(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α1,4-N-アセチルガラクトサミン転移酵素活性及びα1,4-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を併有し、下記の酵素学的性質を有するα1,4-N-アセチルヘキソサミン転移酵素。
(1)作用・基質特異性：N-アセチルガラクトサミン供与体(GalNAc供与体)から、下記式で示される物質の非還元末端にN-アセチルガラクトサミン残基(GalNAc)を転移する。
・GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノール(naphthalenemethanol)
・GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser
・GlcAβ1-3GalNAc
・GlcAβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer
下記式で示される物質の非還元末端にはGalNAcを実質的に転移しない。
・GlcA(3-O-sulfate)β1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer
N-アセチルグルコサミン供与体(GlcNAc供与体)から、下記式で示される物質の非還元末端にN-アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)を転移する。
・GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノール(naphthalenemethanol)
下記式で示される物質の非還元末端にはGlcNAcを実質的に転移しない。
・GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser
（式中、GlcAはグルクロン酸残基、Galはガラクトース残基、Xylはキシロース残基、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン残基、Serはセリン残基、Cerはセラミド残基を示し、3-O-sulfateは３位の水酸基が硫酸化されていることを示す。）
(2)活性化：酵素反応に二価陽イオンを必要とする(GlcAβ1-3GalNAcを受容体として用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
(3)至適ｐＨ：
・ｐＨ６．５(50mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸緩衝液を用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
・ｐＨ７．４(トリス−塩酸緩衝液を用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
(4)分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後にタンパク質を染色すると、38 kDaにタンパク質バンドが検出される。
【請求項２】
さらに下記の酵素学的性質を有する請求項１に記載の酵素。
(5)GalNAc転移酵素活性についてのミカエリス定数(Km)：
1060μM(N-アセチルコンドロシン(GlcAβ1-3GalNAc))
188μM(GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser)
27μM(UDP-GalNAc)
【請求項３】
アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示されるものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
ヒト由来である請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項５】
精製された請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素を含む画分。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α1,4-N-アセチルヘキソサミン転移酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリン／ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸などの硫酸化されたグリコサミノグリカン(GAG)は、多くの細胞の表面や実際上全ての組織の細胞外マトリックスに存在するプロテオグリカンとして合成される。GAGは、それぞれの対応するコアタンパク質のセリン残基(Ser)に、共通のGAG-タンパク質結合構造（GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser）を介して共有結合している。硫酸化GAGの、細胞増殖、細胞分化および組織形態形成の調節および維持との密接な関連は、特定の糖配列により媒介される種々のタンパク質と相互作用するGAGの生物学的活性によるものである。上記の結合構造の合成は、コアタンパク質の特定のセリン残基へのキシロース残基(Xyl)の付加によって始まり、次いで、２つのガラクトース残基(Gal)の付加、そして、グルクロン酸残基(GlcA)の付加により完了する。GAGは、この結合構造に、N-アセチルヘキソサミン残基およびGlcAが交互に付加されることによって構築される。ヘパリン／ヘパラン硫酸は、共通結合構造にGlcNAcが転移されると合成され、一方、コンドロイチン硫酸は、GalNAcが最初に付加されると合成される。しかしながら、異なるGAG鎖の生合成における類別機構は不明のままである。各糖の付加は、特異的な糖転移酵素により触媒されると考えられている（Lindahl, U., et al. (1972) in Glycoprotein (Gottschalk, A., ed)pp.491-517, Elsevier, New York; Roden, L. (1980) in The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J., ed) pp.267-371, Plenum Publishing, New York）。これらの線状GAG重合体を合成するには少なくとも８つの異なる種類の糖転移酵素が必要であるが、現在までにクローン化されているのは、GlcAをGAG-タンパク質結合構造に転移するGlcA転移酵素Ｉ（Kitagawa, H., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 6615-6618）並びにGlcA転移反応およびGlcNAc転移反応の両方を触媒するヘパラン硫酸ポリメラーゼ（Lind, T., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 26265-26268）の２つのみである。なお、ウシのヘパラン硫酸ポリメラーゼは、がん抑制因子の多発性遺伝性外骨腫症(EXT)遺伝子ファミリーのヒトEXT2に94%の相同性を有するタンパク質であることが示されている。
【０００３】
EXTは、多発性外骨腫症、すなわち、骨格異常および低身長を導くことのある、長幹骨に主に現れる軟骨端骨格増殖(cartilage-capped skeletal excrescences)の存在を特徴とする常染色体優性疾患である（Solomon, L. (1964) Am. J. Hum. Genet. 16, 351-363）。外骨腫症は、病理的には、良性骨腫瘍である骨軟骨腫を示すけれども、軟骨肉腫や骨肉腫への悪性転換が、EXT患者の約２％に起こっている(Solomon, L. (1964) Am. J. Hum. Genet. 16, 351-363; Schmale, G. A., etal. (1994) J. Bone Jt. Surg. 76, 986-992)。この疾患の遺伝的連鎖は、染色体8q24.1(EXT1)、11p11-13(EXT2)および19pの３つの独立した座位に特定されている（Cook, A., et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 53, 71-79; Wu, Y., et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3, 167-171; Le Merrer, M., et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3, 717-722）。このファミリーのEXT遺伝子は、EXT遺伝子と高い相同性を示す、３つの別のEXT様遺伝子、すなわち、EXTL1、EXTL2/EXTR2およびEXTL3/EXTR1の同定により拡大されている（Wuyts, W., et al. (1997) Eur. J. Hum. Genet. 5, 382-389; Saito, T., et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 61-66; Wise C. A., et al. (1997) Genome Res. 7, 10-16; Van Hul, W. et al. (1998) Genomics 47, 230-237）。散発性の外骨腫症由来軟骨肉腫は、EXT1およびEXT2の座位のマーカーの異型接合の喪失に帰することができることが示されており（Hecht, J. T., et al. (1995) Am. J. Hum. Genet. 56, 1125-1131; Raskind, W. H., et al. (1995) Am. J. Hum. Genet. 56, 1132-1139）、このことは、EXTに関与する遺伝子ががん抑制遺伝子である可能性を示す。従って、EXT1、EXT2および３つのEXT様遺伝子の遺伝子産物は、がん抑制活性を持つ可能性がある新しいファミリーのタンパク質と考えられる。
【０００４】
ヘパリン／ヘパラン硫酸とコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸の生合成における類別に関与する重要な酵素、すなわち、β-GalNAcの共通結合構造への転移を触媒するβ-GalNAc転移酵素の探索では、プロテオグリカン由来の四糖−セリン（GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser）へのGalNAcの転移を触媒するα-N-アセチルガラクトサミン転移酵素がウシ胎児血清およびマウス肥満細胞で見い出されている（Kitagawa, H., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 22190-22195; Lidholt, K., et al. (1997) Glycoconjugate J. 14, 737-742）。しかしながら、これらの酵素の精製および詳細な特性評価は行われていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、GAGの生合成において重要な酵素である可能性があるα1,4-N-アセチルヘキソサミン転移酵素を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト肉腫細胞系（悪性線維性組織球腫）の無血清培養培地にα-N-アセチルガラクトサミン転移活性を見い出すとともに、この活性を有する酵素を無血清培養培地から精製することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、α1,4-N-アセチルガラクトサミン転移酵素活性及びα1,4-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を併有し、下記(1)の酵素学的性質を有するα1,4-N-アセチルヘキソサミン転移酵素（以下、本発明酵素ともいう）を提供する。
(1)作用・基質特異性：
N-アセチルガラクトサミン供与体(GalNAc供与体)から、下記式で示される物質の非還元末端にN-アセチルガラクトサミン残基(GalNAc)を転移する。
・GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノール(naphthalenemethanol)
・GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser
・GlcAβ1-3GalNAc
・GlcAβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer
下記式で示される物質の非還元末端にはGalNAcを実質的に転移しない。
・GlcA(3-O-sulfate)β1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer
N-アセチルグルコサミン供与体(GlcNAc供与体)から、下記式で示される物質の非還元末端にN-アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)を転移する。
・GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノール(naphthalenemethanol)
下記式で示される物質の非還元末端にはGlcNAcを実質的に転移しない。
・GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser
（式中、GlcAはグルクロン酸残基、Galはガラクトース残基、Xylはキシロース残基、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン残基、Serはセリン残基、Cerはセラミド残基を示し、3-O-sulfateは３位の水酸基が硫酸化されていることを示す。）
【０００８】
本発明酵素は、好ましくは、さらに下記(2)および(3)の酵素学的性質を有する。
(2)活性化：
酵素反応に二価陽イオンを必要とする(GlcAβ1-3GalNAcを受容体として用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
(3)至適ｐＨ：
・ｐＨ約６．５(50mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液を用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
・ｐＨ約７．４(トリス−塩酸緩衝液を用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
【０００９】
本発明酵素は、さらに好ましくは、さらに下記(4)の酵素学的性質を有する。(4)GalNAc転移酵素活性についてのミカエリス定数(Km)：
約1060μM(N-アセチルコンドロシン(GlcAβ1-3GalNAc))
約188μM(GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser)
約27μM(UDP-GalNAc)
【００１０】
本発明酵素は、好ましくは、アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示されるものである。
本発明酵素は、好ましくは、ヒト由来である。
【００１１】
本発明は、また、精製された本発明酵素の酵素を含む画分を提供する。
本発明は、さらにまた、配列番号２に示すアミノ酸配列のうちアミノ酸番号５８〜３３０のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、インシュリンシグナル配列およびプロテインＡのIgG結合ドメインのアミノ酸配列からなるポリペプチドとの融合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
本発明酵素は、α1,4-N-アセチルガラクトサミン転移酵素（以下、α-GalNAcTともいう）活性及びα1,4-N-アセチルグルコサミン転移酵素（以下、GlcNAcTともいう）活性を併有する。なお、α1,4-N-アセチルガラクトサミン転移酵素においては、その酵素の作用によりN-アセチルガラクトサミン残基の転移が起こる供与体基質と受容体基質とが存在する。また、α1,4-N-アセチルグルコサミン転移酵素においては、その酵素の作用によりN-アセチルグルコサミン残基の転移が起こる供与体基質と受容体基質が存在する。従って、本発明酵素においては、α-GalNAcTとGlcNAcTについての供与体基質と受容体基質が存在する。
【００１３】
上記活性は、例えば、以下の標準測定条件により測定できる。すなわち、標準アッセイ溶液は、総容量35μlで、50 mM MES緩衝液, pH 6.5中に、2μlの酵素溶液、１〜250 nmolの受容体基質（例えば5 nmolのN-アセチルコンドロシン）、0.86〜85.7μMの3H標識供与体基質（例えば、8.57μM UDP-[3H]GalNAc (5.28×105 dpm)または8.57μM UDP-[3H]GlcNAc (5.5×105 dpm)）、20 mM MnCl2、171μM ATPを含む。この反応液を37℃で４時間インキュベートし、次いで1 mlの5 mMリン酸ナトリウム, pH 6.8で希釈する。3H標識生成物を3H標識供与体基質から分離する（例えば、反応液をDowex 1-X8 (PO42-, 100〜400メッシュ: Bio-Rad)を通過させて、3H標識生成物をUDP-[3H]GalNAcまたはUDP-[3H]GlcNAcから分離する（Kitagawa, H., et al. (1997) Glycobiology 7, 531-537））。単離された生成物をシンチレーションスペクトロフォトメーターで定量する。受容体基質へのネットの[3H]GalNAcまたは[3H]GlcNAc取り込み（転移酵素活性）は、受容体基質なしでのブランク値を差し引くことで求める。
【００１４】
本発明酵素は、下記(1)の酵素学的性質を有する。
(1)作用・基質特異性：
N-アセチルガラクトサミン供与体(GalNAc供与体)から、下記式で示される物質（GalNAc受容体）の非還元末端にN-アセチルガラクトサミン残基(GalNAc)を転移する。
・GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノール(naphthalenemethanol)
・GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser
・GlcAβ1-3GalNAc
・GlcAβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer
下記式で示される物質の非還元末端にはGalNAcを実質的に転移しない。
・GlcA(3-O-sulfate)β1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer
N-アセチルグルコサミン供与体(GlcNAc供与体)から、下記式で示される物質（GlcNAc受容体）の非還元末端にN-アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)を転移する。
・GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノール(naphthalenemethanol)
下記式で示される物質の非還元末端にはGlcNAcを実質的に転移しない。
・GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser
（式中、GlcAはグルクロン酸残基、Galはガラクトース残基、Xylはキシロース残基、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン残基、Serはセリン残基、Cerはセラミド残基を示し、3-O-sulfateは３位の水酸基が硫酸化されていることを示す。）
【００１５】
また、GalNAc供与体としては、UDP-GalNAcを用いることができ、GlcNAc供与体としては、UDP-GlcNAcを用いることができる。
【００１６】
上記の作用・基質特異性は、上記の標準測定条件において、上記の供与体基質および受容体基質を用いることにより測定できる。
【００１７】
本発明酵素は、好ましくは、さらに下記(2)および(3)の酵素学的性質を有する。
(2)活性化：
酵素反応に二価陽イオンを必要とする(GlcAβ1-3GalNAcを受容体として用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
(3)至適ｐＨ：
・ｐＨ約６．５(50mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液を用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
・ｐＨ約７．４(トリス−塩酸緩衝液を用い、GalNAc転移酵素活性について調べた場合)
【００１８】
これらの活性化および至適ｐＨは、上記の標準測定条件において、20 mM MnCl2を他の２価陽イオンを生じる物質に置き換えることによって、また、50 mM MES緩衝液, pH 6.5を他の緩衝液に置き換えることによって測定できる。
【００１９】
本発明酵素は、さらに好ましくは、さらに下記(4)の酵素学的性質を有する。
(4)GalNAc転移酵素活性についてのミカエリス定数(Km)：
約1060μM(N-アセチルコンドロシン(GlcAβ1-3GalNAc))
約188μM(GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser)
約27μM(UDP-GalNAc)
【００２０】
このミカエリス定数は、上記の標準測定条件において、基質の濃度を変化させて活性を測定することによって測定できる。
【００２１】
また、本発明酵素をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すと、38 kDa付近に主要なバンドが検出される。
【００２２】
本発明酵素としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる。配列番号２に示すアミノ酸配列においては、天然または人工の変異体に存在しうる、上記酵素学的性質に実質的に影響しない１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移があってもよく、このようなアミノ酸配列を有するものも本発明酵素に含まれる。本明細書における「アミノ酸の数個」とは該酵素の酵素学的性質が変化しない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、通常には全アミノ酸数の５％以下の数である。本発明酵素の酵素学的性質は上述の方法により測定することが可能であり、当業者であれば、目的とする酵素学的性質を指標として、該酵素学的性質に実質的に影響しない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００２３】
また、配列番号２に示すアミノ酸配列には、Ｎ末端側に膜貫通ドメインと考えられる配列が含まれており、このような上記酵素学的性質に実質的に影響しない部分はなくてもよい。膜貫通ドメインを欠失した酵素は可溶性形態になり、試薬等として使用するのに有利である。このような可溶性形態の本発明酵素としては、アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示されるものがある。
本発明酵素は、好ましくは、ヒト由来である。
【００２４】
本発明酵素は、後記実施例に記載したように、本発明によって初めて精製され、その酵素学的性質および遺伝子が同定されたものである。
【００２５】
従って、本発明酵素を含む試料から、同定された酵素学的性質を指標にして、酵素の精製に一般に使用される技術により精製し、精製された本発明酵素を含む画分を得ることが可能である。
【００２６】
本明細書において「精製された画分」とは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ均一に精製された画分を意味し、好ましくはさらに、後記実施例２に記載された条件で測定して1300μIU/mg（タンパク質）以上の比活性を有する画分を意味する。
【００２７】
本発明酵素の精製方法としては、本発明酵素を含む試料（例えば、悪性ヒト繊維性組織球腫細胞系の培養上清）から、フェニルセファロース、ヘパリンセファロースおよびUDP-ヘキサノールアミンセファロース（これらの樹脂はAmersham Pharmacia BiotechおよびSigmaから入手可能である）を用いたクロマトグラフィーの組合せによって精製する方法が挙げられる。
【００２８】
また、本発明により遺伝子が明らかにされたので、その塩基配列の一部分に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体DNAあるいはmRNAから本発明酵素をコードするDNAを増幅し、そのDNAで適当な宿主を形質転換し、その宿主の培養物から本発明酵素を採取することによって本発明酵素を取得することも可能である。
【００２９】
本発明酵素の遺伝子の塩基配列としては、GenBankにAccession No. AB009284またはAF000416として登録されている配列が挙げられる。この塩基配列に基づいて作成されるプライマーとしては、配列番号３および４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
形質転換は、公知の発現ベクターに上記DNAのフラグメントを挿入して組換えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて行うことができる。宿主としては大腸菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。
【００３１】
この際には、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、例えば、COS-1細胞等の哺乳類由来の培養細胞とpSVL(Amersham Pharmacia Biotech)等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを採用することができる。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００３２】
このDNAは直接発現させてもよいし、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また、このDNAは全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００３３】
培養物からの本発明酵素の採取は、上述の精製方法によって行うことができる。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含される。
【００３４】
他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させた場合には、他のポリペプチドに基づいて精製を行うことができる。例えば、他のポリペプチドとして、プロテインＡのIgG結合ドメインを用いた場合には、IgGセファロース(Amersham Pharmacia Biotech)に吸着させることによって精製が可能である。
【００３５】
このような融合ポリペプチドとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列のうちアミノ酸番号５８〜３３０のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、インシュリンシグナル配列およびプロテインＡのIgG結合ドメインのアミノ酸配列からなるポリペプチドとの融合ポリペプチドが挙げられる。この融合ポリペプチドは、ヒト胎児肝臓cDNA(CLONETECH)をテンプレートとし、配列番号３に示す塩基配列を有する5'プライマーおよび配列番号４に示す塩基配列を有する3'プライマーを用いてPCRを行い、PCRフラグメントを、pGIR201protA（Kitagawa, H., et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1394-1401）のBamHI部位にサブクローニングし、このベクターに存在するインシュリンシグナル配列およびプロテインＡのIgG結合ドメインにα-GalNAcTが融合したポリペプチドをコードする配列を作成し、融合ポリペプチドをコードする配列を含むフラグメントを適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主を形質転換し、その宿主の培養物から採取することにより得ることができる。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３７】
【実施例１】
α-GalNAcTの部分精製、反応生成物の分析およびα-GalNAcTの特性評価
(1) α-GalNAcTの部分精製
ヒト悪性繊維性組織球腫細胞（MFH-7細胞、滋賀医科大学医学部臨床検査医学科、岡部博士により樹立されたもの）を、１０％(v/v)ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地で培養した。細胞がコンフルエンスに達した後、無血清培地Media I (IBL)で３日間培養した。その後、培養培地を３日毎に新しいMedia Iで置き換え、Media Iでの培養を１５日間続けた。使用したMedia Iをプールし、10,000×gで10分間遠心分離し、細胞片を除いた。上清に、(NH4)2SO4およびグリセロールをそれぞれ1.0 Mおよび10%(v/v)の最終濃度になるように加えた。培養上清のαGalNAc活性は約2 mIU/L、総タンパク質濃度は0.167 g/Lであった。この培養上清(1 L)を、1.0 M (NH4)2SO4を含む、10 mM MES-NaOH, pH 6.5 (バッファーＡ）中の１０％グリセロール溶液で平衡化したフェニルセファロース(Amersham Pharmacia Biotech)のカラム(15.0 ml)にアプライし、150 mlの0.6 M (NH4)2SO4を含むバッファーＡで洗浄し、45 mlのバッファーＡで溶出した。クロマトグラフィーは２回行った。２回のクロマトグラフィーから得られた溶出液を合わせ、Centriplus-50濃縮装置(Amicon Inc.)を用いて、濃縮し、15 mlの0.15 M NaClを含むバッファーＡに対して透析した。得られた調製物のα-GalNAcT活性は約143 mIU/L、総タンパク質濃度は39.1 g/Lであった。従って、比活性は、1.2 mIU/gから3.8 mIU/gへ約３倍上昇した。この調製物を用いて以下の反応生成物の分析を行った。
【００３８】
なお、特記しない限り、α-GalNAcT活性の測定には、以下の標準測定条件を用いた。標準アッセイ溶液は、総容量35μlで、50 mM MES緩衝液, pH 6.5中に、2μlの酵素溶液、5 nmolのN-アセチルコンドロシン、8.57μM UDP-[3H]GalNAc (5.28×105 dpm)、20 mM MnCl2、171μM ATPを含むものとした。ATPはUDP-GalNAcの酵素的分解を防ぐために加えた。この反応液は37℃で４時間インキュベートし、次いで1 mlの5 mMリン酸ナトリウム, pH 6.8で希釈した。反応液をDowex 1-X8 (PO42-, 100〜400メッシュ: Bio-Rad)を通過させて、3H標識生成物をUDP-[3H]GalNAcから分離した（Kitagawa, H., et al. (1997) Glycobiology 7, 531-537）。単離された生成物をシンチレーションスペクトロフォトメーターで定量した。受容体基質へのネットの[3H]GalNAc取り込みは、受容体基質なしでのブランク値を差し引くことで求めた。この条件におけるα-GalNAcT活性の測定では、N-アセチルコンドロシンへのGalNAc取り込みは、８時間までインキュベーション時間に比例していることが確認されている（図１）。
【００３９】
(2) 反応生成物の分析
四糖-セリン（GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser）を受容体として、上記(1)で調製されたα-GalNAcT調製物を反応させた。反応液の組成は、総容量625μlで、100 mM MES緩衝液, pH 6.5中に、25 nmolの四糖-セリン、200μM UDP-[3H]GalNAc (5.04×106 dpm)、20 mM MnCl2、1 mM ATPおよび175μlの酵素溶液（25μIUに相当）であった。反応液を37℃で20時間インキュベートし、試験管を沸騰水に１分間浸すことによって反応を停止させた。反応液を、0.25 M NH4HCO3/7% 1-プロパノールで平衡化したSuperdex 30カラム(1.6×60 cm)でのゲル濾過に付した。流速1.0 ml/minで画分（各1 ml）を回収し、放射活性を測定した。結果を図２に示す。黒丸は、四糖-セリンの存在下での反応生成物、白丸は、四糖-セリン非存在下での反応生成物を示す。α-GalNAcT反応生成物に相当する放射活性ピーク（図２中、バーで示す）をプールし、蒸発乾固して脱塩し、水に再溶解した。
【００４０】
得られた反応生成物(約12 nmol)について、凍結乾燥によりD2Oへの交換を行った。1H NMRスペクトルを、26℃でナノプローブを用いてVarian VXR-500により測定した。ケミカルシフトは、4,4-ジメチル-4-シラペンタン-1-スルホン酸ナトリウムに対する値で求めたが、実際の標準としてはアセトン(δ2.225 D2O中)を用いた。
【００４１】
得られた一次元スペクトルを図３に示す。δ4.5〜5.5 ppmのシグナルは、合成基準化合物GalNAcα1-4GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-SerのNMRスペクトル（Tamura, J., et al. (1996) Liebigs Ann., 1239-1257）との比較から構成糖のH-1の共鳴に帰属された。一次元スペクトルのプロトンシグナルは、二次元COSYスペクトルを用いて帰属された。生成物のNMRデータは、上記合成基準化合物のデータと一致した。従って、α-GalNAcTは、UDP-GalNAcからGalNAcを受容体分子の非還元末端β結合GlcAに、α1,4結合により転移できることが確認された。従って、α-GalNAcTは、UDP-GalNAc:GlcAβ-Rα1,4-N-アセチルガラクトサミン転移酵素とも呼ぶことができる。
【００４２】
(3) α-GalNAcTの特性評価
上記の標準測定条件において緩衝液とpHを変えることにより、緩衝液とｐＨの影響を調べた結果を図４に示す。図４中、黒三角は酢酸ナトリウム緩衝液、白四角はカコジル酸ナトリウム緩衝液、黒丸はMES-NaOH緩衝液、白丸はイミダゾール-HCl緩衝液、白三角はTris-HCl緩衝液を示す。各緩衝液は50 mMの最終濃度で用いた。この結果、至適ｐＨは、MES-緩衝液を用いた場合には約6.5、Tris-HCl緩衝液を用いた場合には約7.4であった。
【００４３】
上記の標準測定条件において20 mM MnCl2を種々の２価陽イオンを生じる物質に置き換え、また、濃度を変えることにより、２価陽イオンの影響を調べた結果を図５に示す。図５のＡは、最終濃度10 mMの種々の２価陽イオンおよびEDTAの存在下での活性を示す。活性には２価陽イオンが必要であり、10 mM EDTAの存在により活性が失われた。Mn2+が最も高い活性を示し、Co2+はMn2+の４０％の活性を示した。図５のＢは、MnCl2の濃度の影響を示す。Mn2+の至適濃度は約20 mMであった。
【００４４】
上記の標準条件において、種々の基質（受容体基質および供与体基質）の濃度を変えることにより、基質の影響を調べた結果を図６に示す。図６のＡは、N-アセチルコンドロシン、Ｂは、UDP-GalNAc、Ｃは、四糖-セリン（GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser）を用いた場合を示す。これらの受容体基質のミカエリス定数(Km)は、N-アセチルコンドロイシンについて約1060μM、UDP-GalNAcについて約27μM、四糖-セリンについて約188μMであった。
【００４５】
なお、特性評価における各試験は独立して２回行われ、これらの実験の結果は実質的に同じであった。
【００４６】
【実施例２】
α-GalNAcTの精製およびＮ末端アミノ酸配列決定
(1) α-GalNAcTの精製
実施例１と同様にして、フェニルセファロース溶出画分を得た。
得られたフェニルセファロース溶出画分を、20%グリシン、0.15 M NaCl、50 mM MES-NaOH, pH 6.5（バッファーＢ）で平衡化したヘパリンセファロース(Amersham Pharmacia Biotech)のカラム(1 ml)にアプライし、0.15 M NaClを含むバッファーＢで洗浄し、0.3 M NaClを含むバッファーＢで溶出した。溶出液をCentriplus-50濃縮装置(Amicon Inc.)を用いて、濃縮し、10 mM MnCl2を含むバッファーＢに対して透析した。
【００４７】
得られたヘパリンセファロース溶出画分を、10 mM MnCl2を含むバッファーＢで平衡化したUDP-ヘキサノールアミンセファロースのカラム(0.5 ml)にアプライし、10 mM MnCl2を含むバッファーＢで洗浄し、2 mM EDTAを含むバッファーＢで溶出した。溶出液をCentriplus-50濃縮装置(Amicon Inc.)を用いて、濃縮し、4 mM MnCl2を含むバッファーＢに対して透析した。これをUDP-ヘキサノールアミンセファロース画分とした。
【００４８】
各精製ステップの結果を表１に示す。α-GalNAcT活性は上記の標準測定条件で測定した。タンパク質は、BCA protein assay kit (Pierce社)を用い、ウシ血清アルブミン(BSA)を標準として測定した。但し、UDP-ヘキサノールアミンセファロース画分については、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、クマシーブリリアントブルーによる染色の程度を、標準（BSA）と比較することにより推定した。
【００４９】
【表１】
0004189073.tif 000002
【００５０】
得られたUDP-ヘキサノールアミンセファロース画分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ポリビニリデンジフルオリド膜(Bio-Rad)に転写し、分離したタンパク質バンドをクマシーブリリアントブルー(Sigma)で染色した。この結果、38 kDaの主要タンパク質バンドが検出され、α-GalNAcTはほぼ均一にまで精製されたことが分かった。
【００５１】
(2) Ｎ末端アミノ酸配列分析
上記(1)で得られた主要タンパク質バンドを含む膜片を切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列分析(Takara Shuzo Co.)に付した。決定されたアミノ酸配列を配列番号１に示す。このアミノ酸配列は、３０アミノ酸残基からなり、データベース検索の結果、同定できなかった第21番目のアミノ酸残基を除いて、EXTL2/EXTR2（Wuyts, W., et al. (1997) Eur. J. Hum. Genet. 5, 382-389; Saito, T., et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 61-66）にコードされるアミノ酸配列の第54番目〜第83番目のアミノ酸残基に完全に一致した（図７）。同定できなかったアミノ酸残基(図７中、X)は、EXTL2/EXTR2のアミノ酸配列では、N-グリコシル化可能部位(図７中、*を付した）に相当するものであり、グリコシル化されていたものと考えられる。
【００５２】
EXTL2/EXTR2の塩基配列は、一つのN-グリコシル化可能部位を含む330アミノ酸からなるタンパク質をコードする990 bpの単一のオープンリーディングフレームを有する。これは、これまでにクローン化されている多くの他の糖転移酵素の特徴であるII型の膜貫通タンパク質のトポロジーである。精製されたα-GalNAcTのＮ末端アミノ酸配列は、EXTL2/EXTR2の翻訳の予測開始部位から54アミノ酸離れており、他のいくつかの糖転移酵素で観察されているように、精製α-GalNAcTは、膜貫通ドメインを失い、酵素産生細胞から遊離した、短縮形態であると考えられる。
【００５３】
【実施例３】
α-GalNAcTの可溶性形態の発現および可溶性形態の特性評価
(1) α-GalNAcTの可溶性形態の発現
EXTL2/EXTR2にコードされるアミノ酸配列のＮ末端の57アミノ酸を欠く、α-GalNAcTの短縮形態をコードするDNAを、ヒト胎児肝臓cDNA(CLONETECH)をテンプレートとし、インフレームのBamHI部位を含む配列番号３に示す塩基配列を有する5'プライマーおよび終止コドンの54 bp下流に位置するインフレームのBamHI部位を含む配列番号４に示す塩基配列を有する3'プライマーを用いてPCRを行い、増幅した。PCR反応は、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用い、96℃30秒、55℃30秒、73℃75秒のサイクルを30回の条件で行った。得られたPCRフラグメントを、pGIR201protA（Kitagawa, H., et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1394-1401）のBamHI部位にサブクローニングし、このベクターに存在するインシュリンシグナル配列およびプロテインＡのIgG結合ドメインにα-GalNAcTが融合したタンパク質をコードする配列を作成した。融合タンパク質をコードする配列を含むNheIフラグメントを発現ベクターpSVL(Amersham Pharmacia Biotech)に挿入した。
【００５４】
得られた発現プラスミド(6μg)を、FuGENETM 6(Roche Molecular Biochemicals)を用いて製造者の指示書に従い、100 mmプレート上のCOS-1細胞にトランスフェクトさせた。トランスフェクションの２日後に、1 mlの培養培地を回収した。
【００５５】
(2) 可溶性形態の特定評価
上記(1)で回収された培養培地を10μlのIgGセファロース(Amersham Pharmacia Biotech)と４℃で１時間インキュベートした。遠心でIgGセファロースを回収し、アッセイバッファー（50 mM MES緩衝液, pH 6.5）で洗浄し、アッセイバッファー中に懸濁した。懸濁液を、α-GalNAcTおよびGlcNAcT活性について、既報（Kitagawa, H., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 22190-22195;  Fretz, T. A., et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 28809-28814）に従い試験した。すなわち、アッセイ混合液は、総容量35μlで、50 mM MES緩衝液, pH 6.5中に、2μlの酵素溶液、受容体基質、8.57μM UDP-[3H]GalNAc (5.28×105 dpm)または8.57μM UDP-[3H]GlcNAc (5.5×105 dpm)、20 mM MnCl2、171μM ATPを含むものであった。受容体基質としては、GAG-タンパク質結合構造に相当する四糖-セリン(1 nmol)、N-アセチルコンドロシン(5 nmol)、および、GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノールを用いた。反応液は37℃で４時間インキュベートし、次いで1 mlの5 mMリン酸ナトリウム, pH 6.8で希釈した。反応液をDowex 1-X8 (PO42-, 100〜400メッシュ: Bio-Rad)を通過させて、3H標識生成物をUDP[3H]GalNAcまたはUDP[3H]GlcNAcから分離した。単離された生成物をシンチレーションスペクトロフォトメーターで定量した。受容体基質へのネットの[3H]GalNAcまたは[3H]GlcNAc取り込みは、受容体基質なしでのブランク値を差し引くことで求めた。
結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
0004189073.tif 000003
活性の値は、２回の独立した実験の平均である。
NDは、検出されず(<0.1 pmol/ml培地/h)。
-は、測定せず。
【００５７】
表２の結果から明らかなように、α-GalNAcT活性は、３つの受容体全てについて検出された。なお、対照のpSVLをトランスフェクトした試料をアフィニティクロマトグラフィーに付してもα-GalNAcT活性は回収されなかった。
【００５８】
また、GlcNAcT活性は、GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノールを受容体基質とした場合に検出され、四糖-セリンを用いた場合には検出されなかった。この基質特異性は、ヘパラン硫酸生合成に関与すると予測されているGlcNAcT-I（Linholt, K., et al. (1997) Glycoconjugate J. 14, 737-742; Fritz, T. A., et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 28809-28814）について報告されているものと一致する。なお、対照のpSVLをトランスフェクトした試料をアフィニティクロマトグラフィーに付してもGlcNAcT活性は回収されなかった。
【００５９】
次に、α-GalNAcT反応またはGlcNAcT反応による生成物の同定のため、生成物を以下の通り分析した。
【００６０】
N-アセチルコンドロシンを受容体として用いたα-GalNAcT反応の生成物の単離を、0.25 M NH4HCO3/7% 1-プロパノールで平衡化したSuperdex 30カラム（1.6×60 cm）でのゲル濾過により行った。生成物を含む放射活性ピークをプールし、減圧乾固した。単離した生成物(約10 pmol)を、総容量20μlの50 mMクエン酸ナトリウム緩衝液, pH 4.5中、37℃で一晩、15 mIUのβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼまたは39 mIUのα-N-アセチルガラクトサミニダーゼにより消化した。得られた消化物を上記Superdex 30カラムを用いて同様に分析した。結果を図８のＡに示す。図中、黒丸はα-N-アセチルガラクトサミニダーゼ消化物、黒四角はβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ消化物、白丸は未消化物を示す。矢印は、遊離GalNAcの溶出位置を示す。各画分は1 mlで、VoおよびVtはそれぞれ画分番号40および120である。
【００６１】
図８のＡから明らかなように、生成物は、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼで完全に消化され、遊離[3H]GalNAcの位置に放射活性ピークを定量的に生じた。一方、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼでは消化されなかった。この結果は、GalNAcがN-アセチルコンドロシンにα結合により転移されたことを示し、本酵素がα-GalNAcT活性を有することが確認された。
【００６２】
GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノールを用いたGlcNAcT反応の生成物の単離を、Nova-Pak(登録商標) C18カラム(3.9×150 mm; Waters)をLC-10ASシステム(Shimadzu Co.)で用いるHPLCにより行った。カラムは、室温において流速1.0 ml/minの水で15分間無勾配展開した後、５分間で0%から100%になるメタノール直線勾配をアプライし、次いで、100%メタノールで40分間無勾配展開した。生成物を含む放射活性ピークをプールし、減圧乾固した。単離した生成物(約74 pmol)を、総容量20μlの50 mMクエン酸ナトリウム緩衝液, pH 4.5中、14 mIUのβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ、または、総容量30μlの、2 mM Ca(OAc)2を含む20 mM酢酸ナトリウム緩衝液, pH 7.0中、3 mIUのヘパリチナーゼＩと、37℃で一晩インキュベートすることにより消化性を試験した。得られた消化物を上記Nova-Pak(登録商標) C18カラムを用いて同様に分析した。結果を図８のＢに示す。図中、白丸はヘパリチナーゼＩ消化物、黒四角はβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ消化物、黒丸は未消化物を示す。矢印は、遊離GlcNAcの溶出位置を示す。各画分は2 mlである。
【００６３】
図８のＢから明らかなように、生成物は、ヘパリチナーゼＩで完全に消化され、遊離[3H]GlcNAcの位置に放射活性ピークを定量的に生じた。一方、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼでは消化されなかった。この結果は、GlcNAcが、専ら、GlcAβ1-3Galβ1-O-ナフタレンメタノールの非還元末端GlcAにα1,4結合により転移されたことを示す。
【００６４】
さらに、得られたα-GalNAcTを、N-グリコシダーゼＦにより、製造者の指示書に従って消化した。消化後、反応液および非消化試料を7.5%SDS-PAGEにより分析し、タンパク質バンドをポリビニリデンジフルオリド膜に転写した。膜を、0.15 M NaCl、0.05% Tween 20および1%ウシ血清アルブミンを含む20 mM Tris-HCl, pH 7.5でブロッキングし、α-GalNAcTと関係のないIgG3型のマウスモノクローナル抗体（Kitagawa, H., et al. (1988) J. Biochem. 104, 817-821）を希釈したもの(1:200)とインキュベートした。結合した抗体を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Promega)を２次抗体として用い、酵素反応により可視化した。
【００６５】
上記発現プラスミドにおいては、EXTL2/EXTR2にコードされる最初の57アミノ酸が、切断可能なインシュリンシグナル配列およびプロテインＡのIgG結合ドメインで置換され、EXTL2/EXTR2のcDNAにコードされるタンパク質の可溶性形態が生成する。このEXTL2/プロテインＡ融合タンパク質をコードする発現プラスミドを、COS-1細胞で発現させると、約66 kDaのタンパク質が分泌された。融合タンパク質の見かけの分子量は、N-グリコシダーゼ処理により60 kDaに減少した。このことは、EXTL2/EXTR2の一つのN-結合グリコシル化可能部位がグリコシル化されていることを示している。
【００６６】
【実施例４】
ヒト組織でのα-GalNAcTの発現レベル
ヒトMultiple Tissue cDNA Panel(CLONETECH)を分析に用いた。製造者は、各cDNA試料を６つのハウスキーピング遺伝子に関して規格化している。これを確認するため、その転写物が組織において常に一定レベルで存在するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの増幅レベルを測定した。
【００６７】
増幅反応は、総容量50μl中、配列番号５に示す塩基配列を有する5'プライマーおよび配列番号６に示す塩基配列を有する3'プライマーを用い、95℃30秒、55℃30秒、72℃90秒の25サイクルにより行った。増幅産物の10μl分液を、エチジウムブロマイドを含む1.0%アガロースゲルでの電気泳動により可視化した。規格化したcDNAを用いて、転写物の増幅を、一連の回数（25-30-35）で行うことにより、半定量的な増幅の条件を検索した。最も良好な結果は、上記の5'プライマーおよび3'プライマーを用いて、96℃30秒、55℃30秒、72℃75秒の３０サイクルを行うことにより得られた。上記の5'プライマーおよび3'プライマーは、混在する可能性のあるゲノムDNAに由来するcDNAから増幅されたPCR産物を区別できるように、EXTL2遺伝子中の２つのイントロンにまたがるように設計されている。PCR産物は、エチジウムブロマイドを含む1.0%アガロースゲルでの電気泳動により可視化した。増幅されたDNAが、EXTL2のmRNAに由来したことを確認するため、増幅フラグメントをゲルにより精製し、pGEM(登録商標)-T Easyベクター(Promega)にサブクローニングし、配列決定を行った。配列決定は、377 DNAシークエンサー(PE Applied Biosystems)によって行った。増幅DNAの塩基配列は、ヒトEXTL2のcDNAのもの（Wuyts, W., et al. (1997) Eur. J. Hum. Genet. 5, 382-389）と同一であった。
【００６８】
予測されたサイズ(875 bp)の単一の増幅DNAが、増幅されたcDNAの量は異なるものの、試験した成人の18種の組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、結腸、卵巣、末梢血白血球、前立腺、小腸、脾臓、精巣、胸腺、骨、皮膚）および胎児の８種の組織（心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺）に由来するcDNA標品から得られ、この遺伝子が遍在的に発現していることが判明した。
【００６９】
【発明の効果】
本発明により、GAGの生合成において重要な酵素である可能性があるα1,4-N-アセチルヘキソサミン転移酵素が提供される。本酵素の提供により、グリコサミノグリカンの生合成の研究が促進されると考えられる。
【００７０】
【配列表】
0004189073.tif 000004
0004189073.tif 000005
0004189073.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】  標準測定条件におけるα-GalNAcT活性の測定での、N-アセチルコンドロシンへのGalNAc取り込みとインキュベーション時間との関係を示す。
【図２】  四糖-セリンを受容体としたときのα-GalNAcTによる反応生成物のゲル濾過分析の結果を示す。
【図３】  四糖-セリンを受容体としたときのα-GalNAcTによる反応生成物の1H NMRスペクトルを示す。
【図４】  緩衝液およびpHのα-GalNAcT活性に対する影響を示す。
【図５】  ２価陽イオンおよびその濃度のα-GalNAcT活性に対する影響を示す。Ａは２価陽イオンを変えた場合、ＢはMn2+の濃度を変えた場合を示す。
【図６】  受容体基質およびその濃度のα-GalNAcT活性に対する影響を示す。Ａは、N-アセチルコンドロシン、Ｂは、UDP-GalNAc、Ｃは、四糖-セリン（GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser）を用いた場合を示す。
【図７】  培養上清から精製されたα-GalNAcTのＮ末端アミノ酸配列と、EXTL2/EXTR2にコードされるアミノ酸配列との比較を示す。
【図８】  GalNAcおよびGlcNAc転移反応の生成物の、グリコシダーゼを用いた分析結果を示す。Ａは、GalNAc転移反応の生成物の分析結果、Ｂは、GlcNAc転移反応の生成物の分析結果を示す。
【図１】
0004189073.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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