(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を誘導するための組成物において、
（i）宿主内で毒性が低くなるように改変された改変組換体カナリアポックスウイルスであって、該カナリアポックスウイルスが、鶏胚繊維芽細胞での２００回より多くの連続継代によって弱毒化されたＲｅｎｔｓｃｈｌｅｒワクチン株に由来し、そのマスターシードを寒天で４回連続的にプラーク精製し、さらにその１つのプラーククローンをさらに５回継代することによって増殖させて弱毒化されたものであり、該カナリアポックスウイルスのゲノムの非必須領域中に少なくとも１つの狂犬病糖タンパク質Ｇエピトープをコードする外来ＤＮＡを含みそれを発現する改変組換体カナリアポックスウイルス；および
（ii）イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエ  バクテリン抗原、およびこれらの抗原の組合せよりなる群から選択されるか、あるいは、ネコ白血病ウイルス抗原、ネコヘルペスウイルス抗原、およびこれらの抗原の組合せより成る群から選択される付加的な抗原；を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記カナリアポックスウイルスがＡＬＶＡＣウイルスまたはＡＬＶＡＣの全ての性質を有するウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項３】
前記改変組換体カナリアポックスウイルスがｖＣＰ６５であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の組成物。
【請求項４】
前記イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）抗原が、ＣＤＶ血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質、ＣＤＶ融合（Ｆ）糖タンパク質、およびその組合せよりなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項いずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記付加的な抗原が、凍結乾燥組成物から提供されることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項いずれか１項項記載の組成物。
【請求項６】
前記付加的な抗原が、該組成物中に含まれる別の組換体ウイルスから提供されることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項いずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
前記改変組換体カナリアポックスウイルスが少なくとも１つの狂犬病糖タンパク質ＧエピトープをコードするＤＮＡに加えて前記付加的な抗原をコードするＤＮＡを含み、該付加的な抗原が前記組換カナリアポックスウイルスにおいて発現されることによって提供されることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項いずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
イヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原およびイヌパルボウイルス抗原のいずれか１つを含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第７項いずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
担体をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第８項いずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記改変組換体カナリアポックスウイルスと前記付加的な抗原が同時にまたは連続して投与されることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項、第８項および第９項いずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
動物（ヒトを除く）において免疫反応を誘導する方法であって、請求の範囲第１項から第１０項いずれか１項記載の組成物を前記動物に投与することを含む方法。
【請求項１２】
動物における免疫学的治療または免疫応答を誘導するための医薬の製造における請求の範囲第１項から第１０項いずれか１項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、1991年3月7日に出願された出願番号07/666,056の一部継続出願である、1991年6月11日に出願された出願番号07/713,967の一部継続出願である、1992年3月6日に出願された07/847,951の継続出願である、1993年8月13日に出願された出願番号08/105,483の一部継続出願であり、1993年3月24日に出願された出願番号08/036,217は、1994年11月15日に米国特許第5,364,773号として発行された。上述した出願および特許の各々をここに引用する。
発明の分野
本発明は、改変組換えポックスウイルス組成物および組合せ組成物、並びにその製造および使用方法；例えば、ワクシニアウイルスまたはアビポックス（例えば、カナリヤポックスまたはニワトリポックス）、例えば、弱毒化組換体等の改変ポックスウイルス−狂犬病ウイルス組換体、その組成物、その組合せ組成物およびその使用、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−狂犬病ウイルス組換体、その組成物およびその組合せ組成物およびその使用に関するものである。このように、本発明は、ウイルスが組成物中で狂犬病ウイルスの遺伝子産生物を発現する組換体ポックスウイルス−狂犬病ウイルスに関するものである。この組成物は、ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のイヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）−イクテロハエモラギアエ（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒａｈａｇｉａｅ）バクテリン抗原、これらの抗原の組合せ、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原またはこれらの抗原の組合せのうちのいずれか１つを含んでいてもよい。そのような組成物は、宿主に投与された場合、狂犬病ウイルス感染に対して、並びに組成物中に存在する他の何れの抗原に対しても免疫反応を誘導可能であり；そして、その組成物は、イヌにおいて狂犬病に対する長期間の免疫性（反応）を引き出すことが可能であり、防御することが可能であり、または母子免疫を有する子犬において免疫反応を引き出すことが可能である。本発明はさらに、そのような組成物の製造および使用のための方法に関している。本発明は、付加的にはポックスウイルスの発現産物であって、それら自体が例えば抗体の産生等の免疫応答を誘発するために有用であり、抗体は狂犬病感染に対して有用であるものに関する。または本発明は、発現産物またはそれによって誘導される抗体であって、事情に応じて動物、ヒトまたは細胞培養物から単離することができて、狂犬病、組換体ウイルス、または感染細胞、あるいは他の系統での抗原または産物の発現を検出するための診断キット、試験またはアッセイを用意するために有用なものに関する。単離された発現産物および組換体ウイルスによって誘導された抗体は、系統、宿主、血清または試料中において抗体または抗原を検出するためのキット、試験またはアッセイにおいて特に有用である。発現産物は抗体の生成にも有用である。
いくつかの出版物がこの出願において参照されている。これらの参考文献の完全な引用は、請求の範囲に先行する明細書の終わり、即ち出版物が記載されている箇所に掲げておいた。これらの出版物の各々をここに参照文献として引用する。
発明の背景
ワクシニアウイルスおよびごく最近では他のポックスウイルスが、異種遺伝子の挿入および発現に用いられている。異種遺伝子を感染性生ポックスウイルス中に挿入する基本技術には、ドナープラスミドの異種遺伝要素に隣接するポックスＤＮＡ配列と、レスキューポックスウイルス中に存在する相同性配列との間の組換えが含まれる（Piccini等，1987）。
特に、組換えポックスウイルスは、従来技術において知られており、米国特許第4,769,330号、同第4,772,848号、同第4,603,112号、同第5,100,587号、および同第5,179,993号に記載されているワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルスのようなポックスウイルスの合成組換体を形成する方法と同様な２段階で構築される。
第１に、ウイルスに挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス給源由来のオープンリーディングフレームを、内部にポックスウイルスのＤＮＡ部分に相同性ＤＮＡが既に挿入されているＥ．コリプラスミド構築物中に配置する。この場合、この挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列を予めプロモーターに連結させる。このプロモーター−遺伝子連結物は、非必須座を含むポックスＤＮＡ領域中に隣接しているＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡの両端に隣接するようにプラスミド構築物中に配置させる。その結果得られるプラスミド構築物を、続いてＥ．コリ細菌の増殖により増幅させ（Clewell，1972）、単離する（Clewell他，1969；Maniatis他，1982）。
第２に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列を含む単離されたプラスミドは、例えばニワトリ繊維芽細胞等の細胞培養中に、ポックスウイルスとともに移入される。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスゲノムの相同性ＤＮＡそれぞれとの間の組換えにより、外来ＤＮＡ配列がそのゲノムの非必須領域中に存在することによって改変されたポックスウイルスが提供される。用語「外来」ＤＮＡとは、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス給源由来のＤＮＡであって、当該外因性ＤＮＡが位置されているゲノムによっては本来生産されない遺伝子産物をコードしているものを意味する。
遺伝的組換えは一般に、ＤＮＡの２つの鎖の間での相同性部分の交換である。ある種のウイルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡと置き換わっていることもあり得る。核酸の相同性部分とは、ヌクレオチド塩基の同じ配列を有する核酸部分（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。
遺伝的組換えは、複製即ち感染された宿主細胞内部で新しいウイルスゲノムが製造される間に自然に生じ得る。このように、ウイルス遺伝子の間の遺伝的組換えは、２以上の異なったウイルスの間またはその他の遺伝的構築物で共感染させた宿主細胞中で行われるウイルス複製サイクルの間に起こり得る。第１のゲノム由来のＤＮＡ部分は互いに交換可能な、第１のウイルスゲノムのＤＮＡに相同である第２の共感染ウイルスのゲノム部分を構築する際に利用される。
しかしながら、組換えはまた、完全には相同でない異なったゲノム中のＤＮＡ部分の間でも生じ得る。例えば遺伝子マーカーまたは抗原決定基をコードする遺伝子等が相同性ＤＮＡの一部に挿入されていることを除いては、第１のゲノムのある部分が、もう一つのゲノムのある部分と相同である場合、組換えは依然起こり得、そしてその組換え産物は、組換えウイルスゲノム中のその遺伝的マーカーまたは遺伝子の存在により検出可能である。組換えワクシニアウイルスの産生のためのさらなる戦略が近年報告された。
改変された感染可能ウイルスによって挿入されたＤＮＡ遺伝的配列を発現することを成功させるには、２つの条件が要求される。第１は、改変ウイルスが生育可能なままであるように、ウイルスの非必須領域中に挿入しなければならないことである。挿入されたＤＮＡの発現のための第２の条件は、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターが存在することである。プロモーターは、発現されるべきＤＮＡ配列の上流に位置するように配置されなければならない。
ワクシニアウイルスは、天然痘に対する免疫化のために成功して用いられてきており、1980年には全世界で天然痘の撲滅を成し遂げた。その歴史において、多くのワクシニア株が生成されている。これらの異なった株は多様な免疫原性を示し、様々な度合いの合併症に関与しているが、その最も深刻なものはワクチン後の脳炎と汎発性種痘疹である（Behbehani，1983）。
天然痘の撲滅と共に、ワクシニアの新しい役割、即ち外来遺伝子を発現するために遺伝的に操作されたベクターとしての役割が重要となった。数多くの異種抗原をコードしている遺伝子がワクシニアにおいて発現され、しばしば対応する病原体に対して防御的に免疫するという結果を得ている（Tartaglia他，1990ａにおいて概説）。
ワクシニアベクターの遺伝的背景によって、発現された外来免疫原の防御的効率が影響されることが明らかとなっている。例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０をワクシニアウイルスＷｙｅｔｈワクチン株において発現させた場合には、コットントップ  タマリン（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎｓ）をＥＢＶウイルス誘導リンパ腫に対して防御しなかったが、一方で同じ遺伝子をワクシニアウイルスＷＲ実験室株において発現させた場合には防御的であった（Morgan他，1988）。
ワクシニアウイルスベースの組換えワクチン候補の、効率と安全性との微妙なバランスは非常に重要である。組換えウイルスは、ワクチン接種された動物において防御的免疫反応を誘導するような様式で免疫原（群）を供与しなければならないが、如何なる重大な病原性特性をも有していてはならない。故にベクター株を弱毒化することは、現在の技術レベルを前進させる極めて望ましいものとなるであろう。
組織培養におけるウイルスの増殖には非必須でありこれを欠失または不活性化させることにより多様な動物系で毒性が減少する数多くのワクシニア遺伝子が同定されてきた。
ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子についてはマッピングが行われ（Hruby他、1982）、また、配列決定も行われている（Hruby他、1983；wier他、1983）。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全欠失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また、ＴＫ-ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位においてインビボ複製する能力を有する。
単純ヘルペスウイルス２型については、ＴＫ-ウイルスをモルモットに膣内投与すると、ＴＫ+ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低くなることが示された（Stanberry他、1985）。ヘルペスウイルスにコードされたＴＫ活性は、インビトロにおいては代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された（Jamieson他、1974）。
ＴＫ-ワクシニアが弱毒化されていることが、マウスに対し脳内投与および腹膜内投与することにより明らかとなった（Buller他、1985）。神経毒性のあるＷＲ実験室株およびWyethワクチン株の双方について弱毒化が認められた。皮内投与されたマウスにおいては、ＴＫ-組換えワクシニアが、親株のＴＫ+ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中和抗体を産生したが、このことは、この試験系では、ＴＫ機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。ＴＫ-およびＴＫ+の組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻内接種すると、他の部位（脳を含む）へのウイルスの伝播が顕著に減少したことが見出された（Taylor他、1991ａ）。
ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素として、リボヌクレオチドレダクターゼがある。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内でコードされているリボヌクレオチドレダクターゼの活性を、そのラージサブユニットをコードしている遺伝子を欠失させることにより喪失させても、インビトロにおける分裂細胞中でのウイルス増殖やＤＮＡ合成は影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが示された（Goldstein他、1988）。眼部の急性ＨＳＶ感染および三叉神経ガングリオンにおける再活性性潜伏感染に関してマウスモデルを用いたところ、リボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニットを欠失したＨＳＶについては、野生型ＨＳＶに比べて毒性が減少することが示された（Jacobson他、1989）。
ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチドレダクターゼのスモールサブユニット（Slabaugh他、1988）およびラージサブユニット（Schmidtt他、1988）のいずれも同定されている。ワクシニアウイルスのＷＲ株において、挿入によりリボヌクレオチドレダクターゼを不活化すると、マウスの頭蓋内接種により測定され得るようなウイルスの弱毒化がもたらされる（Child他、1990）。
ワクシニアウイルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子についてはマッピングおよび配列決定が行われている（Shida、1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は、組織培養における増殖にとって非必須なものである（Ichihashi他、1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたウサギにおいては神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるウサギの外傷は小さくなっていた（Shida他、1988）。ＨＡの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Shida他、1987）、Lister株の派生体（Shida他、1988）およびCopenhagen株（Guo他、1989）に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ-ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo他、1989；Itamura他、1990；Shida他、1988；Shida他、1987）、また、関連する病原体による免疫性テストに対して防御効果を有する（Guo他、1989；Shida他、1987）ことが示された。
ウシポックスウイルス（Brighton赤色株）は、鶏卵の漿尿膜上に赤色（出血性）痘瘡を生じさせる。ウシポックスゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる変異体となる（Pickup他、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた38kDaのタンパク質によることがマッピングされている（Pickup他、1986）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、ウシポックスウイルスに対する宿主の炎症応答を阻害し（Palumbo他、1989）、また、血液凝固のインヒビターである。
このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する（Kotwal他、1989ｂ）。外来遺伝子を挿入することによりｕ領域が不活化されているＷＲワクシニアウイルス組換体を接種されたマウスは、ｕ遺伝子がインタクトのままである類似の組換えワクシニアウイルスを接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高い抗体レベルを産生する（Zhou他、1990）。このｕ領域は、ワクシニアウイルスのCopenhagen株内で欠陥性非機能状態で存在する（Goebel他による報告（1990ａ，ｂ）においてＢ13およびＢ14と称されているオープンリーディングフレーム）。
感染細胞内においてウシポックスウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）中に局在化している（Kato他、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播する間のウシポックスウイルス粒子を防護することにあると考えられている（Bergoin他、1971）。ウシポックスゲノムのＡＴＩ領域は160kDaのタンパク質をコードしており、これがＡＴＩ封入体のマトリックスを形成する（Funahashi他、1988；Patel他、1987）。ワクシニアウイルスは、そのゲノム内に相同領域を含有するが、一般にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は94kDaのタンパク質として翻訳される（Patel他、1988）。ワクシニアウイルスのCopenhagen株においてはＡＴＩ領域に相当するＤＮＡ配列は大部分が欠失されており、該領域に残存する３′末端はＡＴＩ領域の上流にある配列と融合して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ26Ｌを形成する（Goebel他、1990ａ，ｂ）。
ワクシニアウイルスの左末端近傍については、各種の自然欠失（Altenburger他、1989；Drillien他、1981；Lai他、1989；Moss他、1981；Paez他、1985；Panicali他、1981）や人為的欠失（Perkus他，1991；Perkus他，1989；Perkus他，1986）が報告されている。10kbが自然欠失したワクシニアウイルスのＷＲ株（Moss他、1981；Panicali他、1981）が弱毒化されていることが、マウスに頭蓋内接種することにより判明した（Buller他、1985）。後に、この欠失部は17ヶの潜在的ＯＲＦを含む可能性が示された（Kotwal他、1988ｂ）。該欠失部内にある特定の遺伝子としては、ビロカインＮ１Ｌおよび35kDaタンパク質（Goebel他による1990ａ，ｂの報告でC3Lと称されたもの）が挙げられる。Ｎ１Ｌを挿入により不活性化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれについても、頭蓋内接種による毒性が減少する（Kotwal他、1989ａ）。上記の35kDaタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にＮ１Ｌと同様に分泌される。このタンパク質は、補体コントロールタンパク質群、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４bp）に相同性である（Kotwal他、1988ａ）。細胞性Ｃ４bpと同様に、ワクシニアの35kDaタンパク質は補体の第４成分と結合し、古典的補体カスケードを阻害する（Kotwal他、1990）。このように、ワクシニアの35kDaタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関与しているものと考えられる。
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子として同定された２つの遺伝子、Ｋ１Ｌ（Gillard他、1986）およびＣ７Ｌ（Perkus他、1990）を含む。これらの遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系統でワクシニアウイルスの増殖能が減少する（Perkus他、1990）。
本来的に宿主が制限されているポックスウイルスであるところのアビポックスウイルスを使用することを含む２つの特別なワクチンベクター系がある。すなわち、ニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ：fowlpoxvirus）およびカナリアポックスウイルス（ＣＰＶ：canarypoxvirus）の両者を操作して外来遺伝子産生物を発現させてきた。ニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のアビポックス（Avipox）属の原型ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重大な疾病を引き起こすが、1920年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより良好な対策が講じられてきた。アビポックスウイルスの複製は鳥類に限られ（Matthews、1982）、ヒトを含む非鳥類種においてアビポックスウイルスの感染が起こったという報告は文献中に存在しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染することに対する本質的な安全バリアが確保され、アビポックスウイルスをベースとするワクチンベクターは魅力ある手段として動物やヒトへ応用される。
ＦＰＶは、家禽類病原体由来の抗原を発現する優れたベクターとして使用されてきた。毒性トリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換体で発現された（Taylor他、1988ａ）。この組換体をニワトリおよび七面鳥に接種すると、同種または異種の毒性インフルエンザウイルスのいずれの免疫性テストに対しても防御能のある免疫応答が誘起された（Taylor他、1988ａ）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパクを発現するＦＰＶ組換体も開発された（Taylor他、1990；Edbauer他、1990）。
宿主制限によりＦＰＶおよびＣＰＶの複製はトリ系に限られているにも拘わらず、これらのウイルスから誘導された組換体は、非トリ供給源の細胞において外来遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換体ウイルスは、該外来遺伝子産生物に対する免疫応答を引き起こし、場合によっては、対応する病原体による免疫性テストに対する防御能を有することが示された（Tartaglia他、1993ａ，ｂ；Taylor他、1992；1991ｂ；1988ｂ）。
特に米国において、狂犬病の、組合せまたは多価または「カクテル」ワクチンまたは免疫学的組成物（付加的な抗原または抗原群と組み合わせて組成物中にある狂犬病抗原）、特にイヌ用のものは、何れの従来の組合せも無力で有効性試験をパスできないため現在は入手できない。このような従前の組合せは、「有効性干渉」、即ち狂犬病抗原等の１以上の抗原、または組合せ組成物中の付加的な抗原（群）が有効性を維持または達成できないとして知られている現象を示す。これは、投与された場合に、付加的な抗原（群）または狂犬病抗原が存在するために、イヌ等の宿主において、免疫学的、抗原、抗体または防御反応を刺激する抗原が干渉されることによると考えられている。例えば、付加的な他の抗原と組み合わせられた狂犬病抗原は、その組成物がイヌに投与された場合に、免疫学的、抗原、抗体または防御反応を刺激することに関して、そのような組成物中に存在するこれらの付加的な抗原群によって干渉され、また付加的な抗原群に干渉する。さらに特定すると、狂犬病抗原は、１以上または全ての、イヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザウイルス抗原、イヌパルボウイルス抗原、およびレプトスピラ  バクテリン抗原とともに投与された場合に、これらの抗原によって誘導される反応に干渉するかまたは逆に干渉される場合がある。しかしながら、ネコ等の他の宿主に関しては、組合せワクチンが知られている。何れか１つの理論に拘束されることを望むものではないが、この「有効性干渉」は恐らく、（ｉ）宿主（イヌ等）の生物学的システムのいくつかの特性、または（ｉｉ）現在知られている狂犬病抗原による宿主（イヌ等）の生物学的システムとの反応、または（ｉｉｉ）このような従来の組成物中に存在する現在公知である付加的な抗原による宿主（イヌ等）の生物学的システムとの反応、または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）までの要素のいくつかの組合せ、によるものである。狂犬病抗原を含む公知のどの組合せ組成物も、組換体によるものではなくアジュバントを有している。
理論に関係なく、現在知られている、特にイヌに用いる、有効性干渉を示さない狂犬病と付加的な抗原との組合せ組成物は存在しないと考えられている。このように、特にイヌのための狂犬病組合せ組成物に対する需要が存在する。従って、子イヌおよびイヌにおいて、狂犬病からの防御のためには、狂犬病抗原は通常、抗原（群）と組み合わせるのではなく別個に投与される。狂犬病抗原を（他の抗原とともに）、組合せ組成物、即ち狂犬病多価組成物であって有効性干渉がみられない組成物に配合することは、特にイヌにおいては、まったく驚くべきことだが、予想外に容易ではないことである。なぜなら現在の知識および有効性干渉によって示されるとおり、人は抗原組成物を単純に組み合わせて有用な組合せ即ち「多価」組成物を調製することはできないからである。この例（前出の文）においては、「抗原組成物」とは、抗原をコードしそれを発現する組換体ポックスウイルスそれ自体、またはそのような組換体および抗原の組合せを意味しても良い。イヌのための組合せまたは「カクテル」組成物において実際に用いることができる狂犬病抗原が、ネコ等の他の宿主のための組成物においても利用できる場合は、また好ましいであろう。このように、多様な家畜病治療のための組合せ、または多価または「カクテル」組成物のための狂犬病抗原は、必ずしも異なっている必要はなく、そのことによってそれらの製造において経済的な利点を提供している。
さらに、このような狂犬病抗原は、イヌに長期間の防御を供与するかまたは長期間の反応を誘導する場合、および狂犬病に対する母子免疫を有する子イヌに防御を供与するか反応を誘導する場合も有利である。当業者が承知しているとおり、母子免疫とは、誕生および／または哺乳の際に新生児が母親から獲得する免疫であり、この免疫は、ある期間の経過後、その新生児中で衰退し、それによってその新生児は感受性であるままとなってしまう。さらに、新生児中に母子抗体が存在することによって、ワクチン等の抗原組成物を投与された際に、新生児が防御または免疫反応を得ることができない場合がある。このことは、抗原またはワクチン組成物が投与される前に新生児が、新生児にとって危険な免疫性が無いかまたは非常に少ない、即ち感受性の時期を経なければならないことが考えられるということを意味している。母子免疫に関しては、1994年8月16日に刊行された米国特許第5,338,683号を参照する。これをここにおいて参考文献として取り込むものとする。
組合せ、「カクテル」または多価組成物において利用することができ、イヌにおける有効性干渉を有さず、ネコ等の他の宿主のための組成物において利用でき、そして、イヌにおいて長期間の反応または防御を供与し、さらに母子免疫を有しているにもかかわらず子イヌにおいても反応または防御をもたらすことが可能な狂犬病抗原が、組換体ポックス−狂犬病ウイルス等の組換体ウイルスであったなら、さらに有益で、予想外の驚くべきことであろう。そして、さらに、このポックスウイルス−狂犬病ウイルス組換体が、例えばＮＹＶＡＣ−狂犬病またはＡＬＶＡＣ−狂犬病等の弱毒化ワクシニアウイルス−狂犬病ウイルス組換体または弱毒化アビポックスウイルス−狂犬病ウイルス等といったように弱毒化されているように改変されていたら、特に驚くべきで、予想外のことである。なぜなら、この場合、弱毒化、および、宿主中でポックスウイルスが生産的に複製する能力が減少させられているかまたは欠如させられていることから、当業者は特に期待しなかったであろうし、その弱毒化組換体が、イヌまたはその他の宿主のための「カクテル」多価、または組合せ組成物、特にイヌにおいて長期の反応または防御を提供しさらに母子免疫を有しているにもかかわらず子イヌにおいて反応および防御を提供する組成物において有用であることに当業者は驚かされるであろう。
弱毒化ポックスウイルスベクターはまた、抗原性またはワクチン組成物のために、特に組合せまたは「カクテル」または多価組成物のために、特に弱毒化ベクターであることを考えると、意図されている宿主および意図されていないがあり得る偶発的宿主（ベクターまたは抗原を配合または投与することにおいてベクターとともに仕事をしている人、またはこの他にベクターと接触してしまった人等）に対して、病原性が減少させられているか非常に少ないか全く無いという点から特に有益である。即ち、弱毒化ポックスウイルスベクターは、イヌ、子イヌ、ネコ、子ネコおよびそのようなもの等の意図された宿主に対して、またベクターを投与用の組成物に配合する仕事または組成物を投与する仕事に従事している人（獣医、技術者、その他の従業員等）、またはベクターと接触してしまったその他の人（ペットのオーナー等）等の、意図されていないがあり得る偶発的宿主に対しては、病原性が減少させられているか非常に少ないかまたは全くない。
狂犬病ウイルス組換体ポックスウイルス、その組成物およびそれ由来の生産物、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣベースの狂犬病組換体および組成物およびそれ由来の生産物、中でも「カクテル」または多価または組合せ組成物等の他の抗原を含む組成物、およびそれ由来の生産物であって、イヌにおいて有効性干渉を有しておらず、ネコ等の他の宿主に（ポックスウイルス狂犬病組換体組成物として、または「カクテル」または組合せまたは多価組成物としての何れかで）投与可能であり、イヌにおいて長期間の反応または防御を、または母子免疫を有しているにもかかわらず子イヌにおいて反応または防御を誘導可能であるものが提供されることは、現在の技術水準を前進させる望ましいものである。
発明の目的および概要
したがって、本発明の目的は、安全性の向上した改変組換えウイルスを提供すること、およびそのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
付加的な本発明の目的には：組換体ポックスウイルス組成物または抗原組成物、好ましくはポックスウイルス−狂犬病組換体組成物であって、抗原性またはワクチンまたは免疫学的組成物（即ち狂犬病抗原を発現する組換体、または抗体の発現に由来する生産物）、より好ましくは、公知の組成物および公知の「カクテル」または多価または組合せ組成物と比較して増加された安全性レベルおよび／または有効性を有するような組成物を提供すること；そのような物の製造方法および使用方法を提供すること；最も好ましくは、イヌのための「カクテル」または多価または組合せ組成物として有効である組成物であって、ネコ等の他の宿主にも使用できるものであって、最も好ましくは、特にイヌにおいての長期間の反応または防御および／または母子免疫を有しているにもかかわらず反応または防御を供与できるものを提供することである。
本発明のさらなる目的は、ベクターが宿主中において弱毒化された毒性を有するように改変されており、その宿主中において遺伝子産生物を発現するための改変ベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、安全性のレベルが増大した改変組換えウイルスまたは改変ベクターを用いて、インビトロで培養された細胞中で遺伝子産生物を発現する方法を提供すること、および組成物におけるそのような産生物の利用を提供することにある。
これらの、およびその他の本発明の目的と利点は、以下の考慮の後に容易に明白となるであろう。
１つの側面において、本発明は、組換えウイルスが減衰された毒性と促進された安全性を有するように、ウイルスにコードされた遺伝的機能が不活性化された改変組換えウイルスに関する。その機能とは、非必須かまたは毒性に関連したものであり得る。ウイルスは、有利には、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたはニワトリポックスウイルスやカナリアポックスウイルス等のアビポックスウイルスである。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、狂犬病ウイルスから派生された抗原またはエピトープをコードしている異種ＤＮＡ配列を、単独または他の病気の抗原とともに有していても良い。
別の側面においては、本発明は、接種された宿主動物およびヒトにおいて抗原性または免疫性反応を誘導するための抗原性、免疫性またはワクチン組成物または治療組成物に関し、そこにおいて当該組成物は担体と組換えウイルスであって当該組換えウイルスが減衰された毒性および促進された安全性を有するように非必須ウイルスコード遺伝子領域を不活性化されているものを含有しているものに関する。本発明に従った組成物において用いられているウイルスは、有利には、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたは例えばニワトリポックスウイルスやカナリアポックスウイルス等のアビポックスウイルスである。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、例えば狂犬病ウイルス等から派生された抗原タンパク質をコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。さらに当該組成物は付加的に、以下の何れかの１つの抗原等を含んでいても良い：ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  Ｃａｎｉｃｏｌａ）−イクテロハエモラギアエ（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）バクテリン抗原、これらの抗原の組合せの何れか、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原、またはこれらの抗原の組合せの何れか；または、この組成物は、狂犬病抗原および他の抗原または抗原群をコードし発現する組換体ポックスウイルス含んでいても良い。
さらに別の面においては、本発明は前述の組成物を用いる方法に関する；例えば、狂犬病抗原が単独であるかまたは以下の何れかとともにある場合に対する反応をインビボで得るために用いることに関する：ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエ  バクテリン抗原、これらの抗原の組合せの何れか、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原、またはこれらの抗原の組合せの何れか。この方法は当該組成物をイヌまたは他のネコ等の宿主の何れかに投与することを含んでも良い。この方法は、イヌまたは他の宿主に対する長期間の免疫または反応のため、または母子免疫を有しているにもかかわらず、子イヌなどの新生児において反応または防御させるために投与することを含んでも良い。
さらなる側面においては、本発明は、減衰された毒性と促進された安全性を有する改変された組換えウイルスを細胞中に導入することによりインビトロで遺伝子産物を発現させるための方法に関する。改変組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、例えば狂犬病から派生された抗原タンパク質をコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。産物は続いて、免疫反応を刺激するために動物またはヒトに投与可能であり、この投与は単独または多価または「カクテル」組成物中の他の抗原と共に成されても良い。生成された抗体は個体内で狂犬病または他の病気の防御または治療に有用であり得、そして、抗体または単離されたインビトロ発現産物は、狂犬病または他の病気またはそれら由来の抗原またはそれらに対する抗体の、血清などの試料中での存在または不在（および、それ故、ウイルスまたはその産物またはウイルスまたは抗原に対する免疫反応の存在または不在）を決定するためのウイルス診断キット、アッセイまたは試験のために利用可能である。
またさらなる側面においては、本発明は改変組換えウイルス、および、それらを単独で、または、付加的な抗原またはそのような抗原を発現する付加的な組換体とともに「カクテル」または組合せ組成物において含む組成物に関し、そして、そのようなウイルスまたは組成物を利用してイヌ、ネコ、母子免疫を有するイヌ等の宿主中において反応を誘導する方法に関する。該組換えウイルスは、該ウイルス自身にコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの非必須領域に外来源のＤＮＡを含有している。このＤＮＡは、狂犬病ウイルス抗原を、単独または別の病気に関する他の抗原と組み合わせてコードしていても良い。さらに詳述すれば、遺伝子機能は、毒性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって不活化されている。本発明に用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたは例えばニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルス等のアビポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L、およびI4L（Goebel他による1990ａ，ｂの報告における名称による）から成る群、ならびにそれらの組合せにより選択されるのが好ましい。ここで、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域もしくはリボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニット、またはそれらの組合せから成る。ワクシニアウイルスの好適な改変Copenhagen株は、ＮＹＶＡＣとして同定されたものであり（Tartaglia他、1992）、または、J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1LおよびI4Lまたはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域領域、リボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニットが欠失されたワクシニアウイルスである（米国特許第5,364,773号も参照されたい）。他の好適なポックスウイルスは、ＡＬＶＡＣであり、これはカナリアポックスウイルス（Rentschlerワクチン株）が、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞による200回以上の継代培養により弱毒化され、それ由来のマスターシードが寒天培地において４回の連続的なプラーク精製に供された後、５回の追加の継代培養によりプラーククローンが増幅されたものである。
本発明は、さらに別の態様として、本発明による組換えポックスウイルス−狂犬病ウイルスの発現産生物およびその使用、例えば、抗原性、免疫学的またはワクチン組成物、特に多価または「カクテル」または組合せ組成物であって、イヌまたはネコ、または新生児動物等の動物等への投与のための、または新生児動物の長期間の防御または反応のための、または治療、予防、診断または試験のための組成物を形成すること等に関し、またそのような組成物を使用する方法に関する。
これらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明によって提供され、それより明らかであろう。しかしながら、ここにおいて、多価または「カクテル」または組合せ組成物は、以下の何れかを含有していても良いことに注意したい：（ｉ）ポックスウイルス−狂犬病組換体および付加的な抗原であって以下の何れかに由来するもの等：ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のイヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエ  バクテリン抗原、これらの抗原の組合せの何れか、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原、またはこれらの抗原の組合せの何れか；または（ｉｉ）ポックスウイルス−狂犬病組換体、および、以下の何れかに由来する抗原等の別の抗原をコードし発現する別のポックスウイルス組換体を含む組成物：ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のイヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエ  バクテリン抗原、これらの抗原の組合せの何れか、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原、またはこれらの抗原の組合せの何れか；または（ｉｉｉ）狂犬病抗原および以下の何れかから選択された抗原等の別の抗原をコードし発現する組換体ポックスウイルスを含む組成物：ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のイヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエ  バクテリン抗原、これらの抗原の組合せの何れか、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原、またはこれらの抗原の組合せの何れか。もちろん、（ｉ）においては、ポックスウイルス−狂犬病組換体は、それら由来の発現産物で置き換えられていてもよい；（ｉ）において、ポックスウイルス−狂犬病組換体は別の抗原をコードし発現しても良い；そして、（ｉｉｉ）においては、付加的な抗原が存在しても良い。
本発明（組成物および方法および使用）は、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ組換体、特にＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−狂犬病組換体が、他の抗原群であって、抗原群それ自体としてまたは共−あるいは同時発現の産物（同じ組換体または付加的な組換体（群）の発現に由来する）として存在するものとの間で有効性干渉を示さない；およびＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−狂犬病組換体は長期間の防御および母子免疫の存在下での防御を提供する、という発見に基礎を見いだしている。本発明は必ずしもアジュバントを必要とせず、組換体（群）を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
実施例として記載された以下の詳細な記載は、本発明を記載された特定の実施の形態に限定することを意図しておらず、添付の図面とともに最良に理解される。
図１は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生のためのプラスミドｐＳＤ４６０を構築する方法を示している。
図２は、出血領域の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３の産生のためのプラスミドｐＳＤ４８６を構築する方法を示している。
図３は、ＡＴＩ領域の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ６１８の産生のためのプラスミドｐＭＰ４９４Δを構築する方法を示している。
図４は、血球凝集素遺伝子の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３の産生のためのプラスミドｐＳＤ４６７を構築する方法を示している。
図５は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生のためのプラスミドｐＭＰＣＫ１Δを構築する方法を示している。
図６は、リボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニットの欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）の生成のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築方法を模式的に示している。
図７は、ＴＫ欠失遺伝子座に狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を挿入し組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を形成するためのプラスミドｐＲＷ８４２を構築する方法を図示する。
図８は、Ｃ５  ＯＲＦを含有するカナリアポックスのＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:27）を示す。
図９Ａおよび図９Ｂは、組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）を構築する方法を図示する。
図１０は、ＮＹＶＡＣを形成するために欠失させるＯＲＦｓ（オープンリーディングフレーム）を図示する。
図１１Ａから１１Ｄは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ml）、および、同じか別のワクチンの何れかで予め免疫化されたボランティアにおけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（105.5TCID50）の追加免疫効果（ワクチンは第０、28、180日に行い、抗体力価は第０、７、28、35、56、173、187および208日に測定した）のグラフを示す。
発明の詳細な説明
新しいワクシニアワクチン菌株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン菌株を、既知または潜在的な毒性要因をコード化するゲノムの６つの非必須領域の欠失により改変した。一連の欠失が以下に詳細に記載されている（米国特許第5,364,773号を参照）。ワクシニア制限断片、オープンリーディングフレームおよびヌクレオチド位置の全ての指定は、Goebel等，1990ａ，ｂに報告されている用語法に基づいている。
欠失座もまた、異種遺伝子を挿入するための受容体座として操作された。
ＮＹＶＡＣ中で欠失された領域が以下に列記されている。欠失された領域の省略形およびオープンリーディングフレームの指定（Goebel等，1990ａ，ｂ）並びに指定された欠失により全ての欠失を含有するワクシニア組換体（ｖＰ）の指定もまた列記されている：
（1）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
（2）出血領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
（3）Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
（4）血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
（5）宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および
（6）リボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。
ＮＹＶＡＣは遺伝子的に操作されたワクシニアウイルス株であって、毒性および宿主領域に関連した遺伝子産物をコードする１８のオープンリーディングフレームを特異的に欠失させて生成したものである。ＮＹＶＡＣは高度に弱毒化されているが、このことは以下のような多くの特徴からも判る：i）新生マウスに脳内接種後の毒性が減少していること、ii）遺伝学的に（nu+／nu+）または化学的（シクロホスホアミド）に免疫無防備状態マウスに接種できること（ｉｎｏｃｕｉｔｙ）、iii）免疫無防備状態マウスにおいて、播種性感染を引き起こさないこと、iv）ウサギ皮膚の硬化や潰瘍形成がないこと、v）接種部位から迅速に消散すること、およびvi）多くの組織培養細胞系統（ヒト由来のものを含む）において複製能が激減していること。これにも拘わらず、ＮＹＶＡＣに基づくベクターは、外来性免疫原に対して優れた応答を誘起し防御免疫を提供する。
ＴＲＯＶＡＣとは、弱毒化ニワトリポックスであって、１日齢のヒナへのワクチン接種がライセンスされているニワトリポックスウイルスＦＰ−１ワクチン株からプラークを単離して得られたものである。ＡＬＶＡＣは、弱毒化カナリアポックスをベースとするベクターであり、ライセンスされているカナリアポックスワクチンＫａｎａｐｏｘ（Tartaglia他、1992）からプラークをクローニングして得られた派生体である。ＡＬＶＡＣの一般的性質には、Ｋａｎａｐｏｘの一般的性質と同じものがある。外来性免疫原を発現するＡＬＶＡＣベースの組換えウイルスは、ワクチンベクターとしても有効であることが示されている（Tartaglia他、1993ａ，ｂ）。このアビポックスベクターは、その生産的複製がトリ類に限定されている。ヒトの培養細胞においては、ウイルスのＤＮＡ合成より前にウイルス複製サイクルの初期にカナリアポックスウイルスの複製は中断してしまう。しかしながら、外来性免疫原を発現するように操作すれば、哺乳動物細胞中インビトロで真正な発現とプロセシングが認められ、多くの哺乳動物種に接種すると該外来性免疫原に対する抗体および細胞性免疫応答を誘発し、同種の病原体の免疫性テストに対する防御を与える（Taylor他、1992；Taylor他、1991ｂ）。カナリアポックス／狂犬病糖タンパク質組換体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）に関するヨーロッパと米国との両方における最近のフェーズＩ臨床試験によれば、この試験ワクチンは、充分に受け入れられるものであり、防御レベルの狂犬病ウイルス中和抗体を誘起することが示された（Cadoz他、1992；Fries他、1992）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ被接種者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激すると有意レベルのリンパ球増殖を示した（Fries他、1992）。
また、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは、以下の点において、あらゆるポックスウイルスの中でも独特であると考えられている。すなわち、米国公衆衛生局（ＮＩＨ；National Institutes of Health）（米国公共保健サービス）の組換えＤＮＡ勧告委員会（Recombinant DNA Advisory Committee）は、ウイルスやベクターのような遺伝子材料の物理的封じ込めに関するガイドライン、すなわち、特定のウイルスやベクターの病原性に基づくそれらのウイルスやベクターの利用における安全な取扱に関するガイドラインを出しているが、この物理的封じ込めのレベルをＢＳＬ２からＢＳＬ１に下げることを認めた。他のいずれのポックスウイルスもＢＳＬ１の物理的封じ込めレベルを認められていない。ワクシニアウイルスのCopenhagen株（最も一般的な天然痘ワクチンである）ですら、これよりも高い物理的封じ込みレベル、すなわち、ＢＳＬ２を有する。このように、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは他の何れのポックスウイルスよりも病原性が低いことがこの分野で認められている。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣベクターの弱毒化特性およびそれらの示す外来免疫原に対する体液および細胞の両方の免疫学的反応を誘導する能力に明らかに基づいて（Tartaglia他，1993ａ，ｂ；Taylor他，1992；Konishi他，1992）、そのような組換えウイルスは、以前に記述されたワクシニアベースの組換えウイルスを超えためざましい利点を提供するものである。
組換体ポックスウイルス−狂犬病ウイルスまたはその発現産物、本発明の免疫学的、抗原的、またはワクチン組成物または治療用組成物等であって、多価、「カクテル」または組合せ組成物を含むものを投与するための手順は、非経口経路（皮内、筋内、皮下）であってもよい。そのような投与は全身の免疫反応を可能とする。
より一般的には、本発明の抗原性、免疫学的またはワクチンポックスウイルス−狂犬病組成物または治療組成物（本発明のポックスウイルス−狂犬病ウイルス組換体を含む組成物）は、薬学または獣医学の当業者に良く知られた標準的な技術に従って調製される。そのような組成物は、年齢、性別、体重、種、および特定の患者の体調、および投与経路等の要素を考慮しながら、医学または獣医学の当業者に良く知られた技術により、適切な用量で投与されても良い。組成物は単独で、または、本発明の組成物または「その他の」免疫学的、抗原的、またはワクチンまたは治療組成物と共に投与されるか、または所定の順序で投与されても良く、それによって、本発明の多価または「カクテル」または組合せ組成物、およびそれらを用いる方法を提供している。
このような「その他の」組成物は、以下の何れかに由来する精製抗原を含んでいても良い：ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のイヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエ  バクテリン抗原、これらの抗原の組合せの何れか、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原、またはこれらの抗原の組合せの何れか；または、組換体ポックスウイルスまたは他のベクターシステムによるインビトロでのこれらの抗原の発現に由来；または、そのような「その他の」組成物は、組換体ポックスウイルス、即ち以下の何れかに由来する抗原を発現するポックスウイルスを含んでも良い：ＣＤＶ  ＨＡおよび／またはＦ糖タンパク質等のイヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス２型抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエ  バクテリン抗原、これらの抗原の組合せの何れか、またはネコ白血病ウイルス抗原またはネコヘルペスウイルス抗原、またはこれらの抗原の組合せの何れか。再度、前記成分および投与方式（所定の順序または共投与）並びに投与量は、年齢、性別、体重、種、および特定の患者の体調、および投与経路等の要素を考慮しながら決定できる。この点に関して、以下の係属中の特許出願に言及する：イヌヘルペスウイルス抗原のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、およびそれら由来の組換体、およびそれらの使用を標的とした、1994年3月30日に出願された米国特許出願番号第08/220,151号および1995年3月29日に出願された第08/413,118号、および、ポックスウイルス−イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）組換体および組成物およびこれらの組換体の使用方法を標的とした、1994年4月6日に出願された米国特許出願番号第08/224,657号、1995年4月5日に出願された第08/416,616号。これらの各々を、参考文献としてここに取り込むものとするが、特に、組換体の範囲においては、それらに由来する発現産物およびこれらの出願に開示されている核酸コードは、本発明の「カクテル」、多価または組合せ組成物またはその組換体において使用することができる。
本発明の組成物の例には、例えば、腔部（例えば、口、鼻、肛門、膣、経口、胃内など）投与用の液状製剤、例えば、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤など；さらには、非経口、皮下、皮内、筋内または静脈内投与（例えば、静注）用製剤、例えば、無菌の懸濁液またはエマルジョンが含まれる。それらの組成物においては、組換えポックスウイルスに、適当なキャリア、稀釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、ブドウ糖などを混合させてもよい。この組成物は凍結乾燥されていても良い。この組成物は湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または粘度増加添加物、保存剤、フレーバー剤、色素およびそのような物等の補助的物質を、所望の調製物および投与経路に応じて含んでも良い。ここに参考文献として取り込むものとする「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE」17版、1985等の標準的なテキストを、不必要な実験を行うことなく適切な調製物を調製するために参考にしてもよい。好適な投与量は以下の実施例をベースとすることができる。
さらに、本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を直接使用して、ヒトまたは動物における免疫応答を刺激することもできる。すなわち、上述の組成物における本発明の組換えウイルスの代わりにまたはそれとともに、該発現産生物を使用して本発明の組成物とすることもできる。
また、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれに由来する発現産生物は、ヒトおよび動物における免疫または抗体応答を刺激し、したがって該産生物は抗原である。これらの抗体または抗原から、当該技術分野で周知の手法により、モノクローナル抗体を調製することができ、そして、これらのモノクローナル抗体または抗原を、特定の狂犬病または他の抗原（群）の有無、したがって、（狂犬病または「その他の」抗原性の系において）該ウイルスまたは「その他の」病気、または抗原（群）の発現の有無を測定したり、または、該ウイルスまたは「その他の」病気または抗原に対する免疫応答が単に刺激されたか否かを判定するための公知の結合アッセイ、診断キットまたは試験において用いることができる。これらのモノクローナル抗体または抗原は、免疫吸着クロマトグラフィーに使用されて、狂犬病またはその他の病気のための薬剤または本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を回収したり単離することもできる。
モノクローナル抗体を製造する方法およびモノクローナル抗体の使用方法、ならびに狂犬病または「その他の」抗原（本発明のポックスウイルスの発現産生物および組成物）の使用法などは当該技術分野における当業者には周知である。それらは、診断法、キット、テストまたはアッセイなどに使用されるとともに、免疫吸着クロマトグラフィーまたは免疫沈降反応による物質回収に使用され得る。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基に反応し、通常の血清由来の抗体よりも高い特異性を与える。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、所望の特異性、アビディディ（抗原結合力）およびイソタイプを有する個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系統は、化学的に同一の抗体の恒常的且つ安価な供給源となり、そして、そのような抗体の調製は容易に標準化できる。モノクローナル抗体を産生する方法は当該技術分野における当業者には周知であり、例えば、Koprowski，H他による米国特許第4,196,265号（1989年4月1日査定）が参考文献としてここに取り込まれている。
モノクローナル抗体の用途も既知である。そのような用途の一つは診断法に利用するものであり、例えば1983年3月8日付でDavid，G．およびGreene，H．に付与された米国特許第4,376,110号を引用しておく。モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーにより物質を回収するのにも利用されており、例えば、Milstein，C．1980によるScientific American 243：66，70を引用しておく。
従って、本発明の組換体ポックスウイルスおよび組成物は、ここにおいて述べられたいくつかの用途を有している。本発明の実施態様としてはその他の用途もある。
本発明およびその多くの利点は、説明のために記載する以下の実施例から良好に理解されよう。
実施例
ＤＮＡクローニングおよび合成  標準的な方法により、プラスミドを構築し、スクリーニングし、増殖させた（Maniatis等，1982；Perkus等，1985；Piccini等，1987）。制限エンドヌクレアーゼは、メリーランド州、ゲイサースブルグのベセスダリサーチラボラトリーズ；マサチューセッツ州、ビバーリーのニューイングランドバイオラド；およびインディアナ州、インディアナポリスのベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片は、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４  ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラドから得た。様々な供給者により指定された通りに試薬を用いた。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、既述のように（Perkus他、1989）Biosearch 8750またはApplied Biosystems 380B ＤＮＡ合成装置を用いて調製した。ＤＮＡ配列決定は、既述の手法に従い（Guo他、1989）シークエナーゼ（Sequenase）を用いて（Tabor他、1987）ジデオキシ−チェインターミネーション法により（Sanger他、1977）行った。配列確認のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（Engelke他、1988）は、自動式Perkin Elmer Cetus ＤＮＡ熱サイクル装置（ＤＮＡ Thermal Cycler）によりカスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびGeneAmp ＤＮＡ増幅試薬キット（米国コネチカット州Norwalkのパーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus）社製）を用いて実施した。制限エンドヌクレアーゼ分解した後、ＢＡＬ−３１エクソヌクレアーゼによる限定分解および合成オリゴヌクレオチドによる突然変異法（Mandecki，1986）により、プラスミドから過剰ＤＮＡ配列を欠失させた。
細胞、ウイルスおよび移入  ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Copenhagen）株およびＮＹＶＡＣの起源および培養条件は既に明らかにされている（Guo他、1989）。組換えによる組換えウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイチュハイブリダイゼーションおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を利用するスクリーニングについては既に明らかにされている（Piccini他、1987）。
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Copenhagen）株およびＮＹＶＡＣの起源および培養条件は既に明らかにされている（Guo他、1989；Tartaglia他、1992）。組換えによる組換えウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイチュハイブリダイゼーションおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を利用するスクリーニングについては既に明らかにされている（Panicali他，1982；Perkus他，1989）。
カナリアポックスウイルスの親株（Rentschler株）はカナリアのワクチン用菌株である。このワクチン株は、野生型の単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞での200回以上の継代培養を通して弱毒化されたものである。そのマスターウイルスシードは寒天培地において４回の連続的なプラーク精製に供され、そのプラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増幅され、その後、このストックウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に使用された。このプラーク精製カナリアポックス単離体がＡＬＶＡＣと命名されている。
ＦＰ−１と命名されたニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）株については既に明らかにされている（Taylor他、1988ａ）。これは、日齢のヒナのワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン株である。親ウイルス株Duvetteは、フランスにおいてニワトリからニワトリポックス疥癬として入手された。このウイルスがニワトリふ化卵での約50回の連続的な継代培養の後、ニワトリ胚繊維芽細胞における25回の継代培養により弱毒化された。該ウイルスは４回の連続的なプラーク精製に供された。プラークの１つが単離され、初期ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスが樹立された。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ各ウイルスベクターおよびそれらの誘導体の増殖については既に記述されている（Piccini他、1987；Taylor他、1988ａ，ｂ）。増殖にVERO細胞やニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を使用することも既に明らかにされている（Taylor他、1988ａ，ｂ）。
ＮＹＶＡＣおよび特に実施例１から６に関しては、米国特許第5,364,773号を参照しており、本明細書に引用しておく。
実施例１  −  チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４６０の構築
ここで図１を参照する。プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄIII  Ｊ（位置83359-88377）を含有している。ｐＳＤ４０６はＨｉｎｄIIIおよびＰｖｕIIにより切断され、ＨｉｎｄIII  Ｊの左側由来の1.7ｋｂの断片を、ＨｉｎｄIII／ＳｍａＩにより切断されたｐＵＣ８中にクローニングし、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置83855-84385）の全遺伝子を含有している。開始コドンはＮｌａIIIサイト内に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩサイト内に含まれている。転写方向は、図１の矢印により示されている。
左側の隣接アームを得るために、ｐＳＤ４４７から0.8kbのＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩ断片を単離し、次いでＮｌａIIIで消化して0.5kbのＨｉｎｄIII／ＮｌａIII断片を単離した。以下の配列を有するアニーニングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（SEQ ID NO:1／SEQ ID NO:2）を0.5kbのＨｉｎｄIII／ＮｌａIII断片と連結（ライゲート）し、ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミドに導入して、プラスミドｐＳＤ４４９を得た。
0004140862.tif 000002
ワクシニアの右側の隣接アームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限酵素断片を得るために、ワクシニア配列内でＳｓｐＩ（部分的）を、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIIIを用いてｐＳＤ４４７を切断して、2.9kbのベクター断片を単離した。このベクター断片を、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（SEQ ID NO:3／SEQ ID NO:4）と連結して、ｐＳＤ４５９を得た。
0004140862.tif 000003
左側隣接アームと右側隣接アームを１つのプラスミド中に結合させるために、ｐＳＤ４４９から0.5kbのＨｉｎｄIII／ＳｍａＩ断片を分離し、これを、ＨｉｎｄIII／ＳｍａＩで切断されたｐＳＤ４５９ベクタープラスミドに連結してｐＳＤ４６０を調製した。このｐＳＤ４６０をドナープラスミドとして用い、野性型親ワクシニアウイルスCopenhagen株ＶＣ−２との組換えを実施した。鋳型としてＭＰＳＹＮ４５（SEQ ID NO:3）およびプライマーとして相補的な20merオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（SEQ ID NO:5）（５′TTAGTTAATTAGGCGGCCGC３′）を用いるプライマー延長法により32Ｐでラベルされたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０の同定はプラークハイブリダイゼーションにより行った。
実施例２−出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）を欠失させたプラスミドｐＳＤ４８６の構築
図２において、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ（位置160,744〜173,351）を含有する。ｐＳＤ４２２は、右側に隣接するワクシニアＳａｌＩ断片、ＳａｌＩ  Ｊ（位置173,351〜182,746）（ｐＵＣ８にクローニングされている）を含有している。出血性領域ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置172,549〜173,552）が欠失されたプラスミドを構築するため、左側隣接アーム源としてｐＳＤ４１９を用い、また、右側隣接アーム源としてｐＳＤ４２２を用いた。ｕ領域の転写方向は図２の矢印で示す。
ｐＳＤ４１９から非所望配列を除去するために、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩを用いてｐＳＤ４１９を分解し、次いで大腸菌のクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ＮｃｏＩサイト（位置172,253）の左側の配列を除去してプラスミドｐＳＤ４７６を得た。Ｂ１４Ｒの終結コドンにおけるＨｐａＩでのｐＳＤ４２２の分解および0.3kb右のＮｒｕＩによる分解によりワクシニアの右側隣接アームを得た。この0.3kbの断片を単離、ｐＳＤ４７６から単離された3.4kbのＨｉｎｄIIベクター断片に連結して、プラスミドｐＳＤ４７７を得た。ｐＳＤ４７７におけるワクシニアｕ領域の部分欠失位置は三角形で示している。ｐＳＤ４７７における残りのＢ１３Ｒコード配列を除去するため、ＣｌａＩ／ＨｐａＩを用いる分解を行い、得られたベクター断片を、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ22mer／ＳＤ20mer（SEQ ID NO:6／SEQ ID NO:7）に連結して、ｐＳＤ４７９を調製した。
0004140862.tif 000004
ｐＳＤ４７９は、開始コドン（下線）を含有し、その後にＢａｍＨＩサイトがある。Ｂ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失座にｕプロモーターの制御下、大腸菌ベーターガラクトシダーゼを入れるために、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＳＤ４７９ＢＧを調製した。このｐＳＤ４７９ＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えを実施した。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３を、発色性基質Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして分離した。ｖＰ５３３においては、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域が欠失され、ベーターガラクトシダーゼによって置換されている。
ｖＰ５３３からベーターガラクトシダーゼを取り除くために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠失結合部に開始コドンを有しないｐＳＤ４７７の派生体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。先ず、上述のｐＳＤ４７７由来のＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片を、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ42mer／ＳＤ40mer（SEQ ID NO:8／SEQ ID NO:9）に連結して、プラスミドｐＳＤ４７８を調製した。
0004140862.tif 000005
次に、ｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩサイトを破壊するため、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４７８を分解し、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ｐＳＤ４７８Ｅ-を得た。このｐＳＤ４７８Ｅ-をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩを用いて分解し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（SEQ ID NO:10／SEQ ID NO:11）に連結して、プラスミドｐＳＤ４８６を調製した。
0004140862.tif 000006
ｐＳＤ４８６をドナープラスミドとして用い、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えを行ってｖＰ５５３を得た。このｖＰ５５３は、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
実施例３−ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）を欠失させたプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築
図３において、ｐＳＤ４１４は、ｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｂを含有する。Ａ２６Ｌ領域の左側の所望でないＤＮＡ配列を取り除くために、ｐＳＤ４１４を、ワクシニア配列内でＸｂａＩを用いて切断し（位置137,079）、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIIIを用いる切断を行い、次に、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結を行うことにより、プラスミドｐＳＤ４８３を得た。Ａ２６Ｌ領域の右側の非所望ワクシニアＤＮＡ配列を除去するために、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４８３を切断し（位置140,665およびｐＵＣ／ワクシニア結合部）、連結処理（ライゲーション）を行ってプラスミドｐＳＤ４８４を形成した。Ａ２６Ｌコード領域を取り除くため、ＮｄｅＩ（部分的）を用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し上流を切断し（位置139,004）且つＨｐａＩを用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し下流を切断（位置137,889）した。5.2kbのベクター断片を単離し、これを以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（SEQ ID NO:12／SEQ ID NO:13）と連結して、Ａ２６Ｌの上流領域を再構成し、下記の配列に示すようなＢｇｌII、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩの制限サイトを含有する短いポリリンカー領域とＡ２６ＬのＯＲＦを置換した。
0004140862.tif 000007
得られたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域におけるＢｇｌIIサイトおよびＥｃｏＲＩサイトは唯一のものではないので、ＢｇｌIIを用いる分解（位置140,136）およびｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩによる分解を行い、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）により、プラスミド４８３（上述）から非所望のＢｇｌIIサイトおよびＥｃｏＲＩサイトを除去した。得られたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８９由来でＡ２６ＬのＯＲＦを含有する1.8kbのＣｌａＩ（位置137,198）／ＥｃｏＲＶ（位置139,048）断片を対応する0.7kbのポリリンカーを含有するｐＳＤ４８５由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片と置換することによりｐＳＤ４９２を得た。このｐＳＤ４９２のポリリンカー領域におけるＢｇｌIIサイトおよびＥｃｏＲＩサイトは唯一のものである。
ｐＳＤ４９２のＢｇｌIIサイトに、11kDaのワクシニアプロモーター（Bertholet他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.3kbのＢｇｌIIカセットを挿入して、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ５５３との組換えを行った。Ａ２６Ｌ欠失領域にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして単離された。
ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からベーターガラクトシダーゼを欠失させるプラスミドを調製するために、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（SEQ ID NO:14）を用いる突然変異法（Mandecki、1986）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を欠失させた。
0004140862.tif 000008
得られたプラスミドｐＭＰ４９４Δにおいては、位置［137,889〜138,937］をカバーし、Ａ２６ＬのＯＲＦ全体を含むワクシニアＤＮＡが欠失されている。このｐＭＰ４９４Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換体ｖＰ５８１との間の組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
実施例４−血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）を欠失させたプラスミドｐＳＤ４６７の構築
図４において、ワクシニアＳａｌＩ  Ｇ制限酵素断片（位置160,744〜173,351）は、ＨｉｎｄIII Ａ／Ｂ結合部（位置162,539）を包含している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇを含有する。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図４における矢印で示されている。ＨｉｎｄIII Ｂ由来のワクシニア配列の除去には、ワクシニア配列内およびｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIIIを用いるｐＳＤ４１９の分解を行い、その後、連結処理（ライゲーション）した。得られたプラスミドｐＳＤ４５６は、左側を0.4kbのワクシニア配列および右側を0.4kbのワクシニア配列で挟まれたＨＡ遺伝子（Ａ５６Ｒ）を含有する。Ａ５６Ｒをコードする配列を除去するために、Ａ５６Ｒコード配列の上流をＲｓａＩ（部分的；位置161,090）により、また、該遺伝子の末端近傍をＥａｇＩ（位置162,054）によりｐＳＤ４５６を切断した。ｐＳＤ４５６から3.6kbのＲｓａＩ／ＥａｇＩベクター断片を単離し、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（SEQ ID NO:15）、ＭＰＳＹＮ６２（SEQ ID NO:16）、ＭＰＳＹＮ６０（SEQ ID NO:17）およびＭＰＳＹＮ６１（SEQ ID NO:18）に連結（ライゲート）して、Ａ５６ＲのＯＲＦの上流のＤＮＡ配列を再構成し、Ａ５６ＲのＯＲＦを下記に示すようなポリリンカー領域と置換した。
0004140862.tif 000009
得られたプラスミドがｐＳＤ４６６である。このｐＳＤ４６６におけるワクシニア欠失は位置［161,185〜162,053］を包含する。ｐＳＤ４６６における欠失サイトは図４では三角形で示されている。
ｐＳＤ４６６のＢｇｌIIサイトに、11kDaのワクシニアプロモーター（Bertholet他、1985；Guo他、1989）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＢｇｌII／ＢａｍＨＩ（部分的）カセットを挿入して、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ６１８との組換えを行った。Ａ５６Ｒ欠失サイトにベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７０８が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
ドナープラスミドｐＳＤ４６７を用い、ｖＰ７０８からベーターガラクトシダーゼ配列を除去した。ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同じであるが、但し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いるｐＳＤ４６６の分解、それに続く大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結処理（ライゲーション）によりｐＵＣ／ワクシニア結合部からＥｃｏＲＩサイト、ＳｍａＩサイトおよびＢａｍＨＩサイトが取り除かれている点が異なっている。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間に組換えを行うことにより組み換えワクシニア欠失変異体ｖＰ７２３が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
実施例５−オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を欠失させたプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築
図５に関し、次のワクシニアクローンを利用してｐＭＰＣＳＫ１Δを構築した。ｐＳＤ４２０は、ｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｈである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８にクローニングされたＫｐｎＩ  Ｆである。ＳｐｈＩでｐＳＤ４３５を切断、再連結してｐＳＤ４５１を形成した。このｐＳＤ４５１においては、ＨｉｎｄIII ＭにおけるＳｐｈＩサイト（位置27,416）の左側のＤＮＡ配列が除去されている（Perkus他、1990）。ｐＳＤ４０９は、ｐＵＣ８にクローニングされたＨｉｎｄIII Ｍである。
ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターを除去する基質を得るために、先ず、以下のように、ワクシニアのＭ２Ｌ欠失座に大腸菌ベーターガラクトシダーゼを挿入した（Guo他，1990）。ｐＳＤ４０９においてＢｇｌIIサイトを取り除くために、ＢｇｌIIを用いてワクシニア配列（位置28,212）およびＢａｍＨＩを用いてｐＵＣ／ワクシニア結合部において該プラスミドを切断し、次いで連結処理（ライゲーション）を行い、プラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。唯一のＳｐｈＩサイト（位置27,416）においてｐＭＰ４０９Ｂを切断した。以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを用いる突然変異法（Guo他、1990；Mandecki，1986）によりＭ２Ｌをコードする配列を除去した。
ＭＰＳＹＮ８２（SEQ ID NO:19)
0004140862.tif 000010
得られたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、上記のようにＭ２Ｌ欠失座に挿入された唯一のＢｇｌIIサイトを含有する。ＢｇｌIIで切断されたｐＭＰ４０９Ｄに、11kDaのプロモーター（Bertholet他、1985）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌIIカセットを挿入した。得られたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（Guo他、1990）をドナープラスミドとして用い、レスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３との組換えを行った。Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７８４が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠失されたプラスミドを、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片で平滑末端化されたｐＵＣ８に組み込んだ。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｃ配列から成る左側の隣接アームを得るために、ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置18,628）で分解した後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化およびＢｇｌII（位置19,706）を用いる分解を行った。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｋ配列から成る右側の隣接アームは、ｐＳＤ４５１をＢｇｌII（位置29,062）およびＥｃｏＲＶ（位置29,778）で分解して得られた。得られたプラスミドｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄIII ＣのＢｇｌIIサイト（位置19,706）とＨｉｎｄIII ＫのＢｇｌIIサイト（位置290642）との間のワクシニア配列が欠失されている。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫにおけるワクシニア配列の欠失部位は図５に三角形で示している。
ワクシニア欠失部の過剰なＤＮＡを除去するため、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩサイト（位置18,811；19,655）において切断し、Ｂａｌ−３１エクソヌクレアーゼを用いて処理し、さらに、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（SEQ ID NO:20）を用いる突然変異法（Mandecki，1986）に供した。
0004140862.tif 000011
得られたプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δは、12のワクシニアオープンリーデンフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含する18,805〜29,108位置のワクシニア配列が欠失されている。ｐＭＰＣＳＫ１Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニアウイルスｖＰ７８４との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８０４が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
実施例６−リボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）を欠失させたプラスミドｐＳＤ５４８の構築
図６において、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄIII Ｉ（位置63,875〜70,367）を含有する。このｐＳＤ４０５をワクシニア配列内（位置67,933）でＥｃｏＲＶにより、また、ｐＵＣ／ワクシニア結合部においてはＳｍａＩにより消化し、連結処理（ライゲーション）することによりプラスミドｐＳＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５４８の構築に用いたワクシニア制限断片は、全て、このｐＳＤ５１８由来のものである。
ワクシニアのＩ４Ｌ遺伝子は、67,371〜65,059の位置に延在している。Ｉ４Ｌの転写方向は、図６において矢印で示されている。Ｉ４Ｌのコード配列の一部が欠失したベクタープラスミドを得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置65,381）およびＨｐａＩ（位置67,001）を用いて分解し、且つ、大腸菌のクレノウ断片を用いて平滑末端化した。この4.8kbのベクター断片を、ワクシニアの11kDaのプロモーター（Bertholet他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＳｍａＩカセットに連結して、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを得た。このｐＳＤ５２４ＫＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えを行った。Ｉ４Ｌ遺伝子の部分欠失位置にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
ベーターガラクトシダーゼおよび残存するＩ４ＬのＯＲＦをｖＰ８５５から欠失させるために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。以下に詳述し且つ図６に示すように、左側および右側のワクシニア隣接アームをそれぞれ別個にｐＵＣ８に組み込んだ。
左側のワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（SEQ ID NO:21／SEQ ID NO:22）に連結して、プラスミドｐＳＤ５３１を形成した。
0004140862.tif 000012
ＲｓａＩ（部分的）およびＢａｍＨＩでｐＳＤ５３１を切断し、2.7kbのベクター断片を単離した。ＢｇｌII（位置64,459）／ＲｓａＩ（位置64,994）でｐＳＤ５１８を切断して0.5kbの断片を単離した。これらの２つの断片を互いに連結して、Ｉ４Ｌのコード配列の左側の完全なワクシニア隣接アームを含有するｐＳＤ５３７を形成した。
右側のワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでｐＵＣ８を切断し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（SEQ ID NO:23／SEQ ID NO:24）に連結して、プラスミドｐＳＤ５３２を形成した。
0004140862.tif 000013
このｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断して2.7kbのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、ワクシニア配列内をＲｓａＩ（位置67,436）により、また、ワクシニア／ｐＵＣ結合部をＥｃｏＲＩによって切断して0.6kbの断片を単離した。２つの断片を互いに連結し、Ｉ４Ｌをコードする配列の右側の完全なワクシニア隣接アームを含有するｐＳＤ５３８を調製した。
右側のワクシニア隣接アームは、ｐＳＤ５３８から0.6kbのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌII断片として単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIで切断されたｐＳＤ５３７内に連結した。得られたプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４ＬのＯＲＦ（位置65,047〜67,836）がポリリンカー領域によって置換されており、該領域は左側を0.6kbのワクシニアＤＮＡにより、また右側を0.6kbのワクシニアＤＮＡにより挟まれており（フランキングされており）、これらは全てｐＵＣバックグランド内にある。ワクシニア配列内の欠失部は、図６において三角形で示している。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ派生部分のベーターガラクトシダーゼが、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５内のベーターガラクトシダーゼと組換えを行う可能性を回避するため、ｐＳＤ５３９からワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットを取り除いてｐＲＣ１１とした。このｐＲＣ１１は、すべてのベーターガラクトシダーゼが除去され、ポリリンカー領域で置換されたｐＵＣ派生体である（Colinas他、1990）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断して1.2kbの断片を単離した。この断片を、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（2.35kb）に連結して、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換体ｖＰ８５５との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡの分析は、制限酵素分解、次にアガロースゲル上の電気泳動法により行った。制限パターンは予測どおりであった。鋳型としてｖＰ８６６および上で詳述した６つの欠失遺伝子座を挟むプライマーを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）（Engelke他、1988）により予測された大きさのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲで得られた断片の欠失接合領域近傍の配列分析により、接合が期待どおりであることが確認された。上述したような６つの欠失部を有するように工夫した組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６をワクシニアウイルス株「ＮＹＶＡＣ」と命名した。
実施例７−ＮＹＶＡＣへの狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子の挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988ａ，ｂ）の制御下に狂犬病（ウイルス）糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子をＴＫ欠失プラスミドｐＳＤ５１３に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカーが存在している点を除いては、ｐＳＤ４６０（図１）と同一である。
図７に示すように、ｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（SEQ ID NO:25／SEQ ID NO:26）に連結することにより該ポリリンカーを挿入することにより、ベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成した。
0004140862.tif 000014
このｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988ａ，ｂ）の制御下に狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を含有し、ＳｍａＩ末端とした1.8kbのカセットに連結した。得られたプラスミドをｐＲＷ８４２と命名した。このｐＲＷ８４２をドナープラスミドとして用い、ＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）と組換えを行った。狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする配列に対する32Ｐラベル化プローブを用いるプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を同定した。
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとして幾つかの利点を有する。すなわち、ベクターの毒性が弱毒化されているので、ワクチン接種による被接種者が無制御（ランナウェー）感染する可能性が減少し、さらに、感染者から非感染者への伝染や環境の汚染も少なくするという利点を有する。
さらに、本発明の改変組換えウイルスは、インビトロ培養される細胞内で遺伝子産物を発現させるのに用いることもでき、このためには、該細胞内で遺伝子産物をコードし発現する外来遺伝子を有する本発明の改変組換えウイルスを該細胞に導入すればよい。
実施例８−狂犬ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣ組換体の構築
この実施例は、カナリアポックスウイルスベクターＡＬＶＡＣおよびカナリアポックス−狂犬病ウイルス組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の調製ならびにその安全性と効力について記述するものである。
細胞およびウイルス  親カナリアポックスウイルス（Rentschler株）はカナリア用ワクチン株の１つである。このワクチン株は野性型の単離体から入手され、ニワトリ胚繊維芽細胞による200回以上の連続的な継代培養により弱毒化されたものである。マスターウイルスシードは、寒天下の４回の連続的なプラーク精製に供され、さらに、プラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増殖された後、該ストックウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体は、ＡＬＶＡＣと命名されている。
カナリアポックス挿入ベクターの構築  880bpのカナリアポックスＰｖｕII断片を、ＰＵＣ９のＰｖｕIIサイト間にクローニングしてｐＲＷ764.5を調製した。この断片の配列は、図８（SEQ ID NO:27）において1372〜2251位置に示されている。Ｃ５として称されているオープンリーディングフレームの範囲を確認した。このオープンリーディングフレームは、該断片内の位置166で開始され且つ位置487で終結されていることが明らかにされた。オープンリーディングフレームを阻害することなくＣ５の欠失を行った。位置167から位置455までの塩基を、配列（SEQ ID NO:28）GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTと置換した。この置換配列は、ＨｉｎｄIII、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ挿入サイトと、それに後続しワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される翻訳停止シグナルおよび転写終結シグナルを含有している（Yuen他、1987）。Ｃ５オープンリーディングフレームの欠失は以下のように行った。プラスミドｐＲＷ764.5をＲｓａＩで部分的に切断して直線状の生成物を単離した。このＲｓａＩ直線状断片をＢｇｌIIで再切断し、かくして、位置156から位置462までのＲｓａＩからＢｇｌIIまでが欠失したｐＲＷ764.5断片を単離し、以下の合成オリゴヌクレオチド用ベクターとして使用した。
0004140862.tif 000015
オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングし、上述のｐＲＷ764.5 ＲｓａＩおよびＢｇｌIIベクターに挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３１と命名した。
狂犬病Ｇ遺伝子を含有する挿入ベクターの構築  以下にｐＲＷ８３８の構築について説明する。ＡからＥのオリゴヌクレオチド（狂犬病ウイルスＧのＨ６プロモーターの開始コドンと重なっている）をｐＵＣ９にクローニングしてｐＲＷ７３７とした。オリゴヌクレオチドＡからＥはＨ６プロモーターを含有し、ＮｒｕＩで始まり、狂犬病ウイルスＧのＨｉｎｄIIIに到り、その後にＢｇｌIIがある。オリゴヌクレオチドＡからＥ（（SEQ ID NO:31）から（SEQ ID NO:35））の配列は以下のとおりである。
0004140862.tif 000016
また、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＡからＥを図解すると次のようになる。
0004140862.tif 000017
オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングし（95℃で５分間、その後、室温に冷却）、ｐＵＣ９のＰｖｕIIサイト間に挿入した。得られたプラスミドｐＲＷ７３７をＨｉｎｄIIIおよびＢｇｌIIで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（Kieny他、1984）のＨｉｎｄIII−ＢｇｌIIの1.6kbp断片用ベクターとして使用しｐＲＷ７３９を調製した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯＨｉｎｄIIIサイトは、狂犬病Ｇの翻訳開始コドンの86bp下流にある。また、ｐｔｇ１５５ＰＲＯにおいて、ＢｇｌIIは狂犬病Ｇ翻訳停止コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９をＮｒｕＩを用いて部分切断し、さらにＢｇｌIIを用いて完全切断し、かくして、既知のＨ６プロモーター（Taylor他、1988ａ，ｂ；Guo他、1989；Perkus他、1989）の３′末端から狂犬病Ｇの全遺伝子までを含有する1.7kbpのＮｒｕＩ−ＢｇｌII断片をｐＲＷ８２４のＮｒｕＩサイトとＢａｍＨＩサイトとの間に挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３２と命名する。ｐＲＷ８２４に挿入することにより、ＮｒｕＩのＨ６プロモーターの５′が付加された。ＳｍａＩが後に続いているＢａｍＨＩのｐＲＷ８２４の配列は、GGATCCCCGGG（SEQ ID NO:36）である。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスのＨ６プロモーターに非関連遺伝子が正確に結合されたプラスミドである。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの分解によりこの非関連遺伝子を切除した。このｐＲＷ８３２のＳｍａＩの1.8kbp断片（Ｈ６をプロモーターとする狂犬病Ｇを含有している）をｐＲＷ８３１のＳｍａＩに挿入して、プラスミドｐＲＷ８３８を調製した。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの調製  既知のリン酸カルシウム沈降法を用いて（Panicali他、1982；Piccini他、1987）、ＡＬＶＡＣ感染初期ＣＥＦ細胞にｐＲＷ８３８を移入させた。特定の狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションにより陽性クローンを選択し、純粋な集団が得られるまで６回の連続的なプラーク精製に供した。次に、１つの代表プラークを増殖して、得られたＡＬＶＡＣ組換体をＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名した（図９Ａおよび図９Ｂ参照）。配列分析により、狂犬病Ｇ遺伝子がＡＬＶＡＣゲノム内に正しく挿入され、その後の変異が生じていないことを確認した。
免疫蛍光  成熟狂犬病ウイルス粒子が形成される最終段階においては、糖タンパク質成分はゴルジ体から形質膜に移送され、そこで、細胞膜質および細胞膜の外表面にあるタンパク質本体にカルボキシ末端を延ばしながら蓄積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が正しく存在していることを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧで感染された初期ＣＥＦ細胞上で免疫蛍光測定法を実施した。この免疫蛍光法は、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、狂犬病Ｇのモノクローナル抗体を用いて行った。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ細胞においては強い表面蛍光が検出されたが、親のＡＬＶＡＣには蛍光は認められなかった。
免疫沈降  初期ＣＥＦ細胞、VERO細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の細胞系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）、およびＭＲＣ−５細胞（正常なヒト胎児肺組織から派生された繊維芽細胞類似の細胞系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171）から予め形成した単層に、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、放射ラベルした35Ｓ−メチオニンの存在下に、10pfu／細胞で、親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。免疫沈降反応は、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧの場合は、分子量がおよそ67kDaの狂犬病特異的糖タンパク質が効率的に発現していることが検出された。非感染細胞または親ウイルスであるＡＬＶＡＣが感染された細胞においては、狂犬病特異的生成物の検出は認められなかった。
連続継代培養実験  ＡＬＶＡＣを広範囲の非トリ種に適用した研究では、感染の増幅や明白な病気は認められていない（Taylor他、1991ｂ）。しかしながら、親ウイルスおよび組換えウイルスのいずれも非トリ細胞では増殖できないことを確認するため、連続的な継代培養実験を行った。
以下の細胞基質に２種類のウイルス、すなわち、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種して10代の連続的な盲検（ブラインド）継代培養を行った。
（1）11日齢の白色レグホーン胚由来の初期ニワトリ繊維芽（ＣＥＦ）細胞；
（2）VERO細胞−アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の無限増殖性細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）；および
（3）ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児の胚組織由来の二倍体細胞系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171）。
各細胞につき３ヶの60mm培養皿を用い各皿に２×106個の細胞が含有されるようにして、0.1pfu／細胞のm.o.i.で最初の接種を行った。培養皿の１つは、ＤＮＡ複製の阻害剤であるシトシンアラビノシド（Ara C）40μg／mlの存在下に接種を行った。37℃で１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、単層を洗浄して非吸着ウイルスを取り除いた。この時点で、培地の置換を行い、２つの培養皿（試料t0および試料t7）には５mlのEMEM＋２％NBCSを入れ、また、第３番目の培養皿（試料t7A）には40μg／mlのAra Cを含有する５mlのEMEM＋２％NBCSを入れた。試料t0は−70℃で凍結して残存する導入ウイルスの指標とした。試料t7および試料t7Aは37℃で７日間培養し、その後、内容物を回収し、間接音波処理により細胞を破砕した。
各細胞基質の試料t7の１mlを同じ細胞基質の３つの培養皿に稀釈せずに接種し（試料t0、t7およびt7Aとする）、さらに、初期ＣＥＦ細胞の１つの培養皿に接種した。試料t0、試料t7および試料t7Aは第１代継代のために処理した。ＣＥＦ細胞への追加接種は、非トリ細胞中に存在し得るようなウイルスに対する高感度検出用の増殖工程に供した。
この操作を繰り返して、10代の連続ブラインド継代培養（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８代（VERO）の連続ブラインド継代培養を行った。試料を凍結し、３回解凍して初期ＣＥＦ単層上で滴定を行うことにより分析した。
次に、寒天下にＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を測定した。実験結果をまとめて表１および表２に示す。
この結果から、親のＡＬＶＡＣおよび組換体のＡＬＶＡＣ−ＲＧの両方とも、ＣＥＦ単層上で複製を持続する能力を有し力価の損失はないことが示されている。VERO細胞においては、ＡＬＶＡＣについては第２代後、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧについては第１代後にウイルスのレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５においても同様の結果が示され、第１代後にはウイルスが検出されなかった。表１および表２には第４代までの結果しか示していないが継代培養を第８代（VERO）および第10代（ＭＲＣ−５）まで行ったところ、これらの非トリ細胞においてはいずれのウイルスも検知可能となるように成長適応化していなかった。
第１代においては、ＭＲＣ−５細胞およびVERO細胞のt7試料には比較的高レベルのウイルスが存在した。しかしながら、このレベルは、t0試料およびウイルスの複製が起こり得ないようにシトシンアラビノシドの存在下に接種を行ったt7A試料において見られるレベルに等しかった。このことは、非トリ細胞において７日目に認められたウイルスレベルは、残存ウイルスを表し新たに複製されたウイルスではないことを示している。
分析をさらに高感度にするため、各細胞基質から７日目に回収したものの一部を、任意のＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた時に回収するか、またはＣＰＥが見られない場合は７日目に回収した。この実験結果を表３に示す。任意の細胞基質による増殖後においても、ＭＲＣ−５細胞およびVERO細胞においては、更に２代の継代でウイルスが検出されるだけであった。これらの結果から、採用した条件下では、VERO細胞またはＭＲＣ−５細胞においてはいずれのウイルスも増殖できるように適応化されていないことが示唆された。
アカゲザルへの接種  ＨＩＶに関して血清反応陽性の４匹のアカゲザルに先ずＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した（表４）。100日後、該動物に再接種して追加免疫効果を調べ、さらに、追加の７匹のアカゲザルにいろいろな投与量で接種を行った。適当な間隔で血液を抜き出し、56℃において30分間の加熱不活性化後、高速蛍光焦点阻害（Rapid Fluorescent Focus Inhibition：ＲＦＦＩ）分析法（Smith他、1973）により狂犬病ウイルス抗体の存在を血清分析した。
チンパンジーへの接種  オトナのオスのチンパンジー２匹（体重範囲50〜65kg）に、ｖＣＰ６５を１×107pfuで筋内また皮下接種した。該動物の反応を観察し、また、規則的な間隔で採血を行いＲＦＦＩテスト（Smith他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体の存在を分析した。最初の接種から13週間後、同じ投与量で該動物に再接種した。
マウスへの接種  グループ分けしたマウスに、異なるバッチ由来のｖＣＰ６５をいろいろな希釈度で50〜100μｌ接種した。マウスへの接種は足蹠に接種した。14日目に、狂犬病ウイルスの毒性ＣＶＳ株を15〜43マウスLD50で頭蓋内接種することによりマウスの免疫性テストを行った。マウスの生存率を監視し、接種から28日目における50％防御投与量（PD50）を求めた。
イヌおよびネコへの接種  10匹のビーグル犬（５ヶ月齢）および10匹のネコ（４ヶ月齢）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.7または7.7log10TCID50で皮下接種した。４匹のイヌおよび４匹のネコには接種を行わなかった。接種後14日および28日後にそれらの動物の採血を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病ウイルス抗体を分析した。6.7log10TCID50のＡＬＶＡＣ−ＲＧが投与された動物については、接種後29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルス免疫性テスト株の3.7log10（マウスLD50）（ビーグル犬）または4.3log10（マウスLD50）（ネコ）を用いて免疫性テストを行った。
リスザルへの接種  各グループが４匹のリスザル（Saimiri Sciureus）から成る３グループのリスザルに、３種類のウイルスの１つ、すなわち、（a）ＡＬＶＡＣ（カナリアポックス親ウイルス）、（b）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組換体、または（c）ｖＣＰ３７（ネコ白血病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換体）を接種した。接種はケタミン麻酔下に実施した。各動物は以下を同時に投与された：（1）乱刺を行わずに右目の表面に滴注された20μｌ、（2）口中に数滴として100μｌ、（3）右腕の外表面の毛をそった皮膚内の２つの注射部位にそれぞれ100μｌ；および（4）右大腿の前部筋肉に100μｌ。
４匹のサルに各ウイルスを、２匹については5.0log10pfuを、また、他の２匹については70log10pfuを接種した。規則的な間隔で該動物の採血を行い、血清を分析してＲＦＦＩテスト（Smith他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体を調べた。接種に対する該動物の反応を毎日観察した。最初の接種から６ヶ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与された４匹のリスザル、ｖＣＰ３７をはじめに投与された２匹のリスザルに加えて非投与のリスザル１匹に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.5log10pfuで皮下接種した。血清を分析して、ＲＦＦＩテスト（Smith他、1973）により狂犬病ウイルス中和抗体の存在を調べた。
ヒト細胞系統へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種  当該ウイルスが複製しない非トリ細胞内で外来遺伝子が効率的に発現されるか否かを判定するため、５種類の細胞系統、すなわち、１種類のトリ系および４種類の非トリ系について分析を行い、ウイルス収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積を調べた。接種した細胞は次のとおりである。
（a）VERO細胞。アフリカミドリザル腎臓細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81。
（b）ＭＲＣ−５細胞。ヒト胎児肺細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171。
（c）ＷＩＳＨ細胞。ヒト羊膜由来。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ25。
（d）Detroit-532細胞。ヒト包皮由来。ダウン症候群。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。
（e）初期ＣＥＦ細胞。
11日齢白色レグホーン胚由来のニワトリ胚繊維芽細胞を陽性対照として用いた。接種は全て、下記のように予め調製した２×106細胞から成る単層に実施した。
Ａ．ＤＮＡ分析法。
各細胞系統について３ヶの培養皿を用い、被試験ウイルスを５pfu／細胞で接種し、さらに、各細胞系統について１ヶの培養皿を追加し非接種用とした。培養皿の１つについては、40μg／mlのシトシンアラビノシド（Ara C）の存在下に培養を行った。37℃において60分間の吸着期間の後、接種物を除き、単層を２回洗浄して非吸着ウイルスを除去した。次いで、培地（Ara Cを含有するもの、または含有しないもの）の交換を行った。培養皿の１つ（Ara Cを含有しないもの）からは、時間ゼロにおける試料として細胞を回収した。残りの皿は、37℃で72時間保持した後、細胞を回収してＤＮＡ蓄積の分析に用いた。２×106細胞から成る各試料を40mMのEDTAを含有する0.5mlのリン酸緩衝塩溶液（PBS）に再懸濁して37℃で５分間保温した。42℃で予め加温した120mMのEDTAを含有する等体積の1.5％アガロースを細胞懸濁液に添加してゆっくり混合した。該懸濁液をアガロースプラグモールドに移し、少なくとも15分間放置して硬化させた。次いで、アガロースプラグを取り除き、該プラグを完全に覆うような体積の溶解緩衝液（１％のサルコシル、100μg／mlのプロティナーゼＫ、10mMのトリスHCl  ｐＨ7.5、200mMのEDTA）内で50℃において12〜16時間インキュベートした。次に、該溶解緩衝液を5.0mlの滅菌0.5×TBE（44.5mMのトリス−ホウ酸、44.5mMのホウ酸、0.5mMのEDTA）と置換して、TBE緩衝液を３回変えながら４℃において６時間平衡化した。パルスフィールド電気泳動装置を用いて細胞ＲＮＡおよびＤＮＡからプラグ内にあるウイルスＤＮＡを分別した。電気泳動は、50〜90秒のパルス時間で0.5×TBE内で15℃において、180Vで20時間実施した。ラムダＤＮＡを分子量標準としてＤＮＡを泳動させた。電気泳動後、エチジウムブロミドで染色することによりウイルスＤＮＡのバンドを可視化した。次にＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製した放射ラベル化プローブを用いて分析した。
Ｂ．ウイルス収量の推定
培養皿への接種は上記と同じように行った。但し、感染多重度は0.1pfu／細胞とした。感染72時間後、凍結および解凍サイクルを３回連続的に実施することにより細胞を溶解した。ＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を調べた。
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析
組換えウイルスまたは親ウイルスを10pfu／細胞の多重度で培養皿に接種するとともに、追加の皿を非感染ウイルス対照用とした。１時間の吸着期間の後、培地を除去し、無メチオニン培地と置換した。30分後、この培地を、25μCi／mlの35Ｓ−メチオニンを含有する無メチオニン培地と置換した。感染細胞を一晩かけて（約16時間）ラベル化し、次に、バッファーＡ溶解バッファーを添加することにより溶解した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用い既知の手法に従い（Taylor他、1990）、免疫沈降を実施した。
結果：ウイルス収量の推定
細胞当たり0.1pfuで接種し72時間後に行ったウイルス収量を求める滴定分析の結果を表５に示す。この結果が示すように、トリ細胞においては増殖的な感染が生じ得るが、４種類の非トリ細胞系統においてはこの方法ではウイルス収量の増加は検知されない。
ウイルスＤＮＡの蓄積の分析  ＤＮＡ複製の前または後に非トリ細胞におけるウイルス複製の阻害が生じたか否かということを判定するために、細胞破砕物からのＤＮＡを電気泳動法により分画し、ニトロセルロースに移し、ウイルス特異的ＤＮＡを探査した。非感染ＣＥＦ細胞、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞および接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞（40μg／mlのシトシンアラビノシド存在下）由来のＤＮＡはいずれもある程度のバックグランド活性を示したが、これは、おそらく、放射ラベル化ＡＬＶＡＣ  ＤＮＡプローブの調製に際して混入したＣＥＦ細胞ＤＮＡに因るものと思われる。しかしながら、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、約350kbpの領域にＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡの蓄積を表す強いバンドを示した。ＤＮＡ合成阻害剤であるシトシンアラビノシドの存在下に培養物をインキュベートしてもそのようなバンドは検出されなかった。VERO細胞で得られた相応する試料については、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染VERO細胞において約350kbpにおいて非常に弱いバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを表すものであった。接種72時間後にはバンドの強度が増加されており、このことは、VERO細胞においてはある程度のレベルのウイルス特異的DNA複製が起こったが、ウイルス子孫の増加を生じさせはしなかったということを示唆している。ＭＲＣ−５細胞で得られた相応する試料においては、これらの条件下でこの細胞系統においてはウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されなかったことが示された。この実験を広げ、追加のヒト細胞系統、すなわちＷＩＳＨ細胞およびDetroit-532細胞についても実施した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性対照とした。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種されたＷＩＳＨ細胞およびDetroit細胞のいずれにおいてもウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。なお、この方法の検出限界は完全には確認されておらず、ウイルスＤＮＡ蓄積は起こっているのかも知れないが、該方法の感度よりも低いレベルであろう。3Ｈ−チミジンの取り込みによりウイルスＤＮＡ複製が測定された他の実験は、VERO細胞およびＭＲＣ−５細胞に関して得られた上記の結果を支持している。
狂犬病遺伝子の発現分析  ウイルス遺伝子、特に挿入された外来遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製の非存在下においてもヒト細胞系統で起こっているか否かを判定するために、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたトリ系細胞および非トリ系細胞由来の35Ｓ−メチオニンラベル化破砕物について免疫沈降実験を実施した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降実験の結果、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ、VERO、ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨおよびDetroitの各細胞において67kDaの糖タンパク質から成る特異的免疫沈降が認められた。非感染細胞および親ウイルスを感染させた細胞の破砕物のいずれにおいても、そのような特異的狂犬病遺伝子産物は検出されなかった。
この実験結果が示唆することは、分析したヒト細胞系統においては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換体はＨ６初期／後期ワクシニアウイルスプロモータの転写制限下に感染を開始し外来遺伝子産物を発現させることはできるが、ＤＮＡ複製を介する複製は進行せず、また、検知され得るようなウイルス子孫は産生しなかったということである。VERO細胞においては、ある程度のレベルのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ複製は認められたが、この方法ではウイルス子孫は検出されなかった。これらの結果は、分析したヒト細胞系統においてはウイルス複製の阻止はＤＮＡ複製の開始前に起こるが、VERO細胞においてはウイルスＤＮＡ複製の開始後に該阻止が起こることを示している。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性を有するか否かを判定するために、多くの動物種に該組換体を接種してテストした。現行の狂犬病ワクチンの効力はマウスモデル系で評価されている。そこで、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いて同様のテストを行った。感染力価が6.7から8.4（log10（TCID50／ml））の範囲にある９種類の異なったウイルス調製物（種ウイルスを10回組織培養による継代培養して得られたワクチンバッチ（J）を含む）を連続的に稀釈し、50〜100μｌの稀釈液を４週齢から６週齢のマウスの足蹠に接種した。14日後に、マウスLD50（対照用マウスグループにおける致死滴定量から求めた）が15から43の狂犬病ウイルスＣＶＳ株300μｌを頭蓋内投与してマウスを免疫性テストした。PD50（50％防御投与量）として表す効力を免疫性テストから14日目に計算した。実験結果を表６に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは狂犬病ウイルスの免疫性テストに対して恒常的にマウスを防御することができ、PD50値は、3.33から4.56の範囲にあり平均値3.73（STD0.48）であることが示されている。追加実験として、6.0log10TCID50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを含有するウイルス50μｌまたは等体積の非感染細胞懸濁液をオスのマウスに頭蓋内接種した。接種から１日、３日および６日目にマウスを殺し、その脳を取り出し、固定化し薄片に切断した。組織病理学検査によれば、マウス内にＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は認められなかった。
イヌおよびネコに対するＡＬＶＡＣ−ＲＧの安全性および効力を評価するため、14匹の５ヶ月齢のビーグル犬、ならびに14匹の４ヶ月齢のネコから成るグループの分析を行った。該イヌおよびネコのそれぞれについて４匹にはワクチン接種を行わなかった。該動物の５匹には6.7log10TCID50で他の５匹には、7.7log10TCID50で皮下投与した。動物の採血を行い、抗狂犬病抗体の分析を行った。非投与または6.7log10TCID50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与した動物に対しては、接種から29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルス免疫性テスト株の3.7log10（マウスLD50）（ビーグル犬、側部筋に）または4.3log10（マウスLD50）（ネコ、頸部に）を用いて免疫性テストを行った。実験結果を表７に示す。
ネコおよびイヌのいずれにおいても且ついずれの接種ウイルス投与量においても接種に対する副作用は認められなかった。6.7log10TCID50で免疫された５匹のイヌのうち４匹は、ワクチン接種14日目に抗体力価を示し、29日目には全てのイヌが抗体力価を有した。４匹の対照用イヌのうち３匹を死なせるような免疫性テストに対して全てのイヌが防御された。ネコの場合、6.7log10TCID50で投与された５匹のネコのうち、３匹が14日目に特異的抗体力価を有し、そして、29日目には全てが陽性となったが、平均抗体力価は低く2.9 ＩＵであった。対照用ネコの全てを死なせるような免疫性テストにおいて、５匹のネコのうち３匹が生存した。7.7log10TCID550で免疫したネコは全て14日目に抗体力価を示し、29日目には幾何平均力価は8.1国際単位（ＩＵ）であった。
ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび非関連カナリアポックスウイルス組換体の接種に対するリスザル（Saimiri Sciureus）の免疫応答を試験した。幾つかのグループに分けたリスザルに上述したように接種を行い、血清を分析して狂犬病特異的抗体の有無を調べた。皮内投与に対する軽い典型的な皮膚反応を除いては、いずれのサルにおいても副作用は認められなかった。投与から２日目および４日目だけは、皮内接種後の皮膚外傷部から少量の残留ウイルスを単離した。７日目以降は全ての検体が陰性であった。筋注に対する局部反応は認められなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種された４匹のサルは全て、ＲＦＦＩテストで測定すると、抗狂犬病血清中和抗体を産生していた。最初の接種から約６ヶ月後、全てのサルおよび追加の非接種サル１匹に対し、左側大腿部の外表面に6.5log10TCID50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下経路で再接種した。血清を分析して抗狂犬病抗体の存在を調べた。結果を表８に示す。
狂犬病ウイルス未感染の５匹のサルのうち４匹は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種７日後までに血清学的応答を示した。接種11日後までには５匹のサル全てが検出可能な抗体を有した。予め狂犬病糖タンパク質に感染させられた４匹のサルについては、ワクチン接種から３日から７日の間に血清中和力価に有意の増加が認められた。この結果から、リスザルにＡＬＶＡＣ−ＲＧをワクチン接種すると副作用は生じず、一次中和抗体応答が誘起され得ることが示された。再接種により既往反応もまた誘導された。ＡＬＶＡＣに、または非関連外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体に予め感染していても、再ワクチン接種に際して、抗狂犬病免疫反応の誘発は妨げられなかった。
ＨＩＶ−２に関して血清反応陽性のアカゲザルにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫応答を調べた。該動物に上述のように接種を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病血清中和抗体の有無を分析した。表９に結果を示すように、皮下接種されたＨＩＶ−２陽性アカゲザルは、１回の接種から11日目までに抗狂犬病抗体を産生した。最初の接種から約３ヶ月後に与えた追加免疫接種後に既往応答が検出された。該組換体が経口投与された動物には何らの応答も検出されなかった。更に、一連の６匹のアカゲザルに投与量を減少させながらＡＬＶＡＣ−ＲＧを筋内または皮下投与した。接種された６匹のうち５匹がワクチン接種から14日目までに応答を示したが抗体力価に有意の差は無かった。
以前にＨＩＶ感染した２匹のチンパンジーに7.0log10pfuのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下または筋内接種した。該接種から３ヶ月後に両チンパンジーに同じ方法で再ワクチン接種した。結果を表10に示す。
筋内または皮下接種のいずれにおいても接種に対する副作用は見られなかった。いずれのチンパンジーも初回接種から14日目までに応答し、そして、再接種後に強く上昇している応答が検出された。
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実施例９−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５）を用いるヒトの免疫化
実施例９および図９Ａおよび図９Ｂで記述したようにＡＬＢＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を調製した。スケールアップおよびワクチン生産のため、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）卵由来の初期ＣＥＦにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を増殖させた。細胞を0.1の多重度で感染させ、37℃において３日間インキュベートした。
該感染細胞を無血清培地中で超音波破砕することによりワクチンウイルスの懸濁液を得た。次に、細胞破片を遠心分離とろ過により取り除いた。得られた清澄な懸濁液に凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を加え、単一投与用バイアル内に分散させ、凍結乾燥した。凍結乾燥の前に、無血清培地および凍結乾燥剤の混合物に入れたウイルス懸濁液を連続的に10倍稀釈することにより力価が徐々に低下した３種類のバッチを調製した。
細胞基質、培地およびウイルス種株ならびに最終生成物に対しては、外来物質の探索および実験用げっ歯類動物に対する接種性に特に注意して品質管理試験を行った。望ましくない特徴は見出されなかった。
前臨床データ  インビトロ試験によれば、VERO細胞またはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の増殖を支持せず、８回の連続継代培養（VEROの場合）および10回の連続継代培養（ＭＲＣの場合）によって、これらの非トリ細胞系統において当該ウイルスが検出され得るように増殖適応化されないことが示された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）が感染または接種されたヒト細胞系統（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、Detroit-532、ＨＥＬ、ＨＮＫまたはＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞）の分析では、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は認められず、これらの細胞においてはＤＮＡ合成の前に複製の阻害が起こることが示唆された。しかしながら、重要なことは、試験された全ての細胞系統における狂犬病ウイルス糖タンパク質の発現から、カナリアポックス複製サイクルにおける不稔過程はウイルスＤＮＡ複製に先行して起こることが示唆されたことである。
一連の動物実験においてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性と効力が明らかにされた。多数の動物種、例えばカナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験用げっ歯類（マウスの乳獣および成獣）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、リスザル、アカゲザルおよびチンパンジーに、105から108pfuの投与量範囲で接種が行われた。安全なＡＬＶＡＣ−狂犬病ウイルスおよびＮＹＶＡＣ−狂犬病ウイルスを接種されたヒトにおいてもまた、中和抗体が見られた（以下の議論もまた参照にされたい）。各種の投与経路を検討し、最も一般的には皮下、筋内および皮内投与であったが、経口（サル類およびマウス）や頭蓋内投与（マウス）も採用した。
カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は、乱刺部位に「癒着」外傷を引き起こしたが、疾病や死亡の徴候はなかった。ウサギへの皮内接種は典型的なポックスウイルス接種反応を示したが、この反応が拡がることはなく、７日から10日で治癒した。いずれの動物試験においてもカナリアポックスに因る副作用は無かった。げっ歯類、イヌ、ネコおよび霊長動物にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を接種した後、高速蛍光焦点阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）の測定によって、抗狂犬病抗体が産生していることが確認され、免疫原性があることが検証された。また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫したマウス、イヌ、およびネコに対して狂犬病ウイルスの免疫性テストを行うことにより、防御機能が明らかにされた。
ボランティア  狂犬病免疫化の前歴のない年齢20〜45才の25人の健康な成人を登録した。病歴調査、身体検査および血液の化学分析を行うことにより、これらのボランティアの健康状態を調べた。妊娠、アレルギー症、あらゆる種類の免疫低下症、慢性的な衰弱症、がん、過去３ヶ月以内の免疫グロブリンの投与、およびヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎表面抗原に対する血清反応陽性を有する者は除外した。
試験計画  標準的なヒトジプロイド細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）（フランスLyonのPasteur Merieux Serums & Vaccine製）バッチナンバーE0751または対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）のいずれかが投与されるようにボランティアを無作為に振り分けた。
この試験は投与量（用量）漸増試験とした。３つのバッチ由来の試験対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を３グループのボランティア（グループＡ，ＢおよびＣ）に２週間間隔で逐次的に使用した。それらの３つのバッチの濃度は、それぞれ、１回の投与当たり、103.5、104.5および105.5TCID50（Tissue Culture Infectious Dose：50％組織培養感染量）とした。
各ボランティアには、２週間間隔で三角筋域に同一のワクチンを２回皮下投与（注射）した。最初の投与時にはボランティアには投与ワクチンの種類を知らせないが、研究者には分かるようにした。
第２回目の投与時に即時過敏症を可及的に少なくするため、実験対象ワクチンの中間用量が投与されるように割り当てられたグループＢのボランティアには、１時間前に低用量を投与し、また、高用量グループ（グループＣ）のボランティアには１時間間隔で低用量および中間用量を逐次投与した。
６ヶ月後、最も高用量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者（グループＣ）およびＨＤＣワクチンの被投与者に第３回目のワクチン投与を行った。次に、該被投与者を無作為に分けて以前と同一のワクチンまたは別のもう一方のワクチンを投与した。このようにして、以下の免疫化スケジュールに対応する４つのグループを構成した：１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
副作用の観察  すべての被験者を投与１時間後に観察し、さらに次の５日間にわたり毎日検査した。次の３週間、局部反応および全身反応について尋ね、１週間に２度、電話により質問した。
実験室における分析  登録前、ならびに各投与後２日目、４日目および６日目に血液標本を採取した。実施した分析には、血球数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼの分析が含まれていた。
抗体分析  最初の投与の７日前ならびに実験開始から７日、28日、35日、56日、173日、187日および208日目に抗体分析を行った。
中和抗体のレベルの測定には、高速蛍光焦点阻害テスト（ＲＦＩＩＴ）（Smith他、1973）を採用した。カナリアポックス抗体は、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。抗原、すなわち、0.1％Triton×100で破砕した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートに被覆した。血清の固定化稀釈液を室温下で２時間反応させ、ペルオキシダーゼでラベルした抗ヒトＩｇＧヤギ抗体を用いて反応性抗体を出現させた。結果を490nmにおける吸光度で示した。
分析  25名を被験者として登録し試験を行った。男性が10名、女性が15名であり、平均年齢は31.9才（21才〜48才）であった。３名を除く全てが、以前に種痘のワクチン接種を受けていた。残りの３名の被験者は瘢痕およびワクチン接種の前歴がなかった。３名の被験者に試験対象ワクチンの低用量のそれぞれ（103.5および104.5TCID50）を投与し、９名の被験者には105.5TCID50を投与し、さらに10名の被験者にＨＤＣワクチンを投与した。
安全性（表11）  初回免疫に際して、投与から24時間以内に37.7℃より高い熱を示したのは、ＨＤＣを投与された者の１名（37.8℃）および105.5TCID50のｖＣＰ６５を投与された者の１名（38℃）であった。ワクチン接種によるその他の全身性反応はいずれの被投与者にも見られなかった。
皮下接種によるＨＤＣワクチンの被投与者の9/10に、また、103.5、104.5および105.5TCID50のｖＣＰ６５被投与者には、それぞれ0/3、1/3および9/9に局部的反応が見られた。
痛覚が最も一般的な症状であったが、常に軽いものであった。他の局所的症状として発赤および硬化があったが、これらも軽く且つ一過性のものであった。すべての症状は一般に24時間以内におさまり、72時間以上持続することはなかった。
血球数、肝臓酵素またはクレアチンキナーゼの値に有意の変化はなかった。
免疫応答：狂犬病に対する中和抗体（表12）  最初の投与から28日後、ＨＤＣ被投与者のすべてが（感染）防御力価（＞0.5IU/ml）を有していた。これに対して、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者においては、この防御力価に達したのは、グループＡおよびＢ（103.5および104.5TCID50）の被投与者にはなく、またグループＣ（105.5TCID50）では2/9のみであった。
56日目（すなわち、２回目接種（二次接種）から28日目）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチン被投与者においては、グループＡでは0/3、グループＢでは2/3およびグループＣでは9/9が防御力価を得、また、ＨＤＣ被投与者においては10名の全てにおいて、この防御力価が持続されていた。
56日目における幾何平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣにおいて、それぞれ、0.05、0.47、4.4および11.5IU/mlであった。
180日目には、すべての被験者において狂犬病抗体力価はかなり低下したが、ＨＣＤ被投与者のうち5/10、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）被投与者のうち5/9においては、最低防御力価0.5IU/ml以上に持続されていた。ＨＣＤグループおよびグループＣにおける幾何平均力価は、それぞれ、0.51および0.45IU/mlであった。
カナリアポックスウイルスに対する抗体（表13）  高力価被験者にカナリアとの接触の前歴が無いにも拘わらず、0.22から1.230.D.の広範囲にわたる前免疫（pre-immune）力価が認められた。前免疫力価とその後の第２回目の投与による力価との差の２倍以上増加した場合に血清変換（seroconversion）が起こったと定義すれば、グループＢの被験者の1/3、グループＣの被験者の9/9に血清変換が起こったが、グループＡまたはＨＤＣの被験者には血清変換はなかった。
追加免疫投与  ６ヶ月後の追加免疫投与（追加接種）時にはワクチンは充分に許容できるものとなった。ＨＤＣ追加免疫被投与者の2/9、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫被投与者の1/10に発熱が見られた。局部反応は、ＨＤＣ追加免疫被投与者の5/9、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫被投与者の6/10に認められた。
観察結果  図１１Ａ〜図１１Ｄは、狂犬病中和抗体力価（高速蛍光焦点阻害試験、ＲＦＦＩＴによる。単位IU/ml）を示すグラフであり、ボランティアに対するＨＤＣまたはｖＣＰ６５（105.5TCID50）の追加免疫効果を示している（該ボランティアには以前に同一のワクチンまたはもう一方のワクチンを接種）。ワクチン接種は０日、28日および180日目に実施した。抗体力価の測定は、０日、７日、28日、35日、56日、173日、187日および208日目に行った。
図１１Ａ〜図１１Ｂに示すように、追加免疫投与するとどの免疫スケジュールでも全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇をもたらした。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫は、全体的に、ＨＤＣ追加免疫よりも低い免疫応答を誘発しており、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の順序から成るグループは、他の３つのグループよりも顕著に力価が低くなっていた。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を追加免疫投与すると、以前にＨＤＣワクチンが投与された被験者の3/5に、また、以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された被験者の全てに、カナリアポックス抗体力価の上昇をもたらした。
一般的に、ウイルスの局所的複製が起こっていることを示すようなｖＣＰ６５の投与による局所的副作用はなかった。特に、ワクチン接種後に見られるような外傷はなかった。このように見かけ上はウイルスの複製が無いにも拘わらず、該投与により、カナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の双方に対する有意量の抗体がボランティアに産生された。
狂犬病中和抗体の分析は、高速蛍光焦点阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）により実施したが、この方法は、マウスにおける血清中和テストと良好に相関性を有することで知られている。105.5TCID50の被投与者９名のうち５名は、初回投与後の応答レベルが低かった。最も用量（投与量）の高い被投与者全員、また、中間用量の被投与者も３名のうち２名において、２回目の投与後に防御力価を有する狂犬病抗体が得られた。この試験においては、両ワクチンとも、生ワクチンについては一般的に推奨されているが不活性ＨＤＣワクチンには勧められていない皮下投与により接種した。この投与経路を選択したのは、投入部位（注射部位）を入念に調べることができる点において最良であるからであるが、このために、ＨＤＣ被投与者における抗体の出現が遅くなったことも考えられる：事実、ＨＤＣ被投与者のいずれも７日目においては抗体上昇を示さず、一方、ＨＤＣワクチン筋内投与する多くの試験においては、被験者の大部分に抗体上昇が認められている（Klietmann他、Geneva、1981；Kuwert他、Geneva、1981）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下投与に限定されるものではない。
被験ワクチンにおける狂犬病中和抗体のＧＭＴ（幾何平均力価：geometric mean titers）は、ＨＤＣ対照ワクチンよりも低かったが、防御に必要な最低力価を充分に上まわるものであった。３種類の投与量を採用した本試験において得られた明瞭な用量依存性応答は、より高い投与量により、より強い応答を誘発される可能性があることを示している。当業者であれば本明細書の開示から、所与の患者に至適な投与量を選択できることは明らかであろう。
本実施例の他の重要な結果は、抗体応答を追加免疫する能力である。免疫スケジュールの如何に拘わらず６ヶ月日の投与後には全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇が見られており、このことは、カナリアポックスウイルスまたは狂犬病糖タンパク質により誘発された既存の免疫は、当該組換えワクチン候補または従来からのＨＤＣ狂犬病ワクチンによる追加接種に対する阻害作用を有しないということを示している。このことは、ワクシニア組換体をヒトに用いた場合、既存の免疫によって免疫応答が阻害されるという従来の知見（Cooney他，1991；Etinger他，1991）とは対照的である。
かくして、本実施例が明示するように、非複製性ポックスウイルスはヒトにおいて免疫化ベクターとして機能することができ、その際、複製性の作用物質が免疫応答に与えるような全ての利点を有しながら、完全に許容性のウイルスが引き起こすような安全上の問題はない。そして、本実施例および他の実施例の教示から、狂犬病ウイルスまたはその他のコードもしくは発現産物を含有する組換体を投与または免疫接種するに際して、至適な投与量（用量）または投与方式や投与経路を選択することは、インビトロ発現法とともに当業者には明らかであろう。
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実施例10−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株とのＬＤ50の比較
マウス  異系交配したオスのスイス・ウェブスター（Swiss Webster）マウスをTaconic Farms（米国ニューヨーク州Germantown）から購入し、３週齢（「標準」マウス）になって使用に供されるまで、マウス飼料と水を任意に（ad libitum）与えて飼育した。異系交配したオスとメスのスイス・ウェブスター新生マウスはTaconic Faumsによって実施された計画妊娠に従って入手した。使用された新生マウスは全て出産から２日以内に引き渡されたものである。
ウイルス  ＡＬＶＡＣは、カナリアポックスウイルスの集団をプラーク精製し、初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）内で調製されたものである。ショ糖密度勾配遠心法により精製した後、ＣＥＦ細胞内のＡＬＶＡＣのプラーク形成単位を測定した。ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株はＷＲの大プラーク表現型を選択することによって得られたものである（Panicali他、1981）。ワクシニアウイルスのWyeth New York State Board of Healthワクチン株はPharmaceuticals Calf Lymph Type vaccine Dryvaxから管理番号302001Bとして入手したものである。ワクシニアウイルスのCopenhagen株ＶＣ−２はフランスのInstitut Merieuxから入手した。ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株はCopenhagen株ＶＣ−２から誘導されたものである。Wyeth株をのぞき、これらの株は全て、アフリカミドリザルの腎臓由来のVERO細胞で培養し、ショ糖密度勾配遠心法により精製し、そしてVERO細胞上のプラーク形成単位を測定した。Wyeth株はＣＥＦ細胞内で増殖し、ＣＥＦ細胞内のプラーク形成単位を測定した。
接種  各グループ10匹から成る標準マウスにウイルス稀釈液の１つ0.05mlを頭蓋内（ic）接種した。ウイルス稀釈液は滅菌リン酸緩衝食塩水中の保存ウイルス液を連続的に10倍稀釈することによって調製した。場合によっては、保存ウイルス液を稀釈せずに接種した。
各グループ10匹から成る新生マウス（１日齢または２日齢）にも標準マウスと同様にic接種した。但し、接種量は0.03mlとして使用した。
すべてのマウスについて、毎日、接種から14日間（新生マウスの場合）または21日間（標準マウスの場合）にわたって死亡率を観察した。接種の翌朝に死亡したマウスは、トラウマによる死亡の可能性があるので排除した。
被験個体数の50％を死亡させるのに要する致死量（LD50）は、ReedおよびMuenchの比例法に従って求めた（Reed and Muench，1938）。
若い異系交配標準マウスにおけるic経路によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株とのLD50の比較  若い標準マウスにおける、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、試験した他のワクシニアウイルス株よりも数桁低かった（表14）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、Wyeth株よりも3,000倍以上平常マウスにおける毒性が低く；親株であるＶＣ−２株よりも12,500倍以上毒性が低く；そして、ＷＲ（Ｌ）変異株よりも63,000,000倍以上毒性が低いことが見出された。これらの結果から、ＮＹＶＡＣは他のワクシニアウイルスよりも高度に弱毒化されており、また、ＡＬＶＡＣを頭蓋内投与した場合、若いマウスには一般に非毒性性であると考えられる。但し、両者ともきわめて高投与量の場合（ＡＬＶＡＣを3.85×108pfu、ＮＹＶＡＣを３×108pfu）には、未だ不明の機序により、この投与経路によりマウスの死亡をもたらすことがある。
異系交配新生マウスにおけるic投与によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニア株とのＬＤ50の比較  標準新生マウスにおける５種類のポックスウイルス株の相対的毒性を頭蓋内（ic）免疫性テストモデル系における滴定によって調べた（表15）。終点としての死亡および、LD50の値が示したところによれば、ＡＬＶＡＣは、ワクシニアウイルスのWyeth株よりも100,000倍以上毒性が低く；ワクシニアウイルスのCopenhagenＶＣ−２株よりも200,000倍以上毒性が低く；そして、ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株よりも25,000,000倍以上毒性が低い。但し、試験した最高投与量（6.3×107pfu）においては、100％死亡率となった。6.3×106pfuでは33.3％の死亡率が認められた。最高投与量グループ（約6.3LD50）の平均生存時間（MST）が6.7±1.5日であることから、死因は（未だはっきりしないが）おそらく毒性または外傷性によるものではないであろう。免疫性テスト投与量５LD50におけるＷＲ（Ｌ）のＭＳＴは4.8±0.6日であったが、それと比較すると、ＡＬＶＡＣで免疫されたマウスのＭＳＴは有意に長いものであった（Ｐ＝0.001）。
ＮＹＶＡＣと比較すると、Wyethは15,000倍以上毒性が高く；ＶＣ−２は35,000倍以上毒性が高く；そして、ＷＲ（Ｌ）は3,000,000倍以上毒性が高いことが見出された。ＡＬＶＡＣの場合と同様に、ＮＹＶＡＣの投与量が高くなる（６×108pfuおよび６×107pfu）と、100％死亡率となった。しかしながら、そのような最高用量（380 LD50に相応）で免疫性テストされたマウスのＭＳＴは僅か２日（２日目に９匹死亡、４日目に１匹死亡）であった。これに対して、最高用量（500 LD50に等しい）のＷＲ（Ｌ）で免疫性テストされたマウスは全て４日目まで生存した。
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実施例11−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価
免疫沈降  トリ細胞または非トリ細胞の予め形成した単層に、親ウイルスであるＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）ウイルスまたはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを10pfu／細胞接種した。この接種は２％の透析したウシ胎児血清を添加した無メチオニンEMEM内で行った。１時間インキュベートした後、接種物を除き、培地を20μCi/mlの35Ｓ−メチオニンを含有するEMEM（無メチオニン）と置換した。一晩、約16時間インキュベートした後、緩衝液Ａ（１％のNonidet P-40、10mMトリス（ｐＨ7.4）、150mMのNaCl、１mMのEDTA、0.01％のアジ化ナトリウム、アプロチニン500単位／ml、および0.02％のフェニル・メチル・スルホニル・フルオリド）を添加して細胞を溶解した。免疫沈降には、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体24-3F10（入手先：米国ニューヨーク州AlbanyのGriffith Laboratories，New York State Department of HealthのC．Trinarchi博士）およびラットの抗マウスコンジュゲート（入手先：Boehringer Mannheim Corporation，カタログ番号605-500）を使用した。支持マトリックスとしてプロテインＡセファロースＣＬ−４８（入手先：米国ニュージャージー州PiscatawayのPharmacia LKB Biotechnology社）を用いた。10％ポリアクリルアミドゲル上で免疫沈降物を分画した（Dreyfuss他、1984）。ゲルを固定化し、蛍光写真に供するため１Ｍのサリチル酸ナトリウム塩で１時間処理し、KodakのＸＡＲ−２フィルムに露光して免疫沈降したタンパク質種を現像した。
動物源  ニュージーランド（New zealand）白色ウサギをHare-Marland（米国ニュージャージー州Hewitt）から入手した。３週齢のオスの異系交配スイス・ウェブスター（Swiss Webster）マウス、計画妊娠しているメスの異系交配スイス・ウェブスターマウス、および４週齢のスイス・ウェブスターヌードマウス（ｎｕ+ｎｕ+）をTaconic Farms社（米国ニューヨーク州Germantown）から入手した。これらの動物は全てNIHのガイドラインに従って飼育した。動物のプロトコールは全てIACUC規格によって承認されたものである。必要と考えられた場合には、明らかに致命的な疾病を有しているマウスは安楽死させた。
ウサギにおける外傷評価  ２匹のウサギのそれぞれに、104、105、106、107もしくは108pfuの各被験ウイルスを含有するPBSまたはPBSのみを0.1ml複数部位に皮内接種した。４日目から外傷が消散するまでウサギを毎日観察した。硬化および潰瘍形成を測定し記録した。
接種部位からのウイルス回収  １匹のウサギに、106、107もしくは108pfuの各試験ウイルスを含有するPBSまたはPBSのみを0.1ml、複数の部位に皮内接種した。11日目に、ウサギを安楽死させ、各接種部位から採取した皮膚のバイオプシー標本を機械的破砕および間接音波処理により無菌的に調製してウイルスを回収した。ＣＥＦ単層上のプラーク滴定により感染ウイルスを分析した。
マウス内の毒性  各グループ10匹から成るマウス、または５匹から成るヌードマウスに、0.5mlの無菌PBSに溶かしたウイルスのいくつかの稀釈液の１つをip接種した。実施例11も参照。
シクロホスホアミド（ＣＹ）処理  −２日目に４mg（0.02ml）のＣＹ（SIGMA製）をマウスにip注入した後、０日目にウイルス注入を行った。ウイルス感染後、次のようにマウスにＣＹをip経路で注入した：１日目に４mg；４日、７日および11日目に２mg；14日、18日、21日、25日および28日目に３mg。Coulter計数装置を用い11日目に白血球を計数することにより免疫抑制を間接観察した。平均白血球数は、非処理マウス（ｎ＝４）については13,500白血球／μｌ、また、ＣＹ処理した対照マウスについては4,220白血球／μｌであった（ｎ＝５）。
ＬＤ50の計算  ReedおよびMuenchによる比例法（ReedおよびMuench，1938）により、50％死亡率をもたらすのに要する致死量（LD50）を求めた。
マウスにおけるＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ４週齢から６週齢のマウスの足蹠に、ＶＶ−ＲＧ（Kieny他、1984）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Taylor他、1991ｂ）、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかの一定範囲稀釈液（50％組織培養感染量（TCID50）として2.0〜8.0log10）の50〜100μｌを接種した。各グループは８匹のマウスから構成した。ワクチン接種後14日目において、狂犬病ウイルスＣＶＳ株（0.03ml）の15LD50を頭蓋内接種することによりマウスへの免疫性テストを行った。28日目に生存マウスを数え、50％防御投与量（PD50）を求めた。
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導  ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株は、Copenhagenワクチン株をプラーククローニングして得られたＶＣ−２から調製されたものである。本明細書において既述したような一連の操作を行って、18ヶのワクシニアのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）（毒性に関連する多数のウイルスの機能を含む）を正確に欠失させ、ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを調製した。これらの欠失を行うに当たっては、非所望の新規なオープンリーディングフレームが出現しないように設計した。図１０は、ＮＹＶＡＣを調製するのに欠失させたＯＲＦを図示する。図１０の上部には、ワクシニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離体、Copenhagen株）のＨｉｎｄIII制限マップを示す。ＮＹＶＡＣを調製するのに逐次欠失させたＶＣ−２の６つの領域を拡大して示している。これらの欠失については本明細書において既述した（実施例１から実施例６）。そのような欠失位置の下に、遺伝子座から欠失させたＯＲＦを、その遺伝子産物の機能ないしはホモロジーおよび分子量とともに掲記している。
ヒト組織細胞系統におけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの複製試験  ヒト由来の細胞におけるワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製レベルを調べるため、液体培養条件下、導入多重度0.1pfu／細胞で６種類の細胞系統に接種し、72時間保温した。親株のCopenhagenクローン（VC-2）の接種も併せて行った。初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）（10〜11日齢のＳＰＦ起源の胚卵。米国コネチカット州StorrsのSpafas社製）を使用して全てのウイルスに対する許容細胞基質とした。２つの基準、すなわち、産生的なウイルス複製が生じているかということ、および、外来抗原が発現しているかということに基づいて培養物の分析を行った。
ヒト由来のいろいろな細胞におけるＮＹＶＡＣの複製能を表16に示す。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣのいずれもＣＥＦ細胞内で複製する能力を有するが、ＮＹＶＡＣの方が幾分収量（産生量）が低い。ＶＣ−２も、ＥＢＶ形質転換リンパ球芽細胞系統ＪＴ−１（エプステインバーウイルスで形質転換されたヒトリンパ球芽細胞系統。Rickinson他（1984）を参照）を除き、試験した６種類のヒト由来細胞系統で産生的複製能力を有している。これに対して、ＮＹＶＡＣは、試験したヒト由来細胞系統のいずれにおいてもその複製能力が高度に減弱されている。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171、ヒト胎児肺由来）、ＤＥＴＲＯＩＴ５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。ヒト包皮、ダウン症候群）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ137、ヒト胎児肺細胞）、およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞。米国メリーランド州WalkersvilleのWhittiker Bioproducts社製、カタログ＃70-151）細胞から、残存ウイルスレベルを超える感染ウイルスの僅かな増加が見られている。これらの細胞系統における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞または親株のＶＣ−２から得られたウイルス収量（産生量）に比較すると有意に減少していた（表16）。注目すべきことには、ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のいずれについても、ＣＥＦ細胞での24時間におけるウイルス収量は72時間の収量に等しいことである。したがって、該ヒト由来細胞系統培養物を更に48時間（ウイルス生成サイクルの２回分）培養させると、相対的にウイルス収量を上昇させたかも知れない。
上記のヒト由来細胞系統においては、ウイルス収量が低かったことに一致して、ＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２においてもＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡの複製は、検出可能ではあったが、そのレベルは低かった。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２細胞系統におけるＤＮＡ複製レベルは、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞で見出されたレベルと比較すると、ウイルス収量において近似していた。その他のヒト由来細胞のいずれにおいてもＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ複製は見出されなかった。
アビポックスウイルスであるＡＬＶＡＣを用いても同様の実験を行った。このウイルス複製の結果も表16に示す。いずれのヒト細胞系統においても子孫ウイルス（子ウイルス）は検出されず、このことはカナリアポックスウイルスの宿主域によりトリ種に制限されていることに矛盾しない。さらに、いずれのヒト由来細胞系統においてもＡＬＶＡＣに特異的なＤＮＡ蓄積は検出されなかったという事実も、それらのヒト由来細胞のおいてＡＬＶＡＣの産生的複製が起こらないということに矛盾していない。
ヒト細胞におけるＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現  産生的ウイルス複製が実質的に起こらない場合においても外来遺伝子の効率的な発現が得られるかということを判定するために、上記と同じ細胞系統に、35Ｓ−メチオニンの存在下に、狂犬病ウイルス糖タンパク質発現性のＮＹＶＡＣ組換体（ｖＰ８７９、実施例７）を接種した。該狂犬病糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用い、放射ラベルした培養破砕物から狂犬病糖タンパク質を免疫沈降させた。67kDaのタンパク質の免疫沈降物が得られたが、これは狂犬病糖タンパク質が完全にグリコシル化された形態に一致する。非感染細胞破砕物または親のＮＹＶＡＣが感染した細胞破砕物において血清学的に交差性の生成物は検出されなかった。分析した他の細胞においても同様の結果が得られた。
ウサギ皮膚への接種  ワクシニアウイルス株の病原性の尺度として、皮内（id）接種後のウサギの皮膚外傷およびその誘導と特徴が利用されている（Buller他、1988；Child他、1990；Fenner他、1958；Flexner他、1987；GhendonおよびChernos 1964）。そこで、ワクシニア株ＷＲ（ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ70でプラーク精製したＡＴＣＣ＃ＶＲ119からのＬ変異体と命名されたプラーク単離体から、Panicali他（1981）の記述に従って選択されたＡＴＣＣ＃ＶＲ2035。）、ＷＹＥＴＨ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ325。米国ペンシルバニア州MariettaのWyeth Laboratories社からDRYVAXとして市販）、COPENHAGEN（VC-2）およびＮＹＶＡＣを２匹のウサギ（A069およびA128）にid接種した場合の外傷の特徴を調べた。これらの２匹のウサギはウイルスに対する全体的な感度が異なっており、ウサギA128の方がウサギA069よりも軽い反応を示した。ウサギA128においては外傷は比較的軽くて、接種後27日目までに消散した。ウサギA069においては、外傷程度は強く（特にＷＲ接種部位）、49日経過後ようやく消散した。また、外傷の強さは、リンパ液排出網状組織に対する接種部位の相対的な位置に依存していた。特に脊椎上に位置する部位の外傷が強く、側腹にある外傷が消散するのに長い時間を要した。４日目から最後の外傷が消えるまで全ての外傷を毎日調べ、外傷の最大サイズの平均値および消散までの日を求めた（表17）。対照であるPBSの注入部位には局部反応は見られなかった。ＷＲ、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨワクシニアウイルス株の注入部位には潰瘍性外傷が見られた。重要なことは、ＮＹＶＡＣの接種部位には硬化または潰瘍性外傷が観察されなかったということである。
接種部位における感染性ウイルスの残存  接種部位における各ウイルスの相対的な残存性を調べるため、106、107、または108pfuのＶＣ−２、ＷＲ、ＷＹＥＴＨまたはＮＹＶＡＣを含有する0.1mlのPBSをウサギの複数部位に皮内接種した。各ウイルスについて、107pfuを脊椎上に投与し、その両側に106および108を投与した。接種部位を11日間にわたって毎日観察した。ＷＲが最も強い反応を誘導し、次いで、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨとなった（表18）。潰瘍が最初に見出されたのは、ＷＲおよびＷＹＥＴＨについては９日目、ＶＣ−２については10日目であった。ＮＹＶＡＣまたは対照用PBSが接種された部位は硬化または潰瘍形成を示さなかった。接種後11日目に、接種部位から皮膚試料を切除し、機械的に破砕し、ＣＥＦ細胞上でウイルスを滴定した。結果を表18に示す。いずれの場合においても、この時点では投与量よりも多量のウイルスは回収されなかった。ワクシニア株ＷＲの回収量は、ウイルス投与量とは無関係に約106pfuであった。ワクシニア株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収量は投与量と関係なく103から104pfuであった。ＮＹＶＡＣを接種した部位からは感染性ウイルスは回収されなかった。
遺伝的または化学的に免疫不全性のマウスへの接種  ヌードマウスに高投与量のＮＹＶＡＣ（５×108pfu）またはＡＬＶＡＣ（109pfu）を腹腔内投与したが、100日間の観察期間を通じ、死亡、外傷および明らかな疾病を引き起こすことはなかった。これに対して、ＷＲ（103から104pfu）、ＷＹＥＴＨ（５×107または５×108pfu）またはＶＣ−２（104から109pfu）を接種されたマウスは、先ず趾部に、次いで尾部にポックスウイルスに典型的な播種性外傷を示し、その後、幾つかのマウスにおいては深刻な睾丸炎が見られた。ＷＲまたはＷＹＥＴＨを感染させたマウスは播種性外傷が出現すると、一般的に、最終的には死亡したが、ＶＣ−２を感染させたマウスは多くの場合、最終的には回復した。ＬＤ50計算値を表19に示す。
さらに詳述すると、ＶＣ−２を接種されたマウスは先ず趾部に、そして、それより１〜２日後には尾部に外傷（赤色丘疹）を示す。これらの外傷は、高投与量（109、108、107および106pfu）を投与されたマウスについては接種後から11〜13日目、105pfuを投与されたマウスにおいては接種後16日目、また、104pfuを投与されたマウスにおいては接種後21日目に出現した。103および102pfuを投与されたマウスにおいては100日間の観察期間中外傷は見出されなかった。109および108pfuを投与されたマウスにおいては接種後23日目に、また、他のグループのマウス（107から104pfu）においては、それより約７日後に睾丸炎が認められた。睾丸炎は109および108投与グループにおいて特に強く、次第に後退してはゆくが、100日間の観察期間の終わりまで認められた。数匹のマウスの皮膚には、接種後30〜35日目に幾つかのポックス性の外傷が認められた。これらのポックス外傷の多くは、一般に接種後60〜90日目に治癒した。109pfuを接種されたグループのマウスのうち１匹のみが死亡し（接種後34日）、また、108pfuを投与されたグループのマウスの１匹が死亡（接種後94日）した。ＶＣ−２が接種されたマウスにその他の死亡は見られなかった。
104pfuのＷＲワクシア株を接種されたマウスは、接種後17日目にポックス性外傷を示し始めた。これらの外傷は、ＶＣ−２接種マウスに見られた外傷と同じであった（趾部、尾部の腫脹）。103pfuのＷＲ株を接種されたマウスでは接種後34日目まで外傷は出現しなかった。睾丸炎が認められたのは高用量のＷＲ（104pfu）が接種されたマウスのみであった。観察期間の後期に口の周りに外傷が現れマウスは食餌を止めた。104pfuのＷＲを接種したマウスは全て、接種後21日から31日目に死亡するか、必要に応じて安楽死させた。103pfuのＷＲを投与した５匹のうち４匹は、接種後35日から57日目に死亡するか、必要と考えられた場合は安楽死させた。低投与量のＷＲ（１から100pfu）が接種されたマウスには死亡は認められなかった。
高投与量（５×107および５×108pfu）のワクシニアＷＹＥＴＨ株を投与したマウスは、趾部および尾部に外傷を示し、睾丸炎が発生し、そして死亡した。５×106pfuまたはそれ以下のＷＹＥＴＨを投与したマウスは疾病や外傷の症状を示さなかった。
表19に示すように、ＣＹ処理されたマウスは、ポックスウイルスの毒性を分析するのにヌードマウスの場合よりも高感度のモデル系を与える。ＷＲ、ＷＹＥＴＨ、およびＶＣ−２ワクシニアウイルス株に関するLD50値は、このモデル系においてはヌードマウスモデルの場合よりも有意に低くなっていた。さらに、ＷＹＥＴＨ、ＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスをマウスに投与した場合、以下に記すように、各ウイルスをさらに高い用量で投与することにより外傷が出現し、この結果、外傷の形成がさらに迅速になっている。ヌードマウスにおいて見られたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マウスは外傷を示さなかった。しかしながら、ヌードマウスの場合とは異なり、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを用いて免疫性テストされたＣＹ処理マウスにおいては、投与量とは無関係に、死亡が見られたものもあった。これらの不規則な出来事が死因と関係しているかも知れない。
ＷＹＥＴＨが投与されたマウスはいずれの投与量においても（9.5×104から9.5×108pfu）、接種後７日目から15日目の間に尾部および／または趾部にポックス性外傷を示した。さらに、尾部および趾部は腫脹した。尾部での外傷の出現は、ポックス性外傷の典型的なものであり、丘疹の形成、潰瘍形成、そして最後には痂皮の形成を伴う。ＶＣ−２が投与されたマウスも、すべての投与量において（1.65×105から1.65×109pfu）、ＷＹＥＴＨ投与マウスの場合に類似した尾部および／または趾部にポックス性外傷を示した。これらの外傷は、接種後７−12日の間に観察された。これより低用量のＷＲウイルスを投与したマウスには外傷は見られなかったが、これらのグループで死亡は生じた。
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ワクシニアウイルスのCOPENHAGEN株を弱毒化によって得られるＮＹＶＡＣ株のベクターとしての有用性が、実質的に変化していないことを明らかにするため、比較効力試験を行った。該ウイルスを弱毒化するのに行われた一連の遺伝子操作中の該ベクターの免疫原性能を調べるため、リポーター外来抗原として狂犬病ウイルスの糖タンパク質を利用した。該狂犬病糖タンパク質を発現するベクターの感染防御効力の評価は狂犬病に関する標準的なＮＩＨマウス効力試験によった（Seligmann、1973）。表20に示しているように、高度に弱毒化したＮＹＶＡＣベクターについて得られるＰＤ50値は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病遺伝子を含有するCOPENHAGEN由来組換体を用いて得られた値（Kieny他、1984）と同じであり、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（トリ種に複製が制限されているカナリアポックス由来ベクター）について得られたＰＤ50に近似している。
考察  よく知られた毒性遺伝子が欠失され且つ限定されたインビトロ増殖特性を有するＮＹＶＡＣを動物モデル系で分析して、その弱毒化特性を調べた。これらの試験に当たって、神経毒性のあるワクシニアウイルスの実験室株、ＷＲ、２種類のワクシニアウイルスワクチン株、ＷＹＥＴＨ（New York City Board of Health）およびCOPENHAGEN株（VC-2）、さらには、カナリアポックスウイルス株であるＡＬＶＡＣとの比較を行った（実施例11も参照）。さらに、これらのウイルスについてマウス免疫性テストモデルおよびウサギ皮膚モデルにおける相対的な病原性の可能性のスペクトルが調べられた。すなわち、ＷＲが最も毒性の高い株であり、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（VC-2）は弱毒化ワクチン株として既に利用されているような立証された特徴を有し、そして、ＡＬＶＡＣは複製がトリ種に制限されるようなポックスウイルスの１例であることが理解された。これらのインビボ分析は、ワクシニアウイルス株ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（VC-2）に比べるとＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有するものであることを明示している（実施例14〜20）。重要なことは、ＮＹＶＡＣにおけるＬＤ50値は、トリ宿主制限アビポックスウイルスであるＡＬＶＡＣにおいて見出された値に匹敵したということである。ＮＹＶＡＣに因る死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、きわめて高用量のウイルスが頭蓋投与された場合のみ見出された（実施例11、表14、15、19）。この死亡が多量のタンパク質を接種した非特異性に因るものであるか否かは未だ明らかでない。免疫無防備状態マウスモデル（ヌードマウスおよびＣＹ処理マウス）における分析からも、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN株に比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特徴を有することが明らかにされた（表17および18）。重要なことは、ＮＹＶＡＣ接種動物またはＡＬＶＡＣ接種モデルにおいては、観察期間を通して、ワクシニア感染の播種やワクシニア性疾病の形跡が見出されなかったということである。ＮＹＶＡＣにおいて複数の毒性関連遺伝子を欠失させると、病原性に関する相乗効果が示された。ＮＹＶＡＣの接種特性を知る別の手段としてウサギ皮膚への皮内投与を行った（表17および18）。非トリ種において複製能力を有しないウイルスであるＡＬＶＡＣに関する結果を考察すると、接種部位における複製能力のみが反応性に相関しているのではない。ＡＬＶＡＣの皮内接種は投与量に依存して硬化域をもたらしたからである。すなわち、ウイルスの複製能力以外の因子が外傷の形成に寄与しているものと推測される。ＮＹＶＡＣにおいて毒性に関連する特定の遺伝子を欠失させると外傷の発生が防止される。
さらに、本実施例および既述の実施例（実施例10を含む）の結果から、ＷＲ、ならびに既に利用されているワクシニアウイルスワクチン株であるＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGENに比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有することが明らかである。事実、試験した動物モデル系におけるＮＹＶＡＣの病原性プロフィルは、トリ種においてのみ産生的複製を行うことで知られたポックスウイルスであるＡＬＶＡＣのプロフィルに類似していた。ＮＹＶＡＣの産生的複製能がヒト（表16）およびその他の動物（マウス、ブタ、イヌおよびウマを含む）由来の細胞において見かけ上制限されていることが重要な封じ込めとなって、ワクチン接種されたヒトの中で播種する可能性の低いベクターを提供できることに加えて、ワクチン接種者内部または一般的な環境への伝染を制限したり防止することになる。
重要なことは、ＮＹＶＡＣをベースとしたワクチン候補が効力を有することが示されたことである。各種の病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換体は、霊長類を含む幾つかの動物種において該外来遺伝子産物に対する免疫応答を引き起こした。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣをベースとした組換体は致死的な狂犬病ウイルスの免疫性テストに対してマウスを防御する能力を有した。該ＮＹＶＡＣをベースとした狂犬病糖タンパク質組換体の効力は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病糖タンパク質を含有するCOPENHAGEN由来組み換え体のＰＤ50に匹敵するものであった（表20）。また、ＮＹＶＡＣをベースとした組換体は、ウサギにおいて麻疹ウイルス中和抗体を誘起し、ブタにおける擬狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルスの免疫性テストに対して防御機能を有した。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒト、動物、医学および獣医学の分野での利用において安全であるという利点を有する（Tartaglia他、1992）。さらに、一般の実験的発現ベクター系としてＮＹＶＡＣを使用すれば、ワクシニアウイルスに関連する生物学的危険性（ハザード）が激減する。
本実施例およびその他の実施例（実施例10を含む）の結果が示すように、次のような基準によりＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されたものであることを明らかにした：ａ）接種部位に硬化または潰瘍化が検出されないこと（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位から感染ウイルスが迅速に存在しなくなること（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎がないこと（ヌードマウス）；ｄ）毒性が激減していること（３週齢マウスおよび新生マウスの両方における頭蓋内免疫性テスト）；ｅ）免疫不全被験体において病原性が激減しており播種しないこと（ヌードおよびシクロホスホアミド処理マウス）；およびｆ）各種のヒト組織培養細胞において複製能が著しく減少していること。そして、高度に弱毒化されているのにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外来抗原に対する強力な免疫応答を保有している。
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実施例12  ｖＣＰ−６５によるイヌにおける免疫の持続
この実施例は、106.7TCID50で１回免疫化された際に、カナリアポックス−狂犬病組換体ｖＣＰ−６５によって誘導された免疫の、イヌにおける持続を試験する。
材料：
53匹のイヌ、生後８ヶ月、狂犬病抗体無し（ビーグル）および、ＣＥＦで６回目の継代で生産された106.7TCID50／mlのｖＣＰ−６５組換体。
方法：
免疫化
０日目に、41匹のイヌに皮下経路で、１mlのｖＣＰ６５の懸濁液を接種した。12匹の動物は接種しなかった（対照動物）。ワクチン接種された２匹の動物は原因不明で死亡した。
血清学的試験
全てのイヌから、第０日およびワクチン接種後、１、２、３、６ヶ月の時点で採血した。何匹かのイヌからは、さらに続けて（ワクチン接種後12、24、および36ヶ月）採血した。
短期間での追跡として、10匹のイヌから第０、７、14および21日に採血した。
狂犬病抗体：ＲＦＦＩ試験（ＳＮ）
カナリアポックス抗体：  ＥＬＩＳＡ：  精製された全体ウイルスに対する間接的な技術。
安全性試験
第０日から第７日まで：各々の動物を毎日観察し体温を記録。
第７日から第28日まで：週１回観察。
免疫性テスト
５匹のイヌの第１の群を、ワクチン接種の６ヶ月後に、103.4致死量（LD）50％／マウスを、側頭筋へ筋内接種することにより（２×0.5ml）、免疫性テストを行った。ワクチン接種されていない３匹の対照動物に、同じ免疫性テストを同時に受けさせた。
11匹のワクチン接種されたイヌの第２の群に、ワクチン接種の12ヶ月後に同じ条件下で免疫性テストを行い、同時に、３匹の対照動物にもまた免疫性テストを受けさせた。
11匹のワクチン接種されたイヌの第３の群に、ワクチン接種の24ヶ月後に同じ条件下で免疫性テストを行い、同時に、３匹の対照動物にもまた免疫性テストを受けさせた。
12匹のワクチン接種されたイヌの第４の群に、ワクチン接種の36ヶ月後に同じ条件下で免疫性テストを行い、同時に、３匹の対照動物にもまた免疫性テストを受けさせた。
結果
ｖＣＰ６５の安全性
何れのイヌも局所的または全体的反応を示さなかった（体温表26および27を参照されたい）。
血清学
狂犬病抗体：狂犬病ＳＮＡｂは、ワクチン接種された41匹のイヌの全てにおいて、免疫化によって誘導された。最大値は第14日目から28日目の間に見られ、続いて急速に減少した（図21、22および29を参照されたい）。
ＣＰ抗体：第28日目には、全てのイヌが陽性であった。１匹のイヌのみは、非常に低いＡｂレベルを誘導したが、これは低い狂犬病抗体レベルと関連していた（表23および24を参照されたい）。
免疫性テスト
６または12ヶ月後に免疫性テストが行われた、ワクチン接種された全てのイヌが生存していた（表25を参照されたい）。24ヶ月後に免疫性テストが行われた、ワクチン接種されたイヌ11匹中の10匹が、36ヶ月後に免疫性テストが行われた、ワクチン接種されたイヌ12匹中の11匹が生存していた（表28を参照されたい）。
免疫性テスト後２ヶ月の時点で生存していたイヌ（６ヶ月で免疫性テストしたもの）について狂犬病Ａｂ滴定を行った。５匹のイヌが高いＡｂレベルを有していた。
議論：
免疫化されたイヌにおいて抗体動力学は急速に進行するのが見られ、12ヶ月での免疫化テスト時においてはそれらのほとんどが「陰性」に近かった。この事実にもかかわらず、100％が防御された。何匹かのイヌは顕著に低いレベルの狂犬病Ａｂしか誘導しなかった：１以下のＩ．Ｕ．ワクチン接種後１ヶ月。それらのうちの１匹は、12ヶ月での免疫性テストに耐性であった。その他の３匹は後で免疫性テストを行った。
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実施例13  ＡＬＶＡＣ／狂犬病組換体ｖＣＰ６５での母性抗体を有する子イヌの免疫化
材料：
動物：出産の２週間前にＲａｂｉｓｉｎで追加免役された免疫性雌イヌから生まれた16匹のビーグルの子イヌ。
ワクチン：ＡＬＶＡＣ／狂犬病（ｖＣＰ６５）：凍結乾燥バッチ、1ml中に108TCID50を含有、およびＲａｂｉｓｉｎ：バッチ１  RBN of 581、7I.U.／用量。
方法：
免疫化：子イヌは乳離れさせるまで母親と一緒にしておいた。子イヌが２週間になると、無作為に４つの群に振り分けられた：
Ａ：  1mlのＳＣ  ｖＣＰ６５を108TCID50／mlで受容した４匹の子イヌ
Ｂ：  1mlのＳＣ  ｖＣＰ６５を106.7TCID50／mlで受容した４匹の子イヌ
Ｃ：  1mlのＳＣ／Ｒａｂｉｓｉｎを受容した４匹の子イヌ
Ｄ：  ワクチン接種されないまま残された４匹の子イヌ＝「対照」
血清学：  全ての子イヌは第０、14、28、49、82、105および119日目に採血された。免疫性テスト後に生存している動物は第160日目にも採血された。狂犬病Ａｂ滴定：ＲＦＦＩＴ。ＣＰ  Ａｂ滴定：ＥＬＩＳＡ。
免疫性テスト：  免疫化後第119日目に、全ての子イヌを、104.1MLD50を側頭部へＩＭ接種することにより免疫性テストを行った。
結果：
ＣＰ（カナリアポックス）抗体（表31を参照）：観察された高度の異種バックグラウンドにもかかわらず、ワクチン接種は平均ＣＰ  Ａｂ（カナリアポックス抗体）を増加させることを示した。
狂犬病抗体（Ａｂ）および防御比率（表31および32を参照）：対照においての受動的なＡｂの減少と比較すると、ワクチン接種された群においては、安定化あるいは限定的なＳＮ力価の増加すらも第28日までは観察された。３つのワクチン接種された群を識別することはできなかった。108TCID50のＲａｂｉｓｉｎまたはｖＣＰ６５により免疫化された全ての子イヌは、続いての免疫性テストを生きのび、一方で106.7TCID50で免疫化された子イヌは50％（２／４）が生き残った。
生後２週間の子イヌを高いＳＮ  Ａｂ−比を有して免疫化することは、108TCID50のＲａｂｉｓｉｎまたはｖＣＰ６５に関しては可能であった。
同じ条件で、ｖＣＰ６５を106.5TCID50で用いて免疫化することにより、50％の防御が誘導された。
この実施例は、組換えポックスウイルス−狂犬病組成物（例えばｖＣＰ６５組成物等）が、子イヌ内の母子免疫があっても防御を誘導できることを示している。
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実施例14−組換え狂犬病画分（ｖＣＰ６５）を従来の画分：イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、コロナウイルス、パラインフルエンザ、パルボウイルス、狂犬病ワクチン、改変生ウイルス、カナリアポックスベクター、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエバクテリン、と組み合わせて用いたワクチンの、イヌにおける１年間の狂犬病免疫原性および安全性試験
この実施例は、ワクチン接種後少なくとも１年間にわたる、狂犬病免疫性テストに対する防御を示すものであり、この組換体ワクチンの、生後９から12週の子イヌにおいての効率、安全性および干渉の不在を評価するものである。
より詳細には、この実施例は、イヌ組合せワクチンＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５およびＤＡＣＩＰ＋ＬＣＩ中に含まれる組換体狂犬病抗原（ｖＣＰ６５）によって少なくとも１年間にわたって狂犬病に対して防御されることを示すものであり、また、この組合せワクチンを皮下（SQ）経路で若い子イヌに投与した場合の安全性および異なった画分の互いに対する干渉が存在しないことを評価するものである（以下の実施例15も参照されたい）。
生カナリアポックスベクターを、ベクター化組換体狂犬病ワクチンウイルスを調製するために用いた。このカナリアポックスベクターは、遺伝子操作技術により狂犬病ウイルス表面糖タンパク質（Ｇ）をコードする遺伝子を含むよう操作されている。この狂犬病ワクシニア抗原は、マスターシードから５回目の継代（ｖＣＰ６５Ｘ＋５）により調製された。抗原製造体は一価ワクチンにおいて用いられても良い。それはまた、５種類の他の改変生イヌ抗原と組み合わせられて凍結乾燥されてもよい。より明確にするために、これらの抗原に対する以下の略称が、この実施例およびこの実施例に含まれる表において用いられる。
ＭＬＶ成分
略称
イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）             Ｄ
イヌアデノウイルス（ＣＡＶ−２）               Ａ
イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）                   Ｃ
イヌパラインフルエンザ（ＣＰｉ）               Ｐｉ
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）                   Ｐ
カナリアポックスベクター／狂犬病（組換体）     ＣＰ６５
ワクチンＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５およびＤＡＣＰｉＰを再水和するために用いたレプトスピラ  カニコラおよびレプトスピラ  イクテロハエモラギアエ２価バクテリンはＬＣＩと略称する。
手順：
ＤＡＣＰｉＰおよび組換体狂犬病画分（ｖＣＰ６５）を含有し、２つの様式のレプトスピラ組合せバクテリン（ＬＣＩ）で希釈された凍結乾燥された組合せ（ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５＋ＬＣＩ）を１mlの用量で用いて、30匹（30）の血清陰性イヌを皮下経路で２回ワクチン接種した。30匹（30）の血清陰性イヌを、組換体狂犬病画分を含まない同じ組合せ（ＤＡＣＰｉＰ＋ＬＣＩ）でワクチン接種し、狂犬病対照とした。血清試料を、ワクチン接種後第０、28、60、90、180、270および390日目に収集し、ＲＦＦＩＴを利用してそれらの狂犬病抗体力価を得た。全てのイヌに、第２のワクチン接種後第365日目に免疫性テストを行った。免疫性テスト後90日間にわたり、病状および死亡を毎日記録した。より詳細には、
動物：  生後９から12週間の、60匹（60）の狂犬病血清陰性イヌを、Harlan Sprague Dawleyより入手した。
ワクチン接種：  以下の齢（表34）において、30匹（30）のイヌが、組換体狂犬病組合せ（ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５＋ＬＣＩ）で第１のワクチン接種を受けた。
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対照：  組換体狂犬病を含まない同じ組合せワクチンを受容した30匹（30）の対照イヌを、以下のように齢に基づいて分類した：
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ワクチン：  ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５およびＤＡＣＰｉＰ：  これらのワクチンは以下の配合により調製した：
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これらのワクチン懸濁物ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５およびＤＡＣＰｉＰを1.3mlの懸濁液を含むバイアルに配分し、それぞれワクチン接種８日前および61日前に凍結乾燥した。凍結乾燥後のこれらの力価は以下に示されている。
レプトスピラ  バクテリン（ＬＣＩ）：ＬＣＩは、USDAが発売している市販製品番号32010であった。
免疫性テストウイルス：  免疫性テストウイルス培養は、ＮＶＳＬから得られた狂犬病ストリートウイルスのＮＹＣ株であった。受け取りに際して、免疫性テスト培養液はＣＶＳ中で１：100に希釈し、１mlバイアル中に分別し、使用まで−70℃で冷凍保存した。
この研究において、以下の計画を用いた（表37）：
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ワクチン接種：
ワクチン接種群：  30匹（30）のイヌに、液体ＬＣＩバクテリンで再水和した凍結乾燥ワクチン（ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５）バクテリン１mlをSQで投与した。
対照群：30匹（30）のイヌに、ＬＣＩで再水和したＤＡＣＰｉＰを、１mlのSQで投与した。
追加免疫ワクチン接種：  ＤＡＣＰｉＰバクテリンをSQで１ml投与したワクチン接種群および対照群に、第１のワクチン接種の４週間後に、第２のＤＡＣＰｉＰをSQで１ml投与した。両方のワクチンはＬＣＩで再水和されていた。
予備的免疫性テスト：  ９匹のイヌをそれぞれ３匹づつの３の群に配分した。第１群のイヌに10-4まで希釈した免疫性テスト培養液を投与し、第２群のイヌに10-5まで希釈した免疫性テスト培養液を投与し、第３群のイヌに10-6まで希釈した免疫性テスト培養液を投与した。免疫性テスト培養液の希釈はＣＶＳ希釈液中で行った。１mlの免疫性テスト培養液の１／２を、筋内（ＩＭ）経路で、それぞれのイヌの咬筋へ注入した。イヌを、死亡率および／または狂犬病関連の臨床兆候について毎日観察した。
免疫性テスト：  予備的免疫性テストの結果に基づいて、免疫性テスト培養液を10-4.3までＣＶＳ溶液中で希釈した。前もって10-2まで希釈し−70℃で凍結しておいた２つのバイアルを融解し、保存した。１および1.5ml（1.5ml）の保存物を28.5mlのＣＶＳ希釈液に添加し、10-3.3希釈液を得た。10-3.3希釈液から、15mlを135mlのＣＶＳに移すことにより第２の希釈を行い、10-4.3の最終免疫性テスト培養液希釈液を得た。
免疫性テスト培養液の最終希釈液を、15、10mlのバイアルに分散させ、直ちに２つのアイスボックス中に配置し、イヌが飼われている場所に移した。希釈した免疫性テスト培養液を、免疫性テスト投与の間を通して、氷中に置いた。全てのイヌ（ワクチン接種されたものおよび対照）に、0.5mlの投与培養を咬筋に注入し、ＩＭ接種で投与した。
結果：
狂犬病組換体画分の力価は105.6TCID50／用量であった。
ワクチン接種後、局所または全身反応を示した子イヌはいなかった。
何れの画分に関しても、干渉は観察されなかった（以下の実施例15を参照されたい）。
ワクチンにより、対照のイヌ30匹の26匹（86.7％）を死亡させた免疫性テストに対して、ワクチン接種されたイヌ30匹のうち28匹（93.3％）が防御された。
より詳細には、
免疫性テスト後：  免疫性テスト後、イヌを90日間にわたって観察し、結果を記録した。不安定な兆候、麻痺、および死亡等の所見を毎日記録した。小脳、脳橋および海馬由来の脳組織を、ワクチン接種後死亡したそれぞれのイヌから除去し組織を観察期間の終わりまで冷凍保存した。観察期間の終わりに、全ての生存しているイヌを安楽死させた。
狂犬病感染により死亡した各々の動物からの、脳痕跡（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）標本を調製し、アセトン固定し、フルオレセイン標識抗狂犬病グロブリンにより染色した。ＦＡ陽性スライドを、狂犬病ウイルス感染の確認として考慮した。
血液試料を、ワクチン接種後第０、30、60、90、180、270、365および390日目またはその頃に収集し、高速焦点蛍光阻害試験（ＲＦＦＩＴ）により試験した。これは、9 CFR 113.209に従って行った。
また安全性に関し、イヌを、ワクチン投与に関連した臨床的に好ましくない局所または全身の何れかの反応について観察した。
ワクチン力価：  ワクチン後に保持されたワクチン試料凍結乾燥成分のそれぞれの画分を滴定し、以下の力価が得られた（表38）：
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予備的免疫性テスト：  予備的免疫性テストの結果を以下の表３９に示す：
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免疫性テスト培養液の滴定：  免疫性テストの前および最後の免疫性テストの両方について、マウスにおける免疫性テスト培養液のバック（ｂａｃｋ）滴定結果を表40に示す。実際の免疫性テスト力価は107.2MLD50／mlであった。
イヌの免疫性テスト：  最終の免疫性テストの結果を表41（ワクチン接種）および表42（対照）にまとめた。各々のイヌは、複製滴定に基づいた107.15MLD50／mlの用量を受容した。
死亡数：
対照群：  30匹の対照イヌのうち26匹（26）が免疫性テスト後11日から23日の間に死亡した。これは86.7％の死亡率を示している。
ワクチン接種群：  30匹のワクチン接種されたイヌのうち28匹が免疫性テストで生存した。これは93.3％の防御率である。
脳標本のＦＡ試験（表41および42）：
ワクチン接種：  脳痕跡スライド上への直接的ＦＡにより、死亡した２匹のイヌはともに狂犬病ウイルスに対して陽性であったことが判明した。
対照：  脳痕跡スライド上への直接的ＦＡにより、26匹の対照イヌは狂犬病ウイルスにより死亡したことが判明した。
血清学：  第１のワクチン接種後第０、30、60、90、180、270および390日目に収集された血清試料のＲＦＦＩＴ力価を表43および44に示す。この結果は、この研究が始まったときにイヌは狂犬病に対して血清陰性であり、対照は免疫性テストの日を過ぎても陰性のままであったことを示している。試験は9 CFR 113.209に従って行った。
子イヌがワクチン接種された時期おける血清変換を分析し、第２のワクチン接種後30日の平均力価を計算した（表45）。この表はワクチン接種後の抗体力価反応がワクチン接種時期に関係なく増加していることを示している。
安全性：  ２回のワクチン接種の何れの接種後も、ワクチン接種されたイヌで好ましくない局所または全身反応を示したものはいなかった。
結論：
皮下で供与された、105.6TCID50／用量のｖＣＰ６５狂犬病を含むＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５＋ＬＣＩワクチンは：
９から12週齢のイヌに対して安全である。
低い一時的血清変換を誘導する。
過酷な狂犬病免疫性テストに対して、少なくとも１年間にわたって非常に効果的に防御する。
より詳細には、９から12週齢でワクチン接種されたイヌは、他のイヌワクチン（ＤＡＣＰｉＰ）と組み合わせられ、レプトスピラバクテリアで再水和された組換え狂犬病ワクチン（ｖＣＰ６５）によって防御された。免疫性テスト培養液による死亡数は、第１のワクチン接種時の時期に依存していない。
母性抗体が存在している時期である９から12週齢でワクチン接種されたにもかかわらず、イヌは顕著に血清変換した。免疫性テストの際にはワクチン接種されたイヌは事実上、検出できる抗体を有していなかったが、防御された。
従来のバッファーで希釈され、−70℃で保存された免疫性テスト培養液を、免疫性テストに用いても良い。免疫性テスト前滴定が、主要な免疫原性研究を行う前に必要である。投与された免疫性テスト用量は、ＮＶＳＬによって行われた実験において死亡率100％であった用量より50倍高いものであった。
105.6TCID50／mlの力価を有し、ＤＡＣＰｉＰを組み合わせされ、ＬＣＩを有するかまたは有しない組換体狂犬病ワクチンｖＣＰ６５は、少なくとも１年間の期間にわたって防御を付与する。
この組合せワクチンの画分群は、組換え狂犬病画分の免疫原性に干渉しない。組換体狂犬病ワクチンは、対照の86.7％を死亡させた過酷な毒性免疫性テストに対して、ワクチン接種体を93.3％まで防御した。イヌ組合せ組換体狂犬病ワクチンは皮下で子イヌに投与された場合は安全である。
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実施例15−組換え狂犬病画分（ｖＣＰ６５）を従来の画分：イヌジステンパー、アデノウイルス２型、コロナウイルス、パラインフルエンザ、パルボウイルス、狂犬病ワクチン、改変生ウイルス、生カナリアポックスベクター、レプトスピラバクテリン、と組み合わせたワクチンを用いた、イヌにおける干渉の研究
この実施例は、他のＣＤＶ、ＣＡＶ−２、ＣＣＶ、ＣＰｉ、ＣＰＶの凍結乾燥画分の組合せ中に取り込まれ、レプトスピラバクテリン（ＬＣＩ）で希釈された組換体狂犬病ｖＣＰ６５画分が、イヌにおいてイヌの免疫化に関して干渉していないことを示す。
手順：
30匹（30）の狂犬病血清陰性のイヌに、２種類のレプトスピラ組合せバクテリン（ＬＣＩ）中に希釈したＤＡＣＰｉＰおよび組換体狂犬病ウイルス画分（ｖＣＰ６５）を含む凍結乾燥された組合せ（ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５＋ＬＣＩ）ワクチンを、１mlの用量で２回皮下でワクチン接種した。30匹（30）の狂犬病血清陰性のイヌに、組換体狂犬病画分を有さない同じ組合せワクチン（ＤＡＣＰｉＰ＋ＬＣＩ）をワクチン接種し、実施例14に記述された効率研究の狂犬病対照とした。
ワクチン接種後第０日、第30日および第60日目に各々の群から血清試料を採集し、ウイルス血清中和法により試験し、そしてＲＦＦＩＴを狂犬病抗体アッセイに用いた。各々のウイルスの血清中和試験結果を、平均力価±標準偏差によってワクチン接種群と対照とで比較した。より詳細には：狂犬病組換体ワクチン抗原を、実施例14のマスターシードから５回継代（ｖＣＰ６５Ｘ＋５）することにより調製した。この抗原は１価ワクチンとして用いることができる。それはまた、この実施例および実施例14に記載されているように、５つの他の改変生イヌ抗原と組み合わせて凍結乾燥することも可能である。この実施例の略称は実施例14と同じである。
材料：
ワクチン：  実施例14のとおりにＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５およびＤＡＣＰｉＰを調製し、配分し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後に滅菌水で再水和した各々のワクチン成分の力価は実施例14の通りであった。
レプトスピラ  カニコラおよびレプトスピラ  イクテロハエモラギアエの液体画分は、USDA-NVSLによって1992年9月22日に発売された通常の製品ワクチンである。
動物、飼育およびワクチン接種投与：  ９から12週齢の60匹（60）のイヌを、第１のワクチン接種において各々30匹づつの２つの群に分け、以下のワクチンを４週間の日間隔で投与した。
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第０日（ワクチン接種日）および第１のワクチン接種後第28および60日目に各々のイヌから血清を採集した。各々のイヌからの血清を、ＣＤＶ、ＣＡＶ−２、ＣＰｉ、ＣＰＶについての中和抗体（ＳＮ）に関して滴定し、狂犬病に関してはＲＦＦＩＴにより測定した。ワクチン接種体および対照の両方由来の血清において、常に類似の規模で血清変換していることが観察され、それにより各々の成分に干渉がないことが確認された。
結果：以下の表47はワクチン中の各々のウイルス画分に対するＳＮ力価を示している：
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イヌジステンパーウイルス中和抗体：  個々の結果が以下の表48に示されている。たとえ大部分のイヌが第０日（ワクチン接種前）に血清陽性であっても、組合せワクチンでのワクチン接種により、両方の群において、統計的に差のないＣＤＶ特異的ＳＮ活性血清変換が増加していた。
イヌアデノウイルス２型ウイルス中和抗体：  個々の結果が以下の表49に示されている。このデータは、両方の群において、統計的に差がないすばらしい血清変換があったことのみならず、動物間の個々の力価においての標準偏差が減少していることも示唆している。
イヌパラインフルエンザウイルス中和抗体：  個々の結果が以下の表50に示されている。このデータは、両方の群において統計的に差がない血清変換があったことを示唆している。
イヌパルボウイルス中和抗体：  個々の結果が以下の表51に示されている。このデータは、両方の群において、第１のワクチン接種後第30日および第60日に、同じ規模の標準偏差ですばらしい血清変換があったことを示唆している。
イヌコロナウイルス中和抗体：  個々の結果が以下の表52に示されている。このデータは、組合せワクチンＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５＋ＬＣＩにより、たった１度の注入の後に、非常に均等な力価で対照群と差がない明確な血清変換が誘導されることを示している。
組換体狂犬病ウイルス（ｖＣＰ６５）カナリアポックスベクター：  血清中和抗体（以下の表53を参照）。狂犬病ウイルスに対する中和抗体を、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）により検出した。ワクチン接種後60日までに、平均抗体力価において、0.88±0.24から1.38±0.33まで（log10）の明確な増加があった。第０日に、＜1.0（log10）の力価を有していた20匹のうち、17匹が血清変換され、第30日までに＞1.0から2.0（log10）の力価を有していた。
結論：
組換体狂犬病画分（ｖＣＰ６５）は他の凍結乾燥された画分の免疫反応において如何なる干渉もしなかった。第１のワクチン接種の日に抗体が存在したにもかかわらず、成分全てをワクチン接種することによって、両方の群において同等の規模での明確な血清変換が見られた。
ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５組合せを接種することにより、ワクチン接種以前に抗体が存在したにもかかわらず顕著な血清変換が誘導される。力価において0.5（log10）の平均増加があり、これがストリート狂犬病ウイルスでの毒性免疫性テストに対して防御を誘導するために十分であることが明らかとなった（実施例14を参照）。
以前の実験によって、従来の狂犬病ワクチンでのワクチン接種では、大量の検出可能な循環している抗体が常に誘導されるとは限らないことが示されている。同じ現象が組換体狂犬病組合せワクチンに関しても観察された；しかし、たとえ血清変換が低い規模であっても、第２のワクチン接種後第30日までに、ワクチン接種体の2/3において抗体力価は少なくとも倍増した。この実験において、93％のワクチン接種体が狂犬病免疫性テストに対して防御された。毒性狂犬病免疫性テストで生き残った動物のうち、いくつかは血清変換されていたが、他はされていなかった。さらに、免疫性テストの際、事実上全てのワクチン接種されたイヌは狂犬病特異的ＳＮ活性を有してはいなかった。
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実施例16−組換体狂犬病画分（ｖＣＰ６５）を従来のイヌ画分：イヌジステンパー−アデノウイルス２型−コロナウイルス−パラインフルエンザ−パルボウイルス−狂犬病ワクチン、改変生ワクチン、カナリアポックスベクター−レプトスピラバクテリンと組み合わせて含有している乾燥ワクチンの希釈剤としての、レプトスピラ  カニコラ−レプトスピラ  イクテロハエモラギアエ  バクテリアン（ｂａｃｔｅｒｉａｎ）のインビトロ殺ウイルス剤試験
ワクチンＤＡＣＰｉＰ−ｖＣＰ６５を、ＬＣＩと水とでそれぞれ再水和した。ＬＣＩまたは水で希釈された同じ成分の力価と比較することにより、ＬＣＩの殺ウイルス効果を評価するために、各々の画分の成分を滴定した。狂犬病組換体ワクチン抗原を実施例14のとおりにマスターシードから５回継代して調製した（ｖＣＰ６５Ｘ＋５）。５つの他の改変生イヌ抗原と組み合わせて狂犬病抗原を凍結乾燥し、実施例14および15で記述したとおりに効率および干渉を研究するために用いた。レプトスピラ  カニコラおよびレプトスピライクテロハエモラギアエ２価バクテリンをこのワクチンの再水和に用いた。実施例14および15の略称がここでも用いられる。
以下の表54は、ＬＣＩまたは滅菌水で希釈された場合の各々の画分について得られた力価をまとめたものである。
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以下の配合物を、実施例14のとおりに調製された組合せワクチンを得るために用いた。
Ｌ．カニコラおよびＬ．イクテロハエモラギアエは、通常の製品（No.32010）、有効期限1995年7月17日であった。この製品はNVSLにより1992年9月22日に販売された。
細胞系統：  Madin Darbyイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞系統を、ＣＡＶ−２、ＣＰｉ、ＣＣＶ成分の滴定に用いた。Crandellネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞系統をＣＰＶの滴定に用いた。ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞を組換体狂犬病ウイルスの滴定に用いた。増殖培地はウシ胎児血清を有するＦ１５培地であった。
ＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５を再水和するために用いられた液体ＬＣＩバクテリンの殺ウイルス活性は、9 CFR 113.35に従って行った。
凍結乾燥ワクチンＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５を、滅菌水希釈液で再水和し、上記の成分と平行してCFR 113.35に従って試験した。滴定方法は標準的なものであった。ウイルス力価（ＣＤＶ、ＣＡＶ−２、ＣＣＶ、ＣＰｉおよびＣＰ６５についてのlog10TCID50）をＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法に従って算出した。
ウイルス滴定の結果は以下の表55にまとめられている。凍結乾燥されたＤＡＣＰｉＰ−ＣＰ６５の液体ＬＣＩでの再水和は、滅菌水での再水和と比較して、ＣＤＶ、ＣＡＶ−２、ＣＰｉ、ＣＰＶ、ＣＣＶおよびＣＰ６５の力価を減少させなかった。
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実施例17−組換体イヌ狂犬病−パルボウイルスワクチン、改変生ウイルス：ｖＣＰ１３６ワクチンのイヌへの２回の皮下接種後の安全性と効率
この実施例は、イヌにおける組換体狂犬病／イヌパルボウイルスｖＣＰ１３６ワクチン（同じカナリアポックスベクター中に挿入された狂犬病糖タンパク質およびＶＰ２イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）遺伝子）の安全性、抗原性、および効率を示す。カナリアポックスウイルスベースの組換体ｖＣＰ１３６は狂犬病糖タンパク質およびイヌパルボウイルスＶＰ２遺伝子（ＶＰ１３６およびその構築はUSSN08／105483に開示されており、ここに参考文献として取り込む）を含有し；この実施例は、22日間隔で２回、ｖＣＰ１３６をSQでワクチン接種した後のイヌの反応、組換体ｖＣＰ１３６を107pfu／用量で２回接種されたイヌの体液抗体反応、およびワクチン接種されたイヌの、口鼻経路での毒性ＣＰＶの免疫性テストに続く防御的反応を示すものである。
結果：
ワクチン接種されたイヌのうち、ワクチン接種後に局所的または全身の好ましくない反応を示したものはなかった。
ワクチン接種されたイヌは、ＶＮＡ力価は1:380から1:1530の範囲にあり、幾何平均抗体力価（ＧＭＴ）で1:740のパルボウイルス中和抗体力価を生成した。
ＮＶＳＬから得られた毒性ＣＰＶでの口鼻経路での免疫性テストの後、６匹のワクチン接種されていないイヌの５匹がＣＰＶ感染の臨床兆候（食欲不振や下痢）を示した。ワクチン接種されたイヌは何れのＣＰＶ感染の臨床兆候をも示さなかった。
ＣＰＶを、６匹の対照イヌ全てからＣＰＶが平均3.0の単離日数／イヌで単離された。ＣＰＶが、４匹のワクチン接種されたイヌのうちの２匹から平均単離日数0.5／イヌで単離された。
ワクチン接種されたイヌおよびワクチン接種されていないイヌの両方で、直腸の温度パターンは正常に維持された。
免疫性テスト後第６日に、ワクチン接種群と対照との間で白血球減少において統計的に有意の差が観察された。
狂犬病抗体（ＲＦＦＩＴ）力価は、ワクチン接種したイヌ全てにおいて、ｖＣＰ１３６の１回のみの接種の後でさえ非常に高かった。
より詳細には：ビーグル犬の健康状態：  全てのイヌの血清を、ＣＰＶに対するＶＮＡに関して陰性であるか否かについて第−４日（到着の日）および第０日（第１のワクチン接種の日）に試験した。
ワクチンの安全性：  首の上方背部領域に２回のSQでｖＣＰ１３６をワクチン接種された（第０日および第22日）４匹のイヌは、局所的または全身の好ましくない反応を示さなかった。
ＣＰＶについての血清学的状態（表56）：  ２回のSQでｖＣＰ１３６をワクチン接種され、続いて毒性ＣＰＶで免疫性テストされたイヌから得られた血清中のＣＰＶに対するＶＮＡ活性のレベルが表56に示されている。10匹のイヌ全てが、第０日の１：２最終血清希釈で検出可能なＶＮＡ力価を有していなかった。６匹のワクチン接種されていないイヌは第37日にはＣＰＡに感受性のままであった。ｖＣＰ１３６での第１のワクチン接種の22日後、イヌ2002、2021および2025は、１：８から１：12の検出可能なＶＮＡレベルを有していた。イヌ2007は１：４の最終血清希釈で検出可能なＶＮＡを有していなかった。
ｖＣＰ１３６での追加免疫後第15日に、ＶＮＡ力価の顕著な上昇が記録された。ＶＮＡのレベルは１：380から１：1530（2.6から3.2log10）の範囲にあり、幾何平均は１：740（2.8log10）であった。免疫性テスト後第13日に、ワクチン接種されていない対照イヌは１：1530から１：16380の範囲にある（ＧＭＴ＝１：5260）ＶＮＡ力価を有していた。他方、ワクチン接種されたイヌは１：1530から１：3070の範囲にある（ＧＭＴ＝１：2090）ＶＮＡ力価を有していた。
狂犬病成分に対する血清学的状態（表57）：  ワクチン接種されたイヌ４匹全てが、第１のSQ接種の後すばらしい抗体力価で血清変換していた。高度で顕著な抗体力価の上昇が第２の注入の後に記録された。対照のイヌで血清変換したものはなかった。
免疫性の投与：  白血球計数（表58）：  ワクチン接種されていない６匹のイヌのうちの４匹が、免疫性テスト後第６日から始まった白血球減少を示した。その後短期間で白血球計数は通常の値の範囲に戻った。ワクチン接種された４匹のイヌのうちの２匹が免疫性テスト後第８日まで白血球計数の減少傾向を示した。イヌ2002は免疫性テスト後第５日に、イヌ2021は第７日に白血球減少を有していた。
直腸温度（表59）：  ワクチン接種されたイヌとワクチン接種されていないイヌとの間で、毎日の直腸の温度の値に明らかな違いは無かった；異常も認められなかった。
臨床兆候（表60）：  ワクチン接種されていない６匹のイヌのうちの５匹がウイルス感染の目に見える証拠を発現した。様々な程度の食欲不振および粘液状から血性の下痢の発生が観察された。ワクチン接種された４匹のイヌは、どれもＣＰＶ感染の臨床での証拠を示さなかった。
ウイルスの単離（表61）：  ６匹の対照イヌの全てからウイルスが単離された。これらのイヌのうちの何匹かにおいては、免疫性テスト後第１日という早期に、また何匹かは遅れて免疫性テスト後第８日にウイルスが検出された。いくつかの場合には、ＣＲＦＫ細胞中のわずか第２回のサブ継代（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ）の後に検出された。ワクチン接種された４匹のうちの２匹からウイルスが単離されたが、各々のイヌはたった１日で、ＣＲＦＫ細胞培養中のわずか第２回のサブ継代の後にウイルスが単離された。
この試験は、免疫性テストの日に６匹の対照イヌの全てがＣＰＶに感受性のままであったことから、妥当なものである。ワクチン接種されたイヌとワクチン接種されていないイヌとの間で、毎日の直腸内温度の差異は記録されなかった。白血球計数の統計的分析により、ワクチン接種されたものと対照との間に免疫性テスト後わずか第６日で顕著な違いがあることが明らかとなった。ＣＰＶ感染の臨床での証拠（食欲不振および下痢）は、ワクチン接種されていないイヌでのみ見られた。免疫性テストウイルスは、ワクチン接種されたイヌの場合平均で0.5日間、２日間にわたって単離されたが、これに比べてワクチン接種されていないイヌの場合は、平均で３日間、18日間にわたって、免疫性テストウイルスが単離された。さらに、ワクチン接種されたイヌのウイルスは、細胞培養中の第２のサブ培養の後でのみ検出され、これは少量のウイルスが糞標本中に排出されたことを示唆していた。
イヌを毒性狂犬病ウイルスで免疫性テストすることは行わなかった。しかしながら、２回の注入の後に示された狂犬病ＳＮ抗体活性レベルは、狂犬病免疫性テストにかけられた場合に防御するレベルに相当していた。ここに示されたデータは、ワクチン接種されていないイヌと比較した場合の、ワクチン接種されたイヌのＣＰＶ免疫性テストに対する際だった防御反応を示している。
結論：
感受性イヌに対する、カナリアポックスベースの組換体狂犬病−イヌパルボウイルスワクチン（ｖＣＰ１３６組成物）の、107pfu／用量での２回の皮下接種は、以下の結果となった：
たった１回の注入の後における狂犬病ウイルス中和抗体のすばらしいレベルでの生成；ＣＰＶ中和抗体の十分なレベルの生成：および、ワクチン接種されたイヌとワクチン接種されていないイヌとの間の、臨床的および準臨床的症状発現の顕著な差異。従って、ｖＣＰ１３６、または、狂犬病および他の抗原をコードするものを含む組換体を含む組成物は有用であり、有効性干渉を示さなかった。
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実施例18−狂犬病ワクチン、生カナリアポックスベクター血清学的反応、および、ネコ白血病ウイルス感染ネコおよび非感染ネコにおける安全性
この実施例はネコ白血病ウイルス感染ネコ（ＦｅＬＶ＋ネコ）および非感染ネコ（ＦｅＬＶ−ネコ）における、カナリアポックス狂犬病組換体ウイルスの安全性および狂犬病抗体反応を示す。これらの群の中で、30匹のネコを、前もって組換体カナリアポックスネコ白血病ウイルスに接触させた。残りの28匹のネコはカナリアポックスベクターに非接触であった（表65を参照）。２用量のｖＣＰ６５ウイルスを皮下で投与した（第０日および第20−22日）。狂犬病抗体反応を高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）により決定した。より詳細には：（ｖＣＰ９７はUSSN08／105483に記載されている；ｖＣＰ２１２はｖＣＰ１７７（USSN08／105483、実施例50）をレスキューウイルスとして、およびｐＣ３ＤＯＦＧＡＧＶＱ（USSN08／105483、実施例53）をドナーＤＮＡとして用いて生成した（USSN08／105483をここに参考文献として取り込むものとする））。
動物：  グループ１（ＦｅＬＶ−）：
10匹の狂犬病抗体陰性のネコであって、前もって２用量の組換体カナリアポックスネコ白血病ウイルス（ｖＣＰ９５）を接種し、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）で免疫性テストを行ったものを用いた。それらのネコは（ｖＣＰ９７）を第０日および第21日に受容した。それらのネコは、２週間後に、１免疫抑制用量のコルチコステロイドに続いて免疫性テストを受けた。それらのネコは、免疫性テスト後に隔週で採血され、得られた血清をＦＥＬＶ  ｐ２７抗原の存在に関してＥＬＩＳＡにより評価した。ただ１匹のネコ（＃１９５３）がワクチン接種後、一時的に抗原血症であった。免疫性テストの９週間後、カナリアポックス組換体ウイルス（ｖＣＰ６５）での接種に先立って、全てのネコはＦｅＬＶ抗原血症に関しては陰性であった。
グループ１（表64を参照）：  ネコ（ｎ＝10）を２つの投与量群に分割した。１つの群（ｎ＝５）は２用量の106.0TCID50／用量で受容し、もう１つの群（ｎ＝５）は107.0TCID50／用量で受容した。両方の群をワクチン接種し、約３週間後に追加免疫した。血液試料を以下のスケジュールに従って採取した（表62）：
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グループ２（ＦｅＬＶ＋）：
18匹の狂犬病抗体陰性のネコを用いた。ネコは免疫性テストに先立って組換体ウイルスを接種されなかった。１回の免疫抑制の後、それらをＦｅＬＶで免疫性テストした。免疫性テストの11週間後、カナリアポックス狂犬病ウイルス（ｖＣＰ６５）でのワクチン接種に先だって、７匹のＦｅＬＶ陰性（ＦｅＬＶ−）および11匹のＦｅＬＶ陽性（ＦｅＬＶ＋）ネコがいた。
グループ２（表65を参照）：
ネコ（ｎ＝18）を２つの投与量群に分割した。１つの群（ｎ＝５）は２用量の105.0TCID50／用量で受容し、もう１つの群（ｎ＝５）は106.0TCID50／用量で受容した。両方の群を１回ワクチン接種し、22日後に追加免疫した。血液試料を以下のスケジュールに従って採取した（表63）：
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グループ３：（ＦｅＬＶ−）：
30匹の狂犬病抗体陰性のネコを用いた。ネコは、１回目に組換体カナリアポックスネコ白血病ウイルス（ｖＣＰ９５）単独、または別のカナリアポックスＦｅＬＶ組換体（ｖＣＰ２１２）との組合せを接種され、３週間後に２回目を接種され、これに続いて、２週間後に、１免疫抑制用量のコルチコステロイドに続いて免疫性テストを受けた。ネコは、免疫性テスト後に隔週で採血され、この血清をＦＥＬＶ  ｐ２７抗原の存在に関してＥＬＩＳＡにより評価した。ただ１匹のネコ（Ｋ２）がワクチン接種後にＦｅＬＶ＋抗原血症であった。免疫性テストの９週間後、カナリアポックス組換体ウイルス（ｖＣＰ６５）およびネコヘルペス（ＦＨＶ）組換体（ｖＣＰ２４３およびｖＰ１１６４）での接種に先立って、29匹のネコがＦｅＬＶ−であり、１匹はＦｅＬＶ＋のままであった。
ＦＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣベースの組換体（ｖＣＰ２４３）の生成  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤのＦＨＶ−１相同体を、それぞれＩ３Ｌ、Ｈ６および４２Ｋプロモーターの制御下でコードする遺伝子を、単一ＡＬＶＡＣベクターのＣ６サイトに挿入し、ｖＣＰ２４３を生成させた。この挿入に必要であったドナープラスミド、ｐＪＣＡ１０９は以下のように生成した。
ドナープラスミドｐＪＣＡ１０９の構築  Ｉ３Ｌプロモーター／ＦＨＶ−１  ｇＢ遺伝子発現カセットを、プラスミドｐＪＣＡ０７９から２つの断片として得た：ｇＢ遺伝子の５’部分に連結されたＩ３Ｌプロモーターを含む840bpのＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ断片（断片Ａ）およびｇＢ遺伝子の残りの３’部分を含む2155bpのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII断片（断片Ｂ）。
ＦＨＶ−１  ｇＣ遺伝子に結合されたＨ６プロモーターの３’末端を含む1650bpのＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＪＣＡ１００から得て、ＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＢＳ+Ｈ６ベクター断片と連結した（このベクターはｐＢＳ−ＳＫ+ポリリンカー領域中にクローン化されたＨ６プロモーターを含む）。その結果得られたプラスミドをｐＪＣＡ１０８と称した。Ｈ６／ｇＣ発現カセットを、ｐＪＣＡ１０８から1830bpのＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩ断片として得た（断片Ｃ）。
４２Ｋプロモーター／ＦＨＶ−１  ｇＤ遺伝子発現カセットをプラスミドｐＪＣＡ０８０からＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片として得た（断片Ｄ）。
断片Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを続いてＳｍａＩ／ＸｈｏＩ消化されたｐＣ６Ｌ断片に連結し、プラスミドｐＪＣＡ１０９を生成した。ｐＪＣＡ１０９  ＡＬＶＡＣ  Ｃ６サイトドナープラスミドは、それぞれ左から右に方向づけられたＩ３Ｌプロモーター／ｇＢ遺伝子、Ｈ６プロモーター／ｇＣ遺伝子および４２ＫプロモーターｇＤ遺伝子発現カセットを、ＡＬＶＡＣ  Ｃ６隣接アームの間に有する。
このｐＪＣＡ１０９の生成に用いられたプラスミド中間体群は以下のように派生された。
ｐＪＣＡ０７９：  プラスミドｐＪＣＡ００１（USSN07／502834、実施例15）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化しｇＢの中心部分を含む900bpの断片を得た（断片Ａ）。プラスミドｐＪＣＡ０７６をＸｂａＨＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｇＢ変異５’部分に連結されたＩ３Ｌプロモーターを含む840bpの断片を得た（断片Ｂ）。プラスミドｐＪＣＡ０７７をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｇＢの３’部分を含む1255bpの断片を得た（断片Ｃ）。断片Ａ、Ｂ、Ｃを一緒に、ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ消化されたｐＢＳ−ＳＫ+ベクター中へライゲーションし、ｐＪＣＡ０７９を生成した。
ｐＪＣＡ０７６：  プライマーＪＣＡ１５８（SEQ ID NO:37）（５’ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣ  ３’）およびＪＣＡ２１１（SEQ ID NO:56）（５’ＧＴＧＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＡＡＡＧＴＣＧ  ３’）を、プラスミドｐＪＣＡ０７５をテンプレートとして用いて、変異ＴＴＴＴＴＮＴを含む510bpのＸｂａＩ−平滑断片（断片Ａ）をＰＣＲにより合成するために用いた。プライマーＪＣＡ２１２（SEQ ID NO:38）（５’ＣＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＴＣＧ  ３’）およびＪＣＡ２１３（SEQ ID NO:39）（５’ＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣ  ３’）を、プラスミドｐＪＣＡ００１をテンプレートとして用いて平滑−ＢａｍＨＩ330bp断片（断片Ｂ）をＰＣＲによって合成するために用いた。断片ＡをＸｂａＩで消化し、キナーゼ処理した。断片ＢをＢａｍＨＩで消化し、キナーゼ処理した。断片ＡおよびＢを、続いて、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ消化されたｐＢＳ−ＳＫ+ベクター中に一緒に連結し、ｐＪＣＡ０７６を生成した。
ｐＪＣＡ０７５：  プライマーＭＰ２８７（SEQ ID NO:40）（５’ＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴ  ３’）およびＪＣＡ１５８（SEQ ID NO:41）（５’ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣ  ３’）を、ＸｂａＩ−平滑120bpＩ３Ｌプロモーター断片（断片Ａ）をプラスミドｐＭＰ６９１（ｐＭＰ６９１は、無関係な遺伝子−狂犬病糖タンパク質遺伝子−と結合されたＩ３ＬプロモーターをｐＣＯＰＣＳプラスミド中に有している）をテンプレートとして用いてＰＣＲにより合成するために用いた。プライマーＪＣＡ２１３（SEQ ID NO:42）（５’ＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣ  ３’）およびＪＣＡ２３８（SEQ ID NO:43）（５’ＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＣＴＴ  ３’）を、ＦＨＶ  ｇＢ  ５’ＡＴＧから伸長している720bp断片（断片Ｂ）をプラスミドｐＪＣＡ００１をテンプレートとして用いてＰＣＲにより合成するために用いた。断片ＡをＸｂａＩで消化しキナーゼ処理した。断片ＢをＢａｍＨＩで消化しキナーゼ処理した。断片ＡおよびＢを続いて、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ消化されたｐＢＳ−ＳＫ+ベクター中に共に挿入し、プラスミドｐＪＣＡ０７５を生成した。
ｐＪＣＡ０７７：  プライマーＪＣＡ２３９（SEQ ID NO:44）（５’ＡＣＧＣＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣ  ３’）およびＪＣＡ２４９（SEQ ID NO:45）（５’ＣＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＴＧＣ）を、695bpＥｃｏＲＩ−平滑ＦＨＶ  ｇＢ断片（断片Ａ）をプラスミドｐＪＣＡ００１をテンプレートとして用いてＰＣＲにより合成するために用いた。プライマーＪＣＡ２２１（SEQ ID NO:46）（５’ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣ  ３’）およびＪＣＡ２４７（SEQ ID NO:47）（５’ＧＧＴＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＴＣＧＧＧＧＡＴＧＴＧ  ３’）を、560bpＦＨＶ  ｇＢ３’末端平滑−ＰｓｔＩ断片（断片Ｂ）をプラスミドｐＪＣＡ００１をテンプレートとして用いてＰＣＲにより合成するために用いた。断片ＡをＥｃｏＲＩで消化しキナーゼ処理した。断片ＢをＰｓｔＩで消化しキナーゼ処理した。断片ＡおよびＢを、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ消化したｐＩＢＩ２４中に共に挿入し、プラスミドｐＪＣＡ０７７を生成した。
ｐＪＣＡ１００：  プライマーＪＣＡ２７４（SEQ ID NO:48）（５’ＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＡＧＡＣＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＧＧＡＣ  ３’）およびＪＣＡ２７５（SEQ ID NO:49）（５’ＡＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＣＴＧＡＣ  ３’）を、ｇＣ５’部分に連結されたＨ６プロモーターの３’末端を含む107bpＮｒｕＩ−ＳａｌＩ断片（断片Ａ）をプラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦをテンプレートとして用いてＰＣＲにより合成するために用いた。プライマーＪＣＡ２７６（SEQ ID NO:50）（５’ＡＡＡＴＧＴＧＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＣ  ３’）およびＪＣＡ２７７（SEQ ID NO:51）（５’ＡＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＧＡＴＧＡＧ  ３）を、ｇＣ３’部分を含む370bpＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄIII断片（断片Ｂ）をプラスミドｐＪＣＡ０９５をテンプレートとして用いてＰＣＲにより合成するために用いた。断片ＡをＮｒｕＩおよびＳａｌＩで消化した。断片ＢをＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIIIで消化した。100bpの、Ｈ６プロモーターの５’末端を含むＨｉｎｄIII−ＮｒｕＩ断片を得た（断片Ｃ）。プラスミドｐＪＣＡ０９５をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ｇＣの中心部分を含む580bpの断片を得た（断片Ｄ）。断片ＡおよびＣを、ＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ消化したｐＢＳ−ＳＫ+ベクターにともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０９７を生成した。断片ＢおよびＤを、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII消化したｐＢＳ−ＳＫ+ベクターにともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０９９を生成した。プラスミドｐＪＣＡ０９７をＰｓｔＩおよびＳａｌＩで消化し、ｇＣの５’部分に連結したＨ６プロモーターを含む200bpの断片を得た（断片Ｅ）。プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し600bpのｇＣ断片を得た（断片Ｆ）。断片ＥおよびＦを、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ消化したｐＢＳ−ＳＫ+ベクターにともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０９８を生成した。プラスミドｐＪＣＡ０９８をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化しｇＣの５’部分に連結したＨ６プロモーターを含む820bpの断片を得た（断片Ｇ）。プラスミドｐＪＣＡ０９９をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ｇＣの３’部分を含む960bpの断片を得た（断片Ｈ）。断片ＧおよびＨを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII消化したｐＢＳ−ＳＫ+ベクターにともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ１００を生成したが、このプラスミドはＨ６／ｇＣ（５３３ａａ）遺伝子発現カセットをｐＢＳ−ＳＫ+中に有している。
ｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦ：ＦＨＶ−１  Ｃ０株由来の7500bpのＥｃｏＲＩ「Ｆ」断片を、ＥｃｏＲＩ消化したｐＢＳ−ＳＫ+中にクローン化し、プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦを生成した。ＦＨＶ−１ｇＣ遺伝子は、ＨＳＶ  ｇＣ遺伝子とヌクレオチド配列を比較することにより、この断片内部で同定された。
ｐＪＣＡ０８０：  プラスミドｐＪＣＡ０７３（USSN08／105483、実施例57）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＦＨＶ  ｇＤの３’部分を含む960bp断片（断片Ｄ）を得た。プライマーＲＧ２８６（SEQ ID NO:52）（５’ＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡ  ３’）およびＭ１３Ｆ（SEQ ID NO:53）（５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ  ３’）を、４２Ｋプロモーターを含む130bpのＥｃｏＲＩ−平滑断片（断片Ｅ）をプラスミドｐＪＣＡ０３８をテンプレートとしてＰＣＲにより合成するために用いた。プライマーＪＣＡ２３４（SEQ ID NO:54）（５’ＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＧＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴ  ３’）およびＪＣＡ２３５（SEQ ID NO:55）（５’ＴＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣ  ３’）を、ＦＨＶ  ｇＤの５’部分を含有する185bpの平滑−ＢａｍＨＩ断片（断片Ｆ）を合成するために用いた。断片ＥおよびＦをそれぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、キナーゼ処理し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化したｐＢＳ−ＳＫ+ベクター中に一緒に連結させ、プラスミドｐＪＣＡ０７８を得た。プラスミドｐＪＣＡ０７８をＨｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化させ、ｇＤ遺伝子の５’部分に連結された４２Ｋプロモーターを含有する310bpの断片（断片Ｇ）を得た。断片ＤおよびＧをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＢＳ−ＳＫ+ベクター中に連結し、ｐＪＣＡ０８０を生成した。
ｖＣＰ２４３の生成および特徴付け  ＦＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を、ＮｏｔＩ−直線化ｐＪＣＡ１０９ドナープラスミドとＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡとの間でインビトロ組換えを行うことにより、ＡＬＶＡＣゲノム中のＣ６サイトに挿入した。ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含む組換体をプラークハイブリダイゼーションにより同定し、プラーク精製し、増幅した。組換体をｖＣＰ２４３と名付けた。
これらの糖タンパク質の、ｖＣＰ２４３感染ＣＲＦＫ、ＣＥＦおよび／またはVERO細胞においての発現を、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤに対するモノ特異的ポリクローナルヒツジ抗血清を用いてウエスタンブロットおよび／または免疫沈降分析によって評価した。これらのアッセイにより、以下のＦＨＶ−１タンパク質がｖＣＰ２４３−感染細胞中で発現されていることが判明した：100、60、および55kDaのｇＢポリペプチド；110kDaのｇＣポリペプチド；60kDaのｇＤポリペプチド。
ＦＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベース組換体の生成（ｖＰ１１６４）  ｇＢ、ｇＣ、ｇＤのＦＨＶ−１相同体を、それぞれＩ３Ｌ、Ｈ６および４２Ｋプロモーター群の制御の下にコードしている遺伝子を、１つのＮＹＶＡＣベクター中のＡＴＩサイトに挿入し、ｖＰ１１６４を生成した。この挿入に必要とされたプラスミドｐＪＣＡ１０７は、以下のように生成した。
ドナープラスミドｐＪＣＡ１０７の構築  Ｉ３Ｌプロモーター／ＦＨＶ−１ｇＢ遺伝子発現カセットを、プラスミドｐＪＣＡ０７９から２つの断片として得た：ｇＢ遺伝子の５’部分に連結されたＩ３Ｌプロモーターを含有する1740bpのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ断片（断片Ａ）、およびｇＢ遺伝子の残りの３’部分を含有する1255bpのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片（断片Ｂ）。
Ｈ６プロモーター／ＦＨＶ−１  ｇＣ遺伝子発現カセットを、プラスミドｐＪＣＡ１００から1755bpＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩ断片（断片Ｃ）として得た。
４２Ｋプロモーター／ＦＨＶ−１  ｇＤ遺伝子発現カセットを、プラスミドｐＪＣＡ０８０からＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ断片（断片Ｄ）として得た。
断片Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを続いて、ＳｍａＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＳＤ５４１ＶＣベクター断片と連結させ、プラスミドｐＪＣＡ１０７を生成した。ｐＪＣＡ１０７ＮＹＶＡＣＡＴＩサイトドナープラスミドは、それぞれ、左から右へ向けられたＩ３Ｌプロモーター／ｇＢ遺伝子、Ｈ６プロモーター／ｇＣ遺伝子および４２Ｋプロモーター／ｇＤ遺伝子発現カセットを、ＮＹＶＡＣ  ＡＴＩ隣接アームの間に含有する。
ｖＰ１１６４の生成および特徴付け  ＦＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を、ＮｏｔＩ−直線化ｐＪＣＡ１０７ドナープラスミドとＮＹＶＡＣゲノムＤＮＡとの間のインビトロ組換えによってＮＹＶＡＣゲノムのＡＴＩサイトに挿入した。ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有する組換体を、プラークハイブリダイゼーションにより同定し、プラーク精製し、増幅した。この組換体をｖＰ１１６４と名付けた。
これらの糖タンパク質の、ｖＰ１１６４感染ＣＲＦＫ、ＣＥＦおよび／またはVERO細胞においての発現を、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤに対するモノ特異的ポリクローナルヒツジ抗血清を用いてウエスタンブロットおよび／または免疫沈降分析によって評価した。これらのアッセイにより、以下のＦＨＶ−１タンパク質がｖＣＰ２４３−感染細胞中で発現されていることが判明した：100、60、および55kDaのｇＢポリペプチド；110kDaのｇＣポリペプチド；60kDaのｇＤポリペプチド。
群３（表65を参照）：ネコ（ｎ＝30）を５つの用量の群（ｎ＝６／群）に分けた。３つの群に、ｖＣＰ６５を104.0、105.0、106.0TCID50／用量で２用量を受容させた。１つの群（ｎ＝６）に、106.0TCID50／用量で１用量のみを受容させ、１群は接触対照としてワクチン接種しなかった。ネコにワクチン接種をし、続いて３週間後に追加免役した。血液試料を、以下の予定に従って採集した（表64）：
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血液の採集のため、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）塩酸塩（100mg／ml）またはケタミンをキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）と組み合わせて（5-10mg／ml）、5-10mg／kgの筋内投与で用いて、ネコを軽く鎮静させた。アトロピン（0.54mg／ml）をネコあたり0.1-0.2ml皮下投与し、麻酔の間の唾液分泌を減少させた。注入後ネコを痛みと不快について観察し、その後も毎日観察して、２週間ごとに好ましくない臨床的兆候についてモニターした。
血清試料を採集し、狂犬病ウイルス中和抗体について高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）によって評価した。試料から力価を測定し、標準参照ウイルスへ調製された。力価はlog10、真数および国際単位（ｉｕ）で報告された。表67-71は、log10および真数でデータを報告している。
群３からのネコにはまた、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）遺伝子を有する組換体ｖＣＰ２４３（ｎ＝10）をワクチン接種した（表69および70を参照）。ウイルスを、約107.0TCID50／用量で、ｖＣＰ６５と同時に、但し異なった箇所に、皮下で２回投与した。
ウイルス：カナリアポックス組換体ウイルス（ｖＣＰ６５）は、108.0TCID50／mlを含んでいると滴定されたＸ＋５継代のウイルスであった。使用前に、それをF10-199組織培養培地で希釈した。
初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）：  Select Laboratoriesから受け取ったＣＥＦ細胞の懸濁液を用いて、投与後にウイルスを滴定した。
３つの群全てのネコについて、投与後にウイルス希釈を滴定した。群２においては、第１のワクチン接種において、12匹のネコが望ましい106.0TCID50／用量の代わりに106.2TCID50／用量を与えられ、６匹のネコが望ましい105.0TCID50／用量の代わりに105.8TCID50／用量を与えられた。群２の全てのネコ（ｎ＝18）は105.8TCID50／用量を与えられた。ワクチンあたり５回測定した力価は以下の通りである（表66）。
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個々のネコ（群１、２および３）の狂犬病ウイルス中和抗体力価を表67、68および71にそれぞれ示されている。
群１：（表67を参照）：以前にカナリアポックスベクターに接触させたＦｅＬＶ−のネコ（ｎ＝10）は、ｖＣＰ６５に対して強力な血清学的反応を示した。追加免疫に続いて、107.1TCID50／用量を受容した５匹のネコのうちの５匹が、3.0log10より大きな狂犬病抗体力価を有していた（ＧＭＴ＝log103.68±0.4；真数＝4786）。追加免疫に続いて、106.1TCID50／用量を受容した５匹のネコのうちの３匹が、3.0log10より大きな狂犬病抗体力価を有していた（ＧＭＴ＝log102.96±0.8；真数＝912）。
群２：（表68、69および70を参照）：以前にカナリアポックスベクターに接触させていないＦｅＬＶ−およびＦｅＬＶ＋のネコ（ｎ＝18）は、ｖＣＰ６５に対して強力な血清学的反応を示した（ＧＭＴ＝log102.10±0.5；真数＝631）。
表69に示されているように：この群のＦｅＬＶ−のネコ（ｎ＝７）は、第１のワクチン接種に対して、良好な狂犬病抗体力価で反応した（ＧＭＴ＝190±0.6、真数＝79）。追加免疫に続いて、これらのネコは、良好な狂犬病抗体の増加を示した（ＧＭＴ＝log102.96±0.4；真数＝912）。
表70に示されているように：この群のＦｅＬＶ＋のネコ（ｎ＝11）は、１回の注入の後に、良好な血清学的反応を示した（ＧＭＴ＝2.24±0.4、平均＝174）。追加免疫に続いて、ＦｅＬＶ＋ネコの多数は、狂犬病抗体の増加を示した（ＧＭＴ＝log102.80±0.6；真数＝630）。ＦｅＬＶ＋ネコ＃82および＃84は追加ワクチン接種には反応せず、従って追加免疫後のＦｅＬＶネコのＧＭＴは抑制された。これらの２匹の反応しなかったものを除いた追加免疫後のＦｅＬＶ＋ネコの分析も、群２のＦｅＬＶ−ネコより僅かに良くない場合には、同様であった（ＧＭＴ＝log102.99±0.4；真数＝977）。
第１のワクチン接種について、106.2TCID50／用量を受容した群２のネコの抗体反応は、105.8TCID50／用量を受容した群２のネコに対して顕著な差が無かった。故に、このデータは共に平均化された（ＧＭＴa／表68を参照；表69および70も参照のこと）。
群３：（表71を参照）：この群のネコ（ｎ＝30）は、投与されたウイルスの力価に応じて、ｖＣＰ６５に対する様々な血清学的反応を示した。104.0TCID50／用量を受容したネコは、それらが以前にカナリアポックスベクターで接種されていてもいなくても、第１のおよび追加免疫の接種に対して良好には反応しなかった（ＧＭＴ＝0.83log10±0.5；真数＝７）。１つの例外であるＣ５は第１のワクチン接種に良好に反応した。
104.7TCID50／用量を受容したネコもまた、第１のワクチン接種に対して不均一に反応した（ＧＭＴ＝1.65log10±0.5；真数＝45）が、追加免疫に対しては強力に反応した（ＧＭＴ＝2.48log10±0.5；真数＝302）。
105.8TCID50／用量を２用量受容したネコは、104.7TCID50／用量群よりもいくらか高い反応（ＧＭＴ＝1.86log10±0.6；真数＝72）と追加免疫（ＧＭＴ＝2.74log10±0.4；真数＝549）を示した。
１用量のＣＰ６５受容したネコ（105.8TCID50／用量）は、第１のワクチン接種後、２用量の群に匹敵する力価で反応した（ＧＭＴ＝1.92log10±0.4；真数＝83）。
群３：ワクチン接種されなかったがワクチン接種されたものと接触しうる状態で収容されていた対照ネコ（ｎ＝６）は、ワクチン接種後、狂犬病遺伝子について血清学的に陰性のままであった。
安全性：  58匹のネコのうち57匹が、実験期間中を通して臨床的に健康なままであった。ｖＣＰ６５ウイルスは痛みを伴うことなく投与された。ワクチン接種後に観察された腫れあるいは炎症、または全身の病気の兆候は無かった。
ネコＫ２（群３）はワクチン接種前にはＦｅＬＶ＋であった。このネコは第１のワクチン接種後37日に、体重減少、血液酸素欠乏症、および２次細菌感染のため安楽死させた。剖検を行うと、後ろ足および背部唇表面に外傷が見られた。内部の異常は見られなかった。唇組織の試料を凍結し保存した。このネコはＦｅＬＶ感染に関連した兆候を示した；しかし、そのネコは、これまでにＮＶＳＬ投与モデルを用いて投与後に臨床的病徴を示した唯一のＦｅＬＶ＋のネコであったと理論付けられる。群３における接触対照ネコは、試行の期間中を通して臨床的に健康なままであった。
このウイルス（ｖＣＰ６５）は、ＦｅＬＶ感染ネコにおいてすばらしい安全性を示した。興味深いことには、11匹のＦｅＬＶ＋ネコのうちの９匹が、ＦｅＬＶ−ネコが反応したように反応し、追加免疫された。この発見は、免疫機能の抑制が、しばしばＦｅＬＶ感染の後遺症であるという点で驚くべき事である。しかしながら、文献に記述されているように、「清潔な」条件の下で収容されたＳＰＦネコは、環境感染にさらされておらず、それ故にイエネコほど免疫無防備状態ではないこともあり得る。
この開示から、過度の実験を行うことなく、当業者はネコにおいてのこのウイルス（ｖＣＰ６５）の最低防御用量を決定することができる。上記のイヌとの組み合わせの状況に続いては特にそうである。１用量のｖＣＰ６５製品または１価ｖＣＰ６５製品が、所望である場合にはこの開示から過度の実験を行うこと無しに調製できる。
この実施例はまた、カナリアポックスベクターの事前投与に対しては、免疫反応抑制が無いことを示している。ＦｅＬＶカナリアポックスウイルスの事前投与は、カナリアポックス狂犬病ウイルスに対する免疫反応に悪影響を与えなかった。事前の曝露は実際に、続いての同じベクターでのワクチン接種を促進させる（即ち、群１の106.0TCID50を受容したネコは（同じ用量のウイルスを受容した群２のネコよりも）高いＧＭＴで反応した）。このように、ｖＣＰ６５等の組換体ウイルスを、ある期間にわたって複数回ワクチン接種することも可能である。このことにより、ポックスウイルス−狂犬病組換体等のポックスウイルスベクター、特にこのベクター（ＡＬＶＡＣ）および特にｖＣＰ６５が、年間ワクチン接種計画に応用可能であることが示されている。この動物モデル（即ちＦｅＬＶ感染ネコ群）は、しばしばＨＩＶ感染ヒトに匹敵するものとして用いられる。ＦｅＬＶ＋ネコは免疫無防備状態であると考えられており、感染性薬剤の病原性作用に対してより高い感受性を有する。
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表６９および７０：ＦｅＬＶ＋ネコ対ＦｅＬＶ−ネコの血清中和力価（ＲＦＦＩＴ）
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実施例19−イヌのＣＤＶ免疫性テストに対してのＡＬＶＡＣ−ＣＤＶＨＦ（ｖＣＰ２５８）による防御
ｖＣＰ２５８は、ここに参考文献として取り込むこととする、1995年4月5日に出願されたUSSN第08/416616号において論じられている。ＡＬＶＡＣをベースとしたＣＤＶ  ＨＡおよびＦ組換体ウイルスの防御効率を、イヌをワクチン接種後に生ＣＤＶ免疫性テストを受けさせることにより評価した。この実施例においては、13匹のＣＤＶ血清陰性ビーグル犬を２つのワクチン接種群（３匹のイヌは107pfuのｖＣＰ２５８ワクチン用量、４匹のイヌは105.5pfuのｖＣＰ２５８ワクチン用量）と対照群（６匹のイヌ）とに分けた。ワクチン接種は、107TCID50／用量（群１）あるいは105.5TCID50／用量（群２）のｖＣＰ２５８での、皮下接種により３週間間隔をあけて２回行なった。第42日に全てのイヌに、１：10ＮＶＳＬ  ＣＤＶ免疫性テスト用ストックを頭蓋内投与することにより免疫性テストを行った。イヌを免疫性テスト後28日間毎日観察し、罹病率／死亡率をモニターした。
好ましくない局所的または全身の反応は、ｖＣＰ２５８でワクチン接種したイヌにおいては見られなかった。ワクチン接種されていない全ての対照イヌにおいては、血液酸素欠乏症、結膜炎、抑圧、体重減少および脱水症状を含むＣＤＶ感染の臨床的兆候が、免疫性テスト後６日から17日に生じた。４つの発熱性ピーク（＞103.5●Ｆ）が、免疫性テスト後第１、３、８および13日に観察された。６匹の対照のうちの４匹がより深刻な臨床的兆候を示した。事実、これらのイヌの１匹が免疫性テスト後12日で死亡し、その一方で他の３匹は免疫性テスト後13日から17日の間に安楽死させた。生存した２匹の対照動物は、比較的軽い病気の徴候（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｙ）を有していたが、回復し始め、実際に免疫性テスト後19日には体重を増加させ始めた。
重要なことには、いずれのワクチン投与量の群のイヌたちも、ＣＤＶ感染の臨床的兆候を示さなかった。それらは全て、観察期間の間、体重を増加させ通常の行動をみせた。さらに、発熱性の症状も見られなかった。
表72は、免疫性テスト前の様々な時点での、それぞれの分のＣＤＶ特異的血清学的反応を列挙している。抗体力価は、50％中和終了点として表され、各々の群の平均を示している。興味深いことには、105.5TCID50のワクチン用量は対応するＣＤＶ血清中和活性を誘導しないが、この低い投与量でワクチン接種された全てのイヌが、毒性ＣＤＶ免疫性テストに対して完全に防御された。
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実施例20−他のイヌ病原体と組み合わされた状態で用いられた場合の、イヌにおけるＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）およびＡＬＶＡＣ−狂犬病（ｖＣＰ６５）の効率
ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）が、他のイヌ病原体と組み合わされたワクチンにおいて用いられた場合に防御的効率を供するかどうかを決定するために、以下の調査を行った。ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶを、104.6TCID50、104.8TCID50および105.5TCID50／mlの用量まで希釈し、ワクチン用量のイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ2）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰｉ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶx1）、レプトスピラ  カニコラ−イクテロハエモラギアエバクテリンおよびＡＬＶＡＣ−狂犬病（ｖＣＰ６５）と混合させた。24匹の血清陰性イヌおよび２匹の血清陽性イヌを、ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ単独またはイヌ組合せにおいて表73に示したように接種した。イヌは第０日および第21日の２回、皮下経路で接種された。ＣＤＶ血清中和力価を測定するために、第０日と第21日、および免疫性テストに先立って血液を採集した。イヌは、第２回目の接種後、24日または50日の何れかの２つの群で、USDAによって供給されているＣＤＶ免疫性テストウイルスを頭蓋内経路で投与された。免疫性テスト後、イヌを５ヶ月まで観察し、ＣＤＶ感染の兆候をモニターした。血清学および免疫性テストの結果を表74に示す。
結果は、4.8log10TCID50のＡＬＶＡＣ−ＣＤＶ（ｖＣＰ２５８）のみを接種されたイヌは、1.2のＣＤＶ特異的平均中和抗体力価を誘導したが、イヌワクチン組合せ中での5.5log10TCID50および4.8log10TCID50での用量では、それぞれ1.0および0.7の平均力価を誘導した。これらのワクチン群のそれぞれの、全てのイヌが免疫性テストで生存した。組み合わせプラス5.5log10TCID50を受容した群の１匹のイヌが、免疫性テストに続いて非特異的症状を示し、一方で組み合わせプラス4.8log10TCID50を受容した群の１匹のイヌが、ＣＤＶ感染に特異的な症状を示した。ウイルス滴定、ＣＤＶ抗体力価、狂犬病抗体力価、罹病率／死亡率および体重減少／増加を表75から80に示す。
この調査において、イヌコロナウイルスワクチンでのワクチン接種に対する血清学的反応、およびＡＬＶＡＣ−狂犬病ワクチンをモニターした。特に、ＡＬＶＡＣ−ＣＤＶを組み合わせワクチン中に取り込ませることによっては、他の成分（群）、特にイヌコロナウイルスおよび狂犬病ウイルス成分に対する血清学的反応は干渉されなかった。そして、狂犬病ウイルス成分、ｖＣＰ６５は他の抗原に干渉しなかった。
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実施例21−ｖＣＰ６５組換体を有するイヌ狂犬病組合せワクチン：ｖＣＰ６５、ＣＤＶロックボーン（ｒｏｃｋｂｏｒｎ）およびＣＰＶXLのワクチンＤＡＣＰｉＰＣＰ６５±ＬＣＩにおける干渉の欠如
この実施例は、ＣＰＶ（ＰXL）およびＣＤＶ（ロックボーン）が、それぞれＣＰＶおよびＣＤＶ（オンダーステポート；Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株と、組合せワクチンの他の成分に対する干渉を引き起こすこと無く、相互交換可能に使用できることを示すものである：ＤＡＣＰｉＰ＋ＬＣＩ、ＣＰ６５をイヌコンボ（ｃｏｍｂｏ）ワクチン（ＤＡＣＰｉＰ）に添加したものは、他の成分の免疫原性に干渉せず、組合せワクチン（ＤＡＣＰｉＰＣＰ６５）は、組合せワクチン＋ＬＣＩおよびその副産製品についての認可が得られるほどイヌに対して安全であることを示すものである。
一般的手順：多様な抗原成分を有するワクチンの７つのロットを調製した。38匹のイヌを、受容したワクチンおよび血清学によって測定されたそれらの免疫反応に基づいて、異なった群に分けた。ワクチン接種／免疫性テストによってイヌコロナウイルスの効率を測定した。異なったワクチン抗原の添加によって干渉が生じたか否かを、血清中和（ＳＮ）抗体力価を用いて測定した。全てのワクチンを、USDAに認可され十分に試験された製造番号（32010）のＬＣＩとともに再構成し、イヌに注入した。
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材料：
動物、供給源、年：様々な年の17匹のイヌをHarlan Sprague Dawley（ＨＳＤ）より購入した。生後12−16週の５匹のイヌをJames A．Baker Institute of Animal Health，コーネル大学より購入した。生後８−10週の16匹のイヌをLibertyより購入した。それらは、それぞれの研究に関連した全てのワクチン成分に対して血清陰性であった。
ワクチン：
全てのワクチンは、同じマスターシードウイルスに由来する抗原の異なった収穫物を用いて調製した。
４つのワクチンロットを調製した。
−−ＤRＡＰｉＰ（ロットＡ）
−−ＤRＡＣＰＩＰXL（ロットＢ）
−−ＤOＡＣＰｉＰＣＰ６５（ロットＣ）
−−ＤRＡＣＰｉＰXLＣＰ６５（ロットＤ）
上記のワクチンを以下の成分で配合した：
成分            力価／ml（log10）
ＤR             ５．２
ＤO             ５．４
Ａ              ７．４
Ｃ              ６．６
Ｐｉ            ７．５
Ｐ              ７．０
ＰXL            ５．３
ＣＰ６５        ７．９
以下の付加的なワクチンを製造した：
−−ＤRＡＣＰｉＰXLＣＰ６５
−−ＤOＡＣＰｉＰＣＰ６５
ワクチンＤRＡＣＰｉＰXLＣＰ６５
成分            力価／ml
ＤR             ５．２
Ａ              ７．４
Ｃ              ６．６
Ｐｉ            ６．９
ＰXL            ５．３
ＣＰ６５        ８．０
ワクチンＤOＡＣＰｉＰＣＰ６５
成分            力価／ml（log10）
ＤO             ５．４
Ａ              ７．４
Ｃ              ３．１
Ｐｉ            ６．９
Ｐ              ７．０
ＣＰ６５        ８．０
ＣＤＶ画分を含まないワクチンも調製した：
ワクチンＡＣＰｉＰXLＣＰ６５
成分            力価／ml
Ａ              ７．４
Ｃ              ６．２
Ｐｉ            ６．８
ＰXL            ５．４
ＣＰ６５        ８．０
滴定：異なったワクチンロットの各々の画分を、最初のワクチン接種の日かまたは両方のワクチン接種の日の何れかに滴定した。滴定は３つから５つ複製して行った。
方法：ワクチン接種：全てのワクチン（１用量＝１ml）を、皮下経路で21日の間隔をおいて２回投与した。購入した製造番号（No.32010）のＬＣＩを各々のワクチンの希釈剤として用いた。
採血：イヌからワクチン接種後第０、21、および35−42日に採血した。
結果の評価：  血清中和力価：各々の採血日に各々のイヌから採取された血清試料を、ウイルス中和抗体力価に関して試験した。抗体力価によって分析された血清変換を、干渉を測定するための変数として用いた。調査されたワクチンの成分あたり、異なった群のイヌが用いられたが、これは何匹かのイヌはすでにあるウイルスに接触されており、ワクチン接種前であっても高い抗体力価を有していたからである：例えば、最初の４つ（Ａ−Ｄ）のロットを受容したＨＳＤのイヌは、それらの群において購入前にイヌパルボウイルスの突然発生を経験していることが確認された。
ワクチン接種／免疫性テスト（ＣＣＶ）：12（12）匹のイヌを、ＣＣＶLワクチンを含むＣＰ６５コンビネーションでワクチン接種し、６（６）匹の対照イヌをＣＰ６５とＣＣＶLワクチンとを含まない組合せワクチンでワクチン接種した。ワクチン接種後第35日に毒性ＣＣＶで免疫性テストを行い、第41日に剖検した。排泄物中のウイルスの再単離の結果を、ＣＣＶワクチンによって付与された防御に対してｖＣＰ６５が干渉しなかったことを示すものとして用いた。
安全性の評価：ワクチンの各々の投与の後に、各々のイヌを接種部位で触診し、ワクチン接種後少なくとも２時間、局部的または全身の、何れかの好ましくない臨床上の反応があるか否かを観察した。観察は調査期間を通して継続された。
結果：ＣＤＶ（ロックボーンまたはオンダーステポート）およびＣＰＶ（オールドＭＳＶまたはＰXL）ＭＳＶと組み合わせて調製されたＣＰ６５によって誘導された抗体力価は等しかった。他の成分（Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｐｉ、Ｐ）に添加されたＣＰ６５は、これらの何れの免疫反応にも干渉しなかった。組合せワクチン中のＣＣＶ（ＭＬＶ）は、用いられたＭＳＶがＣＤＶかまたはＣＰＶかに関係なく、ＣＰ６５を含む他の全ての成分の存在下で、免疫性テストに対してイヌを防御した。実験期間を通して、全身または局所的な臨床的兆候は観察されなかった。
ワクチン中の抗原成分の力価：  第１のワクチン接種および／または第２のワクチン接種で試験されたワクチンの各々のロット中の各々の抗原の力価が、以下の表81ａ、ｂ、ｃに示されている：
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結果は以下のことを示している：
−−ＣＰ６５の力価はほとんど、ＭＰＤ（5.6）とデーティング（ｄａｔｉｎｇ）において期待される力価（6.3）との間であった。
−−ＤR力価は常に解放力価（ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｔｉｔｅｒ）3.2（log10／ml）の上であった。
−−ＰXL力価は常に期待される解放力価3.3（log10／ml）の上であった。
組換体狂犬病（ＣＰ６５）血清中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ）：ＣＤＶとＣＰＶとが変わっている点のみが異なっている２つのワクチンが、以下の狂犬病中和抗体力価を供与した（表82）：
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狂犬病ＳＮ抗体は、上記の実施例で得られたものに匹敵する良好な血清変換力価を有していた。
統計的分析（ｔ試験）により、上記のワクチンの狂犬病中和抗体力価（表82）は、顕著には異なっていないことが判明した：ジステンパーマスターシードおよびパルボウイルスマスターシードの両方の変化は、イヌにおけるｖＣＰ６５の効率に対してインビボで影響してはいなかった。
狂犬病（ＣＰ６５）ＳＮ力価に対する、ＣＤＶおよびＣＰＶそれぞれの影響：
狂犬病（ＣＰ６５）ＳＮ力価に対するＣＤＶ（ロックボーン株）の影響
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ＣＤＶ（ロックボーン）がイヌコンボワクチン（ＡＣＰｉＰXLＣＰ６５）に添加された場合、ｖＣＰ６５によって誘導された狂犬病血清中和抗体力価に対しては干渉は引き起こされない。
狂犬病（ＣＰ６５）ＳＮ力価に対するＣＰＶ（ＰXL）の影響：組合せワクチン（ＤOＡＣＰｉＰＣＰ６５）中の組換体狂犬病ＣＰ６５が、狂犬病投与に対して効果的であることが（上記の実施例に示されたように）判明した。表82は、ジステンパーＭＳＶをオンダーステポートからロックボーンに変化させることによって、ｖＣＰ６５によって誘導される狂犬病ＳＮ抗体力価は影響されないことを示している。ＣＰ６５用量が非常に低いことは強調される必要がある（デーティングの力価の下で、かつＭＰＤに近い）。ＣＰＶ（ＰXL）は組換体狂犬病（ｖＣＰ６５）ワクチンに対して明らかに干渉していないことが表84に示されており、表82に示された結果を確認している。
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ＣＰＶから新しいＣＰＶマスターシード（ＰXL）への変化は、狂犬病ＳＮ抗体力価に対して、如何なる顕著な違いをももたらさなかった。ロットＤでワクチン接種され、ＤRおよびＰXLを受容した群においては、ＣＰ６５の用量が最小防御用量に近かったにもかかわらず、全てのイヌにおいて良好な血清変換がみられた。
組換体狂犬病（ｖＣＰ６５）を添加することによる他のイヌワクチン画分への影響。
ＣＤＶ（ロックボーン株）ＳＮ力価に対するＣＰ６５の影響
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異なったイヌコンボワクチン中に取り込まれた場合に、組換体狂犬病（ｖＣＰ６５）ワクチンは、ＣＤＶに対する中和抗体の生産には影響しない。低力価であっても、全ての動物において、組み合わされたＤRは完璧な血清変換を誘導する。
狂犬病組換体（ＣＰ６５）を添加することによるＣＰＶ（ＰXL）のＳＮ力価に対する影響
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組換体狂犬病（ｖＣＰ６５）が、ＤＡＣＰｉＰ（ＰまたはＰXL）を有するイヌコンボワクチンに添加された場合には、実験されていない（ｎａｉｖｅ）動物中でのＣＰＶに対する血清中和（ＳＮ）抗体の製造には干渉しない。
ＣＡＶ−２のＳＮ力価に対する、狂犬病組換体（ＣＰ６５）の添加による影響。
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ＣＡＶ−２を含む組合せワクチンにＣＰ６５（組換体狂犬病ワクチン）を添加することによっては、血清学的方法によって測定されたＣＡＶ−２に対する免疫反応は干渉されない。
ＣＰｉのＳＮ力価に対する、狂犬病組換体（ＣＰ６５）の添加の影響
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ｖＣＰ６５を、ＤRＰXLを含む既存のワクチンへ添加することによっては、ＣＰＩ血清中和抗体力価は干渉されない。
組換体（ＣＰ６５）の添加によるＣＣＶ免疫原性に対する影響（血清学による）
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表89は、組換体狂犬病ワクチン（ＣＰ６５）が、認可されたＤｒＡＣＰｉＰの成分（ＤＡＣＰｉＰ）に添加された場合に、ＳＮ力価として測定された免疫原性には干渉しないことを示している。
免疫性テストによる：  ＣＤＶ（ＤR）およびＣＰＶXLが、ＤRＡＣＰｉＰXLワクチン中のＣＣＶの効率に対して干渉しないことは、上記の実施例においてワクチン接種／免疫性テストによって示された。
３つの群のイヌに、ｖＣＰ６５含むかまたはＣＰ６５を含まないワクチンを、表89に示され上記で議論されたようにワクチン接種した。上記の実施例に記載された手順に従った後、全てのイヌを、ＣＣＶで免疫性テストに供した。ワクチンの効率は、免疫性テスト後６日目に、フン中のウイルスを再度単離することにより評価した。
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表90は、免疫性テスト後の防御によって判断された結果として、ＣＰ６５はＣＣＶによるワクチン接種に干渉しないことを確認している。ＣＰ６５を含む全てのイヌコロナウイルスは、全ての対照イヌに影響を及ぼした非常に過酷な免疫性テストに対して、非常に効率的にイヌを防御した。
この実施例において、全てのワクチンは、ワクチン接種後に綿密に観察した結果、イヌにとって安全であると判明した。局所的もしくは全身の臨床反応は、試験期間中を通して見られなかった。
これらの実験では、狂犬病組換体画分であるｖＣＰ６５を添加することによっては、ＤRおよびＰXLを含む他の成分の何れに対しても、如何なる干渉もされないことを血清学的に示した。
凍結乾燥された２つの完成品組合せワクチンであるＤOＡＣＰｉＰＣＰ６５／ＬＣＩおよびＤRＡＣＰｉＰXLＣＰ６５／ＬＣＩ（そこにおいてＤOがＤRに変えられている）を比較し、狂犬病抗体反応においては如何なる干渉も無いということが判明している。ＤRＡＣＰｉＰXLＣＰ６５での狂犬病抗体レベルは、ＤOＡＣＰｉＰＣＰ６５でワクチン接種され免疫性テストを生き延びたイヌのものよりさらに高いかまたは等しい。
ＤRがｖＣＰ６５の免疫反応に干渉しないことをさらに示すために、ＤRを有するかまたは有しない２つのワクチンのＳＮ抗体を比較した。どちらの場合も結果は同等で、ＤR株はＡＣＰｉＰXLＣＰ６５画分の残りに添加されても良いことが示された。
イヌパルボウイルス（ＰXL）を、完成品組合せワクチン（ＤRＡＣＰｉＰXLＣＰ６５）に添加し、別の組合せワクチン（ＤOＡＣＰｉＰＣＰ６５）と比較したが、ＣＰ６５の血清学的事象に対する干渉は見られなかった。
ＰとＰXLが互いに交換可能に用いられた組合せワクチン（ＤＡＣＰｉＰＣＰ６５）においての、イヌパルボウイルスの体液免疫反応は、どちらの場合も同等であった。さらに、結果からは、あるイヌパルボウイルスのＭＳＶを別のものに変えることによっては、他の画分に対するイヌの免疫反応は影響されないことが確認された。
ＣＣＶ  ＭＬＶワクチンによって付与される防御に対し、ＤR、ＰXLおよびＣＰ６５が干渉しないことを、ワクチン接種／免疫性テストによって評価した。ＣＣＶをフンから再度単離することにより、ＣＤＶ（ロックボーン）およびＣＰＶ（ＰXL）ＭＳＶは、組合せワクチンＤRＡＣＰｉＰXLＣＰ６５中において使用できることが明らかとなった。ＣＰ６５を含む両方のイヌコロナワクチンは、ワクチン接種されていない対照イヌの100％に影響したコロナウイルス免疫性テストに対して、イヌを非常に効果的に防御した（表89）。
Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｐｉ、Ｐウイルス抗原と組み合わせられた組換体狂犬病（ｖＣＰ６５）カナリアポックスベクターワクチンは、用いられたイヌパルボウイルスまたはイヌジステンパーウイルスのＭＳＶに関係なく、イヌにおいて安全で効果的であった。
血清学的方法によって評価すると、組換体狂犬病ｖＣＰ６５をＤＡＣＰｉＰに添加することによっては、他の何れのイヌウイルス画分に対しても如何なる干渉も生じない。
免疫性テストによって評価すると、組合せワクチン中に組換体狂犬病（ｖＣＰ６５）、ＤR、ＰXLが存在することによっては、ＣＣＶ成分の効率に対しては如何なる干渉も引き起こされない。
再水和したイヌ狂犬病組合せは、全ての成分について完璧な防御的免疫反応を誘導した。
実施例22−カナリアポックス／狂犬病（ＣＰ６５）：他のワクチン抗原と組み合わせての、ネコにおける予備的な安全性および免疫原性調査
この実施例は、狂犬病組合せワクチンの安全性と免疫原性を示し、従来の抗原はｖＣＰ６５の免疫原性に干渉しないことを示し；ネコにおける安全性を示すものである。
全体的手順：  25匹のネコ（１つの群あたり５匹）に、従来の抗原（ＦＶＲ−Ｃ−Ｐ−ＦＰｎ＋ＦｅＬＶ）と組み合わせた104.8−105.3TCID50のｖＣＰ６５を含むワクチンの実験ロットをワクチン接種した。ネコに、１または２用量のワクチンを皮下で受容させ、第１のワクチン接種後第０日、第18日、第32日に採血した。
材料：動物：25匹のネコを、試験に際して同時に用いた。ネコは、第１のワクチン接種の時点でおよそ生後14−16週齢であった。それらは、受容以前に、供給者によって引き起こされたネコヘルペスウイルス感染から回復した直後であった。
ワクチン：実験用の、ネコ用の５種類のワクチン（ロットＢおよびＣ；表92を参照）であって、ネコ鼻気管炎（ＦＶＲ）；ネコカリチウイルス（Ｃ）；ネコ汎白血球減少症ウイルス（Ｐ）；クラミジア  プシッチシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔｉｃｉ）（ＦＰｎ）および組換体カナリアポックス狂犬病ウイルス（ＣＰ６５）を含むワクチンを調製した。
凍結乾燥させたワクチンを、従来のネコ白血病ワクチン（製品コード1555.20；製造番号65026）または滅菌水を用いて注入の前に水添した。このＦｅＬＶワクチンのシリーズ（ｓｅｒｉａｌ）は、試験の結果、2.6、2.8、2.6の相対有効性を有していた。
ネコを、表92に示されているようにワクチン接種した。
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ネコを肩胛骨の領域で皮下に、１度または２度、18日間の間隔をあけて接種した。狂犬病抗体力価の分析時間を適切にするために、注入の間隔を短くすることが必要であった。ネコから、ワクチン接種前、第１のワクチン接種後18日および32日に採血した。血清を、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）により狂犬病抗体の評価について分析した。ワクチン接種後約15分間、ワクチンに対する好ましくない反応（即ち、痛みまたはひっかき）が無いかネコを観察した。またワクチン接種のサイトをワクチン接種後18日と32日に触診した。改変生ウイルスＦＶＲ−Ｃ−Ｐ−ＦＰｎを滴定した。組換体ｖＣＰ６５を滴定した。第１のワクチン接種の間、ネコＦＸＩに104.8TCID50／用量で２回注入したため、群３のネコの数は４匹に減った。
結果：表93に概略を示す。
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ワクチンを滴定し、以下の量のウイルスを含有させた（表94）。ｖＣＰ６５の滴定値は３回に行った幾何平均として示されている。
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個々のおよび群としての抗体力価を表95にまとめる。各々の日に各々の群について幾何平均力価（ＧＭＴ）を計算した。０日のネコＨＢ１の抗体力価は誤って1.58と報告された。
ワクチンに対する好ましくない反応は見られなかった。接種箇所を18日と32日に触診した。腫れ物や異常は見られなかった。ワクチン接種されたネコの大多数は、試行期間中に健康そうであった。しかしながら、２、３のネコにおいては、ヘルペス感染による慢性呼吸兆候が明らかであった。
狂犬病抗体力価≧1.0log10である場合は、ワクチンに対する反応を示していた。群１、２および３には、少数の（群あたり２−３匹）接種後弱く反応したネコがいた。これらのネコは１または２用量の、従来のＦｅＬＶワクチンで水和されたワクチン、または１用量の水で水和されたワクチン（104.8TCID50／用量）を受容した。
群４には、２用量（104.8TCID50／用量）のワクチンに対して弱く反応した２匹のネコ（FZ1およびHH3）がいた。この群の残りのネコ（FU2、GR3およびHG1）は、第２のワクチン接種後、個々の狂犬病抗体力価≧1.8で良好に反応した。
群５は、ＦｅＬＶで水和された２用量（105.3TCID50／用量）のワクチンを受容した。この群は、ワクチン接種に対して最も良く反応していた（ＧＭＴ＝2.2±1.03）。しかしながら、１匹のネコＧＱ３はワクチン接種に反応しなかった。
この実施例により、ネコにおいて、ポックスウイルス狂犬病組換体組合せウイルスが免疫原性であり安全であることが示された。また、カナリアポックスベクターを投薬されていないネコの、１または２用量のｖＣＰ６５に対する血清学的反応が示された。
この実施例はまた、ｖＣＰ６５と従来のワクチンとの間で実際に干渉が無いことを示した。群２および４を比較すると、ｖＣＰ６５の投与量が低い（即ち104.8TCID50／用量）と、この実験で用いられたＦｅＬＶワクチン（製品コード1555.20）は、第２のワクチン接種後２週間で狂犬病抗体力価を穏やかに抑制するように見える。32日を超える付加的な試料が採集されていないため、これらのネコにおいての狂犬病抗体反応が単に遅れただけであることも考えられる。しかしながら、ｖＣＰ６５を105.3TCID50／用量で含むワクチン、従来のＦｅＬＶで水和されたワクチン、はネコにおいて免疫原性であったので；かくして、干渉の無いことが示されている。
この実施例は、従来の抗原と組み合わせたｖＣＰ６５（105.3TCID50／用量）は安全であり、２用量用いた後ネコにおいて良好な狂犬病抗体力価（即ち、群５のＧＭＴ＝2.12±1.03）を誘導することを示している。
このように、
従来の抗原と組み合わせたポックスウイルス−狂犬病組換体（ｖＣＰ６５）はネコにおいて安全であり；
従来の抗原はポックスウイルス−狂犬病組換体（ｖＣＰ６５等）の免疫原性には（特に105.3TCID50／用量では）干渉せず；
さらに、従来の抗原と組み合わせられＦｅＬＶで水和されたポックスウイルス−狂犬病組換体（ｖＣＰ６５等）（105.3TCID50／用量）を２用量用いると、最も高い狂犬病抗体反応が引き起こされる。
ことが結論づけられる。
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このように、本発明の好ましい実施態様を記述してきたが、添付された請求の範囲によって定義される本発明は、上記で示された特定の詳細に限定されるものではなく、本発明の精神または範囲から離れることなく、数多くの明らかな本発明の変化型が可能であることは理解されるべきである。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｄ】
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