(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗ヒトアクチビンを、カオトロピックイオンの濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマトグラフィーを含有する精製工程に付することを特徴とする純度が改善したヒトアクチビンの製造方法。
【請求項２】
当該クロマトグラフィーが水溶性有機溶媒の存在下及び／又は酸性下に実施される陽イオン交換クロマトグラフィーである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
有機溶媒が低級アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミドの少なくとも１種を含み、その濃度が低くとも２０容量％である請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
粗ヒトアクチビンが、電気的に異なるその類縁体、宿主由来タンパク質、宿主及び／又は培地由来の抗原性物質、発熱物質、リフォールディングに際してリフォールディングしなかった会合凝集体、遺伝子翻訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づく類縁体、及び精製工程で生じるヒトアクチビン分解物、修飾物の少なくとも１種を含む請求項１乃至３記載の製造方法。
【請求項５】
得られるヒトアクチビンの純度が低くとも９９％である請求項１乃至４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規精製ヒトアクチビン、詳しくは純度が改善したヒトアクチビン及びその製造方法に関し、特に、粗ヒトアクチビンＡからヒトアクチビンＡを単離、精製する方法及び高純度に精製されたヒトアクチビンＡに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトアクチビンは、医薬品としての開発が期待されており、特にヒトアクチビンＡは、骨粗鬆症改善治療薬等医薬品その他の用途が期待できる有用物質である。
【０００３】
ヒトアクチビンＡはヒト白血病細胞株THP-1（IFO 50147）の培養上清より単離、精製されたアミノ酸１１６個のポリペプチド鎖２本から成るホモダイマータンパク質である。分子量は、約２５０００ダルトンであり、ポリペプチド鎖毎に９個のシステイン残基（Cys）が存在（ダイマーで合計１８個）、合計９個の分子内、分子間ジスルフィド結合を形成している（Biochemical and Biophysical Research Communications, 142, 1095-1103, 1987参照。）。
【０００４】
本発明者等は、特に、ヒトアクチビンＡの生産、精製手段として以下に示した４種類の方法を発展させてきた。即ち
（１）ヒト骨髄性白血病細胞THP-1（IFO 50147）をホルボールエステルを用いて刺激後に得た培養上清から、硫安分画と４段階のカラムクロマトグラフィーにより得る方法（細胞工学、別冊４、P48-58、1987年参照。）；
【０００５】
（２）ヒトアクチビンＡのｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを導入して得たヒトアクチビンＡ高生産遺伝子組み換えＣＨＯ細胞由来培養上清から、酸有機溶媒沈殿／冷却層分離と逆相HPLCを組み合わせることにより得る方法（Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 230-235, 1988；及び特開平１−３００８９８号公報参照。）；
【０００６】
（３）上記と同じ方法で得られた培養上清から、ヒトアクチビンＡ結合タンパク質であるフォリスタチンをリガンドに用いたアフィニティークロマトグラフィーにより取得する方法（特開平２−２５５０９８号公報参照。）；及び
【０００７】
（４）ヒトアクチビンＡのｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを導入したヒトアクチビンＡ高生産遺伝子組み換え微生物の、菌体中に蓄積される不溶性顆粒より可溶化、リフォールディング処理して得た粗ヒトアクチビンＡ溶液から逆相HPLCにより得る方法（国際出願公開第ＷＯ９７／２３６３８号公報参照。）の４種類の方法である。
【０００８】
上記４種類の方法で得たヒトアクチビンＡは動物実験用サンプルとしては十分に高純度であった。しかし、ヒトアクチビンＡを医薬品として開発するには、ヒトに投与するに足る極めて高純度の医薬品原体を、適切な製造コストで工業生産し得る実用的な精製工程を作り上げる必要があるが、上記方法ではヒトアクチビンＡをヒトに投与し得るに十分な純度まで精製することが困難であった。即ち、上記４種類の生産方法で使用されたクロマトグラフィー類をいくら組み合わせても、宿主又は培地由来の抗原性物質や発熱性物質等、ヒトアクチビンＡ遺伝子の翻訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づく類縁体、及び精製工程で生じるヒトアクチビンＡ分解物、修飾物等を高度に除去することは不可能であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、粗ヒトアクチビン、特に粗ヒトアクチビンＡから医薬用途に適した高純度のヒトアクチビンＡを簡便に単離、精製でき、かつ工業生産規模でヒトアクチビンを製造できる方法の開発並びに高純度ヒトアクチビンの製造、及び提供にある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題解決に向けて鋭意検討を行った結果、粗ヒトアクチビンとして粗ヒトアクチビンＡについて検討を行った。
【００１１】
ヒトアクチビンＡの高生産遺伝子組み換え微生物培養中の不溶性顆粒体よりリフォールディング処理した粗ヒトアクチビンＡ溶液から、ヒトアクチビンＡとその類縁物質との電気的性質の差異を利用して分離するイオン交換クロマトグラフィーを確立することが最も適当と考えた。その理由として、イオン交換クロマトグラフィーは、逆相クロマトグラフィーに比較してスケールアップが容易であり、タンパク質の工業的な大規模製造に最も適する方法であると考えた。
【００１２】
ところで、江藤等は粗ヒトアクチビンＡを、DEAE-トヨパール（東ソー製）、及びMono-Q（アマシャムファルマシアバイオテク製）の２種類の担体を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーで精製している（Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 230-235, 1988参照。）。しかし、大量精製用カラム充填剤であるDEAE−トヨパールを使用して精製した場合、得られたヒトアクチビンＡのタンパク質純度は約２％と低く、高性能な高速液体クロマトグラフィー（HPLC）カラムであるMono-Qを使用した場合でも約５５％のタンパク質純度にとどまっている。何れも医薬品に適した純度のタンパク質純度を達成するためには全く不充分な精製能力であった。加えて、何れのカラムを用いた場合でもヒトアクチビンＡの回収率は低く（前者の回収率約５６％、後者の回収率約６３％）、又希薄な溶液で回収されるために、そのまま工業的な生産に使用するのは不可能と結論した。以上のように、従来知られた一般的な精製技術を使用して、ヒトアクチビンＡのイオン交換クロマトグラフィーを工業的生産規模で実施することが極めて困難なことは全く明らかだった。
【００１３】
本発明者等は、上記課題を解決するために、更に研究を進めた結果、粗ヒトアクチビンＡ溶液から、必要により低分子不純物を除去後、陽イオン交換クロマトグラフィーを含む精製工程を使用することにより、ヒトアクチビンＡを高度に精製する方法を見出し、この知見に基づき本発明を完成するに到った。
【００１４】
より詳しくは、本発明によれば、粗ヒトアクチビン、特に粗ヒトアクチビンＡ溶液に、残留する場合必要によりリフォールディング試薬を一般的な方法により除去した後、好ましくは高濃度有機溶媒を含有させて、カオトロピックイオン、及び極めて低いpH緩衝液で平衡化された陽イオン交換カラムに負荷し、カオトロピックイオンの濃度勾配溶出法によって、電気的性質の異なる類縁体を高度に分離除去し、高純度のヒトアクチビンＡを得ることができる。
【００１５】
即ち、ヒトアクチビンＡ遺伝子を導入した微生物を培養し、産生されたヒトアクチビンＡ不溶性顆粒の可溶化、リフォールディングより得られた活性な粗ヒトアクチビンＡ溶液を精製する場合、好ましくは低分子不純物を除去した後、好ましくは、これを高濃度の有機溶媒、極めて低いｐＨ、及びカオトロピックイオンの性質をもつ塩を組み合わせた条件の陽イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、カオトロピックイオン濃度勾配溶出により、特に好ましくは宿主由来タンパク質、リフォールディングしなかった会合凝集体、及び電気的性質の異なる類縁体の何れも効果的に除去することができ、しかも濃縮ヒトアクチビンＡを高回収率で取得可能である。
【００１６】
即ち、本発明は粗ヒトアクチビンを、陽イオン交換クロマトグラフィー、特に濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマトグラフィーを含有する精製工程に付して精製することにより純度が改善されたヒトアクチビンを製造する方法である。当該濃度勾配溶出法はカオトロピックイオンの濃度勾配溶出法が好ましい。
【００１７】
更に、本発明には下記の内容も含まれる：
[1]  上記製造方法において、水溶性有機溶媒の存在下及び／又は酸性下に陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行う上記製造方法。
【００１８】
[2]  上記[1]の精製方法において有機溶媒が低級アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミドの少なくとも１種を含み、その濃度が低くとも２０容量％、より好ましくは２０〜６０容量％である上記製造方法。
【００１９】
[3]  上記製造方法において、粗ヒトアクチビンが、電気的に異なるその類縁体、宿主由来タンパク質、宿主及び／又は培地由来の抗原性物質、発熱物質等、リフォールディングに際してリフォールディングしなかった会合凝集体、遺伝子翻訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づく類縁体、及び精製工程で生じるヒトアクチビン分解物、修飾物等の少なくとも１種を含む上記製造方法。
【００２０】
[4]  上記製造方法において、粗ヒトアクチビンが、ヒトアクチビン遺伝子を導入した微生物を培養し、産生されたヒトアクチビン不溶性顆粒の可溶化、リフォールディングより得られた活性な粗ヒトアクチビン由来の不純物の少なくとも１種を含有する粗ヒトアクチビンである上記製造方法。
【００２１】
[5]  上記製造方法において、精製工程として低分子不純物を除去する精製工程を組合せた上記製造方法。
【００２２】
[6]  精製工程として、更にアルカリ性下に陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程を含有する上記製造方法。
【００２３】
[7]  上記[6]の製造方法において、クロマトグラフィーが天然多糖をベースマトリックスとした陰イオン交換クロマトグラフィーを含む上記製造方法。
【００２４】
[8]  ヒトアクチビン遺伝子を導入した微生物を培養し、産生されたヒトアクチビン不溶性顆粒の可溶化、リフォールディングより得られた活性な粗ヒトアクチビン溶液から低分子不純物を除去した後、これを高濃度の有機溶媒とカオトロピックイオンを含む極めて低いｐＨで平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、カオトロピックイオン濃度勾配溶出を行うことにより、宿主由来タンパク質、リフォールディングしなかった会合凝集体、及び電気的性質の異なる類縁体を効果的かつ高度に除去した濃縮ヒトアクチビンを高回収率で製造する方法。
【００２５】
[9]  上記[8]の製造方法において、低分子物質の不純物を除去した後、下記２工程を組み合わせることにより、更に効率良く精製を行い粗ヒトアクチビン溶液から高純度のヒトアクチビンを製造する方法。
【００２６】
（ｉ）当該一部精製物を極めて高いｐＨ条件で平衡化された天然多糖をベースマトリックスとした陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、塩濃度上昇、ｐＨ低下、及び有機溶媒を添加した緩衝液へ置換することにより、宿主由来タンパク質、リフォールディングしなかった会合凝集体、電気的性質の異なる類縁体の何れも概ね除去した濃縮ヒトアクチビンＡを定量的に回収する工程；、
（ｉｉ）上記（ｉ）で得られた回収画分の緩衝液を置換した後、有機溶媒を含む極めて高いｐＨで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、塩濃度勾配、及びｐＨ勾配（ｐＨ低下）を施すことにより、宿主由来タンパク質、及び電気的性質の異なる類縁体の何れも概ね除去した濃縮ヒトアクチビンを高回収率で得る工程；及び上記（ｉｉ）で得られた回収画分の緩衝液を置換した後、前記陽イオン交換クロマトグラフィーの精製工程を行う製造方法。
【００２７】
[10]  上記本発明及び[1]乃至[9]の製造方法において得られた純度が改善したヒトアクチビン及び純度が低くとも９９％の高純度ヒトアクチビン。
【００２８】
[11]  その純度が低くとも９９％で、不純物として電気的性質を異にするヒトアクチビン類縁体を実質的に含まないヒトアクチビン。
【００２９】
[12]  上記本発明及び[1]乃至[9]の製造方法並びに上記[10]及び[11]においてヒトアクチビンがヒトアクチビンＡである発明。
【００３０】
[13]  上記本発明及び本発明により得られる純度が改善したヒトアクチビン、特にヒトアクチビンＡを含有する骨粗鬆症改善治療薬その他の医薬製剤。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。
本発明に使用する出発物質である粗ヒトアクチビンには、粗ヒトアクチビンＡ等各種アクチビンの粗生成物が含まれる。従って、各種不純物で通常の精製手段では分離困難な不純物を少なくとも１種含む粗ヒトアクチビンであればよい。不純物の種類としては特に制限されないが、電気的に異なるその類縁体、宿主由来タンパク質、宿主及び／又は培地由来の抗原性物質、発熱物質等、リフォールディングに際してリフォールディングしなかった会合凝集体、遺伝子翻訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づく類縁体、及び精製工程で生じるヒトアクチビン分解物、修飾物等何れも効果的に分離できる点で優れており、特に電気的性質を異にする類縁体の高度分離に適している。
【００３２】
上記ヒトアクチビンＡ精製原料に含有される類縁物質について具体的には、上記した通り、大きく分けて、培養が終了した段階で既に含まれている類縁物質（大腸菌が誤ったアミノ酸を取り込んだしまったり、タンパク質が合成された後に大腸菌の持つ酵素によって異常な修飾を受けることに原因）、精製途中に生じる類縁物質（リフォールディングやクロマトグラフィーにおいて修飾を受けることに原因）の２通りがある。本発明で使用する精製技術は、リフォールディングの最中に生じてしまう修飾物（特に高ｐＨ値下で生じる脱アミド反応物、例えば分子内のアスパラギンがアスパラギン酸に変化したもの）をヒトアクチビンＡから分離除去するのに、特に効果を発揮する。従って、本発明の精製について、特にヒトアクチビンＡを微生物に変性状態で生産させ、人為的にリフォールディングさせた場合に特に有効である。
【００３３】
被精製物としてヒトアクチビンＡの場合を例として、以下に説明する。
ヒトアクチビンＡの遺伝子を組み込んだ微生物から得られる不溶性顆粒体を還元変性抽出処理後、国際出願公開第ＷＯ９７／２３６３８号公報に記載の方法に基づいてリフォールディング処理した粗ヒトアクチビンＡ溶液を使用することができる。この場合、まず、粗ヒトアクチビンＡ溶液から低分子の不純物を分離する方が好ましく、その場合の低分子不純物の除去方法については低分子不純物の除去方法として知られている方法を採用することができ、簡便には例えば限外濾過法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、透析法等、一般的に緩衝液置換する方法を使用すればよい。その際、事前に粗ヒトアクチビンＡ溶液を希釈し、分子分画量１００００程度の膜を使用した濃縮操作により、出発原料中の不純物の種類や含量に関係なくスケールアップが可能となる。
【００３４】
本発明は、粗ヒトアクチビンを、濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマトグラフィー、特にカオトロピックイオンの濃度勾配溶出法により、精製して、純度を改善したヒトアクチビンを製造する方法である。
【００３５】
カオトロピックイオンとはタンパク質の高次構造を壊す効果をもつ塩類のことである。ＮａＳＣＮやＮａＣｌＯ４のように、低分子非電解質、蛋白等の水に対する溶解度を高める、蛋白や核酸の高次構造を破壊して変性させる等の性質を持つイオン（蛋白質・酵素の基礎実験法、pp63（改訂第2版；堀尾武一編、南光堂、1994年参照。）であり、このような性質は、塩が解離して生じたイオンによって水の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに生じる、水のエントロピーの減少が抑制されるためであると考えられている。
【００３６】
このように低分子除去した画分を酸性下、望ましくはｐＨ２〜４程度（より望ましくはｐＨ２．５〜３．５程度）に調整した後、水溶性有機溶媒、好ましくは高濃度水溶性有機溶媒（例えば、２０〜６０％の有機溶媒、好ましくはエタノール、イソプロパノール等炭素数１〜４の低級アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等）と０．２Ｍ以下のカオトロピックイオンの性質をもつ塩（例えば、ＮａＣｌＯ４、ＫＣｌＯ４等の過塩素酸塩、ＮａＳＣＮ、ＫＳＣＮ等のチオシアン酸塩等）を含む酸性下、望ましくはｐＨ２〜４程度（より望ましくはｐＨ２．５〜３．５程度）で平衡化された陽イオン交換カラム（例えば、リソース−Ｓ；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、塩濃度勾配によって溶出する。塩濃度勾配は１０カラム容量以上かけて０．２〜０．４Ｍ程度まで塩濃度を上げることで、電気的性質の異なる類縁体等が効果的に除去された高濃度のヒトアクチビンＡを高回収、製造可能となる。
【００３７】
尚、上記の陽イオン交換クロマトグラフィーでの精製負担を軽減する為、陽イオン交換クロマトグラフィー適用前に、好ましくは以下のように２段階の陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて原料由来の不純物やリフォールディング処理までに生成した不純物を概ね除去しておくことが精製効率を上げるために極めて有利である。
【００３８】
低分子不純物を除去した後（望ましくは、ゲル濾過クロマトグラフィー法により、ｐＨ９．５〜１０．５程度の緩衝液に置換）、５０ｍＭ以下の塩（例えば、ＮａＣｌ使用。）を含むｐＨ９．５〜１０．５程度の緩衝液（例えば、２０ｍＭ１,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ使用。）で平衡化された天然多糖をベースマトリックスとした陰イオン交換カラム（例えば、Ｑ−セファロースＦＦ；アマシャムファルマシアバイオテク製）に６ｍｇ／ｍｌゲル程度負荷し、５カラム容量程度の平衡化緩衝液で洗浄した後、水溶性有機溶媒（例えば、５〜２５％の濃度で、エタノール、イソプロパノール等炭素数１〜４の低級アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等の使用。）と０．１Ｍ以上の塩（例えば、ＮａＣｌ使用。）を含むｐＨ８．５〜９．５程度の緩衝液（例えば、２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ）に置換することにより、モノマーや会合凝集体を概ね除去し、かつ１ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮されたヒトアクチビンＡ画分を得ることができる。この画分をｐＨ９．５〜１０．５程度の緩衝液（例えば、２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ）に置換した後、有機溶媒（例えば、５〜２５％の有機溶媒、好ましくはメタノール、イソプロパノール等低級アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等）と５０ｍＭ以下の塩（例えば、ＮａＣｌ使用。）を含むｐＨ９．５〜１０．５程度の緩衝液（例えば、２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ）で平衡化された陰イオン交換カラム（例えば、リソース−Ｑ；アマシャムファルマシアバイオテク製）に５ｍｇ／ｍｌゲル程度負荷する。１０カラム容量以上かけて塩濃度を０．１Ｍ以上に上げるのと同時にｐＨを８．５〜９．５程度まで下げることにより、陽イオン交換クロマトグラフィーで分離除去困難な類縁体を除去することができる。
【００３９】
最終精製工程として、この画分を例えば実施例１に従った陽イオン交換クロマトグラフィー精製することにより、電気的性質が単一なヒトアクチビンＡを高濃度状態で高回収、製造できる。かつ、これらクロマトグラフィーに用いる充填剤の粒径は大きく、直線的にカラム容量を向上させることでスケールアップが可能である。
【００４０】
尚、最終的に得られた画分の純度について、逆相HPLC（例えば、NucleosilＣ８；GLサイエンス製使用。）、陰イオン交換HPLC（例えば、DEAE-NPR；東ソー製使用。）、陽イオン交換HPLC（例えば、SP-NPR；東ソー製使用。）、及びSDS-PAGE等で確認できる。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００４２】
（実施例１）
ヒトアクチビンＡ遺伝子を導入した組み換え大腸菌から得られる変性ヒトアクチビンＡを国際出願公開第ＷＯ９７／２３６３８号公報記載内容に従ってリフォールディング処理した。このリフォールディング溶液２５０ｍｌ（タンパク質１２ｍｇ）にＨ2Ｏを等量添加した後、分子分画量１００００の膜（フィルトロン製「オメガ」）を使用して初期容量の約１３分の１になるまで濃縮した。この膜濃縮操作において、タンパク質を１１．５ｍｇ回収し（回収率９６％）、逆相HPLCで求めた画分のタンパク質純度は６８％であった。
【００４３】
これを１．８ｍＭ  ＨＣｌで平衡化されたセファデックスＧ−２５Ｍ（2.6φ x 20 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質を１１．３ｍｇ回収した（回収率９８％）。この画分５ｍｇを４０％アセトニトリル、０．１８Ｍ  ＮａＣｌＯ４、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０緩衝液に平衡化されたリソース−Ｓ（0.5φ x 5 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、６ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した後、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで１１分後に０．２４ＭになるようなＮａＣｌＯ４濃度勾配に供した。A280にて検出されたタンパク質を３．７ｍｇ回収した（回収率７４％；図１ｂのクロマトグラフィー参照。）。
【００４４】
尚、溶出塩として、ＮａＣｌＯ４の代わりにＮａＣｌを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを実施したところ（塩の種類と濃度以外は全て同じ）、ＮａＣｌＯ４を用いた場合に比べて前方に分離されていた不純物の分離能が低下し（図１ａのクロマトグラフィー参照。）、それだけ回収率も低下した（回収率５１％）。
【００４５】
（実施例２）
実施例１と同じ条件を使用して、リフォールディング溶液から膜濃縮画分３７．０ｍｇを得た。これを３０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ１,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌで平衡化されたセファデックスＧ−２５Ｍ（1.6φ x 10 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質を３６．３ｍｇ回収した（回収率９８％）。この画分３６．０ｍｇを３０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ（ｐＨ１０）で平衡化されたＱ−セファロースＦＦ（1.6 φ x 3 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、置換した。約３０ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した後、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１２％アセトニトリル、２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）緩衝液へ置換することにより、A280で検出されたタンパク質を３４．９ｍｇ回収した（回収率９７％；図２参照。）。
【００４６】
この回収画分について、逆相HPLC（NucleosilＣ８；GLサイエンス製）、陰イオン交換HPLC（DEAE-NPR；東ソー製）、及び陽イオン交換HPLC（SP-NPR；東ソー製）より得られるタンパク質純度は各々９７％、６５％、７５％であった。この画分３４ｍｇを２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ（ｐＨ１０）で平衡化されたセファデックスＧ−２５Ｍ（1.6φ x 17 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質３３．３ｍｇを回収した（回収率９８％）。この画分５ｍｇを１０％アセトニトリル、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ、ｐＨ９．８で平衡化されたリソース−Ｑ（0.5φ x 5cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷した。
【００４７】
約６ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した後、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで１１分後に１０％アセトニトリル、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ、ｐＨ９．０緩衝液組成になるようなＮａＣｌ濃度勾配、及びｐＨ勾配に供した。この操作を２回繰り返し、A280で検出されたタンパク質を合計で５．５ｍｇ回収した（回収率５５％；図３参照。）。
【００４８】
この画分について、陰イオン交換HPLC（DEAE-NPR；東ソー製）、及び陽イオン交換HPLC（SP-NPR；東ソー製）で求めたタンパク質純度は各々９９％、８８％であった。これを１．８ｍＭ  ＨＣｌで平衡化されたセファデックスＧ−２５Ｍ（1.6φ x 5 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）カラムに負荷することにより、A280で検出されたタンパク質を５．４ｍｇ得た（回収率９８％）。この画分５ｍｇを実施例１に従ってリソース−Ｓ（0.5φ x 5 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質を３．９ｍｇ回収した（回収率７８％；図４参照。）。
【００４９】
これを１．８ｍＭ  ＨＣｌで平衡化されたセファデックスＧ−２５Ｍ（1.6φX 5 cm；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質を３．９ｍｇ回収した（回収率９９％）。この画分について、逆相HPLC（NucleosilＣ８；GLサイエンス製）、陰イオン交換HPLC（DEAE-NPR；東ソー製）、陽イオン交換HPLC（SP-NPR；東ソー製）、及びSDS-PAGEを実施した結果を図５〜８に示した。逆相HPLC（図５参照。）、陽イオン交換HPLC（図６参照。）、及び陰イオン交換HPLC（図７参照。）において、ヒトアクチビンＡのピーク以外にピークは認められず、これ等分析手法において、不純物が検出されなかったことを確認した。又、SDS-PAGE（図８参照。）においても、ヒトアクチビンＡを２．１μｇ負荷したレーンにおいて（レーン２）、ヒトアクチビンＡ以外のバンドは検出されなかった。ヒトアクチビンＡを２１ｎｇ負荷したレーン３でヒトアクチビンＡのバンドが検出されたことと併せて、レーン２に含まれる不純物は１成分として、０．１％以下であることを確認した。
【００５０】
尚、表１には実施例１に記載した膜濃縮操作を含めた本実施例の結果概要、表２には図５〜８の各種HPLC、及びSDS-PAGE分析条件をそれぞれ示した。
従来の精製方法（特開平２−２５５０９８号公報参照。）により得られた精製ヒトアクチビンＡと本実施例２で得られた精製ヒトアクチビンＡのタンパク質純度を、陽イオン交換HPLCを使用して比較した（図９参照。）。従来法（図９ｂ）では、精製ヒトアクチビンＡの他に約２％の不純物が残留したが、本実施例２（図９ａ）による精製ヒトアクチビンＡには不純物は検出されず、純度は低くとも９９％と考えられ、本精製方法の有用性が示された。
【００５１】
【表１】
0004055248.tif 000002
【００５２】
【表２】
0004055248.tif 000003
【００５３】
上記図８、表１及び２の結果から明らかなように、本発明の精製方法を利用すれば高純度に精製されたヒトアクチビンを製造、取得できることが分かる。その純度についても、図８の電気泳動分析の結果からは、１，０００分の１のオーダーで不純物を含まないと考えられるので、その純度は低くとも９９．９％、即ち９９．９％以上の高純度と考えられる。
【００５４】
【発明の効果】
粗ヒトアクチビンを、濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマトグラフィーを含有する精製工程に付する本発明の精製方法により、従来法では得られなかったような高純度のヒトアクチビンを工業的に製造することができるので、医薬用途への使用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１で実施の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。１．８ｍＭ  ＨＣｌに溶解したヒトアクチビンＡ６ｍｇを陽イオン交換クロマトグラフィー（リソース−Ｓ；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、塩濃度勾配溶出に供した。図中、「−」部分を回収した。図中、ａはＮａＣｌ濃度勾配溶出法、ｂはＮａＣｌＯ4濃度勾配溶出法による。
【図２】実施例２において実施の陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  １，３−ジアミノプロパン／ＨＣｌに溶解したヒトアクチビンＡ３６ｍｇを陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、１２％アセトニトリル、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  １，３−ジアミノプロパン／ＨＣｌに置換した。図中、「−」部分を回収した。
【図３】実施例２において２回目の実施の陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。２０ｍＭ  １，３−ジアミノプロパン／ＨＣｌに溶解したヒトアクチビンＡ６ｍｇを陰イオン交換クロマトグラフィー（リソースＱ；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、塩濃度とｐＨの勾配溶出に供した。図中、「−」部分を回収した。
【図４】実施例２において実施の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。１．８ｍＭ  ＨＣｌに溶解したヒトアクチビンＡ６ｍｇを陽イオン交換クロマトグラフィー（リソース−Ｓ；アマシャムファルマシアバイオテク製）に負荷し、塩濃度勾配溶出に供した。図中、「−」部分を回収した。
【図５】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡ画分の逆相HPLCの結果を示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。精製されたヒトアクチビンＡ７μｇを逆相HPLC（NucleosilＣ８; GLサイエンス製）に負荷し、アセトニトリル濃度勾配に供した。保持時間約１７．５分に検出されたピークはヒトアクチビンＡによる。
【図６】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡ画分の陽イオン交換HPLCの結果を示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。精製されたヒトアクチビンＡ１２μｇを陽イオン交換HPLC（SP-NPR；東ソー製）に負荷し、塩濃度勾配溶出に供した。保持時間約１０分に検出されたピ−クはヒトアクチビンＡによる。
【図７】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡ画分の陰イオン交換HPLCの結果を示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。精製されたヒトアクチビンＡ１２μｇを陰イオン交換HPLC（DEAE-NPR；東ソー製）に負荷し、塩濃度勾配溶出に供した。保持時間約７分に検出されたピークはヒトアクチビンＡによる。
【図８】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡのSDS-PAGEの結果を示す図である。精製されたヒトアクチビンＡ２１μｇ、及び２１ｎｇを定法に従ったSDC-PAGE（Phast System ; アマシャムファルマシアバイオテク製）に供した。分子量約２６０００の易動度に検出されたバンドはヒトアクチビンＡによる。レーン１；６種分子量の標準タンパク質（９４０００，６７０００，４３０００，３００００，２００００，及び１４４００）混合溶液（分子量キャリブレーションキットＬＭＷ；アマシャムファルマシアバイオテク製）、レーン２；精製されたヒトアクチビンＡ  ２１μｇ、及びレーン３；精製されたヒトアクチビンＡ２１ｎｇ。
【図９】実施例２及び従来法（特開平２−２５５０９８号公報参照。）で得られたタンパク質純度比較の結果を示す図である。実施例２及び従来法（特開平２−２５５０９８号公報参照。）で得られたヒトアクチビンＡ１２μｇをSP-NPRカラムを使用する陽イオン交換HPLCに供し、タンパク質純度を比較した。図中、ａは実施例２，ｂは従来法による。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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