(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行なう方法であって、以下の工程：
標的核酸配列を、少なくとも２つのPCRプライマーおよびポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの：
標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド；
該オリゴヌクレオチドの第１の位置に付着した蛍光物質分子；
該オリゴヌクレオチドの第２の位置に付着した消光物質分子であって、これにより、該オリゴヌクレオチドプローブが該標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされない場合はいつも、該消光物質分子が、該蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そして該オリゴヌクレオチドプローブが該標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合はいつも、該蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子；
ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって認識されない５'末端；および
ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を有するポリメラーゼによって認識されない３'末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；および
該標的核酸配列、該オリゴヌクレオチドプローブ、および該PCR試薬を、重合化工程を含む熱循環に供する工程であって、該熱循環は該PCR試薬により特定される該標的核酸配列を増幅するに十分である、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記蛍光物質分子がフルオレセイン色素であり、そして前記消光物質分子がローダミン色素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドの前記第１の位置が５'末端である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの前記第１の位置は、５’末端であり、該オリゴヌクレオチドの前記第２の位置は、３’末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を測定する工程をさらに包含し、該測定は熱循環の後に、かつプローブハイブリダイゼーション温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸配列が、１つ以上の固定された細胞中に位置づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を、前記標的核酸配列を元々含有する個々の前記細胞内に該プローブを配置する様式で、プローブハイブリダイゼーション温度で測定する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記固定された細胞、前記PCR試薬、および前記オリゴヌクレオチドプローブを、封じ込めアセンブリー中に配置する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブハイブリダイゼーション温度が、前記熱循環の前記重合化工程の温度以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドプローブが前記重合化工程の間の上流PCRプライマーの５'→３'伸長をブロックするのを防ぐために、熱循環の前にストランドディスプレーサーを添加する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ストランドディスプレーサーが、ヘリカーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光物質および前記消光物質が、少なくとも１８ヌクレオチドだけ離れている、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
背景
本発明は、一般に、核酸増幅およびプロービングの分野に関し、そしてより詳細には、単一の試薬混合物を用いてPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを行なうための方法および組成物に関する。
核酸増幅技術は、遺伝物質の研究のための強力な手段を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特に、クローニング、遺伝子発現の分析、DNA配列決定、遺伝的マッピング、薬物の発見、犯罪の科学捜査などにおいて適用が見い出される、非常に重要な手段となっている。例えば、Innisら、PCR Protocols A guide to Methods and Applications，Academic Press，San Diego（1990）4,683,195号、4,683,202号。
多数の重要な適用に関して、標的核酸配列を増幅することに加えて、核酸ハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、標的配列の全てまたは一部に相補的である、標識された１本鎖ポリヌクレオチド）を用いる処理により、このような配列をさらに特徴づけることが所望される（例えば、Nucleic Acid Hybridization，Hamesら編、IRL Press，Oxford（1985））。プローブハイブリダイゼーションは、通常のPCR増幅を上回るさらなる配列選択性を提供し得、そして独立した様式で、標的核酸配列内の複数の配列部位の特徴づけを可能にする。
伝統的には、PCRおよびプローブハイブリダイゼーションプロセスは、別の作業として行われている。しかし、PCR試薬およびプロービング試薬の両方を含有する単一の試薬混合物を用いて、PCRおよびプローブハイブリダイゼーション反応の両方を組み合わせた様式で行うことが非常に所望される。PCRおよびプロービングプロセスを組み合わせることによって得られる利点がいくつかある：（i）単一の試薬添加工程が必要とされるのみであり、これにより、反応チューブを開ける必要なく、この組み合わされた反応を進行させることが可能であり、これにより、サンプルの混同およびサンプルの汚染の機会を減少させる；（ii）必要とされる試薬がより少量である；（iii）必要とされる試薬添加工程がより少なく、自動化をより容易にする；そして（iv）インサイチュの方法の場合、熱循環の間に細胞サンプルの完全性を保護するのに使用されるサンプル封じ込め（containment）アセンブリを分解する必要がない。
単一の反応において、PCRをハイブリダイゼーションプロービングと組み合わせた、１つの存在する方法は、「Taqman」として知られる技術である。例えば、Hollandら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:7276-7280（1991）。Taqmanアッセイでは、３'末端で伸長性がなく、５'末端で標識され、かつ標的配列内でハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、PCR反応内に導入する。増幅の間のPCR反応産物鎖へのプローブのハイブリダイゼーションは、PCRポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に適切な基質を生成する。従って、増幅の間、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを、より小さなフラグメントに分解し、このフラグメントは、分解されないプローブとは区別され得る。従来の方法を上回る顕著な改良の一方、Taqmanアッセイは、その有用性を制限する多数の重要な欠点を有する。これらの欠点には、（i）PCRに用いられるポリメラーゼ酵素は、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有さなければならないという必要条件、（ii）この５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、色素で標識されたヌクレオチドを効率的に消化し得なければならないこと、そして（iii）検出可能な消化産物は小さく、急速に拡散可能な種であり、これは、インサイチュの方法に適用される場合、標的配列を空間的に位置づける能力に影響を与え得ることが含まれる。
単一の反応においてPCRをプロービングと組み合わせる第２の存在する方法は、Higuchiら、Biotechnology，10:413-417（1992）に開示される方法である。この方法では、臭化エチジウムをPCR反応に添加する。そして、２本鎖DNAの存在下で臭化エチジウムの蛍光は増加するので、蛍光の増加は２本鎖PCR産物の蓄積に相関し得る。しかし、この方法は、PCR反応より優れた配列特異性を全く提供せず、かつ標的核酸配列内の単一の配列部位の検出に制限される。
増幅およびプロービング工程の組み合わせを可能にする第３の方法は、ヨーロッパ特許出願公開公報第0601889A2号のBagwellの方法である。Bagwellの方法におけるプローブは、（i）標的核酸に相補的なセグメント、および（ii）１つ以上のヘアピンを形成し得るセグメントを有するヌクレオチド配列を含む。このプローブはまた、共有結合した蛍光物質および消光物質の分子を含み、これは、ヘアピンが形成された場合に、蛍光物質および消光物質が、それらの間の共鳴エネルギーの転移を可能にするように極めて十分接近するように配置される。この方法は、可能なプローブ配列が、ヘアピン構造を形成し得るプローブ配列に制限されるという重大な欠点を有する。さらに、プローブ-標的結合の速度論および熱力学は、ヘアピン構造の存在により、好ましくない影響を受ける。
要旨
本発明は、一般に、単一の試薬を用いる単一の反応容器中における、増幅および増幅された核酸標的配列のハイブリダイゼーションプローブ検出の組み合わせのために有用な方法および試薬の本発明者らの発見に関する。
本発明の１つの目的は、増幅および増幅した標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅およびプロービングの工程は組み合わせれた様式で行われ、その結果、増幅工程後の試薬の添加は必要とされない。
本発明のさらなる目的は、増幅、および細胞または組織切片内に位置する増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程とプロービング工程との間で封じ込めアセンブリを分解する必要がない。
本発明の別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程およびプロービング工程の両方で、単一の試薬混合物が用いられる。
本発明のさらなる目的は、増幅、および細胞または組織切片内に位置する増幅された標的配列のプロービングのための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程とプロービング工程との間で洗浄工程は必要とされない。
本発明の別の目的は、上記の方法における使用のためのプローブ組成物を提供することであり、このプローブ組成物は、２本鎖状態（例えば、相補的標的配列にハイブリダイズした）であるか、または１本鎖状態であるかに依存して検出可能に異なる蛍光特性を有する。
本発明のなお別の目的は、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性であるオリゴヌクレオチドプローブを提供することである。
本発明の別の目的は、標識されたプローブを提供することであり、ここで、検出時に、この標識は大きな、ゆっくりと拡散する種（すなわち、プローブのサイズ以上のサイズを有する種）に付着される。
本発明のさらなる目的は、２本鎖状態と１本鎖状態との間で差別的なシグナルを提供するためにヘアピン構造を必要としないプローブを提供することである。
本発明の別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、ポリメラーゼは、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有する必要はない。
本発明のなお別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、複数の配列部位が、単一の標的配列内で検出され得る。
本発明のさらに別の目的は、上記の方法の実施のために有用な種々の試薬キットを提供することである。
本発明の上記の目的および他の目的は、１つの局面において、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドプローブによって達成される。このオリゴヌクレオチドは、５'末端をポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性による消化を受けないようにされ、そして３'末端をポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないように改変される。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドの第１の末端に付着した蛍光物質分子、およびこのオリゴヌクレオチドの第２の末端に付着した消光物質分子を含み、その結果、オリゴヌクレオチドプローブが、１本鎖状態である場合は常に、消光物質分子が蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光させ、そしてオリゴヌクレオチドプローブが２本鎖状態である場合は常に、蛍光物質は実質的に消光されない。あるいは、蛍光物質と消光物質とは、少なくとも18ヌクレオチドにより隔てられる。
第２の局面では、本発明は、PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行うための第１の方法を提供する。この方法では、標的核酸配列をPCR試薬と接触させる。このPCR試薬は、少なくとも２つのPCRプライマー、ポリメラーゼ酵素、および上記の本発明のオリゴヌクレオチドプローブを含む。次いで、この混合物を、熱循環に供する。この熱循環は、PCR試薬によって特定された標的核酸配列を増幅するために十分である。
第３の局面では、本発明は、PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行うための第２の方法を提供し、ここで、標的核酸配列をPCR試薬と接触させる。このPCR試薬は、少なくとも２つのPCRプライマーおよび全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠損したポリメラーゼ酵素、およびオリゴヌクレオチドプローブを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドの第１の末端に付着した蛍光物質分子およびオリゴヌクレオチドの第２の末端に付着した消光物質分子を含み、その結果、このオリゴヌクレオチドプローブが１本鎖状態である場合は常に、消光物質分子が蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光させ、そしてこのオリゴヌクレオチドプローブが２本鎖状態である場合は常に、蛍光物質は実質的に消光されない。さらに、プローブの３'末端は、ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないようにされている。標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、およびPCR試薬は、PCR試薬で特定された標的核酸配列を増幅するのに十分な熱循環に供される。
１つの好ましい実施態様では、全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼ酵素を必要とするよりもむしろ、エキソヌクレアーゼ活性インヒビターを反応物に添加する。このインヒビターは、プローブのハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を阻害するのに十分である。
第２の好ましい実施態様では、全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼ酵素を必要とするよりもむしろ、またはエキソヌクレアーゼ活性インヒビターを添加するよりもむしろ、プローブを検出する前に、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を非活性化させる。
【図面の簡単な説明】
図１は、第１の好ましい、PCRとプローブハイブリダイゼーションとを組み合せた方法の概略図を示す。ここで、プローブの融解温度（Tm）とPCR重合化工程の反応温度との間の温度差を用いて、プローブが、PCR重合化工程およびプローブの消化に干渉するのを防ぐ。
図２は、第２の好ましい、PCRとプローブハイブリダイゼーションとを組み合せた方法の概略図を示す。ここで、ストランドディスプレーサー（strand displacer）を用いて、プローブが、PCR重合化工程およびプローブの消化に干渉するのを防ぐ。
好ましい実施態様の説明
ここで、本発明の好ましい実施態様について詳細に言及する。本発明を、好ましい実施態様に関して記載するが、このことは本発明をこれらの実施態様に限定することを意図するものではないことが理解される。それどころか、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される発明に含まれ得る代替物、改変物、および等価物を含むことが意図されている。
１．PCRおよびインサイチュPCR
本明細書中で使用される場合、用語「PCR試薬」は、標的核酸配列を除く、PCRプロセスを実行するために必要とされる化学薬品をいう。これらの化学薬品は、一般的に、以下の５つのクラスの成分からなる：（i）水性緩衝物、（ii）水溶性マグネシウム塩、（iii）少なくとも４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、（iv）オリゴヌクレオチドプライマー（通常、それぞれの標的配列に対して２つのプライマー、その配列は、二本鎖標的配列の２つの相補鎖の５'末端を規定する）、および（v）ポリヌクレオチドポリメラーゼ、好ましくはDNAポリメラーゼ、より好ましくは熱安定性DNAポリメラーゼ（すなわち、少なくとも10分間の合計時間の間、その活性の約半分より多くを失うことなく、90℃と100℃との間の温度に耐え得るDNAポリメラーゼ）。
４種の通常のdNTPは、チミジン三リン酸（dTTP）、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、およびデオキシグアノシン三リン酸（dGTP）である。これら通常の三リン酸は、通常の４種の塩基と同様にWatson-Crick塩基対合する塩基アナログを含むdNTP（例えば、デオキシウリジン三リン酸（dUTP））で補充または置換され得る。
「インサイチュPCR」は、特定の増幅された核酸が、標的核酸配列を元々含んでいた細胞または下位の細胞構造内に実質的に含まれるように、固定された細胞において実行されるPCR増幅をいう。細胞は、水性懸濁液中にあっても、または組織サンプルの部分（例えば、組織化学的切片または細胞化学的スメア）であってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「組織化学的切片」は、凍結または化学的に固定され、ワックスまたはプラスチック中に包埋されることにより固められ、薄板（代表的には、数ミクロンの厚さ）にスライスされ、そして固体支持体（例えば、顕微鏡スライド）に付着された生物学的組織の固体サンプルをいい、そして用語「細胞化学的スメア」は、化学的に固定されそして顕微鏡スライドに付着された細胞（例えば、血球）の懸濁物をいう。好ましくは、細胞は、プロテイナーゼ消化、界面活性剤または有機溶媒を用いる液体抽出、または透過化（permeabilization）法のような他のものによって、PCR試薬に対して透過性にされている。
本明細書中で使用する場合、用語「固定された細胞」は、溶媒変化、温度変化、機械的ストレス、または乾燥による破裂に対して細胞構造（特に、膜）を強化するために化学的に処理された生物学的細胞のサンプルをいう。細胞は、懸濁物中に固定されても、または組織サンプルの部分として固定されても、いずれでもよい。細胞固定液は、一般に、細胞構造のタンパク質構成要素を、最も一般的には、タンパク質アミノ基と反応することによって架橋する化学薬品である。好ましい固定液には、緩衝化ホルマリン、95％エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが含まれる。固定された細胞の透過性は、プロテイナーゼ、または界面活性剤、または膜脂質を溶解する有機溶媒での処理により増加され得る。
２．オリゴヌクレオチドプローブ
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用する場合、規則的なパターンのモノマー−モノマー間の相互作用（例えば、Watson-Crick型の塩基対合など）によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然のまたは改変されたモノマーまたは結合（linkage）（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む）の直鎖状オリゴマーを包含する。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより結合されて、サイズが数個のモノマー単位（例えば、３〜４）から数十のモノマー単位の範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ATGCCTG」のような文字の配列で表される場合はいつでも、他に注記がなければ、ヌクレオチドは左から右へ５'→３'の順序であること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」は、例えば、KornbergおよびBaker、DNA Replication、第２版（Freeman，San Francisco，1992）に記載されるように、2'-デオキシ形態および2'-ヒドロキシル形態を含む天然のヌクレオチドを含む。ヌクレオチドに関しての「アナログ」には、例えば、Scheit、Nucleotide Analogs（John Wiley，New York，1980）；UhlmanおよびPeyman、Chemical Reviews，90:543-584（1990）などに記載されるように、改変された塩基部分および/または改変された糖部分を有する合成ヌクレオチドが、これらが特異的にハイブリダイズし得るという条件のみで含まれる。このようなアナログには、結合特性を高める、縮重を減少させる、特異性を増加させる、酵素基質としての活性を減少させるなどするように設計された合成ヌクレオチドが含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、多くのアプローチ、例えば、Ozakiら、Nucleic Acids Research，20:5205-5214（1992）；Agrawalら、Nucleic Acids Research，18:5419-5423（1990）；などによって合成され得る。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、通常、例えば、以下の文献に開示されるホスホルアミダイト化学のような標準化学を使用して、自動化DNA合成機（例えば、Perkin-Elmer（Foster City，California）Model 392または394 DNA/RNA Synthesizer）で合成される：BeaucageおよびIyer、Tetrahedron，48:2223-2311（1992）；Molkoら、米国特許第4,980,460号；Kosterら、米国特許第4,725,677号；Caruthersら、米国特許第4,415,732号；第4,458,066号；および第4,973,679号など。例えば、非天然骨格基（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートなど）を生じる別の化学もまた、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が有害に影響しないという条件、用いられ得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、15〜150ヌクレオチド長の範囲である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、18〜30ヌクレオチド長の範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列および長さは、それがハイブリダイズする標的核酸配列の性質に一部依存する。結合の位置および長さを変化させて特定の実施態様に適切なアニーリングおよび融解特性を達成し得る。このようなデザイン選択を行うためのガイダンスは、「Taqman」タイプのアッセイを記載する上記文献の多くに見出され得る。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの３'末端ヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長し得ないようにされる。このようなブロッキングは、蛍光物質分子または消光物質分子を、結合部分（linking moiety）によってオリゴヌクレオチドプローブの末端３'炭素に付着させることにより、または３'末端ヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドにすることにより実施され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの３'末端は、そのオリゴヌクレオチドの３'末端中に１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合を含ませることによって、ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないようにされる。最低限、３'末端のヌクレオチド間結合は改変されなければならないが、すべてのヌクレオチド間結合まで改変されてもよい。このようなヌクレオチド間改変には、ホスホロチオエート結合（例えば、Oligonucleotides and Analogs、第４章および第５章、IRL Press，New York（1991））；メチルホスホネート（methylyphosphonate）結合（Oligonucleotides and Analogs、第６章、IRL Press，New York（1991））；ボラノホスフェート結合（例えば、Shawら、Methods Mol.Biol．20:225-43（1993））；および他の同様なポリメラーゼ耐性ヌクレオチド間結合が含まれ得る。プローブの３'伸長をブロックする別の方法は、マイトマイシンＣまたは他の同様な抗腫瘍抗生物質（例えば、Basuら、Biochemistry，32:4708-4718（1993））を使用して、プローブの３'末端に付加物（adduct）を形成することである。
本発明の１つの実施態様の重要な局面において、オリゴヌクレオチドプローブは、核酸ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けないようにされる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの５'末端は、１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合を、そのオリゴヌクレオチドの５'末端中に含むことによって、消化を受けないようにされる。最低限、５'末端のヌクレオチド間結合は改変されなければならないが、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間結合まで改変されてもよい。このようなヌクレオチド間改変には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成において使用されるタイプの改変された結合が含まれ得る。このようなヌクレアーゼ耐性結合の例には、ホスホロチオエート結合（例えば、Oligonucleotides and Analogs、第４章および第５章、IRL Press，New York（1991））；メチルホスホネート（methylyphosphonate）結合（Oligonucleotides and Analogs、第６章、IRL Press，New York（1991））；ボラノホスフェート結合（例えば、Shawら、Methods Mol.Biol．20:225-43（1993））；ポリアミド核酸（PNA）結合（例えば、Nielsenら、Science，254:1497-1500（1991））；および他の同様なエキソヌクレアーゼ耐性結合が含まれる。あるいは、ペプチド分子が、Soukchareunら、Bioconjugate Chemistry，6:43-53（1995）の様式と類似の様式で、プローブの５'末端に付着される。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブの別の重要な局面において、プローブは、オリゴヌクレオチドに結合した蛍光物質および消光物質分子を含む。本明細書中で用いられる用語「消光」または「蛍光エネルギー転移」は、蛍光物質分子および消光物質分子が近接しているときに、蛍光物質分子が励起される度に、励起状態のエネルギーの実質的部分が、消光物質に非放射的に転移し、そこでそのエネルギーは非放射的に消散するか、または蛍光物質の発光波長とは異なる発光波長で発光するプロセスをいう。
消光の効率は、蛍光物質および消光物質の近接度の強い関数であることは周知である。すなわち、その二つの分子が接近するにつれて、消光の効率が増大する。消光が、レポーター分子と消光物質分子の物理的な近接度に強く依存するので、消光物質およびレポーター分子は、互いに数ヌクレオチド内、通常約６〜16ヌクレオチド離れてプローブに付着していなければならないと仮定されてきた（例えば、Leeら、Nucleic Acids Research，21:3761-3766（1993）；Mergnyら、Nucleic Acids Research，22:920-928（1994）；Cardulloら、Proc.Natl.Acad.Sci.,85:8790-8794（1988）；Cleggら、Proc.Natl.Acad.Sci.,90:2994-2998（1993）；Ozakiら、Nucleic Acids Research，20:5205-5214（1992）;など）。代表的には、この分離は、レポーター-消光物質対の一方のメンバーをプローブの５'末端に付着させ、そして他方のメンバーを６〜16ヌクレオチド離れた塩基に付着させることにより達成される。
しかし、蛍光物質および消光物質分子を、オリゴヌクレオチド上の一見遠く見える部位に置くことにより、差分消光が、オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖状態と二本鎖状態（すなわち、ハイブリダイズした状態）との間で見られ得ることが、本発明の一部として認識された（例えば、Bagwellら、Nucleic Acids Research，22（12）：2424-2425（1994）；Bagwell，EP 0 601 889 A2）。蛍光シグナルは、蛍光物質と消光物質が20塩基離れているときは、一本鎖状態と二本鎖状態の間で20のファクターほど異なり得る。この効果は、一本鎖状態において、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの両端が近接し得る可とう性のランダムコイル構造として存在するのに対し、二本鎖状態においては、オリゴヌクレオチドが蛍光物質と消光物質を引き離す剛直な伸展した構造として存在するという事実に、最もおそらく起因する。従って、この配置を用いて、オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖またはハイブリダイズしていない状態にあるとき、蛍光物質の比較的効率的な消光が見られ、そしてオリゴヌクレオチドプローブが二本鎖またはハイブリダイズした状態にあるとき、蛍光物質の比較的効率的な消光が見られる。
好ましくは、蛍光物質分子は、結合部分を介するプローブの末端３'炭素または末端５'炭素への付着のために誘導体化された蛍光有機色素である。好ましくは、消光物質分子もまた有機色素であり、これは、本発明の実施態様に依存して、蛍光性であってもなくてもよい。例えば、本発明の好ましい実施態様において、消光物質分子は蛍光性である。一般的に、消光物質分子が蛍光性であるかまたは非放射的減衰により蛍光物質から転移エネルギーを単に放出するかに関わらず、消光物質の吸収バンドは、蛍光物質分子の蛍光発光バンドに実質的に重複するはずである。励起した蛍光物質分子からエネルギーを吸収するが、放射的にエネルギーを放出しない非蛍光性消光物質分子は、本明細書中で色素原性分子と呼ばれる。
特定のプローブについての適切な蛍光物質-消光物質対を選択するために、文献で入手できる数多くの実践的ガイダンスがあり、以下の参照文献によって例示される：Clegg（上記）；Wuら、Anal.Biochem.,218:1-13（1994）；Pesceら編、Fluorescence Spectroscopy （Marcel Dekker、New York、1971）；Whiteら、Fluorescence Analysis:A Practical Approach（Marcel Dekker，New York，1970）；など。文献には、蛍光性および色素原性分子ならびに蛍光物質-消光物質対を選択するためのそれらの関連する光学的性質の網羅的なリストを提供する参照文献も含まれる。例えば、Berlman、Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules、第２版（Academic Press、New York、1971）；Griffiths、Colour and Constitution of Organic Molecules （Academic Press、New York、1976）；Bishop編、Indicators（Pergamon Press、Oxford、1972）；Haugland Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes、Eugene、1992）；Pringsheim，Fluorescence and Phosphorescence（Interscience Publishers、New York、1949）；など。さらに、文献には、オリゴヌクレオチドに付加され得る共通の反応基を介する共有結合のために蛍光物質および消光物質分子を誘導体化するための広範なガイダンスが存在し、以下の参照文献によって例示される：Haugland（上記）；Ullmanら、米国特許第3,996,345号；Khannaら、米国特許第4,351,760号；など。
典型的な蛍光物質-消光物質対は、フルオレセインを含むキサンテン色素、およびローダミン色素から選択され得る。フェニル部分に置換基を有する多くの適切な形態のこれらの化合物が、広く市販され、そのフェニル部分は結合部位としてまたはオリゴヌクレオチドへの結合のための結合官能性として用いられ得る。別のグループの蛍光化合物は、α位またはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物には、１-ジメチルアミノナフチル-５-スルホネート、１-アニリノ-８-ナフタレンスルホネートおよび２-p-トルイジニル（touidinyl）-６-ナフタレンスルホネートが含まれる。他の色素には、３-フェニル-７-イソシアナトクマリン、９-イソチオシアナトアクリジンアクリジンオレンジのようなアクリジン；N-（p-（2-ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが含まれる。
好ましくは、蛍光物質および消光物質分子はフルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素およびオリゴヌクレオチドへの付着に適切な結合方法論は、多くの参照文献に記載されている。例えば、Khannaら（上記）；Marshall，Histochemical J.,7:299-303（1975）；Menchenら、米国特許第5,188,934号；Menchenら、欧州特許出願87310256.0;およびBergotら、国際出願PCT/US90/05565。後者の４つの文章は、本明細書中で参考として援用される。
蛍光物質または消光物質分子をオリゴヌクレオチドの５'または３'末端に付着するための多くの結合部分および方法論が存在し、以下の参照文献に例示される：Eckstein編、Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach（IRL Press，Oxford，1991）；Zuckermanら、Nucleic Acids Research，15:5305-5321（1987）（オリゴヌクレオチドの３'チオール基）；Sharmaら、Nucleic Acids Research，19:3019（1991）（３'スルフヒドリル）；Giustiら、PCR Methods and Applications，2:223-227（1993）およびFungら、米国特許第4,757,141号（Applied Biosystems，Foster City，CAから入手可能なAminolinkTMIIを介する５'ホスホアミノ基）；Stabinsky,米国特許第4,739,044号（３'アミノアルキルホスホリル基）；Agrawalら、Tetrahedron Letters，31:1543-1546（1990）（ホスホルアミデート結合を介する付着）；Sproatら、Nucleic Acids Research，15:4837（1987）（５'メルカプト基）；Nelsonら、Nucleic Acids Research，17:7187-7194（1989）（３'アミノ基）；など。
好ましくは、市販の連結部分が利用され、それらは合成の間にオリゴヌクレオチドに付着され得る。例えば、Clontech Laboratories（Palo Alto，CA）から入手可能である。
ローダミンおよびフルオレセイン色素もまた、オリゴヌクレオチドの５'ヒドロキシルに、固相合成の最後に、ホスホルアミダイト部分で誘導体化された色素を使って、簡便に付着される。例えば、Wooら、米国特許第5,231,191号；およびHobbs，Jr．、米国特許第4,997,928号。
３.PCR増幅およびプローブハイブリダイゼーションの組み合わせ
PCRおよびプローブハイブリダイゼーションアッセイを組み合わせて行うときに明言されなければならない、３つの重要な問題がある：（i）オリゴヌクレオチドプローブは、PCR重合化工程をブロックまたはさもなくば干渉し、それによって、増幅の段階的効率を低減すべきではない。ここで、本明細書中で用いられるように、用語「重合化工程」は、プライマーが、ポリメラーゼ媒介反応によるヌクレオチド塩基の取り込みによって、その３'末端から伸長される、PCRプロセスの中の工程をいう；（ii）オリゴヌクレオチドプローブは、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により消化されるべきではない；および（iii）プローブは、ポリメラーゼによる５'→３'伸長が不可能であるべきである。
本発明の１つの好ましい実施態様において、プローブは、プローブの融解温度がPCR重合工程の温度より低いようにプローブを設計することにより、PCR重合化工程との干渉から保護される。本明細書中で用いられる用語「融解温度」は、プローブの半分が標的配列にハイブリダイズされ、すなわち二本鎖状態であり、そして半分がハイブリダイズされていない、すなわち一本鎖状態にある温度として定義される。好ましくは、プローブの融解温度は40℃と55℃の間であり、PCRプライマーの融解温度は55℃と70℃の間である。
図１に関して、PCR重合化工程の間に、プローブはハイブリダイズされておらず、すなわち一本鎖状態にあり、そしてそのため消光される。さらに、プローブが標的配列に結合していないので、PCR重合化はプローブからの干渉なしに進行し得る。次いで、ハイブリダイゼーション工程の間、温度はハイブリダイゼーション温度、好ましくはプローブのＴm以下の温度に下げられ、それによって、プローブを標的にハイブリダイズさせる。プローブのハイブリダイゼーションは、消光の量の減少を引き起こし、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションを示す測定可能なシグナルを生じる。このようなシグナルはまた、存在する標的配列の量に関して定量的な情報を提供する。ハイブリダイゼーション工程の間、プローブは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって消化されない。なぜなら、上述のように、プローブはポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないように設計されているからである。
上述のＴm媒介のPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを組み合わせた方法に関するバリエーションにおいて、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないプローブを用いるよりもむしろ、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを用いることによって、ハイブリダイゼーション工程の間のプローブの消化を防ぐ。このような５'→３'欠損ポリメラーゼの例には、DNAポリメラーゼI Klenowフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、およびT7 DNAポリメラーゼ、ならびに他の同様な５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ（例えば、Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL）が含まれる。
上述のＴm媒介のPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを組み合わせた方法に関する第２のバリエーションにおいて、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないプローブを用いるよりも、またはエキソヌクレアーゼ消化からプローブを保護するためにエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを用いるよりもむしろ、ポリメラーゼを、ハイブリダイゼーション工程の間、エキソヌクレアーゼ活性に関して不活性にする。このような不活化は、以下を含む多くの方法によって達成され得る：（i）ハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を阻害する温度感受性インヒビター（例えば、固体の吸着剤、特異的な抗体分子、または他の同様な可逆的または不可逆的ポリメラーゼインヒビター）を反応に導入すること；（ii）活性がハイブリダイゼーション温度で非常に減少するポリメラーゼを用いること；または（iii）ハイブリダイゼーション工程の前に、ポリメラーゼ酵素を不可逆的に失活させる（kill）酵素脱活性化工程（すなわち、高温での延長された期間）を導入すること。
本発明の第２の好ましい実施態様において、プローブは、ストランドディスプレーサーを反応に含めることによって、PCR重合化工程の干渉を免れる。ここで、本明細書中で用いられる用語「ストランドディスプレーサー」は、オリゴヌクレオチドプローブを、それがハイブリダイズする標的から置換（displacement）させ得る薬剤、例えば、DNAヘリカーゼ（例えば、Howardら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12031-12035（1994）、または一本鎖結合タンパク質（E.G．Zijderveld，Journal of Virology 68（2）：1158-1164（1994））をいう。図２に関して、本実施態様では、重合化工程の間、ストランドディスプレーサーは、プローブを鋳型ストランドから置換し、それによって重合化工程がプローブからの干渉なしに進行することを可能にする。次いで、ハイブリダイゼーション工程の間に、プローブのハイブリダイゼーションを可能にするために、ストランドディスプレーサーは不活性にされる。このような不活化は、エキソヌクレアーゼ活性の不活化に関して上述された方法を含む多くの方法によって達成され得る。一般的に、ストランドディスプレーサーのストランド置換活性は、より長いオリゴヌクレオチド二重鎖についてより高く、従って、PCRプライマー自身は、PCR反応の間、ストランドの置換を受けない。
４.実施例
本発明は、以下の実施例を考慮することによりさらに明確にされる。これらの実施例は、本発明の単に例示的なものとして意図される。
実施例１
一本鎖状態と二本鎖状態とでのプローブの蛍光発光の比較
リンカーアームヌクレオチド（「LAN」）ホスホルアミダイトは、Glen Researchから入手した。標準DNAホスホルアミダイト、６-カルボキシフルオレセイン（「６-FAM」）ホスホルアミダイト、６-カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（「TAMRA NHSエステル」）、および３'ブロッキングリン酸を付着するためのPhosphalinkTMは、Perkin-Elmer、Applied Biosystems Divisionから入手した。オリゴヌクレオチド合成を、モデル394 DNA Synthesizer（Applied Biosystems）で行った。オリゴヌクレオチドを、Oligo Purification Cartridges（Applied Bioststems）を用いて精製した。
５'末端に6-FAM標識ホスホルアミダイトを有し、オリゴヌクレオチド配列中の１つのＴをLANで置換され、そして３'末端にPhosphalinkTMを有する二重に標識されたプローブを合成した。脱保護およびエタノール沈澱の後に、TAMRA NHSエステルを、LANを含むオリゴヌクレオチドに、250 mM Na-バイカーボネート緩衝液（pH 9.0）中で室温でカップリングした。未反応の色素を、PD-10 Sephadexカラムに通して除去した。最後に、二重に標識されたプローブを、調製用HPLCによって標準的なプロトコルを用いて精製した。
プローブのオリゴヌクレオチド配列およびその相補体を表１に示す。本明細書中で用いられる用語「相補体」は、プローブ配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド配列をいう。
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４対のプローブを研究した。各対について、一方のプローブは内部ヌクレオチドに付着したTAMRAを有し、他方は３'末端ヌクレオチドに付着したTAMRAを有する。両方のプローブが、５'末端に付着した6-FAMを有する。一本鎖状態のプローブの蛍光を測定するために、518 nmでの蛍光発光を、最終濃度で50 nMのプローブ、10 mMのTris-HCl（pH 8.3）、50 mMのKCl、および10 mMのMgCl2を含む溶液を用いて測定した。二本鎖状態のプローブの蛍光を測定するために、溶液は100 mMの相補体オリゴヌクレオチドをさらに含んだ。MgCl2を添加する前に、120μlの各サンプルを95℃で５分間加熱した。80μlの25 mM MgCl2を添加後、各サンプルを室温まで冷却しそして蛍光発光を測定した。報告した値は３回の測定の平均である。表２は、一本鎖状態および二本鎖状態における、表示されたプローブの蛍光測定の結果を与える。表２中のデータから理解され得るように、蛍光物質および消光物質をヌクレオチドの反対端に有するプローブについて、ハイブリダイゼーションは、蛍光物質および消光物質が互いにより近くにあるときに見られた差分消光の程度に対して、差分消光の程度の劇的な増加をもたらした。より長いプローブについては、蛍光物質と消光物質の間の最適な分離が存在し、よって蛍光物質および消光物質を反対端に置くよりもむしろ、これらはともに内部に位置するが、ある最適距離だけ離れていると本発明者らは考える。
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上記において、ほんのわずかな実施態様を詳細に記載したのみであるが、分子生物学の分野の当業者は、多くの改変およびバリエーションが、上述の実施態様の教示から逸脱することなく、好ましい実施態様において可能であることを明確に理解する。
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