(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレート上に、薬剤とテトラゾリウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウムとを含有する細胞増殖度を呈色度により判定可能な呈色試薬が減圧乾燥法により固相化されたものである薬剤感受性試験用マイクロプレート。
【請求項２】
薬剤が抗真菌薬である請求項１記載の薬剤感受性試験用マイクロプレート。
【請求項３】
以下の工程からなる薬剤感受性試験方法：
（１）薬剤、テトラゾリウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウムを含有する試薬が減圧乾燥法により固相化されたマイクロプレートを調製し、
（２）上記マイクロプレートに細胞を含有する試料を加え、
（３）上記マイクロプレートをインキュベートし、
（４）細胞の増殖度を呈色度により判定する。
【請求項４】
マイクロプレート上に、薬剤とテトラゾリウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウムとを含有する細胞増殖度を呈色度により判定可能な呈色試薬が減圧乾燥法により固相化されたものである薬剤感受性試験用マイクロプレートと細胞増殖用培地とからなる薬剤感受性試験用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床の現場で簡便に使用することができる抗菌薬、特に抗真菌薬感受性試験用マイクロプレート、キット及びその試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵母様真菌による深在性真菌症の発症頻度の上昇と起因菌の多様化、抗真菌薬に耐性を示す菌株の出現に伴い、本感染症に適切な治療薬が必要不可欠になっていることから、医療の現場で抗真菌薬感受性試験の必要性が高まっている。酵母様真菌の感受性試験方法については、米国において1992年にNational Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)からReference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts ; Proposed Standards (M27-P)が、また1995年にはTentative  Standard(M27-T)が発表され、そして1997年6月にはApproved Standard(M27-A)法が勧告されている。M27-A法は培地量０.２ｍｌでのミクロ液体希釈法であり、通常大気中で４６〜５０時間培養した後、菌発育に伴って生じる菌発育終末点の濁りから目視により発育阻止濃度を判読する方法である。
【０００３】
一方、日本国内においては上記M27-P法を独自に改良したミクロ液体希釈法が日本医真菌学会標準化委員会から報告されている（山口ら、日本医真菌学会雑誌、36: 61-86,1995）。
しかし、ＮＣＣＬＳ  Ｍ２７−Ａ法や日本医真菌学会提案法は、臨床検査の現場で実施する場合次のような問題点を含んでいる。
【０００４】
１）薬剤の希釈系列を作製・分注するのに時間がかかる。２）アゾール系薬剤での菌発育終末点（８０％  菌発育抑制）を肉眼的には判読しがたく、菌発育終末点の判読には充分な習熟が必要である。３）マイクロプレートリーダーで読み取る場合、菌塊が均一に分散しにくく、微小な菌塊をも読み取ることになり、その結果、精度が低下する原因となる、などである。
【０００５】
このようなことから、臨床検査の現場では、従来報告されている試験法より簡便な操作で実施でき、かつ信頼性の高い判定結果が容易に得られる試験方法及びそのための試薬の開発が待望されている。試験を行う者にとって好ましい試薬としては、試験実施者が検体であるところの菌液をマイクロプレート上に分注するだけで薬剤感受性試験を開始することができ、これを一定時間培養後、菌発育終末点を容易に判読できる性能をもったもの、と想定される。但し、判読される菌発育終末点はＮＣＣＬＳ  Ｍ２７−Ａ法と大きく乖離しないことが要求される。
【０００６】
予め試験薬剤が濃度希釈系列されたマイクロプレートの開発は薬剤感受性試験の簡便化に大きく貢献するものと思われる。しかし、同マイクロプレートに検体であるところの菌液を分注した場合、菌発育終末点は濁りの程度から判読されるため、上述した判読時の問題点は未解決のまま残される。濁度に依らない菌発育終末点判定法としては、酸化還元指示薬であるAlamar BlueTM (Alamar Biosciences Inc., Sacramento, Calif.）を用い、このAlamar BlueTM の培地中での色調の変化から判定する方法（Pfaller, M. A., et. al., J. Clin. Microbiol.32 : 506-509, 1994; Pfaller, M. A., et. al., J. Clin. Microbiol. 32:1625-1628, 1994）、また指示薬としてレサズリンを用いて判定する方法（山根ら、臨床病理、44:67-75、 1996）が報告されている。しかし、これらの方法は指示薬を培養液に添加するか、または、菌培養液に添加する操作が必要である。また、これらの方法は培地が中間色を呈した場合に判定が困難となる他、レサズリンを混和した培地は光により不安定になるため、遮光下、保存、培養しなければならない（特開平９−１２７０９７号）といった取扱上の問題もある。
【０００７】
【発明の開示】
本発明者らは、テトラゾリウム塩を還元し、その結果生じるホルマザン量（呈色）を測定する方法（ホルマザン発色法：Mosmann, T., J. Immunol. Methods, 65,55-63,1983）を酵母様真菌の増殖度の測定に応用したところ、吸光度と濁度との間に相関関係があることを報告（第９回日本臨床微生物学会総会：平成１０年１月３１日〜２月１日）したが、臨床検査の現場でさらに取扱い易い形態のものとするため、さらに検討を進めた結果、薬剤と呈色試薬の両者を減圧乾燥法によりマイクロプレート上に固相化することに成功し、本マイクロプレートを用いることによって、薬剤感受性試験を簡便に行うことができることを見出した。さらに本発明者らは、フェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウムをマイクロプレート上に同時に固相化させることによって、培地成分に起因する呈色反応を抑制できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、マイクロプレート上に、薬剤および呈色試薬が減圧乾燥法により固相化されたものである薬剤感受性試験用マイクロプレートを提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、上記呈色試薬がテトラゾリウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（以下、１−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳと記す）、フェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウムを含有するものである薬剤感受性試験用マイクロプレート及びそれと細胞増殖用培地とからなるキット製品を提供するものである。
さらに本発明は、以下の工程からなる薬剤感受性試験方法を提供するものである。
【００１０】
（１）薬剤、テトラゾリウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウムを含有する試薬が減圧乾燥法により固相化されたマイクロプレートを調製し、
（２）上記マイクロプレートに細胞を含有する試料を加え、
（３）上記マイクロプレートをインキュベートし、
（４）細胞の増殖度を呈色度により判定する。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のマイクロプレートの作製およびそれを用いる薬剤感受性試験方法は、次に記載する方法によって行った。
【００１２】
Ａ．薬剤および呈色試薬固相化マイクロプレートの作製法
マイクロプレートに固相化するための薬剤溶液はジメチルスルホキシド（Ｄ  ＭＳＯ）に溶解する。調製した薬剤を用いて、ＤＭＳＯまたは蒸留滅菌水で適切な濃度範囲の２倍希釈系列を作製し、一定量各ウエルに分注し、２４時間減圧下にて乾燥・固相化する。固相化した薬剤の濃度範囲としては例えばAmphotericine B(AMPH) : 16〜0.03μg/ml、Flucytosine(5-FC ): 64〜0.125μg/ml、Fluconazole(FLCZ) : 64〜0.125μg/ml、Miconazole(MCZ) : 32〜0.06μg/ml、Itraconazole(ITCZ) : 16〜0.03μg/mlのような範囲があげられる。薬剤の固相化の終了後、呈色試薬（テトラゾリウム塩、１−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウムを含有）を各ウエルに分注し、２４時間減圧下にて乾燥・固相化する。テトラゾリウム塩は還元されることによって呈色する公知のテトラゾリウム塩を利用することができるが、好ましくは生成するホルマザン色素が水に溶けやすく、細胞毒性の低いテトラゾリウム塩、例えば4-[3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen disulfonate sodium salt(WST-8;（株）同仁化学研究所製）（Ishiyama, M. et., al., Talanta, 44:1299-1305, 1997）を好適に用いることができる。作製したプレートは４℃にて保存することができる。
【００１３】
Ｂ．薬剤固相化プレートを用いる抗真菌薬感受性試験
１）培地
試験用培地は以下のように調製する。純水８００ｍｌに、ＲＰＭＩ１６４０粉末培地（Ｌ−グルタミン含有、ＮａＨＣＯ3不含、フェノールレッド不含）１０.４ｇ、グルコース  １０．０ｇ、ＮａＨＣＯ3 ２.０ｇ、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ） ３４.５３ｇを加えて溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ７.０に調整する。全液量を１０００ｍｌに調整し、濾過滅菌する。
このように調製した培地は４℃で保存することができる。
【００１４】
２）菌株
本方法の適用対象菌株としては、Candida albicans、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Candida glabrataなどの Candida 属およびその類縁酵母真菌があげられ、特にサブローデキストロース寒天培地にて３５℃、２４時間以内に充分発育する菌株を対象とする。
精度管理用菌株としては、Candida albicans ATCC 90028、Candida albicans ATCC 24433、 Candida parapsilosis  ATCC 90018、Candida parapsilosis  ATCC 22019、Candida tropicalis ATCC 750、Candida krusei ATCC 6258などが用いられる。
【００１５】
３）試験方法
本発明の微量液体希釈法は、以下のようにして行った。
（１）寒天培地に発育した新鮮分離株のコロニーを試験に用いる。なお、保存菌株を用いる場合寒天培地にて２回、前培養を行い使用する。
（２）この菌コロニーを用いて、McFarland ＃０.５ 濁度の菌液を調製する。
（２）−１．滅菌生理食塩水５ｍｌを入れた試験管に菌コロニー３〜５個を接種し、懸濁する。懸濁後、ボルテックスミキサーにて均一になるまで、よく撹拌する。滅菌生理食塩水は、純水１０００ｍｌにＮａＣｌ ８.５ｇを溶解し、オートクレーブ（１２１℃、１５分）で滅菌し、作製する。
【００１６】
（２）−２．McFarland ＃０.５に相当する濁度に菌液を調整する。
（３）（２）で調製した菌液をマイクロピペットにて採取し、試験用培地に加え、ボルテックスミキサーにて充分撹拌し、規定の濃度になるように希釈する。
（４）（３）で調製した菌液を薬剤および呈色試薬を固相化したウエルに一定量分注する。菌液の接種は、菌液調製後１５分以内に行う（接種できない場合は４℃で２時間まで保存できる）。同時に陰性コントロールとして呈色試薬のみ固相化したウエルに試験用培地を一定量分注し、また、陽性コントロールとして呈色試薬のみ固相化したウエルに（３）で調製した菌液を一定量分注したものを作製する。
（５）プレートに蓋をした後、３５±１℃にて好気培養する。
【００１７】
４）判定方法
判定は２４時間または４８時間培養時点での測定値により行う。
マイクロプレートを１分間振盪撹拌した後、主波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍの吸光度を測定し、次の方法により判定した。
１．完全発育阻止は陰性コントロールと同等またはそれ以下の吸光度を示した最小濃度を最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。
【００１８】
２．８０％  発育阻止濃度（ＩＣ８０）は以下の計算式により求めた吸光度に相当するか、それ以下の値を示すウエルの薬剤濃度をＭＩＣとした。
ＩＣ８０＝（陽性コントロール−陰性コントロール）×０．２＋陰性コントロール
【００１９】
Ｃ．キットの組成
本発明のキットには、上記のようにして減圧乾燥法により作製した薬剤および呈色試薬が固相化されたマイクロプレート、試験用培地が含まれる。すなわち、本発明品のキットの一例としては、ＡＭＰＨ、５−ＦＣ、ＦＬＣＺ、ＭＣＺ、ＩＴＣＺのような適切な抗真菌薬と呈色試薬が固相化されたマイクロプレート、試験用培地として１．２％  グルコース  ＭＯＰＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地、および滅菌生理食塩水を含む抗真菌薬感受性試験キットが挙げられる。
【００２０】
次に、本発明方法と対比のため濁度法（日本医真菌学会提案法）とを実施例として示し、本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものでなく、本発明の趣旨を逸脱しない限り、その変更は任意である。
【００２１】
【実施例】
Ａ．使用菌株
精度管理の目的で、ＮＣＣＬＳ  Ｍ２７−ＡにＭＩＣ許容範囲の記載された６菌株、Candida albicans ATCC 90028、Candida albicans ATCC 24433、Candida parapsilosis ATCC 22019、Candida parapsilosis ATCC 90018、Candida tropicalis ATCC 750、 Candida krusei ATCC 6258を使用した。
いずれの菌株も、サブローデキストロース寒天培地にて２回継代培養した後、培養２４時間以内の菌コロニーを用いて試験した。
【００２２】
Ｂ．試験用マイクロプレート
ＡＭＰＨ、５−ＦＣ、ＦＬＣＺ、ＭＣＺの４薬剤を対象とした。マイクロプレートに固相化するための薬剤溶液は、以下のようにして調製した。薬剤を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解するか、またはそれを用いて希釈した。ＡＭＰＨ  １２８μｇ／ｍｌ、５−ＦＣ  ５１２μｇ／ｍｌ、ＦＬＣＺ  ５１２μｇ／ｍｌ、ＭＣＺ  ２５６μｇ／ｍｌになるように溶液を調製した。調製した薬剤を用いて、ＤＭＳＯまたは蒸留滅菌水で適切な濃度範囲の２倍希釈系列を作製し、２５μｌ／ウエルずつプレートに分注し、２４時間減圧下（１３．３〜２６．６Ｐａ）にて乾燥・固相化した。抗真菌薬を固相化した後、０.７ｍＭ  ＷＳＴ−８、３．５μＭ  １−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ、０.５ｍＭフェリシアン化カリウム、０.５ｍＭフェロシアン化カリウムからなる呈色試薬を２０μｌ／ウエルずつ分注し、２４時間減圧下にて乾燥・固相化した。
【００２３】
Ｃ．試験方法
１）濁度法（比較例）
比較のため、１.２％グルコースＭＯＰＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地を用い、日本医真菌学会提案法（０.２ｍｌ培養系のミクロ液体希釈法）にしたがって実施した。
【００２４】
２）マイクロプレート法（本発明方法）
（１）接種菌液の調製と培養
培養２４時間以内の菌コロニーを用い、滅菌生理食塩水５ｍｌにて菌浮遊液を作製した。波長５３０ｎｍにおける吸光度を測定し、McFarland ＃０.５相当の菌浮遊液を調製した。調製した菌液０.１ｍｌをマイクロピペットにて採取し、１.２％  グルコースＭＯＰＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地０.９ｍｌに加え、ボルテックスミキサーにて充分撹拌した後、その０.１ｍｌをマイクロピペットにて採取し、１.２％  グルコースＭＯＰＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍｌに加え、ボルテックスミキサーにて充分撹拌し、接種菌液（０.５ｘ１０3〜２.５ｘ１０3ｃｆｕ／ｍｌ）を調製した。調製した接種菌液を上記Ｂで調製した２倍希釈系列の濃度勾配をもつ薬剤乾燥固着マイクロプレートの各ウエルに２００μｌずつ分注した。プレートに蓋をした後、３５±１℃にて好気培養した。培養２４時間後の発育コントロール（抗真菌薬および呈色試薬を固相化していないウエルで試験菌を培養）の６３０ｎｍにおける吸光度を測定し、測定した吸光度が０．２以上を示した場合はこの時点を終末点とし、吸光度が０．２未満の場合は４８時間後の吸光度を測定した。
【００２５】
（２）判定方法
マイクロプレートを１分間振盪撹拌した後、主波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍの吸光度を測定し、以下の方法により判定した。
１．ＡＭＰＨは陰性コントロールと同等またはそれ以下の吸光度を示した最小濃度を最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。
２．５−ＦＣ、ＦＬＣＺ、ＭＣＺは８０％  発育阻止濃度（ＩＣ８０）を判定した。以下の計算式により求めた吸光度に相当するかそれ以下の値を示すウエルの薬剤濃度をＭＩＣとした。
（ＩＣ８０＝（陽性コントロール−陰性コントロール）×０．２＋陰性コントロール）
【００２６】
Ｄ．結果
６株のＡＴＣＣ標準菌株を反復して試験したときの濁度法および本発明のマイクロプレート法での成績を表１及び表２にまとめた。濁度法では計１７１回中１０１回（５９．１％）がＮＣＣＬＳ  Ｍ２７−Ａの提案するＭＩＣ許容範囲にあった。ＡＭＰＨについては一致率は低いが、ＭＩＣの再現性は高く、すべて３管目以内に分布した。本発明方法では計１７１回の試験を行った内１３１回（７６．６％）がＮＣＣＬＳ  Ｍ２７−Ａの提案するＭＩＣ許容範囲内にあり、同時に実施した濁度法の成績より高い一致率を示した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のマイクロプレートを用いた微量液体希釈法により、薬剤感受性試験を簡便に、かつ高い再現性をもって行なうことができる。従って、本発明の薬剤と呈色試薬が固相化されたマイクロプレート及びそれと細胞増殖用培地とからなるキット製品は臨床検査用のものとして極めて利用価値の高いものである。
【００２８】
【表１】
0004162750.tif 000002
【００２９】
【表２】
0004162750.tif 000003
※１：（  ）内は測定回数
※２：ＮＣＣＬＳＭ−２７Ａのreference range内を±０、感受性１管差を±１、感受性２管差を±２、感受性３管差を±３とした。