(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱処理された数平均分子量が３４０から４０００の範囲にあるカードラン加水分解物を有効成分とする免疫抑制剤。
【請求項２】
加水分解物が酸加水分解物である請求項１記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
加水分解物が蟻酸による加水分解物である請求項２記載の免疫抑制剤。
【請求項４】
加水分解物がβ−１，３−グルカナーゼによる加水分解物である請求項１記載の免疫抑制剤。
【請求項５】
加熱処理が水溶液中で８０℃以上の温度である請求項１〜４いずれか１項記載の免疫抑制剤。
【請求項６】
免疫抑制作用がリンパ球抑制作用である請求項１〜５いずれか１項記載の免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、重篤な副作用のない免疫抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御に重要な役割を果たしており、その主要な機構は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原特異的に活性化し、これの異物を排除する能力を高めることである。しかし、自己免疫疾患や、臓器移植の拒否反応などの治療、抑制においては、免疫応答を抑制することが必要であり、そのために免疫抑制剤が使用される。
現在、免疫抑制剤としては、抗原非特異性のステロイド剤や核酸合成系に作用する薬剤が多く使用されているが、これらは、重篤な副作用を生ずることがある。また、シクロスポリン等、臓器移植の拒否反応の抑制に使用される免疫抑制剤にも、様々な副作用を伴うものがある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、重篤な副作用なしに優れた免疫抑制作用を示す免疫抑制剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖類および免疫に関する研究を進める上で、加熱処理した直鎖のβ−１,３グルカンが、リンパ球抑制作用を示すことを見いだした。
かかる加熱処理β−１,３グルカンは、免疫担当細胞が抗原特異的および抗原非特異的な刺激を受けたときのＢおよびＴリンパ球の活性化を抑制する作用を有する。すなわち、該加熱処理β−１,３グルカンを脾臓細胞の培養系に添加すると、マイトジェン刺激を加えずに培養したときの生細胞数および細胞代謝活性はそれほど損なわず、Ｂリンパ球マイトジェン刺激下で培養したときのリンパ球の生細胞数、特に、Ｂリンパ球の生細胞数の増加および細胞代謝活性の上昇を強度に抑制し、Ｔリンパ球マイトジェン刺激下で培養したときの細胞代謝活性の上昇を強度に抑制した。
この抑制作用は、リンパ球が活性化されるときにより選択的に働くことから、従来の免疫抑制剤が示した非特異性な作用とは異なることを示しており、また、Ｂリンパ球の活性化を強度に抑制することから、近年提案された免疫抑制剤のＴリンパ球に対する選択的な作用とも異なることを示している。
そのため、公知のステロイド剤に認められる様々な副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる造血器などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、ＦＫ５０６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はないと考えられる。
また、該加熱処理β−１,３グルカンはＢリンパ球の活性化を強度に抑制するため、Ｂリンパ球の異常によって引き起こされる悪性リンパ腫、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療にきわめて有用である。さらにＴリンパ球の活性化も抑制するため、臓器移植の拒絶反応の予防にも有用であると考えられる。
【０００５】
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、加熱処理されたβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫抑制剤を提供するものである。
用いるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類としては、カードラン加水分解物が挙げられる。特に、酸加水分解物、とりわけ蟻酸加水分解物や、β−１,３−グルカナーゼのような酵素による加水分解物で、数平均分子量が３４０から４０００の範囲にあるものが好ましい。加熱処理としては、水溶液中で８０℃以上での加熱が好ましい。
本発明の免疫賦活剤は、副作用がなく、常用に適しており、免疫抑制用の医薬として好適である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、加熱処理に供されるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類としては、グルコース分子が分岐せずに、β−１,３−グルコシド結合により結合したオリゴ糖ないしは多糖であり、代表的な例としては、アルカリゲネス（Alkaligenes）属又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌が産生する、β−１,３−グルコシド結合を有する多糖類であるカードランの加水分解物が挙げられる。
以下、カードランの加水分解物を例として本発明を説明する。
カードランの加水分解物は、自体公知の多糖類の加水分解法により調製できるが、得られる加水分解物の免疫抑制活性から、蟻酸、酢酸のような有機酸、塩酸、硫酸のような無機酸、特に、蟻酸あるいはβ−１,３−グルカナーゼのような酵素で行うことが好ましく、数平均分子量が、３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
【０００７】
本明細書における数平均分子量は、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定したものである。
測定装置としては、東ソー（株）製の高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。
検出器：ＲＩ−８０２２
ポンプ：ＣＣＰＭ−ＩＩ
カラムオーブン：ＣＯ−８０２０
脱気装置：ＳＤ−８０２２
オートサンプラー：ＡＳ−８０２０
測定カラムは、ＴＳＫゲルのカラム（Ｇ−ＯＬＩＧＯ−ＰＷまたはＧ−３０００ＰＷＸＬ、７.８φmm×３０cm）を用い、流速０.６〜０.７ml／分、温度４０℃で測定した。試料の０.０２％水溶液を調製し、その２００μlを用いた。溶出は純水で行った。
一方、分子量既知のプルラン標準品を同様に測定して較正曲線を作成し、この較正曲線を基に、東ソー（株）のＧＰＣ−ＬＡＬＬＳプログラムとマイクロソフト（株）の計算プログラム「エクセル」によって分子量分布関数を求め、数平均分子量として換算した。
【０００８】
酸加水分解は、例えば、１〜８５重量％程度の酸を含有するカードランの０.５〜５.０重量％水溶液を、７０〜１００℃にて１０分〜３時間加熱することにより行うことができる。加水分解反応液を水酸化ナトリウム等のアルカリ剤で中和し、遠心分離して上澄を得、必要に応じて、活性炭処理、透析、溶媒分画、加熱によるホルミル基の除去等の自体公知の方法で精製することにより、所望の加水分解物が得られる。
酵素による加水分解は、例えば、用いる酵素に適したpＨ、温度で所定時間、カードランの０.５〜３重量％水溶液を酵素処理することにより行うことができる。ついで、酵素を失活させた後、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活性炭処理、透析、溶媒分画等の自体公知の方法で精製することにより、所望の加水分解物が得られる。
【０００９】
得られた加水分解物は、水溶液の状態で加熱処理に付される。加熱処理は、一般に、８０℃以上、好ましくは、９０〜１２０℃にて、通常、１０〜３０分間加熱することにより行う。加熱手段は、特に限定するものではなく、加熱後、直ちに室温まで冷却する。
【００１０】
加熱処理されたカードラン加水分解物は、そのまま本発明の免疫抑制剤として使用できる。また、自体公知の医薬担体または賦形剤と自体公知の方法で合して、免疫抑制用の医薬とすることができる。
用いる、医薬担体または賦形剤は特に限定するものではなく、当該免疫抑制剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できる。また、免疫抑制剤の形態も特に限定する物ではなく、具体的用途に応じて、種々の固体や液体の形態とすることができる。
本発明の免疫抑制剤は、経口投与、非経口投与いずれでもよく、その投与量は、カードラン加水分解物の固形分量として１日当たり４mg〜４０gである。
本発明の免疫抑制剤は、ステロイド剤に認められる様々な副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる造血器などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、ＦＫ５０６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はなく、また、本発明はＢリンパ球の活性化を強度に抑制するため、Ｂリンパ球の異常によって引き起こされる悪性リンパ腫、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療にきわめて有用である。さらにＴリンパ球の活性化も抑制するため、臓器移植の拒絶反応の予防にも有用である。
【００１１】
【実施例】
つぎに、実施例および試験例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
実施例１
酵素によるカードラン加水分解物の調製
カードラン４gを０.０５Ｍ酢酸緩衝液２００mlに分散し、ヒイロタケ酵素１８ユニット／mlを添加した。これを４０℃に昇温し、４時間インキュベートした後沸騰水浴中に１５分間保持して酵素を失活させた。ついで、冷却、遠心分離して沈澱部分を除去し、上澄を直径５cmの高さ３０cmのカラムに詰めた活性炭に吸着させ、１０００mlの水で洗浄後、さらに４％エタノール２０００mlで洗浄した。ついで、２０％エタノール２０００mlで吸着成分を溶出し、これをエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥した。
このものはＨＰＬＣで測定したときの数平均分子量が３４０（プルラン換算値）であった。
このものを、水溶液中で、１００℃にて、１０分間加熱し、ついで冷却して免疫抑制剤を得た。
【００１２】
実施例２
蟻酸によるカードラン加水分解物の調製
カードラン３０グラムを８５％蟻酸３０００ml中に分散し、９０℃まで加温して２０分間保持した。ついで、容器ごと冷水にさらして室温まで冷却し、エバポレーターで濃縮した後、５Ｎ ＮaＯＨで中和してpＨ７とし、遠心分離した。上澄はホルミル基を除去するため沸騰水浴中で１２０分間加熱したが、このとき、pＨが低下したので、２Ｎ ＮaＯＨを添加して７に戻した。このものをビスキングチューブ中にいれ純水１０リットルに対して一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。
このものをＨＰＬＣで測定したときの数平均分子量はプルラン換算で約２８００であった。
このものを、水溶液中で１００℃にて１０分間加熱し、ついで冷却して免疫抑制剤を得た。
【００１３】
試験例１
実施例１で得た酵素分解カードランおよび実施例２で得た蟻酸分解カードランを用いて、マウス脾臓リンパ球増殖反応に対する酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品の作用を調べることにより、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品のリンパ球代謝活性上昇およびリンパ球増殖の抑制効果を検証した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１４週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を５×１０6／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００マイクロリットルを播種した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライドを２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナバリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、Ｔリンパ球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリン酸緩衝生理食塩水を１００℃、１０分間加熱して冷却した液（対照）あるいは酵素分解カードランを８mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間加熱して冷却した液、蟻酸分解カードランを８mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間加熱して冷却した液をそれぞれ１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養し、培養後の生細胞数と細胞代謝活性を調べた。
【００１４】
生細胞数の測定は、培養細胞液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後に、培養細胞液２００マイクロリットルにＲ−フィコエリトリンで標識したマウスＢリンパ球に対する特異抗体の抗マウスＣＤ４５Ｒ抗体を１マイクログラム、フルオロセインイソチオシアネートで標識したマウスＴリンパ球に対する特異抗体の抗マウスＴ細胞レセプター（アルファ／ベータ）抗体を１マイクログラム、および死細胞を特異的に染色する７−アミノアクチノマイシンＤを１マイクログラム加え、５℃で３０分間放置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、フローサイトメーターで総細胞に占めるＢリンパ球およびＴリンパ球の割合ならびにＢリンパ球およびＴリンパ球に占める死細胞の割合を測定し、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の生細胞数を算出した。
細胞代謝活性は、培養の終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃で１日放置後、マイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定することにより細胞代謝活性を求めた。
表１にその結果を示す。
【００１５】
【表１】
0004091137.tif 000002
【００１６】
表１に示すごとく、無刺激群においては、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいずれもＢリンパ球の生細胞数を軽度にしか減少させず細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなかったが、Ｂリンパ球刺激群においては、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいずれもＢリンパ球の生細胞数を大幅に減少させ細胞代謝活性の上昇を完全に抑制した。Ｔリンパ球刺激群においては、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいずれも細胞代謝活性の上昇を強度に抑制した。この様に、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品のいずれにも、リンパ球が活性化されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用が認められた。
【００１７】
試験例２
ラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオースおよびラミナリヘキサオース（焼津水産化学）の各試薬を用いて、マウス脾臓リンパ球増殖反応に対する加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースの作用を調べることにより、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースのリンパ球代謝活性上昇抑制効果を検証した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１８週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を５×１０6／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００マイクロリットルを播種した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライドを２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナバリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、Ｔリンパ球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリン酸緩衝生理食塩水を１２１℃、２０分間加熱して冷却した液（対照）あるいはラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオースを８mg／mlの濃度あるいは１mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１２１℃、２０分間加熱して冷却した液、をそれぞれ１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１日間培養し、培養後の細胞代謝活性を調べた。
【００１８】
細胞代謝活性は、培養の終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭ１１６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃で２日放置後、マイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定することにより細胞代謝活性を求めた。
表２にその結果を示す。
【００１９】
【表２】
0004091137.tif 000003
【００２０】
表２に示すごとく、無刺激群においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなかったが、Ｂリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlおよび０．４mg／mlの濃度において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制した。Ｔリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlの濃度において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制したが、０．４mg／mlの濃度においては、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオースのみが細胞代謝活性の上昇を部分抑制した。この様に、加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも、リンパ球が活性化されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用を示し、特に、Ｂリンパ球に対する作用が強く、また、リンパ球抑制活性は加熱処理ラミナリビオースおよび加熱処理ラミナリトリオースが強かった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、重篤な副作用のない、優れた免疫抑制剤が提供される。