(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、下記の理化学的性質を有するケラチナーゼ。
（ａ）作用および基質特異性：ケラチンに作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。
（ｂ）安定pH：30℃、24時間の処理条件において、pH 1.5〜12.0で安定である。
（ｃ）分子量：SDS電気泳動法では約20,000、アミノ酸配列からの分子量は19,150である。
（ｄ）等電点：10.0（等電点電気泳動法）である。
（ｅ）比活性：カゼインを基質とした場合は約1,100（PU/mgタンパク質）であり、ケラチンを基質とした場合約3,300（KU/mgタンパク質）である。
【請求項２】
さらに、下記の理化学的性質を有する請求項１記載のケラチナーゼ。
（ｆ）最適pH：最適pHはカゼインを基質とした場合は11.0〜11.5であり、ケラチンを基質とした場合は、pH8〜12の測定範囲において、12.0である。
（ｇ）最適温度：最適作用温度はカゼインを基質とした場合は70〜75℃であり、ケラチンを基質とした場合65〜70℃である。
（ｈ）安定温度：pH7.0、10分間の処理条件において、カルシウムの添加、無添加にかかわらず60℃まで安定である。
（ｉ）阻害： EDTA（エチレンジアミン四酢酸）で活性は阻害されないが、PMSF（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）、SSI（ストレプトミセスズブチリシンインヒビター）では阻害される。
【請求項３】
請求項１または２に記載のケラチナーゼをコードする配列表、配列番号１に示す遺伝子。
【請求項４】
好アルカリ性放線菌ノカルディオプシス（Nocardiopsis）属菌から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のケラチナーゼ。
【請求項５】
ノカルディオプシス  エスピー（Nocardiopsis sp.）TOA-1株（FERM P-18676）から得られる、請求項４に記載のケラチナーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のケラチナーゼの製造法であって、ノカルディオプシス  エスピー（Nocardiopsis sp.）TOA-1株（FERM P-18676）を培養する工程と、該工程で得られた培養物より該ケラチナーゼを分離する工程とを含んでなるケラチナーゼの製造法。
【請求項７】
前記微生物の培養が培養温度15〜35℃でpH8.0〜11.0のアルカリ性で行われる、請求項６に記載のケラチナーゼの製造法。
【請求項８】
好アルカリ性放線菌ノカルディオプシス  エスピー TOA-1株（FERM P-18676）。
【請求項９】
ケラチンを分解するための、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する酵素の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ケラチン分解能の高い新規なアルカリプロテアーゼおよびその製造法ならびに該アルカリプロテアーゼ産生能を有する新規な好アルカリ性放線菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリプロテアーゼはタンパク質のペプチド結合をアルカリ領域において特異的に加水分解する酵素であり、食品、繊維、皮革、洗剤等の工業において広く利用されている。このようなアルカリプロテアーゼは糸状菌、酵母、細菌等の微生物により広く生産されることが知られており、またいわゆる好アルカリ性微生物と呼ばれる一群の微生物によっても生産される。
【０００３】
前述された好アルカリ性微生物から生産されるアルカリプロテアーゼとしては、いわゆる好アルカリ性バチルス属菌から得られる酵素（例えば、特公平7-63366、特公平7-63367、特公平7-63368等）が多数既に知られており、主に洗剤用として開発が進められている。また、同様な好アルカリ性バチルス属菌から得られる耐熱性酵素として、AH-101株の生産するアルカリプロテアーゼ（特開平2-255087）およびB18-1株の生産するアルカリプロテアーゼ（特公平7-63368）等が知られている。しかしながら、同じ好アルカリ性微生物である好アルカリ性放線菌の産生するプロテアーゼについてはあまり知られておらず、わずかにストレプトマイセス属由来の酵素（Agr. Biol. Chem., 38, (1), 37-44, 1974）、サーモアクチノマイセス属HS682株の生産するアルカリプロテアーゼ（Biosci. Biotech. Biochem.,56, (2), 246-250, 1992）、およびノカルディオプシス  ダッソンビレイOPC-210の生産するアルカリプロテアーゼ（J. Appl. Bacteriol., 69, 520-529, 1990）等が報告されているにすぎない。
【０００４】
一方、洗剤用にプロテアーゼを応用する場合、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても良好に作用する酵素が望ましいことが指摘されている（皆川基：繊消誌、26, 322, 1985）。また、浴槽、風呂釜、浴床排水溝、循環浴槽の配管、便器あるいは洗面化粧台ドレインの洗浄剤にプロテアーゼを応用する場合では、30℃前後の中温で充分な活性を保持し、かつ毛髪、垢あるいは汚れなどのケラチンを代表とする不溶性タンパク質を強力に分解する能力が要求される。加えて、現状の洗剤および洗浄剤は、配合組成の関係からそのpHがアルカリ領域にあることから、これらに配合する酵素はアルカリプロテアーゼが最適である。
【０００５】
さらに、ケラチンを主要タンパク質とする毛髪、羽毛等は化学合成が不可能なアミノ酸であるシステインの製造原料として重要である。しかし、現状では過激な反応条件のため著量のシステインが分解されてしまい収量が極めて悪いため、プロテアーゼ処理等の温和な加水分解方法が望まれていた。さらに、発展途上国で未利用資源として大量に廃棄される牛、水牛の角および羽毛等は有用なアミノ酸で構成されており、穏和な加水分解でペプチド液、アミノ酸液が製造できれば、輸液等の医薬品あるいは栄養補助剤として、これらの国々にとって極めて有用である。これらの場合においても、ケラチンが高アルカリ領域において膨潤し酵素の作用を受けやすくなるという性質から、加水分解剤としての酵素はアルカリプロテアーゼが最適である。
【０００６】
これらの用途以外にも、台所洗剤や食器洗浄器用洗剤および住宅洗剤等の洗剤、毛皮（原皮）の脱毛、絹や羊毛および皮革等の精錬（風合いの向上）、脱毛クリームや入浴剤およびコンタクトレンズ洗浄剤等の医薬部外品、さらに肉質軟化剤等の食品加工や医薬、試薬等の用途に、不溶性タンパク質の分解力に優れたアルカリプロテアーゼは極めて有用である。
【０００７】
このような用途に対して、特にケラチン等の不溶性タンパク質の分解力において従来のアルカリプロテアーゼは不充分であり、さらに強力なケラチン分解力を有する新規なアルカリプロテアーゼの開発が望まれていた。
【０００８】
このような観点から、本発明者らは既に新規なアルカリプロテアーゼを発見し、特許を出願している（特開２０００−０６０５４７号公報）。このアルカリプロテアーゼは分子量が小さく、優れたタンパク質分解活性を有する。しかし、本酵素の生産性が培養ごとで大きくばらつき、かつ酵素がpH 10.0以上では急激に不安定となるという問題点があった。したがって、安定的に酵素の生産が可能であり、かつ高アルカリ領域でも安定なアルカリプロテアーゼの開発が望まれている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、優れたケラチン分解能と高アルカリ領域での安定性を有する新規なアルカリプロテアーゼを提供することを目的としている。
また本発明は、上記アルカリプロテアーゼを生産する新規微生物、およびその微生物を利用した上記アルカリプロテアーゼの安定した製造法を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記のような状況において、発明者らは強力なケラチン分解能を有するアルカリプロテアーゼを生産する微生物を主に好アルカリ性放線菌を中心として検索した結果、好アルカリ性のノカルディオプシス属に属する放線菌１株が、好気的培養により目的とする新規アルカリプロテアーゼを効率良く、かつ安定的に生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は下記の理化学的性質を有する新規アルカリプロテアーゼを提供する。
【００１２】
(a) 作用および基質特異性：タンパク質およびペプチドに作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。また、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても強力な活性を示す。
(b) 安定pH：30℃、24時間の処理条件において、pH1.5〜12.0で安定である。
(c) 分子量：SDS電気泳動法では約20,000、アミノ酸配列からの平均分子量は19,150である。
(d) 等電点：10.0以上（等電点電気泳動法）である。
(e) 比活性：カゼインを基質とした場合は約1,100（PU/mgタンパク質）であり、ケラチンを基質とした場合約3,300（KU/mgタンパク質）である。
【００１３】
また、本発明による上記新規アルカリプロテアーゼの製造法は、好アルカリ性ノカルディオプシス属に属し、上記アルカリプロテアーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で得られる培養物より該新規アルカリプロテアーゼを分離する工程を含んでなるもの、である。さらにまた、本発明による上記新規アルカリプロテアーゼ産生能を有する新規菌株は、ノカルディオプシス  エスピー  TOA-1株（FERM P-18676）である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明で提供するアルカリプロテアーゼは、上記(a)〜(e)の性質に加えて、下記の理化学的性質を有する酵素である。
【００１５】
(f) 最適pH：最適pHはカゼインを基質とした場合は11.0〜11.5であり、ケラチンを基質とした場合12.0以上である。
(g) 最適温度：最適作用温度はカゼインを基質とした場合は70〜75℃であり、ケラチンを基質とした場合65〜70℃である。
(h) 安定温度：pH7.0、10分間の処理条件において、カルシウムの添加、無添加にかかわらず60℃まで安定である。
(i) 阻害： EDTA（エチレンジアミン四酢酸）で活性は阻害されないが、PMSF（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）、SSI（ストレプトミセス ズブチリシン インヒビター）では阻害される。
【００１６】
本発明によるアルカリプロテアーゼは、カゼイン等の可溶性タンパク質だけでなく、従来のプロテアーゼでは分解されにくかったケラチン等の不溶性タンパク質をも強力に加水分解する。したがって、衣料用洗剤や柔軟剤および各種洗剤に洗浄効果を高める目的で配合されたり、浴槽、風呂釜、浴室排水溝、循環浴槽の配管、便器、洗面化粧台ドレインなどの閉塞除去剤に添加されれば、極めて効果的である。さらに、ケラチンを主要タンパク質とする毛髪、羽毛、牛角等からのペプチドおよびシステイン等のアミノ酸製造にも応用が可能である。また、毛皮（原皮）の脱毛、絹や羊毛および皮革等の精錬（風合いの向上）等をより穏和な条件で行うことが可能となる。さらに、脱毛クリーム、入浴剤等の化成品や食肉軟化剤あるいは医薬、試薬等、極めて広範囲の工業分野で利用され得る。また、本発明による菌株は、上記アルカリプロテアーゼを効率良く菌体外に分泌するので、簡便な工程で高効率にその生産を行うことができる点で有利である。
【００１７】
【発明の具体的説明】
本発明による新規アルカリプロテアーゼは、微生物を用いて生産することができる。特に好ましくは、本発明によるアルカリプロテアーゼは、好アルカリ性ノカルディオプシス属、特にノカルディオプシス  エスピー（Nocardiopsis sp.）TOA-1株により生産される。この菌株は発明者らにより、神奈川県茅ヶ崎市の一般家屋より分離されたものである。この菌株は好アルカリ性放線菌であり、下記に示す菌学的性質を有する。なお、本菌株は好アルカリ性微生物であり、通常の中性培地では生育しないか、あるいは生育が極めて不良であるため、下記の菌学的性質の検討に際しては1.0％炭酸ナトリウム添加のアルカリ性培地を用いた。
【００１８】
形態学性質
1)胞子形成菌糸の分岐法および形態：単純分枝・直状
2)胞子の形成法                  ：気菌糸が分断して連鎖する
3)胞子の形態および大きさ        ：たわら型で平滑、0.5 μm×1.0 μm程度
4)鞭毛の有無                    ：無
5)胞子のうの有無                ：無
【００１９】
生理的性質
1)生育温度範囲 / pH             ：15〜40 ℃ / pH 7.5〜13
2)ゼラチンの液化                ：する（3日で液化する）
3)スターチの加水分解            ：加水分解する
4)脱脂牛乳の凝固およびペプトン化：凝固しない：4日でペプトン化する
5)メラニン様色素の生成          ：生成しない
6)各炭素源の資化性（＋、資化する；−、資化しない）
a)L-アラビノース              ：＋
b)D-キシロース                ：＋
c)D-グルコース                ：＋
d)D-フラクトース              ：＋
e)シュクロース                ：＋
f)イノシトール                ：＋
g)L-ラムノース                ：＋
h)ラフィノース                ：＋
i)D-マンニット                ：＋
7)各培地における生育状況（生育状況、集落表面の色、集落裏面の色、拡散色素）
a)シュクロース硝酸塩寒天培地          ：良好、白色、無色、薄肌色〜ピンク色
b)グルコース・アスパラギン寒天培地       ：良好、白色、無色、無し
c)グリセリン・アスパラギン寒天培地       ：良好、白色、無色、無し
d)スターチ・無機塩寒天培地           ：良好、白色、無色、薄茶色
e)チロシン寒天培地              ：良好、白色、無色、薄茶色、メラニン無し
f)栄養寒天培地                  ：良好、白色、無色、無
g)イースト・麦芽寒天培地             ：良好、白色、無色、無
h)オートミール寒天培地                ：良好、白色、無色、薄肌色〜ピンク色
【００２０】
本菌株TOA-1株は上記の菌学的性質、特に形態学的に放線菌の特徴を有する。そこで、「放線菌の分類と同定」（日本放線菌学会編、2001）に従って属の検索を行った。まず、本菌株は細胞壁にmeso-ジアミノピメリン酸のみを含有することから、本菌株はストレプトマイセスおよびキネオスポリア以外の属に属する菌種と考えられる。また、本菌株は基生菌糸の分断とジグザグ状の菌糸は少ないものの、気菌糸の分断は旺盛であり、nocardio-formの放線菌と考えられた。
【００２１】
そこで、成書（同上）に従い本菌株の16SrDNAを調製して放線菌各属との相同性を検索した。その結果、本菌株はノカルディオプシス属の各菌種と94.7〜97.6％の相同性が認められたが、完全に一致する種は認められなかった。最も相同性の高いものは、ノカルディオプシス  アルバであった。また、本菌株同様に好アルカリ性であるノカルディオプシス  ダッソンビレイとは96.7％と、ノカルディオプシス属の中での相同性はそれほど高いものではなかった。
【００２２】
すなわち、本菌株TOA-1は好アルカリ性であること等を考慮してノカルディオプシス  アルバに近縁の一菌種と判断し、ノカルディオプシス  エスピー  TOA-1（Nocardiopsis sp. TOA-1）と命名した。なお、本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18676のもと寄託されている。
【００２３】
培養条件
上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養はアルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にするための方法としては格別である必要はなく、通常の培地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウムを添加するだけで良い。炭素源としてはグルコース、可溶性デンプン、セルロース等の単糖、多糖などを用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキス、スキムミルク、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必要に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源としては、0.5〜2.0％程度の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、アンモニアなどが使用でき、培地のpHは8.0〜11.0程度が望ましい。培養は、このような培地中で培養温度20〜40℃、好ましくは30〜35℃で2日〜7日間好気的に撹袢または振とうしながら行う。本発明による新規なアルカリプロテアーゼは、上記のような培養条件のもとで、主として培養液中に分泌され、蓄積される。
【００２４】
酵素の採取
上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するためには、既知の精製法を単独もしくは併用して利用することができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などによる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒による沈殿法；ケラチン等による吸着法；限外濾過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；疎水クロマトグラフィー、その他の各種クロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製することができる。
【００２５】
好ましい精製法を示せば以下の通りである。まず、培養濾液に80%飽和硫安を添加して塩析を行い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでCM-Toyopearl 650M（東ソー社製）、DEAE-Toyopearl 650M（同社製）によるイオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、SDS電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
【００２６】
酵素の性質
本発明によるアルカリプロテアーゼの性質は以下に示される通りである。なお、以下において活性測定法とは次の方法をいうものとする。
【００２７】
プロテアーゼ活性測定法
カゼイン0.6%を含む50mMグリシン/NaCl/NaOH緩衝液（pH11.0）1.9 mlを0.1mlの酵素液と混合し、30℃で10分間反応させた後、2mlの0.11Mトリクロロ酢酸溶液を加えて30℃で30分間静置した後、アドバンテック社製濾紙N0.5Cで濾過する。次いで、この濾液の0.5mlを2.5mlの0.5M炭酸ナトリウム溶液に加え、さらに3倍希釈したフェノール試薬を0.5ml添加して撹袢後、さらに室温にて30分間放置し、660 nmの吸光度を測定する。上記の測定条件下で1分間に1μｇのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素量を、プロテアーゼ活性1単位（1PU）と定義する。
【００２８】
ケラチン分解活性測定法
60mｇのケラチンパウダー（東京化成）に2.9mlの50mMグリシン/NaCl/NaOH緩衝液（pH12.0）を加え、さらに0.1mlの酵素液を添加して30℃で1時間振とう（120rpm）させて反応させる。次いで、0.11Mトリクロロ酢酸2.5mlを加えて反応を停止させ、30℃で30分静置の後アドバンテック社製濾紙NO.5Cで濾過する。このろ液の0.5mlに0.5M炭酸ナトリウム溶液2.5mlを加え、さらに3倍希釈したフェノール試薬を0.5ml添加撹拌後、さらに室温にて30分間放置し、660nmの吸光度を測定する。上記の測定条件下で10分間に1μｇのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素量を、ケラチン分解活性1単位（1KU）と定義する。
【００２９】
（１）作用および基質特異性
タンパク質およびペプチドに作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。また、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても強力な活性を示す。
【００３０】
（２）最適pHおよび安定pH
上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすpHの影響を調べた。なお、緩衝液としてHCl/KCl(pH1.0-1.5)、グリシン/NaCl/HCl(pH2.0-3.0)、酢酸(pH4.0-5.0)、リン酸(pH6.0-7.0)、トリス塩酸(pH7.0-9.0)、グリシン/NaCl/NaOH(pH9.0-12.0)、KCl/NaOH(pH12.0-13.0)を使用した。第１図に活性の最大値を100とした場合の各pHにおける相対活性を示した。第１図により、本酵素の最適pHは30℃においてカゼインを基質とした場合は11.0〜11.5であり、ケラチンを基質とした場合は12.0以上であることが分かる。同様に本酵素のpH安定性について第２図に示した。本酵素を各pHの緩衝液中に30℃で24時間保持した後、その残存プロテアーゼ活性を未処理の酵素活性を100とした相対活性として示した。第２図から、本酵素は上記処理条件下においてpH1.5〜12.0までの極めて広範囲のpH域で安定であることが分かる。
【００３１】
（３）最適温度および安定温度
上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を調べた。第３図に最大活性を100とした場合の各温度における相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適温度はカゼインを基質とした場合は70〜75℃であり、ケラチンを基質とした場合は65〜70℃であることが分かる。また、本酵素を100 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0)に添加し、40〜80℃の範囲の各条件下で10分間保持した後、その残存プロテアーゼ活性を測定した。その結果を第４図に示した。第４図により、本酵素は60℃まで安定であることがわかる。なお、本酵素の温度安定性に関しては、カルシウム添加（10mM）の効果は認められなかった。
【００３２】
（４）分子量
本酵素の分子量をSDS電気泳動法により測定したところ、分子量は約20,000であった。また、後述する配列表、配列番号2記載のアミノ酸配列から算出した平均分子量は19,150であった。
【００３３】
（５）等電点
本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したところ、等電点は10.0以上であった。
【００３４】
（６）比活性
本酵素の比活性を活性測定法に準じて測定した。なお、タンパク質濃度は酵素を塩酸により加水分解し、生成したアミノ酸をニンヒドリン法で定量することにより算出した。酵素は電気泳動的に均一な精製標品を使用した。その結果、本酵素の比活性はカゼインを基質とした場合は約1,100(PU/mgタンパク質)であり、ケラチンを基質とした場合は約3,300(KU/mgタンパク質)であった。
【００３５】
（７）阻害
一般的な酵素阻害剤であるPMSF(フェニルメタンスルフオニルフルオライド) 、EDTA(エチレンジアミン四酢酸) 、およびSSI（ストレプトミセス ズブチリシン インヒビター）について、これらが本酵素の活性に及ぼす影響を調べた。各阻害剤を所定濃度となるように50mMトリス塩酸緩衝液(pH9.0)に溶解し、本酵素を添加後30℃で30分間処理を行った。次いで、処理溶液より一定量を分取し活性測定法に準じてその残存活性を測定した。その結果、本酵素はPMSFおよびSSIにより阻害され、EDTAによる阻害を受けなかった。このことから、本アルカリプロテアーゼはセリンプロテアーゼであることが判明した。
【００３６】
（８）アミノ末端配列
本酵素のアミノ末端配列を気相プロテインシークエンサー（島津製作所製、PPSQ-21）を用いて決定した。本酵素のアミノ末端から25番目までの配列を下記に示した。
Ala-Asp-Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Ala-Tyr-Thr-Met-Gly-Gly-Arg-Cys-Ser-Val-Gly-Phe-Ala-Ala-Thr-Asn-Ala-Ser
【００３７】
（９）塩基配列およびアミノ酸配列
成書（例えば、J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989など）および使用した機器、試薬キット等のプロトコルに従い、本酵素の遺伝子およびアミノ酸の配列を決定した。まず、プライマーを設計する目的で本酵素の内部配列を決定した。精製酵素を尿素処理後リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬）で分解し、得られたフラグメントを気相プロテインシークエンサーでアミノ酸配列を決定した。ここで得られた適当な内部配列およびアミノ末端配列より、2種類のオリゴヌクレオチドプライマーをホスホアミダイト法により合成した。このプライマーによりPCR（Biometra社製、T-Gradient Thermoblock 050-801）で遺伝子の増幅を行った。その結果、0.5kbp前後に特異的な増幅断片を認めた。この断片をプローブとして本菌株TOA-1のゲノムライブラリーより、本酵素をコードする完全長の遺伝子をスクリーニングした。得られたクローンの塩基配列をジデオキシ法（F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467, 1977）を原理とするDNAシークエンサー（LICOR社製、LICOR-4000）により決定した。その塩基配列（564bp）を配列表、配列番号1に示した。また、塩基配列をもとにアミノ酸配列（188アミノ酸）を決定し、そのアミノ酸配列を配列表、配列番号2に示した。
【００３８】
【実施例】
次に本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
実施例１  粗酵素粉末の調製
ノカルディオプシス  エスピー  TOA-1株の前培養液50ml（30℃、3日間振とう培養）を、スキムミルク0.5％、酵母エキス 0.1％、および別殺菌して添加した炭酸ナトリウム 1.0％を含有する培地（pH10.5）4000mlを入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、30℃で3日間、通気量1 v/v/min、回転数200rpmで培養を行った。培養終了後、培養液を8000 rpmで10分間遠心分離して菌体を除去した。これにより、30PU/mlの粗酵素液約3,800mlを得た。
【００４０】
実施例２  精製酵素の調製
実施例１と同一の培地4000mlを入れた小型ジャーファーメンターに、ノカルディオプシス  エスピー  TOA-1株の前培養液50mlを植菌した。これを実施例１と同様に培養した後、遠心分離により培養上清3,790mlを得た。この上清液のpH11.0におけるプロテアーゼ活性は29PU/mlであった。次いで、この上清液に硫安粉末を80％飽和になるまで加え、１昼夜5℃で暗所に静置後8000rpmで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、セルロースチューブを用いて同緩衝液に対し透析を行った。透析後、その透析内液を10mM MOPS緩衝液（pH7.5）で平衡化したCM-Toyopearl 650Mカラムに通じて酵素を吸着させ、0〜0.5M のNaCl濃度勾配で溶出させた。活性画分を透析後、10mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）で平衡化したDEAE-Toyopearl 650Mカラムに通じて活性画分を通過させ、不純タンパク質を吸着させた。上記一連の精製により、1940PU/mlの精製アルカリプロテアーゼ（比活性：1,100PU/mg）が17ml得られ、酵素活性の回収率は30％であった。本画分はSDS電気泳動的に単一バンドを示し、酵素タンパク質として均一であることが確認された。
【００４１】
実施例３  酵素の生産性
実施例１と同一の培地を用いて、フラスコを用いた振とう培養および小型ジャーファメンターによる培養を行い、培養バッチごとの酵素の生産性を比較した。まず、500ml容肩付きフラスコに培地100mlを入れ、寒天培地からTOA-1株の胞子を1白金耳接種し、30℃、130rpmで４日間振とう培養を行った。この培養を10連行い、フラスコ内のそれぞれの培養液につきプロテアーゼ活性を測定した。また、別に実施例１と全く同様の小型ジャーファメンターを用いた培養を5連行い、それぞれのバッチごとのプロテアーゼ活性を測定した。その結果、フラスコ培養では38〜41PU/ml、小型ジャーファメンター培養では28〜33PU/mlとなり、培養バッチによる活性のばらつきはほとんどなかった。このことから、本酵素の生産性は安定していることが判明した。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によるアルカリプロテアーゼの最適pHを示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によるアルカリプロテアーゼの安定pHを示すグラフである。
【図３】図３は、本発明によるアルカリプロテアーゼの最適温度を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明によるアルカリプロテアーゼの安定温度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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