(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の酵素基質の濃度を決定し、酵素基質を検出するセンサであり且つ、直接又は間接的に検出可能な物質を生成しながら酵素基質と反応することができる酵素の酵素層、検出装置、及び、前記酵素層上に配置された被覆膜であると共に前記酵素基質に透過できるポリマーからなる被覆膜を有するセンサであって、前記ポリマーがポリ塩化ビニル共重合体、即ち塩化ビニル及び他のモノマーの共重合体であり、この共重合体が親水基を含む、上記センサ。
【請求項２】
検出装置がベース電極である酵素電極として提供する請求項１記載のセンサ。
【請求項３】
ベース電極又は酵素含有層に被覆膜を直接、即ち中間の干渉ブロック膜なしで付着する請求項２記載のセンサ。
【請求項４】
被覆膜を接着によってベース電極又は酵素含有層に付着させる請求項３記載のセンサ。
【請求項５】
光学センサとして提供する請求項１〜４のいずれか１項記載のセンサ。
【請求項６】
前記他のモノマーが、前記塩化ビニルの質量をベースとして５質量％〜３５質量％の量で含有される請求項１〜５のいずれか１項記載のセンサ。
【請求項７】
センサを液体試料に接触させることにより、液体試料中の酵素基質の濃度を決定し、酵素基質を検出する方法であって、請求項１〜６のいずれか１項記載のセンサを用いる、液体試料中の酵素基質の濃度決定及び検出方法。
【請求項８】
酵素基質の濃度測定及び検出用センサの酵素層上に配置された被覆膜を製造するための、親水基を含むポリ塩化ビニル共重合体の使用。
【請求項９】
酵素基質の濃度測定及び検出用センサの製造方法であって、親水基を含むポリ塩化ビニル共重合体を、酵素層上に配置された被覆膜を製造するために使用することを含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体試料中の酵素基質の濃度を決定し、これを検出するセンサ（バイオセンサ）に関する。このセンサは、直接又は間接的に検出可能な物質を生成しながら酵素基質と反応することができる酵素、検出装置、及び酵素基質に透過することができるポリマーからなる被覆膜又は被覆層を有する。
【０００２】
【従来の技術】
電流測定センサ、酵素電極又は光学センサ（オプトード(optodes))として提供されるセンサが今日広く使用されている。これらのセンサは、血液及び他の体液中のある種の物質、例えばグルコース、酸素、及びＣＯ2 などの量を決定するか、又はこれらを検出する。
【０００３】
電流測定酵素電極の構造及び機能は、例えば、本願と同一の出願人によるＥＰ−Ａ 0 603 154から既知である。オプトードの構造及び機能は、例えば Biosensors & Bioelectronics 5 (1990) の第 137頁〜第 148頁から既知である。
【０００４】
グルコース、ラクテート又はクレアチニンを決定する電流測定センサは、オキシドレダクターゼ、及び過酸化水素を決定する検出装置（ベース電極（base electrode))を有して構成するのが好ましい。これらのセンサは、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ及びサルコシンオキシダーゼなどのオキシダーゼが、測定する分析物を酸素で酸化して対応する酸化生成物及び過酸化水素を生成するように機能する。生成した過酸化水素の濃度は分析物の濃度に比例し、ステンレス鋼又は炭素電極（ベース電極）で対Ａｇ／ＡｇＣｌ約６５０ｍＶで陽極酸化することにより測定する。あるいは、減少した酸化電圧（約３００ｍＶ）で、白金化炭素及び二酸化マンガンなどの触媒効果を有する電極で測定を行うこともできる。
【０００５】
また、決定手段として、酸素消費量の測定又は媒介物質を使用することもできる。媒介物質は、過酸化水素の代わりに電極で酸化することにより測定でき、また、酸化した形態で酸素の代替物として機能することができる。
【０００６】
古典的な電流測定センサは、４つの層を含む。即ち、ベース電極、干渉ブロック層、酵素層及び被覆膜又は被覆層である。この構造を図１に概略的に示す。参照番号１は、支持体（図示せず）に付着される、例えば銀からなる導電層を示す。導電層１上にベース電極２を付着する。ベース電極２上に、干渉ブロック層３、酵素層４及び被覆膜５を設ける。被覆膜５は試料と接触する。
【０００７】
電流測定センサの干渉ブロック層３は、電極表面で直接酸化する可能性があり、従って誤った過剰なシグナルを示しうる、パラセタモール（paracetamol)、尿酸及びアスコルビン酸などの、試料中のあらゆる電気活性物質を電極から遠ざけるように機能する。干渉ブロック層として、酢酸セルロース及びポリフェニレンジアミンからなる層を用いるのが好適である。ポリフェニレンジアミンは、フェニレンジアミンをベース電極上に直接重合させることによって生成する。未可塑ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）及びナフィオン（nafion) を、これらの溶液から直接付着させることもできる。
【０００８】
被覆層５としては、エッチングによって細孔にしたポリカーボネート膜がしばしば用いられ、その孔の幅は多孔率５％未満で通常０．０３μｍである。この被覆膜は生適合性があり、多孔率が低いために拡散を制限するが、酵素が孔を通って運搬されるのを妨げない。拡散特性を向上させるために、この層をしばしばラミネートするか、及び／又は更に被覆する。疎水性可塑剤で湿らせることにより、いわゆる支持された液体膜を製造することができる。
【０００９】
多孔性ポリカーボネート膜である被覆層５は、下層の酵素層４をプロテアーゼから十分に保護することができないという欠点を有する。更に、酵素は幅０．０３μｍの孔を通って拡散することができるため、酵素層４からの酵素の流出を防ぐことができない。
【００１０】
被覆層はしばしば、酵素層に機械的に付着される。被覆層を酵素層と結合させる場合、この層はベース電極に機械的に付着されなければならない。このような機械的な付着は高価で、技術的に複雑であり、気泡を生じずに下層の上に膜を付着させることが困難であるためにしばしば問題を生じる。機械的な張力下で膜を電極に付着させるには型押しした電極表面が必要であるため、このことによって、センサを設計する際に構造の自由が制限される。必要とされる張力により、亀裂及びしわがしばしば生じる。更に、シート膜は比較的厚く、従って、製造されるセンサは電流が比較的低く、応答時間が長い。
【００１１】
被覆膜を製造するために、ポリマー溶液を酵素層に塗布して溶媒を蒸発させることが更に既知である。従って、例えば、機械的に付着させず、即ち接着のみによって下層に付着する、ナフィオン、ＰＶＣ、ポリウレタン、シリコーン、ポリアクリレート（ｐ−ＨＥＭＡ）及び酢酸セルロースの被覆膜を製造することができる。
【００１２】
これまでに使用されていた、溶液から酵素層又は電極に直接塗布することができるポリマーは、ナフィオン及び酢酸セルロースなど少数であり、これらは電気化学的に活性な妨害物質に対して選択的である。更に、ＤＭＳＯ及びアセトン中の酢酸セルロース、ならびにテトラヒドロフラン及びシクロヘキサノン中のＰＶＣなど、多くのポリマーは揮発性で攻撃的又は毒性の溶媒にのみ可溶である。この状況は、安全性の理由及び製造方法に関係してくる。また、プラスチック部分は劣化する可能性があり、酵素層に存在する酵素はこれらの溶媒によって破壊されうるため、電極自体にも関係してくる。可塑ＰＶＣから、可塑剤が周囲のプラスチック部分又は酵素層に拡散する可能性がある。
【００１３】
別の欠点は、殆どのポリマー、特に可塑ＰＶＣでは、グルコース又はラクテートなどの分析物への透過性は層の厚みを変えることによってしか調節できないことにある。何故なら、透過性は主にこのように製造された膜及び多孔性の欠陥によるからである。層の厚みがわずかに異なることで、透過性を全て失ってしまう場合がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前述のセンサに関して述べた欠点を克服し、特に、被覆層を機械的に付着させる必要のないセンサを提供することにある。更に、溶液から被覆層を塗布する際に、従来技術で使用した攻撃的な毒性の溶媒又は揮発性が非常に高い溶媒を全く使用しない。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
液体試料中の酵素基質の濃度を決定し、酵素基質を検出する本発明のセンサは、直接又は間接的に検出可能な物質を生成しながら酵素基質と反応することができる酵素の酵素層、検出装置、及び、前記酵素層上に配置された被覆膜であると共に前記酵素基質に透過できるポリマーからなる被覆膜を有するセンサであって、このポリマーが、ポリ塩化ビニル共重合体、即ち塩化ビニル及び他のモノマーからなる共重合体であり、この共重合体が親水基を含むことを特徴とする。被覆膜を製造するために本発明に従って使用する共重合体は、ブロック共重合体、交互共重合体又はランダム共重合体とすることができる。
【００１６】
親水基としては、ヒドロキシ基、エステル基及び／又はカルボキシル基が好ましい。
【００１７】
本発明に従って使用するＰＶＣ共重合体は、高沸点エステルに容易に可溶である。これにより、自動的な排出（discharge)を数時間行うことができる。これに対して、通常は純粋なＰＶＣをテトラヒドロフランに溶解するが、これは揮発性が高いため、再生可能で自動的な大量生産を行うことができない。
【００１８】
更なる利点として、溶解したポリマーをその溶液から酵素層に直接塗布することができる。本発明の被覆層によって生じる酵素層の不活性化は実質的に不可能である。何故なら、被覆されていないセンサと比較すると、約半分のシグナルしか失われないからである。しかし、センサの直線性が増加することは注目すべきことである。ナフィオンなどから製造する匹敵した被覆膜は同様のシグナル損失を示すが、センサの直線性を大幅に増加させない。
【００１９】
本発明に従って使用する共重合体は、塩化ビニル、ならびにビニルアルコール、酢酸ビニルなどのビニルエステル、ヒドロキシプロピルアクリレートなどのビニルヒドロキシエステル、及びマレイン酸などのビニルカルボン酸のうち１つ又はそれより多くからなることが好ましい。例示的なＰＶＣ共重合体として、ポリ−（塩化ビニル−コ−酢酸ビニル）、ポリ−（塩化ビニル−コ−酢酸ビニル  コ２ヒドロキシプロピルアクリレート）、ポリ−（塩化ビニル−コ−酢酸ビニル−コ−マレイン酸）及びポリ−（塩化ビニル−コ−酢酸ビニル−コ−ビニルアルコール）がある。
【００２０】
本発明のセンサのある態様として、ポリ塩化ビニル共重合体を生成する他のモノマーは酢酸ビニル及び／又はマレイン酸である。
【００２１】
他のモノマーを、塩化ビニルの質量をベースとして５〜３５質量％、特に１０〜２０質量％の量で共重合体に含むのが好ましい。
【００２２】
本発明のセンサの更に好適な態様として、被覆膜が親水性可塑剤を含有することからなる。可塑剤としては、デキストラン、グリセリン、ポリエチレングリコール又はグリコール類が優れた結果を示した。
【００２３】
可塑剤の添加によって、透過性を正確に調節することができる。電流測定センサでは、例えばグリセリン３質量％を添加することによって、例えばラクテートに対するセンサシグナルを１００％増加させると同時に、同一の層の厚みで直線性を約１０％増加させる。光学センサに適用した場合でさえも、本発明の被覆膜の付着後に、測定範囲は大幅に増加するであろう。
【００２４】
純粋なＰＶＣからなる被覆膜と比較すると、ＰＶＣ共重合体からなる本発明の被覆膜によって、グルコースへの透過性を著しく良好に調整することができる。何故なら、親水性共重合体成分のために、グルコースへの透過性が先験的に優れているからである。層の厚みを２倍にしても、シグナル強度が半分しか低下しないのに対して、純粋なＰＶＣからなる被覆膜の層の厚みを２倍にすると全ての透過性の損失を被る可能性がある。
【００２５】
本発明の被覆膜は、酵素層の酵素又は他の成分の流出を防ぎ、従ってセンサの寿命を長くする。ラクテートセンサの寿命を、１．５日（被覆膜なし）から１４日（被覆膜あり）に延ばすことができる。
【００２６】
ポリ塩化ビニル共重合体をベースとして０．５〜５質量％の量で可塑剤を含有するのがよい。
【００２７】
本発明のセンサを、検出装置がベース電極である酵素電極として提供することができる。
【００２８】
この場合、ベース電極又は酵素含有層に、被覆膜を直接、即ち中間の干渉ブロック膜なしで、塗布することができる。本発明の被覆膜は、拡散妨害が改良されたためにセンサの直線性を高めると共に電気的に活性な妨害物質を締め出すため、このことが可能である。本発明の被覆膜を用いて、パラセタモール１ｍｍｏｌ／リットルの影響を、被覆膜のないラクテート１．４ｍｍｏｌ／リットルからラクテート０．２ｍｍｏｌ／リットルに低下させることができる。また、センサの直線性（ラクテート５ｍｍｏｌ／リットル及び１２ｍｍｏｌ／リットルでの測定値の比は絶対的な直線性である）は、１．１から２．２に増加した。
【００２９】
被覆膜は、接着によってベース電極又は酵素含有層に付着させることができる。機械的な方法でフィルムとしてベース電極又は酵素含有層に付着させる必要はない。
【００３０】
更に、本発明のセンサを光学センサとして提供することができる。
【００３１】
また、本発明は、センサを液体試料に接触させることにより、液体試料中の酵素基質の濃度を決定し、酵素基質を検出する方法に関し、この方法は、本発明のセンサを用いることを特徴とする。
【００３２】
本発明は更に、酵素基質の濃度測定及び検出用センサの酵素層上に配置された被覆膜の製造に、親水基を含有するポリ塩化ビニル共重合体を使用することに関する。
また本発明は、酵素基質の濃度測定及び検出用センサの製造方法であって、親水基を含むポリ塩化ビニル共重合体を、酵素層上に配置された被覆膜を製造するために使用することを含む製造方法に関する。
【００３３】
【発明の実施の形態】
添付の図面によって、本発明の好適な態様をさらに詳しく説明する。図２及び図３はそれぞれ、本発明の酵素電極の断面図、及び本発明の光学センサ（オプトード）を概略的に示す。
【００３４】
図２は、本発明の酵素電極の好適な態様の構造を示しており、参照番号６は、プラスチック支持体（図示せず）に付着した、例えば銀からなる導電層を示している。層６の上に、ベース電極７を付着している。ベース電極７の上には、酵素層８、及び試料と接触した本発明の被覆膜９を設けている。このような酵素電極の層構造を、下記のように構築することができる。
【００３５】
まず、参照電極用の銀の小片の導体、本発明の対極及び酵素電極（それぞれベース電極又は作用電極）をプラスチック支持体上にプリントする。
【００３６】
更に、感知領域に参照電極をＡｇ／ＡｇＣｌペーストから製造する。感知領域の対極を炭素ペーストで更に被覆する。酵素電極のベースとして、ＭｎＯ2 ５％と炭素ペーストの混合物を感知領域にプリントする。この上に、１０％グルコースオキシダーゼ水溶液又は１０％バソトニック（bathotonic）ポリアクリルマトリックス溶液を１滴塗布する。
【００３７】
この後、ＰＶＣ−コ−酢酸ビニル−マレイン酸などのポリ塩化ビニル共重合体の１〜３％酢酸ブトキシエチル溶液１〜３滴を次々に塗布し、溶媒を蒸発させることによって、被覆膜を製造する。
【００３８】
透過性を高め、ポリ塩化ビニル共重合体膜に生じうる結晶化を防ぐために、親水性可塑剤（グリセリン、ＰＥＧ又はデキストランなど）を、ポリ塩化ビニル共重合体の３％の濃度で添加するのがよい。
【００３９】
グルコースオキシダーゼの代わりに、他の基質を決定する他の酵素を用いることもできる。例えば、ラクテートの決定にラクテートオキシダーゼを用いることができる。
【００４０】
図３は光学センサの構造を概略的に示す。ここで、参照番号１０は、例えばポリエステルから製造される支持体を指し、参照番号１１は酸素の検出用にデカシクレンなどの指示薬を含むシリコーン層を指し、参照番号１２は光学分離用の微細炭素の層を指し、参照番号１３は酵素層（ゲル層）を示している。このようなセンサの製造は、例えば、前掲のBiosensors & Bioelectronics 5 (1990)の第 137頁〜第 148頁で知られている。
【００４１】
ポリ塩化ビニル共重合体の被覆膜１４の塗布を、上記のように進める。この被覆層１４は、試料と接触する。
【００４２】
グルコースなどの決定すべき物質は被覆膜１４を貫通し、グルコースオキシダーゼを含む酵素層１３に入る。グルコースの酵素酸化によって生じる酸素は指示薬層１１に貫通し、シリコーン層１１に励起光を放出する励起装置１５によって生成されるデカシクレンの蛍光を消す。蛍光の減少から、前部にフィルタ１７を設けた測定装置１６によって、酸素の濃度、続いてグルコース濃度をほぼ既知の方法で推断することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】古典的な電流測定センサの構造を示す略図である。
【図２】本発明の酵素電極の略断面図である。
【図３】本発明の光学センサ（オプトード）の略図である。
【符号の説明】
１、６    導電層
２、７    ベース電極
３    干渉ブロック層
４、８、１３    酵素層
５、９、１４    被覆膜
１０    支持体
１１    シリコーン層
１２    炭素層
１５    励起装置
１６    測定装置
１７    フィルタ
【図１】
0004087496.tif 000002
【図２】
0004087496.tif 000003
【図３】
0004087496.tif 000004