(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
懸濁培養において商業的スケールで真正体細胞胚を得る方法であって、下記工程：
ｉ）シクラメンまたはキュウリの非カルス外植体を、前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の誘導を促進するのに充分なオーキシンまたはオーキシン混合物の有効量を含む液体植物組織培養培地と接触させた状態で培養すること；
ｉｉ）工程ｉ）で得られたＰＥＭを、オーキシン含有液体培地と接触させた状態で培養することによりＰＥＭの数を増加させること、ここにオーキシン濃度は、顕著なＰＥＭの発達を伴うことなくＰＥＭの成長および増殖を促進するに十分なレベルに維持される；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られたＰＥＭを集め、それらを実質的にオーキシン不含有の液体培地と接触させた状態に置くことにより、体細胞胚生成を誘導すること；次いで、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で誘導された胚から生ずる体細胞胚を集めること、ここに該体細胞胚は、懸濁培養中の非カルス外植体と実質的に同じ表現型および実質的に同じ倍数性を有する商業的な量の植物を提供するために用いられ得るものである
を特徴とする方法。
【請求項２】
液体培地が約１５ｇ／ｌないし９０ｇ／ｌの濃度の炭水化物エネルギー供給源をさらに含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
炭水化物エネルギー供給源がスクロース、グルコースおよびラフィノースから選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
非カルス外植体が原形質体、幹、葉、花弁、胚軸部分、成長点、接合子胚自体、塊茎、維管束、内鞘、子房または葯の花糸に由来するものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
倍数体レベルが
ａ．２倍体；または
ｂ．４倍体
である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法で得られた体細胞胚を、それに由来する外植体先祖細胞性材料と遺伝的に同一である植物に生育させることを特徴とする、植物を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組織培養からの総体植物再生に適する改良された体細胞不定胚分化方法およびさらに具体的には液体培地自体を用いた体細胞不定胚分化による体細胞胚の改良された獲得方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
体細胞不定胚分化の有効な利用方法の商業化は、比較的短い時間間隔で高収量の植物を得られる可能性があるため、例えば器官形成クローニングよりも望ましく、かつ経済的にも魅力あるものと考えられている。
【０００３】
ある種の植物細胞は、適当な植物組織培養培地で培養された場合に、潜在的に総体植物へ分化する能力を有することが知られている。上記培地は、一般的には無機塩類、炭素供給源、例えばスクロース、イノシトール、チアミンなどを含む。常用される植物組織培養培地の例は、ムラシゲおよびスクーグ(ＭＳ培地)、リンズマイアーおよびスクーグの培地、ガンボーグによる(Ｂ５培地)培地である。
【０００４】
上記植物組織培養培地の組成に修飾を加えることにより、使用される特定植物細胞の生長を最適化することができる。ほぼ全ての植物細胞は、植物ホルモン、例えばオーキシンまたはオーキシン様化合物、例えばインドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸または２,４−Ｄ、および／またはサイトキニン、例えばベンジルアデニン、ゼアチン、キネチンなどを必要とする。最適な生長を確実にするためには、ビタミン類、例えばニコチン酸、ピリドキシンまたは他の成分、例えばココヤシ果汁、カゼイン加水分解物などを加えることも有利であり得る。
【０００５】
過去において、典型的な体細胞胚の形成は、次に体細胞胚が誘導され得る一次生長相材料として、非常に大きい液胞を有する細胞および非常に小さい液胞を有するさらに小さい円形細胞の脱分化集塊を含むカルス材料の使用を必要としてきた。しかしながら、体細胞不定胚分化における出発材料としての上記材料の使用は、多くの欠点を有しており、実質的に類似した表現型を有し、および／または倍数体レベルに関して実質的に均一である多数の植物を得る場合には有用性が制限されることが判明した。カルスに端を発する植物は、倍数体レベルに関してソマクローナル変異および／または非均一性を示す傾向を有する[チャレフ(１９８３)、「サイエンス」(Ｓcience)、２１９:６７６−６８２、ラーキン(１９８７)、「アイオワ・ステート・ジャーナル・オブ・リサーチ」(Ｉowa Ｓtate Ｊournal of Ｒesearch)、６１(４):３９３−４３４、デ・クラークＧ−Ｊ(１９９０)、「アクタ・ボタニカ・ネーランディカ」(Ａcta Ｂot．Ｎeerl.)、３９(２):１２９−１４４、カープおよびブライト(１９８５)、「オックスフォード・サーベイズ・オブ・プラント・モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー」(Ｏxford Ｓurveys of Ｐlant Ｍolecular ＆ Ｃell Ｂiology)、２:１９９−２３４、カスターズ等(１９９０)、「アクタ・ボタニカ・ネーランディカ」(Ａcta Ｂot．Ｎeerl.)、３９(２):１５３−１６１(ククミス・サティブス・エル(cucumis sativus Ｌ.))、カイズリー等(１９８７)、「プラント・セル・レポーツ」(Ｐlant cell Ｒeports)、６:３０５−３０８(ピスム・サティブム・エル(pisum sativum Ｌ.))、エズラ(１９９２)、「プラント・サイエンス」(Ｐlant Ｓcience)、８５:２０９−２１３(ククミス・メロ)、およびキビハルジュ等(１９９２)、「プラント・セル、ティシュー・アンド・オーガン・カルチャー」(Ｐlant Ｃell, Ｔissue, and Ｏrgan Ｃulture)、２８:１８７−１９４(シクラメン・ペルシクム・ミル(Ｃyclamen persicum Ｍill))]。
【０００６】
特許出願の既知実例は、体細胞不定胚分化においてカルス材料を使用している。その一例、プラント・ジェネティクス・インコーポレイテッドによるＷＯ９０／０１０５８では、カルス材料の使用による体細胞胚の獲得および広範囲の合成オーキシンの使用効果の研究が報告されている。カルス材料は、何週間にもわたって固形培地における培養および／または継代培養の適当な外植体から形成または生育される。次に、体細胞不定胚分化は、植物ホルモン、例えば２,４−Ｄまたはその類縁体を含む培地へカルス組織を移すことにより開始される。体細胞胚の倍数体レベルまたは得られた植物の倍数体レベルについては全く述べられていない。体細胞不定胚分化におけるカルス材料の使用は、ソマクローナル変異体の獲得が利用可能な遺伝子プールの強化に関して興味深いものであり得る植物を得るのには有望であり得るが、単に実質的に全ての同じ表現型を有する営利的な数の植物の獲得を欲するだけの種子業者または育種家にとってはあまり有用なものではない。
【０００７】
にんじんセルラインは、分裂組織細胞から成るミクロクラスターからクローン化され、それらの胚形成能について試験されたことが認められている(コウトス−テベノット等、「プラント・セル・レポーツ」(Ｐlant Ｃell Ｒeports)(１９９０)８:６０５−６０８)。
【０００８】
著者等は、オーキシン２,４−Ｄを含む植物組織培養培地において国産にんじん(Ｓ１株)の胚軸から得た初回細胞懸濁液を使用し、ろ過により細胞クラスターを単離し、２,４−Ｄを含む植物組織培養培地に細胞クラスターを再懸濁してクラスター密集度を高め、単離クラスターからの細胞コロニーを、２,４−Ｄおよび１％バクト−寒天を含む固体植物組織培養培地を含むペトリ皿に移して細胞コロニー形成を誘導し、それらをナースＳ１株カルスを囲む２,４−Ｄおよび１％バクト−寒天含有第２固形培地中に沈積させ、２,４−Ｄ含有植物組織培養培地中で各細胞コロニーを解離させ、こうして得られた培養物を２,４−Ｄ含有植物組織培養培地中で継代する方法について報告している。この方法により得られたセルラインの後続分析では、４０セルラインのうちの１３は胚形成能を示すが、これらのセルラインの大部分は時間がたつうちにそれらの胚形成能を喪失していることが示された。唯一のセルラインが、長期間かなり一定した胚形成能を有していた。フローサイトメトリー分析によると、このセルラインは倍数体であった。
【０００９】
【発明の効果】
本発明は、技術的に簡単な懸濁培養中で体細胞胚が得られる方法を提供する。その方法は、特にナースカルスの周囲にセルラインを沈積させる必要はない。従って、本発明方法により商業的規模での体細胞胚の製造が可能となる。本発明による体細胞胚は、実質的に同じ表現型を有する植物の大量生産に使用され得る。
【００１０】
現在までのところ、体細胞不定胚分化法は、植物獲得における潜在的に強力な手段として指摘されているが、カルス材料から出発する体細胞不定胚分化の利用は実現不可能であるため、この生産技術の有効利用は妨げられている。
【００１１】
驚くべきことに、商業的規模での真正体細胞胚の生産は、固形培地および／またはカルス組織を使用する必要も無く、液体培養技術そのものの使用を通して達成され得ることが見出された。また、液体培地中のＰＥＭのバイオマス、従ってそこから体細胞胚を大量生産させる能力を増加させ得ることも見出された。上記液体培養技術を用いると、カルス培養／カルス継代培養工程の使用は不必要となり、倍数性レベルに関して均一な体細胞胚の集団を得る手段が初めて提供される。
【００１２】
本発明は、ソマクローナル変異体獲得の危険を実質的に低減化または削除する体細胞不定胚分化を介して体細胞胚を得る方法を提供する。
【００１３】
本発明は、中に含まれる体細胞胚の倍数体レベルが実質的に均一である非ダウクス体細胞胚懸濁培養物を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、実質的に所望の倍数体レベルを有する体細胞胚懸濁培養物から誘導される実質的に均一な倍数性を有する植物(例、２倍体植物または４倍体植物)を提供する。
【００１５】
本発明は、外植体から大量の真正体細胞胚が得られるより確実な手段であって、カルス組織の使用に依存および／または上記手段の必須成分として固形培地を使用しない手段を提供する。
【００１６】
これらおよび本発明の他の対象は、以下の記載および実施例を一読すれば明白である。
【００１７】
【発明の構成】
本発明は、前胚形成塊(ＰＥＭ)が生存可能な体細胞胚を形成させ得る外植体からのＰＥＭ形成の促進方法であって、非カルス植物組織を、有効量のオーキシンまたはオーキシン混合物を含む液体植物組織培養培地と接触させて置くことを特徴とする方法を提供する。前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の促進とは、ＰＥＭ形成を誘導し得、および／またはＰＥＭバイオマスを増加させ得ることを意味する。
【００１８】
使用される外植体（explant material）は、双子葉または単子葉植物種であり得る。好ましくは、外植体は、双子葉植物種から誘導される。典型的には、体細胞胚は、前胚形成塊(ＰＥＭ)、すなわちカルス材料とは形態的に異なってかつ分裂組織クラスター（meristematic clusters）としても知られている構造から誘導される。ＰＥＭは、その由来する外植体と同じ倍数性レベルまたは複数の倍数性レベルを有する。すなわち、２倍体および４倍体細胞を含む外植体が２倍体植物から採取される場合、そこから生じる２倍体および４倍体ＰＥＭは、さらに液体培地中で培養する前にふるい分け、細胞選別などにより分離されるべきであり得る。
【００１９】
ＰＥＭは、実質的に分化した生長中の植物組織を含み、真正体細胞胚の前駆体としてみなされ得る。光学顕微鏡(×４０〜×１００倍率)下では、ＰＥＭは、小さな液胞を含む小さな円形の細胞質に富む細胞の集塊として現れる。それ自体本発明のＰＥＭは、それらが誘導される植物の親細胞と遺伝学用語では実質的に同一のものであるとしてみなされ得、究極的には真正体細胞胚であって、両極性である、すなわち分裂機能を備えた根および茎組織から根および茎を発生させる能力を有するものとして認識可能な胚を発生させ得る。すなわち、生存し得る真正体細胞胚はまた、当業界で常用される適当なさらに別の処理に付された場合、遺伝学的に言えば、それが誘導される外植体始原細胞材料と実質的に同一である少なくとも１種の苗木を生じ得るものである。
【００２０】
本発明方法での使用に適した植物組織材料は、植物器官またはその一部、または他の好適に分化した植物組織、例えば原形質体から得られる外植体である。上記組織は、幹、葉、花弁、胚軸部分、成長点、子房、接合子胚自体、塊茎、維管束、内鞘、葯の花糸などから成る群から選択され得る。別法として、適当な外植体は、体細胞胚自体であり得る。植物組織は、興味の対象である任意の植物種から採取され得、単子葉または双子葉植物から選択される植物組織を含む。興味の対象である植物タイプの選択は、「ハンドブック・フォー・シードリング・エバリュエイション」(Ｈandbook for Ｓeedling Ｅvaluation)、ベケンダムおよびグロブ、ＩＳＴＡ、チューリッヒ、スイス国、１９７９、２８−２９頁に示されており、これを引用して説明の一部とする。好ましい植物タイプには、シクラメン、ウリ、リコペルシコン(Ｌycopersicon)、好ましくは食卓用または食用リコペルシコン、アリウム、ベゴニア、ベータ(Ｂeta)、サクラソウ、アブラナ、トウガラシ、シコリウム(Ｃichorium)、ガーベラ、ホウセンカ、ラクツカ(Ｌactuca)、オリザ(Ｏryza)、ペラルゴニューム、ペチュニア、スミレおよびトウモロコシ属から成る群から選ばれるものがある。最も好ましいのは、シクラメン、ウリ、ベータ、例えばベータ・ブルガリス(Ｂeta vulgaris、テンサイ)、アブラナ、例えばブラシカ・オレラセア(Ｂ．oleracea)またはブラシカ・ナプス(Ｂ．napus)、スミレ、ペラルゴニュームおよびトウガラシから成る群から選ばれる植物タイプである。
【００２１】
本発明方法での使用に適した液体植物組織培養培地は、胚形成の誘導および／または促進に適した液体植物組織培養培地であればよい。当業界で常用される塩基性培地の例には、ガンボーグのＢ５培地(Ｂ５)、ムラシゲおよびスクーグ培地(ＭＳ)およびその変形がある。
【００２２】
本発明の企図するところでは、ＰＥＭ形成を誘導し得る充分な量のオーキシンを、初期誘導相で外植体または他の適当な出発物質を含む適当な液体培養培地に加え、そしてその初期誘導相後、ＰＥＭの生長および増殖を促進し得るさらに別の適当な液体培養培地を使用し、その培地では、オーキシン(複数もあり得る)濃度(複数もあり得る)を適当な間隔で補充する。従って、懸濁の発生段階がＰＥＭレベルで固定されているという確証を得るため、例えば当業界で公知の標準ＨＰＬＣ技術を用い、時間をかけてオーキシン濃度をモニターするのが有利である。また、オーキシン(複数もあり得る)に伴い得る有毒な副作用を回避し、さらに生存し得る状態でＰＥＭを維持するためには、植物組織培養培地にオーキシン(複数もあり得る)を加えすぎないことが重要である。
【００２３】
ＰＥＭ生長および増殖用の液体植物組織培養培地は、体細胞不定胚分化の誘導および促進相が行なわれ得るようにオーキシン濃度および／または他の必須成分が適当な間隔で簡単に補充される初期誘導相植物組織培養培地であり得る。初期誘導相培地はまた、適当な間隔で適当なオーキシン濃度を含む新鮮な植物組織培養培地と交換され得、この場合、液体植物組織培養培地は、最初に使用された適当ではあるが異なる液体植物組織培養培地とは同一または異なるものであり得る。すなわち、使用される現実の植物組織培養培地(複数もあり得る)のタイプは、それらが液体であり、適当なオーキシン濃度の存在下でＰＥＭ形成の誘導および／または促進に使用され得るものであれば、本発明にとって厳密なものではないことがわかる。
【００２４】
また、必要なオーキシン濃度は、植物の種類によって異なり、植物の変種ごとに変化し得ることは容易に理解され得る。所定の変種に関して最適な結果を与えるオーキシンのタイプおよび濃度は、標準試験により決定され得る。植物変種によっては、オーキシンの混合物を使用するのが有利であり得る。本発明方法での使用に適したオーキシンおよびオーキシン様化合物の例には、インドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸およびそれらの混合物がある。オーキシンレベルは、ＰＥＭの生長および形成を促進する濃度に維持される。
【００２５】
オーキシン濃度は、ＰＥＭ数または興味の対象であるバイオマスおよび植物の種類によって、好ましくは約０.１mg／l〜約３０mg／lの濃度で維持される。オーキシンの適当な混合物は、ＮＡＡおよび２,４−Ｄを適当な濃度で含み得る。ナフタレン酢酸(ＮＡＡ)の有効なオーキシン濃度は、興味の対象である植物の種類によって、一般には約０−２０mg／lの範囲であり、２,４−Ｄの場合は約０.１mg／lないし約１０mg／l以下の範囲である。例えば、シクラメンＰＥＭは、ＮＡＡの存在を必要とはしないが、初期濃度約５−１０mg／lの２,４−Ｄの存在を必要とする。リコペルシコンＰＥＭは、初期濃度２０mg／lのＮＡＡおよび初期濃度１mg／lの２,４−Ｄを必要とすることが見出された。
【００２６】
使用される植物変種および植物組織培養培地によっては、非植物毒性量のサイトキニンをオーキシン含有培地に加えることによりオーキシン取り込みを容易にすることが有利であり得る。
【００２７】
本発明はまた、懸濁培養中実質的に同じ倍数性レベルを有する体細胞胚を得る方法であって、
i)前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の誘導を促進するのに充分な有効量のオーキシンまたはオーキシン混合物を含む液体植物組織培養培地と接触させた状態で外植体を培養し、
ii)適当なオーキシン含有液体植物組織培養培地と接触させた状態でi)で得られたＰＥＭの数を増加させ、
iii)ii)で得られたＰＥＭを集め、それらを実質的オーキシン不含有液体培地と接触させた状態に置き、そして
iv)iii)で生成されたＰＥＭから誘導去れた胚を集める
ことを含む方法を提供する。
【００２８】
この方法の段階i)およびii)については上記で検討されている。それらは例えば下記の要領で行なわれ得る。
【００２９】
外植体を、興味の対象である種類によって約０.１mg／l〜約３０mg／lの濃度でオーキシンまたはオーキシン混合物を含み、ＰＥＭ形成の誘導に有効である適当な液体培地、例えばＢ５培地またはＭＳ培地中に置く。外植体を、週単位で時間測定された期間(この期間中にＰＥＭが現れる)、約０.０１グラム(生重量)／l〜約１００グラム(生重量)／l(培養物)、好ましくは約１.０グラム(生重量)／l〜約１０グラム(生重量)／lの適当な密度で培養する。この期間は、興味の対象である植物の種類によって、約２週間〜約１４週間またはそれ以上、典型的には約４週間〜約８週間の範囲であり得る。典型的には、得られたＰＥＭを、例えば培地希釈または培地取り替えにより初期外植体培養から分離し、そして同じまたは類似した新鮮な液体培地でさらに培養する。
【００３０】
得られたＰＥＭは、ＰＥＭ形成誘導に要求される条件と同一または類似した環境条件下で直ちに生長または増殖相に入り得る。ＰＥＭ数の増加またはＰＥＭバイオマスがモニターされ、増大するのが見られることから、便宜上、この相をここでは増殖相と称す。
【００３１】
ＰＥＭ形成の誘導が観察された後、顕著なＰＥＭの発達を伴うこと無く、オーキシン濃度がＰＥＭの生長および増殖を促進するのに充分なレベルで維持されるように液体植物組織培養培地をモニターする。オーキシンレベルが適当な時間間隔でＰＥＭ増殖を促進するのに充分なレベルで制御されるように、増殖相は、選り抜きの液体植物組織培養培地の標準希釈物中での継代培養を必要とし得る。別法として、ＰＥＭを、初期外植体培養から分離し、オーキシン含有植物組織培養培地中に置き、流加培養または連続培養システムを用いることにより、単に所望のＰＥＭバイオマスとなるまで増殖させ得る。典型的には、この方法は、オーキシン濃度を一定期間約０.１mg／lのレベルより上に維持することを必要とする。増殖相に関する期間は、真正体細胞胚への変換にいかに多くのＰＥＭが要求されるかによって年単位で測定され得るが、通常、増殖相は、月または週単位で測定され、要求されるＰＥＭバイオマスの量によって例えば約２〜約３０週である。増殖相において１回、ＰＥＭは実質的オーキシン不含有植物組織培養培地中に置き換えられる時点で集められ得、次いでそれらは続けて真正体細胞胚へ生長し得る。これは、本明細書記載のふるい分け、すなわち好適なサイズのふるい(例、１５０μm孔サイズのふるい)を通過し得るが、より小さいサイズのふるい(例、１００μm孔サイズのふるい)では保持されるあるサイズのＰＥＭフラクションの選択を含み得る。
【００３２】
ＰＥＭ形成および増殖は、液体植物組織培養培地に適当な炭素エネルギー供給源、好都合には可溶性炭水化物、例えばスクロース、グルコースまたはラフィノースを補充することにより有利に影響される。典型的な炭水化物濃度は、植物組織培養培地に対し１５g／l〜９０g／l、好ましくは２０g／l〜６０g／lの範囲に含まれる。
【００３３】
増殖相は、フラスコまたはバイオリアクター中で遂行され得る。バイオリアクターは、２次細胞代謝物製造を目的とする細胞懸濁液の培養に関する業界では公知であるが、ＰＥＭ培養を目的とするバイオリアクターの使用についてはこれまでのところ報告されていない。我々は、バイオリアクターが、比較的短い時間間隔で非常に大量のＰＥＭを製造するのに有用であり得ることを見出した。
【００３４】
便宜上、ＰＥＭ懸濁培養からパックした細胞容量を、適当なバイオリアクター中、興味の対象であるＰＥＭの種類によって、充分量の適当な炭素エネルギー供給源、例えばスクロース、グルコースおよびラフィノースを、約１５g／lないし９０g／lまたはそれ以上、好ましくは約２０g／l〜約６０g／lの濃度で含む適当な培地に接種する。プレイルおよびベック[(１９９１)「アクタ・ホルティクルツラエ」(Ａcta Ｈorticulturae)２８９、「プラント・テクノロジー」(Ｐlant Ｔechnology):１７９−１９２]は、バイブロミキサーの使用によるバイオリアクター中での体細胞不定胚分化について記載しているが、その試験では、ＰＥＭが体細胞胚へ生長する前にＰＥＭ形成および増殖が行なわれることは示唆されていない。ＰＥＭ懸濁培養物においてバイオリアクター中でバイブロミキサーを使用すると、ＰＥＭの寿命が時間をかけて顕著に増加し、ＰＥＭバイオマスの増大が助長され、ＰＥＭバイオマス喪失が低減化され、ＰＥＭの凝集が阻止されることが見出された。穿孔した混合プレートまたは撹はんディスクを備えたバイブロミキサー(各々アプリコンＢＶ(オランダ国)およびチェマップ・アクチエンゲゼルシャフト(スイス国)から入手可能)をバイオリアクターの固定面に設置し、実質的にその固定面で振動させると、ＰＥＭ懸濁培養物はＰＥＭバイオマスを著しく喪失することなく混合または撹はんされる。
【００３５】
好ましくは、バイブロミキサーを実質的に垂直面で振動させる。本発明方法で使用されるバイブロミキサーの一般的稼動振動数は５０Ｈzである。振幅は、好都合には±６mmまたはそれ未満の程度である。一旦、所望の数の体細胞胚を生じ得るＰＥＭバイオマスが得られると、ＰＥＭを実質的オーキシン不含有液体植物組織培養培地と接触した状態に置くことができ、そこでそれらは体細胞胚に生長し得る。
【００３６】
有利にはＰＥＭ懸濁液を曝気する。これは自体公知の方法で遂行され得る。バイブロミキサーを使用する場合、空気は、例えば多孔分散装置を用いてバイブロミキサーリアクター中へ散布され得る。
【００３７】
上記および実施例から、様々なパラメーター、例えばオーキシンのタイプおよび濃度、サイトキニンの存在、エネルギー(炭水化物)供給源、撹はんまたは振動数、酸素供給、光の強度および波長に関する最適条件は、使用される植物材料によって異なることになる。上記の最適条件は、標準試験(実施例で説明されている)を用いて決定され得る。本発明による体細胞胚獲得方法の後続段階iii)およびiv)は、下記の要領で実施され得る。
【００３８】
ＰＥＭから体細胞胚への発達の促進は、オーキシン不含有植物組織培養培地中にＰＥＭを置くことにより達成され得る。生存し得るＰＥＭは、体細胞胚に発達し得る。オーキシン不含有培地に移す前に、ＰＥＭを有利には例えばナイロンメッシュを通してふるいにかけ、最も効果的に所望の体細胞胚を発生するＰＥＭサイズフラクションを選択する。生存不可能なＰＥＭの含有率が高すぎると、体細胞胚の形成は阻止される。一般に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも１５％の率で生存可能なＰＥＭを含むＰＥＭを使用するのが望ましい。最適サイズフラクションは、標準スクリーニング試験により決定され得る。
【００３９】
選ばれたサイズのＰＥＭは、例えばふるいまたは当業界における他のサイズ選別手段により回収され得る。熟練者であれば、所望の大きさをしたＰＥＭ(特に高含有率の生存可能なＰＥＭを有するＰＥＭフラクション)のサイズは、本明細書で詳述されている通り種類によって異なることはわかるはずである。
【００４０】
ＰＥＭのふるい分けられたフラクションは、所定サイズ範囲内のＰＥＭを得るためＰＥＭをろ過手段、例えば既知孔サイズのネットメッシュ、例えばナイロンメッシュに通すことにより得られるものである。ＰＥＭは、植物の種類によっては直径約１mm以下のサイズを有し得るが、ＰＥＭの集合体は直径５mm以下であり得る。一般的に述べると、個々のＰＥＭの望ましいサイズはμmで記される程度である。ＰＥＭのサイズは、そこから誘導される単一体細胞胚の獲得にとって重要なものではないことが見出された。好ましくは、集められたＰＥＭフラクションは、その中の各ＰＥＭが適当な条件下で１個の体細胞胚を生じ得るものである。当然、特定の生存可能なふるい分けられたＰＥＭフラクションのサイズは、植物の種類によって変化する。例えば、キュウリにとって最も有用なＰＥＭフラクションは、ＰＥＭのサイズが約１００μm−約１５０μmの範囲のものである。シクラメンの場合のＰＥＭフラクションは、約１５０μm−約３００μmである。より好ましくは、ＰＥＭフラクションは、各ＰＥＭが少なくとも１個の体細胞胚、好ましくは単一体細胞胚を生じ得るものである。
【００４１】
実質的オーキシン不含有液体植物組織培養培地は、ＰＥＭを体細胞胚に発達させ得るものである。すなわち、実質的オーキシン不含有液体植物組織培養培地は、残留レベルのオーキシンは存在し得るが、オーキシンレベルが存在したとしても、ＰＥＭから体細胞胚への発達を実質的に妨害することの無いオーキシン枯渇植物組織培養培地であり得るか、またはそれはオーキシン不含有植物組織培養培地であり得ると予測される。当然、熟練者であれば、実質的オーキシン不含有植物組織培養培地が、いかに多くの体細胞胚が所望されるかによって、フラスコまたは適当なバイオリアクター、例えばバイブロミキサーを取り付けたものの中に置かれ得ることは認識できるはずである。次いで、得られた体細胞胚は、当業界で公知の方法を用いて植物に変換され得る。すなわち、ＰＥＭバイオマスをモニターすることにより、大量の体細胞胚を商業的規模で得ることが可能となる。
【００４２】
オーキシン不含有培地は、好都合には１５g／l〜９０g／l、好ましくは２０g／l〜６０g／lの濃度で可溶性炭水化物エネルギー供給源を含む。適当な炭水化物エネルギー供給源には、スクロース、グルコースおよびラフィノースがある。
【００４３】
商業的規模の体細胞胚数は、顧客の必要条件によって数百(例、５００)〜数百万(例、３００００００)またはそれ以上の数値の範囲内で変動し得る。例えば、必要条件が約２０００００植物に対するものである場合、ＰＥＭバイオマスが実質的に約２０００００体細胞胚を生じ得る状態に到達するまでＰＥＭ増殖は続行される。次に、前述のＰＥＭをオーキシン不含有液体植物組織培養培地と接触した状態に置くと、そこでそれらは体細胞胚に発達することができる。
【００４４】
一旦真正体細胞胚が実質的オーキシン不含有植物組織培養培地中で発達すると、それらは、当業界で常用されている技術を用いてオーキシン不含有植物組織培養培地から分離され、植物に変換され得る。
【００４５】
体細胞胚は、好都合には商業的使用前に生存不可能なＰＥＭから分離される。これは、自体公知の方法で行なわれ得る。生存不可能なＰＥＭは、一般に体細胞胚よりも小さい。体細胞胚は、例えば手動的、ふるい分けまたは細胞選別により単離され得る。
【００４６】
本発明のさらに別の態様では、実質的に全て同じ倍数性レベルを有する体細胞胚を含む体細胞胚のバッチが提供される。体細胞胚のバッチは、商業的要件によって数百ないし数万またはそれ以上を含み得る。好ましくは、体細胞胚のバッチは、実質的に２倍体の体細胞胚または実質的に４倍体の体細胞胚を含む。体細胞胚のバッチは、単に液体培地が排出された体細胞胚の懸濁液であり得、体細胞胚は適当な容器に入れられる。容器の周囲環境は、高い相対湿度、例えば１００％を有し得、０℃より高く、約１５℃以下の適当な冷温で維持され得る。この方法で貯蔵された体細胞胚は、約４日間以下の間維持され得る。別法として、体細胞胚は、デシケーター(乾燥)処理、冷凍、ペレット化、ゲル封入などに付され得る。
【００４７】
本発明は、実質的に全て同じ倍数性レベルを有する体細胞胚を含む、ダウクスとは異なるさらに別の体細胞胚懸濁培養物を提供する。好ましい体細胞胚は２倍体または４倍体である。体細胞胚は、双子葉または単子葉植物外植体から誘導される。以下、実施例により本発明の説明を行う。当然、実施例はいかなる意味でも本発明の範囲を制限するものとして見なされるべきではないものとする。
【００４８】
【実施例】
実施例１
胚形成シクラメン細胞培養の開始およびそこからの体細胞胚。
シクラメン変種「コンチェルト・スカーレット」(スルイスおよびグルート)の種子を、７０％エタノール(２分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)により表面殺菌し、次いで滅菌水で充分に洗浄(３回)する。２３℃で２−４週間湿った紙の上で種子を発芽させ、発芽した塊茎を外植体として使用する。３つの塊茎を、２３℃で暗所中、１００rpmの回転震とう器(Ｇ１０ジャイロロータリーシェーカー、ニューブルンスウィック・サイエンティフィック、エディソン、ニュージャージー、アメリカ合衆国)において２０g／lのスクロース、１０mg／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイノシトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlを補った塩基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)１０ml中で培養する。７日後、培地を新鮮な培地と交換する。さらに７日後、培養物を新鮮な培地により２０ml容量に希釈(５倍)する。さらに７日後、希釈培養物からの塊茎外植体の維管束および内鞘を含む中心髄を、塊茎外植体から分離し、２０g／lのスクロース、１００mg／lのミオイノシトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lピリドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣl、５mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地２５ml中で塊茎の残りとは別に継代培養する。継代培養物を４週間毎週２倍に希釈する。前胚形成塊は約４週目に現れる。上記要領で２週間さらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖させる。２０g／lのスクロース、１００mg／lのミオイノシトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlを補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有Ｂ５培地でさらに培養することにより、ＰＥＭは生存可能な真正体細胞胚に発達し得る。
【００４９】
実施例２
胚形成性シクラメン細胞懸濁培養の開始およびそこからの体細胞胚。
シクラメン種子(品種コンチェルト・シャルラーケン・オテロ、ツァーデュニーＢＶから入手)を、７０％エタノール(２分間)および１％次亜塩素酸ナトリウム(４５分間)で表面殺菌し、滅菌水で充分に洗浄(３回)する。種子を２３℃で暗所中、２〜５週間湿った紙の上で発芽させる。発芽した塊茎を外植体として使用し、２〜８片に切断する。デ・ラート等(１９８７)「プラント・ブリーディング」(Ｐlant Ｂreeding)９９:３０３−３０７の指示に従い、外植体の倍数性レベルを測定すると、２倍体であることが見出された。
【００５０】
３つの塊茎からの外植体を、暗所中２３℃の温度で回転震とう器(１００rpm)中、２０g／lのスクロース、５mg／lの２,４−ジクロロフェノキシ酢酸および１mg／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶ、ハールレム、オランダ国)１０ml中で培養する。全フラスコをアルミニウムホイルで被覆する。１週間後、２５０mlフラスコ中、２０g／lのスクロース、５mg／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイノシトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlおよび１mg／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地で培養物を５０ml容量に５倍希釈する。さらに２週間後、培養物が含むＰＥＭを、広いノズルを有するピペットで培養物の残りから分離し、別々に培養する。ＰＥＭは、本質的に小さな円形の原形質細胞により構成される細胞クランプとして視覚的に同定される。この段階で、ＰＥＭは、細胞の単一クランプまたは互いに付着した細胞の若干のクランプとして同定される。広いノズルを有するピペットを用いて２５０mlフラスコ中、２０g／lのスクロース、５mg／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイノシトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlおよび１mg／lのキネチンを補って最終容量５０mlにした塩基性Ｂ５培地にパックした細胞１mlを接種することにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。２分間７００×gで培養物からの試料を遠心分離にかけることより、パックした細胞容量(ＰＣＶ)、すなわちＰＣＶ(開始)およびＰＣＶ(最終)に関する遠心分離後の全細胞量を測定する。シュレーゲル(１９８１)、「アルゲメイン・ミクロビオロジー」(Ａllgemeine Ｍicrobiologie)、ティーメ、ステュットガルト、１９０頁の公式を用いてＰＣＶ(開始)およびＰＣＶ(最終)の測定値から算出したところによると、胚形成性セルラインは、一般に約４〜６日の倍加時間で生長する。この方法で得られた胚形成性セルラインを少なくとも４５週間維持すると、遺伝学的に安定している、すなわち倍数性レベルは２倍体、最初の外植体の場合と同じである。
【００５１】
ＰＥＭ培養物を、各々２５０μmおよび１００μmの孔サイズを有するナイロンメッシュに通してふるい分けることにより、ＰＥＭを選択する。継代培養の８日後、ＰＥＭ／mlの最高数に到達する。このフラクションからは、最適な胚の発達が誘導され、ＰＥＭ培養の１ＰＣＶ当たりの胚の最高数が達成される。ふるい分けされたＰＥＭの数は、一般に１０００〜５０００ＰＥＭ／ml ＰＣＶの範囲である。
【００５２】
ふるい分け後、ＰＥＭを洗浄し、生長培地、すなわちスクロースまたはグルコースを補って１７４ミリモルの濃度にしたＭＳまたはＢ５培地に接種する。２５〜５０ＰＥＭ／mlを、アルミニウムホイルおよびネスコフィルム(バンドー・ケミカル・インダストリー社、日本)で密閉したフラスコ中で培養する。３〜４週間後、接合子胚に似た魚雷型胚が形成される。この方法を用いると、２５００００の胚が形成される。胚培養の無作為標本に対してデ・ラート(前出)により報告されたフローサイトメトリー分析技術を用いると、５００体細胞胚のＤＮＡ含有率が評価される。胚は全て、２倍体であることが見出された。
【００５３】
シクラメン胚の変換(すなわち発芽)は、塊茎形成、次いで不定根の形成を含み、液体培地、すなわち各々約１１６ミリモルまたは５８ミリモルのグルコースまたはスクロース含有率を有するＭＳまたはＢ５培地で胚を培養することにより誘導される。塊茎形成は、塊茎または塊茎様構造の胚軸からの生長として定義される。さらに初葉を形成する子葉の生長は、液体培地または固体培地、例えばパーライト、滅菌土壌などで行なわれ得る。
【００５４】
無菌条件下(炭素供給源の存在下)または非滅菌条件(炭素供給源を全く加えず)下、変換胚をパーライトまたは鉢植え用土に直接播種すると、１８°〜２０℃で暗所中２〜４週間後に子葉形成が示される。約９０％という高い相対湿度を使用する。９０％を越える胚が、無菌条件下で子葉段階に変換する。一旦子葉が現れると、生じた苗木を明所に置き、温室へ移す前に寒気にさらして強くする。
【００５５】
実施例３
胚形成性トマト細胞培養の開始
トマト変種「マンハッタン」(スルイスおよびグルート)の種子を、７０％エタノール(２分間)および１５分間次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液で表面滅菌し、次いで滅菌水により充分に洗浄(３回)する。２３℃の温度で３日間にわたり、種子を湿った紙の上で発芽させる。完全な実生を集め、各実生を４片に切断し、次いでそれらを外植体として使用する。１０実生をこの方法で切断し、循環可能な１６時間明所期間および８時間暗所期間で、２３℃で１００rpmの回転震とう器において２０g／lのスクロース、２０mg／lのＮＡＡ、１mg／lの２,４−Ｄ、１mg／lのキネチン、１００mg／lのミオイノシトール、１mg／lのニコチン酸、１mg／lのピリドキシンＨＣlおよび１０mg／lのチアミンＨＣlを補った液体塩基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)１５ml中でインキュベーションする。当業界で公知のＨＰＬＣ技術を用いて、培養培地をオーキシン濃度についてモニターする。一旦オーキシン濃度が０.１mg／lより下に下がると、約７日間後、２０g／lのスクロース、２０mg／lのＮＡＡ、１mg／lの２,４−Ｄ、１mg／lのキネチン、１００mg／lのミオイノシトール、１mg／lのニコチン酸、１mg／lのピリドキシンＨＣlおよび１０mg／lのチアミンＨＣlを補った新鮮な塩基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)１５mlを加えて、３０mlの培養物の容量にする。外植体および細胞を１５分間静置し、使用済み培地１５mlを除き、新鮮な培地１５mlを補充して培養物を清新することにより、この培養物を４−７日ごとに継代培養する。外植体の初回培養後、約４−７週間後に、前胚形成塊(ＰＥＭ)が観察される。上記要領で２週間さらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖させる。ＮＡＡ、２,４−Ｄおよびキネチンを除いて上記と同様に補ったオーキシン不含有塩基性Ｂ５培地においてＰＥＭをさらに継代培養すると、真正体細胞胚が観察される。
【００５６】
実施例４
胚形成性トマト細胞培養の開始。
トマト変種「マジョルカ」(スルイスおよびグルート)の種子を、７０％エタノール(２分間)および１５分間次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液で表面滅菌し、次いで滅菌水により充分に洗浄(３回)する。暗所中２３℃の温度で７日間種子を湿った紙の上で発芽させる。子葉を集め、断片に切断し、外植体として使用する。３実生の６子葉をこの方法で切断し、暗所中２３℃で１００rpmの回転震とう器において４mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１参照)１５ml中でインキュベーションする。１４日後、上記ホルモンを含む新鮮な培地Ａ(表１参照)３５mlを加える。上記ホルモンを補った新鮮な培地Ａ(表１参照)中で２倍希釈することにより、培養物を１４日ごとに継代培養する。外植体の初回培養の約４週間後、ＰＥＭが観察される。上記要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖させる。
【００５７】
【表１】
培地Ａの組成
大量成分(g／l):
ＮＨ4ＮＯ3…１.２０、
(ＮＨ4)2ＳＯ4…０.６６、
ＫＨ2ＰＯ4…０.５５、
ＫＮＯ3…１.０１、
ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ…０.３０、
ＣaＣl2…０.２２、
くえん酸…０.５、
スクロース…２０。
大量成分  ２ml貯蔵溶液／l
ビタミン類  ガンボーグＢ５(１mg／l)  １ml貯蔵溶液／l
ＫＯＨ(１モル)を用いてpＨを５.８に調節。
少量成分(貯蔵溶液)(g／l):
ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ…６.９、
ＣuＳＯ4・５Ｈ2Ｏ…０.６５、
ＣoＣl2・６Ｈ2Ｏ…０.１２、
ＭnＣl2・４Ｈ2Ｏ…２.９７、
ＮaＭoＯ4・２Ｈ2Ｏ…０.２４、
ＫＩ…０.０４１、
ＨＢＯ3…１.５、
ＺnＳＯ4・７Ｈ2Ｏ…４.３、
ＮiＳＯ4・６Ｈ2Ｏ…０.３９、
くえん酸…２、
pＨ＝２.３
g２４
ビタミン類ガンボーグＢ５(デュチェファ)、
ミオイノシトール１００g／l
ニコチン酸１g／l
チアミン−ＨＣl１g／l
を補った貯蔵溶液
【００５８】
実施例５
胚形成性キュウリ細胞懸濁培養の開始およびそこからの体細胞胚。
キュウリ変種「パンドレックス」(スルイスおよびグルート)の種子を、７０％エタノール(２分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)で表面滅菌し、次いで滅菌水により充分に洗浄(３回)する。キュウリ種子を２３℃で２日間湿った紙の上で発芽させる。種子から発芽した幼根を外植体として使用する。１５の幼根を、２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器において２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチンを補い、ビタミンを加えた塩基性液体ＭＳ培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)１０ml中で培養する。当業界で公知のＨＰＬＣ技術を用いることにより、培養培地をオーキシン濃度についてモニターする。オーキシン濃度が＜０.１mg／lに下がった後、約５日後、２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチンを補った５０mlの塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)で培養物を５倍に希釈する。２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチンを補った塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)で培養物を２倍希釈することにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。８週間後、前胚形成塊が現れる。
【００５９】
次いで、２週間ごとに５０mlでパックした細胞容量０.４mlを、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１の)に接種することにより、ＰＥＭ培養物をさらに継代培養する。シュレーゲルの公式(前出)を用いて測定したところによると、キュウリセルラインの倍加時間は約２.７日である。大きさ１００−１５０μm間のＰＥＭに対して、培養物を各々孔サイズ１５０μmおよび１００μmのナイロンメッシュに通してふるい分けることにより、ＰＥＭを選択する。１００−１５０μmフラクションからは、ＰＥＭ培養物の１ＰＣＶ当たり最高数の単一体細胞胚が生じる。このセルラインからのＰＥＭは、２倍体または４倍体である。デ・ラート等の方法(前出)により測定したところ、２倍体および４倍体細胞間の比率は、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培地Ａでは２年を越す期間一定のままである。ＰＥＭは２倍体および４倍体植物を生じる。２倍体:４倍体の測定比率は、ＰＥＭおよび植物に反映されている。
【００６０】
２０gのスクロースおよび５マイクロモルのＡＢＡを補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有ＭＳ培地でＰＥＭを培養することにより、ＰＥＭを真正体細胞胚に生長させる。
【００６１】
実施例６
胚形成性キュウリセルラインの操作による１００％２倍体または１００％４倍体懸濁培養物の獲得。
実施例５の懸濁液は、２倍体および４倍体ＰＥＭにより構成され、同じ倍数性レベルを有する胚の発生をもたらす。
【００６２】
直径約２mmの個々のＰＥＭを、実施例５の方法により開始された１３週令細胞懸濁液から選び出す。デ・ラート等(１９８７)「プラント・ブリーディング」(Ｐlant Ｂreeding)、９９、３０３−３０７頁の方法による倍数性レベルに関する個々のＰＥＭの測定結果は、ＰＥＭが１００％２倍体または１００％４倍体であることを示している。実施例５に記載されている塩基性Ｍ５液体培地中で１５週間にわたって個々のＰＥＭをさらに培養すると(すなわち継代培養を２週間ごとに遂行)、デ・ラート等の方法(前出)を用いて測定したところ１００％２倍体または１００％４倍体細胞から成るセルラインが得られた。２倍体ＰＥＭからは、２倍体胚および２倍体植物が生じる。４倍体ＰＥＭからは、４倍体胚および４倍体植物が生じる。
【００６３】
実施例７
胚形成性キュウリセルラインの操作による１００％２倍体または１００％４倍体懸濁培養物の獲得。
キュウリ変種「パンドレックス」(スルイスおよびグルート)の植物を、実施例３の方法を用いて無菌条件下で生長させる。大きさ約１cmの子房を外植体として使用する。デ・ラート等(前出)の方法に従い倍数性レベルを測定すると、外植体が完全に２倍体であることが示された。果実の約半分を約０.５mm厚さの薄片に切り刻み、２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器において、２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチンを補った１０mlの塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)中で培養する。当業界で公知のＨＰＬＣ技術を用いることにより、培養培地をオーキシン濃度についてモニターする。オーキシン濃度が＜０.１mg／lに下がった後、約５日後、２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチンを補った５０mlの塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレム、オランダ国)で培養物を５倍に希釈する。上記要領で補ったＭＳ培地で培養物を２倍希釈することにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。
【００６４】
８週間後、前胚形成塊が出現する。ＰＥＭ培養物を、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)中で実施例５の記載と同様に継代培養する。パックした細胞容量０.４mlを、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ５０mlに接種する。シュレーゲルの公式(前出)を用いて測定したところによると、キュウリセルラインの倍加時間は培地Ａ(表１)では約２.７日である。デ・ラート等(前出)の方法に従いＰＥＭ懸濁液の倍数性レベルを測定すると、２倍体であることが見出された。大きさ１００−１５０μm間のＰＥＭに対して培養物をナイロンメッシュに通してふるい分けることにより、ＰＥＭを選択する。２０g／lのスクロースを補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有ＭＳ培地において選択されたＰＥＭを培養することにより、ＰＥＭを真正体細胞胚に生長させる。この方法を用いると、２０００００の胚がＰＥＭ培養物から４週間で形成される。デ・ラートの方法(前出)を用いると、無作為選別された５００の体細胞胚の倍数性レベルは全て、２倍体であることが見出された。
【００６５】
実施例８
倍数性レベルに関して安定したＰＥＭ懸濁液の維持。
キュウリＰＥＭ懸濁液を、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)において生長させる。継代培養中、大量成分および少量成分を各継代培養段階でＰＥＭ必要量に対して過剰にしておくことにより、継代培養期間(すなわち２週間)中、これらの成分の不足がおこらないようにする。同じ方法でオーキシンレベル(すなわち１０mg／lの２,４−Ｄ)を維持する。継代培養開始時にキネチン(すなわち０.５mg／l)を培地に加え、４日で培地から枯渇させる。当業界で公知の標準ＨＰＬＣ技術を用い、時間をかけてオーキシン濃度をモニターすることにより、懸濁液の生長段階がＰＥＭレベルで固定されることを確実にする。胚形成性２倍体ＰＥＭ懸濁液を２年以下の間、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)中で維持すると、それらは安定した倍数性レベルを示す。胚形成性４倍体ＰＥＭ懸濁液を６箇月間維持すると、それらは安定した倍数性レベルを示す。胚の生長が開始されるまでこの倍数性レベルを維持する。
【００６６】
実施例９
テンサイＰＥＭ懸濁培養の開始およびそこからの体細胞胚。
テンサイの種子(ヒレショーグ・アクチーボラゲット、スエーデン国)を、エタノールの７０％溶液(２分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)により表面殺菌し、次いで滅菌水で充分に洗浄(３回)する。テンサイ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体として使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器において、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉を培養する。培養物を、１または２週間後１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)により５０mlに希釈(５倍)する。上記要領で補った培地Ａ(表１)で培養物を２倍希釈するか、または培地を上記要領で補った新鮮な培地Ａと交換することにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。４〜６週間後、体細胞胚が外植体組織に出現する。胚を外植体から採取し、別々に培養する。４週間後、培養された胚はＰＥＭを形成する。１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った表１の培地Ａを補充することにより、ＰＥＭ培養物をさらに継代培養する。
【００６７】
ＰＥＭ懸濁液を、まず孔サイズ５００μmのナイロンメッシュ、次いで孔サイズ１００μmのナイロンメッシュでふるい分けることにより、ＰＥＭを集める。ＰＥＭフラクション１００−５００μmからは、一般に単一体細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭは、上記要領で補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有培地Ａ培地で培養されると、真正体細胞胚に生長する。
【００６８】
実施例１０
胚形成性コショウＰＥＭ懸濁培養の開始。
コショウの種子(品種ゲデオン(スルイス・エン・グルート))に、エタノールの７０％溶液(２分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)により表面殺菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗浄する(３回)。コショウ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体として使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器において、１０mg／lの２,４−Ｄを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉を培養する。２週間後、培養物を５０mlに５倍希釈する。上記要領で培養物を２倍希釈するか、または培地を１０mg／lの２,４−Ｄを補った新鮮な培地Ａ(表１)と交換することにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。２〜４週間後、外植体の切断端部から胚が現れる。胚を外植体から採取し、培養物から除去し、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのゼアチンを補った液体培地Ａ(表１)において継代培養する。４週間後、前胚形成塊が現れる。上記要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増大させる。実施例５の記載に従って懸濁液をふるい分けることにより、ＰＥＭを集める。フラクション１００−５００μmからは、単一体細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭを、オーキシンおよびサイトキニン不含有培地Ａ(表１)で培養する。
【００６９】
実施例１１
胚形成性スミレＰＥＭ懸濁培養の開始およびそこからの体細胞胚。
スミレの種子(品種デルタ・バイオレット(スルイス・エン・グルート))に、エタノールの７０％溶液(２分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(３０分間)により表面殺菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗浄する(３回)。スミレ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体として使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器において、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉を培養する。２週間後、培養物を、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)により５０mlに５倍希釈する。培養物を２倍希釈するか、または培地を４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った新鮮な培地Ａ(表１)と交換することにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。８〜１０週間後、前胚形成塊が現れる。上記要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増大させる。使用されるナイロンメッシュ孔サイズが５０μmおよび２５０μmであること以外は実施例５の記載と同じ要領で懸濁液をふるい分けることにより、ＰＥＭを集める。ＰＥＭは、上記要領で補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有培地Ａ(表１)で培養されると、単一体細胞胚に生長する。
【００７０】
実施例１２
胚形成性ペラルゴニュームＰＥＭ懸濁培養の開始。
ペラルゴニュームの種子(品種パルサー・レッド(スルイス・エン・グルート))に、エタノールの７０％溶液(２分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(３０分間)により表面殺菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗浄する(３回)。ペラルゴニューム種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体として使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器において、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉を培養する。１週間後、培養物を、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)により５０mlに５倍希釈する。４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)で培養物を２倍希釈するか、または培地を上記要領で補った新鮮な培地Ａと交換することにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。
【００７１】
４〜６週間後、前胚形成塊が現れる。上記要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖させる。使用されるナイロンメッシュ孔サイズが２５０μmおよび５０μmであること以外は実施例５の記載と同じ要領で懸濁液をふるい分けることにより、ＰＥＭを集める。５０−２５０μmのＰＥＭフラクションからは、単一体細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭは、オーキシンおよびサイトキニン不含有培地Ａ(表１)で培養されると、単一体細胞胚に生長する。
【００７２】
実施例１３
バイオリアクター中で増殖しているＰＥＭバイオマス。
４×８mlのＰＣＶを、実施例５の記載に従い継代培養されたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、インペラーを備えた２つの慣用的な２リットルのバイオリアクターおよびチェマップ・アクチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミキサーを備えた２つのバイオリアクターを含む４つのバイオリアクター(アプリコン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種する。これらは、各々１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)１リットルを含む。空気は、リアクターチャンバーの下部に向かって設置されたバイブレーターシャフトの端部に位置する１５μm多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布される。当業界で公知の標準技術に従うと、一方のバイブロミキサーリアクターにおける溶解酸素濃度は４０％および他方における濃度は９７％で測定される。垂直に位置するバイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で行なわれ、水平運動は最小に保たれるように、バイブロミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向かってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる流動ループに向けられるように、撹はんディスクを振動シャフトの端部に取り付ける。
【００７３】
空気は、１５μm多孔スパージャーを備えた分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオリアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領により各々４０％および９７％の濃度で測定される。インペラーの撹はん速度を約１５０rpm±５０rpmに維持する。
【００７４】
接種の６日後、倍加時間を測定し、ＰＥＭ懸濁液からＰＥＭをふるい分け、ＰＥＭ／ml ＰＣＶを実施例５の記載に従い測定する。
バイブロミキサーを使用すると、１単位容量当たりより多数のＰＥＭが得られる(表２、図１)。
【００７５】
【表２】
0004121160.tif 000002
【００７６】
実施例１４
バイブロミキサーバイオリアクター中で増殖しているＰＣＶバイオマス。
２×８mlのＰＣＶを、実施例３の記載に従い継代培養されたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、チェマップ・アクチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミキサーを備えた２つの２リットルバイオリアクターを含む２つのバイブロミキサーバイオリアクター(アプリコン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種する。一方のバイオリアクターは、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)１リットルを含み、他方もスクロース濃度が５５g／lであること以外は上記と同じ要領で補った培地Ａ１リットルを含む。空気は、リアクターチャンバー基部付近のバイブレーターシャフトの端部に位置する１５μm多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、当業界で公知の標準技術に従い９７％で測定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で行なわれ、左右または水平運動は最小に保たれるように、バイブロミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向かってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる流動ループ中で流れるように、撹はんディスクを振動シャフトの端部に取り付ける。
【００７７】
接種の６日後、倍加時間を測定し、ＰＥＭ懸濁液からＰＥＭをふるい分け、ＰＥＭ／ml ＰＣＶを実施例５の記載に従い測定する。結果を下記表３に示す。
【００７８】
【表３】
0004121160.tif 000003
【００７９】
実施例１５
撹はんバイオリアクター対バイブロミキサーバイオリアクターからのＰＥＭの生存能力の経時比較。
３×８mlのＰＣＶを、実施例５の記載に従い継代培養されたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)１リットルを含むインペラーを備えた１つの慣用的な２リットルのバイオリアクターおよびチェマップ・アクチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミキサーを備えた２つのバイオリアクターを含む３つのバイオリアクター(アプリコン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種する。一方は上記要領で補った培地Ａ１リットルを含み、他方もスクロース濃度が５５g／lであること以外は上記と同じ要領で補った培地Ａ１リットルを含む。
【００８０】
空気は、リアクターチャンバーの下部に向かってバイブレーターシャフトの端部に位置する１５μm多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布される。当業界で公知の標準技術に従うと、バイブロミキサーリアクターにおける溶解酸素濃度は９７％で測定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で行なわれ、水平振動運動は最小に保たれるように、バイブロミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向かってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる流動ループで流れるように、撹はんディスクを振動シャフトの端部に取り付ける。
【００８１】
空気は、１５μm多孔スパージャーを備えた分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオリアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領により９７％の濃度で測定される。インペラーの撹はん速度を約１５０rpm±５０rpmに維持する。
【００８２】
ＰＥＭ／ml ＰＣＶを培養開始時に測定し、実施例５と同じ要領で６および１４日目に倍加時間を測定する。
【００８３】
結果は、撹はんバイオリアクター中のＰＥＭの数がその間顕著に減少し、バイブロミキサー中のＰＥＭの数が２０g／lのスクロース濃度でその間ほぼ一定したままであることを示す。ＰＥＭ数は、５５g／lのスクロース濃度で６日以内に３倍まで増加することが示された(表４)。
【００８４】
【表４】
0004121160.tif 000004
【００８５】
実施例１６
バイオリアクターにおける魚雷段階体細胞胚へのＰＥＭの生長。
２×１０００００のふるい分けされたＰＥＭを、実施例１５の記載に従い継代培養されたキュウリＰＥＭ懸濁培養物から集め(５５g／lスクロース、vb／９７％Ｄo２中)、インペラーを備えた１つの慣用的な２リットルのバイオリアクターおよびチェマップ・アクチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミキサーを備えた１つのバイオリアクターを含む２つのバイオリアクター(アプリコン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種する。各々２０g／lのスクロースおよび５.０マイクロモルの濃度でＡＢＡを含む１リットルのＭＳ培地を含む。酸素は、リアクターチャンバーの基部付近に位置するバイブレーターシャフトの端部に設置された１５μm多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布される。当業界で公知の標準技術に従うと、バイブロミキサーリアクターにおける酸素濃度は９７％で測定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で行なわれ、水平運動は最小に保たれるように、バイブロミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向かってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる流動ループで流れるように、撹はんディスクを振動シャフトの端部に取り付ける。
【００８６】
酸素は、１５μm多孔スパージャーを備えた分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオリアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領により９７％の出発濃度で測定され、７日間かけて３０％±５％に下がる。８日目、溶解酸素濃度を９７％にリセットし、そのレベルを維持する。インペラーの撹はん速度を約１９０rpm±５rpmに維持する。
【００８７】
慣用的バイオリアクターは、１０−１５％間の、ＰＥＭ〜完全生長した使用可能な魚雷段階体細胞胚生長効率を有する。バイブロミキサーバイオリアクターは、２０％より大きい、ＰＥＭ〜完全生長した使用可能な魚雷段階体細胞胚生長効率を有する。使用可能な魚雷段階体細胞胚は、正常に見える植物を生じるものである。
【００８８】
実施例１７
体細胞胚から誘導されたシクラメン植物の形態学的安定性。
実施例２のＦ１雑種から誘導されたシクラメン体細胞胚を、鉢植え用土に体細胞胚を置くことにより苗木に変換させる。初葉形成後、苗木を温室に移し、成熟させる。植物を開花段階に生長させる。開花植物の形態学的試験からは植物の異常性は全く示されない。植物からは、遺伝学的差異によるソマクローナル変異は全く観察されない。
【００８９】
実施例１８
体細胞胚から誘導されたキュウリ植物における遺伝学的ソマクローナル変異。Ｆ１雑種植物から誘導された実施例６の体細胞胚を、ソルバロッド・プラグ(バウムガルトナー・パピエル、スイス国)において植物に変換し、結実植物に生長させる。デ・ラート等(前出)の方法により、８０植物について倍数性レベルを測定する。遺伝学的ソマクローナル変異が観察されないことから、植物は全て同じ倍数性レベルおよび差異を有する。
【００９０】
実施例１９
キュウリ体細胞胚から植物への変換。
キュウリＰＥＭを、低い光強度でバイブロミキサーを備えたバイオリアクターにおいて増殖させ、ふるいにかけ(１００−１５０μm)、２０g／lのスクロースおよび５マイクロモルのＡＢＡを補ったＭＳ培地５０ml当たり５０００ＰＥＭの密度でエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。ＰＥＭを２つのバッチに分け、これらをさらに明所および暗所で体細胞胚に生長させる。両バッチからの体細胞胚を明所で植物に変換させる。結果は、暗所で培養されたＰＥＭから誘導された体細胞胚の場合の体細胞胚から植物への変換効率が、明所で培養された体細胞胚の場合よりも高いことを示している(表５)。
【表５】
明るさの条件    魚雷型胚から植物への総合的変換率[％]
明所              ２８.６
暗所              ６２.７
【００９１】
実施例２０
植物への変換に適した単一魚雷型胚の形成に対するＰＥＭ集合体のサイズ。
１０mg／gの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地を用いて上記実施例５の記載に従い得られた９日令のＰＥＭ懸濁液(５０ml ＰＣＶ／lのＰＥＭ濃度)を、３つの独立事象としてナイロンメッシュでふるい分けることにより、３種の異なるサイズのＰＥＭフラクション:１００−１５０μ、１５０−２００μおよび２００−２５０μを得る。胚の生長は、３マイクロモルのＡＢＡを含むＭＳ培地中約２５−５０ＰＥＭ／mlの初期ＰＥＭ濃度で遂行される。９日の生長培養後、魚雷段階の胚の数を光学顕微鏡で評価する。単一魚雷型胚の数を、多重魚雷型胚の数に対して評価する。魚雷型胚／ＰＥＭ比は５−１５％である。サイズが１００μm未満のフラクションはＰＥＭを含まない。結果を表６に示す。
【表６】
ふるい分けされたフラ                    全体に対する割合とし
クションのサイズ(μm)                    ての単一魚雷型胚(％)
１００−１５０                                  ８５
１５０−２００                                  ２０
２００−２５０                                    ５
単一胚は、１００−１５０μmサイズのフラクションから手で分離され、単一植物に変換される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  キュウリＰＥＭ懸濁液からＰＥＭをふるい分け、ＰＥＭ／mlＰＣＶを測定した結果を示す棒グラフである。
【図１】
0004121160.tif 000005