(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白参を水で抽出し乾燥した白参粉末を水に懸濁した後、前記白参粉末と同重量の乳酸菌を加えて３７℃、７２時間培養し、生物転換人参液を得る生物転換工程と、
前記生物転換人参液の濃縮、凍結、もしくは乾燥し、または遠心分離後に上清を回収し、生物転換人参濃縮物を得る濃縮工程とを備え、
前記乳酸菌として、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１（ＫＣＣＭ−１０３６４）とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２（ＫＣＣＭ−１０３６５）との乳酸菌株を同重量ずつ併せて使用することを特徴とする生物転換人参組成物の製造方法。
【請求項２】
白参をメタノール冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得た白参サポニン分画を水に懸濁した後、前記白参サポニン分画の２倍重量の乳酸菌を加えて３７℃、４８時間培養し、生物転換人参液を得る生物転換工程と、
前記生物転換人参液の濃縮、凍結、もしくは乾燥し、または遠心分離後に上清を回収し、生物転換人参濃縮物を得る濃縮工程とを備え、
前記乳酸菌として、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１（ＫＣＣＭ−１０３６４）とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２（ＫＣＣＭ−１０３６５）との乳酸菌株を同重量ずつ併せて使用することを特徴とする生物転換人参組成物の製造方法。
【請求項３】
前記濃縮工程以後に、前記生物転換人参濃縮物に予め設定された溶媒を添加し、生物転換人参抽出液を得る抽出工程をさらに備えることを特徴とする、請求項１又は２に記載の生物転換人参組成物の製造方法。
【請求項４】
前記抽出工程以後に、甘味料に精製水を加えて混合した飲料原液と前記生物転換人参抽出液とを混合し、生物転換人参混合液を得る撹拌工程と、
前記生物転換人参混合液に、精製水を加えて生物転換人参飲料液を得る希釈工程と、をさらに備えることを特徴とする、請求項３に記載の生物転換人参組成物の製造方法。
【請求項５】
前記撹拌工程の飲料原液が、さらに、クエン酸、クエン酸ナトリウム、生薬抽出物、およびタウリンからなる群より選ばれた一以上の物質を有することを特徴とする、請求項４に記載の生物転換人参組成物の製造方法。
【請求項６】
前記抽出工程以後に、生物転換人参抽出液を凍結乾燥して、生物転換人参粉末を得る乾燥工程を、さらに備えることを特徴とする、請求項３に記載の生物転換人参組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は人参組成物の製造方法に関し、特に、乳酸菌や腸内細菌による人参成分の転換処理工程を通じて、抗がん効果を増強させた生物転換人参組成物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本願出願は大韓民国特許出願番号第２００２‐５３６９（出願日：２００２．０１．３０）“生物転換人参組成物の製造方法”を基にした優先権主張出願である。
【０００３】
植物分類学上五加皮科人参属に属する多年生宿根草である人参は、地球上に約１１種が知られており、代表的な種としては下記の４種がある。
１）高麗人参（学名：Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）
‐アジア極東地域（北緯３３〜４８:韓国、中国東北部、ロシアの一部）にて自生または栽培。人参種のなかでも薬効が極めて優れている。
２）米国参（学名：Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ Ｌ．）
‐米国、カナダにて自生または栽培。
３）田七参（学名：Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ （Ｂｕｒｋ） Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ）
‐中国雲南省東南部から広西省西南部地域にて自生または栽培。
４）竹節参（学名:Ｐａｎａｘ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ Ｃ．Ａ． Ｍｅｙｅｒ）
‐日本、中国西南部、ネパールに至るまで分布する。
【０００４】
前記人参は、主に韓国、中国、日本等のアジア国家にて、生薬として精神医学的、神経系の疾病および糖尿病等の多様な疾病に対し使用されている。さらに、前記人参の主要成分であるサポニンは、強壮、強精、鎮静、造血、および抗高血圧等の効果をもつことが証明されている。
【０００５】
また、近年、前記サポニンの微生物による代謝産物であるＩＨ‐９０１、ＩＨ‐９０２、ＩＨ‐９０３またはＩＨ‐９０４等が、免疫増強作用に加えて、極めて強力な腫瘍血管新生作用またはがん細胞の転移抑制作用を有することが証明され、これらを利用した抗がん人参組成物の開発が期待されている。
【０００６】
前記ＩＨ‐９０１、ＩＨ‐９０２、ＩＨ‐９０３およびＩＨ‐９０４は、プロトパナキサジオール系のジンセノサイド‐Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ 等の微生物による最終代謝の産物であり、ＩＶ型コラーゲナーゼの分泌阻害作用、抗アンジオジェニック（がん、糖尿病、リウマチ）活性および血小板凝集の抑制作用を通じて強力ながん細胞転移抑制効果(ａｎｔｉ‐ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｅｓ)を有する。
【０００７】
特に、前記ＩＨ‐９０１は、毒性および副作用が少なく、白血病細胞（ＨＬ‐６０細胞）の正常分化を阻害することで、細胞の異常増殖を極めて強力に抑制することや、ＩＨ‐９０１のアポトーシス誘導効果は現在抗がん治療剤として広く使用されるシスプラチンの効果に匹敵する程強力であることが、薬理実験および安定性実験等を通じて明らかにされている。
【０００８】
一方、大韓民国特許出願番号第１９８０‐４２９１号“乳酸菌人参飲料の製造方法”には‘人参の固有香りの成分を分離した人参残粕を酵素分解して有機体窒素濃度が ０．２〜０．８％、ブドウ糖の生成含有量が乳酸菌発酵に適合した３％以上になった時、有機酸で ｐＨ３．８〜４．８に調節した後、不溶性高分子蛋白質と繊維質を取り除き、溶出液に乳酸菌を培養させた後、これに人参固有の香り成分を添加する方法’が開示されている。
【０００９】
大韓民国特許出願番号第１９８８‐１２５０２号“人参を利用した活性乳酸菌飲料水の製造方法”には‘人参の生汁やエキスに、または人参を蒸煮するか蒸煮された異化物に、酵素を作用させたものを培地として乳酸菌を培養した後、脱脂牛乳、脱脂粉乳、炭酸水、ビタミン類を添加混合して栄養価の高い人参乳酸菌の炭酸飲料水と氷菓類を製造する方法’が開示されている。
【００１０】
大韓民国特許出願番号第１９９６‐２３７５０号“人参または生人参を含有する発酵乳組成物およびその製造方法”には‘磨砕して ０．１〜０．６ｃｍの微粒状に形成した人参または生人参を、０．００１〜２．３９質量％添加する工程、およびさらに水、ビタミン、糖類、有機酸類、果実類、穀類、野菜類からなる群から選択された１以上の成分を添加する工程を含む、人参または生人参を含有する発酵乳組成物の製造方法’が開示されている。
【００１１】
これらの方法に従うと、既存の発酵乳または乳酸菌飲料等に、人参の香りの成分もしくは人参成分が含有された組成物が得られるが、前記人参含有組成物等は単に人参成分を添加した飲料用組成物であり、人参サポニンの生物代謝産物であるＩＨ‐９０１のような有効成分を高濃度に含有した人参組成物を得ることができない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このような問題を解決するための本発明の目的は、ＩＨ‐９０１等の人参由来の抗がん成分が大幅に強化された生物転換人参組成物の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、人参原材料に含有された有効成分が効能を極大化し得る生物転換人参組成物の製造方法を提供することにある。
【００１４】
また、本発明のさらに他の目的は、抗アレルギー作用、老化防止および大腸癌／肝臓損傷予防などの、人体に有益な効能を有した生物転換人参組成物の製造方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明によって得られる生物転換人参組成物は、生物転換人参組成物であって、(２０‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐２０（Ｓ）‐プロトパナキサジオール ＋ ジンセノサイドＦ２) ／ (ジンセノサイドＲｃ ＋ ジンセノサイドＲｄ ＋ ジンセノサイドＲｂ１ ＋ ジンセノサイドＲｂ２)の比率が０．１以上である生物転換人参組成物である。
【００１７】
乳酸菌または腸内細菌の一部は、飲食物や薬物中の化合物を生物転換し、元化合物に比べて生理活性が高い生物転換体を産生する。
【００１８】
図２に示した通り、本発明において用いられる原材料である人参に含有される化合物である、ジンセノサイド‐Ｒｂ１、ジンセノサイド‐Ｒｂ２、ジンセノサイド‐Ｒｃなどは、乳酸菌(Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ)や腸内細菌(ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ)により代謝され、１次中間代謝物であるジンセノサイド‐Ｒｄ、コンパウンド‐Ｏ、ジンセノサイド‐Ｍｃ１、２次中間代謝物である、ジンセノサイド‐Ｆ２、ＩＨ‐９０２（コンパウンド‐Ｙ）、ＩＨ‐９０３（コンパウンド‐Ｍｃ）を経て、最終代謝物であるＩＨ‐９０１（コンパウンド‐Ｋ）を産生する。
【００１９】
上記構成によると、前記比率が０．１以上であるため、生物転換人参組成物の服用量と、２０‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐２０（Ｓ）‐プロトパナキサジオール（ＩＨ‐９０１）およびその前駆体であるジンセノサイドＦ２の含有量とがバランスして十分な効果を発揮する生物転換人参組成物が提供できる。また、この比率は高ければ高いほど好ましいことは勿論であるが、前記ＩＨ−９０１やその前駆体は、乳酸菌や腸内細菌などの菌体に由来した生物転換物であるため、この比率は実質的に０．１以上１０．０以下の範囲をとり、０．５以上１０．０以下であると、より一層確実に効果と服用量とがバランスした生物転換人参組成物が提供される。
【００２０】
また、本発明によって得られる生物転換人参組成物は、さらに、前記生物転換人参組成物が、ヒスタミンの遊離を抑制する抗アレルギー物質である構成とすることができる。
【００２１】
また、本発明によって得られる生物転換人参組成物は、さらに、前記生物転換人参組成物が、ラジカル消去による抗酸化作用を有する老化防止剤である構成とすることができる。
【００２２】
また、本発明によって得られる生物転換人参組成物は、さらに、前記生物転換人参組成物が、抗がん剤である構成とすることができる。
【００２３】
また、本発明によって得られる生物転換人参組成物は、さらに、前記生物転換人参組成物が、β‐グルクロニダーゼの生成を阻害する、大腸癌または肝臓損傷の予防物質である構成とすることができる。
【００２４】
上記構成によると、生物転換人参成分が大幅に強化された、抗アレルギー剤、抗酸化剤、抗がん剤が提供される。
【００２５】
また、本発明によって得られる生物転換人参組成物は、さらに、前記生物転換人参組成物が、生物転換人参成分含有飲料である構成とすることができる。
【００２６】
この構成によると、抗アレルギー作用、抗酸化作用、抗がん作用をもつ生物転換人参成分を備えた飲料が提供される。
【００２７】
上記生物転換人参組成物を得るための、本発明に係る生物転換人参組成物の製造方法は、白参を水で抽出し乾燥した白参粉末を水に懸濁した後、前記白参粉末と同重量の乳酸菌を加えて３７℃、７２時間培養し、生物転換人参液を得る生物転換工程と；前記生物転換人参液の濃縮、凍結、もしくは乾燥し、または遠心分離後に上清を回収し、生物転換人参濃縮物を得る濃縮工程とを備え；前記乳酸菌として、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１（ＫＣＣＭ−１０３６４）とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２（ＫＣＣＭ−１０３６５）との乳酸菌株を同重量ずつ併せて使用することを特徴とする。また、白参をメタノール冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得た白参サポニン分画を水に懸濁した後、前記白参サポニン分画の２倍重量の乳酸菌を加えて３７℃、４８時間培養し、生物転換人参液を得る生物転換工程と；前記生物転換人参液の濃縮、凍結、もしくは乾燥し、または遠心分離後に上清を回収し、生物転換人参濃縮物を得る濃縮工程とを備え；前記乳酸菌として、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１（ＫＣＣＭ−１０３６４）とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２（ＫＣＣＭ−１０３６５）との乳酸菌株を同重量ずつ併せて使用することを特徴とする。
【００３４】
また、本発明の生物転換人参組成物の製造方法は、さらに、前記濃縮工程以後に、生物転換人参濃縮物に予め設定された溶媒を添加し、生物転換人参抽出液を得る抽出工程を備えた構成とすることができる。
【００３５】
また、本発明の生物転換人参組成物の製造方法は、さらに、前記抽出工程以後に、甘味料に精製水を加えて混合した飲料原液に前記生物転換人参抽出液を加えて撹拌し、生物転換人参混合液を得る撹拌工程と、前記生物転換人参混合液に精製水を加えて生物転換人参飲料液を得る希釈工程とを備えた構成とすることができる。
【００３６】
また、本発明の生物転換人参組成物の製造方法は、さらに、前記撹拌工程の飲料原液に、クエン酸、クエン酸ナトリウム、生薬抽出物、およびタウリンからなる群より選ばれた一以上の物質を添加させることができる。
【００３７】
また、本発明の生物転換人参組成物の製造方法は、さらに、前記抽出工程以後に、生物転換人参抽出液を凍結乾燥して、生物転換人参粉末を得る乾燥工程を備えた構成とすることができる。
【００３８】
上記構成によれば、人参原材料に含有されたサポニン成分を生物転換させ、生理活性の高い代謝物を生成させることにより、抗アレルギー作用、抗酸化作用、抗がん作用をもつ生物転換人参成分が大幅に強化された生物転換人参組成物を製造でき、さらに、サポニン等の有効成分含量が低く人参加工物の原料として使用するに不適合であった人参葉等も原材料として活用できるため製造コストを低減できる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００４０】
図１は本発明の生物転換人参組成物の一例である生物転換人参飲料液の製造方法を示した流れ図である。図１に示すように、本発明の生物転換人参組成物の製造方法は生物転換工程(Ｓ１０)および濃縮工程(Ｓ２０)を含み、抽出工程(Ｓ３０)、乾燥工程(Ｓ４０)、撹拌工程(Ｓ５０)、希釈工程(Ｓ６０)をさらに備えることができる。
【００４１】
上記生物転換人参組成物を、以下のようにして作製した。
【００４２】
〔生物転換工程〕
人参原材料を水に懸濁した後、乳酸菌あるいは腸内細菌を加え一定時間以上、好ましくは２４時間から７２時間、さらに好ましくは４８時間から７２時間の間に培養して生物転換人参液を得た。
【００４３】
ここで、人参原材料としては、生人参、紅参、白参、尾参および人参葉からなる群より選ばれた一以上の天然人参、前記天然人参の人参抽出液、または前記天然人参の人参粉末などを用いることができる。
【００４４】
また、前記乳酸菌としては、人参サポニン成分を代謝し、生物転換体であるＩＨ‐９０１を生成できる限り特に限定されず、ビフィドバクテリウム・Ｋ‐１０３、ビフィドバクテリウム・Ｋ‐５０６、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１およびビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２からなる群から選ばれた一つ以上の乳酸菌を好適に使用できる。
【００４５】
このうち、前記ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１は寄託番号 ＫＣＣＭ‐１０３６４（寄託日：２００２．０３．２２）で、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２は寄託番号 ＫＣＣＭ‐１０３６５（寄託日：２００２．０３．２２）で、それぞれ韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託されている。
【００４６】
また、前記腸内細菌としても、生物転換体であるＩＨ‐９０１を生成できる限り特に限定されず、好ましくはプレボテラ・オリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｒｉｓ）およびフソバクテリウム・Ｋ‐６０からなる群から選ばれた一以上の腸内細菌が使用できる。
【００４７】
〔濃縮工程〕前記生物転換人参液をそのまま濃縮、凍結、乾燥、または遠心後に上清を回収し、生物転換人参濃縮物を得た。
【００４８】
〔抽出工程〕前記生物転換人参濃縮物に予め設定された溶媒を添加して生物転換人参抽出液を得た。
【００４９】
前記溶媒としては、生物転換人参濃縮物に含まれた有効成分を溶解させ抽出できる溶媒が好ましく、具体的には、水、メタノールやエタノールのような低級アルコール、超臨界流体、またはこれらの混合液を用いることができる。
【００５０】
〔乾燥工程〕
前記生物転換人参抽出液を凍結乾燥して生物転換人参粉末を得た。
【００５１】
〔撹拌工程〕
甘味料に精製水を加えて混合した飲料原液に、前記生物転換人参抽出液または生物転換人参粉末を加えて撹拌し、生物転換人参混合液を得た。
【００５２】
ここで、前記飲料原液には、クエン酸、クエン酸ナトリウム、生薬抽出物、タウリンのうちいずれか一つ以上を添加することができる。前記生薬抽出物としては、五味子（ゴミシ）、棗（ナツメ）、桂皮（ケイヒ）、枸杞（クコ）、黄精（オウセイ）、皇耆（きばなおぎ）等を用いることができる。
【００５３】
〔希釈工程〕
前記生物転換人参混合液に予め設定された容量の精製水を加えて生物転換人参飲料液を得た。
【００５４】
上記工程により製造された本発明の生物転換人参組成物は(２０‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐２０(Ｓ)‐プロトパナキサジオール ＋ ジンセノサイド Ｆ２) ／ (ジンセノサイド Ｒｃ ＋ ジンセノサイド Ｒｄ ＋ ジンセノサイド Ｒｂ１ ＋ ジンセノサイド Ｒｂ２)の比率が０．１以上の範囲を維持する。
【００５５】
以下に、実施例および比較例に基づいて、さらに詳細に本発明の内容を説明する。なお、本発明が下記の実施例に限定されるものではないことは勿論である。
【００５６】
（実施例１）
尾参を水で抽出し乾燥して得た人参粉末１００ｍｇを水で懸濁した後、乳酸菌ビフィドバクテリウム・Ｋ‐１０３とビフィドバクテリウム・Ｋ‐５０６菌株を加えて７２時間培養し、これを遠心分離して上清を回収した後、濃縮して、生物転換人参濃縮液を得た。
【００５７】
（実施例２）
生人参を細切して滅菌したのを水で懸濁した後、乳酸菌ビフィドバクテリウム・Ｋ‐１０３とビフィドバクテリウム・Ｋ‐５０６菌株を加えて４８時間培養し、これを遠心分離して上清を回収した後、濃縮して、これを凍結乾燥して生物転換人参粉末を得た。
【００５８】
（実施例３）
尾参または白参を水で抽出し乾燥した後、得られた人参粉末１００ｍｇを水で懸濁した後、乳酸菌ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２菌株を加えて７２時間培養し、これを遠心分離して上清を回収した後、濃縮して、生物転換人参濃縮液を得た。
【００５９】
（実施例４）
白参１ｋｇをメタノールで冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得たサポニン分画を水で懸濁した後、乳酸菌 ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２菌株を加えて７２時間培養し、これを遠心分離して上清を回収した後、濃縮して、生物転換人参濃縮液を得た。
【００６０】
〔実験１：含量分析１〕
白参粉末（２ｇ）に水（５００ｍｌ）を加えた後、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１（寄託先：韓国微生物保存センター、寄託番号：ＫＣＣＭ‐１０３６４、寄託日：２００２．０３．２２）とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２（寄託先：韓国微生物保存センター、寄託番号：ＫＣＣＭ‐１０３６５、寄託日：２００２．０３．２２）の菌株をそれぞれ１ｇづつ加えて３７℃で７２時間培養し、これを減圧濃縮して、実施例３の生物転換人参濃縮液を得た。
【００６１】
前記実施例３の生物転換人参濃縮液（２ｇ）と、白参（２ｇ）とを、それぞれメタノール（１００ｍｌ）で３回抽出して濃縮した後、水に懸濁し、エーテル（１００ｍｌ）で３回抽出した。さらに、ブタノール（１００ｍｌ）で３回抽出した後、ブタノール分画を濃縮し、この濃縮物をメタノールに溶解させ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；Ｓｈｉｍａｚｕ  ＴＬＣ  ｓｃａｎｎｅｒ  ＣＳ‐９３０１ＰＣ）による分析から、総サポニン量に対する各成分の含有率（％）を求めた。その結果を下記表１に示す。
【００６２】
なお、ＴＬＣ分析には、展開溶媒として三塩化メタン・メタノール・水（質量比６５：３５：１０）を、発色試薬に５％硫酸・メタノール溶液を用いた。
【００６３】
【表１】
0004180388.tif 000002
【００６４】
〔実験２：含量分析２〕
白参サポニン分画（１ｇ）に水（１００ｍｌ）を加えた後、ビフィドバクテリウム・ＫＫ‐１とビフィドバクテリウム・ＫＫ‐２の菌株をそれぞれ１ｇづつ加えて３７℃で４８時間培養し、これを減圧濃縮して、実施例４の生物転換人参濃縮液を得た。前記実施例４の生物転換人参濃縮液（１ｇ）と、白参サポニン分画（１ｇ）とを、それぞれメタノールに溶解させ、実験１と同様にＴＬＣで分析し、総サポニン量に対する各成分の含有率（％）を求めた。その結果を下記表２に示す。
【００６５】
【表２】
0004180388.tif 000003
【００６６】
〔実験３：含量分析３〕
尾参を水で抽出し乾燥して得た人参粉末（２ｇ）を水（５００ｍｌ）で懸濁した後、ビフィドバクテリウム・Ｋ‐１０３とビフィドバクテリウム・Ｋ‐５０６の菌株をそれぞれ１ｇづつ加えて３７℃で７２時間培養し、これを濃縮し、実施例１の生物転換人参濃縮液を得た。また、生人参を細切して滅菌した人参乾燥物（２ｇ）を水（５００ｍｌ）で懸濁した後、ビフィドバクテリウム・Ｋ‐１０３とビフィドバクテリウム・Ｋ‐５０６菌株をそれぞれ１ｇづつ加えて３７℃で４８時間培養し、これを濃縮し、実施例２の生物転換人参濃縮液を得た。
【００６７】
前記生物転換人参濃縮液（２ｇづつ）と白参（２ｇ）とを、それぞれメタノール（１００ｍｌ）で３回抽出して濃縮した後、水に懸濁し、エーテル（１００ｍｌ）で３回抽出した。さらに、ブタノール（１００ｍｌ）で３回抽出した後、ブタノール分画を濃縮し、この濃縮物をメタノールに溶解させ、実験１と同様にＴＬＣで分析し、総サポニン量に対する各成分の含有率（％）を求めた。その結果を下記表３に示す。
【００６８】
【表３】
0004180388.tif 000004
【００６９】
本発明の生物転換人参組成物による抗がん作用を調べるため、以下の実験４を行い、がん細胞の増殖抑制効果を調べた。
【００７０】
〔実験４：抗がん効果分析〕
ヒト肝臓がん由来の細胞株（ＨｅｐＧ２）、ヒト肺がん由来の細胞株（Ａ‐５４９）、 マウス骨髄由来細胞株（Ｐ‐３８８）、マウス骨髄性白血病細胞株（Ｌ‐１２１０）を１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ 抗生物質‐抗真菌薬（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ‐ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）および２．２ｇ/Ｌ 炭酸水素ナトリウムを補強したＲＰＭＩ １６４０ 培地で培養した。
【００７１】
前記 ＨｅｐＧ２、Ａ‐５４９は、０．２５％ トリプシンで処理した後、培養フラスコより細胞を取り出し、９６穴（９６ｗｅｌｌ）培養プレートに、それぞれ３Ｘ１０4 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞数に合わせて１８０μｌを敷き、５％ 二酸化炭素（ＣＯ2）が飽和したＣＯ2培養器内（３７℃）で２４時間かけて付着させた。また、Ｐ‐３８８とＬ‐１２１０は、それぞれ４Ｘ１０4 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞数に合わせて１８０μｌを敷き、２時間の間、５％ ＣＯ2が飽和したＣＯ2培養器内で安定させた。
【００７２】
実施例４の生物転換人参濃縮液、または白参をメタノールで冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得たサポニン分画を、１０ｍｇ／ｍｌとなるように濃度を合わせて高圧蒸気滅菌した後、それぞれの培養プレートに、１ ｗｅｌｌあたりの最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、５％ ＣＯ2が飽和したＣＯ2培養器内（３７℃）で４８時間培養した。その後、２０ｍｇ／ｍｌのテトラゾリウム（ＭＴＴ）試薬を、１ ｗｅｌｌあたり５０μlずつ加え、ＣＯ2培養器内でさらに４時間反応させ、培地を取り除いた後の沈澱にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１００μｌ加えて、酵素標識免疫測定法 （ＥＬＩＳＡ）用吸光度測定装置（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）を用いて吸光度（５８０ｎｍにおける）を測定することにより、それぞれのＥＤ50 値を導出した。その結果を下記表４に示す。なお、測定のためのスタンダードとブランクは、対応する公知の方法で準備した。
【００７３】
【表４】
0004180388.tif 000005
【００７４】
表４より、本発明の生物転換人参組成物は優れた抗がん作用を発揮することが分かった。
【００７５】
本発明の生物転換人参組成物による抗アレルギー作用を調べるため、以下の実験５を行い、抗原抗体反応の抑制効果を調べた。
【００７６】
〔実験５：抗アレルギー効果分析１〕
ラット肥満細胞（ＲＢＬ‐２Ｈ３ 細胞）と、１０％ ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）とＬ‐グルタミンを含む培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）とを培養皿に取り、５％ＣＯ2培養器内（３７℃、湿式）で培養した後、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液を用いて、培養皿に固着した細胞を浮遊させ、これを分離、回収した。
【００７７】
前記回収したＲＢＬ‐２Ｈ３ 細胞を２４穴（２４ｗｅｌｌ）培養プレートにそれぞれ ５×１０5 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌずつ分株した後、マウス免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）モノクローナル抗体を０．５μｇ／ｍｌづつ加え、５%ＣＯ2培養器内（３７℃）で１２時間培養し、抗体を感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）させた。
【００７８】
前記感作した細胞をシラガニアン緩衝液（ｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｂｕｆｆｅｒ：１１９ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ 塩化カリウム、０．４ｍＭ 塩化マグネシウム、２５ｍＭ  ピペラジン‐ Ｎ ， Ｎ’‐ビス（２‐エタンスルホン酸）：ＰＩＰＥＳ）、４０ｍＭ 水酸化ナトリウム、ｐＨ７．２) を０．５ｍｌ加えて洗浄した後、５．６ｍＭ グルコース、１ｍＭ 塩化カルシウム 、０．１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに添加したシラガニアン緩衝液を０．１６ｍｌ加え、５％ＣＯ2培養器内（３７℃）で１０分間培養した。
【００７９】
１０分間の培養後、実施例４の生物転換人参濃縮液（０．０４ｍｌ）、白参をメタノールで冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得たサポニン分画（０．０４ｍｌ）、または公知の抗アレルギー剤であるジソディウム・クロモグリケート（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）を加え、２０分後、抗原(ジニトロフェノール‐ウシ血清アルブミン １μｇ／ｍｌ)を ０．０２ｍｌ添加し、３７℃で１０分間培養して細胞を活性化させた後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、回収した上清（０．０２５ｍｌ）を９６穴（９６ｗｅｌｌ）培養プレートに移した。ここに、１ｍＭ ｐ‐ＮＡＧ培養液(p‐ニトロフェニル‐Ｎ‐アセチル‐β‐Ｄ‐グルコサミド 含有の ０．１Ｍ シトレート緩衝液、ｐＨ ４．５)を０．０２５ｍｌ加えた後、３７℃で６０分間培養した後、０．１Ｍ 炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムの水溶液を０．２ｍｌ加えて反応を停止させ、酵素標識免疫測定法 （ＥＬＩＳＡ）用吸光度測定装置（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）を用いて吸光度（４０５ｎｍにおける）を測定することにより、それぞれのＩＣ50 値を導出した。その結果を下記表５に示す。なお、測定のためのスタンダードとブランクは、対応する公知の方法で準備した。
【００８０】
【表５】
0004180388.tif 000006
【００８１】
表５より、本発明の生物転換人参組成物は優れた抗アレルギー作用を発揮することが分かった。
【００８２】
〔実験６：抗アレルギー効果分析２‐ヒスタミン遊離抑制〕
本発明の生物転換人参組成物による、ヒスタミン遊離抑制効果を調べた。
【００８３】
生理溶液（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：１３７ｍＭ 塩化ナトリウム、２．７ｍＭ 塩化カルシウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム・六水和物、５．６ｍＭ グルコース、１ｕｎｉｔ／ｍｌ ヘパリン、５ｍＭ フォスフェート緩衝液、ｐＨ７．２）を、ラット（ｍａｌｅ  Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔ、２００±２０ｇ）の腹膜内に２０ｍｌ投与した。さらに、腹部を軽く２分間マッサージした後、腹膜内から腹膜排出液を注射器で抜き取った。抜き取った腹膜排出液を３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、前記生理溶液を用いて複数回洗浄した。
【００８４】
洗浄後の腹膜排出液(２．５ｍｌ)と、実施例４の生物転換人参濃縮液、白参をメタノールで冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得たサポニン分画（一般人参抽出物：非生物転換人参濃縮液）、または公知の抗アレルギー剤であるジソディウム・クロモグリケート（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）を多様な濃度で懸濁した前記生理溶液（０．５ｍｌ）とを混合させ、３７℃で５分間培養した。
【００８５】
培養後の反応液(３．０ｍｌ)に、ヒスタミン遊離物質（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０）を０．５ｍｌ混合し、３７℃で１０分間培養した後、２５００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上清を回収し、この上清（０．６ｍｌ）に蒸留水（１．４ｍｌ）、１Ｎ 水酸化ナトリウム（０．４ｍｌ）および１％ ｏ‐フタルアルデヒド‐メタノール溶液（０．１ｍｌ）を加えて４分間常温で反応させた後、３Ｎ 塩酸（Ｏ.２ｍｌ）を加えて反応を停止させ、蛍光分光測定装置(Ｊａｓｃｏ ＦＰ‐７５０、励起波長 ３５３ｎｍ、蛍光波長 ４３８ｎｍ)を用いてヒスタミン量を測定し、それぞれのＩＣ50 値を導出した。その結果を下記表６に示す。なお、蛍光分光測定のためのスタンダードとブランクは、対応する公知の方法で準備した。
【００８６】
なお、腹膜排出液中には肥満細胞が多く含まれるため、測定されたヒスタミンは、ほぼ肥満細胞に由来であると考えることができる。
【００８７】
【表６】
0004180388.tif 000007
【００８８】
表６より、本発明の生物転換人参組成物によるヒスタミン遊離抑制効果は、一般人参抽出物よりさらに低い濃度（ＩＣ50）で効果を示し、公知の抗アレルギー剤であるジソディウム・クロモグリケート（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）とほぼ同程度に低い濃度で効果を発揮できることが分かった。したがって、本発明の生物転換人参組成物は生体内において、ヒスタミンの遊離を抑制し抗アレルギー物質として使用可能であると考えられる。
【００８９】
〔実験７：抗アレルギー効果分析３〕
下記のイナガキらの方法(Ｉｎｔ. Ａｒｃｈ. Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., ８７, ２５４‐２５９, １９８８)に従い、本発明の生物転換人参組成物による抗アレルギー効果を調べた。
【００９０】
ジニトロフェノール‐ウシ血清アルブミン（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ‐ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＤＮＰ‐ＢＳＡ）に対するＩｇＥ血清（１０μｇ）を生理食塩水で希釈し、エーテルで麻酔させたマウス（ｍａｌｅ ＩＣＲ ｍｉｃｅ ２０〜２５ｇ）の背に注射した後、手動感作させた。
【００９１】
対照例Ａとして、手動感作から４８時間後に、ＤＮＰ‐ＢＳＡ（０．２ｍｇ）と蛍光色素（ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ、１．６ｍｇ）を含む生理食塩水（０．２ｍｌ）を尾静脈に注射し、その３０分後、頸椎脱臼 （ｃｅｒｖｉｃａｌ ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ）で安楽死させた。
【００９２】
試行例として、ＤＮＰ‐ＢＳＡ（０．２ｍｇ）と蛍光色素（ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ、１．６ｍｇ）を含む生理食塩水（０．２ｍｌ）を尾静脈に注射する１時間前に、実施例４の生物転換人参濃縮液、白参をメタノールで冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得たサポニン分画（一般人参抽出物：非生物転換人参濃縮液）、または公知の抗アレルギー剤であるジソディウム・クロモグリケート（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）を、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇで溶解または懸濁させた生理食塩水を経口投与または腹腔内注入した。
【００９３】
前記対照例Ａまたは試行例のマウスの背から一定部位を切り取って試験管に入れ、１Ｎ 水酸化カリウム（０．７ｍｌ）を加えて３７℃で一晩培養した。
【００９４】
培養後、この試験官に０．６Ｎ リン酸とアセトンとの混合液(質量比５：１３)を４ｍｌ加えた後、振盪し、ろ過抽出した蛍光色素を比色定量（６２０ｎｍにて）し、下記の式（１）に従ってアレルギー反応抑制率を導出した。その結果を下記表７に示す。
【００９５】
ここで、ジニトロフェノール‐ウシ血清アルブミン（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ‐ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＤＮＰ‐ＢＳＡ）に対するＩｇＥ血清を感作させないこと以外は対照例Ａと同様に操作した対照例Ｂを用意し、比色定量した。
【００９６】
【数１】
0004180388.tif 000008
【００９７】
【表７】
0004180388.tif 000009
【００９８】
表７より、本発明の生物転換人参組成物は優れた抗アレルギー作用を発揮することが分かった。
【００９９】
〔実験８：抗酸化効果‐ラジカル消去に伴う老化防止〕
本発明の生物転換人参組成物による、１,１‐ジフェニル‐２‐ピクリルヒドラジル(ＤＰＰＨ)ラジカル消去効果を調べた。
【０１００】
６０μＭ ＤＰＰＨ・エタノール溶液（５００μｌ）と、試料群（各５００μｌ）としての、実施例４の生物転換人参濃縮液、白参をメタノールで冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得たサポニン分画（一般人参抽出物：非生物転換人参濃縮液）、または非常に強いラジカル捕捉作用を有することが知られるカフェイン酸とを混合し、この混合試料溶液を常温で３０分間反応させた。この混合溶液の吸光度（５２０ｎｍにおける）を測定することにより、ＤＰＰＨラジカルが５０％除去される試料の濃度（ＩＣ50）を求めた。その結果を下記表８に示す。なお、ブランクには前記混合試料溶液中のＤＰＰＨ・エタノール溶液の代わりにエタノールを使用し、スタンダードには前記混合試料溶液中の試料の代わりに水を使用した。
【０１０１】
さらに、本発明の生物転換人参組成物による、活性酸素（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ａｎｉｏｎ  Ｒａｄｉｃａｌ）消去効果を調べた。
【０１０２】
０．０５Ｍ 炭酸ナトリウム水溶液(ｐＨ １０．２、９００μｌ)に、３ｍＭ キサンチン(Ｘａｎｔｈｉｎｅ：Ｓｉｇｍａ社)、３ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム(ＥＤＴＡ：Ｓｉｇｍａ社)、１．５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社） 、０．７５ｍＭ ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ：Ｓｉｇｍａ社)をそれぞれ５０μｌずつ添加し、上記試料群（５０μｌ）と０．１μｇ／ｍｌ キサンチン・オキシダーゼ（５０μｌ）を加え３０分間反応させた後、６ｍＭ 塩化銅を加えてこの反応を停止させた。反応停止後にその吸光度（５６０ｎｍにおける）を測定することにより、ＤＰＰＨラジカルが５０％除去される試料の濃度（ＩＣ50）を求めた。その結果を下記表８に示す。なお、測定のためのスタンダードとブランクは、対応する公知の方法で準備した。
【０１０３】
【表８】
0004180388.tif 000010
【０１０４】
表８より、本発明の生物転換人参組成物による５０％ラジカル消去濃度は、カフェイン酸ほどには低濃度でないにしろ、一般人参抽出物よりも低い濃度であることが分かった。このことから、本発明の生物転換人参組成物は抗酸化効果に優れ、生体の老化防止用物質として使用できると考えられる。
【０１０５】
〔実験９：大腸癌／肝臓損傷誘発β‐グルクロニダーゼ阻害効果〕
腸内細菌が生産する酵素であるβ‐グルクロニダーゼは、大腸癌および肝臓損傷を起こすため、この酵素を阻害する物質は大腸癌および肝臓損傷予防効果があることが知られている(参考文献：Ｄ．Ｈ．Ｋｉｍ， Ｉ．Ｓ． Ｊａｎｇ， Ｊ．Ｂ． Ｐａｒｋ， Ｓ．Ｗ． Ｌｅｅ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｏｎ ｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．１８， ７９‐８３， １９９５； Ｄ．Ｈ． Ｋｉｍ， Ｓ．Ｂ． Ｓｈｉｍ， Ｎ．Ｊ． Ｋｉｍ，Ｉ．Ｓ． Ｊａｎｇ， β‐ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ‐ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ． Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２２， １６２‐１６４， １９９９) 。
【０１０６】
本発明の生物転換人参組成物による、β‐グルクロニダーゼ阻害効果を、キムらの方法 (Ｄ．Ｈ． Ｋｉｍ， Ｓ．Ｂ． Ｓｈｉｍ， Ｎ．Ｊ． Ｋｉｍ， Ｉ．Ｓ． Ｊａｎｇ， ‐Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ‐ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ． Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２２， １６２‐１６４， １９９９)により調べた。
【０１０７】
まず、ヒトの腸内で分離した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｇｉａ ｃｏｌｉ ＨＧＵ‐３）株を培養し、キムらの方法に従い、β‐グルクロニダーゼ酵素液を精製した。５０ｍＭ 人参緩衝液（０．３８ｍｌ）と、２０ｍＭ ｐ‐ニトロフェニル‐β‐Ｄ‐グルクロナイド (Ｓｉｇｍａ社製、米国) （０．０２ｍｌ）と、酵素液（０．０５ｍｌ）と、実施例４の生物転換人参濃縮液、白参をメタノールで冷浸して得た抽出液をさらにブタノールで抽出して得たサポニン分画（一般人参抽出物：非生物転換人参濃縮液）、または非常に強いβ‐グルクロニダーゼ活性阻害作用を有することが知られる糖酸‐１，４‐ラクトン（ｓａｃｃｈａｒｉｃ ａｃｉｄ １，４‐ｌａｃｔｏｎｅ）とを混合し、３０分間反応させた後、０．２Ｎ 水酸化ナトリウム（０．５ｍｌ）を加えて反応を停止させた。
【０１０８】
反応停止後、吸光度（４０５ｎｍにおける）を測定することにより、β‐グルクロニダーゼ活性を５０％阻害する試料の濃度（ＩＣ50）を求めた。その結果を下記表８に示す。なお、測定のためのスタンダードとブランクは、対応する公知の方法で準備した。
【０１０９】
【表９】
0004180388.tif 000011
【０１１０】
表９より、本発明の生物転換人参組成物によるβ‐グルクロニダーゼ活性阻害濃度は、糖酸ほどには低濃度でないにしろ、一般人参抽出物よりも低い濃度であることが分かった。このことから、本発明の生物転換人参組成物はβ‐グルクロニダーゼ阻害効果に優れ、大腸癌および肝臓損傷予防物質として使用できると考えられる。
【０１１１】
（その他の事項）
生物転換人参組成物の人参原料として、上記実施例に示した原料に限らず、生人参、紅参、白参、尾参および人参葉からなる群より選ばれた一以上の天然人参、前記天然人参の人参抽出液、または前記天然人参の人参粉末などを用いても、本発明の優れた効果を発揮する生物転換人参組成物が提供されることを確認している。
【０１１３】
また、本発明の生物転換人参組成物の一例である人参飲料は、例えば以下のようにして提供できる。まず、果糖、葡萄糖および白糖に精製水を加え９５℃まで加熱して溶解した後、徐々に冷却して７０℃まで冷却し、これにクエン酸、クエン酸ナトリウムおよび安息香酸ナトリウムを加えて撹拌しながら溶解させる。このとき、五加皮抽出液およびタウリンを撹拌しながら、さらに溶解させてもよい。この溶液に前記生物転換人参濃縮液由来の生物転換人参粉末を加え十分に撹拌した後、総容量が１００ｍｌになるように適正精製水を加えることにより、生物転換人参抽出物（２５０ｍｇ）を含有した飲料（１００ｍｌ）が提供できる。
【０１１４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の生物転換人参組成物の製造方法によれば、抗アレルギー作用、抗酸化作用、抗がん作用をもつ成分が大幅に強化された生物転換人参組成物を提供できる。
【０１１５】
また、本発明の実施例に伴う生物転換人参組成物の製造方法によれば、人参原材料に含有されたサポニン成分を生物転換させ、生理活性の高い代謝物を生成させることにより、サポニン等の有効成分含量が低く人参加工物の原料として使用するに不適合であった人参葉等も原材料として活用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の好ましい実施例に伴う生物転換人参組成物の製造方法を示したフロチャート。
【図２】人参サポニンの生物転換過程を示した概略図。
【符号の説明】
Ｓ１０:生物転換工程
Ｓ２０：濃縮工程
Ｓ３０：抽出工程
Ｓ４０：乾燥工程
Ｓ５０：撹拌工程
Ｓ６０：希釈工程
【図１】
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【図２】
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