(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）、（ｆ）を含む液体ロタウイルスワクチン調合物。
ａ）ロタウイルスの少なくとも１つの株（約１×１０５〜約１０００×１０５ｐｆｕ／ｍｌ）、
ｂ）糖（約１〜約７０（重量／容量）％）、
ｃ）リン酸塩（約０．０１〜約２Ｍ）、
ｄ）少なくとも１つのカルボン酸塩（約０．０５〜約２Ｍ）、
ｆ）約０．００１％〜約２％の非イオン性界面活性剤
【請求項２】
該少なくとも１つのカルボン酸塩がコハク酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩および乳酸塩からなる群から選択される請求項１に記載の調合物。
【請求項３】
該糖がスクロース、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、デキストロース、フコース、トレハロース、ポリアスパラギン酸、イノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）、シアル酸またはＮ−アセチルノイラミン酸−ラクトースからなる群から選択される請求項１に記載の調合物。
【請求項４】
ｇ）容量までの、組織培養培地、生理食塩水および水からなる群から選択される少なくとも１つの希釈剤
をさらに含む請求項１に記載の液体ワクチン調合物。
【請求項５】
糖の濃度が約５から約７０％の間であり、リン酸塩の濃度が約０．０５から約０．３Ｍの間であり、該少なくとも１つのカルボン酸が約０．０５から０．７Ｍの間の濃度のクエン酸塩またはコハク酸塩である請求項１に記載の調合物。
【請求項６】
ｐＨが約ｐＨ５．０から約ｐＨ８．０の間である請求項１に記載の調合物。
【請求項７】
該リン酸塩がモノリン酸塩、ポリリン酸塩およびリン酸化化合物からなる群から選択される請求項１に記載の調合物。
【請求項８】
該リン酸化化合物がリン酸化糖である請求項７に記載の調合物。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤がポリソルベート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ヘプタエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、ソルビタントリオエート、およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる群から選択される請求項１に記載の調合物。
【請求項１０】
界面活性剤の濃度が約０．００５％から約０．５％である請求項１に記載の調合物。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｃ）、（ｅ）を含む凍結乾燥ロタウイルスワクチン調合物。
ａ）ロタウイルスの少なくとも１つの株（約１×１０５〜約１０００×１０５ｐｆｕ／ｍｌ）、
ｂ）少なくとも１つの糖（約１〜約２０（重量／容量）％）、
ｃ）リン酸塩（約０．０５〜約２Ｍ）、
ｅ）約０．１％〜約１．２５％のグルタミンおよび／又はアルギニン
【請求項１２】
該少なくとも１つの糖がスクロース、マンニトールおよびラクトースからなる群から選択される請求項１１に記載の調合物。
【請求項１３】
ａ）スクロースおよびラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖（約１（重量／容量）％）と、
ｂ）マンニトール（約４（重量／容量）％）と、
ｃ）リン酸塩（約０．０１０〜約０．０７５Ｍ）と、
を含む請求項１１に記載の調合物。
【請求項１４】
復元後ｐＨが約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０の間である請求項１１に記載の調合物。
【請求項１５】
（ａ）ロタウイルスを培養し、ロタウイルスを濃縮した安定化溶液と混合し、混合物を形成すること、および所望により、
（ｂ）混合物を透析し、ロタウイルスワクチン溶液を形成すること、を含み、
ワクチン溶液は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される少なくとも１つの成分を含有する、ロタウイルスワクチン調合物の製造方法。
（ｉ）前記調合物が液体調合物の場合には、約０．００１％〜約２％の非イオン性界面活性剤、
（ｉｉ）前記調合物が凍結乾燥調合物の場合には、約０．１％〜約１．２５％のグルタミンおよび／又はアルギニン
【請求項１６】
前記（ａ）及び（ｂ）を具備し、さらにワクチン溶液を凍結乾燥することからなり、ワクチン溶液が約０．１％〜約１．２５％のグルタミンおよび／又はアルギニンを含有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ロタウイルスワクチン経口調合物の製造のための、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される少なくとも１つの成分の使用であって、
（ｉ）前記調合物が液体調合物の場合には、約０．００１％〜約２％の非イオン性界面活性剤、
（ｉｉ）前記調合物が凍結乾燥調合物の場合には、約０．１％〜約１．２５％のグルタミンおよび／又はアルギニン
前記ワクチン経口調合物が、該調合物を投与する前、同時に又は投与に続いて胃酸を中和するのに十分な緩衝能を有する化合物で処置された個体に投与するためのものである、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はワクチンとして有用なロタウイルスの新規液体および凍結乾燥調合物並びにその製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ロタウイルス（ＲＶ）は急性胃腸炎を引き起こし、これは先進国では乳幼児の入院を要する疾患であり、世界の発展途上地域においては５歳以下の子供の死亡原因となることがよくある。米国、オーストラリアおよび日本の研究では、急性の下痢疾患のために入院した子供の３４から６３％がロタウイルス感染を伴っていることが示された。米国の健康管理機関では、ロタウイルス性胃腸炎による入院頻度は１３から２４ヶ月の月齢の子供１０００００人あたり２２２人、１歳以下の子供１０００００人あたり３６２人になると測推された。この小児科集団において急性下痢のための全入院の６３％がロタウイルス感染を伴っていた。１９７３年から１９８３年の米国における死亡データの調査によれば、米国において下痢疾患により４歳以下の子供では年間５００人が死亡し、下痢による冬期の死亡が２０から８０％多いのはロタウイルス感染を伴うものであることが示された。ロタウイルスはまた第３世界の国々において下痢疾患を伴う死亡の相当な割合を占める原因にもなっている。従って効果的なロタウイルスワクチンは世界の先進地域および開発途上地域の双方の子供の健康に大きな影響を及ぼし得る。
【０００３】
ロタウイルスは１１個の遺伝子セグメントにより形成された二本鎖ＲＮＡゲノムを含む内側および外側のキャプシッドを有する。プラーク減少中和試験により複数のセロタイプが決定され、再構築ウイルスの研究により２個の外側のキャプシッドタンパク質、ＶＰ７およびＶＰ４がウイルスセロタイプの決定因子であることが示された。ＶＰ７タンパク質は特定のヒトロタウイルスの遺伝子セグメント７、遺伝子セグメント８または遺伝子セグメント９のいずれかによりコードされている。ＶＰ７コード化遺伝子の位置は通常の実験方法により、各々の特定のロタウイルスに関して決定できる。ＶＰ４タンパク質はロタウイルスの遺伝子４の８８０００ダルトンの主要表面構造タンパク質生成物である。ＶＰ７と同様に、主要セロタイプ特異的抗原としてのその機能は、血清中和（ＳＮ）試験で効力を発揮し、セロタイプ特異的中和抗体を誘導でき、マウス系においてロタウイルス疾患に対してセロタイプ特異的保護免疫を誘導できる。ある先行文献では、ＶＰ４はＶＰ３と称された。１９８８年以降、命名法の変更によりこのタンパク質をより適切にはＶＰ４と称することになった。
【０００４】
ＶＰ７およびＶＰ４タンパク質をコードする遺伝子セグメントが別個に分離されるので、セロタイプ命名法がＶＰ７により決定されるＧ型、ＶＰ４により決定されるＰ型の双方を含めるように提案された。米国では最も多発するロタウイルス感染はＧ型１、２、３または４およびＰ型１、２または３のウイルスにより引き起こされる。しかしながら、例えばＧ９型などのその他のヒトロタウイルス型がアジア、ヨーロッパおよび特定の第３世界諸国でより優勢である。
【０００５】
多くの動物ロタウイルスはヒトにおいては弱毒であり、可能性のあるロタウイルス生ワクチンとして評価されており、ウシセロタイプＧ６  ＷＣ３ロタウイルスなどがある。ＷＣ３ワクチンウイルスは乳児において免疫原であり、非反応性であったが、ヒトロタウイルス感染に対して保護免疫を提供する点で矛盾していた。ロタウイルス性下痢を一貫して保護するのにセロタイプ特異的免疫が必要であることが示唆されている。
【０００６】
ロタウイルス感染およびそれに関連する重篤な臨床症状に対して保護免疫を提供する有効なワクチンが該分野で必要とされている。
【０００７】
ロタウイルスワクチンを全世界に分配するために、多様な環境条件下で安定であるようなワクチンを調合する必要がある。ワクチンを安定化するために使用される成分は既知である。しかしながら、ロタウイルスワクチンを安定化するのに有用な成分の特定の調合は実験に基づいて決定されなければならない。本発明の１つの目的はロタウイルスワクチンを安定化する調合物を提供することである。
【０００８】
（発明の開示）
本発明はワクチンとして有用なロタウイルスの新規調合物およびその製造方法を提供する。
【０００９】
（図面の簡単な説明）
図１は、３７℃で１週間のロタウイルスの安定性に及ぼすバッファーの組み合わせの影響。再構築Ｇ１に関するデータをパネルＡに示し、再構築Ｐ１に関するデータをパネルＢに示す。全ての値を基準、すなわち０日サンプルに対して正規化したｐｆｕ／ｍｌとして表す。バッファーの組み合わせは以下のとおりである。０．０５Ｍ  クエン酸ナトリウム＋０．１５Ｍ  炭酸水素ナトリウム（□）、０．０５Ｍ  クエン酸ナトリウム＋０．１５Ｍ  リン酸ナトリウム（○）、０．０５Ｍ  乳酸＋０．１５Ｍ  炭酸水素ナトリウム（△）、０．０５Ｍ  乳酸＋０．１５Ｍ  リン酸ナトリウム（▽）、および０．２０Ｍ  コハク酸ナトリウム＋０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム（◇）。全調合物のｐＨ値は７である。
【００１０】
図２は、炭酸水素塩と比較した調合用バッファーの酸中和能力。各バッファー１ｍｌを０．０１Ｎ  ＨＣｌで滴定した。記号：０．４Ｍ  炭酸水素ナトリウム（●）、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム＋０．３Ｍ  リン酸ナトリウム（○）、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム＋０．３Ｍ  炭酸水素ナトリウム（＋）、および０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム＋０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（◇）。
【００１１】
図３は、種々の温度で保存した後の、５％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム／０．０５Ｍ  リン酸ナトリウムの液体調合物中の再構築ロタウイルスに関する安定性データ。Ｇ１ロタウイルスに関するデータをパネルＡに示し、Ｐ１ロタウイルスに関するデータをパネルＢに示す。力価はミリリットルあたりで示す。
【００１２】
図４は、種々の温度で保存した後の、５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム／０．０５Ｍ  リン酸ナトリウムの液体調合物中の再構築ロタウイルスに関する安定性データ。Ｇ１ロタウイルスに関するデータをパネルＡに示し、Ｐ１ロタウイルスに関するデータをパネルＢに示す。力価はミリリットルあたりで示す。
【００１３】
図５は、種々温度での、高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＧ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データ。パネルＡはＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（「ＷＥ」）、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、７０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のワクチンに関する安定性データをパネルＢに示す。パネルＣは５０％  スクロース、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム、および０．３Ｍ  リン酸ナトリウム中のＧ１ロタウイルスに関するデータ、パネルＤはＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、および５％  加水分解ゼラチン中のＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。力価はミリリットルあたりで示す。４℃のデータポイントは−７０℃および１５℃のデータポイントに覆われている。
【００１４】
図６は、種々温度での、高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＰ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データ。パネルＡはＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、７０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のワクチンに関する安定性データをパネルＢに示す。パネルＣは５０％  スクロース、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム、および０．３Ｍ  リン酸ナトリウム中のＰ１ロタウイルスに関するデータ、パネルＤはＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、および５％  加水分解ゼラチン中のＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。力価はミリリットルあたりで示す。
【００１５】
図７は、種々の温度で保存した後の、５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム中のロタウイルス液体調合物に関する安定性データ。Ｇ２ロタウイルスに関するデータをパネルＡに示し、Ｇ３に関してはパネルＢに示す。力価はミリリットルあたりで示す。
【００１６】
図８は、種々温度で保存した後のＧ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データ。パネルＡは凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。凍結乾燥前に１％  ラクトース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したワクチンに関する安定性データをパネルＢに示す。パネルＣは凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および７５ｍＭ  リン酸ナトリウムで希釈したＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。力価はミリリットルあたりで示す。
【００１７】
図９は、種々温度で保存した後のＰ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データ。パネルＡは凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。凍結乾燥前に１％  ラクトース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したワクチンに関する安定性データをパネルＢに示す。パネルＣは凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および７５ｍＭ  リン酸ナトリウムで希釈したＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。力価はミリリットルあたりで示す。
【００１８】
図１０は、３０℃の液体調合物中のＧ１ロタウイルスの安定性に及ぼす組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）の安定化の影響。効力変化の値を−７０℃のサンプルに比較した対数  ｐｆｕとして表す。安定剤はｒＨＡ存在下または不在下の５０％  スクロース／０．１Ｍ  リン酸塩／０．２Ｍ  クエン酸塩／組織培養培地／ｐＨ６．２である。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明はワクチンとして有用な新規ロタウイルス調合物およびその製造方法を提供する。より詳細には、本発明は液体および凍結乾燥ロタウイルスワクチンの調合物を安定化することに関する。加えて、これらの調合物には高濃度緩衝化成分を含有するものがあるので、これらの調合物を胃酸を予め中和するかまたは中和しないで経口的に投与することができる。
【００２０】
ワクチンの全世界的な分配、および外界温度の多様性のために、多様な環境条件下で安定であるようにワクチンを調合する必要がある。種々の安定化方法が用いられている。それには以下のようなものがある。
ａ）低温（−１０℃〜−７０℃）。殆んどのワクチンは極低温で保存している間安定である。しかしながら、低温保存装置には経費がかかり、いつも利用可能であるとは限らない。これによりこの方法の有用性および実用が限定される。
【００２１】
ｂ）凍結乾燥。凍結−乾燥ワクチンは適度に安定であり、予め規定された期間２〜８℃で保存できる。しかしながら、凍結乾燥は乾燥中にウイルス力価の喪失を招き、それにより製造工程の収量が減少する。凍結乾燥ワクチンは典型的には液体調合物よりも安定であるが、長期保存において、凍結乾燥ワクチンが免疫を付与するのに十分な力価を有していないか、または有していないかもしれないという点までも劣化する可能性がある。さらに、凍結乾燥ワクチンは使用前に復元する必要があるので、液体復元調製物は使用前に室温で放置する間に効力を喪失し得る。復元中のこの力価の喪失によってもまた免疫を付与するには不十分な力価に至り得る。
【００２２】
ｃ）安定剤。これらは生物学的分子と相互作用し、安定化する特定の化学物質および／またはワクチンに添加される一般的な医薬用賦形剤であり、低温保存または凍結乾燥法のいずれかと組み合わせて用いられる。
【００２３】
これらの調合物を（１）バルクワクチンの安定剤への希釈、（２）安定剤への透析／ダイアフィルトレーション、または（３）バルクワクチンの濃縮および安定剤へのダイアフィルトレーションのいずれかにより、続いて必要な場合凍結乾燥により調製することができる。
【００２４】
本明細書に記載する調合物の成分の量および濃度は、凍結乾燥調合物または液体調合物に言及する場合、重量／容量パーセンテージを意味することは当業者には理解されよう。例えば、液体調合物の１０％濃度は１００ミリリットルあたり１０グラムであり、凍結乾燥調合物の１０％濃度は凍結乾燥前の液体調合物１００ミリリットルあたり１０グラムを意味する。その他の測定値、例えば化合物のモル濃度は凍結乾燥前の液体調合物または凍結乾燥調合物を意味する。
【００２５】
本発明の安定化組成物は以下の成分を示した概量で含有する。便宜的に容量を概数で記載する。しかしながら、記載した値の１０または２０％内の量が適当であると考えられる、すなわち２０％と記載されている場合、１６〜１８％から２２〜２４％の範囲であることを暗に意味しており、この範囲が適当であるということを当業者は認識するであろう。液体調合物に関しては：
スクロース：                                  １〜７０（重量／容量）％
リン酸ナトリウムまたはカリウム：              ０．０１〜２Ｍ
コハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム：  ０．０５〜２Ｍ
組織培養培地、生理食塩水、または水：          ０以上（残りの容量との差し                                                      引き）
凍結乾燥調合物に関しては：
リン酸ナトリウム：  ０．０５〜２Ｍ
スクロース：        １〜２０（重量／容量）％
マンニトール：      １〜２０（重量／容量）％
ラクトース：        １〜２０（重量／容量）％
加えて以下のものも存在し得る：
凍結乾燥ゼラチン：        ２．５（重量／容量）％
塩化ナトリウム：      １５０ｍＭ
グルタミン酸ナトリウム：  ７ｍＭ。
【００２６】
以下の化合物をスクロースの代わりに、相当するオスモル濃度で用いることができる。フコース、トレハロース、ポリアスパラギン酸、イノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）、シアル酸またはＮ−アセチルノイラミン酸−ラクトース。また、いずれかの適当な糖または糖アルコール例えばデキストロース、マンニトール、ラクトース、またはソルビトールを望ましい安定化を達成するのに有効な濃度でスクロースに代用できる。
【００２７】
糖の濃度は調合物の粘度に関係する。低粘度が望まれる場合、低濃度の糖、例えばスクロースを使用するのが好ましいことは当該分野で既知である。必要とされる濾過または処理工程を行う調合物の能力により糖の濃度の上限が決定され得ることもまた当業者に理解されよう。
【００２８】
非イオン性界面活性剤を用いて液体ロタウイルス調合物を安定化することもできる。本明細書にて教示されるワクチン調合物の液体の態様を安定化するために用いることができるある特定の型の非イオン性界面活性剤はポリソルベート（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）である。種々の型の一般的なポリソルベートを添加して、本明細書に教示されるように液体調合物を作製する。最も好ましいのはポリソルベート２０および８０（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）である。非イオン性界面活性剤を添加する場合、約０．００１％から約０．５０％の濃度のポリソルベート８０またはポリソルベート２０を液体調合物中に使用するのが好ましい。同様にその他の非イオン性界面活性剤を液体ロタウイルス調合物を安定化するのに適用することができる。これらにはその他のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、例えばポリソルベート２０、２１、４０、６０、６１、６５、８０、８１、８５および１２０、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばＢｒｉｊ３５（登録商標）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標）、並びに、非限定例として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）およびＮＰ４０（登録商標）などのノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（登録商標）などのヘプタエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、Ｓｐａｎ８５などのトリオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロック共重合体、例えば非イオン界面活性剤のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ１２１）などのその他のものなどがある。
【００２９】
界面活性剤の許容される濃度を決定するために、本明細書にて教示されるように、界面活性剤を力価測定し、得られた調合物の安定性を試験することだけは必要である。上限は界面活性剤のレベルがヒトに投与される調合物として許容されず、界面活性剤がもはや調合物に安定性を付与しないか、または界面活性剤が別の逆の影響を引き起こす場合である。下限は調合物の安定性の改善が観察されない場合である。界面活性剤は約０．００５％から約０．５％の濃度で用いられるのが好ましい。しかしながら、約０．００１％、０．００２５％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、１％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２．０％、２．２５％、２．５％または２．７５％が有用である。
【００３０】
本明細書にて教示される凍結乾燥調合物にアミノ酸を用いることができる。アミノ酸は凍結乾燥調合物で調製されたワクチンの安定性を改善し得ることが解っている。好ましいアミノ酸はアルギニンおよびグルタミンである。約０．２％から約２％濃度の乾燥重量が適当である。凍結乾燥調合物中約０５％から約１．２５％濃度の乾燥重量が好ましく、約１％濃度の乾燥重量が最も好ましい。アミノ酸の組み合わせを用いることができるが、組み合わせたアミノ酸の全濃度が２．０％までにすべきである。界面活性剤に関しては、調合物中の安定性およびいずれかの逆の影響を観察して、アミノ酸の濃度を力価測定できる。特定のアミノ酸濃度は経験的に最良に決定でき、いずれの場合も０．００１％から２．０％の範囲に成り得る。
【００３１】
本明細書にて教示されるワクチンの液体調合物および凍結乾燥調合物の双方において有用な別の賦形剤は組替えヒトアルブミンである。組換えヒト血清アルブミンを遺伝子発現系を用いて生成でき、従ってヒトの血清から単離されたアルブミンよりも安全に使用できる。アルブミンの濃度は典型的には約０．１〜約２％の範囲であり、約１．０％であるのが好ましい。界面活性剤に関しては調合物中の安定性およびいずれかの逆の影響が観察される間で濃度を力価測定できる。特定の濃度を経験的に最良に決定でき、いずれの場合も０．００１％から３．０％の範囲に成り得る。
【００３２】
組織培養培地、生理食塩水または水を希釈剤として用いることができる。しばしば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（「ＷＥ」）が用いられ、それはＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地または修飾Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地のいずれかを意味する。
【００３３】
また、胃酸を中和するための緩衝剤はクエン酸塩、リン酸塩およびコハク酸塩に限定せず、炭酸水素塩または一般的なカルボン酸（カルボン酸塩）例えば、非限定例としては、フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩等を含む。これらの物質をリン酸塩、クエン酸塩またはコハク酸塩と置き換えるかまたは組み合わせる調合物を単に試してみることによりこれらのいずれかの適切性を評価できる。約２．０Ｍまでのカルボン酸塩を本発明の液体調合物および凍結乾燥調合物において用いることができるが、約１．０Ｍ以下、例えば約０．０５〜０．９Ｍを用いるのが好ましく、約０．７Ｍ以下、例えば０．０５〜０．７Ｍでよい。また０．５Ｍ以下、例えば約０．０５〜０．４５Ｍを用いるのも好ましい。特にこれらの範囲の濃度が適当である。また、例えばさらに胃酸を中和する必要がある場合、高濃度の緩衝成分（例えばリン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩）を用いることもできる。リン酸塩／クエン酸塩またはリン酸塩／コハク酸塩バッファーでさらなる緩衝能が有用である場合、緩衝剤としてリン酸塩よりむしろコハク酸塩またはクエン酸塩の濃度をさらに増すのが好ましい。
【００３４】
約２．０Ｍまでのリン酸塩を本発明の液体調合物および凍結乾燥調合物において用いることができるが、約１．０Ｍ以下、例えば約０．０１０〜０．８Ｍ、しばしば約０．５Ｍ以下、例えば０．０１０〜０．４５Ｍを用いるのが好ましい。約０．３５Ｍ以下、例えば０．０１０〜０．３０Ｍを用いるのが最も好ましい。特にこれらの範囲の濃度が適当である。液体調合物では約０．３０Ｍまたはそれ以下の濃度、例えば０．０１０〜０．３５Ｍのリン酸濃度を維持し、例えば長期保存または凍結／解凍サイクルの間にリン酸塩が沈殿するのを避けるのが好ましい。このように、いずれかの特定の調合物におけるリン酸塩濃度の上限は、リン酸塩の形成または沈殿により、および安定性および投与などの分野においてこの塩が調合物の実行に逆の影響を及ぼすかどうかにより決定できる。ｐＨ６〜８の範囲にｐＨを調整するなどの標準的な経験的な試験により、いずれかの特定の調合物に関して特定の濃度を容易に決定できる。
【００３５】
全体の指針として、いくつかの液体調合物の酸中和能の例を以下の表１に提示する。
【００３６】
【表１】
0004138314.tif 000002
【００３７】
また全般的な指針として、いくつかの好ましい調合物をも提供する。凍結乾燥調合物としては：
リン酸ナトリウム：        ２０ｍＭ
加水分解ゼラチン：          ２．５（重量／容量）％
スクロース：                ５％（重量／容量）％
塩化ナトリウム：        １５０ｍＭ
グルタミン酸ナトリウム：    ７ｍＭ、
または
スクロースまたはラクトース：      １（重量／容量）％
マンニトール：                    ４（重量／容量）％
リン酸ナトリウムまたはカリウム：  ０．０１〜０．１Ｍ。
【００３８】
本発明の液体ウイルスワクチン安定剤の好ましい調合物は以下のとおりである。
スクロース：                    ５０（重量／容量）％
リン酸ナトリウムまたはカリウム：  ０．１Ｍ
コハク酸ナトリウム：              ０．２Ｍ
組織培養培地：                    全ての希釈に使用、
または
スクロース：                    ５０（重量／容量）％
リン酸ナトリウムまたはカリウム：  ０．３Ｍ
クエン酸ナトリウム：              ０．１Ｍ
組織培養培地：                    全ての希釈に使用、
または
スクロース：                    ３０（重量／容量）％
リン酸ナトリウムまたはカリウム：  ０．３Ｍ
クエン酸ナトリウム：              ０．７Ｍ
組織培養培地：                    全ての希釈に使用。
【００３９】
これらの好ましい調合物では、組織培養培地と置き換えて、または組み合わせて生理食塩水または水を使用することが適当であり得る。
【００４０】
本発明は、ヒトに対して安全であり、ヒトロタウイルス感染に対して保護免疫を付与できる特徴を有する、ワクチンとして使用するのに適したロタウイルスおよび／または再構築ロタウイルス（ＲＲＶ）の調合物に関する。ＲＲＶは弱毒化ウシロタウイルス（ＷＣ３またはその子孫が好ましい）および疫学的に重要なヒトセロタイプを表す少なくとも１つのロタウイルス間の遺伝的再構築により生成される。ある型のＲＲＶでは、ヒトロタウイルスが、少なくともＶＰ７タンパク質をコードする遺伝子セグメントの再構築に寄与する。別の型のＲＲＶでは、ヒトロタウイルスの親が、少なくともＶＰ４タンパク質をコードする遺伝子セグメントの再構築に寄与する。さらに別の型のＲＲＶでは、ヒトロタウイルスの親株が、少なくともＶＰ７およびＶＰ４遺伝子セグメントの双方に寄与する。また別の型のＲＲＶでは、ヒトロタウイルス親株が、ＶＰ７および／またはＶＰ４抗原をコードするセグメントに加えて他の遺伝子セグメントに寄与し得る。
【００４１】
ＲＲＶにおける中和抗原ＶＰ７および／またはＶＰ４をコードするヒトロタウイルス遺伝子を免疫が望まれるいずれかのヒトロタウイルスセロタイプから選択できる。望ましくは、本発明の再構築ではＶＰ７遺伝子はＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４ヒトロタウイルスセロタイプから誘導され、ＶＰ４タンパク質はヒトＰ１またはＰ２セロタイプから誘導される。ヒトロタウイルス感染において臨床上重要であることが注目されているロタウイルス株（以後「ヒトロタウイルス株」と称する）の中には本発明に有用な株も含まれ、以下に提示する株などがある：
セロタイプＧ１：Ｗ１７９、Ｗａ、Ｄ；
セロタイプＧ２：ＷＩＳＣ２株およびＤＳ１株；
セロタイプＧ３：Ｗ１７８株、Ｐ株、ＨＣＲ３Ａ株；
セロタイプＧ４：Ｂｒｉｃｏｕｔ（Ｂｒ）Ｂ、ＳＴ３；
セロタイプＧ８：６９Ｍ；
セロタイプＧ９：ＷＩ６１；
セロタイプＰ１：ＷＩ７９、ＷＩ７８、ＷＩ６１、Ｗａ；
セロタイプＰ２：ＤＳ１；および
セロタイプＰ３：ＷＩＳＣ２、ＢｒＢ、ＢｒＡ、Ｍ３７。
【００４２】
このヒトロタウイルス株の表は限定的なものではない。例えば、動物感染において以前に同定されたいくつかのロタウイルス株もまたヒト感染において見出されている。これらの株、例えば「ブタ」ロタウイルスＯＳＵ、セロタイプＧ５、および「ウシ」ロタウイルスＢ２２３、セロタイプＧ１０は本発明の目的のための「ヒト」ロタウイルス株として有用であると予想され得る。当業者は適当な受託者または学術用もしくは商業用供給源からその他の適当なヒト株を容易に入手できる。
【００４３】
再構築物に存在するヒト以外の遺伝子は弱毒化セロタイプＧ６、ウシロタウイルス株ＷＣ３またはその子孫から得るのが好ましく、詳細には米国特許第４６３６３８５号に記載されている。しかしながら、その他の再構築ロタウイルス、とりわけその他のウシの再構築物もまた好ましい。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
表２に列挙した株は、無論のこと米国特許第５６２６８５１号および第５７５０１０９号に関してブダペスト条約に基づいて寄託されている。ここに挙げた株は、ワクチンに使用できうるものの例である。
【００４６】
ワクチン組成物
ヒトロタウイルス感染により引き起こされる急性の下痢に対する保護免疫を提供するワクチンは本発明の調合物中１種またはそれ以上のロタウイルスまたは再構築ロタウイルスを含有できる。再構築ロタウイルスおよその組み合わせおよびワクチンにおけるその使用の実例は米国特許第５６２６８５１号および第５７５０１０９号に見出され、双方共に全記載を参照により本明細書の一部とする。表３に数例のワクチン組成物の概要を示す。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
本発明に従って調合したロタウイルスワクチンは慣用される成分を含有できる。適当な成分は当業者に既知である。これらのワクチン組成物を液体形態または凍結乾燥形態に調製できる。その他の任意の成分、例えば安定剤、バッファー、保存剤、着香剤、賦形剤等を加えることができる。ワクチン組成物を安定化するのに有用な特定の調合物の決定には多岐にわたる実験が必要とされた。
【００４９】
経口投与に適用する場合、ある調合物は担体としてＷｉｌｉａｍ’Ｅ培地（「ＷＥ」）／５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸塩／１０ｍＭ  リン酸塩液を含有する。別の調合物は０．２Ｍ  コハク酸塩および０．１Ｍ  リン酸塩、または０．１Ｍ  クエン酸塩および０．３Ｍ  リン酸塩を含有する。別の調合物は０．７Ｍ  クエン酸塩および０．３Ｍ  リン酸塩をＷｉｌｉａｍ’Ｅ培地／３０％  スクロースと共に含有する。加えて、経口投与用に開発された免疫応答を高めるまたは増す新規アジュバントはこれらの調合物に適合するはずである。非経口投与に適用する場合、慣用されるアジュバント（例えばアルミニウム塩）または新規アジュバントをワクチン組成物に用いることもできる。
【００５０】
所望により、その他の活性成分および／または免疫抗原を含有するようにワクチンを調合することが好ましいであろう。例えば経口投与に適用する場合、セービン（Ｓａｂｉｎ）ポリオワクチンを含む調合が望ましいであろう。
【００５１】
ブースターワクチンの時期、数および量などの投与計画はワクチン接種方法に関係し、種々ホストおよび環境因子例えば患者の年齢、投与時期並びに地理的な位置および環境を鑑み決定される。
【００５２】
ワクチン接種方法
従って、本発明はヒトロタウイルス感染に対して新規ＲＲＶワクチン組成物でヒトにワクチン接種する方法をも包含する。本明細書に記載する１種またはそれ以上の再構築物を含有するワクチン組成物は好ましくは経口投与により、適当な用量で、好ましくは液体で投与される。
【００５３】
全ての投与経路のための投与量は一般に再構築物１０５から１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）であり、好ましい投与量は１０７ｐｆｕである。さらなる用量のワクチンを投与することもできる。「ロタウイルスシーズン」になる前に基本的に年１回乳児および子供に接種するのが好ましいであろう。ヒトにおけるロタウイルス感染は同一シーズン、例えば米国では冬に種々の地理的地域で発生するのが観察されている。感染の可能性のある乳児および子供にそのシーズンの前に繰り返し接種するように指示できよう。例えば、米国の現在のある好ましい投与計画ではロタウイルスシーズンが始まる前におよそ２ヶ月間隔で３回投与する。
【００５４】
以下の実施例は本発明のＲＲＶワクチン調合物を調製する方法を説明する。これらの実施例は説明するだけのためであり、発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
実施例１
経口によるワクチン投与はワクチンを低ｐＨの胃内環境に曝すことになる。殆んどのワクチンはかかる極端な条件下では不活性化する傾向がある。活性ワクチンの送達を確実にするために、可能性のあるバッファーを酸中和能およびロタウイルスを安定化する能力に関して試験した。
【００５６】
酸中和バッファー存在下のロタウイルス安定性
クエン酸塩、乳酸塩およびコハク酸塩バッファーの組み合わせ（全部で５）を３７℃で１週間、ロタウイルス安定性に及ぼす影響に関してそれらを評価した。バッファー（濃度は図１の解説にて提示）をＷＥ培地中同一容量のロタウイルスに添加し、０、３または７日間インキュベートした。
【００５７】
Ｇ１セロタイプに関しては、炭酸水素塩の組み合わせは値が５％  スクロース（０．５日）の値に類似したので、感染力価の２分の１を喪失する時間（ｔ１／２）に影響を及ぼさなかった。対照的にクエン酸塩、乳酸塩、およびコハク酸塩を含有するリン酸塩バッファーはウイルスを安定化し、各々１．２、１．４、および１．５日のｔ１／２値を呈した（図１）。
【００５８】
図１に示すように、リン酸塩はＰ１の安定性に類似の効果を有した。５％  スクロース溶液で約１．２日の値に比較して、乳酸塩／リン酸塩バッファーは２．４日のｔ１／２を有し、コハク酸塩／リン酸塩の組み合わせは６．８日のｔ１／２を有した。Ｇ１ロタウイルスに及ぼすこれらの効果に類似して、炭酸水素塩を含有するバッファーの組み合わせはＰ１セロタイプにおいてリン酸塩を含有する類似のバッファーよりも低い安定性しか付与しなかった。
【００５９】
ロタウイルスと酸中和バッファーの組み合わせ−１回投与
コハク酸塩／リン酸塩およびその他のバッファーの安定化効果は調合物が酸中和剤を含有し得ることを示唆している。我々の直接の実験および化学文献から既知である、ロタウイルス感染力を保護するために必要な３．５以上のｐＨを維持するのに十分な酸が試験したバッファー１ｍｌで中和されるようである（図２）。乳児の胃酸容量および酸分泌速度に基づいて、本発明で記載されるように液体調合物ではインビボでおよそ０．５時間ｐＨを維持できるが、ヒト臨床試験を実施してこれらの仮定を確認すべきであろう。緩衝能の別の試験として酸中和能に関するＵＳＰ試験を実施した。表４に示すように、ＲＶ調合緩衝成分は同一容量の乳児用調合物よりも有効である。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
凍結乾燥調合物に関しては、本明細書に記載される酸中和バッファーまたは一般に入手できる酸中和化合物、例えば炭酸水素塩溶液で復元することによりさらなる緩衝能を獲得させることができる。このように、前処置することなく、液体または凍結乾燥調合物のいずれかで十分な緩衝能にすることが可能である。したがって、ロタウイルスワクチン投与を分離された胃酸中和段階とそれに続くワクチンよりむしろ、１回投与が好ましくできうる。ロタウイルスによる通常の経口ワクチン接種のための十分な胃酸中和を確実にするために患者の前処置（炭酸水素塩または制酸剤、例えばＭｙｌａｎｔａ（登録商標）の調合投与または投与）が依然望まれる場合でも、さらに次のセクションで記載するように、これらの調合物により保存安定性が大きく増強される。さらに、再構築ロタウイルスは乳児用調合物（例えばＩｓｏｍｉｌ（登録商標）およびＳｉｍｉｌａｃ（登録商標））および炭酸水素塩バッファーと適合し、これらの中和剤の存在下または不在下で相当の熱安定性を示す。
【００６２】
実施例２
ロタウイルス上の推定結合部位は安定化の標的と考えることができる。ロタウイルスタンパク質にカルシウムおよび亜鉛結合部位が存在し、これらのカチオンの存在がワクチンを安定化できることが示唆されている。その他の２価のカチオンもまたこれらのまたはその他の部位に結合し、ロタウイルスおよびその再構築物を安定化することができる。ワクチンを安定化できるが免疫原性を付与する能力には影響しない化合物を同定するためにその他の化合物による結合もまた試験された。
【００６３】
ａ．２価金属イオンの影響
金属キレート化剤、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの添加はＲＶ感染性の喪失を引き起こすことが知られており、これは恐らくＲＶの外殻の崩壊による。これは構造の完全性に金属が必要であることを示唆している。従って、ロタウイルス（ＲＶ）を安定化する潜在能力を評価するために２価金属イオンを試験した。
【００６４】
ＷＥ培地中のロタウイルスを４℃で約１６時間、２０ｍＭ  トリスバッファーおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で透析した。最終溶液に１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２またはＣａＣｌ２＋ＺｎＣｌ２のいずれかを補充し、最終濃度１０ｍＭの金属イオンとした。調合の前にサンプルを濾過することができる。サンプルを３７℃で０．、２／３および７日間インキュベートし、次いで検定するまで−７０℃で保存した。各データポイントは２つの反復サンプルの平均を表す。
【００６５】
表５に示すように、調合物をロタウイルスバルクを組織培養培地不含調合物へ透析して調製したとき、カルシウムおよびマグネシウムによりＧ１およびＰ１の双方の再構築ロタウイルスの３７℃における安定性が改善される。亜鉛によりＧ１の不活性化半減期（ｔ１／２）が劇的に低下し、カルシウムの存在下または不在下のＰ１のｔ１／２が著明に低下する。Ｚｎ２＋をＣａ２＋と置き換えることは可能であり、それによりＥＤＴＡによるＣａ２＋の除去に類似の方法で外側のキャプシッドの不安定化が引き起こされる。別の説明では、Ｚｎ２＋により内因性メタロプテイナーゼが活性化されるか、または細胞培養により誘導されるヌクレアーゼが強化されるということである。組織培養培地例えばＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅまたは修飾Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅを含有する安定化剤で調合する場合、２価金属の添加によりＲＶの熱安定性は増強されない。カチオン補充した組織培養培地に比較して、再構築Ｇ２およびＧ３は再構築Ｇ１およびＰ１と類似の挙動を示すようであった。
【００６６】
このように、本明細書に記載するロタウイルスの安定化調合物の調製において、十分なレベルの２価金属イオンが存在するのが好ましい。これらの金属イオンはバルクウイルスを調製するために細胞培養において用いられる組織培養培地および細胞により最もよく提供される。必要な場合、別個に直接添加することにより、または組織培養培地を使用することにより、最終調合物に金属イオンを補充することもできる。
【００６７】
【表５】
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【００６８】
ｂ．生物学的に適切な糖およびポリアニオンの影響
前記で記載した予備実験により再構築ロタウイルスがリン酸塩バッファーにより安定化されることが示された。リン酸により安定化されまた関連するポリアニオン（例えば硫酸塩、イノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）および種々の硫酸化化合物（ヘパリンおよび硫酸化β−シクロデキストリン））により安定化される単量体タンパク質の実例があるので、これらの化合物をロタウイルスを安定化する能力に関して試験した。リガンドを低濃度で高い電荷密度に維持できるので、ポリアニオンの重合体形態は一般により有効な安定化剤であり、従って、ポリアスパラギン酸もまた負の電荷密度が高いために試験された。シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）はＶＰ４に結合できるので試験され、熱誘導される分解または変性から保護することができる。同様にシアル酸誘導体、例えばＮ−アセチルノイラミン酸−ラクトースおよびムチンを試験した。宿主成熟を伴なうＲＶ感染性の喪失はシアル酸の存在下フコースへの転換によることが示唆された。したがってフコースを試験した。最後に、好ましい乾燥賦形剤として称される特性のためにトレハロースを試験した。
【００６９】
表６に示すように、ロタウイルス調合物に種々の化合物を添加し、加速安定性試験の間ウイルスを安定化することができる。この試験ではイノシトールヘキサリン酸がその他のリガンドに比較してＲＶを安定化する最大能力を示した。Ｇ１に関しては３７℃で熱安定性が４倍増強されるのが観察された。ムチンは感染性を防御するが、これは恐らくビリオン構造の不安定化によるよりむしろ、ＲＶを金属イオン封鎖することによる（アッセイの前に凝集が観察された）。硫酸化重合体は無視できる程度の影響しかないが、その他の全ての被験化合物は様々な程度でＲＶを安定化した。例えば、トレハロースはＧ１に関しては不活性化半減期を２倍以上、Ｐ１に関しては５０％以下延長した。
【００７０】
シアル酸はＧ１およびＰ１  ＲＶの双方を安定化した。シアル酸は、結合部位がＶＰ４に位置すれば、Ｇ型を安定化するがＰ型を安定化しないはずである。これらの実験では、Ｐ１はポリアニオンの存在下、一般に半減期がより低いようである。ヘパリンおよびポリアスパラギン酸の存在下ｔ１／２が低いことは、ＲＶがこれらのリガンドにより不安定化されているというよりむしろこれらにより強固に結合していることを示唆している。安定性抑制のメカニズムは全て明らかになっているわけではない。プラークアッセイにより測定される感染性のレベル低下はビリオン自体の不安定化またはリガンドによるＲＶの金属イオン封鎖による引き起こされ得る。ＲＶと賦形剤の会合が中程度のものである場合、リガンドはアッセイの希釈条件下で解離すると考えられる（インビボでも同様）。強固に結合した複合体は安定したウイルス粒子を含有でき、しかも解離できないので感染性でない。このケースはムチン、ヘパリンおよび恐らくポリアスパルギン酸に適用されるようだ。またプラークアッセイに用いられた細胞に及ぼす賦形剤の逆効果は無視できない。メカニズムにかかわらず、ある種のポリアニオンには利点がない。イノシトールヘキサリン酸は試験した全てのリガンドの中で最も好ましいようであり、リン酸塩含有バッファーにより誘起される安定性を上回る。これらの結果はまたリン酸塩が劇的にＲＶを安定化することを示す本発明に記載される以前の研究を支持する。このように、種々のリン酸塩（例えばモノリン酸塩およびポリリン酸塩）およびリン酸化化合物（例えばリン酸化糖）はロタウイルスを安定化できる。
【００７１】
【表６】
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【００７２】
実施例３
種々温度でいくつかのＧ１およびＰ１ロタウイルスの最適化凍結乾燥および液体調合物に関して１年安定性試験のデータが得られ、最適化していない調合物、ＷＥ培地／５％  スクロースの安定性データと比較した。スクロース、リン酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含有するＷＥ培地中再構築ロタウイルスを含有する最適化液体調合物は安定性において実質的な改善を示した。凍結乾燥調合物に関しては保存安定性のさらなる改善が観察された。適当な調合物ではロタウイルスの熱安定性が既存の生ウイルス液体（すなわちＯＰＶ）および凍結乾燥（例えば麻疹）ワクチンの熱安定性を上回る。
【００７３】
コハク酸塩／リン酸塩またはクエン酸／リン酸塩バッファーのいずれかの安定化効果は安定性増強を胃酸中和と組み合わせる可能性を提供する。液体調合物およびバッファーを用いて復元できる凍結乾燥調合物により１回投与で送達できる調合物が可能になる。
【００７４】
ａ．液体調合物安定性データ
Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸塩／５０ｍＭ  リン酸塩（ｐＨ７）で調合する場合、再構築Ｇ１ロタウイルスワクチンは４℃で１年間保存した後、−７０℃で保存したサンプルと比較して０．７対数力価を喪失する（図３）。再構築Ｐ１ワクチンは同一の条件下で０．２対数力価を喪失する。２２℃で６ヶ月後、再構築Ｇ１は感染力価の２．６対数を喪失し、一方再構築Ｐ１ロタウイルスは５．２対数喪失した。これは、最近臨床試験で使用され、２２℃で６ヶ月インキュベートした後、感染性の５対数以上の喪失した、および４℃で１年の後１〜２対数喪失した、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５％  スクロース中再構築Ｇ１の最適化されていない液体調合物と比較できる。これらのデータは本発明にて記載する特異的バッファーの組み合わせのさらなる安定化効果を示している。
【００７５】
Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸塩／５０ｍＭ  リン酸塩（ｐＨ７）では、再構築Ｇ１ロタウイルスワクチンは４℃で１年間保存した後、−７０℃で保存したサンプルと比較して０．８対数力価を喪失する（図４）。再構築Ｐ１ワクチンは同一の条件下で０．３対数力価を喪失する。２２℃で１年後、Ｇ１およびＰ１双方のワクチンは感染性の２対数を喪失する。これらのデータは高濃度の糖のさらなる安定化効果を示している。
【００７６】
高濃度バッファー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５０％  スクロース／０．２Ｍ  コハク酸塩／０．１Ｍ  リン酸塩、ｐＨ７）を用いる別の調合物は４℃でＧ１ロタウイルスワクチンをさらに安定化し、−７０℃で保存した類似のサンプルに比較して顕著な力価喪失には至らない（図５）。さらに、４℃で１年間保存したいずれの最適化液体調合物もＧ１力価の喪失は観察されない。再構築Ｐ１の感染性はすべての調合物について−７０℃サンプルよりも０．２対数低い（図６）。再構築Ｇ１およびＰ１ロタウイルスの４℃での安定性は高濃度バッファーを使用した調合物に類似するが、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５０％  スクロース／０．１Ｍ  クエン酸塩／０．３Ｍ  リン酸塩（ｐＨ７）を含有する調合物はその他の調合物と比較して２２℃で喪失が少ないことが示される。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５０％  スクロース／０．２Ｍ  コハク酸塩／０．１Ｍ  リン酸塩中のＧ１ロタウイルスは２２℃で１年後１．５対数の力価の喪失が示されるが、一方Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５０％  スクロース／０．１Ｍ  クエン酸塩／０．３Ｍ  リン酸塩の調合物ではこの期間の後、０．６対数の喪失しか示さない。我々の初期のスクリーニング実験に示されるように、再構築ロタウイルスの熱安定性はリン酸塩およびリン酸化化合物の存在により増強されるので、後者の調合物の高濃度リン酸塩は安定性の増強に寄与し得る。クエン酸塩／リン酸塩緩衝調合物ではロタウイルスが２２℃でより安定であるようであるが、４５℃では双方の再構築物に関して、３７℃ではＰ１ロタウイルスに関して安定性がより低い。
【００７７】
Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地／５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸塩／５０ｍＭ  リン酸塩（ｐＨ７）中４℃で１２ヶ月後、−７０℃で保存した類似のサンプルと比較した場合、再構築Ｇ２ロタウイルスは感染性を０．２対数喪失し、再構築Ｇ３は、０．３対数の力価が減少した（図７）。類似の調合物中の再構築Ｇ１およびＰ１と比較して（図３）、Ｇ２およびＧ３は再構築Ｐ１ロタウイルスに匹敵する安定性を有し、４℃で再構築Ｇ１で見出された安定性よりも良好である。しかしながら、Ｇ２およびＧ３ワクチンは２２℃でＧ１ワクチンよりも安定性は低いようである。
【００７８】
スクロース、リン酸塩およびクエン酸塩を含有する調合物において組織培養培地の存在下および不在下の再構築Ｇ１の安定性を試験した（表７）。ＷＥ中５％  スクロースのみを含有する調合物Ａを本実験の標準として提供した。被験調合物ＢはＷＥ中５０％  スクロースと共に０．３Ｍ  リン酸ナトリウムおよび０．１Ｍ  クエン酸ナトリウムを含有する。被験調合物ＣはＷＥを含まず、５０％  スクロース、０．３Ｍ  リン酸ナトリウムおよび０．１Ｍ  クエン酸ナトリウムを含有する。調合物ＢまたはＣにウイルスバルクを１０倍希釈する。このように、Ｂでは組織培養培地は液体培地の１００％であり、一方Ｃでは組織培養培地は液体培地の１０％である。Ｃでは、ウイルスバルクは組織培養培地の供給源のみである。表７に示すように、調合物ＢおよびＣは調合物Ａよりも高い安定性を示した。調合物中の組織培養培地の存在または不在は３０℃でのロタウイルス安定性に小さいが測定可能な影響を与えた（ＢおよびＣを比較、表７）。この影響は標準（調合物Ａ）と比較して３７℃でより大きいが、依然小さかった。これらのデータは安定性を改善するために広範な濃度範囲（１０〜１００％）の組織培養培地が許容されることを示している。
【００７９】
【表７】
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【００８０】
１０％以下の容量比の組織培養培地の影響を調べるために、ウイルスバルクから組織培養培地を完全に除去するために透析を実施した。透析したウイルスバルクから調製した、従って最終調合物中に含まれる組織培養培地が０％であるロタウイルス液体調合物は、組織培養培地を含まずロタウイルスバルクが単に安定剤に希釈されているだけの調製物（最終ワクチン調合物中組織培養培地が１０％になる）よりも早く不活性化された。これは、透析によりＷＥ組織培養培地に存在する本質的な安定化成分が除去されたかもしれないことを示唆している。有効量の組織培養培地の不在下では、２価カチオン例えばカルシウムを透析ワクチン調合物に添加して安定性を改善できる（表５参照）。透析濾過または限外濾過法を用いて種々の処理規模で透析を実施することもできる。
【００８１】
一連のｐＨで再構築Ｇ１の安定性を試験した。再構築Ｇ１ロタウイルスを種々のｐＨ値で０．３Ｍ  リン酸ナトリウム／０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム／５０％  スクロース安定剤に調合した。加速安定性条件下で、再構築Ｇ１の安定性が、約ｐＨ４．０から約ｐＨ８．０の範囲、とりわけ約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０の間で、ウイルス力価がより大きいことが示される。「ｐＨの約」とは記載するｐＨ値のおよそ０．３単位内であることを意味する。
【００８２】
【表８】
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【００８３】
ｂ．凍結乾燥調合物の安定性データ
Ｇ１ワクチンは１％  スクロース／４％  マンニトール／１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７）の凍結乾燥調合物において２２℃で１年の後、０．３対数の喪失を示した（図８）。１％  スクロース／４％  マンニトール／７５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７）を含有する調合物は２２℃またはそれ以下の温度で１年の後、有意な喪失は示さなかった。Ｐ１ワクチンは対応するＧ１調合物よりも低い安定性を示した。１％  スクロース／４％  マンニトール／１０ｍＭ  リン酸ナトリウム中４℃で１年では、再構築Ｐ１は−７０℃で保存したワクチンに比較して０．４対数の力価喪失を示す（図９）。高濃度リン酸塩を含む類似の調合物は０．２対数以下の感染性の喪失を示す。リン酸塩、スクロースおよび加水分解ゼラチン安定剤中のＰ１ワクチンは４℃で１年の後、有意な喪失は示さない。これらの凍結乾燥調合物はロタウイルスバルクの安定剤への１０倍希釈（組織培養培地の最終濃度１０％）かまたはロタウイルスバルクの安定剤への透析（組織培養培地を完全に除去する）のいずれかにより調製した。
【００８４】
実施例４
液体調合物
ロタウイルス液体ワクチンについて、いくつかの最適化調合物を特定した。１つの最終安定化調合物は５０％  スクロース、０．１Ｍ  リン酸塩、０．２Ｍ  クエン酸塩、およびＷＭＥＭ（ｐＨ６．２）からなる。安定化調合物は０．８ミリ当量／２ｍｌ用量の酸中和能（ＡＮＣ）を有する。この安定剤にポリソルベート８０またはポリソルベート２０を添加することにより再構築Ｇ１ロタウイルスの安定性がさらに改善される。表９に示すように、０．０１〜０．１％  ポリソルベートを含有する最適化調合物ではＧ１ロタウイルスはポリソルベートを含有しない最適化調合物に比較して４〜３０℃で安定性が改善された。
【００８５】
ポリソルベート２０および８０に類似の特性を有する非イオン性界面活性剤は液体ロタウイルス調合物の安定化において有用である。これらにはその他のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、例えばポリソルベート２１、４０、６０、６１、６５、８１、８５および１２０、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばＢｒｉｊ３５（登録商標）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標）、並びに、非限定例としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）およびＮＰ４０（登録商標）などのノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（登録商標）などのヘプタエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、Ｓｐａｎ８５などのトリオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンの遮断共重合体、例えば非イオン界面活性剤のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ１２１）などのその他のものなどがある。
【００８６】
【表９】
0004138314.tif 000010
【００８７】
類似の様式で、再構築Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｐ１ロタウイルスを含有する５価のロタウイルスワクチンもまた組織培養培地中１５％  ウイルスバルクおよび８５％  安定剤（組織培養培地を含有または不含のいずれか）を含有する調合物においてポリソルベート８０の存在により安定化される。目的の最終濃度は１５％または〜１００％  組織培養培地のいずれかを含む５０％  スクロース／０．１Ｍ  リン酸塩／０．２Ｍ  クエン酸塩／ｐＨ６．２である。表１０に示すように、２５℃で１ヶ月後、５価ワクチンではポリソルベート８０を含有する調合物において、ポリソルベート８０不含で調合したワクチンと比較して安定性の改善が示された。
【００８８】
表１０
５価ロタウイルスワクチン安定性に及ぼすポリソルベート８０の濃度の影響。２５℃で１ヶ月の後、ウイルスプラークアッセイで測定される値を−７０℃の対照と比較した効力の喪失として示す。すべての調合物は組織培養培地中１５％  ウイルスバルクおよび８５％  安定剤（組織培養培地含有または不含のいずれか）を含有する。従って、目的とする最終濃度は、１５％または〜１００％  組織培養培地のいずれかを含む５０％  スクロース／０．１Ｍ  リン酸塩／０．２Ｍ  クエン酸塩／ｐＨ６．２である（この場合、「１００％」は組織培養培地で調製した安定剤を意味する）。
【００８９】
【表１０】
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【００９０】
ウイルスプラークアッセイにより測定される、ポリソルベート８０含有液体調合物における１価および５価の双方のロタウイルスワクチンの４℃での長期保存安定性を８ヶ月間にわたって示した。ワクチン調合物は組織培養培地中ウイルスバルクを１５％、および目的とする最終濃度が５０％  スクロース／０．１Ｍ  リン酸塩／０．２Ｍ  クエン酸塩／ｐＨ６．２／０．０１％ポリソルベート８０である安定剤を８５％含有する。４℃で想定される喪失を−７０℃の対照と比較して表１１に示す。
【００９１】
【表１１】
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【００９２】
ロタウイルスワクチンの液体調合物の安定性は組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）の添加によっても改善され得る。図１０に示すように、ｒＨＡ不含の最適化液体安定剤の１つで調合したＧ１ロタウイルスは本実験において３０℃で４週の後、およそ１対数の効力を喪失する（５０％  スクロース／０．１Ｍ  リン酸塩／０．２Ｍ  クエン酸塩／組織培養培地／ｐＨ６．２）。この温度でのウイルスの安定性は同一の安定剤に０．１（重量／用量）％または１．０％  ｒＨＡを添加することにより改善される。その他の供給源からのアルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または血清から精製したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はロタウイルス調合物においてｒＨＡに類似する安定化効果を有し得る。しかしながら、組換えアルブミンがその調製方法のために好ましい。
【００９３】
凍結乾燥調合物
凍結乾燥ロタウイルスワクチン用のいくつかの安定化調合物が同定された。これらの調合物は１％  スクロース、４％  マンニトール、５０％  組織培養培地、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を含有する。凍結乾燥ロタウイルスの安定性は安定剤に１％（重量／用量；１０ｍｇ／ｍｌ）までのアルギニンを添加することによりさらに改善される。再構築Ｇ１およびＧ２ロタウイルスの安定性はアルギニンを添加することにより４〜３７℃の範囲の温度でさらに改善される（表１２）。アルギニンを含有することにより、表１３に示すように一般にロタウイルスの安定性が改善される。表１４に示すように、スクロース／マンニトール安定剤に含まれるその他のアミノ酸もまた３７℃でロタウイルスの安定性を改善する。
【００９４】
復元バッファーを凍結乾燥調合物用に設計した。これは胃酸を緩衝するのに必要なさらなる酸中和能を提供する。このバッファーは５０％  スクロースおよび０．７Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）からなり、１．５ミリ当量／ｍｌのＡＮＣを有する。復元および３７℃で３０分または３０℃で２時間のインキュベーションの後、ロタウイルスＧ１の効力喪失は観察されなかった。
【００９５】
低濃度スクロース（０〜５０％の範囲）およびクエン酸塩（０．２〜０．７Ｍの範囲）もまた望ましい効果を有するであろう。復元容量が増加する場合、復元バッファー中でこれらの低濃度スクロースおよびクエン酸塩を用いることができる。
【００９６】
【表１２】
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【００９７】
【表１３】
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【００９８】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  ３７℃で１週間のロタウイルスの安定性に及ぼすバッファーの組み合わせの影響を示し、再構築Ｇ１に関するデータを示す。
【図１Ｂ】  ３７℃で１週間のロタウイルスの安定性に及ぼすバッファーの組み合わせの影響を示し、再構築Ｐ１に関するデータを示す。
【図２】  炭酸水素塩と比較した調合物用バッファーの酸中和能力を示す。
【図３Ａ】  種々の温度で保存した後の５％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム／０．０５Ｍ  リン酸ナトリウムの液体調合物中の再構築ロタウイルスに関する安定性データを示し、Ｇ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図３Ｂ】  種々の温度で保存した後の５％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム／０．０５Ｍ  リン酸ナトリウムの液体調合物中の再構築ロタウイルスに関する安定性データを示し、Ｐ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図４Ａ】  種々の温度で保存した後の５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム／０．０５Ｍ  リン酸ナトリウムの液体調合物中の再構築ロタウイルスに関する安定性データを示し、Ｇ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図４Ｂ】  種々の温度で保存した後の５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム／０．０５Ｍ  リン酸ナトリウムの液体調合物中の再構築ロタウイルスに関する安定性データを示し、Ｐ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図５Ａ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＧ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（「ＷＥ」）、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図５Ｂ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＧ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、７０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のワクチンに関する安定性データを示す。
【図５Ｃ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＧ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、５０％  スクロース、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム、および０．３Ｍ  リン酸ナトリウム中のＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図５Ｄ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＧ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、および５％  加水分解ゼラチン中のＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図６Ａ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＰ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図６Ｂ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＰ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、７０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．１Ｍ  リン酸ナトリウム中のワクチンに関する安定性データを示す。
【図６Ｃ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＰ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、５０％  スクロース、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム、および０．３Ｍ  リン酸ナトリウム中のＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図６Ｄ】  種々温度での高濃度バッファー、スクロース、および加水分解ゼラチンを用いるＰ１ロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、５０％  スクロース、０．２Ｍ  コハク酸ナトリウム、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、および５％  加水分解ゼラチン中のＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図７Ａ】  種々の温度で保存した後の５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム中のロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｇ２ロタウイルスに関するデータを示す。
【図７Ｂ】  種々の温度で保存した後の５０％  スクロース／０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム、および０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム中のロタウイルス液体調合物に関する安定性データを示し、Ｇ３ロタウイルスに関するデータを示す。
【図８Ａ】  種々温度で保存した後のＧ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データを示し、凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図８Ｂ】  種々温度で保存した後のＧ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データを示し、凍結乾燥前に１％  ラクトース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したワクチンに関する安定性データを示す。
【図８Ｃ】  種々温度で保存した後のＧ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データを示し、凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および７５ｍＭ  リン酸ナトリウムで希釈したＧ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図９Ａ】  種々温度で保存した後のＰ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データを示し、凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図９Ｂ】  種々温度で保存した後のＰ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データを示し、凍結乾燥前に１％  ラクトース、４％  マンニトール、および１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで透析したワクチンに関する安定性データを示す。
【図９Ｃ】  種々温度で保存した後のＰ１ロタウイルス凍結乾燥調合物に関する安定性データを示し、凍結乾燥前に１％  スクロース、４％  マンニトール、および７５ｍＭ  リン酸ナトリウムで希釈したＰ１ロタウイルスに関するデータを示す。
【図１０】  ３０℃の液体調合物中のＧ１ロタウイルスの安定性に及ぼす組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）の安定化の影響を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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