(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とするタンパク質を生産する方法であって：
(a) バクトロセラ・オレアエ(Bactrocera oleae)(オリーブバエ)、バクトロセラ・オリエンタリス(Bactrocera orientalis)(オリエンタルショウジョウバエ)、ヘリオチス・アルミゲラ(Heliothis armigera)(オオタバコガ)、トリコプルサ・ニ(Trichoplusa ni)(イラクサキンウワバ)、マンデュカ・セクスタ(Manduca sexta)(タバコスズメガ)、ロベシア・ボトラナ(Lobesia botrana)(グレープバインガ)、ハマダラカ(Anopheles gambiae)(カ)、アエデス・アエジプティ(Aedes aegypti)(ネッタイシマカ(yellow fever mosquito))、グロシナ・モルシタンス(Glossina morsitans)(ツェツェバエ)、ブユ属種(Simulium sp.)(ブユ)、サシチョウバエ属種(Phlebotomus sp.)(スナバエ)、ムスカ・ドメスチカ(Musca domestica)(イエバエ)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)およびセラチチス・キャピタタ(Ceratitis capitata)(チチュウカイミバエ)からなる群より選択される昆虫の生殖細胞を、適当な制御領域およびシグナルペプチドの制御下で、該昆虫の幼虫内で対象のタンパク質を発現させかつ該タンパク質を血リンパ中に分泌させることのできるトランスポゾンに基づく発現系で形質転換し;
(b) 昆虫を繁殖させて幼虫を産生し;
(c) 該幼虫を大量飼育し;そして、
(d) 該大量飼育幼虫の血リンパからミリグラム量の対象のタンパク質を単離すること;
ただし、該トランスポゾンはMinos、mariner、Hermes、sleeping beautyおよびpiggyBacからなる群より選択されるものである、上記方法。
【請求項２】
昆虫を形質転換することが以下のステップ:
(a) 昆虫内で活性のあるトランスポサーゼタンパク質をコードする転移可能なエレメントを用意し;
(b)対象のタンパク質をコードするコード配列を挿入することによって、該転移可能なエレメントを改変し;そして、
(c) 該改変された転移可能なエレメントで標的とする昆虫を形質転換すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記発現系が、昆虫の幼虫内で機能する誘導可能な転写制御エレメントの制御下に対象のタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記誘導可能な制御系が、テトラサイクリンまたはオエストロゲンにより調節可能なものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記発現系が、昆虫の幼虫内で機能する構成的転写制御エレメントの制御下に対象のタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
上記構成的制御エレメントが、キイロショウジョウバエのAct5Cプロモーターを含む細胞質アクチンプロモーターおよび細胞質チューブリンプロモーターからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
誘導可能な発現制御配列が、キイロショウジョウバエhsp70プロモーターまたはチチュウカイミバエ hsp70 プロモーターを含む熱ショックプロモーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
昆虫が２つ以上の発現系または２つ以上のコード配列を含む発現系で形質転換される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
対象のタンパク質が酵素、サイトカイン、ホルモン、またはタンパク質性医薬からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
昆虫がセラチチス・キャピタタである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
幼虫の飼育を飼育温度の操作により同調させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、昆虫の幼虫でタンパク質を生産するための系に関する。特に、本発明は、ショウジョウバエおよびチチュウカイミバエの幼虫で対象のタンパク質を生産することを包含する。
【０００２】
対象のポリぺプチドまたはタンパク質を遺伝子組換え生物または細胞で産生するタンパク質生産系は、バイオテクノロジー産業の骨格をなしている。最も初期の系は、大腸菌などを宿主とする細菌の発現に基づいたものであり、真核細胞に基づいた系特に、培養哺乳動物細胞、培養昆虫細胞および昆虫個体を構成する昆虫細胞、ならびにヒツジおよびヤギなどのトランスジェニック哺乳動物などに基づく系が加わるようになった。
【０００３】
原核細胞培養系は、維持が容易で操作に要する費用が安い。しかし、原核細胞では、真核生物タンパク質の翻訳後修飾が不可能である。さらに、異常な折り畳み構造となるタンパク質が多く、それらを再度折り畳みなおす特別な手順が必要となり、産生の経費が嵩む。
【０００４】
真核細胞培養系では多くの適用について記載されている。例えば、哺乳動物細胞は、翻訳後修飾が可能であり、一般に正常に折り畳まれた可溶性タンパク質を生産できる。哺乳動物細胞系の最も大きな欠点は、特化された高価な培養設備が必要であり、かつ全培養物を消失することになる感染の危険があることである。
【０００５】
タンパク質発現には植物の生産系を用いることもでき、これは高い収率を得ることができる。しかし、トランスジェニック植物の作物は維持が難しく、かつ遺伝子操作した物質が環境を汚染するという危険性が増大してきている。
【０００６】
昆虫細胞もまたポリペプチドの発現に用いることができる。最も汎用される昆虫細胞の発現系はバキュロウイルスベクターに基づくものである。バキュロウイルス発現ベクターは、強力な天然のポリヘドリンプロモーターの制御下にあるバキュロウイルスの主たる構造タンパク質をコードしているバキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、異種遺伝子に置換することにより構築される。培養昆虫宿主細胞を組換えウイルスで感染させることにより、産生されるタンパク質を、細胞自体から、または適切な分泌シグナルを利用する場合は培養培地から回収することができる。しかし、これらの系はまた、培養物の感染に関する問題および特化された培養設備を必要とするという問題をかかえている。
【０００７】
生物体に基づく発現系は、感染に関する不利な点の多くを回避し、細胞培養より増殖が容易である。例えば、バキュロウイルスなどのウイルスベクターの使用は昆虫個体全体の感染を可能とし、特別な生育条件に関する少数の要件があるだけである。カイコガなどの大型の昆虫では、異種タンパク質の高収率が得られる。常用の抽出技術により、タンパク質を昆虫から抽出することができる。
【０００８】
ヤギおよびヒツジなどの哺乳動物において、乳タンパク質発現制御配列の制御下で対象のタンパク質を発現させて乳中に該タンパク質を発現させることに基づく技術もまた公知である。このような秘術は、大きな潜在的な利点があるが、内在性の哺乳動物ウイルス、プリオンおよびタンパク質の最終産物からの隔離が必要なために経費がかかる。さらに、大型のトランスジェニック動物を繁殖および維持させるのはコストが高くつく。
【０００９】
昆虫の幼虫の使用、トリコプルサ・ニ(Trichoplusa ni)の幼虫の使用は、タンパク質生産系において使用するために提唱されてきた (Phamら、1999 Biotech Bioeng 62: 175-182)。しかし、このような系は、バキュロウイルスなどに基づくウイルスベクターの技法と組み合わせることについてのみ、提唱されていた。
【００１０】
タンパク質が食用または医薬用の用途を意図するものである場合、細菌系および/またはウイルスベクターの使用は望ましくない。したがって、生物個体に基づく系などの強力かつ拡張可能であって、ウイルスに基づかず、ならびに維持する環境における操作が安価であるタンパク質生産系に対する当技術分野における要望がある。
【００１１】
発明の概要
本発明は、第１の態様において、対象とするタンパク質を生産する方法であって：
(a)昆虫の幼虫内で対象のタンパク質を発現可能な非ウイルス発現系で昆虫を形質転換し;
(b) 昆虫を繁殖させて幼虫を産生し;
(c) 該幼虫を飼育し;そして、
(d) 該幼虫から対象のタンパク質を単離すること;
を含む、上記方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法は、昆虫の幼虫は確立した培養技術を用いて飼育できるという簡便さ故、研究目的のミリグラム量のポリペプチドの迅速な産生および臨床および診断用のキログラム量のタンパク質の産生を可能にし、ならびに産業的な酵素の数千キログラムの低コストでの産生をも可能とし得る。
【００１３】
本発明の方法の利点は多岐に渡る。昆虫の幼虫の大量飼育には既存の技術を用いることができ、制御された生産環境で、極めて低コストでポリペプチド産物の産生を可能とする。このことにより、ウイルスおよびプリオンの存在しないことを認可が与えられる前に証明しなければならない哺乳動物などの生物個体に比べて監督当局の認可が簡単となる。さらに、本発明の方法は、哺乳動物細胞培養またはトランスジェニック生産系などの場合におけるより高い感染率、ウイルスまたはプリオンの汚染の危険性などの、動物（昆虫を含む）細胞培養に関連する不利な点を回避する。
【００１４】
「タンパク質」という用語は、一本鎖ポリペプチド分子および共有結合的または非共有結合的手段により個々の構成的ポリペプチドが結合した多重ポリペプチド複合体を包含する。「ポリペプチド」という用語は、２アミノ酸以上の長さ、典型的には５、10または20アミノ酸以上の長さのポリペプチドを包含する。
【００１５】
本明細書中における非ウイルス性発現系とは、バキュロウイルスなどのウイルスに基づかない昆虫を形質転換するための任意の技法を含む。例えば、非ウイルス発現系は、自立複製プラスミド、一体型プラスミドに基づく系およびトランスポゾンに基づく系を含む。昆虫の幼虫に使用するための好ましい発現系は、トランスポゾンに基づくものである。適切なトランスポゾンは、詳細に後述する。
【００１６】
本発明の方法に使用される発現系は、昆虫細胞、特に昆虫の幼虫において活性のある制御エレメントを含む。様々なプロモーターを含む多くの昆虫の制御エレメントは、広範に渡る多くの種で活性がある。したがって、対象とする昆虫に由来する配列を用いることは必須要件ではない。誘導性または構成的に活性な配列を用いるとよい。
【００１７】
制御配列は誘導性の配列が好ましい。好ましい誘導性プロモーターには、幼虫の飼育温度が上昇すると誘導される熱ショックタンパク質HSP70プロモーターおよびテトラサイクリン誘導性発現系がある(Heinrich and Scott, PNAS 97: 8229-8232, 2000)。
【００１８】
タンパク質の産生を増大させるために、多重発現系を利用すると良い。これらの系は、個々の系に存在する２種以上のコード配列を用いて構成することもでき、または複数の単一系として構成することもできる。いずれの場合にも、バランサー染色体を利用して、発現系の維持および昆虫の交配の際の子孫へ転移させることができる。
【００１９】
昆虫の幼虫の飼育における利点は、飼育を同調させて、全ての幼虫が同時に同じ生育レベルに達するようにすることができることである。これは、飼育温度を変化させることにより達成されうる。なぜならば、幼虫の発達は、低温になるほど遅くなるからである。例えば、18℃での幼虫の発達は２５℃での生育に比べると2分の1である。
【００２０】
本発明のさらなる利点は、タンパク質の蓄積を脂肪体に限定させうるか、または幼虫血清タンパク質配列などの適切な制御領域およびシグナルペプチドの制御下で血リンパ中に分泌させうるということである。
【００２１】
発明の説明
本明細書中に記載する技術は一般に当技術分野では公知なものであるが、特にSambrook ら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)およびAusubel ら、 Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第４版. John Wiley & Sons, Inc.に記載されている。
【００２２】
トランスポゾン
トランスポゾンは、ある生物種のゲノム内で、ある位置から他の位置へと「ジャンプ」または転移しうる遺伝子エレメントである。 これらは、昆虫を含む動物に広く分布している。
【００２３】
トランスポゾンは、トランスポサーゼタンパク質（これは、該エレメント自身によってコードされるまたはトランスポサーゼをコードするmRNAの注入、または第2のトランスポサーゼをコードするコード配列の使用もしくはトランスポサーゼタンパク質自体の添加によるなどの他の方法によって得られる）の活性によって宿主生物種内で活性を有する。トランスポジションの機序の理解において有利なのは、遺伝子転移について利用できるトランスポゾンに基づく遺伝子技法が開発されたことである。
【００２４】
所望の昆虫において活性のある転移可能なエレメントを利用するとよい。しかし、Minos, mariner, Hermes, Sleeping BeautyおよびpiggyBacからなる群より選択される選択可能なエレメントが好ましい。
【００２５】
Minosは、チチュウカイミバエで活性をもつ転移可能なエレメントである。これは、米国特許第 5,840,865号に記載されており、該特許明細書の全文を参照として本明細書中に組込むものとする。昆虫を形質転換するためにMinosを使用することは、前記米国特許に記載されている。
【００２６】
mariner は最初にショウジョウバエから単離されたトランスポゾンであるが、種々の無脊椎および脊椎動物種で発見されている。marinerの生物を形質転換するための使用は、国際特許出願W099/09817に記載されている。
【００２７】
Hermesは、一般的なイエバエから見出された。Hermesをトランスジェニック昆虫を作製するために使用することは、米国特許第5, 614, 398号に記載されており、該特許明細書は参照として本明細書中に組込むものとする。
【００２８】
PiggyBacは、バキュロウイルスの宿主であるイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）から見出されたトランスポゾンである。PiggyBacのチチュウカイミバエの生殖細胞形質転換のための使用は、Handler ら（(1998) PNAS (USA) 95: 7520-5）に記載されている。
【００２９】
遺伝子転移は、実証されているトランスポゾン介在性生殖細胞形質転換により達成することができる。選択されるトランスポゾンには、Minosがあり、これはチチュウカイミバエ(Loukerisら、1995)およびショウジョウバエにおける遺伝子導入ベクターとしての機能が示されている。piggyBac (McCombsら、1998)などのチチュウカイミバエで機能する他のトランスポゾンを代わりに用いることもできる。チチュウカイミバエの形質転換法は、文献(Loukerisら、1995)に詳細に記載されている。簡単に述べると、２つのトランスポゾン末端で挟まれている対象とする遺伝子(エリスロポエチンなどの遺伝子と、さらに適切な制御DNA配列)を含むトランスポゾンを含有する環状プラスミドDNAを、プレ胚盤胞（pre-blastoderm）チチュウカイミバエ胚に、トランスポサーゼの供給源(トランスポサーゼ発現プラスミド、in vitroで合成したトランスポサーゼをコードするmRNA、またはトランスポサーゼタンパク質そのもの)と共に注入する。初期胚において、トランスポサーゼはトランスポゾン末端と相互作用して、トランスポゾンの励起およびランダムな位置での染色体への再統合を触媒する。通常、トランスジェニックバエの検出には、優性、可視的または他の選択的表現型を付与する遺伝子などの「マーカー遺伝子」もまたトランスポゾンに含まれている。トランスジェニックバエを、注入処理をしたハエの子孫の中からマーカー遺伝子を利用して検出し、ホモ接合体を作製する。このような系統のいくつかのもの(それぞれ、ゲノムの異なる位置に挿入を有している)は、それぞれにおいて数百に及ぶ卵の注入を包含する形質転換実験において、作製され得る。
【００３０】
多重挿入
発現レベルを増大させるために、多重挿入を含む系統を、異なるトランスジェニック系統間での交配により構築することができる。この手法は、バランサー染色体を用いることにより容易になり得る。バランサー染色体は、複数の重複する反転、1種以上の劣性致死突然変異および少なくとも１つの優性可視的突然変異を有している。これらの染色体を用いて、複数の突然変異遺伝子を担持する染色体を維持および操作することができる。チチュウカイミバエのバランサー染色体であるFiM Iはすでに記載されている。5番染色体の広範な領域に渡って組換えを抑制することにより、複数のトランスポゾンの挿入を担持する5番染色体を構築するために用いることができる。
【００３１】
昆虫とプロモーターの選択
数多くの昆虫の幼虫が、本発明における使用に好適であろう。これらとしては、バクトロセラ・オレアエ(Bactrocera oleae)(オリーブバエ(olive fly))、バクトロセラ・オリエンタリス(Bactrocera orientalis)(オリエンタルショウジョウバエ(oriental fruit fly))、ヘリオチス・アルミゲラ(Heliothis armigera)(オオタバコガ(cotton bollworm))、トリコプルサ・ニ(Trichoplusa ni)(イラクサキンウワバ(cabbage looper))、マンデュカ・セクスタ(Manduca sexta)( タバコスズメガtobacco hornworm))、ロベシア・ボトラナ(Lobesia botrana)(グレープバインガ(grapevine moth))、ハマダラカ(Anopheles gambiae)(カ(mosquito))、アエデス・アエジプティ(Aedes aegypti)(ネッタイシマカ(yellow fever mosquito))、グロシナ・モルシタンス(Glossina morsitans)(ツェツェバエ(tse-tse fly))、ブユ属(Simulium sp.)(ブユ(black fly))、サシチョウバエ属(Phlebotomus sp.)(スナバエ(sand fly))、ムスカ・ドメスチカ(Musca domestica)(イエバエ(house fly))およびセラチチス・キャピタタ(Ceratitis capitata)(チチュウカイミバエ)のうちのいずれか1種が挙げられる。しかしながら好ましいものは、チチュウカイミバエである。
【００３２】
好ましくは、用いるプロモーターは強力なプロモーターである。二者択一のプロモーターの分類(誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター)は使用に際して役立つ。
【００３３】
誘導性プロモーターとしては、例えば熱ショックプロモーターが挙げられる。熱ショックプロモーターとしては、昆虫の熱ショックプロモーターが好ましく、例えばショウジョウバエhsp70プロモーターがあり、これはチチュウカイミバエを含めた異種生物における遺伝子発現を駆動することが可能である。また本発明は、チチュウカイミバエhspプロモーター(Papadimitriouら, (1998) Insect Mol Biol 7: 279-90)の使用も包含する。別の系は、抗生物質テトラサイクリンを用いた誘導に基づくことができる(HeinrichおよびScott, PNAS 97: 8229-8232, 2000)。
【００３４】
熱ショックプロモーターは、チチュウカイミバエの培養条件の温度を上げることで誘導可能である。例えば23〜25℃において、hsp70プロモーターの活性は全くないわけでなく、低レベルである。このことにより、異種タンパク質の産生によって誘導されることなく、ストレスがなくとも昆虫の幼虫が発達できる。しかしながらより高温度(例えば37〜42℃)では、hsp70プロモーターは誘導され、異種タンパク質を高レベルで発現させる。
【００３５】
誘導性プロモーターは、既知の誘導性遺伝子制御エレメントに基づいて構築することができる。例えば誘導性プロモーターを、食餌中に投与することができる薬物またはホルモンに応答するエレメントを組合せることによって構築することができる。好ましい実施形態において、昆虫がヒトエストロゲン受容体を発現する第2コード配列で形質転換されている限りは、ヒトエストロゲン応答性エレメント(ERE)を用いて目的のタンパク質の発現を調節することができる。
【００３６】
また構成的プロモーターを用いて、目的のタンパク質および/または昆虫の幼虫において要求される他のタンパク質を発現させることができる。例えば構成的プロモーターとしては、細胞質アクチンプロモーターを挙げることができる。ショウジョウバエの細胞質アクチンプロモーターはクローニングされたもの(Acr5C)であり、蚊において高い活性が示す(HuynhおよびZieler, (1999) J. Mol. Biol. 288: 13-20)。また細胞質アクチン遺伝子およびそれらのプロモーターを、チチュウカイミバエを含めたその他の昆虫から単離することができる。
【００３７】
その他の例としては、細胞質チューブリンプロモーター、例えばチチュウカイミバエの細胞質チューブリンプロモーターが挙げられる。
【００３８】
分泌性ポリペプチドを制御するプロモーターを適宜適当なシグナル配列とともに用いて、タンパク質の血リンパへの分泌を指令することができる。例えば、幼虫の血清タンパク質プロモーターを用いることができる(Benesら, (1995) Mol. Gen. Genet. 249 (5): 545-56)。
【００３９】
幼虫の飼育
チチュウカイミバエに対する大量飼育法が高度に開発されている。1週間当たり100000万匹を超える幼虫を生じさせる大量飼育設備が存在する。これらのハエを、滅菌昆虫技術によるチチュウカイミバエ病害虫防除のために用いる。これらのハエは、サナギ段階で放射線照射によって滅菌され、次いでフィールドに放たれる。
【００４０】
チチュウカイミバエの生活環は、25℃において約25日間であり、メスは、通常100〜200個の卵を産む。全ての完全変態の昆虫がそうであるように、チチュウカイミバエは4つの異なる発生段階：胚(約2日間続く)、幼虫(約8日間)、サナギ(約10日間)および成虫を有する。性的成熟は、成虫生活の4〜6日以内に達成される。サナギ殻形成(pupariation)の直前には、各々の幼虫の質量は約10mgであり、タンパク質を約200μg含有する。
【００４１】
タンパク質生産については、様々な時間で開始した幼虫培養を適当な温度シフトの型によって同調させることができる。このことは、成長速度が環境温度に依存していることによる可能性がある。18℃において幼虫の成長速度は、約50％まで低減する。
【００４２】
実験室規模での生産においては、ショウジョウバエのようなより小型の昆虫を使用することが好ましい。幼虫1匹当たりでは産生されるタンパク質は少量ではあるが、生活環がより短期であり、生産をより迅速に確立することができる。例えば、ショウジョウバエの生活環は12日間であり、幼虫1mgからタンパク質をそれぞれ20μg得ることが可能である。
【００４３】
本発明を、以下の実施例において説明の目的のためだけに説明する。
【００４４】
実施例
実施例１：チチュウカイミバエおよびショウジョウバエの幼虫におけるGFPの産生
オワンクラゲ(jellyfish Aequoria victoria)に由来する緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、チチュウカイミバエのセラチチス・キャピタタおよびショウジョウバエのキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)において発現させた。それらのゲノム中にMinos/GFPトランスポゾンの単一および複数の挿入を含むトランスジェニックショウジョウバエおよびチチュウカイミバエの幼虫、サナギおよび成虫は、GFPに特有の蛍光を示す。ここでは2種のGFP構築物を用いる：1つは、誘導性プロモーター(ショウジョウバエHsp70)を有するGFP構築物、もう1つは構成的プロモーター(ショウジョウバエアクチン5Cプロモーター)を有するGFP構築物である。Hsp70/GFP遺伝子を有するショウジョウバエおよびチチュウカイミバエの幼虫は、通常の飼育温度(22℃)においては低レベルの蛍光を示し、高温に(39℃)1時間曝露した後には蛍光の上昇を示す。アクチン5C/GFP遺伝子を有するショウジョウバエの幼虫は、構成的な高レベルのGFPの蛍光を示す。GFPは、ショウジョウバエおよびチチュウカイミバエの全ての組織ではないにしても多くの組織において発現される。またGFPタンパク質は、イムノブロットアッセイを用いてトランスジェニック昆虫において検出される。数種のトランスジェニック系統の比較から、GFPの発現レベルはトランスジーンの組込みの位置とゲノム中に存在するトランスジーンのコピー数に依存することが示された。
【００４５】
材料および方法
ハエおよびDNA注入:
ショウジョウバエyw株およびw1遺伝子に対してホモ接合性である白眼(white-eyes)株のセラチチス・キャピタタA71株を、全ての実験において用いる。ハエは、標準的条件下22℃において飼育される。トランスポゾンプラスミドのDNA注入は、トランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドとともにすでに記載した(Loukerisら, 1995, Science)プレ胚盤胞胚を用いて行われた。
【００４６】
プラスミド構築およびDNA分析：
プラスミドpMiHsp70/GFPは、GFP遺伝子を含むPCR増幅断片をプラスミドpHSS6Hsp70PTのマルチクローニング部位に適切な方向性で挿入することによって構築される。プラスミドpHSS6Hsp70PTは、適切な方向性でキイロショウジョウバエHsp70遺伝子のプロモーターと3'mRNAトレーラー-ポリアデニル化シグナル(以下、「ターミネーター」と呼ぶ)とを含む。プロモーターとターミネーターとは、マルチクローニング部位によって隔てられている。またHsp70プロモーターは、mRNAの安定性を増大させるHsp70mRNAの5'非翻訳リーダー配列を含む。次いでプロモーター/GFP/ターミネーターカセットをNotI断片として、チチュウカイミバエ白色(white)遺伝子の野生型cDNAを含むMinosベクター(Loukerisら, 1995, Science)にクローニングする。白色遺伝子は、形質転換体検出用の主要な目に見える遺伝子マーカーとして用いられる(Loukerisら, 1995, Science)。pMiHspGFP/HspCcWトランスポゾン構築物を図１に示す。
【００４７】
プラスミドpMiAct5CGFP(図２)は、遍在的に発現する細胞質アクチンをコードするアクチン5C遺伝子のプロモーターを含むキイロショウジョウバエ2kb断片の下流にGFP遺伝子を含む。プラスミドpMiAct5CGFPは主要なマーカーとして白色遺伝子を含まず、このプラスミドで生成された形質転換体はGFPの発現のみに基づいて同定される(下記を参照されたい)。
【００４８】
典型的な形質転換生成(transgenesis)実験において、トランスポゾンプラスミドDNAとヘルパープラスミドDNAとの混合物は、プレ胚盤葉(産卵後0〜1時間)のショウジョウバエもしくはチチュウカイミバエの胚(眼色が白色に突然変異したものにホモ接合性である）に同時注入される。トランスジェニックチチュウカイミバエを検出するためには、注入された胚(G0世代)に由来するハエを受容株に戻し交雑によって交配し、それらの子孫を白色遺伝子(pMiHspGFP/HspCcWを注入されたハエ)またはGFP(pMiAct5CGFPを注入されたハエ)のいずれかの発現について幼虫段階で個々に試験する。白色遺伝子の発現は、白色から着色(淡黄色から野生型の赤色まで様々である)への眼色の変化として検出可能である。GFPの発現は、1日おきに39℃にて幼虫の2回連続した1時間熱処理後に、幼虫組織においてGFPに特異的な蛍光を標準的な落射型蛍光(epifluorescence)顕微鏡法を用いて検出することによってモニターされる。
【００４９】
個々のトランスジェニック幼虫(G1世代)を受容株に戻し交雑によって交配し、さらに個々の白色またはGFP発現子孫(G2)を交配させてホモ接合性の子孫(G3)を生じさせる。眼色またはGFP蛍光の輝度は遺伝子量に依存する。従ってホモ接合性の個体は、これらの表現型に続くG3子孫の中から検出される。推定のG3個体を交配させて、それらの子孫をサザンブロットによって分析することで、それらが単一または複数の挿入物を含むか否かを決定する。単一の挿入物に対してホモ接合性の株は、この手法によって確立される。
【００５０】
ショウジョウバエおよびチチュウカイミバエの幼虫におけるGFPの熱誘導性発現  MiHspGFP/HspCcWトランスポゾンの挿入物に対してホモ接合性なトランスジェニックショウジョウバエおよびチチュウカイミバエの幼虫を標準的温度22〜24℃にて成長させることにより、非トランスジェニック幼虫と比較して低レベルであるが検出可能なレベルのGFPの蛍光が示される。蛍光は、熱ショック後に劇的に増大する(図３)。
【００５１】
ショウジョウバエにおけるGFPの構成的発現
トランスポゾンMiAct5CGFPの挿入物に対してホモ接合性なトランスジェニックショウジョウバエを標準的温度22〜24℃にて成長させることにより、非トランスジェニックショウジョウバエと比較して成虫バエ(図４)および幼虫(図６)において高レベルのGFPの蛍光が示される。蛍光レベルは、遺伝子量依存的である(図５)。
【００５２】
MiAct5CGFPを注入した1000匹を上回る数のG0世代の子孫において、GFP発現チチュウカイミバエが検出されない。本発明者らは、ショウジョウバエアクチンプロモーターはチチュウカイミバエにおいては弱いプロモーターであり、従って高レベルな異種タンパク質の構成的発現を達成するためには同種アクチンプロモーターをチチュウカイミバエに用いる必要があるであろうと結論づける。
【００５３】
MiAct5CGFPに対してホモ接合性な数種のショウジョウバエトランスジェニック系統を、GFPの発現について相互に比較する。すべての系統で高レベルの蛍光が示されたが、輝度に関しては系統特異的な差異が検出可能である。
【００５４】
実施例２：チチュウカイミバエの幼虫におけるヒト成長ホルモンの産生
hGHをコードするcDNA配列を、Hsp70熱ショック遺伝子に対するキイロショウジョウバエプロモーターの下流にクローニングする。またHsp70プロモーターは、mRNAの安定性を増大させるHsp70mRNAの5'非翻訳リーダー配列を含む。ポリアデニル化シグナルを含むキイロショウジョウバエHsp70の3'非翻訳トレーラーを、hGHコード配列の下流にクローニングする。該構築物を、マーカー構築物も含むMinosベクターに挿入する。マーカー構築物は、キイロショウジョウバエHsp70プロモーターによって駆動されかつまたHsp70の3'領域を含む、オワンクラゲに由来する緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子からなる。このマーカーにより目に見える遺伝子型(GFP蛍光)がトランスジェニック生物に与えられ、トランスジェニックチチュウカイミバエを胚、幼虫または成虫段階で検出するために用いられる。従って完全なトランスポゾンの全構造は、以下のものである：
Minos左側逆位反復配列-hGH発現構築物-GFPマーカー発現構築物-Minos右側逆位反復配列。
【００５５】
BlueScriptベクター中のトランスポゾンを、大腸菌において構築する。
【００５６】
Minosトランスポザーゼをコードするin vitro合成したmRNAを、形質転換形成実験におけるトランスポザーゼ供給源として用いる。該mRNAを、ファージT7プロモーターの下流にクローニングしたトランスポザーゼ遺伝子を含む発現ベクタープラスミドを鋳型として、さらに市販のT7 RNAポリメラーゼを用いてin vitroで合成する。Minosトランスポザーゼをコードする中断されない完全なDNA配列を、Minosトランスポザーゼを発現するトランスジェニックキイロショウジョウバエに由来するMinos mRNAの逆転写により得る。
【００５７】
トランスポゾンを含むプラスミドDNAをMinosトランスポザーゼmRNAとともに、プレ胚盤胞(産卵後0〜1時間)胚に同時注入する。チチュウカイミバエ胚の取扱いと注入の条件は、文献に記載されている(Loukerisら, 1995)。これらの条件下では注入した胚に由来する繁殖可能なハエの10〜20％が、トランスジェニックの子孫を産むことが期待される。トランスジェニックチチュウカイミバエを検出するために、注入した胚に由来するハエ(G0世代)を受容株との戻し交雑によって交配し、それらの子孫を幼虫段階でGFPの発現について個々に試験する。これは、1日おきに39℃にて2回連続した1時間処理の後に幼虫組織においてGFPに特異的な蛍光を標準的な落射型蛍光顕微鏡法を用いて検出することによってなされる。
【００５８】
個々のトランスジェニック幼虫(G1世代)を受容株に戻し交雑によって交配し、さらに個々のGFP発現子孫(G2)を交配させてホモ接合性の子孫(G3)を生じさせる。ホモ接合性のG3個体は、定量的落射型蛍光顕微鏡法によってGFP発現を測定することによって検出可能である。単一の挿入物に対してホモ接合性の株は確立される。
【００５９】
かかるトランスジェニック株において、トランスジーンの発現レベルはプロモーターと誘導条件だけでなく、トランスジーン挿入の位置にも依存する。数種の独立して得られた株(すなわち、異なるGO世代のハエに由来する株)をhGHの発現レベルについて試験すると、分子レベルおよび細胞遺伝学的レベルで最も高いレベルがさらに解析できることが示される。分子的特性解析はサザンブロットからなり、最終的にはそれらの株をトランスジーンのタンパク質生産、クローニングおよび配列決定分析に用いるであろう。細胞遺伝学的特性解析は、唾液腺多糸染色体におけるin situハイブリダイゼーションによって行われ、挿入物の染色体位置を決定する。
【００６０】
複数の挿入物を有する株を構築するためには、異なる株のメンバー間で適切な交雑を行う。これらの交雑から得られる子孫を交配し、複合的なホモ接合性の個体をGFPをマーカーとして用いて回収する。挿入物の染色体位置に応じて、バランサー染色体を有する株を用いてこれらの構築を容易にすることができる。複数の挿入物を有する安定した株を構築するためには3〜4世代が必要とされる。
【００６１】
幼虫の大量飼育は、確立された手法に従って行われる。幼虫を、酵母を補足した糠を主成分とする半乾燥餌食の上に飼育する。幼虫の成長は、適当な温度シフトによって同調させることができ、第3齢の幼虫をトランスジーンの誘導を最大限にするのに必要な時間をかけて39〜41℃で処理する。第3齢後期の幼虫は、餌食からサナギ殻を形成するための場所を求めて移動する。この行動を用いて、大量飼育設備中のハエの大量産生を行うための餌食から幼虫を採集する。またこのことは、タンパク質生産および精製用の餌食非含有幼虫の採集にも適用される。
【００６２】
チチュウカイミバエの幼虫を冷えた生理食塩水で洗浄し、次いでプロテアーゼ阻害剤の存在下でホモジナイズする。hGHを標準的手法に従ってホモジネートから精製する。
【００６３】
実施例３：チチュウカイミバエの幼虫におけるラクダ抗体の産生
幼虫の血リンパにおいてタンパク質を発現するために設計したベクターを図７に示す。LspP/Lは、ショウジョウバエもしくはチチュウカイミバエの幼虫血清タンパク質(Lsp)遺伝子のプロモーターであり(Benesら, (1995) Mol. Gen. Genet. 249 (5): 545-56)、それに続いてLsp5'非翻訳リーダーペプチド(ストライプの枠)とLspシグナルペプチド(黒枠)がある。この場合、目的の遺伝子であるラクダ抗体遺伝子をリーダーペプチドにインフレームで融合する。HspPおよびHspTは、それぞれ熱ショック70遺伝子プロモーターとターミネーターである。CcWは、形質転換体を検出するための目に見えるドミナントマーカーとして用いたチチュウカイミバエの白色遺伝子である。MiLおよびMiRは、Minosエレメントの末端である。
【００６４】
ラクダ抗体をファージ発現ライブラリー(Unilever)から単離する。抗体は、ブタレトロウイルスPERV(ブタ内在性レトロウイルス)に特異的であり、PERV gagタンパク質(ウイルスのコアタンパク質)の成分p30を認識する。p30クローンを発現ベクターpHEN1に発現させることで抗体ライブラリーのスクリーニング用の抗原を得て、それによって抗体クローンを選択する。本実験に用いた抗体の予備配列と翻訳を図８に示す。
【００６５】
トランスジェニックハエを実施例１のように白色発現によって同定する。抗体発現をトランスジェニックハエの幼虫の血リンパ中で検出する。
【００６６】
幼虫抽出物をホモジナイズし、さらにプロテインAカラムクロマトグラフィーによる精製によって抗体を精製する。免疫グロブリンは、pH8.6でプロテインAに結合し、pH4.3でカラムから溶出する。このように溶出はプロテインAカラムのpHを低下させることによって行われる。プロテインAアガロース(0.25g：Sigma)をTris-緩衝生理食塩水(0.05M Tris 0.15M NaCl、pH8.6)中に膨張させ、次いでカラムに詰める(カラム床体積は1mlである)。培養上清を希NaOHを添加することによってpH8.6に調整し、次いで4℃にて600gで30分間遠心分離する。サンプルをローディングした後、カラムからタンパク質が溶出しなくなるまでプロテインAカラムをTris-緩衝生理食塩水、pH8.6で洗浄する。次いで抗体が溶出されるまで、溶出ステップをPBS(0.05Mリン酸塩/0.15M NaCl、pH7.0)、クエン酸緩衝生理食塩水(0.05Mクエン酸塩/0.15M NaCl、pH5.5)および酢酸緩衝生理食塩水(0.05M酢酸塩/0.15M NaCl、pH4.3)を用いて行う。ピークがA280である画分をプールし、0.01 x PBS中で透析して凍結乾燥し、PBS 500μlに再溶解して-70℃で保存する。タンパク質ピークの純度をSDS/PAGEで分析する。カラムは、グリシン-緩衝生理食塩水(0.05Mグリシン/HCI/0.15M NaCl、pH2.3)、次いでTris-緩衝生理食塩水(pH8.6、0.02％NaN3を含有)で洗浄することによって再生される。
【００６７】
ELISAアッセイを、上記のように産生した固定化p30抗原と標識マウス抗ラクダモノクローナル抗体を用いて行う。このようにしてチチュウカイミバエの幼虫から溶出した抗体のPERVp30に対する特異性を確認する。
【００６８】
実施例４：チチュウカイミバエの幼虫におけるヒトα-グルコシダーゼの産生
実施例１に従って熱ショック誘導性トランスポゾン発現系を、GFP遺伝子の代わりにヒトα-グルコシダーゼ遺伝子(GenBank GI:182907)を用いて構築する。
【００６９】
実施例１に従ってトランスポゾンプラスミドDNAとヘルパープラスミドDNAとの混合物を、プレ胚盤葉(産卵後0〜1時間)のショウジョウバエもしくはチチュウカイミバエの胚(眼色が白色に突然変異したものにホモ接合性である）に同時注入する。トランスジェニックチチュウカイミバエを検出するためには、注入された胚(G0世代)に由来するハエを受容株に戻し交雑によって交配し、それらの子孫を白色遺伝子の発現について幼虫段階で個々に試験する。白色遺伝子の発現は、白色から着色(淡黄色から野生型の赤色まで様々である)への眼色の変化として検出可能である。
【００７０】
個々のトランスジェニック幼虫(G1世代)を受容株に戻し交雑によって交配し、さらに個々の白色子孫(G2)を交配させてホモ接合性の子孫(G3)を生じさせる。眼色の輝度は遺伝子量に依存する。従ってホモ接合性の個体は、これらの表現型に続くG3子孫の中から検出される。推定のホモ接合性のG3個体を交配させて、それらの子孫をサザンブロットによって分析することで、それらが単一または複数の挿入物を含むか否かを決定する。単一の挿入物に対してホモ接合性の株は、この手法によって確立される。
【００７１】
ショウジョウバエおよびチチュウカイミバエの幼虫におけるα-グルコシダーゼの熱誘導性発現
MiHspα-グルコシダーゼ/HspCcWトランスポゾンの挿入物に対してホモ接合性なトランスジェニックショウジョウバエおよびチチュウカイミバエを標準的温度22〜24℃にて成長させることにより、Umapathysivamら, Clin Chem 2000 46(9):1318-25に従って免疫学的定量化(immunoquantification)によって評価した場合、脂肪体において非トランスジェニック幼虫と比較して低レベルであるが検出可能なレベルのα-グルコシダーゼが示される。α-グルコシダーゼ量は、熱ショック後に著しく増大する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1 は、pMiHspGFP/HspCcW トランスポゾンの構造である。これはHsp70プロモーターの制御下でGFPおよび白色遺伝子を発現する。
【図２】  図２は、プラスミド pMiAct5CGFPの構造を示す。これは、キイロショウジョウバエActin 5C遺伝子の制御下でGFPを発現する。
【図３】  図３は、熱ショック後のトランスジェニックチチュウカイミバエおよびチチュウカイミバエ の幼虫におけるGFPの発現を示している。
【図４】  図４は、キイロショウジョウバエにおけるGFPの構成的発現を示す。
【図５】  図５は、キイロショウジョウバエ成虫におけるGFPの構成的発現を示す。遺伝子の量に依存する蛍光が観察される。
【図６】  図６は、キイロショウジョウバエ幼虫におけるGFPの構成的発現を示す(上: トランスジェニック；下:野生型)。
【図７】  図７は、幼虫の血リンパ中でタンパク質を発現させるための構造を示す。
LspP/L は、Lsp 5'非翻訳リーダー(斜線の四角)およびLspシグナルペプチド (黒塗りの四角)に連結されたキイロショウジョウバエまたはチチュウカイミバエの幼虫血清タンパク質(Lsp)遺伝子のプロモーターである。対象の遺伝子をリーダーペプチドにインフレームで融合する。HspPおよびHspTは、それぞれ熱ショック70 遺伝子プロモーターおよびターミネーターである。CcWはチチュウカイミバエ 白色遺伝子であり、優性な可視的マーカーとして形質転換体の検出に用いる。MiL および MiR は Minos エレメントの末端である。
【図８】  図８は、ラクダ（camelid）抗体ライブラリーから単離され、チチュウカイミバエの幼虫で発現させた抗-PERV p30 抗体クローンの一次配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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