(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンヒドロトロンビンのカルボキシル基がカルボジイミド誘導体を用いて修飾されたアンヒドロトロンビン誘導体。
【請求項２】
該カルボジイミド誘導体はＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド｛N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride｝およびＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−（４’−メチル−モルフォリニウム）エチルカルボジイミド−ｐ−トルエンスルフォネート）｛N-cyclohexyl-N'-2-(4'-methyl-morpolinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate｝からなる群より選ばれる１種以上である、請求項１記載のアンヒドロトロンビン誘導体。
【請求項３】
該カルボキシル基の修飾はさらにアミノ基を有する物質を用いて行われる請求項１または２に記載のアンヒドロトロンビン誘導体。
【請求項４】
アンヒドロトロンビンのカルボキシル基をカルボジイミド誘導体を用いて修飾することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンヒドロトロンビン誘導体の製造方法。
【請求項５】
該カルボジイミド誘導体はＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド｛N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride｝およびＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−（４’−メチル−モルフォリニウム）エチルカルボジイミド−ｐ−トルエンスルフォネート）｛N-cyclohexyl-N'-2-(4'-methyl-morpolinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate｝からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項４記載のアンヒドロトロンビン誘導体の製造方法。
【請求項６】
該カルボキシル基をさらにアミノ基を有する物質を用いて修飾する請求項４または５に記載のアンヒドロトロンビン誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンヒドロトロンビン誘導体を含有する血栓形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
技術分野
本発明は、トロンビン誘導体およびその製造方法、アンヒドロトロンビン誘導体およびその製造方法、当該トロンビン誘導体を用いた血小板凝集惹起組成物、血小板凝集惹起方法、臨床検査薬および臨床検査方法、当該アンヒドロトロンビン誘導体を用いた血栓形成抑制剤、吸着体およびその製造方法、および当該吸着体を用いて精製された血液凝固第ＶＩＩＩ因子の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
近年、血栓形成防止物質を合成する方法として、特開平１１−４９８００号公報に記載されているセリンプロテアーゼである活性化血液凝固因子にフェニルメチルスルフォニルフルオリド(PMSF)などの阻害剤と反応させて活性部位に存在するセリン残基をデヒドロアラニンに転換し、セリンプロテアーゼ活性を失わせて基質との結合能のみを維持させる方法（アンヒドロ化と称する）、あるいは遺伝子組換え操作によってセリンプロテアーゼ活性を消失させる方法が開発されている。これらの方法を用いてトロンビンを処理することにより得られたアンヒドロトロンビンは、活性化血液凝固因子と基質との反応を競争的に阻害する効果を持ち、トロンビン基質（活性化血液凝固因子、フィブリノーゲンなど）の吸着体のリガンドとしての利用や、血栓形成抑制剤としての利用が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このアンヒドロトロンビンは化学処理や遺伝子操作によってセリンプロテアーゼ活性を失わせたのみで基質の結合能に関しては未処理のトロンビンと基本的に変わらないため、アンヒドロトロンビンをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーでトロンビンの基質（血液凝固第Ｖ、第ＶＩＩＩ、第ＸＩ、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、プロテインＣなど）の混在する血漿などの液から血液凝固第ＶＩＩＩ因子を選択的に吸着、回収することは困難であった。また、アンヒドロトロンビンは抗血栓剤としての機能は有するものの、前述した抗血栓剤同等の抗血栓効果を示すためには使用量が多く必要であり、その使用が限られていた。
【０００４】
また、血小板機能異常の診断において、血小板凝集能の測定は必須であり、トロンビンは血小板凝集惹起物質として測定に使用されているが、トロンビンは血小板の凝集以外にもフィブリノーゲンの活性化も誘起するため、フィブリンの凝集隗が血小板凝集能の測定に悪影響を及ぼす問題があった。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、活性化血液凝固因子であるトロンビン、又はトロンビンをアンヒドロ化したアンヒドロトロンビンに関して、化学的、又は遺伝子操作による修飾によりトロンビン基質（血液凝固第ＶＩＩＩ因子）の選択性を向上させたトロンビンまたはアンヒドロトロンビン誘導体、及びトロンビン誘導体を成分として含む血小板凝集惹起物質及び臨床検査薬、及びこのアンヒドロトロンビンをリガンドとした吸着体、またアンヒドロトロンビン誘導体を主成分とし、抗血栓性能を向上させた血栓形成抑制剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の開示
本発明者は、トロンビンに関して鋭意研究を重ねた結果、トロンビンのカルボキシル基を修飾したトロンビン誘導体は、トロンビン基質のうちフィブリノーゲンの親和性を選択的に低下させる、即ち、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を阻害して、血小板のみを特異的に活性化することを見出した。
【０００７】
また、本発明者は、さらにアンヒドロトロンビンに関して鋭意研究を重ねた結果、アンヒドロトロンビンのカルボキシル基を修飾したアンヒドロトロンビン誘導体は、相対的に血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対する特異的選択性が向上すること、抗血栓性が向上することを知得した。これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、下記の（１）〜（３）の構成からなる。
【０００９】
（１）  アンヒドロトロンビンのカルボキシル基が修飾されたアンヒドロトロンビン誘導体。
【００１０】
（２）  アンヒドロトロンビンのカルボキシル基を修飾することを特徴とする前記アンヒドロトロンビン誘導体の製造方法。
【００１１】
（３）  前記（１）に記載のアンヒドロトロンビン誘導体を含有する血栓形成抑制剤。
【００１２】
図面の簡単な説明
第１図は、全血におけるトロンボエラストグラム（ＴＥＧ）である。
【００１３】
第２図は、実施例８において、１０μｌトロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【００１４】
第３図は、実施例８において、１００μｌ  ＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【００１５】
第４図は、実施例８において、１０μｌ  ＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【００１６】
第５図は、実施例９で得た修飾トロンビンによるフィブリノーゲンに対する凝固活性とアミノ基（アミン）量を示すグラフである。
【００１７】
第６図は、実施例１０において、各濃度のＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
第一の態様によると、本発明は、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基を修飾したトロンビンまたはアンヒドロトロンビン誘導体を提供するものである。
【００２０】
本発明で修飾の対象となるアンヒドロトロンビンの製造方法は特に限定されるものではなく、アンヒドロトロンビンとしては、例えば、特開平１１−４９８００号公報に示されているように、セリンプロテアーゼのセリン活性残基部位とＰＭＳＦなどの阻害剤とを反応させた後、ｐＨ１１以上でアルカリ処理を施し、アンヒドロ化して得られたもの、また、遺伝子組換えなどの手法でトロンビンの活性セリン残基をアラニンに置き換え酵素活性を消失させる方法で得られたものが挙げられる。
【００２１】
アンヒドロトロンビンの精製方法は特に制限されるものではなく、従来公知の精製分離方法を利用する事が出来る。具体的には、ｐＨ４〜１０の範囲で調整された緩衝液（セリンプロテアーゼのアンヒドロ化反応の際に用いられた緩衝液をそのまま使用してもよい）を使用して平衡化されたアフィニティークロマトグラフィーカラムにアンヒドロトロンビンの溶液を通液してクロマトグラフィー担体にアンヒドロトロンビンを選択的に吸着させたのち洗浄し、他の不純物を除去する方法がある。
【００２２】
その後、アフィニティークロマトグラフィー担体に結合したアンヒドロトロンビンを脱離する目的で、セリンプロテアーゼ阻害剤溶液、あるいはアミジノ基、グアニジル基、フェニル基、長鎖アルキル基、アルギニン残基のうち少なくとも１つ以上を有する物質溶液をｐＨ４〜１０に調整し、アフィニティーカラムに通液し、目的物質を溶出させる。その後、透析、限外濾過、ゲル濾過などの手法により前述の脱離液成分を除去し、高純度のアンヒドロトロンビンを得る事が出来る。
【００２３】
本発明のアンヒドロトロンビンの精製に利用する事が可能なセリンプロテアーゼ阻害剤としては、フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、２−フェニルエタン−１−スルホニルフルオリド、メタンスルホニルフルオリド、及びｐ−トルエンスルホニル（トシル）フルオリドなどの各種スルホニルフルオリド、さらに、トシルクロリド、 ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、３，４−ジクロロイソクマリン（３，４−ＤＣＩ）、Ｌ−１−クロロ−３−[４−トシルアシド]−７−アミノ−２−ヘプタノン−塩酸（ＴＬＣＫ）、及びＬ−１−クロロ−３−[４−トシルアシド]−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）などを挙げる事ができる。
【００２４】
上記のようにして得られたアンヒドロトロンビン、またはトロンビンの有するカルボキシル基を修飾し、トロンビン、またはアンヒドロトロンビン誘導体を得る。ここでいう修飾とは、トロンビン、またはアンヒドロトロンビンの有するカルボキシル基の一部または全ての修飾を意味し、その修飾方法としては、イミド結合またはアミド結合であることが好ましく、例えば、トロンビン、またはアンヒドロトロンビンの有するカルボキシル基の一部または全てをイミドと結合させる方法；トロンビン、またはアンヒドロトロンビンの有するカルボキシル基の一部または全てをアミノ基を有する物質と結合させる方法；およびトロンビン、またはアンヒドロトロンビンの有するカルボキシル基の一部または全てをイミド及びアミノ基を有する物質と結合させて、当該カルボキシル基を修飾する方法がある。アミノ基を有する物質としては、化合物、天然由来の物質など特に限定はないが、カルボキシル基周辺の立体的嵩を増すものがより好ましい。また、これらの反応の方法については従来既知の方法を用いることができる。
【００２５】
前記に使用されるイミドは、特に制限されないが、カルボジイミド誘導体、より好ましくは式：Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２で示されるカルボジイミド誘導体が好ましく使用される。上記式において、Ｒ１及びＲ２は、メチル基、エチル基、シクロヘキシル基等の炭素原子数１〜１５の鎖状または環状アルキル基、（２−モルホリノエチル）−ｐ−トルエンメトスルホン酸塩、（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸塩などを表わす。この際、Ｒ１及びＲ２は、同一あってもあるいは異なるものであってもよい。より具体的には、カルボジイミド誘導体としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下「ＤＣＣ」と記載する）［Ｃ６Ｈ１１−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｃ６Ｈ１１］、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド｛N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride｝［ＣＨ３ＣＨ２−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−（ＣＨ２）３Ｎ＋Ｈ（ＣＨ３）２Ｃｌ−］（以下「ＥＤＣ」と記載する）、及びＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−（４’−メチル−モルフォリニウム）エチルカルボジイミド−ｐ−トルエンスルフォネート）｛N-cyclohexyl-N'-2-(4'-methyl-morpolinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate｝(以下「ＣＭＣ」と記載する)などが挙げられる。これらのカルボジイミド誘導体は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。これらのうち、水溶性カルボジイミドであるＥＤＣ及びＣＭＣが特に好ましく使用される。
【００２６】
本発明において、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基のイミドによる修飾条件は、使用されるアンヒドロトロンビンや修飾物質（イミド）の種類や量、ならびに他の条件などによって異なり、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基を所望の程度にまで修飾できる条件であれば特に制限されない。トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基の修飾に好ましい一実施態様を以下に記載する。すなわち、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンをまず適当なｐＨの緩衝液で透析した後、修飾物質を添加し、０〜５０℃、好ましくは４〜２５℃、特に好ましくは室温で、０．５〜２４時間、好ましくは１〜７時間、攪拌する。この際、使用できる緩衝液としては、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７を示す緩衝液から任意に選ばれたものを加えたものであれば良い。こうした緩衝液としては、例えば、ピペス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、生理的塩類溶液あるいはグッドの緩衝液などを挙げることができる。また、修飾物質の添加量は、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基を所望の程度にまで修飾できる量であれば特に制限されないが、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンに対して過剰に存在することが好ましく、例えば、上記緩衝液中に０.０1Ｍ〜５Ｍ、より好ましくは０．１〜２Ｍ程度の濃度で存在することが好ましい。
【００２７】
なお本発明において、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基のイミド（カルボジイミド誘導体）による修飾によって、カルボキシル基は、下記式に示されるように修飾されると考えられる。
【００２８】
【化１】
0004137642.tif 000002
【００２９】
本発明において、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基の修飾は、アミノ基を有する物質を用いて行なわれてもよい。このようなアミノ基を有する物質による修飾によって、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド（−ＣＯ−ＮＨＲ）に変換する。この際、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基の修飾は、アミノ基を有する物質単独を用いて行なわれても良いが、アミノ基を有する物質及びイミドを組合わせて使用して行なわれることが好ましい。後者の場合、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基をイミドで修飾した後に、またはトロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基のイミドによる修飾工程中に同時に加えてもよい。
【００３０】
本発明で使用されるアミノ基を有する物質は、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド（−ＣＯ−ＮＨＲ）に変換するものであれば、化合物、天然由来の物質など特に限定はないが、カルボキシル基周辺の立体的嵩を増すものがより好ましい。アミノ基を有する物質の具体例としては、エチレンジアミン、トリスヒドロキシアミノメチル、ヒドロキシアミン、エタノールアミン、塩化アンモニウムなどが挙げられる。これらのうち、エチレンジアミン、トリスヒドロキシアミノメチルが好ましい。また、これらの反応の方法については従来既知の方法を用いることができる。アミノ基を有する物質は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００３１】
本発明において、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基のイミド及びアミノ基を有する物質による修飾条件は、使用されるアンヒドロトロンビンや修飾物質（イミド及びアミノ基を有する物質）の種類や量、ならびに他の条件などによって異なり、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基を所望の程度にまで修飾できる条件であれば特に制限されない。トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基の修飾に好ましい一実施態様を以下に記載する。すなわち、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンをまず適当なｐＨの緩衝液で透析して夾雑物を除去した後、修飾物質を添加し、０〜５０℃、好ましくは４〜２５℃、特に好ましくは室温で、０．５〜２４時間、好ましくは１〜７時間、攪拌する。この際、使用できる緩衝液としては、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７を示す緩衝液から任意に選ばれたものを加えたものであれば良い。こうした緩衝液としては、例えば、ピペス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、生理的塩類溶液あるいはグッドの緩衝液などを挙げることができる。また、イミド及びアミノ基を有する物質の添加量は、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基を所望の程度にまで修飾できる量であれば特に制限されないが、イミドの添加量は、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンに対して過剰に存在することが好ましく、例えば、上記緩衝液中に０．０１〜５Ｍ、より好ましくは０．１〜２Ｍであることが好ましい。また、アミノ基を有する物質の添加量は、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンに対して過剰に存在することが好ましく、例えば、上記緩衝液中に０．１Ｍ〜５Ｍ、より好ましくは０．５〜２Ｍであることが好ましい。
【００３２】
なお、本発明において、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンのカルボキシル基のイミド（カルボジイミド誘導体）及びアミノ基を有する物質による修飾によって、カルボキシル基は、下記式に示されるように修飾されると考えられる。
【００３３】
【化２】
0004137642.tif 000003
【００３４】
本発明において、上記のトロンビン誘導体は、トロンビンのカルボキシル基の一部または全てをイミドと結合させることにより、またはトロンビンをイミド及びアミノ基を有する化合物と結合させることにより、フィブリノーゲンとの親和性を選択的に低下させたものであり、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を阻害して、血小板のみを特異的に活性化することを特徴とする。このため、本発明のトロンビン誘導体は、血小板凝集惹起物質として、さらには、臨床検査薬、特に血小板の正常性をモニターするための検査薬として有用である。
【００３５】
また、本発明において、上記のアンヒドロトロンビン誘導体は、アンヒドロトロンビンのカルボキシル基の一部または全てをイミドと結合させることにより、またはアンヒドロトロンビンをイミド及びアミノ基を有する化合物と結合させることにより、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を含む血液凝固因子や血小板などへの何等かの作用あるいは影響によって血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対する向上した選択的親和性を有する；および抗血栓性が改善されることを特徴とする。このため、本発明のアンヒドロトロンビン誘導体は、吸着体、特に血液凝固第ＶＩＩＩ因子の精製用の吸着体に；および血栓形成抑制剤、特に血液凝固第ＶＩＩＩ因子に特異的な血栓形成抑制剤として有用である。
【００３６】
第二の態様によると、本発明は、トロンビンのカルボキシル基を修飾したトロンビン誘導体を成分とする血小板凝集惹起物質及び臨床検査薬である。本発明のトロンビン誘導体はフィブリノーゲンの親和性を修飾により低下させており、トロンビンによるフィブリン形成を押さえることが可能なため、フィブリン析出による影響を受けず、血小板凝集作用のみを特異的に生じさせることが可能である。また、この特質を生かし、血栓症などにおける臨床検査用の試薬として使用できる。
【００３７】
第三の態様によると、本発明は、アンヒドロトロンビンのカルボキシル基を修飾したアンヒドロトロンビン誘導体を含有する血栓形成抑制剤を提供するものである。臨床で、血液凝固を抑制すべき病体は多く、その時の状態に応じて血栓形成抑制剤を投与する必要があるが、本発明の血栓形成抑制剤は生理的な物質由来であり、従来のアンヒドロトロンビンを含有する血栓形成抑制剤と比較してより少量で血液凝固抑制効果を示すため、安全性、コスト面からも好ましい。
【００３８】
第四の態様によると、本発明はアンヒドロトロンビンのカルボキシル基と水不溶性担体上の官能基を結合してなる吸着体を提供するものである。
【００３９】
本発明に使用される担体としては、公知の担体が使用できるが、水不溶性担体が好ましく使用される。本明細書において、「水不溶性担体」ということばは、担体を構成する成分が非水溶性、または水溶性の物質を架橋反応などの処理を行うことにより水不溶性とした物質からなる担体を意味する。具体的には架橋アガロース、セルロース、キトサン、及びポリアクリルアミドなどが挙げられ、これらのうち、セルロース及び架橋アガロースが担体として好ましく使用される。また、該水不溶性担体の形状は、特に制限されず、公知の形状が使用されるが、例えば、球状粒子状、中空糸状および膜状などの形状が挙げられる。
【００４０】
本発明において、水不溶性担体が球状粒子である場合には、その形状は正確に真球である必要はないものの、真球度の高いものであることが好ましい。具体的には、球状粒子の真球度が０．９以上、より好ましくは０．９５以上であることが好ましい。なお、本明細書において、「真球度」とは、粒子の最小径（短径）に対する最大径（長径）の比（＝短径／長径）であり、ゆえにこの値が１．０に近づくほど真球度が高い、即ち、真球に近くなることを意味する。
【００４１】
また、本発明において、水不溶性担体の形状が球状である場合、この水不溶性担体は球状セルロースであることが好ましい。このように水不溶性担体として球状セルロースを使用することによって、リガンドであるアンヒドロトロンビンの固定化が容易であり、アンヒドロトロンビンをリガンドして含む活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子吸着体は、生体適合性及び強度とも高くなる。このため、本発明の吸着体は、活性化および／または非活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の吸着体として有効である。なお、ここで示される「生体適合性」ということばは、担体を吸着体担体として用いて精製操作を行う際に、担体から生体に有害な物質の溶出が生じないということを意味する。
【００４２】
本発明において、水不溶性担体の形状が中空糸状である場合における中空糸状の担体とは、内部に連続または不連続の空洞を有する繊維状の担体を意味し、例えば、紡糸液に発泡剤を添加することにより、または特殊な口金などを用いて内部に空洞を形成する事により得られる。
【００４３】
さらに、本発明において、水不溶性担体の形状が膜状である場合における膜状の担体としては、市販のメンブランフィルターのように平板状で多孔を有し、一定の範囲の排除限界分子量を持つものがある。
【００４４】
本発明において、アンヒドロトロンビンのカルボキシル基を水不溶性担体に固定する方法としては、従来既知の方法が使用できるが、例示すると水溶性カルボジイミドであるＥＤＣや、ＣＭＣを用い、水不溶性担体上のアミノ基と結合させる方法、または、アンヒドロトロンビンのカルボキシル基とＥＤＣ、あるいはＣＭＣを結合させた後、エチレンジアミンなどの複数のアミノ基を有する化合物と縮合させた後、導入されたアミノ基と水不溶性担体上のＮ―ヒドロキシサクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）(以下、「ＮＨＳ」と称する。)とを結合させる方法などがある。結合の方法としてはＮＨＳ結合担体を用いての結合が過剰活性基のブロッキングの際にリガンドであるアンヒドロトロンビンの有するアミノ基に影響を与えないため、より好ましい。
【００４５】
水不溶性担体とリガンドの間に挿入するスペーサーに関しては特に限定はなく、エポキシ基、ホルミル基などを有する公知の化合物で適度の長さを持つものを適宜選択することができる。
【００４６】
第五の態様によると、本発明は、第四の態様の活性化凝固第ＶＩＩＩ因子吸着体を使用する活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の製造方法を提供するものである。この方法を使用することによって、他のトロンビン基質であるフィブリノーゲンや、活性化血液凝固第Ｖ因子をほとんど吸着せず、活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を選択的に吸着することができ、また免疫原となる物質や異種蛋白やウィルスなどの混入の可能性も有意に低く押さえることができる。
【００４７】
本発明の活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の製造方法としては、本発明の第四の態様である活性化凝固第ＶＩＩＩ因子吸着体をカラムに充填し、他の血液凝固因子などの含まれた血漿成分、あるいは夾雑物として異種蛋白やウィルスなどが混入している血漿などの溶液中から活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を選択的に吸着し、高度に回収、あるいは除去を行う方法である。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明の実施例により具体的に説明する。
実施例１：アンヒドロトロンビンの合成
人血漿由来トロンビン６０ｍｇを０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００ｍｌに溶解した。この溶液に７％ＰＭＳＦメタノール溶液１００μｌを、３０分間隔で３回添加した。反応の間溶液の温度を２５℃に保った。反応後のトロンビン活性は１％以下であった。ＰＭＳ−トロンビン溶液を０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したセファデックス(Sephadex)  Ｇ−２５カラム（ファルマシア社製）に注入し緩衝液の交換を行った。
【００４９】
上記溶液を４℃、１２０ｍｌに調整し終濃度０．０５Ｍになるように１Ｎ  ＮａＯＨを添加し１２分反応を行なった。得られた溶液に対し３Ｎ  ＮａＣｌ  ６０ｍｌを添加し、次いで１５０ｍｌ  グリセリンを添加攪拌した。上記溶液を１０倍量の１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に透析後、再度０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に透析した。
【００５０】
実施例２：アンヒドロトロンビンの精製
実施例１で得られたアンヒドロトロンビン溶液をバイオマックス１０（ミリポア社）によって５０ｍｌに濃縮し、３０ｍｇ  ｐ−アミジノフェニルメタンスルフォニルフルオリド（ＡＰＭＳＦ）を添加し残存活性を不活性化した。
【００５１】
さらに得られた溶液を０．１％ＰＥＧを含む５ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ６．５に平衡化したベンズアミジンセファロースカラムに添加した。ピークが終わるまで同緩衝液で洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍベンズアミジン（ｐＨ６．５）により溶出し、２０ｍｌずつ６０ｍｌを分取した。それぞれの蛋白量を測定し、アンヒドロトロンビンの含まれるフラクションを確認し、このフラクションを０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で透析し、溶液中のベンズアミジンを取り除いた。この溶液中の蛋白量は３０ｍｇ（収率５０％）であった。
【００５２】
実施例３：アンヒドロトロンビンの修飾
実施例２で得られたアンヒドロトロンビン３０ｍｇをｐＨ６に調整した２０ｍＭ  ピペスバッファー、０．５Ｍ  ＮａＣｌに透析した。透析後３０ｍｌに調整し２０ｍｇ／ｍｌになるようにＥＤＣを加え攪拌した。室温で３時間反応し、アンヒドロトロンビン誘導体としてＥＤＣ修飾アンヒドロトロンビン３０ｍｇを得た。
【００５３】
実施例４：アンヒドロトロンビン結合アフィニティ−クロマトグラフィーの製造
実施例２で得られたアンヒドロトロンビン３０ｍｇをｐＨ６に調整した２０ｍＭ  ピペスバッファー  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ１０ｍｌ中に透析し、アミノセルロファイン（チッソ社）２０ｍｌに添加した。再びｐＨを６に調整し  ２０ｍｇ／ｍｌになるようにＥＤＣを添加し６時間室温で反応させた。
【００５４】
実施例５
実施例４で得られたセルロースゲルをカラムに充填し５０ｍＭ  ピペスバッファー  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５で平衡化した。同バッファーに溶解したコンファクトＦ（化血研）を添加し同バッファーで非吸着ピークを洗浄した。さらに混入するフィブリノーゲンを５０ｍＭ  ピペスバッファー  ０．３Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５で洗浄後５０ｍＭ  ピペスバッファー  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ  １Ｍ  アルギニン塩酸塩  ｐＨ６．５で血液凝固第ＶＩＩＩ因子を溶出した。混入するフィブリノーゲンを除去し約非活性１０００ｕ／ｍｇ  血液凝固第ＶＩＩＩ因子が回収された。
【００５５】
実施例６
実施例３で得られた誘導体を添加し全血のトロンボエラストグラム（ＴＥＧ）を測定し、その結果を第１図に示す。その結果、第１図に示されるように、本発明のＥＤＣ修飾アンヒドロトロンビンは、濃度依存的に凝固を延長した。
【００５６】
実施例７
人血漿に対し実施例３のアンヒドロトロンビン誘導体（ＥＤＣ修飾アンヒドロトロンビン）を添加し、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）（表１）、ＰＴ（プロトロンビン時間）（表２）を測定した。
【００５７】
【表１】
0004137642.tif 000004
【００５８】
【表２】
0004137642.tif 000005
【００５９】
上記表１及び２に示される結果から、本発明のアンヒドロトロンビン誘導体であるＥＤＣ修飾アンヒドロトロンビンは、ＡＰＴＴに特異的な濃度依存的な血漿凝固時間の延長が確認された。この際、ＡＰＴＴは内因系凝固に関連し、ＰＴは外因系凝固に関連することを考え合わせると、本発明のアンヒドロトロンビン誘導体であるＥＤＣ修飾アンヒドロトロンビンは、外因系ではなく内因系凝固に関与して凝固時間を延長し、これから血栓形成抑制剤として有用であることが示唆される。さらに、上記実施例５及び下記実施例１１から、本発明のアンヒドロトロンビン誘導体は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合することから、特に血液凝固第ＶＩＩＩ因子に特異的な血栓形成抑制剤として有用であることが示唆される。
【００６０】
実施例８
人トロンビン４ｍｇを５０ｍＭ  ピペスバッファー  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５  ４ｍｌに溶解し  １００ｍｇＥＤＣを添加し３時間反応し、トロンビン誘導体としてＥＤＣ修飾トロンビンを得た。血小板数４０万／μｌに調整した人多血小板血漿（ＰＲＰ）を用い上記物質を惹起物質として血小板凝集を測定した。凝集は吸光度の低下をモニターした（凝集メータアグリテックＴＥ−５００使用）。ＰＲＰ２４０μｌに対して、惹起物質としてのＥＤＣ修飾トロンビン１０μｌ及び１００μｌを、それぞれ、添加した。比較として１０μＭのトロンビンを用いた。
【００６１】
第２図、第３図及び第４図は、それぞれ、１０μｌ  トロンビン、１００μｌ  ＥＤＣ修飾トロンビン、１０μｌ  ＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。第２図、第３図及び第４図から、ＥＤＣ修飾トロンビンを用いることによって、比較対照としてのトロンビンを用いた場合に比較して、ノイズの少ないモニターが可能であることが分かった。
【００６２】
より詳しくのべると、トロンビンは、血栓形成の惹起物質であり、従来、血小板の正常性をモニターするための血小板活性化物質の一である。しかしながら、第２図に示されるように、トロンビンを用いた場合には、モニター中にノイズがかなり生じることが分かる。このようなノイズは、トロンビンは、血小板の活性化のみでなく、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換をも引き起こすために生じると考えられ、ゆえに、血小板の正常性のみを選択的にモニターするためには、トロンビンからフィブリノーゲンを除去する必要がある。これに対して、本発明のトロンビン誘導体であるＥＤＣ修飾トロンビンは、第３図及び第４図から示されるように、モニター中のノイズがほとんど生じずに、即ち、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換をも引き起こさずに、血小板のみを特異的に活性化できることが示される。したがって、血小板の正常性のモニターにおいて、フィブリノーゲンを除去する必要がないと考えられる。なお、以下の考察によって本発明が限定されるものではないが、本発明のトロンビン誘導体によるフィブリノーゲンからフィブリンへの変換の抑制（または阻害）は、トロンビン誘導体が、トロンビンのカルボキシル基の修飾により、トロンビンによるフィブリノーゲンの活性化部位を修飾することによると考えられる。
【００６３】
これから、本発明のトロンビン誘導体は、血小板凝集惹起物質として、さらには、臨床検査薬、特に血小板の正常性をモニターするための検査薬として有用であると考えられる。
【００６４】
実施例９
（ｉ）：エチレンジアミン修飾トロンビンの調製
トロンビンをヘパリンカラムに添加して吸着させ、１ｍＭ  ピペスバッファー、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて溶出した。得られたトロンビン含有溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）に同量のエチレンジアミンを含む溶液（１Ｍエチレンジアミン−１ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５）を混合した。次いで、これに最終濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＥＤＣを添加し、ＥＤＣの添加から、２時間にわたり、室温で攪拌し、縮合反応を行わせ、カルボジイミド添加時（反応０分時）から１、１５、３０、６０、９０、１２０分後に試料の一部を採取した。
【００６５】
（ｉｉ）：エチレンジアミン修飾トロンビンのフィブリノーゲンに対する凝固活性
上記反応０分時、１分時、１５分時、３０分時、６０分時、９０分時、１２０分時の試料に、同量のバッファー（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を加え縮合反応を停止した。
【００６６】
得られた各サンプル３００μｌにフィブリノーゲン溶液（約０．１％）１ｍｌを加え、フィブリノーゲン凝固時間を室温にて測定した。
【００６７】
反応０分時のサンプルの凝固時間を１００％として、各サンプルの凝固活性を示すと、その活性は減少し、反応６０分時以降、その活性はほぼ喪失した。結果を第５Ａ図に示す。
【００６８】
（ｉｉｉ）：エチレンジアミン修飾トロンビンのアミノ基の定量
上記（ｉ）の反応０分時、１分時、１５分時、３０分時、６０分時、９０分時、１２０分時の試料に、少量の強アルカリ溶液を加え反応を停止し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ−５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液にて充分に透析を行ない、非結合エチレンジアミンを除去した。
【００６９】
得られた各サンプル溶液に０．１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ３を加え、次にＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）液を添加し、速やかに攪拌し、５分後に亜硫酸イオンを含む溶液を加え反応を停止した。
【００７０】
４２０ｎｍでの吸光度（図５ＢにおけるＡ420）を測定し、各サンプルのアミノ基の定量を行った。
【００７１】
結果を第５Ｂ図に示す。縮合反応の経過時間と共に吸光度が増加し、トロンビンの表面へのエチレンジアミンの縮合反応量の増加が示された。なお、トロンビンの表面にはジカルボン酸であるアスパラギン酸やグルタミン酸が存在するため、上記処理（ｉ）により該カルボキシル基にエチレンジアミンのアミノ基が縮合する。また、エチレンジアミンはアミノ基を２個有するため、縮合反応に使用されないアミノ基がＴＮＢＳと反応し４２０ｎｍの吸収によって定量される。
【００７２】
実施例９の結果から、カルボジイミドを用いたトロンビンのカルボキシル基への修飾反応は経過時間と共に進行した。このことは、トロンビンに含まれる複数のカルボキシル基に対するカルボジイミドによる修飾が時間の経過と共に進行し、反応時間が長いほどトロンビンにおけるカルボジイミドの修飾率を増加させ得ることが判明した。そして、該エチレンジアミン修飾トロンビンによるフィブリノーゲンに対する凝固活性は、反応６０分時のエチレンジアミン修飾トロンビンによって完全に消失していた。
【００７３】
一方、フィブリノーゲンに対する凝固活性は、反応１分時から急激に低下しており、対応するアミノ酸の定量値と対比すると、トロンビンの一部にカルボジイミドによる修飾が行われた場合でも有効にフィブリノーゲンに対する凝固活性の低下効果が得られることが判明した。
【００７４】
実施例１０
人トロンビン４ｍｇを５０ｍＭ  ピペスバッファー、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５  ４ｍｌに溶解し  １００ｍｇＥＤＣを添加し３時間反応し、トロンビン誘導体としてＥＤＣ修飾トロンビンを得た。血小板数４０万／μｌに調整した人多血小板血漿（ＰＲＰ）を用い上記物質を惹起物質として血小板凝集を測定した。凝集は吸光度の低下をモニターした（凝集メータアグリテックＴＥ−５００使用）。ＰＲＰに対して惹起物質としてのＥＤＣ修飾トロンビンを、それぞれ、９１．３ｎＭ、３６．５ｎＭ、３０．１ｎＭ、２４．２ｎＭ、２０．１ｎＭ、１０．１ｎＭの濃度になるように、添加した。比較としてＥＤＣ修飾トロンビンを加えないもの（添加濃度：０ｎＭ）を用いた。
【００７５】
第６図は、各濃度のＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。第６図から、ＥＤＣ修飾トロンビンの添加濃度が多いほど、吸光度は急激に立ち上がり、即ち、迅速に血小板を凝集させることが分かり、ゆえに、ＥＤＣ修飾トロンビンは、濃度に依存して血小板を惹起することが分かった。
【００７６】
これから、本発明のトロンビン誘導体は、血小板凝集惹起物質として、さらには、臨床検査薬、特に血小板の正常性をモニターするための検査薬として有用であると考えられる。
【００７７】
実施例１１
本実施例では、エチレンジアミン修飾アンヒドロトロンビンの基質親和性を以下のようにして評価した。
【００７８】
実施例２で得られたアンヒドロトロンビンを、１ｍＭ  ピペスバッファー、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて透析し、得られたアンヒドロトロンビン含有溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）に同量のエチレンジアミンを含む溶液（１Ｍエチレンジアミン、１ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を混合した。次いで、これに最終濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるようＥＤＣを添加し、ＥＤＣの添加から、２時間にわたり、室温で攪拌し、縮合反応を行わせた。反応後、修飾アンヒドロトロンビンを０．５Ｍ  炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（４℃）に対して２回透析して、エチレンジアミン修飾アンヒドロトロンビンを得た。
【００７９】
このようにして得られたエチレンジアミン修飾アンヒドロトロンビン及び比較としてのアンヒドロトロンビンについて、フィブリノーゲン（Ｆｂｇｎ）、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及び血液凝固第Ｖ因子（ＦＶ）との間の解離定数（Ｋｄ値）をＩＡｓｙｓ（日製産業）を用いて測定した。結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
0004137642.tif 000006
【００８１】
上記表３に示されるように、エチレンジアミン修飾アンヒドロトロンビンは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対しては高い親和性を保っていたが、フィブリノーゲン（Ｆｂｇｎ）及び血液凝固第Ｖ因子（ＦＶ）に対しては親和性がＦＶＩＩＩに対する親和性に比して数百分の１程度と有意に低下した。これから、本発明のアンヒドロトロンビン誘導体であるエチレンジアミン修飾アンヒドロトロンビンは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対して特異的に結合することが示唆される。
【００８２】
産業上の利用可能性
本発明のトロンビン誘導体はフィブリノーゲンに対する親和性が低下しているため、血小板凝集惹起組成物として、さらには臨床検査用などに特異的な凝固反応試薬として利用できる。また、アンヒドロトロンビンをリガンドとし、カルボキシル基と結合させたアフィニティークロマトグラフィーにより、血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対してより選択性の高い精製が可能となり、また、アンヒドロトロンビンのカルボキシル基を修飾したアンヒドロトロンビン誘導体は、従来のアンヒドロトロンビンに比べ少量で十分な抗血栓効果を生じるため、血栓形成抑制剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  第１図は、全血におけるトロンボエラストグラム（ＴＥＧ）である。
【図２】  第２図は、実施例８において、１０μｌトロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【図３】  第３図は、実施例８において、１００μｌ  ＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【図４】  第４図は、実施例８において、１０μｌ  ＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【図５】  第５図は、実施例９で得た修飾トロンビンによるフィブリノーゲンに対する凝固活性とアミノ基（アミン）量を示すグラフである。
【図６】  第６図は、実施例１０において、各濃度のＥＤＣ修飾トロンビン添加後の血小板凝集の変化（吸光度の変化）を示すグラフである。
【図１】
0004137642.tif 000007
【図２】
0004137642.tif 000008
【図３】
0004137642.tif 000009
【図４】
0004137642.tif 000010
【図５Ａ】
0004137642.tif 000011
【図５Ｂ】
0004137642.tif 000012
【図６】
0004137642.tif 000013