(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする、配列表の配列番号５６に記載の塩基配列からなる核酸からなる肝芽腫検出用プローブ。
【請求項２】
配列表の配列番号５６に記載の塩基配列に、１〜１０個の塩基が置換、欠失若しくは付加した塩基配列からなる核酸であって、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差がある核酸からなる肝芽腫検出用プローブ。
【請求項３】
肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする、配列表の配列番号５６に記載の塩基配列からなる核酸またはその４０個以上の連続した塩基長を有する断片と、若しくはそれに相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であることを特徴とする肝芽腫検出用プローブであって、
当該ストリンジェントな条件が、４５℃において６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、６５℃において０．２×ＳＳＣで洗浄するものである、
肝芽腫検出用プローブ。
【請求項４】
肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする、配列表の配列番号５６に記載の塩基配列からなる核酸を増幅可能であることを特徴とする肝芽腫検出用ＰＣＲプライマー。
【請求項５】
肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする、配列表の配列番号５６に記載の塩基配列からなる核酸によってコードされうるタンパク質であることを特徴とする肝芽腫検出試薬。
【請求項６】
肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする、配列表の配列番号５６に記載の塩基配列からなる核酸を含有することを特徴とする肝芽腫検出用診断薬。
【請求項７】
配列表の配列番号５６に記載の塩基配列に、１〜１０個の塩基が置換、欠失若しくは付加した塩基配列からなる核酸であって、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差がある核酸を含有することを特徴とする肝芽腫検出用診断薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする核酸に関する。
背景技術
個々の腫瘍にはそれぞれの個性があり、発がんの基本的な原理は同じであっても、その生物学的特性は必ずしも同じではない。近年、がんの分子生物学や分子遺伝学が急速に進歩し、発がんやいわゆる腫瘍細胞のバイオロジーが遺伝子レベルで説明できるようになってきた。
肝芽腫は、小児で最も頻度の高い悪性の肝腫瘍であり、その７０％は２歳までに発病する。肝芽腫に罹患した小児は、通常、健康が全体的に衰えるのと、右上腹部の大きな塊が見られる。肝芽腫は、発見が早期であれば化学療法と外科的手術によって長期生存の希望があるが、発見が遅い場合には完全治癒は難しく、早期の発見が望まれている。
一方、これまで、肝芽腫を診断する際の肝芽腫マーカーとして知られているものは、血液中のＡＦＰ（アルファフェトプロテイン）のみであり、ＡＦＰの検出や定量によって、肝芽腫の診断を行っていた。しかしながら、ＡＦＰは、肝芽腫のみならず肝細胞癌においても血中濃度が上昇することが知られており、また、特異性が低いという欠点があるため肝芽腫や肝細胞癌以外の疾患（例えば、肝硬変症）においても値が上昇することがあった。従って、肝芽腫に特異的な腫瘍マーカーとして使用するには不十分であり、最終的には癌組織の一部を採取して病理学、組織学的な診断をするしか方法がないという問題があった。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、肝芽腫と正常肝との間で発現量に差が見られる遺伝子を明らかにし、その遺伝子情報の提供および腫瘍の診断を可能とすることを目的とする。
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ヒト肝芽腫および正常肝の臨床組織の各々からｃＤＮＡライブラリーを作製することに成功した。この２種類のｃＤＮＡライブラリーから肝芽腫について６０００クローン、正常肝について３０００クローンの遺伝子をエンドシークエンスし、発現プロファイル解析を行った。
さらに本発明者は、解析された遺伝子のうち、いくつかで肝芽腫および正常肝の臨床組織で発現量に差があることを見いだし、当該遺伝子を検出およびクローニングするための塩基配列情報を提供することを可能とした。
さらに、当該塩基配列情報に基づき、肝芽腫の診断に使用可能な腫瘍マーカーを設計することを可能とし、本発明を完成した。
すなわち、本発明の核酸は、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする、配列表の配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸である。
ここで、本発明の核酸は、前記配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列の一部からなる核酸であってもよい。
また、本発明の核酸は、前記配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸またはその断片と、若しくはそれに相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする単離された核酸であってもよい。
本発明の腫瘍検出用プローブは、配列表の配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸であることを特徴とする。ここで、前記腫瘍検出用プローブは、前記核酸の一部からなる核酸であってもよい。
また、本発明の腫瘍検出用プローブは、前記配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸またはその断片と、若しくはそれに相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。
さらに、本発明の腫瘍検出用ＰＣＲプライマーは、配列表の配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸を増幅可能であることを特徴とする。
また、本発明の腫瘍検出用マーカータンパク質は、配列表の配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸によってコードされうるタンパク質であることを特徴とする。
上記の腫瘍検出用プローブ、腫瘍検出用ＰＣＲプライマーまたは腫瘍検出用マーカータンパク質を用いることにより、各種腫瘍の診断が可能となる。
さらに、本発明の腫瘍検出用診断薬は、配列表の配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列の一部または全長からなる核酸のうち少なくとも一種の核酸を有する。このような腫瘍検出用診断薬としては、具体的には、例えば、前記核酸を用いて製造したＤＮＡチップやマイクロアレイが挙げられる。
ここで、前記腫瘍検出用プローブ、腫瘍検出用ＰＣＲプライマー、腫瘍検出用マーカータンパク質および腫瘍検出用診断薬の対象となる腫瘍としては、肝臓癌、大腸癌、乳癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、甲状腺癌等も挙げられるが、肝芽腫であることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明における「核酸」という用語は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、または誘導された活性なＤＮＡもしくはＲＮＡでありうるポリヌクレオチドを指し、好ましくは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡをいう。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸断片が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２および１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃において６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃において２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
本願における「単離された」とは、組換えＤＮＡ技術により作製された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。
本発明における「腫瘍検出用マーカータンパク質」とは、腫瘍細胞または腫瘍組織におけるその発現がその腫瘍細胞または腫瘍組織に対して当該腫瘍細胞または腫瘍組織が腫瘍由来であるか否かを選別可能な表現型を授けるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
先ず、本発明の核酸について説明する。
本発明の核酸は、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差があることを特徴とする、配列表の配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸である。
また、本発明の核酸は、前記配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列の一部からなる核酸であってもよい。
さらに、本発明の核酸は、前記配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸またはその断片、若しくはそれに相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよく、この条件を満たす限りにおいてはその塩基配列は特に制限されない。このような塩基配列としては、具体的には、例えば、前記配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸または前記核酸に相補的な核酸の塩基のいくつかに欠失、置換、挿入、付加がある核酸が挙げられる。ここで、欠失、置換、挿入、付加とは、１〜１０塩基の短い欠失、置換、挿入、付加のみならず、１０〜１００塩基の長い欠失、置換、挿入、付加も含む。
一方、本発明にかかる配列表の配列番号８０から１０２に記載のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸は、前記配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸と同様、肝芽腫および正常肝との比較において発現量に差がある遺伝子として単離されたものである。しかしながら、それらの後者の塩基配列のホモロジー検索において、すでに塩基配列が公開されている既知遺伝子と同一の塩基配列を有することが判明した点で、前記配列番号１から７９のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸とは異なる。
なお、前記配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸は、肝芽腫または正常肝の臨床組織より得ることができる。以下に、これらの核酸を得る方法の一例について説明する。
先ず、肝芽腫および正常肝の臨床組織より公知の方法に基づいてｃＤＮＡライブラリーを作製し、それぞれのｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた遺伝子の塩基配列の決定を行う。
決定された塩基配列に従って、ＰＣＲ用のプライマーを設計し、前記肝芽腫または正常肝のそれぞれ由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として半定量的にＰＣＲを行い、肝芽腫および正常肝との比較において発現量に差が認められる遺伝子の検索を行う。ここで、半定量的なＰＣＲとしては公知の方法により実施することができるが、具体的には、例えば、鋳型となるｃＤＮＡの濃度を予め揃えておき、その後、通常のＰＣＲを行うことにより実施することができる。また、この場合のＰＣＲの条件は、使用するプライマーの塩基数やＴｍ値によって適宜決定すればよい。こうして得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル等によって電気泳動し、肝芽腫あるいは正常肝で発現量に差が認められるか否かを確認すればよい。なお、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量が異なる遺伝子を検索する方法としては、前記のディファレンシャルスクリーニングによるものの他、例えば、ディファレンシャルディスプレイ等の発現量の差を指標に複数の被験体から遺伝子をクローニングする方法が挙げられる。
このようにして得られた本発明にかかる核酸は、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差がある遺伝子として見出されたものであり、かかる核酸は以下のような特徴を有する。
肝芽腫は、小児期にのみ発病する肝癌の１つであり、そこで発現が増加しているまたは発現量が減少している遺伝子を解析することは、肝細胞のバイオロジーを理解する上で非常に大きな知見をもたらすものと考えられる。すなわち、本発明の核酸は、肝発生の初期の段階に関与する遺伝子であると共に、肝細胞の増殖・分化に関与する重要な遺伝子であることが特徴として挙げられる。
また、肝芽腫は小児由来の腫瘍であることも一つの特徴であり、後天的な因子の影響が非常に少ない可能性が高く、癌発生のメカニズムの解析とともに発生学的な情報を入手できる可能性が高いことが予想される。
さらに、本発明の核酸は、肝芽腫および正常肝との比較において、発現量に差が認められる核酸であることから、それらの塩基配列を有するＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、さらには前記ＤＮＡにコードされるタンパク質を検出することによって肝芽腫を診断する腫瘍マーカーの情報としても利用可能である。
また、近年、肝芽腫におけるＷｎｔシグナル伝達経路の異常が報告されている。Ｗｎｔとは、ショウジョウバエのセグメントポラリティ遺伝子の一つとして見出されたｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｒｉｊｓｅｗｉｊｋ  Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ，５０：６４９，１９８７）と、マウス乳癌で同定された遺伝子であるｉｎｔ−１（Ｎｕｓｓｅ  Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ，３１：９９，１９８２）とに由来する名称であり、これらに類似の遺伝子も含めてＷｎｔと総称されている。
Ｗｎｔは、線虫、昆虫からマウス、ヒトに至るまであらゆる動物において、様々な局面で時間的・位置的な発現を示し、形態形成の誘導因子、細胞の極性決定因子、増殖分化の調節因子等として機能している。
一方、大腸癌、乳癌、腎臓癌、胃癌、甲状腺癌等の多くの癌において、その２０〜３０％がＷｎｔシグナルの異常であることが知られている。また、このようなＷｎｔシグナル異常の大部分がβ−カテニン遺伝子の変異によるものであるであるとの報告（実験医学  Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６，２００１）もある。さらに、日本人の肝芽腫の６５％にβ−カテニンの体細胞レベルの変異が認められ、免疫組織化学的染色からは実に約８５％の肝芽腫においてβ−カテニンの核内蓄積が認められることから、肝芽腫の発生についてもβ−カテニンの異常、ひいてはＷｎｔシグナルの異常が原因となっているものと考えられる。
また、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、家族性大腸腺腫症の原因遺伝子であるＡＰＣ等の癌抑制遺伝子が存在する等の発癌との関連が示唆されており、具体的には、Ｗｎｔシグナル伝達経路の異常によって細胞質に存在するカテニンが増加し、そのカテニンが転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦと結合することにより発癌に寄与すると考えられている。
本発明にかかる配列表の配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列を有する核酸は、肝芽腫および正常肝との比較において発現量に差が認められる遺伝子群であることから、Ｗｎｔシグナルの異常に何らかの関与をしていると考えられる。従って、当該遺伝子群のいずれか一つまたは複数の遺伝子の発現量等の解析を行うことにより、ＷｎｔファミリーやＷｎｔシグナル伝達経路の異常を検出するマーカーとして使用することが可能であり、肝芽腫のみならず大腸癌、乳癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、甲状腺癌等の種々の癌マーカーとして使用することが可能である。
さらに、本発明にかかる核酸は、Ｐｌｋ−１（ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ−１）として知られている癌遺伝子をも包含する（Ｃｌａｙ  Ｆ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９０：４８８２−６，１９９３）。Ｐｌｋ−１は、本発明にかかる配列表の配列番号１〜１０１、１０３〜１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列を有する核酸と同様に、肝芽腫および正常肝との比較において発現量に差が認められる。なお、Ｐｌｋ−１の塩基配列を配列表の配列番号１０２に示す（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受理番号Ｘ７３４５８）。
このように、本発明にかかる配列表の配列番号１〜１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列を有する核酸を癌マーカーとして使用した場合に、診断の対象となる癌としては、Ｗｎｔシグナルの異常、中でもβ−カテニン遺伝子の異常によって生じると考えられている癌であれば特に制限はなく、上記の肝芽腫をはじめとする肝臓癌、大腸癌、乳癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、甲状腺癌のうちのいずれかであることが好ましく、肝芽腫（Ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）、肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ＨＮＰＣＣ）、類腱腫（Ｄｅｓｍｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、卵巣癌（Ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）、未分化甲状腺癌（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ウイルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ）のうちのいずれかであることがより好ましい。
以上より、本発明は、肝芽腫およびそれに関連する様々な情報を以下の手段により提供可能とする。
（１）ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本明細書に開示された塩基配列の一部または全長を有する核酸（すなわち、本発明にかかる核酸）をハイブリダイゼーションのプローブとして使用することによって少なくともヒト肝芽腫において発現している遺伝子を検出することが可能である。また、本発明にかかる核酸をハイブリダイゼーションのプローブとして使用し様々な腫瘍、正常組織における遺伝子発現を調べることで、遺伝子発現の分布を同定することも可能である。
本発明にかかる核酸をハイブリダイゼーションのプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション法自身については特に限定されない。好適な方法としては、例えばノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法、マイクロアレイ法、などが挙げられる。
前記ハイブリダイゼーションの１つの応用例として、本発明にかかる核酸をノザンハイブリダイゼーションのプローブとして用い、検定したサンプル中においてｍＲＮＡの長さを測定することや、遺伝子発現を定量的に検出することが可能である。
また、本発明にかかる核酸をサザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いる場合は、検定したサンプルのゲノムＤＮＡ中の、当該核酸の有無を検出することが可能である。
また、本発明にかかる核酸をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）のプローブとして用いることで、目的遺伝子の染色体上の位置を同定することも可能である。
また、本発明にかかる核酸をｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）のプローブとして用いることでその目的遺伝子の発現の組織分布を同定することも可能である。
本発明にかかる核酸をハイブリダイゼーション用プローブとして使用する場合は、少なくとも４０個の塩基長が必要であり、本発明にかかる核酸のうち、４０個以上の連続した塩基長を有する核酸が好ましく用いられる。さらに好ましくは、６０個以上の塩基長を有するものが用いられる。
当業者には、核酸プローブ技法は周知であり、個々の長さの本発明によるプローブと、目的とするポリヌクレオチドとの適当なハイブリダイズ条件は容易に決定される。種々の長さを含むプローブに対し至適なハイブリダイズ条件を得るためのこのような操作は当業者では周知であり、例えばサンブルックら、「分子クローニング：実験手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）」が参照される。
好ましくは、本発明のプローブは、容易に検出されるように標識される。検出可能な標識は、目視によって、または機器を用いるかのいずれかによって検出され得るいかなる種類、部分であってもよい。通常使用される検出可能な標識は、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ等の放射性標識である。ビオチン標識ヌクレオチドは、ニックトランスレーション、化学的および酵素的手段等によって、ＤＮＡまたはＲＮＡに組み込むことができる。ビオチン標識されたプローブは、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光標識剤、酵素、金コロイド複合体等の標識手段を使用したハイブリダイゼーションの後検出される。前記核酸はタンパク質と結合させることによって標識されてもよい。また、放射性または蛍光ヒストン一本鎖結合タンパク質に架橋された核酸を使用してもよい。
（２）ＰＣＲ法に用いるプライマー
目的遺伝子を検出する方法には他にも、本発明にかかる核酸に含まれる任意の配列に基づいてプライマーを設計し、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を用いることにより可能である。例えば、検定したいサンプルからＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。このような方法は、当事者にとって周知の方法によって行われるが、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社）、遺伝子病入門（高久史麿著：南江堂）を参照して行うことができる。
本発明にかかる核酸をＰＣＲ用プライマーとして使用する場合は、１０個から６０個の塩基の長さが必要であり、本発明にかかる核酸のうち、１０個から６０個の連続した塩基を有する核酸が好ましく用いられる。さらに好ましくは、１５個から３０個の塩基を有するものが用いられる。また一般的には、プライマー配列中のＧＣ含量が４０％から６０％が好ましい。さらに、増幅に用いる２つのプライマー間のＴｍ値に差がないことが望まれる。またプライマーの３’末端でアニールせず、プライマー内で２次構造をとらないことが望ましい。
（３）核酸のスクリーニング
本発明にかかる核酸を使用することによって様々な組織や細胞で発現している目的遺伝子発現の分布を検出することが可能である。例えば、本発明にかかる核酸をハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用することによって、目的遺伝子発現の分布を検出することが可能である。
また、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等を用いても遺伝子の発現分布を検出することが可能である。すなわち、本発明にかかる核酸を直接、前記チップ、アレイ上に張り付けことが出来る。チップ、アレイに張り付けるために、高精度分注機でかかる核酸等（ＤＮＡ）を基板にスポットする方法が知られている（例えば、米国特許第５８０７５２２号を参照）。そこに臨床組織サンプルから抽出したｍＲＮＡを蛍光物質などで標識し、ハイブリダイズさせ、その遺伝子がどの様な組織の細胞で高発現しているかを解析することが可能である。またチップ、アレイ上に張り付けるＤＮＡは、本発明にかかる核酸またはその断片をプローブとして用いたＰＣＲの反応産物であってもよい。別法として、本発明にかかる核酸断片（ＤＮＡ断片）を基板上で直接合成してＤＮＡチップ若しくはアレイとすることもできる（例えば、米国特許第５４２４１８６号を参照）。
また、上記技術を用い、本発明にかかる核酸のうち少なくとも一つを用いて診断薬として使用することが可能である。近年、ある疾患に罹患しやすいまたはしにくい、特定の薬剤が効くまたは効かないということが、個々人が持つ遺伝子情報によって支配されているということが明らかになりつつあるが、前記核酸を用いて製造したＤＮＡチップやマイクロアレイ等を使用することにより、被験者における疾患と前記核酸との因果関係が明らかとなり、当該疾患の診断が可能となるばかりか、投与すべき薬剤の選択が可能となる。特に、ＤＮＡチップやマイクロアレイによる検出結果を投与すべき薬剤の選択の指標とするには、本発明にかかる核酸のうち一種の核酸の発現量を検討するばかりでなく、二種以上の核酸の発現量を相対的に比較・検討し投与すべき薬剤の選択を行うことができ、より正確な判断が可能となる。ここで、前記疾患としては本発明にかかる核酸で診断可能な疾患であれば特に制限はないが、癌疾患であることが好ましく、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、甲状腺癌であることがより好ましく、肝芽腫であることが特に好ましい。
（４）ＤＮＡのクローニング
本発明にかかる核酸を使用することによって少なくともヒト肝芽腫において発現している遺伝子をクローニングすることが可能である。例えば、本発明にかかる核酸をノザンハイブリダイゼーションのプローブ、コロニーハイブリダイゼーションのプローブまたはＰＣＲのプライマーとして使用し、本発明にかかる核酸を含む遺伝子をクローニングすることが可能である。
（５）腫瘍の予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカー
本発明にかかる核酸をハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用し、試料細胞中の目的遺伝子発現の増強の有無を調べることにより、肝芽腫の診断が可能である。遺伝子発現の増強の有無を調べるには、例えば本発明にかかる核酸に含まれる任意の部分とハイブリダイズし得るプローブを使用する全ての方法が提供される。すなわち試料細胞中において、プローブ配列とハイブリダイズする核酸の量が当該プローブの発現プロファイルと一致する場合には、前記試料細胞は肝芽腫由来の細胞であると診断することが可能である。またＰＣＲのプライマーとして使用する場合は、例えば、検定したいサンプルからＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。
本発明の別の実施の形態に従えば、本発明にかかる核酸に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明にかかる核酸にハイブリダイズすることが可能であり、アンチセンスＤＮＡとアンチセンスＲＮＡとを含む。アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を阻害し、アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、自動合成機を使用して、または本発明に係る核酸を鋳型とするＰＣＲ法により合成できる。さらに、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性が高められたアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体をも包含する。このような誘導体は、公知のアンチセンス技術を用いて、合成することができる。
ｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、該ＲＮＡの合成を阻止することができ、特に遺伝子の発現抑制効果が高い。従って、本発明は、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを好適に包含する。
（７）遺伝子治療
本発明の別の態様は、遺伝子治療に用いられる治療用遺伝子をコードする塩基配列が提供される。本発明を実施する際に考慮されるように、本発明の遺伝子をコードする核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入遺伝子を発現させ、例えば癌の遺伝子治療に用いることができる。
１．ベクター
導入されうるウイルスベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウイルスの塩基配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２  ２６３−（１９９６））。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。さらに遺伝子導入系としてはエレクトロポレーション、遺伝子銃等も使用可能である。
２．発現プロモーター
さらに、薬物遺伝子に用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく何でも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
（８）肝芽腫検出用マーカータンパク質
本発明にかかる配列表の配列番号１から１０４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸によってコードされうるタンパク質を、肝芽腫の疑いがある患者の血液や肝組織から検出またはその発現量を定量することにより肝芽腫のマーカータンパク質として使用可能である。具体的には、例えば、患者から採取した血液中の当該タンパク質を通常タンパク質の検出に用いられる公知の方法によって検出すればよい。
以上説明したように、本発明にかかる核酸若しくはそれによってコードされうるタンパク質、またはこれらから得られる情報を利用することにより、被検体となる臨床組織が肝芽腫由来か否かを診断することが可能となる。また、前記遺伝子若しくはタンパク質またはこれらから得られる情報を利用することにより、肝芽腫診断に使用可能な腫瘍マーカーを設計することが可能となる。
（実施例）
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（製造例１）
（肝芽腫の臨床組織）
肝芽腫および正常肝の臨床組織は、ＪＰＬＴ（日本小児肝癌スタディーグループ）の組織バンクより供与されたものを用いた。なお、正常肝は、肝芽腫組織を採取した肝臓と同一の肝臓の正常部分を採取することにより準備されたものであり、そして該当患者は、１９９１〜２００１年の間にＪＰＬＴのコーデネーションの元に、方々の病院および施設で処置された。組織は、手術時に凍結され、使用まで−８０℃で保存された。
（製造例２）
（肝芽腫および正常肝臨床組織からのトータルＲＮＡの抽出）
ヒト肝芽腫および正常肝臨床組織からのトータルＲＮＡの抽出はＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。抽出したトータルＲＮＡはフェノール・クロロホルムで精製した後、濃度を決定した。
（実施例１）
（ｃＤＮＡライブラリーの調製）
製造例１において臨床組織から調製したトータルＲＮＡからオリゴキャッピング法（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｇｅｎｅ．１９９７  Ｏｃｔ．２４；２００（１−２）：１４９−５６）を用いてｃＤＮＡライブラリーを調製した。それらは、ＡＦＰを分泌するヒト肝芽腫組織に由来する２つのライブラリー（ＨＭＦＴ、ＨＹＳＴ）、ＡＦＰを分泌しないヒト肝芽腫組織に由来する１つのライブラリー（ＨＫＭＴ）、対応する小児正常肝組織に由来する１つのライブラリー（ＨＭＦＮ）であった。得られたｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（ＴＯＰ−１０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にトランスフォーメーションした。
（実施例２）
（ｃＤＮＡの両末端シークエンスの解析）
実施例１において調製した大腸菌を、肝芽腫由来のｃＤＮＡライブラリー３種と正常肝由来のｃＤＮＡライブラリー１種とからそれぞれ約３０００クローンずつピックアップし、エンドシークエンスを行った。ピックアップした大腸菌よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）を用いてｃＤＮＡの両末端のシークエンスを決定した。すなわち、６００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、８μｌのプレミックス（キット付属品）、３．２ｐｍｏｌのプライマーを混合し、滅菌蒸留水で合計２０μｌになるように調製した。この混合液を９６℃で２分間変性させた後、９６℃、１０秒間・５０℃、５秒間・６０℃、４分間を１サイクルとして２５サイクル繰り返し反応を行った。その後エタノール沈殿で精製した。変性条件下で、ポリアクリルアミドゲル上、電気泳動を行い、配列解析を行った。解析にはＡＢＩ３７７（ＡＢＩ社製）を用いた。
（実施例３）
（データベースを用いたホモロジー検索）
実施例２において両末端シークエンスの解析が終了したｃＤＮＡサンプルについてインターネットを介したＤＮＡ配列のホモロジー検索を行った。検索にはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＵＳＡ）のＢＬＡＳＴを用いた。ホモロジー検索の結果、新規遺伝子と判明したクローンに対してプライマーを設計した。
実施例１〜３を通して、得られた結果をまとめたものが表１である。
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また、上記で得られたホモロジー検索の結果、肝芽腫と正常肝の両方の組織間での既知遺伝子の発現プロファイルを比較したところ、肝芽腫（ただし、ＡＦＰあり：ＨＭＦＴ、ＨＹＳＴ）と正常肝（ＨＭＦＮ）では、共にアルブミンが最も多く発現していた。勿論、前者では特徴的にアルブミンに次いで、ＡＦＰが発現しており、後者では、アルブミンに次いで、チトクロームＰ４５０が発現していた。ＡＦＰを分泌しない肝芽腫（ＨＫＭＴ）とＡＦＰを分泌する肝芽腫（ＨＭＦＴ、ＨＹＳＴ）とでは、発現プロファイルが異なり、前者ではＷｎｔシグナル阻害因子である、Ｗｎｔ阻害因子１（受理番号ＮＭ＿００７１９１）およびｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（受理番号ＢＣ００１５３９）が発現していたが、後者ではそれらは、ほとんど発現していなかった。
（実施例４）
（β−カテニンの変異検索）
肝芽腫および正常肝の臨床組織から得られたゲノムＤＮＡについて、Ｔａｋａｙａｓｕらの方法（Ｔａｋａｙａｓｕら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１，Ａｐｒ．；７（４）：９０１−９０８）に従ってβ−カテニンの変異検索を行った。すなわち、これらのゲノムＤＮＡを鋳型として、β−カテニンのエクソン３の一部を増幅するようなＰＣＲを行った。用いたプライマーは５’−ＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧ−３’（ｅｘ３−２ｆ：配列番号１０５）および５’−ＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣ−３’（ｅｘ３−２ｒ：配列番号１０６）である。
また、β−カテニンのｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎの変異検索を行うために、以下に記載の５種類のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
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ＲＴ−ＰＣＲは肝芽腫および正常肝の臨床組織から調製した全ＲＮＡ  ５μｇ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）２００ｕｎｉｔｓ、１６０ｐｍｏｌのランダムプライマー（宝酒造製）が含まれたトランスクリプターゼ混合液３０μｌを６５℃で１５分で解離反応を行った後、４２℃で９０分インキュベートした。次に、表１に記載の５種類のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１μＭのプライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｕｎｉｔのＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム製）の溶液を、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で４５秒を３５サイクル反応させることにより行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルまたは５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行って欠失変異の有無を解析すると共に、全てのＰＣＲ産物について塩基配列の決定を行って点突然変異の確認をした。
（実施例５）
（ＲＴ−ＰＣＲ）
実施例４においてβ−カテニンに変異が認められたサンプル４種類（ｃａｓｅ１０，５８，７７，８５）および変異が認められなかったサンプル４種類（ｃａｓｅ１４，６７，７８，８１）について、後のディファレンシャルスクリーニングの鋳型として用いるためにＲＴ−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて行った。すなわち、ＲＮＡ５μｇ、２μｌのランダムプライマー（１０μｇ／μｌ）、必要量のＤＥＰＣ水とを添加した溶液を６５℃で１５分インキュベートし、反応終了後氷上に置いた。この溶液に１サンプルあたり６μｌの５×ｂｕｆｆｅｒ、１μｌの０．１ｍＭＤＴＴ、７．５μｌのｄＮＴＰｓ、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩの混合液を加えて４２℃で２時間、次いで９５℃で５分間反応させた。
作製したｃＤＮＡはＤＤＷで５０倍希釈した後、ＧＡＰＤＨプライマーをもちいて濃度調製を行った。ＧＡＰＤＨプライマーの塩基配列は５’−ＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号１１７）および５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号１１８）である。ｃＤＮＡ１μｌに対して１０μＭのｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーをそれぞれ５μｌずつ添加し、１μｌのｄＮＴＰｓ、６μｌのＤＤＷ、０．１μｌのｒＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをそれぞれ添加した混合液を調製し、９５℃で１５秒、５８℃で１５秒、７２℃で２０秒を２７サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで２０分間電気泳動し、濃度の判定を行った。
その結果、ＤＤＷで５０倍希釈した前記のサンプルをそれぞれ、さらにｃａｓｅ１４ｔ（肝芽腫）で６倍、ｃａｓｅ１４ｈ（正常肝）で２倍、ｃａｓｅ６７ｔで５倍、ｃａｓｅ６７ｈで６倍、ｃａｓｅ７８ｔで１０倍、ｃａｓｅ７８ｈで１２倍、ｃａｓｅ８１ｔで８倍、ｃａｓｅ８１ｈで９倍、ｃａｓｅ１０ｔで２倍、ｃａｓｅ１０ｈで１倍、ｃａｓｅ５８ｔで２０倍、ｃａｓｅ５８ｈで４倍、ｃａｓｅ７７ｔで１５倍、ｃａｓｅ８５ｔで６倍、ｃａｓｅ８５ｈで２倍希釈することによりほぼ濃度が揃った。
（実施例６）
（ディファレンシャルスクリーニング）
ｃＤＮＡライブラリーから得られた新規遺伝子に対してプライマーを設計し、濃度調整を行った８組１６サンプルのｃＤＮＡサンプルを用いてディファレンシャルスクリーニングを行った。ＰＣＲの反応液は、ｃＤＮＡ１μｌに対して１０μＭのｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーをそれぞれ５μｌ、１μｌの１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのｄＮＴＰｓ、６μｌのＤＤＷ、０．１μｌのｒＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを混合したものを用いた。ＰＣＲのアニーリング温度は、前記反応液をアニーリング温度が５７℃、５９℃、６１℃の３種の温度でＰＣＲを行うことにより（３５サイクル）、最も濃くバンドが出た温度をそのプライマーのアニーリング温度とした。また、バンドが出なかった場合には、反応を４０サイクルにして同様に条件検討を行い、それぞれのプライマーのアニーリング温度とサイクル数を決定した。
前記で定められたアニーリング温度でＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルで２０分間電気泳動し、エチジウムブロミドで染色して同一患者における肝芽腫と正常肝とのバンドの濃度を比較した。
図１に、肝芽腫と正常肝との比較において、発現量に差が認められる遺伝子のうち４種類についての電気泳動パターンの一例を示す。また、図２および図３に、それぞれ別の例を示す。各遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現に対して、規格化されており、各図中、レーンＮは正常肝組織に対応し、レーンＴは肝芽腫組織に対応する。ただし、ｃａｓｅ７７は、肝細胞癌の組織である。
また、以下の表に示すように、８例中５例以上で肝芽腫（β−カテニンの変異いかんに関わらず）あるいは正常肝に強く発現が見られた遺伝子について再現性があることを確認し、再現性が確認された遺伝子を肝芽腫および正常肝との比較において差がある遺伝子と判定した。以下の表において、Ｎ＜Ｔは肝芽腫組織で発現が高いことを示し、Ｎ＞Ｔは正常肝組織で発現が高いことを示し、Ｎ＝Ｔは肝芽腫組織および正常肝組織において発現量がほぼ等しいことを示す。
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また、β−カテニン遺伝子に変異が見られない４例中３例以上に発現の差が認められ、β−カテニン遺伝子に変異のある４例中３例以上に前記変異が見られないものと反対の発現差を認めた遺伝子もβ−カテニンの変異の有無で発現に差があると判定した（表６）。すなわち、表６に記載の遺伝子は、β−カテニンに変異が見られない場合にＮ＜Ｔであり、β−カテニンに変異が見られる場合にＮ＞Ｔである表現型を示す。
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なお、表７〜表１０に記載の遺伝子は既知遺伝子であり、表１１にホモロジー検索の結果、当該遺伝子それぞれにホモロジーが認められた遺伝子名について記載した。
表１２に記載の遺伝子も、新規であり表に示すように上記の基準から肝芽腫と正常肝との比較において、発現量に差が認められる遺伝子である。これらの遺伝子の全長は、ＨＭＦＮ０８３９を除いてシークエンスされていないが、両末端シークエンスおよびホモロジー検索の結果、表１３に示す既知遺伝子にそれぞれ相同性が認められた。
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（実施例７）
（Ｐｌｋ−１のディファレンシャルスクリーニング）
実施例６と同様にして、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｐｌｋ−１の発現を８組１６サンプルで確認した。結果を図４に示す。ここでも、Ｐｌｋ−１遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現に対して、規格化されており、図中、レーンＮは正常肝組織に対応し、レーンＴは肝芽腫組織に対応する。ただし、ｃａｓｅ７７は、肝細胞癌の組織である。Ｐｌｋ−１の発現量は、腫瘍組織において、正常肝組織よりも明らかに高い。
（実施例８）
（ノーザンブロット）
ヒト肝芽腫、肝細胞癌および正常肝から常法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．，Ｓａｃｃｈｉ  Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−９，１９８７）に従い、トータルＲＮＡ（２５μｇ）を調製した。これをホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル上で電気泳動して、ナイロン膜フィルターにトランスファーし、ＵＶ架橋して固定化した。ランダムプライミングを用いて、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したヒトＰｌｋ−１ｃＤＮＡ断片（９７６塩基）をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った（６５℃、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、７．５％硫酸デキストラン、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中）。その結果を図５に示す。図中、６７ｔ、９３ｔ、５８ｔは、ヒト肝芽腫組織であり、６７ｈ、９３ｈ、５８ｈは、対応する正常肝組織である。また、７７ｔは、ヒト肝細胞癌組織であり、７７ｈは、対応する正常肝組織である。ヒト肝芽腫およびヒト肝細胞癌組織において、正常肝組織よりもＰｌｋ−１の発現が高いことが分かる。
（実施例９）
（予後の統計的解析）
Ｐｌｋ−１の発現量を指標（Ｐｌｋ−１発現量＝１３を中央値）にして、肝芽腫の患者５９症例のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析を試みた。その解析結果を図６に示す。高いＰｌｋ−１発現の患者は、低いＰｌｋ−１発現の患者よりも不良な予後を示した。５年後の前者の生存率は、５５．９％、後者の生存率は、８７．０％であった（統計的有意差：ｐ＝０．０４２）。従って、Ｐｌｋ−１遺伝子の発現量がヒト肝芽腫の予後診断用の優れたマーカーであることが実証された。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明によれば、肝芽腫と正常肝との間で発現量に差が見られる遺伝子配列が明らかとなり、それら遺伝子情報の提供およびそれらに基づく本発明にかかる核酸、さらにはタンパク質をプローブまたはＰＣＲプライマーとして利用することにより、肝芽腫の診断が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＴ−ＰＣＲによるディファレンシャルスクリーニングの結果の一例を示す電気泳動写真に対応する図である。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲによるディファレンシャルスクリーニングの結果の別の例を示す電気泳動写真に対応する図である。
図３は、ＲＴ−ＰＣＲによるディファレンシャルスクリーニングの結果のさらに別の例を示す電気泳動写真に対応する図である。
図４は、ＲＴ−ＰＣＲによるディファレンシャルスクリーニングの結果、Ｐｌｋ−１遺伝子の例を示す電気泳動写真に対応する図である。
図５は、肝芽腫および正常肝組織でのＰｌｋ−１発現を調べたノーザンブロット図である。
図６は、肝芽腫患者の生存率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線プロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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