(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｅ）の段階からなるカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分の合成方法：
（ａ）以下の式からなる群より選択される式を有する部分的に保護された核酸塩基化合物を形成し、
0004089979.tif 000097
（ｂ）該部分的に保護された核酸塩基化合物の環外アミノ基を電子親和性を有するカルボニル含有化合物と反応させて、
0004089979.tif 000098
からなる群より選択される式を有するイソシアネート置換された部分的に保護された核酸塩基化合物を合成し
（ｃ）該イソシアネート置換された部分的に保護された核酸塩基化合物をＲ2−ＯＨを有するアルコールと反応させて、以下の式からなる群より選択される式を有する完全に保護された核酸塩基化合物を合成し、
0004089979.tif 000099
（ｄ）該完全に保護された核酸塩基化合物を金属アルコキシドまたは金属水酸化物と反応させて、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分の金属塩を合成し、この金属塩は主鎖カルボン酸官能基を有し、
（ｅ）該主鎖カルボン酸官能基または複素環Ｎ−原子のプロトン付加に適した条件で、酸を用いて該金属塩を中和して、以下の式からなる群より選択される式を有する核酸塩基側鎖部分を得る
0004089979.tif 000100
ここで、Ｒ1は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、および以下の式：
0004089979.tif 000101
を有するベンジル基またはその誘導体からなる群より選択され、
ここで、ａ〜ｅの各々で表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3からなる群より独立して選択され、
ｇ〜ｈの各々で表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、水素およびメチルからなる群より独立して選択され、
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、ベンジル基またはその誘導体、ジフェニルメタン基またはその誘導体、Ｒ5Ｓ（ＣＨ2）2−基、および置換エチルからなる群より選択され、
ここで、該ベンジル基またはその誘導体は、式：
0004089979.tif 000102
を有し、ここで、ａ〜ｅの各々で表される原子または基は、同一でも異なっていてもよく、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3からなる群より独立して選択され、
ｇ〜ｈの各々で表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、水素およびメチル基からなる群より独立して選択され、
該ジフェニルメタン基またはその誘導体は、式：
0004089979.tif 000103
を有し、ここで、Ａ1〜Ａ10はそれぞれＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシからなる群より独立して選択され、
Ｒ4は、水素、メチルおよびエチルからなる群より選択され、
該Ｒ5Ｓ（ＣＨ2）2−基において、Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびフェニル基またはその誘導体からなる群より選択され、
ここで、該フェニル基またはその誘導体は、式：
0004089979.tif 000104
で表される基であって、ここで、ｉ〜ｍの各々で表される原子または基は互いに同一であっても異なっていてもよく、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3からなる群より独立して選択され、
該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000105
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択される。
【請求項２】
前記部分的に保護された核酸塩基化合物が、２−（１’−シトシル）酢酸エチル、２−（１’−シトシル）酢酸メチル、２−（９’−アデニル）酢酸エチルおよび２−（９’−アデニル）酢酸メチルからなる群の中から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電子親和性を有するカルボニル含有化合物が、カルボニルジイミダゾール、ジ−Ｎ−スクシンイミジルカルボネートおよびホスゲンからなる群の中から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記金属水酸化物が水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化セシウムからなる群の中から選択される第１群遷移金属の水酸化物塩である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アルコールがメタノール、エタノール、２，２，２−トリクロロエタノール、２−（トリメチルシリル）−エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノールおよびアリルアルコール誘導体で構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アリルアルコール誘導体がアリルアルコール、１−イソプロピルアリルアルコール、シンナミルアルコールおよび４−ニトロシンナミルアルコールで構成される群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルコールが下記式で表されるベンジルアルコールである請求項１に記載の方法：
0004089979.tif 000106
ここで、
ａ〜ｅで表される原子または基は互いに同一でも異なっていてもよく、独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3からなる群より選択され、
ｇ〜ｈのそれぞれ表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、独立に、水素およびメチル基で構成される群から選択される。
【請求項８】
前記アルコールが下記式で表される請求頂１に記載の方法：
0004089979.tif 000107
ここで、
Ａ1〜Ａ10は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アミノ、アルキルアミノ、アミドおよびエステル基で構成される群の中から選択され、
Ｒ4は水素、メチルおよびエチル基で構成される群から選択される。
【請求項９】
前記アルコールが下記式で表される請求項１に記載の方法：
Ｒ5Ｓ（ＣＨ2）2ＯＨ
ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびフェニル基またはその誘導体で構成される群から選択され、
ここで、このフェニル基またはその誘導体は、下記式：
0004089979.tif 000108
で表される基であり、
ここで、
ｉ〜ｍで表される原子または基は互いに同一でも異なっていてもよく、独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。
【請求項１０】
前記アルコールが下記式で表される請求項１に記載の方法：
0004089979.tif 000109
ここで、
Ｗは、電子吸引基であり、
Ｒ6〜Ｒ8のそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルで構成される群から選択される。
【請求項１１】
前記完全に保護された核酸塩基化合物が式：
0004089979.tif 000110
で表される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記完全に保護された核酸塩基化合物が式：
0004089979.tif 000111
で表される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分が式：
0004089979.tif 000112
で表される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分が式：
0004089979.tif 000113
で表される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
下記段階（ａ）と（ｂ）とを含む、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分とアミノ保護されたアミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン主鎖とからＰＮＡシントンを合成する方法：
（ａ）請求項１に記載の方法で該カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分を合成し、
（ｂ）該カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分を該アミノ保護されたアミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン主鎖にカップリングさせる。
【請求項１６】
前記アミノ保護されたアミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン主鎖がアルキルエステルを有し、さらに下記段階（ｃ）を含む請求項１５に記載の方法：
（ｃ）該アルキルエステルを加水分解して遊離のカルボン酸を生成させる。
【請求項１７】
前記カップリングが下記段階（ａ）と（ｂ）とを含む請求項１５に記載の方法：
（ａ）前記カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分の混合無水物を調製し、
（ｂ）該混合無水物を前記アミノ保護されたアミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン主鎖と反応させてＰＮＡシントンを合成する。
【請求項１８】
前記カップリングがさらに下記段階（ａ）〜（ｃ）を含む請求項１７に記載の方法：
（ａ）前記アミノ保護されたアミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン主鎖に一時的に保護されたカルボン酸を形成し、
（ｂ）該一時的に保護されたカルボン酸を前記混合無水物と反応させて、一時的に保護されたカルボン酸基を有する一時的に保護されたＰＮＡシントンを合成し、さらに
（ｃ）該一時的に保護されたＰＮＡシントンの一時的に保護されたカルボン酸基の脱保護を行ってＰＮＡシントンを合成する。
【請求項１９】
前記アミノ保護されたアミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン主鎖が下記式で表される化合物である請求項１５に記載の方法：
0004089979.tif 000114
ここで、
Ｐｇは、アルキルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）−エチルオキシカルボニル基、１−メチル−１−フェニル−エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、４−メトキシトリフェニルメチル基、および４，４’−ジメトキシ−トリフェニルメチル基、４，４’−ジメチルベンズヒドロキシカルボニル基で構成される群から選択される保護基であり、
Ｒ3は、水素もしくはメチル、エチル、およびアリル基で構成される群から選択されるアルキル基である。
【請求項２０】
前記アミノ保護されたアミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン主鎖が、Ｎ1−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｎ4−（２−アミノエチル）−グリシン、Ｎ1−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｎ4−（２−アミノエチル）−グリシンメチルエステルおよびＮ1−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｎ4−（２−アミノエチル）−グリシンエチルエステルで構成される群から選択される保護されたアミノ酸である請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＮＡシントンまたはＰＮＡシントンエステルが下記式からなる群より選択される式で表される請求項１５に記載の方法：
0004089979.tif 000115
ここで、
Ｐｇは、アルキルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）−エチルオキシカルボニル基、１−メチル−１−フェニル−エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、４−メトキシトリフェニルメチル基、および４，４’−ジメトキシ−トリフェニルメチル基で構成される群から選択される保護基であり、
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、ベンジル基またはその誘導体、ジフェニルメタン基またはその誘導体、およびＲ5Ｓ（ＣＨ2）2−基で構成される群から選択され、
ここで、該ベンジル基またはその誘導体は、式：
0004089979.tif 000116
を有し、ここで、ａ〜ｅのそれぞれで表される原子または基は、同一でも異なっていてもよく、独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択され、
ｇ〜ｈのそれぞれ表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、独立に、水素およびメチルで構成される群から選択され、
該ジフェニルメタン基またはその誘導体は、式：
0004089979.tif 000117
を有し、ここで、Ａ1〜Ａ10はそれぞれ独立にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシで構成される群から選択され、
Ｒ4は、水素、メチルおよびエチルで構成される群から選択され、
該Ｒ5Ｓ（ＣＨ2）2−基において、Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびフェニル基またはその誘導体で構成される群から選択され、
ここで、該フェニル基は、式：
0004089979.tif 000118
で表される基であって、ここで、ｉ〜ｍのそれぞれで表される原子または基は互いに同一であっても異なっていてもよく、独立にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択され、
Ｒ3は水素もしくはメチル基およびエチル基で構成される群から選択されるアルキル基である。
【請求項２２】
Ｒ2で表される基とＰｇで表される基によってオルソゴナルに保護された請求項２１に記載のＰＮＡシントン。
【請求項２３】
前記ＰＮＡシントンが、式：
0004089979.tif 000119
で表される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＮＡシントンが、式：
0004089979.tif 000120
で表される請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＮＡシントンが、式：
0004089979.tif 000121
で表される請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＮＡシントンが、式：
0004089979.tif 000122
で表される請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
下記段階を含む核酸ポリマー合成方法：
（ａ）請求項２０に記載の方法で少なくとも１つのＰＮＡシントンを合成し、
（ｂ）請求項２０の方法で合成したＰＮＡシントンをＰＮＡオリゴマーに組み込む。
【請求項２８】
前記ＰＮＡオリゴマーが固体担体に結合されている請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＮＡオリゴマーが側鎖保護基を有する核酸塩基を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
さらに前記側鎖保護基を除去する段階を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
以下の式を有する化合物：
0004089979.tif 000123
ここで、
Ｘは、ハロゲン原子であり；
Ｒ1は、水素、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、２−（メチルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ベンジルおよび以下の式：
0004089979.tif 000124
を有する置換ベンジルから選択され、
ここで、
ａ〜ｅの各々は、同一であっても異なっていてもよく、Ｘ（ハロゲン）、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され；そしてｇ〜ｈの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素およびメチルから独立して選択され、
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、２−（メチルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ベンジル、置換ベンジル、置換エチル基、ジフェニルメチル基およびチオエーテル基から選択され、
ここで、該置換ベンジルは、式：
0004089979.tif 000125
を有し、ここで、
ａ〜ｅの各々は、同一であっても異なっていてもよく、Ｘ（ハロゲン）、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され；そしてｇ〜ｈの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素およびメチルから独立して選択され、
該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000126
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択され、
該ジフェニルメチル基は、式：
0004089979.tif 000127
を有し、ここで、
Ａ1〜Ａ10の各々は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシから独立して選択され、そしてＲ4は、水素、メチルおよびエチルから選択され、
該チオエーテル基は、式：
0004089979.tif 000128
を有し、ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、および以下の式：
0004089979.tif 000129
を有するフェニル基から選択され、
ここで、ｉ〜ｍの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択される。
【請求項３２】
式：
0004089979.tif 000130
を有する請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
式：
0004089979.tif 000131
を有する請求項３１に記載の化合物。
【請求項３４】
以下の式を有する化合物：
0004089979.tif 000132
ここで、
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、２−（メチルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ベンジル、置換エチル基、ジフェニルメチル基およびチオエーテル基から選択され、
ここで、該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000133
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択され、
該ジフェニルメチル基は、式：
0004089979.tif 000134
を有し、ここで、
Ａ1〜Ａ10の各々は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシから独立して選択され、そしてＲ4は、水素、メチルおよびエチルから選択され、
該チオエーテル基は、式：
0004089979.tif 000135
を有し、ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、および以下の式：
0004089979.tif 000136
を有するフェニル基から選択され、
ここで、ｉ〜ｍの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択される。
【請求項３５】
式：
0004089979.tif 000137
を有する請求項３４に記載の化合物：
【請求項３６】
以下の式を有する化合物：
0004089979.tif 000138
ここで、
Ｐｇは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニル）−エチルオキシカルボニル基、１−メチル−１−フェニル−エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、４−メトキシ−トリフェニルメチル基、および４，４’−ジメトキシ−トリフェニルメチル基から選択される保護基であり；
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、２−（メチルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ジフェニルメチル基、チオエーテル基および置換エチル基から選択され、
ここで、該ジフェニルメチル基は、式：
0004089979.tif 000139
を有し、ここで、
Ａ1〜Ａ10の各々は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシから独立して選択され、そしてＲ4は、水素、メチルおよびエチルから選択され、
該チオエーテル基は、式：
0004089979.tif 000140
を有し、ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、および以下の式：
0004089979.tif 000141
を有するフェニル基から選択され、
ここで、ｉ〜ｍの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され、
該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000142
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択され、
Ｒ3は、水素、メチルおよびエチルから選択される。
【請求項３７】
式：
0004089979.tif 000143
を有する請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
以下の式を有する化合物：
0004089979.tif 000144
ここで、
Ｒ1は、水素、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ベンジルおよび以下の式：
0004089979.tif 000145
を有する置換ベンジルから選択され、
ここで、
ａ〜ｅの各々は、同一であっても異なっていてもよく、Ｘ（ハロゲン）、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され；そしてｇ〜ｈの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素およびメチルから独立して選択され、
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ジフェニルメチル基、チオエーテル基および置換エチル基から選択され、
ここで、該ジフェニルメチル基は、式：
0004089979.tif 000146
を有し、ここで、
Ａ1〜Ａ10の各々は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシから独立して選択され、そしてＲ4は、水素、メチルおよびエチルから選択され、
該チオエーテル基は、式：
0004089979.tif 000147
を有し、ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、および以下の式：
0004089979.tif 000148
を有するフェニル基から選択され、
ここで、ｉ〜ｍの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され、
該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000149
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択される。
【請求項３９】
式：
0004089979.tif 000150
を有する請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
式：
0004089979.tif 000151
を有する請求項３８に記載の化合物。
【請求項４１】
以下の式を有する化合物：
0004089979.tif 000152
ここで、
Ｐｇは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニル）−エチルオキシカルボニル基、１−メチル−１−フェニル−エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、４−メトキシ−トリフェニルメチル基、および４，４’−ジメトキシ−トリフェニルメチル基から選択される保護基であり；
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ジフェニルメチル基、チオエーテル基および置換エチル基から選択され、
ここで、該ジフェニルメチル基は、式：
0004089979.tif 000153
を有し、ここで、
Ａ1〜Ａ10の各々は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシから独立して選択され、そしてＲ4は、水素、メチルおよびエチルから選択され、
該チオエーテル基は、式：
0004089979.tif 000154
を有し、ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、および以下の式：
0004089979.tif 000155
を有するフェニル基から選択され、
ここで、ｉ〜ｍの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され、
該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000156
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択され、そして
Ｒ3は、水素、メチルおよびエチルから選択される。
【請求項４２】
式：
0004089979.tif 000157
を有する請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
以下の式を有する化合物：
0004089979.tif 000158
ここで、
Ｒ1は、水素、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、２−（メチルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ベンジルおよび以下の式：
0004089979.tif 000159
を有する置換ベンジルから選択され、
ここで、
ａ〜ｅの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、ハロゲン、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され；そしてｇ〜ｈの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素およびメチルから独立して選択され、
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、２−（メチルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、置換エチル基、ジフェニルメチル基およびチオエーテル基から選択され、
ここで、該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000160
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択され、
該ジフェニルメチル基は、式：
0004089979.tif 000161
を有し、ここで、
Ａ1〜Ａ10の各々は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシから独立して選択され、そしてＲ4は、水素、メチルおよびエチルから選択され、
該チオエーテル基は、式：
0004089979.tif 000162
を有し、ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、および以下の式：
0004089979.tif 000163
を有するフェニル基から選択され、
ここで、ｉ〜ｍの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択される。
【請求項４４】
式：
0004089979.tif 000164
を有する請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
式：
0004089979.tif 000165
を有する請求項４３に記載の化合物。
【請求項４６】
以下の式を有する化合物：
0004089979.tif 000166
ここで、
Ｐｇは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニル）−エチルオキシカルボニル基、１−メチル−１−フェニル−エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、４−メトキシ−トリフェニルメチル基、および４，４’−ジメトキシ−トリフェニルメチル基から選択される保護基であり；
Ｒ2は、メチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）−エチル、２−（フェニルチオ）−エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、アリル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、ジフェニルメチル基、チオエーテル基および置換エチル基から選択され、
ここで、該ジフェニルメチル基は、式：
0004089979.tif 000167
を有し、ここで、
Ａ1〜Ａ10の各々は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシから独立して選択され、そしてＲ4は、水素、メチルおよびエチルから選択され、
該チオエーテル基は、式：
0004089979.tif 000168
を有し、ここで、
Ｒ5は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、および以下の式：
0004089979.tif 000169
を有するフェニル基から選択され、
ここで、ｉ〜ｍの各々は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−Ｓ（Ｏ）ＣＨ3から独立して選択され、
該置換エチル基は、式：
0004089979.tif 000170
を有し、ここで、
Ｗは、シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、およびｐ−アルキルスルホニルフェニルから選択され；そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであっても異なってもよく、そして水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルから独立して選択され、そして
Ｒ3は、水素、メチルおよびエチルから選択される。
【請求項４７】
式：
0004089979.tif 000171
を有する請求項４６に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本出願は1993年12月12日提出の米国特許出願第08/172,695号の一部継続出願である。
１．発明の分野
本発明はペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid: PNA）合成に関するものであり、特に、緩やかな条件下におけるＰＮＡ合成および保護解除に適した改良型ＰＮＡシントンに（synthons）に関するものである。
２．背景となる技術の説明
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡ発現の配列特異的な制御と遺伝子をターゲットとする医薬の調製における有望な候補となる合成ポリアミドである（欧州特許出願第EP92/01219号および92/01220号を参照。これらの内容は参考として本明細書の一部を成す）。
ＰＮＡはペプチドに似た主鎖を有し、この主鎖にＤＮＡの核酸塩基が結合したバイオポリマーハイブリッドである。特に、ＰＮＡはアミノ酸のN-(2-アミノエチル）-グリシンの繰り返し単位に核酸塩基のアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウレシルがメチレンカルボニル基を介して結合した合成ポリアミドである。非天然の核酸塩基、例えば偽（pusedo）イソシトシン、5-メチルシトシンおよび2,6-ジアミノプリン、その他無数の核酸塩基もＰＮＡシントンに組み込むことができる。
最も一般的には、ＰＮＡはt-Boc/ベンジル保護方法を用いて保護されたモノマー（ＰＮＡシントン）から合成されている。これは伸長中のポリマーの主鎖を構成するアミノ基をt-ブチロキシカルボニル（t-Boc）基で保護し、核酸塩基の環外アミノ基が存在する場合にはこれをベンジルオキシカルボニル（ベンジル）基で保護する方法である。t-Boc/ベンジル保護方法によって保護されたＰＮＡシントンは現在市販されているが、上記の保護基を外すには非常に厳しい酸性条件が要求されるため使い易いものではない。
t-Boc/ベンジル保護方法では側鎖の核酸塩基を保護しているベンジルオキシカルボニル基を外すために非常に強い酸を必要とし、通常は核酸オリゴマーをフッ化水素酸またはトリフルオロメタン硫酸に一定時間、大抵は１時間以上曝して側鎖を保護しているベンジル基を除去する。最後の保護解除のためのこの過酷な酸処理によってしばしば酸に弱い部分、特に核酸とＰＮＡオリゴマーに結合している可能性のある炭水化物が分解していまう。さらに、フッ化水素酸やトリフルオロメタンスルホン酸等の有害な酸を使用するため、作業者の安全上の問題とオートメーション機器・ラインの腐食問題の点から、この方法を商業的に使用することはできない。
さらに、t-Boc/ベンジル保護方法はオルソゴナルでなくディファレンシャルな方法である。ディファレンシャルな方法とは各保護基がほぼ同じ種類の試薬および条件で除去されが、それぞれの基は相対的に異なる反応速度で除去されるような基の保護システムと定義される。例えば、t-Boc/ベンジル保護方法では各保護基とも酸に対して不安定であるが、効果的な除去をするにはベンジルオキシカルボニル基の方がより強い酸を必要とする。酸に対して不安定なt-Boc保護基を酸を用いて完全に除去した時には、それと同時にベンジル基が一定割合で除去される危険性がある。特に、t-Boc保護基は合成サイクルにおいて主鎖のアミノ基から外す必要がある。それによって次のモノマーが主鎖のフリーのアミノ部位に結合してポリマー鎖が伸長できるようになる。t-Bocによってアミノ基が保護された主鎖の保護を解除するにはトリフルオロ酢酸等の強酸を用いる必要がある。この保護解除と、それに続くＰＮＡまたは核酸オリゴマー構築では、核酸塩基側鎖の保護基すなわちベンジル基が除去されることは好ましくない。しかし、トリフルオロ酢酸は強過ぎるため側鎖のベンジル基の一部を保護解除してしまい、それによってポリマーが分岐し、所望生成物の全収率を低下させることになる。
一方、オルソゴナルな方法では、各保護基を互いに排他的な条件で除去する。例えば、一つの保護基は酸で除去し、別の保護基は塩基で除去する。クリステンセン達は、強酸を用いてt-Bocアミノ主鎖保護基を除去し、続いて9-フルオレニルメチロキシカルボニル（Fmoc）すなわち塩基に対して不安定な保護基を用いて再び保護するというオルソゴナルな方法で保護されたＰＮＡシントンを報告している（Christensen達、“Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis and Complementary Technologies-Biological and Biomedical Applications”3rd SPS Oxford Symposia 1994）。この保護方法では側鎖の核酸塩基の環外アミノ基が早く保護解除される可能性は無くなるが、このモノマーの調製に追加のステップが必要になる。さらに、側鎖保護基であるベンジルの除去には依然としてフッ化水素酸またはトリルフオロメタン硫酸等の強酸が必要である。
ＰＮＡシントン合成における現在の別の制約は側鎖の核酸塩基の保護基をいかに形成するかにある。一般に、核酸塩基、例えばシトシン、アデニンおよびグアニンの環外アミノ基は活性化されたカーボネートまたはクロロホルメートとの反応を介してカーバメートとして保護される。カーバメートを生成するこの方法には欠点がある。すなわち、多くのクロロホルメートは不安定であり、また、求核性がそれ程強くない核酸塩基の環外アミノ基に対してクロロホルメートの反応性は余り良くない。核酸塩基に対して使用される他のカーバメート生成方法にはアシル化剤としてイミダゾライドおよびアルキルイミダゾリウム塩を使用するものが含まれる（Watkins達、J. Orgl Chem., 1982 47;4471-77と、Watkins達、J. Am. Chem. Soc., 1982,104:5702-08参照）。イミダゾライドおよびアルキル化イミダゾライドはカーバメート生成に関するいくつかの問題点を克服するように思えるが、核酸塩基に対してそれらが広く使用されているという報告は聞かない。最近、ＰＮＡシントンの側鎖核酸塩基の環外アミノ基を保護するための保護基として4-メトキシ-トリフェニルメチル（ＭＭＴ）基が提案された（Breipohl達、1st Australian Peptide Conference, Great Barrier Reef, Australia, October 16-21, 1994）。
報告されているグアニンＰＮＡシントンはＣ６カルボニル基の位置でベンジルエーテルとして保護されているが、環外2-アミノ基のベンジルも保護する（欧州特許出願第92/01219号と国際特許出願PCT/US92/10921号参照）。Ｃ６カルボニル基（エノール型）の相対的反応性と、より反応性の高い環外2-アミノ基のことを考えると、ＰＮＡ合成の際にＣ６カルボニル基を保護しなければならない理由は存在せず、より反応性の高い2-アミノ基を保護する方が好ましい。Ｃ６カルボニル基が保護されていない状態でヘテロサイクルの環外2-アミノ基に選択的なベンジル保護（あるいはその他のカーバメート保護）を有するグアニジンＰＮＡシントンを合成する方法は知られていない。
ＤＮＡ合成では核酸塩基であるシトシン、アデニンおよびグアニンの環外アミノ基を保護するためにベンジルオキシカルボニル基が使用されている（Watkins達、J. Org. Chem., （1982）47:4471-77と、Watkins達、J. Am. Chem. Soc., （1982）104:5702-08参照）。しかし、グアニンシントンの調製は困難である。その理由はグアニンの環外2-アミノ基がベンジル基を導入するためにルーチンで使用される試薬、例えばベンジルクロロホルメート、ベンジルオキシカルボニルイミダゾールおよびベンジルオキシカルボニルイミダゾールのアシルイミダゾリウム塩等に対して反応性がないためである。その結果、フェニルクロロチオホルメートを用いた処理によってＣ６カルボニル基と環外2-アミノ基とを両方同時に保護する従来とは異なるマルチステップ法が報告された。その後、付加生成物をカーバメート保護されたグアニンへ変換し、Ｃ６カルボニル保護基を除去する。しかし、この間接的方法は、元の付加生成物からカーバメート保護基を生成し、その後にＣ６カルボニル基を保護解除しなければならず、面倒である。
適切に保護された2-アミノ-6-クロロプリンの誘導体は6-クロロ基を求核性酸素で置換することによってグアニン化合物に変換することができる（Robins達、J. Am. Chem. Soc. （1965）87:4934、Reese達、Nucl. Acids Res., （1981）9:4611およびHodge達、J. Org. Chem., （1990）56:1553参照）。実際、報告されているグアニンＰＮＡシントンの製造法で用いられている出発物質には適切に保護された2-アミノ-6-クロロプリンが含まれる（欧州特許出願第92/01219号および国際特許出願PCT/US/92/10912号参照）。
ＰＮＡの発明者達は環外2-アミノ基が保護されておらず、Ｃ６カルボニル基がベンジルエーテルとして保護されているグアニンシントンを報告している（欧州特許出願第92/01219号参照）。しかし、より反応性の高い2-アミノ基が他のＰＮＡモノマーの活性化されたカルボン酸基（少なくとも末端において）と反応して合成ポリマーに分岐を生じさせる可能性があり、反対に、Ｃ６カルボニルを保護しなかった場合に存在するエノールは、ポリマーに分岐を生じさせるほどの反応性を持たず、従って保護の必要はない。この特定の方法はその他のＰＮＡシントン合成に用いられるt-Boc／ベンジル保護方法と矛盾する。
さらに最近の特許出願では、グアニンＰＮＡシントンは環外2-アミノ基のベンジル保護と、ベンジルエーテルとして保護されたＣ６カルボニル基との両方を有している（国際特許出願第PCT/US 92/10921号参照）。既に述べたように、敢えてグアニンＰＮＡシントンのＣ６カルボニル基を保護する合理性は存在しないが、Ｃ６カルボニル基を保護することによってグアニン複素環の環外2-アミノ基を選択的にイオン化することが可能になり、それによってイオン化した2-アミノ基と一般的なベンジル保護試薬（例えばベンジルオキシカルボニルイミダゾール）との反応が促進される。それでも環外2-アミノ基の保護が核酸塩基のＣ６カルボニル基が保護されたグアニン誘導体で起こり、生成したシントンは環外2-アミノ基とＣ６カルボニル基との双方が保護されている。従って、環外2-アミノ基を選択的にカーバメート保護し且つＣ６カルボニルは保護されないグアニンＰＮＡシントンを、報告されているような高収率で合成する都合の良い方法はない。
固相ペプチド合成法はＰＮＡオリゴマーの合成に適用可能であるが、しばしば過酷な反応条件の使用が要求される。上記のt-Boc/benzyl保護スキームでは大抵の場合、最後の側鎖保護解除と、固体担体からのＰＮＡ分子の開放とが無水フッ化水素酸（ＨＦ）（Sakakibara達、Bull. Chem. Soc. Jpn.,1965, 38, 4921）、ボロントリス（トリフルオロ酢酸）（Pless達、Herv. Chim. Acta, 1973,46,1609）およびトリフルオロメタンスルホン酸やメタンスルホン酸等のスルホン酸（Yajima達、J. Chem.,Soc., Chem. Comm., 1974, 107）を用いて行れる。この従来の強酸（例えば無水ＨＦ）による保護解除法は非常に反応性の高いカルボカチオンを発生させ、このカルボカチオンがＰＮＡ鎖中の感受性残基のアルキル化またはアシル化を引き起こす可能性がある。このような副反応はアニソール、フェノール、ジメチルスルフィドおよびメルカプトエタノール等の捕捉剤を用いて部分的に防止できるに過ぎない。従って、スルフィドに補助された酸分解によるＳＮ2の保護解除方法（Tam達、J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 6442と、J. Am. Chem. Soc.,1986, 108, 5242）すなわち有害なカルボカチオンの前駆体を除去して不活性なスルホニウム塩を生成させるいわゆる『ロー』法が、ペプチドおよびＰＮＡ合成で単独または『ハイ』法と組み合わせてしばしば用いられる。それほど頻度は高くないが、特殊な場合に保護解除および／または最終的なＰＮＡ−固体担体結合の開裂に用いられる他の方法には、例えば塩基触媒を用いたアルコール分解（Barton達、J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, 4501）、アンモニア分解、ヒドラジン分解（Bodanszky達、Chem.Ind., 1964, 1423）、水素分解（Jones, Tetrahedron Lett., 1977,2853およびSchlatter達、Tetrahedron Lett., 1977, 2861）および光分解（Rich and Gurwara, J. Am. Chem.Soc., 1975, 97, 1575）がある。
固相ペプチド合成の合成サイクルにおいてはほとんどの操作が同一である（固相ＰＮＡ合成の場合もそうである）という認識に基づいて、多数のペプチド製造を容易にするための新規なマトリクスＰＥＰＳが最近開発されている（Berg達、J. Am. Chem.Soc., 1989, 111. 8024および国際特許公表第WO90/02749号）。このマトリクスはポリエチレン（ＰＥ）フィルムとペンダントした長鎖のポリスチレン（ＰＳ）グラフトとで構成される（分子量は106程度）。フィルムの負荷容量はビーズ状マトリクスと同程度であるが、ＰＥＰＳは多重合成を同時に起こすのに適したフレキシビリティを有している。
多数のペプチドの同時合成用に提案されている別の２つの方法を多数の異なるＰＮＡ分子の製造に適合することもできる。その第１の方法（Geysen達、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984, 81, 3998）では伸長中のペプチド鎖を固定し、合成を区画に分けて行うために、アクリル酸をグラフトしたポリエチレンロッドと96-マイクロタイタのウェルとを使用する。この方法は非常に効果的であるが、マイクログラムスケールでしか使用できない。第２の方法では従来から用いられているポリマービーズを入れた『ティーバッグ』を用いる（Houghten, Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1984, 82, 5131）。多重ペプチドまたはＰＮＡ合成に関するその他の提案には密度の異なる２種類の担体を同時に使用する方法（Tregear, Chemistry and Biology of Peptides, J. Meienhofer, ed., Ann Arbor Sci., Publ., Ann Arbor, 1972, pp. 175-178）、マニホルドを介して反応容器を連結する方法（Gordman, Anal. Biochem., 1984, 136, 397）、多重カラム固相合成法（例、Krchnak達、J. Peptide Protein Res., 1989, 33, 209、Holm & Meldal, Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, G. Jung and E. Bayer, eds, Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1989, pp208-210）やセルロースペーパーの使用（Eichler達、Collect. Crzch. Chem. Commun., 1989, 54, 1746）がある。
固相ＰＮＡ合成では架橋スチレン／ジビニルベンゼン共重合体マトリクスと、ＰＥＰＳ担体が好ましいとされている。適当な固体担体の非限定的な例としては次のものを挙げることができ、これらはＰＮＡ合成にも適している：
（１）既知量のN-t-ブトキシカルボニル−β−アラニルN'-アクリロイルヘキサメチレンジアミンを含む、N,N'−ビスアクリロイルエチレンジアミンと架橋したジメチルアクリルアミド共重合体をベースにした粒子。通常はβアラニル基を介して数種類のスペーサー分子が付き、それにアミノ酸残基サブユニットが続く。さらに、樹脂ビーズを製造するための重合中にβアラニルを含有するモノマーをアクリロイルサルコシンモノマーで置換できる。重合後、ビーズをエチレンジアミンと反応させて、共有結合した官能基として第１級アミンを含む樹脂の粒子を製造する。ポリアクリルアミドベースの担体は、ポリスチレンベースの担体に比べて相対的に親水性が高く、通常、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、N-メチルピロリドン等の極性非プロトン性溶媒と一緒に使用される（Atberton達、J. Am. Chem. Soc.,1975, 97, 6584, Bioorg. Chem. 1979, 8, 351と、J.C.S.Perkin I 538（1981）参照）。
（２）シリカ含有粒子、例えば多孔性ガラスビーズおよびシリカゲル等をベースとする第２の固体担体群。その１つの例としてはウォーターズアソシエイツ社（Waters Associates Fremingham, MA, USA）からポラシルＥ（PORASILE、登録商標）として市販のトリクロロ-［3-（4-クロロメチル）フェニル］プロピルシランと多孔性ガラスビーズとの反応生成物を挙げることができる（Parr & Grohmann, Angew, Chem.Internal. Ed. 1972, 11, 314参照）。同様に1,4-ジヒドロキシメチルベンゼンとシリカのモノエステル（ウォーターズアソシエイツよりバイオパック（BIOPAK、登録商標）で市販）が有効であると報告されている（Bayer & Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503参照）。
（３）３番目の有効な一般的固体担体は基本的に２成分すなわち樹脂と、使用する有機合成反応条件でほぼ不活性な他の１つの材料とからなる複合材とよぶことができる。この担体として好ましいものは米国特許第5,235,028号に記載されている（この特許は参考として本明細書の一部を成す）。その一例である複合材（Scott達、J. Chrom. Sci., 1971, 9, 577参照）は反応性のクロロメチル基を含む疎水性の架橋スチレンポリマーで被覆されたガラス粒子を用いたものでノースゲートラボラトリーズ（Northgate Laboratories,Inc., Hamden, CT, USA）から供給されている。例として挙げられるもう１つの複合材はフッ素化エチレンポリマーのコアを有し、その上にポリスチレンがグラフトしたものである（Kent and Merrifield, Israel J. Chem. 1978, 17,243およびvan Rietschoten, Peptides 1974, Y. Wolman.Ed., Wiley and Sons. New York, 1975, pp. 113-116参照）
（４）ＰＥＰＳ以外の連続固体担体。例えば綿シート（Lebl and Eichler, Peptide Res. 1989, 2, 232）やヒドロキシプロピルアクリレートで被覆したポリプロピレン膜（Daniels達、Tetrahedron Lett., 1989, 4345）。
現在、ＰＮＡ合成では固相法が好ましいとされているが、その他の方法およびその組み合わせ、例えば、固相法との組み合わせも適当である：
（１）ＰＮＡ化合物の大量生産を考えた場合には、逐次延長法またはセグメント／フラグメント縮合法のいずれかによる従来の溶液相のペプチド合成法が特に適している（例えば、Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin-New York 1984）。
（２）直鎖ポリスチレン（Shemyakin達、Tetrahedron Lett., 1966, 2323）やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Mutter and Bayer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,1974, 13,88）等の可溶性ポリマー担体を用いるいわゆる『液相』法は有用である。
（３）多種多様な分子量の”多分散”ペプチドまたはＰＮＡ分子の混合物が得られるランダム重合（Odian, Principles of Polymerization, McGraw-Hill, New York（1970）参考）は抗ウィルス効果のスクリーニング等の目的に特に適している。
（４）ポリマー担持アミノ酸活性エステルを用いる方法（『逆Merrifield合成』または『ポリマー試薬合成』ともよばれる）（Fridkin達、J. Am. Chem. Soc., 1965, 87, 4646）では、中間生成物の単離・精製という利点が得られ、従って中間のサイズを有し且つ必要に応じて保護されたＰＮＡ分子を合成する上で特に適当な方法を提供する。このＰＮＡ分子はより大きなＰＮＡ分子を得るためのフラグメント縮合で使用できる。
（５）ＰＮＡ分子はプロテアーゼまたはその誘導体のような酵素によって新規特異性（例えば蛋白工学等の人工的な手段によって得られたもの）と組み合わせることができ、さらに多数のＰＮＡ断片を非常に大きなＰＮＡ分子へ縮合するための『ＰＮＡリガーゼ』の開発も考えられる。
（６）抗体は実質的に任意の対象分子にジェルネート（gernate）できるので、レルナー（Tramantano）達のグループ（Science,1986, 234, 1566）およびシュルツ（Pollack）達のグループ（Science, 1986, 234, 1570）によって同時に見出された最近開発された触媒抗体（アブザイム）もＰＮＡ分子構築のための有力な候補と見なされるべきである。アシルトランスファー反応を触媒するアブザイムの製造においては多大な成功を収めている（Shokat達、Nature, 1989, 338,269およびその中の参考文献参照）。
最後に、スチュワートのグループによって開発されたばかりの完全に人工的な酵素（Haln達、Science, 1990 248, 1544）をＰＮＡ合成に合うように開発することもできる。天然に存在するペプチド構成アミノ酸（蛋白質を生成するアミノ酸）が20種類であるのに対してＰＮＡ分子は大抵の場合４種類の異なるアミノ酸（４種類の天然の核酸塩基それぞれに対して１つずつ）のみで構成されるので、一般に適用可能な特異的カップリング反応を仲介できる酵素、リガーゼおよび触媒抗体は『通常の』ペプチド合成よりもＰＮＡ合成でより容易に達成されるはずである。結論として、特定のＰＮＡ分子合成については単一の方法が完全に好適ということはなく、従って、時には複数の方法を組み合わせることによって最良の結果が得られる。
発明の要約
本発明の目的は、緩やかな条件下で除去可能な保護基を有する新規ＰＮＡシントンの便利且つ高収率な合成経路を提供することにある。
本発明の別の目的は、ＰＮＡまたは核酸オリゴマー合成の効率を向上させるためのオルソゴナルに保護されたＰＮＡシントンを提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、市販の製品および機器、例えば自動合成装置等に適合したＰＮＡシントンを提供することにある。
本発明は、緩やかな条件下で除去可能な保護基を有する新規ＰＮＡシントンを便利且つ高収率で得る方法に関するものである。一般に、ＰＮＡシントンは、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分をアミノ保護されたアミノ酸主鎖N-（2-アミノエチル）-グリシンとカップリングさせて合成される。ＰＮＡシントンが緩やかな条件下で除去可能な保護基を有するために、市販の機器および製品と一緒に用いる上で非常に有利である。
本発明の上記以外の特徴および利点は、以下の説明および図面と、請求項から明らかとなり、本発明を実施することによって理解されよう。
本発明方法では、例えばシトシン、アデニン、グアニン、ウラシル、偽イソシトシン、5-メチルシトシン、2.6-ジアミノプリンおよびイノシンなどの環外アミノ基を含む部分的に保護された核酸塩基化合物を求電子性を有するカルボニル同等物と反応させる。この反応によってイソシアネートであると患われるN-置換された中間化合物が得られる。このN-置換中間化合物は単離せず、さらにアルコールと反応させて、カーバメート保護された環外アミノ基を有する完全に保護された核酸塩基化合物を合成する。N-置換中間化合物は各種のアルコールと反応させることが可能であるので、環外アミノ基をカーバメートとして保護するための非常に用途の広い方法が提供される。最後に、完全に保護された核酸塩基化合物を金属アルコキシドまたは金属ヒドロキシドと反応させて出発物質中すなわち部分的に保護された核酸塩基化合物中に存在する側鎖の酢酸エステルを加水分解する。加水分解の結果、次のアミノ酸主鎖とのカップリングに使用可能なフリーのカルボン酸基を有するカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分が得られる。
ＰＮＡシントンは、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分を、アミノ保護された主鎖に（フリーのカルボン酸または保護されたエステルとして）カップリングさせることによって合成される。アミノ保護された主鎖はアミノ保護されたN-（2-アミノエチル）-グリシンの主鎖であるのが好ましい。従って、この方法によって核酸塩基の環外アミノ基と主鎖のアミノ基にオルソゴナルな保護、例えば核酸塩基の環外アミノ基には酸に対して不安定なカーバメート保護を有し、主鎖のアミノ基には塩基に対して不安定な保護を施された新規ＰＮＡシントンが得られる。
その後、主鎖上にフリーのカルボン酸基を有するＰＮＡシントンを用いてヌクレオチドおよびペプチドモノマーとの組み合わせなどでＰＮＡ、核酸オリゴマーおよび核酸ポリマー、を作製する。核酸オリゴマーの例としては（限定的にではなく）、ＰＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列並びにそれらの各種組み合わせがある。ＰＮＡシントンの化学作用が市販の合成装置に合うので、シントンは種々の長さおよび配列を有するポリマー鎖へ容易に変換することができる。
本発明の１つの観点は、環外2-アミノ基に選択的なカーバメート保護を有する新規グアニンＰＮＡシントンを高収率で合成するめの便利な方法を提供することにある。一般に、グアニンＰＮＡシントンは、選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分を、適切に保護されたアミノ酸の主鎖エステル、N-（2-アミノエチル）-グリシンとカップリングさせ、続いて主鎖のエステル基を加水分解することによって合成される。核酸塩基の環外2-アミノ基のみがベンジル保護されているために、本発明による好ましいグアニンモノマーが選択的に保護され、従ってＰＮＡ合成において現在採用されているt-Boc/benzyl保護法と完全に合致する。
本発明の方法では、部分的に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物（例えば図１および２の化合物Ｉ：Ｎ９窒素原子の位置で酢酸エステル部分によってアルキル化されたもの）を、非求核性塩基の存在下で、ホスゲンまたはホスゲン同等物（例えばトリホスゲンまたはジホスゲン）と反応させる。このステップによってプリン中の比較的非求核性の環外アミノ基が反応性で求電子性の2-イソシアネート基へと変換される。中間生成物である2-イソシアナト-6-ハロプリンは単離せず、アルコールと反応させて、カーバメート保護された環外2-アミノ基を有する完全に保護された2-アミノ-6-クロロプリン（例えば図１の化合物IIおよび図２の化合物VI）を合成する。このように、本出願人は、適切に保護されたアミノ酸の主鎖エステルN-（2-アミノエチル）-グリシンとカップリングさせるのに好適な選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分へと直接変換することが可能な選択的に保護された化合物の高収率且つ便利な合成方法を明らかにするものである。
一般に、完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンは、6-ハロ基をＣ６カルボニル基に変換すると同時にＮ９酢酸エステル基を加水分解することによってカーバメート保護されたグアニン側鎖部分へと変換される。3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドを用いた処理による単一の反応で両方の変換が達成されるのが好ましい。つまり、完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンを少なくとも３当量の3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドで処理する。6-ハロ基をＣ６カルボニル基に変換するために２当量のアルコキシドが消費され、Ｎ９酢酸エステル基を加水分解して選択的にカーバメート保護された所望のグアニン側鎖部分を得るために少なくとも１当量が消費される（例えば、図１の化合物IIIおよび図２の化合物VII）。
従って、グアニンＰＮＡシントンの構成要素は、カーバメート保護されたグアニン側鎖部分を適切に保護された主鎖エステルにカップリングさせることによって組み立られる。適切に保護された主鎖エステルはN1-（tert-ブチロキシカルボニル）-N4-（2-アミノエチル）-グリシンエチルエステルであり、これがカーバメート保護されたグアニン側鎖に連結されて、グアニンＰＮＡシントンエステル（例えば化合物IV）が生成する。次いで、合成されたグアニンＰＮＡシントンエステルを、主鎖エステル基を加水分解することによってフリーのカルボン酸へと変換する。結果的にこの方法では、環外2-アミノ基に選択的カーバメート保護を有する一方、Ｃ６カルボニル基が保護されない状態のまま残された新規グアニンＰＮＡシントンが得られる。図１ではグアニンＰＮＡシントンは化合物Ｖである。
適切に保護された主鎖のエステルはN1-（9-フルオレニルメチロキシカルボニル）-N4-（2-アミノエチル）-グリシンエチルエステルまたはメチルエステルであるのが好ましく、これがカーバメート保護されたグアニン側鎖部分にカップリングする。主鎖エステル基の加水分解に続いて新規グアニンＰＮＡシントンが得られる。図２では好ましい主鎖を用いて合成されたＰＮＡシントンの例は化合物VIIIである。
別の方法として、ＰＮＡシントンは、フリーのカルボン酸の形状を有する適切に保護された主鎖を用いて合成することができる。適切に保護された主鎖として好ましいものはN1-（9-フルオレニルメチロキシカルボニル）-N4-（2-アミノエチル）-グリシンであり、これをカーバメート保護されたグアニン側鎖部分とカップリングさせる。この方法によって追加の加水分解ステップを必要とせずにグアニンＰＮＡシントンを合成することができる。
本発明はさらに下記式で表される完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物を対象とする：
0004089979.tif 000002
ここで：
Ｘはハロゲン原子であり、フッ素（Ｆ）、塩素（Cl）、臭素（Br）、およびヨウ素（Ｉ）で構成される群から選択される。
Ｒ1で表される基は、メチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミルおよび下記式で表されるベンジル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000003
ここで、ａ〜ｅのそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3または−（Ｏ）ＳＣＨ3から構成される群から選択され、ｇおよびｈで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素およびメチル基で構成される群から選択される。
Ｒ2で表される基は、メチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、上記に定義のベンジル基および下記式で表されるジフェニル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000004
ここで、Ａ1〜Ａ10のそれぞれで表される原子または基は、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシで構成される群から選択され、Ｒ4で表される原子または基は、水素、メチルおよびエチル基で構成される群から選択される。
もう１つの具体例では、Ｒ2は下記式で表されるチオエーテル基である：
0004089979.tif 000005
ここで、Ｒ5で表される基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチルおよび下記式で表されるフェニル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000006
ここで、ｉ〜ｍのそれぞれで表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、互いに独立にＦ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3または−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。
好ましい具体例では、ＸはCl、Ｒ1は、ａ〜ｅおよびｇ〜ｈが全て水素であるベンジル基で、Ｒ2は、Ｒ5がメチル基であるチオエーテル基である。別の態様としては、ＸがCl、Ｒ1がａ〜ｅおよびｇ〜ｈが全て水素のベンジル基、さらにＲ2は、Ｒ5がｉ〜ｍがそれぞれ水素のフェニル基を表すチオエーテル基である。
本発明はさらに、下記式で表される完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンを対象とする：
0004089979.tif 000007
最も好ましい本発明の具体例は、下記式で表される完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンである：
0004089979.tif 000008
本発明はさらに、下記一般式で表される選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分を対象とする：
0004089979.tif 000009
ここで、Ｒ2で表される基はメチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、上記定義のベンジル基および下記式で表されるジフェニル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000010
ここで、Ａ1〜Ａ10のそれぞれで表される原子または基は、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシで構成される群から選択され、Ｒ4で表される原子または基は水素、メチルおよびエチル基で構成される群から選択される。
もう１つの具体例では、Ｒ2は下記式で表されるチオエーテル基である：
0004089979.tif 000011
ここで、Ｒ5で表される基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチルおよび下記式で表されるフェニル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000012
ここで、ｉ〜ｍのそれぞれで表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、独立にＦ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3または−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。
この化合物の好ましい具体例は、Ｒ2がチオエーテル基で、Ｒ5がメチル基の場合と、Ｒ2がチオエーテル基で、Ｒ5がｉ〜ｍがそれぞれ水素のフェニル基である場合に得られる。
本発明はさらに、下記式で表される選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分を対象とする：
0004089979.tif 000013
本発明はさらに下記式で表される選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分を対象とする：
0004089979.tif 000014
最も好ましい本発明の具体例は、下記式で表される選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分である：
0004089979.tif 000015
本発明はさらに下記一般式で表されるグアニンＰＮＡシントンエステルを対象とする：
0004089979.tif 000016
ここで、Ｐｇで表される基は、アルキルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-（4-ビフェニル）-エチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-フェニル-エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、4-メトキシ-トリフェニルメチル、4,4'-ジトキシトリフェニルメチル、アリルオキシカルボニル基、メチルスルホニルエトキシカルボニル基およびフェニルスルホニルエトキシカルボニル基で構成される群から選択される保護基である。
Ｒ2で表される基は、メチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、上記に定義のベンジル基、上記に定義のジフェニル基、および上記に定義のチオエーテル基で構成される群から選択される。Ｒ3で表される基はメチルおよびエチル基で構成される群から選択されるアルキル基である。
本発明はさらに下記式で表されるグアニンＰＮＡシントンエステルを対象とする：
0004089979.tif 000017
本発明の好ましい具体例は下記式で表されるグアニンＰＮＡシントンエステルである：
0004089979.tif 000018
本発明はさらに下記式で表されるグアニンＰＮＡシントンを対象とする：
0004089979.tif 000019
ここで、Ｐｇで表される基は、アルキルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-（4-ビフェニル）-エチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-フェニル-エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、4-メトキシ-トリフェニルメチルおよび4,4'-ジトキシトリフェニルメチルで構成される群から選択される保護基である。
Ｒ2で表される基は、メチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、上記に定義のベンジル基、上記に定義のジフェニル基、および上記に定義のチオエーテル基で構成される群から選択される。
本発明はさらに下記式で表されるグアニンＰＮＡシントンを対象とする：
0004089979.tif 000020
本発明はさらに下記式で表されるグアニンＰＮＡシントンを対象とする：
0004089979.tif 000021
本発明の好ましい具体例は、下記式で表されるグアニンＰＮＡシントンである：
0004089979.tif 000022
本発明の別の観点は、下記式で表される完全に保護された核酸塩基化合物（例えば、図３の化合物Ｘおよび図４の化合物XIV）を提供することにある：
0004089979.tif 000023
ここで、Ｒ1で表される基はメチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基または下記式で表される置換基を有するあるいは有しないベンジル基である：
0004089979.tif 000024
ここで、ａ〜ｅのそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。ｇ〜ｈのそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素およびメチル基で成される群から選択される。
Ｒ2で表される基はメチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、2-（フェニルチオ）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、置換基を有するまたは有しない上記ベンジル基あるいは下記式で表されるジフェニル基である：
0004089979.tif 000025
ここで、Ａ1〜Ａ10のそれぞれで表される原子または基は、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシで構成される群から選択され、Ｒ4で表される原子または基は、水素、メチルまたはエチル基である。
Ｒ2で表される基は下記式で表されるチオエーテル基であってもよい：
0004089979.tif 000026
Ｒ5で表される基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチルまたは下記式で表されるフェニル基である：
0004089979.tif 000027
ここで、ｉ〜ｍのそれぞれで表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、独立にＦ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。
別の具体例では、Ｒ2は下記式で表されるエチル基にすることができる：
0004089979.tif 000028
Ｗで表される基は電子吸引基であって、Ｒ6〜Ｒ8のそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に水素、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルおよびt-ブチルで構成される群から選択される。好ましい電子吸引基には（限定的にではなく）シアノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、フェニルおよび置換基を有するフェニル基、例えばp-ニトロフェニル基、o-ニトロフェニル基およびp-アルキルスルホニルフェニル基などがある。
好ましい化合物の具体例では、Ｒ1がメチル基で、Ｒ2がジフェニル基（Ａ1〜Ａ10がそれぞれ水素である）、Ｒ4が水素であり、あるいはＲ1がエチル基で、Ｒ2がジフェニル基（Ａ1〜Ａ10がそれぞれ水素である）、Ｒ4が水素である。それ以外の好ましい具体例はＲ2がエチル基で、Ｗがシアノ基で、Ｒ6が水素原子で、Ｒ7およびＲ8がそれぞれメチル基である場合に得られる。
本発明のさらに別の観点は、下記式で表されるカーバメート保護された核酸塩基に対して不安定な側鎖部分（例えば図３の化合物XIおよび図４の化合物XV）を提供することにある：
0004089979.tif 000029
ここで、Ｒ2は上記定義のとおり。
好ましい化合物の具体例は、Ｒ2がジフェニル基で、Ａ1〜Ａ10のそれぞれとＲ4が水素の場合と、Ｒ2がエチル基で、Ｗがシアノ基、Ｒ6が水素原子で，Ｒ7およびＲ8がそれぞれメチル基の場合に得られる。
本発明の別の観点は、下記式で表されるＰＮＡシントン（例えば図３の化合物XIIおよび図４の化合物XVI）を提供することにある：
0004089979.tif 000030
ここで、Ｐｇで表される基は、アルキルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-（4-ビフェニル）-エチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-フェニル-エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、4-メトキシ-トリフェニルメチル、4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル、アリルオキシカルボニル、メチルスルホニルエトキシカルボニルおよびフェニルスルホニルエトキシカルボニル基で構成される群の中から選択される保護基であり、
Ｒ2で表される基は上記の意味を有し、
Ｒ3で表される原子または基は水素もしくはメチルまたはエチル基等のアルキル基である。
好ましい化合物の具体例は、Ｒ2がジフェニル基で、Ａ1〜Ａ10およびＲ4がそれぞれ水素であり、Ｒ3が水素の場合と、Ｐｇが9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、Ｒ2がジフェニル基で、Ａ1〜Ａ10およびＲ4がそれぞれ水素で、Ｒ3がエチル基の場合に得られる。これら好ましい具体例はオルソゴナルに保護されたＰＮＡシントンの例である。
上記の説明および以下の詳細な説明は単なる例示であって、請求項に記載の本発明を説明するためのものであるということは理解できよう。本発明は以下の図面からさらに明確に理解されよう。これらの図面は本明細書に含まれて、本発明の一部を成るものである。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明のグアニンＰＮＡシントンの合成スキーム。
図２は本発明の好ましいグアニンＰＮＡシントンの合成スキーム。
図３は本発明の好ましいアデニンＰＮＡシントンの合成スキーム。
図４は本発明の好ましいシトシンＰＮＡシントンの合成スキーム。
図５は本発明で有用な天然または非天然の核酸塩基の構造を示したチャート。
図６はＰＮＡオリゴマー配列Fmoc-CAGGAGTCGCAT-gly-NH2のＨＰＬＣトレース。
発明の詳細な説明
本出願人は、新規ＰＮＡシントンの合成に好適な、複素環の環外アミノ基をカーバメート保護した新規なN-置換核酸塩基中間体を高収率で調製する便利な方法を開発した。
一般に、ＰＮＡシントンはカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分をアミノ基保護されたアミノ酸主鎖N-（2-アミノエチル）-グリシンにカップリングさせることによって合成される。本発明のＰＮＡシントンは、緩やかな条件下で除去することの可能なカーバメート保護基を含む核酸塩基側鎖部分を用いて調製される。天然または非天然の核酸塩基をＰＮＡシントンに組み込むことができる。本発明のＰＮＡシントンは、カーバメート保護された核酸塩基とアミノ保護された主鎖のオルソゴナルな保護を有することができる。なお、Ｃ６カルボニル基が保護されていない状態で、環外2-アミノ基に選択的にカーバメート保護を有するグアニンＰＮＡシントンは報告されていない。
グアニンＰＮＡシントン合成
本発明の１つの具体例はグアニンＰＮＡシントンの合成方法にある（図１および２参照）。
ステップ１
図１を参照すると、本発明は、環外2-アミノ基に選択的なカーバメート保護を有するグアニンＰＮＡシントンの調製方法を含む。カーバメート保護されたグアニン側鎖部分を調製するための出発物質は2-アミノ-6-ハロプリンである。好ましい2-アミノ-6-ハロプリンは2-アミノ-6-クロロプリンである。まず最初に、2-アミノ-6-ハロプリンをプリン環のＮ９窒素の位置で保護部分を用いてアルキル化し、部分的に保護された2-アミノ-6-ハロプリンを合成する。
『部分的に保護された』とは、複素環のＮ原子を側鎖基で保護し、それによってアミノ保護された主鎖とカーバメート保護された核酸塩基との間の連結が形成される一方、環外アミノ基は保護しない状態にすることと定義される。好ましい側鎖基は酢酸エステル部分である。
『完全に保護された』とは、求電子性のカルボニル均等物と反応する全ての求核原子または官能基を保護することと定義される。例えば完全に保護されたグアニン化合物は、ホスゲンまたは任意のホスゲン均等物に対して不活性になる。
本発明の１つの具体例では、部分的に保護されたの2-アミノ-6-ハロプリン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000031
ここで、Ｘで表される原子はＦ、Cl、BrおよびＩで構成される群から選択されるハロゲン原子であり、
Ｒ1で表されるアルキル基はメチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、2-（フェニルチオ）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、および下記一般式で表されるベンジル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000032
ここで、ａ〜ｅのそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択され、ｇ〜ｈで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素およびメチル基で構成される群から選択される。図１で表される最も好ましい部分的に保護された2-アミノ-6-ハロプリンは下記式で表される：
0004089979.tif 000033
ステップ２
化合物IIおよびVIは完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンの例である。図１を参照すると、化合物Ｉはトリホスゲン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびベンジルアルコールで順次処理される。その結果、完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンが得られる（化合物II）。本発明の好ましい具体例では、化合物Ｉをトリホスゲン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびベンズヒドロールを用いて順次処理する（図２）。その結果、化合物VIで表される完全に保護された2-アミノ-ハロプリンが得られる。部分的に保護された2-アミノ-6-ハロプリンを完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンへと変換することによって非求核性の環外2-アミノ基におけるカーバメート保護が実現する。つまり、本発明の方法では、部分的に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物を、少なくとも２モル当量の非求核性塩基の存在下で少なくとも１モル当量のホスゲン反応させ、それによって2-イソシアナト-6-ハロプリン化合物を合成する。非求核性塩基の例としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリンおよびN-エチルモルホリンがある。非求核性塩基はジイソプロピルエチルアミンであるのが好ましい。通常、反応は非求核性塩基と部分的に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物とを少なくとも部分的に溶解した非求核性無水溶媒を用いて行う。適当な溶媒の例としてはジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ベンゼンおよびトルエンを挙げることができる。好ましい溶媒はテトラヒドロフランである。
ホスゲンは、化学式ＣＯCl2で表される非常に毒性の強いガスである。ホスゲンガスの取扱いおよび正確な分配に関する本質的な危険のために、数種類のホスゲン均等物が入手可能である。これらの均等物には液体ジホスゲンおよび固体トリホスゲンが含まれる。これら均等物はその場で分解して２または３当量のホスゲンを発生するが、気体の均等物に比べて取扱いおよび分配が容易である。従って、これらの試薬は全て本発明の方法に好適なホスゲン均等物の非限定的な例である。
中間体である2-イソシアナト-6-ハロプリン化合物は単離しないのが好ましい。すなわち、この化合物は単離に必要な取扱い操作の段階で容易に加水分解されて、元の部分的に保護された2-アミノ-6-ハロプリンに戻ってしまう。従って、続いて中間体2-イソシアナト-6-ハロプリン化合物の2-イソシアネート基をアルコールと反応させて、カーバメートとして保護された環外2-アミノ基を有する完全に保護された新規2-アミノ-6-ハロプリン化合物を生成させる。
アルコールがイソシアネートと反応してカーバメートを形成することは公知であるが、出願人の知る限り、この化学作用がカーバメート保護されたアミノプリンの合成に利用されたことはない。これはおそらく、ホスゲン（またはホスゲン均等物）が非常に反応性の高い求電子体であるためである。さらに、プリン環のＮ７窒素原子はかなり求核性である。従って、環外2-アミノ基と同様Ｎ７窒素原子においても、かなりのホスゲンの反応が起こるものと予想される。事実、出願人は6-アミノ-N9-エチルカルボキシメチル-プリン（N9-エチルカルボキシメチルアデニン）がカーバメート保護されたアデニン誘導体に変換されないことを確認した。これはホスゲンがＮ７窒素原子と優先的に反応するためと推定される。しかし、Ｎ７窒素の求核性はプリン環の置換基によって変化する。本出願人は、驚くべきことに、2-アミノ-6-クロロ-N9-アルキル化プリン化合物はホスゲンとあまり反応せず、従って環外2-アミノ基に選択的なカーバメート保護を有する完全に保護された新規2-アミノ-6-ハロプリン化合物の調製が可能になるということを見出した。完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物は、グアニンＰＮＡモノマー合成に適したカーバメート保護されたグアニン側鎖部分を調製する上で好ましい。
環外2-イソシアナト基と反応する適当なアルコールには（限定的にではなく）メタノール、エタノール、2,2,2-トリクロロエタノール、2-（トリメチルシリル）-エタノール、プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノールおよびt-ブタノールがある。さらに、アルコールはアリルアルコール誘導体にすることができる。アリルアルコール誘導体はアリルアルコール、1-イソプロピルアリルアルコール、シンナミルアルコールおよび４−ニトロシンナミルアルコールで構成される群から選択することができる。アルコールはさらに、下記式で表される置換基を有するまたは有しないベンジルアルコールにすることができる：
0004089979.tif 000034
ここで、ａ〜ｅのそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択され、ｇ〜ｈで表される原子または基はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、独立に、水素およびメチル基で構成される群から選択される。
好ましいアルコールは、下記式で表されるジフェニル基である：
0004089979.tif 000035
ここで、Ａ1〜Ａ10のそれぞれで表される原子または基は、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシで構成される群から選択され、Ｒ4で表される原子または基は、水素、メチルおよびエチル基で構成される群から選択される。
アルコールはさらに下記式で表されるチオエーテル基にすることができる：
0004089979.tif 000036
ここで、Ｒ5で表される基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチルおよび下記式で表されるフェニル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000037
ここで、ｉ〜ｍのそれぞれで表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、独立にＦ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群の中から選択される。
さらに、アルコールは下記式で表されるエチル基にすることができる：
0004089979.tif 000038
ここで、Ｗで表される基は電子吸引基であって、Ｒ6〜Ｒ8のそれぞれで表される基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルおよびt-ブチルで構成される群から選択される。
完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンは下記一般式で表される化合物である：
0004089979.tif 000039
ここで、Ｒ1およびＲ2は上記に定義のとおりである。図１を参照して、完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンは下記式で表される：
0004089979.tif 000040
図２を参照して、完全に保護された好ましい2-アミノ-6-ハロプリンは下記式で表される：
0004089979.tif 000041
本発明の合成ステップが汎用できることを示すために、所望のアルコールを単純に置き換えることによって調製した完全に保護された2-アミノ-6-クロロプリン化合物の例を数種類挙げる。表Ｉは、Ｒ2基のみを変えて調製した数種類の2-アミノ-6-クロロプリンに関する回収結果をまとめたものである。表に示されるように、アルコールの組成に関係なく収量は一貫して中程度である。
0004089979.tif 000042
ステップ３
適切に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物は、酸素求核性試薬を用いた6-ハロ基の攻撃を含む複数の方法で保護されたグアニン化合物へ変換させることが知られている（Hodge,達Org. Chem.（1990）56:1553-64参照）。しかし、本発明では6-ハロ基をＣ６カルボニル基に変換すると同時にＮ9酢酸エステル基を加水分解する方法を示す。すなわち、カーバメート保護されたグアニン側鎖部分は、完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物から6-ハロ基をＣ６カルボニル基へ変換し、同時にＮ9酢酸エステル基を加水分解する方法で調製される。
驚くべきことに、3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドは、6-ハロ基のＣ６カルボニル基への変換およびＮ9酢酸エステル基の加水分解の両方を行うことができる。従って、カーバメート保護されたグアニン側鎖部分は、完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンから単一の反応によって直接かつ簡単に生成される。図１に示した具体例を参照すると、1,2-（N-［ベンジルオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（化合物II）は2-（N-ベンジルオキシカルボニル］）-N9-（カルボキシメチル）-グアニン（化合物III）へ直接変換される。この方法では少なくとも３当量の3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドを化合物IIと反応させる。6-アミノ基をＣ６カルボニル基に変換するのに２当量が使用され、同時に少なくとも１当量がN9酢酸基を加水分解するために使用される。従って、好ましいカーバメート保護されたグアニン側鎖部分、化合物IIIは高い収率で調製される。
図２に示す好ましい具体例では、同じ合成プロセスを用いて2-（N-［ベンズヒドロールオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（化合物VI）が2-（N-［ベンズヒドロールオキシカルボニル］）-N9-（カルボキシメチル）-グアニン（化合物VII）へと変換される。
本発明方法では非求核性無水溶媒中で3-ヒドロキシプロピロニトリルを金属水素化物で処理することによって完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリン１当量あたり少なくとも３当量の3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドが調製される。使用可能な金属水素化物は（限定的にでなく）、水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウムおよび水素化セシウムなどである。適当な非求核性溶媒は上記に記載した。金属水素化物は水素化ナトリウムで、溶媒はテトラヒドロフランにするのが好ましい。
完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリン化合物を、アルコキシドの調製溶液に添加する。この反応段階のメカニズムは本発明の理解に必要なものではないが、次のように理解されている。まず最初に、１当量のアルコキシドが6-ハロ原子を置換して6-シアノエトキシエーテルを生じる。その後、さらに１当量のアルコキシドによって2-シアノエーテルエーテル基からプロトンが引き出されてβ脱離反応が起こり、それによってＣ６カルボニル基と１当量のアクリロニトリルと１当量の3-ヒドロキシプロピオニトリルとが生成する。このように、６−ハロ基をＣ６カルボニル基に変換するために3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシド２当量が消費される。
同時に行われる完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンのN9酢酸エステル基の加水分解にも、3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドとの反応が関与する。このプロセスでは、3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシド１当量がN9酢酸エステル基と反応してオリジナルのアルコールを置換させ、それによって2-シアノエチルエステルと置換されたアルコールの金属アルコキシドが生成する。その後さらに１当量のアルコキシドを添加することによって2-シアノエチルエステル基からプロトンが引き出されてβ脱離反応が起こり、それによって主鎖カルボン酸基の金属塩と１当量のアクリロニトリルと１当量のアルコールが生成する。シアノエチルエステルからプロトンを引き出すために用いられるアルコキシドは、置換されたアルコールのアルコキシドか、3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドが過剰量使用される場合には3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシド分子にすることができる。N9酢酸エステル基を加水分解するのに必要な3-ヒドロキシプロピオニトリルのアルコキシドは１当量である。過剰量の3-ヒドロキシプロピオニトリルを使用するのが好ましい。
従って、完全に保護された2-アミノ-6-ハロプリンを３当量のアルコキシドと反応させて得られる生成物は、選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分の金属塩；２当量のアクリロニトリル；１当量の3-ヒドロキシプロピオニトリル；および１当量のアルコール（3-ヒドロキシプロピオニトリルであってもそうでなくてもよい）である。その後、選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分の金属塩を、少なくとも２当量の酸と反応させて中和する。中和反応には、プリン複素環のＮ１窒素のプロトン付加と主鎖カルボン酸基の金属塩のプロトン付加の両方が含まれる。酸は有機酸でも無機酸であってもよく、pKa値が約２以下である。それによってプリン複素環のＮ１窒素のプロトン付加と主鎖カルボン酸基のプロトン付加の両方が可能になる。
本発明の１つの具体例では、カーバメート保護されたグアニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000043
ここで、Ｒ2は上記に定義のとおりである。
図１を参照すると、カーバメート保護されたグアニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000044
別の選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000045
別の選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000046
別の選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000047
選択的にカーバメート保護された好ましいグアニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000048
この合成ステップに汎用性があることを示すために、選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分を複数調製した。表Ｉは、アルキル基Ｒ2のみを変えて調製した数種類の選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分に関する回収結果をまとめたものである。表に示されるように、収率は非常に高く、アルキル基Ｒ2の組成によってそれほど変化しない。
図１または２を参照すると、グアニンＰＮＡシントンの調製における最終段階では、カーバメート保護されたグアニン側鎖部分（化合物IIIまたはVII）を適切に保護されたアミノ酸の主鎖エステルN-（2-アミノエチル）-グリシンと反応させ、その後に主鎖のエステル基を分解する。この段階では、まず第１にグアニンＰＮＡシントンエステル（例えば化合物IV）が生成し、第２にグアニンＰＮＡシントン（例えば化合物Ｖ）が生成する。あるいは図２に示すように、グアニンＰＮＡシントンは、カーバメート保護されたグアニン側鎖部分（化合物VII）をフリーのカルボン酸基を有する適切に保護されたアミノ主鎖にカップリングさせることによって調製することができる。この方法で行われるカップリングによって追加の加水分解段階を必要とせずに直接グアニンＰＮＡシントン（化合物８）が生成する。
ステップ４
選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分（例えば化合物IIIおよびVII）の適切に保護されたアミノ酸N-（2-アミノエチル）-グリシンの主鎖エステルへのカップリングは下記のステップを含む。すなわち、まず最初に立体障害を有する酸塩化物の存在下に非求核性塩基で処理することによってカーバメート保護されたグアニン側鎖部分のカルボン酸官能基の混合無水物を作る。次に、調製した混合無水物を適切に保護されたアミノ酸N-（2-アミノエチル）-グリシンの主鎖エステルと反応させてグアニンＰＮＡシントンエステルを合成する。
選択的にカーバメート保護されたグアニン側鎖部分の混合無水物を作るために使用される非求核性塩基は上記に挙げた任意の非求核性塩基にすることができる。塩基はN-メチルモルホリンにするのが好ましい。立体障害を有する酸塩化物はイソブチリルクロライド、トリメチルアセチルクロライド（ピバロイルクロライド）およびアダマンタンカルボキシクロライドで構成される群の中から選択するのが好ましい。最も好ましい酸塩化物はトリメチルアセチルクロライド（ピバロイルクロライドである）。
適切に保護されたアミノ酸N-（2-アミノエチル）-グリシンの主鎖エステルは下記一般式で表される：
0004089979.tif 000049
ここで、Ｐｇで表される保護基は、アルキルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、メチル-1-（4-ビフェニル）-エチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-フェニル-エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、4-メトキシ-トリフェニルメチルおよび4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル基で構成される群の中から選択可能な保護基である。Ｒ3で表されるアルキル基はメチルおよびエチル基で構成される群の中から選択することができる。
図１を参照すると、保護基（Ｐｇ）はtert-ブチロキシカルボニル（t-Boc）であり、アルキル基（Ｒ3）はエチル基である。従って、ＰＮＡシントンエステルは下記式で表される：
0004089979.tif 000050
ここで、Ｒ2は上記に定義のとおりである。
別の具体例では、グアニンＰＮＡシントンエステルは下記式で表される：
0004089979.tif 000051
あるいは、アミノ保護されたアミノ酸主鎖N-（2-アミノエチル）-グリシンは下記式で表すことができる：
0004089979.tif 000052
ここで、Ｐｇで表される基は上記に定義のとおりである。
好ましい主鎖保護基（Ｐｇ）は9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）である。従って、好ましいアミノ保護された主鎖は下記式で表される：
0004089979.tif 000053
Fmoc保護基は塩基に対して不安定な保護基としてペプチド合成で周知のものである。本発明の方法では、グアニンの環外アミノ基が酸に対して不安定なカーバメートとして保護されるので、好ましいFmocによってアミノ保護された主鎖をグアニン側鎖部分にカップリングさせることによって、オルソゴナルに保護されたグアニンＰＮＡシントンが得られる。
オルソゴナルは、個々の種類の保護基がそれ以外の種類の保護基に対して相互に排他的な条件で除去される保護システムとして定義される。個々の種類の保護基を除去するための方法としては、以下に限定されるものではないが、酸加水分解、塩基加水分解、光開裂および水素添加などがある。従って、アミノ酸主鎖保護基を適切に選択することにより、オルソゴナルに保護されたグアニンＰＮＡシントンを合成することができる。
混合無水物の調製について上記に述べたものと類似の方法に従って、アミノ保護された主鎖を混合無水物の冷却溶液に添加する。必要な時間だけ反応を行ってカップリングさせて、グアニンＰＮＡシントンを生成させる。グアニンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000054
ここで、ＰｇおよびＲ2で表される基は上記のものと同じである。保護基（Ｐｇ）は9-フルオレニルメチロキシカルボニル基で、Ｒ2基はジフェニル基（Ａ1〜Ａ10がそれぞれ水素原子でＲ4が水素原子）であるのが好ましい。好ましいグアニンＰＮＡシントン（図２の化合物VIII）は下記式で表される：
0004089979.tif 000055
ステップ５
必要ならば、グアニンＰＮＡシントンエステルの主鎖エステル基を加水分解してグアニンＰＮＡシントンを得る。主鎖エステル基の加水分解には以下のステップが含まれる。すなわち、まず第１にグアニンＰＮＡシントンエステルの主鎖エステル基を塩基と反応させてカルボン酸塩を生成させ、次いでカルボン酸塩を酸を用いて中和する。塩基は水酸イオンがエステルのアルコールを置換可能にするような強度のものでなければならない。塩基は無機塩基、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム等が好ましい。主鎖エステル基の加水分解は約−５℃〜約50℃で起こるが、好ましくは室温で行う。加水分解の溶媒は、約10〜90体積％の割合で水を含む一種または複数の溶媒と水との混合物にする。好適な有機溶媒には（限定的にでなく）、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルが含まれる。カルボン酸基の塩を中和するのに用いる酸は、有機または無機酸にすることができ、好ましくはpKaが約２以下であってカルボン酸基のプロトン付加を可能にする。
本発明の１つの具体例では、グアニンＰＮＡシントンは下記式で表される化合物である：
0004089979.tif 000056
ここで、ＰｇおよびＲ2で表される基は上記に定義のとおりである。図１を参照すると、グアニンＰＮＡシントンは下記式で表される化合物である：
0004089979.tif 000057
好ましい具体例では、グアニンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000058
アデニンおよびシトシンＰＮＡシントンの合成
さらに別の具体例によれば、本発明はアデニンＰＮＡシントン（図３参照）およびシトシンＰＮＡシントン（図４参照）の合成方法にある。
ステップ１
カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分を調製するための出発物質は、酢酸エステル置換基を有する部分的に保護された核酸塩基化合物である。部分的に保護されたアデニン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000059
部分的に保護されたシトシン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000060
ここで、Ｒ1で表される原子または基は、メチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、2-（フェニルチオ）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基および下記一般式で表される置換基を有するまたは有しないベンジル基である：
0004089979.tif 000061
ここで、ａ〜ｅのそれぞれで表される原子または基は、同一でも異なっていてもよく、独立にＦ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択され、ｇ〜ｈで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素およびメチル基で構成される群から選択される。
図３を参照して、部分的に保護された好ましいアデニン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000062
図４を参照すると、部分的に保護された好ましいシトシン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000063
一般に、部分的に保護された核酸塩基化合物は、求電子カルボニル均等物およびアルコールを用いた一連の反応を行った後に極性溶媒で急冷することによって完全に保護された核酸塩基化合物に変換される。すなわち、本発明方法では、部分的に保護された核酸塩基化合物を少なくとも１モル当量のカルボニルジイミジゾールと反応させてN-置換された中間化合物を生成させる。N-置換された中間化合物の生成を促進するために加熱が必要になる場合もある。この中間化合物は環外アミノ基の位置に形成されたイソシアネート誘導体である。反応の進行を追跡するために薄層クロマトグラフィー（tlc）を使用することができる。反応は通常、部分的に保護された核酸塩基化合物を少なくとも部分的に溶解した非求核性の無水溶媒中で行われる。好適な溶媒の例としては（限定的にでなく）、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホフム、四塩化炭素、ベンゼンおよびトルエンなどが挙げられる。好ましい溶媒はジメチルホルムアミドである。
ホスゲンは求電子性のカルボニル均等物であるが、部分的に保護されたアデニン化合物を対応する完全に保護された核酸塩基化合物へと変換するには適当でないことが分かっている。アデニンの場合、ホスゲンは、グアニンに関する部分で既に述べたようにＮ７複素環窒素原子と反応するものと思われる。しかし、カボニルジイミダゾールは、部分的に保護されたアデニン化合物と部分的に保護されたシトシン化合物の環外アミノ基の位置でのみ選択的に反応するための適切な電子親和性を有することが分かっている。さらに、類似の電子親和性を有する他の求電子カルボニル均等物をこの変換に利用することができる。
N-置換された中間化合物は、容易に加水分解されて元の部分的に保護された核酸塩基化合物に戻ってしまうため、単離しない。従って、N-置換された中間化合物をその場でアルコールと反応させて完全に保護された核酸塩基化合物を生成させる。アルコールがイソシアネート化合物と反応してカーバメートを生じることは公知であるが、この化学作用がカーバメート保護された核酸塩基化合物の合成にこれまで利用されたことはない。このカーバメート生成法によって各種のアルコールを使用することが可能になり、用途の広い合成方法が提供されることは有利である。種々のアルコールを反応させることによって緩やかな条件で除去可能なカーバメート基の生成が可能になる。例えば好ましい具体例では、アルコールはベンズヒドロールであって、これはN-置換された中間体と反応して保護基ベンズヒドロキシカルボニル（Bhoc）を生成する。ベンズヒドロールは、酸に対してかなり不安定なカーバメート保護基を生成するという理由によって選択された（Seiber達、Helvetica Chemica Acta 1968. 51:641-622参照）。この保護基の不安定性はトリフルオロ酢酸中で迅速且つ効率的に除去されることによって示され、反応の半減期は１分以下である。従って、アルコールは緩やかな条件で開裂する所望のカーバメート保護基が得られるようにその化学特性および置換基を種々選択することができる。
N-置換された中間化合物と反応するのに適したアルコールには（限定的にでなく）、メタノール、エタノール、2,2,2-トリクロロエタノール、2-（トリメチルシリル）-エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノールおよびt-ブタノールなどが含まれる。アルコールはアリルアルコールまたはアリルアルコール誘導体、例えば1-イソプロピルアリルアルコール、シンナミルアルコールまたは４−ニトロシンナミルアルコールにすることもできる。さらに、アルコールは下記式で表される置換基を有するまたは有しないベンジルアルコールであってもよい：
0004089979.tif 000064
ここで、ａ〜ｅのそれぞれで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。ｇ〜ｈで表される原子または基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素およびメチル基で構成される群から選択される。
アルコールは下記式で表されるジフェニル基であるのが好ましい：
0004089979.tif 000065
ここで、Ａ1〜Ａ10のそれぞれで表される原子または基は、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシで構成される群から選択され、Ｒ4で表される原子または基は、水素、メチルおよびエチル基で構成される群から選択される。最も好ましいアルコールはＡ1〜Ａ10が水素でＲ4が水素のジフェニル基である。
アルコールはさらに下記式で表されるチオエーテル基にすることができる：
0004089979.tif 000066
ここで、Ｒ5で表される基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチルおよび下記式で表されるフェニル基で構成される群から選択される：
0004089979.tif 000067
ここで、ｉ〜ｍのそれぞれで表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、独立にＦ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。
さらに、アルコールは下記式で表されるエチル基にすることができる：
0004089979.tif 000068
ここで、Ｗで表される基は電子吸引基であり、Ｒ6〜Ｒ8のそれぞれで表される基は同一でも異なっていてもよく、独立に水素、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルおよびt-ブチルで構成される群から選択される。好ましい電子吸引基には、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、フェニル基および置換基を有するフェニル基、例えばp-ニトロフェニル基、o-ニトロフェニル基およびp-アルキルスルホニルフェニル基などが含まれる。
部分的に保護された核酸塩基から完全に保護された核酸塩基化合物への変換に必要な時間が経過した後（その間熱を加えてもよい）、極性溶媒を用いて反応物を急冷する。極性溶媒の非限定的な例には水、メタノールおよびエタノールなどがある。完全に保護されたアデニン化合物の場合、好ましい急冷用溶媒は水である。完全に保護されたシトシン化合物の場合、急冷用溶媒としてはメタノールが好ましい。
従って、完全に保護されたアデニン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000069
完全に保護されたシトシン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000070
ここで、Ｒ1で表される基は上記に定義のものであり、Ｒ2で表される基はメチル、エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-（トリメチルシリル）-エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、アリル、1-イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル基、上記した置換基を有するベンジル、および下記一般式で表される置換基を有するまたは有しないジフェニル基である：
0004089979.tif 000071
ここで、Ａ1〜Ａ10のそれぞれで表される原子または基は、独立に、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、メトキシおよびエトキシで構成される群から選択され、Ｒ4で表される原子または基は、水素、メチルおよびエチル基で構成される群から選択される。
Ｒ2で表される基はさらに下記式で表されるチオエーテル基にすることができる：
0004089979.tif 000072
ここで、Ｒ5で表される基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチルまたは下記式で表されるフェニル基である：
0004089979.tif 000073
ここで、ｉ〜ｍのそれぞれで表される原子または基は同一であっても異なっていてもよく、独立にＦ、Cl、Br、Ｉ、水素、メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ、−ＳＣＨ3および−（Ｏ）ＳＣＨ3で構成される群から選択される。
もう１つの具体例では、Ｒ2は下記式で表されるエチル基にすることができる：
0004089979.tif 000074
ここで、Ｗで表される基は電子吸引基であって、Ｒ6〜Ｒ8のそれぞれで表される基は同一でも異なっていてもよく、独立に、水素、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルおよびt-ブチルで構成される群から選択される。
完全に保護された好ましいアデニン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000075
完全に保護された好ましいシトシン化合物は下記式で表される：
0004089979.tif 000076
ステップ２
次に、完全に保護された核酸塩基化合物を、酢酸エステル基を加水分解することによってカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分へと変換する。まず初めに完全に保護された核酸塩基化合物を適当な溶媒系に溶解する。完全に保護された核酸塩基化合物を完全に溶解させるために加熱を要する場合もある。溶媒系の非限定的な例としてはエタノール／アセトニトリル、メタノール／アセトニトリル、エタノール／アセトニトリル／水、メタノール／アセトニトリル／水、エタノール／メタノール／アセトニトリル、およびエタノール／メタノール／アセトニトリル／水を挙げることができる。溶媒系に初めから水が含まれていない場合、完全に保護されたアデニン化合物が完全に溶解した時点で水を添加する。カーバメート保護されたアデニン化合物を溶解させるための好ましい溶媒系はエタノール／アセトニトリルである。溶解後、水を添加する。カーバメート保護されたシトシン化合物の場合の溶解に適した溶媒系はエタノール／メタノール／アセトニトリル／水である。
完全に保護された核酸塩基化合物を含む溶液を氷浴中で、好ましくは約10℃以下の温度まで冷却する。冷却した溶液に金属水酸化物の水溶液を添加し、温度を上昇させる。通常、金属水酸化物は第１群遷移金属の水酸化物、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化セシウムである。完全に保護されたアデニンおよびシトシン化合物の双方について好ましい金属水酸化物は水酸化リチウムである。加水分解は反応の規模に応じて比較的短時間で行われ、酸性水溶液を添加し、急冷する。例えば、約75mmolの酢酸メチルエステル基を有する完全に保護されたシトシン化合物の加水分解は約６分間で行われ、その後、反応液を急冷する。急冷段階で使用する酸は（限定的にではなく）、クエン酸、塩酸および硫酸水素カリウムなどである。好ましくは両方の核酸塩基例についてクエン酸を使用する。
加水分解溶液を酸性にした後、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分を回収する。カーバメート保護されたアデニン側鎖部分は下記式で表され：
0004089979.tif 000077
カーバメート保護されたシトシン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000078
ここで、Ｒ2で表される基は上記に定義の基である。
カーバメート保護された好ましいアデニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000079
カーバメート保護された好ましいシトシン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000080
ここで、Ｗで表される基は電子吸引基であり、Ｒ6〜Ｒ8のそれぞれで表される基は同一でも異なっていてもよく、独立に水素、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルおよびt-ブチルで構成される群から選択される。好ましい電子吸引基には（限定的にではなく）、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、フェニル基および置換基を有するフェニル基、例えばp-ニトロフェニル基、o-ニトロフェニル基およびp-アルキルスルホニルフェニル基などが含まれる。さらに好ましいカーバメート保護されたアデニンまたはシトシン側鎖部分は、Ｗがシアノ基でＲ6が水素原子、Ｒ7とＲ8がそれぞれメチル基の場合に得られる。
好ましいカーバメート保護されたアデニン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000081
好ましいカーバメート保護されたシトシン側鎖部分は下記式で表される：
0004089979.tif 000082
ステップ３
カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分をアミノ保護されたアミノ酸主鎖N-（2-アミノエチル）-グリシンとカップリングさせることによってＰＮＡシントンを合成する。
『ＰＮＡシントン』はアミノ保護されたアミノ酸主鎖N-（2-アミノエチル）-グリシン（フリーカルボン酸またはエステル）に連結されたカーバメート保護された核酸塩基部分として定義される。グアニンについては酸とエステルとを区別するが、アデニンおよびシトシンＰＮＡシントンについての酸／エステルの区別は説明を簡潔にするために省略する。
カップリングは多くの方法で行うことができる。カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分のカルボン酸官能基を活性化された形、例えばエステル、酸塩化物または混合無水物等に変換することもある。この変換を促進するために用いられるカップリング試薬の非限定的な例としては、カルボジイミド試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、ホスホニウム塩、例えばベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）およびウラニウム塩、例えばＨＢＴＵおよびＨＡＴＵなどがある。活性化に続いて、側鎖部分をアミノ保護された主鎖と反応させてＰＮＡシントンを生成する。
一般に、混合無水物法は、より高価なカップリング剤を使用する方法に比べて経済的に有利であり、好ましい方法である。混合無水物の生成に用いられる立体障害を有する酸塩化物の例としてはイソブチルクロライド、トリメチルアセチルクロライド（ピバロイルクロライド）およびアダマンタンカルボキシクロライドなどがある。カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分をアミノ保護された主鎖にカップリングさせるための最も好ましい混合無水物はトリメチルアセチルクロライド（ピバロイルクロライド）である。
一般に、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分の混合無水物は、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分を非求核性塩基で処理した後に酸塩化物と反応させることによって得られる。一連の反応の中のこの段階で有効な非求核性塩基には（限定的にではなく）、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリンおよびN-エチルモルホリンなどがある。好ましい非求核性塩基はN-メチルモルホリンである。特に酸塩化物は非求核性塩基の存在下で冷却されたカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分の溶液に添加する。室温以下の温度、好ましくは約０℃で混合無水物の生成に必要な時間攪拌した後、冷却した溶液に、非求核性塩基の存在下でアミノ保護された主鎖の水溶液を添加する。非求核性塩基の例は、上記に記載のものである。アミノ保護された主鎖溶液に適した好ましい非求核性塩基はトリエチルアミンである。
アミノ保護されたアミノ酸主鎖N-（2-アミノエチル）-グリシンは下記式で表される：
0004089979.tif 000083
ここで、Ｐｇで表される基は、アルキルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、メチル-1-（4-ビフェニル）-エチルオキシカルボニル基、1-メチル-1-フェニル-エチルオキシカルボニル基、トリフェニルメチル基、4-メトキシ-トリフェニルメチルおよび4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル基などの保護基である。Ｒ3で表される原子または基は、水素またはメチルおよびエチル基などアルキル基である。好ましい主鎖保護基Ｐｇは9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）であり、好ましいＲ3置換基は水素である。従って、アミノ保護された好ましい主鎖は下記式で表される：
0004089979.tif 000084
Fmoc保護基はペプチド合成で広く用いられ、塩基に対して不安定な保護基であることはよく知られている。本発明方法では、核酸塩基の環外アミノ基が酸に対して不安定なカーバメートとして保護されることから、好ましいFmocによってアミノ保護された主鎖を核酸塩基側鎖部分にカップリングさせるとによってオルソゴナルに保護されたＰＮＡシントンが得られる。オルソゴナルは、個々の種類の保護基がそれ以外の種類の保護基に対して相互に排他的な条件で除去される保護システムとして定義される。個々の種類の保護基を除去するための方法としては、以下に限定されるものではないが、酸加水分解、塩基加水分解、光開裂および水素添加などがある。すなわち、アミノ酸主鎖保護基を適切に選択することによってオルソゴナルに保護されたＰＮＡシントンを合成することができる。
アミノ保護された主鎖を冷却された混合無水物溶液に添加した後、カップリングつまりＰＮＡシントンの形成に必要な時間だけ反応させる。アデニンＰＮＡシントンは下記式で表され：
0004089979.tif 000085
シトシンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000086
ここで、ＰｇおよびＲ2で表される基は上記に定義のものである。保護基（Ｐｇ）は9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基でＲ2基がジフェニル基（Ａ1〜Ａ10がそれぞれ水素原子でＲ4が水素原子）であるのが好ましい。好ましいアデニンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000087
好ましいシトシンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000088
別の方法として、ＰＮＡシントンをＲ3としてアルキル基を有するアミノ保護された主鎖から合成することもできる。Ｒ3をアルキル基とした場合、アミノ保護された主鎖はアミノ保護された主鎖エステルである。アミノ保護された主鎖エステルをカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分とカップリングさせる場合、ＰＮＡまたは核酸ポリマー合成に適したＰＮＡシントンを合成するには、続いて主鎖エステル基を加水分解する必要がある。一般に、上記のプロセスに従ってカーバメート保護された核酸塩基部分を非求核性塩基の存在下で立体障害を有する酸塩化物と反応させてカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分の混合無水物を作る。N-（2-アミノエチル）-グリシンのアミノ保護された主鎖エステルの塩を、冷却された混合無水物の溶液に添加し、カップリングを行うのに必要な時間攪拌しながら室温に戻す。この変換において有効なN-（2-アミノエチル）-グリシンのアミノ保護された主鎖エステル塩の例としては（限定的にではなく）、塩酸塩およびトリフルオロ酢酸塩を挙げることができる。好ましい塩はトリフルオロ酢酸塩である。カンプリング反応終了後、固体ＰＮＡシントンが沈澱してこれを回収するか、反応混合物を氷温の水に注いでＰＮＡシントンを沈澱させて回収する。アデニンＰＮＡシントンは下記式で表され：
0004089979.tif 000089
シトシンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000090
ここで、ＰｇおよびＲ2で表される基は上記に定義のものと同じであり、Ｒ3で表される基はメチル、エチルおよびアリル基である。Ｒ3がメチル基、Ｐｇが9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、さらにＲ2がジフェニル基（Ａ1〜Ａ10がそれぞれ水素を表しＲ4も水素である）であるのが好ましい。好ましいアデニンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000091
好ましいシトシンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000092
主鎖カルボン酸がエステルとして保護されたＰＮＡシントンの合成に続いて、オリゴマーを合成するためにエステル基を加水分解しなければならない。一般に主鎖カルボン酸保護されたＰＮＡシントンを冷却した水性溶媒系に懸濁し金属水酸化物の水溶液を添加する。水性溶媒系での溶媒の非限定的な例としては水、アセトンおよびアセトニトリルを各種の組み合わせで使用することが挙げられる。加水分解で有効な金属水酸化物には（限定的にではなく）、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化セシウムなどが含まれる。好ましい金属水酸化物は水酸化リチウムである。
加水分解反応終了後、反応物を急冷してＰＮＡシントンを単離精製する。主鎖アミノ保護基が塩基に対して不安定であって、塩基性条件で除去される可能性がある場合には、ＰＮＡシントンを単離する前に主鎖アミノ保護基の活性化された状態のものを添加して万一除去されている任意のアミノ主鎖基を再び保護する。例えば、アミノ主鎖保護基が塩基に対して不安定な保護基の9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基である場合、加水分解後に、単離を行う前に9-フルオレニルメチルオキシカルボニルスクシンイミドを添加することによって、所望のＰＮＡシントンの全体収率が増加する。単離されたアデニンＰＮＡシントンは下記式で表され：
0004089979.tif 000093
シトシンＰＮＡシントンは下記式で表される：
0004089979.tif 000094
ここで、ＰｇおよびＲ2で表される基は上記に定義のものと同一である。保護基（Ｐｇ）は9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基でＲ2基がジフェニル基（Ａ1〜Ａ10がそれぞれ水素を表し、Ｒ4も水素である）であるのが好ましい。好ましいアデニンＰＮＡシントンは化合物XIVで、好ましいシトシンＰＮＡシントンは化合物XIXである。
カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分をアミノ保護され主鎖にカップリングさせる他の方法は、上記のようなアミノ保護された主鎖のエステル化でなく、アミノ保護された主鎖のカルボン酸官能基に一時的な保護を施す方法である。一般には上記プロセスに続いて、カーバメート保護された核酸塩基側鎖部分を非求核性塩基の存在下で立体障害を有する酸塩化物と反応させることによってカーバメート保護された核酸塩基側鎖部分の混合無水物を形成させる。混合無水物生成後、非求核性塩基と立体障害を有するシリルクロライドとの存在下に、アミノ保護された主鎖の溶液を冷却された混合無水物溶液に添加する。カップリングに必要な時間反応物を攪拌した後、反応物を急冷し、乾燥してシリル除去基（例えばフッ化物）を用いて処理する。シリル保護基を除去した後、所望のＰＮＡシントンを単離する。アデニンＰＮＡシントンは下記式で表され：
0004089979.tif 000095
シトシンＰＮＡシントンが下記式で表される：
0004089979.tif 000096
ここで、ＰｇおよびＲ2で表される基は上記に定義のものと同一である。保護基（Ｐｇ）は9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基で、Ｒ2基がジフェニル基（Ａ1〜Ａ10がそれぞれ水素を表しＲ4も水素である）であるのが好ましい。好ましいアデニンＰＮＡシントンは化合物XIVで、好ましいシトシンＰＮＡシントンは化合物XIXである。
ＰＮＡ合成
ＰＮＡシントンはフリーのカルボン酸として互いにカップリングし、ＰＮＡオリゴマー（ＰＮＡ）を構成することができる。さらに、ＰＮＡシントンはその他のペプチドモノマー、ヌクレオチドのような核酸モノマーとカップリングして各種の『バイオ』オリゴマーまたはポリマーを形成することができる。オリゴマーの非限定的な例としてはＰＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの各種組み合わせなどがある。例えば『ＰＮＡ−ＤＮＡキメラと、このキメラ合成用のＰＮＡシントン』と題する関連特許出願（代理人整理番号SYP-105；米国特許出願第08/480,228号；1995年６月７日出願）には、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラが開示されている（この特許の内容は全て参考として本明細書に含まれる）。このＰＮＡシントンの化学作用は市販の合成装置に適合するのでこのＰＮＡシントンは容易に各種の長さおよび配列を有するポリマー鎖へ変換することができる。
これまで化学文献に報告されているペプチド合成に関する各種の方法が一般にＰＮＡオリゴマー合成に適用可能である。これらの方法には（限定的にでなく）、固相ペプチド合成および溶液合成が含まれる。例えば固相合成では、第１アミノ酸のカップリングに続く次のステップで所望のＰＮＡ鎖の計画的合成を行う。この合成には保護解除／カップリングサイクルの繰り返しが含まれる。最後に連結されたアミノ酸の一時的な主鎖保護基、例えばFmocは、適当な処理、例えばピペリジンを用いた塩基処理などによって定量的に除去され、N-末端アミノ基がフリーになる。
続いて、必要な次のN-保護アミノ酸を、最後に連結されたアミノ酸のN-末端に連結する。このアミノ酸Ｃ末端と最後に連結されたアミノ酸のN-末端との連結は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、縮合試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（Sheehan & Hess達、J. Am. Chem. Soc., 1955,77,1067）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（Sraantakis達、Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, 73,336）またはそれらの誘導体を用いて、新たに連結されるアミノ酸のカルボキシル基を直接最後に連結されたアミノ酸のN-末端と反応させるか、新たに連結されるアミノ酸を下記数種類の方法のいずれか任意の方法で活性化したカルボキシル基を含む状態で作ることによって結合させることができる：数種類の方法とは、活性エステル誘導体、例えば2,4,5-トリクロロフェニルエステル（Pless達、Helv Chem. Acta, 1963, 46, 1609）、フタリミドエステル（Nafkens達、Am. Chem. Soc., 1961, 83, 1263）、ペンタクロロフェニルエステル（Kuproyszewski, Rocz.Chem., 1961,35,595）、ペンタフルオロフェニルエステル（Kovacs達、Am. Chem. Soc., 1963,85 183）、o-ニトロフェニルエステル（Bodanzsky, Nature, 1955, 175,685）、イミダゾールエステル（Li達、J. Am Chem. Soc., 1970, 92,7608）および3-ヒドロキシ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン（Dhbt-OH）エステル（Konig達、Chem. Ber., 1973, 103, 2024と2034）を初めに生成する方法と、対称無水物（Wieland達、Angew. Chem.Int.Ed.Engl., 1971, 10, 336）等の無水物を最初に生成する方法である。第２級アミノ基を含むＰＮＡ分子を組み立てる場合には、ベンゾトリアゾリルN-オキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）『カストロの試薬』（例えば、Rivaille達、Tetrahedron 1980, 36, 3414参照）が推奨される。カルボン酸基を活性化するための好ましい試薬には、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）およびそのホスホニウム塩およびウロニウム塩が含まれる（Carpino., L.J.Am.Chem.Soc., （1993）115, 4397参照）。最後に、最近報告されたアミノ酸フッ化物に類似の活性化されたＰＮＡモノマー（Carpino, J. Am. Chem. Soc., 1990,112,9651）はＰＮＡ合成を含めて多いに有望である。
保護基を含む所望のＲＮＡ鎖の合成後に続くステップは、通常、ＰＮＡ鎖のアミノ酸部分の保護解除と、合成したＰＮＡの固体担体からの開裂である。これらのプロセスはほぼ同時に行われてフリーなＰＮＡ分子が所望の形状で得られる。あるいは、別々に合成した２つのＰＮＡ鎖の縮合を行う場合には、合成開始時に、所望のＰＮＡ鎖を対応する固体担体から開裂させるための適切なスペーサー基を選択し（いずれのペプチド鎖も側鎖保護基を組み込まれた状態のままである）、最後に、例えば側鎖が保護された２つのペプチド鎖をカップリングさせて長鎖のＰＮＡ鎖を合成した後に側鎖の保護基を除去する。
以上本発明を一般的に説明したが、以下では実施例を挙げてさらに具体的な説明を行う。これら実施例は特に記載のない限り本発明を限定するものではない。
実施例
実施例１
2-［6'-クロロ（9'-プリニル）］酢酸ベンジル（I）の合成
6-クロロ-2-アミノプリン（300ｇ, 1.77mol；Pharma-Waldorf GmbH, Germany, P/N471720）および炭酸カリウム（366ｇ；2.65mol, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI（以下、Aldrich）, P/N34, 782-5）にジメチルホルムアミド（DMF,3ｌ）を添加し、2-アミノ-6-クロロプリンが溶解するまで溶液を温めた（84℃）。その後、混合物を氷浴中で冷却し、2-ブロモ酢酸ベンジル（299ml,1.89モル；Aldrich P1/N24,563-1）を１時間半かけて滴下した。混合物を０℃でさらに３時間攪拌した後、室温で一夜攪拌した。翌日反応混合物を濾過し、濾液を７ｌの水と150mlの濃塩酸（ＨCl）とを含む溶液に注いだ。混合物を２時間攪拌し、その後、濾過を行って生成物を単離した。生成物を水で十分に洗浄し、固体を沸騰中のアセトニトリル（３ｌ）中に除々に添加して再結晶させた。濃い赤色の溶液を一夜放置し、翌日濾過を行った。生成物をメタノール、続いてジエチルエーテルを用いて十分に洗浄した。収量386ｇ（69％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝8.14（1H,s）, 7.4-7.3（5H,m）, 7.02（2H,s）, 5.21（2H,s）5.08（2H,s）
実施例２
（N-［ベンジロキシカルボニル］）−アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIa）の合成
2-［6'-クロロ（9'-プリニル）］酢酸ベンジル（Ｉ）（292ｇ;0.920モル）と、トリホスゲン（98.8ｇ；0.33モル；Aldrich P/N33,075-2）とをアルゴン雰囲気下で、オーブンを用いて乾燥させた５ｌ容の３つ首反応フラスコに入れ、氷浴中で氷温の無水ＴＨＦ（３ｌ）を添加した。混合物を15分間攪拌し、35分かけてジイソプロピルエチルアミン（348ml; 2.0mol; lanchaster Synthesis, Windham, NH.（以下lanchaster）P/N4310）を滴下した。さらに20分間攪拌後、直ちにベンジルアルコール（153ml；1.5mol;Aldrich P/N 10,800-6）を添加した。混合物を室温に温めながら一夜攪拌した。その後、反応混合物を、6.5ｌの水と80mlの濃塩酸とを含む溶液に注いだ。混合物を室温で２時間攪拌し、減圧濾過で生成物を回収した。固体を水で十分に洗浄し、変性エタノール（２ｌ）を用いて再結晶させ、減圧濾過で生成物を回収し、低温のエタノールで２回洗浄した。収量293g（70％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝10.86（1H,s）,8.52（1H,s）7.5-7.3（10H,m）, 5.22-5.20（6H,m）
実施例３
2-（N-［ベンジルオキシカルボニル］）-N9（カルボキシメチル）-グアニン（IIIa）の合成
アルゴン雰囲気下においた５ｌ容の乾燥丸底フラスコに1100mlの乾燥ＴＨＦを入れ、これに水素化ナトリウム（18.0g; 0.75mol; Ardrich P/N 22,344-1）を添加した。反応フラスコをドライアイス・アセトン浴に15〜20分浸漬した。この溶液に、51.2ml（0.75モル）の3-ヒドロキシプロピオニトリル（Aldrich Chemical P/N 10,992-4）を15〜20分かけて滴下した。添加終了後、ドライアイス・アセトン浴を取外し、反応物を氷浴中で温めながら２時間攪拌した。その後、2-（N-［ベンジルオキシカルボニル］アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（II）（67.9ｇ0.15モル）を乾燥固体の状態で10〜15分かけて徐々に添加した。氷浴を取外し、さらに２時間攪拌を継続した。減圧蒸留を行って全体量を約500mlにした。得られた混合物を４ｌの水と70mlの濃塩酸とを含む溶液に注いだ。混合物を一夜攪拌し、翌日濾過を行った。固体を水で十分に洗浄した後酢酸エチルを用いて３回洗浄した。白色固体。収量48.5ｇ（94％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.55（1H,s）,11.38（1H,s）7.95（1H,s）, 7.5-7.3（5H,m）, 5.26（2H,s）, 4.89（2H,s）
実施例４
2-（N-［4-（t-ブチル）-ベンジルオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9（ベンジルカルボキシメチルプリン（IIb）の合成
2-［6'-クロロ（9'-プリニル）］酢酸ベンジル（Ｉ）（9.05ｇ；30mmol）と、トリホスゲン（2.97ｇ；10mmol；Aldrich P/N33,075-2）とをアルゴン雰囲気下で、オーブンを用いて乾燥させた500ml容の３つ首反応フラスコに入れ、氷浴中で氷温の無水ＴＨＦ（100ml）を添加した。混合物を15分間攪拌し、５分かけてジイソプロピルエチルアミン（10.5ml;60mmol;lanchaster P/N4310）を滴下した。さらに30分間攪拌した後、直ちに4-tert-ブチルベンジルアルコール（8ml；45mol;Aldrich P/N18,426-8）を添加した。混合物を室温に温めながら一夜攪拌した。その後反応混合物を1.0ｌの水と13mlの濃塩酸とを含む溶液に注いだ。混合物を室温で30分間攪拌し、250mlの酢酸エチルを添加して生成物を分離させた。分液し、５％の重炭酸ナトリウム水溶液125mlを用いて有機層を洗浄した。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過後、エバポレーションに供した。残留物を、50mlのトルエン中で結晶化させた。減圧濾過を行って生成物を回収した。収量6.88ｇ（45％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤCl3）δ＝8.04（1H,s）,7.83（1H,s）7.83（1H,s）, 7.42-7.29（9H,m）, 5.21（4H,s）, 5.Ol（2H,s）,1.31（9H,s）
実施例５
2-（N-［4-（t-ブチル）−ベンジルオキシカルボニル］）-N9-（カルボキシメチルグアニン（IIIb）の合成
アルゴン雰囲気下の250ml容の乾燥丸底フラスコに90mlの乾燥ＴＨＦを入れ、これに水素化ナトリウム（1.5g; 60mmol; Ardrich P/N 22,344-1）を添加した。反応フラスコをドライアイス・アセトン浴に10分間浸漬した。この溶液に4.1ml（60mmol）の3-ヒドロキシプロピオニトリル（Aldrich Chemical P/N 10,992-4）を５〜10分かけて滴下した。添加終了後、ドライアイス・アセトン浴を取外し、反応物を氷浴中で温めながら２時間攪拌した。その後、2-（N-［t-（ブチル）ベンジルオキシカルボニル］アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIb）（6.1g; 12mmol）を乾燥固体の状態で２〜３分かけて徐々に添加した。氷浴を取外し、さらに１時間攪拌を継続した。200mlの水を添加し、続いて９mlの６Ｎ塩酸を添加した。溶液を氷浴中で30分間冷却した後、減圧濾過を行って固体を回収した。固体を50mlのアセトニトリル中で１時間沸騰させ、その後溶液を室温に冷却した。減圧濾過を行って生成物を回収した。収量4.13ｇ（86％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.51（1H,s）,11.38（1H,s）7.94（1H,s）, 7.44-7.33（4H,dd）, 5.22（2H,s）, 4.88（2H,s）1.28（9H,s）
実施例６
2-（N-［4-（イソプロピル）-ベンジルオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIc）の合成
2-［6'-クロロ（9'-プリニル）］酢酸ベンジル（Ｉ）（9.05ｇ；30mmol）と、トリホスゲン（2.97ｇ；10mmol；Aldrich P/N33,075-2）とをアルゴン雰囲気下で、オーブンを用いて乾燥させた500ml容の３つ首反応フラスコに入れ、氷浴中で氷温の無水ＴＨＦ（100ml）を添加した。混合物を15分間攪拌し、５〜10分かけてジイソプロピルエチルアミン（10.5ml；60mmol；lanchaster P/N4310）を滴下した。さらに30分間攪拌後、直ちに4-tert-イソプロピルベンジルアルコール（6.9ml；45mmol;Aldrich P/N 19,603-7）を添加した。混合物を室温に温めながら一夜攪拌した。その後、反応混合物を、1.0ｌの水と13mlの濃塩酸とを含む溶液に注いだ。混合物を室温で30分間攪拌し、250mlの酢酸エチルを添加して生成物を分離させた。分液し、５％の重炭酸ナトリウム水溶液125mlを用いて有機層を洗浄した。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過後、エバポレーションに供した。残留物を、25mlのトルエン中で結晶化させた。減圧濾過を行って生成物を回収した。収量7.50ｇ（51％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤCl3）δ＝8.04（1H,s）,7.74（1H,s）7.35-7.20（9H,m）, 5.22（4H,m）,5.02（2H,s）, 2.96-2.84（1H, septet）, 1.25（6H, d）
実施例７
2-（N-［4-（イソプロピル）-ベンジルオキシカルボニル］）-N9-（カルボキシメチル）-グアニン（IIIc）の合成
アルゴン雰囲気下の250ml容の乾燥丸底フラスコに90mlの乾燥ＴＨＦを入れ、これに水素化ナトリウム（1.5g; 60mmol; Ardrich P/N 22,344-1）を添加した。反応フラスコをドライアイス・アセトン浴に10分間浸漬した。この溶液に4.1ml（60mmol）の3-ヒドロキシプロピオニトリル（Aldrich Chemical P/N 10,992-4）を１〜２分かけて滴下した。添加終了後、ドライアイス・アセトン浴を取外し、反応物を氷浴中で温めながら２時間攪拌した。その後、2-（N-［4-（イソプロピル）ベンジルオキシカルボニル］アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIc）（6.1g;12mmol）を乾燥固体の状態で２〜３分かけて徐々に添加した。氷浴を取外し、さらに１時間攪拌を継続した。300mlの水を添加し、続いて11mlの６Ｎ塩酸を添加した。溶液を氷浴中で30分間冷却し、その後減圧濾過を行って固体を回収した。固体を50mlのアセトニトリル中で１時間沸騰させた後、溶液を室温に冷却した。減圧濾過を行って生成物を回収した。収量4.84ｇ（84％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.51（1H,s）,11.38（1H,s）8.18（1H,s）, 7.38-7.24（4H,dd）, 5.21（2H,s）, 4.87（2H,s）2.95-2.80（1H,septet）, 1.2（6H,d）
実施例８
2-（N-［4-（メトキシ）-ベンジルオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIc）の合成
2-［6'-クロロ（9'-プリニル）］酢酸ベンジル（Ｉ）（20g；63mmol）とトリホスゲン（7.46ｇ；25mmol；Aldrich P/N33,075-2）とをアルゴン雰囲気下で、オーブンを用いて乾燥させた１ｌ容の３つ首反応フラスコに入れ、氷浴中で氷温の無水ＴＨＦ（189ml）を添加した。混合物を20分間攪拌し、５〜10分かけてジイソプロピルエチルアミン（24.1ml;140mmol;lanchasterP/N4310）を滴下した。さらに30分間攪拌後、直ちに4-メトキシベンジルアルコール（9.9ml；79mmol;Aldrich P/N 13,690-5）を添加した。混合物を室温に温めながら一夜攪拌した。その後、反応混合物を200mlの水と4.7mlの濃塩酸とを含む溶液に注いだ。混合物を室温で２時間攪拌し、減圧濾過を行って生成物を回収した。水を用いて生成物を十分に洗浄し、アセトニトリル（500ml）から再結晶化させた。減圧濾過で生成物を回収し、低温のアセトニトリルを用いて２回洗浄した。収量16.2ｇ（55％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤCl3）δ＝10.76（1H,s）,8.5（1H,s）7.4-6.8（9H,m）, 5.2-5.1（6H,m）, 3.75（3H,s）
実施例９
2-（N-［4-（メトキシ）-ベンジルオキシカルボニル］）-N9-（カルボキシメチル）-グアニン（IIId）の合成
アルゴン雰囲気下の１ｌ容の乾燥丸底フラスコに200mlの乾燥ＴＨＦを入れ、これに水素化ナトリウム（3.9g; 160mmol; Ardrich P/N 22,344-1）を添加した。反応フラスコをドライアイス・アセトン浴に15〜20分間浸漬した。この溶液に10.95ml（160mmol）の3-ヒドロキシプロピオニトリル（Aldrich Chem. P/N 10,992-4）を15〜20分かけて滴下した。添加終了後、ドライアイス・アセトン浴を取外し、反応物を氷浴中で温めながら２時間攪拌した。その後、2-（N-［4-（メトキシ-ベンジルオキシカルボニル］）アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IId）（15g;32.2mmol）を乾燥固体の状態で10〜15分かけて徐々に添加した。氷浴を取外し、さらに２時間攪拌を継続した。減圧蒸留を行って全体量を約70mlとした。得られた混合物を200mlの水と21mlの濃塩酸とを含む溶液に注いだ。混合物を一夜攪拌し、翌日濾過を行った。固体を水で十分に洗浄した後、酢酸エチルを用いて３回洗浄した。収量9.9ｇ（82％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.40（1H,s）,7.95（1H,s）7.4-7.3（2H,d）, 7.0-6.9（2H,d）, 5.15（2H,s）, 4.85（2H,s）3.8（3H,s）
実施例10
N-（［2-［N-ベンジルオキシカルボニル］-グアニン-9-イル-アセチル）-N-（2-［t-ブチルオキシカルボニル］-2-アミノエチル）-グリシンエチルエステル（IV）の合成
136g（396mmol）の2-（N-［ベンジルオキシカルボニル］）-N9-（カルボキシメチル）-グアニン（III）に、1600mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加した。溶液を氷浴中で冷却しながら30分間攪拌した。トリメチルアセチルクロライド97.6ml（792mmol）（Aldrich, P/N T7,260-5）を添加し、反応物をさらに10分間攪拌した。N-メチルモルホリン（218ml;1.98モル；Fluka Chemical Ronkonkoma, NY, P/N 67870）を20〜30分かけて滴下した後、反応物をさらに30分間攪拌した。溶液を攪拌しながら117g（475mmol）のN1-（tert-ブチルオキシカルボニル）-Ｎ4-（2-アミノエチル）-グリシンエチルエステル（MilliporeCorporation, P/N GEN PNABKB）を100mlの乾燥ＤＭＦに溶解した溶液を添加した。室温に温めながら反応物を一夜攪拌した。不溶のN-メチルモルホリン塩酸塩を濾別した後、ケーキをアセトニトリルで洗浄した。濾液に2.5mlのメタノールを添加し、続いて濾液を完全に蒸発乾固させて黄褐色の固体とした。固体を３ｌの溶媒（エタノール／アセトニトリル／水1:1:1）から再結晶させた。収量は178.2ｇ（311mmol;78％）であった。第二級アミド結合を中心とした回転が制限されているために、数個のプロトンシグナルが２：１に分かれたが、この場合ロトマーはＮＭＲの時間スケール上で区別することができる。従って、主要なロトマー成分に相当する数個の信号をmjで表し、それ以外のロトマー成分をmiで表す。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ＝11.44（1H,d）,11.34（1H,s）7.80（1H,m）, 7.5-7.3（5H,m）, 6.98（1H;mj,t）, 6.73（1H;mi,m）, 5.26（2H,s）, 5.09（2H;mj,s）, 4.92（2H;mi,s）4.41（2H;mi,s）, 4.06（2H;mj,s）, 4,25-4.15（2H;mi,q）, 4.13-4.03（2H;mj,q）, 3.60-2.95（4H,mm）, 1.35（9H,s）, 1.3-1.1（3H,dt）
実施例11
N-（［2-［N-ベンジルオキシカルボニル］-グアニン-9-イル-アセチル］-N-（2-［t-ブチルオキシカルボニル］-2-アミノエチル）-グリシン（Ｖ）の合成
183.3ｇ（320mmol）のN-（［2-［N-ベンジルオキシカルボニル］-グアニン-9-イル-アセチル）-N-（2-［t-ブチルオキシカルボニル）-2-アミノエチル）-グリシンエチルエステル（IV）に、960mlのエタノール（変性エタノール：VWR Scientific, P/N VWO470）と960mlのアセトニトリルおよび480mlの水を添加した。固体が溶解するまで溶液を加熱還流させた。溶液を室温に冷却し、続いて氷／塩浴で５℃以下まで冷却した。懸濁液を激しく攪拌しながら、低温（＜５℃）の２Ｎ水酸化リチウム溶液1.6ｌ（134.3ｇのLiＯＨ、VWR Scientific、P/N JTP406を水で、1.6ｌに稀釈したもの）を素早く添加した。正確に５分間攪拌後、低温（＜５℃）の２Ｎ塩酸1.54ｌを添加して反応物を急冷した（添加後の反応物のpHは4.5、温度は約16℃であった）。粗いフリットガラスシンターを用いて溶液を濾過し、不溶物を全て取り除き、＜10℃に冷却した。続いてこの溶液を激しく攪拌しながら160mlの２Ｎ塩酸水溶液を30分かけて滴下した（試験紙によるpH＝２〜３）。さらに11mlの３Ｎ塩酸水溶液を滴下してpHを１〜２（試験紙）に調整した。その後、溶液を氷浴中で３時間以上攪拌し、減圧濾過を行って生成物を回収した。固体を水で簡単に洗浄した。収量＝173.6ｇ（319mmol：99％）
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.5（1H,d）,11.38（1H,s）7.88（1H,m）, 7.5-7.3（5H,m）, 7.01（1H;mj,t）, 6.76（1H;mi,m）, 5.26（2H,s）, 5.09（2H;mj,s）, 4.92（2H;mi,s）4.32（2H;mi,s）, 3.99（2H;mj,s）, 3.5-2.9（4H,mm）, 1.35（9H,s）
実施例12
2-（N-［ベンズヒドロールオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボギシメチル）-プリン（IIe）の合成
62mmolの2-アミノ-6-クロロ-N9-ベンジルカルボキシメチル-プリンに新規に蒸留した氷温のテトラヒドロフラン約190mlを添加した。氷浴中で溶液を攪拌しながら、22.4mmolのトリホスゲンを添加した。反応物を０℃で１時間攪拌し、その後、136mmolのジイソプロピルエチルアミンを滴下した。０℃で30分間攪拌後、74.4mmolのベンズヒドロールアルコールを添加した。反応物を室温に温めながら一夜攪拌した。翌朝エタノールを添加し、反応物を濃縮乾固させた。残留物をジクロロメタンと10％クエン酸水溶液とで液／液分配した。分離後、５％の重炭酸ナトリウム溶液を用いて１回洗浄した。ジクロロメタン層を乾燥させ、濾過後、エバポレーションに供した。生成物をメタノールから再結晶化させた。収率54％
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.0（1H,s）, 8.5（1H,s）,7.6-7.2（15Hm,m）, 6.8（1H,s）, 5.15（4H,m）
実施例13
2-（N-［ベンズヒドロールオキシカルボニル］）-N9-（カルボキシメチル）-グアニン（IIIe）の合成
365mmolの95％水素化ナトリウムに、新規に蒸留したテトラヒドロフラン約450mlを添加した。氷／アセトン浴中で溶液を20分間冷却し（−78℃）、その後、365mmolの3-ヒドロキシプロピオニトリルを添加した。反応物を０℃で2.5時間攪拌し、73mmolの2-（N-［ベンズヒドロールオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIe）を添加した。反応物を室温に温めながら一夜攪拌した。翌朝、約300mlの溶媒を留去し、残留物を800mlの水を含む溶液に注いで、その後、20％のクエン酸水溶液を加えてpHを約３〜４にした。減圧濾過を行って生成物を回収し、メタノール中で再結晶させた。収率62％。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.7（1H,s）, 11.2（1H,s）8.95（1H,s）, 7.6-7.2（10H,m）, 6.85（1H,s）, 5.9（4H,s）
実施例14
2-（N-［2-（メチルチオ）-エチルオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIf）の合成  50mmolの2-アミノ-6-クロロ-N9-ベンジルカルボキシメチル-プリンに新規に蒸留した氷温のテトラヒドロフラン約200mlを添加した。氷浴中で20分間反応物を冷却し、その後20mmolのトリホスゲンを添加した。反応物を０℃で30分間攪拌した後130mmolのジイソプロピルエチルアミンを滴下した。０℃で20分間攪拌後、70mmolの2-（メチルチオ）-エタノールを添加した。反応物を室温に温めながら一夜攪拌した。翌朝反応物を約半分の量に濃縮し、500mlの水と30mmolの塩酸とを含む溶液に攪拌しながら注いだ。混合物を30分間攪拌し、減圧濾過を行って生成物を回収した。生成物をメタノールから再結晶させた。収率74％
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝10.8（1H,s）, 8.5（1H,s）,7.35（5H,m）, 5.22（4H,m）, 4.25（2H,t）, 2.75（2H,t）, 2.15（3H,s）
実施例15
2-（N-［2-（メチルチオ）-エチルオキシカルボニル）］-N9-（カルボキシメチル）-グアニン（IIIf）の合成
75mmol 95％水素化ナトリウムに、新規に蒸留したテトラヒドロフラン約100mlを添加した。氷浴中で溶液を20分間冷却した後、75mmolの3-ヒドロキシプロピオニトリルを添加した。反応物を０℃で２時間攪拌し、15mmolの2-（N-［2-（メチルチオ）-エチルオキシカルボニル］）-アミノ-6-クロロ-N9-（ベンジルカルボキシメチル）-プリン（IIf）を添加した。反応物を室温に温めながら一夜攪拌した。翌朝、溶媒を完全に留去し、200mlの水と54ｇの塩化ナトリウムと８ｇのＫ2 Ｓ2 Ｏ7とを含む溶液を添加した。溶液を15分間激しく攪拌し、濾別して固体生成物を回収した。生成物をアセトニトリル中で沸騰させて精製した。収率：83％
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）δ＝11.52（1H,s）, 11.37（1H,s）7.93（1H,s）, 4.9（2H,s）, 4.35（2H,t）, 2.785（2H,t）, 2.15（3H,s）
実施例16
2-（1'-シトシル）酢酸エチル（XV）の合成
2.5モルのシトシンに、2.5ｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と2.75モルのカリウムtert-ブトキシドを添加した。反応物が薄い黄褐色になるまで１〜２時間約100℃に加熱した。その後、熱源を取り除き、溶液を氷浴中で10℃以下に冷却した。溶液を素早く攪拌しながら、2.8molのブロモ酢酸エチルを（30〜40分かけて）滴下した。添加後、反応物を室温に温めながら一夜攪拌した。翌朝、30mlの酢酸を加えて反応物を中和した。エバポレーションを行って溶媒を除去し、残留物を数日間高減圧下において痕跡量のＤＭＦを除去した。残留物を再び2.5ｌの水に懸濁し、３時間攪拌した。減圧濾過を行って固体生成物を回収し、数倍量の水を用いて洗浄した。収量：342.7g（70%）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝7.56（d,1H）, 7.18（s,2H）5.68（d,1H）, 4.43（s,2H）, 4.13（q, 2H）, 1.19（t,3H）
実施例17
2-［N'4-ベンズヒドロールオキシカルボニル（1'-シトシル）］酢酸エチル（XVI）の合成
1.8モルの2-（1'-シトシル）酢酸エチルに、3.5ｌのＤＭＦと2.9モルのカルボニルジイミダゾールを添加した。反応物を室温で1.5時間攪拌した。メタノールで急冷した反応物のサンプルを薄層クロマトグラフィー（tlc）分析したところ、イソシアネートの生成が良好に進行したことが示された。この反応物に432ｇのベンズヒドロールを添加し、反応物を60℃に加熱した。約６時間温度を60℃に保ち、その後さらに80ｇのベンズヒドロールを２回に分けて添加した（１時間間隔で）。反応物を室温に冷却しながら一夜攪拌した。翌日100mlのメタノールを添加し、反応物を急冷した。その後、溶媒を完全に留去した。赤色オイルの残留物を2.5ｌのエタノールから再結晶させた（372.2ｇの粗白色結晶）。母液をエバポレーションに供し、２ｌのメタノール／水（3:1）溶液から再結晶化させた（生成物222g）。２つの粗生成物を合わせて、2.5ｌのメタノールから再結晶させた。収量：565g（77％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝11.01（s,1H）, 8.02（d,1H）7.46-7.27（m,10H）, 6.98（d,1H）, 6.79（s, 1H）, 4.60（s,2H）4.13（q,2H）, 1.18（t,3H）
実施例18
2-［N'4-ベンズヒドロールオキシカルボニル（1'-シトシル）］酢酸（XVII）の合成
75mmolのエチル2-［N'4-ベンズヒドロールオキシカルボニル（1'-シトシル）］酢酸エチルに150mlのアセトニトリル、150mlのメタノールおよび75mlのエタノールを添加した。この溶液を固体が全て溶解するまで加熱し、続いて氷浴中で10℃以下まで冷却した。溶液を攪拌しながら、730mmolの水酸化リチウムを250mlの水に溶解した溶液を素早く添加した。その後、反応物を正確に６分間攪拌し、365mmolのクエン酸を350mlの水に溶解した溶液を一度に添加し、急冷した。減圧濾過を行って白色固体沈澱物を回収し、沈澱物を数倍量の水を用いて洗浄した。収量：27.25ｇ白色固体（98％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝8.00（d,1H）, 7.46-7.24（m,10H）, 6.93（d,1H）, 6.78（s, 1H）, 4.51（s,2H）
実施例19
2-（9'-アデニル）酢酸エチル（X）の合成
オーブを用いて乾燥させた389ｇのアデニンを６ｌのＤＭＦに懸濁した溶液に、40ｇの水素化ナトリウムを添加した。反応物を攪拌し、水素ガスの発生をモニタリングした。15分攪拌後さらに42ｇの水素化ナトリウムを添加した。１時間攪拌後、反応物は非常に濃厚になった。さらに1.5ｌのＤＭＦを添加し、その後、水素ガスが全て発生し終わるまでさらに３時間攪拌した。溶液を激しく攪拌しながら351mlのブロモ酢酸エチルを30分かけて滴下した。反応物は氷浴を用いて20〜30℃に維持した。室温に温めながら反応物を一夜攪拌した。その後溶媒を留去し、３ｌの水を添加した。１時間攪拌後、固体生成物を減圧濾過して回収し、数倍量の水で洗浄した。その後生成物を２ｌの沸騰エタノールに懸濁し、攪拌しながら45分間還流させた。一夜室温に放置した後、減圧濾過を行って固体を回収し、エタノールで洗浄した。収量：638ｇ（68％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝8.14（s,1H）, 8.10（s,1H）7.22（s,2H）, 5.05（s, 2H）, 4.18（q,2H）, 1.22（t,3H）
実施例20
2-［N'6-ベンズヒドロールオキシカルボニル（9'-（アデニル）］酢酸エチル（XI）の合成
1.96モルの2-（9'-アデニル）酢酸エチルと2.95モルのカルボニルジイミダゾールに、４ｌのＤＭＦを添加した。反応物を緩やかに105℃まで加熱し、その後この温度で２時間保持した（加熱中はまず初めに全てが溶解し、その後反応物の粘度が上昇し、濃厚になって、最後に再び粘度が低下した）。温度を95℃に下げた後、2.94モルのベンズヒドロールを添加した。熱を全て取り除き、反応物を一夜攪拌した。翌日、2.5倍量の水を添加し、反応物を20分間急速に攪拌して結晶を析出させた。その後溶液を１時間攪拌し、減圧濾過を行って固体生成物を回収し、数倍量の水で洗浄した。続いて回収した生成物を1.8ｌの沸騰メタノールから再結晶化させた。収量：630ｇ（75％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝10.9（s,1H）, 8.6（s,1H）8.42（s,1H）, 7.53-7.23（m,10H）, 6.81（s, 1H）, 5.1（s,2H）,4.2-4.0（q.2H）, 1.2-1.1（t,3H）
実施例21
2-［N'6-ベンズヒドロールオキシカルボニル（9'-アデニル）］酢酸（XII）の合成
300ｇの2-［N'6-ベンズヒドロロキシカルボニル（9'-アデニル）］酢酸エチルに、1.5ｌのエタノールおよび1.5ｌのアセトニトリルを添加した。この溶液を固体が全て溶解するまで加熱し、１ｌの水を添加した。続いて反応物を氷浴中で10℃以下まで冷却した。この混合物を激しく攪拌しながら、294ｇの水酸化リチウムを2.5ｌの水に溶解して成る溶液を添加した（反応温度は20℃に上昇した）。その後反応物を正確に６分間攪拌し（反応物は透明になり、この時点での温度は25℃であった）、1,346ｇのクエン酸を３ｌの水に溶解して成る溶液を一度に添加した。10分攪拌後、種結晶を添加して生成物を析出させた。その後さらに１ｌの水を添加し、氷浴中で冷却しながら反応物をさらに30分間攪拌した。その後減圧濾過を行って生成物を回収し、水で洗浄した。収量251ｇ（89.5％）。同一条件で反応を繰り返した。収量：257.6ｇ（92％）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝11.78（s,1H）, 10.90（s,1H）, 8.60（s,1H）, 8.42（s, 1H）, 7.54-7.27（m,10H）6.81（s,1H）, 5.07（s,2H）
実施例22
N-［N'-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2'-アミノエチル）グリシンの合成
微粉末状のN-（2'-アミノエチル）-グリシン（50ｇ，0.423モル）を850mlのジクロロメタンおよび50mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁した溶液を攪拌しながら、クロロトリメチルシラン（134ml,1.05モル）を添加した。混合物を40分間攪拌し、氷浴中で５℃まで冷却した。その後、混合物に微粉末状の9-フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボネート（134ｇ,0.4モル）を添加し、続いてN-メチルモルホリン（186ml, 1.68モル）を30分かけて滴下した。さらに２時間後、100mlのメタノールを添加した。さらに20分後、１ｌの酢酸エチルを添加した。20分後、懸濁液を濾過し、回収した固体を酢酸エチルで洗浄して、減圧下で部分的に乾燥させた。その後、固体を1.5ｌの水に懸濁し、１時間高速で攪拌した。残留する白色固体を濾過により回収し、水で洗浄して、１ｌのメタノールに激しく攪拌しながら懸濁した。濾過を行って生成物を回収し、メタノールで洗浄後、減圧下に乾燥させた。
収量：80.6ｇのN-［N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2-アミノエチル）］グリシン（53％）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤCl3 ｗ／一滴のＴＦＡ）: δ＝8.3（s,1H）7.9-7.2（m,8H）, 6.2-6.0（m,1H）, 4.7（s,1H）, 4.3（d,1H）4.2（m, 1H）, 3.9（m,lH）, 3.5（m,2H）, 3.3（s,1H）, 3.0（m,1H）, 2.4（s,1H）
実施例23
N-［N'-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2'-アミノエチル）グリシン塩酸塩の合成
N-［N'-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2'-アミノエチル）グリシン（12ｇ,35.29mmol）を100mlのメタノールに懸濁して成る溶液を冷却・攪拌しながら、アルゴン雰囲気下で7.72mlのチオニルクロライドを添加した。反応物を０℃で15分間攪拌した後、1.5時間還流させた。減圧下に溶媒を除去し、残留物をエタノール／メタノール（9:1）混合物に溶解した。溶液を０℃に冷却し、１時間攪拌した。析出した固体を濾過し、エーテルを用いて十分洗浄後、乾燥させた。12.4ｇ（90％）の所望の生成物を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ6）：δ＝9.5（s,2H）, 7.9-7.2（m,9H）, 4.3（d,2H）, 4.2（m,1H）, 4.0（s,2H）, 3.7（s,3H）, 3.3［s.2H］, 3.0（t,2H）
実施例24
N-［N"-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'4-ベンズヒドロールオキシカルボニル（1'-シトシル）］アセチル］グリシンまたはN-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'4-Bhoc（1'-シトシル）］アセチル］グシリン（XVIII）の合成
380.2μｌ（3.08mmol）のピバロイルクロライドに、アルゴン雰囲気下で1.1ｇ（2.94mmol）の2-（N'4-Bhoc-1-シトシル）酢酸および646.5μｌ（5.88mmol）のＮＭＭを10mlのアセトニトリルに添加した溶液を一滴ずつ添加した。得られた混合物を0℃で20分間攪拌した。分離フラスコ内で１ｇ（2.94mmol）の微粉砕したN-Fmoc-アミノエチルグリシンを10mlのアセトニトリル／水（7:3）混合物に懸濁した。懸濁液を激しく攪拌しながら透明な溶液が得られるまでトリエチルアミンを一滴ずつ添加した。２つの溶液を合わせて、得られた混合物を室温で30分間攪拌した。フラスコを氷浴中に置き、20％クエン酸を用いてpH３まで酸性化した。一夜攪拌後、標題の化合物を濾過によって分離し、水で十分に洗浄した。減圧で乾燥した後、1.84ｇ（89.3％）の白色固体を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝10.9（s,1H）, 7.9-7.7（m,3H）, 7.7（d,2H）, 7.5-7.3（m,15H）, 6.9（d,lH）, 6.8（s,1H）, 4.6（s,2H）,4.3-4.2（m,3H）, 3.7（s,2H）, 3.3［s.2H］,3.1（m,2H）
実施例25
N-［N"-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［1'-チミニル）アセチル］グリシンまたはN-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-（1'-チミニル）アセチル］グシリンの合成
190.1μｌ（1.54mmol）のピバロイルクロライドに、アルゴン雰囲気下で、攪拌しながら270mg（1.47mmol）の2-（1'-チミニル）酢酸および323μｌ（2.94mmol）のＮＭＭを５mlのアセトニトリルに添加した予め冷却した溶液を滴下した。得られた混合物を０℃で25分間攪拌した。分離フラスコ中で0.5ｇ（1.47mmol）のN-［N'-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2'-アミノエチル）］グリシンを７mlのアセトニトリル／水（4:3）混合物に懸濁し、完全に溶解するまでトリエチルアミンを滴下した。２つの溶液を合わせて、得られた混合物を室温で30分間攪拌した。フラスコを氷浴中に置き、３Ｎ塩酸を用いてpH２まで酸性化した。一夜攪拌後、所望のモノマー490mg（65％）を白色固体の状態で得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ6）：δ＝1.7（s,3H）, 3.1-3.3（m,4H）, 3.9（s,2H）, 4.1-4.6（m,5H）, 7.2-7.8（m,10H）, 11.2（s,1H）
実施例26
N-［N"-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'6-ベンズヒドロールオキシカルボニル（9'-アデニル）］アセチル］グリシンまたはN-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'6-Bhoc（9'-アデニル）］アセチル］グシリン（XII）の合成
2.32ｇ（5.75mmol）の2-［N'6-Bhoc（9'-アデニル）］酢酸を15mlのアセトニトリルに添加した溶液に、1.3mlのN-メチルモルホリンを室温で一度に添加し、得られた混合物を５分間攪拌した。混合物を０℃に冷却し、アルゴン雰囲気下でピバロイルクロライド（716μｌ、5.81mmol）を滴下した。反応混合物を20分間攪拌した。分離フラスコ内で2.00ｇ（5.88mmol）の微粉砕N-［N'-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2'-アミノエチル）］グリシンを20mlのアセトニトリル／水（1:1）混合物に懸濁した。懸濁液を激しく攪拌しながら透明な溶液が得られるまでトリエチルアミンを一滴ずつ添加した。２つの溶液を合わせて、得られた混合物を室温で15分間攪拌した。溶液を酢酸エチルで稀釈し、塩水で洗浄した。酢酸エチルを用いて４回水層を抽出（バックエキストラクション）した。有機層を合わせて塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、減圧下に蒸発乾固させた。残留物を最小量のメタノールに溶解させ、生成物を氷水中で析出させた。3.65ｇ（87.5％）の所望のモノマーを得た。粗生成物をジオキサン／エーテル混合物から再結晶化させた。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ＝3.1-3.3（m,4H）, 3.9（s,2H）4.2-4.3（m,3H）, 5.1（s,2H）, 6.8［s.1H］,7.2-8.5（m,21H）,10.9（s,1H）
実施例27
N-［N"-ブルオレニルメチルオキシカルボニル-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'2-ベンズヒドロールオキシカルボニル（9'-グアニル）］アセチル］グリシンまたはN-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'2-Bhoc（9'-グアニル）アセチル］グシリン（XIII）の合成
246.5mg（0.588mmol）の2-［N'2-Bhoc（9'-グアニル）酢酸を５mlのアセトニトリル／ＤＭＦ（3:2）混合物に懸濁し、さらに130μｌ（1.18mmol）のＮＭＭを添加した。混合物を室温で５分間攪拌した。反応物を０℃に冷却し、アルゴン雰囲気下でピバロイルクロライド（73.8μｌ、0.6mmol）を滴下した。得られた溶液を０℃で20分間攪拌した。分離フラスコ内で200mg（0.588mmol）のN-［N'-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2'-アミノエチル）］グリシンを５mlのアセトニトリル／水（3:2）混合物に懸濁した。懸濁液を激しく攪拌しながら透明な溶液が得られるまでトリエチルアミンを滴下した。２つの溶液を合わせて、室温で10分間攪拌した。20％のクエン酸を用いて混合物をpH４に酸性化した。減圧して溶媒を留去し、残留物を最小量のメタノールに溶解した。メタノール溶液を氷水に激しく攪拌しながら滴下した。320mg（73.4％）の所望のモノマーを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ：δ＝3.1-3.5（m,4H）, 3.9-5.0（m,7H）, 6.8［s.1H］, 7.2-7.9（m,21H）, 11.2（s,lH）,
実施例28
メチル  N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）-N-［2-［N'2-Bhoc（9'-グアニル）］アセチル］グリシネート（IX）
1.07ｇ（2.56mmol）の（N-2-Bhoc-9-グアニル）酢酸を10mlのアセトニトリル／ＤＭＦ（1:1）混合物に添加した溶液に844μｌ（7.68mmol）のＮＭＭを添加した。溶液を０℃に冷却し、アルゴン雰囲気下でピバロイルクロライド（331μｌ，2.68mmol）を滴下した。反応混合物を０℃で25分間攪拌し、１ｇ（2.56mmol）のメチルN-［N'-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2'-アミノエチル）］グリシネートを一度に添加した。得られた混合物を室温で一夜攪拌した。一夜攪拌後、白色固体が沈澱し、これを濾過し、アセトニトリル／水（1:2）混合物を用いて洗浄後に乾燥させた。目的とするモノマーのメチルエステル1.25ｇ（64.7％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ：δ＝3.1-3.3（m,4H）, 3.7-5.1（m,7H）, 6.8（s.1H）, 7.2-7.8（m,19H）, 11.2（s,1H）, 11.6（s,1H）
実施例29
N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'2-Bhoc（9'-グアニル）］アセチル］グリシン（VIII）
メチルN-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'2-Bhoc（9'-グアニル）］アセチル］グリシネート（1.19ｇ，1.57mmol）を10mlのアセトニトリル／水（8:2）に懸濁して成る溶液を冷却・攪拌しながら6.3mlの2.4N水酸化リチウムを一度に添加した。混合物を０℃で正確に５分間攪拌し、20％クエン酸を用いて中和した後、炭酸水素ナトリウム飽和溶液を用いてpHを８とした。115mgのFmoc-スクシンイミドを一度に添加し、反応混合物を室温で30分間攪拌した。溶液をエーテルで２回抽出後、20％クエン酸を用いて水層のpHを３とした。酢酸エチルを用いて溶液を数回抽出し、有機層を合わせて塩水で洗浄、硫酸マグネシウムを用いて乾燥後、減圧下に蒸発乾固させた。残留物をエーテルで磨砕した。所望のモノマー758mg（65％）が白色固体状態で単離された。1ＨＮＭＲは直接カップリング法で得られたサンプルと同一であった。
実施例30
メチル  N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'6-Bhoc（9'-アデニル）］アセチル］グリシネート（XIV）
２ｇ（4.96mmol）の2-［N'6-Bhoc（9'-アデニル）］酢酸を10mlのアセトニトリル／ＤＭＦ（1:1）に添加して成る溶液に、1.64ml（14.88mmol）のＮＭＭを添加した。溶液を０℃に冷却し、ピバロイルクロライド（672μｌ,5.45ml）をアルゴン雰囲気下に滴下した。反応混合物を０℃で25分間攪拌した。2.27ｇ（4.85mmol）のFmoc-アミノエチルグリシンメチルエステルＴＦＡ塩を一度に添加し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。その後，反応混合物を100mlの氷水中に徐々に添加した。白色固体が析出し、これを濾過して乾燥させた。所望のモノマーのメチルエステル3.5ｇ（96.5％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ：δ＝3.1-3.3（m,4H）, 3.6（s,3H）, 3.7-5.3（m,7H）, 6.8［s,1H］, 7.2-8.5（m.21H）, 10.8（s,1H）
実施例31
N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'6-Bhoc（9'-アデニル）］アセチル］グリシン（XIII）
メチル  N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'6-Bhoc（9'-アデニル）］アセチル］グリシネート（２ｇ、2.7mmol）を15mlのアセトン／水（10:5）に懸濁した溶液を予め冷却し、攪拌しながら、11mlの2.5 Ｎ水酸化リチウムを一度に添加した。得られた混合物を０℃で７分間攪拌し、20％のクエン酸を用いて中和後、炭酸水素ナトリウム飽和溶液を用いてpHを８とした。200mgのFmoc-スクシンイミドを一度に添加し、反応混合物を室温で1.5時間攪拌した。溶液をエーテルで３回抽出後、20％クエン酸を用いて水層のpHを３とした。酢酸エチルを用いて溶液を数回抽出し、有機層を合わせて塩水で洗浄、硫酸マグネシウムを用いて乾燥後、減圧下に蒸発乾固させた。残留物をエーテルで磨砕し、緩やかに温めた。濾過、乾燥後、標題の化合物である灰色かかった白色固体1.5ｇ（77％）を得た。1ＨＮＭＲは直接カップリング法で得られたサンプルと同一であった。
実施例32
メチル  N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'4-Bhoc（1'-シトシル）］アセチル］グリシネート（XIX）
４ｇ（10.5mmol）の2-［N'4-Bhoc（1'-シトシル）］酢酸を30mlのアセトニトリル／ＤＭＦ（1:1）混合物に添加した溶液に3.5ml（31.6mmol）のＮＭＭを添加した。溶液を０℃に冷却し、ピバロイルクロライド（1.44ml,11.6mmol）をアルゴン雰囲気下に滴下した。反応混合物を０℃で22分間攪拌した。4.44ｇ（9.48mmol）のFmoc-アミノエチルグリシンメチルエステルＴＦＡ塩を一度に添加し、得られた混合物を室温で一夜攪拌した。析出した白色結晶を濾過し、温めたアセトニトリルを用いて十分に洗浄後、乾燥させた。所望のモノマーのメチルエステル6.4ｇ（84.8％）が単離された。
1Ｈ−ＮＭＲ：δ＝3.1-3.3（m,4H）, 3.6（s,3H）, 3.7-4.8（m,7H）, 6.7［s,1H］, 6.8-7.9（m.21H）, 10.9（s,1H）
［］内の1Ｈ−ＮＭＲデータは、そのピークがその他のプロトンソースに重なっていることを示す。
実施例33
N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'4-Bhoc（1'-シトシル）］アセチル］グリシン（XVII）
メチル  N-［N"-Fmoc-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'4-Bhoc（1'-シトシル）］アセチル］グリシネート（３ｇ、4.19mmol）を45mlのアセトニトリル／アセトン／水（1:1:1）混合物に懸濁した溶液を予め冷却し、攪拌しながら、16.7mlの2.5Ｎ水酸化リチウムを一度に添加した。得られた混合物を０℃で10分間攪拌し、20％のクエン酸を用いて中和後、炭酸水素ナトリウム飽和溶液を用いてpHを８とした。300mgのFmoc-スクシンイミドを一度に添加し、反応混合物を室温で２時間攪拌した。フラスコを氷浴中に置き、20％クエン酸を用いてpHを３とした。０℃で30分間攪拌後、沈澱した白色固体を濾過し、乾燥させた。残留物をアセトニトリルに懸濁して加熱した。所望の生成物1.8ｇ（61.4％）を得た。1ＨＮＭＲは直接カップリング法で得られたサンプルと同一であった。
実施例34
2［N'4tert-ブトキシカルボニル（1'-シトシル）］酢酸エチルの合成
３ｇ（15.22mmol）の2-（1'-シトシル）酢酸エチルおよび2.96ｇ（18.25mmol）の1,1'-カルボニルジイミダゾールを50mlのＤＭＦ中で室温で２時間攪拌した。続いてtert-ブチルアルコール（7ml,73.19mmol）を一度に添加し、得られた混合物を80℃で２時間加熱した。減圧下に溶媒を留去し、残留物をアセトニトリルに懸濁して、再び溶媒を留去した。得られた褐色のオイルは100mlのアセトニトリルに溶解し、それ以上の精製を行わず直接次の段階に使用した。
実施例35
2［N'4tert-ブトキシカルボニル（1'-シトシル）］酢酸の合成
上記反応より得られた未精製エステルを、30mlの水酸化リチウム（2.5Ｎ）で加水分解した。混合物を室温で10分間攪拌したところ、エステルが完全に消失したことがＴＬＣによって示された。続いて20％クエン酸を用いて溶液を酸性化し、混合物を一夜攪拌した。溶液を濾過し、酢酸エチルを用いて濾液を抽出した。有機層を合わせて濃縮し、室温で一夜放置した。所望の生成物が１ｇ単離された。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）：δ＝7.98（d,1H）, 6.97（d,1H）, 4.47（s,2H）,1.44（s,9H）
実施例36
N-［N"-フルオレニルメチルオキシカルボニル-（2"-アミノエチル）］-N-［2-［N'4tert-ブトキシカルボニル（1'-シトシル）］アセチル］グリシンの合成
2-［N'4-tert-ブトキシカルボニル-1-シトシル）酢酸（0.5ｇ、1.85mmol）およびN-メチルモルホリン（406、3.7mmol）を７mlのアセトニトリルに添加した混合物を予め冷却し、これに233μｌ（1.88mmol）のピバロイルクロライドを滴下した。得られた混合物を０℃で20分間攪拌した。分離フラスコ内で、0.6ｇ（1.76mmol）の微粉砕したN-Fmoc-アミノエチルグリシンを10mlのアセトニトリル／水（1:1）混合物に懸濁した。懸濁液を激しく攪拌しながら透明な溶液が得られるまでトリエチルアミンを滴下した。２つの溶液を合わせ、得られた混合物を室温で20分間攪拌した。フラスコを氷浴中に置き、20％クエン酸を用いてpHを３とした。生成物を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチルを合わせて塩水で１回洗浄した。酢酸エチルを留去し、残留物をメタノールに溶解させて、再び溶媒を減圧下に留去した。最後に生成物を４mlのメタノールに取り、氷冷の水（〜100ml）に滴下した。灰色かかった白色の固体が析出し、これを濾過、乾燥させた。所望のモノマー825mg（79.3％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6ＤＭＳＯ）：δ＝10.3（bs,1H）, 7.89-7.78（m,3H）, 7.68（d,2H）, 7.43-7.27（m,4H）,6.97-6.92（dd,1H）, 4.79（bs,4/3H）, 4.60（bs,2/3H）, 4.34（m,4H）,3.98（bs.2H）, 3.39［m,4H］, 1.44（s,9H）
実施例37
Fmoc／Bhoc保護モノマーを用いたＰＮＡオリゴマーの固相合成
下記合成サイクルに従ってFmoc-Pal-Peg-PS（パーセプティブバイオシステムズP/N GEN 913383：100mg、0.17mmol／ｇ添加）でH-CAG GAG TCG CAT gly-NH2配列を手動で合成した。全ての反応および樹脂洗浄はガラスバイヤル内で行った。合成樹脂の入ったバイヤルに試薬および洗浄溶液を入れて反応させた。所定の時間経過後、減圧濾過によってフリットガラスを通して溶液を除去した。
合成サイクル
1）  ＤＭＦを用いて調製した20％ピペリジンを用いて10分間保護解除を行う。
2）  ＤＭＦを用いて３回洗浄後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて２回洗浄する。
3）  ３当量の適当なモノマー（ＤＭＦを用いて0.1Ｍに調製したもの）とカップリングさせる。３当量のO-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）および３当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加して活性化を開始させる。活性化された混合物を素早く樹脂に添加し、30分間カップリングさせる。
4）  ＤＭＦを用いて３回洗浄後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回洗浄する。
カップリングを行う度にニンヒドリン（Kaiser）反応を行って各段階をモニタリングした。最初のアデニン（pos.3）の場合のみ第２のカップリングが必要であった。最後のFmoc基はオリゴマー上に保持され、このオリゴマーを樹脂から開裂させて分析した。Bhoc保護基の除去と樹脂からの開裂はＴＦＡ／m-cresol（4:1）で90分間処理することによって同時に行われた。開裂はUltrafree装置（Millipore P/N SE3P230J3）を用いて行った。開裂終了後、遠心分離で樹脂を回収し、ＴＦＡ／m-cresolに２倍量のジエチルエーテルを添加して未精製のＰＮＡオリゴマーを単離した。ジエチルエーテルを用いて未精製のＰＮＡオリゴマーを２回洗浄した。標準的な条件の下で粗生成物をＨＰＬＣ（260nm）分析したところ、純度は83％と示された。主たる不純物はアデニンの欠失であった（3.8％）（図６参照）。マトリックスＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Matrix Assisted Laser Desorption-Time of Flight）質量分析装置で求めた生成物の質量は3571.3（amu：atomic mass unit）であった。質量の計算値は3573.1amuであり、結果は機器精度の0.1％の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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