(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２位脱硫酸化ヘパリン又はＮ脱硫酸化Ｎアセチル化ヘパリンと、塩基性線維芽細胞増殖因子とを有効成分として含有する細胞間連絡亢進剤。
【請求項２】
細胞間連絡亢進が、ギャップ機能の亢進による、請求項１記載の細胞間連絡亢進剤。
【請求項３】
Ｎ脱硫酸化Ｎアセチル化ヘパリンと、塩基性線維芽細胞増殖因子とを有効成分として含有するコネキシン発現増強剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、硫酸基を有する特定のグリコサミノグリカンを有効成分とする細胞間連絡亢進剤、及びコネキシン発現増強剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞のシグナル伝達は、分泌によるシグナル伝達（ホルモンなど）、細胞膜に結合した分子によるシグナル伝達（シナプスなど）、及びギャップ結合（以下「GJ」と略記する）によるシグナル伝達によって主になされている。細胞間のシグナル伝達は、生理活性物質の伝搬や、細胞間の電位の伝達等に重要な役割を果たし、生体組織の活動に寄与している。その中でも特にGJによるシグナル伝達は、細胞同士が微細構造により結合することによってなされるため、最も直接的で確実なシグナル伝達がなされ、特に組織中の細胞の統制において重要な役割を果たしている。
【０００３】
このような細胞間の連絡を担うGJは細胞膜タンパク質であるコネキシンが6分子結合した細胞膜微細チャンネル構造（コネクソン）が隣接する２個の細胞間で会合することにより形成される。
【０００４】
細胞間のGJの働きが健常状態よりも減衰すると、正常な組織の生理活動が妨げられる。このような疾病としては例えば紅斑角皮症（Hum. Genet. (2000) 106, 321-329）、ヒルシュプリング病（J. Pediatr. Surg. (2000) 35, 823-828）、慢性高血圧症（Liver (2000) 20, 104-107）、Left venticular hypertrophy（Cardiovasc. Pathol. (1999) 8, 1-6）、腫瘍（Carcinogenesis (2000) 21, 311-315）、自己免疫性甲状腺炎（Thyroid (1997) 7, 913-921）等が知られている。
【０００５】
従って、ギャップ機能の亢進をはじめとする細胞間連絡を亢進することは、これらの疾病の症状の改善、治療、予防のために役立つと考えられていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このようにGJの機能（ギャップ機能）をはじめとする細胞間連絡を亢進する働きを有し、生体にとって安全性が高い細胞間連絡亢進剤が期待されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み、細胞間連絡を亢進する物質を鋭意探索した結果、驚くべきことにヘパリンの誘導体である硫酸基を有する特定のグリコサミノグリカンが、ギャップ機能を強く亢進して細胞間連絡を亢進する働きがあることを見い出し、本発明に至った。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  グルコサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンを有効成分として含有し、該グリコサミノグリカンが、２位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていないヘキスロン酸残基又は2位アミノ基がスルファミノ化されていないグルコサミン残基を含むことを特徴とする細胞間連絡亢進剤。
（２）  細胞間連絡亢進が、ギャップ機能の亢進による、（１）記載の細胞間連絡亢進剤。
（３）  更に増殖因子を含むことを特徴とする（１）又は（２）記載の細胞間連絡亢進剤。
（４）  増殖因子が線維芽細胞増殖因子であることを特徴とする（３）記載の細胞間連絡亢進剤。
（５）  コネキシンの発現を増強することを特徴とする（１）乃至（４）いずれか一項記載の細胞間連絡亢進剤。
（６）  グルコサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンを有効成分として含有し、該グリコサミノグリカンが、2位アミノ基がスルファミノ化されていないグルコサミン残基を含むことを特徴とするコネキシン発現増強剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により、詳述する。尚、本明細書中において、細胞間連絡（機能）とは、ホルモンや電気刺激、化学物質の拡散による細胞同士の連絡、及び細胞同士のGJによる連絡の双方を含む概念であって、ギャップ機能とは、上記GJの細胞間連絡を行う機能として使用する。
【００１０】
（１）本発明亢進剤
本発明はグルコサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンを有効成分として含有し、該グリコサミノグリカンが、２位に硫酸基を有しないヘキスロン酸残基又は2位に硫酸基を有しないグルコサミン残基を含むことを特徴とする細胞間連絡亢進剤（以下「本発明亢進剤」とも記載する）である。
【００１１】
本発明亢進剤における硫酸基を有するグリコサミノグリカンは、グルコサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする多糖である。上記二糖は、グルコサミン残基にヘキスロン酸がβ-1,4-結合した構造を有している。ここでヘキスロン酸とは、ヘキソースの６位炭素原子がカルボキシル基を形成し、2位又は３位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていることもある六炭糖であり、具体的にはグルクロン酸又はイズロン酸を指称する。このような二糖の繰り返し構造からなる基本骨格は、一般にヘパリン骨格といわれている糖鎖である。
【００１２】
本発明における上記糖鎖は、硫酸基を有している。一般にヘパリン骨格においては、ヘキソサミン残基の6位ヒドロキシル基及びヘキスロン酸残基の2位ヒドロキシル基、もしくは同3位ヒドロキシル基において、硫酸エステル化されており、更にヘキソサミン残基の2位アミノ基がスルファミノ化されている。本発明の上記の硫酸基を有するグリコサミノグリカンは、2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていないヘキスロン酸又は2位アミノ基がスルファミノ化されていないグルコサミン残基のいずれかを含んでいる。更に、2位アミノ基がスルファミノ化されていないグルコサミン残基の該アミノ基はアセトアミド化されていることが好ましい。
【００１３】
本発明亢進剤に含まれる上記グリコサミノグリカンは、重量平均分子量が4,000〜23,000程度が好ましく、4,500〜20,000を有していることが更に好ましい。重量平均分子量は、Kaneda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 220, 108-112(1996)に従って、測定することができる。
【００１４】
本発明亢進剤は、in vivo又はin vitroにおいて隣り合う細胞同士の細胞間連絡を亢進するものであればよく、GJを経由したギャップ機能を亢進するものであることが好ましい。本発明亢進剤の効果は、例えばEnviron Sci.Technol.29,2923-2928(1995)に記載されたScrape-loading and dye transfer(SLDT：色素移行)法により、容易に確認することが可能である。
【００１５】
また、本発明亢進剤は、増殖因子を更に含んでいてもよい。該増殖因子としては、例えばヒト男性ホルモン誘導性増殖因子（AIGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、インスリン様成長因子（IGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、毛様体神経成長因子（CNTF）、線維芽細胞増殖因子（FGF（酸性線維芽細胞増殖因子（aFGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）））、血小板由来増殖因子（PDGF）、脳由来成長因子（BNDF）、神経細胞増殖因子（NGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、血管内皮細胞増殖因子（ECGF）、幹細胞増殖因子（CSF）、ミッドカイン（MK）、インターフェロンγ（IFN-γ）、角質細胞成長因子（KGF）、CXCケモカイン、インターロイキン８（IL-8）、ビトロネクチン（VN）、ヘパリン結合性脳細胞分裂誘発因子（HBBM）、及びヘパリン結合性神経突起伸長促進因子（HBNF）等が例示され、FGFがその中でも好ましく、特にbFGFが好ましい。但し、これらの増殖因子を本発明亢進剤が含んでいなくとも、生体内にはこれらの増殖因子が存在するため、生体内に存在する増殖因子と硫酸基を有するグリコサミノグリカンとの相互作用によって所望の効果を奏することも可能である。
【００１６】
また更に、本発明亢進剤はその細胞間連絡を亢進する働きを妨げることがない多糖を含んでいても良い。この場合の多糖としては、グリコサミノグリカンが好ましく、特に硫酸基を有しないグリコサミノグリカンが好ましい。このようなグリコサミノグリカンとしてはヒアルロン酸及びコンドロイチンが例示され、ヒアルロン酸が最も好ましい。
【００１７】
このような細胞間連絡を亢進する本発明亢進剤は、有効成分である硫酸基を有するグリコサミノグリカンが、生体内に存在するグリコサミノグリカンと近似した構造を有するため、生体に対し高い安全性を有していると考えられ、たとえば紅斑角皮症、ヒルシュプリング病、慢性高血圧症、Left venticular hypertrophy、腫瘍、自己免疫性甲状腺炎等の治療剤として使用することも可能であると考えられる。
【００１８】
また、更にギャップ機能の亢進によって、結合組織の細胞間及び細胞と細胞外マトリクスとの連絡の亢進を通じて相互作用の活性化を図ることが可能である。従って、たとえば骨細胞、軟骨細胞等の生体内での再生を促す目的で、本発明亢進剤を投与したり、又は生体外での培養系において、培養時に本発明亢進剤を培地に添加することで、より強固な骨又は軟骨組織の生成又は調製を可能とする。
【００１９】
（２）本発明増強剤
本発明はグルコサミン残基とグルクロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンを有効成分として含有し、該グリコサミノグリカンが、2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていないグルコサミン残基を上記グリコサミノグリカンが含むことを特徴とするコネキシン発現増強剤（以下「本発明増強剤」とも記載する）である。
【００２０】
本発明増強剤に含まれるグリコサミノグリカンは上記本発明亢進剤に含まれるグリコサミノグリカンのうち、2位アミノ基がスルファミノ化されていないグルコサミン残基を有するグリコサミノグリカンである。
【００２１】
このようなグリコサミノグリカンは、コネキシンの発現を増強する。ここで、コネキシンの発現とは、遺伝子の転写の増加（遺伝子レベルでの転写・翻訳の増加）及びタンパク質量の増加（正常な立体構造を維持する働き（分子シャペロンなど）の増強によって、抗体などにより認識される正常の立体構造を有するタンパク質の増加）のいずれもを包含する概念である。本発明増強剤のコネキシン発現の増強作用は、例えば後述の実施例２に従って、タンパク質レベルでの発現の増強を確認することが可能であり、また、例えば前者はCX遺伝子の転写産物であるmRNAをPCR法などの公知の手法（Cancer Res. (1998) 58, 5089-5096）を用いて遺伝子の転写レベルでの発現の増強を行うことにより確認することも可能である。
【００２２】
本発明増強剤は、増殖因子を更に含んでいることが好ましい。該増殖因子としては、例えばAIGF、TGF、IGF、EGF、CNTF、FGF、PDGF、BNDF、NGF、HGF、VEGF、ECGF、CSF、MK、IFN-γ、KGF、CXCケモカイン、IL-8、VN、HBBM、及びHBNF等が例示され、FGFがその中でも好ましく、特にbFGFが好ましい。但し、これらの増殖因子を本発明増強剤が含んでいなくとも、生体内にはこれらの増殖因子が存在するため、生体内に存在する増殖因子と硫酸基を有するグリコサミノグリカンとの相互作用によって所望の効果を奏することも可能である。
【００２３】
また更に、本発明増強剤はその細胞間連絡を亢進する働きを妨げることがない多糖を含んでいても良い。この場合の多糖としては、グリコサミノグリカンが好ましく、特に硫酸基を有しないグリコサミノグリカンが好ましい。このようなグリコサミノグリカンとしてはヒアルロン酸及びコンドロイチンが例示され、ヒアルロン酸が最も好ましい。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
参考例１
2位脱硫酸化ヘパリンの調製
2位脱硫酸化ヘパリン（以下「2DSH」とも記載する）は、以下の方法によって調製した。すなわち、SPL社製のブタ小腸由来のヘパリンのナトリウム塩に対し、20倍量(v/w)の0.4N NaOHを添加して撹拌後、20分間室温に放置した。その後凍結乾燥し、凍結乾燥物に8倍量(v/w)の1N NaOHを添加、撹拌して30分間室温に放置し、さらに1.5倍量(v/v)の蒸留水を添加した。この溶液を3日間蒸留水に対する透析処理、さらに透析内液を凍結乾燥して調製した。
【００２５】
参考例２
N脱硫酸化Nアセチル化ヘパリンの調製
N脱硫酸化Nアセチル化ヘパリン（以下「NDSH」とも記載する）は以下の方法に従って調製した。すなわち、SPL社製のブタ小腸由来のヘパリンを常法によってピリジン塩とし、50倍量(v/w)の95%ジメチルスルホキシド水溶液を添加して50℃で90分間加熱処理した。その後等量(v/v)の蒸留水を添加し、これを3日間透析処理した後、透析内液を凍結乾燥してN脱硫酸化ヘパリンを得た。このN脱硫酸化ヘパリン100mgを50mMの炭酸水素ナトリウムを含む10%メタノール水溶液20mlに溶解、更に酢酸でpHを8.0に調整した。この溶液を400μlのアセトアルデヒドを氷冷下で6回、pHを炭酸水素ナトリウム飽和の10%メタノール水溶液で8.0に調整して激しく撹拌しながら添加し、1時間激しく撹拌を続けた。この溶液に60mlの蒸留水を添加し、蒸留水に対して3日間透析し、その後凍結乾燥してNDSHを得た。
【００２６】
実施例１
ヒト皮膚線維芽細胞の細胞間連絡制御の評価
ヒト皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast; NHDF)の細胞間連絡機能の亢進作用は、SLDT法に従って実施した。
【００２７】
具体的には、まずNHDF(2x10５/dish)をDMEM培地(35mm dish)中で3日間培養した後、培地中に被検物質(2DSH,NDSH)あるいは対照のヘパリン（ブタ小腸由来のヘパリン（SPL社製））（それぞれ最終濃度30μg/ml）、及びbFGF（最終濃度10ng/ml）を添加した。2DSH、NDSH又はヘパリン及びbFGFを無添加のものをコントロールとした。
【００２８】
その後、引き続き細胞を１日間継続培養し、100%コンフルエント状態を維持した。次いで、Ca2+及びMg2+を含むリン酸緩衝生理的食塩水（以下「PBS(+)」とも記載する）で４回洗浄した後、そのコンフルエント状態の表面にカミソリで直線的に切れ目をつけた。そして、1mlの0.1%の蛍光色素(Lucifer yellow)をdishに入れて５分間培養した後、PBS(+)で４回洗浄した。この状態にて、dishを蛍光顕微鏡で観察・測定し（図１）、蛍光強度につき解析ソフトウェアNIH Image（パブリックドメイン）を利用して分析・数値化した（図２、表１）。
【００２９】
【表１】
表１
0004035628.tif 000002
−：コントロールと同程度だった
−−：コントロールと比して抑制された
＋：コントロールと比して促進がみられた
＋＋：コントロールと比して顕著に促進された
【００３０】
その結果、NHDF培養3日目の培地中にbFGFのみを添加すると、コントロールと比較してギャップ機能及び細胞増殖を若干促進した。一方2DSHあるいはNDSHをbFGFとともに添加すると、何も添加しない対照の140%程度にまでギャップ機能を著しく亢進した。他方、ヘパリンのみを添加しても、その作用はコントロールと同程度にとどまった。さらに、NDSHを単独で添加した場合にはギャップ機能が抑制される結果が得られた。
【００３１】
また、使用したヘパリン、2DSH、及びNDSHは、WO00/06608に記載された重量平均分子量の測定法によると、ヘパリンが14,000Da、2DSHが12,000Da、NDSHが11,000Daだった。
【００３２】
また、これらのグリコサミノグリカンを、WO00/06608に記載された「グリコサミノグリカン分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせた酵素的二糖分析法」により分析した（表２）。表中ΔDiHS-0Sは2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコースを、ΔDiHS-NSは2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコースを、ΔDiHS-6Sは2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースを、ΔDiHS-USは2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコースを、ΔDiHS-di(6,N)Sは2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースを、ΔDiHS-di(U,N)Sは2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコースを、ΔDiHS-di(U,6)Sは2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースを、ΔDiHS-tri(U,6,N)Sは2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースをそれぞれ示す。
【００３３】
【表２】
表２
0004035628.tif 000003
【００３４】
実施例２
ヒト線維芽細胞のコネキシン発現制御の評価
NHDFのギャップ結合(GJ)を構成するコネキシン(CX)の発現量に及ぼす2DSH及びNDSHの効果は、2DSH又はNDSH（それぞれ最終濃度30μg/ml）とbFGF（最終濃度10ng/ml）とを培地中に添加してNHDFを培養した後、細胞ライセイトにつきウェスタンブロッティング(WB)法によって評価した（図３）。染色にはCX43の特異抗体であるウサギポリクローナル抗体（抗コネキシン43抗体ウサギIgG、Zymed社製）を用いた。
【００３５】
その結果、コントロール(2DSH又はNDSH及びbFGFとも無添加のもの)に比較して、bFGFあるいはNDSHをそれぞれ単独で添加した場合のバンドはいずれの場合も若干濃くなったのに対し、2DSH添加ではコントロールと同程度だった。bFGFと2DSHを両方とも添加した場合のバンドは、bFGF添加時と同程度であった。一方、bFGFとNDSHを両方とも添加した場合のバンドは、著しく濃くなっていた。これらのバンドが濃くなったことは、CXの発現を増強する働きがあることを示している。さらに、NDSHは単独では、CXの発現を若干増強するにもかかわらず、実施例１ではギャップ機能を抑制する働きが示唆されているため、実施例１及び２の結果を併せて考えると、NDSHにはギャップ機能抑制活性があると考えられる。
【００３６】
実施例３
軟骨組織の強度に対する効果
軟骨組織強度に対する本発明亢進剤の影響を調べた。すなわち、ヒト関節軟骨細胞（株式会社東洋紡販売）の2〜3代培養細胞を常法に従って調製し、この細胞を３次元培養用基材（カプロラクトンとL-乳酸から常法に従って調製した共重合体）を用い、培地として軟骨増殖培地（Cell Application社製）を使用して動的条件下で培養した。培地には上述の2DSH（30μg/ml）、ヒアルロン酸（500μg/ml）、及びbFGF（10ng/ml）を添加したものを使用した。2DSH及びbFGFを添加しない培地を使用して培養した群を対照とした。
【００３７】
４週間の培養後に、形成された軟骨組織を回収し、その機械的強度をテクスチャーメーター（SMS TAXT 2i/5Kgハイレゾタイプ、Stable Micro Systems製）で測定した。
【００３８】
その結果、対照と比較して、機械的強度は1.4倍以上（実験群平均0.92MPa、対照平均0.63MPa）に高まっていた。
【００３９】
【発明の効果】
細胞間連絡を効果的に亢進する、細胞間連絡亢進剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  細胞のギャップ機能を視覚化した図。
【図２】  細胞のギャップ機能を、イメージ解析により数値化した図。
【図３】  細胞のコネキシン発現量の変化を示す図。
【図１】
0004035628.tif 000004
【図２】
0004035628.tif 000005
【図３】
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