(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギ染色体の少なくとも一部の導入が試みられたコムギから取得したＤＮＡを鋳型とし、下記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載のプライマーセットを用いて増幅反応を行い、当該オオムギの１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られるか否かにより、上記コムギの稔性の有無を判定する稔性判定方法。
（ｄ）オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであって、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット。
（ｅ）オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであって、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット。
（ｆ）オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであって、配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット。
【請求項２】
下記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載のプライマーセットを含んでなり、オオムギ染色体の少なくとも一部が導入されたコムギの稔性の有無を判定するための稔性判定用キット。
（ｄ）オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであって、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット。
（ｅ）オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであって、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット。
（ｆ）オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであって、配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オオムギ染色体（特に、１Ｈ染色体長腕）由来の核酸マーカーを、コムギの背景で検出するための新規なプライマーセット、およびその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コムギとオオムギとの属間交雑は、有用遺伝子をコムギに導入する有力な方法の１つである。特に、近年、交雑法の改良や交雑成功率の高い遺伝子型の発見により、オオムギは、コムギの品種改良用の遺伝資源としてより一層注目されるようになった。
【０００３】
重要な穀物でもあるオオムギのゲノム研究は世界的規模で進められており、これにあわせてオオムギ染色体上にある核酸マーカーの研究も盛んに行われている。例えば、最近の研究では、Kunzelらが、マイクロダイセクションで単離したオオムギ転座染色体と特異的ＳＴＳ(sequence tagged site)プライマーとを用いるＰＣＲ(polymerase chain reaction) により、Igri×FrankaのＲＦＬＰ(restriction fragment length polymorphism)地図に転座点や核酸マーカーの情報を統合した細胞遺伝学地図を作成している(Genetics,154:p397-412,2000)。
【０００４】
オオムギ染色体上に位置づけられた核酸マーカーは、当該染色体上にある遺伝子のマッピングに有用である。加えて、オオムギを遺伝資源として用いるコムギの品種改良において、有用遺伝子導入の成否を判定する目的等にも利用できる可能性がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、オオムギ染色体由来の核酸マーカーの全てが、コムギの背景(genetic background:遺伝的背景と同義) でもそのまま使用できるとは限らない。それは、オオムギとコムギとが同じコムギ連に属する近縁植物であるため、コムギのゲノムＤＮＡの影響を受け易いからである。例えば、核酸マーカーがＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) マーカーである場合、コムギのゲノムＤＮＡおよびオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とし、同一のプライマーセットを用いて増幅反応を行えば、両者間でほぼ同サイズの増幅産物が得られることがしばしばある。このような現象はオオムギとコムギとの間でＰＣＲ増幅の結果に多型をもたらさないので、オオムギ由来の上記核酸マーカーをコムギの背景で検出することができなくなる。特に、コムギの中でも４倍体、６倍体コムギは、オオムギと比較してゲノムサイズが著しく大きいため、このような現象が起こる可能性がより高くなる。
【０００６】
そのため、オオムギ染色体（特に有用遺伝子が座乗する遺伝子座）をコムギに効率よく導入するためには、コムギの背景で検出可能なオオムギ染色体由来の核酸マーカー、および当該マーカーを検出するための新規なプライマーセットの開発が不可欠である。また、この核酸マーカーをオオムギ内で検出するためのプライマーセットが公知である場合でも、当該マーカーをコムギの背景で検出するためには、新規なプライマーセットを設計する必要が生じる。
【０００７】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、オオムギの遺伝子を用いたコムギの品種改良などに利用が可能な新規なプライマーセット、当該プライマーセットにより増幅される核酸マーカー、およびその利用方法などを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、オオムギ染色体（特に、１Ｈ染色体長腕）由来の核酸マーカーを、コムギの背景で検出するための新規なプライマーセットについて鋭意検討した。その結果、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする場合と、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする場合とで、増幅結果に有意な多型が認められる複数の新規なプライマーセットを見出した。さらに、これら新規なプライマーセットの中に、コムギの背景において不稔をもたらす因子（以下、不稔因子または不稔遺伝子と称する）と連鎖した核酸マーカーを増幅するものを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明に係る新規プライマーセットは、上記の課題を解決するために、下記（ａ）ないし（ｃ）の何れか一つに示される、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するためのプライマーセットであることを特徴としている。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット（プライマーセットＡと称する）、
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット（プライマーセットＢと称する）、
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット（プライマーセットＣと称する）。
【００１０】
また、本発明に係る他の新規プライマーセットは、上記の課題を解決するために、下記（ｄ）に示す、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであることを特徴としている。
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット（プライマーセットＤと称する）。
【００１１】
本発明に係るさらに他の新規プライマーセットは、上記の課題を解決するために、下記（ｅ）に示す、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであることを特徴としている。
（ｅ）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット（プライマーセットＥと称する）。
【００１２】
本発明に係るさらに他の新規プライマーセットは、上記の課題を解決するために、下記（ｆ）に示す、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットであることを特徴としている。
（ｆ）配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセット（プライマーセットＦと称する）。
【００１３】
上記のプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の何れかを用いたＰＣＲを行えば、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合と、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合とで増幅結果に有意な多型が認められる。また、後述するが、これらプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも、オオムギの１Ｈ染色体長腕の特定領域に位置づけられた核酸マーカーを増幅することが判明している。
【００１４】
よって、上記新規なプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーを、コムギの背景で検出する目的で使用することができ、より具体的には、例えば、当該１Ｈ染色体長腕の特定領域（特定の遺伝子座）がコムギの細胞内に導入されているか否かを効率的に判定することが可能となる。
【００１５】
特に、プライマーセット（Ｄ）〜（Ｆ）は、上記１Ｈ染色体長腕にある不稔因子（コムギ背景でのみ作用）と連鎖した核酸マーカーを増幅することが判明しているので、オオムギ染色体の導入が試みられたコムギを対象として、その稔性の有無を判定することが可能となる。
【００１６】
本発明に係る核酸マーカーは、上記の課題を解決するために、上記何れかの新規プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）により増幅される、コムギの背景で検出が可能なオオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーであることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る染色体導入の成否判定方法は、上記の課題を解決するために、オオムギ染色体の少なくとも一部の導入が試みられたコムギから取得したＤＮＡを鋳型とし、上記何れかのプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）を用いて増幅反応を行い、当該オオムギの１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られるか否かにより、当該１Ｈ染色体長腕が上記コムギに実際に導入されているか否かを判定することを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るコムギの稔性判定方法は、上記の課題を解決するために、オオムギ染色体の少なくとも一部の導入が試みられたコムギから取得したＤＮＡを鋳型とし、上記何れかのプライマーセット（Ｄ）〜（Ｆ）を用いて増幅反応を行い、当該オオムギの１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られるか否かにより、上記コムギの稔性の有無を判定することを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る染色体導入の成否の判定用キットは、上記の課題を解決するために、上記何れかのプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）を含んでなり、オオムギ染色体の少なくとも一部の導入が試みられたコムギにおいて、当該オオムギの１Ｈ染色体長腕が導入されているか否かを判定するためのキットであることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係るコムギの稔性判定用キットは、上記の課題を解決するために、上記何れかのプライマーセット（Ｄ）〜（Ｆ）を含んでなり、オオムギ染色体の少なくとも一部が導入されたコムギの稔性の有無を判定するためのキットであることを特徴としている。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、図１〜図１２を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、特にこの記載に限定されるものではない。
【００２２】
１．本発明に係るプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）
本発明に係るプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも、オオムギ（学名：Hordeum vulgare）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲに供されると、オオムギ１Ｈ染色体（以下、単に１Ｈ染色体と称する）長腕の特定領域内に位置づけられた核酸マーカー（ここでは、ＰＣＲマーカーと同義）に特異的なＰＣＲ増幅産物を産生する、新規なＰＣＲプライマーセットである。加えて、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合と、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合とでＰＣＲ増幅結果に有意な多型が認められる、いわば、１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なＰＣＲプライマーセットである。
【００２３】
よって、上記新規なプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも、１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーを、コムギの背景で検出する目的で使用することができ、より具体的には、例えば、当該１Ｈ染色体長腕の特定領域（特定の遺伝子座）がコムギの細胞内に導入されているか否かを、効率的に判定することが可能となる。特に、プライマーセット（Ｄ）〜（Ｆ）は、１Ｈ染色体長腕にある不稔因子（コムギ背景でのみ作用）と連鎖した核酸マーカーを増幅することが判明しているので、オオムギ染色体の導入が試みられたコムギを対象として、その稔性の有無を判定することが可能となる。
【００２４】
以下、新規なプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）について、その構成（塩基配列）、および、増幅対象となる１Ｈ染色体上の核酸マーカー、などを順に説明する。
【００２５】
プライマーセット（Ａ）は、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるＰＣＲプライマーセットである。プライマーセット（Ａ）は、オオムギゲノム上の核酸マーカーGlb1（Wolfら：Mol. Gen. Genet. 234, p33-42, 1992）が座乗する遺伝子座の一部（本発明にかかる核酸マーカー（Ａ））を増幅するものであり、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約900bpの増幅産物（核酸マーカー（Ａ））を生じさせる一方で、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは増幅産物を全く生じさせない。なお、図１〜図３は、核酸マーカーGlb1周辺のゲノムＤＮＡ塩基配列を示すものであり、この塩基配列中で下線が付された２領域が上記プライマーセット（Ａ）に相当し、この２領域を両端とする連続した二本鎖ポリヌクレオチド（904bp）が核酸マーカー（Ａ）に相当する。また、言うまでもないが、増幅される核酸マーカー（Ａ）のサイズは、オオムギの個体毎に多少の変動がある。核酸マーカー（Ａ）は、セントロメアから３０％〜４７％の範囲内にある１Ｈ染色体長腕上に位置する（実施例参照）。
【００２６】
なお、核酸マーカーの位置は、１Ｈ染色体長腕の全長を１００％として、セントロメアからの距離を百分率（％）で示すこととする。
【００２７】
プライマーセット（Ｂ）は、配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるＰＣＲプライマーセットである。プライマーセット（Ｂ）は、オオムギゲノム上の核酸マーカーBCD386（Kunzel：データベースGrain Genes）が座乗する遺伝子座の一部（本発明にかかる核酸マーカー（Ｂ））を増幅するものであり、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは、制限酵素HaeIIIの認識サイトを持たない約700bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｂ））を生じさせる一方で、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは制限酵素HaeIIIの認識サイトを持つ約700bpの増幅産物を生じさせる（オオムギとコムギとの間での制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ））。なお、図４は、核酸マーカーBCD386周辺のｃＤＮＡ塩基配列（すなわちイントロンを除く塩基配列）を示すものであり、この塩基配列中で下線が付された２領域が上記プライマーセット（Ｂ）に相当する。また、言うまでもないが、増幅される核酸マーカー（Ｂ）のサイズは、オオムギの個体毎に多少の変動がある。核酸マーカー（Ｂ）は、セントロメアから３０％〜４７％の範囲内にある１Ｈ染色体長腕上に位置する（実施例参照）。
【００２８】
プライマーセット（Ｃ）は、配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるＰＣＲプライマーセットである。プライマーセット（Ｃ）は、オオムギゲノム上の核酸マーカーMWG943（Kunzelの私信による）が座乗する遺伝子座の一部（本発明にかかる核酸マーカー（Ｃ））を増幅するものであり、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約1080bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｃ））を生じさせる一方で、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約1110 bpの増幅産物を生じさせる。なお、図５は、核酸マーカーMWG943周辺のゲノムＤＮＡ塩基配列を示すものであり、この塩基配列中で下線が付された２領域が上記プライマーセット（Ｃ）に相当し、「・・・」は配列不明なギャップに相当する。また、言うまでもないが、生じる増幅産物のサイズは、オオムギまたはコムギの個体毎に多少の変動があるが、両者間の多型の検出に影響のでない程度である。核酸マーカー（Ｃ）は、セントロメアから７２％〜８２％の範囲内にある１Ｈ染色体長腕上に位置する（実施例参照）。
【００２９】
プライマーセット（Ｄ）は、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるＰＣＲプライマーセットである。プライマーセット（Ｄ）は、オオムギゲノム上の核酸マーカーJrg12（Leeら：Planta 199:p625-632）が座乗する遺伝子座の一部（本発明にかかる核酸マーカー（Ｄ））を増幅するものであり、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約390bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｄ））を生じさせる一方で、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは増幅産物を全く生じさせない。なお、図６は、核酸マーカーJrg12周辺のｃＤＮＡ塩基配列を示すものであり、この塩基配列中で下線が付された２領域が上記プライマーセット（Ｄ）に相当し、この２領域を両端とする連続した二本鎖ポリヌクレオチド（386bp）が核酸マーカー（Ｄ）に相当する。また、言うまでもないが、増幅される核酸マーカー（Ｄ）のサイズは、オオムギの個体毎に多少の変動がある。核酸マーカー（Ｄ）は、セントロメアから４７％〜７２％の範囲内にある１Ｈ染色体長腕上に位置する（実施例参照）。
【００３０】
プライマーセット（Ｅ）は、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるＰＣＲプライマーセットである。プライマーセット（Ｅ）は、オオムギゲノム上の核酸マーカーHor3（Sorensenら：Mol. Gen. Genet. 250, 750-760(1996)）が座乗する遺伝子座の一部（本発明にかかる核酸マーカー（Ｅ））を増幅するものであり、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約900bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｅ））を生じさせる一方で、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは増幅産物を全く生じさせない。なお、図７，８は、核酸マーカーHor3周辺のゲノムＤＮＡ塩基配列を示すものであり、この塩基配列中で下線が付された２領域が上記プライマーセット（Ｅ）に相当し、この２領域を両端とする連続した二本鎖ポリヌクレオチド（904bp）が核酸マーカー（Ｅ）に相当する。また、言うまでもないが、増幅される核酸マーカー（Ｅ）のサイズは、オオムギの個体毎に多少の変動がある。核酸マーカー（Ｅ）は、セントロメアから４７％〜７２％の範囲内にある１Ｈ染色体長腕上に位置する（実施例参照）。
【００３１】
プライマーセット（Ｆ）は、配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるＰＣＲプライマーセットである。プライマーセット（Ｆ）は、オオムギゲノム上の核酸マーカーgB19.1b（Stacyら：Plant Mol. Biol. 28, 1039-1054(1995)）が座乗する遺伝子座の一部（本発明にかかる核酸マーカー（Ｆ））を増幅するものであり、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは約570bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｆ））を生じさせる一方で、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは増幅産物を全く生じさせない。なお、図９，１０は、核酸マーカーgB19.1b周辺のゲノムＤＮＡ塩基配列を示すものであり、この塩基配列中で下線が付された２領域が上記プライマーセット（Ｆ）に相当し、この２領域を両端とする連続した二本鎖ポリヌクレオチド（570bp）が核酸マーカー（Ｆ）に相当する。また、言うまでもないが、増幅される核酸マーカー（Ｆ）のサイズは、オオムギの個体毎に多少の変動がある。核酸マーカー（Ｆ）は、セントロメアから４７％〜７２％の範囲内にある１Ｈ染色体長腕上に位置する（実施例参照）。
【００３２】
また、上記のプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも、公知の方法により容易に合成可能な一対のオリゴヌクレオチドからなるので、その製造方法についての説明は省略する。
【００３３】
なお、本発明のプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）により増幅される核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）のうち、核酸マーカー（Ｂ），（Ｃ）については、オオムギ中でこれをＰＣＲ増幅するためのＳＴＳ(sequence tagged site)プライマーがすでにKunzelらにより公表されている(Genetics,154:p397-412,2000など)。しかし、このＳＴＳプライマーを用い、コムギ×オオムギ雑種のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うと、得られる増幅産物はオオムギとの間で違い（多型）を示さない。つまり、上記ＳＴＳプライマーは、コムギの背景でオオムギの染色体を検出する目的（本発明の目的）に利用できないことが判明している。
【００３４】
また、核酸マーカー（Ａ）、（Ｄ）、（Ｅ）については、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）を利用してオオムギの遺伝地図上には既にマッピングされていた。しかし、これらオオムギ由来の核酸マーカーを検出するためのＰＣＲプライマーについては、コムギの背景で使用可能なものはおろか、オオムギ中で使用可能なものすら報告がなされていない。なお、核酸マーカー（Ｆ）については、これを検出するためのＰＣＲプライマーの設計や、ＲＦＬＰを利用したマッピングなどに関する報告がなされていない。
【００３５】
２．プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の用途
前記のように、本発明にかかるプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）は、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲと、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲとで、増幅結果に有意な多型が認められる、いわば、１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なＰＣＲプライマーセットである。また、実施例にて後述するように、オオムギの１Ｈ染色体長腕（一部）が導入されたコムギから取得したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の一つを用いて増幅反応を行えば、当該１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られることも確認済である。
【００３６】
すなわち、これらプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）は、例えば、１）オオムギ染色体の少なくとも一部の導入が試みられたコムギ（形質転換コムギ）から取得したＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の少なくとも一つを用いて増幅反応を行い、当該オオムギの１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られるか否かにより、この１Ｈ染色体長腕が上記コムギの細胞に実際に導入されているか否かを判定する目的で利用可能であり、その他、２）オオムギ染色体の少なくとも一部の導入が試みられたコムギ（形質転換コムギ）から取得したＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーセット（Ｄ）〜（Ｆ）の少なくとも一つを用いて増幅反応を行い、オオムギの１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られるか否かにより、上記コムギの稔性の有無を判定する目的で利用可能である。以下、プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の具体的な用途・利用条件・用語の定義などについて詳細に説明を行う。
【００３７】
（用語の定義）
本発明において「オオムギ」とは、「Hordeum vulgare（学名）」と称される植物全般を指すものとする。この理由として、「Hordeum vulgare（学名）」の主要３系統である二条オオムギ（ヤバネオオムギとも称される：Hordeum vulgare ssp. vulgare）、六条オオムギ（Hordeum vulgare ssp. vulgare）、野生型オオムギHordeum vulgare ssp. spontaneumは、互いにゲノム構成が極めて類似しており、また、本発明にかかるプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）が異なる系統で共通に使用できることを確認済であることが挙げられる（実施例参照）。
【００３８】
本発明において「コムギ」とは、特に好ましくは六倍体の普通系コムギTriticum aestivumを指すが、Triticum aestivumと一部重複した遺伝的背景を有するコムギであって、かつ、その細胞内にオオムギ染色体を導入可能なもの（オオムギ染色体による形質転換が可能なコムギ）であれば、特にTriticum aestivumのみに限定されない。すなわち、「コムギ」には、例えば、六倍体のジュコブスキー系コムギ（T. zhukovsky）、四倍体コムギ（T. turgidum, T. timopheevi）、二倍体コムギT. monococcum、タルホコムギ(Triticum taushii(別名Aegilops squarrosa))も含まれる。このような「コムギ」では、オオムギ・コムギ間で多型が見られるＰＣＲ増幅結果が得られると期待される。
【００３９】
なお、Triticum aestivumを除くコムギの中では、上記普通系コムギのＡおよびＢゲノムの提供親であるTriticum turgidumや、普通系コムギのＤゲノムの提供親であるタルホコムギがより好ましく、中でも、品種改良の対象とされる栽培コムギであるという点や、二倍体と比較して異種染色体添加への耐性がより高いという点でTriticum turgidumが特に好ましい。
【００４０】
本発明において「形質転換コムギ」とは、コムギ×オオムギ間の交配（戻し交雑なども含む）、または、遺伝子工学的手法により、細胞内にオオムギ染色体の少なくとも一部の導入が試みられた上記「コムギ」を指すものとする。すなわち、「形質転換コムギ」には、オオムギ染色体により実際に形質転換されたものはもちろん、形質転換が試みられたが失敗したものも含まれる。また、「形質転換コムギ」の範疇には、交配により作出された植物体（雑種コムギ）およびその子孫；根、茎、葉、生殖器官（花器官および種子を含む）などの各種器官；各種組織；細胞；などが含まれ、さらにはプロトプラスト、スフェロプラスト、誘導カルス、カルスからの再生個体およびその子孫、なども含まれるものとする。
【００４１】
なお、上記「遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）」とは、コムギの細胞内に異種染色体（遺伝子）を導入するために確立された公知の手法を指すものとする。具体的には、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポソーム法、適切なベクター系を用いた導入法、などが挙げられる。
【００４２】
（形質転換コムギからのＤＮＡの取得、および、プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）を用いたＰＣＲ増幅）
前記形質転換コムギについて、１）オオムギ１Ｈ染色体長腕が導入されているか否かを判定する目的で、あるいは、２）当該形質転換コムギの稔性の有無を判断する目的でＰＣＲ増幅を行う際には、まず、鋳型となる形質転換コムギの全ゲノムＤＮＡを抽出する（ＤＮＡ抽出工程）。この工程には、例えば、ＣＴＡＢ法（細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ７  植物のＰＣＲ実験プロトコール34〜40頁（秀潤社(2000年)）、およびMurrayら(Nucleic Acids Res.,8:p4321-4325,1980)参照）など公知のＤＮＡ抽出法を採用することができる。
【００４３】
また、上記全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかを用いてＰＣＲ増幅を行う際（ＰＣＲ増幅工程）の反応条件も、通常の条件に従って行えばよい(Saiki, Science, 230, 1350-1354(1985);PCR テクノロジー、宝酒造（株）1990年発行; 等参照)。より具体的には、標的二本鎖ＤＮＡ（鋳型を含む）の熱変性工程は、９０℃〜９６℃、より好ましくは９４℃〜９６℃の温度範囲内で、約１分間〜３分間、より好ましくは約１分間〜２分間行えばよい。また、プライマーのアニーリング工程は、４０℃〜６０℃、より好ましくは５０℃〜６０℃の温度範囲内で、約１分間〜３分間、より好ましくは約１分間〜約２分間行えばよい。さらに、ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長工程は、７０℃〜７４℃、より好ましくは７２℃〜７４℃の温度範囲内で、約１分間〜４分間、より好ましくは約２分間〜３分間行えばよい。
【００４４】
上記熱変性工程、アニーリング工程、および鎖伸長工程を一サイクルとするＰＣＲのサイクル数も特に限定されないが、通常は２０〜４０サイクル、より好ましくは２５〜３５サイクル行えばよい。その他、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類（Taq ポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼ）・量、試薬の種類・量などは従来と同様であり、詳細な説明を省略する。
【００４５】
形質転換コムギの細胞内に１Ｈ染色体長腕が実際に導入されていれば、プライマーセット（Ａ），（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）のいずれかを用いてＰＣＲ増幅工程を行った場合、１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物のみが生成する。また、プライマーセット（Ｃ）を用いた場合には、１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物と、コムギのゲノムＤＮＡに特異的な増幅産物とが生成するが、両者のサイズには明確な相違（多型）が認められる。よって、得られた増幅産物のサイズを特定する手法、例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られているか否かを判定する（１Ｈ染色体由来の増幅産物（増幅断片）の検出工程）。なお、電気泳動の条件などは一般的な条件に従えばよいので、詳細な記述は省略する（新臨床医のための分子医学シリーズ「よく分かる遺伝子工学」p27-31:羊土社発行(2000年)など参照）。
【００４６】
一方、プライマーセット（Ｂ）を用いてＰＣＲ増幅工程を行った場合には、１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物と、コムギのゲノムＤＮＡに特異的な増幅産物との間に実質的なサイズの相違が認められない。ただし、両増幅産物の間には、制限酵素HaeIIIにより検出可能なＲＦＬＰが認められるので、当該制限酵素による増幅産物の消化を行った後に、電気泳動などに供すればよい（１Ｈ染色体由来の増幅産物（増幅断片）の検出工程）。
【００４７】
つまり、増幅産物の検出工程において、１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が認められると、形質転換コムギの細胞内に１Ｈ染色体長腕（少なくとも一部）が導入されたと確認され、一方、当該増幅産物が認められないと１Ｈ染色体長腕が導入されていないと確認される。そして、当該１Ｈ染色体長腕の導入確認方法を採用すれば、例えば、比較的低い頻度でしか起こらないコムギへのオオムギ１Ｈ染色体長腕導入株（形質転換コムギの実用系統）を効率よく選抜することができる。
【００４８】
また、前記核酸マーカー（Ａ）・（Ｂ）（第一群）、核酸マーカー（Ｃ）（第二群）、核酸マーカー（Ｄ）・（Ｅ）・（Ｆ）（第三群）は、１Ｈ染色体長腕の異なる領域内に位置づけられているので（図１１参照）、異なる群に分類される核酸マーカーを増幅する二以上のプライマーセットを併用して、標的遺伝子を含むできるだけ小さな１Ｈ染色体断片が導入された形質転換コムギ（実用系統）を早期に選抜し、育成することが可能となる。
【００４９】
さらに、増幅産物の検出工程において、プライマーセット（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）により１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られた場合には、試験に供された形質転換コムギは高確率で不稔である（実施例参照）。これは、核酸マーカー（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）が座乗する１Ｈ染色体上の領域に、コムギの背景において雄性不稔を引き起こす遺伝因子が存在するためと考えられる。よって、プライマーセット（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）により１Ｈ染色体長腕に特異的な増幅産物が得られるか否かで、形質転換コムギが稔性を有するか否かを判別可能となる。よって、例えば、稔性を有する形質転換コムギのみを早期（例えば、幼苗期）に選別可能となる。
【００５０】
（本発明にかかるプライマーセットを含んでなるキット）
すでに説明のように、前記プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも、オオムギの１Ｈ染色体長腕（その一部を含む）が、コムギの細胞内に導入されているか否かを判定する際に使用できる。よって、これらプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかを用いれば、「コムギ背景における１Ｈ染色体長腕導入の成否判定用キット（キットＡ）」を構築可能となる。また、プライマーセット（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）はいずれも、得られた形質転換コムギの稔性の有無を予断する際に使用できる。よって、これらプライマーセット（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）のいずれかを用いれば、「形質転換コムギの稔性判定用キット（キットＢ）」を構築可能となる。
【００５１】
なお、上記キットＡ・Ｂは、必要なプライマーセットの他に、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（Taq  ＤＮＡポリメラーゼ）、反応緩衝液、ｄＮＴＰs溶液など、ＰＣＲに必須の試薬を組み合わせて構成すればよい。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではない。また、転座染色体の記載に用いたオオムギ染色体の番号は、Hereditas,126:p1-16(1997)に記載のLinde-Laursenらの表記法に従った。
【００５３】
（１）コムギの背景で検出可能な核酸マーカーのスクリーニング
オオムギ１Ｈ染色体由来の核酸マーカーの中から、コムギの背景で検出可能なものをスクリーニングした。具体的には、Blakeらの文献(Theor Appl Genet,93:p826-832,1996)、Sayed-Tabatabaeiらの文献(Barley Genetics Newsletter,28:p15-18,1998)、Kunzelらの文献(Genetics,154:p397-412,2000)、Liuらの文献(Theor Appl Genet,93:p869-876,1996)、およびRamseyらの文献(Genetics,156:p1997-2005,2000)に報告されたＰＣＲマーカーについて、当該文献に記載された約５０のプライマーセット（オオムギのゲノムＤＮＡ用）をそのまま用いてコムギの背景で検出可能か否かの検定を行った。
【００５４】
スクリーニングの方法を以下に簡潔に記す。まず、上記文献に記載された核酸マーカーに係るＰＣＲプライマーセットを委託合成した。次に、コムギ親（Triticum aestivumの一品種「新中長」）、オオムギ親（H.spontaneum(岡山大学資源生物科学研究所  大麦・野生植物資源研究センターの登録系統番号：OUH602)）、コムギ親にオオムギ１Ｈ染色体短腕を添加したもの（短腕添加体と称する）、およびコムギ親にオオムギ１Ｈ染色体長腕を添加したもの（長腕添加体と称する）の計４系統のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。なお、文献に記載のＰＣＲ条件では増幅ができない場合、アニーリング温度の変更、各ステップの時間の変更などを行い、ＰＣＲの条件を最適化した。その後、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動して、コムギの背景で検出可能なＰＣＲマーカーをスクリーニングした。
【００５５】
この実験を上記約５０のプライマーセットについて行った結果、１Ｈ染色体上の核酸マーカーBCD1072, BCD454A, CD089, CD0312など（前記文献、及び図１１参照）を増幅するための１９のプライマーセットにおいて、コムギゲノムを鋳型とした場合とオオムギゲノムを鋳型とした場合とで増幅産物に多型が見られることが判明した。つまり、前記短腕添加体または長腕添加体のいずれかのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記１９のプライマーセットのいずれかを用いたＰＣＲでは、コムギゲノムに特異的な増幅産物とオオムギゲノム（１Ｈ染色体）に特異的な増幅産物との双方が得られた。なお、核酸マーカーBCD454A, CD089, CD0312については、コムギとオオムギとの間での多型を検出するために、増幅産物を適切な制限酵素で消化する必要があった。
【００５６】
また、図１１に示す核酸マーカーのうち、核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）に相当するGlb1,BCD386,MWG943,Jrg12,Hor3,gB19.1bについては、コムギの背景で検出できなかった。その理由は、核酸マーカー（Ｂ），（Ｃ）では、文献に公開されたＳＴＳプライマー（オオムギゲノム用）が、コムギ親とオオムギ親との間で増幅産物に多型（サイズ／ＲＦＬＰ）を与えないからであった。また、核酸マーカー（Ａ）,（Ｄ）,（Ｅ）,（Ｆ）では、これをオオムギ内で検出するためのプライマーセットすら公開されていないためであった。
【００５７】
（２）核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）をコムギ背景で検出するための新規プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の設計、およびスクリーニング
そこで、オオムギ１Ｈ染色体由来の核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）が座乗する遺伝子座をコムギの背景で検出するための、新規ＰＣＲプライマーセットの設計、およびスクリーニングを試みた。
【００５８】
まず、図１から図１０に示す塩基配列情報を元にプライマー設計用ソフトウェアPrimer 3(Whitehead Institute  社,USA)を使用して、核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）毎に、ＰＣＲプライマーセットの候補を数種類ずつ設計した。次いで、これらプライマーセットの候補から、コムギの背景でこれら核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）を再現性良く検出できるプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）を選抜した。
【００５９】
（３）形質転換コムギの作出
コムギ（Triticum aestivum）の一品種「新中長(Scnと表記する場合もある)」と、１Ｈ染色体の関与するオオムギ相互転座６系統T1H-2Haf、T1H-5Hag、TS36、T1H-6Hz、T1H-5HafおよびT1H-2Hah（花粉親）とを交配し、胚培養によってＦ１雑種を獲得した。胚培養は、文献（「Genes and Genest.Syst.,72:p101-106,1997」、「Theor. Appl. Genet,91:p1203-1209,1995」および「Euphytica 97:p91-96,1997」）に記載の方法により行った。
【００６０】
上記オオムギ相互転座系統のうちTS36を除く５系統は、栽培二条オオムギ(Hordeum vulgare ssp. vulgare)系統St.13559（St.13559と表記する場合もある）から誘発されたもので、Kunzelより分譲を受けたものである。TS36は、栽培六条オオムギ系統竹林茨城１号から誘発されたものである。なお、オオムギ相互転座系統T1H-2HafおよびT1H-2Hahは１Ｈ−２Ｈ染色体間において、オオムギ相互転座系統T1H-5HagおよびT1H-5Hafは１Ｈ−５Ｈ染色体間において、オオムギ相互転座系統T1H-6Hzは１Ｈ−６Ｈ染色体間において、オオムギ相互転座系統TS36は１Ｈ−２Ｈ染色体間において相互転座が発生した系統である。また、各オオムギ相互転座系統の転座点（図１１中では、系統名から「‐」を除いた名称を付す）の位置は図１１に示す通りであり、TS36を除いては、後述するＣ−バンド法によりKunzelらの報告を再確認したものである。
【００６１】
次いで、Ｆ１雑種（一回親）をコムギ（反復親）で戻し交雑した後代で、各相互転座系統に含まれる２種類の転座染色体の片方だけを持つ個体を、染色体分染法（Ｃ−バンド法）により選抜し、各転座染色体を個別にコムギに添加した形質転換コムギの１２系統（６×２）を育成した。Ｃ−バンド法（Ｃ−分染法）は、Giraldezらの方法(Z.Pflanzenzuchtg,83:p40-48,1979)を参考にして行った。
【００６２】
なお、以下の説明では、オオムギ相互転座系統T1H-2Hafが有する２種類の転座染色体をT1H2HafおよびT2H1Hafとする。転座染色体T1H2Hafは１Ｈ染色体上の転座点T1H2Hafよりも基部（セントロメア）側の断片を持つものであり、転座染色体T2H1Hafは転座点T1H2Hafよりも末端側の断片を持つものである。また、オオムギ相互転座系統T1H-5Hagが有する２種類の転座染色体をT1H5HagおよびT5H1Hagとする。転座染色体T1H5Hagは１Ｈ染色体上の転座点T1H5Hagよりも基部（セントロメア）側の断片を持つものであり、転座染色体T5H1Hagは転座点T1H5Hagよりも末端側の断片を持つものである。また、オオムギ相互転座系統T1H-6Hzが有する転座染色体をT1H6HzおよびT6H1Hzとする。転座染色体T1H6Hzは１Ｈ染色体上の転座点T1H6Hzよりも基部（セントロメア）側の断片を持つものであり、転座染色体T6H1Hzは転座点T1H6Hzよりも末端側の断片を持つものである。また、オオムギ相互転座系統T1H-5Hafが有する２種類の転座染色体をT1H5HafおよびT5H1Hafとする。転座染色体T1H5Hafは１Ｈ染色体上の転座点T1H5Hafよりも基部（セントロメア）側の断片を持つものであり、転座染色体T5H1Hafは転座点よりも末端側の断片を持つものである。また、オオムギ相互転座系統T1H-2Hahが有する２種類の転座染色体をT1H2HahおよびT2H1Hahとする。転座染色体T1H2Hahは１Ｈ染色体上の転座点T1H2Hahよりも基部（セントロメア）側の断片を持つもの、転座染色体T2H1Hahは転座点T1H2Hahよりも末端側の断片を持つものである。なお、オオムギ相互転座系統TS36が有する２種類の転座染色体は以下の説明に用いないため、特に名称を付さない。
【００６３】
図１２には、TS36に係るものを除く、供試した転座染色体のＣ−バンド法によるバンド像を示している。１Ｈ染色体が関与する転座染色体では、その末端側（図１１では各転座点より下側の領域）を含むものであるか、セントロメア側を含むものであるかの判別に、１Ｈ染色体上の三つのＣ−バンド（図１１、１２参照）を利用する。なお、図１２中「←」は各転座点を示すので、オオムギ相互転座系統T1H-2Haf、T1H-5Hag、T1H-6Hz、T1H-5Haf、あるいはT1H-2Hahが有する上下一組の転座染色体のうち上側に配されたものは、各転座点よりも基部側（セントロメア側）の１Ｈ染色体部分（転座染色体T1H2Haf，T1H5Hag，T1H6Hz，T1H5Haf，あるいはT1H2Hah）が添加された像を示し、下側に配されたものは各転座点よりも末端側の１Ｈ染色体部分（転座染色体T2H1Haf，T5H1Hag，T6H1Hz，T5H1Haf，あるいはT2H1Hah）が添加された像を示している。
【００６４】
なお、図１３は、オオムギ１Ｈ−２Ｈ染色体間での相互転座系統とコムギとを交配させて雑種を取得し、次いで、２種類の転座染色体が別途コムギに添加された形質転換コムギの系統をＣ−バンド法にて選抜し、育成するステップを模式的に示したものである。
【００６５】
（４）コムギの背景での核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）の検出
コムギの背景での核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）の検出は、以下のようにして行った。
【００６６】
はじめに、オオムギ染色体の導入が試みられたコムギ（形質転換コムギ）として、１）コムギ親「新中長(Scn)」にオオムギ１Ｈ染色体短腕を添加したもの(Scn+1HS''と表記)、２）コムギ親「新中長」にオオムギ１Ｈ染色体長腕を添加したもの(Scn+1HL'と表記)、３）オオムギ由来の転座染色体T1H2Haf、T2H1Haf、T1H5Hag、T5H1Hag、T1H6Hz、T6H1Hz、T1H5Haf、T5H1Haf、T1H2HahおよびT2H1Hahが個別に添加されたコムギの１０系統（前記（３）参照）、を準備した。また、他の植物試料として、コムギ「新中長」、栽培二条オオムギSt.13559、および野生型オオムギH.spontaneum(OUH602)、を準備した。
【００６７】
次いで、上記植物試料の葉身からＣＴＡＢ法により全ゲノムＤＮＡを抽出し、当該ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成は、全量を１５μｌとし、鋳型ＤＮＡ １０〜４０ｎｇ、１×バッファー（Applied Biosystems社  AmpliTaq Gold DNA polymeraseに添付）、AmpliTaq Gold DNA polymerase  ０．７５Ｕ、塩化マグネシウム２．５ｍＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、各プライマーセット３００ｎＭ、グリセロール１０％（ｖ／ｖ）となるように調製した。また、増幅反応は、Program Temp Control System PC-800（アステック社）を用いて、以下の表１に示す条件で行った。
【００６８】
【表１】
0004101493.tif 000002
【００６９】
なお、サイクル反応前の初期反応工程は９５℃で９分間、サイクル反応時の熱変性工程は９５℃で１分、鎖伸長工程の反応温度は７２℃であり、いずれの核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）を増幅する場合でも共通とした。また、ＰＣＲのサイクル反応後は７２℃で２分間静置し、次いで、増幅産物を含む反応液を４℃にて保存した。
【００７０】
次いで、得られた増幅産物を２％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドによって染色し、核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）を検出した。結果は表１および図１４・１５に示す。
【００７１】
なお、図１４・１５中、T1H-2Haf「p」、T1H-2Haf「d」は順に、転座染色体T1H2Haf、T2H1Hafが個別に添加されたコムギの系統を指す。また、T1H-5Hag「p」、T1H-5Hag「d」は順に、転座染色体T1H5Hag、T5H1Hagが個別に添加されたコムギの系統を指す。また、T1H-6Hz「p」、T1H-6Hz「d」は順に、転座染色体T1H6Hz、T6H1Hzが個別に添加されたコムギの系統を指す。また、T1H-5Haf「p」、T1H-5Haf「d」は順に、転座染色体T1H5Haf、T5H1Hafが個別に添加されたコムギの系統を指す。また、T1H-2Hah「p」、T1H-2Hah「d」は順に、転座染色体T1H2Hah、T2H1Hahが個別に添加されたコムギの系統である。すなわち、「ｐ」は転座点よりも基部（セントロメア）側の１Ｈ染色体部分が添加されたコムギの系統を指し、「ｄ」は転座点よりも末端側の１Ｈ染色体部分が添加されたコムギの系統を指す。また、図中の「M」は、サイズマーカーを示している。
【００７２】
表１および図１４に示すように、核酸マーカー（Ａ）を増幅するプライマーセット（Ａ）を用いたＰＣＲの場合、コムギ「新中長(Scn)」では増幅産物が得られず、一方、オオムギSt.13559, OUH602では約900bpの増幅産物が得られた。また、核酸マーカー（Ａ）を含む１Ｈ染色体領域が添加されたコムギScn+1HL',T1H-2Haf「d」,T1H-5Hag「p」,T1H-6Hz「p」,T1H-5Haf「p」,T1H-2Hah「p」では、いずれも約900bpの増幅産物（核酸マーカー（Ａ））が得られた。加えて、核酸マーカー（Ａ）は、転座点T1H2HafとT1H5Hagとの間の１Ｈ染色体長腕上に座乗することが分かる。この理由は、転座点T1H2Hafが関与する転座染色体が添加されたコムギの系統と、転座点T1H5Hagが関与する転座染色体が添加されたコムギの系統とを境にして、核酸マーカー（Ａ）が導入された系統が「d」から「p」に変化していることによる（図１１、１５も参照）。
【００７３】
核酸マーカー（Ｂ）を増幅するプライマーセット（Ｂ）を用いたＰＣＲの場合、得られた増幅産物を制限酵素HaeIIIで消化した後に電気泳動にかけることで、コムギ「新中長(Scn)」では約500bpの、オオムギSt.13559では約700bpの増幅産物が得られた。また、同様の処理を行うことで、核酸マーカー（Ｂ）を含む１Ｈ染色体領域が添加されたコムギT1H-2Haf「d」,T1H-5Hag「p」,T1H-6Hz「p」,T1H-5Haf「p」,T1H-2Hah「p」では、いずれも約700bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｂ））と約500bpの増幅産物（コムギの核酸マーカー）とが得られた。加えて、核酸マーカー（Ｂ）は、転座点T1H2HafとT1H5Hagとの間の１Ｈ染色体長腕上に座乗することが分かる（核酸マーカー（Ａ）に関する説明参照）。なお、核酸マーカー（Ｂ）のサイズは、図４から推定された期待値(503bp)より明らかに大きいが、これは増幅した領域にイントロンが存在するためと推測される。
【００７４】
核酸マーカー（Ｃ）を増幅するプライマーセット（Ｃ）を用いたＰＣＲの場合、コムギ「新中長(Scn)」では約1110bpの、オオムギSt.13559, OUH602では約1080bpの増幅産物が得られた。また、核酸マーカー（Ｃ）を含む１Ｈ染色体領域が添加されたコムギT1H-2Haf「d」,T1H-5Hag「d」,T1H-6Hz「d」,T1H-5Haf「p」,T1H-2Hah「p」では、いずれも約1080bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｃ））と約1110bpの増幅産物（コムギの核酸マーカー）とが得られた。加えて、核酸マーカー（Ｃ）は、転座点T1H6HzとT1H5Hafとの間の１Ｈ染色体長腕上に座乗することが分かる（核酸マーカー（Ａ）に関する説明参照）。なお、表１に、核酸マーカー（Ｃ）の期待される増幅産物長は「ca.1030」と記載した。この「ca.1030」は、次のように推定した。まず、MWG943のインサートの全長が1.8kbpであることから、塩基配列が決定されていない内部のギャップ長を約800bpと推定した。次に、塩基配列の分かっている増幅部分226bpを、塩基配列が決定されていない内部のギャップ長約800bpに加えて、期待される増幅産物長を約1030bpと推定した。
【００７５】
核酸マーカー（Ｄ）／（Ｆ）を増幅するプライマーセット（Ｄ）／（Ｆ）を用いたＰＣＲの場合、コムギ「新中長(Scn)」では増幅産物が得られず、一方、オオムギSt.13559, OUH602では約390bp／570 bpの増幅産物が得られた。また、核酸マーカー（Ｄ）を含む１Ｈ染色体領域が添加されたコムギScn+1HL',T1H-2Haf「d」,T1H-5Hag「d」,T1H-6Hz「p」,T1H-5Haf「p」,T1H-2Hah「p」では、いずれも約390bp／570bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｄ）／（Ｆ））が得られた。加えて、核酸マーカー（Ｄ）／（Ｆ）は、転座点T1H2HafとT1H5Hagとの間の１Ｈ染色体長腕上に座乗することが分かる（核酸マーカー（Ａ）に関する説明参照）。
【００７６】
また、核酸マーカー（Ｅ）を増幅するプライマーセット（Ｅ）を用いたＰＣＲの場合、コムギ「新中長(Scn)」では増幅産物が得られず、一方、オオムギSt.13559, OUH602では約900bp・1100 bpの増幅産物が得られた。また、核酸マーカー（Ｅ）を含む１Ｈ染色体領域が添加されたコムギScn+1HL',T1H-2Haf「d」,T1H-5Hag「d」,T1H-6Hz「p」,T1H-5Haf「p」,T1H-2Hah「p」では、いずれも約900bp・1100bpの増幅産物（核酸マーカー（Ｅ））が得られた。加えて、核酸マーカー（Ｅ）は、転座点T1H2HafとT1H5Hagとの間の１Ｈ染色体長腕上に座乗することが分かる（核酸マーカー（Ａ）に関する説明参照）。なお、このＰＣＲでは、期待される約900bpのバンドに加え約1100bpのバンドも出現しているが、この理由は、１Ｈ染色体上にHor3の遺伝子座が近接して２コピー存在するためと推測される。
【００７７】
以上のように、プライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の何れかを用いれば、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合と、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合とで、ＰＣＲ増幅の結果に明確な多型が見られる。さらに、これらプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）の何れかを用い、オオムギの１Ｈ染色体長腕が導入されたコムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うと、オオムギに特異的な増幅産物（核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ））が得られることも確認済である。つまり、これらのプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）は、オオムギ由来の核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）を、コムギの遺伝的背景で検出する目的で使用可能である。また、核酸マーカー（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも１Ｈ染色体長腕の特定領域内に位置づけられているので（図１１参照）、これを増幅するプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）を用いたＰＣＲによって、例えば、１Ｈ染色体長腕の特定領域（特定の遺伝子座）がコムギの細胞内に導入されているか否かを効率的に判定可能となる。
【００７８】
（５）コムギとオオムギとの交雑後代における稔性の判定
コムギとオオムギとを交雑して得られた後代は、しばしば不稔となる。また、不稔（特に雄性不稔）を引き起こす因子は、１Ｈ染色体上に座乗することが知られている。そこで、オオムギ相互転座６系統とコムギとの交配から育成されたオオムギの転座染色体を個別に添加したコムギ１２系統（前記（３）・（４）参照）の稔性の有無を調査した。その調査結果を表２に示す。なお、表２において、コムギの系統名は、交配に用いたオオムギ相互転座系統名（T1H-2Haf,…,TIH-2Hah）と、当該オオムギ相互転座系統が「ｐ」型／「ｑ」型の何れの転座染色体を有するか、との組み合わせで規定される。
【００７９】
【表２】
0004101493.tif 000003
【００８０】
この調査結果により、コムギの背景で不稔を引き起こすオオムギ１Ｈ染色体上の遺伝要因（不稔因子）は、相互転座点T1H5Hag(TS36)とT1H6Hzとの間に存在すると結論された（図１１参照）。なお、相互転座点T1H5HagとTS36とは、染色体観察によっても、ＰＣＲマーカーによる調査でも相対的な位置関係を決定できなかった。
【００８１】
また、すでに説明したように、相互転座点T1H5Hag(TS36)とT1H6Hzとの間に位置する１Ｈ染色体長腕上の領域には、上記不稔因子の他に、３つの核酸マーカー（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）（Jrg12、Hor3、およびgB19.1b）が位置づけられている。したがって、これら３つの核酸マーカー（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）は、形質転換コムギ（コムギ×オオムギ雑種など）において稔性を予断するＰＣＲマーカーとして有用である。例えば、プライマーセット（Ｄ），（Ｅ）または（Ｆ）を用い、形質転換コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことで、当該核酸マーカー（Ｄ），（Ｅ）または（Ｆ）が検出される個体は雄性不稔、検出されない個体は稔性が正常、という形態で稔性の有無を判定することができる。
【００８２】
以下、プライマーセット（Ｄ）を利用した、形質転換コムギの稔性判定の実例につき説明する。はじめに、コムギにオオムギの１Ｈ染色体と６Ｈ染色体とが１本ずつ添加された個体（雑種）を準備した。なお、１Ｈ染色体とともに６Ｈ染色体が添加されると、そのコムギはある程度の雌性稔性は示す。次に、この個体にコムギ花粉を受粉させた戻し交雑後代（形質転換コムギ）を準備し、当該戻し交雑後代の幼苗から取得したゲノムＤＮＡを鋳型にし、プライマーセット（Ｄ）を用いたＰＣＲを行った。
【００８３】
その結果、調査した２５個体のうち、１１個体で核酸マーカー（Ｄ）（Jrg12）が検出された。次いで、上記交雑後代の幼苗を育成し、稔性の有無を確認した。その結果、核酸マーカー（Ｄ）が検出された１１個体は全て雄性不稔であり、一方、残りの１４個体の稔性は正常であることが確認された。このように、幼苗期における核酸マーカー（Ｄ）の有無を調査することで、稔性の有無を早期に判定することができる。
【００８４】
なお、本実施例ではコムギとして「新中長」を用いている。しかし、他の六倍体コムギの品種である「Chinese Spring」でも本発明の核酸マーカー（特に、核酸マーカー（Ｄ），（Ｆ））、およびこれを増幅するプライマーセットが使用可能であることは確認済である。
【００８５】
【発明の効果】
本発明に係る新規プライマーセットは、以上のように、下記（ａ）ないし（ｃ）の何れか一つに示される、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するためのプライマーセットである。（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセットＡ、（ｂ）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセットＢ、（ｃ）配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセットＣ。
【００８６】
また、本発明に係る他の新規プライマーセットは、以上のように、下記（ｄ）に示す、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットである。（ｄ）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセットＤ。
【００８７】
本発明に係るさらに他の新規プライマーセットは、以上のように、下記（ｅ）に示す、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットである。（ｅ）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセットＥ。
【００８８】
本発明に係るさらに他の新規プライマーセットは、上記の課題を解決するために、下記（ｆ）に示す、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規プライマーセットである。（ｆ）配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとで構成されるプライマーセットＦ。
【００８９】
上記新規なプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）はいずれも、オオムギの１Ｈ染色体長腕由来の核酸マーカーを、コムギの背景で検出する目的で使用することができ、より具体的には、例えば、当該１Ｈ染色体長腕の特定領域がコムギの細胞内に導入されているか否かを効率的に判定することが可能となるという効果を奏する。特に、プライマーセット（Ｄ）〜（Ｆ）は、上記１Ｈ染色体長腕にある不稔因子と連鎖した核酸マーカーを増幅することが判明しているので、オオムギ染色体の導入が試みられたコムギを対象として、その稔性の有無を判定することが可能となるという効果を加えて奏する。
【００９０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるプライマーセット（Ａ）を設計する際に利用した、塩基配列情報を示す図である。
【図２】図１に示す塩基配列情報の続きを示す図である。
【図３】図２に示す塩基配列情報の続きを示す図である。
【図４】本発明にかかるプライマーセット（Ｂ）を設計する際に利用した、塩基配列情報を示す図である。
【図５】本発明にかかるプライマーセット（Ｃ）を設計する際に利用した、塩基配列情報を示す図である。
【図６】本発明にかかるプライマーセット（Ｄ）を設計する際に利用した、塩基配列情報を示す図である。
【図７】本発明にかかるプライマーセット（Ｅ）を設計する際に利用した、塩基配列情報を示す図である。
【図８】図７に示す塩基配列情報の続きを示す図である。
【図９】本発明にかかるプライマーセット（Ｆ）を設計する際に利用した、塩基配列情報を示す図である。
【図１０】図９に示す塩基配列情報の続きを示す図である。
【図１１】オオムギ１Ｈ染色体上の転座点、および核酸マーカーの物理位置を示す図である。
【図１２】Ｃ−バンド法により染色された転座染色体を示す図である。
【図１３】オオムギ転座染色体が添加されたコムギの系統を作出する方法を示す図である。
【図１４】本発明にかかるプライマーセット（Ａ）〜（Ｆ）を用いたＰＣＲの結果を示す図である。
【図１５】本発明にかかるプライマーセット（Ａ）を用いたＰＣＲの結果と、オオムギ１Ｈ染色体との関係を位置づけた図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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