(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の同種異系抗原または異種抗原を保持する細胞に対するドナーＴ細胞のＴ細胞耐容性または非応答性を体外で誘発する方法であって、下記：
（ｉ）ドナーＴ細胞含有のドナー組織を含有する培養を準備し；
（ii）該ドナーＴ細胞培養に同種異系抗原または異種抗原を保持する細胞を加えることにより混合リンパ球反応培養をつくり；
（iii）得た混合リンパ球培養に、
ａ）ｇｐ３９に対する抗体；ｂ）ｇｐ３９に対する抗体の断片または誘導体；ｃ）可溶性ＣＤ４０Ｉｇ
からなる群から選択される、ｇｐ３９アンタゴニストを加え；
（iv）これらの細胞を培養中に１から３０日間保持し、ドナーT細胞に、該同種異系抗原または異種抗原を保持する細胞に対する実質的な非応答性を与える；
ことを含む方法。
【請求項２】
ドナーＴ細胞を含有する組織がドナー骨髄または末梢血細胞である、請求項１の方法。
【請求項３】
ｇｐ３９アンタゴニストが抗ｇｐ３９抗体および可溶性ＣＤ４０Ｉｇよりなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項４】
ｇｐ３９アンタゴニストが抗ｇｐ３９抗体である、請求項３の方法。
【請求項５】
該抗ｇｐ３９抗体が抗ヒトｇｐ３９モノクローナル抗体である、請求項４の方法。
【請求項６】
ドナーＴ細胞を該ｇｐ３９アンタゴニストとともに、１日から３０日の範囲の時間、培養する、請求項１の方法。
【請求項７】
該時間の範囲が５日から１５日である、請求項６の方法。
【請求項８】
同種異系抗原または異種抗原保持細胞が、処置しレシピエントＴ細胞を除去した移植予定のレシピエントから得られた細胞または組織を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞の除去が放射線処置によりなされる、請求項８の方法。
【請求項１０】
移植の必要なレシピエントにおいて移植処置のための、請求項１のドナーＴ細胞を含む医薬。
【請求項１１】
免疫再構築を必要とする疾患の処置における、免疫再構築のための請求項１０の医薬。
【請求項１２】
癌または自己免疫疾患の処置のための、請求項１１の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、移植組織または移植臓器（同種異系または異種）に含まれるＴ細胞にドナー抗原（異種抗原または同種異系抗原）に対する耐容性を与えるために、これらの臓器を生体外で処置する方法を提供する。処置した組織または臓器は、移植片対宿主病の危険性を低下して、レシピエントに移植できる。
【０００２】
（発明の背景）
抗原特異的Ｔ細胞の活性化およびクローン増殖を誘導するために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提供される２つのシグナルは、休止Ｔリンパ球の表面に送達されなければならない(Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D.L., et al. (1990) J. Immunol. 144, 3701-3709; Williams, I.R. and Unanue, E.R. (1990) J. Immunol. 145, 85-93)。第１シグナルは免疫応答に対する特異性をもたらす。第１シグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）において示される外来の抗原ペプチドを認識した後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって媒介される。第２シグナルは、同時刺激と呼ばれ、Ｔ細胞を誘導して増殖し、機能的にする(Schwartz, R.H.(1990) Science 248, 1349-1356)。同時刺激は、抗原特異的でもＭＨＣ制限的でもなく、ＡＰＣにより発現される１以上の異なる細胞表面分子により提供されると考えられる(Jenkins, M.K., et al. (1988) J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P.S., et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 6575-6579; Young, J.W., et al. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L., et al (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89. 271-275; van-Seventer, G.A., et al. (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M., et al., (1991) J. Immunol. 147, 774-80; Dustin, M.I., et al., (1989) J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R.J., et al. (1992) Nature 357, 80-82; Liu, Y., et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 437-445)。Ｔ細胞の活性化に関する１つの同時刺激経路は、Ｔ細胞の表面上の分子ＣＤ２８を必要とする。この分子はＢ細胞または他のＡＰＣ上のリガンドにより送達される同時刺激シグナルを受け取り得る。ＣＤ２８のリガンドには、Ｂリンパ球活性化抗原のＢ７ファミリーのメンバー、例えばＢ７−１および／またはＢ７−２が含まれる(Freedman, A.S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G.J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722, Freeman, G.J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262, 909-911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G.J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192) 。Ｂ７−１およびＢ７−２はまた、別の分子のリガンドである。ＣＴＬＡ４は活性化されたＴ細胞の表面上に存在するが、同時刺激におけるＣＴＬＡ４の役割は明らかではない。
【０００３】
同時刺激シグナルによる抗原特異的シグナルのＴ細胞への送達は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。Ｔ細胞の活性化には、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌の両方が含まれる。反対に、同時シグナル不存在下での抗原特異的シグナルのＴ細胞への送達は、Ｔ細胞において不応答または無反応の状態を誘導し、よってＴ細胞に抗原特異的耐容性を誘導すると考えられる。
【０００４】
Ｔ細胞とＢ細胞間の相互作用は、免疫応答において中心的役割を果たす。胸腺依存性抗原への体液性免疫の誘導は、Ｔヘルパー（以後Ｔｈ）細胞により提供される“ヘルプ”を要する。Ｂリンパ球へ提供されるヘルプは、Ｔｈ細胞により放出される可溶性分子（例えば、ＩＬ−４およびＩＬ−５などのリンホカイン）により媒介されるが、Ｂ細胞の活性化はまた、Ｂ細胞とＴｈ細胞間の接触依存性相互作用を要する。Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745-1754 (1989)。これは、Ｂ細胞の活性化がＢ細胞およびＴｈ細胞の細胞表面分子間の不可避な相互作用を必要とすることを示す。従って、Ｔ細胞上の分子は、Ｔ細胞の接触依存性ヘルパー効果機能を媒介する。Ｂ細胞およびＴ細胞上の分子間の接触依存性相互作用は、活性化されたＴ細胞の単離された原形質膜がＢ細胞の活性化に必要なヘルパー機能を提供し得るという報告によりさらに支持される。Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol., 146:1118-1124 (1991)。
【０００５】
分子ＣＤ４０は、未成熟Ｂリンパ球および成熟Ｂリンパ球の表面上で同定され、抗体により架橋されると、Ｂ細胞の増殖を誘導する。Valle et al., Eur J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140:1425-1430 (1988); Gruber et al., J. Immunol., 142:4144-4152 (1989)。ＣＤ４０は分子的にクローン化され、特性が解明されている。Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)。ＣＤ４０のリガンド、ｇｐ３９（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０Ｌおよび最近はＣＤ１５４とも呼ばれる）も、分子的にクローン化され、特性が解明されている。Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)。ｇｐ３９タンパク質は、活性化され休止していないＣＤ４＋Ｔｈ細胞上で発現される。Spriggs et al., J. Exp. Med. 176: 1543-1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22:2573-2578 (1992); Roy et al., J. Immunol., 151:1-14 (1993)。ｇｐ３９遺伝子により形質移入された細胞であって、ｇｐ３９タンパク質をその表面上で発現する細胞は、Ｂ細胞の増殖および同時に他の刺激シグナルを誘発し、抗体の産生を誘導し得る。Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、ドナー同種異系Ｔ細胞のレシピエントへの注入で起きる多重臓器系の破壊プロセスである。急性の移植片対宿主病はＨＬＡ特異的同胞間ドナー移植片で２０−４０％のレシピエントに、非関連ドナー移植片で７０−８０％のレシピエントに生じるので、骨髄移植のこの合併症を防止する手段が必要である。現在のところ一般的に言えば２種の対応がなされている。第１は、メタトリシド、シクロスポリンＡ、ステロイドなどの免疫抑制剤のインビボ注入である。上記したように急性の移植片対宿主病がインビボ免疫抑制剤の注入において見られる。この防止効果が不完全なことに加えて、これらの免疫抑制剤は骨髄移植後に長期間の免疫不全を起こす。これによって、レシピエントは感染合併症の危険に曝され、骨髄移植後の再発の発生率が増加する。第２の対応は、ドナー細胞からＴ細胞の生体外除去である。これは、急性の移植片対宿主病を防止するのにかなり効果的であるが、移植片の失効、再発、感染合併症の発生率が高くなり、免疫再構築の時間を遅くする。
【０００７】
一方、本発明は、ドナーＴ細胞を生体外で処置する方法であって、宿主中への移植に際しこのＴ細胞を同種異系または異種の抗原に対する実質的な非応答性を与える。具体的には、本発明は、ドナーＴ細胞を、少なくとも１種のｇｐ３９（ＣＤ１５４）アンタゴニストおよび同種異系または異種の細胞または組織で処置する方法に関し、該ドナー細胞に、該同種異系または異種の細胞を含有する宿主中に移植した際に、ドナー抗原（同種抗原または異種抗原）に対する実質的な非応答性を与えることを目的とする。
【０００８】
本発明は、ドナー骨髄あるいは末梢血などを含有するドナーＴ細胞または組織または臓器をレシピエントに移植する際に、起こり得る移植片対宿主病を防止または抑制する効果的な手段を提供する。
【０００９】
好ましくは、ドナーＴ細胞を、十分な量の抗ｇｐ３９抗体および移植レシピエント由来の細胞とともに生体外でインキュベートして、ドナーＴ細胞に、移植時にレシピエント細胞に対する実質的な非応答性を与える。
【００１０】
このことは、一般的に、ドナーＴ細胞および切除したＴ細胞宿主同種異系抗原または異種抗原を保持する刺激物を用いて、混合リンパ球の生体外反応を起こすことでなされる。この培養基中にｇｐ３９アンタゴニスト、好ましくは、ｇｐ３９（ＣＤ１５４）に特異的に結合する抗体または抗体断片を加える。あるいは、ｇｐ３９アンタゴニストは、溶性ＣＤ４０、溶性ＣＤ４０融合タンパク質、例えば、ＣＤ４０Ｉｇを含み得る。
【００１１】
(図面の簡単な説明)
図１は、１次ＭＬＲ培養におけるドナＴ細胞の抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ処置の効果を示す。
図２Ａは、１次ＭＬＲ培養におけるＩＬ−２産生に対する抗ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９） ｍＡｂ添加の効果を示す。
図２Ｂは、１次ＭＬＲ培養におけるγ−インターフェロン産生に対する抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂの効果を示す。
図３Ａは、２次培養における抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂによる抗宿主同種異系抗原低反応性の誘導が、外因性ＩＬ−２によって逆転され得ることを示す。
図３Ｂは、１次ＭＬＲ培養における、抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂに暴露されたドナＴ細胞が２次培養における完全なＩＬ−２応答を有することを示す。
図４Ａは、１次ＭＬＲ培養への抗ＣＤ４０Ｌ Ａｍｂの添加が２次培養で測定されるＩＬ−１産生を阻害することを示す。
図４Ｂは、１次ＭＬＲ培養への抗ＣＤ４０Ｌ Ａｍｂの添加が２次培養で測定されるγ−インターフェロン産生を阻害することを示す。
図５Ａは、ＭＬＲ培養中におけるドナＴ細胞の抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ処置がインビボのＧＶＨＤ能を非常に低下することを示す。
図５Ｂは、抗ＣＤ４０Ｌ処置の移植後の平均体重に対する効果を示す。
【００１２】
次の用語は、下記の定義を有すると解される。
同種異系細胞なる用語は、レシピエントと同種の異なる個体から得た細胞を意味する。
同種抗原なる用語は、レシピエントと同種の異なる個体から得た細胞を意味する。
異種の細胞（異種の移植臓器）なる用語は、別種、通常、移植レシピエントに対して異種から得た細胞を意味する。（例えば、ヒヒＴ細胞をヒトレシピエントに移植する場合に、ヒヒＴ細胞が異種個体細胞を含む。）
異種抗原なる用語は、別種、通常、移植レシピエントに対して異種から得た細胞によって発現された抗原を意味する。
ｇｐ３９アンタゴニストなる用語は、ｇｐ３９（ＣＤ１５４）−ＣＤ４０の相互作用を妨げる分子を意味する。ｇｐ３９アンタゴニストは、ｇｐ３９に対する抗体（例えば、ヒトｇｐ３９に対する特異的なモノクロール抗体）、その断片または誘導体（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）'２断片、キメラ抗体、ヒト抗体またヒト適合抗体）であるのが好ましい。また、ｇｐ３９アンタゴニストは、ｇｐ３９リガンドの融合タンパク質の可溶性形態（例えば、可溶性ＣＤ４０Ｉｇ）またはｇｐ３９−ＣＤ４０相互作用に干渉する医薬を包含する。
【００１３】
ｇｐ３９またはＣＤ１５４、即ちＣＤ４０ＬＣＲまたはＣＤ４０ＣＲなる用語は、分子ＣＤ４０と相互作用するＴ細胞の表面で発現された分子を意味する。このＣＤ４０は、Ｂ細胞増殖を誘導することに関与する成熟Ｂ細胞のリンパ球と未熟Ｂ細胞のリンパ球表面で同定される。具体的にはＴ細胞上のｇｐ３９とＢ細胞上のＣＤ４０との相互作用が、抗原に対するＢ細胞の応答を活性化するのに中心的な役割をなす。また、ｇｐ３９が、抗原、例えば、同種および異種抗原に対するＴ細胞の応答に非常に重要な役割を担うことが発見されている。
本発明におけるＴ細胞無応答性またはＴ細胞耐容性なる用語は、ドナー細胞を、ｇｐ３９アンタゴニスト（抗ｇｐ３９抗体）と同種または異種の抗体を保持する細胞とに生体外で接触させた後に、ドナーＴ細胞のレシピエントへの移植の際、同種または異種の抗体保持細胞に対するドナーＴ細胞誘導の免疫の応答（移植片対宿主応答）が低下されることを意味する。
【００１４】
説明したように、本発明は、外来ドナーＴ細胞含有組成物、例えば、同種異系または異種の骨髄または末梢血細胞の移植に際して、移植片対宿主病を防止する従来と異なる手段を提供する。
【００１５】
非常に少量のドナー細胞が宿主同種異系抗原を認識する能力を所有すること（０.０％以下とみられる）が知られている。本発明はこの応答を消失せしめようとするものであって（該細胞を同種異系抗原または異種抗原に対して非応答性または耐容性にする）、同種または異種抗原反応能を有するＴ細胞の集団を機能的に変えることによる。
【００１６】
これが強力に達成され得るのは、本発明による仮説では、ドナーＴ細胞と照射・切除Ｔ細胞宿主同種異系抗原または異種抗原を保持する刺激物との混合リンパ球反応を開始すること、およびこの混合リンパ球反応培養物にｇｐ３９アンタゴニスト、特に抗ｇｐ３９抗体を加えることによる。この考えは、ｇｐ３９−ＣＤ４０のインビトロ相互反応（ドナーＴ細胞と、同種抗原または異種抗原を保持する細胞との間）に干渉し、移植レシピエント中に移植する際に、該細胞に同種異系抗原または異種抗原に対する耐容性または非応答性を与えようとするものである。理論的には、本発明者の発表を含む以前の発表を基にして可能である。これらの発表は、ｇｐ３９アンタゴニスト（抗ｇｐ３９抗体）のみで、または同種異系または異種の細胞と合わせて、異種または同種異系の組織または臓器の移植の前、同時あるいは後に、移植レシピエントを処置することにより、同種異系または異種の組織に対するＴ細胞の耐容性をインビボで誘発することに関する。このインビボ手段は、種々の組織や臓器、例えば、膀胱、皮膚、心臓組織などに対するＴ細胞の耐容性を起こすのに非常に効果的であるとされている。
【００１７】
しかし、この方法をインビトロでＴ細胞の耐容性または非応答性の誘発に拡張し得るかどうかは、予測できなかった。この結果が合理的に予測できなかったのは、文献に発表された以前の研究で、インビトロＴ細胞活性化の誘発にｇｐ３９の存在を必要条件としていないことによる。例えば、Flavellら(Nature, 378: 617-620 (1995))によると、ｇｐ３９発現を遺伝子的に欠くＴ細胞レポーター形質転換Ｔ細胞が抗原提示細胞および抗原に正常に応答した。このことは、Ｔ細胞活性化はｇｐ３９を必要としないで、ｇｐ３９なしでインビトロで正常に起こり得ることを示している。
【００１８】
具体的には、Grewal, J.S. et al, Nature, 378: 617-620 (1995), "Impairment of antigen-specific T-cell priming in mice lacking CD40 ligand"によると、Ｔ細胞の短期間インビトロ活性化はｇｐ３９の存在を必要としないで、ｇｐ３９なしでインビトロで同種Ｔ細胞の耐容性が生じ得る。
【００１９】
従って、該細胞を、ｇｐ３９アゴニストと、レシピエントＴ細胞を除去したレシピエントの同種異系または異種の細胞とともにインキュベートすることにより、Ｔ細胞耐容性すなわちドナーＴ細胞の非応答性がインビトロで効果的に誘発され得ることは、まったく予想外であった。この方法は、移植レシピエントの処置において非常に大きい可能性を与える。なぜなら、移植の組織または臓器に含有される移植Ｔ細胞に、レシピエント同種異系抗原または異種抗原に対する耐容性すなわち非応答性を与える、非常に効果的な非侵傷的手段をもたらすからである。従って、この移植の組織または臓器すなわち異種または同種異系の骨髄は、移植に際し有害な移植片対宿主応答を誘起しない。さらに、耐容性がインビトロで誘発されることはさらに優れた点であり、他の拒絶反応に対する対策、例えば、シクロスポリンなどの免疫抑制剤と合わせて、この処置をとり得る。また、移植の前、同時あるいは後に、抗ｇｐ３９抗体（または他のリガンド）投与を併用し得る。
【００２０】
事実、本方法は、他の抗拒絶反応剤の必要をなくする。抗拒絶反応剤は、免疫抑制作用からして、有害な副作用、例えば、感染や癌の危険性の増大をもたらすことがある。
【００２１】
好ましい実施態様において、ドナー、例えば同種異系または異種のドナーに由来のＴ細胞を、宿主Ｔ細胞の除去処置（例えば、照射）をしたレシピエントの同種異系または異種の組織とともにインビトロで培養する。この培養基に、有効量のｇｐ３９アンタゴニスト、典型的には抗ｇｐ抗体（例えば、米国特許Ｎｏ．ＧＥＴ３１３＃に開示された２４−３１または８９−７６抗ヒトｇｐ３６抗体）を加える。この培養基をＴ細胞耐容性の誘発に十分な時間保持する。典型的には、この時間は、約１−２日から３０日、さらに典型的には約５日から１５日、最も典型的には約１０日である。
【００２２】
培養後、ドナーＴ細胞を試験して、細胞が抗宿主同種または異種の応答を誘起したかどうかを調べることができる。また、該細胞が生存能を有し、処置後の正常なＴ細胞活性、例えば、ＩＬ−２応答を誘起したかどうかを測定できる。
【００２３】
下記の実施例に示すように、本発明により処置したＴ細胞は、抗宿主異種または同種抗原応答を顕著に鈍化し、生存能を保持し、さらに完全なＩＬ−２応答を保持することが分かった。また、再刺激に際し、ドナーＴ細胞は抗宿主同種抗原の超応答性を保持していた。
【００２４】
一次ＭＬＲにおいて、Ｔヘルパー型１（Ｔｈ１）サイトカインの産生の顕著な低下も観察された。同様に、二次再刺激培養において、Ｔｈ１サイトカイン産生の顕著な低下があった。
【００２５】
さらに、対照または抗ｇｐ３９（ＣＤ１５４）モノクロナール抗体処置ドナーＴ細胞の等量のインビボ投与では、移植片対宿主病の性質が非常に異なっていることが分かった。具体的には、対照における３倍高い数のドナーＴ細胞のレシピエントは、対照が０％であるのに比して５０％の計算上の生存率を示した。他の実験で、抗ｇｐ３９（ＣＤ１５４）モノクロナール抗体処置Ｔ細胞を用いると、移植片対宿主病の強度に３０倍もの相違があった。このことからして、驚くべきことに、ドナーＴ細胞が混合リンパ球反応により生体外で効果的に耐容性が与えられると結論した。これは、宿主細胞および異種抗原に対するドナーＴ細胞の耐容性付与に重要な新しい手段を提供する。
【００２６】
この方法は、骨髄または末梢血細胞の移植療法の領域に意味のある可能性を提供する。骨髄および幹細胞の移植は、免疫細胞不全を含む白血球などの種々の疾患の処置のために、よく用いられている。さらに、骨髄移植は、自己免疫疾患の処置などの他の疾患の処置にも、利点をもたらす。しかし、通常の骨髄移植療法に関連してよく起きる危険は、ＧＶＨＤ応答を誘起する危険である。本主題の方法は、この危険を減少または消失せしめ、もって骨髄移植療法の適用を拡大する。
【００２７】
基本的に、これらの方法は、上記のように骨髄または末梢血細胞を生体外で処置し、処置した骨髄または末梢血細胞を、かかる処置を必要とするレシピエント、例えば、患者自身のリンパ様細胞が疾患または疾患処置の結果として除去されているので（例えば、放射線処置のために）、癌患者や自己免疫疾患患者、免疫再構築を必要とするレシピエントに導入することを含む。
【００２８】
本方法は、拒絶に対する他の処置、例えば、メタトリシド、シクロスポリンＡ、ステロイド、ｇｐ３９アンタゴニストの投与などの免疫抑制剤のインビボ注入と併用することができる。
【００２９】
理想的には、本発明方法は、ＧＶＨ応答を誘起しないで処置ドナーＴ細胞のレシピエントにおける免疫再構築を提供する。しかし、ある場合には、移植レシピエントにおいて移植組織を「受け」ないとき、この療法を繰り返す必要がある。あるいは、移植レシピエントのリンパ様システムが疾患または疾患処置の結果として、例えば、放射線処置の結果として障害を受けていると、繰り返しが必要となる。このような場合、適当なドナーＴ細胞を再度、抗ｇｐ３９抗体およびＴ細胞除去同種または異種抗原保持レシピエント細胞に生体外で接触せしめ、Ｔ細胞耐容性を誘発し、ついで移植レシピエントに注入する。
【００３０】
本発明を下記の実施例でさらに説明するが、限定するものではない。すべての参照文献、特許、公表特許出願の内容は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００３１】
表１：ＭＬＲ培養における生体外での抗ＣＤ４０Ｌへの露出は、Ｔ細胞活性化抗原の発現を損なわず、初期アポトーシスを誘発しないで、元のＴ細胞のエフェクター細胞への変換を阻害する
【表１】
0004109828.tif 000002
一次ＭＬＲ培養の１０日終了後の細胞を２色ＦＡＣＳで分析した。表示の分子についての陽性％を表示する。活性化抗原はＣＤ２５２５、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２を含む。エフェクター細胞抗原はＬ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ−４５を含む。７−ＡＡＤは初期アポトーシスの指標である。平均蛍光チャネルを（  ）で表示する。
【００３２】
表２：ＭＬＲ培養における生体外での抗ＣＤ４０Ｌへの露出は、非照射同種異系のレシピエントにおけるドナーＴ細胞の拡張を低下するが、その活性化を低下しない
【表２】
0004109828.tif 000003
胸管リンパ球を、正常のドナー系対照（ｎ＝３）から、対照（ｎ＝４）または抗ｇｐ３９ｍＡｂ処置培養の同種異系ＳＣＩＤ（重い複合免疫不全）レシピエントから収集した（２マウスおよび３マウスからなる培養を低細胞数のために合わせ、次いで別個に分析した）。時間あたり１マウスにつき約１ｍｌを１夜カニューレ挿入法の間に収集した。リンパ球を２色ＦＡＣＳで分析した。表示のように、細胞はＣＤ４陽性であり、表示の抗原の共発現について分析した。活性化抗原はＣＤ２５２５、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２を含む。エフェクター細胞抗原はＬ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ−４５を含む。７−ＡＡＤは初期アポトーシスの指標である。平均蛍光チャネルを（  ）で表示する。
【００３３】
当業者は、通常の実験をさらに行うことなしに、本明細書に記載の発明の具体的な実施態様に均等の多くの事項を認識し、または確認し得る。かかる均等は、請求項に包含されるべきものである。
【００３４】
実施例１
ドナーのＣＤ＋リンパ節Ｔ細胞とＭＨＣクラスII非対称同種抗原を保持する刺激性細胞との混合リンパ球反応(ＭＬＲ)の結果を図１に示す。この実験において、Ｃ.Ｈ２ｂｍ１２由来の高度に精製したＣＤ４＋リンパ節Ｔ細胞を０.５ｘ１０６／ｍｌの最終濃度で２４ウエルプレートのミクロタイターウエルまたはバルク培養基中に入れた。刺激性細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞除去・照射脾臓細胞であって、１ｘ１０６／ｍｌの最終濃度で使用した。ＭＬＲ培地は１０％の子牛胎児血清、５％の付随物および２−ＭＥから成る。抗ｇｐ３９ｍＡｂを５０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。図１で示すように、ＩＬ−２を最終濃度５０単位／ｍｌで加えた。１μＣｉ／ウエルのトリチウム化チミジンを用い、採取前の１８時間、ミクロタイターウエルを振動させた。平均ΔＣＰＭ(実験のＣＰＭ−応答体のＣＰＭのみ)をＹ軸に、一次ＭＬＲ培養日数をＸ軸に示す。このデータは、抗ｇｐ３９ｍＡｂ処置の培養基が強度の低反応性を示すことを証明する。この培養基に外因性ＩＬ−２を加えるとその低反応性を逆にし得る。
【００３５】
実施例２
図１で示す実験から得た普通に培養した細胞の上澄み液を、インターロイキン−２(ＩＬ−２)濃度について分析した。この結果を図１Ａに示す。上澄み液の分析にはＥＬＩＳＡ(R&D Systems，Minneapolis, MN)を用いた。上澄み液濃度(ｐｇ／ｍｌ)をＹ軸に、ＭＬＲ培養日数をＸ軸に示す。抗ｇｐ３９ｍＡｂの追加は、一次ＭＬＲ培養基中のドナーＴ細胞由来のＩＬ−２産生を阻害した。
【００３６】
実施例３
図２Ａに示す実験に使用した同じ培養基中で、ＥＬＩＳＡを用いてインターフェロンガンマの上澄み液濃度を分析した。この結果を図２Ｂに示す。抗ｇｐ３９ｍＡｂの追加は、一次ＭＬＲ培養基中のインターフェロンガンマを強度に低下せしめることがわかる。
【００３７】
実施例４
１０日間の細胞培養の終わりにおいて、２色フローサイトメトリーで細胞の表現型を調べた。表１(実施例の後)から、高レベルのＣＤ２５、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２により立証されるように、抗ｐｇ３９ｍＡｂの追加はＴ細胞の活性を予防しなかったことがわかる。しかしながら、高レベルのＬ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１および低レベルのＣＤ４５が証明するように、抗ｐｇ３９ｍＡｂの追加は、天然Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞への変換を阻害した。処置培養基中の細胞がアポトーシスを受けなかったことは、７−ＡＡＤについての陽性が比較的低いことで立証される。
【００３８】
実施例５
一次ＭＬＲ培養の終わりに、細胞を洗い、９６のウエルプレートを３ｘ１０４濃度にして培養基を作り直した。それぞれのウエルに、Ｃ５７ＢＬ６マウスの照射脾臓細胞を１０５の濃度にして加えた。この結果を図３に示す。表示のようにＩＬ−２を最終濃度５０単位／ｍｌで加えた。培地は１０％の子牛胎児の血清、５％の付随物および２−ＭＥから成る。表示のように採取に先立つ１８時間、各ミクロタイターウエルをそれぞれ１μＣｉでラベルした。平均増殖値(ΔＣＰＭ)をＹ軸に、二次ＭＬＲ培養時間をＸ軸にとる。図３Ａの結果からわかるように、一次培養において抗ｇｐ３９ｍＡｂに露出され、二次培養においては露出されなかったドナーＴ細胞は、二次培養において同種抗原特異的応答性を保持した。この結果は、二次培養基のみに外因性ＩＬ−２を加えると、逆になる。
【００３９】
実施例６
別個の培養基において、対照処置培養基または抗ｇｐ３９ｍＡｂ処置一次ＭＬＲから得たドナーＴ細胞を、５０単位／ｍｌの最終濃度で外因性ＩＬ−２に露出した。この結果を図３Ｂに示す。二次条件下で検査して、対照処置から得たドナーＴ細胞が、抗ｇｐ３９ｍＡｂ処置の一次ＭＬＲ培養の場合と等しい反応を示すことがわかる。
【００４０】
実施例７
二次ＭＬＲバルク培養基から得た上澄み液を、ＩＬ−２(図４)あるいはインターフェロンガンマ(図４Ｂ)の産生に関して、二次ＭＬＲ培養で測定したようにＥＬＩＳＡを用いて試験した。その結果、抗ｇｐ３９ｍＡｂに一次ＭＬＲ培養基で露出し二次では露出しなかったドナーＴ細胞は、ＩＬ−２(図４Ａ)およびインターフェロンガンマ(図４Ｂ)の上澄み液の濃度が極めて低い状態を継続することがわかる。
【００４１】
実施例８
ＭＬＲ培養の終わりにおいて、致死量以下の照射(身体照射総量６００ｃＧｒａｙ)を受けたＣ５７ＢＬ／６レシピエントに対してドナーＴ細胞を投与した。二種類の細胞投与量(１０５または３ｘ１０５)で試験した。この結果を図５に示す。図５から、どちらの細胞投与量の対照培養細胞レシピエントも、移植後４週間になる前に、一様にＧＶＨＤ致死となったことがわかる。それに反して、抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂに生体外で露出した１０５ドナーＴ細胞のレシピエントは８８％の生存率を有した。抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂに露出した３ｘ１０５ドナーＴ細胞のレシピエントは、移植後２ヶ月以上の期間において５０％の生存率を有した。対照培養基から得たドナーＴ細胞のレシピエントと比較して、抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ処置に露出した同数のドナーＴ細胞のレシピエントは、その推計生存率が両方の投与量の場合とも有意に高かった(ｐ＜０.００１)。
【００４２】
実施例９
図５Ａに含まれる実験結果を、実験動物の平均体重曲線でＧＶＨＤのためにモニターした。この結果を図５Ｂに示す。それによると、対照細胞のレシピエントが平均体重カーブの顕著な減少を示し(Ｙ軸)、その減少が移植後２.５週間で始まり、移植後４週間の前にＣＶＨＤ致死となったことがわかる。これに反して、抗ｇｐ３９ｍＡｂ処置細胞のレシピエントは、移植前の平均体重を超える体重曲線を有した。同様に、対照培養基から得た１０５または３ｘ１０５細胞のレシピエントは、ＧＶＨ反応に一致して、著しい平均体重の減少を示した。これは、ＧＶＨＤ致死を抗ｇｐ３９ｍＡｂによる処置で阻害できることを証明する。
【００４３】
別の実験において、抗ｇｐ３９ｍＡｂ処置培養のレシピエントが、対照培養のレシピエントに比べて、ＧＶＨＤ致死率が３０倍まで減少した結果が観察された。
【００４４】
実施例１０
ドナー同種活性Ｔ細胞の生体内増殖を検査した。図１〜５および表１〜２で示した実験から得たドナーＴ細胞を、重い複合免疫不全症のマウスに注入した。このレシピエントは、ＭＨＣクラスＩ＋クラスII遺伝子座のドナーとは非対称である。移植後６日目に、１時間に１ｍｌ(１時間当たり、実験動物の総体水分のおよそ１/４〜１/３を意味する)の液体を連続的にマウスの静脈内に注入した。胸管リンパ本幹にカニューレを挿入して、胸管リンパ球を一夜かけて収集器で集めた。実験動物が死ぬまでに、１匹につき１時間に約１ｍｌずつ集めた。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の１日当たりの産生数を定量した。対照培養細胞のレシピエントが、胸管流出液１ｍｌにつき平均２ｘ１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞を産生したことがわかる。これに反して、抗ｇｐ３９ｍＡｂ処置培養のレシピエントは、１ｍｌにつきわずか０.３ｘ１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞を産生したにすぎず、これは、生体内同種活性Ｔ細胞の発生がおよそ７倍減少したことを意味する。これらのデータによると、抗ｇｐ３９ｍＡｂが生体内ドナーＴ細胞のＧＶＨＤ致死仲介能力を減退させることもさらにわかる。
【００４５】
要約すると、上記の実験は、抗ｇｐ３９ｍＡｂが、生体内におけるＧＶＨＤの能力を著しく減退させる明確な証拠を提供する。これは、生体内におけるＧＶＨＤ致死予防の手段として、宿主抗原あるいは同種抗原に対する耐容性をドナーＴ細胞に与えるための新しい方法を意味する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、１次ＭＬＲ培養におけるドナＴ細胞の抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ処置の効果を示す。
【図２Ａ】  図２Ａは、１次ＭＬＲ培養におけるＩＬ−２産生に対する抗ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９） ｍＡｂ添加の効果を示す。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、１次ＭＬＲ培養におけるγ−インターフェロン産生に対する抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂの効果を示す。
【図３Ａ】  図３Ａは、２次培養における抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂによる抗宿主同種異系抗原低反応性の誘導が、外因性ＩＬ−２によって逆転され得ることを示す。
【図３Ｂ】  図３Ｂは、１次ＭＬＲ培養における、抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂに暴露されたドナＴ細胞が２次培養における完全なＩＬ−２応答を有することを示す。
【図４Ａ】  図４Ａは、１次ＭＬＲ培養への抗ＣＤ４０Ｌ Ａｍｂの添加が２次培養で測定されるＩＬ−１産生を阻害することを示す。
【図４Ｂ】  図４Ｂは、１次ＭＬＲ培養への抗ＣＤ４０Ｌ Ａｍｂの添加が２次培養で測定されるγ−インターフェロン産生を阻害することを示す。
【図５】  図５Ａは、ＭＬＲ培養中におけるドナーＴ細胞の抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ処置がインビボのＧＶＨＤ能を非常に低下することを示す。
【図５Ｂ】  図５Ｂは、抗ＣＤ４０Ｌ処置の移植後の平均体重に対する効果を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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