(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤ依存性組換えギ酸デヒドロゲナーゼおよび野生型酵素よりも凝集および酸化に対して安定している、カンディダボイジニイからのＮＡＤ依存性組換えギ酸デヒドロゲナーゼの突然変異体において、該突然変異体が配列表の配列番号１において、位置２３でセリンへの交換を有し、かつ位置２６２でアラニンへの交換を有するか、位置２３でセリンへの交換を有するか、または該位置２３でセリンへの交換を有し、かつ位置２６２でバリンへの交換を有することを特徴とする、カンディダボイジニイからのＮＡＤ依存性組換えギ酸デヒドロゲナーゼの突然変異体。
【請求項２】
位置２３および２６２でアミノ酸のシステインが互いに無関係に個別的にかまたは一緒にセリン、アラニンまたはバリンと交換されている、請求項１記載の突然変異体。
【請求項３】
請求項２記載の新規の突然変異体をコードする新規遺伝子。
【請求項４】
キラル化合物の製造方法への請求項１記載の突然変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カンディダボイジニイ（Candida boidinii）（DSM 32195）からのギ酸デヒドロゲナーゼの突然変異体に関する。更に、本発明は、この突然変異体をコードする新規の遺伝子配列ならびにキラル化合物への本発明によるギ酸デヒドロゲナーゼの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アミノ酸を製造するために、なかんずく生物触媒が十分な成果を収めて使用されている。この場合には、手始めに還元的アミノ化によるプロキラルα−ケト酸の変換から出発する。この場合に利用されるアミノ酸デヒドロゲナーゼは、α−ケト酸の変換のために共酵素としての化学量論的量のＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを必要とする。この共酵素は、極めて高価であり、したがって上記方法は、工業的規模で使用するには、経済的に重要なものではない。
【０００３】
高い費用を共酵素によって回避する１つの方法は、共酵素を原位置で再生することにある。現在、工業的規模の場合には、特に酵母のカンディダボイジニイからのＮＡＤ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼが酵素反応器中で共酵素再生のために使用されている。
【０００４】
【化１】
0004172861.tif 000002
【０００５】
Ｌ−第三ロイシンへのトリメチルピルビン酸塩の還元的アミノ化の際のＮＡＤ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを用いてのＮＡＤＨの原位置での再生（Bommarius他、Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851 - 2888）。
【０００６】
生産プロセスでカンディダボイジニイからのＦＤＨを使用することの欠点は、プロセスの間にＦＤＨを連続的に添加しなければならない必要性があることにある。それというのも、このＦＤＨは、安定性を欠くために失活するからである。この失活は、次の種々のファクターによって影響を及ぼされるうる：
−  ｐＨ値、
−  温度、
−  機械的負荷、
−  基質溶液のイオン強度およびイオン種、
−  重金属の痕跡、
−  空気酸素によるスルフヒドリル基の酸化、
−  チオール−ジスルフィド交換による架橋。
【０００７】
ティシュコフ（Tishkov）等は、シュードモナス（Pseudomonas）sp. １０１からの組換えＦＤＨの目標とされる突然変異により、水銀塩に対するこの組換えＦＤＨの安定性が増大されるが、しかし、これとは異なり、熱安定性は突然変異誘発によって減少されることを示した（Biochem, Biophys. Res. Commun. 1993, 192, 976 - 981）。
【０００８】
サカイ（Sakai）等は、導き出されたタンパク質配列の１００％がカンディダボイジニイからのこの研究の基礎となる組換えＦＤＨのアミノ酸配列と一致している（図１）、メチロトロフェン酵母のカンディダボイジニイからのＦＤＨの遺伝子配列を解明した（J. Bacteriol. 1997, 179, 4480 - 4485）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
また、前記の刊行物中に記載され論議された公知技術水準に関連して、本発明の課題は、工業的プロセスに使用される、カンディダボイジニイからのＦＤＨを、このＦＤＨが組換えＦＤＨおよび野生型と比較して酸化に対して著しい安定性を有しかつＦＤＨの高価で複雑な後添加が不要であるように変性することであった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この課題および詳細には記載されていない他の課題は、請求項１記載の新規の突然変異体によって解決される。突然変異体の好ましい態様は、請求項２または３に特許の保護が記載されている。請求項４は、この好ましいアミノ酸配列をコードする遺伝子に関する。請求項５は、突然変異されたＦＤＨの本発明による使用に関する。
【００１１】
極めて有利に、しかも意外なことに、カンディダボイジニイからの組換えギ酸デヒドロゲナーゼを目標とされる突然変異誘発により変性することによって、組換えギ酸デヒドロゲナーゼおよび野生型酵素と比較して凝集および酸化に対して安定している突然変異体を再生させかつこうして生産プロセスにおいて前記酵素の著しく長い可使時間を惹起させることに成功した。この場合には、意外なことに、ＦＤＨの別の好ましい性質、例えば触媒活性、配座安定性、熱安定性等は、限界でのみ影響を及ぼされ、したがって新規の利点は、別の付加的な欠点によって否定されるものではない。これは、決して予想できるものではなかった。それというのも、こうして複雑な分子内では、しばしば既に最小の変化により、酵素活性の完全な損失をまねいたからである。
【００１２】
好ましくは、当該の組換えギ酸デヒドロゲナーゼは、酵素の硫黄含有アミノ酸が互いに無関係に個別的または一緒に硫黄不含アミノ酸と交換されるように変性されている。
【００１３】
ＦＤＨの位置２３および２６２にあるシステインは、目標とされる突然変異のための特に好ましいターゲットと思われる。この場合、目標とされる突然変異誘発は、前記位置の１つでのみ行なうことができるかまたは双方の位置で行なうことができる。好ましくは、位置２３および／または２６２の硫黄含有アミノ酸は、互いに無関係に個別的または一緒にスルフヒドリル基なしにアミノ酸と交換される。特に好ましいのは、セリン、アラニンまたはバリンとの交換である。
【００１４】
この変性の成果は、本発明が見出された時点で上記理由から予想することができるものでもなかったし、容易に推考できるものでもなかった。
【００１５】
新規の遺伝子配列によってコードされた、改善された安定性を有する酵素は、特に冒頭に述べた種類のキラル化合物を製造するための酵素的方法の場合に有利に使用される。
【００１６】
ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する本発明による酵素は、好ましくは組換えＦＤＨ遺伝子を基礎にして目標となる突然変異誘発により製造することができ、E. coliで発現させることができる。組換えＦＤＨを用いての作業は、単一の遺伝子配列、ひいては単一の遺伝子生産物が存在し、この場合には、突然変異を発生させることができるという利点を提供する。しかし、突然変異体の突然変異の効果を効果的に野生型酵素の場合と比較しうるために、単一の酵素から出発することができることは、重要な利点である。カンディダボイジニイそれ自体には、酵素の同形が多数存在し、これは、調製的に分離が困難である。全ての場合に、野生型酵素は、タンパク質レベルで微細な不均質性を示す。
【００１７】
更に、例えば増殖または発現に関連するような親有機体に対してエシェリキア・コリ（Escherichia coli）に関連する公知の全ての利点は、使用されることができる。
【００１８】
本発明による遺伝子配列およびアミノ酸配列は、生化学および分子生物学の自体公知の方法により得ることができる。
【００１９】
従って、カンディダボイジニイからのゲノムＤＮＡは、フェルベル（Ferbeyre）他（Bio Techniques 1993, 14, 386）の記載による培養、溶解および沈殿により得ることができる。更に、ＦＤＨ遺伝子は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により増幅されることができる。必要とされたプライマーは、タンパク質配列データから導き出された。得られたＦＤＨ遺伝子は、クローニングベクター中に結合され、E. coli中で形質転換された。商業的に得られる調製キット（例えば、Qiagen Plasmid Tip 20）を用いてE. coli細胞から組換えプラスミドＤＮＡを単離した後、２本のＤＮＡ鎖は配列された。この配列は、図１に示されている。
【００２０】
組換えプラスミドＤＮＡは、同様にホ（Ho）他（Gene, 1989, 77, 52 - 59）の記載によればＰＣＲにより促進される突然変異誘発のための鋳型として使用された。使用されるプライマーは、相応するアミノ酸位置の交換：Ｃ２３（TGT Bp 67 - 69）とＳ２３（TCT）；Ｃ２６２（TGT, Bp 784 - 786）とＶ２６２（GTT）またはＡ２６２（GCT）の交換のために変化されたコドン（括弧内）を維持している。増幅され突然変異されたＦＤＨ遺伝子は、発現ベクターｐＢＴａｃ２（Boehriger）（図２）中でクローニングされ、E. coli中で発現された。突然変異体は、培養されたE. coli細胞の溶解によって細胞不含の粗製抽出液の形で取得された。
【００２１】
新規の酵素の利点は、安定性試験によって明らかになる。比較試験において、カンディダボイジニイからの組換えＦＤＨ、ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ、ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ／Ｃ２６２Ａ、ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ／Ｃ２６２ＶおよびＦＤＨ−Ｃ２６２Ｖの失活が測定され、その失活半減期が測定された。結果は、第１表に示されている。
【００２２】
第１表
酵素                                  半減期（ｈ）
ｒｅｃＦＤＨ                          ２１未満
ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ／Ｃ２６２Ａ          ７５０を上廻る
ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ                      ７５０を上廻る
ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ／Ｃ２６２Ｖ          １６０
ＦＤＨ−Ｃ２６２Ｖ                      ２１
安定性の改善は、突然変異体のＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ／Ｃ２６２ＡならびにＦＤＨ−Ｃ２３ＳおよびＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ／Ｃ２６２Ｖの際の半減期の増大に明らかに認めることができる。ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓの表記法は、当該ギ酸デヒドロゲナーゼの場合にシステイン（Ｃ）がタンパク質配列の位置２３でセリン（Ｓ）によって代替されたことを意味する。同様に、ＦＤＨ−Ｃ２６２Ｖの表記法は、システインが位置２６２でバリンと交換されていることを示すものと理解することができる。
【００２３】
ｒｅｃ−ＦＤＨは、組換えギ酸デヒドロゲナーゼであり、下記の記載によりE. coli中のカンディダボイジニイからの遺伝子のクローニングおよび発現によって取得することができる。
【００２４】
カンディダボイジニイから取得することができる不均質なＦＤＨは、野生型酵素と呼称される。
【００２５】
次の例につき本発明を詳説する。
【００２６】
例１：カンディダボイジニイからのゲノムＤＮＡの製造
酵母からのゲノムＤＮＡの調製をフェルベル（Ferbeyre）他（Bio Techniques 1993, 14, 386）の記載により変性された形で実施した。そのために、カンディダボイジニイ細胞をＹＥＰＤ媒体２００ｍｌ中で３０℃および２００ｒｐｍで後に対数的な成長段階になるまで培養し、引続き遠心分離（１０分間、１５℃、５０００ｒｐｍ、ＧＳＡ回転体）することによって収穫した。前記条件下で、細胞湿潤物質約２．０ｇ／培地１００ｍｌを達成することができた。細胞を１回でクエン酸燐酸塩緩衝液１０ｍＭ、ｐＨ７．５で洗浄し、引続き溶解緩衝液１０ｍｌ中で再懸濁させた。この細胞懸濁液に溶解緩衝液１ｍｌ当たりプロテアーゼ１ｍｇ［Qiagen］およびアントロバクター・ルテウス（Anthrobacter luteus）［Sigma］からのリティカーゼ（Lyticase）２００単位を添加した。この懸濁液を３７℃で６０分間恒温保持し、次に同容量（Vol.）のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（PCI）で抽出した。ＳＳ３４回転体中で室温および１２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離後、水相を除去し、大きな中間相が発生した場合には、再びＰＣＩで抽出した。次に、ＤＮＡを１／１０容量の３モルの酢酸ナトリウムｐＨ５．２および２容量の氷冷却したエタノール（絶対）を有する水相中で沈殿させ、５分間氷上に置き、ガラス棒上に巻付け、かつ滅菌バンクの下で乾燥させた。乾燥後、ＤＮＡを一晩中ＴＥ５ｍｌ、ｐＨ７．５中で４℃で溶解した。ＤＮＡ調製物中のＲＮＡを、溶液１ｍｌ当たりＲＮＡｓｅＡ  １００μｇの添加および水平型振盪機（４０ｒｐｍ）上で軽く振盪しながらの３７℃で６０分間の恒温保持によって消化させた。引続き、ＲＮＡｓｅＡを１容量のＰＣＩを用いての抽出によって沈殿させ、フェノール残基の除去のために、水相を１回１容量のＣＩで抽出した。遠心分離後、水相からのＤＮＡを１／１０容量の３モルの酢酸ナトリウムｐＨ５．２および０．７容量の２−プロパノールを用いて室温で沈殿させ、ガラス棒上に巻付け、以前と同様に乾燥させた。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を一晩中ＴＥ２．５ｍｌ、ｐＨ７．５中に溶解した。
【００２７】
引続き、このｇＤＮＡを０．５％の寒天ゲル中で大きさの分布に関連して分析し、ＯＤ２６０ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍの測定によって定量分析しかつ定性分析した。
【００２８】
この方法を用いた場合には、高分子量で多くの場合に分子生物学的使用にとって十分に清潔なゲノムＤＮＡを良好な収率（ゲノムＤＮＡ７００μｇ／細胞湿潤物質ｇ）で取得した。
【００２９】
使用される媒体および緩衝液の組成：
0004172861.tif 000003
例２：ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲを用いてのＦＤＨ遺伝子の増幅
全てのＰＣＲバッチ量を軽質鉱油５０〜１００μｌ［Sigma］で被覆し、ＰＣＲを自動ＤＮＡ熱サイクラー（Thermal Cycler）［Robocycler, Stratagene］を用いて次のプログラムにより実施した：
ＰＣＲ−プログラム：
９４℃で２分間の変性（プログラムの開始時１回）
９４℃で１分間の変性
４６〜６０℃でプライマーの１．５分間のアニーリング（プライマーの溶融温度に応じて）
７２℃で１．５分間の拡大（Taq-ポリメラーゼによるプライマーの拡大化）
最後の３回の過程の周期的繰り返し（２５〜３０回）
全ての増幅された断片が完全に拡大されることを保証するために、７２℃で１０分間の拡大。
【００３０】
ＰＣＲバッチ量は次のものを含有していた：
ｇＤＮＡ    １０ｎｇ
プライマー  Ｎ−ＴｅｒｍＦ３  ２０ピコモル
プライマー  Ｎ−ＴｅｒｍＦ３  ２０ピコモル
ｄＮＴＰ                      それぞれ０．２ｍＭ
Ｔａｑ−ポリメラーゼ          ０．５μｌ（Boehringer）
緩衝液                        １０μｌ  １０回（Boehringer）
蒸留水で１００μｌになるまで添加
アニーリング温度：４８℃、３５回の作業周期
ＰＣＲ断片をSure-Clone-Kits（Pharmacia, Freiburg）を用いてベクターｐＵＣ１８中に結合した。形質転換のために、ハナハン（Hanahan）（J. Mol. Biol. 1983, 166, 557）による方法を使用した。そのために、結合バッチ量ベクターｐＵＣ−ＦＤＨ２μｌを適格なＥ．  ｃｏｌｉ ＸＬ１ブルー細胞１００μｌに添加した。
【００３１】
例３：突然変異体ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓの製造
ＦＤＨの点突然変異体をクローニングされたＦＤＨ遺伝子（pUC-FDH）（例１参照）を基礎にホ（Ho）他（Gene, 1989, 77, 52 - 59）の方法により製造した。この場合には、次の”内部”オリゴヌクレオチド−プライマーを使用し、これらは双方ともに突然変異を含んでいた：
−  Ｃ２３Ｓの突然変異を導入するための内部プライマー：
Ｓ２３センス：５′−ＴＴＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＣＣＡＴＡＴＡＡ−３′
Ｓ２３アンチセンス：５′−ＴＡＴＡＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＡＴ−３′”外側”プライマーとして、次のオリゴヌクレオチド−プライマーを使用した：
ＰＵＣ１８１Ｓ：５′−ＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧ−３′
Ｃ−ＴｅｒｍＲ５／Ｐｓｔ１：５′−ＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣＧＴＧＴＴＴＡＣＣＧＴＡ−３′
Ｎ−ＴｅｒｍＦ３／ＥｃｏＲＩ：５′−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＴＣＴＴＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴ−３′
１．個々の断片の製造：
バッチ量Ａ：ＳＥＲ２３Ｓ１−ＣＴＥＲＭＲ５／Ｐｓｔ１−断片（１．０ｋｂ）の製造
ｐＵＣ−ＦＤＨ  １００ｎｇ（ｐＵＣ１８中のＦＤＨ−ＥｃｏＲＩ  １．１ｋｂ／Ｐｓｔ１）
プライマーＳＥＲ２３Ｓｌ  ３０ピコモル
プライマーＣＴＥＲＭＲ５／Ｐｓｔ１  ３０ピコモル
Ｐｆｕ−ポリメラーゼ１．５μｌ（２，５Ｕ／μｌ）
ポリメラーゼ緩衝液  １／１０の容量  １０回
ｄＮＴＰ  それぞれ０．２ｍＭ
蒸留水で１００μｌになるまで添加
アニーリング温度：４６℃、３０回の作業周期
バッチ量Ｂ：ＰＵＣ１８Ｓｌ−ＳＥＲ２３ＡＳ１−断片（５００ｂｐ）の製造
ｐＵＣ−ＦＤＨ  １００ｎｇ（上記参照）
プライマーＰＵＣ１８Ｓｌ  ３０ピコモル
プライマーＳＥＲ２３ＡＳｌ  ３０ピコモル
Ｐｆｕ−ポリメラーゼ１．５μｌ（上記参照）
ポリメラーゼ緩衝液  １／１０の容量  １０回
ｄＮＴＰ  それぞれ０．２ｍＭ
蒸留水で１００μｌになるまで添加
アニーリング温度：４４℃、３０回の作業周期
ＰＣＲの後、このバッチ量を調製寒天ゲル（１％）中で分離し、バンドを切り抜き、ジェットソルブ（Jetsorb）−ゲル抽出キット（Genomed）を用いて単離し、分析アガロースゲル中の濃度を評価し（参照物質：ｋｂ−ラダー１μｇ、Gibco）、重なり断片を有する融合−ＰＣＲ中での鋳型として使用した。
【００３２】
２．完全なＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ遺伝子（１．１ｋｂ）を製造するための融合−ＰＣＲ
ＳＥＲ２３Ｓｌ−ＣＴＥＲＭＲ５／Ｐｓｔ１断片１５０ｎｇ
ＰＵＣ１８Ｓｌ−ＳＥＲ２３ＡＳｌ断片９０ｎｇ
プライマーＮＴＥＲＭＦ３／ＥｃｏＲ１  ２０ピコモル
プライマーＣＴＥＲＭＲ５／Ｐｓｔ１  ２０ピコモル
Ｐｆｕ−ポリメラーゼ１．５μｌ（２，５Ｕ／μｌ）
ポリメラーゼ緩衝液  １／１０の容量  １０回
ｄＮＴＰ  それぞれ０．２ｍＭ
蒸留水で１００μｌになるまで添加
アニーリング温度：４６℃、３０回の作業周期
ＰＣＲバッチ量を直接にＡ−テーリング（下記参照）に使用した。
【００３３】
３．ｐＭＯＳブルー中でのＰＣＲ生産物のクローニング：
クローニングをｐＭＯＳブルーＴ−ベクターキット（Amersham）を用いて行なった。
【００３４】
ａ）Ａ−テーリング
融合−ＰＣＲ−バッチ量１００μｌを１容量のクロロホルムイソアミルアルコール（ＣＩ）（２４：１）を用いて抽出した。
【００３５】
水相２５μｌ＝ＰＣＲバッチ量の１／４
緩衝液１．８μｌ  １０回（AmershamのProtokoll参照）
ｄＮＴＰ−Ｍｉｘ  １．８μｌ（AmershamのProtokoll参照）
Ａ−テーリング緩衝液８．５μｌ（AmershamのProtokoll参照）
Ｔｔｈ−ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ
蒸留水で８５μｌになるまで添加
７０℃で１５分間
ＣＩを用いて抽出した  １回
寒天ゲル電気泳動を用いてのＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ遺伝子を含むＰＣＲ断片の単離およびジェット−ソルブ（Jet-Sorb）（Genomed）を用いてのＰＣＲ断片の単離の後、断片をベクターｐＭＯＳブルー中に結合させた。
【００３６】
ｐＭＯＳブルー中での結合：
ｐＭＯＳブルーベクター５０ｎｇ
ＦＤＨ−Ｓｅｒ２３−３′ｄＡ  １２０ｎｇ
ＡＴＰ  ０．５μｌ  １０ｍＭ
リガーゼ緩衝液１．０μｌ
ＤＴＴ  ０．５μｌ  １００ｍＭ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ０．５μｌ（２〜３個のWeiss-Units）
蒸留水で１０μｌになるまで添加
一晩中１６℃で恒温保持。
【００３７】
ｂ）ＭＯＳブルー適格細胞中での形質転換（Amersham Protokoll, 1994による）結合バッチ量１μｌ
適格細胞２０μｌ
４２℃で４０秒
氷上で２分間
添加されたＬＢ媒体８０μｌ、３７℃で１時間
アンピシリンおよびテトラシクリンによりＬＢ上から５０μｌが分離してこびり付いた。
【００３８】
４．発現ベクターｐＢＴａｃ２（Boehringer）中でのＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ遺伝子のクローニング
組換えｐＭＯＳブルー細胞から、E. coli中での増殖後にプラスミド−ＤＮＡ（ｐＭＯＳ−ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ）を単離し、ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ−ＥｃｏＲ１／Ｐｓｔ１断片（１．１ｋｂ）を制限消化を用いて調製した。
【００３９】
調製ＥｃｏＲ１−Ｐｓｔ１の消化
プラスミド−ＤＮＡ１５μｌ（約２００ｎｇ）ｐＭＯＳ−ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ
緩衝液Ｈ３μｌ（Boehringer）
Ｐｓｔ１  ０．５μｌ（１０Ｕ／μｌ）
蒸留水１１μｌ
２時間、３７℃
断片を上記の方法により単離した。
【００４０】
ｐＢＴａｃ２中での結合
ｐＢＴａｃ２  １００ｎｇを、前記の記載と同様に、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ１で消化し、線状にされたベクターを上記の方法により単離した。開かれたベクター中でＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ−ＥｃｏＲ１／Ｐｓｔ１断片（１．１ｋｂ）を結合させた。
【００４１】
結合バッチ量は、次のものを含有していた：
ｐＢＴａｃ２−ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ１  ４５ｎｇ
ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ−ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ１  ６０ｎｇ
リガーゼ緩衝液１μｌ  １０回（Boehringer）
Ｔ４  ＤＮＡ−リガーゼ０．５μｌ（Boehringer）
蒸留水で１０μｌになるまで添加
一晩中１６℃で恒温保持。
【００４２】
５．Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ  １０５中での軽質転換
軽質転換のために、結合バッチ量５μｌに適格なＥ．  ｃｏｌｉ ＪＭ  １０５細胞を添加し、軽質転換をハナハン（Hanahan）（上記参照）の記載により実施した。
【００４３】
例４：Ｅ．  ｃｏｌｉ中でのＦＤＨ−Ｃ２３Ｓの発現
組換え野生型ＦＤＨ遺伝子およびＦＤＨ突然変異体を２００ｍｌの規模でＥ．ｃｏｌｉ細胞ＪＭ１０５中で発現させた。ＬＢ媒体２００ｍｌを１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを選択するために添加し、１：５０の比で一晩中恒温保持された前培地に接種した。この細胞を３７℃および１８０ｒｐｍで往復動振盪機上で培養し、０．６〜０．８の光学密度（ＯＤ５５０ｎｍ）の際にＩＰＴＧ  １ｍＭで誘発させた。発現時間は、５．０時間（細胞湿潤物質０．７ｇ）と２０時間（細胞湿潤物質１．２５ｇ）との間にあった。細胞を遠心分離（１０分間、ＧＳＡ回転体、１００００ｒｐｍ）によって収穫した。
【００４４】
ＬＢ（Luria Bertani）−媒体：バクト（Bacto）−トリプトン１．０％
バクト（Bacto）−酵母抽出液０．５％
ＮａＣｌ  １．０％
ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した。
【００４５】
ＬＢａｍｐ媒体        アンピシリン１００μｇ／ｍｌを有するＬＢ媒体
細胞の溶解は、ガラス玉（直径０．３ｍｍ）を用いて機械的に行なわれた。Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞懸濁液を溶解緩衝液中で製造し、この緩衝液に２倍の重量のガラス玉を添加した。溶解は、１〜２ｍｌの規模の容量に応じて振動ミル［Retsch; Hummel und Kula (1989) J. Microbiol. Meth. 9, 210］中、ＳＳ３４−遠心分離小管（１０〜２０ｍｌ）中、ボアテックス（Vortex）［ＩＫＡ］上または砕解機Ｓ（２０〜５０ｍｌ）［ＩＭＡ］中で２０分間に亘り行なわれた。溶解生産物を１００００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離し、細胞不含の上澄み液を除去し、ガラス玉および細胞ペレットを１回１／４〜１／２の細胞懸濁液容量の緩衝液で洗浄した。再度の遠心分離後、細胞不含の上澄み液を合わせた。細胞不含の粗製抽出液中のＦＤＨ−Ｃ２３Ｓの容量活性は、１０Ｕ／ｍｌであった。
【００４６】
溶解緩衝液：燐酸カリウム緩衝液１００ｍＭ、ｐＨ７．５
ウコラップ（Ucolup）／Ｌ緩衝液  １０滴
例５：ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓの安定性の測定
失活の半減期の測定のために、ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓの細胞不含の粗製抽出液を使用した。
【００４７】
試験用バッチ量は、次のものを含有していた：ＮＨ４−トリメチルピルビン酸塩０．０５〜０．５Ｍ
Ｌ−第三ロイシン０．１〜１Ｍ
ＮＨ４ギ酸塩２．７Ｍ
ＦＤＨ−Ｃ２３Ｓ  ０．５Ｕ／ｍｌ
ｐＨ６〜９
Ｔ＝４０℃
恒温保持は、１８日間に亘って行なわれた。活性試験のための試料を毎日取り出した。時間に対する残留活性を半対数的にプロットすることにより、勾配が不活性定数ｋを表わす直線を生じた。不活性化の半減期τは、関係式τ＝ｌｎ２／ｋにより得られた。
【００４８】
例６：（Ｓ）−ネオペンチルグリシンの製出
ギ酸アンモニウム３１．５３ｇ（０．５モル）および２−ケト−４，４−ジメチルペンタン酸Ｎａ塩２０．８９ｇ（１２５ミリモル）を水４００ｍｌ中に懸濁させ、ｐＨ値をアンモニアで８．２に調節し、こうして溶液を装入し、かつ５００ｍｌになるまで増量する。引続き、ＮＡＤ＋・Ｈ２Ｏ共因子７１．７ｍｇ（０．１ミリモル）ならびにロイシンデヒドロゲナーゼ２０００Ｕ（LeuDH）およびギ酸デヒドロゲナーゼ２５００Ｕ（FDH）を添加した。温度を２８℃に調節し、反応成分を穏やかに撹拌し、ｐＨ値をｐＨ安定化装置によって８．２に一定に維持する。４８時間後、ＨＰＬＣ毎に変換率を測定することによって、反応が終結することを検出する。酵素を目開き１０ｋＤａの限外濾過装置を介して分離し、反応溶液をアンモニアでｐＨ９．５に調節する。引続き、活性炭２％を用いて澄明にし、殆ど無色の溶液をロータリーエバポレーター機で濃縮し、アミノ酸を晶出させ、吸引漏斗を介して分離し、３回微少量のエタノールで洗浄し、かつ真空中で一晩中５０℃で乾燥させる。
【００４９】
収量：１５．４ｇ（理論値に対して８４．９％）
同定試験：ＮＭＲスペクトル
エナンチオマー単位：キラシル−バル（Chirasil-Val）を用いてキラルガスクロマトグラフィーによって測定された９９．８％を上廻るｅ．ｅ．
例７：（Ｓ）−３−メチル−イソロイシン（（Ｓ）−３，３−ジメチル−ノルバリン）の製出
ギ酸アンモニウム６．３ｇ（０．１モル）および２−ケト−３，３−ジメチルペンタン酸Ｎａ塩１．６７ｇ（１０ミリモル）を水８０ｍｌ中に懸濁させ、ｐＨ値をアンモニアで８．２に調節し、こうして溶液を装入し、かつ１００ｍｌになるまで増量する。引続き、ＮＡＤ＋・３Ｈ２Ｏ共因子１４．３４ｍｇ（０．０２ミリモル）ならびにロイシンデヒドロゲナーゼ８００Ｕ（LeuDH）およびギ酸デヒドロゲナーゼ５００Ｕ（FDH）を添加する。温度を３２℃に調節し、反応成分を穏やかに撹拌し、ｐＨ値をｐＨ安定化装置によって８．２に一定に維持する。７２時間後、ＨＰＬＣ毎に変換率を測定することによって、反応が終結することを検出する。この反応溶液をアンモニアでｐＨ９．５に調節し、引続き、活性炭２％を用いて澄明にする。殆ど無色の溶液をロータリーエバポレーター機で濃縮し、アミノ酸を晶出させ、吸引漏斗を介して分離し、３回微少量のエタノールで洗浄し、かつ真空中で一晩中５０℃で乾燥させる。
【００５０】
収量：１．１７ｇ（理論値に対して８０．６％）
同定試験：ＮＭＲスペクトル
エナンチオマー単位：キラシル−バル（Chirasil-Val）を用いてキラルガスクロマトグラフィーによって測定された９９．９％を上廻るｅ．ｅ．
例８：（Ｓ）−ホモネオペンチルグリシン（（Ｓ）−５，５−ジメチル−ノルロイシン）の製出
反応および後処理を例４と同様に実施するが、しかし、全反応時間の間に懸濁液を装入し、反応を９６時間後に初めて終結させた。
使用量：２−ケト−５，５−ジメチル−ヘキサンＮａ塩１．８１ｇ（１０ミリモル）
収量：１．０８ｇ（理論値に対して６７．９％）
同定試験：ＮＭＲスペクトル
エナンチオマー単位：クラウンパック（Crownpak）−ＣＲ＋カラムによって測定された９９．９％を上廻るｅ．ｅ．
【配  列  表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】増幅され突然変異されたＦＤＨ遺伝子がクローニングされる発現ベクターｐＢＴａｃ２のチャート図。
【図１】
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