(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
0004192331.tif 000014
（式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいＣ1−Ｃ10アルキル基；アリル基；アリールがＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいアリールアルキル基；またはＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいアリール基を示し、
Ｘ1およびＸ2は互いに独立して、単結合を示し、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して、水素原子を示す。）
で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類を、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼまたはキラザイム（登録商標）Ｌ−５（Candida antarctica由来、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製）を用いて不斉加水分解することを特徴とする一般式（２）
0004192331.tif 000015
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ2およびＲ3は前記と同じ意味を示し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）
で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類および一般式（３）
0004192331.tif 000016
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3および＊は前記と同じ意味を示す。）
で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の製造方法。
【請求項２】
前記一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類が、２種の光学活性体の混合物である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類において、Ｒ1がＣ1−Ｃ5アルキル基である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類において、Ｒ1がエチル基である請求項１、２または３に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１、２、３または４に記載の一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類の製造方法。
【請求項６】
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼが、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選ばれる変異型エステラーゼである請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（Ａ）クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来の野生型エステラーゼのアミノ酸配列において、１６０番目のアミノ酸がアラニンに、１８９番目のアミノ酸がチロシンに、それぞれ置換された変異型エステラーゼ（１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ）
（Ｂ）クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来の野生型エステラーゼのアミノ酸配列において、４３番目のアミノ酸がセリンに置換された変異型エステラーゼ（Ｎ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ）
（Ｃ）クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来の野生型エステラーゼのアミノ酸配列において、１６０番目のアミノ酸がセリンに、１８９番目のアミノ酸がチロシンに、それぞれ置換された変異型エステラーゼ（１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ）
（Ｄ）クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来の野生型エステラーゼのアミノ酸配列において、１６０番目のアミノ酸がセリンに、１８９番目のアミノ酸がフェニルアラニンに、それぞれ置換された変異型エステラーゼ（１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍ）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類は、医薬などの中間体として有用な化合物である。
従来、かかる光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を製造する方法としては、光学分割法と、光学活性な物質からの誘導法が公知である。
光学分割法としては、例えばラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を光学活性なフェニルエチルアミンなどの光学活性アミン類を光学分割剤として用いて光学分割する方法が知られている（特開平０８−１８８５６１号公報，ＷＯ９６／０４９００号明細書）。
光学活性な物質からの誘導法としては、光学活性なジシクロペンタンジエノンを出発物質として使用することにより光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類へ導く方法が知られている（特開平０８−１８８５６１号公報）。
しかしながら、光学分割法は工業的製造においては、光学分割剤の回収リサイクル工程が必要で工程数が多くなる、光学活性な物質からの誘導法は、出発物質に光学活性化合物を使用するため原料コストが高くなるという問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らは、光学分割剤を用いないで光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類及び光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類を得る方法、特に、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の光学活性体の混合物を光学選択的に加水分解することによって光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を製造する方法について鋭意検討した結果、酵素を用いることによって光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を容易に効率よく製造できることを見い出し、本発明に至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、一般式（１）
0004192331.tif 000002
（式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいＣ1−Ｃ10アルキル基；アリル基；アリールがＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいアリールアルキル基；またはＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいアリール基を示し、
Ｘ1およびＸ2は互いに独立して、単結合を示し、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して、水素原子を示す。）
で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類を、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼまたはキラザイム（登録商標）Ｌ−５（Candida antarctica由来、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製）を用いて不斉加水分解することを特徴とする一般式（２）
0004192331.tif 000003
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ2およびＲ3は前記と同じ意味を示し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）
で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類および一般式（３）
0004192331.tif 000004
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3および＊は前記と同じ意味を示す。）
で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の製造方法（以下、本発明製造方法と略する。）を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明製造方法において用いられる原料である一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類は、種々の方法で合成されるが、例えば、James A.Monnらの方法（Journal of Medicinal Chemistry,1997,Vol.40,No.4,528-537）に準じて行うことで合成される。一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類には、１位、５位、６位の不斉炭素原子を不斉中心とする８種類の光学活性体が存在するが、本発明の方法に用いられる一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類は、これらの光学活性体をそれぞれ等量ずつ含む混合物であってもよいし、どれかの光学活性体を過剰に含む光学活性な化合物であってもよい。
【００１５】
本発明製造方法において用いられる一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類において、Ｒ1で示される基としては例えば、
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等の、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいＣ1−Ｃ10アルキル基、あるいはアリル基、あるいはベンジル基、４−クロロベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−メチルベンジル基、２，４−ジメトキシベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、α−フェニルエチル基、β−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ベンズヒドリル基、トリフェニルメチル基等の、芳香環上にＣ1−Ｃ8アルキル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいアリールアルキル基、
あるいはフェニル基、４−メチルフェニル基、４−クロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、２−ナフチル基等の、芳香環上にＣ1−Ｃ8アルキル、 Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、ハロゲンもしくはニトロで１個以上置換されていてもよいアリール基などが挙げられるが、
好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基等のＣ1−Ｃ5アルキル基、あるいはアリル基、あるいはベンジル基、４−クロロベンジル基等の芳香環上に置換基を複数有していてもよいベンジル基、あるいはフェニル基、４−メチルフェニル基等の芳香環上に置換基を複数有していてもよいフェニル基が挙げられ、
さらに好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基またはｎ−ブチル基、イソブチル基等のＣ1−Ｃ4アルキル基が挙げられる。
かかるＲ1で示される基は、場合によっては不斉炭素原子を有していてもよい。
【００１８】
かかる一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類としては、例えば２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸メチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−プロピルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソプロピルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｔ−ブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ペンチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソペンチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ネオペンチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘキシル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸シクロヘキシルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘプチル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸シクロヘプチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−オクチル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸アリルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンジルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メチルベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４−ジメトキシベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４，６−トリメチルベンジル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（（Ｓ）−フェニルエチル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（（Ｒ）−フェニルエチル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（β−フェニルエチル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルプロピルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンズヒドリルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸トリフェニルメチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（���−メチルフェニル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロフェニル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシフェニル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロフェニル）エステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２−ナフチル）エステルなどが挙げられ、さらに好ましくは２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸メチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−プロピルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソプロピルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｔ−ブチルエステルなどが挙げられる。
【００１９】
本発明製造方法において用いることのできる一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して不斉加水分解能を有する酵素（以下、本酵素と記す）は、微生物由来の酵素であってもよいし、動物由来の酵素であってもよい。
【００２０】
微生物由来の本酵素としては、キャンディダ（Candida）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属の微生物由来の加水分解酵素を挙げることができる。また、これらの微生物由来の本酵素としては、これらの微生物から突然変異剤もしくは紫外線等の処理により誘導された突然変異体由来の酵素であっても、これらの微生物が有する本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物により産生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法により上記本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が１個ないしは数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよく、一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して不斉加水分解能を有していれば本発明製造方法に使用することができる。
【００２１】
本酵素としてさらに具体的には、キャンディダ・アンタークティカ（Candida antarctica）由来、またはクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）株由来の酵素を挙げることができる。
【００２２】
本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばJ.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開平７−１６３３６４号公報、特開平５−５６７８７号公報または特開平１０−２１０９７５号公報記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる組換え微生物によって産生される本酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ（特開平７−１６３３６４号公報）等を挙げることができる。
【００２３】
また、遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、 例えば、Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990） の方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準じた方法を挙げることができる。
【００２４】
本酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸、糖蜜など、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩類、硫酸塩類、およびリン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどを使用することができる。また、上記微生物の有する一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の不斉水解能を高めるために、オリーブ油またはトリブチリン等のトリグリセリドあるいは一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類を適宜培地に添加してもよい。
【００２５】
培養は、通常、好気的に行うのが良く、振とう培養、または通気撹拌培養が適当である。培養温度は、２０〜４０℃程度、好ましくは、２５〜３５℃程度で、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。
また、必要に応じて固体培養法も、一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば適宜採用することができる。
【００２６】
本酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製において使用される方法に従って行えばよい。例えば、まず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス処理等の方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行う。得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等をひとつまたは複数適当に組み合わせることによって目的の酵素を精製することができる。これらカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）や ＢｕｔｙｌーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東洋曹達工業株式会社製）等を挙げることができる。
【００２８】
本酵素としては市販品の酵素を使用することもできる。本酵素の市販品としては、キラザイムＬ−５（登録商標）（Candida antarctica由来、ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）社製）が挙げられる。
【００２９】
本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物などの種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。
【００３０】
かかる本酵素は、目的とする一般式（３）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類に応じて適宜選択するとよい。酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択され、例えば精製酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物を用いる場合、その使用量は一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して通常は０．０１〜２００重量倍程度、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００３１】
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといったリン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液などが挙げられる。かかる水の使用量は一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して通常０．５モル倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いられ、通常は２００重量倍以下である。
【００３２】
不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒などの有機溶媒の存在下に行われてもよい。かかる有機溶媒は、得られる一般式（３）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類及び一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類の光学純度がより向上するため好ましく用いられる。
【００３３】
疎水性有機溶媒としては、例えばｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類などが、親水性有機溶媒としては、例えばｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ブタノールなどのアルコール類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド類などがそれぞれ挙げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独または２種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量は通常一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類に対して２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重量倍程度の範囲である。
【００３５】
不斉加水分解反応は、例えば水、一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類および本酵素を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有機溶媒、水、一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類および本酵素を混合すればよい。
【００３６】
反応系のｐＨは本酵素による不斉加水分解が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されないが、通常はｐＨ４〜１０程度の範囲である。
反応温度は、高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低すぎると反応速度が低下する傾向にあるため、通常５〜６５℃程度であり、好ましくは２０〜５０℃程度の範囲である。
【００３７】
かかる不斉加水分解によって一般式（１）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類の光学活性体が、＊で示される不斉炭素原子の周りの立体配置を維持したまま光学選択的に加水分解されて、目的とする一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類が生成する。
【００３８】
反応後の反応混合物を水層と有機層とに分液し、水層として一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類の水溶液を得る。先の反応において疎水性有機溶媒を用いた場合などには、得られた反応混合物をそのまま分液してもよいが、先の反応において疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒としては例えばｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられる。
【００３９】
次いで、得られた一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類の水溶液から水を留去することによって、目的の一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類を取り出すことができる。また、反応液に酸を加えた後、適当な有機溶媒を用いて抽出し、その有機溶媒を留去することによっても取り出すことができる。得られた一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類はさらに再結晶、カラムクロマトグラフィーなどによって精製されてもよい。
【００４０】
かくして得られる一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類としては、例えば、（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸および、（−）−（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸が挙げられる。
【００４１】
なお、不斉加水分解に際して加水分解されなかった他方の光学活性体である一般式（３）で示される２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類は、分液後の有機層に含まれており、これは溶媒留去などの方法によって容易に有機層から取り出すことができる。得られた一般式（３）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類はさらに再結晶、カラムクロマトグラフィーなどによって精製されてもよい。
【００４２】
かくして得られる一般式（３）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類としては、例えば、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸メチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−プロピルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソプロピルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｔ−ブチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ペンチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソペンチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ネオペンチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘキシル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸シクロヘキシルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘプチル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸シクロヘプチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−オクチル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸アリルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンジルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メチルベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４−ジメトキシベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４，６−トリメチルベンジル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（（Ｓ）−フェニルエチル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（（Ｒ）−フェニルエチル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（β−フェニルエチル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルプロピルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンズヒドリルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸トリフェニルメチルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルエステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メチルフェニル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロフェニル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシフェニル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロフェニル）エステル、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２−ナフチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸メチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−プロピルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソプロピルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ブチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソブチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｔ−ブチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ｎ−ペンチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸イソペンチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ネオペンチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘキシル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸シクロヘキシルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−ヘプチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸シクロヘプチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソ���シクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（ｎ−オクチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸アリルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンジルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メチルベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４−ジメトキシベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２，４，６−トリメチルベンジル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（（Ｓ）−フェニルエチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（（Ｒ）−フェニルエチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（β−フェニルエチル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルプロピルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸ベンズヒドリルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸トリフェニルメチルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸フェニルエステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メチルフェニル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−クロロフェニル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−メトキシフェニル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（４−ニトロフェニル）エステル、（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸−（２−ナフチル）エステルなどが挙げられる。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、特定の酵素を用いることによって、一般式（２）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸類および一般式（３）で示される光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エステル類を、容易に効率よく製造することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例中、ラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルとは、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルと（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルとの等量混合物を示す。
【００４７】
実施例９
表３に示した市販酵素を表４に示した量、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え溶解させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して加え、４０℃に昇温し、攪拌した。表４に反応時間として示した時間後、反応液の一部を取って、ＨＰＬＣ〔カラム：スミキラル（登録商標）  ＯＡ−５０００、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（住化分析センター社製）〕にて分析し、生成した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸の光学純度および反応収率を求めた。（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸が過剰に得られた。結果を表４に示す。
【００５０】
【表３】
0004192331.tif 000005
【００５１】
【表４】
0004192331.tif 000006
【００５２】
参考例１
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の本酵素遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物は特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準じて作製した。即ち、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ遺伝子に部位特異的変異が導入された遺伝子を含むプラスミド ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ、 ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、 ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍおよびｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍを構築し、それぞれを大腸菌ＪＭ１０９株に導入することにより組換え微生物を作製した。
以下に、これら組換え微生物の作製方法に付いて記す。
【００５３】
１．変異プライマーの作製
アミノ酸置換Ａｓｎ４３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１８９Ｔｙｒ、Ｇｌｙ１８９ＰｈｅまたはＡｌａ３６３Ｔｅｒｍ（終始コドン）を導入するための変異プライマーとして、各アミノ酸に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（変異プライマーＮ４３Ｓ（配列番号１）、１６０Ｓ（配列番号２）、１８９Ｙ（配列番号３）、１８９Ｆ（配列番号４）、Ａ３６３Ｔｅｒｍ（配列番号５）、ＲＶ−Ｇ（配列番号６）、ＲＶ−Ｃ（配列番号７）、ＲＶ−Ｄ（配列番号８）、 ＭＹ−３（配列番号９）、ＭＹ−１（配列番号１０）、ＭＹ−２（配列番号１１））を合成した。これらの変異プライマーはアプライドバイオシステムズ社製ＤＮＡ合成機３９４型を用いて合成した後、同社製のオリゴヌクレオチド精製カートリッジにて精製した。
【００５４】
２．部位特異的変異の導入
変異エステラーゼを、 Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990） の方法に準じて作製した。
【００５５】
２−１）プラスミドｐＣＣＮ４３Ｓの作製
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＣ１０１（図１）を、特開平７−２１３２８０号公報の実施例１〜５記載の方法に準じて作製した。こうして得られたｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、変異プライマ−ＲＶ−Ｇ（配列番号６） （１００ｐｍｏｌ）、変異プライマーＮ４３Ｓ（配列番号１）（１００ｐｍｏｌ）およびGeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物（１９０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造株式会社製）カラムを使用して精製した。
続いて、同様にｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、変異プライマーＭＹ−３（配列番号９）（５０ｐｍｏｌ）および先に調製した１９０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PCR Reagentキットを用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造株式会社製）で電気泳動後、約３７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キット（バイオ１０１社製）を用いて精製した。
一方、ｐＣＣ１０１  ３μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に作製した変異の導入されたＮｄｅＩ-Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（２４０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、ｐＣＣＮ４３Ｓを作製した（図２）。
【００５６】
２−２)プラスミドｐＣＣ１６０Ｓの作製
プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡとし、変異プライマ−ＭＹ−１（配列番号１０）（１００ｐｍｏｌ）、変異プライマー１６０Ｓ（配列番号２）（１００ｐｍｏｌ）およびGeneAmp PCR Reagentキット（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物（２７０ｂｐＤＮＡ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２カラム（宝酒造株式会社製）を使用して精製した。
続いて、同様にプラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡとし、変異プライマーＲＶ−Ｃ（配列番号７）（５０ｐｍｏｌ）および先に調製した２７０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmp PCR Reagentキット（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造株式会社製）で電気泳動後、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キット（Ｂｉｏ１０１社製）を用いて精製した。
一方、プラスミドｐＣＣ１０１（３μｇ）を制限酵素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化後、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのＤＮＡ断片（４.２ｋｂｐ）と先に作製した変異の導入された約２４０ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、プラスミドｐＣＣ１６０Ｓを作製した。
【００５７】
２−３）プラスミドｐＣＣ１８９Ｙの作製
ｐＣＣ１６０Ｓの作製の場合に用いた変異プライマー１６０Ｓに替えて変異プライマー１８９Ｙ（配列番号３）を使用して、その他はプラスミドｐＣＣ１６０Ｓの作製の場合と同様にして、プラスミドｐＣＣ１８９Ｙを作製した。
【００５８】
２−４）プラスミドｐＣＣ１８９Ｆの作製
ｐＣＣ１６０Ｓの作製の場合に用いた変異プライマー１６０Ｓに替えて変異プライマー１８９Ｆ（配列番号４）を使用して、その他はプラスミドｐＣＣ１６０Ｓの作製の場合と同様にして、プラスミドｐＣＣ１８９Ｆを作製した。
【００５９】
２−５）ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍの作製
ｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、変異プライマ−ＭＹ−２（配列番号１１） （１００ｐｍｏｌ）、変異プライマーＡ３６３ｔｅｒｍ（配列番号５）（１００ｐｍｏｌ）およびGeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物（１５０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造株式会社製）カラムを使用して精製した。
続いて、同様にｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、変異プライマーＲＶ−Ｄ（配列番号５）（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１５０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PCR Reagentキットを用いてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造株式会社製）で電気泳動後、約２２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
一方、ｐＣＣ１０１  ３μｇをＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に作製した変異の導入されたＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（２２０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ（図３）を作製した。
【００６０】
３．多重変異の導入
３−１）ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの作製
2-1)で得られたｐＣＣＮ４３Ｓ １０μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化して３７０ｂｐの断片を得た。一方、2-5)で得られたｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ ３μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍのＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（４．２ＫｂＰ）と先に作製したＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（３７０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、多重変異型エステラーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを得た（図４）。
【００６１】
３−２）プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍの作製
2-2)で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ（１０μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して得られた０. ６ｋｂｐのＤＮＡ断片、2-3)で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１８９Ｙ（１０μｇ）をＦｓｐＩおよびＢｓｔＰＩで消化して得られた０.４ｋｂｐの断片および2-5)で得られたプラスミドｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ（３μｇ）を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られた３. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片の３種のＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、多重変異型エステラーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍを得た。
【００６２】
３−３）プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍの作製
2-2)で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１６０Ｓ（１０μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して得られた０. ６ｋｂｐのＤＮＡ断片、2-4)で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１８９Ｆ（１０μｇ）をＦｓｐＩおよびＢｓｔＰＩで消化して得られた０.４ｋｂｐの断片および2-5)で得られたプラスミドｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ（３μｇ）を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られた３. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片の３種のＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、多重変異型エステラーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍを得た。
【００６３】
４．形質転換体の作製
プラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍおよびｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍを、大腸菌ＪＭ１０９株にそれぞれ導入し、組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍおよびＪＭ１０９／ ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍを調製した。
【００６４】
参考例２
５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ及びリン酸一カリウム９ｇ、リン酸二カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加え、参考例１にて調製された組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの斜面培養から１白金耳接種し、３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ及びリン酸一カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５００ｍｌを仕込み、そこへ上記の三角フラスコで培養した培養液１５ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養し、対数増殖期中期（培養１０〜１５時間）にＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１ｍＭになるように添加した後、滅菌した培地を流加し、さらに培養を継続、計４０時間培養することにより、上記微生物培養物を得た。
【００６５】
参考例３〜６
参考例２と同様にして、 遺伝子組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍおよびＪＭ１０９／ ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍのそれぞれの微生物培養物を得た。
【００６６】
参考例７
参考例２と同様に培養して得られた組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの微生物培養物を遠心分離（１２０００×ｇ、３０分間、４℃）し湿菌体を得た。この湿菌体を超音波処理（２０ＫＨｚ、１５分間、４℃）した後、遠心分離（１２０００×ｇ、３０分間、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｆａｓｔｆｌｏｗ  ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。０.１５ＭＮａＣｌ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）でカラムを洗浄した後、０.１５ー０.３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。溶出画分の活性測定はエステラーゼの一般的な基質であるｐ-ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）を用いて行った。具体的には、溶出画分を含む１．０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）に、アセトニトリルに溶解した基質を５ｍＭになるように加え、３７℃で保温し、４１０ｎｍの吸光度の増加を測定した。エステラーゼ活性のある画分を集め、該画分を疎水性樹脂（ＢｕｔｙｌーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％(W/V)の（ＮＨ4）2ＳＯ4 ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）でカラムを洗浄した後、１０ー０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。エステラーゼ活性のある画分を集め、精製酵素を得た（以下、この精製エステラーゼをＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ と記す）。
【００６７】
参考例８〜１１
組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、 ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍおよびＪＭ１０９／ ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍの微生物培養物から参考例７と同様にしてそれぞれ精製酵素を得た（以下、これらの精製エステラーゼを １６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、１６０Ｓ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ、１６０Ｓ１８９ＦＡ３６３ｔｅｒｍおよびＡ３６３ｔｅｒｍと記す）。
【００６８】
参考例１２
アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来の本酵素遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物を特開平５−５６７８７号公報記載の方法に準じて作成した。
即ち、特開平５−５６７８７号公報の実施例記載の方法に準じてアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＧＥ−１を作製した。これを制限酵素ＮｓｐＶ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりエステラーゼの翻訳領域を切り出し、エステラーゼ遺伝子の開始コドンＧＴＧをＡＴＧに変換するために合成したＤＮＡ断片および、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）とライゲーションを行った。このようにして、ｐＵＣ１１８が保有するｌａｃプロモーターの下流にアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを構築した後、大腸菌ＪＭ１０５株に導入することにより組換え微生物を調製した。
【００６９】
参考例１３
５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ及びリン酸一カリウム９ｇ、リン酸二カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加え、参考例１２で示した方法で作製された組換え微生物の斜面培養から１白金耳接種し、３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ及びリン酸一カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５００ｍｌを仕込み、そこへ上記の三角フラスコで培養した培養液１５ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養を始め、対数増殖期中期（培養１０〜１５時間）にＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１ｍＭになるように添加した後、滅菌した培地を流加し、さらに培養を継続、計４０時間培養することにより、微生物培養物を得た。
【００７０】
参考例１４
バークホルデリア・セパシアＳＣ−２０株由来の本酵素遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物ＪＭ１０９／ｐＡＬ６１２株（ＦＥＲＭ−ＢＰ５７４０）を、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む１００ｍｌのＬＢ培地（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製）で、３７℃、１６時間培養した後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）することにより菌体を回収した。回収された菌体を、１０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理（１０分間）し、該処理物を遠心分離することにより粗酵素抽出液を得た。さらに得られた粗酵素抽出液を凍結乾燥することにより粗酵素粉末を得た。
【００７１】
実施例３７〜４１
参考例７〜１１で得られた精製酵素を、表５に示したように、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え懸濁させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して加え、４０℃に昇温し、攪拌した。表５に反応時間として示した時間後、反応液の一部を取って、実施例９と同様にして分析し、生成した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸の光学純度および反応収率を求めた。結果を表５に示す。
【００７２】
【表５】
0004192331.tif 000007
【００７５】
実施例４４
参考例８で得られたクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１由来の精製本酵素１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍ１０μｌを、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え懸濁させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して加え、４０℃に昇温し、攪拌した。８時間後、反応液を分液し、水層を実施例１〜８と同様にして分析し、生成した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸の光学純度および反応収率を求めた。また、有機層をＧＣ〔カラム：ＣＰ−シクロデキストリンβ−２，３，６−Ｍ−１９、０．２５ｍｍφ×５０ｍ，０．２５μｍ（クロムパック（CHROMPACK）社製）〕にて分析し、反応せずに残存した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルの光学純度および収率を求めた。その結果、（−）−（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸が光学純度６７．２％、収率５５．１％で得られ、（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルが光学純度８２．３％、収率４４．９％で得られた。
【００７６】
実施例４５
参考例７で得られたクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１由来の精製本酵素Ｎ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ ４０μｌを、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに加え懸濁させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル１０ｍｇをｎ−ヘキサン１ｍｌに溶解して加え、４０℃に昇温し、攪拌した。８時間後、反応液を分液し、実施例４４と同様にして生成した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸の光学純度および反応収率および反応せずに残存した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルの光学純度および収率を求めた。その結果、（−）−（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸が光学純度６８．７％、収率５８．７％で得られ、（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルが光学純度９７．６％、収率４１．３％で得られた。
【００７７】
実施例４６
参考例３で得られたクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１由来の本酵素遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物ＪＭ１０９／ ｐＣＣ１６０Ａ１８９ＹＡ３６３ｔｅｒｍの培養物を６．０ｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００ｍｌに加え懸濁させた。これにラセミの（１ＳＲ，５ＲＳ，６ＳＲ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチル４０．０ｇをｎ−ヘキサン４００ｍｌに溶解して加え、４０℃に昇温し、１０％ＮａＯＨを適宜加えてｐＨ７〜ｐＨ８に保持しながら、４０℃で４時間攪拌した。反応液に１２ＮのＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ４．２とし、セライトを用いてろ過後、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液を加えてｐＨ７．６として、トルエン４００ｍｌで４回抽出分液し、反応せずに残存した２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルを有機層側から取得した。実施例４４と同様にして光学純度および収率を求めた結果、（＋）−（１Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸エチルが光学純度１００％、収率２６．５％で得られた。
【００７８】
配列表フリーテキスト
配列番号１
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ａｓｎ４３Ｓｅｒを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１８９Ｔｙｒを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１８９Ｐｈｅを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼのＡｌａ３６３を終始コドンに変換するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ａｓｎ４３Ｓｅｒを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１８９ＴｙｒあるいはＧｌｙ１８９Ｐｈｅを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼのＡｌａ３６３を終始コドンに変換するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ａｓｎ４３Ｓｅｒを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼに部位特異的変異Ｇｌｙ１６０Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１８９ＴｙｒあるいはＧｌｙ１８９Ｐｈｅを導入するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の野生型エステラーゼのＡｌａ３６３を終始コドンに変換するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００７９】
【配列表】
0004192331.tif 000008
0004192331.tif 000009
0004192331.tif 000010
0004192331.tif 000011
0004192331.tif 000012
0004192331.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】  発現プラスミドｐＣＣ１０１の制限酵素地図を示す図である。図中白抜きは、Chromobacterium  SC-YM-1(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３)株由来のＤＮＡを、黒塗り部はChromobacterium  SC-YM-1(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３)株由来の本酵素（野生型）の翻訳領域を示す図である。
【図２】  組換えプラスミドｐＣＣＮ４３Ｓの構築工程を示す図である。
【図３】  組換えプラスミドｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍの構築工程を示す図である。
【図４】  組換えプラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの構築工程を示す図である。
【図１】
0004192331.tif 000017
【図２】
0004192331.tif 000018
【図３】
0004192331.tif 000019
【図４】
0004192331.tif 000020