(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換体選択のためのマーカー遺伝子と、マーカー遺伝子に作動可能に連結された配列番号１のＸ〜１９２番のＤＮＡ配列（ここで、Ｘは１〜１１１の整数を表す）からなる短縮化プロモーター配列と、ＵＲＡ３遺伝子配列およびＬ４１遺伝子配列並びにこれらの一部のＤＮＡ配列からなる群から選択されるキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）とを含むベクターであって、前記相同ＤＮＡ配列内または相同ＤＮＡ配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、ベクター。
【請求項２】
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子を更に含んでなる、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
マーカー遺伝子と、短縮化プロモーター配列と、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子とを含んだＤＮＡ配列が、その両端において相同ＤＮＡ配列に挟まれている、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
短縮化プロモーター配列が、配列番号１、２、および３からなる群から選択される、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
相同ＤＮＡ配列が、ＵＲＡ３遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列である、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
相同ＤＮＡ配列が、Ｌ４１遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列である、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
マーカー遺伝子が薬剤耐性マーカー遺伝子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
薬剤耐性マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子である、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子がシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１改変遺伝子である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子である、請求項７に記載のベクター。
【請求項１１】
抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子が、バクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子である、請求項７に記載のベクター。
【請求項１３】
抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子が、大腸菌プラスミド由来のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
異種遺伝子が、一本鎖モネリン、グリコシル化阻害タンパク質（ＧＩＦ）、血清アルブミン、α-またはβ-グロブリン、ファクターVIII、ファクターIX、フィブロネクチン、α-１−アンチトリプシン、インターロイキン、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インシュリン、ワクチン生産のためのウイルス由来抗原ポリペプチド、免疫抑制活性を有するタンパク質、キモシン、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、およびペクチナーゼからなる群から選択されるタンパク質またはペプチドの遺伝子である、請求項２〜１３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１５】
異種遺伝子が一本鎖モネリン遺伝子である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
一本鎖モネリン遺伝子が配列番号４のアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
異種遺伝子がグリコシル化阻害タンパク質（ＧＩＦ）遺伝子である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１８】
異種遺伝子がアミラーゼ遺伝子である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１９】
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子が、キャンディダ・ユティリスにおいて発現するように改変された遺伝子である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２０】
異種遺伝子が、キャンディダ・ユティリスにおいて発現するように改変されたアミラーゼ遺伝子である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２１】
改変されたアミラーゼ遺伝子が、配列番号１３のＤＮＡ配列からなる、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子の発現のためのプロモーター配列を更に含む、請求項２〜２１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２３】
ターミネーター配列を更に含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子の発現のためのプロモーター配列および／またはターミネーター配列が、キャンディダ・ユティリス由来である、請求項２２または２３に記載のベクター。
【請求項２５】
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子の発現のためのプロモーター配列および／またはターミネーター配列が、キャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子由来である、請求項２２または２３に記載のベクター。
【請求項２６】
請求項１または２４に記載のベクターでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、そして薬剤耐性となった形質転換体を選択することを含む、キャンディダ・ユティリスの形質転換方法。
【請求項２７】
ベクターＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティリスの染色体に導入され、かつ安定して保持される、請求項２６に記載の形質転換方法。
【請求項２８】
相同配列が、キャンディダ・ユティリスの染色体に導入され、かつ安定して保持される、請求項２６または２７に記載の形質転換方法。
【請求項２９】
相同配列と、その両端を相同配列に挟まれたＤＮＡ配列とが、キャンディダ・ユティリスの染色体に導入され、かつ安定して保持される、請求項２６に記載の形質転換方法。
【請求項３０】
ベクターのマーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性型改変Ｌ４１遺伝子であるベクターを用いる、請求項２６に記載の形質転換方法。
【請求項３１】
キャンディダ・ユティリスがＡＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９９５０からなる群から選択される、請求項２６に記載の形質転換方法。
【請求項３２】
請求項１または２４に記載のベクターで形質転換された、キャンディダ・ユティリス形質転換体。
【請求項３３】
キャンディダ・ユティリスがＡＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９９５０からなる群から選択される、請求項３２に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【請求項３４】
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子によりコードされるタンパク質の製造法であって、請求項３２に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体を培養し、そして該培養物から遺伝子の発現産物を単離、精製することを含む、方法。
【請求項３５】
一本鎖モネリンの製造法である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アミラーゼの製造法である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
菌体抽出タンパク質を加熱処理して宿主由来の夾雑タンパク質を変性沈殿する工程を含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
加熱処理が５０〜７０℃において行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
菌体抽出タンパク質を酸処理して宿主由来の夾雑タンパク質を変性沈殿する工程を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
酸処理がｐＨ４〜５において行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号１のＸ〜１９２番のＤＮＡ配列（ここで、Ｘは１〜１１１の整数を表す）からなるＤＮＡ。
【請求項４２】
配列番号１のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ。
【請求項４３】
配列番号２のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ。
【請求項４４】
配列番号３のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、酵母、特にキャンディダ・ユティリス、の染色体上に多コピーで組込まれ、非選択的培養条件下でも安定に保持されるベクターに関する。本発明は、また、そのベクターを用いた異種遺伝子の発現、特に一本鎖モネリンおよびアミラーゼの高発現、に関し、更には一本鎖モネリンを発現する組換え酵母菌体から一本鎖モネリンを分離精製する方法に関する。
背景技術
組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子産物を大量に生産するためには、適切な宿主生物の選択が重要であることはもとより、遺伝子の転写量を増やすこと、翻訳効率を高めること、生成したタンパク質の安定性を高めることなど、遺伝子の発現における様々なステップにおいて工夫すべきポイントがある。このうち、遺伝子の転写量を増やして遺伝子産物の高生産を行うためには、強力な転写プロモーターを用いることが必要不可欠であると同時に、転写プロモーター／ターミネーター配列と発現させる遺伝子からなる遺伝子発現ユニットのコピー数を増加させることにより、総和としての転写量を増やすことも重要である。また、それと同時に菌体内に遺伝子発現ユニットを安定に保持することは工業的スケールで物質生産を行うために非常に重要であり、この点でプラスミド型のベクターは不利であり、安定化は一般にベクターを染色体上に組み込むことによってなされる。
近年、プロモーター領域を短縮化して発現量が低下した遺伝子を形質転換用マーカーとしたベクターをribosomal ＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）領域に組み込むことにより、ベクターを染色体に数１０コピー組み込むことが可能であることがキャンディダ・ユティリス以外のいくつかの酵母種において報告されている（Lopes T.S. et al., Gene 79 199-206（1989）、Bergkamp R. J. M. et al., Curr. Genet. 21 365-370（1992）、Le Dall M. T. et al., Curr Genet. 26 38-44（1994））。
しかし、染色体への多コピー組み込みを得るためにはベクターをribosomal ＲＮＡ遺伝子領域に組込むことが必須であり、その他の遺伝子座に組み込んだ場合にはベクターのコピー数が高くならないことが示されている（Lopes T.S. et al., Gene 105 83-90（1991））。しかも、組み込まれたベクターは染色体上でタンデムに存在するため、それらの繰り返し配列間での組換えにより、導入した遺伝子の脱落が生じることも報告されている（Lopes T.S. et al.,Yeast 12 467-477（1996））。特に、菌体を非選択条件下で培養する場合や菌体の増殖速度が低い場合（例えば、発現産物が菌体内に大量に存在する場合）には、たとえ低頻度であっても染色体上に組み込まれたベクターが組換えによって脱落すれば、培養を続けることによって、ベクターが脱落した菌体の割合が高くなる。従って、組換え体酵母を非選択培養条件下で培養（特に大量培養）する場合には、組み込まれたベクターの安定保持が非常に重要となる。染色体に組み込むベクターＤＮＡの長さを短くすることによって、染色体上に組み込まれた発現ユニットが安定化することが報告されている（Lopes T.S. et al., Yeast 12 467-477（1996））。
ところで、キシロースを始めとするペントースに対する優れた資化性を示すとともに、ＦＤＡ（Food and Drug Administration）により、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・フラジリスとともに、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）が、食品添加物として安全に使用できる酵母として認められている。最近、キャンディダ・ユティリスにおいて相同組み換えによる形質転換系が開発され、異種タンパク質生産について報告されている（ＷＯ／９５／３２２８９号）。しかし、染色体上における多コピー導入および発現ユニットの安定化に関しては更なる改善の余地を残すものであった。
タンパク性甘味物質は、低カロリーで安全性が高いタンパク性甘味剤として、食品添加物、あるいは甘味料として食品、医薬品など、さらには動物飼料としても広く用いられることが期待される。タンパク性甘味物質としてはモネリンやタウマチンが知られている。
このうちタウマチンは食物の嗜好性を増加する能力（すなわち、他の風味を高めたり向上する能力）を有するタンパク質であり、植物Thaumatoccocus daniellii Benthの実の仮種皮から抽出されている。しかし、抽出に附する果実を得るのが極めて困難であることから、市販されてはいるものの植物由来のタウマチンの工業的用途は極めて限られている。また、現在まで多くの微生物宿主において、その生産が試みられてきているが、発現は極めて困難であって生産されたタンパク質も甘味を失っていることが報告されている（Zemanek E. C.and Wasserman B. P. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 35 455-466（1995））。
一方、モネリンは熱帯植物Dioscoreophyllum cumminsiiの実に存在する、重量比で砂糖の２０００倍以上の甘味を有するタンパク質であり、そのアミノ酸配列も公知である。このタンパク質は非等価な二つのサブユニット（Ａ，Ｂ）から構成されており、その三次元構造も明らかにされている（Hudson G. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 71, 212-220（1976）、Ogata C. et al., Nature 328, 739-742（1987）、van der Wel H. FEBS Letters 21, 88-90（1972）、Morris J.A. et al., Biochim. Biophys. Acta. 261, 114-122（1972）、Bohak Z. et. al., Biochim. Biophys. Acta. 427, 153-170（1976）、Frank G. Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 357, 585-592（1976））。天然モネリンの甘味活性は、酸性pHにおいて熱により容易に失活してしまうが、これを解決するために２本鎖からなるモネリンのサブユニットＡのＮ末端とサブユニットＢのＣ末端を連結して一本のポリペプチド鎖とすることにより、甘味を保持し、かつ耐熱性が向上したタンパク質を作製する試みがされている（特公平２−５０４０２８号公報、特開平５−７０４９４号公報、Kim S-H. et al., Protein Engineering, 2 571-575（1989））。この優れた性質を持つ一本鎖化モネリンは、低カロリーで安定性が高いタンパク性甘味剤として、一般の甘味料の代替品として食品添加物、あるいは甘味料として食品に用いられることが期待されている。
しかし、モネリンの微生物における大量生産は本発明者らが知る限り報告されていない。
発明の概要
キャンディダ・ユティリスにおいてシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子をマーカー遺伝子として用いた場合、相同組み換えによる宿主へのベクターの組み込み数（コピー数）は従来３〜１０個程度（最大で２０個程度）であるとされている。今般、本発明者らは、マーカー遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを短縮化することによってコピー数が２０〜９０個まで上昇することを見いだした。
また、キャンディダ・ユティリス以外の酵母におけるコピー数の増加は、組み込みの標的をｒＤＮＡ配列とした場合にのみ生ずるとされている。また、組み込みの標的をｒＤＮＡ配列とした場合であっても発現ユニットの脱落が避けられない。本発明者らは、マーカー遺伝子に連結されたプロモーターを短縮することに加えて、染色体ＤＮＡと相同な配列がｒＤＮＡ配列以外の遺伝子座を標的とすることによって、コピー数の更なる増加（標的がｒＤＮＡ配列である場合を上回る増加）のみならず染色体上の発現ユニットの安定化が図られることを見い出した。
本発明者らは、また、上記ベクターを用いることにより、タンパク質（特に、一本鎖モネリンやアミラーゼ）の大量発現が可能であること、そして一本鎖モネリン生産菌体から得られた抽出液を加熱処理および／または酸処理することによって、酵母由来の夾雑タンパク質の大部分が不溶性化し沈殿するが一本鎖モネリンは溶液中に残ることを見出した。
本発明者らは、更に、好熱菌スルホロバス・ソルファタリカス由来のアミラーゼ遺伝子のキャンディダ・ユティリスでの発現において、この遺伝子のコドン使用頻度がキャンディダ・ユティリスで最も良く発現されているタンパク質の一つであるグリセルアルデヒド-３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）の構造遺伝子と大幅に異なること、アミラーゼ遺伝子の配列を改変することによってアミラーゼの発現量が大幅に増大すること等を見いだした。本発明はこれらの知見に基づくものである。
従って、本発明は、酵母染色体上に多コピーで組み込まれるベクターの提供をその目的とする。本発明は、また、酵母染色体上に多コピーで組み込まれ、かつ染色体上の発現ユニットの安定性が改善されたベクターの提供をその目的とする。
本発明は、上記ベクターによる形質転換方法、上記ベクターにより形質転換された宿主、該宿主を培養することによるタンパク質の製造法、および一本鎖モネリンの精製法の提供をその目的とする。
本発明は、更に、ベクターの染色体への組み込み数および安定性を改善する短縮化プロモーター、並びにキャンディダ・ユティリスで高発現するように改変されたアミラーゼ遺伝子の提供をその目的とする。
本発明によるベクターは、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子と、マーカー遺伝子に作動可能に連結された短縮化プロモーター配列と、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）と、場合により異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子とを含むベクターであって、前記相同ＤＮＡ配列内または相同ＤＮＡ配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、である。
本発明によるベクターは、また、シクロヘキシミド耐性を与える遺伝子と、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列およびターミネーター配列とを含むベクターであって、
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によりプロモーターおよびターミネーターとを含むＤＮＡ配列が、その両端においてシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子に挟まれてなり、
シクロヘキシミド耐性を有する遺伝子配列内または該遺伝子配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、である。
【図面の簡単な説明】
図１は、リボソームＤＮＡを含むプラスミドの制限酵素地図である。
図２は、リボソームＤＮＡの構造と、ＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーおよびサブクローニングされたプラスミドの構造を表す図であって、図２（ａ）はプラスミドｐＣＲＥ１、ｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐＣＲＸ２、ｐＣＲＸ３、およびｐＣＲＸ４プラスミドの構造を表し、図２（ｂ）はキャンディダ・ユティリスのリボソームＤＮＡを含んだ約１３．５ｋｂのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図である。
図３は、ＵＲＡ３遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、それらプラスミドのサッカロマイセス・セレビシエｕｒａ３−変異の相補能を表す図である。
図４は、ＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーと、制限酵素地図である。
図５は、ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
図６は、ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である。
図７は、ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列であって、図６の続きの配列を表す図である。
図８は、Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、ＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーを示す図である。
図９は、Ｌ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
図１０は、Ｌ４１遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である。
図１１は、プラスミドｐＣＬＢＳ１０、およびｐＣＬＢＳ１２の構築の説明図である。
図１２は、プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＥ３、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２の構築を表す図である。
図１３は、ａ：プラスミドｐＣＬＲＥ２の構造を示す図である。
ｂ：プラスミドｐＣＬＲＥ１１、ｐＣＬＲＥ１５、ｐＣＬＲＥ１６、ｐＣＬＲＥ１７、ｐＣＬＲＥ１８、ｐＣＬＲＥ１９のシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子プロモーターの５’側末端の位置を示す図である。
図１４は、プラスミドｐＣＬＲＥ１１、ｐＣＬＲＥ１５、ｐＣＬＲＥ１６、ｐＣＬＲＥ１７による形質転換体のサザン解析の結果（電気泳動写真）と、組み込まれたベクターのコピー数を表す図である。
図１５は、プラスミドｐＣＬＲ２１５、ｐＣＬＲ２１６、ｐＣＬＲ２１７の構築を表す図である。
図１６は、プラスミドｐＣＲＡＬ１０、ｐＣＲＡＬ１１の構築を表す図である。
図１７は、プラスミドｐＵＲＡＬ１０、ｐＵＲＡＬ１１の構築を表す図である。
図１８は、プラスミドｐＣＬ１２の構築を表す図である。
図１９は、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
図２０は、プラスミドｐＣＬＲＭ２１５、ｐＣＬＲＭ２１６、ｐＣＬＲＭ２１７、ｐＲＭ１０、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１０、ｐＵＭ１１の構築を表す図である。
図２１は、（１）プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１によるキャンディダ・ユティリス形質転換体の可溶性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表す電気泳動写真である。
（２）プラスミドｐＣＴＭＮＹ１によるサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体の可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を表す電気泳動写真である。
図２２は、プラスミドｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１によるキャンディダ・ユティリス形質転換体を５０世代培養した後、それらの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表す電気泳動写真である。
図２３は、プラスミドｐＵＭ１１によるキャンディダ・ユティリス形質転換体から調製した可溶性タンパク質を熱処理および酸処理したサンプル、またはさらにカラムで精製したサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表す電気泳動写真である。
図２４は、改変アミラーゼ遺伝子のセグメントＡ−１およびＡ−２の合成に用いたプライマーを示す図である。
図２５は、改変アミラーゼ遺伝子のセグメントＡ−３およびＡ−４の合成に用いたプライマーを示す図である。
図２６は、改変アミラーゼ遺伝子のセグメントＡ−５〜Ａ−７の合成に用いたプライマーを示す図である。
図２７は、プラスミドｐＣＲＡＬ１１ＵＡ、ｐＵＲＡＬ１１ＵＡ、およびｐＣＬ１２ＵＡの構築を示す図である。
図２８は、プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＵＲＡＬ１１ＵＡによって形質転換されたキャンディダ・ユティリス形質転換体の可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す電気泳動写真である。＋は熱処理をしたサンプル、−は非熱処理サンプルを示す。
図２９は、プラスミドｐＲＡＬＧＩＦ２の構築を表わす図である。
発明の具体的説明
短縮化プロモーター
本発明において、「短縮化プロモーター」とは、その５’側において末端が切り取られたプロモーターであって、発現ベクター中においてマーカー遺伝子のプロモーター配列として存在した場合に、マーカー遺伝子の発現量を低下させることによりベクターの形質転換頻度を減少させ、かつ宿主中のベクターのコピー数を増加させるプロモーターをいう。
後記実施例によれば、その５’側を削り取ることによって短縮化したプロモーター配列により発現するマーカー遺伝子を有するベクターは、通常の長さのプロモーターにより発現するマーカー遺伝子を連結したベクターと比較して、マーカー遺伝子の発現量を低下させることによりベクターの形質転換頻度をより減少させるが、形質転換された宿主においてより高コピー数で存在するという特徴を有する。
本発明において、短縮化プロモーターは、キャンディダ・ユティリスにおいて使用可能なマーカー遺伝子に作動可能に連結させうるものから選択できる。
選択されうるプロモーターとしては、例えば、キャンディダ・ユティリスのＬ４１遺伝子、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子、または原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
プロモーターがＬ４１遺伝子由来である場合には、その短縮化プロモーター配列は、配列番号１のＸ〜１９２番のＤＮＡ配列を含む。ここで、Ｘは１〜１１１のいずれかの整数を表す。配列番号２および３のＤＮＡ配列は、配列番号１のＤＮＡ配列の５′末端配列を削り取ることにより得られたＤＮＡ配列である。
Ｌ４１遺伝子由来の短縮化プロモーター配列は、新規なＤＮＡ配列である。従って、本発明の別の面によれば、配列番号１のＸ〜１９２番のＤＮＡ配列（ここで、Ｘは１〜１１１の整数を表す）並びに配列番号２のＤＮＡ配列および配列番号３のＤＮＡ配列が提供される。これらの配列は、染色体組み込みベクターの選択マーカー遺伝子のプロモーター配列として有用である。
本発明において、短縮化プロモーターはマーカー遺伝子に作動可能に連結される。場合によってはマーカー遺伝子の下流側にターミネーター配列を連結してもよい。
相同ＤＮＡ配列
本発明によるベクターは、宿主染色体への相同組み換えのための相同ＤＮＡ配列を有する。
本発明において、相同ＤＮＡ配列としては、ｒＤＮＡ配列（ribosomal ＤＮＡ配列）、ＵＲＡ３遺伝子配列、Ｌ４１遺伝子配列、ＰＧＫ遺伝子配列、ＧＡＰ遺伝子配列、およびＰＭＡ遺伝子配列並びにこれらのこれらの一部のＤＮＡ配列が挙げられ、キャンディダ・ユティリスの染色体由来であることが好ましい。上記以外のキャンディダ・ユティリスの遺伝子も同様に用いることができる。用いる配列に依存して染色体上の任意の位置に異種遺伝子を組み込むことが可能である。なお、ｒＤＮＡ配列とは、一連のｒＲＮＡ遺伝子を含む意味で用いられる。
本発明においては、ｒＤＮＡ配列以外のキャンディダ・ユティリスの遺伝子配列を、相同ＤＮＡ配列として用いることが好ましい。ｒＤＮＡ配列以外の遺伝子配列を用いた場合、ベクターのコピー数が増加するのみならず、染色体上における安定性が著しく向上するため有利である。具体的には、キャンディダ・ユティリス由来のＵＲＡ３遺伝子配列、Ｌ４１遺伝子配列、ＰＧＫ遺伝子配列、ＧＡＰ遺伝子配列、およびＰＭＡ遺伝子配列並びにこれらのこれらの一部のＤＮＡ配列が挙げられ、ｒＤＮＡ配列以外のキャンディダ・ユティリスの遺伝子も同様に用いることができる。
このベクターは、例えば、ベクター内の相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトでの分解によりベクター（プラスミドＤＮＡ）を直鎖状として使用される。その結果、プラスミドＤＮＡ断片はキャンディダ・ユティリス染色体に相同組換えにより組み込まれる。
本発明の好ましい態様によれば、このベクター中で、マーカー遺伝子および異種遺伝子を含むＤＮＡ配列は、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなる。この態様では、このベクターＤＮＡを相同ＤＮＡ配列の両端において制限酵素切断し、相同ＤＮＡ配列をその両端に有するマーカー遺伝子および異種遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る。こうして得たＤＮＡ断片も、また、相同組換えによりキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡに相同組換えにより組み込まれ得るものである。このように相同配列の両端に相当する制限酵素サイトでの分解によってベクターを直鎖状として同様に使用する場合には、プラスミド由来のＤＮＡが染色体に組み込まれない（すなわち、細菌由来の未知の遺伝子産物を生産する可能性がなくなる）ため、安全面から有利である。
なお、本明細書において、「ＤＮＡ断片（または配列）が、キャンディダ・ユティリス染色体に相同組換えにより組み込まれる」とは、ＤＮＡ断片がキャンディダ・ユティリス染色体に組み込まれる限りにおいて、その組み込みの態様は限定されないが、少なくとも次の二つの態様を含む意味に用いることとする。
すなわち、（１）キャンディダ・ユティリス染色体のＤＮＡ配列と、ＤＮＡ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列部分とが相同組換えを生じ、開裂部分にＤＮＡ断片が”挿入”されて染色体ＤＮＡに組み込まれる態様、および（２）キャンディダ・ユティリス染色体のＤＮＡ配列と、ＤＮＡ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列との相同組換えによって、ベクターＤＮＡ断片がキャンディダ・ユティリス染色体の一部と”置換”されて染色体ＤＮＡに組み込まれる態様のいずれかを少なくとも意味するものとする。（２）の態様においては、挿入されたＤＮＡ断片の前後に、ターゲット配列の反復配列が形成されないため、組み込まれたＤＮＡ断片が更に安定に染色体に存在することが期待される。
マーカー遺伝子
本発明においてマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であることができる。薬剤耐性遺伝子としては、シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子（例えば、シクロヘキシミド耐性型改変Ｌ４１遺伝子）、抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子（例えば、バクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子）、抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子（例えば、大腸菌プラスミド由来のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子）等のようなキャンディダ・ユティリス形質転換株を選択することができる薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
Ｌ４１遺伝子は、シクロヘキシミド感受性であるリボソームタンパク質Ｌ４１をコードする。シクロヘキシミド耐性型改変Ｌ４１は、Ｌ４１のアミノ酸配列の５６番目のＰｒｏがＧｌｎに置換されたものである。この置換によりＬ４１シクロヘキシミド耐性が付与される（ＷＯ／９５／３２２８９号）。
さらに、形質転換体の選択マーカーとして利用可能な細菌由来の薬剤耐性遺伝子としては、前記したＧ４１８耐性遺伝子およびハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子のほかに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（クロラムフェニコール耐性）（Hadfield, C. et.al. Gene, 45,149-158（1986））、ブラストサイジンデアミナーゼ（ブラストサイジン耐性）（Izumi, M. et. al. Exp. Cell Res., 197, 229-233（1991））、フレオマイシン耐性遺伝子（Wenzel, T.J.et. al. Yeast, 8, 667-668（1992））などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。この他に、デハイドロフォレートレダクターゼ遺伝子（メトトレキセート耐性）（Miyajima, A. et. al. Mol. Cell Biol. 4, 407-414（1984））や、酵母由来の優性遺伝子スルホメツロンメチル耐性遺伝子（Casey, G.P. et. al. J. Inst. Brew.94, 93-97（1988））、ＣＵＰ１遺伝子（銅耐性）（Henderson,R.C.A. et. al. Current Genet. 9, 133-138（1985））、ＣＹＨ２遺伝子（シクロヘキシミド耐性）（Delgado, M. et. al. EBC congress, 23, 281-288（1991））など、公知の薬剤耐性遺伝子も利用できる。
異種遺伝子およびキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子
本発明の一の態様においては、本発明によるベクターに異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子（以下、「構造遺伝子」ということがある）を連結して、この遺伝子等を保持したベクターとすることができる。このベクターによってキャンディダ・ユティリスを形質転換すると、それらの構造遺伝子をキャンディダ・ユティリス染色体に安定に組み込むことが可能である。こうして得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、該培養物から構造遺伝子の発現産物を、その発現産物に適した方法で単離、精製することによって、構造遺伝子がコードするタンパク質をキャンディダ・ユティリスで製造することができる。すなわち、キャンディダ・ユティリスにおける構造遺伝子の発現法が提供される。ここで、異種遺伝子とは通常は宿主のキャンディダ・ユティリス染色体上に本来存在しない遺伝子またはその一部のＤＮＡを意味する。
構造遺伝子は、好ましくは、その遺伝子の発現を独立して制御する調節領域と組み合わせるか、または、形質転換の過程で破壊された遺伝子自身の調節領域の影響下にその遺伝子を発現させる。そのような配列はキャンディダ・ユティリスで機能する必要があり、その好ましい具体例としては後記する本発明によるＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、およびＰＭＡ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列が挙げられる。
後記する実施例から明らかなように、本発明により、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列を用いて、一本鎖モネリン遺伝子、ＧＩＦ遺伝子、およびアミラーゼ遺伝子のような異種遺伝子の発現に成功した。
また、さらにホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列、グリセロアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列、ならびに原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列を用いて、構造遺伝子（例えば、アルブミン、α-またはβグロブリン、ファクターVIII、ファクターIX、フィブロネクチン、α-１−アンチトリプシン、インターロイキン、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インシュリン、ワクチン生産のためのウイルス由来抗原ポリペプチド、免疫抑制活性を有するタンパク質（例えば、グリコシル化阻害タンパク質（ＧＩＦ））、キモシン、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、およびペクチナーゼ）の発現が行えることは当業者に自明であろう。また、キャンディダ・ユティリスで構造遺伝子を発現することによってキャンディダ・ユティリスの性質を改変できることも当業者に自明であろう。
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子は、キャンディダ・ユティリスで高発現するように改変することもできる。キャンディダ・ユティリスで高発現するような改変は、キャンディダ・ユティリスで最もよく使用されるコドンに合わせて遺伝子配列を最適化することによって行うことができる。例えば、キャンディダ・ユティリスで高発現する遺伝子で用いられるコドンに従って最適化を行うことができる。
改変される遺伝子は、そのコードするアミノ酸の配列を全く変化させることなく、それぞれのアミノ酸をコードするコドンの種類だけを変化させるように合成する。より具体的にはそれぞれの遺伝子に含まれるメチオニン、およびトリプトファンを除いた１８アミノ酸について、それらをコードするコドンがキャンディダ・ユティリス由来のグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（ＧＡＰ）など発現量の高い遺伝子において高頻度で使用されるコドンを使って合成する。この際、構造遺伝子を数個のセグメントに分割して合成できるように、適切な制限酵素認識部位が構造遺伝子中に約２５０〜３００bpおきに生じるように設計を行なうことが望ましい。
合成遺伝子の作製は、例えば下記のようにして行うことができる。
構造遺伝子を数個のセグメントに分割して合成した後、制限酵素切断部位を利用したライゲーションが可能なように、適切な制限酵素部位が構造遺伝子の中に約１８０−３２０ｂｐおきに生じるように塩基配列の設計を行う。設計した遺伝子の塩基配列に従って、２対の５０〜１００塩基程度の１本鎖オリゴヌクレオチドを常法で合成し、これを鋳型とするＰＣＲ法を行い、２本鎖のセグメントを合成する。より具体的には、１８０ｂｐの２本鎖ＤＮＡを合成する場合、２本の１００塩基のオリゴヌクレオチドをそれぞれの３’末端側で約２０ｂｐの相補鎖を形成するように合成し、これらのオリゴヌクレオチドを鋳型として標準的な条件によりＰＣＲ反応を行なうことにより目的の２本鎖ＤＮＡが得られる。また、約３４０ｂｐの２本鎖ＤＮＡを合成する場合、上述のようにして得られた２本鎖ＤＮＡとそれぞれ３’末端側で約２０ｂｐの相補鎖を形成するように合成した１００塩基の２本のオリゴヌクレオチドを用いて２回目のＰＣＲ反応を行ない、目的とする２本鎖ＤＮＡを得る。なお、この最終的に合成された２本鎖ＤＮＡの両末端には、特異的な制限酵素部位が存在するように設計しており、さらに制限酵素の消化が容易なように両末端の制限酵素認識部位の外側に２ヌクレオチド程度余分な配列を付加しておくことが好ましい。
改変された異種遺伝子としては、配列番号１３のアミラーゼ遺伝子が挙げられる。配列番号１３のＤＮＡ配列は新規な配列である。従って、本発明の他の面によれば、配列番号１３のＤＮＡ配列からなるアミラーゼ遺伝子が提供される。このアミラーゼ遺伝子はキャンディダ・ユティリスのような酵母において高発現させることができる（後記実施例参照）。
さらに、本発明によるベクターは、キャンディダ・ユティリス以外の細胞の形質転換に利用することも可能である。キャンディダ・ユティリス以外の細胞を宿主とする場合、形質転換の実施に際して適当なＤＮＡ断片を選択するのが好ましい。そのようなＤＮＡ断片としては、大腸菌の場合、例えばpBluescriptやｐＵＣ１９のような細菌のプラスミドＤＮＡが挙げられる。また、サッカロマイセス属酵母の場合、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０（Methods in Enzymology, 194, p195-230, Academic Press（1991））などの酵母−大腸菌シャトルベクターが挙げられる。
本発明によるベクターの好ましい例としては、
シクロヘキシミド耐性を与えるマーカー遺伝子と、マーカー遺伝子に作動可能に連結された配列番号１のＸ〜１９２番（ここでＸは１〜１１１の整数を表す）のＤＮＡ配列からなる短縮化プロモーターと、ｒＤＮＡ配列以外のキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）と、異種遺伝子（例えば、キャンディダ・ユティリスにおいて高発現するように改変されていてもよい一本鎖モネリン遺伝子、アミラーゼ遺伝子、およびグリコシル化阻害タンパク質遺伝子）またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合により異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子に作動可能に連結されたキャンディダ・ユティリス由来のプロモーター配列およびターミネーター配列とを含むベクターであって、
相同ＤＮＡ配列内または相同ＤＮＡ配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるベクターが挙げられる。
更に好ましくは、マーカー遺伝子と、短縮化プロモーターと、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によりプロモーターおよびターミネーターとを含むＤＮＡ配列が、その両端においてＵＲＡ３遺伝子に挟まれて存在することができる。
相同ＤＮＡ配列は、好ましくは、ＵＲＡ３遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列であることができる。
本発明のもう一つの面によれば、
シクロヘキシミド耐性を与える遺伝子と、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合により異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列およびターミネーター配列とを含むベクターであって、
シクロヘキシミド耐性を有する遺伝子配列内または該遺伝子配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるベクターが提供される。
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によってはプロモーターおよびターミネーターとを含むＤＮＡ配列は、その両端においてシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子の５’末端部分および３’末端部分に挟まれて存在する。このようなベクターがキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡにタンデムで組み込まれた場合、５’末端部分および３’末端部分に分断されていたシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子はその染色体上において一続きとなる。結果としてその形質転換体はシクロヘキシミド耐性を獲得し、形質転換体を選択培地において選抜することができる。上記ベクターのシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子は、染色体への組み込みのための「相同ＤＮＡ配列」として働くだけでなく、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子としても働く。
なお、本発明において「ベクター」とは、細菌由来のプラスミドを含む意味で用いられるものとする。
形質転換
本発明による形質転換体は、キャンディダ・ユティリスのような宿主にベクターＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）を導入し、そして薬剤耐性となった形質転換体を選択することによって得ることができる。
宿主細胞を細胞外ＤＮＡを取り込み可能な状態にする処理方法としては、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびそれらの改変法などの、サッカロマイセス・セレビシエの形質転換に従来用いられている方法が挙げられる。
電気パルス法による場合、菌体を対数増殖期にまで増殖させた後、洗浄して１Ｍソルビトールに懸濁する。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値（電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が約１０から２０ミリ秒であり、パルス後の生菌率が約１０−４０％となる条件であれば良い。例えば、電気容量が２５μＦ、抵抗値が６００〜１０００オーム、電圧が３．７５〜５ＫＶ／ｃｍの条件で、上記のタイムコンスタント値と生菌率が得られ、１μｇＤＮＡあたり約５００〜１４００個の形質転換体が得られる。
また、電気パルスを加えた後、菌液に１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え３０℃で振盪培養することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得られない場合があることが見出だされた。また、培養時間は４〜６時間程度が適当であり、その後は形質転換体の増殖が無視できなくなる。このほか、ＤＮＡと菌体を接触する際にサーモンスパームＤＮＡなどのキャリアＤＮＡを添加することやポリエチレングリコールを添加することなどによって形質転換頻度を高めることも本発明による形質転換系にあっても好ましい。
また、酢酸リチウム法（Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163-168（1983））はその簡便さから広くサッカロミセス属酵母の形質転換に用いられており、さまざまな改良法が報告されている。これらの方法を用いてもキャンディダ・ユティリスの形質転換が可能であることが確認された（ＷＯ／９５／３２２８９号）。特に、エタノールを添加するリチウム法変法（Soni et. al. Current Genet.24,455-459 1993）によってキャンディダ・ユティリスの形質転換が可能である。また、集菌時の菌体密度、リチウムの濃度、ポリエチレングリコールの種類と濃度、キャリアＤＮＡの種類、形態、量など異なる条件を試みることにより、酢酸リチウム法によるキャンディダ・ユティリスの形質転換の至適条件を決定して、形質転換頻度を高めることが可能である。
本発明によるベクターにより形質転換される宿主としては、キャンディダ・ユティリスを含む酵母が挙げられる。キャンディダ・ユティリスの具体的菌株としては、例えばＡＴＣＣ９２５６（ＩＦＯ  ０６２６）、ＡＴＣＣ９２２６（ＩＦＯ  １０８６）、ＡＴＣＣ９９５０（ＩＦＯ  ０９８８）、ＩＦＯ  ０３９６、ＩＦＯ  ０６１９、ＩＦＯ  ０６３９、ＫＰ−２０５９Ｐ株などが挙げられる。
なお、上記のうちＡＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９９５０の３株についてはそれぞれ染色体多型（Stoltenburg et. al. Curr.Genet.22 441-446（1992））が認められたものの、いずれについても形質転換体が得られること、および異種遺伝子が発現されることが確認されている（ＷＯ／９５／３２２８９号）。このことから、本発明によるベクターがキャンディダ・ユティリス全般について適用可能であることは、当業者にとって容易に推測できるであろう。
タンパク質の製造法
本発明の別の態様によれば、本発明によるベクターによって形質転換されたキャンディダ・ユティリスを培養し、該培養物から構造遺伝子の発現産物を単離、精製することによって、タンパク質を製造することができる。
本発明の更なる態様において、異種遺伝子として一本鎖モネリン遺伝子またはアミラーゼ遺伝子を有する本発明によるベクターによって形質転換されたキャンディダ・ユティリスを培養し、該培養物から一本鎖モネリンやアミラーゼを単離、精製することによって、これらのタンパク質を製造することができる。これら遺伝子は、宿主において高発現されるように改変されていてもよい。
組み込み標的配列をｒＤＮＡとした場合、ベクター単独では安定であったが、タンパク質を高発現することによって、約５０世代継代培養後には発現量が低下した。一方、ＵＲＡ３遺伝子やＬ４１遺伝子のようなｒＤＮＡ以外の配列を組み込みの標的としたベクターを導入した宿主は、約５０世代培養後においてもベクターの保持率は高く、発現量も高く保持される（後記実施例参照）。
すなわち、ＵＲＡ３遺伝子やＬ４１遺伝子を組み込みターゲットとしたベクターを用いることによって、コピー数のみならず、染色体上に組み込まれた遺伝子の安定性が著しく改善されることが示された。
本発明で高発現に成功した一本鎖モネリンは、天然モネリンと同等の甘味を有し、かつ低ｐＨ領域での耐熱性が著しく向上していることが明らかにされている（特開平５-７０４９４号）。この分子においては天然型モネリンのＡ鎖とＢ鎖がリンカーとしてのグリシンを介して結合されている。すなわち、一本鎖モネリンは、天然モネリンのサブユニットＡのＮ末端に、共有結合リンカーによって、自らのＣ末端を通じて天然モネリンのサブユニットＢが連結されたものから主としてなり、具体的には配列番号５のアミノ酸配列を含む。
タンパク質の特性がその構成アミノ酸の一部の欠失あるいは置換、別種アミノ酸の付加があっても実質的に保存されることはよく知られており、１本鎖モネリンにおいてもそのような事実が確認されている（特公平２-５０４０２８号、特開平５-７０４９４号）。
従って、本発明において「一本鎖モネリン」とは、一本鎖モネリン分子と実質的に等価なアミノ酸配列を有するモネリンを含むものとする。ここで、「実質的に等価なアミノ酸配列」とは、置換、欠失、またはアミノ酸の付加等が生じても、天然モネリンと同等の甘味を有するペプチドを意味する。従って、例えば、配列番号５の５０番のＧｌｕがＡｓｎに、５１番のＡｓｎがＧｌｕに、それぞれ置換されたアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸配列）も「実質的に等価なアミノ酸配列」であり、これを含むタンパク質も「一本鎖モネリン」である。なお、本明細書において用語としての「ペプチド」と「タンパク質」は同様の意味において用いられる。
タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、そのアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。従って、「一本鎖モネリン遺伝子」とは、配列番号４に記載のＤＮＡ配列や配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に加え、一本鎖モネリンのアミノ酸配列（実質的に等価なアミノ酸配列を含む）をコードするＤＮＡ配列であって、縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。
更に、一本鎖モネリンをコードするＤＮＡ配列は、当該酵母での至適アミノ酸コドンを使用すれば、さらなる高発現が可能であることは当業者であれば容易に推測できるであろう。
キャンディダ・ユティリスを含む酵母菌体内で可溶性タンパク質として発現された一本鎖モネリンは、加熱処理または酸処理することによって、簡便に精製することができる。
加熱処理は、他の夾雑タンパク質を効率的に沈殿させるためには、５０〜７０℃、好ましくは６０℃付近で行うことができる。また、酸処理は、他の夾雑タンパク質を効率的に沈殿させるためには、ｐＨ５以下、好ましくはｐＨ４〜５の間で行うことができる。上記処理法を実施することによって、モネリンの純度をそれぞれ８０％以上にまで高めることができる。
また、上記加熱処理と酸処理とを組み合わせることによってモネリン純度をほぼ１００％にまで高めることができる。処理の順序は特に限定されない。
更に、陽イオン交換クロマトグラフィーのような公知の精製手段を単独でまたは上記処理と組み合わせて実施することは当業者に自明のことであろう。
更にまた、一本鎖モネリンの共沈を防止するためには、抽出液のタンパク濃度を１０ｍｇ／ｍｌ以下（好ましくは３ｍｇ／ｍｌ以下）にすることが好ましい。
可溶性タンパク質を抽出した後、単に熱処理あるいは酸処理、またはそれらの処理を組み合わせることによって、粗精製したモネリンをそのまま食用または飼料用に用いることができる。また、菌体を破砕した後、適切な熱処理を加えるだけで、各種ビタミンや食物繊維に富みそれ自身が優れた食品である酵母菌体と共にモネリンを使用することもできる。
上記方法によればタンパク質の精製工程の時間と費用を節約することができ、とりわけ、動物用飼料として使用する場合において有利である。
実  施  例
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
なお、各種遺伝子の制限酵素地図における制限酵素サイトについては以下の略号で示してある。
Ａｆ；Ａｆ1II、Ａｐ；ＡｐａＩ、Ａｓｐ；Ａｓｐ７１８、Ｂ；ＢａｍＨＩ、Ｂｇ；ＢｇｌII、Ｃ；ＣｌａＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、ＲＶ；ＥｃｏＲＶ、Ｈ；ＨｉｎｄIII、Ｈｐ；ＨｐａＩ、Ｋ；ＫｐｎＩ、Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｐｖ；ＰｖｕII、Ｓ；ＳａｌＩ、Ｓｅ；ＳｐｅＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｃ；ＳａｃＩ、ＳｃII；ＳａｃII、Ｓｐ；ＳｐｈＩ、Ｘ；ＸｂａＩ、およびＸｈ；ＸｈｏＩである。
実施例１ キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡの調製
キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）の染色体ＤＮＡ抽出は、以下に示す方法で行った。３０ｍｌのＹＰＤ培地に、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を植菌し、３０℃で定常期初期になるまで培養した。遠心分離により菌体を集めて滅菌水で洗浄した後、再度遠心分離により集菌した。菌体は３ｍｌのザイモリアーゼバッファー（０．９Ｍソルビトール、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に懸濁した後、２５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ１００Ｔを含む０．９Ｍソルビトールを２００μｌを加え、３７℃で振とう保温した。顕微鏡下でプロトプラスト化を確認した後、遠心分離してプロトプラスト化した菌を回収した。３ｍｌの溶菌バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、穏やかに、かつ十分に懸濁してから０．３ｍｌの１０％ＳＤＳを混合し、６５℃で一夜保温した。続いて１ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム液を加え、氷上で１時間放置した。その後遠心分離により凝集物を除き、４ｍｌの冷却したエタノールを加え、遠心分離してＤＮＡ等を沈殿させた。沈殿は５０％のエタノールで洗浄し、乾燥した後、３ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ  バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ、ｐＨ７．５）に溶解して、３７℃で３０分保温した。最後に３ｍｌの２−プロパノールを加え、遠心分離して上清を除いた後、沈殿を５０％の２−プロパノールで洗浄し、乾燥させた。この沈殿を０．５ｍｌのＴＥバッファーに溶解したものをキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ試料とした。
キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した後、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１０−５０％ショ糖密度勾配に重層して、120,000ｘｇ、１４時間の遠心分離によりＤＮＡ断片を分画した。このうち１０〜２０ｋｂの染色体ＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したλファージベクターDASHTMII（Stratagene Cloning Systems）とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。続いてGigapackII Gold Packaging Extract（Stratagene Cloning Systems）を用いてインビトロパッケージングし、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
実施例２ ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例１に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片のうち、５〜１０ｋｂの分画のＤＮＡ断片４００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドｐＢＲ３２２、２００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを完成した。
このうち約10,000コロニーについて、Molecular Cloning 2nd edition Sambrook et. al. p12.21-23, Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に従ってフィルターを作製し、サッカロミセス・セレビシエの１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含む１．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ断片を32Ｐ標識し、これをプローブとしてスクリーニングを行った。このプローブとして用いたｒＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ［α，ｓｕｃ２，ｍａｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１］より作製した染色体ＤＮＡライブラリーから、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５′末端の４〜３２番目の塩基に対応するオリゴマーを32Ｐ標識したものをプローブとして取得したものである（曽根ら、特公平６−１４８６５号公報）。
その結果、２００個以上のポジティブクローンが得られた。このうち７個のクローンｐＣＲ１、ｐＣＲ４、ｐＣＲ５、ｐＣＲ６、ｐＣＲ７、ｐＣＲ８、およびｐＣＲ９についてプラスミドの制限酵素地図を作製し、整列させ比較したところ、両端の制限酵素地図が一致した（図１）。このことから、キャンディダ・ユティリスのｒＲＮＡ遺伝子を含む領域が、約１３ｋｂからなる繰り返し構造をとっていることが明らかとなった。
これらのプラスミドより、ＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩ消化により切り出される断片をpBluescriptSK-にサブクローン化して、プラスミドｐＣＲＥ１、ｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐＣＲＸ２、ｐＣＲＸ３、およびｐＣＲＸ４を構築した（図２（ａ））。さらに、これらのプラスミドをさまざまな制限酵素により消化した後、再環状化することにより、各種の欠失プラスミドを構築した。これらプラスミドの挿入断片について図２に矢印で示した領域について塩基配列を決定したところ、１８Ｓ、５．８Ｓ、および２５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に高いホモロジーを示す領域が認められ、これによって３つのｒＲＮＡ遺伝子の存在位置、転写方向などが明らかとなった（図２（ｂ））。
実施例３ オルチジン−５′−フォスフェート  デカルボキシラーゼ遺伝子（ＵＲＡ３遺伝子）の単離
実施例１に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片の内、５〜１０ｋｂの分画のＤＮＡ断片１００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドＹＥｐ１３（Methods in Enzymol. 194, 195-230, 1991）１００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。形質転換体よりプラスミド混合物を抽出後、得られたＤＮＡでｕｒａ３−株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ５００（αｈｉｓ３，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ａｄｅ２，ｌｙｓ２，ｕｒａ３）（Stratagene Cloning Systems）を形質転換し、最少培地で生育するウラシル非要求性の形質転換株を選択した。サッカロマイセス・セレビシエ株の形質転換はMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P122 - 123 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY（1990）記載のリチウム法に従った。
この方法により１０μｇのＤＮＡから、５株のＵｒａ+株が得られた。これら形質転換株より、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P130 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY（1990）記載の方法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。これで大腸菌を形質転換してプラスミドＤＮＡを回収した。これらのプラスミドＤＮＡのうち、ＹＥｐ１３のＢａｍＨＩ部位に６．１ｋｂのインサートを含むプラスミドｐＣＵＲＡ３−３と、８．１ｋｂのインサートを含むｐＣＵＲＡ３−５とについて、制限酵素地図を作製した。その地図は図３に示される通りである。
実施例４ ＵＲＡ３遺伝子領域の特定化と塩基配列の決定
ＵＲＡ３遺伝子領域を特定化するために、プラスミドｐＣＵＲＡ３−３とｐＣＵＲＡ３−５に共通する領域を含む５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＣＵＲＡ３−５より切り出し、プラスミドｐＲＳ３１４（Stratagene Cloning Systems）のＥｃｏＲＩ部位に連結して、プラスミドｐＵＲＡＥ１を作製した（図３）。このプラスミドでＹＰＨ５００株をリチウム法により形質転換したところ、高頻度でＵＲＡ+の形質転換体が得られた。これより、この５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片中にＵＲＡ３遺伝子が存在し、１コピーでサッカロマイセス・セレビシエのｕｒａ３-変異を相補することが明らかにされた。
次に、プラスミドｐＵＲＡＥ１をＸｈｏＩ、またはＰｓｔＩ消化して、再びＴ４リガーゼ反応により再環状化することにより、プラスミドｐＵＲＡＥ１ΔＸｈｏ、およびｐＵＲＡＥ１ΔＰｓｔを得た。
さらにプラスミドｐＵＲＡＥ１より切り出された３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片、および２．３ｋｂのＨｉｎｄIII断片を、それぞれプラスミドｐＲＳ３１４のＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ間、およびＨｉｎｄIII部位に挿入して、プラスミドｐＵＲＡＥＣ１、およびｐＵＲＡＨ１を作製した（図３）。
以上、５種類のプラスミドを用いてＹＰＨ５００株をリチウム法により形質転換し、ｕｒａ３-変異の相補能を調べることにより、これらの断片がＵＲＡ３遺伝子を含むかどうかを調べた。その結果は、図３に示される通りであった。これより、ＵＲＡ３遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII間の２．３ｋｂに限定することができた。
さらにＵＲＡ３遺伝子を含む２．３ｋｂのＨｉｎｄIII断片を、プラスミドpBluescript SK-のＨｉｎｄIII部位に連結して、プラスミドｐＵＲＡＨ２を作製した。つぎに挿入断片の両側からＥｘｏIIIヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、塩基配列を決定した。そのシークエンスストラテジーと塩基配列の解析から明らかにされた制限酵素地図は、図４に示される通りであった。また、得られた２３３０ｂｐからなるＤＮＡ配列は図５に、また推定される２６７アミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列は図６および図７に示される通りである。
推定されたポリペプチドのアミノ酸配列を他の酵母のＵＲＡ３蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエとでは７３．４％、クルイベロマイセス・ラクティスとでは７６．３％、キャンディダ・アルビカンスでは７５．１％と、高い相同性を示した。
実施例５ Ｌ４１遺伝子のクローニングとＬ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
実施例２で作製したライブラリーの約30,000コロニーについて、Molecular Cloning 2nd edition p12.21-23,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に従ってフィルターを作製し、32Ｐ標識したキャンディダ・マルトーサのＬ４１遺伝子ＲＩＭ−Ｃを含む、１．１ｋｂのＸｂａＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片（KAWAI et. al.,J.Bacteriol.,174, 254-262（1992））をプローブとしてスクリーニングを行った。
その結果、５個のポジティブクローンが得られ、このうち３個のクローンｐＣＬ４１−１、ｐＣＬ４１−２、およびｐＣＬ４１−５について制限酵素地図を作製し、それを比較したところ、これらのクローンが４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を共有することが示された（図８）。さらにこれらプラスミドＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析により、キャンディダ・マルトーサのＬ４１遺伝子に相同性を示す領域が、この４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片内の１．４ｋｂＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片内にあることが示された。
そこで４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、pBluescript SK-のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、挿入断片が互いに逆向きのプラスミドｐＣＬＥ１、およびｐＣＬＥ２を作製した。この２種のプラスミドについてＥｃｏＲＩ断片内にサイトをもつＨｉｎｄIII、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩなどによる欠失変異体の作製や、ＥｘｏIIIヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、ＢａｍＨＩサイトからＳａｃＩサイトまでの２０８６ｂｐからなるＤＮＡ配列を決定した（図９）。
この配列を解析すると、サザン解析によりＬ４１造遺伝子が存在すると推定された領域に３６７ｂｐのイントロンで分断された３１８ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在した（図８および図１０）。イントロンと推定された領域の５′と３′端および３′端近傍にはイントロンに共通する配列GTATGT--TACTAAC--AGが認められた。また、その位置も報告されている他の酵母由来の６種類のＬ４１遺伝子（KAWAI et. al,J.Bacteriol. 174,254-262（1992）、POZO et. al.,Eur. J. Biochem. 213, 849-857（1993））と同様、開始コドンの直後に存在していた。キャンディダ・ユティリスＬ４１ポリペプチドの推定されるアミノ酸配列を他のいくつかのＬ４１蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエＬ４１ａとの間では９３．４％、キャンディダ・トロピカリスＬ４１との間では８９．６％、キャンディダ・マルトーサのＬ４１との間では８５．８％と、高い相同性を示した。
実施例６ 部位特異的変異法によるシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子の作製
シクロヘキシミド耐性を示す酵母のＬ４１蛋白質の５６番目のアミノ酸はグルタミンであり、一方、シクロヘキシミド感受性酵母のＬ４１蛋白質においてはこの位置のアミノ酸はプロリンである。そしてこのアミノ酸残基がそのＬ４１蛋白質をもつ酵母のシクロヘキシミドに対する感受性を決定していると報告されている（KAWAI et. al.,J.Bacteriol. 174,254-262（1992））。ここで、シクロヘキシミド感受性であるキャンディダ・ユティリスのＬ４１蛋白質の５６番目のアミノ酸はシクロヘキシミド感受性のサッカロマイセスセレビシエと同様にプロリンであった。そこで、部位特異的突然変異導入によりＬ４１遺伝子の５６番目のプロリンをコードするコドンをグルタミンコドンに変更することによって、この遺伝子がコードするＬ４１蛋白質をシクロヘキシミド耐性型へと変換し、形質転換の選択マーカーとして利用した。まず、プラスミドｐＣＬＥ１から得られる２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＣＬＢＳ１を作製した（図１１）。
また、プラスミドｐＣＬＥ１をＡｆｌII消化し、クレノウ酵素処理により平滑化した後、さらにＸｈｏＩ消化することによって得られる０．６ｋｂの断片を、pBluescript SK-のＳｍａＩとＸｈｏＩ間に挿入して、ｐＣＬＡＸ１を作製した。このプラスミドにおいては、０．６ｋｂ断片の平滑化されたＡｆｌII末端とベクターのＳｍａＩ末端とのライゲーションにより、ＡｆｌII切断部位が再生される。ヘルパーファージを用いてｐＣＬＸＡ１から一本鎖ＤＮＡを調製し、合成した変異用オリゴヌクレオチド5′TG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TGA3′を用いて、Sculptorインビトロミュータジェネシスキット（Amersham）により、変異プラスミドを作製した。得られた候補プラスミドについて０．６ｋｂ挿入断片の全塩基配列を決定し、５６番目のプロリンをコードするコドンCCAがグルタミンのコドンCAAに変異され、その他の配列に変異のないプラスミドｐＣＬＡＸ２０を得た。
ｐＣＬＡＸ２０から０．６ｋｂの挿入断片をＣｌａＩ−ＡｆｌII断片として切り出し、これと、プラスミドｐＣＬＢＳ１をＣｌａＩとＡｆｌIIと消化して得られる４．４ｋｂの断片とライゲーションして、変異型Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドｐＣＬＢＳ１０を構築した。
また、プラスミドｐＣＬＢＳ１０をＢａｍＨＩとＳｐｈＩとで消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端とした後、ＮｏｔＩリンカー（5′AGCGGCCGCT3′）を挿入して、プラスミドｐＣＬＢＳ１２を構築した（図１１）。
次に、作成した変異型Ｌ４１遺伝子が酵母にシクロヘキシミド耐性を付与するかどうかを調べた。ＹＥｐ型ベクターであるＹＥｐ１３Ｋ（Sone et. al.,Appl.Environ. Microbiol. 54, 38-42（1988））のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイト間に、プラスミドｐＣＬＢＳ１０から得られる２．１ｋｂの変異型Ｌ４１遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を挿入して、プラスミドｐＹＥＣＬ１０を作製した。一方、コントロールとしてｐＣＬＢＳ１から得られる２．１ｋｂの野生型Ｌ４１遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をＹＥｐ１３Ｋにクローン化したプラスミドｐＹＥＣＬ１を作製した。
これらのプラスミドを用いてサッカロミセス酵母ＹＰＨ５００株をMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P122-123 Co1d Spring Harbor Laboratory Press NY（1990）記載の酢酸リチウム法に従って形質転換した。形質転換体として、ロイシン非要求性になった株を選択した。これらの形質転換体についてシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートでの生育を調べたところ、ｐＹＥＣＬ１０を保持する株は、５０および１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートで増殖することが示された。一方、ｐＹＥＣＬ１を保持する株は同濃度のシクロヘキシミドを含むプレート上ではまったく増殖しなかった。これによって、作成した変異型Ｌ４１遺伝子がシクロヘキシミド感受性酵母に耐性を付与することが示された。
実施例７ Ｌ４１遺伝子プロモーターの削り込みによるベクターの多コピー組み込み
（１）プロモーター欠失変異体の取得
実施例６記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１０（図１１）のＥｃｏＲＩサイトとＸｂａＩサイトに、実施例２で示したプラスミドｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、およびｐＣＲＸ２（図２）からそれぞれＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩにより切り出される４種類のｒＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＥ３、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２を構築した（図１２）。部位特異的変異を導入することによってシクロヘキシミド耐性型としたキャンディダ・ユティリスＬ４１遺伝子とキャンディダ・ユティリスribosomal ＤＮＡ断片とを含むプラスミドｐＣＬＲＥ２の構造を図１３ａに示す。
このプラスミド５μｇをＰｓｔＩとＢａｍＨＩによって分解した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡを１００μｌのＥｘｏIII緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に溶解し、１８０ユニットのＥｘｏIIIヌクレアーゼを加え、３７℃で保温した。１分ごとに１０μｌをサンプリングし、１０μｌのＭＢバッファー（４０ｍＭ  酢酸ナトリウム，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＺｎＣｌ2，１０％グリセロール（pH４．５））の入った氷冷したチューブに移した。得られた１０本のチューブを６５℃で１０分間保温して酵素を失活させた後、５ユニットのマングビーンヌクレアーゼを加えて、３７℃で３０分間反応した。反応後にアガロースゲル電気泳動により欠失の程度を確認した後、このうち５つの反応液からＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡはクレノウ酵素で末端を平滑化し、１６℃で一晩ライゲーション反応した後、大腸菌を形質転換した。
（２）形質転換と形質転換体の解析
−４１１のＸｈｏＩから＋９７６のＳａｃＩまでを含む改変型Ｌ４１遺伝子を含んだプラスミドと、−１１１０のＢａｍＨＩから＋９７６のＳａｃＯまでを含む改変型Ｌ４１遺伝子を含んだプラスミドとを用いて形質転換を行ったところ、形質転換頻度はほとんど同じであった。このことから、Ｌ４１遺伝子の発現にはプロモーター領域として−４１１のＸｈｏＩサイト（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）から下流の領域で十分であった。従って、欠失がＸｈｏＩサイト付近またはその３’側下流翻訳開始コドン付近にまで及んだ１０種類のプラスミドｐＣＬＲＥ１１−２０を選び、それぞれ約１０μｇについて、ＢｇｌIIで分解した後、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。ｐＣＬＲＥ１１−２０はｐＣＬＲＥ２の構築に準じて調製された。形質転換は電気パルス法（ＷＯ／９５／３２２８９号参照）により行った。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。この結果、シクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子のプロモーター領域の欠失の程度が大きくなることに従って、形質転換頻度が低下することが観察された。具体的には、欠失の程度がほとんど同じｐＣＬＲＥ１１、１２、１３に関しては同程度の形質転換頻度が得られ、ｐＣＬＲＥ１４ではその約３０％、ｐＣＬＲＥ１５、ｐＣＬＲＥ１６においては約１５％、ｐＣＬＲＥ１７においては約０．３％に低下することが示され、ｐＣＬＲＥ１８、１９、２０に関しては形質転換体は得られなかった。これらのプラスミドのうちｐＣＬＲＥ１１、１５、１６、１７、１８、１９についてＬ４１遺伝子プロモーター領域の５’側末端位置を図１３ｂに矢印で示した。
次に、このうちｐＣＬＲＥ１５、１６、１７とｐＣＬＲＥ１１とによって得られた形質転換体、それぞれ４クローンずつに関してＤＮＡを調製してサザン解析を行った。染色体ＤＮＡの調製は、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P131-132 Cold Spring Harbor Laboratory Press NYに記載の方法に従った。調製したＤＮＡはＨｉｎｄIIIにより分解し、アガロースゲル電気泳動した後、ハイボンドＮ＋フィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にトランスファーして、サザンハイブリダイゼーション用のフィルターを作製した。ＤＮＡが固定化されたフィルターは、ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ，５×Denhardt溶液，０．２％  ＳＤＳ）中で６５℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。
次に、Megaprime DNA labelling systems（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）とを用いて標識化したＬ４１遺伝子を含む０．６ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII断片をプローブＤＮＡとし、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターは１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で、６５℃、２時間洗浄した後、オートラジオグラフィーに供してシグナルを検出した。その結果、内在性のＬ４１遺伝子に由来するバンドの他に組み込まれたベクター由来の濃いバンドが認められた。キャンディダ・ユティリスＬ４１遺伝子のコピー数は１細胞あたり２であることは既に示されているので、内在性のＬ４１遺伝子に由来するバンドが２コピーのＬ４１遺伝子に対応するものとして、バンドの強さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーＢＡＳ  ２０００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ社）を用いて測定した。サザン解析の結果及びコピー数を示したグラフは図１４に示した。プロモーター領域を−４２０まで有するプラスミドｐＣＬＲＥ１１のコピー数は、９コピーから１４コピーであるのに対し、プロモーター領域が−１９０（ｐＣＬＲＥ１５）、−１８０（ｐＣＬＲＥ１６）、あるいは−８０（ｐＣＬＲＥ１７）まで削り込まれたプラスミドによる形質転換体それぞれのコピー数は１４コピーから３０コピー（ｐＣＬＲＥ１５）、１７コピーから４２コピー（ｐＣＬＲＥ１６）、３５コピーから９０コピー（ｐＣＬＲＥ１７）であった。以上のようにマーカー遺伝子であるシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子のプロモーター領域が短縮化されたいくつかのベクターにおいては形質転換の際に染色体に組み込まれるコピー数が高くなることが示された。
実施例８ 染色体多コピー組み込み型ベクターの構築
（１）ｒＲＮＡ遺伝子座をターゲットとしたベクターの構築
プラスミドｐＣＬＲＥ２からＡｐａＩ分解により得られるｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡを含む約１．２ｋｂの断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Stratagene社）のＡｐａＩサイトにクローン化してプラスミドｐＣＲＡ１を構築した。次にｐＣＲＡ１をＸｈｏＩで分解した後、クレノウ酵素処理により平滑末端とし、ＳｐｈＩリンカー（５’ＧＧＣＡＴＧＣＣ３’）を付加してｐＣＲＡ２を作製した。このプラスミドのＳｐｈＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に、プラスミドｐＣＬＲＥ１５、１６、１７から切り出したＬ４１遺伝子を含むＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片をクローン化して、プラスミドｐＣＬＲ２１５、２１６、２１７を構築した（図１５）。
また、ｐＣＲＡ１をＡｓｐ７１８で分解した後、クレノウ処理により平滑末端とし、ＮｏｔＩリンカー（５’ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ３’）を付加してｐＣＲＡ３を作製した。このプラスミドをＮｏｔＩとＢｇｌIIで分解することにより、０．５ｋｂと０．７ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌII断片を回収した。一方、ｐＵＣ１９（宝酒造）をＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩとで分解した後、クレノウ処理によりそれぞれを平滑末端とした後ＢｇｌIIリンカー（５’ＣＡＧＡＴＣＴＧ３’）を連結して構築したプラスミドｐＵＣＢｇｌをＢｇｌII分解した後、２種類のＮｏｔＩ−ＢｇｌII断片をクローニングしてｐＣＲＡ１０を構築した（図１６）。また、マーカー遺伝子とするシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子に関しては、染色体に組み込まれるベクターのコピー数をコントロールするために、プロモーターの長さの異なる２種類の断片をＰＣＲにより取得した。すなわち、−４０５から＋９７４までの断片と−１８４から＋９７４までの断片の２種類を取得した（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）。これらの断片はそれぞれ、１０コピー前後の組み込みが得られたｐＣＬＲＥ１１と、２０〜４０コピー程度の組み込みが得られたプラスミドｐＣＬＲＥ１６におけるＬ４１遺伝子断片にほぼ一致する。この際、遺伝子の５’側プライマー末端にはＰｓｔＩサイトを付加し、３’側プライマー末端にはＳａｌＩサイトをもつ様にデザインした。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は、Ｌ４１遺伝子の５’側プライマーとして、
0004158863.tif 000002
３’側プライマーとして、
0004158863.tif 000003
である。
また、鋳型としてはｐＣＬＲＥ２を用いた。２つの増幅断片はＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングした。構築したそれぞれのプラスミドからこれら２種類の断片をＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片として切り出してｐＣＲＡ１０に連結することにより、長いＬ４１遺伝子断片を含むプラスミドｐＣＲＡＬ１０と短いＬ４１遺伝子断片を含むプラスミドｐＣＲＡＬ１１とを構築した。
これらのプラスミドｐＣＲＡＬ１０とｐＣＲＡＬ１１においては組み込みのターゲット配列となるｒＤＮＡ断片が２分割され、その間にＡｍｐ耐性遺伝子を含むｐＵＣプラスミド由来の配列を組み込んだ構造となっている。このベクターは、ＢｇｌIIサイトで分解してから形質転換に用いるため、形質転換体にはターゲットＤＮＡ配列とその間のマーカー遺伝子が組み込まれるが、ｐＵＣプラスミド由来のＤＮＡ配列は組み込まれない。
（２）ＵＲＡ３遺伝子座をターゲットとしたベクターの構築
キャンディダ・ユティリスのＵＲＡ３遺伝子配列（実施例４参照）を元にプライマーをデザインし、ＵＲＡ３遺伝子の５’側及び３’側を含む２種類の断片をそれぞれＰＣＲにより取得した。
ＵＲＡ３遺伝子５’側断片としては＋４から＋３５４までの断片（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）を取得した。その際、その５’側プライマー末端にはＳａｌＩサイトを付加し、３’側プライマー末端にはＢｇｌIIサイトをもつ様にデザインして合成した。プライマーの配列は、
0004158863.tif 000004
である。
また、ＵＲＡ３遺伝子３’側断片としては＋３５６から＋６８５までの断片を取得した。その際、５’側プライマー末端にはＢｇｌIIサイトをもつ様にデザインし、３’側プライマー末端にはＡｓｐ７１８（ＫｐｎＩ）サイトをもつ様にデザインして合成した。プライマーの配列は、
0004158863.tif 000005
である。
得られた２つの増幅断片はＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングした。構築した２種類のプラスミドから、ＵＲＡ３遺伝子５’側断片をＳａｌＩ−ＢｇｌII断片、ＵＲＡ３遺伝子３’側断片をＢｇｌII−Ａｓｐ７１８断片としてそれぞれ切り出し、ｐＵＣ１９（宝酒造）のＳａｌＩサイトとＡｓｐ７１８サイトとの間に連結してプラスミドｐＵＲＡ１を構築した。このプラスミドにおいては、ＵＲＡ３遺伝子オープンリーディングフレーム内部＋３５５の位置の塩基ＡがＣに変わったことによってＢｇｌIIサイトが形成されており、このプラスミドをＢｇｌII分解することによってプラスミドを染色体上のＵＲＡ３遺伝子内に組み込むことが可能になっている。また、ｐＵＲＡ１のＵＲＡ３遺伝子はオープンリーディングフレームの５’側と３’側末端をそれぞれ一部欠失した構造としている。
ｐＵＲＡ１をＡｓｐ７１８で分解し、クレノウ酵素処理することにより平滑末端とした後、ＮｏｔＩリンカー（５’ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ３’）を連結してプラスミドｐＵＲＡ２を構築した。また、ｐＵＲＡ１をＨｉｎｄIIIで分解し、クレノウ酵素処理することにより平滑末端とした後、ＮｏｔＩリンカー（５’ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ３’）を連結してプラスミドｐＵＲＡ３を構築した。さらにｐＵＲＡ２及びｐＵＲＡ３をＮｏｔＩとＢｇｌII分解することにより、それぞれから２種類の約０．３５ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌII断片を得て、これらをＢｇｌII分解したｐＵＣＢｇｌにクローン化してｐＵＲＡ１０を構築した（図１７）。
さらに、（１）でＰＣＲにより取得したシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含む長さの異なる２種類のＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＵＲＡ１０に連結することによって、長いＬ４１遺伝子断片を含むプラスミドｐＵＲＡＬ１０と短いＬ４１遺伝子断片を含むプラスミドｐＵＲＡＬ１１とを構築した。
これらのプラスミドｐＵＲＡＬ１０とｐＵＲＡＬ１１においては組み込みのターゲット配列となるＵＲＡ３断片が２分割され、その間にＡｍｐ耐性遺伝子を含むｐＵＣプラスミド由来の配列を組み込んだ構造となっている。このベクターは、ＢｇｌIIサイトで分解してから形質転換に用いるため、形質転換体にはｐＵＣプラスミド由来のＤＮＡ配列が組み込まれない。
（３）Ｌ４１遺伝子座をターゲットとしたベクターの構築
（シクロヘキシミド耐性型）Ｌ４１遺伝子をターゲットとしたベクターは、以下の様に構築した。（シクロヘキシミド耐性型）Ｌ４１遺伝子に関しては、−８５から＋２９２までの断片約３８０bpと、＋２８８から＋９７１までの約６８０bpの２つの断片をＰＣＲにより取得した。５’側断片の５’末端の位置は、ｐＣＬＲＥ１７における（シクロヘキシミド耐性型）Ｌ４１遺伝子プロモーターの５’末端とほぼ一致する。この際、−８５から＋２９２までの断片については、その５’側にＰｓｔＩサイトを付加し、３’側については＋２８９のＴをＧに変更することにより、ＢｇｌIIサイトを構築した。ＰＣＲに用いたプライマーは、
0004158863.tif 000006
ある。また、＋２８８から＋９７１までの断片については、その３’側にＰｓｔＩとＮｏｔＩサイトを付加し、５’側については＋２８９のＴをＧに変更することにより、ＢｇｌIIサイトを構築した。ＰＣＲに用いたプライマーは、
0004158863.tif 000007
である。
また、鋳型としてはｐＣＬＲＥ２を用いた。２つの増幅断片はＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いてプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングした。構築したそれぞれのプラスミドからこれら２つの断片をそれぞれ、ＰｓｔＩ−ＢｇｌII断片として切り出した後、ＢｇｌII分解したｐＵＣＢｇｌにクローニングしてｐＣＬ１２を構築した（図１８）。
このプラスミドｐＣＬ１２においては組み込みのターゲット配列となるＬ４１遺伝子断片が２分割され、その間にＡｍｐ耐性遺伝子を含むｐＵＣプラスミド由来の配列を組み込んだ構造となっている。このベクターは、ＢｇｌIIサイトで分解してから形質転換に用いるため、形質転換体にはターゲットＤＮＡ配列とその間の異種遺伝子が組み込まれるが、ｐＵＣプラスミド由来のＤＮＡ配列は組み込まれないという特徴を有する。また、マーカー遺伝子は、ベクター上でｐＵＣプラスミド由来の配列により分割されているため、このプラスミドが、染色体上にタンデムに組み込まれた場合にのみ、シクロヘキシミド耐性の形質転換体が得られる。
実施例９ モネリン発現プラスミドの構築
（１）グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニング
キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニングは、遺伝子ライブラリーとして実施例１で構築したキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを用い、他生物の既知のＧＡＰ遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。Molecular Cloning 2nd edition p2. 95-121,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載された方法に従い、上記の遺伝子ライブラリーの約20,000プラークのファージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子を含む2.1ｋｂのＨｉｎｄIII断片を保持するｐＵＣ18プラスミド（Yamano et al. Journal of Biotechnology 32, 165- 171（1994））から、ＧＡＰ遺伝子の大部分を占めるＤＮＡ断片として約1ｋｂのＡｓｕII-ＡｆｌII断片を切り出した。この断片を32Ｐ標識して、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果3つの陽性プラークが分離できた。更にこれらプラークの1つのファージＤＮＡについてサブクローニングを行い、このファージＤＮＡに含まれていた6.5ｋｂＥｃｏＲＩ断片を単離し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＥｃｏＲＩサイトに組込み、プラスミドｐＧＡＰ１および２を構築した（図１９）。
（２）ＧＡＰ遺伝子プロモーター／ターミネーターを含むプラスミドの構築
キャンディダ・ユティリスのグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーター、ターミネーター断片は、それぞれプラスミドｐＧＡＰ１を鋳型としてＰＣＲにより取得した。プロモーターとしては、開始コドン上流−９７６から開始コドン直前−１までの９７４ｂｐの断片（開始コドンＡを＋１とする）を以下のプライマーを用いて取得した。
0004158863.tif 000008
これらプライマーにおいては５’側プライマー末端にＮｏｔＩサイト、３’側開始コドン直前にＸｂａＩとＢａｍＨＩサイトをそれぞれ付加して合成した。また、ターミネーターとしては、終止コドン直後＋１００６から＋１７２８までの７２３ｂｐの断片を取得した。プライマーとしては、
0004158863.tif 000009
を用い、５’側終止コドン直後にはＢａｍＨＩサイト、３’側にＰｓｔＩサイトを付加して合成した。
得られた２つの増幅断片はＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングした。これら２つの断片はそれぞれ、ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片として取得した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−のＮｏｔＩとＰｓｔＩ間にクローニングして、プラスミドｐＧＡＰＰＴ１０を構築した（図２０）。
（３）モネリン遺伝子発現プラスミドの構築と形質転換
配列番号４に示したアミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＭＮＹ１から、モネリン遺伝子をＤｒａＩ−ＢｇｌII断片として切り出した。ｐＭＮＹ１は、概略すると、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＵＣ１８（ファルマシア社）のＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄIIIサイトの間に挿入することによって得ることができる（特開平５−７０４９４号公報参照）。また、プラスミドｐＧＡＰＰＴ１０をＸｂａＩで分解し、クレノウ酵素処理によって平滑末端とした後、さらにＢａｍＨＩで分解した。この断片と、モネリン遺伝子を含むＤｒａＩ−ＢｇｌII断片を連結してプラスミドｐＧＡＰＭ３を構築した（図２０）。さらに、実施例２記載のプラスミドｐＣＬＲ２１５、２１６、２１７、及びｐＣＲＡＬ１０、ｐＣＲＡＬ１１、ｐＵＲＡＬ１０、ｐＵＲＡＬ１１のＰｓｔＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に、ｐＧＡＰＭ３から切り出したＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片を連結してプラスミドｐＣＬＲＭ２１５、２１６、２１７、及びｐＲＭ１０、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１０、ｐＵＭ１１を構築した（図２０）。これら構築したプラスミド７種類をＢｇｌIIで分解した後、実施例１に示した電気パルス法によりキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。その結果、ｐＣＬＲＭ２１５と２１６、ｐＲＭ１０、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１０、ｐＵＭ１１について形質転換体が得られた。ｐＣＬＲＭ２１７については形質転換体は得られなかった。
実施例１０ 酵母形質転換体におけるモネリンの発現
ｐＣＬＲＭ２１５と２１６、ｐＲＭ１０、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１０とｐＵＭ１１による形質転換体をそれぞれ４株ずつを１０ｍｌのＹＰＤ培地で２４時間振盪培養した。菌体を遠心して集めた後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦに懸濁し、グラスビーズで菌体を破砕、１５，０００×ｇで１０分間遠心することにより菌体と不溶性沈殿を除去することにより、可溶性タンパク質を調製した。調製した可溶性タンパク質は１５／２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてその発現を調べた。この結果、いずれのプラスミドによってもモネリンに相当する分子量約１万の位置にバンドが認められた。また、低コピー型のｐＲＭ１０とｐＵＭ１０による形質転換体での発現量に比較して、高コピー型のｐＣＬＲＭ２１５と２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１による形質転換体での発現量が顕著に高くなっていることが示された。このうちｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１によるキャンディダ・ユティリス形質転換体２株ずつの全可溶性タンパク質を１５／２５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した結果を図２１（１）に示した。
また、対照としてｒＤＮＡ断片とシクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドｐＣＬＲＥ４による形質転換体も同様に処理した。ｐＣＬＲＥ４は実施例６に記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１２（図１１）のＥｃｏＲＩサイトに、実施例２に記載のｐＣＲＥ２（図２）から得られる３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入することにより構築した。ゲルは泳動後クマシー染色し、デンシトメーターで乾燥したゲルをスキャンすることにより、全可溶性タンパク質に占めるモネリンの割合を算出した。その結果、ｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１で形質転換されたキャンディダ・ユティリス株においてはいずれも、モネリンが菌体可溶性タンパク質の５０％程度蓄積するとともに、バクテリア由来の配列を除去したｐＵＭ１１やｐＲＭ１１による形質転換体においてその発現量が高まる傾向が認められた。
一方、酵母サッカロマイセス・セレビシエでのモネリンの発現を調べるために、「ＧＡＰプロモーター＋モネリン遺伝子＋ＰＧＫターミネーター」という構成の発現カセットを含み、マーカーとしてＴＲＰ１遺伝子、さらに酵母２μｍＤＮＡ全長をもつプラスミドｐＣＴＭＮＹＩにより形質転換された酵母ＴＤ４（Saccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ  ２６１０８）の変異株（ａ，ｈｉｓ，ｕｒａ，ｌｅｕ，ｔｒｐ））（特開平５−７０４９４号参照）を用いた。この形質転換体２株は、ヒスチジン、ウラシル、ロイシンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌ含んでいるＳＤ培地（０．６７％  酵母ナイトロジェンベース（除アミノ酸）、２％  ブドウ糖）１０ｍｌ中、３０℃で２４時間振盪培養した。また、親株であるＴＤ４は上記培養液にトリプトファンを添加した培地で同様に培養し、可溶性タンパク質を調製後１５／２５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した結果を図２１（２）に示した。デンシトメーターによる定量により、モネリンは全可溶性タンパク質の約５％発現していると算出された。ＣＴＭＮＹＩによるサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体においては、強力なＧＡＰプロモーターを用いて、細胞内に５０コピー以上存在するとされるＹＥｐ型プラスミドで発現させているにもかかわらず、キャンディダ・ユティリスにおける発現量に比較して圧倒的にモネリンの発現量は低いことが示された。また、大腸菌でＴＲＰ遺伝子プロモーター制御下でモネリン遺伝子を発現させた場合、発現量が菌体タンパク質の１０％程度であった（特開平５−７０４９４号参照）。以上から、異種タンパク質の発現にとってキャンディダ・ユティリスは好適な宿主であることが明らかにされた。
次に、ｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１によって得られた形質転換体、それぞれ４クローンずつについてＤＮＡを調製してサザン解析を行った。これは、ｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１によるＤＮＡはＰｓｔＩ＋ＥｃｏＲＩ、ｐＵＭ１１によるＤＮＡはＨｉｎｄIIIにより分解して、０．６ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII  Ｌ４１遺伝子断片をプローブとして解析した。内在性のＬ４１遺伝子由来のバンドが２コピーに対応するものとして、バンドの強さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ社）を用いて測定した。その結果、組み込まれたベクターのコピー数は、ｐＣＬＲＭ２１６による形質転換体では１０から１９コピー、ｐＲＭ１１による形質転換体では１２から１８コピー、ｐＵＭ１１による形質転換体では１７から２７コピーと計算された。
また、同じフィルターに対してｐＵＣ１９をプローブとしてサザン解析を行った結果、ｐＲＭ１１とｐＵＭ１１による形質転換体においてはバクテリア由来のＤＮＡ配列は染色体上に組み込まれていないことが明らかにされた。
また、プラスミドｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１による形質転換体において組み込まれた遺伝子の安定性を調べるために、それぞれ４株ずつについてＹＰＤ液体培地で継代培養を行った。まず、シクロヘキシミドを含むＹＰＤプレート上に生育した菌体を１０ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌して定常期まで培養した。次に、このうち１０μｌを１０ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌して定常期まで培養した。この植え継ぎ操作を４回繰り返すことにより非選択培地で約５０世代継代培養を行った。最後の培養液から菌体を集菌後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＰＭＳＦに懸濁し、グラスビーズで菌体を破砕することにより可溶性タンパク質を調製した。ｐＣＬＲＭ２１６、ｐＲＭ１１、ｐＵＭ１１による形質転換体４株ずつの全可溶性タンパク質を１５／２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を図２２に示した。
この結果から、ｐＣＬＲＭ２１６とｐＲＭ１１で形質転換された株においては、ばらつきがあるもののいずれもモネリンの発現量が低下していたのに対し、ｐＵＭ１１による形質転換体４株においては顕著な発現量の低下は認められなかった。さらに、５０世代培養した培養液を希釈後、ＹＰＤプレートと４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートとにそれぞれ塗布して、３０℃で２日間培養後に生じたコロニー数を調べてその比を求めた。この値は、ｐＣＬＲＭ２１６による形質転換体４株ではそれぞれ、０、２．０、２．３、４．０％、ｐＲＭ１１による形質転換体では１．０、１．０、４．７、７．２％、ｐＵＭ１１による形質転換体では９７．０、１００、４０．２、４３．５％という結果になり、ｐＵＭ１１の安定性がその他の２つのプラスミドに比較して非常に高いということが示された。染色体上に組み込まれたプラスミドの一部分が脱落しても、シクロヘキシミド感受性となると考えられるため、この比はプラスミド保持率を正確に反映するものではないが、開発したベクターのうち特にｐＵＭ１１が期待されるコピー数、安定性ともに優れていることが明らかにされた。
実施例１１ モネリンの精製
ｐＵＭ１１による形質転換体をＹＰＤ培地中３０℃で一晩振盪培養し、遠心分離を行い集菌した。湿重量約１０ｇの同菌体（乾燥重量で２ｇに相当）に０．９Ｍ  ソルビトール１７ｍｌを加え懸濁した後、ザイモリエース１００Ｔ（生化学工業）６ｍｇを加え３７度３０分攪拌しながら反応させた。これをフレンチプレスにて処理（１０００ｐｓｉ、３回）して菌体を破砕した。遠心分離（１００００ｇ  ２０分）を行ない上清画分を集めた。さらに沈殿画分についてもリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回洗浄し、上清画分を集め、先のものと合わせた。これをフレンチプレス処理試料とした。同様に破砕効果を調べる目的で、湿重量約１０ｇの前記菌体についてリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）４０ｍｌ、およびグラスビーズ（４２５〜６００microns Ｓｉｇｍａ社）６０ｍｌをダイノミルで冷却しながら１５分間粉砕した。この粉砕物から上清を集め、さらに前記緩衝液でグラスビーズをタンパクが抽出されなくなるまで洗い込み、先のものと合わせた。これをダイノミル処理試料とした。フレンチプレス処理とダイノミル処理による試料の両方についてＳＤＳ−ＰＡＧＥでモネリンの抽出効率を比較したところ両者に大きな違いは観察されなかった。
次にモネリンの精製のため、酸処理、熱処理の予備実験を行なった。ダイノミル処理試料はタンパク量濃度１．５ｍｇ／ｍｌに希釈した（以下タンパク量の測定は全てＢｉｏ−Ｒａｄ社のプロテインアッセイキットを用いてＢＳＡを標準として行なった）。４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を加えて試料のｐＨを４、４．５、５．５に調整して４℃約１２時間放置することにより酸処理を、あるい試料を５０℃、６０℃、７０℃で１０分間保温することにより熱処理を行なった。その結果、ｐＨ４および４．５の酸処理、または６０℃で１０分間の熱処理によってモネリン以外の酵母由来夾雑タンパクが大幅に沈殿することが明らかになった。
また、熱処理は、５０℃で１０分間では効果がなく、７０℃で１０分間ではモネリンも他のタンパク質とともに沈殿することが明らかにされた。さらに６０℃で１０分間の熱処理とｐＨ４の酸処理を組み合わせることにより夾雑タンパクがほぼ１００％近く除くことが可能であることが明らかにされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２３に示す。
以上の実験結果を基にフレンチプレス処理試料を用いてモネリンの精製を行なった。フレンチプレス処理試料についてリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）でタンパク量が約２．０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、６０℃で１０分間ウォーターバスで熱処理を行なった。沈殿を遠心分離によって除いた後、２００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を加えて攪拌しながらｐＨ４．５になるように調整し、冷却しながら酸処理を行なった。約１時間処理した後、再度２００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてｐＨ６．０に戻るまでｐＨ調節を行なった。沈殿を遠心分離によって除いた後、上清画分について限外濾過（分子量３０００カット）によって濃縮したのち１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。不溶性画分を遠心分離と０．２ミクロンのフィルター（ミリポア社）によって除去し、同緩衝液で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社）を充填したカラム（５０ｍｌ）に吸着させた。非吸着画分を同緩衝液で溶出させた後、ＮａＣｌの線形勾配（０〜０．４Ｍ／１５０ｍｌ）で標的タンパクを得た。この標的タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したところ単一バンドにまで精製されていることが確認された（図２３参照）。
また、天然型モネリンの円二色性スペクトル（波長領域１９０ｎｍから２６０ｎｍ）は、２１２ｎｍ付近に強い負のスペクトル、２３６ｎｍ付近に正のスペクトルを示すが、精製した組換えモネリンは、天然体の円二色性スペクトルとよく一致したスペクトルを示した。
精製１本鎖化モネリン並びに天然モネリン標品を、純水に０．３μｇ／μｌ，０．２μｇ／μｌ，０．１μｇ／μｌ，０．０５μｇ／μｌ，０．０２μｇ／μｌの各濃度になるように溶解し、それぞれ１０μｌを舌にのせて味わうことにより、甘味活性を評価した。天然体、組換え体ともに、甘味閾値濃度は０．０５−０．１μｇ／μｌであり（即ち０．５−１μｇタンパク）酵母で生産したモネリンは天然体と同等の比活性を有していた。
実施例１２ アミラーゼ遺伝子の合成
スルホロバス・ソルファタリカスＫＭ１株由来アミラーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列（Kobayashi,K et al.,Biosci. Biotech Biochem., 60（10）1720-1723（1996））について、メチオニンとトリプトファン以外のコドンについて、キャンディダ・ユティリスのグリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素遺伝子のコドンで特に使用頻度の高いコドンを用いてＤＮＡ配列に変換した。その際それぞれの遺伝子に含まれる各アミノ酸についてのコドンのばらつきが極力ＧＡＰと近いものに、且つ約１８０〜３２０塩基ごとに特異的な制限酵素部位が形成され、各遺伝子が数個のセグメントによって構成されるように設計した。形成される制限酵素部位の都合上、マイナーなコドンも一部使用した。さらに構造遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）より１塩基はさんで５’上流側にＸｂａＩ認識部位を、また翻訳終止コドンより１塩基はさんで３’下流側にＢｇｌII認識部位が形成されるように設計した。以上の点を考慮してスルホロバス・ソルファタリカスＫＭ１株由来アミラーゼ遺伝子はセグメントＡ-１〜７の７セグメント（配列番号６〜１２）によって構成されるように設計した。各セグメントの両端には特異的な制限酵素認識部位が形成されるようにし、また、同制限酵素によって各セグメントが直接消化されるように、末端の制限酵素認識部位の両端にさらに２ヌクレオチドずつ無意味な配列を付加した。各セグメントの合成に用いたプライマーを図２４〜２６に示す。
各セグメントＡ−１〜Ａ−７の合成は、以下に示す方法により行った。ＰＣＲプロセスはＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用い、ｄＮＴＰの量をマニュアルの１／１０量（ｄＡ，ｄＧ，ｄＣ，ｄＴ各２０μＭ）で行ない、９４℃  ３０秒、７２℃９０秒２５サイクル、あるいは９４℃３０秒、５５〜６５℃６０秒、７２℃６０秒２５サイクルで行なった。以下遺伝子合成における２本鎖ＤＮＡ化のＰＣＲ反応は全てプライマーの種類と鋳型ＤＮＡが異なる以外は同様の条件で行なった。
セグメントＡ−１（配列番号６）は両端にＸｂａＩ、ＳｔｙＩ部位を持つ２８２ｂｐの断片で、これは４本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーＡ−１−２、Ａ−１Ｃ−２を用いてＰＣＲを行なった。このＰＣＲで得られた反応液を鋳型としてプライマーＡ−１−１、Ａ−１Ｃ−１を用いてＰＣＲを行ない２８２ｂｐの２本鎖ＤＮＡを得た。
セグメントＡ−２（配列番号７）は両端にＳｔｙＩ、ＡｃｃＩ部位を有する３１２ｂｐの断片で、これも４本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーＡ−２−２、Ａ−２Ｃ−２を用いてＰＣＲを行なった。合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてプライマーＡ−２−１、Ａ−２Ｃ−１でＰＣＲを行ない３１２ｂｐの断片を得た。
セグメントＡ−３（配列番号８）は両端にＡｃｃＩ、ＸｈｏＩ部位を有する２４１ｂｐの断片で、これも４本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーＡ−３−２、Ａ−３Ｃ−２を用いてＰＣＲを行なった。合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてプライマーＡ−３−１、Ａ−３Ｃ−１でＰＣＲを行ない２１４ｂｐの断片を得た。
セグメントＡ−４（配列番号９）は両端にＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ部位を有する２１４ｂｐの断片で、これも４本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーＡ−４−２、Ａ−４Ｃ−２を用いてＰＣＲを行なった。合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてプライマーＡ−４−１、Ａ−４Ｃ−１でＰＣＲを行ない２１４ｂｐの断片を得た。
セグメントＡ−５（配列番号１０）は両端にＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ部位を有する１８４ｂｐの断片で、これは２本のオリゴヌクレオチドから作られた。プライマーＡ−５−１、Ａ−５Ｃ−１を用いてＰＣＲを行ない１８４ｂｐの断片を得た。
セグメントＡ−６（配列番号１１）は両端にＳａｌＩ、ＣＣｌａＩ部位を有する２４１ｂｐの断片で、これも４本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーＡ−６−２、Ａ−６Ｃ−２を用いてＰＣＲを行なった。合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてプライマーＡ−６−１、Ａ−６Ｃ−１でＰＣＲを行ない２４１ｂｐの断片を得た。
セグメントＡ−７（配列番号１２）は両端にＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ部位を有する２８４ｂｐの断片で、これも４本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーＡ−７−２、Ａ−７Ｃ−２を用いてＰＣＲを行なった。合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてプライマーＡ−７−１、Ａ−７Ｃ−１でＰＣＲを行ない２８４ｂｐの断片を得た。
以上の増幅された７断片についてｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Invitrogen社）、またはクレノウ処理およびリン酸化処理を行なったｐＵＣ１１８  ＨｉｎｃIIサイトにクローニングした。同７断片について塩基配列を決定して、設計したものと同一であることを確認した。これらの断片についてそれぞれの末端を認識する制限酵素で消化したのち、低融点アガロースゲル（FMC BioProducts社）を用いて回収を行い、β-Agarase-I（日本ジーン社）を用いて精製を行なった。
これら７断片の接続は以下のように行なった。セグメントＡ−１、Ａ−２、Ａ−３の３断片についてはｐＢＳＩＩＫＳ＋のＸｂａＩ、ＸｈｏＩ部位に同時に挿入した。このプラスミドをｐＡｍｙ１２３と命名した。このプラスミドよりセグメントＡ−１〜Ａ−３を含むＸｂａＩ、ＸｈｏＩ断片を回収しセグメントＡ−４であるＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶ断片とともにｐＢＳＩＩＫＳ＋のＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶ部位に挿入した。このプラスミドをｐＡｍｙ１２３４と命名した。このプラスミドよりセグメントＡ−１〜Ａ−４を含むＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを回収し、セグメントＡ−５を含むＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片と共にｐＢＳＩＩＫＳ＋のＸｂａＩ、ＳａｌＩ部位に挿入した。このプラスミドをｐＡｍｙ１２３４５と命名した。ｐＢＳＩＩＫＳ＋のＳｍａＩ部位にＢｇｌIIリンカー（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）を挿入したベクター（ｐＢＳＢｇｌと呼ぶ）を準備した。このベクターのＢｇｌII、ＳａｌＩ部位にセグメントＡ−６、Ａ−７を挿入した。このプラスミドをｐＡｍｙ６７と命名した。ｐＵＣ１２のＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩサイトをクレノウ処理したのちＢｇｌIIリンカー（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）を挿入したベクター（ｐＵＣ１２ＢｇｌIIと呼ぶ）についてＸｂａＩ、ＢｇｌIIで消化をした。このプラスミドに先のｐＡｍｙ１２３４５よりセグメントＡ−１〜Ａ−５を含むＸｂａＩ−ＳａｌＩ領域、およびｐＡｍｙ６７よりセグメントＡ−６およびＡ−７を含むＳａｌＩ−ＢｇｌII領域を同時に挿入し、スルホロバス・ソルファタリカスＫＭ１株由来アミラーゼ遺伝子（配列番号１３）の合成を完了した。
実施例１３ アミラーゼ発現カセットの作製と形質転換
スルホロバス・ソルファタリカスＫＭ１株由来アミラーゼ遺伝子のＸｂａＩ−ＢｇｌII断片を、ｐＧＡＰＰＴ１０のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ部位に挿入した。このプラスミドをｐＧＡＰＵＡと命名した。その後ＧＡＰプロモーターとＧＡＰターミネーターの間にアミラーゼ遺伝子を含む約３．４ｋｂの発現カセットをＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片として回収した。実施例８で得られたｐＵＲＡＬ１１、ｐＣＲＡＬ１１、およびｐＣＬ１２のＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ部位にｐＧＡＰＵＡ由来の約３．４ｋｂのＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片を挿入し、プラスミドｐＵＲＡＬ１１ＵＡ、ｐＣＲＡＬ１１ＵＡ、およびｐＣＬ１２ＵＡを作製した（図２７）。これらのプラスミドについて制限酵素ＢｇｌＩＩで分解した後、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を実施例７に記載した電気パルス法に従って形質転換を行なった。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行なった。
実施例１４ 酵母形質転換体におけるアミラーゼの発現
プラスミドｐＵＲＡＬ１１ＵＡ、ｐＣＲＡＬ１１ＵＡ、およびｐＣＬ１２ＵＡによる形質転換体をＹＰＤ液体培地で一日培養した後、集菌した菌体について実施例１０の方法に従って可溶性タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、いずれの株においてもアミラーゼは可溶性タンパク質の５０％以上蓄積することが示された。これらのうち、ｐＵＲＡＬ１１ＵＡ由来の株３株、およびシクロヘキシミド耐性遺伝子のみを含むプラスミド（ｐＣＬＲＥ２）で形質転換した株１株から抽出した可溶性タンパク質を４／２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。またさらに、本アミラーゼは耐熱性を有するため、可溶性タンパク質を７０℃３０分処理したサンプルについても、同様に４／２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果を図２８に示す。熱処理した試料に関して活性を調べたところ、スルホロバス・ソルファタリカスＫＭ１株由来アミラーゼの特異的なアミラーゼ活性が認められた。本酵素精製標品の比活性を基に得られた活性から求めた生産量とＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から推定された生産量との間に大きな差が認められなかったことから、酵母で生産したアミラーゼは、活性型であることが示された。
さらにｐＣＲＡＬ１１ＵＡ、ｐＵＲＡＬ１１ＵＡ、およびｐＣＬ１２ＵＡによる形質転換体をそれぞれ、実施例１０の方法に従い、非選択培地で約５０世代培養した後の組み込んだ遺伝子の安定性をみた。その結果、ｒＤＮＡをターゲットとして組み込んだｐＣＲＡＬ１１ＵＡ由来の株においては、５株中３株において生産量の顕著な低下が認められたが、ＵＲＡ３遺伝子座をターゲットとしたｐＵＲＡＬ１１ＵＡおよびＬ４１遺伝子座をターゲットとしたｐＣＬ１２ＵＡ由来の株においては、生産量に大きな変化は認められなかった。このことから、Ｌ４１遺伝子座をターゲットとしたプラスミドもＵＲＡ３遺伝子座をターゲットとしたプラスミド同様、多コピー導入による遺伝子の高発現とその安定性に優れていることが明らかにされた。
実施例１５ ＧＩＦの発現
ヒトGlycosylation Inhibiting Factor（GIF）はＴ細胞で主に生産されるアミノ酸１１５個からなる分子量１２，５００の蛋白質であり、免疫抑制活性を有することが知られている（Mikayama et al.,Proc. Narl. Acad. Sci. USA,90,10056-10060（1993））。このアミノ酸配列をもとにキャンディダ・ユティリスのコドン使用頻度に合わせた３４８ｂｐからなるＤＮＡを合成した。この際、その５’末端にはＮｈｅＩサイト、３’側末端にはＢｇｌＩＩサイトを付加した。この３５０ｂｐからなる断片をＸｂａＩとＢａｍＨＩとで分解したプラスミドｐＧＡＰＰＴ１０（実施例３）に連結してｐＧＡＰＧＩＦ１を構築した（図２９）。
一方、実施例２に記載した１．２ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＳａｌＩシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子断片を、プラスミドｐＣＲＡ１のＸｈｏＩとＰｓｔＩサイトの間に連結してプラスミドｐＣＲＡＬ２を構築した。このプラスミドｐＣＲＡＬ２のＮｏｔＩとＰｓｔＬとの間にプラスミドｐＧＡＰＧＩＦ１からＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片として切り出したＧＡＰプロモーター＋ＧＩＦ遺伝子＋ＧＡＰターミネーター断片を連結してプラスミドｐＲＡＬＧＩＦ２を構築した（図２９）。
このプラスミドをｒＤＮＡ断片内部のＢｇｌＩＩサイトで分解した後、実施例７に示した電気パルス法により、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。得られた形質転換体のうち８株を１０ｍｌのＹＰＤ培地で２４時間振盪培養した。菌体は遠心集菌後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦに懸濁し、グラスビーズで菌体を破砕、１５，０００×ｇで１０分間遠心することにより菌体と不溶性沈殿を除去することにより、可溶性蛋白質を調製した。調製した可溶性蛋白質は１５−２５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより泳動してＧＩＦの発現を調べた。この結果、ＧＩＦに相当する分子量約１．２万の位置にバンドが認められた。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１９２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源：
微生物名：キャンディダ・ユティリス
株名：ＡＴＣＣ  ９９５０
配列
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配列番号：２
配列の長さ：１８４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源：
微生物名：キャンディダ・ユティリス
株名：ＡＴＣＣ  ９９５０
配列
0004158863.tif 000011
配列番号：３
配列の長さ：８２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源：
微生物名：キャンディダ・ユティリス
株名：ＡＴＣＣ  ９９５０
配列
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配列番号：４
配列の長さ：２９１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：５
配列の長さ：９７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：６
配列の長さ：２８２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：セグメントＡ−１
配列
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配列番号：７
配列の長さ：３１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：セグメントＡ−２
配列
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配列番号：８
配列の長さ：２４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：セグメントＡ−３
配列
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配列番号：９
配列の長さ：２１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：セグメントＡ−４
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：１８４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：セグメントＡ−５
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：２４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：セグメントＡ−６
配列
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配列番号：１２
配列の長さ：２８４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：セグメントＡ−７
配列
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配列番号：１３
配列の長さ：１６８０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴
他の情報：アミラーゼ遺伝子
配列
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0004158863.tif 000023
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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