(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィターゼの、形質転換されたHansenula polymorphaの培養による調製方法であって、
前記Hansenula polymorphaは、ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーターの制御下に接続されたフィターゼをコードする核酸を含み、
抑制基質であるグルコースまたはスクロースを炭素源の９０〜１００％を占めるように用い、
炭素源が流加相の間制限され、培養の全期間中、溶存酸素が継続的に培地中に存在している、調製方法。
【請求項２】
反復流加培養の形態で行なわれる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、内因性のまたは異種のタンパク質の、形質転換されたまたは形質転換されていない真核細胞の培養による調製方法であって、抑制基質を炭素源として用い、炭素源が流加相の間制限され、培養の全期間中、連続的な酸素制限が生じないことを特徴とする調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
メチロトローフ酵母は、近年、異種タンパク質の適切な発現系として研究されてきた。特に、Hansenula polymorphaおよびPichia pastorisは、幅広い種々の外来遺伝子について宿主生物を扱いやすいと記載されてきた（概説は、Gelissen & Melber 1996およびCregg & Madden 1998を参照）。メタノール代謝に関与する酵素のプロモーターは非常に強いことが見出されていたので、それらは一般にタンパク質の異種発現を制御するために用いられている（ＥＰ０１７３３７８、ＥＰ０２９９１０８、ＥＰ０１８３０７１を参照）。
【０００３】
これらの生物の培養のために用いられる炭素源がプロモーター調節に大きな影響を与えることは公知である。Gelissenら（1994）は、Hansenula polymorphaにおけるメタノール代謝の鍵酵素が、メタノール上での増殖の間に大量に存在すると記載している。有意なレベルの酵素メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）およびギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）は、グリセロール増殖細胞中では検出することができるが、グルコースが炭素源として用いられている場合には存在しないこともまた見出された（例えば、ＥＰ０２９９１０８参照）。このデータに基づくと、これらの酵素がメタノールによって誘導されると結論づけられる。グリセロール上での増殖の間のＭＯＸおよびＦＭＤＨの発現は、プロモーターの脱抑制により説明される。Hansenula polymorphaおよびKloeckera sp.2201のグルコース制限ケモスタット培養では、ＦＭＤＨのみが増殖速度０．１ｈ-1未満で非常に少量産生される（Egliら、1980）。したがって、これまでは、非抑制炭素源がタンパク質の異種発現のためにメチロトローフ酵母と一緒に用いられてきた。Hansenula polymorphaは、幅広い種々の医薬タンパク質の製造のため、グリセロールによる単一炭素源モードで、あるいはグリセロールおよび更なるメタノールによる２炭素源モードのいずれかで流加培養法で培養されている（Gelisson & Melber 1996）。一般的な操作手順は、Weydemannら（1995）によりヒルジンの製造について詳細に記載されている。非抑制炭素源としてやはりグリセロールを用いているPichia pastorisによるトロンボモジュリンの製造方法がChenら（1996）により記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、グリセロールの値段が高いので、この方法は現在まで、飼料または工業用酵素のような低コストのタンパク質の製造には適していない。したがって、本発明の目的は、そのような障害を克服し、内因性のまたは異種のタンパク質の、形質転換されたまたは形質転換されていない真核細胞の培養による調製方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この方法においては、抑制基質を炭素源として用い、この炭素源が流加相の間制限され、培養の全期間中、連続的な酸素制限はないか；あるいは、そのような方法においてタンパク質が酵素、特に飼料酵素、例えば、フィターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、または工業用酵素、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ナラギナーゼ(naraginase)、コラゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはプルラナーゼであるか；あるいはそのような方法において、細胞はメチロトローフであるか、および／またはメタノール代謝に関与する酵素のプロモーター、例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤまたはＦＭＤＨ）プロモーター、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プロモーターもしくはジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳまたはＤＨＡＳ）プロモーターを含むＤＮＡ配列で形質転換されているか；あるいはそのような方法において、細胞はメチロトローフ酵母、好ましくはHansenula、pichia、Candida、またはTorulopsis、例えば、Hansenula polymorphaまたはPichia pastorisであるか；あるいはそのような方法において、抑制基質は、炭素源の１〜１００％、好ましくは４０〜１００％またはより好ましくは９０〜１００％を占めるか、あるいは単一の炭素源であるか；あるいはそのような方法において、基質は、モノ−、ジ−、オリゴ−、もしくはポリサッカライドのような糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、デンプン、グリコーゲン、セルロース、もしくはデキストロース、または糖含有化合物、例えば、糖蜜、グルコースシロップ、もしくはフルクトースシロップであるか；あるいはそのような方法は反復流加培養の形態で行なわれる、ことを特徴とする。さらに、そのような方法は、流加速度範囲が微生物の代謝特性および（特に、酸素についての）バイオリアクターのマストランスファー能力により制限される。流加速度は、産生を可能にする最小値と培養物中の酸素制限を回避する最大値との間に好ましくは維持される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
異種タンパク質の製造方法の場合、真核細胞は、そのような異種タンパク質、例えば、本件の場合のフィターゼ、をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列またはベクターにより形質転換される。分子生物学の分野の当業者はそのような形質転換真核細胞を調製するために用いられる方法を熟知しており、例えば、本件の特定の例については、ＥＰ６８４３１３または欧州特許出願第９７８１０１７５．６を参照されたい。
【０００７】
本発明の関係において、「培養」とは、当業者が熟知している通常の意味を有する。特定の培養条件は、用いられる細胞と産生されるタンパク質およびそれらの発現系に依存する。タンパク質の発酵生産の分野の当業者もまたそのような条件を熟知している。さらに、短いバッチ相、すなわち、細胞の増殖期の間に本発明を実施するためには、抑制または非抑制炭素源、例えば、それぞれグルコースまたはグリセロールを用いることができることも理解される。流加相は、所望のタンパク質の産生期であるが、その間は、培養方法は本発明により提供される方法で行なわれる。
【０００８】
さらに、本発明の実施のための目的のメチロトローフ酵母は、例えば、ＥＰ１７３３７８の第３７および３８頁から得ることができる。
【０００９】
【実施例】
実施例１
主な炭素源としてグリセロールまたはグルコースを用いるHansenula polymorphaによるA.Fumigatusのフィターゼの産生
流加する基質としてグリセロールまたはグルコースを用いてフィターゼの産生を比較するため、２つの流加培養実験を、１５lのリアクター中で、約８０コピーのAspergillus fumigatusの野生型フィターゼ遺伝子（Pasamontesら1997）をＦＭＤプロモーターの制御下で用いて行なった。
【００１０】
振盪フラスコ培養を、−７０℃で以下の組成の５０mlの培地で維持していたグリセロール保存細胞懸濁液１mlを接種することにより開始した：３０．０g/lグリセロール；２．５g/lＫＨ2ＰＯ4；５g/lＮＨ4Ｈ2ＰＯ4；２．２５g/lＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；２．５g/l（ＮＨ4)2ＳＯ4；１．１５g/lＫＣｌ；０．２５g/lＮａＣｌ；０．３７５g/lＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；０．２５mg/lＨ3ＢＯ3；０．０５g/l（ＮＨ4)2Ｆｅ（ＳＯ4)2・６Ｈ2Ｏ；４mg/lＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；１５mg/lＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；２０mg/lＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．０５g/lＮａ−ＥＤＴＡ；０．５mg/lＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ；０．５mg/lＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．５mg/lＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；０．５mg/lＫＩ；０．０５g/lチアミン・ＨＣｌ；０．１５mg/lビオチン。それらを３０℃、２００rpmで２４時間培養し、３０mlを第２の振盪フラスコ工程に同じ培地３００mlと一緒に移し、３０℃、２００rpmでさらに２４時間培養した。
【００１１】
このシード培養物３００mlを、以下のように構成された開始培地５lの入った１５lの発酵槽用の接種物として用いた：１０．０g/lグリセロール；５．０g/lＫＨ2ＰＯ4；１０g/lＮＨ4Ｈ2ＰＯ4；４．５g/lＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；５．０g/l（ＮＨ4)2ＳＯ4；２．３g/lＫＣｌ；０．５g/lＮａＣｌ；０．２ml/l消泡剤；０．７５g/lＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；０．５mg/lＨ3ＢＯ3；０．１g/l（ＮＨ4)2Ｆｅ（ＳＯ4)2・６Ｈ2Ｏ；８mg/lＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；３０mg/lＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；４０mg/lＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１g/lＮａ−ＥＤＴＡ；１．０mg/lＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ；１．０mg/lＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；１．０mg/lＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；１．０mg/lＫＩ；０．１g/lチアミン・ＨＣｌ；０．３mg/lビオチン。全工程の間は、温度、pH、および通気はそれぞれ３０℃、pH４．６、および５l/hの一定に保たれた。pHは２５％のＮＨ3の添加により制御した。酸素飽和度は、スターラー速度と圧力（０〜０．５bar）を制御することにより、リアクター内で最小値の２０％飽和に維持した。培地中の最初のグリセロールの完全消費はｐＯ2値の急速な上昇を導き、バッチ相の終わりを示した。この時点で、グリセロールまたはグルコースのいずれかの溶液７００g/lの流加を開始した。最初の１８時間の流加には、２５g溶液/hの開始流加速度を用い、次いで、速度を５０g/hまで増加させた。培養物容量は、約６lの炭素源溶液の流加のため培養の最後には約１１lまで増加していた。
【００１２】
グルコースが流加される培養の場合、この工程の間に代謝される全炭素源の９８％がグルコースであり、残りの２％はバッチ相の間に使われるグリセロールに相当する。全工程の間、上清中でグルコースを計測することはできなかった。
【００１３】
１６５時間の工程時間の後、５．８６g/lのフィターゼが、グリセロールを用いた培養から得たサンプル中で、タンパク質測定のためのBradford法を用いることにより定量された。グルコースを用いた培養からは、１６０時間の工程時間の後のサンプルに７．１２g/lのフィターゼ（同じ方法により測定された）が含まれていた。これらの結果により、グルコースの抑制的効果を、流加相の間の厳格な炭素制限を確実にする流加法により、回避することができることが確認された。図１は、主な炭素源としてグリセロールを用いて行なった培養とグルコースを用いて行なった培養の時間経過の比較を示す。
【００１４】
実施例２
主な炭素源としてスクロースを用いるHansenula polymorphaによるA.Fumigatusのフィターゼの産生
この実施例では、培養は１５lのバイオリアクター内で、実施例１由来のそれと同じ株を用いて行なった。シード培養と主培養の条件は、流加溶液が７００g/lのスクロースを含んでいること以外は、実施例１のときと全く同じであった。工程の間、上清サンプル中のスクロース濃度は、一度も１g/lより高くならず、同じサンプル中にはグルコースもフルクトースも検出され得なかった。１６７時間の培養時間の後、フィターゼ５．２７g/lをタンパク質測定のためのBradford法により培地中で測定することができた。
【００１５】
実施例３
単一の炭素源としてグルコースを用いるHansenula polymorphaによるA.Fumigatusのフィターゼの産生
この実施例では、培養は実施例１および２と同じ株を用いて１５lのバイオリアクター内で行なった。シード培養物は実施例１および２と同じ条件下で得た。主培養は、最初のグリセロール１０g/lをグルコース１０g/lによって置換した以外は実施例１に記載したのと同じ組成でバイオリアクター中５lの開始培地を用いて開始した。流加溶液はグルコース７００g/lからなり、実施例１に記載したのと全く同じ条件下で培養物に添加した。１６０時間の工程時間の後、フィターゼ７．２１g/lをBradford法による測定で培地中に検出することができた。
【００１６】
実施例４
反復流加培養モードでのHansenula polymorphaによるA.Fumigatusのフィターゼの産生
この実施例では、実施例１，２および３で用いたのと同じHansenula polymorpha株をもちいて、反復流加培養を１５lのリアクター内で行なった。最初の培養のため、シード培養物は、以下の組成の３００mlの培地に、−７０℃で維持していたグリセロール保存細胞懸濁液１mlを接種することにより得た：３０．０g/lグリセロール；１３．３g/lＮＨ4Ｈ2ＰＯ4；３．０g/lＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；６．７g/l（ＮＨ4)2ＳＯ4；３．３g/lＫＣｌ；０．３３g/lＮａＣｌ；１．０g/lＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；０．６７mg/lＨ3ＢＯ3；０．０６７g/l（ＮＨ4)2Ｆｅ（ＳＯ4)2・６Ｈ2Ｏ；５．３mg/lＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２０mg/lＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；２６mg/lＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．０６７g/lＮａ−ＥＤＴＡ；０．６７mg/lＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ；０．６７mg/lＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．６７mg/lＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；０．６７mg/lＫＩ；０．１３g/lチアミン＊ＨＣｌ；０．４mg/lビオチン。振盪フラスコを、３０℃、２００rpmで３０時間培養し、３００mlを、主培養の接種物として以下を含む１５lのバイオリアクター中で開始容量７．５lの培地に対して用いた：１５０．０gグリセロール；１００．０gＮＨ4Ｈ2ＰＯ4；２２．５gＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；５０．０g（ＮＨ4)2ＳＯ4；２５gＫＣｌ；２．５gＮａＣｌ；７．５gＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；５mgＨ3ＢＯ3；０．５g（ＮＨ4)2Ｆｅ（ＳＯ4)2・６Ｈ2Ｏ；４０mgＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；１５０mgＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；４０mgＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．５gＮａ−ＥＤＴＡ；５．０mgＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ；５．０mgＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；５．０mgＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；５．０mgＫＩ；１gチアミン・ＨＣｌ；３mgビオチン。
【００１７】
全工程の間は、温度、pH、および通気はそれぞれ３０℃、５．０、および９．０l/分の一定に保たれた。pHは２５％のＮＨ3の添加により制御した。酸素飽和度は、スターラー速度と圧力（０〜０．５bar）を制御することにより、リアクター内で最小値の２０％飽和に維持した。培地中の最初のグリセロールの完全消費はｐＯ2値の急速な上昇を導き、バッチ相の終了を示した。この時点で、全炭素源濃度７００g/lに対してグルコース４０％およびグリセロール６０％を含む溶液を用いて、流加を開始した。流加速度は、全流加相の間４５g/hに制御された。
【００１８】
次の反復流加培養のため、先に実施したものからの０．５〜１lの培養ブロスを、工程の終わりに、次の実施のための接種物としてバイオリアクター内に維持した。上記と同じ総量の塩を含むが炭素源のない新しい滅菌培地を所定の開始容量までバイオリアクター内に添加した。したがって、バッチ相はなく、流加を上記のように直ちに開始した。流加溶液は全部で７００g/lの炭素源を含んでいた。異なる割合のグリセロールとグルコースならびに開始容量を以下のように用いた：
【００１９】
第２サイクル−グルコース６６％、グリセロール３４％、開始容量７．５l
第３サイクル−グルコース９０％、グリセロール１０％、開始容量７．５l
第４および第５サイクル−グルコース１００％、開始容量５l
【００２０】
各サイクルの終わりに獲得したフィターゼの濃度は、図２に示すように、それぞれ第１〜第５サイクルについて、４．７g/l、３．９g/l、４．３g/l、６．０g/l、および４．４g/lであった。第４サイクルでは、増殖期の終わりのより緩慢で長い流加モードがより高い生成物濃度を導いた。
【００２１】
実施例５
Hansenula polymorphaによるコンセンサスフィターゼの産生この実施例では、ＦＭＤプロモーターの制御下の約４０コピーのコンセンサスフィターゼ遺伝子（欧州特許出願第９７８１０１７５．６号）を含むHansenulra polymorphaの株を、実施例１に記載したのと同じ培地で同じ条件下で１５lのバイオリアクター内で、流加培養相のために７００g/lのグルコースを含む流加溶液を用いて、培養した。１６５時間の培養時間の後、培地内のフィターゼ濃度は、Bradford法による測定で、１３．１g/lであった。
【００２２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】流加相において単一の炭素源としてグリセロールまたはグルコースを用いるH.polymorphaの比較培養の時間経過。
【図２】流加溶液中のグルコースの割合を増加させながら行なった反復流加培養サイクル。
【図１】
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【図２】
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