(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）ストレプトコッカス ニュモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の細菌ＤＮＡを単離する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡを、ペニシリンに感受性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的な少なくとも１つのＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびペニシリンに耐性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的な少なくとも１つのＤＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする工程
（ｃ）ペニシリンに感受性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的な少なくとも１つのＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびペニシリンに耐性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的な少なくとも１つのＤＮＡオリゴヌクレオチドが、工程（ａ）の単離されたＤＮＡとハイブリダイズしたかどうかを検出する工程；ならびに
（ｄ）ストレプトコッカス ニュモニエがペニシリンに対して耐性であるかどうかを決定する工程、ここでペニシリンに耐性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、該ストレプトコッカス ニュモニエにおけるペニシリン耐性の指標である
を含む、ストレプトコッカス ニュモニエにおけるペニシリン耐性の同定方法であって、
ペニシリンに感受性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的なプローブが、下記オリゴヌクレオチド：
AGT CAG CAA CGG GTA AG
AAC GAA CGA TGG ACG GT
CAT TTC CAG NCC CCT CCA
TGC AGA TGC CAC GAT TC
CTG GTC AGC TTC CTG CG
TGG TTA TCT AGT CGG GTT AA
CTG TAT CGA TGA GTC CG
AAC AGT TCT GCT GAA GAA G
TAG GAG CAC GCC ATC AGT
GAC GAA ATG CCT ATC TTG
CTC TCA ATT TGT AGC ACC T
CTA TTC TAA CCG TCT GAC A
ATC AAA TAC CTA TAT GGT CC
より選ばれ、
ペニシリンに耐性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的なプローブが、下記オリゴヌクレオチド：
TGG AGA ATA NTT CAA TAG N
GTC TAC TTG AAC AAA AAA TG
TTA GTT GGG ACG GAC CCT
GTA ACN NTT CAA CAG CCT
CTC CGA NCA ATA CGT CTC T
GCT CCA GAT NAA ATG TTT GT
より選ばれる、方法。
【請求項２】
プローブが放射性標識されたものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ストレプトコッカス ニュモニエよりＤＮＡを単離する手段および特異的な耐性決定因子のＰＣＲ増幅のための手段のそれぞれと、ペニシリンに感受性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的なＤＮＡプローブおよびペニシリンに耐性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的なＤＮＡプローブと、試薬、溶液、緩衝液ならびにハイブリダイゼーションおよびそれにつづくハイブリダイズしたＤＮＡの同定のための手段とを含む、ストレプトコッカス ニュモニエのペニシリン−耐性株を同定するためのキットであって、
ペニシリンに感受性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的なプローブが、下記オリゴヌクレオチド：
AGT CAG CAA CGG GTA AG
AAC GAA CGA TGG ACG GT
CAT TTC CAG NCC CCT CCA
TGC AGA TGC CAC GAT TC
CTG GTC AGC TTC CTG CG
TGG TTA TCT AGT CGG GTT AA
CTG TAT CGA TGA GTC CG
AAC AGT TCT GCT GAA GAA G
TAG GAG CAC GCC ATC AGT
GAC GAA ATG CCT ATC TTG
CTC TCA ATT TGT AGC ACC T
CTA TTC TAA CCG TCT GAC A
ATC AAA TAC CTA TAT GGT CC
より選ばれ、
ペニシリンに耐性のストレプトコッカス ニュモニエのＤＮＡ配列に特異的なプローブが、下記オリゴヌクレオチド：
TGG AGA ATA NTT CAA TAG N
GTC TAC TTG AAC AAA AAA TG
TTA GTT GGG ACG GAC CCT
GTA ACN NTT CAA CAG CCT
CTC CGA NCA ATA CGT CTC T
GCT CCA GAT NAA ATG TTT GT
より選ばれる、キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、細菌の抗生物質耐性株の同定のためのＤＮＡプローブ、方法およびキットに関する。
細菌の、特にストレプトコッカス株の抗生物質−耐性株の発生は、問題を増加する。これまで、抗生物質感受性試験は、細菌を単離し、培養を行って生物学的試験において最小抗生物質阻止濃度を規定することにより行われている。この方法は少なくとも１〜２日を要する。充分に計算され、それと共に最適な処置はこの期間内では不可能である。それゆえ、耐性の存在のより迅速な同定が必要とされている。
本発明の目的は、細菌株、特にストレプトコッカッス株を、抗生物質耐性の存在について、迅速かつ確実に試験し得る、産物（Ｍｉｔｔｅｌ）および方法を提供することにある。
この目的は、請求の範囲に規定された主題により達成される。
本発明を、ペニシリン耐性のストレプトコッカス  ニュモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により、以下に説明する。しかしながら、この原理は、同様な一般の様式で、細菌および他の抗生物質に対する耐性にも適用する。β−ラクタマーゼを産生しない、ナイセリア株およびＭＲＳＡ株（メチシリン耐性スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）について実施例にて言及する。
全てのペニシリン耐性ストレプトコッカス  ニュモニエ株は、ペニシリン標的タンパク質（ペニシリン結合タンパク質、ＰＢＰ）を改変していた。ストレプトコッカス  ニュモニエにおいてペニシリン耐性の獲得に決定的な要素として働く遺伝子のＤＮＡ配列が、今のところ、多くのペニシリン−耐性ストレプトコッカス株において決定されていた。感受性株と耐性株の間での差異がペニシリン耐性の獲得に関して生ずる３つの遺伝子：ＰＢＰ２ｘ、ＰＢＰ１ａおよびＰＢＰ２ｂが同定された。
ＤＮＡ配列間の比較は、全ての感受性ストレプトコッカス  ニュモニエ株に存在するが、耐性株では改変されている遺伝子領域内に示す。この点に関し、耐性株は、ＰＢＰ２ｘ遺伝子において感受性株Ｒ６と多かれ少なかれ明らかに異なるが、それら自体の中においても異なることを示す図１を参照にする。
ペニシリン−感受性株とペニシリン−耐性株間の差異が特定の遺伝子内で生ずるという前記発見ゆえ、出願人は、耐性株と感受性株とを区別し得るＤＮＡプローブを開発した。この点に関し、図４を参照にする。感受性配列に特異的なプローブは、ペニシリン耐性を担う低親和性ＰＢＰ変異体をコードする遺伝子を識別する。耐性配列に特異的なプローブは、非常に頻繁に生ずるクラスのＰＢＰ変異体と反応し、疫学的な目的にも用いられ得る。
出願人は、下記のＤＮＡプローブを同定した：
ａ）ＰＢＰ２ｘ用の感受性−特異的プローブ。「ヌクレオチド」欄における数字は公表された配列を指す（Ｌａｉｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５，１９９３〜２００２頁（１９９１））。括弧内の数字は構造遺伝子のコドン内のコドンおよび位置（１、２または３）を指す。ヌクレオチドにおける塩基の番号は「量体（ｍｅｒ）」で示す。
0004172824.tif 000002
ｂ）ＰＢＰ２ｘ用の耐性−特異的プローブ（前記のように；括弧内の配列は感受性株の対応する部分に従う）。
0004172824.tif 000003
ｃ）ＰＢＰ１ａ用の感受性−特異的プローブ（値は構造遺伝子の公表された配列のヌクレオチドをいう；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，３８３１〜３８３６頁（１９９２））。
0004172824.tif 000004
ｄ）ＰＢＰ１ａ用の耐性−特異的プローブ。
0004172824.tif 000005
ｅ）ＰＢＰ２ｂ用の感受性−特異的プローブ（値は構造遺伝子の公表された配列のヌクレオチドを指す；Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ，Ｒ．，Ｍａｔｒｉｎ，Ｃ．，Ｄｏｗｓｅｎ，Ｃ．，Ｇｒｅｂｅ，Ｔ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，５５７４〜５５７７頁（１９９６））。
0004172824.tif 000006
Ｎ＝いずれかのヌクレオチド
前記プローブおよびそれとは１または数個のヌクレオチド、好ましくは４個までのヌクレオチドが異なるプローブのそれぞれは、ペニシリン耐性について未知のストレプトコッカス  ニュモニエ株を試験するのに申し分なく適する。
この目的のため、本発明に従って細菌を試料から遠心分離し、ストレプトコッカス  ニュモニエの場合、ＰＢＰ遺伝子（耐性決定因子）を文献（Ｇｒｅｂｅ  ａｎｄ  Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ（１９９６），Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０，８２９〜８３４頁）に記載されるようにしてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を介して直接増幅する。ストレプトコッカス  ニュモニエに関する利点は、界面活性剤で誘導される溶解が速やかに生じ、従ってＰＣＲを、長く回りくどいＤＮＡ調製なく行い得ることにある。この工程は他のストレプトコッカスを用いるとうまくいかないので、ニュモコッカスＤＮＡのみがこの工程により特異的に増幅される。別の方法として、細菌ＤＮＡ（染色体のものおよび／または染色体外のもの）を標準法に従って単離する。このＤＮＡを、当業者が充分精通している標準条件（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）の下、少なくとも１つの感受性−特異的プローブおよび少なくとも１つの耐性−特異的プローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、好ましくはハイブリダイズするＤＮＡの融解温度の２０℃以下等のストリンジェントな条件下に行われる。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、それらが同様な融解温度を有しており、それと共に、それらのいくつかのものは同じ条件の下で同じハイブリダイゼーションバッチにて試験し得るように、選ばれる（図２参照のこと）。オリゴヌクレオチドは、（Ｐ32、Ｓ35、ビオチン／アビジン系；ジオキシゲニン（ＤＩＧ）−標識；フルオレセイン−標識）が提供された際には、好ましく標識され、そして、固定化ＤＮＡに対しハイブリダイズする。別の方法としては、オリゴヌクレオチドは、非標識の様式でオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ｏｌｉｇｏｎｕｋｌｅｏｔｉｄ−Ｍｉｋｒｏａｒｒａｙ）上に提供され、ハイブリダイズするＤＮＡは、ＰＣＲを介して得られ、増幅の間に標識される。
ハイブリダイゼーションの結果から、未知の株が抗生物質に対し感受性であるか否かを結論づけ得る。耐性遺伝子に依存して、少なくとも１つの感受性−特異的プローブおよび１つの耐性−特異的プローブをハイブリダイゼーションに用いなければならない。しかしながら、一組の感受性−特異的プローブおよび耐性−特異的プローブのみによる耐性の評価は、不正確であり、むしろ荒い推測としてのみ働き得るので、未知の株のＤＮＡは、連続して、いくつかの感受性−特異的プローブおよび耐性−特異的プローブと都合よくハイブリダイズする。これは、ニュモコッカスおよびナイセリアにおけるペニシリン耐性の場合に特に適用する。
好ましいハイブリダイゼーション条件は、ＡＴ含量およびオリゴヌクレオチドの長さに依存する。当業者は、技術知識に基づき適する条件を選択し得る。従って、例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＰＢＰ２ｘ用の標識オリゴヌクレオチド（前記参照のこと）が、４５℃〜６０℃のハイブリダイゼーション温度で少なくとも５時間、好ましくは一晩、ＳＳＣハイブリダイゼーション溶液中で使用される。
オリゴヌクレオチドは、また、それを用いたＰＣＲ試験を行う際に、ＰＣＲプライマーとして使用し得る（図３参照のこと）。この試験により、いくぶんより時間を浪費するハイブリダイゼーションの手間を省くことができる。しかしながら、数度のＰＣＲを株当たりに用いなければならない。この方法は、とりわけ疫学的な目的に適している。
ＰＢＰ１ａ用や、特にＰＢＰ２ｂ用のプローブがほとんど知られていない状況は、より小さな遺伝子領域がＰＢＰ１ａや、特にＰＢＰ２ｂにおける耐性にとって重要であり、それゆえ、より小さい領域のみがまた配列変化を有するという事実により理解される。
本発明は、また、前記方法を行うためのキットに関する。このキットは、細菌からＤＮＡを単離するための手段および特異的な耐性決定因子のＰＣＲ増幅のための手段それぞれ、感受性−特異的ＤＮＡプローブおよび耐性−特異的ＤＮＡプローブ（凍結乾燥したものおよびオリゴヌクレオチドアレイとしたもの、それぞれ）、試薬、溶液、緩衝液ならびにハイブリダイゼーションおよびそれにつづくハイリダイズしたＤＮＡの検出のための手段を含む。感受性−特異的ＤＮＡプローブおよび耐性−特異的ＤＮＡプローブは、好ましくは前記列挙したものである。
本発明の利点は、細菌、特にニュモコッカスを最短の時間内、すなわち数時間内で抗生物質耐性に関し評価し得ることである。これは続いて、病気を患った患者の充分計算された充分な処置を可能にする。
本発明を、以下に示す図によりさらに説明する：
図１は、ペニシリン−感受性株とペニシリン−耐性株間でのストレプトコッカス  ニュモニエＰＢＰ２ｘ遺伝子の遺伝子セクション；コドン８５〜７５０の比較を示す。
Ｒ６：  ペニシリン−感受性株。
その他：  ペニシリン−耐性株。
図２は、オリゴヌクレオチドアレイ上でのハイブリダイゼーションを示す。アレイ上におけるプローブの配置は、図の第１番目のブロックに示される。数字（１）〜（８）および（Ｉ）〜（ＩＶ）はそれぞれ、ＰＢＰ２ｘ用の前記プローブの番号付けに対応する。
Ａ）Ｒ６株、感受性ストレプトコッカス  ニュモニエ研究所株および代表的な他の感受性株：全ての感受性−特異的オリゴヌクレオチド（番号１〜８）が同定されるが、４つの全ての耐性−特異的オリゴヌクレオチド（Ｉ〜ＩＶ）は同定されない。
Ｂ）そのＰＢＰ２ｘ遺伝子が、耐性ニュモコッカスのＰＢＰ２ｘ遺伝子の中で頻繁にそして全体的に存在するクラスに属する２３４９株。改変された配列が遺伝子の３’領域を含んでいないので、１つの感受性−特異的オリゴヌクレオチドのみが同定される。他の全ての感受性−特異的オリゴヌクレオチド（番号２〜８）はハイブリダイズしない。全ての耐性−特異的オリゴヌクレオチド（Ｉ〜ＩＶ）はハイブリダイズする。
Ｃ）Ｊ１９株、一部にのみ２３４９株の配列に相当する配列を有するＰＢＰ２ｘを有する耐性株。１つの耐性−特異的オリゴヌクレオチド（ＩＩＩ）は応答しない。
Ｄ）Ｐｎ１２株、そのＰＢＰ２ｘが異常な配列を有する、パプア由来の耐性株。５つの感受性−特異的オリゴヌクレオチドは応答せず、ＰＢＰ２ｘが連続した感受性配列を有していない（従って、耐性を生ずる）という事実が明らかである。しかしながら、耐性−特異的オリゴヌクレオチドも応答せず、それは、異常な配列が「耐性」遺伝子領域にも存在することを示す。このような株は例外であるが、スクリーニングのため、とりわけ、さらに他のＰＢＰに特異的なオリゴヌクレオチドを用いる場合に、明確に検出し得る。
図３は、アガロースゲル上に適用した際のストレプトコッカス  ニュモニエＲ６  ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲ反応の結果を示す。使用したＰＣＲプライマーは、フォワードプライマーとしての前記（１）〜（７）で示された前記ＰＢＰ２ｘプローブとリバースプライマーとしてのプローブ（８）との各々であった。フォワードプライマーとしてのプローブ（Ｉ）及びリバースプライマーとしてのプローブ（ＩＶ）を有するＰＣＲ、並びにフォワードプライマーとしてのプローブ（ＩＩ）及びリバースプライマーとしてのプローブ（ＩＶ）を有するＰＣＲそれぞれを、コントロールとして実施した。Ｍ＝サイズマーカー。ゲル上で示される、感受性−特異的プローブのみが増幅され、一方、耐性−特異的プローブでは何も生じないことが明らかに同定され得る。
図４（ａ）−（ｉ）配列比較による本発明のプローブの検出。
本発明を、実施例により更に説明する。
実施例：ストレプトコッカス  ニュモニエ細菌ＤＮＡの単離とペニシリン耐性の存在についてのそれにつづく試験
細菌ストレプトコッカス  ニュモニエＲ６株をブレイン−ハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロスに接種し、一晩３７℃で生育させた。細胞を遠心分離して回収し、１０μｌの１０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．２、０．０５％トリトンＸ−１００中で沈殿物を再懸濁し溶解した。各１μｌの細胞懸濁液を２０μｌのＰＣＲバッチ（０．２μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ、１ｐＭ  各オリゴヌクレオチドプライマー、２μｌ  １０×ＰＣＲ緩衝液、４〜６ｍＭ  ＭｇＣｌ2）当たりに使用した。９６℃で５秒のアニーリング、５２℃で５秒のアニーリング、７２℃で１０秒の伸長の２５サイクルでＰＣＲ反応は充分である。
Ａ）アガロースゲル電気泳動
以下のプライマーの組み合わせをＰＣＲ反応に用いる（条件は前記参照のこと）：
0004172824.tif 000007
プローブの名称は、配列に関して前記に示した、ＰＢＰ２ｘについての数字に対応する。
それぞれの場合において、ＰＣＲ反応物４μｌ当分量（アリコート）を１．５％アガロースゲルにアプライし、電気泳動により分離した。その結果を図３に示す。その結果から、Ｒ６が感受性株であることがわかる。
Ｂ１）ドットブロット
ストレプトコッカス  ニュモニエ細菌ＤＮＡを、ＰＣＲ反応において通常のプライマー（Ｇｒｅｂｅ  ａｎｄ  Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ（１９９６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ．４０、８２９〜８３４頁）で増幅する（条件は前記参照のこと）。ＰＣＲで増幅したＤＮＡを加熱（９６℃で２分、次いで４℃）により変性し、その各２μｌをナイロンメンブレン上に、試料ごとにアプライする。ＤＮＡを長波長ＵＶ光を照射することによりメンブレン上に固定し、プレハイブリダイゼーション液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、０．１ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡ）中で５時間ゆっくり振盪しながら非特異的な結合部位を飽和する。ＰＢＰ２ｘ感受性−特異的オリゴヌクレオチドプローブ（１）〜（８）と耐性−特異的プローブ（Ｉ）〜（ＩＶ）それぞれとのハイブリダイゼーションをハイブリダイゼーション緩衝液（プレハイブリダイゼーション液と同様であるが、５０ｎｇ／ｍｌオリゴヌクレオチドプローブを有する）中、約５０℃で一晩行う。フィルターを、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにより、室温で洗浄し、５５℃で２×５分間洗浄した。試料を製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示に従って抗−ＤＩＧ−ＡＰコンジュゲートを用いて染色する。ここで、更に感受性−特異的プローブのみがハイブリダイズし、それは、ストレプトコッカス  ニュモニエＲ６株がペニシリン−感受性株であることを示すということが判明する。
Ｂ２）オリゴヌクレオチドマイクロアレイ
本方法は、Ｂ１）の下、前記規定されるようにして行われたが、オリゴヌクレオチドを最終的なアレイとして提供し、ハイブリダイズするＤＮＡを、ＤＩＧまたはフルオレセイン標識ヌクレオチドによりＰＣＲを介して標識しなければならないという違いがある。高密度マイクロアレイハイブリダイゼーションの原理は、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、１６７５〜１６８０頁、１９９６」に記載されている。この実験の結果を図２Ａに示す。
【図１】
0004172824.tif 000008
【図２】
0004172824.tif 000009
【図３】
0004172824.tif 000010
【図４】
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