(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＤＮＡがＡＴＣＣ Ｎｏ．９８１０２から得られることを特徴とするＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮＡベクター。
【請求項３】
単離ＤＮＡがＡＴＣＣ Ｎｏ．９８１０２から得られることを特徴とするＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをコードする単離ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載の単離ＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター。
【請求項５】
請求項２または４に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項２または４に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞をＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下で培養することを特徴とするＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、並びに、組換えＤＮＡからのＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
クラスIIの制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に存在する一群の酵素である。これらの酵素を細菌の他の成分から分離して精製することができれば、実験室で制限エンドヌクレアーゼを使用し、ＤＮＡ分子を分子クローニング及び遺伝子キャラクタリゼーションのための正確なフラグメントに開裂させることが可能である。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿ってヌクレオチドの特定配列（「認識配列」）を認識しこの配列に結合することによって作用する。制限エンドヌクレアーゼは一旦結合すると、次いで認識配列の内部またはその片側で分子を開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に親和性を有している。今日まで試験された数百種類の細菌について、ユニークな特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは２００種類以上同定されている。
【０００４】
概して、細菌は、個々の種毎には少数の制限エンドヌクレアーゼしか有していない。典型的には起原となる細菌に因んでエンドヌクレアーゼが命名されている。従って、例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は異なる３種類の制限エンドヌクレアーゼを合成し、これらはＤｒａＩ、ＤｒａII及びＤｒａIII と命名されている。これらの酵素は夫々、配列５′ＴＴＴＡＡＡ３′、５′ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ３′及び５′ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ３′を認識し開裂する。他方で、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＹ１３は、配列５′ＧＡＡＴＴＣ３′を認識する１種類の酵素ＥｃｏＲＩだけを合成する。
【０００５】
制限エンドヌクレアーゼは本来は細菌細胞の自己防御機能を果たすと考えられている。制限エンドヌクレアーゼの存在によって細菌は、ウイルス及びプラスミドのような細菌を破壊したりまたは細菌に寄生したりする外来ＤＮＡ分子の感染に対して耐性になる。制限エンドヌクレアーゼは、認識配列が発生する度毎に侵入性外来ＤＮＡ分子を開裂することによって耐性を与える。開裂が生じると、感染遺伝子の多くはその能力を失い、感染遺伝子のＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによって更に分解され易くなる。
【０００６】
細菌の防御系の第二成分は、修飾メチラーゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護して外来の感染性ＤＮＡから識別できるようにする手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し該認識配列に結合するが、ＤＮＡを開裂するのでなく、メチル基を付加することによって配列内部のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾する。メチル化後の認識配列は制限エンドヌクレアーゼによってもはや開裂されない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの活性によって常に十分に修飾されている。従って、該ＤＮＡは、内在性制限エンドヌクレアーゼの存在に対しては完全に不感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及び開裂に感受性なのは、修飾されていないため外来であることが確認された外来ＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現に伴って、遺伝子をクローニングし、これらの遺伝子がコードしているタンパク質及び酵素を従来の精製技術で得られるよりも大量に産生することがいまや可能になっている。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の単離クローンを得るためには、複合「ライブラリー」内部のクローン、即ち、「ショットガン」手順によって１０-3から１０-4という低い頻度で発生するクローンの集団を同定する簡便で信頼できる方法を開発することが必要である。所望の希少なクローンを生存させながら大多数の不要なクローンを破壊するようにその方法が選択的であるのが好ましい。
【０００８】
クラスIIの制限−修飾系がクローニングされる頻度は増加しつつある。クローニングされた最初の系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染を使用した（ＥｃｏＲII：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７８：７１７−７１９（１９８０）；ＨｈａII：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ  ３：９７−１１２（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１５０３−１５０７（１９８１））。細菌中に制限−修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ感染に対して耐性になる。従って原則的には、クローニングされた制限−修飾遺伝子を含む細胞はファージに接触したライブラリーから生存細胞として選択的に単離され得る。しかしながらこの方法は余り有用でないことが判明した。即ち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は選択的生存を与えるための十分なファージ耐性を必ずしも示さないことが判明したからである。
【０００９】
別のクローニング方法では、最初にプラスミド耐性（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）であると特性決定された系を大腸菌クローニングプラスミドに導入する。（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７６（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４０２−４０６（１９８３）；Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ  ａｎｄ  Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ  １９：３５５−３５９（１９８２）；ＰｖｕII：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９（１９８５））。
【００１０】
系をクローニングする場合の使用頻度が増えている第三の方法は、活性メチラーゼ遺伝子の選択を用いるクローニング方法である（１９９３年４月６日許諾の米国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２１（１９８５））。制限遺伝子と修飾遺伝子とはしばしば密接に結合しているので、双方の遺伝子がしばしば同時にクローニングされる。この選択は完全な制限系を必ずしも産生せず、メチラーゼ遺伝子だけを産生したりする（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，Ｇｅｎｅ  １０：２１９−２２５（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ  ２０：１９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ  ａｎｄ  Ｂａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ  ２１：１１１−１１９（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４１（１９８３））。
【００１１】
もっと最近になって、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合を含む指標大腸菌株に基づいて大腸菌中の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする方法（“ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ  ｍｅｔｈｏｄ”）が発表された（Ｆｏｍｅｎｋｏｖら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３９９−２４０３，１９９４）。この方法は、制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアーゼによってＤＮＡ損傷を生じた大腸菌のＳＯＳ応答を利用する。複数の熱安定ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔｔｈ１１１Ｉ，ＢｓｏＢＩ，Ｔｆヌクレアーゼ）がこの方法によってクローニングされた（１９９６年３月１２日許諾の米国特許第５，４９８，５３５号）。
【００１２】
大腸菌中でのこれらの系のクローニングの別の障害は多様なメチラーゼ遺伝子をクローニングする過程で発見された。（クローニングに常用されている菌株を含む）多くの大腸菌株はシトシンメチル化を含むＤＮＡの導入に抵抗する系を有している（Ｒａｌｅｉｇｈ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８３：９０７０−９０７４（１９８６））。従って、（１つまたは複数の）どの大腸菌株をクローニングに使用するかを慎重に考慮することも必要である。
【００１３】
精製された制限エンドヌクレアーゼ、より限定的には修飾メチラーゼは実験室で遺伝子キャラクタリゼーションを行うための有効なツールであるから、これらの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によって得ることは商業的な動機からも要望されている。このような菌株が有用である理由は、これらの菌株が精製作業を容易にし且つ工業的に有用な量を産生する手段を提供するからである。
【００１４】
上記に指摘したような制限−修飾遺伝子のクローニングに関連する問題以外にも、大腸菌にこのような外来制限修飾系をクローニング及び導入する場合、恐らくは大腸菌中の遺伝子の無効な転写または翻訳が原因で、天然エンドヌクレアーゼ産生菌株に比較してメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼの収率が極めて低い値になったりする。特に放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓの遺伝子を大腸菌にクローニングするときにはこれらの２種類の微生物のＧＣ含量が違っているのが原因でこのような低収率が生じ易い。従って、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種に由来のＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のような放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓの遺伝子を大腸菌中で十分に発現させ効率的な遺伝子発現に基づいて選択させ得るクローニング系の開発が望まれている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、修飾メチラーゼ選択方法によって大腸菌中でＳａｐＩ制限−修飾系のメチラーゼをクローニングする方法に関する。本発明方法の好ましい段階を図１に示す。放線菌ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅのＳａｐＩメチラーゼ遺伝子のクローニングにおいて、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種から目標のメチラーゼ遺伝子（ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子）をクローニングするために、ｐＵＣ１９ベクターを用いる標準メチラーゼ遺伝子選択方法を使用した。１つのＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）をクローニングした。ＳａｐＩの認識配列は非対称なので（一方のストランドは５′ＧＣＴＣＴＴＣ３′、他方のストランドは５′ＧＡＡＧＡＧＣ３′である）、ＳａｐＩ制限−修飾系は２つのメチラーゼと１つのエンドヌクレアーゼとを含んでいるに違いないと推測した。Ｍ１  ＤＮＡの左半部と右半部をプローブとして用いるサザンブロット法によってゲノムＤＮＡ地図を作成した。メチラーゼ選択方法によって第二のメチラーゼ遺伝子をクローニングするために、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩのゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。
【００１６】
第二のＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ２）をクローニングし配列決定した後、２つのＳａｐＩメチラーゼ遺伝子の上流及び下流のＤＮＡフラグメントのクローニング及び配列決定を試みた。通常は、特定の制限−修飾系におけるメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子は互いに極めて近接した位置に存在する。Ｍ２遺伝子の上流の合計１７３１ｂｐのＤＮＡを配列決定し、ＧｅｎＢａｎｋの全ての既知遺伝子と比較した。このＤＮＡは、抗生物質合成に関与する１つの遺伝子に相同性を有する推定遺伝子を含む。ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼはＭ２の上流には存在せず、Ｍ１遺伝子の下流に存在するらしいという結論が得られた。Ｍ１と下流のＤＮＡとを含むより大きいゲノムインサートをクローニングするために、ＮｌａIII 部分ゲノムライブラリーを構築した。下流のＤＮＡをＮｌａIII ライブラリーからスクリーニングし配列決定した。このＤＮＡは６５７ｂｐの長さしかなく、完全エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードできる十分な大きさではなかった。次に、エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むと考えられる配列の残部を逆ＰＣＲを使用して増幅しクローニングした。
【００１７】
別々の逆ＰＣＲ増幅を２回行った後、Ｍ１の下流のＤＮＡフラグメントをクローニングして配列決定し、１つの読取り枠を発見した。この読取り枠（ＯＲＦ）はＧｅｎＢａｎｋの既知の遺伝子に相同性を全く有していなかった。これをＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子であると推測した。ＳａｐＩ制限−修飾系の遺伝子編成を図２に示す。Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４またはｐＳＣ１０１に由来のベクターにクローニングし、染色体ＤＮＡを予め修飾するために大腸菌中に形質転換させた。
【００１８】
推定ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９にクローニングし、予め修飾した大腸菌宿主を形質転換させた。ｐＵＣ１９中のインサートを含むプラスミドは、細胞抽出物中で低いＳａｐＩエンドヌクレアーゼ活性を示したが、大量培養物中では全部の単離物が活性を喪失しており、クローンが安定でないことを示した。発現クローンを安定化するために、Ｍ２の手前に有効なリボソーム結合部位を組み込んで、ｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。Ｍ１遺伝子も同じベクターにクローニングした。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、Ｔ７プロモーターの上流に転写ターミネーターを有しているＴ７発現ベクター（ｐＥＴ２１誘導体）にクローニングした。転写ターミネーターは更に、非誘導条件下の遺伝子発現の基底レベルを更に低下させた。エンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、Ｔ７発現ベクターに挿入した。最終構築物はｐＵＣ１９−ＳａｐＩＲよりも安定であった。
【００１９】
【発明の実施の形態】
ＳａｐＩのメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングし発現させる本発明の方法は図１に示されており、以下の段階を含む。
【００２０】
１．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡを精製した。
【００２１】
２．Ｓａｕ３ＡＩもしくはＮｌａIII またはそのアイソシゾマーのいずれかのような、完全ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子を含む（１つまたは複数の）ＤＮＡフラグメントを生じさせる制限エンドヌクレアーゼによってＤＮＡを部分消化する。２−２０ｋｂの範囲のＤＮＡフラグメントをゲル精製した。
【００２２】
３．段階２でＳａｕ３ＡＩ消化したゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９クローニングベクターに結合させた。ＮｌａIII 消化したゲノムＤＮＡをＳｐｈＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９クローニングベクターに結合させた。得られた混合物を用いて適当な宿主、即ち大腸菌ＲＲ１株のようなＨｓｄＲ- 、ＭｃｒＢＣ- 、Ｍｒｒ- 菌株を形質転換させた。ＤＮＡ／細胞混合物を形質転換細胞用のアンピシリン選択培地で平板培養した。インキュベーション後、形質転換コロニーを収集し、収集コロニーを一緒にして一次細胞ライブラリーを作製した。
【００２３】
４．一次細胞ライブラリーから組換えプラスミドを完全に（ｉｎ  ｔｏｔｏ）精製して一次プラスミドライブラリーを作製した。精製したプラスミドライブラリーを次に、ＳａｐＩエンドヌクレアーゼまたは任意のＳａｐＩアイソシゾマーによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全消化した。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ消化は非修飾のメチラーゼ非含有クローンを選択的に破壊し、ＳａｐＩメチラーゼを含むクローンの相対頻度が増加した。
【００２４】
５．ＳａｐＩメチラーゼクローンの同定。消化したプラスミドライブラリーＤＮＡで大腸菌ＲＲ１のような宿主を再度形質転換させ、アンピシリンプレートに平板培養することによって形質転換コロニーを再度調製した。コロニーを採取し、それらのプラスミドＤＮＡを調製し、ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子の存在を分析するために、精製したプラスミドＤＮＡをＳａｐＩエンドヌクレアーゼと共にｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートすることによってＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを判定した。
【００２５】
６．メチラーゼ遺伝子がクローニングされたことを確認した後、制限地図作成及び欠失地図作成によってクローンを分析した。完全インサートを配列決定し、ＳａｐＩ  Ｍ１メチラーゼ遺伝子に対応する１つの読取り枠を発見した（図３、配列番号１参照）。
【００２６】
７．Ｍ１遺伝子の近傍のゲノムＤＮＡ地図を構築するために、Ｍ１クローンに由来の２つのＤＮＡフラグメント（ＣｌａＩ−ＳｍａＩフラグメント及びＣｌａＩ−ＳｐｈＩフラグメント）を、ＡａｔII、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩ、ＸｍｎＩ、ＡｆｌII、ＡｖｒII、ＢｓｇＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ，Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａIII 、ＥａｇＩ、Ｅｃｏ４７III 、ＥｃｏＮＩ、ＭｓｃＩ、ＭｕｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｒｕＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｍｌＩ、ＲｓｒII、ＳａｃII、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩまたはＳｔｙＩによって消化されたゲノムＤＮＡを検出するサザンブロットのプローブとして使用した。サザンブロットは、ＥｃｏＲＩ（１１ｋｂ）、ＫｐｎＩ（５．８ｋｂ）及びＳｍａＩ（６．５ｋｂ）のフラグメントがＳａｐＩＭ２遺伝子及び／またはＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングの有望な候補であることを示した。
【００２７】
８．ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩで消化した。約１１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント、約５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメント及び約６．５ｋｂのＳｍａＩフラグメントをゲル精製し、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩ消化しＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ベクターに結合させ、結合したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を形質転換させてＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーＤＮＡを一緒に混合し、ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＲＲ１コンピテント細胞を再度形質転換させ、ＳａｐＩ耐性クローンをスクリーニングした。
【００２８】
９．ＳａｐＩ消化に部分耐性を示すクローンとして５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントインサートを含む３つのクローンを単離した。制限地図作成及び欠失地図作成によってこれらのクローンを分析した。サブクローンを配列決定した。第二のメチラーゼ（Ｍ２）をコードする読取り枠を発見した（図４、配列番号２参照）。
【００２９】
１０．５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントインサートはＭ２遺伝子全部とＭ１遺伝子の大部分とを含む。読取り枠の位置の検出を期待してＭ２の上流のＤＮＡを配列決定した。Ｍ２遺伝子の上流の合計１７３１ｂｐのＤＮＡを配列決定し、この新しい配列をＧｅｎＢａｎｋの全部の既知遺伝子に比較した。抗生物質合成に関与するａｂａＡ遺伝子に相同性を有する１つの読取り枠を発見した。ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子はＭ２遺伝子の上流には存在しないという結論が得られた。
【００３０】
１１．Ｍ１遺伝子の下流のＤＮＡ配列を増幅するために逆ＰＣＲを行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、ＡｓｅＩ、ＢｇｌII、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮｇｏＭＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｐｐｕ１０ＩまたはＰｓｔＩのような制限酵素または逆ＰＣＲ反応に適した大きさの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ未満）を生じる任意の他の制限酵素によって消化した。消化したＤＮＡは低いＤＮＡ濃度（１ｍｌあたり２マイクログラム未満）で自己結合した。結合した環状ＤＮＡを鋳型として使用し、ＳａｐＩ  Ｍ１遺伝子の末端にアニーリングした１組のプライマー（実施例１、第５項参照）を用いて逆ＰＣＲ反応を行った。
【００３１】
１２．ＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、ＡｓｅＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｅＲ７Ｉ及びＰｐｕ１０Ｉで消化し自己結合した、逆ＰＣＲで用いたＤＮＡ鋳型中に増幅産物が検出された。ＣｌａＩ反応からの逆ＰＣＲ産物（１．４ｋｂ）及びＮｓｉＩ反応からの逆ＰＣＲ産物（１．６ｋｂ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって処理し、ＨｉｎｃII開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。完全インサートを配列決定した。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（図５、配列番号３）をコードしている１つの読取り枠がＭ１遺伝子に対して対向方向に存在することが判明した。
【００３２】
１３．大腸菌宿主を予め修飾するためにＳａｐＩのＭ１遺伝子及びＭ２遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。２つのプライマーを用いたＰＣＲによって完全読取り枠（ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子）を増幅させた。ＡＴＧ開始コドンの前に有効なリボソーム結合部位と７ｂｐのスペーシングとを作製した。エンドヌクレアーゼ遺伝子を先ずｐＵＣ１９のような高コピー数発現ベクターにクローニングした。しかしながらクローンは安定でなかった。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ活性は１０ｍｌ培養物の細胞抽出物から検出できるが、５００ｍｌ培養物からは検出できない。クローンを安定化するために、エンドヌクレアーゼ遺伝子を修飾されたＴ７発現ベクターｐＥＴ２１ｔに挿入し、ＳａｐＩメチラーゼで修飾した細胞の形質転換に用いた。ＥＲ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２，ｐＥＴ２１ｔ−ＳａｐＩＲ〕（ＮＥＢ＃９９８；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）は湿潤大腸菌細胞１ｇあたり約２０，０００単位のＳａｐＩエンドヌクレアーゼ活性を産生した。ＮＥＢ＃９９８のサンプルはブダペスト条約の約定及び条件に従って１９９６年７月１１日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号９８１０２で寄託されている。
【００３３】
以下の実施例は現在好ましく実施されている本発明の実施態様を説明する。この実施例は単なる代表例であり本発明を限定するものではないこと、及び、本発明は特許請求の範囲の記載によって限定されることは理解されよう。
【００３４】
前出及び後出の引用文献は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００３５】
実施例１
ＳａｐＩ制限−修飾系のクローニング
１．ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）のクローニング
１０μｇのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡを４、２、１、０．５、０．２５単位のＳａｕ３ＡＩによって３７℃で３０分間部分開裂した。部分消化したＤＮＡをゲル電気泳動によって分析した。１単位及び０．５単位のＳａｕ３ＡＩ消化によって限定部分消化が生じることが知見された。２００μｇのＤＮＡについて部分消化を繰り返した（試験管あたり１０μｇのＤＮＡを用いて２０の消化を実施した）。アガロースゲルからＤＮＡを切り出し、凍結−解凍し、遠心することによって、２−２０ｋｂの範囲のゲノムＤＮＡフラグメントをゲル精製した。ＤＮＡ含有上清を９５％エタノールで沈降させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥバッファに再懸濁させた。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ開裂／ＣＩＰ処理したｐＵＣ１９  ＤＮＡに１６℃で一夜結合させた。結合したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を形質転換させ、アンピシリンプレートで平板培養した。形質転換に由来する細胞が合計で約５×１０4 個得られた。これらの細胞を一緒にプールし、１リットルのＬＢブイヨンにＡｐを加えた培地に接種し、３７℃で一夜培養した。一次細胞ライブラリーからプラスミドＤＮＡを調製した。１０、５、２、１μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼによって３７℃で４時間開裂した。ＳａｐＩ消化したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を再度形質転換させた。生存する形質転換体からプラスミドＤＮＡを再度単離し、プラスミドＤＮＡがＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを確認するためにＳａｐＩ制限酵素によって消化した。７２プラスミドがＳａｐＩ消化耐性についてチェックされた。約１．５ｋｂのゲノムＤＮＡインサートを含む１つの耐性クローン（＃３２）が見出された。欠失クローン及びカスタムプライマーによるプライマーウォーキングを用いて完全インサートを配列決定した。インサートはＳａｐＩメチラーゼ遺伝子（Ｍ１）を含んでいることが判明した。予測されたアミノ酸（ａａ）配列は、保存されたＮ4 シトシンメチラーゼモチーフＶＸＤＰＸＧＧＸＧＴ（配列番号４）及びＳＰＰＦを含む。ＤＮＡコーディング配列と予測されたａａ配列とを図３に示す。
【００３６】
２．ＳａｐＩ  Ｍ１遺伝子の周囲のゲノムＤＮＡの制限地図作成
Ｍ１クローンに由来のＭ１メチラーゼのＣ末端をコードする１つのＣｌａＩ−ＳｍａＩ  ＤＮＡフラグメントを、ＡａｔII、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩ、ＸｍｎＩ、ＡｆｌII、ＡｖｒII、ＢｓｇＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａIII 、ＥａｇＩ、Ｅｃｏ４７III 、ＥｃｏＮＩ、ＭｓｃＩ、ＭｕｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｒｕＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｍｌＩ、ＲｓｒII、ＳａｃII、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩまたはＳｔｙＩによって消化されたゲノムＤＮＡを検出するサザンブロットのプローブとして使用した。エンドヌクレアーゼ消化したゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲルで電気泳動処理した。ＤＮＡを変性し、ブロッティングによってニトロセルロース膜に移した。膜のＤＮＡとビオチニル化したＣｌａＩ−ＳｍａＩフラグメントプローブとを６５℃で一夜ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたＤＮＡをＮＥＢｌｏｔ（登録商標）ホトトープ（ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ）検出システムによって検出した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。同じゲノムＤＮＡの膜をストリッピングし、ＳａｐＩメチラーゼＭ１のＮ末端をコードするＣｌａＩ−ＳｐｈＩ  ＤＮＡプローブによって再度プロービングした。サザンブロットは、ＥｃｏＲＩ（１１ｋｂ）、ＫｐｎＩ（５．８ｋｂ）及びＳｍａＩ（６．５ｋｂ）のフラグメントが、ＳａｐＩ  Ｍ２遺伝子及び／またはＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする周囲のＤＮＡのクローニングの有望な候補であることを示した。
【００３７】
３．ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子Ｍ２のクローニング
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩによって開裂した。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲルで電気泳動処理した。約１１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント、約５．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメント及び約６．５ｋｂのＳｍａＩフラグメントをゲル精製し、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＳｍａＩ消化しＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ベクターに結合した。結合したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を形質転換させた。約６，０００のコロニーを一緒にプールし、５００ｍｌのＬＢブイヨンにＡｐを加えた培地に接種し、一夜培養した。混合した一次細胞ライブラリーからプラスミドＤＮＡを調製した。１０、５、２、１μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼによって３７℃で４時間開裂した。ＳａｐＩ消化したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を再度形質転換させた。Ｍ１  ＤＮＡプローブを用いて形質転換体のコロニーハイブリダイゼーションを行った。プラスミドＤＮＡを陽性クローンから単離し、プラスミドＤＮＡがＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを判断するためにＳａｐＩ制限酵素によって消化した。単離物＃５、＃１８及び＃３２はＳａｐＩ消化に部分的に耐性であり、５．８ｋｂのＫｐｎＩゲノムインサートを含む。制限地図作成、欠失地図作成及びＤＮＡ配列決定は、インサートが第二のメチラーゼ遺伝子Ｍ２とＭ１の大部分とを含むことを示した。Ｍ２のコーディング配列と予測ａａ配列とを図４に示す。ＳａｐＩ  Ｍ２メチラーゼはまた、保存されたＮ4 シトシンメチラーゼモチーフＶＸＤＰＸＧＧＸＧＴ（配列番号４）及びＳＰＰＹを含む。Ｍ２の上流の余分なＤＮＡは約３．３ｋｂである。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子である読取り枠を見出すことを期待してＭ２に隣接のＤＮＡを配列決定した。合計１７３１ｂｐのＤＮＡを配列決定し、ＧｅｎＢａｎｋの全部の既知遺伝子に比較して相同性を検査した。Ｍ２の上流の１つの読取り枠は、抗生物質合成に関与する１つの遺伝子に類似性を有することが判明した。Ｍ２遺伝子の上流のこの読取り枠はＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子でないという結論が得られた。
【００３８】
４．部分ＮｌａIII ライブラリーの構築によるＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の一部分のクローニング
ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がＭ１遺伝子の下流の位置に存在する可能性が高いので、Ｍ１とＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子との双方を含むより大きいＤＮＡフラグメントのクローニングを試験した。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＮｌａIII 制限エンドヌクレアーゼによって部分消化した。３−２０ｋｂの範囲のゲノムＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ＳｐｈＩ消化しＣＩＰ処理したｐＵＣ１９に挿入した。結合したＤＮＡを用いてＲＲ１コンピテント細胞を形質転換させた。一次細胞ライブラリーからプラスミドＤＮＡを調製した。１０、５、２、１μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼによって３７℃で４時間開裂した。ＳａｐＩ消化したＤＮＡでＲＲ１コンピテント細胞を再度形質転換させた。プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドＤＮＡがＳａｐＩ消化に耐性であるか否かを観察するためにＳａｐＩ制限酵素によって消化した。１５３のプラスミド単離物のスクリーニング後、ｐＵＣ１９−ゲノムインサート＃９、＃１３、＃１４、＃５９、＃８３、＃８４、＃８８、＃１０９、＃１１８、＃１２３、＃１２６、＃１３３、＃１４８はＳａｐＩ消化に耐性であることが判明した。制限地図作成によれば、＃１３、＃１４及び＃５９が同じインサートを含むことが判明し、Ｍ１メチラーゼ遺伝子の下流のＤＮＡが配列決定された。＃１３のインサートはＭ１インサートから更に６５７ｂｐだけ伸びる余分なＤＮＡを含んでいた。しかしながらこの６５７ｂｐは完全ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードできる大きさではない。＃１３は細胞抽出物中で検出可能な制限エンドヌクレアーゼ活性を全く示さなかった。
【００３９】
５．逆ＰＣＲによるＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の残部のクローニング
Ｍ１遺伝子の下流に存在するＤＮＡ配列を増幅するために逆ＰＣＲを使用した。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡをＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、ＡｓｅＩ、ＢｇｌII、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮｇｏＭＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｐｐｕ１０ＩまたはＰｓｔＩから成る制限酵素によって消化した。消化したＤＮＡは低いＤＮＡ濃度で自己結合した（結合反応：２０μｌの消化ＤＮＡ、約１μｇ、５０μｌの１０×結合バッファ、５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、４２５μｌの滅菌蒸留水，１６℃、一夜）。結合した環状ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3 抽出及びエタノール沈降によって精製し、ＳａｐＩ  Ｍ１遺伝子の末端にアニーリングした１組のプライマーを用いる逆ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。逆ＰＣＲに使用したプライマー配列を以下に示す。
【００４０】
順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー：
５′ＴＡＡＧＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧ３′（配列番号５）
逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー：
５′ＡＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＡＧＴＴＧＴＡ３′（配列番号６）
逆ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で２分間であり、これを３０サイクル反復した。逆ＰＣＲ産物は、ＡｆｌIII 、ＡｇｅＩ、ＡｓｅＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｅＲ７Ｉ及びＰｐｕ１０Ｉで消化し自己結合したＤＮＡ鋳型中で検出された。ＣｌａＩ反応からの逆ＰＣＲ産物（１．４ｋｂ）及びＮｓｉＩ反応からの逆ＰＣＲ産物（１．６ｋｂ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｃII開裂／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。欠失クローン及びカスタムプライマーを用いて完全インサートを配列決定した。Ｍ１遺伝子に対して対向方向で存在する１つの読取り枠が発見された。ＤＮＡコーディング配列及び予測ａａ配列を図５に示す。
【００４１】
６．ｐＵＣ１９中のＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現
ＳａｐＩ  Ｍ１遺伝子をｐＲ９７６（ＴｃR 、ｐＡＣＹＣ１８４誘導体、図６）にサブクローニングし、Ｍ２遺伝子をｐＬＧ３３９（ＫｎR ，ｐＳＣ１０１誘導体、Ｓｔｏｋｅｒら，Ｇｅｎｅ  １８：３３５−３４１）にクローニングした。宿主染色体を予め修飾するために、ｐＲ９７６−Ｍ１及びｐＬＧ３３９−Ｍ２の双方で大腸菌を形質転換した。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９に結合させた。低レベルのＳａｐＩ発現が大腸菌〔ｐＲ９７６−Ｍ１、ｐＬＧ３３９−Ｍ２、ｐＵＣ１９−ＳａｐＩＲ〕中で得られたが、菌株は安定でなかった。ＳａｐＩ活性は１０ｍｌの培養物中でのみ検出された。５００ｍｌ培養物中ではＳａｐＩ活性は喪失していた。
【００４２】
７．Ｐtac プロモーターコントロール下の低コピー数プラスミドｐＲ９７６中のＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現
ｐＵＣ１９のような高コピー数プラスミド中のＳａｐＩ発現が安定でなかったので、低コピー数プラスミド中の発現は安定化されるであろうと考えた。宿主ＤＮＡを修飾するために大腸菌コンピテント細胞をｐＵＣ１９−Ｍ１及びｐＬＧ３３９−Ｍ２で形質転換させた。ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐＲ９７６のＰｓｔＩ部位に挿入した。大腸菌株〔ｐＵＣ１９−Ｍ１、ｐＬＧ３３９−Ｍ２、ｐＲ９７６−ＳａｐＩＲ〕は、湿潤大腸菌細胞１ｇあたり約１，０００単位のＳａｐＩを産生し、これは天然型菌株の３倍の産生量であった。この場合にも、大量細胞培養物中では活性が減少したので菌株は安定でなかった。この不安定性の原因はおそらくメチル化が不十分なこと、及び、Ｐtac プロモータからの構成的エンドヌクレアーゼ発現にある。
【００４３】
８．ｐＵＣ１９及びｐＡＣＹＣ１８４におけるＭ１及びＭ２の発現
ＳａｐＩ発現クローンは安定でなかったので、ＳａｐＩメチラーゼ遺伝子Ｍ１及びＭ２の過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が問題解決の助けとなると考えられた。有効なリボソーム結合部位ＧＧＡＧＧＴ及び６ｂｐのスペーシングＡＡＡＴＡＡをＰＣＲによってＭ２遺伝子の手前に作製し、遺伝子をｐＵＣ１９−ＳａｐＩＭ１に挿入した。得られたプラスミドはｐＵＣ１９−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２（ベクター中に１つのＳａｐＩ部位が存在する）であった。このプラスミドを単離しＳａｐＩで消化すると、ＤＮＡの約７０％だけがＳａｐＩ消化に耐性であった。これはｉｎ  ｖｉｖｏではＳａｐＩメチラーゼの発現が少なく／ＳａｐＩメチラーゼタンパク質が不安定であることを示す。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏのＳａｐＩメチラーゼ修飾レベルを比較するために、Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にもクローニングした。得られたプラスミドはｐＡＣＹＣ１８４−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２であった。このプラスミドとｐＵＣ１９で大腸菌細胞を同時形質転換させた。プラスミドＤＮＡ混合物を細胞から単離し、ＳａｐＩ消化処理した（ｐＵＣ１９中には１つのＳａｐＩ部位が存在するが、ｐＡＣＹＣ１８４−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２中にはＳａｐＩ部位が存在しない）。ｐＵＣ１９  ＤＮＡの約７０％がＳａｐＩ消化に耐性であることが判明した。これは、高コピー数プラスミド及び低コピー数プラスミドを用いてメチラーゼを発現させた場合同様のレベルのＳａｐＩ部位修飾が生じたことを示す。
【００４５】
９．修飾されたＴ７発現ベクター中のＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現
ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するために２つのプライマーを作製した。プライマー配列は、
順方向プライマー：５′ＣＧＣＴＣＴＡＧＡ（ＸｂａＩ部位）ＧＧＡＧＧＴ（リボソーム結合部位）ＴＡＡＡＴＡ（スペーシング）ＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣ３′（配列番号７）
逆方向プライマー：５′ＧＡＧＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ部位）ＴＣＡＧＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＡＧ３′（配列番号８）
ＳａｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種のゲノムＤＮＡから増幅させるために、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５０：１の割合）を用い、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分３０秒間のサイクルを２０回反復するＰＣＲ条件で処理した。ＰＣＲ  ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3 抽出及びエタノール沈降によって精製し、ＴＥバッファに再懸濁させた。ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼによって消化し、修飾したＴ７発現ベクターｐＥＴ２１ｔに結合させた。発現ベクターｐＥＴ２１ｔは、非誘導条件下の基底発現レベルを更に低下させるためにＴ７プロモーターの上流に転写ターミネーターを含んでいる（ｐＥＴ２１ｔはＨ．Ｋｏｎｇ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって構築され提供されたものである）。結合したＤＮＡを使用してＳａｐＩメチラーゼで修飾した細胞ＥＲ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２〕を形質転換させた。ＥＲ２５０４はＴｏｎＡ- 及びＤＮａｓＩ- のＢＬ２１（λＤＥ３）誘導体である。大腸菌細胞ＥＲ２５０４〔ｐＡＣＹＣ−ＳａｐＩＭ１−Ｍ２、ｐＥＴ２１ｔ−ＳａｐＩＲ〕をＬＢブイヨン中で後期対数増殖期（約１５０ｋｌｅｔｔ単位）まで増殖させ、エンドヌクレアーゼ産生を誘発するためにＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加した。ＩＰＴＧ誘発と細胞培養とを３時間継続した。細胞を遠心によって採取し、音波処理バッファ（１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に再浮遊させた。リゾチームを添加して細胞を溶解し、音波処理した。落屑細胞を遠心によって除去し、上清のＳａｐＩ活性をλＤＮＡに対するアッセイによって検定した。菌株は湿潤大腸菌細胞１ｇあたり約２０，０００単位のＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼを産生していた。１００リットルの発酵槽で培養した細胞もやはりＳａｐＩエンドヌクレアーゼを産生した。
【００４６】
１０．組換えＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼの精製
組換えＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼを、ヘパリン−セファロースカラム、ホスホセルロースカラム及びＱ−セファロースＨＰＬＣを用いたクロマトグラフィーによって精製した。精製した酵素をλ  ＤＮＡ及びｐＵＣ１９を基質としたアッセイによって検定した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニング及び産生を示すスキームである。
【図２】ＳａｐＩ制限−修飾系の遺伝子編成の概略図である。
【図３】ＳａｐＩＭ１遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）及びこれによってコードされたタンパク質配列である。
【図４】ＳａｐＩＭ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号２）及びこの配列にコードされているタンパク質配列である。
【図５】ＳａｐＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３）及びこの配列にコードされているタンパク質配列である。
【図６】ｐＲ９７６の構築を示す。ベクターｐＲ９７６は、Ｐtac プロモーターとＰtac プロモーターの下流の多重クローニング部位とを有するｐＡＣＹＣ１８４誘導体である。このベクターは更に、Ｐtac プロモーターからの遺伝子発現を調節するためのＬａｃリプレッサーをコードしているｌａｃＩ遺伝子を含んでいる（Ａｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ  ２５：１６７−１７８（１９８３））。
【配列表】
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【化１】0004172661.tif 000003
【化２】0004172661.tif 000004
0004172661.tif 000005
【化３】0004172661.tif 000006
【化４】0004172661.tif 000007
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【化５】0004172661.tif 000009
【化６】0004172661.tif 000010
【化７】0004172661.tif 000011
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【化８】0004172661.tif 000013
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【化９】0004172661.tif 000015
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【化１０】0004172661.tif 000017
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【化１１】0004172661.tif 000019
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【化１２】0004172661.tif 000021
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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