(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
（ｂ）配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、該ポリペプチドの植物中での発現が該植物の頂端分裂組織の花形成へのスイッチングを制御する、
をコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物。
【請求項２】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する核酸単離物。
【請求項３】
配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する核酸単離物。
【請求項４】
以下のポリペプチド：
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
（ｂ）配列番号５において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、該ポリペプチドの植物中での発現が該植物の頂端分裂組織の花形成へのスイッチングを制御する、
をコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物。
【請求項５】
配列番号４に示すヌクレオチド配列を有する核酸単離物。
【請求項６】
配列番号４において
221位においてｃがｔに；
274位においてｇがａに；
307位においてｇがａに；若しくは
329位においてｇがａに、
置換されたヌクレオチド配列を有する、核酸単離物。
【請求項７】
前記コード化配列の発現のための調節配列を更に含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸単離物。
【請求項８】
前記調節配列が誘導可能プロモーターを含むことを特徴とする請求項７に記載の核酸単離物。
【請求項９】
前記調節配列が、以下のプロモーター：
（ａ）配列番号３のヌクレオチド１〜4417のヌクレオチド配列からなるプロモーター；又は
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１〜4417において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるプロモーターであって、植物内で頂端分裂組織特異的発現を促進する、
を含む、請求項７に記載の核酸単離物。
【請求項１０】
植物細胞の形質転換に適し、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８及び１０のいずれか１項に記載の核酸を含む宿主細胞であって、ここで該核酸が前記細胞に対して異種性である、前記宿主細胞。
【請求項１２】
微生物である請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
植物細胞である請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記核酸をゲノム内に有する請求項13に記載の植物細胞であってここで、該核酸が前記細胞に対して異種性である、前記植物細胞。
【請求項１５】
半数体ゲノム当り１超の前記ヌクレオチド配列を有する請求項14に記載の植物細胞。
【請求項１６】
請求項13〜15のいずれか１項に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１７】
真に人工受粉で作り出さ（breed）ない請求項16に記載の植物。
【請求項１８】
請求項16又は17に記載の植物の自殖もしくはハイブリッド子孫、又は種子のような前記植物もしくは子孫のいずれか一部もしくは零余子。
【請求項１９】
請求項13〜15のいずれか１項に記載の細胞を含む請求項18に記載の子孫、一部又は零余子。
【請求項２０】
植物の頂端分裂組織の花形成へのスイッチングを制御する方法であって、前記植物の細胞内で、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸によりコードされる産物の発現を引きおこし又は許容することを含み、ここで、該核酸が前記細胞に対して異種性である、前記方法。
【請求項２１】
植物の頂端分裂組織の花形成へのスイッチングを制御する方法であって、前記植物の細胞内で、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸からの転写を引きおこし又は許容することを含み、ここで、該核酸が前記細胞に対して異種性である、前記方法。
【請求項２２】
トランスジェニック植物の生産における請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
開花遺伝子
本発明は、開花の遺伝制御に関し、アンチルリヌム（Antirrhinum）のcen遺伝子及びアラビドプシス（Arabidopsis）のtfl1遺伝子のクローニングに基づく。
アリエル（ariel）植物発達に関連する分裂組織には３つの主な型：生長（vegitative）、花序及び開形成（floral）がある。アンチルリヌム・マジュス（Antirrhinum majus）のような多くの種の頂端の分裂組織は、最初に生長期に入り、頂端の横の細胞が軸のまわりの生長的分裂組織と共に葉の原基になる（Coen，1991）。開の誘導に基づいて、頂端の分裂組織は花序分裂組織に変わる。花序に一般に関連する特徴は、葉の器官の変化及び節間の長さの変化である。アンチルリヌムの花序は、頂端の分裂組織が無限花序に成長する総状花序又は穂状花序である。開の分裂組織は変化した葉の軸内でおこり、有限で、花の器官原基の４つの輪状体又は環帯を作り出す。これにより、頂端の分裂組織は２つの別個のアイデンティティー、生長及び次の花序を通り過ぎる。末端に花を形成する種においては、頂端の分裂組織は有限であり、そして最終的に第３のアイデンティティー、開の分裂組織のそれになる。重要な発達の問題は、いかにして頂端の分裂組織のアイデンティティーが制御されるかを理解することである。
アンチルリヌムのセトトロラジアリス（centroradialis）（cen）変異体は、最初に、Gatersleben, Germany（Kuckuck and Schick, 1930；Stubbe, 1966）に記載される。cen変異体は、頂端分裂組織が開の分裂組織に変わる前にいくつかの腋生の花を作り出す。これにより、cen植物においては、頂端の分裂組織が３つの別個のアイデンティティー：生長、花序及び次の開形成を通り過ぎる。それゆえcenの野生型の役割は頂端分裂組織が開花へスイッチするのを防ぐことである。
アンチルリヌムのcen変異体はいくつかの点で野生型と異なり得る。変異体は末端に花を形成し、その花序を無限花序から有限花序に変化させる。結果として、その構造はより短く、より短木の植物に変化する。ここで枝条は無限花序に成長することができない。約10の腋生の花が末端の花の下に作られる。その末端の花の分裂組織はその下の腋生の花より先に発達する。腋生の花と違い、器官数及びそれらの配置（葉序）は末端の花において極めて種々である。末端の花は通常、放射状に対称であり、ここで全ての花弁は液生の花の腹部の（最も低い）花弁に似る。
cenに似た変異体であるterminal flower1（tfl1）はアラビドプシスにおいて記載されている（Shannon and Meeks-Wagner, 1991；Alvarezら、1992）。分裂組織のアンデンティティーに影響を与えることに加えて、tfl1変異体も早期に開花する。それゆえ、tfl1遺伝子の通常の役割は、開花を限害すること及び頂端分裂組織が花形成へスイッチすることを防ぐことである。
アラビドプシスにおいて、tfl1変異体は、野生型から区別される２つの重要な特徴を有し：早期に抽苔し、そして頂端分裂組織は最終的に開形成アイデンティティーを獲得し、末端の花の形成を導く（図１）。典型的には、ロゼットの葉の通常の数の約半分が、抽苔の前に形成され、約１〜５の末端の花が、花序の頂端の分裂組織が最終的に開形成アイデンティティーを獲得する前に作られる。その末端の花の構造はしばしば野生型と異なる。野生型の花は器官の４つの輪生体；４つの最も外部のがく片、６つのおしべ及び２つの心皮の中心輪状体からなる。アラビドプシスのtfl1変異体の末端の花において、器官の数はしばしば種々であり、それらは野生型の輪生の配置と違い、らせん状に生じ得る。２つの型の花の器官から構成されるモザイク器官も見い出すことができる。これらの表現型の効果の全ては、開花時期の著しい変化を除いて、アンチルリヌムのcen変異体においても見い出される。
それゆえこれらの遺伝子両方は頂端分裂組織のアイデンティティーにおいて重要な役割を演ずる。
cenの機能及びそれが機能する分子経路を示すために、その遺伝子を単離するためにトランスポゾン変異誘発プログラムを作った。1992年において、cenの３つの新しい対立遺伝子（cen-663，cen-665及びcen-666）が上手く単離され、そして１の対立遺伝子中のcen表現型に連結されたトランスポゾンが同定された。1994年初期に、このトランスポゾン挿入物の側面にあるDNAは、cen座がクローンされ、cen cDNAの単離及びその発現のキャラクタリゼーションを許容することを示すのに用いられた。CENは、動物の脂質結合性タンパク質のクラスに似ており、枝条頂端において発現される。
本発明は、アンチルリヌムからのcen遺伝子及びアラビドプシス、tfl1からの同族体のクローニングに基づく。Broadleyら（Nature 1996, Vol.379, 791〜797（cen））及びBradley, Carpenter及びCoen,“Conserved control of in florescence architecture in Arabidopsis and Antirrhinum”も参照のこと。
本発明の一態様によれば、cen，tfl1又は無限（indeterminacy）機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸単離物を提供する。当業者は、用語“cen機能”、“tfl1機能”及び“無限機能”が開花の時期及び／又はアンチルリヌム又はアラビドプシスの各々cen又はtfl1遺伝子に表現型的に似た花形成にスイッチすることからの分裂組織の防止に影響を与える能力をいうことを認めるであろ。“無限花序機能”とは分裂組織成長を無限に維持する能力をいう。本発明の特定の実施形態は、アンチルリヌム又はアラビドプシス中のcen又はtfl1変異体を補足する能力を有し得る。
本発明の種々の態様による核酸はcenもしくはtfl1遺伝子の配列を有し得、又は供される配列の突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子であり得る。好ましい突然変異体、変異体、誘導体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされる産物の機能的特徴、特にcenに関して頂端の分裂組織が開形成にスイッチするのを阻害する能力及び／又はtfl1に関して開花を阻害／遅延する更なる能力を保持する産物（核酸分子又はポリペプチド）をコードするものである。他の好ましい突然変異体、変異体、誘導体及び対立遺伝子は野生型と比較して開花を促進する産物又は花形成への頂端分裂組織のスイッチングを供し及び／又は促進する配列の遺伝子をコードする。突然変異体、変異体又は誘導体を作り出すための配列の変換は、コードされたポリペプチド産物における１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導き得る核酸中の１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の付加、挿入、欠失又は置換により得る。もちろん、コードされるアミノ酸配列に差を形成しない核酸の変化も含まれる。
本発明の好ましい実施形態において、核酸分子は図４（ａ）に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。そのヌクレオチド配列は図４（ａ）に示されるコード化配列を含み得、又は同じアミノ酸配列をコードするその突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子であり得る。
更なる実施形態において、本発明による好ましい核酸分子は図６（ａ）に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、又は同じアミノ酸配列をコードするその突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子であり得る。
図に示される配列からの変換又は差を含む配列も、本明細書に議論されるように本発明に用いられ得る。
本発明は、いずれかの供された配列を有する核酸を含むベクター、好ましくは、その核酸配列によりコードされた産物ポリペプチド又は核酸分子が発現され得るベクターも提供する。そのベクターは、好ましくは植物細胞への形質転換に適している。本発明は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を更に含む。これにより、本発明による核酸を含む宿主細胞、例えば植物細胞が供される。その細胞内で、その核酸は染色体内に組み込まれ得る。半数体ゲノム当り１を超える異種ヌクレオチド配列が存在し得る。これは、例えば、以下に議論されるように、内在レベルと比較して遺伝子産物の発現を増加させることができる。
本発明による核酸を含むベクターは、特にそのベクターがゲノム内への組換えのための細胞内にその核酸を導入するのに用いられるなら、プロモーターを含む必要はない。
本発明による核酸分子及びベクターは、単離されて及び／又はそれらの天然の環境から、実質的に純粋なもしくは均一な形態で、又は関心の種の核酸もしくは遺伝子もしくは要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の源がないもしくは実質的にない状態で供される。本発明による核酸は、cDNA，RNA、ゲノムDNAを含み得、そして全体的又は部分的に合成であり得る。用語“単離物”は、全てのこれらの可能性を含み得る。
本発明は、いずれの開示される核酸配列の発現産物も、適切な宿主細胞中で適切な条件下でそのためのコード化核酸からの発現により発現産物を作る方法も含む。当業者は、十分に、ベクターを作り、組換え遺伝子発現の産物の発現及び回収のためのプロトコルをデザインすることができる。プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適切な他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターを選択し、又は作製することができる。更に詳しくは、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrookら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。形質転換手順は用いる宿主によるが、公知である。例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、細胞内へのDNAの導入及び遺伝子発現における核酸の操作、並びにタンパク質の分析のための多くの周知の技術及びプロトコルは、Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubelら、eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載される。Sambrookら及びAusubelらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。
例えばそれのためのコード化核酸からの発現により組換えにより産生された精製されたタンパク質、又はそのフラグメント、突然変異体又は変異体は、当該技術で標準的な技術を用いて抗体を作るのに用いることができる。抗体の抗原結合フラグメントを含む抗体及びポリペプチドは、更に後に議論される他の種から相同体を同定するのに用いることができる。
抗体を作り出す方法は、タンパク質又はそのフラグメントでの哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル）を免疫化することを含む。抗体は、当該技術で周知である種々の技術のいずれかを用いて、免疫化した動物から得ることができ、好ましくは関心の抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングすることができる。例えば、ウェスタンブロッティング技術又は免疫沈降を用いることができる（Armitageら、1992, Nature 357：80〜82）。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。
哺乳動物を免疫化するためのかわりのもの又はそれへの補足物として、適切な結合特異性を有する抗体を、例えばそれらの表面上に機能的イムノグロブリン結合ドメインを示すラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、発現されるイムノグロブリン可変ドメインの組換えにより作られたライブラリーから得ることができる；例えばWO 92／01047を参照のこと。
ポリペプチド又はペプチドに対する抗体は、相同なポリペプチド、及び次にコード化遺伝子の同定及び／又は単離に用いることができる。これにより、本発明は、（本明細書に開示される実施形態に従う）要求される機能を有するポリペプチドを同定又は単離する方法であって、CENもしくはTfl1ポリペプチド又はそのフラグメントもしくは変異体に結合することができるか又は好ましくはそのポリペプチドに結合特異性を有する、例えば図４又は図６に示されるアミノ酸配列を有する抗体の抗原結合ドメイン（例えば全抗体又はそのフラグメント）を含むポリペプチドで、候補のポリペプチドをスクリーニングすることを含む方法を提供する。前記ポリペプチド又はその突然変異体、変異体又は誘導体に結合し又は好ましくはそれらに特異的である抗体の抗原結合ドメインを含む抗体及びポリペプチドのような特異的に結合するメンバーは、それらの使用及びそれらを用いる方法と共に、本発明の更なる態様を示す。
スクリーニングするための候補のポリペプチドは、例えば関心の植物から得られた核酸を用いて作られた発現ライブラリーの産物であり得、又は天然のソースからの精製過程の産物であり得る。
抗体に結合することが見い出されたポリペプチドは、単離され、次にアミノ酸配列決定にかけられ得る。全体的又は部分的にポリペプチドを配列決定するためにいずれかの適切な技術を用いることができる（例えばポリペプチドのフラグメントを配列決定することができる）。アミノ酸配列情報は、例えば候補の核酸へのハイブリダイゼーションにおけるプローブ又はプライマーとして用いるための１又は複数のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドの縮重したプール）をデザインすることにより、又はコンピューター配列データベースを調査することにより、そのポリペプチドをコードする核酸を得るのに用いることができる。
本明細書に供されるヌクレオチド配列情報又はそのいずれか一部は、その発現産物が植物の開花特徴に影響を与える能力についてテストされ得る相同な配列を見い出すためにデータベースにおいて用いることができる。相同体を配列決定し、それらの発現パターンを研究し、そしてそれらの発現を変える効果を検査することにより、同様の機能を行う遺伝子を得ることができる。
本発明の更なる態様は、アンチルリヌム・マジュス以外の植物種からのcen相同体を同定及びクローニングする方法であって、図のいずれかに示されるものから得られたヌクレオチド配列を用いる方法を提供する。本明細書に供されるヌクレオチド配列情報又はそのいずれか一部は、その発現産物が植物分裂組織及び／又は他の開花特徴に影響を与える能力についてテストされ得る相同配列を見い出すためにデータベース調査において用いることができる。これらはcenもしくはtfl1機能又は各々の突然変異表現型を補足する能力を有し得る。好ましい実施形態において、用いられる配列は、本明細書に供されるcen及びtfl1遺伝子により共有されるものである。核酸ライブラリーは、当業者に公知である技術を用いてスクリーニングされ得、そしてそれにより相同な配列が同定され、次にテストされる。
例えば、このような方法は、相同体について調査するために図４及び６の配列間に保存された配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることができる。これにより、その発現が植物の開花特徴に影響を与えることができる核酸を得る方法であって、標的／候補核酸への上述のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は核酸分子のハイブリダイゼーションを含む方法を提供する。標的又は候補核酸は、例えば前記核酸を含むことが知られている又はそれを含むと推測される生物から得ることができるゲノム又はcDNAライブラリーを含み得る。成功したハイブリダイゼーションが同定され得、そして更なる研究及び／又は使用のために標的／候補核酸が単離され得る。
ハイブリダイゼーションは、核酸をプローブし、（周知の技術に従う）適切なストリンジェント条件下で陽性ハイブリダイゼーションを同定すること及び／又はPCRのような核酸増幅の方法におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用に関連し得る。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究され得る陽性体として同定された少数のハイブリダイゼーションの単純なパターンであるのに十分にストリンジェントであるものである。少い陽性クローンのみが残るまで、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを次第に増加させることは当該技術で公知である。
プロービングのかわりに、なお核酸ハイブリダイゼーションを用いるが、DNA配列を増幅するようデザインされたオリゴヌクレオチドを、PCR反応又は慣用的な手順を用いる核酸の増幅に関する他の方法に用いることができる。例えば、“PCR protocols; A Guide to Methods and Applications”, Eds.Innisら、1990, Academic Press, New Yorkを参照のこと。
プローブ又はPCRプライマーのデザインに用いるのに適した好ましいアミノ酸配列は、開花特徴、特に頂端分裂組織の開花へのスイッチングに影響を与えることができる少くとも２つのポリペプチド間に（完全に、実質的に又は部分的に）保存された配列、例えば本明細書の図４及び６のアミノ酸配列である。
アミノ酸配列情報に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、遺伝コードの縮重を考慮してデザインすることができ、そして適切なら、候補核酸からの生物のコドン利用がもたらされる。
好ましくは、例えば核酸増幅に用いるための、本発明によるオリゴヌクレオチドは約10又はそれ未満のコドン（例えば６，７又は８）、即ち長さが約30又はそれ未満のヌクレオチド（例えば18，21又は24）である。
このようなPCR産物が耐性遺伝子に相当するか否かの評価は、種々の方法において行うことができる。このような反応からのPCRバンドは産物の複合混合物を含み得る。個々の産物をクローンすることができ、そして各々個々にスクリーニングすることができる。それは、関心の植物への導入に基づく機能を評価するために形質転換により分析することができる。
本発明は、図に供される配列情報（アミノ酸及び／又はヌクレオチド）から得られたヌクレオチド配列を用いて得られるcen又はtfl1相同体をコードする核酸にも広げられる。
これにより、アンチルリヌムのcen又はアラビドプシスのtfl1の相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸分子は本発明の範囲内に含まれる。相同体はヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列レベルにおいてであり得る。好ましくは、相同体の核酸又はアミノ酸配列、又は突然変異体、対立遺伝子もしくは変異体（上記参照のこと）は、図４又は図６のヌクレオチド配列の配列と、又はそれによりコードされる配列と、好ましくは少くとも約50％、又は少くとも約60％、又は少くとも約70％、又は少くとも約75％、又は少くとも約80％の相同性、最も好ましくは少くとも約90％の相同性で相同性を有し、そしてそのコードされた産物は、cen及び／又はtfl1遺伝子と表現型、好ましくは開花への頂端分裂組織のスイッチング及び／又は開花の時間に影響を与える能力を共有する。その影響は、野生型と比較して、上記スイッチング及び／又は開花を促進し又は遅らせることができる、“相同性”とは、機能的用語において、当該技術で標準的であるようなアミノ酸配列の類似性をいうと理解され得る。これにより、例えばａ％類似性の数字は、ロイシンからイソロイシンへのような機能的重要性がほとんどないか又は全くないアミノ酸の差を含むであろう。さもなければ、相同性は、同一性をいうと考慮され得る。
例えば、経済的に重要な単子葉植物の作物、例えばコメ及びトウモロコシからの遺伝子相同体が同定され得る。単子葉植物及び双子葉植物中の同じタンパク質をコードする遺伝子は、そのヌクレオチドレベルにおいて比較的ほとんど相同性を示さないが、アミノ酸配列は保存されている。
特定の実施形態において、特定の配列の対立遺伝子、変異体、誘導体、突然変異体又は相同体は、少しの全体的相同性しか示さず、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％又は約45％の特定の配列との相同性を示し得る。しかしながら、機能的に重要なドメイン又は領域において、アミノ酸相同性はよりかなり高くなり得る。そのポリペプチドのアミノ酸配列の比較は、機能的に重要なドメイン及び領域、即ち頂端分裂組織のスイッチング及び／又は開花の時期のような植物の開花特徴に影響を与える役割を示す。欠失変異誘発は、例えばポリペプチドの領域の機能及びその役割又は時期のような開花特徴の影響の必要性をテストするのに用いることができる。
また、本発明によれば、そのコードされたポリペプチドの発現の制御のためのプロモーターの作用的制御下で、そのゲノム内に組み込まれた本発明により供されるようなヌクレオチドの配列を有する植物細胞を提供する。本発明の更なる態様は、前記植物を作る方法であって、ヌクレオチドの配列を含むベクターを植物細胞内に導入し、そして該ヌクレオチドの配列をゲノム内に導入するためにベクターと植物細胞ゲノムとの間の組換えを引きおこし又は許容することを含む方法を提供する。
本発明は、例えば細胞又はその祖先への核酸の導入の結果として、本発明による核酸を含む植物細胞を含む植物、並びに該植物の自家又はハイブリッド子孫及びいずれかの派生物、並びに前記植物、子孫又は派生物のいずれか一部又は零余子、例えば種子を更に包含する。
特定の実施形態において、本発明による植物は、真に人工受粉で作り出さ（breed true）ないものでもあり得る。安定性、即ち人工受粉で作り出す能力は植物が植物品種権（Plant Variety Rights）を受けるためのUPOV条約の要求である。
本発明は、頂端分裂組織スイッチング及び／又は植物の開花特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内に、異種のcen又はtfl1遺伝子配列（又は議論されるような突然変異体、対立遺伝子、誘導体又は相同体）の発現を含む方法を更に提供する。用語“異種”とは、問題の遺伝子（ヌクレオチドの配列が、遺伝子工学を用いて、即ちヒトの介入により、例えば適切な形質転換技術を用いて、前記植物の細胞又はその祖先に導入される。その遺伝子は、ゲノム外ベクターであり得、又はゲノム内に好ましくは安定に、組み込まれ得る。その異種遺伝子は、内因性の等価の遺伝子、即ち同じ又は類似した機能を通常行うものと置きかわることができ、又はその挿入された配列は、内因性遺伝子に付加することができる。異種遺伝子の導入の利点は、遺伝子発現に影響を与え、それゆえ優先に従って植物表現型に影響を与えることができるために、選択されたプロモーターの制御下で遺伝子の発現を行う能力である。更に、野生型遺伝子の突然変異体、変異体及び誘導体、例えば野生型より高い又は低い活性のものが内在性遺伝子のかわりに用いることができる。
本発明を用いて変えることができる主な特徴は、開花への分裂組織のスイッチ及び開花の時期を制御することである。tfl1遺伝子の遺伝子産物の過剰発現は、開花を遅くさせることができ、下降発現は早熟の開花を導き得る。下降制御は、例えば以下に更に議論されるアンチセンス又はセンス制御のような“遺伝子サイレンシング”技術で行うことができる。
この制御の程度は、例えばハイブリッド生産における雄及び雌親系の同調した開花を確実にするのに役立つ。他の使用は、成長する時期を伸ばし又は減少させるために、天候による命令に従う開花を進め又は遅らせることである。同様に、頂端分裂組織の開花へのスイッチングは、cen又はtfl1遺伝子産物のレベルに従って遅延され又は促進され得る。cen又はtfl1の下降制御に基づく末端の開花表現型への無限成長の転換は、特定の期間で完全に発達し、成熟し及び／又は乾燥する限られた数の果実又は種子の発達を許容し得る。これは、未発達の、熟していない及び／又は乾燥していない果実又は穀物の収集が要求されない場合に有益であり得る。例えば、寒さが落ち込み時期尚早に発達及び成熟過程を停止した時のクロロフィルをまだ含む若い成熟していないカノーラ（canola）種子は、要求されない緑色である粉砕された油の更なる高価な精製を要求する。
CEN／Tfl1を過剰発現する穀物又は果実は、特定の作物の収率を増加させるのに用いることができる。有限から無限又は無限から有限のいずれかの観賞植物種の構造、特に花を変えることは、商業的に価値あるものであり得る。
本発明による核酸は、外部から誘導できる遺伝子プロモーターの制御下におかれ、これにより分裂組織スイッチングの時期及び／又は開花を使用者の制御下におく。誘導可能なプロモーターの使用を以下に記載する。これは、花の形成及び次の種子の形成のような出来事が、切り花又は装飾用植木鉢における、市場の要求に合致するよう時期を合わせることができる点で有利である。鉢の植の開花を遅らせることは、生産者からの売る地点への生産物の輸送のために利用できる期間を長くし、開花期間を長くすることは購入者に明らかに有利である。
プロモーターに適用される“誘導可能”という用語は当業者に十分理解される。本質において、誘導可能なプロモーターの制御下での発現は、適用された刺激に応じて“スイッチ−オン”され又は増加される。刺激の性質はプロモーター間で種々である。特定の誘導可能プロモーターは、適切な刺激の欠如下で、少い又は検出できないレベルの発現を引きおこす（又は発現を引きおこさない）。他の誘導可能プロモーターは、刺激の欠如下で検出可能な構成的発現を引きおこす。発現のレベルが刺激の欠如下であっても、いずれかの誘導可能プロレーターからの発現は、正確な刺激の存在下で増加する。好ましい状況は、表現型の特徴を変えるのに有効な量による関連ある刺激の適用に基づいて増加する場合である。これにより、そのレベルが極めて低くほぼ要求される表現型をもたらさない（実際、０であり得る）レベルの刺激の欠如下での発現の基底レベルを引きおこす誘導可能（又は“スイッチ可能”）プロモーターを用いることができる。刺激の適用に基づいて、発現は、ほぼ要求される表現型をもたらすレベルまで増加（又はスイッチ−オン）される。
適切なプロモーターは、本質的に全ての植物組織内で高レベルに発現されるカリフラワーモザイクウイルス35Ｓ（CaMV 35S）遺伝子プロモーター（Benfeyら、1990a及び1990b）；外因性セーフナー（safener）の適用に応じて活性化されるトウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼイソホームII（GST-II-27）遺伝子プロモーター（本発明に好ましい）；生長頂端分裂組織並びに植物の体内のいくつかの十分に局在化した位置、例えば根及び枝条内の内篩部、花原基、分枝点内で発現されるカリフラワーmeri5プロモーター（Medford, 1992; Medfordら、1991）；及び花の発達において極めて早期に発現されるアラビドプシス・タリアナLEAFYプロモーター（Weigelら、1992）。
本発明の一態様は、トランスジェニック植物の生産における本発明による核酸の使用である。
選択された遺伝子構成物を細胞内に導入する場合、当業者に公知である特定の考慮が払われなければならない。挿入されるべき核酸は、転写を促進するであろう有効な調節因子を含む構成物内でアセンブルされるべきである。その構成物をその細胞内に輸送する方法が利用できなければならない。その構成物が細胞膜内に入った後、内在性の染色体材料への組込みがおこるか又はおこらないだろう。最終的に、植物を考慮する限り、標的細胞型は、細胞が全体の植物内に再生され得るようでなければならない。
その配列を含むDNAセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝操作について既に知られている普通の技術によって作ることができる。DNAは、いずれかの適切な技術、例えばその天然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリウムが有するジスアームド（disarmed）Ti−プラスミドベクター（EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR12（22）8711-87215, 1984）、粒子又はマイクロプロジェクティルボンバードメント（US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616）、マイクロインジェクション（WO 92／09696, WO 94／00583, EP 331083, EP 175966, Greenら（1987）Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press）、エレクトロポレーション（EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser）、直接的DNA取込みの他の形態（DE 4005152, WO 9012096, US 4684611）、リポソーム媒介性DNA取込み（例えばFreemanら、Plant Cell Physiol. 29：1353（1984））、又はボルテキシング法（例えばKindle, PNAS U.S.A. 87：1228（1990d））を用いて植物細胞内に形質転換することができる。植物細胞の形質転換のための物理的方法は、Oard, 1991, Biotech.Adv. 9：1-11に報告されている。
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物種を形質転換するために当業者に広く用いられる。現在、ほとんど全ての経済的に関連のある双子葉植物における安定な豊富なトランスジェニック植物のルーチン的生産に対する実質的な進展がある（Toriyama，ら．（1988）Bio／Technology 6, 1072-1074; Zhang，ら．（1988）Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang，ら．（1988）Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto，ら．（1989）Nature 338, 274-276; Datta，ら．（1990）Bio／Technology 8, 736-740; Christou，ら．（1991）Bio／Technology 9, 957-962; Peng，ら．（1991）International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao，ら．（1992）Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li，ら．（1993）Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore，ら．（1993）Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm，ら．（1990）Bio／Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm，ら．（1990）Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin，ら．（1992）Plant Cell 4, 1495-1505; Walters，ら．（1992）Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel，ら．（1993）Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I.K.（1994）Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks，ら．（1993）Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers，ら．（1992）Bio／Technology 10, 1589-1594; WO92／14828）。特に、アグロバクテリウム媒介性の形質転換は、現在、単子葉植物における非常に有効なかわりの形質転換法としても浮かび上がっている（Hieiら（1994）The Plant Journal 6, 271〜282）。
豊富なトランスジェニック植物の形成は、穀物、コメ、トウモロコシ、コムギ、オート及びオオムギにおいて達成されている（Shimamoto, K.（1994）Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil，ら．（1992）Bio／Technology 10, 667-674; Vainら., 1995, Biotechnology Advances 13（4）: 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702に報告されている）。
マイクロプロジェクティルボンバードメントエレクトロポレーション及び直接的DNA取込みは、アグロバクテリアが効率が悪いか又は効果がない場合に好ましい。あるいは、形質転換法の効能を増強するために、異なる技術の組合せ、例えば創傷を導くためのアグロバクテリアでコートされた微粒子でのボンバードメント（EP-A-486234）又はマイクロプロジェクティルボンバードメントの後に、アグロバクテリウムの同時培養（EP-A-486233）を用いることができる。
形質転換の後、植物は、当該技術で標準的であるように、例えば単一細胞、カルス組織又は葉の円盤状組織から、再生することができる。植物の細胞、組織及び器官からほとんどいずれの植物も全体的に再生することができる。利用できる技術は、Vasilら（Cell Culture and Somatic Cell Cenetics of Plants, Vol I, II及びIII、Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984）及びWeissback and Weissback（Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989）に報告される。
形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換する効能並びに選択された特定の方法で本発明を行う人の経験及び好みにより決定されよう。核酸を植物細胞に導入するための形質転換システムの特定の選択は、本発明に本質的でなく、又は本発明を限定するものでもない。また植物再生のための技術の選択もそうである。
本発明において、過剰発現はセンス方向におけるヌクレオチド配列の導入により達成することができる。これにより、本発明は、植物の開花特徴、例えば分裂組織スイッチングに影響を与える方法であって、前記植物の細胞内の核酸から、本発明による核酸のヌクレオチド配列によりコードされる産物（ポリペプチド又は核酸）の発現を引きおこし又は許容することを含む方法を提供する。
遺伝子産物ポリペプチドの下降発現は、アンチセンス技術又は“センス制御”を用いて達成することができる。遺伝子発現を下降制御するためのアンチセンス遺伝子又は部分的遺伝子配列の使用は現在、十分に確立されている。二本鎖DNAは、DNAの“アンチセンス”鎖の転写が標的遺伝子の“センス”鎖から転写される通常のmRNAに相補的であるRNAを作り出すように、“逆方向”においてプロモーターの制御下におかれる。その相補的アンチセンスRNA配列は、次に、mRNAに結合して二本鎖を形成し、標的遺伝子からの内在性mRNAのタンパク質への転写を阻害すると考えられる。これが作用の実際の態様であるか否かはまだ不確かである。しかしながら、技術が働くことは確かな事実である。例えば、Rothsteinら、1987 PNAS USA, 84: 8439-8443; Smithら、（1988）Nature 334, 724-726; Zhangら、（1992）The Plant Cell 4, 1575-1588, Englishら．，（1996）The Plant Cell 8, 179-188を参照のこと。アンチセンス技術は、Bourque（1995）（Plant Science 105, 125-149）及びFlavell（1994）（PNAS USA 91, 3490-3496）にも報告されている。
逆方向におけるコード化配列に相当する完全な配列は用いる必要はない。例えば、十分な長さのフラグメントを用いることができる。アンチセンス阻害のレベルを最適化するためにコード化配列の種々の大きさの及び種々の部分からのフラグメントをスクリーニングすることは当業者にとってルーチン的事項である。開始メチオニンATGコドン、及びおそらく該開始コドンの上流に１又は複数のヌクレオチドを含むことが有利であり得る。適切なフラグメントは、約14〜23ヌクレオチド、例えば約15，16又は17ヌクレオチドを有する。
これにより、本発明は、植物の開花特徴、例えば分裂組織スイッチングに影響を与える方法であって、前記植物の細胞内での本発明による核酸からのアンチセンス転写を引きおこし又はそれを許容することを含む方法も提供する。
標的遺伝子の付加的複製を標的遺伝子と同じ方向であるセンスで挿入した場合、過剰発現がおこる個体及び標的遺伝子からのタンパク質の下降発現がおこるいくつかを含む特定範囲の表現型が形成される。その挿入された遺伝子が内在性遺伝子の一部だけである場合、そのトランスジェニック集団の下降発現する個体の数は増加する。センス制御、特に下降制御がおこるメカニズムは十分に理解されていない。しかしながら、この技術は、科学及び特許文献にも十分に報告されており、遺伝子制御のためにルーチン的に用いられている。例えば、van der Krolら（1990）The Plant Cell 2, 291〜299; Napoliら（1990）The Plant Cell 2, 279〜289; Zhangら（1992）The Plant Cell 4, 1575〜1588を参照のこと。
これにより、本発明は、植物の開花及び／又は分裂組織スイッチング特徴に影響を与える方法であって、開花特徴に影響を与える能力を有するポリペプチドの活性を抑制するために前記植物の細胞内での本発明による核酸からの発現（少くとも転写）を引きおこし又は許容することを含む方法も提供する。ここで、そのポリペプチドの活性は好ましくは、その植物細胞内の下降発現の結果として抑制される。
上述のように、遺伝子の発現パターンは、それを外来プロモーターに融合することによって変えることができる。例えば、国際特許出願WO 93／01294（Imperial Chemical Industries Limited）は、トウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、isoform II遺伝子（GST-II-27）の27kDサブユニットから単離された化学的に誘導可能な遺伝子プロモーター配列を記載する。形質転換により外因性遺伝子に連結し、植物内に導入された場合に、GST-II-27プロモーターは、外因性遺伝子の発現の外部的制御のための手段を提供する。
GST-II-27遺伝子プロモーターは、成長中の植物に適用することができる特定の化学的化合物によって誘導されることが示されている。そのプロモーターは、単子葉植物及び双子葉植物の両方に機能的である。それゆえそれは、農作物、例えばカノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ；穀物、例えばコムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、モロコシ種；果樹、例えばトマト、マンゴー、モモ、リンゴ、西洋ナシ、サクランボ、バナナ、及びメロン；並びに野菜、例えばニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギを含む種々の遺伝子に改良された植物において遺伝子発現を制御するのに用いることができる。GST-II-27プロモーターは、根、葉、幹及び再生組織を含む種々の組織に用いるのにも適している。
従って、本発明は、更なる態様において、本発明により供されるヌクレオチド配列に作用的に結合した誘導可能プロモーターを含む遺伝子構成物を提供する。これは、遺伝子の発現の制御を可能にする。本発明は、前記遺伝子構成物で形質転換された植物並びに上述のような構成物の植物細胞内への導入及び／又は適切な刺激、有効な外因性インデューサーの適用による植物細胞内での構成物の発現の誘導を含む方法も提供する。そのプロモーターは、GST-II-27遺伝子プロモーター又はいずれかの他の誘導可能な植物プロモーターであり得る。
センス構成物の正規の場所外の発現は、開花を阻害し、分裂組織を無限成長に変えるのに用いることができる。これは、その収量が特に発現が後に止められる場合に、より長い生長を有することにより増加することができる作物に役立つ。例えばplena／agamousプロモーター下でのcenの限られた発現は、花弁に包まれた無限花序の幹、潜在的に高い飾りついた幹を形成し得る。
アンチセンス又は同時抑制構成物、変異体選択又は遺伝子活性に影響を与える他のメカニズムは、異なる種においてcen及び相同体を阻害し、無限花序頂端分裂組織を花に転化することができる。これは、側生及び“短木様”発達を促進するために、頂部が摘みとられなければならない場合、又はより大きな花又は果実を供するために花の数を制限する場合に作物に役立ち得る。切り花産業は新しい品種を楽しむことができ、他方果樹及び紙木産業は、分枝構造の変化から利益を得ることができる。
議論されるように、tfl1遺伝子は、開花を遅らせる効果も有する。これにより、開花時期に影響を与えるために、センス及びアンチセンス構造の両方を用いることができる。テンサイ及びレタスのような開花を遅らせること、又は開花を促進させることから利益を得る種においては、議論されるように、トランスジェニック体はtfl1又は適切な相同体、変異体もしくは誘導体を用いることができる。
その表現型がcen／tfl1に相補的であり、そしてその逆も可であるflo又はlfyのような他の遺伝子の発現を調節するために、cen及びtfl1遺伝子を用いることができる。
分子及び表現型分析の両方はcen／tfl1とflo／lfyとの間の相互のアンタゴニズムを示す。開花の通常のパターンは、これら２つのアンタゴニスト活性間のバランスがいかにして確立されるかによる。このバランスを操作することにより、要求される結果を達成するために異なる方法で開花を制御することができる。cen／tfl1を発現する系の表現型は、遺伝的に（例えばflo／lfy又はその相同体を発現する植物の選択された表現型と、cen／tfl1又はその相同体を発現する植物の選択された表現型を交配することにより）、又は遺伝子転移的に（例えば、flo／lfyと比較してcen／tfl1を誘発するのにより強力な又はより弱いプロモーターを用いる発現カセットを用いることにより）、flo／lfy発現を変えることにより変えることができ、その逆も可である。例えば、延長された生長期でcen／tfl1を過剰発現する植物は、誘導可能プロモーターの制御下でflo／lfy構成物の活性化により花を誘導することができる。
予備的分析は、cenがちょうど根の分裂組織より下にある頂端領域にその発現を制限することを示す。それゆえ、cenプロモーターは適切な核酸構成物を用いる頂端への遺伝子の指図された発現に用いることができる。
例えば、cenプロモーターは、花序及び／又は花の分裂組織へスイッチする頂端分裂組織を阻害しそれにより抽苔及び／又は開花を防ぐために、適切な植物毒を発現するのに用いることができる。
この目的のための適切な植物毒は、これらに限定されないが、リボソーム阻害タンパク質（Lordら．（1991）Seminars in Cell Biol. 2: 15-22, Stirpe et al.（1992）Bio／Technology 10: 405-412）例えばジアンチン（Legnameら．（1991）Biochem.Biophys. Acta 1090: 119-122）、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（PAP）（Chenら．（1993）Physiol.Mol.Plant Pathol. 42: 237-247）、リシンＡ（Endo及びTsurugi（1988）J.Biol.Chem. 263: 8735-8739）、リボヌクレアーゼ、例えばバルナーゼもしくはRNAse T1（Marianiら．（1990）Nature 347: 737-741, Mariani et al.（1992）Nature 357: 384-387）又はジフテリア毒素Ａ鎖（Thorsnessら．（1991）Dev.Biol. 143: 173-184）を含み得る。
従って、本発明の更なる態様は、cenプロモーター配列、例えば図４に示されるプロモーター配列、又はその突然変異体、誘導体、変異体、対立遺伝子もしくは相同体、特にcen組織発現パターンに適合し又はそれに類似した組織パターンで組織特異的発現を促進する能力を保持するものを含む核酸単離物を提供する。予測されるプロモーターは、NT4327の図４の上流、おそらく開始コドンの500nt内にある。核酸は、選択されたヌクレオチド配列が発現のための（適切な方向、間隔等を用いる）プロモーターの制御下におかれる遺伝子構成物であり得る。核酸操作及び植物形質転換、及び本発明のこの態様を行うために必要な他の手順のための技術は、cen及びtfl1遺伝子、相同体、突然変異体及び誘導体に関して先に開示される。
本発明は、ヌクレオチド１−4417として図４（ｂ）に示されるヌクレオチド配列又は植物内で頂端分裂組織特異的発現を促進するプロモーター能力を供するその突然変異体、対立遺伝子、変異体、誘導体、相同体、もしくはフラグメントを含むプロモーターを含む又はそれから本質的になる核酸単離物を提供する。
そのプロモーターは、要求される組織特異性で遺伝子発現を促進するのに十分な図４（ｂ）に示される配列の１又は複数のフラグメントを含み得る。要求される最小の配列を決定するために、核酸を消化し、次に（テスト配列に作用的に結合したGUSのようなリポーター遺伝子を含む構成物で植物を形質転換することに関する）適切なアッセイを行うために、制限酵素又はヌクレアーゼを用いることができる。本発明の好ましい実施形態は、組織特異的プロモーター活性のために要求される図４（ｂ）に示される最小のヌクレオチド配列を有する核酸単離物を提供する。
“プロモーター”とは、下流に（即ち二本鎖DNAのセンス鎖上で３′方向に）作用的に連結されたDNAの転写が開始し得るヌクレオチドの配列を意味する。
“作用的に結合”とは、同じ核酸分子の一部として、転写がプロモーターから開始するための適切な位置及び方向で結合することをいう。プロモーターに作用的に結合したDNAは、そのプロモーターの“転写開始制御下”にある。
本発明は、本明細書に供されるプロモーターにおける１又は複数のヌクレオチド付加、挿入、置換及び欠失による、対立遺伝子；突然変異体、変異体又は誘導体であるヌクレオチド配列を有するプロモーターに広げられる。ヌクレオチドを変化させるための核酸の系統的又はランダム変異誘発は、当業者に周知であるいずれかの技術を用いて行うことができる。本発明によるプロモーター配列への１又は複数の変換はプロモーター活性を増加又は減少させることができる。
“プロモーター活性”とは転写を開始する能力をいうために用いられる。プロモーター活性のレベルは、例えばそのプロモーターからの転写により産生されるmRNAの量の測定により又はそのプロモーターからの転写により産生されるmRNAの翻訳により産生されるタンパク質産物の量の測定により定量することができる。発現システム内に存在する特定のmRNAの量は、例えばmRNAとハイブリダイズすることができ、標識される特定のオリゴヌクレオチドを用いて決定することができ、又はポリメラーゼ鎖反応のような特定の増幅反応に用いることができる。リポーター遺伝子の使用は、タンパク質生産を引用することにより、プロモーター活性の測定を容易にする。
本発明の種々の実施形態において、図４（ｂ）に示されるプロモーターの配列の１又は複数のヌクレオチド付加、挿入、欠失又は置換によるフラグメント、突然変異体、対立遺伝子、誘導体又は変異体である配列を有するプロモーターは、示される配列の一方又は両方と少くとも約60％の相同性、好ましくは少くとも約70％の相同性、より好ましくは少くとも約80％の相同性、より好ましくは少くとも約90％の相同性、より好ましくは少くとも約95％の相同性を有する。本発明の実施形態による配列は、示される配列又は（DNAは一般に二本鎖であるので）その相補配列の一方又は両方とハイブリダイズすることができる。
本発明は、更に、発現されるべきヌクレオチド配列、例えばコード化配列又は（例えばセンス又はアンチセンス制御のための）要求されるRNAをコードする配列に作用的に結合された本発明によるプロモーターを含む又はそれから本質的になる核酸構成物である。その遺伝子は、cenのそれ以外の配列を意味する異種であり得る。一般に、その配列は、発現後に検出されそして好ましくは定量され得るペプチド又はポリペプチド産物に翻訳され得るmRNA内に転写され得る。そのコードされた産物が発現後にアッセイされ得る遺伝子は、“リポーター遺伝子”、即ちプロモーター活性を“レポートする”遺伝子をいう。
更に、本発明の態様として、本発明によるプロモーターを含む核酸を含むベクター構成物及び宿主細胞が供される。宿主細胞は微生物又は植物であり得る。品種又はそうでなくても、前記植物細胞を含む植物も、トランスジェニック植物の生産における前記核酸の使用も本発明により供される。植物内のものであり得る植物細胞のような宿主細胞中でのプロモーターからの発現を引きおこし又はそれを許容する方法は、本発明の更なる態様である。
本明細書に言及される全ての文献は引用により組み込まれる。
本発明を行うための実験研究は、添付の図面を引用して記載されよう。
図１：tfl1変異体及び野生型植物の絵
野生型（図１ａ）において、花序は無限的に成長し、そして花（円）は、無限花序分裂組織の末端（黒ぬりの矢印の頭）から生ずる。tfl1植物（図１ｂ）において、花序はしばしば単一の末端の花に置き換わる。
図２：ゲノムDNAブロット
野生型アンチルリヌム祖先系（JI.2 WT）、もとのGatersleben cen対立遺伝子（cen-594）及び変異誘発JI. WT植物及びcen-594間の交配から生じたＦ１集団において同定された３つの新しいcen対立遺伝子（663，665及び666）をEcoRＩで消化し、ブロットし、そしてpJAM2017の隣接領域でプローブした（図３を参照のこと）。cen-594対立遺伝子から生じた変異誘発において生じた野生型Ｆ１姉妹細胞（sib）及び野生型復帰変異体（Revt）を同様に処理した。
図３：cen座
図３（ａ）：cen-663対立遺伝子を有するcenゲノム領域のマップ。トランスポゾンTam6の挿入部位は、EcoRＩがＥで、XbaＩがＸで示される。cen-663を有する植物のcen表現型で分離するのに用いられる内部Tam6 XbaＩフラグメントは、ゲノムDNA消化物を部分的にのみ切断するEcoRＩ部位（Ｅ）に隣接する。これは、cen-663からの6.0kbフラグメントの単離を許容し、pJAM2017としてクローンした。図２のゲノムDNAをプローブするのに用いた２kb隣接領域（AccＩ，Ａ，EcoRＩフラグメントに）は、その座の下のより太い線として示される。6.5kb EcoRＩ野生型ゲノムフラグメントをpJAM2018としてサブクローンした。７kbのBamHＩ，ＢをpJAM2019としてサブクローンした。これらの野生型クローンの配列決定は、各々中抜きの四角並びにｇ及びｆで示されたアンチルリヌム遺伝子グロボサ（globosa）及びFIL1の上流領域に類似する２つの領域を示した。
図３（ｂ）：cen遺伝子の構造及び配列決定により決定されたトランスポゾン形成対立遺伝子の挿入。エキソンは、コードするものについて黒塗りの、翻訳されないものについて中抜きの四角によって示される。イントロンは水平線により示される。垂直線上の三角は、示される対立遺伝子のトランスポゾン挿入部位を示す。矢印は、転写の方向を示す。
図４
図４（ａ）は、５′及び３′RT-PCR産物からのcen cDNAのヌクレオチド配列並びにゲノム配列との比較を示す。その縮重したアミノ酸配列及び最も長いオープンリーディングフレームを下に示す。
図４（ｂ）は、cen遺伝子を含む、ゲノム配列を示す。cen cDNA配列は、下側に、予想されるアミノ酸配列で供される。上側は、５′及び３′領域並びにイントロンを示す。プロモーター配列が含まれる。
図５：動物脂質結合性タンパク質に対するcenの類似性
アンチルリヌムのcenの縮重したタンパク質遺伝子産物（Cen）、ラットのモルフィン−もしくは脂質−結合タンパク質（Pbp1）及びウシホスファチジルエタノールアミン−結合タンパク質（Pbp）についてのアミノ酸配列（一文字コード）を示す。
図６：
図６（ａ）は、アラビドプシスESTから得られたtfl1 cDNAのヌクレオチド配列、及びその予想されるコードされるアミノ酸配列を示す。すぐ上の塩基で置換した下線の塩基で示されるように、tfl1対立遺伝子において点変異を検出した。これらの変異は、コードされたアミノ酸配列における変化：tfl1-1においてグリシンをアスパラギン酸に、tfl1-11においてグリシンをセリンに、tfl1-13においてグルタミン酸をリシンに、そしてtfl1-14においてトレオニンをイソロイシンに変化させた。
図６（ｂ）は、EST cDNAクローン129D7T7を含むアラビドプシスクローンのゲノム配列を示す。EST cDNA配列は、下側に、その予想されるアミノ酸配列で供される。上側は５′及び３′領域並びにイントロンを示す。
図７：cenに類似したアラビドプシス及びコメExpressed Sequence Tags
アラビドプシスクローン（Arab）を完全に配列決定し、そして全長であることを明らかにし、他方、コメクローン（Rice 1946）は３′末端においてのみ配列決定した。データは、コメクローンがプロセシングされていない転写物からのcDNAであることも示唆した。それゆえ、ほぼ３′コード化領域のみが転写されて、示される予想されるペプチドを供した。データベースからの別個のコメクローンRice 2918もプロセシングされていないようであり、それゆえ、cenのエキソン２及び３のそれに似た２つのペプチドａ及びｂを比較のため翻訳した。
図８：cen及びtfl1の異所発現のためのプラスミド構成物
cen及びtfl1オープンリーディングフレームをカリフラワー35Ｓプロモーターの下流にクローンし、バイナリーベクター（SLJ44024A）内に挿入して、各々プラスミドpJAM2075（図８（ａ））及びpJAM2076（図８（ｂ））を供した。
材料及び方法
植  物
オリジナルのcen対立遺伝子cen-594をGatersleben, Germanyから得た。グロボサ（globosa）対立遺伝子を含むストックJI.2の誘導体を用いた。このJI.系の植物を15℃で成長させ、次に１５℃で増殖させたcen-594と交配するのに用いた（Carpenterら、1987）。これらの交配からの子孫を成長させ、３つの新しいcen対立遺伝子cen-663，cen-665及びcen-666を得た。各々のファミリーからのこれらのＦ１植物及び３つの野生型姉妹細胞を切断物として維持した（Carpenter and Coen, 1995）。
DNA及びRNA分析
DNA及びRNA抽出のための方法及びブロット分析を、上述（Coenら、1986；Coen及びCarpenter, 1988）の通り行った。スクリーニングに用いたTam6フラグメントは、EcoRＩ部位により両側に隣接した４kb XbaＩフラグメントであった（図３のマップを参照のこと：Doyleら、未出版）。Tam6でcen-663内で同定された6.0kb EcoRＩフラグメントを、（オリジナルのＦ１の自殖から得た）ホモ接合cen-663植物からのゲノムDNAを消化し、アガロースゲル電気泳動によりDNAを分画し、そして５〜７kbの大きさの画分を電気溶出することにより単離し、これをNACS PREPACカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィー（Bethesda Research Laboratories, Inc.）により精製し、そしてKitプロトコルに記載されるようなEcoRＩで消化され、ホスファターゼ処理されたラムダgt10（Amersham cDNA迅速クローニングモジュール−ラムダgt10コードRPN1713）に連結した。試験管内パッキング（AmershamモジュールN3342）は、約150,000の組換え体のライブラリーを供し、それをTam6プローブを用いてスクリーニングした。6.0kbのEcoRＩフラグメントを含む１つの陽性体を、3.6及び2.4kbバンドは種々の量で存在したが、単離し、精製した。その6.0kbフラグメントをBluescriptベクターKS+（Stratagene）内にサブクローンしてpJAM2017を供し、そしてマッピングした時、3.6及び2.4kbフラグメントを供する内部EcoRＩ部位を示した。これは、6.0kbバンドが、スクリーニングに用いたTam6及び内部XbaＩプローブのマップから予想されるように、部分的にのみ消化されたことを示唆した。Tam6に隣接する領域（2kb AccＩ-EcoRＩフラグメント）を用いてSau3Aで部分的に消化された野生型アンチルリヌムDNAのラムダEMBL4ライブラリーをスクリーニングするのに用いた。約500,000の組換え体から、平均サイズ15〜16kbの挿入を有する７のオーバーラップするクローンを単離した。これらのクローンを用いてゲノム領域のマップを作製し、異なる対立遺伝子に応じた挿入物の適切な位置を決定した。正確な挿入部位を、両方の方向においてcenに対するオリゴヌクレオチド、及び転置要素のCACTAファミリーに対する保存されたオリゴで、各々の対立遺伝子のゲノムDNA上のPCRを用いて決定した（Doyleら、未出版）。6.5kbのゲノムクローンpJAM2018は全ての対立遺伝子の挿入部位を含んでいたが、野生型アンチルリヌムの若い花序から単離したポリ（A）RNAから作製されたcDNAライブラリーに対してプローブとして用いた場合にいずれのcDNAクローンも同定しなかった（Simonら、1994）。それゆえ、cen-663対立遺伝子に隣接する小さな領域（約200bp）を、United States Biochemical CorporationからのSequence version 2を用いるジデオキシヌクレオチド法（Chen及びSeeburg, 1985）により配列決定した。この配列に基づくオリゴを、野生型及びcen変異体の若い花序からの全RNAに基づくRT-PCRについて、可能なオープンリーディングフレームにおいて両方向においてデザインした。これは、対立遺伝子各々において発現されないcen-663内の挿入物に隣接する領域起源のcDNAを同定した。この部分的cencDNAをpJAM2020としてBluescriptベクターKS+にサブクローンした。ゲノムクローン及びcDNAクローンの両方を全体的に配列決定して、イントロン−エキソン境界を決定した。cen mRNAの５′末端をcDNA末端の迅速増幅のための５′RACEのキット（Gibco BRL）を用いて決定した。完全なcen cDNAを、便利な制限酵素部位を用いて異なるRT-PCR産��から作製した。データベース・サーチは、BLASTIN（Altschulら、1990）及びFASTA（Pearson及びLipman, 1988）を含む。
アラビドプシスクローン129D7T7を、Ohio StateのArabidopsis Biological Resoure Centerから得て、それは、もとはＡ．タリアナ変異コロンビア（A.thaliana var Columbia）から単離し、MSU-DOE, MichiganのNewmanらによって部分的に配列決定されたものであった（受託番号T44654）。コメクローンS1946＿1AをSasakiら（National Institution of Agrobiological Resoure Rice Genome Resource Project, Ibaraki, Japan）から得て、それは、オリザ・サチバ（Oryza sativa）から単離したものであった（受託番号D40166）。コメクローンR2918＿1Aの部分的配列はデータベースから得た。クローンされたアラビドプシスのマッピングは開示される通りであった（Schmidtら、1994）。
in situハイブリッド形成
RNAプローブのジゴキシゲニン標識形成、組織調製及びin situハイブリダイゼーションのための方法は記載される通りである（Bradleyら、1993）。部分的cen cDNAの内部AccＩ−RsaＩフラグメントpJAM2020をBluescriptベクターKS+にサブクローンし、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼを用いるアンチセンス及びセンス制御プローブを作るのに用いた。fflの内部フラグメントをPCRにより作り、pGEM-Tベクター（Promega）にサブクローンしてプラスミドpJAM2045を供し、そしてＴ７及びSP６ポリメラーゼを用いてアンチセンス及びセンスプローブを作るのに用いた。
構成物及び形質転換
cen及びtfl1オープンリーディングフレームを単離し、その各々をプラスミドSLJ4D4及びSLJ4KI各々のGUS遺伝子を置換するのに用いた（Jonesら、1992）。CaMV 35Sプロモーター及びocs又はnosターミネーター各々に隣接したcen及びtfl1オープンリーディングフレームを単離し、バイナリーベクターSLJ44024A（Jonesら、1992）にクローンしてpJAM2075及びpJAM2076を供した。アラビドプシスの形質転換を、真空浸透（vacuum infiltration）（Bechtoldら、1993）及び根形質転換（root transtormation）及び再生（Valvekansら、1988）により行った。
結  果
新しいcen対立遺伝子の単離
Gaterslebenから得たオリジナルのcen対立遺伝子（cen-594）の初期の分析は、それはあまり不安定でなく、それゆえトランスポゾン誘導され得ないことを示唆した。更に、それは、John Inne系に存在するものに利用できるプローブからのトランスポゾンの全く異なるアレイを有し得る系内であった。それゆえ、1990年に、特異的タグの試みが、Gatersleben対立遺伝子と交配した15℃で生長させたトランスポゾン活性John Innes系を用いて作られた。選択された系は、ストックJI.2の誘導体であり、新しいグロボサ（globosa）（glo）対立遺伝子を含んでおり、これは、トランスポゾンはglo領域内でおそらく活性であることを示唆した。初期のマッピングデータはcen及びgloの間の連結を示唆し、この系がcenの近くの活性トランスポゾンのソースを供し得る（Stubbe, 1966）。また、トランスポゾンは連結した部位にジャンプする傾向があるので、cenにおける挿入物の頻度はこの系内に増強することができた（Coenら、1988）。1992年には、約10,000の植物のスクリーンから、cenの３つの新しい対立遺伝子がＦ１形成において上手く単離された。これらの対立遺伝子の生産は、cenが単離されるのを許容する道具である特有のリソースを供した。
野生型及びcen変異体の記載
全てのcen対立遺伝子における早期の開発は野生型；休眠の又は更なる生長枝条を有する葉を生産する生長期を進む頂端分裂組織としてであった。開花に基づいて、野生型及びcen変異体の両方の頂端分裂組織は、それらの軸内に花を有する変化した葉（苞葉）を作り出すようスイッチした。しかしながら、野生型はこの状態を維持したのに対し、cen植物の頂端分裂組織は、いくつかの補助的な花が形成された後に花に変わった（図１）。温室又は制御された環境の条件（16時間の日照時間で20〜25℃）において、各々の対立遺伝子の主要な枝条上に約５〜20の補助的な花が形成され、そして側生の枝条上にはほとんどなかった。その新しい対立遺伝子は、末端の花の前に形成された補助的な花の数及び頂端の花の形態の両方において変化を示した。頂端の花の特定範囲の対称が、補助的な花のそれに近い形態への放射状の対称から見い出された。
cenのクローニング
cen-663及び３つの野生型Ｆ１姉妹細胞からのゲノムDNAをEcoRＩで消化し、トランスポゾンTam1〜Tam8でプローブした。Tam6プローブは、cen-663中に特有に存在し、cen表現型に連結した6.0kbのバンドを供した。cen-663の野生型、ストックJI.2への戻し交雑から、Ｆ２ファミリーの個体からDNAをプローブすることにより連結を確立した。そのフラグメントを、EcoRＩ消化ゲノムcen-663 DNAの５〜７kb画分を単離し、ラムダベクターに連結し、そしてその生じたライブラリーをTam6でスクリーニングすることにより、単離した。陽性クローンを単離し、そしてその挿入物をBluescriptベクターKS+にサブクローンしてpJAM2017を供した。このクローンをマッピングして、その隣接領域を、異なるcen対立遺伝子及び野生型姉妹細胞に対するプローブとして用いた（図２）。cen-663において、予想される6.0kbのバンド及び種々のレベルの2.5kbバンド（6.0kbフラグメントの誘導体、以下に説明する）を検出し、他方野生型祖先、JI.2は6.5kbのバンドを供した。特異的タグ実験で親として用いたGaterslebenからの対立遺伝子cen-594は、8.1及び2.5kbのバンドを供した。予想される通り、これらの２つのバンドは全てのF1 cen対立遺伝子及びそれらの野生型姉妹細胞中に存在した。しかしながら、各々のcen変異体は6.5kbの先祖野生型バンドを失っていた。cen-665においては、3.4kbの新しいバンドが存在し、他方cen-666及び野生型はいずれの新しいバンドも存在しなかった。cen-666対立遺伝子はホモ接合状態で得られず、未知の大きさの欠失を有するようであった。我々が、ホモ接合のcen-594，cen-663及びcen-665の復帰変異体子孫の分析からのcen座の部分をクローンし、15℃で成長させ、自殖した試験が野生型表現型の復帰変異体子孫を供したことは、これらの対立遺伝子が各々トランスポゾン挿入により引きおこされることを示した。各々の場合の復帰変異体は、それらのヘテロ接合表現型から予想されるように、6.5kbの復帰した野生型バンド及び各々の対立遺伝子の対応する変異体バンドを有した（図２）。
野生型ゲノムライブラリーからのオーバーラップするクローンを単離してcen領域のマップを作製するのに用いた（図３ａ）。野生型6.5kb EcoRＩフラグメントをpJAM2018としてクローンし、全体を配列決定した。異なるcen対立遺伝子を引きおこす挿入物を、最初にゲノムDNAブロットによりマッピングした。cen領域へのオリゴヌクレオチドとの組合せにおいて、アンチルリヌム中のトランスポゾンのファミリーのCACTA末端への保存されたオリゴヌクレオチド（オリゴ）を用いて（以下を参照のこと）、示される対立遺伝子を正確にマッピングした（図３ｂ）。異なる挿入物は6.5kb EcoRＩフラグメントの右手端がcen機能に重大であることを示した。しかしながら、pJAM2018のこれ及び他の領域を野生型アンチルリヌムの若い花序からのポリ（A）RNAから作られたcDNAライブラリーをプローブするのに用いた場合、ハイブリダイズするクローンは検出されなかった。RNAブロットも同様に不確定的にプローブされたので、約200bpの隣接するcen-663対立遺伝子を配列決定した。この配列及び両方の方向における可能なオーブンリーディングフレーム（ORF）に基づくいくつかのオリゴを合成し、野生型アンチルリヌム又はcen変異体、若い花序又は生長枝条及び葉からの全RNAでのRT-PCRに用いた。同じ方向（図３のマップにおいて左から右に５′から３′）を示すオリゴのみがPCR産物を供し、これはcen対立遺伝子のRNAから欠如していた。
３′PCR cDNAをpJAM2020としてクローンし、cen mRNAの５′末端を５′RACE-PCRにより決定した。完全な予想されるcDNA及びORFを決定した（図４）。その転写単位は約930bpを含む４つのエキソンからなっていた。ORFは20.3kDaの181アミノ酸タンパク質をコードする能力を有していた。データベースに対する調査は、動物中に存在する脂質結合タンパク質のファミリーに最も類似性を示した（図５）。大きな類似性の領域はそのタンパク質全体を通して広がっており、潜在的なヌクレオチド結合領域は部分的に保存されていた（CEN残基116〜132）。これらのタンパク質は、GTP−結合タンパク質とも複合体形成できるが、両方の機能のためのドメインは明らかに定義されなかった。
プローブとしてcen cDNAを用いて、野生型アラビドプシス・タリアナ変種コロンビアのゲノムライブラリーを適度なストリンジェンシーでプローブした。１つの強くハイブリダイズするクローンを単離し、そのプローブに最も似た領域を全体的に配列決定した（図６）。合間に、データベースサーチは、cenに似たアラビドプシスExpressed Sequenced Tags（EST）クローン129D7T7を同定した。アラビドプシスクローンの完全な配列決定は、cenに対して70％同一で、約82％類似した予想されるタンパク質（Arab）を示した（図７）。アラビドプシスEST配列はゲノムクローンと同一であり、イントロン−エキソン構造を測定するのを許容した（図６）。これは、イントロンについて同一の位置でcen遺伝子に極めて似ていた。更なるデータベースサーチは、その部分的配列がcenに似た位置でイントロンを有するようである２つのコメのクローン（S1946＿1A及びR2918＿1A）を同定した。これらの配列は、Ｃ末端、Rice 1946についてのcenの端と80％の同一性を有する60アミノ酸ペプチド、及びcenのエキソン２及び３と高い類似性を示す２つの予想されるペプチド（Rice 2918a及びｂ）を予測した（図７）。
cenに対する相同体としてのtfl1の同定
アラビドプシスクローン129D7T7を、染色体５の端に最も近い利用できるRFLP及びYACマーカーを用いてマッピングした。tfl1変異はこの領域をマッピングした。この配列に基づくプライマーを、tfl1の４つの対立遺伝子内の対応するゲノム領域（tfl1-1，tfl1-11，tfl1-13，tfl1-14）を単離するのにPCRで用いた。
異なるtfl1対立遺伝子の配列比較のため、野生型アラビドプシス（Columbia）及びtfl1対立遺伝子-1，-11，-13又は-14を有する植物を長期間、土の上で成長させ、そしてミニプレップ法を用いてゲノムDNAを単離した。凍結しながら葉の組織をホモジナイズし、緩衝液（50nM EDTA、0.1Ｍ Tris-HCl、pH８、１％ SDS）を加え、そしてそのサンプルを65℃で２分、解凍した。DNAをフェノール、フェノール−クロロホルム、クロロホルムで抽出し、そしてイソプロパノール／酢酸ナトリウムで沈殿させた。エタノールで洗った後、DNAをRNaseを含むTE中に再懸濁した。ATGの上流約160bp及び停止コドンの下流120bpを配列決定するためにオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。PCR人偽結果を避けるために、各々のDNA調製物に基づいて３つの別個のPCRを行い、各々からの１つのPCR産物をpGEM-Tベクター（Promega）にクローンした。約1.3kbの各々のクローンを、ABI Prismシステム（Perkin-Elmer）を用いて配列決定し、いずれか１つの対立遺伝子についての全部で３つのPCR産物中に存在する塩基変換のみを本物であると考えた。
全部で４つの対立遺伝子が、予測されるアラビドプシスタンパク質を破壊するであろう変異を示し、この遺伝子がtfl1であることを証明した。その変換を図６（ａ）に示し、そして図に示されるように単一ヌクレオチド変異であり、次のアミノ酸変換：tfl1-1−グリシンからアスパラギン酸へ、tfl1-11グリシンからセリンへ、tfl1-13−グルタミン酸からリシンへ、そしてtfl1-14−トレオニンからイソロイシンへ：を生じた。（ヌクレオチドとアミノ酸との両方の変異体配列は各々本発明の態様である）。
cen及びtfl1の発現研究
cen及びtfl1 RNAの時期的及び一組織学的分布を、アンチルリヌム及びアラビドプシス各々の野生型組織に対するtfl1アンチセンスRNA上のジゴキシゲニン標識cenを用いるin situハイブリダイゼーションにより決定した。野生型において、cen及びtfl1は、頂端分裂組織直後の領域における若い花序の枝条頂端において発現される。
アラビドプシスにおけるtfl1及びcenの異所性発現
cen及びtfl1を過剰発現させるために、それらの各々のオープンリーディングフレームをカリフラワー35Ｓプロモーターの下流にクローンし、バイナリーベクター内に挿入してプラスミドpJAM2075及びpJAM2076を供し（図８）、形質転換のために用いた。35S-cen構成物で１つの形質転換体を得て、これは、抽だい及び開花の遅れ並びに花の葉の多い枝条への転化を示した。35S-tflで６つの形質転換体を得、それら全てが花の葉の多い枝条への転化を示した。それらは、特定範囲の開花及び抽だい時期も示し、そして最も厳しい場合、開花は野生型と比較して大きく遅れた（ロゼット葉の通常の数の２倍超）。これらの結果を合わせると、cen又はtfl1の異所性発現が開花を遅らせることができることを示す。更に、アラビドプシスの開花時期を変えるアンチルリヌムのcen遺伝子の能力は、これらの遺伝子が広い分類学的距離を横切って機能し得ることを示す。
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【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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