(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースを生産しうる微生物を培養する工程と、
該培養された微生物の複数ロットにそれぞれ変異処理を施し複数の変異株を得る工程と、
該得られた複数の変異株をそれぞれ別個に水溶性セルロースエーテル及び単糖又は二糖類及び窒素源を含有する培地を用いて固体培養する工程と、
各々の変異株の増殖したコロニーについて選抜の指標となる性状を調べ、各々の変異株をその指標となる性状の差に基づいて選抜する工程と
を有し、
該水溶性セルロースエーテルがカルボキシメチルセルロースあるいはヒドロキシエチルセルロースである
ことを特徴とするセルロース生産菌変異株のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記変異株の選抜の指標となる性状が、各コロニーの形成速度であり、該選抜された変異株のコロニーの形成速度が親株のそれを上回る請求項１に記載のセルロース生産菌変異株のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記変異株の選抜の指標となる性状が、セルロース球晶の生成能力であり、該選抜された変異株のセルロース球晶の生成能力が親株のそれを上回る請求項１に記載のセルロース生産菌変異株のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記変異株の選抜の指標となる性状が、培地中の水溶性セルロースエーテルの減少によって評価されるセルラーゼ活性の強弱であり、該選抜された変異株のセルラーゼ活性が親株のそれより強いものである請求項１に記載のセルロース生産菌変異株のスクリーニング方法。
【請求項５】
セルロースを生産しうる微生物から変異操作により得られ、かつ該変異した株の選抜の指標となる性状の差に基づいて選抜された変異株を、セルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれた少なくとも１つを炭素源として含み、更に窒素源を含む培地で培養する工程を有し、かつ、
得られたバクテリアセルロースが、分子量が100万以上のものであることを特徴とするバクテリアセルロースの製造方法。
【請求項６】
該変異株が、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法でスクリーニングされたものである請求項５に記載のバクテリアセルロースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高分子量バクテリアセルロース及びその製造方法、そのために用いられるセルロース生産菌の変異株のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物によって生産されるバクテリアセルロースは可食性であり食品分野で利用される他、水系分散性に優れているので食品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳化安定化助剤としての産業上利用価値がある。バクテリアセルロースは木材パルプ等から製造されるセルロースに較べ、フィブリルの断片幅が２ケタ程度も小さいことを特徴とする。従って、バクテリアセルロースの離解物はミクロフィブリルのかかる構造的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤として各種の産業用用途がある。このようなセルロース性離解物を紙状または固形状に固化した物質は高い引張弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的特徴に基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材としての応用がある。
【０００３】
従来、ＮＴＧ等の変異剤を用いた化学的変異処理方法や、紫外線、放射線照射等によって、セルロース生産菌に変異処理を施すことにより、セルロース生産速度及びセルロースの重合度等の点で改良された各種変異株を創製する試みがなされている。このような変異株の創製に際しては、変異処理後に行なわれる目的とする菌株のスクリーニングでは、副生物の質的・量的変化を見て形態に変異のある菌株を選抜したり、又は、サルファ剤耐性株(特開平７-３２７６６９号公報)、ピリミジンアナログ耐性株(特開平８-２６０号公報)、ＤＨＯ-ＤＨase阻害剤耐性株(特開平８-９９６５号公報)並びに糖アナログ及びアミノ酸アナログに耐性な菌株(ＷＯ９７/４０１３５号公報)等のように、各種薬剤に対する耐性に着目し、かかる耐性を有する菌株を選抜していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらのスクリーニング方法では、各種薬剤に対する耐性など、菌株のある生理的性質に着目してスクリーニングしているため、他の性質に由来して能力の高まった菌を網羅的にスクリーニングすることができないことや、ある特性を有する変異株を選抜するために、変異処理によって生じた変異株ひとつひとつにつき長時間慎重に液体培養してバクテリアセルロースを生産し、そのセルロースの生産性や特性を測定することが必要である。従ってスクリーニングの効率が非常に低くなってしまう、といった問題があった。
【０００５】
また、特開平１１-１８７８９６号公報にはセルラーゼを適度に培地に添加することにより、添加セルラーゼによる分解速度以上にセルロースを生産できるようなセルロース生産速度の高い菌株や、添加セルラーゼでは分解されにくい高重合度や高結晶度等の性質を有するセルロースを生産する菌株を選抜するスクリーニング方法が示されている。この方法によれば、簡便かつ一度に多検体をスクリーニングできるが、 Ｂiosci.Ｂiotech.Ｂiocheｍ.５９(５),805(1995)には、培地にセルラーゼを添加した場合、セルロース生産菌の代表種である酢酸菌のセルロース生産量が増加するということが記載されており、本先行例が示すようにセルラーゼを添加した培地で生産されるセルロースの量を指標にしてセルロース生産速度の高い菌株や、高重合度、高結晶度等の性質を有するセルロース生産菌株を選抜することは実際には困難である。
【０００６】
以上の点から、セルロース生産速度の高い菌株又は分子量の高いセルロースを生産する菌株を多検体中から簡便かつ迅速にスクリーニングする方法が依然必要とされている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、セルロース生産速度の高い菌株や高分子量のセルロースを生産する菌株等、セルロースの生産性や生産されるセルロースに特徴を有する菌株が水溶性セルロースエーテルを含有した寒天培地上でコロニー形成速度が速い等の特徴を示すことに着目し、変異処理によって得られた変異株につき簡便にかつ一度に多検体をスクリーニングし、その中から上記の特性を有するような所望の菌株を選抜できる方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は、セルロースを生産しうる微生物を培養する工程と、該培養された微生物の複数ロットにそれぞれ変異処理を施し複数の変異株を得る工程と、該得られた複数の変異株をそれぞれ別個に水溶性セルロースエーテル特にカルボキシメチルセルロースあるいはヒドロキシエチルセルロース、及び単糖又は二糖類及び窒素源を含有する培地を用いて固体培養する工程と、各々の変異株の増殖したコロニーについて選抜の指標となる性状を調べ、各々の変異株をその指標となる性状の差に基づいて選抜する工程とを有することを特徴とするセルロース生産菌変異株のスクリーニング方法に関するものであり、
好ましくは、形成されたコロニーの形成速度、セルロース球晶の形成、セルラーゼ活性によって、セルロース生産速度の高い変異株や高分子量のセルロースを生産する変異株、セルロース球晶の生産性の高い変異株等、特定の性質を有するセルロース生産変異株を選抜することを特徴とする。
【０００９】
また、セルロースを生産しうる微生物から変異操作により得られ、かつ該変異した株の選抜の指標となる性状の差に基づいて選抜された変異株を、セルロース及び水溶性セルロースエーテル特にカルボキシメチルセルロースあるいはヒドロキシエチルセルロースの少なくとも一方を炭素源として含み、更に窒素源を含む培地で培養する工程を有し、かつ、得られたバクテリアセルロースが、分子量が100万以上のものであることを特徴とするバクテリアセルロースの製造方法に関するものである。
【００１０】
さらに、前記記載の方法でスクリーニングされたセルロースを生産しうる微生物の変異株により製造され、かつ、分子量が100万以上であることを特徴とするバクテリアセルロースも本発明と関連するものである。
【００１１】
[作用]
液体培養においてカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)等の水溶性セルロースエーテルを添加することでセルロース生産菌の生産したバクテリアセルロースと水溶性セルロースエーテルが複合化し、セルロースの生産量が増加することが知られている(バイオサイエンスとインダストリー vol.５７,Ｎo.６,1999)。その理由としては、水溶性セルロースエーテルがセルロース生産菌の生産したバクテリアセルロースと水素結合を形成し、バクテリアセルロースどうしのミクロフィブリルの形成を阻害すること等が挙げられている。また、結晶構造も水溶性セルロースエーテルとの複合化により本来のバクテリアセルロースのIα型からIβ型に変化することが記述されている。
【００１２】
固体培養、即ち寒天培地に水溶性セルロースエーテルを添加して培養を行なったときの菌の生育やセルロース生産に関しては研究例を見ないが、発明者がＣＭＣを用いて実際に検討を行なったところ、ＣＭＣを添加していない培地よりもＣＭＣを添加した培地の方がコロニー形成速度が増加することが示された。このコロニー形成速度の違いは、コロニー面積あたり３〜７倍以上に及んだ。
【００１３】
このコロニー形成速度が増加した理由としては次のようなことを考える。水溶性セルロースエーテルを添加していない寒天培地では、菌が寒天培地上においてコロニーを形成する際、生産するセルロースがコロニー拡張にとって“たが”になってしまい、コロニー形成速度を抑制しているが、水溶性セルロースエーテルを添加するすると、菌自身のセルロース生産能力が高まることに加え、水溶性セルロースエーテルが菌の生産するセルロースのレールのような役割を担い、生産したセルロース及びそれに付着した菌の寒天培地上での拡散を促進することが考えられる。
【００１４】
実際にＣＭＣを添加した寒天培地上のコロニーを観察すると、コロニー周縁からセルロース繊維と見られる白色、針状の構造が突発的に伸びているのが確認されている。これは寒天培地中のＣＭＣの微視的・局所的な存在形態が菌の生産したバクテリアセルロースの複合化にとって偶然親和性の高い状態に置かれていたためだと考えられる。さらに水溶性セルロースエーテルとバクテリアセルロースが複合化することで結晶構造がIβ型に変化することや、結晶化度が低下すること等から、菌の生産するセルロースがコロニーの拡張にとって“たが”としての剛直性を失うことが原因だと考えられる。
【００１５】
以上のようにＣＭＣ等の水溶性セルロースエーテルを培地に添加することで寒天培地上でのコロニー形成速度が高まることがわかったが、さらに変異処理を行なった変異株を固体培養した場合、ＣＭＣを添加した培地では変異株の種類によってコロニー形成速度に大きな差が見られた。一方、ＣＭＣを添加していない培地では、形成されるコロニーサイズが小さいこともあり、コロニー形成速度の違いを見分けられる変異株の種類ははるかに減少した。これは、ＣＭＣを添加して各変異株が総じてコロニー形成速度を高めることによって、もともと各変異株が有するコロニー形成速度の違いがより明確にされたことによると考えられる。
【００１６】
次に、ＣＭＣを添加した寒天培地上でコロニー形成速度に違いの見られた数種類の変異株をＣＭＣを添加していない培地で液体培養してセルロースを生産させたところ、親株よりコロニー形成速度の高い変異株はセルロース生産速度や生産するセルロースの分子量が高いことがわかった。
【００１７】
これらの実験結果についてさらに検討を進め、第一の発明に至った。すなわち、セルロース生産菌に変異処理を施すことで得られた変異株を水溶性セルロースエーテル及び単糖又は二糖類及び窒素源を含有する培地を用いて固体培養し、得られた変異株のコロニー形成速度が親株のコロニー形成速度より高い変異株を選抜することで分子量の高いセルロースを生産する変異株もしくはセルロース生産速度の高い変異株を取得する、簡便かつ迅速なスクリーニング方法である。
【００１８】
ここで、通常セルロース生産菌によって生産されるセルロースの分子量は数万から数十万であるが、例えば分子量が 10〜20万のセルロースを生産する親株を用いた場合、本方法によって取得した分子量の高いセルロースを生産する変異株が生産するセルロースの分子量は 100万以上である。
【００１９】
第二の発明は第一の発明と同様に変異株を固体培養し、得られたコロニーがセルロース球晶を示す変異株を選抜することでセルロース球晶の生産性の高い変異株を取得するスクリーニング方法である。
【００２０】
球晶とは、多数の微結晶が一点から放射状に配列した球状の多結晶をいい、構成する微結晶の結晶化度の高さや異方性または比対称性から特異な光学的性質を有する。球晶は材料の機械的強度を劣化させるものとして問題視されてきたが、最近では液晶表示素子のような光学材料、耐熱性・耐光性材料としての用途や、成形性向上のために材料中に球晶を形成させることが行なわれている。
【００２１】
球晶を形成する結晶化度の高い有機材料はナイロン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、イソタクチックポリスチレン、結晶化しやすいポリアミドやポリイミド樹脂等がある。セルロースの球晶に関してはセルロース生産菌の作るバクテリアセルロースの中に球晶が形成されることが報告されている(Ｃellulose Ｃheｍistry and Ｔechnology,１５,153(1981))。セルロースの球晶は現在までのところ実用的にはあまり利用されていないが、セルロースのキラルネマチック液晶の光学材料としての研究(Journal of Pulp and Paper Science,２４(５),146(1998))等が盛んになってきていることから、今後光学材料等の応用が期待されている。
【００２２】
水溶性セルロースエーテルを添加した培地で固体培養する本発明の方法により、セルロースの球晶を形成しやすい性質を有する菌株が変異株中から多数取得された。これは寒天培地上のコロニーが球晶そのものとなることで識別され、他の培地においても球晶を形成しやすい菌株であることが分かった。球晶はセルロースの分子量や結晶性によって形成が左右されるので、これらの菌株は球晶の形成にとって好適な性質を有するセルロースを生産する菌株であると考えられる。
【００２３】
一方、水溶性セルロースエーテルを添加していない固体培養では球晶形成菌の取得率は非常に低い。このことから、理由は定かではないが、水溶性セルロースエーテルを添加した寒天培地は水溶性セルロースエーテルとの複合化の点も含めて球晶の形成にとって有利な環境であり、またコロニー形成速度も高くなることから球晶の形成が促進され、視認されやすくなったことが原因ではないかと考えられる。
【００２４】
第三の発明は第一の発明と同様に変異株を固体培養し、培地中の水溶性セルロースエーテルの減少によって評価されるセルラーゼ活性が親株のセルラーゼ活性より高い変異株を選抜することで、水溶性セルロースエーテル及び単糖又は二糖類及び窒素源を含有する培地を用いて液体培養した場合に変異株の生産するバクテリアセルロースと水溶性セルロースエーテルとのセルロース複合体の生産速度の高い変異株を取得するスクリーニング方法である。さらにこの方法によって取得されたセルラーゼ活性の高い変異株を用いて、セルロースや水溶性セルロースエーテルを炭素源とし、それに窒素源を含有した培地によってバクテリアセルロースを生産する方法である。
【００２５】
セルロース生産菌、特に酢酸菌はセルロースを生産するとともにある条件においてセルロースを分解する酵素であるセルラーゼを発現すること、さらにセルロース誘導体(水溶性セルロースエーテル)はセルラーゼの発現を誘導することが知られている(セルロース学会第５回年次大会要旨集、p４８(1998))。酢酸菌がセルラーゼを生産する理由としては、菌が生産するセルロースの分子量を制御するためや、炭素源が豊富なときに備蓄したセルロースを炭素源が不足したときに分解して利用するためのものだという推測がなされている。
【００２６】
そこで第一、第二の発明と同様、培地に水溶性セルロースエーテルを添加すれば、セルロース分解菌がセルラーゼを発現した場合、水溶性セルロースエーテルがセルラーゼによって分解作用を受けるため、試薬等の添加によって水溶性セルロースエーテルの分解の程度を検査すれば、菌株の有するセルラーゼ活性を検出することができる。
【００２７】
セルラーゼ活性の高いセルロース生産菌をスクリーニングすることは以下のような有用性がある。例えば、セルラーゼ活性はセルロース生産菌の生産するバクテリアセルロースと水溶性セルロースエーテルとのセルロース複合体の生産量を増加させることができるため(セルロース学会第５回年次大会要旨集、p４８(1998))、本スクリーニング方法によりセルラーゼ活性の高い変異株等を選抜することで、セルロース複合体の生産速度を高めることができる。また、培地に添加したセルロースや水溶性セルロースエーテルをセルラーゼ活性の高い菌株によって分解させ、分解産物である糖を原料としてバクテリアセルロースを生産することが可能となる。これによって添加したセルロースやセルロース誘導体より物性の優れたバクテリアセルロースを生産できる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以上の第一、第二、第三の発明ではいずれも固体培養の方法は同じであるため、培養後に複数の検出方法を組み合わせることによって、変異株を複数の特性に関して同時に選抜することが可能である。例えば、分子量の高いセルロースを生産する変異株と、球晶を形成する変異株を同時に選抜することが可能である。さらに、分子量の高いセルロースを生産し、かつ球晶を形成する変異株といった複数の特性を同時に有する変異株をスクリーニングすることも可能である。
【００２９】
本発明の変異処理に供する親株としてのセルロース生産菌としてはいかなるものでもよく、例えば、アセトバクター・パスツーリアヌス、アセトバクター・アセチ、アセトバクター・キシリナム等の酢酸菌(アセトバクター属)、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、サルシナ属、シュードモナス属、アクロモバクター属、アルカリゲネス属、アエロバクター属、アゾトバクター属、ズーグレア属等であり、すでに一度変異処理を受けた株であってもよい。
【００３０】
ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処理方法には、例えば、Ｂio Ｆactors,Ｖol.１,p.297-302(1988)及び Ｊ.Ｇen.Ｍicrobiol,Ｖol.１３５,p.2917-2929(1989)等に記載されているものがある。従って、当業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異株は他の変異方法、例えば紫外線照射や放射線照射等によっても得ることができる。
【００３１】
固体培養に用いる寒天培地は液体培養においてセルロース生産菌を培養してセルロースを生産させるときに通常用いる培地成分に、ＣＭＣ等の水溶性セルロースエーテルを適当量添加し、それに培地を固化させて固体培養を行なうための寒天を適当量添加したものを用いる。
【００３２】
通常用いる培地成分としては、炭素源としてシュクロース、グルコース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース等の単糖類または二糖類を使用することができる。 また、窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或いは酵母エキス、ポリペプトンなどの含窒素天然栄養源を使用してもよい。
【００３３】
添加する水溶性セルロースエーテルはカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)、ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)、メチルセルロース(ＭＣ)、ヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ)等を用いることができるが、この中ではＣＭＣ及びＨＥＣが好ましく、特にＣＭＣが好適である。
【００３４】
添加する水溶性セルロースエーテルはスクリーニングの目的とする菌株の性質に応じて添加量を適宜変化させてもよいが、溶解度や寒天培地の性状に対する影響から培地に対する重量濃度として 0.1〜５％とするのが望ましく、さらには 0.5〜１％とするのがより望ましい。
【００３５】
プレート上に出現するコロニー数としては、コロニー形成速度への影響を考え、20〜30個以下とするのが望ましく、適当な希釈段階を用いる。また、特にセルラーゼ活性を検出する場合には、後述するクリアゾーンの識別のしやすさから、10個程度とするのが望ましい。
【００３６】
その他の培養条件は、菌の種類並びに目的に応じて適宜選択することができる。
【００３７】
固体培養の期間は３日間程度行なえば十分に各菌株のコロニーの状態を識別できる状態になる。
【００３８】
プレート上での菌株の識別方法は、まずコロニーの形成速度に関しては、形成されるコロニーの面積を経時的に測定し、それによってコロニー形成速度を実際に求めて親株のコロニー形成速度と比較してもよいが、より正確には親株も同時に固体培養し、その形成されるコロニーの大きさを比較することによって行なえる。
【００３９】
球晶の形成は偏光下で観察すれば明確であるが、本発明の方法であれば、通常の光源のもとで肉眼で観察することによっても容易に識別可能である。
【００４０】
セルラーゼ活性に関しては、菌株の培養後に水溶性セルロースエーテルと反応する試薬を培地に添加し、コロニー周辺に水溶性セルロースエーテルの存在しなくなった部位がクリアゾーンとして表現されることを利用し、そのクリアゾーンの大小によって識別を行なう。試薬としては１％濃度のセチルトリメチルアンモニウムブロミドを用いるのが便利であり、適当量寒天培地表面にかけ流すことで水溶性セルロースエーテルと反応して白濁を生じる。この際、菌株の生産したセルロースと試薬が反応し、それによってクリアゾーンにコンタミが生じることがあるが、寒天培地の下部にのみ試薬を浸潤させたり、試薬を染み込ませたパット等を寒天培地の表面に一定時間重層する等の方法によりコンタミを防止しながらクリアゾーンを検出できる。コロニーと試薬が直接接触すると菌株が死滅する可能性があるので、レプリカ等で別のプレートに菌株を移植してから検査するのがよい。
【００４１】
以上が固体培養によるスクリーニング操作であり、操作内容としては非常に簡便であり、かつ迅速に多検体を処理することができる。
【００４２】
固体培養によって目的の性質を持つものとしてある程度の精度で選抜されるが、それらの菌株を水溶性セルロースエーテルを含まない通常の培地で液体培養し、培養液中に生産されたバクテリアセルロースの生産速度、セルロースの分子量等の物性を測定することで、選抜した菌株の能力を確定することができる。
【００４３】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。
【００４４】
【実施例】
＜実施例１＞
コロニー形成速度を指標としたセルロース生産速度及び分子量の高いセルロースを生産する変異株のスクリーニング
(１)ＮＴＧ変異処理
酢酸菌 Ａcetobacter pasteurianus ＮＣIＭＢ 5346株を GLUCOSE YEAST 培地 10ｍLに植菌して 30℃、12時間培養したのち、培養液中に生成されたセルロースゲルを取り出した。これにセルラーゼ溶液(セルラーゼオノズカをpＨ５のクエン酸緩衝液に５％濃度で溶解し、濾過滅菌)10ｍLを添加し、30℃で２時間振とうしてセルロースゲルを溶解し、ゲルに内包された増殖菌体を脱離させた。
【００４５】
この菌懸濁液を 7000rpｍで 10分間遠心し、上清のセルラーゼ溶液を除いた後、菌体をクエン酸緩衝液 10ｍLに懸濁した。これを再び遠心集菌したのち、クエン酸緩衝液２ｍLに懸濁した。これに 0.05％のＮＴＧ溶液(クエン酸緩衝液)0.5ｍLを添加し、30℃で30分間静置して変異処理を行なった。このときの生存率は約２％であった。
【００４６】
変異処理した菌体を集菌し、前述のように遠心集菌・再懸濁を繰り返して洗浄し、次に GLUCOSE YEAST 培地で 30℃、一夜培養し変異を固定化した。
＜GLUCOSE YEAST 培地＞
Ｙeast extract            10g
Ｇlucose                  50g
蒸留水                     1L
(寒天培地の場合、寒天 12g/L)
(２)固体培養によるスクリーニング
変異株を培養して得られた菌液を滅菌水で数段階希釈し、ＣＭＣを５％含有する GLUCOSE YEAST 寒天培地プレートに塗布し、30℃で３日間静置培養してコロニーを形成させた。そして親株が同プレート培地で形成するコロニーと比較観察して、より大きなコロニーを形成した変異株を選んで、親株よりもセルロース生産速度の高いもしくは分子量の高いセルロースを生産する可能性のある変異株とした。選抜率は 7.5％であった。
【００４７】
また、ＣＭＣを含有しない GLUCOSE YEAST 寒天培地で同様に変異株を固体培養し、同様に親株と比較してコロニー形成速度の高い変異株を選抜したところ、選抜率は 2.4％であった。
【００４８】
《液体培養による変異株の評価》
プレート培養で選んだ変異株を 50ｍL容のグライナー遠心管(グライナー社製)中の GLUCOSE YEAST 液体培地 10ｍLに植菌し、容器を横にして静置培養し、30℃で３日間静置培養した。生産されたセルロースゲルを取り出し、水洗して培地成分を除去した後、0.1Ｎ ＮaＯＨ水溶液中で 30℃、20分間処理し、さらにメタノールに１時間ずつ４回浸してゲル中の水分を除き、減圧乾燥した後乾燥重量を測定した。同様に液体培養した親株が生産するセルロースの乾燥重量を測定し、選抜した変異株の生産したセルロース重量と比較した。
【００４９】
その結果、固体培養での選抜株のうち親株のセルロース生産量より多い、すなわち親株のセルロース生産速度(1.6ｍg乾燥重量/ｍL/３day)より生産速度の高い変異株は 65％であった。それらの変異株のうち、最高の生産速度を示したものでは生産速度は 6.2ｍg/ｍL/３dayであった。
【００５０】
また、ＣＭＣを含有しない固体培養で選抜した変異株を同様に液体培養し、同様にセルロース生産速度を親株と比較したところ、親株より生産速度の高い変異株は選抜菌株中 38％で、最高の生産速度を示す変異株でも 2.8ｍg/ｍL/３dayあった。
【００５１】
また、各変異株の生産したセルロースの分子量を測定した。乾燥したセルロースを発煙硝酸-五酸化リン溶液で Ｗ.J.Ａlexander,Ｒ.Ｌ.Ｍitchell,Ａnalytical cheｍistry ２１,１２,1497-1500(1949)の方法によりニトロ化し、ＴＨＦに 0.05％濃度で溶かしたのち、1.0μｍポアサイズのフィルターで濾過した。 このサンプルをＧＰＣ(Ｔosoh ＨＬＣ-8020)、カラムはＴＳＫgel  ＧＭＨ-ＨＲ(Ｓ)(7.5IＤ×300ｍｍ×２本)とガードカラム(ＨＨＲ(Ｓ))(Ｔosoh Ｃo.,Ｌtd.)を用いて、溶離液にＴＨＦ、流速 0.5ｍL/ｍin、サンプル注入量 100μL、温度 35℃で測定し、ポリスチレン換算で重量平均分子量を計算した。
【００５２】
その結果、選抜変異株と親株の生産したセルロースの分子量を比較したところ、固体培養での選抜変異株のうち、親株の生産するセルロースの分子量(22万)の高いセルロースを生産した変異株は 37％であった。また、それらの変異株のうち最大の分子量を示したものでは分子量は 180万であった。
【００５３】
また、ＣＭＣを含有しない固体培養で選抜した変異株を同様に液体培養し、同様に生産されるセルロースの分子量を親株と比較したところ、親株より分子量の高いセルロースを生産する変異株は選抜変異株中 28％で、最高の分子量を示す菌変異でも 75万であった。
【００５４】
以上のことから、本発明のスクリーニング方法によってコロニー形成速度の高い変異株を選抜することで、セルロース生産速度の高い変異株及び分子量の高いセルロースを生産する変異株を高い確率で選抜できることがわかった。
【００５５】
＜実施例２＞
コロニー形成速度を指標としたセルロース生産速度及び分子量の高いセルロースを生産する変異株のスクリーニング
親株として酢酸菌 Ａcetobacter aceti ＮＣIＭＢ 8132株を、水溶性セルロースエーテルとして５％濃度のヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)を用いた他は実施例１と同様の方法でセルロース生産速度の高い変異株及び分子量の高いセルロースを生産する変異株をスクリーニングした。
【００５６】
その結果、固体培養で 1.8％で選抜された変異株のうち親株のセルロース生産速度(1.2ｍg/ｍL/３day)より生産速度の高い株は 43％であった。それらの変異株のうち、最高の生産速度を示したものでは生産速度は 4.5ｍg/ｍL/３dayであった。
【００５７】
また、親株の生産するセルロースの分子量(15万)よりも高い分子量のセルロースを生産した変異株は 37％であった。また、それらの株のうち最大の分子量を示したものでは分子量は 120万であった。
【００５８】
以上のことから、本発明のスクリーニング方法によって、コロニー形成速度の高い変異株を選抜することで、セルロース生産速度の高い変異株及び分子量の高いセルロースを生産する変異株を高い確率で選抜できることがわかった。
【００５９】
＜実施例３＞
球晶の形成を指標としたセルロース球晶形成能を有する変異株のスクリーニング
実施例１と同様の親株及び条件によって変異処理を行ない、水溶性セルロースエーテルとしてＣＭＣを用いて固体培養を行なった。そして通常の光源下、肉眼によって寒天培地上に球晶の形成が認められたコロニーを選抜した。選抜率は 0.04％であった。また、水溶性セルロースエーテルの含まれていない培地で培養した場合、球晶の認められたコロニーの選抜率は 0.002％であった。
【００６０】
次にこの選抜変異株のコロニーをかきとり、滅菌水に懸濁したのち超音波処理によって分散し、その懸濁液を通常の GLUCOSE YEAST 培地に少量接種し、良く攪拌してから液体培養を行ない、経時的に観察を行なった。その結果、セルロースを生産しはじめた菌の周囲に微細な球晶が観察された。球晶の形成が認められた株は選抜変異株中の 24％であった。また、親株及び球晶を示さない他の変異株 10株につき、同様に液体培養を行ない、観察を行なった結果、球晶を形成した株はなかった。
【００６１】
以上のことから、本発明のスクリーニング方法によりコロニー形状として球晶を示す変異株を選抜することで、球晶形成能を有する変異株を選抜できることがわかった。
【００６２】
＜実施例４＞
セルラーゼ活性を指標としたセルロース複合体生産速度の高い変異株のスクリーニング
実施例１と同様の親株及び条件によって変異処理を行ない、水溶性セルロースエーテルとしてＣＭＣを用いて固体培養を行なった。培養後、形成されたコロニーをレプリカパッドで別のプレートに移植してから、１％濃度のセチルトリメチルアンモニウムブロミドを染み込ませたポリウレタン製のパッドを寒天培地の表面に 10分間重層し、培地表面のバクテリアセルロースを撹乱することなく培地内のＣＭＣと試薬を反応させた。
【００６３】
そしてコロニー周辺のクリアゾーンを観察し、親株が同プレート培地で形成するコロニー周辺のクリアゾーンと比較して、より大きなクリアゾーンを形成した変異株を選び、親株よりもセルラーゼ活性の高い変異株とした。選抜率は 0.4％であった。
【００６４】
その選抜変異株を 50ｍL容のグライナー遠心管(グライナー社製)中のＣＭＣを５％含有する GLUCOSE YEAST 培地で３日間液体培養し、菌が生産するセルロースと培地中に存在するＣＭＣが複合することで形成されるセルロース複合体の生産速度を測定したところ、親株の生産速度(2.5ｍg乾燥重量/ｍL/３day )より生産速度の高い変異株は 35％であった。それらの変異株のうち最高の生産速度を示したものでは生産速度は 8.3ｍg/ｍL/３dayであった。
【００６５】
以上のことから、本発明のスクリーニング方法により、セルラーゼ活性の高い変異株を選抜することで、セルロース複合体生産速度の高い変異株を高い確率で選抜できることがわかった。
【００６６】
＜実施例５＞
セルラーゼ活性の高い菌を用いたセルロースを炭素源としたバクテリアセルロースの生産
実施例４で選抜した変異株のうち、セルラーゼ活性の最も高い株を用いて、セルロースを単一炭素源としたバクテリアセルロースの生産を行なった。
【００６７】
50ｍL容のグライナー遠心管(グライナー社製)中のグルコースを除いた GLUCOSE YEAST 培地に超音波処理によりさらに微細にしたセルロース微結晶粉末(Ａldrich Ｃheｍical Ｃoｍpany Inc.製)を 0.1g添加し、それに菌株を植菌して 30℃で３日間静置培養した。また、対照としてセルロース微結晶粉末を添加しない培地でも同様にして静置培養を行なった。
【００６８】
生産されたセルロースゲルを取り出し、乾燥して重量を測定したところ、0.4ｍg/ｍLであった。この中には最初に添加した微結晶粉末セルロースが生産されたバクテリアセルロースによって包摂された分が含まれる可能性があるが、生産されたセルロースはグルコースを含んだ通常の培地で生産したものと同様のゲル状であった。一方、セルロース微結晶粉末を添加しないグルコースを除いた GLUCOSE YEAST 培地で同様に培養した場合、生産されたセルロースは 0.05ｍg/ｍLであり、ゲル状のものは認められなかった。
【００６９】
以上のことから、本発明のスクリーニング方法により選抜されたセルラーゼ活性の高い変異株を用いて、炭素源にセルロースを用いてバクテリアセルロースを生産できることがわかった。
【００７０】
【発明の効果】
水溶性セルロースエーテルを含有する固体培養を用いた本発明のスクリーニング方法によって、分子量の高いセルロースを生産する変異株、セルロース生産性の高い変異株、セルロース球晶の生産性の高い変異株、バクテリアセルロースと水溶性セルロースエーテルとの複合セルロースの生産速度の高い変異株の選抜を迅速かつ簡便に行なうことが可能となった。
【００７１】
さらに、本方法によって取得したセルラーゼ活性の高い変異株を用いることで、セルロースもしくは水溶性セルロース複合体からバクテリアセルロースを生産することが可能となった。