(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料におけるリウマチ性関節炎特有の自己抗体をインビトロで検出するための方法であって、少なくとも以下の工程を含むことを特徴とする方法：
−  上記生物試料を、以下のｉ）〜iv）の水溶性の抗原のうちの少なくとも一つに接触させて、該試料中に存在する可能性のあるリウマチ性関節炎に特異的な自己抗体との免疫複合体が形成されるようにする工程、
ｉ）等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、ラットの食道上皮から抽出された蛋白質抗原組成物より分離される、見掛平均分子量が約２１０ｋＤであり且つｐＨｉ値が約５．８５から６．８５まで変化する蛋白フラクションからなる抗原蛋白質、
ii）等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、ラットの食道上皮から抽出された蛋白質抗原組成物より分離される、見掛平均分子量が約９０ｋＤと約１３０ｋＤとの間にあり且つｐＨｉ値が５．８５から７．３５まで変化する蛋白フラクションからなる抗原蛋白質、
iii）等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、ラットの食道上皮から抽出された蛋白質抗原組成物より分離される、見掛平均分子量が約１２０ｋＤから約６７ｋＤまで変化する一方、ｐＨｉ値が５から７．５まで変化する蛋白フラクションからなる抗原蛋白質、
iv）ヒト表皮から抽出された水溶性の蛋白質抗原であって、等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、見掛平均分子量が約４０ｋＤであり、且つ約５．８と７．４の間のｐＨｉ値を有するもの、
−該免疫複合体の存在がリウマチ性関節炎を示すものとして、前記生物試料中における該免疫複合体の存在を検出する工程。
【請求項２】
以下のものを含むことを特徴とする、生物試料からリウマチ性関節炎のインビトロ診断をするための診断キット：
−  以下のｉ）〜iv）の水溶性の抗原のうちの少なくとも一つと、
ｉ）等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、ラットの食道上皮から抽出された蛋白質抗原組成物より分離される、見掛平均分子量が約２１０ｋＤであり且つｐＨｉ値が約５．８５から６．８５まで変化する蛋白フラクションからなる抗原蛋白質、
ii）等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、ラットの食道上皮から抽出された蛋白質抗原組成物より分離される、見掛平均分子量が約９０ｋＤと約１３０ｋＤとの間にあり且つｐＨｉ値が５．８５から７．３５まで変化する蛋白フラクションからなる抗原蛋白質、
iii）等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、ラットの食道上皮から抽出された蛋白質抗原組成物より分離される、見掛平均分子量が約１２０ｋＤから約６７ｋＤまで変化する一方、ｐＨｉ値が５から７．５まで変化する蛋白フラクションからなる抗原蛋白質、
iv）ヒト表皮から抽出された水溶性の蛋白質抗原であって、等電点電気泳動による二次元電気泳動に続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いた電気泳動により、見掛平均分子量が約４０ｋＤであり、且つ約５．８と７．４の間のｐＨｉ値を有するもの、
−  免疫反応のための媒体を調製するための試薬と、
−  形成される免疫複合体の存在がリウマチ性関節炎を示すものとして、該免疫複合体を検出することの出来る少なくとも１つの試薬。
【発明の詳細な説明】
本発明は、リウマチ性関節炎（以下、ＲＡと略称する）の診断及び治療に関連した人間（ヒト）のフィラグリン（filaggrin）及び抗原の使用に関するものである。
ＲＡは、最もよく知られた慢性の炎症性リウマチ病である。このリウマチ病に開発国の人口の約２％が冒されている。
ＲＡは進行性があり、患部の機能を喪失させ、その初期段階における診断が困難であり、また特別な治療を要するものである。リウマチ病診断医は、臨床において発見される兆候及び放射線により認められる兆候以外には、一般的な生物学的試験に、ＲＡの診断を頼らざるを得ないのが現状である。そして、その最も広く使用されているものに、ワーラー・ローズ反応（Ｒose-Ｗaaler Ｔest）やラテックス・テストが知られており、これらの方法で、ＲＡの１０例中、７例においてリウマチ因子が検出される。しかしながら、これらの試験方法の精度は非常に低く、他の自己免疫病の多くの場合にも、更にに健康な個体においても、リウマチ因子が検出されてしまう。
ＲＡ、紅斑性狼瘡、強皮症及び多発性筋炎等の自己免疫疾患の一般的な兆候は、細胞様生体構成分に対する自己抗体の存在である。これらの疾患において、多くのタイプの自己抗体が認められているが、特にＲＡ患者に特異的に存在し、食道上皮抗原と反応する自己抗体のタイプが、Ｂ．Ｊ．Ｊ．Ｙｏｕｎｇ等によって、Ｂr．Ｍed．Ｊ．２：９７〜９９において、１９７９年に初めて記述された。それらの自己抗体は、当時、抗ケラチン抗体（antikeratin antibodies）と称された。それらの自己抗体は、サイトケラチン（cytokeratin）向けとして、今日迄、一般的に認められている。
これらのＲＡに特異的に有効な自己抗体は、現在、ラットの食道の横行クリオセクション（transverse cryosection）上での間接免疫蛍光検査法（ＩＩＦ）により検出・滴定されている。
しかしながら、ＩＩＦ法は、ＲＡの日常的な診断に、その適用が限られるという欠点を有している。特に、この方法は、組織クリオセクションを使用する必要があり、そのために時間的ロスを生じたり、専門家の関与の必要があり、特に組織学に精通した人以外には、診断結果の分析及び信頼性の高い判断ができないという問題が有る。
従って、ＲＡに有効な自己抗体によって認識される精製抗原製剤を得て、それを通常の免疫化学診断技術において利用可能にする事が、特に望まれている。
Ｇ．Ｓｅｒｒｅ等は、Ｒｅｖ．Ｒｈｕｍ．５３（１１）：６０７−６１４（１９８６）において、それらの自己抗体によって特定される抗原が、哺乳類の或る種の角質化したマルピギー上皮（粘液上皮）に特徴的である事を証明した。この抗原は、これらの上皮の角質層に主として存在し、例えば、人間の表皮に認められる。
しかし、現在に至るまで、そのような抗原の正確な同定や精製（純粋化）は成功していない。
本発明者等は、表皮及びマルピギー上皮の変異・分化の分野における研究、特に新規な変異抗原を特定するための単クローン性（モノクローナル）抗体の製造に関する研究及びこれらの抗原に対する人間の自己抗体の研究により、ラットの食道の抗角質層（anti-stratum corneum）抗体は信頼できる自己抗体であり、これらはサイトケラチン（cytokeratin）の認識はしないが、特に鼠の食道の上皮や人間の表皮に存在する他の抗原の認識をするものであることを明らかにすることが出来た。
本発明者等の更なる研究により、ラットの食道上皮や人間の表皮から、ＲＡ患者に存在する自己抗体により特異的に認識される抗原決定因基を持つ抗原を抽出することが可能となり、また、これらの抗原の精製及び生化学的同定化が可能となった。
本発明の目的は、次に述べる特性を備えた抗原を得ることにある：
−  ヒトの表皮またはラットの食道上皮から抽出可能であること、
−  自然蛋白質（protein in nature）であること、
−  ヌクレアーゼによる処理によって、その免疫反応性が変化しないこと、
−  エタノールによる処理によって、その免疫反応性が変化しないこと、
−  トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による処理によって、その免疫反応性が変化しないこと、
−  水溶性であること、
−  ＲＡ患者に存在する自己抗体によって特異的に認識されること。
ＲＡ患者に存在する自己抗体によって特異的に認識される第一の抗原をヒトの表皮から抽出した。
この抗原は、特に下記の特性を有する。
−  自然状態におけるポリアクリルアミド・ゲルの電気泳動法（ＰＡＧＥ）により、基準標本（分子量が約８０〜４００ｋＤである球状蛋白質）と同様の泳動（migration）挙動を有する複数の抗原蛋白質に分離する。最も免疫反応性の高い蛋白質の分子量は約８０〜１２０ｋＤの範囲にある。
−  等電点電気泳動（ＩＥＦ：isoelectric focusing；焦点電気泳動）により、その等電点（ｐＨｉ）が５．８〜７．４の範囲で変化する複数の抗原蛋白質に分離する。
−  ＩＥＦ型二次元電気泳動の後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下におけるＰＡＧＥ泳動により、見掛けの平均分子量（apparent average molecular weight）が約４０ｋＤで、ｐＨｉが５．８〜７．４の範囲にある１つの抗原蛋白質になる。
本発明者等は、また、上記抗原がヒトのフィラグリンと共通の免疫特性及び生化学的特性を有しており、プロフィラグリン（profilaggrin：フィラグリンの先駆物質）の蛋白分解フラグメント（fragment）に対応するものであることを知見した。
この知見に基づき、本発明者等は、フィラグリン及びヒトのプロフィラグリンのＲＡに対する自己抗体との免疫反応性の試験を行なった結果、上記本発明の抗原と同様の反応性を示すことが、判明した。
フィラグリンは、上皮のケラチン化において異なる複数の種が認められている蛋白質の一族である。それらの蛋白質種は、ヒスチジンが豊富な、塩基性の蛋白質であり、先駆物質であるプロフィラグリンの脱燐化及び蛋白質分解により得られ、その熟成中に塩基性アルギニン残基が中性のシトルリン残基に変換される。この熟成現象がフィラグリン製剤の同質性の欠如の一因となっており、フィラグリン製剤は分子量が同じでも、等電性が異なる幾つかの形態を採っているのである。
フィラグリンの先駆物質であるプロフィラグリンは、フィラグリンのドメインの連続したものから本質的に成り、フィラグリンとプロフィラグリンの分子間には緊密な免疫学上の関係がある。フィラグリンに関する文献として、ＤＡＬＥ等の「Cellular and Molecular Biology of Intermediates Filaments」、ｐｐ．３９３−４１２、ＧＯＬＤＭＡＮ及びＳＴＥＩＷＥＲＴ  ｅｄｓ．Plenum Press（１９９０）がある。
プロフィラグリンとフィラグリンとは、イオン力の大きな緩衝剤の作用によって尿素の存在下において、表皮から抽出される。但し、フィラグリンは、精製時、イオン力の小さい中性ｐＨの緩衝剤に部分的に溶解する。
ヒト・フィラグリンと、クラスＧの抗角質層（anti- stratum corneum）自己抗体により認識される“抗ケラチン”と称される自己抗体との類似性は、今日まで示唆されていない。二、三の著者が、フィラグリン又はプロフィラグリンと核周囲因子（リウマチ性関節炎の免疫化学的マーカー）との間に共局在（colocalization）という関係が有ることを示唆しているが、核周囲因子は：フィラグリンとは異なるとの結論に達している〔ＨＯＥＴ等、Clin. Exp. Immunol．８４．５９−６５（１９９１）〕。
本発明者等は、ラットの食道上皮から、ＲＡ患者に存在する自己抗体により特異的に認識される第二の抗原を抽出した。
この第二の抗原は、下記の特性を有している。
−  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、次の２つの抗原蛋白質に分離する。
・  見掛上の平均分子量が約２１０ｋＤである第一の蛋白質
・  見掛上の平均分子量が約９０ｋＤ〜１３０ｋＤである第二の蛋白質
−  自然状態におけるＰＡＧＥ電気泳動により、次の３つの抗原蛋白質に分離する：
・  分子量が約４４０ｋＤである馬の脾臓フェリチン（鉄蛋白質）と同様の泳動挙動を示す第一の蛋白質
・  分子量が約２３２ｋＤである雄牛の肝臓カタラーゼと同様の泳動挙動を示す第二の蛋白質
・  分子量がそれぞれ約１４０ｋＤと約６７ｋＤである雄牛の心臓乳酸デヒドロゲナーゼ（乳酸脱水素酵素）と牛の血清蛋白との中間の泳動挙動を示す第三の蛋白質
−  ＩＥＦ型二次元電気泳動に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動により、次の３つの抗原蛋白質に分離する：
・  見掛上の平均分子量が約２１０ｋＤであり、ｐＨｉ値が約５．８５〜約６．８５の範囲である第一の蛋白質
・  見掛上の平均分子量が約９０ｋＤ〜約１３０ｋＤの範囲であり、ｐＨｉ値が約５．８５から約７．３５の範囲である第二の蛋白質
・  見掛上の平均分子量が約１２０ｋＤ〜約６７ｋＤの範囲であり、ｐＨｉ値が約５〜約７．５の範囲である第三の蛋白質
−  ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を順次行なうことにより、本第二の抗原は、それぞれ相対疎水性が異なる次の２つの抗原蛋白質の分屑（fraction）に分離する：
・  見掛上の平均分子量が約２１０ｋＤである蛋白質と約９０ｋＤ〜約１３０ｋＤの範囲である蛋白質とを含む、疎水性が比較的高い蛋白分屑
・  見掛上の平均分子量が約１２０ｋＤ〜約６７ｋＤの範囲である蛋白質を含む、疎水性が比較的低い蛋白分屑。
本発明者等は、更に、次の観察結果を得た。
−  ラットの食道の抗原は、ヒトのフィラグリン（及び当然ながらプロフィラグリン）及びラットの表皮から抽出したフィラグリンと免疫学的交叉反応（cross-reaction）を示すが、これらの交叉反応は、同一のエピトープ（epitope）に関わるものではない。事実、ラットの表皮から抽出したフィラグリンは、ＲＡに有効な自己抗体により認識されるものではない。即ち、これらの自己抗体により認識されるエピトープは、ラットの食道上皮の抗原とラットの表皮フィラグリンとの間の交叉反応に関わるものではない。このことは、ラットの食道上皮抗原とヒト・フィラグリンとの間の交叉反応とは状況が異なる。即ち、後者の交叉反応は、ＲＡに有効な自己抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部に関与するものである。このＲＡに有効な自己抗体により認識されるエピトープは、ヒト・フィラグリンのエピトープの内の一部であることを確認すべきである。例えば、ヒト・フィラグリンを認識する単クローン性抗体ＡＫＨ１〔ＤＡＬＥら、Ｊ．Invest.Dermatol ８８、３０６−３１３（１９８７）〕は、ラットの食道上皮抗原を認識するものではない。しかも、抗体ＡＫＨ１が人間の表皮のクリオセクションの間接免疫蛍光検査に使用される場合には、ＲＡに有効な抗角質層（anti-stratum corneum）自己抗体が使用される場合と、観察される標識が異なる。
−  人間の表皮抗原は、フィラグリン及びヒト・プロフィラグリンと交叉反応を示すが、この交叉反応には、ＲＡに有効な自己抗体により認識されるエピトープ及び単クローン性抗体ＡＫＨ１により認識されるエピトープ等の、その他のエピトープが関与する。
人間の表皮及びラットの食道の抗原を構成する上記蛋白分屑は、全てＲＡ患者に存在する自己抗体により精製され、試験されている。これらの蛋白分屑は、それらが得られる抗原の免疫学的特性と均等な個々の特性を有していると思われる。
本発明は、人間の表皮の抗原分屑、ラットの食道の抗原分屑、それらの抗原やそれらのフラグメント（fragment）から得られるペプチド・フラグメント、フィラグリンやヒト・プロフィラグリン及びそれらの分屑から得られ、ＲＡに有効な自己抗体により特異的に認識されるエピトープを持つペプチド・フラグメントをも、その範囲に含むものである。本発明において使用される“分屑”なる用語は、ＲＡに有効な抗角質層自己抗体により認識され、上記の抗原の何れかから適当な分別方法（電気泳動法、クロマトグラフィー、等電点電気泳動等）により得られる全ての抗原製剤を意味するものであり、フィラグリンやヒト・プロフィラグリンの製剤から得られる分屑、更には、人間の表皮及びラットの食道上皮細胞の水溶性抗原から得られる上記の分屑をも、その範囲に含むものである。
従って、本発明は、ラットの食道上皮から抽出した抗原から、ＩＥＦ型二次元電気泳動及びそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動により得られる３つの蛋白質にも関わるものである。
これらの３つの蛋白質は、ラットの食道上皮から抽出された抗原より、ゲル濾過、疎水的相互作用クロマトグラフィー及び非自然状態下での電気泳動を順次行なうことにより得られる蛋白分屑としても、得られた。
第一の蛋白分屑は約２１０ｋＤの見掛平均分子量を有し、そのｐＨｉ値は５．８５〜６．８５の範囲で変化するものである。第二の蛋白分屑は、約９０ｋＤ〜約１３０ｋＤの範囲の見掛平均分子量を有し、そのｐＨｉ値は約５．８５〜約７．３５の範囲で変化するものである。また、第三の蛋白分屑は、約６７ｋＤ〜約１２０ｋＤの範囲の見掛平均分子量を有し、そのｐＨｉ値は約５〜約７．５の範囲で変化するものである。
本発明は、また、人間の表皮から抽出した抗原から、ＩＥＦ型二次元電気泳動及びそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動により得られる蛋白質にも係わるものである。この蛋白質は、約４０ｋＤの分子量を有し、そのｐＨｉ値は約５．８〜約７．４の範囲で変化するものである。
本発明において使用されるペプチド・フラグメントなる用語は、次のものを意味するものである。
−  例えば、トリプシン、キモトプリシン、パパイン、プロテアーゼＶ８等のプロテアーゼの作用によって惹起された抗原蛋白質の蛋白質分解により得られるペプチド・フラグメント、及び組織から抽出されて、抗原蛋白質の自然熟成により得られる蛋白質分解フラグメント、
−  上記抗原の１つのもののシーケンス（配列）から得られる少なくとも５つのアミノ酸の抗原ペプチド；この中には、特に、合成ペプチド、及び遺伝子工学により得られ、抗ＲＡ自己抗体により認識されるエピトープを有する抗原フラグメントのシーケンスを構成するペプチドが含まれる。
これらの抗原ペプチドの取得方法に関わらず、所望の１つ又は複数のエピトープを有する抗原ペプチドは、ＲＡに有効な自己抗体に対する反応性に基づいて選択される。
それらのペプチドは、例えば、公知の〔ＧＡＮ等の出版物、Biochem．２９、９４３２−９４４０（１９９０）参照〕ヒト・プロフィラグリンのシーケンスのフラグメントから得ることができる。
本発明は、また、ＲＡに有効な自己抗体により認識され、本発明の抗原（蛋白質、蛋白分屑、ペプチド・フラグメント）及び／又はヒト・プロフィラグリン又はフィラグリンと免疫学的交叉反応（この反応は、上記自己抗体により認識される抗原決定基に関与する）する抗原の製剤（preparation）にも係わるものである。
上記抗原は、マルピギー上皮や、場合に依っては、哺乳類（ヒト及びラットの種を含む）の関節組織、更にこれらの組織の細胞の培養体から、特に得ることができる。
故に、本発明者等の研究は、ＲＡに有効なクラスＧ自己抗体により認識される新規な水溶性抗原の生産、及びそのような自己抗体のヒト・フィラグリンとの特異な反応の観察にも、及ぶものである。
上記分野の研究は、ＲＡの診断に直接に適用されるものであり、従って本発明は、次のことにも係わるものである。
−  ＲＡ患者の生物試料中に自己抗体が存在するか否かの診断をするために使用される、次の群から選ばれる少なくとも１つの抗原を含むことを特徴とする抗原物質；
・  ラットの食道上皮から抽出される抗原
・  ヒトの表皮から抽出される抗原
・  先に定義した、上記抗原の分屑又はペプチド・フラグメント
−  フィラグリン、プロフィラグリン、又はそれらの分屑又はフラグメントを、ＲＡのインビトロ診断（in vitro diagnosis）のために使用すること、特にＲＡ患者の生物試料中に自己抗体が存在するか否かの診断をするために使用される抗原物質を調製すること。
これらの抗原物質を使用することによって、本発明に従う抗原（蛋白質、蛋白分屑及びペプチド・フラグメント）とＲＡ患者の血清等の生物試料に存在する自己抗体との間において、抗原−抗体複合体が形成される。
本発明の主題は、生体液中においてＲＡに有効なクラスＧ自己抗体を検出する方法で、該生体液を、下記の群から選ばれる少なくとも１つの抗原と接触せしめる少なくとも１つの工程を含み、この生体液と抗原との接触が、ＲＡに有効な自己抗体が生体液中に存在すれば、それにより抗原−抗体複合体が形成され得る条件下で行なわれることを特徴とするものである。
−  人間のフィラグリン及びプロフィラグリン
−  前述の如くラットの食道上皮細胞から抽出される抗原
−  前述の如くヒトの表皮から抽出される抗原
−  上記抗原から得られる分屑又はペプチド・フラグメント
抗原は、必要に応じて、標識されたり、担体分子と抱合される。
上記工程後、形成された免疫複合体（免疫性コンプレックス）の生体液中における検出が、公知の物理的又は化学的方法で行なわれる。
上記診断を、下記のものを使用して、実施してもよい。
−  本発明に従う少なくとも１つの、必要に応じて標識された抗原（蛋白質、それらの分屑又はフラグメント）、又はこの抗原又は蛋白質と担体分子との抱合体
−  生物試料に自己抗体が存在すれば、それと免疫反応する媒体を構成するための試剤
−  形成された免疫複合体を検出するための１つ又は複数の試剤又は試薬
―  必要に応じて、１つ又は複数の陰性血清及び１つ又は複数の陽性血清等の基準試料。
本発明の好ましい実施例に従う方法において、ＲＡに有効なクラスＧ抗角質層自己抗体を検出するための免疫移動（immnotransfer）試験法が開発された。
鼠の食道上皮抗原抽出物を使用して、免疫反応域の決定精度及び診断精度を向上するために、免疫移動試験手順を適正化し、リウマチ疾患の血清の多くの試料から、診断的見地から、抗原蛋白質の分離（自然状態下又は非自然状態下における電気泳動）若しくは分析された血清の希釈により、３つの異なる条件を有効化した。
上記３つの条件において、試験の診断精度が、免疫反応性の存在又は非存在のみを考慮した場合、９５％の領域の特異性に対して５０％前後変動することが判明した。
これに対して、自然状態下での分離後に分子量がそれぞれ１４０ｋＤ及び６７ｋＤである２つの基準標本の間を泳動する抗原蛋白質は、ＲＡ患者の血清によってより特異的に認識され、９９％の特異性について、６８％の精度を以て、これらの血清を検出することが出来た。これは、９９％の特異性について４３％の血清検出精度を持つ間接免疫蛍光検査法のものと比べて非常に優れたものである。
同様な試験を、人間の食道から抽出した抗原について行なった結果、その食道の唯一の免疫反応形態である４０−ｋＤ蛋白質により、分子量がそれぞれ１４０ｋＤ及び６７ｋＤである２つの基準標本の間を泳動する鼠の抗原蛋白質と同様な診断精度を得ることが出来ることが判った。
また、本発明は、ＲＡ患者に特異的に存在する自己抗体を精製する方法にも係わる。その方法は、少なくとも以下の工程を含むことを特徴とするものである。
−  ＲＡ患者の生体液を、本発明に従う少なくとも１つの抗原、及び／又はヒト・プロフィラグリン又はフィラグリン、又は上述したそれらの分屑又はペプチド・フラグメントに対して、前記自己抗体との免疫複合体が形成され得る条件下において接触せしめる工程、
−  反応媒体から上記複合体を分離する工程、
−  免疫複合体自己抗体を分離する工程。
本発明は、また、免疫原として、本発明に従う少なくとも１つの抗原（蛋白質、蛋白分屑またはペプチド・フラグメント）を使用することを特徴とする、抗体の製造方法にも係わるものである。これらの抗体は、抗血清、多クローン性抗体、又は単クローン性抗体に対応し得るものである。単クローン性抗体は、通常の脾臓細胞間結合方法に従って準備される雑種細胞により得られる抗原により試験管内で活性化されたものか、本発明の抗原蛋白質や骨髄腫の１つに対して免疫感作された動物から得られたものである。
本発明は、また、単クローナル若しくは多クローナル抗体を調製する方法にも係わる。この方法は、免疫感作抗原としてヒト・プロフィラグリン又はフィラグリンを使用すること、及びラットの食道上皮抗原をも認識する抗体を収集することを特徴とする。
更に、本発明は、本発明に従う単クローナル若しくは多クローナル抗体により動物を免疫感作する工程を含むことを特徴とする、抗遺伝型（anti-idiotype）抗体を調製する方法にも係わる。
また、本発明は、人間の単クローナル抗体を製造する方法にも係わる。この方法は、本発明の抗原（蛋白質、蛋白分屑又はペプチド・フラグメント）及び／又はヒト・プロフィラグリン又はフィラグリンの内の少なくとも１つを認識する抗体を分泌するクローンを、ＲＡ患者から得られるリンパ球から選択する工程を含むことを特徴とするものである。
さらに、本発明は、人間の抗イデオタイプ単クローナル抗体を精製（純粋化）する方法にも係わり、この方法は、上記方法により得られる人間の単クローナル抗体又はＲＡに有効な、本発明の方法に従って精製される自己抗体を特異的に認識するクローンを、ＲＡ患者から得られるリンパ球から選択する工程を含むことを特徴とするものである。
本発明が、上記方法により得られる抗体の全てに係わることは、自明のことである。
そのような抗体は、特に、ＲＡに関する免疫学的機構を解明するための研究目的、及びＲＡ治療の分野で使用することができる。
また、それらの抗体は、本発明の抗原と同様の特徴を有する抗原、特にマルピギー上皮及び、人またはラット以外の哺乳類種を含む哺乳類の関節組織に存在する可能性のある抗原の発見及びそれらの特徴を特定するためにも、使用可能である。
本発明の他の特徴及び効果は、添付図面に基づいて、以下に例示する実施例から明らかになるであろう。これらの実施例によって、特許請求の範囲が減縮されるように解釈され得ないことが、理解されるべきである。
実施例  １  ―  ラットの食道上皮から抽出される抗原の特徴の特定
Ｉ．―  材料及び方法
Ａ）―  上皮蛋白質の抽出
１）  絨毛膜上皮切断による食道上皮の準備
ラットの食道は、３つの主要な皮膜から成る。即ち、その内側から外側に向かって、結合組織層（外膜）、筋肉層（筋層）及び角質化したマルピギー上皮により被覆された絨毛膜から成る膜（粘膜）の３つの膜から構成される。
外膜と筋層を切断除去した後、上皮を絨毛膜（絨毛膜上皮分割）から機械的に分離する（絨毛膜上皮切断）。この時、事前に４℃と５７℃との間で媒体液〔８．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  エチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）；４ｍＭ  フェニルメチルスルホニル  フルオライド（ＰＭＳＦ）；ｐＨ７．４〕中において熱ショックサイクルを繰り返し行なう。切断した上皮を最小限のＰＢＳ（８．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）にて水和し、その後、絨毛膜が残っていないか否かを確認する生物組織チェックを行なう。
２）  上皮蛋白質の抽出
ａ）  緩衝剤及び抽出手順
本発明の抗原は、専ら上皮に存在するところから、抽出は上皮のみを用いて行なわれることとなる。
切断した上皮を用いて、上皮蛋白質の抽出物をポッタ（potter）内で粉砕し、４℃にて攪拌することにより、順次行なう。
上皮組織、特に表皮から蛋白質を順次抽出するために、始めに、標準的手順（Ｗ．Ｗ．Ｆｒａｎｋｅ等、Ｊ．Mol.Biol．１５３：９３３−９５９、１９８１  −  Ｔ．Ｔ．Ｓｕｎ及びＨ．Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．Biol．Chem．２５３（６）：２０５３―２０６０、１９７８）を用いた。その後、１工程抽出の試験を行なった。塩（ＫＣｌ、ＮａＣｌ）の添加されたTris−ＨＣｌ緩衝剤、この塩の添加されないTris−ＨＣｌ緩衝剤、洗浄剤（Triton、Nonidet  Ｐ４０〔ＮＰ４０〕）、変性剤（尿素、ＳＤＳ）及び還元剤（β−メルカプトエタノール〔２−ＭＥ〕のそれぞれに対応する種々の抽出媒体を試験した。
分屑抽出の際に、イオン力の小さいTris緩衝剤又はＥＤＴＡ及びTritonの添加されたTris−緩衝塩類（ＴＢＳ）に対応する分屑中に抗原が専ら存在するか検査した。これにより、抗原はサイトケラチン（cytokeratin）でないことが確認され、尿素及び還元剤の非存在下で抽出可能であり、また水溶性であることが判明した。
しかし、上記の種々の抽出技術を比較した結果、免疫反応性の強さはＮＰ４０の存在下における方が大きいことが判明した。従って、ＴＢＳと抑制剤と０．５％ＮＰ４０とから成る抽出媒体が最も効果的であると思われる。
抗原の精製工程中、特にゲル濾過クロマトグラフィにおいて、２８０ｎｍにおけるＮＰ４０の強い吸収は、蛋白質の吸収と干渉する。ＴＢＳ緩衝剤と抑制剤とを含みＮＰ４０を含まない抽出媒体を、精製工程前の抗原抽出に用いることができる。
ｂ）  物理的抽出条件の適正化
抽出手法の適正化を計るため、所定の物理的パラメータを組織的に開発した。これらのパラメータは、温度、時間、粉砕方法、攪拌方法及び酵素抑制剤の作用であった。
−  粉砕
粉砕は、電気ポッタ内において高速度で、又は手動ポッタ内において比較的低速度で行なった。いずれの場合も、略同一の抽出効率であった。しかし、電気ポッタのほうがより多くの数の食道試料を粉砕できるので、電気ポッタの使用が好ましい。
−  音波粉砕
ポッタ内処理後の音波処理によって抽出の適正化が計られるか否か、処理時間を変えて、試験した。その結果、音波処理の効果は僅かであることが確認された。従って、音波粉砕は必要ない。
−  攪拌
攪拌速度を変化させて、その効果を比較した。洗浄剤の存在下で高速攪拌を行なうと、泡が発生し、媒体の酸素飽和度が過剰になり、抗原の質低下を招く傾向がある。実際上、高速攪拌も低速攪拌も抽出状態は同じであったが、抗原をできるだけ長く保存するために、低速攪拌を採用した。
−  温度
室温での抽出結果と４℃での抽出結果とを比較した結果、４℃での抽出の方が良い結果が得られた。
−  時間
攪拌時間を１５分、２時間及び１７時間と変えて、抽出結果を比較した。抗原の抽出量は、攪拌時間を延ばすことにより多少増加するが、抗原の質低下の恐れを最小限に抑えるため、１５分攪拌を採用した。
―  抑制剤
以下の抑制剤の抗原保護効果を試験した。
・  バクテリア増殖抑制剤
アジ化ナトリウム
・  溶菌酵素の抑制剤
プロテアーゼ（アプロチニン、ＰＭＳＦ）、ホスファターゼ（ＮａＦ、ＰＣＭＢ（ｐ−クロロメルクリ安息香酸））、グリコシターゼ（デオキシマンノジリマイシン、デオキシジリマイシン）
特に、種々の酵素の作用による抗原の生物化学的特徴を抽出物により特定する場合において、抑制剤を使用せずに抽出を行なったが、抑制剤の不使用による抗原の変化は認められなかった。
−  適正化された抽出手順
上記パラメターを検討することによって、抽出手順が、下記の如く最適化された。
・  基材：切断絨毛膜から得られたラットの食道上皮
・  緩衝剤：４０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
ｐＨ７．４
・  抑制剤：０．１％  アジ化ナトリウム
１ｍＭ  ＰＭＳＦ
アプロチニン  ２μｇ／ｍｌ
・  基材／緩衝剤率：各切断食道上皮に対して緩衝剤５００μｌ
・  条件：
粉砕：電気ポッタ内で１５分
粉砕温度：４℃
粉砕後の攪拌：４℃にて１５分
・  抽出物の総蛋白質濃度
５〜８ｍｇ／ｍｌ
・  粗抽出物の保存
−２０℃乃至−４０℃
−  食道粘膜全体からの抽出
抽出手順を簡単化する目的で、食道粘膜全体からの抗原の抽出を検討した。絨毛膜を切断することなく、単に粘膜全体を切り取った。こうして得られた抽出物の蛋白質汚染について検査した。
粘膜全体からの抽出と切断上皮からの抽出を平行して行なった。
抽出した蛋白質とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、絨毛膜の存在によって抗原のモル質量域において大きな蛋白質汚染は認められない。粉砕によって抽出された上皮−絨毛分屑の免疫移動（immunotransfer）の後、抗原は十分に検出可能である。
ｃ）  粗抽出物の濃度
粗抽出物中の抗原の濃度は総蛋白質量の１％以下と低いため、抗原濃度を高める作業が必要である。特に、抽出物の分析が“Pharmacia Phastsystem”（登録商標）型のミニチュア式電気泳動法（試料サイズが１mlオーダであるもの）によって行なわれる場合には必要である。
種々の濃度増加方法を試験した結果、１０％ＴＣＡを用いた沈降により抽出物を濃縮する沈降法を採用した。この方法は、実施が簡単で、抗原の劣化を惹起せず、その免疫学的応答性が十分に保持される。
また、エタノールや硫酸アンモニウムによる沈降法、更に凍結乾燥も、抗原の実質的劣化をもたらすものではなく、それらの適用に問題はない。
Ｂ  −  電気泳動法
上記の検討された抽出媒体に拘わらず、水溶性蛋白質は、ＰＡＧＥ（電気泳動法）により分離され、ニトロセルロース上に電気移動する。
１）  水平ＩＥＦ（免疫蛍光検査法）
・  ゲル：９×１５ｃｍ、３．５〜９．５のＰＨ勾配を形成するアンフォリン（ampholin）を含む４％アクリルアミド
・  適用試料：上記手順により粗抽出物が準備され、それが１０％ＴＣＡ沈降法により濃縮され、水中に取り上げられた。
２）  一次元電気泳動法
−  Ｌａｅｍｍｌｉにより記述の方法（“Nature”、２２７：６８０−６８５、１９７０）に従う従来の垂直電気泳動法
・  ゲル：１０×１０ｃｍ、７％アクリルアミド
・  泳動緩衝剤：２５ｍＭ  Tris、１９２ｍＭ  グリセリン、１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３
・  適用試料：粗抽出物が凍結乾燥され、１０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２％ＳＤＳ、１％２−ＭＥ、０．１％ブロモフェノール青、１０％  グリセロール中に取り上げられた。
−  非自然状態下におけるミニチュア式水平電気泳動法
・  ゲル：４×４ｃｍ、７．５％  アクリルアミド
・  緩衝剤：２００ｍＭ  Tris、２００ｍＭ  トリシン、０．５５％ＳＤＳ、ｐＨ８．１
・  適用試料：粗抽出物が１０％ＴＣＡ沈降法により濃縮され、１０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２％ＳＤＳ、１％２−ＭＥ、０．１％ブロモフェノール青中に取り上げられた。
−  自然状態下におけるミニチュア式水平電気泳動法
・  ゲル：４×４ｃｍ、アクリルアミドの８％から２５％の勾配
・  泳動緩衝剤：２５０ｍＭ  Tris、８８０ｍＭ  Ｌ−アラニン、ｐＨ８．８
・  適用試料：粗抽出物が１０％ＴＣＡ沈降法により濃縮され、水中、若しくは２００ｍＭ  Tris−ＨＣｌ緩衝剤中に異なるｐＨ値で取り上げられた。
３）  二つの二次元ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法
−  一次：水平ＩＥＦ
・  ゲル：４×４ｃｍ、４％アクリルアミド、ｐＨ勾配３．５〜９．５
・  適用試料：粗抽出物が、エタノールを用い（４容量倍）、沈降法により濃縮され、水中に取り上げられた。
−  二次：上記の非自然状態下における電気泳動法
・  適用試料：１１２ｍＭ  Tris、１１２ｍＭ酢酸、２．５％ＳＤＳ、１％２−ＭＥ中において培養されたＩＥＦゲルレーン
Ｃ  −  免疫検出
ＲＡ患者から得られた人間血清を用いて、抗原の免疫検出を実施した。この際、ラットの食道角質層に対する自己抗体を事前に半定量ＩＩＦにより、ＧＩＦＲＥ（Ｇ−免疫蛍光−ラット食道）パラメータ値が０から８の範囲で滴定した。ＲＡに対する９９％以上の診断特異性に対応するしきい値ＧＩＲＲＥ＝２を設定することにより、患者の血清をＧＩＦＲＥ＋とＧＩＦＲＥ−の２つのグループに分類することができる（Ｃ．Ｖｉｎｃｅｎｔ等、Ann.Rheum.Dis．４８：７１２−７２２、１９８９）。
選ばれた血清において、次の免疫学的パラメターも考慮した：即ち、このパラメターとは表皮サイトケラチンに対するクラスＧ自己抗体の、ＥＬＩＳＡ（ＧＥＬＩＳＡ）（Ｇ．Ｓｅｒｒｅ等、Ｊ．Invest.Dermatol．８８：２１−２７、１９８７）で決定される力価である。これらの自己抗体は、作業技術者の自然落屑により抽出物中に汚染物質として存在する可能性のあるヒト・サイトケラチンと免疫移動反応する。また、血清を選択するにあたって、これらの自然自己抗体の力価に従って、力価の高い（吸光度＞０．６）ＧＥＬＩＳＡ＋グループの血清と、力価の低い（吸光度＜０．２）ＧＥＬＩＳＡ−グループの血清とを使用した。全部で、下記の４つのＲＡ血清サブグループを使用した。
−  ＧＩＦＲＥ＋／ＧＥＬＩＳＡ＋
−  ＧＩＦＲＥ＋／ＧＥＬＩＳＡ−
−  ＧＩＦＲＥ−／ＧＥＬＩＳＡ＋
−  ＧＩＦＲＥ−／ＧＥＬＩＳＡ−
最後に、正常な個体又は非リウマチ性関節炎疾患患者の対照血清、及びヒト・サイトケラチンに有効な鼠の単クローナル抗体も試験に含めた。（Ｇ．Ｓｅｒｒｅ等、ＩＮＳＥＲＭ  Colloquium、Jhon Libbey Eurotext，Ｖｏｌ．１７１：５２４、１９８８）．
蛋白質のＰＡＧＥ処理、ニトロセルロース薄膜上への免疫移動、及びヒト血清又は単クローナル抗体による培養の後、山羊の抗ヒトＩｇＧ（ガンマ）のＦ（ａｂ’）2フラグメント又は羊の抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＦａｂフラグメントに対応する第二のペルオキシダーゼ−標識抗体が、薄膜で培養され、抗原−抗体複合体の形成が、Ｈ2Ｏ2及び４−クロロ−１−ナフトールによるペルオキシダーゼ活性により観察される。
かかる実験条件下、抗原が、ＧＩＦＲＥ＋ＲＡ血清の特異的免疫反応性によって、免疫移動状態において同定される。約６５−６７ｋＤの免疫域が、力価が比較的高く、またＧＩＦＲＥ値と完全に独立なＧＥＬＩＳＡ＋血清にのみ存在することによって、抗原がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分離される場合にのみ、自然の抗原サイトケラチン自己抗体が現れる。
Ｄ  −  クロマトグラフィ
ゲル濾過／疎水的相互作用クロマトグラフィの後、抗原分子を異なる分屑に分離した。このようにして得られた分屑を、自然状態下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。
Ｅ  −  酵素消化
１）  プロチナーゼ（蛋白質分解酵素）
ＴＢＳ／ＮＰ４０緩衝剤中のラットの食道上皮の２つの抽出物を１０％ＴＣＡにて沈降させ、その蛋白質を５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ緩衝ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2中に取り上げる。２つの抽出物の１つをプロチナーゼＫ（市販のものに含まれている可能性のある他の加水分解酵素を取り除くため、３７℃にて１時間、事前に培養したもの）により、最終濃度が５０μｇ／ｍｌで処理した。その後、２つの試料を３７℃にて１時間培養し、自然状態下のＰＡＧＥ又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による泳動の後、免疫移動状態において比較分析する。
２）  ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）
ＴＢＳ／ＮＰ４０緩衝剤中のラットの食道上皮の２つの抽出物を１０％ＴＣＡにて沈降させる。そのうちの１つを、５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＣａＣｌ2中の２Ｕ／μｌマイクロ球菌ヌクレアーゼ（ＤＮＡとＲＮＡの加水分解）にて加水分解する。第二の未処理試料を対照試料として使用する。２つの試料を３７℃にて１時間培養した後、自然状態下のＰＡＧＥ又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による泳動の後、免疫移動状態において比較分析する。
Ｆ  −  デグリコシレーション（Deglycosilation）
１）  過ヨード酸による酸化
ＷＯＯＤＷＡＲＤ等（Ｊ．ＩＭＭ．ＭＥＴＨ．７８：１４３−１５３、１９８５）のプロトコール（試験手順）を利用した。この手順により、ニトロセルロース膜上に移行された試料の周期的酸化が可能で、その酸化の後に、免疫検出を行なう。
ラットの食道上皮の抽出物が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動により、移動せしめられる。ニトロセルロース膜を複数の帯（レーン）に切断し、それらのレーンを周期酸化処理（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝ｐＨ４．４、２０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム中において、室温、暗室にて１時間培養）後、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、５０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）にて、室温で３０分間還元する。還元以外の化学処理をしていない対照試料も用いる。全ての試料について、免疫検出を実施する。
２）  トリフロロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）による処理
ＥＤＧＥ等（ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．１１８：１３１−１３７、１９８１）の方法に従って、ＴＦＭＳを使用することにより、ペプチドを保存しつつ、糖蛋白質を略完全にデグルコシレートすることができる。この方法を、対照糖蛋白質、牛のフェチュイン、及び抗原を含むラットの食道上皮抽出物に適用した。これらの抽出物を水に対して透析した後、凍結乾燥する。それらを、ＴＦＭＳとアニソール（ペプチドを保護する物質）との混合物（６６：３３Ｖ／Ｖ）を添加し、試験管内大気を窒素で飽和後、攪拌培養することによって、処理する。上記方法に基づく手順を、次のパラメータを変え、最適化した。
−  処理される蛋白質質量に対するＴＦＭＳ−アニソール混合物の比率：
食道抽出物中の総蛋白質のｍｇあたり混合物３３μｌ〜２６６μｌ
−  温度：
０℃、４℃、又は室温
−  培養時間：１時間、３時間、又は２４時間
全ての場合において、培養後に、純粋エーテルの２容量部及びピリジン−水混合物）５０：５０Ｖ／Ｖ）の３容量部を添加して反応を停止する。エーテル相に溶解するピリジニウム・トリフロロメタンスルホネートの沈降物をエーテル相と共に取り除く。純粋エーテルにより更に抽出後、水相を水にて透析する。その後、試料を凍結乾燥、ＰＡＧＥ分離移動し、免疫検出する。
４）  ペプチドＮ−グリコシダーゼ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）による処理
グリコペプチドＦ又はＮ−グリカナーゼとも称されるＰＮＧａｓｅ  Ｆは、糖蛋白質のアスパラギニル基と、全てのＮ−結合オリゴ糖に共通の構造のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースとのアミド結合を加水分解する。
フェチュインは３つのＮ−結合オリゴ糖鎖を含み、それをＰＮＧａｓｅ  Ｆにより取り除くことによりモル質量が低下するが、この低下はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により簡単に観察できる（Ｓ．ＨＩＲＡＮＩ等、ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．１６２：４８５−４９２、１９８７）。
牛のフェチュイン（２ｍｇ／ｍｌ）とラットの食道上皮の凍結乾燥抽出物（蛋白質８ｍｇ／ｍｌ）を２％ＳＤＳと０．０５Ｍ  ２−ＭＥにより９０℃で５分間変性処理する。その後、蛋白質を下記の成分を有する反応媒体中に導入する。
−  １．２５％  ＮＰ４０（酵素をＳＤＳの変性作用から保護するため）
−  １６６ｍＭ  亜リン酸カリウムｐＨ８（酵素のｐＨを最適値に保持するため）
−  最終濃度１０％でメタノール中に溶解する１０ｍＭ  １、１０−オルトフェナントロリン（プロテアーゼ抑制剤）
−  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ  ０．３Ｕ／μｌ
この反応媒体において、ＳＤＳ及び２−ＭＥの最終濃度はそれぞれ０．１６６％及び１６ｍＭである。培養は３７℃で２４時間行われる。
酵素なしで培養される対照“フェチユイン”及び“抗原抽出物”が試験手順に含まれている。加水分解及びＴＣＡ沈降による濃縮の後、試料はＰＡＧＥ法により分離移動され、免疫検出される。
Ｄ  −  異なる植物凝集素（レクチン）による反応性
本発明者等は、ペルオキシダーゼと結合した植物凝集素を持つある種の糖を検出することにより、抗原の糖蛋白質の特質を確認する試験を行なった。２つの植物凝集素、即ち小麦の麦芽レクチン（ＷＧＡ）とコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を選択し、それらの特異性の差異を調べた（Ｉ．Ｊ．ＧＯＬＳＴＥＩＮ及びＲ．Ｄ．ＰＯＲＥＴＺ、“Ｔｈｅ  Lections（レクチン）：生物学及び医薬における特性、機能及び適用：
−  ＷＧＡは、下記のような順序で親和性が増加するＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を認識する：
（１）ＧｌｃＮＡｃ＜＜ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ＜ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、そしてまたシアル酸残基と低親和性をもって結合する。
−  ＣｏｎＡは、下記のような順序で親和性が増加する糖と結合する：
（２）αＧｌｃＮＡｃ＜αＧＬｃ＜αＭａｎ＜Ｍａｎα１−２Ｍａｎ＜Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２Ｍａｎ。
２つの粗又は純粋抗原抽出物蛋白質を、一次元ＰＡＧＥ又はＩＥＦ／ＰＡＧＥ泳動法によりニトロセルロース上に移動させ、ニトロセルロース上に形成された帯をペルオキシダーゼと最低濃度２０ｇ／ｍｌ及び１５ｇ／ｍｌでそれぞれ結合するＣｏｎＡ及びＷＧＡにより培養する（Ｊ．Ｃ．Ｓ．ＣＬＥＧＧ、ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．１２７：３８９−３９４、１９８２、及びＷ．Ｆ．ＧＬＡＳＳ等、ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．１１５：２１９−２２４、１９８１）。この培養は、５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ緩衝ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2．１ｍＭ  ＭｎＣｌ2．及び０．１％トゥイーン（Tween）、中で、３７℃で１時間、また４℃で１晩行なう。培養の前後に、上記緩衝剤中で洗浄する工程を設ける。過ヨード酸処理にて酸化されたゲラチン又は牛の血清アルブミン等の種々の飽和剤を添加しても、トゥイーンのみを使用して得られる反応は増幅しない。最終洗浄後、免疫検出時同様、Ｈ2Ｏ2及び４−クロロ−１−ナフトールによるペルオキシダーゼ活性により、レクチン（植物凝集素）と抗原の組合せが観察される。
ＩＩ．―  抗原の物理化学的特徴の特定
ラットの食道上皮の粗抽出物及び精製された抗原分屑を用いて、抗原の物理化学的特徴を調査した。いずれの場合にも、電気泳動分離により蛋白質が移動して、ＲＡ患者の血清の免疫検出が行われた。
Ａ  −  モル質量
図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離されたラットの食道上皮の抽出物の免疫分析を示す。粗抽出物が、１０％ＴＣＡ沈降により１０倍に濃縮され、Laemmli緩衝剤中に取り出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％）にて分離されて、ニトロセルロース上に移動され、１００分の１に希釈されたＲＡ血清のＧＩＦＲＥ＋（レーン１〜１２）及びＧＩＦＲＥ−（レーン１３及び１４）の免疫検出が行なわれた。“Ｃ0”は二次抗体のみで培養した陰性対照を示し、“ＭＷ”は分子量マーカーを示す。抗原は、平均モル量が略２１０ｋＤの蛋白質に対応する狭い免疫反応域、及び平均モル量が９０ｋＤ乃至１３０ｋＤの蛋白質に対応する広い免疫反応域を示す。
Ｂ  −  等電点
粗抽出物が、１０％ＴＣＡ沈降により５倍に濃縮され、水中に取り出され、ＩＥＦ分離（ｐＨｉ３．５〜９．５）移動され、ＲＡ患者の血清のＧＩＦＲＥ＋及びＧＩＦＲＥ−の免疫検出が行なわれた。抗原分子は、非常に異なる配列を呈す。即ち、抗原分子は、等電点が５．２から７．５に変化する５つの帯域の群中に分布するＧＩＦＲＥ＋血清の多くに、より特異的に認識される粗抽出物蛋白質である。
Ｃ  −  自然状態下における泳動特性
図２は、酸性媒体中に取り出され、自然状態下でＰＡＧＥ泳動分離された、ラットの食道食道上皮の抽出物の免疫移動を示す。粗抽出物が、１０％ＴＣＡ沈降により１０倍に濃縮され、水中（ｐＨ４以下）に取り出され、自然状態下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜２５％）にて分離、移動され、１００分の１に希釈されたＲＡ血清のＧＩＦＲＥ＋（レーン１〜４）の免疫検出が行なわれた。“Ｃ0”は二次抗体のみで培養した陰性対照を示す。これらの条件において、試料を酸性ｐＨで取り出し、ＲＡ患者の４つの血清についての免疫移動により、それぞれ次の蛋白質に対応する３つの免疫反応域が認められる：
・  馬の脾臓フェリチン（分子量：４４０ｋＤ）と同様の泳動挙動を示す第一の蛋白質
・  雄牛の肝臓カタラーゼ（分子量：２３２ｋＤ）と同様の泳動挙動を示す第二の蛋白質
・  雄牛の心臓の乳酸デヒドロゲナーゼ（分子量：１４０ｋＤ）と牛の血清蛋白質（分子量：６７ｋＤ）との中間の泳動挙動を示す第三の蛋白質。
上記３つの免疫反応域は、血清に従い異なる親和性をもって認識される。
Ｄ  −  二次元ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法
ＩＥＦを一軸方向にとりＳＤＳ−ＰＡＧＥを別の軸方向にとることによって、種々の抗原分子の等電点とモル量とを同時に決定することができ、更に、それらの大きな電荷差及び大きな質量差を確認することができる。
図３は、二次元ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により分離されたラットの食道上皮の抽出物の免疫移動を示す。粗抽出物は、エタノールを使用した沈降により１０倍濃縮され、水中に取り出され、ＩＥＦ（ｐＨｉ５〜８）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％）により分離移動され、１００分の１に希釈されたＲＡ患者の血清のＧＩＦＲＥ＋（レーン１、２）の免疫検出が行われた。９０ｋＤ〜１３０ｄＫの免疫反応域は５．８５〜７．３５の範囲のｐＨｉ値を有し、２１０ｋＤのｐＨｉ値は５．８５〜６．８５の範囲で変化する。更に、コンマ形状の第三の免疫反応集団は１２０ｋＤ〜６７ｋＤの範囲で泳動し、それらのｐＨｉ値は５〜７．５の範囲内に連続的に分布している。９０ｋＤ以下のモル量の抗原分子は、二次元電気泳動により明瞭に検出されるが、一次元電気泳動によっては、力価の高い血清についてのみ、分子量の小さい領域に向かって免疫反応域が延長される形で検出される。このように、二次元ＩＥＤ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によるほうが、抗原検出量が多く、より高い免疫検出の精度が保証される。
Ｅ  −  クロマトグラフィ分離の特徴
図３は、Superrose１２（溶出プロフィールに続く２８０ｎｍでの吸光率測定）上でのゲル濾過クロマトグラフィにより粗抽出物から再精製された抗原溶液の疎水的相互作用クロマトグラフィ分離を示す。このように事前に精製された免疫反応分屑は、フェニル−Superrose（ライン２＝平衡緩衝剤：５０ｍＭ  リン酸、１．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７；溶出緩衝剤：５０ｍＭリン酸ｐＨ７；注入量：３．６ｍｌ；流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；ＯＤ２８０ｎｍフルスケール（ライン１）：０．０５）上で分離される。
種々の抗原分屑の溶出プロフィール及び免疫移動分析は、多くの精製物について、再現性が非常に高いことが証明された。従って、種々の分屑中における抗原分子の分布・配列をモデル化することができた。
図５は、ゲル濾過及び疎水的相互作用クロマトグラフィにより精製された抗原分屑の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１）又は自然状態下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（２）により得られた、免疫反応プロフィールのモデルを示す。免疫反応帯域又は反応域の強度差は各分屑（Ａ−Ｈ）中の抗原蛋白質の相対的豊富さを表すものである。
非自然状態下での電気泳動法において、２１０ｋＤ帯域（分屑Ｆ、Ｇ及びＨ）、広いが境界が不明瞭な９０ｋＤから１３０ｋＤまでの帯域（分屑Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）、及び６７ｋＤから９０ｋＤまでの帯域（分屑Ｃ、Ｄ及びＥ）が観察された。
自然状態下での電気泳動法において、狭い４４０ｋＤ帯域（分屑Ｆ、Ｇ及びＨ）、２３２ｋＤ帯域（分屑Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）、及び１４０−ｋＤから６７−ｋＤまでの広い基準標本帯域（分屑Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）が観察された。
種々の精製分屑（図５）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した抗原分子と、図３に示す粗抽出物の二次元（ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動により同定された分子とを比較することにより、それぞれの疎水性に関する情報が得られる。
−  ｐＨｉ値が５．８５から６．８５まで変化する２１０ｋＤ帯域が、溶出の終了時に得られる分屑（Ｆ、Ｇ及びＨ）に認められる。従って、非常に疎水性が高いものである。
−  ｐＨｉ値が５．８５から７．３５の範囲である９０ｋＤから１３０ｋＤまでの拡散帯域は、２１０ｋＤ帯域（分屑Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）と同じ溶出プロフィールを有し、従ってそれと同じ疎水性を有する。
−  一方、ｐＨｉ値が５から７．５までの広い範囲において変化するコンマ形状の集団は、主として溶出の開始時に認められ、従って上記の２つの分子と比べてより低い疎水性を有する。
ＩＩＩ．  −  抗原の生物化学的特徴の特定
Ａ  −  抗原分子は天然蛋白質である
図６は、プロチナーゼＫにて消化された（ｂ）又は消化されていない（ａ）抗原抽出物中の蛋白質の免疫移動分析を示す。この抽出物は、自然状態下（８〜２５％）でＰＡＧＥ泳動分離され、ＲＡ患者の３種のＧＩＦＲＥ＋血清（レーン１―３）及び１種のＧＩＦＲＥ−血清（レーン４）の免疫検出が行なわれた。“Ｃ0”は、二次抗体のみで培養した陰性対照を示す。
処理された試料に対応するニトロセルロース帯域のポンソー（Ponceau）レッド染色により、抽出物中の蛋白質が完全に消化されていることが判る。自然状態下でのＰＡＧＡＥ泳動後の免疫検出で、試料をプロチナーゼＫにより事前に消化している場合には、ＧＩＦＲＥ＋血清の特異免疫反応性が消失することが判る。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による試料の移動後の免疫検出によって確認された。
抗原性を有する分子の蛋白質特性を確認後、本発明者等は、蛋白質の同質性、異質性、等電点及び見掛モル量の相違を説明することが可能であった抗原の組合せ及び／又は置換、及び認識されたエピトープの生物化学的特性について検討した。
Ｂ  −  抗原蛋白質は核酸と結合しない
抗原の核酸の可能な組合せを検討した。図７は、（１）において、マイクロ球菌ヌクレアーゼにより処理された（ｂ）又は処理されていない（ａ）ラットの食道上皮の抽出物の分析を示す。抽出物は、１％アガロース・ゲル中で電気泳動分析された後、臭化エチジウムにより染色された。“Ｍ”は、キロベース・ペア（kirobase pair）におけるサイズマーカを現す。
試料を１％アガロース・ゲル中で電気泳動分離後に、処理試料中に核酸が存在しない場合には、酵素消化の効果が認められる。
図７は、（２）において、自然状態下（８〜２５％）、ＰＡＧＥ泳動後の、ＲＡ患者の３種のＧＩＦＲＥ＋血清（レーン１〜３）及び１種のＧＩＦＲＥ−血清（レーン４）の免疫移動分析結果を示す。“Ｃ0”は、二次抗体のみで培養した陰性対照を示す。
自然状態下、ＰＡＧＥ泳動後の免疫検出により、ＲＡ患者の血清の反応性の観点からも、またその見掛けのモル量の観点からも、抗原蛋白質のヌクレアーゼ処理に対する感性が無いことが判り、抗原蛋白質が核酸と結合されていないことが示される。
Ｃ  −  抗原蛋白質は糖蛋白であるか？
糖蛋白は、しばしば、等電点の大きな相違を示し、また糖蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分解するＳＤＳの拘束レベルは、一定していない。糖蛋白のこれらの特性に鑑みて、本発明者らは、糖蛋白の炭水化物残基との置換の可能性を調査した。この目的で、ペプチドバックボーンに含まれている可能性のある糖分子を変性させるための技術若しくは蛋白質部からそのグリカン（多糖）残基を除く技術を研究した。
１）  過ヨード酸による炭水化物の破壊
図８は、ラットの食道上皮の抽出物の免疫検出を示す。この抽出物にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％）泳動移動の後、以下の処理を施した：
−  ＰＢＳ緩衝剤中において１時間３０分培養（“培養”対照：レーンａ）
−  酢酸ナトリウム緩衝剤中において１時間培養後、水素化ホウ素ナトリウムにて３０分還元（“還元”対照：レーンｂ）
−  酢酸ナトリウム緩衝剤中において過ヨード酸にて１時間培養後、水素化ホウ素ナトリウムにて３０分還元（“試験”：レーンｃ）
３種のＧＩＦＲＥ＋ＲＡ血清（レーン：１〜３）、２種のＧＩＦＲＥ−ＲＡ血清（レーン：４、５）及び２種の対照ＦＲＥ−ＲＡ血清（レーン：６、７）を用いた。“Ｃ0”は二次抗体のみで培養した陰性対照を示す。
過ヨード酸による処理は、ＲＡ患者の血清により特異的に認識される蛋白質の変化を生じさせるものではなかった。このことについて、次の３つの解釈が考えられる：
−  抗原蛋白質は糖蛋白であるが、これらの糖蛋白質に含まれ周期酸化に感応する糖は、ＲＡに有効な自己抗体により主に認識されるエピトープに係わるものではない。
−  抗原蛋白質は糖蛋白であるが、これらの糖蛋白が含む糖は、それらの特性として及び／又はそれらの結合形態により、周期酸化（過ヨード酸が２つの隣接炭素間の結合を解く：何れの炭素も、当初は、アルコール機能を有するか、若しくは一方の炭素が当初アルコール機能を有し、他方の炭素が酸又はケトン又は一次又は二次のアミン機能を有する）に感応しない。
−  抗原蛋白質は糖蛋白ではない。
これらの３つの可能性を区別するために、本発明者等は全デグリコシレーションの方法を使用し、質量の変化又は抗原特性の免疫反応性を調査した。
２）  デグリコシレーション
オリゴ糖とペプチドのバックボーンとの組合せには、２つの主要な結合形態がある：即ち、オリゴ糖とセリン又はトレオニン（稀に、ヒドロキシリシン）残基との組合せを、Ｎ−アセチル化ガラクトサミンを介して可能とするＯ−グリコシド結合と、Ｎ−アセチル化グルコサミンを介してオリゴ糖をアスパラギン残基に結合するＮ−グリコシド結合とが有る。
糖蛋白をデグリコシレートするために、次の２つのタイプの処理方法が適用可能である：
−  蛋白質への結合がＮ−グリコシド結合か、Ｏ−グリコシド結合かに拘わらず、全ての形態の炭水化物基の除去が可能な、例えば、トリクロロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）による化学処理等の非特定的処理；
−  結合形態の何れかのに特定的に適用される処理で、Ｏ−グリコシド結合に適用される水酸化ナトリウムによるβ−脱離、及びＮ−グリコシド結合に適用され、Ｎ−結合糖の化学的特性に或る程度依存する、多くの酵素加水分解処理を含むもの。
ａ）  ＴＦＭＳによる非特定的処理
ＴＦＭＳにより処理された抗原抽出物及び水中で培養された抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％）後の免疫移動分析により、抗原蛋白質の見掛モル量は対照試料に比して多少小さいことが判る。この差は、約１０ｋＤ〜２０ｋＤの範囲と小さいが、全ての処理条件について観察され、異なる２つの実験によって認められる。ＴＦＭＳにより処理されたラットの食道上皮の抽出物中の蛋白質のＩＥＦ後の免疫移動分析により、ＲＡ患者の血清の対照試料に対する特異的な免疫反応性は、ｐＨｉ値が略５．２〜７．５の範囲に広がっていることが判る。ＴＦＭＳ処理の後、ＲＡ患者の血清について免疫検出が行われた蛋白質は、６〜８の塩基性のｐＨｉ値を示した。
抗原蛋白質の上記ｐＨｉ値及び見掛モル量の変化は分子のグリカン（多糖）置換の可能性を支持するものである。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による検出精度が低く、またＩＥＦ法におけるｐＨｉ値の範囲が広いことから、抗原蛋白質の他の非炭水化物基との置換の可能性も考えられ、また観察結果は特に不安定なペプチド結合を切断したためとも考えられる。
しかしながら、ＴＦＭＳ処理後の免疫反応性が持続することは、ＲＡに有効な自己抗体により認識される１種又は複数種のエピトープが非炭水化物特性を有するものであることを支持する強い議論でもある。
ｂ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる特定的処理
ＴＦＭＳにて得られた結果を確認するため、本発明者等は、Ｎ−結合糖を特定的に除去する酵素：ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて、デグリコシレーション実験を行なった。
このＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いたデグリコシレーションは、水に対して透析され且つ凍結乾燥された粗抗原抽出物に対して行なわれた。この抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動移動による免疫検出分析によると、ＰＮＧａｓｅ  Ｆにより処理された抗原と対照抗原との差は何等見つからなかった。この結果の解釈は、次の２つが可能である：
−  抗原はＮ−オリゴ糖と置換されない、
−  蛋白質のアスパラギン残基に結合されたオリゴ糖は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによって切断されない新規な化学的構造を持っている。
しかし、一次元分析のみでは、抗原蛋白質が二次元電気泳動分析により示されるように部分的に重なり合うことから、抗原蛋白質のＰＮＧａｓｅ  Ｆに対する不感応性は明らかにならなかった。
３）レクチンによる糖の検出
抗原の小麦の麦芽レクチン（ＷＧＡ）又はコンカナバリン（ＣｏｎＡ）との反応性の可能性を、ニトロセルロース上で“親和性検出”により試験し、ＲＡ血清の特異的な免疫検出プロフィールと比較した。
ＲＡ患者の血清により、自然状態下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで認識されたラットの食道上皮の粗抗原抽出物中の蛋白質は、レクチンにより認識された蛋白質とは異なっていた。しかし、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける２１０ｋＤ蛋白質については、反応性の共通帯域から判断すると、ＷＧＡ及びＣｏｎＡはいずれも抗原の一部を認識するものと思われる。ゲル濾過クロマトグラフィにより精製された抗原分屑が同一の条件下で分析された。この実験の結果、或る種の糖蛋白と同じ分子量の糖蛋白はＣｏｎＡにより認識されたこと、及び、ＷＧＡの反応性プロフィールはＲＡ患者の血清のものと類似していることが確認された。
ラットの食道の抗原蛋白質に対するレクチンの親和性が、ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより粗抗原抽出物の分析により確認された。
図９は、二次元電気泳動（ＩＥＦ、等電点５〜８／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、７．５％）及びニトロセルロース上への移動による、粗抗原抽出物中蛋白質の分析結果を示すものであり、（１）はＲＡ患者のＧＩＦＲＥ−血清のもの、（２、３）はＲＡ患者のＧＩＦＲＥ＋血清のもの、（４）はＣｏｎＡのもの、（５）はＷＧＡのものである。
反応性を増幅する目的で、抗原抽出物をＩＥＦゲル上に３例適用した。陽極側に適用した抗原の１分屑（２１０ｋＤ帯；免疫反応域９０−１３０ｋＤ）そこに沈降し、酸性ｐＨｉ域の人口的反応産物が産出された。
この研究により、ＣｏｎＡにより認識される分子は抗原と異なるが、ＷＧＡは９０〜１３０−ｋＤ及び２１０−ｋＤ抗原蛋白質と特異的に結合することが判明した。これに対して、１２０ｋＤ〜６７ｋＤの範囲でｐＨｉ値が５〜７．５に渡って広がる“コンマ”形状の免疫反応蛋白質は、ＷＧＡに対して反応性を示さない。
実施例  ２  ―  ヒト表皮から抽出される抗原の特徴の特定
Ｉ．―  材料及び方法
Ａ  −  患者及び血清
臨床的及び生物学的観点から十分に特徴づけられた種々のリウマチ性疾患の患者の６４種の血清を用いて、検討を行なった。これら６４種の血清の内、４５種は米国リウマチ協会（American Rheumatism Association）の基準に従って定義されるＲＡ患者のものである。また、３２種の健康な人の血清が、対照血清として使用された。
２つの単クローナル抗体（ＭＡｂ）が使用された。その中の１つの抗体は、ヒト・サイトケラチンに有効なＦ１２−１９（抗サイトケラチン参照番号：２２０−８１、Dept.Biosoft  ＣＬＯＮＡＴＥＣ）であり、もう１つの抗体は、ヒト・フィラグリンに有効なＡＫＨ−１（カタログ番号：ＢＴ−５７６、Biomedical Technologies Inc.）である。
Ｂ  −  表皮蛋白質の抽出
乳房又は腹部の成形手術若しくは環状切除により収集された皮膚フラグメントを−８０℃で保存した。その表皮を、Kassis及びSondergard（ＡＲＣＨ．ＤＥＲＭＡＴＯＬ．ＲＥＳ．２７３：３０１−３０６、１９８２）が記述の方法に従って、真皮から機械的に分離した。即ち、４℃にて熱処理後、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５ｍＭ  ＰＭＳＦを含むＰＢｓ緩衝剤（８．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中において５７℃にて熱処理し、更に４０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ緩衝剤ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ４０（以後、“緩衝剤Ａ”と呼ぶ）中において、機械的に粉砕された。
１２、０００ｇで１５分間遠心分離した後、上澄が、表皮サイトケラチンを含むペレットから分離された。
更に、上記と同様の手順に従って、２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ緩衝剤ｐＨ７．４、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（以後、“緩衝剤Ａ”と呼ぶ）中において、表皮蛋白質の抽出を行なった。
種々の分屑が−２０℃で保存された。
Ｃ  −  種々の分屑蛋白質を、平衡時及び平衡前ＩＥＦ（ＮＥｐＨＧＥ）、又は自然状態下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、分析した。また、二次元電気泳動法も実施された。
蛋白質の濃度を増加させるため、４容量部のエタノール又はＴＣＡを用いて、最終濃度１５％で随時沈降させた。
Ｄ  −  免疫検出
ＴＯＷＢＩＮ等（ＰＮＡＳ  ７６：４３５０−４３５４、１９７９）の記述する技術に従い、蛋白質をニトロセルロース膜上に移動した。ニトロセルロース帯状片をＰＢＳ、０．０５％トゥイーン２０中で培養した後、１／１０から１／１００に希釈した血清を使用した。この血清の存在下、３７℃で１時間培養した後、４℃で１２時間培養を続けた。
単クローナル抗体ＡＫＨ−１（１／１００に希釈したもの）又はＦ−１２（１／５００に希釈したもの）を３７℃で２時間培養した。洗浄の後、ニトロセルロース帯状片を、ペルオキシダーゼ−標識された抗−ヒト又は抗−鼠ＩｇＧ二次抗体により、観察した。
Ｅ  −  酵素処理
濃縮表皮抽出物（８０μｇ／μｌ）を、１ｍｇ／ｍｌのプロチナーゼＫにより、１％ＳＤＳの存在下、３７℃で３０分間、又は１００Ｕ／ｍｌのマイクロ球菌ヌクレアーゼにより、３０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ緩衝剤、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８中において、３７℃で３０分間、処理した。
Ｆ  −  免疫沈降
プロテインＡ−セファロース上に事前に吸着された表皮抽出物を、抗体ＡＫＨ−１又は抗体Ｆ１２−１９とＮａＣｌ（最終濃度１Ｍ）の存在下、３７℃で２時間培養した。
形成された抗原抗体複合物が、プロテインＡ−セファロースと共に収集されて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による免疫移動により分析された。
Ｇ  −サイトケラチンの精製
Ｔ．Ｔ．ＳＵＮ及びＨ．ＧＲＥＥＮ（Ｊ．Biol Chem．２５２：２０５３−２０６０、１９７８）が記載の方法に従い、尿素溶解性サイトケラチンを乳房表皮から精製した。
Ｈ  −  ヒト・フィラグリンの精製
フィラグリンを、哺乳動物表皮から、ＬＹＮＬＥＹ及びＤＡＬＥ（Ｂ．Ｂ．Ａ．７７４：２８−３５、１９８３）が記載の技法に従い抽出した．即ち、還元剤の存在下、６Ｍ尿素中の表皮抽出物をアニオン交換樹脂を使ったＦＰＬＣクロマトグラフィにより精製した。非保持カチオン蛋白質を４容量部のアセトンで沈降させ、１．５％のＳＤＳ及び２．５％の２−ＭＥを含む少量の緩衝剤中に再溶解させ、高さ１０ｃｍのＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫体ゲルの上部に与えた。その後、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社から市販されている“Immobilon”（登録商標）ＰＶＤＦ型薄膜上にゲルを移した。フィラグリンに対応する領域を抗体ＡＫＨ−１により免疫検出同定し、切断した。更に、フィラグリンを０．３ｍｌ／ｃｍ2の溶離緩衝剤（５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、２％ＳＤＳ、１％Triton  Ｘ−１００）で溶離し、沈降濃縮した。
Ｉ  −  抗原の精製
２０ｃｍ2の乳房表皮を電気ポッタで緩衝剤中において粉砕した。ホモジネートを１０、０００ｇで１５分間遠心分離して、上澄みをＴＣＡ（最終濃度１５％）による沈降により分離した。沈降物を少量の３０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ８、５ｍＭ  ＣａＣｌ2中に再溶解した。溶解分屑を遠心分離により清澄化し、１．５％ＳＤＳ及び２．５％２−ＭＥで処理した後、高さ１０ｃｍのＳＤＳ免疫体ゲルの上部に与えた。その後、上記フィラグリンに適用した溶離法により精製した。抗原に対応する領域をＲＡ血清により免疫検出同定した。
ＩＩ  −  結果
Ａ  −  抗原の物理化学的及び生物化学的特徴の特定
ＲＡ血清により認識される抗原の特徴を特定するために、非イオン洗浄剤（ＮＰ４０）の存在下、緩衝剤Ａ中の乳房表皮を均質化することによって、乳房表皮抽出物を準備した。
この溶解抽出物を、ＰＡＧＥ及び蛋白質のニトロセルロース上への移動による免疫検出により分析した。
図１０は、ＲＡ血清及び対照血清による上記ＮＰ４０抽出物の免疫移動分析結果を示す。即ち、ＮＰ４０抽出物（８ｍｇ／ｍｌ）はＴＣＡにより沈降させ、Tris−ＣａＣｌ2緩衝剤中にとりあげ、更に７倍濃縮の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（勾配８〜２５％）による免疫移動によって分析した。血清は、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で１／１０に希釈された。血清１及び２は悪性骨髄腫の患者から、血清２はシャープ病（Sharp’s disease）患者から、血清４は骨関節炎患者から、血清５は多発性筋炎患者から、血清６はパジェット病（変形性骨炎）患者から、血清７〜２１はＲＡ患者から、血清２２〜３８は健康体から、それぞれ採取したものである。“Ｃ0”は、標識化抗−ヒトＩｇ抗体のみで培養された陰性対照である。
ＲＡ患者の血清の大部分（８０％）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる約４０ｋＤの分子量を有する蛋白質を認識した。同一緩衝剤中に還元剤（２−ＭＥ）が含まれていなくても、蛋白質の泳動に変化は無かった。このことから、この分子は多分ジスルフィド結合（架橋）を含まないものと思われる。これに対して、非リウマチ性関節炎患者の血清の８９％及び対照血清の０％は上記蛋白質抗原を認識しなかった。試験した血清群の全てに属する血清の大部分により６８−ｋＤ蛋白質が非特異的に検出され、従って自然自己抗体によって検出されたと思われる。
図１１は、上記ＮＰ４０抗原抽出物の免疫移動分析結果を示す。図中、（１）はヌクレアーゼにより処理され、又はされないものであり、（２）はプロテアーゼにより処理され、又はされないものである。（１）においては、乳房表皮のＮＰ４０抽出物がＴＡＣＡで沈降させられ、Tris−ＣａＣｌ2緩衝剤中に取り出され、３７℃で３０分間、マイクロ球菌ヌクレアーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）で処理されたもの（＋）もあり、されないもの（−）もあった。また、（２）においては、上記と同じヒト表皮のＮＰ４０抽出物がＴＣＡで沈降させられ、１％ＳＤＳ中にとりあげられ、３７℃で３０分間、１０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼで処理されないもの（−）もあり、されたもの（＋）もあった。全ての場合において、蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜２５％）分離移動され、１／１００希釈された対照血清（ａ）及びＲＡ患者の血清（ｂ）について免疫検出された。プロテアーゼＫによる抽出物の処理の後に免疫反応域が消失したが、これは自己抗体により認識されるエピトープを保有する分子の蛋白質特性を確認するものであり、この免疫反応性域はマイクロ球菌ヌクレアーゼによる核酸の消化の後にも変化することはなかった。
図１２は、自然状態下電気泳動による抗原の分析結果を示すものである。即ち、ヒト表皮のＮＰ４０抽出物をエタノールにて沈降させ、自然状態下（８〜２５％）ＰＡＧＥにより免疫検出し、１／１００希釈されたＲＡ患者血清（レーン１〜４及び８〜９）及び対照血清（レーン５〜７）と共にニトロセルロース上に移した。ヒト抗原は、分子量が８０〜４００ｋＤの基準標本と同様な泳動挙動を示す幾つかの抗原蛋白質に分離する。免疫反応性の最も高い蛋白質の分子量範囲は８０ｋＤ乃至１２０ｋＤであった。
図１３は、抗原のＩＥＦ分析結果を示す。即ち、乳房表皮ＮＰ４０抽出物中の蛋白質をエタノールで沈降させ、ＩＥＦ分離（ｐＨ３〜９）し、ニトロセルロース上に移動させ、１／１００希釈されたＲＡ患者血清（レーン５〜１２）及び対照血清（レーン１〜４）について免疫検出した。ヒト抗原はｐＨｉ値が５．８から７．４までの範囲で大きくバラツキ、このｐＨｉ値の変化二次元（ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動法で確認された。ゲルの移動後にＲＡ患者血清により特異的に認識された蛋白質は、特徴的な“コンマ”形状を呈し、その見掛分子量はｐＨｉ値が塩性側に近ずくと共に減少する。
図１４は、二次元ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中抗原の分析結果を示す。即ち、乳房表皮ＮＰ４０抽出物中の蛋白質をエタノールで沈降させ、ＩＥＦ（ｐＨｉ５〜８）とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）により分離し、ニトロセルロース上に移動させ、ＲＡ患者血清及び対照血清について免疫検出した。質量及びｐＨｉ値の両方につて抗原の異質性が相当にみとめられたが、これはイソフォルム（isoform）が変化したためと思われ、また抗原をグリコシレート化又はフォスフォリル化することの可能性を示唆するものである。しかし、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦによる処理は、泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫反応性の何れも変化させるものではなかった。
Ｂ  −  抗原の水溶解度
５cm2乳房表皮を、緩衝剤Ａ又はＢ中で、機械的方法で粉砕した。得られたホモジネートを１０、０００ｇで１０分間遠心分離した。２つの上澄中の溶解蛋白質をそれぞれ同量エタノールで沈降させ、自然状態下ＰＡＧＥ（８〜２５％）により分離し、ニトロセルロース上に移動させ、ＲＡ患者血清及び対照血清について免疫検出した。この試験により、抗原は洗浄剤（緩衝剤Ａ）の存在下のみならず、その不存在下におても抽出されることが判明した。加えて、抗原は常に溶解分屑中に主に存在し、ペレット中には非常に少量存在することも判った。これらの結果は、ラットの食道上皮と同様に、ヒト抗原が非常に高い水溶性を有する分子であることを示すものである。
Ｃ  −  種々の解剖学的部位の表皮抗原の表出
腹部表皮及び包皮表皮のＮＰ４０抽出物中の蛋白質の免疫検出により、ＲＡに係わる抗原は、性や採取部位（胸部、腹部又は包皮）、年齢（幼児又は成人）の如何に係わらず、ヒトの表皮に存在することが判る。抗原は角質層に存在することが組織学的に認識されていることから、抗原の豊富さは角質層の厚さ（解剖学的部位により異なる）に依存するという所見は正当性を有する。
Ｄ  −  抗原の同定
ＲＡ患者の血清により認識される抗原はヒトの表皮サイトケラチンではない。
図１５は、次のことを表すものである：
−  図１５（ａ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜２５％）及びニトロセルロース上への移動後、ＲＡ患者の血清について免疫検出した乳房表皮のＮＰ４０抽出物；レーン１は抽出緩衝剤により事前培養したもの、レーン２は抽出物自体により事前培養したもの、レーン３は表皮サイトケラチンを濃縮した不溶性分屑により事前培養したものである
−  図１５（ｂ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜２５％）及びニトロセルロース上への移動後、抗サイトケラチンＭＡｂ  Ｆ１２−１９について免疫検出した尿素溶解サイトケラチン；レーン１は抽出緩衝剤により事前培養したもの、レーン２は表皮抽出物により事前培養したもの、レーン３はサイトケラチンを濃縮した分屑により事前培養したものもの、レーン４は尿素溶解サイトケラチンで事前培養したものである
−  図１５（ｃ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８−２５％）分離移動後、抗サイトケラチンＭＡｂ  Ｆ１２−１９について免疫検出した蛋白質；レーン５は表皮抽出物中のもの、レーン６はサイトケラチンを濃縮した分屑中のもの、レーン７は純粋尿素溶解サイトケラチン中のもの
ＲＡ患者の血清の反応性は表皮チトケラチン（濃縮化又は精製されたもの）による事前培養によって抑制されなかったが、皮膚の水溶性抽出物の存在下では消失した。同様に、単クローナル抗体Ｆ１２−１９は抗原抽出物のいかなる蛋白質も免疫移動において認識しなかった。
二次元ゲルにおける抗原の特徴的“コンマ”形状及びそのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける見掛分子量は、表皮の変異により顆粒層に現れる蛋白質であるフィラグリニン（ＳＡＲＲＥＴ等、Path.Biol．３７：２９７−３０３、１９８９）のものと同様である。故に、本発明者等は、フィラグリンと本発明の抗原とは同一であるか否か、またＲＡ患者の血清に抗フィラグリン自己抗体が含まれているか否かについて、検討を加えた。
図１６は、乳房表皮の抽出物中の蛋白質の免疫移動分析の結果を示す。即ち、抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）分離（Ａ）又は自然状態下ＰＡＧＥ分離（Ｂ）又はＩＥＦ（ｐＨｉ３−９）分離（Ｃ）し、ニトロセルロース上に移動した後、ＲＡ患者血清（レーン１、３、６、７及び８）、抗フィラグリンＭＡｂ  ＡＫＨ−１（レーン２）、対照ＭＡｂ（レーン４）及び対照血清（レーン５）について、免疫検出した。得られた蛋白質を、ＮＥｐＨＧＥに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８−２５％）により３分割し（Ｄ）、ニトロセルロース上に移動した後、ポンソーレッドで染色した（ａ）、又は単クローナル抗体ＡＫＨ−１について免疫検出した（ｂ）或いはＲＡ患者血清について免疫検出した（ｃ）。特徴的な“コンマ”形状により抗原が認識可能である。
抗ヒト・フィラグリン単クローナル抗体は、ＮＰ４０の存在下で溶解する、非自然下又はひ自然状態下における電気泳動においてＲＡ抗原と同じ泳動挙動を呈するヒト表皮蛋白質を、免疫移動において特異的に認識する。ＩＥＦ及び二次元ゲル処理後、抗原とＡＫＨ−１により免疫移動認識された蛋白質とは同一の分析結果が得られる。
次に、本発明者等は、単クローナル抗体ＡＫＨ−１がＮＰ４０中の表皮抽出物から抗原を免疫沈降できるか否かについて、検討した。
図１７は、プロテインＡ−セファロース上に事前吸着したＮＰ４０表皮抽出物中の蛋白質の比較分析結果を示す。蛋白質は、ＭＡｂ  ＡＫＨ−１による免疫沈降の前（図１７において“Total”で示す）、又はＭＡｂ  ＡＫＨ−１による免疫沈降の後（図１７において“Ｉｐ  ＡＫＨ１”で示す）、又は対照ＭＡｂ  ＡＫＨ−１による免疫沈降の後（図１７において“Ｉｐ  Ｇ３６”で示す）に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ８１２．５％）により分離された。ニトロセルロース上への移動の後、これらの蛋白質は抗体ＡＫＨ−１及びＧ３６、ＲＡ患者血清（ＲＡ）、対照血清（ＣＯ）、又は抗―鼠Ｉｇ（Ｃ0ｍ）及び抗―ヒトＩｇ（Ｃ0ｈ）二次抗体について免疫検出した。Ｇ３６で免疫沈降された上澄分屑（図１７において“Surn  Ｇ３６”で示す）及びＡＫＨ−１で免疫沈降された上澄分屑（図１７において“Surn  ＡＫＨ−１”で示す）に存在する蛋白質は、ＴＣＡ沈降後に、同じ方法で分析された。
上記分析結果から、ＡＫＨ−１がＲＡ抗原と同じ分子量の表皮蛋白質を実際に免疫沈降させ、この分子がＲＡ患者血清によって免疫移動において特異的に認識されることが判明した。この免疫沈降は、２角蛋白質）（フィラグリンと抗原間の結合による共免疫沈降の可能性を低下させる１Ｍ  ＮａＣｌの存在下で行われた。更に、ＡＫＨ−１で認識される抽出蛋白質とＲＡ患者血清で認識される抽出蛋白質とが同一であることを確認するために、抗フィラグリンＭＡｂの免疫沈降上澄をＲＡ患者血清の免疫移動により分析した。図１７は、抽出物が抗原及びフィラグリンに対して、抗原フィラグリンによって消耗（部分的又は全体的に）してしまったことを示している。一方、ＲＡ患者血清は抗原を認識しなかった。この否定的結果は自己抗原の親和性の低さ、血清中の抗体の量が少な過ぎること、又は抗体が自然状態の抗原を認識出来ないこと、に因るものと思われる。抗原が自然状態下電気泳動後にニトロセルロース上で免疫検出出来ることからして、最後の仮定は考えられない。
フィラグリンとＲＡ抗体が、少なくとも、ＭＡｂ  ＡＫＨ−１で検出されるエピトープを共通に持っていることを確認するために、抗原を移動薄膜からの溶離により精製した。図１８は、この精製の間に行われた、種々の蛋白質分屑のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫移動分析の結果を示す。ヒト表皮抽出物中の全蛋白質（レーン１）、ＴＣＡによる抽出物沈降後の溶解性蛋白質（レーン２）及び最終精製抗原分屑中の蛋白質（レーン３）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）分離され、ニトロセルロース上に移動され、アミドブラック（“Amido”）で染色、又はＲＡ患者血清（ＲＡ）、対照血清（Ｃｏ）、抗フィラグリンＭＡｂ（ＡＫＨ−１）及び対照ＭＡｂ（Ｇ３６）について免疫検出した。
ＲＡ患者血清もまたヒト・フィラグリンを認識し、従ってヒト・フィラグリンが抗原と密接に関係していることを確認するために、本発明者等はＬＩＮＬＥＹ及びＤＡＬＥ（ＢＢＡ７７４：２８−３５、１９８３）が記述している方法でフィラグリンを精製した。図１９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）分析され、ニトロセルロース上に移動後、ＲＡ患者血清（レーン１〜４）、対照血清（レーン５）、対照ＭＡｂ（レーン６）及びＭＡｂ  ＡＫＨ−１（レーン７）について免疫検出、又はポンソーレッドにより染色（レーン８）した。図１９は、ＲＡ血清がヒト・フィラグリンを特異的に認識することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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