(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般構造式：
R−NH−K−Q−K−NH−R      （I）
{式中、
Qは、１，４−シクロヘキサンジ−イル基を表し、
Kは、メチレン基を表し、そして
Rは、ベンジル基；１個のハロゲンにより、または１個、２個もしくは３個のトリハロメチル基により置換されたベンジル基；あるいは置換されたトリハロメチルベンジル基を表す。}
を有する化合物を含む、AIDS患者の免疫機能を促進するための医薬組成物。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、トランス−１、４−ビス[クロロベンジルアミノメチル]シクロヘキサン二塩酸塩であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
下記一般構造式：
R−NH−K−Q−K−NH−R （I）
{式中、
Qは、１，４−シクロヘキサンジ−イル基を表し、
Kは、メチレン基を表し、そして
Rは、ベンジル基；１個のハロゲンにより、または１個、２個もしくは３個のトリハロメチル基により置換されたベンジル基；あるいは置換されたトリハロメチルベンジル基を表す。}
を有する化合物と、
以下の：ＤＤＩ（２’−３’−ジデオキシイノシン）、ＤＤＣ（２’−３’−ジデオキシシチジン）、３ＴＣ（２’−デオキシ−３’−チアシチジン）及びＡＺＴ（３’−アジド、３’−デオキシチミジン）から成る群より選ばれる抗ウイルス性を有する化合物を含む、抗ウイルス併用薬。
【発明の詳細な説明】
本発明は、脂環式ジアミンの新規使用に関する。
フランス国特許公開第1 387 971号公報は、新規脂環式ジアミンおよびそれらの調製方法を記載している。
下記の一般構造式を有する脂環式ジアミン：
Ｒ−ＮＨ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−ＮＨ−Ｒ      （Ｉ）
（上式中、Ｑは下式II〜Ｖを有する二価の基を表し、
0004037450.tif 000002
Ｋはメチレン基を表すか、または記号Ｑが式IIにより表される時には、原子価結合を表し、そして
記号Ｒは次の基VI〜ＸVIIから成る群より選ばれた基を表す：
VI    ベンジル
VII    １個のハロゲンによりまたは１，２もしくは３個の
トリハロメチル基により置換されたベンジル
VIII    置換されたトリハロメチルベンジル
IX    インダニル
Ｘ    アルキル
ＸＩ  シクロアルキル
ＸII  シクロアルキルアルキル
ＸIII  アルケニル
ＸIV  シクロアルケニルアルキル
ＸＶ  ビシクロアルキル
ＸVI  ビシクロアルケニルアルキル
ＸVII  ビシクロアルキルアルキル）
およびそれらと有機または無機酸との酸付加塩は、脂質代謝に影響を及ぼす性質を有する。
長期の研究の後、本出願人は上記に定義した生成物が顕著で独特な免疫調節性質を有することを発見した。
特に、上記生成物は、外因性または内因性病理学に関連づけられるサイトカイン遺伝子の機能不全の場合にサイトカイン遺伝子および／またはそれらの受容体の発現を修復することができる。それらの性質は後述の実施例において例証される。
それらの生成物は、人間を防御するのに不可欠である炎症性分子、例えばキミオカイン（MIP1α，β，およびRantes；これらの抗ウイルス性は例えばCocchi他，Science 270，1811-1518，1995により記載されている）の産生も刺激することができる。
式Ｉのジアミンは、ＡＩＤＳ（エイズ）では大きく乱されることが知られているＴＨ１型サイトカイン（例えばＩＬ2，ＩＬ12）の刺激物質として働くと思われる。ＨＩＶおよび他の病理学により誘発されるアポプトシス（枯死）作用がこのメカニズムにより制限され得るだろう。
このため、本発明の目的は、特に外因性または内因性病理学に関連づけられる機能不全の場合にサイトカイン遺伝子および／またはそれらの受容体の発現を調節することができる免疫調節剤を調製するためおよびサイトカイン産生を刺激するための、前記式Ｉを有する化合物の使用である。
この病理学は、Ｉ型もしくはII型ＡＩＤＳ、ヘルペス、肝炎、乳頭腫のようなウイルス感染症、またはリーシュマニア症、マラリアもしくはビルハルツ住血吸虫症のような寄生虫感染症に関連し得る。それは例えば、シクロスポリンのような免疫抑制剤の作用によりもしくはコルチコイド類の作用により、または腫瘍、特にミエローマもしくは組織腫瘍のような血液学的腫瘍により誘発される、医原性のものである場合もある。
特に、考えられる病理学は自己免疫疾患、例えばリウマチ様多発性関節炎、エリテマトーデス（紅斑性狼瘡）もしくは自己免疫性糖尿病である。
上記式Ｉの化合物のより具体的な定義およびそれらの調製方法並びに既知の用途は、例えば、フランス国特許公開第1 387 971号、並びにそれのフランス国および外国対応特許、特にフランス国医薬特許第3559M号に与えられている。それらの化合物、特にAY 9944として知られるトランス−１，４−ビス〔２−クロロベンジルアミノメチル〕シクロヘキサン二塩酸塩、に関する文献も多数存在する。
特に、この化合物の薬理学および毒物学に関するデータは文献中に広く記載されている。
本発明は特に、
−ウイルス病
−寄生虫病
−医原性疾病
−腫瘍
−自己免疫疾患
の治療用薬剤を調製するための上記化合物の使用に関する。
それらの使用には、特に、記号Ｑが１，４−シクロヘキサンジ−イル基、即ち記号Ｑが上記式IIに相当する式Ｉの化合物、特に記号Ｒがベンジル基であるか、あるいは１個のハロゲン、例えばフッ素、臭素および特に塩素によりまたは１，２もしくは３個のトリハロメチル基により置換されたベンジル基であるか、あるいはまた１もしくは複数個（例えば１個、２個もしくは３個）のハロゲンによりまたはＣ1〜Ｃ5アルキルもしくはアルコキシ基により置換されたトリハロメチルベンジル基である式Ｉの化合物、より特別には化合物AY 9944、即ち下式：
0004037450.tif 000003
を有する化合物の二塩酸塩が使われる。
外因性または内因性病理学に関連づけられるサイトカイン遺伝子の機能不全の場合にサイトカイン遺伝子および／またはそれらの受容体の発現を修正する前記化合物の性質（下記の実施例において説明する）は、外因性または内因性病理学に関連づけられる機能不全の場合にサイトカイン遺伝子および／またはそれらの受容体の発現を修正する薬剤として上記式Ｉを有する誘導体およびそれの塩を使用することの正当な理由となる。
本発明の薬剤は、例えば、上記に挙げた病理学の治療的処置または予防的処置に用いることができる。
それらは自己免疫疾患の処置に特に有用である。
通常の用量は処置する被検者および病気の原因に応じて異なるが、ヒトへの経口投与の場合、例えば、必要に応じてAY 9944として知られる化合物10mg〜２ｇ／日の用量であることができる。
薬剤として、上記式Ｉを有する化合物およびそれらの塩を経口または非経口投与用の医薬組成物に配合することができる。それらの医薬組成物は固体または液体であることができ、例えばヒトの薬に慣用的に使われる剤形、例えば単純な錠剤または糖衣錠、ゼラチンカプセル、粒剤、シロップ剤、坐剤または注射剤の形態であることができ；それらは常法を使って調製される。それらの医薬組成物において常用される賦形剤、例えばタルク、アラビアガム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、カカオ脂、水性または非水性ビヒクル、動物または植物性脂肪、パラフィン誘導体、グリコール、様々な湿潤剤、分散剤または乳化剤、および保存剤と一緒に、１または複数の活性成分を含めることができる。
本発明者らは、式Ｉの免疫調節性化合物と抗ウイルス性を有する化合物（例えばＤＤＩ、ＤＤＣ、抗プロテアーゼ、３ＴＣおよび好ましくはＡＺＴ）とを併用すると、実施例の項目に記載されるようにそれらの各々の効果が増強される。
このため、本発明の目的は、上記で定義した化合物、特にトランス−１，４−ビス〔クロロベンジルアミノメチル〕シクロヘキサン二塩酸塩と、抗ウイルス性を有する化合物とを含んで成ることを特徴とする併用でもある。
抗ウイルス性化合物は、好ましくは、ＤＤＩ、ＤＤＣ、抗プロテアーゼ、３ＴＣおよび特にＡＺＴより選ばれる。
図１は、ＡＩＤＳ患者からの末梢血の培養物中に存在する単核細胞の数（Ｔ４＝400／mm3）に対する、３×10-6Ｍの最終濃度のAY 9944（ＡＹ）の効果を示す。培養期間（日数）が横座標軸であり、ウエル当たりの細胞数が縦座標軸である。
図２は、ＡＩＤＳ患者からの末梢血の培養物（Ｔ４＝400／mm3）中の生存細胞の率に対する３×10-6Ｍの濃度のAY 9944の効果を示す。培養期間（日数）が横座標軸であり、細胞死亡率が縦座標軸である。
図３は、培養期間（日数）の関数としての培養液中に観察されるＲＴ活性に対する３×10-6Ｍの濃度のAY 9944の効果を示す。
図４は、健康な被検者（対照）および様々なＡＩＤＳ患者（１〜５）から単離した末梢血中のリンパ球集団の中のＩＬ−２受容体を発現している細胞の率（％）に対する、３×10-6Ｍの濃度のAY 9944の効果を示す。
図５は、ＣＤ４を発現している末梢血リンパ球の率（％）に対する、３×10-6Ｍの濃度の数種類の試験化合物の効果を示す。対照はＡＩＤＳ患者からの未処理の末梢血リンパ球（Ｔ４＝約400／mm3）を表す。
図６は、ＡＩＤＳ患者の単核細胞から得られた無細胞抽出物において測定された逆転写酵素活性に対する試験化合物の効果を示す。
図７は、健全な被検者から得られたリンパ球に対するＨＩＶ−１IIIＢウイルスの細胞変性効果に対する、３×10-6Ｍの用量の試験化合物の効果を示す。
図８，９，10および11は、IFN  γ，MIP1α，MIP1βおよびRantesの各サイトカイン合成に対する３×10-6Ｍの用量の試験化合物の効果を示す。
下記の実施例は本発明を例証する。
実施例
ＡＩＤＳ患者から、フィコール（Ficoll）勾配により単核細胞を単離し、そして植物性血球凝集素（ＰＨＡ）を使って37℃で一晩活性化した。次いでそれらを洗浄し、そして40 UI／mlのインターロイキン２（組換え体、Roussel-Uclaf）および試験濃度、即ち３×10-6ＭのAY 9944の存在下または非存在下で、補体除去剤10％ウシ胎児血清が補足されたRPMI培地中で洗浄しそして８×105／mlにまで培養した。１または複数の試験化合物での処理を用いてまたは用いずに、細胞生存度（トリパンブルー試験）をカウントし、３日毎にモニタリングしそして培地を新しいものと交換した。
補助的Ｔリンパ球に特徴的な膜ＣＤ４抗原に対して惹起されたフルオレセイン接合モノクローナル抗体を使って、細胞分取器（“FACS”，Beckton-Dickinson）を使って定期的に細胞の型別を実施した。
実施例１
生存度と細胞増殖に対する効果
図１は、ＡＩＤＳを有する提供者からの血液（Ｔ４：400／mm3）中に存在する単核細胞の数が、感染細胞（対照）では僅かに増加したが10日後には減少した（ウイルスの細胞変性効果およびアポプトシス過程）のと対照的に、３×10-6Ｍの濃度の試験分子（ＡＹ：AY 9944）で処置しておいた感染培養物では劇的な増殖が観察されたことを示す。AY 9944の場合、例えば、15日後の培養物の細胞数は未処置の培養物のものの５〜７倍であった。
更に、図２は、例えばAY 9944で処置した培養物の場合には、培養物中の死細胞の比率が感染後およそ10％に維持されたが、未処置の感染培養物（対照）の場合には、感染の２週間後には約70％に達した。更に、それらの細胞がＡＩＤＳウイルスにより誘発されるアポプトシスによって死亡することは知られているので、AY 9944がアポプトシス発生防止（anti-apoptogenic）効果を有すると結論づけることができる。このアポプトシス発生抑制効果は、下記に与えるサイトカインに対する試験の結果により裏付けられる。
このように培地中の式（Ｉ）の化合物の存在は、ウイルスの細胞変性効果から単核細胞を保護し且つレクチン（ＰＨＡ）の存在下でかなりの増殖を可能にする。
実施例２
培養液中に観察される逆転写酵素（ＲＴ）活性に対する効果
逆転写酵素（ＲＴ）活性は、
0004037450.tif 000004
他（Science，1983,220:868）により記載された通りに測定した。ＲＴ活性は様々な培養期間において感染細胞の培養液中で測定した。
図３に示した結果は、培養液中に観察されるＲＴ活性がAY 9944で処置した培養物の場合にはかなり低いままであったが未処置の培養物の上澄液では1000％以上増加したことを明白に証明する。この劇的な効果は、この種の化合物がウイルスチャージを大きく減らすことを示唆する。更に、これは（ＲＴ）酵素の直接阻害によるためではなくて他のメカニズムによるウイルス生産の阻害によるためであることが下記に示されるだろう。
実施例３
インターロイキン２（ＩＬ−２）受容体の発現に対する効果
インターロイキン２は、免疫系の調節、特にＡＩＤＳでは害されることが判っている補助的Ｔ細胞の増殖に主要な役割を果たすサイトカインである。図４は、AY 9944で処置した培養物においてＩＬ−２受容体の発現が明らかに刺激されることを示す。この研究は５人の異なる患者から得られた末梢血リンパ球において実施し、どの場合でも（ＩＬ−２受容体の発現の程度が有意に低下しなかったNo．４の患者を含む）、ＩＬ−２受容体の大きな増加が観察された。後者の場合、対照（正常な被検者からの末梢血リンパ球）に比較してＩＬ−２受容体の過剰発現が認められた。患者１、２および５については、受容体発現度が15-18％（対照では約40％）から30-45％になり、この受容体の発現の程度に正真正銘の標準化が認められた。最後に、試験化合物は健康な被検者からの末梢血リンパ球（対照）に対して目立った効果がなかった点に注目すべきである。
この効果は非常に重要である。何故なら、ＩＬ−２は免疫において重要な役割を担っているサイトカインの１つであり、それの生産の制御異常はＨＩＶ感染後に認められる問題の重点の１つだからである。ＩＬ−２受容体の数の減少はＣＤ４数およびウイルスチャージと大きな相関関係がある。最近の実験は、ウイルスタンパク質Ｔａｔの初期発現がＩＬ−２メッセンジャーの発現を阻害することも示している（Chirmule他，1995，J．Virol．69：492）。
実施例４
ＣＤ４発現細胞の比率に対する効果
周知の通り、ＡＩＤＳ感染の最も明白な特徴の１つは、マーカーＣＤ４を発現しているＴ４リンパ球の数の減少であり、この結果、“ＣＤ４”を計数することがこの病気の発病を監視するために最も汎用されるパラメーターの１つとなった。図５は、ＣＤ４発現細胞（ＣＤ４に対する蛍光抗体を使ったＦＡＣＳにより検出される）の比率の相当な上昇を示す。この一連の実験において、ＣＤ４+細胞の比率を対照（病気患者からの未処置の末梢血リンパ球）では約30％、上述した２つの化合物の存在下で培養した末梢血リンパ球では約70％増加させたことから、AY 9944（ＡＹ）が最も有効であると証明された。
要約すれば、AY 9944での処置後には、細胞増殖および細胞生存度に対する正の効果、ウイルスチャージの減少、インターロイキン２メッセンジャーおよびインターロイキン２のＴａｃ受容体の発現の刺激、並びに正常なＣＤ４／ＣＤ８比の再建を伴うＣＤ４+リンパ球の比率の増加が観察された。試験化合物を10-7Ｍまたは10-8Ｍの濃度で使用した時も同様な結果が得られた。
実施例５
転写レベルに対する効果
Ｔリンパ球増殖に同じく重要な役割を果たし且つ抗原提示細胞により分泌されるインターロイキンであるＩＬ−12のメッセンジャーＲＮＡの発現に対するAY 9944の効果を研究した。106個の細胞を溶解せしめ、常用技術を使ってＤＮＡを抽出し、市販の逆転写酵素を使って対応するＲＮＡを得、次いで所望のＲＮＡに相当するプライマーを使ったＰＣＲによりそれらを増幅せしめた。結果は、AY 9944がＩＬ−12をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を増加させることを示す。ＰＣＲ技術は、ＩＬ−12の２つのサブユニット（Ｐ40：ライン１〜４；Ｐ35：ライン５〜８）に相当する次の式を有する２つの異なるプライマーを使って実施した：
0004037450.tif 000005
グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNA（ライン９〜12）を比較として実験した。
試験化合物は他の機序の中でも転写レベルに対して作用し、HIV-Ｉのようなレトロウイルスにより抑制されている或る種の遺伝子の発現現象を回復させるようだ。従って、その作用は病原性物質によりゲノムレベルで誘発される初期妨害よりも上流に観察される。
実施例６
細胞分化に対する効果
単核細胞の分化に対する効果を調べる目的で別の実験を行った。
AY 9944の存在下で６日間培養した後、ＡＩＤＳ患者の末梢血から得られた単核細胞集団の中の活性マクロファージの比率に実質的な増加が観察された。
実施例７
試験管内（無細胞抽出物）において測定される逆転写酵素に対する効果
AY 9944で処置した培養物の上澄液中のＲＴ活性の減少（図３参照）が、該化合物の直接阻害作用のためでないことも証明された。図６は、無細胞抽出物の場合には、試験物質がどれも使用した濃度範囲（10-6〜10-5Ｍ）でＲＴ活性を有意に阻害しなかったことを示す。
AY 9944を使って得られた結果は左側から３番目と４番目のカラムに示され、それより右側の他のカラムは別の試験化合物の結果に相当する。
結論として、式（Ｉ）の化合物は逆転写酵素の阻害剤ではない。これはそれらの活性が独特の性質のものであることを確証し、前記化合物は現存するＡＺＴタイプの薬剤と作用の共通点を持たない。
実施例８
両親媒性陽イオン分子で処置したリンパ球のＨＩＶ感染に対する試験管内保護
健康な個体の末梢血からのリンパ球を使用し、高ウイルスチャージに対する試験化合物の効果をモニタリングするために強ビルレント株（ＨＩＶ−IIIＢ）により試験管内で二次感染させた。図７は、この場合、ウイルス感染前に一週間に渡り化合物（３×10-6Ｍの試験化合物）で予備処置しておいた細胞では、該ウイルスの細胞変性効果から細胞を保護したことを示す。
実施例９〜12
ＡＩＤＳ患者からの単核細胞をフィコール勾配により単離し、そして植物性血球凝集素（ＰＨＡ）を使って37℃で一晩活性化した。次いでそれらを洗浄し、そして40 UI／mlのインターロイキン２（組換え体、Roussel-Uclaf）および試験濃度、即ち３×10-6ＭのAY 9944の存在下または非存在下で、補体除去済の10％ウシ胎児血清が補足されたRPMI培地中で洗浄しそして８×105／mlにまで培養した。１または複数の試験化合物での処置を用いてまたは用いずに、細胞生存度（トリパンブルー試験）を計測し、そして３日毎にモニタリングしそして培地を新しいのと交換した。
10日目に、培地中で生産されたIFN γ，MIP1α，MIP1βおよびRantesの量を測定した。その結果を図８，９、10および11に示す。左２つのカラムは１人の患者（Ｆ７）に相当し、その他のカラムは別の患者（Ｆ130）に相当する。各患者について、左側のカラム（−）はAY 9944の非存在下での生産を表し、そして右側のカラム（＋）はAY 9944の存在下での生産を表す。
いずれの場合でも、サイトカイン合成はAY 9944の存在下でかなり増加し、それらの生産は４週間の培養の間中高レベルに維持された。
実施例13
AY 9944と抗ウイルス性化合物との相乗効果
Ｈ９ヒト細胞系の細胞にウイルス株HIV-HTLVIIIＢを感染させた。
３日毎に10％ウシ胎児血清が補足されたRPMI培地中にリンパ球を３×105細胞／mlの濃度で取り出した。
AY 9944、ＡＺＴまたはAY 9944とＡＺＴの混合物を培地に添加した。
30日間培養した後、Ｐ24テストを使ってウイルスの存在を測定し、トリチル化チミジンの取込みにより細胞増殖を測定し、トリパンブルー排除試験により細胞生存度を測定し、そして細胞により発現されるＣＤ４分子の比率を測定した。
それらの結果を下記の表に示す。−ｖは「ウイルス無し」を表し、＋ｖは「ウイルス有り」を示す。
AY 9944が３×10-8ＭそしてＡＺＴが１μg/mlの用量から大きな相乗効果が観察されたが、３×10-6Ｍの用量の単独のAY 9944はほとんど効果がなく（ｐ24＝70）、１μg/mlの用量のＡＺＴは全く効果が無かった（ｐ24＞1000）。
AY 9944はウイルスにより阻害された細胞増殖に対して回復効果を有する。
細胞死亡率の減少も観察された（１μg/mlのＡＺＴ単独の場合の58％から、わずか３×10-8Ｍの濃度でAY 9944を添加すると11％への減少）。
最後に、ＡＺＴ（１μg/ml）に３×10-8Ｍの濃度のAY 9944を加えると、ＣＤ４表現型が26％から正常値の83％に回復した。
それらの結果を下の表に示す。この表は、ＨＩＶ増殖、リンパ球に対するそれの溶解作用およびＣＤ４抗原発現に対するＡＺＴとAY 9944の累積効果を表す。それらの結果は、分離株（ＨＩＶ−１IIIＢ）により感染させたＨ９細胞を４週間培養後に得られた。リンパ球を３日毎に継代し、３×10-5／mlの濃度で接種した。
下表の結果が示す通り、抗ウイルス作用を有する（ｐ24＝０）10μg/mlのＡＺＴは、ＡＺＴの存在が細胞増殖を28,000cpmに減らしたことから、免疫細胞系Ｈ９の細胞に対する抑制作用（増殖抑制）も有する。この濃度のＡＺＴにＡＹを加えると（表の６段目）、細胞増殖は47,000cpmに増加した。このことは、増殖抑制作用を有する薬剤（10μg/mlのＡＺＴ）の活性とは対照的に、細胞増殖に対するAY 9944の回復効果を示す。
0004037450.tif 000006
実施例14
次の処方箋に従って錠剤を調製した：
トランス−１，４−ビス〔２−クロロベンジル
アミノメチル〕シクロヘキサン二塩酸塩          ……10mg
錠剤を完成させるための賦形剤、適量            ……100mgまで
（賦形剤の詳細：ラクトース、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム）
実施例14
次の処方箋に従って分割可能な錠剤を調製した：
トランス−１，４−ビス〔２−クロロベンジル
アミノメチル〕シクロヘキサン二塩酸塩          ……15mg
錠剤を完成させるための賦形剤、適量            ……100mgまで
（賦形剤の詳細：ラクトース、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム）
実施例15
次の処方箋に従って分割可能な錠剤を調製した：
トランス−１，４−ビス〔２−クロロベンジル
アミノメチル〕シクロヘキサン二塩酸塩          ……15mg
ＡＺＴ                                        ……100mg
錠剤を完成させるための賦形剤、適量            ……250mgまで
（賦形剤の詳細：ラクトース、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム）
【図１】
0004037450.tif 000007
【図２】
0004037450.tif 000008
【図３】
0004037450.tif 000009
【図４】
0004037450.tif 000010
【図５】
0004037450.tif 000011
【図６】
0004037450.tif 000012
【図７】
0004037450.tif 000013
【図８】
0004037450.tif 000014
【図９】
0004037450.tif 000015
【図１０】
0004037450.tif 000016
【図１１】
0004037450.tif 000017