(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性腸内病原体に対する弱毒生ワクチンを作製するために使用する、グラム陰性腸内病原体に対する弱毒生ワクチン株の遺伝子組み換え体であって、
前記弱毒生ワクチン株が、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＣＶＤ１０３−ＨｇＲ又はＣＶＤ１１１であり、
遺伝子組み換え技術を用いて前記弱毒生ワクチン株にｒｆｂＡ遺伝子及びｒｆｂＢ遺伝子を不活化させる定義された変異を導入して作製され、
前記定義された変異が、前記弱毒生ワクチン株のｒｆｂＡ及びｒｆｂＢ遺伝子領域における２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位間の欠失変異であり、
前記定義された変異に起因して、前記弱毒生ワクチン株のＯ−ＰＳ（Ｏ−ポリサッカライド）の発現が欠失しており、
異種Ｏ−ＰＳを導入して発現させると、完全な異種ＬＰＳを発現できることを特徴とする遺伝子組み換え体。
【請求項２】
前記定義された変異が、前記弱毒生ワクチン株染色体のｒｆｂＡ及びｒｆｂＢ遺伝子を含むＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片内の２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位間の領域が除去された断片を含むポリヌクレオチドを用いた遺伝子組み換えにより導入された変異である請求項１記載の遺伝子組み換え体。
【請求項３】
前記弱毒生ワクチン株が、Ｏ１又はＯ１３９Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅである請求項１又は２に記載の遺伝子組み換え体。
【請求項４】
さらに、異種Ｏ−ＰＳを発現する請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え体。
【請求項５】
前記異種Ｏ−ＰＳの発現が、ソネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）由来ｒｆｂ／ｒｆｃsonnei遺伝子、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅｌ）由来ｒｆｂdysenteriae遺伝子、及びビブリオ・コレラＯ１３９（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＯ１３９）由来ｒｆｂO139遺伝子からなる群から選択される遺伝子の導入に起因する請求項４記載の遺伝子組み換え体。
【請求項６】
さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ｒｆｅ遺伝子が導入された請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え体。
【請求項７】
さらに、異種ＬＰＳコアを発現する請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え体。
【請求項８】
前記異種ＬＰＳコアの発現が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ｒｆａR1遺伝子の導入に起因する請求項７記載の遺伝子組み換え体。
【請求項９】
前記完全な異種ＬＰＳが、前記弱毒生ワクチン株のリピドＡ（ｌｉｐｉｄＡ）と、前記弱毒生ワクチン株のＬＰＳコアと、異種Ｏ−ＰＳとが結合した異種ＬＰＳである請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え体。
【請求項１０】
前記完全な異種ＬＰＳが、前記弱毒生ワクチン株のリピドＡ（ｌｉｐｉｄＡ）と、異種ＬＰＳコアと、異種Ｏ−ＰＳとが結合した異種ＬＰＳである請求項７又は８に記載の遺伝子組み換え体。
【請求項１１】
異種遺伝子の発現が、前記弱毒生ワクチン株ゲノムのｈｙｌＡ、ｈｌｙＢ、ｃｔｘＡ、ｒｆｂＡ、ｒｆｂＢ、及びｒｆｂＡ／ｒｆｂＢからなる群から選択される遺伝子座への遺伝子導入により実現されている請求項１から１０のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え体。
【請求項１２】
グラム陰性腸内病原体であるソネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）に対する生ワクチンであって、
請求項９記載の遺伝子組み換え体を含み、
前記遺伝子組み換え体において、前記弱毒生ワクチン株がＣＶＤ１０３−ＨｇＲ株であり、前記異種Ｏ−ＰＳがソネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）のｒｆｂ／ｒｆｃsonnei遺伝子に由来する異種Ｏ−ＰＳであることを特徴とする生ワクチン。
【請求項１３】
さらに、薬学的に容認できるキャリア、胃酸度を中和するための緩衝剤、及び、前記生ワクチンを生きたまま腸管へ輸送するためのシステムからなる群から選択されるものを含む請求項１２記載の生ワクチン。
【請求項１４】
グラム陰性腸内病原体であるソネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）に対する免疫接種のために使用する請求項１２又は１３に記載の生ワクチン。
【請求項１５】
経口投与又は鼻内投与により使用する請求項１２から１４のいずれか一項に記載の生ワクチン。
【請求項１６】
グラム陰性腸内病原体に対する免疫感作のための生ワクチンの製造方法であって、請求項１から１１のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え体を使用することを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
グラム陰性菌からの異種Ｏ抗原の高レベルの発現に有用な生ワクチン担体株と生ワクチンとして使用するためのその誘導体
本発明は、グラム陰性菌からの異種Ｏ抗原（Ｏ−ＰＳ）の発現と輸送に有用なグラム陰性弱毒生ワクチン担体株に関する。前記株は、定義された遺伝子修飾のため、同種Ｏ−ＰＳの発現には不足し、好ましくは欠失し、そして、そのため望ましい異種Ｏ−ＰＳを、同種もしくは異種ＬＰＳコアリピッドＡと共有結合するように効率的に発現することができる。さらに本発明は、Ｏ−ＰＳをコードする異種遺伝子または一組の異種遺伝子群を含む生ワクチン担体株に関する。好ましくは、前記株は、完全平滑異種ＬＰＳの合成に必要な遺伝子をさらに含む。また本発明は、前記株を、好ましくはグラム陰性腸内病原体に対する免疫感作のために含む生ワクチンに関する。
グラム陰性腸内病原体は、軽度の漿液性下痢から、発熱、血便性下痢、胃や腸の穿孔または潰瘍といった生命を脅かす重篤なものまで広範な徴候を示す様々な疾患の単独症状もしくは合併症の原因となる。そのような疾患の例としては、腸チフス熱、細菌症赤痢、コレラ、腸毒素産生性大腸菌、腸病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌による感染症ならびにヘリコバクターピロリやカンピロバクタージジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｖａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）による感染症があげられる。
その感染プロセスの第一段階は消化管内の粘膜表面に起こる。そのため、徴候があらわれる前に感染のこの最初の段階を妨げることは特に魅力的なアプローチとなる。これを達成するための最も効果的な手段は、経口投与ワクチンの使用によって局所的防御免疫反応を引き起こすことである（メステッキー著、ジャーナル  オフ  クリニカルイミュノロジー７（Ｍｅｓｔｅｃｋｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７）、（１９８７）、２６５−２７６）；マックギー、キヨノ共著、インフェクシャス  エージェント  ディジーズ２（Ｇｈｅｅ＆Ｋｉｙｏｎｏ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ．２）（１９９３），５５−７３；ウォーカー著、ワクチン１２（Ｗａｌｋｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ１２）（１９９４）３８７−４００）。現在のところ、腸疾患に対しては、２つの経口弱毒生ワクチンのヒトへの使用が承認されている。これらは、腸チフス熱予防のためのサルモネラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）のＴｙ２１ａ株と、コレラ予防のためのビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＣＶＤ１０３−ＨｇＲ株である（ゲルメニア、フューラー共著、ジャーナル  オブ  インフェクシャス  ディジーズ１３１（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ  ａｎｄ  Ｆｕｒｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３１）（１９７５），５５３−５５８）；リーバン他著、ランセット（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ）（１９８８），４６７−４７０）。
例えばＳ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ種）といった数種の腸内病原体に対する防御が、細胞表面成分、特に通常Ｏ−ポリサッカライド（Ｏ−ＰＳ）と呼ばれるＬＰＳのＯ−抗原成分に対する免疫反応の誘発に関連していることが多く実証されている。例えば、天然罹患もしくは実験的に誘発された疾患からの回復後の細菌性赤痢に対する免疫性は、血清型特異的抗ＬＰＳ抗体の実質的な上昇と関連する（デュポン他著、（ＤｕＰｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２５（１９７２），５−１１；Ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２（１９７２），１２−１６；ヘーリングトン他著、ワクチン８（Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ８）（１９９０），３５３−３５７）。さらに疫学研究の所見からも、この分野のＳｈｉｇｅｌｌａ感染に対する防御と血清抗ＬＰＳ抗体の濃度の上昇が関連することがわかった（コーエン他著、（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５７（１９８８），１０６８−１０７１）。
ＳｈｉｇｅｌｌａＬＰＳに対する高濃度の血清抗体を、Ｓｈｉｇｅｌｌａのそのような種が流行している地域に住む、これらの病原体の天然被曝および／または感染を受けたと推定される者から検出することができる。
ＬＰＳはグラム陰性菌の外膜の必須構成要素であり、細胞表面成分の７０％をしめることもある。ＬＰＳは３つの部分からなり、最も内側がリピドＡで、それはホスホリピッド外膜２重層に包埋されている。コアポリサッカライドは通常２−ケト、３−デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）を介してリピドＡ成分と付着する。そのコアは通常５〜７の糖類を含む。現在までに、腸内菌科に７種のコア分子が確認され、Ｒａ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｋ−１２、Ｂと名づけられている。腸内菌と比較すると、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、フルクトースや単一のＫＤＯ分子をその内コアに含む珍しいコア構造をもつ（コンドウ他著、カルボヒドレイトリサーチ２３１（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２３１）（１９９２），５５−６４）。ＬＰＳコアの生合成は、ｒｆａ座によってコードされる。腸内菌の中でも、ｒｆａ座やｒｆｂ座は同一連鎖群に属さないようである。対照的に、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおけるこの２つの座は少なくとも部分的には密接な結合をしていることを示唆するいくつかの証拠が存在する（マニング他著、（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、「ビブリオ・コレラとコレラ：分子的展望から地球的展望まで」ｐ７７−９４，（Ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｅｒａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）（１９９４）；ワクスマスＫ．ブレーク、Ｐ．Ａ、オルスヴィック（共編）（Ｗａｃｈｓｕｍｕｔｈ  Ｋ．，Ｂｌａｋｅ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｌｓｖｉｋ．￥（ｅｄｓ．）．）Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；アメリカンソサエティー  フォー  マイクロバイオテクノロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ））。
ＬＰＳ分子の最も外側の部分は、様々な長さの繰返しサッカライド単位からなるＯ−ＰＳで構成されている（リューデリッツ他著、カレントトピックス  メンブレン  アンド  トランスポート１７（Ｌｕｕｄｅｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｍｂｒ．Ｔｒａｎｓ．）１７（１９８２）、７９−１５１；リーツ他著、アニュアル  レヴュー  バイオケミカル５９（Ｒａｅｔｚ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９）（１９９０），１２９−１７０）。ＬＰＳ分子のＯ−ＰＳ領域は、細菌に血清特異性を与える。ＬＰＳ分子は、例えば、ポリンや他の外膜タンパク質（ＯＭＰ）など外膜表面上に発現した他の分子と密接に相互作用し、外膜の浸透性を決定する。ＯＭＰの組立てならびに細胞からのタンパク質の分泌が、Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳ中の突然変異の影響を受けることは公知である（レイアード他著、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー１７６（Ｌａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６）（１９９４），２２５８−２２６４；スタンレー他著、モレキュラー  アンド  マイクロバイオロジー１０（Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０）（１９９３），７８１−７８７）。
Ｏ−ＰＳ内に存在する糖類のみならず、それらの化学結合や配列も血清特異性を与える（Ｌｕｕｄｅｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｍｂｒ．Ｔｒａｎｓ．１７（１９８２），７９〜１５１）。従って、Ｏ−ＰＳはグラム陰性菌種間で非常に多様であるが、一方、コアポリサッカライドは、所与の種や属内で比較的一定している（Ｌｕｕｄｅｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．１７（１９８２），７９〜１５１；Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０（１９９３），７８１〜７８７）。例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属には合計４７の公知の血清型がある。それらは、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（サブグループＡ，１２血清型）、フレクスナー赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（サブグループＢ，１３血清型）、ボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）（サブグループＣ，１８血清型）、ソネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）（サブグループＤ，１血清型）の４つの主病原体種に分類される（イーウィング著、イーウィングＷ編「エドワードとイーウィングによる腸内菌科の確認」第４刷  エルセヴィア  サイエンス出版社、ニューヨーク（Ｅｗｉｎｇ，Ｉｎ：Ｅｗｉｎｇ  ＷＨ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｅｗｉｎｇ′ｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｅｌｅｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｃｏｍｐ．（１９８６），１３５〜１７２）。例えば、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉにおいては、Ｏ−ＰＳは、２つの珍しい糖類をもつ二糖類繰り返し単位、２−アセトアミド−４−アミノ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−ガラクトースと１，４結合によって結合している２−アミノ−２−デオキシ−Ｌ−アルツロニン（ａｌｔｕｒｏｎｉｃ）酸からなる（ケン他著、（Ｋｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．７８（１９８０），１１９〜１２６）。対照的に、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（赤痢菌の標準種）の血清型１のＯ−ＰＳはラムノース−ラムノース−ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコースアミンの繰り返しブロックにより構成される（イーウィング、リンドバーグ共著、ベルガンＴ．編「メソード  イン  マイクロバイオロジー」１４巻、アカデミック出版、ロンドン、（Ｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｖｅｒｇ，Ｉｎ：Ｂｅｒｇａｎ  Ｔ．（ｅｄ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｏｒｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１４．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１１３−１４２））。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ０１のＯ−ＰＳは１７〜１８のペロサミン（ｐｅｒｏｓａｍｉｎｅ）サブユニットからなり、そのそれぞれが３−デオキシ−Ｌ−グリセロ−テトロン酸によってアクリレート化されている。キノボースアミンもまた低濃度で発見されているが、そのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ０１のＯ−ＰＳ内の位置は不明である（レッドモンド著、ＦＥＢＳレター５０（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）５０（１９７５），１４７−１４９；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１００（１９８２），３４１−３４９）。
腸細菌性Ｏ−ＰＳの生合成に関与する酵素類はｒｆｂ座によってコードされる。Ｓｈｉｇｅｌｌａ種の場合、ｒｆｃと名づけられた付加遺伝子は、個別の繰り返し単位を様々な長さの鎖に重合する機能を果たすＯ−ＰＳポリメラーゼをコードする。大半のＳｈｉｇｅｌｌａ種では、ｒｆｂ／ｒｆｃ座は染色体上にある（クリーナ、シュナーチマン共著、マイクロバイオロジー  レヴュー５７（Ｋｌｅｎａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎａｔｉｍａｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）５７（１９９３），６５５−６８２）。しかし、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種の中には、ｒｆｂ座の全てもしくは一部がプラスミッドエピゾーム上にあるものもある（モーレリー著、サンソネッティー共著（Ｍａｕｒｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．４２（１９８８），１２７−１５０）。腸内細菌性の共通抗原（ＥＣＡ）の生合成に関与するｒｆｅと名づけられた付加遺伝子は、Ｏ抗原グループＣ１及びＬのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種におけるＯ−ＰＳ合成に必要であり（クーン他著（Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＭＳ  Ｍｃｒｏｂｉａｌ．Ｒｅｖ．５４（１９８８），１９５−２２２；マケラ他著、ジャーナル  オブ  ジーン  マイクロバイオロジー６０（Ｍａｋｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ６０）（１９７０），９１−１０６）、同様にＥ．ｃｏｌｉのいくつかの血清型及びＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタイプ１におけるＯ−ＰＳ合成に必要である（Ｋｎｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｃｒｏｂｉａｌ．Ｒｅｖ．５４（１９８８），１９５−２２２；シュミット他著、（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７（１９７６），７５５  ７６２；Ｋｌｅｎａ  ａｎｄ  Ｃｈｎａｉｔｍａｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７（１９９３），６５５−６８２）。ｒｆｐと名づけられた、さらに別の遺伝子はガラクトシル転移酵素をコードし、そして、それはＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ型１の全長Ｏ−ＰＳの生成に必要である（Ｋｌｅｎａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７（１９９３），６５５〜６８２頁）。さらに、血清型変換は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種及びＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉに溶原性の特定のファージによって促進されるＯ−ＰＳ糖の置換によって達成され得る（クラーク他著（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  １０７（１９９１），４３〜５２；バーマ他著、（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．）Ｇｅｎｅ  １２９（１９９３）１０１）。
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの特異的ケースにおいては、ｒｆｂの全ての座は染色体上でコードされる。ペロサミン合成（ｒｆｂＡＢＤＥ）、重合されたＯ−ＰＳの細胞表面への輸送（ｒｆｂＧＨＩ）、並びにテトロン酸のペロサミンサブユニット上への転移（ｒｆｂＫＬＭＮＯ）に関与する各遺伝子は、連続して単一オペロンを構成すべく組織化されている。さらに、ｒｆｂＰＱＲＳと名づけられた機能不明の４つの遺伝子が、オペロンの３’末端を構成する。ｒｆｂオペロンに直接に隣接しているのはｒｆｂＴ遺伝子であり、それはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの０１菌株のＩｎａｂａとＯｇａｗａ血清特異性を決定している。近年、Ｉｎａｂａ血清型株がｒｆｂＴ突然変異体であると判明した（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，７７−９４，Ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｈｌｅｒａｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｅｒａ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（１９９４）．Ｗｃｈｓｍｕｔｈ，Ｋ．，Ｂｌａｋｅ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｌｓｖｉｋ，φ（ｅｄｓ．）．Ｗａｓｈｉｇｎｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．）。
上記のように、局所的腸内免疫反応の誘発は多くの腸内病原体による感染を予防するための最も有効な手段かもしれない。これを達成するための証明された有効な方法は、経口弱毒生ワクチン株の使用である。上記のＳ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａやＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅＣＶＤ１０３−ＨｇＲワクチン株は、不発感染プロセスを起こし、それによって天然感染の影響を受けたのと非常によく似た免疫反応を誘発する。上記２つの株は、ヒトにとって極めて安全であるという明確な利点を持っている（リーバン他著、レヴュー  ディジーズ  １１（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｄｉｓ．１１）（１９８９），（ｓｕｐｐ１３），５５２−５６７；クライツ他著、（Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ．）、インフェクシャス  イミュノロジー６１（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１）（１９９３），１１４９−１１５１；リーバン、ケイパー共著（Ｌｅｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｋａｐｅｒ）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１（１９９３）２０７−２１２）。
安全性は、経口投与生ワクチンの開発において最も達成困難な特性であるとされていた。多くの場合、ワクチン株の候補は、保護免疫反応を誘発するが有害反応が受忍限度をこえているか、安全性はあるが非防御的であるかのどちらかであった（リンドバーグ著、「ワクチンと遺伝子治療」クライツＪｒ．Ｓ．Ｊ編、パーガモン出版ニューヨーク（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｒｙｚ  Ｊｒ，Ｓ．Ｊ．（ｅｄ．）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）（１９９１），９５〜１１２；リーバン、ホーン共著、「ワクチンと遺伝子治療」Ｌｅｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｏｎｅ，Ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．）Ｃｒｙｚ  Ｊｒ，Ｓ．Ｊ．（ｅｄ．）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ、（１９９１），５９〜７２）。
上記のように、認可された経口投与弱毒生ワクチン株を、異種ワクチン抗原を腸管へ輸送するための担体として使用することは望ましい。Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ株をワクチン抗原の担体として使用する試みは、見込みのある結果をもたらさなかった（クラチスＩＩＩ「ニュージェネレーションワクチン」ウッドローＧ．Ｃ．＆リーバンＭ．Ｍ．（共編）、マーセルデッカー社ニューヨーク（Ｃｒｕｔｉｓｓ  ＩＩＩ，Ｉｎ；Ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｇ．Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｍ．（ｅｄｓ．）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．）（１９９０），１６１〜１８８；カーデナス、クレメンツ共著、クリニカル  マイクロバイオロジー  レヴュー５（Ｃａｒｄｅｎａｓ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５）（１９９２），３２８〜３４２）。これは、この株が多発性突然変異を誘発する高力価の化学的変異誘発物質を用いて開発されたという経緯からほぼ説明がつく。従って、正確な弱毒突然変異体は不明である。さらに、Ｔｙ２１ａ株は生体内では複製が不十分であり、ワクチンの多回投与の必要がある。対照的に、ＣＶＤ１０３−ＨｇＲワクチン株は、正確な遺伝子病変の確認が可能な組換えＤＮＡ技術を用いて作成された（ケトレイ著、（Ｋｅｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１（１９９３），１５〜２２頁）。さらに、この株は、実験的コレラに対して高レベルの免疫性を誘発するためにワクチンは単回投与だけでよいという事実が証明しているように、この株は生体内での複製がよいようである（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ（１９８８），４６７〜４７０頁）。
上記株を担体として使用した最初の試みは二価のワクチンの開発を予見するものであった。そのような場合、組換え株は２つのＯ−ＰＳ抗原を共同発現させるだろう。しかし、そのような二価のワクチン株の開発の成功は、様々な理由から極めて困難であることが判明した。その理由のいくつかを示す。第一に、実験データによれば、Ｏ−ＰＳ成分とＬＰＳコア領域との間の共有結合が、免疫性の効率的な誘発にあらかじめ必要であると思われる（ベックマン他著、ネイチャー２０１（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１）（１９６４），１２９８〜１３０１；Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５４（１９８８），１９５〜２２２；アトリッジ他著、マイクロバイオロジックパソロジー（Ａｔｔｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．８（１９９０），１７７〜１８８；バーロン他著（Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５（１９８７），２７９７〜２８０１）。第二に、２つのＯ−ＰＳ実体を共同発現すると、しばしば１つの抗原をマスクする結果となり、それによって免疫反応をブラントする（Ａｔｔｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．８（１９９０），１７７〜１８８；フォレスト他著（Ｆｏｒｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖａｃｃｉｎｅ９（１９９１），５１５〜５２０）。第三に、依然として組換え株は担体株に関連した防御抗原を完全に発現しなければならない。最後に、外来抗原の発現が、二価株が生体内で複製するか、もしくは粘膜表面をコロニー化する能力に悪影響を及ぼしてはならない。
下記の例は、二価ワクチン株を作成する際に遭遇する実際的な問題を示している。フォーマル他著（Ｆｏｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１９８１），７４６〜７５０）は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの１２０Ｍｄａｌ毒性プラスミドをＳ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ接合を介して導入した。５０７６−１Ｃと名づけられた結果ハイブリッド株はＳ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳ抗原を発現した。それはＳ．ｔｙｐｈｉＬＰＳコアと結合しないカプセル状の物質であるＴｙ２１ａの表面のプラスミッドによってコードされている（ザイド他著、ジャーナル  オブ  バイオロジックケミストリー（Ｓｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１９８４），９０２８〜９０３４）。志願者をこの株で免疫化した結果、激しい抗Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  ＬＰＳ抗体反応が起こった。しかし、攻撃試験においては、様々なロットのこのワクチンはＳ．ｓｏｎｎｅｉ疾患に対して有意の防御を一貫してもたらすことはできなかった（Ｈｅｒｒｉｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ８（１９９０），３５３〜３５７；ブラック他著（Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５（１９８７），１２６０〜１２６５；ファンデバーグ他著（Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｖｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８（１９９０）２００２〜２００４）。この可変的防御の正確な理由は明らかにされてはいない。可能な説明としては、１）効率的にコロニー化する能力によってＴｙ２１ａ株の表面にＳ．ｓｏｎｎｅｉ抗原が存在することが妨げられる。２）その毒性プラスミドがＳ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳや他の毒性関連抗原の発現によって妨げられる自発的欠失を引き起こすＴｙ２１ａ内において遺伝的に不安定であることがわかった。３）Ｔｙ２１ａ内のＳ．ｓｏｎｎｅｉプラスミドの発現が、生残率、増殖またはコロニー形成の低下といった生体内でのみはっきり示される有害効果を誘発し得た。
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＯ−ＰＳ生合成をコードする遺伝子を株ＥＸ６４５を生成するＴｙ２１ａに導入することによって二価ワクチン株を作った。この株は、志願者に投与された時、たとえ異種Ｏ−ＰＳがＬＰＳコアと結合したとしても、中等度の抗Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＬＰＳ免疫反応を誘発した（Ｆｏｒｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５９（１９８９），１４５〜１４６頁）。ＥＸ６４５の免疫接種による実験的コレラに対して中等度の防御ができたにすぎなかった。続く研究においては、より長いＳ．ｔｙｐｈｉＯ−ＰＳが、やや短いＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅＯ−ＰＳユニットをマスクする可能性があったことが示され、免疫反応の悪さを説明している。ＥＸ８８０と名づけられた、ＥＸ６４５の誘導体を、Ｓ．ｔｙｐｈｉＯ−ＰＳの発現に関与する遺伝子を不活化することによって作成した。ＥＸ８８０は、ＥＸ６４５と比較して、はるかに激しい抗Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＬＰＳ抗体反応を引き起こすことがわかった（Ａｔｔｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９（１９９１），２２７９〜２２８４）。
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのｒｆｂ／ｒｆｃ及びｒｆａＲ１座を、適合性プラスミッドを使用してＣＶＤ１０３−ＨｇＲに導入した（ビレット他著（Ｖｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（１９９３），２３９〜２５２）。これは、ＬＰＳコアと結合したＳ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳの有効発現を可能にした。しかし、これらの同じ遺伝子位置がＣＶＤ１０３−ＨｇＲ（株ＣＨ３，ＣＨ９）の染色体に導入されたとき、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳはＬＰＳコアと共有結合しないか、わずかしかしなかった（ビレット、ファーブル共著、バイオロジカル２２（Ｖｉｒｅｔ  ａｎｄ  Ｆａｖｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）２２（１９９４），３６１〜３７２）。かわりに、その物質はＣＶＤ１０３−ＨｇＲ表面にカプセル状の物質として発現した。
上記観察は下記を示唆している。１）同種Ｏ−ＰＳの合成が抑制を受けたときのみ、異種Ｏ−ＰＳが、同種もしくは異種ＬＰＳコアと効率的に結合できる。２）適切な条件のもとで、異種Ｏ−ＰＳがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの独自のコアと共有結合することが可能となり、そのため異種コア分子をコードする遺伝子を導入する必要がなくなる。３）二価のワクチンを作り出す同じ担体株による２つの異なるＯ−ＰＳ分子の共同発現が不可能なこともある。従って、それぞれ異なるＯ−ＰＳ成分を示す２つの完全なＬＰＳ分子の効率的な同時発現が単一宿主株の容量を超え得る。考えられる理由としては、転写レベルでのそれぞれの遺伝子の発現による妨害、Ｏ−ＰＳ分子の細胞外側表面といった外膜構造への転写に関与する分子の生合成に関与する成分を制限するための競合、またはＬＰＳコア分子上の有効な部位へ導入または結合するためのＯ−ＰＳ分子間の競合、がある。
前記の自然発生的なこれらの問題を避ける試みの中で、Ｏ−ＰＳの合成には不足しているＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅＣＶＤ１０３−ＨｇＲの定義されていない突然変異体を分離した。そのような株は、染色体上に組込まれたｒｆｂ／ｒｆｃ座によってコードされたＳ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳのＬＰＳコアへの共有付着をサポートすることが可能であった。しかし、そのような株の中に存在する突然変異体の性質が定かでないために、それらをヒトに使用することは認められていない。
従って、本発明の根拠となる技術的問題は、弱毒生ワクチン担体株を提供することである。それは、グラム陰性菌からの異種Ｏ抗原（Ｏ−ＰＳ）を異種Ｏ−ＰＳが免疫反応を誘発し得るように発現と輸送するのに有用であり、しかも安全でワクチンとしての投与が許容されるものである。
前記技術的問題の解決は請求項に特徴を述べた態様により達成される。驚くべき発見によれば、定義された遺伝子修飾を弱毒生ワクチン株に導入でき、前記株を異種抗原の担体として最適ならしめるために必要な担体株の機能を妨げず、同種Ｏ−ＰＳの合成において前記株の欠失を導き、それによって異種Ｏ−ＰＳがＬＰＳコアと共有結合し、免疫反応を誘発できるように、望ましい異種Ｏ−ＰＳを効率的に発現することができる。
本発明の態様は、とりわけ、一価のワクチン株の作成を可能とし、下記の特徴を持つ。１）経口弱毒生ワクチン株、好ましくはヒトへの使用に適するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅＣＶＤ１０３−ＨｇＲの異種抗原の担体としての使用する、２）正確な突然変異体、例えば非致死のｒｆｂ遺伝子内への導入によって同種Ｏ−ＰＳの合成には不足し、同種ＩｎａｂａＯ−ＰＳの合成を止め、そして異種Ｏ−ＰＳのＬＰＳコアとの共有結合を可能とするための前記担体株の修飾する、３）異種の、重合された他の腸内病原菌由来のＬＰＳ分子を生成し、それらを発現させるのに必要な遺伝子を含有する。尚、ここでクローン化された異種遺伝子を担体株の表現型に有害作用を及ぼさない部位、特に、経口投与後に防御免疫反応を誘発し得る形質へ組み込むことによって安定した発現が達成される。４）コードされたＯ−ＰＳが、担体株のＬＰＳコアもしくは適切なｒｆａ座の導入後、担体株によって生成される異種ＬＰＳコアのどちらかと共有結合するように異種Ｏ−ＰＳ遺伝子を発現する。５）異種Ｏ−ＰＳ成分を持つＬＰＳ分子が担体株の表面に発現される、好ましくは外膜タンパク質に組込まれる、６）ヒトへの使用に適する担体株の遺伝子型／表現型が維持される。
そのようなワクチン株を作るために、Ｏ−ＰＳの合成を削除するために、様々な遺伝子修飾を、担体株のＯ−ＰＳ発現のための遺伝子中へ導入した。
驚いたことに、腸内Ｉｎａｂａ  ｒｆｂ座（約２０ｋｂ）の欠失はＣＶＤ１０３−ＨｇＲ及びそのＳ．ｓｏｎｎｅｉ  ｒｆｂ／ｒｆｃをもつ誘導体（株ＣＨ３及びＣＨ９）に致死的な作用を及ぼした。そのため、ｒｆｂ座内またはその近隣に不可欠な機能をコードする遺伝子が存在しなければならないこと、そして、そのような機能が欠けている株は、恐らくはその機能的外膜構造を合成することができないため、増殖不能であろうということが推定された。それゆえに、例えば、特異的欠失をｒｆｂ座の３つの異なる領域内へ導入することが求められてきた。非致死の欠失をｒｆｂ座に導入することがその目標であった。そしてそれは同種ＩｎａｂａＯ−ＰＳ成分の発現を止めることに加えて、異種Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳとＩｎａｂａＬＰＳコアを共有結合することをサポートするであろう。そのような構成の第一はｒｆｂＥＧＨＩ突然変異体であった。ｒｆｂＥ座は、ペロサミン合成物をコードする。一方、ｒｆｂＧ，Ｈ，Ｉ座は、外膜を介してＩｎａｂａ  Ｏ−ＰＳの輸送に関与する（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．７７  ９４，Ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｅｒａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（１９９４）．Ｗａｃｈｓｍｕｔｈ  Ｋ．，Ｂｌａｋｅ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｌｓｖｉｋ．（ｅｄｓ．）．Ｗａｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。ｒｆｂＥＧＨＩ欠失がＣＶＤ１０３ＨｇＲにおいて致死的であることがわかった。第二の株では、ｒｆｂＮ座（ペロサミン置換３−デオキシ−Ｌ−グリセロ−テトロン酸の合成に関与している）の欠失が、Ｉｎａｂａのコアと結合しない異種Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳの弱い生成のみを偶発的に生み出した。従って、Ｉｎａｂａ  ｒｆｂ座内の特殊の遺伝子機能が、異種Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  ｒｆｂ遺伝子の発現にも、そのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅＬＰＳコアとの、まだ明らかにされていない方法での共有結合にも有用である。次にｒｆｂＡ座とｒｆｂＢ座は、この２つの座の間の結合と重複する１．２ｋｂの断片を欠失させることによって不活化した。これらの座はＩｎａｂａＯ−ＰＳのペロサミン成分の合成に関与している。特に、ｒｆｂＡタンパク質はホスホ-マンノースイソメラーゼまたはマンノース−１−ホスファートグアニル転移酵素活性を有する酵素と関連し、一方でｒｆｂＢ座は恐らくホスホ−マンノムターゼをコードする。ｒｆｂＡ／ｒｆｂＢ突然変異体をＳ．ｓｏｎｎｅｉ  ｒｆｂ／ｒｆｃ座を含むＣＶＤ１０３−ＨｇＲへ導入することによって、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳと全長ハイブリッドＬＰＳ分子を引き起こすＩｎａｂａＬＰＳコアの発現と共有結合を可能とした。Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  ｒｆｂ／ｒｆｃ座を用い、またＲ１コアを用いるか用いずに、ＩｎａｂａｒｆｂＡ／ｒｆｂＢ欠失を発現する組換え株が遺伝子型的、表現型的に生体外経路では安定であることがわかった。さらに、これらの株はヒトにおける使用に適するＣＶＤ１０３−ＨｇＲ株の全ての特徴：１）コレラ毒素活性の欠如、２）非毒性Ｂサブユニットコレラ毒素の生成、３）毒素共調節繊毛の発現、ならびに４）高濃度の水銀イオンの存在下での成長能力���を有していた。
従って、本発明は、下記の特性によって特徴づけられるグラム陰性腸内病原体に対する弱毒生ワクチンに関する。
（ａ）定義された遺伝子修飾による同種Ｏ−ＰＳの発現の欠失
（ｂ）異種Ｏ−ＰＳがＬＰＳコアと共有結合するように前記Ｏ−ＰＳを効率的に発現する能力
ここで使用されている「定義された遺伝子修飾」という語は、組換えＤＮＡ技術によって導入された全ての修飾及びランダムな突然変異形成もしくは自発的な突然変異によって導入された修飾とは対照的に、その性質と位置について定義されている全ての修飾を含む。前記修飾は、ヌクレオチドの欠失、付加、置換または再配列でありうるが、復帰突然変異体を発生させないことが好ましい。本発明による最適な遺伝子修飾は、下記の実施例に示された教示に従って当業者により導入され得る。そのような修飾は、前記株を異種Ｏ−ＰＳのための担体として最適ならしめるために必要な担体株の諸機能を妨げるべきでないが、同種Ｏ−ＰＳの発現を十分削除すべきである。例えば、同種Ｏ−ＰＳの生合成に影響を及ぼす前記修飾は、異種Ｏ−ＰＳ、例えば、リピドＡ、ＬＰＳコアの合成、Ｏ−ＰＳの合成と細胞外側表面への輸送、ＬＰＳ分子の外膜への固着に関与する遺伝子からなる完全ＬＰＳの生合成に不可欠な遺伝子の発現に有害な作用を及ぼすべきでない。
前記修飾により、前記株は、同種リピドＡと同種および／または、下記の特殊な態様においては、異種のＬＳＰコアのみからなるＬＰＳ分子を合成する。好ましくは、前記修飾は欠失である。ここで使用する「同種Ｏ−ＰＳの発現の欠失」という語は、同種Ｏ−ＰＳが全体的に削除されるか、または望ましい異種Ｏ−ＰＳの効率的な発現及びその担体株のＬＰＳコアもしくは、択一的に異種ＬＰＳコアとの共有結合が可能となるように少なくとも減少するかを意味する。
ここで使用される「異種Ｏ−ＰＳを効率的に発現する能力」という表現は、前記Ｏ−ＰＳを、生成される異種Ｏ−ＰＳの量が免疫反応を導き出すのに十分な量であるように発現することが可能であることを意味する。
好ましい態様によれば、前記ワクチン株担体はｒｆｂ、ｒｆｃおよび／またはｒｆｐ座もしくはそれらの組み合わせに含まれる遺伝子内の定義された遺伝子修飾によるものであり、それはＯ−ＰＳ生合成に関与する。
特に好ましい態様によれば、ワクチン株担体は、定義された遺伝子修飾がｒｆｂＡ、ｒｆｂＢ，ｒｆｂＤおよび／またはｒｆｂＥ遺伝子またはそれらの組み合わせに、好ましくはｒｆｂＡおよび／またはｒｆｂＢ遺伝子内にある。
最も好ましいのは、前記遺伝子修飾が図１のｐＳＳＶＩ２５５−２０として示された欠失に対応する欠失であるワクチン株である。この欠失は、ｒｆｂInabaオペロンの最初に位置し、１．２ｋｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片の削除に関する。それはペロサミンＯ−ＰＳサブユニットの生合成に関与するｒｆｂＡ遺伝子、ｒｆｂＢ遺伝子を不活化する。
適切なワクチン株は、当業者が望ましい目的に応じて選択し得る。そのような担体株としては、例えば、下記のＣＨ１９、ＣＨ２１、ＣＨ２２、ＣＨ２４、ＣＨ２５またはＣＨ３０がある。
好ましい態様によれば、前記ワクチン株は、Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属の株、Ｓ．ｔｙｐｈｉ株、Ｏ１もしくはＯ１３９Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、ヘリコバクターピロリもしくはカンピロガクタージジュニである。好ましいＳ．ｔｙｐｈｉ株は、Ｓ．ｔｙｐｈｉＴｙ２１ａ、Ｓ．ｔｙｐｈｉＣＶＤ９０８、もしくは付加弱毒突然変異体を含むＳ．ｔｙｐｈｉＣＶＤ９０８である。
付加弱毒突然変異体の例としては、ＲｐｏＳシグマ因子のような転写シグナルをコードするｖｉａＢまたはｈｔｐＲ遺伝子の中の突然変異体、もしくは環境的ストレス耐性や新しい成長条件への適応能力といった毒性の形質に関与する遺伝子中の突然変異体または、芳香族の酸の合成に関与する遺伝子中の突然変異体があげられる。
好ましいＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株としては、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＣＶＤ１０３、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＣＶＤ１０３−ＨｇＲ，ＣＶＤ１１０，ＣＶＤ１１１，ＣＶＤ１１２，Ｂｅｎｇａｌ−１５もしくはＰｅｒｕ−１４がある。
好ましいＳｈｉｇｅｌｌａ株としては、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ，Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ，またはＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ血清型Ｙがある。
上記ワクチン株は、異種Ｏ−ＰＳの効率的な発現に使用できる。この目的のために、異種遺伝子もしくはＯ−ＰＳをコードする一組の異種遺伝子群が当業者にとって公知の方法、例えば、後述の実施例に記載の方法によって挿入される。
従って、本発明は、異種遺伝子もしくはＯ−ＰＳをコードする一組の異種遺伝子群が存在することをさらに特徴とするワクチン株に関する。
異種Ｏ−ＰＳをコードする前記遺伝子群の挿入は、下記のように行うべきである：（ｉ）  前記遺伝子群が安定して発現し、その親株から本質的には識別不能な全長平滑ＬＰＳの合成を可能とし、（ｉｉ）  完全なハイブリッドＬＳＰを同種コア領域に結合するワクチン株のリピドＡから作成する。従って、前記遺伝子（群）を挿入する際、当業者は、
ｉ）同種Ｏ−ＰＳをコードする遺伝子を欠く細菌担体株を使用すべきであり、
ｉｉ）プラスミッド、例えば、異種Ｏ−ＰＳをコードする全ての遺伝子からなる前記異種Ｏ−ＰＳ遺伝子が挿入されるべき座に対応する相同遺伝子領域の側面にあるｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴを使用すべきであり、そして
ｉｉｉ）その後下記実施例３に記載されている方法に従うべきである。
ワクチン株の好ましい実施形態によれば、異種遺伝子（群）はプラスミドベクター上に存在するか、前記株の染色体の前記担体株による防御免疫反応を誘発するために不可欠ではない限定された組込み部位に安定して組込まれる。
一組の異種遺伝子群は、感熱型レプリコン、例えばｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴや挿入が行われるべき遺伝子に対応する相同遺伝子領域からなる欠失ベクターにおいてクローン化すべきである。異種遺伝子は、相同領域の中間部でクローン化されるだろう。異種遺伝子の組み込みのためには、このプラスミッドを最適な担体株に導入し、その後、下記の実施例５，６，７，８のように処理すべきである。
異種遺伝子（群）のワクチン株の染色体への組込みに好適な部位は、免疫原性と安全性に必要な株の特性に絶対に作用を及ぼさないような遺伝子である。
好ましい態様によれば、前記異種遺伝子もしくは一組の異種遺伝子群は、ｈｌｙＡ，ｈｌｙＢ，ｒｆｂＡ，および／またはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのｒｆｂＡ／ｒｆｂＢ座に組込まれる。
さらに特に好ましい態様は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ株に関する。ここでは、前記異種遺伝子もしくは一組の異種遺伝子群は、Ｈ2Ｓ生成遺伝子、例えばＲｐｏＳシグマ因子などの転写シグナルをコードするｉｌｖ，ｖｉａＢ，ｈｔｐＲ遺伝子、例えば環境ストレスへの耐性、新しい成長条件への適応能力といった毒性の形質に関与する遺伝子、または、芳香族の酸の合成に関与する遺伝子に組み込まれる。環境ストレスへの耐性、または新しい成長条件への適応能力に関与する遺伝子とは、ＯｍｐＲ−ＥｎｒＺ系、ＰｈｏＰ−ＰｈｏＱ系ならびにｃｙａ−ｃｒｐ転写調節系の遺伝子である。芳香族の酸の生合成に関与する遺伝子としては、例えばａｒｏＡ，ａｒｏＣ，ａｒｏＤがあげられる。
また、上記ワクチン株は、ｒｆａ，ｒｆｅ，ｒｆｐおよび／または単一の染色体部位に直列に組込まれるか、個別の部位にそれぞれ組込まれる完全平滑異種ＬＰＳの合成に必要な全ての付加遺伝子を含む。
完全平滑異種ＬＰＳの合成に必要な付加遺伝子には、例えば、ｒｆｃやｒｆｆがある。正しくそして調整されて発現した上記遺伝子の組込みは、当業者が公知の方法すなわち、例えば、ハミルトン他著、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー１７１（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７１）（１９８９），４６１７〜４６２２頁に記載の方法によって行うことができる。
そのようなワクチン株は、異種ＬＰＳコア領域と共有結合する、好ましくは、腸内細菌によって生成される天然のＬＰＳ由来のものと実質的には識別できないポリメリゼーションをある程度示す異種Ｏ−ＰＳを発現することができる。もし望めば、そのようなワクチン株は、同種ＬＰＳコア合成には不足するように修飾することができる。
好ましい態様によれば、異種ｒｆａ遺伝子はＲａ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｋ−１２またはＢ  ＬＰＳコアを、好ましくはＲ１コアをコードする。
本発明はまた、上記ワクチン株および任意に薬学的に容認できる担体および／または、胃酸度を中和するための緩衝剤および／または前記ワクチンを生きたままの状態で腸管へ輸送するためのシステムを含む生ワクチンに関する。
前記ワクチンは、免疫防御的で非毒性的な量の前記ワクチン株を含む。適切な量は、当業者が決定できるが、通常１０7から１０9バクテリアである。
薬学的に認容できる担体、適切な中和緩衝液ならびに適切な輸送システムは、当業者が選択することができる。
好ましい態様によれば、前記生ワクチンはグラム陰性腸内病原体に対する免疫接種のために使用される。
本発明のワクチンの投与方法は免疫防御的な量のワクチンを標的に輸送するいかなる適切なルートでもよい。しかし、ワクチンは経口投与もしくは鼻内投与が好ましい。
本発明はまた、グラム陰性腸内病原体に対する免疫接種のための生ワクチン調製のための上記ワクチン株の使用に関する。その使用においては、前記ワクチン株を、上記の担体、緩衝液および／または輸送システムと組み合わせる。
以下実施例を用いて本発明を説明する。
まとめとして、Ｉｎａｂａ  ｒｆｂＡ／ｒｆｂＢ欠失突然変異体を異種Ｏ−ＰＳ抗原の担体またはベクターとして使用することについて説明する。Ｏ１３９Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのｒｆｂ座を約３２ｋｂ断片上でクローン化し、ｒｆｂＡ／ｒｆｂＢ欠失突然変異体のｈｌｙＡ：：ｍｅｒ座に組み込んだ。この構造は、Ｉｎａｂａコアと結合したＯ１３９Ｏ−ＰＳを発現し、特異的な抗Ｏ１３９抗体によって認識した。同様に、Ｏ−ＰＳの生成を可能とするＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからのｒｆｂ／ｒｆｐ座を１３．８ｋｂの断片上でクローン化し、上記のようにＣＶＤ１０３−ＨｇＲのｒｆｂＡ／ｒｆｂＢを欠失突然変異体に組み込んだ。この構造においては、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｏ―ＰＳを細胞表面で生成し、コアと共有結合させ、特異的な抗Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｏ−ＰＳによって認識した。しかし、この構造は天然のＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＬＰＳと関連する全長のはしご構造ではなく、非常に短いＬＰＳ分子のみを発現した。しかし、Ｏ−ＰＳの重合に関与していると考えられているＥ．ｃｏｌｉのｒｆｅ遺伝子のプラスミドへの付加、もしくはこの構造の染色体への組み込みの結果、天然のＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのものと識別不能な表現型をもつＬＰＳが合成された。
実施例１：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＣＶＤ１０３−ＨｇＲのｒｆｂ座のクローンニング及び物理地図作成
遺伝子銀行の作成。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＣＶＤ１０３-ＨｇＲ  ＤＮＡ遺伝子銀行を低コピー数コスミドｐＬＡＦ５で作成した（キーン他著、ジーン７０（Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７０）（１９８８），１９１-１９７）。ＣＶＤ１０３-ＨｇＲ染色体上のＤＮＡから分離したＤＮＡ断片を、部分的Ｓａｕ３Ａ制限及びしょ糖こう配で分別したサイズによって生成した。２０〜３０ｋｂ断片を含むフラクションを精製し、βａｍＨＩとＳｃａＩ切り取りベクターに結紮した。結紮混合物を、製造者の説明書に従って試験管（ギガパックＩＩプラスパッケージングキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｐｌｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧＭＢＨ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内でパッケージした。続いて、そのパッケージしたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１に導入し、得られた培養物を１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢプレート（ＬＢＴｃプレート）上で培養し、トランスフェクタントを選択した。耐性コロニーをプールし、分取し、その分取標本を４０％グリセロール中に−７０℃で保存した。
遺伝子銀行の選別。コスミッドバンクの凍結分取標本の１つを希釈し、ＬＢＴｃプレート上で培養した。発生したコロニーをニトロセルロースフィルター上に移した。続いて、フィルターについて、承認されているプロトコール（サムブルック他著、モレキュラークローニング、第二刷、コールドスプリングハーバープレス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＵＳＡ，（１９８９））に従って、免疫検出を行った。Ｉｎａｂａ／Ｏｇａｗａ特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＶＣＯ４（前述Ｈ４；グスタフソン、ホーム共著、ジャーナル  オブ  クリニカルマイクロバイオロジー１８（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８）（１９８３），４８０-４８５）でのフィルターのプローブによって、いくつかの独立クローンが分離できた。それらは同じｍＡｂを使って追試を行ったとき、依然として強い陽性を示した。ｐＳＳＶＩ２５５−３，ｐＳＳＶＩ２５５−５，ｐＳＳＶＩ２５５−７と名づけられた３つのクローンがさらに特徴づけられた。
ｐＳＳＶＩ２５５−３，ｐＳＳＶＩ２５５−５，ｐＳＳＶＩ２５５−７の制限分析。様々な制限酵素を用いて得た制限パターンは３つのクローンの間にはかなりの程度の重複があることを示した。ＥｃｏＲＩ，ＳａｃＩ，ＰｓｔＩを使って３つのクローン全てを地図に位置づけた。Ｅｌ  Ｔｏｒ  Ｏｇａｗａ  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株Ｏ１７からのｒｆｂ座を含む約２０ｋｂ  ＳａｃＩ断片の公知のＤＮＡ塩基配列の援助を受けて（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，７７  ９４．Ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｅｒａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（１９９４）．Ｗａｃｈｓｍｕｔｈ  Ｋ．，Ｂｌａｋｅ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｌｓｖｉｄ￥．（ｅｄｓ．）．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、各クローン中のｒｆｂ座の正確な位置を測定することができた。この情報に基づいて、クローンｐＳＳＶＩ２５５−７（図１）だけを更なる研究に使用した。
実施例２：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの染色体上の欠失を導入するための欠失プラスミドの作成
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのｒｆｂ座内の欠失成功率を最大限に得るために、ｒｆｂ座内の４つの異なる断片を選択して個別に欠失させた。図１は、発生した様々な欠失ベクターをまとめている。ｐＳＳＶＩ２５５−７の外側ＳａｃＩ部位間の２３．５ｋｂのＤＮＡを除去することによって、また、双方の配向において、ｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴのブラントされたＨｉｎｄＩＩＩ部位への残りの挿入部分をサブクローニングすることによって、プラスミドｐＳＳＶＩ２０５−１及びｐＳＳＶＩ２０５−２を作成した（図２）。後者のプラスミドはプラスミドｐＪＦＦ３５０（フェレイ他著、（Ｆｅｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  ７６（１９８９），２１５−２２６）のｏｒｉＴ領域の付加によって移動可能とされた自殺ベクターｐＭＡＫ７００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１（１９８９），４６１７-４６２２）に対応する。プラスミドｐＳＳＶＩ２５５−１２は、３．８ｋｂのＢａｍＨＩ内部断片が欠失したｐＳＳＶＩ２５５−７の１０．５ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ中心断片をもつｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴに対応する。この欠失によってｒｆｂＥＧＨＩ遺伝子は不活化する。遺伝子ｒｆｂＥは、ペロサミン合成酵素であると推定される。一方、遺伝子ｒｆｂＧ，Ｈ，ＩはｒｆｂInabaコードされたＯ−ＰＳ成分の外膜経由の輸送に関与する（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．７７−９４．Ｉｎ  ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｅｒａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（１９９４）．Ｗａｃｈｓｍｕｔｈ  Ｋ．，Ｂｌａｋｅ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｏｌｓｖｉｋ  φ（ｅｄｓ．）．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。プラスミドｐＳＳＶＩ２５５−１９，ｐＳＳＶＩ２５５−２０は、ともにｐＳＳＶＩ２５５−７から誘導され、限定された制限断片の高コピー数ベクターｐＭＴＬ２２ｐへのサブクローニング（チャンバー他著（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  １９８８，６８：１３９〜１４９）、中心領域の欠失、さらには得られた挿入のｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴへのサブクローニングを介していた。ｐＳＳＶＩ２５５−１９は５．３ｋｂのＣｌａＩ内部断片に対応しており（地図位置１５７７０〜２１０３０、図１）、そこからは１．９ｋｂのＳａｃＩ断片が欠失した。その欠失は、ペロサミン置換３−デオキシ−Ｌ−グリセロ−テトロン酸の合成に関与すると考えられているｒｆｂＮ遺伝子と重複する。ｐＳＳＶＩ２５５−２０は、ｒｆｂInabaオペロン（地図位置１８５００〜２３４００）の最初に位置する５．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片に対応し、そこからは１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ内部断片が欠失した。この欠失はペロサミンＯ−抗原サブユニットの生合成に直接関与するｒｆｂ  Ａ及びｒｆｂ  Ｂ遺伝子を不活化する。ｒｆｂＡの機能はホスホ−マンノースイソメラーゼもしくはマンノース−１−ホスフェイトグアニル転移酵素活性に密接に関連しており、ｒｆｂＢはホスホ-マンノ突然変異体であると推定される。
実施例３：標的担体株中のｒｆｂＡＢ欠失の導入：ＣＨ１５，ＣＨ１９、ＣＨ３０株の作成
まず実施例２に記載の様々なプラスミドをエレクトロポレーション法によってＥ．ｃｏｌｉ移動株Ｓ１７．１に転移し（サイモン他著、バイオ／テクノロジー１（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １）（１９８３），７８４−７９１）、続いてＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＣＶＤ１０３−ＨｇＲ中に移した。さらに、ｐＳＳＶＩ２５５−２０をＥｌ  Ｔｏｒ  Ｏｇａｗａワクチン株ＣＶＤ１１１に移した。
選択ＢＨＩ−Ｃｍプレート上で３０℃で平板培養することによってトランス接合体を分離した。次にトランス接合体を培養液で（ＢＨＩ−Ｃｍ培地）で３０℃で増殖させ、ＢＨＩ−Ｃｍプレート上に好適な希釈液を入れ、３０℃または４１〜４２℃でインキュベートした。通常、４１〜４２℃における平板培養効率は３０℃のときに比べて約１０4倍低かった。温度感受性レプリコンの効力によって、プラスミドは４１℃以上では複製できないので、許容範囲外の温度のコロニーは染色体中に全体的な欠失プラスミドをもつまれな細胞から生じているのであろう。４１〜４２℃で成長可能な一組のコロニーを４１〜４２℃でインキュベートしたＢＨＩ−Ｃｍプレート上でさらに画線培養した。３０℃でインキュベートした、選択されなかったＢＨＩプレート上での画線培養を介してベクター配列から放出された細胞の選択を行った。続いて、免疫学的選別によってＶＣＯ４ｍＡｂに対して陰性反応を示すコロニーが分離し得た。この抗体は、ＯｇａｗａＯ−ＰＳ及びＩｎａｂａＯ−ＰＳの両方を認識する。これらのコロニーをさらに選別し、それらがベクターに固有のクロラムフェニコール耐性形質を失っていることを確認した。
しかし、そのような安定した組込みが常に分離されるわけではなく、いくつかの欠失は致死的であると指摘されている。このため、全ｒｆｂ座もしくはｒｆｂＥＧＨＩ遺伝子が欠失している株の導入は得られなかった。ｐＳＳＶＩ２５５−１９を使用するＣＶＤ１０３−ＨｇＲにおけるｒｆｂＮ欠失の導入によって得られた株をＣＨ１５と名づけた。そして、ｐＳＳＶＩ２５５−２０を使用したＣＶＤ１０３−ＨｇＲ及びＣＶＤ１１１におけるｒｆｂＡＢ欠失突然変異体をそれぞれＣＨ１９、ＣＨ３０と名づけた。これらの欠失株は通常ｒｆｂ座に特異的なプローブを使用するサザンハイブリダイゼーション法によって遺伝子的に特徴づけられた。試験された全ての株の遺伝子構造は予測どおりであった。
実施例４：Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳを単独でもしくはＥ．ｃｏｌｉ  ｒｆａ  Ｒ１  ＬＰＳコアと組み合わせて発現する組換えＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株におけるｒｆｂＡＢ欠失の導入
実施例３に記載のように、上記プラスミドを株ＣＨ３、ＣＨ９中に移した。ＣＶＤ１０３−ＨｇＲの場合と同様、おそらく致死的効果のために、ＣＨ３またはＣＨ９のｒｆｂ座欠失全体を導入することはできなかった。同様にＣＨ３株においては、ｐＳＳＶＩ２５５−１９からの２ｋｂＳａｌＩ欠失の導入もしくはｐＳＳＶＩ２５５−２０からの１．２ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ欠失の導入は成功しなかった。ｐＳＳＶＩ２５５−１２のＣＨ３及びＣＨ９への組込みから生じるｒｆｂＥＧＨＩ欠失突然変異体をそれぞれＣＨ１３及びＣＨ１４と呼ぶ。ｐＳＳＶＩ２５５−１９を用いたＣＨ９中のｒｆｂＮ欠失の挿入をＣＨ１７と名づけ、そしてｐＳＳＶＩ２５５−２０からのｒｆｂＡＢ欠失をもつＣＨ９欠失突然変異体をＣＨ２１と名づけた。これらの欠失突然変異体はｈｌｙＡ遺伝子のプローブ、ｒｆｂ／ｒｆｃsonnei座の組込み標的に加えて、ｒｆｂInabaかｒｆｂ／ｒｆｃsonneiのいずれかの座に特異的なプローブを使用するサザンハイブリダイゼーション法によって遺伝子的に特徴づけられた。試験された全ての株の遺伝子型は予測どおりであった。
実施例５：ｒｆｂ／ｒｆｃsonnei座のＣＨ１９への組込み。ＣＨ２２株の作成
ｐＳＳＶＩ２５５−２０を使ったＣＨ３欠失突然変異体を生成することができなかったので、遺伝子構造的に類似の株ＣＨ２２を、逆アプローチ、即ち、プラスミドｐＳＳＶＩ２０１−１（図３）上にあるｒｆｂ／ｒｆｃsonnei遺伝子のＣＨ１９の染色体への組込みにより作成した。まずｐＳＳＶＩ２０１−１をＣＨ９株の作成のために使用した。そのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株Ｓ１７．１（ｐＳＳＶＩ２０１−１）からＣＨ１９に移動した。その後、完全なｒｆｂ／ｒｆｃsonnei座の存在をｍＡＢ  Ｓｈ５Ｓを用いた免疫学的選別によって方法の各工程をチェックした以外は実施例２に記載の方法と全く同じ方法でトランス接合体のプールを組み込んだ（Ｖｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０（１９９２），２７４１−２７４７）。安定したＣｍS／Ｓｈ５Ｓ＋組込みを分離し、ＣＨ２２と名づけた（図４）。
実施例６：コレラＯ１３９株ＭＯ４５からのｒｆｂ座のＣＨ１９への導入：株ＣＨ２５の作成
ＤＮＡ遺伝子銀行の作成と選別。野生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＯ１３９株ＭＯ４５由来の染色体上の遺伝子銀行、基準Ｏ１３９流行性株を、実施例１と同様の下記方法でｐＬＡＦＲ５において構成した。その遺伝子銀行を、ＭＯ４５特異性ウサギポリクローナル抗体を用いて免疫学的に選別した。１３コスミドクローンの全てを分離した。それらはポリクローナル抗体と強く反応した。その後、これらのクローンについて、重複のレベルを測定するために様々な制限酵素を用いた制限分析を行った。
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＬＰＳ発現。プラスミドの制限パターンに基づいて選択した株から、ＬＰＳ小型標本（ミニプレップ）を作った。これらのミニプレップから分取を行い、陰性対照ＣＨ１９及びＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１２-１５）及び陽性対照ＭＯ４５からのＬＰＳミニプレップとともに、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び原発性抗体として抗Ｏ１３９ポリクローナル血清を用いた免疫ブロッティング法（ウエスタンブロット法）によって分析した。作られた抗体はセイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＡＧ，Ｒｏｔｋｅｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）であった。抗体を用いたインキュベーション後のゲルのニトロセルロース膜へのブロッティングの方法と欠失は前記した通りであった（Ｖｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０（１９９２），２７４１−２７４７）。
図５に示された結果は、クローンの大半が低いサイズの範囲で（レーン６〜１１）ＭＯ４５（レーン４、全てＯ１３９株の特徴）と全く同一のＬＰＳパターンを表示することを示している。しかし、１つのクローン、つまり、ｐＳＳＶＩ２１２−３（レーン５）だけが、全長ＭＯ４５  ＬＰＳパターンと一致した。即ち、低分子量物質と高分子量物質をもち、後者が、カプセル状のポリサッカライドの典型である。ＣＨ１９株担体のわずかな非特異的反応（レーン２、９〜１１）は、Ｏ１及びＯ１３９株のＬＰＳコア内のいくつかの共通のエピトープによるものでもよい。カプセル状のポリサッカライドはＯ１３９病原体に対して有意の免疫反応を起こすのに必要であると考えられているので、ｐＳＳＶＩ２１２−３をさらなる研究のために選択した。
ＣＨ２５の作成。さらにｐＳＳＶＩ２１２−３の制限分析は、ＮｏｔＩ制限部位が約３０ｋｂ挿入内に生じたことを示した。しかし、ＮｏｔＩ部位はクローンニング部位からの１．０〜１．５ｋｂの挿入のどちらかの側のコスミドベクターｐＬＡＦＲ５内で得ることができた。従って、Ｏ１３９ｒｆｂ座を含む約３２ｋｂのＮｏｔＩ断片がサブローンニングされ、ｐＳＳＶＩ２０９（図６）組込みベクターのＳａｌＩ部位にブラントされ、ｐＳＳＶＩ２２０を生成した。その後プラスミドｐＳＳＶＩ２２０をエレクトロポレーション法によってＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７．１に導入し、ＣＨ１９に移した。ｈｌｙＡ：：ｍｅｒ座におけるＯ１３９ｒｆｂ座の組込み方法は、完全なＯ１３９ｒｆｂ座の存在をＣＨ１９に対して予備吸着されていた上記抗Ｏ１３９ポリクローナル抗血清を用いてチェックした以外は、実施例４に記載したとおりである。抗生物質の選択なしで３０℃で成長した数個のコロニーは、ＣｍSであり、抗Ｏ１３９抗体と反応することが分かった。これらのコロニーの１つを保存し、その株をＣＨ２５と名づけた。
実施例７：Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ｒｆｂ／ｒｆｐ座のＣＨ１９の染色体上への組込み：株ＣＨ２３の作成
組込みプラスミドｐＳＳＶＩ２０８−２の作成。Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１からのｒｆｂ／ｒｆｐ座のソースはプラスミドｐＳＳ３７であった（シュトラム他著（Ｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．１（１９８６），２８９−２９７）。ｐＳＳ３７からのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶ挿入を、Ｓｃｅ−Ｋｍカセットを用いて（ビレット著、バイオテクニーク（Ｖｉｒｅｔ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１４（１９９３），３２５−３２６）、低コピー数ベクターｐＧＢ２のＳａｌＩ部位に直列にクローン化し（チャーチワード他著（Ｃｈｕｒｃｈｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  ３１（１９８４），１６５−１７１）、ｐＳＳ３７−１Ｋを得た。その後、１３．８ｋｂ挿入をＳａｌＩで削除して両配向中の組込みベクターｐＳＳＶＩ１９９Ｓ（図７）のＳａｌＩ部位にクローン化し、ｐＳＳＶＩ２０８−１Ｋ及びｐＳＳＶＩ２０８−２Ｋを作成した。その後ｐＳＳＶＩ２０８−２ＫからのＳｃｅＩ−ＫｍカセットをＳｃｅＩプラスミドの制限及び自己結紮によって削除し、ｐＳＳＶＩ２０８−２（図８）を産生した。
ＣＨ２３の作成。プラスミドｐＳＳＶＩ２０８−２をエレクトロポレーション法によってＥ．ｃｏｌｉＳ１７．１に導入し、ＣＨ１９に移した。そして、３０℃でＬＢ−Ｃｍプレート上にトランス接合体を選択した。続く組込みは、ｒｆｂ／ｒｆｐ座を含むコロニーを選別するためにポリクローナル抗Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１ウサギ抗血清を使用した以外は、実施例４と同様の方法で行った。抗生物質の選択なしで３０℃で成長させた数個のコロニーは、ＣｍSであり抗Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ抗体と反応することが分かった。これらのコロニーの１つをＣＨ２３と名づけた。
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉのｒｆｅ遺伝子のＣＨ２３への導入。株ＣＨ２４の作成
ｒｆｅ遺伝子を使用する理由。先の実験は、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のｒｆｂ／ｒｆｐ座のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅへの発現は、天然のＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１ＬＰＳからわかるように、結果として完全ＬＰＳはしごを生成しないということを示した。しかし、酵素ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコースアミン：：ウンデカプレニルホスフェートＮ−アセチルグルコースアミン−１−ホスフェート転移酵素（マイサー-ダイエター他著（Ｍｅｉｅｒ−Ｄｉｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１９９２），７４６−７５３）をコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｒｆｅ遺伝子とＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ｒｆｂ／ｒｆｐ座との共同発現が欠陥の克服を可能とし、その結果、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１との識別不能なＬＰＳはしごを生成した。
組込みプラスミドｐＳＳＶＩ２１９の作成。従って、ｒｆｅ遺伝子をＣＨ２３の染色体に組み込むためのプラスミドを作成した。プラスミドｐＲＬ１００の１．５ｋｂ  ＸｍａＩＩＩ−ＣｌａＩ断片（Ｍｅｉｅｒ−Ｄｉｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１９９２），７４６−７５３）をサブクローニングし、プラスミドｐＭＡＫ／ｈｌｙＡのＫｌｅｎｏｗ−ｂｌｕｎｔｅｄ  ＢａｍＨＩ部位にブラントし、ｐＳＳＶＩ２１９を得た（図９）。
ＣＨ２４の構成。プラスミドｐＳＳＶＩ２１９をエレクトロポレーション法によってＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７．１に導入し、ＣＨ２３に移し、３０℃でＬＢ−Ｃｍプレート上にトランス接合体を選択した。続く組込みは、完全なｒｆｅ遺伝子をもつコロニーを選別するためにＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＯ−ＰＳ特異的モノクローナル抗体（ＤｙｓＨ２６、未発表）を使用した以外は、実施例４と同様の方法で行った。ＤｙｓＨ２６ｍＡｂは、高度に重合されたＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＬＰＳを特異的に認識し、従って、活性もしくは不活性ｒｆｅ遺伝子を含む細胞間の識別を行う。抗生物質の選択なしで３０℃で成長した数個のコロニーは、ＣｍSであり、ｍＡＢ  ＤｙｓＨ２６に対して陽性を示すことが分かった。これらのコロニーの１つをＣＨ２４と名づけた。
実施例９：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｒｆｂInaba突然変異体中の組込みｒｆｂ座からの異種Ｏ−ＰＳの発現
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  ｒｆｂ／ｒｆｃ座の単独もしくはＥ．ｃｏｌｉ  ｒｆａR1座と組み合わせての発現。ＣＨ３及びＣＨ９におけるＳ．ｓｏｎｎｅｉおよびＩｎａｂａＬＰＳ及びそれらのそれぞれのＩｎａｂａ陰性誘導体の発現を、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上及びｍＡｂ  Ｓｈ５Ｓ（Ｖｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０（１９９２），２７４１−２７４７）もしくはＶＣＯ４を用いた免疫ブロット法によって調べた。図１０は、様々な欠失突然変異体及びそれらのそれぞれの親株におけるＳ．ｓｏｎｎｅｉ及びＩｎａｂａＬＰＳの発現を示す。すべてのｒｆｂInaba欠失はＩｎａｂａＯ−ＰＳの生成を止めた（パネルＡ、Ｃ、レーンｆ〜ｌ対レーンｂ，ｄ，ｅ）。そのような欠失はまた、異種Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳの作成に様々な程度で影響及ぼすという予期せぬ所見が得られた。完全なｒｆｂ  Ｉｎａｂａ座をもつ株ＣＨ３及びＣＨ９（それぞれレーンｄ，ｅ）はともに一定量の、コアと結合したＳ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳ（パネルＡ）を発現した。ＩｎａｂａＯ−ＰＳの輸送／ｐｅｒｓａｍｉｎｅ合成もしくはテトロン酸合成に関与する遺伝子における欠失をこれらの株（それぞれＣＨ１３／ＣＨ１４及びＣＨ１５）に導入したとき、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳは発現が乏しく、結合していないままの状態だった（パネルＢのレーンｆ，ｇ，ｉ）。対照的に、ペロサミン合成に特異的な欠失（ＣＨ２１株およびＣＨ２２株）は、大量のコア結合異種Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＯ−ＰＳの発現を可能とし、ゲルの低い部分において、典型的なＬＰＳはしご状構造として示されている（パネルＡ及びＢ，レーンｋ及びｌ）。
ＣＨ２３、ＣＨ２４におけるＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ型１Ｏ−ＰＳの発現。ＣＨ２３及びＣＨ２４中のＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＬＰＳの発現は、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上及び低分子量、高分子量Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＬＰＳの認識をするｍＡｂ  ＭＡＳＤ−１（フラット、リンドバーグ共著（Ｆａｌｔ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．１６（１９９４），２７−４１）を用いた免疫ブロット法によって調べた。図１１は、完全ＬＰＳの発現はｒｆｅ遺伝子（レーン２，５，６，８，１０）上の存在に依存する。従って、ＣＨ２４（レーン１０）は、ｐＳＳＶＩ２０８−１及びｐＲＬ１００（それぞれ、レーン５及び６）に共通感染したＣＨ１９及びＣＨ３−Ｉ−及びＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＳＳ３７）（レーン２）と類似のＬＰＳはしごを作成する。対照的に、ＣＨ２３（レーン７）はわずかな量の低分子量物質を合成する。ＣＨ２３株（ｐＳＳＶＩ２１９）及びＣＨ２４（それぞれレーン８，１０）は、プラスミド上にｒｆｂ／ｒｆｐ座をもつそれらの対象物より重合がやや少ないＬＰＳを合成した（レーン５，６）。従って、その違いはプラスミドによって運ばれる座をもつ株に対するＣＨ２４のより低いコピー数のｒｆｂ／ｒｆｐ座により生じるようである。
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＯ１３９  ＯＡの発現。ＣＨ２５のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅＯ１３９ＬＰＳの発現をＣＨ−１９吸着型抗Ｏ−１３９ポリクローナル抗血清を用いた免疫ブロット法で試験した。図１２は、ＣＨ２５（レーン４及び５）がＯ１３９野生型株ＭＯ４５（レーン３）の典型である低分子量ＬＰＳ及び高分子量ＬＰＳのを生成することを示している。ＣＨ２５ＬＰＳとＯ１３９ｒｆｂ座がＥ．ｃｏｌｉ（レーン６，７）の低コピー数プラスミドベクターで行われる株からのＬＰＳとの比較から、ＣＨ２５のＯ１３９ｒｆｂ座の染色体上への組込みの結果として生じるコピー数の減少により、対応してＬＰＳ生成量は減少しなかったことがわかる。
実施例１０：担体株ＣＨ１９の物理的特性及びＣＨ２１、ＣＨ２２のワクチン候補
一般に定義されている、３０℃で培養されたｒｆｂInaba欠失突然変異体の物理的特性を表２に示す。欠失突然変異体の表現型は、様々な培地の成長による影響を著しく受けたが、一方、ＣＶＤ１０３−ＨｇＲは受けなかった。３７℃で培養したとき、ＣＶＤ１０３−ＨｇＲを含む全ての株は、著しい運動性の減少を示した。ｒｆｂＡＢ欠失（株ＣＨ１９）の導入に続いてＩｎａｂａＯ−ＰＳを合成するためのＣＶＤ１０３−ＨｇＲの不活化の結果、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳ発現対象物ＣＨ２１、ＣＨ２２とはかなり違う表現型になった。従って、ＣＨ１９は、運動性に乏しく、ほとんど単一細胞もしくは短繊維として成長した。また最も目を引いたことに、試験された全ての培地において自然に凝集が起こった。ｒｆｂＡＢ欠失バックグラウンド（株ＣＨ２２）におけるＳ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳの発現は、ＣＶＤ１０３−ＨｇＲによって発現した多くの形質、例えば、運動性や、凝集せずに、多くは非糸状形での成長などを回復した。ＣＨ２１株におけるＲ１コアの共同発現の結果、糸状性成長及び運動性の削除がおこった。
実施例１１：ＣＨ２１及びＣＨ２２のさらなる物理的特徴
両方の株の安定性を試験した。テスト株の培地をＬＢ培地中で３７℃で成長させ、静止相にした。同じ培地で２００倍に希釈し、さらに３７℃でインキュベートし、静止相にした。毎回、安定性を測定するために静止培地の希釈液をＬＢ培地上で平板培養した。遺伝子の安定性は、５０世代以上の成長後になお望ましい表現型を発現しているコロニーの比率とした（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳの発現もしくは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｏ−ＰＳの喪失）。両株はＳ．ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ−ＰＳを安定して（＞９９．９％）発現することがわかった。同じ比率を維持し、ＲＩ  ＬＰＳコアをＣＨ２１株内に発現することがわかった。一方、試験された全てのコロニーはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＩｎａｂａＯ−ＰＳを発現することができなかった。
また株ＣＨ２１及びＣＨ２２についても、Ｙ１−副腎細胞アッセイによって（サック  アンド  サック（Ｓａｃｋ  ａｎｄ  Ｓａｃｋ）、Ｉｎｆｒｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１１（１９７５），３３４−３３６）無害性を、ＧＭ１ガングリオシド結合アッセイ（スベンナーホルム、ホムグレン共著、カレント  マイクロバイオロジー１（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｈｏｍｇｒｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１）（１９７８），１９−２３）を用いてコレラ毒素Ｂサブユニットの生成及び水銀に対する耐性の有無を調べた。後の試験については、ＣＶＤ１０３−ＨｇＲ、ＣＨ２１及びＣＨ２０の培地を一晩、ＢＨＩ培地内で３７℃でシェーキングしながら成長させた。静止相培地を一組のＨｇＣｌ2濃度（ＢＨＩ／ＨｇＣｌ2）を含むＢＨＩ２ｍｌ内で２００倍に希釈または２０ｍｌＢＨＩ内で４０倍に希釈した。後者の培地をさらに３７℃で２時間インキュベートし、再び様々な濃度のＨｇＣｌ2を含むＢＨＩ／ＨｇＣｌ2培地２ｍｌ内で４０倍に希釈した。その後すべての培地を最長３日間３７℃でシェーキングしながらインキュベートした。１日目、２日目、３日目に目視試験により陽性培養を記録した。３つ全てのアッセイにおいて、ＣＨ２１、ＣＨ２２はＣＶＤ１０３ＨｇＲと識別不能であった。
ｔｃｐレグロンの生成物である毒素共調節繊毛は、腸細胞に接着させるためのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの重要な因子として知られている。ピリンをコードする遺伝子であるｔｃｐＡの発現を評価するために、ＣＶＤ１０３−ＨｇＲ、ＣＨ２１，ＣＨ２２の細胞全体の抽出物のウエスタンブロットをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で行い、ピリン特異性抗血清を使ってプローブした。図５に示された結果からＣＨ２１もＣＨ２２もどちらもＣＶＤ１０３−ＨｇＲのものと同量のピリンを生成することがわかった。
実施例１２：株ＣＨ２２の免疫性
死んだ全ＣＨ２２細胞を用いて免疫化したマウスの血清について、抗相ＩＳ．ｓｏｎｎｅｉ及びＣＶＤ１０３−ＨｇＲ  ＩｎａｂａＬＰＳ抗体が存在するかどうか試験した。対照として、非免疫血清もしくは死んだ全ＣＶＤ１０３−ＨｇＲ細胞によって免疫化されたマウスの血清を使用した。表３に示すように、ＣＨ２２を用いた免疫化は高タイターの抗Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＬＰＳ抗体を誘発したが抗ＩｎａｂａＬＰＳ抗体を誘発しなかった。対照的に、ＣＶＤ１０３−ＨｇＲによって免疫化されたマウスからの血清は抗Ｉｎａｂａ抗体のみを生成した。対照マウスからの血清はどのテスト抗原にも反応しなかった。
図の説明
図１：Ｉｎａｂａ  ｒｆｂ  クローンｐＳＳＶＩ２５５−７及び誘導された欠失ベクターの制限地図
矢印は、ｒｆａＤ遺伝子及びｒｆｂInabaオペロンの転写方向を示す。ホワイトボックスは様々なｒｆｂ遺伝子を示し、ストライプボックスは機能領域を意味する。これらのデータは発表されている結果から推論している（Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｐ．７７−９４．Ｉｎ  ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｅｒａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（１９９４）．Ｗａｃｈｓｍｕｔｈ  Ｋ．，Ｂｌａｋｅ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｏｌｓｖｉｋ  φ（ｅｄｓ．）．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。下の線は右に示されたプラスミド挿入に対応している。太い二重線部は、染色体組込み及びベクター配列の切除に使用される相同領域を表す。残りの部分（細い線）は各プラスミドから欠失した染色体領域を表す。
図２：移動可能自殺ベクターｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴの制限地図
ｏｒｉ１０１はｐＳＣ１０１オリジンの複製；ｒｅｐ１０１は温度感受性複製開始タンパク質の遺伝子；ｃａｍはクロラムフェニコール耐性遺伝子；ｏｒｉＴはＲＰ４／ＲＫ２転写オリジン。調整は塩基対内で行う。
図３：ｒｆｂ／ｒｆｃsonnei座組込みプラスミドｐＳＳＶＩ２０１−１の制限地図
矢印は指示された遺伝子の転写方向を示す。ホワイトボックスはｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴベクターを表す。地図ライン上の中断されたストライプボックスはＳ．ｓｏｎｎｅｉ  ｒｆｂ／ｒｆｃ座を表す。中断部はその活性の大きさが表現できないほど大きいことを意味する。細い線はＣＶＤ１０３−ＨｇＲ染色体ＤＮＡに対して相同な領域である。ｈｌｙＡはｈｌｙＡ遺伝子の５’末端；ｍｅｒは水銀耐性オペロン；ｃａｔはクロラムフェニコール耐性；ｒｅｐ１０１ｔｓは温度感受性複製開始タンパク質の遺伝子；ｏｒｉＴはＲＰ４／ＲＫ２転写起点を表す。
図４：ｈｌｙＡ：：ｒｆｂsonnei座におけるＣＨ２２の遺伝子構造
上の地図は、ＣＨ１９のｈｌｙＡ：：ｍｅｒ座の構造、すなわちｒｆｂsonnei領域をＳａｌＩ部位へ組込む前の構造を示す。矢印は指示された遺伝子の転写方向を示す。
図５：Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１及びＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅＣＨ１９のＯ１３９ｒｆｂクローンのＬＰＳミニプレパレーションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
パネルＡ：銀染色法。パネルＢ：ＣＨ１９吸着ポリクローナルウサギＯ１３９特異性抗血清を使ったウエスタンブロット法。レーン：１は分子量マーカー；２はＣＨ１９；３はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１２−１５）陰性対照；４はＭＯ４５陽性対照；５はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１２−３）；６はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１２−１０）；７はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１２−１３）；８はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１２−１６）；９はＣＨ１９（ｐＳＳＶＩ２１２−１０）；１０はＣＨ１９（ｐＳＳＶＩ２１２−１３）；１１はＣＨ１９（ｐＳＳＶＩ２１２−１６）を示す。
図６：組込みベクターｐＳＳＶＩ２０９の制限地図
略語とシンボルは図３と同じ。
図７：組込みベクターｐＳＳＶＩ１９９Ｓの制限地図
略語とシンボルは図３と同じ。
図８：ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ｒｆｂ／ｒｆｐ座組込みプラスミドｐＳＳＶＩ２０８−２の制限地図
略語とシンボルは図３と同じ。左向き斜線付ボックス：ｒｆｐ座、右向き斜線付ボックス：ｒｆｂ座。
図９：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｆｅ遺伝子組込みプラスミドｐＳＳＶＩ２１９の制限地図。
矢印は指定された遺伝子の筆写方向を示す。ホワイトボックスはＣＶＤ１０３−ＨｇＲゲノム領域；ブラックボックスはｒｆｅ遺伝子；点付きの細い線はｐＭＡＫ７００ｏｒｉＴベクターを示す。ＣｍＲはクロラムフェニコール耐性遺伝子。ｈｌｙＢは中断ｈｌｙＢ遺伝子の５’末端；ｈｌｙＢ’は中断されたｈｌｙＢ遺伝子の３‘末端を示す。その他は、図３と同じ。
図１０：ＣＶＤ１０３−ＨｇＲ、ＣＨ３，ＣＨ９及びＣＨ２２の様々なｒｆｂInaba突然変異体におけるＯ−ＰＳ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
パネルＡ：銀染色されたゲル。パネルＢ：Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ特異的ＭＡｂ  Ｓｈ５Ｓを用いた免疫ブロット；パネルＣ：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＯ−ＰＳ特異性ＭＡｂ  ＶＣＯ４を用いた免疫ブロット。レーン：ａは分子量標準；ｂはＣＶＤ１０３−ＨｇＲ；ｃはＳ．ｓｏｎｎｅｉ４８２−７９（ｐＷＲ１０５）；ｄはＣＨ３；ｅはＣＨ９；ｆはＣＨ１３；ｇはＣＨ１４；ｈはＣＨ１５；ｉはＣＨ１７；ｊはＣＨ１９；ｋはＣＨ２１；ｌはＣＨ２２を示す。
図１１：プラスミドにより運ばれたｒｆｂ／ｒｆｐ座を単独もしくはプラスミドによって運ばれたｒｆｅ遺伝子とともに有するＣＨ２３、ＣＨ２４及びＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ担体株のＬＰＳミニプレパレーションのウエスタンブロット分析
レーン：１は分子重量マーカー、２はＤＨ５α（ｐＳＳ３７）；３はＣＨ１９；４はＣＨ１９（ｐＳＳＶＩ２０８−２）；５はＣＨ１９（ｐＳＳＶＩ２０８−２／ｐＲＬ１００）；６はＣＶＤ−Ｉ−（ｐＳＳＶＩ２０８−２／ｐＲＬ１００）；７はＣＨ２３；８はＣＨ２３（ｐＳＳＶＩ２１９）；９はＣＨ２３（ｐＲＬ１００），１０はＣＨ２４を示す。抗体のプローブ：マウスＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＯ−ＰＳ特異性ＭＡｂ  ＭＡＳＤ−１。
図１２：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１及びＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＣＨ２５中のＯ１３９ｒｆｂクローンのＬＰＳミニプレパレーションのウエスタンブロット分析
レーン：１は分子重量マーカー、２はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１５）陰性対照；３はＭＯ４５陽性対照；４，５はＣＨ２５；６はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１５−１２）；７はＨＢ１０１（ｐＳＳＶＩ２１５−２３）を示す。抗体のプローブ：ＣＨ１９吸着型ポリクローナルウサギＯ１３９特異性抗血清。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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