(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．月経周期２０−２４日から選択された子宮内膜のサンプルを未産として同定し、
ｂ．該サンプルをβ3インテグリンに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、
ｃ．該サンプル中のβ3インテグリンについて分析し、そして
ｄ．β3インテグリン発現の不存在を子宮内膜症と関連づける
ことを含んでいる子宮内膜症を予測する方法であって、ここで該子宮内膜症は軽い／極微の子宮内膜症である方法。
【請求項２】
該モノクローナル抗体がＳＳＡ６である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
該β3が他のインテグリンサブユニットと組み合わされている、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
該他のインテグリンサブユニットがαvである、請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
該モノクローナル抗体が２３Ｃ６である、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
β3に特異的な該モノクローナル抗体と接触した子宮内膜の該サンプルからβ3を免疫組織化学的に染色することにより該β3を検出する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】
β3に特異的な該モノクローナル抗体と接触した子宮内膜の該サンプルからのβ3を免疫ブロッティングすることにより該β3を検出する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項８】
該子宮内膜が人間の子宮内膜である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項９】
ａ．月経周期２０−２４日から選択された子宮内膜のサンプルを未産として同定し、
ｂ．該サンプルをβ3インテグリンに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、
ｃ．該サンプル中のβ3インテグリンについて分析し、そして
ｄ．β3インテグリン発現の不存在を子宮内膜症と関連づける
ことを含んでいる子宮内膜症を予測するためにβ3インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用する方法であって、ここで該子宮内膜症は軽い／極微の子宮内膜症である方法。
【請求項１０】
該モノクローナル抗体がＳＳＡ６である、請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】
該β3が他のインテグリンサブユニットと組み合わされている、請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１２】
該他のインテグリンサブユニットがαvである、請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１３】
該モノクローナル抗体が２３Ｃ６である、請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１４】
該子宮内膜が人間の子宮内膜である、請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１５】
β3に特異的な該モノクローナル抗体と接触した子宮内膜の該サンプルを免疫組織化学的に染色することにより該β3を監視する、請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１６】
β3に特異的な該モノクローナル抗体と接触した子宮内膜の該サンプルからのβ3を免疫ブロッティングすることにより該β3を検出する、請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１７】
月経周期の該段階が卵胞段階および分泌段階よりなる群から選択される、請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１８】
ａ．月経周期２０−２４日から選択された子宮内膜のサンプルを未産として同定し、
ｂ．該サンプルを分析して該サンプルの中のβ3インテグリンを検出し、そして
ｃ．β3インテグリン発現の不存在を子宮内膜症と関連づける
ことを含んでいる子宮内膜症を予測する方法であって、ここで該子宮内膜症は軽い／極微の子宮内膜症である方法。
【請求項１９】
β3インテグリンが以下から選択される方法により検出される、請求の範囲第１８項記載の方法：免疫組織化学的技術、免疫ブロッティング、ウェスタンブロッティング、免疫ペルオキシダーゼ染色、フルオレセインラベリング、ジアミノベンザジンおよびビオチニル化。
【発明の詳細な説明】
出願の関連性
本出願は１９９２年６月１２日に出願された出願番号８９７，７０６の一部継続である。
政府認可の関連性
この研究はバイオメディカル・リサーチ・サポート・グランド・プログラム、ディヴィジョン・オブ・レサーチ・レソーセス、ザ・ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス、認可番号Ｂ．Ｒ．Ｓ．Ｂ． Ｓ０７−ＲＲ−０５４１５−２９およびＨＤ３０４７６−１からの研究認可により一部支援された。米国政府は本発明にある種の権利を有する。
発明の背景
過去１０年にわたり、研究者は上に重なっている上皮の成長、分化および機能の指揮における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の重要性を認識してきている。Getzenberg他、”The Tissue Matrix: Cell Dynamics and Hormone Action”, Endocrine Rev. 1990, 11:399。細胞と細胞外マトリックス（すなわち下層）との間の相互作用は数種類の細胞付着分子により伝達されており、最も重要なものはインテグリンである。Albelda他、”Integrins and Other Cell Adhesion Molecules”, FESEB J. 1990, 4:2868。Buck他、”Integrin, a Transmembrane Glycoprotein Complex Mediating Cell-Substratum Adhesion”, J. Cell Sci. Suppl. 1987, 8:231。糖蛋白質受容体のこの種々の群がヘテロ二量体状αおよびβインテグリンサブユニットとして細胞膜上で発現されそして細胞−細胞および細胞−下層付着の両者に影響する。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、例えばフィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニン（ＬＭ）およびコラーゲン（Ｃｏｌ）の特異的認識および結合が情報をホルモン応答および遺伝子活性化の促進における主要な役割を有する相互作用である細胞骨格構造に伝達する。Burridge他、”Focal Adhesions: Transmembrane Junctions Between the Extracellular Matrix and the Cytoskeleton”, Ann. Rev. Cell. Biol. 1988, 4:487および上記のGetzenberg他の文献。
特異的インテグリン蛋白質に関する多くの情報が存在しているが、例えば、Helmer, M.E. ”VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Functions and Their Role on Leukocytes”, Annu. Rev. Immunol. 1990, 8:365、女性の生殖路におけるこれらの受容体の分配に関してはほとんど知られていない。子宮内では、腺上皮および関連する間葉（間質）からなる子宮内膜が周期性のホルモン環境に応答して複雑な一時的および空間的機能を維持する。Tabibzadehはインテグリン発現における機能的な変化が月経周期を一時的に選びだす他の組織変化を伴うと報告しているが、Tabibzadeh, S., ”Patterns of Expression of Integrin Molecules in Human Endometrium Throughout the Menstrual Cycle”, Hum. Reprod. 1992, 7:876、RogersおよびMurphy, ”Uterine Receptivity for Implantation: Human Studies”, in Blastocyst Implantation 1989, Yoshinaga, K. ed., Serono Symposia, p.231により報告されているように子宮受容性の形態学的または生化学的マーカーに関する研究は現在まで成功していない。そのようなマーカーが同定されると、胚着床、受胎能、避妊並びに子宮内膜成熟および受容性を含む子宮内膜現象も同様に同定できる。従って、ある種のインテグリンが受容性のマーカーに関する基準に合致しているようなら、子宮内膜内でインテグリン細胞付着分子を検出する方法に関する大きな要望がある。
子宮と胚成長との間の非同期性は、子宮内膜と胚受容性との間の調整不良による妊娠失敗の原因として示唆されており、Pope他、”Uterine Asynchrony: A cause of Embryonic Loss”, Biol. Reprod. 1988, 39:999を参照のこと。
極微の子宮内膜症と未産および不妊症との間の関係は論争の余地がある。この関与を支持するための多くの説得力のある議論が存在するが、医師は現在ではこの疾病の極微のまたは軽い形態は夫婦の受胎能に重要であるとはまだ信じていない。正常な子宮内膜を有する女性を軽いまたは極微の子宮内膜症の女性と比べた数種の研究は、周期生殖能、例えば動物モデルにより立証されたドナープログラムであるＩＶＦまたはＧＩＦＴにおける成功率、の減少を示した。この受容性欠如の１つの理由は、妊娠管理が現在使用中の処置と同程度の妊娠率を生ずるという多くの結果の発見である。
子宮内膜症患者の周期的生殖能における減衰を説明するために示唆されている多くの機構の中では、子宮受容性における欠如が多分最も少ししか注目を受けていなかった。Fedeleは重い子宮内膜症の女性における生来の子宮内膜における特別な変化を報告しており、Fedele, L.他、”Structural and Ultrastructural Defects in Preovulatory Endometrium of Normo-Ovulating Infertile Women with Minimal or Mild Endometriosis”Fertil. Steril. 1990, 53:989。Yovichは（ＩＶＦ−ＥＴ実験を基にして）重い子宮内膜は着床における欠陥と関連していることを示唆しており、Yovich他、”Hormonal Profiles and Embryo Quality in Women with Severe Endometriosis Treated by In Vitro Fertilization and Embryo Transfer”, Fertil. Steril. 1988, 50:308を参照のこと。手術誘発性子宮内膜症により着床が悪影響を受けること並びにこの影響が卵管水腫液により伝達されることを示唆する兎における研究からのデータがあり、Hahn他、”Experimantal Evidence for Failure to Implant as a Mechanism of Infertility Associated with Endometriosis”, Am. J. Obstet. Gynecol. 1986, 155:1109を参照のこと。
子宮内膜症は全般的な妊娠可能な女性母集団の推定２−５％を冒す疾病であるが、不妊女性におけるその罹病率は３０−５０％に達する、Peterson他、”Laparoscopy of the infertile Patient”, Obstet. Gynecol. 1970, 36:667。多くの罹病した女性は兆候がないかもしれないが、他の女性は月経困難症（疼痛、苦しい月経）、性交疼痛（性交中の疼痛）、月経不順および不妊症に罹っている。軽いまたは極微の子宮内膜症が不妊症と関連することは多くの研究により示唆されており、Hasson H.M., ”Incidence of Endometriosis in Diagnostic Laparoscopy”, J. Reprod. Med. 1976, 16:135、そして最近再調査されている、Bancroft他、”Minimal/Mild Endometriosis and Infertility. A Review”, Br. J. Obstet. Gynaecol. 1989, 96:454。極微の子宮内膜症が不妊症を引き起こす機構ははっきりしないままである。卵胞生成、排卵、卵輸送、受精、精子性質、胚、黄体段階機能、および自然流産率の増加に対する悪影響は全て言及されている。これらの影響は例えばプロスタグランジン、サイトキン、および成長因子の如き腹腔内因子の作用、腹腔内大食細胞の活性化、または例えば天然キラー細胞の活性減少の如き免疫機能における変化により伝達されるかもしれない。Kurzrock他、”LIF: Not Just a Leukemia Inhibitory Factor”, Endo. Rev. 1990, 12:208。２、３人の著者は、胚に対する子宮受容性は主として子宮内膜症により影響を受けることを示唆しており、Muscato他、”Sperm Phagocytosis by Human Peritoneal Macrophages: A Possible Cause of Infertility in Endometriosis”, Am. J. Obstet. Gynecol. 1982, 144:503およびYovich他、上記文献、そして動物モデルにおける手術誘発性子宮内膜症からの限られたデータはこの仮説を立証している、Hahn他、上記文献。さらに、正常な受胎可能な対照と比べての子宮内膜症の女性の子宮内膜における構造的異常も記載されている、Fedele他、上記文献。
非手術手段を用いて子宮内膜症の女性を同定するための多くの方式が検討されている。血清マーカー、例えばＯＣ−１２５（Barbieri他、”Evaluation of a Serological Test for the Diagnosis of Endometriosis using a Monoclonal Antibody OC-125”, SGI Annual Meeting 1985; March:331P（absract））は子宮内膜症の女性で増加するが、正常または他の疾病状態との重複が診断試験としてのその有用性を大きく限定している、Hornstein他、”Menstrual Cyclicity of CA-125 in Patients with Endometriosis”, Fertil. Steril. 1992, 58:279。さらに、疾病の重篤度に伴うその段階的上昇においては、ＯＣ−１２５は極微のまたは軽い種類の子宮内膜症ではほとんど有用性がない。例えばＭＲＩまたは超音波の如き他の様式も進行した子宮内膜症の存在下ではそれらの最も高い感度を有する。現在まで、極微のまたは軽い段階の子宮内膜症の診断用に有効であることが証される方法は腹腔鏡検査法以外にはない。
子宮受容性はあまり理解されていない現象であるが、母親の子宮内層に対する胚の初期付着が着床工程における決定的な段階であると考えられる。着床窓は１９５９年代からの詳しい研究および進歩した生殖技術を用いた最近の研究により定義されている、Hertig他、1956およびNavot他、1992。正常な月経周期の１９日後に子宮内膜上皮細胞上に必ず出現するインテグリン細胞付着分子の存在はこの着床の推定時期に相当する、Lessey他、”Integrin Adhesion Molecules in the Human Endometrium”, J. Clin. Invest. 1992, 90:188。このインテグリン、すなわちαVβ3ビトロネクチン受容体の発現は子宮内膜の成熟遅延の女性においては遅れる（ここで、子宮内膜組織は不適切なホルモン水準のために遅延するかまたは阻害され、または存在するホルモン水準に応じて減少する）。子宮内膜症による不妊症は子宮受容性における欠如を反映していることが数人により示唆されているように、不妊症女性の子宮内膜におけるこの蛋白質の発現を研究することは興味深い。子宮受容性を研究するための診断道具としてのインテグリンの使用は冒された個人を同定する際の意義ある価値を有することが証明されており、そして軽い状態の子宮内膜症に関する不妊症の病因の理解を助ける。
発明の要旨
本発明は子宮内膜症を予測する方法に関する。β3インテグリンに対するモノクローナル抗体の使用方法も本発明の範囲内である。
子宮内膜症の予測方法は、月経周期２０−２４日から選択された子宮内膜のサンプルを得て、子宮内膜サンプルを未産であると同定し、該サンプルをβ3インテグリンに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、該サンプル中のβ3インテグリンに関して効力検定し、そしてβ3インテグリンの不存在を子宮内膜症と関連づけることを含んでおり、ここで該子宮内膜は軽い／極微の子宮内膜症であると同定される。本発明はまた一般的な不妊女性母集団中で子宮内膜症を予測する際にも有用である。
子宮内膜症を予測するためにβ3インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用する方法は、月経周期２０−２４日から選択された子宮内膜のサンプルを得て、該サンプルをβ3インテグリンに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、該サンプル中のβ3に関して効力検定し、そしてβ3の不存在を子宮内膜症と関連づけることを含んでおり、ここで子宮内膜は未産であるかまたは軽い／極微の子宮内膜症であると同定される。
本発明はモノクローナル抗体を用いて子宮内膜におけるαv／β3インテグリンのβ3サブユニットを検出することにより胚着床に対する子宮内膜の受容性を検出する方法に関する。
子宮内膜周期の複数の段階からの子宮内膜中でのインテグリンのβ3サブユニットの出現を監視することによる哺乳動物における受胎の診断方法および子宮内膜成熟の監視方法も提供される。これは好適にはモノクローナル抗体を用いて行われる。
本発明はまた、子宮内膜サンプル中のインテグリンのβ3サブユニットを好適にはモノクローナル抗体を用いて検出することによる子宮内膜中での胚着床の最適な窓を検出する方法も提供する。
本発明の他の面は、子宮内膜中のインテグリンのβ3サブユニットをβ3に対する中和Ｆａｂ抗体と接触させることによる胚着床の予防方法を含む。試験管内受胎方法も本発明の態様である。これらは子宮内膜サンプル中でインテグリンのβ3サブユニットを検出し、卵を試験管内で受精させ、そして接合体をβ3サブユニットを発現する子宮内膜組織を有する子宮内に加えることを含む。
避妊具および診断具もそれにより考えられる。
本発明のこれらのおよび他の面は以下の詳細な記述を以下の図面と共に用いる時にさらに明白となるであろう。
図面の簡単な記述
図１は正常な子宮内膜の免疫ペルオキシダーゼ染色を示している。顕微鏡写真は月経周期全体にわたり変化しない６種のインテグリンに関する分布パターンを示している。濃い部分は陽性染色を表し、薄い部分は染色の不存在（特異的なインテグリンサブユニットの不存在）を表す。コラーゲン／ラミニン受容体サブユニット：α2（Ａ）、α3（Ｂ）、α6（Ｃ）、およびβ4（Ｄ）の免疫組織化学的染色は上皮の顕著な染色（←）および微小容器（←）を示し、α2、α3、およびβ4に関する意義ある間質染色（＊）はない。基底外側の染色α6およびβ4に関する基底染色に注目すること。フィブロネクチン受容体サブユニットα4（Ｅ）に関する染色は増殖段階では存在せず、α5（Ｆ）は減少する上皮染色（←）を有する優勢な間葉染色（＊）を示す。免疫反応（濃い染色の部分）はアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体により色原体としてジアミノベンザジンを使用して展開させた。比較的大きい感度には、対比染色は適用されなかった。
倍率：１２５Ｘ。
図２は増殖対分泌子宮内膜中のインテグリンサブユニットα1に関する免疫組織化学的染色の顕微鏡写真を示す。腺上皮における染色（←）は増殖段階（Ａ）ではほとんど存在せず、そして月経周期１４日（Ｂ、２０日の子宮内膜）後には全ての部分で顕著である。微小血管（←）染色も顕著であり、そして月経周期全体にわたり変化しなかった。分泌子宮内膜腺で見られる染色は背景（Ｃ）のものより相当高かった。倍率：１２５Ｘ。
図３は増殖段階対分泌段階の子宮内膜におけるαvおよびβ3（ビトロネクチン受容体インテグリンの２つの対になったサブユニット）の免疫染色を示す。増殖段階（Ａ）中のαvの染色強度は間質細胞（＊）に関しては「＋」と判定されそして腺αv（←）に関しては「±」と判断される。２２日の子宮内膜（Ｂ）におけるαvに関する免疫染色は腺染色における意義ある増加を示す（「＋＋」染色強度の例）。同様に、β3に関する染色は増殖上皮（Ｃ、←）においては存在せずそしてこの２２日の分泌子宮内膜（Ｄ）においては顕著に増加した。倍率：１２５Ｘ。
図４は月経周期全体にわたる３５個の子宮内膜サンプル中での上皮αvおよびβ3サブユニットに関する染色の相対強度を示す。αvに関する発現パターンはＡに示されており、月経周期全体にわたり染色における徐々の増加を示す。対照的に、Ｂにおけるβ3に関するパターンは月経周期の２０日付近のこのインテグリンサブユニットにおけるより急な上昇を示す。サンプルを持続する月経周期に従い段階づけた。切片標本は盲験観察者により０（−、陰性）、１（±、弱い）、２（＋、中程度）または３（＋＋、強い）の目盛りが指定され、そして第二の観察者により確認された。
図５は子宮内膜成熟遅延の１２人の不妊症患者における上皮β3の染色強度を示す。子宮内膜を不妊症に関して評価中の女性から集めた。組織基準と排卵期間および／またはその後の月経期間を基にした月経周期決定との間の相互関係を基にして、生検を２つの群に分けた。「段階外」の３日以上の子宮内膜生検患者（ＯＯＰ群）を「段階内」（正常）である２５人の生検患者と比較しそしてＡに示す。上皮β3染色の強度を基にして、切片標本は０（−、陰性）、１（±、弱い）、２（＋、中程度）または３（＋＋、強い）の目盛りが指定された。各群中で上皮β3染色を対比するために、「段階外」生検材料（Ｂ）および正常の「段階内」サンプル（Ｃ）の免疫組織化学的染色例を含む。倍率：４００Ｘ。
図６はβ3サブユニットに関して染色した増殖および分泌子宮内膜の免疫ブロット分析を示す。早期の且つ軽い増殖段階（レーン２、３）並びに黄体段階（レーン４および５、それぞれ２３および２６日）からの２つのサンプルと比較した（Ａ）血小板抽出の免疫ブロット（レーン１）は、β3に相当する約９５ｋＤ分子量における帯を示す。子宮内膜のサンプルをコラゲナーゼを用いて部分的に消化させそしてSatyaswaroop他、”Isolation and Culture of Human Endometrial Glands”, J. Clin. Endocr. Metab. 1979, 48:639の方法の変法を使用して腺要素を得た（Ｂ）。腺は周囲間質を含まない中空構造であるように思える。レーン３および４からのサンプル（それぞれ、ＣおよびＤ）の免疫蛍光検査はＡにおける９５ｋＤの不存在および存在に対応する。倍率：４００Ｘ。
図７は周期の１−２８日の子宮内膜サンプル形におけるβ3インテグリンサブユニットに関する免疫組織化学染色法を示すスキャッターグラムである。全てのサンプルは既知の子宮内膜日数決定を有しており、そしてどれも組織学的に段階外でない。
図８はαvβ3ビトロネクチン受容体のβ3サブユニットに関する免疫染色を示す。子宮内膜上皮細胞（やじり）は月経周期全体にわたりβ3発現における変化を受けた。サンプルは増殖段階（Ａ）、早期分泌段階（Ｂ、１８日）および中間分泌段階（Ｃ、２２日）から得られた。軽い子宮内膜症の患者からの子宮内膜生検材料（Ｄ）は２２−２３日段階で組織基準により「正常」と判定されたにもかかわらずβ3に関する上皮染色を有していなかった。免疫反応（褐色染色部分）はアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体によりジアミノベンザジンを色原体として使用して展開させた。血管要素（アステリスク）は全てのサンプルにおいてβ3サブユニットに関して陽性に染色した。より良い対比のために、その部分をメチルグリーンで対比染色した。緑色染色はβ3発現の不存在を意味する。ＡおよびＢにおける染色のパターンは０のＨＳＣＯＲＥに相当しそして「Ｃ」におけるものは２．６のＨＳＣＯＲＥに相当する。倍率：２００Ｘ。
図９は正常な受胎能対照（対照：ｎ＝２０）、子宮内膜症および経産の不妊症女性（経産；ｎ＝２８）および子宮内膜症の未産の不妊症女性（未産；ｎ＝７６）における子宮内膜症β3インテグリンに関する免疫染色結果の比較である。対になっていないｔ試験は２群の平均を比較しそして変化により起きる観察された差の可能性を測定し、その変化がｐ値として報告されている。対になっていないｔ試験を用いると、全体的なＨＳＣＯＲＥは後者の群では他の２つと比べて意義あるほど低かった。ＨＳＣＯＲＥは記載されている通りにして計算された。
図１０は正常な月経周期中のα4およびβ3の分布を示す。２つのサブユニットの共−発現が排卵後６−９日には推定着床窓に相当することに注目すること。
好適態様の記述
本発明は子宮内膜症の予測方法に関する。β3インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用する方法も本発明の範囲内である。
子宮内膜症を予測する方法は、月経周期２０−２４日から選択される子宮内膜のサンプルを経て、子宮内膜サンプルを未産として同定し、子宮内膜をβ3インテグリンに関するモノクローナル抗体と接触させ、サンプル中のβ3インテグリンを効力検定し、そしてβ3インテグリンの不存在を子宮内膜症と関連づけることを含んでおり、ここで子宮内膜は軽い／極微の子宮内膜症と同定される。子宮内膜のサンプルは好適には月経周期２０−２４日、より好適には月経周期２０−２３日、さらに好適には月経周期２２日から選択される。周期２０−２４日は排卵後６−１０日に相当する。本発明は一般的な不妊症女性母集団における子宮内膜症の予測においても有用である。
子宮内膜症を予測するためのβ3インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用する方法は、子宮内膜のサンプルを得て、このサンプルをβ3インテグリンに関して特異的なモノクローナル抗体と接触させ、サンプル中のβ3に関して効力検定し、β3の不存在を子宮内膜症と関連づけることを含んでおり、ここで子宮内膜は軽い／極微の子宮内膜症と同定される。
本発明は、子宮内膜のサンプルを得て、このサンプルをインテグリンのβ3サブユニットに関するモノクローナル抗体と接触させそしてβ3サブユニットを検出することを含む哺乳動物の子宮内膜の受容性を検出する方法に関する。
本発明の目的のためには、β3サブユニットはβ3単独であっても他のインテグリンサブユニット、例えばαv、と組み合わされていてもよい。
ここで使用されているインテグリンは細胞膜上で発現する多種の糖蛋白質受容体であると定義される。インテグリンは免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞付着分子である。インテグリンはヘテロ二量体状αおよびβサブユニットからなり、そして細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス付着に影響する。インテグリンファミリーは白血球−白血球および白血球−内皮細胞付着並びに細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン、ラミニン、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンとの細胞相互作用、および組織化された組織中の細胞−細胞相互作用を伝達する非共有的に関与するα／βヘテロ二量体対からなる受容体の広く分布された群である。
インテグリンは事実上全ての細胞タイプ（例外は赤血球細胞である）上で見られ、インテグリンの発現は細胞タイプ毎に変動する。人間の子宮内膜中では、ここで測定されたように、腺上皮細胞はコラーゲンラミニン受容体であるα2、α3およびα6インテグリンサブユニットを主として発現する。間質細胞はフィブロネクチン受容体であるα5を優先的に発現する。腺上皮細胞上のα1の存在は分泌段階中にのみ見られる特異的な月経周期である。ビトロネクチン受容体であるαv／β3の両者のサブユニットの発現も子宮内膜上皮細胞上で月経周期特異的変化を受ける。αvの発現は月経周期全体にわたり増加するが、β3サブユニットは月経周期２０日に管腔および腺上皮細胞上で突然出現する。α4発現も２３日に消えることが見いだされた。モノクローナル抗体ＳＳＡ６を用いるβ3の発現に関する効力検定は、２０日以降の周期のβ3発現を示した。α4発現は１４日に始まりそして２３日後にはMartin Hemler, Dana Farber Cancer Center, Boston, MAにより提供されたモノクローナル抗体Ｂ５Ｇ１０を用いてα4に関して効力検定することにより測定するともはや発現しなかった。さらに、本発明に従うと、α4およびαv発現は１９−２１日の間で着床窓を重複させることも発見された。
その結果、図１０に見られるように、インテグリンが受胎可能な生殖年令の女性における着床窓を規定する。これらの細胞付着分子は着床時間に関して機能的に調整されておりそして月経周期のこの時間に関する優れたマーカー蛋白質として作用する。図１０に示されている通り、α4およびβ3（２種のインテグリン種を表す）の共発現は既知の着床窓では正確に終了する（排卵後６−９日、Herting他、1956およびNavot他、1992の研究に基づく）。不妊症の多くの女性では分解されるようにみえるβ3インテグリンとは対照的に、α4インテグリンはそうならない。着床過程は多種の蛋白質または因子、例えばα4およびβ3のような２種のインテグリンの共発現を含むようであるが、例えばβ3の如き１つの個体の損失だけでもこれらの子宮内膜症患者で見られる受胎能の損失にとって十分であるようである。
本発明は哺乳動物の子宮の子宮内膜に関する。子宮壁はほとんど平滑筋すなわち子宮筋層である。子宮内膜、すなわちホルモンであるエストロゲン／プロゲステロンに非常に敏感な可変性の厚さの腺層、が子宮筋層を覆っている。子宮内膜は５、６枚の機能層からなっている。子宮筋層に最も近い層は基底層と称され、そして表面に近い層は機能層として知られている。この組織は上皮細胞、間質（すなわち間葉）細胞および子宮内膜白血球から製造されている。上皮細胞は腺状（子宮内膜の表面下で腺を生成する）または管腔状（子宮内膜の表面を覆う）である。これらの異なるタイプの上皮は異なる目的のために作用しそして異なるマーカー蛋白質用の染色パターンは必ずしも常に腺と管腔との間のものではない。人間の胚と最初に遭遇するものは管腔表面でありそしてそれは最初の付着に含まれると考えられる。初潮前の少女および閉経期以降の女性はホルモンであるエストロゲンおよびプロゲステロンの欠如により萎縮性である。生殖年令の女性では、子宮内膜はホルモン放出の卵巣周期に基づく周期成熟性変化を受ける。月経の第１日が周期の第１日であり、月経は一般的には５日で終了する。子宮内膜成長が次にエストロゲンの影響下で再開しそして増殖段階である１４日から約２８日まで進行する。１４日から２８日まで、子宮内膜はほとんどプロゲステロンの影響による分泌段階である増加した腺成長および分泌の兆候を示す。卵胞段階中には、卵胞は卵巣中で成長し且つエストロゲンが優勢なホルモンである一方、子宮内膜はより厚く成長する。排卵（典型的には２８日周期の１４日）で女性はエストロゲンおよびプロゲステロンに呈される。これは分泌または黄体段階と称され、そして周期が続きながら進行する型にはまった一連の組織変化が注目される。これらの組織変化は過去４０年間にわたるその使用にもかかわらず依然として論争の余地のある工程である子宮内膜の日付決定用に病理学者により使用されている。子宮内膜の日付決定において有用性が証明された信頼のおける免疫組織化学的マーカーは報告されていない。
黄体段階機能不全（ＬＰＤ）は子宮内膜の発育遅延に関する語である。それは受精卵と子宮内膜との間の非同調性ゆえに不妊症の既知の原因である。胚は容易に付着するが子宮内膜が遅れるなら、妊娠は起きないようである。ＬＰＤに関する原因には卵巣による不適切なホルモン産出が含まれており、そして例えば下垂体または視床下部からの不適切な性腺刺激ホルモン産出の如き比較的高い中心からの不完全な標識付けを意味する。ＬＰＤは不妊症および自然流産の既知の原因でありそしてホルモン増加で補正することができる。
胚着床段階は、並置胚の上皮細胞が母親の子宮内膜表面の外側（管腔）の上皮細胞と触れる時には、付着、および栄養膜のその下にある間質中への侵入を含み、そこでそれ自身が制定されそして成長し始める。母親の血管との接触がなされて栄養分および酸化された血液を得てそして侵入段階中に廃棄生成物自身を除く。胚が着床時に達する成長段階は未分化胚芽細胞段階であり、それは孵化と同時に起きる。多分、胚はその上皮細胞を露呈させて（透明帯殻の外）母親の細胞層と相互作用しなければならないため、着床が起きる前に孵化が必要であるという証拠がある。ここに示した通り、この相互作用はインテグリンにより起きる。
本発明の目的のためには子宮内膜症は子宮内膜組織の異所発生として定義され、しばしば変化した赤血球細胞を含有する嚢胞を生成する。子宮内膜症の段階はAmerican Fertility Society, AFSにより制定されている。American Fertility Society: Revised American Fertility Society Classification of Endometriosis: 1985. Fertil Steril 1985; 43:351-352。ＡＦＳは段階Ｉの子宮内膜症を極微の段階と定義しておりそして段階IIの子宮内膜症を軽い段階と定義している。
本発明で示されている通り不妊症とは受胎能の減少または受胎能の不存在であると定義されているため、雌性の哺乳動物が、最後まで持続しないかもしれない妊娠の可能性を有する適切な解剖学的構造および不確かな機能を有する。未産は、子を出産していない雌性の哺乳動物からの子宮内膜を含むがそれに限定されない。未産は子を妊娠しそして２０週間の妊娠を越えて保つことができずその代わりに自然流産した女性も含む。経産は本発明に従うと、人間に関しては、２０週間の妊娠後に且つ５００グラムの体重の生きているまたは死んでいる新生児を出産したことと定義される。適当な妊娠の長さおよび体重は人間に関して示されているものと匹敵するようにして他の哺乳動物にも適用できる。
本発明の目的のためには、哺乳動物は齧歯動物目、例えばマウス；ロゴモルファ目、例えば兎；より特に猫および犬を含む食肉動物；さらに特に偶蹄目である牛および豚；並びに馬を含む奇数指目；並びに最も特に霊長類目、セボイドおよびシモイド（猿）並びに類人猿（人間および無尾猿）を含むがそれらに限定されない。最も好適な態様の哺乳動物は人間である。本発明の実施において有用なモノクローナル抗体はインテグリンのβ3サブユニットとの親和力または結合力を有するモノクローナル抗体を含む。そのようなモノクローナル抗体の例はＳＳＡ６である。モノクローナル抗体ＳＳＡ６は、Bennett他、PNAS 1983, 80:2417およびBrass他、J. Biol. Chem. 1985, 260:7876により記載されている通りにして製造できる。
他のインテグリンサブユニットと組み合わされたβ3を認識するモノクローナル抗体も使用できる。そのようなモノクローナル抗体の１つは２３Ｃ６であり、それはDavies他、J. Cell Biol. 1989, 109:1817の方法に従い製造できる。例えば２３Ｃ６の如きモノクローナル抗体（無傷のαv／β3インテグリンに対して特異的、すなわちビトロネクチン受容体）を用いる免疫染色はβ3サブユニットを測定するだけのＳＳＡ６と同一のパターンを生成する。これは、αv特異的抗体は全てのαv含有インテグリンを測定するが無傷のαv／β3インテグリンまたはβ3サブユニットを認識する抗体を使用してこのインテグリン（αv／β3「ビトロネクチン受容体」）を研究できることを示している。
他のモノクローナル抗体も使用できる。モノクローナル抗体の製造は当技術の専門家に既知である。特に、KohlerおよびMilstein, Nature 1975, 256:495の方法を使用して本発明における使用のためのモノクローナル抗体を製造できる。
分析用の子宮内膜組織を得る方法は当技術で既知の手術および非手術技術を含む。手術方法は生検、拡張およびクレテージを含むがそれらに限定されない。非手術方法は免疫細胞化学的評価を伴う子宮洗浄および子宮ブラシかけを含むがそれらに限定されない。
子宮内膜中でβ3を検出する方法は当技術で既知の糖蛋白質を同定する全ての方法を含む。これらの方法は免疫組織化学的技術、例えば免疫ブロッティングまたはウェスタンブロッティング、免疫ペルオキシダーゼ染色、フルオレセインラベリング、ジアミノベンザジンおよびビオチニル化を含むが、それらに限定されない。
一般的には、免疫組織化学は低温切開された組織サンプルの染色を含む。ここで使用される子宮内膜サンプルは約４−８μの厚さに低温切開することができる。子宮内膜を第一抗体、例えばＳＳＡ６、と接触させ、その後に第二抗体、例えばビオチニル化された山羊の抗−マウス抗体、と接触させる。子宮内膜を次にアビジン−共役ホースラディッシュペルオキシダーゼ高分子複合体の中で培養し、その後に例えばジアミノベンザジンの如き色素体培養を行う。次にフルオレセインを加えてインテグリン分布を観察する。
免疫ブロッティングはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での蛋白質、ここではインテグリン、の分析を含む。ゲルを非還元条件下で走行させそしてサンプルを例えばニトロセルロース膜に移す。膜を第一抗体、例えばＳＳＡ６、を含有する培地の中で培養する。第二抗体、例えばアルカリ性ホスファターゼ−共役山羊抗−マウス抗体、を用いてフィルターを展色させる。
子宮内膜症を予測するための本発明の方法は、子宮内膜のサンプルを得て、子宮内膜のサンプルを未産と同定し、このサンプルをβ3インテグリンに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、サンプル中のβ3インテグリンを効力検定し、そしてβ3インテグリンの不存在を子宮内膜症と相互関連させることを含み、ここで子宮内膜症は軽い／極微の子宮内膜症である。
子宮内膜症を予測するためにβ3インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用する方法も本発明の範囲内であり、そして子宮内膜のサンプルを得て、子宮内膜のサンプルを未産と同定し、サンプルをβ3インテグリンに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、サンプル中のβ3インテグリンを効力検定し、そしてβ3インテグリンの不存在を子宮内膜症と相互関連させることを含み、ここで子宮内膜は軽い／極微の子宮内膜症であると同定される。
不妊症を診断するためおよび哺乳動物の子宮内膜中で胚着床窓を検出するための方法も本発明の範囲内である。ここに提唱されているように、インテグリンのβ3サブユニットは月経周期の２０日に出現する。ここでは子宮内膜の上皮上のαv／β3がフィブロネクチン、ビトロネクチンおよびオステオポンチンと結合することも提唱される。これらの分子が子宮内膜のαv／β3インテグリンと胚との間の橋を与える。さらに、黄体段階機能不全の患者は子宮内膜成熟遅延、不妊症および２０−２４日にβ3に関する陰性の染色を有する。従って、受胎の最適時間を月経周期における複数の段階で子宮内膜サンプルを繰り返し試験することにより決めることができる。そこで、β3に関するスクリーニングが不妊症の診断方法および子宮内膜中での胚着床窓の検出方法を提供する。着床窓は、子宮の子宮内膜が胚着床に利用できる時期である。この窓は、αv／β3インテグリンの発現により選ばれ、好適には人間の月経周期の１９日−２３日であり、そしてより好適には２０日である。
同様な周期は他の哺乳動物に関しても知られており、前記の方法論をそのような周期に適用させることは当技術の専門範囲内である。
本発明は試験管内受精方法にも関する。インテグリンのβ3サブユニットが妊娠用に選択された動物中で検出されると、同一もしくは相異なる動物からの１つもしくは複数の受精可能卵を子宮内で置換して妊娠を設定させることができる。卵および適当な精子を一緒にして試験管内で受精卵を製造する。本発明の目的のためには、試験管内受精はペトリ皿中で、試験管内などで、行われる。さらに、試験管内受精は卵および精子を輪卵管に独立して加えてその中で受精卵を製造することとも考えられる。いずれの場合にも、受精卵は妊娠用に選択された動物の子宮に加えられそして子宮壁の子宮内膜中への着床に関して監視される。
或いは、本発明は胚着床を妨害する方法にも関する。それは子宮内膜をβ3に特異的な中和Ｆａｂフラグメントと接触させることにより行うことができる。本発明の目的のためには、β3を結合するモノクローナル抗体からのＦａｂフラグメントは本発明の範囲内である。Ｆａｂフラグメントはモノクローナル抗体ＳＳＡ６および２３Ｃ６からのＦａｂフラグメントも含むが、それらに限定されない。Ｆａｂフラグメントは生体内に胚着床を妨害するのに治療的に有効な時間にわたり留まることができる。Ｆａｂフラグメントはβ3に関するモノクローナル抗体の配位子結合部分、すなわちβ3に関する結合部位を含む。中和Ｆａｂフラグメントを典型的なモノクローナル抗体の代わりに使用して炎症反応の可能性を減少させる。
避妊が本発明の他の態様である。避妊薬は、好適には子宮内適用に適合された製剤的に許容可能な担体中の治療的有効量のβ3インテグリンに関して特異的な中和Ｆａｂフラグメントモノクローナル抗体を含む。Ｆａｂフラグメントは例えばＳＳＡ６であるがそれに限定されないβ3を認識するモノクローナル抗体からであってもよい。避妊薬は例えばαvであるがそれに限定されない他のインテグリンサブユニットと組み合わされたβ3を含んでいてもよい。αvβ3の場合には、Ｆａｂはモノクローナル抗体２３Ｃ６からであってもよい。
胚のこのαv／β3受容体への結合を特異的に妨害する化合物も本発明の範囲内に含まれる。例には、ビトロネクチン受容体に関する活性結合部位であるアミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ＲＧＤ、を含有するペプチド類（Pierschbacher他、”Synthetic Peptide with Cell Attachment Activity of Fibronectin”, PNAS 1983, 80:1223）が含まれる。研究者によると、この配列は妊娠誘発細胞（栄養膜）の試験管内での付着を妨害すると報告されている、Kao他、”The Human Villous Cytorophoblast: Interactions with Extracellular Matrix Proteins, Endocrine Function, and Cytoplasmic Differentiation in the Absence of Syncytium Formation”, Development 1988, 130:693。このようにして、配列ＲＧＤを含有する避妊薬を局部的に投与して胚着床を妨害することができる。
製剤的に許容可能な担体は腟坐薬、子宮内装置（ＩＵＤ）、ゲル、例えば遅延放出調合物、例えば、デポ形態のホルモン−全身的循環中に注射されそして遅延放出されるかまたはサイラスティック管中に分配された微結晶を含むが、それらに限定されない。避妊調合物は約１０μｇ／ｍｌで投与される。
子宮内膜成熟を監視する方法も本発明の範囲内である。子宮内膜は胚受容性、胚着床、不妊性、子宮内膜補充および排卵に関して監視することができる。
診断具も本発明の範囲内である。そのような道具は溶液中でβ3を急速に検出するためのモノクローナル抗体、予め吸収されたβ3に対する抗体を含有しそしてそれに対して子宮洗浄を行える吸収剤検出装置、存在する時にβ3を可視化させる現像剤を含む。
β3発現を妨害する化合物も本発明の範囲内に含まれる。１９−２０日における子宮内膜インテグリンの導入用の調整信号はまだ確実ではないが、本発明の結果として、腹腔液が不妊症および子宮内膜症の女性における欠陥のあるインテグリン発現に関連すると思われる生体活性剤を含有することが今回わかった。異常な腹腔環境を有する生体活性成分は子宮内の子宮内膜細胞間のパラクリン・クロススターク内の破壊をもたらすかもしれない。候補には、極微および軽い子宮内膜症の女性において上昇しそして最近では齧歯動物モデルにおける着床を妨害することが知られているインターロイキン−１β受容体作用薬が含まれる、Simon, C.他、Annual Meeting of the American Fertility Society, Montreal, S2-Abst 0-3, 1993。解放しているまたは妨害されていない輪卵管が子宮内膜β3インテグリンの子宮内膜症−伝達効果に対する予備条件であるかもしれない。
本発明に従うと、卵管水腫液はここでは子宮内膜欠陥を引き起こす可能性のある候補であると同定される。本発明の方法は、管流体集積を引き起こす輪卵管の末端閉塞のある女性の５０％以上が着床時期中にαvβ3インテグリンの損失があることが見いだされた。β3陰性である３人の女性はインテグリン発現欠陥の完全な補正がなされた。これらの３人の女性は卵管水腫液が手術により除去された前後に子宮内膜生検を受けた。このことは、集積しそして子宮内に戻って空になる管からの流体が子宮内膜の機能不全を引き起こして不妊症をもたらすことを示唆している。このことは、ＩＶＦ−試験管内受精臨床処置に入った卵管水腫液のない女性と比べて卵管水腫液のある女性における子宮受容性の減少を示す最近の報告と一致する。
本発明は、卵管水腫液の存在のために子宮内膜症を有する疑いのある哺乳動物をスクリーニングしそして該液を不活性化することを含む子宮内膜症のある哺乳動物の処置方法に関する。卵管水腫液を不活性化する段階は液の除去または液に対する抗体の接触を含むが、それらに限定されない。抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ抗体並びにＦａｂフラグメントを含むことができる。或いは、卵管水腫液から単離できる因子に関するスクリーニングおよび該因子の不活性化も本発明に含まれる。
本発明は輪卵管または子宮を卵管水腫液または卵管水腫液因子と接触させることによる胚着床の妨害にも関する。卵管水腫液は胚着床を妨害するための治療的に有効な時間にわたり生体内に留まることができる。
避妊が本発明の別の態様である。避妊約は治療的に有効な量の卵管水腫液またはそこから単離された因子を含むことができる。避妊薬はまた製剤的に許容可能な担体と一緒に加えることもできる。本発明の避妊薬の適用量は患者の体重および臨床的状態に関して決められる。活性成分対担体の割合比はもちろん化合物の化学的性質、溶解度、および安定性、並びに意図する薬用量に依存するであろう。本発明の避妊薬は好適には輪卵管または子宮内適用のために適合される。
本発明を下記の実施例でさらに詳細に記載する。これらの実施例は添付された請求の範囲を限定するものではない。
実施例
人間のサンプル
３５人の生殖年令の女性から子宮摘出時に子宮内膜を得た。組織を早期増殖段階（５日）から後期増殖段階（２８日）に得て、そして良性疾病のために子宮全摘を行った。女性に対して不妊症に関する評価の一部として子宮内膜生検を行った。全ての患者は周期的に正常でありそして手術前に少なくとも３ヶ月間にわたりホルモンを受けていなかった。子宮内膜の日付決定をNoyes他、”Dating the Endometrium”, Fertil. Steril. 1950, 1:3の基準に従い評価した。子宮内膜生検を排卵時期および／または次の月経期間の開始に関して評価した。組織の日付決定が月経周期の予測日に関して３日以上遅れたら、サンプルは「段階外」と判定された。増殖性子宮内膜は組織学および最後の月経期間に基づき判別された。サンプルを氷上で研究室に移しそしてドライアイス上で瞬間凍結しそして−７０℃で貯蔵した。
抗体
それぞれα2、α3、α5サブユニットに特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）であるＰ１Ｈ５、Ｐ１Ｂ５、Ｐ１Ｄ６はDrs. Elizabeth Wayner and William Carterから入手した。それぞれα1およびα4サブユニットに対して指定されたＭａｂであるＴＳ２／７およびＢ−５Ｈ１０はDr. Martin Hemlerから入手した。α6に対して指定された特異的ＭａｂであるＧｏＨ３はDr. Arnoud Sonnenbergから入手した。αvに対するＭａｂであるＬＭ１４２はDr. David Chereshから入手した。β4抗体はDr. Steven Kennelから入手した。αvと付着したβ3を認識する２３Ｃ６抗体はMichael Hortonから得た。
免疫組織化学
免疫ペルオキシダーゼ染色を月経周期全体からの子宮内膜サンプルの低温槽部分で行った。一連の４−８μ厚さの低温部分をポリ−Ｌリシンコーテイングスライド上に置き、−２０℃のアセトン中で１０分間定着させ、そしてVectastain EliteR ABCキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて染色した。ジアミノベンザジン（DAB; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.）を色原体として使用した。第一抗体を低温部分上にＰＢＳ中１％牛血清アルブミンを用いる阻止後に置き、そして室温において１時間結合させた。ｐＨ７．２−７．４の燐酸塩で緩衝された食塩水（ＰＢＳ）すすぎをビオチニル化された山羊の抗−マウス抗体からなる第二抗体により３０分間行った。ＰＢＳすすぎ後に、内因性ペルオキシダーゼを無水エタノール中０．３％Ｈ2Ｏ2を用いる３０分の培養およびその後のＰＢＳ中での３０分の再水和で収集した。アビジン：ビオチニル化されたホースラディッシュペルオキシダーゼ高分子量複合体（ＡＢＣ）を次に切片標本上で３０分間培養し、その後にジアミノベンザジンを３分間にわたり加えて反応を完了させた。免疫蛍光顕微鏡用に一部のサンプルを１：２００希釈度のフルオレセイン−ラベル付けされた抗−マウス抗体で１時間処理した。サンプルを引き続きＰＢＳ中で洗浄しそして置いた。生じた染色をニコン顕微鏡上で低い倍率（１００Ｘ）およびそれより高い倍率（４００Ｘ）で蛍光を用いてまたは用いずに評価した。染色は不存在（−）、弱い（±）、中程度（＋）または強い（＋＋）と判定された。各々の例は図３に表示されている。光顕微鏡写真はコダックＴ−ＭＡＸ１００ＡＳＡフィルムを用いて撮られた。
正常の子宮内膜中のインテグリン分布
主としてコラーゲン（Ｃｏｌ）および／またはラミニン（ＬＭ）を認識するインテグリンのα2、α3、α6、およびβ4サブユニットの分布は図１Ａ−Ｄに示されている。これらのサブユニットは月経周期全体にわたり腺上皮（←）上に存在した。子宮内膜内のそれらの分布はほとんどの上皮組織に関して見られたものの典型であった。α2およびα3サブユニットは細胞の全周囲の周りに分布されていたが、α6およびβ4サブユニットは子宮内膜腺の基部膜（ＢＭ）に隣接する基底外側表面に局在しているようであった。間葉（＊）によるこれらのサブユニットの発現はあまり顕著ではなかった。間質細胞上のα6に関しては中手程度の染色が見られたが（図１Ｃ）、β4に関しては非常に少ない染色が見られた。フィブロネクチンを結合することが知られているインテグリンのα4およびα5サブユニットの発現（表１）は非常に制限された。α4サブユニットは上皮または間葉のいずれでも背景染色上では検出不能であった（図１Ｅを図２Ｃと比較せよ）。古典的なフィブロネクチン受容体の代表例であるα5サブユニット（図１Ｆ）は上皮成分上では見られなかったが、フィブロネクチンに富んだ間葉では強く発現された。
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インテグリンのこれらの他のサブユニットに関する免疫染色の強さは月経周期−依存方法において変化することが見いだされた。増殖段階（図２Ａ）におけるα1に関する免疫染色は背景水準（図２Ｃ）よりわずかしか上でなかった。染色の強さは分泌段階（図２Ｂ）全体にわたり増加した。この強い周辺染色は１５−２８日の全てのサンプルに対して腺および管腔上皮で見られた。同様に、αvは増殖段階（図３Ａ）では上皮および間葉の両者で弱く発現され、そして染色は分泌段階中に図３Ｂで見られた水準まで徐々に増加した。増殖段階中にβ3染色は間葉細胞上にだけ存在した（図３Ｃ）。増加したβ3染色は管腔並びに腺上皮上で月経周期の１９日後にのみ出現し（図３Ｄ）、そして細胞周囲分布にも存在した。対照的に基底層はαvおよびβ3に関して意義あるほど染色しなかった。周期全体にわたる上皮αvおよびβ3のこの変化するパターンを３５人の子宮内膜サンプルで研究し、そして図４Ａおよび４Ｂにグラフ表示した。
α2、α3およびα6により同定されたコラーゲン／ラミニン受容体（ｃｏｌ／ＬＭ）は月経周期全体にわたり均一に発現され、表２を参照のこと。α2およびα3サブユニットの細胞周囲分布はα6サブユニットのものとは著しく異なっていた。ラミニン受容体であるα6の特徴は基底外側表面に集中していた。α6と対であるβ4サブユニットも上皮細胞の基底外側表面上に分布されていることが見いだされ、そしてその分布は基底孔にさらに大きく制限されているようである。主要フィブロネクチン受容体であるα5／β1インテグリンも月経周期全体にわたり均一に発現された。コラーゲンおよびラミニン受容体とは異なり、α5／β1の分布は間葉に限定された。
αvの分布の一時的パターンは変化した。免疫染色は最初は周期全体にわたる強さの増加を伴って分泌段階前に検出された。
αvと対になることが知られている１つのサブユニットはβ3である。β3は上皮細胞上に特徴的に存在しない。１９日後のβ3サブユニットの突然の出現は、ビトロネクチン受容体の発現が人間の子宮内膜中で調整されることを示唆している。正常な周期中の増加した上皮αv／β3染色は分泌段階中の着床窓と相互関連している。着床窓に関する生理学的基礎はこれまでに制定されていないが、母親と胚細胞との間の初期相互作用におけるインテグリンの提唱されている役割は受容性の子宮内膜期間を示している。
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調和しない子宮内膜中のインテグリン
上皮β3サブユニットの存在は黄体段階成熟の一定の内部マーカーであるようであり、そしてβ3発現のタイミングは着床近くの期間すなわち胚着床の窓と関連していた。この現象を子宮内膜生検の臨床的評価で利用できるかどうかを検討するために、免疫染色を成熟遅延兆候を示した周期からの黄体段階子宮内膜サンプルに対して行った。月経および組織学的な日付決定の一致した２５人の女性からの子宮内膜生検材料（「正常」群）を排卵時期またはその後の月経のいずれかに基づき≧３日の段階外であると同定された１２個の生検材料と比較した。サンプルをα1、αvおよびβ3サブユニットに関して免疫染色した。全ての生検を月経周期２０日から２４日に行った。全ての場合、これらの３種の抗原に関する免疫染色が正常群からの子宮内膜上皮で存在していた。３日以上遅れた生検では、α1およびαv染色は存在したが、上皮β3染色は存在しなかった。２群におけるβ3染色強さの比較は図５Ａに示されている。段階外生検（ＯＯＰ；Ｂ）および正常な「段階内」生検（Ｃ）からのβ3免疫染色の添付されている光顕微鏡写真が含まれており、それはβ3染色において見られる差を示している。その後の処置周期では、２人のＯＯ患者で正常な周期中に生検が繰り返され、その時点では上皮β3に関する免疫染色が存在していた。これは、β3の欠如がＯＯＰ群における固有の欠陥でないことを示唆している。むしろ、β3が欠如した調和しない生検材料はこれまでに正常な２０−２４日の子宮内膜の黄体中間フェノタイプを制定していなかった。
細胞収集およびＮＰ−４０抽出
免疫組織化学的染色が子宮内膜上皮上でのβ3サブユニットの発現における変化を正確に反映していることをさらに示すために、免疫ブロット（ウェスタン・ブロット）を増殖および分泌段階からの富裕な子宮内膜腺要素に対して行った。４個の子宮内膜サンプルを増殖性（ｎ＝２）および後期分泌性（ｎ＝２）の子宮内膜上皮中でβ3サブユニットの評価用に得た。各々のサンプルを、１０％の胎牛血清（Flow Laboratories, McLean, VA）、グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）、ヘペス緩衝液（２５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（５８４ｍｇ／Ｌ）、および炭酸水素ナトリウム（３．７グラム／Ｌ）が補充されたダルベッコの改変イーグル培地（DMEM; Sigma, St. Louis, MO）中に入れた。子宮内膜をプラスチックペトリ皿中で粉砕し、その後に６ｍｇのコラゲナーゼ（タイプ１Ａ、５５０単位／ｍｇ；Sigma, St. Louis, MO）と共に３７℃において２時間にわたりSatyaswaroop他により”Isolation and Culture of Human Endometrial Glands”,J. Clin. Endocr. Metab. 1979, 48:639に記載された工程の変法を使用して培養した。生じた懸濁液を引き続き２５０μｍのふるいおよび３８μｍのふるい（Newark Wire Cloth Co, Newark NJ）の中に通した。粗い（２５０μｍ）ふるいは未消化物質を除去し、第二のものは腺要素を拘束しそして個々の間葉および血液細胞を除外した。十分なすすぎ後に、１０−２０ｍｌのＤＭＥＭを用いる逆洗浄により腺要素が得られた。単離された腺構造体を次に１．５ｍｌのマイクロフュージ管に移しそしてＰＢＳを用いる中間的洗浄を行いながら２分間にわたり３回遠心した（８２×ｇ）。少量（１００−２００μｌ）のｐＨ８．０の１０ｍＭトリス−アセテート、０．５％のＮＰ−４０、０．５ｍＭのＣａ2+（ＴＮＣ）を２ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチル−スルホニルフルオライド）と共に最終的ペレットに加え、ピペット処理しそして氷上で１５分間培養することにより、膜抽出物を製造した。溶解産物を微細遠心機中で１６，０００×ｇにおいて５分間遠心した。生じた上澄み液はＮＰ−４０抽出物と称されそして使用するまで−７０℃において凍結させた。元の未消化組織の一部をβ3の免疫組織化学的位置確認のために低温切開した。
ゲル電気泳動および免疫ブロット
各々のＮＰ−４０抽出物および血小板抽出物（陽性対照）の蛋白質濃度をLowry他により”Protein Measurement with Folin Phenol Reagent”, J. Biol. Chem. 1951, 193:265中に記載された技術を用いて測定した。等量の蛋白質を有するサンプルを電気泳動サンプル緩衝液（６２．５ｍＭのトリスベース、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．８）に加えた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより６％ポリアクリルアミドゲルを用いて、Laemml i, U.K.,”Cleavage of Structural Proteins During Assembly of the Head of Bacteriophage T4”,Nature 1970,227:680により記載された非還元条件を用いて分析した。バイオラド移送装置（Biorad, Richmond, CA）を用いてゲルをニトロセルロースに移しそして０．２％のＮａアジドを含むＰＢＳ中４％ＢＳＡを用いて１時間にわたり阻止した。２時間にわたり第一抗体（Promega Corp., Madison, WI）を用いてAlbelda他、”EndoCAM: A Novel Endothelial Cell-Cell Adhesion Molecule”, J. Cell Biol. 1990, 110:1227により記載された方法に従い展色した。
図６Ａに示されている通り、増殖段階上皮構造体は、陽性対照（血小板抽出物；レーン１）またはβ3に関する強い染色を示した分泌段階（レーン４および５）からのサンプルと比べて９５ｋＤ（レーン２および３）において免疫染色をほとんどないし全く有していなかった。単離された子宮内膜腺は取り囲んでいる間葉のない管状構造体として出現した（図６Ｂ）。レーン３および４（それぞれ中間増殖段階および２３日）に相当するサンプルからのβ3に関する免疫蛍光染色は図６ＣおよびＤに示されている。増殖サンプル中の腺染色の不存在に注目されるが、腺および管腔免疫染色の両者は分泌段階から明白である。これらのデータは、人間の子宮内膜中での上皮β3の発現が周期特異的現象であることを確認するものであった。
子宮内膜症の決定
患者の選択
ペンシルバニア大学で不妊症に関する検討を受けている５００人の女性から月経周期全体にわたり生検材料を得た。生検材料を月経周期日の正確な知識または「段階内」組織学に基づいてスクリーニングし、月経周期不調（無排卵（排卵の一時的停止または休止））、閉経状態（機能不全性子宮出血）、黄体段階欠如（子宮内膜の成熟遅延の組織学的兆候）、子宮内装置の存在または使用または子宮内膜炎（炎症剤もしくは化学的刺激による子宮内膜の炎症）を除く。子宮内膜肥厚症（子宮内膜内の細胞数における増加）、新形成（良性もしくは悪性の異常組織もしくは腫瘍の生成または成長をもたらす病理学的過程）、およびホルモン療法（経口避妊薬、エストロゲン置換療法およびプロゲルテンを含む）を有する患者も同様に排除された。２６８人の女性がこの研究における参加に適しており、２−２７日の周期の範囲にわたった。最も一般的な主な診断は子宮内膜症（４１．４％）であり、その後に説明のつかない不妊症（２３．５％）があり、表３を参照のこと。以上で示されているような正常な「段階内」組織学の関連基準に従い、黄体段階不全の全ての症例は除外された。
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子宮黄体形成ホルモン、ＬＨ、急増または次の月経期間、上皮β3が発現された時の月経周期における時期に基づいて、１９日後（排卵後６日以降）２４１人の患者の子宮内膜生検材料を得た、Lessey他、上記文献。残りの患者（ｎ＝２７）は２０日前に生検し、従ってβ3インテグリンを製造することは予測されなかった。腹壁中を通過する腹腔鏡を用いる腹腔内容物の試験を含む診断用腹腔鏡を含む一般的な不妊症処置に基づくと、これらの女性の１０５人（群の４３．６％）が子宮内膜症を有していた。１０５人の女性を次に試験症例とみなした。子宮内膜症の２０人の女性も過去の不妊症、≧１の経産を有する出産した若者とも記載されており、ここで各女性は≧１のこれまでの出産回数を有しており、そして両側の管結紮を有しており、または明らかに同定された男性要因の不妊症（すなわち男性相手の不妊症）と同定されていた。これらが受胎対照として機能するために選択された。残りの１１６人の女性（群の４８．１％）は不妊対照であるとみなされた。
免疫組織化学
Lessey他の上記文献により記載されている通りにして、免疫ペルオキシダーゼ染色を２４１個のサンプルに対して行った。簡単に述べると、免疫ペルオキシダーゼ染色は月経周期全体にわたり子宮内膜の低温静止切片標本に対して行われた。一連の４−８μ厚さの低温切片標本をポリ−Ｌリシンコーティングスライド上に置き、−２０℃のアセトン中で１０分間定着させ、そしてVectastain EliteR ABCキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて染色した。ジアミノベンザジン（DAB; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.）を色原体として使用した。SSA6（ビトロネクチン受容体のβ3サブユニットに特異的）を含む第一抗体を低温部分上にＰＢＳ中１％牛血清アルブミンを用いる阻止後に置き、そして室温において１時間結合させた。ｐＨ７．２−７．４の燐酸塩で緩衝された食塩水（ＰＢＳ）すすぎを行い、次ぎにビオチニル化された山羊の抗−マウス抗体からなる第二抗体と３０分間、培養した。ＰＢＳすすぎ後に、内因性ペルオキシダーゼを無水エタノール中０．３％Ｈ2Ｏ2を用いる３０分の培養およびその後ＰＢＳ中での３０分の再水和で停止させた。アビジン：ビオチニル化されたホースラディッシュペルオキシダーゼ高分子量複合体（ＡＢＣ）を次に切片標本上で３０分間培養し、その後にジアミノベンザジンを３分間にわたり加えて反応を完了させた。免疫蛍光顕微鏡用に一部のサンプルを１：２００希釈度のフルオレセイン−ラベル付けされた抗−マウス抗体で１時間処理した。サンプルを引き続きＰＢＳ中で洗浄しそして置いた。
子宮内膜β3に関する免疫染色を月経周期全体から得られた２６８個の子宮内膜生検材料の各々に対して行った（図７参照）。免疫組織化学的染色を用いるβ3サブユニットの周期特異的発現の例が図８Ａ（増殖）、図８Ｂ（１８日）、図８Ｃ（２２日）、および「段階内」生検が組織学的部分に対して「２２−２３日」と読みとられた子宮内膜症の患者における陰性染色を有する周期２３日からのサンプルに示されている。全ての場合に見られる通り、血管上皮の免疫染色はこのインテグリンに関する上皮染色のないサンプル（Ｄ）中でも見られるため、免疫染色技術用の陽性内部対照として作用する。図７に示されたβ3の分布およびβ3サブユニットが２０日以降の子宮内膜中で正常に発現されるという理論に基づき、周期２０日以降と組織学的に日付決定された全てのサンプルがその後の評価用に含まれた（ｎ＝２４１）。子宮内膜症の既往症のある症例（１０２／２４１；４３．５％）を子宮内膜症のない不妊症例（１１６／２４１；４８．１％）および２０人の受胎対照（２０／２４１；８３％）と比較した。表４に示されているように、子宮内膜症群および不妊症対照は受胎対照より若かった。生じた染色をニコン顕微鏡上で低い倍率（１００Ｘ）およびそれより高い倍率（４００Ｘ）で評価した。ＨＳＣＯＲＥ、すなわちβ3インテグリンに関する陽性染色の強さおよび分布の両者を推定する半定量的指数は下記の式：
ＨＳＣＯＲＥ＝ΣＰｉ（ｉ十１）
を使用して計算され、ここでｉ＝それぞれ弱い、中程度、または強い１、２、または３の値を有する染色の強さであり、そしてＰｉは各々の強さに関する染色された上皮細胞の百分率であり、０−１００％に変化する。この技術を用いて子宮組織中での低い内部観察値（ｒ＝０．９９４；ｐ＝０．００００１）がBudwit-Novotny, D.A.他により報告されている、”Immunohistochemical Analyses of Estrogen Receptor in Endometrial Adenocarcinoma Using a Monoclonal Antibody”, Cancer Res., 1986 46:5419-54525。染色の強さおよび分布の変化する水準を反映する代表的なＨＳＣＯＲＥは図８に示されている。光顕微鏡写真はコダック１００ＡＳＡフィルムを用いて撮られた。
統計的分析
不妊症の子宮内膜症患者を子宮内膜症のない不妊症対照および受胎対照と比較した。比較は未産と子宮内膜症患者および経産子宮内膜症患者との間で例えば年令およびＨＳＣＯＲＥの如き選択された特性に関して行われ、そして非パラメーター的なウィルコキソン試験を用いて行われた、Wilcoxon, F., Individual Comparisons by Ranking Methods. Biometrics Bull 1945; 1:80-85。
受容操作者特性（ＲＯＣ）分析を使用して将来腹腔鏡法を受ける女性におけるＨＳＣＯＲＥに関する最適なカットオフ値を示す。Metz, C.E., Basic Principles of ROC analysis. Sem Nuclear Med 1978; 8:283-298。ＨＳＣＯＲＥカットオフ値は中程度の感度を犠牲にして高い特異性を探すことを意味する子宮内膜症の最も高い陽性予測値であるとして求められた。この試験を子宮内膜症の診断様式として使用すると、高い陽性予測値がそうでなければ不必要な手術を受けるであろう女性の数を最少にする。ＨＳＣＯＲＥカットオフ値は０．７であり、それは３８％の感度、９１％の特異性、および子宮内膜症の検出用の８６％の陽性予測値を与えた。
ＨＳＣＯＲＥと子宮内膜症との間の関係は最初に非パラメーター的試験（ウィルコキソン試験）により評価されそしてさらに生検材料が組織学的周期の２０日以降である２４１人の女性のサンプル中の複数回の論理的回帰法により評価された。表４に見られる通り、平均ＨＳＣＯＲＥは不妊症の子宮内膜症群（ｐ＜０．００３）に関しては受胎対照（ｐ＜０．００２）および子宮内膜症のない不妊症の対照（ｐ＜０．０１２）と比べて意義あるほど低かった、表４参照。興味あることに、子宮内膜症のない不妊症の対照は受胎対照群（ｐ＝０．０５）より境界線的に低いβ3に関するＨＳＣＯＲＥも有していた。
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ＡＦＳ分類に基づく子宮内膜症の重篤度はβ3免疫染色の存在または不存在と関連するようである。不妊症および子宮内膜症の１０５人の全ての患者を疾病の重篤度により序列区分した。ＡＦＳ重篤度目盛りに基づく２群のＨＳＣＯＲＥ、すなわちＩおよびII（極微および軽い；ｎ＝８４）対IIIおよびIV（中程度および重い；ｎ＝２１）はウィルコキソン試験を用いると意義ある差を示した（ｐ＝０．０１５１）。従って、欠陥のあるβ3発現は子宮内膜症段階ＩおよびIIに特異的に関連している。
ＥＧＲＥＴを用いる複数回の計算回帰法を使用して、年令および経産状態の影響を調整した後に、そして経産状態の可能性のある相互作用を考慮して、子宮内膜症とＨＳＣＯＲＥとの間の関連性を評価した。Mauritisen, R. EGRET. Statistics and Epidemiology Research Corporation Software, Seattle, WA, 1990。
複数回の計算分析により、独立変数としてＨＳＣＯＲＥだけを用いるモデルに基づく未処理の関連危険性（ＲＲ）および９５％信頼間隔（ＣＩ）並びに依存性（結果）変数としての子宮内膜症の存在または不存在は、０．７のＨＳＣＯＲＥに関して計算した時には０．６（０．５−０．８）であった（ＲＯＣ分析による）。１の相対的危険性（ＲＲ）は影響がないこと、すなわち２群が子宮内膜症の危険性に関して同じであることを意味する。０．６のＲＲは十分高く、信頼間隔は試験の信頼範囲を示す。一緒になって、ＲＲおよびＣＩは０．７もしくはそれ以下のＨＳＣＯＲＥを有する未産の女性における子宮内膜症を有する増加した危険性を規定する。モデル中への年令の追加は結果を変化させなかったが、経産状態（ｐ＝０．０３０）との統計学的に意義ある相互作用があった。従って、調整されたＲＲ（９５％ＣＩ）は経産女性に関しては０．６（０．４−０．９）であり、それと比べて未産女性に関しては１．２（０．８−１．８）であった。これらの結果は未産女性におけるβ3（ＨＳＣＯＲＥにより示されている）の不存在が子宮内膜症の統計学的に意義ある予測法であることを示している。この分析を極微のおよび軽い疾病だけの女性に限定しても結果を実質的に変化させなかった。未産女性における調整されたＲＲ（９５％ＣＩ）すなわち０．５（０．４−０．８）と経産女性における１．２（０．７−１．８）と比較した。
生殖組織とＨＳＣＯＲＥとの間のこの関係をさらに試験するために、子宮内膜症の１０５人の患者を経産により序列区分しそして受胎対照群と比較した（表５）。対照人口は経産および未産の子宮内膜症群より年をとっていた。未産の子宮内膜症群におけるＨＳＣＯＲＥは経産の子宮内膜症群および受胎対照群（各群に関して、ｐ＜０．０００１）のものより少なかったが、子宮内膜症の経産群と受胎対照（ｐ＝０．９８）との間の差はなかった。これらの３群間の比較は図９にグラフ表示されている。
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インテグリン発現における差が子宮内膜症の診断と相互関連していたという観察が診断用腹腔鏡に将来向かう女性におけるこの疾病の予測におけるこのマーカーの有用性の評価を促進させた。元の２４１個のサンプルの副群として８９個の生検材料を診断用腹腔鏡の前に将来のために得た。時間学的な日付決定法は子宮の黄体形成ホルモン、ＬＨの変動および／または次の月経期間の開始により制定された。子宮内膜症日付決定はNoyes他、”Dating the Endometrium”, Fertil. Steril. 1950, 1:3の基準を用いて行われた。これらの８９人の女性全てが次に診断用の腹腔鏡法を受けて子宮内膜症の存在または不存在が制定された。存在している時には疾病の重篤性はAmerican Fertility Society: Revised American Fertility Society cassification of emdometriosisu、上記文献に示されている基準である改定されたAmerican Fertility Society ＡＦＳに従い段階付けされた。診断用腹腔鏡法を行う外科医は免疫組織化学的発見の結果に関しては知らされなかった。同様に生検結果（β3発現の推定）の解釈も、β3インテグリンに関する陽性染色の強さおよび分布の両者を推定するＨＳＣＯＲＥを用いて盲験方式でなされた。最適なカットオフとして測定された０．７のＨＳＣＯＲＥ値は子宮内膜症の予測検出に関して３８％の感度、９１％の特異性および８６％の最高陽性予測値を与えた。全体的に、５０人の患者が腹腔鏡法で子宮内膜症を種々のＡＦＳ段階で有することが予測的に発見された。ＲＯＣ分析に基づいてβ3発現を示さない陰性染色が２２個のサンプル中で検出された。β3染色のないこれらの２２人の患者の中で、１９人は子宮内膜症を有することが見いだされた。ＲＯＣ分析を行って正常サンプルに関する最適なカットオフ値を制定した。出願人が知る限り、本発明は極微のまたは軽い子宮内膜症の存在を予測することを示した最初の非手術試験である。
その後に子宮内膜症を有することが見いだされた全ての患者はβ3サブユニットを失わなかった。本発明は欠陥のある子宮受容性の女性を同定するβ3における欠如のある不妊症患者の副群を同定する。子宮内膜症と欠陥のあるβ3インテグリン発現との間のこの関係は推定上の着床窓中の最初の周期−特異的欠陥があるかもしれない。β3の損失の検出は子宮内膜因子のための不妊症に関する危険が多い子宮内膜症の患者を規定することができる。着床は異なる分子のカスケードの結果であるかもしれないが、本発明は単独成分の損失が着床失敗を説明するのに十分であることを示している。
本発明は着床窓の最初に正常に発現されるβ3の損失が不妊症と思われる女性とほぼ関係があることを示している。このマーカー蛋白質の予測使用はβ3インテグリンサブユニットが極微のまたは軽い子宮内膜症の非手術診断用の高い特異性および陽性予測値を有する有用な試験であることを示した。受胎可能性を予測できる子宮受容性の陽性マーカーとして、この不妊症患者の副群の研究がこの不可解な疾病の診断をより精密にする。
不妊患者母集団における子宮内膜症の決定
不妊症に関して評価しようとする女性から月経周期全体にわたり生検材料を得る。経産および未産の女性が研究に含まれるであろう。生検材料を月経周期日の正確な知識すなわち「段階内」組織学および月経周期不順（無排卵（排卵の一時停止もしくは休止）、閉経状態（機能不全性子宮出血）、黄体段階欠如（子宮内膜の成熟遅延の組織学的兆候）、子宮内装置もしくは子宮内膜炎（感染剤もしくは化学的刺激による子宮内膜の炎症）の存在または使用を含む基準を基にした研究で関与に関してスクリーニングした。子宮内膜肥厚（子宮内膜中の細胞数の増加）、新形成（良性もしくは悪性の異常な組織または腫瘍の生成または成長を生ずる病理学的過程）、ホルモン療法（経口避妊薬、エストロゲン置換療法およびプロゲステン）並びに黄体段階欠如を有する患者は除かれるであろう。
子宮黄体生成ホルモン、ＬＨの変動または次の月経期間、上皮β3が発現される時の月経周期における時期を基にして１９日後（排卵後６日以降）に子宮内膜生検を得る、Lessey他、上記文献。受胎および不妊対照も選択される。
Lessy他の上記文献により記載されている通りにして、免疫ペルオキシダーゼ染色を患者のサンプルに対して行った。簡単に述べると、免疫ペルオキシダーゼ染色は月経周期全体にわたり子宮内膜の低温静止切片標本に対して行われた。一連の４−８μ厚さの低温切片標本をポリ−Ｌリシンコーテイングスライド上に置き、−２０℃のアセトン中で１０分間定着させ、そしてVectastain EliteR ABCキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて染色した。ジアミノベンザジン（DAB; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.）を色原体として使用した。SSA6（ビトロネクチン受容体のβ3サブユニットに特異的）を含む第一抗体を低温部分上にＰＢＳ中１％牛血清アルブミンを用いる阻止後に置き、そして室温において１時間結合された。ｐＨ７．２−７．４の燐酸塩で緩衝された食塩水（ＰＢＳ）すすぎを行い、次ぎにビオチニル化された山羊の抗−マウス抗体からなる第二抗体と３０分間、培養した。ＰＢＳすすぎ後に、内因性ペルオキシダーゼを無水エタノール中０．３％Ｈ2Ｏ2を用いる３０分の培養およびその後のＰＢＳ中での３０分の再水和で停止させた。アビジン：ビオチニル化されたホースラディッシュペルオキシダーゼ高分子量複合体（ＡＢＣ）を次に切片上で３０分間培養し、その後にジアミノベンザジンを３分間にわたり加えて反応を完了させた。サンプルを引き続きＰＢＳ中で洗浄しそして置いた。
不妊症の女性に関するウィルコキソン試険、ＲＯＣ分析、およびｐ値を使用するＨＳＣＯＲＥおよび統計的分析は上記の未産の不妊症女性のものと同様であると予期される。ＨＳＣＯＲＥカットオフ値、感度および特異性値は不妊症患者における子宮内膜症の検出に関して決められるであろう。患者はＡＦＳ分類に基づいて子宮内膜症の重篤度に関しても分離されるであろう。上記の年令および経産状態の影響を調整した後に、ＥＧＲＥＴを使用して子宮内膜症とＨＳＣＯＲＥとの間の関係を評価する。粗い相対的危険性および信頼区間が子宮内膜症に関して計算される。全体的に、β3の不存在により検出されるインテグリン発現が不妊症女性における子宮内膜症の診断と相互関連することが予期される。
ここに示されそして記載されたものの他の本発明の種々の改変が以上の記述から当技術の専門家に明白となるであろう。そのような改変は添付された請求の範囲内に入るものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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