(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）
【化１】
0004040082.tif 000021
（式中、R１およびR2はそれぞれ水素原子、またはグリシン、N-アシルグリシン、N-アルキルグリシン、N,N-ジアルキルグリシン、コハク酸及びその塩から選ばれる酸残基を表し、R１, R2の少なくとも一方はグリシンのカルボン酸残基、またはコハク酸残基である。R3は水素原子または下記一般式（II）
【化２】
0004040082.tif 000022
もしくは下記一般式（III）
【化３】
0004040082.tif 000023
で示される基を表す。nは１〜１4の整数を意味する。）で表されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類またはその塩の少なくとも一種類を含有する癌治療剤。
【請求項２】
請求項１記載の一般式（I）で表されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類またはその塩の少なくとも一種類を含有する、キノン系抗癌剤の作用増強補助剤。
【請求項３】
請求項１記載の一般式（I）で表されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類またはその塩の少なくとも一種類を含有する、癌予防剤。
【請求項４】
請求項３記載の癌予防剤において、癌再発予防剤であることを特徴とする癌予防剤。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００５年１月２８日付け出願の日本国特許出願２００５−２２３０１号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は癌疾患に適用される薬剤、特にビタミンＫヒドロキノン誘導体を用いる癌治療剤、癌予防剤及びキノン系抗癌剤の作用増強補助剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
天然型ビタミンＫはフィロキノン(ビタミンＫ１)とメナキノン-４（ビタミンＫ2(20)）であるが、これらの天然型ビタミンＫ類はγ-カルボキシグルタミン酸残基(Gla)を有するProthrombinや他のビタミンＫ依存性タンパク質類の生合成に必須であり、止血剤、骨粗鬆症治療剤として用いられている。ビタミンＫ依存性タンパク質の生合成において、ビタミンＫは二電子還元体であるビタミンＫヒドロキノンとなり、グルタミン酸残基(Glu)をγ-カルボキシグルタミン酸残基(Gla)に変換する酵素（γ-グルタミルカルボキシラーゼ）の補因子として働くことが知られている。そしてビタミンＫ欠乏時やワルファリンなどのクマリン系薬物によるビタミンＫサイクル阻害時には、Gla化が不完全になり脱γカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質が生成される。【０００４】
一方、天然型ビタミンＫであるフィロキノン(ビタミンＫ１)とメナキノン-４（ビタミンＫ2(20)）は癌細胞に対する抗腫瘍効果を有することが知られている（非特許文献１、２）。特に、メナキノン-４（ビタミンＫ2(20)）は、ビタミンＫ欠乏時と同様にGluがGlaに変換されていない異常プロトロンビン（ＤＣＰ、Des-γ-Carboxy  Prothrombin）を放出するＤＣＰ陽性肝細胞癌に対して抗腫瘍効果と肝細胞癌の門脈浸潤抑制効果を有することが知られている（特開２００４-１０７３３０、非特許文献３）。さらに、メナキノン-４には細胞分化誘導作用による抗腫瘍効果が知られている（特開平６-３０５９５５）。また、合成ビタミンＫであるビタミンＫ3やその誘導体が肝細胞癌に対して抗腫瘍効果を有することが知られている。（非特許文献１、４参照）しかし、天然型ビタミンＫの抗腫瘍効果はビタミンＫ3やその誘導体に比較して非常に低いことが報告されている（非特許文献１、２参照）。【０００５】
一方、ビタミンＫ類は水に全く溶解しない化合物である。経口投与においては、溶解性がバイオアベイラビリティの律速過程となるため、ビタミンＫ類の水溶性製剤の調製には、大量の非イオン性界面活性剤の添加による可溶化の方法が用いられている。しかし大量の非イオン性界面活性剤の添加はアナフィラキシーショック等の重篤な問題を生じる場合がある。したがって反復して投与する場合には、その有害性を完全に払拭することはできない。
天然型ビタミンＫ類が抗腫瘍効果を有することは前述の通りであるが、確認されている顕著な抗癌効果が肝細胞癌に限定されること、抗癌効果が比較的低いこと、水溶解性に起因する低いバイオアベイラビリティなどの現状が抗癌作用を効果的に発揮させるための障害となっている。したがって、抗癌効果を各種癌に対して有し、抗癌効果が高く、バイオアベイラビリティが高くあることで、抗癌作用を効率良く発揮できる医薬品の開発が強く望まれている。【０００６】
本発明者等は、特定の構造を有するビタミンＫヒドロキノン誘導体が投与後に還元過程を経ないで活性型ビタミンＫであるビタミンＫヒドロキノンを生成し、高いバイオアベイラビリティを発揮してビタミンＫの水不溶性問題を克服すること、および低プロトロンビン血症に対してすぐれた効果を呈することを既に開示した（特許第３０８８１３７号、非特許文献５、６）。しかし、ビタミンＫヒドロキノン誘導体が抗癌効果を示すか否かについては明らかにはされていない。
【特許文献１】特開２００４-１０７３３０
【特許文献２】特許第３０８８１３７号
【非特許文献１】Wu  et  al.,  Life Sci.,  52,  1797-1804(1993).
【非特許文献２】Wang  et  al.,  Hepatology,  22,  876-882(1995).
【非特許文献３】Otsuka  et  al.,  Hepatology,  40,  243-251(2004).
【非特許文献４】Nishikawa et al., J. Biol. Chem., 270, 28304-28310 (1995).
【非特許文献５】Takata  et  al.,  Pharm  Res.,  12,  18-23(1995).
【非特許文献６】Takata  et  al.,  Pharm.  Res.,  12,  1973-1979(1995).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、水溶性が高く、投与後、還元過程を経ないで活性型ビタミンＫであるビタミンＫヒドロキノンへと変換し、高いバイオアベイラビリティを発揮できる特定の構造を有する化合物を用いた抗癌剤、癌再発予防剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述のとおり、本発明者等はビタミンＫヒドロキノン誘導体が、投与後に還元過程を経ないで活性型ビタミンＫであるビタミンＫヒドロキノンへと変換し、高いバイオアベイラビリティを発揮してビタミンＫの水不溶性問題を克服すること、および低プロトロンビン血症に対してすぐれた効果を呈することを既に報告している（特許第３０８８１３７号、非特許文献５、６）。引き続き他の疾患への有効性を検討した結果、ビタミンＫヒドロキノン誘導体が各種癌に対する治療剤、再発予防剤として有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。前記ビタミンＫヒドロキノン誘導体は下記一般式（I）で表される。
一般式（I）
【化１】
0004040082.tif 000002
（式中、R１およびR2はそれぞれ水素原子、またはアミノ酸、N-アシルアミノ酸、N-アルキルアミノ酸、N,N-ジアルキルアミノ酸、ピリジンカルボン酸及びそれらのハロゲン化水素酸塩、アルキルスルホン酸塩または糖酸塩の残基から選ばれる窒素置換基を有するカルボン酸残基、またはジカルボン酸及びそのアルカリ金属塩の残基から選ばれるジカルボン酸残基を表し、R１,
R2の少なくとも一方は窒素置換基を有するカルボン酸残基、またはジカルボン酸残基である。R3は水素原子または下記一般式（II）
【化２】
0004040082.tif 000003
もしくは下記一般式（III）
【化３】
0004040082.tif 000004
で示される基を表す。nは１〜１4の整数を意味する。）で表されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類またはその塩。【０００９】
即ち、本発明は、前記一般式（I）で表されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類またはその塩の少なくとも一種類を含有する抗癌剤、癌予防剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
以上説明したように本発明にかかる癌疾患用薬剤によれば、ビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステルまたはその塩を適用することにより、各種の癌に対し優れた治療、予防効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体による肝細胞癌（PLC/PRF/5）に対する増殖抑制効果を示す説明図である。
【図２】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体による肺癌細胞（A549）に対する増殖抑制効果を示す説明図である。
【図３】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体による白血病細胞（HL60）のカスパーゼ-３／７活性に対する影響を示す説明図である。
【図４】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体による胃癌細胞（SDT4）に対する増殖抑制効果を示す説明図である。
【図５】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体によるマイトマイシンC耐性胃癌細胞（ST4）に対する増殖抑制効果を示す説明図である。
【図６】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体による大腸癌細胞（HT29）に対する増殖抑制効果を示す説明図である。
【図７】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体によるキノン系抗癌剤の抗癌作用に対する作用増強効果を示す説明図である。
【図８】本発明にかかるビタミンＫヒドロキノン誘導体によるマウス移植ヒト肝細胞癌に対する抗癌作用を示す説明図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細な説明を行う。
本発明は、前記一般式（I）で表される化合物またはその塩を含有する抗癌剤、癌再発予防剤に関する。前記一般式（I）で表される化合物は、単独で製剤に含有させることもできるし、その塩として製剤に配合することもできる。本発明において、窒素置換基を有するカルボン酸残基R１,
R2としては次のものが例示される。
窒素原子に対し水素原子；
窒素原子に対し１または２のアルキル基；
窒素原子に対しアシル基。
前記アルキル基としては、炭素数１〜６の直鎖、もしくは分枝のアルキル基であり次のものが例示される。
メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、ｎ-ブチル基、n-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、１-メチルプロピル基、tert-ブチル基、１-エチルプロピル基、イソアミル基。
上記アルキル基としてはメチル基、エチル基が特に好ましい。また、アシル基を有する場合の炭化水素鎖も同様に定義可能である。【００１３】
アミノ基とカルボニル基の間は、好ましくは炭素数１〜７の直鎖、分枝または環状のアルキレン基で結合される。前記分枝状のアルキレン基としては、次のものが例示される。
イソプロピル、イソブチル、tert-ブチル、１-エチルプロピルなどのアルキル基から誘導されたもの。
前記環状アルキレン基としては、次のものが例示される。
シクロペンタン環、シクロヘキサン環、あるいはメチルシクロヘキサン環などを構造中に含むもの。
上記アルキレン基としては、メチレン基またはエチレン基が特に好ましい。【００１４】
ハロゲン化水素酸塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩などが好ましい。本発明において、ハロゲン化水素酸塩は結晶化ないし固形化する場合が多く、製剤化にあたっての取り扱いが容易になるという利点がある。
その他の塩としては次のものが例示される。
アルキルスルホン酸塩としてはメタンスルホン酸塩等、糖酸塩としてはグルコン酸塩、グルコヘプタン酸塩、ラクトビオン酸塩等。【００１５】
本発明において、ジカルボン酸残基R１,
R2はジカルボン酸及びそのアルカリ金属塩の残基から選ばれる。ジカルボン酸残基のカルボニル基間は炭素数２〜４の直鎖のアルキレン基で結合される。アルキレン基として特に好ましいのは、エチレン基である。アルカリ金属塩としてナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。【００１６】
本発明において、前記一般式（I）で表される化合物の式中、R１, R2としてはそれぞれ水素原子、または前記窒素置換基を有するカルボン酸残基、または前記ジカルボン酸残基から選ばれる基である。R１,
R2の少なくとも一方は前記窒素置換基を有するカルボン酸残基または前記ジカルボン酸残基であるが、より好ましくは窒素置換基を有するカルボン酸残基である。【００１７】
また、本発明において、一般式（I）で表される化合物の製造方法は種々考えられるが，代表的な方法を述べれば以下の通りである．
【化４】
0004040082.tif 000005
【００１８】
一般式（IV）で表されるビタミンＫ類を還元剤で還元し、一般式（V）で表されるビタミンＫヒドロキノンとし、このビタミンＫヒドロキノンと、窒素置換基を有するカルボン酸、若しくはその反応性酸誘導体またはこれらのハロゲン化水素酸塩とを常法によりエステル化反応を行なうことにより、本発明の目的物質（I）を得ることができる。ここで用いられる還元剤はビタミンＫ類のナフトキノン骨格をナフトヒドロキノン骨格に還元するものであり、次のものが例示される。
水素化ホウ素ナトリウム、ハイドロサルファイトナトリウム、トリ-n-ブチルホスフィン、塩化亜鉛、塩化第一スズ。【００１９】
ビタミンＫヒドロキノンのエステル化反応は常法に従うが、１級、２級アミノ基あるいは側鎖に水酸基、チオール基を有するアミノ酸のエステル化を行なう際は、tert-ブトキシカルボニル基（以下t-BOC基と略記）、ベンジルオキシカルボニル基（以下Ｚ基と略記）、９-フルオレニルメトキシカルボニル基（以下ＦＭＯＣ基と略記）などの適切な保護基で保護して用い、N,N-ジアルキルアミノ酸はハロゲン化水素酸塩を用いて、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下DCCと略記）、N,N-ジサクシニミドオキザレート（以下DSOと略記）などの活性エステル化試薬の存在下に反応を行なうことが好ましい結果を与える。前記反応の際の反応溶媒としては無水ピリジンが好ましい。また、反応性酸誘導体を用いる方法では、酸ハロゲナイト、中でも酸クロリドを用いる方法が特に好ましい。この場合の反応溶媒としては無水ベンゼン−無水ピリジン混合物が好ましい。ハロゲン化水素酸塩、アルキルスルホン酸塩、糖酸塩は常法により遊離のビタミンＫヒドロキノン窒素含有カルボン酸エステルとハロゲン化水素酸、アルキルスルホン酸、酸性糖のラクトン体を反応させて製造する。また、N-アシルアミノ酸エステルを製造した後、常法によりハロゲン化水素酸で脱保護基化することによってハロゲン化水素酸塩を製造することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明のより具体的な実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１〜２８
下記の製造方法Ａ〜Ｇに示す方法により表１〜５に示すビタミンＫヒドロキノン誘導体を製造した。また、得られた物質の質量スペクトル（イオン化方法；FD法およびFAB法）および１H-NMRスペクトルの値を表６〜８に示す。【００２１】
［製造方法Ａ］
アミノ酸0.1molを蒸留水-ジオキサン（１：１  v／v）100mlに溶解し、トリエチルアミン30mlを加え、ジ-tert-ブチルジカルボネートを徐々に加え30分間室温で撹拌する。減圧下ジオキサンを留去し、炭酸水素ナトリウム水溶液（0.5M）50mlを加え酢酸エチル100mlで洗う。酢酸エチル層を50mlの炭酸水素ナトリウム液で洗い、水層を合わせて氷冷下でクエン酸水溶液(0.5M)を加えて酸性（pH３）とし、塩化ナトリウムを飽和させた後、酢酸エチルで抽出する(100ml×３回)。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、油状残渣にイソプロピルエーテルを加えるか、または冷却にて結晶化させて、N-t-BOC-アミノ酸を得る。ビタミンＫ6.75mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47mmolをメタノール15mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと蒸留水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100mlを加えて可溶画分を抽出し、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣にn-ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。【００２２】
ビタミンＫヒドロキノン、N-t-BOC-アミノ酸13.55mmol、DCC13.55mmolを無水ピリジン50mlに加え室温で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加えて可溶画分を抽出する(100ml×２回)。抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；n-ヘキサン-イソプロピルエーテル）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-N-t-BOC-アミノ酸を得る。ビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-N-t-BOC-アミノ酸を少量のアセトンに溶解し、塩酸-ジオキサン(2.5〜4.0N)をエステル量の約20倍モル量の塩酸量に相当する量加え１時間撹拌後、減圧下溶媒を留去する。残渣をアセトン-メタノール系で再結晶してビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-アミノ酸エステルの塩酸塩を得る。【００２３】
［製造方法Ｂ］
ビタミンＫ6.75mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47mmolをメタノール15mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと蒸留水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣にn-ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノン、塩酸N,N-ジアルキルアミノ酸13.55mmol、DCC13.55mmolを無水ピリジン50mlに加え室温で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を、蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のpHを７〜８に調整した後に酢酸エチルで抽出する(100ml×３回)。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル-酢酸エチル）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-N,N-ジアルキルアミノ酸エステルを得る。【００２４】
［製造方法Ｃ］
ビタミンＫ6.75mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、ハイドロサルファイトナトリウム50mmolを蒸留水50mlに溶解して加え、イソプロピルエーテルが褐色を呈し、さらに無色になるまで室温で撹拌する。イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣にn-ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノンに塩酸N,N-ジアルキルアミノ酸6.75mmol、DCC6.75mmolを加え無水ピリジン50ml中で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を、蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のpHを７〜８にした後酢酸エチルで抽出する(100ml×３回)。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル-酢酸エチル、３：２）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン-1-N,N-ジアルキルアミノ酸エステルおよびビタミンＫヒドロキノン-4-N,N-ジアルキルアミノ酸エステルを得る。【００２５】
［製造方法Ｄ］
ビタミンＫ6.75mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47mmolをメタノール15mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと蒸留水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣にn-ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノンを無水ベンゼン-無水ピリジン（１：１、v／v）30mlに溶解し、塩酸ピリジンカルボン酸クロリドを加え室温で３時間撹拌する。不溶物を濾過で取り除き、濾液を減圧下濃縮する。残渣を蒸留水100mlに懸濁させ、炭酸水素ナトリウムを加え(pH７〜８)、酢酸エチルに可溶分画を抽出する(100ml×３回)。抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル-酢酸エチル、9：1）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-ピリジンカルボン酸エステルを得る。【００２６】
［製造方法Ｅ］
ビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-N,N-ジアルキルアミノ酸エステル又はビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-ピリジンカルボン酸2mmolをアセトン20mlに溶解し、塩酸-ジオキサン(2.5〜4.0N)を塩酸量がエステルの10倍モル量に相当する量加え、溶媒を減圧下留去し、残渣をアセトン-メタノールで再結晶してビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-N,N-ジアルキルアミノ酸又はビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-ピリジンカルボン酸の塩酸塩を得る。【００２７】
［製造方法Ｆ］
ビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-N,N-ジアルキルアミノ酸又はビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-ピリジンカルボン酸2mmolをジクロロメタン20mlに溶解し、アルキルスルホン酸2mmolを加え撹拌する。析出する結晶を濾取してビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-N,N-ジアルキルアミノ酸エステル又はビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-ピリジンカルボン酸エステルのアルキルスルホン酸塩を得る。【００２８】
[製造方法Ｇ]
ビタミンＫ4.55mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム31.5mmolをメタノール15
mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと精製水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣にジメチルアミノピリジン8.97mmol、無水コハク酸18.0mmolを加え、イソプロピルエーテル-ジオキサン（6:4,
v/v）100mlに溶解して、室温で３時間撹拌後、50〜60℃に加熱しながら２時間反応させ、さらに室温で放冷しながら１０時間反応させる。反応液に精製水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣をイソプロピルエーテルに懸濁し、遠心して得た沈殿物に酢酸エチル100mlと精製水100mlを加え酢酸エチル可溶画分を抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣をイソプロピルエーテルに懸濁し不溶物を酢酸エチルで再結晶して、ビタミンＫヒドロキノン-1,4-ビス-コハク酸エステルを得る。【００２９】
【表１】
0004040082.tif 000006
【００３０】
【表２】
0004040082.tif 000007
【００３１】
【表３】
0004040082.tif 000008
【００３２】
【表４】
0004040082.tif 000009
【００３３】
【表５】
0004040082.tif 000010
【００３４】
【表６】
0004040082.tif 000011
【００３５】
【表７】
0004040082.tif 000012
【００３６】
【表８】
0004040082.tif 000013
【００３７】
次に本発明を具体的に説明するために以下に適用例をあげるが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３８】
本発明化合物の抗癌剤、癌再発予防剤としての有用性を示すため、各種ヒト培養細胞系による増殖抑制実験例およびin vivoにおけるマウス移植ヒト癌に対する抑制効果の実験例をあげる。
実験に用いたヒト培養癌細胞はPLC/PRF/5（肝細胞癌）、HepG2細胞（肝細胞癌）、Hep3B細胞（肝細胞癌）、A549（肺癌）、HL60（白血病）、SDT4細胞（胃癌）、ST4細胞（胃癌、マイトマイシンＣ耐性株）、HT29細胞（大腸癌）、HT29/MMC細胞（大腸癌、マイトマイシンＣ耐性株）である。【００３９】
ヒト肝細胞癌であるPLC/RPF/5細胞、Hep3B細胞とHepG2細胞は１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むDulbecco’s
modified Eagle’s medium (DMEM)培地を用い、SDT4細胞、ST4細胞、HT29細胞、HT29/MMC細胞は１０％ウシ胎児血清、カナマイシンを含むRPMI1640培地を用い、HL60細胞は１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用い継代培養して用いた。【００４０】
評価方法１：WST-8を用いる細胞数評価による増殖抑制効果評価
PLC/RPF/5細胞、Hep3B細胞、HepG2細胞、A549細胞の各細胞を96well plateに0.5x104cells/well播種し、２４時間培養後、培地をメナテトレノン、メナジオン、化合物No.
１０、１１、１２、２４、２５、２９を添加した培地に交換し、３７℃、５％CO2条件で２４時間、４８時間、７２時間培養後に薬物を含む培地を取り除き、薬物を含まない培地に交換し、WST-8試薬を加え２時間培養した後、450nm,
655nmの吸光度測定により細胞数を測定し、細胞増殖抑制効果を評価した。【００４１】
評価方法２：3H-thymidineの取り込みの阻害による増殖抑制効果評価
Hep3B細胞、HepG2細胞の各細胞を24well-plateに2x104 cells/well播種し、２４時間培養後、培地をメナテトレノン、メナジオン、化合物No.
１０、１１、１２、２４、２５を添加した培地に交換し３日間培養した。培地を3H-thymidineを0.5mμCi/mL含む培地に交換し、４時間培養した後、培地を除去し、細胞を等張リン酸緩衝液で２回洗浄後、Lysis
Buffer 400μLで細胞を溶解した。細胞溶解液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカクテルを加え、液体シンチレーションカウンターにより放射能を測定し、3H-thymidineのDNA取り込みの阻害から細胞増殖抑制効果を評価した。【００４２】
評価方法３：CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay試薬を用いる細胞数評価による増殖抑制効果評価
HL60細胞を96 well plateに1x104 cells /well播種し、さらに薬物を添加後、３７℃、5%
CO2条件で培養し、薬物添加から３、６、１２、２４時間後にCelltiter-Glo Luminescent Cell
Viability Assay試薬（プロメガ）を１00μL各ウェルに添加し、96ウェルプレートルミノメーターで発光量を測定して細胞増殖抑制効果を評価した。【００４３】
（適用例１）
［肝細胞癌に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の増殖抑制効果］
肝細胞癌であるPLC/RPF/5細胞の細胞増殖は、メナキノン-４、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）の添加によって用量依存的に抑制された。しかし、増殖抑制効果の発現時間は薬物によって大きく異なり、添加８時間ではメナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）で僅かに増殖抑制効果が観察されたが、添加２４時間では化合物１０、１２に顕著な増殖抑制効果が観られ、添加４８時間で化合物１１の顕著な増殖抑制効果が発現した。メナキノン-４は添加４８時間まで増殖抑制効果は観られず７２時間で増殖抑制効果が発現した。典型例として図１に評価方法１によるPLC/RPF/5細胞の細胞増殖に及ぼす増殖抑制効果を示した。表９にPLC/RPF/5細胞に対する50％生育阻止濃度(IC50)を示した。図１と表９から明らかなように、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）はメナキノン-４に比較して素早く細胞増殖抑制効果を発現することが明らかになった。また、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）の添加７２時間におけるIC50は何れもメナキノン-４に比較して低用量ですぐれた癌細胞増殖抑制効果を示した。【００４４】
HepG2細胞とHep3B細胞の細胞増殖は、メナキノン-４、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、２９）、メナジオン（ビタミンＫ３）の添加によって用量依存的に抑制された。増殖抑制効果の発現時間は薬物によって大きく異なり、添加２４時間では化合物１０、１１、１２、２９およびメナジオンに顕著な増殖抑制効果が観られたが、メナキノン-４は添加７２時間でわずかな増殖抑制効果が観られた。表１０と表１１にそれぞれ評価方法１によるHepG2細胞とHep3B細胞に対する50％生育阻止濃度(IC50)を示した。さらに、表１２に評価方法２によるHepG2細胞とHep3B細胞に対するメナキノン-４、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）、フィロキノン、フィロヒドロキノン誘導体（化合物２４、２５）、メナジオン（ビタミンＫ３）の50％生育阻止濃度(IC50)を示した。HepG2細胞とHep3B細胞に対するメナジオンとメナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、２９）はメナキノン-４に比較して素早く細胞増殖抑制効果を発現することが明らかになり、添加７２時間におけるIC50は何れもメナキノン-４に比較して低用量ですぐれた癌細胞増殖抑制効果を示した。DCP陽性のHepG2細胞とDCP陰性のHep3B細胞のどちらの肝細胞癌に対しても低濃度で効果を示すことが明らかになった。表１２から、Hep3B細胞に対してフィロヒドロキノン誘導体（化合物２４）はフィロキノンよりも優れた増殖抑制効果を示していることが明らかである。しかし、メナヒドロキノン-４誘導体の効果に比較してフィロヒドロキノン誘導体の効果は低かった。【００４５】
肝細胞癌に対してビタミンＫヒドロキノン誘導体はメナキノン-４に比較して速く増殖抑制効果を発現し、その速度は化合物１０＞化合物１２＞化合物１１であった。また、高田等は肝臓ミクロソーム中の酵素によって化合物１０〜１２からメナヒドロキノン-４が生成される速度は化合物１０＜化合物１２＜化合物１１であることを既に報告している（Takata  et  al.,  Pharm  Res.,  12,  18-23(1995)）。すなわち、ビタミンＫヒドロキノン誘導体からメナヒドロキノン-４（化合物V）への変換が遅い化合物ほど、増殖抑制効果を速やかに発揮することになり、ビタミンＫヒドロキノン誘導体（化合物１０〜１２）はメナヒドロキノン-４（化合物V）に変換されずに、誘導体の構造の状態で癌細胞増殖抑制効果を発揮できることを示唆している。
したがって、ビタミンＫヒドロキノン誘導体自身、およびその二次代謝産物であるビタミンＫヒドロキノンにも特定の肝臓癌において癌細胞増殖抑制効果があることとなり、より効率の良い、安全な癌治療剤の提供が可能になることが明らかである。【００４６】
［ビタミンＫヒドロキノン誘導体投与後の標的臓器への送達性］
肝細胞癌に対してビタミンＫヒドロキノン誘導体がすぐれた効果を持つことを適用例１で示したが、このすぐれた効果がさらに効率良く発揮されるためには、ビタミンＫヒドロキノン誘導体が標的臓器である肝臓に送達されることが好ましい結果をあたえる。高田等は、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）はラットにおいて静脈内投与後１５分でほぼ肝臓に移行することを明らかにしている（Takata  et  al.,  Pharm.  Res.,  12,  1973-1979(1995)）。すなわち、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）はメナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）の肝臓への選択的送達法であることから、メナヒドロキノン-４誘導体は肝細胞癌の効率的な治療法を提供できることを示している。また、高田等はメナヒドロキノン-４誘導体は肝臓中でメナヒドロキノン-４およびメナキノン-４に変換されることを明らかにしており（Takata  et  al.,  Pharm.  Res.,  12,  1973-1979(１995)）、メナキノン-４は肝細胞癌に対して抗癌効果を有することが明らかにされていることからメナキノン-４としても抗癌剤として機能できる。さらに、メナヒドロキノン-４誘導体はメナキノン-４に代謝されること、メナキノン-４は骨粗鬆症治療において重篤な副作用が報告されていない安全な化合物であることから、メナヒドロキノン-４誘導体は肝細胞癌に対して優れた効果を発揮でき、さらに安全性が高い肝細胞癌の効率的な治療法を提供できることを示している。【００４７】
【表９】
0004040082.tif 000014
【００４８】
【表１０】
0004040082.tif 000015
【００４９】
【表１１】
0004040082.tif 000016
【００５０】
【表１２】
0004040082.tif 000017
【００５１】
（適用例２）
［肺癌細胞に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の増殖抑制効果］
肺癌細胞であるA549細胞の細胞増殖は、メナキノン-４、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、１４）の添加によって用量依存的に抑制された。フィロキノンの添加によって増殖抑制は観られなかった。増殖抑制効果の発現時間は薬物によって大きく異なり、添加２４時間ではメナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１２、１４）で顕著な増殖抑制効果が観られ、添加４８時間で化合物１１の顕著な増殖抑制効果が発現した。メナキノン-４は添加４８時間まで増殖抑制効果は観られず７２時間で増殖抑制効果が発現した。典型例として図２に評価方法１によるA549細胞の細胞増殖に及ぼす増殖抑制効果を示した。表１３に評価方法１によるA549細胞に対する50％生育阻止濃度(IC50)を示した。表１３から明らかなように、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、１４）はメナキノン-４に比較して素早く細胞増殖抑制効果を発現することが明らかになった。また、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、１４）の添加７２時間におけるIC50は何れもメナキノン-４に比較して低用量ですぐれた肺癌細胞増殖抑制効果を示した。【００５２】
【表１３】
0004040082.tif 000018
【００５３】
（適用例３）
［白血病細胞に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の増殖抑制効果］
白血病細胞であるHL60細胞の細胞増殖は、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、１４）の添加によって用量依存的に抑制された。増殖抑制効果の発現時間は薬物によって大きく異なり、添加３時間ではメナヒドロキノン-４誘導体（化合物１４）で顕著な増殖抑制効果が観察され、添加１２時間でメナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１２）に顕著な増殖抑制効果が観られ、添加２４時間で化合物１１の顕著な増殖抑制効果が発現した。メナキノン-４とフィロキノンは添加２４時間まで増殖抑制効果は観られなかった。表１４に評価方法３によるA549細胞に対する50％生育阻止濃度(IC50)を示した。表１４から明らかなように、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、１４）はメナキノン-４に比較して素早く細胞増殖抑制効果を発現することが明らかになった。また、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２、１４）の添加２４時間におけるIC50は何れもメナキノン-４に比較して低用量で優れた癌細胞増殖抑制効果を示した。【００５４】
［HL60細胞中のカスパーゼ-３／７活性に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の効果］
HL60細胞を96 well plateに１x１04 cells /well播種し、さらに薬物を添加後、37℃、5%
CO2条件で培養し、薬物添加から４、１２時間後にCaspase-Glo 3/7 Assay試薬（プロメガ）を１00μL各ウェルに添加し、96ウェルプレートルミノメーターで発光量を測定してカスパーゼ-３／７活性を評価した。カスパーゼ３の阻害剤としてZ-VAD-FMKを用いた。
HL60細胞のカスパーゼ-３／７は、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１４）の添加により活性化され、化合物１４の40μM添加後４時間で約６倍、化合物１０の80μM添加後１２時間で約７倍に上昇した（図３）。また、誘導体によるカスパーゼ-３／７活性の上昇は、カスパーゼ阻害剤、Z-VAD-FMKの添加により完全に抑制された。メナヒドロキノン-４誘導体のHL60細胞の増殖抑制には、カスパーゼ３の活性化を伴うアポトーシスの誘導が関与することが示された。【００５５】
【表１４】
0004040082.tif 000019
【００５６】
（適用例４）
［胃癌細胞に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の増殖抑制効果］
胃癌細胞であるSDT4細胞の細胞増殖は、メナキノン-４、メナジオン、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）の添加によって何れも用量依存的に抑制された。典型例として図４に評価方法２によるSDT4細胞に対する増殖抑制効果を示した。表１５に50％生育阻止濃度(IC50)を示した。SDT4細胞に対するメナキノン-４のIC50は5000μM以上であったが、これに比してメナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）のIC50は何れも低濃度であり、特に化合物１０は約百分の１以下の濃度であり、すぐれた胃癌増殖抑制効果を示した。IC50はメナジオン（ビタミンＫ３）と同程度であった。【００５７】
【表１５】
0004040082.tif 000020
【００５８】
（適用例５）
［マイトマイシンＣ（MMC）耐性胃癌細胞に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の増殖抑制効果］
マイトマイシンＣ（MMC）耐性胃癌細胞であるST4細胞の細胞増殖は、メナキノン-４、メナジオン、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）の添加によって何れも用量依存的に抑制された。典型例として図５にST4細胞に対する増殖抑制効果を示した。表１５に50％生育阻止濃度(IC50)を示した。メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１１、１２）はマイトマイシンＣ（MMC）耐性胃癌細胞であるST4細胞に対してもSDT4細胞に対する効果と同様の増殖抑制効果を示し、マイトマイシンＣ（MMC）耐性株に対しても有効であることが示された。【００５９】
（適用例６）
［大腸癌細胞に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の増殖抑制効果］
大腸癌細胞であるHT29細胞の細胞増殖は、メナキノン-４、メナジオン、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１２）の添加によって何れも用量依存的に抑制された。典型例として図６にHT29細胞に対する増殖抑制効果を示した。表１５に50％生育阻止濃度(IC50)を示した。HT29細胞に対するメナキノン-４のIC50は7000μM以上であったが、これに比してメナヒドロキノン誘導体（化合物１０、１２）のIC50は何れも低濃度であり、すぐれた大腸癌増殖抑制効果を示した。特に化合物１０のIC50は30μMでありメナジオン（ビタミンＫ３）の20μMと同程度であった。【００６０】
（適用例７）
［マイトマイシンＣ（MMC）耐性大腸癌細胞に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体の増殖抑制効果］
マイトマイシンＣ（MMC）耐性大腸癌細胞であるHT29/MMC細胞の細胞増殖は、メナキノン-４、メナジオン、メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１２）の添加によって何れも用量依存的に抑制された。表１５に50％生育阻止濃度(IC50)を示した。メナヒドロキノン-４誘導体（化合物１０、１２）はマイトマイシンＣ（MMC）耐性大腸癌細胞であるHT29/MMC細胞に対してもHT29細胞に対する効果と同様の増殖抑制効果を示し、マイトマイシンＣ（MMC）耐性株に対しても有効であることが示された。【００６１】
（適用例８）
［キノン系抗癌剤の抗癌作用に対する作用増強効果］
胃癌細胞であるSDT4細胞に対するキノン系抗癌剤マイトマイシンＣ（MMC）の細胞増殖抑制効果に対するビタミンＫヒドロキノン誘導体（化合物１１）の効果を、上記実験方法に従って評価した。結果を図７に示す。MMCのIC50（0.25μM）はメナヒドロキノン-４誘導体の添加によって0.8μMまで約１／３に低下し、ビタミンＫヒドロキノン誘導体はMMCの細胞増殖抑制効果を増強することが示された。【００６２】
（適用例９）
［in vivoにおけるビタミンＫヒドロキノン誘導体のマウス移植ヒト肝細胞癌に対する抗腫瘍効果］
PLC/PRF/5細胞をBDマトリゲルに懸濁し１x106
cellsを８週齡の雄性BALB-c nu/nuマウス（日本SLC）の側腹部皮下に移植した。移植９日後に、PLC/PRF/5移植マウスを６匹／群とし、メナヒドロキノン-1,4-ビス-ジメチルグリシネート（化合物１０）を４％エタノールに溶解して400μMとし飲水投与した。コントロール群は４％エタノールを飲水投与した。飲水の平均値は４mL／匹／日であり、化合物1０の投与量は0.7mg／匹／日である。同一実験者が、デジタル表示ノギスを用いて、腫瘍の長径及び短径を測定し、長径×(短径)２×0.52を腫瘍体積とした。腫瘍体積の増加抑制から抗癌効果を評価した。図８にPLC/PRF/5細胞移植後の腫瘍体積の変化を示した。化合物１０の投与群の腫瘍体積の増加はコントロール群に比較して有意に低く、化合物１０はin
vivoにおいて肝細胞癌に対して抗腫瘍効果を発揮できることが明らかになった。また、薬物投与による体重減少は観察されなかった。【００６３】
以上説明したように、本発明による上記一般式（Ｉ）で示されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類を含有する癌治療剤、癌再発予防剤は、肝癌の中でメナキノン-４が有効とされているDCP(des-g-carboxy prothrombin)陽性肝癌とメナキノン-４の効果が極めて低いDCP陰性肝癌のどちらに対しても優れた効果を持つ。また、本発明による上記一般式（Ｉ）で示されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類を含有する癌治療剤、癌再発予防剤はメナキノン-４の効果が低い肺癌、胃癌、大腸癌など上皮性の癌に対して優れた効果を持つ。上記一般式（Ｉ）で示されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類を含有する癌治療剤、癌再発予防剤は、キノン系抗癌剤耐性の胃癌や大腸癌など上皮性の癌に対しても優れた効果を持つ。さらに、本発明による上記一般式（Ｉ）で示されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類を含有する癌治療剤、癌再発予防剤は、キノン系抗癌剤の作用を増強する。上記一般式（Ｉ）で示されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類を含有する癌治療剤、癌再発予防剤は、白血病に対しても優れた効果を持つ。
さらに、本発明にかかる化合物の体内における代謝産物は主としてビタミンＫ類であり、その安全性はきわめて高い。
また上記一般式（Ｉ）で示されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステル類それ自身が抗癌作用ないし癌再発予防作用を発揮することが明らかとなり、その二次代謝産物であるビタミンＫ類にも抗癌作用ないし癌再発予防作用があるので、本発明により、さらに効率の良い安全な癌治療剤、癌再発予防剤の提供が可能となる。
【図１】
0004040082.tif 000024
【図２】
0004040082.tif 000025
【図３】
0004040082.tif 000026
【図４】
0004040082.tif 000027
【図５】
0004040082.tif 000028
【図６】
0004040082.tif 000029
【図７】
0004040082.tif 000030
【図８】
0004040082.tif 000031