(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ再生性呼吸系症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質のグリコシル化形態を製造する方法であって、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の１つまたはそれ以上をコードする１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片で宿主細胞を形質転換することにより前記ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４が導入されている宿主細胞を使用し、前記宿主細胞が、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質を共発現し、前記発現された蛋白質を採取することを特徴とする上記方法。
【請求項２】
ブタ再生性呼吸系症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質のグリコシル化形態を製造する方法であって、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４が導入されている宿主細胞を使用し、前記ＯＲＦがそれぞれＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をコードする１つまたはそれ以上の異種ＤＮＡ断片を含む１つまたはそれ以上のベクターウイルスで細胞を（共）感染することにより導入されており、前記宿主細胞がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質を共発現し、そして前記発現された蛋白質を採取することを特徴とする前記方法。
【請求項３】
同じ宿主細胞が、１種またはそれ以上のベクターウイルスでの（共）感染の結果としてＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ベクターウイルスがバクロウイルスであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
プロモーターの転写調節下にある、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の１つまたはそれ以上をコードする１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片で宿主細胞を形質転換することによりＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４が導入されている宿主細胞であって、前記ＯＲＦの蛋白質を発現することができる前記宿主細胞。
【請求項６】
１種またはそれ以上の異種ＤＮＡ断片を含むベクターウイルスであって、該ＤＮＡ断片がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をコードすることを特徴とする上記ベクターウイルス。
【請求項７】
ウイルスが仮性狂犬病ウイルスであることを特徴とする請求項６に記載のベクターウイルス。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターウイルスの１種またはそれ以上の混合物であって、しかも宿主細胞に共感染しかつ該細胞中でＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４を発現することのできる該混合物。
【請求項９】
各ＯＲＦが作動的に別々のプロモーターに結合されている、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質のグリコシル化形態の製造方法、この方法において用いるための宿主細胞またはベクターウイルス、該ＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ分子、該ＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質のグリコシル化形態並びに該ＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質を含むワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ブタ再生性呼吸系症候群ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＰＲＲＳＶ）は、１９９０年の後半以来北欧の５，０００以上の豚農場を襲ってきた新しい豚の病気の原因である。現在ブタ再生性呼吸系症候群（ＰＲＲＳ）と呼ばれるこの病気は、不可解豚病（Ｍｙｓｔｅｒｙ  Ｓｗｉｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）としても知られている。最初この問題はドイツにおいて１９９０年の１２月に確認され、１９９１年の初めには益々重大になった。１９９１年の１月および２月には、該病気はオランダおよびベルギーに広がった。勃発は、スペインからも報告されている。該病気は経済的観点から非常に費用がかかるようになり、しかしてオーエスキー病に匹敵またはそれより悪くなろうと予想されている。
【０００３】
雌ブタにおける主要な臨床的徴候は、食欲減退および妊娠１１０日目までの後期流産である。子ブタの場合、呼吸系の問題に加えて、死産のおよび／または弱い子ブタの高い発生率が観察される。肥畜においては、慢性肺炎および死亡率の増大が起こる。
【０００４】
ＰＲＲＳに対してブタを保護するためのワクチンを開発するためにあるいはブタにおける感染を決定するための診断方法を開発するために、この病気の病原体が同定され、分離され、そしてワクチンにおける免疫原または診断的検定における抗原として適合するようにされねばならない。
【０００５】
従来のワクチンは、化学的に不活性にされたウイルスワクチン、または変性生ウイルスワクチンからなり得る。しかしながら、不活性化ワクチンは、追加的免疫化を必要とし、不利なことにはアジュバントを含有し、製造するのに高価であり、また投与するのに骨が折れる。更に、いくつかの感染ウイルス粒子が、不活性化過程を生き残りそして当該動物に投与後病気を起こし得る。
【０００６】
一般に弱毒生ウイルスワクチンが好まれ、何故ならそれらは、体液性反応および細胞性反応の両方に基づく免疫応答をしばしば引き起こすからである。今日まで、ＰＲＲＳＶ株に基づくかかるワクチンは、マクロファージ細胞培養における毒性株の培養および連続継代によりのみ製造され得る。しかしながら、この処理のために、制御されない変異がウイルスのゲノム中に導入されて、それらの毒性および免疫化の性質において異種のウイルス粒子の集団をもたらす。加えて、かかる伝統的な弱毒生ウイルスワクチンは毒力が戻って、接種された動物の病気および他の動物への病原体の蔓延をもたらし得ることがよく知られている。更に、マクロファージ細胞系におけるＰＲＲＳＶ株の培養は非常に骨が折れ、また該ウイルスの低収量の結果となる。
【０００７】
改善されたワクチンは、生ワクチンおよびサブユニットワクチンの両方共、組換えＤＮＡ技術に基づいて構築され得る。これらのワクチンは、ＰＲＲＳＶ病原体に対して免疫応答を誘発することのできる必要なおよび関連のＰＲＲＳＶ免疫原物質もしくは該物質をエンコードする遺伝情報のみを有しそして生ワクチンまたは不活性化ワクチンの上記の不利を示さないであろう。
【０００８】
該病気の病原体は今小さな包膜ＲＮＡウイルスであると知られ、そしてこのウイルスの欧州型はウエンスヴールト等（「ザ・ヴェト・クオータリ（Ｔｈｅ  Ｖｅｔ．  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ），１３，１２１〜１３０，１９９１」）に記載されている。乳酸デヒドロゲナーゼを高めるウイルス（ＬＤＶ）およびウマ動脈炎ウイルスとのその関連性はコンゼルマン等（「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９３，３２９〜３３９，１９９３」）によりあるいはメウレンベルグ等（「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９２，６２〜７２，１９９３」）により記載されており、かくして該ウイルスをアーテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）の群に位置付ける。
【０００９】
レリスタッドウイルス（ＬＶ）と呼ばれるこの欧州型の株は、オランダ国レリスタッドのザ・セントラル・ヴェテリナリ・インスティチュートによりＰＣＴ  ＷＯ９２／２１３７５と関連してフランス国パリのザ・インスティチュート・パスツールに番号Ｉ−１１０２下で寄託されている。
【００１０】
別の欧州株が、ＥＰＡ第９１，２０２，６４６．５号に記載されておりそしてフランス国パリのザ・インスティチュート・パスツールのザ・コレクション・ナチオナル・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオーガニズムズ（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−１１４０下で寄託されている。
【００１１】
この欧州株は、最近コンゼルマン等（「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９３，３２９〜３３９，１９９３」）により記載されている。
【００１２】
該ウイルスのアメリカ型が、ベンフィールド等（「ジェイ・ヴェト・ダイアグン・インヴェスト（Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．），４，１２７〜１３３，１９９２）」）に記載されている。該アメリカ型の株は、ＡＴＣＣに番号ＶＲ−２３３２下で寄託されておりそしてＰＣＴ  ＷＯ９３／０３７６０および欧州特許出願０，５２９，５８４に挙げられている。該ウイルスが見つけられた後の早期に重要な観察がウエンスヴールト等（「ジェイ・ヴェト・ダイアグン・インヴェスト（Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．），４，１３４〜１３８，１９９２）」）によりなされ、しかして彼はアメリカ型および欧州型をそれらの抗原的特徴に基づいて比較しそしてアメリカ型および欧州型の株がかなりの抗原的相違を示すことを実証した。
【００１３】
ＰＲＲＳＶの２種の欧州株のゲノムおよび米国分離株のゲノムの一部が、分子的にクローニングされそして配列決定された（ＰＣＴ  ＷＯ９２／２１３７５；メウレンベルグ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９２，６２〜７２，１９９３」；コンゼルマン等前掲；ワング等「ジェイ・ヴェト・ダイアグン・インヴェスト（Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．），６，２９３〜２９６，１９９４」；マーダッシ等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル（Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．），７５，６８１〜６８５，１９９４」；メング等「プロク・第１３回ＩＰＶＳコングレス（Ｐｒｏｃ．  １３ｔｈ  ＩＰＶＳ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ），６１，１９９４」）。
【００１４】
ＰＲＲＳＶゲノムのＲＮＡは約１５ｋｂを含みそして８つの開放型読み枠（ＯＲＦ）がその中で同定され得、即ちＯＲＦ１Ａ，ＢおよびＯＲＦ２〜７である。ＯＲＦ１Ａ，ＢはとりわけウイルスＲＮＡポリメラーゼをエンコードするのに対し、ＯＲＦ２〜６はウイルス膜（エンベロープ）蛋白質をエンコードする。ＯＲＦ７は、ヌクレオキャップシド蛋白質をエンコードする。感染された細胞においては、６種の主要なサブゲノムｍＲＮＡの３′共末端入れ子化セット（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）が、欧州分離株および米国分離株（メング等前掲）の両方において実証され得る。第１表に、ＰＲＲＳＶの構造蛋白質をエンコードするＯＲＦ（コンゼルマン等前掲）の特徴が要約されている。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
ＰＲＲＳＶゲノム上のＯＲＦの分布が、図１に示されておりそしてメウレンベルグ等（前掲）により見出されたものに相当する。
【００１７】
前記に挙げられたＯＲＦにより発現されるＰＲＲＳＶ蛋白質についてはほとんど知られていない。約１５〜２６ｋＤの５種のウイルス蛋白質が、欧州または米国ＰＲＲＳ分離株で接種された細胞の溶菌液において同定された（ネルソン等「ジェイ・クリン・マイクロバイオル（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），３１，３１８４〜３１８９，１９９３）」およびベンフィールド等「プロク・第１３回ＩＰＶＳコングレス（Ｐｒｏｃ．  １３ｔｈ  ＩＰＶＳ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ），６２，１９９４」）。ＯＲＦ７、ＯＲＦ６およびＯＲＦ５の蛋白質はビリオン中に存在することが実証された（メウレンベルグ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），２０６，１５５〜１６３，１９９５」）。今般、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の２種の形態即ち小さな形態および大きな形態がＰＲＲＳＶで感染された細胞中に存在するが、しかし１種の形態のみが感染細胞の上澄みから分離された精製ビリオン中に存在することが見出された。各ＯＲＦ蛋白質の２種の形態は、それらの炭水化物鎖のプロセッシングのレベルにより区別される。精製ビリオン中に存在する形態である大きな形態はエンドグリコシダーゼＨ（エンド−Ｈ）耐性であるのに対し、小さな形態はエンド−Ｈ感受性である。酵素エンド−Ｈの基質は、糖蛋白質の“高マンノシル化”形態のみである。この酵素は、アミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ）に結合されている炭水化物基ＧｌｃＮａｃ直後のオリゴ糖鎖を開裂する。より複雑な形態即ちグリコシル化過程が完了している形態は、エンド−Ｈ開裂に対して耐性である。ＯＲＦ３および４の蛋白質のグリコシル化過程の段階を決定するために並びにＯＲＦ蛋白質の小さな（“高マンノース”）形態をそれらの大きな（“複雑な”）形態から区別するために、エンド−Ｈ耐性がここにおいて用いられた。酵素ペプチド−Ｎ−グリコヒドロラーゼ（ＰｎＧａｓｅ−Ｆ）を用いて、ＯＲＦ３および４の完全に脱グリコシル化された形態（ポリペプチド骨格）が得られた。ビリオン中に組み込まれたＯＲＦ３および４の糖蛋白質は大きな（“複雑な”）形態であることが分かり、しかしてこれらの形態はそれらの前駆体である小さな（“高マンノース”）形態から更なるプロセッシングによりもたらされ、その結果該大きな形態はエンド−Ｈ耐性になった。ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された分子量（ＭＷ）が第２表に示されている。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
個々のＯＲＦで形質転換された真核細胞中での個々のＯＲＦの発現後、ウイルス感染細胞とは対照的に専らＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の小さな形態が産生されることが分かった。それらの個々の蛋白質は真核細胞中で完全にはプロセッシングされないので、小胞体からゴルジ装置の中嚢への該蛋白質の輸送は可能でないということが最も有りそうである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の大きな形態を得るために１つの細胞中におけるＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の共発現が必要とされかつ充分であるということが今般見出された。感染過程中、動物は該蛋白質の成熟（大きな）形態に直面する。それ故、本発明は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の成熟した大きな形態の組換えＤＮＡの調製方法を提供する。
【００２１】
それ故、本発明は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片で形質転換された適当な宿主細胞あるいはＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片を含むベクターウイルスで感染された宿主細胞を該蛋白質を発現する条件下で培養する工程および発現された蛋白質を採取する工程からなる、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質のグリコシル化形態の製造方法において、同じ宿主細胞が同時にＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質を発現することを特徴とする上記方法を提供する。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４は、図１に示されているＰＲＲＳＶゲノム上のこれらのＯＲＦの分布を示す地図により定められるようなポリメラーゼをエンコードする領域ＯＲＦ１の下流（３′方向）の大きな蛋白質をエンコードする（部分的に重複する）領域として定められる。この地図は、メウレンベルグ等（前掲）において示されたものと一致しそしてすべてのＰＲＲＳウイルスにとっての代表的地図と考えられる。ＯＲＦ５〜７もまた、前記の地図上のそれらの位置により定められる。
【００２２】
特に、上記のＯＲＦは、コンゼルマン等（前掲）に開示されたそれぞれのＯＲＦによりエンコードされるＰＲＲＳＶ蛋白質のアミノ酸配列により特徴づけられる。
【００２３】
特定のＯＲＦ蛋白質にとって、個々のＰＲＲＳＶ分離株の間には自然変異が存在し得ることが理解されよう。これらの変異は、全体の配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸の相違により実証され得る。かかる変異ＰＲＲＳＶおよびこれらのＯＲＦ蛋白質のアミノ酸配列の例は、メウレンベルグ等（前掲）により開示されている。
【００２４】
好ましくは、本発明において用いられるべきＯＲＦ蛋白質は、コンゼルマン等（前掲）により開示されたアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列レベルに基づいて少なくとも５５％一層好ましくは少なくとも７０％の相同を示す。
【００２５】
本発明の本質的観点は、全く同一の宿主細胞がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質を共発現することである。このことは、３つの該ＯＲＦを含むＤＮＡ断片で宿主細胞を形質転換することによりあるいは３つすべてのＯＲＦが該細胞中に導入されるように１種より多いＤＮＡ断片で該細胞を形質転換することにより達成され得る。例えば、宿主細胞は、ＯＲＦ２を含む第１断片、ＯＲＦ３を含む第２断片およびＯＲＦ４を含む第３断片である３種のＤＮＡ断片で共形質転換され得る。
【００２６】
同様に、宿主細胞は、上記の３つのＯＲＦが同じ細胞中に導入される限り、１種のベクターウイルスまたはそれ以上のベクターウイルスにより（共）感染され得る。
【００２７】
ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４を有する宿主細胞中での同時発現がＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の大きな成熟形態を生産するために必要とされかつ充分であるけれども、所望するならＯＲＦ５〜７の１つまたはそれ以上のようなＰＲＲＳＶの他のＯＲＦ特にＯＲＦ５および／またはＯＲＦ７もまた、該宿主細胞により共発現され得る。
【００２８】
更に、本発明による方法において、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４のすべては、これらのＯＲＦの発現が保証されるようにプロモーター配列の転写調節下にある。好ましくは、各ＯＲＦは、別々のプロモーターに作動的に結合されている。
【００２９】
本発明において用いられるべきＤＮＡ断片は、当該ＯＲＦが事実上会合または結合されない種々の複製遂行ＤＮＡ配列を含み得、その結果適当な宿主の形質転換のために用いられ得るいわゆる組換え核酸分子をもたらす。かかるハイブリッドＤＮＡ分子は、好ましくは、例えばプラスミドから誘導される。ＰＲＲＳＶのＯＲＦをクローニングするために用いられ得る特定のベクターは、当該技術において公知でありそしてとりわけｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭおよびブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミド（ロドリグクエズ・アール・エルおよびディー・ティー・デンハルト編集「ベクターズ（Ｖｅｃｔｏｒｓ）：分子クローニングベクターおよびそれらの使用の調査（Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ），バターワースス，１９８８」；レンストラ・ジェイ・エイ等「アーク・ヴァイロル（Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．），１１０，１〜２４，１９９０」も参照）のようなプラスミドベクターを含む。かかる組換え核酸分子の構築のために用いられるべき方法は、当業者に公知でありそしてとりわけマニアティス・ティー等（「分子クローニング研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，第２編，１９８９」）に記載されている。
【００３０】
適当な宿主細胞は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦの蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片により形質転換され得かつ該ＰＲＲＳＶのＯＲＦの蛋白質をグリコシル化形態にて発現することのできる細胞である。ここで用いられる“形質転換”は、用いられる方法例えば直接取込みまたは形質導入に無関係に、宿主細胞中への異種核酸配列の導入を指す。該異種核酸配列は、宿主ゲノム中に統合され得る。発現のために、異種ＤＮＡ断片は、選定された宿主と適合し得かつ挿入された核酸配列の発現を調節し得る適切な発現制御配列を備える。
【００３１】
宿主は好ましくは、酵母例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真核源のものあるいはＨｅＬａ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含めた昆虫、植物または哺乳類の細胞のようなより高等の真核細胞である。昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のＳｆ９細胞系（ルッコウ等「バイオテクノロジー（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６，４７〜５５，１９８８」）を含む。真核クローニング系におけるＰＲＲＳＶのＯＲＦのクローニングおよび発現に関する情報は、エッサー・ケイ等（「真核生物のプラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ），スプリンジャー・ヴェアラグ，１９８６」）に見られ得る。
【００３２】
宿主細胞が酵母である場合、例示的な有用な発現制御配列は、例えばα−接合因子を含む。昆虫細胞に対しては、バクロウイルスのポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターが用いられ得る（スミス・ジー・イー等「モル・セル・バイオル（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．）３，２１５６〜６５，１９８３」）。宿主細胞が哺乳類源のものである場合、例示的な有用な発現制御配列は、例えばＳＶ−４０プロモーター（ベルマン・ピー・ダブリュー等「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２２，５２４〜５２７，１９８３」）あるいは例えばメタロチオネインプロモーター（ブリンスター・アール・エル「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９６，３９〜４２，１９８２」）または熱ショックプロモーター（ヴォエルミー等「プロク・ナトル・アカド・サイ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）８２，４９４９〜５３，１９８５」）を含む。
【００３３】
あるいは、適当な宿主細胞は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦをエンコードするＤＮＡ断片を含むベクターウイルスによる感染を受けやすい細胞である。ベクターウイルスにおいて、異種ＤＮＡ断片が、該ウイルスの非必須領域即ち該ウイルスの感染または複製に必要な機能のような該ウイルスの必須機能を壊すことなく該ＤＮＡ断片の組込みのために用いられ得る領域中に挿入される。かかる領域は、一般に、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスを含めて種々のウイルスについて当該技術において知られている。
【００３４】
多量のＰＲＲＳＶのＯＲＦの蛋白質を得るために、好ましい発現系はバクロウイルス発現系（ＢＶＥＳ）である。この系においては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ；ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１）のような昆虫細胞は、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のように、バクロウイルス用の宿主として細胞培養において保持される。ＡｃＮＰＶにおける遺伝子のいくつかは、高レベルに発現されるがしかしウイルス感染サイクルに対して非必須である。これらの遺伝子は、ｐＡｃＡＳ３のようなバクロ転移プラスミドと野性型（ｗｔ）ＡｃＮＰＶのＤＮＡとの間でトランスフェクションされた細胞における異種組換えの標的である。ｐＡｃＡＳ３（ジェイ・ヴラック等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７９，３１２〜３２０，１９９０」）においては、異種遺伝子は、組換え過程の標的を定めるｗｔ  ＡｃＮＰＶの配列により囲まれた非必須のｐ１０遺伝子の代わりにｐ１０プロモーターの下流に挿入される。組換え体のスクリーニングを容易にするために、ｐＡｃＡＳ３はＬａｃＺ遺伝子をも含んでいて、培地へのＸ−ｇａｌの添加時に組換え体プラークが青色に変わるようにする。
【００３５】
【発明の実施の形態】
請求項に記載された方法において、上記に定められた宿主細胞は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の発現にとって好都合である条件下で培養され得る。ワクチンまたは診断的検定体は粗製培養物、宿主細胞溶菌液または宿主細胞抽出物の試料を用いて調製され得るけれども、別の具体的態様においては使用目的に依存してより精製されたＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質が製造され得る。生産された蛋白質を精製するために、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ３の全てを発現する宿主細胞が適切な容量にて培養されそして産生された蛋白質がかかる細胞からあるいは該蛋白質が分泌されるならば培地から単離される。培地中に排出された蛋白質は標準的技法例えば塩分別、遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィー、ゲル濾過免疫沈降または免疫アフィニティークロマトグラフィーにより単離されそして精製され得、一方細胞内蛋白質は最初に該細胞を収集し、これらの細胞を例えば音波処理によりまたはフレンチプレスのような他の機械的破壊手段により破壊し、次いで所望するなら該蛋白質を他の細胞内成分から分離することにより単離され得る。細胞破壊はまた、化学的手段（例えば、ＥＤＴＡ処理）またはリゾチーム消化のような酵素的手段により達成され得よう。
【００３６】
本発明の更なる具体的態様によれば、１種またはそれ以上の異種ＤＮＡ断片を含むベクターウイルスにおいて、該ＤＮＡ断片がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をエンコードすることを特徴とする上記ベクターウイルスが提供される。かかるベクターウイルスは、一般的意味で既に上記に記載されている。このベクターウイルスは、ワクチンの開発の新しい手法即ち弱毒生ウイルスワクチン株をキャリヤー（ウイルスワクチンベクター）として用いる外来病原体の遺伝子の発現において用いられ得る。生ベクターウイルスによる抗原の発現は、自然感染後の発現を模擬し得そして体液性および細胞性の両方の免疫応答を刺激し得る。かかるベクターは、適切なワクチンが現在入手されないかあるいは安全的にまたは容易に作られ得ない病気対する免疫化のために用いられ得る。上記に概略されているように、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４を含むベクターウイルスによる免疫原の発現は、本発明によるベクターウイルスが適用される場合のみ自然感染を模擬する。
【００３７】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の同時発現のために適するウイルスベクターは、当業者に知られておりそしてワクチニア（ピッシニおよびパオレッチ「アドヴ・ヴァイル・レス（Ａｄｖ．  Ｖｉｒ．  Ｒｅｓ．）３４，４３〜６４，１９８８」；リヴィエレ等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）６６，３４２４〜３４３４，１９９２」；メンゲリング等「アーク・ヴァイロル（Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．）１３４，２５９〜２６９，１９９４」）のようなポックスウイルス、豚痘（ヴァン・デア・リーク等「ザ・ヴェト・レコード（Ｔｈｅ  Ｖｅｔ．  Ｒｅｃｏｒｄ）１３４，１３〜１８，１９９４」）、アデノウイルス（フス等「ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）１２，６０７，１９９４」）および仮性狂犬病ウイルスのようなヘルペスウイルスを含む。
【００３８】
本発明において用いられるべき好ましいベクターウイルスは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）から誘導される。
【００３９】
例えば、ＰＲＶについては、いつくかの非必須領域が開示されておりかつｇｐ５０、ｇｐ６３、ｇＩ、ｇＩＩＩ、ｇＸ、１１Ｋ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、蛋白質キナーゼ（ＰＫ）または２８Ｋ（ピーターズ等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）６７，１７０〜１７７，１９９３」；デ・ウインド・エヌ等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）６４，４６９１〜４６９６，１９９０」；ムーアマン・アール・ジェイ・エム等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル（Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．）７１，１５９１〜１５９５，１９９０」；ペトロヴスキス・イー・エイ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１５９，１９３〜１９５，１９８７」；ヴァン・ジイル・エム等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル（Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．）７１，１７４７〜１７５５，１９９０」；トムセン・ディー・アール等「ジーン（Ｇｅｎｅ）５７，２６１〜２６５，１９８７」；キーラー・シー・エル等「ジーン（Ｇｅｎｅ）５０，２１５〜２２４，１９８６」；ウイーレイ・エム・イー等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）６２，４１８５〜４１９４，１９８８」；ヴァン・ジイル・エム等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）６５，２７６１〜２７６５，１９９１」；メッテンレイター・ス・シー等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７９，４９８〜５０３，１９９０」；米国特許第４，６０９，５４８号、欧州特許第０２６３２０７号、欧州特許出願第９４２０３６４３号およびＰＣＴ出願ＷＯ／９４／０１５７３）をエンコードする遺伝子のような異種ＤＮＡ配列の組込みのために用いられている。
【００４０】
周知の、ＤＮＡ配列をクローニングベクター中に挿入するための処理操作並びに生体内の同種組換えまたはコスミドクローニングの技法が、ＯＲＦをヘルペスウイルスのゲノムの非必須領域中に挿入するために用いられ得る（マニアティス・ティー等「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，１９８９；欧州特許出願第０７４８０８号；ロイズマン・ビーおよびジェンキンス・エフ・ジェイ「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２９，１２０８，１９８５」；ヒグチ・アール等「ニュウクレイック・アシッズ・レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１６，７３５１，１９８８」；デ・ウインド・エヌ等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）６４，４６９１〜４６９６，１９９０」；ヴァン・ジイル・エム等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）６２，２１９１〜２１９５，１９８８」；アッカーマン・エム「ジェイ・ヴェト−メド・ビー（Ｊ．  Ｖｅｔ−  Ｍｅｄ．  Ｂ．），３５，３７９〜３９６，１９８８」並びに上記のパラグラフに記載されている方法）。
【００４１】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片は、ベクターウイルスゲノムの同じまたは異なる領域において挿入され得る。
【００４２】
当然本発明はまた２種またはそれ以上好ましくは２種または３種のベクターウイルスの混合物を提供し、しかして該混合物は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質が同じ細胞により生体内で同時に発現されるように生体内で宿主細胞を共感染することができるものである。この混合物はまた、ワクチン中の活性成分として用いられ得る。該混合物が２種のベクターウイルスを含む場合、一方のウイルスは上記の３つのＯＲＦのうちの２つを含みそして第２のウイルスは第３の所要ＯＲＦを含む。該混合物が３種のベクターウイルスを含む場合、各ウイルスは所要ＯＲＦのうちの１つを含む。所望するなら、該混合物中のベクターウイルスの１種またはそれ以上がＰＲＲＳＶのＯＲＦ５〜７のうちの１つまたはそれ以上を含む。
【００４３】
好ましくは該混合物において組み込まれるべきベクターウイルスはＰＲＶワクチンウイルスから誘導され、しかして好ましくは遺伝子型的にｇＤ- （および所望するなら表現型的にｇＤ+ ）および／またはｇＥ- であるＰＲＶ株（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０１５７３，ＥＰ出願第９４２０３６４３号）が用いられる。
【００４４】
本発明によるベクターウイルスまたは上記の混合物中に組み込まれるべきベクターウイルスは該ベクターウイルスで感染された宿主細胞を培養することにより製造され得、その後ウイルス含有細胞および／または該細胞中で生長されたベクターウイルスが、随意に純粋な形態にて、収集されそしてワクチン中に随意に凍結乾燥された形態にて組み込まれ得あるいは診断的検定に用いられ得る。
【００４５】
本発明は更に、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をエンコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片において、該蛋白質をエンコードする各ＯＲＦが作動的にプロモーターに結合されている該ＤＮＡ断片を提供する。かかるＤＮＡ断片は、上記に定められた宿主細胞またはベクターウイルスの製造のために用いられ得る。
【００４６】
本発明の範囲内には、精製されたエンド−Ｈ耐性のＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質も含まれる。該エンド−Ｈ耐性のＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質の好ましい形態は、それぞれ５５〜６０ｋＤまたは４０〜４７ｋＤの分子量を有する。
【００４７】
これらのエンド−Ｈ耐性ＯＲＦ蛋白質は、本発明による方法により得られる、これらが通常事実上会合されるＰＲＲＳＶ物質を含まない実質的に純粋な形態にてあるいはＰＲＲＳＶ蛋白質の混合物として提供され得る。
【００４８】
更に、本発明は、ＰＲＲＳウイルスに対してブタにおいて効果的な免疫応答を誘発するワクチンを提供する。このワクチンは、製薬上受容され得るキャリヤーまたは希釈剤と一緒に本発明による方法により産生されたＯＲＦ３および／またはＯＲＦ４の蛋白質を含むサブユニットワクチンであり得る。
【００４９】
あるいは、製薬上受容され得るキャリヤーまたは希釈剤と一緒に本発明によるベクターウイルスもしくは上記に定められたベクターウイルスの混合物を含むベクターワクチンが提供される。
【００５０】
例えば、該ワクチンはまた、例えば活性および／または貯蔵寿命を増大させるためにしばしば他の成分と混合されているところの、水性媒質または水含有懸濁液を含み得る。これらの成分は、塩、ｐＨ緩衝剤、安定剤（脱脂乳、カゼイン加水分解物またはクエン酸等）あるいはチメロサール、メルチオレートおよびゲンタマイシンのような保存剤で有り得る。
【００５１】
所望するなら、本発明によるワクチンは、１種またはそれ以上のアジュバントと共に処方される。適当な例は、クイル（Ｑｕｉｌ）Ａのようなサポニン、水酸化アルミニウム、コレラトキソイドまたはテタヌストキソイド、オイル乳濁液（ｏ／ｗまたはｗ／ｏ）および水性ビタミンＥ分散液である。
【００５２】
本発明によるワクチンは、慣用の能動免疫化スキーム即ち投与量処方と適合し得るようにおよび発症予防上および／または治療上効果的でかつ免疫原性がある量にて一回投与または反復投与にて投与され得る。該ワクチンの投与は、例えば皮内に、皮下に、筋肉内に、腹膜腔内に、静脈内に、鼻内にまたは経口的になされ得る。
【００５３】
本発明はまた“免疫化学試薬”に関し、しかして該試薬は本発明の方法により産生されたＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質の少なくとも１種を含む。
【００５４】
用語“免疫化学試薬”は、該蛋白質が適当な支持体に結合されているかあるいは標識性物質を備えていることを意味する。
【００５５】
用いられ得る支持体は、例えば、微小試験用ウェルまたはキュベットの内壁、チューブまたはキャピラリー、膜、フィルター、試験用ストリップあるいは例えばラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルまたはゾル粒子としての金属化合物のような粒子の表面である。
【００５６】
適当な標識性物質は、とりわけ、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾルまたはゾル粒子としての金属化合物である。
【００５７】
“免疫化学試薬”は、抗ＰＲＲＳＶ抗体を含有する疑いのあるサンプルと共に該試薬がインキュベーションされそしてその後該抗体の有無が決定される診断的検定において用いられ得る。
【００５８】
本発明はまた免疫検定において用いられるべき試験キットに関し、しかしてこの試験キットは少なくとも１種の本発明による免疫化学試薬を含有する。
【００５９】
この試験キットを用いて行われる免疫化学反応は、好ましくはサンドイッチ反応、凝集反応、競合反応または阻害反応である。
【００６０】
【実施例】
実施例１
ワクチニアウイルスによる同じ細胞中での複数のＰＲＲＳＶのＯＲＦの遷移的同時発現
ＰＲＲＳＶからのｃＤＮＡクローンｐＲＲＳＶ−Ｔ１の製造および分析は、コンゼルマン等（前掲）において記載された。ＰＲＲＳＶの完全なＯＲＦを含有しかつそれぞれのＡＴＧ開始コドンに近くで始まる断片が、クレノウポリメリラーゼでの処理後、ベクタープラスミドブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫＩＩ−（ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＴ７プロモーターの下流においてＥｃｏＲＶ制限部位（ＯＲＦ２およびＯＲＦ５）またはＳｍａＩ制限部位（ＯＲＦ３およびＯＲＦ４）中にクローニングされた。これらの挿入体は、次のＰＲＲＳＶ−Ｔ１配列残基を含有していた（コンゼルマン等，前掲）。
【００６１】
ＯＲＦ２：  （ＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌ，クレノウ充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ））１６０２〜２３８１
ＯＲＦ３：  （ＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｆＩ，クレノウ充填）２２０７〜３０４０
ＯＲＦ４：  （ＢｓｔＹＩ−ＳｐｅＩ，クレノウ充填）  ２６７３〜４９２０
ＯＲＦ５：  （ＢｓｔＸＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ，クレノウ充填）
３３０４〜３９５４
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するｖＴＦ７−３（フエルスト等，１９８６，ＰＮＡＳ８３，８１２２〜８１２６）での５の感染多重度における感染後のクローンＢＳＲであるＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓）細胞において、トランスフェクション実験を行った。１時間の後感染細胞を、製造者の指図に従ってストラタゲン“哺乳類トランスフェクションキット”を用いて、２μｇのプラスミドでトランスフェクションした。
【００６２】
メチオニン不含の培地でのトランスフェクション後４時間して、細胞を洗浄した。３０分間の飢餓後皿当たり５０μＣｉのＴｒａｎ（３５Ｓ）標識を添加し、そしてこれらの細胞を３７℃にて２４時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）中で溶解し、そして蛋白質を９５℃および２％ＳＤＳにより変性した。
【００６３】
ケッスラー（「メソッズ・エンジモル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）７３，４４２〜４５９，１９８１」）に従って、粗製蛋白質のサンプルを抗ＯＲＦ４モノクローナル抗体（ｍａｂ３５）および固定スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞と共に沈澱させた。これらの免疫複合体を遠心分離により収集した。生じたペレットを、３０μｌのラエムミリ（Ｌａｅｍｍｉｌｉ）サンプル緩衝液中に再懸濁しそして９５℃にて５分間インキュベーションした。遠心分離後、上澄みをＳＤＡ−１０％ポリアクリルアミドゲル中で分析した。ゲルを固定し、Ｅｎ３Ｈａｎｃｅで含浸し、ワットマン３ＭＭ濾紙上で乾燥しそして−７０℃にてコダックＸ−ＡＲ５フィルムに露光した。
【００６４】
発現された蛋白質のエンド−Ｈによる脱グリコシル化を、次のように行った。沈澱および洗浄された免疫複合体をＮＥＢ緩衝液（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））中に再懸濁した。１．５単位のエンド−Ｈを添加し、そしてこのサンプルを３７℃にて１６時間インキュベーションしそして次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために３０μｌのラエムミリ（Ｌａｅｍｍｉｌｉ）サンプル緩衝液中に再懸濁した。
【００６５】
第１実験（図２）において、いくつかのＯＲＦ組合わせの共発現を行った。ＯＲＦ４の成熟した大きな形態（４０〜４７ｋＤ）の発現を支持するためにＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の共発現が必要とされかつ充分であることが実証されている。ＯＲＦ４の蛋白質の観察された分子量形態がビリオン中に存在するものと同様であることを実証するために、エンド−Ｈでの脱グリコシル化実験を異なる組合わせの発現生産物に関して行った（図３）。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４で共形質転換された細胞のみがＯＲＦ４の蛋白質の大きな形態を発現すること並びにこれらの大きな形態はエンド−Ｈ処理に対して耐性であることが示されている。
【００６６】
実施例２
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、３および４を発現するＰＲＶベクターウイルスの混合物
ＰＲＶ  ｇＤ- およびｇＥ- ベクターウイルスの構築。
【００６７】
ＰＲＶ  ＮＩＡ−３株から、ｇＤを含有するＰｓｔＩ  ＮｃｏＩ断片をＰＧＥＭ５ＺＦ（＋）ベクターにおいてサブクローニングした。トランスフォーマー（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標））処理操作（クロネテク（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））でもって、ＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩの制限部位を導入した。ＳｐｅＩ部位は、ｇＤのＡＴＧ開始コドンの上流の１７ヌクレオチドの所にて導入された。ＡｖｒＩＩ部位は、ＴＧＡ終止コドンの後の最初のヌクレオチドの所にて導入された。これらの変異が導入された後、ＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩでの制限酵素消化により完全なｇＤ遺伝子を除去した。以前のｇＤ部位上に、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖｒＩＩの制限部位を含有するオリゴヌクレオチドを挿入した。次いで、ＰｓｔＩ−ＮｃｏＩ断片をプラスミドから分離し、そしてピーターズ等（ジェイ・ヴァイロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６６，８９４〜９０５，１９９２）により記載された方法によるＰＲＶ  Ｒ１株（デ・ウインド等「ジェイ・ヴァイロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６４，４６９１〜４６９６，１９９０」）での同種組換えのために用いた。
【００６８】
ｇＤ−およびｇＥ−マイナスの変異体を得るために、ＰＲＶのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ断片のＮｄｅＩ−ＳｔｕＩ断片を、ｇＤ欠失を含むＮｄｅＩ−ＳｔｕＩ断片で置換した。このＨｉｎｄＩＩＩ断片もまた、ｇＥを包囲する欠失（位置６８３１におけるＤｒａＩ部位から位置８５６２における変異体３２４（デ・ウインド等，１９９０，前掲）のリンカー挿入部位）を含有していた。生じたプラスミドを次いで、野性型コスミドｃ−１７９、ｃ−２７およびｃ−４４３（ヴァン・ジイル等「ジェイ・ヴァイロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６２，２１９１〜２１９５，１９８８」）での組換えによりｇＤ−，ｇＥ−ウイルスを発生させるために用いた。
【００６９】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、３および４を発現するＰＲＶ  ｇＤ変異体の構築。
【００７０】
上記の仮性狂犬病ｇＤ−，ｇＥ−ベクターＤ５７において、各ＯＲＦを別々に挿入した。次のやり方が組換えウイルスを得るのに用いられた。ＯＲＦは、ポリメリラーゼ連鎖反応を用いることにより特異的に増幅された。増幅された生成物は、次いでｐＣＲtmＩＩベクター中にクローニングされた。次いで、ＯＲＦはこのベクターから分離され、そして転移ベクターｐＤＨβ中にクローニングされた。このベクターは次いで、ＰＲＲＳＶのＯＲＦをＰＲＶ  Ｄ５７株のウイルスゲノム中に転移するのに用いられた。
【００７１】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦのＰＣＲ増幅
特定のＯＲＦを増幅するために、ＰＲＲＳＶ配列に対応する次のプライマー対を用いた。
【００７２】
ＯＲＦ２：上方プライマー，ヌクレオチド１６０９〜１６２８（１６０９および１６２８を含めて）
下方プライマー，ヌクレオチド２３５１〜２３７０（２３５１および２３７０を含めて）の相補的配列
ＯＲＦ３：上方プライマー，ヌクレオチド２２１１〜２２３０（２２１１および２２３０を含めて）
下方プライマー，ヌクレオチド３０２５〜３０４４（３０２５および３０４４を含めて）の相補的配列
ＯＲＦ４：上方プライマー，ヌクレオチド２７４７〜２７６６（２７４７および２７６６を含めて）
下方プライマー，ヌクレオチド３２９６〜３３１５（３２９６および３３１５を含めて）の相補的配列
すべてのヌクレオチド番号は、コンゼルマン等（ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１９３，３２９〜３３９，１９９３）により与えられているようなＰＲＲＳＶ配列を指す。
【００７３】
これらのＯＲＦを、ＰＲＲＳＶのすべての構造遺伝子を含有するプラスミド（ｐＰＲＲＳＶ）から次の方法により増幅した。
【００７４】
５μｌ（１０ｘ）ＰＣＲ緩衝液（酵素供給者から購入）、５μｌ（２ｍＭ）ｄＮＴＰ類、５μｌ（１０μＭ）上方プライマー、５μｌ（１０μＭ）下方プライマー、０．２Ｕスーパー・タク（Ｓｕｐｅｒ  Ｔａｑ）（セファロ（Ｓｅｐｈａｒｏ）Ｑ）、１μｌ（１μｇ／μｌ）ｐＰＲＲＳＶおよび５０μｌの総容量になるまでの水を添加することにより、ＰＣＲミックスを調製した。この混合物の上に鉱油を１滴垂らした後、９４℃にて１分、５５℃にて１分および７２℃にて１分のサイクルを３０回用いてＰＣＲを遂行した。増幅後、それらの生成物は、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル上で可視化され得た。
【００７５】
増幅化されたＯＲＦのクローニング
増幅化された生成物を、インヴィトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲtmＩＩベクター中にクローニングした。すべての処理操作は製造者の指図に従って遂行された。このベクターから、ＯＲＦを転移ベクターｐＤＨβ中にクローニングした。正しい配向（ｒｉｇｈｔ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にてクローニングされたＰＣＲ生成物（ｐＣＲtmＩＩベクターのＴ７プロモーターの側面に位置するＡＴＧ出発コドンＯＲＦ）を該ベクターからＢａｍＨＩ消化により除去し、次いで平滑末端を生ずるためのクレノウ処理およびその後ＸｂａＩ消化を行った。それらの生成物を１％アガロースゲル上で分離し、そしてＯＲＦを含有する帯域を該ゲルから製造者の指図に従ってゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）で精製した。このベクターを最初ＥｃｏＲＩでそしてその後ＸｂａＩで消化し、ゲル上で分離し、そしてこの線状ベクターをゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）の使用して精製した。すべてのＯＲＦ含有断片を、Ｔ４リガーゼを用いて該線状化されたベクター中に連結した。すべての酵素はファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入し、そしてすべての方法は標準的技法（モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）のカレント・プロトコールズ）を用いて遂行された。
【００７６】
ＰＲＲＳＶ挿入体を含有するＰＲＶ変異体の発生
ｇＤおよびｇＥ遺伝子が欠失しているＰＲＶウイルス（Ｄ５７株）を、ｇＤを補足するＶｅｒｏ細胞にて培養した。完全ＣＰＥにおいてウイルスを採取し、そしてそのＤＮＡを標準的技法により抽出した。ウイルスＤＮＡを、形式的（ｆｏｒｍａｌ）ｇＤ遺伝子座中に位置するユニークＥｃｏＲＩ部位を用いてＥｃｏＲＩで開裂した。ＰＲＲＳＶ挿入体を含有するｐＤＨβベクターをＭｌｕＩで線状化した。この線状化されたプラスミドおよび切断されたウイルスＤ５７のＤＮＡを、製造者の指図に従ってＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム）と混合した。総量５μｇのＤＮＡが、総容量５００μｌの２０ｍＭヘペス緩衝液中の１０μｌのＤＯＴＡＰと混合された。該ＤＮＡについては、１０コピーのプラスミドＤＮＡ対１コピーのウイルスＤＮＡのモル比が用いられた。該混合物を、培地が除去されていた該ｇＤを補足するＶｅｒｏ細胞の８０％の集密的単層上において３７℃にて６時間インキュベーションした。このインキュベーション期間後、培地を添加しそしてそれらのプレートを更に３７℃にてインキュベーションした。完全ＣＰＥにおいて、その培地を採取した。最後に、採取された培地から組換えウイルスを限界希釈により分離し、そして免疫蛍光を用いて挿入ＰＲＲＳＶ遺伝子の発現により同定した。ＯＲＦ２、３および４を発現するベクターウイルスの混合物が、製造されそしてブタの免疫化のために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】決定されたＰＲＲＳＶ配列中の開放型読み枠の分布並びにサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ  ｍＲＮＡ，囲みはリーダーＲＮＡを表す）の所在を示す図である。
【図２】遷移的に発現されたＰＲＲＳＶのＯＲＦのラジオイムノ沈降を示す電気泳動写真である。発現された蛋白質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡゲル上で分離された。左のレーンは、マーカー（Ｍ）蛋白質を含む。他のレーンは、上部に挙げられているＯＲＦで形質転換された宿主細胞により発現された標識された蛋白質の電気泳動を示す。
【図３】図２と同じくラジオイムノ沈降を示す電気泳動写真である。追加的ないくつかの発現生産物が、エンド−Ｈ（ＥＨ）で処理された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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