(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ｎ種の界面活性剤がそれぞれ分注されたｎ個のチューブ、並びに縦方向にｎ個の列および横方向にｍ個の列の合計ｎ×ｍ個の穴を有する溶液用プレートであって、ｍ個の列から選択される複数の列（以下、密度勾配遠心用溶液列）の各列のｎ個の穴に、各列ごとに異なる濃度の密度勾配遠心用溶液が分注されている溶液用プレートを用意して、該溶液用プレートのｍ個の列から選択される一列（以下、緩衝液列）のｎ個の穴に緩衝液を分注し、別の一列（以下、純水・塩溶液列）のｎ個の穴に純水又は塩溶液を分注し、さらに別の一列（以下、可溶化緩衝液列）のｎ個の穴に可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液又は水を分注し（但し、ｎは2以上の整数を示し、ｍは５以上の整数を示す）；
（２）界面活性剤、緩衝液列の緩衝液、及び純水・塩溶液列の純水・塩溶液をそれぞれ、密度勾配遠心用溶液列の穴および可溶化溶液用緩衝液列の穴に添加し、
（３）密度勾配遠心用溶液列の異なる濃度の溶液をそれぞれ、ｎ個の密度勾配遠心用遠心管の中に重層して密度勾配を形成し、
（４）ｎ個の可溶化用遠心管に試料を添加し、縦方向にｎ列および横方向にｐ列の合計ｎ×ｐ個の穴を有するサンプル分取用プレートのｐ個の列から選択される一列（以下、試料列）のｎ個の穴に試料を添加し、別の一列（以下、可溶化用緩衝液列）のｎ個の穴に可溶化用緩衝液を添加し（但し、ｐは４以上の整数を示す）、
（５）溶液用プレートの可溶化緩衝液列の溶液を、試料を含む可溶化用遠心管に添加し、遠心を行って不溶物を沈殿させ、
（６）遠心後のチューブから遠心上清の一部をサンプル分取用プレートの一列に添加し、遠心上清の別の一部を（３）で作製した密度勾配遠心用溶液を含有する密度勾配遠心用遠心管に重層して遠心し、
（７）遠心終了後、密度勾配の上部から複数の画分を分取して、サンプル分取用プレートの複数の列の複数の穴に添加し、目的タンパク質を検出する、
工程を含む、界面活性剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
（Ａ）ｎ種類（ｎは２以上の整数）の界面活性剤を、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ１、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ２、・・・ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａｋ（密度勾配遠心用溶液Ａ１、Ａ２、・・・Ａｋは、互いに濃度のみが異なる。また、ｋは２以上の整数）、およびｎ個のタンパク質可溶化用緩衝液に添加する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた、界面活性剤を含むｎ個のタンパク質可溶化用緩衝液と、目的タンパク質を含む試料とを混合し、遠心分離を行ってｎ個の上清を得る工程と、
（Ｃ）前記工程（Ａ）で得られた、それぞれ界面活性剤を含む、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ１、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ２、・・・ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａｋを重層して、ｎ個の密度勾配溶液を形成する工程と、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたｎ個の密度勾配溶液に、前記工程（Ｂ）で得られたｎ個の上清を一部添加して密度勾配遠心分離を行う工程と、
（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた遠心済みのｎ個の密度勾配溶液のそれぞれから複数種の画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉ（ｉは２以上の整数）を取得する工程と、
（Ｆ）前記目的タンパク質を含むｎ個の試料を一方向に整列保持し、前記工程（Ｂ）で得られたｎ個の上清を一方向に整列保持し、さらに前記工程（Ｅ）で得られたｎ個の画分Ｂ１、ｎ個の画分Ｂ２、・・・ｎ個の画分Ｂｉを一方向に整列保持することにより、前記試料、上清、および画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉを相互に比較可能な状態として目的タンパク質を検出する工程を含む、界面活性剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記工程（Ａ）における界面活性剤を添加する操作、前記工程（Ｂ）におけるタンパク質可溶化用緩衝液と、目的タンパク質を含む試料とを混合する操作、前記工程（Ｃ）における密度勾配遠心用溶液Ａ１、Ａ２、・・・Ａｋを重層する操作、前記工程（Ｄ）における上清を添加する操作、前記工程（Ｅ）における画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉを取得する操作、および、
前記工程（Ｆ）における試料、上清、および画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉを整列する操作から選択される少なくとも一つの操作を、ｎ回の注入を同時に行うことができる注入手段により同時に行う、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れかに記載のスクリーニング方法を行うための、異なる界面活性剤がそれぞれ分注された複数のチューブから構成される界面活性剤キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は界面活性剤の効率的なスクリーニング方法、より詳細には、あるタンパク質を可溶化するのに好適な界面活性剤の種類と濃度を効率的にスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
生体内で機能するタンパク質の多くは、数個のタンパク質から成る複合体として機能し、またこれらの多くは生体膜に組み込まれたタンパク質（膜タンパク質）である。これらの膜タンパク質複合体の解析のためには、それらの機能を保持した状態で膜から溶かし出すことが必須であり（可溶化）、この可溶化のためには各種の界面活性剤が用いられる。タンパク質を複合体構造や機能を保持したまま可溶化するためには、界面活性剤の選択が重要であり、各タンパク質に応じて、可溶化に適した界面活性剤の種類と濃度は異なることが知られている。
【０００３】
新規に見出された膜タンパク質を構造や機能を保ったまま可溶化することができる好適な界面活性剤を見つけるための従来の方法においては、１種乃至少数種類の界面活性剤を用いて目的のタンパク質を可溶化できるかどうかを検討し、効率的な可溶化が達成できない場合には、異なる界面活性剤を用いた試行錯誤の繰り返しにより、適当な界面活性剤およびその使用条件を選択することが行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、膜タンパク質複合体の可溶化に適した界面活性剤の種類と濃度を効率よくスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、膜タンパク質複合体の可溶化に適した界面活性剤とその使用条件を簡便かつ短時間にスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、マルチチャンネルピペットに対応した８連などのチューブに異なる界面活性剤を各種の濃度で分注しておくユニット（チューブ）、可溶化用の緩衝液および密度勾配遠心のための緩衝液を調製するユニット（プレート）、可溶化のための遠心管ユニット、および可溶化されたタンパク質の密度勾配遠心による分離ユニットを用いて、界面活性剤を効率的にスクリーニングできるアッセイ系を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、（１）異なる界面活性剤がそれぞれ分注された複数のチューブ、および複数の列の各列の複数の穴に各列ごとに異なる濃度の密度勾配遠心用溶液が分注されている溶液用プレートを用意し、溶液用プレートの別の一列の複数の穴に可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液又は水を分注し、
（２）チューブ中の界面活性剤を、溶液プレートの密度勾配遠心用溶液が分注されている穴および可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液が分注されている穴に添加し、
（３）界面活性剤が添加された異なる濃度の密度勾配遠心用溶液を密度勾配遠心用遠心管の中に重層して密度勾配を形成し、
（４）可溶化用遠心管に試料を添加し、サンプル分取用プレートの一列の複数の穴に試料を添加し、別の一列の穴に可溶化用緩衝液を添加し、
（５）溶液用プレートの可溶化緩衝液列の溶液を、試料を含む可溶化用遠心管に添加し、遠心を行って不溶物を沈殿させ、
（６）遠心後のチューブから遠心上清の一部をサンプル分取用プレートの一列の複数の穴に添加し、遠心上清の別の一部を（３）で作製した密度勾配遠心用溶液を含有する密度勾配遠心用遠心管に重層して遠心し、
（７）遠心終了後、密度勾配の上部から複数の画分を分取して、サンプル分取用プレートの複数の列の複数の穴に添加し、目的タンパク質を検出する、
工程を含む、界面活性剤のスクリーニング方法が提供される。
【０００７】
好ましくは、本発明によれば、（１）ｎ種の界面活性剤がそれぞれ分注されたｎ個のチューブ、並びに縦方向にｎ個の列および横方向にｍ個の列の合計ｎ×ｍ個の穴を有する溶液用プレートであって、ｍ個の列から選択される複数の列（以下、密度勾配遠心用溶液列）の各列のｎ個の穴に、各列ごとに異なる濃度の密度勾配遠心用溶液が分注されている溶液用プレートを用意して、該溶液用プレートのｍ個の列から選択される一列（以下、緩衝液列）のｎ個の穴に緩衝液を分注し、別の一列（以下、純水・塩溶液列）のｎ個の穴に純水又は塩溶液を分注し、さらに別の一列（以下、可溶化緩衝液列）のｎ個の穴に可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液又は水を分注し（但し、ｎは2以上の整数を示し、ｍは５以上の整数を示す）；
（２）界面活性剤、緩衝液列の緩衝液、及び純水・塩溶液列の純水・塩溶液をそれぞれ、密度勾配遠心用溶液列の穴および可溶化溶液用緩衝液列の穴に添加し、
（３）密度勾配遠心用溶液列の異なる濃度の溶液をそれぞれ、ｎ個の密度勾配遠心用遠心管の中に重層して密度勾配を形成し、
（４）ｎ個の可溶化用遠心管に試料を添加し、縦方向にｎ列および横方向にｐ列の合計ｎ×ｐ個の穴を有するサンプル分取用プレートのｐ個の列から選択される一列（以下、試料列）のｎ個の穴に試料を添加し、別の一列（以下、可溶化用緩衝液列）のｎ個の穴に可溶化用緩衝液を添加し（但し、ｐは４以上の整数を示す）、
（５）溶液用プレートの可溶化緩衝液列の溶液を、試料を含む可溶化用遠心管に添加し、遠心を行って不溶物を沈殿させ、
（６）遠心後のチューブから遠心上清の一部をサンプル分取用プレートの一列に添加し、遠心上清の別の一部を（３）で作製した密度勾配遠心用溶液を含有する密度勾配遠心用遠心管に重層して遠心し、
（７）遠心終了後、密度勾配の上部から複数の画分を分取して、サンプル分取用プレートの複数の列の複数の穴に添加し、目的タンパク質を検出する、
工程を含む、界面活性剤のスクリーニング方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、溶液用プレートおよびサンプル分取用プレートとして、縦方向に８個の列および横方向に１２個の列から成る９６穴プレートを用いる。
好ましくは、界面活性剤として、Triton X-100、Tween 20、Tween 40、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、BIGCHAP、デオキシBIGCHAP、ジギトニン、Mega-9、Tergitol type NP-40、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ラウリルサルコシネートナトリウム、またはでドデシル硫酸ナトリウムから選択される界面活性剤を使用する。
好ましくは、試料として細胞由来の膜画分を使用する。
【０００９】
さらに本発明によれば、（Ａ）ｎ種類（ｎは２以上の整数）の界面活性剤を、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ１、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ２、・・・ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａｋ（密度勾配遠心用溶液Ａ１、Ａ２、・・・Ａｋは、互いに濃度のみが異なる。また、ｋは２以上の整数）、およびｎ個のタンパク質可溶化用緩衝液に添加する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた、界面活性剤を含むｎ個のタンパク質可溶化用緩衝液と、目的タンパク質を含む試料とを混合し、遠心分離を行ってｎ個の上清を得る工程と、
（Ｃ）前記工程（Ａ）で得られた、それぞれ界面活性剤を含む、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ１、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ２、・・・ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａｋを重層して、ｎ個の密度勾配溶液を形成する工程と、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたｎ個の密度勾配溶液に、前記工程（Ｂ）で得られたｎ個の上清を一部添加して密度勾配遠心分離を行う工程と、
（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた遠心済みのｎ個の密度勾配溶液のそれぞれから複数種の画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉ（ｉは２以上の整数）を取得する工程と、
（Ｆ）前記目的タンパク質を含むｎ個の試料を一方向に整列保持し、前記工程（Ｂ）で得られたｎ個の上清を一方向に整列保持し、さらに前記工程（Ｅ）で得られたｎ個の画分Ｂ１、ｎ個の画分Ｂ２、・・・ｎ個の画分Ｂｉを一方向に整列保持することにより、前記試料、上清、および画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉを相互に比較可能な状態として目的タンパク質を検出する工程を含む、界面活性剤のスクリーニング方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、前記工程（Ａ）における界面活性剤を添加する操作、前記工程（Ｂ）におけるタンパク質可溶化用緩衝液と、目的タンパク質を含む試料とを混合する操作、前記工程（Ｃ）における密度勾配遠心用溶液Ａ１、Ａ２、・・・Ａｋを重層する操作、前記工程（Ｄ）における上清を添加する操作、前記工程（Ｅ）における画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉを取得する操作、および、
前記工程（Ｆ）における試料、上清、および画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉを整列する操作から選択される少なくとも一つの操作を、ｎ回の注入を同時に行うことができる注入手段（例えば、８連マルチピペットなどのｎ連マルチピペット）により同時に行うことができる。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、異なる界面活性剤がそれぞれ分注された複数のチューブから構成される、上記した本発明のスクリーニング方法を行うための界面活性剤キットが提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の界面活性剤のスクリーニング方法は、試料の可溶化に適した界面活性剤をスクリーニングする方法に関する。試料の種類は特に限定されないが、例えば、細胞由来の膜画分を使用することができる。本発明の方法を利用することにより、細胞膜や細胞内小器官の膜に存在する膜タンパク質や膜タンパク質複合体を可溶化するのに適した界面活性剤を効率的にスクリーニングすることが可能である。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は本明細書中上記の工程（１）から（７）を含むことを特徴とする。以下、工程（１）から（７）について順番に説明する。なお、工程（１）〜（７）の操作を行う順番は特に限定されず、本発明の目的を達成することができる限り、適宜順番を設定して行うことができる。例えば、工程（３）は、工程（４）または工程（５）の後に行うことができる。
【００１４】
工程（１）においては、異なる界面活性剤がそれぞれ分注された複数のチューブ、および複数の列の各列の複数の穴に各列ごとに異なる濃度の密度勾配遠心用溶液が分注されている溶液用プレートを用意し、溶液用プレートの別の一列の複数の穴に可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液又は水を分注する。
【００１５】
本発明で用いる界面活性剤の種類は特に限定されず、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、その他ステロイド骨格を持つ界面活性剤の何れでもよい。
【００１６】
陰イオン性界面活性剤の具体例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、または３，５−ジヨードサリチル酸リチウムなどが挙げられる。
【００１７】
陽イオン性界面活性剤の具体例としては、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド、またはテトラデシルアンモニウムブロミドなどが挙げられる。
【００１８】
両性界面活性剤の具体例としては、パルミトイルリゾレシチン、Ｎ−ドデシルベタイン、ステアリル−Ｎ−ベタインドデシル−β−アラニン、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、または３−（テトラデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸などが挙げられる。
【００１９】
非イオン性界面活性剤の具体例としては、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セチル−ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ｐ−ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン、ラウリルジメチルアミンオキサイド、または１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄグルコピラノシドなどが挙げられる。
【００２０】
ステロイド骨格を有する界面活性剤の具体例としては、コール酸ナトリウム、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ジギトニンなどが挙げられる。
【００２１】
本発明によれば、上記した各種界面活性剤の中から異なる界面活性剤を選択し、各界面活性剤をそれぞれ分注した複数のチューブから界面活性剤キットを構成することができる。当該界面活性剤キットは、本発明のスクリーニング方法の実施に好適である。
【００２２】
工程（１）では複数の異なる界面活性剤を予め複数のチューブにそれぞれ分注しておく。例えば、スクリーニングは２連以上の任意の数の系で行うことができるが、８×１２列の９６穴プレートを使用する場合には８連で行うことが好ましい。この場合、８種の界面活性剤を８本のチューブに分注しておく。
【００２３】
また、工程（１）では、複数の列の各列の複数の穴に各列ごとに異なる濃度の密度勾配遠心用溶液が分注されている溶液用プレートを用意し、溶液用プレートの別の一列の複数の穴に可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液又は水を分注する。溶液用プレートとしては、縦方向にｎ個の列および横方向にｍ個の列の合計ｎ×ｍ個の穴を有する溶液用プレートを使用することができる。ここで、ｎは2以上の任意の整数を示し、例えば、２〜２０の任意の整数を示す。ｍは５以上の任意の整数を示し、例えば、５〜２０の任意の整数を示す。好ましい態様によれば、溶液用プレートとしては、市販の９６穴プレートを使用することができるが、この場合はｎ＝８、ｍ＝１２となる。
【００２４】
溶液プレートの横方向のｍ個の列から選択される複数の列の各列のｎ個の穴には、各列ごとに異なる濃度の密度勾配遠心用溶液が分注されている。この列のことは以下、密度勾配遠心用溶液列とも言う。密度勾配遠心用溶液列の列の数は２以上であれば特に限定されず、一般的には２〜６列、好ましくは３〜５列、例えば４列とすることができる。密度勾配遠心用溶液としては、例えば、ショ糖溶液を用いることができ、異なる濃度としては、数％から数十％の任意の濃度を設定することができる。濃度勾配の一例としては、２５％、１８．７５％、１２．５％および６．２５％の４段階を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
好ましくは、工程（１）では上記の溶液用プレートの横方向のｍ個の列から選択される一列のｎ個の穴に緩衝液を分注する。以下、この列を緩衝液列とも言う。この緩衝液は後述する工程（２）の操作において、密度勾配遠心用の溶液と可溶化溶液を調製するために使用される。緩衝液の種類は特に限定されないが、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられる。
【００２６】
好ましくは、工程（１）ではさらに、溶液プレートの別の一列のｎ個の穴に純水又は塩溶液を分注する。以下、この列を純水・塩溶液列とも言う。この純水・塩溶液は、後述する工程（２）の操作において、密度勾配遠心用の溶液と可溶化溶液を調製するために使用される。塩溶液の種類は特に限定されないが、例えば、酢酸カリウム溶液などが挙げられる。
【００２７】
工程（１）ではさらに、溶液プレートのさらに別の一列のｎ個の穴に可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液又は水を分注する。以下、この列を可溶化緩衝液列とも言う。可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液の種類は特に限定されないが、例えば、ソルビトール溶液などが挙げられる。
【００２８】
工程（２）においては、工程（１）で用意したチューブ中の界面活性剤を、溶液プレートの密度勾配遠心用溶液が分注されている穴および可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液が分注されている穴に添加する。ｎ個の界面活性剤含有チューブ中の界面活性剤はそれぞれ、一列につきｎ個ずつ存在する密度勾配遠心用溶液が添加された穴に添加される。
好ましくは、工程（２）においては、溶液プレートの緩衝液列の緩衝液、及び純水・塩溶液列の純水・塩溶液をそれぞれ、密度勾配遠心用溶液列の穴および可溶化溶液用緩衝液列の穴に添加して溶液を調製する。
【００２９】
工程（３）においては、工程（２）で調製した界面活性剤が添加された異なる濃度の密度勾配遠心用溶液を、密度勾配遠心用遠心管の中に重層して密度勾配を形成する。ｎ種の界面活性剤を使用し、密度勾配遠心用溶液が一種の濃度につきｎ個の穴に存在する場合、ｎ個の密度勾配遠心用遠心管を用意し、各々の遠心管の中に１種の界面活性剤を含むように密度勾配遠心用溶液を添加することが好ましい。異なる濃度の少なくとも２種類以上の密度勾配遠心用溶液を１本の遠心管の中に重層することによって、密度勾配を形成することができる。遠心管の容積は特に限定されないが、例えば、２００μｌの遠心チューブを使用することができる。また、作業の便宜上、密度勾配遠心用遠心管はアルミラック中に立てた状態で使用することができる。
【００３０】
工程（４）においては、可溶化用遠心管に試料を添加し、サンプル分取用プレートの一列の複数の穴に試料を添加し、別の一列の穴に可溶化用緩衝液を添加する。試料としては、上記した通り、任意のタンパク質含有試料を使用することができ、例えば、細胞由来の膜画分を使用することができる。試料を添加する可溶化用遠心管も密度勾配用遠心管の場合と同様、界面活性剤の種類の数に対応した数の遠心管を用意する。例えば、８種の界面活性剤をスクリーニングする場合（即ち、ｎ＝８）は、８個の可溶化用遠心管を用意する。
【００３１】
工程（４）ではさらに、サンプル分取用プレートの一列の複数の穴に試料を添加し、別の一列の穴に可溶化用緩衝液を添加する。サンプル分取用プレートは、溶液プレートとは別個の異なるプレートである。サンプル分取用プレートとしては、縦方向にｎ列および横方向にｐ列の合計ｎ×ｐ個の穴を有するプレートを使用することができる。ここで、ｐは４以上の整数を示し、例えば４〜２０の任意の整数を示す。好ましい態様によれば、サンプル分取用プレートとしては８×１２列の９６穴プレートを使用することができる。
【００３２】
工程（５）においては、溶液用プレートの可溶化緩衝液列の溶液を、試料を含む可溶化用遠心管に添加し、遠心を行って不溶物を沈殿させる。即ち、工程（５）は可溶化を行う工程である。溶液用プレートの可溶化緩衝液列の溶液がｎ個ある場合（各々の溶液には異なる界面活性剤が添加されている）、ｎ個の可溶化用遠心管の各々に１種類ずつの界面活性剤が添加されるように、可溶化緩衝液をそれぞれの遠心管に添加する。遠心の条件は特に限定されないが、例えば、２００μｌの遠心チューブを使用する場合、４００，０００×ｇで行うことができる。遠心時間も特に限定されないが、一般的には１０分〜３０分程度行うことができる。
【００３３】
工程（６）では、遠心後のチューブから遠心上清の一部をサンプル分取用プレートの一列の複数の穴に添加する。これは、可溶化タンパク質画分に相当する。さらに工程（６）では、遠心上清の別の一部を（３）で作製した密度勾配遠心用溶液を含有する密度勾配遠心用遠心管に重層して遠心する。密度勾配遠心の条件も特に限定されず、例えば、２００μｌの遠心チューブを使用する場合、４００，０００×ｇで行うことができる。遠心時間も特に限定されないが、一般的には１０分〜３０分程度行うことができる。
【００３４】
工程（７）では、工程（６）の遠心終了後、密度勾配の上部から複数の画分を分取して、サンプル分取用プレートの複数の列の複数の穴に添加し、目的タンパク質を検出する。タンパク質の検出は当業者に既知の常法により行うことができる。例えば、目的タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫ブロットやＥＬＩＳＡなどを行うことにより、目的タンパク質を検出することができる。
【００３５】
本発明の別の側面によれば、本明細書中上記の工程（Ａ）から（Ｆ）を含むことを特徴とする界面活性剤のスクリーニング方法が提供される。以下、工程（Ａ）から（Ｆ）について順番に説明する。
【００３６】
工程（Ａ）は、ｎ種類（ｎは２以上の整数）の界面活性剤を、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ１、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ２、・・・ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａｋ（密度勾配遠心用溶液Ａ１、Ａ２、・・・Ａｋは、互いに濃度のみが異なる。また、ｋは２以上の整数）、およびｎ個のタンパク質可溶化用緩衝液に添加する工程である。該工程（Ａ）は、本明細書中上記の工程（１）および（２）に対応する。なお、本明細書において、「タンパク質可溶化用緩衝液」とは、可溶化溶液用密度勾配形成剤溶液（可溶化緩衝液（列））と同義である。
【００３７】
工程（Ｂ）は、前記工程（Ａ）で得られた、界面活性剤を含むｎ個のタンパク質可溶化用緩衝液と、目的タンパク質を含む試料とを混合し、遠心分離を行ってｎ個の上清を得る工程である。該工程（Ｂ）は、本明細書中上記の工程（５）に対応する。
【００３８】
工程（Ｃ）は、前記工程（Ａ）で得られた、それぞれ界面活性剤を含む、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ１、ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａ２、・・・ｎ個の密度勾配遠心用溶液Ａｋを重層して、ｎ個の密度勾配溶液を形成する工程である。該工程（Ｃ）は、本明細書中上記の工程（３）に対応する。
【００３９】
工程（Ｄ）は、前記工程（Ｃ）で得られたｎ個の密度勾配溶液に、前記工程（Ｂ）で得られたｎ個の上清を一部添加して密度勾配遠心分離を行う工程である。該工程（Ｄ）は、本明細書中上記の工程（６）に対応する。
【００４０】
工程（Ｅ）は、前記工程（Ｄ）で得られた遠心済みのｎ個の密度勾配溶液のそれぞれから複数種の画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉ（ｉは２以上の整数）を取得する工程であり、工程（Ｆ）は、前記目的タンパク質を含むｎ個の試料を一方向に整列保持し、前記工程（Ｂ）で得られたｎ個の上清を一方向に整列保持し、さらに前記工程（Ｅ）で得られたｎ個の画分Ｂ１、ｎ個の画分Ｂ２、・・・ｎ個の画分Ｂｉを一方向に整列保持することにより、前記試料、上清、および画分Ｂ１、Ｂ２、・・・Ｂｉを相互に比較可能な状態として目的タンパク質を検出する工程である。該工程（Ｅ）および（Ｆ）は、本明細書中上記の工程（７）に対応する。
【００４１】
上記した方法によれば、ｎ種類の界面活性剤を対象として、１）全タンパク質画分（試料）と、可溶化タンパク質画分（上清）との比較、および２）可溶化タンパク質画分中のサイズ分布の特定、を同時に行うことが可能となる。これにより、目的タンパク質およびその複合体を、好適なサイズを保持したままで可溶化できる界面活性剤を迅速にスクリーニングすることが可能になる。また、この工程をｎ回の注入を同時に行うことができる注入手段（例えば、ｎ連マルチピペットなど）を用いて行うことにより、スクリーニングをより迅速に行うことができる。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、８連の界面活性チューブを用意し、溶液プレート及びサンプル分取用プレートとしての８×１２列の９６穴プレートを使用し、８連のマルチチャンネルピペットを用いて溶液の添加を行う。最終的には、全タンパク質画分、可溶化タンパク質画分、及び可溶化タンパク質画分を沈降速度に応じて分離した１０画分から構成される全部で１２画分が一列に並ぶフォーマットでスクリーニングを行うことができる。このフォーマットによれば、８種の異なる可溶化条件の分離サンプルが１枚の９６穴マイクロタイタープレート上に分画される。本発明の方法を利用することにより、可溶化の程度と可溶化産物の大きさの検討がハイスループットで行うことができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
【実施例】
実施例１：出芽酵母から調製したミクロソーム画分からの、１５種の界面活性剤を用いたSec22pを含む複合体の可溶化条件の検討
本実施例では、緩衝液として、20mM HEPES-KOAc pH6.8, 1mM Mg(OAc), 0.2M KOAcを用いた。
【００４４】
（１）材料及び方法
分離のための試薬等
・Saccharomyces cerevisiae RSY445 株からWuestehube and Schekman （1992）の方法により調製したミクロソーム画分, 40 ODU/ml.
・純水
・2.5 M KOAc
・濃縮緩衝液 [0.4 M HEPES-KOAc pH6.8, 0.02 M Mg(OAc)2]
・2.5 M sorbitol
【００４５】
・５％の以下の界面活性剤溶液
Triton X-100
Tween 20
Tween 40
Octylglucoside
Octylthioglucoside
CHAPS
CHAPSO
BIGCHAP
deoxyBIGCHAP
Digitonin
Mega-9
Tergitol type NP-40
Sodium deoxycholate monohydrate
Sodium Laurylsalcosynate
Sodium dodecylsulfate
【００４６】
・25% Sucrose水溶液
・18.75% Sucrose水溶液
・12.5% Sucrose水溶液
・6.25% Sucrose水溶液
【００４７】
分離のための消耗品、小型機具、機器
・マルチチャンネルピペット、１２連、８連
・９６穴マイクロタイタープレート  ４枚以上
・200マイクロリッターチップ、９６対応のラック入り
・８列リザーバー  （ハイテック、T-90008）２枚以上
・ベックマン超遠心用チューブ、#343775, 32本
・上記超遠心チューブ用アルミラック、１２穴×4列、２枚
・上記超遠心チューブ用アクリルラック、１２穴×４列、
・ベックマン卓上超遠心機  Optima TLX
・ベックマン卓上超遠心機用ローター  TLA-100
・Adhesive Plate Seale, ABgen #AB-0580
【００４８】
Sec22pを含む複合体の検出電気泳動後、特異抗体を用いた免疫ブロット（常法による）。
【００４９】
ストックの調製
８連リザーバーの４スロットに、25% Sucrose水溶液、18.75% Sucrose水溶液、12.5% Sucrose水溶液、6.25% Sucrose水溶液を加えた。２枚のマイクロタイタープレートの６列から９列の各々の穴に、マルチチャンネルピペットを用いて、８連リザーバーから100μlの溶液を添加した。これを、ストックのプレートとして複数枚製作し、上部をAdhesive Plate Sealeでシール後、凍結保存している。
なお、以下の実験にはこれを２枚用いた。
【００５０】
８連リザーバーの各スロットに、純水、５％のTriton X-100、Tween 20、Tween 40、Octylglucoside、Octylthioglucoside、CHAPS、CHAPSOを各々100μl分注した。もう一枚の８連リザーバーの各スロットに、５％のBIGCHAP、deoxyBIGCHAP、Digitonin、Mega-9、Tergitol type NP-40、Sodium deoxycholate monohydrate、Sodium Laurylsalcosynate、Sodium dodecylsulfateを分注した。これらのスロットから、100μlの溶液を８連チューブに分注し、凍結保存した。なお、以下の実験には界面活性剤を分注してある８連チューブを各１セット用いた。
【００５１】
可溶化実験に用いる溶液の調製
凍結してあるマイクロタイタープレート（以下、溶液用プレートと呼ぶ）２枚と、界面活性剤を分注してある８連チューブを各１セットを、室温に戻し、溶液を溶解させた。1000回転で２分遠心した。ことにより、蓋に付いた水滴を回収した。界面活性剤溶液を含むチューブは、軽く震盪して溶液を混合後、1000回転２分の遠心により溶液を回収した。
【００５２】
８連リザーバーの２スロットに、左から順に濃縮緩衝液、2.5 M KOAcをそれぞれ2.5 mlずつ加える。
上記のショ糖溶液を分注してある２枚の溶液用プレートの３、４列の各々の穴に、マルチチャンネルピペットを用いて、上記の８連リザーバーから100μlの溶液を加えた。
また、これら２枚のプレートの第10列の各穴に、マルチチャンネルピペットを用いて67.5μlの純水と10μlの2.5 M sorbitolを分注した。
【００５３】
次いで、マルチチャンネルピペットを用いて、溶液用プレートの第３列から6.25μlずつ第６列から第10列の穴に溶液を添加した。さらに、マルチチャンネルピペットを用いて、第４列から、10μlずつ第６列から第10列の穴に溶液を添加した。また、界面活性剤溶液を分注してある８連チューブから、マルチチャンネルピペットを用いて6.25μlずつ第６列から第10列の穴に溶液を添加した。
次いで、150μlにセットしたマルチチャンネルピペットを用いて、第６列から第10列の溶液を吸い上げてから排出した。操作を数回繰返すことにより、溶液を混合した。
下記の密度勾配の作成後、溶液用プレートを氷上に１０分以上置くことにより溶液を冷却した。
【００５４】
２回目の遠心に用いる密度勾配の作成
アルミラックの２列の端から８番目迄の穴に、１から１６の番号をふった超遠心用チューブを順に並べる。各穴に立ったチューブに、マルチチャンネルピペットを用いて、溶液用プレートの第６列の溶液45μlを分注した。次いで、マルチチャンネルピペットを用いて、溶液用プレートの第７列、第８列、第９列の溶液45μlをそれぞれ順に重層し、4段階のステップ密度勾配を作成した。
この密度勾配を室温で２０分程度保温し、次いでアルミラックごと氷上に置くことによりグラジエントを冷却した。
【００５５】
膜蛋白質の可溶化と可溶化蛋白質複合体の分離
アルミラックの２列の端から８番目迄の穴に、１から１６の番号をふった超遠心用チューブを順に並べる。アルミラックごと氷上に置くことによりチューブを冷却した。また、９６穴マイクロタイタープレート２枚（サンプル分取用プレート）を氷上に置き冷却した。
【００５６】
アルミラック中の各チューブに10μlのミクロソーム画分を分注した。また、氷上の空のサンプル分取用プレートの第１列の各穴に２μlのミクロソーム画分を分注し、次いでマルチチャンネルピペットを用いて溶液用プレートの第１０列より18μlの溶液を分注した。さらに、サンプル分取用プレート第２列に溶液用プレートの第１０列より10μlの溶液をマルチチャンネルピペットを用いて分注した。
【００５７】
ミクロソーム画分を含むアルミラック上のチューブに、溶液用プレートの第１０列より40μlの溶液をマルチチャンネルピペットを用いて分注し、溶液を吸い上げてから出す操作を５回繰返すことにより溶液を混合した。氷上で１０分間保温後、チューブをTLA-100ローターにセットし、100,000回転で２０分間遠心した。遠心後のチューブをアルミラックに戻し、マルチチャンネルピペットを用いて10μlの遠心上清を溶液をサンプル分取用プレート第２列に移し、内部の溶液と混合した。
【００５８】
次いで、遠心後のチューブからマルチチャンネルピペットを用いて、20μlの遠心上清をマイクロチューブ中のグラジエントに重層した。チューブをTLA-100ローターにセットし、100,000回転で２０分間遠心した。ローターから取り出したチューブを８チューブずつ２列にアクリルラックに並べた。マルチチャンネルピペットを用いて、20μlずつ上部から分取し、サンプル分取用プレートの第３列の穴に加えた。この分取操作を繰返して行った。なお、分取した画分はサンプル分取用プレートの第４列以降の穴に順次移して行った。
【００５９】
以上の操作で、界面活性剤無しのコントロールと、１５種類の界面活性剤（終濃度0.25％）での蛋白質の複合体としての可溶化条件のための分画が完了した。実験の開始から分画の終了までに、３時間１５分程度を要した。
なお、以上の操作全体の流れを、図１および図２に示す。
【００６０】
分離した画分に含まれるSec22pを含む複合体の検出
サンプル分取用プレートの各ウエルに20μlの２×SDS-PAGEサンプルバッファーを加え、６５℃で10分保温した。このサンプル中の蛋白質を、各列のサンプルが一列に並ぶようにしてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、PVDF膜に転写後、抗Sec22p特異抗体を用いた免疫ブロットにより検出した。免疫ブロットの方法は常法に従った。
【００６１】
（２）結果と考察
今回の検討結果を図３に示す。レーン１に含まれる膜全量に対応するシグナルの強度とレーン２に含まれる可溶化された蛋白質に対応するシグナルの強度を比較すると、Triton X-100, Octylthioglucoside, CHAPS, CHAPSO, deoxyBIGCHAP, Digitonin, Sodium deoxycholate, Sodium Laurylsalcosynateでは、それらの強度が殆ど同じことから、効率良く可溶化が行われたことがわかる。全蛋白質を溶解するために用いたSodium dodecylsulfate については、ドデシル硫酸イオンが緩衝液中のカリウムイオンと不溶性の塩を作るので、Sec22pがこれに巻き込まれることにより可溶性画分に回収されなかったと考えられる。他の界面活性剤では、可溶化が効率良く行われなかったと考えられる。
【００６２】
可溶化が効率良く行われた界面活性剤においての、密度勾配遠心でのSec22pの沈降パターンを検討すると、Triton X-100, Octylthioglucoside,  deoxyBIGCHAP, Sodium Laurylsalcosynateでは殆どのシグナルが上部4画分に回収されており、この付近に殆どの蛋白質が検出されるので（結果は示さない）これらの画分に認められるSec22pは、大きな複合体を形成していないと考えられる。CHAPS, CHAPSO, Sodium deoxycholateでは、グラジエントの下部までシグナルが認められることから、可溶化されたものの一部は大形の複合体を作っていると考えられる。Digitoninの場合は、グラジエント上部にはシグナルが認められないことから、可溶化されたものの殆どは大形の複合体を形成していると考えられる。さらに、CHAPSOとdeoxyBIGCHAPの場合は、グラジエントの最も下部にシグナルが認められ、このことは可溶化されたものの一部は凝集しがちであることを示していると考えられる。
以上の結果から、Sec22pを含む蛋白質複合体の性質の検討のために用いる界面活性剤としては、ジギトニンが適当であると判断される。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、膜タンパク質複合体の可溶化に適した界面活性剤の種類と濃度を効率よくスクリーニングする方法を提供することが可能になった。本発明によれば、膜タンパク質複合体の可溶化に適した界面活性剤を簡便かつ短時間にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施例の操作全体の流れ（前半）を示す。
【図２】図２は、本発明の実施例の操作全体の流れ（後半）を示す。
【図３】図３は、本発明の方法に従って分離した画分に含まれるSec22pを含む複合体を検出した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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