(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の植物由来抗凍結ポリペプチドを含む冷凍菓子製品において、水性組成物中の前記抗凍結ポリペプチドが、−４０℃以下への急速凍結および続いての−６℃で１時間の貯蔵の後に、１５μｍ未満の氷晶サイズ数平均を有し、
前記抗凍結ポリペプチドが、Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix fragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccharoides, Oxalis, Geranium, Daucus carota（ニンジン），Vinca minor（ツルニチニチソウ），Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua（スピアグラス），Poa pratensis（ケンタッキー・ブルー・グラス），Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis,およびFestuca contractaに由来するものであることを特徴とする冷凍菓子製品。
【請求項２】
前記抗凍結ポリペプチドが、Lichen科に由来する、請求項１記載の冷凍菓子製品。
【請求項３】
前記抗凍結ポリペプチドが、Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica,またはUsnea subfloridanaに由来する、請求項２記載の冷凍菓子製品。
【請求項４】
前記抗凍結ポリペプチドが、Juncus squarrosusまたはGeraniumに由来する、請求項１記載の冷凍菓子製品。
【請求項５】
前記抗凍結ポリペプチドが、少なくとも３０秒間、６０℃を超える温度で熱処理した後に、氷晶の成長を制限するその能力を維持している、請求項１記載の冷凍菓子製品。
【請求項６】
前記抗凍結ポリペプチドが、１分を超える時間、６０℃を超える温度で熱処理した後に、氷晶の成長を制限するその能力を維持している、請求項１記載の冷凍菓子製品。
【請求項７】
前記抗凍結ポリペプチドが、Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellate, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensisおよびAgrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annuaに由来する、請求項５記載の冷凍菓子製品。
【請求項８】
前記抗凍結ポリペプチドが、非毒性植物に由来する、請求項１記載の冷凍菓子製品。
【請求項９】
製品が、ウィンターライ由来の抗凍結ポリペプチドを含まない、請求項１記載の冷凍菓子製品。
【請求項１０】
アイスクリーム、フローズンヨーグルト、アイスウォーター、及びアイスミルクから選択される、請求項１記載の冷凍菓子製品。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、ＡＦＰ（抗凍結タンパク）を含有する冷凍食品に関する。
発明の背景
抗凍結タンパクは、文献に記載されてきた。例えば、Marilyn Griffith and K. Vanya Ewart, Biotechnology Advances, Vol. 13, No. 3, 375-402(1995)を参照されたい。抗凍結タンパクは、一般に以下の特性の１つまたはそれ以上を有する：熱ヒステリシス（thermal hysteresis）、氷再結晶化の阻害、氷晶（氷結晶）形の制御および氷核形成剤（ice nucleators）との相互作用。
熱ヒステリシスは、ＡＦＰの最もよく知られた特性であり、この特性は、通常、ＡＦＰの存在について試験するために用いられる。熱ヒステリシスは、融解温度に影響せずに熱ヒステリシス活性ＡＦＰを含有する溶液の見かけの凍結温度を低下させることによりもたらされる。熱ヒステリシス試験によるＡＦＰ源の同定は、文献に広く記載されている。例えば、John G. Duman, Cryobiology 30, 322-328(1993)を参照されたい。
氷再結晶化の阻害は、ＡＦＰの別の特性である。この活性は、氷晶成長抑制とも呼ばれている。この特性は、ＡＦＰの存在下およびＡＦＰの不存在下で、ある時点での結晶の氷晶サイズを比較することにより試験することができる。魚ＡＦＰの試験におけるこの方法の適用は、米国特許第５，１１８，７９２号（DNA Plant Technology Corporation）に記載されている。
ＡＦＰの第三の特性は、氷晶の形に影響するその能力である。この特性は、氷晶のある面に対するＡＦＰの選択的結合から由来し、それをもってある方向への結晶成長を制限する。こうして、六方晶系の両錐体は、ＡＦＰの存在の指標と考えられる。この方法は、例えばＷＯ９２／２２５８１（University of Waterloo）において細胞外ウィンターライ（winter rye）ＡＦＰの活性を試験するために記載されている。
ＡＦＰの第四の特性は、氷核形成物質の活性を阻害するその能力である。ＡＦＰと氷核形成剤とのこの相互作用は、例えば増大した熱ヒステリシスによりもたらされうる。この特性は、例えばＷＯ９６／４０９７３（University of Notre dame du Lac）において試験されている。
ＡＦＰは、製品の凍結寛容性を改良することについて示唆されてきた。この文脈において多くの適用が示唆されてきた。
例えば、ＡＦＰは、生物学的物質の低温保存を強化することについて示唆された（ＷＯ９１／１２７１８、Agouron Pharmaceuticals；ＷＯ９１／１０３６１、The Regents of the University of California）。また、ＡＦＰは、例えば化粧品または医薬における、リポソームからの漏れを防止するために示唆された（ＷＯ９６／２０６９５を参照されたい）。更に可能な適用は、ＡＦＰを植物中に含ませることにより（または植物中でトランスジェニック技術で産生させることにより）植物の凍結寛容性を増大させることである（J. Cell Biochem. Suppl. vol. 14e, 1990, p.303 XP002030248, Lee et al.,アブストラクトＲ２２８を参照されたい）。また、魚ＡＦＰは、食品、例えばフローズンヨーグルトまたはアイスクリームにおける用途のために示唆された（米国特許第５，６２０，７３２号、Pillsbury；およびＷＯ９６／１１５８６、HSC Research and Development limited partnership）。
しかし、現在まで、ＡＦＰの用途は、商業的規模では適用されていなかった。本出願人は、商業的使用がない理由の１つは、多くのＡＦＰが記載されてきたが、実践において実際の商業製品における使用は深刻な問題に直面することであると考えている。
本出願人は、これらの問題の重要な理由の１つは、文献に記載されてきた非常に多数のＡＦＰのうち、各適用について限られたセットのＡＦＰしか好適に適用できないことであることを見出した。また、本出願人は、好適なＡＦＰのこの選択は、所望の適用および／または達成すべき製品の性質に依存することを見出した。
ＡＦＰの特に望ましい源は、植物性物質である。植物性物質は、適度に容易に比較的大量を入手でき、ＡＦＰ含有濃縮物を得るために比較的簡便な単離手順を用いることができる。更に、植物性物質からのＡＦＰの使用は、例えば魚ＡＦＰよりも天然野菜供給源を好む傾向がある消費者により、好まれると信じられている。
Marilyn GriffithおよびK. Vanya Ewartは、Biotechnology Advances, Vol. 13, No. 3, 375-402(1995)において、抗凍結活性が見出された２７種の高等植物種のリストを挙げている。この論文はまた、ＡＦＰについて広い範囲の可能な適用をも示唆する。
本出願人は、植物ＡＦＰの使用についての特定の適用を選択する場合、その適用において有利に適用することができる限られたセットのＡＦＰを選択するための特定の試験が必要となることを見出した。
したがって、本発明の目的は、冷凍菓子製品において有利に使用することができる植物ＡＦＰを提供することである。
驚くべきことに、本出願人は、非常に多数の植物がＡＦＰを含有するという事実にもかかわらず、ほんの限られたセットの植物しか、冷凍菓子製品に優れたテクスチャーを与えることができるＡＦＰを含有しないことを見出した。驚くべきことに、比較的簡便な試験方法を用いて好適なＡＦＰを選択することができることが見出された。
したがって、第一の側面においては、本発明は、植物由来の１またはそれ以上のＡＦＰを含む冷凍菓子製品であって、水中の前記ＡＦＰは、−４０℃への急速凍結およびその後の−６℃で１時間の貯蔵（以下に記載するように測定する）の後、１５μm未満の氷晶サイズを有することを特徴とする冷凍菓子製品に関する。
発明の背景
ＡＦＰは潜在的にアイスクリームのような冷凍菓子製品のテクスチャー特性に好ましい影響を与えるために用いることができる可能性があることは、多数の文献に示唆されていた。しかし、これらの文献のほとんどは、いかにしてこれらの好ましい特性を実際に実践において達成することができるかの教示を提供していない。
別のセットの文献は、魚ＡＦＰの用途を記載している。
ＷＯ９６／１１５８６は、冷凍発酵食品における魚抗凍結ポリペプチドの適用を教示する。この文献は、これらの製品における植物由来の特定のＡＦＰの用途を教示していない。
ＷＯ９６／３９８７８は、アイスクリームにおけるＡＦＰの適用を記載している。この適用のための好適なＡＦＰは、南極の魚、北極の（artic）魚、蠕虫および昆虫の血液および筋肉組織に由来していてもよい。ここでもまた、植物ＡＦＰを用いることができるという教示はまったく与えられていない。
米国特許第５，１１８，７９２号は、実施例３Ｂにおいて、ポプシクル（popsicle）混合物中での精製Ａ−Ｓａｆ５融合タンパクによる再結晶化の阻害を記載している。この文献もまた、植物由来のＡＦＰの用途を教示していない。
ＷＯ９２／２２５８１は、ウィンターライの細胞外腔由来の複数のポリペプチドを記載している。これらのポリペプチドのいくつかの可能な適用は一般的に記載されており、これらの中にアイスクリームがある。しかし、良質のアイスクリームを得るためにどのポリペプチドを選択するべきかについての教示は与えられていない。本出願人は、ウィンターライの特定のタンパクのみがアイスクリームにおける用途のために好適であることを見出した（実施例を参照されたい）。
本出願人は、現在までそのように列挙されていなかった非常に多数の植物が、有意なレベルのＡＦＰを含有することを見出した。一方、ＡＦＰ含有植物のすべてが冷凍菓子のテクスチャーに好ましい影響を与えるために正しいタイプのＡＦＰを提供するわけではないことが見出された。本出願人は、そこで、驚くべきことに、一方では優れたＡＦＰ特性を提供し、他方ではアイスクリームのテクスチャー特性に好ましい影響を与えることができる植物源の特定の新規な選択を提供することを目的とする。
特に、好適なＡＦＰは、水性組成物中のＡＦＰを含む組成物を採取し、この組成物を急速に−４０℃以下に凍結させ、続いて−６℃で１時間貯蔵することにより、選択することができることが見出された。好適なＡＦＰは、これらの条件下で１時間の貯蔵後、１５μm未満、より好ましくは５〜１４μm、最も好ましくは８〜１２μｍの氷晶サイズをもたらす。急速凍結の温度は、有利には−４０〜−１００℃、好ましくは−８０℃である。この特性を決定するための好適な試験の詳細な説明は、実施例Ｉに示す。
一般に、試験は、ＡＦＰおよび水を含むあらゆる好適な組成物に適用することができる。一般に、このような試験組成物中のＡＦＰのレベルは、非常に重要というわけではなく、例えば０．０００１〜０．５重量％、より好ましくは０．０００５〜０．１重量％、最も好ましくは０．００１〜０．０５重量％、例えば０．０１重量％であることができる。水性組成物中の水のレベルは、有利には３０重量％以上、例えば５０重量％〜９９．９９９９重量％である。
ＡＦＰおよび水を含むあらゆる好適な組成物を用いて試験を実行することができる。望ましい場合、添加剤（例えばスクロースまたは緩衝剤）が存在していてもよい。しかし、一般に、ＡＦＰを精製形態で得る必要はない。実用的な適用のためには、通常、植物性物質の液体抽出物またはジュースを調製し、次いでこの抽出物またはジュースを試験することで充分である。好適な液体組成物を調製する好適な方法は、実施例IIに示す。
通常、好適なＡＦＰについて試験すべき植物は、低温にさらされたものである。例えば、寒冷な気候において生育した植物、例えば南極の（antartic；極地）植物を試験することができる。あるいは、冬期、好ましくは１２月〜３月、より好ましくは１月〜２月、最も好ましくは１月（北半球）、または６月〜９月、より好ましくは７月〜８月、最も好ましくは７月（南半球）に植物を収穫することができる。
本出願人は、多数の植物を上記の試験に付した。その結果を実施例IIIおよびIVに示す。
ＡＦＰの好ましい供給源は、Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix fragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccheraroides, Oxalis, Geranium, Daucus carota（ニンジン），Vinca minor（ツルニチニチソウ），Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua（スピアグラス），Poa pratensis（ケンタッキー・ブルー・グラス），Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis,およびFestuca contractaから由来する。
本出願人は、本発明の説明において与えられる指針に基づいて、当業者は植物から好適に由来しうる更なるＡＦＰを選択することができると考える。これらのＡＦＰの使用もまた、本発明の範囲内に包含される。
食品における適用のために特に有用な１つの態様は、上述の結晶サイズ試験を満足し、非毒性または低毒性植物に由来する、植物ＡＦＰである。この点において、好ましいものは、ニンジン類、草、竹等に由来するＡＦＰである。
上述の供給源からの別の好ましい選択は、Lichen科、特にAlectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridanaから由来するＡＦＰである。これらのＡＦＰは、冷凍菓子製品において特に良好な特性を示す。
特に良好な活性を示す他のＡＦＰは、Juncus squarrosusまたはGeraniumから由来するものである。
いくつかの適用については、６０℃を超える温度での熱処理の後、最も好ましくは、少なくとも３０秒、更に好ましくは１分を超え、１０分または１時間を超える時間、８０〜１０５℃での熱処理の後であっても、（上述の試験により明らかにされる）氷晶成長を制限するその能力を維持するＡＦＰが選択される。熱安定性である好適な植物供給源は、例えばAcer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensisおよびAgrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annuaである。
上述した植物に加えて、本出願人は、Secale cereale（ウィンターライ）からのＡＦＰを試験した。いくつかのウィンターライＡＦＰはＷＯ９２／２２５８１に記載されている。驚くべきことに、本出願人は、ウィンターライから由来する３２kDaタンパクは上述の結晶サイズ試験を満足するが、ウィンターライから由来する他のタンパクはその試験を満足しないことを見出した（実施例IXを参照されたい）。したがって、本発明の目的のためには、ウィンターライ由来のＡＦＰを用いる場合には、好ましくは３２kDaタンパクを適用する。
本発明の別の好ましい態様は、上述の試験を満足し、ウィンターライに由来しない、植物ＡＦＰの冷凍菓子製品における用途に関する。
発明の詳細な説明
本発明にしたがった冷凍製品は、植物供給源から由来することができる少なくとも１つのＡＦＰを含む。
ＡＦＰは、あらゆる好適な方法、例えば上述の文献に記載された単離方法によって、植物供給源から得ることができる。あるいは、ＡＦＰは、植物から抽出することができ、これは、例えば植物（または植物の部分）から植物抽出物を調製し、場合により続いて濃縮工程を行うことによって行うことができる。上記の抽出物を得る好適な方法の例は、実施例において示す。
また、微生物または植物を、ＡＦＰを発現するように遺伝的に改変してもよく、そのＡＦＰを本発明にしたがって用いてもよい。
遺伝子操作技術を用いて、天然にＡＦＰを含有する植物源から直接得られたＡＦＰに対して少なくとも８０％、より好ましくは９５％を超える、最も好ましくは１００％のホモロジーを有するＡＦＰを産生させてもよい。本発明の目的のためには、この高レベルのホモロジーを有するこれらのＡＦＰもまた、「植物由来のＡＦＰ」という用語の範囲に含まれる。本発明の目的のためには、「植物由来のＡＦＰ」という用語は、好ましくは、非植物性供給源（例えば魚）に天然に存在し、植物によりトランスジェニック経路で産生されるＡＦＰを含まない。
遺伝子操作技術は、以下のようにして用いてもよい。すなわち、適切な宿主細胞または生物を、所望のポリペプチドについてのコード領域を含有する遺伝子構築物で形質転換する。
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター中に挿入することができる。上記ベクターは、転写および翻訳に必要な要素を、それらが適切な条件下で発現されるような方式（例えば正しいリーディングフレームの適性な向きで、かつ適切なターゲティングおよび発現配列を備えて）でコードする。
これらの発現ベクターを構築するために必要な方法は、当業者には周知である。
ポリペプチドコード配列を発現させるために、多数の発現系を用いることができる。これらとしては、適切な発現ベクターで形質転換された、細菌、酵母、昆虫細胞系、植物細胞培養系および植物が挙げられるが、これらに限られない。
上述の供給源から得ることができるＡＦＰは、あらゆる好適な冷凍菓子製品において用いることができる。本発明の目的のためには、「冷凍菓子製品」という用語は、ミルク含有冷凍菓子、例えばアイスクリーム、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベ、アイスミルクおよびフローズンカスタード、ウォーターアイス、グラニタおよびフローズンフルーツピューレが含まれる。いくつかの目的のためには、発酵冷凍食品における使用は、好ましさが劣る。
好ましくは、冷凍菓子製品中のＡＦＰのレベルは、最終製品ベースで０．０００１〜０．５重量％、より好ましくは０．０００５〜０．３重量％、最も好ましくは０．００１〜０．２重量％である。
好ましくは、冷凍菓子中の固体（例えば糖、脂肪、香料等）のレベルは、２重量％を超え、より好ましくは４〜７０重量％である。
望ましい場合、本発明の冷凍菓子製品は、例えば５０〜５００％の超過量まで、空気を含ませてもよい。
本発明の冷凍菓子製品を調製する方法は、調製のためのあらゆる好適な方法から選択することができる。ＡＦＰは、一般に調製の種々の段階で添加することができ、例えばこれを成分の最初のプレミックスに添加したり、または後に調製プロセスの後の段階で添加することができる。いくつかの適用については、製造プロセスの比較的遅い段階で、例えば製品の（部分的）予備凍結の後に、ＡＦＰを添加することが好ましい。
冷凍菓子製品のための凍結プロセスは、あらゆる好適な凍結プロセスから選択することができ、場合によっては、例えば５０〜３００％の超過量への、含気（エアレーション）工程を含んでいてもよい。いくつかの目的のためには、凍結工程は、例えば−３０Ｆ（Fahrenheit）以下の温度での、寒冷硬化工程を含むことが有利である。
いくつかの適用のためには、冷凍菓子製品に２以上の異なるＡＦＰの混合物を含ませることが有利である可能性がある。これについての１つの理由は、例えば、用いるべきＡＦＰの植物供給源が１を超えるＡＦＰを含有し、例えば用いるべき植物抽出物中にそれらが両方存在するために、これらを添加することが好都合であることであり得る。あるいは、異なる供給源からの１を超えるＡＦＰを添加することがしばしば望ましい可能性がある。
本発明を、以下の実施例により更に説明する。
実施例Ｉ
急速冷却およびその後の−６℃で１時間の貯蔵後の氷晶粒子サイズの決定のための試験
好ましい方法は以下のとおりである。
Ｉａ：
抗凍結活性を、「スプラットアッセイ（splat assay）」（Knight et al., 1988）の変法を用いて測定した。３０％（W/W）スクロース中の２．５μlの試験対象溶液を、適切にラベルした清浄な１６mm円形カバースリップ上に移した。第二のカバースリップを溶液の液滴の上に置き、このサンドイッチを指の間で圧迫した。このサンドイッチをドライアイスの箱の中で−８０℃に保ったヘキサン浴中に入れた。すべてのサンドイッチの調製が完了したとき、サンドイッチを、ドライアイスで予め冷却したピンセットを用いて−８０℃のヘキサン浴から−６℃に保ったヘキサン含有観察室（viewing chamber）に移した。−６℃に移した際、サンドイッチは、透明から濁った外観に変化するのが見られた。画像をビデオカメラで記録し、２０倍の対物レンズを用いて画像解析システム（ＬＵＣＩＡ、Nikon）にかけた。各スプラットの画像を、時間（ｔ）＝０および６０分後に記録した。
あるいは、（好ましさは劣るが）この特性は以下のようにして測定することができる。
Ｉｂ：
水を含有するＡＦＰ含有製品の試料を、３０重量％のスクロースレベルに調整する（試料の出発レベルが３０％を超える場合、これは希釈によって行い、出発レベルがこれより低い場合、スクロースを３０％レベルまで添加した）。
試料の３μlの液滴を２２mmのカバースリップ上に置いた。次に、直径１６mmのカバースリップをその上に置き、試料の上に２００gの重りを置いてスライドの厚さを確実に均一にした。カバースリップの端部は、透明のマニキュアでシールした。
スライドをLinkham  THM  ６００温度制御顕微鏡のステージに置いた。このステージを、急速に（１分あたり５０℃）−４０℃まで冷却して、小さい結晶の大集団を生成させた。次に、ステージの温度を急速に（１分あたり５０℃）−６℃まで上昇させ、この温度に維持した。
氷相は、Leica  Aristoplan顕微鏡を用いて−６℃で観察した。λプレートとともに偏光条件を用いて氷晶のコントラストを増強した。氷相の状態（氷晶のサイズ）は、Ｔ＝０およびＴ＝１時間で３５mm顕微鏡写真術により記録した。これにより１５μｍ未満の平均粒子サイズ（視覚的決定、数平均）は、冷凍菓子製品における使用のために好適なＡＦＰを示す。
実施例II
ＡＦＰおよび水を含有する組成物を得る方法
Ａ．  植物部分（例えば根、茎、つぼみまたは葉）の新鮮組織を、ペッスルおよびモルタル（４℃に冷却したもの）を用いて等量の緩衝液Ａ（例えば１０mMＥＤＴＡ、２０mMアルコルビン酸、トリスでｐＨ７．４に緩衝化したもの）を用いてすりつぶすことができる。このホモジネートを１層または複数層のモスリンを通してろ過し、更に使用するまで氷中に維持する。
この方法は、一般にほとんどの植物に適用することができ、ＡＦＰを含有する新鮮植物ジュースを提供する。一般に、この目的のために植物全体を用いることができるが、実際的な理由でしばしば部分のみ（例えば樹木の葉、根菜の根、および草本植物の茎）を用いてもよい。
Ｂ．  草本のように熱に耐えうる供給源からＡＦＰを抽出する方法。この方法は、混合草を用いて例示される。しかし、この方法を他の熱安定性植物に同様に適用してもよいことは明らかである。
混合草組織（Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis）を１月に刈り取った（その月の平均気温は３．５℃であり、植物の適切な寒冷気候順化を確実にした）。更に処理し、水でよく洗ってごみを除去するために、草組織を迅速に実験室に移送した。
５００gの刈り取った草を６５０ワットの電子レンジ中に置き、最大出力で５分間加熱して、これにより温度を８５〜１００℃に上昇させた。次に、刈り取った草を周囲温度まで冷却した。
加熱工程後、ＡＦＰの豊富なジュースを草からろ過して分離した。等量の水の存在下で連続して５分間物質を攪拌し、次いで３層のモスリンを通して絞った。
実施例III
種々の植物のスクリーニング。非南極植物は、１月（中冬期）に収穫した。南極植物は、中夏期に収穫した（２月〜３月）。
別に記載していない場合、実施例IIａに記載した方法にしたがって、根を用いてＡＦＰ含有ジュースを調製した。
試料を、実施例Ｉａの試験に付した。冷凍菓子製品における適用に好適なＡＦＰは、正の記号（＋）で示す。
更に、このジュースの熱ヒステリシス特性を以下のようにして測定した。
ＡＦＰを含有する製品の試料の熱ヒステリシスを、マイクロスライド（Camlab Cambridge、パス長０．１mm）上に融解した製品を置くことにより決定した。マイクロスライドの端部は、ワセリンでシールした。エアロゾル凍結スプレーを用いて氷を試料に導入した。次いでスライドを−０．１℃に温度制御したエタノール浴中に浸漬した。５分間平衡化した後、試料を検査した。氷が完全に融けている場合、浴の温度を０．１℃の段階で下げ、平衡化した。これらの工程を、試料中に少量の氷晶が存在する温度に達するまで繰り返した。その温度での平衡化の後、浴温度を１分あたり０．０１℃の段階で低下させた。試料の凍結点を、平衡化した結晶から氷成長が始まる温度として記録した。次に、試料の融解温度を、すべての氷晶が融解するまで、凍結点から始めて１分あたり０．０１℃の段階で温度を上昇させることによって決定した。この温度は、試料の融解温度である。試料の熱ヒステリシスは、融解温度と凍結温度との間の差である。有意な程度の熱ヒステリシスを有するＡＦＰを、正の記号（＋）で示す。以下の結果が得られた。
0004175520.tif 000002
これらの結果は、多数の植物が熱ヒステリシス特性を示すが、これらの少数のもののみしか再結晶試験を満足しないことを明らかに示す。
実施例IV
種々の植物のスクリーニング。非南極植物は、１月（中冬期）に収穫した。南極植物は、中夏期に収穫した（２月〜３月）。
別に記載していない場合、実施例IIａに記載した方法にしたがって、根を用いてＡＦＰ含有ジュースを調製した。
試料を、実施例Ｉａの試験に付した。冷凍菓子製品における適用に好適なＡＦＰを、正の記号（＋）で示す。
0004175520.tif 000003
0004175520.tif 000004
0004175520.tif 000005
0004175520.tif 000006
0004175520.tif 000007
実施例Ｖ
アイスクリームを製造するための液体プレミックスを、以下のものを混合することにより作成した。
0004175520.tif 000008
このミックスを好都合に８５℃で１５秒間低温殺菌し、缶に入れて冷蔵した。
このミックスを、従来の家庭用ミキサーで約１００％の超過量までホイップし、続いて家庭用フリーザー中で静置して凍結させることにより、アイスクリームの製造に用いることができる。
本発明にしたがった組成物は、対照試料よりも顕著に優れたテクスチャーを有していた。
同様の結果を、以下の植物供給源を用いて得ることができる：Acer saccaroides, Bamboo, Buddleia, Isothecium, myosuroides, Ramalina farinaceae, Usneasubfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carexaquatilis, Colobanthus quintensisおよびAgrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua。
実施例VI
アイスクリームを製造するための液体プレミックスを、以下のものを混合することにより調製した。
0004175520.tif 000009
成分を周囲温度で混合し、続いて８９℃で６０秒間低温殺菌した。このミックスを無菌的に５００mlのパックに詰め、シールして周囲温度で貯蔵した。
このミックスを、従来の家庭用ミキサーで約７０％の超過量までホイップし、続いて家庭用フリーザー中で静置状態で凍結することによりアイスクリームの製造に用いることができる。２ヵ月間の貯蔵後、本発明にしたがった組成物は、対照試料よりも顕著に優れたテクスチャーを有していた。
実施例VII
この例は、ニンジンＡＦＰの単離および配列決定を説明する。同様の方法を他の植物ＡＦＰに用いることができる。
寒冷気候順化したニンジンの根組織を、予め冷却したペッスルおよびモルタルの中で、３倍容量（W/V）の緩衝液（２０mMアルコルビン酸、１０mMＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）中でホモジナイズし、１層のモスリンを通してろ過した。ろ液を６，０００×gで４℃で１０分間遠心した。上清を集め、１００，０００×gで４℃で１時間遠心した。この工程からの１００，０００×g上清を可溶性画分、ペレットをミクロソーム画分と呼ぶ。
上清を、予め５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化した３０mlのファストフローＱセファロース（Pharmacia）カラムに、Gradifrac低圧クロマトグラフィシステム（Pharmacia）により４℃に制御したHiLoadポンプＰ−５０で５ml／分の流速で供給して、溶出液をＵＶモニター（モニターＵＶ１、Pharmacia）によりＯＤ２８０で監視し、チャートレコーダー（ＲＥＣ１０２、Pharmacia）で記録した。カラムを、ＯＤ２８０が０に戻るまで、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で同じ流速で洗浄した。次に、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、０〜０．４M塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の１５０mlのグラディエントを適用し、続いて、２M  ＮａＣｌでカラムを洗浄した。溶出液画分を実施例Ｉのようにスプラットアッセイに付した。
抗凍結活性を含有する画分をプールし、以下のようにしてポリエチレングリコールを用いて濃縮した。水道水で洗浄し、５０mMＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で１０分間煮沸し、ミリQ水ですすいでおいた１０kDaカットオフの透析チューブ（Sigma）に画分を移した。濃縮すべき試料を含有する透析チューブを、分子量１５，０００〜２０，０００の固体ポリエチレングリコール化合物（Sigma）でカバーし、４時間まで、または透析チューブ内の試料容積が１０倍減少するまで、４℃でインキュベートした。
Ｑセファロースカラムからのプールした濃縮物を、フェニルセファロースカラム、ＳＭＡＲＴスーパーデックス７５ゲル透過カラムまたはＦＰＬＣスーパーデックス７５ゲル透過カラムのいずれかに適用した。
ニンジン根抗凍結タンパクを、以下のようにしてゲル透過クロマトグラフィにより精製した。
試料の２０μlアリコートを、０．１５M  ＮａＣｌを含有する５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液Ｅ）で予め平衡化したＳＭＡＲＴスーパーデックス７５カラム（Pharmacia）に、流速４０μl／分で適用し、平衡化緩衝液中で同じ流速でゲル透過により成分を分離した。溶出液は、ＯＤ２８０およびＯＤ２１５で監視した。０．８５〜０．８９mlの間で８０μl画分を集め、０．８９〜１．２４mlの間で４０μl画分を集め、そして１．２４〜３．０mlの間で１００μlの画分を集めた。カラムのボイド容積（Ｖｏ）は、ブルーデキストランの溶液の保持容積から決定したところ、０．９１mlであった。スーパーデックスカラムは、５mg／mlＢＳＡ（分子量６６kDa、保持（Ｖｅ）＝１．０２ml）、３mg／mlカルボン酸アンヒドラーゼ（分子量２９kDa、Ｖｅ＝１．２２ml）、２mg／mlチトクロームＣ（分子量１２．４kDa、Ｖｅ＝１．４１ml）、および２mg／mlアプロチニン（分子量６．５kDa、Ｖｅ＝１．５９ml）を含有する１０μlの溶液を適用することにより較正し、分子量の対数に対してＶｅ／Ｖｏの標準曲線をプロットした。抗凍結活性を含有する画分は、実施例Ｉのスプラットアッセイにより同定し、活性のピークは１．１６mlの保持容積および４０kDaの見かけの分子量を示した。これらの測定値は、寒冷気候順化したニンジンからの３８kDaバンドが抗凍結ペプチドであったことを確認するものであった。
Laemmli（1970）にしたがって、Bioradミニシステムを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析すべき試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Laemmli, 1970）に溶解させ、ドライヒーティングブロック（Techne）上で１００℃で５分間加熱し、室温で１０，０００×gで３分間遠心した。試料（１０〜５０μl）をミニゲル（Biorad；０．７５、１．０または１．５mm厚、１０、１２、１５％アクリルアミドまたは１０〜２０％グラディエントアクリルアミド（Biaradからのプレポアド））に適用し、電気的に分離した。分離したポリペプチドは、固定し、ゲル中でクマシー・ブルー（０．１％（W/V）クマシー・ブリリアント・ブルー、酢酸／メタノール／ミリＱ水（５：４：３１、容量）中）で染色するか、または製造者の指示書にしたがってBiorad銀染色キットを用いて銀染色した。ゲルを、製造者の指示書にしたがってBiorad  Gelairドライヤー中で２枚のGelairセロハン（collophane）シートの間で乾燥した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での見かけの分子量の決定のために、製造者の指示書にしたがってSigmaの高および低分子量マーカーキットを用いた。
寒冷気候順化ニンジン根および非寒冷気候順化ニンジン根を用いてイオン交換クロマトグラフィを行った。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、寒冷気候順化試料中に約３８kDaのバンドの存在を示した。このバンドは、非寒冷気候順化根中でははるかに少量であった。したがって、この（約）３８kDaのバンドに抗凍結活性が帰属するとされた。
タンパク配列決定のために、約３８kDaのニンジン根タンパクを前記の実施例に記載したように精製し、次いで、更なる精製を確実にするために、配列決定すべき試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出して、ポリアクリルアミドゲルのスライス中でインサイチュでタンパク分解的に消化した。
約３８kDaのほとんど純粋なタンパクの調製物（いくらかの少量の夾雑タンパクをなお含んでいた）を、１２％ポリアクリルアミドゲルに付した。各々２μgのタンパクを３つのレーンに入れ、色素のフロントがゲルの底部に達するまで、ゲル中を電気泳動させた。次いで、ゲルを０．２％クマシー・ブリリアント・ブルー（W/V）、３０％メタノール（V/V）、１％酢酸（V/V）中で２０分間染色し、次いでタンパクのバンドが見えるようになるまで３０％メタノールで脱色した。３８kDaのバンドは、隣接するレーンに入れた分子量マーカーと比較することにより同定し、混在するバンドを排除するように注意しながら各レーンからのバンドを外科用メスの刃で切り出した。
ゲルのスライスを、清浄なエッペンドルフチューブに移し、０．５mlの５０％アセトニトリル（V/V）、１００mMトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．５を用いて２回洗浄した。洗浄により、クマシーで染色され、部分的に脱水されたゲルスライスのいくらかが除去された。次いで、ゲルスライスを、チューブから取り出して、有意に縮んで巻き上がりはじめるまで実験台上で空気中で乾燥した。次に、これらをエッペンドルフチューブに戻し、まず、１０μlの、１μgのエンドプロテイナーゼＬｙｓ  Ｃ（Boehringer Mannheim）を含有する１００Mmトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．５で再水和した。これは、リジン残基のカルボキシ末端側でポリペプチド鎖を特異的に切断するプロテイナーゼである。更に、トリス緩衝液を、ゲルスライスが充分に再水和されるまで添加し、次いで３７℃で１６時間インキュベートした。
インキュベーション後、１μlのトリフルオロ酢酸をチューブに添加して反応を停止させ、次いでゲルスライスを０．３mlの６０％アセトニトリル（V/V）、０．１％ＴＦＡ（V/V）で、３０℃で３０分間、２回洗浄した。これは、再びゲルスライスを部分的に脱水し、それらを縮ませて、生成されたペプチドを溶出させるためであった。上清を別の清浄なエッペンドルフチューブに移し、次いで遠心エバポレーター中で２時間、試料がほぼ乾燥するまで乾燥し、０．１％ＴＦＡで０．１mlの容量に再懸濁した。
次に、ＳＭＡＲＴ微量精製システム（Pharmacia）上で逆相ＨＰＬＣによりペプチドを分離した。ペプチド消化物を、０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）で平衡化したＣ１８カラム（２．１×１００mm）上に流速０．１ml／分で付した。次いで、カラムを、０〜７０％の溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル（V/V）、０．０８５％ＴＦＡ（V/V））のグラディエントで、同じ流速で７０分間にわたって溶出した。光学密度を２１４nmで監視し、個々のペプチドピークを手動で進行させながらフラクションコレクターで集めた。製造者の推奨にしたがって液相化学サイクルを用いて、モデル４９２Perkin  Elmerタンパクシークエンサーにかけることにより、ポリペプチドを配列決定した。
３８kDaバンド中のいくつかのポリペプチドフラグメント（Ａ〜Ｅ）を解析し、これらは、以下の配列と実質的に相同な配列を有していた：
0004175520.tif 000010
抗凍結タンパクの製造のための細胞培養物は、以下のようにして作成した。
新規な細胞培養を、Gamborg and Wetter 1975、Torres 1989、Dodds and Roberts 1985に記載された方法に基づいて開始した。
寒冷気候順化ニンジン（Autumn King)：
貯蔵根の表面を、まず、１０％Teepol界面活性剤で洗浄し、続いて流水下でこすり洗いし、次いで流水で１５分間すすぐことにより滅菌した。（サイズに基づいて）実施可能な場合、根の皮をむいた。次に、根を無菌的に０．５cmのスライスに切り、これらを振とうしながら７０％（V/V）エタノール中に１０分間置き、続いて振とうしながら１０％（V/V）Domestos＋２滴のTween２０（Sigma）中に２５分間置いた。次に、切片を滅菌蒸留水で３回洗浄した。およそ０．５cmの直径の円筒を、外科用メスを用いてスライスを通じて切り取り、残りを２〜３mmの長さに切った。これらの組織ディスク（外生体）を、６０mlのSterilin容器に入れられた３０g／lスクロース、１０mg／lインドール酢酸（ＩＡＡ）、０．１mg／lキネチンおよび８g／lテクニカルアガーを含有する固体ＭＳ培地に無菌的に移した。外生体を、２０℃で暗黒下でインキュベートした。
必要なときに、生じたカルスを小さい切片に分けて、これを新鮮な培地にプレーティングした。次いで、活発に生育するカルスから、懸濁培養を開始した。
更に、ニンジン細胞懸濁培養株（ＮＯＲおよびＯＸ６）を、Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Leedsから入手した。１０mlのこれらの培養物を、９０mlの２５g／lスクロースおよび１mg／l  ２，４−Ｄを含有する新鮮Murashige and Skoog培地（Sigma）に７日ごとにサブ培養した。培養物は、暗黒下で、２５℃で、旋回振とうインキュベーター中で１５０rpmでインキュベートした。
ＮＯＲ培養物を、以下のようにして寒冷処理した。
１８×５mlの７日目のＮＯＲ培養物を、４５mlのニンジンＭＳ培地を含有する１８×１００mlの三角フラスコに加えた。この培養物を、前に記載したように２５℃で４日間インキュベートし、次に、インキュベーターの温度を４℃に低下させた。すぐに２個のフラスコを取り出して、ｔ＝０として、前に記載したように細胞および培地を収穫した。残りのフラスコは、ｔ＝８時間、１日、２日、４日、７日、９日、１１日および１４日に２個ずつ収穫した。
ＮＯＲおよびＯＸ６のより大規模な培養物を用いて寒冷気候順化処理を繰り返した。これらは、２５℃での生育の４日および７日後に４℃に移した。ｔ＝０、ｔ＝７日およびｔ＝１４日の時点で培養物を収穫した。収穫することに加えて、各時点で各培養物についてＰＣＶを決定した。
ＮＯＲ寒冷気候順化細胞を、以下のようにして実施例Ｉのようなスプラットアッセイのために調製した。急速冷凍細胞を、ペッスルとモルタルを用いて液体窒素中で微細粉末に破砕した。粉末化した試料を、２×容量の１０mMＥＤＴＡ＋２０mMアスコルビン酸中に再懸濁し、３０秒間渦巻攪拌により混合して、次に１０，０００×gで１０分間遠心した。陰性対照として緩衝液対照を用いて上清の１０μlアリコートをスプラットした。ＲＩ活性は、寒冷気候順化細胞においては検出することができたが、非寒冷気候順化試料中には検出することができなかった。
ＮＯＲ懸濁液からの培地試料を、以下のようにして解析した。ＮＯＲニンジン培地を、１００μlの１Mトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加することにより緩衝化した。次に、これを、１mlのＱセファロースカラム（Pharmacia）に１ml／分の流速で適用し、結合した分子を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４の３mlアリコートで溶出した。１mlの画分を集めた。
このアニオン交換法は、ｔ＝０、２日、４日、７日、１１日の寒冷気候順化培地試料およびｔ＝７日の非寒冷気候順化培地試料を分画するためにも用いた。画分を、実施例Ｉに記載したようなサンドイッチスプラットアッセイにより活性について試験した。
培地中の抗凍結活性を、以下のようにしてゲル透過クロマトグラフィにより精製した。上記のＱセファロースカラムからの１４の寒冷気候順化０．５M塩化ナトリウム溶出液（画分２）を、アセトン沈殿に付し、ペレットを５０μlの５０mMトリス−ＨＣｌ＋０．１５M  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中に再懸濁した。次に、これを、１０，０００×gで１０分間遠心し、２０μlをPharmacia  ＳＭＡＲＴシステムでスーパーデックス７５ゲル透過カラム上に適用した。流速は、４０μl／分であり、移動（mobile）相は５０mMトリス−ＨＣｌ＋０．１５M  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２であった。８０μlの画分を集め、スプラットした。この手順を、Ｑセファロースカラムからのｔ＝１４日の非寒冷気候順化０．５M  ＮａＣｌ溶出液および新鮮培地を用いて繰り返した。
活性タンパクの更なる単離は、上述のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により行うことができる。
実施例VIII
寒冷気候順化ニンジン根からの根抽出物を、冷水中で新しく抜いた寒冷気候順化ニンジンをこすり洗いすることにより調製した。頂部を除去し、家庭用ジュース抽出器（Russel Hobbs、モデル番号９９１５）を用いてジュースを抽出した。ジュースを１リットルのブロックに凍結させて、アイスクリーム試作における使用のために回収する前に−２０℃で貯蔵した。
ニンジンＡＦＰジュースを、以下のアイスクリーム処方に添加した。
0004175520.tif 000011
上記の処方を凍結させ、１０６％超過量までエアレーションすることによりアイスクリームを調製した。
新鮮試料および−１０℃で１０日間の貯蔵により酷使した試料について測定を行った。
比較として、ニンジン抽出物なしの試料を同様に測定した。測定は、以下のように行った。
試料を、Prolan環境キャビネット中で約１２時間、−１８℃で平衡化した。アイスクリームの各バッチから代表的に３つの試料を選び、各ブロックの中央からアイスクリームの薄層を顕微鏡スライド上にスメアすることによりCryostat温度制御キャビネット中で各々からスライドを調製した。ホワイトスピリットの１滴をスライドに適用し、次いでカバースライドを適用した。各スライドを、次に、温度制御した顕微鏡ステージに移した（Leit LaborLux S, Leica １０×対物レンズ、温度−１８℃）。氷晶の像（約４００個の氷晶）を集め、ビデオカメラ（Sanyo CCD）を通じて画像保存および解析システム（LEICA Q520MC）にリレーした。
保存した氷晶像は、境界線に沿って線を引くことにより手動でハイライトし、次いでこれが結晶全体をハイライトした。次いで、ハイライトされた結晶の像を、最も長い直線（長さ）、最も短い直線（幅）、アスペクト比（長さ／幅）を完了するのに必要な画素の数をカウントする画像解析ソフトウェアを用いて測定した。アイスクリームの１バッチの各氷晶についてのデータをスプレッドシートに取り入れて、ここでデータのセットの解析を行って平均および標準偏差を見出した。
アイスクリーム硬度の測定は、Hounsfield H10KMユニバーサルテスター、Hounsfield 100Nロードセルおよび１０cmシリンダー状ステンレススチールプローブを用いて行った。アイスクリーム試料は、−１８℃に設定したProlan温度制御キャビネット中で４８６mlのアイスクリームブロックを１６時間インキュベートすることにより調製した。
アイスクリームブロックをProlan温度制御キャビネットから取り出し、Hounsfield H10KMユニバーサルテスターに置いた。１０cmシリンダー状プローブをアイスクリームブロックに４００mm／分の一定速度で２０mmの深さまで押し込んだ。加圧の間に記録された最大力を用い、アイスクリーム硬度として表現した。試料の亀裂または破砕が観察された場合、これは、右側の欄に示した。
以下の結果が得られた。
0004175520.tif 000012
以下の結論を導くことができる：
a)  最初の氷晶サイズは、ニンジンＡＦＰを含有するアイスクリームの方が小さく、したがってニンジンＡＦＰは再結晶を阻害する。
b)  ニンジンＡＦＰアイスクリーム中の氷晶は、その再結晶化過程において遅延される。
c)  ニンジンＡＦＰアイスクリーム中の氷晶形は、従来のアイスクリームにおいて見られる結晶形と有意に異ならない。
d)  ニンジンＡＦＰを含有するアイスクリームの物質特性は、従来のアイスクリームについて記されているものから改変されている。すなわち、アイスクリームは従来のアイスクリームより硬いが、それでもなお例えば魚ＡＦＰを含有するアイスクリームよりは柔らかい。第二に、ニンジンＡＦＰを含有するアイスクリームは、破砕することが観察された。
GeraniumまたはJuncus squarrosusを用いて同様によい結果を得ることができる。
実施例IX
この例では、ウィンターライからの種々のタンパクの単離およびそれらの試験を記載する。
３０日間寒冷気候順化したライ植物からの葉を、３cmの長さに切り、蒸留水中で充分に洗浄して細胞内容物を除去した。葉の片をペーパータオルでパット乾燥し、５mMＥＤＴＡ、１０mMアスコルビン酸、２mMカプロン酸、２mMベンズアミジンおよび１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の抽出媒体中に完全に浸漬した。次に、これらを、６０分間ブフナーフラスコ中に真空浸透させ、その後、葉を取り出し、完全にパット乾燥した。次に、これらをカットオフプラスチックシリンジ筒中に縦に配置し、２，０００×gで３０分間穏やかに遠心した。アポプラスチック抽出物をシリンジの下のエッペンドルフチューブに集めた。
このアポプラスチック抽出物を、ＰＭ１０膜を有するAmicon限外ろ過器を用いて７倍濃縮した。最初の精製は、５０μlの濃縮アポプラスチック抽出物をＳＭＡＲＴ分離システムでサイズ排除スーパーデックス７５ＰＣ３．２／３．０（分離域３〜７０kDa）カラム（共にPharmacia）上に適用することによって行った。緩衝液は、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５であった。分離は、流速５０μl／分で行い、５０μlの画分を２．５mlの容量まで集め、実施例Ｉに記載したように再結晶についてアッセイした。
活性画分を、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５で平衡化した強力アニオン交換MonoQ  ＦＰＬＣカラム（Pharmacia）に適用し、０．５Ｍまでの塩化ナトリウムの直線状グラディエントを含む同じ緩衝液を用いてタンパクを溶出した。溶出緩衝液を２５分間にわたって０．５M  ＮａＣｌの濃度まで添加して、１０分間維持し、１５分間にわたって０Mに減少させた。流速１ml／分でクロマトグラフィを行い、１mlの画分を集めた。実施例Ｉにしたがった試験において陽性であった画分を、７，０００rpsのCentricon PM10遠心濃縮器で容量が５０μlに減少するまで濃縮し、再びＳ７５カラムに適用した。実施例Ｉの試験を満足した画分は、約１５０mM塩の単一ピークであった。
この活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した（実施例VIIと同様の方法論）。これにより、３２kDaが活性画分であることが確認された。
ウィンターライタンパクのこの３２kDa画分は、冷凍菓子製品の製造において有利に用いることができる。