(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ1−Ｒ2およびＲ1−Ｌ−Ｒ2からなる群より選ばれる式を有する融合タンパク質であって、式中、Ｒ1はＦｃタンパク質、その類似体または誘導体、Ｒ2はＯＢタンパク質、その類似体または誘導体、Ｌはリンカーを示し、
該Ｆｃ、その類似体または誘導体が、
（ａ）配列番号９の１〜２３３位のアミノ酸、配列番号１２の１〜２３３位のアミノ酸、配列番号１５の１〜２２８位のアミノ酸および配列番号１８の１〜２２８位のアミノ酸よりなる群から選ばれ、
配列番号３に記載のアミノ酸配列１〜１４６または配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜１４６からなる群より選択されるＯＢタンパク質の血中半減期に比べて、該融合タンパク質の血中半減期が長くなっており、安定性が増大しており、分解性が低下していることを特徴とする、前記融合タンパク質。
【請求項２】
該ＯＢタンパク質、その類似体または誘導体が、
（ａ）配列番号３または配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜１４６；
（ｂ）３５位にリシン残基を有し７４位にイソロイシン残基を有する配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜１４６；
（ｃ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５位（配列番号６の番号付けを使用している）の３２箇所のうちの１〜３２箇所の位置で置換された異なるアミノ酸を有する（ｂ）項のアミノ酸配列；
（ｄ）２８位のグルタミニル残基が場合により欠けていてもよい（ａ）、（ｂ）または（ｃ）項のアミノ酸配列；
（ｅ）Ｎ末端にメチオニル残基を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）項のアミノ酸配列；
（ｆ）トランケート化ＯＢタンパク質類似体であって、以下（３５位にリシン残基を有し７４位にイソロイシン残基を有する配列番号６の番号付けを使用している）から選ばれるもの：
（ｉ）アミノ酸９８〜１４６、
（ｉｉ）アミノ酸１〜３２、
（ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６、
（ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６、
（ｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６（アミノ酸位置１００〜１１１の１〜１２個のアミノ酸がアミノ酸９９と１１２との間に順番に位置する）、および
（ｖｉ）アミノ酸位置１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１３箇所のうち１〜１３箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉ）項のトランケート化ＯＢ類似体、
（ｖｉｉ）アミノ酸位置４、８および３２の３箇所のうち１〜３箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉｉ）項のトランケート化類似体、
（ｖｉｉｉ）アミノ酸位置５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１および１１２の２１箇所のうち１〜２１箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉｉｉ）項のトランケート化類似体、
（ｉｘ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の２５箇所のうち１〜２５箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉｖ）項のトランケート化類似体、
（ｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の３２箇所のうち１〜３２箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｖ）項のトランケート化類似体、
（ｘｉ）Ｎ末端メチオニル残基を有する（ｆ）（ｉ）〜（ｘ）項のいずれかのトランケート化類似体；
（ｇ）タンパク質部分に結合した化学残基部分を含む、（ａ）〜（ｆ）項のいずれかのＯＢタンパク質、類似体または誘導体；
（ｈ）該化学残基部分が水溶性重合体残基である（ｇ）項の誘導体；
（ｉ）該水溶性重合体残基がポリエチレングリコールである（ｈ）項の誘導体；
（ｊ）該水溶性重合体残基がポリアミノ酸残基である（ｈ）項の誘導体；および
（ｋ）該水溶性重合体残基が該タンパク質部分のＮ末端のみに結合している（ｈ）項の誘導体
よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
該リンカー配列が、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびアラニンよりなる群から選ばれる１以上のアミノ酸である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
該リンカーが、
（ａ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｂ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｃ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｄ）ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｅ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｆ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｇ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ；
（ｉ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｊ）化学残基部分；および
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）項の任意の組合せ
よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｒ1−Ｒ2およびＲ1−Ｌ−Ｒ2よりなる群から選ばれる式で表される融合タンパク質をコードする核酸であって、式中、Ｒ1はＦｃタンパク質、その類似体または誘導体、Ｒ2はＯＢタンパク質、その類似体または誘導体、Ｌはリンカーを示し、
該Ｆｃタンパク質、その類似体または誘導体は、
（ａ）配列番号９の１〜２３３位のアミノ酸、配列番号１２の１〜２３３位のアミノ酸、配列番号１５の１〜２２８位のアミノ酸および配列番号１８の１〜２２８位のアミノ酸よりなる群から選ばれ、
配列番号３に記載のアミノ酸配列１〜１４６または配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜１４６からなる群より選択されるＯＢタンパク質の血中半減期に比べて、該融合タンパク質の血中半減期が長くなっており、安定性が増大しており、分解性が低下していることを特徴とする、前記核酸。
【請求項６】
ＯＢタンパク質、類似体または誘導体部分を有する融合タンパク質をコードする請求項５に記載の核酸であって、
該ＯＢタンパク質、類似体または誘導体部分を有する融合タンパク質が、
（ａ）配列番号３または配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜１４６；
（ｂ）３５位にリシン残基を有し７４位にイソロイシン残基を有する配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜１４６；
（ｃ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５位（配列番号６の番号付けを使用している）の３２箇所のうちの１〜３２箇所の位置で置換された異なるアミノ酸を有する（ｂ）項のアミノ酸配列；
（ｄ）２８位のグルタミニル残基が場合により欠けていてもよい（ａ）、（ｂ）または（ｃ）項のアミノ酸配列；
（ｅ）Ｎ末端にメチオニル残基を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）項のアミノ酸配列；
（ｆ）トランケート化ＯＢタンパク質類似体であって、以下（３５位にリシン残基を有し７４位にイソロイシン残基を有する配列番号６の番号付けを使用している）から選ばれるもの：
（ｉ）アミノ酸９８〜１４６、
（ｉｉ）アミノ酸１〜３２、
（ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６、
（ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６、
（ｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６（アミノ酸位置１００〜１１１の１〜１２個のアミノ酸がアミノ酸９９と１１２との間に順番に位置する）、および
（ｖｉ）アミノ酸位置１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１３箇所のうちの１〜１３箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉ）項のトランケート化ＯＢ類似体、
（ｖｉｉ）アミノ酸位置４、８および３２の３箇所のうちの１〜３箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉｉ）項のトランケート化類似体、
（ｖｉｉｉ）アミノ酸位置５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１および１１２の２１箇所のうちの１〜２１箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉｉｉ）項のトランケート化類似体、
（ｉｘ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の２５箇所のうちの１〜２５箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｉｖ）項のトランケート化類似体、
（ｘ）アミノ酸位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の３２箇所のうちの１〜３２箇所が別のアミノ酸で置換されている（ｆ）（ｖ）項のトランケート化類似体、
（ｘｉ）Ｎ末端メチオニル残基を有する（ｆ）（ｉ）〜（ｘ）項のいずれかのトランケート化類似体；
（ｇ）タンパク質部分に結合した化学残基部分を含む、（ａ）〜（ｆ）項のいずれかのＯＢタンパク質、類似体または誘導体；
（ｈ）該化学残基部分が水溶性重合体残基である（ｇ）項の誘導体；
（ｉ）該水溶性重合体残基がポリエチレングリコールである（ｈ）項の誘導体；
（ｊ）該水溶性重合体残基がポリアミノ酸残基である（ｈ）項の誘導体；および
（ｋ）該水溶性重合体残基が該タンパク質部分のＮ末端のみに結合している（ｈ）項の誘導体
からなる群より選ばれる、前記核酸。
【請求項７】
Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａよりなる群から選ばれる１以上のアミノ酸のリンカー配列を有する融合タンパク質をコードする、請求項５に記載の核酸。
【請求項８】
（ａ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｂ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｃ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｄ）ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｅ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｆ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｇ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ；
（ｉ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｊ）化学残基部分；および
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）項の任意の組合せ
よりなる群から選ばれるリンカーを有する融合タンパク質をコードする、請求項５に記載の核酸。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸配列を含有するベクター。
【請求項１０】
該ベクターがｐＡＭＧ２１および請求項５に記載の核酸配列である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターを含有する原核性または真核性宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主細胞を適当な条件下で培養し、産生したタンパク質を単離する工程を含んでなる、請求項１に記載の融合タンパク質の製造法。
【請求項１３】
産生した融合タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項１２に記載の製造法。
【請求項１４】
医薬上許容される希釈剤、佐剤または担体中に請求項１に記載の融合タンパク質の有効量を含む医薬組成物。
【請求項１５】
過剰体重、糖尿病、高い血中脂質レベル、動脈硬化症、動脈斑、胆石形成（の軽減または予防）、不十分な非脂肪組識重、不十分なインスリン感受性および卒中からなる群より選ばれる障害の治療のための医薬組成物であって、請求項１に記載の融合タンパク質の有効量を含む前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、Fc-OB融合タンパク質組成物ならびにその製造法および用途に関する。
背景
肥満の分子的基礎はほとんど知られていないが、「OB遺伝子」およびコードされるタンパク質（「OBタンパク質」または「レプチン」）の同定により、体脂肪蓄積を調節するために身体が用いているメカニズムが、ある程度解明されてきている（PCT公開WO 96/05309（12/22/96），Friedman; Zhangら，Nature 372: 425-432（1994）; また、Nature 374: 479（1995）の訂正も参照されたい）。OBタンパク質は、ob/ob突然変異マウス（OB遺伝子産物の産生の欠損によるマウスの肥満）および正常な野生型マウスの両方においてインビボで活性である。その生物学的活性は、とりわけ、体重の減少として現れる。概論として、Barinaga，“Obese”Protein Slims Mice，Science 269: 475-456（1995）を参照されたい。OBタンパク質、その誘導体、ならびに動物（哺乳動物およびヒトを含む）の体重および脂肪症の制御のためのモジュレーターとしてのその用途は、図面を含めて参考として本明細書に組入れるPCT公開WO 96/05309（12/22/96）に、より詳しく開示されている。
OBタンパク質の他の生物学的効果は、十分には特徴づけられていない。ob/ob突然変異マウスにOBタンパク質を投与すると、例えば、血清インスリンレベルおよび血清グルコースレベルが減少することが公知である。また、OBタンパク質を投与すると、体脂肪が減少することが公知である。これは、ob/ob突然変異マウスおよび非肥満正常マウスの両方で認められた［Pelleymounterら，Science 269: 540-543（1995）；Halaasら，Science 269: 543-546（1995），また、Campfieldら，Science 269: 546-549（1995）（マイクログラム用量のOBタンパク質の末梢および中枢投与により、ob/obおよび食餌誘導肥満マウスでは食物摂取および体重が減少したが、db/db肥満マウスでは減少しなかった）も参照されたい］。これらの報告ではいずれも、最高用量においても毒性は認められていない。
OBタンパク質の臨床適用の有望さにもかかわらず、OBタンパク質のインビボでの作用様式は明らかには解明されていない。OB受容体に関する情報は、ラットの視床下部で検出されるOBタンパク質の高親和性結合を示しており、これは、OB受容体の位置を示すものである（Stephensら，Nature 377：530-532）。db/dbマウスは、ob/obマウスと同じ表現型（すなわち、極端な肥満およびII型糖尿病）を示す。特にdb/dbマウスはOBタンパク質の投与に応答しないため、この表現型はOB受容体の欠損によると考えられる（Stephensら，前掲を参照されたい）。
組換えDNA技術の進歩に伴い、治療用組換えタンパク質が入手可能になったことは、タンパク質の製剤化および化学修飾における進歩をもたらした。そのような修飾の１つの目標は、タンパク質の保護および軽減された分解である。融合タンパク質および化学的結合は、タンパク質分解酵素がタンパク質バックボーン自体と物理的に接触するのを有効に阻止し、それにより分解を防ぐことが可能である。追加的な利点としては、ある状況下における、治療用タンパク質の安定性、循環時間および生物学的活性の増加などが挙げられる。タンパク質の修飾および融合タンパク質を記載している概説としては、Francis，Focuson Growth Factors 3: 4-10（1992年５月号）（Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane，London N20，OLD，UK発行）が挙げられる。
そのような１つの修飾は、免疫グロブリンのFc領域の使用である。抗体は、機能的に独立した２つ部分、すなわち、抗原に結合する「Fab」として公知の可変ドメインと、エフェクター機能（例えば、補体または食細胞）に対する結合を付与する「Fc」として公知の定常ドメインとからなる。免疫グロブリンのFc部分は長い血漿半減期を有し、一方、Fabは短命である（Caponら，Nature 337:525-531（1989））。
より長い半減期を付与したり、あるいはFc受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合、胎盤通過などの機能（これらはすべて、免疫グロブリンのFcタンパク質に存在する）を付与するために、Fcドメインを使用して、治療用タンパク質産物が構築されている（前掲誌）。例えば、IgG1抗体のFc領域が、ホジキン病腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞および他の悪性細胞型上で発現されるCD30受容体に結合する分子であるCD30-LのＮ末端に融合されている（米国特許第5,480,981号を参照されたい）。抗炎症および抗拒絶物質であるIL-10をマウスFcγ2aに融合させて、該サイトカインの短い循環半減期を増加させている（Zheng，X．ら，The Journal of Immunology,154: 5590-5600（1995））。また、敗血症性ショックの患者を治療するために、ヒトIgG1のFcタンパク質に結合させた腫瘍壊死因子受容体を使用することが、研究において評価されている（Fisher，C．ら，N．Eng．J．Med.，334: 1697-1702（1996）；Van Zee，Van Zee，K．ら，The Journal of Immunology，156:2221-2230（1996））。また、エイズ治療用タンパク質を製造するために、FcがCD4受容体と融合されている（Caponら，Nature，337:525-531（1989）を参照されたい）。また、インターロイキン２の短い半減期およびその全身毒性を克服するために、インターロイキン２のＮ末端がIgG1またはIgG3のFc部分と融合されている（Harvillら，Immunotechnology，1: 95-105（1995）を参照されたい）。
OBタンパク質は有望な治療用タンパク質であることが確認されているため、OBタンパク質の投与と共に又はその代わりに臨床的に適用するためのOB類似体組成物を開発することが必要とされている。そのような開発には、タンパク質の製剤化および化学修飾によりタンパク質の分解の減少、安定性および循環時間の増加が達成されているOB類似体組成物が含まれるであろう。本発明は、そのような組成物を提供する。
発明の概要
本発明は、Fc-OB融合タンパク質組成物、そのような組成物の製造法およびその用途に関する。特に、本発明は、OBタンパク質または類似体のＮ末端部分に融合した免疫グロブリンのFc領域または類似体を含んでなる遺伝子的融合タンパク質に関する。Fc-OB融合タンパク質は、Fc領域のシステイン残基を介して二量化することが可能である。予想外にも、OBタンパク質のＮ末端におけるFcとの遺伝子的融合修飾は、OBタンパク質では認められない又はOBタンパク質のＣ末端に対するFcの融合の場合には認められない安定性、クリアランス速度および減少した分解における利点を示す。驚くべき、かつ、重要なことは、OBタンパク質と比べて又はOBタンパク質のＣ末端に対するFc修飾の場合と比べて、Ｎ末端修飾が、予想外にもタンパク質を分解から保護し、循環時間および安定性を増加させることである。OBタンパク質に対するFc修飾からのそのような予想外の利点は、これらの変化が必要用量または投与頻度の減少をもたらす点でOBタンパク質の消費者にとって好都合であろう。したがって、後記で更に詳しく説明するとおり、本発明は、OBタンパク質（またはその類似体）とFc領域との融合によるタンパク質の遺伝子的修飾ならびにその具体的な修飾、製造および使用方法に関する多数の態様を有する。
したがって、１つの態様において、本発明は、OBタンパク質（またはその類似体）のＮ末端にFcが遺伝子的に融合しているFc-OB融合タンパク質を提供する。また、該Fc部分は、当該技術分野で公知のペプチドまたは化学的リンカーを介して、OBタンパク質（またはその類似体）のＮ末端に結合させることが可能である。前記のとおり、また、後記で更に詳しく説明するとおり、OBタンパク質またはＣ末端OB-Fc融合タンパク質と比べて、本Fc-OB融合タンパク質は、予想外の、分解からの保護特性、増加した循環時間および安定性を有する。したがって、本発明の追加的な態様には、Fc-OB融合タンパク質組成物だけでなく、そのようなタンパク質をコードするDNA配列、関連ベクター、およびそのようなベクターを含有する宿主細胞（それらは共に、本発明の融合タンパク質の製造に有用である）も含む。
もう１つの態様において、本発明は、Fc-OB融合タンパク質の製造を提供する。そのような方法には、組換えタンパク質を製造するための組換えDNA技術が含まれる。さらに、そのような態様には、発酵方法および精製方法も含まれる。
もう１つの態様において、本発明は、Fc-OB融合タンパク質の投与による、ヒトまたは動物における過剰体重および／または脂肪蓄積の治療（例えば、モジュレーション）方法を提供する。Fc-OB融合タンパク質の特性に基づいて、Fc-OB体重減少剤を使用することによりOBタンパク質の投与の量および／または頻度を減少させる方法が意図される。
さらにもう１つの態様において、本発明は、過剰な脂肪に関連した副次的罹患状態（co-morbidities）、例えば、糖尿病、異常または高脂質血症、動脈硬化症、動脈斑の治療、胆石形成、卒中の軽減または予防、およびインスリン感受性の増加および／または非脂肪組識量（lean tissue mass）の増加のための療法を提供する。
もう１つの態様において、本発明はまた、前記療法で使用するための、Fc-OBタンパク質、その類似体および誘導体の関連医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１：組換えマウスmetOBの（二本鎖）DNA（配列番号１および２）およびアミノ酸配列（配列番号３）。
図２：組換えヒトmetOB類似体の（二本鎖）DNA（配列番号４および５）およびアミノ酸配列（配列番号６）。
図３（A-C）：組換えヒトmetFc-OBの（二本鎖）DNA（配列番号７および８）およびアミノ酸配列（配列番号９）。
図４（A-C）：組換えヒトmetFc-OB変異体の（二本鎖）DNA（配列番号10および11）およびアミノ酸配列（配列番号12）。
図５（A-C）：組換えヒトmetFc-OB変異体の（二本鎖）DNA（配列番号13および14）およびアミノ酸配列（配列番号15）。
図６（A-C）：組換えヒトmetFc-OB変異体の（二本鎖）DNA（配列番号16および17）およびアミノ酸配列（配列番号18）。
詳細な説明
本発明は、Fc-OB融合タンパク質組成物、そのような組成物の製造法およびその用途に関する。特に、本発明は、OBタンパク質のＮ末端部分に対する免疫グロブリンのFc領域の遺伝子的または化学的融合に関する。予想外にも、OBタンパク質のＮ末端におけるFcの融合は、OBタンパク質では認められない又はOBタンパク質のＣ末端でのFcの融合の場合には認められない利点を示す。驚くべきことに、OBタンパク質と比べて又はOBタンパク質のＣ末端に対するFc修飾の場合と比べて、Ｎ末端で修飾されたFc-OBタンパク質は、予想外の、タンパク質分解からの保護、循環時間の増加および安定性の増加をもたらす。したがって、Fc-OB融合タンパク質およびその類似体または誘導体、ならびに関連した使用方法および製造法を、以下で更に詳しく説明する。
組成物
配列番号９（図３を参照されたい）に記載の組換えヒトFc-OB配列のFc配列は、ヒト免疫グロブリンIgG-1重鎖（Ellison，J．W．ら，Nucleic Acids Res．10:4071-4079（1982）を参照されたい）または当該技術分野で公知の他の任意のFc配列［例えば、IgG-2、IgG-3およびIgG-4を含む（これらに限定されるものではない）他のIgGクラスまたは他の免疫グロブリン］から選択することができる。Fc部分の変異体、類似体または誘導体は、例えば、残基または配列の種々の置換を作製することにより構築することができる。
Fc配列のジスルフィド架橋の形成を妨げるために、システイン残基を欠失させたり又は他のアミノ酸で置換することが可能である。特に、配列番号９の５位のアミノ酸はシステイン残基である。配列番号９の組換えFc-OB配列は、378アミノ酸のFc-OBタンパク質である（メチオニン残基は数えていない）。図３の組換えFc-OBタンパク質の最初のアミノ酸配列を+1とし、この場合、メチオニンは−１位である。
５位のシステイン残基を除去したり、あるいはそれを１以上のアミノ酸で置換することが可能である。６位のシステイン残基をアラニン残基で置換して、図４の変異アミノ酸配列（配列番号12）を得ることができる。図４の組換えFc-OBタンパク質は、378アミノ酸のFc-OBタンパク質である（メチオニン残基は数えていない）。図４の組換えFc-OBタンパク質の最初のアミノ酸配列を+1とし、この場合、メチオニンは−１位である。
同様に、配列番号９の５位のシステインを、セリンまたは他のアミノ酸残基で置換したり、あるいは欠失させることが可能であろう。また、配列番号15（図５を参照されたい）の変異体のように、１、２、３、４および５位のアミノ酸の欠失により変異体または類似体を調製することができる。また、これらの位置での置換も可能であり、本発明の範囲内に含まれる。図５の組換えFc-OBタンパク質は、373アミノ酸のFc-OBタンパク質である（メチオニン残基は数えていない）。図５の組換えFc-OBタンパク質の最初のアミノ酸配列を+1とし、この場合、メチオニンは−１位である。
また、Fc受容体結合部位および補体（C1q）結合部位を除去するために、４個のアミノ酸の置換を導入する修飾を行なうことも可能である。配列番号15からのこれらの変異体修飾は、15位のロイシンからグルタミン酸への置換、98位のグルタミン酸からアラニンへの置換、ならびに100位および102位のリシンからアラニンへの置換を含む（図６および配列番号18を参照されたい）。図６の組換えFc-OBタンパク質は、373アミノ酸のFc-OBタンパク質である（メチオニン残基は数えていない）。図６の組換えFc-OBタンパク質の最初のアミノ酸配列を+1とし、この場合、メチオニンは−１位である。
同様に、１以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することも可能である。さらに、他の変異アミノ酸の挿入、欠失および／または置換も意図され、本発明の範囲内に含まれる。さらに、改変は、ペプチド模擬体、D-アミノ酸などの改変アミノ酸の形態であることが可能である。また、Fcタンパク質は、種々の長さの化学的な又はアミノ酸の「リンカー」部分によりFc-OBタンパク質のOBタンパク質に結合させることができる。そのような化学的リンカーは当該技術分野でよく知られている。アミノ酸リンカー配列には、以下のものを含めることが可能であるが、それらに限定されるものではない：
（a）ala、ala、ala；
（b）ala、ala、ala、ala；
（c）ala、ala、ala、ala、ala；
（d）gly、gly；
（e）gly、gly、gly；
（f）gly、gly、gly、gly、gly；
（g）gly、gly、gly、gly、gly、gly、gly；
（h）gly-pro-gly；
（i）gly、gly、pro、gly、gly；および
（j）（a）〜（i）項の任意の組合せ。
Fc-OBタンパク質のOB部分は、配列番号３（図１を参照されたい）に記載の組換えマウスタンパク質、またはZhangら（Nature，前掲；これを参考として本明細書に組入れることとする）に記載されている組換えヒトタンパク質または28位のグルタミニル残基を欠くものから選択することができる（Zhangら，Nature，前掲428頁を参照されたい）。また、１）35位にリシンの代わりにアルギニンを含有し、２）74位にイソロイシンの代わりにロイシンを含有する配列番号６（図２を参照されたい）に記載の組換えヒトOBタンパク質類似体を使用することもできる（この類似体の略称は、組換えヒトR→L35、I→L74である）。OBタンパク質のＮ末端に融合したFc部分を有する又は有さない組換えヒトまたは組換えマウスタンパク質または類似体のアミノ酸配列は、-１位にメチオニル残基が存在するものとして以下に記載されているが、これらのOBタンパク質および類似体のいずれにおいても、該メチオニル残基は存在していなくてもよい。
該マウスタンパク質は、該ヒトタンパク質と実質的に相同である（特に、成熟タンパク質として、そしてさらに特にＮ末端において）。該組換えヒトタンパク質の類似体は、該組換えヒト配列内の、該マウス配列と異なるアミノ酸を改変（例えば、アミノ酸残基を置換）することにより製造することができる。該組換えヒトタンパク質はマウスにおいて生物活性を有するため、そのような類似体は、おそらくヒトにおいて活性であろう。例えば、残基35にリシンを有し残基74にイソロイシンを有する（最初のアミノ酸がバリンであり146位のアミノ酸がシステインである配列番号６の番号付けによる）ヒトタンパク質を使用して、32、35、50、64、68、71、74、77、89、97、100、105、106、107、108、111、118、136、138、142および145位のアミノ酸の１以上を別のアミノ酸で置換することができる。マウスタンパク質（配列番号３）の対応位置のアミノ酸または別のアミノ酸を選択することができる。
さらに、ラットOBタンパク質配列に基づき、「コンセンサス」分子を製造することができる（Murakamiら，Biochem．Biophys．Res．Comm．209: 944-952（1995）；これを参考として本明細書に組入れることとする）。ラットOBタンパク質は、以下の位置（配列番号６の番号付けを使用）でヒトOBタンパク質と異なる：４、32、33、35、50、68、71、74、77、78、89、97、100、101、102、105、106、107、108、111、118、136、138および145。異なっているこれらの位置のアミノ酸の１以上を別のアミノ酸で置換することができる。太字の位置は、マウスOBタンパク質およびラットOBタンパク質がヒトOBタンパク質と異なっている位置であり、したがって改変に特に適した位置である。対応するラットOBタンパク質からのアミノ酸または別のアミノ酸を、これらの１以上の位置において置換することができる。
ラットおよびマウス双方のOBタンパク質は、成熟ヒトOBタンパク質と以下の位置で異なる：４、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142および145。前記アミノ酸の１以上が別のアミノ酸（例えば、対応するラットまたはマウス配列中に見出されるアミノ酸）で置換されている配列番号６（35位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する）のヒトOBタンパク質も有効かもしれない。
また、成熟ヒトOBタンパク質と異なるアカゲザルOBタンパク質中に見出されるアミノ酸は、8(S)、35(R)、48(V)、53(Q)、60(I)、66(I)、67(N)、68(L)、89(L)、100(L)、108(E)、112(D)および118(L)（アミノ酸の種類が、括弧内に１文字のアミノ酸略語で示されている）である。組換えヒトOBタンパク質はシノモルグスザルにおいて活性であるため、アカゲザルの相違アミノ酸の１以上が別のアミノ酸（例えば、括弧内のアミノ酸）で置換されている配列番号６（35位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する）のヒトOBタンパク質は有効かもしれない。アカゲザルの或る相違アミノ酸はまた、前記マウス種において見出されるアミノ酸である（35、68、89、100および112位）ことに注目すべきである。したがって、以下の位置（35位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する配列番号６の番号付けを使用）のアミノ酸の１以上が別のアミノ酸で置換されたマウス／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子を製造することができる：４、８、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142および145。
他の類似体は、タンパク質アミノ酸配列の一部を欠失させることにより製造することができる。例えば、該成熟タンパク質は、リーダー配列（−22〜−１）を欠く。以下のトランケート化形態のヒトOBタンパク質分子（配列番号６の番号付けを使用している）を製造することができる：
（a）アミノ酸98〜146
（b）アミノ酸１〜32
（c）アミノ酸40〜116
（d）アミノ酸１〜99および（それが接続している）112〜146
（e）アミノ酸１〜99および（それが接続している）112〜146（アミノ酸100〜111の１以上がアミノ酸99と112との間に位置する）。
さらに、該トランケート化形態においてはまた、ヒトOBタンパク質と異なるアミノ酸（ラット、マウスまたはアカゲザルOBタンパク質内）の１以上が改変されていてもよい。さらに、いずれの改変も、改変アミノ酸（例えば、ペプチド模擬体またはD-アミノ酸）の形態であってもよい。
したがって、本発明は、以下のものから選ばれるOBタンパク質を含有するFc-OB融合タンパク質を含む：
（a）配列番号３（後記）または配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜146；
（b）35位にリシン残基を有し74位にイソロイシン残基を有する配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜146；
（c）４、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142および145位（配列番号６の番号付けを使用しており、28位にグルタミニル残基が存在しない場合であっても同じ番号付けのままである）の１以上の位置で置換された異なるアミノ酸を有する（b）項のアミノ酸配列；
（d）28位のグルタミニル残基が所望により欠けていてもよい（a）、（b）または（c）項のアミノ酸配列；
（e）Ｎ末端にメチオニル残基を有する（a）、（b）、（c）または（d）項のアミノ酸配列；
（f）トランケート化OBタンパク質類似体であって、以下（配列番号６の番号付けを使用している）から選ばれるもの：
（i）アミノ酸98〜146、
（ii）アミノ酸１〜32、
（iii）アミノ酸40〜116、
（iv）アミノ酸１〜99および112〜146、
（v）アミノ酸１〜99および112〜146（アミノ酸100〜111の１以上がアミノ酸99と112との間に位置する）、および
（vi）アミノ酸100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（i）項のトランケート化OB類似体、
（vii）アミノ酸４、８および32の１以上が別のアミノ酸で置換されている（ii）項のトランケート化類似体、
（viii）アミノ酸50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111および112の１以上が別のアミノ酸で置換されている（iii）項のトランケート化類似体、
（vix）アミノ酸４、８、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、112、118、136、138、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（iv）項のトランケート化類似体、および
（x）アミノ酸４、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（v）項のトランケート化類似体、および
（xi）Ｎ末端メチオニル残基を有する（i）〜（x）項のいずれかのトランケート化類似体；および
（g）タンパク質部分に結合した化学的（残基）部分を含む、（a）〜（f）項のいずれかのOBタンパク質または類似体誘導体；
（h）該化学的部分が水溶性重合体（残基）部分である（g）項の誘導体；
（i）該水溶性重合体部分がポリエチレングリコールである（h）項の誘導体；
（j）該水溶性重合体部分がポリアミノ酸部分（残基）である（h）項の誘導体；
（k）該部分が該タンパク質部分のＮ末端のみに結合している（h）〜（j）項の誘導体；および
（l）医薬上許容される担体中の（a）〜（k）項のいずれかのOBタンパク質、類似体または誘導体。
誘導体
本発明のFc-OB融合タンパク質（用いる「タンパク質」なる語は、特に示さない限り、「ペプチド」、Fc、OBまたは類似体（例えば以下に挙げるもの）を包含するものとして使用する）はまた、１以上の化学的部分をFc-OB融合タンパク質部分に結合させることにより誘導体化することができる。後記のとおり、これらの化学的に修飾された誘導体はさらに、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、経口、鼻内、肺内、局所または他の投与経路用に製剤化することができる。生物学的に活性なタンパク質の化学修飾により、ある状況下ではさらなる利点（例えば、該治療用タンパク質の安定性および循環時間の増加ならびに免疫原性の減少）が得られることが判明している。1979年12月18日付け発行のDavisら，米国特許第4,179,337号を参照されたい。概説としては、Abuchowskiら，Enzymes as Drugs（J.S.HolcerbergおよびJ．Roberts編，pp．367-383（1981））、Francisら，前掲を参照されたい。
そのような誘導体化に適した化学的部分は、種々の水溶性重合体から選択することができる。選択する重合体は、それが結合するタンパク質が水性環境（例えば、生理的環境）中で沈殿しないように水溶性であるべきである。最終生成物を治療用に使用する場合には、該重合体は、好ましくは、医薬上許容されるものである。該重合体／タンパク質結合体を治療用に使用するか否か、また、その場合の所望の用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性およびその他の考慮事項に基づき、所望の重合体の選択が当業者において可能であろう。本タンパク質およびペプチドでは、誘導体化の有効性は、誘導体を所望の形態で（すなわち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射または注入により、あるいは、例えば経口、肺または鼻内運搬のためにさらに製剤化することにより）投与し、生物学的効果を観察することにより（本明細書に記載のとおり）、確認することができる。
該水溶性重合体は、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体またはランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールよりなる群から選択することができる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中で安定であるため、製造上有利かもしれない。また、スクシナートおよびスチレンも使用することができる。
Fc-OB融合タンパク質を調製するために使用するOBまたはFcタンパク質は、ポリアミノ酸または分枝点アミノ酸をFcまたはOBタンパク質（または類似体）部分に結合させることにより製造することができる。例えば、該ポリアミノ酸は、前記Fc-OB融合タンパク質により達成される利点に加えて、本発明のOBタンパク質またはOB類似体に融合するFcと同様に該タンパク質の循環半減期を増加させるように作用する追加的な担体タンパク質であることが可能である。本発明における治療目的または美容目的には、そのようなポリアミノ酸は、中和抗原性応答や他の有害な応答を有さない又は引き起こさないものであるべきである。そのようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、追加的な抗体またはその一部（例えば、Fc領域）または他のポリアミノ酸（例えば、リシン）よりなる群から選択することができる。後記のとおり、該ポリアミノ酸の結合位置は、Fc-OBタンパク質部分のＮ末端、またはＣ末端、またはそれらの間の他の位置となることが可能であり、化学的「リンカー」部分によりFc-OBタンパク質に連結することができる。
該重合体は、任意の分子量のものであることが可能であり、また、分枝状または非分枝状であることが可能である。ポリエチレングリコールでは、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さの点で、約2kDa〜約100kDaである（「約」なる語は、ポリエチレングリコール調製物のうち、ある分子は、示されている分子量より大きく、ある分子は小さいことを示す）。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放性の持続時間、生物活性に対する存在する効果、取り扱い易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に応じて、他のサイズを用いることができる。
そのように結合するポリマー分子の数は、様々であることが可能であり、当業者であれば、機能に対するその効果を確認することができるであろう。モノ−誘導体化（mono-derivatize）を行なったり、同じまたは異なる化学的部分（例えば、異なる重量のポリエチレングリコールなどの重合体）により、ジ−、トリ−、テトラ−誘導体化あるいは誘導体化のいくつかの組合せを行なうことが可能である。タンパク質（またはペプチド）分子に対する重合体分子の比率は、反応混合物中のそれらの濃度と同様、特に限定されるものではない。一般に、最適な比率（過剰な未反応タンパク質または重合体が存在しないという観点からの反応効率に関して）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択した重合体の分子量、該重合体が分枝状か非分枝状か、反応条件などの因子により決定することとなる。
該化学的部分は、該タンパク質の機能ドメインまたは抗原ドメインに対する効果を考慮して該タンパク質に結合させるべきである。多数の結合方法が当業者に利用可能であり、例えば、参考として本明細書に組入れるEP 0 401 384（G-CSFに対するPEGの結合）を参照されたい。また、Malikら，Exp．Hematol．20:1028-1035（1992）（塩化トレシル（tresyl chloride）を用いるGM-CSFのペジル化（pegylation）を報告している）も参照されたい。例えば、ポリエチレングリコールは、アミノ酸残基により反応性基（例えば、遊離のアミノまたはカルボキシル基）を介して共有結合させることができる。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合しうる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リシン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含めることができる。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基を含めることができる。また、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として、スルフヒドリル基を使用することができる。治療目的に好ましいのは、アミノ基における結合、例えば、Ｎ末端またはリシン基における結合である。受容体結合が望まれる場合には、受容体結合に重要な残基での結合は避けるべきである。
Ｎ末端で化学修飾されたFc-OB融合タンパク質が特に望ましい場合もある。ポリエチレングリコールを本組成物の例示として用いると、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などにより）、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、行なうペジル化反応の型、およびＮ末端がペジル化された選択したタンパク質を得る方法から選択することができる。Ｎ末端がペジル化された調製物を得る（すなわち、必要に応じて、他のモノペジル化部分からこの部分を分離する）方法は、ペジル化されたタンパク質分子の集団から、Ｎ末端がペジル化された物質を精製することによるものであることが可能である。選択的なＮ末端の化学修飾は、ある特定のタンパク質の誘導体化に利用可能な種々のタイプの一級アミノ基の反応性の相違（リシン対該Ｎ末端）を利用する還元的アルキル化により達成することができる。適当な反応条件下で、カルボニル基含有重合体による、該タンパク質の実質的に選択的なＮ末端での誘導体化が達成される。例えば、該タンパク質のリシン残基のε-アミノ基とＮ末端残基のα-アミノ基との間のpKaの相違が利用可能なpHで反応を行なうことにより、該タンパク質のＮ末端を選択的にペジル化することができる。そのような選択的な誘導体化により、タンパク質に対する水溶性重合体の結合が制御される。すなわち、該重合体との結合は該タンパク質のＮ末端で優先的に生じ、他の反応性基（例えば、リシン側鎖アミノ基）の有意な修飾は生じない。還元的アルキル化を用いる場合は、該水溶性重合体は、前記のタイプのものであってもよく、該タンパク質に結合するための単一の反応性アルデヒドを有すべきである。単一の反応性アルデヒドを含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用することが可能である。
治療剤の製造の容易さの点で、Ｎ末端がモノペジル化された誘導体が好ましい。Ｎ末端のペジル化の場合には、ジ−、トリ−または他の多ペジル化生成物に比べて生成物の特徴付けが単純化されるため、均一な生成物が保証される。Ｎ末端生成物の製造には、商業的製造の容易さのため、前記の還元的アルキル化方法を用いることが好ましい。
複合体
Fc-OB融合タンパク質、その類似体または誘導体は、結合組成物との複合体として投与することができる。そのような結合組成物は、Fc-OB融合タンパク質、類似体または誘導体で得られる循環時間を更に一層延長する効果を有する可能性がある。そのような組成物は、タンパク質（あるいは同義的にペプチド）であることが可能である。結合タンパク質の一例として、OBタンパク質受容体またはその一部（例えば、その可溶性部分）が挙げられる。血清中のOBタンパク質またはFc-OBタンパク質を調べることにより、あるいは結合の存在に関して実験的にスクリーニングすることにより、他の結合タンパク質を確認することができる。用いる結合タンパク質は、典型的には、OBタンパク質、Fc-OB融合タンパク質またはそれらの類似体または誘導体が内因性OBタンパク質受容体に結合し及び／又はシグナル伝達を引き起こす能力を損なわないであろう。
医薬組成物
本発明はまた、Fc-OB融合タンパク質および誘導体の医薬組成物の使用方法を提供する。そのような医薬組成物は、注射投与用、または経口、肺内、鼻内、経皮または他の形態の投与用であることが可能である。一般に、本発明のタンパク質または誘導体生成物の有効量と、医薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤（アジュバント）および／または担体とを含んでなる医薬組成物が、本発明に包含される。そのような組成物は、種々の緩衝液含有物（例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pHおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えば、Tween 80、Polysorbate 80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Thimersol、ベンジルアルコール）、充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤；該物質が重合性化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒子状調製物内またはリポソーム内へ封入されたものを含む。また、ヒアルロン酸（hylauronic acid）を使用することも可能であり、これは、循環における持続化を促進する効果を有するかもしれない。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理学的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。例えば、参考として本明細書に組入れるRemington’s Pharmaceutical Sciences，第18版（1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042）第1435〜1712頁を参照されたい。該組成物は、液体形態または乾燥粉末（例えば、凍結乾燥形態）として製造することができる。移植可能な徐放製剤、および経皮製剤も意図される。
参考として本明細書に組入れるRemington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990（Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042）第89章に一般的に記載されている経口固体投与形態の使用が、本発明で意図される。固体投与形態には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ、カシェ剤またはペレット剤が含まれる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入により、本組成物を製剤化することができる（例えば、米国特許第4,925,673号で報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）。リポソーム封入を利用することが可能であり、また、種々の重合体で該リポソームを誘導体化することが可能である（例えば、米国特許第5,013,556号）。治療用の可能な固体投与形態の説明は、参考として本明細書に組入れるMarshall，K.，Modern Pharmaceutics，G.S．BankerおよびC.T．Rhodes編，第10章，1979に記載されている。一般には、該製剤は、Fc-OB融合タンパク質（または類似体もしくは誘導体）と、胃環境に対する保護および生物学的に活性な物質の腸内放出を許容する不活性成分とを含むことになる。
また、前記の誘導体化されたタンパク質の経口投与形態が特に意図される。該誘導体の経口運搬が有効となるように、Fc-OB融合タンパク質を化学修飾することができる。意図される化学修飾は、一般には、（a）タンパク質分解の抑制および（b）胃または腸から血流中への取込みを許容する少なくとも１つの部分を、タンパク質（またはペプチド）分子自体に結合させることである。また、該タンパク質の全安定度を増加させること、および体内循環時間を増加させることが望ましい。そのような部分には、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが含まれる。AbuchowskiおよびDavis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts，“Enzymes as Drugs”，HocenbergおよびRoberts編，Wiley-Interscience，New York，NY，（1981），pp 367-383；Newmarkら，J．Appl．Biochem．4: 185-189（1982）を参照されたい。使用しうる他の重合体としては、ポリ-1,3-ジオキソランおよびポリ-1,3,6-チオキソカン（tioxocane）が挙げられる。前記のとおり、医薬的な使用に好ましいのは、ポリエチレングリコール部分である。
Fc-OB融合タンパク質、類似体または誘導体の場合、放出部位は、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸または回腸）または大腸となることが可能である。胃内で溶解しないが該物質を十二指腸またはその他の腸内部位で放出する製剤が、当業者において入手可能である。好ましくは、Fc-OB融合タンパク質、類似体もしくは誘導体を保護するか又は胃環境を越えた部位（例えば、腸内）で生物学的に活性な物質を放出するかのいずれかにより、その放出は胃環境の悪影響を回避することとなる。
完全な胃抵抗性を保証するためには、少なくともpH5.0までは不透過性であるコーティングが不可欠である。腸溶性コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分としては、酢酸トリメリト酸セルロース（CAT）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMCP）、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリビニルアセテートフタレート（PVAP）、Eudragit L30D、Aquateric、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、Eudragit L、Eudragit SおよびShellacが挙げられる。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。
コーティングまたはコーティング混合物はまた、錠剤上で使用することもできるが、これらは、胃から保護することを意図したものではない。これには、糖衣、または錠剤の飲み込みを容易にするコーティングを含めることが可能である。カプセル剤は、乾燥した治療剤（すなわち粉末）を運搬するための硬い殻（例えば、ゼラチン）よりなるものであることが可能であり、液体形態の場合には、軟ゼラチン殻を使用することが可能である。カシェ剤の殻物質は、濃厚なデンプンまたは他の可食性紙であることが可能であろう。丸剤、ロゼンジ、成形錠剤または錠剤粉末化物では、湿塊化（moist massing）技術を用いることができる。
該治療剤は、粒径約1mmの顆粒剤またはペレット剤の形態の細かい多粒子（multiparticulate）として製剤中に含まれていることが可能である。また、カプセル剤で投与する場合には、粉末剤、軽く圧縮されたプラグとして又はさらには錠剤として、物質を製剤化することもできるであろう。該治療剤は、圧縮により調製することができるであろう。
着色剤および香味剤がすべて含まれていることが可能である。例えば、該タンパク質（または誘導体）を製剤化し（例えば、リポソームまたはミクロスフェア封入により）、ついでさらに、食用品（例えば、着色剤および香味剤を含有する冷却された飲料）中に含有させることが可能である。
該治療剤の容量を不活性物質で希釈または増加させることができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを含めることができる。また、ある種の無機塩、例えば三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを、充填剤として使用することができる。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤としては、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellが挙げられる。
該治療剤を固体投与形態に製剤化する場合には、崩壊剤を加えることができる。崩壊剤として使用する物質には、デンプンをベースとした市販の崩壊剤であるExplotabなどのデンプンが含まれるが、これらに限定されるものではない。デンプングリコール酸ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトがすべて使用可能である。崩壊剤のもう１つの形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。崩壊剤および結合剤として粉末ガムを使用することも可能であり、これらには、寒天、Karaya、トラガカントなどの粉末ガムを含めることができる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
該治療剤を互いに結合させて硬質の錠剤を形成させるためには、結合剤を使用することができ、結合剤には、アラビアゴム、トラガカント、デンプン、ゼラチンなどの天然産物由来の物質が含まれる。その他には、メチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）およびカルボキシメチルセルロース（CMC）が含まれる。ポリビニルピロリドン（PVP）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）は共に、該治療剤を顆粒化するためにアルコール性溶液中で使用することができるであろう。
製剤化工程中の固着を防ぐために、該治療剤の製剤化において減摩剤を加えることができる。該治療剤とダイ壁との間の層として滑沢剤を使用することが可能であり、これらには、ステアリン酸（そのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、流動パラフィン、植物油およびワックスを含めることができるが、これらに限定されるものではない。また、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000などの可溶性滑沢剤を使用することができる。
製剤化中の薬物の流動特性を改善することが可能で圧縮中の再配列を補助する滑り剤（glidant）を加えてもよい。該滑り剤には、デンプン、タルク、発熱性シリカ、水化ケイ酸アルミニウム（hydrated silicoaluminate）を含めることができる。
該治療剤が水性環境中に溶解するのを補助するために、湿潤剤として界面活性剤を加えることができる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン界面活性剤を含めることができる。陽イオン界面活性剤を使用することも可能であり、これらには、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含めることができる。界面活性剤として製剤中に加えうる可能な非イオン界面活性剤としては、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアラート、ポリオキシエチレン水素化ひまし油10、50および60、グリセロールモノステアラート、ポリソルベート40、60、65および80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に単独でまたは種々の比率の混合物として存在することが可能であろう。
該タンパク質（または誘導体）の取込みを潜在的に増強する添加剤としては、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられる。
コントロールドリリース製剤が望ましいかもしれない。該薬物は、拡散または浸出のいずれかのメカニズムによる放出を許容する不活性マトリックス（例えば、ガム）中に取込ませることが可能であろう。また、徐々に変性するマトリックス（例えば、アルギナート、多糖類）を製剤中に取込ませることも可能である。この治療剤のコントロールドリリースのもう１つの形態は、浸透作用により単一の小さな開口から水が浸入し薬物を押し出すのを可能にする半透膜中に該薬物を封入するOros治療系（Alza Corp.）に基づく方法によるものである。また、いくつかの腸溶性コーティングは徐放効果を有する。
他のコーティングを製剤化に使用することも可能である。これらには、コーティングパン内で適用しうる種々の糖が含まれる。また、該治療剤は、フィルムコーティングされた錠剤として提供されることも可能であり、この場合に用いる物質は、２つのグループに分類される。１つめは、非腸溶性物質であり、これには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールが含まれる。第２のグループは、一般にはフタル酸のエステルである腸溶性物質よりなる。
最適なフィルムコーティングを得るためには、物質の混合物を使用することが可能であろう。フィルムコーティングは、パンコーター内または流動床内で、または圧縮コーティングにより行なうことが可能である。
また、本タンパク質（またはその誘導体）の肺運搬も本発明で意図される。該タンパク質（または誘導体）は、吸入されて哺乳動物の肺に運搬され、肺上皮内層（lung epitheliallining）を越えて血流に入る。（これに関する他の報告には、Adjeiら，Pharmaceutical Research 7: 565-569（1990）; Adjeiら，International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144（1990）（酢酸ロイプロリド）; Braquetら，Journal of Cardiovascular Pharmacology 13（増刊５）: s．143-146（1989）（エンドセリン−１）; Hubbardら，Annals of Internal Medicine 3: 206-212（1989）（α1-抗トリプシン）; Smithら，J．Clin．Invest．84: 1145-1146（1989）（α-1-プロテイナーゼ）; Osweinら，“Aerosolization of Proteins”，Proceedings of Symposiumon Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，1990年３月（組換えヒト成長ホルモン）; Debsら，The Journal of Immunology 140: 3482-3488（1988）（インターフェロン-γおよび腫瘍壊死因子α）およびPlatzら，米国特許第5,284,656号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる）。
該治療用生成物の肺運搬用に設計された多種多様な機械装置（例えば、噴霧器、定量吸入器、粉末吸入器などの、いずれも当業者によく知られているものが含まれるが、これらに限定されるものではない）を本発明の実施で使用することが意図される。
本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの具体例としては、Mallinckrodt，Inc．（St．Louis，Missouri）製のUltravent噴霧器、Marquest Medical Products（Englewood，Colorado）製のAcorn II噴霧器、Glaxo Inc．（Research Triangle Park，North Carolina）製のVentolin定量吸入器およびFisons Corp．（Bedford，Massachusetts）製のSpinhaler粉末吸入器が挙げられる。
そのようないずれの装置においても、タンパク質（または類似体もしくは誘導体）の投薬に適した製剤を使用することが必要である。典型的には、各製剤は、用いる装置の型に特有のものであり、治療に有用な希釈剤、佐剤および／または担体に加えて適当な噴射物質の使用を伴うことが可能である。
遠位の肺への最も有効な運搬のためには、該タンパク質（または誘導体）は、10μm（またはミクロン）未満、最も好ましくは0.5〜5μmの平均粒径を有する粒子形態で製造されるのが最も有利であろう。
担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトールなどの炭水化物が含まれる。製剤中で使用する他の成分には、DPPC、DOPE、DSPCおよびDOPCを含めることができる。天然または合成界面活性剤を使用することができる。ポリエチレングリコールを使用することができる（これは、該タンパク質または類似体の誘導体化におけるその使用と独立して使用することが可能である）。シクロデキストランなどのデキストランを使用することができる。胆汁酸塩および他の関連した増強剤を使用することができる。セルロースおよびセルロース誘導体を使用することができる。アミノ酸（例えば、緩衝液の調製で使用するもの）を使用することができる。
また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、包接複合体、または他の型の担体の使用も意図される。
噴霧器（ジェット式または超音波式のいずれか）と併用するのに適した製剤は、典型的には、溶液1ｍＬ当たり生物学的に活性なタンパク質約0.1〜25mgの濃度で水に溶解したFc-OBタンパク質、その類似体または誘導体を含むであろう。また、該製剤は、緩衝剤および単糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節用のもの）を含むことが可能である。また、エーロゾルの形成において該溶液の噴霧により生じる該タンパク質の界面誘導凝集を抑制または予防するために、該噴霧製剤は界面活性剤を含有することが可能である。
定量吸入装置と併用する製剤は、一般に、界面活性剤の補助により噴射剤に懸濁されたタンパク質（または誘導体）を含有する微細化粉末を含む。該噴射剤は、この目的に用いる通常の任意の物質（クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または炭化水素、例えばトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、1,1,1,2-テトラフルオロエタンなど、またはそれらの組合せ）であることが可能である。適当な界面活性剤には、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用かもしれない。
粉末吸入装置からの投薬のための製剤は、タンパク質（または誘導体）を含有する微細化乾燥粉末を含む。また、該製剤は、その装置からの粉末の分散を促進する量（例えば、該製剤の50〜90重量％）の増量剤（例えば、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトール）を含むことが可能である。
また、該タンパク質（または類似体もしくは誘導体）の鼻内運搬も意図される。鼻内運搬によれば、該治療用生成物を鼻へ投与した後、該生成物の肺内での析出を要することなく、該タンパク質を直接血流へ通過させることが可能となる。鼻内運搬用の製剤には、デキストランまたはシクロデキストランを含有する製剤が含まれる。他の粘膜を通過する輸送を介した運搬も意図される。
投与
当業者であれば、投与および所望の治療効果の観察により、有効な投与量を確認することができるであろう。本発明は、OBタンパク質のＮ末端修飾により、OBタンパク質またはOBタンパク質のＣ末端修飾体と比べて、予想外にも、タンパク質を分解から保護し、循環時間および安定性を増加させる。したがって、当業者であれば、有効な投与のためには、より低用量または低頻回投与で十分であると、これらの変更から確認することが可能であろう。
好ましくは、該分子の製剤化は、約0.10μg/kg/日〜10mg/kg/日で所望の治療効果が得られるように行なう。有効な投与量は、時間経過に対して診断手段を使用することにより決定することができる。例えば、まず、血液（または血漿または血清）中のOBタンパク質またはFc-OB融合タンパク質の量を測定するための診断手段を用いて、タンパク質の内因性レベルを測定することができる。そのような診断手段は、抗体サンドイッチアッセイなどの抗体アッセイの形態であることが可能である。まず、内因性OBタンパク質を定量し、基線を決定する。内因性および外因性のOBタンパク質またはFc-OB融合タンパク質（すなわち、自己産生されたか又は投与されたかのいずれかの、体内で見出されるタンパク質、類似体または誘導体）の定量を治療の経過中に継続しながら、治療量を決定する。したがって、該用量は、治療の経過中に変化させることが可能であり、最初は、治療上の利益が認められるまで比較的高い用量を用い、そして治療上の利益を維持するために、より低い投与量を用いることができる。
理論的には、血中脂質レベルの減少のみを望む場合、血中脂質レベルの減少の維持を望む場合、または非脂肪体重の増加を望む場合には、その用量は、体重減少を引き起こすには不十分であろう。したがって、肥満のヒトの最初の治療経過中は、体重の減少およびそれに伴う血中脂質レベルの減少またはそれに伴う脂肪組織の減少／非脂肪量（lean mass）の増加が達成される用量を投与することが可能である。十分な体重減少が達成されたら、体重が再び増加するのを防ぐのに十分で、かつ、所望の血中脂質レベルまたは非脂肪重の増加（または非脂肪重の減少（depletion）の予防）を維持するのに十分な用量を投与することができる。OBまたはFc-OBタンパク質の効果は可逆的であるため（例えば、Campfieldら，Science 269: 546-549（1995）p．547）、これらの用量は実験的に決定することができる。したがって、体重減少を望まない場合に、ある用量で体重減少が生じることが認められたら、所望の所望の血中脂質レベルまたは非脂肪組織量の増加を達成すると同時に所望の体重を維持するために、より低い用量を投与することになる。
インスリンに対する個体の感受性を増加させるために、投与に関する同様の事項を考慮することができる。糖尿病の治療のために個体に投与するインスリン（または、潜在的には、アミリン、チアゾリジンジオンまたは他の潜在的な糖尿病治療薬）の量を減少させるのに十分な、体重減少を伴わない非脂肪量の増加を達成することが可能である。
全身的（overall）強度を増加するために、投与に関して同様の点を考慮することが可能である。全身的強度の増加を伴う非脂肪量の増加は、体重減少を引き起こすには不十分な用量で達成することが可能である。赤血球（および血中の酸素化）の増加、骨吸収または骨粗鬆症の軽減などの他の利点も、体重減少を伴うことなく達成することが可能である。
組合せ
本方法は、糖尿病の治療に有用な薬（例えば、インスリンおよび恐らくチアゾリジンジオン、アミリンまたはそれらのアンタゴニスト）、コレステロールおよび血圧降下薬（例えば、血中脂質レベルを減少させる薬物または他の心臓血管薬）、活動亢進薬（例えば、アンフェタミン）などの他の薬と共に用いることできる。また、食欲抑制剤（例えば、セロトニンまたは神経ペプチドＹのレベルに影響を及ぼすもの）を使用することができる。そのような投与は、同時にまたは連続的に行なうことができる。
さらに、本方法は、身体の全体的な外観を変えるよう意図された整容手術（例えば、体重を減少させるよう意図された脂肪吸引またはレーザー手術）などの外科的方法と共に用いることができる。動脈斑などの脂肪蓄積による血管の遮断阻害により引き起こされる有害な状態を軽減するよう意図された心臓手術（バイパス手術その他の手術）から得られる健康上の利益は、本組成物および方法の併用により増強される可能性がある。また、超音波またはレーザー法などの胆石除去方法を、一連の本治療方法の前、間または後のいずれかで使用することができる。さらに、本方法は、骨折、筋肉損傷の手術または療法、または非脂肪組織量の増加により改善される他の療法の補助手段として用いることができる。
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：皮下注射によるマウスFc-OBタンパク質の使用
この実施例では、マウスFc-OBタンパク質の皮下注射が正常マウスにおいて体重減少を引き起こすことを示す。正常（非肥満）CD1マウスに、マウスFc-OBタンパク質を皮下注射により22日間にわたり投与した。10mg（タンパク質）/kg体重/日の投与は、注射後22日目までに基線体重から14％（+/-1.1％）の減少を引き起こした。PBSの投与は、注射後22日目までに基線体重から3.9％（+/-3.3％）の減少を引き起こした。肥満CD1マウスにおける10mg（タンパク質）/kg体重/日のFc-OBタンパク質の使用による体重減少は、基線体重から10％（+/-4.3％）の減少を引き起こし、PBSの投与は、基線体重から8.7％（+/-1.3％）の減少を引き起こした（共に注射後22日目まで）。
CD1マウス（８週齢）における基線体重からの相違（％）を以下に示す。
0004175668.tif 000002
この表から認められるとおり、22日間の皮下投与計画の終了時に、Fc-OBタンパク質を投与した動物は、PBSビヒクルだけを投与した動物と比較して、また、基線量と比較して、痩せ型（lean）群ではそれらの体重の14.1％以上の減少を引き起こし、肥満群では体重の10％の減少を引き起こした。
驚くべきことに、Fc-OBタンパク質を22日目まで投与した動物は、最終注射の４日後の28日目まで体重を減少し続けた。10mg（タンパク質）/kg体重/日のマウスFc-OBタンパク質を皮下注射により投与し該投与を22日目に停止した正常（非肥満）CD1マウスは、28日目に基線体重から21％の減少を引き起こした（22日目においては14％の減少であった）。同様に、10mg（タンパク質）/kg体重/日のマウスFc-OBタンパク質を投与し該投与を22日目に停止した肥満CD1マウスは、28日目に基線体重から13％の減少を引き起こした（22日目においては10％の減少であった）。34日目には、減少は、肥満マウスでは10％の減少で維持され、一方、痩せ型マウスは5％の減少にまで回復した。22日目〜34日目の各系における対照の平均は、肥満マウスでは4％の増加、痩せ型マウスでは7％の増加であった。
実施例２：C57マウスにおける皮下注射によるヒトFc-OBタンパク質の使用
この実施例では、ヒトFc-OBタンパク質の皮下注射が正常マウスにおいて体重減少を引き起こすことを示す。正常（非肥満）C57マウスに、ヒトFc-OBタンパク質を皮下注射により７日間にわたり投与した。10mg（タンパク質）/kg体重/日の投与は、注射後７日目までに基線体重から12％（+/-1.3％）の減少を引き起こした。1mg（タンパク質）/kg体重/日の投与は、注射後７日目までに基線体重から8.9％（+/-1.5％）の減少を引き起こした。肥満C57マウスにおける10mg（タンパク質）/kg体重/日のヒトOBタンパク質の使用による体重減少は、基線体重から1.1％（+/-.99％）の減少を引き起こし、1mg（タンパク質）/kg体重/日の投与は、基線体重から2.5％（+/-1.1％）の減少を引き起こした（共に注射後７日目まで）。
結果
C57マウス（８週齢）における基線体重からの相違（％）を以下に示す。
0004175668.tif 000003
この表から認められるとおり、10mg/kg/日での７日間の皮下投与計画の後の17日目の終わりに、Fc-OBタンパク質を投与した動物は、それらの体重の8％まで回復した。７日間の皮下投与計画の後1mg/kg/日の用量を投与した動物は、12日後に体重の6.4％まで回復した。
これらの研究はまた、７日目の最終注射後の７日目〜22日目の回復期間中、体重の回復は、Fc-OBで処理したC57マウスでは、OBで処理したマウスより遅かったことを示している。これは、Fc-OBタンパク質がOBタンパク質ほど迅速には除去されず、そのため体重減少効果の延長をもたらすことを示唆している。
実施例３：Fc-OB融合タンパク質で処理したCF7マウスの用量反応
追加的研究は、Fc-OBタンパク質の連続投与に対する用量反応が存在することを示した。この研究では、前記実施例と同様の方法を用いて、肥満CF7マウス（体重35〜40g）に組換えFc-OBタンパク質を投与した。結果を、以下の表３に示す（体重減少率（％）は、前記のとおり測定した基線量に対するものである）。
0004175668.tif 000004
この表から認められるとおり、0.25mg/kg/日から1mg/kg/日へ用量を増加させると、体重減少は4％から16％まで増加した。また、1mg/kg/日の投与により５日目に16％の体重減少が生じたことは注目に値する。また、これらの研究は、０％までの体重回復速度が遅いことを示し、このことは、Fc-OBタンパク質が迅速には除去されず、そのため体重減少効果の延長をもたらすことを示唆している。
実施例４：CD-1マウスおよびイヌにおける組換えヒトFc-OBの薬物動態学
この研究では、CD-1マウスおよびイヌにおける組換えヒトmet Fc-OBタンパク質の薬物動態学的特性を示した。1mg/kg/日で静脈内または皮下投与した後、組換えヒトmet Fc-OBタンパク質およびヒトmet OBタンパク質の血清濃度を、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ELISA）により測定した。
どちらの種においても、組換えmetヒトOBタンパク質と比べて、曝露の増加（これは、より高いピーク血清濃度およびより大きな血清濃度曲線下面積（AUC）として定量される）が認められた。Fc-OBは、組換えmetヒトOBタンパク質より低い全身クリアランスを有する。これは、Fc-OBがOBタンパク質の場合より低いクリアランスおよびより長い半減期を有することから認められる。サイズの増加は、タンパク質の安定性の増加だけでなく腎クリアランスの効率の減少も引き起こす。その結果、Fc-OBは、より遅く全身循環から除去される。Fc-OBタンパク質に関するピーク時間、ピーク血清濃度およびAUCの増加は、より低い。Fc-OBタンパク質は、OBタンパク質より実質的に高い系曝露をもたらすであろう。結果を以下の表４に示す。
0004175668.tif 000005
実施例５
この実施例では、上昇した血中脂質レベルを有しておらず肥満でない正常マウスにおいて、ヒト組換えFc-OBタンパク質の投与によりコレステロール、グルコースおよびトリグリセリドのレベルが低下することを示す。また、この実施例は、これらのレベルが、３日間の回復期間にわたり低いまま維持されることを示す。
正常なCD1マウスに、組換えヒトFc-OBタンパク質を皮下注射により投与した。注射の最終日である23日目の24時間後に血液サンプルを採取した。前記のとおり、投与した用量において、その動物の体重は減少した。表５に示すとおり、それらのマウスは、対照と比較して、血清コレステロール、グルコースおよびトリグリセリドの用量依存的な実質的な減少を示した。
0004175668.tif 000006
これらのデータは、Fc-OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体が、有効な血中脂質低下剤であることを示している。
実施例６
肥満のヒトの患者に、体重を減少させる目的で、ヒトFc-OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体を投与する。その肥満患者はまた、上昇した血中脂質レベル（200mg/100ml以上に上昇したコレステロールレベルを含む）を有する。その患者は、Fc-OB療法の経過中に、満足しうる体重減少を得る。Fc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体の維持量を、該非肥満患者に投与して、低下した血中脂質レベル（200mg/100ml未満に低下したコレステロールレベルを含む）を維持する。その投与量は、さらに体重減少を引き起こすには不十分である。投与は、長期間継続する。循環するFc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体のレベルは、OBタンパク質（または適用可能な他の抗原源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いてモニターすることができる。
実施例７
非肥満のヒトの患者に、冠状動脈バイパス手術または進行した段階の動脈斑の形成を軽減する他の侵襲性治療を施す。その手術の後、動脈斑の再形成を防ぐために、その患者にFc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体の維持量を投与する。その投与量は、体重減少を引き起こすには不十分である。投与は、長期間継続する。循環するFc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体のレベルは、OBタンパク質（または適用可能な他の抗原源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いてモニターすることができる。
実施例８
閉塞した動脈からの血流が制限されたことにより高血圧となっている非肥満のヒトの患者がいる。その患者に、動脈の閉塞を引き起こしている動脈斑を減少させるのに十分な量のFc-OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体を投与する。その後、さらなる動脈斑の形成および高血圧に関して、患者をモニターする。その状態が再び現れたら、血流を回復するには十分であるが体重減少を引き起こすには不十分な有効量のFc-OBタンパク質、類似体または誘導体を患者に再投与する。循環するFc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体のレベルは、Fc-OBタンパク質（または適用可能な他の抗原源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いてモニターすることができる。
実施例９
胆石を有するヒトの患者がいる。いずれの胆石も除去せず、追加的な胆石の形成を防ぐよう努める。あるいは、胆石は除去するが胆嚢は維持し（例えば、レーザーまたは超音波手術により行なう）、追加的な胆石の形成を防ぐよう努める。追加的な胆石の蓄積または胆石の再蓄積を予防するために、Fc-OBタンパク質、その類似体または誘導体の有効量を、その患者に投与する。循環するFc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体のレベルは、Fc-OBタンパク質（または適用可能な他の抗原源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いてモニターすることができる。
実施例10
糖尿病の治療のためのインスリンの使用量を減少することを望んでいる糖尿病のヒトの患者がいる。その患者に、脂肪除外組識量の増加をもたらすFc-OBタンパク質、その類似体または誘導体の有効量を投与する。インスリンに対するその患者の感受性を増加させ、必要なインスリンの単位の減少の点または１日当たりに必要なインスリンの注射回数の減少の点のいずれかにおいて、糖尿病の症状を軽減するのに必要なインスリンの投与量を減少させる。循環するFc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体のレベルは、OBタンパク質（または適用可能な他の抗原源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いてモニターすることができる。
実施例11
脂肪除外組識量を減少させる病気からの回復などの治療目的に、脂肪除外組識量の増加を望んでいる非肥満のヒトの患者がいる。その患者に、脂肪除外組識量の所望の増加をもたらすFc-OBタンパク質、その類似体または誘導体の有効量を投与する。脂肪除外組識量の増加は、DEXAスキャンニングを用いてモニターする。循環するFc-OBタンパク質または類似体もしくは誘導体のレベルは、OBタンパク質（または適用可能な他の抗原源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いてモニターすることができる。
材料および方法
動物：前記実施例においては、野生型CD1マウスおよび（+/+）C57B16マウスを使用した。該マウスは開始時点で８週齢であり、該動物を体重安定化に付した。
給餌および体重測定：通常の塊状の餌を使用する場合より正確かつ高感度な測定を可能にする粉砕化されたげっ歯類用の餌（Allentown Caging and Equipment）をマウスに与えた。体重は、所望の期間、毎日同じ時刻（午後2：00）に測定した。注射前日の体重を基線体重として定義した。使用したマウスの体重は18〜22グラムであった。
収容：マウスは１匹ずつ収容し、思いやりのある条件下で維持した。
タンパク質またはビヒクルの投与：タンパク質（後記のとおり）またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、pH7.4）を、皮下注射または静脈内に投与した。
対照：対照動物は、Fc-OB融合タンパク質またはOBタンパク質のいずれをも加えていないビヒクルだけを注射した動物であった。
タンパク質：配列番号１、２および３は、マウス組換えOB DNAおよびタンパク質（図１）を記載しており、配列番号４、５および６は、類似体組換えヒトOB DNAおよびタンパク質（図２）を記載している。前記のとおり、配列番号６に記載の前記組換えヒトOBタンパク質は、35位にリシン残基を有し、74位にイソロイシン残基を有する。さらに、Zhangら，Nature，前掲およびPCT公開WO 96/05309（12/22/96）（それらを共に、図面を含め参考として本明細書に組入れる）に記載の組換えヒトタンパク質、ならびに図１および２に記載のマウスおよびヒト類似体組換えタンパク質は、治療および医薬の製造のための本方法におけるFc-OB融合タンパク質の製造に使用することができるOBタンパク質の例示にすぎない。Fc-OB融合タンパク質を製造するためには、他のOBまたはFcタンパク質またはその類似体もしくは誘導体を使用することも可能である。
ここでは、組換えOBタンパク質のアミノ酸配列の最初のアミノ酸を+1とし、それはバリンであり、-１位のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ酸は146番目（システイン）である（図１および２を参照されたい）。図３の組換えヒトFc-OBタンパク質の最初のアミノ酸の配列を+1とし、それはグルタミン酸であり、-１位のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ酸は378番目（システイン）である。図４の組換えヒトFc-OBタンパク質変異体の最初のアミノ酸の配列を+1とし、それはグルタミン酸であり、-１位のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ酸は378番目（システイン）である。図５の組換えヒトFc-OBタンパク質変異体の最初のアミノ酸の配列を+1とし、それはアスパラギン酸であり、-１位のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ酸は373番目（システイン）である。図６の組換えヒトFc-OBタンパク質変異体の最初のアミノ酸の配列を+1とし、それはアスパラギン酸であり、-１位のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ酸は373番目（システイン）である。
発現ベクターおよび宿主株
使用したプラスミド発現ベクターは、pCFM1656（ATCC受託第69576号）の誘導体であるpAMG21（ATCC受託第98113号）であり、lux PRプロモーターの下流に遺伝子の挿入のための適当な制限部位を含有する（lux発現系の説明に関しては米国特許第5,169,318号を参照されたい）。図3〜6に示されている後記Fc-OB DNAを作製し、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで線状化された発現ベクターpAMG21中に連結し、大腸菌（E．coli）宿主株FM5中に形質転換した。大腸菌（E．coli）FM5細胞は、Amgen Inc．（Thousand Oaks，CA）において、大腸菌K-12株から誘導した（Bachmannら，Bacterial．Rev．40: 116-167（1976））。該細胞は、組込まれたλファージリプレッサー遺伝子cI857を含有する（Sussmanら，C.R．Acad．Sci．254: 1517-1579（1962））。ベクターの産生、細胞の形質転換およびコロニーの選択は、標準的な方法（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）により行なった。宿主細胞をLB培地中で増殖させた。
Fc-OB DNAの構築
プラスミドpFc-A3（後記）は、アミノ酸番号99（Glu）から天然カルボキシル末端までのヒト免疫グロブリンIgG-1重鎖のための配列源として役立つ。ヒトIgG-1配列は、Genebankから入手可能である（P01857）。
ヒトOB配列は、前記において、また、Zhangら，Nature，前掲およびPCT公開WO 96/05309（それらを共に、図面を含め参考として本明細書に組入れる）において開示されている。該OB DNAを、標準的なクローニング法（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）を用いて、制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIで線状化された発現ベクターpCFM1656中に連結した。OB DNA配列を保持するプラスミドpCFM1656は、組換えヒトOB遺伝子の配列源として役立つ。
これらの２つの配列の遺伝的融合は、PCR重複伸長（overlapextension）の方法（Ho，S.N.ら，Site Directed Mutagenesis By Overlap Extension Using The Polymerase Chain Reaction，Gene77:51-59（1989））により行なった。該PCRの産物を、制限エンドヌクレアーゼNdeIで切断して５’付着末端を作り、制限エンドヌクレアーゼBamHIで切断して３’付着末端を作った。ベクターpAMG21を同様に切断した。該融合断片と該線状化ベクターとで連結を行なった。連結されたDNAを、大腸菌（E．coli）宿主株中にエレクトロポレーションにより形質転換した。カナマイシン（50μg/ml）選択寒天プレート上で生存したクローンを、Fc-OBの大きさのタンパク質の発現に関して調べた。個々のクローン由来のプラスミドを単離し、遺伝子コード領域の配列を確認した。
Fc-OB遺伝子の追加的な修飾が望ましい場合には、そのような変更を施すために再びPCR技術を用いた。変異体（配列番号12および15）を作製するために、該融合タンパク質（配列番号９）のFc部分のＮ末端において２組の変更を行なった。補体（Clq）結合部位（アラニンで置換される98位のグルタミン酸、アラニンで置換される100位のリシン、およびアラニンで置換される102位のリシン）Fc受容体結合部位（グルタミン酸で置換される15位のロイシン）を除去する４個のアミノ酸置換を導入するために、もう１つの変異体を構築した（Xin Xiao Zhengら，J．Immunol．154:5590-5600を参照されたい）。この構築物の鋳型は配列番号15であり、生じる変異体は配列番号18であった。
pFC-A3ベクターの構築
ヒンジドメインの最初のアミノ酸Glu-99からカルボキシル末端、５’-NotI融合部位ならびに３’-SalIおよびXbaI部位までのヒト免疫グロブリンIgG-1重鎖のFc部分をコードする領域を含有するプラスミドpFc-A3（Ellison，J．W．ら，Nucleic Acids Res．10:4071-4079（1982）を参照されたい）を、ヒト脾臓cDNAライブラリーのPCR増幅により作製した。PCR反応は100mlの最終容量中で行ない、400mMの各dNTPおよび増幅する1ngのcDNAライブラリーを1uMの各プライマーと共に含有する20mM Tris-HCl（pH8.8）、10mM KCl、10mM（NH4）2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100中、２単位のVent DNAポリメラーゼを使用した。反応は、95℃で２分間の変性により開始し、ついで95℃で30秒間、55℃で30秒間および73℃で２分間の30サイクルを行なった。５’-プライマーには、IgG-1のヒンジドメインの最初の残基（Glu-90）の直ぐ５’側にNotI部位を取込ませた。３’プライマーにはSalIおよびXbaI部位を取込ませた。717塩基対のPCR産物をNotIおよびSalIで消化し、得られたDNA断片を1％アガロースによる電気泳動により単離し、精製し、NotI、SalIで消化されたpBluscript II KSベクター（Stratagene）中にクローニングした。得られたプラスミドpFc-A3中の挿入断片を配列決定して、該PCR反応の忠実度を確認した。
製造法
生物学的に活性な組換えメチオニルマウスまたはヒト類似体OBタンパク質およびFc-OB融合タンパク質を製造するために、以下の製造法を用いた。生物学的に活性な組換えメチオニルヒトOBタンパク質を製造するために、同様の方法を用いることができる。
発酵方法
バッチ発酵法を用いた。培地組成は以下に記載する。
主として窒素源よりなる培地の一部を発酵容器中で滅菌した（25〜35分間、120〜123℃まで昇温することによる）。冷却すると同時に、炭素、マグネシウム、リン酸塩および微量金属源を無菌的に加えた。前記の組換えマウスタンパク質を産生する細菌の一晩培養物500mL（LBブロス中で増殖させたもの）を、その発酵槽へ加えた。培養物の光学密度（細胞密度に関する指標として600nmで測定）が15〜25吸収単位に達したら、組換え遺伝子の発現を誘導するために、自己誘導溶液（0.5mg/mLホモセリンラクトース）を培養に加えた（1mL/L）。該発酵法を更に10〜16時間継続し、ついで遠心分離によりブロスを収穫した。
培地組成：
0004175668.tif 000007
微量金属溶液：
塩化第二鉄（FeCl3・6H2O）：27g/L
塩化亜鉛（ZnCl2・4H2O）：2g/L
塩化コバルト（CoCl2・6H2O）：2g/L
モリブデン酸ナトリウム（NaMoO4・2H2O）：2g/L
塩化カルシウム（CaCl2・2H2O）：1g/L
硫酸第二銅（CuSO4・5H2O）：1.9g/L
ホウ酸（H3BO3）：0.5g/L
塩化マンガン（MnCl2・4H2O）：1.6g/L
クエン酸ナトリウム二水和物：73.5g/L
ヒトFc-OB融合タンパク質の精製方法
ヒトFc-OB融合タンパク質の精製は、以下の工程により行なった（特に示さない限り、以下の工程は4℃で行なった）。マウスおよびヒトOBタンパク質の精製は、参考として本明細書に組入れるPCT公開WO 96/05309（前掲）に開示されている。
１．細胞ペースト
大腸菌（E．coli）細胞ペーストを５倍容量の蒸留水に懸濁した。その水中の細胞を、ミクロフルイダイザー（microfluidizer）に２回通過させることにより、さらに破壊した。その破壊された細胞を、J5-4.2ローターの付いたBeckman JB-6遠心機中、4.2Krpmで１時間遠心分離した。
２．封入体の洗浄
前記からの上清を除去し、ペレットを５倍容量の蒸留水に再懸濁した。該混合物を、工程１と同様に遠心分離した。
３．可溶化
該ペレットを10倍容量の50mMトリス（pH8.5）、8M塩酸グアニジン、10mMジチオトレイトールで可溶化し、室温で１時間攪拌した。該溶液を40mMシスタミン二塩酸塩とし、１時間攪拌した。
４．工程３からの溶液を、20〜30倍容量の以下のリフォールディング溶液に加えた：50mMトリス（pH8.5）、0.8Mアルギニン、2M尿素および4mMシステイン。該リフォールドを8℃で16時間攪拌する。
５．緩衝液の交換
工程４からの溶液を濃縮し、10mMトリス（pH8.5）中にダイアフィルトレーションする。
６．酸の沈殿
工程５からの溶液を、50％氷酢酸でpH4.75に調整し、室温で30分間インキュベートする。該溶液を濾過する。
７．陽イオン交換クロマトグラフィー
工程６からの溶液をpH7.0に調整し、10℃でCM Sepharose Fast Flowカラム上にローディングする。10mMリン酸塩（pH7.0）、0Mから1.0MのNaClにより、20カラム容量の勾配を行なう。
８．陰イオン交換クロマトグラフィー
工程７からのCM溶出プールを、5mMトリス（pH7.5）で５倍希釈し、Q Sepharose Fast Flow上に10℃でローディングする。10mMトリス（pH7.5）、0Mから0.2MのNaClにより、20カラム容量の勾配を行なう。
９．疎水性相互作用クロマトグラフィー
該Ｑセファロースプールを0.75M硫酸アンモニウムとし、メチルMacroprep疎水性相互作用カラム上に室温でローディングした。10mMリン酸塩（pH7.0）、0.75Mから0Mの硫酸アンモニウムにより、20カラム容量の勾配を行なう。
10．緩衝液の交換
必要に応じて工程９からのプールを濃縮し、PBS緩衝液に対して透析した。
本発明は好ましい実施態様に関して記載されているが、その変更および修飾が当業者に認識されると理解される。したがって、添付の請求の範囲は、特許請求されている本発明の範囲内にあるそのような均等なすべての変更を包含すると意図される。
配列表
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：491塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：41
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met＝ATG」
（xi）配列：配列番号１：
0004175668.tif 000008
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：491塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号２：
0004175668.tif 000009
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：147アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：タンパク質
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met（ATG）は−１位から開始する」
（xi）配列：配列番号３：
0004175668.tif 000010
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：454塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met＝ATG」
（xi）配列：配列番号４：
0004175668.tif 000011
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：454塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号５：
0004175668.tif 000012
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：147アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：タンパク質
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met（ATG）は−１位から開始する」
（xi）配列：配列番号６：
0004175668.tif 000013
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1150塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met＝ATG」
（xi）配列：配列番号７：
0004175668.tif 000014
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1150塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号８：
0004175668.tif 000015
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：379アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：タンパク質
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met（ATG）は−１位から開始する」
（xi）配列：配列番号９：
0004175668.tif 000016
0004175668.tif 000017
（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1150塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met＝ATG」
（xi）配列：配列番号10：
0004175668.tif 000018
（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1150塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号11：
0004175668.tif 000019
（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：379アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：タンパク質
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met（ATG）は−１位から開始する」
（xi）配列：配列番号12：
0004175668.tif 000020
0004175668.tif 000021
（２）配列番号13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1135塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met＝ATG」
（xi）配列：配列番号13：
0004175668.tif 000022
（２）配列番号14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1135塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号14：
0004175668.tif 000023
（２）配列番号15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：374アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：タンパク質
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met（ATG）は−１位から開始する」
（xi）配列：配列番号15：
0004175668.tif 000024
0004175668.tif 000025
（２）配列番号16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1135塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met＝ATG」
（xi）配列：配列番号16：
0004175668.tif 000026
（２）配列番号17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1135塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号17：
0004175668.tif 000027
（２）配列番号18の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：374アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：タンパク質
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：／注＝「Met（ATG）は−１位から開始する」
（xi）配列：配列番号18：
0004175668.tif 000028
0004175668.tif 000029
【図１Ａ】
0004175668.tif 000030
【図１Ｂ】
0004175668.tif 000031
【図２Ａ】
0004175668.tif 000032
【図２Ｂ】
0004175668.tif 000033
【図３Ａ−１】
0004175668.tif 000034
【図３Ａ−２】
0004175668.tif 000035
【図３Ｂ−１】
0004175668.tif 000036
【図３Ｂ−２】
0004175668.tif 000037
【図３Ｃ】
0004175668.tif 000038
【図４Ａ−１】
0004175668.tif 000039
【図４Ａ−２】
0004175668.tif 000040
【図４Ｂ−１】
0004175668.tif 000041
【図４Ｂ−２】
0004175668.tif 000042
【図４Ｃ】
0004175668.tif 000043
【図５Ａ−１】
0004175668.tif 000044
【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ−１】
0004175668.tif 000046
【図５Ｂ−２】
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【図５Ｃ】
0004175668.tif 000048
【図６Ａ−１】
0004175668.tif 000049
【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｃ】
0004175668.tif 000053