(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌を、難消化性デキストリンおよびポリデキストロースからなる群より選ばれる該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養することを特徴とする麹菌の培養方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法で得られる培養物。
【請求項３】
麹菌を、難消化性デキストリンおよびポリデキストロースからなる群より選ばれる該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養することを特徴とする麹菌培養物の製造方法。
【請求項４】
麹菌を、難消化性デキストリンおよびポリデキストロースからなる群より選ばれる該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養し、培養物中にグルコアミラーゼを生成、蓄積させることを特徴とする、グルコアミラーゼを含有する麹菌培養物の製造方法。
【請求項５】
麹菌を、難消化性デキストリンおよびポリデキストロースからなる群より選ばれる該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養し、培養物中にグルコアミラーゼを生成、蓄積させることを特徴とするグルコアミラーゼの製造方法。
【請求項６】
請求項２記載の培養物を用いることを特徴とする酒類または発酵食品の製造方法。
【請求項７】
酒類の製造方法が、全行程を液相で行うことを特徴とする請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
酒類が、焼酎である請求項６または７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いた麹菌の培養方法、該培養方法で得られる培養物または該培養物の処理物、該培養物または該培養物の処理物を用いた酒類または発酵食品の製造方法、麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いた麹菌培養物の製造方法、グルコアミラーゼを含有する麹菌培養物の製造方法およびグルコアミラーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の酒類または発酵食品、例えば日本酒、焼酎、しょうゆ、みそ、みりん等の製造では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）またはアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）などの麹菌の胞子を、蒸煮した穀類などの固体原料へ散布し、その表面で麹菌を増殖させる固体培養法により製麹された、いわゆる固体麹が広く利用されている。
【０００３】
例えば、焼酎製造では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）やアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）などの固体麹が用いられている。しかしながら、固体培養は、原料や麹菌体が不均一に分散する培養系であるため、温度や水分含量、各種栄養成分といった因子を均一に保つことが困難であり、その培養制御は大変煩雑といえる。また、開放状態で製麹されることも多く、雑菌汚染といった品質管理面での注意も要する。
【０００４】
一般に、液体培養法は、固体培養法に比べ、培養制御や品質管理がはるかに容易であるが、麹菌を液体培養して得られる培養物が、実際の焼酎麹として用いられた例は少ない。なお、液体培養法で得られる培養物とは、液体培養法で得られる培養物そのもの（以下、液体麹ともいう）、培養液、菌体、それらの濃縮物またはそれらの乾燥物のことをいう。
【０００５】
液体培養法で得られる培養物が利用されない大きな理由として、液体培養では麹菌のアミラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ等の酵素の生産性が固体培養と比較して全般的に著しく低下することがあげられる。（Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994)、Hashimoto T. et al: J. Ferment. Bioeng., 88, 479-483 (1999)、Iwashita K. et al: Biosci. Biotechnol. Biochem.,62,1938-1946）。
【０００６】
通常、焼酎をはじめとする酒類製造では、並行複発酵によりアルコールが生成される。従って、麹菌へのグルコース供給に影響を与える麹菌の糖質分解関連酵素、特にグルコアミラーゼがアルコール発酵における鍵酵素となるが、液体培養法で得られる培養物におけるその活性は著しく低いことが知られている[Ishida H. et al: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307(1998)、Morimura S. et al: J. Ferment. Bioeng., 71, 329-334(1991)]。
【０００７】
つまり、液体培養法で得られる培養物を実際の焼酎製造に利用するためには、培養工学的手法による麹菌のグルコアミラーゼ活性の向上や焼酎仕込み方法の改良などが必須となる。
液体培養法で得られる麹菌体あたりのグルコアミラーゼ生産性が低い場合、高密度菌体培養することにより培養物全体の活性を焼酎製造に十分なレベルまで増強させる方法が考えられるが、麹菌の高密度菌体培養は、麹菌の形態制御をはじめとする種々の培養制御が必要とされる[Julie M. et al: Biotech. Bioeng., 59, 407-418(1998)、Pedersen H. et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 272-277(2000)]ため、麹菌を高密度菌体培養することは容易ではない。
【０００８】
したがって液体培養法で得られる培養物の焼酎製造への利用には、比較的培養が容易な低密度菌体培養によってグルコアミラーゼ活性が増強された培養物が得られることが望ましいが、これまでに知られている液体培養法において麹菌体あたりのグルコアミラーゼ生産性を向上させる方法は、厳密な制御または特殊な培養装置が必要であり（特開平11-225746）、現実的な方法ではない。
【０００９】
麹菌のグルコアミラーゼ活性を上昇させる方法としては、麹菌培養系内にデンプン、デキストリンまたはマルトースなどの麹菌によって容易に分解、資化される糖質を添加する方法が知られており、遺伝子レベルでその発現機構も解明されつつある［Y.Hata et al.: Curr.Gent.,22, 85-91(1992)］。しかしながら、実際の酒類等の製造においては、添加したこれらの糖質が麹菌によって速やかに資化されてしまうため、培養液中の麹菌密度が増加してしまい、培養液の粘性の上昇による通気不足、撹拌不十分といった現象が生じる。前述したように麹菌の高密度培養の培養制御は困難なため、上記糖質の添加培養も実用的な方法ではない。
【００１０】
また、麹菌のグルコアミラーゼ活性を上昇させる方法として、焙炒した穀類を麹菌培養液に添加する方法（特開2001-321154）も報告されているが、穀類を焙炒するという、新たな製造工程が加わることになる。
一方、実際の焼酎製造においては、麹歩合を上げる、すなわち単一仕込あたりの麹菌培養物の使用量を増やした仕込み方法も有効であると考えられるが、麹歩合の上昇は製麹プロセスの省力化、低コスト化という点から望ましい方法ではない。また、酵素活性の低い液体麹を濃縮する方法や市販酵素を添加する方法も報告されているが安価な方法ではない（土谷ら,熊本県工業技術センター研究報告,58-61,1994）。
【００１１】
以上のように、酒類または発酵食品の製造に使用することができる、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を簡便に、しかも安価に製造する方法が望まれているが、現在までそのような方法は知られていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酒類または発酵食品の製造に使用可能な糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を取得するための簡便で安価な麹菌の培養方法、該培養方法により得られる培養物、該培養物を用いた酒類または発酵食品の製造方法、特に全工程を液体化した酒類の製造方法、糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物の簡便で安価な製造方法、グルコアミラーゼを含有する麹菌培養物の製造方法およびグルコアミラーゼの製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて麹菌を培養することにより、麹菌あたりの糖質分解関連酵素、特にグルコミアラーゼの比活性が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）  麹菌を、該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養することを特徴とする麹菌の培養方法。
（２）  麹菌の難分解性糖質が、該麹菌を液体培養したときに発現する糖質分解酵素による分解率が５０％以下の糖質である上記（１）の培養方法。
（３）  麹菌の難分解性糖質が、難消化性デキストリン、ポリデキストロース、水溶性セルロースおよびプルランからなる群より選ばれる糖質である上記（１）または（２）の培養方法。
（４）  上記（１）〜（３）のいずれか１つの方法で得られる培養物。
（５）  麹菌を、該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養することを特徴とする麹菌培養物の製造方法。
（６）  麹菌を、該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養し、培養物中にグルコアミラーゼを生成、蓄積させることを特徴とする、グルコアミラーゼを含有する麹菌培養物の製造方法。
（７）  麹菌を、該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養し、培養物中にグルコアミラーゼを生成、蓄積させることを特徴とするグルコアミラーゼの製造方法。
（８）  麹菌の難分解性糖質が、該麹菌を液体培養したときに発現する糖質分解酵素による分解率が５０％以下の糖質である上記（５）〜（７）のいずれか１つの製造方法。
（９）  麹菌の難分解性糖質が、難消化性デキストリン、ポリデキストロース、水溶性セルロースおよびプルランからなる群より選ばれる糖質である上記（８）の製造方法。
（１０）上記（４）の培養物を用いることを特徴とする酒類または発酵食品の製造方法。
（１１）  酒類の製造方法が、全行程を液相で行うことを特徴とする上記（１０）の製造法。
（１２）  酒類が、焼酎である上記（１０）または（１１）の製造方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる麹菌は、糖質分解酵素生産能を有する麹菌、好ましくはグルコアミラーゼ生産能を有する麹菌であり、例えば前記したようなアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）等に代表される白麹菌、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等で代表される黒麹菌、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等に代表される黄麹菌などをあげることができる。
【００１６】
より具体的には、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）IFO4308、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）IFO4033、IFO4388、IFO1955、IFO8875、IFO8876、IFO8877、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）IFO4414、IFO4415、IFO4416、IFO4417、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）IFO4079、IFO4176、IFO4177、IFO4178、IFO4181、IFO4182、IFO4183、IFOP4184、IFO4190、IFO4191、IFO4193、IFO4194、IFO4202、IFO4206、IFO4209、IFO4210、IFO4214、IFO4215、IFO4228、IFO4240、IFO4254、IFO4255、IFO4268、IFO4370、IFO4377、IFO4379、IFO4384、IFO4385、IFO5238、IFO5239、IFO5240、IFO8871、IFO30104、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）IFO4239、IFO4241、IFO4243、IFO4244、IFO4252、IFO4274、IFO4279、IFO4386、IFO4391、IFO5241、IFO32074、IFO33082、IFO33083、IFO33084、IFO33085、IFO33086、IFO33087、IFFFO33088などをあげることができる。
【００１７】
本発明において、培地に接種する麹菌の形態は任意であり、胞子または菌糸を用いることができる。
本発明に使用する液体培地は、上記麹菌が生育し、かつ該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地であればいずれでもよく、例えば麹菌の難分解性糖質および糸状菌の培養に一般的に用いられる窒素源、無機塩類等を含む液体培地をあげることができる。また、上記麹菌が生育し、かつ該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地であれば、天然培地または合成培地のいずれも本発明に用いることができる。
【００１８】
上記窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物等を用いることができる。
【００１９】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
前述の天然培地としては、焼酎蒸留粕をあげることができる。ここでいう焼酎蒸留粕とは、本格焼酎を製造する際の蒸留残さのことであり、芋焼酎、米焼酎、麦焼酎、そば焼酎など種々の焼酎蒸留粕をあげることができる。
【００２０】
本発明に用いられる麹菌の難分解性糖質とは、該麹菌を液体培養したときに発現する糖質分解酵素によって分解されにくい糖質を意味し、通常、該酵素による分解率が50%以下の糖質、好ましくは0.01%〜50%の糖質、より好ましくは0.1〜40%の糖質、さらに好ましくは0.5〜30%の糖質、特に好ましくは1〜20%の糖質をあげることができる。
【００２１】
本発明に用いられる麹菌の難分解性糖質として、具体的には該麹菌を液体培養したときに発現する糖質分解酵素による分解率が50%以下である水溶性グルコースポリマーをあげることができる。さらに具体的には、難消化性デキストリン、ポリデキストロース、プルランおよび水溶性セルロースをあげることができる。また、上記の糖質分解酵素による分解率は、以下の方法により決定されるものである。
【００２２】
すなわち、1gの糖質を、10mmol/L 酢酸緩衝液（10mmol/L  酢酸：10mmol/L  酢酸ナトリウム＝3.2:6.8の比で混合したもの、pH5.0）10mLに溶解し、121℃、20分間オートクレーブ処理する。これに麹菌酵素液10mLを投入し、30℃で12時間処理した後、該処理液の上清（以下、処理上清という）の還元糖量を測定する方法により決定されるものである。
【００２３】
該麹菌酵素液としては、以下の方法により調製したものを用いる。まず、改変ツァペックドックス培地［マルトース2％、ポリペプトン（Difco）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム７水和物0.05%、硫酸鉄７水和物0.01%］100mlを容量500mlのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、その後の実際の酒類または発酵食品の製造に用いる麹菌、例えば焼酎の製造にアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）IFO4308を用いる場合は該IFO4308を接種し、30℃、180rpmにて48時間培養する。この培養液をろ紙（アドバンテック社製、No.5A）にてろ過し、その上清10mLを透析膜に入れ、10mmol/L酸緩衝液（10mmol/L 酢酸：10mmol/L 酢酸ナトリウム＝3.2:6.8の比で混合、pH5.0）に対して低温で一晩透析した後、水で10mLにしたものを、上記麹菌酵素液とする。
【００２４】
処理上清の還元糖量は例えば第四回改正所定分析法注解［注解編集委員会編、日本醸造協会（1993）］に記載の方法に従い測定できる。具体的にはフェーリング溶液10mLを300mL容三角フラスコにとり、水40mLおよびブドウ糖標準溶液約18mLを加えて電気コンロ上で沸騰させ、なお沸騰を続ける程度に火力を弱めて２分間沸騰を続けた後、ビューレットよりブドウ糖標準溶液を滴下し、硫酸銅の青色がなくなってから、メチレンブルー溶液４滴を加え煮沸しつつさらに液を滴下し、青色が消失したところを終点とする。滴定は沸騰を始めてから3分以内に終わらせる。ここで使用したブドウ糖標準液の全量をｂｍLとする。
【００２５】
次に、フェーリング溶液10mLを再び三角フラスコにとり、処理上清の適当量（糖量50mg以下を含むようにようにする）をピペットで加え、前記の操作にならってブドウ糖標準溶液を用いて滴定し、このmL数をｍとすれば還元糖は次式により求められる。
還元糖量（g／100ml）＝２（ｂ−ｍ）×[100／加えた処理上清（mL）]／1000なお、上記で用いるメチレンブルー溶液は、メチレンブルー１ｇを水に溶かして調製する。また、フェーリング溶液はＡ液とＢ液の２種類の溶液を調製し、これを5mLずつ加えることで調製する。Ａ液は、硫酸銅・５水和物34.639ｇを水に溶かして500mLとし、２日間放置後ろ過して使用する。Ｂ液は酒石酸カリウム・４水和物173gと水酸化ナトリウム50gを水に溶かして500mLとし、これを２日間放置後ろ過して使用する。ブドウ糖標準液は、ブドウ糖2.046gと安息香酸1gを水に溶かして１Lとしたものを使用する。
【００２６】
前記の方法によって求めた処理上清還元糖の値から糖質の分解率を以下の式に従って算出する。
分解率（％）＝処理上清還元糖（g／100ml）／（1／20×100）×100
麹菌の難分解性糖質の培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは0.1〜5%（重量／容量）、より好ましくは1〜2%（重量／容量）である。また、糖質の添加時期については、培養初発から添加することが好ましいが、菌体増殖が定常期に入る培養1日〜2日目に添加してもよい。
【００２７】
培養は、振盪培養または深部通気かくはん培養などの好気的条件下で行い、培養温度は15〜45℃、好ましくは30〜40℃が適当である。撹拌数や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよい。培養時間は通常1〜7日間である。
また、本発明の培養方法では、ペレット状の菌形態で培養が進行するため、デキストリン等の糖質添加培養のようにパルプ状の菌形態を示す培養に比べ、格段に液体培地の粘性が低く、撹拌不足による酸素律速等の培養工程における障害が回避され、培養工程の管理が容易である。
【００２８】
ここで、ペレット状とは、液体培養における糸状菌が示す形態の一種で、1個ずつが独立した、肉眼で容易に認められる大きさの菌糸塊であって、球状または球状に近似した形状を示す菌形態であり、パルプ状とは、繊維状の菌糸群が液中にほぼ均一に分散している菌形態とされている［Aspergillus, Plenum Press, New York（1994）］。
上記の培養法で得られる培養物および培養物の処理物としては、該培養物そのもの、該培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、麹菌体、それらの濃縮物またはそれらの乾燥物等をあげることができる。
【００２９】
該培養物または該培養物の処理物は、酒類または発酵食品の製造に用いることができる。
例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階において、しょうゆを製造する場合には、盛り込みの段階において、みそを製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、該培養物または該培養物の処理物を固体麹の代わりに用いることができる。
【００３０】
また上記した培養物若しくは該培養物から得られる培養液またはそれらの濃縮物などを用いて酒類または発酵食品の製造に用いる場合には、全行程を液相で行うことができる。
全工程を液相で行う酒類の製造方法としては、例えば焼酎を製造する場合、とうもろこし、麦、米、いも、さとうきび、黒糖などを原料に用い、該原料を約80℃の高温で耐熱性酵素剤を使って溶かした後、これに上記した培養物若しくは該培養物から得られる培養液またはそれらの濃縮物、および酵母を添加することでアルコール発酵させた発酵液を、常圧蒸留法または減圧蒸留法などにより蒸留して製造する方法をあげることができる。
【００３１】
また、清酒の製造法としては、米を原料に用い、該原料を約80℃の高温で耐熱性酵素剤を使って溶かした後、これに上記した培養物若しくは該培養物から得られる培養液またはそれらの濃縮物、および酵母を添加することでアルコール発酵させ、該発酵液を圧搾などによりろ過して製造する方法をあげることができる。グルコアミラーゼを含有する麹菌培養物は、上記した液体培地、培養方法に従って麹菌を培養することにより製造できる。グルコアミラーゼ活性は、基質にでんぷんを用いて酵素反応を行い、生成したグルコース量を公知の化学的または酵素的方法により定量することで測定できる。具体的には、第四回改訂国税庁所定分析法［注解編集委員会編、日本醸造協会（1993）］に記載の方法によって酵素反応を行った後、生成したグルコース量を市販のグルコース定量キット（和光純薬工業社製  グルコースB-テストワコーキットなど）等を用いて測定する方法をあげることができる。
【００３２】
グルコアミラーゼは、上記した液体培地、培養方法に従って麹菌を培養し、培養液中にグルコアミラーゼを生成蓄積させ、該培養液上清から通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、分離精製することができる。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を示すが、該実施例は本発明を限定するものではない。
以下の実施例で用いているアスペルギルス・カワチ IFO4308は、財団法人発酵研究所発行のカタログに記載されており、請求により分譲を受けることができる。
【００３４】
試験例１  糖質の分解率の測定
糖質の分解率は、上記した方法により麹菌酵素液を調製し、該酵素液を用いて上記した第四回改正所定分析法注解に記載の方法に従い、還元糖量を測定することにより決定した。糖質には、イソマルトース、マルトトリオース、デキストリン、可溶性デンプン、ポリデキストロース（カルター・フードサイエンス社製のライテス）、難消化性デキストリン（松谷化学工業製のパインファイバー）、水溶性セルロース（日本食品化工社製のセルエース）およびプルラン（林原商事社製）を用いた。
結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
0004087624.tif 000002
【００３６】
試験例２  グルコアミラーゼ比活性の測定
グルコアミラーゼ比活性は、麹菌体量ならびにグルコアミラーゼ活性量をそれぞれ測定した後、次の式により決定した。
グルコアミラーゼ比活性（U/mg‐菌体）＝培養物グルコアミラーゼ活性（U/ml）／培養物麹菌体量（mg/ml）
また、上記培養物菌体量は、培養物中の麹菌体を溶菌酵素で分解した後、遊離するＮ‐アセチルグルコサミンを測定するキッコーマン社製麹菌体量測定キットを用いて測定した。具体的には、麹菌培養物を溶菌用緩衝液にて5倍に希釈した試料を調製し、該試料1mlに溶菌酵素液1ml、溶菌用緩衝液3mlを添加した後、37℃で3時間加温することで麹菌を溶菌し、該溶菌液中のＮ‐アセチルグルコサミンを該測定キット付属の説明書に従って定量することにより、麹菌培養物1mlあたりの麹菌mg数を計算した。
【００３７】
グルコミラーゼ活性は、第四回改訂国税庁所定分析法［注解編集委員会編、日本醸造協会（1993）］に従って測定した。すなわち、デンプン溶液1mlにM/5酢酸緩衝液（10mmol/L  酢酸：10mmol/L  酢酸ナトリウム＝3.2:6.8の割合で混合し調製したもの、pH5.0）0.2mlを加え、40℃で5分間予熱した。これに酵素液（麹菌培養物から遠心分離により菌体を除いた培養上清）0.1mlを加え、40℃で20分間反応させ、1mol/L 塩酸溶液を0.1ml加えて中和した。別の対照として、デンプン溶液1mlにM/5酢酸緩衝液（組成は前記のものと同様）0.2mlを加え、40℃で5分間予熱し、1mol/L水酸化ナトリウム溶液を0.1ml加えた後に酵素液を0.1ml添加し、以下上記と同様に操作した。続いて、反応溶液中に生成したグルコース含量（mg）を和光純薬工業（株）製のグルコースB-テストワコーキットを用い、添付の説明書に従って測定した。
【００３８】
具体的には酵素反応終了後の反応液0.02mlにキットに同梱の発色試薬3.0mlをよく混合した後、37℃で20分間加温し、分光光度計を用いて505nmの吸光度を測定した。別の対照として発色試薬のみ3.0mlを37℃、20分間加温したものについても上記と同様の操作で吸光度を測定した。グルコース濃度を算定する検量線は、キット同梱のグルコース標準液を蒸留水で希釈し、これを試料として用い、上記と同様の操作で吸光度を測定することで作成した。
【００３９】
このようにしてあらかじめ作成した検量線から酵素反応溶液の吸光度に相当するグルコース濃度を求めた。グルコアミラーゼ活性は、可溶性デンプンから40℃で60分間に1mgのブドウ糖を生成する活性を１単位とした。
【００４０】
実施例１  改変ツァペックドックス培地を用いたグルコアミラーゼ活性が増強された麹菌培養物の製造
ポリペプトン（Difco社製）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム７水和物0.05%、硫酸鉄７水和物0.01%を含有する培地に、イソマルトース、マルトトリオース、デキストリン、可溶性デンプン、難消化性デキストリン（松谷化学工業製のパインファイバー）、ポリデキストロース（カルター・フードサイエンス社製のライテス）、水溶性セルロース（日本食品化工社製のセルエース）またはプルラン（林原商事社製）を2％になるように加えた培地（ｐＨ無調整）100mlを容量500mlのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、アスペルギルス・カワチ IFO4308の胞子懸濁液を1×106胞子数/mlになるように接種した。その後、温度30℃、振盪速度180rpmにて48時間培養を行った。培養終了後、培養物の菌体量およびグルコアミラーゼ活性を測定し、菌体量あたりの比活性としてグルコアミラーゼ活性を評価した。表２に各炭素源における培養物のグルコアミラーゼ比活性を示した。
【００４１】
【表２】
0004087624.tif 000003
【００４２】
グルコアミラーゼ誘導基質として知られているマルトースの類縁物質であるイソマルトース、マルトトリオース、およびデキストリン添加区におけるグルコアミラーゼの比活性は、それぞれ2.5U/mg-菌体、2.7U/mg-菌体、および2.1U/mg-菌体であり、グルコース添加区0.8U/mg-菌体の約３倍の誘導能を示したのに対し、アスペルギルス・カワチ IFO4083の難分解性糖質である難消化性デキストリン添加区では8.8U/mg-菌体、ポリデキストロース添加区では9.6U/mg-菌体、水溶性セルロース添加区では4.5U/mg-菌体、プルラン添加区では5.4U/mg-菌体であり、それぞれグルコース添加区の11倍、12倍、約5.6倍、6.8倍と顕著に高いグルコアミラーゼ誘導能を示した。これは、麹菌の難分解性糖質がグルコアミラーゼの発現誘導にきわめて適した誘導基質であることを示している。
【００４３】
また、麹菌の難分解性糖質を添加する培養方法においては、ペレット状の菌形態が観察された。ペレット状の菌体からなる培養液は、その粘土が低く、撹拌によって十分な酸素を培養液に供給できるので、麹菌の難分解性糖質を添加する培養方法は培養作業の面においても優れた培養方法であることが確認された。
【００４４】
実施例２  焼酎蒸留粕を培地に用いたグルコアミラーゼ活性が増強された麹菌培養物の製造（１）
麦焼酎蒸留粕を以下の方法で調製し、麹菌の培養に供した。
すなわち、発酵温度を25℃に保ち、表３に示した配合で、焼酎用酵母を用いた一次仕込を5日間行い、次に大麦700gを用いた二次仕込を14日間行った。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
発酵が終了した焼酎醪1Lを、ロータリーエバポレーター N-1NW-29型を用いて、300〜100mHg、醪品温48〜52℃、冷却温度10℃の条件下で減圧蒸留し、400mlの留出部を焼酎原酒として回収する一方、600mlの濃縮部を麦焼酎蒸留粕として取得した。
該麦焼酎蒸留粕を水道水で5倍に希釈したものに、デキストリン、難消化性デキストリン（松谷化学工業製のパインファイバー）、ポリデキストロース（カルター・フードサイエンス社製のライテス）、水溶性セルロース（日本食品化工社製のセルエース）またはプルラン（林原商事社製）を2％になるように添加した培地（pH無調整）100mlを作成し、容量500mlのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、アスペルギルス・カワチ IFO4308の胞子懸濁液を1×106胞子数/mlになるように接種した。その後、温度30℃、振とう速度180rpmにて48時間培養を行った。培養終了後、培養物の菌体量ならびにグルコアミラーゼ活性を測定し、菌体量あたりの比活性としてグルコアミラーゼ活性を評価した。表４に各炭素源における培養物のグルコアミラーゼ比活性を示した。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
その結果、デキストリン添加区は3.0U/mg-菌体であり、誘導基質無添加の対照区1.8U/mg-菌体の約1.7倍の誘導能を示したのに対し、難消化性デキストリン添加区は8．7U/mg-菌体で対照区の約4.8倍、ポリデキストロース添加区は7.5U/mg-菌体で対照区の約4.2倍、水溶性セルロース添加区は3.9U/mg-菌体で対照区の約2.2倍、プルラン添加区は5.4U/mg-菌体で対照区の3.0倍といずれもデキストリン添加区に比べ高い誘導能を示した。これは、麦焼酎蒸留粕培地を用いた場合においても、麹菌の難分解性糖質はグルコアミラーゼの優れた発現誘導基質であることを示している。
【００４９】
実施例３  焼酎蒸留粕を培地に用いたグルコアミラーゼ活性が増強された麹菌培養物の製造（２）
上記実施例２で得られた麦焼酎蒸留粕を水道水で5倍に希釈したものに、デキストリンまたは難消化性デキストリン（松谷化学工業製のパインファイバー）を2％になるように添加した培地（pH無調整）1Lを作成し、容量2Lのジャーファーメンターに入れ、オートクレーブ滅菌後、アスペルギルス・カワチ IFO4308の胞子懸濁液を1×106胞子数/mlになるように接種した。その後、温度30℃、撹拌数400rpmにて72時間培養を行った。培養期間中、1日おきに培養物のサンプリングを行い、菌体量ならびにグルコアミラーゼ活性を測定し、菌体量あたりの比活性としてグルコアミラーゼ活性を、デキストリンおよび難消化性デキストリンのいずれも無添加の対照区と比較評価した。図１に各炭素源における培養物のグルコアミラーゼ比活性の経時変化を示した。
【００５０】
グルコアミラーゼ比活性は各試験区とも培養の進行に伴って上昇していく傾向にあったが、特に難消化性デキストリン添加区で顕著であった。培養７２時間目の比活性を比較すると、デキストリン添加区は3.6U/mg-菌体で、対照区の2.0U/mg-菌体と比較して1.8倍なのに対し、難消化性デキストリン添加区は9.5U/mg-菌体で、対照区の約4.3倍にまで活性が誘導された。これは、麦焼酎蒸留粕培地を用いた大量培養においても、麹菌の難分解性糖質はグルコアミラーゼの優れた発現誘導基質であることを示している。
【００５１】
実施例４  グルコアミラーゼ活性が増強された麹菌培養物を用いた全行程が液相による焼酎の製造
実施例３において、麹菌の難分解性糖質添加培養により調製した培養物を用い、全工程が液相による焼酎製造を行った。すなわち、表５に示した仕込配合にて、総麦1kgの仕込を行い、発酵温度を25℃に保ち、一次仕込5日間、二次仕込14日間の二段仕込を行った。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
一次仕込ならびに二次仕込で用いる麦原料は液化処理したものを用いた。大麦の液化処理は、以下の方法で行った。すなわち、内容量5Lの撹拌機、ジャケット付き反応缶に水1.5 Lを入れ、50℃に保温しながら、原料精白大麦（精麦度80％）1.0 kgを投入し、リクイファーゼL４５（阪急バイオインダストリー製、α‐アミラーゼ）1ｇとオリエンターゼ10NL（阪急バイオインダストリー製、中性プロテアーゼ）0.5ｇとを添加し、撹拌しながら60分間反応させ、ついで3時間で直線的に90℃まで昇温させた。20分後、冷却を開始し、45℃まで冷却した時点で、セルロシンAL（阪急バイオインダストリー製、ヘミセルラーゼ剤）1.0ｇを添加し、引き続き冷却し、25℃になった時点で液化処理を終了した。引き続き、該液化処理液を容量比１：４に分割し、おのおの一次仕込、二次仕込に使用した。
また、対照仕込として表６に示すような固体麹と液化処理しない粒原料を用いた仕込を実施した。
【００５４】
【表６】
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【００５５】
図２にその発酵経過を示した。図２から明らかなように、固体麹を使用した対照仕込みと比較して、液体麹を用いた仕込みにおいても、ほぼ同様の発酵経過を示した。また、両者を減圧蒸留後、アルコール度数25％に和水したものをパネラー１０名による採点法（５点評価法、１：良、５：悪）により官能評価を行い、その平均点を表７に示した。
【００５６】
【表７】
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【００５７】
その結果、酒質の差異もほとんど認められず、液体麹を用いて十分に焼酎製造が可能であることが確認された。
以上の結果から、本発明によれば、液体培養によっても焼酎製造に必要なグルコアミラーゼ活性の高い麹菌培養物を、特別な培養装置や特殊な培養工学的手法による厳密な培養制御を行うことなく、簡便な液体培養法にて製造することができることが示された。また、固体培養に比べて極めて厳密な製麹管理を容易に行うことができる液体培養によって、品質の高い麹の安定的な製造が可能になった。また、麹の液体化により、もろみの流動化による発酵管理の簡易化だけでなく、麹製造プロセス、ひいては焼酎製造プロセスの省力化、効率化も可能となった。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、液体培養によってグルコミラーゼ活性が増強された麹菌培養物を提供することができる。液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能なので安価に品質が安定した麹を製造することができる。液体培養によって得られる培養物そのものは、液体麹として利用することができ、固体麹を使用する従来の焼酎製造とは異なり、全工程を液相のままで行うことが可能なので、本発明により従来に比べ効率的かつ安定的な焼酎製造システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  麦焼酎蒸留粕培地を用いた麹菌液体培養における麹菌のグルコアミラーゼ生産性に対する該麹菌の難分解性糖質の添加効果を示す図である。図中、▲は難消化性デキストリン添加区、●はデキストリン添加区、◆は対照区を示す。
【図２】  麹菌を液体培養して得られる培養物を用いた焼酎製造における発酵経過を示す図である。図中、▲は難消化性デキストリン含有液体培地で培養した麹菌培養物を、●は固体培養で培養して得られる麹菌を用いた発酵経過を示す。
【図１】
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【図２】
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