(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される有機物質層、該有機物質層上に配置されるビオチン層、該ビオチン層上に配置されるアビジン層、及びビオチン標識核酸を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項２】
前記有機物質層が３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、メルカプトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカプト−１−アミノブタン、１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパン、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉草酸、メルカプトアセトアルデヒド、２−メルカプトプロピルアルデヒド、３−メルカプトブチルアルデヒド、又は４−メルカプトバレルアルデヒドにより形成された層であることを特徴とする、請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項３】
透明基板上に、金属膜、有機物質層、ビオチン層、アビジン層、及びビオチン標識核酸を、この順に配置していくことを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。
【請求項４】
前記有機物質層が３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、メルカプトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカプト−１−アミノブタン、１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパン、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉草酸、メルカプトアセトアルデヒド、２−メルカプトプロピルアルデヒド、３−メルカプトブチルアルデヒド、又は４−メルカプトバレルアルデヒドを用いて形成させることを特徴とする、請求項３記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、臨床検査等で免疫反応を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサーが使用されている。
【０００３】
このような表面プラズモン共鳴を利用した装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）では、測定対象物と相互作用をする生理活性物質を装置内の測定チップに固定して測定を行う。測定チップは、通常、ガラス基板とその上に形成される金属膜と金属膜に結合するカルボキシメチルデキストランからなり（例えば、ファルマシアバイオセンサー社製BIAcore 2000用の測定チップ）、カルボキシメチルデキストランに生理活性物質を固定化する。
【０００４】
しかし、カルボキシメチルデキストランに、抗体や酵素などの蛋白質を固定化することは容易であるが、核酸のような酸性物質を固定化することは非常に難しい（「蛋白質  核酸  酵素」Vol 37 No.15 2997-2984(1992)）。また、前記測定チップの層構造では、測定対象物と実質的にかつ効率的に相互作用する生理活性物質は、カルボキシメチルデキストランからなる層の表面に露出するものだけであるため、層の内部に結合されている生理活性物質は有効に機能せず、その分感度が低下することとなる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、核酸を効率的に固定化することができ、また、固定化する核酸が少量であっても、良好な感度が得られる表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は、金属膜上に、ビオチン層を介してアビジン層を形成させることにより、アビジン層に効率的にビオチンで標識した核酸を固定化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される有機物質層、該有機物質層上に配置されるビオチン層、及び該ビオチン層上に配置されるアビジン層を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップである。
【０００８】
また、本発明は、透明基板上に、金属膜、有機物質層、ビオチン層、及びアビジン層を、この順に配置していくことを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ（以下、単に「測定チップ」という）とは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに測定対象物と相互作用をする物質を固定化する部分とを含む部材をいい、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００１０】
本発明の測定チップは、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される有機物質層、該有機物質層上に配置されるビオチン層、及びビオチン層上に配置されるアビジン層を備えている。ここで、「透明基板上に配置される金属膜」とは、金属膜が直接接して透明基板上に配置されている場合のほか、金属膜が透明基板に直接接することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意である。「金属膜上に配置される有機物質層」、「有機物質上に配置されるビオチン層」、及び「ビオチン層上に配置されるアビジン層」も上記と同様の意味である。
【００１１】
本発明の一例による測定チップの断面概略図を図１に示す。
本実施例による測定チップは、透明基板１と、透明基板１上に形成された金属膜２、金属膜２上に形成された有機物質層３、有機物質層３上に形成されたビオチン層４、及びビオチン層４上に形成されたアビジン層５の５層からなる。
透明基板１としては、通常表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるものであればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
【００１２】
金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金属膜２に使用することのできる金属の種類としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独で又は組み合わせて使用することができる。また、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１３】
金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるのが好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。3000Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが好ましい。
【００１４】
金属膜２の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いるのが好ましい。
有機物質層３は、金属膜中の金属原子と結合することができ、かつ、ビオチン層４のビオチン分子とアミド結合することができる物質からなる層である。有機物質層３の厚さは、10〜300 Åであるのが好ましく、特に10〜100 Åであるのが好ましい。
【００１５】
有機物質層３は、シランカップリング剤、又はメルカプト基と他の有機官能基を有する化合物（以下、単に「チーオル化合物」という）用いて形成させることができ、また、ＬＢ（ラングミュア・ブロジェット）法によっても形成させることができる。ＬＢ法によって成膜した場合、シランカップリング剤やチオール化合物によって成膜した場合に比べ、金属膜との結合能が弱いという短所があるが、広範な物質に適用でき、また、凝集膜を形成できるので単位面積当たりに結合させる生理活性物質の数を増加させることができるという長所もある。
【００１６】
層形成に使用できるシランカップリング剤としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシランなどが挙げられる。また、チオール化合物としては、メルカプトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカプト−１−アミノブタン、１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパン、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉草酸、メルカプトアセトアルデヒド、２−メルカプトプロピルアルデヒド、３−メルカプトブチルアルデヒド、４−メルカプトバレルアルデヒドなどが挙げられ、これらの中でも多官能物質であり、より多くのビオチンを固定できる１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパンなどを用いるのが好ましい。ＬＢ法に適用できる物質としては、アミノ酢酸、２−アミノプロピオン酸、３−アミノ酪酸などを例示することができる。
【００１７】
シランカップリング剤を用いて有機物質層３を形成する方法としては、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラビア法）などを用いることができ、チオール化合物を用いて有機物質層３を形成する方法としては、飽和蒸気法、浸漬法、スピンコーティング法、グラビア法などを用いることができる。
【００１８】
ビオチン層４はビオチン分子からなる層である。ビオチン層４は、所定量のビオチンを有機物質層３に所定時間接触させることにより形成させることができる。具体的な方法としては、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに有機物質層３を形成させた透明基板を設置して一定流量のビオチンを所定時間（所定量）流す方法を例示できる。
【００１９】
ビオチン層４を設けることにより、アビジン層５に、効率的にビオチン標識核酸６を固定することができる。即ち、アビジンは、１分子中にビオチンと結合するサイトを４つ持つが、これらは２個ずつ互いに反対方向を向いている。ビオチン層４上にアビジン層５を形成させ、ビオチン分子とアビジン分子を結合させると、アビジン分子のビオチンが結合しない側の結合サイトが測定チップの外側（ビオチン層４の反対側）を向くことになり、結合サイトがランダムに並んでいた場合に比べ、ビオチン標識核酸が結合し易くなる。
【００２０】
アビジン層５はアビジン分子からなる層である。アビジン層５は、所定量のアビジンをビオチン層４に所定時間接触させることにより形成させることができる。具体的な方法としては、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーにビオチン層４を形成させた透明基板１を設置して一定流量のアビジンを所定時間（所定量）流す方法を例示できる。
【００２１】
本発明の測定チップは、図２に示すようにアビジン層５に測定対象とする核酸とハイブリダイズすることができるビオチン標識核酸６を固定して使用する。
ビオチン標識核酸６は、測定対象とする核酸とハイブリダイズし得るような塩基配列を有するものであれば特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよい。測定対象とする核酸としては、細菌の産生する毒素をコードするＤＮＡ、腫瘍遺伝子（oncogene）、フェニルケトン尿症などの遺伝病遺伝子などを例示することができる。
【００２２】
ビオチン標識核酸６は、ビオチン部分をアビジン分子に結合させることにより固定化できる。ビオチン標識核酸６をアビジン分子に固定化する方法としては、インクジエット法、マクロディスペンサー法などを例示することができる。インクジェット法は、極めて狭い領域に精度よくビオチン標識核酸６を含む液滴を発射できるので、固定化するビオチン標識核酸６を有効利用できるという点で有利である。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測定チップを設置して一定流量のビオチン標識核酸６を所定時間（所定量）流すことによっても固定化できる。この固定化方法によれば、ビオチン層４及びアビジン層５の形成、並びにビオチン標識核酸６の固定を一連の操作で行うことができるという点で有利である。核酸をビオチンで標識する方法としては、ビオチンを結合させたプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。
【００２３】
本発明の測定チップは、例えば、図３に示されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用することができる。
この表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測定チップ10を設置して使用する。測定チップ10は、透明基板が上になるように設置する。カートリッジブロック７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出される。
【００２４】
光源８からは、測定チップ10の透明基板に向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を検出することができる。
【００２５】
上記のような構造によって、ある入射角θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透明基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるため、測定対象物質と生理活性物質との相互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強度曲線の谷のずれによって、測定対象物質の濃度の変化を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の測定チップは、核酸を効率的に固定化でき、また、固定化する核酸が少量で  あっても、良好な感度で測定対象物質を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定チップの一実施例を示す概略断面図である。
【図２】ビオチン標識核酸を固定化した本発明の測定チップの一実施例を示す概略断面図である。
【図３】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの概念図である。
【符号の説明】
１…透明基板
２…金属膜
３…有機物質層
４…ビオチン層
５…アビジン層
６…ビオチン標識核酸
７…カートリッジブロック
71…測定セル
72，73…流路
８…光源
80…入射光
９…検出器
90…反射光
10…測定チップ
【図１】
0004087472.tif 000002
【図２】
0004087472.tif 000003
【図３】
0004087472.tif 000004