(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：10及び配列番号：11に記載の部分アミノ酸配列を含んで成り、SDS-PAGEにより測定される35ｋDaの見かけ分子量（Mr）を有し、そして約4.9の推定等電点（pI）を有する、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のアミノペプチダーゼ活性を示す酵素。
【請求項２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有し、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素。
【請求項３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の保存的置換、１〜30個のアミノ酸の削除、又は１〜25個のアミノ酸の付加により修飾されているアミノ酸配列から成り、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素。
【請求項４】
アミノペプチダーゼ活性を示し、且つ下記のDNA配列によりコードされる酵素：
(a)配列番号：１に記載のDNA配列のアミノペプチダーゼコード部分；あるいは
(b)上記(a)において定義するDNA配列の類似体であって、配列番号：１に記載のDNA配列のアミノペプチダーゼコード部分に対して90％以上の同一性を有するDNA配列。
【請求項５】
配列番号：１に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列によりコードされており、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素。
【請求項６】
アミノペプチダーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構成物において、このDNA配列が、
(a)配列番号：１に記載のDNA配列のアミノペプチダーゼコード部分；あるいは
(b)上記(a)において定義するDNA配列の類似体であって、配列番号：１に記載のDNA配列のアミノペプチダーゼコード部分に対して90％以上の同一性を有するもの、
を含んで成る、ことを特徴とするDNA構成物。
【請求項７】
配列番号：３に記載の部分DNA配列及び／又は４に記載の部分DNA配列及び／又は５に記載の部分DNA配列を含んで成る、請求項６に記載のDNA構成物。
【請求項８】
前記DNA配列が、真菌から得られうる、請求項６又は７に記載のDNA構成物。
【請求項９】
前記真菌が糸状菌又は酵母である、請求項８に記載のDNA構成物。
【請求項１０】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構成物。
【請求項１１】
請求項６〜10項のいずれか１項に記載のDNA構成物を含んで成る、組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項６〜10のいずれか１項に記載のDNA構成物又は請求項11に記載の組換え発現ベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記真菌宿主細胞が酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項13に記載の細胞。
【請求項１５】
アミノペプチダーゼ活性を示す酵素の製造方法において、請求項12〜14のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、そして培養物から前記酵素を採取することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素を含んで成る、食品用タンパク質又はタンパク質加水分解物の苦味を緩和するのに有用な酵素製品。
【請求項１７】
セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、キシラナーゼ、ペプチダーゼ、又はエンドプポテアーゼの如き少なくとも１種の他の酵素を更に含んで成る、請求項16に記載の酵素製品。
【請求項１８】
生地からベークド製品を製造する方法であって、生地製造工程において、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素を生地又は生地原料に添加し、そして得られた生地をベーキングにかける、ことを含んで成る方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素を含んで成る、食品用タンパク質又はタンパク質加水分解物のために使用される組成物。
【請求項２０】
食品用タンパク質又はタンパク質加水分解物の苦味除去のための、請求項19に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素、前記酵素の生産方法、アミノペプチダーゼ活性を示す前記酵素を含有する酵素製剤、および様々な産業目的への前記酵素の使用に関する。
発明の背景
タンパク質水解物は多数の食料品に使用されている。タンパク質水解物は伝統的には酸加水分解により製造されたけれども、現在は酵素加水分解が興味深い代替法と考えられている。
タンパク質水解物の主な問題点の１つは、それらがしばしば苦味を有することである。タンパク源として例えば疎水性Ｌ−アミノ酸が豊富である大豆タンパク質またはカゼインを使った時、タンパク質水解物は苦味を有する傾向がある。一般に、タンパク質の味が苦いかどうかは、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンのようなＬ−アミノ酸残基の平均疎水性によると思われる。
ペプチダーゼ活性を示す多数の酵素は、植物、酵母および／または動物タンパク質に対して酵素加水分解を行うことができ、スープ、ソース、グレーヴィー、ペースト、豆腐、ブイヨン、調味料、乳児用調合乳（フォーミュラ）、スナック、調理済食品などの製品における食品添加物として有用な非常に栄養性の高いタンパク質水解物を生成する。
ペプチダーゼ
ペプチダーゼまたはプロテアーゼは全て、タンパク質またはそれの部分水解物に作用してペプチド結合を分解するヒドロラーゼである。
EP 427,385（The Japanese R & D Association）明細書は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のような黄カビに由来するアルカリ性プロテアーゼをコードするゲノム遺伝子を開示している。
JP-0-2002374および0-2002375（Shokuhin）明細書は、医薬品、食品および洗剤に使われるアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のアルカリ性プロテアーゼを記載している。
SU-891777（Khark）明細書は、食品、医薬品などに使うことができるアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の微生物プロテアーゼに関する。
JP-5-4035283（味の素株式会社）明細書は、ほとんど完全にタンパク質を加水分解することができる、例えばアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の、エンドペプチダーゼ活性を示す酵素の調製を開示している。
WO 94/25580（Novo Nordisk A/S）は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）菌株由来のタンパク質分解酵素製剤と共にインキュベートすることによる、植物または動物タンパク質を加水分解する方法を記載している。
アミノペプチダーゼ
ペプチダーゼ（プロテアーゼ）の１つの亜群はアミノペプチダーゼと呼ばれ、国際生化学・分子生物学連合（IUBMB）による酵素命名法（1992）に従って酵素分類番号E.C．3.4.11（アミノペプチダーゼ）のもとに分類される。
アミノペプチダーゼはポリペプチドから１または複数のアミノ末端残基を除去することができる。
JP-7-5034631（野田）明細書は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）を含む黄色コウジカビ由来のロイシンアミノペプチダーゼを開示している。
JP-7-4021798（財団法人野田産業）明細書は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）460株とIAM 2616株を含む、多数のカビを培養することにより調製したロイシンアミノペプチダーゼIIの添加による、味噌の製造を開示している。
Van Heeke他，Bioch．Biophys．Acta（1992），1131，337-340は、ATCC No．15338のもとにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託された細菌ビブリオ・プロテオリティカス（Vibrio proteolyticus）からの30kDaアミノペプチダーゼのクローニングを開示している。
アスペルギルス・オリゼ460株は、多数のロイシンアミノペプチダーゼを生産することが知られている。それらのうちの３つの分子量は、ゲル濾過によりそれぞれ26,500、56,000および61,000と算定された〔Nakada他，Agr．Biol．Chem．，（1972），37（4），757-765；Nakada他，Agr．Biol．Chem．，（1972），37（4），767-774；Nakada他，Agr．Biol．Chem．，（1972），37（4），775-782〕。アスペルギルス・オリゼ460株はＡ．オリゼATCC No．20386としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されている。
タンパク質水解物の苦味の軽減
EP 65,663およびEP 325,986（Miles Inc.）明細書は、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼを含有する酵素混合物を使ったタンパク質の酵素加水分解に関する。得られたタンパク質水解物は苦味のない口当りのよい味を有する。
JP-4-7029577（旭電気化学工業）は、タンパク質を分解する時に何ら苦味成分を生じない、アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼに関する。
従来技術はペプチダーゼ、アミノペプチダーゼおよび他の酵素活性を示す多数の酵素を開示している。前記酵素は真菌種アスペルギルス・オリゼを含む様々な微生物から得ることができる。
一般に、苦味をもたないタンパク質水解物を製造するのに有用な生成物は、ペプチダーゼ活性とアミノペプチダーゼ活性の混合物を含んで成る。
従って、食品に使われるタンパク質水解物の苦味を減らすのに有用な活性のみを示す一成分酵素（即ち、実質的に全く副活性を持たない酵素）を提供することが望ましい。
【図面の簡単な説明】
図１は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）A01568 35kDaアミノペプチダーゼ生産性形質転換体からの上清のSDS-PAGE分析の結果を示す。
発明の要約
本発明の目的は、改良されたパン製品を製造するのにそして食品用の苦味を持たないタンパク質および／またはタンパク質水解物を製造するのに特に有用である活性を示す一成分酵素を提供することである。
本発明者らは、驚くべきことに、ベークド製品の味、皮の焼色、内相および生地の粘弾性を改良するために有利に使うことができるアミノペプチダーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を単離することに成功した。更に、前記新規酵素は、苦味のないタンパク質またはタンパク質水解物を製造するのに有用である。
前記アミノペプチダーゼをコードする完全ＤＮＡ配列は、一成分アミノペプチダーゼの調製を可能にする。
本発明のアミノペプチダーゼをコードする配列番号１に示される完全ＤＮＡ配列を、プラスミド中に組み込み、菌株エシェリキア・コリ（Escherichia coli）DSM No．9965中に形質転換せしめた。これについては下記に更に記載する。
データベース整列検索により、配列番号１に示されるＤＮＡ配列が新規であることがわかった。最高の相似度および一致度は、細菌ビブリオ・プロテオリティカス（Vibrio proteolyticus）（ATCC寄託番号15338）からの上述の30kDaアミノペプチダーゼに対してそれぞれ53％および32％であるとわかった。
本発明者らは、分泌シグナルと35kDaアミノペプチダーゼから成るアミノペプチダーゼの前駆体形を特徴づけた。この前駆体形の分子量（Ｍw）は41kDaと計算され、等電点（ｐＩ）は約4.9であると推定された。更に、該アミノペプチダーゼのアミノ酸組成は表１に示されるように推定された。
0004040677.tif 000002
35kDa酵素のアミノ酸配列の推定完全前駆体形が配列番号２に示される。
従って、本発明の第一の面は、SDS-PAGEにより決定すると約35kDaの見かけ分子量（Ｍw）を有する、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素に関する。
質量分析法は、組換えアミノペプチダーゼの平均質量が33kDa〜35kDaの範囲内であることを示した。該酵素の等電気点（ｐＩ）は約4.9であると決定された。
等電点ｐＩは、酵素分子複合体（場合により付属の金属または他のイオンを有する）が中性である、即ち、該複合体の静電荷の合計（実効静電荷、ＮＥＣ）がゼロに等しいｐＨ値として定義される。この合計には、もちろん、静電荷の正または負の性質を考慮に入れなければならない。
下記において、「35kDaアミノペプチダーゼ」および「アミノペプチダーゼ活性を示す酵素」という語は、本発明の一成分酵素と相互に交換可能に使われる。
本発明のアミノペプチダーゼ活性を示す酵素は、多数の微生物から得ることができる。本発明者らは、糸状菌アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）A01568から本発明のアミノペプチダーゼを単離した。この菌株は、アスペルギルス・オリゼ460（FERM-P No．1149，ATCC No．20386）としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託された株であり、米国特許第3,914,436号明細書に更に詳しく記載されている。
本発明のアミノペプチダーゼ活性を示す酵素は、配列番号６，７，８，９および10に示される部分アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含んで成る。配列番号11はＮ末端配列と重複しており且つＮ末端配列を延長するペプチド５である。
第二の面では、本発明は、前記アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物であって、前記ＤＮＡ配列が
a）配列番号１に示されるＤＮＡ配列および／またはＥ．コリDSM 9965から得られるＤＮＡ配列のアミノペプチダーゼコード部分；あるいは
b）a）に定義されたＤＮＡ配列の類似体であって、
i）配列番号１に示されるＤＮＡ配列および／またはＥ．コリDSM 9965から得られるＤＮＡ配列と相同であるか、または
ii）配列番号１に示されるＤＮＡ配列および／またはＥ．コリDSM 9965から得られるＤＮＡ配列と同じオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか、または
iii）配列番号１に示されるＤＮＡ配列および／またはＥ．コリDSM 9965から得られるＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと相同であるポリペプチドをコードするか、または
iv）アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）A01568に由来するかまたはＥ．コリDSM 9965から得られる配列番号１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる精製アミノペプチダーゼに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードする
前記ＤＮＡ配列の類似体
を含んで成る、ＤＮＡ構成物に関する。
本明細書中、配列番号１に示されるＤＮＡ配列またはＥ．コリDSM 9965から得られるＤＮＡ配列の「類似体」とは、前記性質i）〜iv）の少なくとも１つを有する、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素をコードする任意のＤＮＡ配列を意味するものである。
この類似体ＤＮＡ配列は、
−  配列番号３〜５に示されるＤＮＡ配列のいずれかに基づいて、例えば本明細書中に記載した手法を使って、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素を生産する別のまたは関連の（例えば同じ）生物体から単離することができ、従って例えば本明細書中に示されるＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体または種変異体であることができる；
−  配列番号３〜５に示されるＤＮＡ配列のいずれかに基づいて、例えば該ＤＮＡ配列によりコードされるアミノペプチダーゼの別のアミノ酸配列を生じないけれども該酵素の生産に使われる宿主生物のコドン用法に該当するようなヌクレオチド置換の導入により、または異なるアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換の導入により、作製することができる。しかしながら、後者の場合、アミノ酸変更は好ましくは重要でない性質のものであり、即ち、ポリペプチドの折り畳みまたは活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換、小規模の、典型的には１〜約30アミノ酸の削除、小規模のアミノ末端もしくはカルボキシル末端伸長、例えば１つのアミノ末端メチオニン残基、約20〜25残基までの小型リンカーペプチドの付加、または精製を容易にする小規模の伸長、例えばポリヒスチジン領域、抗原性エピトープもしくは結合ドメインの付加である。一般にFord他（1991）Protein Expression and Purification 2: 95-107を参照のこと。保存的置換の例は塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）および小型アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）のグループ内である。
当業者には、そのような置換が酵素分子の機能に重要な領域の外側で行われそしてまだ活性酵素をもたらし得ることは明白であろう。本発明の酵素の活性に不可欠であり、従って置換を受けないのが好ましいアミノ酸は、当業界で既知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン−スキャニング突然変異誘発（CunninghamおよびWells，Science  244, 1081-1085，1989）に従って同定することができる。後者の技術では、分子内のあらゆる残基のところに変異を導入し、得られた変異分子を生物分解活性（即ちアミノペプチド分解活性）について試験して、該分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。核磁気共鳴法、結晶学または光親和性標識法のような技術により決定されるような結晶構造の分析によって、基質−酵素相互作用部位も決定することができる。例えば、de Vos他，Science 255, 306-312，1992；Smith他，J．Mol．Biol．224, 899-904，1992；Wlodaver他，FEBS Lett．，309: 59-64，1992を参照のこと。
配列番号３〜５に示されるＤＮＡ配列が、アミノペプチダーゼをコードする完全ＤＮＡ配列、例えば配列番号１に示されるＤＮＡ配列および／または寄託菌株Ｅ．コリDSM 9965中に形質転換されたＤＮＡ配列、を単離するのに使うことができる配列であることは理解されよう。用語「類似体」は、配列番号３〜５に示される部分配列のうちの１つもしくは複数を含んで成る前記完全ＤＮＡ配列、またはそれの一部分を包含するものである。アミノ酸配列（配列番号１に示されるＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列）は配列番号２に示される。
i）において言及される相同性は、第二配列からの第一配列の派生を示唆する２つの配列間の一致度として決定される。相同性は、適切には、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されたＧＡＰ〔Needleman，S.B．およびWunsch，C.D.，（1970），Journal of Molecular Biology，48，p.443-453〕のような当業界で既知のコンピュータープログラムを使って決定することができる。ＤＮＡ配列比較のために次の設定：ギャップ生成ペナルティー5.0、およびギャップ延長ペナルティー0.3でＧＡＰを使った時、該ＤＮＡ配列のコード領域は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列のコード領域またはＥ．コリDSM 9965中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のコード領域と、好ましくは少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％の一致度を示す。
上記のii）において言及されるハイブリダイゼーションは、類似体ＤＮＡ配列が、下記の「材料および方法」のところで詳細に記載する或る特定の条件下で、本発明のアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列と同じプローブにハイブリダイズすることを示すものである。
通常、類似体ＤＮＡ配列は、本発明のアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列に高度に相同であり、例えば配列番号１に示されるＤＮＡ配列またはＥ．コリDSM 9965中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列に少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％までも相同である。
上記のiii）において言及される相同性は、第二配列からの第一配列の派生を示唆する２つの配列間の一致の度合として決定される。相同性は、適切には、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されたＧＡＰ〔Needleman，S.B．およびWunsch，C.D.，（1979），Journal of Molecular Biology，48，p.443-453〕のような当業界で既知のコンピュータープログラムを使って決定することができる。ＤＮＡ配列比較のために次の設定：ギャップ生成ペナルティー5.0、およびギャップ延長ペナルティー0.3でＧＡＰを使った時、該ＤＮＡ配列のコード領域は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列のコード領域またはＥ．コリDSM 9965中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のコード領域と、好ましくは少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％の一致度を示す。
上記の性質iv）に関連した「〜に由来する」という語は、A01568株により生産されるアミノペプチダーゼを示すだけでなく、A01568株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされそして前記ＤＮＡ配列により形質転換された宿主生物中で生産されるアミノペプチダーゼも意味するつもりである。免疫学的反応性は下記の「材料および方法」という項目に記載する方法によって決定することができる。
更なる面では、本発明は、本発明のＤＮＡ構成物を含有する発現ベクター、該ＤＮＡ構成物または発現ベクターを含んで成る細胞、およびアミノペプチダーゼ活性を示す酵素の生産方法であって、前記酵素の生産を許容する条件下で前記細胞を培養しそして培養物から前記酵素を回収することを含んで成る方法に関する。
本発明の35kDaアミノペプチダーゼが濃縮された酵素調製物を提供することも本発明の目的である。
更に、本発明は、本発明のアミノペプチダーゼ活性を示す酵素を含んで成るパン改良または生地改良用組成物を提供する。前記組成物は別の酵素、例えばデンプン分解酵素、および従来のパン改良剤と組み合わせることができる。
更に別の面では、本発明は、本発明の35kDaアミノペプチダーゼを含んで成るベークド製品および冷凍生地の製造方法に関する。
最後に、本発明は、本発明の35kDaアミノペプチダーゼの使用に関する。本発明の酵素またはそのような酵素を含んで成る本発明の組成物は、ベークド製品の風味、外皮の焼色および内相構造を改良するために、並びに冷凍生地の粘弾性を改良するために使うことができる。本発明のアミノペプチダーゼは、更に、苦味のないタンパク質およびタンパク質水解物と関連して有益に利用することができ、そしてタンパク質含有物質の分解または修飾；コンタクトレンズの洗浄；食品および動物飼料の製造をはじめとする、様々な目的に使うことができる。
発明の詳細な説明
アミノペプチダーゼ活性を示す酵素をコードする本発明のＤＮＡ配列は、次の段階を含む一般法により単離することができる：
−  アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）からのＤＮＡライブラリーを適当なベクター中でクローニングし、
−  前記ベクターを用いて適当な酵母宿主細胞を形質転換せしめ、
−  該ＤＮＡライブラリー中のクローンによりコードされる着目の酵素を発現せしめるのに適当な条件下で前記宿主細胞を培養し、
−  そのようなクローンにより生産される酵素のアミノペプチダーゼ活性を測定することにより、陽性クローンについてスクリーニングし、そして
−  そのようなクローンから１酵素をコードするＤＮＡを単離する。
この一般法はWO 93/11249に開示されており、その内容が参考として本明細書中に組み込まれる。スクリーニング方法の更に詳細な説明は下記の実施例３に与えられる。
微生物源
本発明のアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列は、例えば、ドナー生物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして適当な酵素活性（即ちロイシン−７−アミド−４−メチルクマリンを加水分解する酵素の能力により定義されるようなアミノペプチダーゼ活性）を発現するクローンについて選択することにより、単離することができる。次いで、そのクローンから標準手順、例えば実施例１に記載した手順により適当なＤＮＡ配列を単離することができる。
ドナー生物は、米国特許第3,914,436号に記載された真菌アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（ATCC No．20386）であることができる。
本発明のアミノペプチダーゼをコードする完全な全長ＤＮＡ配列を、発現プラスミドpYES 2.0（Invitrogen）中に含めた形で、Ｅ．コリの菌株中に形質転換せしめた。本発明者らは前記細菌を特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って、ＤＳＭ（the Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellku-lturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，ドイツ連邦共和国）に寄託した。
寄託日：1995年５月11日
寄託者側の参照番号：NN49001
ＤＳＭ名称：Ｅ．コリDSM No．9965
ブダペスト条約に基づく国際寄託機関であるＤＳＭ（Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）は、前記条約の規則と規定（特に第９条を参照のこと）に従って、寄託を実行する。37 C.F.R．Par．1.14および35 U.S.C．Par．122のもとに米国特許商標局の局長により権利を与えると決定された人に対して、当該特許出願の係属中に２つの寄託物の入手が可能であろう。また、上記寄託物はEPC 28規則に従った微生物に関する欧州特許出願の要件を満たす。
上記寄託物は、単離された細菌の実質的に純粋な培養物を表す。この寄託物は、本出願の相応物またはそれの子出願が出願される国における外国特許法により求められれば入手可能である。しかしながら、寄託された菌株の入手可能性が、政府の制定により認められる特許権を損害して本出願を実施するための認可を与えるものではないと理解すべきである。
アミノペプチダーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列は、例えば、上述した寄託菌株から標準法により単離することができる。
別の微生物から、相同酵素をコードするＤＮＡ配列、すなわち類似ＤＮＡ配列が得られると期待される。例えば、別の微生物、特に真菌、例えばアスペルギルス種の菌株、特にＡ．アクレータス（A．aculeatus）もしくはＡ．ニガー（A．niger）の菌株、別のトリコデルマ（Trichoderma）種の菌株、特にＴ．リーセイ（T．reesei）、Ｔ．ビリデ（T．viride）、Ｔ．ロンギブラキアタム（T．longibrachiatum）もしくはＴ．コニンギイ（T．koningii）、フザリウム（Fusarium）種の菌株、特にＦ．オキシスポラム（F．oxysporum）の菌株、またはフミコラ（Humicola）種の菌株、のｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることにより誘導することができる。
あるいは、本発明のアミノペプチダーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列は、周知の手順に従って単離することができ、便利には、本明細書中に開示されるＤＮＡ配列に基づいて調製した合成オリゴヌクレオチドプローブを使って、適当な供給源、例えば上述した微生物のいずれかのＤＮＡから、単離することができる。例えば、適当なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３〜５に示されるヌクレオチド配列もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列またはそれらの任意の適当な部分配列のいずれかを基にして調製することができる。
単離されたＤＮＡ配列は、続いて、組換え発現ベクター中に挿入することができる。この組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ操作に上手くかけることができる任意のベクターであり、発現ベクターの選択はしばしばそれを導入しようとする宿主細胞によるだろう。よって、ベクターは自己複製ベクター、即ちその複製が染色体複製から独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいは、ベクターは宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
ベクター中、アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーターおよびターミネーター配列に作用可能に連結されるべきである。プロモーターは特定の宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、宿主細胞にとって相同または非相同であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導することができる。アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれ連結せしめ、そしてそれらを適当なベクター中に挿入するのに使う手法は、当業者に周知である〔例えばSambrook他（1989），Molecular Cloning．A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NYを参照のこと〕。
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列により形質転換される宿主細胞は、好ましくは真核細胞、特に真菌細胞、例えば糸状菌または酵母細胞である。特に、該細胞は、アスペルギルス種に属し、最も好ましくはアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）または
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）に属することができる。真菌細胞は、それ自体既知の方法で、プロトプラスト形成およびプロトプラストの形質転換に続く細胞壁の再生を含む方法により形質転換せしめることができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用は欧州特許第238 023号（Novo Nordisk A/S）明細書に記載されており、その内容は参考として本明細書中に組み込まれる。宿主細胞は酵母細胞、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）種、特にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）もしくはサッカロミセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）の株、またはシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種、特にシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）の株、ハンゼヌラ（Hansenula）種、ピキア（Pichia）種、ヤロウィア（Yarrowia）種、例えばヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia  lipolytica）、またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）種、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）の株であってもよい。
本発明の酵素の生産方法
更に別の面では、本発明は、本発明の酵素の生産方法であって、該酵素をコードするＤＮＡ配列によって形質転換された適当な宿主細胞を、該酵素の生産を許容する条件下で培養し、そして生成した酵素を培養物から回収することを含んで成る方法に関する。
形質転換した宿主細胞を培養するのに使う培地は、問題の宿主細胞を増殖させるのに適当な任意の通常培地であることができる。発現されたアミノペプチダーゼを便利には培地中に分泌させ、そして遠心分離または濾過により該培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩を使って培地のタンパク様成分を沈澱させ、次いでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー手法により精製することを含んで成る周知の手順により、培地から該アミノペプチダーゼを回収することができる。
酵素製剤
更に他の面では、本発明は、食品用のタンパク質および／またはタンパク質水解物の苦味を減らすのに有用な酵素製剤に関する。
本発明の酵素が濃縮されている酵素製剤は、例えば、複数の酵素活性を含んで成る酵素製剤、例えばタンパク質水解物の製造のための複数の酵素を含んで成る酵素製剤であることができる。濃縮させることのできる酵素製剤は、Flavourzyme▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/Sから入手可能）であることができる。Flavourzyme▲Ｒ▼は、タンパク質の加水分解用に開発されたアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ／ペプチダーゼ複合体である。
該酵素製剤を使用する予定である用途に応じて、本発明のアミノペプチダーゼを後述するような別の酵素と組み合わせることができる。
本明細書中、「濃縮された（enriched）」という語は、便利には上記方法により調製された本発明の酵素の添加によって酵素製剤のアミノペプチダーゼ活性が増加されていること、例えば少なくとも約1.1、好ましくは1.1〜10、より好ましくは2〜8、特に4〜6の濃縮倍率で増加されていることを示すものである。
あるいは、アミノペプチダーゼ活性が濃縮された酵素製剤は、主要酵素成分として本発明の酵素を含んで成るもの、例えば一成分酵素製剤である。
酵素製剤は当業界で既知の方法に従って調製することができ、液体または乾燥製剤の形であることができる。例えば、酵素製剤は顆粒または微粒の形であることができる。該製剤中に含めるべき酵素は、当業界で既知の方法に従って安定化することができる。
別の面では、本発明は、本発明のアミノペプチダーゼを含んで成るパン改良またはパン生地改良組成物に関する。前記組成物は、デンプン分解酵素、例えばα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、麦芽α−アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、酸安定性アミラーゼ、および１，６−プルラナーゼを含む群より選ばれた酵素を更に含んで成ってもよい。
そのような酵素は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）の株から得られるAMGTM（アミログルコシダーゼ）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の株から得られるFungamylTM（真菌アミラーゼ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus  stearothermophilus）の株から得られるNovamylTM（麦芽アミラーゼ）として、Novo Nordisk A/Sから入手可能である。
本発明の組成物は１または複数の追加の酵素を含んで成ってもよい。そのような酵素の例としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ（生地の伸展性を増加させるペントサンの部分加水分解に有用である）、リパーゼ（生地を柔らかくするような生地または生地成分中に存在する脂質の改質に有用である）、ペルオキシダーゼ（パン生地の粘弾性を改善するのに有用である）、オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ラッカーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ（特に硬質小麦粉を使う時、グルテン弱化に有用である）。
別の酵素成分は、好ましくは微生物起源のものであり、上述したような当業界で使う常用技術により得ることができる。
本発明において使うことができる１または複数の酵素は、問題の用途に適した任意の形態、例えば乾燥粉剤または粒剤の形、特に無粉塵性粒剤、液体、特に安定化液体、または保護された酵素の形であることができる。粒剤は、例えば米国特許第4,106,991号および同第4,661,452号（ともにNovo Industri A/S）明細書に開示されたようにして製造することができ、そして所望により当業界で既知の方法によりコーティングすることができる。液体酵素製剤は、例えば、確立された方法に従って、栄養学的に許容される安定剤、例えば糖、例えば糖アルコールまたは別のポリオール、乳酸もしくは別の有機酸を添加することにより、安定化することができる。保護された酵素は欧州特許第238,216号明細書に開示された方法に従って調製することができる。
通常、プレミックスまたは小麦粉の中に含めるには、酵素は乾燥製品、例えば無粉塵性粒剤の形であることが有利であり、一方で液体と一緒に含めるには、液体の形であるのが有利である。
別の酵素成分に加えてまたはそれに代わるものとして、生地改良および／またはパン改良用組成物は、常用のベーキング剤、例えば下記成分のうちの１つまたは複数を含んで成ることができる：
粉乳（皮の焼色を提供する）、グルテン（薄力粉のガス保持力を改善する）、乳化剤（生地の伸展性を改善しそして出来上がったパンのコンシステンシーを幾らか改善する）、粒状脂肪（生地を柔らかくするためおよびパンのコンシステンシーのため）、酸化剤（グルテン構造を強化するために添加される；例えばアスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、または過硫酸アンモニウム）、砂糖および塩（例えば生地をより引き締める働きをする、塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸カルシウム）、小麦粉、または澱粉。そのような成分は本発明の方法に従って直接添加してもよい。
適当な乳化剤の例は、モノまたはジグリセリド、モノまたはジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、リン脂質およびレシチンである。
本発明のパン改良および／または生地改良用組成物は、典型的には0.01〜５％、特に0.1〜３％に相当する量で生地の中に含められる。
本発明のアミノペプチダーゼ活性を有する酵素を、所望により上述したような別の酵素と組合せて、生地および／またはベークド製品の調製に使用する本発明の方法によれば、１または複数の酵素は、そこから生地が作られる混合物にまたはそこから生地を作ることになっている任意の成分（例えば小麦粉）にそのままの形で添加することができる。あるいは、１または複数の酵素は上述の生地改良および／またはパン改良用組成物の１成分として、小麦粉もしくは他の生地成分にまたは生地を作ることになっている混合物に直接添加することができる。
本発明の方法に使うことのできる酵素の用量は、問題の生地の性質および組成に、並びに使用する酵素の性質に合わせるべきである。通常、酵素製剤は、小麦粉１kgあたり酵素タンパク質0.01〜1000mg、好ましくは小麦粉１kgあたり酵素タンパク質0.1〜100mg、より好ましくは小麦粉１kgあたり酵素タンパク質0.1〜10mgに相当する量で添加される。
酵素活性の点から見ると、ベークド製品の皮の焼色または小麦粉の所望の改良を果たすために、所望により１または複数の別の酵素と組み合わせた、アミノペプチダーゼ活性を有する一定の一成分酵素の適切量は、１または複数の問題の酵素と１または複数の酵素基質に依存するだろう。最適量は、小麦粉または酵母の種類およびベーキング（焙焼）方法によって異なり得る。熟練者は当業界で既知の方法に基づいて適当な酵素単位用量を決定することができる。
しかしながら、本発明によれば、本発明のアミノペプチダーゼ活性を示す酵素は、小麦粉１kgあたり30〜1000LAPU、好ましくは50〜500LAPU、特に80〜300LAPU、例えば約100LAPUに相当する量で添加される。LAPUについては下記に定義する。
デンプン分解酵素は通常、小麦粉１kgあたり1〜50FAUの量で添加される。１FAU（真菌α−アミラーゼ単位）は、αアミラーゼ活性の測定のためのNovo Nordiskの標準法を使って１時間あたり5.26gのデンプン（Merck，Amylum solubile Erg．B.6，BAch 9947275）を分解する酵素の量である。Novo Nordiskの分析方法（AF 216）の詳細は請求すれば入手可能である。
麦芽アミラーゼは通常、小麦粉１kgあたり１〜1000MANU（麦芽アミラーゼNovo単位）の量で添加される。１MANUは、標準条件下で１分あたり１マイクロモルのマルトトリオースを加水分解する酵素の量として定義される。分析方法（AF 203）は請求すれば入手可能である。
本発明の方法に従って１または複数の追加の酵素活性を添加しようとする時、エキソペプチダーゼ活性を有する一成分酵素と別々にまたは一緒に、所望により本発明のパン改良および／または生地改良用組成物の１成分もしくは複数成分として、それらの活性を添加することができる。この追加の酵素活性は上述した酵素のいずれであってもよく、確立されたベーキング方法に従って用量決定することができる。
上述したように、アミノペプチダーゼ活性を示す酵素は、所望により１または複数の別の酵素と組み合わせて、生地成分の任意の混合物に、生地に、または生地中に含めるべき成分のいずれかに添加することができ、言い換えれば、酵素は生地調製の任意の段階で添加することができ、そして適当ならば１，２またはそれ以上の段階で添加することができる。
生地の処理および／またはベーキング（焙焼）は、問題の生地および／またはベークド製品に適当な任意の方法で、典型的には生地を練り、生地を１または複数のプルーフ処理にかけ、そして適当な条件下で、即ち適当な温度で且つ十分な時間に渡り、製品を焼き上げることを含んで成る方法により、行われる。例えば、生地は、通常の直捏法（ストレート法）、醗酵生地法、一晩生地法、低温長時間醗酵法、冷凍生地法、Chorleywood製パン法、または中種法（スポンジ法）を使って調製することができる。
本発明の方法により製造された生地および／またはベークド製品は、所望により他の種類のあら粉または細粉、例えばトウモロコシ粉、ライ麦のあら粉もしくは細粉、オート麦の細粉もしくはあら粉、大豆粉、モロコシのあら粉もしくは細粉またはジャガイモのあら粉もしくは細粉と組み合わせた、小麦あら粉または小麦粉をベースにしている。
本明細書中、「ベークド製品」という語は、柔らかい性質（ソフト）またはカリカリした性質（クリスピー）のいずれかの、生地から調製された任意の製品を包含するつもりである。白色、薄色または濃色のタイプのいずれかに関わらず、本発明により有利に製造することができるベークド製品の例は、典型的にはローフ形またはロール形のパン（白パン、全麦パンまたはライ麦パン）、バケット型のフランスパン、ピタパン、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クリスプパンなどである。
本発明の生地は、上述したタイプのいずれのものであってもよく、そして生のものまたは冷凍のものであってもよい。
冷凍生地の調製は、K．KulpとK．Lorenzにより“Frozen and Refrigerated Doughs and Batters”中に記載されている。冷凍パンに本発明のアミノペプチダーゼを使うと、香り、皮の焼色およびサクサク感が改善される。
上記開示から、本発明の生地は一般に醗酵させた生地または醗酵にかける生地であることは明らかだろう。生地は様々な方法で、例えば重炭酸ナトリウムなどの添加により、またはパン種（醗酵した練り粉）を添加することにより醗酵させることができるが、適当な酵母培養物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae；パン酵母）の培養物を添加することにより、生地を醗酵させるのが好ましい。市販のＳ．セレビシエ株のいずれを使ってもよい。
上述したように、本発明は更に、生地用のまたは生地から作られるベークド製品用の、例えば小麦粉配合物の形の、プレミックスであって、本発明のアミノペプチダーゼ活性を示す酵素と、所望により上記に明記したような別の酵素とを含んで成るプレミックスに関する。該プレミックスは、関連する１または複数の酵素または該酵素を含んで成る本発明のパン改良および／または生地改良用組成物を、適当な担体、例えば小麦粉、デンプン、砂糖または塩と混合することにより、調製することができる。このプレミックスは、他の生地改良および／またはパン改良用添加物、例えば上述した添加物（酵素を含む）のいずれを含んでもよい。
本発明の35kDaアミノペプチダーゼの利用
ベークド製品の製造への本発明の酵素の利用
本発明の酵素または酵素製剤は、例えばいわゆる硬質小麦粉を軟らかくする目的で小麦粉のグルテン成分を減らすために、ベーキング時に用いることができる。
しかしながら、驚くべきことに、本発明のアミノペプチダーゼはベークド製品の製造にプロテアーゼを使った時に通常観察されるようなグルテンの網目構造を分解しないことがわかった。従って、生地の特性や内相構造に影響を及ぼさない。
更に、ベークド製品の製造時に生地または生地成分に本発明の35kDaアミノペプチダーゼを添加すると、実施例13に示されるようにベークド製品の風味および／または内相および／または皮の焼色が実質的に改良されるだろう。
更に、本発明の酵素は生地の粘弾性を改良する。
本発明の酵素の添加は、「焼きたての」パンの香りを与える、イースト風味を有するベークド製品をもたらす。これは、酵素の添加が付随のイースト風味の低下を伴わずに中種醗酵時間を減らすことができるために、中種法（スポンジ法）にとって特に興味深い発明であり、そして直捏法から製造した製品に通常欠けているイースト風味を本発明の酵素が提供できるために、直捏法（no-time-dough process）（大部分のヨーロッパ製法）においても特に興味深い発明である。
特定の理論に限定されることなく、エキソペプチダーゼ活性を有する一成分酵素を、デンプン分解酵素、特に小麦粉または生地の他の成分から還元糖分子を遊離させることができるデンプン分解酵素と併用して使った時、改良されたベークド製品の風味および／または皮の焼色を得ることができると現在のところ考えられる。生地の中の還元糖の量が増加すると、Maillard反応が増大し、それによってベークド製品の風味および皮の焼色を更に良くする。
苦味を減らすための本発明の酵素の利用
本発明の酵素または酵素製剤は、食料品中のタンパク質および／またはタンパク質水解物の苦味を減らすために使うことができる。
本発明に従って期待されるのは、タンパク質および／またはタンパク質水解物からの遊離アミノ酸の生産である。遊離アミノ酸がグルタミン酸である場合、それは食品の風味を高める。
前記タンパク質またはタンパク質水解物は動物または植物起源のものであることができる。
本発明の一態様では、加水分解されるタンパク質がカゼインまたは大豆タンパク質である。
該タンパク質はチーズまたはココア含有食品のような食品を製造するのに用いることができる。
本発明のアミノペプチダーゼおよび本発明の酵素が濃縮された酵素製剤は、苦みのないタンパク質またはタンパク質水解物の製造と関連して特に有利に使用することができるけれども、本発明のアミノペプチダーゼは、タンパク質含有物質、例えば細胞壁の分解または修飾を含む、多数の工業的用途に用いることができる。エクステンシンのような或る種のタンパク質は植物細胞壁の成分である。従って、アミノペプチダーゼは植物細胞壁の分解または修飾を促進するだろう。
本発明の酵素製剤の用量および該製剤を使用する際の他の条件は、当業界で既知の方法に基づいて決定することができる。
植物からの油の抽出
本発明の酵素製剤は、オリーブやセイヨウアブラナのような植物源からの油の抽出に並びにリンゴ、ナシおよび柑橘類のような様々な果物からの果汁の製造に有用である。曇り生成を防ぐために、ワイン産業、特に白ワイン産業にも有用であろう。更に、タンパク質を改質しそして分解させるため、例えばタンパク質によって生じるもしくは部分的に生じる粘性を減らすため、またはタンパク質が関与する醗酵工程を促進するためにも用いることができ、あるいはタンパク質および他の栄養素の消化性を高めるために用いることができる。
食品および飼料の製造への利用
アミノペプチダーゼ製剤は、タンパク質の消化性を高めるために食品および飼料産業において利用することもできる。例えば、酵素または酵素製剤を動物飼料に添加することができ、または動物飼料、特に子豚もしくは家禽用の飼料を加工するのに使うことができる。
更に、本発明の酵素または酵素製剤は、例えば大豆、エンドウマメ、ハウチワマメもしくは菜種タンパク質のような植物タンパク質、乳状カゼイン、肉タンパク質、または魚タンパク質から、タンパク質水解物を製造するのに有用である。該アミノペプチダーゼは、タンパク質水解物の溶解度、粘稠度もしくは醗酵度を改良するためにまたは抗原性を減少させるために有用であり、または食品、飼料もしくは医薬品を製造する際の他の目的に有用である。該アミノペプチダーゼは単独でまたは他のアミノペプチダーゼと共にもしくはエキソペプチダーゼのような別の酵素と共に使用することができる。エキソペプチダーゼ濃縮酵素製剤と併用した本発明のアミノペプチダーゼの使用は、タンパク質水解物の味を良くするだろう。
更に、本発明の酵素または酵素製剤は、魚または肉の加工において、例えば触感および／または粘りを変えるために用いることができる。
醸造工程における利用
本発明の酵素製剤は、例えばビールの製造のための大麦、モルトおよび他の原料の酵母醗酵といった醗酵工程を促進するためにも用いることができる。
プロトプラスト形成への利用
本発明の酵素製剤は真菌からのプロトプラストの形成にも有用である。
ペプチドの製造への利用
本発明の酵素製剤はタンパク質からのペプチドの製造に有用であり、この場合、他のタンパク質分解活性を本質的に持たないクローン化された酵素を使うことが有利である。
タンパク質の分解への利用
更に、本発明のアミノペプチダーゼ製剤は、様々な生成物の精製を促進するためまたは様々な生成物の品質を改良するために、例えばゴム、例えばグアーゴム、キサンタンゴムの精製もしくは品質向上、シルクの精錬、またはウールの品質向上に、利用することができる。
コンタクトレンズの洗浄への利用
更に、本発明の酵素または酵素製剤はコンタクトレンズの洗浄に利用することができる。
本発明を下記の実施例においてより具体的に記載するが、この実施例は本発明の請求の範囲を限定するために与えられるのではない。
材料および方法
材料
・ドナー生物：アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）A01568（米国特許第3,914,436号明細書に記載）。
・宿主生物：
エシェリキア・コリ（Escherichia coli）MC1061〔Meissner他（1987），Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，84，4171-4176〕：cDNAライブラリー株。
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）W3124〔van den Hazel他（1992），Eur．J．Biochem．，207，277-283〕：活性スクリーニング株。
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）：
0004040677.tif 000003
他（1989），FEBS Letters，248，105-110。
・他の生物：
アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）A1560〔Christensen他（1988），Bio/Technology 6，1419-1422〕。
・プラスミド：
pYES 2.0：形質転換ベクター（Invitrogen）。
pHD414：アスペルギルス発現ベクターはプラスミドp775の誘導体（欧州特許第238.023号明細書に記載）である。pHD414の作製はWO93/11249中に更に記載されている。pHD414はＡ．ニガーのグルコアミラーゼターミネーターとＡ．オリゼのTAKAアミラーゼプロモーターを含有する。
pHD423は、新しいポリリンカーを有するpHD414の誘導体（WO 94/20611に記載）である。
pUC18：発現ベクター〔Sambrook他（1989），Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York〕。
pC1EXP3：本発明の35kDaアミノペプチダーゼをコードする1.4kb cDNA挿入断片を含んで成るプラスミド（実施例３と配列番号１を参照のこと）。
pC1EXP4：pC1EXP3の1.4kb cDNA挿入断片よりも120bp短いcDNA配列を含んで成るプラスミド（実施例10と配列番号12を参照のこと）。
p3SR2：Ａ．ニデュランス（A．nidulans）amdS+遺伝子を含有するプラスミド〔Christensen他（1988），Bio/Technology 6，1419-1422〕。
pP1：ＡＤＨプロモーターおよび選択マーカーとしてのURA 3を含有するＥ．コリ／Ｓ．ポンベ間シャトルベクターである酵母発現ベクター
0004040677.tif 000004
・プライマー
万能pUCプライマー〔Sambrooｋ他（1989），前掲〕。
ＰＣＲ反応において使われる推定プライマー配列
0004040677.tif 000005
（ｓ＝センス、as＝アンチセンス）
Ａ＝アデニン；Ｇ＝グアニン；Ｃ＝シトシン；Ｔ＝チミン；Ｉ＝デオキシイノシン；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＴ。
正および逆pYESプライマー（Invirtogen）。
・酵素
リジン特異的プロテアーゼ
ノボザイム（Novozym▲Ｒ▼234；登録商標）（Novo Nordisk A/S）
アルカラーゼ（Alcalase▲Ｒ▼；登録商標）（Novo Nordisk A/S）
ニュートラーゼ（Neutrase▲Ｒ▼；登録商標）（Novo Nordisk A/S）
・35kDaアミノペプチダーゼのペプチド
配列番号６〜11を参照のこと。
Ｎ末端：
真正および組換えアミノペプチダーゼの直接Ｎ末端配列分析は２つの酵素のＮ末端アミノ酸配列が同じであることを明らかにし、これは、組換え酵素が真正酵素と同じようにタンパク質分解プロセシングされることを示す。判明したＮ末端配列は次の通りであった：
0004040677.tif 000006
（Xaaはグリコシル化されたAsn残基である）
リジン特異的プロテアーゼでの開裂によってアミノペプチダーゼのＳ−カルボキシメチル化試料から誘導されたペプチドより、次のペプチド配列が得られた。
0004040677.tif 000007
（Ｎ末端配列と重複しそしてＮ末端配列を伸長する）
・培地および他の材料
ＳＴＣ：1.2Mソルビトール、10mM Tris-HCl，pH=7.5，10mM CaCl2
ＢＳＡ：Sigma，H25型
ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン（Sigma）
PEG 4000（ポリエチレングリコール、分子量＝4,000）
（BDH，England）
シークエナーゼ（Sequenase▲Ｒ▼；登録商標）キット
（United States Biochemical，USA）
ハイボンド−Ｎナイロン膜（Amersham，USA）
Ｑ−セファロース（Pharmacia商標）
Superdex 200  商標
Amicon膜
VG Analytical TofSpec
α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（Aldrich，Steinheim，Germany）
ＹＰＤ：10gの酵母エキス、20gのペプトンを水で810mlに。オートクレーブ滅菌し、90mlの20％グルコース（濾過滅菌済）を加えた。
10×Basal塩：66.8gの酵母窒素ベース、100gのコハク酸、60gのNaOH、水を加えて1000mlにし、濾過滅菌した。
sc-URA：90mlの10×Basal塩、22.5mlの20％カザミノ酸、９mlの１％トリプトファンを、水で806mlにし、オートクレーブ滅菌し、3.6mlの５％スレオニンと90mlの20％グルコースまたは20％ガラクトースを加えた。
SC-Hブロス：7.5g/ｌのアミノ酸不含有酵母窒素ベース、11.3g/ｌのコハク酸、6.8g/ｌのNaOH、5.6g/ｌのビタミン不含有カザミノ酸、0.1g/ｌのトリプトファン。121℃で20分間オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ後、培地100mlあたり、10mlの30％ガラクトース溶液、５mlの30％グルコース溶液および0.4mlの５％スレオニン溶液を加えた。
SC-H寒天：7.5g/ｌのアミノ酸不含有酵母窒素ベース、11.3g/ｌのコハク酸、6.8g/ｌのNaOH、5.6g/ｌのビタミン不含有カザミノ酸、0.1g/ｌのトリプトファンおよび20g/ｌの寒天（Bacto）。121℃で20分間オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ後、培地450mlあたり、55mlの22％ガラクトース溶液と1.8mlの５％スレオニン溶液を加えた。
YNB-1寒天：3.3g/ｌのKH2PO4、16.7g/ｌの寒天、pHを７に調整。121℃で20分間オートクレーブ滅菌。オートクレーブ後、寒天450mlあたり25mlの13.6％アミノ酸不含有酵母窒素ベース、25mlの40％グルコース溶液、1.5mlの１％Ｌ−ロイシン溶液および1.5mlのＬ−ヒスチジン溶液を加えた。
YNB-1ブロス：YNB-1寒天と同じ組成だが、寒天を含まない。
最少平板：〔Cove Biochem．Biophys．Acta 113（1966）51-56〕1.0Mショ糖，pH7.0、窒素源としての10mMアセトアミドおよび20mM CsClを含有する。
乳漿タンパク質水解物：アルカラーゼ▲Ｒ▼とニュートラーゼ▲Ｒ▼で加水分解したホエーをタンパク質含量が全溶液の８％（w/w）になるまで水で希釈したもの。
方法
・ＲＮＡの単離：
Ａ．オリゼA01568の菌糸の凍結乾燥粉末から、チオシアン酸グアニジンでの抽出後に5.7M CsClクッションを通した超遠心により、全ＲＮＡを単離した〔Chirgwin他（1979），Biochemistry 18，5294-5299〕。ポリ（Ａ）+ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニティークロマトグラフィーにより単離した〔Aviv，H.およびLeder，P．（1972），Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．69，1408-1412〕。
・cDNA合成：
25ngのランダムヘキサヌクレオチドプライマー（Pharmacia，Sweden）を第一鎖合成に含めること以外はKofod他，J．of Biol．Chem．（1994），269，29182-29189により記載された通りに、５μgのアスペルギルス・オリゼのポリ（A）+RNAから二本鎖cDNAを合成した。
・cDNAライブラリーの作製：cDNAライブラリーはKofod他，J．of Biol．Chem．（1994），269，29182-29189により記載された通りに作製した。
・サッカロミセス・セレビシエの形質転換：
全細菌クローンを酵母中で試験したことを保証するために、もとのプールの中の細菌クローン数の５倍の酵母形質転換体数を限界と設定した。
個々のプールからの精製プラスミドＤＮＡ（100ng／μｌ）の１μｌアリコートを、40μｌの受容能のある（コンピテント）Ｓ．セレビシエ細胞（500ml YPD中のOD600＝1.5、冷却した蒸留水中で２回、冷却した１Ｍソルビトール中で１回洗浄し、0.5mlの１Ｍ冷ソルビトール中に再懸濁した；Becker & Guarante，1991）中にエレクトロポレーションした（200オーム、1.5kV、24μＦ）。１mlの１Ｍソルビトールの添加後、80μｌアリコートをＳＣ＋グルコース−ウラシル上に塗布して250〜400c.f.u.（コロニー形成単位）／プレートを与え、30℃で３〜５日間インキュベートした。
・シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換：
シゾサッカロミセス・ポンベは
0004040677.tif 000008
（1987）BioTechniques，5,51-517により記載された通りに形質転換せしめた。
・アスペルギルス・オリゼからの35kDaアミノペプチダーゼの精製：
アスペルギルス・オリゼA01568の醗酵上清の凍結乾燥粉末１ｇを100mlのTris−酢酸塩緩衝液（25mM pH8）中に溶かした。イオン強度は2mSiであった。この懸濁液を45μのミリポアフィルターを通して濾過した。その濾液を、Ｑ−セファロースを充填してTris−酢酸塩緩衝液で平衡化しておいた200mlのアニオン交換クロマトグラフィーカラム上に適用した。等電点８を有する主要エンドプロテアーゼであるアルカリホスファターゼを流出液中に集めた。流出液中にもはやＵＶ吸収性材料が存在しなくなるまでカラムをTris酢酸塩緩衝液で洗浄した。
10カラム容積を使ったTris−酢酸塩緩衝液（pH8）中の０〜0.5M NaClの直線塩勾配を使って、４ml／分の流速で、結合したタンパク質を溶出せしめた。アミノペプチダーゼ活性を含む画分（下記参照）をプールし、そしてTris−酢酸塩緩衝液（25mM，pH6）に対して透析した。
活性を含む透析プールをpH6およびイオン強度2mSiに調整し、そして25mM Tris−酢酸塩緩衝液pH6で平衡化されているアニオン交換クロマトグラフィー用の50mlの高性能Ｑ−セファロースカラムに適用した。次いで流出液中のＵＶ吸収性材料が280nmで0.05以下になるまで、カラムを洗浄した。次いで０〜0.5M NaClの20カラム容積の直線塩勾配を使って、２ml／分の流速で、結合した活性を溶出せしめた。アミノペプチダーゼ活性を含む画分をプールし、そして50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6）を使った限外濾過により濃縮した。
アミノペプチダーゼ活性を含む濃縮プール２mlを、0.1M NaClを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6）で平衡化されたセファデックス200（商標）カラム上に適用した。0.5ml／分の流速を使ってゲル濾過を実施した。アミノペプチダーゼ活性を含む試料をプールし、そして10kDaのカットオフ値を有するAmicon膜を使った限外濾過により濃縮した。
・アスペルギルス・オリゼのアミノペプチダーゼのＮ末端および中間部ペプチドのアミノ酸配列決定：
精製した生来のアミノペプチダーゼのＳ−カルボキシメチル化試料をリジン特異的プロテアーゼで消化し、得られたペプチドを逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）により分離し、そしてMatsudaira，A Practical Guide to Protein and Peptide Purifi-cation for Microsequencing，3-88，Academic Press lnc.，San Diego，CAにより記載された通りに、製造業者の指示（Applied Biosystems）に従ってApplied Biosystems 473Aシークエンサー中で配列決定した。
アミノ酸配列決定用の試薬および溶媒はApplied Biosystems（Foster City，CA）からのものである。
・ＰＣＲプライマーの設計：
ＰＣＲプライマーはKofod他，J．of Biol．Chem．（1994），269,29182-29189により記載された通りに設計した。
・ＰＣＲを使ったアミノペプチダーゼ用のcDNAプローブの作製：
cDNAライブラリープールからの二本鎖プラスミドＤＮＡ１μｇを、各々500ピコモルの設計したプライマー、500ピコモルのpYES 2.0ポリリンカープライマー（正と逆）、ＤＮＡ熱循環器（Landgraf，Germany）および2.5単位のTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を使ってＰＣＲ増幅せしめた。
94℃で１分の変性、55℃で２分のアニーリングおよび72℃で３分の伸長の循環プロフィールを使って、30サイクルのＰＣＲ反応を実施した。
・ジデオキシ−チェーン−ターミネーション法：
この方法は、シークエナーゼ▲Ｒ▼キットと万能pUCプライマーを使って、Sanger他（1977），Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，74，5463-5467により記載された通りに実施した。
・サザンブロット分析による陽性cDNAクローンの特徴づけ：
プローブとして0.5kbのランダムプライム32Ｐ標識ＰＣＲ生成物または35kDaアミノペプチダーゼを使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより、陽性クローンを特徴づけた。２×ＳＳＣ、５×デンハーツ溶液、0.5％（w/v）ＳＤＳ、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ中で、65℃で48時間ハイブリダイゼーションを実施し、その後、２×ＳＳＣ（２×15分間）、２×ＳＳＣ＋0.5％ＳＤＳ（30分間）、0.2×ＳＳＣ＋0.5％ＳＤＳ（30分間）、そして最後に２×ＳＳＣ（15分間）中で、65℃にて高緊縮性下で洗浄を行った〔Sambrook他（1989）、前掲〕。
・電気泳動：
電気泳動はSeaKem，FMCからの0.7％アガロースゲル上で実施した。
・毛管ブロッティング：
毛管ブロッティング法は、移行緩衝液として10×ＳＳＣを使って、Sambrook他（1989）前掲により記載された通りに実施した。
・ハイブリダイズしたクローンの高緊縮性洗浄：
洗浄は、２×ＳＳＣ中で２×15分間、0.1×ＳＳＣ＋0.5％ＳＤＳ中で２×30分間、そして２×ＳＳＣ中で15分間、65℃にて実施した。
・アスペルギルス・オリゼの形質転換：
アスペルギルス・オリゼの形質転換は、Christensen他（1988），Biotechnology 6，1419-1422により記載された通りに行った。
・アスペルギルス用のアミノペプチダーゼ発現カセットの作製
標準手順を使って陽性Ｅ．コリクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析により分析した。適当な制限酵素を使ってcDNA挿入断片を切り出し、アスペルギルス発現ベクター中に連結せしめた。
・アスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーの形質転換（一般法）
Ａ．オリゼまたはＡ．ニガーの胞子を100mlのＹＰＤ（Sherman他，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory,1981）に接種し、そして振盪させながら37℃で約２日間インキュベートした。Miraclothを通した濾過により菌糸を収穫し、200mlの0.6M MgSO4で洗浄した。15mlの1.2M MgSO4，10mM NaH2PO4，pH=5.8中に菌糸を懸濁した。この懸濁液を氷上で冷却し、120mgのNovozyme▲Ｒ▼234を含有する緩衝液１mlを加えた。５分後、１mlの12mg/mlＢＳＡを添加し、顕微鏡下で検査した試料中に多数のプロトプラストが見えるようになるまで穏やかに攪拌しながら37℃で1.5〜2.5時間攪拌を続けた。
前記懸濁液をMiraclothを通して濾過し、濾液を無菌試験管に移し、その上に５mlの0.6Mソルビトール，100mM Tris-HCl，pH=7.0を重層した。100×gで15分間遠心し、MgSO4クッションの上部からプロトプラストを集めた。プロトプラスト懸濁液に２容のＳＴＣを加え、その混合物を1000×gで５分間遠心した。プロトプラストペレットを３mlのＳＴＣ中に再懸濁し、そして再ペレット化した。これを繰り返した。最後にプロトプラストを0.2〜１mlのＳＴＣに再懸濁した。
プロトプラスト懸濁液100μｌを、10μｌのＳＴＣ中の適当なＤＮＡ5〜25μgと混合した。プロトプラストをp3SR2（Ａ．ニデュランスamdS遺伝子担持プラスミド）と混合した。この混合物を室温で25分間置いておいた。0.2mlの60％PEG 4000，10mM CaCl2および10mM Tris-HCl，pH7.5を加え、注意深く混合し（２回）、最後に0.85mlの同溶液を加え、注意深く混合した。この混合物を室温で25時間置いておき、2500gで15分間遠心し、ペレットを２mlの1.2Mソルビトール中に再懸濁した。もう１回沈降を行った後、プロトプラストを適当な平板上に塗抹した。バックグラウンド増殖を防ぐために最少平板上にプロトプラストを塗抹した。37℃で４〜７日間インキュベートした後、胞子を取り、単一コロニーになるように塗抹した。この操作を繰り返し、２回目の再単離後の単一コロニーの胞子を、限定された形質転換体として保存した。
・アスペルギルス・オリゼ形質転換体の精製
アスペルギルス・オリゼのコロニーを、AmdS+平板（＋0.01％Triton X-100）上での分生胞子形成とＹＰＭ培地中での30℃での３日間の増殖により精製した。
・アミノペプチダーゼ陽性アスペルギルス・オリゼ形質転換体の同定
アスペルギルス・オリゼ形質転換体からの上清を、60μg/mlのロイシン−７−アミド−４−メチルクマリンが上に重層された寒天平板上でアミノペプチダーゼについてアッセイした。この平板を30℃で５分〜２時間インキュベーションした後でＵＶ光下で蛍光分析することにより、陽性形質転換体を同定した。
・SDS-PAGE分析
アスペルギルス・オリゼのアミノペプチダーゼ産生形質転換体の上清のSDS-PAGE分析。形質転換体を５mlのＹＰＭ中で３日間増殖させた。10μｌの上清を12％ SDS−ポリアクリルアミドゲルに適用した後、それをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
・質量分析
質量分析は、VG Analytical TofSpec中でのマトリックス補助レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析法を使って行った。質量分析用に２μｌの試料を飽和マトリックス溶液２μｌ〔0.1％ＴＦＡアセトニトリル（70：30）中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸〕と混合し、その混合物２μｌをターゲット板上にスポットした。質量分析器に導入する前に、蒸発により溶媒を除去した。試料は限界レーザー力での４nsレーザーパルス（337nm）により脱着・イオン化され、25kVの加速電圧により無電界飛行管中に加速される。1850Vに設定されたマイクロチャンネルプレートによりイオンを検出した。既知の質量のタンパク質を使って外部的にスペクトルを検量した。
・免疫学的交差反応性：
免疫学的交差反応性を測定するのに使用する抗体は、精製アミノペプチダーゼを使って調製することができる。より詳しくは、N．Axelsen他，A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973年，第23章に記載された方法、またはA．Johnstone & R．Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，1982（具体的には第27〜31頁）に記載された方法に従って、ウサギ（または他の齧歯類）を免疫処置することにより、本発明のアミノペプチダーゼに対する抗血清を惹起せしめることができる。抗血清から、例えば塩沈〔（NH4）2SO4〕に続く透析およびイオン交換クロマトグラフィー、例えばDEAE−セファデックス上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、精製された免疫グロブリンを得ることができる。タンパク質の免疫化学的特徴付けは、Outcherlonyの二重拡散分析法〔O．Outcherlony，Handbook of Experimental Immunology（D.M．Weir編），Blackwell Scientific Publications，1967，655〜706頁〕、交差免疫電気泳動法（N．Axelsen他，前掲，第３および４章）、またはロケット免疫電気泳動法（N．Axelsen他，前掲，第２章）のいずれかにより行うことができる。
・サザンブロット分析：
Yelton他（1984），Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．81，1470〜1474頁に従って、Ａ．オリゼからゲノムＤＮＡを単離し、そしてBamHI，BglII，EcoRIおよびHindIII（10μg/試料）で完全消化し、0.7％アガロースゲル上で分画し、変性させ、そして移行緩衝液として10×ＳＳＣを使ってナイロン膜（Hybond-N）にブロッティングする〔Southern，E.M．（1975），J．Mol．Biol．，98，503-517頁〕。アミノペプチダーゼcDNAをランダムプライミングにより32Ｐ標識し（＞１×109cpm／μg）、それをサザン分析においてプローブとして使用する。ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件はＲＮＡゲルブロット分析のところで後述する通りである。フィルターを−80℃で12時間オートラジオグラフィー処理する。
・ＲＮＡゲルブロット分析：
Ａ．オリゼからのポリ（Ａ）+ＲＮＡ（１μｇ）を1.2％アガロース／2.2Ｍホルムアルデヒドゲル中で電気泳動し〔Thomas，P.S.（1983）Methods Enzymol．100，255-2663頁〕、そして移行緩衝液として10×ＳＳＣを使ってナイロン膜（Hybond-N）にブロッティングする。アミノペプチダーゼcDNAをランダムプライミングによって32Ｐ標識し（＞１×109cpm／μg）、そして５×ＳＳＣ、５×デンハーツ溶液、0.5％ＳＤＳ（w/v）および100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ中で65℃にて18〜20時間膜にハイブリダイズさせる。次いでその膜を65℃にて５×ＳＳＣ（15分間×２回）、２×ＳＳＣ＋0.5％ＳＤＳ（30分間×１回）、0.2×ＳＳＣ＋0.5％ＳＤＳ（30分間×１回）、および５×ＳＳＣ（15分間×２回）中で洗浄する。その膜を−80℃で12時間オートラジオグラフィー処理する。
・アミノペプチダーゼ活性（LAPU）の測定
１LAPUは、AF 298/1-GB（請求すればNovo Nordisk A/Sから入手可能）に記載の方法を使って、１分あたり１μモルのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを加水分解する酵素の量として定義される。
・TMBS分析に基づいた％DHの測定
タンパク質加水分解の程度は、達成された加水分解度により測定することができる。本発明の明細書中では、加水分解度（DH）は次の式により定義される：
0004040677.tif 000009
ｈは加水分解されたペプチド結合の数であり、ｈtotalはタンパク質中のペプチド結合の総数である。ｈtotalは原料の種類に依存し、一方ｈは例えばTMBS分析により測定されるmeqvロイシンNH2の関数として表すことができる。
％DHの測定はEF-9415317（請求すればNovo Nordisk A/Sから入手可能）に記載されている。
・生地およびパンの試験
本発明によれば、アミノペプチダーゼ活性を有する一成分酵素を添加することの効果は、次の方法を使うことによってパン生地およびパンにおいて試験することができる：
パンの製造
手順：
1．生地混捏（渦動攪拌機）
700RPMで３分
1400RPMで５分
混合時間は、使用する試験条件下で最適な生地の粘りが得られるように、使用する小麦粉に基づいて製パン業者により予め決定されそして調整される。
2．第一プルーフ：30℃、80％ＲＨ（相対湿度）、15分。
3．計量および整形
4．周囲温度で５分間の寝かし
5．最終プルーフ：32℃、80％ＲＨ、ロールパンの場合45分、食パンの場合55分
6．焙焼（ベーキング）：225℃、ロールパンの場合22分、ローフの場合30分
生地およびベークド製品の評価
生地およびベークド製品は次のように評価することができる：
ローフの比容積：伝統的な中種法を使って４ローフ容積の平均値を測定する。パン１ｇあたりの容積mlとして比容積を計算する。対照（酵素を添加しない）の比容積を100と定義する。相対的な比容積指数を次のようにして算出する。
0004040677.tif 000010
生地の粘りおよび内相は次の等級表に従って目視評価することができる：
0004040677.tif 000011
実施例
実施例１：cDNAライブラリーの作製
アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）A01568から全RNAを抽出した。オリゴ（dT）−セルロースアフィニティークロマトグラフィーによりポリ（A）+RNAを単離し、そして二本鎖cDNA（ds cDNA）を合成した。
3.5×106個のクローンから成るアスペルギルス・オリゼA01568からのcDNAライブラリーを酵母発現ベクターpYES 2.0中に作製した。
実施例２：cDNAクローンの増幅および特徴づけ
「材料および方法」の項目において上述した通りにアスペルギルス・オリゼA01568からアミノペプチダーゼを精製した。
Ｓ−カルボキシメチル化した精製タンパク質をリジン特異的プロテアーゼで消化することにより、該アミノペプチダーゼの長いＮ末端配列と４つの中間部配列（ペプチド１〜５を含む）を得た。
それらの配列に基づいて３つのプライマーを合成した（それぞれas1，s2およびs3）。二本鎖cDNA（ds cDNA）を「材料および方法」の項目で上述したようなＰＣＲ増幅実験において鋳型として使用した。
得られたＰＣＲ生成物の分析は、１プライマー対（プライマーs3とプライマーas1）を有する0.5kb断片の存在を明らかにした。
ＰＣＲ断片を、SmaIで切断し脱リン酸したpUC18ベクター中にサブクローニングし、そして「材料および方法」の項目において上述したようなジデオキシチェーンターミネーション法を使って両端から配列決定した。
プライマーによりコードされる残基に加えて、精製アミノペプチダーゼから得られたペプチド２の配列は、推定アミノ酸配列と整列せしめると、所望のcDNA種が特異的にＰＣＲ増幅されたことを確証した。
実施例３：アスペルギルス・オリゼ由来のアミノペプチダーゼをコードするクローンについてのcDNAライブラリーのスクリーニング
アスペルギルス・オリゼA01568からのcDNAライブラリーからの約10,000個のコロニーを、上述したようなコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。この結果、650bp〜1.5kbに及ぶ挿入断片を有する陽性クローンが得られた。
これらの陽性クローンを、「材料および方法」の項目において上述したようなサザンブロット分析により分析した。
アミノペプチダーゼcDNAクローンから得られた精製プラスミドＤＮＡ（約１μｇ）をHindIIIとXbaIにより完全消化して、pYESベクターからcDNA挿入断片を遊離せしめた。試料を電気泳動し、次いで毛管ブロット法によりHybond-Nナイロン膜に移行せしめた。この膜を高緊縮性下で洗浄して、900bp〜1700bpに及ぶ挿入断片を有する陽性クローンを得た。
強力にハイブリダイズするクローンを、正および逆pYESプライマーを使ってcDNAの末端を配列決定することにより分析した。
配列データの分析は、それらのクローンのうち幾つかが先端の切り取られたcDNAであり、その他のものは全長クローンであることを示した。全長クローンのうちの１つ（pC1EXP3）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（図１に示す）は、1.4kbのcDNA挿入断片を含有する。
実施例４：アスペルギルス・オリゼ中でのアミノペプチダーゼの発現
アスペルギルス・オリゼ中でのアミノペプチダーゼの高レベル生産を得るために、pC1EXP3クローンからのcDNA挿入断片をpHD423中にサブクローニングし、そして上述したようにしてAmdS+プラスミドと一緒に同時形質転換せしめた。
pC1EXP3からの1.4kb cDNA挿入断片を、HindIIIとNotI消化によりpYES 2.0から単離し、NotI／HindIIIで開裂させたpHD 423ベクター中に連結し、そしてＥ．コリ中に形質転換せしめた。
得られた形質転換体を２回精製し（上記参照）、上述したようにアミノペプチダーゼ活性についてアッセイした。形質転換体pA3EXP3/1は検出可能なアミノペプチダーゼ活性を示した。
実施例５：アミノペプチダーゼ生産性形質転換体（pA3EXP3/1）の発現レベル
形質転換体（pA3EXP3/1）から分泌されるアミノペプチダーゼの量および純度（発現レベル）を、陰性対照として未形質転換体のＡ．オリゼ株A01560を使用し且つ陽性対照としてＡ．オリゼ株A01568を使用して、SDS-PAGEにより半定量的に測定した（図１参照）。
pA3EXP3/1では、陰性対照中に存在しない36〜37kDaポリペプチドが検出可能であった。この組換えアミノペプチダーゼのサイズは、生来のアミノペプチダーゼのサイズ（約35kDaの二重バンド）のものよりも約2kDa大きい。これは、多分、追加のグリコシル化かまたは他の形の翻訳後修飾のためであろう。
実施例６
質量分析は、cDNA配列から32.4kDaであると算定されたポリペプチドの質量よりも質量が大きく測定されたことから、組換えアミノペプチダーゼがグリコシル化されていることを示した。
組換えアミノペプチダーゼの平均質量は34.1kDaであり、33kDa〜35kDaの範囲の質量であった。
SDS-PAGE（「材料および方法」に記載されたような）により測定された見かけ分子量（Ｍw）は約35kDaであることがわかった。
実施例７：35kDaアミノペプチダーゼを生産する形質転換体の醗酵
アスペルギルス・オリゼ形質転換体pA3EXP3/1を、150mlのDAP 2C（pH＝5.9）の入った１ｌの振盪フラスコ中で30℃にて３日間増殖させた。
分泌されたアミノペプチダーゼの量は、SDS-PAGE分析により約0.5ｇ／ｌ上清と概算された。
実施例８：Ｓ．ポンベ中での35kDaアミノペプチダーゼクローンの発現
全長35kDaアミノペプチダーゼcDNAクローンpC1EXP3を、エレクトロポレーションによりシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）中に再形質転換せしめた。SpeIとNotI消化によりpYES 2.0ベクターから1.4kb cDNA挿入断片を取り出し、それをSpeI／NotIで開裂させた酵母発現ベクターpP1（これはADHプロモーターを含むＥ．コリ／Ｓ．ポンベ間シャトルベクターである）中にサブクローニングし、そしてアミノペプチダーゼ活性についてアッセイした。
１つのＳ．ポンベ形質転換体が強力なアミノペプチダーゼ活性を有することが証明された。このことは、Ｓ．ポンベがアスペルギルス・オリゼA01568からの機能的に活性な35kDaアミノペプチダーゼを合成しそして分泌することを示す。
実施例９：アミノペプチダーゼ遺伝子の編成および発現
「材料および方法」の項目において記載したサザンブロットハイブリダイゼーションにより、Ａ．オリゼA01568ゲノム中のアミノペプチダーゼ遺伝子のコピー数を決定した。Ａ．オリゼから単離した全ＲＮＡをBamHI，BglII，EcoRIまたはHindIIIで完全消化し、そしてアミノペプチダーゼcDNAとハイブリダイズせしめた。アミノペプチダーゼプローブは、ヌクレオチド位置640のところのBamHI部位のために２つのハイブリダイズする断片を与えるBamHI消化を除いて、各場合に１つだけの強力にハイブリダイズする断片を検出する。これは、アミノペプチダーゼ遺伝子がＡ．オリゼA01568ゲノム中に単一コピーとして存在することを示す。
実施例10
35kDaアミノペプチダーゼ遺伝子の発現を調べるために、Ａ．オリゼA01568菌糸から抽出したポリ（Ａ）+ＲＮＡをノーザンブロット分析にかけた。ブロットしたＲＮＡをアミノペプチダーゼcDNAを使って探査すると、約1.45および1.55キロ塩基の２つのmRNA種の存在が明らかになった。それらの２つのmRNAは、フィルターを高緊縮性で洗浄した時に同じハイブリダイゼーションパターンが観察されることから、２つの異なる遺伝子の転写物を表すとは思われない。２つのmRNAのサイズの相違は、アスペルギルス・オリゼcDNAライブラリーから単離された２つのcDNA種（１つがpC1EXP3クローンに該当しそしてもう１つがそれより120bp短いpC1EXP4クローンに該当する）に相応して、２つのポリアデニル化部位のために３′非翻訳領域の長さが異なることによる結果であるかもしれない。両mRNAとも同じアミノペプチダーゼをコードする。
実施例11：乳漿タンパク質水解物からの苦味の除去
アスペルギルス・オリゼ形質転換体pA3EXP3/1の醗酵ブロスを、８％（w/v）プロテアーゼ水解乳漿タンパク質を含有する溶液の苦味を除去する能力について試験した。
醗酵ブロスのアミノペプチダーゼ活性は5.58LAPU/gであった。
基質タンパク質溶液を100gの８％タンパク質水解物の入ったフラスコにおいて試験した。5000LAPU/g（12.5LAPU/gタンパク質と等価）を有する生成物に基づいて算定した時の酵素と基質の関係（Ｅ／Ｓ）が0.25％になるまでアミノペプチダーゼ活性を示す醗酵ブロスを添加し、次いで50℃，pH7.0で６時間再び加水分解した。
１分後と６時間後にそれぞれｐＨと重量オスモル濃度を測定した（標準法を使って）。TNSB法（上述）を使って％ＤＨを測定し、そして標準法を使って％ＦＡＡ（％遊離アミノ酸）を測定した。
0004040677.tif 000012
13％ＦＦＡを含む、苦味が除去された水解物の試料をロイシン含量について分析した。ロイシンは該試料の約2.7％を構成し、ブラインド試料の約0.3％を構成することがわかった。
実施例12：味覚試験
苦味が除かれたタンパク質水解物の味を、０（苦味なし）から10（ブラインド）までの苦味指数（ＢＩ）を使って５人の味覚試験審査員団により評価した。
苦味のある3.5％タンパク質水解物の試料（ブラインド試料）と、形質転換体にさらした同様な試料の苦味を評価した。
形質転換体にさらしたタンパク質水解物試料の苦味指数（ＢＩ）は約6.2の範囲であることがわかった。
この結果は、35kDaアミノペプチダーゼがタンパク質水解物試料の苦味を除去したことを示す。
実施例13：パンの風味、生地の粘弾性および内相
０〜300LAPU／kg小麦粉を使って製造したパンの風味、生地の粘りおよび内相を、市販品Flavourzyme▲Ｒ▼を使って製造したパンと比較した。パンは「材料および方法」の項目で上述したようにして製造しそして評価した。
次のような結果が観察された（二重反復試験の平均）：
0004040677.tif 000013
上記表から明らかなように、本発明の35kDaアミノペプチダーゼは30〜300LAPU／kg小麦粉の量で添加した時に「焼きたての」パンの香りという形で有意に風味を増加させる。内相部は本発明のアミノペプチダーゼにより影響されない。生地の粘弾性は市販のプロテアーゼ／ペプチダーゼ複合体であるFlavourzyme▲Ｒ▼に比較して改良される。
本発明の実施に際して本発明の精神および範囲から逸脱することなく多数の変更および修正が可能であることは、上記開示を考慮すれば当業者に明白であろう。従って、本発明の範囲は後述する請求の範囲により限定されるものに従って解釈すべきである。
配  列  表
(1)一般情報
（i）出願人
（Ａ）名称：ノボ  ノルディスク  Ａ／Ｓ
（Ｂ）通り：ノボ  アレ
（Ｃ）市名：バクスバエルト
（Ｅ）国名：デンマーク
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：DK-2880
（Ｇ）電話：+45 4444 8888
（Ｈ）テレファックス：+45 4449 3256
（ii）発明の名称：アミノペプチダーゼ活性を有する酵素
（iii）配列の数：12
（iv）コンピューター読み取り形式
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：IBM PC互換型
（Ｃ）駆動システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0，Version #1.30B（EPO）
(2)配列番号１に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：1409塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（vi）起源：
（Ｂ）株名：アスペルギルス・オリゼ A01568
（ix）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：CDS
（Ｂ）存在位置：52..1183
（xi）配列の記載：配列番号１：
0004040677.tif 000014
0004040677.tif 000015
0004040677.tif 000016
(2)配列番号２に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：377アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２：
0004040677.tif 000017
0004040677.tif 000018
(2)配列番号３に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（iii）ハイポセティカル：No
（iv）アンチセンス：Yes
（xi）配列の記載：配列番号３：
0004040677.tif 000019
(2)配列番号４に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（iii）ハイポセティカル：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号４：
0004040677.tif 000020
(2)配列番号５に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：23塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：プライマー
（iii）ハイポセティカル：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号５：
0004040677.tif 000021
(2)配列番号６に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：16アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：No
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列の記載：配列番号６：
0004040677.tif 000022
(2)配列番号７に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：No
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列の記載：配列番号７：
0004040677.tif 000023
(2)配列番号８に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：15アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：No
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列の記載：配列番号８：
0004040677.tif 000024
(2)配列番号９に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：24アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：No
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列の記載：配列番号９：
0004040677.tif 000025
(2)配列番号10に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：29アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：No
（v）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（xi）配列の記載：配列番号10：
0004040677.tif 000026
(2)配列番号11に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：18アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：No
（v）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（xi）配列の記載：配列番号11：
0004040677.tif 000027
(2)配列番号12に関する情報
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：1272塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii)配列の種類：cDNA
（vi）起源：
（Ｂ）株名：アスペルギルス・オリゼA01568
（xi）配列の記載：配列番号12：
0004040677.tif 000028
0004040677.tif 000029
【図１】
0004040677.tif 000030