(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体としての分離媒体および分析する試料が入口端から出口端まで分離チャンバ（１）を通過して流れ、前記試料は、電極（６、７）により発生させる電界により空間的に画分に分離され収集される無担体偏向電気泳動法であって、前記試料を、前記電極（６、７）に電圧を印加していない状態で前記電極（６、７）間にある分離スペースに導入し、前記試料を前記分離スペースに導入した後前記電極（６、７）に電圧を印加し、前記入口端から出口端までの前記電極（６、７）間で、前記試料を導入する際の流量に対してゆっくりとした流れまで低下させた分離媒体および試料の流量で電気泳動分離を実施し、且つ、前記電極（６、７）間の分離スペースに、実質的に試料全体が依然存在している間のみ前記電極（６、７）に電圧を印加することを特徴とする無担体偏向電気泳動法。
【請求項２】
担体としての分離媒体および分析する試料が入口端から出口端まで分離チャンバ（１）を通過して流れ、前記試料は、電極（６、７）により発生させる電界により空間的に画分に分離され収集される無担体偏向電気泳動法であって、前記試料を、前記電極（６、７）に電圧を印加していない状態で前記電極（６、７）間にある分離スペースに導入し、前記試料を前記分離スペースに導入した後前記電極（６、７）に電圧を印加し、且つ、前記試料が前記分離媒体とともに入口端から出口端までの流れの方向に静止している状態で前記電気泳動分離を実施することを特徴とする無担体偏向電気泳動法。
【請求項３】
試料の成分または標識物質が、前記分離チャンバ（１）内の一定空間位置に達したことを外部検出器が確認したらすぐに前記電気泳動分離を終了することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分離された試料の成分が、前記電極（６、７）に電圧を印加していない状態で、分別装置を介して分離された試料用容器に運搬されることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、無担体偏向電気泳動に関するものである。
従来、無担体偏向電気泳動は連続方法においてのみ使用されていた。分離する物質のバンド幅への層流プロファイルのマイナス影響を最小化できる場合、または、マイナス影響が全く作用しない場合、実際この方法は、連続操作において特に優れた結果をもたらす。これは、特に、連続等電点電気泳動法に当てはまる。
偏向電気泳動の全ての電気移動法において、分離媒体（単数または複数）の層流プロファイルによって生じるバンド拡幅は、分離能の深刻な低下を引き起こす。
連続方法における無担体偏向電気泳動の基本については既に３０年以上前に文献において説明されており、マックス−プランク社（Max-Planck Company）の１９６８年年鑑、１１７〜１３７頁の説明が挙げられる。この方法はまた、ＦＦＥ（自由流電気泳動（free flow electrophoresis））またはＣＦＥ（連続流電気泳動（continuous flow electrophoresis））といった用語の下でも説明されている。（ケイ．ハニッヒ（K.Hannig）：無担体連続電気泳動およびその応用（Carrier-free continuous electrophoresis and its application）アナル．ケミ．（Anal.Chem.）181、233（1961）；エム．シー．ローマン（M.C.Roman）およびピー．アール．ブラウン（P.R.Brown）；アナル．ケミ．（Anal.Chem.）自由流電気泳動（Free Flow Electrophoresis）、66（N2）、86〜94、（1994）；アール．ブラウン（R.Braun）、エイチ．ヴァーグナー（H.Wagner）およびジー．ヴェーバー（G.Weber）：調製用自由流電気泳動−強力な天然物質分離法（Preparative Free Flow Electrophoresis−a powerful procedure for separating natural substances）、ゲーイーテーファッハツァイトシュリフト フューア ダス ラボラトリウム（GIT Fachzeits chrift fuer das Laboratorium）39（1995）、317〜322）。
ＦＦＥ分離方法は、生物性粒子（bioparticles）に至るまであらゆる分子量のイオンを分離するために使用される。ここでは、分離する試料がそれ自体帯電しているかどうか、または、その帯電がイオンの付加または吸着によって生じたものであるかどうかは関係ない。
この方法は、調製用および分析用分離のいずれにも使用される。
本出願人は、連続偏向電気泳動法（ドイツ特許出願第4139472号明細書（未公開））の本質的態様を向上させた
これら向上の度合いは、以下のように様々なＦＦＥ分離手法において異なっていた。
全てのＦＦＥ分離手法において、分離の長期安定性は明らかに向上した。分離能は、連続等電点電気泳動法に関しては１０〜５０倍に向上し、一方、電気移動法においては２〜４倍向上しただけであった。そして、この向上は、前記特許明細書において説明されているような向流を用いた新規の「デッドボリュームの無い（dead volume-free）」分別によってもっぱら達成された。電気移動法の分離能への層流プロファイルのマイナス影響は、前記向上によって影響を受けなかった。
以下、「典型的」電気移動法、つまりゾーン電気泳動法に基づいて、連続偏向電気泳動法を説明する。
図１は、分離チャンバ１の概略図を示している。前記分離チャンバ１の下端には、少なくとも三つの導入口２、３、４があり、これらは、三つのラインによって多チャンネルポンプ５の運搬経路と接続されている。分離媒体は、中央導入口３を介して分離スペースに導入され、一方、安定化媒体は、二つの外側導入口２および４を介して導入される。
これらの媒体は、層流状態で前記分離スペースを通り流れる。前記分離チャンバの側端部に平行に電極６、７が位置しており、これらは、高流量の付属ポンプによる循環流で洗浄される。膜８、９は電流を伝導するもので、分離スペースから電極スペースを分割し、流体流による媒体どうしのあらゆる交換を防ぐ。
ここで、流動している分離媒体に、独立測定ポンプ１０を用いて最適な計量比で試料混合物を導入した場合、この試料は微噴流として分離媒体と共に運搬される。
電極に高圧を印加した場合、媒体および試料中の全ての帯電成分は本来の方向からそれ、これらイオン成分が有する電荷数が増加するにつれてこの偏向（それ）が増大する。
従って、様々な電荷の成分は、分離スペースを通って分離路（図１参照）に添って移動し、異なった位置で流れの方向に対して横切るように配置された一列に並んだホース穴１１に達する。その後、前記成分は媒体と共に別々の貯溜容器１２に送られる。穴どうしの間隔を可能な限り狭くしたこの一連のホース穴は、分別装置と呼ばれ、平行に配置されたこれらのホースの数は、３０から最高で１６０までの範囲内である。
付加媒体（向流媒体）は、分離チャンバの上端から入口１３を介して分離媒体と反対方向に流れ、分別装置のホース穴を介して分離スペースを出る。
上記説明に従って考案された装置による分離では、連続偏向電気泳動の全ての分離手法において分離プロファイルに関し顕著な長期安定性を示す。しかし、その分離の質（分離度）は、連続等電点電気泳動の場合においてのみ類似の分析分離手法において達成されるレベルに匹敵し得る。
分離能は、全ての連続電気移動法において、類似の分析分離手法と比較してささやかなものである。
多数の出版物に、連続偏向電気泳動における分離中の分析物のいわゆるバンド拡幅の一因となる自然科学上又は電気化学上の影響について記載されている（ジェイ．エイ．ジアンノヴァリオ（J.A.Giannovario）、アール．グリフィン（R.Griffin）、イー．エル．グレイ（E.L.Gray）：自由流電気泳動の数理モデル（A mathematical model of free-flow electrophoresis）。ジャーナル オブ クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、153、329〜352（1978）；エフ．ジー．ベーゼ（F.G.Boese）：自由流電気泳動の数学的論理への貢献（Contribution to a mathematical theory of free flow electrophoresis）、ジェイ．クロマト．（J.Chromat.）483、145〜170（1988）；ケイ．ハニッヒ（K.Hannig）およびエイチ．ジー．ハイドリッヒ（H.G.Heidrich）：自由流電気泳動（Free-Flow Electrophoresis）、1990 GIT出版社ダルムシュタット国際標準図書番号（ISBN）3-921956-88-9）。
これらの効果のうち最も重要なものは：
層流プロファイルによる拡幅、
熱対流による拡幅、
電気浸透による拡幅、
界面動電効果による拡幅がある。
ここまで説明した全ての界面動電効果のマイナス影響は、十分に高いイオン強度を有する適切なイオン成分を含む分離媒体を用いると同時に、試料の濃度を過度に高めないことにより最小にできるかまたは排除できる。
電気浸透のマイナス影響を最小にするためには多くの方法があり、例えば、適切な壁材（グラスまたは石英ではなくプラスチック）を選択すること、または、最も好ましくは、電気浸透を防止する分離媒体に界面活性化学薬品を添加することがあげられる。この方法は、文献中、「動的被覆（dynamic coating）」と呼ばれている。
熱対流のマイナス影響は、分離チャンバを鉛直ではなく水平に配置することにより非常に簡単に減少させることができる。
層流プロファイルのマイナス影響は、分離チャンバギャップの中央において最高線速度で運搬される分析物の集中も可能にする十分に長い分離時間を選択する限り、連続等電点電気泳動では見られない。
これに対して、そのマイナス影響は、電気移動法の場合には非常に重要である。分離チャンバの壁近傍または壁との境界面を移動する分析物は、分離チャンバギャップの中央の分析物よりもかなり長い時間をかけて分離チャンバを通過し（図２．１および２．２参照）、従って明らかにより高度に偏向される。この影響により、電気移動の方向にテーリングとして検出可能なバンド拡幅が生じる。図３．１は、互いに反対電荷を有する２低分子分析物に対するこの影響のバンド拡幅を示し、一方図３．２は高分子粒子に対するものを示している。
無担体電気泳動の周辺条件のもと連続的に実施する電気移動法において、層流プロファイルのマイナス影響は、低分子分析物に関しては防ぐ事はできない。分析物の移動距離が増加するにつれて、バンド拡幅の絶対値が上がる。粘性を高めた分離媒体を使用することにより拡散を減少させても役に立たない。というのも、これにより層流プロファイルは更に不都合なものとなるからである（図２．２）。
生物性粒子を分離する場合、分離チャンバギャップの中央に供給する試料を量的に減少させると、分離度を向上させることができる。なぜならば、極めて低い拡散性により、粒子が１０分未満の滞留時間内に分離チャンバ壁の領域に入ることができないからである（図３．２も参照）。層流プロファイルの影響は、試料処理量を明らかに減少させる（０．３〜０．０５倍）ことによるこの方法においてのみ最小化することができる。
本発明の目的は、層流プロファイルの影響を排除する無担体偏向電気泳動法を提供する事である。
前記目的は、請求項１に記載の特性を備えた方法により本発明に従って達成される。本発明の有益な実施形態は、従属クレームの主題となっている。
本発明に係る間隔操作における方法は、電界を印加していない状態で試料を分離スペースに導入し、その後、試料の全部分が依然電界中に残留している間のみ電気泳動分離を行うものである。この方法は、分離チャンバ壁の領域における低流量の層流プロファイルが電界中の試料の異なった部分の滞留時間を変化させることにより分離度を低下させるといった連続方法の短所を克服する。
流れの方向における電極の長さを制限すると同時に、十分多量の試料を確保するため、試料および担体媒体が静止した状態、または少なくとも試料を導入する際の流量と比較してかなり低下させた、出口に向かった分離スペース中の試料のゆっくりとした流れと同等の流量で、電気泳動分離を行うことが好ましい。
知られている方法では、試料を分離媒体または担体媒体と共に連続的に添加し、電界を連続的に印加した状態で、電気泳動分離を連続的に行う。本発明では、かわりに、少なくとも試料は電界を印加していない状態で断続的に導入し、好ましくは、試料が分離媒体と共に静止した状態で、または試料が分離媒体と共にゆっくりと流れている状態で、分離スペース中に依然として試料の全部分が残留している間のみ電気泳動分離を行う。このようにして、試料の異なった部分の様々な流量が電気泳動の結果に影響することを防ぐことによって、分離度を向上させる。
以下、本発明の一実施形態を添付の図面に基づいて説明する。
図１は、偏向電気泳動を実施するための周知となっている装置、
図２．１は、比較的低粘性の媒体に関する層流プロファイルであり、分離チャンバギャップが、流れ方向を包含した断面図に示されており、
図２．２は、粘性を高めた媒体に関する層流プロファイルであり、分離チャンバギャップが、流れ方向を包含した断面図に示されており、
図３．１は、高拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物の分離によるバンド拡幅であり、分離チャンバギャップが、流れ方向に対して垂直な断面図に示されており、
図３．２は、低拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物の分離によるバンド拡幅であり、分離チャンバギャップが、流れ方向に対して垂直な断面図に示されており、
図３．３は、本発明に従って実施したＦＦＥ分離工程中の、高拡散率のアニオンおよびカチオン分析物の分離によるバンド拡幅であり、分離チャンバギャップが、流れ方向に対して垂直な断面図に示されており、
図４．１、４．２および４．３は、図１に示した装置における本発明に係る方法の一実施形態に関する時間的進行を示しており、その中で、
図４．１は、電界をゼロに設定した状態での媒体および試料を導入した初期段階、
図４．２は、電界を印加し、媒体および試料が運搬されていない後続段階、そして
図４．３は、電界を印加していない状態での媒体導入および試料除去の後続段階であり、および
図５は、本発明に係る方法（上）と連続方法（下）とにおける分離された分析物に関する分布パターンの比較を示している。
図４．１〜図４．３は、図１に示したものと同一の分離チャンバ１を同様に概略形態で示している。図１に示しされている同一部は、同一参照記号で示している。
図４．１に示している初期段階では、分離媒体が中央導入口３を介して分離スペースに導入され、一方、安定化媒体が二つの外側入口２および４を介して分離スペースに導入される。同時に、向流媒体が入口１３を介して流入する。試料は、入口２０を介して導入される。電極６および７（ダッシュ線で表された電極で示されている）間に電圧は印加されていない。
その後試料は、電極（入口２０を介して走っている矢印の先から端を発している鉛直線で示されている）に対し本質的に平行に広がる。
図４．２に示している次の段階では、電極６および７に電圧を印加することにより、電界（図面中、水平電界方向）が分離チャンバ内に形成される。媒体および試料の運搬が中断され、試料の成分が、図面中水平方向に空間的に分離される（図４．２において、二つの鉛直方向の平行な実線で示されている）。
図４．３に示した最終段階では、再び電界を印加せず、入口２、３、４および１３を介して媒体を再度導入するが、試料は導入しない。このようにして、電気泳動により空間的に分離した試料成分を、ホース穴１１を介して運び去る。
最初の段階で電極６および７間に導入された試料が、電気泳動分離の後続段階の間にその全部分を備え電界中に残留することが確実である限り、試料は、電気泳動分離中、静止したままである代わりに、ゆっくりと流れていてもよく、また、適正な寸法の電極を用いた場合には、導入された時と同じ速さで流れてもよい。試料の成分または標識物質が、前記分離チャンバ１内の一定空間位置に達したことを外部検出器が確認したらすぐに前記電気泳動分離を終了してもよい。
本発明に係る間隔操作における方法を実施することにより、周知の連続方法と比較して分離度において明らかな向上がもたらされる。
これは、一旦連続自由流電気泳動を行い、その後本発明による断続的自由流ゾーン電気泳動により、電気的に帯電した染料の混合物を分離することにより説明できる。
図５は、本発明に係る方法、および周知となっている連続方法による各収集容器（マイクロタイタープレートの窪み（microtiter plate cavity））内の分離された分析物の分布パターンの比較を示す。本発明に係る間隔操作の場合（図面上部の結果）、分離の質は全分析物に関して同等に優れており、連続方法の比較テスト（図面下部の結果）よりはるかに優れている。
同一装置を使用し、比較可能な電気泳動条件下（同一分離媒体、類似電気泳動移動経路、類似電気泳動性能）で比較を行った。
間隔操作では、連続操作において可能なレベルの分離の質を得るために、かなり短い分離時間で十分であるため、間隔操作においてもより多くの処理量が得られる。
連続操作に対して間隔操作において分離度が向上した理由は、流れの方向に対して垂直であり、且つ、電界方向に対して平行である分離チャンバを通る断面を示す図３．１〜３．３から明らかである。
図３．１および３．２は、高拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物、または低拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物に関する連続操作におけるバンド拡幅を示している。図３．３は、静止媒体（standing media）の場合の高拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物に関するバンド拡幅を示している。
連続操作において、バンド拡幅は、層流断面により生じ（図２．１と比較）、電界中での分析物の滞留時間が長くなり、従って、分離チャンバ壁の領域において横への移動がより強くなる。これにより、拡散によるバンド拡幅に重ね合わされる付加的な鎌状バンド拡幅が生じる。
間隔操作において、電界が静止分析物に作用する場合、バンド拡幅はもっぱら拡散により生じ、従って連続操作の場合より少ない。バンド拡幅がより少なければ、より高い分離度が結果として得られる。従って、連続操作より間隔操作において分離度はより優れている。
【図１】
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【図２．１】
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【図２．２】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【図３．３】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図４．３】
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【図５】
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