(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）（式中、Ｒ１は水素原子またはヒドロキシル基、Ｍ１は側鎖を示す）で示される５−メトキシインドール化合物を液体クロマトグラフにより測定する方法であって、カラムによる分離前又は分離後に５−メトキシインドール化合物を一般式（２）（式中、Ａｒはアリール基、Ｌは脱離基を示す）で示される蛍光誘導体化試薬と接触させて蛍光誘導体化することを特徴とする前記測定方法。
【化１】
0004172103.tif 000005
【化２】
0004172103.tif 000006
【請求項２】
一般式（１）（式中、Ｒ１は水素原子、Ｍ１は側鎖を示す）で示される５−メトキシインドール化合物及び一般式（３）（式中、Ｍ２はＭ１と同じ側鎖を示す）で示される５−ヒドロキシインドールが共存した試料を液体クロマトグラフにより測定する方法であって、両者をカラムにより分離した後に、両方又は５−メトキシインドール化合物を一般式（２）（式中、Ａｒはアリール基、Ｌは脱離基を示す）で示される蛍光誘導体化試薬と接触させて蛍光誘導体化することを特徴とする前記測定方法。
【化３】
0004172103.tif 000007
【化４】
0004172103.tif 000008
【化５】
0004172103.tif 000009
【請求項３】
蛍光誘導体化試薬とともに酸化剤を共存させることを特徴とする、請求項１項又は請求項２項の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術】
本発明は、組織抽出液、血清、血漿、尿などの試料中に含まれる５−メトキシインドール化合物類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般式（１）（式中、Ｒ１は水素原子またはヒドロキシル基、Ｍ１は側鎖を示す）で示される５−メトキシインドール化合物の中で、Ｒ１が水素、側鎖Ｍ１が２−メチルアミドエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ3）である化合物をメラトニンと呼び、日内リズムに関する生体内の重要な物質である。
【０００３】
【化６】
0004172103.tif 000002
【０００４】
メラトニンは、従来、抗体を用いた方法（吉岡正則ら、蛋白質核酸酵素 ＶＯＬ．２６  Ｎｏ．９  （１９８１）ｐ１１８４）、電気化学検出器を用いた液体クロマトグラフによる方法（Ｓｈｉｓｕｆｕｍｉ Ｅｂｉｈａｒａ， ｅｔ ａｌ．  ＳＣＩＥＮＣＥ ＶＯＬ．２３１（１９８６）ｐ４９１）により測定されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
メラトニンの従来の測定方法には、次のような課題がある。まず抗体を用いる方法では、類似化合物との交差反応を避けることが困難であるため、メラトニンの値を正確に知ることができない。次に、電気化学検出器を用いた液体クロマトグラフによる方法では、抗体を用いる方法のように交差反応が問題となることはないが、電気化学検出器にはメンテナンスを頻繁に行う必要があるという課題がある。このメンテナンスを怠ると測定結果に悪影響が出てしまうため、測定を一定時間に渡って実施した後には、装置の運転を止めて前記検出器をメンテナンスしなければならない。この結果、装置当たりの稼働時間が短くなり、大量の検体についての迅速な測定を行うには不適当である。
【０００６】
そこで本発明の目的は、メラトニンを含む５−メトキシインドール化合物を、類似化合物との交差反応を生じず、しかも検出器等の装置メンテナンスを頻繁に行う必要のない測定法法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、特異的蛍光誘導体化試薬を用いてプレカラム又はポストカラム測定方法によりメラトニン等を測定する方法を完成した。
【０００８】
即ち本発明は、前記一般式（１）（式中、Ｒ１は水素原子またはヒドロキシル基、Ｍ１は側鎖を示す）で示される５−メトキシインドール化合物を液体クロマトグラフにより測定する方法であって、カラムによる分離前又は分離後に５−メトキシインドール化合物を一般式（２）（式中、Ａｒはアリール基、Ｌは脱離基を示す）で示される蛍光誘導体化試薬と接触させて蛍光誘導体化することを特徴とする測定方法である。
【０００９】
【化７】
0004172103.tif 000003
【００１０】
また本発明は、前記一般式（１）（式中、Ｒ１は水素原子またはヒドロキシル基、Ｍ１は側鎖を示す）で示される５−メトキシインドール化合物及び／又は一般式（３）（式中、Ｍ２は側鎖を示す）で示される５−ヒドロキシインドールを液体クロマトグラフにより測定する方法であって、両者をカラムにより分離した後に、両方又は一方を前記一般式（２）（式中、Ａｒはアリール基、Ｌは脱離基を示す）で示される蛍光誘導体化試薬と接触させて蛍光誘導体化することを特徴とする前記測定方法である。
【００１１】
【化８】
0004172103.tif 000004
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
前記一般式（２）（式中、Ａｒはアリール基、Ｌは脱離基を示す）示される蛍光誘導体化試薬のうち、１，２−ジフェニルエチレンジアミンは、カテコールアミン類、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、セロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸に対する蛍光誘導体化試薬として、ベンジルアミンは、セロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸に対する蛍光誘導体化試薬として知られているが、メラトニンに代表される、一般式（１）（式中、Ｒ１は水素原子またはヒドロキシル基、Ｍ１は側鎖を示す）で示される５−メトキシインドールを蛍光誘導体化するための試薬としては知られていない。
【００１４】
前記一般式（２）（式中、Ａｒはアリール基、Ｌは脱離基を示す）示される蛍光誘導体化試薬（アリールアミノメチル誘導体）において、Ａｒで示されるアリール基としては、フェニル基、置換フェニル基、ナフチル基、置換ナフチル基（例えばメチルナフチル基、メトキシルナフチル基等）、ピリジル基、フリル基又はビフェニル基などが例示できる。前記置換フェニル基の置換基としては、例えば２−、３−又は４−位メトキシル基、エトキシル基、ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、クロル基、フルオロ基、ジメチルアミノ基、シアノ基、ニトロ基、３，４−位ジメトキシル基、ジクロル基、メチレンジオキシル基などが例示できる。
【００１５】
一般式（２）中のＬで示される脱離基としては、水素原子、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン基（例えば、クロル基、フルオロ基、ブロム基など）、置換アシル基、置換スルホニル基、ヒドロキシル基、チオール基又はアリールアミノメチル基等が例示できる。前記置換アシル基及び置換スルホニル基の置換基としては、アルキル基（例えばメチル基、エチル基など）、アミノ基、アミノ置換基（例えばカルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニル基、アミノアルキルカルボニル基、アミノアリールスルホニル基、スルホアリール基、アミノカルボキシアリール基又はアミノアルコキシカルボニルアルキル基など）が例示できる。ここで、前記アリールアミノメチル基のアリール基としては、フェニル基、置換フェニル基、ナフチル基、置換ナフチル基（例えばメチルナフチル基、メトキシルナフチル基等）、ピリジル基、フリル基又はビフェニル基などが例示できる。また前記置換フェニル基の置換基としては２−、３−又は４−位メトキシル基、エトキシル基、ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、クロル基、フルオロ基、ジメチルアミノ基、シアノ基、ニトロ基、３，４−位ジメトキシル基、ジクロル基、メチレンジオキシル基等が例示できる。
【００１６】
一般式（１）で示される、測定物質されるべき５−メトキシインドール化合物は、Ｒ１が水素原子であり、側鎖Ｍ１が２−メチルアミドエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ3）であるメラトニンを例示できる。またメラトニンの代謝産物も本発明の方法により測定することができる。例えばＲ１がヒドロキシル基で、側鎖Ｍ１が２−メチルアミドエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ3）である、６−ヒドロキシメラトニンや、Ｒ１が水素原子であり、側鎖Ｍ１がそれぞれ２−アミノエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2）、カルボキシメチル基（−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）である５−メトキシトリプタミン、５−メトキシインドール酢酸等を具体的に例示できる。
【００１７】
検体中の５−メトキシインドール化合物と上記蛍光誘導体化試薬が接触すると、５−メトキシインドール化合物は蛍光誘導体化される。５−メトキシインドール化合物の蛍光誘導体化は、検体中の５−メトキシインドール化合物を液体クロマトグラフ用カラムで分離する前であっても、分離した後であっても良い。分離前に検体と上記蛍光誘導体化試薬を接触させる方法は、いわゆるプレラベル測定法でであり、分離後に接触させる方法は、いわゆるポストラベル測定法である。
【００１８】
本発明においては、通常のプレラベル測定法又はポストラベル測定法を実施するための液体クロマトグラフ装置をそのまま使用することができ、蛍光誘導体化された５−メトキシインドール化合物の検出は通常の蛍光検出器を用いることができる。
【００１９】
前記一般式（２）のアリールアミノメチル誘導体をプレラベル蛍光誘導体化試薬とし、５−メトキシインドール化合物を蛍光誘導体化した後、該蛍光誘導体を分離し測定する場合には、液体クロマトグラフ用カラムとして、イオン交換カラム、逆相カラム等を使用すれば良い。
【００２０】
検体中の５−メトキシインドール化合物において、一般式（１）中のＲ１が水素原子であり、その側鎖Ｍ１と同じ側鎖Ｍ２を持つ一般式（３）の５−ヒドロキシインドール化合物が試料中に存在する場合は、この５−ヒドロキシインドール化合物を５−メトキシインドールと分離した後にラベル化反応を行う必要がある。これは、５−メトキシインドール化合物とアリールアミノメチル誘導体との反応機構が、まずその６位のメトキシル基が酸化され、ヒドロキシル基になり、誘導体化反応が起こるためである。すなわち、一般式（１）の５−メトキシインドール化合物のＲ１が水素原子であり、その側鎖Ｍ１と同じ側鎖Ｍ２を持つ一般式（３）の５−ヒドロキシインドール化合物が共存する場合、これらがアリールアミノメチル誘導体と反応すると、分離できない蛍光物質が産生されるからである。
【００２１】
具体的には、例えばメラトニンについてプレラベル蛍光誘導体化法により測定する場合には、試料中にＮ−アセチルセロトニンが含まれないか、測定上無視できる濃度であればそのまま測定することが可能であるが、Ｎ−アセチルセロトニンの存在が予想される場合には、まず例えば逆相カラムやイオン交換カラムを用いてＮ−アセチルセロトニンとメラトニンを分離し、次に蛍光誘導体化を行い、そして液体クロマトグラフにより測定する。液体クロマトグラフカラムで検体中の５−メトキシインドール化合物を分離した後、分離した５−メトキシインドール化合物を蛍光誘導体化し測定するポストラベル測定法の場合は、前記例で述べれば、あらかじめメラトニンとＮ−アセチルセロトニンが分離されているため、検体中にメラトニンとＮ−アセチルセロトニンの両者が共存していても、メラトニンの測定に支障はない。
【００２２】
一般式（２）で示されるアリールアミノメチル誘導体による、一般式（１）で示される５−メトキシインドール化合物の蛍光誘導体化反応は、酸化剤が共存すると速やかに進むことから、本発明においても両者が酸化剤共存下で接触するようにすることが好ましい。酸化剤としては、例えばＫＩＯ4、ＮａＩＯ4、ＮａＩＯ3、ＫＩＯ3、Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6等を例示することができる。例えば、ＮａＩＯ4とＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6を併用し、それぞれの最終濃度を３．３ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌとするこにより、蛍光誘導体化反応を速やかに進行させることができる。更に、５−メトキシインドール化合物を蛍光誘導体化する際には、メタノール、エタノール、アセトニトリル、２−プロパノール等の水溶性有機溶媒を共存させることにより、蛍光誘導体化をより速やかに生じさせることができる。
【００２３】
蛍光誘導体化に要する反応温度や時間は、反応温度が低ければ反応温度が高い場合に比べて長時間を要するという関係にある。本発明者の知見によれば、反応温度が９０℃であれば、反応時間は１から３分程度とすることが望ましい。上記以外に蛍光誘導体化反応を促進させるためには、モリブデン酸アンモニウム、タングステン酸塩、ニオブ酸塩又はクロム酸塩などの金属酸化物イオンを触媒として加えてることが例示できる。
【００２４】
前記したように、検体中に５−メトキシインドール化合物と５−ヒドロキシインドール化合物が共存する場合、両者を液体クロマトグラフ用カラムで先に分離しておけば、５−メトキシインドール化合物のみを測定し、５−ヒドロキシインドール化合物のみを測定し、又は、５−メトキシインドール化合物と５−ヒドロキシインドール化合物の両者を測定することが可能である。この場合にも、蛍光誘導体化反応を促進するために酸化剤を用いることが好ましいが、５−ヒドロキシインドール化合物については、最終濃度で１ｍｍｏｌ／Ｌ程度の酸化剤を用いれば充分である。また前記同様に、水溶性有機溶媒や金属酸化物イオンを加えることによっても、蛍光誘導体化反応を促進することができる。更に反応温度については、例えば、反応温度が９０℃であれば、反応時間は１から３分が好ましい。
【００２５】
本発明により測定される５−ヒドロキシインドール化合物は、一般式（３）で示される化合物であり、側鎖Ｍ２が２−アミノエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2）、カルボキシメチル基（−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）である場合は、それぞれセロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸である。カルチノイド、ダンピング症候群の患者では尿中のセロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸が、片頭痛の発作時には尿中の５−ヒドロキシインドール酢酸が、それぞれ高値になることが知られていることから、これらを測定することには臨床的な意義がある。
【００２６】
この他にも、側鎖Ｍ２がそれぞれ２−メチルアミドエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ3）、アルデヒドメチル基（−ＣＨ2−ＣＨＯ）、２−アミノ３−カルボキシエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ）、２−ヒドキシルエチル基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＨ）である化合物Ｎ−アセチルセロトニン、５−ヒドロキシインドールアルデヒド、５−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトフォール等が、５−ヒドロキシインドール化合物として知られている。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例 １
図１に示した構成の装置を用いてプレラベル測定を実施した。１は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ硝酸アンモニウム及び１０％アセトニトリルからなる溶離液（ｐＨ４．５）であり、２は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ硝酸アンモニウム及び５０％アセトニトリルからなる溶離液（ｐＨ４．５）である。
【００２９】
ポンプ３はマルチポンプＣＣＰＭ（東ソー（株）製、商品名）、ミキサ４はダイナミックミキサＭＸ８１０（東ソー（株）製、商品名）、オートサンプラ５はオートサンプラＡＳ−８０１０（東ソー（株）製、商品名）、カラム６はＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー（株）製、商品名、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、逆相カラム）、蛍光検出器７は蛍光検出器ＦＳ−８０１０（東ソー（株）製、商品名）を用いた。
【００３０】
試料は、０．５μｍｏｌ／ｍｌの濃度の５−ヒドロキシインドール酢酸又はメラトニンを用いた。試料は０．０１Ｎ塩酸溶液により調製した。２種類の反応試薬（Ａ；４０ｍｍｏｌ／Ｌベンジルアミン、１％ナトリウムメチラート及び５０％アセトニトリルを含む反応試薬、Ｂ；６ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＩＯ4を含む反応試薬）を調製し、使用した。
【００３１】
前記試料１００μＬ、６％過塩素酸溶液２．５μＬ、反応試薬Ａ５０μＬ、そして、反応試薬Ｂ５０μＬを密栓付きガラスバイヤルに入れ、９０℃で２分間反応させ、測定に供した。なお、オートサンプラのインジェクション量は２０μＬとした。溶離液は、溶離液１と２を４：６の割合になるようにポンプ３にて送液し、その流量は１．０ｍｌ／ｍｉｎである。また蛍光検出は、励起波長３４５ｎｍ、蛍光検出波長４８１ｎｍで行った。
【００３２】
５−ヒドロキシインドール酢酸とメラトニンそれぞれの測定結果を、図３及び４にそれぞれ示す。
【００３３】
実施例２
図２に示した構成の装置を用いてポストラベル測定を実施した。８は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ硝酸アンモニウム及び１０％アセトニトリルからなる溶離液（ｐＨ４．５）であり、９は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ硝酸アンモニウム及び５０％アセトニトリルからなる溶離液（ｐＨ４．５）である。
【００３４】
ポンプ１０はマルチポンプＣＣＰＭ（東ソー（株）製、商品名）、ミキサ１１はダイナミックミキサＭＸ８１０（東ソー（株）製、商品名）、オートサンプラ１２はオートサンプラＡＳ−８０１０（東ソー（株）製、商品名）、カラム１３はＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー（株）製、商品名、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、逆相カラム）、カラムオーブン１４はカラムオーブンＣＯ−８０１０（東ソー（株）製、商品名）、反応コイル１５はテフロン管（０．４ｍｍＩ．Ｄ．×２５ｍ）、冷却コイル１６ハテフロン管（０．４ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍ）、蛍光検出器１７は蛍光検出器ＦＳ−８０１０（東ソー（株）製、商品名）、ポンプ１８はデュアルポンプＤＰ−８０２０（東ソー（株）製、商品名）を用いた。
【００３５】
標準試料は、５−ヒドロキシトリプトファン、セロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸、５−ヒドロキシトリプトフォール、Ｎ−アセチルセロトニン、メラトニンの全てが８３ｎｍｏｌ／ｍｌとなるように、０．０１Ｎ塩酸溶液により調製した。血漿試料は、ＥＤＴＡ２Ｋ採血管を用い採血した血漿に対し、半分量の６％過塩素酸溶液を加え混合し、遠心分離した上清を用いた。反応試薬１９は、４０ｍｍｏｌ／Ｌベンジルアミン、１％ナトリウムメチラート及び５０％アセトニトリルを含み、反応試薬２は、６ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＩＯ4を含み、オートサンプラのインジェクション量は２０μＬとした。
【００３６】
溶離液は、０から２５分までは溶離液８を１００％送液し、２５から２７分にかけて溶離液８と９が６：４の割合となるようにグラディエント操作を行い、２７分以降は溶離液８と９を６：４の割合で、ポンプ１０で送液した。流量は１．０ｍｌ／ｍｉｎであるが、反応液１９、２０の流量は、どちらも０．２５ｍｌ／ｍｉｎとした。また反応温度（カラムオーブン１４の設定温度）は９０℃とした。蛍光検出は、励起波長３４５ｎｍ、蛍光検出波長４８１ｎｍで行った。
【００３７】
標準試料と血漿試料それぞれの測定結果を図５及び６に示す。血漿試料（図６）では、セロトニンのピークが確認され、標準試料に含まれる他の成分は感度以下であった。
【００３８】
実施例３
反応試薬１９として、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  １，２−ジフェニルエチレンジアミン、１％ナトリウムメチラート及び５０％アセトニトリルを含む試薬を用いた以外は、実施例２と同一の操作を行った。測定結果を図７に示す。
【００３９】
実施例４
溶離液１と２を７：３の割合になるようにポンプ３にて送液した以外は、実施例１と同一の操作を行った。なお試料は、６−ヒドロキシメラトニン、メラトニン両者が濃度２５０ｎｍｏｌ／ｍｌになるように、０．０１Ｎ塩酸溶液により調製したものである。測定結果を図８に示す。
【００４０】
【発明の効果】
本発明は、一般式（２）で示される蛍光誘導体化試薬を用いてメラトニンに代表される５−メトキシインドール化合物を蛍光誘導体化し、これを通常の液体クロマトグラフ用の蛍光検出器で測定するものである。
【００４１】
本発明でポストラベル化測定を実施すれば、５−メトキシインドール化合物のみを測定し、５−ヒドロキシインドール化合物のみを測定し、或いは５−メトキシインドール化合物と５−ヒドロキシインドール化合物を一度の操作で同時に測定することが可能である。
【００４２】
従来の抗体を用いた測定と比較すると、本発明は、類似化合物との交差反応によって測定精度が影響されるようなことはなく、しかも抗体を用いた測定では実施が困難な、５−メトキシインドール化合物と５−ヒドロキシインドール化合物の同時測定をも実現することができる。また従来の電気化学検出器を用いる方法と比較すると、本発明は、一般に使用されているプレラベル又はポストラベルの手法によって実施可能であり、また頻繁なメンテナンスを必要とする電気化学検出器を必要としないから、実施が容易で、しかも大量の検体（血液や尿等の生体試料）を次々に間隙なく測定することが可能である。
【００４３】
このように本発明は、５−メトキシインドール化合物及び／又は５−ヒドロキシインドール化合物を、より短時間内に、しかも連続してより大量に処理可能とするから、測定コストを低減するとともに、臨床データの蓄積をすすめ、上記化合物を測定することによる各種疾病の早期発見、早期治療に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１及び４で使用したプレラベル測定装置の概要図を示すものである。
【図２】図２は、実施例２及び３で使用したポストラベル測定装置の概要図を示すものである。
【図３】図３は、実施例１の５−ヒドロキシインドール酢酸の測定結果である。図中の５ＨＩＡＡは５−ヒドロキシインドール酢酸を示す。
【図４】図４は、実施例１のメラトニンの測定結果である。図中のＭＬＴはメラトニンを示す。
【図５】図５は、実施例２の標準試料の測定結果である。図中の５ＨＴＰ、５ＨＴ、５ＨＩＡＡ、５ＨＴＯＬ、Ｎ−Ａｃ５ＨＴ、ＭＬＴは、それぞれ５−ヒドロキシトリプトファン、セロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸、５−ヒドロキシトリプトフォール、Ｎ−アセチルセロトニン、メラトニンを示す。
【図６】図６は、実施例２の血漿試料の測定結果である。図中の５ＨＴはセロトニンを示す。
【図７】図７は、実施例３の標準試料の測定結果である。図中の５ＨＴＰ、５ＨＴ、５ＨＩＡＡ、５ＨＴＯＬ、Ｎ−Ａｃ５ＨＴ、ＭＬＴは、それぞれ５−ヒドロキシトリプトファン、セロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸、５−ヒドロキシトリプトフォール、Ｎ−アセチルセロトニン、メラトニンを示す。
【図８】図８は、実施例４の測定結果である。図中の６ＨＭＬＴ、ＭＬＴはそれぞれ６−ヒドロキシメラトニン、メラトニンを示す。
【符号の説明】
１・２・８・９  溶離液、３・１０・１８  ポンプ、４・１１  ミキサ、５・１２  オートサンプラ、６・１３  カラム、７・１７  蛍光検出器、１０  ポンプ、１４  カラムオーブン、１５  反応コイル、１６  冷却コイル、１９・２０  反応試薬
【図１】
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【図２】
0004172103.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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