(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーキセンダン（Azadirachta excelsa JACOBS）の頂芽、腋芽、葉あるいは茎を培養して多芽体、不定胚あるいは不定芽を誘導し増殖させ、増殖した多芽体、不定胚あるいは不定芽をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させる、コーキセンダンの組織培養による大量増殖法であって、
頂芽をベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）５μＭ〜１０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を誘導し；腋芽をゼアチン０．１μＭ〜１０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を誘導し；葉をＢＡＰ１０μＭ〜２０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して不定胚を誘導し；あるいは茎をＢＡＰ１μＭ〜３０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して不定芽を誘導し、次いで不定芽をＢＡＰ１μＭ〜１０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を形成させ、
多芽体をＢＡＰ１μＭ〜１０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で増殖させ：あるいは不定胚をＢＡＰ１０μＭ〜２０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で増殖させ、
増殖した多芽体をＢＡＰ１μＭ〜１０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養してシュートを伸長させ；あるいは不定胚を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０．１μＭ〜１．０μＭおよびＢＡＰ１０μＭ〜２０μＭを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養してシュートを伸長させ、
次いで伸長したシュートを植物成長調節物質を含有しないＭＳ培地またはその改変培地で培養して発根させる、
コーキセンダンの組織培養による大量増殖法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コーキセンダン（Azadirachta excelsa JACOBS）の組織培養による大量増殖法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コーキセンダンは、世界の熱帯地域における造林木であり、材は用材として利用され、樹皮や葉は薬用として用いられている。増殖法は実生苗を育成する方法又は挿し木苗を育成する方法が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、組織培養技術の発達により、薬用物質の大量生産、それに係わる遺伝子の単離が行われており、コーキセンダンにおいてもそのような技術の開発が期待されている。しかしながら、このような技術開発を行う場合、優良苗を無菌増殖する必要があるが、コーキセンダンの組織培養による大量増殖法は、未だ開発されておらず、効率的な培養方法の開発が望まれている。
本発明の目的は、コーキセンダンの大量生産を可能にする大量増殖法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、コーキセンダンの頂芽、腋芽、葉あるいは茎からシュートを大量生産し、植物体を再生することができることを特徴とするコーキセンダンの大量増殖法である。
即ち、コーキセンダンの苗木、あるいは成木を用いて、大量生産を可能にする大量増殖法を開発することを目的として鋭意研究した結果、コーキセンダンの頂芽、腋芽、葉あるいは茎を培養して多芽体又は不定胚又は不定芽を効率よく誘導させ、更には誘導された多芽体、不定胚あるいは不定芽を増殖させ、次いで多芽体あるいは不定胚からシュートを伸長させることを見出した。増殖したシュートを、発根培地で培養することにより、更なるシュート伸長及び発根が可能になることを見出した。
【０００５】
従って本発明は、コーキセンダン（Azadirachta excelsa JACOBS）の頂芽、腋芽、葉あるいは茎を培養して多芽体、不定胚あるいは不定芽を誘導し増殖させ、増殖した多芽体、不定胚あるいは不定芽をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させる、ことを特徴とするコーキセンダンの組織培養による大量増殖法に関する。
更に本発明は、コーキセンダンの頂芽をベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体をＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを植物成長調節物質を含有しないＭＳ培地またはその改変培地で培養して発根させる、コーキセンダンの組織培養による大量増殖法に関する。
【０００６】
更に本発明は、コーキセンダンの腋芽をゼアチンを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を誘導し、次いでＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を増殖し、増殖した多芽体をＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを植物成長調節物質を含有しないＭＳ培地またはその改変培地で培養して発根させる、コーキセンダンの組織培養による大量増殖法に関する。
更に本発明は、コーキセンダンの葉をＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して不定胚を誘導し増殖させ、増殖した不定胚を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及びＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地でシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを植物成長調節物質を含有しないＭＳ培地またはその改変培地で培養して発根させる、コーキセンダンの組織培養による大量増殖法に関する。
更に本発明はコーキセンダンの茎をＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して不定芽を誘導し、次いでＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を形成させ、形成した多芽体をＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養して多芽体を増殖し、増殖した多芽体をＢＡＰを含有するＭＳ培地またはその改変培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを植物成長調節物質を含有しないＭＳ培地またはその改変培地で培養して発根させる、コーキセンダンの組織培養による大量増殖法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、コーキセンダンの苗及び成木の頂芽、腋芽、葉あるいは茎から、多芽体又は不定胚又は不定芽を誘導、増殖させ、次いで得られた多芽体、不定胚あるいは不定芽からシュートを伸長させ、これを発根させることにより、大量の幼植物体を効率よく生産することができる。
本発明で用いる培養材料としては、苗木及び成木から採取した頂芽、腋芽、葉又は茎が用いられる。採取した材料は、通常の方法に従って、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸化水素水あるいは塩化水銀（昇汞水）で表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後、培地中で培養する。
培養に用いる基本培地としては、無機成分及び炭素源を必須成分とし、その他植物成長調節物質、ビタミン、アミノ酸を含有する培地が用いられる。無機成分としては、窒素、燐、カリウム、ナトリウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、沃素、硼素、モリブデン、塩素、コバルト等の元素を含む無機化合物が用いられる。炭素源としては、炭水化物、例えばしょ糖又はグルコースが用いられる。植物成長調節物質としては、オーキシン、サイトカイニンが用いられる。オーキシンとしては、例えば、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、４−クロロ−２−メチルフェノキシ酢酸、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸等が挙げられ、サイトカイニンとしては、例えばベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、カイネチン、ゼアチン、６−（ｒ，ｒ−ジメチルアラミノ）プリン（ＺｉＰ）、Ｎ−（２−クロロ−４−ピリド）−Ｎ′−フェニルウレア（ＣＰＰＵ）、１−フェニル−３−（１，２，３−ティアディアゾール−５−ＹＬ）ウレア（４ディアズロン）等が挙げられる。ビタミンとしては、例えばチアミン、ピリドキシン、ニコチン酸等が挙げられる。アミノ酸としては、例えばグリシン、グルタミン酸、リジン等が挙げられる。
【０００８】
実際に培養する際に用いられる培地としては、植物組織培養に用いられる培地、例えばＭＳ培地（Murashige, T.(1962), Physiol. Plant. 15: 473 - 497) 、Ｂ５培地（Gamborg, O.L. (1968), Exp. Cell. Res. 50: 151 - 158)、ＷＰ培地(Lloyd, G. (1981), Int. Plant Prop. Soc. 30: 421 - 427) 、ＢＴＭ培地（Chalupa, V. (1984) Biologia Plnt. (praha) 26: 374 - 377)等が挙げられる。
特に、ＭＳ培地及びその改変培地（全培地成分を半分量にしたＭＳ培地）が好ましい。定芽、不定芽からなる多芽体の誘導及び成長を促進するため、頂芽を材料に用いる場合には、ＢＡＰを５μＭ〜１０μＭ、特に５μＭ含有する培地、腋芽を材料に用いる場合には、ゼアチンを０μＭ〜１０μＭ、特に０．１μＭ程度含有する培地、葉から不定胚を誘導するには、ＢＡＰを１０〜２０μＭ程度含有する培地を用いることが好ましく、また茎を材料に用いる場合には、ＢＡＰを１〜３０μＭ、特に１０μＭ程度含有する培地を用いることが好ましい。
【０００９】
次いで、得られた多芽体、不定胚あるいは不定芽を増殖培地に移植することにより、多芽体、不定胚あるいは不定芽を効率よく増殖させることができる。
増殖培地としては、多芽体又は不定芽では、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、ＢＡＰを１μＭ〜１０μＭ、特に５μＭ程度含有するＭＳ培地またはその改変培地が好ましく、不定胚では、ＢＡＰを１０〜２０μＭ程度含有するＭＳ培地またはその改変培地が好ましい。
【００１０】
次いで、増殖した多芽体、不定胚あるいは不定芽を、シュート伸長培地に移植することにより、多芽体、不定胚あるいは不定芽から効率よくシュートを伸長させることができる。
シュート伸長培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、多芽体あるいは不定芽ではＢＡＰを０μＭ〜１０μＭ、特に５μＭ程度含有するＭＳ培地またはその改変培地が好ましく、不定胚では２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を０μＭ〜１．０μＭ、特に０．１μＭ、ＢＡＰを０μＭ〜２０μＭ、特に２０μＭ程度含有するＭＳ培地またはその改変培地が好ましい。
【００１１】
次いで、伸長したシュートを分割、あるいは分割せずに発根培地に移植することにより、シュートを更に伸長させ、かつ発根させることができる。
発根培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有するＭＳ培地またはその改変培地が好ましい。また、植物成長調節物質は含有しないＭＳ培地またはその改変培地が好ましい。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】
材料
マレーシアから入手したコーキセンダン苗木（高さ０．２〜０．５ｍ) を温室で成育させ、高さ１．０〜６．０ｍに成長させた後、材料を採取した。
【００１４】
材料の殺菌
コーキセンダンの成木から頂芽、腋芽、葉および茎を採取し、７０％エタノール中で３０秒、２％次亜塩素酸ナトリウム中で７分間表面殺菌を行い、滅菌水で数回洗浄後、滅菌濾紙上で風乾した。風乾後、寒天培地で培養した。
【００１５】
実施例１
頂芽からの大量増殖
(1) 多芽体誘導
培地としては、改変ＭＳ培地（全培地成分を半分量にしたＭＳ培地）にショ糖３０ｇ／ｌ及び植物成長調節物質としてＢＡＰを０〜１０μＭ添加し、ｐＨを５．７に調整後、殺菌して用いた。培養は２６±２℃、１６時間日長（３，０００ｌｕｘ）で行った。培養１〜３ヶ月後には、伸長した頂芽の基部より新しい芽の形成が始まり、頂芽は多芽体へ成長した。１ヶ月後の多芽体誘導の結果を表１に示した。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
表１の結果から明らかなように、特に、ＢＡＰ５μＭを添加することが効果的であった。
(2) 多芽体の増殖
(1) で得られた多芽体は１個ずつの芽に分割し、増殖培地に移植した。培地には、ＢＡＰを０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、上記(1) と同様な条件で行った。１ヶ月後の多芽体増殖の結果を表２に示した。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
表２の結果から明らかなように、培養１カ月後には、１個ずつの芽から多芽体が再生され、特に、ＢＡＰ５μＭを添加することが効果的であった。
(3) シュート伸長
(2) で増殖した多芽体をそのままシュート伸長培地に移植した。培地には、ＢＡＰを０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(1) と同様である。１ヶ月後のシュート伸長の結果を表３に示した。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
表３の結果から明らかなように、培養１カ月後には、５〜１０本の芽を長さ約１０〜４０ｍｍに伸長することができ、特に、ＢＡＰ５μＭを添加することが効果的であった。
(4) 発根
(3) で得られた大量のシュートを一本ずつに切り分け、発根培地に移植した。培地には、ＮＡＡを０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(1) と同様である。２ヶ月後の発根率の結果を表４に示した。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
表４の結果から明らかなように、培養２カ月後には、８０％の個体で発根が観察され、同時に３〜５ｃｍのシュートを伸長、２〜５枚の新葉を展開させることができ、特に、植物成長調節物質を添加しないことが効果的であった。
【００２４】
実施例２
腋芽からの大量増殖
(1) 多芽体誘導
培地としては、改変ＭＳ培地（全培地成分を半分量にしたＭＳ培地）にショ糖３０ｇ／ｌ及び植物成長調節物質としてＩＢＡを０〜１μＭ、ゼアチンを０〜１０μＭ添加し、ｐＨを５．７に調整後、殺菌して用いた。培養は２６±２℃、１６時間日長（３，０００ｌｕｘ）で行った。培養１ヶ月後には、腋芽の伸長が起こり、長さ１５〜４０ｍｍ程度のシュートが得られた。このシュートを同組成の培地に移植すると、培養１〜２ヶ月後には、シュートの基部より新しい芽の形成が始まり、多芽体へと成長した。１ヶ月後の多芽体誘導の結果を表５に示した。
【００２５】
【表５】
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【００２６】
表５の結果から明らかなように、特に、ゼアチン０．１μＭを添加することが効果的であった。
(2) 多芽体の増殖
(1) で得られた多芽体は１個ずつの芽に分割し、増殖培地に移植した。培地には、ＢＡＰを0 〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、上記(1) と同様な条件で行った。１ヶ月後の多芽体の増殖の結果を表６に示した。
【００２７】
【表６】
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【００２８】
表６の結果から明らかなように、培養１カ月後には、１個ずつの芽から多芽体が再生され、特に、ＢＡＰ５μＭを添加することが効果的であった。
(3) シュート伸長
(2) で増殖した多芽体をそのままシュート伸長培地に移植した。培地には、ＢＡＰを0 〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(1) と同様である。１ヶ月後のシュート伸長の結果を表７に示した。
【００２９】
【表７】
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【００３０】
表７の結果から明らかなように、培養１カ月後には、５〜１０本の芽を長さ約１０〜４０ｍｍに伸長することができ、特に、ＢＡＰ５μＭを添加することが効果的であった。
(4) 発根
(3) で得られた大量のシュートを一本ずつに切り分け、発根培地に移植した。培地には、ＮＡＡを０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(1) と同様である。２ヵ月後のシュートからの発根率の結果を表８に示した。
【００３１】
【表８】
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【００３２】
表８の結果から明らかなように、培養２カ月後には、９０％の個体で発根が観察され、同時に３〜５ｃｍのシュートを伸長、２〜５枚の新葉を展開させることができ、特に、植物成長調節物質を添加しないことが効果的であった。
【００３３】
実施例３
葉からの大量増殖
(1) 不定胚誘導
殺菌した葉を２ｃｍ角に切り分け、培地に植えつけた。培地としては、改変ＭＳ培地（全培地成分を半分量にしたＭＳ培地）にショ糖３０ｇ／ｌ及び植物成長調節物質としてＮＡＡを０〜１μＭ、ＢＡＰを１０〜２０μＭ添加し、ｐＨを５．７に調整後、殺菌して用いた。培養は２６±２℃、暗所で行った。培養１〜２ヶ月後には、葉の切り口よりカルスの形成が起こり、培養３ヶ月後にはカルス表面に不定胚が形成された。
３ヶ月後の不定胚誘導の結果を表９に示した。
【００３４】
【表９】
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【００３５】
表９の結果から明らかなように特に、ＢＡＰ１０〜２０μＭを添加することが効果的であった。
(2) 不定胚増殖
(1) で得られた不定胚は１個ずつ増殖培地に移植した。培地には、ＮＡＡを０〜１μＭ、ＢＡＰを１０〜２０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(1) と同様である。
１ヶ月後の不定胚増殖の結果を表１０に示した。
【００３６】
【表１０】
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【００３７】
表１０の結果から明らかなように、培養１カ月後には、不定胚上に新たな胚（２次胚）の形成が認められ、特に、ＢＡＰ２０μＭを添加することが効果的であった。
(3) シュート伸長
(2) で増殖した不定胚をそのままシュート伸長培地に移植した。培地には、２，４−Ｄを０〜０．１μＭ、ＢＡＰを１０〜２０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養は２６±２℃、１６時間日長（３，０００ｌｕｘ）で行った。
１ヶ月後のシュート伸長の結果を表１１に示した。
【００３８】
【表１１】
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【００３９】
表１１の結果からも明らかなように、培養１カ月後には、不定胚上から数十本の芽が伸長し始め、培養２ヶ月後には５〜１０本の芽を長さ約１０〜４０ｍｍに伸長することができた。特に、２，４−Ｄ０．１μＭ、ＢＡＰ２０μＭを添加することが効果的であった。
(4) 発根
(3) で得られた大量のシュートを一本ずつに切り分け、発根培地に移植した。培地には、ＮＡＡを０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(2) と同様である。
２ヶ月後のシュートの発根率の結果を表１２に示した。
【００４０】
【表１２】
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【００４１】
表１２の結果から明らかなように、培養２カ月後には、１００％の個体で発根が観察され、同時に３〜５ｃｍのシュートを伸長、２〜５枚の新葉を展開させることができ、特に、植物成長調節物質を添加しないことが効果的であった。
【００４２】
実施例４
茎からの大量増殖
(1) 不定芽誘導
殺菌した茎（腋芽を含まない節間）の表皮を剥ぎ、縦に２分割して培地を植えつけた。培地としては、改変ＭＳ培地（全培地成分を半分量にしたＭＳ培地）にショ糖３０ｇ／ｌ及び植物成長調節物質として、ＢＡＰを０〜３０μＭ添加し、ｐＨを５．７に調整後、殺菌して用いた。培養は、２６±２℃、暗所で行った。培養１〜２ヶ月後には、材料の表面全体にカルスの形成が起こり、培養３ヶ月後にはカルス表面に不定芽が形成された。
３ヶ月後の不定芽誘導の結果を表１３に示した。
【表１３】
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【００４３】
表１３の結果から明らかなように特に、ＢＡＰ５〜１０μＭを添加することが効果的であった。
(2) 不定芽増殖
(1) で得られた不定芽は１個ずつ増殖培地に移植した。培地には、ＢＡＰ０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、２６±２℃、１６時間日長（３，０００ｌｕｘ）で行った。
１ヶ月後の不定芽増殖の結果を表１４に示した。
【００４４】
【表１４】
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【００４５】
表１４の結果から明らかなように、培養１ヶ月後には、不定芽が多芽体へと成長し、不定芽の増殖が認められ、特にＢＡＰ５μＭを添加することが効果的であった。
(3) シュート伸長
(2) で増殖した多芽体をそのままシュート伸長に移植した。培地には、０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(2) と同様である。
１ヶ月後のシュート伸長の結果を表１５に示した。
【００４６】
【表１５】
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【００４７】
表１５の結果からも明らかなように、培養１ヶ月後には、５〜１０本の芽を長さ約１０〜４０ｍｍに伸長することができ、特に、ＢＡＰ５μＭを添加することが効果的であった。
(4) 発根
(3) で得られた大量のシュートを１本ずつに切り分け、発根培地に移植した。培地には、ＮＡＡを０〜１０μＭ添加した改変ＭＳ培地（前記(1) と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(2) と同様である。
２ヶ月後のシュートの発根率の結果を表１６に示した。
【００４８】
【表１６】
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【００４９】
表１６の結果から明らかなように、培養２ヶ月後には、９０％の個体で発根が観察され、同時に３〜５ｃｍのシュートを伸長、２〜５枚の新葉を展開させることができ、特に植物成長調節物質を添加しないことが効果的であった。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、コーキセンダンの組織培養用に供する無菌幼植物体、挿し木用に供する苗及び挿し穂を、試験管内で短期間に大量に生産することができ、コーキセンダンの大量生産の可能性が高くなる。