(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．疾患に関連する特異的な細胞表面構造に結合することができるインターロイキン、ホルモン、抗体、抗体の抗原結合断片、及び成長因子からなる群から選択される生体特異的親和性相対物と、
ｂ．ペプチドとからなり、
前記ペプチドが
ｉ．超抗原ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（超抗原ＳＥＡ）に由来するアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．Ｔ細胞受容体のＶβ鎖に結合することができ、且つ
ｉｉｉ．該ペプチドの由来源である超抗原ＳＥＡと比べてＭＨＣクラスII抗原へ結合する能力を下げるため、ＳＥＡの４７位のアミノ酸をアラニンに置換したものであり、
これらの部分ａ及びｂが互いに共有結合している結合体。
【請求項２】
ＳＥＡの１２８位のアミノ酸が変異した請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
ＳＥＡの１８７位のアミノ酸が変異した請求項１または２に記載の結合体。
【請求項４】
ＳＥＡの２２５位のアミノ酸が変異した請求項１または２に記載の結合体。
【請求項５】
ＳＥＡの２２７位のアミノ酸が変異した請求項１または２に記載の結合体。
【請求項６】
ＳＥＡの４７位、１２８位、１８７位、２２５位および２２７位のアミノ酸が変異した請求項１〜５のいずれかに記載の結合体。
【請求項７】
特異的な細胞表面構造が、癌特異的エピトープである請求項１〜６のいずれかに記載の結合体。
【請求項８】
特異的な細胞表面構造が、Ｃ２４２エピトープである請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項９】
生体特異的親和性相対物が抗体または抗体の抗原結合断片であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１０】
抗体の抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、および一本鎖抗体から選択されることを特徴とする請求項９のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１１】
生体特異的親和性相対物がモノクローナル抗体Ｃ２４２であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１２】
生体特異的親和性相対物がモノクローナル抗体Ｃ２１５であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１３】
Ｔリンパ球を活性化し、細胞表面に細胞表面構造を示す細胞を溶解する能力を有する請求項１〜１２のいずれか１項に記載された結合体。
【請求項１４】
哺乳動物の疾患状態の治療における医薬としての使用のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載された結合体であり、かつ該結合体はＳＥＡの２２７位のアミノ酸がアスパラギン酸からアラニンへ置換された結合体であって、当該状態は、疾患に特異的な細胞表面構造の発現により、状態に関与する特異的な細胞の存在に関連し、生体特異的親和性相対物が疾患の細胞特異的表面構造に対するものであることを特徴とする結合体。
【請求項１５】
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載された結合体であり、かつＳＥＡの２２７位のアミノ酸がアスパラギン酸からアラニンへ置換された結合体、および
ｂ）製薬上、許容されうるビヒクル、
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
超抗原は主にウイルス又は細菌由来タンパク質からなり、哺乳動物細胞上のＭＨＣクラスII抗原及びＴ細胞受容体Ｖβ鎖に同時に結合することができる。この結合は、Ｔリンパ球の活性化及びＭＨＣクラスII担持細胞の溶解を引き起こす。Ｖβ鎖の結合部分が中等度の多形性を有するため、（正常抗原プロセシングを介する活性化と比較して）比較的多くのＴリンパ球が超抗原との接触によって活性化される。
超抗原の概念は最初、種々のブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ1、ＳＥＣ2、ＳＥＤ及びＳＥＥ）に関連するものであった。最近になって、ＳＥＨと称する新しいブドウ球菌エンテロトキシンが発見された（Ｋｅｙｏｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０（１９９４）１６７５−１６８３）。関心が高まってから、別の超抗原が発見された。具体例としては特に、毒ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１）、火傷様皮膚症候群に関係がある剥脱毒（Ｅｘｆｔ）、連鎖球菌発熱性外毒素Ａ、Ｂ及びＣ（ＳＰＥ  Ａ、Ｂ及びＣ）、マウス乳癌ウイルスタンパク質（ＭＭＴＶ）、連鎖球菌Ｍタンパク質、ウェルシュ菌エンテロトキシン（ＣＰＥＴ）が挙げられる。超抗原及びその特性については、Ｋｏｔｚｉｎら（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４（１９９３）９９−１６６）参照のこと。
シュードモナス外毒素Ａは機能性超抗原とみなされてきた。なぜなら、この毒素が補助細胞により細胞内プロセスされて、Ｖβ鎖に結合し次いでＴ細胞を活性化することができる細胞表面発現フラグメントになることを示す研究結果が存在するからである（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ．Ｌｅｇａａｒｄら，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（１９９１）３７２−３８２）。
超抗原は、それ自体で、種々の疾患の治療に使用できることが提案された。治療効果は、免疫系の一般的活性化を介して達成される（Ｋａｌｌａｎｄら、ＷＯ  ９１０４０５３号；Ｔｅｒｍａｎら，ＷＯ  ９１１０６８０号；Ｔｅｒｍａｎら，ＷＯ  ９３２４１３６号；Ｎｅｗｅｌｌら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１）１０７４−１０７８）。
ワクチンに関連して、ＴＣＲ結合能を喪失するように突然変異させた超抗原を使用することが提案された（Ｋａｐｐｌｅｒ  ＆  Ｍａｒｒａｃｋ，ＷＯ  ９３１４６３４号）。
超抗原の突然変異は既に記述されている（Ｋａｐｐｌｅｒ  ＆  Ｍａｒｒａｃｋ，ＷＯ  ９３１４６３４号；Ｋａｐｐｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５（１９９２）３８７−３９６；Ｇｒｏｓｓｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）３２７４−３２８１；Ｈｕｆｎａｇｌｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９（１９９１）２１２６−２１３４）。
本発明者ら自身は、抗体が指向する（結合する）相手である構造体を発現する細胞を溶解するために、超抗原と抗体との結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を治療に使用することを以前に提案した（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，ＷＯ  ９２０１４７０号；Ｌａｎｄｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６（１９９３）２２３−２２８；Ｋａｌｌａｎｄら，Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕｍｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１０（１９９３）３７−４７；Ｌａｎｄｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（８パート２）（１９９３）１１４Ａ（Ｊｏｉｎｔ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ（米国コロラド州デンバーで開催された米国免疫学者協会及び臨床免疫学会合同会議，５月２１日−２５日（１９９３）；Ｌａｎｄｏら，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．３３（０）（１９９２）３３９（Ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ（米国カリフォルニア州サンディエゴで開催された米国癌研究協会年次会議），５月２０日−２３日（１９９２））；Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１）９２８７−９２９１）。治療することが提案された疾病は、癌、ウイルス感染症、寄生虫感染症、自己免疫疾患、及び他の、疾患特異的表面構造体を発現する細胞に関連した疾患である。これまで行われてきた実験作業は、組換えＳＥＡと種々の抗癌抗体とを含む結合体に集中していた。このような結合体は、非結合形の超抗原と比べて、ＭＨＣクラスII抗原への結合能が幾らか劣っていた。ＭＨＣクラスII抗原結合能の低下が、最適な溶解及び最適な治療効果を得る上で有益であるか否かは不明であった。
腫瘍特異的抗イディオタイプ抗体に化学的に結合させたＳＥＢを用いる免疫療法実験がＯｃｈｉら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）３１８０−３１８６）によって記述された。
本願の優先権主張出願の係属中に、スエーデン特許庁は、プロテインＡとＳＥＢフラグメントとの融合体を、ＭＨＣクラスIIとの結合や細胞を殺すための前記融合体の使用を全く強調せずに、開示しているＢｕｅｌｏｗら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１−６）、並びに非融合形の超抗原である連鎖球菌エリトロジェニック毒素Ａ（ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｉｃ  ｔｏｘｉｎ  Ａ）のＭＨＣクラスII結合に影響を及ぼす突然変異体を開示しているＨａｒｗｉｇら（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１９９３）８６９−８７５）も引用した。
発明の目的
本発明の第一の目的は、公知の超抗原−抗体結合体を一般的免疫刺激（ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）対特異的細胞毒性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）に関して改善することにある。刺激はＴリンパ球を活性化し、超抗原のＴ細胞受容体及びＭＨＣクラスII抗原両方への結合能に依存する。
本発明の第二の目的は、生体特異的親和性相対物（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）（例えば抗体）と、ＭＨＣクラスII抗原に対する親和性が変化した超抗原との結合体を提供することにある。これは、（結合体の抗体／生体特異的親和性相対物が向かう相手である）抗原を露出する細胞の超抗原抗体依存的細胞溶解（ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ＝ＳＡＤＣＣ）に対する選択性を、別のＭＨＣクラスII抗原露出細胞と比べて改善することが判明した。本発明の第三の目的は、癌、自己免疫疾患、寄生虫感染症、ウイルス感染症、又はそれぞれの疾患に特異的な構造体を表面に発現する細胞に関連した別の疾患にかかっている哺乳動物の治療で有効成分として使用できる結合体を提供することにある。
発明
本発明の主な態様は、ａ．結合体に結合するよう意図された構造体に指向する生体特異的親和性相対物と、ｂ．ペプチドとからなる結合体であって、前記ペプチドがｉ．超抗原に由来し、ｉｉ．Ｔ細胞受容体のＶβ鎖に結合することができ、ｉｉｉ．該ペプチドの由来源である超抗原（野生型超抗原＝ＳＡ（ｗｔ））と比べて変化したＭＨＣクラスII抗原結合能を有する、前記結合体にある。
前記ペプチド及び親和性相対物は架橋（Ｂ）を介して互いに共有結合している。
好ましい結合体は、Ｔリンパ球を活性化して、親和性相対物が向かう相手である構造体を表面に露出する細胞を選択的に溶解させる能力を有する。これは、結合体がＳＡＤＣＣ（Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）仲介法で細胞溶解を生起することを意味する。後述の実験の説明、及び超抗原と抗体との結合体に関する本出願人の公開文書（例えばＤｏｈｌｓｔｅｎら，ＷＯ  ９２０１４７０号）参照のこと。
本発明の結合体は、先行技術の超抗原−抗体結合体（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，ＷＯ  ９２０１４７０号、本明細書に参考として包含される）と類似の構造を有する。即ち、本発明の結合体は式Ｔ−Ｂ−ＳＡ（ｍ）で示される。前記式中、Ｔは生体特異的親和性相対物を表し、ＳＡ（ｍ）は改変型超抗原（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ）（前述のペプチド）であり、ＢはＴとＳＡ（ｍ）を結合する共有結合架橋を表す。
Ｔは原則として、生体特異的親和性を介して結合する任意の構造体であり得る。通常は、Ｔは細胞表面構造体、好ましくは前述のような疾患特異的構造体に結合することができる。Ｔが向かう相手である構造体は通常、（ａ）超抗原由来ペプチド（ＳＡ（ｍ））が結合するＶβ鎖エピトープ、及び（ｂ）非改変型超抗原が結合するＭＨＣクラスII抗原エピトープとは異なる。生体特異的親和性相対物Ｔは主に、インターロイキン（例えばインターロイキン−２）、ホルモン、抗体及び抗体の抗原結合フラグメント、成長因子等から選択し得る。例えば、１９９３年１１月７日〜１１日にノースカロライナ州アッシュビルで開催された会議“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（癌の免疫療法に対する分子的アプローチ）”で発表されたＷｏｏｄｗｏｒｔｈのＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｔｏｘｉｎｓ（サイトカイン毒素の前臨床及び臨床的発生）参照のこと。免疫グロブリン定常部（例えばプロテインＡ及びＧ及びＬ）、レクチン、ストレプトアビジン、ビオチン等に結合するポリペプチドは、本願優先日には、重要性は低いと考えられていた。
本願優先日には、Ｔが抗体又は抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、一本鎖抗体等を含む）であるのが好ましいとされ、いわゆるＣ２４２エピトープ（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、ＷＯ  ９３０１３０３号）に対する、又は別の癌特異的エピトープに対する、抗体の抗体活性フラグメント（例えばＦａｂ）が特に強調された。
Ｔは、抗体の場合には、主にモノクローナルであるか、又は所定数のモノクローナル（例えば２、３、４、５又はそれ以上）の混合物である。Ｔは、非療法的使用の場合にはポリクローナル抗体であってもよい。
Ｔは必ずしもポリペプチド構造を有する必要はない。
改変型超抗原ＳＡ（ｍ）は主に突然変異超抗原であるが、化学的に改変した超抗原であってもよく、これにはＴ細胞受容体のＶβ鎖に結合する能力を保持している超抗原フラグメントが含まれる。
「突然変異超抗原」なる表現は、ＭＨＣクラスII抗原に結合する超抗原生来の能力が、天然超抗原の１個以上のアミノ酸の置換、挿入又は除去により、ゲノムレベルで変化したことを意味する。
完全アミノ酸配列の一部を除去する突然変異によって得た超抗原フラグメント、及び超抗原の酵素的又は化学的切断によって得たフラグメントは、本発明の化学的結合体で同等に使用し得る。
改変型超抗原ＳＡ（ｍ）は、種々の超抗原に由来し且つ突然変異したものであってもよい一つ以上のアミノ酸配列を含むことができ、例えば下記の好ましい超抗原の組合わせからなり得る。
改変型超抗原ＳＡ（ｍ）は、天然超抗原より低い免疫原性及び毒性を示し得る。
Ｔ細胞受容体のＶβ鎖と交差反応することができる別の基（ｇｒｏｕｐ）／物質も潜在的に、前述のような突然変異超抗原（ＳＡ（ｍ））と同等に使用し得る。このような基／物質は非ポリペプチド構造を有し得る。
本願の優先権を主張する年の年末には、本発明の最も興味深いと目される生成物は、複数のＭＨＣクラスII結合部位及び／又はＺｎ2+配位（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）能力を有する突然変異形の超抗原、例えばＳＥＡ、ＳＥＤ、ＳＥＥ及びＳＥＨであった。
Ｔ及びＳＡ（ｍ）は組換え技術によって製造し得る。
架橋Ｂは既述のように選択し得る（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、ＷＯ  ９２０１４７０号）。即ち、架橋Ｂは好ましくは親水性であり、アミド、チオエーテル、エーテル、ジスルフィド等の中から選択される一つ以上の構造を示す。該架橋が非置換非切断炭化水素鎖を有する場合には、フェニルのような芳香族環を含まないのが好ましい。最も重要な架橋は、組換え技術によって形成されたもの、即ち結合がゲノムレベルで生起する時のものである。このような場合には、親水性アミノ酸残基、例えばＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ及びＡｒｇを含むオリゴペプチド架橋が好ましい。Ｐｒｏ及びＨｉｓが含まれていてもよい。本願の優先権を主張する年の間に、好ましい架橋は３個のアミノ酸残基（ＧｌｙＧｌｙＰｒｏ）を含むペプチドであると決定された。
本発明の結合体は、生体特異的親和性相対物１個当たり１個以上の変異超抗原、又は変異超抗原１個当たり１個以上の生体特異的親和性相対物を含み得る。これは、前記式中のＴが、生体特異的相対物の他に、１個以上の改変型超抗原を含み得ることを意味する。同様に、ＳＡ（ｍ）は１個以上の生体特異的親和性相対物Ｔを含み得る。親和性相対物Ｔ及びＳＡ（ｍ）は別の構造体も含み得る。親和性相対物１個当たりの改変型超抗原数は、１又は２が好ましい。
本発明の新規の結合体の合成は原則として、２つの主要な方法、即ち、１．組換え技術、及び２．ＳＡ（ｍ）へのＴの化学的結合によって実施し得る。これらの方法は当業者によく認識されており、多数の変形例を含む。従って、本発明は主に、人工結合体、即ち天然には存在しない結合体に関する。
改変型超抗原を生体特異的親和性相対物Ｔに化学的に結合する方法では、各化合物中で多数の位置に存在する官能基（例えば第一アミノ基又はカルボキシ基）が使用されることが多い。従って最終生成物は、結合が生起した位置が異なる複数の結合体分子の混合物を含むことになる。
組換え結合体（融合タンパク質）の場合は、結合位置に関して均一な結合体物質が得られる。改変型超抗原のアミノ末端が生体特異的親和性相対物のカルボキシ末端に結合するか、又はその逆である。抗体、例えば完全抗体及び抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ等）については、Ｌ鎖又はＨ鎖をこの種の融合に使用し得る。現時点では組換え結合体が好ましく、Ｆａｂフラグメントと、抗体Ｈ鎖第一定常部（ＣＨ１）への改変型超抗原アミノ末端の結合が好ましいが、Ｌ鎖又はＶＨ及びＶＬドメインへの類似の結合も使用でき、かなり良好な結果をもたらし得る。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で大量の超抗原を得る方法は二つある。即ち、細胞内産生又は分泌である。本発明の結合体には分泌の方が好ましい。なぜなら、周辺質及び培養培地から正しく折り畳まれたタンパク質を精製することができるからである。細胞内産生は複雑な精製操作を要し、（タンパク質が正しい三次構造を得るために）タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再度折り畳む必要がしばしばある。これは、別の宿主細胞、例えば酵母又は哺乳動物細胞のような真核細胞内でも活性な結合体の産生が可能であることを否定するものではない。
突然変異超抗原の製造、及びＭＨＣクラスII抗原への結合能（親和性）が変化した突然変異体の選択は、公知の方法で実施し得る（例えばＫａｐｐｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５（１９９２）３８７−３９６参照）。本明細書の実験説明の項も参照。
結合体が、Ｔ細胞受容体Ｖβ鎖、標的構造体に結合して、標的細胞の溶解を引き起こす能力は特に、超抗原に由来するペプチド（ＳＡ（ｍ））、生体特異的親和性相対物（Ｔ）、並びに架橋（Ｂ）の構造及び長さに依存する。当業者は、公知の超抗原抗体結合体に関して開示されているモデルを用いて効果と構造との関係を調べることにより、結合能と溶解生起能とについて本発明の結合体を最適化することができる（前出の参考文献参照）。後述の実験の項も参照のこと。
改変したＭＨＣクラスII抗原結合能力とは主に、ＩＣ50（ＳＡ（ｗｔ））：ＩＣ50（ＳＡ（ｍ））の比が＜０．９（９０％）、例えば＜０．５（＜５０％）であり、＜０．０１（＜１％）の可能性もあることを意味する。あるいは、本発明の結合体の改変した結合能は、解離定数Ｋd（ＳＡ（ｗｔ））：Ｋd（ＳＡ（ｍ））の比として測定できる。但し、ＫdはｎＭで測定され、限界値はＩＣ50（ＳＡ（ｗｔ））：ＩＣ50（ＳＡ（ｍ））比と同じである。ＩＣ50（ＳＡ（ｗｔ））、ＩＣ50（ＳＡ（ｍ））、Ｋd（ＳＡ（ｍ））及びＫd（ＳＡ（ｍ））の決定については後述の実験の項参照のこと。
ある種の超抗原が、ＭＨＣクラスII抗原に結合する部位を２個以上有し得ることは既に知られている（Ｆｒａｓｅｒら，Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ：Ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｈｕｂｅｒ  ＆  Ｐａｌｍｅｒ編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７（１９９３）７−２９）。この種の超抗原の場合は、結合能を結合部位のうちの少なくとも一つで、例えば前記大きさの減少として変化させる。おそらくは、二つのＭＨＣクラスII結合部位に対する親和性の差を、好ましくは少なくとも一つの部位の親和性を低下させることにより、例えば＞１０％変化させる超抗原改変で十分であろう。
超抗原は、様々な親和性を有する種々の亜族のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する。本発明の融合タンパク質／結合体では、使用する超抗原が、亜族特異性を変化させるか又は亜族の一つ以上のメンバーに対する親和性を変化させるように改変させたものであってよい。ＴＣＲ  Ｖβ鎖に対する親和性とＴＣＲを介する刺激との間には放物線関係がある、即ち中等度の親和性が最大の刺激を与えるという説明には確実な根拠がある。従って、改変型超抗原を含む融合タンパク質／結合体が、本質的に全てのヒトＶβ亜族の分布を表す休止Ｔ細胞集団を大いに刺激して増殖させることができれば、ＴＣＲ  Ｖβに対する改変型超抗原の適当な親和性を使用し得る。Ｔ細胞集団は、無作為に選択したヒト個体に由来するＴ細胞をプールしたものであり得る。大いに（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）とは、刺激が測定可能であることを意味する。実験説明の項で表IIに示す結果（右欄）は、本発明の結合体／融合タンパク質のＳＡＤＣＣを生起する能力がしばしば、野生型超抗原を含む融合体の場合と本質的に同じであることを示している。
本発明の結合体／融合タンパク質の主な用途
本発明の結合体は主に、正常超抗原と抗体との結合体と同じ疾患の治療に使用される。前出の文献参照のこと。従って本発明の結合体は、主療法又は補助療法として、外科又は他の薬剤と一緒に投与し得る。
本発明の医薬組成物は、当業界で公知の配合物であるが、本発明の新規の結合体を含む点で公知のものとは異なる配合物からなる。本発明の組成物は、凍結乾燥粒状物質、無菌溶液もしくは無菌条件で製造した溶液、錠剤、アンプル等の形態を有し得る。水（好ましくは例えばＰＢＳによって生理学的ｐＨ値に緩衝したもの）又は他の不活性固体もしくは液体物質のようなビヒクルを含んでいてもよい。一般的には、本発明の組成物は、結合体を１種類以上の水溶性又は水不溶性の水性又は非水性ビヒクルと混合するか、その中に溶解するか、結合させるか又は他の方法で組み合わせることによって製造し、必要であれば適当な添加剤及びアジュバントも加える。ビヒクル及び条件は、結合体の活性に悪影響を与えるようなものであってはならない。水はそれ自体でビヒクル中に含ませる。
結合体は通常、それぞれが有効量の結合体を含むように予め小分けした用量で販売され、投与される。前記有効量は、現時点で提供されている結果に基づいて、１０μｇ〜５０ｍｇと考えられる。正確な用量は事例毎に異なり、患者の体重及び年齢、投与方法、疾患、抗体、超抗原、結合（−Ｂ−）の種類等に応じて決定される。
投与方法は当業界で一般的に知られているもの、即ち標的細胞溶解有効量又は治療有効量の本発明の結合体を標的細胞と接触させる方法である。前述の定義に従えば、これは通常、非経口投与、例えば、ヒトのような哺乳動物への注射もしくは点滴（皮下、静脈内、動脈内、筋内）を意味する。結合体は局所的又は全身的に投与し得る。
「標的細胞溶解有効量」とは、Ｔリンパ球を活性化し指令して標的細胞を破壊させるのに有効な量を意味する。
優先権を主張する年の年末に、非改変型超抗原を含む結合体／融合タンパク質の好ましい投与方法は、解熱剤（パラセタモール）と組合わせた３時間／日の静脈点滴であると決定された。投与は４日間繰り返し、患者体内で融合タンパク質／結合体に対して二次抗体が生じる前に停止する。この投与計画は本発明の結合体／融合タンパク質にも適用し得ると思われる。
別の用途
本発明の結合体は、標的探索基（Ｔ）が向かう相手である構造体を定量的又は定性的に検出するために使用することもできる。一般的に、これらの方法は当業者に良く知られている。例えば、改変型超抗原は免疫組織化学を含むイムノアッセイでマーカー基として機能し得る。即ちこのマーカー基が、例えば、ペプチド（ＳＡ（ｍ））に対する抗体であって酵素、同位体、発蛍光団又は他の公知のマーカー基で標識された抗体によって検出されるのである。別のイムノアッセイ方法は、標的探索基（Ｔ）に結合できる構造体を表面に発現する細胞を細胞集団内で検出することからなる。この使用方法は、細胞集団の試料を、ＳＡＤＣＣアッセイの場合のように本発明の結合体と一緒にＴリンパ球とインキュベートすることを意味する。インキュベーションによって細胞が溶解すれば、細胞集団は、前記構造体を表面に発現する細胞を含んでいることになる。
実験の説明
組換えタンパク質の製造
抗体
本発明に関連した実験作業は主に、モノクローナル抗体Ｃ２１５をモデル物質として行った。この抗体は、ＧＡ−７３３ファミリーの抗原に対するものである（例えば欧州特許第３７６，７４６号並びに前出参考文献及びＬａｒｓｓｏｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．３２（１９８８）８７７−８２参照）。Ｃ２１５エピトープは、ヒトの癌治療では十分に特異的でないと判断された。本願優先日の時点では、ｍａｂ  Ｃ２４２（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら，ＷＯ  ９３０１３０３号）が、野生型ＳＥＡとの融合生成物に関する実験に基づいて判断して、より適当な物質であると考えられた。
細菌株及びプラスミド
大腸菌株ＵＬ６３５（ｘｙｌ−７、ａｒａ−１４、Ｔ４R、ΔｏｍｐＴ）及びＨＢ１０１（Ｂｏｙｅｒ及びＲｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｅｓｓｏｉｘ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１（１９６９）４５９−４７２）をそれぞれ発現及びクローニングに使用した。ベクターｐＫＰ８８９をＦａｂ−ＳＥＡ融合タンパク質（マウス抗体Ｃ２１５由来）の発現に使用し、ベクターｐＫＰ９４３及びｐＫＰ１０５５をＳＥＡの分泌に使用した（第１図）。Ｆａｂ−ＳＥＡ発現ベクターｐＫＰ８８９は、ＣH１とＳＥＡとの間のスペーサーがＧｌｙＧｌｙＡｌａＡｌａＨｉｓＴｙｒＧｌｙである点を除いて、ｐＫＰ８６５（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）印刷中）と同じである。ｐＫＰ９４３からの発現では、天然アミノ末端を有するＳＥＡが得られる。ｐＫＰ１０５５を使用すると、アミノ末端にＧｌｙ残基が付加したＳＥＡが得られる。どちらのベクターでも、ブドウ球菌プロテインＡ
0004175489.tif 000002
からのシグナルが転写及び翻訳に使用され、合成シグナルペプチドが分泌に使用される
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ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発
ポリメラーゼ連鎖反応をパーキン−エルマー・サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）で実施して、突然変異を生起させた。反応混合物（１００μｌ）は、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（追加）、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、２．５単位のＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ、ＵＳＡ）及び１００ｎｇ  ＤＮＡ鋳型を含んでいた。プライマーを最終濃度０．８μＭで加えた。元の鋳型はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓエンテロトキシンＡ遺伝子を含むプラスミドであった。これは、（Ｓｅｒをコードする）最初のコドンがＴＣＣに変えられて遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位が与えられている点以外は、Ｂｅｔｌｅｙら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（１９８８）３４−４１）によって公表されたものと同じである。その後、サイレント突然変異によって導入された単一度（ｕｎｉｑｕｅ）のより高い制限酵素部位を含む誘導体が使用された。制限部位の隣に導入する突然変異は、一組のプライマーを用いて生起させた。これらのプライマーの一つが突然変異と制限部位にまたがった。大抵の突然変異では二組のプライマーを使用しなければなず、ＰＣＲを二つの連続ステップで実施した。新しい制限酵素部位を各突然変異と共に導入して、容易な同定を可能にした。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）で合成した。各突然変異を確認するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＤＮＡシーケンサーで、同社のＴａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ヌクレオチドの関連部分を決定した。
タンパク質の製造及び分析
種々の遺伝子構築物を有する大腸菌細胞を、室温（Ｆａｂ−ＳＥＡベクター）及び２４〜３４℃（分泌ベクター、最適条件は突然変異に依存する）で一晩増殖させた。ブイヨンは、２×ＹＴ（１６ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏトリプトン、１０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ酵母菌抽出物、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）にカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を加えて調製した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを最終濃度１００μＭで加えることにより、融合タンパク質を誘導した。（非融合ＳＥＡの発現に使用したプロテインＡプロモーターは構成性である）。細胞を５０００×ｇでペレット化し、凍結した細胞ペレットを氷上の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で１時間撹拌しながらゆっくり解凍することによって、周辺質の中味を放出させた。周辺質抽出物を９５００×ｇで１５分間遠心分離して清澄化した。Ｆａｂ−ＳＥＡタンパク質はそれ以上精製せずに使用した。ＳＥＡ及びＧｌｙ−ＳＥＡは抗ＳＥＡ抗体カラムでのアフィニティクロマトグラフィーによって更に精製した。ポリクローナルウサギ抗ＳＥＡ抗体を、ＳＥＡで予め免疫感作したウサギから予め回収し、プロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのアフィニティクロマトグラフィーで精製した。
タンパク質の分析
タンパク質をプレキャストポリアクリルアミドＳＤＳトリス−グリシンＮｏｖｅｘゲルで分離し（勾配４−２０％又は均一１２％、Ｎｏｖｅｘの新しい実験技術）、クーマシーブルーで染色するか又はウェスタン・ブロットで使用した。ウェスタン・ブロット分析でＳＥＡを検出するためにポリクローナルウサギ抗ＳＥＡ抗体（上述）を使用し、次いでブタ抗ウサギＩｇ抗体、並びにウサギ抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体及びペルオキシダーゼを使用した。Ｆａｂ−ＳＥＡ融合タンパク質と一緒に、κ鎖を認識するペルオキシダーゼ結合ラット抗体も使用した（ＡＡＣ  ０８Ｐ、Ｓｅｒｏｔｅｃｈ  ＬＴＤ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）。３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）をペルオキシダーゼの視覚化に使用した。
Ｊ−７２０分光偏光計（ＪＡＳＣＯ、Ｊａｐａｎ）を用いて、０．０２ｍＭ  ＺｎＳＯ4及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を加えた１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．２中、室温（２２〜２５℃）で、円二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。走査速度を１０ｎｍ／分とし、各スペクトルを５回の走査の平均値として記録した。セル光路長は１ｍｍであり、タンパク質濃度は０．２〜０．５ｍｇ／ｍｌであった。平衡状態でのグアニジン塩酸塩（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）変性を、タンパク質濃度０．３ｍｇ／ｍｌ、セル光路長１ｍｍ、２２２ｎｍでＣＤにより２３℃で測定した。これらのデータを使用して、折り畳まれていないタンパク質の見掛けフラクション（ａｐｐａｒｅｎｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（Ｆapp）を計算した。データを二部位折り畳みプロセス（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）に適合させて、平衡非折り畳みパラメーター（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を算出した（Ｈｕｒｌｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（１９９０）４４１０−４４１９）。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合及び機能アッセイ
材料
試薬：  Ｇｉｂｃｏ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄから入手したＲＰＭＩ  １６４０培地を使用した。該培地はｐＨ７．４であり、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ3（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンスルフェート（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、１ｍＭ  Ｎａ−ピルベート（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＵＳＡ）、０．０５ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）、１００倍濃縮非必須アミノ酸（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を加えたものからなる。組換えＳＥＡ（ｗｔ）、ＳＥＡ（ｍ）並びに融合生成物Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）及びＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｍ）を前述のように得た。ヒト組換えＩＬ−２はＣｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡから入手した。マイトマイシンＣはＳｉｇｍａ  Ｃｏ．，ＵＳＡから入手した。Ｎａ251ＣｒＯ4はＭｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。マグネシウム及びカルシウムを含まないリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）はＩｍｐｅｒｉａｌ，Ｅｎｇｌａｎｄから入手した。
細胞：  ヒト結腸癌細胞系Ｃｏｌｏ２０５及びＢ細胞リンパ腫細胞系ＲａｊｉはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した（ＨＬＡ−ＤＲ３／ｗ１０、−ＤＰ７、−ＤＱｗ１／ｗ２発現）。ＥＢＶ形質転換リンパ芽球（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）Ｂ細胞系ＢＳＭは、オランダ、ライデンのＤｒ．Ｄａｎｉｅｌ  ｄｅｎ  Ｈｏｅｄ癌センター、免疫学部、Ｄｒ．ｖａｎ  Ｄｅ  Ｇｒｉｅｎｄから恵与された。細胞は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｔ．Ｃ．検査、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡで、マイコプラズマ感染について繰り返し検査した。
ＳＥＡ活性化Ｔ細胞系は、末梢血由来の単核細胞の活性化によって製造した。血液はＬｕｎｄ大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｌｕｎｄ）で血液ドナーからバフィーコートとして受け取った。ＰＢＭは、１０％ＦＣＳを含む培地中でマイトマイシンＣ処理ＳＥＡコーティングＢＳＭ細胞（１００ｎｇ／ｍｌＳＥＡで予備インキュベートしたもの）で、濃度２×１０6細胞／ｍｌで刺激した。Ｔ細胞系は２週間毎に２０Ｕ／ｍｌヒト組換えＩＬ−２で再刺激し、１週間毎にマイトマイシンＣ処理ＳＥＡコーティングＢＳＭ細胞で再刺激した。細胞系はアッセイで使用する前に４〜１２週間培養した。
エフェクター細胞の生存率は、トリパンブルー排除法で測定して５０％を超えていた。
野生型及び突然変異型ＳＥＡのＭＨＣクラスII結合特性の決定放射性ヨウ素化処理
ラクトペルオキシダーゼ技術（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で酵素ビーズ（ｅｎｚｙｍｏｂｅａｄ）を用いて、適量の野生型又は突然変異型ＳＥＡを１０〜２５ｍＣｉ  Ｎａ125Ｉで放射性標識した。アジ化ナトリウムでクエンチングすることによって反応を停止させ、タンパク質結合放射能を、Ｒ１０培地を溶離緩衝液としてＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を通過させて濾過することにより遊離ヨウ素から分離した。条件は、ヨウ素１２５とタンパク質との化学量論比が≦２：１となるように選択した。放射化学純度をＴＳＫ  ＳＷ  ３０００  ＨＰＬＣカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって確認した。放射性ヨウ素化が結合活性に及ぼす作用を野生型ＳＥＡについてだけ検査した。その結果、影響はないことが判明した（データ示さず）。
直接的結合アッセイ
予めＲ１０培地で培養したＲａｊｉ細胞６×１０4／１００μｌを円錐ポリプロピレン管に加え、１００μｌ／管の逐次希釈125Ｉ標識野生型又は突然変異型ＳＥＡと一緒に三つ組みでインキュベートした（２２℃／４５分）。細胞を１０ｍＭリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２ｍｌで洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離し、吸引した。この操作を２回繰り返した。最後に、ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ．ＵＳＡ）で細胞結合放射能について細胞を分析した。非特異的結合（即ち、Ｒ１０培地のみと一緒にでインキュベートした後の結合）を差し引いた後、飽和での見掛け解離定数Ｋd及び結合部位数ＮをＳｃａｔｃｈａｒｄの方法（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１（１９４９）６６０−７２）で計算した。
阻害アッセイ（突然変異型ＳＥＡによる125Ｉ標識野生型ＳＥＡ結合の阻害）
これらの阻害実験は、直接的結合アッセイで説明したものと殆ど同じ方法で実施した。要約すれば、５０μｌの125Ｉ標識野生型ＳＥＡを、６×１０4／１００μｌのＲａｊｉ細胞への結合について、過剰量の非標識野生型又は突然変異型ＳＥＡ（５０μｌ／管）と競合させた。阻害アッセイで最大の感度を得るために、直接的アッセイで約４０％の結合放射能を与えたトレーサー濃度を使用した。競合体の置換能力（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ）は、結合放射能を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）として表した。野生型ＳＥＡと対比した突然変異体の結合親和性は、式ＩＣ50（ＳＥＡ（ｗｔ））：ＩＣ50（ＳＥＡ（ｍ））を用いて計算した。
突然変異体が野生型ＳＥＡと同じＲａｊｉ細胞上位置への結合について競合するかどうかを分析するために、ＳＥＡ突然変異体に関して得られた結合データを対数−ｌｏｇｉｔ関数としてプロットし、野生型ＳＥＡに関する対応データとの類似を調べた。
阻害アッセイ（非標識野生型ＳＥＡ及びＳＥＡ突然変異体による蛍光標識野生型ＳＥＡの結合の阻害）
１０％ＦＣＳ、グルタミン及びゲンタマイシンを加えたＣＯ2独立培地（Ｇｉｂｃｏ）５０μｌに希釈した阻害物質（野生型又は突然変異型ＳＥＡ；０〜６０００ｎＭ）と一緒に、Ｒａｊｉ細胞（２．５×１０5）を３７℃で３０分間インキュベートした。フルオレセイン結合野生型ＳＥＡを最終濃度３０ｎＭで加え、試料を更に３０分間、３７℃でインキュベートした。１％ＢＳＡを加えた氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で試料を３回洗浄し、最終的に氷上の０．４ｍｌＰＢＳ−ＢＳＡ中に分析まで維持した。各試料に由来する１０，０００個の生存細胞を、ＦＡＣＳｔａｒ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターで緑色蛍光について分析し、ＬＹＳＩＳIIプログラムを用いて平均蛍光値を計算した。
ＳＥＡ（ｗｔ）、ＳＥＡ（ｍ）及びこれらとＣ２１５Ｆａｂとの融合タンパク質のＳＤＣＣ及びＳＡＤＣＣアッセイ
ＳＤＣＣアッセイ
ＳＥＡ（ｗｔ）、ＳＥＡ（ｍ）及びこれらとＣ２１５Ｆａｂとの融合体がＭＨＣクラスII+Ｒａｊｉ細胞に対して示す細胞毒性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激したＳＥＡ特異的Ｔ細胞系をエフェクター細胞として用いて、標準的４時間51Ｃｒ3+放出アッセイで分析した。要約すれば、51Ｃｒ標識Ｒａｊｉ細胞を、添加剤の存在下又は不在下（対照）に、所定のエフェクター対標的細胞比で、微量滴定ウェル内で２．５×１０3細胞／０．２ｍｌ培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ）でインキュベートした。特異的細胞毒性％を１００×（［ｃｐｍ実験放出−ｃｐｍバックグラウンド放出］／［ｃｐｍ全放出−ｃｐｍバックグラウンド放出］）として計算した。エフェクター対標的細胞の比は、非融合ＳＥＡの場合が３０：１、融合タンパク質の場合が４０：１であった。
ヒト結腸癌細胞に対するＳＡＤＣＣ
Ｃ２１５+ＭＨＣクラスII-結腸癌細胞ＳＷ６２０に対するＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）、Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｍ）、ＳＥＡ（ｗｔ）及びＳＥＡ突然変異体の細胞毒性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激したＳＥＡ特異的Ｔ細胞系をエフェクター細胞として用いて標準的４時間51Ｃｒ3+放出アッセイで分析した。要約すれば、51Ｃｒ3+標識ＳＷ６２０細胞を、添加剤の存在下又は不在下（対照）に、エフェクター対標的細胞比３０：１で、微量滴定ウェル内で２．５×１０3細胞／０．２ｍｌ培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ）でインキュベートした。特異的細胞毒性％をＳＤＣＣアッセイの場合と同様に計算した。
ｉｎ  ｖｉｖｏ機能実験
腫瘍細胞
ヒト腫瘍関連抗原Ｃ２１５をコードするｃＤＮＡをトランスフェクションしたＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（Ｂ１６−Ｃ２１５）（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（モノクローナル抗体−超抗原融合タンパク質）：Ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ（Ｔ細胞ベースの腫瘍治療用の腫瘍特異的物質）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，印刷中，１９９４）を、付着細胞としてほぼ集密状態まで増殖させた。培養培地は、ＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）に５×１０-5βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）及び１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を加えたものである。細胞は、０．０２％ＥＤＴＡ中で短時間インキュベートすることによって分離し、１％同系マウス血清（ビヒクル）を加えた氷冷リン酸緩衝塩水に４×１０5細胞／ｍｌで懸濁した。
動物及び動物の処置
マウスは、Ｔ細胞受容体Ｖβ３鎖に関してトランスジェニックな週齢１２〜１９のＣ５７Ｂ１／６マウスであった（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９（１９９３）５２０−５２７）。０．２ｍｌのビヒクル中で、十万個のＢ１６−Ｃ２１５腫瘍細胞を尾静脈にｉ．ｖ．注射した。第１日、第２日及び第３日に、Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）又はＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）を０．２ｍｌのビヒクル中で第５図ａ及び第５図ｂに示す用量でマウスに静脈注射した。対照マウスには同じ投与計画でビヒクルのみを注射した。腫瘍細胞の注射後２１日目に頸部切除によってマウスを殺し、肺を除去し、ブアン（Ｂｏｕｉｎ）溶液中に固定し、肺転移の数を数えた。
結果
ブドウ球菌エンテロトキシンＡの「アラニン走査」
ＳＥＡの構造は最初不明であり、どの側鎖が表面アクセス可能であるかを考察することしかできなかった。従って、突然変異体の大半は相同超抗原系列から選択した（Ｍａｒｒａｃｋ及びＫａｐｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（１９９０）７０５−７１１）。これらの超抗原の一部は保存されるようにＨＬＡ−ＤＲに結合するらしいという推論に基づいて、保存（主に極性）残基を選択した（Ｃｈｉｔａｇｕｍｐａｌａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）３８７６−３８８１）。アラニン置換を公知の方法で使用した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（１９８８）１０８１−１０８５）。この作業の間に、使用可能な情報が増加した。即ち、ｉ）Ｚｎ2+イオンはＳＥＡとＭＨＣクラスII（ＨＬＡ−ＤＲ）との間の相互作用にとって重要であることが判明し（Ｆｒａｓｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９１）５５０７−５５１１）、ｉｉ）ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）の突然変異分析が示され（Ｋａｐｐｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５（１９９２）３８７−３９６）、ｉｉｉ）ＳＥＢの構造が明らかにされた（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９（１９９２）８０１−８０６）。
ＨＬＡ−ＤＲに対する親和性が著しく減少した本発明者らの最初の突然変異体Ｄ２２７Ａは、Ｚｎ2+イオンを殆ど配位しないことが判明した（データ示さず）。ＳＥＡ及びＳＥＢが共通部分（ｃｏｍｍｏｎ  ｆｏｌｄ）を有するという前提で、この新しいデータは二つのＭＨＣクラスII結合領域の存在を示唆した。一つはＺｎ2+イオンにかかわるものであり、もう一つはＳＥＢ内で決定された部位に対応する。これらの前提に基づいて、第二セットの突然変異を行った。この第二セットの突然変異体は、アミノ末端に付加されたグリシンを有するＳＥＡの形態で発現された。最初に、この伸長は野生型ＳＥＡの結合特性に影響しないことが判明した（次のセクション参照）。
突然変異体の大半は、モノクローナル抗体の結合の分析で判断して機能形態で大腸菌により発現され分泌された（表Ｉ）。突然変異体Ｅ１５４Ａ／Ｄ１５６Ａ及びＲ１６０Ａは極めて少量であった。従って、これらの突然変異体は研究から除外した。残基１２８、１８７、２２５又は２２７にＡｌａ置換を有する突然変異体はモノクローナル抗体１Ｅによって認識されなかった。最後に挙げた二つの突然変異体は発現レベルが低く（３４℃では２４℃より顕著であった）、変性条件下ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ時により速く移動したが還元条件下ではそうではなかった（他の総ての突然変異体は野生型ＳＥＡのように移動した、データ示さず）。ＣＤスペクトル分析で判断すると、Ｄ２２７Ａの構造は天然ＳＥＡとやや異なるが（第２図）、安定性は野生型ＳＥＡに極めて類似していた（グアニジン塩酸塩変性に対する耐性として測定）。突然変異体と天然ＳＥＡ（ＳＥＡ（ｗｔ））との間のΔΔＧの計算値は−０．１６ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、ΔＧ°値（データ示さず）の約４％にすぎない。大半がβシートである構造から予測されたように、ＣＤ分析のシグナルは全体的に弱かった。最近になって、Ｈｉｓ２２５がＺｎ2+を配位することが報告された（Ｆｒａｓｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９１）５５０７−５５１１）の未公表データ）。Ａｓｐ２２７はＺｎ2+配位に関わり（上述）、おそらくはＨｉｓ２２５と同じβシート内に位置するため、これは、これら二つの残基が亜鉛配位タンパク質中の亜鉛結合核を構成することを示唆する（Ｖａｌｌｅｅ及びＡｕｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（１９９０）５６４７−５６５９）。
ＭＨＣクラスII及びＴ細胞受容体への結合
大量のＭＨＣクラスIIを露出するＲａｊｉ細胞についてフルオレセイン標識野生型ＳＥＡと競合するのに必要な量に基づき、ＭＨＣクラスII親和性を計算した。突然変異体の置換能力は、競合体としての野生型ＳＥＡについて必要な濃度と比較した結合蛍光の５０％阻害濃度（ＩＣ50）から算出した。野生型ＳＥＡ及び一部の突然変異体について、この分析の結果を、125Ｉ標識野生型ＳＥＡをトレーサーとして使用した分析の結果と比較した。表IIから明らかなように、これら二つの阻害分析で得られた数値はかなり相関している。
６個の選択した突然変異体について、ＭＨＣクラスIIへの結合を、125Ｉ標識突然変異体ＳＥＡを用いて直接測定した（表II）。突然変異体Ｈ５０Ａについては、直接的結合アッセイで得られた値と阻害アッセイで得られた値とが十分に相関していたが、突然変異体Ｆ４７Ａについては大きな矛盾が見られた。即ち、直接結合は野生型ＳＥＡの１／７の強さにすぎない結合を示したが、二つの競合分析は約１／７０の強さの結合を示した。残りの突然変異体のうち二つの突然変異体について得られたデータは、二つの別個の結合相互作用を明らかにした。突然変異体Ｈ２２５Ａ及びＤ２２７Ａの場合は、この分析でも親和性が検出限界より低かった。
本発明者らが既に明らかにしたように、ＳＥＡとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用がそれ自体を検出するには弱すぎる一方で（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，印刷中）、癌反応性抗体のＦａｂフラグメントとＳＥＡとからなる融合タンパク質は、細胞毒性Ｔ細胞に癌細胞の特異的溶解を行うように指令するために使用し得る。従って、単離超抗原を用いる分析と異なり、Ｆａｂ融合コンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）は、ＭＨＣクラスII結合とは関係なく、ＳＥＡとＴＣＲとの間の相互作用に関する機能アッセイを可能にする。そこで、Ｆａｂ部分によって認識される細胞の溶解を行うようにＴ細胞に指令する種々の結合体の効果を、クロム放出アッセイで調べた。この分析では、ＭＨＣクラスII結合に影響することが判明した突然変異がＴＣＲ結合には影響しないことが確認された（表II）。
突然変異の生物学的効果
増殖効果を、末梢リンパ球を刺激して細胞分裂させる能力として測定した。ＭＨＣクラスIIに関して殆ど競合しない三つの突然変異体はいずれも増殖を殆ど又は全く誘発せず、中間突然変異体Ｈ１８７Ａはある程度の増殖能力を示し、検査したその他の突然変異体は野生型と区別することができなかった（表III）。Ｈａｒｒｉｓら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１（１９９３）３１７５−３１８３）により、ＳＥＡ突然変異体Ｆ４７Ｇ及びＬ４８ＧのＴ細胞刺激活性が同様に著しく低いことが最近報告された。明らかに、示唆された二つの結合領域の大幅な減少は増殖誘発能力に大きく影響する。これは、ＳＥＡがＭＨＣクラスIIの二つの分子を架橋させてＴＣＲを二量化し、これがシグナル変換を行うために必要であることを示唆するものである。
これに対し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激したＳＥＡ  Ｔ細胞にＭＨＣクラスII担持標的細胞を溶解するよう指令する際の種々の突然変異体の効果は、競合能力ではなく結合親和性との相関を示す（表III）。例えば、Ｆ４７Ａ及びＤ２２７Ａの効果はそれぞれ２．５分の１及び３００分の１に減少している。従って、ここでは二価であることの生来的必要も明らかではない。活性化Ｔ細胞の表面のＴＣＲ数の大幅な増加に起因する多価度（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）の増加は、ＳＥＡ／ＭＨＣクラスII相互作用の結合活性低下の効果を部分的に隠蔽し得る。Ｔ細胞の細胞毒性を指令するのに二量化が必要でないことは、一つの抗ＣＤ３部分と一つの抗癌部分とを含む癌特異的二機能性抗体の使用によって既に立証されている（Ｒｅｎｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４（１９９４）８３３−３５）。
ｉｎ  ｖｉｖｏ機能実験
結果は第６図ａ及び第６図ｂに示す。Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）及びＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）でのマウスの処置はどちらも、Ｂ１６−Ｃ２１５メラノーマ細胞の肺転移数を減らす上で極めて効果的であった。治療効果は、標的超抗原の二つの変異体について本質的に同じであった。Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）処置では、５μｇ／注射の用量で致死率７０％であった。これに対し、Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）を同じ用量で使用した時には死亡したマウスはいなかった。全体から見れば、ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）は毒性が低下した突然変異体の一例であり、Ｆａｂ−ＳＥＡ融合タンパク質に組み込んだ時に治療効果を保持する。
考察
ＳＥＢとＨＬＡ−ＤＲとの結合体の構造は最近報告された（Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（１９９４）７１１−７１８）。この相互作用に関与することが確認されたＳＥＢ残基の大半はＳＥＡ中で保存される。突然変異体Ｄ２２７Ａに関する本発明者らのデータは、このＳＥＡ部位（アミノ近位部位）とＭＨＣクラスIIとの間の相互作用に対する親和性が弱く、Ｋd値が８μＭを超えることを示している。ＳＥＢとＨＬＡ−ＤＲとの間の相互作用のＫdは１．７μＭであることが最近報告された（Ｓｅｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６９（１９９４）３２４−２７）。ＳＥＢ、ＴＣＲ及びＨＬＡ−ＤＲの間の種々の相互作用を調べたところ、ＳＥＢとＨＬＡ−ＤＲとの結合体はＴＣＲの不在下では安定に維持されないことが判明した。その原因が速すぎるオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）にあることがプラスモン共鳴実験で明らかにされた。ＳＥＡが二つのＭＨＣクラスII分子を架橋させ、その結果ＴＣＲが二量化された時に得られる結合活性作用は、Ｋdを遥かに下回る濃度でＳＥＡが如何に増殖効果を誘発するかを説明し得るものである。突然変異体Ｆ４７Ａがアミノ近位部位の親和性を著しく低下させると想定すれば、Ｚｎ2+部位のＫdは約９５ｎＭである。この仮説は、突然変異体Ｆ４７Ｒ、Ｆ４７Ｒ／Ｈ５０Ａ及びＦ４７Ｒ／Ｌ４８Ａ／Ｈ５０ＤがＭＨＣクラスIIに対してＦ４７Ａと同じ親和性を示すという最近の観察事項（未公表）により信憑性が高まった。
ＳＥＢ構造（Ｋａｐｐｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５（１９９２）３８７−３９６）及び相同性整列比較（Ｍａｒｒａｃｋ及びＫａｐｐｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（１９９０）７０５−７１１）に基づいて、Ｈｉｓ２２５及びＡｓｐ２２７が同じβシート内に位置し、従って側鎖が近位であり得ることが強く示唆される。従って、これら二つの残基が亜鉛配位タンパク質中に存在する亜鉛結合核を構成する可能性は極めて高い（Ｖａｌｌｅｅ及びＡｕｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（１９９０）５６４７−５６５９）。これらの突然変異体と同様に、残基１２８又は１８７に置換を有する突然変異体も１Ｅ以外の総てのモノクローナルによって認識される。Ｆｒａｓｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９１）５５０７−５５１１）は、Ｚｎ2+がＳＥＡに結合し、ＭＨＣクラスIIとの親和性相互作用に必要であることを明らかにした。亜鉛に対する親和性はＨＬＡ−ＤＲの付加によって影響されなかった。この観察と、Ｚｎ2+に対する高い親和性（約１μＭのＫd）とに基づいて、ＳＥＡによってのみ与えられ且つ４倍配位（４  ｆｏｌｄ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）を含む配位が示唆された。本発明者らのデータは、４個の残基Ｎ１２８、Ｈ１８７、Ｈ２２５及びＤ２２７の関与を示している。最初の二つの残基の機能はまだ不明である。Ｎ１２８は、配位子を与えるのではなく、Ｄ２２７の脱プロトン化を補助し得る。これに関する議論の一つは、Ｄ２２７の置換の影響がＨ２２５の置換の影響より大きいということである。
ＭＨＣクラスIIに対する種々の超抗原の親和性と、Ｔ細胞を刺激して増殖させる能力との間に相関性がないことは既に報告されている（Ｃｈｉｎｔａｇｕｍｐａｌａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）３８７６−３８８１）。これらの結果は、超抗原が種々のＴＣＲ  Ｖβ鎖に対して異なる親和性を示すことによってある程度説明され得る。ここで、本発明者らは同じ相関性欠如を観察したが、別個の超抗原と対照的に、突然変異体はＦａｂ−ＳＥＡコンテクストで示したものと同じＴＣＲ親和性を示す（ＳＡＤＣＣとして測定）。相関性欠如の最も真実性のある説明は、この分析で同定された二つの結合領域が二つの別個の結合部位を表し、これが協同的結合（ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を生起するだけでなく、二つのＭＨＣクラスII分子を架橋させ、その結果Ｔ細胞受容体の二つの分子を二量化するというものである。これは、両方の部位の親和性が増殖効果を得るために重要であることを暗示している。ＳＥＡ、ＴＣＲ及びＭＨＣクラスIIの二つの分子を含む六量体結合体内の相互作用によって大きな親和性が生じる。従って、ＭＨＣクラスIIに対するＳＥＡの強い親和性／結合活性は、直接的親和性が低いにもかかわらず、ＳＥＡとＴＣＲとの相互作用を可能にする。
他の生体特異的親和性相対物
ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）とブトウ球菌プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインとの融合タンパク質を組換え技術で製造し、大腸菌内で発現させた。この試薬は、Ｔリンパ球を、Ｍｏｔ４と、ＣＤ７及びＣＤ３８陽性であるがＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ及び−ＤＲ陰性であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣから入手）とにターゲットさせるために使用することができた。Ｍｏｔ４及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は、抗ＣＤ７又は抗ＣＤ３８マウスモノクローナル（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と一緒に予備インキュベートした。マウスモノクローナルと融合タンパク質のＩｇＧ結合部との結合を促進するために、ウサギ抗マウスＩｇ抗体も加えた。
プロテインＡ−ＳＥＡ（ｗｔ）と比較すると、プロテインＡ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）はＭＨＣクラスII抗原を発現するＤａｕｄｉ細胞への結合能力が低かった。
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図面の説明
概説：突然変異体ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）（＝ＳＥＡ（ｍ９）又は突然変異体ｍ９）は本願優先日には最も期待されるＳＥＡ変異体であった。従って本発明者らは、この変異体に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ結果を選択し提示することにした（第３図〜第６図）。
第１図
ＳＥＡ及びＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡの発現に使用したプラスミドの簡単な説明図。コーディング領域及び産生物遺伝子に続く二つの転写ターミネーターは枠で示す。カナマイシン耐性タンパク質をコードする遺伝子には符号Ｋｍを付した。ｌａｃＩはｌａｃリプレッサー遺伝子である。ＶH及びＣH１はマウス抗体Ｃ２１５のＨ鎖のＦdフラグメントをコードする遺伝子を示す。また、Ｖk及びＣkはκ鎖をコードする遺伝子を表す。ｒｏｐはｐＢＲ３２２由来の複製制御タンパク質をコードする遺伝子である。産生物遺伝子の転写を指令するプロモーターは矢印で示す。ｐＫＰ８８９ではｔｒｃプロモーター、他の二つのベクターではブドウ球菌プロテインＡ（ｓｐａ）由来のプロモーターである。複製起点を含む領域はｏｒｉで示す。ｐＫＰ９４３でコードされるＳＥＡとｐＫＰ１０５５でコードされるＳＥＡとの唯一の相違は、後者のＮ末端にグリシン残基が付加されている点にある。後者のベクターに含まれているＳＥＡ遺伝子は、サイレント突然変異によって導入された単一度のより高い制限酵素部位も含む。
第２図
野生型ＳＥＡ並びに突然変異体Ｆ４７Ａ及びＤ２２７Ａの円二色性スペクトル。各ＭＨＣクラスII結合領域の最も著しく減少した突然変異体を表す。実線は野生型ＳＥＡを表す。突然変異体Ｆ４７Ａ及びＤ２２７Ａを表す曲線はそれぞれ点線及び鎖線で示した。
第３図
ＳＥＡ（ｗｔ）及びＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の超抗原依存的仲介細胞毒性（ＳＤＣＣ）の濃度依存性を示す。
第４図
Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）及びＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の超抗原依存的細胞仲介細胞毒性（ＳＤＣＣ）の濃度依存性を示す。
第５図
Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）及びＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の超抗原依存的細胞仲介細胞毒性（ＳＤＣＣ）の濃度依存性を遊離ＳＥＡ（ｗｔ）と比較して示す。
第６図ａ
Ｂ１６−Ｃ２１５メラノーマ細胞の肺転移を有するＣ５７Ｂ１／６マウスをＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ｗｔ）及びＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）でそれぞれ処置した場合の治療効果を比較して示す。
第６図ｂ
第６図ａに示した処置に関するＣ２１５−ＳＥＡ（ｗｔ）及びＣ２１５−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の毒性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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