(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、または
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、グルタミン：フルクトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、またはこれらの塩。
【請求項２】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、または
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、グルタミン：フルクトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、またはこれらの塩。
【請求項３】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列、または
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列、を含有する請求項１または２記載のタンパク質またはその塩。
【請求項４】
請求項１または２記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号：４で表わされる塩基配列を含有する請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列を含有する請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換体を培養し、請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質またはその塩を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質またはその塩の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質またはその塩に対する抗体。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質またはその塩の酵素活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質またはその塩を含有する請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質またはその塩の酵素活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１４】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【請求項１５】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタミン：フルクトース−６−リン酸  アミドトランスフェラーゼ（Glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase、以下、ＧＦＡＴと略記）等の活性を示す新規タンパク質およびそれをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は近年その患者数が増加しており、成人病のひとつとして注目されている。インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は我が国に多い糖尿病のタイプであり、早期発見、早期治療がその予後の点からも重要である。しかし、ＮＩＤＤＭはその成因が多様であり、予想されうる原因についての知見は乏しい。
ＮＩＤＤＭにおけるインスリン作用不足の原因として、インスリン感受性機構の異常とインスリン分泌の低下が挙げられる。欧米では多くは前者、すなわちインスリン抵抗性を主徴とするが、我が国ではインスリン分泌不全を主徴とする場合も少なくない。最近、分子生物学の急速な進展によりインスリン感受性機構の知見が集積されてきた。インスリン受容体構造の解明にはじまり、受容体以降のシグナル伝達機構も次第に明らかとなってきた。また、この１０年の間に糖輸送担体遺伝子がクローニングされ、これらの遺伝子の変異と糖尿病発症との関連が検討されている。ただし、現在までに明らかになっているインスリン、グルコキナーゼ、ミトコンドリア遺伝子異常を合わせてもＮＩＤＤＭの１％に満たず、将来さらに他の遺伝子異常が明らかにされる必要がある。
近年、従来の経口血糖低下薬とは作用メカニズムの全く異なる糖尿病治療薬（α−グリコシダーゼ阻害薬：Acarbose, Voglibose〔ダイアビティース・フロンティア（Diabetes Frontier）, 3, 557-564 (1992); ドラッグス（Drugs）, 46, 1025-1054 (1994); 医学のあゆみ, 149, 591-618 (1989); 臨床と研究，67, 219-233 (1990); 臨床と研究, 69, 919-932 (1992); 臨床医21（増刊）, 578-587 (1995)〕、インスリン抵抗性改善薬：Troglitazone, Pioglitazone〔ダイアビティース（Diabetes）, 37, 1549-1558 (1998); 臨床医薬9（Suppl 3), 127-150 (1993); ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New Engl. J. Med.）, 331, 1188-1193 (1994); 「新しい糖尿病治療薬」（後藤由夫編）, 医薬ジャーナル社, 大阪, (1994)〕）が登場し、発売されようとしている。
一方、アメリカでは１９９６年、１８年ぶりにBiguanide薬〔ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New Engl. J. Med.）, 333, 541-549 (1995); ダイアビティース・スペクトラム（Diabetes Spectrum）, 8, 194-197 (1995)〕が糖尿病治療薬として認められ、日常診療での治療が可能となり注目を集めている。これらの薬剤はいずれも、日常診療において古くから汎用されているスルフォニル尿素（ＳＵ）薬とは異なり、膵β細胞からのインスリン分泌を促進することなく血糖を下げる働きをもっている。
【０００３】
現在、インスリン抵抗を改善する働きをもった糖尿病治療薬の作用メカニズムとしては、以下の９項目が考えられている。▲１▼インスリン受容体キナーゼの活性化，▲２▼糖輸送担体の細胞膜への移行促進，▲３▼糖代謝の律速酵素の働き、糖代謝異常の是正，▲４▼肝糖新生の抑制，▲５▼肝による糖取り込み促進，▲６▼肝グリコーゲン生成の亢進，▲７▼血中脂質の低下，▲８▼血中脂質の低下に伴う肝糖新生の減少，▲９▼血中脂質の低下に伴うインスリン感受性の亢進等である。
ＧＦＡＴはヘキソサミン生合成経路において、律速段階であるフルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する重要な酵素である。ＧＦＡＴの活性を阻害する薬剤は細胞内へのグルコースの取り込みを促進し、血糖値を低下させることができると考えられており、そのため糖尿病治療薬としての開発が期待される。作用メカニズムとしては、上記のうち▲２▼あるいは▲５▼等に関与するものと考えているが、以下のように説明できると思われる。
ヘキソサミン生合成経路はその代謝過程において、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン，ＣＭＰ-Ｎ-アセチルノイラミン酸等を産生するが、これらはタンパク質の糖化修飾やプロテオグリカンあるいはガングリオシド等への粗原料として流れていくものと考えられている。一方、インスリンが細胞表面のレセプターに結合することにより細胞内シグナルが活性化され、細胞内にプールされていた糖輸送担体（ＧＬＵＴ４など）が膜表層に移行し、グルコースの取り込みが促進される。取り込まれたグルコースは解糖系により代謝されエネルギー源としてのＡＴＰを蓄積するが、過剰に取り込まれた場合はグルコース代謝物であるフルクトース−６−リン酸がヘキソサミン生合成経路へ流れることになる。流れたフルクトース−６−リン酸はＧＦＡＴによりグルコサミン−６−リン酸に変換される。詳細な機構は不明であるが、いろいろな状況証拠から、グルコサミン−６−リン酸代謝産物が糖輸送担体の膜移行を抑制し、それによって細胞内へのグルコースの取り込みが抑制されることが判明している〔ファセブ・ジャーナル（FASEB J.）, 5, 3031-3036 (1991); ダイアビィトロジア（Diabetologia）, 38, 518-524 (1995); ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 266, 10155-10161 (1991); ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 266, 4706-4712 (1991); エンドクリノロジー（Endocrinology）, 136, 2809-2816 (1995)〕。
【０００４】
このことから、ヘキソサミン生合成経路は、その一つの役割として、グルコースの過剰取り込みに対するフィードバック機構として機能するものと考えられる。ＧＦＡＴはその経路における律速酵素として重要である。また糖尿病患者においてはこのＧＦＡＴ活性が一般的に高いことが知られており、高血糖値を示す一つの原因であると考えられる〔ダイアビティース（Diabetes）, 45, 302-307 (1996)〕。
ＧＦＡＴのように主作用を膵外に求めた血糖低下薬は、いずれも標的組織におけるインスリン抵抗を解除する働きがある。これらの薬剤は単なる血糖降下作用以外にも種々の臨床的メリットがあり、さらに二次的効果が期待できる。また、他薬との併用療法での効果が期待される。
ヒト由来のＧＦＡＴ遺伝子は現在１種のみ知られており〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 267, 25208-25212 (1992)〕、６８１アミノ酸からなる７７kDaのタンパク質であることが報告されている。また、他の動物種からもＧＦＡＴ遺伝子がクローニングされており、例えばマウス由来のＧＦＡＴはヒト由来ＧＦＡＴと塩基レベルで９１％、アミノ酸レベルで９８.６％と高い相同性を示す〔ジーン（Gene）, 140, 289-290 (1994)〕。他に酵母由来ＧＦＡＴ〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 264, 8753-8758 (1989)〕や大腸菌由来ＧＦＡＴ〔バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.）, 224, 779-815 (1984)〕も報告されているが、いずれもヒトＧＦＡＴに高い相同性を示し、新規なＧＦＡＴの存在については全く知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＧＦＡＴ活性を示す新たなタンパク質の単離は、ヘキソサミン生合成経路におけるＧＦＡＴによる調節機能の解明、また臓器特異的に発現していれば臓器別の糖代謝系機構の解明について一層詳細な究明を可能にし、また該ＧＦＡＴタンパク質に対して阻害活性を有する特異的な薬剤が見い出されれば、副作用の少ない糖尿病疾患の予防や治療に役立つ新たな作用メカニズムを有する血糖低下薬の開発が期待できる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーから、新規な塩基配列を有するｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、それにコードされるタンパク質がＧＦＡＴ活性を示すことを見いだした。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：２もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列またはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第（１）項記載のタンパク質、
（３）グルタミン：フルクトース−６−リン酸  アミドトランスフェラーゼ活性を有する第（１）項または第（２）項記載のタンパク質、
（４）第（１）項記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（５）第（１）項記載のタンパク質または第（４）項記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（６）配列番号：４で表わされる塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮＡ、
（７）配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮＡ、
（８）第（５）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（９）第（８）項記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１０）第（９）項記載の形質転換体を培養し、第（１）項記載のタンパク質またはその塩を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の製造方法、
（１１）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医薬、
（１２）低血糖症の治療・予防剤である第（１１）項記載の医薬、
（１３）第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（１４）低血糖症の治療・予防剤である第（１３）項記載の医薬、
【０００８】
（１５）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、
（１６）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１７）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１８）第（１６）項記載のスクリーニング方法または第（１７）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩、
（１９）第（１６）項記載のスクリーニング方法または第（１７）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、および
（２０）糖尿病の治療・予防剤である第（１９）項記載の医薬を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、
（２１）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する第（４）項記載の部分ペプチド、
（２２）配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（２３）第（２２）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（２４）第（２３）項記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（２５）第（２４）項記載の形質転換体を培養し、第（２２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第（２２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質またはその塩の製造方法、
（２６）第（２５）項記載の製造法で製造される、第（２２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質またはその塩、
（２７）第（１５）項記載の抗体と、被検液および標識化された第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法、
（２８）被検液と担体上に不溶化した第（１５）項記載の抗体および標識化された別の第（１５）項記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法、
【００１０】
（２９）第（１５）項記載の抗体（好ましくは、第（１）項記載のタンパク質の活性を中和する活性を有する第（１５）項記載の抗体）を含有してなる医薬、
（３０）糖尿病の治療・予防剤である第（３３）項記載の医薬、
（３１）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させた場合と（ii）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化合物を接触させた場合における、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の酵素活性を測定して、比較することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３２）第（５）項または第（２２）項記載のＤＮＡに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンスＤＮＡ、
（３３）第（５）項または第（２２）項記載のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列が、該ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上（好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有する塩基配列である第（３２）項記載のアンチセンスＤＮＡ、
（３４）第（３２）項記載のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬、および
（３５）糖尿病の治療・予防剤である第（３４）項記載の医薬を提供する。
【００１１】
本発明のタンパク質は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列（配列番号：２もしくは図１で示されるアミノ酸配列の第１番目〜４２５番目のアミノ酸配列、または、配列番号：３もしくは図２で示されるアミノ酸配列の第１番目〜４２５番目のアミノ酸配列）またはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である。
本発明のタンパク質は、例えば、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【００１２】
配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、もっとも好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、前記した配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＦＡＴ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＧＦＡＴ活性などの活性が同様（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５倍〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＧＦＡＴ活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、後述する医薬候補化合物のスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、本発明のタンパク質としては、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有するタンパク質なども用いられる。
【００１３】
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質のより好ましいものとしては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列（図１のアミノ酸配列）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号：３（図２のアミノ酸配列）で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質などが用いられる。
配列番号：２と表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用いられ、特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、前記した配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＦＡＴ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＧＦＡＴ活性などの活性が同様（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５倍〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＧＦＡＴ活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、後述する医薬候補化合物のスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１４】
また、本発明のタンパク質としては、▲１▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有するタンパク質なども用いられる。
【００１５】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用いられ、特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、前記した配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＦＡＴ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＧＦＡＴ活性などの活性が同様（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５倍〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＧＦＡＴ活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、後述する医薬候補化合物のスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１６】
また、本発明のタンパク質としては、▲１▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有するタンパク質なども用いられる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失、付加または置換されている場合、その欠失、付加または置換の位置としては、特に限定されないが、例えば、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜４２５番目のアミノ酸配列（すなわち、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列）以外の位置などが挙げられる。
【００１７】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質ＴＧＣ０２８−３（図１）または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質ＴＧＣ０２８−４（図２）などが用いられる。
【００１８】
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドであって、好ましくは、ＧＦＡＴ活性を有するものなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：７（配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜第１４９番目のアミノ酸配列）、配列番号：８（配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１５０番目〜第２７０番目のアミノ酸配列）または（および）配列番号：９（配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第２７１番目〜第４２５番目のアミノ酸配列）で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドなどが用いられる。より具体的には、本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜２７０番目のアミノ酸配列（すなわち配列番号：７で表わされるアミノ酸配列および配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列）、または配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１５０番目〜４２５番目のアミノ酸配列などを有する部分ペプチドなどが用いられる。
【００１９】
また、本発明の部分ペプチドとしては、▲１▼配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（例、１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸を含有する部分ペプチドなども用いられる。
また、本発明の部分ペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、前記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原として用いることができるので、必ずしもＧＦＡＴ活性を有する必要はない。
【００２０】
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質、部分ペプチドまたはそれらの塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質またはペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法またはこれに準じる方法に従って製造することもできる。
本発明のタンパク質、部分ペプチドまたはそれらの塩をヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、部分ペプチドもしくはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えばクロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質または部分ペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
【００２１】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に、樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ＤＭＦ、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類、あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００２２】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えばアルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
【００２３】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Pd黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２４】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖（タンパク質鎖）を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドのエステル体を得るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質または部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２５】
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、目的とするペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて、目的のペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡまたは▲２▼配列番号：４で表わされる塩基配列にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２７】
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２８】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２９】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性（例、ＧＦＡＴ活性など）を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。  配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３０】
より具体的には、本発明の配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：１０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：１１で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１１で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３１】
本発明の配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または▲２▼配列番号：１２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
上記のなかでも、本発明の配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明の配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明の配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、（１）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または（２）適当なベクターに組み込んだＤＮＡと、本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別すること、などが挙げられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、自体公知のオリゴヌクレオチドの合成法に従って製造することもできる。
ＤＮＡの塩基配列の変換（欠失・付加・置換）は、公知のキット、例えば、MutanTM-G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））などを用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００３３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子で形質転換された細胞をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導入することによって形質転換体を製造することができる。
【００３５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２  ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.），４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン（Gene），２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００３６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（in Vivo）,１３巻, ２１３−２１７(１９７７)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０細胞，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞，２９３細胞，Ｃ１２７細胞，ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞，Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞、２９３細胞などが好ましい。
【００３７】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55（1988）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology） 52, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1, 841-845（1982）〕等が挙げられる。
このようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
【００３８】
なお、動物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質またはその塩を製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３９】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば３β−インドリル  アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４０】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（J. Amer. Med. Ass.）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proc. Soc. Biol. Med.），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
以上のようにして、形質転換体に本発明のタンパク質を生成せしることができる。
【００４１】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在または活性は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより検出または測定することができる。
【００４２】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する）に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。さらには、本発明のタンパク質等に対する抗体は、本発明のタンパク質等の活性を中和する活性を有するものであってもよい。
本発明のタンパク質等に対する抗体は、本発明のタンパク質等を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質等は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が約１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４３】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４４】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４５】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質等の抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカップルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記ハイブリドーマ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４６】
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡまたはｍＲＮＡ（以下、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡと略記する）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的、または実質的に相補的な塩基配列を有し、本発明のタンパク質等の発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質等のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００４７】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、例えば、ヘキソサミン生合成経路においてフルクトース−６−リン酸とグルコサミン−６リン酸との変換反応を触媒するＧＦＡＴ活性などの作用を有しており、特に、フルクトース−６−リン酸をグルコサミン−６−リン酸に変換するＧＦＡＴ活性が相対的に強いタンパク質である。したがって、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩はさまざまな用途に用いることができる。
以下に、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する）、本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する）、本発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する）およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００４８】
（１）医薬
本発明のタンパク質等または本発明のＤＮＡは、例えば、ＧＦＡＴをコードする遺伝子の欠損やそれに起因する疾病あるいはＧＦＡＴの機能の低下やそれに起因する疾病（例、低血糖症など）などの治療・予防剤などの医薬として有用である。
例えば、生体内においてＧＦＡＴが減少あるいは欠損しているために、細胞における、ＧＦＡＴ活性が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質等を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質等を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、（ハ）本発明のタンパク質等を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質等の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のタンパク質等を上記の医薬として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。本発明のＤＮＡを用いる場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質等を上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００４９】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は、注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記の治療・予防剤には、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液などの医薬組成物は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００５０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症の治療目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡも上記と同様にして使用することができる。
【００５１】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することにより、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ（以下、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡと略記）の異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、欠損、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などを検出するための遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いて上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４−８７９（１９８９）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），第８６巻，２７６６−２７７０（１９８９））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、糖尿病などの疾病であるか、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、例えば、低血糖症などの疾病であるか、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、低血糖症、糖尿病などの疾病であるか、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００５２】
（３）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する）を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のタンパク質等に対する抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００５３】
また、本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体（以下、抗タンパク質抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００５４】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量等を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられるモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定することにより、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離にはポリエチレングリコールを用いるが、これ以外に前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、さらに、第１抗体として固相化抗体を用いる固相化法、あるいは第１抗体に可溶性抗体を用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法などがある。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離し、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５６】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in Enzymology」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のようにして、本発明のタンパク質抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質等が関与する種々の疾病の診断をすることができる。
具体的には、本発明のタンパク質等の濃度の減少が検出された場合は、例えば、低血糖症などの疾病の可能性が高いと診断することができる。
一方、本発明のタンパク質等の濃度の増加が検出された場合は、例えば、糖尿病などの疾病の可能性が高いと診断することができる。
このように、本発明の抗体は、上記疾患の診断剤として有用である。
さらに、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。
【００５７】
（４）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体のうち、本発明のタンパク質等に結合して本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を中和することができる抗体は、本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を阻害することができるので、例えば、糖尿病などの疾病の治療・予防剤などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の糖尿病の治療・予防のために使用する場合には、本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を中和する抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を中和する本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００５８】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated  castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお、前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５９】
（５）各種疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進する化合物またはその塩は、例えば、低血糖症などの各種疾病の治療・予防剤などの医薬として使用できる。
一方、本発明のタンパク質の酵素活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病などの各種疾病の治療・予防剤などの医薬として使用できる。
したがって、本発明のタンパク質等は、本発明のタンパク質の酵素活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のタンパク質等を用いることを特徴とする本発明のタンパク質等の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、ＧＦＡＴ促進剤またはＧＦＡＴ阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２）（ｉ）本発明のタンパク質等に基質を接触させた場合と（ii）本発明のタンパク質等に基質および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするＧＦＡＴ促進剤またはＧＦＡＴ阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ii）の場合における、本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性などを測定して、比較することを特徴とするものである。
【００６０】
基質としては、本発明のタンパク質等の基質となり得るものであれば何れのものでもよく、通常、フルクトース−６−リン酸およびグルタミンが用いられる。フルクトース−６−リン酸としては、放射線標識（例、14Ｃ、3Ｈなど）したフルクトース−６−リン酸などを用いるのが好適である。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質等を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより本発明のタンパク質等の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパク質等と基質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性は公知の方法、例えば、Smithらの方法〔アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）, 98, 478-480(1979)〕に従って測定することができる。例えば、１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン、０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８.０）からなる混合液に本発明のタンパク質等を添加した溶液を２５℃で３０分間保温する。同溶液に０.５Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間反応させた後、２.５％ ＮａＮＯ2と１２.５％ ＮＨ4Ｏ3ＳＮＨ2を添加し、さらに０.２５％ ２−メチル−２−ベンゾチアゾロンを添加する。次に、０.５％ FeCl3を加えて、その溶液を６５０ｎｍで吸光度を測定し、生成されるグルコサミン−６−リン酸を定量する。
例えば、上記（ii）の場合におけるＧＦＡＴ活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進している場合、該試験化合物を本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を促進する化合物として選択することができる。一方、例えば、上記（ii）の場合におけるＧＦＡＴ活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害されている場合、該試験化合物を本発明のタンパク質等のＧＦＡＴ活性を阻害する化合物として選択することができる。
【００６１】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質等を含有するものである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬〕
▲１▼測定用緩衝液
０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８.０）
▲２▼タンパク質標品
本発明のタンパク質またはその塩
▲３▼基質
１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン
▲４▼検出
６５０ｎｍでの吸光度を測定する。
〔測定法〕
１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン、本発明のタンパク質またはその塩および０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８．０）からなる反応液に試験化合物を添加した後、２５℃で３０分間保温する。これに０.５Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間加水分解する。２.５％ＮａＮＯ2と１２.５％ＮＨ4Ｏ3ＳＮＨ2を添加し、次いで０.２５％ ２−メチル−２−ベンゾチアゾロンを添加する。次に、０.５％ ＦｅＣｌ3を添加した後、６５０ｎｍで吸光度を測定する。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物（例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など）から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進または阻害する化合物である。該化合物は、新規化合物であってもよいし、公知化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質等の酵素活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、低血糖症などの各種疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
本発明のタンパク質等の酵素活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病などの各種疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質の酵素活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６４】
（６）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な、本発明のタンパク質等の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内において上記の作用を発揮する本発明のタンパク質等の機能を抑制することができる。したがって、該アンチセンスＤＮＡは、例えば糖尿病などの疾病の治療・予防剤などの医薬として使用することができる。
該アンチセンスＤＮＡを上記の医薬として使用する場合、前記した本発明のＤＮＡを含有する各種疾病の治療・予防剤と同様にして製造し、哺乳動物に投与することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００６５】
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
【００６６】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病態動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ組織インヒビター１、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【００６８】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物由来ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３´下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ｍＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の遺伝子工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡが存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
【００６９】
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に本発明の外来性ＤＮＡが存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【００７０】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来性ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常の遺伝子工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡが存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の外来性異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来性異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
【００７１】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての利用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、または組織中のタンパク質を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
▲３▼本発明のＤＮＡを有する組織からの細胞が、標準的な組織培養技術により培養しうることがある場合の、これらの細胞を使用することによる、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異タンパク質の単離精製およびその抗体の作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞を株化することが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、糖代謝調節機能を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００７２】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（ii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iii）ネオマイシン耐性である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iv）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（ｖ）ゲッ歯動物がマウスである第（ii）項記載の胚幹細胞、
（vi）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（vii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、
（viii）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、
（ix）ゲッ歯動物がマウスである第（viii）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（ｘ）第（vii）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００７３】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表例とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００７４】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えばＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００７５】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気、または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単一な細胞とし、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第２９２巻、１５４（１９８１）；G. R. Martin  プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第７８巻、７６３４（１９８１）；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー（Journal of Embryology and Experimental Morphology）、第８７巻、２７（１９８５）〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける重要性を検討する上で有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００７６】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクター中の本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【００７７】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体の該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００７８】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例、低血糖症など）に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、低血糖症に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を低血糖症に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
【００７９】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例、低血糖症など）に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８０】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものが挙げられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が好適である。
本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【００８１】
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００８２】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができるので、例えば、低血糖症などの疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
一方、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば、糖尿病などの疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００８３】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、低血糖症治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
【００８４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＥＩＡ          ：エンザイムイムノアッセイ
【００８５】
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
【００８６】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Cl2Bzl          ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ、Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ          ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ        ：ジイソプロピルエチルアミン
【００８７】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列であり、配列番号：１の第１番目〜第１４９番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列であり、配列番号：１の第１５０番目〜第２７０番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３および−４が共通して有する部分アミノ酸配列であり、配列番号：１の第２７１番目〜第４２５番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
配列番号：７で表わされる部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
配列番号：８で表わされる部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
配列番号：９で表わされる部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００８８】
〔配列番号：１３〕
参考例１においてタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例１においてタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡをクローニングするために、また実施例１において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
参考例１においてタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡをクローニングするために、また実施例１において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例１において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡに対するノーザンブロティングを行なうために、実施例３において使用したプローブの塩基配列を示す。
【００８９】
〔配列番号：１８〕
タンパク質ＴＧＣ０２８−２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例４において本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４の発現ベクターの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００９０】
後述の参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４２は、平成８年８月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２１として、平成８年８月８日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ  １６００３として寄託されている。
後述の実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４３は、平成８年８月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２２として、平成８年８月８日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ  １６００４として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４４は、平成８年８月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２３として、平成８年８月８日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ  １６００５として寄託されている。
【００９１】
【実施例】
以下に、参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法はモレキュラー・クローニング（Molecular cloning）２ｎｄ（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載されている方法に従った。
【００９２】
【参考例１】
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−２タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−２タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて行なった。
ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリー（ギブコ・ビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株をTerrific Broth（１２g/l Bacto−Tryptone（ディフコ社），２４g/l Bacto−Yeast Extract（ディフコ社），２.３g/l リン酸一カリウム，１２.５g/l リン酸二カリウム）で３０℃で１６時間培養し、キアジェン・プラスミドキット（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを精製抽出した。精製したプラスミドｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれもギブコ・ビーアールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
一方、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プローブは、ＴｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて、３'末端をビオチン化することで標識した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処理した後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加えて３７℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、ＭＰＧR−ストレプトアビジンマグネットビーズ（ギブコ・ビーアールエル社）を加えて、室温で２分ごとに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーントラッパーポジティブ選択システム・マグネットラック（ギブコ・ビーアールエル社）中に入れ、２分間放置した。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッパーポジティブ選択システム・ウオッシュバッファーで洗浄した。このウオッシュバッファーによる洗浄を３回行なった。その後、マグネットラックに入れて放置し、上清を捨て、ジーントラッパーポジティブ選択システム・溶出バッファーを加え、５分間室温で放置した。マグネットラックに入れて５分間放置した後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。
【００９３】
取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）を入れ、９５℃で１分間放置した。ジーントラッパーポジティブ選択システム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して二本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。
得られた形質転換株を用いて２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１４、配列番号：１５）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによるスクリーニングを行なった。ＰＣＲにより６１２ｂｐの増幅断片が形成されたコロニーを陽性クローンとして１株選択した。
選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、Ｔａｑダイデオキシターミネーター・サイクルシーケンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行い、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取得したクローンは、poly(Ａ)+鎖を含んでおり、配列番号：１９で表される１４５８個の塩基配列を有していた〔図３〕。このＤＮＡ断片には、配列番号：１８で表される４８６個のアミノ酸からなる新規タンパク質ＴＧＣ０２８−２がコードされており、予想される遺伝子産物はヒトＧＦＡＴとはアミノ酸レベルで６８％の相同性を有していた。
タンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４２を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４２を得た。
【００９４】
【実施例１】
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて行なった。
ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリー（ギブコ・ビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株をTerrific Broth（１２g/l Bacto−Tryptone（ディフコ社），２４g/l Bacto−Yeast Extract（ディフコ社），２.３g/l リン酸一カリウム，１２.５g/l リン酸二カリウム）で３０℃で１６時間培養し、キアジェン・プラスミドキット（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを精製抽出した。精製したプラスミドｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれもギブコ・ビーアールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
一方、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１６）をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プローブは、ＴｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコ・ビーアールエル社）を用いて、３'末端をビオチン化することで標識した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処理した後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加えて３７℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、ジーントラッパーポジティブ選択システム・マグネットビーズ（ギブコ・ビーアールエル社）を加えて、室温で２分ごとに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーントラッパーポジティブ選択システム・マグネットラック（ギブコ・ビーアールエル社）中に入れ、２分間放置した。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッパーポジティブ選択システム・ウオッシュバッファーで洗浄した。このウオッシュバッファーによる洗浄を３回行なった。その後、マグネットラックに入れて放置し、上清を捨て、ジーントラッパーポジティブ選択システム・溶出バッファーを加え、５分間室温で放置した。マグネットラックに入れて５分間放置した後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。
【００９５】
取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１６）を入れ、９５℃で１分間放置した。ジーントラッパーポジティブ選択システム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して二本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。
得られた形質転換株を用いて２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１４、配列番号：１５）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによるスクリーニングを行なった。ＰＣＲにより６１２ｂｐの増幅断片が形成されたコロニーを陽性クローンとして１株選択した。
選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、Ｔａｑダイオキシターミネーター・サイクルシーケンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行い、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取得したクローンは、poly(Ａ)+鎖を含んでおり、配列番号：５で表される１８４５個の塩基配列を含む２７７３個の塩基配列を有していた〔図１〕。このｃＤＮＡ断片は、配列番号：２で表される６１５個のアミノ酸からなる新規ＧＦＡＴタンパク質ＴＧＣ０２８−３がコードされており、予想される遺伝子産物はヒトＧＦＡＴとはアミノ酸レベルで７４％、ＴＧＣ０２８−２とは８８％の相同性を有していた。
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４３を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４３を得た。
【００９６】
【実施例２】
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードする遺伝子の構築
新規ＧＦＡＴ・ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４３より、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで切り出される１７８８個の塩基配列を有する遺伝子断片を得た。一方、ＧＦＡＴ様遺伝子断片を保持するプラスミドから、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出されるＤＮＡ断片を回収した。各々の遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩで処理したプラスミドベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（ノバジェン社）に挿入し、プラスミドｐＴＢ１９４４を構築した〔図４〕。このプラスミドベクターは、ＴＧＣ０２８−３には含まれない６５個のアミノ酸配列をＣ末端に含み、配列番号：６で表わされる２０４６個の塩基配列からなるオープンリーディング領域を保持しており、配列番号：３で表わされる６８２アミノ酸残基からなる遺伝子産物をコードしていることとなる〔図２〕。
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４４を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４４を得た。
【００９７】
【実施例３】
ノーザンブロット解析による遺伝子発現の組織特異性の解析
ノーザンブロッティングによる遺伝子の発現臓器の特異性の解析は、ヒューマンマルチプルティシュ・ノーザンブロット（クロンテック社）およびヒューマンマルチプルティシュ・ノーザンブロットII（クロンテック社）のメンブレンを用いて行なった。まず、このメンブレンをハイブリダイゼーションバックに入れた後、５ｍｌのハイブリダイゼーション用緩衝液（５０％脱イオン化ホルムアミド，５×ＳＳＰＥ，２×Denhardt's液，２％ ＳＤＳ，１００μg/ml 熱変性ニシン精子ＤＮＡ）を添加した後、５０℃で３時間保温し、プレハイブリダイゼーションを行なった。一方、プローブとしては、１７９６個からなる配列番号：１７で表わされる本発明のタンパク質ＴＧＰ０２８−３の部分配列をコードするＤＮＡ断片を（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ（アマシャム社）とＢｃａベストラベリングキット（宝酒造）を用いて標識した。該標識プローブを上記ハイブリダイゼーションバックに添加した後、５０℃で２時間保温した。
保温後、メンブランをバックより取り出し、２×ＳＳＣ，０.０５％ ＳＤＳからなる洗浄液で、室温で２回洗浄し、さらに、０.１×ＳＳＣ，０.１％ ＳＤＳからなる洗浄液で、５０℃で２回洗浄した。その後、該フィルターに対するオートラジオグラムをとってプローブが結合したバンドを調べた。その結果、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、平滑筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸および大腸のすべての臓器でバンドが検出され、ＲＮＡの大きさは、いずれも約４.０ｋｂであった〔図５〕。また、このメンブランを沸騰させた０.５％ ＳＤＳ溶液中で１０分間処理することで、結合したプローブをフィルターから除き、コントロールとしてヒトβ−アクチンプローブ（和光純薬工業（株））を用いてβ−アクチンに対するハイブリダイゼーションを行なった結果、β−アクチンも全臓器で検出された〔図６〕。
【００９８】
【実施例４】
大腸菌を用いた組換えＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質の発現
本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３の発現ベクターの構築については以下のように行なった。まず、ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４３を鋳型にし、２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２０、配列番号：２１）をプライマーとし、TaKaRa Ex TaqTM（宝酒造（株））を用いてサーマルサイクラーGeneAmpR PCR System 2400（パーキンエルマー社）にて、９４℃・１分を１サイクル、９４℃，１分→６０℃，１分→７２℃，２分を３０サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行ない、該ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られた該ＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を確認した後、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）にて回収・精製した。該ＤＮＡ断片をｐＴ７ブルー Ｔ-ベクター（ノバジェン社）のＴクローニング部位にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して得られたアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列については、種々の合成オリゴＤＮＡをプライマーとし、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（パーキンエルマー社）を用いたサイクルシークエンス反応を、添付資料の条件にしたがってGeneAmp PCRR System 2400で行なった後、該試料をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー社）で分析した。得られた塩基配列は遺伝子解析ソフトレーザージーン（Lasergene、ディーエヌエースター（DNASTAR）社）で解析した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡのうち、塩基配列の相違が無かったクローンを選択し、そのＤＮＡ断片の５'末端および３'末端を制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩを用いて消化した後、アガロースゲル電気泳動とキアクイックゲル抽出キットを用いてＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡ断片を回収・精製した。一方、ｐＥＴ３２ａ（＋）ベクター（ノバジェン社）を、制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩを用いて消化した後、回収・精製した。このｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターに、先に取得したＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られたアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。このようにして構築したプラスミドＤＮＡをｐＥＴ３２ａ（＋）／ＴＧＣ０２８−３とした。
【００９９】
次に、ＴＧＣ０２８−３タンパク質を発現させるため、プラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）／ＴＧＣ０２８−３よりタンパク質をコードするＤＮＡ断片を単離し、ｐＥＴ３２ｂ（＋）ベクター（ノバジェン社）への導入を行なった。すなわち、ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片の、５'側に制限酵素ＮｄｅＩにより認識される部位を、３'側に制限酵素ＳａｌＩにより認識される部位を付加するため、ｐＥＴ３２ａ（＋）／ＴＧＣ０２８−３を鋳型に、２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２２、配列番号：２３）をプライマーとし、TaKaRa Ex TaqTM（宝酒造（株））を用いてサーマルサイクラーGeneAmpR PCR System 9600（パーキンエルマー社）にて、９４℃・１分を１サイクル、９８℃，１０秒→５５℃，１分→７２℃，２分を３５サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行ない増幅した。得られた該ＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を確認した後、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）にて回収・精製した。該ＤＮＡ断片をｐＴ７ブルー Ｔ-ベクター（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して得られるアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列については、前述と同様な方法でＤＮＡシークエンスを行なって確認した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡのうち、塩基配列の相違が無かったクローンのＤＮＡを調製し、５'末端および３'末端を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩを用いて消化した後、前述と同様な方法で回収・精製した。一方、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて消化後、前述と同様な方法で回収・精製したｐＥＴ３２ｂ（＋）ベクター（ノバジェン社）に、ＴＧＣ０２８−３タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入して得られるアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−３−２とした。この結果、ＴＧＣ０２８−３は、Ｃ末端側にＶａｌ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓの８アミノ酸が付加された融合タンパク質として発現することになる。
【０１００】
一方、本発明のＴＧＣ０２８−４タンパク質の発現ベクターの構築については以下のように行なった。まず、ＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９４４を鋳型にし、ＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードするＤＮＡ断片の５'側に制限酵素ＮｄｅＩにより認識される部位を、３'側に制限酵素ＳａｌＩにより認識される部位を付加するため、２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２４、配列番号：２５）をプライマーとし、TaKaRa Ex TaqTM（宝酒造（株））を用いてサーマルサイクラーGeneAmpR PCR System 9600（パーキンエルマー社）にて、９４℃・１分を１サイクル、９８℃，１０秒→５５℃，１分→７２℃，２分を３５回サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行ない、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られた該ＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を確認した後、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）にて回収・精製し、ｐＴ７ブルー Ｔ-ベクター（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られたアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列については、前述と同様な方法でＤＮＡシークエンスを行なって確認した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡのうち、塩基配列の相違が無かったクローンを選択し、そのＤＮＡ断片の５'末端および３'末端を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩを用いて消化した後、前述したのと同様な方法でＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡ断片を回収・精製した。一方、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて消化後、前述したのと同様な方法で回収・精製したｐＥＴ３２ｂ（＋）ベクター（ノバジェン社）に、先に取得したＴＧＣ０２８−４タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて連結し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入して得られるアンピシリン耐性株より目的のプラスミドＤＮＡを選択・単離した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−４−２とした。この結果、ＴＧＣ０２８−４は、Ｃ末端側にＶａｌ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓ，Ｈｉｓの８アミノ酸が付加された融合タンパク質として発現することになる。
【０１０１】
大腸菌を用いて組換えＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質を発現させるためには、ｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−３−２を保持する大腸菌またはｐＥＴ３２ｂ（＋）／ＴＧＣ０２８−４−２を保持する大腸菌を、Ｌブロス培地５００mlで３７℃、３時間培養した後、イソプロピル−β−Ｄチオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を０.１mMとなるように添加し、発現誘導をかけた後、２３℃で１５時間培養した。培養終了後、４，８００×ｇ、１０分間、４℃の遠心操作により菌体を回収後、１Ｍ 尿素、０.２５％ ザルコシル、０.５％ ＮＰ−４０および１mM フェニルメチルサルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むＰＢＳ１０mlに懸濁した後、菌体を超音波破砕した。該菌体破砕液を４，８００×ｇ、１０分間、４℃で遠心して得た上清に、４０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加した。さらに、該破砕液を４，８００×ｇ、１０分間、４℃で遠心し、得られた上清に５４％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加した。これを再度４，８００×ｇ、１０分間、４℃で遠心して得た沈殿は、ＰＢＳ １０mlで溶解した後、大量のＰＢＳに対して透析を行なった。このようにして得られた組換えＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質の粗抽出液は、２.５ml容量Ｈｉｓ ｂｉｎｄカラム（ノバジェン社）に通した後、同カラムを２５mlのバインディングバッファー（５ｍＭイミダゾール、０.５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７.９）で洗浄、ついで１５mlの２０mM イミダゾールを含有する同バインディングバッファーで洗浄した後、組換えＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質を１５mlの６０mM イミダゾールを含有する同バインディングバッファーで溶出した。
【０１０２】
【実施例５】
ＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質の有するＧＦＡＴ活性の測定
ＴＧＣ０２８−３およびＴＧＣ０２８−４タンパク質の有するＧＦＡＴ活性は以下の方法により測定した。すなわち、ｐＨ７.５の次の組成からなる溶液（０.１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4、５０mM ＫＣｌ、５０mM ＨＥＰＥＳ、１mM ＥＤＴＡ、５mM ＤＴＴ）に、反応基質であるグルタミンおよびフルクトース−６リン酸をそれぞれ終濃度が６mMおよび１０mMになるように添加した反応液１００μｌに、ＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質を１μｌ添加し、室温で５時間反応させた。反応後、該反応液を遠心濾過器ウルトラフリーＣ３ＧＣ（分子量１万カット、ミリポア社）に供し、遠心して得た濾液にメタノール：水：トリエチルアミン（２：２：１）の混合液を等量加えた。該溶液を真空乾燥した後、メタノール：水：トリエチルアミン：フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）（７：１：１：１）の混合液２０μｌで溶解し、室温で２０分反応した。該溶液を真空乾燥させた後、５mM ＮａＨ2ＰＯ4、５％ アセトニトリルからなる混合液１００μｌに溶解させ、ＨＰＬＣ（日立 L-4200 UV-VIS ディテクター，L-6200 インテリジェントポンプ）を用いて、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸の生成率を調べた。コントロールには、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸を用いた。カラムにはTOSOH TSK-GEL ODS-80TM（東ソー社）を用い、２３２mM 酢酸ナトリウム、０.１％ トリエチルアミン、５％ アセトニトリル（ｐＨ６.０）からなる移動相を１ml／分の流速で流して分離を行ない、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸はＵＶ２５４nmで検出した。その結果、反応液にＴＧＣ０２８−３またはＴＧＣ０２８−４タンパク質をフルクトース−６リン酸とともに加えた場合にのみ、ＰＩＴＣ結合グルコサミン−６リン酸に相当する位置にピークが確認された。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、例えば、ＧＦＡＴ活性などの作用を有している。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、および本発明のタンパク質またはその部分をコードするＤＮＡは、例えば、低血糖症などの疾患の治療・予防剤などの医薬として有用である。さらに、本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡの発現異常を検出することができるので、低血糖症や糖尿病などの疾患の遺伝子診断剤として有用である。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量などに使用することができる。
さらに、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、本発明のタンパク質のＧＦＡＴ活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするための試薬として有用である。
【０１０４】
【配列表】
【配列番号：１】
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0004175680.tif 000003
0004175680.tif 000004
【０１０５】
【配列番号：２】
0004175680.tif 000005
0004175680.tif 000006
0004175680.tif 000007
【０１０６】
【配列番号：３】
0004175680.tif 000008
0004175680.tif 000009
0004175680.tif 000010
0004175680.tif 000011
【０１０７】
【配列番号：４】
0004175680.tif 000012
【０１０８】
【配列番号：５】
0004175680.tif 000013
0004175680.tif 000014
【０１０９】
【配列番号：６】
0004175680.tif 000015
0004175680.tif 000016
【０１１０】
【配列番号：７】
0004175680.tif 000017
【０１１１】
【配列番号：８】
0004175680.tif 000018
【０１１２】
【配列番号：９】
0004175680.tif 000019
【０１１３】
【配列番号：１０】
0004175680.tif 000020
【０１１４】
【配列番号：１１】
0004175680.tif 000021
【０１１５】
【配列番号：１２】
0004175680.tif 000022
【０１１６】
【配列番号：１３】
0004175680.tif 000023
【０１１７】
【配列番号：１４】
0004175680.tif 000024
【０１１８】
【配列番号：１５】
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【０１１９】
【配列番号：１６】
0004175680.tif 000026
【０１２０】
【配列番号：１７】
0004175680.tif 000027
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【０１２１】
【配列番号：１８】
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0004175680.tif 000030
0004175680.tif 000031
【０１２２】
【配列番号：１９】
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【０１２３】
【配列番号：２０】
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【０１２４】
【配列番号：２１】
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【０１２５】
【配列番号：２２】
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【０１２６】
【配列番号：２３】
0004175680.tif 000037
【０１２７】
【配列番号：２４】
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【０１２８】
【配列番号：２５】
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【０１２９】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２】実施例２で得られた本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３】参考例１で得られたタンパク質ＴＧＣ０２８−２をコードするＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図４】本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−４をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＢ１９４４の構築図を示す。
【図５】本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするＤＮＡをプローブとして用いて、本発明のタンパク質ＴＧＣ０２８−３をコードするｍＲＮＡのヒトの各組織における発現量をノザンハイブリダイゼーションで調べた結果を示す（電気泳動写真図）。（１）は心臓を、（２）は脳を、（３）は胎盤を、（４）は肺を、（５）は肝臓を、（６）は平滑筋を、（７）は腎臓を、（８）は膵臓を、（９）は脾臓を、（１０）は胸腺を、（１１）は前立腺を、（１２）は精巣を、（１３）は卵巣、（１４）は小腸を、（１５）は大腸を示す。縦軸のｃｍは泳動距離を示す。
【図６】ヒトβ−アクチンプローブをプローブとして用いて、ヒトβ−アクチンをコードするｍＲＮＡのヒトの各組織における発現量をノザンハイブリダイゼーションで調べた結果を示す（電気泳動写真図）。（１）は心臓を、（２）は脳を、（３）は胎盤を、（４）は肺を、（５）は肝臓を、（６）は平滑筋を、（７）は腎臓を、（８）は膵臓を、（９）は脾臓を、（１０）は胸腺を、（１１）は前立腺を、（１２）は精巣を、（１３）は卵巣、（１４）は小腸を、（１５）は大腸を示す。縦軸のｃｍは泳動距離を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
0004175680.tif 000046
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
0004175680.tif 000049
【図２−５】
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【図２−６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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