(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア属の病原性細菌の直接同定を可能にする栄養寒天培養培地であって、該培地はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）によって特異的に切断される合成色素原基質を含有する培養培地。
【請求項２】
色素原基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つである、請求項１記載の培養培地。
【請求項３】
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つが１００〜５００ｍｇ／ｌの濃度、好ましくは１５０〜３００ｍｇ／ｌの濃度である、請求項２記載の培養培地。
【請求項４】
血液またはその誘導体の１つ、好ましくは血清をさらに含有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の培養培地。
【請求項５】
血液またはその誘導体の割合が培養培地１リットル当り２０〜８０ｍｌ、より特定すると４０〜６０ｍｌ、好ましくは５０ｍｌである、請求項４記載の培養培地。
【請求項６】
カオリンまたはシリカのような粉状薬剤をさらに含有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の培養培地。
【請求項７】
粉状薬剤の濃度が５〜３０ｇ／ｌ、好ましくは１５〜２５ｇ／ｌである、請求項６記載の培養培地。
【請求項８】
リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物をさらに含有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の培養培地。
【請求項９】
リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物がキシロースである、請求項８記載の培養培地。
【請求項１０】
炭水化物の濃度が５〜１５ｇ／ｌである、請求項８または９記載の培養培地。
【請求項１１】
ｐＨ指示薬、好ましくはフェノールレッドをさらに含有する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の培養培地。
【請求項１２】
ｐＨ指示薬の濃度が５０〜３００ｍｇ／ｌである、請求項１１記載の培養培地。
【請求項１３】
好ましくは塩化リチウム、塩酸アクリフラビン、ナリジクス酸、ポリミキシンＢ、セフォタン、硫酸コリスチン、ホスホマイシン、セフタジジム、モキサラクタム、シクロヘキシミドおよびアムホテリシンＢの中から選択される１つ以上の抗菌剤および／または抗真菌剤をさらに含有する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の培養培地。
【請求項１４】
リステリア属の病原性細菌の同定方法であって：
−  リステリア属の病原性細菌を含有しそうな試料を、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＰＩＰＬＣ特異的色素原基質を含有する寒天培養培地上に接種する工程、
−  該試料を接種した培養培地をインキュベートする工程、および
−  基質の特徴的着色によってリステリア属の病原性細菌の存在を決定する工程を包含する方法。
【請求項１５】
病原性細菌を含有しそうな試料を請求項１〜１３のいずれか１項記載の培養培地上に接種する前に事前に濃縮する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つの、リステリア細菌の研究、単離、計数および直接同定を可能にする寒天培養培地の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、リステリ属の病原性細菌の研究、単離、計数および直接同定を可能にする培養培地ならびにこの培地を用いる方法に関する。
【０００２】
細菌リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）の単離および同定は、農食物衛生学および医学的細菌学のモニターにおける主要な問題である。リステリア属細菌の中で、種モノサイトジェネスのみがヒトに病原性であることが知られている。リステリアの他の種は病原性でないか、または動物のみに病原性である。これは特にリステリア・イヴァノヴィ（Listeria ivanovii）の場合にそうである。さらに、バクテリオシンを使用することによってリステリア・モノサイトジェネスの増殖を阻害することが可能であることが知られている。例えば、特許出願ＥＰ  ３２６  ０６２は、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）起源のバクテリオシンを用いるリステリア・モノサイトジェネスの阻害法を記載している。
【０００３】
リステリア．モノサイトジェネスによる汚染経路は、しばしば食物起源である。従って、農食物経路の端から端まで（原料から製造施設の環境を通過して消費が意図される完成品まで）をリステリア・モノサイトジェネスの検出に供することが必要である。
【０００４】
ヒトにおける細菌状態の診断状況においては、リステリア・モノサイトジェネスを、病原体でないリステリア属の他の細菌の中から識別することも同様に重要である。
【０００５】
リステリア種の検出および単離は、従来、選択培養培地を使用して実施されている。Ｏｘｆｏｒｄ（Ｃｕｒｔｉｓら，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９８９），  ８，  ８５−９８頁）およびＰａｌｃａｍ（Ｖａｎ  Ｎｅｔｔｅｎら，  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９８８），  ６，  １８７−１８８頁）選択培地が現在最も使用されている。これらの培地は、リステリア属の全ての種の検出を可能にする。従って、モノサイトジェネス種の所属を確立するためには、観察された代表的なコロニーを、補助的同定（顕微鏡試験および／または生化学的試験および／または免疫学的試験および／または遺伝学的試験）に供しなければならない。しかし、リステリア・モノサイトジェネスの同定に必要な補助的操作は分析の長さおよび費用を増加させる。これらの操作は、多数の試薬および適格人員の使用を必要とする。さらに、同定に供されるコロニーの回収は不確かであり、補助的操作はしばしば間違いのもとであるか、または少なくともより低い正確さおよび信頼性の原因である。これは特に単離培地上のリステリア・モノサイトジェネスのコロニーが、リステリアの他の種によって形成されるコロニーに比較して非常に少ない場合にそうである。
【０００６】
特許出願ＥＰ  ４９６  ６８０は、リステリア・モノサイトジェネスをリステリア属の他の細菌から識別する細菌学的分析法を記載している。
【０００７】
この方法によれば、グリシンアミノペプチダーゼによって加水分解され得る色素原基質または蛍光原基質を含む同定培地を使用する。使用する培地に、その化学的変換によって分析しようとする試料中に存在するリステリア種の特徴付けを可能にする発酵基質および／または還元可能基質および／または酵素的に加水分解可能な基質（α−マンノシダーゼの基質のような）を含有させることも可能である。
【０００８】
さらに、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）の特異的ホスファチジルイノシトール活性を示すことによって、リステリアの病原性種であるリステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィを、他のリステリアから識別することも可能であることが知られている。
【０００９】
事実、ＰＩＰＬＣが、リステリア属の病原性種（リステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィのような）の培養培地中に分泌されていることが示されている（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗａｃｈｔｅｒら，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９９１）  ５（２），  ３６１−３６６頁；  Ｊ．  Ｍｅｎｇａｕｄら，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９９１）  ５（２），  ３６７−３７２頁、およびＧｏｌｄｆｉｎｅら，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （１９９２）  ６０（１０），  ４０５９−４０６７頁）。これら２つの病原性種を間接的方法によって同定することが可能であることも知られている（Ｎｏｔｅｒｍａｎｓら，  Ａｐｐ．  ａｎｄ  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９１），  第５７巻  第９号，  ２６６６−２６７０頁）。Ｎｏｔｅｒｍａｎｓらによって提唱された方法によれば、試験しようとするリステリアの株（事前に単離されている）を、ＴＹ（トリプトン酵母エキス）寒天の表面上にスポットとして接種する。２４〜４８時間３７℃でインキュベートした後、第２の寒天層をペトリ皿に注ぐ。この第２の層は、アガロース、クロラムフェニコールおよびＬ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩＰＬＣの天然基質）を含有する。次いでディッシュを再度３７℃でインキュベートし、５日間観察する。従って、この方法は、株の単離、寒天上へのスポットとしての接種およびＰＩＰＬＣ基質を含有する寒天の第２の層の分配のようないくつかの工程を必要とする。さらに、この方法によって、ヒトに病原性であるリステリア・モノサイトジェネス細菌を、上記で示したようにヒトに病原性でないリステリア・イヴァノヴィ細菌から識別することはできない。
【００１０】
本発明の主題は、単一工程でのリステリア属の病原性細菌の同定を可能にする培地である。
【００１１】
より詳細には、本発明は、リステリ属の病原性種の研究、単離、計数および直接同定を可能にする特異的培養培地に関し、この培地はＰＩＰＬＣによって特異的に切断される合成色素原基質、詳細には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールを含有する。この色素原基質は、好ましくは塩形態、例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩形態で使用される。塩の中でアンモニウム５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルミオイノシトール−１−イルホスフェートが好ましい。
【００１２】
本発明による培地は、一方で着色コロニーを形成するリステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィ、ならびに他方でコロニーが着色しないリステリアの他の種の間の直接的な区別を可能にする。
【００１３】
本発明の好ましい実施方法によれば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールを使用することによって、青色コロニーを形成する種リステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィの検出が可能になり、リステリアの他の種は着色しないままである。
【００１４】
優先的には、本発明による栄養寒天培養培地は、遊離形態または塩形態の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールを１００〜５００ｍｇ／ｌの濃度、好ましくは１５０〜３００ｍｇ／ｌの濃度で含有する。
【００１５】
本発明において使用する栄養寒天培養培地は、リステリア種の増殖を可能にしなければならない。例えば、ペプチド、デンプン、塩化ナトリウムおよび寒天から作製され、当業者に周知のＣｏｌｕｍｂｉａ寒天を使用することが可能である。
【００１６】
本発明は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つの、リステリア属の病原性種、詳細には細菌リステリア・モノサイトジェネスの研究、単離、計数および直接同定を可能にする特異的培養培地の製造のための使用にも関する。
【００１７】
驚くべきことに、血液またはその誘導体（例えば、血漿または血清のような）を培養培地に添加することによって、非常に明確な色を有する陽性ＰＩＰＬＣコロニーを得ることが可能になることも見出された。
【００１８】
本発明は、リステリア属の病原性種、詳細には細菌リステリア・モノサイトジェネスの研究、単離、計数および直接同定を可能にする特異的栄養寒天培養培地にも関し、この培地は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つおよび血液またはその誘導体の１つ（好ましくは血清）を含有する。
【００１９】
本発明による培地における血液またはその成分の割合は、培養培地１リットル当り２０〜８０ｍｌ、より特定すると４０〜６０ｍｌ、好ましくは５０ｍｌであり得る。１００〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つおよび１リットルの培地当り４０〜６０ｍｌの割合の血清を含有する培養培地が好ましい。
【００２０】
カオリンまたはシリカのような粉状薬剤の培養培地への添加は、ＰＩＰＬＣのコロニーの培養物の陽性着色の増感に寄与し、従って試験の判断をより容易にする。
【００２１】
好ましくは、粉状薬剤を、血清を用いて作製された培養培地に添加する。
【００２２】
ＰＩＰＬＣによって特異的に切断される合成色素原基質としての５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つ、血清および粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）を含有する、本発明による栄養寒天培養培地も本発明の一部である。
【００２３】
栄養寒天培養培地における粉状薬剤の濃度は使用する薬剤の性質に依存し、５〜３０ｇ／ｌ、好ましくは１５〜２５ｇ／ｌで変動し得る。
【００２４】
本発明によれば、培養培地は、リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物（例えばキシロースのような）も含有し得る。そのような炭水化物を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つを含有する培養培地へ添加すると、一方で純粋な青色のコロニーを形成するリステリア・モノサイトジェネス、および他方で薄い青色から緑色のコロニーを形成するリステリア・イヴァノヴィ、ならびに最後にコロニーが着色しないリステリアの他の種の間の区別が可能になる。リアステリア・モノサイトジェネスによって代謝されるいくつかの炭水化物は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第６版  −  １９９５）ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．  ３４３−３４４頁に記載されている。
【００２５】
本発明は、リステリア・モノサイトジェネスの研究、単離、計数および直接同定を可能にする特異的栄養寒天培養培地にも関し、この培地はＰＩＰＬＣによって特異的に切断される合成色素原基質としての５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つ、血液誘導体（好ましくは血清）、粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）およびリステリア・イヴァノヴィによっては代謝または発酵され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝または発酵され得ない炭水化物（好ましくはキシロース）を含有する。
【００２６】
培養培地におけるリステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物の濃度は５〜１５ｇ／ｌの間で変動し得、もちろん使用する炭水化物に依存する。
【００２７】
本発明による培養培地は、ｐＨ指示薬も含有し得る。ｐＨ指示薬としては、微生物学において現在使用されているもの（例えば、アリザリンスルホン酸、メチルレッド、クロロフェノールレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブロモフェノールレッド、ブロモキシレノールブルー、アリザリン、ブロモチモールブルー、フェノールレッドなど）に言及することが可能である。もちろん、ｐＨ指示薬は調整した濃度で培養培地において使用しなければならない。後者は指示薬の性質に依存し、５０〜３００ｍｇ／ｌで変動し得る。異なるｐＨ指示薬の中で、フェノールレッドを使用することが好ましい。この指示薬は、リステリア・モノサイトジェネスとリステリア・イヴァノヴィとの間の区別をさらに改善する。培地が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つを含有する場合、コロニーはそれぞれ、リステリア・モノサイトジェネスについては指示薬の変色なしに純粋な青色であり、リステリア・イヴァノヴィについては薄い青色で黄色円に囲まれ、この現象は指示薬の変色に関連する。
【００２８】
本発明によれば、好ましい培地は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つ、血液誘導体（好ましくは血清）、粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）、リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物（好ましくはキシロース）およびｐＨ指示薬（フェノールレッドのような）を含有する栄養寒天培養培地である。
【００２９】
他方、ＰＩＰＬＣ活性はリステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィに排他的に存在するのではない。この酵素活性は特に、バチルス（Bacillus）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９９１）  １９７，  ４９３−５０２頁）およびクロストリディウム（Clostridium）（Ｔａｇｕｃｈｉら，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  （１９７８），  １８６，  １９６−２０１頁）の特定の種において見出される。さらに、培養培地上での顕著な雑菌叢（細菌または酵母）の発達は、競合現象によって、リステリア・モノサイトジェネスの検出に有害であり得る。従って、偽陽性（リステリア・モノサイトジェネス以外の細菌によって形成される青色コロニー）または偽陰性（他の汚染物の顕著な発達によるリステリア・モノサイトジェネスのコロニーの青色着色のマスキング）の危険性を排除するためには、妨害微生物の増殖を阻害することが望ましい。これらの現象を回避するためには、リステリア種がさほど感受性ではないかまたは非感受性である抗菌剤および／または抗真菌剤を用いて培養培地を作製することが推奨される。これらの薬剤を単独でか、または組合せて使用することができる。これらの薬剤の中で、例えば、塩化リチウム、塩酸アクリフラビン、ナリジクス酸、ポリミキシンＢ、セフォタン、硫酸コリスチン、ホスホマイシン、セフタジジム、モキサラクタム、シクロヘキシミドおよびアムホテリシンＢに言及することが可能である。
【００３０】
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つ、血液誘導体（好ましくは血清）、粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）、リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物（好ましくはキシロース）、ｐＨ指示薬（特にフェノールレッドのような）および抗菌剤または抗真菌剤を含有する栄養寒天培養培地も本発明の一部である。
【００３１】
本発明は、リステリア属の病原性細菌の同定方法にも関する。この方法は：
−  リステリア属の病原性細菌を含有しそうな試料を、ＰＩＰＬＣ特異的色素原基質を含有する寒天培養培地上に接種する工程、
−  上記試料を接種した培養培地をインキュベートする工程、および
−  基質の特徴的着色によってリステリア属の病原性細菌の存在を決定する工程を包含する。リステリア属の病原性細菌を含有しそうな試料を、粗形態で接種するか、または上記で定義するような培養培地上に接種する前に事前に希釈するかまたは事前に濃縮する。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様によれば、試験しようとする粗試料を培養する。この試料を栄養寒天培養培地上で、希釈するか、または１つ以上の濃度相に供しておく。この栄養寒天培養培地は、ＰＩＰＬＣによって特異的に切断される合成色素原基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つ）、血液誘導体（血清のような）、粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）、リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物（好ましくはキシロース）、場合によってはｐＨ指示薬（特にフェノールレッドのような）および抗菌剤または抗真菌剤を含有する。リステリア・モノサイトジェネスの存在は、そのコロニーの特徴的な着色によって決定される。
【００３３】
下記の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００３４】
実施例１：リステリア病原体、他のリステリア種および妨害物質の間の識別
培養培地の製造
0004083980.tif 000002
【００３５】
培地２：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール
この培地のｇ／ｌでの組成は培地１の組成と同一であるが、培地２はさらに３００ｍｇ／ｌのアンモニウム塩形態の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール（Ｂ−７４０４  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルミオイノシトール−１−イルホスフェートアンモニウム塩、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する。
【００３６】
各培地の製造を以下のように実施する：
−  非熱感受性成分を浸透水中に溶解する。
−  混合物を加熱して沸騰させる。
−  必要であれば、ｐＨを７．３＋／−０．２に調整する。
−  ９５ｍｌ／フラスコの割合でフラスコ中に分配する。
−  フラスコを１２０℃で１５分間オートクレーブにかける。
−  寒天を約４７℃に冷却した後、滅菌溶液中の熱感受性成分を添加する。
−オートクレーブにかけた培地を滅菌ペトリ皿（直径９０ｍｍ）に１５〜２０ｍｌ／ディッシュの割合で分配する。
【００３７】
試験株
試験した株は以下のとおりである：
0004083980.tif 000003
【００３８】
培養−インキュベーション−読み取り
株をトリプト−カゼイン−ソヤ（Trypto-Caseine-Soja）ブロス中で継代培養し、次いで３７℃でインキュベートする。
１８時間インキュベートした後、ブロスを「トリプトン塩」希釈剤（１／１００のトリプトンペプトンおよび８．５／１０００の塩化ナトリウムから作製する）中で希釈し；１０6〜１０7細胞／ｍｌの懸濁物を得る。
【００３９】
各懸濁物について、１μｌの滅菌ループ、培地１のディッシュおよび培地２のディッシュを用いる単離によって接種を実施する。ディッシュを３７℃でインキュベートする。２４時間および４８時間インキュベートした後、ディッシュを読み取る。読み取りは、各々の培地において各々の株によって形成されるコロニーの色の観察からなる。得られた結果を表Ｉに示す。
【００４０】
【表１】
0004083980.tif 000004
【００４１】
培地２は、病原性および非病原性リステリア種の識別を可能にする。さらに、選択補助物は、細菌バチルス・セレウスおよびスタフィロコッカス・オーレウス（培養培地において潜在的に偽陽性）の阻害を可能にする。
【００４２】
実施例２：病原性リステリア種と他のリステリア種との間の識別
培養培地の製造
培地２：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール
培地２は実施例１に記載のとおりである。
培地３：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール
培地３の組成は上記の培地２の組成と同一であるが、この培地は３００ｍｇ／ｌ（培地２）ではなく、１５０ｍｇ／ｌのアンモニウム塩形態の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールを含有する。
培地４：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール＋血液
培地４の組成は培地３の組成と同一であるが、この培地はさらに５０ｍｌ／ｌのウマ血液を含有する。培地の製造のために、血液を熱感受性成分として扱う。培地５：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール＋血清
培地５の組成は培地４の組成と同一であるが、この培地は血液ではなく５０ｍｌ／ｌのウマ血清を含有する。
培地６：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール＋血清＋シリカ
培地６の組成は培地５の組成と同一であるが、この培地はさらに２０ｇ／ｌのシリカ（非熱感受性成分）を含有する。
各培地の製造を実施例１に記載のように実施する。
【００４３】
試験株
試験した株は以下のとおりである：
0004083980.tif 000005
【００４４】
培養−インキュベーション−読み取り
培養、インキュベーションおよび読み取りについては、方法は実施例１に記載のとおりであった。得られた結果を表ＩＩに示す。
【００４５】
【表２】
0004083980.tif 000006
【００４６】
表ＩＩの結果は、試験の特定の正確な読み取りを実施するためには、すなわち病原性リステリア種と非病原性リステリアとの間の良好な区別を得るためには、血液、血清または血清とシリカとの混合物を用いて培養培地を作製することが望ましいことを示す。培地への血液、血清または血清とシリカとの混合物の添加は、陽性ＰＩＰＬＣコロニーの青色着色を強力に増感し、従って培養培地における５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールの濃度の非常に有意な低下を可能にする。
【００４７】
実施例３：リステリア・モノサイトジェネスと他のリステリア種（リステリア・イヴァノヴィを含む）との間の識別
培養培地の製造
培地６：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール＋血清＋シリカ
培地６は実施例２に記載のとおりである。
培地７：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール＋血清＋シリカ＋キシロース
培地７の組成はこの実施例に記載の培地６の組成と同一であるが、この培地はさらに１０ｇ／ｌのキシロース（培地の製造のために熱感受性成分であるとみなされる成分）を含有する。
培地８：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトール＋血清＋シリカ＋キシロース＋フェノールレッド
培地８の組成は上記の培地７の組成と同一であるが、この培地はさらに８０ｍｇ／ｌのフェノールレッド（非熱感受性成分）を含有する。
各培地の製造を実施例１に記載のように実施する。
【００４８】
試験株
0004083980.tif 000007
【００４９】
培養−インキュベーション−読み取り
培養、インキュベーションおよび読み取りについては、方法は実施例１に記載のとおりであった。得られた結果を表ＩＩＩに示す。
【００５０】
【表３】
0004083980.tif 000008
【００５１】
（−）：着色指示薬の変色なし。寒天はコロニー周囲で赤のまま（−キシロース株）。
（＋）：着色指示薬変色。コロニー周囲で黄色円（＋キシロース株）。
【００５２】
表ＩＩＩの結果は、好ましくはフェノールレッドと組合せてキシロースを培養培地に添加することによって、リステリア・モノサイトジェネスとリステリアの全ての他の種（特にリステリア・イヴァノヴィ）との間の区別が可能になったことを示す。
【００５３】
実施例４：本発明による方法の実施
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｐａｒｉｓ）から供給されるリステリア属２１４株を培地８上で試験した。
【００５４】
0004083980.tif 000009
【００５５】
培養、インキュベーションおよび読み取りについては、方法は実施例１に記載のとおりであった。
【００５６】
リステリア・モノサイトジェネスの全ての株が同定され、リステリア・イヴァノヴィの全ての株が同定され、偽陽性の結果は同定されなかった。
【００５７】
この実験は、本発明による方法の特異性および信頼性を示す。