(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物のコクシジウム症に対する予防的または治療的使用に用いる医薬を製造するための、水性微生物から得られるオメガ−３−脂肪酸を水性微生物の培養により得られるバイオマスの形及び／または油状物の形で含む製剤の使用。
【請求項２】
製剤が４０％のＤＨＡを含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
水性微生物が従属栄養的に培養可能な微藻類である請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
微藻類がクリプテコジニウム目に属する請求項３に記載の使用。
【請求項５】
微藻類がミドリムシ目に属する請求項３に記載の使用。
【請求項６】
水性微生物が低級菌類である請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項７】
低級菌類がトラウストキトリウム目に属する請求項６に記載の使用。
【請求項８】
低級菌類がモルティエラ目に属する請求項６に記載の使用。
【請求項９】
水性微生物が光合成微藻類に属する請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
微藻類がフェオダクチラム、イソクリシス、モノダス、ポルフィリジウム、スピルリナ、クロレラ、ボトリオコッカス、シクロテラ、ニツシア、ダナリエラおよびナンノクロロプシス目から選択される請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
水性微生物が細菌に属する請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項１２】
細菌がアルテロモナスおよびシェワネラ目から選択される請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
製剤が請求項３から請求項１２に記載の二つまたはそれ以上の異なった水性微生物の混合物から得られる請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項１４】
動物のコクシジウム症が鳥コクシジウム症である請求項１から請求項１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
水性微生物から得られるオメガ−３−脂肪酸を水性微生物の培養により得られるバイオマスの形若しくは油状物の形で含む、動物のコクシジウム症に対する予防的または治療的使用のための医薬品。
【請求項１６】
一つまたはそれ以上の他の医薬品と組み合わせた請求項１５に記載の医薬品。
【請求項１７】
少なくとも一つのさらなるコクシジウム抑制剤を含む、請求項１５に記載医薬品。
【請求項１８】
該医薬品がサリノマイシンを含む請求項１６に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動物の寄生虫症に対する予防的または治療的使用に用いる医薬品を製造するためのオメガ−３−脂肪酸含有製剤の使用に関している。
背景技術
オメガ−３−脂肪酸（オメガ−３−多不飽和脂肪酸＝オメガ−３−ＰＵＦＡ）、特にＥＰＡ（エイコサペンタエノン酸）およびＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）はヒト食事療法に最近ますます重要になっている。それらは正の食事療法および健康促進効果を持っている。コレステロールレベルの低減および心臓血管疾患頻度の低減に関して、オメガ−３−脂肪酸でヒト食事療法を強化するのは道理にかなっている。病理学的代謝過程に対するオメガ−３−ＰＵＦＡの正の効果は多数の研究により示されている。さらに、ドコサヘキサエン酸は中枢神経系（脳）および網膜においての構築ブロックとして重要な役割を果たしている。
従来、魚の飼育を除いて、動物の健康の分野におけるオメガ−３−ＰＵＦＡの重要性の研究は比較的少なかった。現在まで、ヒトによるオメガ−３−ＰＵＦＡ摂取が意図されたある種の動物産物（卵、肉）を強化する目的でオメガ−３−ＰＵＦＡ製剤は給餌を通して動物に主として投与されてきた。従って、家禽類の筋肉脂肪組織のオメガ−３−ＰＵＦＡ含量は、ＰＵＦＡ含有生成物を給餌することにより著しく増加させることができた（Ｍｏｏｎｅｙ  ＆  ｖａｎ  Ｅｌｓｗｙｋ，１９９５，Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７４，Ｓｕｐｐｌ．１，８９）。さらに、産卵している鶏の餌をオメガ−３−ＰＵＦＡ含有成分（アマニ油、アブラナ油、ダイズ油、魚油）で強化することにより卵をオメガ−３−ＰＵＦＡで強化することが可能なことが示されている（Ｈｅｒｂｅｒ  ｖａｎ  Ｅｌｓｗｙｋ，１９９５，Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７４，Ｓｕｐｐｌ．１，Ｓ．５７；Ｇｒａｓｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｎｃｈ  １９９６，ＤＧＳ  ６，６−９）。
従来、有用な動物の寄生虫症を管理するための予防的および治療的手段に関してオメガ−３−ＰＵＦＡ製剤を使用する研究はなかった。現在の家禽飼育業において、ある種の原虫種（アイメリア属）により起こされるコクシジウム症は、高い死亡率のため、腸疾患として高い実際的な経済的重要性を持っている。最近公表された研究は、コクシジウム感染の進行を、飼料に魚油を強化することにより抑えることができたことを示している（腸損傷の数／強度の軽減、体重喪失の軽減）。この効果は魚油中に存在するオメガ−３−ＰＵＦＡの作用に帰されている。
寄生虫感染は農業的に有用な動物の間で、特に若齢動物間で世界中に拡がっており、経済的な損失を被っている。
オメガ−３−ＰＵＦＡ製剤は、消化管中で、蠕虫（寄生虫）に対する活性を現し、そこで駆虫する。
しかしながら、オメガ−３−脂肪酸源としての魚油の使用は、多くの他の脂肪酸に加え、魚油にはコレステロールおよびある種の重金属もまた存在しているため問題である。さらに、ＰＵＦＡ含量の組成が魚の種類、時期および漁場に依存して変化し（ある場合にはかなりの程度で）、それは魚からの単一濃度含量ＰＵＦＡ生成物の製造を困難にしている。さらに、味および臭いの点における最終生成物への影響のため、魚油は飼料食へ制限された量しか用いることができない。強調されなければならないさらなる問題は、魚油中のオメガ−３−ＰＵＦＡ濃度は通常多くても１５−２０％であり、飼料添加物の製造に必要とされる脂肪酸の濃度に濃縮することは技術的に非常に困難であることである。
本発明は、オメガ−３−ＰＵＦＡ、特にエイコサペンタエノン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含む製剤を製造するための産生株として水性微生物（微藻類、原虫、菌類、細菌）を用いることにより上記の問題を解決する。これらの製剤は抗寄生虫（特に抗コクシジウム）効果を開発するために飼料添加物として用いられる。産生株は従属栄養的にまたは自己栄養的に培養され、採取され、および続いて乾燥および／または抽出される。ＰＵＦＡ製剤はここではバイオマスの形、または飼料添加物としての油として用いることができる。
従って、本発明は特に、動物の寄生虫症に対する予防的または治療的使用に用いる医薬品を製造するための、水性微生物から得られるオメガ−３−脂肪酸含有製剤の使用に関している。
製剤は好適には、水性微生物の培養により得られるバイオマスから成っているか、油状物の形で存在しているか、またはその両方である。
本発明の特に好適な態様に従うと、オメガ−３−脂肪酸含有製剤は従属栄養的に培養可能な微藻類から得られ、これらの微藻類は特に好適にはクリプテコジニウム目またはミドリムシ目に属している。
さらに好適な態様において、上記の製剤は低級菌類、好適にはトラウストキトリウムまたはモルティエラ目から得られる。
本発明のさらに好適な態様において、水性微生物は、フェオダクチラム、イソクリシス、モノダス、ポルフィリジウム、スピルリナ、クロレラ、ボトリオコッカス、シクロテラ、ニツシア、ダナリエラおよびナンノクロロプシス目から選択される光合成微藻類に属している。
さらに好適な態様では、上記の製剤は好適にはアルテロモナスおよびシェワネラ目から選択される細菌から得られる。
付随する図（本出願の一部を形成している）はＰＵＦＡを投与していない対照群およびＰＵＦＡが投与された群のニワトリよるオーシスト排出の評価をグラフにより示している。
もしくは、製剤は上記の水性微生物の二つまたはそれ以上の異なったものの混合物から得られる。
オメガ−３−脂肪酸含有製剤は特に、鳥コクシジウム症の予防的および治療的使用に用いる医薬品を製造するために適している。
上記の製剤はさらにまた、大または小動物の内部寄生虫症の予防または治療用の医薬品を製造するためにも適している。
従って、本発明はまた上記のように得られるオメガ−３−脂肪酸含有製剤を含む、動物の寄生虫症に対する予防的または治療的使用のための医薬品にも関している。
医薬品は一つまたはそれ以上の他の医薬品と組み合わせることができる。
コクシジウム症の治療および予防のための本発明に従った医薬品は、もしそれが少なくとも一つの追加のコクシジウム抑制薬（好適にはサリノマイシン）を含んでいるならば特に有効である。
本発明は以下に詳細に説明されるであろう。
オメガ−３−脂肪酸含有製剤を製造するために特に適した生産種はクリプテコジニウムまたはミドリムシのような従属栄養的に増殖する微藻類および原虫；トラウストキトリウム、シゾキトリウムおよびモルティエラのような低級菌類；フェオダクチラム、イソクリシス、モノダス、ポルフィリジウム、スピルリナ、クロレラ、ボトリオコッカス、シクロテラ、ニツシア、ダナリエラおよびナンノクロロプシス目の光合成微藻類および、例えば、アルテロモナスおよびシェワネラ目の細菌である。
オメガ−３−脂肪酸含有製剤の製造過程は以下の工程を含む：
−  培養培地への生産株の接種。
−  適した条件下での培養物のインキュベーション、培養はバッチ、フィードバッチまたは連続発酵として実施することが可能である。
−  特に、以下の方法を用いる培養物の採取：低温ペレット化、濾過、遠心分離、噴霧乾燥。
−  バイオマスをオメガ−３−ＰＵＦＡ製剤として直接使用しない場合には、続いて湿潤または乾燥バイオマスを用いて、抽出物を得るための抽出工程（例えば、超臨界ＣＯ2抽出または有機溶媒による抽出）を行うことができる。
抽出物の形の製剤は、随意に使用前に、例えば、ＳＦＣ（超臨界液体クロマトグラフィー）またはＨＰＬＣ法により精製される。
本発明の製剤において、オメガ−３−ＰＵＦＡはなかんずく、リン脂質、糖脂質、モノ−、ジ−またはトリグリセライドまたは硫脂質、またはさもなくば遊離酸またはそれらのエチルエステルの形で存在しているであろう。
飼料に混合されるオメガ−３−ＰＵＦＡ製剤（バイオマスまたは油）のＤＨＡまたはＥＰＡ含量は全脂肪酸含量に基づいて５から８０％の間である。
油状物はＰＵＦＡの良好な加工処理および保護を確かにするために使用前にマイクロカプセル化してもよい。オメガ−３−ＰＵＦＡの酸化安定性を増加させるために、例えば、トコフェロールおよびアスコルビン酸パルミテートのような安定化剤を製剤に加えることが可能である。
オメガ−３−脂肪酸含有製剤のコクシジウム抑制作用は、標的種卵巣をとった雌ニワトリでの感染実験を用いて制御される。使用された感染種はアイメリア  アセルブリナ、Ｅ．マキシマおよびＥ．テレラである。これらの実験は３週間の期間に渡って実施され、感染の経過に対するＰＵＦＡの影響は二つの異なった濃度でモニターされた。
投与および処置計画：
0004201349.tif 000002
この実験の間に種々のパラメーターがモニターされた。以下のパラメーターはＰＵＦＡの有効性を示している。
−  動物体重の個々の増加
−  オーシスト排出
−  腸病変の軽減（病変評点インデックスを用いて登録）
−  死亡率
さらに、感度試験を用いて、本発明に従ったオメガ−３−脂肪酸含有製剤と組み合わせたコクシジウム抑制剤サリノマイシンの作用を制御することが可能である。
本発明に従った製剤を含んでいる培地内での、成虫の寄生虫（治療効果）および発育段階の寄生虫（予防効果）への損傷は、寄生しては生きられない寄生虫（例えば、ケノルハブジティス  エレガンス）を用いた、または環境で発育する寄生虫（例えば、反芻動物の毛様線虫）の外生段階を用いた、適したインビトロ試験モデルで試験できる。本発明に従った製剤の有効性に使用された基準は、寄生虫の生存および移動度、および若齢段階の発育速度である。
試験：
Ｅ．タネラ（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，実験室株）で感染させた後の感染経過に対するＰＵＦＡ（クリプテコジニウムからのドコサヘキサエン酸）およびサリノマイシンの組み合わせ効果が、卵巣をとった雌ニワトリでの給餌実験において、個々の全オーシスト排出を特に考慮することにより研究された。
コーン強化食（コーンのパーセント４４．６％）を給餌し、アイメリア感染に対するドコサヘキサエン酸／サリノマイシン組み合わせの効果がこの実験で研究された。原因生物体の病原性に対する組み合わせ効果の結論を引き出せるように、各々の試験動物の全オーシスト排出および盲腸における病変評点の程度が決定された。動物の体重増加および飼料変換は感染の程度に対してさらなる指標を与えた。
研究の特徴
試験期間：２０日間
試験製剤
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試験系
種：Ｌｏｈｍａｎｎ肥畜ニワトリ
性：オス
年齢：生後１日のニワトリ
試験フェーズ
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投与および処置スキーム
ＳａｃｏｘR＋ＲＢＤ−ＤＨＡＳＣＯRの投与：飼料とともに経口で
Ｅ．タネラによる感染、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（実験室株）：食道チューブにより経口で
感染量：５００胞子形成したオーシスト／動物（１％ｗ／ｖウシ胆汁水溶液）
感染時のオーシスト齢：２１日
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試料物質の処理：
糞便採取：
糞便は毎日２４時間に渡って、４％二クロム酸カリウム溶液を含むプラスチックボウルに集められた。すべての糞便は収集容器に移された。
糞便試料の処理：
個々の糞便は攪拌し（磁気攪拌、２５０ｒｐｍ）、ふるいを通し（メッシュの大きさ１ｍｍ）、最終容量で３００または８００ｍｌ（予期されるオーシスト排出に依存して）の濃ＮａＣｌ溶液とした。続いて、過剰のＮａＣｌ結晶を攪拌しながら加えた。攪拌の間、約１ｍｌの懸濁液をピペットまたはシリンジを用いて採取し（液体円柱の中間から）、ＭｃＭａｓｔｅｒチャンバーにこの試料を充填した。
オーシストの計数：
検査者に向かっている側からチャンバーを泡が入らないように充填した。充填に先立って、カバーガラスを、約３ｍｍ幅のギャップがチャンバーの上に形成されるように移した。計数前に、カバーガラスをその適切な位置に移動させた（チャンバーが完全に被覆されなければならない）。約５分間浮揚後、８０または３２０の倍率で３つの計数ネットの１０セクション中のオーシストを計数した。
各々の計数ネットの容量（１０ｍｍｘ１０ｍｍｘ１．５ｍｍ＝０．１５ｍｌ）および懸濁液の容量を考慮して、オーシストの数が計算された。
実験の実施：
全実験は良好な実験実行の原則に従って実施された。
結果は以下の表および図に示されている。
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