(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、該配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質であって、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを導入された形質転換体。
【請求項４】
請求項３記載の形質転換体を培養し、その培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する生成物を回収することからなる、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱安定性の優れたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤと略称する）は酸化還元酵素の１つであって、例えば、臨床及び食品の分野でアマドリ化合物の分析に有用であることが知られている。アマドリ化合物とは、タンパク質等のアミノ基を有する物質のアミノ基と、アルドース等の還元性の糖のアルデヒド基とが非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移して生成する糖化タンパクである。生体内では、グルコースとアミノ酸が結合してフルクトシルアミン誘導体が生成し、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパクが糖化された誘導体はフルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映していることから、その測定値は、糖尿病の症状の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
【０００３】
アマドリ化合物の定量は、以下の反応式で表されるように、酸化還元酵素の作用によって生成する過酸化水素の量、又は消費される酸素の量に基づいて行われる。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｏ2  ＋  Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  Ｒ2−ＮＨ2  ＋  Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
上記反応に用いうる酵素として、本出願人は、アスペルギルス属（Ａspergillus）由来の菌が産生するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤ−Ｌという）を見出し、そのＤＮＡ組換え技術による製造に成功した（特願平８−１９３３４４）。
【０００４】
【発明が解決すべき課題】
しかしながら、これら天然又は組換え技術で得られた酵素は、４０℃付近で不安定になる傾向があるために、保管、輸送に際して失活する恐れがあり、取り扱いが困難であった。また、通常、測定に先立って被検試料をプロテアーゼ処理するが、プロテアーゼを不活化するためにインヒビターを用いている。そのために、操作手順が繁雑になり、自動分析装置や測定者に過大な負担がかかるという問題点があった。また、従来法によれば、硫安沈殿、ゲルろ過及びイオン交換樹脂等のカラム精製及び透析等の様々な工程を経て酵素を精製する必要があり、時間及び手間がかかる上、十分な収率をあげることができなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、従来のＦＡＯＤ−Ｌに比較して熱安定性に優れた酵素であって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、該配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと略す）との融合タンパク質であって、ＦＡＯＤ活性を有する組換えタンパク質を提供するものである。
【０００６】
本発明の組換えタンパク質は、アスペルギルス・テレウスＧＰ１（Ａspergillus terreus GP1；FERM BP-5684）が産生するＦＡＯＤ−Ｌと、ＧＳＴとの融合タンパクであり、後述するように、ＦＡＯＤ−Ｌの酵素活性は維持したまま、極めて優れた熱安定性を示すことから、上記の従来技術における課題を解決し、例えば、プロテアーゼインヒビターを使用せず、加熱処理により、プロテアーゼを不活化することができ、実用性に優れた、有用な酵素である。しかも、精製工程が極めて簡単であり、収率が低下する恐れも少ないという利点がある。
ＧＳＴ（EC2.5.1.18）は様々な生物に見出され、立体構造研究が最も進んでいる薬物代謝酵素である（ファルマシア、360-364頁、Vol.33, No.4,1997）。本発明に用いたＧＳＴは、Schistosoma japonicumより見出されたものであって、分子量は約２６,０００である。
本発明の組換えタンパク質は、ＦＡＯＤが使用される様々な分野で、それら酵素と同様に用いることができ、特に、上記のアマドリ化合物の分析に有用である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡは、一般に入手可能なＥ.coli SOLR/pFAL2 FERM BP-5981から常法に従って単離することができる。そのようにして得られるＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡの塩基配列と推定のアミノ酸配列を配列番号１に示す。本発明の目的には、配列番号１に示した全アミノ酸配列を有するＦＡＯＤ−Ｌのみならず、所望の酵素活性を有するそのアミノ酸配列における変異体も同様に有用である。そのような変異体は、当業者既知の方法で、アミノ酸の欠失、置換及び／又は挿入により誘導することができる。
【０００８】
本発明の融合タンパク質の製造に際しては、まず、Ｅ.coli SOLR/pFAL2 FERM BP-5981からＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡを抽出する。次いで、このｃＤＮＡとＧＳＴをコードするＤＮＡとを適当な発現ベクター内で連結して融合タンパク質の発現ベクターを構築する。そのような発現ベクターは、予め、ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡとＧＳＴ ＤＮＡとを連結した後、適当な発現ベクターに挿入するか、あるいは、後述の実施例に記載のごとく、融合タンパク質としてＧＳＴ及びＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡが発現されるように、適当なＧＳＴの発現ベクター（例、ｐＧＥＸ）にＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡを挿入することにより、構築することができる。このようにして得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、適当な培地で培養すると、目的の融合タンパク質が生産される。得られた融合タンパク質の精製については、無細胞抽出液をGlutathion Sepharose 4B カラム(ファルマシア製)に吸着させ、トリス−塩酸緩衝液で洗浄した後、グルタチオンを含む同緩衝液で溶出する。なお、一連の操作は、当該技術分野で入手可能な制限酵素、宿主細胞、発現ベクターを用い、当業者既知の方法で行うことができる。
【０００９】
以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、これらは本発明を制限するものではない。以下の実施例で用いたプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って使用した。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行なった。また、酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。
【００１０】
力価測定法
生成する過酸化水素を比色法により測定する方法（速度法）
１００ｍＭ ＦＺＬ（Ｎα−Ｚ−リジン）溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを蒸留水で溶解することによって調製する。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／mlパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ  フェノール溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）１ml、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で３.０mlとする。３０℃で平衡化した後、１００ｍＭ ＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定する。生成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位とする。
【００１１】
実施例１  融合タンパク質の製造
１．ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡの抽出
Ｅ.coli SOLR/pFAL2 (FERM BP-5981）は、アスペルギルス・テレウスGP1(Aspergillus terreus GP1;FERM BP-5684）からクローニングされたＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡを有する形質転換体である。このＥ.coli SOLR/pFAL2（FERM BP-5981）を５０μｌ／mｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地５mｌで、３７℃、１０時間培養し、次いで、菌体を集菌し、以下の方法に従ってプラスミドの抽出を行った。
培養液３mｌから得た菌体をＴＥ緩衝液で洗浄する。次に、Solution Ｉ（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス−塩酸（pＨ８.０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌに菌体を懸濁したのち、１０mg／mlのリゾチーム５０μｌを加え、軽くボルテックスし、室温で５分間放置する。次に、Solution II（０.２Ｎ水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ）を加えて穏やかに撹拌し、５分間氷冷する。次に、５Ｍの酢酸カリウムを１５０μｌ加えて撹拌後、５分間氷冷する。氷冷終了後、４℃、１２,０００rpm、５分間の遠心を行い、上清を別のマイクロチューブに移す。これを２度、フェノール／クロロホルムで抽出して精製し、２倍量のエタノールを加えてエタノール沈殿させる。これを７０％エタノールで洗浄した後、減圧して乾燥させる。
【００１２】
次いで、これを５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ＲＮａｓｅを１μｌ加えて３７℃で３０分間反応させる。反応終了後、２０％ＰＥＧ／２.５Ｎ塩化ナトリウムを３０μｌ加え、穏やかにボルテックスした後、１時間氷冷する。その後、４℃、１４,０００rpm、２０分間遠心し、プラスミドを沈殿させる。そして、７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解する。
上の操作で得たプラスミドｐＦＡＬ２の制限地図を図１に示す。ｐＦＡＬ２は約４.５ｋｂのプラスミドで、lacプロモーターの下流にＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡがＥcoＲＩ〜ＸｈｏＩで挿入されている。
【００１３】
２．ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡの増幅
配列番号１に記載のＦＡＯＤ−Ｌの塩基配列のＮ−末端およびＣ−末端からＰＣＲ用のプライマーを設計した。プライマーには、プラスミドへの接続のための制限酵素部位（ＥcoＲＩ）を接続した。２つのプライマー（ｐＦＡＬ５（配列番号２）及びｐＦＡＬ３（配列番号３））を合成した。上記（１）で得たプラスミドｐＦＡＬ２とこれら２つのプライマー、及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq；宝酒造社製）を用い、供給者の指示に従って、以下の手順でＰＣＲを行った。すなわち、（９４℃,１分；６０℃,１分；７２℃,２分）からなる一連の処理を３０サイクル行った後、７２℃で２分処理してＰＣＲを行った。
この操作により、約１.５ｋｂのＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡが増幅された。そして、このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、Sephaglas Band Prep Kit (ファルマシア社製）を用いて切り出した。
【００１４】
３．ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡの、ＧＳＴ発現ベクターへのライゲーション
上の操作で得たＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡをＧＳＴ発現ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ファルマシア社製、以下、ｐＧＥＸベクターという）に接続した。このｐＧＥＸベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流には、ＧＳＴをコードするＤＮＡが挿入されている。
まず、ｐＧＥＸベクターを制限酵素ＥcoＲＩで処理し、得られた制限酵素処理物をアルカリホスファターゼ（Calfintestine；宝酒造社製）で、供給者の指示に従って処理した。次に、ＰＣＲで得たＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡを制限酵素EcoRIで処理した。
次いで、ｐＧＥＸの制限酵素処理物とＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡの制限酵素処理物とを、Ｔ４ＤＮＡ Ligase（宝酒造社製）を用い、供給者の指示に従ってライゲーションした。この操作により、ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡがｐＧＥＸベクターのＥcoＲＩ部位に挿入され、ＧＳＴ ＤＮＡとＦＡＯＤ−Ｌ ＤＮＡとが、５’側から直列に並んで挿入されているプラスミドｐＦＡＬＧ１を得た。このプラスミドｐＦＡＬＧ１の制限地図を図２に示す。
【００１５】
４．大腸菌の形質転換
上記の操作で得たプラスミドｐＦＡＬＧ１を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。大腸菌のコンピテントセルの調製は常法に従って行った。大腸菌形質転換株をアンピシリン、ＩＰＴＧを含む２×ＴＹプレートで培養し、形質転換株のみを常法通り選別した。
【００１６】
５．ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡ挿入株の選別
上で得た大腸菌を培養したプレートをろ紙に転写し、１％のリゾチーム溶液で３０℃、３０分間処理して溶菌した。次に、これを室温下で風乾し、下記のＦＡＯＤ発色液に浸漬させ、上記のＦＡＯＤ酵素活性測定法（速度法）と同様、ＦＡＯＤ−Ｌを発現させている株を発色に基づいて特定し、それに対応する株をプレーから選別した。
0004040736.tif 000002
【００１７】
６．大腸菌組組換え株でのＦＡＯＤ−Ｌ−ＧＳＴ融合タンパク質の発現
上の操作で選別した大腸菌形質転換株Ｅ.coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬＧ１をジャーファーメンターで、２８℃にて培養した。培地として５０μｌ／mｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１Ｌ）を用い、１００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液を培養開始２時間後に培地の１／１０００容量加えて発現を誘導した。培養中、２時間毎に菌体を１部集菌し、増殖（Ｇrowth；ＯＤ606）と比活性（Ｕ／mg）を調べたところ、ＩＰＴＧ添加後８時間でＦＡＯＤ生産が最大となった（図３参照）。図３中、上側の曲線（白丸）は、菌体の増殖、下側の曲線（黒丸）はＦＡＯＤの発現量（比活性）を表している。
【００１８】
７．ＦＡＯＤ−Ｌ−ＧＳＴ融合タンパク質の精製
融合タンパク質の精製については、無細胞抽出液をGlutathion Sepharose 4B カラム(ファルマシア製)に吸着させ、供給者の指示に従って、トリス−塩酸緩衝液で洗浄した後、グルタチオンを含む同緩衝液で溶出してアフィニティー精製し、１２.２Ｕ／mgの精製酵素を得た。この精製酵素をそのまま、以下の実験に用いた。なお、一連の操作は、当該技術分野で入手可能な制限酵素、宿主細胞、発現ベクターを用い、当業者既知の方法で行うことができる。
【００１９】
８．ＦＡＯＤ−Ｌ−ＧＳＴ融合タンパク質の性質
１）分子量
ＦＡＯＤ−Ｌ−ＧＳＴ融合タンパク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果、７４ｋＤａであった。これは、ＦＡＯＤ−Ｌ（分子量５１ｋＤａ）とＧＳＴ（分子量２６ｋＤａ）との融合タンパク質であることを示している。
２）基質特異性
融合タンパク質の基質特異性は、速度法で求めた場合、ＦＺＬに対して、１２.２Ｕ／mg、ＦＶ（フルクトシルバリン）に対して４.３６Ｕ／mgであり、ＦＺＬ／ＦＶは約３であった。これは、Ａ．テレウスＧＰ１から精製したＦＡＯＤ−ＬのＦＺＬ／ＦＶが約３であることと一致しており、非融合型のＦＡＯＤ−Ｌとの基質特異性における同一性が確認された。
【００２０】
３）熱安定性
熱安定性は、対象となる温度で、上記７で精製した酵素を１０分間インキュベートした後、以下の組成の反応液で、３０℃、３０分間反応させ、５０５ｎｍにおけるキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1ｃｍ-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位とした。
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そして、２０℃処理で得た数値を１００とし、２０〜６０℃における処理で得た数値を図４に表した。図４から明らかなように、ＦＡＯＤ−Ｌの場合には、５０℃、１０分間のインキュベーションでほぼ完全に失活するのに対し、本発明のＦＡＯＤ−Ｌ−ＧＳＴ融合タンパク質の場合には、ほぼ１００％の活性が維持されていた。４０℃においても、活性の相違が認められた。
【００２１】
【配列表】
【００２２】
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【００２３】
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【００２４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＦＡＬ２の制限地図。
【図２】  ＦＡＯＤ−Ｌ−ＧＳＴをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＦＡＬＧ１の制限地図。
【図３】  大腸菌形質転換株Ｅ．coli JM109/pFALG1の増殖（ＯＤ606）と比活性（Ｕ／mg）との関係を示すグラフ。図中、白丸は、菌体の増殖(OD606)、黒丸はＦＡＯＤの発現量(U/mg)を表している。
【図４】  ＦＡＯＤ−Ｌ−ＧＳＴ融合タンパク質とＦＡＯＤ−Ｌの熱安定性を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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