(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合時にコンフォメーションの変化を受けるアロステリックリガンド受容体へのリガンドの結合を高分子量の競合物質の非存在下で表面プラスモン共鳴法により検出し、分析する方法であって、
該リガンドを、固定化されたアロステリック受容体に結合するステップと、
このような結合を表面プラスモン共鳴法における表面屈折率の変化によって検出するステップと
を含み、
前記リガンドが結合した際の受容体のコンフォメーションの変化に基づく表面屈折率の変化に比して、前記リガンドの質量に基づく表面屈折率の変化が小さい、方法。
【請求項２】
前記受容体が結合性タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面屈折率の変化が、表面共鳴特性の変化または散乱光の波長の変化によって検出される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドの質量が受容体の質量に比して小さい請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドが、アミノ酸類、ペプチド類、ヌクレオチド類、オリゴヌクレオチド類、糖類およびイオン類からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドの分子量が１５００未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドの分子量が３０〜４００である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リガンドと、該リガンドに結合する際にコンフォメーションの変化を受けるアロステリックリガンド受容体との間の複合体の形成を高分子量の競合物質の非存在下で表面プラスモン共鳴法により検出し、分析する方法であって、
前記リガンドを、固定化されたアロステリック受容体に結合させて複合体を形成するステップと、
表面プラスモン共鳴法における表面屈折率の変化により前記複合体の存在を検出するステップと
を含み、
前記リガンドが結合した際の受容体のコンフォメーション変化に基づく表面屈折率の変化に比して、前記リガンドの質量に基づく表面屈折率の変化が小さい、方法。
【請求項９】
前記受容体が結合性タンパク質である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体の存在が、表面プラスモン共鳴による共鳴角の変化または散乱光の波長の変化によって検出される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドの質量が受容体の質量に比して小さい請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記リガンドが、アミノ酸類、ペプチド類、ヌクレオチド類、オリゴヌクレオチド類、糖類およびイオン類からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記リガンドの分子量が１５００未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記リガンドの分子量が３０〜４００である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、屈折率の変化をモニタリングすることによるリガンドと受容体との相互作用の検出に関し、特に比較的小さいリガンドと比較的大きい受容体との間のこのような相互作用を検出することに関する。
【０００２】
【発明の背景】
屈折率は、ある特定の放射線の真空中での速度と、所与の媒質中でのその速度との比率とにより定義される。１つの媒質から異なる密度の別の媒質に進むとき、または密度が一様でない媒質を横切るときに、光線の方向が変わる（すなわち、屈折する）。このような屈折をモニタリングする１つの方法は、表面プラスモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）であり、この方法は、より高い屈折率を有する媒質（たとえば、ガラス）を通過する光が、十分に傾斜した角度でより低い屈折率を有する媒質（たとえば、溶液）に対面したときに全反射される、全反射という現象に基づく。ＳＰＲ検出において、反射光の強度は２つの媒質の境界面に金属表面が存在することにより減衰する。強度の低下はある明確な角度で起こり、これは「共鳴角」と呼ばれる２つの媒質の屈折率によって左右される。タンパク質が金属表面上に吸着するにつれて、境界面付近の溶液の屈折率が変化し、反射光が減衰する角度がシフトする（すなわち、共鳴角がシフトする）。共鳴角のシフトを検出することが、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）と呼ばれる装置の原理であり、１つのリガンドが化学的に修飾された金の表面上に固定されるため、可溶性リガンドから固定化されたリガンドへの会合および解離がリアルタイムの関数としてモニタリングされる。この光学に基づくセンサーは、醗酵培地等の複合溶液中のタンパク質を直接検出することができる（Ｈ．Ｖ．Ｈｅｓｉｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６，９９７-１００３）。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）のシグナル出力は共鳴単位（ＲＵ）と呼ばれ、共鳴角を表す。一般に、タンパク質の場合、１ＲＵはおよそ１ｐｇ／ｍｍ2である。ＳＰＲ測定用の他の機器は、Ｂｉｏ−Ｔｕｌ（Ｐｌａｓｍｏｏｎ）およびＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓｐｒｅｅｔａ）から入手できる。表面屈折率変化に基づく機器を開発している他の会社としては、ＬｕｎａＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ（長周期グレーティング（Ｌｏｎｇ  Ｐｅｒｉｏｄ  Ｇｒａｔｉｎｇ）に基づくセンサー、すなわちＬＰＧ）およびＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ（ＩＡｓｙｓ）などがある。
【０００３】
リガンドと受容体との結合を分析するために、ＳＰＲおよび類似の技法が使用されてきた。固液境界面付近の溶液の屈折率は境界面の分子の質量によって影響を受ける可能性があり、概して、リガンドと受容体との結合により質量が増加するため、結果として反射角が増大する。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）等のＳＰＲ機器は、結合事象を連続的にモニタリングする。こうした技術を使用して、結合反応速度論およびアフィニティを解析することができる。
【０００４】
さらに最近では、タンパク質のコンフォメーションを研究するためにＳＰＲが使用されている。Ｈ．Ｓｏｔａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｈａｓｅｇａｗａ（１９９８．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０，２０１９−２０２４）は、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸還元酵素を固定し、タンパク質の酸変性によるＳＰＲシグナルの増強を観察した。Ｓ．Ｂｏｕｓｓａａｄら（２０００．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２，２２２−２２６）は、チトクロームＣの電子状態のモニタリングにおけるＳＰＲの使用について報告しており、タンパク質が酸化状態から還元状態に変化するとき、関連するコンフォメーションの変化を示す共鳴角の減少を確認した。しかし、これらの例には、受容体とリガンドとの結合は含まれない。
【０００５】
リガンド／受容体相互作用のＳＰＲ分析の１つの欠点は、結合時の質量の変化が、屈折率の変化として検出されるほど十分に大きくなければならないことである。ＳＰＲは、一般に比較的大きいリガンドの固定化された受容体への結合（たとえば抗体／抗原結合）のモニタリングに使用される。この結合はシグナルの比較的大きい増強を伴う。複合体の質量が著しく増加する結果として、屈折率が大きく変化する。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）等の機器はかなり感度が高いが、一般に、屈折率の増加として検出するためには、表面への非常に小さいリガンドの結合は質量の増加が小さすぎるため、検出できない。現在利用できるＳＰＲ機器の検出限界以下であろうと考えられる（結合時における質量の最小限の増加に基づく）結合反応の一例は、カルモジュリン（ＣａＭ）へのカルシウム結合である。このため、ＣａＭ／カルシウム結合時のコンフォメーション変化の研究には、Ｔ．Ｌ．Ｂｌａｉｒら（１９９４．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６，３００−３０２）により記載されているＳＰＲを含まない蛍光分析法等の代替分析法が使用されてきた。ＣａＭ結合を分析するためのＳＰＲ分析法は、今までのところ、たとえば、Ｔ．Ｏｚａｗａら（１９９９．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４３４，２１１−２２０）およびＥ．Ｔａｋａｎｏら（１９９４．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５２，２４７−２５０）により報告されているような、溶液中のＣａＭが固定化されたオリゴペプチドに結合するのを、カルシウムが仲介するシステムに限定されていた。こうしたシステムでは、ＣａＭ（分子量〜１７０００）を溶液分子として使用することにより、従来のＳＰＲ法で相互作用を検出することができる。
【０００６】
オプティカルファイバー長周期グレーティング（ＬＰＧ）センサーは、アフィニティコーティングを繊維表面に塗布することにより、生物学的標的の検出に使用されてきた（Ｍ．Ｅ．Ｊｏｎｅｓ，ｅｔａｌ．２０００，ＮＳＦ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｆ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＳＢＩＲ−５１０）。ＬＰＧは、グレーティング周期、繊維屈折率および周囲の媒質の屈折率に基づいてある特定の波長で光を散乱させる。アフィニティコーティングが標的分子を吸着すると屈折率が変化し、ＬＰＧで「見られる」散乱光の波長がシフトする。著者らは、リガンドを主成分とするアフィニティコーティング（ポリクローナル抗体）へのβ−ガラクトシダーゼ結合の検出を波長のシフトとして報告している。しかし、このような結合は質量の比較的大きい変化をもたらすものの、受容体におけるコンフォメーションの変化は生じない。
【０００７】
従来技術では、たとえばアロステリック受容体へのリガンド結合を分析するための方法などの表面屈折法の使用については報告されていない。ＣａＭ／Ｃａ結合はアロステリックであるが、カルシウムがＣａＭに結合されてからその複合体が固定化されたオリゴペプチドに結合するため、上記ＣａＭの結合についての研究では検出されていない。検出しようとしている結合であるオリゴペプチドへの複合体の結合は、アロステリックではない。
【０００８】
【発明の概要】
リガンドへの結合時に、受容体（たとえば、結合性タンパク質）または受容体表面複合体がコンフォメーションの変化を受けるとき、屈折率の変化を使用して固定化された受容体へのリガンドの結合を検出できることが、予期せず発見された。リガンドが小さく且つ受容体が大きいときでもコンフォメーションの変化を検出することができる。このコンフォメーションの変化は、リガンド結合時の質量の増加に基づいて予測されるものではない。このようなアロステリック結合剤がそれらのリガンドに結合すると、ＳＰＲによる光学応答において負の偏差（すなわち、共鳴角の減少）が生じる。本発明がいかに作用するかに関しては、特定の理論には縛られたくないが、出願人らは、結合時のシグナルの減少はリガンドの結合時にリガンド周囲の「閉鎖する（closing）」または「崩壊する」結合性タンパク質に起因すると考える。この結果、結合時の質量の増加より大きい流体力学的体積（hydrodynamic volume）の減少を招く可能性がある。逆に、リガンドの結合時にアロステリック結合剤が「開く」とき、光学応答の増強がＳＰＲで確認されている。
【０００９】
従って、本発明はアロステリック受容体類のそれらのリガンドへの結合を検出し、分析するための新規な光学的方法を提供する。本発明の方法は、結合時に顕著な質量を加えないため、表面屈折率の変化では検出できないであろうと考えられる小さいリガンドに特に有用である。
【００１０】
当技術分野で使用される用語「受容体」は、一般に２つの結合パートナーのうち大きい方を指し、一般に結合時にコンフォメーションの変化を受ける結合対のメンバーである。「リガンド」は、一般に受容体より小さく、受容体により結合される。本発明によるＳＰＲに関して、受容体は固定化された分子であり、リガンドは溶液中の分子であることが好ましい。この構成は、Ｂｉａｃｏｏｒｅが推奨するものと反対である。本発明の方法を使用して、リガンドまたはリガンドと受容体との相互作用を検出すること、リガンドの受容体への結合を分析すること、または受容体を分析することが可能である。一般に、屈折率の変化によるリガンドと受容体との相互作用の検出は、リガンドの分子量（または質量）によって異なる。リガンドが大きいほど結合時のシグナルの増強は大きい。屈折率の変化を測定するためにＳＰＲを使用する小さいリガンドの分析法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００（およそ２５０，０００．００ドル）等の非常に感度が高く且つ高価な機器を必要とするか、または大きく競合的な結合性タンパク質を使用した間接的分析法を必要とする。しかし、結合時に受容体がコンフォメーションの変化を受けるとき（すなわち、受容体がアロステリックであるとき）、小さい分子のリガンドでもその結合を屈折率の変化によって直接検出することが可能である。ＳＰＲで分析するとき、アロステリック受容体にリガンドが結合する際にシグナルの減少を観察することが可能である。受容体は結合時に明らかに閉鎖するか崩壊するため、その結果リガンドの質量が付加されるにも拘わらず、複合体の流体力学的体積が減少する。小さいリガンドの場合でも、シグナルの変化は、感度が低いために安価なＳＰＲ機器で検出することができる大きさであり、従って、迅速で安価且つ小型化できる分析方法を提供する。質量の増加を直接モニタリングするとき、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器では、１８０Ｄａ以上の分子の結合の検出に限られるため、これは重要な改良点である。したがって、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器は、一般に、カルシウムイオン（４０Ｄａ）等の小分子の結合を検出することはできない。本発明の方法を使用すれば、より簡易で且つ安価な機器を使用して、ＣａＭまたはトランスグルタミナーゼへのカルシウムの結合を含むアロステリック結合反応を検出することができる。
【００１１】
屈折率の変化のモニタリングに関する技術分野で周知のいずれかの方法を、本発明の方法で使用することが可能である。選択される方法は、ＳＰＲまたはＬＰＧに基づく方法のように、受容体とリガンドとの結合時の表面屈折率変化をモニタリングすることが好ましい。
【００１２】
本発明の受容体はアロステリックであること、すなわち、リガンドに結合したとき、結合部位それ自体または分子内の他の個所のコンフォメーションを変えることが好ましい。一般にアロステリック結合はリガンド周辺の受容体の「閉鎖（closing）」を含むが、一部のアロステリック受容体ではリガンド結合が受容体コンフォメーションの「開放（opening）」を引き起こす。この種の受容体は、しばしばアロステリック受容体類またはアロステリック結合剤類と呼ばれ、当技術分野で周知の結合性タンパク質などがある。このような結合性タンパク質の例としては、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、グルコース結合性タンパク質（ＧＢＰ）、小さい糖を結合する他のタンパク質、ペリプラズム結合性タンパク質、ＣａＭおよびトランスグルタミナーゼなどが挙げられるが、本明細書に記載の本発明で使用するのに適した特性を有する多くの他のタンパク質が当業者に知られている。アロステリックであることがわかっていないのであれば、その受容体を本発明の方法で使用し、小さいリガンドに結合したときにＳＰＲのシグナルの変化が認められるか否かを判定することにより、創意に富む技術を使用することなく、さらなるアロステリック受容体を容易に評価することができる。このようなスクリーニング技術は、コンフォメーションの変化が起こっているかどうか、また、選択された受容体およびそのリガンドを、本発明の方法を使用して分析することができるかどうかに関する情報を速やかに提供する。アロステリック受容体はいかなるサイズ、質量または分子量であってもよいが、結合時の流体力学的体積の変化も比較的大きくなるように、選択されたリガンドに比して大きいことが好ましい。大きいアロステリック受容体は、一般に約１５，０００より大きい分子量であり、多くの場合、約１５，０００〜約１００，０００の分子量であるが、選択されたリガンドのサイズおよびコンフォメーション変化の程度によって、他の分子量の受容体が本発明で有用なこともある。本発明で使用されるリガンドは、約１５００未満の分子量であることが好ましく、さらに好ましくは３０〜４００の分子量であるが、必ずしもこれに限定される必要はなく、アミノ酸類およびペプチド類、ヌクレオチド類およびオリゴヌクレオチド類、糖類、イオン類および当技術分野で周知の他の小部分などが含まれる。好ましいリガンドは、結合時に受容体のコンフォメーションの比較的大きい変化を生む。本発明の方法は、リガンドおよびその受容体の純然たる相対的なサイズに左右されないことに留意されたい。さらに重要なことは、選択されるリガンドが、結合時の受容体のコンフォメーションの変化の大きさに比して小さいことである。すなわち、結合時の受容体のコンフォメーションの変化が大きければ、本発明の方法を使用して、小さいリガンドの比較的小さい受容体への結合を検出することが可能である。
【００１３】
本発明の範囲を限定するつもりはないが、出願人らはアロステリック結合剤がそのリガンドに結合したときに観察される屈折率シグナルの変化は、少なくともある程度、関連する受容体のコンフォメーションの変化に起因するという仮説を立てた。すなわち、受容体はリガンドによって「閉鎖する」ため、「アロステリック結合剤すなわち受容体の流体力学的体積の減少は、リガンドを加えることにより生じる質量の変化より大きい可能性がある。この結果として、複合体の体積の最終的な減少および屈折率の最終的な減少を招く。同様に、リガンドに結合する際に「開く」アロステリック結合剤で観察される屈折率の増加は、付加されたリガンドの質量より大きい流体力学的体積の増加に起因する可能性がある。この現象は屈折率を使用した研究で以前に確認されており、アロステリック結合と関連した屈折率の変化を使用することにより、リガンドが小さいときでも受容体／リガンド結合を簡単に検出することができる。
【００１４】
【実施例】
［実施例１］
浸透圧ショックライゼートからＭＢＰを調製し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングキットからの試薬を用いて実施する標準ＥＤＣ／ＮＨＳ手順を使用して、ＣＭ５（カルボキシメチルデキストラン）チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）に結合させた。ＭＢＰは、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中１０μＭであった。５ｍＭのＣａＣｌ2を加えたＨｅｐｅｓ緩衝食塩水ＥＰ（ＨＢＳ−ＥＰ：０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０；Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＡＢ）を、溶離剤として使用した（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。エタノールアミン（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）を使用して、未反応のエステルを失活させた。エタノールアミンは、非共有的に吸着されたタンパク質をチップ表面から除去する際にも有効であった。所望の濃度のマルトース溶液をｄＨ2Ｏで調製した。マルトースのインジェクションは、１０μｌ／分（接触時間２分）の流量にて２０μｌであった。インジェクション後１００秒に記録点を収集した。ブランク表面上へのインジェクションによって得られた記録点を減じた。気泡等の明らかな異常の間に収集されたデータについては、データポイントを除いた。使用した緩衝液（running buffer）は、５ｍＭのＣａＣｌ2を加えたＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）であった。
【００１５】
１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５に溶解した１００ｍＭのグルコースを２０μｌインジェクションすることにより、結合したマルトースを除去した。存在する可能性があるマルトース不純物を除去するために、グルコースを１水和物として、水から１回再結晶させた。再生後、表面を３００秒間安定させた後、さらにリガンドをインジェクションした。
【００１６】
固定化されたＭＢＰ上のマルトースの質量が増加する場合に予期されるＲＵの正の変化に反して、ＭＢＰ上にマルトース溶液をインジェクションすることにより、再現可能なＲＵの正味の減少を招いた。様々な濃度の一連のマルトース溶液のインジェクションに、２８００ＲＵのＭＢＰを担持する表面を使用した（図１）。これらの溶液に対する応答を測定し、０．３μＭという見掛けの半最大応答が測定された。溶液中での、ＭＢＰに結合するマルトースの解離定数（Ｋｄ）は、およそ１μＭであると報告されている（Ｊ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．７０，１０１−１０８）。これらの値が類似していることから、ある特異的なリガンドと受容体との結合事象が示唆される。
【００１７】
［実施例２］
浸透圧ショックライゼートからグルコース／ガラクトース（ＧＧＢＰ）を調製し、標準ＮＨＳ／ＥＤＣ手順を使用して、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、２０μＭにて、ＣＭ５チップ表面に結合させた。エタノールアミン（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）を使用して、未反応のエステルを失活させた。エタノールアミンは、非共有的に吸着されたタンパク質をチップ表面から除去する際にも有効であった。緩衝液を一晩流したままにして、さらなる非共有的に結合したＧＧＢＰを表面から除去した後、リガンドのインジェクションを実施した。２０００ＲＵのＧＧＢＰを担持する表面を実験に使用した。所望の濃度のリガンドをｄＨ2Ｏで調製した。インジェクションは、２０μｌ／分（接触時間２分）の流量にて１０μｌであった。インジェクション後１００秒に記録点を収集した。ブランク表面上へのインジェクションによって得られた記録点を減じた。一般にブランク対照表面上へのインジェクションは最小限（＜５ＲＵ）のシグナルを与えるが、それにも拘わらずこれを減じた。リガンドのインジェクションを３〜５回繰り返し、インジェクションの順序を定期的に逆さまにした。気泡等の、明らかな異常の間に収集されたデータについては、データポイントを除いた。残りのデータをＱ試験に供した。誤差は１の標準偏差を表す。対照表面および試験表面上へのインジェクションに、１セットの糖溶液類を使用した。流す緩衝液（running buffer）は、５ｍＭのＣａＣｌ2を加えたＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）であった。１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５に溶解した１００ｍＭのα−メチルマンノシドのインジェクション、または５００〜１０００秒の緩衝液を流すことによる（running buffer）洗浄のいずれかによって、ＧＧＢＰリガンドを除去した。
【００１８】
１セットの糖類をＧＧＢＰ表面にインジェクションした（図２）。グルコースのみが有意な負の応答を示した。他の単糖類、二糖類、および多糖類（たとえば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、およびシクロデキストリン）は、ＧＧＢＰ表面上にインジェクションしたとき、無視できるかまたは僅かに正であるかのいずれかの相対的ＲＵの増加を示した。従って、ＳＰＲ表面応答は溶液試験で確認されたＧＧＢＰのグルコースに対する特異性と一致する。このことは、非特異的結合事象（正のＲＵ応答）と特異的結合事象（負のＲＵ応答）とを識別するための方法も示す。
【００１９】
［実施例３］
組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）をＳｉｇｍａ社から入手し、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中にて、１．３ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。標準的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学を使用して、２５００ＲＵのｔＴＧを担持する表面を調製し、これを実験に使用した。エタノールアミン（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）を使用して、未反応のエステルを失活させた。所望の濃度の塩化カルシウムをｄＨ2Ｏで調製した。インジェクションは、２０μｌ／分（接触時間２分）の流量にて２０μｌであった。インジェクション後１００秒において記録点を収集した。ブランク表面上へのインジェクションによって得られた記録点を減じた。一般に、ブランク対照表面上へのインジェクションは最小限（＜５ＲＵ）のシグナルを与えるが、それにも拘わらずこれを減じた。濃度に関して、インジェクションを無作為化した。気泡等の明らかな異常の間に収集されたデータについては、データポイントを除いた。流した緩衝液（running buffer）は、カルシムを加えないＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ）であった。５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０をインジェクションすることにより、トランスグルタミナーゼからカルシウムを除去した。ＥＤＴＡのインジェクション後、この表面を３００秒間安定させてからさらにカルシウムをインジェクションした。
【００２０】
ある濃度範囲でカルシウムをインジェクションした。興味深いことに、ｔＴＧへのカルシウムの結合は応答を正に変化させた（図３）。ｔＴＧの半最大応答は、報告されたタンパク質に対するカルシウムのＫｄ（０．５ｍＭでの実験、報告された値はおよそ１ｍＭ）と類似していた。最新のＢｉａｃｏｒｅ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００）を用いたリガンドの検出限界は、およそ１８０Ｄａである。従って、カルシム（４０Ｄａ）の結合はこの機器で効果的に見ることができない。しかし、ｔＴＧに対する応答の正の変化は、イオン結合を伴う既知のコンフォメーションの変化と一致している。ＭＢＰ、ＧＧＢＰおよびＣａＭは、そのリガンドによって流体力学的半径が減少して「閉鎖する」ことが分かっているが、カルシウム結合時に、ｔＴＧは流体力学的半径の正の変化を受ける（Ａ．Ｄｉｖｅｎｅｒｅ，ｅｔａｌ．，２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３９１５−３９２１）。
【００２１】
［実施例４］
ウシ脳カルモジュリン（ＣａＭ）をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から入手し、標準的なＢｉａｃｏｒｅ  ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学的方法を使用して、カルボキシメチルデキストラン金の表面上に固定した。ＨＳＢ−ＥＰを溶離剤として使用した。ＣａＭを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中、０．５ｍｇ／ｍｌにてインジェクションした（５４分のインジェクション）。この方法で、およそ４８０ＲＵのカルモジュリンを固定した。固定中、流量は５μｌ／分であった。一部の実験では、Ｂａｉｃｏｒｅ（商標）３０００を使用した。他の実験では、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｕｐｇｒａｄｅを使用した。一般に、インジェクションはＨＢＰ−ＥＰ緩衝液中、５または１０μｌ／分の流量で行った。ＨＢＰ−ＥＰ中の様々な濃度のＣａＣｌ2（３．５〜５０ｍＭ）を、ＣａＭ表面およびブランク表面にインジェクションした。全ての濃度でシグナルの減少が認められた。
【００２２】
結合時にＲＵの減少を示す５０ｍＭのＣａＣｌ2に関する結果を図４に示す。ＣａＭ表面もブランク表面もバックグラウンドシグナルが高く、インジェクションそのものの間にＲＵ増加を招く。しかし、ブランク表面上のシグナル（１５０２ＲＵ）は、ＣａＭ表面上のシグナル（１３５０ＲＵ）よりはるかに高い。試験した様々な濃度のＣａＣｌ2について、ＣａＣｌ2濃度が高くなるにつれて応答の強さが増大し、このアッセイを使用してカルシムイオンを計量できることが示唆される。
【００２３】
［実施例５］
ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）修飾表面を有するＬＰＧ繊維センサーを、Ｌｕｎａ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｌａｃｋｂｕｒｇ，ＶＡ）から入手した。２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．８中、３７ｍｇ／ｍｌのＥＤＣおよび７．５ｍｇ／ｍｌのＮＨＳからなる溶液とＬＰＧセンサーを１時間インキュベートすることにより、繊維表面を活性化させた。活性化されたセンサーを、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．８、および１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０で洗浄し、次いで、１０ｍＭのＮａＯＡｃ中２０μＭのＧＧＢＰの溶液に移し、室温で２時間インキュベートした。１０ｍＭのＮａＯＡｃですすいだ後、１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ９．０の溶液に１時間曝露することにより、センサー表面上の未反応のエステルを失活させた。その後、ベース緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のポリソルベート２０、ｐＨ７．４）でセンサーをすすいだ。
【００２４】
分光計、検出器、コントローラー、インターフェースを備えたラップトップコンピューター、および複数のＬＰＧセンサーの呼びかけ信号用スイッチ機構からなるＬｕｎａｓｃａｎシステム（Ｌｕｎａ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって、ＬＰＧセンサーのモニタリングを行った。ＧＧＢＰに曝露していない標準ＣＭＤ被覆ＬＰＧセンサーとの比較により、修飾されたセンサーはタンパク質の固定化により、約０．４０ｎｍ波長だけシフトすることがわかる。
【００２５】
ＨＥＰＥＳベース緩衝液で完全にすすいだ後、修飾センサーおよび非修飾の標準センサーを以下の溶液（表参照）に曝露した。各溶液の間に、ベース緩衝液（ＨＥＰＥＳ）でプローブをすすいだ。センサー性能に対するバルク屈折率（bulk refraction index）作用に関して補正するために、標準チャネルのトレースをＧＧＢＰチャネルから減じた。得られた結果から、１０μＭおよび１ｍＭのグルコースレベルに対して検出可能で且つ可逆的な応答を示すことが分かる（図５）。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
本発明は、高分子量の競合物質を必要とすることなく、小分子を検出する方法を提供する。コンフォメーションの変化を受ける受容体の小さいリガンドへの結合を表面屈折率の変化によって直接モニタリングできることが分かった。低分子量の被験体の存在について報告するために、このようなコンフォメーションの変化を使用することが可能である。リガンド結合時に、流体力学的体積を減少させる受容体（たとえば、ＭＢＰ、ＧＧＢＰおよびＣａＭ）は、ＳＰＲで分析したとき、屈折率が負に変化する。リガンド結合時に、流体力学的体積を増加させる受容体（たとえば、ｔＴＧ）は、ＳＰＲで分析したとき、屈折率が正に変化する。小さいリガンドの結合時に検出される応答の正負は、表面屈折率をモニタリングするために選択された方法によって異なる可能性がある。たとえば、グルコースへのＧＧＢＰ結合をＬＰＧで分析すると、ＳＰＲで確認される負の応答ではなく、正の応答をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に記載の通りに、本発明の方法をマルトースのＭＢＰへの結合に使用した結果を示す図である。
【図２】実施例２に記載の通りに、本発明の方法を糖類のＧＧＢＰへの結合に使用した結果を示す図である。
【図３】実施例３に記載の通りに、本発明の方法をカルシウムイオンのトランスグルタミナーゼへの結合に使用した結果を示す図である。
【図４】実施例４に記載の通りに、本発明の方法をカルシウムイオンのＣａＭへの結合に使用した結果を示す図である。
【図５】実施例５に記載の通りに、本発明の方法をグルコースのＧＧＢＰへの結合に使用した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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