(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
0004138870.tif 000025
〔式中、
ＸはＯ、NHまたはＮ−（C1〜C5）−アルカノイルであり；
Ｒは水素であり；
R1は水素または（C1〜C5）−アルカノイルであるか、またはＲとR1はそれらが結合している窒素原子と一緒になってジメチルアミノメチレンアミノ基を形成し；
R2は水素、メチル、フェニル、ヒドロキシル、メトキシまたはアミノであり；
R3は基-OR4、-NR5R6、-S（O）mR7（ここでｍは０、１または２である）または基-COR11（ここでR11中に含まれるR14はベンジルオキシカルボニルであり、R11中に含まれるR13はメチル、イソプロピルまたはベンジルである）であり；
R4は（C1〜C10）−アルキル、シクロヘキシル、ベンジル、置換されていないかまたは塩素もしくは基-COR8で置換されているフェニル、置換されていないかまたは窒素上で１個または２個の同一または相異なる（C1〜C4）−アルキル基により置換されているアミノカルボニルメチル、２−メトキシエチル、（2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル）メチル基または基-COR9であり；
R5は水素、メチル、エチル、２−ヒドロキシエチル、２−クロロエチル、ベンジル、ピリジルメチル、フェニルエチル、ピリジルエチルまたはアセチルであり；
R6はR5の意味とは独立して、R5について示された意味を有するか、またはR5が水素もしくはメチルである場合にはまた、シクロヘキシル、３−（２−エトキシエトキシ）プロピル、ベンジル（これはフェニル環に１個または２個の塩素原子もしくは基-COR10を担持している）、（C1〜C5）−アルカノイル、基-COR10または基-（CH2）4-COR10でもあり；
R7は（C1〜C4）−アルキル、ベンジル、置換されていないかまたは塩素、基-COR8もしくは基-CO-O-CO-（C1〜C4）−アルキルにより置換されているフェニルであるかまたはナフチルであり；
R8はヒドロキシル、メトキシ、アミノまたはR10であり；
R9は（C1〜C4）−アルキル、ヒドロキシメチル、トリフルオロメチル、（C1〜C2）−アルコキシまたはR11であり；
R10は基
0004138870.tif 000026
であり；
R11は基
0004138870.tif 000027
であり；
R12はヒドロキシルまたは（C1〜C2）−アルコキシであり；
R13は（C1〜C4）−アルキルまたはベンジルであり；
R14は水素またはベンジルオキシカルボニルである〕
で表されるプテリジン誘導体もしくはそれらの互変異性体またはそれらの薬理学的に許容し得る塩を含有する、増加した一酸化窒素濃度により惹起される疾患の予防および治療用医薬。
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｒが水素であり、ＸがＯまたはNHである、請求項１記載の医薬。
【請求項３】
式Ｉにおいて、R1および／またはR2が水素である、請求項１記載の医薬。
【請求項４】
式Ｉにおいて、R3が（C1〜C10）−アルキルオキシ、フェニルオキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたは基-COR11である請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
サイトカインによる敗血症性ショックおよび腫瘍の治療での病理学的血圧低下の治療および予防のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項６】
炎症性疾患の治療および予防のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
梗塞性損傷または再灌流性損傷の治療および予防のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項８】
移植拒絶反応の治療および予防のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
アルツハイマー病、癲癇および偏頭痛からなる群より選択される神経系疾患の治療および予防のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
本発明は、内在性一酸化窒素の産生を調整することができるが故に有害な一酸化窒素濃度を有する点に特徴のある病態の予防および抑制に有用な医薬である式Ｉ
0004138870.tif 000002
で表されるプテリジン誘導体に関する。
一酸化窒素（NO）はあらゆる種類の生理学的過程において重要な役割を果たす（例えばR.Henning, Nachr. Chem. Tech. Lab. 41（1993）, 413; H.H.H.W.Schmidt et al., Biochim. Biophys. Acta 1178（1993）, 153参照）。それは例えば、血管の平滑筋系に弛緩作用を有し、それで実質的に血圧調整に関係している。それは血小板凝集の阻害により血液凝固を抑制する。それは例えば、脳内の神経伝達物質として長期記憶の蓄積に関係している。また、NOは末梢神経系のNANC神経中のメッセンジャー物質としても機能する。NOの細胞毒性作用は感染に対する防御のためにマクロファージが利用している。
内在性NOは少なくとも３種の異なるNO−シンターゼ イソ酵素を利用してアルギニンから生成される（例えばJ.F.Kerwin, Jr.およびM.Heller, Med. Res. Rev. 14（1994）, 23参照）。これらの酵素は体中におけるそれらの局在性、Ca2+／カルモデュリンによるそれらの調節可能性並びにエンドトキシンおよびサイトカインによるそれらの誘導可能性に関して相違する。構成酵素のカルシウム依存性NO−シンターゼは例えば内皮細胞（III型）および脳（Ｉ型）内に見いだされ、そこで血圧および血液凝固の調整並びに伝導過程に関係している。サイトカイン誘導性、カルシウム非依存性イソ型（II型）はマクロファージ、平滑筋細胞および肝細胞に生ずる。それは長期にわたって、かなり多量のNOを産生することができかつ炎症過程およびマクロファージの細胞毒性活性の原因であると考えられている。
有害なNOバランスは重篤な疾患および損傷を生ずる。すなわち敗血症性または出血性ショックでの過剰なNO生成は病理学的に大きな血圧低下を生起させる。過剰なNO産生は１型の糖尿病およびアテローム性動脈硬化症の生成に関係しそしてまた脳虚血症後のグルタメート生起による神経毒性の原因であると思われる。さらに高NO濃度はシトシンの脱アミノ化の結果としてDNA損傷をもたらす可能性がある。内在性NOの欠如により直接または間接的に惹起される疾患の例としては動脈性高血圧症、鬱血性疾患、心臓疾患および勃起機能不全がある。これら症状の治療用にNO産生の調整を利用する試みは今までアルギニン類似体を用いて実現されただけである（GB-A-2240041; WO-A-93／13055参照）。文献中に論述されたさらに別の可能性のあるNO−シンターゼ阻害剤としてはＮ−イミノエチルオルニチン（McCall et al., Br. J. Pharmacol. 102（1991）, 234）、アミノグアニジン（T.P.Misko et al., Eur. J. Pharmacol. 233（1993）, 119; EP-A-547588）および７−ニトロインダゾール（P.K.Moore et al., Br. J. Pharmacol. 108（1993）, 296）がある。
種々のプテリジン誘導体は天然に産し、医薬の活性化合物としてのプテリジン誘導体の使用もまた従来記載されている。細胞静止性メトトレキセートはプテリジン誘導体である。EP-B-290819には認識に関する病状の治療のためにプテリジン（それらの中にはR3がヒドロキシルである式Ｉのプテリジンもある）を使用することも開示されている。機序的問題を考慮したNO−シンターゼについての調査では、今まで特に水素化プテリジン誘導体が特に使用された（例えばKwon et al., J.Biol. Chem. 264（1989）, 20496またはGiovanelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）, 7091参照）。それによれば、テトラヒドロビオプテリンはNO産生を刺激し、NO−シンターゼの補因子である。NO産生の刺激はまた7,8−ジヒドロビオプテリンについても見いだされた。HevelおよびMarletta（Biochemistry 31（1992）, 7160）は６−メチル−5,6,7,8−テトラヒドロプテリンによるNO−シンターゼ活性の増加について報告している。非水素化プテリジン例えばビオプテリン、プテリン、葉酸または６−ヒドロキシメチルプテリンはこの種の調査において有意な効果を全く示さなかった（Kwon et al., J. Biol. Chem. 264（1989）, 20496参照）。
意外なことに、本発明によれば式Ｉのプテリジン誘導体が特に内在性NO産生に対する阻害調整作用を有しそしてそれ故に過剰なNO濃度を有する点に特徴のある疾患の医薬として適していることが見いだされた。
本発明は増加した一酸化窒素濃度により惹起される疾患の予防および治療のための式Ｉ
0004138870.tif 000003
〔式中、
ＸはＯ、NHまたはＮ−（C1〜C5）−アルカノイルであり；
Ｒは水素であり；
R1は水素または（C1〜C5）−アルカノイルであるか、またはＲとR1はそれらが結合している窒素原子と一緒になってジメチルアミノメチレンアミノ基を形成し；
R2は水素、メチル、フェニル、ヒドロキシル、メトキシまたはアミノであり；
R3は基-OR4、-NR5R6または-S（O）mR7（ここでｍは０、１または２である）であり；
R4は水素、（C1〜C10）−アルキル、シクロヘキシル、ベンジル、置換されていないかまたは塩素もしくは基-COR8で置換されているフェニル、置換されていないかまたは窒素上で１個または２個の同一または相異なる（C1〜C4）−アルキル基により置換されているアミノカルボニルメチル、２−メトキシエチル、（2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル）メチル基または基-COR9であり；
R5は水素、メチル、エチル、２−ヒドロキシエチル、２−クロロエチル、ベンジル、ピリジルメチル、フェニルエチル、ピリジルエチルまたはアセチルであり；
R6はR5の意味とは独立して、R5について示された意味を有するか、またはR5が水素もしくはメチルである場合にはまたシクロヘキシル、３−（２−エトキシエトキシ）プロピル、ベンジル（これはフェニル環に１個または２個の塩素原子もしくは基-COR10を担持している）、（C1〜C5）−アルカノイル、基-COR10または基-（CH2）4-COR10でもあり；
R7は（C1〜C4）−アルキル、ベンジル、置換されていないかまたは塩素、基-COR8もしくは基-CO-O-CO-（C1〜C4）−アルキルにより置換されているフェニルであるかまたはナフチルであり；
R8はヒドロキシル、メトキシ、アミノまたはR10であり；
R9は（C1〜C4）−アルキル、ヒドロキシメチル、トリフルオロメチル、（C1〜C2）−アルコキシまたはR11であり；
R10は基
0004138870.tif 000004
であり；
R11は基
0004138870.tif 000005
であり；
R12はヒドロキシルまたは（C1〜C2）−アルコキシであり；
R13は（C1〜C4）−アルキルまたはベンジルであり；
R14は水素またはベンジルオキシカルボニルである〕
で表されるプテリジン誘導体およびそれらの互変異性体並びにそれらの薬理学的に許容し得る塩の使用に関する。
アルキル基は直鎖または分枝鎖状であることができる。これはまた、アルキル基が例えばアルコキシ、アルキルメルカプト、アルコキシカルボニルまたはアルカノイル基のような他の基に現れる場合にも適用される。本発明により使用され得る式Ｉの化合物中に例えば（C1〜C4）−もしくは（C1〜C10）−アルキルとしてまたは他の基中に存在し得るアルキルの例としてはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、2,2−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルまたはｎ−デシルがある。特に（C1〜C5）−アルカノイルの例としてはホルミル、アセチル、プロピオニル、ｎ−ブチリル、ｉ−ブチリル、ｎ−バレロイル、３−メチル−ｎ−ブチリルまたは2,2−ジメチルプロピオニルがある。（C1〜C2）−アルコキシの例としてはメトキシおよびエトキシがある。
ピリジル基は２−ピリジル、３−ピリジルまたは４−ピリジル基であることができるが、２−ピリジル基が好ましい。１個の置換基を担持しているフェニル基はその置換基を２−、３−または４−位に担持することができる。３−および４−位が好ましいが、４−位が特に好ましい。フェニル基が２個の置換基を担持している場合には、これらは例えば2,3−、2,4−、3,4−または3,5−位に存在することができる。それらは2,4−または3,4−位に存在するのが好ましい。ナフチル基は１−ナフチルまたは２−ナフチル基であることができるが、２−ナフチル基が好ましい。フェニルエチルおよびピリジルエチル基の場合のフェニルまたはピリジル基は１−位または２−位に存在することができるが、２−位にあるのが好ましい。
式Ｉの化合物は種々の互変異性体および種々の立体異性体で存在することができる。本発明は全ての互変異性体の使用のみならず、全ての立体異性体の使用をも包含する。すなわち例えば純粋なエナンチオマー、エナンチオマー混合物ないしラセミ混合物、純粋なジアステレオマーないしジアステレオマー混合物の各使用をも包含する。
ＸはＯまたはNHであるのが好ましい。
Ｒは水素であるのが好ましい。
R1は好ましくは水素である。
R2は好ましくは水素である。R2が（C1〜C5）−アルカノイルである場合にはアセチル、ｉ−ブチリルおよびピバロイルが好ましい。
R3は（C1〜C10）−アルキルオキシ、フェニルオキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたは基-COR11であるのが好ましい。特に好ましくは、R3は（C5〜C10）−アルキルオキシ、アミノまたは基-COR11（ここでR11に含まれるR14はベンジルオキシカルボニルであり、R11に含まれるR13はメチル、イソプロピルまたはベンジルである）である。
式Ｉの化合物は知られており、そして知られた方法でまたはそれらと類似の方法で製造することができる。式Ｉのプテリジン誘導体の知られた合成方法は例えば、ガブリエルーイセイ（Gabriel-Isay）法またはテイラー（Taylor）法である（例えばD.J. Brown, Fused Pyrimidines III, Pteridines（E.C. Taylor and A. Weissberger（Ed）, Wiley & Sons, New York）参照）。詳細には、式Ｉの化合物の製造は例えばEP-A-108890、
0004138870.tif 000006
の論文またはJ. Med. Chem. 30（1987）, 40に記載されている。
本発明により使用され得る式Ｉの化合物は無機酸または有機酸と塩を形成することができる。薬理学的に許容し得る酸付加塩の形成に適当な酸は例えば塩酸、臭化水素酸、ナフタレンジスルホン酸特に1,5−ナフタレンジスルホン酸、またはリン酸、硝酸、硫酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、酢酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバリン酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸またはアジピン酸である。式Ｉの化合物は１種以上の酸同等物を加えることができる。酸付加塩は慣用の方法で好都合には適当な溶媒または希釈剤中で各成分を合一することにより製造することができる。酸付加塩は陰イオン交換により互いに変換され得る。酸性基を含有する式Ｉの化合物は無機塩基または有機塩基で塩を形成することができる。このような塩の例としては例えばアルカリ金属塩特にナトリウム塩およびカリウム塩、またはアンモニウム塩特にアンモニウム窒素上で有機基と一緒になった塩を挙げることができる。
式Ｉの化合物によるNO放出阻害はBredtおよびSnyderおよびまたSchmidt氏等（D.S. Bredt and S.S. Snyder, Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-requiring enzyme, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87（1990）, 682; H.H.H.W. Schmidt et al., Purification of a soluble isoform of guanylyl cyclase-activating factor synthase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）, 365参照）の研究に基づいた活性アッセイにより測定することができる。精製NO−シンターゼ（NOS）に関するこのアッセイではNO生成中に得られる副生成物のＬ−シトルリンを定量的に測定する。これは酵素反応の基質として3H−放射能標識Ｌ−アルギニンを使用することにより実施され、その際それは反応すると3H−Ｌ−シトルリンおよびNOになる。酵素インキュベーションの終了後に、得られたＬ−シトルリンを反応混合物のイオン交換クロマトグラフィーにより未使用のＬ−アルギニンから除去する。そこで液体シンチレーション測定により測定される3H−活性はＬ−シトルリンの量に相当する。この操作の詳細はさらに以下に示すとおりである。
増加したNO濃度により生起するが、本発明により式Ｉの化合物で治療され得るかまたはこれらを使用して予防され得る疾患は特に、例えば敗血症または出血性ショック、サイトカインによる腫瘍またはガンの治療または肝硬変に生ずるような病理学的血圧低下である。さらに、炎症性疾患例えばリウマチ性関節炎および特に潰瘍性大腸炎並びにインシュリン依存性糖尿病および移植拒絶反応も挙げられる。
しかしまた、一酸化窒素の増加した産生と関連がありそして本発明により治療または予防され得る疾患は以下のようなものでもある。心血管分野ではそれらは動脈硬化症、虚血後組織損傷および梗塞性損傷、再灌流損傷、コックサッキー（Coxsackie）ウイルス感染による心筋炎および心筋症であり；神経系／中枢神経系分野ではそれらは種々の病因因子による神経症（神経炎の諸形態）、脳脊髄炎、ウイルス性神経変性疾患、アルツハイマー病、痛覚過敏症、癲癇および偏頭痛であり（但し、式Ｉ中のR3がヒドロキシルである場合には、アルツハイマー病の治療および予防は除外される）、腎臓の分野ではそれらは急性腎不全および種々の病因因子による腎炎特に糸球体腎炎である。
さらに、胃および子宮／胎盤の分野での治療およびまた冒された精子能動性の治療もまた、式Ｉの化合物の使用され得る分野である。
式Ｉの化合物およびそれらの薬学的に許容し得る塩は生化学および薬理学的研究における補助剤として調査および診断の過程で用いることができ、それらは動物好ましくは哺乳動物特にヒトにそれ自体で、お互いの混合物としてまたは慣用の薬学的に無毒な賦形剤および添加剤の外に有効量の少なくとも１種の式Ｉの化合物またはその塩を活性成分として含有する経腸もしくは非経口的使用の可能な製剤の形態で治療剤として投与することができる。
治療剤は例えば丸剤、錠剤、ラッカー被覆錠剤、コーティング錠剤、ハードないしソフトゼラチンカプセル剤、溶液、シロップ、乳液もしくは懸濁液またはエーロゾル混合物の形態で経口的に投与することができる。しかし、例えば坐薬の形態で直腸に、または例えば注射液もしくは注入液の形態で非経口的に、または例えば軟膏もしくはチンキの形態で皮下に投与することもできる。
活性化合物および賦形剤の外に、製剤はまた添加剤例えば充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味剤、着色剤、香味剤または芳香剤、緩衝物質、溶剤もしくは可溶化剤またはデポ作用を得るための剤並びに浸透圧を変えるための塩、コーティング剤または抗酸化剤も含有することができる。それらはまた２種以上の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容し得る塩およびまた他の治療的に活性な物質も含有することができる。
前記タイプの他の治療的に活性な物質としては例えばβ−レセプター遮断剤例えばプロプラノロール、ピンドロール、メトプロロール；血管拡張剤例えばカルボクロメン；精神安定剤例えばバルビツール酸誘導体、1,4−ベンゾジアゼピンおよびメプロバメート；利尿剤例えばクロロチアジド；強心剤例えばジギタリス製剤；降圧剤例えばヒドララジン、ジヒドララジン、ラミプリル、プラゾシン、クロニジン、ラウオルフィア（Rauwolfia）アルカロイド；血中脂肪酸レベルを低下させる剤例えばベザフィブレート、フェノフィブレート；血栓症予防用剤例えばフェンプロクモン；抗炎症物質例えばコルチコステロイド、サリシレートまたはプロピオン酸誘導体例えばイブプロフェン；抗生物質例えばペニシリンまたはセファロスポリン；NOドナー例えば有機ナイトレートまたはシドノンイミンまたはフロキサンを挙げることができる。
投与量は広範囲で変わることが可能であり、各個々の場合の個々の状態に合わせるべきである。一般には、経口投与の場合にはヒト個人当たり１日につき約0.5〜100mg好ましくは１〜20mgの投与量が適当である。他の投与形態の場合にもまた、１日当たりの投与量は同様の範囲の量、すなわち一般的には0.5〜100mg／ヒトである。この１日当たりの投与量は例えば２〜４回の部分投与量のようにいくつかに分割することができる。
製剤を調製するには薬学的に不活性な無機または有機の賦形剤を使用することができる。丸剤、錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセル剤を調製するには例えばラクトース、コーンスターチもしくはその誘導体、タルク、ステアリン酸もしくはその塩等を使用することができる。ソフトゼラチンカプセル剤および坐薬用の賦形剤は例えば脂肪、ワックス、半固形ないし液状のポリオール、天然油または硬化油等である。溶液およびシロップの調製に適した賦形剤は例えば水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオール等である。注射液調製用に適した賦形剤は例えば水、アルコール、グリセロール、ポリオールまたは植物性油である。
今日まで式Ｉで表される種々のプテリジン誘導体について、その薬理作用または医薬用途は全く知られていなかった。このような化合物について本発明が最初の医薬適応症を提供する。本発明はまた式Ｉ
0004138870.tif 000007
〔式中、
ＸはＯ、NHまたはＮ−（C1〜C5）−アルカノイルであり；
Ｒは水素であり；
R1は水素または（C1〜C5）−アルカノイルであるか、またはＲとR1はそれらが結合している窒素原子と一緒になってジメチルアミノメチレンアミノ基を形成し；
R2は水素、メチル、フェニル、ヒドロキシル、メトキシまたはアミノであり；
R3は基-OR4、-NR5R6または-S（O）mR7（ここでｍは０、１または２である）であり；
R4は水素、（C1〜C10）−アルキル、シクロヘキシル、ベンジル、置換されていないかまたは塩素もしくは基-COR8で置換されているフェニル、置換されていないかまたは窒素上で１個または２個の同一または相異なる（C1〜C4）−アルキル基により置換されているアミノカルボニルメチル、２−メトキシエチル、（2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル）メチル基または基-COR9であり；
R5は水素、メチル、エチル、２−ヒドロキシエチル、２−クロロエチル、ベンジル、ピリジルメチル、フェニルエチル、ピリジルエチルまたはアセチルであり；
R6はR5の意味とは独立して、R5について示された意味を有するか、またはR5が水素もしくはメチルである場合にはまたシクロヘキシル、３−（２−エトキシエトキシ）プロピル、ベンジル（これはフェニル環に１個または２個の塩素原子もしくは基-COR10を担持している）、（C1〜C5）−アルカノイル、基-COR10または基-（CH2）4-COR10でもあり；
R7は（C1〜C4）−アルキル、ベンジル、置換されていないかまたは塩素、基-COR8もしくは基-CO-O-CO-（C1〜C4）−アルキルにより置換されているフェニルであるかまたはナフチルであり；
R8はヒドロキシル、メトキシ、アミノまたはR10であり；
R9は（C1〜C4）−アルキル、ヒドロキシメチル、トリフルオロメチル、（C1〜C2）−アルコキシまたはR11であり；
R10は基
0004138870.tif 000008
であり；
R11は基
0004138870.tif 000009
であり；
R12はヒドロキシルまたは（C1〜C2）−アルコキシであり；
R13は（C1〜C4）−アルキルまたはベンジルであり；
R14は水素またはベンジルオキシカルボニルである〕
で表されるプテリジン誘導体およびそれらの互変異性体並びにそれらの薬理学的に許容し得る塩（しかし、ここで薬理活性化合物としてR3がヒドロキシルである式Ｉの化合物は除外される）に関する。この型の好ましいプテリジン誘導体については、前述のものが相応して適用される。
以下に本発明により使用可能な式Ｉの化合物を実施例により記載する。実施例中、下記の略記を使用する。
Me＝メチル
Et＝エチル
iPr＝イソプロピル
iBu＝イソブチル
tBu＝tert−ブチル
Ph＝フェニル
Py＝２−ピリジル
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル
Ph-4-COOH、Ph-4-Clおよび対応する事項は４−位が基-COOHによりまたは塩素によりまたは特定の例で指定された基により置換されているフェニル基である。R10a、R10bおよびR10cは式
0004138870.tif 000010
で表される基であって、R10aの場合には基R12はヒドロキシルであり、R10bの場合には基R12はエトキシでありそしてR10cの場合には基R12はメトキシである。
Raは（2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル）メチル基（Ｄ−型）である。
実施例１〜109において式ＩのＲは水素である。
0004138870.tif 000011
0004138870.tif 000012
0004138870.tif 000013
0004138870.tif 000014
実施例110
式
0004138870.tif 000015
で表される化合物。
精製一酸化窒素シンターゼ（NOS）の活性の阻害測定
この活性アッセイでは、NOの生成中に精製NOSにより得られる副生成物Ｌ−シトルリンを定量的に測定する。酵素反応に用いる基質は3H−放射性標識されたＬ−アルギニンであり、これは反応すると3H−Ｌ−シトルリンおよびNOになる。酵素インキュベーションの終了後に、得られたＬ−シトルリンを反応混合物のイオン交換クロマトグラフィーにより未使用のＬ−アルギニンから除去する。そこで液体シンチレーションで測定した3H活性はＬ−シトルリンの量に対応し、それはNOS活性の直接の測定値である。
酵素反応実施用の基礎培地はTE緩衝液（トリエタノールアミン, EDTA, pH7.0）である。各インキュベーションの最終容量は100μlである。反応混合物は下記の６成分を氷上で混合することにより得られる。
１．“REAミックス”（pH7.0）（これはトリエタノールアミン、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、EDTA、Ｌ−アルギニン、カルモデュリンおよびフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を含有する）；
２．新しく調製した、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元型（NADPH）の原液；
３．（6R）−5,6,7,8−テトラヒドロ−Ｌ−ビオプテリンジ塩酸塩原液（BH4）またはBH4なしの実験の場合にはこれの代わりにTE緩衝液；
４．ブタ小脳またはブタ肝臓由来の精製されたNO−シンターゼ；
５．Ｌ−〔2,3,4,5-3H〕−アルギニン塩酸塩原液（1.5〜2.6TBq／mmol）；
６．供試物質
インキュベーション容量100μl中の各成分の最終濃度は、トリエタノールアミン50mM、EDTA 0.5mM、CaCl2 226μM、MgCl2 477μM、Ｌ−アルギニン50μM、カルモデュリン0.5μM、FAD5μM、NADPH １mM、BH4（加える場合には）２μM、供試物質100μMである。各成分を氷上で混合した後に反応混合物を水浴中において直ちに37℃で15分間インキュベートする。このインキュベーション時間の経過後に氷冷“停止用緩衝液”（酢酸ナトリウム20mM、EDTA ２mM、pH5.5）900μlの添加により反応を停止し、混合物（全容量1.0ml）を氷上に置く。未反応の3H−Ｌ−アルギニンを完全に分離するには、あらかじめすすぎ、停止用緩衝液２mlと平衡状態にあった、0.8mlのDowex AG50 WX-8（100〜200メッシュ）を有するイオン交換カラムに混合物を加える。試料の適用後、カラムをそれぞれ水１mlずつで２回溶出する。試料および溶出液の流出物をシンチレーション容器中で集め、精製する（全容量３ml）。シンチレーター溶液９mlを測定水溶液３mlに加え、その均一混合物をTricarb 2500TR（Packard社製）液体シンチレーションカウンター中で１試料につき１分間測定する。供試物質で検出された活性は対照物の活性の％で示される。テトラヒドロビオプテリン２μMの存在下において各物質を100μMの濃度でアンタゴニスト作用について試験し、テトラヒドロビオプテリンの不在下においてNOSに対するアゴニスト作用について試験する。全てのインキュベーションは３回ずつ行う。各実験は種々の酵素製剤を用いて３回繰り返す。いくつかの結果は下記表に示すとおりである。
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実施例Ａ
カプセル１個当たり活性化合物100mgを含有するゼラチンソフトカプセル：
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実施例Ｂ
１ml当たり活性化合物2.0mgを含有する注射液：
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実施例Ｃ
５ml当たり活性化合物60mgを含有する乳液：
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実施例Ｄ
坐薬１個当たり活性化合物40mgを含有する直腸用製剤：
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実施例Ｅ
錠剤１個当たり活性化合物40mgを含有する錠剤：
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実施例Ｆ
コーティング錠剤１個当たり活性化合物50mgを含有するコーティング錠剤：
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実施例Ｇ
ハードゼラチンカプセルの内容物の調製用には下記の処方が適当である：
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実施例Ｈ
滴剤は下記の処方により調製することができる（１ml中の活性化合物100mg＝20滴）
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