(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産することを特徴とする植物体の製造法であって、
植物プロモーターが以下の(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のＤＮＡを含む繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターであり
(ａ)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
(ｂ)(ａ)の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ
(ｃ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ、
植物プロモーターがそれに接続された目的遺伝子を、繊維形成・伸長時の繊維組織、ならびに花柱、葯、花弁および葉からなる群より選択される初期成長組織において発現させる、植物体の製造法。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを含む植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主ワタ植物細胞に導入して形質転換ワタ植物細胞を得て、該形質転換ワタ植物細胞から形質転換ワタ植物体を再生し、得られた形質転換ワタ植物体からワタ植物種子を得て、該ワタ植物種子からワタ植物体を生産することを特徴とするワタ植物体の製造法であって、
植物プロモーターが繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターであり、
植物プロモーターがそれに接続された目的遺伝子を、繊維形成・伸長時の繊維組織、ならびに花柱、葯、花弁および葉からなる群より選択される初期成長組織において発現させる、ワタ植物体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物においてプロモーター機能を有するＤＮＡ、いわゆる植物プロモーターに関する。さらに詳しくは、本発明は、ワタ植物においてワタ繊維などの発現を調節する植物プロモーターに関する。本発明の植物プロモーターは、真核生物または原核生物のいずれにおいても、外来遺伝子の発現を調節することが可能である。
【０００２】
【従来の技術】
プロモーターとは、ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ上のシグナルであり、特徴的な塩基の共通配列を有する。特に、真核生物においては、転写開始点の２０塩基前後上流に、「ＴＡＴＡボックス」と呼ばれる共通配列があり、転写開始に必要な部位であると考えられている。そして、目的のタンパクを大量に産生させるためには、より強力なプロモーターを用いることが有利であると考えられている。一般に、植物ではその活性が強いことから、カリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)の３５Ｓプロモーターがよく利用されており、実際、除草剤耐性植物やウイルス抵抗性植物の作出に用いられている。しかし、３５Ｓプロモーターは、組織特異性が低いので、組織特異性が要求される用途には適していない。これまで、組織特異性を有する植物プロモーターとして、シス因子、トランス因子の研究が行われているが、組織特異性を有する植物プロモーターを用いると、所望の植物器官において、導入した遺伝子の発現を調節することが可能な形質転換植物体を作出することができる。
【０００３】
現在、ワタ繊維はゴシピウム(Gossypium)属に属するワタ植物を栽培し、得られたさく果(コットンボール)から採取することにより生産されている。ワタ繊維は、様々な物性(以下「繊維特性」という)によって特徴付けられるが、その中でも特に重要なものとして、繊維長、繊度、強度などが挙げられる。従来から、ワタの繊維特性を改善するために多大な努力がなされてきた。今日、遺伝子工学の発展により、ワタ植物を形質転換して、その繊維特性を変化させることが可能となってきている。その際、目的遺伝子を所望の組織および時期に発現させることは非常に重要なことである。しかし、ワタ繊維の形成および伸長機構は充分に解明されておらず、関与する遺伝子やプロモーターについても充分に知られていないのが現状である。目的遺伝子を所望の組織または時期に発現させるには、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのように常に発現しているものではなく、より組織特異的または時期特異的なプロモーターを用いることが望ましい。特にワタ繊維の改良には、こうしたプロモーターが必要不可欠である。
【０００４】
ワタ繊維は胚珠の表皮細胞が各々伸長したものであり、一本の繊維は一個の細胞から構成されている。ワタ繊維は、成長開始、伸長、二次壁沈着、成熟の段階を経て形成される。これまでにいくつかのワタ由来のプロモーターが発見され、繊維特性を改善するのに有用であると報告され(国際出願公開第WO94/12014号)、例えば、Ｅ６プロモーターまたはＢ８プロモーターが開示されている。特に、Ｅ６構造遺伝子について詳しく研究されており、Ｅ６ｍＲＮＡは、開花後１５日目以降に繊維で強く発現していることが示されている。また、様々な組織のｍＲＮＡにＥ６ｃＤＮＡ由来のプローブを用いて、ノーザンブロティングをロングエクスポーズすると、花や胚珠、葉において弱いシグナルが得られている[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユー・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)89,5769-5773,1992の図１参照]。さらに、ＦｂＬ２Ａプロモーターは、開花後２５〜３０日目に繊維で強く発現することが示されている[プラント・フィジオロジー(Plant Physiol.)(1996)112:1331-1341]。また、プロモーターの強さや作用する時期などは、各々のプロモーターによって、様々に異なっていることが知られている。しかし、開花後１５日目以降はワタの繊維形成において伸長の後半期にあたり、繊維特性の改善には、これらのプロモーターだけでは充分ではなく、開花直後から１５日目までに作用するプロモーターも必要である。また、繊維以外の組織でも作用する、いわゆる組織特異性の低いプロモーターであっても、有用なものになると考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明のある目的は、ワタの繊維特性を改善するのに有用なプロモーター、該プロモーターを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体などを提供することにある。さらなる目的は、ワタ以外の植物においても、目的遺伝子を所望の組織または器官で発現させて、形質転換植物体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、すでに、ワタの繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるために鋭意研究して、ワタ繊維よりいくつかのｃＤＮＡを単離した(米国特許出願第08/391,696号、第08/580,545号、特願平8-31987号)。これらの単離したｃＤＮＡの組織特異的および時期特異的な発現を調べ、さらに、特に遺伝子Ｇｈ３の上流配列をクローニングし、解析した結果、ワタの繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるのに有用な植物プロモーターを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のＤＮＡを含む植物プロモーターを提供する。
(ａ)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
(ｂ)(ａ)の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ
(ｃ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ
【０００８】
また、本発明は、上記植物プロモーターをベクターに挿入した植物発現ベクター、該植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体、該形質転換植物体から得られた植物種子、上記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該種子から植物体を生産することを特徴とする植物体の製造法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを含む植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主ワタ植物細胞に導入して形質転換ワタ植物細胞を得て、該形質転換ワタ植物細胞から形質転換ワタ植物体を再生し、得られた形質転換ワタ植物体からワタ植物種子を得て、該ワタ植物種子からワタ植物体を生産することを特徴とするワタ植物体の製造法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の「植物プロモーター」とは、植物においてプロモーターとして作用する能力(プロモーター機能)を有するＤＮＡのことである。「プロモーター」とは、ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡ合成(転写)を開始するＤＮＡ上の特定塩基配列を意味し、塩基の共通配列を有し、これを認識してｍＲＮＡを合成する酵素(ＲＮＡポリメラーゼ)がｍＲＮＡを合成する。ここで、「プロモーター機能」とは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ上の特異的な領域に結合し、転写開始する作用をいう。
【００１１】
本発明の植物プロモーターは、具体的には、以下の(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のＤＮＡを含む。
(ａ)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
(ｂ)(ａ)の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ
(ｃ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ
【００１２】
本発明者らは、本発明の植物プロモーターを得るために、アシルキャリアープロテイン遺伝子に対し相同性を有するワタ繊維で発現する遺伝子Ｇｈ３の上流領域をクローニングした。様々な組織のｍＲＮＡにＧｈ３ｃＤＮＡ由来のプローブを用いてノーザンブロッティングしたところ、Ｇｈ３は、開花後２日目から胚珠でシグナル(転写産物)が認められ、開花後６〜８日目にピークとなった。繊維と比べて、子葉、根、茎、葉、繊維を取り除いた胚珠では、ほとんどシグナル(転写産物)が認められなかった。しかし、Ｇｈ３遺伝子の上流領域をレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子と連結したキメラ遺伝子構築物を作成し、それを導入した形質転換ワタでは、繊維でＧＵＳ活性が認められたほか、花柱、葯、花弁、葉でもＧＵＳ活性が認められた。ノーザンブロッティングとプロモーター：ＧＵＳ遺伝子構築物を導入した形質転換体での発現パターンとの違いは、Ｇｈ３遺伝子の転写後の修飾が考えられる。また、組織特異性を調節する領域が、さらに上流に存在する可能性も考えられる。
【００１３】
このように、ゴシピウム(Gossypium)属に属するワタ植物由来の遺伝子Ｇｈ３の上流領域は、繊維形成・伸長時のワタ繊維組織だけでなく、花柱や葯などの初期成長(ヤングディヴェロッピング)組織でもプロモーター機能を示す植物プロモーターであり、その塩基配列を決定したところ、配列番号１の塩基配列を有することが判明した。以下、この植物プロモーターを、特に「Ｇｈ１０」と呼ぶことがある。
【００１４】
本発明の植物プロモーターは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、配列番号１の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ、また、配列番号１の塩基配列において、その３'末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、プロモーター活性を失うことなく、その５'末端を欠失したものを含む。
【００１５】
さらに、本発明の植物プロモーターは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、２ｘＳＳＣ(３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸)、４２℃である。
【００１６】
本発明の「植物発現ベクター」とは、上記植物プロモーターをベクターに挿入したものである。ベクターとしては、大腸菌由来のベクター、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔベクター、β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)遺伝子を含むプラスミド、ｐＢＩ１０１−Ｈｍ２、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、ｐＲＫ２０１３などが挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスを利用することもできる。ベクターは、各々の宿主細胞に応じて選択する。なお、植物プロモーターをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子をベクターに挿入する方法に従う。
【００１７】
本発明の「形質転換植物細胞」とは、上記植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞である。宿主植物細胞としては、シロイヌナズナ、トマト、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウモロコシ、カボチャ、キュウリ、ワタなどが挙げられる。植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入する形質転換法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００１８】
本発明の「形質転換植物体」とは、上記形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法がある。使用する培地としては、ワタでは、ＭＳＩＣ培地(ＭＳ塩、０.７５％ＭｇＣｌ2、１.９ｇ/ｌ ＫＮＯ3、３０ｇ/ｌグルコース、２.０ｇ/ｌジェランガム、ｐＨ５.８)、ニンジンでは、カマダ・アンド・ハラダ(Kamada & Harada)培地などが例示される。
【００１９】
本発明の「植物体を製造する方法」は、上記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。
【００２０】
形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程という。また、種子から植物体を生産する工程とは、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。
【００２１】
本発明の植物プロモーターは、例えば、以下のようにして製造し、利用することができる。
【００２２】
(１)ワタ繊維形成および伸長に関与する遺伝子のプロモーター領域の単離
ワタ繊維から得られた組織特異的遺伝子Ｇｈ３の塩基配列から合成オリゴヌクレオチドを調製し、インバースＰＣＲ法を行う。ワタ繊維からゲノムＤＮＡを抽出した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、自己連結させた後、ＰＣＲの鋳型として用いる。第一プライマー群を用いてＰＣＲを行った後、反応産物をさらに第二プライマー群を用いてＰＣＲを行い、上流領域をクローニングする。
【００２３】
アガロースゲル電気泳動で目的の長さのクローンを得た後、ＴＡクローニングベクターにサブクローニングして、配列決定を行う。得られたＰＣＲ断片の塩基配列の一部がＧｈ３の塩基配列と完全に一致することから、Ｇｈ３の上流の存在する植物プロモーターと判断する。
【００２４】
(２)ワタ繊維形成および伸長に関する遺伝子のプロモーター領域の利用
上記方法で得た植物プロモーターを、ワタ植物またはその他の植物において、キメラ遺伝子構築物を作成し、繊維形成および伸長に関与するタンパクの発現制御に利用することができる。さらに、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と組み合わせると、細胞壁での各種タンパクの発現による細胞壁成分の改変が可能となり、耐病性などを付与した新規植物の育種にも応用できる。
【００２５】
例えば、繊維形成および伸長に関与する遺伝子を本発明の植物プロモーターに接続して、ワタ植物またはその他の植物に導入すると、目的タンパクの含量を増大させることができる。これに対し、マイナス鎖(コード配列に相補的な配列)の少なくとも一部を逆向きに植物プロモーターに接続したものを植物に導入し、いわゆるアンチセンスＲＮＡを発現させると、目的タンパクの含量を低下させることができる。
【００２６】
(３)植物プロモーターのベクターへの導入と宿主植物細胞の形質転換
植物細胞の形質転換方法としては、プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソームなどとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティクルガン法などの方法が挙げられる。
【００２７】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる[ホーン(Hohn)ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラント・チューモアーズ(Molecular Biology of Plant Tumors)、アカデミック・プレス、ニューヨーク、549-560(1982)、米国特許第4,407,956号]。
【００２８】
さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドを利用する方法がある。アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物体に導入することができる。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因する。さらに、ＴｉまたはＲｉプラスミド上には、ｖｉｒ領域と呼ばれる領域があり、Ｔ−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれるのに必須である。ｖｉｒ領域自体は、植物中に移行することはなく、また、Ｔ−ＤＮＡ領域が存在するプラスミドとは別のプラスミド上にあっても機能しうる[ネイチャー(Nature)303,179(1983)]。
【００２９】
ＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいＤＮＡを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むことができる。ここで、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中のクラウンゴールまたは毛状根を発生させる部分を、目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得られたものをベクターとして使用することもできる。
【００３０】
このように、本発明においては、様々なベクターを用いることができる。例えば、バイナリーベクターと呼ばれるｐＢＩ１０１(クロンテック社)などのベクターに、本発明の植物プロモーターに繊維形成および伸長に関与する遺伝子をセンスまたはアンチセンス方向で接続したものを挿入して、これらを植物細胞に導入することができる。なお、これらのベクターは、上記のｖｉｒ領域を有していないので、該ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細菌は、ｖｉｒ領域を含む他のプラスミドを有する必要がある。
【００３１】
また、これらのベクターは、アグロバクテリウム属の細菌だけではなく、大腸菌においても増幅することができるシャトルベクターである。従って、Ｔｉプラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことができる。また、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌または植物細胞などを形質転換する際に、形質転換体を容易に選別することができる。さらに、これらのベクターには、カリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)の３５Ｓプロモーターが存在しており、これらのベクターに目的遺伝子を挿入して植物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発現させることが可能となる。
【００３２】
(４)形質転換植物細胞から植物体の再生
まず、ワタ植物以外の植物、例えば、シロイヌナズナについて、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入および形質転換植物細胞の植物体への再生法を以下に詳述する。
【００３３】
シロイヌナズナの種子を常法に従って播種し、無菌的に栽培する。発根した胚軸の切片を用いてカルス培養を行う。本発明の植物プロモーターに目的遺伝子を接続し、抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、カルス化した胚軸の切片と共存培養する。アグロバクテリウムが肉眼で観察できるまで充分に増殖したら、除菌操作を行う。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているので、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が５ｃｍ程度の大きさになり、シュートを形成するまで培養する。完全なシュートの形状を示すようになったら、発根プレートに移植し、発根後、ロックウール上に定植する。
【００３４】
発根した植物体を無機塩類培地に浸した土に移植して種子を得る。この種子を滅菌処理し、発芽させることにより形質転換体を得る。この形質転換体から常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、繊維形成および伸長に関与する遺伝子をプローブに用いてサザーンハイブリダイゼーションを行い、形質転換の有無を確認する。
【００３５】
次に、ワタ植物について、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入および形質転換植物細胞の植物体への再生法を以下に詳述する。
【００３６】
形質転換は、エヌ・トロリンダー(N. Trolinder)らの方法[セオレティカル・アンド・アプライド・ジェネティクス(Theor. Appl. Genet.)(1992)83:645-649]で行うことができる。具体的には、まず、ワタ種子を殺菌した後、発芽させる。その胚軸をアグロバクテリウムに感染させ、培養を続ければ、数カ月でカルスが得られる。さらに生育させて直径１ｃｍ程度になれば、懸濁培養を行う。胚を約１ｃｍに成熟させた後、培養チューブで発育させる。ある程度まで生育させた後、土壌に移植すれば、最終的に複数個の形質転換ワタ植物体が得られる。得られた形質転換体について、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法で確認することで、目的遺伝子が導入されているかどうかを調べることができる。
【００３７】
また、常法に従って形質転換体や非形質転換体からＲＮＡを抽出し、繊維形成および伸長に関与する遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列を有するプローブを作成し、これらのプローブを用いてノーザンハイブリザイゼーションを行ない、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。
【００３８】
(５)レポーター遺伝子を用いたプロモーターの強さの評価
本発明の植物プロモーターは、例えば、その３'末端にレポーター遺伝子、例えば、植物で広く用いられているＧＵＳ遺伝子を連結して用いれば、ＧＵＳ活性を調べることでプロモーターの強さを簡単に評価することができる。なお、レポーター遺伝子としては、ＧＵＳ遺伝子以外にも、ルシフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインなども用いることができる。
【００３９】
【発明の効果】
繊維形成および伸長に関与する遺伝子は、ワタ繊維細胞において、ワタ繊維形成過程で発現し繊維伸長に関与するので、その塩基配列の上流領域などを用いることで、ワタ繊維の伸長に関与する転写因子などが同定される可能性がある。従って、本発明の植物プロモーターは、ワタ繊維形成および伸長に関与するプロモーターであり、繊維形成および伸長を誘導する技術の確立、繊維伸長に関与するシス因子やトランス因子の単離、繊維形成および伸長のメカニズムの解明またはそれを調節する遺伝子の単離に利用することができ、細胞形成および伸長に関する技術分野において極めて有用である。また、初期成長組織で発現を示すことより、初期成長組織で目的遺伝子をセンス方向やアンチセンス方向で発現させることにより、期待する変化を得ることができる。
【００４０】
さらに、本発明の植物プロモーターは、繊維形成および伸長に関与するタンパクをコードする塩基配列と連結したキメラ遺伝子を作成し、特定の組織の植物細胞壁の構造を変化させることができ、産業分野で用いられる植物原料の加工に有用である。また、一般にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いることによって、植物の器官全体に生活環の全過程を通して形態変化をもたらすことができる。光、熱、傷害などに対する調節性プロモーターを用いれば、生育環境に応じて、その形態が変化しうる植物体を作製することができる。また、器官または組織に特異的なプロモーターを用いれば、特定の器官または組織だけに形態変化を生じさせることができる。つまり、本発明のプロモーターを用いることによって、繊維の形成を制御し繊維特性の変化をもたらすことができる。また、初期成長組織においても適用できる。
【００４１】
本発明の植物プロモーターを用いることにより、特定の植物組織で特異的に目的遺伝子を発現させることができる。特に植物の初期成長組織やワタ繊維で目的遺伝子を発現させることができる。例えば、本発明の植物プロモーターを用い、特定の遺伝子をワタ繊維で発現させることにより、ワタ繊維の繊維長、繊度、強度などの繊維特性の改善および生産性の向上を行うことが可能となる。換言すれば、本発明の植物プロモーターを利用することにより、より優れた繊維特性を有し、かつ生産性の高い新規なワタ品種を作出することができる。
【００４２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４３】
実施例１
(１)ワタ繊維組織由来の遺伝子Ｇｈ３の上流領域(Ｇｈ１０)のクローニング
ゴシピウム属(Gossypium)に属するワタ植物(コーカー３１２)を播種した後、１００日目の植物体の葉から、マーレイ(Murray)およびトンプソン(Thompson)の改良法でゲノムＤＮＡを抽出し、インバースＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニングを行った。
【００４４】
まず、１μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、Ｔ４ライゲースで自己連結させた。連結したＤＮＡ５００μｇを鋳型にしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｇｈ３遺伝子の上流領域(以下「Ｇｈ１０」という)を増幅した。この反応は、配列番号２および３の塩基配列を有する第一プライマー群を用い、９８℃、３０秒間および６８℃、６分間を３５サイクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列番号４および５の塩基配列を有する第二プライマー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を電気泳動に付して量および長さを確認し、得られたＤＮＡ断片をベクターｐＧＥＭ−Ｔ(プロメガ社)に導入し、大腸菌(Escherichia coli)ＪＭ１０９を形質転換してクローニングした。こうして得られたプラスミドクローンをｐＧｈ１０と命名した。その後、シーケネースシークエンスキット(アマシャム社)を用いて、ｐＧｈ１０の塩基配列を決定した。この塩基配列はプライマーの配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノム領域であることが確認できた。この塩基配列を配列番号１に示す。
【００４５】
(２)β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)遺伝子との融合
ＮｃｏＩ制限酵素部位を有する３'末端のプライマー(５'-GCAATAGAAGCCATGGGAGAGAG-３')を合成した。このプライマーとＴ７プライマーを用いて、１０６９ｂｐの断片をＰＣＲで増幅した。この断片を制限酵素部位を用いてｐＧＥＭ−Ｔベクターにサブクローニングした。サブクローニングされたものから制限酵素ＰｓｔＩおよびＮｃｏＩで切断して断片を取り出し、ＧＵＳレポーター遺伝子および３５Ｓターミネーターに連結した。正しく連結されたプラスミドをｐＧｈ１０：ＧＵＳと命名した。
【００４６】
さらに、このプラスミドｐＧｈ１０：ＧＵＳを制限酵素ＰｓｔＩで切断し、電気泳動後、断片をバイナリーベクターｐＣＧＮ１５７８のＰｓｔＩ制限酵素部位に挿入して、新規なプラスミドｐＣＧＮ−Ｇｈ１０：ＧＵＳを得た。その概略を図１に示す。次に、このプラスミドｐＣＧＮ−Ｇｈ１０：ＧＵＳで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、大腸菌ＪＭ１０９/ｐＣＧＮ−Ｇｈ１０：ＧＵＳを得た。
【００４７】
(３)プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
(２)で得られた大腸菌ＪＭ１０９/ｐＣＧＮ−ＧＧｈ１０：ＧＵＳと、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を有する大腸菌とを、各々、５０ｍｇ/ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩培養した。別途、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１株を５０ｍｇ/ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で二晩培養した。
【００４８】
各培養液１.５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り、集菌した後、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、三種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ寒天培地にプレートし、２８℃で培養して両方のプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達させた。１〜２日後に一部を白金耳で掻き取り、５０ｍｇ/ｌカナマイシン、２０ｍｇ/ｌハイグロマイシンおよび２５ｍｇ/ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をＥＨＡ１０１/ｐＣＧＮ−ＧＧｈ１０：ＧＵＳと命名した。
【００４９】
(４)形質転換ワタ植物体の作出
アグロバクテリウムＥＨＡ１０１/ｐＣＧＮ：ＧＧｈ１０：ＧＵＳを用いて、ワタ植物(コーカー３１２)を形質転換した。形質転換法としては、エヌ・トロリンダー(N. Trolinder)らの方法[セオレティカル・アンド・アプライド・ジェネティクス(Theor. Appl. Genet.(1992)83:645-649)]を用いた。コーカー３１２の種子を３％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で２０分殺菌した後、セファトキシム入りの滅菌水で３回洗浄した。次にスチュワート(Stewart)培地で６日間発芽させた。その胚軸を５ｍｍほどに切断し、一晩培養したアグロバクテリウムを約１０μｌ感染させ、０.８％アガロース培地上に置き、常温で暗所に３日間放置した。次に、この胚軸をＢ５ビタミン、３０ｇ/ｌグルコース、０.１ｍｇ/ｍｌ ２,４Ｄ、０.５ｍｇ/ｌカイネチン、１.６ｍｇ/ｍｌゲルライト(ケルコ社製)、７５０μｇ/ｍｌ塩化マグネシウムを含むＭＳ培地で、３０℃、３日間前培養した。抗生物質は５０μｇ/ｌカナマイシン、５００μｇ/ｌセファタキシムを用いた。この後、植え継ぎは４週間毎に行った。
【００５０】
細胞懸濁培養の開始および維持は、以下のように行った。得られたコーカー３１２のカルスが直径約１ｃｍ程度になった後で懸濁培養液に移した。培地はカルスイニシエーション培地と同じ組成であるが、ホルモンとゲル化剤を含まないものを使った。１０ｍｌの懸濁培養液には約１００ｍｇのカルスを用いた。培養は１２０ｒｐｍ、３０℃、照明下で行った。植え継ぎは約１カ月毎に行った。細胞懸濁培養液のプレーティングを行い、胚の発達は半固体の培地の上で行った。
【００５１】
胚の発芽および植物体の再生には１ｃｍ以上になった成熟した胚を用いて、２５×１５０ｍｍの培養チューブ内で培養した。培養チューブには、０.１ｍｇ/ｌのＩＡＡ入りスチュワート・アンド・シュー(Stewart and Hsu)培地を含浸したバーミキュライトを満たした。胚は、９０μＥｍ-2ｇ-1の光照射下、２８℃で培養した。発芽およびシュート形成時には、新鮮な培地をバーミキュライトに補給した。最終的に複数個の形質転換ワタ植物体が得られた。このうち形質転換ワタ植物体＃３−５、＃４−１、＃４−３、＃４−９、＃４−８について、遺伝子が導入されているかどうか、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法で確認したところ、図２に示すように、明らかに導入されていることを示すＤＮＡ断片が得られた。
【００５２】
(５)ＧＵＳ活性の測定
得られた形質転換ワタ植物体を栽培し、組織をメスで切り取り、切片を数ｍｌの固定液(０.０３％ホルマリン、１０ｍＭ ＭＥＳ(ｐＨ５.６)、０.３Ｍマンニトール)に室温で４５分間浸した。次に５０ｍＭリン酸バッファー(ｐＨ７.０)で数回洗浄した。切片をＧＵＳ染色液(５０ｍＭリン酸バッファー、０.５Ｍフェリシアン化カリウム、０.５Ｍフェロシアン化カリウム、１ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートした。クロロフィルを除くため、５％ホルマリンに１０分間浸した後、５％酢酸に１０分間、５０％エタノールに１０分間、１００％エタノールに１０時間浸した。青く染まった組織を顕微鏡で観察したところ、形質転換ワタ植物体においてプロモーター活性が認められた。図３に示すように、開花後２日目の繊維(左)は染色されたが、野生型ワタ(右)は染色されなかった。図４に示すように、開花後１２日目の繊維(右)も染色されたが、野生型ワタ(左)は染色されなかった。また、図５に示すように、花柱(右)も染色されたが、野生型ワタ(左)は染色されなかった。さらに、図６に示すように、葯(左)も染色されたが、野生型ワタ(右)は染色されなかった。
【００５３】
また、ＧＵＳ活性を測定したところ、図７に示すように、形質転換ワタ植物体＃４−８および＃４−９において発育中の胚珠で強いＧＵＳ活性が認められた。次に、様々な組織においてＧＵＳ活性を測定したところ、図８に示すように、花柱や葯に加えて、葉や花弁でも活性が認められた。
【００５４】
これらの結果から、Ｇｈ１０プロモーターは、ワタ植物の繊維、花弁、葯、花柱および葉においてプロモータ機能を有することが明らかである。
【００５５】
【配列表】
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0004118385.tif 000003
【００５６】
配列番号：２
配列の長さ：31
配列の形：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列：
GTTTGGCAGC ACAGCAGATC TGCAAGCGAG C                                   31
【００５７】
配列番号：３
配列の長さ：30
配列の形：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列：
GCAGAACTTC TTGAGAAGCT GTGCAGTGAG                                     30
【００５８】
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【００５９】
0004118385.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】  β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)レポーター遺伝子がＧｈ１０プロモーターに連結されたｐＧｈ１０：ＧＵＳキメラ遺伝子構築物の概念図である。この遺伝子構築物は、アグロバクテリウム感染による遺伝子組換えワタ植物の作出に用いられた。
【図２】  目的遺伝子の導入を確認するために形質転換ワタ植物体のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法による分析の結果を示すバンド図である。
【図３】  開花後２日目のワタ胚珠のＧＵＳ染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図４】  開花後１２日目のワタ胚珠のＧＵＳ染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図５】  ワタ花柱のＧＵＳ染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図６】  ワタ葯のＧＵＳ染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図７】  ワタ胚珠におけるＧｈ１０/ＧＵＳ発現の蛍光定量分析の結果を示す棒グラフ図である。ここで、「ＤＰＡ」という用語は開花後の日数(days post-anthesis)の略であり、例えば、「４ＤＰＡ」は開花後４日目を表す。
【図８】  様々なワタ組織におけるＧｈ１０/ＧＵＳ発現の蛍光定量分析の結果を示す棒グラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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