(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス  ラクチス宿主生物体にベクターを形質転換し、融合タンパク質を発現させると、目的とするタンパク質またはポリペプチドが宿主の細胞壁の外表面に付着し該外表面上でディスプレイするように、タンパク質ｕｓｐ４５のシグナル配列由来の分泌シグナル配列、目的とするタンパク質またはポリペプチドおよび少なくともスタフィロコッカスアウレウス  プロテインＡ由来のＣ−末端固着ドメインから構成される細胞壁付着ドメインからなる融合タンパク質をコード化する核酸を含む組換ベクターで形質転換されるラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項２】
目的とするタンパク質またはポリペプチドを予め発現させ、細胞壁に共有結合により付着させ、宿主生物体の表面の外面上でディスプレイさせる、請求の範囲第１項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項３】
細胞壁固着ドメインによりラクトコッカス  ラクチスは目的とするタンパク質またはポリペプチドを細胞壁表面に付着させ該表面上でディスプレイすることができる、ラクトコッカス  ラクチスが融合タンパク質を発現できるように、タンパク質ｕｓｐ４５のシグナル配列由来の分泌シグナル配列、目的とするタンパク質またはポリペプチドおよび少なくともスタフィロコッカス  アウレウスプロテインＡ由来のＣ−末端固着ドメインからなる細胞壁付着ドメインからなる融合タンパク質をコード化する組換核酸をラクトコッカス  ラクチスに形質転換することからなる、目的とするタンパク質またはポリペプチドを宿主表面上でディスプレイするためのラクトコッカス  ラクチス宿主生物体の操作方法。
【請求項４】
該融合タンパク質をコード化する核酸は発現させる制御配列に操作により連結される、請求の範囲第１項または第２項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項５】
該核酸は融合タンパク質をコード化する核酸の上流に形成される誘導プロモーターで制御されるＴ７ポリメラーゼ遺伝子からさらになる、請求の範囲第４項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項６】
該融合タンパク質をコード化する核酸は発現させる制御配列に操作により連結される、請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項７】
該核酸は融合タンパク質をコード化する核酸の上流に形成される誘導プロモーターで制御されるＴ７ポリメラーゼ遺伝子からさらになる、請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
ラクトコッカス ラクチス宿主生物体にベクターを形質転換し、融合タンパク質を発現させると、目的とするタンパク質またはポリペプチドが宿主の細胞壁の外表面に付着し該外表面上でディスプレイするように、タンパク質ｕｓｐ４５のシグナル配列由来である分泌シグナル配列、目的とするタンパク質またはポリペプチドおよび少なくともスタフィロコッカス アウレウス プロテインＡ由来のＣ−末端固着ドメインから構成される細胞壁付着ドメインからなる融合タンパク質をコード化する核酸を含む組換ベクター。
【請求項９】
該融合タンパク質をコード化する核酸は発現させる制御配列に操作により連結される、請求の範囲第８項に記載の組み換えベクター。
【請求項１０】
該核酸は融合タンパク質をコード化する核酸の上流に形成される誘導プロモーターで制御されるＴ７ポリメラーゼ遺伝子からさらになる、請求の範囲第９項に記載の組み換えベクター。
【請求項１１】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドが免疫反応を生じさせることを目的とする少なくとも一のエピトープを含む、請求の範囲第１項、第２項、第４項または第５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項１２】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドが病原体の免疫原、抗原または付着因子である、請求の範囲第１１項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項１３】
適当な担体との混合物における請求の範囲第１１項または第１２項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体からなるワクチン。
【請求項１４】
ワクチンの調製における請求の範囲第１１項または第１２項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体の使用。
【請求項１５】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドがそれに対して耐性を誘発させることを目的とするものである、請求の範囲第１項、第２項、第４項または第５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項１６】
タンパク質またはポリペプチドに対する耐性の誘発における請求の範囲第１５項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体の使用。
【請求項１７】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性を有する分子である、請求の範囲第１項、第２項、第４項または第５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項１８】
該生物学的に活性を有する分子が薬剤、ホルモン、酵素、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質、または他の一緒に発現及び分泌されるタンパク質に二次的な修飾を行える物質である、請求の範囲第１７項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項１９】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドが宿主生物体をターゲット部位に結合させることができるターゲット基である、請求の範囲第１項、第２項、第４項または第５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項２０】
該ターゲット基がターゲット抗原またはハプテンに結合できる、抗体、またはその断片、または付着因子である、請求の範囲第１９項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項２１】
請求の範囲第１項、第２項、第４項、第５項、第１５項、または第１７項から第２０項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体からなる薬剤組成物。
【請求項２２】
薬剤に使用される請求の範囲第１項、第２項、第４項、第５項、第１１項、第１２項、第１５項、または第１７項から第２０項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項２３】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドがリガンドの特異的な結合パートナーである、請求の範囲第１項、第２項、第４項または第５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項２４】
該リガンドが宿主生物体がその上に固定化されるように固体表面に結合されるものである、請求の範囲第２３項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項２５】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドがストレプトアビジンであり、該リガンドがビオチンまたはビオチン結合体である、請求の範囲第２４項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項２６】
ラクトコッカス  ラクチス宿主生物体をリガンドを予め固定した表面と接触させることからなる、請求の範囲第２３項から第２５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体の固定化方法。
【請求項２７】
リガンドの精製または分離における請求の範囲第２３項から第２５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体の使用。
【請求項２８】
核酸が発現の際にレポーター活性を生じさせる遺伝子からさらになる、特異的なリガンドを有する複合体の検出における請求の範囲第１項、第２項、第４項または第５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体の使用。
【請求項２９】
該レポーター活性が蛍光タンパク質またはルシフェラーゼであり、該目的とするタンパク質がストレプトアビジンである、請求の範囲第２８項に記載の使用。
【請求項３０】
該目的とするタンパク質またはポリペプチドが酵素である、請求の範囲第１項、第２項、第４項または第５項のいずれかに記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体。
【請求項３１】
該酵素は予め発現され、宿主生物体の細胞表面上でディスプレイされる、請求の範囲第３０項に記載のラクトコッカス  ラクチス宿主生物体からなる組成物。
【請求項３２】
酵素によって触媒される反応における請求の範囲第３１項に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
ラクトコッカス  ラクチス宿主生物体にタンパク質ｕｓｐ４５のシグナル配列由来の分泌シグナル配列を含む物質及び少なくともスタフィロコッカス  アウレウス  プロテインＡ由来のＣ−末端固着ドメインからなる細胞壁固着ドメインの融合物をコード化する核酸を形質転換し、該融合物を細胞表面上で発現させる段階からなる、物質のライブラリーのスクリーニング方法。
【請求項３４】
該物質が抗体または抗原またはこれらの断片である、請求の範囲第３３項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）等のグラム陽性細菌の細胞表面における、物質、特にタンパク質及びポリペプチドの排出（exportation）、細胞壁への付着（attachment）およびディスプレイ（display）に関する材料および方法に関するものである。抗原、特異的結合タンパク質及び酵素などの、タンパク質の細胞壁固着（anchoring）の表面発現に関して提供される方法が開示される。
発明の背景
細菌の表面上でのポリペプチドのディスプレイ（display）は、ここ数年間の研究の対象であった。組換ＤＮＡ技術により広範な異なるタンパク質の安価な生産を目的とした工場として細菌細胞を使用することが可能になるため、このような興味が生じた。研究は、グラム陰性細菌の表面上でのポリペプチドのディスプレイ（display）に集中した。例えば、米国特許第５３４８８６７号の評論を参照。しかしながら、グラム陰性細菌では、ポリペプチドが高密度で表面にしっかりと付着するように細胞の表面上にポリペプチドをディスプレイするのに適当な方法を発見するのが困難であることが分かった。
しかしながら、細菌表面上での組換産物の高密度表面発現は、特定の工業用途に、さらにはワクチンの開発、ペプチドライブラリーの構築及び全細菌細胞吸着剤の製造の領域に上記細菌を使用するために前もって必要である。細菌の表面上で、より好ましくはラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）や同様のまたは関連する種等のグラム陽性細菌の細胞表面上で矛盾のなく、安定して、高密度に発現させるような発明は、いまだ知られていない。
ポリペプチドの細菌表面の提示（presentation）に関する従来の研究は、主に、大腸菌（E.coli）やサルモネラ（Salmonella）等のグラム陰性細菌を使用するものに集中していた（ゲオルギオウ（Georgiou）ら、１９９３年）。グラム陰性細菌では、ペプチドグリカン細胞壁は２種の別の脂質膜によって結合する。外膜は、５００（Ｍｒ）を超える相対分子質量を有する分子に対しては非常に不透過性であり、その結果、タンパク質はほとんど増殖培地中に放出されない。外膜の存在によって、グラム陰性細菌の表面接触タンパク質は、内在性外膜タンパク質または線毛若しくは鞭毛等のタンパク質付属器のいずれかである。
グラム陰性生物体によって分泌される少数のタンパク質は、１４までの異なる遺伝子産物を含む特殊な輸送システムによって外膜を介して輸送される（例えば、プルラナーゼ分泌；コルナカー（Kornacker）及びパグスレイ（Pugsley）、１９９０ａ）。
内在性膜タンパク質とのＣ−末端融合を行うことによって外来タンパク質をディスプレイする可能性は、多くの内在性膜タンパク質のＣ−末端領域が外膜内のタンパク質のターゲティング及び正しい組立に必要であると考えられるという事実によって複雑化される。このような問題の一つの手段としては、融合タンパク質を外膜に向かわせるために大腸菌（E.coli）の主要なリポプロテイン（Ｌｐｐ）のＮ−末端ターゲティング配列を使用することがある。Ｌｐｐは外膜を通過しないので、外膜タンパク質（ＯＭＰ；例えば、大腸菌（E.coli）のＯｍｐＡ）の膜スパニングドメイン（membrane spanning domain）もまた、細胞表面に融合タンパク質を局在化するのに必要である。にもかからわず、これらのＬｐｐ−ＯｍｐＡ融合物をβ−ラクトマーゼ、１本鎖Ｆｖ抗体及びセルロース結合タンパク質等の機能タンパク質をディスプレイするのに利用することが示された（ゲオルギオウ（Georgiou）ら、１９９０年）。
他のポリペプチドの表面ディスプレイ法は、ＬａｍＢ等の内在性膜タンパク質の外膜ループ内にまたは膜内外ドメインを含まないピリン及びフラゲリンタンパク質中にアミノ酸挿入物を作製することからなる（チャービット（Charbit）ら、１９９１年；サーティ（Thirty）ら、１９８９年；スタイドラー（Steidler）ら、１９９３ａ、ｂ）。上記方法に関する主要な問題は、大きなアミノ酸の挿入物／置換が、細菌細胞を固定化するのに使用されると融合タンパク質が外膜から抽出されるようにして、融合タンパク質の適切な折りたたみおよび／または局在化を破壊することであった（スタイドラー（Steidler）、ＰｈＤ学位論文、ユニバーシティ  オブ  ゲント（University of Gent）、ベルギー）。
重要な進歩が近年グラム陰性細菌のタンパク質の表面ディスプレイ方法の開発においてなされたが、このような目的に内在性膜タンパク質を使用することに関する主要な欠点としては、融合タンパク質は細胞表面に堅固に付着しないことがある。さらに、膜タンパク質の高レベルの発現は細胞に有害であることが知られているため、高密度の表面発現が必要である場合にはこのようなシステムを使用する可能性が制限される。
これに対して、グラム陽性細菌は外膜を持たず、細胞表面でディスプレイされるタンパク質はそのＣ−末端を介して細胞表面に連結すると考えられる（シュニーウィンド（Schneewind）ら、１９９２年）。グラム陽性細菌の多くの表面タンパク質はこれらの生物体に独特な特定の共通する性質を有する。各分子は、そのＮ−末端に細胞の分泌物に関する排出シグナルとして作用する分泌リーダーペプチド、ＬＰＸＴＧモチーフ（LPXTG motif）、Ｃ−末端疎水性ドメイン及び非常にＣ末端の荷電アミノ酸を有する。これらの特性化及び機能に関するほとんどの研究は、スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡの細胞壁選別及び固着ドメイン（cell wall sorting and anchoring domain）を用いてスタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）内で行われた（ナバレ（Navarre）及びシュニーウィンド（Schneewind）ら、１９９４年）。プロテインＡは、未だ解明されていないメカニズムによってスタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）の細胞壁に共有結合することが示された。
発明の要約
本発明は、ラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）及び他のグラム陽性細菌の表面への外来タンパク質の堅固な付着が（１）Ｎ−末端分泌シグナル、（２）表面で発現させようとするタンパク質及び（３）スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡの細胞壁選別及び固着ドメイン（cell wall sorting and anchoring domain）をコード化する核酸を含む融合タンパク質をコード化するキメラ遺伝子を構築することによって可能になることを示すものである。
大腸菌（E.coli）と比較すると、比較的少ない異種タンパク質がラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）中で高レベルで発現したので、本研究前では特定のタンパク質の発現が可能であるかどうかまたはこのような発現が細胞に有毒であるかどうかを確信をもって予想することは不可能であった。このような毒性は、タンパク質の排出は細胞膜の完全性または一般的な分泌経路の機能に悪影響を及ぼすので、分泌または膜結合タンパク質を高レベルで発現させる際に起こると考えられる。
したがって、本発明は、タンパク質またはポリペプチドは細胞壁固着ドメインとの融合物として発現する際にはグラム陽性細菌の細胞壁に堅固に付着できることを初めて示すものである。以下に示されるように、一般的に非共有結合タンパク質を放出するイオン性界面活性剤の存在下で細胞を煮沸することによってタンパク質を除去することは可能ではない。特定の理論に結びつけることを意図するものではないが、我々は、ラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）は細胞壁のペプチドグリカンに発現プロテインＡ融合物を（共有）結合させるのに必要な酵素を有するのではないかを考える。この結合は、これらのモチーフは共有結合による細胞壁固着を起こすのに必要ではあるが十分条件ではないので、グラム陽性細菌の多くの表面タンパク質に共通なＬＰＸＴＧモチーフのプロテインＡ及びＣ−末端疎水性ドメインによって入手から容易に予想された。
したがって、本発明は、分泌シグナル配列、目的とするタンパク質またはポリペプチド及びスタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡ由来のもの等の細胞壁付着ドメインをコード化する核酸からなるキメラ遺伝子を用いて、有益なタンパク質及びポリペプチド（以下に制限されるものではないが、付着因子、抗原、酵素及びリガンドなど）をラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）等のグラム陽性細菌のペプチドグリカン細胞壁の外面に堅固に付着させることが可能であるという知見から生じるものである。
したがって、第一の概念によると、本発明は、ベクターをグラム陽性細菌宿主に形質転換し、融合タンパク質を発現させると、目的とするタンパク質またはポリペプチドが宿主の細胞壁の外表面に付着しディスプレイするように、分泌シグナル配列、目的とするタンパク質またはポリペプチドおよび細胞壁付着ドメインからなる融合タンパク質をコード化する核酸を含む組換ベクターを提供するものである。
さらなる概念によると、本発明は、上記したような組換ベクターで形質転換されたグラム陽性宿主生物体を提供するものである。
さらなる概念によると、本発明は、目的とするタンパク質またはポリペプチドを予め発現させ、さらに細胞壁に共有結合により付着させ、宿主生物体の表面に外面でディスプレイさせる、上記グラム陽性宿主生物体を提供するものである。
さらなる概念によると、本発明は、細胞壁固着ドメインにより宿主は目的とするタンパク質またはポリペプチドを細胞壁表面に付着させディスプレイすることができる、宿主が融合タンパク質を発現できるように、分泌シグナル配列、目的とするタンパク質またはポリペプチドおよび細胞壁付着ドメインからなる融合タンパク質をコード化する組換核酸をグラム陽性宿主生物体に形質転換することからなる、目的とするタンパク質またはポリペプチドを宿主表面上でディスプレイするためのグラム陽性宿主生物体の操作方法を提供するものである。上記概念はまた、上記方法によって得られるグラム陽性宿主生物体の株（strain）をも含むものである。
好ましくは、グラム陽性宿主生物体は、ラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス（Lactococcus）宿主、または融合タンパク質を発現し目的とするタンパク質またはポリペプチドを細胞表面上に付着させ安定してディスプレイさせる性質を有する同様のまたは関連する種である。プロテインＡ融合物がラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）及びスタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）の細胞壁に同様に付着するという予想されないような知見から、これは同様のまたは関連するグラム陽性細菌の他の細胞壁結合ドメインでもいえるであろうことが示唆される。このような他のグラム陽性細菌の例としては、バシラス  サチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトコッカス  ゴルドニィ（Streptococcus gordonii）、スタフィロコッカス  キシローサス（Staphylococcus xylosus）、ラクトバシラス種（Lactobacillus spec.）及び属バシラス種（genera Bacillus spec.）、クロストリジウム種（Clostridium spec.）及びコリネバクテリウム種（Corynebacterium spec.）の好冷（psychrophilic）及び低温（psychrotropic）種が挙げられる。
好ましくは、分泌シグナル配列は、分泌の第二依存経路（sec dependent pathway）を介して分泌を目的とするタンパク質をターゲットすることができ、ｕｓｐ４５等の天然に分泌されるタンパク質のシグナル配列由来である。しかしながら、この分泌シグナル配列は本実施例中で使用されるが、他の分泌タンパク質由来の分泌シグナル配列など、他の分泌シグナル配列を使用してもよい。
好ましくは、細胞壁固着ドメインは、Ｃ−末端に、スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡ由来の固着ドメインを有する。しかしながら、細胞の表面に安定して結合し続ける性質を有しかつ細胞表面上の目的とするタンパク質またはポリペプチドを表す（represent）ことができるものであれば、他のタンパク質を細胞壁固着ドメインとして使用してもよい。
好ましくは、融合タンパク質をコード化する核酸は発現させる制御配列に操作により連結（operably link）される。このような例としては、プロモーターはポリメラーゼの発現の結果選択的に融合タンパク質をコード化する核酸を転写させる制御配列が融合タンパク質をコード化する核酸の上流に形成されるポリメラーゼに特異的なプロモーターからなる、ラクトコッカス（Lactococcus）宿主に有効な誘導プロモーターの制御下のＴ７またはＴ７様ポリメラーゼ遺伝子からなる核酸でさらに形質転換されるラクトコッカス（Lactococcus）宿主生物体がある（ＧＢ−Ａ−２２７８３５８号を参照）。
Ｔ７ポリメラーゼシステムを用いて達成できる異種タンパク質の高レベルの発現により、細菌表面上のプロテインＡ−融合ポリペプチドの高レベルの発現が得られることが分かった。本発明で推定される多くの用途について、この関連プロセスの経済は、細菌に最高の可能性のある表面密度の融合分子を達成することにより実質的に賛同を示すであろう。しかしながら、用途によっては、特により低レベルの発現を必要とする場合には、構成（constitutive）、またはより活性の低い、プロモーターを使用することにより有用な結果が得られる。
開示されたベクターに関する多くの変異は、既知の技術及び本明細書中の開示を用いることにより当業者によって定常的に調製される。さらに、上記核酸配列によってコード化されるタンパク質またはポリペプチドを、例えば、一以上の塩基対またはアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換により核酸またはアミノ酸を操作することによって、実質的にその性質を変えることなくそのアミノ酸配列を変化させることによって修飾してもよい。本明細書中で開示されるこのようなポリペプチドの誘導体は本発明に含まれる。
上述したように、融合タンパク質をコード化する核酸を形質転換したグラム陽性宿主生物体は、ワクチンとして、細胞表面上で生物学的に活性を有する分子をディスプレイするのに、吸着剤としておよび例えば、触媒として使用するなどの、細胞表面上で酵素をディスプレイするのに、広範に適用される。
したがって、さらなる概念によると、本発明は、目的とするタンパク質またはポリペプチドが免疫反応を生じさせることを目的とする少なくとも一のエピトープを含むグラム陽性宿主生物体を提供するものである。好ましくは、上記タンパク質またはポリペプチドは、病原体の免疫原、抗原または付着因子である。
上記概念において、本発明はまた、適当な担体との混合物における上記宿主生物体からなるワクチンを提供するものである。本発明はまた、目的とするタンパク質またはポリペプチドが免疫反応を生じさせることを目的とするエピトープであるワクチンの調製における上記グラム陽性宿主生物体の使用を含むものである。好ましくは、上記ワクチンは、鼻腔内に若しくは非経口で、または経口若しくは経膣によるなどの他の粘膜経路を介して投与される。
さらなる概念によると、本発明は、目的とするタンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性を有する分子であるグラム陽性宿主生物体を提供するものである。一例としては、生物学的に活性を有する分子は、薬剤、ホルモン、酵素、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質、または他の一緒に発現（coexpress）及び分泌されるタンパク質に二次的な修飾（グリコシル化、ジスルフィド異性化）を行える物質である。または、目的とするタンパク質またはポリペプチドは、ターゲット基（targeted group）、例えば、抗体、またはその断片、またはレセプターに特異的な付着因子であってもよい。
上記概念において、本発明はまた、グラム陽性宿主生物体からなる薬剤組成物、および医療の方法へのこれらの使用をも含むものである。
さらなる概念によると、本発明は、目的とするタンパク質またはポリペプチドがリガンドの特異的な結合パートナーであるグラム陽性宿主生物体を提供するものである。上記概念において、本発明はまた、目的とするタンパク質またはポリペプチドがリガンドの特異的な結合パートナーであり、生物体の表面における特異的な結合パートナーのディスプレイにより結合パートナーをリガンドに結合させることができる、リガンドの精製または分離方法におけるグラム陽性宿主生物体の使用をも含むものである。
本発明はまた、例えば、細胞表面上に表されるストレプトアビジンが固相に固定化されるビオチンに結合できるように細胞壁固着ドメインに融合されるストレプトアビジンを発現させることによって、固相にグラム陽性宿主生物体を固定化する方法をも提供するものである。したがって、本発明は、本発明の上記概念のグラム陽性宿主生物体をリガンドを予め固定化した固体表面と接触させることからなる本発明のグラム陽性宿主生物体の固定化方法を提供するものである。本発明はまた、検出しようとするリガンド（例えば、ストレプトアビジンまたはプロテインＡ）に結合するタンパク質をも表面に発現する細胞中でルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質等のレポーター活性を一緒に発現（coexpress）することによって特異的リガンド（例えば、ビオチンまたは免疫グロブリン）との複合体の検出方法を提供するものである。
さらなる概念によると、本発明は、目的とするタンパク質またはポリペプチドが酵素であるグラム陽性宿主生物体を提供するものである。本発明の上記概念は、目的とするタンパク質またはポリペプチドが予め発現し宿主の細胞表面上でディスプレイした酵素であるグラム陽性宿主生物体からなる組成物、および酵素、例えば、周辺環境から脂肪やコレステロール等の不要な食物成分を破壊できる表面酵素によって、触媒される反応における上記組成物の使用をも含むものである。
さらなる概念によると、本発明は、グラム陽性宿主生物体に物質及び細胞壁固着ドメインの融合物をコード化する核酸を形質転換し、物質が細胞表面上でディスプレイするように融合物を発現させることからなる、抗体または抗原またはこれらの断片等の物質のライブラリーのスクリーニングを方法を提供するものである。スクリーニングされる特定の物質はさらに認識剤（recognition agent）、例えば、標識される抗体を用いて検出できる。
図面の簡単な記述
図１は、下記の遺伝子融物に関する構築を示すものである；
図２は、（ｉ）増殖培地，（ｉｉ）リオスタフィン（lyostaphin)処理細胞の上清、（ｉｉｉ）ラエムリ（Laemmli）ＳＤＳバッファ中で煮沸された無傷（intact）細胞［破砕放出（cracking released）］、および（ｉｖ）リオスタフィン処理細胞の細胞ペレットの残渣から回収されたタンパク質のウエスタンブロットを示すものである。示されたタンパク質（矢印の先を参照）は、標準的な方法に従ってウサギ抗ストレプトアビジン抗血清と第２抗体結合体による免疫ブロット法で検出した。これらの結果から、ラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）中で産生されたストレプトアビジン−プロテインＡ融合物が細胞表面に堅固に付着していることが示される；
図３は、ビオチン結合体がストレプトアビジン−プロテインＡ融合物を発現する無傷細胞表面に特異的に結合することができることを示し、これからタンパク質は細胞表面上に存在することが示される。この図面は、ストレプトアビジン−プロテインＡ融合物（ｐＬ２ＳＡＸ）またはストレプトアビジン（ｐＬ２ＳＡ）を発現する細胞を集めてビオチン化西洋ワサビのペルオキシダーゼ（Ｂ−ＰＯＤ）または予めストレプトアビジン（ＳＡ）で処理して結合部位を遮断したＢ−ＰＯＤ（Ｂ−ＰＯＤ／ＳＡ標識ウエルを参照のこと）と反応させたフィルターを示すものである。Ｂ−ＰＯＤと結合する細胞は、西洋ワサビのペルオキシダーゼに対して色素を形成する（chromageic）基質をのインキュベーションによって検出した。ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質をその表面に発現する無傷細胞だけがビオチン化酵素結合体Ｂ−ＰＯＤと結合した；
図４：ｐＬ２ＳＡＸのラベルがはられたパネルは、ビオチン化西洋ワサビのペルオキシダーゼ結合体で被覆されたポリスチレン表面に結合した、表面上にストレプトアビジン−プロテインＡ融合物を発現するラクトコッカス  ラクチス（Lactococcus lactis）細胞の写真を示す。本明細書に記載される全てのコントロールサンプルの代表であるネガティブコントロールには細胞は見つからない；
図５（Ａ）は、広範なグラム陽性宿主のベクターである、ｐＴＲＥＸ１、ｐＴＩＬ２ＴＴおよびＰＴＩＴＴの物理的及び遺伝子学的地図を示すものである。発現カセット、マクロライド剤、リンコサミド剤（lincosamides）およびストレプトグラミンＢ（ＭＬＳ）耐性決定基、ＴＴＦＣ遺伝子、ｕｓｐ４５の分泌シグナル配列（Ｌ２）、スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡアンカー（ＳＰＡ−Ｘ）およびレプリコン（ｐＡＭβ１’由来のＯｒｉ−）は太線で示される；
図５（Ｂ）は、遺伝子発現に関わりのある様々な配列エレメント、独特の制限酵素部位の位置、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）モチーフ及び翻訳開始出発コドン（ＡＴＧ）を示すｐＴＲＥＸ１における発現カセットの概略図を示すものである；
図５（Ｃ）は、ｐＴＲＥＸ１発現カセットのＤＮＡ配列と制限酵素部位地図を示すものである。キー発現エレメントもまた地図上に示される；
図６は、ＰＣＲに使用されるプライマーのリストを示すものである；
図７は、細胞内にＴＴＦＣを発現する（ｐＴＩＴＴ）、ＴＴＦＣを分泌する（ｐＴＩＬ２ＴＴ）またはＴＴＦＣ−プロテインＡ融合タンパク質を発現する（ｐＴＴＡ）無傷細胞をウサギのＴＴＦＣポリクローナル抗血清とインキュベートし、膜上に集めた後、抗体ペルオキシダーゼ結合体及び基質と反応させて細胞の表面上の抗ＴＴＦＣ抗体の結合を検出したフィルターを示すものである。ＴＴＦＣ−プロテインＡ融合物を発現する無傷細胞のみが細胞表面上でＴＴＦＣをディスプレイした。
詳細な説明
抗ポリペプチド抗体産生用の生または不活化細菌ワクチン及び手段
本発明は、ラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）などのグラム陽性細菌における抗原、付着因子および生物学的に活性を有する分子の表面発現用に使用してもよい。これらの細菌は、粘膜の免疫処置用ワクチンデリバリー賦形剤として提案されているものの中にある（Well et al、1993）。細菌の細胞表面に露出する抗原は、マクロファージ、樹状細胞およびＢリンパ球等の抗原認識及びプロセシング細胞上のレセプターに対する表面抗原のより大きな接触性のために免疫系によって（細菌の死亡や分解後に放出されるのみの抗原に比べて）より容易に認識される。したがって、抗原やエピトープの表面発現はグラム陽性細菌ワクチンにより発現される抗原の免疫原性を向上する。表面に抗原を発現する全細胞は、動物にポリクローナル及びモノクローナル抗体を生じさせるための有用な免疫原にもなるであろう（Charbit et al、1987）。
生物学的に活性を有する分子の細菌デリバリー
抗原および／または生物学的に活性を有する分子の発現に加えて、腸及びその他の粘膜組織（例えば気道、尿生殖路や鼻腔路（nasal tract））の細胞および／または組織に存在するレセプターに特異的な付着因子の表面発現により、組換細菌を特異細胞や組織、例えば、新形成を標的とすることが可能になる。このようなターゲティングは、上記細菌を抗原および／または生物学的に活性を有する分子を粘膜表面にデリバリーするのに使用できる際の効率を増加させる。使用される細菌が一般的に特定の粘膜表面に接着せず、または表面上で増殖しない場合には、ターゲティングにより細菌表面と粘膜表面との接触時間が増加するので、デリバリーおよび／または細菌によって合成される一分子若しくは複数の分子の吸収を容易にする。
多くの生物学的に活性を有する分子の表面発現は、数多くのホルモン、サイトカインまたは他の免疫修飾分子、細胞レセプターおよび／またはそのリガンド、酵素、細胞特異毒素のいずれかのデリバリーによって、病気の治療において広範な用途を有する。このような分子は、インベーシンまたは細菌が細胞に侵入できるおよび／またはエンドソームの細胞質中に放出されうる他のタンパク質と共に発現する；これにより、細菌の細胞への、および細胞内の区画に対するターゲティングは、本発明の手段によって容易となる。
さらに、十分な結合親和性を有する表面リガンドを用いることにより、細菌を広範な目的とする分子で被覆してもよい；例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質の表面発現を用いて生物体をＤＮＡまたはＲＮＡで被覆してもよい。このような方法は、遺伝子治療または核酸のワクチン注射に適用できることが見出された。
特異抗原、抗体およびリガンドの表面ディスプレイ
ファージディスプレイ技術の最近の発達により、特異抗原、抗体およびその他のリガンドを、後に有益な抗原、抗体またはレセプターを含む固定化支持体に接着するカウンターリガンドを発現する組換バクテリオファージを洗浄すること（panning）によって、複合したライブラリーから単離することが可能になった（Chiswell and McCafferty、1992）。その他の手段としては、タンパク質やペプチドの表面提示を目的としてグラム陽性細菌を使用することがある。細菌ディスプレイ技術についての利点としては、（ｉ）目的とするリガンドを発現する細菌は、プローブとして蛍光カウンターリガンドを用いて直接に検出される；さらに、これらの細菌は、単一の細菌を選別できるＦＡＣＳ機械を用いて非発現因子細胞を含まずに得られる。この方法は、有益なクローニングされたＤＮＡ配列を回収するファージを増殖させる必要性がない。（ｉｉ）より高密度の表面タンパク質発現がファージ系と比較して細菌において可能であり、さらに（ｉｉｉ）特定の組換ファージを（増殖できるように）大腸菌（E.coli）に感染することができないという問題が生じない。
全細胞吸着剤としての細菌の使用
生物学的産物の精製用にアフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、多段ステップを単一のステップへ、またはほぼ単一のステップに変えることができることが多い。これにより、さらに生物学的産物の回収と関連するより下流の操作工程の複雑さを減少でき、これはまた、投下資本を大きく節約でき；作業コストを低減でき、さらに生成物自体をより迅速に回収できることを意味する。実際、この手段の最も好ましい実施例の一つとしては、野生型スタフィロコッカス  アウレアス（Staphylococcus aureus）を用いて抗体に結合させ、抗体を精製することがある。
細菌表面で発見されたプロテインＡは、ある種の免疫グロブリンのＦｃドメインに対して高い親和性を有し、熱で殺され、化学的に安定化されたスタフィロコッカス  アウレアス（S.aureus）細胞は抗体の精製に定常的に使用された。
しかしながら、固定形態のリガンドを大量に供給することに対する要求は、アフィニティークロマトグラフィーを不経済とする。
細菌表面における１本鎖抗体、タンパク質レセプター、付着因子などのリガンドまたはカウンターリガンドの機能断片の発現により、これらの分子を細菌の成長によって低価格で複製複製することが可能になる；さらに、捕獲された細菌細胞は低価格の形態の吸着剤を提供するのに使用される。
ラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）などの無毒なグラム陽性細菌は、この細菌中で作製された全ての組換産物に最初に混入し、精製工程中で除去されなければならない、大腸菌（E.coli）中に存在するエンドトキシンを含まない。これにより、リガンドの表面ディスプレイにグラム陽性細菌を使用することにより、産物へのエンドトキシンの混入は生じないであろう。
バイオ触媒としての酵素で被覆された細菌
グラム陽性細菌や他の生物体で作られた多くの酵素は、これらの生物体によってそれらの環境中に分泌され、様々な生化学的な変換を媒介する。これらの化学的な転換は生存や成長に必須であり、または生物体をそれらの環境において他の生物体とより効果的に競合させることができる。
栄養目的で要求される酵素としては、例えば、炭水化物、脂質、核酸やタンパク質などの生物学的なポリマーをそれらの置換体に分解できる酵素が挙げられ、生物体を成長させるための栄養素が提供される。
また、分泌された酵素は、細菌や他の生物体をそれらの環境において好適な表面にそれ自体を付着できる、粘液やムチン（グリコタンパク質またはプロテオグリカン）の生合成などのある範囲の異なる機能を実施する。分泌された酵素は、他の生物体から生ずる抗生物質または毒素などの抗菌性物質を不活性化する；上記酵素は地質学的または工業上のプロセスによって環境に残る毒性または扱い難い物質を分解する。
これらの分泌酵素の多くは、工業上の利用性を有するが、固相を通過する液体反応物質が固定化酵素によって接触転換をうけられるように、理想的には固相中に存在することが必要である。
本発明の他の重要な概念としては、固定化形態の酵素を製造できる細菌の形態で、このような生体内変換に必要な活性成分を提供することにより、工業プロセスにおいて酵素を用いる可能性を向上することにある。
分泌タンパク質の製造用の固定化細胞の使用
本発明は、固定化支持体に付着するグラム陽性細菌による分泌タンパク質の製造方法を提供するものである。例えば、その表面上にストレプトアビジンをディスプレイし、有益な酵素または他のタンパク質を分泌する細胞を、ビオチン被覆固相に付着させる。この手段の利益の一つとしては、有益な分泌タンパク質を含む増殖培地の回収は細菌細胞を除去するための遠心分離を必要しないことである。
二元機能性アミノ末端ドメインを有するヘテロ二量体タンパク質の細菌表面での組立
本発明の上記態様において、ヘテロ二量体の一方のパートナー、例えば、シグナルペプチド、１本鎖抗体、重鎖のヒンジおよび／または定常ドメインおよびスタフィロコッカス  アウレアス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡの細胞壁固着ドメインからなる融合タンパク質を、細菌表面で発現させ、他方のパートナーを分泌させ、この際、他方のパートナーは、類似の融合ポリペプチド、例えば、異なる１本鎖抗体（異なる抗原を認識する）または酵素活性から構成されるが、細胞壁固着は欠失する。構成パートナーポリペプチドは、同様に操作された細胞においてまたはコカルチャーで成長させた異なる方法で操作された細胞において合成されてもよい。
この実施例において、細菌表面は、二機能性アミノ末端ドメインを有するヘテロ二量体分子に対してのみ組立部位として作用する。さらに、組立られたタンパク質は、特異的に放出され、例えば、リソスタフィンの作用によって、回収した細菌から精製される。その他の方法として好ましくは、放出は、特異的なプロテアーゼ、例えば、認識部位が細胞壁固着のすぐ上流の融合ポリペプチド中に導入された、ファクターＸａ、エンテロキナーゼ、コラゲナアーゼ，Ｉｇａｓｅ（ナイセリア  ゴノルヘア（Neisseria gonorrhoeae）由来）、トロンビン（thrombine）、ＴＥＶ（タバコエッチウィルス（Tobacco Etch Virus））のプロテアアーゼを有する全細菌への作用によって得られてもよい。目的とするタンパク質は、公知の分離技術によって精製してよい。
二機能性ヘテロ二量体の製造方法は既知であるが、現在、やむおえず一緒に製造されるホモ二量体（即ち、単一機能）分子からこれらを分離するのに利用できる一般的に応用できる方法はない。
さらに、この方法は、細菌表面のホモ−多量体タンパク質の組立に使用される。
実施例１
発現プラスミドの構築
ステージ１：スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡ固着ドメインのクローニング
スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）株Cowan I NCTC 8530のスタフィロコッカス  プロテインＡ（ＳＰＡ）アンカーをコード化するＤＮＡフラグメントが公表された配列（サイキら（Saiki et al）、１９８５年）に基づくプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた。ＰＣＲは、各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１μＭのセンス（及びアンチセンス）プライマー及び１μｇのマーマーら（Marmur et al）（１９６１年）の方法によりスタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）株Cowan I NCTC 8530から単離されたゲノムＤＮＡを含む製造業者によって供給された１００μｌのバッファにおける熱安定性ベントＤＮＡポリメラーゼ（Vent DNA polymerase）（ニューイングランド  バイオラブス（New England BioLabs））を用いて、実施された。センス及びアンチセンスプライマーは、後のクローニング段階を容易なものとするために、５’末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに関する制限酵素部位を含むように設計された。変性（９４℃で４５秒間）、プライマーのアニーリング（６８℃で３０秒間）およびＤＮＡのポリメリゼーション（７２℃で４５秒間）を２０サイクル行った後に、予想された大きさ（６２１ｂｐ）を有するＰＣＲ増幅化ＤＮＡ産物がアガロースゲル電気泳動によって検出された。次に、純化ＤＮＡフラグメントをクローニングし、標準的な方法（マニアティス（Maniatis））を用いて配列を決定した。スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡのＣ末端領域（ｎｔ  １０４３〜２２５２）をコード化するクローニングされたＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、既に報告された（シュットルウォースら（Shuttleworth et al））ものと同一であった。
ステージ２：ストレプトアビジン遺伝子のクローニングおよび操作
ストレプトアビジンは、本発明の可能性を示すためのレポータータンパク質として選択された。ストレプトアビジンは容易に検出され、抗血清が商業的に入手できるビオチンに結合することが知られている。ストレプトアビジン遺伝子フラグメントは、ストレプトアビジン遺伝子を予め成熟タンパク質のコード配列の出発及び終止に異なる制限酵素を包含するように変異をかけた一連のプラスミドから得られた。
成熟形態のストレプトアビジンをコード化する遺伝子フラグメントを、ＮａｅＩで消化したラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）発現プラスミドｐＬＥＴ２Ｎ（ステイドラーら（Steidler et al）、１９９５年）中に連結し、ｕｓｐ４５シグナル分泌シグナルリーダー（ｐＬＥＴ２Ｎ中に存在）とストレプトアビジンのコーディング配列とのフレーム融合物を生起させた（図１）。得られたプラスミド（ｐＬ２ＳＡと称呼する。）は、ラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）中にストレプトアビジンを発現および分泌するために用いられることができる（以下参照のこと）。次に、ｐＬ２ＳＡ中のストレプトアビジンの３’末端に融合するストレプトコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡのＣ末端固着ドメイン（以下、Ｘドメインと称する）を含有するプラスミドｐＬ２ＳＡＸを、プロテインＡ固着領域をコード化するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築した（ステージ１および図１を参照のこと）。ｐＬ２ＳＡＸを有するラクトコッカスの発現株は、細胞壁へ堅固に付着するストレプトアビジン−プロテインＡ  Ｃ末端ドメイン融合タンパク質を発現する（下記参照のこと）。
ラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）におけるストレプトアビジンおよびストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質の発現
プラスミドｐＬ２ＳＡおよびｐＬ２ＳＡＸを、大腸菌（E.coli）株ＭＣ１０２２から単離し、これを用いてエレクトロポレーションによってｐＩＬＰｏｌを有するラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）Ｔ７発現宿主株ＭＧ１８２０（ＵＣＰ１０００株；ウェルズら（Wells et al）、１９９３年）に形質転換した。ストレプトアビジンおよびストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質の発現を、増殖培地中のグルコースをラクトースに置換することによってラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）中で誘発した（ステイドラーら（Steidler et al）、１９９５）。ラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）におけるストレプトアビジンタンパク質産物の発現を検出するために、細胞分画およびイムノブロッティングを３時間誘発した細胞を用いて行った。１０ｍｌの細胞をまず遠心分離によりペレット化し、上清を２回、１００，０００×ｇで１時間遠心分離して、不溶性材料を除去した。次に、タンパク質画分を、既に述べられた（ステイドラー、１９９５年）フェノール抽出によって高速上清から回収された。第１段階で得られた細胞ペレットを、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）中で３回洗浄され、リソスタフィン（lysostaphin）（シグマ社、米国セントルイス州）０．６ｍｇを含有する１０％ショ糖加２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）２５０μｌ中に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートして、細胞壁を酵素により消化した。
リソスタフィン処理後、細胞（以下、残渣と称する）を、遠心分離によって酵素により放出された細胞壁材料から分離し、ラエムリ（Laemmli）クラッキングバッファ中で煮沸することによって溶解（lyse）した。「リソスタフィン放出タンパク質分画（lysostaphin released protein fractions）」と称される上清を、同様にクラッキングバッファで処理した。増殖培地から回収したタンパク質、リソスタフィン放出分画および細胞残渣を、標準的な方法を用いてストレプトアビジンに対する抗血清でイムノブロッティングすることによって分析した。リソスタフィンは、細胞壁のペプチドグリカンに存在するペンタグリシンペプチドに結合するタンパク質を特異的に放出することが示された（シュニーウインドら（Schneewind et al）、１９９３年）。
細胞分画およびｐＬ２ＳＡを有するラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）発現株ＵＣＰ１０００から回収されたタンパク質のイムノブロッテイングの結果から、ストレプトアビジンに関して予想された大きさのタンパク質がラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）によって増殖培地中に産生及び分泌されたことが示された。ストレプトアビジンは、リソスタフィンで処理された細胞の全細胞タンパク質残渣中には検出されず、微量のタンパク質のみがリソスタフィン放出細胞壁材料中に検出された（図２参照のこと）。この株において、リソスタフィンで細胞を処理することによって放出された分泌ストレプトアビジンの全量のうちの比較的小さな割合部分は、細胞膜を介して輸送された後に細胞壁を通って拡散しなかったストレプトアビジンの結果であろう。
これらの知見に相対して、ｐＬ２ＳＡＸを有する株により産生されたストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質は、増殖培地中に分泌されなかった。しかしながら、この融合タンパク質は、リソスタフィンでの処理によって細胞壁から放出された材料中に実質的な量で存在しており、これからこれは細胞壁と結合（associate）したことが示された（図２）。この融合タンパク質はまた、リソスタフィン処理細胞のペレット（残渣）中に検出されたことから、放出タンパク質の一部はリソスタフィンとのインキュベーション中に細胞壁の外部へは拡散しなかったことが示唆された。ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質を発現する洗浄細胞をラエミリクラッキングバッファ中で煮沸すると、イムノブロッティングによって検出されたタンパク質は、リソスタフィンで処理された細胞の分画の上清中に検出されたタンパク質よりも大きな見かけ分子量を有していた（図２）。このより高い分子量のポリペプチドは、細胞壁に対して融合タンパク質を選別し固着する経路における中間体を表すものであろう。双方の形態のタンパク質が、リソスタフィン処理細胞の煮沸細胞ペレット（残渣）分画に見出されたことから、リソスタフィンによる細胞のより温和な酵素処理はより高い分子量形態の融合タンパク質を上清中にと放出しないことを示していた。
ラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）の表面上におけるストレプトアビジンのディスプレイ
ストレプトコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡのＣ末端ドメインへのストレプトアビジンの融合により細胞表面上に発現タンパク質がディスプレイすることを示すために、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン−プロテインＡ融合産物を発現するラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）株を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＢＳ中で３回洗浄し、ビオチン化西洋ワサビのペルオキシダーゼ（１μｇ）と室温にて１時間インキュベートした。また、細胞のコントロールサンプルを可溶性ストレプトアビジンの存在下でビオチン化西洋ワサビのペルオキシダーゼとインキュベートしたところ、細胞に対する結合が遊離基質との競合によって遮断されたことが示された。次いで、細胞を１％ＢＳＡを含有するＴＢＳで３回洗浄し、真空装置を用いてニトロセルロースフィルター上に回収した。細胞表面へのビオチンの結合を、製造業者の推奨に従い、ＴＭＢ（西洋ワサビのペルオキシダーゼ基質）の溶液中でフィルターをインキュベートすることによって検出した。図３における結果から、ビオチン−西洋ワサビのペルオキシダーゼ結合体は、ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質を発現する無傷細胞の表面には結合したが、ストレプトアビジンを発現する細胞には結合しないことが示された。ビオチン−西洋ワサビのペルオキシダーゼ結合体が、ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質を発現するラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）の細胞表面に非特異的に結合する可能性は、可溶性ストレプトアビジンの存在下において結合が阻害されたため、無視できる。
細胞表面上にストレプトアビジンを発現するラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）細胞の特異的固定化
細胞表面上にストレプトアビジンを発現する細菌細胞を特異的に結合させる固相表面を提供するために、ペトリ皿（２０ｍｍ、マキシソープ（Maxisorp）、ヌンク（Nunc）、デンマーク国）を、室温にてＴＢＳ１ｍｌ中で１時間、ビオチン化アルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）、ドイツ国）１μｇ／ｍｌで被覆した。次に、非特異的な結合部位を、プレートを１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ２ｍｌと室温にて２時間インキュベートすることによって遮断した。ストレプトアビジンあるいはストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質のいずれかを発現する細胞１０ｍｌを、ＴＢＳ中で３回洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ１ｍｌ中に室温にて１時間かけて再懸濁した。このインキュベーション段階中、細胞は毎分６秒間振盪することによって懸濁状態で保持された。最後に、細胞懸濁液を、ＴＢＳを用いて１０ｍｌに希釈し、この懸濁液１ｍｌを、室温にて１時間、予め処理されたペトリ皿（上記参照のこと）に添加した。次いで、ペトリ皿を、オービタルシェーカーで１０分間、ＴＢＳ  １ｍｌで３回洗浄した後、光学顕微鏡で検査した。結果（図４および表１）から、ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質を発現するラクトコッカス  ラクティス（L.lactis）は、ビオチン−アルカリホスファターゼで被覆したペトリ皿の表面には結合するが、この結合体で処理されないペトリ皿には結合しないことが示される。ストレプトアビジンを発現、分泌する細胞は、被覆または非被覆ペトリ皿のいずれにも結合しなかった。ストレプトアビジン−プロテインＡ融合産物を発現する細胞の結合は可溶性ストレプトアビジンの添加によって遮断されたことから、結合は特異的で、かつ細胞の表面上に存在するストレプトアビジンへのビオチンの結合に仲介されることが示された。
0004180111.tif 000002
実施例２
ラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）の表面における破傷風毒素フラグメントＣ（TTFC）のディスプレイ
この追加的な実験は、タンパク質抗原を、（１）Ｎ末端の分泌シグナル、（２）表面発現させようとするタンパク質抗原および（３）スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡの細胞壁選別及び固着ドメイン（cell wall sorting and anchoring domain）をコード化した核酸を含む融合タンパク質をコード化するキメラ遺伝子を構築することによって、ラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）の表面に堅固に付着できることを証明するものである。
ステージ１：ＴＴＦＣおよびスタフィロコッカス  アウレウス  プロテインＡ固着ドメインのクローニングと遺伝子操作
（１ａ）ｐＴＲＥＸ及びｐＴＲＥＸ１の構築
推定ＲＮＡ安化定配列、翻訳開始領域およびターゲット遺伝子に関する複数のクローニング部位をコード化する合成オリゴヌクレオチドを、塩化ナトリウム１５０ｍＭを含む２００μｌの１×ＴＢＥにおける各オリゴヌクレオチド２０μｇを沸騰し、室温まで冷却することによって、アニールした。アニールされたオリゴヌクレオチドを、３５℃、４５℃、５５℃及び６５℃で各１分間、さらに、７２℃１０分間、２５０μＭ  デオキシヌクレオシド３リン酸及び１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有する１×Ｔｆｌバッファ中でＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸張した。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、クローニングをさらに容易にするために、５’末端にそれぞれＮｈｅＩとＢａｍＨＩの認識部位を含ませた。得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントをＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングされたｐＬＥＴ１（Well et al.,1993c）由来のＴ７発現カセットを含むｐＵＣ１９の誘導体である、ｐＵＣ１９ＮＴ７のＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングした。このようにして得られた構築物をｐＵＣＬＥＸと称した。次に、ｐＵＣＬＥＸ中の完全発現カセットをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ブラントエンドにすることにより除去した後、ＥｃｏＲＩで切断し、さらにｐＩＬ２５３のＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ（ブラントエンド）部位にクローニングすることによって、ベクターｐＴＲＥＸを得た。発現ベクターｐＴＲＥＸ１を構築するために、ラクトコッカスのプロモーターＰ１を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＴＲＥＸの発現カセット中に存在するＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位間にクローニングした（図５）。このプロモーターは、既に、プロモータープローブベクターｐＳＢ２９２を用いて単離されており、プライマー伸張及びＤＮＡの配列決定分析（Waterfield et al.,1995）によって特性が明らかにされた。
（１ｂ）プラスミドｐＴ１Ｌ２ＴＴの構築
ｕｓｐ４５遺伝子のラクトコッカスのシグナル分泌リーダー配列に融合された破傷風毒フラグメントＣ遺伝子をコード化するＤＮＡフラグメントを、鋳型としてのプラスミドｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣ及び公知の配列（Wells et al.,1993b）を使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得た。ＰＣＲは、各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１μＭのセンス及びアンチセンスプライマー（図１０）及び約５０ｎｇの鋳型としてのプラスミドｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣを含む製造業者によって供給された１００μｌの反応バッファにおける熱安定性ベントＤＮＡポリメラーゼ（vent DNA polymerase）（ニューイングランド  バイオラブス（New England BioLabs））を用いて、実施された。アンチセンスプライマーは、後のクローニング段階を容易なものとするために、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含むように設計された。変性（９４℃で４５秒間）、プライマーのアニーリング（５０℃で３０秒間）およびＤＮＡのポリメリゼーション（７２℃で１２０秒間）を３０サイクル行った後に、予想された大きさ（１４７８ｂｐの２本鎖のＤＮＡ）を有するＰＣＲ増幅化ＤＮＡ産物がアガロースゲル電気泳動によって検出された。次に、精製されたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、予めまずＳｐｈＩで切断し、ブラントエンドにした後ＢａｍＨＩで切断されたラクトコッカスの発現プラスミドｐＴＲＥＸ１中にクローニングした。このようにして得られたプラスミド（ｐＴ１Ｌ２ＴＴと称する）を図５に示す。
（１ｃ）ｐＴ１ＴＴの構築
各５’及び３’末端にそれぞれＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位をコード化した破傷風毒素フラグメントＣ遺伝子（ＴＴＦＣ）のフラグメントを、ＰＣＲ（標準的な条件を用いた；上記参照）によって得た。停止コドンは、ＢａｍＨＩ部位の前のＴＴＦＣ配列の３’末端に導入された。ＴＴＦＣのＰＣＲフラグメントを、まずｐＵＣＬＥＸのＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位間にクローニングした後、ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩで切断することによって除去し、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化されたｐＴＲＥＸ１に再度クローニングした。このようにして得られたプラスミド（ｐＴ１ＴＴと称する）を図５に示す。
（１ｄ）ｐＴＴＡの構築
スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）株Cowan I NCTC 8530のスタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡ（ＳＰＡ）アンカーをコード化するＤＮＡフラグメントを、公知の配列（図１０）に基づくプライマーを用いてＰＣＲによって得た。センスおよびアンチセンスプライマーは、後のクローニング段階を容易なものとするために、５’末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩに関する制限酵素部位を含むように設計された。ＰＣＲは、各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１μＭのセンス及びアンチセンスプライマー（図６）及び約５０ｎｇの鋳型ＤＮＡとしてのプラスミドｐＬ２ＳＡＸ（本特許出願においてさらに説明される）を含む製造業者によって供給された１００μｌの反応バッファにおける熱安定性ベントＤＮＡポリメラーゼ（vent DNA polymerase）（ニューイングランド  バイオラブス（New England BioLabs））を用いて、実施された。変性（９４℃で４５秒間）、プライマーのアニーリング（５５℃で３０秒間）およびＤＮＡのポリメリゼーション（７２℃で３５秒間）を３０サイクル行った後に、予想された大きさを有するＰＣＲ増幅化ＤＮＡ産物がアガロースゲル電気泳動によって検出された。次に、精製されたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、予めまずＢａｍＨＩで切断し、製造業者の推奨した方法に従い、ウシの腸のホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））を用いて脱リン酸化されたプラスミドｐＴ１Ｌ２ＴＴ中にクローニングした。このようにして得られたプラスミド（ｐＴＴＡと称する）は、ＴＴＦＣ遺伝子の３’末端に融合されたスタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡのＣ末端ドメイン（以下、Ｘドメインと称する）を含む（図５）。
ステージ２：ラクトコッカス  ラクチスにおけるＴＴＦＣ−プロテインＡ融合タンパクの発現および表面ディスプレイ
スタフィロコッカス  アウレウス（S.aureus）プロテインＡのＣ末端ドメインとのＴＴＦＣの融合により細胞表面上に発現タンパク質がディスプレイすることを示すために、細胞内にＴＴＦＣを発現する（即ち、プラスミドｐＴＩＴＴを有する）、ＴＴＦＣを分泌する（即ち、プラスミドｐＴＩＬ２ＴＴを有する）またはＴＴＦＣ−プロテインＡ融合タンパク質を発現する（即ち、プラスミドｐＴＴＡを有する）ラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）の株を遠心によって集め、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ（２０ｍＭ  トリス−塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、室温で３０分間、１μｇのウサギ抗ＴＴＦＣと共にインキュベートした。次に、細胞を１ｍｌのＴＢＳで３回洗浄し、１ｍｌのＴＢＳ中に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌ中における細胞を、真空装置によってニトロセルロース膜（０．２２μｍ）上に収集した。次いで、この膜を、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（Boehringer Manheim）に結合させた抗ウサギＩｇＧを５μｇ含む５ｍｌのＰＢＳ−２．５％スキムミルク粉末中で、室温で１時間、インキュベートした。ｐＴＴＡは有するがｐＴ１Ｌ２ＴＴ及びｐＴ１ＴＴを有さないラクトコッカス  ラクチス（L.lactis）の無傷細胞表面上に結合するウサギ抗ＴＴＦＣ抗体への抗ウサギペルオキシダーゼの結合を、製造業者の推奨に従って、ＴＭＢ（西洋ワサビのペルオキシダーゼ基質）の溶液中で上記フィルターをインキュベートすることによって検出した。図７に示される結果から、ＴＴＦＣは、ＴＴＦＣ−プロテインＡ融合タンパク質を発現する無傷細胞の表面上でのみ検出されることが示される。
引用文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ（Ｉ）】
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【図５Ｃ（ＩＩ）】
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【図６】
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【図７】
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