(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質またはその1もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配列を含みセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質またはその1もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配列を含みセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項3に記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項4に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項5に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項８】
配列番号：1もしくは3に記載のDNAの転写物またはその一部に結合するアンチセンスDNAである、該DNAの発現抑制剤。
【請求項９】
請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質のセリン／スレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（a）被検化合物の存在下で、請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質とこれらタンパク質によりリン酸化を受ける基質とを接触させ、請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質のキナーゼ活性を検出する工程、
（b）工程（a）において検出されたキナーゼ活性を、被検化合物非存在下において検出したキナーゼ活性と比較し、請求項1または2のいずれかに記載のタンパク質のキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なセリン／スレオニンキナーゼ遺伝子に関する。
背景技術
胎児の組織には、活発に増殖を行っている未分化細胞、高度に活性化されている細胞、また新生血管内皮細胞等が多く含まれている。胎児の組織におけるこれら細胞の活動は厳密な制御下にあり、個体の成熟に応じて抑制されていくが、制御を受けるかどうかという点を除けば、胎児の組織は固形腫瘍における状態に類似した状態にあるといえる。従って、胎児の組織に特異的、あるいはより強く発現している遺伝子（胎児遺伝子：fetal gene）の一部は、異常増殖性や、不死化、浸潤、転移、血管新生といった固形腫瘍に特徴的な現象に関与する遺伝子である可能性が存在する。また腫瘍以外の疾病についても、正常な生体では抑制されている胎児遺伝子が、異常に活性化されることにより起こるものがあると推測される。従って、胎児遺伝子を単離し、それらを解析することによって、腫瘍をはじめとする様々な疾病に関与する遺伝子を探索し得ると考えられる。
しかし、このような視点に立った、胎児遺伝子にのみ着目した組織的な解析については未だほとんど報告例がなく、これらの遺伝子群についての完全な理解には遠いというのが現状である。
発明の開示
本発明は、胎児組織に特異的に発現している遺伝子を単離し、疾病に関連する遺伝子を探索することを課題とする。
本発明者らは、胎児組織の細胞の状態が固形腫瘍の細胞の状態の一つのモデルになり得ると考え、胎児遺伝子を単離し解析することによって、腫瘍など疾病に関与する遺伝子を探索し得ると考えた。さらに、その遺伝子を標的にした薬剤等を設計することにより、新たな作用機序による医薬品の開発が可能であると考えた。そこで、本発明者らは、かかる考えに基づき、胎児遺伝子の単離を試みた。
具体的には、本発明者らは、サプレッション  サブトラクティブ  ハイブリダイゼーション法により、胎児肝臓特異的に（あるいは成人肝臓より強く）発現している遺伝子を多く含むサブトラクションライブラリーを作製し、このライブラリーよりランダムにクローンを抽出し、その構造の解析を行った。これにより、本発明者らは、セリン/スレオニンキナーゼ活性部位のコンセンサス配列を含む新規な遺伝子（VRK1）を単離することに成功した。また、本発明者らは、単離した遺伝子から推定されるアミノ酸配列を基にデーターベース検索を行った。この結果、この遺伝子産物が、ワクシニアウイルスのDNA複製に関与していると考えられているB1Rキナーゼと有意な相同性を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、この遺伝子と非常に高い相同性を持つヒトESTをデータベース上に見出し、その全長cDNA（VRK2）を単離した。ノーザンブロット解析により、種々の細胞における単離した２つの遺伝子の発現を解析したところ、これら遺伝子はヒト胎児肝臓、精巣や種々の癌細胞株など特に増殖性の高い細胞で強く発現していた。さらに、本発明者等は、VRK1タンパク質が実際にプロテインキナーゼ活性を有することを見いだした。
即ち、本発明は、新規なヒトセリン／スレオニンキナーゼ遺伝子「VRK1」および「VRK2」に関し、より具体的には、
（１）  配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはその１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配列を有しセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質、
（２）  配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはその１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配列を有しセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質、
（３）  配列番号１に記載のDNA配列またはその相補配列にハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質、
（４）  配列番号３に記載のDNA配列またはその相補配列にハイブリダイズするDNA配列によりコードされ、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質、
（５）  （１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA、
（６）  （５）に記載のDNAを含むベクター、
（７）  （６）に記載のベクターを保持する形質転換体、
（８）  （７）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、（１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質の製造方法、
（９）  （１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質に結合する抗体、
（１０）  （５）に記載のDNAもしくはその一部に対するアンチセンスDNA、
（１１）  （１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質のセリン／スレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下で、（１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質とこれらタンパク質によりリン酸化を受ける基質とを接触させ、（１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質のキナーゼ活性を検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）において検出されたキナーゼ活性を、被検化合物非存在下において検出したキナーゼ活性と比較し、（１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質のキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、
に関する。
本発明は、新規なセリン／スレオニンキナーゼ「VRK1」および「VRK2」に関する。「VRK1」のcDNAの塩基配列を配列番号：1に、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：2に示す。また「VRK2」のcDNAの塩基配列を配列番号：3に、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：4に示す。「VRK1」cDNAは、ワクシニアウイルスのDNA複製に関与していることが示唆されるB1Rキナーゼと有意な相同性を有し、またその遺伝子は胎児肝臓、精巣、種々の癌細胞株など増殖性の高い細胞において強い発現を示すという特徴を有する。また、「VRK1」タンパク質の過剰発現はNIH3T3細胞の増殖活性を顕著に増大させる。これら事実は、「VRK1」が、特に細胞増殖の制御機構に関与していることを示唆するものである。「VRK1」タンパク質はプロテインキナーゼ活性を有するため、この活性が細胞増殖の制御において重要な役割を担っていると考えられる。一方、「VRK2」は「VRK1」と高い相同性を有し、特にセリン／スレオニンキナーゼ領域において高い相同性を示す。「VRK2」は「VRK1」と同様に、B1Rキナーゼと有意な相同性を有し、またその遺伝子は胎児肝臓、精巣、種々の癌細胞株など増殖性の高い細胞において強い発現を示すという特徴を有する。これら事実から「VRK2」も「VRK1」と同様の機能を担っていると考えられる。
「VRK1」タンパク質および「VRK2」タンパク質は、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することができる。組換えタンパク質は、例えば、後述するようにこれらタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。一方、天然のタンパク質は、当業者に周知の方法、例えば、後述の本発明の抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、これらタンパク質の発現の高い胎児肝臓や精巣、HeLa S3などの癌細胞株から単離することが可能である。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体であれば、例えば、これらタンパク質をウサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、これらタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。また、モノクローナル抗体であれば、これらタンパク質をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、これらタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、「VRK1」タンパク質または「VRK2」タンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。なお、得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療など）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト型化抗体またはヒト抗体を用いると有効である。抗体をヒト型化する方法としては、モノクロナール抗体生産細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するCDRグラフト法などが挙げられる。また、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウスを免疫して、通常のモノクロナール抗体と同様に直接ヒト抗体を作製こともできる。
また、当業者であれば、天然型の「VRK1」タンパク質および「VRK2」タンパク質（配列番号：2および配列番号：4）のみならず、公知の方法を用いてこれらタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行い、天然型のタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加により天然型のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、PCRによる部位特異的変異誘発システム（GIBCO-BRL,Gaithersburg,Maryland）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Kramer,W.and Fritz,HJ（1987）Methods in Enzymol.,154:350-367）、Kunkel法（Methods Enzymol.85,2763-2766（1988））などが挙げられる。なお、アミノ酸の置換は、通常、10アミノ酸以内であり、好ましくは6アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。置換、欠失、付加がなされる部位はセリン／スレオニンキナーゼ活性が保持される限り特に制限はない。アミノ酸の付加、欠失もしくは置換は、セリン／スレオニンキナーゼ活性部位のコンセンサス配列に相当する領域及びプロテインキナーゼATP結合部位のコンセンサス配列に相当する領域以外の領域であることがタンパク質の活性上好ましい。なお、タンパク質のセリン／スレオニンキナーゼ活性は、例えば、後述の実施例9に記載の方法により検出することが可能である。
また、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press,1989）などを用いて、「VRK1」タンパク質または「VRK2」タンパク質をコードするDNA（配列番号：1または3）またはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAから「VRK1」タンパク質または「VRK2」タンパク質（配列番号：2または4）と実質的に同一の機能を有するタンパク質を得ることも通常行いうることである。このように「VRK1」タンパク質または「VRK2」タンパク質をコードするDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。ハイブリダイズするDNAを他の生物から単離する場合には、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシなどが用いられ、特に胎児肝臓や精巣などの組織が単離に適している。これにより単離される「VRK1」タンパク質または「VRK2」タンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質をコードするDNAは、通常、「VRK1」タンパク質または「VRK2」タンパク質をコードするDNA（配列番号：1または3）と高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上の配列の同一性を指す。特に、セリン／スレオニンキナーゼ活性部位のコンセンサス配列に相当する領域及びプロテインキナーゼATP結合部位のコンセンサス配列に相当する領域について高い相同性を有することが、タンパク質の活性上好ましい。
このようなDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件の例を示せば、以下の如くである。即ち、「ExpressHyb Hybridization Solution」（CLONTECH社製）を用い、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、37℃から55℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、1xSSC、0.1% SDS中、37℃で20分の洗浄を1回行う。より好ましい条件としては、「ExpressHyb Hybridization Solution」（CLONTECH社製）を用い、60℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、60℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、1xSSC、0.1% SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行う。さらに好ましい条件としては、「ExpressHyb Hybridization Solution」（CLONTECH社製）を用い、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、68℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、0.1xSSC、0.1% SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行う。
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするDNAに関する。本発明のDNAは、上記本発明のタンパク質をコードしうる限り、cDNAの他、ゲノムDNAや合成DNAなども含まれる。本発明のDNAは、組換えタンパク質の生産に利用しうる。即ち、本発明のDNA（例えば、配列番号：1または3に記載のDNA）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより組換えタンパク質を調製することが可能である。組換えタンパク質の生産に用いる細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞、NIH3T3細胞などの哺乳類細胞、Sf9細胞などの昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌（E.coli）が挙げられる。また、細胞内で組換えタンパク質を発現させるためのベクターは、宿主細胞に応じて変動するが、例えば、哺乳類細胞のベクターとしてはpcDNA3（Invitrogen社製）やpEF-BOS（Nucleic Acids.Res.1990,18（17）,p5322）などが、昆虫細胞のベクターとしては「BAC-to-BAC baculovirus expression system」（GIBCO BRL社製）などが、酵母細胞のベクターとしては「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）などが、大腸菌のベクターとしてはpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）などが挙げられる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクロポレーション法、塩化カルシウム法など用いて行うことができる。得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、常法、例えば、文献「The Qiaexpressionist handbook,Qiagen,Hilden,Germany」記載の方法を用いて行うことが可能である。
なお、本発明のDNAは、ゲノムDNAの変異に起因する疾患の遺伝子治療に用いることも考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のDNAをアデノウイルスベクター（例えば、pAdexLcw）やレトロウイルスベクター（例えば、pZIPneo）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
また、本発明のタンパク質は細胞増殖の制御に関与していると考えられるため、本発明のDNAもしくはその一部に対するアンチセンスDNAを、細胞増殖抑制剤や抗腫瘍薬として利用することも可能である。アンチセンスDNAは生体内に直接、または上記ベクターに挿入して投与する。アンチセンスDNAは当業者に公知の方法で合成することができる。
また、本発明は、本発明のタンパク質のセリン／スレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で、本発明のタンパク質とこれらタンパク質によりリン酸化を受ける基質とを接触させ、本発明のタンパク質のキナーゼ活性を検出する工程、および（ｂ）工程（ａ）において検出されたキナーゼ活性を、被検化合物非存在下において検出したキナーゼ活性と比較し、本発明のタンパク質のキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程を含む。
このスクリーニング方法に用いる被検化合物には特に制限はなく、低分子化合物、タンパク質（上記本発明の抗体も含む）、ペプチドなどが挙げられる。被検化合物は、人工的に合成したものであっても天然のものであってもよい。基質としては、例えば、カゼイン、IkBαタンパク質などが挙げられる。本発明のタンパク質のキナーゼ活性は、例えば、放射標識したリン酸を持つATPを、本発明のタンパク質および基質を含む反応系に添加し、基質に結合したリン酸の放射活性を測定する方法で検出することが可能である。具体的には、実施例9に記載の方法に従って検出することができる。これにより単離された化合物は、細胞増殖抑制剤や抗腫瘍薬としての利用が考えられる。また、本発明者らは「VRK1」タンパク質が、IkBαタンパク質をリン酸化することを見いだした。IkBαはリン酸化されると速やかな分解を受け、これにより結合しているNF-kBを解放し、NF-kBが活性化すると考えられている。そして、このNF-kBは広範囲の免疫反応、炎症反応を引き起こす中心的な転写調節因子であることもよく知られている。このため本発明のタンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物は抗炎症剤や抗免疫剤としての利用も考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、サブトラクションライブラリー作製に用いたアダプターを示す図である。
図２Ａは、セリン/スレオニンキナーゼの活性部位のコンセンサス配列を示す図であり、図２Ｂは、プロテインキナーゼATP結合部位のコンセンサス配列を示す図である。
図３は、fls223クローンの塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。
図４は、胎児肝臓及び成人肝臓におけるVRK1、VRK2の発現を検出するためのRT-PCR解析の結果を示す電気泳動像である。図中、「Ａ」は成人肝臓（Adult liver）を示し、「Ｆ」は胎児肝臓（Fetal liver）を示す。また、「低」、「中」、「高」は、PCRのサイクルのレベルを示す。
図５は、VRK1とB1Rのアミノ酸配列の比較を示す図である。
図６は、VRK1とVRK2のアミノ酸配列の比較を示す図である。
図７は、VRK2とB1Rのアミノ酸配列の比較を示す図である。
図８は、ノーザンブロティングにより、種々の細胞におけるVRK1及びVRK2遺伝子の発現を解析した結果を示す電気泳動像である。
図９は、抗c-Myc抗体によるウエスタンブロッティング解析を示す電気泳動像である。1はpcDNA3プラスミドDNA、2はpcDNA3/VRK1mycプラスミドDNAをそれぞれトランスフェクションしたCOS7細胞の細胞抽出液を用いて検出した。
図１０は、VRK1 cDNAをプローブとしたノーザン解析を示す電気泳動像である。1はpCOSプラスミドDNA、2はpCOS/VRKlwプラスミドDNAをそれぞれトランスフェクションしたNIH3T3細胞より調製した全RNA、3はヒト肝臓癌細胞株であるHepG2細胞より調製した全RNAを用いて検出した。
図１１は、コロニーアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。「pCOS」はpCOSプラスミドDNA、「pCOS/VRK1w」はpCOS/VRK1wプラスミドDNAをそれぞれNIH3T3細胞にトランスフェクションして得られた細胞プールを検出した。
図１２は、精製されたGST融合タンパク質の電気泳動像（CBB染色）を示す。1は野生型VRK1タンパク、2は変異型VRK1タンパクを用いて検出した。
図１３は、キナーゼアッセイの結果を表す電気泳動像を示す。加えたタンパクを上部に「+」で示した。矢印は、「A」はリン酸化されたGST-VRK1（自己リン酸化）、「C」はリン酸化されたカゼイン、「I」はリン酸化されたGST-IkBα、「P」はリン酸化されたIkBαのC末側ペプチドをそれぞれ示す。
図１４は、キナーゼアッセイの結果を表す電気泳動像を示す。それぞれ右側に示した種類と濃度の二価カチオンの存在下で反応を行った。矢印は、「A」はリン酸化されたGST-VRK1（自己リン酸化）、「C」はリン酸化されたカゼインをそれぞれ示す。
図１５は、抗VRK1ペプチド抗体による、K562細胞抽出液を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す電気泳動像である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  サブトラクションライブラリーの作製
サブトラクションライブラリーはPCR-SelectTM cDNA Subtraction kit（CLONTECH社製）を用い、ルダ・ディアチェンコ（Luda Diatchenko）らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, 6025-6030, 1996）に基本的に従って作製した。
まず、ヒト胎児肝臓由来polyA+ RNA及びヒト成人肝臓由来polyA+ RNAよりMMLV逆転写酵素を用いた標準的な方法で二本鎖cDNAを合成した。次にT4 DNAポリメラーゼによりこのcDNA末端を平滑化し、さらにRsaIにより切断した。胎児肝臓由来cDNA（テスター）の一部を2分割し、アダプター1とアダプター2（図１）をそれぞれ別々にライゲートした。これにそれぞれ過剰量の成人肝臓由来cDNA（ドライバー）を添加し、熱変性を行った後、68℃で8時間の１次ハイブリダイゼーションを行った。次にこれを熱変性せずに混合し、さらに熱変性した過剰量のドライバーを添加し68℃で約16時間の2次ハイブリダイゼーションを行った。これを希釈用バッファーにて希釈し、75℃で7分インキュベートし、アダプターの短い方の鎖を除去したものをPCRの鋳型として用いた。アダプターに対応するプライマーである「PCRプライマー1」（配列番号：５）、「PCRプライマー2」（配列番号：６）を用いたPCRを行うことにより、両端に異なるアダプターを持ったcDNA（サブトラクションされたcDNA）のみを選択的に増幅した（サプレッションPCR）。この一部を鋳型とし、「PCRプライマー1」（配列番号：５）、「PCRプライマー2」（配列番号：６）のさらに内側に位置するプライマーである「Nested PCRプライマー1」（配列番号：７）と「Nested PCRプライマー2」（配列番号：８）を用いたPCRを行うことにより、さらに選択性を増した生成物を得た。この生成物を「QIAquick PCR Purification kit」（QIAGEN社製）を用いて精製し、pT7Blue-Tベクター（Novagen社製）にTAクローニング法によりクローニングし、サブトラクションライブラリーとした。
［実施例２］  シークエンスの解読
シークエンシングは、アルカリSDS法によって調製したプラスミドDNA、またはコロニーPCR産物を鋳型とし、ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmplyTaq DNA Polymerase,FSを用いたサイクルシークエンシング法により行い、ABI 377 DNA Sequencerにより解読した。
なお、コロニーPCRは、ベクタープライマーである「M13 P4-22プライマー」（配列番号：９）及び「M13 P5-22プライマー」（配列番号：１０）を含むPCR反応溶液の中に、組み換え体を持つコロニーを直接懸濁することにより行った。PCR反応後、増幅されたインサートDNAから、ゲル濾過法などにより未反応のプライマー、ヌクレオチド等を除き、シークエンシングの鋳型として用いた。
この結果、fls223クローン（261bp）（後に「VRK1」と改名する）は、セリン/スレオニンキナーゼの活性部位のコンセンサス配列（［Leu,Ile,Val,Met,Phe,Tyr,Cys］-Xaa-［His,Tyr］-Xaa-Asp-［Leu,Ile,Val,Met,Phe,Tyr］-Lys-Xaa-Xaa-Asn-［Leu,Ile,Val,Met,Phe,Tyr,Cys,Thr］-［Leu,Ile,Val,Met,Phe,Tyr,Cys,Thr］-［Leu,Ile,Val,Met,Phe,Tyr,Cys,Thr］）（配列番号：２に記載のアミノ酸の173〜185番目に相当する）（図２Ａ）を含むアミノ酸配列をコードし得ることが見いだされた（図３）。また、このクローンの塩基配列と完全一致する遺伝子はデータベースに登録されておらず、これは未知の遺伝子であった。
［実施例３］  RT-PCRアッセイ
胎児肝臓及び成人肝臓より抽出したpolyA+ RNAから、SUPERSCRIPTTM II RNaseH- Reverse Transcriptase（GIBCO BRL社製）を用いた標準的な方法により1本鎖cDNAを合成し、その一部をfls223のRT-PCRアッセイの鋳型として用いた。PCRにはTaKaRa Taq（TaKaRa社製）をTaqポリメラーゼとして用い、これにTaqStartTM Antibody（CLONTECH社製）を加えることによるホットスタート法を行った。fls223増幅用のプライマーには、「FLS223 S1プライマー」（配列番号：１１）及び「FLS223 A1プライマー」（配列番号：１２）を用いた。
なお、対照として、様々な組織でほぼ均等に発現しているハウスキーピング遺伝子であり、様々な誘導物質によっても発現量に影響を受けにくいことが知られているG3PDH（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）遺伝子を用いた。G3PDHは、「hG3PDH5’プライマー」（配列番号：１３）及び「hG3PDH3’プライマー」（配列番号：１４）を用いて増幅した。このRT-PCR解析により、fls223クローンは成人肝臓にもその発現が見られるものの、胎児肝臓により強く発現していることが確認された（図４）。そこで、次にこの遺伝子のより詳細な解析を目指し、全長cDNAのクローニングを行った。
［実施例４］  RACE（Rapid Amplification of cDNA End）法によるクローニングMarathonTM Ready cDNA（CLONTECH社製）、あるいはMarathonTM cDNA Amplification Kit（CLONTECH社製）により作製したcDNAを鋳型とし、5’RACE及び3’RACE（Chenchik A. et al., CLONTECHniques X, 1, 5-8, 1995）を行った。
VRK1/fls223については、上記「FLS223 S1プライマー」（配列番号：１１）及び「FLS223 A1プライマー」（配列番号：１２）を5’RACE及び3’RACEのプライマーとして用いた。これらのプライマーと、鋳型cDNAのアダプターに対応するプライマーAP1（配列番号：１５）との組み合わせで、基本的に94℃で2分、「94℃で30秒、68℃で4分」を5サイクル、「94℃で30秒、62℃で1分、72℃で3分」を30サイクル、72℃で10分の反応を行った。PCRにはTaKaRa Ex Taq（TaKaRa社製）を用い、TaqStartTM Antibody（CLONTECH社製）を加えたホットスタート法を行った。反応後、現れたバンドをQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて回収し、pT7Blue-Tベクター（Novagen社製）にサブクローニングした。
全塩基配列を解読した結果、fls223全長cDNAは396アミノ酸からなるオープンリーディングフレームをコードしていることが明らかとなった（配列番号：１参照）。このアミノ酸配列中には、前半にプロテインキナーゼATP結合部位のコンセンサス配列（［Leu,Ile,Val］-Gly-Xaa-Gly-Xaa-［Phe,Tyr,Trp,Met,Gly,Ser,Thr,Asn,His］-［Ser,Gly,Ala］-Xaa-［Leu,Ile,Val,Cys,Ala,Thr］-Xaa-Xaa-［Gly,Ser,Thr,Ala,Cys,Leu,Ile,Val,Met,Phe,Tyr］-Xaa（5 times or 18 times）-［Leu,Ile,Val,Met,Phe,Tyr,Trp,Cys,Ser,Thr,Ala,Arg］-［Ala,Ile,Val,Pro］-［Leu,Ile,Val,Met,Phe,Ala,Gly,Cys,Lys,Arg］-Lys）（配列番号：２に記載のアミノ酸配列の43〜71番目に相当する）（図２Ｂ）と、オリジナルクローンにも含まれていたセリン/スレオニンキナーゼ活性部位のコンセンサス配列が存在し、この遺伝子産物は新規のセリン/スレオニンキナーゼであると考えられた。
また、全データベースに対してホモロジー検索を行ったところ、この遺伝子はワクシニアウイルスのB1R遺伝子産物（J. Gen. Virol., 70, 3187-3201, 1989; J. Gen. Virol., 72, 1349-1376, 1991）と高い相同性を示すことが判明した（図５）。B1R遺伝子は300アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、その配列中にプロテインキナーゼATP結合部位様配列、及びセリン/スレオニンキナーゼ活性部位のコンセンサス配列を含むことから、セリン/スレオニンキナーゼをコードしていると考えられている。fls223全長cDNAとB1R遺伝子は、キナーゼ部位のみならず、全体的に比較的高い相同性を示した（Blast searchにおけるSmallest Sum probability= 2.7e-78）。このことから、この遺伝子を「Vaccinia virus B1R kinase Related Kinase 1」（VRK1）と命名した。
B1Rキナーゼはワクシニアウイルスの感染後数時間といった初期に発現し、その後抑制される初期遺伝子である。この遺伝子中に点変異を持つ変異株はDNA複製の過程でウイルスの増殖が停止することが解明されており、この事実から、B1RキナーゼがウイルスDNAの複製機構を制御しているのではないかという仮説が提唱されている（J. Biol. Chem.,264,21458-21461,1989）。
VRK1は、セリン／スレオニンキナーゼ領域以外の部分においてもB1Rキナーゼと明らかな相同性を示している。従って、ウイルスにおける場合と同様に細胞のDNA複製の制御機構、あるいはより広い意味での細胞増殖の制御機構に関与していることが考えられる。このことは、VRK1が胎児肝臓や精巣などの増殖性の高い細胞が多い組織でより強く発現しているという事実からも裏付けられる。
さらにデーターベース検索において、VRK1と非常に高いホモロジーを持つパブリックの「human EST-H80169」が存在することも明らかとなった。5’RACE及び3’RACEのプライマーとして、「RK A2プライマー」（配列番号：１６）及び「RK S1プライマー」（配列番号：１７）を用い、この遺伝子の全長cDNAのクローニングをVRK1と同様の方法で行ない全塩基配列を決定したところ、この遺伝子は508アミノ酸からなるオープンリーディングフレームをコードしており（配列番号：３参照）、そのアミノ酸配列中にセリン/スレオニンキナーゼ活性部位のコンセンサス配列が存在することが判明した。このことから、この遺伝子も新規セリン/スレオニンキナーゼをコードするものであると考えられた。このアミノ酸配列は、特にキナーゼ領域付近においてVRK1と非常に高い相同性を示し（図６）、またワクシニアウイルスB1Rキナーゼとも高い相同性を示した（図７）。これらの事実から、このキナーゼもB1Rキナーゼと密接な関係にあることが推測されたため、「Vaccinia virus B1R kinase Related Kinase 2」（VRK2）と命名した。
なお、VRK2においてもRT-PCR法において胎児肝臓に成人肝臓よりも強い発現があることが確かめられた（図４）。RT-PCRのプライマーには、「RK S2プライマー」（配列番号：１８）及び「RK A2プライマー」（配列番号：１６）を用いた。
［実施例５］  クロモゾームマッピング
GENEBRIDGE 4 Radiation Hybrid Panel（Research Genetics, Inc.）を用い、VRK1及びVRK2のクロモゾームマッピング（Nature Genetics, 7, 22-28, 1994）を行った。このパネルのDNAを鋳型とし、VRK1の場合は上記の「FLS223 S1プライマー」（配列番号：９）と「FLS223 A1プライマー」（配列番号：１２）の組み合わせにより、94℃で5分、「94℃で30秒、72℃で2分」を5サイクル、「94℃で30秒、68℃で2分」を30サイクル、72℃で3分の条件でPCRを行った。またVRK2については、「VRK2 Aプライマー」（配列番号：１９）と、「VRK2 Bプライマー」（配列番号：２０）の組み合わせにより、94℃で3分、「94℃で30秒、60℃で1分、72℃で2分」を30サイクル、72℃で5分の条件でPCRを行った。得られたパターンをインターネット上のデータベース（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl）において解析し、マップを得た。
この結果、VRK1は第14番染色体のSTSマーカー「D14S265」と「AFM063XE7」に挟まれた位置に、またVRK2は、第2番染色体のSTSマーカー「CHLC.GATA23H01」と「D2S357」に挟まれた位置にマッピングされた。
［実施例６］  ノーザン解析
様々なヒト正常組織と癌細胞株におけるVRK1及びVRK2 mRNAの発現を、ノーザンブロット法により解析した（図８）。
VRK1 cDNAの5’側断片（546番目のHindIIIサイトより上流部分）及びVRK2 cDNAの5’側断片（426番目のEcoRIサイトより上流部分）を、Ready-to Go DNA labelling beads（Pharmacia社製）を用いたランダムプライマー法により［α-32P］dCTPでラベルし、プローブとして用いた。Multiple Tissue Northern（MTN）Blot-Human,Human II, Human Fetal II, Human Cell line（CLONTECH社製）を用い、ExpressHyb Hybridization Solution（CLONTECH社製）中で、メーカー推奨の方法に従い、68℃でハイブリダイゼーションを行った。最終的な洗浄は、0.1 X SSC, 0.1% SDSにて50℃で行い、ハイブリダイゼーションを行ったフィルター上のイメージを、BAS-2000IIバイオイメージングアナライザー（富士写真フィルム社製）によって解析した。
なお、図８中の「G361」は悪性黒色腫由来細胞であり、「A549」は肺癌由来細胞であり、「SW480」は結腸腺癌由来細胞であり、「Raji」はバーキットリンパ腫由来細胞であり、「MOLT-4」は急性リンパ芽球性白血病（T細胞）由来細胞であり、「K-562」は慢性骨髄性白血病由来細胞であり、「HeLaS3」は子宮頸部癌由来細胞であり、「HL60」は前骨髄性白血病由来細胞である。
この結果、VRK1の発現は胎児の組織において比較的高く、特に胎児肝臓に非常に強い発現がみられた。ほとんどの成人の組織に弱いVRK1の発現が見られたが、精巣、及び胸腺には特に強い発現が見られた。また癌細胞株では、調べた8種の細胞のうち6種の細胞において非常に強い発現が観察された。
また、VRK2の発現パターンも基本的にはVRK1の場合と同様であり、やはり胎児肝臓及び精巣に強い発現が見られた。癌細胞株にも同様に強い発現が見られたが、MOLT4には全く発現が見られない点で、VRK1の発現パターンと異なっていた。
［実施例７］  発現用プラスミドDNAの構築
VRK1およびVRK2の全コーディング領域を含むcDNAを、それぞれVRK1 S1プライマー（配列番号：２１）と、VRK1 A1プライマー（配列番号：２２）、およびVRK2 S1プライマー（配列番号：２３）と、VRK2 A1プライマー（配列番号：２４）を用いたPCRにより、ヒト胎児肝臓由来polyA+RNAより合成したcDNAから増幅した。この増幅産物を、プライマーの末端に付加したNotIサイトで切断し、アガロースゲル電気泳動によって正しいサイズを持つDNA断片を精製した。これを、あらかじめNotIで切断し、アルカリフォスファターゼ/CIAP（宝酒造社製）により末端を脱リン酸化したpCOSベクターに組み込んだ。このベクターはEF1αプロモーターを持ち、広範な哺乳動物細胞株において、組み込んだcDNAを強く発現することができる。得られたサブクローンをシークエンシングすることにより、PCRエラーなどの変異がないクローン（pCOS/VRK1w, pCOS/VRK2w）を選択し、以降の強制発現や、さらなる発現用プラスミドDNAの構築に用いた。
C末端に抗c-Myc抗体のエピトープ配列（配列番号：２５）を付加した発現用プラスミドは、以下の様にして構築した。すなわち、pCOS/VRK1wおよびpCOS/VRK2wプラスミドDNA約50ngを鋳型とし、それぞれVRK1 MYC1プライマー（配列番号：２６）とVRK1 MYC2プライマー（配列番号：２７）、およびVRK2 MYC1プライマー（配列番号：２８）とVRK2 MYC2プライマー（配列番号：２９）を用いたPCRによってC末に抗c-Myc抗体のエピトープが付加されたコーディング配列を持つcDNAを増幅した。この際DNAポリメラーゼとして、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。この増幅産物を、プライマーの末端に付加したBamHIサイトで切断し、アガロースゲル電気泳動により正しいサイズを持つDNA断片を精製した。これを、あらかじめBamHIで切断し、アルカリフォスファターゼ/CIAP（宝酒造社製）により末端を脱リン酸化したpcDNA3ベクター（Invitrogen社製）に組み込んだ。得られたサブクローンをシークエンシングすることにより、PCRエラーなどの変異がないクローン（pcDNA3/VRK1myc, pcDNA3/VRK2myc）を選択し以降の実験に用いた。
大腸菌による、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タンパク質との融合タンパク質としての発現用プラスミドDNAは以下のようにして構築した。すなわち、pCOS/VRK1wおよびpCOS/VRK2wプラスミドDNAを鋳型とし、それぞれVRK1 H3プライマー（配列番号：３０）とVRK1 H4プライマー（配列番号：３１）、およびVRK2 H3プライマー（配列番号：３２）とVRK2 H4プライマー（配列番号：３３）を用いたPCRによって、コーディング領域を増幅した。この増幅産物を、プライマーの末端に付加したBamHIサイトで切断し、アガロース電気泳動により正しいサイズを持つDNA断片を精製した。これを、あらかじめBamHIで切断し、アルカリフォスファターゼ/CIAP（宝酒造社製）により末端を脱リン酸化したpGEX-5X-1ベクター（Pharmacia社製）に組み込んだ。得られたサブクローンをシークエンシングすることにより、PCRエラーなどの変異がないクローン（pGEX/VRK1w, pGEX/VRK2w）を選択し以降の実験に用いた。
また、キナーゼ触媒部位における推定ATP結合サイトへ変異を導入したクローン（配列番号：２のアミノ酸配列の71番目のLysをTrpに置換）の作製は、ChameleoTM Double-Stranded Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社製）を用い、以下の様に行った。すなわち、pGEX/VRK1wプラスミドDNA約1μgと、VRK1 KW1プライマー（配列番号：３４）、および選択用プライマーであるSelect1プライマー（配列番号：３５）を混合し、これを5分間煮沸することによって熱変性した。これを、室温で30分保温することにより変異を含む両プライマーとプラスミドDNAとをアニーリングさせた。次に、基質塩基とDNAポリメラーゼ等を加えることにより、このプライマーから新しいDNA鎖を合成した。これをPstIで切断することにより野生型のプラスミドDNAを切断し、XLmutSコンピテント細胞に導入した。一晩液体培養した後プラスミドDNAを抽出し、さらに混在する野生型プラスミドDNAをPstIにより切断した後、再びコンピテント細胞に導入した。シングルコロニーをいくつか単離し、それぞれをシークエンシングすることにより、変異が導入されたクローン（pGEX/VRK1K71W）を選択した。
［実施例８］  哺乳類細胞株での発現
pcDNA3/VRK1mycプラスミドDNA、およびpcDNA3プラスミドDNAの約10μgを、SuperFect（Qiagen社製）を用いた方法により、COS7細胞に導入（トランスフェクション）した。すなわち、約10個のCOS7細胞を10cmディッシュに蒔き、一晩培養した後、10μgのプラスミドDNAと60μlのSuperFectの混合物を添加し、約3時間培養を行った。その後培養液を新しいものに交換し、さらに2日間培養した後、細胞をトリプシン-EDTA液ではがして回収した。PBSで細胞を一度洗浄した後、RIPAバッファー（1% NP-40、10mM トリス-塩酸pH7.2、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15M 塩化ナトリウム、1mM EDTA、10μg/mlアプロチニン、1mM PMSF）中で細胞を破壊し、これを遠心する事によって細胞抽出液を得た。この細胞抽出液をSDSゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、抗c-Myc抗体（SANTA CRUZ社製）を用いてウエスタンブロッティングを行うと、pcDNA3/VRK1mycプラスミドDNAをトランスフェクションした場合に特異的に約50kDaのバンドが現れ、VRK1mycタンパク質が発現しているものと考えられた（図9）。
次に、pCOS/VRK1wプラスミドDNA、およびpCOSプラスミドDNAの約7.5μgを、カチオニックリン脂質DOTAP（ペーリンガーマンハイム社製）を用いた方法によりNIH3T3細胞に導入した。トランスフェクション後、培養液に終濃度500μg/mlのG418（GIBCO-BRL社製）を添加することにより、形質転換された細胞の選択を行った。こうして得られたそれぞれの形質転換細胞のプールより、全RNAをISOGEN（和光純薬社製）を用いた方法により調製し、VRK1 cDNAをプローブとしてノーザンブロッティングを行った。その結果、pCOS/VRK1wプラスミドDNAをトランスフェクションして得られた細胞プールには、VRK1 mRNAが発現していることが確認された（図10）。これらの細胞プールを用い、軟寒天培地中におけるコロニー形成能を調べた（コロニーアッセイ）。すなわち、2x104個の細胞を、融解した0.4% SeaPlaqueアガロース（宝酒造社製）を含む10%ウシ胎児血清、DMEM（ダルベッコ変法イーグル培養液）中に懸濁し、これを0.53% SeaPlaqueアガロース、10%ウシ胎児血清、DMEMによって作製したボトムアガロースの上に重層した。2週間ほど培養を行った後観察すると、pCOS/VRK1wプラスミドDNAをトランスフェクションすることによって得られた細胞プールの場合、pCOSプラスミドDNAの場合に比較し、明らかにサイズの大きい細胞コロニーが多数形成されていた。このことから、VRK1を過剰発現することにより、細胞に異常な増殖活性が与えられることが示唆された（図11）。
［実施例９］  大腸菌におけるVRK1タンパク質の発現とキナーゼアッセイ
大腸菌により、GSTタンパク質との融合タンパク質として、野生型および変異型のVRK1タンパク質を発現させ、精製を行った。すなわち、上記pGEX/VRK1w、およびpGEX/VRK1K71WプラスミドDNAを保持している大腸菌DH5α株を、2xYT培地10ml中で37℃一晩培養した後、この一部を新たな2xYT培地で100倍に希釈し、600nmにおけるODが0.6になるまで37℃で培養を続けた。その後IPTG（イソプロピル-β-D（-）-チオガラクトピラノシド）を終濃度0.1mMになるように添加し、さらに培養を数時間続けた。大腸菌を遠心により集め、1% TritonX-100、1% Tween 20、PBSに懸濁し、超音波処理を施すことにより、細胞を破壊し、タンパク質を可溶化させた。この可溶化サンプルより、グルタチオンセファロース4B（Pharmacia社製）を用いたアフィニティー精製によって、GSTタンパク質との融合タンパク質として発現された野生型、および変異型のVRK1タンパク質を精製した。これらのタンパク質をSDS-PAGEにかけ、クーマシー（CBB）染色を行い、純度を確認した（図12）。また同様にして、GSTタンパク質、およびGST-IkBαタンパク質もそれぞれ調製した。
キナーゼアッセイは、野生型または変異型VRK1タンパク質0.2μg、50mM トリス塩酸（pH7.2）、1mM ジチオスレイトール（DTT）、2mMあるいは10mM 二価カチオン（Mg, Mn, Zn, Ca）、基質タンパク質〜5μg、［γ-32P］ATP 3000Ci/mM, 10mCi/ml（アマシャム社製）1μlで全量50μlとして行った。また、いくつかの実験においてはバッファー系として、40mM ヘペスpH7.4、1mM DTT、2.5mM EGTAを用いた。
具体的には、まず、基質タンパク質としてヒストン（ナカライ社製）、カゼイン（Sigma社製）、ミエリン塩基性タンパク質/MBP（sigma社製）、GST、GST-IkBα、並びにIkBαのC末側ペプチド（配列番号：36）を用い、10mM Mgの存在下で37℃、30分間の反応を行った。反応液をSDS-PAGEにかけ、リン酸化されたタンパク質の放射活性をBAS2000IIバイオイメージングアナライザー（富士写真フィルム社製）によって解析した。その結果、野生型VRK1タンパク質は、カゼインおよびGST-IkBαをリン酸化する事が示された（図13）。一方、推定ATP結合部位に変異を導入した変異VRK1を用いた場合にはリン酸化は観察されず、このことからVRK1が一般的な触媒部位を持つプロテインキナーゼであることが示された。また、VRK1によってGSTタンパク質は全くリン酸化されないことから、GST-IkBαタンパク質におけるリン酸化は、GST部位ではなく、IkBαタンパク質内で起こっているものと考えられた。
IkBαは転写調節因子であるNF-kBと複合体を形成することによりNF-kBの機能を負に制御している因子であると考えられている。また、IkBαは自身がリン酸化されることにより速やかなタンパク質分解を受けて失活し、NF-kBが解放されることにより活性化するという機構が広く受け入れられている。NF-kBは広範囲の免疫反応、炎症反応を引き起こす中心的な転写調節因子であると考えられており、従ってIkBαをリン酸化するキナーゼは抗炎症薬の標的分子として重要である。VRK1はin vitroにおいてIkBαを強くリン酸化する活性を有することから、in vivoにおいてもIkBαをリン酸化することにより、NF-kBの活性化に関与している可能性が考えられる。よって、VRK1のキナーゼ活性を阻害すること、あるいはタンパク質量を減少することなどにより、抗炎症効果、あるいは抗免疫効果が期待できるものと考えられた。
次に、VRK1リン酸化における二価カチオンの要求性を検討した（図14）。終濃度2mM、あるいは10mMの各種二価カチオン（Mg, Mn, Zn, Ca）の存在下で、基質タンパク質としてカゼインを用いてキナーゼ反応を行った。その結果、Zn以外の二価カチオンにおいては、VRK1はリン酸化活性を持つことが示された。しかしその程度は異なっており、特にMn存在下に強い活性を示すことが明らかとなった。
［実施例１０］  VRK1タンパク質に対する抗体の作製
VRK1推定アミノ酸配列のC末端の配列に相当するペプチド（配列番号：37）を合成し（サワディテクノロジー）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル（MBS）を介した方法により、そのアミノ末端のシステインでキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に結合させた。これを抗原としてウサギに免疫し、抗血清を得た。この抗血清より、ペプチドに特異的に反応する抗体を、ペプチドをセルロファイン（生化学工業社製）に結合して作製したアフィニティカラムを用いてアフィニティ精製した。VRK1を強く発現していることがノーザン解析により示されているK562細胞の細胞抽出液を用いてウエスタン解析を行ったところ、分子量約50kDaのシングルバンドが染色され、VRK1タンパク質を特異的に認識しているものと考えられた（図15）。
産業上の利用可能性
本発明者らにより単離されたセリン／スレオニンキナーゼ遺伝子は、DNA複製に関与していることが示唆されているワクシニアウイルス遺伝子と有意な相同性を有し、また増殖性の高い細胞で強い発現を示す。さらに該遺伝子がコードするタンパク質の過剰発現は細胞の増殖活性を顕著に高める。このため単離したセリン／スレオニンキナーゼ遺伝子は、特に、細胞増殖の制御などに関与していると考えられる。従って、本発明の遺伝子を標的とした薬剤（アンチセンスDNAなど）やその発現を調節することが可能な薬剤、あるいは本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を調節することが可能な薬剤をスクリーニングすることにより、新しい作用機序に基づく細胞増殖阻害剤や抗腫瘍薬の開発を行うことが可能であると考えられる。
配列表
（１）出願人氏名：株式会社中外分子医学研究所
（２）発明の名称：新規なセリン／スレオニンキナーゼ遺伝子
（３）整理番号：Ｃ１−８０５ＰＣＴ
（４）出願番号：
（５）出願日：
（６）優先権のもととなった出願をした国名および出願番号：日本国、特願平８−３５７８６４号
（７）優先日：平成８年１２月２６日
（８）配列の数：３７
配列番号：  １
配列の長さ：  1662
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号:  CDS
存在位置:  76..1266
配  列
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0004121155.tif 000003
0004121155.tif 000004
0004121155.tif 000005
配列番号：  2
配列の長さ：  396
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：  タンパク質
配  列
0004121155.tif 000006
0004121155.tif 000007
0004121155.tif 000008
配列番号：  3
配列の長さ：  1833
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号:  CDS
存在位置:  131..1657
配  列
0004121155.tif 000009
0004121155.tif 000010
0004121155.tif 000011
0004121155.tif 000012
配列番号：  4
配列の長さ：  508
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
配  列
0004121155.tif 000013
0004121155.tif 000014
0004121155.tif 000015
配列番号：  5
配列の長さ：  22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000016
配列番号：  6
配列の長さ：  21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000017
配列番号：  7
配列の長さ：  21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  8
配列の長さ：  21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000019
配列番号：  9
配列の長さ：  22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000020
配列番号：  10
配列の長さ：  22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000021
配列番号：  11
配列の長さ：  24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000022
配列番号：  12
配列の長さ：  24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000023
配列番号：  13
配列の長さ：  26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000024
配列番号：  14
配列の長さ：  24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  15
配列の長さ：  27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  16
配列の長さ：  24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  17
配列の長さ：  24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  18
配列の長さ：  24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  19
配列の長さ：  24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
0004121155.tif 000030
配列番号：  20
配列の長さ：  25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  21
配列の長さ：  36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  22
配列の長さ：  36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  23
配列の長さ：  37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  24
配列の長さ：  36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  25
配列の長さ：  10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
配  列
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配列番号：  26
配列の長さ：  33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  27
配列の長さ：  60
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  28
配列の長さ：  33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  29
配列の長さ：  60
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  30
配列の長さ：  31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  31
配列の長さ：  31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  32
配列の長さ：  31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  33
配列の長さ：  31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  34
配列の長さ：  29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  35
配列の長さ：  31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： その他の核酸  合成DNA
配  列
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配列番号：  36
配列の長さ：  25
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： ペプチド
配  列
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配列番号：  37
配列の長さ：  19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： ペプチド
配  列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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