(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示す核酸配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチドからなる単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号：５に示す核酸配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチドからなる単離核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドの相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載されるポリヌクレオチド由来のＤＮＡのオープンリーディングフレームを含む組換え分子であって、該オープンリーディングフレームが、所望の宿主ベクターを適合可能なコントロール配列に作動可能に連結されて複製的に適格な組換え分子を形成する、組換え分子。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなる精製哺乳動物ポリペプチド。
【請求項７】
運動ニューロンの再生および運動ニューロンの軸索の再生を促進するために疾患部位に直接適用される医薬組成物であって、請求項６に記載の精製哺乳動物ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項８】
さらに担体を含む請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記精製哺乳動物ポリペプチドが、体重１ｋｇあたり５ｎｇないし５０μｇの濃度で適用される、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
インビトロにおいて運動ニューロンおよび軸索の成長を促進するための医薬組成物であって、請求項６に記載の精製哺乳動物ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
運動ニューロン疾患の軽減のために疾患部位に直接適用される医薬組成物であって、請求項６に記載の精製哺乳動物ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１２】
神経傷害における炎症および瘢痕を抑制するために疾患部位に直接適用される医薬組成物であって、請求項６に記載の精製哺乳動物ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１３】
神経の成長を促進するための医薬の製造における、配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白の使用方法。
【請求項１４】
神経の成長を促進するための医薬の製造における、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによって発現される蛋白の使用方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、仮出願U.S.S.N. 60/026,792（1996年９月27日出願）の一部継続出願であるU.S.S.N. 08/751,225（1997年５月６日出願）（これらを、本明細書中において参考として援用する）の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、ニューロンの選択された集団の増殖、維持、生存、および機能的能力を促進するタンパク質の固有のグループをコードするヒト遺伝子に関する。
発明の背景
ニューロン栄養性因子（NTF）は、ニューロンの選択された集団の生存、増殖、維持、および機能的能力を促進するのに機能するタンパク質の固有のグループである。最近の研究は、ニューロンの死が、増殖および発生の特定の期間に、脊椎動物の神経系において生じることを実証している。しかし、関連する標的組織からの可溶性ニューロン栄養性因子の添加は、ニューロン死のこの現象を緩和するように作用する。以下の引用は、ニューロン栄養性因子を議論し、そしてそれらの開示は、本明細書中で参考として援用される：Chau,R.M.W.ら、Neuronotrophic Factor, 6 Chin.J.Neuroanatomy 129（1990）；Kuno,M, Target Dependence of Motoneuronal Suevival：The Current Status, 9 Neurosci. Res. 155（1990）；Bard,Y.A., Trophic Factors and Neuronal Survival, 2 Neuron 1525（1989）；Oppenheim,R.W., The Neurotrophic Theory and Naturally Occurring Motoneuron Death, 12 TINS 252（1989）；Bard,Y.A., What, If Anything, is a Neurotophic Factor?, 11 TINS 343（1988）；ならびにThoenen,H.およびEdgar,D., Neurotrophic Factors, 229 Science 238（1985）。
脊椎動物の神経筋系において、胎児性運動ニューロンの生存度は、関連して発生する骨格筋に由来する特定の栄養性物質に依存することが見い出されている。骨格筋は、インビボおよびインビトロの両方の研究によって、胎児性運動ニューロンの変性および続く自然細胞死から予防することによって、運動ニューロンの生存および発生を増強し得る物質を産生することが観察されている。O’Brian,R.J.およびFischbach,G.D., Isolation of Embryonic Chick Motoneurons and Their Survival In Vitro, 6 J.Neurosci. 3265（1986）；Hollyday,M.およびHamburger,V.、Reduction of the Naturally Occurring Motor Neuron Loss by Enlargement of the Periphery, 170 J.Comp.Neurol. 311（1976）（これらの開示を、本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。同様に、幾人かの研究者は、ニワトリおよびラット骨格筋が、インビボおよびインビトロの両方で胚性運動ニューロンの自然細胞死を防止し得る特定の栄養性因子を保有することを報告している。McManaman,J.L.ら、Purification of a Skeletal Muscle Polypeptide Which Stimulates Choline Acetyltransferase Activity in Cultured Spinal Cord Neurons, 263 J.Biol.Chem. 5890（1988）；Oppenheim,R.W.ら、Reduction of Naturally Occurring Motoneuron Death In Vitro by a Target Derived Neurotrophic Factor, 240 Science 919（1988）；およびSmith,R.G.ら、Selective Effects of Skeletal Muscle Extract Fractions on Motoneurons Development In Vitro, 6 J.Neursci, 439（1986）（これらの開示を、本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。
さらに、ポリペプチドは、インビボでの胎児性ニワトリ運動ニューロンの生存度、ならびにこれらの運動ニューロンにおけるコリンアセチルトランスフェラーゼの活性を選択的に増強することが見い出されているラット骨格筋から単離されている。このポリペプチドは、コリンアセチルトランスフェラーゼ発生因子（CDF）と称されており、そしてその生物学的機能が、神経増殖因子（NGF）、繊毛神経節神経栄養性因子（CNTF）、脳由来神経栄養性因子（BDNF）、および網膜神経節神経栄養性因子（RGNTF）のような他の栄養性因子とは異なることが実証されている。Levi-Montalcini,R.,「Developmental Neurobiology and the Natural History of Nerve Growth Factor」、5 Ann.Rev.Neurosci. 341（1982）；Varon,S.ら、Growth Factors, Advances in Neurology,第47巻；Functional Recovery in Neurological Disease, Waxman,S.G.（編）、Raven Press, New York, 493〜521頁（1988）；Barde, Y.A., Trophic Factors and Neuronal Survival, 2 Neuron 1525（1989）；Chau,R.M.W.ら、The Effect of a 30kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons, 34 Science in China, Series B, 908（1991）（これらの開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。
本願において開示された本発明の発明者ら（Dr. Raymond Ming Wah Chau）は、35kDおよび22kDの見かけの分子量を有するラット筋組織からの２つの運動性神経栄養性因子の単離および特徴付けを報告した結果を示した。このデータは、1991年に、パリ（フランス）で開催されたWorld Congress of Cellular and Moelcular Biologyで最初に報告された。Chau,R.M.W.ら、Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord. In：Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, 第５巻、Peeters Press, Leuven, Belgium, 89〜94頁（1992）（この開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。この35kDタンパク質は、Dr.Chauによって、運動ニューロン栄養性因子１（MNTF1）として同定されており、そして見かけ上22kDタンパク質は、運動ニューロン栄養性因子２（MNTF2）として同定されている。これらの２つの栄養性因子は、インビトロで、Dr.Chauによって、ラットランバー（lumber）脊髄性コードの単離された前角運動ニューロンおよび骨髄性外植片の両方の成長および／または再生を指示することが実証されている。
続いて、1993年に、Dr.Chauは、ヒトMNTF1の首尾良いクローニング、55kDの見かけの分子量を有するタンパク質、およびヒト網膜芽細胞cDNAライブラリーからのその関連したレセプターを報告した。Chau,R.M.Wら、Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1（MNTF1）and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes,（要約）19 Soc.for Neurosci. Part 1, 252（1993）（この開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。クローン化ヒトMNTF1は、ラット前角運動ニューロンのインビトロでの成長が報告される点で、「天然の」MNTF1タンパク質の活性に類似の生物学的活性を有することが示された。
MNTF1の種々の生物学的局面は、科学学術誌において幅広く公表されているが、クローン化ヒトMNTF1およびその関連するレセプターのDNA配列および推定アミノ酸配列は、Dr.Chauによって公的に入手可能になっておらず、これらの配列は当該技術分野内の同僚の概説によって確認されてもいない。さらに、クローン化ヒトMNTF1（Dr.Chauによって1993年に報告された）は、適切なベクター（例えば、インビトロ哺乳動物発現系）にサブクローン化されるのに影響を受けやすい形態に存在しなかった。従って、適切に操作され、配列決定され、適切なベクター（単数または複数）にサブクローン化され、適切な発現系（単数または複数）および関連する宿主（単数または複数）にサブクローン化されるヒトMNTF1遺伝子、ならびに、ヒト治療用様式において続く潜在的な有用性のために、得られる組換えヒトTMNFlタンパク質の単離および精製の必要性が残存する。
発明の要旨
本発明は、MNTF1およびMNTF2を含む運動ニューロン栄養性因子のファミリー（これは、哺乳動物における診断用および治療用適用を有することが示されている）に関する。本発明はまた、運動ニューロン栄養性因子（組換えMNTF1-F3（配列番号１）およびMNTF1-F6（配列番号２）を含む）をコードする新規なDNA配列、これらの新規なDNA配列を含むベクター、これらの新規なDNA配列を含む発現系および関連する宿主ならびに前述の発現系によって産生される新規な組換えヒトMNTF-F3（配列番号３）およびMNTF1-F6（配列番号４）タンパク質に関する。
本発明はまた、軸索再生を促進するため、遺伝性運動ニューロン疾患の効果を阻害するため、瘢痕組織形成の影響を最小化または阻害するため、および瘢痕組織およびケロイド形成の影響を同時に最小化または阻害する間創傷治癒を加速させるための運動ニューロン栄養性因子の使用に関する。
図面の説明
本発明は、添付の図面を参照することによって、当業者により、より理解されそしてその利点をより評価され得る。ここで：
図１Aは、MNTF1-F3タンパク質をコードするMNTF1-1443 DNAフラグメントのDNA配列を示す（配列番号１）。標準的な慣習によってDNA配列は、5’から3’方向に示される。
図１Bは、MNTF1-F6タンパク質をコードするMNTF1-927 DNAフラグメントのDNA配列を示す（配列番号２）。標準的な慣習によってDNA配列は、5’から3’方向に示される。
図１Cは、図１Bに示されるDNA配列の最初の99ヌクレオチド（配列番号５）（33コドン）を表す。
図２Aは、MNTF1-F3タンパク質の直接アミノ酸配列を示す（配列番号３）。標準的な慣習によってアミノ酸配列は、アミノ（NH2-）末端からカルボキシ（-COOH）末端へ報告される。
図２Bは、MNTF1-927DNAフラグメントによってコードされるMNTF1-F6タンパク質の直接アミノ酸配列を示す（配列番号４）。標準的な慣習によってアミノ酸配列は、アミノ（NH2-）末端からカルボキシ（-COOH）末端へ報告される。
図３（パネルA〜C）は、「細胞によるタンパク質バンドフィッシング」方法論を示す。これは、単離された前角運動ニューロンが、PhastGel内のタンパク質バンドに電気泳動的に分離していた筋肉抽出物からのMNTF1およびMNTF2を含むPhastGel領域において生存および増殖したことを示した。図３は（パネルa〜c）は、「細胞によるタンパク質バンドフィッシング」方法論を、運動ニューロン栄養性因子MNTF1およびMNTF2を単離するために利用した場合に得られた結果を図示する。
図４（パネル１〜４）は、MNTF1を含む35kDゲルバンドとともに３、７、および14日間培養した単離された運動ニューロン（それぞれ、パネル２、３、および４）、および35kD MNTF1含有ゲルを含まないコントロール培養（パネル１）の結果を示す。
図５（パネル１〜６）は、MNTF1（パネル１、３、および５）およびその推定MNTF1レセプター（パネル２、４、および６）の、筋肉（パネル１および２）；シュワン細胞（パネル３および４）；および運動ニューロン（パネル５および６）における、免疫組織化学的分布を示す。
図６は、10日齢のSprague Dawleyラットの座骨神経の軸索切断術を示す。右側の臀部領域での座骨神経は、除去した神経の１mmで軸索切断され、そしてMNTFは続いて、神経の切り口に沿って配置された。
図７Aおよび７Bは、MNTF1（35kD）およびMNTF2（22kD）の、Sprague Dawleyラットにおける座骨神経の軸索切除した運動ニューロンの生存度における、相乗効果を示す。パネル１は、ゲル添加せず（NG）、そしてパネル３は22kD MNTF2ゲル添加した；（I）は、無処置な側であり、そして（A）は軸索切除した側である。パネル２は、35kD MNTF1ゲル添加し、そしてパネル４は、35kDおよび22kDの両方のゲル添加した。
図８Aおよび８Bは、座骨神経の軸索切除した運動ニューロンの、Sprague Dawleyラットにおける座骨神経の切除に続く、部分的に精製および単離した運動ニューロン栄養性因子MNTF1およびMNTF2による、相乗保護および救助の棒グラフおよび表を用いた結果を提供する。
図９（パネル１〜４）は、MNTFの、Sprague Dawleyラットにおける切除した顔面神経の顔面神経核における運動ニューロンの生存における顕微鏡効果を示す。パネル（１）正常な無処置なコントロールラットの２週間後の顔面神経核、パネル（２）因子を伴わずに軸索切除した２週間後の顔面神経核；パネル（３）および（４）それぞれ、35kD MNTFを伴って、ならびに35kDおよび22kD MNTF1およびMNTF2の両方を伴って、２週間軸索切除した顔面神経核。
図10Aおよび10Bは、筋肉由来の運動ニューロン栄養性因子（22kD、35kD、および22kD+35kD）の、Sprague Dawleyラットにおける顔面神経の切除に続くニューロンの生存における、インビボでの効果の棒グラフおよび表を用いた結果を提供する。
図11Aおよび11Bは、筋肉由来の35kD MNTF1運動ニューロン栄養性因子の、Sprague Dawleyラットにおける顔面神経の切除に続くニューロンの生存における、ヤギ抗ウサギIgGまたは抗35kD運動ニューロン栄養性因子モノクローナル抗体の存在下での、インビボでの効果の棒グラフおよび表を用いた結果を提供する。
図12（パネル１〜４）は、35kD MNTF1および22kD MNTF2タンパク質の、Sprague Dawleyラットにおける背根神経節の切除に続く神経生存におけるインビボでの効果を実証する、一連の４枚の顕微鏡写真を示す。
図13は、腹側脊髄に対する尺骨神経および背側脊髄に対する正中神経の外科切除自動記録を描く、成体Sprague DawleyラットにおけるT1-T3レベルでの脊髄の片側切断を示す。
図14（パネル１〜６）は、神経自己移植片（autograph）を有するSprague Dawleyラットにおける脊髄の半側切断後の運動ニューロンの生存においての、MNTFの栄養性および救助効果を示す。パネル１〜４は、以下を実証する：（１）MNTF1およびMNTF2の存在下で、自己移植片神経（N）および脊髄（C）の接合部での炎症、瘢痕形成、および白血球浸潤が低減した；パネル（２）MNTFなしでは、自己移植片神経（N）および脊髄（C）の接合部での瘢痕形成、炎症、およびWBC浸潤が増大した；パネル（３）は、MNTFを伴う自己移植片神経の電子顕微鏡写真であり、これは、健常な骨鞘形成を伴う再生神経繊維の数およびサイズにおける増加を示す；（４）は、MNTFなしの自己移植片神経のEMであり、これは、健常に骨鞘形成した再生神経繊維を示さない。
図15Aおよび15Bは、パネルAにおけるホモ接合（N1〜N4）およびパネルBの野生型マウスにおけるヘテロ接合（N1〜N4）の体重対ラットMNTF（W5〜W8）および（W1〜W4）でそれぞれ処理したそれらの同腹子動揺病（wobbler）マウスの体重を示す。
図16（パネルA〜F）は、ヒト組換えMNTF1（hrMNTF1）との同時培養の14日後の腰椎の脊髄に由来するインビトロで単離された前根運動ニューロン培養物の生存（神経突起成長を伴う）を示す。パネルa〜c、単離された運動ニューロン培養物は２日目に撮影され、そしてパネルd〜eは14日目に撮影された；パネルaおよびdは、hrMNTF1を含まないコントロール培養物を示し；そしてパネルb、c、e、およびfは、hrMNTF1を含む実験培養物を示す。
図17（パネル１〜６）は、MNTF1-F6（パネル１）およびMNTF1-F3（パネル２）を含まない；MNTF1-F6（パネル３）およびMNTF1-F3（パネル４）のGST融合タンパク質を含む；そしてMNTF1-F6（パネル５）およびMNTF1-F3（パネル６）の切断タンパク質を含む、同時培養の８日後の腰椎の脊髄に由来するインビトロで単離された前根運動ニューロン培養物の生存度を示す。低倍率（×100）。
図18（パネル１〜６）は、上記の図17（１〜６）のような、インビトロで単離された前根運動ニューロン培養物の生存度（神経突起成長を伴う）を示す。高倍率（×320）。
図19（パネル１〜２）は、MNTF1-F6の切断タンパク質との同時培養の８日後の、インビトロで単離された前根運動ニューロン培養物の生存度（神経突起成長を伴う）を示す。高倍率（×400）。
図20（パネル１〜４）は、インビトロで単離された前根運動ニューロンからの骨鞘形成した神経繊維の生存、成長、および再生を示す。これは、MNTF1-F6の切断タンパク質との同時培養の21日後の、図17（パネル５）、18（パネル５）、および19（パネル１〜２）においてもともと実証された培養物由来である。パネル（１）は、神経繊維を示す；約1.5mmのものおよび他の3mmは、培養した運動ニューロンから再生された。低倍率（×40）。パネル（２）は、パネル（１）の高倍率（×140）であり、そして、乏突起膠細胞（おそらくシュワン細胞？★）に結合した骨鞘形成した再生神経繊維を示す合成写真である。パネル（３）および（４）は、Rannierの節を有する内部再生した骨鞘形成神経繊維における軸索円柱（cylinder）を明白に示す。高倍率（×400）。
発明の説明
本発明は、運動ニューロンにおいて栄養性効果を及ぼす能力を所有するニューロン栄養性因子のファミリーおよびこれらの因子をコードする遺伝子を含む。これらの因子は単離されており、そしてこれらの因子をコードする遺伝子はクローン化および発現されており、そして核酸およびポリペプチドの両方の配列が提供されている。
単離された因子および発現された組換え因子は、運動ニューロンの持続性生存度および神経突起成長を誘導し得ることが実証されている。それゆえ、これらの因子は、「運動ニューロン栄養性因子」または「MNTF」として分類されている。
MNTFは、ラットおよびヒトの両方の供給源から単離されており、そしてそれらの生物学的活性は、インビボおよびインビトロの両方において調べられている。例えば、それらの潜在的な生物学的活性は、外科的軸索切除および遺伝的に病的な動物の両方において調べられている。
本発明において開示されるMNTFは、種々の目的に有用である。それらは、疾患の徴候を変化させることにおいて、それらの効果を活用することによって、運動ニューロン疾患の診断に利用され得る。例えば、詳細な説明が以下に提供され、これは、動揺病マウスにおけるMNTF1-F3およびMNTF1-F6の成功した使用の証拠を提供する。動揺病マウスは、遺伝性運動ニューロン疾患についての二重の劣性遺伝子を保有する動物である。運動ニューロン疾患は、それ自身、生後約３週間で最初にあらわれる上肢神経筋不全の徴候を表す。この状態はまた、有害な様式で、動物の体重、一般的な健康状態、呼吸、および寿命に影響する。疾患は徐々に、３月齢までに、動物の死亡率における劇的な増加に伴って、最終末期（ステージ４と定義する）に進行する。動揺病マウスの前述のMNTFに対する徴候応答性は、運動ニューロンレベルで生じる欠損の指標であり、従って、欠損の遺伝的性質を確立している種々の遺伝子の証拠を確認するのに役立つ。
さらに、MNTFはまた、治療的に利用され、損傷または疾患した運動ニューロンを処置し得る。例えば、詳細な説明は、外科的切除した運動ニューロンにおけるこれらの因子を用いる実験を含み、切除した運動ニューロンの大きな割合の回復の結果とともに、以下に提供される。また、前述の遺伝性運動ニューロン疾患（動揺病マウス）における因子の利用は、処置した動物が、付随する病理学的徴候学の阻止により生存し、そして未処理の動物のものより長期間成長することを実証する結果とともに記載される。
「細胞によるタンパク質バンドフィッシング」方法論
ラットMNTF1およびMNTF2を、Chau,R.M.W.ら、Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord,：Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, 第５巻、Peeters Press, Leuven, Belgium, 89〜94頁（1992）において報告されるような、「細胞によるタンパク質バンドフィッシング」方法論を利用して単離した。栄養性因子は、一般的に、インビボで微量に見いだされる；それゆえ、これは、伝統的な生化学的方法論を利用するそれらの単離法における途方もない困難を潜在的に生じ得る。この事実から、「細胞によるタンパク質バンドフィッシング」と称される新規な技術を開発し、ここにおいて、生存可能な前角運動ニューロンを、ラット腓骨筋から分離したタンパク質を含む電気泳動ゲルで同時培養した。従って、この方法論は、生存可能な前角運動ニューロンを、これらの運動ニューロンに特異的な生物学的活性を示したこれらの腓骨筋タンパク質を「フィッシュアウト」することを可能にした（すなわち、インビトロでの持続性生存度および生育の実証による）。
電気泳動タンパク質分離のために、３週齢のSprague Dawleyラットからの腓骨の長および短骨格筋（結合した腱を含まない）を、小さな区画に無菌的に解剖し、そしてCa+2/Mg+2を含有しないHankの培地で３回洗浄した。次いで、筋肉組織を、10mM Tris-HCl（pH7.2）にホモジナイズした。細胞溶解物を、100,000×gにて10分間の遠心分離によって得、そして上清を、0.2m Millipore濾過膜（Millipore Corp., MA）を利用して濾過した。得られた濾過物を、筋肉抽出物（Me）と称した。
細胞培養のために、４匹の３週齢のラットからの精髄を切除して、そして髄膜および任意の関連する血管を除去した。運動ニューロンを、続く顕微鏡視覚化のために、ローダミンＢを含むゲル泡沫（gelfoam）を実験動物の固有の筋肉に、それらの屠殺の１週間前に移植することによって、ローダミンＢで予め標識したことに注意すべきである。区画L4〜L5の前角領域の灰白質を、各切除したらせん糸から続いて除去し、Ca+2/Mg+2を含有しない培地で数回洗浄し、そしてコラゲナーゼ（0.08％）で37℃にて60分間処理した。穏和な解離および沈降に続いて、細胞を、RPMI 1640培地／６％ウシ胎児血清／20mM HEPES／１×ストレプトマイシンおよびペニシリンに懸濁し、そして続くPhastGel培養に利用した。
次いで、濾過した筋肉抽出物（Me、１mg/ml溶液の10〜20ｌ）を、Phast Systemゲル電気泳動（Pharmacia LKB Biotech AB, Upsala, Sweden）による分離のために、pre-cast 20％ native PhastGel（50×40×0.45mm、Pharmacia LKB Biotech AB, Upsala, Sweden）にアプライした。利用した電気泳動条件は、Oleson,I.ら、Computer Program for Optimizing Electrophoretic Protein Separation, 9 Electrophoresis 16（1988）のコンピュータープログラムによって示唆されるものであった。
電気泳動に続いて、PhastGelの中間部分を、１×106脊髄細胞／ゲルでの続く培養のために、無菌技術をにより除去した。PhastGelの残りの部分を、銀染色法を用いて染色し、得られたタンパク質バンドを、同定および位置づけした。２〜７日のインキュベーションに続いて、PhastGel／脊髄細胞培養物を、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中0.4％パラホルムアルデヒドにおいて、約２時間固定した。次いで、ゲルのこの部分を、PhastGelのその本来の部分に挿入し直し、そして生存可能な大きな（約25μm）ローダミンＢ逆方向性プレ標識化運動ニューロンについて、培養した精髄細胞において、逆相（Zeiss Axiophot Inverted Microscope, West Germany）または蛍光顕微鏡（Zeiss, West Germany）のいずれかを用いて実験した。
銀染色は、筋肉抽出物から分離した、全34ネイティブタンパク質バンド（＞30kDの見かけの分子量を有する26タンパク質バンドおよび＜30kDの見かけの分子量を有する８タンパク質バンド）を実証した。これらの結果を、図３、パネルA〜Cに示す。興味深いことに、培養した脊髄細胞からの大きな（約25μm）ローダミンＢ逆方向性プレ標識化運動ニューロンは、35kDおよび22kDの見かけの分子量のタンパク質バンドに対応する２つの空間的に区別できる領域のみにおいて生存することを見いだした。これらの結果を、図３、パネルBに示す。さらに、銀染色方法論は、22kDタンパク質バンドに比べて、35kDタンパク質バンドのより重い染色を実証し、従って、筋肉抽出物におけるこれらの２つの栄養性因子の相対濃度を、潜在的に反映する。ニューロン細胞の他の型で、生存していることが見いだされたものはなく、前述の運動ニューロンで、異なる見かけの分子量を有するさらなるタンパク質に対応する任意の他の位置における生存度を残すものはなかった。これらの前述の結果は、大きなローダミンＢ逆方向性プレ標識化運動ニューロンの、全34の固有の筋肉タンパク質バンドの間から「フィッシュアウト」し、これら自身の栄養性因子が、35kDおよび22kDの見かけの分子量を有することの指標であり、そして図３、パネルCに示す。35kDおよび22kDタンパク質バンドを、それぞれ、MNTF1およびMNTF2と命名した。
MNTF1およびMNTF2の生物学的活性の決定
次いで、ラットMNTF1およびMNTF2タンパク質を、潜在的な生物学的活性について、前角運動ニューロンを用いて試験した。前角運動ニューロンを、４匹の３週齢Sprague Dawleyラット腰椎脊髄から、関連する灰白質の回収を介して単離した。次いで、回収した灰白質を、DMEM培地中0.08％コラゲナーゼ溶液で消化した。DMEM培地中の運動ニューロンを、５mlアリコートで回収し、そして室温にて２分間安定させた。上清の上部4.5mlを吸引および破棄し、そして残った培地（運動ニューロンを含む）を続いて利用して、ラットMNTF1およびMNTF2タンパク質の生物学的活性を試験した。
ラットMNTF1およびMNTF2を、前述のPhast Systemゲル電気泳動装置を利用して、それぞれ、35kDおよび22kDタンパク質バンドを含むPhastGel区画（１×30mm）の無菌切除によって単離した（図３、パネルA〜Cを参照のこと）。次いで、前角運動ニューロン（３週齢のSprague Dawleyラットのランバー脊髄から単離した）を、MNTF1およびMNTF2含有PhastGel区画の存在を伴ってまたは伴わずに同時培養した。結果は、両MNTF1およびMNTF2含有PhastGel区画は、前角運動ニューロンの持続性生存度を指示し得、ならびに神経突起成長を支持し得ることを示した。
同様の実験（図４、パネル１〜４に示される）において、次いで、前角運動ニューロン（３週齢のSprague Dawleyラットのランバー脊髄から単離した）を、MNTF1およびMNTF2含有PhastGel区画の存在を伴ってまたは伴わずに、３、７、および14日間同時培養した（それぞれ、パネル２、３、および４）。この実験の結果を図４に示し、これは、MNTF1が２週間以上の前角運動ニューロンの持続性生存度を支持し得ることを示す。運動ニューロン生存度および神経突起成長の決定を、MTTミクロアッセイおよび顕微鏡形態測定の両方を利用して実施した。MTTは、高度に感受性の、比色定量用テトラゾリウム誘導体［3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）−2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］であり、これは、生存可能な細胞によって変換されて、ELISA比色計で続いて測定され得るホルマザン産物を形成し得る。コントロールアッセイ（パネル１）（選択した残存タンパク質含有PhastGel区画またはPhastGel単独を利用する）は、前角運動ニューロンの持続性生存度または神経突起成長のいずれかを指示するのに失敗した。
軸索切断した動物におけるラットMNTF1およびMNTF2のインビボ試験
次に、ラットMNTF1およびMNTF2のインビボ試験を、軸索切除した動物を利用して行った。軸索切除したラットの坐骨、顔面、舌下、および筋皮神経を、10日齢のSprague Dawleyラットの右側において切除した。前述の神経を、ラットの左側でインタクトなままにし、対側内部コントロールとして供した。MNTF1および／またはMNTF2含有PhastGelの切片（５〜30ngのMNTFを含む約２×３mm切片）を、移植を介して、軸索切除した部位にアプライした。坐骨神経の軸索切除および続くMNTF含有ゲル（単数または複数）の移植を、図６に示す。外科的手順において、殿部領域の右側を解剖して、坐骨神経を露出した。坐骨神経の１mm切片を切り出し、そして神経の残った末端を、端から端までの吻合を実施せずに、空間的に配列させた。次いで、MNTF含有およびコントロールゲル切片を、外科切除部位に沿って配置し、そして最初の切開を閉じた。MNTFを含まないPhastGelにおいて軸索切除した動物を、類似の様式において移植し、そしてコントロールとして利用した。２、４、および８週間後、軸索切除した動物を屠殺し、そして組織切片を、顕微鏡実験を介する運動ニューロン生存／生存度の決定のために、切り出し、そして調製した。
結果は、MNTFの適用を伴わずに、前述の神経に関連する運動ニューロンの60〜70％が分解されており、それゆえ、運動ニューロンの30〜40％のみが、顕微鏡実験の時点で、なお生存可能であったことを示した。逆に、MNTF1またはMNTF2のいずれかの存在下について、運動ニューロンの55〜75％は、上記の観察期間の間、持続性生存度を示した。MNTF1およびMNTF2の両方の存在下で、運動ニューロンの90％が、持続性生存度を示すことが見いだされた。
図７および８は、坐骨神経の横断面に続く、ニューロン生存に対する筋肉由来運動ニューロン栄養性（motoneuronotropic）因子のインビボでの効果の結果を示す。先に議論したように、坐骨神経を、10日齢のSprague Dawleyラットの右側において切り出した（図６を参照のこと）；一方、坐骨神経は、ラットの左側でインタクトなままにし、対側内部コントロールとして供した。MNTF1含有および／またはMNTF2含有PhastGelの切片（５〜30ngのMNTFを含む約２×３mm切片）を、移植を介して、軸索切除した部位にアプライした。MNTF1およびMNTF2は、それぞれ、35kDおよび22kDタンパク質に対応する。MNTFを含まないPhastGel切片を、類似の様式において軸索切除した動物に移植し、コントロールとして供した。３週間後、軸索切除した動物を屠殺し、そして腰椎骨髄の切片を、顕微鏡試験を介する運動ニューロン生存／生存度の決定のために、切り出し、そして調製した。結果は、MNTFの適用を伴わずに、前述の神経に関連する運動ニューロンの56％が分解されていることを示した。それゆえ、運動ニューロンの44％のみが、顕微鏡実験の時点で、なお生存可能であった。逆に、35kDタンパク質MNTF1または22kDタンパク質MNTF2のいずれかの存在下において、運動ニューロンの76％および71％が、それぞれ、顕微鏡評価の時点で、持続性生存度を示した。
図７Aおよび７Bは、Sprague Dawleyラットにおける坐骨神経の横断面に続く、ニューロン生存における筋肉由来運動ニューロン栄養性因子のインビボでの効果を示す、一連の８つの顕微鏡写真を示す。これらの結果を、それぞれ、図８Aおよび８Bにおいて、表および棒グラフの形で示す。この一連の実験において、軸索切除した坐骨神経を、成体Sprague Dawleyラットの右側において切除し、一方、左側坐骨神経を、内部対側コントロールとしてインタクトなままにした。MNTF1含有またはMNTF2含有PhastGelの切片（５〜30ngのMNTFを含む約２×３mm切片）を、移植を介して、軸索切除した部位にアプライした。MNTFを含まないPhastGel切片を、類似の様式において軸索切除した動物に移植し、コントロールとして供させた。全ての腰椎４および５前角運動ニューロンを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で、動物屠殺の２週間前に、逆方向性プレ標識し、この時点で、坐骨神経の切片を、顕微鏡細胞計数方法論を介する運動ニューロン生存／生存度のその後の決定のために、切り出し、そして調製したことに注意すべきである。
コントロール顕微鏡写真（図７A、パネル１を参照のこと）内に示された結果は、MNTFの適用なし（NG）で、比較的低い数の生存可能な（すなわち、HRP標識した）運動ニューロンが、インタクトな側と比較して、腰椎脊髄の軸索切除した部位（A）の全ての連続的な切片において存在することを実証した。この発見は、図８に示した表の結果によって実証され、これは、坐骨神経に関連したHRP標識化運動ニューロンの56％が、分解していることを示す。逆に、22kDタンパク質MNTF2（図７A、パネル３を参照のこと）、35kDタンパク質MNTF1（図７B、パネル２を参照のこと）、または22kDおよび35kD MNTFの両方（図７B、パネル４を参照のこと）の存在下において、HRP標識化運動ニューロンの顕著に高い割合の生存を実証した。これらの結果を、図８Aおよび図８Bにおいて定性的に示し、そして、35kD MNTF1タンパク質または22kD MNTF2タンパク質の利用が、持続性生存度を示すHRP標識化運動ニューロンのそれぞれ76.5％および71.3％を生じたという事実によって確認した。同様に、MNTF1およびMNTF2の両方の存在下において（図７B、パネル４を参照のこと）、多数の生存可能な運動ニューロンが、両方のMNTFでの処理の結果として持続性生存度を示す運動ニューロンの86.8％に関して見い出される（図８Aおよび８Bを参照のこと）。
図９、パネル１〜４は、顕微鏡写真形態における、ラット顔面神経の切除に続く運動ニューロン生存および生存度におけるMNTF適用のインビボでの効果の結果を示す。この一連の実験において、軸索切除した顔面神経を、１０日齢のSprague Dawleyラットの右側において切り出し、一方、左側の顔面神経を、内部対側コントロールとしてインタクトなままにした。MNTF1含有および／またはMNTF2含有PhastGelの切片（５〜30ngのMNTFを含む約２×３mm切片）を、移植を介して、軸索切除した部位にアプライした。先に述べたように、MNTF1およびMNTF2は、それぞれ、35kDおよび22kDタンパク質に対応する。MNTFを含まないPhastGel切片を、類似の様式において軸索切除した動物に移植し、コントロールとして供した。１および２週間後、軸索切除した動物を屠殺し、そして脳における顔面神経の連続的な切片を、組織学的染色後の顕微鏡試験を介して、運動ニューロン生存／生存度の続く評価のために調製した。図９、パネル１における結果は、２週間後の、正常なインタクトなコントロールラットの顔面神経核を示す；パネル２は、２週間後の、因子を含まない軸索切除した顔面神経核を示す；パネル３および４は、２週間後の、それぞれ、35kD MNTF1ならびに35kDおよび22kDの両方のMNTF1 ＆ MNTF2を含む軸索切除した顔面神経核を示す。図10Aおよび10Bは、それぞれ、表状および棒グラフ形態における結果を示す。図９、10A、および10Bに示される結果は、いずれかのMNTFの適用なしで、顔面神経核と関連する運動ニューロンの約50％が、わずか１週間後に分解しており、そして約65％が、２週間後に分解していることを示す（パネル１）。対照的に、35kDタンパク質MNTF1（パネル３）または22kDタンパク質MNTF2（パネル２）の存在下で、運動ニューロンの約70％が、１週間後に持続性生存度を示し、約55％が、２週間後もなお生存可能であった。同様の結果を、35kD（MNTF1）および22kD（MNTF2）タンパク質の両方を利用した場合に得た（パネル４）。
図11Aおよび11Bは、ヤギ抗ウサギIgGまたは抗35kDモノクローナル抗体のいずれかの存在下での、ラット顔面神経の切除後の、ニューロンの生存および生存度に対する筋肉由来運動ニューロン栄養性因子のインビボでの効果の結果を、それぞれ、表および棒グラフの形で示す。抗35kD MNTF1モノクローナル抗体の発生を、本明細書中の以下の節でにおいて議論する。ヤギ抗ウサギIgGをコントロールとして利用し、非特異的相互作用に起因する35kD MNTF1タンパク質の生物学的活性の阻害が存在しないことを確認した。結果は、顔面神経と関連する運動ニューロンの約80％は、２週間後も生存可能生存可能であったことを示した。対照的に、運動ニューロン生存度における顕著な減少（２週間後に50％の生存度）を、抗35kD MNTF1モノクローナル抗体を利用したときに見い出した。それゆえ、ニューロンの生存度の減少は、抗35kD MNTF1モノクローナル抗体による35kD MNTF1タンパク質の阻害の機能であるようであった。
図12、パネル１〜４は、Sprague Dawleyラットにおける脊髄神経節の切除に続く、ニューロンの生存および生存度に対するインビボでの効果を示す、一連の４つの顕微鏡写真である。この一連の実験において、軸索切断した脊髄神経節を、10日齢のSprague Dawleyラットの右側において切り出した。左側の脊髄神経節をインタクトなままにし、内部対側性コントロールとして供させた。MNTF1含有またはMNTF2含有PhastGelの切片（５〜30ngのMNTFを含む約２×３mm切片）を、移植を介して、軸索切除した部位に適用した。既に述べたように、MNTF1およびMNTF2は、それぞれ、35kDおよび22kDタンパク質に対応する。MNTFを含まないPhastGel切片を、類似の様式において軸索切断した動物に移植し、コントロールとして供した。結果は、MNTF1またはMNTF2のいずれも存在せずして、運動ニューロンの約40％のみが生存可能なままであったことを示す（図12、プレート１を参照のこと）。対照的に、60〜70％が、MNTF1（図12、プレート２を参照のこと）、MNTF2（図12、プレート３を参照のこと）、またはMNTF1およびMNTF2の両方（図12、パネル４を参照のこと）の存在下で、生存可能なままであった。
MNTF1およびMNTF2の半切片化脊髄における神経自己移植片でのインビボ試験
次の一連の実験（図13および図14（パネル１〜６）に示される）において、ラットMNTF1およびMNTF2を、半切片化脊髄ラットにおいて末梢神経自己移植片で、インビボ試験した。バルビタール（barbitol）での麻酔に続いて、成体Sprague Dawleyラットの脊髄の左側を、T1-T3（８mm）レベルで半切片化した。解剖顕微鏡の下で、20mm長尺骨および左前肢からの正中神経幹を解剖し、そしてそれぞれ、外側腹部および外側背部部分で、脊髄のT1-T3領域に移植した（図13を参照のこと）。神経移植片を、それらの関連する膜を10-0糸で縫合することによって脊髄に固定した。実験群において、MNTF1含有およびMNTF2含有PhastGelの全16切片（約１×１mm）を、神経移植片および脊髄の接合部に密接に近接して配置した。コントロール群において、MNTFを含まないPhastGel切片を、類似の様式で移植した。
結果は、MNTF1含有およびMNTF2含有PhastGel切片の存在下で（それぞれ、図14、パネル１および３を参照のこと）、生存率、全体の回復率、再生した有髄および無髄神経繊維の両方の数、および半切片化ラットの生存する運動ニューロンの数（図14、パネル３を参照のこと）は、MNTFの存在を伴わないコントロール群によって示されたもの（図14、パネル２および４を参照のこと）より非常に多かった。結果を、一般的および組織学的観察によって得、これを記録および比較した。一般的な観察に関して、ラットの移動性の能力（すなわち、這うまたは歩く能力）および指圧迫に対する反応を記録した。組織学的観察は、炎症反応（浸潤マクロファージ、リンパ球、および瘢痕組織の存在）、ニューロンの形態および超微細構造、有髄シュワン細胞の存在、および有髄神経の存在の決定を含む。結果は、MNTFで処理した実験動物が、コントロール動物群より非常に効率的な様式において、運動および感覚ニューロン機能の両方を回復したことを実証した。実験動物はまた、最小限の炎症反応、わずかまたは全く示されない瘢痕組織形成、正常なシュワン細胞形態、および正常な有髄および無髄神経形態を示した（図14、パネル３を参照のこと）。対照的に、コントロール動物群は、炎症反応を示し、これは、神経移植片の場所での多数の浸潤マクロファージ／リンパ球およびコラーゲン含有瘢痕組織形成によって示された（図14、パネル５を参照のこと）。さらに、コントロール動物群のシュワン細胞は、非生存可能であったか、または空胞化との膨れた形態を示したかのいずれかであった（図14、パネル２を参照のこと）。
さらに、続く実験結果は、MNTF1および／またはMNTF2の適用が、再生した有髄神経繊維の量、サイズ、およびニューロン形状を有意に増加することを示した。これらの結果から、MNTFは、ミエリンの種々のタンパク質構成要素（例えば、ミエリン塩基性タンパク質、Wolfgramタンパク質など）の生合成において重要な役割を果たすことを想定し得る。これらのタンパク質の濃度における減少は、有髄神経繊維のいくつかの退行性疾患に関係する。
遺伝性運動ニューロン疾患におけるラットMNTF1およびMNTF2のインビボ試験
ヒト運動ニューロン疾患（筋萎縮性（Amotrophic）側索硬化症（ALS）および脊髄性筋萎縮（SMA）を含む）についての分子機構は、未だ解明されていない。しかし、動揺（wobbler）マウス（遺伝子型wr/wr）が開発されており、そして脊髄および脳幹の運動ニューロン疾患に関する研究のための動物モデルとして幅広く使用される。例えば、Duchen,L.W.およびStrich,S.J., An Hereditary Motor Neuron Disease with Progressive Denervation of Muscle in the Mouse：The Mutant“Wobbler”,31 J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry, 535（1968）；La Vail,J.H.ら、Motoneuron Loss in the Abducens Nucleus of Wobbler Mice, 404 Brain Res. 127（1987）（これらの開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。動揺マウスは、第11染色体において（特にegfr遺伝子とrel遺伝子との間に位置する）、遺伝性常染色体二重劣性遺伝子変異を有し、これは、脊髄および脳幹の運動ニューロンの進行性変性を導く。Kaupman,K.ら、13 Genomics 35（1992）（この開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。
産後約３週間で、動揺マウスは、前肢の筋肉の萎縮ならびに指および鉤爪を広げ得ないことの両方を導く頚部運動ニューロンの付随する変性とともに、「動揺する」症状（段階１）を発症し始める。３月齢までに、病的症状は、前肢における全ての関連する間接（例えば、橈骨手根関節、肘関節、および肩関節）の「凝集（clumping together）」、ならびに多量の体重減少および慢性疲労を伴う段階４まで進行する。しかし、頻繁に、ほとんどのマウスは、３月齢に達する前に死ぬ。
動揺マウスモデルは、運動ニューロンの変性への、以下を含むいくつかの栄養性因子の制限された保護効果を実証することにおいて利用されている：（i）毛様体神経栄養性因子（CNTF；例えば、Sendner,M.ら、Ciliary Motoneurotrophic Factor Prevents the Degeneration of Motor Neurons After Axotomy, 345 Nature 440（1990）を参照のこと）、（ii）脳由来神経栄養性因子（BDNF；例えば、Oppenheim,R.W.ら、Brain-Derived Motoneurotrophic Factor Rescues Developing Avian Motoneurons From Cell Death, 360 Nature 755（1992）を参照のこと）、（iii）神経節由来神経栄養性因子（GDNF；例えば、Henderson,C.E.ら、GDNF：A Potent Survival Factor for Motoneurons Present in Peripheral Nerve and Muscle, 266 Science 1062（1994）を参照のこと）、および（iv）CNTFおよびBDNFの組合せ（例えば、Mitsumoto,I.L.ら、265 Science 1107（1994）を参照のこと）。これらの前述の研究において、処置した動揺マウスに、各投薬で対応する栄養性因子のミリグラム（mg）濃度で、１週間あたり数回の投薬からなる処置スケジュールで数週間の期間で投与した。ほとんどの場合において、動揺マウスによる栄養性因子処置への応答（運動機能の改善によって測定した場合）を、１ヶ月間計数した。しかし、興味深いことに、栄養性因子処置マウスは、頻繁に、処置を受けていないコントロールの動揺マウスより早く死亡した。例えば、Ikeda,S.ら、Histometic Effects of Cilliary Neurotrophic Factor in Wobbler Mouse Motor Neuron Disease, 37 Ann. Neurol. 47（1995）；Ikeda,S.ら、Effects of Brain-Derived Neurotrophic Factor on Motor Dysfunction in Wobbler Mouse Motor Neuron Disease, 37 Ann. Neurol. 505（1995）を参照のこと。
これらの前述の栄養性因子研究によって実証された「ネガティブな」結果は、これらの研究者が、適切な栄養性因子（単数または複数）および／または適切な生物学的アッセイで研究していたかどうかの疑問を提起する。それゆえ、運動ニューロンとそれらの関連する標的筋肉との間の証明された関係に基づいて、本発明者らは、本明細書中で、運動ニューロン自身によってそれぞれの運動ニューロンの標的組織（すなわち骨格筋）から同定した運動ニューロン栄養性因子（MNTF1およびMNTF2）を単離および精製するため；およびMNTF1を単回用量のみで、ナノグラム（ng）濃度で１年間投与した後の処置動揺マウスの生存曲線を研究するためにい選択したことを本明細書中に開示した。この研究に利用されたMNTF濃度は、いくつかの他の運動ニューロン栄養性因子に関する以前の研究（例えば、Ikeda,S.ら、Histometic Effects of Cilliary Neurotrophic Factor in Wobbler Mouse Motor Neuron Disease, 37 Ann. Neurol. 47（1995）；Ikeda,S.ら、Effects of Brain-Derived Neurotrophic Factor on Motor Dysfunction in Wobbler Mouse Motor Neuron Disease, 37 ANN. Neurol. 505（1995）を参照のこと）に利用されたものより1000倍少ない（すなわち、ng対mg濃度）であったことに注意すべきである。
一連の実験（図15Aおよび15Bに示される）において、遺伝性運動ニューロン疾患におけるラットMNTF1およびMNTF2のインビボ試験を、動揺マウスにおいて行なった。動揺マウスは、遺伝性運動ニューロン疾患についての二重劣性遺伝子（wr/wr）を有する動物である（Bethesda, Marylandのアメリカ国立保健衛生研究所（NIH）で開発され、そして親切に提供された）。運動ニューロン疾患は、それ自身が、上肢神経筋不全の症状とともにあらわれ、これは最初生後約３週間であらわれる。この状態はまた、動物の体重、全身の健康状態、呼吸、および寿命に有害な様式で影響を与える。この疾患は、徐々に、動物の死亡率における関連する劇的な増加を伴って３月齢までに最終段階（４段階）に進行する。
MNTF1含有およびMNTF2含有PhastGelの切片（約２×６mm）を細かく刻み、そして脊髄のC7-T3領域で僧帽筋と菱形筋との間への前述のMNTF含有PhstGel切片の移植を介して動揺マウスに適用した。動揺マウスのコントロールグループは、MNTFを含まないPhastGel切片を受けた。結果は、MNTF含有PhastGelの単回「用量」（35μg/kg体重）の６週齢の動揺マウスへの適用は、10カ月までの観察期間の間、最初の段階（段階１）に関連する症状への運動ニューロン疾患の症状の進行を阻止したことを示した。さらに、コントロール動物グループと比較して、実験動物は、健康、呼吸、体重、前肢の強度の一般的な改善、ならびに呼吸、前肢の神経筋活性の悪化およびそれらの頚部運動ニューロンの空胞形成および染色質溶解の一般的な予防を実証した。結論として、これらの結果は、動揺マウスにおける遺伝性運動ニューロン疾患のさらなる症状進展を阻止するラットMNTFの例示である。
図15Aおよび15Bは、ホモ接合性およびヘテロ接合性の野生型マウス対動揺マウスの重量をグラフにより示す。この一連の実験において、４匹の「正常な」ホモ接合性マウス（A）および４匹のヘテロ接合性マウス（B）の体重を、各４匹のホモ接合性動揺マウス（W1-W4）および（W5-W8）の体重と比較した。各動揺マウスをラットMNTF1およびMNTF2で処置し、一方、「正常な」マウスは未処置のままにした。動揺マウスは、一貫した体重増加および増加した寿命を示したにもかかわらず、一方、動揺マウスの全体重は、「正常な」動物の体重より一般的に少なかった。対照的に、未処置の動揺マウスは、この型の一貫した体重増加を示さず、そして通常、約３月齢で死亡した。図15Aおよび15Bの両方における急激な「下降点」が、特定の動物が止息した日付を示すことに注意すべきである。それゆえ、結論として、これらの結果は、MNTFでの処置は、動揺マウスにおける遺伝性運動ニューロン疾患に劇的な影響を有することを示す。
個々の筋線維とそれらの関連する運動ニューロンとの間の関係の解明は、多発性硬化症（MS）、筋ジストロフィー（MD）、および重症筋無力症（MG）のような疾患を理解することにおいて最優先の重要な事項である。関連する一連の実験において、運動ニューロンの顕著な再生を生じるMNTF1および／またはMNTF2の適用が、筋線維形成に関連する回復を同時に導くことを実証した。さらに、筋線維の増殖、生存、および再生を促進する筋線維の神経刺激、ならびに筋肉由来MNTFの推定産生の神経刺激は、運動ニューロンと神経繊維との間の循環関係において非常に重要な役割を果たす。
MNTF1およびMNTF2に対するモノクローナル抗体の開発
ラットMNTF1およびMNTF2に特異的なモノクローナル抗体を調製した。35kD（MNTF1）および22kD（MNTF2）のタンパク質含有バンドをPhast Systemゲル（約100ngの運動ニューロン栄養性因子を含む１×30mmのゲル切片）から切り出し、そして別のグループのBalb/cマウスの免疫化において抗原として利用した。詳細には、MNTF含有PhastGel切片を切り出し、そして細かく刻んだ。次いで、PhastGel片を、等量の完全フロイントアジュバントと混合し、そしてBalb/cマウスに直接腹腔内注射した。全３回の抗原免疫化を、生理食塩水中のMNTF1含有およびMNTF2含有PhastGelの腹腔内注射で、最初の免疫の７日後および21日後に実施した。Balb/cマウスの脾臓を採取し、そしてNS-1またはSP2/0ミエローマ細胞のいずれかと融合させた。次いで、得られたハイブリドーマを、MTTマイクロアッセイおよび顕微鏡実験を利用してスクリーニングし、MNTF1ニューロン栄養性因子およびMNTF2ニューロン栄養性因子の機能をブロックし得る、最も効力のあるモノクローナル抗体を選択した。例えば、35kD（MNTF1）融合物からは、この前述のMNTF1タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生する全480ウェルの中から全８個のハイブリドーマを選択し、そして続いて開発した。
組換えヒトMNTF1の免疫選択
選択したMNTFブロッキングモノクローナル抗体を、次に利用して、ヒト運動ニューロン栄養性因子のクローンを免疫選択した。ヒト運動ニューロン栄養性因子のブロッキングモノクローナル抗体（MAb-MNTF）を、選択したヒト網膜芽細胞腫cDNAライブラリー（Clontech Co., Palo Alto, CAによって製造される）からのポジティブ発現クローンのスクリーニングにおいて、免疫プローブとして使用した。簡単には、cDNAライブラリーについての免疫選択／免疫沈降手順は、Rb Y-79網膜芽細胞腫細胞株の細胞からのmRNAの単離を含んでいた。単離した網膜芽細胞腫mRNAをテンプレートとして利用して逆転写反応を実施して、cDNAを合成した。cDNAをλファージベクター（gt-11）に連結し、そして続いて、E.coli株Y1090宿主細菌において形質転換した。
利用した免疫スクリーニング手順は、Young,R.A.およびDavis,R.W., Efficient Isolation of Genes Using Antiboby Probes, 80 Proc.Nat’l Acad.Sci. USA 1194（1983）（この開示を本明細書中で参考として援用する）に記載される手順の改変物であった。この改変は、硫酸ニッケルアンモニウムを増強剤として使用し、ジアミノ-ベンジジンを基質として利用してペルオキシダーゼ-アビジン-ビオチン複合体の感度を100倍増加させることからなっていた。最大４個のニトロセルロース膜「レプリカ」を、免疫スクリーニングのために各コロニープレートから作製し、そして最も激しく染色されたクローンのみを、免疫スクリーニング手順において選択した。次いで、選択したクローンを、それらの組換えヒトタンパク質を発現させ、これを続いてアッセイして、培養におけるそれらの潜在的なMNTF生物学的活性を決定した。次いで、運動ニューロン培養において最大のMNTF特異的生物学的活性を提示するクローンを、さらなる分析のために選択した。
MNTF1およびMNTF1レセプターの免疫組織化学的局在決定
MNTF1モノクローナル抗体を利用して、10日齢のSprague Dawleyラットの腓骨筋、シュワン細胞、および運動ニューロンにおけるMNTF1および推定MNTF1レセプターの免疫組織化学的分布を解明した。利用した手順は、Ren,F.およびChau,R.M.W., Production and Assessment of Monoclonal Antibodies Specific for Rat Retinal Ganglion Neuronotrophic Factor, 7 J.Monoclonal Antibody 13（1991）に以前に記載された。図５は、腓骨筋（プレート１および２）、シュワン細胞（プレート３および４）、および運動ニューロン（プレート５および６）におけるMNTF1タンパク質（プレート１、３、および５）のこの免疫組織化学的局在決定の結果を実証する。結果は、Ｔ系の細管、運動終板、および介在性神経線維で局在化した、より濃い染色とともに、筋線維の間の微細な免疫反応陽性「染色」の一様でない分布を示す。個々の筋線維の線条は、対比染色を利用しなくとも明確に明確であった。さらに、図５は、推定MNTF1レセプターの免疫組織化学的局在決定を例示する（プレート２、４、および６）。
ヒト組換えMNTF1のクローニングおよび配列分析
ヒト組換えMNTF1（hrMNTF1）を、潜在的な生物学的活性について、単離した前角運動ニューロンを用いて以下の様式においてインビトロで試験した（図16、パネルA〜Fを参照のこと）。前角運動ニューロンを、10日齢のSprague Dawleyラットの腰脊髄灰白質から単離し、続いて15％ウシ胎児血清を含むDMEM培地中0.08％のコラゲナーゼ溶液において消化した。コラゲナーゼ消化に続いて、前角運動ニューロンを、15％ウシ胎児血清を補充したDMEM培地において培養した。結果は、hrMNTF1と同時培養した前角運動ニューロンが生存可能なままであり、hyMNTF1を含まないコントロール培養物の神経突起成長（図16、パネルDを参照のこと）よりも高レベルの神経突起成長を示したことを示した（図16、パネルEおよびパネルFを参照のこと）。生存度および神経突起成長を、以前に記載のように、MTTマイクロアッセイおよび顕微鏡実験の両方を利用して決定した。
gt-11ファージベクターにおいてクローン化した組換えヒトMNTF1（λ.35kD.MNTF1と称す）を、E.coli株Y1090において発現した。インビトロで、アポトーシス体への細胞断片化の欠如および核濃縮核におけるクロマチンの凝集によって証明されるように、アポトーシス（細胞「死」のプロセス）に入った単離前角運動ニューロンの全体数を３桁減少させ得ることが見出された。さらに、hrMNTf1は、展開した成長錘状体含有軸索を有する巨大な活性ニューロンへの運動ニューロンの成長および「展開」を支持した（図16、パネルEおよびパネルFを参照のこと）。対照的に、発現されたhrMNTF1を欠くコントロール運動ニューロン培養物、多くの非ニューロン細胞（例えば、グリア細胞および線維芽細胞）では、15％ウシ胎児血清を補充したDMEM培地における培養10日後に活発に成長していたが（図16、パネルDを参照のこと）、これらのコントロール培養においては生存可能な成長している運動ニューロンは完全に欠如していた。
次いで、λ.35kD.MNTF1クローンのcDNAインサートを、インビトロ発現ベクター系にサブクローン化し、そしてそのDNA配列を、以下の方法論によって解明した：
1.λ35KD.MNTF1の調製および精製
10プラーク形成単位（pfu）のλ35KD.MNTF1／gt 11ファージをE.coli.菌株Y1090の一晩培養物500mlに接種し、細菌を完全に溶解させた。λファージを回収し、遠心分離および、NaCl/PEG 8000中でのRNaseおよびDNaseでの酵素処理を行って精製した後、高速CsCl密度勾配遠心分離を行い、最終勾配密度の約1.5g CsCl/mlにおける精製ファージを収集した。
λファージ（1ml）をEDTA、SDSおよびプロテイナーゼK中で消化した後、フェノール、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムにより反復抽出を行うことにより容易にλ35KD.MNTF1 DNAを単離し、精製した。次に、DNAを95％エタノールによりエタノール沈殿させ、遠心分離して集めた。70％エタノールで洗浄を繰り返した後、λ35KD.MNTF1 DNAペレットをTris-EDTA緩衝液に再溶解した。
2.λ35KD.MNTF1 DNAからの35KD.MNTF1 cDNAの回収
λ35KD.MNTF1 DNA 10gをEcoR1で一晩消化し、切断された35KD.MNTF1 cDNAをアガロースゲル電気泳動により回収した。電気泳動後、DNAバンドをU.V.光線で可視化した。EcoR1消化の結果、二つの分離DNA断片、つまり1.44kbp断片の35F3および0.93kbp断片の35F6、の存在が認められた。この二本のDNAバンドをアガロースゲルから個々に切り出し、標準技術によりDNAを回収した。次に、回収したDNAを調製して、M13ファージの遺伝子組換えによるDNA配列決定およびpGEX-1 λT EcoR1/BAPベクターの遺伝子組換えによる高タンパク質発現を行った。
3 .35KD.MNTF1 cDNAの35F3および35F6 DNA断片の配列決定
M13による35F3および35F6の遺伝子組換え後、Sangerのジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーションディ配列決定方法論（Bst DNAポリメラーゼを使用）を用いて、二つのMNTF1 DNA断片のDNA配列を解明した。Sanger、F.、ら、バクテリオファージDNAのヌクレオチド配列、162 J.Mol.Biol.729（1982）を参照すること。その開示を、本明細書中に参照として援用する。この配列決定法により、35KD.MNTF1 cDNA断片からの二つのEcoR1-生成断片のDNA配列決定に関しては、極めて精確な、かつ再現性のある結果が得られ、また、35F3断片が1443塩基対から成るのに対し、35F6断片は927塩基対から成ることが示された。
図1Aは、35F3 DNA断片（1443bp）のDNA配列（配列番号1）を示す。標準的慣習により、DNA配列を、5’から3’方向に示す。35F3クローンをλ35KD.MNTF1クローンのEcoR1消化により構築した。次に、得られた35F3 EcoR1生成断片をM13で遺伝子組換えを行い、前述のSanger法を利用してDNA配列を決定した。
図1Bは、35F6 DNA断片（927bp）のDNA配列（配列番号2）を示す。標準的慣習により、DNA配列を5’から3’方向に示す。35F6クローンをλ35KD.MNTF1クローンのEcoR1消化により構築した。次に、得られた35F6 EcoR1生成断片をM13で遺伝子組換えを行い、前述のSanger法を利用してDNA配列を決定した。
4. 35F3および35F6 EcoR1生成MNTF1 DNA断片のサブクローン化
35F3（1443塩基対）および35F6（927塩基対）EcoR1生成MNTF1 DNA断片をpGEX-1λT EcoR1/BAP高タンパク質発現ベクター（以後pGEXとする）にサブクローン化した。得られたサブクローンをMNTF1-1443（35F3）およびMNTF1-927（35F6）と命名した。pGEXベクターを次の因子により選択した：（i）5’-末端および3’-末端ポリ（A）尾部に高効率転写プロモーターを有する、そして（ii）グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）含有MNTF1融合タンパク質のアフィニティーカラムクロマトグラフィーベースの精製により、容易にMNTF1-1443およびMNTF1-927組換えタンパク質の精製のための容易な方法論を提供する。
A.組換えプラスミドの形質転換
pGEXベクターをEcoR1で消化した。次に、消化されたpGEXベクターをEcoR1-生成MNTF1-1443およびMNTF1-927 DNA断片と、T4 DNAリガーゼ存在下で一晩インキュベートした。連結後、コンピテントE.coli菌株DH5を組換えベクターで形質転換し、100g/mlアンピシリンを含むLuriaブロス（LB）寒天プレートに移した。pGEXベクターには形質転換細菌にアンピシリン耐性を付与する遺伝子が含有されたという事実に起因して、アンピシリンスクリーニングの使用により、形質転換細菌クローンの独占的な選択が可能になった。このような組換えベクターを含有するこれらの細菌のみが生存可能であるからである。
B.MNTF1-1443およびMNTF1-927形質転換体の同定および単離
形質転換細菌コロニーを個々に選択し、小量の100g/mlアンピシリン含有LB培地に接種し、約３時間インキュベートした。インキュベーション後、形質転換細菌を遠心分離により集め、次に、Maniatis、T.、Fritsch、E.F.、およびSambrook、J.、Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York pp.134-136（1986）に記載されたアルカリ法「ミニプレップ」方法により組換えベクターDNAを単離した。この方法を用いて、収集した細菌を激しく攪拌しながら、Tris-EDTA/NaOH/SDS溶液を添加して溶解した。遠心分離により夾雑細胞残渣を集めた後、組換えベクターDNA含有上清を吸引し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、次に95％エタノールで沈殿させた。混合物を遠心分離し、沈殿したDNAを集め、核酸ペレットをTris-EDTA緩衝液に溶解した。二つの組換え種、pGEX-MNTF1-1443およびpGEX-MNTF1-927を同定した。
次に収集した組換えベクターDNAをEcoR1で消化し、4.9kbp pGEXベクターから1443bp MNTF1-1443および927bp MNTF1-927DNA挿入物を放出させた。消化されたDNAをアガロースゲル電気泳動に供し、個々のDNAバンドをU.V.光線で可視化して同定した。
「ポジティブ」細菌コロニー（すなわち、MNTF1-1443またはMNTF1-927DNA挿入物の一方を含んでいたコロニー）を選択した後、LB培地に接種し、アルカリ法およびPEG沈殿によりプラスミドを大量に精製した。次いで、精製組換えベクターDNAをE.coli菌株BL-21宿主細菌にトランスフェクトして、ヒト組換えMNTF1-F3（hrMNTF1-F3）およびMNTF1-F6（hrMNTF1-F6）タンパク質の高レベル発現を容易にした。
C.hrMNTF1-F3およびhrMNTF1-F6融合タンパク質の発現および増幅
pGEX-MNTF1-1443またはpGEX-MNTF1-927 DNAをLB培地50ml中のE.coli菌株BL-21コンペテント細菌にトランスフェクトした。IPTGを利用して、hrMNTF1-F3およびhrMNTF1-F6タンパク質の高レベル発現を誘発した。収集した細菌を細胞溶解し、液体窒素を用いて凍結および解凍を計４回行い、超音波処理し、そして遠心分離した。次に、hrMNTF1-F3およびhrMNTF1-F6融合タンパク質を含有する上清を、抗GST単クローン性抗体を含む抗GSTアフィニティークロマトグラフィーカラム（Pharmacia）に通した。この型のアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより、GST部分を通じてマトリックスに結合したGST-hrMNTF1-F3およびGST-hrMNTF1-6融合タンパク質の精製が可能になる。高濃度塩による洗浄後、GST-hrMNTF1-F3およびGST-hrMNTF1-F6融合タンパク質を溶出した。タンパク分解酵素のトロンビンを用いてMNTFとGST部分の結合を切断して精製し、hrMNTF1-F3およびhrMNTF1-6タンパク質を集めた後、インビボおよびインビトロでの測定を行い、アミノ酸配列を決定した。
hrMNTF1-F3およびhrMNTF1-F6の栄養活性のインビトロおよびインビボ試験
ヒト組換え運動ニューロン栄養性因子（hrMNTF）を融合タンパク質または精製タンパク質としてのいずれかで利用し得る。精製タンパク質型hrMNTF1-F3およびhrMNTF1-6を得るため、pGEX-MNTF1-1443またはpGEX-MNTF1-927プラスミドの発現産物を前述のようにして単離した。発現産物は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）で融合されたMNTFを含有する融合タンパク質からなる。次に、融合タンパク質をGST-モノクローン性抗体アフィニティークロマトグラフィーカラム（Pharmacia）で精製した。このカラムは、発現栄養因子（MNTF）とGST部分間の結合を特異的に切断する。続いて、栄養因子をカラムから溶出し、上記の精製「天然」タンパク質として同様の方法で使用し得る。
前角運動ニューロンを10日齢（生後）Sprague Dawleyラット腰椎から15％ウシ胎児血清含有DMEM培地でコラーゲナーゼ消化により単離した。図17は、種々濃度のGST-hrMNTF1-F3（パネル４）、GST-hrMNTF1-6（パネル３）と培養した前述の前角運動ニューロンの低倍率（100×）顕微鏡写真を示し、そしてトロンビンタンパク質分解によりGST部分が除去されたhrMNTF1-3（パネル６）およびhrMNTF1-6（パネル５）タンパク質を運動ニューロン培養物に添加した。８日間培養後、GST結合体化または非GST結合体化hrMNTF1-F3またはhrMNTF1-F6の存在下で培養した運動ニューロンは、これらの前述タンパク質の無存在下で培養した運動ニューロンよりもはるかに大きな成長パターンを示し、同様に、関連する非ニューロン細胞増殖の著明な減少を示すことが観察された（図17、パネル１および２を参照）。類似した結果がhrMNTF1-F3およびhrMNTF1-F6との運動ニューロン培養物間で認められたことから、pGEX-MNTF1-1443およびpGEX-MNTF1-927が共に、生物学的に活性な向神経性因子の活性部位をコードする遺伝子、または遺伝子の一部分を所有し得ることを示唆する。
図18は、初めに図17に示した結果の高倍率（320×）顕微鏡写真を示す。図18のパネル1-6が図17に示されるパネルと単離前角運動ニューロンとの共同培養で使用したMNTFタンパク質型に関して等しいことに注目すべきである。
図19は、トロンビンタンパク質分解によりGST部分を除去したhrMNTF1-F6と培養したインビトロ-単離前角運動ニューロンの運動ニューロン生存性および神経突起外殖の高倍率（400×）顕微鏡写真を示す。
図20、パネル1-4は、初めにそれぞれ図17（プレート５）、図18（プレート５）および図19（プレート１）に示すように、トロンビンタンパク質分解によりGST部分が除去されたhrMNTF1-F6と21日間共培養した後のインビトロ-単離前角運動ニューロン有髄神経繊維の生存性、再生および神経突起外殖を示す。図20（プレート１）は、インビトロ-単離前角運動ニューロンの培養物から再生した二つの異なる運動ニューロン（長さ１〜1.5mmおよび長さ１〜3mm）の低倍率（100×）顕微鏡写真を示す。プレート２は、初めにプレート１で示した運動ニューロンの低倍率（140×）顕微鏡写真と同様に、付着した乏突起膠細胞（推定シュバン細胞）により再生した有髄ニューロンの複合顕微鏡写真を示す。プレート３および４は、内部に再生された有髄神経繊維の軸索円柱を示す高倍率（400×）顕微鏡写真で、明らかにランヴィエ紋輪（Node of Rannier）が幾つか認められる。
ヒト組換えMNTF1-F3およびMNTF1-F6タンパク質のアミノ酸配列決定
ヒト組換えMNTF1-F3およびMNTF1-F6タンパク質のアミノ酸配列を直接タンパク質配列決定方法により解明した。配列決定の前に、タンパク質を前述のGST-親和性カラムクロマトグラフィーにより精製し、非融合型にした。MNTF1-F3タンパク質[配列番号3]のアミノ酸配列を図2Aに示す。MNTF1-F6タンパク質[配列番号4]のアミノ酸配列を図2Bに示す。このタンパク質は、33アミノ酸長であり、そしてMNTF1-F6の最初の99ヌクレオチドによってコードされる[配列番号５]。標準的慣習により、アミノ酸配列をアミノ（MH2-）末端からカルボキシル（-COOH）末端へ記す。
薬物送達用MNTFの調製
したがって、本発明のMNTFを薬理学的に容易に利用し得る。インビボ適用では、この因子は哺乳類、特にヒトに投与される。MNTFを経口または注射により投与し得るが、運動ニューロン患部または付近に局所投与するのが好ましい。
本発明の製薬組成物を、承認された方法に従い、哺乳類、特にヒトにおいて所望の生理活性を生成するのに十分な非毒性濃度で、一種以上のMNTFと不活性、非毒性賦形剤とを取り込み通常の投薬単位形態に調製する。この組成物は、投薬量単位当り（例えば、被験体の体重kg当り）約5ng〜5μg濃度から選択した、生物学的に活性で無毒性濃度の活性成分を含有するのが好ましい。利用する濃度は、成分の全生物学的比活性、所望の生物学的比活性および被験体の状態や体重などの因子に依存する。
使用される賦形剤またはビヒクルは、例えば、固体または液体であり得、種々の薬学的形態を用い得る。従って、固体の賦形剤を使用する場合、調製物は、単に粉砕化した製剤、オイル中に微紛化した製剤、錠剤化した製剤、微粉末またはペレットの形態で硬ゼラチンカプセルまたは腸溶性剤皮カプセルに充填した製剤、またはトローチ、ロゼンジまたは坐剤の形態の製剤であり得る。MNTFを含む固体賦形剤はまた、使用前に粉砕し得る。
液体賦形剤中で使用する場合、アンプルなど、または水性または非水性懸濁液などの液剤であり得る。局所投与について、活性成分を無味性加湿基剤を用いて、例えば、軟膏剤またはクリーム剤に製剤化し得る。適した軟膏基剤例として、ワセリンおよび揮発性シリコン、ラノリン、ならびにEucerin▲Ｒ▼（Beiersdorf）などの油中水型乳剤があるが、これらに限定されない。適したクリーム基剤例として、Nivea▲Ｒ▼ Cream（Beiersdorf）、コールドクリーム（USP）、Purpose Cream▲Ｒ▼（Johnson & Johnson）、親水性軟膏剤（USP）およびLubriderm▲Ｒ▼（Warner-Lambert）があるが、これらに限定されない。
さらに、本発明に関して、活性成分を運動ニューロン患部または付近に内部適用し得る。例えば、充分に透過性があり、活性成分を放出、好ましくは徐放的に放出させる固体またはゲル化媒体をこのような内部適用に使用し得る。このようなゲルの例として、ポリアクリルアミド、アガロース、ゼラチン、アルギニン酸塩または他の多糖類ゴムがあるが、これらに限定されない。さらに、活性成分をろ紙などの固形材に包埋し得る。このろ紙は、活性成分を吸収し、次いで適当な時間および部位で活性成分を放出し得る。
本発明の実施態様および明細書を例示および実施例で目的を明確に理解できるようにある程度詳細に述べてきたが、本明細書に含まれる発明の精神からはずれることなく多くの変更を実行できることは当業者にとって明白である。従って、本発明は、添付の請求の範囲の精神を除くいかなる様式にも限定されない。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：ケイエム  バイオテック，インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：運動ニューロン栄養性因子の単離および使用
（iii）配列数：５
（iv）連絡住所：
（A）名称：シェルトン  アンド  マック
（B）番地：サウス  レイク  アベニュー225, 9ティーエイチ  フロアー
（C）市：パサデナ
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：91101
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピー ディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換用
（C）OS：Windows 95
（D）ソフトウェア：ワードパーフェクト  8
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：PCT/US97/17142
（B）出願日：1997年9月22日
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：フェアラー，デイビット  エイ
（B）登録番号：38,134
（C）照会／記録番号：12592-2PCT
（ix）電話回線情報：
（A）電話：01-626-796-4000
（B）テレファックス：01-626-795-6321
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1443塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）配列：配列番号１：
0004095673.tif 000002
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：927塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）配列：配列番号２：
0004095673.tif 000003
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：481アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）配列：配列番号３：
0004095673.tif 000004
0004095673.tif 000005
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：33アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）配列：配列番号４：
0004095673.tif 000006
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：99塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）配列：配列番号５：
0004095673.tif 000007
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
0004095673.tif 000022
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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