(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの内部流路を有する弾性体からなる透光性の本体部と、本体部の端部において本体部内部流路と通じ外部開放されている接続部と、を備える微細弾性管；
微細弾性管内に粒子懸濁液を送液する送液部；及び
微細弾性管内部を通る粒子を測定する検出部を備える粒子測定装置。
【請求項２】
微細弾性管の内部流路の内径が１０〜３００μｍである請求項１記載の粒子測定装置。
【請求項３】
微細弾性管の弾性体がシリコーン樹脂である請求項１又は２記載の粒子測定装置。
【請求項４】
微細弾性管の本体部の外壁が平面を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子測定装置。
【請求項５】
検出部が光源に照明された粒子からの画像情報を撮像する撮像装置からなる請求項１〜４のいずれか1項に記載の粒子測定装置。
【請求項６】
所定の外径を有する芯体を接続部に挿入する工程と、
接続部を型枠の端部において型枠の内部空間側に突出するように保持する工程と、
型枠に流動性高分子樹脂を注入する工程と、流動性高分子樹脂を硬化させる工程と、
前記型枠から成形体を取り出す工程と、前記成形体から前記芯体を取り出す工程からなる請求項１〜５のいずれか1項に記載の粒子測定装置に用いられる微細弾性管の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、透光性を有し、かつ、柔軟であり、微細な流路を持った微細弾性管を用いた粒子測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
シースフローは、従来から血球検出において血球が重ならない状態で１個１個血球を検出できることから、血球計数装置に広く採用されている。シースフローは、試料流をシース液で囲み、試料流を数十μｍまで細くした流れにするものである。もし、試料流と同じくらい細いチューブが作成できれば、シースフローなしでも血球が重ならない状態で１個１個血球を検出することも可能になる。
近年、マイクロマシン技術の発展に伴ってエッチングを用いた微細流路形成が盛んに行われている。ここで開発されている流路は、数μから数百μｍまで様々であるが、ウエハーを積層する構造上、断面は角形であり、また単結晶シリコンにコーティングなどの処理を施し、生体由来の血球に対する親和性を持たせる必要がある。
また、マイクロマシン技術において作成された流路は、断面形状が限られており、エッジが必ず生じる。そのため、微小な粒子を流した際には、エッジ部分に付着し、より正確な流れを得ることができなかった。また、この技術を実施するには膨大な設備投資が必要となるため、研究開発を行うことができるものは限られていた。
一方、一般的な流路としてチューブが考えられ、シリコン、テフロンなど様々なものが市販されている。しかし、市販チューブは寸法が限られ、大きさは内径０．５ｍｍ外径１ｍｍまでのものが最小となっている。また、押し出し・引き抜きによる製造を行っているため、治工具を微小なチューブ寸法に応じた加工をするのは、非常に困難であった。
【０００３】
これを解決すべく特公平６−５２２６５号では作成したチューブを加熱・延伸することにより更なる微細径が得る方法が開示されている。
しかしながら、上記チューブの作製方法において、押し出し・引き抜きで作成を行うと、急速冷却を行うことになり、残留応力のため複屈折が少ない透明なチューブを得ることは非常に困難である。また、断面形状においては外形状・内形状ともに安定した円形のものを作成することは容易であるが、角形など他の形状における微細化において高精度のものは困難である。また、延伸による微細化においては、シリコーンのような柔軟な樹脂におけるチューブの作製が困難であり、流路内の可視化を行えるだけの透光性を得ることに関しても困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、透光性を有し、かつ、柔軟であり、微細な流路を持った微細弾性管を用いた粒子測定装置を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の粒子測定装置は、少なくともひとつの内部流路を有する弾性体からなる透光性の本体部と、本体部の端部において本体部内部流路と通じ外部開放されている接続部とを備える微細弾性管、微細弾性管内に粒子懸濁液を送液する送液部、及び微細弾性管内部を通る粒子を測定する検出部を備えることを特徴とする。また、前記微細弾性管の製造方法は、所定の外径を有する芯体を接続部に挿入する工程と、接続部を型枠の端部において型枠の内部空間側に突出するように保持する工程と、型枠に流動性高分子樹脂を注入する工程と、流動性高分子樹脂を硬化させる工程と、前記型枠から成形体を取り出す工程と、前記成形体から前記芯体を取り出す工程からなる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
【０００７】
弾性体は、天然ゴムあるいはシリコーン樹脂、ブチル樹脂、ニトリル樹脂、クロロプレン樹脂、ＳＢＲ、エチレン−プロピレンタ−ポリマーゴム等の樹脂、好適にはシリコーン樹脂により形成され、任意に弾性変形可能である。
前記弾性体を用いた微細弾性管は、任意に弾性変形可能であり、血球に対する親和性が高いので、その流路内を通る血球に対して損傷を与えることは非常に少ない。
【０００８】
接続部は、管状の硬質性素材で構成することができる。例えば、金属や硬質性の樹脂、ガラスなどである。金属であれば、耐食性のステンレスを用いることが好ましい。また、硬質性の樹脂であれば、ポリアセタール樹脂、ポリカーボネイト樹脂、テフロン樹脂、ナイロン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、珪素樹脂、フェノール樹脂、アミノ樹脂、エポキシ樹脂等の成形、加工の容易なものが好ましい。
【０００９】
微細弾性管は１つの内部流路を有する構成でも良いし、複数の内部流路から構成される場合、複数の内部流路が平行となる構成でも良いし、交差する構成であっても良い。
また、微細弾性管は内部流路を有する弾性体からなる透光性の本体部と、本体部において本体部内部流路に通じ外部開放されている接続部とから構成されるのが好ましい。
【００１０】
微細弾性管の内部流路は１０〜３００μｍが好ましく、より好ましくは３０〜５０μｍが良い。また、微細弾性管の肉厚は０．１〜５ｍｍが好ましく、より好ましくは０．５〜２ｍｍが良い。
【００１１】
微細弾性管の本体部の外壁は凸曲面状の形状であっても良いし、平行な面を有する形状であっても良い。ここで、平面を有する形状にすると、微細弾性管を設置するときに、安定した状態で設置できる利点がある。
【００１２】
芯体は、金属が使用でき、ステンレスワイヤやタングステンワイヤが好ましい。より好ましくは、抗張力で歪みの少ないタングステンワイヤが良い。また、外径が１０〜３００μｍのタングステンワイヤを使用するのが好ましい。タングステンは歪みが少ないことから、外径精度の良いワイヤを作成可能であり、抗張力であることから型から引き抜くときにちぎれない。そのため、微細弾性管の製造に用いると、流路径の寸法が安定したものが製造できる。さらに、タングステンワイヤの断面形状が長方形のものを用いることも可能である。
【００１３】
型枠は、金属や硬質性の樹脂、ガラスから構成することができる。金属であれば、耐食性のステンレスを用いることが好ましい。また、硬質性の樹脂であれば、ポリアセタール樹脂、ポリカーボネイト樹脂、テフロン樹脂、ナイロン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、珪素樹脂、フェノール樹脂、アミノ樹脂、エポキシ樹脂等の成形、加工が容易なものが好ましい。
【００１４】
微細弾性管を製造する工程において、先ず、芯体を接続部に挿入する工程を行うことにより、接続部を型枠の端部において型枠の内部空間に突出するように保持する工程が容易に行える。接続部を型枠に保持した後に、芯体を通すことは容易ではないからである。
【００１５】
型枠に流動性高分子樹脂を注入する工程では、注射器やシリンジ、注ぎ口の付いた容器等を使用して、樹脂を注入できる。
【００１６】
流動性高分子樹脂は、硬化前の流動性をもった樹脂であり、天然ゴムあるいはシリコーン樹脂、ブチル樹脂、ニトリル樹脂、クロロプレン樹脂、ＳＢＲ、エチレン−プロピレンタ−ポリマー樹脂等の樹脂、好適にはシリコーン樹脂である。硬化には熱による硬化、重合剤による硬化等が使用できる。
このようにして、完成した微細弾性管は、血球、尿中の粒子、培養細胞、微生物、プランクトン等の粒子、ファインセラミックス、トナー、顔料、研磨剤等の工業用粒子などの観察、測定などの粒子測定用に用いることが好ましい。
【００１７】
微細弾性管を用いた粒子測定装置において、送液部は、シリンジポンプ、ペリスタリックポンプ、ギアポンプ、エアポンプ等の陽圧ポンプや陰圧ポンプが使用できる。陽圧ポンプを使用すると、微細弾性管内の流路は拡張するので、血球が通り易くなる。陰圧ポンプでも、試料の送液は可能であるが、微細弾性管内の流路が閉塞することがある。そのため、血球の通り易さの点で、送液部には陽圧ポンプを使用することが好ましい。
【００１８】
検出部は、光源に照明された粒子からの光学情報を検出する光学検出器であっても良い。この場合、光学情報とは例えば粒子の前方又は側方散乱光、前方又は蛍光などであるが、それらの発光強度や発光時間（パルス幅）なども含まれる。従って、光源には、連続的に発光する光源、例えばレーザー光源を用いることが好ましい。光検出器としては、フォトダイオード、フォトトランジスタ又はフォトマルチプライヤチューブなどを用いることができる。
【００１９】
検出部は、通常、試料液中の粒子を照明する照明光源と、照明された粒子を撮像するカメラと組み合わせた撮像装置を用いても良い。なお、照明光源としては、パルス発光するストロボやパルスレーザ光源を用いることが好ましい。この照明光源に連続的に発光する光源を用いることもできるが、この場合にはカメラにシャッター手段を設ける必要がある。カメラとしてはビデオカメラを用いることができる。
【００２０】
【実施例】
図１は本発明の微細弾性管７３の一実施例の外観図であり、内径３０μｍ、肉厚９８５μｍ、外寸２ｍｍ×２ｍｍ×１１０ｍｍのシリコンチューブ製の本体部１の両端に内径１９０μｍ、外径４１０μｍ、長さ１５ｍｍのステンレス製の接続部２と３が接続された状態を示している。
【００２１】
次に、その製造方法について説明する。図３に示すように、型枠はステンレス製であり、型枠４、５、６の３つの構成部からなる。そして、型枠４、５、６のはネジ８、９、１０、１１によって結合することにより、型枠として機能する。
【００２２】
先ず、接続部２と３にタングステンワイヤ７（日立電線：Ｗ３１−ＣＳ、外径３０μｍ、長さ２００ｍｍ）を通し、接続部２と３を型枠４（外寸：１５ｍｍ×１０ｍｍ×１２０ｍｍ）の両端部に位置させる。型枠４の両端には１．２ｍｍ×１．２ｍｍ×５ｍｍの直交する切り欠きを備える１２ａと１２ｂが形成されている。また、型枠５（外寸：１０ｍｍ×１２ｍｍ×１２０ｍｍ）の両端には１．２ｍｍ×３．２ｍｍ×５ｍｍの凸部を備える１３ａと１３ｂが形成され、その凸部の型枠内側に面する角が０．４ｍｍ×０．４ｍｍ×５ｍｍ欠損し、直交する切り欠きを形成している。そしてこの切り欠きの部分が、型枠４と型枠５が組み立てられたとき、１２ａと１３ａ、１２ｂと１３ｂの間に接続部２、３を保持する部分が形成され、接続部２、３はしっかりと固定される。
次に、型枠４と型枠５をネジ８、９でネジ止めし、型枠４の側面と型枠５の側面を密着する。すると、図４に示すような、内部空間１５を有する型枠が完成する。
【００２３】
次に、２液混合製硬化型シリコーン（東芝シリコーン製ＴＳＥ３４５５Ｔ）を用いて、シリコーン樹脂を作製した。すなわち、まず一定の割合で液状シリコンーンと重合剤を容器内で混合する。次に、その容器を真空容器内に置き、真空ポンプで最大到達圧力が０．１３Ｐａの状態で１０分間脱気する。その後、真空容器から混合後のシリコーン樹脂の入った容器を取り出し、シリコンーン樹脂を内部空間１５にタングステンワイヤ７に沿って注射器を用いて流し込む。次に、型枠６（外寸：１５ｍｍ×２ｍｍ×１２０ｍｍ）をネジ９、１０でネジ止めする（図５）。この状態で２４時間放置する。
【００２４】
図２は図５のＡ方向の断面の拡大図がである。１２ａと１３ａは壁を構成し、その手前の空間は内部空間１５を形成している。型枠４に形成された１２ａの直交する切り欠きと型枠５に形成された１３ａの直交する切り欠きとの間にできた空間１４に接続部２がしっかりと保持されているのがわかる。
【００２５】
２４時間放置した後、型枠から全てのネジをはずし、成形体を取り出す。次に成形体からタングステンワイヤ７を引き抜くと、図１に示すような微細弾性管が完成する。成形前に本体部１に接する型枠を顕微鏡用レンズ磨きで磨くと、成形後の微細弾性管の本体部１は、その透光性を増すので、内部流路内を通る血球をより分析し易くなる。
【００２６】
本発明の微細弾性管を粒子測定用として用いた例を説明する。図６は微細弾性管を用いた粒子測定装置の一実施例の斜視図である。
微細弾性管７３は、ステージ３５上に設けられた固定部材４８ａと４８ｂによって、両側から軽く保持される。測定装置本体部４１は上下方向に移動可能であり、支持棒４３に可動部４４を介して固定される。可動部４４は測定装置本体部４１を固定すると共に、撮像画像のピントを合わせるために使用される。光源２３からの光は光ファイバ２４によって測定装置本体部４１に供給される。
【００２７】
図７は本発明の粒子測定装置の構成図である。図７において、光源２３から発せられた光は、光ファイバ２４を介して測定装置本体部４１内へ導かれデイフューザ２６を照射する。光はデイフューザ２６により拡散され、レンズ３０、ミラー３４、対物レンズ３８ｂで形成される光学系において透明板６６を介して微細弾性管７３流路内の試料流７５を照射する。試料流７５からの光は、透明板６６および対物レンズ３８ｂを介してＣＣＤ４０ａで受光される。ＣＣＤ４０ａで撮像された画像は解析装置２０で解析される。解析装置２０では、撮像された領域の画像を解析し、粒子像をモニター２２に表示可能である。
【００２８】
血液試料７１は採血された血液を生理食塩水で８０倍に希釈したもので（血液の希釈倍率は５〜１００倍が好ましい）、吸引口７２から吸引させ陽圧ポンプ２７で微細弾性管内に送液すると、本体部４１に設けられたＣＣＤカメラ４０で微細弾性管７３内の試料流７５の画像が撮像される。また、０．５〜２．０％のアクリジンオレンジを含む食塩水で血液を希釈することにより、白血球を特異的に染め、その蛍光画像を得ることができる。送液された試料は排液瓶７４に貯留される。撮像された画像情報は、各種の画像処理を行う解析装置２０、画像を記憶するビデオ２１、画像をリアルタイムで可視化するモニター２２に供給される。ステージ３５は、Ｘ−Ｙ操作部２５によって、Ｘ方向のアクチュエーター４６、Ｙ方向のアクチュエータ４７を動作させることにより、測定装置本体部４１に対して検出部位を動かすことができる。
【００２９】
観察時に得られた画像はビデオ２１にて保存する。保存データは解析したり、モニター２２に表示が可能である。
【００３０】
図８は、本発明の粒子測定装置によって得られた血液試料の撮像画像である。図に示されたように、赤血球が１個１個流れている様子がわかる。この撮像画像から血液試料の単位体積当たりの血球数を測定可能である。撮像さた血球数…Ａ、流路の長さ…Ｂ、流路の断面積…Ｃとすると、単位体積当たりの血球数はＡ／（Ｂ＊Ｃ）となる。例えば、Ａ：７個、Ｂ：２００μｍ、Ｃ：（１５μｍ）２×πとすると、血球数は５万個／μＬとなる。希釈倍率は８０倍であるから、希釈前の血液の赤血球濃度は４００万個／μＬとなる。さらに、精度の高い赤血球濃度の測定を実現するために、実際は、赤血球の総個数が所定の個数（例えば約１００００個）に達するまで、撮像を繰り返すことが好ましい。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の粒子測定装置は、透光性を有し、かつ、柔軟であり、微細な流路を持っており、血球等の試料を通しても血球に対して親和性が高く損傷を与えることが少ない微細弾性管を備える。また、微細弾性管の製造方法は、簡便であり、高精度の治工具を必要としないため、設備のコストアップを招くことはない。従って、その微細弾性管を用いた本発明の粒子測定装置は、簡単な構成で、安価な装置とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微細弾性管の外観を示す斜視図である。
【図２】図５のＡ方向の断面の拡大図を示す断面図である。
【図３】型枠の構成を示す斜視図である。
【図４】シリコーン樹脂を注入する前の型枠の外観を示す斜視図である。
【図５】シリコーン樹脂を注入後の型枠の外観を示す斜視図である。
【図６】本発明の粒子測定装置の外観を示す斜視図である。
【図７】本発明の粒子測定装置の構成図を示す図である。
【図８】本発明の粒子測定装置で得られた撮像画像の例を示す図である。
【符号の説明】
１  本体部
２  接続部
３  接続部
４  型枠
５  型枠
６  型枠
７  タングステンワイヤ
２０  解析部
２１  ビデオ
２２  モニター
２３  光源
２４  光ファイバ
２７  陽圧ポンプ
４０  ＣＣＤカメラ
６６  透明板
７１  血液試料
７３  微細弾性管
【図１】
0004095217.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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