(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸試料、呼吸沈渣および口腔液から選ばれる粘性生物学的試料からのマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌群およびマイコバクテリウム・アビウム菌群より選ばれる細菌の濃縮方法であって、
a)  前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有する、置換または無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、置換または無置換プロピルアルコール、およびケトン類から成る群より選ばれる水溶性密度降下剤を前記試料に添加し；そして
b)  前記試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌をペレット化する
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記試料が、N-アセチル-L-システイン-水酸化ナトリウム（NALC-NaOH）、水酸化ナトリウム-ドデシル硫酸ナトリウム（NaOH-SDS）および単独のNaOHより選ばれる核酸分析を妨害する試薬で前処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が呼吸沈渣である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記密度降下剤が置換または無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、および置換または無置換プロピルアルコールから成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記密度降下剤がエタノールである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試料１容につき２〜６容の密度降下剤が添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料１容につき２〜2.5 容の密度降下剤が添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌がマイコバクテリウム・ツベルクローシスであり、前記粘性生物学的試料が呼吸沈渣であり、そして前記密度降下剤がエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
呼吸試料、呼吸沈渣および口腔液から選ばれる生物学的試料からのマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌群およびマイコバクテリウム・アビウム菌群より選ばれる細菌および遊離細菌核酸の濃縮方法であって、
a)  前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有する、置換または無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、置換または無置換プロピルアルコール、およびケトン類から成る群より選ばれる水溶性密度降下剤、および前記遊離細菌核酸を沈澱させるのに十分な量で一価の塩を前記試料に添加し；そして
b)  前記試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌および任意の遊離細菌核酸をペレット化する
ことを含んで成る方法。
【請求項１０】
前記試料が、N-アセチル-L-システイン-水酸化ナトリウム（NALC-NaOH）、水酸化ナトリウム-ドデシル硫酸ナトリウム（NaOH-SDS）および単独のNaOHから選ばれる核酸分析を妨害する試薬で前処理される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が呼吸沈渣である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記密度降下剤が置換または無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、および置換または無置換プロピルアルコールから成る群より選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記密度降下剤がエタノールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料１容につき２〜６容の密度降下剤が添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
試料１容につき２〜2.5 容の密度降下剤が添加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一価の塩が、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸アンモニウムおよび塩化リチウムから成る群より選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌がマイコバクテリウム・ツベルクローシスであり、前記粘性生物学的試料が呼吸沈渣であり、前記密度降下剤がエタノールであり、そして前記一価の塩が酢酸ナトリウムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
呼吸試料、呼吸沈渣および口腔液から選ばれる粘性生物学的試料からのマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌群およびマイコバクテリウム・アビウム菌群より選ばれる細菌の濃縮方法であって、
a)  前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有する、置換または無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、置換または無置換プロピルアルコール、およびケトン類から成る群より選ばれる水溶性密度降下剤、およびｐＨ緩衝剤を前記試料に添加し；そして
b)  前記試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌をペレット化する
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】
前記ｐＨ緩衝剤が前記試料のｐＨを６〜９に緩衝化する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的試料からの細菌および遊離細菌核酸の濃縮および回収方法に関する。特に、本発明は、その後の核酸分析と適合できる方法でマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis；ヒト結核菌）を濃縮する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの結核の原因物質であるマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis；ヒト結核菌；Mtb ）は、従来、時間のかかる微生物培養により同定されている。マイコバクテリア培養に付される臨床試料は、より迅速に増殖する別の微生物によってしばしば汚染される。それらの試料、典型的には喀痰または他の呼吸試料は、粘性有機物質を液化しそして不要な生物を除去するために消化−汚染除去工程にかけなければならない。この消化−汚染除去工程に使われる最も一般的な試薬はＮ−アセチル−Ｌ−システイン−水酸化ナトリウム（NALC−NaOH）、水酸化ナトリウム−ドデシル硫酸ナトリウム（NaOH−SDS ）または単独のNaOHである。典型的な消化−汚染除去プロトコールは、呼吸試料を上記試薬のうちの１つと共にインキュベートし、緩衝液または水で希釈することによって該混合物のｐＨを下げ、そして該混合物を遠心してマイコバクテリアをペレットに濃縮することを含む。上清の一部をデカンテーションし、残った上澄液または緩衝液中にペレットを再懸濁する。こうして得られた懸濁液は「呼吸沈渣」と呼ばれる。
【０００３】
呼吸沈渣は培養に適する一方、核酸増幅、制限消化および核酸配列決定といった核酸分析には不適当である。核酸分析を行う前に、呼吸沈渣から消化−汚染除去試薬を除去することが必要である。何故なら、それらの試薬は核酸分析を妨害するからである。核酸検出の確度を高めるために、核酸分析の前に低マイコバクテリア力価を有する沈渣試料からマイコバクテリアを更に濃縮することも有用である。
【０００４】
本発明より前に、当業者らは試料を水性溶液中に希釈し、更に遠心してマイコバクテリアをペレットにし、そして消化−汚染除去試薬を含む上澄液を捨てることにより、消化−汚染除去試薬の混入および低い細菌濃度という課題を解決しようと試みている。例えば、Beavis他〔J. Clin. Microbiol., 33, 2582-2586 (1995) 〕は、Tris-HClと１％可溶化剤を含む検体洗浄試薬 500μL と呼吸沈渣 100μL とを混合する方法を用いている。12,500×ｇでの10分間の遠心により混合物からマイコバクテリアをペレット化している。（Roche Molecular Systems. 1994. Roche Amplicor Mycobacterium tuberculosis test insert, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ も参照のこと。）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、そのような方法には制限がある。洗浄緩衝液の添加が容量を５倍も増やすため、それらの方法は大量の試料容量からの細菌の濃縮には特に適さない。その上、マイコバクテリアは非常に浮遊性であり、水性培地からペレット化するのが難しいため、そのような方法は制限される。よって、Beavis他が使用したような水または水性緩衝液中での遠心は標的生物のかなりの損失を引き起こし得る。加えて、呼吸沈渣中の遊離のマイコバクテリア核酸は水性培地中での遠心操作の間にペレット化しない。新鮮試料の消化と汚染除去により、および貯蔵後の呼吸沈渣の凍結と解凍によって起こる溶菌の間に核酸が放出され得るので、呼吸沈渣には遊離核酸が存在する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、粘性生物学的試料から、Ｍ．ツベルクローシス（ヒト結核菌）をはじめとする細菌を濃縮する方法を提供することにより、これらの課題を解決する。本発明はまた、生物学的試料中に存在する細菌だけでなく遊離の細菌核酸も濃縮する方法を提供する。本発明の方法に従って処理された試料は、その後の核酸分析に使用することができる。
【０００７】
よって、本発明の目的は、試料から消化−汚染除去試薬を除去する細菌の濃縮および処理方法を提供することである。
本発明の別の目的は、生物学的試料中に存在する細菌と任意の遊離細菌ＤＮＡを同時に回収することである。
【０００８】
意外にも、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有する水混和性密度降下剤を使って生物学的試料から細菌を濃縮できることを発見した。そのような密度降下剤を一価の塩、例えば酢酸ナトリウムと併用して、標的細菌の密度より高い密度を有する生物学的試料から完全細菌および細菌ＤＮＡを回収することができることも発見した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
一態様では、本発明は、粘性生物学的試料からの細菌の濃縮方法に関する。この方法は、前記試料の密度を細菌の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有する水溶性密度降下剤を前記試料に添加し、そして前記試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌をペレット化することを含んで成る。
【００１０】
別の態様では、本発明は、生物学的試料からの細菌と細菌核酸の濃縮方法に関する。この方法は、前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有する水溶性密度降下剤、および前記遊離細菌核酸を沈澱させるのに十分な量で一価の塩を前記試料に添加することを含んで成る。次いで、前記試料を遠心して、試料中に存在する細菌および遊離細菌核酸をペレット化する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、粘性生物学的試料から細菌を濃縮し且つ同時に試料のｐＨを調整する方法に関する。この方法は、前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有する水溶性密度降下剤、およびｐＨ緩衝剤を前記試料に添加することを含んで成る。次いで、前記試料を遠心して、前記試料中に存在する細菌をペレット化する。
【００１２】
本発明の様々な他の目的および利点は、発明の具体的説明から明白であろう。
本明細書中に言及される全ての刊行物は参考として組み込まれる。
【００１３】
本発明は、核酸分析と適合できる、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis；ヒト結核菌）のような細菌の検出および同定のための試料の処理方法を提供する。本発明は様々な核酸分析方法、例えば核酸増幅（例えばＰＣＲおよびリガーゼ連鎖反応）、制限消化およびヌクレオチド配列決定と適合できる。その理由は、試料の消化−汚染除去に使われる阻害物質が効率的に除去されるからである。
【００１４】
一態様では、本発明は粘性生物学的試料からの細菌の濃縮方法に関する。生物学的試料を水混和性密度降下剤と混合し、次いで前記試料中に存在する細菌をペレット化することにより、生物学的試料中に含まれる細菌を濃縮する。密度降下剤は生じた混合物の密度を細菌の密度より下にまで下げ、それによって遠心分離による細菌の回収率を高める。
【００１５】
本発明での使用に適する密度降下剤は、水溶性であり、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度を有し、且つ50℃より高い沸点を有する。そのような剤としては、非限定的に、置換または無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、置換または無置換プロピルアルコール、およびケトンが挙げられる。例えば、エタノール、メタノール、メチルエチルケトン、２−ペンタノール、３−ペンタノン、プロパノール、イソブチルアルコール、２−プロパノール、tert−ブチルアルコール、または２−プロパノンを本発明の密度降下剤として使用することができる。好ましくは、密度降下剤は置換または無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、置換または無置換プロピルアルコールである。より好ましくは、本発明の方法における密度降下剤としてエタノールが使われる。
【００１６】
密度降下剤は、標的細菌の密度より低い密度にまで試料の密度を下げるのに十分な量で試料に添加される。そのような量は当業者により容易に決定することができる。好ましくは、試料１容につき２〜６容の密度降下剤が添加され；より好ましくは、試料１容につき２〜2.5 容の密度降下剤が添加される。
【００１７】
別の態様では、本発明は、粘性生物学的試料から細菌を濃縮し、且つ同時に試料のｐＨをその後の分析に適合するレベルに調整する方法に関する。酢酸塩、クエン酸塩またはトリス（Tris）のような緩衝剤を密度降下剤と併用して12〜14のｐＨを有する痰沈渣試料を洗浄することにより、ポリマー捕捉（pH 6.8）またはＰＣＲ（pH 8.5）に適合するレベルにまでｐＨを下げることができる。（ポリマー捕捉については、米国特許第5,582,988 号、同第5,434,270 号および同第5,523,368 号明細書を参照のこと。）試料を水溶性密度降下剤およびｐＨ緩衝剤と混合することにより、生物学的試料中に含まれる細菌を濃縮する。次いで該試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌をペレット化する。
【００１８】
更なる態様では、本発明は、生物学的試料からの細菌と遊離細菌核酸の濃縮方法に関する。細菌核酸は、例えば貯蔵や凍結−解凍処理の間に細菌から遊離され得る。試料中のこの遊離細菌ＤＮＡを、本発明を使って濃縮しそして回収することができる。試料を水溶性密度降下剤および一価の塩で処理することにより、生物学的試料中に含まれる細菌と遊離細菌核酸の両方が濃縮される。密度降下剤と一価の塩は、予備混合してからまたは個別にペレットに添加することができる。次いで混合物を遠心して、試料中に存在し得る細菌と細菌核酸をペレット化する。一価の塩は、ＤＮＡ上の負電荷を中和するのに必要とされるカチオンを提供するので、水溶液からの遊離ＤＮＡの沈澱を促進する。ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたはリチウムの酢酸塩または塩化物のような一価の塩と一緒に、エタノールまたはイソプロパノールのような密度降下剤を使用することにより、試料中に存在する細菌と遊離細菌ＤＮＡの濃縮および回収が達成される。
【００１９】
本発明での使用に適する一価の塩としては、金属の酢酸塩または塩化物および非金属の酢酸塩または塩化物が挙げられるが、それに限定されない。好ましくは、一価の塩は酢酸リチウム、ナトリウム、カリウムもしくはアンモニウムまたは塩化リチウム、ナトリウム、カリウムもしくはアンモニウムである。より好ましくは、一価の塩は酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸アンモニウムまたは塩化リチウムである。一価の塩は、試料中に存在し得る遊離の細菌核酸を沈澱させるのに十分な量で添加される。そのような量は当業者が容易に決定できるものである。
【００２０】
本発明の方法を使って濃縮することができる細菌としては、非限定的に、マイコバクテリア〔例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）およびマイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium  avium）〕、プレボテラ（Prevotella）種、ポルフィロモナス（Porphyromonas ）種、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia  trachomatis）種、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria  gonorrhoeae）種、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトコッカス（Streptococcus ）種、エンテロコッカス（Enterococcus）種、クロストリジウム（Clostridium ）種、およびバクテロイデス（Bacteroides ）種が挙げられる。他の検出可能な種は当業者に容易に明白であろう。
【００２１】
本発明の方法を使って、非限定的例として呼吸試料（例えば喀痰試料）、呼吸沈渣、口腔液、膣液、精液、創傷感染液および膿瘍液をはじめとする様々な生物学的試料から、細菌を濃縮しそして回収することができる。好ましくは、生物学的試料が呼吸試料である。より好ましくは、本発明の方法に使われる呼吸沈渣を得るために呼吸試料が前処理される。
【００２２】
一例として、本発明の方法に従って呼吸沈渣からマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ヒト結核菌）を濃縮することができる。呼吸沈渣を調製するために、喀痰などの呼吸試料を常用の液化および汚染除去方法により処理する。既知の消化−汚染除去方法のいずれもこの段階に適し、その例としては、NALC−NaOH処理の種々の変形〔Kent & Kubica, Public Health Mycobacteriology A Guide for the Level III Laboratory, U.S. Department of Health and Human Services, 31-47 (1985)；Noordhock 他, J. Clin. Microbiol., 32, 277-284 (1994) 〕が挙げられる。それらの方法は一般に、試料を液化し、そして消化−汚染除去試薬を使って競合細菌を殺菌し、次いで液化試料を遠心して細菌をペレット化することを含んで成る。次いで再懸濁したペレット、即ち呼吸沈渣を、本発明に従って処理してその中に存在するマイコバクテリアを濃縮することができる。例えば、調製した呼吸沈渣から密度降下剤エタノールを使ってＭ．ツベルクローシスを濃縮することができる。
【００２３】
呼吸沈渣中に存在するＭ．ツベルクローシスおよび任意のマイコバクテリア核酸を濃縮し回収するためには、本発明の方法に従って試料をエタノールのような密度降下剤と、酢酸ナトリウムのような一価の塩とで処理して、低い細菌力価を濃縮し、そして遊離マイコバクテリア核酸を回収することができる。
【００２４】
密度降下剤を酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムと併用して、呼吸沈渣試料からマイコバクテリア調製物を濃縮し、洗浄し、そしてｐＨを所望の値に変更することができ、それらをその後の核酸検出または分析、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析に適するものにすることができる。核酸検出および／または分析用に、ペレット中に存在する回収されたマイコバクテリアを、当業者に周知である標準溶菌法を使って溶菌させる。適当な溶菌法としては、加熱、音波処理、ビーズ叩解、凍結−解凍、およびプロテアーゼ消化が挙げれるが、それらに限定されない。例えば、Noordhock 他, J. Clin. Microbiol., 32, 277-284 (1994) ; Nolte 他, J. Clin. Microbiol., 31, 1777-1782 (1993) ; Forbes他, J. Clin. Microbiol., 31, 1688-1694 (1993) ; Hurley他, J. Clin. Microbiol., 25, 2227-2229 (1987) ; およびFolgueira 他, J. Clin. Microbiol., 31, 1019-1021 (1993) を参照のこと。
【００２５】
溶菌させたマイコバクテリアより放出された核酸および回収された遊離のマイコバクテリウム核酸は、消化−汚染除去試薬が除去されているので、核酸分析に使用することができる。回収された核酸は、例えば、核酸ハイブリダイゼーション法や核酸増幅法、例えばＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、核酸配列特異的増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖転位増幅（ＳＤＡ）およびＱ−βレプリカーゼ法に用いることができる。そのようなプロトコールは当該技術分野で周知であり、当業者に容易に利用可能である。例えば、ＰＣＲを使った核酸の増幅および検出のための一般原理および条件は、非常に良く知られており、その詳細は米国特許第4,683,195 号、同第4,683,202 号および4,965,188 号明細書並びにGuatelli他, Clin. Microbiol. Rev., 2 (2), 217-226 頁(1989)を初めとする多数の参考文献中に与えられている。指摘の米国特許明細書は本明細書中に参考として組み込まれる。本明細書中に与えられる技術の教示と特別な教示のゆえに、当業者は本発明の細菌の濃縮および回収方法を細胞溶解やポリメラーゼ連鎖反応方法と組み合わせることによって本発明を実施することに何ら困難はないだろう。
【００２６】
下記の実施例は本発明の幾つかの態様を例証するために与えられるのであって、本発明を限定するものであると解釈してはならない。
【００２７】
【実施例】
材料および方法：
Ｍ．ツベルクローシス（MTb ）を含まないまたは含む凍結痰沈渣試料は、数カ所の臨床微生物学研究室から入手した。
次の試薬を調製し、実験に使用した。（全ての試薬の調製には脱イオン水を使った。）
【００２８】
１．酢酸ナトリウム溶液（NaAc）：
無水酢酸ナトリウム（12.3 g）を約40 ml のH2O に溶かした。氷酢酸を使ってこの溶液のpHを5.2 に調整し、水で容量を50 ml にした。
【００２９】
２．エタノール／酢酸ナトリウム試薬（EtOH／NaAc）：
上記酢酸ナトリウム溶液１容量部を20〜25容量部のエタノールと混合した。200 プルーフ（厳密）のエタノールと変性エタノール（５％イソプロパノールと５％メタノールを含む）の両方とも同様な成果で用いられた。
【００３０】
方法１…痰沈渣試料へのNaAcおよびEtOHの別々の添加
１容量部の上記NaAc溶液を1.5 mlの超遠心管にピペットで添加した。そこに10容量部の痰沈渣を加え、溶液を手短に渦動攪拌して混合した。20〜25容量部のエタノールを加え、再び溶液を手短に渦動攪拌して混合した。試料の入った超遠心管を超遠心機の中に置き、16,000×ｇで15分間遠心して細菌をペレットにし且つ核酸を沈澱させ、そして上澄液を捨てた。
【００３１】
更なる処理のため、細菌／ＤＮＡペレットを溶菌試薬（10 mM Tris, pH 8.0, １％Tween 20, １％Triton X-100, 0.1 ％ドデシル硫酸ナトリウム）中に再懸濁し、100 ℃で30分間加熱して細菌を溶解させ、ＤＮＡを遊離させた。米国特許5,582,988 号明細書に記載されたようなポリマー捕捉技術により、それらの溶解物からＤＮＡを回収した。簡単に言えば、可溶性の弱塩基性カチオンポリマーを使用する。ＤＮＡはそれの負に帯電したリン酸基によってポリマーに静電結合し、不溶性複合体を形成する。この複合体を遠心によりペレット化し、上澄液を捨て、アルカリ溶液中で加熱することにより精製ＤＮＡを遊離させる。
【００３２】
回収されたマイコバクテリアＤＮＡを、米国特許第5,089,233 号、同第5,229,297 号および同第5,380,489 号明細書中に記載されたようなJohnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.のＰＣＲ核酸増幅および検出用パッチ封じ込めシステムを使って増幅および検出した。簡単に言えば、試料とＰＣＲ試薬を混合し、プラスチックパッチのふくれ部分の中に充填し、次いでパッチをシールする。MTb に独特のＤＮＡ配列を表すビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるMtb 特異的ＤＮＡの増幅反応を開始させる。試料、ＤＮＡポリメラーゼ、dNTP、緩衝剤および塩を含有する反応混合物をまず加熱してＤＮＡを変性させ、次いで変性させるための高温（95℃）と、プライマーをアニーリングさせそしてＤＮＡ配列を伸長させるかまたはコピーを合成するための低温（65〜75℃）とを前後に循環させる。反応生成物を検出チャンバーの中に通し（そこでそれらがビーズに取り付けられた相補的オリゴ体とハイブリダイズする）た後、増幅させた標的を検出する。ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびそれに引き続いてＨＲＰ−色素基質を検出チャンバーの中に通した後、ハイブリダイズした生成物を検出する。
【００３３】
方法２…痰沈渣試料とNaAc／EtOH組合せ試薬の混合
20〜25容量部の組合せEtOH／NaAc試薬をピペットで超遠心管に入れた。10容量部の痰沈渣試料を加え、手短に渦動攪拌して溶液を混合した。試料の入った超遠心管を超遠心機に入れ、16,000×g で15分間遠心して細菌と沈澱した核酸をペレット化し、上澄液を捨てた。
【００３４】
更に処理するために、細菌／ＤＮＡペレットを溶菌試薬（10 mM Tris, pH 8.0, １％ Tween 20,  １％ Triton X-100, 0.1％ドデシル硫酸ナトリウム）中に再懸濁し、100 ℃で30分間加熱して溶菌させてＤＮＡを遊離させた。米国特許第5,82,988号明細書に記載されたようなポリマー捕捉技術により、それらの溶解物からＤＮＡを回収した。
【００３５】
米国特許第5,089,233 号、同第5,229,297 号および同第5,380,489 号明細書に記載されたようなJohnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.のＰＣＲ核酸増幅および検出用パッチ封じ込めシステムを使って、回収したマイコバクテリアＤＮＡを増幅し検出した。
【００３６】
実施例１：遊離ＤＮＡの沈澱と回収に対するpH、塩、アルコールおよび温度の効果
痰沈渣および他の呼吸沈渣試料に見られるpH域において溶液からの遊離ＤＮＡの回収の最適条件を同定するために、水を水酸化ナトリウムでpH 7, 10または14に調整して呼吸沈渣のpH域を模擬し、その水溶液を使って、Sigma Chemical Co.から入手した子ウシ胸腺ＤＮＡ（Ct−ＤＮＡ）を50 ng ＤＮＡ／μL の最終濃度に希釈した。塩化ナトリウム（NaCl）か酢酸ナトリウム（NaAc）のどちらか一方を各pH調整済ＤＮＡ試料に加えて0.2 M NaClまたは0.3 M NaAcの最終濃度にした。1/2 mlアリコートを超遠心管に移し、1 mlのエタノール（EtOH）か0.5 mlのイソプロパノール (IPP)のいずれかと混合し、そしてすぐに周囲の室温（RT）で遠心するかまたは−20℃で１時間インキュベートしてから遠心した。遠心は16,000×ｇで15分間であった。ペレット材料を0.5 mlの水に再懸濁し、分光光度計を使ってＤＮＡのλmax （最大吸収波長）である260 nmでそれの吸光を測定し、未沈澱材料の吸収と比較した。異なる実験条件下でのＤＮＡの回収率を下記の表１に与える。
【００３７】
【表１】
0004083860.tif 000002
【００３８】
その結果は、即座に遠心するかまたは−20℃でインキュベートした後で遠心するかいずれにせよ、EtOHかIPP と組み合わせたNaAcが、pH 7または10において試料からＤＮＡを定量的に回収する場合に効果的であることを示す。pH 14 でさえも、NaAcとEtOHの組合せを使ったＤＮＡの回収率はほぼ定量的であったが、IPP とNaAcの組合せはこのpHであまり効果的でなかった。NaClとアルコールの組合せは、試験したいずれの条件においても、Ct−ＤＮＡの効率的回収を与えなかった。従って、NaAcとEtOHの組合せと、試料を周囲温度で混合した後すぐの遠心が、痰沈渣や他の呼吸沈渣試料を使う場合に好ましい。
【００３９】
実施例２：痰沈渣からのＭ．ツベルクロシス (Mtb)の回収
この実験において、試料をまずEtOHのみでまたはNaAcとEtOHの組合せで希釈すると、痰沈渣試料からのMtb の回収がより効率的であることが証明された。混合した呼吸沈渣のプールのアリコートに培養したMtb を添加して、ＰＣＲアッセイごとにコロニー形成単位（ＣＦＵ）で表示される数種類の異なる力価を得、上記の方法１に従ってNaAc／EtOH処理を実施した。200 μL アリコートを表２に示す通りに処理した。EtOHのみの場合、NaAcを洗浄から抜かした。遠心のみの場合、洗浄を完全に省略し、即ち、上から２つの処理に関する限りはEtOHまたはNaAcを使わないで呼吸沈渣のみを遠心した。ペレット化した試料を更に後処理し、上記で概説したようにＰＣＲによりMtb についてアッセイした。遠心しない呼吸沈渣に溶解試薬を直接添加した「遠心なし対照」は、最大回収を示すために実験に含めた。エタノール洗浄せずに使用した多数の呼吸沈渣試料はポリマー捕捉またはＰＣＲを妨害したけれども、この特定の試料を「遠心なし対照」に選んだ。その理由はそれがポリマー捕捉またはＰＣＲを妨害しなかったからである。表２に与えた値は、Mtb に関してＰＣＲ陽性であった複製物のパーセントである；ｎ＝４（* ｎ＝３；**ｎ＝１）。
【００４０】
表２に示した結果は、EtOHを使わず痰沈渣の直接遠心を使った時（遠心のみ）よりもEtOHまたはNaAc／EtOHを含む培地中の呼吸沈渣から、より一層効率的に培養菌ペレットが回収されたことを示す。使用した呼吸沈渣プールは、ＣＦＵ＝０の組における時折のＰＣＲ陽性結果の説明となる、培養により検出されないごく少数のMtb 生物で汚染されていた。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
実施例３：患者試料からのMtb の回収
この実験は、Mtb の供給源が培養物ではなくて実際の患者試料であったこと以外は実施例２と同じであった。培養によるMtb 試験が陽性であった呼吸沈渣試料のプールを、培養によるMtb 試験が陰性であった呼吸沈渣試料のプールで希釈した。200 μL アリコートを実施例２と同様に試験した。表に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性である複製物の割合（％）である；ｎ＝４。実施例２と同様に、培養陰性プールは、ＰＣＲにより検出される程度のMtb を含んでいた。従って、NaAcを使う洗浄と使わない洗浄の間に何も差が観察されなかった。それにもかかわらず、エタノールも酢酸ナトリウムを使わないでペレット化した試料（遠心のみ）では標的(Mtb) の損失が検出された。
【００４３】
【表３】
0004083860.tif 000004
【００４４】
実施例４：純エタノールと変性エタノールの比較
費用と規定上の問題から、純エタノールの変わりに変性エタノールを使用することが有利かもしれない。従って、純エタノール（200 プルーフ）と変性エタノール（90％エタノール、５％メタノール、５％イソプロパノール）を使って呼吸沈渣プールからの培養マイコバクテリアの回収の効力を比較した。試験試料を調製し、実施例２と同様にNaAcとEtOHで処理した。ただし、１組の試料では純エタノールの変わりに変性エタノールを使用した。下表に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性である複製物の割合（％）である；ｎ＝６。実施例２および３と同様に、培養陰性プールはわずかにMtb で汚染されるけれども、結果は純エタノールと変性エタノールの場合で同じである。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
実施例５：EtOHのみとEtOH／NaAcとの比較
この実験は、EtOHと組み合わせたNaAcが、痰沈渣試料のサブセットからのマイコバクテリアの一層効率的な回収および検出に備えることを証明する。実施例２と同様に試験試料を調製しそしてNaAc／EtOHまたはEtOHのみで処理した。ただし、呼吸沈渣の別のＰＣＲ陰性プールを使用し、呼吸沈渣の容量を300 μL に増やし、そして700 μL の組合せEtOH／NaAc試薬（上記方法２に記載）を使用した。下表５に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性であった複製物（ｎ＝４）の割合（％）である。示す通り、エタノールと酢酸ナトリウムの組合せはエタノールのみよりもずっと効率的であった。その後の実験は、エタノール処理にNaAcを含めた時にポリマー捕捉によりＤＮＡが効率的に回収されたことを証明した。効率的ポリマー捕捉は6.8 に非常に近いpHを必要とした。エタノール洗浄からNaAcを除外した場合には、幾つかの呼吸試料のpHはポリマー捕捉の間7.4 であり、ＤＮＡが効率的に捕捉されなかった。しかしながら、EtOHと共にNaAcを含めた場合には、それらの同じ試料の第二のアリコートのpHは6.8 〜7.1 であり、ＤＮＡが効率的に捕捉された。NaAcの添加がpHを調整し、それによって、臨床試料のこのサブセットからのMtb ＤＮＡの回収を改善したことは明白である。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
実施例６：凍結−解凍後の痰沈渣試料における遊離Mtb ＤＮＡの検出
この実験は、前に凍結された痰沈渣中の遊離Mtb ＤＮＡの存在を証明する。実施例３と同様に調製した培養陽性痰沈渣試料の３つの200 μL アリコートを、EtOH／NaAcを添加せずに遠心した。得られた上澄液を0.2 μm フィルターに通して残留細菌を除去した。遊離のMtb ＤＮＡを含むであろう濾過した上澄液と、Mtb それ自体を含むであろうペレットの両方を、上述したのと同様に更に処理し、ＰＣＲによりMtb ＤＮＡについてアッセイした。表６は、Mtb ＤＮＡについてＰＣＲ陽性であった複製物（ｎ＝４）の割合（％）を示す。このデータは、この痰沈渣試料に、完全なMtb 生物から回収された量の10倍ほどの、かなりの遊離Mtb ＤＮＡが存在することを指摘する。この実施例と実施例１に示されるように、本発明の方法を使って遊離ＤＮＡを回収することができる。
【００４９】
【表６】
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