(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトカルシトニンを特異的に認識するモノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体Ｎo.２(ハイブリドーマＨＣＴ-Ｍ-０２から産生される抗体)およびモノクローナル抗体Ｎo.８(ハイブリドーマＨＣＴ-Ｃ-０８から産生される抗体)からなる群から選択されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトカルシトニンを特異的に認識するモノクローナル抗体であって、サンドイッチ法において固定化抗体として使用されるモノクローナル抗体Ｎo.２(ハイブリドーマＨＣＴ-Ｍ-０２から産生される抗体)および二次抗体として使用されるモノクローナル抗体Ｎo.８(ハイブリドーマＨＣＴ-Ｃ-０８から産生される抗体)からなるモノクローナル抗体Ｎo.２およびＮo.８。
【請求項３】
サンドイッチ法により試料中のヒトカルシトニン量を測定するための免疫測定法であって、固定化抗体としてモノクローナル抗体Ｎo.２(ハイブリドーマＨＣＴ-Ｍ-０２から産生される抗体)を使用し、二次抗体としてモノクローナル抗体Ｎo.８(ハイブリドーマＨＣＴ-Ｃ-０８から産生される抗体)を使用することを特徴とする測定法。
【請求項４】
ヒトカルシトニンを抗原としてマウスを免疫し、該マウスより得た抗体産生能を有する脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させて得られる、ヒトカルシトニンを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株であって、ハイブリドーマＨＣＴ-Ｍ-０２およびＨＣＴ-Ｃ-０８からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトカルシトニンに高い親和性を有するモノクローナル抗体、特にサンドイッチ検定法に適するモノクローナル抗体に関する。該モノクローナル抗体を使用することによって、血清中に産生されるヒトカルシトニン量を高感度に定量することができ、治療や診断におけるヒトカルシトニンの動態を的確に判断することができる。
【０００２】
【従来の技術】
カルシトニン(ＣＴ)は、３２個のアミノ酸からなるペプチドホルモンであり、哺乳類においては甲状腺Ｃ細胞から分泌される。その生理作用は、骨に対する骨吸収抑制による血中カルシウム低下や腎臓に対する尿中無機リンの排泄促進による血清リン低下などが知られているが、未だ不明な点も多い。
【０００３】
現在、血中ヒトカルシトニン(ｈＣＴ)の測定にはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)法が用いられており、甲状腺髄様癌の診断、治療経過の観察、家族性甲状腺髄様癌のスクリーニングに、あるいは異所性ｈＣＴ産生腫瘍の診断に利用されている。しかし、市販されているＲＩＡキットは、抗ｈＣＴポリクローナル抗体を用いたものであり、種々のエピトープに対する抗体の混合物であるため、血中ではモノマーｈＣＴ以外の分解物も測定している可能性がある。従って、このようなポリクローナル抗体を用いたＲＩＡ法による測定では、正確に血中ｈＣＴを測定することはできないと考えられる。また、感度も３０pg／ml程度と低く、正常人の血中ｈＣＴ濃度を正確に測定することができない。
【０００４】
一方、ｈＣＴと特異的に結合するモノクローナル抗体は、ｈＣＴのある特定部分(エピトープ)のみを認識して結合するため、特異的かつ高感度な測定システムを構築することができる。特に、ｈＣＴの互いに異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法を構築すれば、分解物などの干渉を受けずにモノマーｈＣＴのみを特異的に測定できると考えられる。
【０００５】
サンドイッチ法は、エピトープの異なる２種類のモノクローナル抗体を用いる測定法である。一方のモノクローナル抗体を固相に固定し、次に試料を反応させることにより、試料中の抗原はモノクローナル抗体を介して固相に固定される。さらに、もう一方の標識したモノクローナル抗体を反応させることにより、固定された抗原を介して標識したモノクローナル抗体が固定される。最終的に固定された標識物質を検出することにより、抗原量を測定することができる。
【０００６】
高感度のサンドイッチ法を構築するためには、サンドイッチ法に適したモノクローナル抗体の組合せを見い出すことが必要である。このようなモノクローナル抗体の最適組合せを見い出すためには、入手可能なモノクローナル抗体の全ての組合せを用いてサンドイッチ法を構築し、最も高い感度を発現するモノクローナル抗体の組合せを選択することが必要である。
【０００７】
既に、血中ｈＣＴを測定するサンドイッチ法についてはいくつかの報告があり、感度および精度ともにＲＩＡ法より優れていることが確認されている。しかし、その感度は、正常人の血中ヒトカルシトニンレベルを測定するには未だ不十分である。
【０００８】
本発明者らは、甲状髄様癌および他の臓器の悪性腫瘍に特異的に感応して血中のヒトカルシトニン量が上昇するという公知の事実に鑑み、甲状髄様癌および他の臓器の悪性腫瘍においてその動態を的確かつ簡便に判断するために、既にヒトカルシトニンに特異的に反応するモノクローナル抗体を作製し、特許出願をしている(特開平０５−１０３６８９号)。しかし、これらのモノクローナル抗体をサンドイッチ法に用いた場合、どの組合せを用いても感度の点でなお不十分であることがわかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はヒトカルシトニンのサンドイッチ法による免疫測定法において、正常人の血中ヒトカルシトニン濃度を高感度に測定できる高感度なモノクローナル抗体を提供するものである。また、本発明は該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、該抗体の製造方法、および該抗体を用いるヒトカルシトニンの高感度かつ迅速な測定法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今回新たに、抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を細胞融合法によって樹立し、得られたモノクローナル抗体の最適組合せを検討することにより、サンドイッチ法による高感度なヒトカルシトニン検出法を実現するモノクローナル抗体を選択した。この結果、後記実施例に示す特定のモノクローナル抗体の組合せが、特にサンドイッチ法において高感度を与えることを見い出した。
上記目的のためには、ハイブリドーマＨＣＴ-Ｍ-０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、ＨＣＴ-Ｃ-１５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体が特に適していることを見い出した。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は細胞融合法によって得ることができる。即ち、抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ヒトカルシトニンに特異性を示すクローンを選択し、該クローンを培養し、産生されたモノクローナル抗体を回収することによって目的の抗体を得ることができる。
【００１２】
抗体産生細胞は、例えば、ヒトカルシトニンまたは所望により担体タンパク質と結合させたヒトカルシトニンコンジュゲートを適当なアジュバントと混合し、この混合物を用いて免疫した動物の脾臓細胞またはリンパ節由来のＢ細胞などであってよい。
免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどを用いることができる。
【００１３】
抗原となるヒトカルシトニンは化学的に合成することができる。ヒトカルシトニンコンジュゲートを調製する際の担体タンパク質としては、例えばオボアルブミンを挙げることができ、また、架橋試薬としては、例えば１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを挙げることができる。
免疫は、例えば、ヒトカルシトニンコンジュゲート４〜４０mgを動物の腹腔内に２〜３週間の間隔で３〜４回投与することにより行ってよい。追加免疫の３日後に免疫動物より抗体産生細胞を回収する。
【００１４】
抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合は常法に従って行ってよい。ミエローマ細胞としてはマウス、ラット、ヒトのものを使用することができる。細胞融合法としてはポリエチレングリコール法、電気的融合法などが挙げられる。
【００１５】
細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択は、例えば、ラジオイムノアッセイ、あるいは酵素標識抗体法(ＥＬＩＳＡ)、蛍光標識抗体法等によって行う。即ち、ヒトカルシトニンとハイブリドーマ培養上清を反応させ、ヒトカルシトニンに特異性を示す抗体を産生しているハイブリドーマを選択し、限界希釈法によってクローニングを行う。
【００１６】
モノクローナル抗体の回収は、例えば次のようにして行うことができる。選択したクローンを、例えば、予めプリスタン(２,６,１０,１４−テトラメチルペンタデカン)を投与したマウスの腹腔に移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を含む腹水を回収する。腹水からの抗体の回収は硫安分画法、イオン交換クロマトグラフ法あるいはアフィニティークロマトグラフィー等により容易に達成される。
【００１７】
サンドイッチ法に最適なモノクローナル抗体の組合せの探索は、通常、作製したモノクローナル抗体の全てを組合せたサンドイッチ法を検討し、最も高い感度を発現するモノクローナル抗体の組合せを見い出すことにより行う。
【００１８】
得られたモノクローナル抗体を用いて、生体中、例えば血清あるいは血漿中のヒトカルシトニンを特異的かつ高感度に測定することができる。測定のために抗体を酵素、蛍光物質あるいは放射性同位体等で標識することができ、常法に従ってサンドイッチ酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイあるいはラジオイムノアッセイ等の免疫学的測定法を行うことができる。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体の作製
(１)抗原の調製
後記の表５に示す３２個のアミノ酸からなるヒトカルシトニンペプチドを、通常のペプチド合成法により合成した。このペプチド抗原の免疫原性を高めるため、架橋試薬を用いて担体タンパク質に結合させた。即ち、２５mg／mlヒトカルシトニン水溶液(２２.４μl)に、１０mg／mlオボアルブミン水溶液(１６.８μl)と１００mg／mlの１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(１６.８μl)を添加し、一晩反応させた。この反応液を蒸留水に対して透析し、１０mg／mlのヒトカルシトニンを含むヒトカルシトニンコンジュゲート溶液とした。
【００２０】
(２)マウスの免疫
１０mg／mlのヒトカルシトニンを含むヒトカルシトニンコンジュゲート溶液(１００μl)をフロイントの完全アジュバント(１００μl)と混合した。この混合液(２００μl)を、２〜３週間の間隔で３〜４回、ＢＡＬＢ／cマウスの腹腔内に投与して免疫した。
【００２１】
(３)細胞融合
最終免疫より２０〜４０日経過後に１０mg／mlのヒトカルシトニン(１００μl)を３日間連続して投与し、さらにその３日後に脾臓をマウスより摘出して脾臓細胞を回収した。マウスミエローマ細胞(Ｐ３Ｘ６３Ａg８Ｕ１)は、１５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ溶液で予め３７℃のＣＯ2インキュベーター内で培養した。０.５〜１×１０8個の脾細胞と２×１０7個のミエローマ細胞を５０mlの遠心管に入れ、十分に混合した。混合した細胞に０.５mlの５０％ポリエチレングリコール１５００を含む７５mＭ ＨＥＰＥＳ溶液を加え、穏やかに混合して脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させた。次に、この細胞混合液にＤＭＥＭ溶液(４０ml)を穏やかに混合しながら約１０分間以内に加え、さらに、１５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ溶液(３０ml)を穏やかに混合しながら約１０分間以内に加えた。この細胞融合操作は３７℃で行った。融合細胞を含む溶液(７０ml)を９６ウエルのプレート２枚に分注し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で一晩培養した。未融合のミエローマ細胞と融合細胞は、ＨＡＴ培地で選別した。即ち、一晩培養した培養液の半量(０.１ml)を、１０μＭヒポキサンチン、０.４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンおよび１５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ溶液(ＨＡＴ培地)と交換し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で培養を継続して、未融合のミエローマ細胞を死滅させた。
【００２２】
(４)抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
ハイブリドーマのスクリーニングはラジオイムノアッセイ法により行った。増殖が認められたウエルの培養上清(１００μl)を採取し、これに125Ｉで標識したヒトカルシトニン(１００μl)および未標識ヒトカルシトニン(１００μl)を加えて反応させた。次いで、５０％ポリエチレングリコール６０００(１００μl)を反応系に添加して沈澱させ、その放射活性を測定した。抗体産生が確認できたウエル中のハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングした。ハイブリドーマは１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。以上の方法で１８種類のクローンを樹立した。
【００２３】
(５)モノクローナル抗体の大量調製と精製
マウスの腹腔内へ、プリスタン[２,６,１０,１４−テトラメチルペンタデカン(和光純薬)](０.５ml)を注射し、２週間以上マウスを飼育した。予め増殖させていたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を回収し、ＤＭＥＭで細胞数が約４×１０6個／mlになるように希釈した。この細胞液(０.５ml)をマウスに腹腔内注射し、１〜３週間後に腹部を切開し、パスツールピペットで腹水を回収した。採取した腹水は、等量の溶血液と混合したのち、２０００rpmで１０分間遠心し、得られた上清をモノクローナル抗体溶液とした。
このモノクローナル抗体溶液から、マウスＩgＧ精製キット[アフィゲルプロテインＡ ＭＡＰＳ−II、バイオラッド(BIO-RAD)社]を用いたプロテインＡカラムクロマトグラフィーによって、モノクローナル抗体を精製した。
【００２４】
実施例２  サンドイッチ法に最適なモノクローナル抗体の選択
実施例１で得られたモノクローナル抗体を用いてサンドイッチ法を実施することにより、サンドイッチ法に最適なモノクローナル抗体を選択した。
精製したモノクローナル抗体を、ビオチン化キット[アマーシャム(Amersham)]を用いてビオチン標識した。精製したモノクローナル抗体を、ＮＡＰ−２５カラムで脱塩処理し、定量したのち、モノクローナル抗体(１mg)を分注し、凍結乾燥した。凍結乾燥試料を５０mＭホウ酸ナトリウム緩衝液(pＨ８.６)(１ml)に溶解し、ビオチン化試薬(４０μl)を加え、室温で振盪しながら１時間反応させた。ＮＡＰ−２５カラムで未反応試薬を除去し、１００mＭ ＮaＮ3(１８０μl)を加え、ビオチンラベル化モノクローナル抗体とした。
【００２５】
固定化抗体１８種類、二次抗体１８種類の全ての組合せについてサンドイッチ法を実施した。マイクロタイタープレート[コースター(Costar)社]の各ウエルに固定化抗体[１０μg／mlの精製抗体を含む５０mＭ炭酸緩衝液(pＨ９.６)]を５０μlずつ満たし、４℃で一晩放置した。次いで、固定化抗体を除き、ＰＢＳで洗浄したのち、ブロック液[４倍希釈のブロックエース(雪印乳業)]を２００μlずつ満たし、室温で１時間放置した。次いで、ブロック液を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、抗原溶液(５ng／mlのｈＣＴを含む１０倍希釈のブロックエース溶液)を５０μlずつ満たし、室温で２時間放置した。次いで、抗原溶液を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、二次抗体(１００倍希釈のビオチンラベル化抗体を含む１０倍希釈のブロックエース溶液)を５０μlずつ満たし、室温で２時間放置した。次いで、二次抗体を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、酵素溶液[５００倍希釈のＨＲＰ−ストレプトアビジン(アマーシャム)を含む１０倍希釈のブロックエース溶液]を５０μlずつ満たし、室温で２時間放置した。次いで、酵素溶液を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、基質溶液(１２mg／mlのｏ-フェニレンジアミンを含む１００mＭクエン酸緩衝液(pＨ４.５)]を２００μlずつ満たし、室温で１５分間反応させた。６Ｎ Ｈ2ＳＯ4(５０μl)を加えて反応を停止させ、４９０nmでの吸光度を測定した。
【００２６】
１８種類のモノクローナル抗体の全ての組合せについて、サンドイッチ法によりヒトカルシトニンの測定を試みた結果を以下の表１に示す。
【表１】
0004037933.tif 000002
【００２７】
この結果、以下の表２に示す(a)〜(e)のモノクローナル抗体の組合せを用いたサンドイッチ法により、ヒトカルシトニンを高感度に測定することが可能であることがわかった。
【表２】
0004037933.tif 000003
【００２８】
表２に挙げた６種類のモノクローナル抗体Ｎo.２、Ｎo.８、Ｎo.１１、Ｎo.１５、Ｎo.１６およびＮo.１８をそれぞれ産生する６種類のハイブリドーマＨＣＴ-Ｍ-０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、ＨＣＴ-Ｃ-１５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８は、平成８年(１９９６)１１月２１日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号として、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−５７５０、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５２、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４９、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５３、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５７５４を取得している。
【００２９】
実施例３  モノクローナル抗体の特性化
次に、上記表２の組合せを構成する６種類のモノクローナル抗体の性質について検討した。
(１)アイソタイプの分析
選択した６種類のモノクローナル抗体について、アイソタイプを分析した。０.２５ng／mlのヒト合成カルシトニン(５０μl)をＥＬＩＳＡプレート(コースター社)の各ウエルに加え、３７℃で１時間反応させて固相化抗原とした。ブロッキング剤(３００μl)を加えて３７℃で２時間静置したのち、各精製抗体(５〜５０ng)を添加し、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、マウスタイパーサブアイソタイピングパネル(バイオラッド社)添付の各アイソタイプに対する抗体(５０μl)を加えて、３７℃で１時間反応させた。次いで、パーオキシダーゼ標識抗体(５０μl)を添加し、室温で１時間静置した。ウエルを十分に洗浄したのち、２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、測定波長:４９０nm、対照波長:６５５nmにおける吸光度を測定した。
【００３０】
表３に示したように、ＨＣＴ-Ｃ-１５およびＨＣＴ-Ｍ-１６はＩgＧ２a、その他のクローンはＩgＧ１であり、Ｌ鎖はいずれもκであった。これらの結果を表４にまとめた。
【表３】
0004037933.tif 000004
【表４】
0004037933.tif 000005
【００３１】
(２)エピトープ部位の解析
合成ヒトカルシトニンペプチド(３.４×１０-11モル)をＥＬＩＳＡプレート(コースター社)に加え、３７℃で１時間反応させて固相化抗原とした。ウエルを洗浄したのち、ブロッキング剤(３００μl)を加えて３７℃で２時間静置した。
次いで、各精製抗体(５〜５０ng)を添加し、３７℃で１時間反応させた。３０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスＩgＧ(γ鎖認識)抗体(５０μl)を添加して室温で１時間反応させたのち、０.１５％Ｈ2Ｏ2含有０.１％ｏ-フェニレンジアミン溶液(５０μl)を加えて室温で１０分間反応させた。２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、測定波長:４９０nm、対照波長:６５５nmにおける吸光度を測定した。
【００３２】
解析に用いた合成ヒトカルシトニンペプチドの配列は、以下の表５に示した通りである。
【表５】
0004037933.tif 000006
【００３３】
エピトープ部位の解析結果を以下の表６に示す。抗カルシトニンモノクローナル抗体産生クローンは、表７にまとめたように、それぞれヒトカルシトニンのＮ末端側、中央部分、またはＣ末端側を認識した。
【表６】
0004037933.tif 000007
【表７】
0004037933.tif 000008
【００３４】
(３)抗体価(親和性)の測定
０.２５ng／mlのヒト合成カルシトニン(５０μl)をＥＬＩＳＡプレート(コースター社)の各ウエルに加え、３７℃で１時間反応させて固相化抗原とした。ブロッキング剤(３００μl)を加えて３７℃で２時間静置した。次いで、ウエルを十分に洗浄し、各精製抗体を０.０１ng／ml〜１０００ng／mlの濃度に調整し、５０μlずつ添加した。３７℃で１時間反応させたのち、パーオキシダーゼ標識抗体抗マウスＩgＧ(Ｈ＋Ｌ鎖認識)(５０μl)を添加し、室温で１時間静置した。ウエルを十分に洗浄したのち、０.４２％Ｈ2Ｏ2含有４０％Ｏ−フェニレンジアミン溶液(２００μl)を加えて室温で１５分間反応させた。次いで、３Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、測定波長:４９０nm、対照波長:６５５nmにおける吸光度を測定した。
【００３５】
抗体量−反応性曲線を作成し(図１)、本条件下、ＯＤ４９０／ＯＤ６５５が１.０である抗体濃度(Ｍ)の逆数を抗体価とした。表８に示すように、得られたモノクローナル抗体はヒトカルシトニンに高い特異性を示した。
【表８】
0004037933.tif 000009
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、ヒトカルシトニンに対して高親和性を有するモノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクローナル抗体を利用することにより、ヒトカルシトニンのための高感度かつ高精度のサンドイッチ法による免疫測定法を構築することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のモノクローナル抗体について、抗体の濃度−抗原との反応性の関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
0004037933.tif 000010