(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含み、区画と区画以外の部分との光透過率が異なる生体関連物質マイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取る読取装置であって、マイクロアレイに光を透過させる透過用光源と、区画に存在する蛍光物質を励起する励起用光源と、透過用光源から照射され、マイクロアレイを透過した透過光、及び励起用光源によって励起された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段と、この撮像手段によって撮像された、マイクロアレイを透過した光の画像に基づいて、マイクロアレイ上に配置された区画の位置及び／又は大きさを検出する検出手段とを含む、生体関連物質マイクロアレイ読取装置。
【請求項２】
マイクロアレイを透過した光を撮像する際の光学系と、蛍光物質から発せられた蛍光を撮像する際の光学系との差を補正する補正手段を更に含む、請求項１記載の読取装置。
【請求項３】
複数の区画を含み、区画と区画以外の部分との光透過率が異なる生体関連物質マイクロアレイに、蛍光物質が付与された検体を反応させるステップと、該マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された透過光に基づいて、区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマイクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップとを含む、生体関連物質マイクロアレイの読取方法。
【請求項４】
複数の区画を含み、区画と区画以外の部分との光透過率が異なる生体関連物質マイクロアレイに、蛍光物質が付与された検体を反応させるステップと、該マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された透過光に基づいて、区画の位置を、撮像する視野内の適切な位置に移動させるステップと、再びマイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマイクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップとを含む、生体関連物質マイクロアレイの読取方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブを固定化して配列した生体関連物質マイクロアレイに、蛍光物質を付与した検体を反応させ、励起光を照射して、励起した蛍光の量を読み取る生体関連物質マイクロアレイ読取装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子発現解析が知られている。この解析方法においては、例えば、基板の表面、凹部、凸部またはキャピラリーの内壁部あるいはキャピラリー中空部に保持された高分子ゲル状物の区画の何れかに、例えば、異なる遺伝子ペプチド、タンパク質、抗体等の生体関連物質をプローブとして数十から数万個固定化したマイクロアレイを使用する。このプローブに対して、各種特異的反応を利用することにより、プローブとして使用された物質とその生体機能発現との関係を調べることができる。このような方法は、今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論として開発されてきた。
【０００３】
プローブと検体の反応物を検出する方法においては、まず、蛍光標識した検体と、マイクロアレイにプローブとして固定化された生体関連物質とを反応させる。次いで、蛍光レーザースキャナーや蛍光顕微鏡等の蛍光測定装置により蛍光量を検出することにより、蛍光標識された検体が、どのプローブと反応物を形成したかを検出することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、検体の蛍光強度が低い場合や、マイクロアレイの配列の位置精度が低い場合には、検出された蛍光と、マイクロアレイにプローブとして固定化された生体関連物質との間の対応を正確認識することが困難であり、検体が、どのプローブとハイブリッドを形成したかを容易に正確に検出するのが困難であるという問題がある。
【０００５】
このような問題を解決するために、特許文献１にはマイクロアレイの読取方法が記載されている。この方法は、マイクロアレイにプローブとして固定化する生体関連物質の中に、検体を標識するための蛍光物質とは別の蛍光物質を予め混合しておき、プローブに混合された蛍光物質を励起して得られる蛍光を検出することによってスポットの位置を検出するものである。
【０００６】
しかしながら、この方法においては、マイクロアレイに固定化してプローブを形成する生体関連物質の中に、検体に付与する蛍光物質とは異なる蛍光物質を付与する必要がある。この生体関連物質に付与された、プローブの位置を予め検出するための蛍光物質は、本来検出すべき、検体に付与された蛍光物質の検出を行う際のノイズ源になるという問題がある。また、新たに生体関連物質に混合した蛍光物質を検出するためのフィルタ等、新たな光学系を構成する必要があるという問題もある。
【０００７】
本発明は、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いアレイにおいても、プローブとして使用する生体関連物質に新たな物質を混合することなく、生体関連物質を固定化した検出すべき区画の位置及び／又は大きさの情報を正確に取得することができるマイクロアレイの読取装置及び方法を提供することを目的としている。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−２７６０７号
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上述した課題を解決するために、本発明は、蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含む生体関連物質マイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取る読取装置であって、マイクロアレイに光を透過させる透過用光源と、区画に存在する蛍光物質を励起する励起用光源と、透過用光源から照射され、マイクロアレイを透過した光を撮像すると共に、励起用光源によって励起された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段と、この撮像手段によって撮像された、マイクロアレイを透過した光の画像に基づいて、マイクロアレイ上に配置された区画の位置及び／又は大きさを検出する検出手段と、を有することを特徴としている。
【００１０】
また、マイクロアレイの区画以外の部分が不透明に構成されていることが好ましい。
【００１１】
さらには、マイクロアレイ上に配置された区画の位置から、区画を、撮像手段の視野内に移動させる手段を有していることを特徴としている。
【００１２】
次に、このマイクロアレイの区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させ、マイクロアレイのプローブと検体の反応物を形成させる。次いで、このマイクロアレイに透過用光源から光が照射され、マイクロアレイを透過した透過光が撮像手段によって撮像される。
【００１３】
検出手段は、撮像された透過光の画像から、マイクロアレイ上の区画の位置及び／又は大きさを検出する。好ましくは、撮像された透過光の画像から、マイクロアレイ上の区画全体の位置を検出する。次いで、この検出したマイクロアレイ上の区画全体の中心位置が、撮像手段の視野中心位置と一致するように、マイクロアレイを移動する。次いで、再度マイクロアレイに透過用光源から光が照射され、マイクロアレイの区画を透過した透過光が撮像手段によって撮像され、撮像された透過光の画像から、マイクロアレイ上の区画の位置及び／又は大きさを検出する。
【００１４】
さらに、励起用光源からマイクロアレイに励起光が照射され、マイクロアレイ上に存在する蛍光物質を蛍光させる。この蛍光は、撮像手段によって撮像され、撮像された画像は、先に検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて解析される。
【００１５】
この構成により、マイクロアレイ上に形成された区画の位置及び／又は大きさを容易に認識することが可能になるので、区画を配置する位置精度が悪いマイクロアレイを使用した場合や、マイクロアレイから発せられる蛍光が微弱な場合においても、蛍光を正確に検出することができる。
【００１６】
検出手段が、撮像手段によって撮像された区画を透過した光の画像の一部分を選択し、この選択された部分の蛍光を検出するように構成するのが良い。
【００１７】
このように構成された本発明においては、透過光を撮像することによって検出された区画の画像であるスポットの一部分の画像情報を取り出し、その画像情報を基に解析を行う。この構成によれば、マイクロアレイ上の検出すべき蛍光物質以外から発せられる蛍光、例えば、マイクロアレイの区画以外の部分の材料から発せられる自家蛍光の影響を排除することができる。
【００１８】
好ましくは、検出手段は、マイクロアレイを透過した光を撮像する際の光学系と、蛍光物質から発せられた蛍光を撮像する際の光学系との差を補正する補正手段を更に有する。
【００１９】
このように構成された本発明においては、マイクロアレイを透過した光を撮像する際の光学系と、蛍光物質から発せられた蛍光を撮像する際の光学系が異なり、この光学系の相違により、画像にずれを生じるような場合においても、誤差なく区画の蛍光を検出することができる。
【００２０】
また、撮像手段はＣＣＤカメラで構成することができる。
【００２１】
さらに、透過用光源と励起用光源を、兼用としても良い。
【００２２】
また、透過用光源又は励起用光源は、発光手段と、この発光手段によって発光された光を導く光ファイババンドルと、によって構成することもできる。
【００２３】
このように構成された本発明においては、透過用光源又は励起用光源を任意の位置に配置することができ、また、光ファイバによって、光源が発する熱線がマイクロアレイに照射されるのを防止することができる。
【００２４】
さらに、透過用光源又は励起用光源を、ＬＥＤ光源によって構成することもできる。
【００２５】
このように構成された本発明においては、透過用光源又は励起用光源の寿命を長くすることができる。
【００２６】
また、本発明の生体関連物質マイクロアレイの読取方法は、蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含む生体関連物質マイクロアレイを準備するステップと、マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、このステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップと、を有することを特徴としている。
【００２７】
また、本発明の生体関連物質マイクロアレイの読取方法は、蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含む生体関連物質マイクロアレイを準備するステップと、上記マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、このステップにおいて撮像された透過光に基づいて、区画の位置を撮像する視野内の適切な位置に移動させるステップと、再びマイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、上記区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、このステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された上記区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップと、を有することを特徴としている。
【００２８】
さらには、本発明のマイクロアレイ読取方法は、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて、蛍光物質から発せられる蛍光を撮像した画像にマスクを施すことを特徴としている。
【００２９】
【発明の実施形態】
次に、添付図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。図１は、本発明の第１又は第２の実施形態によるマイクロアレイの読取装置の概略構成図である。
【００３０】
また、図２は、本実施形態によるマイクロアレイの読取装置に使用されるマイクロアレイＡの平面図である。図１に示すように、本発明の第１実施形態によるマイクロアレイ読取装置１は、マイクロアレイＡを透過させる透過光を照射する透過用光源２と、蛍光物質を励起させるための光をマイクロアレイＡに照射する励起用光源６と、を有する。更に、マイクロアレイの読取装置１は、マイクロアレイＡを透過した透過光及びマイクロアレイＡ上の検体に付与された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段であるＣＣＤカメラ４と、このＣＣＤカメラ４によって撮像された画像に基づいて、検体を解析する検出手段５と、を有する。
【００３１】
また、マイクロアレイの読取装置１は、所定の光を透過し又は反射させるダイクロックミラー８、吸収フィルタ１０、励起用フィルタ１２、及び、マイクロアレイＡに対する対物レンズ１４から構成される光学系を備えた顕微鏡１６を有する。さらに、マイクロアレイの読取装置１は、マイクロアレイＡを水平面内で所望の位置に移動させるＸＹステージ１８と、透過光光源２、ＣＣＤカメラ４、励起用光源６、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるフォーカスステージ（図示せず）、及び、ＸＹステージ１８等を制御する制御装置２０とを有する。
【００３２】
透過用光源２は、この光源が射出する光の光軸と、顕微鏡１６の光軸とが整合するように、ＸＹステージ１８の下方に配置されている。透過用光源２として、例えば、ハロゲンランプ、又はＬＥＤを複数個配列したＬＥＤアレイ光源を使用することができる。本実施形態では、透過用光源２として、ＬＥＤアレイ光源、ハロゲンランプが使用されている。
【００３３】
また、透過用光源２は、必ずしもＸＹステージ１８の下方に配置される必要はなく、ＸＹステージ１８の下方の位置以外の位置から適宜レンズ、ミラー等を介して顕微鏡１６の光軸と整合する方向に光を照射するように構成しても良い。あるいは、光源から光ファイババンドルを用いて、所定の位置まで光を導光しても良い。このように、光ファイババンドルを用いて導光した場合には、光ファイバによって光線の熱線を除去することができる。
【００３４】
また、各光ファイバの出射端をマイクロアレイＡの区画Ｃが配置された位置に合わせることにより、各区画Ｃに効率良く光を照射することができる。更に、光源にＬＥＤを使用した場合には、安定した光量、光源の長寿命化を実現することができる。
【００３５】
また、励起用光源６は、顕微鏡１６の鏡筒の側面から鏡筒内に光を射出するように配置されている。好ましくは、励起用光源６として、マイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起することができる波長成分の光を多く含む光源を選択する。本実施形態に置いては、励起用光源６として、高圧水銀ランプが使用されている。
【００３６】
励起用フィルタ１２は、励起用光源６から射出された光の中の、マイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起させることができる波長成分だけを透過し、それ以外の波長成分を遮断するように構成されている。また、吸収用フィルタ１０は、マイクロアレイＡから発せられる蛍光の波長の光を透過させ、蛍光物質を励起させる波長成分の光を透過させないように構成されている。ダイクロックミラー８は、励起用フィルタ１２を透過した、蛍光物質を励起させることができる波長成分の光を反射してマイクロアレイＡの方に差し向けるように構成され、配置されている。
【００３７】
また、このダイクロックミラー８は、マイクロアレイＡ上の蛍光物質から発せられた蛍光の波長の光を透過させるように構成されている。
【００３８】
本実施形態においては、蛍光物質としてＣｙ３を使用し、吸収フィルタ１０として、中心波長６１０ｎｍ、半値幅７５ｎｍのバンドパスフィルタが、励起用フィルタ１２として、中心波長５４５ｎｍ、半値幅３０ｎｍのバンドパスフィルタが、ダイクロックミラー８として、約５７０ｎｍ以下の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過させるミラーが使用されている。なお、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２は、使用する蛍光物質の励起波長及び蛍光物質が発する蛍光の波長に合わせて選択、構成し、複数の蛍光物質を使用する場合には、顕微鏡１６において、容易に切替え可能に構成するのが良い。
【００３９】
ＣＣＤカメラ４は、その光軸が顕微鏡１６の光軸と整合するように、顕微鏡１６の鏡筒の、対物レンズ１４の反対側端部に取り付けられている。好ましくは、ＣＣＤカメラ４として、マイクロアレイＡから発せられる微弱な蛍光を、少ないノイズで撮像することができるように、カメラの冷却機能を備えた冷却ＣＣＤカメラを使用する。本実施形態においては、１３９２×１０４０有効画素を有し、−３０℃に冷却して使用するＣＣＤカメラが用いられている。また、本実施形態においては、顕微鏡１６は落射蛍光顕微鏡であり、倍率２倍の対物レンズを使用し、ＣＣＤカメラの手前に０.５倍のレンズを挿入して、等倍の光学系を使用している。
【００４０】
検出手段５は、ＣＣＤカメラ４によって撮像された画像データを基に、種々の画像処理を行ってマイクロアレイＡから発せられる蛍光を検出するように構成されている。検出手段５は、例えば、ＣＣＤカメラ４からの画像データを入力するためのインターフェース、パーソナルコンピュータ、及び、それを作動させるためのコンピュータプログラム等によって構成することができる。
【００４１】
ＸＹステージ１８は、ＣＣＤカメラ４によってマイクロアレイＡの各部を撮像するため、マイクロアレイＡを水平面内で移動させることができるように構成されている。フォーカスステージ（図示せず）は、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるように構成されている。また、制御装置２０は、ＣＣＤカメラ４による撮像、ＸＹステージ１８の移動、透過用光源２及び励起用光源６のＯＮ／ＯＦＦ、フォーカスステージの移動等を制御する。或いは、透過用光源２又は励起用光源６として、頻繁にＯＮ／ＯＦＦを繰り返すような使用に適さない種類の光源を使用する場合には、透過用光源２又は励起用光源６の前に光を遮断するためのシャッター（図示せず）を設け、このシャッターの開閉を制御装置２０によって制御する。制御装置２０は、例えば、各装置を作動させるアクチュエータと、このアクチュエータに信号を送るパーソナルコンピュータ等によって構成し、パーソナルコンピュータは検出手段５で使用するパーソナルコンピュータと兼用することができる。
【００４２】
次に、図２を参照して、本発明の第１又は第２の実施形態によるマイクロアレイの読取装置に使用するマイクロアレイＡを説明する。図２に示すマイクロアレイＡは、区画Ｃが貫通穴により形成されており、且つ区画Ｃが複数個、整然と配列されたマイクロアレイである。そのようなマイクロアレイは、例えば、WO 00/53736号、特開2000-60554号、特開2000-78998号公報記載の方法により作成される。
【００４３】
各区画には、区画の内壁部に直接、又はゲルを介してプローブとなりうる生体関連物質が固定されている。
【００４４】
区画以外の基材部分Ｂは、区画Ｃと光透過率が異なれば、その構成に特に限定はない。また基材部分Ｂと区画Ｃは、光透過率に差があれば良く、どちらが透明であるかは問題ではない。
【００４５】
好ましくは、基材部分Ｂが不透明材料で構成されている。ここで「不透明」とは、マイクロアレイＡのプローブが固定された区画よりも光を透過しにくい性質を意味し、必ずしも、光の透過率が０％であることを意味するものではない。
【００４６】
図２では、区画Ｃとして中空円形状物を例示しているが、区画の外形は円形に限定されるものではない。区画Ｃの構造内径は１７０μｍ、外径は２２０μｍである。
【００４７】
また、図２では区画Ｃの肉厚部分及びそれを包含する樹脂製の基材部分Ｂにおいて、光透過率が１％以下になる材料で構成されているマイクロアレイを例示している。区画Ｃの肉厚部分は、カーボンブラックを２％混合したＰＭＭＡ又はポリカーボネート樹脂により成形されている。この区画Ｃは、並行に縦横５列ずつ４２０μｍピッチで等間隔に配置しており、その周囲は、カーボンブラックを２.５％混合したウレタン樹脂で包含されている。
【００４８】
次に、本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置１の作用を説明する。ここでは、実際に検体から発する蛍光の検出を説明する前に、本実施形態によるマイクロアレイの読取装置１の検出精度を検証するための検証実験について説明する。検証実験では、マイクロアレイＡの各区画Ｃに充填されたゲル状物に、予め設定した濃度で蛍光物質を直接固定化し、その蛍光物質から発せられる蛍光を検出する。
【００４９】
まず、マイクロアレイＡの各区画Ｃに充填されたゲル状物に、各々異なる濃度で蛍光物質を固定化する。この検証実験では、蛍光物質としてＣＹ３を使用した。表１は、各区画Ｃに固定化された蛍光物質の濃度を示す。
【００５０】
【表１】
0004043925.tif 000002
表１に示すように、各区画Ｃには、１から２５の番号が付されており、第１行は、左端から順に１番乃至５番の番号が付され、第２行左端が６番、以下同様に、第５行右端の２５番まで番号が付されている。各区画Ｃの中心座標及び固定化された蛍光物質濃度は、表１に示す通りである。また、各区画Ｃの中心座標及び内径の数値は、マイクロアレイＡの設計値である。
【００５１】
表２は、このように構成されたマイクロアレイＡに投影機によって光を照射し、マイクロアレイＡの各区画を透過した光のスポットの位置及びスポット径を測定した結果を示す。なお、表２の値は、５回の測定値の平均値である。
【００５２】
【表２】
0004043925.tif 000003
次に、このマイクロアレイＡを、本発明の第１実施形態によるマイクロアレイ読取装置１のＸＹステージ１８にセットし、透過用光源２の光を透過させ、透過した光をＣＣＤカメラ４によって撮像する。図３は、このようにして撮像された透過光のスポットの画像の一例を示す。このスポットの画像を構成する各画素は所定の閾値によって２値に分類され、所定の閾値よりも明るい部分がスポットの部分、所定の閾値よりも暗い部分がスポット以外の部分と認識される。次いで、図３に示したスポットの画像のスポット径を、検出手段５によって収縮させる。ここでは、各スポットの直径を約７０μｍずつ収縮させている。この画像処理には、MEDIA CYBERNETICS社製のイメージングソフトウェアであるImage-Pro PLUS（登録商標）を使用した。即ち、このソフトウェアのProcessメニューの中のFilter機能であるMorphologicalのErodeにおいて、１１×１１Circleオプションを用いて各スポットの径を７０μｍずつ収縮させた。
【００５３】
図４は、検出手段５によって画像処理し、各スポットの径を収縮させた結果の一例を示す。しかしながら、画像処理に用いるソフトウェア、画像処理方法は、任意適当なものを使用することができる。例えば、ここでは、各スポットの径を一定量ずつ縮径させているが、各スポットの径を一定割合で縮径させても良いし、スポットの中心位置から一定半径の円領域とすることも出来る。
【００５４】
表３は、図４に示す各スポットの位置及び大きさを測定した結果の一例を示す。
【００５５】
【表３】
0004043925.tif 000004
表２と表３を比較すると、各スポットの中心座標は良く一致しており、スポット径は、表３では、表２よりも約７０μｍ小さくなっていることがわかる。従って、表３のように求められた各スポットの位置及び大きさに従って、各スポットの蛍光を測定することにより、マイクロアレイＡ上の各区画Ｃの周辺部を除外し、区画Ｃの中心付近の領域について測定を行うことが可能になる。
【００５６】
次に、マイクロアレイ読取装置１のＸＹステージ１８上にセットされているマイクロアレイＡに、励起用光源６から励起光を照射し、マイクロアレイＡに配置されている各区画Ｃに充填されているゲル状物に固定化された蛍光物質からの蛍光を、ＣＣＤカメラ４によって撮像する。図５は、ＣＣＤカメラ４によって撮像された画像の一例を示す。また、図６は、図５の画像に、図４から測定された各スポットの輪郭線を重ね合わせた結果を示す。
【００５７】
図６の輪郭線の中の各画素の明るさを表すＣＣＤ読取値を平均した平均ＣＣＤ読取値ＤAVが、検出手段５によって計算される。図７は、このようにして求められた各スポットの平均ＣＣＤ読取値ＤAVと、対応するスポットに固定化されている蛍光物質濃度との関係をグラフに示したものである。ただし、縦軸の各平均ＣＣＤ読取値ＤAVは、各スポットのＣＣＤ読取値の平均値から、蛍光物質濃度０［ｎｍｏｌ／ｍｌ］、即ち、蛍光物質を固定化していない全てのスポットのＣＣＤ読取値を平均した値を夫々減じた値である。なお、縦軸の平均ＣＣＤ読取値ＤAV、横軸の蛍光物質濃度とも、対数目盛によって示されている。
【００５８】
図７に示すように、蛍光物質濃度と、平均ＣＣＤ読取値ＤAVとの関係は両対数グラフ上でほぼ直線関係になる。従って、平均ＣＣＤ読取値ＤAVから各区画Ｃのゲル状物に固定化された蛍光物質の濃度を求めることができる。
【００５９】
次に、本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置１の作用を説明する。まず、各区画Ｃにプローブを含むマイクロアレイＡを用意する。一方、解析すべき検体には蛍光物質を付与し、この検体を、マイクロアレイＡに作用させる。或る検体が、所定の構造のプローブに作用すると、プローブと検体が反応し、反応物が形成されるので、検体に付与された蛍光物質が、マイクロアレイＡの区画Ｃの中に固定される。従って、解析すべき検体とハイブリッドを形成することができる構造のプローブが固定されている区画Ｃの中にのみ蛍光物質が存在することになる。
【００６０】
マイクロアレイＡの読み取りを開始する前に、マイクロアレイの読取装置１のＸＹステージ１８の上に、均一な光の拡散板（図示せず）をセットする。次に、励起用光源６から拡散板に光を照射し、拡散板による反射光をＣＣＤカメラ４によって撮像する。撮像された拡散画像の情報は、励起用光源６の光量斑を補正するために、検出手段５に記憶させておく。ここで撮像する画像は、サンプル面における励起光の照射斑を後の工程で補正するために、励起光の照射斑を撮像する物であり、一般的に拡散板に対してピントを外した状態で撮像する。また、拡散板を用いずに、ＸＹステージ１８の上に何も置かない、つまり、サンプル面に何も存在しない状態で励起用光源６から光を照射し、その状態でＣＣＤカメラ４によって撮像する場合もある。
【００６１】
次に、マイクロアレイＡをＸＹステージ１８にセットする。ＸＹステージ１８にマイクロアレイＡをセットする時のＸＹステージ１８の位置と、マイクロアレイＡの測定を行う時のＸＹステージ１８の位置が異なる場合、ＸＹステージ１８を測定位置に移動する。
【００６２】
次いで、透過用光源２からマイクロアレイＡに光を照射する。透過用光源２から照射され、マイクロアレイＡを透過した光は、対物レンズ１４を通ってＣＣＤカメラ４によって撮像される。このとき撮像される画像は、マイクロアレイＡの寸法精度、マイクロアレイＡの区画Ｃの配列精度、マイクロアレイＡをＸＹステージ１８にセットする際の位置精度、ＸＹステージ１８の移動精度、等の要因により、例えば図９に示すように、ＣＣＤカメラ４の視野にマイクロアレイＡの区画Ｃが収まらない場合がある。ここで、図９におけるＣＣＤカメラ４の視野は、ＣＣＤカメラ４の動作速度をできるだけ速くするために、使用したマイクロアレイＡの区画Ｃの配置に合わせて画像を取り込む範囲を調整している。
【００６３】
次に、ＣＣＤカメラ４によって撮像した画像における、区画Ｃの位置、数量等の情報を基に、検出手段５において、マイクロアレイＡの区画Ｃ全体の位置を算出し、マイクロアレイＡの区画Ｃ全体がＣＣＤカメラ４によって撮像可能となるように、制御装置２０によってＸＹステージ１８を移動する。次いで、再度透過用光源２からマイクロアレイＡに光を照射する。透過用光源２から照射され、マイクロアレイＡを透過した光は、対物レンズ１４を通ってＣＣＤカメラ４によって撮像される。マイクロアレイＡの区画Ｃ全体が、ＣＣＤカメラ４の全視野内に収まらない場合には、予め設定しておいた区画Ｃの数毎に纏まった領域がＣＣＤカメラ４の視野内に収まるようにし、ＸＹステージ１８を使用して、マイクロアレイＡを順次移動させて全ての区画Ｃを撮像する。このとき、ＸＹステージ１８の移動精度等を考慮して、マイクロアレイＡを順次移動させて、全ての区画Ｃの撮像を行ってから後の蛍光の撮像を行うのではなく、区画Ｃの撮像後、ＸＹステージ１８を移動させる前に、蛍光の測定も合わせて実施することが望ましい。
【００６４】
ＣＣＤカメラ４によって撮像された透過光のスポットは、検出手段５によって画像解析され、各スポットの位置及び大きさが測定される。更に、測定されたスポットの大きさは、検出手段５によって所定量収縮処理され、この収縮されたスポットの輪郭は、検出手段５に記憶される。なお、適用によっては、透過光を撮像する際には、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び励起用フィルタ１２を、顕微鏡１６の光軸から外れるように移動させておいて良い。
【００６５】
スポットを収縮させる割合は、区画Ｃ周辺の基材部分Ｂや、区画Ｃの壁面の影響によるノイズの大きさに応じて適宜選択することができる。例えば、スポット周辺部の形状斑が大きく、プローブの固定化率がスポットの中心部と周辺部で異なる場合、或いは、基材部分Ｂ又は区画Ｃの壁面の自家蛍光が強い場合等は、収縮させる割合を大きく、即ち、区画Ｃの中心付近の画像のみを採用するようにする。一般的には、元のスポットの概略直径を３０乃至１００％程度の大きさに縮小させるのが良い。この検出手段５によって、スポット径を収縮させる手順は、上述した検証実験と同様であるので、説明を省略する。
【００６６】
また、プローブが各区画の内壁に直接固定化されているタイプのマイクロアレイ、又は、各区画の内壁部にのみゲル状物が付与されているタイプのマイクロアレイにおいては、プローブは各区画の内壁付近にのみ存在し、中心付近は空洞になる。従って、このようなマイクロアレイにおいては、区画の中心付近の透過光強度が、区画の内壁付近の透過光強度よりも更に強くなる。このタイプのマイクロアレイを読み取る場合には、スポットの内部の各画素を、第２の閾値で更に分類し、スポットの中心付近の空洞部分の画像を取り除いて後の解析を行うようにしても良い。
【００６７】
透過光のスポットを撮像した後、透過用光源２の光を遮断し、次いで、励起用光源６を点灯させ、あるいは、励起用光源６のシャッターを開放することにより、励起用光源６の励起光をマイクロアレイＡに照射する。励起用光源６から射出された光は、励起用フィルタ１２に入射し、蛍光物質の励起に必要な波長の光だけが透過される。励起用フィルタ１２を透過した励起光はダイクロックミラー８によって反射され、顕微鏡１６の対物レンズ１４の方に差し向けられる。ダイクロックミラー８によって反射された励起光は、対物レンズ１４によって集光され、マイクロアレイＡに照射される。
【００６８】
励起光をマイクロアレイＡに照射すると、マイクロアレイＡ上に存在する蛍光物質は、励起光によって励起され、励起光とは異なる波長の蛍光を発する。マイクロアレイＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１４、ダイクロックミラー８を透過して吸収用フィルタ１０に入射する。また、マイクロアレイＡによって反射され、ダイクロックミラー８へ戻った励起光の波長成分は、ダイクロックミラー８によって反射されるので、吸収用フィルタ１０には殆ど入射しない。吸収用フィルタ１０は、入射した光のうちマイクロアレイＡ上の蛍光物質から発せられた蛍光の波長成分を透過させ、励起光の波長成分の光を遮断する。吸収用フィルタ１０を透過した蛍光は、ＣＣＤカメラ４によって撮像される。
【００６９】
ＣＣＤカメラ４によって撮像された、マイクロアレイＡ上の蛍光物質から発せられた蛍光のスポット画像は、先に撮像され、検出手段５に記憶させておいた拡散画像に基づいてシェーディング補正される。即ち、マイクロアレイＡに照射された励起光の光量斑が、検出手段５によって数値的に補正される。
【００７０】
また、透過光の撮像時にダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２を顕微鏡１６の光軸から外した事による光学系有無、あるいはこれらを外さない場合でも、使用する光学系の収差によって画像の位置ずれを引き起こす場合があり、このずれを予め検出手段５に記憶させておき、それに基づいて画像取込のピント位置、蛍光画像とスポット画像の位置等を補正するのが良い。次に、先に撮像され、検出手段５に記憶させておいた透過光のスポットの輪郭の画像が、シェーディング補正された蛍光のスポット画像と重ね合わせられる。各蛍光のスポットの輪郭線内部の各画素のＣＣＤ読取値が、検出手段５によって平均され、そのスポットの平均ＣＣＤ読取値が求められる。この求められた平均ＣＣＤ読取値から、解析すべき検体が、各プローブとハイブリットを形成した量を求めることができる。
【００７１】
また、シェーディング補正された蛍光のスポット画像に対して、検出手段５に記憶させておいた透過光のスポットの輪郭によって、画像の不必要な部分をマスクすることができる。このようにしてマスクした画像は、圧縮処理によってその保存容量を少なく抑えることが可能となる。
【００７２】
本発明の第１又は第２の実施形態によるマイクロアレイの読取装置によれば、マイクロアレイ上のどの位置に区画が配置されているかを予め認識することができるので、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いマイクロアレイにおいても、検出された蛍光が、どのプローブと反応物を形成した検体から発せられたものであるかを正確に識別することができる。さらに、ＣＣＤカメラによって撮像された透過光のスポットを収縮させて、スポットの一部分の画像を採用して蛍光の解析を行うので、区画自体の自家蛍光等、蛍光物質が発する蛍光以外のノイズの影響を効果的に除去することができる。
【００７３】
上述した第１又は第２の実施形態においては、１つのマイクロアレイに対して１種類の蛍光物質が付与されていたが、１つのマイクロアレイに対して蛍光の波長が異なる複数の蛍光物質を同時に付与することもできる。この場合には、検出する蛍光の波長に合わせて、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２の組が、制御装置２０によって適宜交換されるように構成するのが良い。ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２の組を交換することによって、スポットの結像位置に微妙なずれが生じる場合には、このずれを予め測定しておき、使用したフィルタ等の組に応じてずれを補正するように構成することができる。
【００７４】
次に、図８を参照して、本発明の第３又は第４の実施形態を説明する。本発明の第３又は第４の実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０は、透過用光源と励起用光源が兼用にされている点が、上述した実施形態とは異なる。従って、ここでは、第３又は第４の実施形態が上述した実施形態と異なる点のみを説明し、同様の構成、作用、効果については説明を省略する。
【００７５】
図８は、本発明の第３又は第４の実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０の概略構成図である。図８に示すように、本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０は、マイクロアレイＡを透過させる透過光及び蛍光物質を励起させる励起光を照射する透過・励起用光源３２と、この透過・励起用光源３２の射出光にフィルタをかける励起用フィルタ３４と、を有する。更に、マイクロアレイの読取装置３０は、透過光及び蛍光を撮像するＣＣＤカメラ４と、検体を解析する検出手段５と、を有する。
【００７６】
また、マイクロアレイの読取装置３０は、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、対物レンズ１４から構成される光学系を備えた顕微鏡１６を有する。更に、マイクロアレイの読取装置３０は、マイクロアレイＡを水平面内で所望の位置に移動させるＸＹステージ１８と、透過・励起用光源３２、ＣＣＤカメラ４、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるフォーカスステージ（図示せず）、及び、ＸＹステージ１８を制御する制御装置２０とを有する。
【００７７】
本実施形態においては、透過・励起用光源３２及び励起用フィルタ３４がＸＹステージ１８の下方に配置されている。励起用フィルタ３４は、マイクロアレイＡ上に存在する蛍光物質を励起させる波長の光のみを透過するように構成されている。
【００７８】
本発明の第３の実施形態の他の構成要素は、上述した実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００７９】
次に、本発明の第４の実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０の作用を説明する。まず、マイクロアレイＡに透過光を照射する際には、励起用フィルタ３４を光軸から外し、透過・励起用光源３２からマイクロアレイＡに直接、透過用の光が照射される。透過・励起用光源３２から照射された光は、マイクロアレイＡを透過し、ＣＣＤカメラ４によって撮像される。次に、透過・励起用光源３２からマイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起させる際には、励起用フィルタ３４が光軸上に配置され、蛍光物質を励起させることができる波長の励起光が、下方からマイクロアレイＡに照射される。また、マイクロアレイＡを透過した励起光は、ダイクロックミラー８によって反射され、ＣＣＤカメラ４に入射する光軸の外へ偏向される。励起光の照射によって励起された蛍光物質から発せられた蛍光は、ダイクロックミラー８、及び、吸収用フィルタ１０を透過してＣＣＤカメラ４に入射する。以上の点以外の作用は、上述した実施形態と同様であるので、説明を省略する。
【００８０】
本実施形態によれば、透過用光源と励起用光源とを兼用にすることができる。
【００８１】
また、励起光がマイクロアレイＡの下方から照射されるので、顕微鏡１６に入射するのは、全てマイクロアレイＡの区画Ｃの部分を透過した光である。従って、第１又は第２の実施形態のように、マイクロアレイＡに照射された励起光が、マイクロアレイＡの基材部分Ｂによって反射され、その反射光が顕微鏡１６に入射することがない。これにより、検出すべき蛍光のＳ／Ｎ比を改善することができる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明のマイクロアレイの読取装置によれば、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いマイクロアレイにおいても、プローブに新たな物質を混合することなく、プローブを固定化した検出すべき区画の位置及び／又は大きさの情報を正確に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置の概略構成図である。
【図２】本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置に使用されるマイクロアレイの平面図である。
【図３】ＣＣＤカメラによって撮像されたマイクロアレイを透過する光のスポットの一例を示す図である。
【図４】図３に示した透過光のスポットを縮径させた結果の一例を示す。
【図５】ＣＣＤカメラによって撮像されたマイクロアレイから発せられる蛍光のスポットの一例を示す図である。
【図６】図５に示した蛍光のスポットに、図４に示した縮径させた透過光のスポットの輪郭を重ね合わせた結果を示す図である。
【図７】各蛍光のスポットのＣＣＤ読取値と、対応するスポットに固定化されている蛍光物質濃度との関係を示したグラフである。
【図８】本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置の概略構成図である。
【図９】ＣＣＤカメラによって撮像されたマイクロアレイを透過する光のスポットが、ＣＣＤカメラ視野に対してずれた場合の一例を示す図である。
【符号の説明】
Ａ      マイクロアレイ
Ｂ      基材部分
Ｃ      区画
１      本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置
２      透過用光源
４      ＣＣＤカメラ
５      検出手段
６      励起用光源
８      ダイクロックミラー
１０    吸収用フィルタ
１２    励起用フィルタ
１４    対物レンズ１４
１６    顕微鏡
１８    ＸＹステージ
２０    制御装置
３０    本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置
３２    透過・励起用光源
３４    励起用フィルタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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