(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のＣ−末端分解産物であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１４〜３３キロダルトンの分子量を有する低分子量産物の形態の関節炎分解産物（ＬＭＷ−ＣＯＭＰ）のレベルの測定のためのアッセイであって、
(１)関節炎患者から得た体液サンプルの還元条件下でのインキュベート；
(２)当該体液サンプルと抗−ＬＭＷ−ＣＯＭＰ抗体とのインキュベート；そして
(３)当該体液サンプル中の結合抗−ＬＭＷ−ＣＯＭＰ抗体のレベルの測定
を含むアッセイ。
【請求項２】
還元条件がジチオスレイトールおよびメルカプトエタノールからなる群から選択される還元剤の溶液である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
体液を更にＬＭＷ−ＣＯＭＰを分離するための分離法に付す、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
抗−ＬＭＷ−ＣＯＭＰ抗体が配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチドおよび配列番号４のペプチドからなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項５】
体液サンプル中の結合抗−ＬＭＷ−ＣＯＭＰ抗体のレベルの測定法がウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
体液を工程(３)の前に還元剤不活性化物質にさらす、請求項１〜５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１４,０００ダルトンから３３,０００ダルトンの分子量を有し、抗−ＬＭＷ−ＣＯＭＰ抗体により認識されるタンパク質を含む、単離ＬＭＷ−ＣＯＭＰタンパク質。
【請求項８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２０,０００ダルトンの見かけの分子量を有するＬＭＷ−ＣＯＭＰに結合する抗体。
【請求項９】
分子量１４から３３キロダルトンのＬＭＷ−ＣＯＭＰの溶液を含む、体液サンプル中のＬＭＷ−ＣＯＭＰのレベルの測定用キット。
【請求項１０】
抗−ＬＭＷ−ＣＯＭＰ抗体を更に含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
(１)請求項１に従った、関節炎患者由来の体液サンプル中のＬＭＷ−ＣＯＭＰ分解産物のレベルの測定；
(２)体液サンプル中のケラタンスルフェート（ＫＳ）のレベルの測定；そして
(３)ＬＭＷ−ＣＯＭＰ対ＫＳの比率の決定
を含む、ＬＭＷ−ＣＯＭＰ分解産物対ＫＳの比率の測定のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(ＣＯＭＰ)の分解生産物である新規低分子量タンパク質フラグメント、このフラグメントに独特な抗体および関節炎状態の重症度の測定のためのこのような抗体の使用に関する。
発明の背景
軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(ＣＯＭＰ)は、軟骨の細胞外マトリックスの一部である分子量４３５,０００の５量体である。約８７,０００の各モノマーは、軟骨細胞により合成され、分泌される。ＣＯＭＰは軟骨の湿重量の約１％を構成すると考えられている。ＣＯＭＰはスロンボスポンディン遺伝子ファミリーのメンバーと構造が類似している。タイプ３反復およびＣ−末端領域が類似している。スロンボスポンディンは、ＣＯＭＰと構造が類似しているが、細胞遊走の調節および生育、増殖(血管平滑筋のような)および内皮細胞の生育阻害に対する活性を有する(Newton et al., (1994) Genomics 24:435-439)。
ＣＯＭＰの生理学的機能は知られていないが、その滑液および血清への存在が骨関節症(Sharif et a1., (1995) 34:306-310)および関節リウマチ(Forslind et a1., Brit. J. Rheumatology, (1992) 31:593-598)と関連している。滑液および血液の軟骨ターンオーバーの指標としてもまた提案されている(SaxneおよびHeinegard, D. (1992) Br. J. Rheumatology 31:583-591)。更に、高レベルのＣＯＭＰを有する間接リウマチ患者の滑液は６５キロダルトンフラグメントおよび恐らく(還元条件下で)低分子量種の痕跡量を含む(SaxneおよびHeinegard, D. (1992) Br. J. Rheumatology 31:583-591)。近年の研究は、また、骨関節症および関節リウマチの患者の軟骨および滑液が４３kDa、６７−９４kDa、１５０−２００kDaの範囲のフラグメントも含むことを証明している(Dicesare P. E. et al., (1996) J. Orthopaedic Res. 14:946-955)。
他の軟骨マトリックスタンパク質、軟骨マトリックス糖タンパク質(ＣＭＧＰ)が骨関節症のイヌから発見されているが(FifeおよびBrandt (1989) J. Clin. Invest. 84:1432-1439)、軟骨破壊の結果であるということが示されていない。米国特許第４,７７８,７６８号は、軟骨傷害とプロテオグリカンおよびフラグメントの測定値の相関を記載している。プロテオグリカンのＧ１ドメインの放出は、関節リウマチの重症度に伴って増加するが、同じ状況下でグリコサミノグリカン−富領域(ＣＳ／ＫＳドメイン)が減少する(SaxenおよびHeinegard, (1993) Arthritis Rheum. 35:385-390)。この証明は、現在まで、タンパク質のフラグメントが疾病の状態を予測できるかどうか、予期できていない。
アグレカンは軟骨に存在するプロテオグリカンである。このタンパク質はケラタンスルフェート(ＫＳ)側鎖を含む。関節炎において、アグレカン分解産物が患者の滑液で見られる。滑液および血清中のアグレカン分解産物の測定の一つの方法は、ケラタンスルフェート側鎖を認識する抗体を使用したＥＬＩＳＡによる定量である(Thonar E J-MA et al,, (1995) Acta Orthop. Scand (S266) 66:103-106)。数カ所の研究室での実験は、関節炎患者の血清ＫＳの測定の有用性を確認していない。
スロンボスポンティン(４５０kDa)は分子量１５０kDaの３つの同一のモノマーから成る高分子量粘着性糖タンパク質である。これは軟骨中で発見され、関節軟骨細胞により産生される(MillerおよびMcDevitt (1988), Biocem. Biophys. Res. Comm. 153:708-714)。今日まで、関節炎患者の滑液中のスロンボスポンディンまたはその分解産物の存在を記載した報告はない。
血清ＣＯＭＰの定量は関節リウマチおよび骨関節炎の予知値であり得る(M Sharif, Saxne T, Shepstone L, Kirwan JR, Elson CJ, Heinegard D, Dieppe PA; Br J Rheumatol 34:4, 306-10, 1995;Hansson B M, Carey D, Alini M, Ionescu M, Rosenberg LC, Poole AR, Heinegard D, Saxne T, J Clin Invest 95:1071-7, 1995)。しかしながら、血清ＣＯＭＰを定量する先のアッセイは軟骨分解が関節炎患者で進行しているか否かの測定は不可能である。
抗原性ＫＳはヒト骨関節炎の関節由来の滑液に増加した量で存在する(Shimozuru et al., Orthop. Trans. 20:419, 1995)。プロテオグリカン異化作用のこのおよび他のマーカーのレベルは、特に、関節軟骨質量の二次炎症性変化または損失が存在する関節において、この疾病の前放射線医学段階の間最高であり、経時的に減少する傾向にある(レビューのためにThonar E J-M A et al., Sports medicine & arthroscopy review:chondral injuries (編Andrish J. T) Raven Press, New York 1994:13-29参照)。これはデータの解釈を困難にする。しかしながら、この困難さは、更なるマーカーを測定し、この結果を一つのマーカー対他のマーカーの比率として報告するにより回避できる(Thonar EJ-MA et al., Acta Orthop. Scand. (Suppl 266) 66:103-106, 1995)。興味深いことに、最近の報告は、同じ患者の滑液における抗原性ＣＯＭＰ対抗原性ＫＳの比率が、軟骨巨大分子ターンオーバーの変化の追跡に有用であり得ると主張している(Peterson et al., (1997) Ann. Rheum. Disease 56:64-67)。
その滑液および／または血清の存在が関節炎(骨関節炎または関節リウマチ)のような疾病状態と相関し得る新規タンパク質またはタンパク質のフラグメント(分解産物)または異なるタンパク質またはフラグメントの比率の同定が、このような疾病の診断および処置に有用である。更に、このような新規タンパク質またはタンパク質フラグメントの検出のための新規抗体および他の分子の開発は、関節炎患者の診断および処置に慣用的に適用されるアッセイを容易に利用可能とする。関節炎の新規医薬開発のために、軟骨マトリックスにおける新規医薬の効果の評価のためのアッセイおよび処置治療のための患者の選択手段が必要である。本発明は、関節炎の進行と関連したＣＯＭＰタンパク質の新規低分子量フラグメント、これらのフラグメントに結合する抗体および、これらのフラグメントおよび他の既知のＣＯＭＰフラグメントおよびスロンボスポンディン−１(“ＴＳＰ−１”)のフラグメントの定量による関節炎疾病状態の重症度の測定のためのアッセイを見出した。我々のＣＯＭＰのカルボキシ末端への抗ペプチド抗体を使用した実験において、予測できなかったことは、この分子のカルボキシル末端由来の特異的分解産物またはこの分解産物対ＫＳの比率が診断的または予知的価値を有するということであった。ＣＯＭＰのレベルがこのＣ−末端分解産物と異なり、全分子より幾分異なっていることを反映することが示された。加えて、抗体は他の既知のＣＯＭＰフラグメントを認識することが判明した。更に、この抗ペプチド抗体は、予期せずに、ウシスロンボスポンディンのＮ−末端２０kDaフラグメントおよび完全長ヒトＴＳＰ−１を認識した。ウシおよびヒトスロンボスポンディンのＮ−末端配列が同一であるため、この抗体はヒトＴＳＰ−１のＮ−末端２０kDaフラグメントを認識することが予測される。
本発明の要約
本発明は、ＣＯＭＰのＣ−末端分解産物である新規および新規発見低分子量タンパク質フラグメントを記載する。本明細書で“LMW-COMP”と呼ぶ最初のグループは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１４−３３キロダルトンの分子量を有する。好ましくは、LMW-COMPフラグメントは約３０、２０、１８、１６または１４キロダルトンの分子量を有し、最も好ましくはLMW-COMPは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０キロダルトンの見かけの分子量を有する低分子量分解産物の優勢種である。このＣＯＭＰフラグメントは、関節炎疾病状態がより重症になるにつれ、増加した量で産生される。これらの新規発見Ｃ−末端ＣＯＭＰフラグメントは、還元状態でのみ他のＣＯＭＰ成分と分離され、従って、その分離は、ＣＯＭＰフラグメント(存在する場合)の分離が、このような還元条件下で行われるアッセイに依存する。本発明の他の局面は、この新規LMW-COMPに結合できるポリクローナルおよびモノクローナル抗体である。このLMW-COMPは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体によって、ＣＯＭＰの少なくともカルボキシ末端由来１７アミノ酸のアミノ酸ポリペプチドを認識される。これらの抗体は、ウエスタン・ブロッティングで、約６７kDaから約８０kDaおよび１５０kDaから２５０kDaの分子量を有する、ＣＯＭＰ  Ｃ−末端分解フラグメントの他のグループを検出し、ＴＳＰ−１のＮ−末端由来のスロンボスポンディンの２０kDaフラグメントである他の関節炎分解産物と交差反応もする。LMW-COMPフラグメント、６７−８０kDaおよび２２０−２５０kDa  ＣＯＭＰフラグメントおよびスロンボスポンディンフラグメントは、本明細書で集合的に“関節炎分解産物”または“ＡＤＰ”と呼ぶ。従って、“関節炎分解産物”または“ＡＤＰ”なる用語の使用は、上記の３つ総てのフラグメントであると共に、１個またはそれ以上の個々のフラグメントも意味し得る。これらのフラグメントを認識し、結合する抗体は、従って、“ＡＤＰ抗体”と呼ぶ。本発明のまた別の局面は、種々の体液、好ましくは滑液および血清におけるＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイ法である。
本発明のアッセイの局面の好ましい態様は：
(１)関節炎患者から得た体液サンプルの還元または非還元条件下でのインキュベート；
(２)体液サンプルと抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして
(３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定
を含むＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイである。
このアッセイの最も好ましい態様において、ＡＤＰはLMW-COMPフラグメントである。
所望により、体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルは、関節炎の診断および／または処置中の異なる時間での体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ交代のレベルと比較し得る。
本発明の更に別の局面は、関節炎の診断および／または処置のための、患者由来の体液サンプル、好ましくは滑液および血清サンプル中の、関節炎分解産物対ＫＳのレベルの比率の測定のための診断的アッセイを教示する。
図面の説明
図１は、ウサギ抗−Ｈ７４１抗体を使用した、異なる関節炎状態の患者の滑液のウエスタンブロット分析を示す。レーン５：中度ＲＡ；レーン４：仮性通風；レーン３：通風性関節炎；レーン２：仮性通風；レーン１、低分子量マーカー：９７.４kDa、６６.３kDa、４５kDa、３１kDa、２１.５kDa。
図２はウサギ抗−Ｈ７４１抗体を使用した、異なる関節炎状態の患者の滑液のウエスタンブロット分析を示す。レーン１、乾癬性関節炎(患者＃１９)由来の滑液の、５０倍モル過剰のペプチドＨ７４１存在下での免疫ブロッティング；レーン２、患者＃１９由来の滑液；レーン３、重症骨関節炎／関節リウマチ(サンプル＃96020)；レーン４、中度ＲＡ；レーン５、中度ＲＡ；レーン６、低分子量マーカー：９７.４kDa、６６.３kDa、４５kDa、３１kDa、２１.５kDaおよび１４.４kDa。
図３  ヒトＣＯＭＰのモノマーサブユニットの模式図：ヒトＣＯＭＰはＮ−末端ドメイン、鎖間結合領域、ＥＧＦおよびＴＳＰ様反復ドメインおよびＣ−末端ドメインから成る。Ｃ−末端ＣＯＭＰへの合成ヘプタデカペプチドが抗体製造に使用された。
図４  ウサギ抗−ヒトＣＯＭＰおよびＨ７４１におけるウサギ抗ペプチド抗体による滑液で検出される免疫反応性フラグメントの比較：滑液５マイクロリットル／レーンを、還元条件下でSDS-PAGEゲルに使用し、ニトロセルロース膜に電気泳動的にブロットし、個々のレーンを切片に切ったレーン２はＣＯＭＰに対するポリクローナル抗体を使用して分析し、レーン２は抗ペプチド抗体Ｈ７４１を使用して分析し、そしてレーン４はウサギで発生させた非関連抗体を使用して分析した。分子量マーカーの位置は左に示す。
図５  抗体Ｈ７４１を使用したリウマチ(ＲＡ)および骨関節炎患者(ＯＡ)の滑液のウエスタン分析：滑液５マイクロリットル／レーンを、還元(ａ)および非還元(Ｂ)条件下で４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。ゲルをニトロセルロース膜にブロットし、抗体７４１(２.５マイクログラム／ミリリットル)を使用して分析した。レーン１：軽度ＲＡ患者；レーン３：重症ＯＡ患者；レーン５：中度ＲＡ患者；レーン７：重症ＯＡ患者。
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＯＭＰのＣ−末端分解産物である新規および新規発見低分子量タンパク質フラグメントを記載する。タンパク質フラグメントは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１４から３３kDAの間の分子量を有するLMW-COMPフラグメントである。好ましくは、LMW-COMPフラグメントは約３０、２０、１８、１６または１４キロダルトンの分子量を有し、最も好ましくはLMW-COMPは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０キロダルトンの見かけの分子量を有する低分子量分解産物の優勢種である。このＣＯＭＰフラグメントは、関節炎状態がより重症になるにつれ、増加した量で産生される。これらの新規発見Ｃ−末端ＣＯＭＰフラグメントは、還元状態でのみ他のＣＯＭＰ成分と分離され、従って、その分離は、ＣＯＭＰフラグメント(存在する場合)の分離が、このような還元条件下で行われるアッセイに依存する。
他の態様で本発明は新規LMW-COMPへのポリクローナルおよびモノクローナル抗体を記載する。これらの抗体はまた、約６７kDaから約８０kDaおよび１５０kDaから２５０kDaの分子量を有する、ＣＯＭＰ  Ｃ−末端分解フラグメントの他のグループと交差反応し、ＴＳＰ−１のＮ−末端由来のＴＳＰ−１の２０kDaフラグメントである他の関節炎分解産物と交差反応もする。適当な体液は、関節炎患者から得られる任意の体液を含む。適当な体液の例は、滑液、血液血清および尿であり、滑液および血清が最も好ましい。滑液は最も高いレベルのＡＤＰを含む可能性が高い。関節炎患者は、医師により診断されたか、関節炎に関連する症状を有する者である。関節炎は骨関節炎および関節リウマチの両方を含む。ＡＤＰはまた外傷性関節または骨傷害の結果としての軟骨分解にも関連することが判明している。これは、骨折、軟骨骨折、関節脱臼などを含む。
ＡＤＰは、ＣＯＭＰおよび他のＣＯＭＰ分解産物から、既知の分離法を使用して単離および分離され得る。これらは、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動および選択的沈殿を含む。１４−３３キロダルトンのフラグメントの分離法は還元条件下で行うことが重要である。明らかに、LMW-COMPは少なくとも一つのジスルフィド結合をそれ自体にまたはＣＯＭＰの他の部分に有し、結合の還元はLMW-COMPを遊離し、分離および検出され得る。還元条件は、典型的に還元剤を添加する体液の溶液に関与する。適当な還元剤は、ジスルフィド結合を還元する、当分野で既知のものを含む。好ましい還元剤は、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)、β−メルカプトエタノール、システインおよびアスコルビン酸である。還元剤は、ジスルフィド結合の還元を促進するのに十分な濃度で使用し、少なくともジスルフィト結合：還元剤の１：１の比率での濃度を可能にする。典型的に、０.１−１００ｍＭの還元剤が十分であり、還元剤とのインキュベーションは約３０秒から約３０分、約２５−４５℃の温度で行う。好ましくは、インキュベーションは約５分、約３７℃で行う。体液の所望の分離の時間の還元剤への暴露の後、過剰の還元剤を、ヨードアセトアミドまたはｎ−エチルマレイミドのような還元剤不活化物質を使用して不活性化できる。この不活性化段階は、ＥＬＩＳＡアッセイを検出または測定法として使用する場合、特に重要である。還元剤不活性化物質の濃度は、先に体液に添加した還元剤の濃度より過剰であり、好ましくは約２倍以上である。従って、体液中の還元剤の濃度が１ｍＭである場合、還元剤不活性化物質の濃度は少なくとも２ｍＭである。所望により、体液は体液の粘性を減少させる物質(粘性減少剤)で処理し得る。これは、体液が滑液であり、LMW-COMPの検出がウエスタンブロッティングである場合、特に有用である。プロテアーゼ・フリー・ステレオマイセス・ヒアルロニダーゼが適当な粘性減少剤の一つであり、他は当分野で既知である。他の体液の所望の処理は、体液中のタンパク質の選択的沈殿であり、ＣＯＭＰの低分子量フラグメントを増加させる。選択的沈殿は、例えば、３０％硫酸アンモニウムまたは２０％ポリエチレングリコールを使用して行い得る。
LMW-COMPが、ＣＯＭＰおよび他のＣＯＭＰ分解産物から単離または分離されていてもまたはいなくても、LMW-COMPの測定、検出または定量は重要である。分離を行う場合、検出は純度の程度の確認を可能にする。分離を行わない場合、検出は、疾病の一つの徴候がLMW-COMPの産生である時の疾病の重症度の同定として測定されるLMW-COMPの量を可能にする。これらの抗体は６７−８０kDaフラグメントおよび１５０−２５０kDaフラグメントおよびＴＳＰ−１のＮ−末端と交差反応し、従って、“ＡＤＰ抗体”と呼ぶ。これは、先に記載のように、Ｃ−末端ＣＯＭＰおよびＮ−末端ＴＳＰ−１のアミノ酸配列が完全に異なるため、予期されないことである。それ自体既知である６７−８０キロダルトン−ＣＯＭＰフラグメントが非還元条件で優勢であり、完全長ＣＯＭＰフラグメントのＣ−末端を有し、滑液および培養したヒト骨関節炎軟骨で見られる。これは、マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)で消化したヒト軟骨を使用して、培地中の６７−８０kDaフラグメントの定量により証明される。
このように産生した抗体は、例えば、両方とも当分野で既知のウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡによるＡＤＰの検出に使用できる。還元剤への抗体の感受性のため、ＡＤＰの遊離に使用した過剰の還元剤を、抗-LMW-COMP抗体に体液をさらし、またはインキュベーションする前に、還元剤不活性化物質で不活性化することが必要であり得る。更に、ＥＬＩＳＡによるＡＤＰの測定は、免疫反応性の定量であり、測定する分子量ではないため、還元状態ではなく行うことができる。ＥＬＩＳＡは、６７−８０kDaおよび１５０−２５０kDa  ＣＯＭＰフラグメントの形成の阻害をする医薬の効果の追跡に使用し得る。驚くべきことに、６７−８０kDa  ＣＯＭＰフラグメントがセリンメタロプロテイナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼでの消化により産生されることが判明した。従って、このアッセイは、ＭＭＰおよび、インビトロおよびインビボ両方での他の望ましくない酵素の阻害剤の効果の追跡の可能性がある。以下に記載するＥＬＩＳＡアッセイは、ポリクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡと比較した場合、ＣＯＭＰ組成物の予測により感受性であり得る。加えて、このアッセイは性質および疾病重症度に依存した軟骨分解の異なる機構の可能性を示す。
ＡＤＰへの抗体は種々の方法で得られる。単離LMW-COMPは試験動物で抗体を産生するための免疫原として塩油できる。また、ＴＳＰ−１のＮ−末端２０kDaフラグメントは免疫原として使用できる。抗体をマウスで産生した場合、モノクローナル抗体を既知の方法で製造できる。更に、キメラ抗体およびヒト化抗体もまた当分野に従って製造できる。特記しない場合、動物内で産生したポリクローナル抗体を使用できる。また、完全長LMW-COMPを免疫原として使用する代わりに、Ｃ−末端ペプチド配列のようなLMW-COMPの短いセグメントを、LMW-COMPの一部に対応する配列を有する合成ペプチドとして使用できる。好ましい合成ペプチドは、好ましくはＣＯＭＰのＣ−末端由来である。好ましい合成ペプチドは完全長ＣＯＭＰの特異的残基を含むペプチドＨ７４１、およびＨ６６９である。
0004189033.tif 000002
得られる抗体は、それぞれ抗体Ｈ７４１および抗体Ｈ６６９と呼ばれ、それを産生する細胞はそれぞれハイブリドーマＨ７４１およびＨ６６９と呼ばれる。
更に好ましい合成ペプチドは、ラットＣＯＭＰのＣ−末端領域およびウシＣＯＭＰのＣ―末端領域である。
0004189033.tif 000003
得られる抗体は同様にそれぞれ抗体Hratおよび抗体Hbovと呼ばれ、それらを産生する細胞はそれぞれハイブリドーマHratおよびHbovと呼ばれる。上記のペプチドに対して産生した抗体は、ウエスタンブロッティングで全ＡＤＰフラグメントを検出することに注目することは重要である。ＣＯＭＰを認識しない抗体は、これらのＡＤＰフラグメントの検出ができなかった。これらの観察は、これらのタンパク質、ＡＤＰフラグメントが、滑液中でＣＯＭＰの分解産物であることを示す。更に、Ｃ−末端抗ペプチド抗体は、ＣＯＭＰに対するポリクローナル抗体でのウエスタン分析で認識されなかったＡＤＰフラグメントを認識することが判明した。
体液中のＡＤＰの量の測定の特に好ましい方法は、本発明のアッセイ局面である。ＡＤＰのレベルの測定のこのようなアッセイは：
関節炎患者から得た体液サンプルの還元または非還元条件下でのインキュベート；
(２)体液サンプルと抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして
(３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定
を含む。
アッセイの好ましい態様において、ＡＤＰはLMW-COMPであり、体液は滑液または血清である。還元条件を使用した事象において、還元条件は、約１ｍＭで約５分、３７℃のジチオスレイトールまたはメルカプトエタノールである。好ましい抗ＡＤＰ抗体は、ペプチドＨ７４１で感作したウサギで産生させる。結合抗−LMW-COMP抗体のレベルの好ましい測定法は、電気泳動に続くウエスタンブロッティングである。ウエスタンブロッティングを測定法として使用する場合、体液サンプルと抗−LMW-COMPとのインキュベーションを開始する前に、還元剤不活性化物質で、過剰の還元剤を不活性化することが通常望ましい。
本発明は、また、本発明のアッセイ局面を行うためのキットも含む。このようなキットは、１個またはそれ以上のLMW-COMPと約１４から約３３キロダルトンおよび／または抗−ＡＤＰ抗体の溶液または混合物を含む。キットは、体液サンプルをインキュベートするためのバイアルまたは容器、粘性減少剤、還元剤不活性化物質およびまたは分離物質も更に含み得る。
免疫アッセイは、ＣＯＭＰのＣ−末端１７アミノ酸配列(配列番号：１)に対する抗体を使用して開発し、関節炎患者由来のヒト滑液における抗原性ＣＯＭＰを定量した。疾病の異なる段階での関節炎患者由来の滑液のＣＯＭＰの抗原含量を同じ滑液中のプロテオグリカン(ＫＳ  ＥＬＩＳＡで測定)の含量と比較した場合、明白なＣＯＭＰ抗原含量／ＫＳ比率が各疾病群の患者から得られた。従って、このＣＯＭＰに対するＣ−末端由来抗体を使用したＣＯＭＰ顔料の測定は、関節炎患者の診断および追跡に有用である。
本発明の他の局面において、軟骨破壊の付加的マーカーの測定のためのアッセイを記載し、結果を一つのマーカー対他のものの比率として示す。このアッセイにおいて、ＡＤＰを上記のように測定する。軟骨のプロテオグリカンに優勢に存在するグリコサミノグリカンであるＫＳの量を次いでそれ自体既知の方法を使用して測定する(Campion, G. V. et al., ArthritisおよびRheum. 34(10):1254-1259 (1991))。次いで、ＡＤＰ対ＫＳ値の比率の測定のためにＡＤＰ値をＫＳ値と比較する。この比率は関節炎状態の段階の指標であり、軟骨保護的治療の一つの目標はＡＤＰ／ＫＳの比率の増加の防止である。好ましい態様において、数個の体液サンプルを、ＣＯＭＰおよびLMW-COMPのレベルおよびその中のＫＳに関してアッセイし、各々の平均値を取る。平均値を次いでこれらのフラグメントと他のものの比率の測定に使用する。
本発明は、関節炎疾病の予知、診断および処置におけるＡＤＰの測定に有用である。関節炎状態の重症度の測定として、本発明は医師の処置および関節炎の処置における医薬の投与の最適化を可能にする。処置の前または初期のＡＤＰのレベルと処置中または後のレベルの比較により、医師は処置の有効性の追跡および医薬の投与の調節または他の処置が可能となる。本発明はまた経時的にＡＤＰのレベルを追跡することによる関節炎状態の段階の診断にも使用できる。ＡＤＰレベルの変化は、関節炎状態が悪化、快方または安定であるかを支持できる。この情報は、計画および適用する処置の良好な経過もまた可能とし得る。
本発明のＡＤＰは、関節炎状態の診断の分子マーカーとして有用である。例えば、単離LMW-COMPフラグメントは、サンプル中のＣＯＭＰフラグメントの分散の指標として電気泳動ゲルまたはゲル濾過カラムでサンプル中のＡＤＰと並行に動き得る。この場合、サンプルは体液サンプルであり得、または細胞または組織培養、特にＣＯＭＰを産生する細胞または組織培養(例えば、軟骨細胞など)由来のものであり得る。
本明細書に引用の総ての文献は、引用して本明細書に包含させる。
実施例
実施例は、本発明の具体的な実施態様を説明するために提供するものであって、いかにしても本発明を限定するものと解釈されるものではない。
実施例１
ＣＯＭＰのＣ−末端領域由来の合成ペプチドに対する抗ペプチド抗体の製造
ヒトＣＯＭＰポリペプチド中のＣys741-Ａsn-Ａsp-Ｔhr-Ｉle-Ｐro-Ｇlu-Ａsp-Ｔyr-Ｇlu-Ｔhr-Ｈis-Ｇln-Ｌeu-Ａrg-Ｇln-Ａla757-ＣＯＯＨ(配列番号１)(Ｈ７４１)で始まる残基に相当する配列を持つ合成ペプチドそれぞれを、Ｎ−末端システインを介してカサガイ(Keyhole limpet)ヘモシアニンに結合させ、既に確立されている方法(Briand et al., (1985) J. Immunol. Methods 78: 59-69)を用いてウサギ中で抗体を調製した。セファロース−ペプチドアフィニティーカラムを用いて抗体をアフィニティー精製した。ヒトＣＯＭＰ Ｌys669-Ａsp-Ｐro-Ａrg-Ａsn-Ｖal-Ｇly-Ｔrp-Ｌys-Ａsp-Ｌys-Ｌys-Ｓer-Ｔyr683-ＣＯＮＨ２(配列番号２)(Ｈ６６９)の第２の合成ペプチドをグルタルアルデヒド法(Briand et al., (1985) J. Immunol. Methods 78: 59-69)を介してＫＬＨに結合させ、ウサギ抗体を上記のとおり調製した。
モノクローナル抗体は、確立された方法(Kohler and Milstein, (1975) Nature 256: 495-497; Yelton and Sharff (1981) Ann. Rev. Biochem. 50: 657-680)に従い、Ｈ７４１1およびＨ６６９ペプチドを用いて調製する。得られた抗体はそれぞれ抗体Ｈ７４１および抗体Ｈ６６９と呼び、これらの抗体を産生する細胞はそれぞれハイブリドーマＨ７４１およびＨ６６９と呼ぶ。更に、キメラ抗体およびヒト化抗体も当業者なら作成できる。
実施例２
ＣＯＭＰの分解産物としてのＣＯＭＰの低分子量フラグメントの同定
ストレプトマイセス処理した滑液から取ったヒアルロニダーゼ１０μlを、１０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳ試料緩衝液１０μlと混合した。試料を４分間煮沸し、１５μlを１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。電気泳動後、タンパク質を電気泳動(１００ボルト、４℃で２時間)によりニトロセルロース膜上へ移した。ニトロセルロース膜を１％酢酸中、０.２％ ponesau Ｓレッド染料(Sigma Chemical, St. Louis, Missouri)で染色して、タンパク質マーカーを可視化した。マーカーを緑色ペンシルでマークし、ブロットをＰＢＳで十分に洗浄し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡで４℃で１８時間ブロックした。実施例３に記載のように、ブロットをウサギ抗体Ｈ７４１で展開させた。図１および図２は、みかけの分子量約３０、２０、１８、１６および１４キロダルトンを持つ様々なＬＭＷ−ＣＯＭＰフラグメントが得られたことを示す。最も優勢な種は、分子量約２０キロダルトンを持つと思われる。
実施例３
ウェスタン・イムノブロッティングによるＣＯＭＰフラグメントについてのヒト滑液の分析
ヒト滑液をＥＤＴＡ中に集め、血清を血漿から調製し、使用するまで凍結貯蔵した。ウェスタン・ブロット分析用に、滑液を薬品イソプロパン中、５６℃で２時間、１０mg/mlＰＭＳＦ(フェニルメタンスルホン酸)１μlの存在下でヒアルロニダーゼ(Saxne and Heinegard, (1992) Br. J. Rheumatol. 31: 583-591)処理し、使用するまで凍結貯蔵した。ＥＬＩＳＡアッセイ用に、滑液または血清を２mＭヨードアセトアミド(Aldrich Chem.)または２mＭＮ−エチルマレイミド(Aldrich Chem.)で処理する。滑液または血清を３０％硫酸アンモニウムまたは２０％ＰＥＧで選択的に沈殿させ、ＣＯＭＰの低分子量フラグメントを豊富化させ、次いで、−２０℃で貯蔵した。
尿を集め、遠心し、使用するまで凍結貯蔵した。
ヒト滑液２０マイクロリットルを１０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥ充填緩衝液(NOVEX, San Diego, CA)と１：１に混合した。試料を４分間煮沸し、１４％または４−１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−Ｇlyゲル(Novex, CA)上に１レーン当り１５mlずつ入れた。これらの試料の別のセットも、非還元条件での分析用に準備した。分子量マーカーは、未知の分子量の位置を特定するために使用した。電気泳動後、試料を電気泳動によりニトロセルロース紙上に移した。この紙を、１０mＭリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、pＨ７.５(ＰＢＳ)中、４℃で１８時間、２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)で処理した。
このニトロセルロース紙をＰＢＳ(１０mＭリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ ＮaＣl、pＨ７.２)で濯いだ。アフィニティー精製抗体５ml(ストック溶液中で濃縮した３.６mg/mlタンパク質)をＥＬＩＳＡ希釈緩衝液(２０mＭトリス、０.１５Ｍ ＮaＣl、０.１％ツイーン-２０、０.１％チメルソル(thimersol)、０.１％ウシ血清アルブミン)にて７mlに希釈し、この溶液をニトロセルロース膜上に塗った。室温で１時間後、膜をアルブミンなしのＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で４回(５分/洗浄)洗浄した。次いで、この膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma Immunochemicals, USA)にコンジュゲートしたウサギＩｇＧに対するモノクローナル抗体１mgと共に、ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液１ml中、室温で１時間インキュベーションした。この膜をアルブミンなしのＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で５回、リン酸緩衝塩水、ｐＨ７.５で２回洗浄した。次いで、結合抗体をＥＣＬまたはＥＣＦ基質(Amersham Co.)を用いて検出した。分子動力学濃度計(Molecular Dynamics densitometer)(Sunnyvale, CA)を用いてフラグメントを定量した。次いで、同じニトロセルロース膜をＴＭＢ(Promega, Madison, WI)基質を用いて可視化した。
実施例４
ＥＬＩＳＡアッセイによるＣＯＭＰ断片化の定量
幾つかのＥＬＩＳＡ技術を用いて、ＣＯＭＰタンパク質の断片化を測定する。
１.競合ＥＬＩＳＡアッセイ
９６-ウェルマイクロタイタープレートをＰＢＳ中５０ng/mlの抗原(Ｎ−末端システインを持たない合成ペプチドＨ７４１)０.１ml/ウェルで４℃で４８ないし７２時間コーティングした。ウェルをＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)３００μl/ウェルで室温(ＲＴ)で１.５時間ブロックした。ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液(０.１５Ｍ ＮaＣl、０.１％ツイーン２０、０.１％チメルソル含有２０ｍＭトリス、ｐＨ７.５)で２回洗浄し、各ウェルに、アッセイ緩衝液(０.１％ＢＳＡ含有ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液)で１：１０、１：２０または１：４０に希釈した体液(滑液、血清または尿)５０μlを加え、次いで、ウサギ抗ＣＯＭＰペプチド抗体５０μl/ウェルをアッセイ緩衝液中０.７μg/mlで加えた。体液中の抗原物質の濃度を見積もるために、標準(既知濃度の抗原溶液)を用いて標準曲線を作った。この標準は、アッセイ緩衝液中で、最終濃度１.５ｎＭ、４.６ｎＭ、１１.５ｎＭ、３４ｎＭ、４６ｎＭ、１１５ｎＭおよび４６３ｎＭになるように調製した。次いで、５０μl/ウェルを加え、次いで、ウサギ抗ＣＯＭＰペプチド抗体５０μl/ウェルと混合することにより、二重にアッセイした。全ての試料、標準および滑液試料をＲＴで２時間インキュベーションし、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液中、ストック溶液で１：３０００に希釈して調製したアルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体(Calbiochem, San Diego, CA)１００μl/ウェルを添加した。ＲＴで１時間後、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、結合抗体をｐ−ニトロフェニルホスフェート基質溶液(Sigma, St. Louis, MO)１００μl/ウェルを添加し、光学密度(ＯＤ)を４０５nmで測定することにより検出した。方程式ｙ＝(Ａ−Ｄ)/(１＋(ｘ/Ｃ)B)＋Ｄ、ここで、ｙ＝ＯＤ405nm、ｘ＝ｎＭ Ｈ７４１の４−パラメーターロジスティック曲線を用いて、標準曲線を得た。次いで、滑液中の抗原濃度を、マッキントッシュコンピューターにつなげたモレキュラー・デバイス・マイクロプレート・リーダーでのグラフを用いて外挿した。
結果：
Ｈ７４１ ＣＯＭＰ抗原は、関節炎患者の幾つかの滑液で、うまく定量された。下記の表１は、その事実を要約したものである。
0004189033.tif 000004
このデータは、明らかに、このＥＬＩＳＡアッセイにより様々な病状進行段階の患者におけるＣＯＭＰフラグメント間の量的相違が同定されることを示している。
２.サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ：
マイクロタイタープレートは、冷所中１８時間、ウサギ抗ペプチドＨ７４１抗体１μg/ウェルでコーティングする。ウェルは、ＰＢＳ中２％ＢＳＡ３００mlで室温で２時間ブロックする。ヒト滑液または血清または尿を０.１％ＢＳＡ含有ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液(２０ｍＭトリス、０.１５ＭＮａＣｌ、０.１％ツイーン２０、０.１％チメルソル)で希釈したもの数種を調製する。その１００μlをマイクロタイタープレートに加え、室温で１時間インキュベーションする。試料をＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄(４回)する。ヒトＣＯＭＰまたはペプチドＨ６６９に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、あるいは、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせた６７−８０ｋＤａの単離ＣＯＭＰフラグメントに対する抗体１００μlを、１μg/ウェルでウェルに加え、室温で１時間インキュベーションする。後に、ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、結合抗体を冒頭に記載したようにして定量する。分子量約２０ｋＤａの精製ＣＯＭＰ分解産物を用いた標準曲線を、未知の内容物を定量するのに使用する。
ヒト滑液または血清は、既に公開されているＥＬＩＳＡ法(Saxne and Heinegard, (1992) Br. J. Rheumatol. 31: 583-591)により非分解ＣＯＭＰ総量について分析する。
実施例５
関節炎疾患の患者におけるＣＯＭＰフラグメントの定量
この実施例では、滑液をＣＯＭＰフラグメント源として使用し、抗ペプチド抗体Ｈ７４１を分析に用いた。上記実施例３および４に記載の方法は、血清中のＣＯＭＰおよびそのフラグメントの分析、あるいは尿中のフラグメント(のみ)の分析にも適用できる。
第１に、還元条件下での１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、続いてウサギ抗ペプチドＨ７４１抗体でのウェスタン・ブロッティングの後、滑液ＣＯＭＰの断片化パターンを測定した。試験片にもよるが、この抗体は、還元条件下でのみ、分子量およそ３３ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０ｋＤａ、１８ｋＤａ、１６ｋＤａおよび１４.４ｋＤａと思われる数種のバンドを検出した。免疫反応性物質の量は、濃度計により各バンドの容量を測定することにより定量した。９４キロダルトンのタンパク質は、完全なＣＯＭＰである。表２に示したように、骨関節症の場合、疾病の重篤度が重くなればなるほど、フラグメント数は増える。慢性関節リウマチでは、２０キロダルトンのフラグメントが重度疾病の場合に増大した。このことは、ＣＯＭＰ断片化の種類および程度は、関節炎プロセスの段階を示す。ＬＷＭ−ＣＯＭＰマーカーは、痛風性関節炎症状における骨関節症や慢性関節リウマチに限定されず、乾癬性関節炎はこれらのフラグメントを高レベルで示す。
0004189033.tif 000005
第２に、抗原性ＣＯＭＰ総量を、各断片化免疫反応性ＣＯＭＰそれぞれの容量内容物全てを加えることにより、定量した(上記実施例３および５参照)。ＣＯＭＰ総量は、ＣＯＭＰ ＥＬＩＳＡにより定量した(Saxne and Heinegard, D. (1992) Br. J. Rheumatology 31: 583-591)。
ＣＯＭＰ総量に対する断片化ＣＯＭＰの比率を含む表から、軟骨破壊度を考察できる。表３では、容量測定により測定した断片化ＣＯＭＰ総量を用いて、かかる比率を作成した。
0004189033.tif 000006
上記の結果に基づけば、疾病重篤度および疾病種(乾癬性関節炎)は、ＣＯＭＰ総量に対する断片化ＣＯＭＰの比率がより高く、またフラグメント数も多いようである。このことは、軟骨の細胞外マトリクスが著しく分解されたことを示唆する。よって、治療の目的となるのは、滑液(または血清／尿)中のＣＯＭＰフラグメント数を減らすこと、およびＣＯＭＰ総量に対する断片化ＣＯＭＰの比率を下げることであろう。その他の滑液成分に対するＣＯＭＰフラグメントの比率もまた、疾病プロセスを評価するための手段である。
実施例６
関節炎症状、抗関節炎剤および軟骨保護剤の評価
１．慢性関節リウマチ
標準プロトコール(Pettipher et al (1988) Br. J. Pharmacol. 95: 169-176)によりウサギにて自己免疫関節炎を誘導する。滑液を疾病の進行に合わせていろいろな間隔で集める。ヒツジで産生したＣ−末端ＣＯＭＰに対する抗体を用いて滑液をウェスタンメブロッティングまたはＥＬＩＳＡにより分析する。
２．骨関節症
外科的施術(Columbo et a1, (1983) Arthritis Rheum. 26: 875-86)によりウサギの膝に骨関節症を誘導する。滑液、血清および尿を疾病の進行に合わせていろいろな間隔で集める。ＣＯＭＰフラグメントの分析は、実施例２および３に記載のようにして行う。
３．ＫＳ値に対するＬＭＷ−ＣＯＭＰ値の比率
実施例４.１に由来する滑液をＫＳについてアッセイした。平均ＫＳ値(μg/ml)は、Campion GV et al., Arthritis Rheum. 34(10): 1254-1259 1991の確立された方法を用いて測定し、実施例４.１の方法に従い得られた平均ＣＯＭＰフラグメント値は、平均ＫＳ値当りの平均ＣＯＭＰフラグメントの比率を測定するため、ＫＳ含量と比較した。下記表４に示したように、ＫＳ含量は、グループ間で類似するようであるが、ＫＳに対するＣＯＭＰフラグメントの比率は、疾病が軽度から中度、重度へと進行するにつれて、変化する。
0004189033.tif 000007
全長ＣＯＭＰ/ＫＳ比率は、疾病状態に対して、ＬＭＷ-ＣＯＭＰ/ＫＳ比率よりも感度が低い。
実施例７
ヒトにおける抗関節炎剤および軟骨保護剤の評価
滑液は、骨関節症または慢性関節リウマチいずれかの患者から得た。滑液試料２０μlをヒアルロニダーゼで処理し、加熱し、次いで、非還元緩衝液または還元緩衝液のいずれかで処理し、その後、実施例３に記載のようにＳＤＳゲルにかけた。ＣＯＭＰおよび低分子量ＣＯＭＰフラグメントの存在について、実施例３に記載の適切な抗体を用いて測定した。表５は、関節炎症状の処置は、その処置がメトトレキセートまたはピロキシカムなどの強い抗関節炎化合物による場合、より少ないＬＭＷ−ＣＯＭＰフラグメントを産生することを示す。
0004189033.tif 000008
関節炎症状の連続的処置は、診断中または処置前のＣＯＭＰフラグメントレベルを測定するアッセイを実施し、それとＣＯＭＰフラグメントレベルとを、処置進行中の様々な時点で比較することにより、監視し、測定した。こうして、在籍内科医および臨床医は、抗関節剤の投与を調整して、関節炎症状の処置および軽減を最適化できる。
配列表
(１)一般的情報：
(ｉ)出願人：ガヌ・ビシュワス・エス
(ii)発明の名称：定量的関節炎状態のアッセイ
(iii)配列の数：４
(iv)連絡住所：
(Ａ)宛名：ノバルティス  アクチエンゲゼルシャフト
(Ｂ)通り：シュバルツバルトアレー215
(Ｃ)都市：バーゼル
(Ｅ)国：スイス
(Ｆ)郵便番号(ZIP)：4058
(iv)コンピューター読解形式：
(Ａ)媒介タイプ：フロッピーディスク
(Ｂ)コンピューター：IBM PC互換性
(Ｃ)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(Ｄ)ソフトウエア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(vi)優先権主張出願データ：
(Ａ)出願番号：US 60/024,041
(Ｂ)出願日：１９９６年８月１５日
(ix)遠隔通信情報：
(Ａ)電話番号：41-61-324 1111
(Ｂ)ファックス番号：41-61-322 7532
(２)配列番号：１の情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：１７アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：関係なし
(Ｄ)トポロジー：関係なし
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：１：
0004189033.tif 000009
(２)配列番号：２の情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：１４アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：関係なし
(Ｄ)トポロジー：関係なし
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：２：
0004189033.tif 000010
(２)配列番号：３の情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：１７アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：関係なし
(Ｄ)トポロジー：関係なし
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：３：
0004189033.tif 000011
(２)配列番号：４の情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：１７アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：関係なし
(Ｄ)トポロジー：関係なし
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：４：
0004189033.tif 000012
【図１】
0004189033.tif 000013
【図２】
0004189033.tif 000014
【図３】
0004189033.tif 000015
【図４】
0004189033.tif 000016
【図５】
0004189033.tif 000017