(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる数の電極針を有する複数の電極アプリケータを受容することが可能な電気穿孔治療装置のための電極針アドレススキームを自動的に設定するためのシステムであって、
ａ）複数の電極針および型識別要素を有する電極アプリケータであって、該型識別要素が少なくとも電極針の数を表すものと；
ｂ）電極アダプターが該電気穿孔治療装置に接続されたとき、該型識別要素から電極針の数を決定するため、該電気穿孔治療装置に設けられた回路と；
ｃ）その決定した電極針の数をアドレスするよう該電気穿孔治療装置を設定するための回路と；
を具備してなるシステム。
【請求項２】
異なる複数の電極アプリケータを受容することが可能な電気穿孔治療装置のための電気的治療パラメータを自動的に設定するためのシステムであって、
ａ）針電圧設定値、パルス長またはパルス形状の、該電極アプリケータで用いられる電気的治療パラメータの少なくとも１つを表す型識別要素を有する電極アプリケータと；
ｂ）電極アダプターが該電気穿孔治療装置に接続されたとき、該型識別要素から電気的治療パラメータを決定するため、該電気穿孔治療装置に設けられた回路と；
ｃ）その決定した電気的治療パラメータに該電気穿孔治療装置を設定するための回路と；
を具備してなるシステム。
【請求項３】
異なる数の電極針を有する複数の電極アプリケータを受容することが可能な電気穿孔治療装置において電極針アドレススキームを自動的に設定するための電極アプリケータであって、
ａ）電気穿孔療法のため形成された複数の電極針と；
ｂ）該電気穿孔治療装置に電気的に接続されるべく形成され、少なくとも電極針の数を表す型識別要素と；
を具備してなり、
電極アダプターが該電気穿孔治療装置に接続されたとき、該型識別要素が該電気穿孔治療装置に与えられ、決定した電極針の数をアドレスするよう該電気穿孔治療装置を自動的に設定可能にしたことを特徴とする電極アプリケータ。
【請求項４】
異なる複数の電極アプリケータを受容することが可能な電気穿孔治療装置のための電気的治療パラメータを自動的に設定するための電極アプリケータであって、
ａ）電気穿孔療法のための複数の電極針と；
ｂ）該電気穿孔治療装置に電気的に接続されるべく形成され、針電圧設定値、パルス長またはパルス形状の、該電極アプリケータで用いられる電気的治療パラメータの少なくとも１つを表す型識別要素と；
を具備してなり、
電極アダプターが該電気穿孔治療装置に接続されたとき、該型識別要素が該電気穿孔治療装置に与えられ、決定した電気的治療パラメータをアドレスするよう該電気穿孔治療装置を自動的に設定可能にしたことを特徴とする電極アプリケータ。
【請求項５】
ａ）電圧パルスの発生源と；
ｂ）異なる数の電極針を有する複数の電極アプリケータの１つのためのコネクターであって、各電極アプリケータが少なくとも上記電極針の数を表す型識別要素を含むものと；
ｃ）電極アダプターが該コネクターに接続されたとき、該型識別要素から電極針の数を決定するための回路と；
ｄ）その決定した電極針の数をアドレスするよう該電気穿孔治療装置を設定し、発生した電圧パルスをアドレスされた電極針へ供給するための回路と；
を具備してなる電気穿孔治療装置。
【請求項６】
電圧パルスの発生を制御するための遠隔治療活性化装置をさらに具備してなる請求の範囲５の電気穿孔治療装置。
【請求項７】
該遠隔治療活性化装置が足踏みスイッチからなる請求の範囲６の電気穿孔治療装置。
【請求項８】
ａ）針電圧設定値、パルス長またはパルス形状の少なくとも１つからなるプログラム可能な電気的治療パラメータを有する電圧パルスの発生源と；
ｂ）電極針を有する複数の電極アプリケータの１つのためのコネクターであって、各電極アプリケータが選択された電気的治療パラメータを必要とし、さらに各電極アプリケータがそこで用いられる特定の電気的治療パラメータを表す型識別要素を含むものと；
ｃ）電極アダプターが該コネクターに接続されたとき、該型識別要素から特定の電気的治療パラメータを決定するための回路と；
ｄ）電気穿孔治療装置のための電気的治療パラメータを、上記の決定した特定の電気的治療パラメータへプログラムするための回路と；
を具備してなる電気穿孔治療装置。
【請求項９】
電圧パルスの発生を制御するための遠隔治療活性化装置をさらに具備してなる請求の範囲８の電気穿孔治療装置。
【請求項１０】
該遠隔治療活性化装置が足踏みスイッチからなる請求の範囲９の電気穿孔治療装置。
【請求項１１】
異なる複数の電極アプリケータを受容することが可能な電気穿孔治療装置のための針アレイ型パラメータを自動的に設定するための電極アプリケータであって、
ａ）電気穿孔療法のための複数の電極針と；
ｂ）該電気穿孔治療装置に電気的に接続されるべく形成され、針数、針間隔または針スイッチング・シーケンスの、該針アレイ型パラメータの少なくとも１つを表す型識別要素と；
を具備してなり、
電極アダプターが該電気穿孔治療装置に接続されたとき、該型識別要素が該電気穿孔治療装置に与えられ、決定した針アレイ型パラメータに対し該電気穿孔治療装置が自動的に応答可能にされたことを特徴とする電極アプリケータ。
【請求項１２】
異なる複数の電極アプリケータを受容することが可能な電気穿孔治療装置のためのアプリケータ用の特定のパラメータを提供するための電極アプリケータであって、
ａ）電気穿孔療法のための複数の電極針と；
ｂ）該電気穿孔治療装置に電気的に接続されるべく形成され、少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータの識別を与える型識別要素と；
を具備してなり、
電極アダプターが該電気穿孔治療装置に接続されたとき、該型識別要素が該電気穿孔治療装置に与えられ、決定したアプリケータ用の特定のパラメータに対し該電気穿孔治療装置が応答可能にされたことを特徴とする電極アプリケータ。
【請求項１３】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータ内の針の数である請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項１４】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータ内の針の間隔である請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項１５】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータのための針のスイッチング・シーケンスである請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項１６】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータの針に印加されるべき電圧設定値である請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項１７】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータの針に印加されるべきパルス長である請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項１８】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータの針に印加されるべきパルス形状である請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項１９】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータの貯蔵寿命である請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項２０】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータの使用限界である請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項２１】
電極アプリケータに固有のデータを記憶できる書き込み可能な能動回路を更に含む請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項２２】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータの貯蔵寿命であり、貯蔵寿命を超えたときのための貯蔵寿命ロックアウト・コードが書き込み可能な能動回路に記憶されている請求の範囲１２の電極アプリケータ。
【請求項２３】
該少なくとも１つのアプリケータ用の特定のパラメータが電極アプリケータの使用限界であり、使用限界を超えたときのための使用限界ロックアウト・コードが書き込み可能な能動回路に記憶されている請求の範囲２２の電極アプリケータ。
【請求項２４】
該電極アプリケータのための使用履歴が書き込み可能な能動回路に記憶されている請求の範囲２２の電極アプリケータ。
【請求項２５】
捕捉エラー・コードが書き込み可能な能動回路に記憶されている請求の範囲２２の電極アプリケータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の背景
本発明は、一般的には、細胞の透過性を増加させるための電気パルスの使用に関し、特に、電気穿孔療法（ＥＰＴ）、また既知の細胞穿孔療法（ＣＰＴ）及び電気化学療法（ＥＣＴ）によって、生体内で、薬剤及び遺伝子の分配のための制御された電界を印加するための方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９７０年代に、細胞に致命的な損傷を与えることなしに孔を穿設できることが発見された。この発見によって、細胞の細胞質に高分子を注入することが可能となった。遺伝子や、薬理学的化合物等の分子は、電気穿孔法というプロセスを介して、生きている細胞に組み入れることが可能であることが知られている。遺伝子その他の分子は、緩衝媒体内の生きている細胞に混合され、高電界において短パルスが加えられる。この細胞膜は一時的に多孔性となり、遺伝子または分子が細胞の中に入り、これらは細胞のゲノムを改変する。
【０００３】
電気穿孔法の適用は、生体内で、一般的に、電極が配置される組織の皮膚に近接する組織または細胞に限定される。従って、別の方法として、体系的な薬物の投与や化学療法によって対処できる、例えば、腫瘍等については、一般的に、電気穿孔のために使用される電極を適用することができない。ある種のガンを化学療法で治療する際には、受け入れがたい程多くの通常細胞を壊死させることなく、ガン細胞を殺すための多量の薬物を使用する必要がある。もし、ガン細胞の内部に直接化学薬物を注入できれば、この目的は達成される。ある種の抗ガン剤、例えば、ブレオマイシンは、通常、効果的にある種のガン細胞の細胞膜を貫通することができない。しかし、電気穿孔法によって、ブレオマイシンを細胞の中に注入することが可能となる。
【０００４】
治療は、典型的には、抗ガン剤を直接腫瘍に注入し、一対の電極間の腫瘍に電界を形成することによって行われる。電界強さは、いかなる通常の細胞、すなわちすべての健全な細胞を損傷させることなく、または最小限の損傷に留めるように腫瘍の細胞に電気穿孔が行われるように、適切かつ精密に調整しなければならない。これは、電界が電極間に形成されるように、外部腫瘍に対してその対向する電極の位置とすることによって通常容易に行うことができる。電界が均一の場合には、電極間の距離を計測することができ、式  Ｅ＝Ｖ／ｄに応じた適当な電圧を電極に加えることができる（Ｅは電界強度で単位はＶ／ｃｍ、Ｖは電圧で単位はボルト、そして、ｄは距離であって単位はｃｍである）。大きな、すなわち内部の腫瘍を治療する場合には、適当に電極を配置し、これらの間の距離を計測するのは容易ではない。上記本出願の親出願は、生体内で、腫瘍に挿入できる電極を用いた電極システムを開示している。関連する米国特許第５，２７３，５２５号において、電極としても機能する注入針として利用できる、電気穿孔のために分子及び高分子を注入する注射器が開示されている。この構成によって、電極を表面下に位置させることが可能となる。
【０００５】
細胞穿孔療法を使用した目的物の治療によって、典型的には制ガン剤または細胞毒性剤の適用に関連する有害な影響を回避する手段を提供することができる。そのような治療によって、周囲の健全な細胞または組織への影響を回避しながら、選択的に、好ましくない細胞を損傷させ、または殺傷することができる薬剤を提供することができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
予め選択された組織に所定の電界を形成するため、便利かつ効果的に位置決めすることのできる改良装置を提供することが第１の目的である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の特徴に対応して、患者の身体の一部に電気穿孔を提供するための本発明にかかる電極装置は、支持部材と、組織に挿入するため、前記支持部材に、互いに選択された位置及間隔で搭載された複数の針電極と、所定の強度の電界を形成するため、前記両電極の間の距離に比例した電極への電気信号を提供するための前記距離信号に応答する信号発生器を含む手段とで構成される。
本発明は、治療物質を組織に注入するように機能するとともに、前記組織の細胞の部分に電界を形成する電極としても機能する針を含む。
【０００８】
本発明の一実施例には、治療電圧パルスを接点及び選択的な配列の変更パターンを決定する、抵抗や能動回路等の「キー」素子を有する針アレイ電極を含む臨床電気穿孔療法のためのシステムが含まれる（このシステムを有する装置はメドパルサ（MedPulser、登録商標）と呼ばれる）。電極配置を種々変更することによって、種々の組織サイトへのアクセス及び処置を行うことが可能となる。
本発明のもう一つの実施例では、最小限の侵襲を伴う電気穿孔治療法のため、内視鏡とともに用いられる腹腔鏡用針アプリケータが提供される。
本発明は、細胞、特に腫瘍細胞の治療のための針アレイ装置を利用した治療法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
概観
本発明は、電気穿孔法の治療への応用のための装置及び方法を提供するものである。この方法には、化学治療剤または分子の注入及びこれらの腫瘍への電気穿孔法が含まれる。特に、ある種の薬剤または分子が組織に注入され、電圧パルスが組織に配置された「針状」電極に付加される。すなわち、電界が組織の細胞に形成されるのである。後述するこの針状電極組立体は、試験管内または生体内で、腫瘍その他の組織の表面下に、またはその近傍に電極を位置決めすることができる。そのような治療方法は、電気穿孔治療法（ＥＰＴ）と呼ばれる。また、電気化学的治療法と呼ばれることもある。以下ではＥＰＴに焦点を当てているけれども、本発明は、生体のある種の臓器の遺伝子治療等の他の治療法にも適用することができる。
【００１０】
ＥＰＴの一般的な説明については、本出願の同時係属出願である、１９９５年９月２９日出願の出願番号０８／５３７，２６５号を参照されたい。この出願は、１９９５年６月６日出願の出願番号０８／４６７，５６６号の一部係属出願であって、この出願は、現在は放棄されたが、１９９３年４月１日出願の出願番号０８／０４２，０３９号の一部係属出願である。これらのすべては、本明細書に参考文献として記載されている。
【００１１】
電極組立体
図１は、本発明の一実施例にかかる針組立体１００を示す断面図である。この針組立体１００は、中空ステンレス鋼またはナイロン等の医療用プラスチック等で形成された細長い管状支持体すなわちシャフト１１２を備える。このシャフトが導電体で形成されている場合には、患者と内科医を保護するため、外側部分を電気的に絶縁する必要がある。シャフト１１２は、その末端部に複数の電極針１１４を含み、この電極針１１４はマルチ導電ワイヤケーブル１１６の各々の導体と結合する。この電極針１１４は、鋭利または鈍く形成され、中空または中実に所望の長さに形成される。電極針１１４の材質は、電気的に導体でなければならないが、金属で均一に形成する必要はない（例えば、金属被覆プラスチックまたはセラミック針のような合成物または層構造を使用することができる）。治療物質を注入するため、少なくとも１本の中空電極針１１４を使用することができる。別の実施例では、電極針１１４は、矩形状、六角形状、または円形配置としている。しかし、他のパターンも適用することができる。
【００１２】
使用にあたって、マルチ導電ワイヤケーブル１１６は、高電圧発生装置に接続される。図示した実施例では、末端部近傍の摩擦Ｏリング１２０によって規制される伸縮自在シールド１１８が、電極針１１４を保護するとともに、露出させるため、シャフト１１２の本体に沿って前後に移動することができる。
【００１３】
図２ａ乃至図２ｅは、本発明にかかるいくつかの電極例を図式的に示すものである。図２ａ及び図２ｂは、直線的な本体を有する電極であって、異なる間隔で針２００が備えられる。例えば、図２ａの針は、直径０．５ｃｍのアレイを構成するが、図２ｂのものは直径１．４ｃｍのアレイを構成する。また、種々の本体寸法を採用することができる。例えば、図２ａの電極は、その本体に段付部が形成され、大径の後方部２０４に対して前方部２０２は小径に形成されている。図２ｂの電極は、本体２０６の径が均一に形成される。図２ａ及び図２ｂに示す電極は、特に表面の狭い腫瘍の治療に適する。
【００１４】
図２ｃ及び図２ｄは、電極の本体２０６に対して傾斜した針先端部２００を備えるものである、図２ｃは、針先端部が本体２０６に対して約４５゜傾斜したものを示している。図２ｄは、針先端部が本体２０６に対して約９０゜傾斜したものを示している。図２ｃ及び図２ｄに示す電極は、特に頭部及び頸部の腫瘍の治療に適する。
【００１５】
図２ｅは、本体の小径前方部２０２に対して傾斜した針先端部２００を備える、２重傾斜電極を示す。大径後方部２０４も傾斜している。図２ｅの電極は、特に喉頭の腫瘍を治療するのに適するが、身体の他の空隙部についても使用することができる。
【００１６】
図２ｆは、特に大きな腫瘍に適する電極を示す。針２０８の間隔は、例えば、０．６５ｃｍである。図２ｇは、特に、内部腫瘍の治療に適する電極を示す。針の間隔２０８は、例えば、１．０ｃｍである。
【００１７】
図２ａ乃至図２ｇにおけるいかなる別部材の配置要素（例えば、本体寸法、本体配置、頭部及び本体の角度等）についても好みに応じて組み合わせることができる。特別な寸法に合わせるとともに、針にアクセスするため、針組立体の他の配置を採用することも可能である。
【００１８】
ＥＰＴ装置
図３は、本発明の一実施例にかかるＥＰＴ治療装置３００を示す図である。電極アプリケータ３１２が、着脱可能に装置３００に接続され、電極アプリケータ３１２の選択された電極針３１４に選択的に電圧パルスを加える。装置３００によって出力される、パルス長さ、電圧レベル、及び電極針のアドレスまたは切り換えパターンのすべてについてプログラム化することができる。
【００１９】
表示装置３１６は、治療電圧設定ポイントを表示する。電極アプリケータ３１２にパルスを与えるための足踏みスイッチ３２０を使用可能とするため、遠隔治療能動結合部３１８が備えられる。この足踏みスイッチ３２０によって、内科医が、患者の組織内の電極アプリケータ３１２を位置決めするために両手を自由にしたまま装置３００を動作させることができる。
【００２０】
故障検出、電源入り、及び治療動作の完了を示すための指示ライト３２２が便宜のために備えられる。他の指示ライト３２４が、電極アプリケータ３１２が装置３００に接続されていることを積極的に示すため、及び針アレイの型を示すため（以下の説明を参照されたい）設けられる。装置を「休止」させるとともに、すべての装置の機能をリセットしてデフォルト状態に戻すため、スタンバイ／リセットボタン３２６が備えられる。治療を行うにあたって装置を準備するため、準備ボタン３２８が備えられる。「治療中」であることを際だって指示するための指示ライト３３０が、電極針３１４に電圧パルスが付加されていることを示す。さらに、装置３００は、ボタン押下、治療の開始または終了、治療中であること等を示すための音声指示器を備えることも可能である。
【００２１】
他の実施例では、装置３００は、心臓の鼓動を検出するフィードバックセンサに接続される。心臓の近くにパルスを印加すると、通常の心臓のリズムと干渉するおそれがある。パルスを鼓動の間の安全な期間に同期させることによって、そのような干渉の可能性を低減することができる。
【００２２】
図４は、図３の治療装置３００に使用される回路４００のブロック図である。交流電源入力モジュール４０２が、電気的に分離された電力を治療装置３００の全体に供給する。低圧直流電源４０４が、適当な電力を装置３００の制御回路に提供する。高圧電源４０６が、ＥＰＴ治療に必要な（例えば、数千ボルトまでの）適当な高電圧を提供する。高圧電源４０６の出力は、制御組立体４１０の制御のもとで種々の幅及び電圧のパルスを発生させるパルス電源組立体４０８に接続される。パルス電源組立体４０８は、高電圧スイッチアレイ４１２を介して針アレイコネクタ４１４に接続される。遠隔治療動作用足踏みコネクタ４１６によって、足踏みスイッチ３２０の取り付けが可能となる。
【００２３】
高電圧スイッチアレイ４１２によって、ＥＰＴに必要な高電圧が針組立体１００の電極の選択されたサブグループに付加される、ＥＰＴ治療用装置の以前の型のものでは、そのような電圧の付加は典型的には、手動の回転式「分配器」スイッチに含まれていたか、または、そのようなスイッチの駆動部に含まれていた。しかし、本発明では、すべてのスイッチは、電子的制御リレーによるものであって、種々のスイッチパターンにわたって、より高速で静かな切換を行うことができ、寿命が長く、より良く、より柔軟な制御を提供することができる。
【００２４】
図５は、図４に示す回路の高電圧スイッチアレイ４１２の１つの選択スイッチエレメント５００の図を示す。多くのそのような選択スイッチエレメント５００が、少なくとも取り付けられている針組立体１００の最も多い電極の数に見合うように備えられなければならない。各選択スイッチエレメント５００が、針組立体１００に供給される高電圧を制御するために備えられ、関係する電極の各極に電圧を提供する能力を有する。
【００２５】
特に、逆入力アンプ５０２ａに「負」の制御電圧が付加されると、関係する通常開アレイ５０４ａが閉じ、電極コネクタ５０６を介して結合する１対の電極にパルスを与えるための負の戻り通路が確立される。同様に、第２の逆入力アンプ５０２ｂに「正」の制御電圧が付加されると、関係する通常開アレイ５０４ｂが閉じ、電極コネクタ５０６を介して結合する１対の電極にパルスを与えるための正の戻り通路が確立される。
【００２６】
針アレイのアドレス
図３の装置３００は、可変数の電極針３１４を有する電極アプリケータ３１２を収容するように設計される。従って、好適例においては、ＡからＰまでに指定され、９つまでの矩形治療領域及びいくつかの種類の拡大された治療領域を形成する、１６種類までの異なる針をアドレスできるように開発がなされた。治療領域は、特別なパルスの間アドレスされる対向する対配置で構成される、少なくとも４本の針で構成される。特別なパルスの間、治療領域の２本の針は正極であって、他の２本は負極となる。
【００２７】
図６は、９つの矩形治療領域を形成する針のため、中心から時計回りに番号を付けられた好適な４×４マッピングアレイを示す図である。この好適例において、このマッピングアレイは、４本、６本、８本、９本及び１６本の針電極の配置を定義する。４針電極は、位置Ｆ、Ｇ、Ｋ及びＪ（治療領域１）で構成される。９針電極は、治療領域１〜４で定義される位置に位置決めされる。１６針電極は、治療領域１から９で定義される位置に位置決めされる。
【００２８】
図７ａは、本発明の一実施例にかかる２×２治療領域のパルスシーケンスを示す。いかなる４つのパルスも、図示されるように、円形の対向する針に各々正または負の電荷が与えられる。時計回り、反時計回りに進めることにより、そのような対の他のパターンもまた可能である。９針電極配置の場合には、好適な円形が１６パルスで構成される（４つのパルスの各々に４つの治療領域が存在する）。１６針電極配置の場合には、好適な円形は３６パルスで構成される（４つのパルスの各々に９つの治療領域が存在する）。
【００２９】
６針電極は、図７ｂ乃至図７ｄに示される円形または６角形配置で構成することができる。または、６針電極は、図６に示すような大規模配列のサブセットとして定義することができる。例えば、図６を参照すると、６針電極は、治療領域１〜２（または他の直線的な治療領域対）として定義される位置に配置された針の２×３の矩形配置として定義することができるか、（図６において点線で描かれている）拡大治療領域を定義する針Ｂ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｉ、Ｅ（または６角形を形成する位置にある他のすべての組）の６角形配置として定義することができる。同様に、８針電極は、８角形、または図６に描かれた大規模配置のサブセットを構成することができる。例えば、図６を参照すると、８針電極は、治療領域１、２または６（または治療領域の直線上のすべての３点）を定義する位置に配置された針の２×４配置、または拡大された治療領域を定義する針Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｏ、Ｎ、Ｉ、Ｅ（または８角形を定義する位置の他のすべての組）の８角形配置として定義される。
【００３０】
図６ｂ乃至図６ｄは、６角形配置及び可能な動作シーケンスの一例を示す。図６ｂは、第１シーケンスを示し、第１パルスにおいて、針Ｇ及びＫは正であって、針Ｉ及びＥは負であって、次のパルスで逆の極性となり、針Ｂ及びＮは、点線の外隔線で示されるように能動的でない。図６ｃは、第２シーケンスを示し、第１パルスにおいて、針Ｋ及びＮは正であって、針Ｅ及びＢは負であり、次にパルスにおいて逆の極性となり、針Ｇ及びＩは能動的でない。図６ｄｅは、第３シーケンスを示し、第１パルスにおいて、針Ｎ及びＩは正であって、針Ｂ及びＧは負であって、次のパルスで逆の極性となり、針Ｋ及びＥはに能動的でない。シーケンスの１周期において全部で６パルスが印加される。同様の動作シーケンスを８角形配置にも使用することができる。
【００３１】
物理的配置にかかわらず、本発明の好適例は、ＥＰＴを行っている間組織に比較的均一な電界を形成するため、常に、（例えば、図７ａに示すように）少なくとも２つの変更可能な電極対を使用する。電界強さは、電気穿孔法による工程を効果的なものとするため、治療薬の注入を可能とするに十分な強度とすることが必要である。
【００３２】
電極アプリケータの自動確認
上記マッピング技法によって、同じ装置３００に連結される、異なる電極アプリケータ３１２を連結することが可能となる。電極針３１４の数は可変であるため、本発明には、適当な数の電極針３１４をアドレスするため、自動的に装置３００を配置する手段が含まれる。一実施例においては、各電極アプリケータ３１２には、「キー」抵抗のように、装置３００が電極針３１４の数を決定することができ、適合するアドレススキームを設定するようにする埋め込み式の確認エレメントが含まれる。電極アプリケータ３１２が装置３００に連結されたときに、装置３００は型確認エレメントを読む。この型確認エレメントを、電極アプリケータ３１２のコネクタに組み入れることも可能であり、割り当てられたまたは専用の電気結合を介してアクセスすることができる。
図示例として、次の表には、電極針３１４の番号と抵抗値が示されている。
0004180285.tif 000002
装置３００の治療電圧を自動的に設定するため、同様の技術を使用することができる。すなわち、各電極アプリケータ３１２は、特定の電極アプリケータ３１２のための治療パルスの適当な電圧レベルを決定するため、「キー」抵抗等の埋め込み式の電圧確認エレメントを含む。電極アプリケータ３１２が装置３００に連結されたときに、装置３００は、電圧確認エレメントを読む。
図示例として、次の表には、設定電圧に対する抵抗値が示されている。
0004180285.tif 000003
型及び電圧の確認に、同一または異なる確認エレメントを使用することもできる。確認エレメントの性質を変更することもできる。例えば、種々の変数として記憶させたデジタル値またはアナログ値を伴う電子回路を各電極アプリケータ３１２に組み入れることも可能である。電極アプリケータ３１２にコード化される情報の例としては、針の数、針の間隔、針アレイの幾何学的配置及び／または針の変換シーケンス等の針アレイ型を示すパラメータ、電圧設定値、パルス長さ及び／またはパルス形状等の電気パルスパラメータ、貯蔵寿命、使用期限等がある。電極アプリケータ３１２がデータを記憶することのできる書き込み可能な能動回路（例えばＮＶＲＡＭ）を使用する場合には、電極アプリケータ３１２にコード化される他の情報として、貯蔵寿命による廃棄（すなわち、その貯蔵寿命が終わった場合には電極アプリケータ３１２の使用を不可とするコード）、使用回数及び廃棄（すなわち、電極アプリケータ３１２が使い捨てとして設計されている場合に、使用回数が許容限度を超えると電極アプリケータ３１２の使用を不可とするコードであって、この特徴によって再使用による汚染を回避することができる）、使用履歴（例えば、印加されたパルスの回数、印加した日及び時間等を記憶したログ）、及び例えば、電極アプリケータ３１２が製造業者に戻し、そのアプリケータまたは装置３００の故障モードを解析することができるようにする）エラーコードの捕捉等がある。
【００３３】
廃棄は、アプリケータの使用開始からの時間及び単一の装置での治療実施回数によって決定される。これは、使い捨てアプリケータの「キー」エレメント能動回路に、装置への最初の結合に関する時刻スタンプを押印し、その期限を越えて使用しないようにすることで達成される。廃棄を決定する期間は、１回の手術手順の最大実施時間に基づいて決定されるべきである。
【００３４】
さらに、「キー」エレメントの使用法には、製造及び品質管理情報を含めることができる。そのような情報の一例としてロットコードがある。また、それによって、試験していない材料を使用しないこと、例えば、製造検査に合格した後にのみ装置を使用することを義務づけることによって、装置の品質管理を援助することができる。
【００３５】
腹腔鏡用針アプリケータ
内部腫瘍の治療に特に有用な本発明の一実施例として、侵襲を最小限に押さえるため、ＥＰＴ腹腔鏡用針アレイと内視鏡検査システムを組み合わせたものがある。図８は、従来の内視鏡検査システム８００を示す図である。光源８４０からの光が、公知の要領で光ファイバ伝送路８４２を介して内視鏡８４４に伝達される。組織は内視鏡８４４の末端部から放射される光によって照明される。反射光内視鏡８４４の末端部で集光され、光カプラ８５０を介して、アイピース８４６またはビデオカメラ８４８に伝達される。ビデオカメラ８４８からの信号がビデオカセットレコーダ８５２に記録されるか、ビデオモニタ８５４に表示され、あるいはこれらの両方を行うことができる。
【００３６】
図９ａ及び図９ｂは、図８の内視鏡８４４の末端部を改良したものの部分透視側面図であって、本発明にかかる伸縮針アレイ９６０の詳細を示すものである。可動シース９６２が内視鏡９４４及び針アレイ９６０を覆っている。図９ａは、延伸位置にあるシース２６２を示し、この位置で内視鏡９４４及び針アレイ９６０を完全に覆っている。図９ｂは、収縮位置にあるシース９６２を示し、内視鏡９４４及び針アレイ９６０を露出させている。（好適例では、可動シース９６２を使用しているが、シース９６２と内視鏡９４４との間の相対運動が可能であれば足り、内視鏡９４４を可動エレメントとすることも可能である。）
好適例では、針アレイ９６０は、少なくとも２本の電極針９６４を含み、各々は電源（図示しない）に結合され、少なくとも１本は中空であって、管９６６を介して薬剤供給装置（図示しない）に結合される。電極針９６４の先端は、好適には、内視鏡９４４の末端部を越えて延設されるように位置し、これによって、電極針９６４が組織に注入される間、組織サイトを内視鏡９４４によって観察することができる。
【００３７】
各電極針９６４は、圧縮メカニズム９６８に連結される。図示の例では、圧縮メカニズム９６８は、各電極針９６４のために、内視鏡９４４及び第１延長アーム９７４に沿って自由に移動することのできる回転可能なスライドベース９７２に連結される支持アーム９７０を有する。各第１延長アーム９７４は、回転可能に、内視鏡９４４に取り付けられた固定ベース９７６、及び対応する電極針９６４に連結される。第２延長アーム９７７は、（支持アーム９７０を有しないが）第１延長アーム９７４と同様に構成され、後述のように、配置されたときに電極針９６４の安定を増すために提供される。
【００３８】
シース９６２が延伸位置にあると、電極針９６４は互いに近接する位置にある。使用方法によって、この近接の程度は、特定の電圧にとって好ましいものであるが、他の場合には電極針９６４より離間されていることが必要である。
【００３９】
従って、好適例では、シース９６２が収縮位置に移動すると、圧縮エレメント９７８（例えば、ばね）が各スライドベース９７２を固定ベース９７６から離れる方向に付勢し、各支持アーム９７０が結合された第１延長アーム９７４を引っ張って展開させる。この収縮力によって、延長アーム９７４、９７７が内視鏡９４４から離れて展開位置に向かうように回転し、これによって、図９ｂに示すように電極針９６４間の間隔を増加させる。
【００４０】
シース９６２が延伸位置に移動すると、シース９６２は電極針９６４とともに押圧し、延長アーム９７４、９７７を折り畳む。これによって、第１延長アーム９７４が、各支持アーム９７０が結合された第１延長アーム９７４を引っ張って展開させる。各支持アーム９７０の収縮力によって、各スライドベース９７２が固定ベース９７６に向かって移動して被覆配置となり、図９ａに示すように、圧縮エレメント９７８を押圧する。
【００４１】
電極針９６４を分離するため、内視鏡９４４と電極針９６４との間に配置され、最も広い部分が内視鏡９４４の末端部に位置する（発泡体、ゴム等の）圧縮可能な弾性体で形成されたウェッジ（または中空の円筒円錐）他の圧縮メカニズム９６８を使用することができる。シース９６２が収縮位置にあるときには、ウェッジの基端部にあるときよりも末端部にあるときの方が弾性体が膨張し、これによって電極針９６４の間隔が増加する。さらに、圧縮メカニズム９６８によって電極針９６４のすべてを可動とする必要はない。例えば、他の電極針９６４が圧縮された位置と延長された位置との間を移動可能であって、内視鏡９４４に対して電極針９６４の一つが固定された位置にあり、展開配置にあるときに内視鏡９４４に対して２本の電極針９６４が対象に配置されている場合には、電極針９６４間の十分な間隔を提供することができる。
いずれの場合でも圧縮メカニズム９６８は電極針９６４間を電気的に絶縁しなければならず、これによって非導電性プラスチックのように、全体または一部を好適に絶縁することができる。
【００４２】
腹腔鏡の好適例には内視鏡が含まれるが、ある実施例では、内視鏡とは別体の腹腔鏡針アレイを使用することができる。この配置では、内視鏡９４４の支持ロッドを図１５ａ、図１５ｂに示すもので代用することができる。
【００４３】
電界パラメータ
発生する電界の性質は、組織の性質、選択された組織の寸法及びその位置によって決定される。電界はできるだけ均一で適正な強さであることが好ましい。電界強さを強くしすぎると、細胞を溶解させることとなり、一方、弱すぎると、効力が低下する。電極は、種々の要領で搭載され、操作されるが、親出願に記載されているものに限定されない。電極は、便利に鉗子上で、または鉗子によって内部位置に操作してもたらされる。
【００４４】
パルス発生器によってもたらされる電気信号の波形は、指数関数的に減衰するパルス、矩形パルス、単一極性発振パルス列、二極性発振パルス列、またはこれらの波形を組み合わせた形とすることができる。通常の電界強さは、約１０Ｖ／ｃｍから約２０ｋＶ／ｃｍとすることができる（通常の電界強さは電極針間の電圧をこれらの間の距離で割ることにより決定される）。パルス長さは、約１０μ秒から１００ｍ秒とすることができる。パルスの数は所望のもとすることができるが、典型的には１秒当たり１００パルスとすることができる。パルスセットの待ち時間は所望の時間とすることができ、例えば１秒とすることができる。波形、電界強さ及びパルス長さはまた、細胞の型及び電気穿孔を介して細胞に注入される分子の型にも依存する。
【００４５】
既知のすべての細胞の電気穿孔に必要な電界強さを含む種々のパラメータが、これらを主題とする調査報告書及び本出願の譲受人である、カリフォルニア州サンディエゴのGENETRONICS INC.によって管理されるデータベースから入手可能である。ＥＰＴ等の生体内の細胞の電気穿孔に必要な電界は、一般的に、試験管内の細胞に必要な電界の強さと同じである。本発明者の近年の調査によって、好適な強さの範囲は、１０Ｖ／ｃｍから約１３００Ｖ／ｃｍである。この範囲の最高の範囲は、約６００Ｖ／ｃｍであって、科学的な出版物において報告されている他の生体内実験によって証明されている。
【００４６】
通常の電界は、「高」または「低」を指定することができる。好適には、高電界を使用する。通常の電界は約７００Ｖ／ｃｍから１３００Ｖ／ｃｍであって、より好適には、約１０００Ｖ／ｃｍから１３００Ｖ／ｃｍである。低電界を使用する際には、好適には、通常の電界は約１０Ｖ／ｃｍから１００Ｖ／ｃｍであって、より好適には、約２５Ｖ／ｃｍから７５Ｖ／ｃｍである。特定の実施例では、電界が低いときには、パルス長さを長くするのが好適である。例えば、通常の電界が約２５〜７５Ｖ／ｃｍの場合には、パルス長さを約１０ｍ秒とするのが好適である。
【００４７】
本発明にかかる治療方法は、好適には、患者の身体の一部に対して電気穿孔を適用するための電極装置を提供するため、支持部材と、この支持部材に搭載され、選択された部位の組織内に注入され、互いに離間して配置された複数の針電極と、本発明にかかる装置と、所定強さの電界を発生させるため前記電極間の距離に比例する電気信号を電極に印加するための前記距離信号に応答する信号発生装置を含む手段を利用する。
【００４８】
代替策として、本発明にかかる治療方法（例えば、低電圧長パルス治療）に、他のシステム、例えば、矩形波パルス電気穿孔システムを利用することができる。例えば、カリフォルニア州サンディエゴのGENETRONICS INC.から入手可能なエレクトロスクウェアポレータ（Electro Square Porator）（Ｔ８２０）を使用することができる。矩形波パルス電気穿孔システムによって、設定電圧まで迅速に上昇し、設定された時間（パルス長さ）そのレベルを維持し、そして迅速に０に低下する、制御された電気パルスを提供する。この型のシステムによって、指数関数的に減衰するシステムに比較して、伝送効率のより良い植物の原形質体及び哺乳動物の細胞ラインの電気穿孔を提供することができる。
【００４９】
エレクトロスクウェアポレータ（Ｔ８２０）は、商業的に入手しうる最初の３０００ボルトまで発生させることのできる矩形波パルス電気穿孔システムである。パルス長さは５μ秒から９９ｍ秒である。矩形波電気穿孔パルスは、高い細胞生育力を提供することのできる、より穏やかな効果を細胞に与えることができる。
【００５０】
Ｔ８２０型エレクトロスクウェアポレータは、高電圧モード（ＨＶＭ）（１００〜３０００ボルト）及び低電圧モード（ＬＶＭ）（１０〜５００ボルト）の両方において動作させることができる。ＬＶＭにおけるパルス長さは約０．３〜９９ｍ秒であって、ＨＶＭにおけるパルス長さは約５〜９９μ秒である。Ｔ８２０は、１〜９９パルスの多パルス発生能力を備える。
【００５１】
治療方法
本発明にかかる治療方法には、細胞または組織に高分子を提供するための本発明にかかる装置を使用し、ここでもまた電気穿孔治療法（ＥＰＴ）と呼ばれる電気治療法が含まれる。前述のように、用語「高分子」または「分子」は、ここでは、薬剤（例えば、化学治療剤）、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）、抗体を含むペプチド及びポリペプチドを指す。ポリペプチドという用語には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列が含まれる。
【００５２】
本発明にかかる方法に使用されることを意図される薬剤は、典型的には、抗腫瘍または細胞毒性の効果を有する化学治療剤である。そのような薬剤または化学治療剤には、ブレオマイシン、ネオカルシノスタチン、スラミン、ドキソルビシン、カルボプラチン、タクソール、マイトマイシンＣ及びシスプラチンが含まれる。その他の化学治療剤は、本発明の属する技術分野における熟練者には公知であろう（例えば、メルクインデックスを参照されたい）。さらに、「膜機能」剤もまた本発明にかかる方法に含まれる。これらの化学治療剤はまた、上述の薬剤か、または、主に細胞膜を損傷することによって機能する薬剤である。膜機能剤の例としては、Ｎ−アルキルメラミド及びパラクロロ水銀ベンゾエートがある。この薬剤の化学組成によって、電気パルスの印加に関連して薬剤の適用を行う最も適当な時間が決定される。例えば、特別な理論によって縛られることを希望するのではないが、低等電ポイントと有する薬剤（例えば、ネオカルシノスタチン、ＩＥＰ＝３．７８）は、電界内でより強く帯電した薬剤の静電的相互作用を回避するため電気穿孔後に適用された場合には、より効果的であるように思われる。さらに、そのような薬剤は、ブレオマイシンであって、負の極性の大きいログＰ（ここで、Ｐは、オクタノールと水との間の分配係数である）を有し、寸法的に大きく（ＭＷ＝１４００）、親水性であって、これによって脂質細胞膜に非常に近くなり、腫瘍細胞に非常にゆっくり拡散し、典型的には、電気パルスの前または実質的に同時に適用される。さらに、ある薬剤には、細胞により効果的に導入するため改良を要する場合がある。例えば、タクソール等の薬剤は、細胞により効果的に導入するため、水溶性が高くなるように改良する必要がある。電気穿孔法は、細胞膜に空隙を形成することによって、ブレオマイシンその他同等の薬剤を腫瘍細胞に導入するのを助長する。
【００５３】
一実施例では、本発明は、主体の組織細胞に分子を導入するため電気穿孔治療法を行うための方法であって、電極アレイを備え、組織を貫通するための１つの針配置を有する少なくとも１本の電極と、組織内に分子を導入するために選択された組織の針電極を挿入し、選択された組織に導電性に関連した電極アレイの第２の電極を位置決めし、組織の電気穿孔のために、電極に電極間の距離に比例した高電流電気信号のパルスを与える。試験管内、または生体内外で組織の電気穿孔を行うことができることを理解しなければならない。電気穿孔はまた、例えば、単一細胞浮遊、または試験管内または細胞培養における生体内外の単一の細胞を利用して行うこともできる。
【００５４】
本発明にかかる方法によって、分子の導入によって細胞内の遺伝子の発現を調整することが好ましい。「調整」という用語は、発現しすぎたときに、遺伝子の発現の超過を予見するか、発現が少ないときに、発現を高めることを意味する。細胞の増殖性異常が遺伝子の発現に関係する場合には、翻訳レベルの核酸配列を使用することができる。このアプローチでは、例えば、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸または三重化剤でマスクするか、それにリボザイムを付着させることにより、特定のｍＲＮＡの転写または翻訳をブロックするため、アンチセンス核酸、リボザイム、三重化剤を利用する。
【００５５】
アンチセンス核酸は、少なくとも特定のｍＲＮＡ分子（Weintraub、Scientific American、262:40,1990）の一部を補完するＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。細胞内で、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡに雑種を作り、二重らせん分子を形成する。細胞は、二重らせん構造のｍＲＮＡを翻訳しないため、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡを干渉する。目的の細胞内に導入するには、より大きな分子よりも、１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマが好適である。試験管内での遺伝子の翻訳を抑制するアンチセンス法の使用は公知である（Marcus-Sakura、Anal Biochem,172:289,1988)。オリゴマが二重らせんＤＮＡの回りに巻き付けられ三重らせんを形成するため、転写を停止させるオリゴヌクレオチドの使用は三重戦略として公知である。従って、これらの三重合成物は、選択された遺伝子の特別なサイトを認識するように設計することができる（Maherら、Antisense Res.及びDev.1(3):227、1991;Helen,C.,抗ガン剤調合6(6):569,1991）。
【００５６】
リボザイムは、ＤＮＡ規制エンドヌクレアーゼに類似の要領でＤＮＡ特に他の単一らせんＲＮＡを付着する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをエンコードしてヌクレオチド配列を改良することによって、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを付着する分子を作ることが可能となる（Cech、J.Amer、Med.Assn.,260:3030,1988）。このアプローチの大きな利点は、それらは配列が具体的であるため、特定の配列を伴うｍＲＮＡのみが不活性化されることである。
【００５７】
リボザイムには主に２種の基本形が存在し、その１つはテトラヒメナ型（Hasselhoff、Nature、334:585、1988）であり、もう１つは「シュモクザメ」型である。テトラヒメナ型リボザイムは、長さにおいて４つのベースの配列を認識し、シュモクザメ型リボザイムは長さにおいて１１〜１８のベース配列を認識する。認識配列が長ければ長い程、配列が目標のｍＲＮＡ種のみにおいて起こる可能性が高くなる。従って、特別のｍＲＮＡ種を不活性化するため、シュモクザメ型リボザイムはテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、１８ベース認識配列はより短い認識配列よりも好ましい。
【００５８】
本発明は、特定の遺伝子またはその不存在によってもたらされる細胞増殖性または免疫不全の治療のための遺伝子治療法をも提供する。そのような治療法は、障害を有する細胞にセンスまたはアンチセンスのポリヌクレオチドを導入することによって治療効果を達成することができる。ポリヌクレオチドの分配は、キメラウイルス等の組替発現ベクトルを使用することによって達成されるか、または、ポリヌクレオチドは、例えば、「裸の」ＤＮＡとして分配される。
【００５９】
ここで教示された遺伝子治療のために利用することができる種々のウイルスベクトルには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニア、または好適には、レトロウイルス等のＲＮＡウイルスが含まれる。好適には、レトロヴァイラルベクトルは、マウスまたは鳥類のレトロウイルスの誘導体である。単一の外部遺伝子を注入することのできるレトロヴァイラルベクトルの例としては、次に示すものがあるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺ガンウイルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉種ウイルス（ＲＳＶ）である。主体が人間の場合には、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）等のベクトルを利用することができる。種々の追加的なレトロヴァイラルベクトルを多重遺伝子に組み込むことができる。これらのベクトルのすべてが、変換された細胞の確認及び発生を可能とするため選択可能なマーカのために遺伝子を移動または組み入れることができる。
【００６０】
治療用ペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明にかかる治療法に含まれる。例えば、免疫調整剤及び他の生体応答調整剤を、細胞による組み入れのために導入することができる。ここで、「生体応答調整剤」という用語は、免疫応答を改良する際に含まれる物質を包囲することを意味する。免疫応答調整剤の例としては、リンフォカイン等の合成物が含まれる。リンフォカインには、腫瘍壊死因子、インターロイキン１、２及び３、リンフォトキシン、マクロファージ活性化因子、遊走素子因子、コロニー刺激因子、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、及びそれらの亜型が含まれる。
【００６１】
例えば、ファクタVIIIまたはファクタIX等の抗脈管形成剤を含む代謝酵素及びタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。本発明にかかる高分子もまた抗体分子を含む。ここで「抗体」という用語は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２等の無傷の分子及びそのフラグメントを意味する。
【００６２】
本発明にかかる方法における薬剤、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの適用は、例えば、腸管外において、注入、急速導入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収、口からの吸収によって行われる。腫瘍の場合には、例えば、化学治療剤等を、腫瘍に部分的に、組織的にまたは直接注入する。例えば、薬剤を直接腫瘍に適用するときには、薬剤を「開扇現象」の要領で行うのが有利である。「開扇現象」という用語は、腫瘍の全体にわたって薬剤を大量に分配することを目的として、薬剤を注入しているときに針の方向を変化させることにより薬剤を提供すること、または、ボーラスとしてよりもハンドファンを開くように多方向に注入することによって薬剤を適用することを意味する。本発明の属する技術分野において典型的に使用される容量に比較して、腫瘍全体にわたって薬剤を十分分配させるために薬剤を適用（注入）するときは、薬剤を含む溶液の容量を増加するのが好ましい。例えば、マウスを使用する例では、本発明の属する技術分野における熟練者は、典型的に５０μｌの薬剤を含む溶液を注入するが、容量を１５０μｌに増加することによって結果は大幅に改善される。人間の臨床治療研究では、腫瘍の適切な灌流を確保するため約２０ｍｌが注入された。好適には、注入は基部のまわりに開扇現象によって非常にゆっくりと行うべきである。腫瘍の中心部では、細胞間の圧力が非常に高いが、そこは腫瘍が頻繁に壊死する場所でもある。
【００６３】
好適には、分子は、実質的に電気穿孔治療と同時に適用される。「実質的に同時」とは、時間的に、分子と電気穿孔治療とが適当に短い間隔で適用されることを意味する。分子または治療剤の適用は、例えば、腫瘍の性質、患者の状態、分子の寸法及び科学的性質、分子の半減期等に応じていかなる間隔で行うことができる。
【００６４】
腸管外の適用の準備には、無菌の、水性または非水性溶液、浮遊剤、乳液が含まれる。非水性溶液の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、オレイン酸エチル等の注入可能な有機質エステル等がある。不活性希釈液の他に、そのような合成物には、またアジュバント、湿潤液、乳化剤、浮遊剤が含まれる。さらに、パルスを付加する前に局所的に治療剤を維持するため、血管収縮剤を使用することができる。
【００６５】
本発明にかかる方法によっていかなる細胞をも治療することができる。ここで図示した例は、例えば、膵臓、肺、頭、首、皮膚、皮下層ガン等の腫瘍細胞の治療のために本発明にかかる方法を使用する場合について説明したものである。他の細胞の増殖不全は、本発明にかかる電気穿孔法によって容易に治療することができる。「細胞増殖不全」という用語は、形態学的及び遺伝子的の両方において組織のまわりとは異なってしばしば現れる悪性及び良性の細胞集団を意味する。悪性細胞（すなわち、腫瘍またはガン）は、多くの過程を経て発現する。本発明にかかる方法は、特に、例えば、膵臓、頭、首の細胞（例えば、喉頭、鼻咽頭、中咽頭、下咽頭、唇、喉）及び肺、また、心臓、腎臓、筋肉、胸、結腸、前立腺、胸腺、精巣、卵巣等種々の臓器システムの悪性腫瘍その他の障害を治療するのに有用である。さらに、基底細胞ガンまたはメラノーマ等の皮膚の悪性腫瘍についてもまた、本発明にかかる治療法によって取り扱うことができる（例２を参照願う）。主体が人間であることが好適であるが、本発明はまた人間以外の動物またはほ乳類における獣医学的な使用にも有用である。
【００６６】
もう一つの実施例において、本発明は、損傷した、または死滅した細胞を中に含む主体の組織に電気穿孔を行う治療法を適用する方法を提供する。この方法には、電極アレイを提供し、選択された組織に導電性に関連した電極アレイの第２の電極を位置決めし、組織の電気穿孔のために、電極に電極間の距離に比例した高電流電気信号のパルスを与えることが含まれる。本方法は、好適には、追加的な細胞毒性のまたは化学治療剤の必要性を防止する低電圧及び長いパルス長さを利用する。例えば、好適には通常の電界は約２５Ｖ／ｃｍ〜７５Ｖ／ｃｍの間であり、パルス長さは約５μ秒から９９ｍ秒である。
【００６７】
次の例は、本発明に関するものであるが、本発明を限定するものではない。これらの例は使用されうるものとして典型的なものであって、本発明の属する技術分野における熟練者にとって公知の手順を代わりに使用することも可能である。
【００６８】
【実施例】
以下の実施例は細胞系、動物、ヒトにおけるＥＰＴの使用を説明するものである。ここで、実施例１は裸マウスの脇腹に皮下的に異種移植したみすぼらしく分化したヒトすい臓腫瘍（Ｐａｎｃ−３）におけるＥＰＴを説明するものである。実施例２は基底細胞癌腫および黒色腫の治療のためＥＰＴを用いヒトに対し臨床試験を行った結果を示す。実施例３は頭部および首部腫瘍の治療のためＥＰＴを用いヒトに対し臨床試験を行った結果を示す。実施例４は低電圧（電界）および長いパルス長を利用してＥＰＴについての生体外データを提供するものである。ＥＰＴについてのパラメータは実施例中に記載されている。すなわち、実施例１および頭部および首部臨床試験については公称電界は１３００Ｖ／ｃｍ、１秒間隔で９９−１００μ秒間で６パルスであった。臨床試験（実施例２）も同様のパラメータを用いたが、電界は１１３０Ｖ／ｃｍとした（公称電界（Ｖ／ｃｍ）は針対間の距離（ｃｍ）だけ分けられた針対間に電圧（Ｖ）が印加される）。これらの実施例は生体外および生体内における好ましくない細胞集合（例えば腫瘍）を効果的に死滅させるためのＥＰＴの使用を説明するものである。
【００６９】
実施例１−生体内での腫瘍治療のためのＥＰＴ
上述のようにファニングを用いながら、ブレオマイシン（０．１５ｍＬの食塩水中、０．５単位）を腫瘍内に注射し、ついで１０分後、上述のように直径１ｃｍの円の周りに沿って配列した針アレイ電極を用いて６つの矩形波パルスを印加し、単一の治療処置を行った。この針アレイは腫瘍の種々の大きさに適合させるため種々の直径（例えば、０．５ｃｍ，０．７５ｃｍおよび１．５ｃｍ）のものを使用することができる。また、種々の高さのストッパーをこの針アレイの中央に挿入することにより、針の腫瘍内への穿刺深さを変化させる。組込み機構により電極を切替えてパルス波が腫瘍を最大限にカバーすることができた。この電気的パラメータは、中央電界強度が７８０Ｖ／ｃｍ、１秒間に６×９９μ秒パルスであった。
【００７０】
その結果、殆ど全てのマウスの治療部位において著しい壊死および浮腫が認められた。治療グループ（Ｄ＋Ｅ＋；Ｄ＝薬剤、Ｅ＝電界）のマウスの腫瘍容積に実質的な減少（浮腫のため、最初に若干増大した後）が認められたが、対照グループ（Ｄ＋Ｅ−）では腫瘍容積は著しく増大した。腫瘍サンプルの組織学的分析の結果、Ｄ＋Ｅ＋グループにおいては壊死腫瘍細胞ゴーストが見られたのに対し、Ｄ＋Ｅ−グループにおいては生存細胞と壊死細胞の混合からなっていた。ヒト非微小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍を裸マウスに異種移植したもので予備研究したものでもブレオマイシンを用いＥＰＴ治療を行ったものは非常に期待できる結果が得られた。
【００７１】
腫瘍細胞系Ｐａｎｃ−３、つまりすい臓のみすぼらしく分化した腺癌細胞系がアンチ・キャンサー・インステチュート（サンジエゴ）により供給された。ＥＰＴ試験のため、ストック・マウスから採取した組織で腫瘍系が維持されているものを解かし、これをそれぞれ約１ｍｍの大きさの非常に小さい片に切断し、その８−１０片を裸マウスの左脇腹に形成された皮下嚢に外科的に異種移植した後、６．０縫合糸で閉じた。その平均腫瘍サイズが約５ｍｍに達した後、この触診可能な腫瘍を持ったマウスを無差別に分けた。対照グループ（Ｄ＋Ｅ−；Ｄ＝薬剤、Ｅ＝電界）として１０匹のマウス、ＥＰＴ治療のための１０匹のマウス、すなわちブレオマイシン注射についで、ＢＴＸ矩形波Ｔ８２０ジェネレータからのパルシング（Ｄ＋Ｅ＋）による治療を行うものに分けた。腫瘍寸法を測定し、下記式により腫瘍容積を計算した。
(II／６)×ａ×ｂ×ｃ
ここで、ａ，ｂおよびｃはそれぞれ腫瘍の長さ、幅および厚みである。
【００７２】
０．５単位のブレオマイシン（シグマ・ケミカル社）を０．９％ＮａＣｌ溶液０．１５ｍＬ中に溶解させ、対照グループ（Ｄ＋Ｅ−）および治療グループ（Ｄ＋Ｅ＋）の双方にファニングにより各マウスの腫瘍内に注射した。この注射１０分後、（Ｄ＋Ｅ＋）グループのマウスに、針アレイ電極のセットを備えたＢＴＸＴ８２０矩形波ジェネレータからのパルスを与えた。電気的パラメータは以下の通りであった。電界強度は１３００Ｖ／ｃｍ、１秒間に各９９μ秒の６パルスであった。
マウスは死亡率について毎日モニターし、病気状態の何らかのサインについて記録した。腫瘍の寸法を一定時間ごとに測定し、腫瘍成長退化／進行をモニターした。
【００７３】
図１０は、薬剤を用いたもの、用いないもの、Ｐａｎｃ−３腫瘍のためのブレオマイシンを用いパルシングを行ったもの、行わないものなどの種々の対照動物、治療動物についてのＥＰＴ結果を示している。腫瘍容積について、治療したマウスと治療しなかったマウスとの間に著しい差異が認められた。治療の約２４日後は検知可能な腫瘍は実質的に認められなかった。この図１０の結果を下記表１に４３日までの分について要約されている。腫瘍の実際の退化が図１３ａないし図１３ｄの連続図に示されており、対応する組織が図１４ａないし図１４ｃに示されている。
【００７４】
0004180285.tif 000004
このＰａｎｃ−３についての実験を非微小肺癌細胞系（ＮＳＣＬＣ）および１７７（アンチ・キャンサー・インステチュート，サンジエゴ、ＣＡ）を用いて繰返した。その結果は図１０に示すブレオマイシンを用いたＰａｎｃ−３についての実験の結果と同様であった。１つの実験において、再発した腫瘍を２７日目（図１２）に再治療したところ、７日後には腫瘍の痕跡は認められなかった。
【００７５】
Ｐａｎｃ−３およびＮＳＣＬＣを、薬剤ネオカルシノスタチン（ＮＣＳ）を用い、上記同様の手法に従って処置した。図１１ａに示すように、ＮＣＳのパルス前投与をブレオマイシンを用いた実験と同様にして行ったが、腫瘍の大きさを減少させる効果は全くなかった。これはＮＣＳの低い等電位点のため、静電的相互作用により薬剤が腫瘍細胞に入り込むことが妨げられたためと思われた。従って、最初にパルシングを行い、ついでパルス後ＮＣＳ注射を行うことにより実験を繰返した。
【００７６】
図１１ｂは、７匹の治療マウス（マウスＩＤ：１−７）について、最初の腫瘍容積（Ｉ）を１３日目での最終腫瘍容積（Ｆ）と比較したものが示されている。このマウスの幾つか（ＩＤ：１，２，４および７）については、腫瘍容積の増大が観察されたが、これは浮腫によるものと思えた。しかし、図２０ｄに示すように、５匹のマウスの別のグループを２３日目に検査したところ、全てのマウスは腫瘍容積の顕著な減少を示した。
図１１ａと図１１ｂとの比較からパルス後のＮＣＳの投与はパルス前のＮＣＳの投与よりも効果的であった。
【００７７】
この実施例は、裸マウスに皮下的に異種移植したみすぼらしく分化したヒトすい臓腫瘍（Ｐａｎｃ−３）および非微小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を、ブレオマイシンまたはＮＣＳおよび針アレイ電極を用いた本発明のＥＰＴ法により効果的に治療できること示している。なお、他の同様の化学治療剤でも本発明のこのＥＰＴ法を効果的に利用することができる。
【００７８】
ブレオマイシンを用いたＥＣＴに対するＰａｎｃ−３の応答が表２に示されている。治療したマウスの６８％（１７／２５）に治療後２８日後に完全な腫瘍の退化が観察され、２０％（５／２５）に部分的（８０％以上）退化が観察され、また８％（２／２５）には応答が認められず、４％（１／２５）が治療後２０日目に死亡した。治療後１２０日後でも６４％（１６／２５）が触診可能な腫瘍は観察されなかった。このグループからの代表的な動物（２／１７）についてモニターしたが、その後２４３日間、腫瘍は認められなかった。その後、これら動物は安楽死させた。これらマウスの内の８％について、治療後３５日目に腫瘍の再発が認められたが、その速度は非常に遅かった。
【００７９】
組織学的研究から、ＥＰＴを行ったグループについて腫瘍区域における著しい壊死が明らかに確認され、それに対し、対照グループについては壊死は明らかには認められなかった。ブレオマイシンをより多量に腫瘍内に注射し、これをファニングと組合わせ、腫瘍容積全体に最大限に均一に分散させることは、パルシングの前に薬を注射する従来の方法と比べて非常に効果的であることが見出された。
【００８０】
表２
ブレオマイシンを用いたＰａｎｃ−３の電気化学療法
治療後の日数      ２８  ３５  ５７  ８４  ９４  １２０
治療マウス数：２５
完全な退化(100%)   17    16    16    16    16     16
部分的退化 (≧80%)  5     3     3     3     3     3e
応答なし            2     2     1a    1     1c
死亡                1                 2b
腫瘍再発                        2           1d
再治療                          2
組織                      1
ａ，ｃ：腫瘍増大による負担のためマウスを死亡させる
ｂ：１匹は再治療後死亡、また１匹は触診可能な腫瘍はなかったが、６４日生存後に死亡
ｄ：二次的転移腫瘍
ｅ：繊維状組織
ＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（メドパルサー、登録商標）を用いた生体内試験結果
裸マウスの皮下に異種移植し成長させた腫瘍の治療をメドパルサー（登録商標、本発明の装置）を用いて行った予備的実験において良好な結果が得られた。メドパルサーおよびブレオマイシンを用い、ＥＰＴにより、ヒトすい臓癌異種移植（Ｐａｎｃ−４）の治療を行ったところ、観察３９日目までに治療したマウスの約７５％に完全な腫瘍の退化が認められた。同様にして、ヒト前立腺癌異種移植（ＰＣ−３）の治療を行ったところ、マウスの約６６％に完全な腫瘍の退化が認められた（治療後、６０日までに癌の再発は認められなかった）。ＥＰＴによる腫瘍の治療において、４および６針アレイが有効である。
【００８１】
ＰＣ−３の生体外実験でのＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（メドパルサー、登録商標）の４針アレイおよび６針アレイの比較
ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）に対する生体外でのＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（メドパルサー、登録商標）の４針アレイ対６針アレイの性能比較実験を行った。細胞をＲＰＭＩ媒体に懸濁させ、２００，０００細胞／ｍＬの割合で均一に接種を行った。ついで、２×１０−５Ｍのブレオマイシンを各ウェル（Ｄ＋Ｅ−およびＤ＋Ｅ＋のみ）に添加した。次に、メドパルサーに接続した６−針アレイおよび４−針アレイ電極を用いて２４ウェルプレートにおいて細胞を電気穿孔した。電気パルスのパラメータは６−針アレイについては６×９９μ秒、１１２９Ｖ、４−針アレイについては４×９９μ秒、８４８Ｖとした。ついで、細胞を９６ウェルプレートに移し、３７℃で２０時間培養した。細胞生存率は、ＸＴＴのホルマザンへの代謝変換に基づき、４５０ｎｍの波長で分光測光法的に測定されるＸＴＴ検査法を用いて判定した。細胞生存率の値は、サンプルのＯ.Ｄ.値、すなわち１００％細胞生存の対照（Ｄ−Ｅ−）および０％細胞生存の対照（Ｄ−Ｅ−、全ての細胞を溶解させるＳＤＳを用いた）から計算した相対値である。この細胞生存データは次の通りである。
【００８２】
表３
治療            平均生存率（％）    ＳＥ
Ｄ−Ｅ−              １００      ３．６５（ｎ＝６）
Ｄ＋Ｅ−            ２７．７１    １．０５（ｎ＝６）
Ｄ−Ｅ＋（４Ｎ）  １０１．１５    ４．３２（ｎ＝12）
Ｄ−Ｅ＋（６Ｎ）    ９７．７２    ４．３３（ｎ＝12）
Ｄ＋Ｅ＋（４Ｎ）      ４．７８    ７．５３（ｎ＝12）
Ｄ＋Ｅ＋（６Ｎ）    −４．１２    ０．５９（ｎ＝12）
この実験から得られた予備的データから、統計的に見ると、生体外における腫瘍細胞の死滅に対し、４−針アレイおよび６−針アレイの双方ともほぼ等しく有効であると思われる。
【００８３】
実施例２−基底細胞癌腫および黒色腫についての臨床試験
ブレオマイシン−ＥＰＴの腫瘍に対する有効性を、実施例１で使用したのと同様の腫瘍応答基準を用い８週間の終りまで検査した。
【００８４】
投与されたブレオマイシンの濃度は５Ｕ／１ｍＬであった。ブレオマイシンの投薬量は下記のようにして投与された。
【００８５】
0004180285.tif 000005
下記表５は治療に対する応答結果を示す
ＮＥ＝効果無し；腫瘍容積の減少は５０％未満
ＰＲ＝部分的応答；腫瘍容積の減少は５０％以上
ＣＲ＝完全な応答；身体検査および／または生検による判定の結果、腫瘍の全ての兆候が消滅した。
【００８６】
実施例３−頭部および首部の癌に対するＥＰＴ
下記の患者の全てに対しブレオマイシンの腫瘍内注射と、直径の異なる６個の針アレイとを用いて治療を行った。電圧は１３００Ｖ／ｃｍの公称電界強度を達成するようにセットした（針アレイの直径に対し１３００を掛け、設定されたジェネレータの電圧を与えるようにした）。パルス長は１００μ秒であった。
【００８７】
研究方法
この研究は単一中央実行可能性臨床研究として設計し、その中で病変内ブレオマイシン投与との組合わせによるＥＰＴ手法の有効性を従来の外科療法、放射線療法、および／または全身的化学療法と比較した。約５０個の研究被検体をこの研究に参加させた。全ての研究被検体は身体検査および生検により治療前に検査した。研究被検体の術後評価を４ないし６週間に亘り毎週ごと行われ、その後、１２ケ月に亘り毎月ごとに行われた。治療後約８ないし１２週間、腫瘍部位の生検を行った。ＣＴまたはＭＲＩ走査の使用を、ＨＮＣ被検体の標準医療追跡評価に従って利用した。
【００８８】
腫瘍の評価は、腫瘍の径（センチ）の測定、その容積（立方センチ）の見積りが含まれている。ブレオマイシン・スルフェートの腫瘍内投与の前に腫瘍部位を１％リドカイン（キシロカイン）および１：１００，０００エピネフィリンを用い麻酔にかける。注射されたブレオマイシン・スルフェートの濃度は１ｃｃ当たり４単位とし、腫瘍当たりの最大投与量を５単位とする。１被検体当たり１腫瘍を超えて治療する場合、１被検体当たり全体として２０単位を超えないようにする。ブレオマイシンの投与量を計算された腫瘍容積１ｃｍ２ 当たり１単位とする。ブレオマイシン・スルフェートを注射した後、ほぼ１０分経たとき、アプリケータを腫瘍上に置き、電気的パルスを開始する。電気的パルスの各印加または開始をシーケンスとして参照する。このＥＰＴの使用は被検体が必要とする後の緩和治療に対し禁忌とはならない。
【００８９】
この研究において、１６週間以内にかなりの腫瘍退化が認められ、かつ、伝統的療法で見られる主な副作用を生じさせない場合を成功と定義づけた。可能な応答結果としては下記の３つの場合が存在する。
＊完全な応答（ＣＲ）：身体検査および／または生検による判定の結果、腫瘍の全ての兆候の消滅
＊部分的応答（ＰＲ）：５０％以上の腫瘍容積の減少
＊応答なし（ＮＲ）：５０％未満の腫瘍容積の減少
腫瘍の大きさが増大した場合（２５％腫瘍容積）、必要とする場合は、他の療法が被検体の望みに応じて始められる。
【００９０】
治療に対する被検体の応答
表６は治療に対する被検体の応答を示している。３個の被検体は完全な応答を示した（被検体Ｎｏ．１、３および４）。４個の被検体は部分的応答を示した（被検体Ｎｏ．２、６、８および９）。２個の被検体は応答を示さなかった（被検体Ｎｏ．５および７）。３個の被検体は病気の進行またはこの研究治療に関係のない合併症が原因で１２週に達する前に死亡した（被検体Ｎｏ．２、５および７）。この３個の被検体の内、１個の被検体（Ｎｏ．２）は４週目でＰＲを達成した。２個の被検体はこの研究へ加わる前にそれらの腫瘍について臨床的癌治療を全く受けていなかった（被検体Ｎｏ．４および８）。３個の被検体は装置のアプリケータ部分に完全にアクセスさせることができなかったため、分割的な治療が施された（被検体Ｎｏ．５、７および９）。
表７はブレオマイシン・スルフェートおよび本発明の装置、メドパルサーを用いたＥＰＴを適用して行われた臨床試験の要約を示している。
【００９１】
表６
ブレオマイシン・スルフェート／ＥＰＴに対する応答
被検体  前の治療  治療の  応答時間  応答状態  最後の
No./記号            週    （週）              臨検
１／J-S Ｓ      ０        ２，８    PR,CR     ２２
２／G-C Ｒ      ０，４    ４        PR          ４
３／L-O Ｒ      ０        ３        CR        １６
４／G-R なし    ０，４    ４，９    PR,CR       ９
５／R-H Ｒ      ０，４    ｎａ      NR**        ４
６／C-B Ｒ      ０，１２  ２        PR        １２
７／C-J  S,R,C  ０        ｎａ      NR**        １
８／L-J なし    ０，６    ４        PR          ９
９／J-T  S,R,C  ０，７    ７        PR**        ７
（注）
（Ｓ）外科療法、（Ｒ）放射線療法、（Ｃ）化学療法；ＰＲ−部分的応答；ＣＲ−完全な応答；ＮＲ−応答なし；＊＊分割療法。
【００９２】
実施例４−低電圧長パルス長（ＬＶＬＰ）ＥＰＴ
従来の電気化学療法では、高電圧短パルス時間のものを腫瘍の治療のために使用している。しかし、１２００−１３００Ｖ／ｃｍ、１００μ秒の電界条件がブレオマイシン、シスプラチン、ペプロマイシン、ミトマイシンｃ、カルボプラチンなどの抗がん剤を使用する場合、生体外および生体内において非常に効果的であることが見出された。これらの結果は生体外および生体内試験によるものである。このような電気的条件は臨床試験において患者が十分に耐え得るものであるが、そのような治療は一般に患者の筋肉の痙攣を伴い、患者に不快を生じさせることがある。この不快感はしばしば、個々の患者の苦痛感に関連することが見出された。同一の実験条件下でも患者の応答が著しく異なることがしばしば見受けられた。この問題の幾つかは電気化学療法で低電圧長パルス長を用いることによりかなり減少させることができる。生体内遺伝子転写について報告されている最低電界強度は６００Ｖ／ｃｍである（Ｔ．Ｎｉｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：１０５０−１０５５、１９９６）。生体内ＥＰＴ試験において使用された最大電界強度を表８に示す。ここで細胞の５０％を殺傷させるのに必要な電界強度は５０Ｖ／ｃｍ以下である。
【００９３】
ＭＣＦ−７（ヒト胸癌）、ＰＣ−３（ヒト前立癌）およびＣ６（ラット神経膠腫）のような種々の腫瘍細胞系を用いた下記生体外試験によれば、腫瘍細胞の殺傷に関しては、低電圧長パルス時間の使用は高電圧短パルス時間の場合と等しいかまたはそれ以上の効果があることが確認された。これらの結果はＭＣＦ−７で示されている。パルス長は４−１５ｍ秒の範囲とすることができる。ＭＣＦ−７の電気穿孔応答は、ＸＴＴ検査法を用い、高電圧短パルス長（ＨＶＳＰ）および低電圧長パルス長（ＬＶＬＰ）の双方で行った。また、このＸＴＴ検査は処置の７０時間後におけるＸＴＴのホルマザンへの代謝変換に基づき、４５０ｎｍの波長で分光測光法的に測定したものである（Ｍ．Ｗ．Ｒｏｅｈｍら、“テトラゾリウム塩ＸＴＴを利用した細胞増殖および生存能のための改良された比色分析法”、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４２：２，２５７−２６５，１９９１）。ＸＴＴはテトラゾリウム試薬、２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム・ヒドロキシド（ＸＴＴ）であり、これは生存細胞中で代謝的に還元されて水溶性ホルマザンとなる。従って、生きている細胞のみがＸＴＴをホルマザンに変換させる。細胞生存率の値は、サンプルのＯ.Ｄ.値からの式を用いて計算された相対値である、すなわち１００％細胞生存の対照（Ｄ−Ｅ−）および０％細胞生存の対照（Ｄ−Ｅ−、ＳＤＳを用いる）から計算した相対値である。このＨＶＳＰを用いた試験はこの開発されたＥＰＴモードのＬＶＬＰと直接の比較をし得るように行われた。
【００９４】
0004180285.tif 000006
２５Ｖ／ｃｍ程度の低い電圧でも細胞に対しかなりの細胞毒性を生じさせることができた。電界を増大させることにより細胞を完全に死滅させることができた。Ｃ６グリオマのような細胞系の或るものは、高電圧パルスではそれ程著しい影響を受けなかったが、２０ないし３０Ｖ／ｃｍの低電圧により完全に死滅させることができた。これらの生体外試験結果はＥＰＴ治療のＬＶＬＰモダリティーの有効性を明らかに画定するものである。
【００９５】
生体外でのＥＰＴを用いた薬剤の細胞毒性
ＭＣＦ−７に対し種々の薬剤を用いた生体外ＥＰＴ試験結果を高電圧および低電圧の双方を用いた場合について以下に説明する。
細胞はＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・テシュ−・コレクション、ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手し、その推奨された手法により維持させた。ついで、細胞を適当な媒体中に懸濁させ、これに２４／９６ウエルプレート中にて均一に接種を行った。ブレオマイシン、シスプラチン、ミトマイシンＣ、ドクソルビシンおよびタクソールから選択される１つの薬剤を細胞懸濁液に直接添加し最終濃度が約１×１０−４（１Ｅ−４）ないし１．３×１０−９（１．３Ｅ−９）となるようにした。ＢＴＸ  Ｔ８２０エレクトロ・スクエア・ポレータから発生する電気的パルスを、上述のＢＴＸ針アレイ電極を用いてマイクロプレート中の細胞懸濁液に伝達させた。
【００９６】
試験に対応させて、１００μ秒または１０ｍ秒の６個のパルスを、高電圧または低電圧の種々の公称電界を、ＥＰＴ−１９６針アレイスイッチを用い６−針アレイの２つの対向する電極対間に印加した。ついで、このマイクロプレートを２０時間または７０時間、培養し、細胞生存率をＸＴＴ検査法により測定した。その結果の幾つかを図１５（ａ）、図１５（ｂ）、図１６（ａ）、図１６（ｂ）および図１７に示す。
図１７に対応する曲線はメドパルサーを用いて得たものである。
【００９７】
ＬＶＬＰモードについて述べると、この方法により薬剤無しで細胞に対しパルスを印加した場合でも、細胞の生存率は５０％よりかなり小さく、薬剤と組合わせた場合はその生存率は更に減少した。薬剤がパルスよりむしろ大きい効果を示し、パルスのみによる最初の生存率が約８０％となるように選択することが、更に望ましい。ＬＶＬＰモードについての典型的細胞死滅曲線を図１５（ａ）に示す。
【００９８】
以上、本発明を好ましい具体例を参照して説明したが、その他、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることを理解されたい。従って、本発明は以下に記載する請求の範囲により定められるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一実施例を示す組立断面図である。
【図２】図２ａ乃至２ｇは、本発明にかかる電極のいくつかの実施例を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明にかかる治療装置のブロック図である。
【図４】図４は、図３の治療装置のための回路の概略ブロック図である。
【図５】図５は、図４の回路の選択切換素子の概略図である。
【図６】図６は、本発明の一実施例にかかる９つの治療領域を形成する針のための好適な４×４マップの配置図である。
【図７】図７ａは、本発明の一実施例にかかる２×２治療領域のパルスシーケンスを示す図である。図７ｂ乃至図７ｄは、本発明の一実施例にかかる６つの針アレイのパルスシーケンスを示す図である。
【図８】図８は、従来の内視鏡検査システムを示す図である。
【図９】図９ａ及び図９ｂは、本発明にかかる伸張／収縮針アレイの詳細を示す図である。
【図１０】図１０は、パンク−３異種移植ヌードマウスにブレオマイシンを使用したＥＰＴ後１２０日までの腫瘍体積、（Ｄは薬を、Ｅは電気穿孔を示し）、静脈制御グループ（Ｄ＋Ｅ−）、Ｄ−Ｅ−、Ｄ−Ｅ＋）、治療グループ（Ｄ＋Ｅ＋）を示す。
【図１１】図１１ａ及び図１１ｂは、ネオカルシノスタチンのパンク−３のＥＰＴの効果を示す図であって、薬の注入前後の各々２４日までを示す。
【図１２】図１２は、異種移植ヌードマウスの非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）におけるブレオマイシンを使用したＥＰＴ後３４日までの腫瘍体積を示す。矢印は、２７日目における１匹のマウスの再治療を示す（Ｄは薬を、Ｅは電気穿孔を示す）。
【図１３】図１３ａ乃至図１３ｄは、ＥＰＴによる腫瘍異種移植（ａ）治療に含まれる経過を、傷痕（ｂ）の形成から、乾燥し、最終的にはがれ落ち（ｃ）、腫瘍の存在しないきれいに治癒した皮膚（ｄ）へと導かれる治療状態を示す。
【図１４】図１４ａ乃至図１４ｃは、治療後３５日経過後の腫瘍サンプルの微細構造を示す。Ｄ＋Ｅ＋グループは、Ｄ＋Ｅ−グループ（ａ）の生存できる細胞と壊死細胞の混合に比較して、壊死細胞のゴースト（ｂ）を示す。１２０日後の腫瘍サイトからのサンプルの微細構造は、腫瘍細胞の完全な消滅を示す（ｃ）。
【図１５】図１５ａ及び図１５ｂは、各々、低電圧または高電圧ＥＰＴに曝されたＭＣＦ−７（胸ガン）細胞の生存を示す。
【図１６】図１６ａ及び図１６ｂは、ブレオマイシンを使用した低電圧または高電圧ＥＰＴに曝されたＭＣＦ−７（胸ガン）細胞の生存を示す。
【図１７】図１７は、異なる濃度のブレオマイシン及びメドパルサーを使用したパルスのない、またはパルスのあるＭＣＦ−７の効果を示す。各々の図において、同一の番号及び同一の符号を付したものは同一の要素を示す。
【図１】
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【図２】
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0004180285.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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