(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫチャンネルをコードしているＤＮＡの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける海綿体平滑筋の緊張低下を高めるための医薬調製物の調製のための、使用。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、前記Ｋチャンネルをコードしている分子に機能的に連結されたプロモーターを含む請求の範囲第1項に記載の使用。
【請求項３】
前記プロモーターが、平滑筋特異的プロモーターである請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項４】
前記Ｋチャンネルが、Ｃａ２＋感受性Ｋチャンネルである請求の範囲第１項〜第3項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｃａ２＋感受性Ｋチャンネルが、maxi−Ｋである請求の範囲第４項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記調製物が、前記ＫチャンネルをコードしているＤＮＡの発現を、海綿体平滑筋細胞において可能にする請求の範囲第1項〜第６項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記海綿体平滑筋が収縮亢進を持つ請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記調製物が勃起障害を軽減させる請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記勃起障害が平滑筋の不完全な緊張低下から生じる請求の範囲第９項に記載の使用。
【請求項１１】
前記勃起障害が神経原性機能不全から生じる請求の範囲第９項に記載の使用。
【請求項１２】
前記勃起障害が動脈原性機能不全から生じる請求の範囲第９項に記載の使用。
【請求項１３】
前記勃起障害が静脈閉鎖不全から生じる請求の範囲９の使用。
【請求項１４】
前記平滑筋が動脈の平滑筋を含む請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
勃起障害は、米国では概算で１千万から３千万の男性が罹患している一般的な疾患である（Feldmanら、J. Clin. Epidemiol., 47.5:457-467（1994）;著者不詳、Internatl. J. Impotence Res., 5.4:181-284（1993））。勃起障害の主要な疾患関連原因には粥状硬化症、糖尿病、加齢、高血圧および降圧治療、慢性腎疾患、骨盤手術および放射線治療、並びに心理性不安がある（Feldmanら、J. Clin. Epidemiol., 47.5:457-467（1994））。これらの多様で多面性を有する病的状態の血管破壊に対する直接的な治療方法は近い将来にはまだ存在しないであろう。したがって最近の１０年間には低下した勃起能力を直接回復させる幾つかの治療方式が開発されてきた。しかしながら、現在利用可能な治療法はいずれも、非特効性であるか（ホルモン療法）、全体的に成功に限界があるか（例えば真空勃起装置）、侵襲性であるか（例えば体内注入療法）、または不可逆性で高価である（例えば人工陰茎移植手術）。これらの治療的限界にもかかわらず、勃起障害の海綿体内治療用カバジェクト（Caverject）の最近のＦＤＡの承認は重要な前進を示している。本質的には、この連邦政府の処置は、当該疾患の医学的特性を公式に認知することとなり、さらにその治療法を正式に認めることになった。
米国における現代の文化的パターンの変化は、性および性的障害についての自由でより開放的な公の議論を可能にした。この文化的傾向によって、この疾患の重要性に光が当てられるとともに、同時に勃起障害の治療法の改善の必要性が強調された。この疾患についての議論および治療に関連する最近の広告およびメディア活動が盛んになったことによって、男性およびその性的パートナーは、勃起障害は正規の（連邦政府によって承認された）治療方法が利用可能な一般的な疾患であることをさらに認識するようになった。これらの出来事が組合わさって、今後１０年間により多くの男性がかかりつけの医師からインポテンツの治療を受けようと努めるであろう。したがって、完全な組織レベル、細胞レベルおよびつい最近では細胞下レベルにおける海綿体平滑筋および動脈平滑筋機能の研究を通して、ヒトの勃起に対する年令と疾患の影響をより一層理解することが要求される。さらに、器官性勃起障害の新規な治療がより経済性を有し、より有効で副作用が少ないことを担保する実験室の研究結果を臨床に直接移入することを可能にする研究手法が要求されている。
研究によれば、海綿体（corporal）の平滑筋緊張力の変化（これは収縮亢進または緊張低下障害のいずれかをもたらす）が、大部分の不能男性の勃起障害の基本的な原因である。これらの研究はさらに、重篤な動脈性疾患または先天的な構造異常（これらは少数の患者で認められる）が存在しないかぎり、海綿体平滑筋の完壁な緊張低下が勃起能力を回復させるために必要かつ十分であることを示した。ＦＤＡによる平滑筋弛緩剤ＰＧＥの海綿体内注射の承認はこの仮説の信憑性を立証した。
上記で述べたような勃起機能における海綿体平滑筋細胞が果たすこの重要な役割は、これら平滑筋細胞を勃起障害の治療における分子治療のための優れた標的にした。これまでの努力は、いくつかの心脈管系疾患の潜能治療の基礎として血管の平滑筋細胞に遺伝子を移入する技術に向けられていた。このような心脈管疾患には、とりわけ粥状硬化症、血管炎およびバルーン血管形成術後の再狭窄がある。これら初期の研究によって、平滑筋細胞における遺伝子移入の方法の効率および持続性に関する重要な情報が提供された（Finkelら、FASEB J., 9:843-851（1995））。
したがって（勃起障害は主として平滑筋の緊張力の変化によって惹起されるので）、平滑筋の緊張力の変化に関与する遺伝子を標的とする遺伝子治療の方法が強く所望されるところである。さらに、in vivoでの遺伝子治療のアプローチの全てについて極めて重要なことは、作用を受けねばならない標的細胞の割合および、生理学的に相関性を有する治療効果を得るために所望の細胞型のみに作用を与える比較効率である。したがって、組織機能の全面的変化に影響を与えるために少数の細胞のみの遺伝的改変が必要な遺伝子治療の方法が要求されている。最後に、勃起障害を軽減する効果的な遺伝子治療の方法は、現行の方法よりも好ましい選択肢であると思われるので要請は極めて高い。
発明の要旨
本発明は、平滑筋緊張力の制御に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む組換え体（リコンビナント）ベクターを平滑筋細胞に供給し発現させることによる勃起障害の遺伝子治療を目的とする。
本発明は特に遺伝子治療方法を提供するが、当該方法では、平滑筋細胞の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、血管の緊張低下を調整することによって海面体平滑筋細胞内の海綿体平滑筋緊張力を調節する蛋白質をコードする。これらの蛋白質は海綿体平滑筋の緊張低下を高め、その結果より容易な勃起の達成をもたらすであろう。さらにまた、本発明は、当該ＤＮＡ配列が平滑筋の血管収縮を抑制する蛋白質をコードする遺伝子治療の方法を目的とする。
さらに本発明は、海綿体平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を対象者の十分な数の細胞に導入し発現させて対象者の陰茎勃起を誘発することを含む、陰茎勃起を当該対象者で誘発させる方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明の遺伝子治療の方法は勃起障害を軽減するために用いられる。
本発明はまた、ウイルスゲノムの少なくとも一部分のＤＮＡまたはそれに対応するＤＮＡ（当該部分はＤＮＡ配列の発現を指令することができる）、および当該ウイルスＤＮＡに機能できるように連結され、さらに標的細胞内で機能的な遺伝子産物として発現させることができる海綿体平滑筋の緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡを含むリコンビナントベクターを提供する。
本発明はさらに、平滑筋の緊張力の調節に必要な蛋白質をコードする平滑筋細胞（例えば海綿体平滑筋細胞または動脈平滑筋細胞）を提供する。
本発明のさらに別の目的は以下の記載から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
図１：図１は、maxi−Ｋチャンネルの選択的封鎖が単離したヒトの海綿体組織片でどのようにしてＮＴＧで誘発される緊張低下反応を変化させるかを示す。先に発表された動的変化プロトコルを修正して用い（Christら、Am. J. Physiol., 263:H15-H19（1992））、２つの指標、τ１／２（ＮＴＧの添加から５０％の定常状態の緊張低下反応に達するまでの経過時間）およびＲＳＳ（ＮＴＧ誘発緊張低下反応の定常状態での強さ）を誘導した。単離海綿体組織片の予備保温はＮＴＧ誘発緊張低下反応の強さの顕著な低下（１００ｎＭ）をもたらすことに留意されたい。
ＰＥ＝フェニルエフリン、ＮＴＧ＝ニトログリセリン。
図２：図２は、Ｋチャンネルの機能および海綿体平滑筋緊張力の制御を示す。Ｋ＋イオンの流量は３つの主要なエフェクター経路によって制御される。初めの２つの経路は、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ（ＰＫＡ：蛋白キナーゼＡ）およびｃＧＭＰ／ＰＫＧ（蛋白キナーゼＧ）経路で、これらはそれぞれＰＧＥ１およびＮＯによって活性化され、さらにこれらの経路はmaxi−Ｋチャンネルの活性を明瞭に調整する（これらのＫＡＴＰチャンネルに対する影響は未だ証拠付けされていない）。第三の経路はカリウムチャンネル調整物質で、これはＫＡＴＰチャンネルの活性を調整する。これらイオンの細胞内および細胞外空間における配置のために、Ｃａ２＋チャンネルの開放はその電気化学勾配に沿ってＣａ２＋の流入をもたらし、続いて細胞内脱分極を生じ、一方、Ｋチャンネルの開放はその電気化学勾配に沿ってＫ＋の細胞からの流出をもたらし、続いて細胞内過分極を生じる。膜電位および海綿体平滑筋緊張力レベルに対するこれらの相互経路の影響が、少なくとも部分的に細胞内カルシウム濃度の調整を介して、収縮に付随する細胞内カルシウムの増加および緊張低下に付随する細胞内カルシウムの減少を示しながら強力に発揮されている。（＋）は陽性または興奮性作用を表し、（−）は陰性または抑制性作用を表し、？は不明作用を表す。ＰＩＰ２：ホスファチジルイノシトールビスホスフェート、ＤＡＧ：ジアシルグリセロール、ＩＰ３：イノシトールトリスホスフェート、ＮＯ：酸化窒素、ＮＴＧ：硝酸塩供与体ニトログリセリン、ＥＴ−１：エンドセリン−１、ＰＥ：フェニルエフリン、Ｌ型Ｃａ２＋：Ｌ型、電圧依存性カルシウムチャンネル。
図３：図３は、圧モニター用カニューレの外科的準備および設置を示す。図示したように、ラットを麻酔して仰臥させる。左頸動脈内の動脈ラインは、連続して血圧をモニターするために変換器および変換器増幅装置を経由してマックラブ（MacLab）データ捕捉盤に連結されている。右の側方頸静脈ラインは静脈内輸液または血液のサンプリングのために用いられる。図示したように、前立腺は下方正中線切開によって露出させた。海綿体の神経は、骨盤神経節（これは下腹部神経と骨盤神経の結合によって形成される）から始まり前立腺の後外側表面上に認められる。両側で鼠径陰嚢切開を実施し、併せて陰茎の外皮をはぎ取ることによって２つの海綿体を露出させた。海綿体内薬剤注入のためにさらに別のラインを左の海綿体に挿入する。最後に、神経刺激プローブを電流刺激のために海綿体周辺に設置する。
図４：図４は、神経刺激に反応する海綿体内圧（ＩＣＰ）の機能的変化を測定した実験結果を示す。
図５：図５は、海面体平滑筋緊張力を調節する主要なメカニズムを示す模式図である。側面境界の間隙接合斑（gap junction plaque）によって相互に連結された２つの海面体平滑筋細胞が示されている。さらに電圧依存ＣａチャンネルおよびＫチャンネルもまた図示されている。左の細胞は海面体平滑筋の収縮と連動している一連の細胞内事象（細胞内カルシウムレベルの上昇）を示し、一方、右の細胞は海面体平滑筋の緊張低下と連動している一連の細胞内事象（細胞内Ｃａ２＋レベルの減少）を示す。＋は興奮性、陽性または増加性作用を示し、−は抑制性または陰性作用を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むリコンビナントベクターを平滑筋細胞に供給し当該平滑筋細胞内でこれを発現させることによる勃起障害の遺伝子治療を提供する。このＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。
本発明はさらに、平滑筋の緊張力の調節に必要な蛋白質が血管の緊張低下を調整するものである遺伝子治療方法を提供する。血管の緊張低下を調整する蛋白質の例には、例えば酸化窒素シンターゼ、グアニレートシクラーゼ、アデニレートシクラーゼ、蛋白キナーゼＧ、蛋白キナーゼＡ、カリウムチャンネル、カルシウムチャンネルおよびそのいずれかの組み合わせが含まれる。これらの蛋白質は、平滑筋の緊張低下を高め、その結果勃起をより容易に達成させるであろう。
さらにまた、平滑筋の血管収縮を調整する蛋白質を抑制する作用をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を本発明で使用することが意図される。海面体平滑筋の血管収縮を調整する蛋白質の例は蛋白キナーゼＣである。平滑筋細胞の血管収縮に必要な蛋白質を抑制する蛋白質は、少なくとも部分的には細胞内Ｃａ２＋レベルの減少および筋フィラメントの感受性の変化を介してそれらの作用を発揮して最終的には海綿体平滑筋の緊張低下の強化とより容易な勃起の達成をもたらすであろう。
本遺伝子治療の方法を用いることができる平滑筋細胞の例には海面体平滑筋細胞および動脈平滑筋細胞が含まれるが、しかしこれらに限定されない。海面体平滑筋と他の血管組織間で多くの組織学的および生理学的類似性が与えられる場合には、同様な原理が陰茎の動脈の平滑筋細胞にも当然適用されるであろう。
ＤＮＡ配列は、当業者に既知の多くの方法によって平滑筋細胞に導入することができる。当該方法は、例えば電気穿孔、ＤＥＡＥデキストラン、一価陽イオン性リポソーム融合、多価陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ＤＮＡ被覆微少発射体ボンバードメント、in vivoでの電場の生成、複製欠損リコンビナントウイルスの注入、同種組換え、および裸出ＤＮＡの移入である。上記のＤＮＡ移入方法のいずれも組み合わせ可能であることは当業者には理解されるところである。
本発明はまた、平滑筋の緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を対象者の十分な数の平滑筋細胞に導入し発現させて陰茎の勃起を誘発することを含む、対象者で陰茎を勃起させる方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明の方法は勃起障害を軽減させるために用いられる。勃起障害は、神経原性機能不全、動脈原性機能不全および静脈閉鎖性機能不全を含む多様な疾患の他に、平滑筋の不完全な緊張低下を引き起こす他の病的状態から生じるであろう。患者は動物でもヒトでもよいが、好ましくはヒトである。
患者細胞へのＤＮＡ配列の導入は当業者に既知の方法によって実施できる。当該方法は、例えば電気穿孔、ＤＥＡＥデキストラン、陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、インビボ電場の生成、ＤＮＡ被覆微少発射体ボンバードメント、複製欠損リコンビナントウイルスの注入、同種組換え、および裸出ＤＮＡの移入である。上記のＤＮＡ移入方法のいずれも組み合わせ可能であることは当業者には理解されよう。本発明の好ましい実施態様では、ＤＮＡ移入が好ましい方法である。裸出ＤＮＡを平滑筋細胞に移入するために、本発明のリコンビナントベクター（発現のための遺伝子を含む）を滅菌水溶液（好ましくは受容者（レシピエント）の血液と等張）と混合することができる。そのような製剤は、生理学的に合致する物質（例えば塩化ナトリウム、グリシンなど）を含み、生理学的な条件に合致するように緩衝させたｐＨをもつ水に当該リコンビナントベクターを懸濁させて水溶液を生成し、さらに当該溶液を滅菌することによって調製できる。本発明の好ましい実施態様では、リコンビナントベクターは、平滑筋細胞への導入用調製物として２０−２５％蔗糖の食塩水溶液と混合される。
発現のためのＤＮＡ配列を含む本発明のリコンビナントベクターはまた、陽イオン性リポソームに取り込ませ直接患者の平滑筋細胞中に注入してもよい。本発明の好ましい実施態様では、平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列の移入は裸出ＤＮＡ移入によって実施される。
本発明はまた、（１）ウイルスの核酸またはウイルスゲノムの少なくとも一部分に対応する核酸（当該部分はＤＮＡ配列の発現を指令することができる）、および（２）当該ウイルス核酸に機能的に連結され、さらに標的細胞内で機能的な遺伝子産物として発現できる、平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むリコンビナントベクターを提供する。本発明の組換えウイルスベクターは、当業者に既知の多様なウイルス核酸から得ることができる。これらのウイルス核酸は、例えばＨＳＶ、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、セムリキフォレストウイルス、ワクシニアウイルス、および他のウイルス（ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを含む）のゲノムである。
本発明のリコンビナントベクターはまた、適切なホスト細胞内で当該ベクター構築物の発現を達成するための適切な調節成分をコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書で用いられるように、”発現”とは、当該挿入されたＤＮＡ配列をｍＲＮＡに転写し、それによって当該挿入核酸によってコードされた蛋白質の合成をもたらすことができるベクターの能力を指す。多様なエンハンサーおよびプロモーターが本発明の構築物で使用するために適していることは当業者の理解するところであろう。さらに、当該リコンビナントベクター構築物がホスト細胞に導入されたとき、平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列の適切な転写およびプロセッシングに要求される開始配列、終止配列および制御配列が当該構築物に含まれることは当業者には理解されよう。
平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列の平滑筋細胞での発現に適したベクターは当業者には周知で、以下のものが含まれる：ｐＥＴ−３ｄ（Novagen）；ｐＰｒｏＥｘ−１（Life Technologies）；ｐＦａｓｔＢａｃ１（Life Technologies）；ｐＳＦＶ（Life Technologies）；ｐｃＤＮＡＩＩ（Invitrogen）；ｐＳＬ３０１（Invitrogen）；ｐＳＥ２８０（Invitrogen）；ｐＳＥ３８０（Invitrogen）；ｐＳＥ４２０（Invitrogen）；ｐＴｒｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Invitrogen）；ｐＲＳＥＴＡ、Ｂ、Ｃ（Invitrogen）；ｐＹＥＳ２（Invitrogen）；ｐＡＣ３６０（Invitrogen）、ｐＶＬ１３９２およびｐＶｌ１３９２（Invitrogen）；ｐＣＤＭ８（Invitrogen）；ｐｃＤＮＡＩ（Invitrogen）；ｐｃＤＮＡＩ（ａｍｐ）（Invitrogen）；ｐＺｅｏＳＶ（Invitrogen）；ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）；ｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen）；ｐＲｃ／ＲＳＶ（Invitrogen）；ｐＲＥＰ４（Invitrogen）；ｐＲＥＰ７（Invitrogen）；ｐＲＥＰ８（Invitrogen）；ｐＲＥＰ９（Invitrogen）；ｐＲＥＰ１０（Invitrogen）；ｐＣＥＰ４（Invitrogen）；ｐＥＢＶＨｉｓ（Invitrogen）およびλＰｏｐ６。他のベクターも当業者の知るところであろう。
適切なプロモーターには構造性プロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘発性プロモーターが含まれるが、しかしこれらに限定されない。本発明の実施態様の１つでは、平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列の発現は、当該ＤＮＡ配列が導入された個々のベクターによって制御され作用を受ける。いくつかの真核細胞性ベクターは、ホスト細胞内で高レベルで挿入核酸を発現できるように改造されている。そのようなベクターは多数の強力なベクターの１つを利用して高レベルの発現を誘導する。真核細胞性ベクターは、ウイルス遺伝子のプロモーター・エンハンサー配列（特に腫瘍ウイルスのそれ）を利用する。本発明のこの特定の実施態様は、誘発性プロモーターを利用した当該蛋白質をコードするＤＮＡの発現調節を提供する。誘発性プロモーターの非限定的な例としてメタロチオニンプロモーターおよびマウス乳癌ウイルスプロモーターが含まれるが、しかしこれらに限定されない。平滑筋細胞でのＤＮＡ配列の発現は、ベクターに応じて細胞の増殖サイクルのある時点で特定の化合物の添加によって誘発されるであろう。本発明のリコンビナントベクターで効果的に使用できる他のプロモーターおよびエンハンサーの例には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＳＶ４０（サルウイルス４０）、ＨＳＶ（単純疱疹ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタイン＝バーウイルス）、レトロウイルス、アデノウイルスのプロモーターおよびエンハンサー、並びに平滑筋特異的プロモーターおよびエンハンサー。
本発明はさらに、平滑筋緊張力の調節に必要な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現する平滑筋細胞を提供する。本明細書で用いられるように、”外因性”とは、当該ＤＮＡ配列が器官の外部から導入されることを意味する。当該ＤＮＡ配列を含むリコンビナントベクターの平滑筋細胞への導入は、当業者に既知の方法、例えば電気穿孔、ＤＥＡＥデキストラン、陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ＤＮＡ被覆微少発射体ボンバードメント、複製欠損リコンビナントウイルスの注入、同種組換え、および裸出ＤＮＡの移入によって達成できる。上記のＤＮＡ移入方法のいずれも組み合わせ可能であることは当業者には理解されよう。
in vivoでの遺伝子治療方法について極めて重要なことは、作用を受けなければならない標的細胞の割合および、生理学的に対応する治療効果を得るために所望の細胞型のみに作用を与える比較効率である。これに関して、他のより全身的な心脈管系疾患（例えば上記に概略したようなもの）での遺伝子治療の提唱使用に較べて勃起障害の遺伝子治療の成功度が本質的に高いことを疑わせる２つの主要な理由が存在する。
海面体平滑筋細胞および動脈平滑筋細胞は、普遍的に分布している間隙接合蛋白質として知らる細胞間チャンネル集団によってin vivoおよびin vitroで相互に連結されているということは多くの記載によって証明されている事実で、そのメカニズムは図５に図示されている（G.J. Christら、Life Science, 49.24:PL195-200（1991）; G.J. Christら、Internatl. J. Impotence Res., 5.2:77-96（1993）; G.J. Christら、J. Pharmacol. ＆ Exptl. Therapeutics, 266.2:1054-65（1993）;G.J. Christら、Biophysical J., 67.3:1335-44（1994）;G.J. Christら、Urological Clinic of North America, 22.4:727-745（1995）;G.J. Christら、WorldJ. Urol.，印刷中（1997）；Christら、Circulation Res., 79:631-646（1996）;Christ ＆ Melman, Mol. Urol.，印刷中（1997））。
海綿体では、平滑筋の収縮（すなわち細胞内カルシウムレベルの上昇）は、ノルエピネフリンによるか、またはＥＴＡレセプターのエンドセリン−１活性化によるα１−アドレナリン作動性レセプターの活性化に続いて達成されるかもしれない。両方の事例でレセプターの活性化はＣａ２＋の動員をもたらす。特に、ノルエピネフリンまたはＥＴ−１によるこれらのレセプターの活性化はホスホリパーゼＣ（これは膜結合ホスファチジルイノシトール（ＰＩＰ２）をＩＰ３とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とに切断する）の活性化をもたらす。図２に示したように、ＤＡＧおよびＩＰ３の増加は、少なくとも細胞内Ｃａ２＋レベルの増加を介して最終的にその作用を発揮する。反対に、膜間Ｃａ２＋流量の減少または細胞内Ｃａ２＋の除去をもたらすいずれの生理学的事象（例えば膜の過分極）も平滑筋の緊張低下を生じるであろう。そのようにして、ＰＧＥ１はＰＧＥ１レセプターを活性化しアデニレートシクラーゼ酵素を刺激し、当該酵素は続いてＡＴＰをｃＡＭＰに変換する。ｃＡＭＰの増加は続いて蛋白質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を刺激する。また別には、平滑筋の緊張低下は、内皮またはニューロン性供給源から遊離される酸化窒素によって達成される。酸化窒素は平滑筋細胞内に拡散し、可溶性グアニレートシクラーゼ（ＧＴＰからｃＧＭＰへの変換を触媒する）を活性化する。ｃＧＭＰレベルの上昇は蛋白キナーゼＧ（ＰＫＧ）を活性化する。間隙接合、ＫチャンネルおよびＣａ２＋チャンネルに対するＰＫＡ、ＰＫＧおよびＰＫＣの作用は、標的蛋白質（間隙接合、ＫチャンネルおよびＣａ２＋チャンネル）上の固有のアミノ酸残基の燐酸化を介して仲介されると考えられる。図５は、それらの推定的作用を以下のように示している：＋は興奮性、陽性または増加性作用を、−は抑制性または陰性作用を示している。この単純化モデルは、これらの重要な第二のメッセンジャー系がどのように間隙接合、ＫおよびＣａ２＋チャンネルに影響を与え、したがってin vitroおよびin vivoで海綿体平滑筋の緊張力を調整するかを示している。
コネキシン４３はヒトの陰茎で発現されている主要なアイソフォームである。これらの細胞間チャンネルは、隣接する平滑筋細胞間の部分的な細胞質の連続性を提供し、生理学的対応イオン（Ｋ＋およびＣａ２＋）および第二のメッセンジャー分子（ＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）の細胞間交換を可能にする。このことは、海面体実質の比較的まばらな自律神経支配を考えるならば健康な男性の場合ですら極めて重要な点である。したがって、間隙接合が存在することによって、正常な陰茎勃起とともに腫脹減少のために海面体平滑筋細胞に必要な迅速で合胞体性の収縮および緊張低下反応に要求される構造的基礎が提供される。この態様では、健康な男性の場合でさえ、間隙接合の存在は、この主要な細胞間経路によって対応するニューロンシグナルで直接活性化されない平滑筋細胞を迅速に（間接的であろうとも）収縮反応または緊張低下反応に動員させることを可能にする。この仮説を立証する実験的および臨床的証拠が最近の刊行物に概略され（G.J. Christら、Circulation Res., 79:631-646（1996）;G.J. Christ, World J. Urology，印刷中（1997））、さらにこの反応を説明する数学的モデルが構築された（G.J.Christら、J. Urology, 155:620A（要約）（1996）; G.J. Christら、FASEB J., 9:A914（1995））。このことが意味する主なことは、これら間隙接合チャンネルの存在によって、海面体平滑筋の緊張力において全体的な変化を与えるためには海面体平滑筋細胞のわずかの部分のみが遺伝的に改変されればよいということがより確実になるということである。
遺伝子治療を極めて有望なものにするヒト陰茎の第二の主要な特徴は、多くの不能患者で薬理学的に誘発される勃起が認められることによって、多くのこれら患者で静脈閉鎖メカニズムは適切に機能していることが示唆されるということである。そのような患者では、勃起は、通常の海綿体内薬剤によって薬理学的に誘発され、一方問題の遺伝子を同時に注入することができるであろう。そのような場合、静脈の流出量は正常な勃起時には極めて少ないので、注入遺伝子は海綿体実質にもっぱら限定されると予想できるであろう（Carrierら、J. Urol., 42.4:468-81（1993）; Anderssonら、Physiological Reviews, 75.1:191-236（1995）;Lernerら、J. Urol., 149.5 Pt2:1246-55（1993）; Lueら、J. Urol., 137:829（1987））。このシナリオでは、全身的な脈管系の副作用の危険性は殆どないであろう。
本発明の遺伝子治療方法は、収縮刺激と緊張低下刺激間のバランスにおける比較的わずかな変化が勃起の生理学と機能における深遠な変化をもたらすことができるという事実を利用できるようにデザインされた（Lernerら、J. Urol., 149.5 Pt2:1246-55（1993）; Azadzoiら、J. Urol., 148.5:1587-91（1992）;Christら、British J. Pharmacology, 101.2:375-81（1990）;G.J. Christ, Urological Clinics of North America, 22.4:727-745（1995）; Taubら、J. Urol., 42:698（1993））。遺伝子治療のゴールは、海面体平滑筋の対応する生理学的蛋白質をコードする外因性遺伝子の発現に続く収縮刺激と緊張低下刺激間のより正常なバランスを回復させることである。これら外因性遺伝子の発現が１週間から数カ月の間維持できる場合（本明細書ではラットモデルで示されるように）、この期間中他の一切の外因性操作の非存在下で患者が”正常な”勃起を達成することを可能にさせるであろう。これは、明らかに現在利用可能な全ての治療方法を越える主要な利点であろう。
以下の考察では、勃起障害の遺伝子治療についての２つの具体的な手法が概略される。第一の事例では、ヒトのmaxi−ＫｃＤＮＡを細胞に核酸感染（トランスフェクト）することによって、平滑筋細胞の内因性ニューロン刺激に対する”感受性”が特に高められるであろう。第二の事例では、海綿体平滑筋細胞に構造的に発現される酸化窒素シンターゼｃＤＮＡ、ｂＮＯＳをトランスフェクトすることによって、勃起のためのニューロン性”駆動力”が高められる。遺伝子治療のためのこの手法は、明らかに本トランスフェクションの効率と安定性の両方に左右される。これら効率と安定性の両方についての証明は下記に提示する。
本発明は、以下の実験の詳細な説明のセクションで詳述するが、これは本発明の理解を補助するためのものであって、以下に続く請求の範囲に規定される本発明を制限するものと解してはならない。
実験の詳細な説明
Ａ．材料と方法
１．プラスミドと遺伝子
ｐＣＭＶβおよびｐｃＤＮＡ３プラスミドはインビトロゲン（Invitrogen，サンディエゴ、カリフォルニア）から購入した。ヒトmaxi−ＫｃＤＮＡ（ｈｓｌｏ）はサルコフ博士（Dr. Salkoff, Washington University School of Medicine，セントルイス、ミズーリ）（D.P. McCobbら、Am. J. Physiol., 269:H767-H777（1995））から入手した。ニューロンＮＯＳｃＤＮＡはスナイダー博士（Dr. S. Snyder, Johns Hopkins University）およびブレット博士（Dr. D. Bredt, Univ. Calif. San Francisco）（Bredtら、Nature, 351:714-8（1991））から入手した。ヒトMaxi−ＫチャンネルｃＤＮＡ（約３．９ｋｂ）（Am. J. Physiol., 269:H767-H777（1995））およびニューロンＮＯＳｃＤＮＡ（Bredt/Snyder91287795）（Bredtら、Nature, 351:714-8（1991））は両方ともｐｃＤＮＡ３ベクターのＸｈｏＩ−ＸｂａＩクローニング部位に挿入した。このベクターでは発現はＣＭＶプロモーター（Invitrogen）から外されている。１００μｇのプラスミドＤＮＡを２０％蔗糖含有滅菌ＰＢＳの２００μｌに懸濁し、麻酔ラットの海綿体中に注射した。
２．種々の技術を用いたＬａｃＺの海綿体内への遺伝子移入
裸出ＤＮＡ：２００μｌの燐酸緩衝食塩水（２０％蔗糖含有）中の１００μｇのｐＣＭＶβプラスミド（Clonetech，カリフォルニア）（ＣＭＶプロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子を含む）を３ヵ月齢のフィッシャーラットの海綿体中に（麻酔下で）注射した。１０日後海綿体組織を切除し、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。
リポソーム：１００μｌのＰＢＳ中のｐＣＭＶβプラスミド５μｇを１００μｌのリポフェクチン試薬（Gibco）と混合し、得られたリポソーム複合体（２００μｌ）を３ヵ月齢のフィッシャーラットの海綿体中に（麻酔下で）注射した。１０日後海綿体組織を切除し、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。
アデノウイルスベクター：ｌａｃＺｃＤＮＡを含むアデノウイルスベクター２００μｌ（＞１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）をショーデュリー博士（Dr. Roy Chowdhury, AECOM gene therapy core）から入手し、３ヵ月齢のフィッシャーラットの海綿体中に（麻酔下で）注射した。１０日後海綿体組織を切除し、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。
３．β−ガラクトシダーゼ活性の染色
海綿体組織を注射後いろいろの時期にラットから切り出し、４％パラホルムアルデヒド／０．１％グルタルアルデヒドで３時間固定し、Ｘ−Ｇａｌで１５時間３７℃で染色した（M. Vitadelloら、Human Gene Therapy, 5:11-8（1994））。
動物：６２匹の雄のスプラーグ・ドーリーラット（Taconic Farms, Germantown，ニューヨーク）（１０−２０週齢、体重２００−２５０ｇ）をこれらの実験で用いた。全てのラットにプリナ・ラブ（Purina lab）のゲッ歯類用飼料を随意に与え、７：００から１９：００の点灯サイクルで１匹ずつ別々の飼育箱に入れた。表１に示すようにラットを分けた。
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４．in vivo勃起実験用動物の調製
麻酔の誘発：ラットは、ペントバルビタールナトリウム（Anpro Pharmaceuticals）の腹腔内注射（３５ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔した。麻酔の維持が必要とされる場合、引続きペントバルビタール（５−１０ｍｇ／ｋｇ）を４５−６０分毎に注射することによって実験プロトコルの間（２−３時間）麻酔を維持した。
圧モニター用カニューレの外科的準備と設置：図３は完全な実験工程を示している。動物を仰臥させ、膀胱および前立腺を正中線腹腔切開によって露出させた。下下腹神経叢（すなわち骨盤神経叢または大骨盤神経節）、両側の骨盤神経および海綿体神経を前立腺の後外側で特定し、ステンレス鋼の二極性ワイヤー電極を電気刺激のためにこれら構造物の周辺に設置した。陰茎の皮膚を剥ぎ、上に重なっている座骨海綿体筋の一部を除去することによって両陰茎脚を露出させた。海綿体内圧（ＩＣＰ）をモニターするために、２３ゲージのカニューレを２５０単位／ｍｌのヘパリン溶液で満たし、ＰＥ−５０チューブ（Intramedic, Becton Dickinson）に連結し、右海綿体に挿入した。続いてこのチューブを７−０ダーマロン（Dermalon）縫合糸を用いて膜に固定し、ＩＣＰ測定時の安定性を確保した。別の２３ゲージのカニューレを１ｍｌの注射筒に連結し、海綿体内薬剤注入のために左海綿体に挿入した。全身動脈血圧（ＢＰ）を頸動脈に設置した２５ゲージカニューレを介してモニターした。
（ＢＰ）および（ＩＣＰ）のための両方のラインを圧変換器に連結した。これを順次、変換器増幅装置（ETH400CB, Sciences, Inc）を経由してデータ捕捉盤（MacLab/8e7, ADI Instruments，メリーランド）に連結した。圧測定値のリアルタイム表示および記録はマッキントッシュコンピュータ（Mac-LabソフトV3.4）で実施した。圧変換器およびＡＩＤ盤の目盛りはＨ2Ｏのｃｍであった。
海綿体神経の神経刺激と海綿体内圧の記録：海綿体神経の直接電気刺激は、多連結型クランプに連結した極細のステンレス鋼二極性フック電極を用いて実施した。各プローブは直径が０．２ｍｍで、２つの電極は１ｍｍ離れていた。単相矩形パルスをシグナル発生装置（注文誂えで組み込み式定常電圧増幅装置を有する）によって送りこんだ。刺激パラメーターは以下の通りであった：周波数は２０Ｈｚ、パルス幅は０．２２ｍｓｅｃ、持続時間は１分。電流プロトコルは以下の間隔での増加電流を用いた：０．５、１、２、４、６、８および１０ｍＡ。海綿体内圧および全身血圧の変化は各神経刺激レベルで記録した。
５．組織の調達、固定および免疫組織化学的分析
組織の回収：神経刺激実験が終了した後、遺伝子治療動物と週齢合致コントロール動物の両者の陰茎を集め、当該陰茎の遠位端にメチレンブルーで印を付けて後で遠位端と基部端を正しく認定できるようにした。全陰茎組織を直ちにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドに移して４時間２０℃で固定し、後に免疫染色のためにｐＨ７．４の３０％蔗糖を含む冷０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ；４℃で一晩またはそれ以上）中で寒冷保護を施した。当該動物の陰茎の一部分を液体窒素中で凍結し、分子生物学的実験のために−８０℃で保存した。簡単に記せば、クリオスタットで１４μｍの組織切片を作製し、この切片をスライド上で乾燥させパラフィン包埋した。このスライドを−２０℃で染色まで保存した（通常２−４週以内）。
組織学：切片の組織学的検査を実施して神経と平滑筋の特定を確認した。スライドに載せた連続切片を１０％のホルマリンで固定し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。全てのスライド調製物をツァイス（Zeiss）の顕微鏡で観察した。
酸化窒素シンターザの免疫組織化学：スライド上の組織切片をキシレンで脱パラフィン処理し、分別アルコールで再水和させ、さらに３％の過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼ活性を封鎖した。当該標本に対する抗体の非特異的反応は、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１．５％の正常ヤギ血清とともに室温で３０分保温して封鎖した。続いてスライドの水分を除き、一次抗体とともに室温で１時間保温した。用いた抗体は、脳ＮＯＳに対して作製したウサギの多クローン性（ポリクローナル）抗体（Transduction Laboratories，レキシントン、ケンタッキー）であった。１．０μｇ／ｍｌの抗体濃度が免疫染色には最適であることが判明した。抗原の結合は、ベクタステイン・エリート（VectaStain Elite）ＡＢＣキットを用いアビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ法によって検出した。着色反応は、過酸化水素で活性化したジアミノベンチジン（ジアミノベンチジンは色素原）を用いて進行させた。一次抗体の代わりにＰＢＳを用いた陰性コントロールでは染色は明瞭ではなく、本実験に用いた一次抗体が特異的であることを示した。
統計分析：全ての統計分析はスタット・ビュー（Stat-View）４．５ソフト（Abacus Concepts，バークレー、カリフォルニア）を用いて実施した。無関係のサンプルのためのtwo-tailedスチューデントｔ検定を用いて、遺伝子治療ラットと週齢合致コントロール動物間の問題のパラメーター（ＮＯＳまたはMaxi−Ｍ）についての群平均を比較した。全ての相違はｐ＜０．０５で有意であると考えられた。別に記載がなければ、全てのデータは平均値Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。
神経刺激データの分析：刺激反応曲線は、コントロールと遺伝子治療ラットの両者について段階的電流増加（１、２、４、６、８、１０ｍＡ）（Sigma Plot Mac V5.0, Jandel Scientific，サンラファエル、カリフォルニア）に対する平均全身血圧の関数（ＩＣＰ／ＢＰとして表現）として海綿体圧における段階変化を作表することによって神経刺激について作製した。
６．ラット海綿体の平滑筋細胞へのＬａｃＺの遺伝子移入
血管平滑筋細胞への遺伝子移入は、種々の技術（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、陽イオン性リポソームまたは裸出ＤＮＡ移入）を用いて達成された。in vivoでの海綿体内遺伝子移入についてこれらの技術の効率を決定するために、ＬａｃＺｃＤＮＡ（β−ガラクトシダーゼをコードする）を含む裸出ＤＮＡ、または陽イオン性リポソームに取り込ませたＤＮＡ、またはリコンビナントアデノウイルスとしてプラスミドｐＣＭβを各々３匹のラットの海綿体組織中に注射した。３つの遺伝子移入技術の全てで陽性結果が得られたが、アデノウイルス仲介遺伝子移入が最も効果的であった。これは、色素原性基質Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド）がβ−ガラクトシダーゼの活性によってその青色の分解生成物に変換されることによって全組織レベルで立証された。
β−ガラクトシダーゼを発現している細胞の相対的な数および組織学的タイプを決定するために、２００μｌの燐酸緩衝食塩水（２０％蔗糖含有）中のｐＣＭＶβプラスミド１００μｇを３ヵ月齢のフィッシャーラットの海綿体内に（麻酔下で）注射した。３０日後に、注射ラットおよびコントロールラットの海綿体を切り出し、４％パラホルムアルデヒド／０．１％グルタルアルデヒドで３時間固定し、Ｘ−Ｇａｌとともに１５分３７℃で反応させ、パラフィン包埋して切片を作製した（M. Vitadelloら、Human Gene Therapy, 5:11-8（1994））。図２に示したように、β−ガラクトシダーゼ活性はＤＮＡ注射後に極めて多数の平滑筋細胞で明瞭である。
７．ニューロンＮＯＳまたはカリウムチャンネルＭａｘｉ−ＫのｃＤＮＡの注射後の海綿体内圧の増加
ヒトMaxi−ＫチャンネルｃＤＮＡ（ｈＳｌｏ）（約３９００ヌクレオチド）（McCobb）およびニューロンＮＯＳｃＤＮＡ（約５０００ヌクレオチド）（Bredt/Snyder91287795）が、ｐｃＤＮＡ３ベクター（このベクターでは発現はサイトメガロウイルスのプロモーターから外されている）のＸｈｏＩ−Ｘｂａｌクローニング部位に挿入された。２００μｌの燐酸緩衝食塩水（２０％蔗糖含有）中の各プラスミド１００μｇを４ヶ月齢のフィッシャーラットの海綿体内に（麻酔下で）注射した。コントロールラットには擬似手術を施すか、２０％蔗糖含有ＰＢＳ２００μｌの海綿体内注射による擬似手術を施すか、または２０％蔗糖および１００μｇのｐＣＤＮＡベクターＤＮＡを含むＰＢＳ２００μｌの海綿体内注射による擬似手術を施した。基準海綿体内圧および神経刺激海綿体内圧（ＩＣＰ）を注射後２週間から４ヵ月の間測定した。検査した期間枠内では海綿体内圧において顕著な相違は認められず、各群内の全動物の結果を一緒にした。同様に種々のコントロール間で顕著な相違は認められず、全てのコントロールデータを一緒にした。
図４並びに下記の表２および３のデータは、ＮＯＳまたはMaxi−ＫｃＤＮＡのいずれかの注射は基準ＩＣＰおよび神経刺激ＩＣＰの両方を顕著に増加させた。ＩＣＰにおける基準値の段階変化の平均は、ＮＯＳ注射ラットでは約８（ＨＯ2のｃｍ）のコントロールレベルから約１４に増加し、Maxi−Ｋ注射ラットでは１３まで増加した。同様に、ＩＣＰにおける神経刺激を与えた場合の段階変化は、２−１０ｍＡの刺激範囲ではＮＯＳおよびmaxi−Ｋ注射ラットの両方で約３０％高かった。
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Ｂ．結果
カリウムチャンネルと海綿体平滑筋の機能：Ｋチャンネル機能の変化は緊張低下に対する”感受性”を高めることができるという証拠
本発明者らによる最近の実験は、カリウムチャンネルの活性化による海綿体平滑筋細胞の過分極が、海綿体平滑筋の緊張力制御のための重要なメカニズムであることを示した（F. Holmquistら、J. Urol., 144:146（1990）; G.J. Christら、J. Andrology, 14.5:319-28（1993）;S.F. Fan、J. Urol., 153:818（1995）; G.J.Christ, Urological Clinics of North America, 22.4:727-745（1995））。この観察は、ヒトの海綿体の平滑筋の持続的収縮（これは弛緩性状態（ほぼいつもの状態）の特徴である）は、電圧作動性（voltage-gated）Ｃａ2+チャンネルからの持続的な膜通過Ｃａ2+流に主として依存するという事実を反映している。海綿体平滑筋細胞のこれら電圧依存性カルシウムチャンネルの活性は、順次過分極電流によって緊密に調整され、主としてＫチャンネルによって開始され維持される。Ｋ+チャンネルのサブタイプ間では、約１８０ｐｓのＣａ2+感受性maxi−Ｋチャンネルは海綿体平滑筋細胞で最も重要なものの１つである（S.F. Fanら、J. Urol., 153:818（1995））。Ｋチャンネルの活性化に続く海綿体平滑筋細胞の膜過分極は、レセプター（例えばＰＧＥまたはＮＯ）仲介刺激および非レセプター仲介（例えばＮＯまたはｃＧＭＰ）刺激（ニューロンの他に内皮供給源に由来する）によって達成される。これらのデータは図２および表５に要約されている。
仮説的作用メカニズムは以下のようなものと考える：内因性の海綿体血管緊張低下物質（例えば酸化窒素）の遊離は、Ｋチャンネルを直接活性化させるか、または、可溶性グアニレートシクラーゼの活性化、細胞内ｃＧＭＰレベルの増加、Ｇキナーゼの活性化および細胞性蛋白質（例えばＫおよびＣａ2+チャンネルのような非接合性イオンチャンネルを含む）の燐酸化にとって二次的なＫチャンネル活性を調節すると考えられる。キナーゼ活性（ＡまたはＧのいずれか）の増加はＣａ2+およびＫチャンネルに対して反対作用を有し、前者の活性減少および後者の活性増加をもたらす。したがって、細胞内ＮＯおよび／またはｃＧＮＰレベルの上昇は、Ｋチャンネルの活性化およびＣａ2+チャンネルの抑制の両方をもたらすことができる。これら２つの反対の作用の代数的総和は、膜通過カルシウム流を顕著に減少させ、その結果海綿体平滑筋の緊張力の低下、したがって海綿体平滑筋の緊張低下をもたらすことができる。
maxi−Ｋチャンネルの活性は、生理学的に対応する海綿体平滑筋の緊張力の内因性調節物質の全て（ＰＧＥ（Zhangら、J. Urol., 155:678A（1996）; Zhaoら、J. Urol., 154:1571-1579（1995）;Zhaoら、J. Urol., 155:678A（1996））とともにＮＯ（Christら、未発表データ）を含む）によって調整されるように見えるので（図２）、それは明らかに海綿体平滑筋の緊張度の最後の重要な共通仲介物質である。この仮説と一致して、本発明者らは、このチャンネルの調節／機能の変化は、それ自体、ヒトの海綿体平滑筋において器官性勃起障害が存在する場合の重要な特徴となりうるという予備的証拠を有する（S.F. Fanら、J. Urol., 153:818（1995）; G.J. Christ, Urologic Clinics of North America, 22.4:727-745（1995）; G.J. Christら、J. Urol., 155:620A（1996））。これらの理由のいずれについても、本発明者らは、ヒトの平滑筋のmaxi−ＫチャンネルのｃＤＮＡを海綿体平滑筋細胞に比較的安定的にトランスフェクトすることが、勃起能の調節のための重要で有望な方法の代表的なものと考える。
酸化窒素および海綿体平滑筋の機能：海綿体組織で発現されるＮＯ量を増加させることによって緊張低下のための”駆動力”を高めることができる
実験によって得られた最近の豊富な実験的証拠は、動脈および海綿体平滑筋の緊張低下（したがって陰茎勃起）において酸化窒素（ＮＯ）が演じる重要な役割についての証拠を提供する（Argiolasら、Neuropharmacology, 33.11:1339-44（1994）;Burnettら、Science, 257.5068:401-3（1992）; Trigo-Rochaら、J. Physiol., 264.2Pt2:H419-22（1993）; Burnettら、Biology of Reproduction, 52.3:485-9（1995））。例えば、ヒト（Saenz de Tejadaら、New England J. Medicine, 320.16:1025-30（1989））およびウサギ（Ignarroら、Biochem. Biophys. Res. Commun.,170:843-850（1990））の海綿体筋肉片の電気刺激によって平滑筋の緊張低下が生じる。これらの反応は、酸化窒素の遊離によって仲介されると考えられる。この仮説と一致して、これらの緊張低下反応は、Ｌ−アルギニンのニトログリセリン置換類似体（これはＮＯの生成を遮断する）によって抑制することができる（Ignarroら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:843-850（1990）;Holmquistら、Acta Physio. Scand., 141:441-442（1991）;Kimら、J. Clin. Invest., 88:112-118（1991））。さらに、ウサギおよびヒトの海綿体平滑筋の緊張低下は、ＮＯを遊離させる化合物によって誘発することができる（Ignarroら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:843-850（1990）;Rajferら、New England J. Med., 326:90-94（1992）;G.J. Christら、Urological Clinics of North America, 22.4:727-745（1995））。さらにまた、ヒト海綿体の平滑筋の緊張低下のためのＮＯ依存経路の重要性もまた文献に多く示されている（Bushら、J. Urol., 147:1650-1655（1992）; Trigo-Rochaら、Neurology  ＆  Urodynamics, 13.1:71-80（1994）;Christら、Canadian J. Phys. ＆ Pharmacol., 73:714-726（1995））。
酸化窒素は、Ｌ−アルギニンのＬ−シトルリンへの酵素変換の産物として酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）酵素によって生成される。ＮＯは、コリン作動性刺激またはニューロン供給源（ＮＡＮＣ神経末端から遊離）によって内皮細胞内で生成される。後者については、ＮＯは、神経末端のシナプス小胞に蓄積されないが、要求に応じて合成される新規な神経伝達物質である。ウサギおよびラットの陰茎での生化学的および組織化学的証拠によれば、陰茎の勃起において機能するＮＯＳ酵素はｃＮＯＳ型に属することが示唆される（Burnettら、Science, 257.5068:401-3（1992））。ラットの陰茎におけるＮＯＳの神経供給源はキーストによって明らかにされ、ＮＯＳは、ラットのｃＮＯＳ抗体により免疫組織化学的に、さらにＮＡＤＰＨジアホラーゼにより組織化学的にラットおよびヒトの陰茎の自律神経に分布することが示された（J.R. Keast, Neurosciences Letter, 143:69-73（1992）; Burnettら、J. Urol., 150.1:73-6（1993）;Burnettら、Science, 257.5068:401-3（1992））。ＮＯの作用メカニズムは、以下のようであると考えられる：産生後、ＮＯ（親油性物質）は海綿体の平滑筋細胞中に（三次元的に）迅速に拡散し（Christら、Biophysical J., 67:1335-1344（1944））、ここでＮＯは可溶性グアニレートシクラーぜの活性化をもたらし、当該酵素はＧＴＰからｃＧＭＰへの変換を触媒する。このｃＧＭＰの増加は蛋白キナーゼＧを活性化し、これは、図２に示したように細胞内Ｃａ2+の減少をもたらして海綿体平滑筋の緊張低下を生じる（S. Moncada, Acta Physiol. Scand., 145:201-227（1992））。上記で述べたように、ＮＯは直接Ｋチャンネルと相互に作用して過分極および平滑筋の緊張低下を誘発する。
弛緩状態では、ＮＯＳ活性は最小であると考えられる（Ignarroら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:843-850（1990）;Rajferら、New Eng. J. Med., 326:90-94（1992）; Azadoziら、J. Urol., 147.1:220-225（1992）; Brockら、Urol., 42.3:412-417（1993）;Hellstomら、J. Urol., 151.6:1723-7（1994）;Pickardら、British J. Urol., 75.4:516-22（1995）; Carrierら、J. Urol., 153.5:1722-7（1995）; Garbanら、Am. J. Physiology, H467-H475（1995）;Burnettら、Biology of Reproduction, 52.3:485-9（1995））。海綿体組織のＮＡＤＰＨジアホラーゼの組織化学的検出の強さは、海綿体神経損傷をもつ患者で減少することが示されたが、このことはＮＯＳ活性の低下を暗示する（Brockら、Urol., 42.3:412-417（1993））。さらに、糖尿病男性の海綿体神経の緊張低下反応の障害（勃起野刺激に対して）もまたＮＯＳ生成の低下のためであることが提唱された（I. Saenz de Tejada, New Eng. J. Med., 320.16:1025-30（1989）; Taubら、Urol., 42:698（1993）; G.J. Christ, Urologics of North America, 4 22.4:727-745（1995）; Vernetら、Endocrinology, 136:5709-5717（1995））。したがって、構造的に発現される酸化窒素シンターゼｃＤＮＡの導入によって、平滑筋の緊張低下並びにより強い休止圧反応および神経刺激圧反応がもたらされることが期待される。下記で述べるように、ニューロンＮＯＳのｃＤＮＡをラットの海綿体に挿入し、統計的に有意で生理学的に相関する変化が、海綿体神経の電気刺激に対する海綿体内圧反応で認められた（表２）。
ラットモデルの選択：ラットの陰茎はヒトの陰茎と組織学的および薬理学的に類似していることが示されたので（Lessonら、Investigative Urlogy, 3.2:144-145（1965））、ラットを遺伝子治療実験のために選んだ。多くの既知のモデルの中で、ラットは、陰茎勃起のための研究（Lessonら、Investigative Urlogy, 3.2:144-145（1965）; Quinlanら、J. Urol., 141.3:656-61（1989）; Chenら、J. Urol., 147:1124-1128（1992）;Martinez-Pineiroら、European Urology, 25:62-70（1994））並びに神経原性および糖尿病性インポテンツのための研究（Rehmanら、Am. J. Physiol.,（印刷中）（1997））において優れている。
maxi−Ｋチャンネルの結果
Ｋチャンネルが海綿体平滑筋の緊張低下を調整するという証拠：ヒト海綿体でのＮＴＧ誘発およびＰＧＥ1誘発緊張低下反応を仲介する場合のmaxi−Ｋチャンネルの仮説的役割：細胞実験および単離組織実験の両方から得られた証拠によって、海綿体組織の緊張低下反応を調整するmaxi−Ｋチャンネルの重要な役割が示された。
ＮＴＧおよびmaxi−Ｋ：図１に代表的な例を示したように、ＰＥ誘発収縮反応に対する前述の作用の他に、１ｍＭのＴＥＡによるmaxi−Ｋチャンネルの選択的遮断もまたＮＴＧ誘発緊張低下反応の顕著な減弱（１００ｎＭ）をもたらす。５つの他の海綿体組織片を用いた実験は、１００ｎＭのＮＴＧによって誘発した緊張低下反応の平均値±ＳＥＭ％は２０．３±３．２％であることを示し、この値は最近の別の刊行物で決定されたように予想値５０．１％に比肩しえる。この発見は、おそらくmaxi−Ｋチャンネルの活性化もまたＮＴＧ誘発緊張低下反応の重要な成分であろうということの証拠を提供する。この仮説と一致して、培養海綿体平滑筋細胞でのパッチクランプ細胞予備実験（すなわち貼付パッチ記録モード）では、はるかに高いＮＴＧ濃度ではあるが（１００μＭ）、培養海綿体平滑筋に対してmaxi−Ｋチャンネル活性のＮＴＧ誘発増加が示された。
ＰＧＥ1およびmaxi−Ｋ：４つの記録モード全てを用いた最近の電気生理学的実験では、ＰＧＥ1は、我々が培養細胞でｃＡＭＰ生成を観察した濃度と同じ濃度範囲にわたってmaxi−Ｋチャンネルの活性の濃度依存的な増加を引き起こし、さらに予め収縮させた単離ヒト海綿体平滑筋片の緊張低下を引き起こすという証拠を提供した（Zhangら、J. Urol., 155:678A（1996））。さらに、maxi−Ｋチャンネル活性の増加は、fura−２付加培養海綿体平滑筋細胞で見られるＥＴ−１誘発細胞内カルシウムの過渡値における顕著な変化と相関する。特に、５００ｎＭのＰＧＥ1とヒト海綿体の培養平滑筋細胞を予備保温することによって、基準値（すなわち約７０ｎＭ）を越えるＥＴ−１誘発カルシウム過渡値のピーク振幅（コントロール値１６１．５±１９．５ｎＭから１０２．６±９．５ｎＭ）が顕著に減少（約４０％、５０ｎＭ）する（Zhaoら、J. Urol., 155:678A（1996））。この減少は、細胞外Ｃａ2+の非存在下（２ｍＭのＥＧＴＡ）で、または細胞をニフェジピン（Zhao ＆ Christ, J. Urol,, 154:1571-1579（1995））またはベラパミル（Christら、未発表データ）と予備保温した場合に認められる減少と区別がつかないことに留意されたい（ニフェジピンおよびベラパミルは両方ともＬ型電圧依存カルシウムチャンネルの遮断剤である）。
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最後に、ヒト海綿体平滑筋培養細胞にヒト平滑筋のmaxi−ＫｃＤＮＡ（ｈＳｌｏ）をトランスフェクトすることによって、平均休止細胞内カルシウムレベルの顕著な減少（約２５％）が、ＥＴ−１誘発細胞内カルシウム過渡値のピーク振幅の減少（約４５％）と同様に生じることを示す（表６）。前者の観察の生理学的意義は不明であるが、一方、ＥＴ−１誘発細胞内カルシウム過渡値に対するトランスフェクションの影響は、ＰＧＥ1、ニフェジピンおよびベラパミルの存在下、または細胞外カルシウムの非存在下で認められるものと極めて類似していることに留意されたい。総合すれば、これらデータは全て、大量のmaxi−Ｋチャンネルの存在に続くか（おそらくトランスフェクションの影響、ただしこれは明瞭に確立されたわけではない）、または（例えばＰＧＥ1による）細胞の活性化に続くmaxi−Ｋチャンネル活性の増加は、細胞の過分極、Ｌ型電圧依存カルシウムチャンネルを通る膜通過カルシウム流の減少、およびＥＴ−１誘発カルシウム過渡値のピーク振幅における対応する減少に付随するという仮説と全体的に一致する。さらにまた、海綿体平滑筋培養細胞で測定された細胞内カルシウム過渡値のピーク振幅は、単離海綿体組織片で測定された定常状態の収縮反応の強さを正確にたどるので（Christら、J. Urol., 153:1998-2003（1995））、これらのデータは、maxi−Ｋチャンネル活性の増加は、膜通過カルシウム流を変えることによって海綿体平滑筋の収縮反応を少なくとも部分的に調整するということの強力な証拠を提供する。収縮および緊張低下の両方の強さを調整することに関するmaxi−Ｋチャンネルの二重の役割は、maxi−Ｋによって誘発される膜通過カルシウム流抑制は、細胞内カルシウムの作動薬（ＰＥまたはＥＴ−１）誘発増加の後か、またはＰＧＥ1（おそらくＰＫＡ）またはＮＴＧ（おそらくＰＫＧ）によって誘発されるmaxi−Ｋチャンネル燐酸化の増加の後で生じるという事実を利用するということを指摘するのは重要なことである。（このような考えは、他の血管平滑筋細胞型に関する文献と一致する（下記表５および図２を参照されたい）。
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Ｋチャンネル活性の調整が勃起障害の治療に利用できる可能性についての最初のテストとして、予備実験をラットin vivoモデルで実施した。簡単に記せば、ヒト平滑筋maxi−Ｋチャンネルをコードする裸出ｃＤＮＡ（すなわちｈＳｌｏ；サルコフ博士（Dr. Salkoff, Washington University）から入手）のラット海綿体への注射は顕著な取り込みと遺伝子発現をもたらすことが判明した。このことは、maxi−ＫｃＤＮＡを注射した８ヵ月齢のスプラーグ・ドーリラットで観察される神経刺激海綿体内圧増加は、月齢合致コントロール、擬似手術動物で認められる海綿体内圧反応よりも顕著に高いという事実によって明らかであった（図３および表５）。さらにまた、この遺伝子の編入は３ヵ月以上安定を維持した（同様にコントロール動物と比較して顕著な海綿体内圧上昇によって判定）。これらin vivo実験は、本発明者らのin vitroでの観察の全てと完全に一致し、したがって海綿体平滑筋の調整にとってのＫチャンネルの重要性を証拠付ける。最後に、ヒト平滑筋maxi−Ｋチャンネルの他のサブユニットがヒト海綿体組織で存在する可能性が認識されているが（L. Salkoff，私信）、これらの実験は、勃起の生理学におけるmaxi−Ｋチャンネルの役割を評価するための合理的な出発点となるであろう。要約すれば、Ｋチャンネルが平滑筋緊張力を多様な患者集団において調整する態様を一層詳細に理解した後、収縮と緊張低下との間のバランスをより正確に変化させるために分子遺伝学の強力なツールを用いることができる可能性をこれらの実験は提供するように思える。そのような分子遺伝学のツールによって、現在の治療方法に付随する一切の制約を受けることなく、患者は彼ら自身で堅固な勃起を常に達成することができるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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