 000024
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする請求項７に記載の検索用キット。
【請求項９】
一般式（４）
【化９】
0004192218.tif 000025
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｎは０〜４の整数を表し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を含むことを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索用キット。
【請求項１０】
前記一般式（４）で示されるダイオキシン類縁化合物が化学式（２）
【化１０】
0004192218.tif 000026
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする請求項９に記載の検索用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なダイオキシン類縁化合物、ダイオキシン類分解生物等を検索する方法およびダイオキシン類分解生物等検索キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ダイオキシン類は、その毒性および環境残留性から、近年ダイオキシン類による環境汚染が社会問題化しているが、未だダイオキシン類の実用的で効率的な除去法は見出されていない。特に低濃度で広範囲に存在するダイオキシン類の汚染の場合、汚染物を集積して物理的または化学的に処理する方法は非常に困難であると考えられている。このような低濃度の汚染の処理には、生物機能を応用した生物的環境浄化法（バイオメデレーション）が最も有効であると考えられ、自然界よりダイオキシン類を迅速かつ強力に分解・代謝・無毒化できる生物を検索し、単離し、環境修復系を構築することが急務となっている。
【０００３】
従来、ダイオキシン類分解生物の検索には、ダイオキシン類自身または放射能ラベル化化合物を用いて生分解力を評価して選抜する方法が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のダイオキシン類分解生物の検索方法には、生分解力評価に前処理操作が必要であったり、放射能ラベル化化合物の特殊な分析施設が必要であったり、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを用いた機器分析に時間を要するという欠点があった。
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、従来のダイオキシン類分解生物の検索法の欠点を解消し、より簡便にダイオキシン類を分解する生物等を検索する方法、検索のための化合物および検索用のキットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
ダイオキシン類の生物分解において、例えばジベンゾ−ｐ−ジオキシン分解菌による一般的な分解経路では、下記反応式に示したようにダイオキシン類の基本骨格であるジベンゾ−ｐ−ジオキシンのエーテル結合の開裂が律速となる。
【０００７】
【化１１】
0004192218.tif 000002
【０００８】
本発明者らは、上記反応式で示されるジベンゾ−ｐ−ジオキシンの生分解経路に着目し、ジベンゾ−ｐ−ジオキシンの一方のベンゼン環を、ベンゼン環を有する蛍光を発する化合物に置換したダイオキシン類縁化合物を基質とし、分解代謝物の蛍光を指標とすることにより対象となる生物、酵素、酵素遺伝子がダイオキシン類分解能を有するかどうかのスクリーニングを容易に行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下（１）〜（１０）の発明に関するものである。
【００１０】
（１）  化学式（１）
【００１１】
【化１２】
0004192218.tif 000003
【００１２】
で示される新規ダイオキシン類縁化合物。
【００１３】
（２）  化学式（２）
【００１４】
【化１３】
0004192218.tif 000004
【００１５】
で示される新規ダイオキシン類縁化合物。
【００１６】
（３）  ダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子を検索する方法であって、一般式（３）
【００１７】
【化１４】
0004192218.tif 000005
【００１８】
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｍは０〜４の整数を表し、Ｒ1は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を基質とし、検索対象となる生物、酵素または酵素遺伝子を作用させ、代謝物の蛍光発光を指標とすることを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索方法。
【００１９】
（４）  前記一般式（３）で示されるダイオキシン類縁化合物が、化学式（１）
【００２０】
【化１５】
0004192218.tif 000006
【００２１】
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする前記（３）項に記載の検索方法。
【００２２】
（５）  ダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子を検索する方法であって、一般式（４）
【００２３】
【化１６】
0004192218.tif 000007
【００２４】
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｎは０〜４の整数を表し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を基質とし、検索対象となる生物、酵素、酵素遺伝子を作用させ、代謝物の蛍光発光を指標とすることを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索方法。
【００２５】
（６）  前記一般式（４）で示されるダイオキシン類縁化合物が化学式（２）
【００２６】
【化１７】
0004192218.tif 000008
【００２７】
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする前記（５）項に記載の検索方法。
【００２８】
（７）  一般式（３）
【００２９】
【化１８】
0004192218.tif 000009
【００３０】
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｍは０〜４の整数を表し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を含むことを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索用キット。
【００３１】
（８）  前記一般式（３）で示されるダイオキシン類縁化合物が化学式（１）
【００３２】
【化１９】
0004192218.tif 000010
【００３３】
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする前記（７）項に記載の検索用キット。
【００３４】
（９）  一般式（４）
【００３５】
【化２０】
0004192218.tif 000011
【００３６】
（ただし式中、Ｘは塩素原子を表し、ｎは０〜４の整数を表し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を表す）
で示されるダイオキシン類縁化合物を含むことを特徴とするダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索用キット。
【００３７】
（１０）  前記一般式（４）で示されるダイオキシン類縁化合物が化学式（２）
【００３８】
【化２１】
0004192218.tif 000012
【００３９】
で示されるダイオキシン類縁化合物であることを特徴とする前記（９）項に記載の検索用キット。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明において、ダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素およびダイオキシン類分解酵素遺伝子により分解されるダイオキシン類とは、２，３，７，８‐テトラクロロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジオキシンを初めとするポリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシンである。
【００４１】
本発明において、前記化学式（１）および化学式（２）で示されるダイオキシン類縁化合物は、新規化合物である。
【００４２】
前記化学式（１）で示される新規ダイオキシン類縁化合物は、例えば不活性ガス雰囲気下に、ヘキサメチルりん酸トリアミド（ＨＭＰＡ）等の溶媒中で、水素化ナトリウムとクラウンエーテル（１８−Ｃｒｏｗｎ−６）の存在下で、４−メチルエスクレチンと１，２，４，５−テトラクロロベンゼンを反応させることにより得られる。
【００４３】
前記化学式（２）で示される新規ダイオキシン類縁化合物は、例えば不活性ガス雰囲気下に、ヘキサメチルりん酸トリアミド（ＨＭＰＡ）等の溶媒中で、水素化ナトリウムとクラウンエーテル（１８−Ｃｒｏｗｎ−６）の存在下で、２，３−ジヒドロキシナフタレンと１，２，４，５−テトラクロロベンゼンを反応させることにより得られる。
【００４４】
本発明のダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素およびダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索方法は、前記一般式（３）で示されるダイオキシン類縁化合物（以下、エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物と呼ぶ）または一般式（４）で示されるダイオキシン類縁化合物（以下、ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物と呼ぶ）を基質として、ダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素、ダイオキシン類分解酵素遺伝子を作用させ、代謝物の蛍光の有無により、対象とする生物、酵素または酵素遺伝子がコードするタンパク質（酵素）がダイオキシン分解能を有するかどうかを評価するものである。
【００４５】
前記一般式（３）で示されるエスクレチン型ダイオキシン類縁化合物において、Ｒ1は水素原子またはメチル基、エチル基、プロピル基の炭素数１〜３の低級アルキル基を挙げることができるが、好ましくは前記化学式（１）の化合物を挙げることができる。
【００４６】
前記一般式（４）で示されるナフタレン型ダイオキシン類縁化合物において、Ｒ2は水素原子またはメチル基、エチル基、プロピル基の炭素数１〜３の低級アルキル基を挙げることができるが、好ましくは前記化学式（２）の化合物を挙げることができる。
【００４７】
本発明におけるダイオキシン類分解生物とは、ダイオキシン類をその生物の代謝系により二酸化炭素まで資化することができる生物またはその生物の代謝系、生物機能により解毒・無毒化、改質することができる生物を指す。
【００４８】
本発明におけるダイオキシン類分解酵素とは、ダイオキシン構造中のエーテル結合開裂に直接、間接的に関与する酵素類、および塩素化ダイオキシンの脱塩素、水酸化に直接、間接的に関与する酵素類を指す。
【００４９】
本発明におけるダイオキシン類分解酵素遺伝子とは、上記酵素タンパク質をコードする遺伝子、および調節タンパク質をコードする遺伝子、関連遺伝子を指す。
【００５０】
本発明のダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素を検索する方法は、前記エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物または前記ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物を基質として、検索対象となる生物等を作用させ、その分解代謝物の蛍光発光を指標とするものである。
【００５１】
ダイオキシン類縁化合物の分解代謝物の蛍光発光を指標として、検索対象生物等がダイオキシン類分解能を有するかどうかを判定できるのは、下記反応式に示すように、基質となる本発明のダイオキシン類縁化合物のジオキサン環のエーテル結合が開裂することにより生成する化合物（化学式（１ａ），（１ｂ），（２ａ），（２ｂ），（２ｃ））が蛍光発光するためである。
【００５２】
【化２２】
0004192218.tif 000013
【００５３】
【化２３】
0004192218.tif 000014
【００５４】
上記反応式に示した分解生成物のうち、エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物から分解生成する分解生成物（化学式（１ａ），（１ｂ））は、３５０〜３８０ｎｍの励起光の照射により４５０〜４６０ｎｍの蛍光発光を示し、ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物から分解生成する分解生成物（化学式（２ａ），（２ｂ），（２ｃ））は、３５０〜３６０ｎｍの励起光により４００〜４５０ｎｍの蛍光発光を示す。従って、エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物またはナフタレン型ダイオキシン類縁化合物を基質として検索対象の生物等を作用させて得られる分解代謝物に、３５０〜３８０ｎｍ（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）または３５０〜３６０ｎｍ（ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）の励起光を照射し、４５０〜４６０ｎｍ（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）または４００〜４５０ｎｍ（ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）の蛍光発光を検出、測定することにより、検索対象の生物等がダイオキシン分解能を有していることを判定できる。蛍光発光を検出、測定する手段は、例えば、分光光度計を挙げることができる。すなわち、分解代謝物から４５０〜４６０ｎｍ（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）、４００〜４５０ｎｍ（ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）の蛍光発光を検出、測定できたときは、その検索対象の生物等はダイオキシン分解能を有していることが判定できる。また、分解代謝物の蛍光発光を肉眼によって確認し、ダイオキシン分解能を有する生物等を選別してもよい。
【００５５】
本発明により、ダイオキシン類分解生物を検索する方法としては、培地に少量の有機溶媒に溶解した基質（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物またはナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）を添加し検索対象生物等と培養し、所定時間培養後、一部上静を採取し、アルカリ緩衝液（１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ水酸化ナトリウム  ｐＨ１０）を加え希釈した後、蛍光分光光度計等により３５０〜３８０ｎｍ（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）または３５０〜３６０ｎｍ（ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）の励起光で４５０〜４６０ｎｍ（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）または４００〜４５０ｎｍ（ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）の蛍光発光を検出、測定、または分光光度計により蛍光発光を検出、測定する。有機溶媒としてはＤＭＳＯ、アセトン、等水溶性のものを用い培地に対する有機溶媒濃度が１％以上にならないように添加することが好ましい。培地に界面活性剤を添加する場合は非水溶性の有機溶媒、ノナン、ヘキサン等に基質を溶解し、最終濃度が濃度が１％を越えないように添加し、十分に撹拌し分散させればよい。
【００５６】
本発明により、ダイオキシン類分解酵素の検索する方法としは、ガラス製試験管に本基質を含む緩衝液（ｐＨ４〜７）、分解能を有すると思われる生物の粗酵素（粗抽出液）、または分画操作した画分の酵素タンパク質を加え、所定時間反応後、その一部または全部を新たなガラス製試験管に移しにアルカリ緩衝液（１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ水酸化ナトリウム  ｐＨ１０）を加え、希釈した後、蛍光測定用石英セルに移し蛍光分光光度計等により、３５０〜３８０ｎｍ（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）または３５０〜３６０ｎｍ（ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）の励起光を照射し、４５０〜４６０ｎｍ（エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）または４００〜４５０ｎｍ（ナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）の蛍光発光を測定、または分光光度計により発色を測定する。有機溶媒としてはＤＭＳＯ、アセトン、等水溶性のものを用い反応液に対する有機溶媒濃度が１％以上にならないように添加した。反応液に界面活性剤を添加する場合は非水溶性の有機溶媒、ノナン、ヘキサン等に基質を溶解し、最終濃度が濃度が１％を越えないように添加し、十分に撹拌し分散させればよい。
【００５７】
本発明により、ダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索する方法としては、ダイオキシン分解能力の無い大腸菌等バクテリアや、酵母等真核微生物に、ダイオキシン分解能のある生物の遺伝子ライブラリーを導入し、形質転換生物を上記分解生物の検索方法に従い選別し、分解関連酵素遺伝子を特定する。
【００５８】
本発明のダイオキシン類分解生物、ダイオキシン類分解酵素またはダイオキシン類分解酵素遺伝子の検索キットは、前記一般式（３）で表されるエスクレチン型ダイオキシン類縁化合物または一般式（４）で表されるナフタレン型ダイオキシン類縁化合物を含むことを特徴とするものである。
【００５９】
ダイオキシン分解生物、分解酵素、分解酵素遺伝子検索キットは前述の検索方法を実施するために一般化されたものであり、前記エスクレチン型ダイオキシン類縁化合物またはナフタレン型ダイオキシン類縁化合物の基質の結晶、基質溶解用有機溶媒（ＤＭＳＯまたはアセトン）、測定時添加用アルカリ緩衝液（１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ水酸化ナトリウム  ｐＨ１０．０）を含むもので、操作手順は前述に従って行う。
【００６０】
【実施例】
実施例１
窒素ガス雰囲気下、室温で４−メチルエスクレチン０．１９ｇ（１．０ｍＭ）、水素化ナトリウム（６０％オイル懸濁液）０．０７２ｇ（１．８ｍＭ）、クラウンエーテル（１８−Ｃｒｏｗｎ−６）０．４７６ｇ（１．８ｍＭ）、を４ｍｌのヘキサメチルりん酸トリアミド（ＨＭＰＡ）に混合し、完全に溶解するまで撹拌した。次に、１，２，４，５−テトラクロロベンゼン０．１０８ｇ（０．５ｍＭ）を加え５０℃で撹拌しながら十分に溶解した。溶解後、１２０℃、３時間反応させた。反応は随時薄層クロマトグラフィー（展開溶媒  酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３）によりモニターした。反応終了後、室温まで放冷し、酢酸エチル５０ｍｌで希釈後、飽和食塩水で反応溶液を３回洗浄し、有機層を減圧濃縮した。濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液  酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３）で精製し標記化合物の油状物０．１２ｇを得た。油状物はクロロホルム、ヘキサンにより結晶化を行い、前記化学式（１）の化合物の結晶８６ｍｇを得た。得られた化合物の物性値を以下に示す。
融点：２９６〜２９８℃
1Ｈ−ＮＭＲ（δ：ｐｐｍ）〔ＣＤＣｌ3〕
2.34(3H,s),6.19(1H,s),6.82(1H,s), 6.96(1H,s),6.99(1H,s),7.02(1H,s)
13Ｃ−ＮＭＲ（δ：ｐｐｍ）〔ＣＤＣｌ3〕
18.7,105.1,111.1,114.0,116.3,117.8,118.0,127.1,127.5,137.9,139.8,
140.4,143.9,150.5,160.4
【００６１】
実施例２
窒素ガス雰囲気下、室温で２，３−ジヒドロキシナフタレン０．１６ｇ（１．０ｍＭ）、水素化ナトリウム（６０％オイル懸濁液）０．０７２ｇ（１．８ｍＭ）、クラウンエーテル（１８−Ｃｒｏｗｎ−６）０．４７６ｇ（１．８ｍＭ）、を４ｍｌのヘキサメチルりん酸トリアミド（ＨＭＰＡ）に混合し、完全に溶解するまで撹拌した。次に、１，２，４，５−テトラクロロベンゼン０．１０８ｇ（０．５ｍＭ）を加え５０℃で撹拌しながら十分に溶解した。溶解後、１３０℃、３時間反応させた。反応は随時薄層クロマトグラフィー（展開溶媒  酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３）によりモニターした。反応終了後、室温まで放冷し、酢酸エチル５０ｍｌで希釈後、飽和食塩水で反応溶液を３回洗浄し、有機層を減圧濃縮した。濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液  酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３）で精製し標記化合物の油状物０．０９８ｇを得た。油状物はヘキサンにより結晶化を行い、前記化学式（２）の化合物の結晶６８ｍｇを得た。得られた化合物の物性値を以下に示す。
融点：１３６〜１３８℃
1Ｈ−ＮＭＲ（δ：ｐｐｍ）〔ＣＤＣｌ3〕
7.03(2H,s),7.24(2H,s),7.34(1H,s),7.35(1H,s),7.63(1H,s),7.64(1H,s)
13Ｃ−ＮＭＲ（δ：ｐｐｍ）〔ＣＤＣｌ3〕
112.5,117.8,125.7,126.5,126.9,131.0,140.6,140.7
【００６２】
実施例３
数種の木材腐朽菌類（アイアナタケ WD844（Grammothele fuligo WD844)、カミウロコタケ WD1694(Phanerochaete crassa WD1694)、ファネロケーテ  クリソスポリウム  ME446(Phanerochaete chrysosporium ME446)、オオウズラタケ(Fomitopsis palustris)、カワラタケ(Coriolus versicolor)、ウスヒラタケ(Pleurotus pulmonarius））を供試菌として、実施例１で得られたダイオキシン類縁化合物（エスクレチン型）を用いたダイオキシン分解菌の検索を行った。
【００６３】
改変ＮＳ培地（３％グルコース、１％ペプトン、無機塩類、ｐＨ５．０）１０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコに馬鈴薯寒天培地にて前培養した検索対象木材腐朽菌をコルクボーラーで打ち抜いたものを接種し、５日〜１週間２８℃で静置培養した。その後、最終基質濃度が１ｐｐｍとなるようにＤＭＳＯに溶かした基質（実施例１で得られたエスクレチン型ダイオキシン類縁化合物）溶液を１００μｌ添加した。ＤＭＳＯ濃度は培地に対して１％で添加した。経時的（１，３，５日後）に培養液を採取し、その１００μｌに対してアルカリ緩衝液（１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ水酸化ナトリウム  ｐＨ１０．０）１．９ｍｌを加え、励起光として長波長紫外線（３６５ｎｍ）を照射する事により蛍光を発するものを肉眼で選別した。培養７日目の蛍光強度を、蛍光分光光度計により励起波長３５０ｎｍで、蛍光波長４５０ｎｍの蛍光発光強度を測定した。その測定結果を表１に示す。なお、表中のコントロールとは、上記微生物培養用の培地にダイオキシン類縁化合物（エスクレチン型）を加えただけのものである。
【００６４】
【表１】
0004192218.tif 000015
【００６５】
本基質を用いた木材腐朽菌の検索の結果、ウスヒラタケ（Pleurotus pulumonairus）が強力に蛍光を発し、次いでアイアナタケ WD844(Grammothele fuligo WD844)、ファネロケーテ  クリソスポリウム  ME446（Phanerochaete chrysosporium ME446)、カワラタケ(Coriolus versicolor)となり、ダイオキシン分解性木材腐朽菌と認知されているカミウロコタケ ME446（Phanerochaete chrysosporium ME446)よりも強い蛍光を示す木材腐朽菌、ウスヒラタケ（Pleurotus pulmonarius)が選別された。
【００６６】
実施例４
数種の木材腐朽菌類（アイアナタケ WD844（Grammothele fuligo WD844）、カミウロコタケ WD1694（Phanerochaete crassa WD1694）、ファネロケーテ  クリソスポリウム ME446（Phanerochaete chrysosporium ME446）、オオウズラタケ（Fomitopsis palustris）、カワラタケ（Coriolus versicolor）、ウスヒラタケ（Pleurotus pulmonarius））を供試菌として、実施例２で得られたダイオキシン類縁化合物（ナフタレン型）を用いたダイオキシン分解菌の検索を行った。
【００６７】
改変ＮＳ培地（３％グルコース、１％ペプトン、無機塩類、ｐＨ５．０）１０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコに馬鈴薯寒天培地にて前培養した検索対象木材腐朽菌をコルクボーラーで打ち抜いたものを接種し、５日〜１週間２８℃で静置培養した。その後、最終基質濃度が１ｐｐｍとなるようにＤＭＳＯに溶かした基質（実施例２で得られたナフタレン型ダイオキシン類縁化合物）溶液を１００μｌ添加した。ＤＭＳＯ濃度は培地に対して１％で添加した。経時的（１，３，５日後）に培養液を採取し、その１００μｌに対してアルカリ緩衝液（１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ水酸化ナトリウム  ｐＨ１０．０）１．９ｍｌを加え、励起光として長波長紫外線（３６５ｎｍ）を照射する事により蛍光を発するものを肉眼で選別した。その結果、最も発光強度の強い木材腐朽菌として、ウスヒラタケ（Pleurotus pulumonairus）が選別された。
【００６８】
参考例１
実施例３および実施例４で選別されたウスヒラタケ(Pleurotus pulmonarius)のダイオキシン分解能を測定した。
【００６９】
実施例３および実施例４と同様にウスヒラタケ(Pleurotus pulmonarius)をグルコース−ペプトン培地にて培養し、培養７日目に２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンを最終濃度０．５ｐｐｍとなるように添加し、２０日間培養した。その後、培養菌体を含む培地を凍結乾燥し、ヘキサンで１６時間環流抽出を行い、ヘキサンを留去後、１００ｐｐｍのTriton X-100を含むメタノール２００ｍｌを加え２００倍に希釈し、米国ケープテクノロジー社のHigh Performance Dioxin Immunoassay Kitの説明書に従いダイオキシン濃度を測定し、ダイオキシン分解率を求めた。その結果を表２に示す。表中コントロールとは、上記微生物培養用の培地に２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンを加えただけのものである。なお、ネガティブコントロールとしてオオウズラタケ(Fomitopsis palustris)を用いた。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
表２に示した結果から明らかなように、実施例３および実施例４で選別したウスヒラタケ(Pleurotus pulmonarius)がダイオキシン分解能を有することが分かる。なお、ダイオキシン分解能のないオオウズラタケ(Fomitopsis palustris)において９％の分解率が示されたが、これは分解ではなく、菌体への非特異的吸着により生じたものと考えられる。
【００７２】
参考例２
本発明化合物のアッセイ基質としての有効性を検討するため、実施例３および４で本発明化合物を用いてスクリーニングされた菌株（木材腐朽菌）の塩素化ダイオキシン代謝能を放射性ラベル化ダイオキシンを用いて検討した。30ｍｌ容バイアル瓶にKirk Low N培地（Glucose 1%, Ammoniumtertrate 1.2mM, Kirk Salt solution 10ml/100ml.Kirk Salt solution: KH2PO420g/l,MgSO4・7H2O 5g/l, CaCl2・2H2O 1.3g/l, Thiamine 0.005g/l, trace element1.66ml/l)を５ｍｌ入れ、寒天培地で培養した上述の菌株をコルクボーラーで打ち抜いたものを植菌し、２８℃、５日間静置培養したところに放射活性が48.2mCi/mmolの2,3,7,8-tetrachloro[U-14C]dibenzo-p-dioxinを130ppbとなるように加えた。そしてゴム栓でバイアル瓶を密栓し再び２８℃で定期的に酸素を送り込みつつ静置培養した。14CO2の回収及び放射活性の測定は、バイアル瓶に２本の注射針を刺しそれぞれにチューブを付けその一方を酸素ボンベに、他方を液体シンチレーションカウンター用のミニバイアル中の14CO2捕捉剤（シンチラミン）とシンチレーションカクテル（シンチゾル500）の混液につないだ。ボンベから100％酸素を送り込み微生物代謝により放出された14CO2をミニバイアルに捕捉した後、その放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。この操作は経時的（７日毎）に行った。
【００７３】
本発明化合物をアッセイ基質として用いてスクリーニングにより選抜された木材腐朽菌Pleurotuspulmonariusのダイオキシン代謝能を検定するため、放出される14CO2を経時的に測定した。その結果を図１ に示す。代謝実験開始後１週間目で14CO2を検出する事が出来、培養２週間目でも１週間目と同程度の１４CO2を検出することが出来た。これより、本代謝実験により新規アッセイ基質を用いて選抜された菌株（Pleurotuspulmonarius）は塩素化ダイオキシン分解・代謝能を有することが確認され、本研究に用いたダイオキシン構造類似新規化合物を用いたスクリーニングの有効性が示された。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、生物的環境浄化（バイオメディエーション）に適用するダイオキシン類を迅速かつ強力に分解・代謝・無毒化できる生物等を迅速、簡便、好感度に検索し、単離することができるので、社会問題化しているダイオキシン類汚染の環境修復技術の構築が可能となる。
【００７５】
また本発明により、生物等によるダイオキシン類分解・代謝系の生化学的解析（酵素化学的、動力学的、分子生物学的解析）が可能となり、環境浄化のための新規バイオリアクター開発、タンパク質工学による酵素蛋白の高機能化、分解系機能獲得のための分子進化の基礎データを蓄積することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例２における、木材腐朽菌Pleurotospulmonariusのダイオキシン代謝能の測定結果を示すグラフ。
【図１】
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