(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示される塩基配列を有する２１塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用フォワード側プライマーと、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有する１８塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用リバース側プライマーとから成る、サルＢウイルス測定用プライマーセット。
【請求項２】
配列表の配列番号６に示される塩基配列を有する２０塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用フォワード側プライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を有する１８塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用リバース側プライマーとから成る、サルＢウイルス測定用プライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行い、増幅産物を測定することから成る、サルＢウイルスの測定方法。
【請求項４】
ＰＣＲ反応液中のベタインの濃度が0.5〜2.0Mである請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サルＢウイルス(Herpesvirus simiae)（以下、「ＢＶ」と言うことがある）の特異的な測定方法及びそれに用いられるプライマーセットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＢＶは、ヒト単純ヘルペスウイルス(HSVタイプ１(HSV-1)及びタイプ２(HSV-2))と同様、アルファヘルペスウイルス亜科に属するウイルスである。このウイルスは、マカク猿における一般的な病原体である。ＢＶがサルに感染しても通常、無徴候であるが、ヒトに感染すると、感染直後に適切な医療処置がとられない限り、高い死亡率でヒトに死をもたらす。従って、ＢＶ感染を正確かつ迅速に診断することは、ＢＶ−陽性サル又は組織に接触する可能性がある研究者や動物世話係の人々の安全にとって極めて重要である。
【０００３】
従来より、ＢＶ感染の確定診断は、スワブ培養により行われている。しかしながら、スワブ培養には２〜３日かかり、また、物理的封じ込めレベル４の施設が必要である。一方、各種ウイルスＤＮＡの診断に、迅速かつ安全なＰＣＲが用いられるようになり、ＢＶの診断にもＰＣＲを用いることが提案されている(Black, D.H. et al., 1997, J. Vet. diagn. Invest. 9:225-231; Scinicariello, F. et al., J. Infect. Dis. 168:747-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lancet 341:1660-1661; Slomka, M.J. et al., 1993, Arch. Virol. 131:89-99)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＰＣＲを用いたこれらの公知方法のうち、Slomka, M.J. et al., 1993, Arch. Virol. 131:89-99に記載された方法は、ヒトに対して最も多くの死をもたらしているアカゲザル由来のウイルスを検出することができない。また、他の方法では、ＢＶの遺伝子と塩基配列が類似しているHSVの遺伝子も増幅されてしまい、増幅産物がＢＶ由来かHSV由来かを調べるために、増幅産物をさらに制限酵素で処理してその切断パターンを調べる(RFLP)か、又は放射標識プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションを行わなければならず、そのための手間と時間がかかっていた。もし、ＰＣＲにより、ＢＶ由来の核酸のみが増幅され、HSV由来の核酸が増幅されなければ、増幅後のRFLPやサザン法を行う必要がなくなり、より迅速な診断が可能となり、有利である。
【０００５】
従って、本発明の目的は、ＢＶ由来の核酸は増幅されるがHSV由来の核酸は増幅されない、ＰＣＲにより検体中のＢＶを測定する方法及びそれに用いられるプライマーを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、ＢＶの糖タンパクＧ(glycoprotein G)遺伝子(以下、「BVgG」と言うことがある）が、対応するHSV遺伝子との相同性が比較的低いことに気付き、この遺伝子中の適切な領域とハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより上記本発明の目的を達成できるのではないかと考えた。しかし、通常の条件でＰＣＲを行うと、増幅が起きなかった。これは、BVgG遺伝子中のシトシンとグアニンの含量が多いため、セルフライゲーションが起きて増幅が進まないためと考えられた。そこで、シトシンとグアニンの含量が多い核酸のＰＣＲによる増幅に用いることが知られている、ベタインの存在下にＰＣＲを行ったところ増幅が起きた。そして、被検試料中にＢＶとHSVの両者が共存する場合であっても、BVgG中の領域は増幅されるが、HSV遺伝子中の領域は増幅されないようにすることが可能なプライマー領域の組合せを見出し、これを実験的に確認して本願発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有する２１塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用の第１のフォワード側プライマーと、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有する１８塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用の第１のリバース側プライマーとから成る、サルＢウイルス測定用の第１のプライマーセットを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号６に示される塩基配列を有する２０塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用の第２のフォワード側プライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を有する１８塩基の核酸から成るサルＢウイルス測定用の第２のリバース側プライマーとから成る、サルＢウイルス測定用の第２のプライマーセットを提供する。さらに、本発明は、上記第１又は第２のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行い、増幅産物を測定することから成る、サルＢウイルスの測定方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる第１のフォワード側プライマーは、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有する２１塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGS4)を用いている。配列番号１に示す塩基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列(Slomka, M.J. et al., J. Gen. Virol. 76(Pt)), 2161-2168(1995); DDBJ Accession No. AB032191)の1063番目のヌクレオチド（本明細書において、「1063nt」と記載する。他のヌクレオチドの位置も同様な方法で記載する）〜1103ntの領域に相当し、プライマーgGS4は、1073nt〜1093ntの領域に相当する。
【０００９】
本発明で用いられる第１のリバース側プライマーは、配列表の配列番号４に示す塩基配列を有する１８塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGAS4)を用いている。配列番号３に示す塩基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1254nt〜1291ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS4は、1264nt〜1281ntの領域に相補的である。
【００１０】
本発明で用いられる第２のフォワード側プライマーは、配列表の配列番号６に示す塩基配列を有する２０塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGS5)を用いている。配列番号５に示す塩基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1330nt〜1369ntの領域に相当し、プライマーgGS5は、1340nt〜1359ntの領域に相当する。
【００１１】
本発明で用いられる第２のリバース側プライマーは、配列表の配列番号８に示す塩基配列を有する１８塩基から成る核酸であり、下記実施例では、該核酸(プライマーgGAS5)を用いている。配列番号７に示す塩基配列は、配列番号９に示すBVgGの塩基配列の1503nt〜1540ntの領域に相補的であり、プライマーgGAS5は、1513nt〜1530ntの領域に相補的である。
【００１２】
上記したプライマーは、市販のＤＮＡ合成装置等を用いて容易に化学合成することができる。
【００１３】
本発明のＢＶの測定方法では、上記第１のフォワード側プライマーと、上記第１のリバース側プライマーとから成る第１のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行う。あるいは、上記第２のフォワード側プライマーと、上記第２のリバース側プライマーとから成る第２のプライマーセットを用いて、ベタインの存在下で被検試料についてＰＣＲを行う。ここで、ベタインとは、1-カルボキシ-N,N,N-トリメチルメタンアンモニウム分子内塩を意味する。ＰＣＲ反応液中のベタイン濃度は0.5M〜2.0Mが好ましく、さらに好ましくは0.8M〜1.8Mであり、さらに好ましくは1.3M〜1.7Mである。ベタイン濃度が0.5M未満の場合には、測定可能な程度に増幅が起きにくく、2.0Mを超える場合にも感度が低下する。反応溶液がベタインを含むこと以外は、常法によりＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲの方法自体は周知であり、そのための試薬キット及び装置が市販されているので、それらを用いて容易に行うことができる。なお、ＰＣＲの条件の一例が下記実施例に詳細に記載されている。
【００１４】
被検試料としては、ＢＶを含むか否かを知りたいいずれのものであってもよく、血液等の体液を挙げることができる。血液からのＤＮＡの抽出は、常法により行うことができる。
【００１５】
ＰＣＲによる増幅後、増幅産物を測定する。これは、増幅産物を電気泳動にかけ、エチジウムブロミド等で染色して増幅バンドを検出する常法により容易に行うことができる。また、検出される増幅バンドの強度に基づき、被検試料中のＢＶウイルス量を半定量することも可能である。さらに、増幅産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合されたプローブの存在下にＰＣＲを行う、いわゆるリアルタイムＰＣＲに行えば、増幅産物を定量することができる。従って、本明細書で言う、ウイルスの「測定」には、定性的な検出の他、上記のような半定量的又は定量的な検出も包含される。
【００１６】
上記の方法により、例えば、下記実施例の方法のように、第１のフォワード側プライマーであるプライマーgGS4と第１のリバース側プライマーであるプライマーgGAS4とを用いてＰＣＲを行った場合には、BVgG（配列番号９）の1073nt〜1281ntの209bpの断片が増幅される。また、第２のフォワード側プライマーであるgGS5と第２のリバース側プライマーであるgGAS5とを用いてＰＣＲを行った場合にはBVgGの1340nt〜1530ntの191bpの断片が増幅される。なお、下記実施例において具体的に記載されている通り、ＢＶと類似したゲノミックＤＮＡの塩基配列を有するHSV-1及びHSV-2が被検試料中に存在している場合であっても、本発明の方法によれば、ＢＶのみが増幅され、HSV-1及びHSV-2は増幅されない。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
ＢＶのE-2490株を、無血清培地中でコンフルーエントに単層培養されているベロ細胞中で増殖させた。ソラレン存在下で紫外線照射後、ビリオンを回収し、ヨウ化ナトリウム法(Ishizawa, M. et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:5792)によりウイルスＤＮＡを精製した。すなわち、ウイルスタンパク質を4.5Mヨウ化ナトリウムで可溶化し、次いで、ウイルスＤＮＡを、５０％イソプロパノール中でグリコーゲンと共に共沈殿させることにより精製した。
【００１９】
上記プライマーgGS4とプライマーgGAS4のセット、又はプライマーgGS5とプライマーgGAS5のセットを用いてＰＣＲを行った。Clonetech社製のAdvantage-GCキットを用い、5% DMSO、１μｌのＢＶ  ＤＮＡ溶液、及び各0.4μＭのフォワード側及びリバース側プライマーを含む50μｌのＰＣＲ混合物を調製した。なお、ベタイン濃度は0、0.5M、1.0M又は1.5Mとした。なお、この反応溶液１μｌは、800 TCID50（50%組織培養感染価）のビリオンから抽出されたＢＶ  ＤＮＡを含むと見積もられた。ＰＣＲは、最初に９４℃、５分間の変性工程を行った後、９４℃、１分間の変性工程、５５℃、１分間のアニーリング工程、７２℃、１分間の伸長工程から成るサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃、７分間の伸長工程を行うことにより行った。ＰＣＲ産物を５％アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、SYBR Green I（Molecular Probes社製）で染色後、波長234nmの紫外線を照射して増幅バンドを可視化した。なお、分子量マーカーとしては、φX174ファージのHaeIII消化物を用いた。
【００２０】
その結果、いずれのプライマーセットの場合もベタイン濃度０の時は増幅バンドは全く検出されなかったが、gGS4-gGAS4セットの場合は、ベタイン濃度1.0M及び1.5Mの場合、gGS5-gGAS5セットの場合はベタイン濃度1.5Mの場合に増幅バンドが明瞭に検出された。上記以外の場合は増幅バンドは薄かった。従って、実施例２以降では、ベタイン濃度を1.5Mとした。gGS4-gGAS4セットを用いた場合には、209bpの断片が増幅され、gGS5-gGAS5セットの場合には191bpの増幅バンドが観察された。さらに、これらの増幅バンドを切り出して常法によりＤＮＡを抽出し、その塩基配列を決定したところ、gGS4-gGAS4セットを用いて増幅された断片は、配列番号９の1073nt〜1281ntの塩基配列を有しており、gGS5-gGAS5セットを用いて増幅された断片は配列番号９の1340nt〜1530ntの塩基配列を有していた。従って、上記の方法により、BVgG遺伝子中の意図した領域が増幅されたことが証明された。
【００２１】
実施例２
ヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、HSV-1(HF株）及びHSV-2(UW268株)を常法により増殖させ、ウイルスＤＮＡを実施例１と同様にヨウ化ナトリウム法により精製した。実施例１と同様に、ヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、あるいは800TCID50のHSV-1又はHSV-2を含むＰＣＲ混合溶液を調製し、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。その結果、いずれのプライマーセットを用いた場合にも増幅は起きなかった。
【００２２】
偽陰性の可能性を排除するために、プライマーとして、HSV-1及びHSV-2ならびにBVを増幅させることが知られているBV1（配列番号１０）及びBV2(配列番号１１）(Scinicariello, F. et al., J. Infect. Dis. 168:747-750; Scinicariello, F. et al., 1993, Lancet 341:1660-1661)を用いて上記と同様にＰＣＲを行った。その結果、報告されている通り、128bpの増幅断片が観察された。よって、ＰＣＲ溶液中にヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、HSV-1及びHSV-2が含まれていたことが明らかになり、偽陰性の可能性が排除された。
【００２３】
さらに、本発明の方法の特異性を証明するために、実施例１のＰＣＲ溶液にヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、あるいは各800 TCID50のHSV-1及びHSV-2とを添加した混合溶液、並びに実施例１のＰＣＲ溶液に1000コピーのＢ型肝炎ウイルスゲノミックＤＮＡを添加した混合溶液について実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。
【００２４】
その結果、いずれの場合にも、gGS4-gGAS4セットの場合は209bpの断片のみが増幅され、gGS5-gGAS5セットの場合は191bpの断片のみが増幅された。これにより、本発明の方法によれば、被検試料中にヒヒHPV2、アフリカミドリザルAS8、HSV-1若しくはHSV-2又はＢ型肝炎ウイルスが共存している場合であっても、BVgG遺伝子中の上記領域のみが増幅されることが証明された。
【００２５】
実施例３
実施例１で用いたＢＶ試料を１０倍低減希釈し、それらについて実施例１と同様にＰＣＲを行った。その結果、１０倍希釈の場合、gGS4-gGAS4セットを用いた場合は209bpのバンドが明瞭に増幅バンドが検出され、gGS5-gGAS5セットを用いた場合は191bpの薄い増幅バンドが検出された。１００倍希釈の場合には、いずれのプライマーセットを用いても増幅バンドは検出されなかった。このことから、上記方法により、80 TCID50のウイルスＤＮＡは検出可能であるが8 TCID50のウイルスＤＮＡは検出できないことがわかった。この感度は、Scinicariello et al.（上掲）の方法による感度と同程度である。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、ＢＶを特異的に、迅速に、かつ、高感度に測定することができる方法及びそのためのプライマーが初めて提供された。本発明の方法によれば、被検試料中にＢＶが存在する場合にのみ増幅が起き、存在しない場合には増幅が起きないので、増幅が起きたか否かを調べるだけで被検試料中にＢＶが存在するか否かを知ることができる。特に、ＢＶと各遺伝子の塩基配列が類似しているHSV-1及びHSV-2が被検試料中に共存している場合であっても、BVgG遺伝子中の断片のみが増幅され、HSV-1やHSV-2由来の断片の増幅は起きない。従って、HSV-1又はHSV-2の増幅と区別するためにＰＣＲ後にRFLPや、サザン分析を行う必要がなく、迅速かつ簡便に測定を行うことができる。従って、本発明は、ヒトがＢＶに感染した場合のように、緊急を要する診断に大きな威力を発揮するものと考えられる。
【００２７】
【配列表】
0004083370.tif 000002
【００２８】
0004083370.tif 000003
【００２９】
0004083370.tif 000004
【００３０】
0004083370.tif 000005
【００３１】
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【００３２】
0004083370.tif 000007
【００３３】
0004083370.tif 000008
【００３４】
0004083370.tif 000009
【００３５】
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【００３６】
0004083370.tif 000011
0004083370.tif 000012
【００３７】
0004083370.tif 000013
【００３８】
0004083370.tif 000014