(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量４万から１２万のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体を粒子の構成主剤として、鳥類腸管リンパ組織の取込目的物を含んで調製された微粒子であって、鳥類への経口投与により該取込目的物を腸管リンパ組織に取り込ませるために用いられる鳥類腸管リンパ組織への取込目的物搬送用の微粒子。
【請求項２】
微粒子が、取込目的物を含んだ状態で平均粒子径が１０μｍ以下に形成されたものであることを特徴とする請求項１に記載の鳥類腸管リンパ組織への取込目的物搬送用の微粒子。
【請求項３】
鳥類がニワトリであることを特徴とする請求項１又は２に記載の鳥類腸管リンパ組織への取込目的物搬送用の微粒子。
【請求項４】
鳥類の腸管リンパ組織に取り込ませる取込目的物を分子量４万から１２万のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体と混合して粒子化したものを、鳥類に経口投与することを特徴とする鳥類腸管リンパ組織への取込目的物の搬送方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、鳥類の腸管リンパ組織に取込目的物を取り込ませるのに用いられる微粒子、及びその取込目的物を搬送させる方法に関し、例えば、免疫反応を喚起させる抗原を取込目的物として、これを鳥類に経口的に投与して腸管リンパ組織に効率よく取り込ませることができる微粒子と、その搬送方法に関する。
【０００２】
【発明の背景および従来の技術】
一般に、病原体による感染症の疾病から生体を防御する目的で用いられるワクチンには弱毒生ワクチンと不活化ワクチンがあり、これらは、通常は注射によって生体に投与されている。
【０００３】
しかし、注射法に依存する方法では、接種部位での炎症やワクチンの遺残、さらに投与の簡便性に欠けるなどの問題がある他、多頭羽飼育されているニワトリなどでは注射時の労力が大きな問題となっている。
【０００４】
このような問題を解決するために、弱毒ワクチンを用いた経口投与型のものが開発されているが、これはニューカッスル病ワクチンなどの特殊なものに限定されており、またニワトリの不活化ワクチンで経口投与型のものは提案されていない。
【０００５】
この経口投与型のワクチンは、リンパ組織が豊富に存在する腸管粘膜をワクチンの標的の場として捉えるものである。すなわち、多くの病原微生物の侵入門戸である粘膜面には、その侵入を阻止するための防御機構が備わっており、その機構の一つに粘膜面で産生され抗原に特異的に作用する分泌型ＩｇＡがあり、その誘導は微生物感染を予防する手段として利用される。粘膜面での局所性の免疫系は、全身性の免疫系とは独立して存在し、通常、不活化抗原の場合、全身性の免疫を誘導するために行われる筋肉内あるいは皮内接種はこの系には効果的でない。局所免疫の誘導には、粘膜面に存在するリンパ組織を抗原で直接、刺激することが必要なためである。
【０００６】
ところで、不活化抗原を経口免疫の免疫原とし、生体の局所性の免疫系を動かすためには、通常、大量の抗原が必要とされる。これは経口投与された抗原が胃を通過する際に酸の作用を受けること、あるいは腸管管腔内に存在する酵素の作用を受けることによって抗原性が変性することが考えられるためであり、腸管に達し有効にリンパ組織の免疫系を刺激するのに必要な抗原量の確保が問題となることを意味する。
【０００７】
以上のことからすれば、経口ワクチンの投与により消化管の免疫応答を惹起させる方法では、投与された抗原を変性させずに消化管部位に到達させること、腸管管腔内に到達した抗原を免疫担当細胞が存在するリンパ組織に効率よく取り込ませること、取り込んだ抗原によりリンパ組織を刺激すること、の各段階がそれぞれ重要であることがわかる。
【０００８】
ところで、上述したような消化管免疫の誘導およびその問題を解析するための研究が哺乳類を対象としてなされており、その一つの方法として、酸および酵素による分解作用から抗原を保護できる素材を用いて微粒子（マイクロスフエアー（ＭＳ））化した搬送用担体（ビヒクル）を形成し、これにより抗原性を保持したまま腸管に抗原を到達させ、腸管管腔内からリンパ組織に取り込ませ、やがてビヒクルから放出された抗原によりリンパ組織を刺激するというメカニズムで、経口ワクチンを用いて免疫応答を惹起させることが試みられている（なお本明細書中で用いているマイクロスフェアー（ＭＳ）の用語は、固体の性状を示す粒子をいい、従ってＩＳＣＯＭやリポソームのような膜構造をもつものは含まない）。ＭＳの経口ワクチンへの応用は、それらは哺乳類についての研究に係わるものであって、動物種が異なる鳥類について抗原をマイクロスフェアー（ＭＳ）化する素材を用いてビヒクルとし、これを経口投与することに関する報告はなく、従って効率よく腸管リンパ組織に取り込まれるＭＳの素材についてもニワトリでは不明である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
鳥類について抗原をマイクロスフェアー（ＭＳ）化し、経口投与して局所免疫の誘導を行う技術が未だ提案されていない理由は、鳥類における局所性の免疫応答は、哺乳類において認められている免疫応答と比べると、組織学的構造や免疫応答のメカニズムが違っているために哺乳類で報告されている知見がそのままあてはまらないためと考えられる。
【００１０】
すなわち、哺乳類における腸管免疫の誘導組織はパイエル氏板であり、これを覆う上皮細胞間に存在するＭ細胞を介して腸管管腔内の抗原が取り込まれ、下部のリンパ組織を抗原刺激することから免疫応答が開始される。Ｍ細胞は１０μｍ以下の粒子状物質を比較的効率よく取り込むという性質があることが報告されている（Eldridge,J.H. ら；J.Controlled Rel.,11,205〜214,1990）。
【００１１】
これに対し鳥類では、例えば、腸管の主要なリンパ組織であるパイエル氏板が哺乳類と比較して未発達であるという大きな違いがあり、哺乳類で得られた知見がそのままあてはまらない。
【００１２】
具体的には、哺乳類のウサギをモデルとした研究において、乳酸とグリコール酸の重合比（Ｌ／Ｇ比）が５０：５０、平均分子量２万のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体を構成主剤としたマイクロスフェアー（ＭＳ）がパイエル氏板に取り込まれることが報告されている（Jepson,M.A.,ら：J.Drug Targeting,245〜249,1993）。また、同じ素材を用いてマウスで免疫応答が惹起されることが報告されている（Challacombe,S.J.ら： Immunology,76,164〜168,1992）。なおこのポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（以下「ＰＬＧＡ」と略記する）は、生適合性であるとともに生体内分解性の性質を持つことから薬剤の搬送坦体（ビヒクル）素材として有力視されているものの一つである。
【００１３】
しかし、鳥類において行ったポリスチレン・ラテックスＭＳを用いて行った粒子取り込みの確認試験では、哺乳類の場合と一部同様の知見、すなわち、腸管管腔内からリンパ組織への取り込まれかつその取り込み量は粒径の小さいほど良好であるという知見が得られたが、ウサギにおいてパイエル氏板への取り込みが確認されている重合比（Ｌ／Ｇ比）が５０：５０、平均分子量２万のＰＬＧＡで作製した粒子径５μｍ以下を主体とするＭＳを用いたニワトリの取り込み確認試験では、腸管のリンパ組織に殆ど取り込まれないことが知見されたのである。
【００１４】
この確認試験の結果は、鳥類に関して腸管リンパ組織の免疫応答を刺激するための経口ワクチンの提案が未だないことの理由を示しているとも言える。
【００１５】
本発明は、以上のような従来技術の実状の下で、鳥類における局所性の免疫応答を実現するために必要な微粒子の腸管リンパ組織への取り込みが可能な搬送用担体（ビヒクル）の提供を課題とするものである。
【００１６】
また本発明は、上記課題の解決を通じて鳥類におけるＭＳ化したビヒクルが取り込まれる免疫担当部位を明らかにするものでもある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決する本願請求項１の発明の特徴は、分子量４万から１２万のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を粒子の構成主剤として、鳥類腸管リンパ組織の取込目的物を含んで調製された微粒子であって、鳥類への経口投与により該取込目的物を腸管リンパ組織に取り込ませるために用いられるニワトリ等の鳥類の腸管リンパ組織への取込目的物搬送用の微粒子を提案するところにある。
【００１８】
上記微粒子は、取込目的物を含んだ状態で平均粒子径が２０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下に形成されたものであることがよい。
【００１９】
また本願請求項４の鳥類腸管リンパ組織への取込目的物の搬送方法の発明は、鳥類の腸管リンパ組織に取り込ませる取込目的物を、分子量４万から１２万のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体と混合して粒子化し、鳥類に経口投与することを特徴とする。
【００２０】
【発明の実施の形態】
上記構成にいう取込目的物（被搬送物）は、鳥類、代表的にはニワトリの疾病に対してワクチンとなる物質、具体的には、不活化ワクチン，ペプチドワクチン，ＤＮＡワクチン等の抗原を挙げることができるが、これに限定されるものではない。さらに抗原と共にアジュバントなどを当該搬送用の微粒子に含有させることができる。
【００２１】
なおここで「含む（含有）」というのは、消化器系を搬送される途中で酸等からの作用を受けて抗原等が変性しないように該抗原等の取込目的物を包接（被包）する状態とすることをいい、一般的には、上記ＰＬＧＡと抗原等とを混合することによって含有の状態とさせることができる。
【００２２】
本発明において上記構成が採用される理由は次のことによる。
【００２３】
上記したように、ポリスチレン・ラテックス（ＰＬ）のＭＳを用いた哺乳類及び鳥類の腸管リンパ組織への取り込み試験では、取り込みが行われること、および、より小さい粒径のものほど取り込み数が多いことが確認されている一方で、重合比（Ｌ／Ｇ比）が５０：５０で平均分子量２万のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）をＭＳの構成主剤として調製したＭＳは、哺乳類の場合には経口投与することで腸管リンパ組織に取り込まれるものの、鳥類においては腸管リンパ組織に取り込まれないことが上述の通り確認されている。
【００２４】
しかし、本発明者が鳥類のＭＳ化したビヒクルが取り込まれる免疫担当部位を明らかにする研究を進めた過程において、常識的には上記ポリスチレン・ラテックス（ＰＬ）の取り込みで知見されている事実とは相反する実に驚くべき事実を知見した。
【００２５】
すなわち、分子量が４万〜１２万のＰＬＧＡを用いて作製した本発明のマイクロスフェアー（ＭＳ）は、粒子径が５μｍ以上のものが多く含まれているため、粒子径が５μｍ以下を主体とした分子量２万のＰＬＧＡで作製したＭＳでさえ取り込まれず、またポリスチレン・ラテックス（ＰＬ）でみられる小さなＭＳの取り込み性がよりよいという知見からして、全く取り込まれないと予想されたにもかかわらず、驚くべきことに、分子量２万のＰＬＧＡを構成主剤とした小さな粒径主体のＭＳでは認められない優れた取り込み性を示すことが知見されたのである。
【００２６】
このような予想に反した特定分子量のＰＬＧＡ主剤のＭＳの取り込みが現れる理由は、免疫応答部位である腸管リンパ組織が哺乳類と鳥類という動物種により異なることや、Ｍ細胞を含めたパイエル氏板の組織構造学的な違い、あるいは搬送用担体（ビヒクル）としてのＭＳの構成主剤であるＰＬＧＡの疎水性の度合等に関連する乳酸とポリグリコール酸の重合比及び分子量の違いなどが考えられるが必ずしも明らかではない。
【００２７】
【実施例】
以下に、参考例、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明をする。
【００２８】
参考例１
（ニワトリの腸管における取込み部位の検討）
ウサギあるいは齧歯類で詳細に検討されている微粒子（ＭＳ）の腸管リンパ組織への取り込み、あるいはその性状はニワトリでは不明な部分が多い。そこで、ポリスチレン・ラテックスＭＳを用いて、ニワトリの腸管のどの部位のリンパ組織に取り込まれるかの確認試験を行った。
【００２９】
すなわち、蛍光物質であるＦＩＴＣを含有したポリスチレン・ラテツクス（ＰＬ）のＭＳ（粒子径０．７５μｍ，２．０μｍ，４．５μｍの３種：ポリサイエンス社製）を用いて、ニワトリ腸管リンパ組織への取り込み試験を次のようにして行った。
【００３０】
上記ＭＳをリン酸緩衝食塩水に懸濁し、ゾンデを用いて３回連日食道内に投与し、最終投与後２日目に各部腸管を採取し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドに包埋後急速凍結し、作製した凍結切片を蛍光顕微鏡で観察して蛍光を発する粒子の所在を見ることで取り込みを判定した。１回の投与に用いたＭＳの量は１２．５ｍｇとした。
【００３１】
検索した腸管の部位は０．７５μｍＰＬのＭＳ投与群については、下行および上行十二指腸中央部、空腸開始部、空腸開始部とメッケル憩室の中間部、メッケル憩室、メッケル憩室近傍の空腸、メッケル憩室と回腸開始部の中間部、回腸開始部、回腸開始部とパイエル氏板の中間部、パイエル氏板、パイエル氏板と回盲部の中間部、回腸終末部、盲腸扁桃、盲腸末端部、直腸中央部、ファブリキウス嚢の以上ｌ６箇所である。その他のＭＳを投与した群については、０．７５μｍＰＬのＭＳの取り込みの効率の良かつた部位について検索した。結果を下記表１に示した。なお、取り込み効率の評価は、切片を作製してリンパ組織に取り込まれた粒子数をカウントし、１０切片の合計粒子数によって行った（以下において同じ）。
【００３２】
【表１】
0004095696.tif 000002
【００３３】
０．７５μｍＰＬのＭＳを３回連日投与しその２日後の腸管各部でのＭＳの取り込みを観察したところ、哺乳類で報告されているように、ニワトリにおいてもパイエル氏板での取り込みが認められたが、観察されたＭＳの分布の様子は哺乳類のものとは少し異なっていた。すなわち、哺乳類での報告では、ＭＳは管腔側の粘膜固有層であるドーム領域、あるいは体腔側に分布するというものに対し、ニワトリのパイエル氏板においては粘膜固有層に散在する他、一部リンパ濾胞への集簇像も認められた。そして、この部位でのＭＳの分布はパイエル氏板に限局され、リンパ組織のない腸絨毛の粘膜には見られなかった。パイエル氏板以外でのＭＳの取り込みがみられたのは、メッケル憩室およびその近傍の空腸、あるいは空腸開始部とメッケル憩室の中間部であるが、その頻度はパイエル氏板よりも低いものであった。ファブリキウス嚢を含めたその他の検索した部位での取り込みは認められないか、極めて少ないものであった。特に、リンパ組織の非常に発達した盲腸扁桃および盲腸末端部では管腔にＭＳが存在するにも拘わらず、パイエル氏板で見られたような取り込みはなかった。
【００３４】
２．０μｍあるいは４．５μｍＰＬのＭＳについても同様に投与し、パイエル氏板での取り込みの有無を観察した。これらのＭＳにおいてもパイエル氏板への取り込みは確認されたが、０．７５μｍのＰＬのＭＳよりも頻度は低く、また粒子径が増すほど取り込み頻度が低くなる傾向がみられた（表１参照）。
【００３５】
実施例及び比較例
ニワトリにおけるＰＬのＭＳが取り込まれる腸管リンパ組織の部位をふまえて、ＰＬＧＡを構成主剤として作製したＭＳのパイエル氏板における取り込み試験を行った。すなわち、広範囲の分子量を網羅する３種類のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を構成主剤とし、蛍光色素を含有したＭＳを以下のようにして作製し、ニワトリの腸管リンパ組織の取り込み試験を行った。
【００３６】
（ＰＬＧＡによるＭＳの作製）
ＭＳの作製に用いたＰＬＧＡは、重合比（Ｌ／Ｇ比）が５０：５０で平均分子量２００００（以下「ＰＬＧＡ２０」という：和光純薬工業社製）の比較例、平均分子量６０１００（４００００〜７５０００，以下「ＰＬＧＡ６０」という：シグマ社製）の実施例１、及びＬ／Ｇ比が７５：２５で平均分子量９９８００（７５０００〜１２００００，以下「ＰＬＧＡｌ００」という：シグマ社製）の実施例２の３種である。
【００３７】
蛍光物質であるクマリン６（アクロス社製）を上記３種のＰＬＧＡに含有させてＭＳを液中乾燥法により作製した。
【００３８】
すなわち、ＰＬＧＡおよびクマリン６をジクロロメタンに溶かし、これを１３０００ｒｐｍで攪拌しているポリビニルアルコール中に滴下して粒子形成を行い（４℃，５分間）、その後、スターラーでゆっくり攪拌し、ジクロロメタンを液中で揮発させて固化させた（室温で一昼夜）。形成された粒子は遠心操作により回収し、蒸留水で洗浄後、凍結乾燥を行い試験に用いた。作製されたＭＳの粒子径は、比較例のＭＳ（ＰＬＧＡ２０）は５μｍ前後以下、実施例１（ＰＬＧＡ６０）のＭＳおよび実施例２（ＰＬＧＡｌ００）のＭＳは１５μｍ前後ないしそれ以下が主体であった。
【００３９】
なお、作製方法は本例の方法に限定されず、例えば相分離法あるいはスプレードライ法などの他の方法によっても良い。
【００４０】
（ＭＳの経口投与試験）
ニワトリヘの経口投与は、各例のＭＳ５０ｍｇを１日間隔２回行い、その２日後の腸管を採材した。観察は、ポリスチレン・ラテックス（ＰＬ）のＭＳ取り込みの見られたパイエル氏板について行った。結果を下記表２に示した。
【００４１】
【表２】
0004095696.tif 000003
【００４２】
この表２に示されるように、調べた３例のＰＬＧＡのＭＳ全てについて同じような取り込みがみられるものではなかった。とくにＰＬＧＡ２０で作製した比較例のＭＳは、５μｍ前後以下の粒子径であってＰＬのＭＳの取り込み成績から考えてパイエル氏板への取り込み粒子の大きさに問題がないにも拘わらず、パイエル氏板への取り込みは極めて効率が悪かった。なお、このＰＬＧＡ２０のＭＳはウサギのパイエル氏板では取り込まれることが報告されているものであり、このことは、パイエル氏板への取り込みは動物種により異なること示すものであると考えられる。
【００４３】
上記のように比較例（ＰＬＧＡ２０）のＭＳが取り込まれなかったのに対し、実施例１（ＰＬＧＡ６０）のＭＳ、あるいは実施例２（ＰＬＧＡｌ００）のＭＳでは、ニワトリ・パイエル氏板への取り込みがみられ、ＰＬのＭＳでみられたのと同様に、粘膜固有層に散在するとともにリンパ濾胞に集簇する像も認められた。
【００４４】
以上の結果から、ＰＬＧＡには種々の分子量のものがあり叙放性に影響を与えることが知られているが、叙放性ばかりでなく腸管リンパ組織への取り込みにも大きく影響を与えることが示された。すなわち、ウサギのパイエル氏板への取り込みが報告されているＰＬＧＡ２０では、ニワトリのパイエル氏板への取り込み効率は極めて悪く、従って、これを素材としたＭＳでの経口ワクチンは、ニワトリなどの鳥類には不適当であると考えられるが、他方、分子量４００００以上のＰＬＧＡ６０あるいはＰＬＧＡｌ００で作製したＭＳは、ニワトリ・パイエル氏板リンパ組織への取り込みが確認された。
【００４５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば鳥類における腸管リンパ組織の局所性の免疫応答を実現する抗原等の取込目的物を、腸管の免疫担当細胞に取り込み可能とした搬送用微粒子、及び該取込目的物を搬送する方法を提供することができ、ニワトリ等の鳥類用経口ワクチンの開発等に有効である。