(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀類ブランから遊離型フェルラ酸を調製する方法であって、
a）試料投入速度20〜50kg/hrで、粉砕した脱脂穀類ブランを同方向完全噛合型二軸加圧押出機に投入する工程、
b）スクリュー速度200〜400rpm、水分含量15〜40％及び温度100〜200℃に維持する工程、
c）加圧押出した穀類ブランを水に懸濁し、重量比1：0.001〜1：0.1で植物細胞壁加水分解酵素を添加し、温度30〜60℃で30分〜12時間撹拌しながら混合物を維持する工程、並びに
d）酢酸エチルを用いて加水分解物を抽出し、酢酸エチルを蒸発させ、フェルラ酸を回収する工程、
を含むことを特徴とする、前記調製方法。
【請求項２】
前記穀類ブランが米糠、小麦糠、ライ麦糠、玉蜀黍糠、大麦糠及び燕麦糠から成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
前記植物細胞壁加水分解酵素が、セルラーゼ、及び／又はアラビナーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ及びグルカナーゼから成る群より選択させるヘミセルラーゼであることを特徴とする、請求項１記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は穀類由来の生理活性物質およびその調製方法に関する。より詳細には、本発明は穀類ブラン(cereal bran)を加圧工程処理した後に細胞壁加水分解酵素を添加するという複合的処理工程によりフェルラ酸(ferulic acid)およびアラビノキシラン(arabinoxylan)を分離して調製する方法に関する。
【０００２】
背景技術
穀類ブランは穀類の研磨過程(polishing process)で生じる副産物であり、穀類の外皮層(outer layer)のうち副皮(hull)を除いた果皮(pericarp)、種皮(seed coat)、糊粉層(aleurone)などから構成され、場合によっては、生産過程で胚(germ)と胚乳(endosperm)の一部が含まれることもある(Kulp，K．et al.,Handbook of Cereal Science and Technology，Marcel Dekker,Inc.,Switzerland,2000)。
【０００３】
穀類ブランの細胞壁はセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニンおよび糖蛋白質などの高分子物質で構成されている。これら構成成分らは互いに遊離した状態で存在するのではなく、大部分が、共有結合・水素結合・イオン結合および疎水結合などにより強く結合しており、ほとんどが不溶性の状態で存在する(Dey，P.M.and Brinson,K．Adv.Carbohydr.Chem．Biochem.,42：265ー382，1986)。
【０００４】
穀類ブランの細胞壁内には前記高分子物質以外にもビタミン、無機質などが存在しており、特に、最近機能性生理活性成分として注目されているフェノール類成分(phenolic compounds)である、フェルラ酸(ferulic acid),カフェイン酸(caffeic acid)、シナピン酸(sinapic acid)、コウマリン酸(coumaric acid)などが公知である(Clifford,M.N. et al.,Int.J.Pharmacol.,199：39ー47，2000)。
【０００５】
フェルラ酸は穀類ブランの細胞壁内で遊離型(free form)で存在するのではなく、細胞壁構成成分であるアラビノキシランとエステル結合により強く結合された不溶性状態で存在する(Saulnier，L．and Thibault,J.F.,J.Sci.Food Agric.,79：396-402，1999)。
【０００６】
穀物を摂取した場合、人の体内にはフェルラ酸とアラビノキシランのエステル結合を分離し得る酵素系がないため、フェルラ酸が穀物内に存在していても、生体利用能力が極めて低いので、実質的な生理活性は期待し難い(Saunders,R.M. et al.,Cereal Chem.,49：436-442，1972；Annison,G.et al.,World's Poult.Sci.J.,47：232-242,1991)。
【０００７】
一方、穀類ブランの細胞壁を構成するヘミセルロースのうちアラビノキシランは、代表的な複合型炭水化物の一種であり、最近、免疫賦活作用、抗糖尿病、感染に対する抵抗力の増強、悪性腫瘍治癒補助剤、水溶性食物繊維活性などの生理活性が知られており、新たな機能性食品素材として注目されている(Ghoneum,M.,Int.J.Immunother.,104(2)：89-99，1998；Miyazaki,H．et al.,Int.J.Immunophamacol.,16(2)：163-170，1994；Menon,P.V．et al.,J.Nutr.,106(4)；555-562，1976)。
【０００８】
しかし、アラビノキシランの場合にも、穀類ブランの細胞壁内において遊離型で存在するのではなく、他の細胞壁成分と強く結合した不溶性の状態で存在している(Hatfield,R.D．et al.,J.Sci.Food Agric.,79：404-407，1999)。ヒト体内には前記のように不溶性組織を水溶性にする酵素系がないため、アラビノキシランの場合も生体利用性を期待し難い。
【０００９】
穀類の加工工程として通常的に用いられている蒸し(steaming)、炒り(roasting)、乾燥、粉砕工程などは、工程の特性上、穀類内において不溶性状態に強く結合した形態のフェルラ酸とアラビノキシランを他の細胞壁構成成分から分離するのが非常に難しい。
【００１０】
一方、穀類の植物細胞壁構造は結合組織が非常に稠密であり酵素が浸透し難いため、酵素処理の単独工程による穀類の不溶性成分の分離は困難である。加圧工程は短時間高温処理による加熱効果のみならず、高圧および強い剪断力(shear force)を伴うので、堅固な植物細胞壁構造の変性に極めて効果的である(Hwang et al.,J.Korean Soc.Food Nutr.,23(2)：358-370，1994)。
【００１１】
従って、酵素を単独的に処理する場合には植物細胞壁の構成成分へ到達することが容易ではないが、加圧処理を先に行う場合には細胞壁の構造が相当に弛緩されているため、穀類の細胞壁に対する酵素の作用が円滑であり、生理活性成分の分離が可能である。
【００１２】
本発明者らは、前述の点に着目して、米・小麦・ライ麦・玉蜀黍・麦・燕麦などのような穀類ブランを加圧工程処理により一次的に堅固な穀類ブランの細胞壁構造を弛緩させた後、二次的に細胞壁加水分解酵素を利用して不溶性成分を加水分解する複合的処理工程を適用して効率的にフェルラ酸とアラビノキシランを分離調製することにより、本発明を完成した。
【００１３】
従って、本発明の目的は、穀物から分離したフェルラ酸およびアラビノキシランのような生理活性物質を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、前記穀物から分離した生理活性物質の調製法を提供することにある。
【００１５】
本発明の前記の目的は、米・小麦・ライ麦・玉蜀黍・麦・燕麦などから由来する穀類ブラン(cereal bran)を二軸加圧押出機(twin screw extruder)に投入して加圧押出した後、セルラーゼ(cellulase)やアラビナーゼ(arabinase)、キシラナーゼ(xylanase)、マンナーゼ(mannase)、グルカナーゼ(glucanase)などのヘミセルラーゼ(hemicellulase)を加えて加水分解することにより、フェルラ酸(ferulic acid)とアラビノキシラン(arabinoxylan)などのような生理活性物質を単離調製し、これら生理活性物質を測定して評価することにより達成された。
【００１６】
発明の説明
本発明は粉砕した穀類ブランを二軸加圧押出機に投入して加圧押出する第一段階、加圧押出後の試料に水を加えて分散させた後に細胞壁加水分解酵素を加えて加水分解する第二段階、酵素加水分解液に酢酸エチルを加えて抽出した後に溶媒抽出液を減圧濃縮してフェルラ酸を調製する第三段階、該第二段階の酵素加水分解液を濾過した後に濾過液にαーアミラーゼとしてTermamyl 120L(Novozymes A/S，Denmark)を加えて澱粉を加水分解する第四段階、限外濾過機(ultrafiltrater)を利用して濾過する第五段階、そして、限外濾過した残留濃縮液を乾燥してアラビノキシランを含む水溶性多糖類を調製する第六段階により構成される。
【００１７】
本発明の望ましい実施例を図１に示した。
【００１８】
本発明で用いる穀類ブランは、米・小麦・ライ麦・玉蜀黍・麦・燕麦などの搗精過程で生じるブラン層(bran layer)を粉砕して用いた。
【００１９】
前記第一段階で用いる加圧押出機(extruder)は、L/Dの比が20：1である同方向完全噛合型ニ軸加圧押出機 (coratation intermeshing type twin-screw extruder； Buhler Brothers Co.DNDL-40，Switzerland)を用いた。加圧押出（extruding）条件は、スクリュー速度200〜400rpm，試料投入速度20〜50kg/h、試料水分含量は15〜40％、加熱温度は100〜200℃に調節するのが望ましい。また、加圧押出機としては全ての一軸加圧押出機(single screw extruder)または二軸加圧押出機が適しているが、穀類ブランの堅固な細胞壁構造を弛緩するためには二軸加圧押出機を用いる方がより望ましい。
【００２０】
本発明で細胞壁加水分解酵素は、セルラーゼ(cellulase)、アラビナーゼ(arabinase)、キシラナーゼ(xylanase)、マンナーゼ(mannase)およびグルカナーゼ(glucanase)を含む植物細胞壁分解酵素を単独で用いるか、または二種以上を混合して用いることができる。
【００２１】
本発明で加水分解酵素としては、商業的に販売されている酵素であるセルクラスト(Celluclast，Novozymes A/S，Denmark)、エコナーゼHC400(Econase HC400、Econase Co.,Finland)、セレミキス(Ceremix，Novozymes A/S，Denmark)を重量比で同量混合したものを用いた。前記商業的酵素は、精製酵素ではなく非精製酵素であり、セルラーゼ、βーグルカナーゼ、アラビナーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼなどを複合的に含んでいるため、単一の精製酵素より複合性炭水化物で構成されている穀類の細胞壁の加水分解により効果的である。
【００２２】
本発明で用いる酵素の添加量は加圧押出した穀類ブランに対し重量比１：0．001〜１：0.1の比率で添加されるのが望ましく、添加後30〜60℃で30分〜12時間加水分解するのが望ましい。
【００２３】
以下、本発明の具体的な方法を実施例と実験例を挙げて詳細に説明するが、本発明の権利範囲はこれらの例のみに限定されるのではない。
【００２４】
発明を実施するための最良の形態
実施例１：本発明の米糠の加圧押出後に酵素処理の複合方式によるフェルラ酸の調製
粉砕した脱脂米糠(defatted rice bran)を同方向完全噛合型ニ軸加圧押出機(corotation intermeshing type twin-screw extruder；Buhler Brothers Co.DNDL-40,Switzerland)に投入後、スクリュー速度300rpm、試料投入速度30kg/h、水分含量30％に保ちながら、温度150℃で加圧工程を実施した。加圧工程を経た米糠１kgを20Lの水に分散させた後、セルクラスト(Celluclast, Novozymes A/S,Denmark)：エコナーゼHC400(Econase HC400, Econase Co.,Finland)：セレミキス(Ceremix, Novozymes A/S,Denmark)を重量比で1：1：1に混合した酵素液10mlを添加した後、60℃で２時間攪拌した。次いで、酵素反応液に20Lの酢酸エチル(ethyl acetate)を加えて抽出した後、抽出液を分画して減圧濃縮することにより、フェルラ酸を含む乾燥抽出物を調製した。
【００２５】
実験例１：本発明のフェルラ酸の生産収率
本発明の前記実施例１で調製した試料0.1gにメタノールと水を1：1の体積比で混合した混合液10mlを加えて溶解させた後、毛細管電気泳動装置(Capillary Electrophoresis; Beckman Inc.,USA)を利用してフェルラ酸を測定した。
【００２６】
毛細管電気泳動の分析条件として、カラムは融合型シリカ毛細管カラム(fused silica capillary column)を用い、バッファー溶液としては0.1Mのホウ酸バッファー溶液を用いた。注入条件は加圧下で３秒間注入し、25KV、温度25℃に調節して分析した後、パルスダイオードアレイ検出器(pulsed diode array detecter)を用いて検出した。
【００２７】
原料脱脂米糠１kgに20Lの１N NaOHを加え、25℃で１時間加水分解してフェルラ酸を遊離させた後、乾燥し、これを前記実験例と同一の方法でフェルラ酸を抽出し、試料に含まれる総フェルラ酸含量を、毛細管電気泳動装置で測定した。
【００２８】
図２は前記毛細管電気泳動装置の分析条件で脱脂米糠からNaOHで分離した総フェルラ酸を示すものである。
【００２９】
図３は前記の毛細管電気泳動分析条件で、前記実施例１の通り、加圧押出後に酵素処理を行う複合方式により脱脂米糠から分離したフェルラ酸を示したものである。
【００３０】
図４は前記の毛細管電気泳動分析条件で、加圧押出の単独処理により脱脂米糠から分離したフェルラ酸を示すものである。
【００３１】
図５は前記の毛細管電気泳動分析条件で、加圧押出せずに直接酵素処理を行う単独工程により脱脂米糠から分離したフェルラ酸を示すものである。
【００３２】
下記表１は処理工程別に原料の米糠から分離された遊離型フェルラ酸の含量とNaOH処理した試料のフェルラ酸を100％としたときの相対的分離収率を示すものである。
【００３３】
【表１】
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前記表１に示されている通り、米糠内に不溶性状態で結合していたフェルラ酸は、加圧押出または酵素処理の単独工程によっては分離収率が非常に低いが、加圧押出後に酵素処理を行う複合的工程によると、総フェルラ酸の約81.5%が不溶性フェルラ酸が遊離型フェルラ酸として分離されるという著しい効果を示した。
【００３４】
実施例２：本発明の米糠の加圧押出後に酵素処理を行う複合的工程によるアラビノキシランの調製
粉砕した脱脂米糠(defatted rice bran)を同方向完全噛合型ニ軸加圧押出機(corotation intermeshing type twin-screw extruder；Buhler Brothers Co.DNDL-40,Switzerland)に投入後、スクリュー速度300rpm、試料投入速度30kg/h、水分含量30％に保ちながら、温度150℃で加圧工程を実施した。加圧工程後の米糠１kgを20Lの水に分散した後、セルクラスト(Celluclast,Novozymes A/S，Denmark)、エコナーゼHC400(Econase HC400，Econase Co.，Finland)、セレミキス(Ceremjx，Novozymes A/S，Denmark)を重量比で同量混合した酵素液10mlを添加し、60℃で２時間攪拌して反応させた後、遠心濾過(centrifugal filter)により濾過を行った。濾過液にTermamyl 120L(Novozymes A/S，Denmark)10mlを添加し、90℃で１時間澱粉を加水分解した後、分子量切断(molecular weight cut off)が5，000である濾過膜を装着した限外濾過機(ultrafiltrator;Proflux M60，Millipore，USA)を利用して濾過した。限外濾過された濃縮液を乾燥してアラビノキシランを含む水溶性多糖類を調製した。
【００３５】
実験例２：本発明の水溶性多糖類のアラビノキシラン含量
前記実施例１により調製された水溶性多糖類１mgに２N硫酸1.2mlを加え、100℃で３時間加熱して生成された中性糖(neutral sugars)の含量をBio-LC(Dionex DX-500，USA)を利用して測定し、アラビノース(arabinose)とキシロース(xylose)の合計をアラビノキシランの含量と決定した。
【００３６】
Bio-LCの分析条件は、カラムはカーボパックPA1(Carbopac TMPA1)を用い、定組成溶出液(isocratic eluent)には22.6mM NaOHを用い、再生バッファーとしては200mM NaOHを用いた。溶出液の流速は0.3ml/min，試料注入量は50μlであり、電気化学的検出器(ECD; electro chemical detecter)を用いて検出した。
【００３７】
アルカリで抽出した水溶性多糖類は、原料脱脂米糠１kgに20Lの１N NaOHを加えて溶かして水溶液とした後、該水溶液を１N HClを用いてpH6.0に調整し、前記実施例２と同一の方法で澱粉を除去し、限外濾過を行って調製した。
【００３８】
図６は、前記Bio-LC分析条件で、１N NaOH処理により脱脂米糠から分離した水溶性多糖類の中性糖分布を示すものである。
【００３９】
図７は前記Bio-LC分析条件で実施例２の通り加圧押出した後に酵素処理を行う複合的工程により脱脂米糠から分離した水溶性多糖類の中性糖の分布を示すものである。下記表２は処理工程別に原料米糠から分離された水溶性多糖類の収率と中性糖の分布を示すものである。
【００４０】
【表２】
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前記表２に示した通り、加圧押出した後に酵素処理を行う複合的工程は、アルカリ処理と殆ど類似した収率を示した。これに対して、加圧押出または酵素処理を単独で施行した場合には、水溶性多糖類の生産収率は非常に低いことが示された。
【００４１】
特に、加圧押出後に酵素処理を行う複合方式によるアラビノースとキシロースの中性糖含量は90.5％であって、アルカリ処理した試料の52.7％に比べてかなり高いが、このことは、アルカリ処理に比べて、加圧押出と酵素処理からなる複合的工程により調製された水溶性多糖類のアラビノキシランの純度が、非常に高いことを意味する。従って、脱脂米糠における加圧押出と酵素処理からなる複合的工程は、それぞれの単独工程に比べて水溶性多糖類の生産収率とアラビノキシランの含量を有意に増加させることが分かる。
【００４２】
実験例３：本発明の水溶性多糖類の分子量
前記実施例１により調製された水溶性多糖類0.01gに蒸留水10mlを加え分散させた後、その分子量の分布をゲル浸透クロマトグラフィー(Gel Permeation Chromatography:Alliance2690、Waters,USA)を用いて測定した。
【００４３】
GPCの分析条件では、カラムはウルトラハイドロゲル・リニア(Ultrahydrogel linear)とウルトラハイドロゲル500(Ultrahydrogel 500)を連結させて用いた。定組成溶出液(isocratic eluent)としては0.1N NaNO３を用い、溶出液の流速は1.0ml/minとした。カラム温度と検出器の温度はそれぞれ45℃と35℃であった。試料の注入量は100μlであり、屈折率検出器(Refractive Index detector)を用いて検出した。
【００４４】
アルカリ溶解性多糖類は、原料脱脂米糠１kgに20Lの１N NaOHを加えて溶解した後、１N HClによりpH6.0に調整し、前記実施例２と同一の方法で澱粉を除去して限外濾過により調製した。
【００４５】
図８は、前記GPC分析条件で１N NaOH処理により脱脂米糠から分離した水溶性多糖類の分子量分布を示す
ものである。
【００４６】
図９は前記GPC分析条件で実施例２の通り加圧押出と酵素処理の複合工程により脱脂米糠から分離した水溶性多糖類の分子量分布を示すものである。
【００４７】
アルカリ処理により調製された水溶性多糖類は、分子量約5,000〜1,170,000にわたって広く分布している。これに対して、本発明の加圧押出と酵素処理からなる複合工程により調製されたアラビノキシランは、平均分子量が約5,000であって、非常に均一な分子分布を示している。
【００４８】
実施例３：小麦糠(Wheat bran)から生理活性物質の調製
本発明の前記実施例１と実施例２に示した通り、加圧押出後に酵素処理を行う複合方式により小麦糠から生理活性物質を分離調製した。フェルラ酸は実験例１と同一の方法により測定した結果、ふすまに存在する総フェルラ酸の84.6％が分離され、アラビノキシランは実験例２と同一の方法により測定した結果、原料小麦糠から15.2％(重量比)が分離されていた。
【００４９】
実施例４：ライ麦ブラン(Rye bran)から生理活性物質の調製
本発明の前記実施例１および実施例２に示した通り、加圧押出後、酵素処理の複合方式によりライ麦ブランから生理活性物質を分離し調製した。フェルラ酸は実験例１と同一の方法により測定した結果、ライ麦ブランに存在する総フェルラ酸の78.5％が分離され、アラビビノキシランは実験例２と同一の方法により測定した結果、原料ライ麦ブランから13.5％(重量比)が分離されていた。
【００５０】
実施例５：玉蜀黍ブラン(Corn bran)から生理活性物質の調製
本発明の前記実施例１と実施例２の通り、加圧押出後、酵素処理の複合方式により玉蜀黍ブランから生理活性物質を分離調製した。フェルラ酸は実験例１と同一の方法により測定した結果、玉蜀黍ブランに存在する総フェルラ酸の78.5％が分離され、アラビノキシランは実験例２と同一の方法により測定した結果、原料玉蜀黍ブランから13.5％(重量比)が分離されていた。
【００５１】
実施例６：麦ブラン(Barley bran)から生理活性物質の調製
本発明の前記実施例１および実施例２の通り、加圧押出後に酵素処理を行う複合方式により麦ブランから生理活性物質を分離調製した。フェルラ酸は実験例１と同一の方法により測定した結果、麦ブランに存在する総フェルラ酸の78.5％が分離され、アラビノキシランは実験例２と同一の方法により測定した結果、原料麦ブランから11.9％(重量比)が分離されていた。
【００５２】
実施例７：燕麦ブラン(Oat bran)から生理活性物質の調製
燕麦ブランを前記実施例１および実施例２の通り、加圧押出後に酵素処理を行う複合的工程によりフェルラ酸とアラビノキシランを調製した。調製したフェルラ酸は実験例１と同一の方法により測定した結果、燕麦ブランに存在する総フェルラ酸の69.2％が分離され、アラビノキシランは実験例２と同一の方法により測定した結果、原料燕麦ブランから14.7％(重量比)が分離されていた。
【００５３】
産業上の利用可能性
本発明は以上の実施例と実験例により説明した通り、穀類ブランを加圧押出した後に植物細胞壁加水分解酵素で処理する、2つの処理を組合せた複合方式の適用により、従来の加圧押出工程または酵素処理工程それぞれの単独工程に比べて生理活性物質であるフェルラ酸とアラビノキシランを容易に、かつ有意に優れた収率で分離するという有利な効果があるので、食品加工産業上非常に有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は本発明の脱脂米糠から加圧押出と酵素処理の複合的工程によりフェルラ酸とアラビノキシランを得るための好ましい実施例を示す概略図である。
【図２】  図２は、NaOH処理により脱脂米糠から分離された総フェルラ酸含量を示す毛細管電気泳動装置の測定結果である。
【図３】  図３は、本発明の加圧押出後に酵素処理を行う複合的工程により脱脂米糠から分離されたフェルラ酸量を示す毛細管電気泳動装置の測定結果である。
【図４】  図４は、加圧押出の単独工程により脱脂米糠から分離されたフェルラ酸量を示す毛細管電気泳動装置の測定結果である。
【図５】  図５は、酵素処理の単独工程により脱脂米糠から分離されたフェルラ酸量を示す毛細管電気泳動装置の測定結果である。
【図６】  図６は、NaOH処理により脱脂米糠から分離された水溶性多糖類の中性糖の分布を示す図である。
【図７】  図７は、本発明の加圧押出後に酵素処理の複合工程により脱脂米糠から分離された水溶性多糖類の中性糖分布を示す図である。
【図８】  図８は、NaOH処理により脱脂米糠から分離された水溶性多糖類の分子量分布を示す図である。
【図９】  図９は、本発明の加圧押出後に酵素処理を行う複合工程により脱脂米糠から分離された水溶性多糖類の分子量分布を示す結果図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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