(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長λの入射光により励起される蛍光色素で標識した試料を固定し、前記入射光の照射による前記蛍光色素からの蛍光を検出するための蛍光検出用支持体であって、
基材の表面に少なくとも１層からなる薄膜が形成されており、前記薄膜の光学的膜厚ｎｄ（ｎは屈折率、ｄは膜厚を表す）がλ／４の奇数倍±λ／１０の範囲であり、前記基材は前記薄膜より大きな屈折率を有することを特徴とする蛍光検出用支持体。
【請求項２】
前記薄膜は入射光の透過率が９０％以上であることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出用支持体。
【請求項３】
前記薄膜が、１層または多層の絶縁性被膜であることを特徴とする請求項１または２記載の蛍光検出用支持体。
【請求項４】
前記基材は入射光に対する反射率が８０％以上であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載の蛍光検出用支持体。
【請求項５】
前記基材が、シリコン、またはアルミニウム、クロム、および金からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の金属または半導体で形成されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の蛍光検出用支持体。
【請求項６】
前記基材の表面が溝構造を有することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項記載の蛍光検出用支持体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光標識した試料を検出するための、蛍光検出用支持体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体物質の高感度な検出技術が盛んに報告されつつあり、特に遺伝子のようなナノスケールの被検試料についての研究も可能になってきている。例えば、検出すべき遺伝子についての発現頻度を検出する手法として、核酸プローブアレイによる解析が行われている。核酸ハイブリダイゼーション反応による検出を行う支持体として、従来はナイロン膜を用いて、ＤＮＡの＋電荷を利用してプローブＤＮＡを基板上に固相化していた（特願平１０−３１１１６４号公報）。ハイブリダイゼーション反応後の検出は、化学発光やラジオアイソトープにて行っている。
【０００３】
近年は、マイクロアレイ技術により一定規格のスライドグラス（約７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を用いて、多種類のプローブＤＮＡを高密度に固相化する方法（特願平１１−１８９３６０号公報）と、フォトリソグラフィー技術により半導体基板にＤＮＡプローブを合成する方法とが知られている。これらのマイクロアレイ技術を用いることにより、ナイロン膜では１つのスポットが３ｍｍ〜５ｍｍであったが、ガラス基板では１００μｍ〜３００μｍの極微小なスポットが可能になっており、高密度化が図れる。またナイロン膜と異なり、ガラスやシリコン基板は蛍光が少ないためハイブリダイゼーション結果を蛍光検出により行うことが可能になっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように近年、ＤＮＡの解析においては多数の異なったＤＮＡプローブを、ガラスなどの固相基板上に１００μｍ〜３００μｍの極微小なスポットサイズで高密度に固定し、その上に標識ＤＮＡをハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出し、そのデータをコンピュータで大量解析している。しかしながら、これには次のような問題がある。
【０００５】
ガラスやシリコン基板においては、ナイロン膜と比較し、反応し得る表面積が少ないため、プローブＤＮＡ固相化量が少ない。一方、遺伝子の発現頻度などの測定においては、発現頻度の低い遺伝子は非常に弱い蛍光強度しか得られない。そのため、高精度の測定を行うためにはより高感度の検出が望ましいが、共焦点光学系と光電子倍増管を組み合わせた現技術では、限界に近い高感度化を計っても不十分な場合がある。また、従来マイクロアレイ用蛍光検出基板として市販されているガラス基板は、その感度を向上させるために特別な表面研磨処理等を施しているため、比較的高価である。
【０００６】
従って、本発明は、励起光の増強や光電子倍増管などの検出光学系を変えることなく、効率的な蛍光検出が可能であり、かつ低価格で製造できる支持体構造を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の蛍光検出用支持体は、波長λの入射光により励起される蛍光色素で標識した試料を固定し、前記入射光の照射により前記蛍光色素からの蛍光を検出するための蛍光検出用支持体であって、基材の表面に少なくとも１層からなる薄膜が形成されており、薄膜の光学的膜厚ｎｄ（ｎは屈折率、ｄは膜厚を表す）がλ／４の奇数倍±λ／１０の範囲であり、前記基材は前記薄膜より大きな屈折率を有することを特徴とする。
【０００８】
薄膜は、具体的には、１層または多層の絶縁性被膜であることが好ましい。
【０００９】
基材の屈折率は薄膜より大きくかつ入射光に対する反射率は８０％以上であることが好ましく、具体的には基材は、シリコン、アルミニウム、クロム、および金からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の金属または半導体で形成されることが好ましい。また、基材の表面は溝構造を有していてもよい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、蛍光標識した試料を多層膜構造の支持体上に固定し、蛍光検出を行うと、特定の膜厚において蛍光強度が増強されることを見出した。その理由は明確でないが、入射光と膜厚の関係を見ると反射光強度が最低の条件で高い蛍光強度を示すことが明らかとなった。本発明はこの知見に基づく。
【００１１】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明するが、これらは本発明を限定するものではなく、本発明の主旨に沿って、種々の置換、付加等の変更ができる。
【００１２】
図１は、本発明の支持体の一実施の形態を示した模式図（図１ａ）、およびその支持体を用いて蛍光励起を行った場合の原理図（図１ｂ）を示す。図１ａは、基材１に薄膜２が形成され、その上に蛍光色素で標識した試料３が固定されている様子を示している。
【００１３】
ここで、上述したように、反射強度が最低の条件では高い蛍光強度が得られることが分かっているが、その原理は次のようであると考えられる。図１ｂは、図１ａの支持体に励起光を照射し、蛍光の励起を行った様子を示している。蛍光の励起光（入射光４）を支持体に入射すると、入射光４の波長λに対し膜厚ｄと屈折率ｎの積がλ／４の奇数倍に相当する条件では、基材１の表面と薄膜２の表面の間で多重反射５が起きていると想定される。このとき、入射光４は薄膜２内に閉じ込められ、かつ干渉作用により互いに強め合い、試料３に照射される。従って、支持体において反射された入射光４が効率的に利用され、より高強度の蛍光６が得られるものと想定される。即ち、同一の検出光学系を使っても、高感化が期待できる。
【００１４】
本発明の支持体の寸法は特に制限は無いが、例えばストリップ状の支持体であれば、その汎用性から、一定規格のスライドグラス（約７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）の寸法であることが好ましい。
【００１５】
本発明の支持体を構成する薄膜は、蛍光物質から放出された蛍光のクエンチングを防止するために絶縁性被膜を用いることが好ましい。薄膜の入射光の透過率は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。具体的な例としては、シリコン酸化膜、酸化アルミ等を用いることが可能であり、また、透明性が高く、蛍光を発しないものであればプラスチック薄膜を用いることもできるが、これらに限定されない。薄膜は、通常の薄膜の形成に用いられる方法により形成され、例えば熱酸化により形成される。膜厚は、反射光強度が最低の条件となるように調整する。即ち、薄膜の光学的膜厚ｎｄ（ｎは素材の屈折率、ｄは薄膜の厚さである）が、入射光λに対しλ／４の奇数倍±λ／１０の範囲となるように調整する。また、膜厚は１ｍｍ以下であることが好ましい。
【００１６】
薄膜は、基材の表面の少なくとも一部に形成され、全表面に形成されても良い。例えば、本発明の支持体をＤＮＡアレイに使用しようとする場合は、ＤＮＡプローブが固相される部分に局部的に形成されても良い。厳密には表面に固定した固定対象物も光学的膜厚に含めて考慮することが好ましいが、現実的には膜厚制御が困難であり、また、固定対象物（ＤＮＡプローブ）の厚さは高々数十ｎｍ程度であるので、膜厚範囲の許容範囲としてみなすことができる。ここで、固定対象物としてＤＮＡプローブを例として示したが、本発明の支持体に使用できる固定対象物は、蛍光標識ができるものであれば特に限定されず、例えば遺伝子を含む核酸、抗原、抗体、酵素を含むタンパク質、アレルゲン、ホルモンを含む生理活性物質、または細胞等を用いることができる。なお、固定する対象物がＤＮＡ等の核酸以外であっても、ある程度の光透過性を有している限り、任意の厚さおよび密度でもって固定対象物を固定化することができる。
【００１７】
さらに、本発明の応用例として、光学的膜厚ｎｄ（屈折率と膜厚の積）が入射光の波長λに対しλ／４の奇数倍±λ／１０の範囲にあるような複数の異なる膜厚部分を設けた１以上の支持体を用いれば、膜厚毎に異なる固定対象物を固定化したり、膜厚毎に異なる反応用試薬および／または被検試料と反応させることにより、多項目の検査を高い処理能力で検査できる可能性がある。
【００１８】
本発明の支持体を構成する基材としては、薄膜を形成する表面において入射光を反射するものであれば、任意の材質のものを使用することができる。また、光吸収特性を有するものでも本質的には本発明に適用できる。場合によっては透過光を利用できるように光透過性を有するものであってもよいが、光反射性である方が、上述したように基材上の薄膜中で多重反射が起こって蛍光強度を増強できるので好ましい。即ち、基材表面における入射光の反射率が、８０％以上であることが好ましく、反射率の高いものを使用することがより好ましい。具体的な例としては、シリコンなどの表面研磨半導体、またはアルミニウム、クロム、金などの表面研磨金属基材を用いることが可能であるが、これらに限定されない。
【００１９】
なお、本発明の支持体の薄膜および基材は１層に限定されることなく、反射率が最低となる、即ち、薄膜の光学的膜厚ｎｄが入射光の波長λに対しλ／４の奇数倍±λ／１０の範囲にあるという条件を満たせば、多層構造でも良い。
【００２０】
本発明の支持体の形状は、固定対象物を表面に固定化して蛍光検出を行うために使用可能な形状であれば、屈折率が薄膜より大きいという条件以外特に限定されない。支持体の表面は平坦である必要はなく、例えば図２に示すように溝形状でも良いし、逆に凸構造でも良い。図２に示すような溝構造では、その上部をカバーで覆うことにより、流路構造にして用いることも可能である。また、支持体の表面は曲面を有していても良く、断面が円形または楕円形であるような内壁を有する流路を形成してもよい。さらに、支持体は球形または多面体などの粒子状のものでもよい。この場合には、１以上の粒子状の支持体を液体中で懸濁させたり、沈降させたりして粒子の運動状態を加味した各種検出（例えば、粒子凝集分析法、蛍光相関分光法等）も可能となる上に、均質な混合液を得ることができる。また、支持体が棒状、糸状、繊維状、テープ状、ストリップ状の場合には、その外壁または端面に固定対象物を固定化することができる。
【００２１】
以上のような構成とすることにより、入射光が有効に利用され、高感度に蛍光を検出できるので、本発明の支持体は、ＤＮＡプローブアレイなどの微量の試料の検出に有効に利用されることができる。さらに、基材および薄膜に用いる素材の選択により、従来使用されているマイクロアレイ用スライドガラスよりも高感度な蛍光検出用支持体が、はるかに低価格で製造することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
＜実施例１＞
図３は、シリコン基板（屈折率：ｎ＝４．０９，ｋ＝０．０４）の表面に種々の膜厚のシリコン酸化膜を形成し、これに波長５４３ｎｍの入射光を入射角９０度で照射した場合の反射率を、計算により求めたものである。縦軸は反射率を、横軸はシリコン酸化膜の膜厚を表す。ここで、入射光の波長を５４３ｎｍとしたのは、以下の実施例で蛍光測定に用いた装置の励起光の波長を用いたためである。この結果は計算結果であるが、実際の反射率測定結果も同様の結果を示した。この結果より、シリコン酸化膜の屈折率ｎ：１．４６と膜厚ｄの積ｎｄがおおよそ入射光の波長λのλ／４の奇数倍のときで、基板の屈折率が薄膜より大きい条件で、反射率が最低となっていることが分かった。これは、無反射コーティングの条件ｎｄ＝λ／４と類似の条件である。このことから、シリコン基板上に形成したシリコン酸化膜が入射光に対し選択吸収膜の様に機能していることが分かる。
【００２４】
＜実施例２＞
平坦面からなる表面研磨したシリコン基板（直径４インチ、厚さ０．５ｍｍ、（１００）面の単結晶シリコン製（（株）セミテック））上に、シリコン酸化膜をそれぞれ１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、４８０ｎｍの厚さで形成したＤＮＡプローブ固相用基板を準備した。酸化膜は、シリコン基板の表面をＲＣＡ洗浄した後、酸化炉で所定の膜厚になるように形成した。ここで、ＲＣＡ洗浄は、過酸化水素：塩酸：純水＝１：１：６の混合液で８０℃、１０分ボイル後、過酸化水素：アンモニア水：純水＝１：１：６の混合液で８０℃、１０分ボイルしてから純水で流水洗浄することにより行った。また、比較のため市販のスライドガラス（白ガラス）とマイクロアレイ用スライドガラス（ＭＡ）を準備した。これらの基板に以下に示す手順でＤＮＡプローブを固相し、ハイブリダイゼーション反応後、蛍光観察を行った。
【００２５】
スライドの前処理法としては、一般的にはガラス基板をアルカリや酸などで洗浄を行う。その後、プローブＤＮＡ固相に必要な処理を行う。本実験では、シリコン酸化膜の厚さが変化するのを防ぐため弱アルカリと過酸化水素の混合液で洗浄を行った。表面はγ−アミノプロピルトリエトキシシランの１％希釈溶液を用いてシラン処理を行い、アミノ基を形成した。これを純水ですすぎ、乾燥後、ピンタイプアレイヤーであるＳＰＢＩＯ（（株）日立ソフトウェアエンジニアリング製）を用いてプローブＤＮＡの点着を行った。プローブ溶液には両側にアミノ基と結合するサイトを有するリンカー分子を混合し、このリンカー分子により基板表面のアミノ基とＤＮＡプローブ末端のアミノ基を共有結合で固定する。基板側に固定化するプローブＤＮＡは、５’ＮＨ化−ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ３’（３０ｍｅｒ）の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブである。スライド作製後、プローブＤＮＡに対して相補的配列（５’  ＡＧＧ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ３’）を有するオリゴヌクレオチドに５’末端蛍光標識を行ったものをターゲットＤＮＡとしてハイブリダイゼーション反応を行った。今回用いた蛍光色素はＣｙ３で、波長５３５ｎｍの励起光で、５６０ｎｍの蛍光を発する色素である。ハイブリダイゼーション反応後のスライドを、１×ＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）で洗浄し、蛍光検出器ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００（ＧＳＩ  ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）を用いて検出した。但し、蛍光検出器ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００は装置構成上、波長５４３ｎｍの励起光を用いた。各膜厚の基板について２枚ずつ実験を行い、各基板の蛍光強度を求めた。蛍光強度は、６４スポットの平均値である。観察結果の実測値を表１に示した。また、図４は、縦軸に蛍光強度を取り、表１の結果をグラフに表したものである。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
シリコン酸化膜を１００ｎｍから４８０ｎｍまで変化させると、図に示すように周期的な強度変化を示した。また、蛍光強度の最大値は市販の白ガラスやマイクロアレイ用スライドガラスに比べ数倍の強度であった。この結果と図３を比較するとほぼ同様の周期的変化が認められ、すなわち励起光の反射率が低くなるほど高い蛍光強度が得られることが明らかになった。これは、反射率が低い条件で励起光を用いると、図１ｂに示した原理により効率的に蛍光色素を励起できるためと思われる。
【００２８】
＜実施例３＞
次に、実施例２による検出結果に関して更に詳細な検討を行うため、シリコン酸化膜の厚さを細かく変化させ、６０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１４０ｎｍとしたＤＮＡプローブ固相用基板で実験を行った。他の実験条件は実施例２に記載の条件と同一である。その結果を図５に示す。蛍光強度は８０ｎｍの膜厚で最大となった。図３の反射率の測定においては約９０ｎｍに極小値を示しており、多少のずれはあるものの、図４と同様の傾向を示したことから、反射率と蛍光強度は同様の周期で変化すると考えられる。
【００２９】
これらの実験結果から蛍光観察用支持体を多層膜構造にして励起光の反射率を最小にするような薄膜を形成することにより、より高感度の蛍光観察が可能であることが分かった。
【００３０】
上記実施例１ないし３の結果から計算すると、シリコン酸化膜とシリコン基板構造においては、反射率が約３０％以下であれば市販の白ガラスやマイクロアレイ用スライドガラスに比べて高い蛍光強度が観察され、それ以上の反射率では逆に市販のものよりも悪い結果が得られた。この結果を一般的な構造に適用すると光学的膜厚ｎｄがλ／４の奇数倍±λ／１０以内とすることにより、市販の白ガラスやマイクロアレイ用スライドガラスに比べ良好な結果が得られることが分かった。
【００３１】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、励起光の増強や光電子倍増管などの検出光学系を変えることなく、効率的な蛍光検出が可能であり、かつ低価格で製造できる支持体構造が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の支持体の一実施の形態を示した模式図（ａ）、およびその支持体を用いて蛍光励起を行った場合の原理図（ｂ）。
【図２】本発明の蛍光検出用支持体の表面に溝構造を有する場合の支持体の構成図。
【図３】シリコン基板上にシリコン酸化物膜を形成したときの単層膜の反射率を表すグラフ。
【図４】シリコン基板上に種々の膜厚のシリコン酸化物膜を形成した支持体上の蛍光標識物質に励起光を照射した場合の蛍光強度を表すグラフ。
【図５】シリコン基板上に種々の膜厚のシリコン酸化物膜を形成した支持体上の蛍光標識物質に励起光を照射した場合の蛍光強度を表すグラフ。
【符号の説明】
１…基材
２…薄膜
３…試料
４…励起光
５…多重反射
６…放射光
【図１】
0004121762.tif 000003
【図２】
0004121762.tif 000004
【図３】
0004121762.tif 000005
【図４】
0004121762.tif 000006
【図５】
0004121762.tif 000007