(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性状を有し、且つ生育にメチオニン及びグルタミン酸を必要としない受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９２８の微生物であって、リジン残基のC末端側のペプチド結合を特異的に切断するリジン残基特異的酵素の生産能を有する微生物。
ａ．形態：桿菌
ｂ．大きさ：0.7〜0.8×2.0〜3.0μm
ｃ．グラム染色性：陰性
ｄ．胞子：陰性
ｅ．運動性：陰性
ｆ．酸素に対する態度：好気性
ｇ．オキシダーゼ：陽性
ｈ．カタラーゼ：陽性
ｉ．Ｏ−Ｆテスト：陰性
ｊ．集落の色調：特徴的色素有せず又は薄い黄色系
ｋ．キノン系：Ｑ−８
ｌ．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量：７０ ｍｏｌ％
【請求項２】
請求項１に記載の微生物を培養し、該培養液から産生したリジン残基のC末端側のペプチド結合を特異的に切断するリジン残基特異的酵素を採取することを特徴とする、リジン残基特異的酵素の取得方法。
【請求項３】
請求項１に記載の微生物を培養し、該培養液を、順に硫安分画、DEAE-セルロースSHカラムクロマトグラフィー処理及びAHセファロース 4Bカラムクロマトグラフィー処理することにより得られるものであり、分子量が27850である、リジン残基のC末端側のペプチド結合を特異的に切断するリジン残基特異的酵素。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リシン残基特異的酵素産生能が高い新種の微生物並びにこれを用いるその酵素の取得方法に関する。
【０００１】
【従来の技術】
タンパク質及びペプチドのＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断する酵素としては、アクロモバクター  リティカス M497-1（Achromobactor lyticus M497-1）の培養液から単離されたアクロモバクター プロテアーゼＩ［ＡＰＩ、EC 3.4.21.50.、商品名 リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社商標登録第2255563号）］が最も良く知られている。このＡＰＩはセリンエンドペプチダーゼの一種で、Lys-Pro結合を含む全ての-Lys-X結合を切断するリシン残基特異的酵素であり、タンパク質やペプチドの一次構造のための断片化やペプチドマップの作成、-Lys-X-化合物の合成に極めて有用である。このＡＰＩはアクロモバクター  リティカス M497-1菌を培養して生産されているが、産生効率が悪いため酵素を安価にすることができないという問題点を有している。
そのため、リシン残基特異的酵素を効率よく生産する微生物及び安価に取得し得る方法が求められている。
【０００２】
【発明が解決すべき課題】
上記した如き状況に鑑み、本発明が解決すべき課題は、リシン残基特異的酵素を高効率に産生する微生物及びこの微生物を用いたその酵素の取得方法を提供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の性状を有し、且つ生育にメチオニン及びグルタミン酸を必要としない受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９２８の微生物であって、リジン残基のC末端側のペプチド結合を特異的に切断するリジン残基特異的酵素の生産能を有する微生物の発明である。
ａ．形態：桿菌
ｂ．大きさ：0.7〜0.8×2.0〜3.0μm
ｃ．グラム染色性：陰性
ｄ．胞子：陰性
ｅ．運動性：陰性
ｆ．酸素に対する態度：好気性
ｇ．オキシダーゼ：陽性
ｈ．カタラーゼ：陽性
ｉ．Ｏ−Ｆテスト：陰性
ｊ．集落の色調：特徴的色素有せず又は薄い黄色系
ｋ．キノン系：Ｑ−８
ｌ．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量：７０ ｍｏｌ％
また、本発明は、上記微生物を培養し、該培養液から産生したリジン残基のC末端側のペプチド結合を特異的に切断するリジン残基特異的酵素を採取することを特徴とするリジン残基特異的酵素の取得方法の発明である。
更に、本発明は、上記微生物を培養し、該培養液を、順に硫安分画、DEAE-セルロースSHカラムクロマトグラフィー処理及びAHセファロース 4Bカラムクロマトグラフィー処理することにより得られるものであり、分子量が27850である、リジン残基のC末端側のペプチド結合を特異的に切断するリジン残基特異的酵素の発明である。
【０００４】
即ち、本発明者らは、土壌から得られた各種菌類の性状について鋭意研究を重ねた結果、リシン残基特異的酵素を高効率で産生する新種の微生物を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明の微生物は、本発明者らにより新たに土壌から単離され、同定されたものであり、本発明者らによりキサントモナス属IB-9374（Xanthomonas sp IB-9374）と命名されている。
【０００６】
このキサントモナス属IB-9374の凍結乾燥品は、ブダペスト条約の国際寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に１９９８年８月３日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９２８として受託されている。
【０００７】
本発明のキサントモナス属IB-9374の培地組成としては、通常この微生物が生育し得るものであれば天然培地及び合成培地の何れでもよく、培地は固体又は液体培地の何れでもよい。これらの培地には、例えば、炭素源としての、グルコース、マルトース、マンノース等の糖類、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類など、窒素源としてのペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸などの一般天然窒素源の他に、各種無機、有機アンモニウム塩などが含まれ、その他、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩などの無機塩類などが必要に応じて適宜添加される。また、本発明のキサントモナス属IB-9374の培養は慣用の方法で行うことができるが、培養温度は通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３５℃であり、培地のｐＨは通常は６〜８、好ましくはｐＨ６.５〜７.５である。また、培養は、振とう或いは通気攪拌などの手段により好気的条件下で行われる事が望ましく、培養時間は通常１５０〜２５０時間である。
【０００８】
本発明のキサントモナス属IB-9374からリシン残基特異的酵素（以下、Xan.Lys-Cと略記する場合がある）を取得する方法は、具体的には以下のようにして実施される。即ち、キサントモナス属IB-9374を上記した如き培養条件で培養し、培養液中のリシン残基特異的酵素活性が高値となった時点で培養液を濾過し、得られた培養濾液を、少なくとも硫安分画（５０〜９０％）、DEAE-セルロース SH処理及びAH セファロース 4Bカラムクロマトグラフィーをすることによりリシン残基特異的酵素が得られるが、好ましくは６段階の精製を行うのがよい。即ち、培養濾液の硫安分画、CM-トヨパール 650M処理、DEAE-セルロース SH処理、AH セファロース 4Bカラムクロマトグラフィー、ソイビーントリプシンインヒビター（Soybean trypsin inhibitor；STI） セファロース 4B アフィニティーカラムクロマトグラフィー、セファデックス G-50 カラムクロマトグラフィーを、この順番で行うのが好ましい。
【０００９】
本発明のリシン残基特異的酵素の採取を６段階の精製工程を用いて行う場合でも、アクロモバクター  リティカス M497-1からＡＰＩを取得する場合（T.Masaki,K.Nakamura,M.Isono and M.Soejima;Agric.Biol.Chem.,42 1443-1445(1978)、７段階）と比較すると、より簡便で、より短時間にリシン残基特異的酵素を得ることができる。
【００１０】
しかも、酵素タンパク質量としての収量は、アクロモバクター  リティカス M497-1から生産される、本酵素と同じ特異性を持つＡＰＩの収量の約７倍量に相当する。即ち、同量のリシン残基特異的酵素を得るのに必要な菌の培養量がアクロモバクター  リティカス M497-1を生産菌として用いた場合の７分の１ですむので、その取得コストを大幅に削減することができる。
【００１１】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１．新規なリシン残基特異的酵素高効率産生菌の選別
菌の選別は以下のようにして行った。
採取した土壌１ｇを滅菌生理食塩水１０ｍＬに加え、しばらく攪拌した後、滅菌ピペットで上澄液１ｍＬを取り、滅菌生理食塩水９ｍＬを加えて再度攪拌した。これを、滅菌生理食塩水で順次希釈を行い１０2〜１０9倍の希釈液を調製した。各希釈液３滴を１％小麦タンパク質を唯一の栄養源として含む寒天平板培地（２％）に滴下し、滅菌済みのコンラージ棒で均一に攪拌した。次いで、３０℃で２〜３日間培養した後、十分に生育した多数のコロニーの中から、コロニーの周りに透明帯（ハロー）を生成している単一コロニーを選択し、このコロニーの微生物を綿栓付き試験管（２５ｍｍ×２００ｍｍ）中の液体培地（ｐＨ７.２、０.５％カゼイン、１.０％シュークロース、１.０％ポリペプトン、０.０１％KH2PO4、０.０１％K2HPO4及び０.０１％MgSO4・7H2Oを含有。以下、Ａ培地と呼ぶ）１５ｍＬに釣菌し、３０℃で２４時間培養した。培養後、遠心分離（１６,０００ｒｐｍ×１０分）し、得られた上澄液を粗酵素液とした。粗酵素液のNα-ベンゾイル-DL-リシン-p-ニトロアニリド臭化水素酸塩（以下、BZ-lys-pNAと略記する）に対するアミダーゼ活性を調べた。アミダーゼ活性が陽性を示した微生物を５００ｍＬ坂口フラスコ中のＡ培地１００ｍＬに釣菌し、３０℃で２４時間培養した。培養後遠心分離して得られた上澄液を硫安分画、STIセファロース 4Bアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより部分精製し、得られた精酵素のグルカゴン（ペプチド鎖中にリシン残基１個存在）に対する特異性を調べた。
【００１３】
その結果、分離された３１,５６３株の中から１株だけが、リシン残基特異的酵素を産生することが判った。
【００１４】
尚、アミダーゼ活性は、基質としてBZ-lys-pNAを使用し、酵素作用により遊離されるpーニトロアニリンを４０５ｎｍで測定するTuppyらの方法（H.Tuppy,UWiesbaver and Wintersberger;Hoppe-Seyler's Z.physiol.Chem.,329,278(1962)）により測定した。即ち、試験管（１.５×１３cm）に２.５ｍＭ BZ-lys-pNA水溶液０.１５ｍＬと０.２Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.２）１.３ｍＬをそれぞれ分注し、３０℃の恒温水槽中で５分間保った後、酵素溶液０.０５ｍＬを加えて同温度で反応させた。正確に５分後、４５％酢酸溶液０.５ｍＬを加えて反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。対照試料は基質水溶液０.１５ｍＬ、０.２Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.２）１.３ｍＬ、４５％酢酸溶液０.５ｍＬ、酵素溶液０.０５ｍＬを順次添加し、すばやく混合したものを用いた。上記の条件で１分間に１μｍｏｌのpーニトロアニリン（分子吸光係数９６２０）を遊離する酵素活性を１単位と定義した。
また、グルカゴンに対する特異性は以下のようにして調べた。
グルカゴン７０μｇを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.２）０.１ｍｌに溶解し、モル比で基質の１/１００相当量の酵素１０μｌ（５.６μｇ、０.２０ｎ ｍｏｌ）を加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応終了後、その分解物は１００℃の沸騰水で３分間加熱して反応を停止させ、凍結乾燥した。凍結乾燥した分解物はＨＰＬＣで分画し、精製した。精製した各ペプチドをアミノ酸組成分析、及びＮ末端アミノ酸配列分析により同定し、分子量をＥＳＩ−ＭＳ法により測定した。アミノ酸組成分析は、８３５形アミノ酸分析計（日立社製）により、また、Ｎ末端アミノ酸配列分析はApplied Biosystems 494 Protein Sequencerにより同定した。ＥＳＩ−ＭＳ法は、Perkin Elmer API300により分子量を測定した 。
【００１５】
実施例２．
分離選別した菌体の同定を日本食品分析センターに依頼した結果、キサントモナス  マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia。前名はPseudomonas maltophilia。現在はStenotrophomonas maltophiliaと呼ばれる。）と同定されたが、その文献値（N.R.Krieg and J.G.Holt:"Bergey's Manual of Synstematic Bacteriology" Vol.1(1984) Williams &Wilkins 、 J.Swings,P.De Vos ,M.Van den Mooter and J.De Ley :Int.J.Syst.Bacteriol.,33,409(1983)）と本菌株とを比較すると、運動性やオキシダーゼ等の性状が若干異なることが明らかとなった。
尚、分析結果を表１に示す。尚、表１には、本菌株、アクロモバクター  リティカス M497-1（Achromobacter lyticus M497-1）の文献値（特公昭46ー42953号公報）及びキサントモナス  マルトフィリアの文献値を併せて示す。
【００１６】
【表１】
0004085486.tif 000002
【００１７】
また、グラム陰性桿菌同定キット ID 32GN（ビオメリュー社製）を用いた自動細菌検査装置ATB Expression（ビオメリュー社製）による同定試験及び腸内細菌以外のグラム陰性菌同定キットAPI 20NE（ビオメリュー社製）を用いた同定結果は以下の通りである。
ATB Expressionによる資化性試験：陽性；Ｎ−アセチルグルコサミン、クエン酸ナトリウム、３−ヒドロキシ酪酸及びＬ−プロリン。陰性；ラムノース、Ｄ−リボース、イノシトール、シュークロース、イタコン酸、スベリン酸、マロン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸、Ｌ−アラニン、Ｄ−マンニトール、グルコース、サリシン、Ｄ−メリビオース、Ｌ−フコース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−アラビノース、プロピオン酸、ｎ−カプリン酸、ｎ−吉草酸、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、５−ケトグルコン酸、グリコーゲン、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、２−ケトグルコン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸及びＬ−セリン。
また、ATB Expressionによるエスクリンの加水分解試験、ＤＮＡの分解試験及びレシチナーゼ試験は全て陽性であった。
【００１８】
API 20NEによる資化性試験：陽性；グルコース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マルトース、ＤＬ−リンゴ酸及びクエン酸ナトリウム。陰性；Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸及び酢酸フェニル。
また、API 20NEによる硝酸塩還元試験、インドール生成試験、グルコース発酵性試験、アルギニンジヒドロラーゼ試験及び尿素分解試験は陰性であり、エスクリン分解試験、ゼラチン液化試験、ＰＮＰＧ試験及びオキシダーゼ試験は陽性であった。
【００１９】
この結果、本菌株はシュークロースを資化しなかったが、アクロモバクター  リティカス M497-1はシュークロースを資化することから、これらは別の菌株であることが示唆された。資化性の異同を観るため、更に両菌をバイオローグシステム（Biology社、Microstation システム、USA）による９５種類の炭素源の資化性について比較検討した。
【００２０】
その結果、α−シクロデキストリン、ギ酸、フェニルエチルアミン、プトレッシン、２−アミノエタノール、２,３−ブタンジオール、セバシン酸及びγ−アミノ酪酸の８種の炭素源について、キサントモナス属IB-9374では陽性、アクロモバクター  リティカス M497-1では陰性と、相違が観られた。
この結果より、キサントモナス属IB-9374は、アクロモバクター  リティカス M497-1とは異なる菌株であることが明らかとなった。
【００２１】
アクロモバクター  リティカス M497-1の他に本菌株と類似の生化学的性質を有するものにステノトロフォモナス  マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）がある。この菌株の生育には、メチオニン及びグルタミン酸が必要であるという報告がなされている。そこで、メチオニン及びグルタミン酸の存在、非存在による生育への影響を調べた。その結果を図１及び図２に示す。尚、図１中の−○−は、メチオニンを培地に加えたときの、また、--○--はメチオニンを培地に加えないときのキサントモナス属IB-9374の生育曲線を夫々示し、−◆−は、メチオニンを培地に加えたときの、また、--◆--はメチオニンを培地に加えないときの、アクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線を夫々示す。図２中の−○−は、グルタミン酸を培地に加えたときの、また、--○--はグルタミン酸を培地に加えないときのキサントモナス属IB-9374の生育曲線を夫々示し、−◆−は、グルタミン酸を培地に加えたときの、また、--◆--はグルタミン酸を培地に加えないときのアクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線を夫々示す。
【００２２】
この結果から、メチオニン及びグルタミン酸によるキサントモナス属IB-9374への生育の影響は認められなかった。この結果より、キサントモナス属IB-9374は、ステノトロフォモナス  マルトフィリアとも別の菌であることが判明した。
【００２３】
さらに、本菌株の１６Ｓ−ｒＤＮＡ塩基配列分析を行い、既知の微生物の塩基配列との相同性を検討したところ、ステノトロフォモナス  マルトフィリア LMG 11087［（Stenotrophomonas maltophilia LMG 11087）、旧名：キサントモナスマルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）］、キサントモナス  バシコラ LMG 736T（Xanthomonas vasicola LMG 736T）、キサントモナス  アルボリコラ 747T（Xanthomonas arboricola 747T）、キサントモナス  カムペストリス LMG 568T（Xanthomonas campestris LMG 568T）、キサントモナス  カッサバエ LMG 673T（Xanthomonas cassavae LMG 673T）、キサントモナス  ホルトルム LMG 733T（Xanthomonas hortorum LMG 733T）、キサントモナス  オリイザエ LMG 5047T（Xanthomonas oryzae LMG 5047T）、キサントモナス  ピシ LMG 847T（Xanthomonas pisi LMG 847T）、キサントモナス  ベシカトリア LMG 911T（Xanthomonas vesicatoria LMG 911T）及びキサントモナス  カムペストリス pv.カムペストリス Xc17（Xanthomonas campestris pv.campestris Xc17）の１０種が、本菌株の16S-rDNAの塩基配列と高い相同性（９３％以上）を示した。尚、塩基配列分析の相同性は、各種細菌の16S-rDNA配列を用い、遺伝子解析ソフトウェアGENETYX-MAC7.3（SOFTWARE DEVELOPMENT社製）で計算を行った。
【００２４】
以上の結果より、本菌株はキサントモナス属の新菌種であると判断し、本菌株をキサントモナス属IB-9374と命名した。
【００２５】
実施例３．各種培地におけるキサントモナス属IB-9374のXan.Lys-C産生能の検討種々の培地を用い、キサントモナス属IB-9374のXan.Lys-C産生能を検討した。即ち、酵母エキス、カサミノ酸、肉エキス、ミルクカゼイン、ソイビーンパウダー、シュークロース、グルコース、ポリペプトン、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4・7H2Oを所定濃度含有する各種培地でキサントモナス属IB-9374を３０℃所定時間培養した後、培養上清を採取し、培養上清のアミダーゼ活性を測定して、その値よりXan.Lys-C産生能を比較した。
【００２６】
その結果、０.５％ミルクカゼイン、１.０％シュークロース、１.０％肉エキス、０.０１％KH2PO4、０.０１％K2HPO4及び０.０１％MgSO4・7H2Oを含有するｐＨ７.２の培地（以下、Ｂ培地と呼ぶ）が最も好ましいことが判った。Ｂ培地を用いると、１５０時間で培養上清１ｍＬ当たり０.１単位（ｕ）、２５０時間で０.１８ｕの最も高いアミダーゼ活性を示した。Ｂ培地を用いた場合のキサントモナス属IB-9374の生育曲線（−○−）と所定時間培養後の培養上清のアミダーゼ活性を示す曲線（--◇--）を図３に示す。尚、対照として、アクロモバクターリティカス M497-1を同じＢ培地中で培養した場合の生育曲線（−□−）と所定時間培養後の培養上清のアミダーゼ活性を示す曲線（--×--）を図３に併せて示す。  図３の結果から、アクロモバクター  リティカス M497-1のそれと比較した場合、培養１００時間で約５倍、２５０時間で約４倍の高い活性を示すことがわかる。また、図３の結果より、本発明のキサントモナス 属IB-9374が、アクロモバクター  リティカス M497-1と異なる菌株であることが判明した。
【００２７】
実施例４．
実施例１で単離した菌を培養して得られるXan.Lys-Cを以下の手法により精製した。
（１）培養液１０Ｌを５０〜９０％の硫安分画し、CM-トヨパール処理、DEAE-セルロース処理、AHセファロース 4Bカラムクロマトグラフィー、STIアフィニティークロマトグラフィー、セファデックス G-50カラムクロマトグラフィーの６段階の操作で精製を行った。
操作方法の詳細を以下に示す。尚、精製操作は、全て４℃で行った。
【００２８】
▲１▼培養濾液の硫安分画
１５０時間培養した培養濾液９２１０ｍＬに５０％飽和度（温度４℃）になるように硫安を加えた。次にこれをバッチ式遠心分離（３１,０００ｇ、２０分、４℃）して得られた上清液１０,２９５ｍＬに９０％飽和度となるように硫安を加えた。続いて、上記と同様に遠心分離し、得られた沈殿を適当量の１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.０；以下、緩衝液Ａと呼ぶ）に溶解させた後、緩衝液Ａに対して４℃で７２時間透析した。
【００２９】
▲２▼CM-トヨパール 650M処理
透析して得られた酵素液１１２０ｍＬを緩衝液Ａで平衡化したCM-トヨパール 650M 約５２６.７ｇ（ｗｅｔ）に加えて室温で穏やかに１時間攪拌した。次いで、ガラスフィルター（直径１１.５cm、２５Ｇ−３）で樹脂を除去し、更に、こ のフィルター上の樹脂を緩衝液Ａ（ｐＨ７.０）１０００ｍＬで洗浄し、濾液と 洗浄液とを合わせ、未吸着画分であるXan.Lys-Cを含む酵素液２４００ｍＬを得 た。
【００３０】
▲３▼DEAE-セルロース SH処理
▲２▼で得られた褐色の酵素液２４００ｍＬをダイヤフローセル（膜：ＰＭ−１０）で１２００ｍＬに濃縮後、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０；以下、緩衝液Ｂと呼ぶ）で充分透析した。その後、この酵素液１２５０ｍＬに緩衝液Ｂで平衡化したDEAE-セルロース SH 約４７５ｇ（ｗｅｔ）を加えて、室温で穏やかに攪拌しながら着色タンパク質をはじめとする他の不純タンパク質を吸着させた。１時間後、ガラスフィルター（直径１１.５cm、２６Ｇ−３）で樹脂を除去し、次いで緩衝液Ｂ１０００ｍＬで樹脂を洗浄した。濾液と洗浄液とを合わせたXan.Lys-Cを含む溶液２４００ｍＬをダイヤフローセルにより２３７ｍＬに濃縮し、２ｍＭ トリス塩酸緩衝液（以下、緩衝液Ｃと呼ぶ）に充分透析した。
【００３１】
▲４▼AH セファロース 4B カラムクロマトグラフィー
▲３▼で得られた透析した酵素液２７０ｍＬを緩衝液Ｃで充分平衡化したAH セファロース 4B カラムクロマトグラフィー（４.１×１８cm）に吸着させた。同緩衝液で充分洗浄後、緩衝液Ｃ（ｐＨ８.０）１０００ｍＬと１.０Ｍ NaClを含む緩衝液Ｃ１０００ｍＬを用いて直線濃度勾配で溶出した。その結果、Xan.Lys-Cは完全に吸着され、０.５Ｍ NaClで溶出された。その活性画分を集め、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０；以下、緩衝液Ｄと呼ぶ）に充分透析した酵素液７２０ｍＬをダイヤフローセルにより２８０ｍＬに濃縮した。
【００３２】
▲５▼STI セファロース 4B アフィニティーカラムクロマトグラフィー
▲４▼で得られた酵素液２８０ｍＬを２回に分けてクロマトグラフィーを行った。すなわち、酵素液１４０ｍＬを緩衝液Ｄで平衡化したSTI セファロース 4B アフィニティーカラム（３.２×６.０cm）に吸着させ、同緩衝液５００ｍＬで充分洗浄後、０.５Ｍ NaClを含む５０ｍＭ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ４.５）で溶出させた。活性画分を集め、緩衝液Ｃに充分透析し、ダイヤフローセルにより濃縮する操作を２回行った。
尚、溶出時には分画用試験管に予め１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）０.１ｍＬを入れておいて分画を行った。
【００３３】
▲６▼セファデックス G-50 カラムクロマトグラフィー
▲５▼で得られた濃縮酵素液１０ｍＬを２回に分けて、ゲル濾過を行った。すなわち、濃縮酵素液５ｍＬを０.１Ｍ NaClを含む緩衝液Ｃで平衡化したセファデックス G-50 カラムクロマトグラフィー（２.０×９２cm）にかけ、Xan.Lys-Cの活性画分を集めた。残りの酵素液５ｍＬも同様にゲル濾過を行い、活性画分を集めて１回目の活性画分と合わせ、緩衝液Ｃに充分透析した。この透析した酵素液を、ダイヤフローセルにより濃縮し５ｍＬとして、−１５℃で冷凍保存した。
【００３４】
段階毎の回収率及び比活性等の値を表２に示した。
【００３５】
【表２】
0004085486.tif 000003
【００３６】
最終的な回収率は約６８％となり、比活性は約９３０倍に上昇した。この時点で得られた酵素タンパク質量は、培養液１０Ｌ当たり０.１ｇで、アクロモバクター  リティカス M497-1の培養液から生産されるＡＰＩのタンパク質量と比較すると約７倍量に相当した。
【００３７】
実施例５．キサントモナス属IB-9374が産生するXan.Lys-Cの性質の検討
Xan.Lys-Cについて、アミダーゼ活性、エステラーゼ活性又は／及びプロテイナーゼ活性を指標として、至適ｐＨ、至適温度、安定性、各種化合物の影響、アルカリ金属イオン及びアルカリ土類金属イオンの影響並びにタンパク質変性剤の影響を検討した。また、Xan.Lys-Cのアミノ酸組成及びＮ−末端アミノ酸配列についても検討した。
尚、アミダーゼ活性は、実施例１と同様にして測定した。また、エステラーゼ活性及びプロテイナーゼ活性の測定方法を以下に示す。
【００３８】
▲１▼エステラーゼ活性の測定法
石英セルに８０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１.５ｍＬ、５ｍＭ N-トシル-L-リシンメチルエステル（以下、Tos-Lys-OMeと略記する）０.２ｍＬ、純水１.２ｍＬを加えて３０℃で５分間保った後、酵素液０.１ｍＬを添加して反応させた。酵素添加と同時に５秒間攪拌し、２４７ｎｍでの吸光度変化を記録し、この結果に基づいて酵素活性を測定した。対照試料は、酵素溶液を純水に代えたものを用いた。
尚、酵素活性の単位は、上記の条件下で１分間当たりに１μｍｏｌのＮ−トシル−Ｌ−リシン（分子吸光係数９６０）を遊離する酵素活性を、１単位と定義した。
【００３９】
▲２▼プロテイナーゼ活性の測定法
反応用と対照用の２本の二股消化管の一方の股に酵素溶液０.２ｍＬ、他の股に基質緩衝液（０.８４％カゼインを含む６０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９.０）１ｍＬを分注し、４０℃の恒温水槽中に５分間保った後、反応用二股消化管の両股内の液を良く混合した。そして、混合の時から正確に２０分間４０℃の恒温水槽に保って反応させた後、タンパク質沈殿試薬（０.１１Ｍトリクロロ酢酸と０.２２Ｍ酢酸ナトリウムを含む混合液を酢酸でｐＨ３.０に調整したもの）１ｍＬを加えて良く混合した。そして、再び４０℃の恒温水槽に３０分間保ち、沈殿の生成を完成させた後、濾紙（Advantec Ｎｏ.４Ａ）を用いて自然濾過させた。一方、対照用の二股消化管の液は、混合せずにそのまま同時間保った後、タンパク質沈殿試薬１ｍＬを酵素液に加えてからよく混合して反応用二股消化管と同様に処理した。得られた濾液試料は島津製分光光度計（ＵＶ−２５０型）を用いて、対照試料に対して２７５ｎｍにおける吸光度を測定した。
尚、酵素活性の単位は、上記の条件下（反応温度４０℃、反応ｐＨ９.０、基質濃度０.７％、反応時間２０分間）で１分間当たりにＬ−チロシン１μｍｏｌ相当量の生成物を与える酵素活性を、１単位と定義した。
【００４０】
（１）Xan.Lys-Cの至適ｐＨの検討
Bz-Lys-pNA、Tos-Lys-OMe及びカゼインに対するアミダーゼ活性、エステラーゼ活性及びプロテイナーゼ活性を指標とし、Xan.Lys-Cの至適ｐＨについて検討した。
アミダーゼ活性についての結果を図４に、エステラーゼ活性についての結果を図５に、プロテイナーゼ活性についての結果を図６に夫々示す。尚、図４に於いて、−●−は１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.３−１０.０）を用いたときのアミダーゼ活性を、また、--○--は１００ｍＭ 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール−塩酸緩衝液（ｐＨ７.７−１０.６）を用いたときのアミダーゼ活性を夫々示す。また、図６に於いて、−●−は５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.０〜９.０）を用いたときのプロテイナーゼ活性を、また、--△--は５０ｍＭ ほう酸塩緩衝液（ｐＨ８.０〜１１.５）を用いたときのプロテイナーゼ活性を夫々示す。尚、図５のデータは１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.１〜９.０）を用いて得られたものである。
【００４１】
その結果、アミダーゼ活性及びエステラーゼ活性の至適ｐＨは、それぞれ９.０〜９.６、８.０〜８.５であった。一方、プロテイナーゼ活性のそれは８.５〜１０.５と幅広い曲線が得られた。これらはＡＰＩのアミダーゼ活性（ｐＨ９.０〜９.５）、エステラーゼ活性（ｐＨ７.８〜８.２）及びプロテイナーゼ活性（ｐＨ８.５〜１０.７）の至適ｐＨと同じ傾向を示した。
（２）Xan.Lys-Cの至適温度
Bz-Lys-pNA、Tos-Lys-OMe及びカゼインに対するアミダーゼ活性、エステラーゼ活性及びプロテイナーゼ活性を指標とし、Xan.Lys-Cの至適温度を検討した。結果を図７に示す。尚、図７中の−●−はXan.Lys-Cのアミダーゼ活性を、--◆--はXan.Lys-Cのプロテイナーゼ活性を、--△--はXan.Lys-Cのエステラーゼ活性を夫々示す。
【００４２】
これらの結果から、何れの場合も５０℃で最大活性を示すことが判った。
【００４３】
（３）Xan.Lys-Cの安定性
▲１▼ｐＨ安定性
Bz-Lys-pNAに対するアミダーゼ活性を指標とし、ｐＨを変化させたときのXan.Lys-Cの安定性を検討した。
酵素（１μｇ）を所定ｐＨの各１００ｍＭの酢酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液、ＡＭＰ緩衝液及びリン酸緩衝液の夫々０.１ｍｌに入れ、４℃で２４時間放置後、Bz-Lys-pNAに対する活性の残存率（％）を測定した。
結果を図８に示す。尚、図８に於いて、−●−は１００ｍＭ酢酸緩衝液でのアミダーゼ活性を、−×−は１００ｍＭトリス塩酸緩衝液でのアミダーゼ活性を、−◆−は１００ｍＭ ＡＭＰ緩衝液でのアミダーゼ活性を、また、−◇−は１００ｍＭリン酸緩衝液でのアミダーゼ活性を夫々示す。
【００４４】
この結果から、Xan.Lys-Cの安定領域はｐＨ４.５〜１０.０であることが判る。これはＡＰＩの安定領域（ｐＨ４.０〜１０.７）と比べると少し狭い傾向が認められた。
【００４５】
▲２▼温度安定性
Bz-Lys-pNAに対するアミダーゼ活性を指標とし、温度を変化させたときのXan.Lys-Cの安定性を検討した。
酵素（０.６μｇ）を１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）０.１ｍｌに溶解したものを各種温度（２０〜６０℃）で３０分間放置後、急冷し、Bz-Lys-pNAに対する活性の残存率（％）を測定した。
結果を図９に示す。
【００４６】
この結果から、Xan.Lys-Cは４０℃までは安定であったが、６０℃で完全に失活することが判った。
【００４７】
（４）Xan.Lys-Cに対する各種化合物の影響
Bz-Lys-pNA及びTos-Lys-OMeに対するアミダーゼ活性、エステラーゼ活性を指標とし、Xan.Lys-Cに対する金属キレート試薬、ＳＨ試薬、及び還元剤等の影響を検討した。
即ち、酵素と各種のペプチダーゼ阻害剤を４０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）で、３０分間３０℃で前処理した後、Xan.Lys-Cのアミダーゼ活性及びエステラーゼ活性を測定することにより、その影響を調べた。尚、アミダーゼ活性法を測定する場合にはBz-Lys-pNAが０.０５〜０.１６ｍＭの範囲になるように、エステラーゼ活性を測定する場合にはTos-Lys-OMeが０.０５〜０.５ｍＭの範囲になるようにした。
結果を表３に示す。尚、表３に於いて、ＥＤＴＡはエチレンジアミン−４酢酸（Ethylenediaminetetraacetic acid）の略、２−ＭＥは、２−メルカプトエタノールの略、ＮＥＭはN-エチルマレイミド（N-Ethylmaleimide）の略、ＭＩＡはモノイオド酢酸（Monoiodoacetic acid）の略、ＰＣＭＢはp-クロロメルクリ安息香酸（p-chloromercuribenzoic acid）の略、ＤＦＰはジイソプロピルフルオロリン酸（Diisopropyl fluorophosphate）の略、ＰＭＳＦはフェニルメタンスルホニルフルオリド（Phenylmethansulfonyl fluoride）の略、ＴＬＣＫはNα-トシル-L-リシンクロロメチルケトン（Nα-Tosyl-L-lysyl chloromethyl ketone）の略、ＴＡＣＫはNα-トシル-L-アルギニルクロロメチルケトン（Nα-Tosyl-L-arginyl chloromethyl ketone）の略、ＴＰＣＫはNα-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン（Nα-Tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone）の略を表し、以下同様に略記する。
【００４８】
【表３】
0004085486.tif 000004
【００４９】
表３の結果から、Xan.Lys-Cの活性が金属キレート試薬（ＥＤＴＡ、ｏ-フェナントロリン）、還元剤（システイン、2-ＭＥ）、及びＳＨ試薬（ＮＥＭ，ＭＩＡ，ＰＣＭＢ）によって阻害されないことより、Xan.Lys-Cは、メタルエンドペプチダーゼ及びシステインエンドペプチダーゼの何れでもないとみなされた。一方、ＤＦＰ及びＰＭＳＦがXan.Lys-Cのアミダーゼ活性及びエステラーゼ活性を強く阻害することから、Xan.Lys-Cはセリンエンドペプチダーゼであるとみなされた。更に、Xan.Lys-Cはトリプシンの活性中心にあるＨｉｓ残基に対して特異的に反応するＴＬＣＫによって阻害されたが、キモトリプシンのＨｉｓ残基に特異的であるＴＰＣＫによって阻害されなかったことから、Xan.Lys-Cはトリプシン様セリンエンドペプチダーゼあると認められた。また、トリプシンに対して、ＴＬＣＫよりも強力に阻害するＴＡＣＫによっては殆ど影響が認められなかった。このことはXan.Lys-Cがリシン残基に対して強い親和性を有していることを示唆している。
【００５０】
（５）Xan.Lys-Cに対する金属イオンの影響
Bz-Lys-pNA及びTos-Lys-OMeに対するアミダーゼ活性、エステラーゼ活性を指標とし、Xan.Lys-Cに対する金属イオンの影響を検討した。
即ち、酵素液と所定の金属イオンとを含有する４０ｍＭ トリスイオン酸緩衝液（ｐＨ８.０）を３０分間３０℃で前処理した後、Bz-Lys-pNA及びTos-Lys-OMeに対する残存活性を測定した。結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】
0004085486.tif 000005
【００５２】
Xan.Lys-Cのアミダーゼ活性及びエステラーゼ活性は１ｍＭ Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃｄ2+、Ｎｉ2+、Ｓｒ2+、Ｃｏ2+、０.１ｍＭ Ｈｇ2+によって殆ど影響は受けなかった。しかし、Xan.Lys-Cは１ｍＭ Ｂａ2+によって弱く、１ｍＭ Ｚｎ2+によって強く阻害され、特に後者の金属イオンの場合にはエステラーゼ活性に対して強い阻害が認められた。
【００５３】
（６）Xan.Lys-Cに対するアルカリ金属イオン及びアルカリ土類金属イオンの影響について
Bz-Lys-pNA及びTos-Lys-OMeに対するアミダーゼ活性、エステラーゼ活性を指標とし、Xan.Lys-Cに対するアルカリ金属イオン、Ｂａ2+、及びＮＨ4+の影響を検討した。
即ち、３０℃のセル中に、８０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１.５ｍｌ、各種濃度の金属水溶液１.０ｍＬ、各種濃度のTos-Lys-OMe又はBz-Lys-pNA０.４ｍＬを順次加えた後、酵素溶液０.２５μｇ／０.１ｍＬ（或いは１.０μｇ／０.１ｍＬ）をすばやく加え、３０℃で５分間反応させたものについての活性を調べた。その結果の一例としてＢａ2+のXan.Lys-Cに対する阻害作用のLineweaver-Burkプロットを図１０に示す。
その結果、何れの活性も、Ｂａ2+、ＮＨ4+、Ｃｓ+、Ｒｂ+，Ｋ+、Ｎａ+、Ｌｉ+によってこの順序で拮抗的に阻害されることが明らかとなった。
【００５４】
また、阻害作用が認められた各種イオンの拮抗的阻害定数（Ｋｉ）をＤｉｘｏｎプロットにより算出した結果を、表５に示す。尚、表５にはＡＰＩについての結果も併せて示す。
【００５５】
【表５】
0004085486.tif 000006
【００５６】
その結果、アルカリ金属イオンについては、阻害作用はイオン半径が小さくなるに従って強くなることが判る。しかし、アルカリ土類金属についてはＢａ2+のみに強い阻害が認められ、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｓｒ2+の影響は殆ど認められなかった（表５には未記載）。これらの結果は、ＡＰＩのそれと同じであった。
【００５７】
（７）Xan.Lys-Cに対するタンパク質変性剤の影響
Tos-Lys-OMeに対するエステラーゼ活性を指標とし、Xan.Lys-Cに対する尿素、塩酸グアニジン及びドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略記する）の影響を検討した。
即ち、各種濃度の尿素、塩酸グアニジン又はＳＤＳと、酵素（５μｇ）を含む４０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）０.５ｍｌを３０分間３０℃で前処理した後、その溶液０.１ｍＬ（１μｇ）を、１ｍＭ Tos-Lys-OMeを含む４０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）２.９ｍＬに加え５分間反応させ、エステラーゼ活性の残存率（％）を調べた。
尿素についての結果を図１１に、塩酸グアニジンについての結果を図１２に、ＳＤＳについての結果を図１３に夫々示す。
【００５８】
尚、４Ｍ尿素、０.２Ｍ塩酸グアニジン又は０.１％ＳＤＳを含む４０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）中で酵素を、２０℃で２０分間前処理した場合のエステラーゼ活性の残存率は、それぞれ１００％、５０％、及び８５％と、ＡＰＩと同様の傾向を示した。
【００５９】
（８）Xan.Lys-Cの基質特異性の検討
Xan.Lys-Cの各種合成基質に対する特異性を検討した。
これらの結果を表６に示す。
尚、Kcat/Km値はLineweaver-Burkプロットから算出し、Kcat値は酵素の分子量を２８０００として算出した。
【００６０】
【表６】
0004085486.tif 000007
【００６１】
表６の結果より、エステル基質の中では、Tos-Lys-OMeが本酵素によって最もよく加水分解され、そのKcat/Km値は、対応するTos-Arg-OMeのそれの約５００００倍の高い値を示した。また、Bz-Orn-OMeのKcat/Km値は、Tos-Arg-OMeのそれと比較すると、約１/１２００であり、あまり加水分解されなかった。これらのエステル基質に対するKcat/Km値をＡＰＩについてのそれと比較するとほぼ同じ値を示していた。
また、アニリド基質の中では、Bz-Lys-pNAとAc-Lys-pNAがよく加水分解され、Lys-pNAも若干加水分解された。一方、Bz-Arg-pNAとArg-pNAは、酵素濃度を８０倍以上高くして２４時間反応させてみたが、全く分解されなかった。更に、Suc-Ala-pNA、Boc-His-pNA、Ac-Phe-pNA、Bz-Tyr-pNA、Ac-Leu-pNAも同様に反応させたが、これらも全く加水分解されなかった（表６には未記載）。これらのアニリド基質に対するKcat/Km値もＡＰＩについてのそれとほぼ同じ値を示した。
以上の結果より、本酵素は、合成基質のリシルペプチド結合に対してＡＰＩと同等の加水分解能を有することが判明した。
【００６２】
（９）Xan.Lys-Cのアミノ酸組成
Xan.Lys-Cのアミノ酸組成分析を行った。Xan.Lys-Cのアミノ酸組成はＭｏｏｒｅとＳｔｅｉｎの方法に従って分析した。また、トリプトファン含量はＳｉｍｐｓｏｎの方法（R.J.Simpson,M.R.Neuberger and T.Y.Liu;J.Biol.Chem.,251,1936(1976)）、システイン及びシスチン含量ははHirsの方法（C.H.W.Hins;J.Biol.Chem.,219,611(19656)）による過ギ酸法及びSpencerとWoldの方法（R.L.Spencer and F.Wold;Anal.Biochem.,32,185(1969)）によるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）法によって定量をした。
【００６３】
Xan.Lys-Cの分子量を２７,８４９.５９（Electrospray−ＭＳ法より算出）と してアミノ酸残基数を求めた結果を表７に示す。尚、スレオニン及びセリンは、加水分解を２度行い、４８、７２、９６時間の加水分解物量より０時間に外挿し平均を取ったものを表記した。また、イソロイシンは、加水分解を２度行い、７２時間及び９６時間の平均より求め、システインは、２４時間の平均より求めた。それ以外のものは、加水分解を２度行い、２４、４８、７２、９６時間での平均値より求めた。また、比較として、［］内にＡＰＩのアミノ酸残基数を示す。
【００６４】
【表７】
0004085486.tif 000008
【００６５】
その結果、Xan.Lys-Cのアミノ酸総数は２６５残基と算出された。
また、常法によりＮ−末端アミノ酸の種類を同定した結果、Xan.Lys-CのＮ−末端アミノ酸はグリシンであることが判った。
【００６６】
以上、酵素の性質をまとめると、分子量は２７,８５０、等電点は６.７６、カゼインに対する至適ｐＨは８.５〜１０.５、Bz-Lys-pNAに対する至適ｐＨは９.０〜９.６、Tos-Lys-OMeに対する至適ｐＨは８.０〜８.５であった。また、ｐＨ安定性領域は４.５〜１０.０、至適温度は５０℃、温度安定性は４０℃であり、０.１％ＳＤＳ含有時のタンパク加水分解率は８５％、４Ｍ尿素含有時は１００％、０.２Ｍ塩酸グアニジン含有時は５０％であった。Ｎ−末端アミノ酸はＧｌｙであり、阻害剤は、ＴＬＣＫ、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、Ｚｎ2+、Ｂａ2+、Ｋ+、Ｎａ+、Ｌｉ+であった。
【００６７】
これらの結果より、キサントモナス属IB-9374により産生されるXan.Lys-Cは、トリプシン様セリンエンドペプチダーゼに属し、リシン残基に対して高い親和性を有する酵素であると認められた。
【００６８】
【発明の効果】
上述した如く、本発明は、有用な酵素であるリシン残基特異的酵素を高効率で産生する微生物（菌）並びにこの酵素の取得方法を提供するものであり、本発明を用いればリシン残基特異的酵素を効率よく安価に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で得られた、メチオニン添加・無添加培地中でのキサントモナス属IB-9374及びアクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線を表した図である。
【図２】実施例２で得られた、グルタミン酸添加・無添加培地中でのキサントモナス属IB-9374及びアクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線を表した図である。
【図３】実施例３で得られた、キサントモナス属IB-9374及びアクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線及び培養上清のアミダーゼ活性を示した図である。
【図４】実施例５で得られた、ｐＨを変化させたときのリシン残基特異的酵素のアミダーゼ活性を示した図である。
【図５】実施例５で得られた、ｐＨを変化させたときのリシン残基特異的酵素のプロテイナーゼ活性を示した図である。
【図６】実施例５で得られた、ｐＨを変化させたときのリシン残基特異的酵素のプロテイナーゼ活性を示した図である。
【図７】実施例５で得られた、温度を変化させた時のリシン残基特異的酵素のアミダーゼ活性、エステラーゼ活性及びプロテイナーゼ活性を示した図である。
【図８】実施例５で得られた、リシン残基特異的酵素のｐＨ安定曲線である。
【図９】実施例５で得られた、リシン残基特異的酵素の温度安定曲線である。
【図１０】実施例５で得られた、リシン残基特異的酵素に対するＢａ2+の阻害作用のLineweaver-Burkプロットを示した図である。
【図１１】実施例５で得られた、リシン残基特異的酵素の尿素に対する安定性を示した図である。
【図１２】実施例５で得られた、リシン残基特異的酵素の塩酸グアニジンに対する安定性を示した図である。
【図１３】実施例５で得られた、リシン残基特異的酵素のドデシル硫酸ナトリウムによる安定性を示した図である。
【符号の説明】
図１に於いて、−○−は、メチオニンを培地に加えたときの、また、--○--はメチオニンを培地に加えないときのキサントモナス属IB-9374の生育曲線を夫々示す。また、−◆−は、メチオニンを培地に加えたときの、また、--◆--はメチオニンを培地に加えないときの、アクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線を夫々示す。
図２に於いて、−○−は、グルタミン酸を培地に加えたときの、また、--○--はグルタミン酸を培地に加えないときのキサントモナス属IB-9374の生育曲線を夫々示す。また、−◆−は、グルタミン酸を培地に加えたときの、また、--◆--はグルタミン酸を培地に加えないときのアクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線を夫々示す。
図３に於いて、−○−は、キサントモナス属IB-9374の生育曲線を示し、また、--◇--は、同培地でのキサントモナス属IB-9374培養上清のアミダーゼ活性を夫々示す。また、−□−は、アクロモバクター  リティカス M497-1の生育曲線を、また、--×--は、アクロモバクター  リティカス M497-1培養上清のアミダーゼ活性を夫々示す。
図４に於いて、−●−は１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.３−１０.０）を用いたときのアミダーゼ活性を、また、--○--は１００ｍＭ 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール−塩酸緩衝液（ｐＨ７.７−１０.６）を用いたときのアミダーゼ活性を夫々示す。
図６に於いて、−●−は５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.０〜９.０）を用いたときのプロテイナーゼ活性を、また、--△--は５０ｍＭ ほう酸塩緩衝液（ｐＨ８.０〜１１.５）を用いたときのプロテイナーゼ活性を夫々示す。
図７に於いて、−●−はリシン残基特異的酵素のアミダーゼ活性を、--◆--はリシン残基特異的酵素のプロテイナーゼ活性を、また、--△--はリシン残基特異的酵素のエステラーゼ活性を夫々示す。
図８に於いて、−●−は１００ｍＭ酢酸緩衝液でのアミダーゼ活性を、−×−は１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液でのアミダーゼ活性を、−◆−は１００ｍＭ ＡＭＰ緩衝液でのアミダーゼ活性を、また、−◇−は１００ｍＭリン酸緩衝液でのアミダーゼ活性を夫々示す。
【図１】
0004085486.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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