(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性部材、及び該導電性部材表面に薄膜状に形成したスーパーオキシドジムスターゼを含んで成り、該スーパーオキシドジムスターゼが鉄スーパーオキシドジムスターゼ及び／又はマンガンスーパーオキシドジムスターゼであり、スーパーオキシドイオンと接触することにより、前記鉄及び／又はマンガンの価数が３価から２価に変化する電気化学用電極と、対極及び基準電極を、スーパーオキシドイオンを含有する対象溶液に浸漬し、鉄及び／又はマンガンの価数が３価から２価に変化することによる電流を検出することにより、スーパーオキシドイオン濃度を測定することを特徴とする濃度測定用センサー。
【請求項２】
導電性部材表面に、その表面をチオール基を含む有機化合物で薄膜状に修飾した金下地層を有する請求項１に記載の濃度測定用センサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気化学用電極を使用する濃度測定用センサーに関し、特に生体内の活性酸素であるスーパーオキシドイオン（Ｏ2-）の濃度やこのスーパーオキシドイオンの分解酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide Dismutase、以下ＳＯＤという）の濃度測定用電気化学的電極を使用するスーパーオキシドイオン濃度及び／又はＳＯＤの濃度測定用センサーに関し、より詳細には生体内にインビボ（in vivo)に適用できるほど微小化が可能なスーパーオキシドイオンやＳＯＤの濃度測定用センサーに関する。
【０００２】
活性酸素種は生体内では、生理活性物質の合成、殺菌作用、老化現像などに関連して重要な役割を有している。この活性酸素種は生体内ではキサンチン酸化酵素（ＸＯＤ）によるキサンチン及びヒポキサンチンなどの尿酸への酸化、酸素のヘモグロビンによる還元などにより生成する。
活性酸素種の一種であるスーパーオキシドイオン（Ｏ2-）の生体内での濃度測定は各種疾患の特定などのために重要である。従来インビトロ（in vitro、体外） で、チトクロムＣ（３価、Ｆｅ3+）のスーパーオキシドイオンによる還元反応（式（１））により生ずるチトクロムＣ（２価）の550 nmの光吸収量を測定することにより前記スーパーオキシドイオンの定量、及びこれを応用するＳＯＤの濃度測定が試みられている。ＳＯＤの濃度測定はＳＯＤが活性であると式（１）の反応が進行せず、チトクロームＣ（２価）が生成しないことを利用する。しかし、Ｏ2-との反応特異性が十分でないこと、及び反応が遅くかつ操作が煩雑であるという問題があった。
cyt c （３価）＋  Ｏ2- →  cyt c （２価）＋  Ｏ2 （１）
【０００３】
その他にＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）の還元、ＴＮＭ（テトラニトロメタン）の還元、アドレナリンの酸化、ウミホタルルシフェリン誘導体（MCLA, Cypridina luciferin analog, 2-methyl-6-[p-methoxyphenol]-3,7,dihydroimidazo-[1，2-a] pyrazine-3-one), 又はCLA (2-methyl-6-phenyl-3,7,dihydroimidazo-[1，2-a] pyrazine-3-one)) へのＯ2-の付加物の発光等を利用してスーパーオキシドイオンの濃度測定が試みられているが、いずれもインビトロでの分光学的手法である。
【０００４】
インビボで直接血液中のＯ2-を検出することも従来から試みられている。Cooperらは、金や白金の表面をＮ−アセチルシステインで修飾し、その上にＳＯＤやチトクロムＣなどの蛋白質をＳ−Ａｕ結合させた酵素電極を作製し、チトクロムＣ（３価）のスーパーオキシドイオンによる還元で生じたチトクロムＣ（２価）を該チトクロムＣ（２価）が酸化されうる（式（２））程度に酵素電極の電位を保ち、これにより得られる酸化電流からスーパーオキシドイオンの濃度を測定する方法を提案している [J. Electroanal. Chem., 347, 267-275(1993)]。更にこの方法では間接的にＳＯＤ濃度を測定できる。
cyt c （２価）→  cyt c （３価）＋  ｅ                （２）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら式（１）の反応速度が遅いため（約105Ｍ-1s-1) 、チトクロムＣとＯ2-との反応を用いるこの方法は実用的でなく、又この式（１）の反応はスーパーオキシドイオンに特有のものでなく、生体内の他の還元種でも還元されてスーパーオキシドイオン独自の電流以上の電流が流れるため、発生する電流とスーパーオキシドイオンとが正確に対応せず、間接的に測定されるＳＯＤに関しても同様であるという問題点がある。
【０００６】
ＳＯＤを使用するスーパーオキシドイオン測定方法では、ＳＯＤを測定液に溶かし、式（３）のように測定対象であるスーパーオキシドイオンの還元反応（ＳＯＤによる分解）により生成する過酸化水素を、該過酸化水素が酸化分解されうる程度の電極電位に保ち（0.32Ｖ以上）、式（４）に示すような反応で分解させこの際に生ずる酸化電流を測定しその測定値からスーパーオキシドイオンの濃度を判定している〔C.J.McNeil et al., Free Rad. Res. Comms.,
17, 399-406(1992)]。
２Ｏ2- ＋  ２Ｈ+   →  Ｈ2Ｏ2  ＋  Ｏ2 （３）
Ｈ2Ｏ2 →  Ｏ2＋  ２Ｈ+ ＋  ２ｅ                  （４）
【０００７】
式（３）の反応速度は速い（ｐＨ４〜７で107〜105Ｍ-1ｓ-1）ため、電流と濃度の対応関係は良好であるが、過酸化水素の濃度測定による間接的な濃度測定となるため、例えば過酸化水素が他の生体内部位で生産され安定に血液中に存在している場合にはスーパーオキシドイオンに起因しない過酸化水素の濃度分だけ濃度が増加するため、不正確な濃度測定法になってしまうという欠点がある。
本発明は、Ｏ2-濃度の検出や分解に使用できる電気化学的電極を使用して、高速検出と過酸化水素等の併存物質に影響されない高精度検出を可能にするＯ2-濃度測定用センサーを提供すること、特にインビボで安全かつ高精度で迅速にＯ2-濃度を検出できるＯ2-濃度測定用センサーを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、導電性部材、及び該導電性部材表面に薄膜状に形成したスーパーオキシドジムスターゼを含んで成り、該スーパーオキシドジムスターゼが鉄スーパーオキシドジムスターゼ及び／又はマンガンスーパーオキシドジムスターゼであり、スーパーオキシドイオンと接触することにより、前記鉄及び／又はマンガンの価数が３価から２価に変化する電気化学用電極と、対極及び基準電極を、スーパーオキシドイオンを含有する対象溶液に浸漬し、鉄及び／又はマンガンの価数が３価から２価に変化することによる電流を検出することにより、スーパーオキシドイオン濃度を測定することを特徴とする濃度測定用センサーである。
【０００９】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、主としてＳＯＤを有する電極のスーパーオキシドイオンに対する特異性を利用して、スーパーオキシドイオンの濃度測定を行うことを意図している。そして本発明の電極やセンサーはインビボ（in vivo 、生体内）への適用が可能である。又本発明は、チオール基を含む有機化合物とＳＯＤの相互作用による結合を利用してＳＯＤ濃度を測定することもできる。そして本発明では前記ＳＯＤが鉄ＳＯＤ又はマンガンＳＯＤであることを特徴とする。
ＳＯＤのレドックス系は異なるが、生物や臓器の種類に応じて現在までに、銅−亜鉛−ＳＯＤ、マンガン−ＳＯＤ、鉄−ＳＯＤ、鉄−亜鉛−ＳＯＤ、ＥＣ（細胞外）銅含有−ＳＯＤなどが知られている。
これらのＳＯＤのＯ2-のＨ2Ｏ2及びＯ2への分解機構を検討したところ、ＳＯＤ中に含まれる酸化還元中心となる金属イオンとして、Ｆｅ（２＋）／Ｆｅ（３＋）あるいはＭｎ（２＋）／Ｍｎ（３＋）を有する鉄ＳＯＤあるいはマンガンＳＯＤでは、他のＳＯＤより反応速度が増大し、センサー感度を５倍程度向上させることができた。ＳＯＤは百以上のアミノ酸が配列した分子量39500の物質であり、ＳＯＤの表面の一部には、上縁（入口）側が200〜300ｎｍ、底部（奥部）が40ｎｍ程度の孔が存在する。ＳＯＤの反応部位はこの孔の底部に位置し、孔内面にはカチオン基が密集している。従って例えば血液中の成分のうちアニオンのみが選択的に前記孔内を移動でき、しかもスーパーオキシドイオンのような小さいアニオンのみが前記反応部位に到達でき、スーパーオキシドイオンの選択特異的な分解反応（特に不均化反応といわれる）が起こると考えられている。分解生成物である酸素と過酸化水素は反応部位から放出される。従ってＯ2-由来の電流のみを検出して正確な濃度測定を行える。
【００１０】
ＳＯＤによるスーパーオキシドイオンの酸素と過酸化水素への分解機構は、それに含まれる金属イオンである鉄及びマンガンが寄与していると考えられている。
つまりＳＯＤのＭ（３価）はＯ2-と反応して自身がＭ（２価）に還元されてＯ２を放出し（式（５））、更にＯ2-が存在するとＭ（２価）はＯ2-と反応して自身がＭ（３価）に酸化されるとともにＨ＋及びＯ2-と反応してＨ2Ｏ2を生成する（式（６））。
Ｍ３＋  ＋  Ｏ2- →  Ｍ２＋＋  Ｏ2 （５）
Ｍ２＋  ＋  ２Ｈ＋  ＋  Ｏ2-  →  Ｍ３＋  ＋  Ｈ2Ｏ2 （６）
溶液中にＳＯＤが存在し、これにＯ2-が接触すると、Ｍ３＋−Ｍ2+対による式で示した酸化還元反応（メディエーション反応）が進行する。この状況を図１に示した。
【００１１】
又個々の電極ごとに見ると次のようになる。
ＳＯＤを有する電極を、そのＳＯＤ中のＭ３＋が安定でかつＯ2-が不安定な電位範囲に維持すると、陽極に到達したＯ2-は式（５）に従って酸化されて酸素となりＭ３＋はＭ２＋となる。生成したＭ２＋はＯ2-から奪った電子を陽極に与えて図２に示す通り再びＭ３＋となる。このときの酸化電流を測定すると、Ｏ2-の濃度を知ることができる。
他方ＳＯＤを有する電極を、そのＳＯＤ中のＭ２＋が安定でＯ2-が不安定で更に過酸化水素が安定な電位範囲に維持すると、陰極に到達したＯ2-は式（６）に従って還元されて過酸化水素となり、Ｍ２＋はＭｎ３＋になる。生成したＭｎ３＋はＯ2-に移った電子を補うため陰極から電子を奪って再びＭ２＋となる。この様子を図３に示した。
【００１２】
この際に生ずる酸化還元電流はこの酸化還元反応で消費されるスーパーオキシドイオンの総量に比例するため、予め流れる電流とスーパーオキシドイオンの濃度の関係を求めておけば、電流値からスーパーオキシドイオンの濃度を測定できる。
本発明の導電性部材表面に薄膜状にＳＯＤを形成した電極では、酸化還元反応に寄与するＭ2+及びＭ3+（Ｍは鉄又はマンガン）がＳＯＤの細孔内深い箇所に存在し、スーパーオキシドイオンとは反応するが過酸化水素とは反応しないという特質を有するため、この酸化還元系とは別個に生体内に過酸化水素が安定に存在してもこの過酸化水素が前記Ｍ2+及びＭ3+と接触してこれに起因する電流が流れることがなく、スーパーオキシドイオン濃度の正確な測定が可能になる。
【００１３】
前述した通り、本発明では、導電性部材表面と前記ＳＯＤ薄膜間に、導電性部材側から、金の下地層及びその上にチオール基を含む有機化合物の薄膜を形成した修飾電極を構成しても良く、前記チオール基とＳＯＤの相互作用による結合を利用してＳＯＤ濃度を測定することもできる。
【００１４】
本発明に係る電極の導電性部材としては、導電性があり安定であれば限定されず、例えばカーボン、チタン、ニッケル、鉄あるいはそれらの酸化物を使用することができ、ＳＯＤ測定用電極の場合は該導電性部材の表面は前述した通り金で被覆されて金下地層として存在することが特に望ましい。
金は熱分解法、樹脂による固着法、蒸着法、電気めっき法、無電解めっき法等により、10〜100 ｇ／ｍ2となるように形成させる。チオール成分を溶解させた水又は有機溶媒（例えばメタノールやアセトン）に金下地層を形成した導電性部材を浸漬し、取り出し乾燥することにより容易に形成できる。乾燥しても金下地層に固着しなかったチオール成分は有機溶媒のみの溶液に浸漬することにより容易に溶解除去できる。なお金下地層を形成する代わりに導電性部材として金を使用しても良い。
このような金下地層とチオール基を有する有機化合物の薄層を形成する理由は、金下地層とチオール基の硫黄との間に強固なＡｕ−Ｓ結合を形成するとともに、有機化合物の有する親油性、親水性等により該有機化合物とＳＯＤの間にも強い相互作用を生じさせるためである。但し導電性部材の表面に直接ＳＯＤの薄層を形成しても良い。
【００１５】
前記チオール基を有する有機化合物として次の化合物を例示できる。チオフェノール（Ｃ6Ｈ5−ＳＨ）、４−アミノチオフェノール（ｐ−Ｈ2Ｎ−Ｃ6Ｈ4−ＳＨ）、４−メルカプトピリジン（ｐ−Ｃ5Ｈ4ＮＳＨ）、ビス（４−ピリジル）ジスルフィド（ｐ−Ｃ5Ｈ4Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｃ5Ｈ4Ｎ−ｐ）、メチオニン〔ＣＨ3−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ〕、ｐ−チオクレゾール（ｐ−ＨＳ−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ3）、２−メルカプトピリミジン（Ｃ4Ｎ2Ｈ3−ＳＨ）、ブタンチオール（Ｃ3Ｈ7−ＳＨ）、２−アミノエタンチオール（ＨＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、シスチン〔ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ〕、システイン〔ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ2〕、イソシステイン〔Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＯＯＨ〕、Ｎ−アセチルシステアミン（ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯＣＨ3）、Ｎ−アセチルシステイン〔ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯＣＨ3〕、システイニルグリシン〔ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ〕、α−ホモシステイン〔ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ〕、β−ホモシステイン〔ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ〕、α−メチルシステイン〔ＨＳ−ＣＨ2−Ｃ（ＮＨ2）（ＣＨ3）−ＣＯＯＨ〕、３−メルカプトプロピオン酸（ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）、メルカプト酢酸（ＨＳ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）。
【００１６】
このようにチオール基を有する有機化合物の薄層を形成した導電性部材を好ましくは水洗した後に、ＳＯＤの薄層を形成する。該薄層は、例えばＳＯＤの水溶液あるいはＳＯＤを溶解したＥＤＣ（水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）溶液に前記チオール修飾導電性部材を１時間から１日程度浸漬し、固着されなかった分をリン酸緩衝液（ｐＨ７）で十分に浸漬して除去して作製でき、該薄層を形成することにより特に濃度測定用として好ましく使用できる電気化学用電極が完成する。
この濃度測定用電極を実際に濃度測定に使用する際には対極が必要で、該対極は生体内に入ることが多いため、安全性の高い材料（例えば白金、チタン及びカーボン等）で構成することが好ましい。
【００１７】
電位を制御する基準電極は、通常、銀／塩化銀、水銀／塩化第二水銀が用いられるが、固体の基準電極を用いることもできる。電位を好ましい範囲に維持する際に検出限界濃度を向上させる目的で電位のパルスを与えることも好ましい。微小電極の場合、あるいは複数個の電極から構成される構造の場合は、濃度に対して一定の拡散電流が観察されることを利用しても良い。これらの工夫により流速の影響を排除できる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
次に添付図面に基づいて本発明の濃度測定用電極を有する濃度測定装置及び濃度測定用センサーの一実施形態を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
図４は、本発明のスーパーオキシドイオン濃度測定用装置の一実施形態を示す概略断面図、図５は図４の濃度測定用電極の拡大断面図である。
図４において、濃度測定用装置１は、試料室２及び該試料室２に、スーパーオキシドイオンが溶解した試料溶液が供給される試料供給管３及び濃度測定後の試料溶液が排出される排出管４から成っている。試料室２内の試料溶液５中には濃度測定用電極６、カーボン製対極７及び基準電極８が浸漬されている。
【００１９】
前記濃度測定用電極６は図５に示すように、カーボンやチタンからなる導電性部材９、該導電性部材９上に被覆された金下地層10、該金下地層10の金原子に結合したチオール基を有する有機化合物11及び該有機化合物11と相互作用するスーパーオキシドイオン分解酵素（スーパーオキシドジムスターゼ、ＳＯＤ）12から成っている。
このような構成から成る装置１の試料室２にスーパーオキシドイオンが溶解した試料溶液５を試料供給管３を通して供給すると、濃度測定用電極６のＳＯＤ12中のマンガン及び／又は鉄がＭｎ2+又はＦｅ2+であれば前述のように自身がＭｎ3+又はＦｅ3+に酸化されるとともにスーパーオキシドイオンを還元して過酸化水素を生成する。
【００２０】
このときに流れる電流を対極７及び基準電極８を利用して測定すると、試料室２に供給された試料溶液５中に溶解しているスーパーオキシドイオン濃度を検出することができる。
更に前記濃度測定用電極６に担持されたＳＯＤ12のマンガンイオン又は鉄イオンは過酸化水素とは接触しにくく過酸化水素が存在しても該過酸化水素に起因する酸化電流が流れることは殆どなく、従来と異なり正確な濃度測定ができる。
ここに例示したスーパーオキシドイオンとは異なりスーパーオキシドイオン分解酵素の濃度を測定する場合には、図５においてＳＯＤ12が結合していない電極を使用する。
【００２１】
図６は、本発明の濃度測定用センサーの一実施形態を示す概略断面図である。
濃度測定用センサー21は円筒状本体の下端部を縮径した中空状の形状を有し、この縮径部に作用極22が充填され、該作用極22への導線23がセンサー21の側壁に沿って配設されている。前記作用極22の上方には、離間して対極24と基準極25が配設され、それぞれ導線26、27によりセンサー本体の基部に嵌合されたストッパ28を通って外部に導かれている。
このような構成から成るセンサー21は、人体の要所に挿入され、図４及び５で説明した原理によりスーパーオキシドイオン及び／又はＳＯＤの濃度測定が行われる。
【００２２】
次に本発明に係る濃度測定用センサーによる濃度測定の実施例及び比較例を記載するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１
電極直径1.6 mmの金線の先端を電極とし、側面部位はシールした。更に表面を研磨し、水中で超音波洗浄した後、硫酸中で電気化学的に酸化還元し活性処理を行って電極ｃとした。
メルカプトプロピオン酸を１ｍＭ溶解した溶液に前記電極ｃを10分間浸漬し、メルカプトプロピオン酸の修飾層を形成した。前記溶液から取り出した電極ｃを純水に浸漬して電極ｃに固着されなかったメルカプトプロピオン酸を除去して電極ａとした。
【００２３】
次いで鉄−ＳＯＤ［シグマ社製、Ｓ5389、酵素活性3000〜6000Ｕ／mg−蛋白質］が500Ｕ／mlの濃度になるように、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、この緩衝液に前記電極ａを浸漬し、かつ取り出し後に乾燥して電極ｂとした。
電極ａ、ｂ及びｃのそれぞれを別個に、鉄−ＳＯＤを含まない５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に入れ、対極を白金線、基準電極を銀／塩化銀とし、該対極及び基準電極を前記電極ａ、ｂ又はｃに近接させてセンサーを構成した。
前記各電極ａ、ｂ又はｃを有する各センサーに対し100mV／秒の走査速度で電流電位測定を行った。該測定の結果（電流電位応答性）を図７のグラフにそれぞれ曲線ａ、ｂ又はｃで示した。
【００２４】
電極ｂのみで０Ｖ及び0.2Ｖ付近にＳＯＤの酸化還元に相当する電流ピークが可逆的に観察され、ＳＯＤがメルカプトプロピオン酸の修飾層の上に固定されていることが示された。
図８に、２ｍＭのＯ2-を含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）での前記電極ａ、ｂ及びｃの電流電位応答曲線を示した。電極ｂではＯ2-の酸素への酸化分解に対応する酸化電流の増大が0.2Ｖ付近で見られたが、電極ａ及びｃでは、これに対応する電流が全く観察されなかった。一方、電極ｂでは、0.1Ｖ付近にＯ2-の還元分解に対応する電流が見られたが、電極ａ及びｃではこれに対応する電流は全く観察されなかった。
【００２５】
実施例２
実施例１の緩衝液を、鉄−ＳＯＤを結合した実施例１の電極ｂ、対極及び基準電極を有する図４の装置に６ml／分の速度で供給し、電極電位を−0.05Ｖ及び0.3Ｖに固定し、そのときに観察される鉄−ＳＯＤ濃度に対する定常電流値をそれぞれ図９ａ及び図９ｂに示した。両図から、鉄−ＳＯＤ濃度と定常電流値は直線関係にあることが分かった。
【００２６】
実施例３
鉄−ＳＯＤの替わりに、マンガン−ＳＯＤ［シグマ社製、Ｓ5639、酵素活性2500〜5000Ｕ／mg−蛋白質］を用いたこと以外は、実施例１と同様にして電極ｂ（マンガン−ＳＯＤを結合した電極）を作製した。この電極ｂの電流電位応答曲線性を図10に示した。
図10から、0.1Ｖ及び0.2Ｖ付近にＳＯＤの酸化還元に相当する電流ピークが可逆的に観察され、ＳＯＤがメルカプトプロピオン酸の修飾層の上に固定されていることが示された。
Ｏ2-が存在すると酸素への酸化分解に対応する電流の増大が0.2Ｖ付近に見られ、又0.1Ｖ付近では還元分解に対応する電流が見られたが、Ｏ2-が存在しないときには、マンガン−ＳＯＤそのものの酸化還元電流だけが観察された。
【００２７】
比較例１
実施例１の金線にＮ−アセチルシステインを被覆し、その上にチトクロムＣをＳ−Ａｕ結合で担持させて酵素電極とした。
この電極を使用して実施例１と同一条件で電流を観察したところ、Ｏ2-の分解に対応する電流が見られた。しかし過酸化水素を共存させたところ、電流が増加しＯ2-の定量は不可能であった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、導電性部材、及び該導電性部材表面に薄膜状に形成したスーパーオキシドジムスターゼを含んで成り、該スーパーオキシドジムスターゼが鉄スーパーオキシドジムスターゼ及び／又はマンガンスーパーオキシドジムスターゼであり、スーパーオキシドイオンと接触することにより、前記鉄及び／又はマンガンの価数が３価から２価に変化する電気化学用電極と、対極及び基準電極を、スーパーオキシドイオンを含有する対象溶液に浸漬し、鉄及び／又はマンガンの価数が３価から２価に変化することによる電流を検出することにより、スーパーオキシドイオン濃度を測定することを特徴とする濃度測定用センサーである。
本発明のセンサーの濃度測定用電極の導電性部材上に形成したＳＯＤは、Ｏ2-のみを選択的に酸化して酸素ガスを発生し又は還元して過酸化水素を生成し、過酸化水素及び酸素に対しては不活性である。従ってＯ2-を含む溶液中に前記電極を浸漬すると、過酸化水素及び酸素の存否に影響されることなく、Ｏ2-のみに対応する酸化又は還元電流が流れる。この電流値を測定することにより、前記溶液中の正確なＯ2-濃度が検出できる。又生体内で安定でありかつ反応速度が速いため、インビボで好適に使用できる。
そして本発明の鉄ＳＯＤ及び／又はマンガンＳＯＤは他の金属−ＳＯＤより５倍程度の感度で電流検出ができ、センサーとして使用する場合の機能信頼性が向上する。
又カーボンやチタン製である導電性部材表面に、チオール基を含む有機化合物を薄膜状に修飾した金下地層を形成しても良く、この金下地層は導電性部材とＳＯＤをＳ−Ａｕ結合を介して強固に結び付け、Ｏ2-測定の正確性を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＯＤ中の金属（鉄又はマンガン）イオンを使用するＯ2-の酸化還元サイクルを示す説明図。
【図２】図１の陽極側のＯ2-の酸化状況を示す説明図。
【図３】図１の陰極側のＯ2-の還元状況を示す説明図。
【図４】本発明の濃度測定用装置の一実施形態を示す概略断面図。
【図５】図１の濃度測定用電極の要部拡大図。
【図６】本発明の濃度測定用センサーの一実施形態を示す概略断面図。
【図７】実施例１の電極ａ、ｂ又はｃの５ｍＭリン酸緩衝液中での電流電位応答性を示すグラフ。
【図８】実施例１の電極ａ、ｂ又はｃの２μＭのＯ2-を含む５ｍＭリン酸緩衝液中での電流電位応答性を示すグラフ。
【図９】図９ａ及び図９ｂはそれぞれ、実施例２で電極電位を−0.05Ｖ及び0.3Ｖに固定したときに観察される鉄−ＳＯＤ濃度に対する定常電流値を示すグラフ。
【図１０】実施例３の電極ｂの電流電位応答性を示すグラフ。
【符号の説明】
１    濃度測定用センサー
２    試料室
３    試料供給管
４    排出管
５    試料溶液
６    濃度測定用電極
７    対極
８    基準電極
９    導電性部材
10    金下地層
11    有機化合物
12    スーパーオキシドイオン分解酵素
21    濃度測定用センサー
22    作用極
24    対極
25    基準極
【図１】
0004085173.tif 000002
【図２】
0004085173.tif 000003
【図３】
0004085173.tif 000004
【図４】
0004085173.tif 000005
【図５】
0004085173.tif 000006
【図６】
0004085173.tif 000007
【図７】
0004085173.tif 000008
【図８】
0004085173.tif 000009
【図９】
0004085173.tif 000010
【図１０】
0004085173.tif 000011