(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デューテロライシン（Ｄｅｕｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）を有効成分として含有することを特徴とする肉類の食感及び風味改良剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肉類の食感及び風味改良剤に関し、更に詳しくは、肉類に対して接触処理を行うことにより、焼く、炒める、揚げるなどの加熱調理を行っても、柔らかい肉質で、肉汁に富み且つ良好な風味と食感を与えることのできる肉類の食感及び風味改良剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び課題】
牛、豚、羊などの畜肉、鶏、鴨などの鳥肉は調理に際して、焼く、炒める、揚げるなどの調理方法に拘わらず、適度な柔らかさと、旨味、コク味を有した状態で食されることが望まれている。特に最近、安価な輸入牛肉が購入できるようになっているが、一般に、輸入牛肉は国産牛肉に比べ肉質が硬く、旨味、コク味に欠けるという難点がある。
【０００３】
従来、肉の軟化剤としてプロテアーゼが用いられており、例えば、パパイン、ブロメライン、フィシンなどの植物由来のプロテアーゼを肉に作用させることにより軟化処理が行われている。しかしながら、これらのプロテアーゼは基質特異性が低いため、軟化制御が難しく、添加量、反応時間を精密にコントロールしないと軟化が進みすぎて、肉の組織が脆くなり、べたつき感が生じて食感が損なわれてしまうという欠点がある。また、肉自体の風味や呈味性の著しい向上は認められず、酵素の種類によっては分解生成物由来の異臭や苦味が生じることがある。
【０００４】
一方、基質特異性の高いプロテアーゼを肉の軟化乃至風味改良剤として用いる方法として、例えば、エラスターゼを用いて肉中の硬蛋白を特異的に分解し、軟化する方法（特開平４−１９７１５６号公報、特開平５−２７６８９９号公報）、バチルス属に属する菌株の生産する金属プロテアーゼを作用させる方法（特開平８−５６６６４号公報）などが提案されている。
【０００５】
上記の基質特異性の高いプロテアーゼを肉に作用させる方法は、肉を適度な柔らかさに軟化する点ではそれなりの効果は見られるが、その効果を発現させるためにかなりの酵素量、処理時間を必要としたり、肉の旨味、コク味を向上させる点では必ずしも満足できるものではない。
【０００６】
従って、本発明の目的は、肉類に対して接触処理を行うことにより、焼く、炒める、揚げるなどの加熱調理を行っても、柔らかい肉質で、肉汁に富み且つ良好な風味と食感を与えることのできる肉類の食感及び風味改良剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、麹菌が生産する耐熱性金属プロテアーゼであり、基質特異性の高いデューテロライシンに着目し、その利用検討について鋭意研究を重ねた結果、今回、該酵素を肉類に対して接触処理を行うと、焼く、炒める、揚げるなどの加熱調理を行っても、柔らかい肉質で、肉汁に富み且つ良好な風味と食感を与えることができることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００８】
かくして、本発明は、デューテロライシン（Ｄｅｕｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）を有効成分として含有することを特徴とする肉類の食感及び風味改良剤を提供するものである。
【０００９】
以下、本発明の肉類の食感及び風味改良剤について、更に詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明に使用されるデューテロライシンは、麹菌が生産する耐熱性金属プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．３９）であり（化学と生物，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．３，１４９−１５１，２０００年）、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、リゾープス・ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ムコール・フェマリス（Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ）などの微生物を常法に従って培養することにより得ることができる。具体的には、例えば、公的保存機関にタイプ・カルチャーとして寄託されているアスペルギルス・オリゼ  ＡＨＵ  ７１３８、アスペルギルス・ソヤ  ＩＡＭ  ２６６９、アスペルギルス・タマリ  ＩＡＭ  ２１３８、アスペルギルス・アワモリ  ＡＴＣＣ  １１３６４、アスペルギルス・ニガー  ＩＡＭ  ３００１、アスペルギルス・メレウス  ＡＴＣＣ  １６８８９、アスペルギルス・ニデュランス  ＩＡＭ  ２１３８、エメリセラ・ニデュランス  ＩＦＯ  ８００３、リゾープス・ミクロスポラス・バー・オリゴスポラス  ＩＦＯ  ３２００３、ムコール・フェマリス  ＩＦＯ  ４５６５などの微生物を、例えば、小麦フスマまたは米糠等を栄養源とした固体培地、もしくは通常使用されている液体栄養培地に接種し、培養することによりデューテロライシンを得ることができる。培養物中からのデューテロライシンの採取および精製は、通常の酵素の採取および精製手段に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離、濾過などにより菌体を分離し、その培養濾液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈殿法、溶媒抽出法によって蛋白を沈殿させたり、また限外濾過により濃縮することにより得ることができる。
【００１１】
本発明では、デューテロライシンを含有する培養物そのものでも使用することができるが、共存する他のプロテアーゼを除去するため、通常汎用されているカラムクロマトグラフィーなどの適宜な分離手段を用いて精製して使用することが好ましい。また、デューテロライシンは耐熱性のプロテアーゼであるため培養液を、例えば、約７５℃にて約１０分以上加熱し、共存する他のプロテアーゼを失活させてデューテロライシンのみの活性を利用することもできる。
【００１２】
また更に、麹菌由来の市販プロテアーゼ、例えば、スミチームMP（新日本化学工業（株）製、アスペルギルス・エスピー由来のプロテアーゼ）、プロテアーゼＭ（アマノエンザイム（株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、プロテアーゼＰ（アマノエンザイム（株）製、アスペルギルス・メレウス由来のプロテアーゼ）、 プロテアーゼＡ（アマノエンザイム（株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、ウマミザイム（アマノエンザイム（株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、プロテアーゼＮＰ−２（（株）ヤクルト本社製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、ブロチンFN（大和化成（株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、PROMOD 192P（BIOCATALYSTS（株）製、カビ由来のプロテアーゼ）、オリエンターゼ ON（阪急バイオインダストリー （株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、オリエンターゼ ON5（阪急バイオインダストリー （株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、IP酵素（キッコーマン（株）製、 アスペルギルス・ソーヤ由来のプロテアーゼ）、AO-プロテアーゼ（キッコーマン（株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、サカナーゼ（科研ファルマ（株）製、アスペルギルス・ソーヤ由来のプロテアーゼ）、フレーバーザイム（ノボノルディスクバイオインダストリー（株）製、 アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、デナチーム AP（ナガセ生化学工業 （株）製、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）、コクラーゼSS（三共（株）、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ）などのプロテアーゼを水に溶解後、例えば、約７５℃にて約１０分以上加熱し、共存する他のプロテアーゼを失活させてデューテロライシンのみの活性を利用することもできる。
【００１３】
本発明の肉類の食感及び風味改良剤は、以上のようにして得られる酵素液をそのまま肉類の食感及び風味改良剤として用いることもできるが、比活性を上げるためにそれ自体既知の方法により濃縮、精製して使用することもできる。更に酵素液を凍結乾燥し、酵素粉末の形態として用いることもできる。凍結乾燥することにより酵素活性が長期間にわたり安定に保たれ、また幅広い利用が可能となる。また例えば、他の調味剤に混合して利用することもできる。
【００１４】
本発明の肉類の食感及び風味改良剤は、種々の肉に適用することができ、例えば、牛、豚、羊などの畜肉；鶏、鴨などの鳥肉などの肉に適用することができる。肉に対する適用方法は、肉が屠殺直後から調理されるまでの間に酵素が肉に対して有効に作用する方法である限り、特に限定されないが、一般的には、肉を液状の本発明の食感及び風味改良剤に漬け込む、液状の本発明の食感及び風味改良剤を肉に注入する、粉末または液状の本発明の食感及び風味改良剤を肉に振りかける等の方法により適用することができる。本発明の肉類の食感及び風味改良剤はその本質が酵素であるので、酵素反応が充分に進行するように、酵素の至適条件下に肉と該改良剤との接触状態を一定時間保持するのが望ましい。通常、肉を本発明の改良剤にて処理後、例えば、約５℃〜約２５℃の範囲内の温度で、約３〜約８の範囲内のｐＨで、約０．５時間〜約２０時間保存するのが好都合である。
【００１５】
本発明の肉類の食感及び風味改良剤の使用量は、処理する肉の種類や目的とする肉の柔らかさ、あるいは処理温度、処理時間、処理方法などにより異なるが、通常、酵素活性量として肉１．０ｇ当たり約０．０５〜約１ユニットの範囲内の量が適当である。
【００１６】
なお、酵素活性は０．５％サルミン溶液（ｐＨ８．０）を基質とし、３０℃、２０分間反応後、ＴＣＡ溶液（１２．５％）を加え、その可溶化画分をニンヒドリン発色法にて測定することができる。その際、標準アミノ酸としてチロシンを用い、反応１分間に１μｍｏｌのアミノ酸（チロシン相当）を遊離する酵素量を１ユニットと定義する。
【００１７】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００１８】
【実施例】
参考例１（デューテロライシンの調製方法：微生物から分離する方法）
麹菌(アスペルギルス・オリゼ AHU7138)を小麦フスマ培地(小麦ふすま：水=１：１)にて３０℃、３日間培養し、これをシードとした。次いでこのシード５ｇをGPYC液体培地(Bacto Peptone 1.5%, casamino acid  0.1%, Yeast Extract 0.5%, KH2PO4 0.5%, MgSO4・7H2O 0.05%, glucose 3 %)２０Lに添加し、30℃で48時間、通気、撹拌培養した。この培養液より菌体部分を遠心分離器により除去した後、ろ紙ろ過を行うことにより、培養ろ液18 kgを得た。この培養ろ液に対し８０％飽和になるように(１０．１Ｋｇ)硫酸アンモニウムを加え、硫安塩析を行い、遠心分離により沈殿を得た。
【００１９】
この沈殿をｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解後、同緩衝液に対し一晩透析を行い、６５０ｍｌの粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を予め５０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)にて平衡化したセルロファインＧＣＬ−３００(東ソー（株））に供し、同緩衝液によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、活性画分３．６Ｌを分取した。この活性画分を脱塩濃縮し、２０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０) にて平衡化したQ Shepharose (アマシャムファルマシアバイオテク（株））に供し、ＮａＣｌ濃度勾配によるイオン交換クロマトグラフィーを行い、活性画分１．５Ｌを分取し、蒸留水に対し透析を行った後、凍結乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて均一な精製デューテロライシン２８０ｎｇを得た。
（酵素活性およびデューテロライシンであることの確認）
酵素活性は前述のようにサルミンを基質とした活性測定法にて測定できる。すなわち、サルミン(PROTAMINE SULFATE Grade X: シグマアルドリッチジャパン（株）)をｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸緩衝液にて０．５％（Ｗ／Ｗ）になるように溶解し、基質溶液とした。この基質溶液１．０ｍｌを試験管に分注し３０℃にプレインキュベートした。この基質溶液に適度に希釈した酵素溶液（３０℃にプレインキュベート）を１．０ｍｌ添加し、３０℃で２０分振とう反応させた。このとき盲検として酵素未添加の試験管も用意し、インキュベートした。反応は１２．５％のＴＣＡ溶液を２．０ｍｌ添加することで停止した。盲検に対してもＴＣＡ溶液を加えた後、同酵素溶液を加えた。反応液および盲検液を１０分間、３０℃にて静置後、東洋ろ紙Ｎｏ．２によりろ過し、ろ液を得た。それぞれのろ液０．２ｍｌ、および１００μＭチロシン溶液、チロシンブランク溶液０．２ｍｌをそれぞれ試験管に分注した。これらそれぞれの試験管に０．５Ｍクエン酸緩衝液４．０ｍｌおよびニンヒドリン試薬溶液(ニンヒドリン試液−セット：和光純薬工業（株））２．０ｍｌを加え撹拌後、１００℃で１５分間加熱し発色させた。加熱後、氷冷し直ちに５７０ｎｍの吸光度を測定した。活性は以下の式にて算出した。
【００２０】
活性（ｕ／ｍｌ）＝（試料の吸光度−盲検の吸光度）／（チロシンの吸光度−ブランクの吸光度）× 希釈倍率 ／５０
参考例１で得られた酵素画分を９０℃で５分加熱し、上記の方法で酵素活性を測定したところ、８０％以上の活性が残存しており、本酵素が耐熱性酵素であることが確認された。また、本酵素はＥＤＴＡ等のキレート剤によりその活性が阻害されることから、本酵素が金属プロテアーゼであることが確認された。参考例１で得られた酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥより分子質量は１９．８ｋＤａであった。さらに、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を測定したところ、ＴＥＶＴＤＣＫＧＤＡであった。これらの結果より、参考例１で得られた酵素はデューテロライシンであることが確認された。
参考例２(デューテロライシンの調製方法：市販プロテアーゼから調製する方法）
スミチームＭＰ原末（新日本化学工業（株）製）１００ｇに対し、１０倍容量の水を加え溶解した。この酵素溶液を７０℃で１５分加熱し、遠心分離を行い上清９７０ｇを得た。この上清に対し８０％飽和になるように硫酸アンモニウム（５４４ｇ）を加え、硫安塩析を行い、遠心分離により沈殿８４ｇを得た。この沈殿をｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解後、同緩衝液に対し一晩透析を行い粗酵素液１５０ｍｌを得た。得られた透析液を予め５０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて平衡化したセルロファインＧＣＬ−３００ (東ソー（株））に供し、同緩衝液によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、活性画分を分取した。この活性画分２３０ｍｌを５０ｍｌまで脱塩濃縮し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて平衡化したQ Shepharose (アマシャムファルマシアバイオテク（株））に供し、ＮａＣｌ濃度勾配によるイオン交換クロマトグラフィーを行い、活性画分を分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて均一な精製デューテロライシン３．８５ｍｇを得た。
（酵素活性およびデューテロライシンであることの確認）
酵素活性は参考例１と同様にして測定した。また、参考例２で得られた酵素も前記と同様な確認試験によりデューテロライシンであることが確認された。
【００２１】
実施例１
牛もも肉スライス（厚さ約５ｍｍ）、豚もも肉スライス（厚さ約７ｍｍ）および鶏ささみスライス（厚さ約１ｃｍ）を約１５〜約２５ｇを皿に入れ、これに参考例２で得られたデューテロライシンまたはパパイン（長瀬産業（株）製パパイン末）を各１ユニット／ｍｌの濃度に調整した酵素水溶液を肉重量の１／１０量塗布した。コントロールとして酵素水溶液の代わりに同量の水を塗布し、それぞれ２０℃にて１、３、６、２４時間反応させた。反応後の肉は、２２０℃のホットプレートで、肉の中まで完全に火が通るように、牛肉では、片面２０秒、裏面３０秒、豚肉および鶏肉では、表９０秒、裏６０秒で焼成し、直ちにレオメーターで最大荷重を測定した。数値はコントロールを１００とした相対値で求めた。また、同時に専門パネラーによる官能評価も行った。
（レオメーターによる軟化度の測定）
レオメーター（不動工業  ＲＴ−２００２Ｊ；侵入速度：５０ｍｍ／ｍｉｎ；プランジャー：３ｍｍ平板）により肉の軟化度を、その最大荷重の相対比（コントロール品の最大荷重を１００とする）で求めた。
（１）牛肉
肉片１枚につき２カ所でレオメーターの測定を行った。４点測定を行い最も高い値と低い値を除去し、中心２点の平均を測定値とした。その結果を表１および図１に示す。この結果、デューテロライシンにて処理した肉は経時的に徐々に軟化するが、６時間より最大荷重の低下は緩やかになる。これに対して、パパイン処理の肉は３時間までに急激に最大荷重が下がり、２４時間では肉中の水分の離水が起った。
（２）豚肉
牛肉と同様にレオメーターの測定を行った。その結果を表２および図２に示す。この結果、デューテロライシンにて処理した肉は１時間で最大荷重がやや下がったものの２４時間の反応でも最大荷重の著しい低下は見られなかった。一方、パパイン処理の肉は６時間までは最大荷重が経時的に低下し、牛肉と同様に２４時間で過消化により離水を起こした。
（３）鶏肉
牛肉、豚肉と同様にレオメーターの測定を行った。その結果を表３および図３に示す。この結果、デューテロライシンにて処理した肉は６時間の処理で約７５％に最大荷重が低下し、さらに２４時間の処理でも約７０％の最大荷重が維持されていた。一方、パパイン処理の肉は３時間処理で最大荷重が約６３％まで低下し離水を起こした。
【００２２】
【表１】
0004101485.tif 000002
【００２３】
【表２】
0004101485.tif 000003
【００２４】
【表３】
0004101485.tif 000004
【００２５】
（官能評価）
（１）牛肉
デューテロライシン処理では、１時間処理ではあまり変化を感じないが、３時間処理で適度に柔らかくなり２４時間処理においても適度の柔らかさを保っていた。風味については、熟成感を伴った旨味、コク味があり良好な評価であった。一方、パパイン処理では１時間の処理でも柔らか過ぎ、６時間処理では歯ごたえがなくなり離水が始まった。風味としては、パパイン由来の臭みが強く、苦味も強く感じられた。デューテロライシン処理では３〜６時間程度の処理が適当と思われる。また、パパイン処理では活性を落とし、処理時間をコントロールするのが難しいと考えられる。
（２）豚肉
デューテロライシン処理では、牛肉の場合と比較して軟化する傾向は弱いが、２４時間処理においても適度な柔らかさを保っていた。風味については、熟成感を伴った旨味、コク味があり良好な評価であった。一方、パパイン処理では３時間処理で適度な柔らかさになるが、６時間処理では離水が始まった。風味としては、豚肉特有の臭みを軽減するが、やや苦味を感じた。
（３）鶏肉
デューテロライシン処理では、１時間処理で適度な柔らかさとなり、ささみの繊維は残していた。６時間処理ではさらに柔らかくなったが、ささみの繊維は維持しているため鶏肉特有の歯ごたえは残った。風味については、熟成感を伴った旨味、コク味があり良好な評価であった。一方、パパイン処理では１時間の処理でも過消化が起こり、柔らか過ぎてささみの繊維が全くなくなった。風味としては、パパイン由来の臭みが強く、苦味も強く感じられた。
【００２６】
【発明の効果】
上記実施例から明らかなとおり、本発明の肉類の食感及び風味改良剤は、肉類に対して接触処理を行うことにより、焼く、炒める、揚げるなどの加熱調理を行っても、柔らかい肉質で、肉汁に富みかつ良好な風味と食感を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】牛肉の酵素処理による軟化度の経時変化を示すグラフである。
【図２】豚肉の酵素処理による軟化度の経時変化を示すグラフである。
【図３】鶏肉の酵素処理による軟化度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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