(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から単離された核酸を増幅することを含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のｈＭＬＨ１タンパクの４４位における非保存的アミノ酸置換を生じるＣからＴへの転位型突然変異により特徴付けされるｈＭＬＨ１変異を検出することを含む、患者の遺伝的非ポリポシス大腸ガン（ＨＮＰＣＣ）に対する罹りやすさを調べる方法。
【請求項２】
前記単離された核酸がＲＮＡである場合、前記単離された核酸の逆転写を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出工程が、
−ＭＬＨ１遺伝子を欠いた酵母株に患者から単離された核酸を導入する工程；および
−ＤＮＡミスペアを修正する酵母株の能力をアッセイする工程
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子産物と野生型ｈＭＬＨ１タンパクとの間の相互作用の程度を測定することをさらに含む、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法においてｈＭＬＨ１ゲノム配列を増幅することができる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−１２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法の検出工程においてｈＭＬＨ１遺伝子とハイブリダイズすることができる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２によって表されるプローブ。
【請求項７】
前記検出工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド部位１１８−１３５および３４３−３５９に対応する二つのプライマーのセットによって増幅される、患者のｈＭＬＨ１遺伝子のＤＮＡ配列における変異を検出することを含む、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、［the National Institute of Health in the General Sciences Division］によって授与された認証番号ＧＭ３２７４１および認証番号ＨＧ００３９５／ＧＭ５０００６の基で、政府の支持を得てなされたものである。政府は、本発明において一部の権利を有する。
本願は、１９９４年３月８日に出願された出願米国特許出願第０８／２０９５２１号、名称：ほ乳類ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子ＰＭＳ１およびＭＬＨ１（MAMMALIAN DNA MISMATCH REPAIR GENES PMS1 AND MLH1）の一部継続出願であって、この出願は、１９９３年１２月１７日に出願された米国特許出願第０８／１６８８８７号の一部継続出願である。上述の全ての特許出願を参照として取り込む。
発明の分野
本発明は、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子に関連する。特に、本発明は、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子における変異および多型性の検出、ＤＮＡミスマッチ修復不完全腫瘍（mismatch-repair-defective-tumors）の同定および特徴付け、並びにガンの遺伝的な罹りやすさ（susceptibility）の検出に関連する。
背景
近年、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）等の強力なクローニングおよび増幅技術の進展に伴い、多数のヒト遺伝子とマーカーの構造および局在箇所に係る情報の急速な蓄積と組み合わせて、高頻度である種の遺伝的疾患を示すと同定されたファミリーのメンバーである個人のＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルを回収し分析することが実用かつ利用できるようになってきた。例えば、スクリーニング工程は、鎌状赤血球貧血、嚢胞性繊維症、ぜい弱Ｘクロモソーム症候群および多発性硬化症を含む遺伝子のスクリーニングに決まって使用される。ある種の疾患では、早期の診断により、例えば、積極的な診断方法の採用および／または、予期された問題の予防または準備に適切であればライフスタイルを変えることによって、ヒトの長期の予後を大幅に改良することができる。
ある特定のヒト遺伝子変異が同定され、ある病気と関連づけられれば、危険性の高い個人を同定するスクリーニング工程の改良は比較的直ぐになされる。例えば、変異遺伝子の構造および正常でない表現型の役割がわかった後で、試験のために個人から遺伝子の増幅量を得るための、ＰＣＲ用プライマーを設計することができる。しかしながら、変異遺伝子の最初の発見、すなわちその構造、局在箇所および既知の遺伝的な健康上の問題との結合は、実質的な実験の努力を必要とし、調査手段を生じる。
ある疾患を引き起こす変異遺伝子の役割を発見する一つの試みは、高頻度にその疾患を示すファミリーの個人に係る診療研究から始まる。これらの研究では、疾患誘発座（locus）の適切な位置は、その座で隔離しがちなクロモソームを調査することによって間接的に決定される。この試みの原理的な制限は、その遺伝子の適切な遺伝子位置を決めることはできるが、一般的にその遺伝子を実際に単離または配列決定できないことである。例えば、Ｌｉｎｄｂｌｏｍら3は、高い発生率の遺伝的非ポリポシス大腸ガン（ＨＮＰＣＣ）を示すことが知られているファミリーの個人におけるＳＳＬＰ（単純配列長さ多型性（simple sequence length polymorphism））マーカーを用いて行われた結合分析研究の結果を報告している。Ｌｉｎｄｂｌｏｍらは、ヒトクロモソーム３（３ｐ２１−２３）の短い腕の多型性マーカーと、大腸ガンを進展する個人の危険性を増加する原因となるであろう疾患座との間の“堅固な結合”を見出した。３ｐ２１−２３は、全体的な遺伝子に対してかなり特異的な位置ではあるが、問題の大きさの変異遺伝子に対する巨大なＤＮＡ領域を示す。この変異遺伝子は、多数の塩基で、その座を同定するマーカーから分けることができる。ある人の危険性を予測するために、遺伝的分析は、そのファミリーにおける多数の関連した個人にしっかり結合した遺伝マーカーで行われなければならないため、このような結合研究は、せいぜいスクリーニング目的に利用性を限定してしまう。特に病気に冒されたファミリーのメンバーが死亡してしまう場合には、このような情報を得ることは多くの場合不可能である。また、情報マーカーは、分析下でファミリーに存在しないかもしれない。遺伝子構造を知ることなくして、サンプリング、増幅、配列決定および個人が変異遺伝子を有するか否かを直接的に決定することは不可能である。
疾患誘発変異遺伝子を見出す別の試みは、疾患に係る既知の情報、例えば病状のメカニズムの理論、関連するタンパクの構造および機能、ヒトまたは他の種における可能な類似遺伝子等に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計することおよび試みることから始まる。その目的は、個人に疾患の傾向を与える変異体に起こると信じられている候補の正常遺伝子を単離および配列決定することである。この試みは、その疾患について分子レベルでどれくらい多くのことが知られているか、並びに候補の遺伝子を見出す戦術および方法を組み立てるための研究者の力量に高度に依存する。候補の遺伝子の変異と疾患との関係は、疾患の高い発生率を示すファミリーのメンバーにおける試験を行うことによって究極的に調べられなければならない。ファミリーの研究におけるそのような結合を確かめる最も直接的かつ決定的な方法は、そのファミリーのメンバーから回収されたサンプルの候補となる遺伝子の部分を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いることである。次いで、変異を探して特徴付けるために、増幅遺伝子産物を配列決定し、正常な遺伝子構造と比較する。所定の変異は、病気にかかっていない個人はそれを持っていないが、病気にかかった個人はそれを有していることを示すことによって、並びに、その変異が、簡単な多重性ではないタンパク機能における変化を引き起こすことを示すことによって、最終的に関係付けられる。
候補の遺伝子変異と疾患との間の結合の高い見込みを示す別の方法は、遺伝子のクロモソームの位置を決定し、次いで遺伝子地図の位置をＬｉｎｄｂｌｏｍらによって同定されたもの等の疾患関連座の既知の領域と比較することによる。以前に同定された疾患関連座の領域の候補遺伝子の完全に一致するマップ位置は、候補遺伝子における変異と疾患との間の関係を強力に関連づけるであろう。
遺伝子候補における変異が疾患に係るかもしれないことを示す別の方法がある。例えば、人工的に産生された遺伝子の変異形態を動物に導入することができる。次いで、変異遺伝子を有する動物における疾患の発生率を、正常な遺伝子型を有する動物と比較することができる。野生型の遺伝子を備えた動物と比べて、変異遺伝子型を有する動物において疾患の発生率が顕著に高められたことは、候補の遺伝子内の変異が、時に疾患の発生の原因であるという理論を支持しうる。
疾患関連遺伝子変異により最近多くの注目を集めたある種の疾患は、遺伝的非ポリポシス大腸ガン（Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer）（ＨＮＰＣＣ）1,2である。また、ＨＮＰＣＣファミリーのメンバーは、子宮内膜、卵巣、胃および胸を含む別のガンへの罹りやすさを増加することも示す。大腸ガンの約１０％は、ＨＮＰＣＣであると信じられている。ＨＮＰＣＣ患者の腫瘍は、ヒトクロモソームＤＮＡ（“ミクロサテライトＤＮＡ”）に見られるジヌクレオチド（二つのヌクレオチド）の繰り返し配列のような、短い、繰り返しＤＮＡ配列が不安定と思われる、異常な遺伝的欠陥を示す。この短い、繰り返しＤＮＡ配列の遺伝子の不安定性は、“ＲＥＲ＋”発現型と称されることがあるが、多くの種類の散在性の腫瘍にかなりの割合で観察され、多くの散在性の腫瘍がＨＮＰＣＣにおける遺伝した変異に類似（または同一）の変異を得ることが仮定される。
遺伝的結合の研究は、９０％程度のＨＮＰＣＣを説明すると考えられる二つのＨＮＰＣＣ座を同定した。この座は、ヒトクロモソーム２ｐ１５−１６（２ｐ２１）および３ｐ２１−２３に位置づけられる。後の研究により、ヒトＤＮＡミスマッチ修復遺伝子ｈＭＳＨ２が、クロモソーム２ｐ２１上の遺伝子であることを同定し、変異がＨＮＰＣＣガンの重要な画分であることを説明した1,2,12。ｈＭＳＨ２は、その正常な機能は、クロモソーム複製の各段階に流れるミスペアを含むＤＮＡのミスペアを同定して正すいくつかの遺伝子の一つである。
最もよく調べられたミスマッチ修復経路は、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｍｕｔＳおよびｍｕｔＵ（ｕｖｒＤ）遺伝子産物に依存したロングパッチ（約３Ｋｂ）切除修復反応を起こすＥ．ｃｏｌｉのＭｕｔＨＬＳ経路である。このＭｕｔＨＬＳ経路は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける最も活性の高いミスマッチ修復経路と考えられており、ＤＮＡ複製の正確さを増加し、ミスペアの塩基を含む中間物の組換えに作用することが知られている。このシステムはin vitroで再構築され、ＤＮＡポリメラーゼIIIホロ酵素、ＤＮＡリガーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク（ＳＳＢ）およびＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ VIIまたはＲｅｃＪ等の一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼの一つと一緒に、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｍｕｔＳおよびｕｖｒＤ（ヘリカーゼII）タンパクを必要とする。ｈＭＳＨ２は、細菌性ｍｕｔＳ遺伝子に相同である。イーストにおける類似経路は、イーストＭＳＨ２遺伝子およびＰＭＳ１およびＭＬＨ１と称される二つのｍｕｔＬ様遺伝子を含む。
ヒトｍｕｔＳ型遺伝子（ｈＭＳＨ２）の変異が時にガンを引き起こすという知識、およびＨＮＰＣＣ腫瘍がミクロサテライトＤＮＡの不安定性を表すという発見に基づいて、他のＤＮＡミスマッチ修復遺伝子および遺伝子産物における関心、およびＨＮＰＣＣおよび／または他のガンにおけるその可能な役割がいっそう強烈になった。２００人中１人が、ｈＭＳＨ２遺伝子または同じＤＮＡミスマッチ修復経路における別のタンパクをコードする他の関連遺伝子に変異を起こすと概算される。
我々の研究の重要な目的は、ガンを引き起こす危険性の高い個人をスクリーニングおよび同定するのに使用できるヒト遺伝子を同定することである。他の目的は：このような遺伝子のエキソンおよび隣接するイントロンの構造の配列を決定すること；ガンの罹りやすさを与える遺伝子産物の欠損または欠陥をもたらす変異を見出し特徴付ける目的の試験方法を設計するために構造的な情報使用すること；このような変異を“無害な”多型性の種類と区別することである。他の目的は、腫瘍のタイプを診断し適切な治療を処方するために、ガン関連遺伝子のエキソンおよび隣接するイントロン配列に係る構造情報を用いることである。他の目的は、研究用の他の関連候補ヒト遺伝子を同定するために、ガン関連遺伝子に係る構造情報を用いることである。
発明の要旨
ミスマッチ修復遺伝子の保存を含む細菌およびイーストにおけるＤＮＡミスマッチ修復メカニズムに関する我々の知識に基づいて、ヒトＤＮＡミスマッチ修復同族体が存在すべきであること、およびタンパク機能に影響するこのような同族体における変異が、ことによるとヒトのガンのある形態を引き起こす危険性を増す遺伝学的な不安定性を引き起こすであろうことを理由付けた。
それぞれＤＮＡミスマッチ修復に係る一つのタンパクをコードする二つのヒト遺伝子、ｈＰＭＳ１およびｈＭＬＨ１を単離して配列決定した。ｈＰＭＳ１およびｈＭＬＨ１は、Ｅ．ｃｏｌｉで見出されたｍｕｔＬ遺伝子に相同である。我々の研究は、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子における変異とＨＮＰＣＣへの罹りやすさとの間の関係を強力に支持する。しかして、本発明のＤＮＡミスマッチ修復遺伝子配列情報、すなわちｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１に係るｃＤＮＡおよび遺伝子構造は、ガンの危険性の決定および診断に関連する多数の使用可能な方法を可能にする。また、本発明は、このような方法に使用できる多数のヌクレオチドおよびタンパクの構造を含む。
我々は、ｈＭＬＨ１の位置をヒトクロモソーム３ｐ２１−２３にマップした。これは、ファミリーの研究に基づいた、個人をＨＮＰＣＣに罹りやすくする座を保有するヒトゲノムの領域である。さらに、我々は、スウェーデンのファミリーのＨＮＰＣＣに冒された個人におけるｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡの保存された領域に変異を見出した。この変異は、同じファミリーの病気に罹っていない個人からは見出されず、単なる多型性ではなかった。また、イーストにおける相同な変異が、欠陥のあるＤＮＡミスマッチ修復タンパク質をもたらすことを見出した。また、英国のファミリーの病気に冒された個人のｈＭＬＨ１にフレームシフト変異を見出した。ｈＭＬＨ１のガン関連変異の我々の発見は、以前に同定されたＨＮＰＣＣ関連座と完全に一致する遺伝子マップの位置、さらにはｈＭＬＨ１遺伝子の変異防止における役割を組み合わせて、ｈＭＬＨ１遺伝子を共通に遺伝したヒトのガンの一つの形態の基礎となる主な候補、および癌の発生の危険の高い個人をスクリーニングして同定するための主な候補とする。
ｈＭＬＨ１は、１９のエキソンと１８のイントロンを備えている。我々は、それぞれの１８のイントロンの位置を、ｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡに対して決定した。ｈＭＬＨ１のイントロン／エキソン境界領域の構造も決定した。イントロン／エキソン境界領域の構造の知識は、遺伝子産物の構造および機能を負に影響する変異を突き止める効率的なスクリーニングを可能にする。さらに、周りを取り囲むイントロンの境界構造と共に、個人の完全なエキソンを増幅するためのＰＣＲに使用することができる完全なセットのオリゴヌクレオチドプライマーのペアを設計した。
我々は、ｈＰＭＳ１の位置をヒトクロモソーム７にマップした。他者39による後の研究は、この遺伝子における変異がＨＮＰＣＣに関連するという我々の予想を確かめた。
最も直接的な本発明の使用は、例えばＨＮＰＣＣのような非常に高頻度の早期開始ガンを示すファミリーのメンバーのヒト個人におけるスクリーニング試験である。従って、本発明の一つの態様は、患者の組織のミスマッチ修復遺伝子または遺伝子産物における変異を検出することにより、患者のガンへの罹りやすさの診断方法を含み、ここでは変異が患者のガンへの罹りやすさの指標である。本発明の好ましい態様では、検出工程は、ヒトｍｕｔＬ同族体遺伝子、例えばｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１における変異を検出することを含む。
診断方法は、好ましくは以下の工程を含む：１）ミスマッチ修復遺伝子のセグメントまたは単離された核酸から遺伝子産物を増幅する；２）増幅されたセグメントと、ミスマッチ修復遺伝子の野生型対立遺伝子の類似セグメントまたは遺伝子産物とを比較する；および３）増幅セグメントと類似セグメントとの間の差異を検出する、この差異は、ミスマッチ修復遺伝子における変異、あるいはガンへの罹りやすさを与える遺伝子産物の指標である。
本発明の別の態様は、増幅されたセグメントと類似の野生型セグメントとの間の差異が病気に冒された表現型を引き起こすか否か、すなわち、配列の変化がＤＮＡミスペアを修復する個人の能力に影響するか否かを決定する方法を提供する。
診断方法は以下の工程を含んでもよい：１）ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子のＲＮＡコピーの全部または一部を逆転写する；および２）逆転写によって産生されたＤＮＡのセグメントを増幅する。本発明の増幅段階は、ミスマッチ修復遺伝子の反対の鎖に、反対の方向でハイブリダイズし得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを選択すること、並びに、プライマー間に介入しているミスマッチ修復鎖の核酸が増幅されて増幅セグメントとなるようなオリゴヌクレオチドプライマーを利用したポリメラーゼチェーン反応を行うことを含んでもよい。
上述の方法の好ましい実施態様において、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子は、ｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１である。ＤＮＡのセグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６−２４からなる群から選択されたヌクレオチド配列の独特の部位に対応する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：４４−８２からなる群から選択された“第一段階の”オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡセグメントを増幅するＰＣＲで用いられる。また、本発明は、鋳型ＤＮＡのより特異的な増幅および保存のために第一段階のプライマーと使用するための、“第二段階の”ネスティドプライマー（nested primers）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：８３−１２２）を用いる方法を提供する。
“本発明の他の態様は、ミスマッチ修復遺伝子または遺伝子産物、好ましくはｍｕｔＬ同族体（ｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１）における変異を腫瘍中に検出することを含むＤＮＡミスマッチ修復欠陥腫瘍を同定および分類する方法を提供するものであり、この変異は、腫瘍のミスマッチ修復システムにおける欠陥の指標である。
また、本発明は、使用できるヌクレオチドおよびタンパク組成物を提供する。このような組成物の一つは、好ましくはｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１のいずれかから誘導された、ヒトｍｕｔＬ同族体遺伝子または遺伝子産物の独特の部分に続いて対応するセグメントを含む、単離されたヌクレオチドまたはタンパク質構造である。
本発明の他の組成物の態様は、ヒトｍｕｔＬ同族体遺伝子、好ましくはｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１の独特のセグメントを特異的に増幅するポリメラーゼチェーン反応において共に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
本発明の他の態様は、ヒトｍｕｔＬ同族体遺伝子の一部の相補的な塩基に対するワトソン／クリック対形成によって特異的に結合しうるヌクレオチド配列；並びにこの配列に取り付けられたラベル分子を含むプローブを提供するものであって、ここでラベル分子は、蛍光、放射活性および化学発光からなる群から選択された特徴を備えている。
また、マウスのＭＬＨ１（ｍＭＬＨ１）およびＰＭＳ１（ｍＰＭＳ１）遺伝子を単離および配列決定した。マウスミスマッチ修復遺伝子に関する我々の知識を用いて、ガン研究用の動物モデルを作製した。このモデルは、さらなるガン遺伝子の同定、および変異誘発に対する環境の影響を研究するのに使用できる。
ｍＰＭＳ１ ｃＤＮＡによってコードされたタンパクの一部に向けられたポリクローナル抗体を産生した。また、この抗体はｈＰＭＳ１タンパクと反応し、正常のｈＰＭＳ１遺伝子によってコードされたタンパクの存在を検出するのに使用できる。また、ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１に向けられたモノクローナル抗体を生成している。
遺伝子の診断および治療の使用に加えて、ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１に関する我々の知識は、ヒトのガンのある形態において役割を演じるための候補である関連した機能の他の遺伝子を調査するために用いることができる。
図の説明
図１は、ヒトおよびマウスのＰＭＳ１およびＭＬＨ１遺伝子を単離、特徴決定および使用するために使用した実験工程の順序の概要を示すフローチャートである。
図２は、さらなるｍｕｔＬ同族体を単離するための縮重（degenerate）ＰＣＲオリゴヌクレオチドを作製するために用いた二つの高度に保存された領域（下線が引かれている）を示すｍｕｔＬ同族体のタンパク配列の並び（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１−３）である。
図３は、ヒトＭＬＨ１遺伝子の完全なｃＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびヒトＭＬＨ１タンパクの対応する推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す。下線が引かれたＤＮＡ配列は、ＭＬＨ１遺伝子の一部を増幅するために独創的に用いられた縮重ＰＣＲプライマーに対応するｃＤＮＡの領域である（ヌクレオチド１１８−１３５および３４３−３５９）。
図４Ａは、完全なｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡ構造に集団で対応する１９のエキソンのヌクレオチド配列を示す。このエキソンは、イントロン境界構造が隣接している。プライマー部位には、下線が引かれている。隣接するイントロン構造を伴ったエキソンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６−２４に対応する。下線が引かれていない小文字で表されたエキソンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：２５−４３に対応する。
図４Ｂは、個々のエキソンを増幅するためにＰＣＲで用いられたプライマーペアのヌクレオチド配列を示す。“第二段階”増幅プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：８３−１２２）は、対応する“第一段階”増幅プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：４４−８２）で得られた増幅産物の標的エキソンを増幅するために用いられる“ネスティド”プライマーである。図４Ｂにおける構造は、表２および３における構造に対応する。
図５は、ヒトおよびイースト（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：５および１２３）ＭＬＨ１タンパクの推測されたアミノ酸配列の並びである。
図６は、ｍｕｔＬ関連タンパクの系統樹である。
図７は、二つの写真である。最初のパネル（Ａ）は、クロモソーム３のｈＭＬＨ１遺伝子のハイブリダイゼーションを示す中期拡散（metaphase spread）である。第二のパネル（Ｂ）は、ヒトクロモソーム３表意文字と並べられた多重中期拡散のクロモソーム３の構成物である。
図８は、ｈＭＬＨ１タンパクの４４位で非保存的アミノ酸置換を生じるＣからＴへの転写変異の同定を示す、病気に冒された個人と病気に罹っていない個人からの配列クロマトグラムの比較である。
図９は、推測されるアミノ酸置換の部位を囲むタンパクのＭＬＨファミリーの高度に保存された領域のアミノ酸配列の並び（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１２４−１３１）である。太文字は、病気に冒された個人におけるセリンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換の位置を示す。また、強調されているのは、ＭｕｔＬ様タンパクのこの位置において保存されたセリンまたはアラニン残基である。点は、高度のアミノ酸の保存の位置を示す。ＭＬＨ１タンパクでは、点は、配列が得られていないことを示す。配列は、図６の系統樹を参照して、下に記載されるように並べられた。
図１０は、ｈＰＭＳ１の完全なヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）。
図１１は、ヒトおよびイーストＰＭＳ１タンパク（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１３３および１３４）の推測されたアミノ酸配列の並びである。アミノ酸の同一は囲みで示され、ギャップはダッシュで示されている。
図１２は、マウスＭＬＨ１（ｍＭＬＨ１）ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）の一部のヌクレオチド配列である。
図１３は、ｍＭＬＨ１とｈＭＬＨ１タンパク（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１３６および５）の推測されたアミノ酸配列の比較である。
図１４は、マウスＰＭＳ１（ｍＰＭＳ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。
図１５は、ｍＰＭＳ１およびｈＰＭＳ１タンパク（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１３８および１３３）の推測されたアミノ酸配列の比較である。
定義
遺伝子  −  “遺伝子”完全なコード配列を含むヌクレオチド配列を意味する。一般的に、“遺伝子”は、コードされたポリペプチドの発現に影響するコード配列の上流（例えば、プロモーター配列、エンハンサー等）または下流（例えば、転写終結シグナル、ポリアデニレーション等）に見られるヌクレオチド配列をも含む。
遺伝子産物  −  “遺伝子産物”は、遺伝子の一部のＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡ）コピーのいずれか、あるいは、ｍＲＮＡから翻訳された対応するアミノ酸配列である。
野生型  −  “野生型”という用語は、本発明の核酸およびタンパクに適用された場合には、天然に生じる、正常な核酸またはタンパク（すなわち、野生型の活性を備えた核酸またはタンパク）から区別できないように機能する核酸またはタンパクの形式を意味する。例えば、ミスマッチ修復遺伝子の“野生型”対立遺伝子は、細胞におけるミスマッチ修復を検出可能に変えることなく、宿主細胞内で同一の遺伝子の正常な内因性コピーを機能的に置換することができる。同じ核酸またはタンパクの別の野生型は、構造的に互いに違っても違わなくてもよい。
非野生型  −  “非野生型”という用語は、本発明の核酸およびタンパクに適用された場合には、天然に生じる、正常な核酸またはタンパクから区別できるように機能する核酸またはタンパクの形式を意味する。本発明の核酸の非野生型対立遺伝子は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列における差異および／またはポリペプチド産物のコードされたヌクレオチドの転写の発現レベルでの差異に限定されないが、これらを含む種々の点で同じ核酸の野生型対立遺伝子から構造的に区別できる。
例えば、本発明の核酸の非野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、ヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または転移によって、野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列と異なってもよい。同様に、非野生型ミスマッチ修復タンパクのアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸の付加、置換および／または転移によって野生型ミスマッチ修復タンパクのアミノ酸配列と異なってもよい。
正常な宿主細胞に導入された場合に、内因性ミスマッチ修復経路を妨げる特定の非野生型の核酸またはタンパクは、“優性陰性（dominant negative）”核酸またはタンパクと称する。
相同  −  “相同”という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のレベルで高度に関連する核酸またはポリペプチドを指す。互いに相同である核酸またはポリペプチドは、“同族体”と称する。
“相同”という用語は、必須的に二つの配列間の比較を指す。本発明によれば、二つのヌクレオチド配列は、コードするポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の一続きに対して、少なくとも約５０−６０％同一、好ましくは約７０％同一であれば相同であると見なされる。また好ましくは、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも４−５の独特に指定されたアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。お互いにこれらのアミノ酸の同一性およびおよその間隔（the approximate spacing）は、ヌクレオチド配列が相同であると見なされるように考えられる必要がある。長さにして６０ヌクレオチドより短いヌクレオチド配列では、相同性は、少なくとも４−５の独特に指定されたアミノ酸の一続きをコードする能力によって決定される。
上流／下流  −  “上流”および“下流”という用語は、ヌクレオチド配列の部位の位置を指す技術用語である。“上流”は、参照部位より５’側の部位を意味する。“下流”は、参照部位より３’側の部位を示す。
イントロン／エキソン  −  “エキソン”および“イントロン”という用語は、ゲノム遺伝子配列の種々の部位を指す技術用語である。“エキソン”は、タンパクをコードするゲノム遺伝子配列の部位である。“イントロン”は、ゲノム遺伝子配列のエキソン間に見られるヌクレオチドの配列である。
病気に冒された  −  “病気に冒された”という用語は、ここで用いられるように、特有のガン（例えば、ＨＮＰＣＣ血統における大腸ガン）が発生した、および／または、例えば遺伝学的研究に基づいて、癌にかかりやすくなる遺伝した変異を有することが予告された血縁のメンバーを指す。
独特の  −  遺伝子またはタンパクの“独特の”セグメント、フラグメントまたは部位は、個々のゲノムの他の遺伝子またはタンパクのセグメントと連続して異なる遺伝子またはタンパクの一部を意味する。実際には、遺伝子の独特のセグメントまたはフラグメントは、典型的には、長さにして少なくとも約１３塩基のヌクレオチドであろうし、オリゴヌクレオチドプライマーが選択的かつ特異的にセグメントを増幅するように設計および使用されるべく、他の遺伝子セグメントとは十分に異なるであろう。タンパクの独特のセグメントは、典型的に、遺伝子の独特のセグメントから翻訳されうるアミノ酸配列である。
参考文献
以下の刊行物は、本出願の文章に番号で示される。各刊行物は、参照としてここに取り込まれる。
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発明の説明
我々は、ＤＮＡミスマッチ修復に係る哺乳類の遺伝子を見出した。その遺伝子の一つｈＰＭＳ１は、イーストＤＮＡミスマッチ修復タンパクＰＭＳ１に相同であるタンパクをコードしている。ｈＰＭＳ１の位置をヒトクロモソーム７にマップし、マウスＰＭＳ１遺伝子をマウスクロモソーム５、バンドＧにマップした。他の遺伝子、ｈＭＬＨ１（ＭｕｔＬ Ｈｏｍｏｌｏｇ（ＭｕｔＬ同族体））は、イーストＤＮＡミスマッチ修復タンパクｍｌＨ１に相同なタンパクをコードする。我々は、ｈＭＬＨ１の位置をヒトクロモソーム３ｐ２１．３−２３およびマウスクロモソーム９、バンドＥにマップした。
研究1,2は、ＨＮＰＣＣのクロモソーム２ｐのヒトＤＮＡミスマッチ修復遺伝子同族体の関係を証明した。結合データに基づいて、第二のＨＮＰＣＣ座は、クロモソーム３ｐ２１−２３3に割り当てられた。クロモソーム３関連血族の腫瘍ＤＮＡの調査が、他のＨＮＰＣＣファミリー6に観察されるものおよび数種の散発性の腫瘍7-10と似たジヌクレオチド繰り返し不安定性を示した。ジヌクレオチド繰り返し不安定性は、ＤＮＡミスマッチ修復における欠陥の特徴であるため5,11,12、クロモソーム３ｐ２１−２３に関連したＨＮＰＣＣが、第二のＤＮＡミスマッチ修復遺伝子における変異から来るものであると推論した。
大腸菌（Escherichia coli）におけるミスマッチしたＤＮＡの修復は、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＬおよびｍｕｔＨを含むいくつかの遺伝子を必要とし、そのいずれかにおける欠陥は、自発的な変異速度を上昇させる13。イースト  サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）における遺伝的研究により、３つのＤＮＡミスマッチ修復遺伝子：ｍｕｔＳ同族体、ＭＳＨ２14、および二つのｍｕｔＬ同族体、ＰＭＳ１16とＭＬＨ１4が同定された。これら３つの遺伝子はいずれも、ジヌクレオチドの繰り返しの安定化を含む正確なＤＮＡ複製という点において不可欠な役割を演じる5。
ｈＭＬＨ１遺伝子産物とイーストＤＮＡミスマッチ修復タンパク、ＭＬＨ１との類似性4、ｈＭＬＨ１遺伝子とクロモソーム３のＨＮＰＣＣ座が同一場所にあること、およびクロモソーム３関連ＨＮＰＣＣファミリーの病気に冒された個人に見出されたミスセンス変異に基づいて、ｈＭＬＨ１が、以前にクロモソーム３ｐに関連付けされたＨＮＰＣＣ遺伝子であると信じた。
ヒトおよびマウスのＭＬＨ１およびＰＭＳ１遺伝子構造に関する我々の知識は、多くの重要な使用を備えている。遺伝子配列情報は、ガンの危険性について個人をスクリーニングするために使用することができる。遺伝子構造の知識は、正常な配列との比較およびガンの危険性の分析のために、ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１遺伝子の部位を選択的に増幅するのに用いられるＰＣＲプライマーを容易に設計することを可能にする。また、この種の試験は、ガンのスクリーニングに関する労力を特異的な遺伝子座に最後に集中するために、ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１ガン関連変異を調査および特徴付けることも可能にする。ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１におけるガン関連変異の特異的な特徴付けは、特異的な遺伝子の変異が存在するか否かを決定するスクリーニング試験に用いられる対立遺伝子特異的プローブ等の、別の価値ある診断の道具を作製することを可能にする。
さらに、ｈＭＬＨ１および／またはｈＰＭＳ１の遺伝子配列情報は、例えば、ガンに関連する候補である関連した機能を有する別の遺伝子を調査するために、二つのハイブリッドシステムで使用することもできる。
ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１遺伝子構造は、特定の部位または完全なｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１タンパクに向けられた抗体を生成するのに使用されるタンパクを調製するのに使用できる。このような抗体は、調査および診断の目的で、対応するタンパクおよび関連しうるタンパクを単離するために用いられる。
マウスＭＬＨ１およびＰＭＳ１遺伝子配列は、それぞれの遺伝子に変異を備えたマウスを作製するのに使用できる。変異マウスは、遺伝子の機能、特にそれとガンとの関係を研究するのに使用できる。
哺乳類ＭＬＨ１およびＰＭＳ１遺伝子の単離および特徴付けの方法
４つの哺乳類の遺伝子、すなわちヒトＭＬＨ１（ｈＭＬＨ１）、ヒトＰＭＳ１（ｈＰＭＳ１）、マウスＭＬＨ１（ｍＰＭＳ１）およびマウスＰＭＳ１（ｍＰＭＳ１）を単離および特徴付けした。これらの遺伝子間の構造の類似性により、単離および特徴付けに用いた方法は、一般的に同じである。図１は、広い意味で、４つの遺伝子を単離および特徴付けるために用いた実験の試みを示す。以下の議論は、図１に示された段階的な工程を示す。
段階１  ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプールの設計
初期のレポートは、３つのＭｕｔＬ様タンパクの部位、すなわち細菌から二つ、ＭｕｔＬおよびＨｅｘＢ、およびイーストから一つ、ＰＭＳ１は、高度に保存されていることを示唆した16,18,19。図２に示すように、ＨｅｘＢ、ＭｕｔＬおよびＰＭＳ１タンパクのアミノ酸配列の調査後、ＭｕｔＬ様タンパクの二つの高度に保存された領域、ＫＥＬＶＥＮおよびＧＦＲＧＥＡに対応する縮重オリゴヌクレオチドペアのプールを設計した。４つの遺伝子を単離するのに使用した縮重オリゴヌクレオチドの配列（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１３９および１４０）は、以下に示すものである。
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プライマー内の下線を引いた配列は、それぞれＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。これらは、ＰＣＲ増幅フラグメントのクローニングを容易にするために導入された。オリゴヌクレオチドの設計において、所定のアミノ酸は一つ以上のＤＮＡトリプレット（コドン）によってコードされることを考慮した。これらの配列内の縮重は、（）内の複数のヌクレオチドによって、もしくはその位置にどの塩基が存在してもよいものとしてＮで示されている。
段階２  ヒトの細胞から単離されたポリＡ＋選択ｍＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ
培養したヒトの細胞からメッセンジャー（ポリＡ＋に富んだ）ＲＮＡを単離し、そのｍＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡを合成し、縮重オリゴヌクレオチドでＰＣＲを行った4。アニーリング温度を調製するなどして、いくつかの異なるＰＣＲ条件を試した後、ＭｕｔＬ様タンパクに予想される大きさのＤＮＡ（〜２１０ｂｐ）を増幅することに成功した。
段階３  ＰＣＲ生成フラグメントのクローニングおよび配列決定；ヒトＰＭＳ１およびＭＬＨ１を表す二つの遺伝子フラグメントの単離
アガロースゲルからＰＣＲ増幅物（〜２１０ｂｐ）を単離し、これをプラスミド（ｐＵＣ１９）にクローン化した。いくつかの異なるクローンのＤＮＡ配列を決定した。二つのクローンのＤＮＡ配列から推量されるアミノ酸配列は、他の既知のＭｕｔＬ様タンパクに強い類似性を示した4,16,18,19。クローンの一つに予想されるアミノ酸配列は、イーストのＰＭＳ１タンパクに非常に類似していた。それゆえ、それにヒトＰＭＳ１、ｈＰＭＳ１という名前を付けた。第二のクローンは、イーストのＭＬＨ１タンパクに非常に近接に類似したポリペプチドをコードすることがわかり、ヒトＭＬＨ１、ｈＭＬＨ１という名前を付けた。
段階４  プローブとしてＰＣＲフラグメントを用いた完全なヒトおよびマウスＰＭＳ１およびＭＬＨ１のｃＤＮＡクローンの単離
ヒトおよびマウスｃＤＮＡライブラリー（Stratagene社、あるいは参考文献３０の記載による）の両方をスクリーニングするためのプローブとして、ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１のｃＤＮＡの２１０ｐｂのＰＣＲ生成フラグメントを使用した。これらの二つの遺伝子に対応するいくつかのｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡの多くは、５’末端で切りつめられていた。必要であれば、ｃＤＮＡライブラリーのさらなるスクリーニングに加えて、ＰＣＲ技術31を遺伝子の５’末端を得るために用いる。完全な構造のｃＤＮＡ配列を、ヒトおよびマウスのアミノ酸配列、ｍｌＨ１およびＰＭＳ１タンパクの推測に用いた。
段階５  ヒトおよびマウス、ＰＭＳ１およびｍｌＨ１ゲノムクローンの単離
ヒトＭＬＨ１およびＰＭＳ１遺伝子のゲノムおよびｃＤＮＡ構造の情報は、ガンの傾向のあるファミリーで変異を完全にスクリーニングするのに必要である。ヒトＰＭＳ１およびＭＬＨ１のゲノム配列を単離するプローブとしてヒトｃＤＮＡ配列を用いた。全てではないが、ほとんどのｃＤＮＡ（エキソン）配列を含有すると思われる、ｈＰＭＳ１の４つのコスミドと二つのＰ１クローンを単離した。ｈＭＬＨ１に関して、５’-ＭＬＨ１ゲノム配列を含有する４つのオーバーラップするλファージクローンと４つのＰ１クローン（二つの完全な長さのクローンとプロモーター領域の５’コード末端プラス部位を含む二つ）Ｐ１クローンを単離した。ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡの５’および３’末端に特異的なオリゴヌクレオチドの組を用いたＰＣＲ分析は、Ｐ１クローンが完全なｈＭＬＨ１のｃＤＮＡの情報を含むことをはっきりと示した。同様に、マウスＰＭＳ１およびＭＬＨ１遺伝子のゲノムクローンが、（段階８に記載するようにして）単離および部分的に特徴付けされた。
段階６  蛍光in situハイブリダイゼーションによる、ヒトおよびマウス、ＰＭＳ１およびＭＬＨ１遺伝子のクロモソーム位置マッピング
蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）20,21によって、クロモソームの位置決めをするためにヒトおよびマウスのＰＭＳ１およびＭＬＨ１から単離したゲノムクローンを用いた。ヒトのＭＬＨ１遺伝子を、以下により詳細に記載するようにして、図７に示されたクロモソーム３ｐ２１．３−２３にマップした。マウスＭＬＨ１遺伝子をクロモソーム９バンドＥにマップし、この領域は、マウスとヒトの間のシンテニー（synteny）である22。ＦＩＳＨ技術に加えて、げっ歯類／ヒト体細胞ハイブリッドマッピングパネル（Coriell Institute for Medical Research, Camden, N.J.）からのＤＮＡを分析するために、一対のｈＭＬＨ１特異的オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行った。このパネルを用いたＰＣＲの結果は、ｈＭＬＨ１がクロモソーム３に位置することを明確に示唆する。ｈＭＬＨ１  ３ｐ２１．３−２３の位置は、関連データに基づいたＨＮＰＣＣの第二座を保有することが知られている領域と一致する。
図１２に示すように、ｈＰＭＳ１遺伝子をクロモソーム７の長い腕（ｑ）（それぞれ７ｑ１１または７ｑ２２）、マウスＰＭＳ１をクロモソーム５バンドＧにマップした。これら二つの領域は、ヒトとマウスの間のシンテニーである22。ｈＰＭＳ１に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、げっ歯類／ヒト細胞パネルのＤＮＡにＰＣＲを行った。ＦＩＳＨのデータと一致して、ｈＰＭＳ１の位置は、クロモソーム７上にあることが確認された。これらの観察は、ｈＰＭＳ１がクロモソーム７に位置するという我々のヒトのマップ位置が正しいことを確信させるものであった。ｈＰＭＳ１の物理的な位置は、潜在的にｈＰＭＳ１にガンに関連した変異を有するファミリーを同定する目的に使用できる。
段階７  ＨＮＰＣＣファミリーのｈＰＭＳ１およびｈＭＬＨ１遺伝子における変異を同定するためのゲノムおよびｃＤＮＡ配列の利用
ｈＰＭＳ１またはｈＭＬＨ１遺伝子における変異を同定する目的のためにＨＮＰＣＣファミリーの個人から回収したサンプルを分析した。我々の試みは、既知の正常な配列と比較することができるエキソン／イントロンセグメントを得るために、遺伝子構造に関する我々の知識に基づいてＰＣＲプライマーを設計することである。この試みを“エキソン-スクリーニング”と称する。
ｃＤＮＡ配列情報を用いて、ゲノム配列内のエキソン／イントロンの境界を描写するためにｈＰＭＳ１およびｈＭＬＨ１特異的オリゴヌクレオチドを設計し、現在も続けている。ｈＰＭＳ１およびｈＭＬＨ１特異的オリゴヌクレオチドは、その配列を含むエキソンの存在についてゲノムクローンを調べるために用いられた。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、ゲノムクローンからＤＮＡの配列決定のためのプライマーとして用いられた。エキソン-イントロン接合は、ゲノム配列とｃＤＮＡ配列を比較することによって同定された。
ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの特異的エキソンの増幅およびその産物の配列決定は、変異についてＨＮＰＣＣファミリーをスクリーニングする一つの方法である1,2。ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ情報を含むゲノムクローンを同定し、ｈＭＣＨ１の１９のエキソンが隣接する全てのイントロン／エキソン境界領域の構造を決定した。
クロモソーム３に関連を示すＨＮＰＣＣファミリーの個人のＭＬＨ１遺伝子を調べるためにエキソン−スクリーニング手段を用いた3。以下により詳細に記載するように、ＣをＴに置換することからなる、このようなファミリーの一つのＭＬＨ１遺伝子に変異を同定した。ＣをＴに置換することが、このタンパクの高度に保存された領域において、セリンをフェニルアラニンに置換すると推論した。ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１遺伝子におけるさらなる変異を見出すために、サンプルを得たＨＮＰＣＣファミリーを同定し続けている。
また、ｈＰＭＳ１とｈＭＬＨ１における変異を同定するための第二の試みを用いている。この試みは、逆転写オフＲＮＡ（reverse transcription off RNA）によって第一鎖ｃＤＮＡを作製するためにｈＰＭＳ１またはｈＭＬＨ１特異的オリゴヌクレオチドプライマーを設計することである。遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、これらの遺伝子から特異的領域を増幅することができるであろう。増幅されたフラグメントのＤＮＡ配列により、変異を検出することができるであろう。
段階８  ＥＳ細胞におけるマウスＰＭＳ１およびＭＬＨ１遺伝子を崩壊するためのターゲッティングベクターの設計；ミスマッチ修復に欠陥のあるマウスの研究
ゲノムマウスＰＭＳ１ ＤＮＡ構造に関する知識を基に、遺伝子ターゲッティングベクターを作製した。マウス胎児性幹細胞のＰＭＳ１遺伝子を崩壊するためにこのベクターを用いた36。この細胞を、ＰＭＳ１変異を有する細胞にキメリック（混合）であるマウスに発達したマウス胚盤胞に注入した。このキメリックな動物は、ＰＭＳ１変異にヘテロ接合およびホモ接合であるマウスを生むために使用される。これらのマウスは、生物体全体におけるＰＭＳ１遺伝子の役割を研究するために用いられる。
ヒトＭＬＨ１
以下の記載は、ｈＭＬＨ１に関する我々の実験的研究の説明をより詳細にするものである。上述したように、哺乳動物のＭＬＨ遺伝子をクローン化するために、イーストのＭＳＨ１、ＭＳＨ２およびＭＬＨ１遺伝子、並びにヒトＭＳＨ２遺伝子を同定するのに用いられたものと同様のＰＣＲ技術を用いた1,2,4,14。ＰＣＲの鋳型として、培養された一次ヒト繊維芽細胞から調製されたポリ（Ａ＋）に富んだＲＮＡから合成された二本差ｃＤＮＡを用いた。縮重したオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端アミノ酸配列ＫＥＬＶＥＮおよびＧＦＲＧＥＡ（図３参照）に向けられており、これら二つは、細菌およびイーストについて以前に記載されたタンパクのＭｕｔＬファミリーの最も保存された領域である16,18,19。推定された大きさの二つのＰＣＲ産物を同定し、クローン化し、ＭｕｔＬ様タンパクに対する相同性を備えた推定されたアミノ酸配列をコードすることを示した。ＰＣＲによって生成されたこれら二つのフラグメントは、ヒトｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡクローンを単離するために用いられた。
ヒトＭｕｔＬ関連配列を増幅するために用いたこのオリゴヌクレオチドプライマーは、５’-
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である。ＰＣＲは、ｃＤＮＡ鋳型、１．０μＭの各プライマー、５ＩＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｃ）５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５および１．５ｍＭ ＭｇＣｌを含む５０μＬ反応系で行われた。ＰＣＲは、１分間９４℃、１分間４３℃および１．５分間６２℃の３５サイクルで行われた。予想された大きさのフラグメント、約２１２ｂｐは、ｐＵＣ１９にクローン化され配列決定された。クローン化ＭＬＨ１ ＰＣＲ産物は、ランダムプライマーラベリングキット（ＲａｄＰｒｉｍｅ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）でラベルされ、標準的な方法でヒトｃＤＮＡおよびゲノムコスミドライブラリーをプローブするために用いられた。二本鎖プラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定は、以前に記載されたようにして行われた1。
図３に示されているｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、２２６８ｂｐのオープンリーディングフレームをコードする。また、ｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡにコードされた予想されるタンパク配列も図３に示されている。下線を引いたＤＮＡ配列は、ＭＬＨ１遺伝子の一部（ヌクレオチド１１８−１３５および３４３−３５９）を増幅するために最初に用いられた縮重ＰＣＲプライマーに対応するｃＤＮＡの領域である。
図４Ａは、ｈＭＬＨ１の部位に対応する１９ヌクレオチド配列を示す。各配列は、その全体の中に、隣接するイントロン配列で囲まれた１９のエキソンの一つを含む。標的ＰＣＲプライマー部位に下線が引かれている。図４Ａに示された配列の誘導および使用に関するさらなる詳細については、後述する。
図５に示すように、ｈＭＬＨ１タンパクは７５６アミノ酸からなり、イーストＤＮＡミスマッチ修復遺伝子、ＭＬＨ１のタンパク産物と４１％の同一性を備えている4。イーストＭＬＨ１に非常に類似したｈＭＬＨ１タンパクの領域は、５５％の同一性を示すアミノ酸１１から３１７、および二つのタンパク間で同一な少なくとも１３アミノ酸に対応する。図５は、予想されるヒトＭＬＨ１およびS.cerevisiaeのＭＬＨ１タンパク配列の並びを示す。アミノ酸の同一は四角で囲まれ、ギャップはダッシュで示されている。ペアワイズ（pair wise）タンパク配列の並びは、クラスタル方法（the clustal method）を用いたＤＮＡＳｔａｒ ＭｅｇＡｌｉｇｎで行われた27。ペアワイズ配列のパラメーターは、クプツル（ktuple）が１、ギャップペナルティー（gap penalty）が３、ウィンドウが５並びに対角線が５であった。さらに、図１３に示すように、ヒトおよびマウスＭＬＨ１タンパクの予想されるアミノ酸配列は、少なくとも７４％の同一性を示す。
図６は、ＭｕｔＬ関連タンパクの系統樹を示す。この系統樹は、７つのＭｕｔＬ関連タンパク、すなわちヒトＭＬＨ１；マウスＭＬＨ１；S.cerevisiaeのＭＬＨ１；S.cerevisiaeのＰＭＳ１；E.coli；ＭｕｔＬ；S.typhimuriumのＭｕｔＬおよびS.pneumoniaeのＨｅｘＢの推定されるアミノ酸配列を用いて構成された。必要な配列は、ＧｅｎＢａｎｋリリース７．３から得られた。この系統樹は、ギャプペナルティー３および長さペナルティー０．１を用いて、Genetics Computer GroupのソフトウェアのＰＩＬＥＵＰプログラムで作られた。ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１の記録されたＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
ｈＭＬＨ１イントロンの位置およびイントロン／エキソン境界構造
我々の先の米国特許出願第０８／２０９５２１号において、ヒト遺伝子、ｈＭＬＨ１の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンのヌクレオチド配列を記載した。ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、本発明の図３に提示されている。ヒトの集団内の多型性および遺伝コードの縮重に由来して、個々のｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡ構造の間にいくつかの可変性があるのかもしれないことに言及している。
本出願において、我々の遺伝配列の研究結果を報告する。特に、個々のエキソンおよびその周りのイントロン／エキソン境界構造に特に焦点を当てて、ｈＭＬＨ１遺伝子を含むヒトゲノム領域をクローン化した。ガンにかかりやすくなる変異を同定および特徴付ける包括的および効率的な試みを設計するという究極の目的に向けて、ｈＭＬＨ１遺伝子のエキソンに隣接するイントロン構造の野生型の配列を知ることは重要であると信じている。エキソン境界の近くのイントロンの配列を知ることの一つの利点は、完全な個々のエキソンを選択的に増幅するプライマーペアを設計することを可能にすることである。さらに重要なことに、ｍＲＮＡスプライシングエラーを引き起こすようなイントロン領域における変異により、遺伝子のエキソン領域に何の異常も示すことなく、欠陥のある遺伝子産物を生ずる、すなわちガンに罹りやすくなる可能性がある。包括的なスクリーニングの試みは、エキソンまたはｃＤＮＡだけでなく、エキソン境界に隣接するイントロン構造における変異を調べる必要があると信じている。
当該技術で知られた手段を用いてｈＭＬＨ１を含むヒトゲノム領域をクローン化たが、他の既知の手段を用いてもよい。ＰＣＲを用いてｈＭＬＨ１遺伝子のＰ１ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。４つのクローンを得たが、二つは全体の遺伝子を含み、二つはＣ末端を欠くものであった。全長のクローンの一つをサイクルシークエンシングにより特徴付けたが、これは、１９のｈＭＬＨ１エキソンの両側に全てのイントロン／エキソン接合配列の我々の定義をもたらした。次ぎに、個々のエキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーの多数のセット（第一段階プライマー）を設計し、いくつかの異なるゲノムＤＮＡサンプルを増幅することおよびＡＢＩ３７３シークエンサーを用いて得られたフラグメントを配列決定することにより各エキソンと隣接するイントロン配列の配列を確かめた。さらに、ＰＣＲ法を用いて各ｈＭＬＨ１エキソンの大きさを決定した。最後に、個々のエキソンを再増幅するために、一組のネスティドＰＣＲプライマー（第二段階のプライマー）を工夫した。ｈＭＬＨ１変異に係るＨＮＰＣＣファミリーおよび腫瘍を分析するために複式の方法（a multi-plex method）で第二段階のプライマーを用いた。一般的に、ネスティドＰＣＲプライマーの手法では、それぞれ別のエキソンに向けられた４〜８組の“第一段階”のプライマーで最初の複式増幅を行った。次いで、１組の第二段階のプライマーを用いて、最初の増幅段階の産物から各エキソンを再増幅した。
ゲノム配列の研究を通して、ｈＭＬＨ１遺伝子内の１９のエキソンの全てを同定し、イントロン／エキソン境界をマップした。それゆえ、本発明の一つの態様は、ｈＭＬＨ１遺伝子の個々のエキソンである。表１は、ｈＭＬＨ１エキソン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５−４３）のヌクレオチドの相関（すなわち、遺伝子のコード領域内の各イントロンの挿入箇所）を示す。示された相関は、ｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡ配列に基づき、位置“１”は、始まりの“ＡＴＧ”の“Ａ”を示す（Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド１である）。
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ｈＭＬＨ１遺伝子のエキソンに隣接するイントロン領域の核酸も決定した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６−２４は、それぞれの上流および下流のイントロン配列が結合した個々のエキソン配列である。同じヌクレオチド構造が、図４Ａに示されており、ここでエキソンは、クロモソーム座位に関してＮ末端からＣ末端の方向に番号付けされている。５の番号は、エキソンを増幅するのに用いられたプライマーを示す。全ての配列は、ＡＴＧコドンのＡがヌクレオチド１になるように番号が付されている。（）内の番号は、示されたエキソンに見られるコード配列のヌクレオチドの相関である。大文字はイントロンである。小文字はエキソンまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡクローンに見られる翻訳されない配列である。小文字かつ下線が引かれた配列は、プライマーに対応する。２２６９−２２７１における停止コドンは、イタリックで表され、下線が付されている。
表２は、隣接するイントロン構造と共に各エキソンを増幅するのに使用される最初のペア（“第一段階”プライマー）の配列を示す。
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さらに、一組の“第二段階”の増幅プライマーを設計し、その構造は、下の表３に示されている。以下に記載するように、第二段階のプライマーは、ネスティド増幅プロトコルで第一段階のプライマーと組み合わせて使用する。
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表３で、アスタリスク（*）は、５’ヌクレオチドが、ビオチニル化されていることを示す。エキソン１−７，１０，１３および１６−１９を、１．５ｍＭまたは３ｍＭ ＭｇＣｌ2のいずれかを含有するＰＣＲ反応において特異的に増幅することができる。エキソン１１および１４は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＰＣＲ反応で唯一特異的に増幅され、エキソン８，９，１２および１５は、３ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＰＣＲ反応で唯一特異的に増幅される。エキソン１２に関して、第二段階の増幅プライマーは、エキソン１２が二つの半片で再増幅されるように設計されている。２０５４６および２０００２のプライマーセットは、Ｎ末端半分を増幅する。プライマーセット１９８２９および１９８３５は、Ｃ末端半分を増幅する。１８１７８に代わるプライマーは、１９０７０である。
我々の研究により提供され、本出願および先の関連出願に開示されたｈＭＬＨ１配列の情報は、単一産物バンドにおける一つ以上のエキソン（および／または隣接するイントロン配列）を増幅するプライマーを含む、個人のガンの罹りやすさおよび／または腫瘍の発達に関連するｈＭＬＨ１変異を同定することに使用される多数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに使用することができる。
当業者であれば、所望のフラグメントまたは遺伝子を増幅するのに使用されるＰＣＲプライマーの設計に重要な考慮を熟知しているであろう3。上述したように、配列決定プライマーの設計に関するものと同じである必要はないが、これらの考慮は類似していてもよい。一般的に、プライマーが比較的特異的にハイブリダイズすることが重要である（すなわち、約５５℃以上、好ましくは６０℃程度のＴｍを有する）。ほとんどの場合、長さが約１７〜２５ヌクレオチドの間のプライマーが、良く機能する。長いプライマーは、長いフラグメントを増幅するのに使用できる。各ペアのＰＣＲプライマーが、唯一、正しいフラグメントを増幅するように、どの場合にもヒトゲノムの一つ以上の配列に相補的なプライマーの使用を避けるのが好ましい。それでも、正しいバンドが、ＰＣＲ反応における他の産物のバンドから区別できることが、唯一絶対に必要である。
正確なＰＣＲ条件（例えば、塩濃度、サイクル数、ＤＮＡポリメラーゼの種類等）は、当該技術で知られているように変形して、反応の収率または特異性等を改良することができる。特に、必要なＤＮＡ基質の量を減少し、増幅特異性を改善するために、ＰＣＲ反応でネスティドプライマーを使用することが有益であることを見出した。
二つの実施例を以下に記載する。第一の実施例は、第一段階のプライマーペア（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６９と７０）を使用してイントロン／エキソンセグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を増幅することを例証するものである。第二の実施例は、第二段階のプライマーを使用して、第一段階のプライマーを用いた第一ＰＣＲ増幅工程の産物から標的イントロン／エキソンセグメントを増幅することを例証したものである。
実施例１：Ｐ１ファージライブラリーのｈＭＬＨ１ゲノムクローンの増幅
２５ｎｇのゲノムＤＮＡ（もしくは１ｎｇのＰ１ファージを用いることができる）を、
０．０５ｍＭ  ｄＮＴＰ
５０ｍＭ  ＫＣｌ
３ｍＭ  Ｍｇ
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５
０．０１％  ゼラチン
５μＭ  プライマー
を含むＰＣＲ反応に使用した。
反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓモデル９６００温度循環装置で行った。
反応系を９５℃で５分間インキュベートした後に、
９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で１分間
のサイクルを３５サイクル（Ｐ１ファージでは３０サイクル）行った。
次いで、最後の７分の延長反応を７２℃で行った。望ましいＰ１クローンは、正確に近いｂｐ産物バンドが生成されるもののクローンである。
実施例２：ネスティドＰＣＲプライマーを用いたゲノムＤＮＡのｈＭＬＨ１配列の増幅
以下のようにして、ゲノムＤＮＡのｈＭＬＨ１配列の二段階ＰＣＲ増幅を行った。典型的に、第一の増幅は、
２５ｎｇのクロモソームＤＮＡ
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲバッファーII（あらゆる適切なバッファーを用いることが可能）
３ｍＭ  ＭｇＣｌ2
５０μＭ  各ｄＮＴＰ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
５μＭ  プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６９，７０）
を含む２５マイクロリットルの反応系で行い、９５℃で５分間インキュベートした後に、
９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
のサイクルを２０サイクル行った。産物のバンドは、典型的にあまりに小さいので（約５００ｂｐ未満）、別の延長段階は、各サイクルの一部として行われない。むしろ、２０サイクルが完了した後、一回の延長段階を７２℃で７分間行った。反応産物を４℃で保存した。
第二増幅反応は、
１または２マイクロリットル（反応の体積に依存）の第一増幅反応産物
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲバッファーII（あらゆる適切なバッファーを用いることが可能）
３ｍＭ  ＭｇＣｌ2
５０μＭ  各ｄＮＴＰ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
５μＭ  ネスティドプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１０９，１１０）
を２５または５０マイクロリットルの反応系に含み、９５℃で５分間インキュベートした後に、
９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
のサイクルを２０−２５サイクル行い、このサイクルが完了した後に、一回の延長反応を７２℃で７分間行った。反応産物は４℃に貯蔵した。
標的ｈＭＬＨ１配列を増幅することができるあらゆる組み合わせのプライマーを、最初の増幅反応で用いることができる。最初の増幅反応で各ｈＭＬＨ１エキソンを増幅するために、表２に示された各プライマーセット用いた。また、最初の増幅反応で複数の個々のｈＭＬＨ１エキソンを増幅する、これらのプライマーセットの組み合わせを用いた。
最初の増幅段階で用いられたネスティドプライマーは、最初の増幅反応で用いられたプライマーに関して設計された。すなわち、第二の反応で用いられるプライマーは、第一の増幅反応プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含むべきでないこと、並びに、第二の増幅プライマーのＴｍが第一の増幅反応プライマーのＴｍとほぼ同じであるように３’末端がより十分に伸びていることを除いて、一組のプライマーが最初の増幅反応に用いられれば、第二増幅反応に用いられるプライマーは最初の反応で用いられたプライマーと同じであるべきである。我々の第二の反応のプライマーは、典型的に、最初の増幅反応プライマーの最も５’側の３つのヌクレオチドを欠き、約３−６ヌクレオチド３’末端で伸びている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６９および７０が第一増幅反応で用いられた場合に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１０９，１１０は、第二増幅反応で用いられるネスティドプライマーペアの例である。
また、配列決定反応を準備する第二の増幅反応プライマーの一方の５’末端に標準的な配列を含むことが有益であることも見出した。さらに、産物のバンドがマグネチックビーズを用いて容易に精製され40、配列決定反応がビーズ結合産物に直接的に行われるように、第二増幅反応プライマーの一方または両方の最後のヌクレオチドをビオチニル化することが有益であることを見出した41-45。
複式の増幅および配列決定方法のさらなる議論として、ＺｕらおよびＥｓｐｅｌｕｎｄら46,47による参考文献を参照されたい。
ガンとｈＭＬＨ１との関係
ｈＭＬＨ１がヒトクロモソーム３ｐ２１−２３のＨＮＰＣＣ座の候補であるか否かを調べる最初の段階として3、ｈＭＬＨ１を蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）でマップした20,21。ＦＩＳＨ分析にｈＭＬＨ１遺伝子の二つに分かれたゲノムフラグメント（データ示さず）を用いた。いくつかの中期クロモソーム拡散の試験により、ｈＭＬＨ１をクロモソーム３ｐ２１．３−２３に位置づけた。
図７のパネルＡは、中期拡散におけるｈＭＬＨ１プローブのハイブリダイゼーションを示す。以前に記載されたように20,21、ビオチニル化ｈＭＬＨ１ゲノムプローブを、縞のヒト中期クロモソームにハイブリダイズした。検出を、蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）結合アビジン（緑色のシグナル）で行った；青で示されたクロモソームは、４’６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色された。それぞれ、ＣＣＤ Ｉｍａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ；ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４；Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏｓｈｏｐおよびＧｅｎｅｊｏｉｎ Ｍａｘｐｉｘというプログラムに沿って、冷却したＣＣＤカメラで画像を撮影し、増幅し、偽色を施し（pseudocoloured）、組み合わせた。図７のパネルＢは、ヒトクロモソーム３の表意とともに並べられた多数の中期拡散からクロモソーム３の構成物を示している。ハイブリダイゼーションの領域（３ｐ２１．３−２３の端部）は、この表意に垂直の線で示されている。
クロモソーム３上のｈＭＬＨ１の位置の独立した確認として、一組のｈＭＬＨ１特異的オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲとｈＭＬＨ１特異的プローブを用いたサザンブロッティングの両方を用いてＮＩＧＭＳ２げっ歯類／ヒト細胞パネル（Coriell Inst. for Med. Res., Camden, NJ, USA）のＤＮＡを分析した。両方の技術の結果は、クロモソーム３関連を示した。また、ＦＩＳＨにより、クロモソーム９バンドＥにマウスＭＬＨ１遺伝子をマップした。これは、ヒトクロモソーム３ｐにシンテニーの位置である22。それゆえ、ｈＭＬＨ１遺伝子は、クロモソーム３−関連ＨＮＰＣＣファミリーに係わる遺伝子領域内の３ｐ２１．３−２３に位置づけられる3。
次いで、二つのクロモソーム−３候補ＨＮＰＣＣファミリー3の病気に冒された個人および病気に冒されていない個人の血液サンプルを、変異について分析した。一つのファミリー、ファミリー１は、ＨＮＰＣＣと３ｐ上のマーカーとの間に重要な関連（組換えフラクション０でロッドスコア（lod score）＝３．０１）を示した。第二のファミリー、ファミリー２では、報告されたロッドスコア（１．０２）は、一般的な許容レベルの重要性より低く、３ｐの同一マーカーへの関連が示唆されたに過ぎなかった。３ｐ２１．３のミクロサテライトマーカーＤ３Ｓ１２９８を用いたファミリー２の次なる関連分析は、組換えフラクション０でより重要なロッドスコア１．８８を与えた。最初に、直接的なＤＮＡ配列決定によってｈＭＬＨ１遺伝子の二つのＰＣＲ増幅エキソンの変異をスクリーニングした（図４）。ファミリー１の病気に冒された３人のこれら二つのエキソンを調べたが、予想された配列との差異をなにも検出しなかった。ファミリー２では、大腸ガンに冒された４人が、エキソンがコードするアミノ酸４１−６９におけるＣからＴへの置換のヘテロ接合（heterozygous）であることが観察され、これは、このタンパクの高度に保存された領域に対応している（図９）。一人の病気に冒されたヒトについて、ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡを付加的な配列の差異についてスクリーニングした。この病気に冒された個人の二つのエキソンとｃＤＮＡから得られた組み合わせられた配列情報は、オープンリーディングフレームの９５％（すなわち最初の１１６ｂｐ以外の全て）を示した。ＣからＴへの置換以外のヌクレオチドの変化は全く観察されなかった。さらに、関連データに基づいてキャリアーであると推定されているが、まだ大腸ガンに冒されていないファミリー２の４人の個人は、同じＣからＴへの置換によりヘテロ接合であることが見出された。これらの推定されたキャリアーの二人は、この特定のファミリーにおける平均の開始期（５０年）よりも低く、二人はこれより上である。この同一のファミリーから調べられた病気に冒されていない二人の個人であって、両方とも関連データからキャリアーでないことが推定される個人は、この位置に予想される正常な配列を示した。ファミリー２におけるＣからＴへの置換を含む関連分析は、組換えフラクション０でロッドスコア２．２３を与えた。厳密性の低いガン診断基準を用いて、ロッドスコア２．５３を計算した。これらのデータは、ＣからＴへの置換がファミリー２におけるＨＮＰＣＣへの重要な関連を示すことを示唆している。
図８は、ｈＭＬＨ１タンパクの４４位における非保存アミノ酸置換を生成するＣからＴへの転移変異を示す配列クロマトグラムを表している。一人の病気に冒されていない個人（上のパネル、プラスおよびマイナス鎖）と一人の病気に冒された個人（下のパネル、プラスおよびマイナス鎖）の配列分析が示されている。ヘテロ接合ヌクレオチドの位置が、矢印で示されている。配列クロマトグラフの分析により、病気に冒された個人がこの部位でヘテロ接合であるのに十分なＣピークにおけるＴシグナル、およびＧピークにおけるＡシグナルが存在することが示された。
このＣからＴへの置換が多型性であるか否かを決めるために、無関係の４８人のゲノムＤＮＡから増幅されたこれと同じエキソンを配列決定したが、正常な配列のみが観察された。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション分析を用いてさらに２６人の無関係の個人を調べた33。用いたＡＳＯ配列（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１４１および１４２）は、
0004101285.tif 000016
直接的なＤＮＡ配列およびＡＳＯ分析によれば、これらの７４人の無関係の個人の誰もＣからＴへの置換を有していなかった。それゆえ、ファミリー２の個人に見られるＣからＴへの置換は、多型性ではないようである。上述したように、第二クロモソーム３関連ファミリー、ファミリー１の病気に冒された個人にはこれと同じＣからＴへの置換を検出しなかった3。我々は、ｈＭＬＨ１の変異について、ファミリー１の個人の研究を続けている。
以下の表４は、ファミリー２の病気に冒されたおよび病気に冒されていない個人、並びに無関係の個人の血液サンプルの実験的分析をまとめたものである。
0004101285.tif 000017
いくつかの基準に基づいて、ｈＭＬＨ１のコード領域に観察されるＣからＴへの置換が、ファミリー２におけるＨＮＰＣＣの根拠となる変異を示すと考えられる3。先ず、ＤＮＡ配列およびＡＳＯ分析は、無関係の７４人の個人にＣからＴへの置換を検出しなかった。しかして、ＣからＴへの置換は、単なる多型性ではない。第二に、観察されたＣからＴへの置換は、４４位におけるセリンからフェニルアラニンへの変化を生じると推定される（図９参照）。このアミノ酸置換は、このタンパクの保存された領域における非保存的変化である（図３および９）。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎパラメーターを用いた二次的な構造の推定は、ターンに位置する４４位を備えたヘリックスターンβシート構造を示唆する。４４位におけるＳｅｒからＰｈｅへの置換は、このターンの推定を顕著に低め、推定されたアミノ酸の置換が、ｈＭＬＨ１タンパクの高次構造を変えることを示唆する。ＳｅｒからＰｈｅへの置換が、ガンに罹りやすくなる変異であるという示唆は、イーストＭＬＨ１遺伝子におけるアナログ置換（アラニンからフェニルアラニン）が、機能しないミスマッチ修復タンパクを生じるということを示す実験によってさらに支持される。細菌およびイーストにおいて、ＤＮＡミスマッチ修復に影響する変異が、二つのヌクレオチドの繰り返し内の付加および欠失を含む自発的な変異の速度を顕著に増加する4,5,11,13,14,15,16。ヒトでは、ｈＭＳＨ２の変異は、クロモソーム−２ＨＮＰＣＣ1,2、ミクロサテライト不安定性およびミスマッチ修復における明らかな欠陥を示す腫瘍の根拠である12。クロモソーム３関連ＨＮＰＣＣは、二つのヌクレオチドの繰り返しの不安定性に関係する3。これらの観察と組み合わせて、ヒトＭＬＨ１タンパクとイーストＤＮＡミスマッチ修復タンパクＭＬＨ１との間の高度の保存は、ｈＭＬＨ１がＤＮＡミスマッチ修復において機能することを示唆する。ｈＭＬＨ１遺伝子の単離の間に、ｈＰＭＳ１遺伝子を同定した。この観察は、イーストのように4、哺乳動物のＤＮＡミスマッチ修復が少なくとも二つのＭｕｔＬ様タンパクを必要とするかもしれないことを示唆する。異なるＨＮＰＣＣファミリーは、ＭＬＨ１遺伝子において異なる変異を示すらしいことに注目すべきである。上述したように、ファミリー１の病気に冒された個人は、ＨＮＰＣＣと３ｐ２１−２３の領域の座位との間に“堅固な関連”を示した。しかしながら、ファミリー１の病気に冒された個人は、ファミリー２に見られたＣからＴへの変異を備えていない。ファミリー１の病気に冒された個人は、ＭＬＨ１遺伝子に別の変異を備えているらしい。さらに、本出願に記載された構造情報および方法を使用して、イギリスの大きなＨＮＰＣＣファミリーの変異遺伝子のヘテロ接合キャリアーにガンに罹りやすくなる別のｈＭＬＨ１変異を見出し、かつ特徴付けを行った。イギリスのファミリーにおけるｈＭＬＨ１変異は、切りつめられたｈＭＬＨ１タンパクの合成を導くと思われる＋１Ｔフレームシフトである。必須に全ての既知の病気に冒された個人が同じ変異を有する鎌状赤血球貧血等と違って、多数のｈＭＬＨ１変異が見出されガンに結びつけられている。それゆえ、ｈＭＬＨ１（並びに、おそらくｈＰＭＳ１）の完全なｃＤＮＡ��列、並びに特にエキソンを取り囲むゲノム配列に関する知識は、高頻度のガンを示すと同定されたファミリーの変異を特徴付けるのに使用できるとともに重要である。
ｈＭＬＨ１に変異を起こすガンに関する我々の発見に続いて、他者による研究は、ｈＭＬＨ１における少なくともさらに５つの変異の特徴付けをもたらし、これらはそれぞれ、少なくとも一つのＨＮＰＣＣファミリーの個人をガンに罹りやすくするようである。例えば、Papadopoulosらは、コドン５７８から６３２の間の１６５塩基対のインフレーム欠失（in-frame deletion）によって特徴付けされた、前記変異を同定した。別のファミリーでは、Papadopoulosらは、フレームシフトと新しいアミノ酸の置換、すなわちコドン７２７と７２８の間の４塩基対の欠失に特徴を有するｈＭＬＨ１変異を観察した。また、Papadopoulosらは、ＣＯＯＨ末端の延長、すなわちコドン７５５と７５６の間に４塩基対の挿入に特徴を有するｈＭＬＨ１ガン関連変異を報告している38。
要約すると、遺伝性ポリポシス大腸ガン遺伝子であるらしいＤＮＡミスマッチ修復遺伝子ｈＭＬＨ１が、クロモソーム３ｐ２１−２３に関連分析によって先に位置づけられたことを示した。ｈＭＬＨ１遺伝子配列の有用性は、ガン関連変異に関するＨＮＰＣＣファミリーのスクリーニングを容易にするであろう。さらに、関連マーカーのヘテロ接合性の損失（ＬＯＨ）は、ＨＮＰＣＣの２ｐまたは３ｐ形態のいずれかの特徴ではないが3,6、３ｐ２１．３−２３領域を含むＬＯＨは、いくつかのヒトのガンに観察されている24-26。このことは、ｈＭＬＨ１変異がこのような腫瘍において何らかの役割を演じ得る可能性を示唆している。
ヒトＰＭＳ１
ヒトＰＭＳ１を、図１を参照して記載された方法を用いて単離した。図１０は、完全なｈＰＭＳ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。図１１は、推定されるヒトおよびイーストのＰＭＳ１タンパク配列の並びを示す。ＦＩＳＨ分析によって、ヒトＰＭＳ１がクロモソーム７に位置することを調べた。ｈＰＭＳ１に関する我々の発見に続いて、他者がＨＮＰＣＣに罹りやすくなると考えられる遺伝子の変異を同定した。
マウスＭＬＨ１
図１を参照して上記された方法を用いて、図１２に示すようなマウスＭＬＨ１のｃＤＮＡの部分的なヌクレオチド配列を決定した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）。図１３は、対応して推定されるｍＭＬＨ１タンパクのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）を、推定されるｈＭＬＨ１タンパク配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）と比較して示している。マウスとヒトのＭＬＨ１タンパクとの比較、並びにｈＭＬＨ１とイーストＭＬＨ１タンパクとの比較により、図９に示すような高度の保存が示された。
マウスＰＭＳ１
図１に示す上記の方法を用いて、図１４に示すように、マウスＰＭＳ１遺伝子を単離および配列決定した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）。このｃＤＮＡ配列は、図１５に示すように、８６４アミノ酸の推定されるタンパク（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）をコードし、図１５では、推定されたアミノ酸配列とｈＰＭＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）との比較がされている。推定されたマウスとヒトのＰＭＳ１タンパク間の同一性の度合いは高く、これは二つの哺乳動物間に予想される通りである。同様に、上述したように、図１１に示すように、ヒトＰＭＳ１タンパクとイーストのＤＮＡミスマッチ修復タンパクＰＭＳ１との間に強力な類似性がある。イーストのＰＭＳ１とＭＬＨ１が、イーストにおいてＤＮＡミスマッチを修復するように機能するという事実は、ヒトとマウスのＰＭＳ１とＭＬＨ１もミスマッチ修復タンパクであるということを強力に示唆する。
マウスＭＬＨ１とＰＭＳ１の使用
ｍＭＬＨ１およびｍＰＭＳ１遺伝子に関する我々の単離および特徴付けは、多くの調査手段を有すると確信している。例えば、上述した様に、特にｈＰＭＳ１と反応する抗体を産生するのにｍＰＭＳ１遺伝子の知識を用いた。ヒトのタンパク、ＭＬＨ１またはＰＭＳ１に向けられた抗体は、調査目的はもちろん診断目的にも使用できることを既に説明した。
また、ｍＰＭＳ１およびｍＭＬＨ１に関する知識が、ＤＮＡミスマッチ修復欠陥の結果を研究するためにマウスモデルを構築するのに使用できると確信している。クロモソーム２ｐおよび３ｐ関連ＨＮＰＣＣが、ミスマッチ修復遺伝子にそれぞれ欠陥を有することから、ｍＰＭＳ１またはｍＭＬＨ１欠陥マウスが、ガンに高い傾向を示すことを予想した1,2。上述したように、ｍＰＭＳ１に欠陥のある遺伝子を有するキメリックマウスを既に作製した。現在、ｍＰＭＳ１またはｍＭＬＨ１変異に関してヘテロ接合性のマウスを作製中である。これらのヘテロ接合性マウスは、ヒトのガン、特にＨＮＰＣＣを研究するために使用できる動物モデルを提供すべきものである。このマウスは、ガンの危険性および進行を決定する内因性および外因性の両方の分析に使用される。また、ミスマッチ修復欠陥に関係するガンは、他のガンと比較して従来の治療に別に反応する。このような動物モデルは差異があるか否かを決定するのに使用され、この種の腫瘍の効果的な治療の療法を開発することができる。また、このような動物モデルは、遺伝と発ガン性物質における食事の要素との間の関係を研究するためにも使用される。
多型性と変異との区別
ガンの罹りやすさの研究、並びに腫瘍の同定および特徴付けのために、“変異”と“多型性”とを区別することは重要である。“変異”は、遺伝子の“非野生型対立遺伝子”を生成する。遺伝子の非野生型対立遺伝子は、細胞内で正常に機能しない転写体および／またはタンパク生成物を生成する。“変異”は、挿入、欠失、置換および転移を含むヌクレオチド配列内のあらゆる変化とすることができる。
一方、“多型性”は、正常に機能する（すなわち“野生型”）遺伝子の集団内に見られる配列の差異である。ある多型性は、核酸コードの縮重による。すなわち、ほとんどのアミノ酸が一つ以上のトリプレットコドンによってコードされていると仮定すると、多くの異なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコードすることができる。他の多型性は、遺伝子またはコードされたポリペプチドの機能に重要な影響を与えない単なる配列の相違である。例えば、ポリペプチドは、多くの場合、小さい挿入または欠失、あるいはポリペプチドの機能を顕著に変えることのないそのアミノ酸配列における“保存的な”置換に対して寛容的である。
“保守的な”置換とは、ある特定のアミノ酸が、化学的特徴が類似した別のアミノ酸で置換されることである。例えば、アミノ酸は、しばしば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む“非極性（疎水性）”；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む“極性中性（polar neutral）”；アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む“陽性帯電性（塩基性）”；並びにアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む“陰性帯電性（酸性）”として特徴付けされる。あるアミノ酸を同一グループ内の他のアミノ酸で置換することは、特に、二つの関連のあるアミノ酸の側鎖が類似する大きさのアミノ酸である場合には、一般的に“保存的”であると見なされる。
ミスマッチ修復遺伝子配列における変異または多型性を同定する第一段階は、ここで記載した技術を含めた利用できる技術を用いて、ミスマッチ修復遺伝子、（または遺伝子断片）、すなわち同じミスマッチ修復遺伝子（または遺伝子断片）の既知の正常な（例えば野生型）配列とは異なる配列の同定を含む。例えば、ｈＭＬＨ１遺伝子（または遺伝子断片）配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６−２４のいずれかのような既知の正常な（例えば野生型）ｈＭＬＨ１配列とは、少なくとも一つのヌクレオチドの位置で異なることが同定される。
変異は、種々の方法のいずれかを用いて多型性から区別することができ、おそらく最も直接的な方法は、データ収集および腫瘍の発達との相関である。すなわち、例えば、患者は、そのｈＭＬＨ１遺伝子配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６−２４に報告された配列とは異なると同定されるが、その患者はガンではなく、その家族もガンに罹ったことがない人である。もし、他の、好ましくはその患者の家族の年長者が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６−２４とは異なるｈＭＬＨ１遺伝子配列を同様に有するならば、患者のｈＭＬＨ１遺伝子配列は、“多型性”として区分することができるであろう。もし、別の無関係の個人が、同じｈＭＬＨ１遺伝子配列で同定され、その家族にもガンの経歴がないならば、その区分は確実なものとされる。
中でもこのような変異は、病気に冒された個人の全ての組織およびその患者の親の少なくとも一方の生殖系にはおそらく存在し、ガンの経歴のない病気に冒されていないファミリーにはおそらく見られないことから、遺伝的にガンに冒されやすくなることに対応する変異を同定することができる。
多型性と変異を区別する場合に、少なくとも一つの既知のミスマッチ修復遺伝子変異の存在下において、特定の配列の差異を評価することは時に価値がある。ある場合には、特定の配列の変化は、単独でアッセイした場合には、顕著な効果を持たない（すなわち、多型性と見られる）が、例えば、変異のみを有する個人よりも、明らかな多型性の差異と既知の変異の両方を有する個人は、より高い確率でガンになるというように、既知の変異の浸透度を増加する。このような効果を有する配列の差異は、弱いが適切に変異であると考えられる。
上述および以前に記載したように（米国特許出願第０８／１６８８７７および０８／２０９５２１）、ミスマッチ修復遺伝子または遺伝子産物における変異は、その遺伝子または遺伝子産物の非野生型を生成する。それ故、ある変異は、In vivoまたはin vitroにおけるミスマッチ修復アッセイにおけるその機能的特徴によって、多型性と区別される。利用できる全てのミスマッチ修復アッセイを、これらの特徴を分析するために用いることができる49-63。ある変異はどのアッセイでも観察されない効果を有するため、配列の変化を多型性として区分する前に、一つ以上のミスマッチ修復アッセイを利用することが一般的には好ましい。
例えば、変異を有するミスマッチ修復遺伝子は、宿主細胞のミスマッチ修復に検出可能に影響せずに、宿主細胞中の同じ遺伝子の内在性コピーを置換することは不可能と考えられる；しかしながら配列多型性を有するミスマッチ修復遺伝子は、宿主細胞のミスマッチ修復に検出可能に影響することなく、宿主細胞中の同じ遺伝子の内在性コピーを置換することができると期待される。このような“置換”の研究では、例えばある種の遺伝子産物が、他の種の別のミスマッチ修復遺伝子産物と相互作用できないことによる複雑さを避けるために、試験遺伝子が得られた細胞と同種（もしくは少なくとも近い関係）の宿主細胞中に試験されるべき遺伝子を導入することが一般的に好ましい。同様に、変異ミスマッチ修復タンパクは、in vitroミスマッチ修復システム（好ましくは関係する生物体由来）において正常に機能するとは考えられないが、多型性ミスマッチ修復タンパクは、正常に機能すると考えられる。
ここおよび以前に記載した方法は、異なる種類のミスマッチ修復遺伝子変異を同定する。以下の実施例は、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子における多型性から変異を区別するためのプロトコルを例証するものである。
実施例３：イースト、S. cerevisiaeにおける、ｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１遺伝子に見られる変異の機能的重要性を試験するためのシステムを開発した。このシステムは、本出願では、例えば、上述したように、ＨＮＰＣＣのファミリーに見られた、セリン（ＳＥＲ）からフェニルアラニン（ＰＨＥ）によるｈＭＬＨ１における変異を用いて記載する。必須にそのＭＬＨ１遺伝子を欠き、このために強力なミューテーターであるイースト株を誘導した（すなわち、個々に対する所定のアミノ酸に成長依存からの復帰を含む簡単な遺伝的マーカーアッセイにおいて、正常の割合より１０００倍高い（ｈｏｍ３−１０対立遺伝子の復帰、Prolla, ChristieとLiskay, Mol Cell Biol. 14:407-415, 1994）。正常のイーストＭＬＨ１遺伝子（既知の全てのコントロール領域を備えた完全なもの）を、ＭＬＨ１を欠く株に単一コピーとして安定に維持されたイーストプラズマに入れた場合に、腫瘍表現型は、アミノ酸独立アッセイに対する復帰を用いて十分に訂正される。しかしながら、イーストＭＬＨ１の欠失コピーを導入すると、全く訂正されない。次いで、ＨＮＰＣＣファミリーにおいてＳＥＲからＰＨＥへの変化を誘発する変異を試験した。結果的な変異イーストタンパクが腫瘍の表現型を訂正しないということから、おそらく野生型の遺伝子配列からの変化によってガンに罹りやすくなり、それゆえ多型性ではなく変異として区分されるということが、強力に示唆されることを見いだした。次いで、“セレン（serene）”の位置に別のアミノ酸を含むようにされたタンパクを試験して、ほとんどの変化が完全な変異体、もしくは少なくとも部分的な変異の表現型をもたらすことを見いだした。
ＭＬＨ１およびＰＭＳ１遺伝子における他の“ポイント”変異が、ガンのファミリーに見いだされるので、適切なイースト同族体遺伝子および研究されたタンパク機能に基づくそれらの共通配列中に設計することができる。さらに、ＭＬＨ１とＰＭＳ１遺伝子の両方においていくつかの高度に保存されたアミノ酸を同定した。また、ｈＭＬＨ１がイーストＰＭＳ１と相互作用するという証拠がある。この知見は、ｈＭＬＨ１遺伝子に観察された変異を、イーストシステムにおいてより直接的に試験することができるという可能性を高めた。これらの保存された位置のアミノ酸を変える変異を組織的に作成し、アミノ酸の置換が慣用されるか否かを調べる。ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１に係る変異情報を回収し、ＨＮＰＣＣファミリーに実際に見られた変異を決定および文書で証明し、実験システムで試験するために人工的に変異を合成することにより、結局、個人のｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１の構造が決定されれば、その構造と既知のデータに対する多型性とを比較するだけのガンに罹りやすさを試験するプロトコールを実行することができる。
実施例４：ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１との間の物理的相互作用を研究するために用いた別の方法を、遺伝子産物中の特定の変化がタンパク−タンパク相互作用の度合いに変化をもたらすか否かを研究するために用いることができる。タンパク−タンパク相互作用における変化に係る情報は、特定の遺伝子変化が変異または多型性であるかを調べあるいは確かめる。in vitroとin vivoにおけるイーストＭＬＨ１とＰＭＳ１タンパク間の相互作用に関する我々の研究室の発見に続いて（米国特許出願第０８／１６８８７７）、これらの二つのＤＮＡミスマッチ修復タンパクのヒトの対応物間の相互作用を調べた。ヒトのＭＬＨ１とヒトのＰＭＳ１タンパクを、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）親和クロマトグラフィーを用いたin vitro相互作用に関して試験した。ｈＭＬＨ１タンパクをＭＢＰ融合タンパクとして調製し、ＭＢＰを介してアミロース樹脂カラムに固定化し、in vitroで合成されたｈＰＭＳ１への結合を試験した。ｈＰＭＳ１タンパクはＭＢＰ−ｈＭＬＨ１マトリックスに結合したが、コントロールのタンパクはマトリックスへの親和性を全く示さなかった。in vitroで翻訳されたｈＭＬＨ１タンパクをＭＢＰ−ｈＰＭＳ１融合タンパクマトリックスを通すと、ｈＭＬＨ１タンパクがＭＢＰ−ｈＰＭＳマトリックスに結合したが、コントロールは結合しなかった。
ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１との潜在的なin vivo相互作用は、イースト“２ハイブリッド”システムを用いて試験された28。最初の結果は、ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１はin vivoでイースト中で相互作用することを示した。また、同じシステムを、遺伝子または遺伝子産物構造における変化から得られ、多型性またはガンに罹りやすくい変異として区別されなければならない、タンパク−タンパク相互作用における変化を検出するために用いることができる。
ＨＮＰＣＣファミリーの検出およびそれらの変異
米国の約１００００００人がＨＮＰＣＣ変異遺伝子を有する（またはヘテロ接合）と概算されている29。さらに、５０−６０％のＨＮＰＣＣファミリーが、クロモソーム２ｐ上にあるＭＳＨ２遺伝子の変異を分離すると考えられる1,2。別の重要なフラクションは、上述したＣからＴへの転換のような、おそらくはｈＭＬＨ１変異のために、クロモソーム３ｐ２１−２２にマップするＨＮＰＣＣ遺伝子と関係しているようである。ｈＭＳＨ２またはｈＭＬＨ１遺伝子のいずれかの変異対立遺伝子を分離するファミリーの同定すること、およびこれらのファミリーの個人が実際に変異を有することを調べることは、この疾患に早くから干渉するのに非常に有効である。このような早期の干渉は、病気に冒された個人のスクリーニングによる早期検出および攻勢的な追求処置を含むであろう。さらに、家族的および散在性の腫瘍の両方の遺伝子の塩基を調べることにより、治療方法を根本の腫瘍、あるいは再発に向けることができた。
最初に、ＨＮＰＣＣの候補のファミリーは、家系の研究を通して、例えば、病院の腫瘍学者により、局地的なレベルで部分的に診断される。ＨＮＰＣＣのある基準は、患者の腫瘍のミクロサテライト不安定性の観察である3,6。患者は、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１およびこれらが同定されたようにＤＮＡミスマッチ修復に係る他の遺伝子における変異が試験される。これは、個人の血液をサンプリングすることにより最も容易になされる。また、新鮮に冷凍された腫瘍組織は、より高度に使用できる。スクリーニングの工程で、病気に冒された個人は、正常組織における変異にヘテロ接合であることに注意することが重要である。
血液および腫瘍等の利用できる組織は、以下の工程の一つまたは両方を用いてＰＣＲに基づく変異分析が行われる。
１）ｈＭＬＨ１遺伝子にしっかりと結合したミクロサテライトマーカーを用いた結合分析
ガンの傾向があるファミリーをｈＭＬＨ１変異に関して同定する一つの試みは、ｈＭＬＨ１内に位置する、あるいはこれにしっかりと結合した高度に多型性のマーカーで結合分析を行うことである。ミクロサテライトは、高度に多型性であり、それ故結合分析におけるマーカーとして非常に有益である。Ｐ１ファージクローン（〜１００ｋｂｐ）の単一の巨大なゲノムフラグメント上にｈＭＬＨ１遺伝子を有しているので、二つのヌクレオチドの繰り返しの管（tracts）等の一つ以上のミクロサテライトが、ｈＭＬＨ１遺伝子内、あるいは非常に近くに存在するらしい。少なくとも一つのこのようなミクロサテライトが報告されている38。このようなマーカーが同定されれば、ＰＣＲプライマーは、このミクロサテライトを含むＤＮＡの伸長を増幅するように設計することができる。高頻度のガンを有するファミリーから病気に冒されたおよび病気に冒されていない個人のＤＮＡをスクリーニングして、ＭＬＨ１マーカーの分離とガンの存在を調べる。結果のデータは、ロッドスコアを計算するために用いることができ、このためｈＭＬＨ１とガンの発生との間の関係の見込みを調べる。一度所定のファミリーにおける関係が確立されれば、ｈＭＬＨ１変異を有する見込みの血縁の他のヒトを調べるのに同じ多型性マーカーを用いることができる。
逆転写されたｃＤＮＡの配列決定
ａ）病気に冒された個人、病気に冒されていない個人、および無関係の個人のＲＮＡを逆転写し（ＲＴ’ｄ）、ＰＣＲを行って４−５重複部位におけるｃＤＮＡを増幅した34,37。ＰＣＲの目的のために、多くの異なるオリゴヌクレオチドプライマーの組の配列が、遺伝的スクリーニングの目的のために個人のｈＭＬＨ１またはＰＭＳ１遺伝子の関連部分を増幅するのに潜在的に用いられることに注目するべきである。遺伝子のｃＤＮＡ構造の知識を用いて、遺伝子の選択された部分を特異的に増幅するのに効果的であると思われるプライマー対を作製することは、率直な行動である。プライマー配列は典型的には２０〜３０塩基の長さであるが、特異的に選択された遺伝子セグメントを増幅するために、約１３塩基程度の短いプライマーを使用することができる。どのくらい短いプライマー配列が許容されるかの原理的な限定は、特異的に標的の遺伝子セグメントにハイブリダイズするのに十分な長さでなければならないことである。ＰＣＲの特異性は、一般的にプライマーの伸長および／またはネスティドペアのプライマーを用いることによって改良される。
完全なｃＤＮＡを全体的に示すＰＣＲ産物を、配列決定し、既知の野生型配列と比較した。多くの場合、変異は、病気に冒された個人に見られる。理想的には、変異の性質は、遺伝子産物を不活性化しそうであることを示す。そうでなければ、変化が単なる多型性ではないという可能性が、決定されなければならない。
ｂ）スプライシングまたは停止コドンの翻訳に影響する様な、ある種の変異は、変異遺伝子から生じたメッセンジャーＲＮＡを不安定化するため、正常なＲＴに基づく変異検出方法を含む。最近報告された技術は、変異ｃＤＮＡが、正常な長さのタンパクの合成を、組み合わされたin vitro転写／翻訳システムに向けることができるか否かを調べることによって、この問題を回避することができる32。
３）ゲノムＤＮＡの直接的な配列決定
変異を検出するための第二の経路は、直接的にＤＮＡの鋳型を欠いたＰＣＲサイクル配列決定によるエキソンおよびイントロン／エキソン境界を調べることに基づく1,2。この方法は、直接的なＰＣＲサイクル配列決定用に個々のエキソンを増幅する、上記表２および３に記載されたオリゴヌクレオチドペアの使用を必要とする。この方法は、各イントロン／エキソン境界におけるゲノムＤＮＡ配列情報に基づく（各境界で５０ｂｐ、またはそれ以上）。この技術の利点は、二つである。第一に、ＤＮＡがＲＮＡより安定であるため、ＰＣＲで用いられる物質の条件は、ＲＮＡに基づくプロトコルほど重要ではない。第二に、スプライシングに影響するイントロンの変異を含めた、遺伝子の実際に転写される領域内におけるほとんどの変異は、検知可能である。
それぞれの候補の遺伝子にとって、変異検出は、完全なｃＤＮＡ構造と、ゲノム構造の全てのイントロン／エキソン境界の両方の知識を必要としてもよい。このような情報に基づいて、特定のファミリーにおける原因の変異の種類を調べることができる。代わって、より特異的で効率的な変異検出機構を特定のファミリーに適用することができる。一つ以上の遺伝子が関係し、互いの遺伝子に対して複数の種類の変異が関係するという意味で、遺伝的に不均一な塩基を有するため、疾患（ＨＮＰＣＣ）をスクリーニングすることは複雑である2。所定のファミリーは、一つの特定の変異を高度に分離するようである。しかしながら、複数のファミリーにおいて腫瘍の性質が調べられるので、集団の最も一般的な変異のスペクトルが決定される。一般的に、最も高頻度の変異の決定は、直接的かつ合理的な変異検出である。
ＨＮＰＣＣが人類に普及しているので、誕生時にキャリアーを検出することは、標準的な新生児の試験の一部となりうる。危険性のあるファミリーを同定することができ、以前に試験されていない全てのメンバーを調べることができる。最終的には、病気に冒された全ての親族を決定することができる。
変異スクリーニングおよび試験の方式
ＤＮＡに基づく試験
標準的な診断および家系の研究によりＨＮＰＣＣファミリーであろうと同定することを含む最初の試験は、局地的かつより小さいＤＮＡ診断研究所でなされるであろう。しかしながら、多数のファミリーのメンバーの巨大なスケールの試験、並びにある程度の集団の広い試験は、究極的には、非常に効率的な集中した商業的施設を必要とするであろう。
少なくともクロモソーム２ｐ上のｈＭＳＨ２遺伝子およびクロモソーム３ｐ上のＭＬＨ１遺伝子を含む、ＨＮＰＣＣの基礎になる主要な遺伝子の最も一般的な変異の決定に基づいて試験が開発されるであろう。種々の試験が開発される。一つの可能性は、例えば、正常なｖｓ．変異対立遺伝子を区別するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用いる一組の試験である33。既に述べたように、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１およびｈＭＳＨ２遺伝子のヌクレオチド構造に関する知識により、遺伝子スクリーニングおよびガンの危険性の分析に関する個人のミスマッチ修復遺伝子の特異的部分を増幅するために使用することができる多数のオリゴヌクレオチドプライマーペアを設計することができる。遺伝子の構造に関する知識も、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の一つの全てまたは一部の存在または欠失を決定するために素早く用いることができる標識されたプローブの設計を可能にする。例えば、対立遺伝子特異的オリゴマープローブ（ＡＳＯ）は、対立遺伝子間で区別されるように設計することができる。ＡＳＯは、正常および変異対立遺伝子間の差異を反映する単一の塩基の違いを除いては配列において同じである短いＤＮＡセグメントである。適切なＤＮＡハイブリダイゼーション条件下で、これらのプローブは、二つの他の点で同じＤＮＡ配列間の単一塩基の差異を認識することができる。プローブは、放射活性、あるいは種々の非放射活性レポーター分子、例えば、蛍光または化学的発光分子等で標識することができる。標識されたプローブは、疾患誘発対立遺伝子の存在について、ＰＣＲサンプルを分析するために用いられる。いくつかの種々の疾患誘発遺伝子が存在するか否かは、単一のサンプルで容易に調べられる。プローブの長さは、標的以外のヌクレオチド配列に非特異的に結合することを避けるのに十分な長さでなければならない。どの試験も、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＰＭＳ１およびＨＮＰＣＣに関係している他のＤＮＡミスマッチ修復遺伝子に関する正確かつ完全な構造情報に究極的に依存するであろう。
タンパク検出に基づくスクリーニング
タンパク産物自身の機能に基づいた試験を用いることもできる。タンパクを調べる試験は、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１およびｈＭＳＨ２タンパク、またはこれらが同定されるように別の関連する“ガン”遺伝子産物のいずれかに特異的な抗体試薬を利用することができる。
例えば、冷凍された腫瘍試験片を切断して、間接的な蛍光技術を用いて抗体染色に調製することができる。ある遺伝子変異は、抗体染色後、変化または減少したシグナルを与えるようにタンパクの構造を十分に変化または不安定化すると予想される。このような試験は、ファミリーのガンにおける遺伝子の関係が確立される必要がある場合に行われるだろう。ヒトＭＬＨ１およびＰＭＳ１タンパクに対する診断モノクローナル抗体を開発中である。我々は、細菌においてＭＬＨ１およびＰＭＳ１ヒトタンパクを発現（overexpressing）させている。このタンパクを精製し、マウスに注入して、診断および調査の目的に使用するタンパク特異的モノクローナル抗体を誘導する。
ＤＮＡミスマッチ修復腫瘍の同定および特徴付け
患者がガンに罹りやすいかを診断することに加えて、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な核酸配列は、中でも、ミスマッチ修復欠陥腫瘍の同定および特徴付けにおける使用に利用することができる。ミスマッチ修復欠陥腫瘍が特定の治療の多くによりよく反応するので、このような同定および特徴付けを利用することができる。例えば、ミスマッチ修復欠陥腫瘍は、特に他の治療剤と組み合わせて投与された場合に、ＤＮＡ損傷剤に敏感である。
ミスマッチ修復遺伝子における欠陥は、個人の腫瘍形成に寄与するように個人の組織を通して存在する必要はない。特定の細胞または組織におけるミスマッチ修復遺伝子の自発的変異は、その組織における腫瘍形成に寄与する。実際に、少なくともいくつかの場合には、ミスマッチ修復遺伝子の単一の変異は、腫瘍の発達に重要ではない。そのような場合には、ミスマッチ修復遺伝子に単一の腫瘍を備えた個人は、ガンになりやすいが、第二の変異が発生するまで腫瘍を発達しないだろう。さらに、ある場合には、個人の厳密に腫瘍と係わる同じミスマッチ修復遺伝子変異は、遺伝的にガンに罹りやすいファミリーにおいては、ガンに罹りやすくすることの原因となる。
本発明の他の態様では、腫瘍（または腫瘍細胞ライン）を分析するため、並びにミスマッチ修復遺伝子における腫瘍関連変異を同定するために、我々が提供した配列情報を当該技術で知られた方法で使用することができる。好ましくは、これらの腫瘍関連変異が、同じ個人の非腫瘍組織に存在しないことを調べることができる。本願に記載された情報は、短い繰り返しＤＮＡ部材の遺伝的不安定性を示す腫瘍（または腫瘍細胞ライン）内のミスマッチ修復遺伝子変異の同定に特に使用できる。
本発明の配列情報および試験プロトコルも、二つの腫瘍が関連するか否か、すなわち第二の腫瘍が、特定のＤＮＡミスマッチ修復遺伝子変異を示す先に見出された第一の腫瘍から転移したものか否かを調べるのに使用できる。
関連した機能のさらなる遺伝子の単離
物理的にｈＭＬＨ１および／またはｈＰＭＳ１と相互作用するタンパクは、ＤＮＡミスマッチ修復に関連するであろう。ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ２に対する類似性により、このようなタンパクをコードする遺伝子の変異は、潜在的にガンと関連する強力な候補であろう。“２ハイブリッドシステム”と称されるイーストを使用する強力な分子遺伝試験は、ｈＭＬＨ１等の関心のある遺伝子産物と相互作用するタンパクをコードする遺伝子を比較的急速に検出および単離する28。
２ハイブリッドシステムは、融合タンパクをコードする二つのプラスミドベクターを含む。二つのベクターはそれぞれ、転写活性因子の一部またはドメインを含む。活性因子のみでは、転写を活性化することはできない。しかしながら、二つのドメインが近づけられれば、転写が起こる。ｈＭＬＨ１等の関心のタンパクのｃＤＮＡを、一方のベクターの読み枠内に挿入する。これは、“ベイト（bait）”と呼ばれる。転写活性の別のドメインと融合を作るように第二プラスミドベクターに挿入されたヒトｃＤＮＡのライブラリーを、“ベイト”ベクターを有するイースト細胞に導入する。特定のイースト細胞が、ｈＭＬＨ１タンパクと相互作用するタンパクをコードするヒトｃＤＮＡを含有するライブラリーメンバーを受ける場合には、この相互作用は、転写活性化因子の二つのドメインを近づけ、レポーター遺伝子の転写を活性化し、イースト細胞を青色にする。次いで、挿入物を、データベースの配列に関連するか否かを調べるために配列決定した。同じ方法または関連する方法を、ＤＮＡミスマッチ修復のイーストタンパクを同定するために用いることができる。イーストおよびヒトの平行した“捜索（hunts）”を行うことは、ある利点を有する。新規イースト同族体の機能は、遺伝子の分離、および新規に見出された遺伝子において欠陥のある遺伝的共通配列の試験によってイーストで早く調べられる。これらのイーストの研究は、ＰＭＳ１およびＭＬＨ１に関するイーストの研究が、ヒトＭＬＨ１およびＰＭＳ１遺伝子に関する我々の研究に影響したのと同様に、新規のヒトの“ｈＭＬＨ１-もしくはｈＰＭＳ１-相互作用”タンパク分析の誘導を助けるだろう。
抗体の産生
ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１のＤＮＡ配列に関する我々の知識を用いて、抗体を産生するために予想されるタンパク構造の全部または一部を合成することができる。ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１タンパクに向けられた抗体の一つの重要な使用は、ＤＮＡミスマッチ修復に係る他のタンパクを捕獲するためである。例えば、共同免疫沈降（coimmunoprecipitation）技術を用いることによって、ｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ１のいずれかに向けられた抗体は、機能的および／または物理的に関連した他の結合したタンパクと共に沈降することができる。抗体の別の重要な使用は、腫瘍組織からｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ１タンパクを単離する目的のためである。腫瘍からのｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１タンパクは、適切な治療手段を調べるために特徴付けすることができる。
ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ１タンパクに向けられたモノクローナル抗体を開発中である。
実施例５：ヒトおよびマウスのＰＭＳ１タンパクに向けられたポリクローナル抗体を産生するために以下の工程を用いた。
細菌性発現プラスミドベクター，ｐＥＴ（Novagen, Madison, WI）にマウスＰＭＳ１のｃＤＮＡの３’フラグメントを挿入した。予想されたマウスＰＭＳ１タンパクの発現部位は、ＰＭＳ１タンパクの末端の約２００アミノ酸の領域に対応する。ｍＰＭＳ１のこの部分は、イーストＰＭＳ１で保存されるが、ヒトまたはマウスのＭＬＨ１タンパクで保存されない。抗体を産生するためのＰＭＳ１タンパクのこの部位を選択した一つの理由は、ＭＬＨ１と交差反応する抗体を得たくなかったことである。マウスＰＭＳ１タンパクフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉで高度に発現し、ポリアクリルアミドゲルから精製し、溶出されたタンパクを動物注射用に調製した。約２ｍｇのＰＭＳ１タンパクフラグメントを、ウサギに注入するためにＰｏｃｏｎｏ Ｒａｂｂｉｔ Ｆａｒｍ（ＰＡ）に送った。複数回のウサギの血清を、標準的なＥＬＩＳＡ技術を用いてＰＭＳ１抗原に対して滴定した。マウスＰＭＳ１タンパクに特異的なウサギ抗体を、固定されたマウスＰＭＳ１タンパクを含むカラムを用いて親和精製した。親和精製されたポリクローナル抗体調製物を、さらにウエスタンブロッティングおよびドットブロッティングを用いて試験した。ポリクローナル抗体が、マウスＰＭＳ１タンパクだけでなく非常に類似するヒトＰＭＳ１タンパクをも認識することを見出した。ウエスタンブロットに基づいて、ヒトまたはマウスのＭＬＨ１タンパクのいずれかを含む、別のタンパクが我々の抗体によって強く認識されるという示唆はなかった。
ＤＮＡミスマッチ修復欠陥マウス
実施例６：全体的な動物系におけるＤＮＡミスマッチ修復欠陥および結果的なガンを研究するための実験モデル系を作製するために、真核性ステム（ＥＳ）細胞技術を用いてＤＮＡミスマッチ修復欠陥マウスを誘導した。ｍＰＭＳ１遺伝子の一部を含むゲノムＤＮＡを用いて、相同的組換えに基づいてクロモソームｍＰＭＳ１遺伝子の分離を引き起こすベクターを作製した。１２９マウス株のマウスＥＳ細胞が、崩壊したｍＰＭＳ１対立遺伝子を含むことを確かめた。ＥＳ細胞をＣ５７／ＢＬ６宿主胚盤胞に導入して、１２９とＣ５７／ＢＬ６細胞のキメラすなわち混合の動物を作製した。ＥＳ細胞の取り込みを、アグーチ・コート・カラーリング（agouti coat coloring）（ＥＳ細胞の寄与の指標）のパッチの存在によって同定した。全てのオスのキメラは、Ｃ５７／ＢＬ６のメスのマウスと交配した。
次いで、ＥＳ細胞の遺伝物質の生殖系（germline）伝達の示唆する、アグーチ・コート・カラーが検出された１２匹の子孫（Ｆ2）が誕生した。１２匹の子孫の尾の先から抽出したＤＮＡの分析は、６匹の動物がｍＰＭＳ１変異にヘテロ接合（１匹の野生型と１匹の変異対立遺伝子を含む）であることを示した。６匹のヘテロ接合の動物の、３匹はメス（動物Ｆ2−８、Ｆ2−１１およびＦ2−１２）であり、３匹はオス（Ｆ2、Ｆ2−１０およびＦ2−１３）であった。ｍＰＭＳ１変異にホモ接合であるマウスを得るために、またさらにヘテロ接合のマウスを得るために４つの交配のための囲いを設定した。動物Ｆ2−１１とＦ2−１０を含む交配のための囲い＃１は、３回で全体で１３匹産み、その内４匹が遺伝子型（genotyped）がわかった。交配のための囲い＃２（動物Ｆ2−８およびＦ2−１３）は、３回で２２匹産み、その３匹の遺伝子型がわかった。７匹の遺伝子型がわかった動物の、３匹のホモ接合のメスの動物が同定された。未知の原因で、１匹の動物が６週間で死亡した。残りのホモ接合のメスは、１２週でも生存しており、健康であった。結果は、ｍＰＭＳ１ホモ接合欠陥マウスが生存できることを示している。
交配のための囲い＃３および＃４は、Ｃ５７／ＢＬ６バックグラウンドにｍＰＭＳ１変異を戻し交配するために用いた。交配のための囲い＃３（Ｃ５７／ＢＬ６マウスに交配した動物Ｆ2−１２）は、２回で２１匹の動物を産み、９匹の遺伝子型がわかった。交配のための囲い＃４（Ｃ５７／ＢＬ６マウスに交配した動物Ｆ2−６）は、８匹のマウスを産んだ。さらに、元のオスのキメラ（交配のための囲い＃５）は、３１匹のさらなる子孫を産んだ。
動物の遺伝子型を決定するために、変異および野生型ｍＰＭＳ１遺伝子を同定するために用いられる一連のＰＣＲプライマーを開発した。これらは、以下のものである（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１４３−１４８）。
0004101285.tif 000018
我々が開発したマウスは、ＤＮＡミスマッチ修復における欠陥の結果および結果的なＨＮＰＣＣを研究するための動物モデル系を提供する。ｍＰＭＳ１変異およびその種類にホモ接合およびヘテロ接合のマウスの長期の生存、並びにこれらのマウスにおける腫瘍のタイミングを決定することができる。このマウスは、皮の状態の悪化と組み合わせて、背を丸める外観によって同定されるガンの示唆の開始について日々スクリーニングされる。ｍＰＭＳ１変異を有するこれらのマウスを用いて、環境的および遺伝的な腫瘍形成に係る他の因子の効果を調べることができる。例えば、結腸および他の種の腫瘍への食事の影響は、正常なマウスとヘテロ接合またはホモ接合の遺伝型のいずれかのｍＰＭＳ１変異を有するマウスとを比較することができる。さらに、ｍＰＭＳ１変異は、ミスマッチ修復経路の遺伝子と、例えばｐ５３等のヒトのガンに係る他の遺伝子との相互作用について調べるために別の遺伝的バックグラウンドに挿入することができる。ｍＰＭＳ１変異を有するマウスは、予想される結腸癌等の、マウスに発生する癌の体細胞遺伝子治療の効果を調べるためにも使用できる。さらに、ホモ接合およびヘテロ接合ｍＰＭＳ１マウスの同質の繊維芽細胞細胞ラインが、自発的変異率の調査を含む種々の細胞研究における使用のために確立される。
ｍＭＬＨ１における変異を有するマウスを誘導するためにマウスｍＭＬＨ１遺伝子を崩壊するためのベクターを現在作成中である。ｍＰＭＳ１に欠陥を有するマウスとｍＭＬＨ１に欠陥を有するマウスとを比較するつもりである。さらに、二つのＨＮＰＣＣ遺伝子に変異を有する相乗効果があるか否かを調べるために、両方の遺伝子に変異を有するマウスを作製する。ｍＭＬＨ１変異マウスに関する他の研究は、ｍＰＭＳ１変異マウスについて上述した通りであろう。
【配列表】
（１）一般情報
（ｉ）出願人：Ｌｉｓｋａｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍ．
Ｂｒｏｎｎｅｒ，Ｃ．Ｅｒｉｃ
Ｂａｋｅｒ，Ｓｅａｎ  Ｍ．
Ｂｏｌｌａｇ，Ｒｏｎｉ  Ｊ．
Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｄ．
（ii）発明の名称：ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子に関する組成物および方法
（iii）配列の数：１４８
（iv）連絡の住所：
（Ａ）住所：Ｋｏｌｉｓｃｈ，Ｈａｒｔｗｅｌｌ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ＆  Ｈｅｕｓｅｒ
（Ｂ）通り：５２０  Ｓ．Ｗ．Ｙａｍｈｉｌｌ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｕｉｔｅ２００
（Ｃ）都市名：Ｐｏｒｔｌａｎｄ
（Ｄ）州名：オレゴン
（Ｅ）国名：米国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：９７２０４
（ｖ）コンピューターが読み込むことのできる形態：
（Ａ）媒体種：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン（ＰａｔｅｎｔＩｎ）  リリース＃１．０、バージョン＃１．２５
（vi）本出願の情報：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士／代理人の情報：
（Ａ）名称：Ｖａｎ  Ｒｙｓｓｅｌｂｅｒｇｈｅ，Ｐｉｅｒｒｅ  Ｃ．
（Ｂ）登録番号：３３５５７
（Ｃ）参照／事件整理番号：ＯＨＳＵ  ３０６Ｂ
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：（５０３）２２４−６６５５
（Ｂ）ファックス：（５０３）２９５−６６７９
（Ｃ）テレックス：３６０６１９
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
0004101285.tif 000019
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５３８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
0004101285.tif 000020
0004101285.tif 000021
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６０７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
0004101285.tif 000022
0004101285.tif 000023
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４８４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
0004101285.tif 000024
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７５６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
0004101285.tif 000025
0004101285.tif 000026
0004101285.tif 000027
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
0004101285.tif 000028
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
0004101285.tif 000029
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
0004101285.tif 000030
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
0004101285.tif 000031
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：
0004101285.tif 000032
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：
0004101285.tif 000033
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：
0004101285.tif 000034
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：
0004101285.tif 000035
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：
0004101285.tif 000036
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：
0004101285.tif 000037
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：
0004101285.tif 000038
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：
0004101285.tif 000039
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４７８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：
0004101285.tif 000040
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：
0004101285.tif 000041
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：
0004101285.tif 000042
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：
0004101285.tif 000043
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：
0004101285.tif 000044
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：
0004101285.tif 000045
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５６３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：
0004101285.tif 000046
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：
0004101285.tif 000047
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：
0004101285.tif 000048
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：
0004101285.tif 000049
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：
0004101285.tif 000050
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９：
0004101285.tif 000051
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０：
0004101285.tif 000052
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１：
0004101285.tif 000053
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２：
0004101285.tif 000054
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３：
0004101285.tif 000055
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４：
0004101285.tif 000056
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５：
0004101285.tif 000057
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６：
0004101285.tif 000058
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７：
0004101285.tif 000059
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８：
0004101285.tif 000060
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９：
0004101285.tif 000061
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０：
0004101285.tif 000062
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１：
0004101285.tif 000063
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２：
0004101285.tif 000064
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３：
0004101285.tif 000065
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４：
0004101285.tif 000066
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５：
0004101285.tif 000067
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６：
0004101285.tif 000068
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７：
0004101285.tif 000069
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８：
0004101285.tif 000070
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９：
0004101285.tif 000071
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０：
0004101285.tif 000072
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１：
0004101285.tif 000073
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２：
0004101285.tif 000074
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３：
0004101285.tif 000075
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４：
0004101285.tif 000076
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５：
0004101285.tif 000077
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６：
0004101285.tif 000078
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７：
0004101285.tif 000079
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８：
0004101285.tif 000080
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９：
0004101285.tif 000081
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０：
0004101285.tif 000082
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１：
0004101285.tif 000083
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２：
0004101285.tif 000084
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３：
0004101285.tif 000085
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４：
0004101285.tif 000086
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５：
0004101285.tif 000087
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６：
0004101285.tif 000088
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７：
0004101285.tif 000089
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９：
0004101285.tif 000091
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
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（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
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（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
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（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
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（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９：
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（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０：
0004101285.tif 000102
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１：
0004101285.tif 000103
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２：
0004101285.tif 000104
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３：
0004101285.tif 000105
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４：
0004101285.tif 000106
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５：
0004101285.tif 000107
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６：
0004101285.tif 000108
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７：
0004101285.tif 000109
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８：
0004101285.tif 000110
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９：
0004101285.tif 000111
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０：
0004101285.tif 000112
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１：
0004101285.tif 000113
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２：
0004101285.tif 000114
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３：
0004101285.tif 000115
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４：
0004101285.tif 000116
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５：
0004101285.tif 000117
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６：
0004101285.tif 000118
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７：
0004101285.tif 000119
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８：
0004101285.tif 000120
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９：
0004101285.tif 000121
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１００の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００：
0004101285.tif 000122
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１：
0004101285.tif 000123
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２：
0004101285.tif 000124
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３：
0004101285.tif 000125
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４：
0004101285.tif 000126
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５：
0004101285.tif 000127
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６：
0004101285.tif 000128
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７：
0004101285.tif 000129
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８：
0004101285.tif 000130
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９：
0004101285.tif 000131
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０：
0004101285.tif 000132
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１：
0004101285.tif 000133
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２：
0004101285.tif 000134
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３：
0004101285.tif 000135
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４：
0004101285.tif 000136
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５：
0004101285.tif 000137
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６：
0004101285.tif 000138
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７：
0004101285.tif 000139
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８：
0004101285.tif 000140
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９：
0004101285.tif 000141
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０：
0004101285.tif 000142
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１：
0004101285.tif 000143
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）その他の情報：／note=“ゲノムイントロンＤＮＡに向けられたプライマー”
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２：
0004101285.tif 000144
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７７０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３：
0004101285.tif 000145
0004101285.tif 000146
0004101285.tif 000147
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４：
0004101285.tif 000148
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５：
0004101285.tif 000149
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６：
0004101285.tif 000150
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：
0004101285.tif 000151
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：
0004101285.tif 000152
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９：
0004101285.tif 000153
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０：
0004101285.tif 000154
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１：
0004101285.tif 000155
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（viii）ゲノム内での位置：
（Ｂ）染色体上の位置：７ｑ
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２：
0004101285.tif 000156
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８６２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３：
0004101285.tif 000157
0004101285.tif 000158
0004101285.tif 000159
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９０３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４：
0004101285.tif 000160
0004101285.tif 000161
0004101285.tif 000162
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５７７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５：
0004101285.tif 000163
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７２８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６：
0004101285.tif 000164
0004101285.tif 000165
0004101285.tif 000166
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０６５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７：
0004101285.tif 000167
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８：
0004101285.tif 000168
0004101285.tif 000169
0004101285.tif 000170
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９：
0004101285.tif 000171
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０：
0004101285.tif 000172
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１：
0004101285.tif 000173
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２：
0004101285.tif 000174
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３：
0004101285.tif 000175
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４：
0004101285.tif 000176
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５：
0004101285.tif 000177
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６：
0004101285.tif 000178
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７：
0004101285.tif 000179
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８：
0004101285.tif 000180
【図１】
0004101285.tif 000181
【図２】
0004101285.tif 000182
【図３】
0004101285.tif 000183
【図４Ａ−１】
0004101285.tif 000184
【図４Ａ−２】
0004101285.tif 000185
【図４Ａ−３】
0004101285.tif 000186
【図４Ａ−４】
0004101285.tif 000187
【図４Ａ−５】
0004101285.tif 000188
【図４Ａ−６】
0004101285.tif 000189
【図４Ｂ−１】
0004101285.tif 000190
【図４Ｂ−２】
0004101285.tif 000191
【図４Ｂ−３】
0004101285.tif 000192
【図４Ｂ−４】
0004101285.tif 000193
【図５】
0004101285.tif 000194
【図６】
0004101285.tif 000195
【図７】
0004101285.tif 000196
【図８】
0004101285.tif 000197
【図９】
0004101285.tif 000198
【図１０】
0004101285.tif 000199
【図１１】
0004101285.tif 000200
【図１２】
0004101285.tif 000201
【図１３】
0004101285.tif 000202
【図１４】
0004101285.tif 000203
【図１５】
0004101285.tif 000204