(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−システノール酸を有効成分として具備するフェントン反応抑制剤。
【請求項２】
Ｄ−システノール酸を有効成分として具備する一重項酸素産生抑制剤。  
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬品、医薬品の原料や、健康食品、家畜や魚の試料の添加剤として用いるＤ−システノール酸の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−システノール酸（Ｃ３Ｈ９ＮＯ４Ｓ：分子量１５５）は、イワシに微量で含まれる含硫アミノ酸であり、その血栓防止効果は医薬品の原料として期待されている。近年、血栓症の治療および予防剤、並びに血中コレステロールの低下剤として適用するために、イワシから抽出したＤ―システノール酸を使用する発明がなされ、出願された（特願昭６１−４７８８０を参照されたい）。また、Ｄ−システノール酸またはその胆汁酸抱合体を含有するコレステロール低下剤についても特許出願がなされている（特願平３−４９１１３等を参照されたい）。
【０００３】
また、Ｄ−システノール酸は、１９５７年にウィックバーグ（Ｂ．Ｗｉｃｋｂｅｒｇ）により紅藻から分離、同定され、更に、１９６３年には、緑藻や褐藻等にもＤ−システノール酸は存在することを伊藤（広島大）が明らかにした。一方、本発明らは、アオサを用いて工業的にＤ−システノール酸を製造する方法を開発し、その製造法と装置に関して別途出願した（特願平１１−２２２４７０を参照されたい）。このＤ−システノール酸製造方法は、それまでの製法に比較して非常に効率的なものである。
【０００４】
以上のように、幾つかの知見に基づくＤ−システノール酸に関しての考案が幾つかなされている。しかしながら、Ｄ―システノール酸の生理活性には、依然として不明な点が存在しているのが現状であり、それがＤ−システノール酸の用途を狭いものに留めている。
【０００５】
近年、老化や発癌等の種々の疾患に対する活性酸素の関与が注目されている。活性酸素には、スーパーオキシドアニオン(即ち、O2-)、一重項酸素(1O2)およびヒドロキシラジカル(即ち、・OH；以後、・OHとも称する)を代表とする多く種類が存在する。その中でも特に、ヒドロキシラジカルは反応性および障害性が高い。そのため、ヒドロキシラジカルを消去することにより障害発生の予防手段になるとして多くの分野の研究者によって研究されている。生体内において、ヒドロキシラジカルは、好中球、内皮細胞、メサンギウム細胞、心筋および肝細胞等の多くの細胞の内外で発生し、発生した後に直ちに近傍の分子と反応して、それによって可逆的または不可逆的な細胞障害が惹起され、その結果、種々の疾患が引き起こされると一般的に考えられている。現在、障害および疾患等を防ぐために多くの薬剤が開発されている。しかし、そのような薬剤は、一般的に、ヒドロキシラジカルを消去することを作用機序としている。しかしながら、前述した通りヒドロキシラジカルの反応性が非常に高いので、発生してしまった後に・ＯＨを捕捉する薬剤では効果に限界がある。
【０００６】
ヒドロキシラジカルの発生経路には、以下の式１に示すフェントン反応がある：
Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ２→・ＯＨ＋ＯＨ−＋Ｆｅ３＋          （１）
この反応は生体内におけるヒドロキシラジカルの主な発生経路であると言われており、この反応によって生じたヒドロキシラジカルが、老化や発癌等の初期反応物質となる。この反応の抑制剤として、アジ化ナトリウムが、従来から知られているが、毒性が高く、その安全性が問題となっている。従って、該反応を効果的に抑制し、且つ高い安全性を有する薬剤の開発が、予防医学や健康維持の面から期待されている。
【０００７】
更にまた、上記のフェントン反応の生じ易い部位の１つに目や皮膚等が挙げられる。目および皮膚等では、フェントン反応により多量のヒドロキシラジカルが生じている。またそれと同時に、目および皮膚等では、光励起反応に伴う一重項酸素の発生も惹起され易い。一重項酸素の消去する薬物は、特開平７−２３３０４６号で開示されているが、ヒドロキシラジカルと一重項酸素を同時に消去する化合物は報告されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景から、本発明の目的は、ヒト等の動物において安全にヒドロキシラジカルの生成を抑制し、それと同時に、一重項酸素を消去する物質を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、ヒドロキシラジカルの生成を阻害するため、および一重項酸素を消去をするためのＤ−システノール酸の使用を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
以前、本発明者は、Ｄ−システノール酸を多く含む材料を、海藻を中心に鋭意、分析、評価して検討した。その結果、海藻中の緑藻のアオサ（Ｕｌｖａ属）に、Ｄ―システノール酸が、乾燥重量当０．１〜０．６％と多量に含有されることを見出し、Ｄ−システノール酸の製造方法および装置について先に出願した（特願平１１−２２２４７０）。
【００１０】
今回、本発明は、Ｄ−システノール酸の新たな生理作用を発見し、この生理作用を利用することによって、上記の課題を解決できることを見出した。
【００１２】
その第１の手段は、Ｄ−システノール酸を有効成分として具備するフェントン反応抑制剤である。
また、第２の手段は、Ｄ−システノール酸を有効成分として具備する一重項酸素産生抑制剤である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、本発明者等が、Ｄ−システノール酸がヒドロキシラジカル発生阻害作用および一重項酸素産生阻害作用を有することを発見したことに基づく。
【００１４】
本発明で使用するＤ−システノール酸は、天然物質からの抽出物であっても、または合成により製造することも可能であるが、好ましく、アオサから工業的に製造する。アオサを用いることより、アオサを有効に利用することが可能になり好ましい。しかしながらこれに限定されるものではない。
【００１５】
アオサからのＤ−システノール酸の製造方法は、例えば、海よりアオサを採取して培養した後に回収し、乾燥し、それを適切な溶媒を用いて抽出し、Ｄ−システノール酸を得て、更に得られたＤ−システノール酸を精製することにより行うことが可能である。
【００１６】
アオサから工業的にＤ−システノール酸を製造する方法は、不稔性アオサを培養過程において、Ｄ−システノール酸の構成成分であるイオウ化合物と共に過酸化物を存在することにより行うこと、および、Ｄ−システノール酸の分解を最小限に留めるために、アオサを遮光した環境下で乾燥することを具備する方法により実施することが可能である（特願平１１−２２２４７０を参照されたい）。
【００１７】
該製造方法における培養時に使用するイオウ化合物は、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム等であり、硫酸塩が好ましい。添加する硫酸イオン濃度は、海中に存在する濃度の１〜１．５倍が望ましい。また、過酸化物は、過酸化水素やオゾン等である。これらを培養槽への注入時の濃度は、過酸化水素で０．２〜１０ｐｐｍ、オゾンで０．０１〜０．１ｐｐｍが好ましい。遮光した環境下、例えば、直射日光を遮る開放空間または室内において、約24時間から７２時間で、約４０〜６０℃で乾燥したアオサから、Ｄ−システノール酸を抽出する。抽出は、例えば以下の方法によって実施可能である。即ち、アオサを数ミリ大に切断し、５０〜７０℃の熱水、および５０〜７０℃の６０〜７５(v/v)％エタノールまたはメタノール溶液を使用し、約１〜２時間抽出することにより行うことが可能である。
【００１８】
Ｄ−システノール酸の粗精製は、例えば、ジエチルエーテルで脱色し、活性炭を加えて色素を吸着し、濾過により透明な溶液を得て、更にこれを濃縮することにより行うことが可能である。また更に、純度の高いＤ−システノール酸を得るめの精製を行ってもよく、その精製は、例えば、イオン交換樹脂に供し、更に７０〜８０(v/v)％のエタノールまたはメタノール共存下での結晶化することにより行うことが可能である。
【００１９】
上記の方法により、Ｄ−システノール酸を高い回収率で産生することが可能であるが、これに限られるものではない
実験結果等の詳細は実施例において記載するが、本発明者は、Ｄ−システノール酸が、フェントン反応を阻害し、その結果、ヒドロキシラジカルの発生を阻害する効果を有することを明らかにした。更にまた、紫外線照射による一重項酸素の発生を阻害することも明らかにした。この効果は、眼科、皮膚科、外科および内科等における、広範に亘って、予防および治療学的に利用することが可能である。また、医学および薬学等の広範な分野における実験室等で、フェントン反応阻害剤とし、また一重項酸素阻害剤として使用することが可能である。また、ヒドロキシラジカルの産生と一重項酸素の産生を同時に阻害することにより優れた予防および治療効果を期待できる。
【００２０】
本発明は、Ｄ−システノール酸を有効成分として具備するフェントン反応および一重項酸素産生抑制剤を提供する。本発明のフェントン反応および一重項酸素産生抑制剤は、活性成分としてＤ−システノール酸を具備する。また、本発明の抑制剤中にＤ−システノール酸以外の賦形剤等の所望に応じた物質、また、他の活性成分を含有することも可能である。
【００２１】
更に、本発明は、Ｄ−システノール酸を活性成分として具備する医薬組成物を提供する。本発明の組成物は、ヒドロキシラジカルおよび一重項酸素に関連する疾患を予防または治療するために使用できる。特に、様々な活性酸素の関与する疾患、例えば、虚血性疾患、動脈硬化、糖尿病、腎炎、老化および種々の癌等、並びに皮膚科的および眼科的疾患等の予防および治療に効果的である。尚、本発明の医薬組成物についての詳細を更に後述する。
【００２２】
また、本発明は、Ｄ−システノール酸を活性成分として具備する食品を提供する。本発明のＤ−システノール酸を添加した食品は、栄養強化食品または特定保健用食品として用いることも可能である。更に、抗酸化剤として食品その他に用いることも可能である。尚、本発明の食品についての詳細は、更に後述する。
【００２３】
更にまた、本発明は、Ｄ−システノール酸を活性成分として具備する化粧品または化粧品原料を提供する。本発明のＤ−システノール酸を、化粧品および化粧品原料において活性成分として使用することも可能である。それにより、皮膚および頭髪等における活性酸素による影響を回避することが可能である。本発明の化粧品は、クリーム、化粧水、乳液、クレンジング、マッサージ用製品、パック、シャンプーおよびリンス等様々な形態または種類の製品を含み、更に前記製品に使用するための原料であってもよい。その製造方法は、従来の何れの方法も用いることが可能である。
【００２４】
以下に、本発明で用いられる医薬組成物について説明する。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、その活性成分であるＤ−システノール酸により、ヒドロキシラジカルおよび一重項酸素の産生が抑制され、それによって虚血性疾患、動脈硬化、糖尿病、腎炎、癌、皮膚科的疾患、および眼科的疾患等の活性酸素に関連する疾患を予防および／または治療することが可能である。
【００２６】
また、本発明の医薬組成物は、Ｄ−システノール酸と共に、治療および／または予防効果を有する様々な他の活性成分を含むことも可能である。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、Ｄ−システノール酸を有効量で含有し、例えば、単回投与量として約０．２５ｍｇ／体重ｋｇから約５０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内で含有することが可能である。また、その投与は、１日当たりの投与量を１回で投与することも可能であるし、または数回に分割する方法で投与することも可能である。厳密な用量は、投与様式、投与薬の剤形、治療する対象の症状および体重等によって広範に変化し得るので、責任のある医師若しくは獣医師の経験と選択によって決定されるべきものである。
【００２８】
投与経路は、活性物質が、適切且つ希望する作用部位に効果的に輸送される限り、経口または非経口投与、例えば経直腸、経皮膚、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、眼科的経路等の如何なる経路による投与も可能であるが、経口が好ましい。
【００２９】
典型的な組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、本発明の活性成分を含む。医薬組成物の製造においては、該抽出物を、薬学的に使用可能な賦形剤および補助剤を含む担体を含有することが可能であり、それ自身公知の方法、例えば、慣用的な混合、顆粒化、糖衣形成、溶解または凍結乾燥工程のような方法で製造できる。例えば、該活性抽出物は、通常担体と混合し、担体により希釈し、または担体内に封入することが出来る。これらはアンプル、カプセル、紙またはその他の容器中に加えることが出来る。希釈剤として担体を用いるときは、その担体は、該活性抽出物のための媒体、賦形剤または媒介物となり得るような固体、半固体または液体材料等が当てはまる。適切な担体として、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ひまし油、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、脂肪酸モノグリセライドおよびジグリセライド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース並びにポリビニルピロリジン等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００３０】
薬学的製剤は、滅菌することができ、また所望とあれば、本発明の活性抽出物と無害に混合できるものである限り、如何なる補助剤、乳化剤、浸透圧調整用塩、緩衝液および／または着色剤等と共に混合することができる。
【００３１】
経口剤に使用可能な薬学的製剤は、薬学的に経口剤として許容される限り、粉末、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル、軟カプセル、溶液、懸濁液、シロップ等の如何なるものも可能である。
【００３２】
非経口投与のための適切な処方には、薬学的に非経口投与剤として使用出来るものである限り、注射用水性溶液、注射用水性懸濁液、油性注射剤用懸濁液等の如何なるものも可能である。
【００３３】
以下に、本発明の食品について説明する。本発明のＤ−システノール酸は、ヒドロキシラジカル抑制効果および一重項酸素抑制効果を有する添加剤として、如何なる種類、また如何なる形状の食品にも含ませることも可能である。該添加物を添加することにより、様々な食品を健康食品、保健食品、栄養強化食品等として使用することを可能にする。
【００３４】
本発明の食品は、Ｄ−システノール酸を、該活性化成分を含有しない食品（または少量含有する食品）に補うことにより、本発明の食品を摂取した健康な対象において、活性酸素、特にヒドロキシラジカルおよび一重項酸素を抑制することによって健康を恒常性に維持すること寄与する。例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、虚血性疾患、腎炎、老化および種々の癌、並びに皮膚科的および眼科的疾患等の活性酸素に関連する疾患を食品として穏やかに予防し、それにより健康の維持と体調の改善に寄与することが可能である
また、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、虚血性疾患、腎炎、老化および種々の癌、並びに皮膚科的および眼科的疾患等の活性酸素に関連する疾患を罹患する対象が、本発明の食品を摂取すれば、活性酸素、特に、ヒドロキシラジカルおよび一重項酸素の産生を抑制することにより、医師若しくは獣医師により施される医療効果を補助することも可能であろう。
【００３５】
本発明の食品には、Ｄ−システノール酸を食品として相応しい有効量で添加することが適切である。
【００３６】
当業者に周知のことであるように、前記罹患の対象に与える場合の本発明は、該疾患に悪影響を与えない組成にする必要がある。
【００３７】
Ｄ−システノール酸を添加することが可能な食品には、米類、豆類、麦類、小麦粉、澱粉、砂糖、澱粉糖、パン類、麺類、菓子類、食用油、乳製品（バター、チーズ、アイスクリーム、乳酸菌製品等）、豆製品、園芸加工品（缶詰、ジャム、乾燥果実、果実飲料等）、清涼飲料、発酵食品類（酒類、食酢、醤油、ソース、味噌、納豆、漬物等）、肉製品類（ハム、ベーコン、ソーセージ、缶詰類）、卵製品、水産食品類、各種冷凍食品類、乾燥食品類、インスタント食品類、レトルト食品類等が例に挙げられ、また、調味料類、酵素製品類等に添加することも可能であるが、これらに限られるものではない。また、前記の食品への添加の方法は、当業者に公知の如何なる方法によっても可能である。
【００３８】
［実施例］
実施例１
海洋におけるアオサ生産を陸上で再現するため、横浜市金沢区八景島付近から入手した溶存態窒素濃度が約１．１ｐｐｍの海水を用いて、アオサＭＨＩ−ＡＴＲＣ株を屋外の透明アクリル製の培養装置（４０Ｌ）で培養した。尚、培養は以下の操作で行った。空気を培養槽（受光面積９００ｃｍ２×深さ５ｃｍ）に０．１５Ｌ／海水容量Ｌ・分の速度で供給し、海水をアオサへの溶存態窒素を供給するため２Ｌ／ｈｒの流速で入れ替えた。また、アオサはリーフパンチで直径０．６ｃｍの大きさに調製した後、このアオサ３，０００個体を培養槽に添加して３日間の予備培養の後、更に、１１日間の培養を行った。この培養によって増殖速度を求めた結果、１５ｇ（乾燥重量）／ｍ２・日で増殖する好ましいが確認された。一方、この藻体を回収し、窒素およびリンの含有量を測定したところ、それぞれ乾燥重量当り、３％と０．２％を示し、海水から窒素とリンを吸収したことが判明した。次に、培養１１日目以降の増殖したアオサに、イオウ成分、ＳＯ４２−として最終濃度が０．３４ｇ／ＬとなるようにＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを添加し、更に、最終濃度が１ｍｇ／Ｌ（１ｐｐｍ）となるように過酸化水素を添加した。その後、２日間培養してＤ−システノール酸の含有率を高めたアオサを生育した。
【００３９】
次に、このような培養により得られたアオサを純水で洗浄した後、脱水機にかけて脱水した後、新聞紙上に広げ、直射日光の当たらない室内で扇風機にて乾燥した。こうして乾燥重量として２０ｇのアオサを得た。このアオサを数ｍｍ大に手で切断した後、エタノール水溶液に浸し、その抽出液を得た。次に、この溶液を活性炭処理し、余分な色素を吸着させ、透明な水溶液を得た。この濾液をエバポレーターで濃縮し、濃縮した抽出液を強酸性陽イオン交換体に供し、素通り部分を得た。この画分を濃縮し、更に弱塩基性陰イオン交換体を用いて、同様に酢酸水溶液にて溶出した画分を得た。こうして得られた画分の余剰な酢酸をエバポレーターで除去した後、シロップ状の液を水に溶解した。その後、最終濃度７５（ｖ／ｖ）％のエタノールを加え、冷却下で保存し、静置することで白色針状結晶のＤ−システノール酸を得た。
【００４０】
実施例２
実施例１の方法により得られたＤ−システノール酸のフェントン反応抑制効果を試験した。試験は、Ｄ−システノール酸を式(I)のフェントン反応系に添加し、電子スピン共鳴装置（以下、ＥＳＲと称す）を用いて、・ＯＨラジカルの抑制率を計測した。即ち、最終濃度１ｍＭのＨ２Ｏ２と０．１ｍＭのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏにより・ＯＨを発生し、その生じた・ＯＨと、スピントラップ剤であるＤＭＰＯ（5,5-ジメチル-1-ピロリン N-オキシド）の９ｍＭとの反応産物をＥＳＲで検出した。尚、この反応液の容積は０．３ｍＬであり、このうち０．２ｍＬを石英製の偏平セルに移してＥＳＲの測定を行った。この際、ＥＳＲのシグナル（即ち、スピンアダクト）強度を１００として、Ｄ−システノール酸添加によるスピンアダクトの強度変化を測定した。その結果、図１に示すようにＤ-システノール酸の添加濃度に依存して、スピンアダクトの強度が低下した（図１）。従って、Ｄ−システノールの添加により・ＯＨの生成が抑制されることが明らかとなった。
【００４１】
更に、Ｄ−システノール酸の作用機構を明らかにするために、フェントン反応以外の反応を用いた・ＯＨ発生系であるＨ２Ｏ２に紫外線を照射する系を用いて検討した。これにより、Ｄ−システノール酸が、遊離の・ＯＨを消去するのか、或いはフェントン反応による・ＯＨ生成反応そのものを阻害するのかを検討することが可能である。
【００４２】
実験は、最終濃度１ｍＭのＨ２Ｏ２と９ｍＭのＤＭＰＯとを混合し、０．３ｍＬの該反応溶液に対して紫外線を照射し、発生した・ＯＨを、フェントン反応の場合と同様にＥＳＲにより測定することにより行った。該照射は、紫外線スポット照射装置（ハマフォト（株）L2859-01）を用いて、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を３０秒間照射することにより行った。またこのとき、ＥＳＲのシグナル（スピンアダクト）強度を１００とし、Ｄ−システノール酸の添加によるスピンアダクトの強度変化を測定した。その結果を図２に示した。Ｄ−システノール酸は、Ｈ２Ｏ２−紫外線照射系で発生する・ＯＨを抑制しなかった（図２）。これらの結果から、Ｄ−システノール酸は、遊離の・ＯＨを抑制するのではなく、・ＯＨを産生する反応そのものを抑制する効果、即ち、フェントン反応を抑制する効果を有することが判明した。
【００４３】
実施例３
また、Ｄ−システノール酸の一重項酸素(1Ｏ2)に対する消去活性を検討した。実験は、以下の方法により行った。１Ｏ２の発生は、０．５μＭのリボフラビンとＴＭＰＤ(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリドンヒドロクロリド)を含むｐＨ８のリン酸緩衝液に紫外線を照射して行い、それにより生じる１Ｏ２とＴＭＰＤとの反応産物であるＴＥＭＰＯＮＥ(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリドン-1-オキシル)をＥＳＲで検出した。該照射は、紫外線スポット照射装置(ハマフォト(株)Ｌ2859-01)を用いて、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１２０秒間照射することにより行った。測定は、ＥＳＲのシグナル強度を１００として、Ｄ−システノール酸添加によるシグナル変化を測定した。
【００４４】
その結果、図３に示したように、Ｄ−システノール酸には、１Ｏ２抑制効果があることが判明した(図３)。
【００４５】
尚、データには示さないが、Ｄ―システノール酸は、キサンチン-キサンチンオキシダーゼ系により発生したスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）に対して抑制効果は示さなかった。
【００４６】
【発明の効果】
上述した通り、不稔性アオサから抽出精製したＤ−システノール酸は、生体に有害な反応であるフェントン反応を抑制することが可能である。また、同時に、Ｄ−システノール酸は、光励起反応によって生じる一重項酸素を消去することが可能である。
【００４７】
本発明は、一般的に食品として用いられている安全性の高いアオサ由来のＤ−システノール酸の予防医学的な新たな利用方法を提供する。それと共に、本発明によってアオサ自体の新たな利用方法を提供し、アオサの付加価値向上に効果を奏する。
【００４８】
また、本発明により、Ｄ−システノール酸を、安全性の高いフェントン反応抑制剤、即ち、ヒドロキシラジカル発生抑制剤として、および一重項酸素阻害剤として、眼科、皮膚科、外科および内科等における広範に亘って、予防および治療学的な使用に利用することが可能である。また、医学および薬学等の広範な分野における実験室等で、フェントン反応阻害剤として使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｄ−システノール酸によるフェントン反応抑制効果を示す図。
【図２】  Ｄ−システノール酸による遊離ヒドロキシラジカルの消去効果を示す図。
【図３】  Ｄ−システノール酸による一重項酸素抑制効果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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