(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｉ：
FS−Pro−Aib−Aib−Aib−Aib−Ala−Ala−Aib−βAla−Leu−Aib−βAla−Ala−Aib−βAla−Ala−Aib−Aib−Aib−Ala−Arg−ol  （Ｉ）
（式中、FSはオキソ脂肪酸基であり、Aibはアミノイソ酪酸であり、Arg−olはアルギニノールである）のペプチド。
【請求項２】
オキソ脂肪酸残基は３〜20個の炭素原子から構成される請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
オキソ脂肪酸残基は８〜15個の炭素原子から構成される請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
オキソ脂肪酸残基のオキソ基は３位置に存在する請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
オキソ脂肪酸残基は式II：
0004095116.tif 000006
の構造を有する請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
脂肪酸残基はＲコンフィギュレーションを有する請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
脂肪酸残基はＳコンフィギュレーションを有する請求項５記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の化合物を製造する方法において、スクレロデルマ・テキセンスを水性メジウム中で培養し、ついで標的化合物を単離精製することからなる方法。
【請求項９】
スクレロデルマ・テキセンスDSM 10601を使用する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
医薬として使用する請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
真菌感染症の処置用医薬を製造するための請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド少なくとも１種および医薬補助剤からなる医薬。
【請求項１３】
スクレロデルマ・テキセンスDSM 10601。
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なペプチドすなわちスクレロデルマ・テキセンス（Scleroderma texense）からのテキセノマイシン（texenomycin）類、とくにペプチドのテキセノマイシンＡおよびＢ、それらの製造方法ならびにそれらの医薬としてのとくに抗真菌剤としての使用に関する。
本発明によるテキセノマイシンは、とくにアミノ酸配列Ｉ：
FS−Pro−Aib−Aib−Aib−Aib−Ala−Ala−Aib−βAla−Leu−Aib−βAla−Ala−Aib−βAla−Ala−Aib−Aib−Aib−Ala−Arg−ol  （Ｉ）
（式中、FSはオキソ脂肪酸基であり、Aibはアミノイソ酪酸であり、Arg−olはアルギニノールである）を特徴とする。
脂肪酸残基は３〜20個好ましくは８〜15個の炭素原子から構成される。
脂肪酸残基のオキソ基は好ましくは３位置に存在する。
テキセノマイシンに相当する化合物はこれまで文献に記載されていない。最近トリコスポリンのような構造的に類似した化合物が報告されているが（T. Fujitaら、J. Antibiotics（1988）, 41, 814参照）、Aib基の数が少ないことおよびアミノ酸配列によって相違する。
本発明のペプチドの脂肪酸残基はとくに好ましくは、式II：
0004095116.tif 000002
の構造を有する。好ましいペプチド、テキセノマイシンＡおよびＢは互いに２個のカルボニル基の間に配置された炭素原子のコンフィギュレーション（ＲまたはＳコンフィギュレーション）、またはこの原子を置換するメチル基の空間的配置によってのみ相違する。
好ましいテキセノマイシンＡおよびＢは、真菌スクレロデルマ・テキセンス、好ましくはスクレロデルマ・テキセンスDSM 10601によって形成され、それらは実験式C97H170N24O23（テキセノマイシンＡ）あるいはC97H170N24O23（テキセノマイシンＢ）、280nmにおけるUV最大吸収（メタノール中において測定）および融点215〜216℃（テキセノマイシンＡ）または209℃（テキセノマイシンＢ）を有することを特徴とする。
本発明の主題はさらに、上述の化合物の製造方法を包含する。上述の化合物の製造方法は、微生物、スクレロデルマ・テキセンス（Scleroderma texense）、好ましくはスクレロデルマ・テキセンスDSM 10601を水性メジウム中で培養し、ついで標的化合物を単離精製することからなる。
微生物スクレロデルマ・テキセンスDSM 10601はブダペスト条約の規定により1996年３月20日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物・培養細胞収集機関，DSMZ, Mascheroder Weg 1b, D−38124 Brunswick）に寄託された。
株DSM 10601以外にも、それらが式Ｉのペプチドを合成できる限り、その突然変異体および変異体を使用することも可能である。このような突然変異体はそれ自体既知の様式で、物理学的方法、たとえば紫外線もしくはＸ−線のような放射線照射、または化学的突然変異誘発物質、たとえばメタンスルホン酸エチルエステル（EMS）、２−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン（MOB）もしくはＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG）によって製造することができる。
したがって、本発明はまた、スクレロデルマ・テキセンスDSM 10601ならびにその突然変異体および変異体に関する。
以下に記載する発酵条件をスクレロデルマ・テキセンスおよびその寄託された単離体DSM 10601に適用する。発酵は実験室規模（ミリリットルおよびリットル規模）または工業規模（立法メートル規模）で実施できる。
炭素源および窒素源ならびに慣用の無機塩、スクレロデルマ・テキセンスとくにスクレロデルマ・テキセンスDSM 10601を含有する栄養溶液中で式Ｉのペプチドが産生される。
好気的発酵に適当な好ましい炭素源は同化可能な炭水化物および糖アルコールたとえばグルコース、ラクトースまたはＤ−マンニトール、ならびに炭水化物含有天然産物たとえば麦芽エキスである。適当な窒素源含有栄養物にはアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびにそれらの分解産物たとえばペプトン、もしくはトリプトン、さらには肉汁エキス、粉砕された種子たとえばトウモロコシ、小麦、豆、大豆もしくは綿実、アルコール製造に際しての蒸留残留物、肉汁もしくは酵母エキス、さらにはアンモニウム塩および硝酸塩がある。栄養溶液に添加できる無機塩は、たとえばアルカリ金属、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。
スクレロデルマ・テキセンス好ましくはDSM 10601を用いる式Ｉの化合物の形成は、0．05〜５％好ましくは0.1〜２％のカゼインペプトン、0.5〜７％好ましくは0.1〜２％の肉汁ペプトン、0.1〜５％好ましくは0.5〜３％のグルコースならびに0.1〜５％好ましくは0.5〜３％のマルトース（それぞれ総栄養溶液の重量を基準とする）を含有する栄養溶液中でとくに良好に進行する。
培養は好気的に、すなわち、たとえば振盪もしくは攪拌しながら深部培養で、またはファーメンター中で、適宜、空気または酸素を導入しながら行われる。それは15〜30℃、とくに23〜28℃の温度範囲で行われる。pHはpH１〜７、有利にはpH2.5〜4.5である。真菌は、これらの条件下に100〜300時間好ましくは120〜168時間にわたって培養される。
培養は多くの段階で実施するのが有利である。すなわち、最初に液体栄養培地中で１または２以上の前培養を調製し、ついで実際の産生培地、主培養に、たとえば容量比１：10で移す。前培養はたとえば菌糸体を栄養溶液に移し、これを約100〜200時間好ましくは120〜168時間増殖させて得られる。菌糸体はたとえば、菌株を固体または液体栄養メジウムたとえば酵母−麦芽アガーまたは馬鈴薯−デキストロースアガー上、７〜40日間好ましくは10〜20日間増殖させて得ることができる。
発酵の経過は、各場合、培養液のpHまたは菌糸体の容量により、およびクロマトグラフィー法たとえば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によってモニタリングすることができる。
テキセノマイシンは菌糸体および培養ろ液の両者に存在し、通常大部分の量は培養ろ液中に見出される。したがって、ろ過または遠心分離によってろ液から細胞塊を分離するのが有利である。ろ液を凍結乾燥し、凍結乾燥物をメタノール、アセトニトリルまたは１−ブタノールのような溶媒によって抽出する。テキセノマイシンは菌糸体からも同様に抽出できる。抽出は広範のpH範囲において実施できる。pH3.0〜pH7.5の範囲が有利である。
単離の他の方法はそれ自体既知の溶液分配である。
他の精製方法には、吸着樹脂たとえばDiaion▲Ｒ▼HP−20（MitsubishiCaseiCorp., Tokyo）上、Amberlite▲Ｒ▼XAD7（Rohm and Haas, USA）上、Amberchrom▲Ｒ▼CG（Toso Haas, Philadelphia, USA）上または類似の支持体上でのクロマトグラフィーがある。多くの逆相支持体たとえば高速液体クロマトグラフィーで一般的に用いられるようなRP−18がさらに適当である。テキセノマイシンの更なる精製の可能性には、たとえばシリカゲルまたはアルミナ等のような、いわゆる直相支持体の使用がある。たとえば、クロロホルム／メタノールまたはジクロロメタン／ｎ−ブタノール混合物のような多くの溶媒が溶出に適している。
テキセノマイシンの単離のための別法には、いわゆるモルキュラーシーブたとえばFractogel▲Ｒ▼TSK HW−40、Sephadex▲Ｒ▼LH−20等の使用がある。さらに、濃縮された材料からは結晶化によってテキセノマイシンを得ることもできる。この目的では、たとえば無水または水を添加した有機溶媒およびそれらの混合物が適当である。酸たとえばトリフルオロ酢酸、硫酸、塩酸、ギ酸等の添加も同様に有利である。
テキセノマイシンは、様々なヒト病原性真菌類たとえばカンジダ・アルビカンスの増殖をMIC（最小阻止濃度）0.24μg／ml（テキセノマイシンＡ）もしくは0.49μg／ml（テキセノマイシンＢ）で阻止する。
本発明の化合物は真菌の感染の治療および予防に適している。
したがって、本発明はまた式Ｉのペプチドの医薬としての使用、とくに式Ｉのペプチド少なくとも１種および医薬補助剤からなる医薬としての使用に関する。
本発明はとくに、真菌感染の処置用医薬の製造のためのテキセノマイシンまたはそれらの誘導体の使用に関する。
実施例
１．ａ）産生株スクレロデルマ・テキセンスDSM 10601の菌糸体の調製
500mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコ中100mlの栄養溶液（１ｌの水道水中に20ｇの麦芽エキス、２ｇの酵母エキス、10ｇのグルコース、0.5ｇの（NH4）2HPO4を含有。滅菌前のpH6.0）にDSM 10601株を接種し、回転振盪器上140rpm、25℃で240時間インキュベートする。栄養溶液［馬鈴薯浸出液（200ｇの馬鈴薯のH2O 1000ml中浸出液）4.0ｇ／ｌ、20.0ｇのＤ−グルコース、滅菌前のpH5.6］を含有する500mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコに20mlの培養液体を均一に分布させ、これにさらに固化のためにアガール15ｇ／ｌを加え、傾瀉する。培養液を25℃で10〜21日間中インキュベートする。
この時間後にフラスコ内に生じた菌糸体を滅菌接種針を用いて採取し、直ちに再使用するか−４℃で水中に保存する。
１．ｂ）エルレンマイヤーフラスコ中培養または前培養産生株の調製
上記ａ）記載の栄養溶液100mlを含有する500mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコに斜面培養で増殖させた培養液またはサイズ１ccmの菌糸体片を接種し、回転振盪器上140rpm、25℃でインキュベートする。式Ｉの化合物の最大産生は約168時間後に達成される。同じ栄養液の72時間齢の深部培養液（接種量約５％）は10回の100mlファーメンターの接種に十分である。
２．式１の化合物の調製
10ｌのファーメンターを以下の条件で操作する。
カゼインペプトン    ５ｇ／ｌ
マルトース          10ｇ／ｌ
肉汁ペプトン        ５ｇ／ｌ
グルコース          10ｇ／ｌ
pH6.5               （滅菌前）
pHは２Ｎ NaOHまたはHCl水溶液を用いて調整する。
インキュベーション時間：168時間
インキュベーション温度：25℃
撹拌器速度：200rpm
通気：空気 ５ｌ／分
泡の形成は数滴のエタノール性ポリオール溶液を繰り返し添加することにより抑制することができる。最大産生は約96時間後に達成される。
３．テキセノマイシンの単離
実施例２に従って得られた培養液８ｌを遠心分離により除去し、細胞塊を凍結乾燥する。35ｇの凍結乾燥物を、各回600mlのメタノールと攪拌し、各回目の粗いろ紙を通し吸引によりろ過して洗浄する。ろ液の溶媒を除去し、水の添加後に凍結乾燥する。８ｇの凍結乾燥物をメタノールで浸出し、再度ろ過する。
４．テキセノマイシンの精製
実施例３において得られたメタノール溶液150mlをFractogel▲Ｒ▼TSK HW−40（カラム容量2.5ｌ）上メタノールを用いクロマトグラフィーに付す（流速40ml／分）。テキセノマイシンＡ含有分画を合わせ真空中で濃縮する。
濃縮された物質をアセトニトリル／メタノール中に懸濁し、セルロースフィルターを通してろ過し、水で溶媒含量30％に希釈し、Merck RP−select Ｂ上、アセトニトリル−水勾配（0.05％トリフルオロ酢酸、50〜100アセトニトリル）を用いてクロマトグラフィーに付す（カラムサイズ250×20mm，流速23ml／分）。テキセノマイシンＡを含有する分画を合わせ、真空中で濃縮し、凍結乾燥する（テキセノマイシンＡ 45mgの白色粉末）。テキセノマイシンＢはFractogel▲Ｒ▼TSK HW−40クロマトグラフィー後、テキセノマイシンＢ含有分画から同様にして得られる。
得られたテキセノマイシンの構造はNMRスペクトルによって決定した。
５．テキセノマイシンＡ＋Ｂの活性の段階希釈試験による抗真菌スペクトル
0004095116.tif 000003
１mg／ml濃度を用いた場合のテキセノマイシンＡおよびＢ活性の抗菌および抗真菌スペクトル
0004095116.tif 000004
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表わす記号：ペプチド
存在位置：1..21
他の情報：／label＝
／note＝“2-5 XaaはAib；8 XaaはAib；9 AlaはβAla；
11 XaaはAib；12 AlaはβAla；14 XaaはAib；15 Alaは
βAla；17-19 XaaはAib；21 Argはargininol”
配列：
0004095116.tif 000005