(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが１個のアミノ酸からなるスペーサー若しくはペプチド結合した2〜8個のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している薬物複合体、又はカルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが該スペーサーを介さずに結合している薬物複合体の製造方法であって、以下の工程：（１）カルボキシル基を有する多糖誘導体のアルカリ金属塩を有機アミンとの塩に変換する工程；及び（２）該有機アミンとの塩と医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスペーサーとを非水系で反応させる工程を含む方法。
【請求項２】
カルボキシル基を有する多糖誘導体がカルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、完全にポリアルコール化可能な条件下でデキストランを処理して得られたデキストランポリアルコールであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールがカルボキシメチルデキストランポリアルコールである請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
医薬化合物がラクトン環を形成しうる医薬化合物である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
有機アミンとの塩と医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスペーサーとの反応において、ラクトン環を形成した医薬化合物又はラクトン環を形成した医薬化合物を結合させたスペーサーを用いる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ラクトン環を形成しうる請求項７に記載の医薬化合物が（1S,9S）-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ［de］ピラノ［3’,4’:6,7］インドリジノ［1,2-b］キノリン-10,13（9H,15H）-ジオンである請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、多糖誘導体と抗腫瘍剤などの医薬化合物とを結合させた薬物複合体の製造方法に関するものである。
背景技術
肺癌や消化器癌などの固形癌や白血病などの血液癌の治療に際して用いられる抗腫瘍剤は、静脈内投与や経口投与などの投与経路により全身的に投与された後、特定の腫瘍部位に移行して癌細胞の増殖を阻害ないし抑制することにより治療効果を発揮する。しかしながら、全身投与された抗腫瘍剤は、血中から肝臓・網内系臓器に速やかに取り込まれたり、あるいは速やかに尿中排泄されるために、血中濃度が低下して腫瘍部位への移行が十分でない場合がある。また、通常の抗腫瘍剤自体では腫瘍部位への移行選択性（腫瘍選択性）が低いために、抗腫瘍剤が全身の様々な細胞や組織に満遍なく分布してしまい、正常な細胞や組織に対しても細胞毒として作用するので、嘔吐、発熱、あるいは脱毛などの副作用を極めて高率に発生させるという問題がある。従って、抗腫瘍剤を効率的かつ選択的に腫瘍部位に移行させる手段の開発が求められている。
このような手段の一つとして、カルボキシル基を有する多糖誘導体を薬物担体として用い、該多糖誘導体に対して抗腫瘍剤を結合させて抗腫瘍剤の血中からの消失を遅延させるとともに、癌組織への指向性を高める方法が提案されている。
例えば、国際公開WO94/19376号には、カルボキシル基を有する多糖のカルボキシル基にペプチド鎖（アミノ酸数1〜8）が結合されており、さらにこのペプチド鎖を介してドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、又はブレオマイシンなどを結合した薬物複合体が開示されている。また、特公平7-84481号公報には、カルボキシメチル化されたマンノグルカン誘導体にシッフ塩基や酸アミド結合を介して上記の抗腫瘍剤を導入した薬物複合体が開示されている。これらの薬物複合体は、薬物送達のキャリアーに結合されていない抗腫瘍剤自体に比べてより優れた抗腫瘍効果を有するとともに、毒性・副作用が軽減されていることを特徴としている。
その他、ポリアルコール化多糖誘導体を薬物送達のキャリアーとして用いた薬物複合体に関する技術については、「多糖−ペプチド−ドキソルビシン複合体に関する研究・多糖誘導体の血中安定性と抗腫瘍効果の関係」（第10回日本ＤＤＳ学会講演要旨集，279，1994）；「多糖−ペプチド−ドキソルビシン複合体に関する研究・体内動態と抗腫瘍効果」（第９回日本薬物動態学会年会講演要旨集，292，1994）；第19回研究開発動向セミナー（医薬品機構主催）要旨集，D-9，1995；及び「多糖キャリアーによる腫瘍への薬物送達に関する研究」（第12回コロイド・界面技術シンポジウム，日本化学会，講演要旨集，51，1995）などの報告がある。
従来、これらの薬物複合体は、カルボキシメチルプルラン、カルボキシメチルマンノグルカンなどのカルボキシル基を有する多糖誘導体をナトリウム塩として調製した後に、該多糖誘導体のカルボキシル基と抗腫瘍剤のアミノ基（又は抗腫瘍剤に結合したペプチド鎖のＮ末端アミノ基）とを酸アミド結合させることにより製造されている。多糖誘導体のナトリウム塩は有機溶媒には全く溶解しないために、この反応を行うにあたっては、多糖誘導体のナトリウム塩を水又は水を含む水性有機溶媒の溶液として調製しておき、この溶液中に縮合剤と塩酸塩などの形態の抗腫瘍剤（又はペプチド鎖を有する抗腫瘍剤）とを溶解させる方法が採用されてきた。
しかしながら、この反応では脱水縮合反応を水を含む溶媒中で行うために、目的物を高収率で得ることが不可能であった。反応原料として用いる抗腫瘍剤などは一般に高価であり、製造コストの観点から上記の薬物複合体を効率よく製造する方法の開発が求められていた。また、抗腫瘍剤として有用な特開平6-87746号公報に記載された化合物は分子中にラクトン環を有しているため、これにペプチド鎖が結合した化合物を上記の反応に付すると塩基及び水の存在下でラクトン環が開環し、生じたカルボキシル基が抗腫瘍剤に結合したペプチド鎖のＮ末端アミノ基と反応して目的物の収率を著しく低減させてしまい、また、目的とする均一な薬物複合体が得られないという問題があった。このため、ラクトン環が開環した化合物の生成を回避できる反応方法の開発が求められていた。
発明の開示
本発明は、抗腫瘍剤や抗炎症剤などの有効成分を腫瘍部位などに対して部位選択的に移行させることができる薬物複合体を効率的に製造する方法を提供することを課題としている。より具体的には、カルボキシル基を有する多糖誘導体と抗腫瘍剤等の医薬化合物又は医薬化合物を結合させたオリゴペプチド等のスペーサーとを効率よく反応させて、薬物複合体を大量かつ安価に製造することができる方法を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、カルボキシル基を有する多糖誘導体を医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスペーサーと反応させるにあたり、従来用いられてきた多糖誘導体のナトリウム塩に替えて有機アミンとの塩を用いると、多糖誘導体の塩を実質的に水を含まない有機溶媒中に高濃度に溶解することができ、多糖誘導体と医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスペーサーとの反応を極めて収率よく行うことができ、しかも副生成物などを低減させることができることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち本発明は、カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが１個のアミノ酸からなるスペーサー若しくはペプチド結合した2〜8個のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している薬物複合体、又はカルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが該スペーサーを介さずに結合している薬物複合体の製造方法であって、カルボキシル基を有する多糖誘導体の有機アミンとの塩と医薬化合物又はスペーサを結合させた医薬化合物とを非水系で反応させることを特徴とする方法；並びに、該薬物複合体の製造方法であって、以下の工程：（1）カルボキシル基を有する多糖誘導体のアルカリ金属塩を有機アミンとの塩に変換する工程；及び（2）該有機アミンとの塩と医薬化合物又はスペーサを結合させた医薬化合物とを非水系で反応させる工程を含む方法を提供するものである。
本発明の好ましい態様によれば、カルボキシル基を有する多糖誘導体がカルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールである上記方法；カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下でデキストランを処理して得られたデキストランポリアルコールであることを特徴とする上記方法；カルボキシＣ1-4アルキルデキストランポリアルコールがカルボキシメチルデキストランポリアルコールである上記方法；カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールが、分子量5,000〜500,000の範囲、好ましくは50,000〜450,000の範囲、より好ましくは200,000〜400,000の範囲のカルボキシメチルデキストランポリアルコールであり、カルボキシメチル化度が構成糖残基あたり0.01〜2.0の範囲、好ましくは0.1〜1.0の範囲、より好ましくは0.3〜0.5の範囲である上記方法；並びに、医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である上記方法が提供される。
さらに本発明の好ましい態様により、医薬化合物がラクトン環を形成しうる化合物である上記方法；有機アミンとの塩と医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスペーサーとの反応において、ラクトン環を形成した医薬化合物又はラクトン環を形成した医薬化合物を結合させたスペーサーを用いる上記方法；及び、ラクトン環を形成しうる上記医薬化合物が（1S,9S）-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ［de］ピラノ［3’,4’:6,7］インドリジノ［1,2-b］キノリン-10,13（9H,15H）-ジオンである上記方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の方法で製造した例８の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第２図は、本発明の方法で製造した例８の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第３図は、本発明の方法で製造した例９の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第４図は、本発明の方法で製造した例９の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第５図は、本発明の方法で製造した例１０の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第６図は、本発明の方法で製造した例15の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第７図は、本発明の方法で製造した例15の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第８図は、本発明の方法で製造した例28の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第９図は、本発明の方法で製造した例28の薬物複合体の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第10図は、本発明の方法で製造した例29の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第11図は、本発明の方法で製造した例29の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第12図は、本発明の方法で製造した例34の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第13図は、本発明の方法で製造した例34の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第14図は、本発明の方法で製造した例39の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第15図は、本発明の方法で製造した例39の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第16図は、本発明の方法で製造した例41の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第17図は、本発明の方法で製造した例41の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第18図は、本発明の方法で製造した例44の薬物複合体のGPCチャートを示す図である。
第19図は、本発明の方法で製造した例44の薬物複合体の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
第20図は、本発明の方法で製造した例15の薬物複合体の体内動態を示す図である。図中の各点は３例の平均値を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の製造方法により製造される薬物複合体は、カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが１個のアミノ酸からなるスペーサー若しくはペプチド結合した2〜8個のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合しているか、又はカルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが該スペーサーを介さずに結合していることを特徴としている。
薬物複合体に含まれる医薬化合物の残基は、例えば、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤などの医薬としてヒトを含む哺乳類の病気の治療及び／又は予防に用いられる医薬化合物に由来し、その部分構造により構成される。もっとも、該残基が由来する医薬化合物は上記のものに限定されることはない。また医薬化合物としては、多糖誘導体又はスペーサーとの結合に関与できる１又は２以上の反応性官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、エステル基など）を有するものであればいかなるものを用いてもよい。本明細書において医薬化合物という場合には、それ自体が医薬作用を有する化合物の主要構造をその部分構造として含み生体内で該化合物を再生することができるプロドラッグ化合物も含まれる。
より具体的には、本明細書において医薬化合物の残基とは、多糖誘導体又はスペーサーと医薬化合物残基との結合が医薬化合物中の反応性官能基と多糖誘導体又はスペーサー中の反応性官能基との反応（例えば脱水縮合など）により形成されたと仮定した場合において、結合後の化合物中に存在する医薬化合物に由来する部分構造を意味している。例えば、医薬化合物がD-NH2，D-COOH，D-COOR，D-OH，D-SH，D-CONH2，D-NH-COOR（Rは低級アルキル基等）で表される場合、医薬化合物の残基はそれぞれD-NH-（D-NH-CO-Qなど），D-CO-（D-CO-NH-Q，D-CO-O-Q，D-CO-S-Qなど），D-CO-（D-CO-NH-Q，D-CO-O-Q，D-CO-S-Qなど），D-O-（D-O-CO-Q，D-O-Qなど），D-S-（D-S-CO-Q，D-S-Qなど），D-CONH-（D-CO-NH-CO-Qなど），D-NH-CO-（D-NH-CO-O-Q，D-NH-CO-NH-Qなど）で表される（カッコ内はスペーサー又は多糖誘導体と医薬化合物残基との結合を示し、Qはスペーサー及び多糖誘導体からそれぞれ反応性官能基及びカルボキシル基を除いた残りの部分構造を示す）。もっとも、スペーサー又は多糖誘導体と医薬化合物残基との結合の種類は上記のものに限定されることはない。医薬化合物の残基は、多糖誘導体のカルボキシル基、スペーサーのＮ末端アミノ基若しくはＣ末端カルボキシル基、又はスペーサーを構成するアミノ酸に存在する反応性官能基に結合していてもよい。
医薬化合物の残基としては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、白金系抗腫瘍剤（シスプラチン若しくはその誘導体）、タキソール若しくはその誘導体、カンプトテシン若しくはその誘導体（特開平6-87746号公報に記載された抗腫瘍剤、好ましくは請求項２に記載された（1S,9S）-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ［de］ピラノ［3’,4’:6,7］インドリジノ［1,2-b］キノリン-10,13（9H,15H）-ジオン等）などの抗腫瘍剤の残基を好適に用いることができる。また、例えば、コハク酸ヒドロコルチゾン、コハク酸プレドニゾロンなどのステロイド系抗炎症剤、又はメフェナム酸、フルフェナム酸、ジクロフェナク、イブプロフェン、チノリジンなどの非ステロイド系抗炎症薬の残基も好適である。
医薬化合物の残基は多糖誘導体と直接結合していてもよいが、スペーサーを介して結合していてもよい。このようなスペーサーとしては、１個のアミノ酸からなるスペーサー又はペプチド結合した2〜8個のアミノ酸からなるスペーサーを用いることができる。より具体的には、医薬化合物の残基と多糖誘導体とがスペーサーを介して結合している場合には、該スペーサーは、１個のアミノ酸の残基（アミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基からそれぞれ１個の水素原子及び１個の水酸基を除いた残基を意味する）、又はペプチド結合した２ないし８個のアミノ酸からなるオリゴペプチドの残基（Ｎ末端のアミノ基及びＣ末端のカルボキシル基からそれぞれ１個の水素原子及び１個の水酸基を除いた残基を意味する）の形態を有している。
好ましいスペーサーは２〜６個のアミノ酸からなるオリゴペプチドの残基である。スペーサーを構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、例えば、L-又はD-アミノ酸、好ましくはL-アミノ酸を用いることができ、α−アミノ酸のほか、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸、γ−アミノ酪酸などを用いてもよい。このようなα−アミノ酸以外のアミノ酸は、スペーサー中で多糖誘導体に近接した位置に配置されることが好ましい。
例えばオリゴペプチドスペーサーを用いる場合の結合方向は特に限定されないが、一般的には、カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールのカルボキシル基にスペーサーのＮ末端を酸アミド結合によって結合し、医薬化合物のアミノ基にスペーサーのＣ末端を結合することができる。また、例えば、ペプチドスペーサーの構成単位としてリジン残基を含めておき、リジン残基のα−アミノ基及びε−アミノ基をそれぞれ他のアミノ酸のカルボキシル基と酸アミド結合させると、ペプチドスペーサーの両末端がＮ末端になるので、医薬化合物のカルボキシル基を結合することが可能になる。さらに、スペーサー中に１個又は２個以上のジアミン化合物またはジカルボン酸化合物の残基（例えばエチレンジアミンなどのジアミンの残基やコハク酸などのジカルボン酸の残基など）を構成単位として含めておき、それぞれ両末端がＮ末端のスペーサー及び両末端がＣ末端のスペーサーを利用してもよい。
オリゴペプチドからなるスペーサーを用いる場合のアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、スペーサーが-X-Z-で表されるジペプチドの残基（Xは疎水性アミノ酸の残基を示し、Zは親水性アミノ酸の残基を示し、-X-Z-は疎水性アミノ酸（X）と親水性アミノ酸（Z）とがそれぞれＮ末端側及びＣ末端側となってペプチド結合したジペプチドのＮ末端のアミノ基及びＣ末端のカルボキシル基からそれぞれ１個の水素原子及び１個の水酸基を除いた残基を意味する）であるか、又は該ジペプチドの残基を部分ペプチド配列として含むスペーサーを好適に用いることができる。疎水性アミノ酸としては、例えば、フェニルアラニン、チロシン、ロイシンなどを用いることができ、親水性アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニンなどを用いることができる。スペーサーがこのようなジペプチド残基の繰り返し配列（例えば-X-Z-X-Z-，-X-Z-X-Z-X-Z-など）を有していてもよい。
このようなジペプチド構造を含むスペーサーを用いると、スペーサーがペプチダーゼが豊富であると考えられる腫瘍部位や炎症部位で加水分解され、当該部位において医薬化合物が高濃度に遊離するので、上記ジペプチドを含むスペーサーと医薬化合物とが結合して形成される構造は、本発明の方法により製造される薬物複合体の好ましい部分構造である。医薬化合物の残基として、濃度に依存した抗腫瘍作用を発現する抗腫瘍剤（より高い濃度でより強い抗腫瘍作用を発現する抗腫瘍剤：濃度依存型の抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビシンなど）の残基を用いる場合には、-X-Z-で示される上記のジペプチド残基からなるスペーサー又は該ジペプチド残基を部分ペプチド配列として含むスペーサーを用いることが特に好ましい。
また、医薬化合物の残基として、一定の濃度以上で作用時間の持続を必要とする時間依存型の抗腫瘍剤を用いる場合にも、上記のスペーサーを用いることによって高い抗腫瘍効果を達成できる場合があり、例えば、特開平6-87746号公報に記載された抗腫瘍剤、好ましくは請求項２に記載された抗腫瘍剤が挙げられる。一般的には、上記のスペーサーに限定されることなく、抗腫瘍剤の作用機作、体内動態や毒性発現の特徴、体内での抗腫瘍剤の遊離性などの観点から好ましいスペーサーを選択する必要がある。なお、一般的に、増殖の速い癌種に対しては、短時間に高濃度の医薬化合物を遊離することができる上記のスペーサーを選択することが好ましい。
スペーサーの具体例を以下の表に示すが、本発明の薬物複合体の製造方法に用いられるスペーサーは以下のものに限定されることはなく、医薬化合物の至適な遊離速度を与えるように当業者が適宜選択可能であることはいうまでもない。表中、ペプチド配列は左側がＮ末端であり、Ｃ末端側に医薬化合物の残基が結合する。D-PheはD-フェニルアラニン残基を示し、その他のアミノ酸はL-アミノ酸を示す。なお、遊離速度の大小はドキソルビシンを結合した薬物複合体のWalker 256担癌ラットに対する薬効の発現の程度、またはWalker 256担癌ラットの腫瘍部位における遊離ドキソルビシンの濃度によって判定したものである。これらのスペーサーのうち、ドキソルビシンに対しては（N末端）-Gly-Gly-Phe-Gly-等の短時間に高濃度の医薬化合物を遊離することができるスペーサーを用いることが好ましい。
0004137184.tif 000002
薬物複合体の多糖誘導体部分を構成するカルボキシル基を有する多糖誘導体としては、例えば、多糖類又はそれらを化学的若しくは生物学的に修飾した誘導体であって分子中にカルボキシル基を有するものであればいかなるものを用いてもよい。例えば、ヒアルロン酸、ペクチン酸、アルギン酸、コンドロイチン、ヘパリンなどの多糖類のほか、プルラン、デキストラン、マンナン、キチン、イヌリン、レバン、キシラン、アラバン、マンノグルカン、キトサンなどの多糖の一部又は全部の水酸基に対してカルボキシル基を有する官能基を導入したものなどを用いることができる。例えば、水酸基をカルボキシC1-4アルキル化したものや、水酸基に多塩基酸の一のカルボキシル基をエステル結合させたものなどを好適に用いることができる。また、上記の多糖類をポリアルコール化した後に、カルボキシル基を有する官能基を導入したものを用いてもよい。
これらの多糖誘導体のうち、カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを用いることが好ましい。カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールのポリアルコール化度は特に限定されないが、カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下においてデキストランを処理して得られたデキストランポリアルコールであることが好ましい。
カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを製造するために用いるデキストランの種類は特に限定されず、α-D-1,6-結合を任意の割合で含んでいてもよい。例えば、α-D-1,6-結合の割合が85%以上、90%以上、又は95%以上のデキストランなどを用いることができる。デキストランの分子量は特に限定されないが、例えば10,000程度から2,000,000程度のもの、好ましくは50,000程度から800,000程度のものを用いることができる。カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールのカルボキシC1-4アルキル基を構成するC1-4アルキルとしては、直鎖又は分枝鎖のC1-4アルキル、具体的にはメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基などを用いることができるが、好ましくはメチル基を用いることができる。
本発明の方法は、上記の薬物複合体を製造するにあたり、カルボキシル基を有する多糖誘導体の有機アミンとの塩と医薬化合物自体、又はカルボキシル基を有する多糖誘導体の有機アミンとの塩と医薬化合物を結合させたスペーサーとを実質的に水を含まない有機溶媒中、すなわち非水系で反応させることを特徴としている。以下、本発明の方法の好ましい態様として、カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを多糖誘導体として用いる場合について具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの態様に限定されることはない。
出発原料としてデキストランを用いる場合には、デキストランに大過剰の過ヨウ素酸ナトリウムと水素化ホウ素ナトリウムとを順次作用させてデキストランを実質的に完全にポリアルコール化したデキストランポリアルコールを製造することができる。もっとも、デキストランのポリアルコール化の方法は上記のものに限定されることはなく、当業者に利用可能なものであればいかなる方法を採用してもよい。カルボキシC1-4アルキル化は、例えば、デキストランポリアルコールの水酸基に対してクロル酢酸、ブロム酢酸、α−クロルプロピオン酸、α−メチル−α−クロルプロピオン酸、β−クロルプロピオン酸、α−メチル−β−クロルプロピオン酸、α−クロル酪酸、β−クロル酪酸、γ−クロル酪酸などのハロゲン化C1-4アルキルカルボン酸、好ましくはクロル酢酸を反応させて水酸基を部分的又は完全にカルボキシC1-4アルキル化することにより行うことができる。
例えば、デキストランポリアルコールを反応に関与しない不活性溶媒（例えば、水、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）に溶解し、塩基（例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等）の存在下にハロゲン化C1-4アルキルカルボン酸またはその塩を添加し、氷冷下ないし100℃程度の温度範囲で数分ないし数日間反応させればよい。カルボキシC1-4アルキル基の導入の程度は、例えば、カルボキシC1-4アルキル化の反応温度や試薬として用いるハロゲン化C1-4アルキルカルボン酸及び塩基の量を適宜選択することにより容易に調節可能であり、そのような手段は当業者に周知である。デキストランポリアルコールの水酸基に対するカルボキシC1-4アルキル化の程度は特に限定されないが、例えば、構成糖残基あたり0.01〜2.0の範囲、好ましくは0.1〜1.0、より好ましくは0.3〜0.5の範囲である。カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールの分子量は、ゲルろ過法で測定した場合に5,000から500,000程度、好ましくは50,000〜450,000程度、より好ましくは200,000〜400,000程度である。
このようにして製造されるカルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールは、ナトリウム塩又はカリウム塩などのアルカリ金属塩の形態の水溶液として調製される。本発明の方法では、このような多糖誘導体のカルボキシル基に対して医薬化合物又は医薬化合物の残基と結合させたスペーサーを結合させるにあたり、上記のアルカリ金属塩の形態の多糖誘導体に替えて、有機アミンとの塩の形態の多糖誘導体を用いることを特徴としている。このような有機アミンとの塩の形態の多糖誘導体は、実質的に水を含まない有機溶媒中に高濃度に溶解でき、反応を非水系で行うことを可能にするので、反応効率を著しく高めることができる。
有機アミンとの塩としては、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリエタノールアミンなどの脂肪族アミン類の塩のほか、N-メチルピロリジン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルホリン、ジメチルアミノピリジンなどの脂環式又は芳香族アミン類の塩、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウムなどの四級アンモニウム塩、などを用いることができる。多糖誘導体のナトリウム塩から有機アミンとの塩への変換は、イオン交換樹脂などを用いて行うことができる。例えば、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩を水に溶解し、Bio-Rad AG50W-X2（200-400メッシュ、H+型）樹脂を充填したカラムに付して水で溶出した後、トリエチルアミンなどの有機アミンを添加して凍結乾燥することができる。また、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩を水に溶解し、トリエチルアンモニウム型の樹脂を通過させることによって一工程で変換を行うことも可能である。
医薬化合物自体とカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基との結合、又は医薬化合物を結合させたスペーサーとカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基との結合は、一般的には、医薬化合物が有する反応性アミノ基又はスペーサーのＮ末端アミノ基とカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基とを、酸アミド結合させればよい。もっとも、医薬化合物又はスペーサーとカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基との結合は上記のものに限定されることはなく、他の化学結合や１又は２以上のスペーサーを利用した結合であってもよい。例えば、スペーサーのＣ末端カルボキシル基又は医薬化合物のカルボキシル基とカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基とにより酸無水物を形成させてもよく、また、エチレンジアミン等のジアミン化合物をスペーサーとして用いてそれぞれのカルボキシル基をジアミンの各アミノ基に酸アミド結合させてもよい。
医薬化合物が有する反応性アミノ基又はスペーサーのＮ末端アミノ基とカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基とを酸アミド結合により結合させる場合には、ペプチド鎖の合成に用いる通常の脱水縮合剤、例えば、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）のようなN,N’-ジシクロアルキルカルボジイミド類、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDAPC）等のカルボジイミド誘導体、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）のようなベンゾトリアゾール誘導体のほか、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（EEDQ）などを用いることができる。また、活性エステル法や酸ハライド法などにより反応を行ってもよい。
反応は実質的に水を含まない有機溶媒であって、反応種（カルボキシメチルデキストランポリアルコールの有機アミンとの塩及び医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスペーサー）を溶解することができるものならばいかなるものを用いてもよい。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、N-メチルピロリドン、スルホランなどを用いることが好適である。医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスペーサーを反応させることによりカルボキシメチルデキストランポリアルコールに導入される医薬化合物残基の量は特に限定されないが、医薬化合物残基の物理化学的性質、並びに薬物複合体の体内動態、薬効、及び毒性などの観点から適宜選択すべきである。一般的には、0.1〜30重量％、好ましくは1〜15重量％程度の範囲を選択することができる。カルボキシメチルデキストランポリアルコールに導入された医薬化合物残基の割合は、例えば、吸光度分析などにより容易に決定することが可能である。
本発明の製造方法の好ましい態様として、特開平6-87746号公報の請求項２に記載された抗腫瘍剤である医薬化合物を結合したオリゴペプチドをカルボキシメチルデキストランポリアルコールに導入する方法を以下のスキームに示すが、本発明の方法はこのスキームに示されたものに限定されることはない。下記スキームにおいて、医薬化合物残基の導入量は、例えば1〜15重量％、好ましくは4〜8重量％程度である。また、下記スキーム中には、ポリアルコール類の構成単位のうち１個又は２個のカルボキシメチル基が導入された構成単位のみを例示的に記載したが、薬物複合体の多糖誘導体部分は上記構成単位の繰り返しによって構成されるものではないことを理解すべきである。
0004137184.tif 000003
薬物複合体
0004137184.tif 000004
上記スキーム中の医薬化合物は、酸性水性媒体中（例えばpH3程度）ではラクトン環を形成した化合物（閉環体）に平衡が偏り、一方、塩基性水性媒体中（例えばpH10程度）ではラクトン環が開環した化合物（開環体）に平衡が偏ることが知られているが、このような閉環体及び開環体に対応する残基を導入した薬物複合体は同等の抗腫瘍効果を有している。しかしながら、カルボキシメチルデキストランポリアルコールと上記医薬化合物を結合させたスペーサー（例えばオリゴペプチド・スペーサー）とを反応させる場合に開環型の反応種が反応系に存在すると、ラクトン環に由来するカルボキシル基とスペーサー由来のアミノ基との間で縮合反応が進行し、著しく反応収率が低下するだけでなく、目的とする均一な薬物複合体が得られない場合がある。このような副反応は、平衡が達成されない非水系において反応種として閉環体を用いることにより回避することができる。従って、本発明の方法は上記の医薬化合物を含む薬物複合体の製造に特に好適である。
本発明の方法により製造される上記の薬物複合体は、医薬化合物の残基の種類（例えば、抗腫瘍剤または抗炎症剤などの医薬化合物の残基）に応じて、所望の医薬活性を腫瘍部位や炎症部位などの局所において特異的に発現させることができ、かつ、医薬化合物自体の有する毒性を低減できるという特徴を有する。例えば、多糖誘導体部分であるカルボキシメチルデキストランポリアルコールは薬物送達のキャリアーとして極めて優れた血中滞留性及び腫瘍・炎症部位への集積性を有しており、上記の薬物複合体は腫瘍選択性及び炎症部位選択性を有している。また、腫瘍部位や炎症部位ではプロテアーゼ（ペプチダーゼ）が発現されていると考えられるので、オリゴペプチドからなるスペーサーを有する薬物複合体はスペーサー部分で容易に加水分解され、遊離した医薬化合物が薬効を発揮する。
本発明の方法により製造された薬物複合体を含む医薬は、通常、凍結乾燥品などの形態でバイアル等に充填することができ、用時溶解型の注射用または点滴用製剤等の非経口投与用製剤として臨床に提供されるが、このような医薬の製剤形態は上記態様に限定されることはない。上記製剤の製造には、例えば、溶解補助剤、pH調節剤、安定化剤など当業界で利用可能な製剤用添加物を用いて製造される医薬組成物を用いることができる。上記医薬の投与量は特に限定されないが、通常は、医薬化合物残基を構成する医薬化合物の投与量、薬物複合体中に導入された医薬化合物の残基の量、患者の状態や疾患の種類などを勘案して決定すべきである。例えば、特開平6-87746号公報の請求項２に記載された抗腫瘍剤の残基が約6重量%程度の割合で導入された薬物複合体を非経口投与する場合には、一般に一日あたり体表面積1m2につき約1〜500mg程度、好ましくは約10〜100mgの範囲で一回投与し、3〜4週毎に繰り返すことが好ましい。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中、「A-NH-」は、特開平6-87746号公報の請求項２に記載された医薬化合物（実施例中で「DX-8951」という場合がある）などのようにラクトン環を有する医薬化合物において、ラクトン環が閉環した医薬化合物をA-NH2で表した場合の医薬化合物残基を表し、その一例は、上記のスキーム中にA-NH-で示した基（ラクトン環を形成したもの）である。また、A’-NH-は、A-NH-で表される医薬化合物残基中のラクトン環が閉環型若しくは開環型のいずれか又はそれらの混合形態であることを示す。
また、実施例中、特に言及しない場合には、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシメチル化度（構成糖残基あたりのカルボキシメチル基の置換度）は、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩を遊離酸型に変換した後、0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解して0.1N塩酸で滴定することにより求めた。カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩の水溶液をBio-Rad AG50W-x2（H+型）カラムに付して通過液を凍結乾燥して試料として用いた。この試料を所定過剰量の0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、フェノールフタレンを指示薬として0.1N塩酸で滴定した。試料の採取量をs（mg）、0.1N水酸化ナトリウム水溶液の所定過剰量をa（ml）、0.1N塩酸の滴定量をb（ml）とし、カルボキシメチル化度を13.4（a-b）/［s-5.8（a-b）］の式により求めた。また、薬物の導入量（重量％）は、薬物の特性吸収を利用した吸光度分析（362nm付近）から求めた。さらに、ゲル濾過法は次の条件に従って行った（カラム：TSK gel G4000 PWXL、溶離液：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min、カラム温度：40℃）。
例１：（Boc-Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）
0004137184.tif 000005
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly（600mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（160mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（20ml）に溶解し、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（280mg）を添加した。この溶液に特開平6-87746号公報の請求項２に記載された医薬化合物のメタンスルホン酸塩（600mg：上記公報の実施例50に記載された化合物）とトリエチルアミン（0.16ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（30ml）溶液を加えて、遮光下に室温で16時間撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：0.5%酢酸を含むジクロロメタン：メタノール=10:1溶液）で精製して標記化合物（1.0g）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.40(d,1H,J=8.3Hz),8.10-8.17(m,2H),7.91-8.01(m,1H),7.78(d,1H,J=10.75Hz),7.32(s,1H),6.94-6.96(m,1H),6.50(s,1H),5.57(t,1H,J=4.5Hz),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.77(dd,2H,J=5.85Hz,J=8.80Hz),3.70(d,2H,J=4.40Hz),3.65(d,2H,J=5.35Hz),3.56(d,2H,J=5.85),3.15-3.25(m,2H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35).
Mass(FAB);m/e 854(M+1)
例２：（Boc-Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）の合成
Boc-Gly-Gly-Gly-Phe（600mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（160mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（20ml）に溶解し、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（280mg）を添加した。この溶液にDX-8951のメタンスルホン酸塩（600mg）とトリエチルアミン（0.16ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（30ml）溶液を加えて、遮光下に室温で16時間撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：0.5%酢酸を含むジクロロメタン：メタノール=10:1溶液）で精製して標記化合物（700mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.57(d,1H,J=7.8Hz),8.19(d,1H),8.05-8.07(m,2H),7.79(d,1H,J=11.2Hz),7.32(s,1H),7.10(d,2H,J=7.8Hz),6.93-7.03(m,4H),6.51(s,1H),5.52-5.55(m,1H),5.44(s,2H),5.18(d,1H,J=18.5Hz),4.84(d,1H,J=18.5Hz),4.57-4.59(m,1H),3.57-3.71(m,6H),3.15-3.25(m,2H),3.00-3.02(m,1H),2.80-2.90(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).
Mass(FAB);m/e 854(M+1)
例３：（Boc-Gly-Gly-Gly-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）の合成
Boc-Gly-Gly-Gly-Gly（120mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（39mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（20ml）に溶解し、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（70mg）を添加した。この溶液にDX-8951のメタンスルホン酸塩（150mg）とトリエチルアミン（0.039ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）溶液を加えて、遮光下に室温で16時間撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール=10:1溶液）で精製して標記化合物（100mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.40(d,1H,J=8.3Hz),8.10-8.17(m,2H),7.91-8.01(m,1H),7.78(d,1H,J=10.75Hz),7.32(s,1H),6.94-6.96(m,1H),6.50(s,1H),5.57(t,1H,J=4.5Hz),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.77(dd,2H,J=5.85Hz,J=8.80Hz),3.70(d,2H,J=4.40Hz),3.65(d,2H,J=5.35Hz),3.56(d,2H,J=5.85Hz),3.15-3.25(m,2H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).
Mass(FAB);m/e 764(M+1)
例４：（Gly-Gly-Gly-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）トリフルオロ酢酸塩の合成
0004137184.tif 000006
（Boc-Gly-Gly-Gly-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（79mg）をトリフルオロ酢酸（3ml）に溶かし、１時間放置した。溶媒を留去し、メタノール（30ml）で共沸を２回、エタノール（30ml）で共沸を２回行った後、残渣をエーテルで洗浄して、標記化合物（80mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.59-8.61(m,1H),8.50(d,1H,J=8.3Hz),8.21-8.27(m,2H),7.91-8.01(br,3H),7.81(d,1H,J=11.2Hz),7.32(s,1H),6.50-6.52(br,1H),5.57-5.59(m,1H),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.80-3.82(m,3H),3.70-3.75(m,3H),3.15-3.25(m,2H),2.41(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86-1.88(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).
例５：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
デキストランT2000（10g，ファルマシア社製，平均分子量2,000,000）を0.1M酢酸緩衝液（pH5.5，1,000ml）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（33.0g）の水溶液（1000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（7.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（14g）を加えて溶解した後、室温で一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-30膜（ミリポア社製）を用いて限外濾過法による低分子画分の除去を行なった。高分子画分を凍結乾燥して、デキストランポリアルコールを得た。このデキストランポリアルコールをpH3.0で１時間処理した後、バイオマックス-50膜で低分子画分を除去し、次いで高分子画分をバイオマックス-100膜で除去し、凍結乾燥して精製デキストランポリアルコール（2.0g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過法、デキストラン標準）は、220Kであった。
この精製デキストランポリアルコール（1.8g）を、水酸化ナトリウム（10.5g）を水（45ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（15g）を加えて溶解させた後、室温で20時間反応させた。この反応液を酢酸でpHを8に調整した後、バイオマックス-10膜を用いて限外濾過法による低分子画分の除去を行なった。高分子画分を凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（1.8g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、デキストラン標準）は330Kであり、カルボキシメチル化度は0.8であった。
上記のカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（300mg）を水に溶解し、Bio-Rad AG50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラム（1.5×8.6cm）にのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（0.5ml）を加えた後、凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（380mg）を得た。カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（各300mg）を上記と同様にカラム処理して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（380mg，400mg）を得た。
例６：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩の合成
上記例５で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（0.15g）を、水酸化ナトリウム（1.05g）を水（4.5ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（1.5g）を加えて溶解させた後、室温で18時間反応させた。この反応液を酢酸でpHを8に調整し、90mlのメタノール中に滴下した後、3M塩化ナトリウム水溶液（0.15ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱をメタノールで洗浄した後、水（5ml）に溶解し、3M塩化ナトリウム水溶液（0.15ml）を加えた。この水溶液をミリポアフィルター（0.45μm）で濾過し、濾液を35mlのエタノール中に滴下して、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱をエタノールで洗浄した後、水に溶解し、透析膜（スペクトラポア１、カットオフ分子量6,000-8,000）を用いて、純水に対して透析した。透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後に凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（0.18g）を得た。この物質の糖残基あたりのカルボキシメチル化度（アルカリ滴定法）は1.2であった。
例７：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩の合成
例５で得た精製デキストランポリアルコール（0.2g）を、水酸化ナトリウム（0.84g）を水（6ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（1.2g）を加えて溶解させた後、室温で18時間反応させた。この反応液を酢酸でpHを8に調整し、120mlのメタノール中に滴下した後、3M塩化ナトリウム水溶液（0.2ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱をメタノールで洗浄した後、水（5ml）に溶解し、3M塩化ナトリウム水溶液（0.2ml）を加えた。この水溶液をミリポアフィルター（0.45μm）で濾過し、濾液を35mlのエタノール中に滴下して、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱をエタノールで洗浄した後、水に溶解し、透析膜（スペクトラポア１、カットオフ分子量6,000-8,000）
を用いて、純水に対して透析した。透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（0.20g）を得た。この物質の糖残基あたりのカルボキシメチル化度（アルカリ滴定法）は0.4であった。
例８：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例５で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（380mg，カルボキシメチル化度0.8）をN,N-ジメチルホルムアミド（30ml）に溶解した。この溶液に、（Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（49mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（5ml）溶液、トリエチルアミン（0.017ml）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（380mg）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液を1M水酸化ナトリウム水溶液でpH10に調整した後、25mlのエタノール中に5mlずつ滴下した。この混合物に3M塩化ナトリウム水溶液（1ml）、ジエチルエーテル（5ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。
この沈澱を水に溶解し、透析膜（スペクトルポア１、カットオフ分子量6,000-8,000）を用いて純水に対して透析し、透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥した。得られた粗生成物を水（30ml）に溶解し、0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整し、37℃で１時間処理した。この処理液を上記と同様に透析した後、透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過し、凍結乾燥して標記化合物を289mg得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソー株式会社製 TSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液，pH9.0，0.25mg/ml）をそれぞれ図１及び図２に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ5.3%（W/W）であった。
例９：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）合成
（Boc-Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（50mg）から例４と同様の方法により脱Boc化して得られる（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-Aのトリフルオロ酢酸塩を、例８と同様の方法に従って、例５で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（380mg）に導入して標記化合物（300mg）を合成した。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソー株式会社製 TSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液，pH9.0，0.19mg/ml）をそれぞれ図３及び図４に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ5.3%（W/W）であった。
例10：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Gly-Gly-NH-A’（A-NH2）=DX-8951）の合成
（Boc-Gly-Gly-Gly-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（41mg）から例４と同様の方法により脱Boc化して得られる（Gly-Gly-Gly-Gly）-NH-Aのトリフルオロ酢酸塩を、例８と同様の方法に従って、例５で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（380mg）に導入して標記化合物（190mg）を合成した。本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液，pH9.0，0.34mg/ml）を図５に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ5.3%（W/W）であった。
例11：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
マウス線維肉腫Meth A細胞1×106個をBALB/c系の雄マウス（7週齢）の右鼠蹊部皮下に移植してMeth A担癌マウスを作成した（１群７匹）。7日目に注射用蒸留水に溶解した例９の薬物複合体をMeth A担癌マウスの尾静脈内に４日毎に４回投与した。移植後21日日に腫瘍を摘出して重量を測定し、腫瘍増殖抑制率を次式：腫瘍増殖抑制率（%）＝［1-（検体投与群の平均腫瘍重量／コントロール群の平均腫瘍重量）］×100により算出した。その結果、例９で得られた本発明の薬物複合体は、毒性（体重減少）を発現することなく、上記医薬化合物自体（スペーサー及び多糖誘導体なし）に比較して抗腫瘍効果が大幅に増強されていた。多糖誘導体自体（例５）及びスペーサーのみを導入した医薬化合物残基（例１の化合物から例４の方法に従って脱BOC化して得られたるH2N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩）は無効であった。
0004137184.tif 000007
例12：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例11と同様の方法によりMeth A担癌マウスを作成し（１群６匹）、7日目に例８及び例９の薬物複合体を単回投与した場合の抗腫瘍作用を比較した。その結果、抗腫瘍作用の程度は（多糖誘導体）-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’＞（多糖誘導体）-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A’＞医薬化合物自体であった。スペーサーを介することなく医薬化合物残基を例５のカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基に直接結合した化合物（医薬化合物残基の導入量：6.2重量%）は無効であった。
0004137184.tif 000008
例13：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
デキストランT500（10g，ファルマシア社製，分子量500K）を0.1M酢酸緩衝液（pH5.5，1000ml）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（33g）の水溶液（1000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（7.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（14g）を加えて溶解した後、一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、8M水酸化ナトリウム水溶液でpH7.5に調整して溶液１を得た。別に、デキストランT500（10g，ファルマシア社製，分子量500K）について、上記の一連の操作を行い、溶液２を得た。さらに、デキストランT250（各10g，ファルマシア社製，分子量250K）について、上記の一連の操作を行い、溶液３と溶液４を得た。これらの溶液１〜４を合して、バイオマックス-50膜を用いて限外濾過法により、低分子画分の除去を行った。高分子画分を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（25g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、163Kであった。
このデキストランポリアルコール（11g）を、水酸化ナトリウム（46.2g）を水（330ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（66g）を加えて溶解させた後、室温で一晩反応させた。
この反応液を酢酸でpHを９に調整した後、バイオマックス-30膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（13g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は228Kであり、カルボキシメチル化度は0.4であった。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（600mg）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラム（直径44mm、長さ210mm）にのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（0.93ml）を加えた後、凍結乾燥して標記化合物（690mg）を得た。
例14：（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）トリフルオロ酢酸塩の合成
例１で得た（Boc-Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（79mg）をトリフルオロ酢酸（3ml）に溶かし、１時間放置した。溶媒を留去し、メタノール（30ml）で共沸を２回、エタノール（30ml）で共沸を２回行った後、残渣をエーテルで洗浄して、標記化合物（80mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.53(d,1H,J=8.3Hz),8.40-8,48(m,2H),8.28(d,1H,J=8.3Hz),7.95-8.07(br,3H),7.81(d,1H,J=10.2Hz),7.30-7.37(m,2H),7.15-7.30(m,5H),6.50-6.55(br,1H),5.50-5.57(m,1H),5.41(d,2H,J=7.82Hz),5.25(s,2H),4.55-4.62(m,1H),3.55-3.92(m,6H),3.15-3.25(br,2H),2.98-3.03(m,1H),2.73-2.82(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.84-1.92(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).
例15：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例13で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（400mg）をトリエチルアンモニウム塩（470mg）に変換し、N,N-ジメチルホルムアミド（30ml）に溶解させた。この溶液に、例14で得た（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（62mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（5ml）溶液、トリエチルアミン（0.02ml）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（470mg）を順次加え、遮光して室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。
これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離により集めた。この沈澱を0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整した後、透析膜（スペクトルポア１、カットオフ分子量6000-8000）を用いて、純水に対して透析した。透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（600mg）を得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソー TSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液、pH9.0、0.1mg/ml）をそれぞれ図６及び図７に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ5.8%（W/W）であった。
例16：（Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）トリフルオロ酢酸塩の合成
例２で得た（Boc-Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（79mg）をトリフルオロ酢酸（3ml）に溶かし、１時間放置した。溶媒を留去し、メタノール（30ml）で共沸を２回、エタノール（30ml）で共沸を２回行った後、残渣をエーテルで洗浄して、標記化合物（80mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.62-8.66(m,2H),8.23(d,1H,J=8.3Hz),8.18-8.20(m,1H),7.98-8.10(br,2H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.32(s,1H),7.09(d,2H,J=7.3Hz),6.93-7.03(m,4H),6.50-6.60(br,1H),5.52-5.55(m,1H),5.44(s,2H),5.18(d,1H,J=18.5Hz),4.80(d,1H,J=18.5Hz),4.57-4.59(m,1H),3.57-3.71(m,6H),3.15-3.25(m,2H),3.00-3.02(m,1H),2.80-2.90(m,1H),2.50(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86-2.00(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).
例17：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例13で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（1.0g）をトリエチルアンモニウム塩（1.2g）に変換し、N,N-ジメチルホルムアミド（90ml）に溶解させた。この溶液に、例16で得た（Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（158mg）のN,H-ジメチルホルムアミド（15ml）溶液、トリエチルアミン（0.05ml）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（1.2g）を順次加え、遮光して室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離により集めた。この沈澱を0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整した後、透析膜（スペクトルポア１、カットオフ分子量6000-8000）を用いて、純水に対して透析した。透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（1.4g）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ5.2%（W/W）であった。
例18：Boc-Gly-Phe-Leu-OHの合成
H-Gly-Phe-Leu-OH（3.0g）を50%ジオキサン水溶液（48ml）に加えて氷冷した。この溶液に1N水酸化ナトリウム水溶液（9.45ml）と（Boc）2O（2.27g）を含むジオキサン（24ml）溶液を加え、１晩撹拌した。反応液に1N塩酸（9.45ml）を加え、溶媒を溜去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝５：１溶液）で精製して標記化合物（2.5g）を得た。
例19：Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzlの合成
例18で得たBoc-Gly-Phe-Leu-OH（2.4g）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（656mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（50ml）に溶解し、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（1.17g）を添加し、２時間撹拌した。この溶液にH-Gly-OBzlのトシル酸塩（1.9g）とトリエチルアミン（0.79ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（40ml）溶液を加えて、室温で16時間撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝50：１溶液）で精製して標記化合物（2.0g）を得た。
1H-NMR(DNSO-d6)δ:8.20-8.30(m,1H),8.12(d,1H,J=8.3Hz),7.83(d,1H,J=8.3Hz),7.32-7.37(m,5H),6.89-6.95(m,1H),5.12(s,1H),4.52-4.59(br,1H),4.34(dd,1H,J=7.3Hz,J=15.1Hz),3.93(dd,1H,J=5.5Hz,J=17.2Hz),3.84(dd,1H,J=5.5Hz,J=17.2Hz),3.54(dd,1H,J=5.9Hz,J=16.7Hz),3.42(dd,J=5.9Hz,J=16.7Hz),3.00(dd,1H,J=4.4Hz,13.7Hz),2.78(dd,1H,J=8.8Hz,J=13.2Hz),1.50-1.65(m,1H),1.45(t,2H,J=7.3Hz),1.36(s,9H),0.86(d,3H,J=6.4Hz),0.82(d,3H,J=6.4Hz).
例20：Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OHの合成
例19で得たBoc-Gly-Phe-Leu-OBzl（1.7g）を酢酸エチル（30ml）とメタノール（30ml）の混合溶液に溶解させた後、5%Pd-C（1.5g）を加え、接触還元を行った。反応液を濾過し、濾液を減圧乾固して、標記化合物（1.15g）を得た。
例21：（Boc-Gly-Phe-Leu-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）の合成
例20で得たBoc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH（200mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（58mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（5ml）に溶解し、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（104mg）を加えて溶解させた。この溶液にDX-8951のメタンスルホン酸塩（224mg）とトリエチルアミン（0.059ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（5ml）溶液を加えて、遮光下に室温で16時間撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：0.5%酢酸を含むジクロロメタン：メタノール＝10：１溶液）で精製して標記化合物（200mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.35(d,1H,J=7.8Hz),8.08-8.18(m,2H),7.75-7.85(m,2H),7.32(s,1H),7.10(d,2H,J=6.8Hz),7.08-7.13(m,3H),6.85-6.95(br,1H),6.40-6.65(br,1H),5.52-5.55(m,1H),5.46(d,1H,J=18.5Hz),5.37(d,1H,J=18.5Hz),5.24(s,2H),4.44-4.52(m,1H),4.15-4.25(m,1H),3.68-3.72(m,2H),3.40-3.52(m,2H),3.15-3.25(br,2H),2.85-2.95(m,1H),2.65-2.75(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.80-1.91(m,2H),1.50-1.65(m,1H),1.45(t,2H,J=7.3Hz),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.4),0.86(d,3H,J=6.4Hz),0.82(d,3H,J=6.4Hz).
例22：（Gly-Phe-Leu-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）トリフルオロ酢酸塩の合成
例21で得た（Boc-Gly-Phe-Leu-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（97mg）をトリフルオロ酢酸（3ml）に溶かし、１時間放置した。溶媒を留去し、メタノール（30ml）で共沸を２回、エタノール（30ml）で共沸を２回行った後、残渣をエーテルで洗浄して、標記化合物（95mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.57(d,1H,J=8.3Hz),8.47(d,1H,J=8.3Hz),8.32(d,1H,J=7.8Hz),8.17(t,1H,J=5.5Hz),7.81-7.91(br,3H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.32(s,1H),7.21-7.23(m,5H),7.12-7.17(m,1H),6.45-6.55(br,1H),5.57(q,1H,J=4.4Hz),5.43(d,1H,J=16.1Hz),5.34(d,1H,J=16.1Hz),5.23(s,2H),4.67(dt,1H,J=4.0Hz,J=9.0Hz),4.31(dd,1H,J=8.5Hz,J=15.0Hz),4.0-4.4(br,1H),3.74-3.76(m,2H),3.56(dd,1H,J=6.0Hz,J=16.0Hz),3.41(dd,1H,J=6.0Hz,J=16.0Hz),3.17-3.19(br,2H),3.02(dd,1H,J=4.0Hz,J=14.0Hz),2.70(dd,1H,J=10.0Hz,J=14.0Hz),2.40(s,3H),2.05-2.15(m,1H),1.85(dt,2H,J=7.0Hz,J=14.0Hz),1.50-1.55(m,1H),1.45(t,2H,J=6.0Hz),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.4),0.85(d,3H,J=6.4Hz),0.80(d,3H,J=6.4Hz).
例23：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Phe-Leu-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例13で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（690mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（50ml）に溶解させた。この溶液に、例22で得た（Gly-Phe-Leu-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（95mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）溶液、トリエチルアミン（0.03ml）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（690mg）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離により集めた。この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整した後、透析膜（スペクトルポア１、カットオフ分子量6000-8000）を用いて、純水に対して透析した。透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、濾液を凍結乾燥して標記化合物（600mg）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、4.8%（W/W）であった。
例24：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
デキストランT500（50g，ファルマシア社製，分子量500K）を0.1M酢酸緩衝液（pH5.5，5000ml）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（165.0g）の水溶液（5000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（35.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（70g）を加えて溶解した後、一晩撹拌した。
反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-50膜を用いて限外濾過法による低分子画分の除去を行なった。高分子画分を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（27.1g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、140Kであった。
このデキストランポリアルコール（5g）を、水酸化ナトリウム（21g）を水（150ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（30g）を加えて溶解させた後、室温で一晩反応させた。この反応液を酢酸でpHを８に調整した後、バイオマックス-50膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（5.6g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は263Kであり、カルボキシメチル化度は0.4であった。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.0g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラム（直径44mm、長さ210mm）にのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（4ml）を加えた後、凍結乾燥して標記化合物（2.2g）を得た。
例25：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリメチルアンモニウム塩の合成
例24で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（1.0g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、Me3N H+型）カラムにのせ、水で溶出した。この溶出液を凍結乾燥して標記化合物（950mg）を得た。
例26：（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）塩酸塩の合成
例14と同様の方法で（Boc-Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（400mg）から得た（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-Aトリフルオロ酢酸塩を水-MeOH（1:4）に溶解して、Bio-Rad AG1-X8（200-400メッシュ、Cl-型）カラム（1.5cm×8.6cm）にのせ、上記溶媒で溶出した。この溶出液を濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（310mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.53(d,1H,J=8.5Hz),8.46-8.48(m,1H),8.37-8.39(m,1H),7.95(d,1H,J=8.0Hz),7.80(s,3H),7.78(d,1H,J=11.1Hz),7.34(s,1H),7.14-7.24(m,5H),6.50(s,1H),5.56-5.60(m,1H),5.35-5.40(m,2H),5.24(s,2H),4.51-4.56(m,1H),3.86(dd,J=4.8,13.5Hz,1H),3.68-3.79(m,3H),3.54(s,2H),3.15-3.22(m,2H),3.01(dd,J=5.6,13.5Hz,1H),2.78(dd,J=9.6,3.5Hz,1H),2.41(s,3H),2.12-2.23(m,2H),1.81-1.89(m,2H),0.88(t,3H,J=7.2Hz).
Mass(FAB);m/e 753(M+1)
例27：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例25で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリメチルアンモニウム塩（0.1g）をN,N-ジメチルホルムアミド（6ml）に溶解させた。この溶液に、例26で得た（Gly-Gly-Phe-Gly）NH-A（A-NH2=DX-8951）の塩酸塩（24mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）溶液、トリエチルアミン（5μl）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（0.1g）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-30膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（90mg）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ11%（W/W）であった。
例28：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例25で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリメチルアンモニウム塩（0.1g）をN,N-ジメチルホルムアミド（6ml）に溶解させた。この溶液に、例26で得た（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）の塩酸塩（36mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）溶液、トリエチルアミン（8μl）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（0.1g）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH12とした。得られた水溶液をバイオマックス-30膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（80mg）を得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソ−TSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液、pH9.0、36μg/ml）をそれぞれ図８及び図９に示す。本化合物の医薬化合物基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ15%（W/W）であった。
例29：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
デキストランT250（20g，EXTRASYNTHESE製，平均分子量250K）を0.1M酢酸緩衝液（pH5.5，2000ml）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（66.0g）の水溶液（2000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（14.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（28g）を加えて溶解した後、室温で一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-30膜を用いた限外濾過法により低分子画分を除去して、膜を通過しない残留溶液１を得た。別に、デキストランT250（50g，EXTRASYNTHESE製，平均分子量250K）を0.1M酢酸緩衝液（pH5.5，5000ml）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（165g）の水溶液（5000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（35.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（70g）を加えて溶解した後、室温で一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-30膜を用いた限外濾過法により低分子画分を除去して、膜を通過しない残留溶液２を得た。残留溶液１と残留溶液２を合して、限外濾過法によりバイオマックス-50膜を通過する画分をバイオマックス-30膜を用いて低分子画分を除去し、凍結乾燥してデキストランポリアルコール（25.7g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、47Kであった。
このデキストランポリアルコール（5g）を、水酸化ナトリウム（35g）を水（150ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（50g）を加えて溶解させた後、室温で18時間反応させた。この反応液を酢酸でpHを８に調整した後、バイオマックス-50膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（7.2g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は127Kであり、カルボキシメチル化度は0.8であった。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.2g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラム（直径44mm、長さ210mm）にのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（4ml）を加えた後、凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（2.69g）を得た。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（2.67g）をN,N-ジメチルホルムアミド（200ml）に溶解した。この溶液に、例２と同様に合成した（Boc-Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（350mg）から例16と同様の方法で脱Boc化して得られる（Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-Aのトリフルオロ酢酸塩とトリエチルアミン（0.116ml）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶かして得られる溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（2.67g）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶かして得られる溶液を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液に3M塩化ナトリウム水溶液（100ml）を加え、8mlずつを各30mlのエタノール中に滴下した。それぞれに3M塩化ナトリウム水溶液（1ml）、ジエチルエーテル（5ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱をアセトンで洗浄した後、水に溶解し、3M塩化ナトリウム水溶液（10ml）を加えた後、0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整し、37℃で１時間処理した。この処理液をバイオマックス-10膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（2.30g）を得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソ−TSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液，pH9.0，0.20mg/ml）をそれぞれ図10及び図11に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、5.8%（W/W）であった。
例30：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
デキストランT10（20g，ファルマシア社製、平均分子量10K）の0.1M酢酸緩衝液（pH5.5）溶液（2000ml）に、過ヨウ素酸ナトリウム（66.0g）の水溶液（2000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（14.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（28g）を加えて溶解した後、室温で一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-5膜（ミリポア社製）を用いた限外濾過法により低分子画分を除去して、膜を通過しない残留溶液をバイオマックス-30膜を通過させた。得られた通過液を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（8.0g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、13Kであった。
このデキストランポリアルコール（3.7g）を、水酸化ナトリウム（25.9g）を水（111ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（37g）を加えて溶解させた後、室温で20時間反応させた。この反応液を酢酸でpH8に調整した後、バイオマックス-5膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（6.2g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、37Kであり、カルボキシメチル化度は0.9であった。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（6.0g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラムにのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（9.3ml）を加えた後、凍結乾燥して標記化合物（7.2g）を得た。
例31：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
例30で得たデキストランポリアルコール（3.9g）を、水酸化ナトリウム（16.3g）を水（117ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（23.4g）を加えて溶解させた後、室温で18時間反応させた。この反応液を酢酸でpH8に調整した後、バイオマックス-5膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（5.0g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、28Kであり、カルボキシメチル化度は0.5であった。このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（4.8g）を例30と同様にトリエチルアンモニウム塩に変換して、標記化合物（5.6g）を得た。
例32：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
デキストラン4（20g、フナコシ社製、平均分子量4K-6K）の0.1M酢酸緩衝液（pH5.5）溶液（2000ml）に、過ヨウ素酸ナトリウム（66.0g）の水溶液（2000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（14.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（28g）を加えて溶解した後、室温で一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-3膜（ミリポア社製）を用いた限外濾過法により低分子画分を除去した。得られた通過液を凍結乾燥してデキストランポリアルコール（6.0g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、9Kであった。このデキストランポリアルコール（2.7g）を、水酸化ナトリウム（18.9g）を水（81ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（27g）を加えて溶解させた後、室温で20時間反応させた。この反応液を酢酸でpH8に調整した後、バイオマックス-5膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（4.2g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、20Kであり、カルボキシメチル化度は0.9であった。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（4.0g）を例30と同様にトリエチルアンモニウム塩に変換して、標記化合物（4.8g）を得た。
例33：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
例32で得たデキストランポリアルコール（2.7g）を、水酸化ナトリウム（11.3g）を水（81ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（16.2g）を加えて溶解させた後、室温で18時間反応させた。この反応液を酢酸でpH8に調整した後、バイオマックス-5膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.7g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、16Kであり、カルボキシメチル化度は0.5であった。このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.7g）を例30と同様にトリエチルアンモニウム塩に変換して、標記化合物（3.1g）を得た。
例34：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例30で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（1.5g）N,N-ジメチルホルムアミド（90ml）溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（0.07ml）と（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（210mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（40ml）溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（1.5g）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。それぞれに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-3膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（1.3g）を得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソーTSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液、pH9.0、65μg/ml）をそれぞれ図12及び図13に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ6.4%（W/W）であった。
例35：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例31で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（1.2g）をN,N-ジメチルホルムアミド（90ml）溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（0.056ml）と（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（168mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（30ml）溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（1.2g）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。それぞれに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。
この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-3膜を用いた限外濾過法により脱塩した。
膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（1.0g）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、4.8%（W/W）であった。
例36：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例32で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（1.2g）をN,N-ジメチルホルムアミド（90ml）溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（0.056ml）と（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（168mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（30ml）溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（1.2g）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。それぞれに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。
この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-3膜を用いた限外濾過法により脱塩した。
膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（1.0g）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、5.9%（W/W）であった。
例37：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例33で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（1.5g）をN,N-ジメチルホルムアミド（90ml）溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（0.07ml）と（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（210mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（40ml）溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（1.5g）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。それぞれに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。
この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-3膜を用いた限外濾過法により脱塩した。
膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（1.3g）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、4.6%（W/W）であった。
例38：Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A（A-NH2=DW-8286）の合成
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly（42mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（12mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（2ml）に溶解し、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（22mg）を添加した。この溶液に下記式：
0004137184.tif 000009
で表される化合物［（1s,9s）-1-アミノ-5-クロロ-9-エチル-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-1H,12H-ベンゾ［de］ピラノ［3’,4’:6,7］インドリジノ［1,2-b］キノリン-10,13（9H,15H）-ジオン:DW-8286］の塩酸塩（50mg）とトリエチルアミン（0.01ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（6ml）溶液を加えて、遮光して、室温で16時間撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：0.5%酢酸を含むジクロロメタン：メタノール＝10：１溶液）で精製して標記化合物（27mg）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.10-8.20(br,1H),7.95-8.05(br,1H),7.70-7.80(br,2H),7.50-7.60(br,1H),7.40-7.50(br,1H),7.10-7.25(m,5H),7.05-7.15(br,1H),5.85-5.95(br,1H),5.50-5.60(br,1H),5.40-5.50(m,1H),5.25-5.35(m,1H),5.05-5.15(m,1H),4.90-5.00(m,1H),4.70-4.80(br,1H),4.10-4.25(br,2H),3.60-3.90(m,4H),3.10-3.40(m,3H),2.95-3.05(br,1H),2.15-2.30(br,1H),1.75-1.90(br,2H),1.39(s,9H),0.80-1.00(m,3H).
例39：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DW-8286）の合成
例24で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（175mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（20ml）に溶解させた。この溶液に、例38で得られた（Boc-Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DW-8286）（27mg）から例４と同様の方法で脱Boc化して得られる（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-Aのトリフルオロ酢酸塩（29mg）とトリエチルアミン（9μl）のN,N-ジメチルホルムアミド（5ml）溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（175mg）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（20ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-30膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（135mg）を得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソーTSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液、Ph9.0、99μg/ml）をそれぞれ図14及び図15に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量は、0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、6.1%（W/W）であった。
例40：（Boc-Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DW-8089）の合成
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly（163mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（45mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶解し、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（79mg）を添加した。この溶液に下記の式：
0004137184.tif 000010
で表される化合物［（1s,9s）-1-アミノ-9-エチル-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-1H,12H-ベンゾ［de］ピラノ［3’,4’:6,7］インドリジノ［1,2-b］キノリン-10,13（9H,15H）-ジオン:DW-8089］のトシル酸塩（170mg）とトリエチルアミン（0.054ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（30ml）溶液を加えて、遮光下に室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：0.5%酢酸を含むジクロロメタン：メタノール＝94：６溶液）で精製して標記化合物（100mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.51(d,1H,J=8.5Hz),8.41(t,1H,J=5.6Hz),8.29(s,1H),8.17(d,1H,J=8.0Hz),8.03(d,1H,J=8.0Hz),7.90(dd,1H,J=4.8,5.6Hz),7.79(t,1H,J=5.6Hz),7.53(d,1H,J=7.2Hz),7.36(s,1H),7.13-7.25(m,5H),6.94-6.95(m,1H),5.60-5.63(m,1H),5.36-5.47(m,2H),5.21-5.30(m,2H),4.42-4.47(m,1H),3.63-3.96(m,3H),3.51-3.59(m,3H),3.31-3.40(m,1H),3.09-3.21(m,1H),3.02(dd,1H,J=4.8,13.5Hz),2.76-2.81(m,1H),2.13-2.17(m,2H),1.85-1.90(m,2H),1.37(s,9H),0.89(t,3H,J=8.0Hz).
Mass(FAB);m/e 822(M+1)
例41：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DW-8089）の合成
例24で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（1.6g）をN,N-ジメチルホルムアミド（60ml）に溶解させた。この溶液に、例40で得られた（Boc-Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DW-8089）（200mg）から例４と同様の方法で脱Boc化して得られる（Gly-Gly-Phe-Gly）-NH-Aのトリフルオロ酢酸塩とトリエチルアミン（0.07ml）をN,N-ジメチルホルムアミド（20ml）に溶かして得られる溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（1.6g）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。それぞれに3M塩化ナトリウム水溶液（2.5ml）、ジエチルエーテル（25ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（2500rpm，８分）により集めた。この沈澱をエタノールで洗浄した後、水に溶解し、3M塩化ナトリウム水溶液（20ml）を加え、0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整した。この溶液をバイオマックス-10膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（1.20g）を得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソーTSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液，pH9.0，0.26mg/ml）をそれぞれ図16及び図17に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、5.0%（W/W）であった。
例42：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩の合成
デキストランT150（20g、ファルマシア社製、平均分子量150K）を0.1M酢酸緩衝液（pH5.5、2000ml）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（66.0g）の水溶液（2000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（14.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（28g）を加えて溶解した後、室温で一晩撹拌した。反応液を氷冷して、酢酸でpH5.5に調整し、４℃で１時間撹拌した。氷冷下で8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-5膜（ミリポア社製）を用いた限外濾過法により、500mlまで濃縮して溶液１を得た。別に、デキストランT110（20g）について上記の一連の操作を行い、溶液２を得た。溶液１と溶液２を混合し、混合溶液のpHを3.0とし、40℃で４時間インキュベートした後、pHを７に調整して低分子化されたデキストランポリアルコールを含む溶液を得た。バイオマックス-30膜を通過させ、次いでバイオマックス-5膜を用いて脱塩した後、凍結乾燥してデキストランポリアルコール（4.6g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、17Kであった。
このデキストランポリアルコール（2.5g）を、水酸化ナトリウム（17.5g）を水（75ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（25g）を加えて溶解させた後、室温で20時間反応させた。この反応液を酢酸でpHを９に調整した後、バイオマックス-5膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（4.0g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は45Kであり、CM化度は0.9であった。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（3.7g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラムにのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（5.8ml）を加えた後、凍結乾燥して標記化合物（4.4g）を得た。
例43：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例42で得られたカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（4.4g）をN,N-ジメチルホルムアミド（300ml）に溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（0.19ml）と（Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（580mg）を含むN,N-ジメチルホルムアミド（45ml）溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（4.4g）を順次加え、遮光して室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液を1M水酸化ナトリウム水溶液でpH10に調整した後、5mlずつを各25mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（1ml）、ジエチルエーテル（5ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱を水に溶解し、透析膜（スペクトルポア１、カットオフ分子量6000-8000）を用いて、純水に対して透析し、透析内液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（3.4g）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1トリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、4.6%（W/W）であった。
例44：α−メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例42で得られたデキストランポリアルコール（2g）を、水酸化ナトリウム（14g）を水（60ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でα−ブロモプロピオン酸（19ml）を加えて溶解させた後、室温で18時間反応させた。この反応液を酢酸でpH8に調整した後、バイオマックス-50膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、α−メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.95g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、45Kであった。糖残基あたりのα−メチルカルボキシメチル化度は、カルボキシメチルデキストランポリアルコールの場合に準じて以下の様に求めた。α−メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩の水溶液をBio-Rad AG 50W-X2（H+型）
カラムに付し、通過液を凍結乾燥して試料として用いた。この試料を所定過剰量の0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、フェノールフタレインを指示薬として0.1N塩酸で滴定した。試料の採取量をs mg、0.1N水酸化ナトリウム水溶液の所定過剰量をa（ml）、0.1N塩酸の滴定量をb（ml）とし、α−メチルカルボキシメチル化度を13.4（a-b）/［s-7.2（a-b）］の式により求めた。その結果α−メチルカルボキシメチル化度は0.8であった。
このα−メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.2g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラム（直径44mm、長さ210mm）にのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（4ml）を加えた後、凍結乾燥してα−メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（2.69g）を得た。
このα−メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（2.68g）をN,N-ジメチルホルムアミド（60ml）に溶解した。この溶液に、例２と同様に合成した（Boc-Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（350mg）から例16と同様の方法で脱Boc化して得られる（Gly-Gly-Gly-Phe）-NH-Aのトリフルオロ酢酸塩とトリエチルアミン（0.116ml）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶かして得られる溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（2.68g）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶かして得られる溶液を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液に3M塩化ナトリウム水溶液（40ml）を加え、6mlずつを各30mlのエタノール中に滴下した。それぞれに3M塩化ナトリウム水溶液（1ml）、ジエチルエーテル（5ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱をアセトンで洗浄した後、水に溶解し、3M塩化ナトリウム水溶液（10ml）を加え、0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整し、37℃で１時間処理した。この処理液をバイオマックス-10膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（2.15g）を得た。本化合物を0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、GPC（カラム：東ソーTSK Gel PW-4000XL、溶媒：0.1M NaCl、流速：0.8ml/min）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（0.1Mトリス緩衝液，pH9.0，0.21mg/ml）をそれぞれ図18および図19に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、5.9%（W/W）であった。
例45：（Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）トリフルオロ酢酸塩の合成
Phe-Gly-OBzlのp-トルエンスルホン酸塩（3.06g）、Boc-Gly-OH（1.10g）、N-ヒドロキシスクシンイミド（941mg）、N-メチルモルフォリン（0.725ml）、N,N-ジメチルホルムアミド（40ml）の混合物を４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（1.56g）を加えた。室温で一晩撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝98：２溶液）で精製してBoc-Gly-Phe-Gly-OBzl（1.93g）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.52(dd,1H,J=5.6,6.4Hz),7.97(d,1H,J=8.8Hz),7.30-7.39(m,5H),7.15-7.26(m,5H),6.83(t,1H,J=5.6Hz),5.14(s,1H),4.52-4.57(m,1H),3.87-3.96(m,2H),3.57(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.43(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.01(dd,1H,J=4.8,14.3Hz),2.77(dd,1H,J=5.6,14.3Hz),1.37(s,9H).
得られたBoc-Gly-Phe-Gly-OBzl（1.78g）を酢酸エチル（60ml）に溶解し、5%-Pd-C（1.8g）存在下、24時間接触還元した。触媒を濾去し、濾液を減圧濃縮し、Boc-Gly-Phe-Gly-OH（1.41g）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.35(t,1H,J=5.6Hz),7.94(d,1H,J=8.8Hz),7.15-7.26(m,5H),6.85(dd,1H,J=5.6,6.4Hz),4.52-4.58(m,1H),3.76(d,2H,J=5.6Hz),3.56(dd,1H,J=6.4,16.7Hz),3.43(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.03(dd,1H,J=5.0,13.5Hz),2.79(dd,1H,J=9.5,13.5Hz),1.37(s,9H).
上で得られたBoc-Gly-Phe-Gly-OH（500mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（161mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶解した。この溶液にDX-8951のメタンスルホン酸塩（530mg）とトリエチルアミン（0.146ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（50ml）溶液を加えて、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（268mg）を加えて、遮光下に室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝96：４溶液）で精製して（Boc-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（100mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.39(d,1H,J=8.0Hz),8.34(t,1H,J=5.6Hz),7.98(d,1H,J=7.2Hz),7.78(d,1H,J=10.3Hz),7.33(s,1H),7.13-7.24(m,5H),6.80(dd,1H,J=5.6,6.4Hz),5.55-5.61(m,1H),5.44(d,1H,J=16.0Hz),5.41(d,1H,J=16.0Hz),5.25(s,2H),4.43-4.46(m,1H),3.69-3.79(m,2H),3.50(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.41(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.16-3.19(m,2H),2.98(dd,1H,J=4.8,14.3Hz),2.79(dd,1H,J=9.5,14.3Hz),2.41(s,3H),2.19-2.25(m,1H),2.10-2.15(m,1H),1.82-1.90(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).
Mass(FAB);m/e 797(M+1)
得られた（Boc-Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（100mg）をトリフルオロ酢酸（3ml）に溶かし、１時間放置した。溶媒を留去し、メタノール（30ml）で共沸を２回、エタノール（30ml）で共沸を２回行った後、残渣をエーテルで洗浄して、標記化合物（80mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.52-8.62(m,1H),7.94(s,3H),7.79(t,1H,J=11.1Hz),7.34(s,1H),7.15-7.27(m,5H),6.52(s,1H),5.57-5.61(m,1H),5.36-5.46(m,2H),5.24(s,2H),4.66-4.70(m,1H),3.69-3.81(m,2H),3.61-3.68(m,1H),3.40-3.47(m,1H),3.15-3.23(m,1H),3.01(dd,1H,J=4.0,13.5Hz),2.77(dd,1H,J=9.5,13.5Hz),2.12-2.23(m,2H),1.81-1.91(m,2H),0.89(t,3H,J=7.2Hz).
Mass(FAB);m/e 697(M+1)
例46：（Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）トリフルオロ酢酸塩の合成
Boc-Phe-Gly（771mg）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（300mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶解した。この溶液にDX-8951のメタンスルホン酸塩（1058mg）とトリエチルアミン（0.293ml）を溶解したN,N-ジメチルホルムアミド（50ml）溶液を加えて、４℃に冷却した後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（494mg）を加えて、遮光下に室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝98：２溶液）で精製して（Boc-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（1.20g）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.29(d,1H,J=8.0Hz),8.21(t,1H,J=4.8Hz),7.76(d,1H,J=10.3Hz),7.32(s,1H),7.13-7.25(m,5H),6.92(d,1H,J=7.2Hz),6.49(s,1H),5.56-5.61(m,1H),5.44(d,1H,J=15.9Hz),5.38(d,1H,J=15.9Hz),5.25(s,2H),4.08-4.12(m,1H),3.78(d,1H,J=4.8Hz),3.16-3.25(m,2H),2.99(dd,1H,J=4.0,13.5Hz),2.72(dd,1H,J=10.3,13.5Hz),2.40(s,3H),2.09-2.35(m,2H),1.80-1.91(m,2H),1.16(s,9H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).
Mass(FAB);m/e 741(M+1)
上記で得られた（Boc-Phe-Gly）-NH-A（170mg）をトリフルオロ酢酸（4ml）に溶かし、１時間放置した。溶媒を留去し、メタノール（10ml）で共沸を２回、エタノール（10ml）で共沸を２回行った後、残渣をエーテルで洗浄して、標記化合物（100mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.88(t,1H,J=4.8Hz),8.68(d,1H,J=8.7Hz),8.05-8.15(m,3H),7.79(d,1H,J=11.1Hz),7.26-7.36(m,5H),6.52(d,1H,J=7.2Hz),5.57-5.62(m,1H),5.43(d,1H,J=15.9Hz),5.38(d,1H,J=15.9Hz),5.19-5.28(m,1H),4.10-4.18(m,1H),3.93(dd,1H,J=4.8,16.7Hz),3.82(dd,1H,J=4.8,16.7Hz),3.17-3.24(m,2H),3.14(dd,1H,J=4.8,13.5Hz),2.95(dd,1H,J=8.0,13.5Hz),2.42(s,3H),2.14-2.25(m,2H),1.83-1.91(m,2H),0.89(t,3H,J=8.0Hz).
Mass(FAB);m/e 640(M+1)
例47：Gly-NH-A（A-NH2=DX-8951）トリフルオロ酢酸塩の合成
DX-8951のメタンスルホン酸塩（530mg）とトリエチルアミン（0.28ml）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶解し、４℃に冷却した後、Boc-GlyのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（327mg）を加えた。遮光下に室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液を減圧乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝98：２溶液）で精製して（Boc-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）（500mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.38(d,1H,J=8.3Hz),7.77(d,1H,J=10.7Hz),7.31(s,1H),6.89-6.91(m,1H),6.49(s,1H),5.55-5.59(m,1H),5.45(d,1H,J=16.1Hz),5.38(d,1H,J=16.1Hz),5.27(d,1H,J=19.0Hz),5.18(d,1H,J=19.0Hz),3.50-3.62(m,2H),3.15-3.19(m,2H),2.41(s,3H),2.18-2.24(m,1H),2.08-2.12(m,1H),1.81-1.91(m,2H),1.31(s,9H),0.87(t,3H,J=8.0Hz).
Mass(FAB);m/e 593(M+1)
上で得られた（Boc-Gly）-NH-A（100mg）をトリフルオロ酢酸（2ml）に溶かし、１時間放置した。溶媒を留去し、メタノール（10ml）で共沸を２回、エタノール（10ml）で共沸を２回行った後、残渣をエーテルで洗浄して、標記化合物（70mg）を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.88(d,1H,J=8.8Hz),8.08(s,3H),7.81(d,1H,J=11.2Hz),7.34(s,1H),6.52(s,1H),5.63-5.67(m,1H),5.45(d,1H,J=16.7Hz),5.40(d,1H,J=16.7Hz),5.36(d,1H,J=19.1Hz),5.25(d,1H,J=19.1Hz),3.56(s,2H),3.11-3.19(m,2H),2.43(s,3H),2.23-2.28(m,1H),2.11-2.19(m,1H),1.81-1.91(m,2H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).
Mass(FAB);m/e 493(M+1)
例48：カルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリメチルアンモニウム塩の合成
デキストランT500（50g，ファルマシア社製，分子量500K）を0.1M酢酸緩衝液（pH5.5，5000ml）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（165.0g）の水溶液（5000ml）を加えた。遮光しながら４℃で10日間撹拌した後、エチレングリコール（35.0ml）を加え、一晩撹拌した。反応液を8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（70g）を加えて溶解した後、一晩撹拌した。
反応液を氷冷し、酢酸でpH5.5に調整して４℃で１時間撹拌した後、8M水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.5に調整した。得られた水溶液をバイオマックス-50膜を用いて限外濾過法による脱塩を行なった。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（20.2g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は、159Kであった。
このデキストランポリアルコール（7.5g）を、水酸化ナトリウム（31.5g）を水（225ml）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（45g）を加えて溶解させた後、室温で一晩反応させた。
この反応液を酢酸でpHを８に調整した後、バイオマックス-50膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（8.5g）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は274Kであり、カルボキシメチル化度は0.4であった。このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.0g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、H+型）カラム（直径44mm、長さ210mm）にのせ、水で溶出した。この溶出液にトリエチルアミン（4ml）を加えた後、凍結乾燥して標記化合物（2.2g）を得た。
例49：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例48で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（200mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（7ml）に溶解させた。この溶液に、例45で得た（Gly-Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（41mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（5ml）溶液、トリエチルアミン（0.014ml）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（100mg）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.0ml）、ジエチルエーテル（25ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-50膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（190mg）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ4.5%（W/W）であった。
例50：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Phe-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例24で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（2.5g）を水に溶解し、Bio-Rad AG 50W-X2（200-400メッシュ、Et3N H+型）カラムにのせ、水で溶出した。この溶出液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（2.5g）を得た。
このカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（200mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（12ml）に溶解させた。この溶液に、例46で得た（Phe-Gly）-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（42mg）とトリエチルアミン（0.016ml）のN,N-ジメチルホルムアミド（5ml）溶液、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（200mg）を順次加え、遮光して室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液に水（300ml）を加え、限外濾過膜10K（フィルトロン社製）を用いて限外濾過した。膜を通過しない残留溶液を0.1N水酸化ナトリウム水溶液でpH10とし、濾過膜（0.16μm、フィルトロン社製）を通過させた。通過した溶液をバイオマックス-50膜を用いた限外濾過法により脱塩し、次いでミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（180mg）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ6.1%（W/W）であった。
例51：カルボキシメチルデキストランポリアルコール-Gly-NH-A’（A-NH2=DX-8951）の合成
例48で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニウム塩（370mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（10ml）に溶解させた。この溶液に、例47で得たGly-NH-A（A-NH2=DX-8951）のトリフルオロ酢酸塩（57mg）のN,N-ジメチルホルムアミド（3ml）溶液、トリエチルアミン（0.027ml）、1-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキシキノリン（185mg）を順次加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。この反応液の5mlずつを各10mlのエタノール中に滴下した。これに3M塩化ナトリウム水溶液（2.0ml）、ジエチルエーテル（25ml）を加えて、析出した沈澱を遠心分離（3500rpm，８分）により集めた。この沈澱を0.5M食塩水に溶解し、氷冷下0.1M水酸化ナトリウム水溶液でpH9とした。得られた水溶液をバイオマックス-50膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（0.22μm）で濾過した後、凍結乾燥して標記化合物（290mg）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）中での362nmにおける吸光度に基づいて定量したところ0.5%（W/W）であった。
例52：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例11と同様の方法によりMeth A担癌マウスを作成し（１群６匹）、例15の薬物複合体について、例12と同様の方法で単回投与した場合の抗腫瘍作用を調べた。
その結果、例15の薬物複合体は例12の医薬化合物自体に比べて、顕著な抗腫瘍効果の増強と有効用量域の拡大を示した。
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例53：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
ヒト胃癌SC-6の腫瘍塊をヌードマウス（BALB/c-nu/nu，雄）の右鼠径部皮下に移植してSC-6担癌ヌードマウスを作成した（１群５匹）。移植後24日目に注射用蒸留水に溶解した例15の薬物複合体を静脈内に単回投与し、抗腫瘍作用を医薬化合物自体と比較した。その結果、例15の薬物複合体は医薬化合物自体に比べて、毒性死を示すことなく、高い抗腫瘍効果を発揮した。
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例54：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例53と同様の方法によりヒト肺癌QG-90担癌ヌードマウスを作成した（１群５匹）。移植後16日目に注射用蒸留水に溶解した例15の薬物複合体を静脈内に単回投与し、抗腫瘍作用を医薬化合物自体と比較した。その結果、例15の薬物複合体は医薬化合物自体に比べて、顕著な抗腫瘍効果の増強と有効用量域の拡大を示した。
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例55：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例11と同様の方法によりMeth A担癌マウスを作成し（１群６匹）、例12と同様の方法で例41の薬物複合体を単回投与した場合の抗腫瘍作用を医薬化合物自体と比較した。その結果、例41の薬物複合体は医薬化合物自体に比べて、顕著な抗腫瘍効果の増強と有効用量域の拡大を示した。
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例56：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例11と同様の方法によりMeth A担癌マウスを作成し（１群６匹）、例12と同様の方法で例29、例43および例44の各薬物複合体をそれぞれ単回投与した場合の抗腫瘍作用を調べた。
その結果、何れの薬物複合体も高い抗腫瘍効果と広い有効用量域を示した。
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例57：本発明の薬物複合体の体内動態
例11と同様の方法によりMeth A担癌マウスを作成し、例15の薬物複合体について、例12と同様の方法で単回投与（10mg/kg：医薬化合物換算量）して、薬物複合体の各組織内における濃度推移を調べた。その結果、例15の薬物複合体は著しく高い血中滞留性、腫瘍組織への高い移行性および肝臓と小腸に対する高い腫瘍選択性を示した。結果を図20に示す。
産業上の利用可能性
カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物又はスペーサーを結合させた医薬化合物との反応を収率よく行うことができ、しかも、ラクトン環を有する医薬化合物などを反応させる場合に副反応を抑制することができるので、薬物複合体の製造方法として極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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