(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され及び／又は組換え的に製造されたＨＩＰポリペプチドであって、
該ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７及び８またはこれらのヘッジホッグ相互作用性断片の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＨＩＰポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とするＨＩＰポリペプチド。
【請求項２】
単離され及び／又は組換え的に製造された哺乳類ＨＩＰポリペプチドであって、
前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号１、２、３または４の少なくとも１つから選択される配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、前記ＨＩＰポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とするＨＩＰポリペプチド。
【請求項３】
ヘッジホッグタンパク質に結合したＨＩＰアミノ酸配列を含む、単離され及び／又は組換え的に製造されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが、配列番号５、６、７及び８よりなる群から選択される配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、２、３および４よりなる群から選択される配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされていることを特徴とする請求の範囲第３項記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７、８又はこれらのヘッジホッグ相互作用性断片よりなる群から選択される配列と同一であり、前記ＨＩＰポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列が、少なくとも25個のアミノ酸残基長であることを特徴とする請求の範囲第５項記載のポリペプチド。
【請求項７】
ヘッジホッグタンパク質と結合するのに十分なＨＩＰアミノ酸配列を含んでいる単離され及び／又は組換え的に製造されたポリペプチドであって、前記ＨＩＰアミノ酸配列が配列番号５の残基18〜678及び配列番号６の残基18〜678よりなる群から選択される配列と少なくとも90％同一であり、前記ポリペプチドがヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、（ｉ）ニューロン細胞の分化を調節し、（ii）分化したニューロン細胞の生存を調節し、（iii）軟骨細胞の増殖を調節し、（iｖ）精巣生殖系列細胞の増殖を調節し、及び／又は（ｖ）パッチド遺伝子又はヘッジホッグ遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求の範囲第１項から第７項いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが融合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項から第７項いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ニューロン細胞の分化又は分化したニューロン細胞の生存を促進することを特徴とする請求の範囲第１項から第７項いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ニューロン細胞がドーパミン作動性ニューロンであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ニューロン細胞が運動ニューロンであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のうちの１つに表されている配列と同一であることを特徴とする請求の範囲第５項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、配列番号２の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされていることを特徴とする請求の範囲第３項記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、哺乳類の天然ヘッジホッグ遺伝子によってコードされていることを特徴とする請求の範囲第３項記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列が、ＨＩＰタンパク質のコアポリペプチド配列の少なくとも100個のアミノ酸残基のフラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲第６項記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４よりなる群から選択される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するＨＩＰタンパク質と特異的に結合する抗体と免疫学的に交差反応性のＨＩＰアミノ酸配列を含んでいる単離され及び／又は組換え的に製造されたポリペプチドであって、前記ＨＩＰアミノ酸配列がヘッジホッグタンパク質と結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１８】
請求の範囲第１項記載のＨＩＰポリペプチドと特異的に免疫反応性である単離され及び／又は組換え的に製造された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１９】
請求の範囲第１項記載のＨＩＰポリペプチドと特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体。
【請求項２０】
請求の範囲第１９項記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２１】
請求の範囲第１項記載のＨＩＰポリペプチドをコードするコード配列を含む単離核酸。
【請求項２２】
ヘッジホッグタンパク質と結合するＨＩＰアミノ酸配列をコードするＨＩＰコード配列を含む単離核酸であって、
前記核酸が、配列番号１、２、３または４の少なくとも１つで示される配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記核酸が、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とする単離核酸。
【請求項２３】
前記ＨＩＰアミノ酸配列が、配列番号５、６、７及び８よりなる群から選択される配列と少なくとも90％同一であることを特徴とする請求の範囲第２２項記載の核酸。
【請求項２４】
（ｉ）請求の範囲第２２項記載のコード配列と（ii）異種転写調節配列とを含む核酸。
【請求項２５】
前記ＨＩＰコード配列が、哺乳類の天然ヘッジホッグ遺伝子に由来することを特徴とする請求の範囲第２３項記載の核酸。
【請求項２６】
前記ＨＩＰアミノ酸配列が、ＨＩＰタンパク質の細胞外フラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲第２２項記載の核酸。
【請求項２７】
請求の範囲第２２項又は第２３項記載の核酸を含み、原核細胞及び真核細胞のうちの少なくとも１つで複製し得る発現ベクター。
【請求項２８】
請求の範囲第２７項記載の発現ベクターでトランスフェクションされそして前記組換えポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項２９】
細胞培養培地中で請求の範囲第２８項記載の細胞を培養して前記ＨＩＰポリペプチドを発現させ、そして前記細胞培養物から前記ＨＩＰポリペプチドを単離することを含む、組換えＨＩＰポリペプチドの製造方法。
【請求項３０】
請求の範囲第２１項記載の核酸を含む導入遺伝子を包含する細胞を有するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
ヒト以外のトランスジェニック動物であって、ＨＩＰ依存性シグナル形質導入経路が、拮抗性ＨＩＰポリペプチドの発現又はＨＩＰ遺伝子の破壊のどちらか１つによって該動物の１つ又はそれより多くの組織で阻止され、前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７、８またはこれらのヘッジホッグ相互作用性断片よりなる群から選択される配列を含み、該ＨＩＰポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項３２】
治療的に有効な量の請求の範囲第１項から第７項記載のポリペプチド、または請求の範囲第２２項または第２３項記載の核酸を投与することを含む、ヒト以外の動物の細胞増殖、分化又は生存を調節する方法。
【請求項３３】
ヘッジホッグタンパク質とＨＩＰタンパク質との相互作用を阻止する前記ポリペプチドを投与することを含む請求の範囲第３２項記載の方法。
【請求項３４】
前記作用剤が、ヘッジホッグタンパク質と結合するＨＩＰタンパク質の可溶性細胞外ドメインであることを特徴とする請求の範囲第３３項記載の方法。
【請求項３５】
ヒト以外の対象が望まれていない細胞増殖、分化又は死亡を特徴とする疾患の危険にさらされているのかどうかを決定する方法であって、前記対象の組織において、（ｉ）配列番号５、６、７および８からなる群より選択される配列を有するＨＩＰタンパク質をコードする遺伝子の突然変異；及び（ii）前記遺伝子の誤った発現；のうちの少なくとも１つを特徴とする遺伝子病変の存在又は非存在を検出することを含む方法。
【請求項３６】
前記遺伝子病変の検出が、
ｉ．  前記遺伝子からの１つ又はそれより多くのヌクレオチドの欠失、
ii．  前記遺伝子に対する１つ又はそれより多くのヌクレオチドの付加、
iii． 前記遺伝子の１つ又はそれより多くのヌクレオチドの置換、
iｖ． 前記遺伝子の全体的な染色体転位、
ｖ．  前記遺伝子の異常なメチル化、
ｖi． 前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物値の全体的な改変
ｖii．前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在、及び
ｖiii．非野生型の前記タンパク質値、
のうちの少なくとも１つの存在の確認を含む請求の範囲第３５項記載の方法。
【請求項３７】
前記の遺伝子病変の検出が、
ｉ． 配列番号１、２、３、４、又はこれらの天然変異体の少なくとも１つのセンス又はアンチセンス配列、或いは前記遺伝子と天然に結合している５'又は３'フランキング配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含有するオリゴヌクレオチドを含む核酸を提供し；
ii． 前記核酸を前記組織の核酸に暴露し；そして
iii.前記核酸と前記核酸とのハイブリダイズによって遺伝子病変の存在又は非存在を検出する；ことを含む請求の範囲第３５項記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子病変の検出が、組織試料の細胞及び／又は体液中における可溶性タンパク質としてのＨＩＰタンパク質の存在又は非存在を検出することを含む請求の範囲第３６項記載の方法。
【請求項３９】
生物学的試料中に存在する細胞におけるＨＩＰリガンドの存在を検出する方法であって、ＨＩＰポリペプチドが同系リガンドと特異的に結合し得る条件下で前記細胞を標識ＨＩＰポリペプチドと接触させ、そして前記細胞と結合したＨＩＰポリペプチドの存在を検出する工程を含み、前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７および８からなる群より選択される配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
細胞の増殖、分化または生存を調節する薬剤の製造において、請求の範囲第１項から第７項記載のポリペプチド、または請求の範囲第２２項または第２３項記載の核酸を治療的に有効な量使用する方法。
【請求項４１】
ＨＩＰポリペプチドをコードする核酸構築物を、調節されるべき細胞又はこれら細胞の近くに位置する細胞に取り込まれそして組換え的に発現される条件下で使用する工程を含み、前記核酸構築物が、配列番号１、２、３または４の少なくとも１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、前記核酸構築物が、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節するＨＩＰポリペプチドをコードすることを特徴とする請求の範囲第４０項記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、ＨＩＰタンパク質とのヘッジホッグタンパク質の相互作用を抑制することを特徴とする請求の範囲第４０項記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合するＨＩＰタンパク質の可溶性細胞外領域であることを特徴とする請求の範囲第４２項記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、配列番号５、６、７及び８またはこれらのヘッジホッグ相互作用性断片の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とする請求の範囲第４０項記載の方法。
【請求項４５】
単離され及び／又は組換え的に製造されたＨＩＰポリペプチドであって、該ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７及び８またはこれらのヘッジホッグ相互作用性断片の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＨＩＰポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節し、前記ＨＩＰポリペプチドが、細胞表面でヘッジホッグタンパク質を隔離してヘッジホッグタンパク質の有効濃度を調節することを特徴とするＨＩＰポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが哺乳類ポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲第４５項記載のＨＩＰポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリペプチドがヒトポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲第４５項記載のＨＩＰポリペプチド。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、10、11、12、13および14からなる群より選択される配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされうることを特徴とする請求の範囲第４５項記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、少なくとも25アミノ酸残基長であり、ヘッジホッグタンパク質に結合することを特徴とする請求の範囲第４５または４８項記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが、配列番号５の残基18〜678及び配外番号６の残基18〜678よりなる群から選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とする請求の範囲第４５項記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが軟骨細胞の増殖を調節することを特徴とする請求の範囲第４５から５０いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが融合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第４５から５０いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが、ニューロン細胞の分化または生存を促進し、該ニューロン細胞がドーパミン作動性ニューロンまたは運動ニューロンであることを特徴とする請求の範囲第５１項記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７及び８の１つで示される配列に少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とする請求の範囲第４５項記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７及び８の１つで示される配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とする請求の範囲第４５項記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記ＨＩＰポリペプチドが、65℃で0.2X SSCの洗浄工程を含むストリンジェントな条件下で、配列番号２の核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節することを特徴とする請求の範囲第４５項記載のポリペプチド。
【請求項５７】
前記ＨＩＰアミノ酸配列が、少なくとも100アミノ酸残基の断片に対応し、前記ポリペプチドが、ヘッジホッグタンパク質に結合することを特徴とする請求の範囲第４９項記載のポリペプチド。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、配列番号１、２、４および４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＩＰタンパク質を特異的に結合する抗体と免疫学的に交差反応性のＨＩＰアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求の範囲第４５項記載のポリペプチド。
【請求項５９】
請求の範囲第４５項記載のポリペプチドと特異的に免疫反応性であることを特徴とする単離され及び／又は組換え的に製造された抗体または抗体断片。
【請求項６０】
請求の範囲第４５項記載のポリペプチドと特異的に免疫反応性であることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項６１】
請求の範囲第６０項記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項６２】
ＨＩＰポリペプチドをコードするコード配列を含む単離核酸であって、該核酸が、65℃で0.2X SSCの洗浄工程を含むストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、３、４、９、10、11、12、13および14の少なくとも１つで示される配列にハイブリダイズし、前記核酸が、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節するポリペプチドをコードし、前記ＨＩＰポリペプチドが、細胞表面でヘッジホッグタンパク質を隔離してヘッジホッグタンパク質の有効濃度を調節し、前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７および８からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項６３】
前記ＨＩＰポリペプチドが、配列番号５、６、７及び８からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、前記核酸が、ヘッジホッグタンパク質に結合しヘッジホッグシグナリングを調節するポリペプチドをコードすることを特徴とする請求の範囲第６２項記載のポリペプチド。
【請求項６４】
（i）請求の範囲第６２または６３項記載のコード配列、および（ii）異種転写調節配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項６５】
請求の範囲第６２または６３項記載の核酸を含み、原核細胞および真核細胞の少なくとも１つにおいて複製が可能である発現ベクター。
【請求項６６】
請求の範囲第６５項記載の発現ベクターでトランスフェクションされ、前記組換えポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項６７】
細胞培養培地中で請求の範囲第６６項記載の細胞を培養して組換えＨＩＰポリペプチドを培養して前記ＨＩＰポリペプチドを発現させ、そして前記細胞培養物から前記ＨＩＰポリペプチドを単離する工程を含むことを特徴とする組換えＨＩＰポリペプチドの製造方法。
【請求項６８】
（i）真核細胞中でＨＩＰポリペプチドを発現されるために転写調節配列に作用可能に結合する請求の範囲第６２または６３項記載の核酸を含む遺伝子構築物、および
（ii）前記遺伝子構築物を細胞に供給し、該細胞を前記遺伝子構築物でトランスフェクションするための遺伝子供給組成物、
を含むことを特徴とする組換えトランスフェクション系。
【請求項６９】
前記遺伝子供給組成物が、組換えウィルス粒子、リポソーム、およびポリカチオン核酸結合剤からなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第６８項記載の組換えトランスフェクション系。
【請求項７０】
生理条件下でＨＩＰ遺伝子に特異的にハイブリダイズしその発現を抑制する、ＨＩＰ遺伝子に相補的な塩基配列を有するアンチセンス核酸の精製製剤であって、ＨＩＰ遺伝子が、65℃で0.2X SSCの洗浄工程を含むストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、３、４、９、10、11、12、13および14の少なくとも１つで示される配列にハイブリダイズする核酸を含み、ＨＩＰ遺伝子が、配列番号５、６、７および８からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含み、
前記アンチセンス核酸が
（i）合成オリゴヌクレオチド
（ii）一本鎖
（iii）直鎖
（iv）10-50ヌクレオチド長、および
（v）ヌクレアーゼ分解に耐性のDNA類似物
の少なくとも１つであることを特徴とする製剤。
【請求項７１】
前記アンチセンス核酸が、ヌクレアーゼ分解に耐性のDNA類似物であることを特徴とする請求の範囲第７０項記載の製剤。
【請求項７２】
ヒト以外のトランスジェニック動物であって、ＨＩＰ依存性シグナル形質導入経路が、ＨＩＰ遺伝子の破壊により動物の１つ以上の組織で抑制され、前記ＨＩＰ遺伝子が、65℃で0.2X SSCの洗浄工程を含むストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、３、４、９、10、11、12、13および14の少なくとも１つで示される配列にハイブリダイズする核酸を含み、前記核酸が、ヘッジホッグに結合しヘッジホッグシグナリングを調節するポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが、配列番号５、６、７、および８からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項７３】
ＨＩＰ生物活性を調節する化合物を同定するアッセイであって、
（a）以下を含む反応混合物を形成する工程、
（i）ＨＩＰポリペプチドであって、該ＨＩＰポリペプチドが、65℃で0.2X SSCの洗浄工程を含むストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、３、４、９、10、11、12、13および14の少なくとも１つで示される配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、配列番号５、６、７、および８からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むＨＩＰポリペプチド、
（ii）ヘッジホッグタンパク質、および
（iii）試験化合物、
（b）ＨＩＰポリペプチドおよびヘッジホッグタンパク質の相互作用を検出する工程であって、試験化合物の不存在下での相互作用に関連して、試験化合物の存在下でのヘッジホッグタンパク質およびＨＩＰポリペプチドの相互作用の変化が、試験化合物についての潜在的なＨＩＰ調節活性を示す工程、
を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項７４】
前記反応混合物が、無細胞タンパク質製剤であることを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【請求項７５】
前記反応混合物が、ＨＩＰポリペプチドを組換えにより発現する異種核酸を含む組換え細胞を含むことを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【請求項７６】
前記ヘッジホッグタンパク質およびＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する工程が、結合タンパク競合測定法を含むことを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【請求項７７】
前記ヘッジホッグタンパク質およびＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する工程が、ヘッジホッグタンパク質によるシグナリンに反応する細胞内セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第７５項記載のアッセイ。
【請求項７８】
前記ヘッジホッグタンパク質およびＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する工程が、ヘッジホッグ情報伝達に反応する転写調節配列により調節される遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第７５項記載のアッセイ。
【請求項７９】
前記組換え細胞が、内生ＨＩＰタンパク質を実質的に発現しないことを特徴とする請求の範囲第７５項記載のアッセイ。
【請求項８０】
前記組換え細胞が、パッチ化タンパク質を共発現することを特徴とする請求の範囲第７５項記載のアッセイ。
【請求項８１】
前記組換え細胞が、平滑化タンパク質を共発現することを特徴とする請求の範囲第７５項記載のアッセイ。
【請求項８２】
前記反応混合物が、細胞膜製剤であることを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【請求項８３】
前記反応混合物が、再構成タンパク質混合物であることを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【請求項８４】
前記反応混合物が、ＨＩＰポリペプチドをヘッジホッグレセプターとして再構成するリポソームであることを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【請求項８５】
前記アッセイの各工程が、少なくとも100の異なる試験化合物の斑入りライブラリについて反復されることを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【請求項８６】
前記試験化合物が、小さい有機分子および天然産物の抽出物からなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第７３項記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
基金
本明細書に記載した研究は米国立衛生研究所（ＮＩＨ）の基金で支援された。米国政府は本発明に関して一定の権利を有している。
発明の背景
パターン形成は、胚細胞が、分化した組織の秩序正しい空間配置を形成する活性である。高等生物の身体的な複雑性は、胚形成中に細胞固有の系譜と細胞外因性のシグナリングの相互作用によって生じる。誘導的な相互作用は身体プランの最初の確立から器官系のパターン形成まで、即ち、組織分化中の多様な細胞型の生成までの脊椎動物の発生における胚のパターン形成に必須である（Davidson, E.（1990年）Development 108:365〜389; Gurdon, J.B.（1992年）Cell 68:185〜199; Jessell, T.M.等（1992年）Cell 68:257〜270）。発生上の細胞の相互作用の効果は変動する。典型的には、応答細胞は、非誘導状態と誘導状態の両方の応答細胞とは異なる細胞を誘導する（誘導）ことによって細胞分化の１つの経路から別の経路に転換される。ときには細胞は近接細胞を誘導してそれら細胞と同じ様に分化させ（同一発生誘導）；他の場合には、細胞は近接細胞がその細胞と同じ様に分化することを阻止する。初期発生における細胞の相互作用は、２つの細胞型間の初期誘導によって多様性が順次増幅されるように連続的であろう。更に、誘導的な相互作用は胚だけでなく成体細胞でも同様に生起し、そして分化を誘導するだけでなく形態学的パターンを確立しそして維持するように作用することができる（J.B. Gurdon（1992年）Cell 68:185〜199）。
全ての脊椎動物の神経系の起源は原腸形成終了まで溯ってたどることができる。この時点で、胚の背側外胚葉はその発生運命を表皮から神経に変化させる。新たに形成された神経外胚葉は肥厚して神経板と呼ばれる平らな構造を形成し、そして或る脊椎動物では中心溝（神経溝）と肥厚した側部縁（神経褶）がこの神経板の特徴である。分化の初期段階で、神経板は既に、その前後軸（Ａ-Ｐ）及び中外側軸（Ｍ-Ｌ）に沿った部位的分化の徴候を示している。神経褶は最終的に背側中心線で融合して神経管を形成し、そして神経管はその前部末端で脳に分化しそして後部末端で脊髄に分化する。神経管が閉じると、以前の中外側分化のために背側／腹側の差異が生じる。かくして、神経胚形成終了時に、神経管は明白な前後（Ａ-Ｐ）、背腹（Ｄ-Ｖ）及び中外側（Ｍ-Ｌ）極性を有している（例えば、Principles in Neural Science（第３版）、Kandel, Schwartz及びJessell編集、Elsevier Science Publishing Company: ニューヨーク州、1991年；及びDevelopmental Biology（第３版）、S.F. Gilbert編集、Sinauer Associates: マサチューセッツ州サンダーランド、1991年参照）。神経管内の細胞の運命を定める誘導的な相互作用によって胚性脊椎動物神経系の初期パターンが確立される。脊髄では、細胞型の同一性は、一部には、２つの中心線細胞群、即ち脊索及び底板由来のシグナルによって制御され、そしてこれらのシグナルは神経板細胞を誘導して底板、運動ニューロン及び他の腹側ニューロン型に分化させる（van Straaten等（1988年）Anat. Embryol. 177:317〜324; Placzek等（1993年）Development 117:205〜218; Yamada等（1991年）Cell 64:035〜647; 及びHatta等（1991年）Nature 350:339〜341）。加えて、交連ニューロン突起の方位及び方向は底板由来のシグナルによるものである（Placzek, M.等（1990年）Development 110:19〜30）。神経管のパターン形成に加えて、脊索及び底板は、腹側領域における背側体節派生物の分化を阻止することによって体節のパターン形成を制御するシグナルも産生させる（Brand-Saberi, B.等（1993年）Anat. Embryol. 188:239〜245; Porquie, O.等（1993年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5242〜5246）。
他の重要なシグナリングセンターは発生途中の肢芽の後方の間充織に存在しており、極性化活性域又は「ＺＰＡ」と呼ばれている。肢芽の後方領域から得られる組織を別の肢芽の前方のヘリ部分に移植すると、得られる四肢は前後軸に沿って鏡像関係の指を更に有して発生する（Saunders及びGasseling（1968年）Epithelial-Mesenchymal Interaction、78〜97頁）。この発見から、四肢の前後の正常なパターン形成はＺＰＡによるものであるというモデルが導き出された。ＺＰＡは、初期胚芽を横断して濃度勾配を形成する「モルフォゲン」と呼ばれるシグナルを放出することによって機能すると仮定されている。このモデルによれば、ＺＰＡから種々の距離にある細胞の運命はモルフォゲンの局所濃度で決定され、特定閾のモルフォゲンが連続構造を誘導する（Wolpert（1969年）Theor. Biol. 25:1〜47）。これは、指の重複度が移植されたＺＰＡ細胞数に比例するという発見によって支持されている（Tickle（1981年）Nature 254:199〜202）。
ＺＰＡ中に誘導シグナルが存在することは長年の間知られていたが、これらシグナルの分子同一性は今やっと解明され始めたばかりである。重要な前進段階は、分泌されるタンパク質ソニック（Ｓonic）ヘッジホッグ（Ｓhh）が、脊索、底板及びＺＰＡを含む、組織形成特性を有する幾つかの組織で産生されるという発見であった（Echelard等（1993年）、Cell 75:1417〜1430; Bitgood, M.J.及びA.P. McMahon（1995年）Dev. Biol. 172:126〜138）。Ｓhhの誤った発現は神経管や体節で異所性脊索に対する誘導効果を模擬し（Echelard等（1993年）、上述）そして肢芽でもＺＰＡ機能を模擬する（Riddle等（1993年）Cell 75:1401〜1416; Chang等（1994年）Development 120:3339〜3353）。
脊椎動物のヘッジホッグ遺伝子ファミリーには少なくとも４つのメンバー、例えば、単一のショウジョウバエヘッジホッグ遺伝子のパラロガス遺伝子（paralogs）が含まれる。代表的なヘッジホッグ遺伝子とタンパク質はＰＣＴ公開ＷＯ 95/18856及びＷＯ 96/17924に記載されている。上記メンバーのうち本明細書でデザート（Ｄesert）ヘッジホッグ（Ｄhh)、ソニックヘッジホッグ（Ｓhh）及びインディアン（Indian）ヘッジホッグ（Ｉhh）と称する３つは明らかに、魚、鳥及び哺乳類を含む全ての脊椎動物に存在している。本明細書でチギー・ウィンクル（tiggie-winkle）ヘッジホッグ（Ｔhh）と称する４番目のメンバーは魚に特異的であるように思われる。デザートヘッジホッグ（Ｄhh）は主として、マウスの胚発生中の精巣並びに成体齧歯類及びヒトの精巣で発現され；インディアンヘッジホッグ（Ｉhh）は胚形成中の骨発生及び成体の骨形成に関与しており；そしてＳhhは、上記したように、主として形態形成及び神経誘導活性に関与している。脊椎動物の器官の発生及び維持におけるヘッジホッグポリペプチドの重要な誘導的役割を所与のものとすると、ヘッジホッグ相互作用性タンパク質の同定が臨床と研究の両文脈で極めて重要である。
発明の要約
本発明は、本明細書でＨＩＰ（ヘッジホッグ相互作用性タンパク質）と称する新しいクラスのヘッジホッグ結合タンパク質の発見に関する。本発明のＨＩＰポリペプチドには、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーの産生物と結合するポリペプチドが含まれる。ヘッジホッグファミリーのメンバーは、成体及び胚脊椎動物における分化した組織の秩序正しい空間配置の形成及び維持に広範に関与していることが知られており、そしてインビトロ及びインビボの両方で種々の脊椎動物組織の配列を生じさせそして／又は維持するために使用することができる。
一般的に、本発明は単離ＨＩＰポリペプチド、好ましくは主題ＨＩＰポリペプチドの実質的に純粋な調製物を特徴としている。本発明はまた、組換え的に製造したＨＩＰポリペプチドも提供する。好ましい実施態様では上記ポリペプチドは、ヘッジホッグタンパク質と高い親和性、例えば、ナノモル又はそれより小さい解離定数（ＫD）で結合する能力を含む生物学的活性を有している。このような活性に特異的に拮抗し、例えば切断変異体によって提供されるようなＨＩＰポリペプチドも特に意図されている。
１つの実施態様では、上記ポリペプチドは配列識別番号:５、配列識別番号:６、配列識別番号:７及び配列識別番号:８又はこれらのコアポリペプチド配列（例えば、配列識別番号:５又は６の残基16〜678に相当する）で表されているＨＩＰポリペプチドと同一又は相同である。ＨＩＰファミリーの関連メンバーも意図されており、例えば、ＨＩＰポリペプチドは好ましくは、配列識別番号:５、配列識別番号:６、配列識別番号:７及び配列識別番号:８で表されているポリペプチドと少なくとも65％、67％、69％、70％、75％又は80％相同のアミノ酸配列を有しているが、より高い、例えば82％、85％、90％及び95％の配列相同性を有するポリペプチドも意図されている。好ましい実施態様では、ＨＩＰポリペプチドは、配列識別番号:１〜４及び９〜14のいずれか１つ又はそれより多くで表されている核酸配列と緊縮条件下でハイブリッドを形成する核酸でコードされている。主題ＨＩＰタンパク質の同族体には、例えば、修飾部位（例えば、チロシン、スレオニン、セリン又はアスパラギン残基）を変えるか、又はタンパク質のグリコシル化を妨げるか、又は該タンパク質とＨＩＰリガンド、例えばヘッジホッグポリペプチドとの相互作用を妨げる突然変異によるような転写後修飾に対して抵抗性のタンパク質体も含まれる。
ＨＩＰポリペプチドは、配列識別番号:５、配列識別番号:６若しくは配列識別番号:７に表されているような全長タンパク質を含んでいることができるか、又はそれらのコアポリペプチド配列（例えば、配列識別番号５又は６の残基16〜678に相当する）を含んでいることができるか、或いは１つ若しくはそれより多くの特定のモチーフ／ドメイン又は任意の大きさ、例えば、少なくとも５、10、25、50、100、150若しくは200個のアミノ酸長に相当するフラグメントを含んでいることができる。好ましい実施態様では、ＨＩＰポリペプチドはヘッジホッグリガンドと、好ましくは９μＭ又はそれ未満、そして更に一層好ましくは９nＭ又はそれ未満のＫDで特異的に結合し得るのに十分な細胞外リガンド結合ドメイン部分を含んでいる。切断形態のタンパク質には可溶性のリガンド結合ドメインフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
或る好ましい実施態様では、本発明は約78.4kdのコアポリペプチド分子量を有する精製又は組換えＨＩＰポリペプチドを特徴としている。他の実施態様では、成熟ＨＩＰタンパク質のペプチドコアは好ましくは38.6kdから76.8kＤの範囲の分子量を有している。或る種の転写後修飾、例えば、グリコシル化、プレニル化、ミリスチル化等によって、非修飾ポリペプチド鎖と比べてＨＩＰタンパク質の見かけ上の分子量が増加し得ることが理解されよう。
主題タンパク質はキメラ分子として、例えば融合タンパク質の形態で提供することもできる。例えば、ＨＩＰタンパク質は、第２のポリペプチド部分、例えば、ＨＩＰポリペプチドと関係のない（異種）アミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含んでいる組換え融合タンパク質として提供することができる。例えば、上記第２のポリペプチド部分はグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼであり、例えば、上記第２のポリペプチド部分はアルカリホスファターゼのような酵素活性であり、例えば、上記第２のポリペプチド部分はエピトープタグである。
更にもう１つの実施態様では、本発明はＨＩＰポリペプチドをコードしている核酸を特徴としており、そしてこれは野生型ＨＩＰポリペプチドの活性の少なくとも１部分を調節する、例えばそれを模擬するか又はそれと拮抗する能力を有している。代表的なＨＩＰコード化核酸配列は配列識別番号:１、配列識別番号:２、配列識別番号：３又は配列識別番号:４で表されている。
もう１つの実施態様では、本発明の核酸には、緊縮条件下で配列識別番号:１〜４のうちの１つ又はそれより多くで示されているコード化配列の全部又は一部分とハイブリッドを形成するコード化配列が含まれる。これらの核酸のコード化配列は配列識別番号:１、２、３、４、９、10、11、12、13又は14で表されているコード化配列と同一の配列を含んでいることができるか、又はこれら配列と単に相同性であるだけのこともできる。好ましい実施態様では、上記核酸は、アゴニストとしてか又はアンタゴニストとして作用することによって野生型ＨＩＰポリペプチドの１つ又はそれより多くの生物活性を特異的に調節するポリペプチドをコードしている。
更に、或る好ましい実施態様では、主題ＨＩＰ核酸は転写調節配列、例えば、少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列を含んでおり、そして上記調節配列はＨＩＰ遺伝子配列と機能的に結合している。このような調節配列はＨＩＰ遺伝子配列を発現ベクターとして使用するのに適合させるために使用することができる。転写調節配列はＨＩＰ遺伝子又は異種遺伝子由来であることができる。
本発明は、原核生物であれ真核生物であれ上記発現ベクターでトランスフェクションした細胞及び上記発現ベクターを使用することによるＨＩＰタンパク質の製造方法も意図している。
更に他の実施態様では、主題発明は遺伝子活性化構築物を提供し、その際該遺伝子活性化構築物は細胞内で、例えば、異種組換えによって、ゲノムＨＩＰ遺伝子のコード化配列と機能的に結合した異種転写調節配列を提供するためにゲノムＨＩＰ遺伝子で組み換えるように設計されている。遺伝子活性化構築物で修飾されたゲノムＨＩＰ遺伝子を有する細胞も特に意図されている。
尚もう１つの実施態様では、本発明は緊縮条件下で、配列識別番号:１、配列識別番号:２、配列識別番号:３及び配列識別番号:４のセンス配列か又はアンチセンス配列のどちらかの少なくとも12個の連続ヌクレオチドに相当するが、好ましくは少なくとも25個の連続ヌクレオチド；そして更に好ましくは、配列識別番号:１、配列識別番号:２、配列識別番号:３及び配列識別番号:４のセンス配列か又はアンチセンス配列のどちらかの少なくとも40、50又は75個の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブとハイブリッドを形成する核酸を提供する。
本発明の尚もう１つの特徴は、免疫原性調製物中にＨＩＰポリペプチドを含んでいる免疫原に関係しており、そしてこの免疫原はＨＩＰポリペプチドに特異的な免疫応答；例えば体液応答、例えば抗体応答、例えば細胞応答を誘発することができる。好ましい実施態様では、上記免疫原は配列識別番号:５、配列識別番号:６、配列識別番号:７及び／又は配列識別番号:８のうちの１つで表されているタンパク質から得られる抗原決定基、例えばユニーク決定基を含んでいる。
本発明の更にもう１つの特徴はＨＩＰ免疫原のエピトープと特異的に反応性の抗体及び抗体調製物を特徴としている。
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、導入遺伝子を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、カエル又はブタ、例えば、本明細書に記載したＨＩＰ遺伝子の異種形態を含んでいる（そして好ましくは発現している）動物又は内在性ＨＩＰ遺伝子を誤っって発現している動物、例えば１つ若しくはそれより多くの主題ＨＩＰタンパク質の発現が妨げられている動物も特徴としている。このようなトランスジェニック動物は、突然変異若しくは誤って発現されたＨＩＰ対立形質を含んでいる細胞及び組織障害の研究用又は医薬品のスクリーニングに使用するための動物モデルとして使用することができる。
本発明はまた、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでいるプローブ／プライマーも提供し、そしてこのオリゴヌクレオチドは、緊縮条件下で配列識別番号:１〜４及び９〜14、又はこれらの天然生起変異体のいずれか１つ又はそれより多くのセンス配列又はアンチセンス配列の少なくとも12個の連続ヌクレオチドとハイブリッドを形成するヌクレオチド配列領域を含んでいる。好ましい実施態様では、上記プローブ／プライマーはこれと結合しており且つ検出可能な標識基を更に含んでいる。標識基は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素及び酵素補因子からなる群から選択することができる。本発明のプローブは、ＨＩＰタンパク質の誤った発現と関係した機能不全を同定する、例えば患者から単離した細胞試料中でＨＩＰタンパク質をコードしている核酸値を検出する；例えば細胞中のＨＩＰ ｍＲＮＡ値を測定するか、又はゲノムＨＩＰ遺伝子が変異されているのかそれとも欠失しているのかを決定するための診断試験キットの一部として使用することができる。本発明のこれらの所謂「プローブ／プライマー」はまた、例えば転写及び／又は翻訳を阻止することによって主題ＨＩＰタンパク質の発現を阻止するように、１つ又はそれより多くの上記タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリッドを形成する（例えば、結合する）オリゴヌクレオチドプローブ又はこれらの誘導体の投与又はインシトゥ産生について言う「アンチセンス」治療法の一部として使用することもできる。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは少なくとも12個のヌクレオチド長であるが、25、40、50又は75個のヌクレオチド長のプライマーも意図されている。
尚もう１つの特徴では、本発明はヘッジホッグタンパク質とＨＩＰポリペプチドレセプター間の相互作用のインヒビター、或いは強化剤用の試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。代表的な方法には、（ａ）（ｉ）ヘッジホッグポリペプチド、（ii）ＨＩＰポリペプチド及び（iii）試験化合物を含む反応混合物を形成し；そして（ｂ）ヘッジホッグポリペプチドとＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する段階が含まれる。試験化合物の非存在下での相互作用と比較して、試験化合物の存在下でのヘッジホッグポリペプチドとＨＩＰポリペプチドの相互作用における統計的に有意な変化（強化又は阻止）は、試験化合物に関してヘッジホッグの生物活性の潜在的なアゴニスト（模擬又は強化剤）又はアンタゴニスト（インヒビター）であることを示している。反応混合物は細胞不含タンパク質調製物、例えば、再構築タンパク質混合物若しくは細胞溶解物であることができ、又は組換え的にＨＩＰポリペプチドを発現する異種核酸を含んでいる組換え細胞であることができる。
好ましい実施態様では、ヘッジホッグポリペプチドとＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する段階は競合的結合アッセイである。他の好ましい実施態様では、ヘッジホッグポリペプチドとＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する段階は、ＨＩＰポリペプチド介在性シグナリングに応答性の第２の細胞内メッセンジャー値の変化を細胞に基づくアッセイで検出することに関係している。更にもう１つの好ましい実施態様では、ヘッジホッグポリペプチドとＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する段階は、ＨＩＰポリペプチドによるシグナリングに応答性の転写調節配列によって制御される遺伝子の発現値の変化を細胞に基づくアッセイで検出することを含んでいる。
好ましい実施態様では、上記のアッセイ段階は少なくとも100個の異なる試験化合物、更に好ましくは少なくとも103、104又は105個の異なる試験化合物の多様なライブラリーに対して反復される。試験化合物は、例えば、ペプチド、核酸、炭水化物、小さい有機分子又は天然産生物抽出物（又はこれらのフラクション）であることができる。
本発明は更に、上記の医薬品スクリーニングアッセイで同定される１つ又はそれより多くの作用剤の医薬製剤も意図している。
他の実施態様では、本発明はＨＩＰと結合しそしてＨＩＰを発現する細胞内でヘッジホッグ誘導性シグナリングを模擬するか又はこれと拮抗する分子、好ましくは小さい有機分子を提供する。
本発明の尚もう１つの特徴はＨＩＰ生物活性を調節することによって、例えば、或る種のタンパク質−タンパク質相互作用を強化するか又は妨害することによって、細胞の増殖、分化又は生存の１つ又はそれより多くを調節する方法に関係している。一般的に、インビボで実施しようと、インビトロで実施しようと又はインシトゥで実施しようと、上記方法は、処理していない細胞と比較して、（ｉ）細胞の増殖速度、（ii）分化又は（iii）生存のうちの少なくとも１つを変化させるように、有効量のＨＩＰ治療剤で細胞を処理することを含んでいる。従って、上記方法は、ＨＩＰタンパク質又はＨＩＰタンパク質結合リガンド、例えば、ヘッジホッグタンパク質由来のシグナリングの効果を発揮するか又はこの効果に拮抗し上記で言及した医薬品スクリーニングで同定されるペプチド及びペプチド模擬体又は他の分子のようなＨＩＰ治療剤で実施することができる。他のＨＩＰ治療剤には、ＨＩＰタンパク質の発現を阻止するアンチセンス構築物、野生型ＨＩＰタンパク質の上流でリガンド相互作用をそして下流でシグナル形質導入を競合的に阻止するＨＩＰタンパク質のドミナントネガティブ突然変異体及び遺伝子活性化構築物を含んでいる遺伝子治療構築物が含まれる。
１つの実施態様では、ＨＩＰ生物活性を調節する主題方法は精子形成を調節するように精巣細胞の治療で使用することができる。もう１つの実施態様では、主題方法は骨形成を調節するために使用され、この方法にはＨＩＰ生物活性を調節する作用剤で骨形成細胞を処置することが含まれている。同様に、処置される細胞が軟骨形成細胞である場合、本発明の方法は軟骨形成を調節するために使用される。更にもう１つの実施態様では、主題方法を使用してニューロン細胞の分化を調節し、ニューロン細胞を分化した状態で維持し、そして／又はニューロン細胞の生存を高める、例えばアポプトーシス若しくは他の形態の細胞死を防止することができる。例えば、本発明の方法を使用して、運動ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン及びペプチド作動性ニューロンのようなニューロン細胞の分化に影響を与えることができる。
本発明のもう１つの特徴では、対象、例えば、動物患者が望まれていない細胞増殖又は分化若しくはアポプトーシスの異常な制御を特徴とする疾患の危険にさらされているかどうかを決定する方法を提供する。この方法には、対象の組織内で、（ｉ）ＨＩＰタンパク質をコードしている遺伝子の突然変異；又は（ii）ＨＩＰ遺伝子の誤った発現のうちの少なくとも１つを特徴とする遺伝子病変の存在又は非存在を検出することが含まれる。好ましい実施態様では、上記の遺伝子病変の検出には、ＨＩＰ遺伝子から１つ又はそれより多くのヌクレオチドの欠失；上記遺伝子に対して１つ又はそれより多くのヌクレオチドの付加、上記遺伝子の１つ又はそれより多くのヌクレオチドの置換、上記遺伝子の全体的な染色体転位；上記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物値の改変；上記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在；上記タンパク質の非野生型の値；及び／又は可溶性ＨＩＰタンパク質の異常値のうちの少なくとも１つの存在を確認することが含まれる。
例えば、上記遺伝子病変の検出は、（ｉ）ＨＩＰ遺伝子若しくはその天然生起変異体のセンス若しくはアンチセンス配列又はＨＩＰ遺伝子と天然に結合している５'若しくは３'フランキング配列とハイブリッドを形成するヌクレオチド配列領域を含有するオリゴヌクレオチドを含んでいるプローブ／プライマーを提供し；（ii）上記プローブ/プライマーを組織の核酸に暴露し；そして（iii）上記プローブ／プライマーと上記核酸とのハイブリッドを形成させることによって、上記遺伝子病変の存在又は非存在を検出することを含んでいることができる；例えば、上記病変の検出には、上記プローブ／プライマーを使用してＨＩＰ遺伝子のヌクレオチド配列及び、任意に、上記フランキング核酸配列を決定することが含まれている。例えば、上記プローブ／プライマーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は連結連鎖反応（ＬＣＲ）で使用することができる。別の実施態様では、ＨＩＰタンパク質値は、ＨＩＰタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を使用してイムノアッセイで検出される。
本発明の実施には、他に示されない限り、当該技術分野の技術範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の慣用の技術が使用される。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）、第２版、サムブルック（Sambrook）、フリッツ（Fritsch）及びマニアチス（Maniatis）編集（Cold Spring Harbor Laboratory Paress: 1989年）；ディエヌエイ クローニング（DNA Cloning）、Ｉ及びII巻（D.N. Glover編集、1985年）；オリゴヌクレオチド シンセシス（Oligonucleotide Synthesis）（M. J. Gait編集、1984年）；ムリス（Mullis）等、米国特許第4,683,195号；ヌクレイック アシッド ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）（B.D. Hames及びS.J. Higgins編集1984年）；トランスクリプション アンド トランスレーション（Trancription And Translation）（B.D. Hames及びS.J.Higgins編集1984年）；カルチャー オブ アニマル セルズ（Culture Of Animal Cells）（R.I. Freshney, Alan R.Liss, Inc.、1987年）；イモビライズド セルズ アンド エンザイムズ（Immobilized Cells And Enzymes）（IRL Press、1986年）；ビィ.ペーバル（B. Perbal）、ア プラクチカル ガイド トゥ モレキュラー クローニング（A Practical Guide To Molecular Cloning（1984年）；専門書、メソッズ イン エンザイモロジー（Methods In Enzymology）（Academic Press, Inc.、ニューヨーク州）；ジーン トランスファー ベクターズ フォア マンマリアン セルズ（Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells）（J.H. Miller及びM.P. Calos編集、1987年、Cold Spring Harbor Laboratory)；メソッズ イン エンザイモロジー、154及び155巻（Wu等編集）、イムノケミカル メソッズ イン セル アンド モレキュラー バイオロジー（Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology）（Mayer及びWalker編集、Academic Press、ロンドン、1987年）；ハンドブック オブ エクスペリメンタル イムノロジー（Handbook Of Experimental Immunology）、Ｉ〜IＶ巻（D.M. Weir及びC.C. Blackwell編集、1986年）；マニピュレイチング ザ マウス エンブリィオ（Manipulating the Mouse Embryo）、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年）参照。
本発明の他の特徴や利点は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、ＨＩＰタンパク質配列のマウス、ヒト、ニワトリ及びゼブラフィッシュ相同体の整列である。上向き矢印はＣ末端の疎水性アンカーを示している。
図１Ｂは、マウス、ヒト、ニワトリ及びゼブラフィッシュから単離したＨＩＰｃＤＮＡのコード化配列の整列である。
図２はＨＩＰタンパク質の図式図である。
図３は、Ｓhh−ＡＰ（ＡＰ＝アルカリフォスファターゼ）融合タンパク質とＨＩＰ及びＰＴＣタンパク質の結合の２つのスキャッチャードプロットを示す。
図４は、ヒトの多数の組織のＨＩＰ転写産物のノーザンブロットである。
図５は、マウスの多数の組織のＨＩＰ転写産物のノーザンブロットである。
図６は、切断形態（この場合にはＣ末端の22個のアミノ酸を欠いている）のＨＩＰタンパク質は細胞上清液中に分泌され、一方全長ＨＩＰタンパク質は細胞フラクションに保持されている、例えば、依然として膜に結合していることを説明している。更に、Ｓhhの存在下で、抗-Ｓhhは分泌された形態のＨＩＰタンパク質を含んでいるコンプレックスを免疫沈降させることができる。
発明の詳細な説明
脊椎動物の組織を発生分化・維持するのにとりわけ重要なことは、誘発と呼ぶ細胞外のある型の伝達であり、この伝達は隣り合った細胞層と組織間に起こる。誘発相互作用において、１つの細胞集団が分泌する化学シグナルは、第二の細胞集団の発生運命に影響する。一般に、誘発シグナルに応答する細胞は１つの細胞の運命から他の細胞の運命へと転換されるが、そのいずれもがシグナル発生細胞の運命と同一ではない。
誘発シグナルは脊椎動物形態形成に機能する基本的な制御タンパクであり、胚期に作動することが知られた重要ななシグナル発生センターに存在し、例えば、脊椎動物胚の体制形成を規定する。これらのシグナル発生構造としては、例えば、神経系形成を開始させ、その中で異なる型の神経細胞を規定介助する一過性構造である脊索を含む。脊索はまた、体軸に沿った中胚葉の形態化を制御する。確かなシグナル発生活性を有する他の異なる一群の細胞は、神経管の床板（脊髄と脳の前駆体）であり、異なる神経細胞型の分化をシグナル化する。また、一般に信じられていることは、肢を形成する芽の底部中胚葉域（分極活性ゾーン（Zone of Polarizing Activity）またはＺＰＡと呼称する）が、発育途上にある肢の正しい形態を最終的に生ずる形態形成物質（Morphogen）分泌し、シグナル発生センターとして作用するということである。
ヘッジホッグ・タンパクのシグナル化制御は発生の調整にとって重要なメカニズムである。本発明は新しい一群のヘッジホッグ結合タンパクの発見に関し、ここでは「ヘッジホッグ相互作用タンパク」または「ＨＩＰ」と称するが、このものはヘッジホッグのポリペプチドに高い親和性をもって結合することが証明されている。マウスのＨＩＰは、それがヘッジホッグ・タンパクに結合する能力によて発現クローニング技術により最初に同定された。続いて、様々の他の脊椎動物同族体が、さらに標準的な技法によりマウス・クローンにもとづき、プローブとプライマーを用いてクローン化されている。本明細書に記載のごとく、該脊椎動物ＨＩＰタンパクは、ヘッジホッグ介在誘発において重要な役割を示す空間的・時間的に制限された発現ドメインを有する。
種々の脊椎動物（下記表１参照）からクローン化した典型的なＨＩＰ遺伝子の配列は、それが細胞膜に固定され得る分泌タンパクをコード化していることを示している。マウス、ヒト、ひな鳥およびゼブラフイッシュからのＨＩＰ配列を比較すると（図１参照）、保存シグナル・ペプチド配列、保存ヘッジホッグ結合ドメイン、および潜在的膜透過性ドメインが浮かび上がる。さらに、該タンパクの配列を分析すると、当該タンパクのＣ−末端部分にＥＧＦ様ドメインが存在することを示唆している（図２参照）。これらのドメイン以外、ＨＩＰコード化配列は、これまでに同定されたいずれの遺伝子に対しても密接な配列相同性を示さず、これらの遺伝子が新しい遺伝子群を含むことを示唆する。
ヘッジホッグ・タンパクへの結合能力を通してみると、ＨＩＰタンパク類は明らかにヘッジホッグのシグナル発生を制御することができる。ＨＩＰタンパクはヘッジホッグ・レセプター（またはそのサブユニット）として機能するか、細胞表面のヘッジホッグ・タンパクを隔離するように作用し、このようにして、パッチ化など他のヘッジホッグ・レセプターに利用可能なヘッジホッグ・ペプチドの有効濃度を調整する。ＨＩＰタンパク類は可溶ヘッジホッグ・タンパクと複合体を形成し、細胞表面レセプターとの相互作用するこれらタンパクの能力に影響して、ヘッジホッグの勾配形成を仲介する。このように、本発明ポリペプチドは多くの以下のヘッジホッグ介在生物活性に影響を与える：背部中胚葉から誘導される組織、軟骨および精子形成に関与する組織などの中胚葉誘導組織の増殖、生存および/または分化を調節する能力；真皮、神経管、神経冠、または頭部間葉から誘導される組織などの外胚葉誘導組織の増殖、生存および/または分化を調節する能力；原始消化管から誘導される組織などの内胚葉誘導組織の増殖、生存および/または分化を調節する能力。
マウスＨＩＰｃＤＮＡは、細胞での発現を可能とするプラスミドにクローン化したマウス肢芽ｃＤＮＡライブラリーを用い、発現したタンパクに特異的に結合した標識Shhタンパク量の検出による潜在的ヘッジホッグ結合タンパクのスクリーニングに際して同定された。単一の陽性クローンをスクリーニングに掛けた７０，０００中に同定した。リガンド−レセプター結合の研究によると、ＨＩＰペプチドは大多数のヘッジホッグ群を高い親和性をもって結合させることができる。例えば、マウスのＨＩＰポリペプチドとShhおよびDhhそれぞれとの結合は、約１nＭの解離定数（kd）で起こった。例えば、図３参照。この結合はパッチ化について観察されたヘッジホッグ結合親和性に比較し得るものである（図３参照）。この知見は、ヘッジホッグ間で選択的に区別する結合タンパクに対立するものとして、マウスＨＩＰｃＤＮＡが一般のヘッジホッグ結合タンパクをコード化し得ることを示唆する。しかし、このタンパクの他の同族体は、結合親和性により、Shh、IhhおよびDhh間を区別することが可能であることを予測させる。
マウスＨＩＰクローンに加えて、我々は、プローブとしてマウスｃＤＮＡを用い、ヒト、トリおよびサカナのＨＩＰ遺伝子を含む他の脊椎動物からｃＤＮＡクローンを得た。追加の配列リストによると（表１も参照）、マウスＨＩＰポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１によりコード化される；ヒトＨＩＰポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２によりコード化される；ニワトリＨＩＰポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３によりコード化される；そしてゼブラフィッシュＨＩＰポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４によりコード化される。
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ＨＩＰタンパク間の全配列相同性を表２に示す。
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蛍光in situハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）によると、ヒトＨＩＰ遺伝子は染色体位置４Ｑ３１に位置している。図４および５に説明したように、ノーザン・ブロット分析によると、ＨＩＰ遺伝子がある成人組織中で、心臓、骨格筋および膵臓中、少なくともこれまでに試験した組織検体中に高レベルで発現されていることを示唆する。
本発明が期待するのは、追加の配列リストに提示したクローン化ＨＩＰ遺伝子は、種間群の関連遺伝子の呈示に加えて、種内群の各部分でもあるということである。すなわち、期待されるのは、ヒトとマウスのＨＩＰタンパクの他のパラログがこれらの動物に存在し、各ＨＩＰのオーソログが他の動物に保存されるということである。例えば、低位ないし中位の緊縮条件において、約４．４ｋｂおよび９ｋｂの転写物をマウス検体のノーザン分析により観察すると、後者がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示したＨＩＰｃＤＮＡの可能と思われるパラログおよび/またはスプライス変異体を呈示していた。
種々のＨＩＰ同族体間の配列変化に加えて、脊椎動物のＨＩＰタンパクは明らかにプロ形を含む多くの異なる形態で天然に存在する。該プロ形は該タンパクの少なくともＮ末端ドメインの直接分泌のためのＮ−末端シグナルペプチド（約１〜１５のＮ−末端残基）を含む一方、全長の成熟形はこのシグナル配列を欠いている。ある場合には、この成熟形にさらに加工処理が起こって、該タンパクの生物活性フラグメントを生じる。
同様に、図６に説明するように、全長ＨＩＰタンパクはまた、膜固定ドメイン、例えば、膜透過性ドメインを含み、該タンパクのＣ−末端が約２２ケのアミノ酸からなる。この配列を欠くＨＩＰポリペプチドは膜結合よりもむしろ完全分泌されることが示されている。手短に言えば、myc−標識融合タンパクが、完全長ＨＩＰ配列、myc−ＨＩＰ−１、およびＣ−末端２２アミノ酸myc−ＨＩＰ−１（Δ２２）の短縮形と共に産生された。該myc−ＨＩＰ−１融合タンパクは完全長ＨＩＰタンパクと比較すると、それぞれを抗myc−および抗ＨＩＰ抗体で検出したとき、僅かに遅く（高ＭＷ）移動することが示された。抗myc−抗体は細胞ペレットのイムノブロット検体およびmyc−ＨＩＰ−１融合タンパクもしくはmyc−ＨＩＰ−１（Δ２２）融合タンパクのいずれかを発現する細胞が産生する細胞上清に対し用いられた。myc−ＨＩＰ−１を発現する細胞、例えば、推定膜固定ドメインを保持する細胞では、該タンパクが実質的に排他的に細胞ペレット中に検出された。他方、上清および細胞ペレットの両方に検出することができた。さらに、myc−ＨＩＰ−１（Δ２２）タンパクは、ＨＩＰタンパクをShhタンパクと培養したときに、抗Shh抗体により免疫沈降させることができた。
野生型タンパクがグリコシル化されていることを示唆する証拠は現在ないが、該ＨＩＰタンパクが、ある状況下で翻訳後に、Ｏ−，Ｓ−および/またはＮ−結合グリコシル化などで修飾されるということが、形式的には可能である。マウスＨＩＰタンパク配列に関連する潜在的Asn−グリコシル化部位は、Asn99、Asn416、Asn447およびAsn459である。プロテオグリカン様ＧＡＧ鎖（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸など）に対する潜在的付着部位はSer235である。
種を越えた種々のＨＩＰクローンの発現形式を決定するために、in situハイブリッド形成研究をマウス、ニワトリおよびサカナの胚を発生させることにより実施した。下記実施例に記載したように、ＨＩＰ ＲＮＡの分布とその一過性の発現はヘッジホッグ・シグナル発生の下流標的としてのＨＩＰポリペプチドの役割と矛盾がない。マウス胚のin situハイブリッド形成は、ＨＩＰ ＲＮＡがヘッジホッグ・シグナル発生の最小となる部位、すなわち、Shh、IhhまたはDhhの発現が最小である部位で低レベルで発現し、ＨＩＰ発現の劇的な上方制御がヘッジホッグ上方制御に応答して起こることを示している。第一に、ＨＩＰポリペプチドの上方制御はhh上方制御と一時的に同時に起こり、その発現はhh遺伝子発現の部位の反対側で起こる。第二に、ＨＩＰ（ＲＮＡ）の異所性発現はＣＮＳ中のShhの異所性発現に応答して発生する。さらに、ＨＩＰ発現は優性陰性型ｃＡｍｐ依存性タンパクキナーゼＡ（ＰＫＡ）の発現に応答して活性化されるが、該タンパクキナーゼはまた、パッチ化などの他のhh標的遺伝子を活性化する。ヌルDhh−欠損変異マウスを分析すると、Dhhシグナル発生にとっての標的部位である睾丸でのＨＩＰ発現損失が明らかとなる。
１．  従って、本発明のある面は、ＨＩＰポリペプチドをコード化する核酸、ＨＩＰポリペプチドそれ自身（種々のフラグメントを包含する）、ＨＩＰタンパクと免疫反応する抗体、およびそのような組成物の調製に関する。さらに、本発明は、例えば、ＨＩＰ、ＨＩＰリガンド（特にヘッジホッグタンパク）、またはそのシグナル変換器などの異常発現（またはその欠失）を含む疾患の検出および治療用診断および治療アッセイおよび試薬を提供する。
さらに、ＨＩＰタンパクの生物機能を調節し得る作用薬を同定するための薬物探索アッセイ法を提供するが、その方法は例えば、ＨＩＰ分子がヘッジホッグタンパクもしくは他の細胞外/マトリックス因子に結合するのを変化させるか、あるいは結合したＨＩＰタンパクがヘッジホッグ・シグナルを変換する能力を変化させることにより行う。このような作用薬は、組織、特に、軟骨、精子形成に関与する組織および背部中胚葉から誘導される組織などの中胚葉誘導組織；真皮、神経管、神経冠、または頭部間葉から誘導される組織などの外胚葉誘導組織；原始消化管から誘導される組織などの内胚葉誘導組織、などの増殖、維持および/または分化を変化させるために治療的に有用である。本発明の他の面を以下に記載するが、当業者には本開示に照らしてそれが明瞭となるであろう。
便宜上、本明細書および特許請求の範囲で用いる正確な用語をここにまとめる。
「ヘッジホッグ結合タンパク」または「ＨＩＰ」ポリペプチドという用語は、少なくとも一部がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５〜８のいずれかで表されるＨＩＰポリペプチドの全部または一部と同一であるか、一定の配列相同性を共有することで特徴づけられる一群のペプチドをいう。該ＨＩＰポリペプチドは多くの真核生物、とりわけ、脊椎動物、特に、哺乳動物のいずれかからクローン化または精製することができる。さらに、他のＨＩＰポリペプチドは本発明に従い産生させることができるが、該ポリペプチドは天然には存在しないが、むしろ非天然変異原性技術により産生されるものである。
該ＨＩＰタンパクの多くの特徴が精査により観察されている。特に、ＨＩＰ配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の残基１〜１５に相当する分泌シグナル配列（例えば、少なくとも該タンパクの一部の細胞外分泌を惹起するペプチド部分）を有する分泌タンパクをコード化していることを認めていた。膜固定化ドメイン、例えば、膜透過ドメインの形状にあるドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５の３５７〜３７７または６８０〜７００のいずれかに相当する残基により提供される。
「膜固定化」領域はＨＩＰポリペプチドを細胞表面に保持することのできるアミノ酸配列をいう。
「グリコシル化」ＨＩＰポリペプチドは、グリコシル基（例えば、炭水化物で誘導化した）との共有結合を有するＨＩＰポリペプチドである。例えば、該ＨＩＰタンパクは現存残基上でグリコシル化し得るか、あるいは炭水化物の付着を妨げるように変異させ得るか、あるいはＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化などの新しいグリコシル化部位を提供するように変異させることができるものである。
ここに用いるとき、「脊椎動物ヘッジホッグ・タンパク」という用語はドロソフィリア（Drosophilia）ヘッジホッグ・タンパクに関係する脊椎動物細胞間シグナル発生分子をいう。3種の脊椎動物ヘッジホッグ・タンパク、すなわち、デザート・ヘッジホッグ（Dhh）、ソニック・ヘッジホッグ（Shh）およびインデアン・ヘッジホッグ（Ihh）が、両生類、魚類、鳥類および哺乳類を含むすべての脊椎動物に明らかに存在する。この群の他のメンバー、例えば、バンデッド（Banded）ヘッジホッグ、セファリック（Cephalic）ヘッジホッグ、ティギイ−ウインクル（tiggy-winkle）ヘッジホッグ、およびエキドナ（echidna）ヘッジホッグがこれまでに魚類および/または両生類に同定されている。代表的なヘッジホッグ・ポリペプチドはＰＣＴ出願ＷＯ９６/１７９２４、ＷＯ９６/１６６６８、ＷＯ９５/１８８５６に記載されている。
ここに用いるとき、「核酸」という用語はデオキシ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチド、および適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）をいう。この用語は等価物として、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、および記載された態様に適用し得るものとして、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されるべきである。
ここに用いるとき、「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、ＨＩＰポリペプチドをコード化するオープン読み枠からなる核酸をいい、エクソンおよび（任意に）イントロン配列を含む。「組換え遺伝子」はＨＩＰポリペプチドをコード化し、ＨＩＰコード化エクソン配列を含む核酸をいい、例えば、染色体ＨＩＰ遺伝子から、または無関係の染色体遺伝子から誘導されるイントロン配列を任意に含んでいてもよい。対象のＨＩＰポリペプチドをコード化する代表的な組換え遺伝子は追加の配列リストに示してある。「イントロン」という用語は、タンパク内には翻訳されず、一般にエクソン間に見出される特定のＨＩＰ遺伝子中に存在するＤＮＡ配列を意味する。
ここに用いるとき、「トランスフェクション」という用語は、核酸、例えば、発現ベクターを受容細胞中に、核酸介在遺伝子伝達により導入することを意味する。「形質転換」は、ここに用いるとき、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取り込みの結果として、細胞遺伝子型を変化させる過程をいうが、例えば、形質転換細胞がＨＩＰポリペプチドの組換え型を発現するか、またはアンチセンス発現が伝達された遺伝子から生じる場合には、ＨＩＰタンパクの天然産型の発現が中断される。
ここに用いるとき、「特異的にハイブリッド化する」という用語は、本発明の核酸プローブ/プライマーがＨＩＰ遺伝子の少なくとも１５の連続するヌクレオチドにハイブリッド化する能力をいうが、該遺伝子は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜４および９〜１４のいずれか一つもしくはそれ以上に示したＨＩＰ配列、またはそれに相補的な配列、またはその天然産変異体であり、ここに定義するＨＩＰ以外のタンパクをコード化する細胞性核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に対してのバックグランド・ハイブリッド化が１５％より低く、好ましくは１０％より低く、より好ましくは５％より低いものである。
「有効量」のヘッジホッグ・ポリペプチド、またはその生物活性フラグメントとは、治療の対象方法に関して、製剤中のアゴニストまたはアンタゴニストの量をいい、所望の投与用量計画の一部として投与したとき、細胞の増殖、分化または生存の調整、例えば、精子形成、神経細胞分化、または骨格形成、例えば、骨形成、軟骨形成、または四肢形成の調整を可能とする。
ここに用いるとき、「表現型」とは、例えば、一つの特性または一群の特性を有する細胞の、全体の物理的、生化学的および生理的構成をいう。
「誘発」または「誘発する」という用語は、ヘッジホッグ・タンパクの生物活性に関係するものとして、一般には表現型細胞に特定の効果を引起こす原因となる過程または作用をいう。そのような効果は表現型の変化、例えば、別の細胞表現型への分化の原因となる形態にあること、あるいは特定細胞中の細胞を維持する形態、例えば、細胞の脱分化防止または生存を促進する形態にあることである。
処理すべき「患者」または「対象」とはヒトあるいは非ヒト動物を意味する。
ここに用いるとき、「ベクター」という用語は他の核酸に結合して、それを運搬することのできる核酸分子をいう。好ましいベクターの一つの型はエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、該ベクターに結合している核酸の自律複製および/または発現が可能なものである。有効に結合している遺伝子の発現を左右することの可能なベクターを、ここでは「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術に利用する発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形態にあり、プラスミドは一般に円形の二重鎖ＤＮＡループをいい、ベクターの型にあっては染色体に繋がっていない。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は相互に交換可能な用語であり、プラスミドが最も共通に用いられるベクターの形態である。しかし、本発明は、同等の機能を果たし、これに続く技術において既知となるような他の形態のベクターをも包含するものである。
「転写制御配列」は、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターなどのＤＮＡ配列を引用するために明細書全体に用いる一般的用語であり、操作可能な状態でそれに結合しているタンパク・コード配列の転写を誘発または調整するものである。好ましい態様において、組換えＨＩＰ遺伝子の転写はプロモーター配列（または他の転写制御配列）の調整下にあり、プロモーター配列は発現させようとする細胞型中の組換え遺伝子の発現を調整する。組換え遺伝子は転写制御配列の調整下にあるが、その配列が天然存在型ＨＩＰ遺伝子の転写を調整する配列と同一または異なるものであることも理解されよう。
ここに用いるとき、「組織特異プロモーター」という用語は、プロモーターとして作用するＤＮＡ配列、すなわち、プロモーターに実施可能なように結合した選択ＤＮＡ配列の発現を制御するＤＮＡ配列であって、組織の特定細胞、例えば、神経系もしくは造血系起源の細胞中、選択ＤＮＡ配列の発現を果たすものを意味する。この用語はまた、いわゆる「漏出」プロモーターをも包含し、該プロモーターは一つの組織において主として選択ＤＮＡの発現を制御するが、他の組織においても同様に少なくとも低レベルの発現を惹起することができるものである。
ここに用いるとき、「標的組織」という用語は、動物、例えば、哺乳類、例えば、ヒトに存在する、あるいはin vitro培養物、例えば、細胞培養物に存在する結合組織、軟骨、骨組織または肢組織をいう。
ここに用いるとき、「形質転換動物」とは、いわゆる動物、好ましくは、非ヒト哺乳動物、鳥類または両生類であって、その動物の一つ以上の細胞がヒトの介在、例えば、技術上周知の形質転換技法により導入された異種核酸を含むもをいう。該核酸は計画的な遺伝子操作、例えば、マイクロインジェクションまたは組換えウイルスの感染などにより、細胞の前駆体に導入することで、直接または間接的に細胞中に導入する。遺伝子操作という用語は古典的な交配またはin vitroでの受精を包含せず、むしろ組換えＤＮＡ分子を導入することを目指すものである。この分子は染色体内に組込まれるか、あるいは染色体外でＤＮＡを複製することができる。代表的な形質転換動物において、導入遺伝子は細胞に対しＨＩＰタンパクの組換え型、例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト型を発現させる。しかし、組換えＨＩＰ遺伝子が不活性な形質転換動物はまた、例えば、以下に記載するＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性構築物として期待される。さらに、「形質転換動物」はまた、ヒトの介在、例えば、組換えおよびアンチセンス技術の両方により１以上のＨＩＰ遺伝子が遺伝子中断されている組換え動物を含む。
本発明の「非ヒト動物」は脊椎動物、例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、家畜類、鳥類、両生類、爬虫類などを含む。ここで用いる「キメラ動物」という用語は、そこに組換え遺伝子が見出される動物、あるいはそこに組換え体がその動物のすべてではないが一部に発現している動物をいう。「組織特異キメラ動物」は組換えＨＩＰ遺伝子がある組織に存在しているか、および/または発現しているか、または中断しているが、他の組織ではそうではないものをいう。
ここに用いるとき、「導入遺伝子」は、一部または全部が導入される形質転換動物または細胞に対して異種、すなわち外来性であるか、または導入される形質転換動物または細胞の内在性遺伝子に対して相同である核酸配列（例えば、ＨＩＰポリペプチドをコード化する、またはそれにアンチセンス転写物をぶらさげる）を意味するが、該配列はそれを挿入する細胞のゲノムを変化させるような方法で動物のゲノムに挿入するべく設計するか、あるいは挿入する（例えば、それは天然の遺伝子のものとは異なる位置に挿入されるか、またはその挿入がノックアウトに至るものである）。導入遺伝子は１以上の転写制御配列およびイントロンなどの他の核酸であって、選択した核酸の最適発現に必要となるものを含む。
周知のように、特定のポリペプチドのための遺伝子は個々のゲノム内の単一または複数のコピーに存在する。そのような二重の遺伝子は同一であってもよいし、あるいはある種の修飾、例えば、ヌクレオチドの置換、付加または欠失を有してもよく、それらはすべて実質的に同じ活性を有するポリペプチドをなおコードする。従って、「ＨＩＰポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列」という用語は特定個体内の１以上の遺伝子をいう。さらに、ヌクレオチド配列の幾つかの相違は同一種の個体間に存在することが可能であり、それをアレレ（対立遺伝子）と呼称する。そのようなアレレの差異はコード化ポリペプチドのアミノ酸配列の差異となる場合とならない場合があるが、それでもなお同じ生物活性を有するタンパクをコード化する。
「相同性」および「同一性」はそれぞれ２つのポリペプチド配列間の配列類似をより厳格な比較である同一性で言及する。相同性および同一性はそれぞれ比較の目的で一列に並べた各配列での位置を比較することにより決定する。比較した配列の位置が同じアミノ酸残基で占められているとき、そのペプチドはその位置で同一であるということができる；等価の部位が同じアミノ酸（例えば、同一）または類似のアミノ酸（例えば、立体的および/または電気的性質が似ている）により占められているとき、その分子はその位置で相同であるという。配列間の相同性または同一性の百分比は、該配列が共有する調和もしくは相同位置数の関数である。「無関係」または「非相同性」配列は、本発明のＨＩＰ配列をもち、好ましくは２５％より低い同一性であるが、４０％より低い同一性を共有するものである。
「オーソログ」という用語は、種形成を介して同族体であり、例えば、密接に関連して構造的および機能的考察にもとづき共通の系統をもつと仮定される遺伝子またはタンパクをいう。オーソロガスタンパクは異なる種において同一の活性を認識し得るものとして機能する。「パラログ」という用語は、遺伝子重複を介して同族体である遺伝子またはタンパク、例えば、ゲノム内遺伝子の重複変異体をいう。フリッチ（Fritch、WM）（１９７０）Syst Zool １９：９９〜１１３も参照。
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」はここでは相互に交換して用いる用語である。そのような用語は特定対象の細胞ばかりではなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫をもいう。ある改変が変異または環境の影響により次世代に生じるかも知れないので、そのような子孫は実際に親細胞と同一ではないが、ここで用いる用語の範囲内になお包含される。
「キメラタンパク」または「融合タンパク」は、ＨＩＰポリペプチドをコード化する第一アミノ酸配列と、ＨＩＰタンパクのいずれのドメインに対しても外来性であり、本質的に相同ではないドメインを規定する第二アミノ酸配列（例えば、ポリペプチド部分）との融合体である。キメラタンパクは第一タンパクをも発現する生物体中に見出される（異なるタンパクであるにかかわらず）外来ドメインを呈示するし、あるいは「種間」、「遺伝子間」など、異なる種類の生物体が発現するタンパク構造の融合体であってもよい。一般に、融合タンパクは一般式：Ｘ−ＨＩＰ−Ｙで表すことができる（ただし、式中ＨＩＰはＨＩＰタンパクから誘導される融合タンパクの一部を表し、ＸおよびＹは独立に存在しないか、または生物体のＨＩＰ配列に関係のないアミノ酸配列を表す）。
ここに用いるとき、「レポーター遺伝子構築物」は転写制御配列に有効に結合する「レポーター遺伝子」を含む核酸である。レポーター遺伝子の転写はこれらの配列によって調整される。少なくとも１以上のこれらの調整配列の活性は、直接的または間接的にホスホリパーゼの関与するシグナル伝達経路により制御されるが、例えば、直接的または間接的にホスホリパーゼ活性により産生される第二メッセンジャーにより制御される。転写制御配列はプロモーターと他の制御領域、例えば、プロモターの活性を調節するエンハンサー配列、あるいはプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの活性または効率を調整する制御配列、あるいはエフェクター分子により認識される制御配列を含み、これらはホスホリパーゼの活性化により特異的に誘発される。例えば、プロモーター活性の調節は、プロモター領域に結合するＲＮＡポリメラーゼを変化させることにより実施し得るし、あるいは別法として、ｍＲＮＡの転写または延長開始を妨げることにより実施し得る。このような配列をここでは集約的に転写制御要素または配列という。さらに、該構築物は第二メッセージに応答して生じるｍＲＮＡの翻訳安定性または速度を変え、それによってレポーター遺伝子産物の量を変えるヌクレオチドの配列を含んでもよい。
ここに用いるとき、「トランスフォーミング成長因子−ベータ」および「ＴＧＦ−β」という用語は、脊椎動物に偏在する一群の構造的に関連するパラ分泌ポリペプチド、および大きな一群のプロトタイプであるメタゾア成長、分化、形態形成因子を意味する（総説として参照；マサック（Massaque）ら（１９９０）、Ann Rev Cell Biol ６：５９７〜６４１；およびスポーン（Sporn）ら（１９９２）、J Cell Biol １１９：１０１７〜１０２１）。この群に含まれるものは「骨形態形成タンパク」または「ＢＭＰ」であり、骨から単離されたタンパク、およびそのフラグメント、また、単独で、あるいは適切な補助因子と組み合せたときに骨の沈着を誘発することのできる合成ペプチドをいう。ＢＭＰ−１、−２、−３および−４などのＢＭＰ類の調製は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ８８/００２０５に記載されている。ウオズニー（Wozney）（１９８９）Growth Fact Res １：２６７〜２８０はＢＭＰ−２に密接に関連したさらなるＢＭＰを記載しており、ＢＭＰ−５，−６および−７と命名している。ＰＣＴ公報ＷＯ８９/０９７８７およびＷＯ８９/０９７８８は「ＯＰ−１」と呼ぶタンパクを記載しているが、現在このものはＢＭＰ−７として知られている。他のＢＭＰもこの技術において既知である。
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸についてここで用いる「単離した」という用語は、天然源の高分子に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡそれぞれから分離した分子をいう。例えば、ＨＩＰポリペプチドをコード化する単離した核酸は、１０キロベース（ｋｂ）を超えない核酸配列を含み、ゲノムＤＮＡ中のＨＩＰ遺伝子に当然に直接的に隣接するが、より好ましくは５ｋｂを超えない天然産のフランキング配列であり、最も好ましくは１．５ｋｂを超えない天然産のフランキング配列である。ここに用いる‘単離した’という用語はまた、細胞物質を実質的に含まない、あるいは組換えＤＮＡ技法により産生したときには培地を含まない、あるいは化学合成したときには化学前駆物質または他の化学物質を含まない核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離した核酸」とは、フラグメントとしては天然に存在せず、天然状態では見出せない核酸フラグメントを含むものとする。
以下に記載するように、本発明の一面は、ＨＩＰポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離した核酸、および/またはそのような核酸の等価物に関する。ここに用いる核酸という用語は等価物としてのフラグメントを含むものとする。等価物という用語は、機能的に等価のＨＩＰポリペプチドまたはここに記載するようなＨＩＰタンパクの活性をもつ機能的に等価のペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むものと理解される。等価のヌクレオチド配列は、アレレ変異体などの１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なっている配列を含む；従って、該配列は、遺伝子コードの同義性により、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜４および９〜１４の１つ以上に示したＨＩＰコード配列のヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。等価物はまた、緊縮条件下（すなわち、約１Ｍ塩となるＤＮＡ複式の融点（Ｔｍ）以下の約２０〜２７℃に等価）ハイブリッド形成してＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１，２，３，４，９，１０，１１，１２，１３または１４で表されるヌクレオチド配列とするヌクレオチド配列をも含む。一態様において、等価物はさらに、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示したヌクレオチド配列から誘導され、これらに進展的に関係する核酸配列を含む。
さらに、一般に有利であると認識されることは、天然型タンパクの生物活性のサブセットのみを促進または阻害するために、一定の条件下で、アゴニスト（例えば、野生型ＨＩＰタンパクの生物活性をまねるか、または増強する）またはアンタゴニスト（例えば、野生型ＨＩＰタンパクの生物活性を阻害する）の一つとして限られた能力内で機能するＨＩＰペプチドの同族体を提供することである。このようにして、特定の生物効果を限られた機能の同族体で処理することにより引き出すことができる。例えば、ヘッジホッグ相互作用タンパクの先端切断型、例えば、細胞外ドメインの可溶フラグメントは野生型ＨＩＰタンパクに結合するリガンド（ヘッジホッグ）を競合的に阻害するようにすることができる。
対象のＨＩＰタンパクの同族体は別々の点突然変異などの突然変異誘発により、または先端切断により産生させることができる。例えば、突然変異はその変異を誘導したＨＩＰポリペプチドの生物活性を同一なものとして、あるいは単なるサブセットとして保持する同族体を生じることができる。あるいは、天然産型タンパクの機能を阻害し得る該タンパクのアンタゴニスト型が産生されるが、これはヘッジホッグ・タンパクに競合的に結合し、野生型ＨＩＰと競合するか、または他のヘッジホッグ相互作用タンパク（ヘッジホッグ・レセプターのサブユニットなど）に結合して非応答性のヘッジホッグ・レセプター複合体を形成する。このように、本主発明により提供されるＨＩＰタンパクおよびその同族体は、細胞の成長、死および/または分化の正または負の制御物質である。
一般に、ＨＩＰタンパク（例えば、「生物活性」である）の活性を有するものとしてここに言及するポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８に示したＨＩＰタンパクのアミノ酸配列のすべてまたは一部に対応する（例えば、一致するか、相同である）アミノ酸配列を含み、天然産ＨＩＰタンパクの生物学的/生化学的活性のすべてまたは一部を作動するか、または拮抗するポリペプチドと定義される。そのような生物活性の例は、高い親和性によってヘッジホッグタンパクに結合する能力を含む。対象ＨＩＰポリペプチドの確かな態様の生物活性は、背部中胚葉から誘導される組織などの中胚葉誘導組織、神経管、神経冠、または頭部間葉から誘導される組織などの外胚葉誘導組織、あるいは原始消化管から誘導される組織などの内胚葉誘導組織などからの細胞および組織の分化および/または維持を促進する能力により特徴づけられる。
対象ＨＩＰタンパクの他の生物活性はここに記載のとおりであり、当業者には当然に明瞭である。本発明によると、ポリペプチドが天然産型のＨＩＰタンパクの特異アゴニストまたはアンタゴニストであるならば、そのポリペプチドは生物活性を有する。
好ましい核酸は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８で表されるような天然産ＨＩＰタンパクのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％または８０％の相同性、より好ましくは少なくとも８５％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性のアミノ酸配列からなるＨＩＰポリペプチドをコード化する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９８〜９９％の相同性のポリペプチドをコードする核酸はまた、核酸の配列が配列リストに例示したＨＩＰ配列と一致する場合は、勿論、本発明の範囲内である。一態様において、該核酸は対象ＨＩＰポリペプチドの少なくとも一つの活性を有するポリペプチドをコード化するｃＤＮＡである。
確かな好ましい態様において、本発明は６８ｋｄないし８８ｋｄの範囲の分子量、さらにより好ましくは７６ｋｄないし８０ｋｄ（全長ＨＩＰタンパクとして）の範囲の分子量を有するペプチド鎖の精製もしくは組換えＨＩＰポリペプチドを特徴とする。理解されることは、一定の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、ホスホリル化などは、未修飾ポリペプチド鎖に比例してＨＩＰタンパクの見かけの分子量を増大させ、一定配列の切断、例えば、プロ配列は同様に見かけの分子量を減ずる。他の好ましいＨＩＰポリペプチドは以下のとおりである：シグナル配列ペプチドを欠失する成熟ＨＩＰポリペプチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の残基１６〜７００に相当、例えば、約７６．８ｋＤの分子量を有する；レセプターの成熟細胞外フラグメント（可溶性）、例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の残基１６〜３５６に相当、例えば、約７４．４ｋＤの分子量を有する；または、例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の残基１６〜６７９に相当、例えば、約３８．６ｋＤの分子量を有する。好ましい態様において、該核酸はヘッジホッグ結合ドメイン含有ＨＩＰポリペプチドをコード化する。「約〜の分子量」が意味するのは約±５ｋｄである。
本発明の他の面では、高もしくは低緊縮条件下で、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜４および９〜１４によって表される１以上の核酸にハイブリッド形成する核酸を提供する。ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適正な緊縮条件は、例えば、約４５℃での６．０ｘ塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで５０℃での２．０ｘ ＳＳＣによる洗浄であり、当業者には既知のことであるが、カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology)、ジョン・ウイリ・アンド・サンズ（John Wiley & Sons）、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６にも見出すことができる。例えば、洗浄工程での塩濃度は５０℃での２．０ｘ ＳＳＣによる低緊縮から５０℃での０．２ｘ ＳＳＣによる高緊縮までの範囲から選択し得る。さらに、洗浄工程の温度は室温（約２２℃）での低緊縮条件から約６５℃での高緊縮条件まで上昇させることができる。
遺伝子コードの縮退のためにＳＥＱ ＩＮ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＮ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＮ Ｎｏ．３またはＳＥＱ ＩＮ Ｎｏ．４に示したヌクレオチド配列とは異なる配列をもつ核酸もまた、本発明の範囲内である。そのような核酸は等価のペプチド（すなわち、ＨＩＰポリペプチドの生物活性を有するペプチド）を機能的にコード化するが、遺伝子コードの縮退のために配列リストに示した配列とは異なる配列である。例えば、いくつかのアミノ酸は１より多いトリプレットにより指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、または同義コドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはそれぞれヒスチジンをコード化する）はＨＩＰポリペプチドのアミノ酸配列に影響しない「サイレント」変異に至る。しかし、対象ＨＩＰポリペプチドのアミノ酸配列変化に導くＤＮＡ配列の多型性が、例えば、ヒトの中で存在することが期待される。ＨＩＰポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコード化する核酸の１以上のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）におけるこれらの変異が、自然のアレレ変異による特定種の個体間に存在するということを当業者は認識するであろう。
ここに用いるとき、ＨＩＰ遺伝子フラグメントとは、ＨＩＰの完全成熟型をコード化するヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドの核酸をいい、さらにこのものは、（好ましくは）全長タンパクのある種生物活性を保持するポリペプチドをコード化する。本発明が意図するフラグメントサイズは、例えば、アミノ酸の長さで５、１０、２５、５０、７５、１００、または２００ケである。先端切除したレセプターの好ましい態様において、該ポリペプチドはヘッジホッグ・ポリペプチドに結合するために、リガンド・ドメインのすべてまたは十分な部分を含むものである。
下に示した実施例に述べたように、ＨＩＰタンパク−コード化核酸はメタゾア生物体の細胞に存在するｍＲＮＡから得られる。成体および胚双方のゲノムＤＮＡから本発明ＨＩＰポリペプチドをコード化する核酸を得ることもまた可能である。例えば、ＨＩＰタンパクをコード化する遺伝子は、ここに記載のプロトコールならびに当業者周知のプロトコールに従って、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローン化することができる。ＨＩＰタンパクをコード化するｃＤＮＡは、必要に応じ、哺乳動物細胞などの細胞、例えば、ヒト細胞から全ｍＲＮＡを単離することにより得ることができる。二重鎖ｃＤＮＡは全ｍＲＮＡから調製し、次いで、多くの既知技術の一つを用い、適当なプラスミドまたはバクテリオファージ・ベクターに挿入することができる。ＨＩＰタンパクをコード化する遺伝子はまた、本発明が提供するヌクレオチド配列の情報に従って、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用い、クローン化することができる。本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。好ましい核酸はｃＤＮＡであり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４のいずれか一つにより表されるヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の面は「アンチセンス」治療法において、当該単離した核酸を使用することに関する。ここに用いるとき、「アンチセンス」治療法は、オリゴヌクレオチド・プローブまたはその誘導体を投与すること、またはin situで産生させることをいい、該プローブは細胞条件下で対象ＨＩＰタンパクをコード化する細胞ｍＲＮＡおよび/またはゲノムＤＮＡをハイブリッド形成する（結合する）ものであって、その結果、例えば、転写および/または翻訳を阻害することにより、該タンパクの発現を阻害する。結合は通常の塩基対相補性によるものであるか、あるいは、例えば、デュープレックスに結合する場合には、二重らせんの主溝における特異相互作用による。一般に、「アンチセンス」治療法は当該技術において通常採用される技術範囲のものをいい、オリゴヌクレオチド配列に特異的に結合させることによる治療法を包含する。
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、発現プラスミドとして送達することができるが、細胞中で転写するときは、ＨＩＰタンパクをコード化する細胞性ｍＲＮＡの少なくともユニーク部分に相補的となるＲＮＡを産生する。あるいは、該アンチセンス構築物はオリゴヌクレオチドプローブであって、ex vivoで産生され、細胞中に導入したときに、ＨＩＰ遺伝子のｍＲＮＡおよび/またはゲノム配列とハイブリッド形成することにより発現を阻害するものである。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは修飾したオリゴヌクレオチドであって、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼに抵抗し、それ故にin vivoで安定なものである。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとして使用する代表的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類似体（米国特許５，１７６，９９６；５，２６４，５６４；および５，２５６，７７５参照）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。さらに、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築する一般的な方法が、例えば、バン・デル・クロール（Van der Krol）ら（１９８８）バイオテクニック６：９５８〜９７６；およびシュタイン（Stain）ら（１９８８）キャンサー・リサーチ４８：２６５９〜２６６８にまとめられている。
従って、本発明の修飾オリゴマーは治療面、診断面および研究面において有用である。治療応用において、該オリゴマーは一般にアンチセンス療法に適した方法で利用される。そのような治療法のために、本発明のオリゴマーは、全身および局所または限局投与などの種々の投与経路用に製剤化することができる。一般的な技術および製剤化についてはレミントンの薬科学（Remmington's Pharmaceutical Sciences）メッド出版、イーストン、ペンシルベニアで見ることができる。全身投与としては、注射が好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下注射である。注射用には、本発明のオリゴマーを液状溶液、好ましくはハンク溶液またはリンゲル溶液などの生理的に両立し得るバッファーの溶液である。さらに、該オリゴマーは固形に製剤化して、使用直前に再溶解または懸濁する。凍結乾燥形態も包含する。全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるか、または化合物を経口投与することもできる。経粘膜または経皮投与のためには、浸透すべき障壁に適した浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は一般に技術上知られており、例えば、経粘膜投与のためには胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含む。さらに、浸透を容易にするために洗浄剤を使用してもよい。経粘膜投与は鼻スプレーによっても、あるいは座剤を用いてもよい。経口投与のためには、該オリゴマーを常用の経口剤、例えば、カプセル、錠剤およびトニックに製剤化する。局所投与用には、本発明のオリゴマーを当該技術で一般に知られた軟膏、ゲルまたはクリームに製剤化する。
治療用途に加えて、本発明のオリゴマーは診断薬として使用し、それらが特異的に結合する標的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在または不存在を検出することができる。そのような診断試験については以下にさらに詳細に記載する。
同様に、本発明のアンチセンス構築物は、ＨＩＰタンパクの正常な生物活性に拮抗すること、例えば、発現のレベルを減ずることによる、in vivoおよびex vivo双方での組織の微妙な操作、例えば、組織の維持、分化または成長に使用することができる。
さらに、アンチセンス技法（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、またはプラスミドであって、その転写物がＨＩＰｍＲＮＡもしくは遺伝子配列に関してアンチセンスであるものでのトランスフェクション）は発生事象におけるＨＩＰの役割、ならびに成体組織におけるＨＩＰの正常細胞機能の研究に使用することができる。そのような技法は細胞培養に利用できるが、形質転換動物（上記）の創製にも使用することができる。
本発明はまた、少なくとも１つの転写制御配列に操作可能に結合したＨＩＰポリペプチドをコード化する核酸含有発現ベクターを提供する。操作可能に結合とは、ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で制御配列に結合していることを意味するものとする。制御配列は技術的に認められているものであって、対象ＨＩＰタンパクの発現を指示するように選択される。従って、転写制御配列という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調整要素を含む。そのような制御配列はゲッデル（Goeddel）著:遺伝子発現技術：メソッド・イン・エンザイモロジー（Method in Enzymology）１８５、アカデミック・プレス、サンジエゴ、カリフォルニア（１９９０）に記載されている。例えば、広範な発現調整配列、ＤＮＡ配列が操作可能に結合してその発現を調整する配列のいずれもが、本発明のＨＩＰポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列発現のために、これらのベクターにおいて使用してもよい。このように有用な発現調整配列は、例えば、モロニー・マウス白血病ウイルスのＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ，ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス即時型プロモーター、lacシステム、trpシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、発現がＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより指示されるＴ７プロモーター、ファージλのメジャー・オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク用調整領域、３−ホスホグリセレート・キナーゼまたは他の解糖酵素用プロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系および他の配列であって、原核もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調整することの知られた配列のポリヘドロン・プロモーター、およびその様々な組合わせを含む。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択および/または発現しようとするタンパクの型などの因子に依存することを理解すべきである。
さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調整する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによりコード化される他のタンパクの発現もまた考慮すべきである。一態様において、該発現ベクターは、対象ＨＩＰポリペプチドのアゴニスト活性を有するポリペプチドをコード化する、あるいはＨＩＰタンパクのアンタゴニスト型であるポリペプチドをコード化する組換え遺伝子を含む。本発明の代表的なＨＩＰポリペプチドはリガンド結合ドメインを維持するタンパク、例えばヘッジホッグ・ポリペプチドに結合する能力を維持する可溶性先端切断型タンパクである。そのような発現ベクターは細胞に移入し、それによってここに記載の核酸によりコード化した、融合タンパクを包含するポリペプチドを産生させるのに使用することができる。
さらに、本発明の遺伝子構築物は、例えば、対象ＨＩＰタンパクのアゴニストまたはアンタゴニスト型または上記のアンチセンス分子をコード化する核酸送達のための遺伝子治療プロトコールの一部としても使用することができる。このように、本発明の他の面は、特定の細胞型においてＨＩＰポリペプチドまたはアンチセンス分子のin vivoまたはin vitroトランスフェクションおよび発現用発現ベクターを特徴とするが、それが天然産型タンパクが誤って発現された（または中断されている）組織中でＨＩＰ誘発転写の機能を再構築するか、あるいはその生物機能のすべてもしくは一部を廃棄する；または組織の維持もしくは分化を変化させる、あるいは新生物形成または過形成増殖を阻害する形態のタンパクを送達する。
対象ＨＩＰポリペプチドの発現構築物ならびにアンチセンス構築物は、生物学的に有効な担体、例えば、組換え遺伝子をin vivoで細胞中に有効に送達し得る製剤または組成物によって投与してもよい。操作方法は対象遺伝子を組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス−１を含むウイルスベクター、あるいは組換えバクテリアまたは真核細胞プラスミド中に挿入することを含む。ウイルスベクターは直接細胞に移入する；プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体（例えば、複合抗体）、ポリリジン複合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープまたは他のその種の細胞内担体の介助により、あるいは遺伝子構築物の直接のインジェクションまたはin vivoで実施するＣａＰＯ4沈殿により送達することができる。適切な標的細胞の形質導入は遺伝子治療において決定的な第一段階となるので、特定の遺伝子送達システムが、企図する標的の表現型および投与ルート、例えば、局所または全身投与などの因子に依存するであろうことが正しく認識されるだろう。さらに、ＨＩＰ発現のin vivo形質導入のために提供された特定遺伝子構築物が、細胞のin vitro形質導入にも有用であること、例えば、下記ex vivo組織培養システムに使用し得ることが認識されるだろう。
核酸を細胞にin vivo導入するための好ましい方法は、核酸、例えば、所望の特定ＨＩＰポリペプチドをコード化するｃＤＮＡを含むウイルスベクターの使用によるものである。細胞をウイルスベクターで感染させることは、大部分の標的細胞が当該核酸を受けることができるという利点がある。さらに、ウイルスベクター内にコード化された分子は、例えば、ウイルスベクター内に含まれるｃＤＮＡにより、ウイルスベクター核酸を取り込んでいる細胞内で効率的に発現される。レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクターおよびアデノ関連ウイルス・ベクターは外来遺伝子をin vivoで、特にヒトに転移するための代表的な組換え遺伝子送達システムである。これらのベクターは遺伝子を細胞中に効率的に送達し、転移された核酸は宿主の染色体ＤＮＡに安定に組込まれる。
前出説明のようなウイルス転移法に加えて、非ウイルス法も動物組織中での対象ＨＩＰポリペプチドの発現を引起こすために採用し得る。遺伝子転移の殆どの非ウイルス法は、高分子の取り込みと細胞内転移のために哺乳動物細胞により用いられる通常のメカニズムに基づいている。好ましい態様において、本発明の非ウイルス遺伝子送達システムは、標的細胞による対象ＨＩＰポリペプチド遺伝子取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存する。この型の代表的遺伝子送達システムはリポソーム誘導システム、ポリリジン複合体、および人工ウイルスエンベロープを含む。
臨床条件設定において、治療用ＨＩＰ遺伝子のための遺伝子送達システムは、多くの方法により患者−動物に導入することが可能であり、その方法のそれぞれは技術上よく知られたものである。例えば、遺伝子送達システムの薬学的製剤は、全身的に、例えば、静脈注射により導入可能であり、該タンパクの標的細胞への特異的形質導入は、遺伝子送達ビークルにより提供される特異性、受容体遺伝子の発現を調整する転写制御配列による細胞型または組織型発現、またはその組み合せから優先的に起こる。他の態様において、組換え遺伝子の最初の送達は非常に局在化している動物に導入することにより、より限定される。例えば、遺伝子送達ビークルはカテーテル（米国特許５，３２８，４７０参照）により、または定位固定インジェクション（例えば、チェン（Chen）ら（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４〜３０５７）により導入することができる。ＨＩＰ遺伝子は、例えば、デブ（Dev）ら（（１９９４）Cancer Treat Rev ２０：１０５〜１１５）が記載の技術を用い、エレクトロポレーションにより遺伝子治療構築物に送達することができる。
遺伝子治療構築物の薬学的製剤は、実質的に、許容し得る希釈剤中の遺伝子送達システムからなるか、遺伝子送達ビークルを徐放マトリックスに包埋したものであってもよい。あるいは、完全な遺伝子送達システムが組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから未処理のまま産生し得る場合には、該薬学的製剤は遺伝子送達システムを産生する１以上の細胞から成り立っていてもよい。
さらに他の態様において、対象の発明は「遺伝子活性化」構築物を提供するが、これはゲノムＤＮＡとの相同的組換えにより、内在性ＨＩＰ遺伝子の転写制御配列を変化させる。例えば、遺伝子活性化構築物はＨＩＰ遺伝子の内在性プロモーターを非相同性プロモーターと置換えることができるが、非相同性プロモーターとは、例えば、ＨＩＰ遺伝子の構成性発現を惹起するもの、またはＨＩＰの正常発現様式とは異なる条件下遺伝子の誘導発現を惹起するものである。遺伝子活性化構築物に対する多様性に富むフォーマットが入手可能である。例えば、トランスカリオティック・テラピー（Transkaryotic Therapies）、Ｉｎｃ；ＰＣＴ公開：ＷＯ９３/０９２２２、ＷＯ９５/３１５６０、ＷＯ９６/２９４１１、ＷＯ９５/３１５６０およびＷＯ９４/１２６５０参照。
好ましい態様において、遺伝子活性化構築物として用いられるヌクレオチド配列は、（１）組換えを指示する内在性ＨＩＰ遺伝子（エクソン配列、イントロン配列、プロモーター配列など）のある部分からのＤＮＡ，および（２）遺伝子活性化構築物の組換えにもとづき、ゲノムＨＩＰ遺伝子用コード配列に操作可能に結合している非相同性転写制御配列から構成される。ＨＩＰ産生細胞の培養物作製に使用するために、該構築物は細胞中にノックアウト構築物の存在を検出するためのレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。
遺伝子活性化構築物は細胞中に挿入し、本来のＨＩＰ遺伝子と操作可能に関連して非相同性制御配列を提供するような位置に細胞のゲノムＤＮＡに組込む。そのような挿入は相同性組換えにより起こる、すなわち、内因性ＨＩＰ遺伝子に相同な活性化構築物の組換え領域がゲノムＤＮＡにハイブリッド化し、そしてゲノム配列と組み換り、その結果、構築物がゲノムＤＮＡの対応する位置に組込まれる。
「組換え領域」または「標的配列」という用語は、ゲノム遺伝子配列、例えば、ゲノム遺伝子の５'末端切除配列に実質的に同一である、あるいは実質的に相補的である配列を有する遺伝子活性化構築物のセグメント（すなわち、一部分）をいい、ゲノム配列と標的導入遺伝子構築物の間の相同性組換えを容易にする。
ここに用いるとき、「置換え領域」という用語は、組換え領域とゲノム配列の間の相同性組換えに続いて、内在性染色体の位置に組込まれることとなる活性化構築物の一部をいう。
非相同性制御配列、例えば、置換え領域に与えられる配列は多様な要素を包含し、以下のようなものである：プロモーター（構成的または誘発性プロモーターなど）、エンハンサー、陰性制御要素、遺伝子座調整領域、転写因子結合部位、またはその組み合せ。In vivoで標的遺伝子の発現を調整するのに用いることのできるプロモーター/エンハンサーは、これらに限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＣ）プロモーター/エンハンサー（カラスヤマら、１９８９、J.Exp.Med.,１６９：１３）、ヒトβ−アクチン・プロモーター（ガンニング（Gunning）ら（１９８７）ＰＮＡＳ８４：４８３１〜４８３５）、マウス乳房腫瘍ウイルス長端反復（ＭＭＴＶＬＴＲ）に存在するグルココルチコイド誘発性プロモーター（クレジッヒ（Klessigh）ら（１９８４）Mol.Cell Biol. ４：１３５４〜１３６２）、モロニー・マウス白血病ウイルスの長端反復配列（ＭｕＬＶ ＬＴＲ）（ワイス（Weiss）ら（１９８５）ＲＮＡ腫瘍ウイルス、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）、ＳＶ４０初期または後期領域プロモーター（ベルノイスト（Bernoist）ら（１９８１）Nature２９０：３０４〜３１０；テンプレトン（Templeton）ら（１９８４）Mol.Cell Biol.、４：８１７；およびスプラグー（Sprague）ら（１９８３）J.Virol.,４５：７７３）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の3'長端反復に含まれるプロモーター（ヤマモトら（１９８０）Cell、２２：７８７〜７９７）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジン・キナーゼ・プロモーター/エンハンサー（ワグナー（Wagner）ら（１９８１）ＰＮＡＳ８２：３５６７〜７１）、および単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロモーター（ウオルフェ（Wolfe）ら（１９９２）Nature Genetics,１：３７９〜３８４）などを包含する。
さらに他の態様において、置換え領域は未変性遺伝子の負の転写調整要素を単に欠失を引起こして、例えば、発現を活性化し、あるいは正の調整要素を除去して、例えば、標的遺伝子の発現を阻害する。
本発明の他の面はＨＩＰタンパクの組換え型に関する。本発明において好ましい組換えポリペプチドは、未変性のタンパクに加えて、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の１以上により表されるアミノ酸配列と６０％または７０％相同であり、より好ましくは少なくとも８０％相同であり、最も好ましくは８５％相同である。ＨＩＰタンパクの活性を有し（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト活性）、かつ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７および/またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８との相同性が少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８〜９９％であるポリペプチドも本発明の範囲内である。上記のようなポリペプチドはタンパクの種々の先端切除型を含む。
「組換えＨＩＰポリペプチド」という用語は組換えＤＮＡ技術により調製されるポリペプチドをいい、この場合、ＨＩＰポリペプチドをコード化するＤＮＡは、異種タンパクを産生するための宿主細胞を形質転換するのに順次用いる適切な発現ベクターに挿入される。さらに、「から誘導される」という句は、組換えＨＩＰ遺伝子に関して、「組換えタンパク」の意味内に包含されることを意味し、これらのタンパクは未変性ＨＩＰタンパクのアミノ酸配列、または天然産型タンパクの置換および欠失（先端切断を含む）を含む突然変異により産生される類似のアミノ酸配列を有する。
本発明はさらに組換え型の対象ＨＩＰポリペプチドに関し、該ポリペプチドは哺乳類（例えば、ヒト）、爬虫類または両生類から誘導される遺伝子がコード化し、かつ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８で表されるＨＩＰタンパクに進化的に関連するアミノ酸配列を有する。そのような組換えＨＩＰポリペプチドは、好ましくは、追加の配列リストに示す野生型（「真正の」）ＨＩＰタンパクの少なくとも１つの生物活性を有するアゴニストまたはアンタゴニストのいずれか１つの役割において機能することのできるものである。「進化的に関連する」という用語は、ＨＩＰタンパクのアミノ酸配列に関して、天然に生ずるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および、例えば、コンビナトリアル変異誘発により誘導されるＨＩＰポリペプチドの突然変異体両方についていう。
本発明は該ＨＩＰポリペプチドを産生する方法も提供する。例えば、対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベクターによってトランスフェクションされた宿主細胞を、ペプチドの発現が起こることを可能とするために、適切な条件下で培養することができる。例えば、ＧＳＴ融合タンパクの場合においてなど、組換えタンパクに分泌シグナルペプチドが備わっていない場合には、細胞を採取し、溶解させ、タンパクを単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞と、培地と、他の副産物とを含む。細胞培養物に適した培地は当業者には周知である。組換えＨＩＰポリペプチドは、細胞培養物培地または宿主細胞から、またはその両者から、タンパク精製のための当業者に周知の技術、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、かかるペプチドに特有の抗体による免疫親和性精製などの技術を用いて単離することができる。好ましい実施の形態において、組換えＨＩＰポリペプチドは、ＧＳＴ融合タンパクまたはポリ（Ｈｉｓ）融合タンパクなどの、精製を容易にするドメインを含有する融合タンパクである。
本発明はまた、対象HIPペプチドの組換え型の発現のためにトランスフェクションされた宿主細胞にも関する。宿主細胞はなんらかの真核細胞または原核細胞であればよい。したがって、ＨＩＰタンパクのクローニングから誘導された、全長タンパクの全部または選択された部分をコード化するヌクレオチド配列を用い、微生物または真核細胞過程を経てＨＩＰポリペプチドの組換え型を産生することができる。発現ベクターなどの遺伝子構築物内にポリヌクレオチド配列を結合すること、および宿主、すなわち真核（酵母、トリ、昆虫、哺乳動物の）または原核（細菌の）細胞のいずれかに転換またはトランスフェクションすることは、例えば、ヘッジホッグタンパク、ＴＧＦβタンパクなどの他の周知のタンパク、および広範なレセプターの産性において用いられる標準的な手法である。類似の手法、またはその変形を使い、本発明に従った微生物手段または組織培養技術によって、組換えＨＩＰポリペプチドを調製することもできる。
組換えＨＩＰ遺伝子は、ＨＩＰポリペプチドをコード化する核酸を原核細胞または真核細胞のいづれか、またはその両方における発現に適したベクター内に結合することによって産生することができる。対象ＨＩＰペプチドの組換え型を産生するための発現ベクターには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、ＨＩＰポリペプチドの発現に適したベクターには、以下のタイプのプラスミドが含まれる：大腸菌などの原核細胞における発現のための、pBＲ３２２誘導プラスミド、ｐＥＭＢＬ誘導プラスミド、pEＸ誘導プラスミド、ｐＢＴａｃ誘導プラスミドおよびｐＵＣ誘導プラスミド。
酵母において組換えタンパクを発現させるためのベクターには多くのベクターがある。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）内への遺伝子構築物の導入に役立つクローニングおよび発現のビークルである（例えば、ブローチ（Broach et al）ら（１９８３）, Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. イノウエ、アカデミック・プレス, p. 83を参照；ここにおいて参照によって組み込む）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２が存在しているために、大腸菌内で、および酵母２ミクロンプラスミドの複製決定因子のために、Ｓ．セルビシエ内で複製することができる。加えて、アンピシリンなどの薬剤耐性遺伝標識を用いることができる。図示の実施の形態において、ＨＩＰポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に表わされたＨＩＰ遺伝子のコーディング配列をサブクローニングすることによって産生される発現ベクターを用いて、組換えにより産生される。
哺乳動物の好ましい発現ベクターは、バクテリア内でのベクターの増殖を容易にする原核細胞配列と、真核細胞内で発現される１つまたはそれ以上の真核細胞転写単位の両方を含有している。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ誘導ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、ｐＢＲ３２２などのバクテリアプラスミドからの配列で修飾され、原核および真核細胞両方においての複製と薬剤耐性選択とを容易にする。また代わりに、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ誘導体、およびｐ２０５）などのウイルス誘導体を、真核細胞内でのタンパクの一過性発現のために用いることもできる。プラスミドの調製および宿主生物体の形質転換に採用される種々の方法は当該技術において周知である。原核細胞および真核細胞両方に対する他の適切な発現系ならびに一般の組換え手法については、モレキュラー・クローニング・ラボラトリー・マニュアル、第二版、サムブルーク（Sambrook）、フリッシュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）編集（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス；１９８９）第１６章および１７章参照。
ある場合には、バキュロウイルス発現系を用い、組換えＨＩＰポリペプチドを発現させることが望ましい。そのようなバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ誘導ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ誘導ベクター（ｐＡＣＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ誘導ベクター（pBluBacIIIを含むβ−galなど）を包含する。
Ｎ−末端部分を欠く形態、すなわち、シグナルペプチドを欠く先端切断変異体などのＨＩＰタンパクの一部のみを発現したい場合には、発現すべき所望の配列を含むオリゴヌクレオチド・フラグメントに開始コドン（ＡＴＧ）を付加することが必要である。Ｎ−末端位のメチオニンは酵素メチオニン・アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を使用することにより酵素的に切断することができる。ＭＡＰは大腸菌（E.coli）（ベン−バサット（Ben-Bassat）ら（１９８７）J.Bacteriol.１６９：７５１〜７５７）およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）からクローン化されるが、そのin vitro活性は組換えタンパクについて証明されている（ミラー（Miller）ら（１９８７）ＰＮＡＳ８４：２７１８〜１７２２）。それ故、Ｎ−末端メチオニンの除去は、必要ならば、in vivoではＭＡＰを産生する宿主（例えば、大腸菌またはＣＭ８９またはＳ．セレビシエ（S.cerevisiae））にＨＩＰ誘導ポリペプチドを発現することにより、またはin vitroでは精製ＭＡＰを使用することにより（例えば、ミラー（Miller）ら、上記）達成することができる。
別法として、ポリペプチドのコード配列は異なるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列含有融合遺伝子の一部として組込むことができる。このタイプの発現系はＨＩＰタンパクの免疫原フラグメントを調製したい場合の条件下で有用である。例えば、ロタウイルスのＶＰ６キャプシドタンパクは、ＨＩＰポリペプチド部分のための免疫キャリアータンパクとして、モノマー形またはウイルス粒子の形態で用いることができる。対象ＨＩＰタンパクに対し抗体を起こすためのタンパク部分に相当する核酸配列は融合遺伝子構築物に組込むことができるが、該構築物はビリオンの部分としてＨＩＰエピトープ含有融合タンパク発現組換えウイルスのセットを産生するための後期ワクシニアウイルス構造タンパク用のコード配列を含む。肝炎Ｂ表面抗原融合タンパクを利用する免疫原融合タンパクを使用して、組換え肝炎Ｂウイルスが同様にこの役割において利用し得るということが証明されている。同様に、ＨＩＰタンパクの部分およびポリオウイルス・キャプシドタンパクを含む融合タンパクをコードするキメラ構築物を創製して、ポリペプチド抗原セットの免疫原性を高めることができる（例えば、ＥＰ公開Ｎｏ．０２５９１４９；およびエバンス（Evans）ら（１９８９）Nature３３９：３８５；ハン（Huang）ら（１９８８）J.Virol.６２：３８５５；およびシュリンジャー（Schlienger）ら（１９９２）J.Virol.６６：２）。
ペプチド−ベース免疫化用の多様抗原ペプチドシステムも免疫原を調製するために利用することができるが、この場合、ＨＩＰポリペプチドの所望部分は、オリゴマー分枝リジン・コア上でペプチドの有機化学合成により直接得られる（例えば、ポスネット（Posnett）ら（１９８８）ＪＢＣ２６３：１７１９およびナーデリ（Nardelli）ら（１９９２）J.Immunol.１４８：９１４）。ＨＩＰタンパクの抗原決定因子はバクテリア細胞により発現され、呈示される。
免疫原性を高めるために融合タンパクを利用することに加えて、融合タンパクがタンパクの発現を容易にすること、また従って、本発明のＨＩＰポリペプチド、特に先端切断型のＨＩＰタンパクの発現に使用することができることも広く認められる。例えば、ＨＩＰポリペプチドはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−融合）タンパクとして産生される。このようなＧＳＴ様式タンパクはＨＩＰポリペプチドの精製を、例えば、グルタチオン誘導マトリックスを使用することにより容易にすることができる（例えば、カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー、オウスベル（Ausubel）ら編纂（Ｎ．Ｙ．；ジョーン・ウイリー・アンド・サンズ、１９９１）参照）。
他の態様において、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子、例えば、組換えタンパクの所望部分のＮ−末端でのポリ（Ｈｉｓ）/エンテロキナーゼ開裂部位配列は、Ｎｉ２＋メタル樹脂を用いるアフィニティクロマトグラフィーによる発現融合タンパクの精製を可能とする。精製リーダー配列は次いでエンテロキナーゼでの処理により除去し、精製タンパクを提供する（ホクリ（Hochuli）ら（１９８７）J.Chromatography４１１：１７７；およびジャンクネヒト（Janknecht）ら、ＰＮＡＳ８８：８９７２）。
融合遺伝子を作製するための技術は当業者の知るところである。本質的には、異なるペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの結合は、連結用平滑末端またはスタッガー末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、不所望の結合をさけるために適切なアルカリホスファターゼ処理を施す付着末端充填、および酵素連結を用いる通常の技術に従って実施する。他の態様において、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成機を含む常用技術により合成することができる。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間で相補的に重なり合うような固定プライマーを用い実施することができるが、該遺伝子フラグメントは次いでアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生じることができる（例えば、カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー、オウスベル（Ausubel）ら編纂、ジョーン・ウイリー・アンド・サンズ（１９９２）参照）。
該ＨＩＰポリペプチドはまた、化学的に修飾して、他の化学的部分、例えば、グリコシル基、リピド、コレステロール、リン酸エステル、アセチル基などとの共有もしくは凝集接合体を形成することにより、ＨＩＰ誘導体とすることができる。ＨＩＰタンパクの共有結合誘導体は、該タンパクのアミノ酸側鎖上の、またはポリペプチドのＮ−末端もしくはＣ−末端の官能基に化学的部分を結合させることにより調製することができる。
適切な場合には、多量体ＨＩＰポリペプチドの形成も提供する。対象ＨＩＰポリペプチドの可溶型多量体は技術上既知の方法に従い製造し得る。一態様において、ＨＩＰ多量体は、ＨＩＰポリペプチドの可溶型ダイマーまたはより高次の多量体の形成に至らしめる既知方法を用いることにより化学的に架橋させる。ＨＩＰポリペプチドの可溶型多量体を製造するもう一つの方法は、組換え技術、例えば、ヒンジ領域の封入による。このリンカーはキメラタンパクの柔軟性を高めるのを容易にし、２つのフラグメント間の立体障害を減少させることにより種々のＨＩＰモノマー・サブユニットが自由に、かつ、（任意に）同時にＨＩＰリガンドと相互作用するのを可能とし、同様に、各部分の適切な折りたたみの起こることを可能にする。該リンカーはタンパクの２つのドメイン間でランダムコイル状に存在することが確かめられている配列など、天然起源のものであってもよい。あるいは、該リンカーは合成起源のものであってもよい。例えば、配列（Gly4Ser）3は合成非構造リンカーとして用いることができる。このタイプのリンカーはヒューストン（Huston）ら（１９８８）ＰＮＡＳ８５：４８７９および米国特許５，０９１，５１３および５，２５８，４９８に記載されている。ヒト起源の天然産非構造リンカーは免疫原性の危険を減少させるので好ましい。
各多量体は２つまたはそれ以上のモノマーからなり、それぞれは可溶型のＨＩＰポリペプチドまたはその塩もしくは機能的誘導体からなる。多量体中のモノマー数の上限は重要ではなく、多くのそのようなモノマーをもつリポソームを用いてもよい。そのような多量体は、好ましくは、２〜５ケのモノマー、より好ましくは２または３ケのモノマーを有する。
本発明はまた、他の細胞性タンパクから単離される、あるいは実質的に他の細胞性タンパクを含まない単離したＨＩＰポリペプチド、特にＨＩＰポリペプチドと通常関係のあるレセプターおよび/または他の誘発ポリペプチドを利用可能とする。「実質的に他の細胞性タンパクを含まない」（またはここでは「混入タンパク」という）または「実質的に純粋なまたは精製した調製物」という用語は、乾燥重量で２０％より低い混入タンパク、好ましくは５％より低い混入タンパクを含むＨＩＰポリペプチドの調製物を包含するものとして定義する。機能型の対象ポリペプチドは、ここに記載するクローン化遺伝子を使用することによって、精製した調製物として初めて調製することができる。「精製した」とは、ペプチドまたはＤＮＡまたはＲＮＡ配列に言及するときは、問題とする分子が、他のタンパクなどの他の生物的高分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。ここで使用するとき「精製した」という用語は、乾燥重量で少なくとも８０％、より好ましくは重量で９５〜９９％の範囲で、そして最も好ましくは重量で少なくとも９９．８％の同タイプの生物学的高分子が存在することを意味する（しかし、水、バッファー、および他の小分子、特に分子量が５０００より小さい分子は存在してもよい）。ここに用いるとき「純粋な」という用語は、好ましくは、直ぐ上の「精製した」と同じ数値的制限をもつ。「単離した」と「精製した」とは、未変性状態にある天然物、または成分に分離したが、純粋な（例えば、混入タンパク、または例えば、アクリルアミドまたはアガロースなどの変性剤およびポリマーなどのクロマトグラフィー試薬を欠く）物質または溶液として得たものではない天然物（例えば、アクリルアミドゲル中）のいずれをも包含するものではない。好ましい態様において、精製したＨＩＰ調製物は、例えば、酵母またはバクテリア細胞中での哺乳動物ＨＩＰタンパクの組換え発現により実施することができるように、ＨＩＰを正常に産生する同じ動物からの混入タンパクを含まない。
組換えポリペプチドについて上記したように、単離したＨＩＰポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはその相同性配列で表されるＨＩＰポリペプチドに相当するアミノ酸配列の全部または一部を包含する。
ＨＩＰタンパクの単離したペプチド部分はまた、そのようなペプチドをコード化する核酸の対応するフラグメントから組換えにより産生したペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。さらに、フラグメントは常用のメリフィールド（Merrifield）固相ｆ−Mocまたはｔ−Boc化学のような技術上既知の技法を用いて化学的に合成することができる。例えば、本発明のＨＩＰポリペプチドはフラグメントの重なりのない所望の長さのフラグメントに任意に分割することが可能であるが、または好ましくは所望の長さの重なり合うフラグメントに分割してもよい。このフラグメントは（組換えにより、または化学合成により）調製し、野生型（例えば、「標準的」）ＨＩＰタンパクのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するこれらペプチドフラグメントの同定のために試験することができる。例えば、ローマン（Roman）ら（１９９４）Eur J Biochem ２２２：６５〜７３は、結合するドメインを同定するために、巨大タンパクからの短鎖の重なり合う合成ペプチドを用いる競合結合アッセイの使用につき記載している。
本発明の組換えＨＩＰポリペプチドは、例えば、ユビキチン化、プレニル化などを変化させる変異、細胞外ドメインの酵素的放出、または該タンパクと関連する他の酵素的標的によるタンパク分解切断に抵抗するこれらタンパクの変形体など、標準ＨＩＰタンパクの同族体を含む。
対象ＨＩＰポリペプチドの構造を修飾することは、治療的または予防的効率、安定性（例えば、ex vivo保存性およびin vivoタンパク分解に対する抵抗）、翻訳後修飾を高める目的のものである。そのような修飾ペプチドは、天然産型タンパクの少なくとも一つの活性を保持するように、あるいはその特異的アンタゴニストを産生するように設計するとき、ＨＩＰポリペプチドの機能的等価物と考えられる（それらは標準タンパクの生物活性のアゴニストまたはアンタゴニストであるが）。そのような修飾ペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加により産生させることができる。
例えば、当然に期待し得ることは、ロイシンをイソロイシンまたはバリンと、アスパラギン酸をグルタミン酸と、スレオニンをセリンと独立に置換えること、あるいはあるアミノ酸を構造的に関係のあるアミノ酸と（すなわち、活性中心および/または等電点の変異）の同様の置換えは、得られる分子の生物活性に主要な効果をもたらさないということである。保存的置換えは一群のアミノ酸の側鎖に関係する範囲内で起こるものである。遺伝子的にコード化したアミノ酸は４つの群に分割することができる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは時に芳香族アミノ酸として共に分類される。同様の方式で、アミノ酸のレパートリーは以下のようにグループ化できる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、ただし、セリンとスレオニンは別にヒドロキシ化脂肪族としてグループ化される；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；および（６）イオウ含有＝システインおよびメチオニン。（例えば、Biochemistry第二版、ストライヤー（L.Sryer）監修、ＷＨフリーマン・アンド・カンパニー；１９８１）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的ＨＩＰ同族体（例えば、得られるポリペプチドが標準型に似るか、または拮抗するという意味での機能的）に至るか否かは、変異体ペプチドが野生型タンパクに類似の様式で細胞において応答する能力、あるいはかかる応答を競合的に阻害する能力を評価することにより容易に決めることができる。置換えが１つより多く起こっているポリペプチドは同様の方法で容易に試験することができる。
本発明はさらに対象ＨＩＰタンパクのコンビナトリアル点変異体のセットならびに先端切断変異体を産生する方法を期待するものであり、シグナル変換および/またはリガンド結合の調節において機能的である潜在的変異体配列（例えば、同族体）を同定するために特に有用である。そのようなコンビナトリアル・ライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、新規のＨＩＰ同族体であって、それがアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか、または別途、一緒になって新規の活性を有するものを産生させることである。例を挙げて説明すると、ＨＩＰ同族体は本方法により構築して、ヘッジホッグ活性の選択的構成的活性化を提供すること、あるいは別途、ＨＩＰ依存シグナル導入の優性な負のインヒビターであることである。例えば、変異誘発は細胞外リガンドに結合し得るが、細胞内制御タンパクを介して結合することまたはシグナル送達し得ないＨＩＰ同族体を提供することができる。
本方法の一面において、異なる種または他の関連タンパクからの一群のＨＩＰ同族体に対するアミノ酸配列を一列に並べ、好ましくは最も高い可能な相同性を助長することである。そのような一群の変異体は、例えば、１またはそれ以上の種からのＨＩＰ同族体を含む。整列した配列の各位置に表れるアミノ酸はコンビナトリアル配列の変性セットを創製するために選択される。好ましい態様において、ＨＩＰ変異体の斑入り型ライブラリーがコンビナトリアル変異誘発により核酸レベルで生じ、斑入り型遺伝子ライブラリーによりコード化される。例えば、合成オリゴヌクレオチド混合物は遺伝子配列に酵素的に連結し、潜在的ＨＩＰ配列の変性セットが個々のポリペプチドとして、またはそこにＨＩＰ配列のセットを含むより大きな融合タンパクのセット（例えば、ファージ表示のために）として発現し得る。
図示態様において、潜在的ＨＩＰアゴニストおよびアンタゴニストの変性ライブラリーを作り出すために図１に整列した全長配列を比較する。例えば、ＨＩＰポリペプチドのライブラリーは下記一般式で表される変性コア・ポリペプチド配列を包含するように作り出すことができる。
0004083810.tif 000004
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５）
ただし、Ｘの各意味は独立して（天然の）アミノ酸残基、より好ましくは図１に示したマウス、ヒトまたはニワトリタンパクの対応する位置に発生する残基から選択されるアミノ酸残基（またはギャップ）またはそれに対する保存置換であり、さらにより好ましくは図１に示したマウス、ヒトまたはニワトリタンパクの対応する位置に発生する残基から選択されるアミノ酸残基（またはギャップ）である。スクリーニング・アッセイに適当である場合、ライブラリーのポリペプチドはＨＩＰタンパクの一つから誘導される分泌シグナル配列および/またはＣ−末端膜固定配列を含む。
他の態様において、変性ライブラリーはヒトおよびマウスの比較に基づき、下記一般式で表される変性コア・ポリペプチド配列を包含する。
0004083810.tif 000005
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）
ただし、Ｘの各意味は独立して（天然の）アミノ酸残基、より好ましくは図１に示したマウスまたはヒトタンパクの対応する位置に発生する残基から選択されるアミノ酸残基（またはギャップ）またはそれに対する保存置換であり、さらにより好ましくは図１に示したマウスまたはヒトタンパクの対応する位置に発生する残基から選択されるアミノ酸残基（またはギャップ）である。
潜在的ＨＩＰ同族体のこのようなライブラリーを変性オリゴヌクレオチド配列から作成する方法は沢山ある。変性遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機で実施可能であり、合成遺伝子は次いで適切な発現ベクターに結合することができる。遺伝子の変性セットの目的は、ヒトつの混合物中に、潜在的ＨＩＰ配列の所望のセットをコード化する配列のすべてを提供することにある。変性オリゴヌクレオチドの合成は当該技術において周知である（例えば、ナラン（Narang）SA（１９８３）Tetrahedron３９：３；イタクラ（Itakura）ら（１９８１）組換えＤＮＡ、Proc 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,ウオルトン（Walton AG）編纂、アムステルダム：エルスビア ｐ．２７３〜２８９；イタクラら（１９８４）Annu.Rev.Biochem.５３：３２３；イタクラら（１９８４）Science １９８：１０５６；イケ（Ike）ら（１９８３）Nucleic Acid Res.１１：４７７参照）。そのような技術は他のタンパクの目的とする進化に採用されている（例えば、スコット（Scott）ら（１９９０）Science ２４９：３８６〜３９０；ロバーツ（Roberts）ら（１９９２）ＰＮＡＳ８９：２４２９〜２４３３；デブリン（Devlin）ら（１９９０）Science ２４９：４０４〜４０６；クイルラ（Cwirla）ら（１９９０）ＰＮＡＳ８７：６３７８〜６３８２：同様に米国特許５，２２３，４０９、５，１９８，３４６および５，０９６，８１５参照）。
同様に、コード配列フラグメントのライブラリーは、生物活性フラグメントのスクリーニングおよび引き続く選択のための斑入り群作製のために、ＨＩＰクローンを提供することができる。化学合成を含め、かかるライブラリーを作製する多くの技法が当該技術上既知である。一態様において、コード配列フラグメントのライブラリーは、（i）１分子当たり略１回ニッキングが起こるような条件でＨＩＰコード配列の二重鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理すること；（ii）二重鎖ＤＮＡを変性させること；（iii）該ＤＮＡを復元して異なるニック産物からのセンス/アンチセンス対を含む二重鎖ＤＮＡを形成させること；（iv）Ｓ１ヌクレアーゼで処理することにより、再生した二本鎖から一本鎖部分を除去すること；そして（v）得られるフラグメント・ライブラリーを発現ベクターに連結することにより作製することができる。この代表的な方法により、種々の大きさのＮ-末端、Ｃ-末端および内部フラグメントを誘導することができる。
点突然変異または先端切断により作製されたコンビナトリアル・ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、また、一定の性質を有する遺伝子産物用のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技法が当該技術において既知である。かかる技法は一般に、ＨＩＰ同族体のコンビナトリアル突然変異誘発により作製した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに応用される。大型の遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く使用されている技法は、一般に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そしてその産物が検出された遺伝子をコード化するベクターの比較的簡単な単離が所望の活性の検出により容易となるような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることからなる。
代表的な態様において、ＨＩＰ変異体のライブラリーはウイルス粒子の表面上に融合タンパクとして発現され、ウイルス粒子はヘッジホッグ・マトリックス上で選り分けられる。例えば、繊維状ファージ系において、外来ペプチド配列は感染性ファージの表面で発現され、それによって２つの有意な利益を授与することができる。第一に、これらのファージが非常に高い濃度で親和性マトリックスに適用し得るので、大量のファージが一度にスクリーニングし得る。第二に、各感染性ファージはコンビナトリアル遺伝子産物をその表面上に展開するので、もし特定のファージが低収率で親和性マトリックスから回収されるならば、該ファージは感染の繰返しにより増幅することができる。殆ど一致する大腸菌繊維状ファージＭ１３、ｆｄ．、およびｆ１のグループは、ファージgIIIまたはgVIIIコートタンパクのどれもが、ウイルス粒子の究極パッケージングを中断することなく融合タンパクを産生させるのに用いることができるので、ファージ展開ライブラリーに頻繁に使用される（ラドナー（Ladner）らＰＣＴ公開ＷＯ９０/０２９０９；ガラード（Garrard）ら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２/０９６９０；マークス（Marks）ら（１９９２）J.Biol.Chem. ２６７：１６００７〜１６０１０；グリフィス（Griffiths）ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ１２：７２５〜７３４；クラクソン（Clackson）ら（１９９１）Nature ３５２：６２４〜６２８；およびバーバス（Barbas）ら（１９９２）ＰＮＡＳ８９：４４５７〜４４６１）。例えば、組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、ファルマシア・カタログ番号２７−９４００−０１）は、ＨＩＰコンビナトリアル・ライブラリーの発現およびスクリーニングに用いるために、マトリックス固定ヘッジホッグ・ポリペプチド上で選り分け、リガンドに結合する高い能力をもつＨＩＰ同族体を富化させることにより、容易に修飾することができる。
本発明はまた、模倣品、例えば、ペプチドまたは非ペプチド試剤を調製するためのＨＩＰタンパク還元法を提供するが、該試剤は本発明のＨＩＰポリペプチドの生物活性を絶つことができるもの、例えば、タンパク−タンパク相互作用、例えば、リガンドタンパクとの相互作用のインヒビターである。このようにして、かかる上記変異原性技法は、例えば、対象ＨＩＰポリペプチドとヘッジホッグ・ポリペプチドとの相互作用に関わるタンパク−タンパク相互作用に関与するＨＩＰタンパクの決定因子をマップ化するためにも有用である。あるいは、類似のシステムは、ＨＩＰタンパクに結合し、全長ヘッジホッグ・タンパクの結合を競合的に阻害するヘッジホッグ・タンパクのフラグメントを誘導するのに用いることができる。
さらに説明すると、他の分子認識に関与するＨＩＰタンパクまたはヘッジホッグ・タンパクの臨界残基は、その決定後、ヘッジホッグ/ＨＩＰタンパク相互作用を競合的に阻害するＨＩＰ誘導またはヘッジホッグ誘導ペプチド模倣品を作製するのに使用することができる。例えば、他のタンパク結合に関与するタンパクのアミノ酸残基をマップ化するために変異誘発走査を採用することにより、該相互作用を容易にするこれらの残基を模倣するペプチド模倣品が作製可能である。従って、このような模倣品はＨＩＰタンパク（またはそのリガンド）の正常機能を障害するのに用い得る。例えば、かかる残基の水解不能ペプチド類似体は、ベンゾジアゼピン（例えば、フライディンガー（Freidinger）ら、Peptides:化学と生物学、マーシャル（G.R.Marshall）編集、ＥＳＣＯＭ出版、ライデン、オランダ、１９８８、参照）、アゼピン（例えば、ハフマン（Huffman）ら、Peptides: 化学と生物学、マーシャル（G.R.Marshall）編集、ＥＳＣＯＭ出版、ライデン、オランダ、１９８８、参照）、置換ガンマ・ラクタム環（ガーベイ（Garvey）ら、Peptides: 化学と生物学、マーシャル（G.R.Marshall）編集、ＥＳＣＯＭ出版、ライデン、オランダ、１９８８）、ケト−メチレン疑似ペプチド（エベンソン（Ewenson）ら（１９８６）J.Me.Chem. ２９：２９５；およびエベンソン（Ewenson）ら、Peptides:構造と機能（Proceeding of the 9th American Peptide Symposium）ピアース化学会社、ロックランド、イリノイ、１９８５）、ｂ−ターン・ジペプチド・コア（ナガイ（Nagai）ら（１９８５）Tetrahedron Lett ２６：６４７；およびサト（Sato）ら（１９８６）J.Chem.Soc.Perkin Trans １：１２３１）、およびｂ−アミノアルコール（ゴードン（Gordon）ら（１９８５）Biochem Biophys Res Commun １２６：４１９；およびダン（Dann）ら（１９８６）Biochem Biophys Res Commun １３４：７１）などを用い調製することができる。
本発明の他の局面は、特にＨＩＰタンパクと反応する抗体に関する。例えば、ｃＤＮＡ配列に基づいて、ＨＩＰタンパクから誘導された免疫原を用いて、抗タンパク／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を、標準的なプロトコルによって作ることができる（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane（Cold Spring Harbor Press: 1988）参照）。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、ペプチドの免疫原性形状物で免疫することができる（例えば、抗体応答を導き出すことができるＨＩＰポリペプチドまたは抗原フラグメント）。タンパクまたはペプチドに対する免疫原性を与えるための技術は、担体への結合または当業者に周知の他の技術を含む。ＨＩＰタンパクの免疫原性部分はアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の過程は、血漿または血清中の抗体価を検出することによってモニターすることができる。標準ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを、抗原としての免疫原と共に用いて抗体のレベルを評価することができる。好ましい実施例において、対象抗体は、哺乳動物などの生物体のＨＩＰタンパクの抗原決定基に対して、例えばSEQ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、SEQ ＩＤ Ｎｏ．７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８で表わされるタンパク、または密接に関連のある同族体（例えば、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するもの）の抗原決定基に対して免疫特異的である。本発明のさらに好ましい実施の形態においては、例えば、別個のＨＩＰ同族体に対して免疫選択的である抗体を与えるために、抗ＨＩＰポリペプチド抗体は、選択されたＨＩＰとの相同性が、例えば、８５％、９０％または９５％に満たないタンパクと実質的に交差反応しない（すなわち特異的に反応しない）。「実質的に交差反応しない」ことは、かかる抗体は非相同性タンパクに対して、目的とされる標的ＨＩＰに対する抗体の結合親和性よりも、少なくとも１桁、より好ましくは少なくとも２桁、およびさらに好ましくは３桁低い結合親和性を有することを意味している。
ＨＩＰポリペプチドの抗原製剤により動物を免疫すると、その結果として抗ＨＩＰ抗血清を得ることができ、所望であれば、血清から単離されたポリクローナル抗ＨＩＰ抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を産生するために、免疫した動物から抗体産生細胞（リンパ球）を取得し、骨髄腫細胞などの不死化細胞と標準体細胞融合手法によって融合させ、ハイブリドーマ細胞を産生することができる。かかる技術は当業者に周知であって、例えば、ハイブリドーマ技術（元来はコーラー（Kohler）およびミルシュタイン（Milstein）（１９７５）Nature, 256;495-497によって開発されたもの）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズバー（Kozbar）ら（１９８３）Immunology Today, 4; 72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術（コーレ（Cole）ら（１９８５）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. ７７〜９６）を含む。ハイブリドーマ細胞は本発明のＨＩＰポリペプチドと特異的に反応する抗体を産生するために、免疫化学的にスクリーニングし、かかるハイブリドーマ細胞を含む培養物からモノクローナル抗体を単離することができる。
ここで使われている抗体という用語は、ＨＩＰポリペプチドとも特異的に反応するそのフラグメントを含むと解釈される。抗体は従来の技術を用いてフラグメントとすることが可能であり、そのフラグメントは、抗体全体に対して上述した手法と同じ手法で実用のためにスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）2フラグメントは抗体をペプシンで処理することによって産生することができる。産生されたＦ（ａｂ）2フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂフラグメントを産生することができる。本発明の抗体はさらに、該抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって与えられたＨＩＰタンパクに対して親和性を有する二重特異性のキメラ分子を含むことを企図している。
標準ＨＩＰポリペプチドまたはＨＩＰ変異体に対して向けられた、モノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ａｂ）、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ）2、ＦｖおよびｓｃＦｖなどの抗体フラグメントを用いて、ＨＩＰタンパクの作用をブロックすることが可能で、これらのタンパクの、例えば、組織の分化における役割を調べることができる。この種の実験は、例えば、様式化と組織の形成における、増殖対分化の調節に関与し得るＨＩＰタンパクの役割の解読に役立つ。
ＨＩＰエピトープに特異的に結合する抗体は、各対象ＨＩＰポリペプチドの存在量と発現パターンを評価するために、組織試料の免疫組織化学染色にも用いることができる。抗ＨＩＰ抗体は、免疫沈降および免疫ブロッティングにおいて診断上の使用が可能で、臨床試験手法の一部として、組織内のＨＩＰタンパクのレベルが検出、評価される。例えば、かかる計測値は、増殖または分化異常の兆候または発現の予測評価に有用である。同様に、個体におけるＨＩＰタンパクレベルをモニターすることが可能であり、それによってかかる異常に悩む個体に対する所与の治療計画の効果を測定することができる。ＨＩＰポリペプチドのレベルは、脳脊髄液または羊膜液の試料などの体液中の細胞から測定してもよく、または、例えば生検によって生じるような組織内で測定することもできる。抗ＨＩＰ抗体を用いる診断アッセイは、例えば、異常、特に誕生時に顕在化している異常の、早期の診断に役立つよう考案された免疫アッセイを含む。抗ＨＩＰポリペプチド抗体を用いる診断アッセイも、早期の診断および新生物形成または過形成障害の表現に役立つよう考案された免疫アッセイを含む。
本発明の抗ＨＩＰ抗体の他の用途は、（gt11、（gt18-23、（ZAPおよび（ORFなどの発現ベクター内に構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングにある。このタイプのメッセンジャーライブラリーは、正しい読み枠および配向に挿入されたコーディング配列を有し、融合タンパクを産生することができる。例えば、（gt11は、そのアミノ末端が（−ガラクトシダーゼアミノ酸配列からなり、そのカルボキシ末端が外来ポリペプチドからなる融合タンパクを産生する。次いで、ＨＩＰタンパクの抗原エピトープ、例えば他の種からのＨＩＰタンパクのオーソログを抗体で検出することが可能であり、例えば感染させたプレートから吊り上げたニトロセルロースフィルターを抗ＨＩＰ抗体と反応させる。次いで、このアッセイによって検出された陽性のファージを感染させたプレートから単離することができる。このように、ヒトからの（スプライシング変異型を含む）イソ型を代替することができるような他の動物から、ＨＩＰ同族体の存在を検出し、クローニングすることができる。
さらに、生物体からのＨＩＰ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列によって、例えば、他の組織からの、他の細胞型においてのＨＩＰ同族体、ならびに他の生物体からのＨＩＰ同族体の同定および／またはクローニングに使用するように設計されたプローブおよびプライマーの産生が可能となる。例えば、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーも提供し、該ヌクレオチドは、SEQ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４、または自然に発生するそれらの突然変異体からなる群から選択されたセンス、またはアンチセンス配列の少なくとも１５の連続的配列に、厳しい条件下においてハイブリッド形成するヌクレオチド配列の領域を含む。例えば、SEQ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４で表わされる、核酸に基づくプライマーをＰＣＲ反応において用いて、ＨＩＰ同族体をクローニングすることができる。同様に、対象ＨＩＰ配列に基づくプローブを用いて、ＨＩＰ同族体または相同タンパクをコード化する転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施の形態において、該プローブはさらに、それに付着された、検出可能な標識群を含み、例えば、該標識群は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、および酵素補助因子から選択される。
かかるプローブは、ＨＩＰタンパクを誤って発現する細胞または組織を、患者である動物から採取した細胞試料中のＨＩＰコード化を行う核酸のレベルを計測することによって、例えば、ＨＩＰ ｍＲＮＡレベルを検出することによって、またはゲノムＨＩＰ遺伝子が突然変異しているのか、欠失しているのかを決定することによって同定する診断試験キットの一部として用いることも可能である。
例証するならば、ＨＩＰコード化転写物の存在（または不存在）のために、無傷の組織および組織試料の組織学的スクリーニングを容易にするヌクレオチドプローブを、対象ＨＩＰ遺伝子から産生することができる。抗ＨＩＰ抗体の診断学的使用と同様に、ＨＩＰメッセージに向けられた、またはゲノムＨＩＰ配列に向けられた試料は、例えば、各細胞型の喪失による変性障害、アポトーシス、新生物形成および／または過形成障害（例、好ましくない細胞の増殖）または組織の異常な分化などにおいて現れ得る対立遺伝子突然変異の予測評価および治療評価両方のために用いることができる。オリゴヌクレオチドプローブを上述の免疫アッセイと共に用いれば、ＨＩＰタンパクの発現（またはその欠如）に関連して、なんらかの異常を伴うことがあり得る発生障害の、分子レベルでの根拠の決定を容易にすることの一助となる。例えば、ポリペプチド合成における変化をコード化配列における突然変異と区別することができる。
従って、本方法は被験者が異常なアポトーシス、細胞増殖および/または分化により特徴づけられる疾患の危険にあるかどうかを決定する方法を提供する。好ましい態様において、該方法は、被験者からの細胞標本中に、遺伝子病変の存在または不存在を検出することを一般的特徴とするが、該病変は（i）ＨＩＰタンパクをコード化する遺伝子の完全な状態を変化させること、または（ii）ＨＩＰ遺伝子の発現ミスの少なくとも一つにより特徴づけられるものである。説明のために、そのような遺伝子上の病変は少なくとも以下の項目の一つの存在を確認することにより検出することができる：（i）ＨＩＰ遺伝子からの1以上のヌクレオチドの欠失、（ii）ＨＩＰ遺伝子に１以上のヌクレオチドを付加すること、（iii）ＨＩＰ遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、（iv）ＨＩＰ遺伝子のグロス染色体転移、（v）ＨＩＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルでのグロス変化、（vi）ゲノムＤＮＡのメチル化様式などのＨＩＰ遺伝子の異常修飾、（vii）ＨＩＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシング様式の存在、（viii）ＨＰＩタンパクの非野生型レベル、および（ix）ＨＩＰタンパクの不適切な翻訳後修飾。下に述べるように、本発明はＨＩＰ遺伝子の病変を検出する多数のアッセイ技術を提供するが、重要なことは、ＨＩＰ依存性異常細胞成長、増殖および/または分化の裏に潜む異なる分子の原因間で識別する能力を提供することである。
代表的な態様において、ＨＩＰ遺伝子のセンスもしくはアンチセンスにハイブリッド化することのできるヌクレオチド配列の領域を有する（精製した）オリゴヌクレオチド・プローブからなる核酸組成物を提供するが、該配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜４および９〜１４で表されるもの、またはその天然産変異体、または対象ＨＩＰ遺伝子と自然に関係する５'もしくは３'フランキング配列またはイントロン配列である。細胞の核酸はハイブリッド形成に利用可能となり、該プローブが標本の核酸に接触し、次いで、該プローブが標本の核酸にハイブリッド形成したものを検出する。かかる技術は欠失、置換などを含むゲノムまたはｍＲＮＡレベルでの病変を検出するのに、また、ｍＲＮＡ転写レベルを決定するのに使用することができる。
ある態様において、病巣の検出はアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許４，６８３，１９５および４，６８３，２０２参照）あるいはまた連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ランデグラン（Landegran）ら（１９８８）Science ２４１：１０７７〜１０８０；およびナカザワ（Nakazawa）ら（１９４４）ＰＮＡＳ９１：３６０〜３６４）においてプローブ/プライマーを利用することを特徴とするが、後者はＨＩＰ遺伝子の点突然変異を検出するのに特に有用である。単なる実例としての態様によると、当該方法は以下の工程を含む：（i）患者から細胞の標本を収集すること；（ii）標本の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離すること；（iii）（もし存在するなら）ＨＩＰ遺伝子のハイブリッド化および増幅が起こるような条件下でＨＩＰ遺伝子に特異的にハイブリッド化する１またはそれ以上のプライマーと該核酸を接触させること；そして、（iv）増幅産物の存在または不在を検出するか、または増幅産物の大きさを検出して、その長さを対照標本と比較すること。
さらに他の態様によると、ＨＩＰタンパクのレベルはイムノアッセイにより検出できる。例えば、生検標本の細胞を溶解させ、細胞中に存在するＨＩＰタンパクのレベルを標準イムノアッセイ技術により定量することができる。さらに他の代表的態様において、ＨＩＰ遺伝子の異常なメチル化様式は患者標本からのゲノムＤＮＡを、メチル化に感受性であって、その認識部位がＨＩＰ遺伝子に存在する（フランキングおよびイントロン配列を含む）１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化することにより検出することができる。例えば、ビューティング（Buiting）ら（１９９４）Human Mol Genet ３：８９３〜８９５参照。ＨＩＰ遺伝子のメチル化状態は、標本ＤＮＡから作製した制限パターンを既知メチル化標準品のパターンと比較することにより決定することができる。
さらに他の態様によると、ＨＩＰレセプターのリガンド結合ドメインはＨＩＰリガンド、例えば、ヘッジホッグ・タンパクのレベルを定量的に検出するために用いることができる。説明のために、ヘッジホッグ結合活性を維持する可溶型ＨＩＰタンパクを産生させることができる。体液の標本、例えば、血漿、血清、リンパ、骨髄、脳/脊髄液、尿などを、リガンド/レセプター結合が起こり得る条件下でレセプターと接触させ、形成したリガンド/レセプター複合体のレベルを当該技術上既知の種々の技法により検出することができる。例えば、ヘッジホッグ・タンパクの標準化標本を用いる競合結合アッセイが、液状サンプルから結合した分析対象物量を定量するのに使用することができる。
さらに他の態様によると、かかるＨＩＰレセプターは細胞表面上のＨＩＰリガンドの存在を検出するのに用いることができる。例えば、ＨＩＰタンパクは剖検による細胞と接触させ、標本の特定細胞を装飾するＨＩＰタンパクの能力を確認する。標本の細胞群にＨＩＰタンパクが結合するのは、例えば、ＨＩＰタンパクに対する抗体の使用により、またはＨＩＰタンパクと結合する標識を検出することにより、検出することができる。後者の場合には、ＨＩＰタンパクが、例えば、化学修飾または融合タンパクにより標識することができる。代表的な標識は放射同位元素、蛍光化合物、酵素補助因子などであり、これらはタンパクを化学修飾することにより付加することが可能であり、さらに、ｍｙｃ、ｐＦＬＡＧなどのエピトープ標識、あるいはＧＳＴもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素活性なども含むが、これらも化学修飾または融合タンパクの作製などにより付加することができる。
さらに、本発明はまた、体液標本中の可溶型ＨＩＰレセプターの検出を企図する。例えば、ディエッツールイッツ（Diez-Ruiz）ら（１９９５）Eur J Haemato １５４：１〜８、およびオウエン−シャウブ（Owen-Schaub）ら（１９９５）Cancer Lett ９４：１〜８［ＣＮＴＦレセプターと記載］に記載されているように、ある場合には、可溶型レセプターがアゴニスト/アンタゴニストパターンにおける同族体リガンドの生物学的機能モジュレーターとしての役割を演じていると信じられる。種々の病理状態において、可溶性ＨＩＰタンパクの産生と放出は宿主応答を仲介し、ＨＩＰリガンドと相互作用することにより、また細胞表面レセプターと競合することによって疾患の経過と結果を決める。体液中の可溶性ＨＩＰレセプターの決定は、種々の疾患症状についての情報を得るための新しい手段であり、臨床医にとって予後貴重なものとなり得る。例えば、体液中の可溶性ＨＩＰタンパクのレベルがモニターにとって、なかんずく、神経系疾患のモニターにとって、ならびに外胚葉、中胚葉または内胚葉起源の新生物形成または過形成の悪性転換治療に有用な情報を与える。
所定の標本中に存在する可溶性レセプターのレベルは、本明細書の記載に照らして、既知の手法と技法を用い、定量することができる。例えば、ＨＩＰタンパクのリガンド結合ドメインに対し免疫選択性の抗体は、例えば、周知のイムノアッセイ技法により、標本中にそれが存在することを検出し定量するのに使用することができる。別法として、レセプターの標識したリガンドは液状標本中のレセプターの存在を検出するのに使用することができる。
ＨＩＰレセプターに対するさらなるリガンドを同定するための多くの技法が今や当該技術分野に存在する。例えば、発現クローニングはｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーについて、標識形態のレセプターで装飾した細胞を単離することにより実施し得る。好ましい態様において、当該技法は組織標本と全生物体中のＨＩＰリガンドを検出するin situアッセイにおいてＨＩＰレセプターを使用する。一般に、フラナガンおよびレダー（Flanagan and Leder）の下記のＲＡＰ−in situアッセイ（Receptor Affinity Probe）（ＰＣＴ公開ＷＯ９２/０６２２０；およびチェン（Cheng）ら（１９９４）Cell ７９：１５７〜１６８）は発現クローニング・システムの使用を伴い、これによりＨＩＰリガンドはＨＩＰ/アルカリホスファターゼ融合タンパクへの結合に基づき配点する。一般に本方法は以下の工程よりなる：（i）ＨＩＰレセプターまたは少なくともそのリガンド結合ドメインを含むハイブリッド分子（親和性プローブ）を供給するが、このものは酵素的に活性な標識、好ましくはそれに対する発色基質が存在する標識物に共有結合により結合しているものである；（ii）該組織または生物体を親和性プローブと接触させ、標本中でプローブと同族体リガンドとの間に複合体を形成させ、未結合のプローブを除去する；そして（iii）親和性プローブに結合した酵素活性に対し、発色基質を用いて親和性複合体を検出する。
この方法は、分散した細胞培養物についてのみ実施される先行技術の方法とは違って、非分散の全体に及ぶ組織および動物標本をプローブする手段を提供する。本方法は、ＨＩＰリガンドのクローニングを容易にすることに加えて、ＨＩＰレセプターの特定リガンドを発現する様式を検出するために、また、組織標本中でのレセプター/リガンド相互作用の親和性を測定するために、同様に、組織標本中の薬物スクリーニングアッセイを作成するために使用することができる。さらに、親和性プローブはＨＩＰリガンドが発現ミスをしていないか否かを決めるための診断スクリーニングに使用することもできる。
さらに本発明の他の側面において、対象ＨＩＰポリペプチドは、ＨＩＰに結合する他のタンパク（「ＨＩＰ結合タンパク」または「ＨＩＰ-ｂｐ」）のコード配列を単離するための「ツー・ハイブリッド（two hybrid）」アッセイまたは「相互作用トラップ」アッセイを作成するのに使用することができる（例えば、米国特許５，２８３，３１７；ゼルボス（Zervos）ら（１９９３）Cell ７２：２２３〜２３２；マヅラ（Madura）ら（１９９３）J Biol Chem ２６８：１２０４６〜１２０５４；バーテル（Bartel）ら（１９９３）Biotechniques １４：９２０〜９２４；イワブチ（Iwabuchi）ら（１９９３）Oncogene ８：１６９３〜１６９６；およびブレント（Brent）ＷＯ９４/１０３００；参照）。
簡単に説明すると、相互作用トラップとは２つの異なる融合タンパクからの機能的転写活性化剤タンパクをin vivoで再構築することである。特に、本方法はハイブリッドタンパクを発現するキメラ遺伝子を使用する。説明すると、第一のハイブリッド遺伝子は、ＨＩＰポリペプチドのコード配列の枠内に融合した転写活性化のＤＮＡ結合ドメインのコード配列を含んでいる。第二ハイブリッドタンパクはｃＤＮＡライブラリーからの標本遺伝子の枠内に融合した転写活性化ドメインをコード化している。もし釣り餌と標本ハイブリッドタンパクが相互作用し得る、例えば、ＨＩＰ依存性複合体を形成し得るならば、それらは転写活性化剤の２つのドメインを極めて接近したものとする。この近接は転写活性化剤に応答する転写制御部位に操作可能に結合したレポーター遺伝子の転写を惹起するのに十分であり、レポーター遺伝子の発現を検出し、ＨＩＰと標本タンパクの相互作用に配点するために使用することができる。
さらに、精製した組換えＨＩＰポリペプチドを利用可能にすることにより、本発明は対象ＨＩＰタンパクの正常細胞機能のアゴニストまたはアンタゴニストである薬物のスクリーニングに使用し得るアッセイ法の開発を容易にし、細胞の維持、分化および/または増殖およびそれに関連する疾患の病因論におけるそれらの役割の解明を容易にする。一般的な意味において、そのアッセイ法はＨＩＰポリペプチドと、ＨＩＰポリペプチドと相互作用する分子、例えば、ヘッジホッグ・タンパクなどのリガンドとの間の結合を調節する化合物の能力を評価する。かかるＨＩＰ介在相互作用に対しスクリーニングされ得る代表的な化合物は、動物、植物、かび、および/または微生物から単離されるようなペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子、および天然物の抽出物ライブラリーを包含する。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいては、所定の時間内で探索される化合物数を最大とするための高処理量アッセイ法が望まれる。無細胞系で実施されるアッセイは、精製または準精製タンパクで誘導されるように、「一次」スクリーニングとしてしばしば好まれるが、試験化合物が仲介する分子標的の変化の迅速な進展と比較的容易な検出を可能とするために作成される。さらに、試験化合物の細胞毒性および/または生物利用能の効果は一般にin vitro系では無視することができるが、代りにこのアッセイ法はリガンドとの結合親和性の変化が明らかであるような分子標的に対する薬物の効果に焦点が絞られる。従って、本発明の代表的なスクリーニングアッセイにおいては、反応混合物はＨＩＰポリペプチド、興味対象の化合物、および「標的分子」、例えば、ＨＩＰポリペプチドと相互作用するタンパクを含んで生成する。代表的な標的分子はヘッジホッグタンパクなどのリガンド、ならびに他のペプチドおよび非ペプチド相互作用分子を包含する。ＨＩＰポリペプチドと標的分子との相互作用の検出および定量は、ＨＩＰと標的分子間の相互作用を阻害する（または増強する）化合物の効果を定量する手段を提供する。化合物の効果は試験化合物の種々の濃度により得られるデータから用量応答曲線を作成することにより評価し得る。さらに、対照アッセイをも実施し、比較のための基準線を用意する。対照アッセイにおいては、ＨＩＰポリペプチドと標的分子の相互作用を試験化合物の不在下に定量する。
ＨＩＰポリペプチドと標的分子との相互作用は種々の技法で検出し得る。複合体形成の調節は、例えば、検出可能な標識タンパク、例えば、放射標識、蛍光標識または酵素標識ＨＩＰポリペプチドを用い、イムノアッセイにより、クロマトグラフィー検出により、またはアセチラーゼの固有の活性を検出することにより定量することができる。
一般的には、ＨＩＰまたは標的分子のいずれかを固相化して、一方または両方のたんぱくの未複合体型からの複合体の分離を容易にし、同時にアッセイの自動化を図ることが望ましい。ＨＩＰを標的分子に結合させるには、候補試薬の存在または不在下、反応物を収容するのに適切な容器中で実施することができる。その例はマイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ遠沈管である。一態様において、タンパクをマトリックスに結合させる得るドメインを付加する融合タンパクを提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ/ＨＩＰ（ＧＳＴ/ＨＩＰ）融合タンパクをグルタチオン・セファロース・ビーズ（シグマ化学、セントルイス、ミズーリ）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させ、それを次いで細胞溶解物、例えば、35Ｓ−標識体、および試験化合物と組合わせ、そしてその混合物を複合体形成に伝導性の条件下、例えば、塩とｐＨに対する生理条件下培養するが、わずかにより厳しい条件が望ましい。培養後、ビーズを洗浄して未結合の標識物を除去し、マトリックスを固相化し、そして放射標識を直接定量する（例えば、ビーズをシンチレーションカウンターに容れる）か、あるいは複合体を次いで解離させた後に定量する。別法として、複合体をマトリックスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ビーズのフラクションに見出される標的分子のレベルを標準的電気泳動技法によるゲルから定量する。
タンパクおよび他の分子をマトリックスに固相化する他の技法もまた、対象とするアッセイで使用するために利用することができる。例えば、ＨＩＰまたは標的分子はビオチンおよびストレプトアビジンの接合を利用して固相化することができる。例えば、ビオチニル化ＨＩＰ分子は技術上周知の技法を用い、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し（例えば、ビオチニル化キット、ピアース・ケミカル、ロックフォード、イリノイ）、ストレプトアビジン被覆９６穴プレート（ピアース・ケミカル）のウエルに固相化する。別法として、ＨＩＰと反応するが、ＨＩＰと標的分子間の相互作用を妨害しない抗体をプレートのウエルに誘導し、ＨＩＰを抗体接合によりウエルにトラップする。上記のように、標的分子と標的分子の調製物をプレートのＨＩＰ呈示ウエル中で培養し、ウエルにトラップされた複合体量を定量することができる。かかる複合体を検出するための代表的方法は、ＧＳＴ−固相複合体についての上記のものに加えて、標的分子と反応するか、またはＨＩＰタンパクと反応し、標的分子と競合する抗体による複合体の免疫検出；ならびに酵素結合アッセイであって、標的分子と結合した酵素活性を、内因性または外因性の活性として検出することによる方法である。後者の場合には、酵素は化学的に接合するか、標的分子との融合タンパクとして提供することができる。例示すると、標的分子を西洋わさびペルオキシダーゼと化学的に架橋するか、遺伝子的に融合（もしそれがポリペプチドである場合）し、複合体にトラップしたポリペプチド量を酵素の発色基質、例えば、３，３'−ジアミノ−ベンチジン・テトラヒドロクロリドまたは４−クロロ−１−ナフトールにより評価することができる。同様に、該ポリペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼからなる融合タンパクを提供し、複合体の形成はＧＳＴ活性を１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンにより検出し、定量する（ハビッヒ（Habig）ら（１９７４）J Biol Chem ２４９：７１３０）。
複合体にトラップしたタンパクを定量するための免疫検出による方法では、抗ＨＩＰ抗体などの該タンパクに対する抗体を使用することができる。別法において、複合体中の検出すべきタンパクは融合タンパクの形で「エピトープ標識する」ことができるが、該タンパクはＨＩＰ配列に加えて、対応する抗体が容易に入手可能（例えば、市販品）第二のポリペプチドを含む。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパクは、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いる結合の定量にも用いることができる。他の有用なエピトープ標識物はｃ−ｍｙｃからの１０残基の配列を含むｍｙｃ−エピトープ（例えば、エリソン（Ellison）ら（１９９１）J Biol Chem ２６６：２１１５０〜２１１５７参照）、ならびにｐＦＬＡＧシステム（インターナショナル・バイオテクノロジー・インク）またはｐＥＺＺタンパクＡシステム（ファルマシア、ＮＪ）である。
本発明の代表的薬物スクリーニング・アッセイは以下の工程からなる：（a）以下の反応混合物を形成すること：（i）ヘッジホッグ・ポリペプチド、（ii）ＨＩＰポリペプチド、および（iii）試験化合物；および（b）ヘッジホッグとＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出すること。試験化合物不存在下での相互作用に比較して、試験化合物存在下でのヘッジホッグとＨＩＰポリペプチドとの相互作用における統計的に有意な変化（増強または阻害）は、試験化合物がヘッジホッグ生物活性の潜在的アゴニスト（模倣品または増強剤）またはアンタゴニスト（インヒビター）であることを示している。反応混合物は無細胞タンパク調製物、例えば、再構成タンパク混合物または細胞溶解物であるか、またはＨＩＰポリペプチドを組換えにより発現する異種核酸含有組換え細胞であってもよい。
ＨＩＰポリペプチドがヘッジホッグ・レセプターを形成するオリゴマー複合体の部分として関与する場合、例えば、該複合体が他のタンパクサブユニットを含む場合、無細胞系とは、例えば、細胞膜調製物、再構成タンパク混合物、またはヘッジホッグ・レセプターとしてのレセプター・サブユニットを再構成するリポソームである。あるいは、再構成したＨｉｐタンパクを用いるリポソーム調製物を利用してもよい。例えば、ヘッジホッグ・レセプター複合体のタンパクサブユニットは標準および組換え起源の両方からの洗浄剤抽出物から精製し、人工脂質ベシクル（例えば、ホスファチジルコリン・リポソーム）または細胞膜誘導ベシクル（例えば、ベアー（Bear）ら（１９９２）Cell ６８：８０９〜８１８；ニュートン（Newton）ら（１９８３）Biochemistry ２２：６１１０〜６１１７；およびレバー（Reber）ら（１９８７）J Biol Chem ２６２：１１３６９〜１１３７４）に再構成することができる。得られるリポソームのラメラ構造およびサイズは電子顕微鏡により特性化し得る。再構成膜のＨＩＰタンパクの外部配向は、例えば、免疫電子顕微鏡により証明し得る。ヘッジホッグ・タンパクと、ＨＩＰ複合体およびタンパクなしのリポソームを含有するリポソームとの相互作用は、候補試薬の存在下比較して、ヘッジホッグ−ＨＩＰポリペプチド相互作用の潜在的モジュレーターを同定することができる。
さらに他の態様において、薬物スクリーニングアッセイはＨＩＰポリペプチドを発現する総細胞を含むように誘導される。ＨＩＰタンパクの活性を変化させる試験薬の能力を組換え細胞の分析により検出することができる。例えば、ＨＩＰ生物活性のアゴニストまたはアンタゴニストは、細胞の増殖または分化（表現型）における変化に配点することにより検出することができる。それぞれを検出する一般的手法は周知であり、所定のアッセイに利用される特定の試薬細胞の起源に対応して変える。細胞ベースのアッセイにとって、組換え細胞とは、好ましくは、メタゾア細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、昆虫細胞、例えば、アフリカツメガエル細胞、例えば、卵母細胞である。他の態様において、ヘッジホッグ・レセプターは酵母細胞に再構成することができる。
代表的な態様において、ＨＩＰレセプターを発現する細胞、例えば、それが内在性であろうと異種性であろうと、該レセプターからのシグナル変換を誘発することのできるＨＩＰレセプターのリガンド、例えば、ヘッジホッグ・タンパクと接触させ、得られるシグナルを経路の様々な点、あるいは試薬細胞に対する表現型変化に基づき検出することができる。一態様において、試薬細胞は該レセプターの架橋を惹起する抗体と接触させ、その架橋により誘発されるシグナル・カスケードを次いで検出する。その経路を調節する試験化合物、例えば、増強または阻害する化合物を、レセプターを欠いているか、試験化合物を欠いている対照実験と比較して検出することができる。例えば、試薬細胞の形態を目視観察により、標的ＨＩＰタンパクの生物活性が添加した試薬の影響を受けているかどうか判定する。
形態学的な検討に加えて、ＨＩＰポリペプチドによるシグナル発生に応答する細胞内の第二メッセンジャーのレベル変化を検出することができる。例えば、種々の態様において、アッセイは変化を引起こす試験試薬の能力を評価することであり、その変化はリン酸化の様式、アデニル酸シクラーゼ活性（ｃＡＭＰ産生）、ＧＴＰ水解、カルシウム移動性、および/またはレセプター刺激によるホスホリピド水解（ＩＰ3、ＤＡＧ産生）の変化である。細胞内シグナルの変化、例えば、第二メッセンジャーまたは遺伝子発現の変化、ヘッジホッグ・ポリペプチドと接触した細胞の変化などを検出することにより、ＨＩＰ依存性ヘッジホッグシグナル発生に対する候補アゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。
一定の細胞内シグナルの変換はhhポリペプチドとＨＩＰタンパクとの特異的相互作用により始まるが、一方、他のシグナルは間接的にその相互作用により変化させることができる。ショウジョウバエでは、そして恐らく脊椎動物細胞も同様に、多くの遺伝子産物、例えば、ＨＩＰ、パッチ物、転写因子キュビタス・インターラプタス（cubitus interruptus）（ci）、セリン/スレオニン・キナーゼ融合物（fu）、およびコスタル−２（costal-２）、スムース株または融合物サプレッサーの遺伝子産物が、ヘッジホッグ依存性シグナル変換経路の推定成分として関係している。最近クローニングされたショウジョウバエ遺伝子の脊椎動物同族体が示唆することは、ヘッジホッグシグナル発生経路はショウジョウバエから脊椎動物種まで高度に保存されているということである。これらタンパクの各活性は、直接的に（融合物のキナーゼ活性など）、あるいはシグナル経路の下流で産生される第二メッセンジャーのレベルをモニターすることにより間接的に検出することができる。
さらに説明すると、最近の研究はショウジョウバエおよび脊椎動物生体のヘッジホッグシグナル発生の可能な成分としてプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を関係づけている（ハンマーシュミット（Hammerschmidt）ら（１９９６）Genes ＆ Dev １０：６４７）。高いＰＫＡ活性はこれらの系においてヘッジホッグシグナル発生に拮抗することが示されている。ＰＫＡが直接下流で作用するのか、あるいはヘッジホッグシグナル発生と並行して作用するのか明らかではないが、ＨＩＰタンパクを介して発生するヘッジホッグシグナルがＰＫＡ活性の阻害に影響するという可能性がある。このように、ＰＫＡ活性の検出は瞬間アッセイの潜在的読み出しを可能にする。
ヘッジホッグがＨＩＰタンパクに結合するとホスホリパーゼ活性を促進する。イノシトール脂質は標準的な脂質抽出技法により抽出、分析する。三種すべてのイノシトール脂質（ＩＰ1、ＩＰ2、ＩＰ3）の水溶性誘導体はまた、放射標識技法またはＨＰＬＣにより定量することができる。
細胞内カルシウムの移動性または細胞外からのカルシウムの流入はヘッジホッグの刺激またはその欠如に応答するものである。試薬細胞でのカルシウム流入は標準的技法により測定し得る。適切なカルシウム指示薬、蛍光、生物発光、金属クロム、またはＣａ++感受性ミクロ電極の選択は、細胞型、検討事象の大きさと時間定数に依存する（ボリー（Borie）（１９９０）Environ Health Perspect ８４：４５〜５６）。Ｃａ++検出の代表的方法として、標準的方法により細胞をＣａ++感受性蛍光色素フラ−２またはインド−１を負荷し、蛍光計によりＣａ++の変化を測定する。
アッセイ法のある態様においては、細胞内のリン酸化の変化をスクリーニングすることが望ましい。一例として、セリン/スレオニン・キナーゼをコード化するショウジョウバエ遺伝子融合体fused（fu）はヘッジホッグシグナル発生の潜在的下流標的として同定されている（プリート（Preat）ら（１９９０）Nature ３４７、８７〜８９；テロンド（Therond）ら（１９９３）Mech.Dev. ４４、６５〜８０）。セリン/スレオニン・キナーゼ活性化を調節する化合物の能力はリン酸化セリンまたはスレオニン残基に対する抗体を用いるコロニー免疫ブロッティングによりスクリーニングすることができる（リオンおよびネルソン（Lyons and Nelson）（１９８４）ＰＮＡＳ８１：７４２６〜７４３０）。かかるアッセイを実施するための試薬は市販品として入手できるが、例えば、これら残基のリン酸化に際しての増加を測定するホスホセリンおよびホスホスレオニン特異抗体は市販供給源から購入し得る。
ヘッジホッグ・タンパクとＨＩＰタンパクとの相互作用は、下流エフェクターの活性化と阻害に関与するカスケードを始動させるが、該エフェクターの終局の配列は、ある場合には、遺伝子の転写と翻訳における検出可能な変化である。ＨＩＰ依存性ヘッジホッグシグナル発生の潜在的転写標的は、ＨＩＰ遺伝子そのもの、そのパッチ化遺伝子（ハイダルゴおよびインガム（Hidalgo and Ingham）（１９９０）Development １１０、２９１〜３０１；マリゴー（Marigo）ら（１９９６）Development １２２：１２２５〜１２３３）、およびショウジョウバエ・キュビタス・インターラプタス（ci）遺伝子の脊椎動物同族体、ＧＬＩ遺伝子（ヒュイ（Hui）ら（１９９４）Dev Biol １６２：４０２〜４１３）である。パッチ化遺伝子の発現はShhに応答する肢芽細胞と神経板細胞に誘発されることが示されている（マリゴー（Marigo）ら（１９９６）ＰＮＡＳ、印刷中；マリゴー（Marigo）ら、上掲）。ＧＬＩ遺伝子は亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する推定転写因子をコード化する（オレニック（Orenic）ら（１９９０）Genes ＆ Dev ４：１０５３〜１０６７；キンズラー（Kinzler）ら（１９９０）Mol Cell Biol １０：６３４〜６４２）。ＧＬＩ遺伝子の転写は肢芽のヘッジホッグに応答して上方制御されること、また一方、ＧＬＩ３遺伝子の転写はヘッジホッグ誘発に応答して下方制御されることが報告されている（マリゴー（Marigo）ら（１９９６）Development １２２：１２２５〜１２３３）。本発明は、ヘッジホッグ誘発に応答してこれらの遺伝子の上方−または下方−制御をつかさどるかかる標的遺伝子、例えば、ＨｉｐまたはＧＬＩ遺伝子から転写制御配列を選択することにより、また、かかるプロモーターをレポーター遺伝子に操作可能に結合することにより、ヘッジホッグシグナル発生経路に影響する特異試験化合物の能力に感受性のある転写ベースアッセイ法を提供する。
代表的な態様において、ヘッジホッグとＨＩＰポリペプチドの相互作用を検出する工程は、ＨＩＰポリペプチドによるシグナル発生に応答する転写制御配列によって調整される遺伝子の発現レベル変化を、細胞ベースアッセイで検出することからなる。本発明のレポーター遺伝子ベースアッセイは、上記事象、例えば、転写モジュレーションのカスケードの終末段階を測定することである。従って、本アッセイの一態様を実施するにあたっては、レポーター遺伝子構築物はヘッジホッグシグナル発生に基づく検出シグナルを生じさせるために、試薬細胞中に挿入する。レポーター遺伝子の発現は、このようにＨＩＰ依存性ヘッジホッグ誘発のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を開発するための価値あるスクリーニング手段を提供する。
本アッセイの一態様を実施するにあたっては、ヘッジホッグ・タンパクでのＨＩＰ依存性誘発により生成した第二メッセンジャーに依存して検出シグナルを生じさせるために、レポーター遺伝子構築物は試薬細胞中に挿入する。代表的には、レポーター遺伝子構築物はヘッジホッグ活性に応答する１以上の転写制御要素と操作可能に結合し、ヘッジホッグ依存性検出シグナルを与えるレポーター遺伝子の発現レベルを有するレポーター遺伝子を包含する。レポーター遺伝子からの転写量は当業者にとって適当な既知の方法を用い、測定することができる。例えば、レポーター遺伝子からのｍＲＮＡの発現はリボヌクレアーゼ（ＲＮＡse）防御またはＲＮＡベースＰＣＲにより検出可能であり、あるいは、レポーター遺伝子のタンパク産物は特性化染色または固有活性により同定することができる。レポーター遺伝子からの発現量は試験化合物の存在しない同一細胞中での発現量と比較するか、あるいは標的レセプタータンパクを欠く実質的に同一の細胞中の転写量と比較する。転写量の統計的な、あるいはさもなくば有意な差があるとき、試験化合物がヘッジホッグ・タンパクの誘発活性をある様式で変化させたことを示している。
下にさらに詳細に記載するように、好ましい態様において、レポーターの遺伝子産物は当該産物と関連する固有の活性により検出される。例えば、レポーター遺伝子は遺伝子産物をコード化するが、この産物は酵素活性により発色、蛍光または発光に基づく検出シグナルを生じる。他の好ましい態様において、レポーターまたはマーカー遺伝子は選択的増殖の有利さを提供するが、例えば、レポーター遺伝子は細胞の生存度を高め、細胞の栄養要求性を緩和し、そして/または薬物に抵抗性を与える。多くのレポーター遺伝子が当業者などに知られており、同業者既知の方法により同定し、合成することができる。レポーター遺伝子はＲＮＡまたはタンパクなどの検出可能な遺伝子産物を発現する遺伝子を含む。
好ましいレポーター遺伝子は容易に検出し得るものである。該レポーター遺伝子はまた、所望の転写制御配列を含む遺伝子、あるいは他の所望の性質を示す遺伝子との融合遺伝子の形で構築物中に包含される。レポーター遺伝子の例はこれに限定されるものではないが、以下のとおりである：ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ）（アルトンおよびバプネック（Alton and Vapnek）（１９７９）Nature ２８２：８６４〜８６９）、ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ；ホタル・ルシフェラーゼ（デウエット（deWet）ら（１９８７）Mol.Cell Biol. ７：７２５〜７３７）；バクテリア・ルシフェラーゼ（エンゲブレヒトおよびシルバーマン（Engebrecht and Silverman）（１９８４）ＰＮＡＳ １：４１５４〜４１５８；ボウルドウイン（Baldwin）ら（１９８４）Biochemistry ２３：３６６３〜３６６７）；アルカリホスファターゼ（トー（Toh）ら（１９８９）Eur.J. Biochem.１８２：２３１〜２３８；ホール（Hall）ら（１９８３）J.Mol.Appl. Gen. ２：１０１）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（クーレンおよびマリム（Cullen and Malim）（１９９２）Method in Enzymol. ２１６：３６２〜３６８）。
従って、本発明対象薬物スクリーニングアッセイのさらに他の態様は、例えば、上記の薬物スクリーニング法のある方法を実施するための組換え細胞を提供し、以下の項目からなる：（i）そのシグナル変換活性がヘッジホッグ・タンパクに結合することにより調節される異種ＨＩＰポリペプチドをコード化する発現可能な組換え遺伝子；および（ii）ＨＩＰポリペプチドのシグナル変換活性に応答する１以上の転写制御要素に操作可能に結合したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物。本発明のさらに他の側面は試験化合物をスクリーニングするためのキットを提供するが、該化合物はヘッジホッグ・タンパクとヘッジホッグ・レセプターとの結合を調節する試薬を同定するためのものであり、上記参照細胞と精製したヘッジホッグ・ポリペプチドの調製を包含する。
薬物スクリーニングのさらに他の態様において、２つのハイブリッドアッセイ法（上記）がＨＩＰポリペプチドと標的分子により作製することができる。相互作用の薬物依存性阻害または増強が配点され得る。
ＨＩＰタンパクの１以上の生物活性（ヘッジホッグ結合など）の潜在的モジュレーターとしてある試験化合物を同定した後、対象となるアッセイの実施者は選択した化合物の有効性と特異性をin vitroおよびin vivoの両方で試験し続ける。継続するin vivo試験のためであろうと、または承認薬物のように動物への投与のためであろうと、対象となるアッセイにて同定された試薬は、動物、好ましくはヒトへのin vivo投与のための薬物製剤に製剤化することができる。
本発明の他の側面は、分化状態を誘発および/または維持し、生存を高め、および/または細胞をＨＩＰ依存シグナル変換経路調節試薬と接触させることにより、該細胞の増殖を阻害する（あるいは増強する）方法に関する。対象となる方法は一連の異なる組織をin vitroおよびin vivoの両方で産生および/または維持するために用いる。「ＨＩＰ治療薬」は、ＨＩＰタンパクの活性を調節することに関して阻害か増強かにかかわらず、適切なものとして、上記の製剤のいずれかのものであるが、例えば、単離したＨＩＰポリペプチド（アゴニストおよびアンタゴニスト型の両方を含む）、遺伝子治療構築物、アンチセンス分子、ペプチド模倣品、またはここで提供された薬物アッセイにより同定される試薬を包含する。ある態様において、レセプターの細胞外リガンド結合ドメインを含む可溶型のＨＩＰタンパクは、ＨＩＰリガンドの細胞表面ＨＩＰレセプターへの結合に拮抗する手段として提供することができる。例えば、かかる形状のレセプターはレセプターリガンドの生物活性に拮抗させるために使用する。
本発明のＨＩＰ治療化合物は、例えば、疾病状態時の神経、精巣、骨形成または軟骨形成組織の細胞性増殖と維持の調節に重要な役割を演じていると思われる。ＨＩＰ活性のモジュレーターを一過性に使用することにより、組織のin vivo再形成が、例えば、外胚葉パターン化ならびに一定の中胚葉および外胚葉分化過程などの器官の発生および維持において行われる。異なる細胞に対する増殖および分化の潜在力を調製することにより、対象となるＨＩＰ治療薬が傷害を受けた組織を再生すること、または移植組織の移植片および形態を改善することに用い得る。例えば、ＨＩＰアンタゴニストおよびアゴニストは異なる方式で、物理的、化学的または病理学的損傷後の器官修復の異なる段階を制御するのに採用することができる。本方法は細胞培養技術にも適用することができる。
本発明のこの側面をさらに説明すると、in vitroでの神経細胞培養系は、神経発生の研究、ならびに神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛栄養性因子（ＣＮＴＦ）、および脳誘導神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養性因子同定用の基礎的で不可欠な手段であることを証明している。神経細胞が一旦最終的分化段階となると、その細胞は一般に他の最終的分化細胞型に変化することはない。しかし、神経細胞はそれにもかかわらず容易にその分化状態を失うことができる。このことはそれらが成体組織から培養して増殖するとき、また、それらの再生時、芽体を形成するときに一般に観察されることである。本方法は分化の種々の段階で神経細胞を維持するために適切な制限環境を確保するための手段を提供し、例えば、他の栄養性因子の特異活性を試験するために設計された細胞培養に採用することができる。対象となる方法のかかる態様において、培養した細胞をＨＩＰ治療薬、例えば、ＨＩＰ依存性ヘッジホッグ生物活性を増強する上記のアッセイで同定された薬剤と接触させ、神経細胞（例えば、幹細胞）の分化を誘発し、または分化の欠失を防ぐことにより最終的に分化した神経細胞培養物の完全な状態を維持する。あるいは、ヘッジホッグ誘発のアンタゴニストは、本発明ＨＩＰ同族体のあるものがそうであると期待して、培養物中の始原細胞の分化を防止するのに使用することができる。
ＨＩＰ治療薬がヘッジホッグ・アゴニストまたはアンタゴニストであるとして、その使用につきさらに説明すると、脳内の移植が中枢神経系治療に対するさらなる方法として浮かび上がることに特に言及する。例えば、損傷した脳組織を修復する一つの方法は、胎仔または新生児動物からの細胞を成体の脳に移植することである（ダンネット（Dunnett）ら（１９８７）J Exp Biol １２３：２６５〜２８９；およびフロインド（Freund）ら（１９８５）J Neurosci ５：６０３〜６１６）。様々の脳領域からの胎仔神経細胞を成体脳に成功裏に合体させ得るが、かかる移植片は行動上の欠陥を軽快にし得る。例えば、脳底神経節へのドーパミン作動性突起の病変により誘導される行動障害が胎児性ドーパミン作動性ニューロンの移植により防止することができる。新皮質の病変後に障害される複雑な認識機能が胎児皮質性細胞の移植により部分的に回復させることができる。ヘッジホッグ・アゴニストまたはアンタゴニストを培養に特異的に使用すると、培養により実施し得る分化のタイミングと形式を制御することができる。
ヘッジホッグ・アゴニストおよびアンタゴニストの存在下に培養した細胞の移植と他のin vitroの用途に加えて、本発明のさらに他の側面は、中枢神経系および末梢神経系双方において、ニューロンと他の神経細胞の生存を高めるためのＨＩＰ治療薬の治療的適用に関する。神経系発生時そしてまた恐らく成体状態においても、ヘッジホッグ・タンパクが神経細胞の分化を制御する能力は、ヘッジホッグ・タンパクのあるものが、そして従ってヘッジホッグの生物活性を調節するＨＩＰ治療薬が、正常細胞の維持、機能的性能および老化に関係する成体ニューロンの制御；化学的にまたは機械的に病変した細胞の修復および再生；およびある病理症状での分化の欠損から生じる退化と未成熟死の防止などを容易にすると合理的に期待できる。この理解に照らして、本発明は特に以下の症状から派生する神経学的症状の治療（重症度の防止および/または減少）に問題のＨＩＰ治療薬を適用することを期待するものである：（i）急性、亜急性または慢性の神経系に対する損傷、例えば、外傷、化学的損傷、血管損傷および欠損（発作から生じる虚血など）、ならびに感染性/炎症性および腫瘍誘発の損傷；（ii）アルツハイマー病を含む神経系の老化；（iii）神経系の慢性神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症など、ならびに脊髄小脳変性；および（iv）神経系の、または神経系に影響する慢性免疫疾患、例えば、多発性硬化症。
多くの神経障害が神経要素の個々の集団と関係があり、ヘッジホッグ・アゴニストとして作用するＨＩＰ治療薬を含む治療法で治療可能である。例えば、アルツハイマー病はいくつもの神経伝達系の欠損と関係があり、新皮質に突出しているものと皮質と共に存在するものとの両方がある。例えば、アルツハイマー病患者の基底神経節は、年齢相応の対照と比較してニューロンの損失が甚だしい（７５％）ことが観察されている。アルツハイマー病はずば抜けて共通した痴呆の形態であるが、いくつかの他の障害も痴呆を生ずる。これらの幾つかは変性疾患であって、中枢神経系の様々な部分、特に大脳皮質のニューロンの死によって特徴づけられる。しかし、痴呆のある形態は視床または大脳皮質下部の白質の変性と関係がある。ここで、認識機能障害は遠心性と求心性の変性による皮質領域の絶縁から生じるものである。ハンチントン病は線条体内および皮質性コリン作用性ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性を伴う。ピック病は前頭葉および側頭前葉の新皮質における重度の神経細胞変性であり、ときには線条体におけるニューロンの死を伴う。かかる変性症状の患者の治療はＨＩＰ治療薬の適応症状であり、例えば、ニューロンの損失が生じる分化とアポトーシス事象を調整し（例えば、既存のニューロンの生存を高め）、同時に障害領域での始原細胞による分化と再集団化を促進する。
変性誘発痴呆に加えて、１以上の対象となるＨＩＰの製薬製剤は振戦と不随意運動の発症の治療に適切に適用することができる。例えば、パーキンソン病は大脳皮質下部構造に影響し、黒質線条体の経路、縫線核、青班核、および迷走神経運動核の変性により特徴づけられる。バリズムは一般にしばしば急性の血管故障による視床下核の損傷と関連がある。さらに包含するのは、最終的に末梢神経系の体細胞分裂に影響する神経性および筋障害性疾患であり、神経筋障害として発症する。その例は慢性の萎縮症、例えば、筋栄養側索硬化症、ギラン−バレー症候群および慢性の末梢神経障害、ならびに進行性球麻痺または脊髄性筋萎縮症として発症する他の疾患を含む。本方法は病変に同側の四肢に障害をもたらす小脳の病変など、弛緩または運動失調に至る小脳の障害を治療することができる。例えば、ＨＩＰ治療薬の製剤はアルコール中毒患者に共通する前葉関与限定型の小脳皮質変性（虫部および脚領域）の治療に用いることができる。
説明すべき態様において、本方法は筋栄養側索硬化症の治療に用いることができる。ＡＬＳは上部および下部運動性ニューロンの関係する障害の複合体に与えられた名称である。患者は進行性の脊髄筋萎縮、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、またはこれらの症状の組合わせを呈する。主な病理学的異常は、脊髄の下部運動性ニューロンおよび大脳皮質の上部運動性ニューロンの選択的進行性変性により特徴づけられる。ヘッジホッグアゴニストの治療応用は、ＡＬＳ患者の運動性ニューロン変性を防止および/または逆転させるために、単独で、またはＣＮＴＦ、ＢＤＮＦまたはＮＧＦなどの他の神経栄養因子と組み合わせて使用することができる。
本発明のＨＩＰ治療薬は、平滑筋および内分泌組織（腺組織など）の神経支配に影響する障害を含む末梢神経系の自律性障害の治療に使用することができる。例えば、心臓の横紋筋を神経支配する神経の変性症状から生じる頻脈または心房性不整脈の治療に使用することができる。
さらに、該ＨＩＰ治療薬の一部に対する潜在的役割は、軸索ニューロンの樹状突起の発生および維持におけるヘッジホッグ・タンパクの役割から誘導する。ヘッジホッグアゴニストの潜在的役割は樹状突起の指標となること、および神経支配細胞の樹状突起への分化および/または維持を促進する能力を含む。従って、ヘッジホッグ活性を増強するＨＩＰ治療薬を含む組成物は、いくつかの型の交換神経ニューロンおよび知覚ニューロンならびに運動性ニューロンの生存と再突出を支持するのに用い得る。特に、かかる治療用組成物は、例えば、病変誘発死を救うように設計された治療、同様に、そのような損傷後のニューロンの再突出を導く治療に有用である。かかる疾患は、それに制限されるものではないが、ＣＮＳ外傷性梗塞形成、感染症（水痘−帯状疱疹を有するウイルス感染）、代謝性疾患、栄養失調、毒性薬物（シスプラチン治療など）を包含する。
さらに、該ＨＩＰ治療薬のあるものは（例えば、ヘッジホッグ誘発に拮抗する）、知覚ニューロンの剥離、例えば、慢性の疼痛症候群の治療に有用である。
適切なものとして、該ＨＩＰ治療薬は中枢および末梢神経損傷の修復のための神経プロテーゼ（補綴）に使用することができる。特に、挫傷または切断軸索にプロテーゼ装置を使用して挿管がなされている場合、ＨＩＰ治療薬のあるものは該挿管に加えて、樹状突起の成長と再生率の増大をはかることができる。代表的な神経ガイドチャンネルは米国特許５，０９２，８７１および４，９５５，８９２に記載されている。従って、切断した軸索突起をプロテーゼ神経ガイドが分断している神経末端に向かわせることができる。
他の態様において、問題の方法は中枢神経系に起こり得る新生物形成または過形成の悪性転換治療に使用することができる。例えば、該ＨＩＰ治療薬のあるものは神経細胞の分化を誘発するが、かかる悪性転換細胞が有糸分裂後となるように、または細胞消滅するように利用することができる。ＨＩＰ治療薬での処理はＴＧＦ−βまたはＰＤＧＦ自己刺激性ループなどの自己分泌ループの中断を容易にするが、該ループはいくつかの神経細胞腫瘍の新生物形成悪性転換に関わると信じられているものである。ＨＩＰ治療薬は、従って、例えば、悪性神経膠腫、髄芽腫、神経外胚葉腫瘍、および脳室上衣細胞腫などの治療に有用である。
本発明のさらに他の側面は、ヘッジホッグ・タンパクが、上記の神経細胞分化に加えて、他の内胚葉形成ならびに中胚葉および内胚葉分化過程において明瞭な役割をもつ他の脊椎動物の器官形成経路に関与する形態形成シグナルであるという発見の応用である。文献に記載されているように、Shhは中胚葉のBmp-2および外胚葉のFgf-4を含むシグナル化分子の発現に始まることで適切な四肢の成長・形成の役割を担う。このように、本発明はＨＩＰ治療薬のあるものを含む組成物が細胞培養および非神経組織の産生と維持に関係する治療法の双方に利用し得ることを期待するものである。
一態様において、本発明は、Shhなど、ヘッジホッグ・タンパクが原腸から由来する消化管、肝臓、肺、およびその他の器官の形成に関わる幹細胞の発生を制御するのに明らかに関与しているという発見を使用することである。Shhは内胚葉から中胚葉への誘発シグナルとして働き、消化管の形態形成に重要である。それ故、例えば、ヘッジホッグ・アゴニストは正常肝臓の多様な代謝機能をもつことのできる人工肝臓の発達および維持に採用することができる。代表的態様において、ヘッジホッグ・アゴニストとして働くＨＩＰ治療薬は消化管幹細胞の分化を誘発し、肝細胞培養物を形成させるために使用することができるが、該培養物は細胞外マトリックスに集合させ得るものであり、また、生変換可能なポリマー中に包含させることが可能であり、その結果、移植可能な、また、体外用人工肝臓とすることができる。
他の態様において、ヘッジホッグ・アゴニストの治療用組成物はかかる人工肝臓ならびに胚の肝臓構造物と共に利用し、腹腔内移植、血管新生、および植え込んだ肝臓組織のin vivoでの分化および維持を促進することができる。
さらに他の態様において、ＨＩＰ治療薬は物理的、化学的または病理学的傷害後のかかる臓器を制御するために治療的に採用することができる。例えば、ヘッジホッグ・アゴニストを含む治療用組成物は部分的肝切除に続く肝臓の修復に利用し得る。同様に、ヘッジホッグ・アゴニストを含む治療用組成物は、気腫の治療において肺組織の再生を促進するのに使用することができる。
本発明のさらに他の態様において、ＨＩＰ治療薬を含む組成物は、例えば、骨格形成幹細胞からの骨格組織のin vitro生成、ならびに骨格組織欠損症のin vivo治療に使用することができる。本発明は、軟骨形成および/または骨形成誘発能力など、ヘッジホッグが骨格形成活性を増強するＨＩＰ治療薬の使用を特に期待する。「骨格組織欠損症」とは、骨または結合組織の回復が必要ないずれかの部位において骨または他の骨格結合組織が欠損している症状を意味し、その欠損症状が、例えば、外科処置の介在、腫瘍の除去、潰瘍、移植、骨折、または他の外傷性もしくは変性症状の結果としてか否か、その起源は問題としない。
例えば、本発明は軟骨機能を結合組織に復帰させる有効な治療方法と組成物を利用可能とするものである。かかる方法は、例えば、軟骨組織における欠陥または病変の修復に有用であるが、それらは関節炎に至るような変性摩耗の結果であるもの、ならびに組織への外傷により引起こされ得る他の機械的障害、例えば、裂傷半月組織、関節半月板切除、裂傷靭帯による関節の弛緩、関節の悪性化、または遺伝性疾患によるものなどである。この予備的方法は軟骨マトリックスを改造するために、例えば、形成外科または整形外科、ならびに歯周外科などにおいて有用である。本方法はまた、以前の修復手技、例えば、半月、靭帯、または軟骨の外科的修復後の手技を改善するのに適用できる。さらに、この方法は外傷後十分早期に適用するならば、変性疾患の発病または悪化を防止し得る。
本発明の一態様において、当該方法は罹患した結合組織を治療的に十分量のヘッジホッグ・アゴニスト、特にIhh活性を増強するＨＩＰ治療薬で処理し、組織に埋設した軟骨細胞の分化および/または増殖を刺激することにより、結合組織中に軟骨修復応答を生じさせることからなる。ヘッジホッグ・アゴニストでの処理による軟骨細胞の誘発は、続いて、処理した細胞による新しい軟骨マトリックスの合成に至る。関節軟骨、関節間軟骨（半月）、肋骨軟骨（真骨と胸骨を結合する）、靭帯、および腱などの結合組織は特に当該方法を用いる再構成および/または再生療法での治療が可能である。ここで用いるとき、再生療法とは組織の障害が明らかに現われている段階まて進行している変性状態の処理、ならびに変性が初期段階あるいは切迫した状態にあるような組織の予防的処置を包含する。当該方法はさらに、新たな軟骨の定常的産生を維持することによって鉱化作用が繊維組織中に拡散するのを防止するために使用できる。
例示による態様において、可動関節、例えば、膝、踵、肘、ＨＩＰ、手首、手指または足指の関節、または顎関節などの軟骨を処理するのに使用できる。この処理は関節の半月に、関節の関節軟骨に、あるいは両方に向けられる。さらに説明すると、当該方法は膝の変性障害、例えば、外傷性傷害（例えば、スポーツ傷害または過度の摩耗）または骨関節症の結果であるような障害の処理に使用し得る。ＨＩＰ治療薬は、例えば、関節鏡針を用い関節へ注射することにより、罹患軟骨を処理する。ある場合には、注射した薬剤は上記のヒドロゲルまたは他の遅速放出ビークルの形態にして、処理組織と薬剤のより広範な定常的接触を可能とすることができる。
本発明はさらに軟骨の移植およびプロテーゼ装置療法の分野で当該方法を使用することを企図する。これまで、自己由来または同種異系の軟骨移植ではいずれの場合も新たな軟骨の成長は殆どが不成功であった。問題が起こるのは、例えば、軟骨および繊維軟骨の特性が異なる組織間で変わること；例えば、関節、半月軟骨、靭帯および腱の間で、同一の靭帯または腱の２つの末端間で、および組織の浅在部分と深部間で変わるためである。これら組織の帯状配列は機械的な性質の段階的変化を反映しており、移植された組織がそのような条件下で分化されず、適正な応答能力を欠くときに失敗が起こる。例えば、半月軟骨を前十字靭帯の修復に使用すると、組織は形成異常を受けて純粋な繊維性組織となる。軟骨形成を促進することにより、当該方法を特にこの問題に向けて用いると、移植した細胞が新しい環境により適応して、組織の初期発生段階の肥厚性軟骨細胞に効果的に類似させることができる。このように、移植組織の軟骨形成作用が、当該方法が提供するように、また、活発に再生している組織にかかる機械的力が、そこに備わるべき新たな機能により適した、改良された移植体を産生するように相乗的に作用することができる。
同じ様式で、当該方法はプロテーゼ軟骨装置の生成を高めること、およびその移植挿入に適用することができる。改良された処理法の必要性が新しい軟骨の創製を目指す動機づけとなり、その軟骨はコラーゲン−グリコサミングリカン鋳型（ストーン（Stone）ら（１９９０）Clin Orthop Relat Red ２５２：１２９）、単離した軟骨細胞（グランデ（Grande）ら（１９８９）J Orthop Res ７：２０８；およびタキガワ（Takigawa）ら（１９８７）Bone Miner ２：４４９）、および天然または合成ポリマーに連結した軟骨細胞（ワリタニ（Walitani）ら（１９８９）J Bone Jt Surg ７１B：７４；バカンティ（Vacanti）ら（１９９１）Plast Reconstr Surg ８８：７５３；ホン・シュローダー（von Schroeder）ら（１９９１）J Biomed Mater Res ２５：３２９；フリード（Freed）ら（１９９３）J Biomed Mater Res ２７：１１；およびザ・バカンティ（the Vacanti）ら、米国特許５，０４１，１３８）に基づくものである。例えば、軟骨細胞はポリマーから形成された生分解性、生可変性、高多孔性骨格上で培養により増殖させることができるが、該ポリマーはポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースゲル、または他のポリマーであって、ポリマー背景の水解機能として時間とともに分解して無害のモノマーとなる。マトリックスは移植が起こるまでの細胞への適切な栄養補給とガス交換が可能なように設計する。該細胞は適切な細胞容量と密度が移植すべき細胞に備わるまでin vitroで培養する。マトリックスの一つの利点は個々の状況に基づいて所望の形状に鋳造するかまたは鋳型で造ることが可能であり、その結果、最終産物は患者自身の耳または鼻に酷似したものとなる、または可撓性マトリックスは関節などに挿入する際に巧みな操作を可能とするように使用し得る。
当該方法の一態様において、移植体は培養工程においてIhhアゴニストなどのＨＩＰ治療薬と接触させ、培養物中に分化した軟骨細胞を誘発および/または維持し、移植体内での軟骨マトリックス産生を促進する。このような方法において、培養した細胞は軟骨形成細胞に典型的な表現型（すなわち、肥厚性）を維持するように仕向け、そこでマトリックスの集団化と軟骨組織の産生を続ける。
他の態様において、移植挿入した装置はＨＩＰ治療薬で処理し、移植マトリックスを活発に改造し、企図した機能により適したものとする。組織移植に関して上述したように、人工移植片は、マトリックスが移植挿入される実際の機械的環境に匹敵する設置環境では誘導し得ないという同じ欠陥を担っている。当該方法によるマトリックス中の軟骨細胞の活性化は、置換えを意図する組織に類似した特性を必要とする移植片を可能とする。
さらに他の態様において、当該方法はプロテーゼ装置の取り付けを増加させるのに用い得る。説明すると、当該方法は歯周プロテーゼの移植埋め込みに使用し得るが、この場合周囲の結合組織の処理がプロテーゼ近辺の歯周靭帯形成を促進し、さらにプロテーゼ装置に最も近い繊維組織の形成を阻害する。
なおさらなる態様において、当該方法は骨格組織が欠落している動物においてある部位での骨の生成（骨形成）のために採用することができる。インド・ヘッジホッグは最終的に造骨細胞と置き換わる過形成軟骨細胞と特に関連している。例えば、本発明のＨＩＰ治療薬の投与が被験者の骨損失を治療するための方法の一部として採用することができるが、例えば、これによって骨多孔症および他の骨減少障害を防止および/または逆行し、また、骨の成長と成熟を制御することができる。例えば、ヘッジホッグ・アゴニスト含有製剤は、例えば、少なくとも骨化の「モデル」を形成するための軟骨性組織の形成を容易にする限りにおいて、軟骨内の骨化を誘発するために採用し得る。ＨＩＰ治療薬の治療用組成物は、要すれば、他の骨誘発因子、例えば、骨成長因子（例えば、骨形態形成因子ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４などのＴＧＦ−β因子、ならびにアクチビン）などを補うことが可能であり、また、エストロジェン、ビスホスホネート、フッ化ナトリウム、カルシトニン、またはタモキシフェンなどの骨吸収インヒビターまたはその関連化合物と組み合せて包含させる、あるいは投与してもよい。しかし、IhhおよびShhなどのヘッジホッグ・タンパクはＢＭＰの上流であると思われ、例えば、ヘッジホッグ・アゴニストでの処理は他の因子とともにＢＭＰの内因性発現を開始させるという利点をもつ。
さらに他の態様において、本発明のＨＩＰ治療薬は、精子形成を調節するための睾丸細胞の処理に使用することができる。ヘッジホッグ・タンパクは精巣生殖細胞の分化および/または増殖および維持に関与するという知見に照らして、ヘッジホッグ・アゴニストは天然産のヘッジホッグ・タンパクの作用をブロックするのに利用することができる。好ましい態様において、ＨＩＰ治療薬は、精巣中でヘッジホッグに競合的に結合することによって、精子形成に関係するDhhの生物活性を阻害する。すなわち、ＨＩＰ治療薬は避妊薬製剤として投与することができる。また、Dhhの精子形成活性を増強するＨＩＰ治療薬は受精力高揚剤として使用することができる。同様の仕方で、ヘッジホッグ・アゴニストおよびアンタゴニストは正常の卵巣機能を調節するために潜在的に有用である。
本発明の他の局面は形質転換非ヒト動物を特徴とし、該動物は本発明の非相同ＨＩＰ遺伝子を発現し、および/または該動物は少なくとも動物の組織または細胞−型に切断された１以上のゲノムＨＩＰ遺伝子を有している。従って、本発明は発育障害の動物モデルを特徴とし、該動物は発現ミスした１以上のＨＩＰアレレを有する。例えば、動物は１またはそれ以上のＨＩＰアレレが欠失しているか、またはさもなくば不活性になっているように造られる。かかるモデルは従って発現ミスしたＨＩＰ遺伝子から生じる障害の研究に、同様に、類似の障害の潜在的治療法を評価するために用いることができる。
本発明の形質転換動物はすべて本発明の導入遺伝子をその複数の細胞内に含んでいるが、該導入遺伝子はＨＩＰタンパクによる制御、例えば、細胞成長、死および/または分化に関して「宿主細胞」の表現型を変化させる。ここに記載した１以上の導入遺伝子構築物を利用して、本発明の形質転換生物体を生成させることが可能なので、外来性遺伝子物質に一般的に言及することで、形質転換生物体の生産についての一般の記載とする。この一般記載は、ここに記載の方法と材料および一般に知られた技術を利用して、当業者が特定の導入遺伝子配列を生物体に包含させるために応用することができる。
一態様において、導入遺伝子構築物はノックアウト構築物である。かかる導入遺伝子構築物は通常挿入型または置換型構築物である（ハスティ（Hasty）ら（１９９１）Mol Cell Biol １１：４５０９）。ＨＩＰ遺伝子切断用導入遺伝子構築物は、ゲノムＨＩＰ遺伝子の一部との同種組換えを容易となるように設計し、内在性ＨＩＰ遺伝子の機能的発現を防止するようにする。好ましい態様において、ノックアウト構築物として用いられるヌクレオチド配列は、（１）組換えを指示する内在性ＨＩＰ遺伝子のある部分からのＤＮＡ（エクソン配列、イントロン配列、プロモーター配列、など）、および（２）細胞中にノックアウト構築物の存在を検出するのに用いるマーカー配列から構成される。ノックアウト構築物は細胞中に挿入され、未変性ＨＩＰ遺伝子の転写を防止または中断するような位置で細胞のゲノムＤＮＡと組込む。かかる挿入は相同の組換えにより起こるが、すなわち、内在性ＨＩＰ遺伝子配列に相同なノックアウト構築物の領域はゲノムＤＮＡにハイブリッド化し、ゲノム配列と組換えし、その結果、該構築物はゲノムＤＮＡの対応する位置に組込まれる。ノックアウト構築物は（１）中断されるＨＩＰ遺伝子の１またはそれ以上のエクソンおよび/またはイントロンの全または部分配列；（２）ＨＩＰ遺伝子のコード配列の５'および３'末端のフランキング配列；または（３）その組み合せからなる。
好ましいノックアウト構築物は標的の相同組換えにより内在性ＨＩＰ遺伝子の実質的構造要素を欠失している。例えば、標的構築物はゲノムＨＩＰ遺伝子と組換え可能であり、コード配列の一部を欠失可能であり、および/または遺伝子の実質的転写制御配列を欠失していてもよい。
別法として、ノックアウト構築物はポリヌクレオチド配列の標的挿入により内在性ＨＩＰ遺伝子の実質的構造および/または制御要素を中断するのに用いることができる。例えば、ノックアウト構築物はＨＩＰ遺伝子と組換え、neo発現カセットなどの非相同性配列を構造要素（例えば、エクソン）および/または制御要素（例えば、エンハンサー、プロモーター、イントロン・スプライス部位、ポリアデニル化部位など）中に挿入し、挿入中断をもつ標的アレレを生じる。挿入された核酸はその大きさが１ケのヌクレオチド（例えば、フレームシフトを生じる）から数キロベース以上までに渡り、標的技術の効率によってのみ制限される。
中断の位置と特性に応じて、導入遺伝子構築物は形質転換動物を産生させるのに用いるが、該動物は標的ＨＩＰ遺伝子の実質的にすべての発現が該動物細胞の少なくとも一部において阻害される。もし制御要素のみが標的であるならば、標的とした遺伝子の幾分低レベルの発現が起こる（すなわち、標的アレレは「漏出」である）。
ノックアウト構築物を含むヌクレオチド配列は技術上周知の方法を用いて得ることができる。かかる方法は、例えば、対応するゲノムＨＩＰ遺伝子と制御配列を同定するためのＨＩＰｃＤＮＡプローブをもつゲノム・ライブラリーをスクリーニングすることである。別法として、ｃＤＮＡ配列をノックアウト構築物の部分として用いる場合には、ｃＤＮＡは上に示したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより取得してもよい。
他の態様において、本発明の「形質転換非ヒト動物」は非ヒト動物の生殖系列に挿入することにより作製される。種々の発生段階で胚の標的細胞が導入遺伝子を導入するために用いることができる。異なる方法は胚の標的細胞の発生段階に応じて用いられる。この発明の実施のために用いる動物の特定系は、一般に良好な健康、良好な胚産生、胚内での良好な前核可視性、および良好な生殖適合性により選択される。さらに、ハプロタイプは意味のあるファクターである。例えば、形質転換マウスを作製するとき、Ｃ５７ＢＬ/６またはＦＶＢ系などの株がしばしば用いられる（ジャクソン・ラボラトリー、バー・ハーバー、ＭＥ）。好ましい株はＣ５７ＢＬ/６またはＤＢＡ/１などのＨ-２b、Ｈ−２dまたはＨ−２qハロタイプをもつものである。この発明を実施するために用いられる系統はそれ自体形質転換体であってもよく、および/またはノックアウトであってもよい（すなわち、部分的にまたは完全に抑制した１またはそれ以上の遺伝子をもつ動物から得られる）。
一態様において、導入遺伝子構築物は単一段階胚に導入される。遺伝子移送の標的として接合体を使用すると、殆どの場合、注射されたＤＮＡが最初の切断前に宿主遺伝子に組込まれるという主な利点がある（プリンスター（Brinster）ら（１９８５）ＰＮＡＳ８２：４４３８〜４４４２）。結果として、形質転換動物のすべての細胞は組込まれた導入遺伝子を担っている。生殖細胞の５０％が導入遺伝子を集めているので、このことは創始細胞の子孫に導入遺伝子が効率的に伝達されていることに一般に反映される。
導入遺伝子ヌクレオチド配列を胚に導入することは当該技術既知の手段で実施し得るが、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはリポフェクションなどである。導入遺伝子ヌクレオチド配列を胚に導入した後、胚をin vitroで時間を変えて培養するか、代用の宿主に再移植するか、または両方を実施する。成熟までのin vitro培養は本発明の範囲内にある。一つの共通した方法は胚をin vitroで約１〜７日間、種に応じて培養し、次いで、それを代理の宿主に移植することである。
外来性遺伝子物質を核遺伝子物質に付加することを可能とする技術は、それが細胞、核膜または他の既成の細胞または遺伝子構造に破壊的でない限り、いずれも利用可能である。外来性遺伝子物質は、好ましくは、マイクロインジェクションにより核遺伝子物質に挿入される。細胞または細胞構造物のマイクロインジェクションは既知であり、当該技術で使用されている。
再移植は標準的な方法により実施する。通常、代理宿主は麻酔して、その卵管に胚を挿入する。特定の宿主に移植する胚の数は種により変わるが、通常はその種が自然に出産する子孫の数に相当する。
代理宿主の形質転換子孫は導入遺伝子の存在および/または発現につき適当な方法でスクリーニングする。スクリーニングは導入遺伝子の少なくとも一部に相補的なプローブを用い、サザーン・ブロットまたはノーザン・ブロット分析法により多くの場合実施する。導入遺伝子によりコード化したタンパクに対する抗体を用いるウエスタン・ブロット分析法は導入遺伝子産物の存在をスクリーニングするための代替法または追加の方法として実施する。一般には、ＤＮＡは切除した組織から調製し、導入遺伝子に対するサザーン・ブロット分析法またはＰＣＲにより分析する。あるいは、最高レベルで導入遺伝子を発現すると信じ得る組織または細胞は、サザーン分析法またはＰＣＲを用いて導入遺伝子の存在および発現について試験するが、この分析にはいずれの組織または細胞型をも用い得る。
レトロウイルスの感染も非ヒト動物に導入遺伝子を導入するために使用し得る。成長しつつある非ヒト胚は未分化胚芽細胞の段階までin vitroで培養し得る。この期間、分割球はレトロウイルス感染の標的であり得る（イェニッヒ（Jaenich R）（１９７６）ＰＮＡＳ７３：１２６０〜１２６４）。分割球の有効な感染は酵素処理により透明帯を除去することで得られる（マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）、ホーガン（Hogan）編纂（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、１９８６）。導入遺伝子を導入するために使用するウイルスベクター系は一般に導入遺伝子を担う複写欠如レトロウイルスである（ヤーナー（Jahner）ら（１９８５）ＰＮＡＳ８２：６９２７〜６９３１；バン・デル・プッテン（Van der Putten）ら（１９８５）ＰＮＡＳ８２：６１４８〜６１５２）。トランスフェクションはウイルス産生細胞の単層上分割球を培養することにより、容易に、かつ、効率的に達成される（バン・デル・プッテン（Van der Putten）、上記；スチュワート（Stewart）ら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３８３〜３８８）。別法として、感染は後期の段階で実施し得る。ウイルスまたはウイルス産生細胞は胞胚腔に注射することができる（ヤーナー（Jahner）ら（１９８２）Nature ２９８：６２３〜６２８）。創始細胞の殆どは導入遺伝子についてモザイク状であるが、その理由は組込みが形質転換非ヒト動物を形成する細胞のサブセットにのみ起こるからである。さらに、創始細胞は、子孫中で一般に分裂するゲノムの異なる位置に導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入物を含む。加えて、導入遺伝子は妊娠中の胚の子宮内レトロウイルス感染により生殖系列に導入することが可能である（ヤーナー（Jahner）ら（１９８２）上記）。
導入遺伝子導入用第三の型の標的細胞は胚幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞はin vitroで培養した移植前の胚から得られ、胚と融合する（エバンス（Evans）ら（１９８１）Nature ２９２：１５４〜１５６；ブラッドレイ（Bradley）ら（１９８４）Nature ３０９：２５５〜２５８；ゴスラー（Gossler）ら（１９８６）ＰＮＡＳ８３：９０６５〜９０６９；およびロバートソン（Robertson）ら（１９８６）Nature３２２：４４５〜４４８）。導入遺伝子はＤＮＡトランスフェクションにより、またはレトロウイルス介在形質導入によりＥＳ細胞内に効率的に導入することができる。かかる形質転換ＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物からの未分化胚芽細胞と組み合せることができる。その後、ＥＳ細胞は胚をコロニー化し、得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する。総説として、イエニッシュ（Jaenisch R）（１９８８）Science ２４０：１４６８〜１４７４参照。
一態様において、遺伝子を標的にすること、これは動物のゲノムを修飾するために相同性組換えを用いる方法であるが、培養した胚幹細胞に変化を導入するために用いることができる。ＥＳ細胞中のＨＩＰ遺伝子を標的とすることによって、これらの変化はキメラを生成させるために生殖系列に導入することができる。遺伝子を標的とする手法は、組織培養細胞にＤＮＡ標的構築物を挿入することにより達成されるが、該構築物はＨＩＰ座に相同なセグメントを含み、また、ＨＩＰゲノム配列に対する企図した修飾を含む（例えば、挿入、欠失、点突然変異）。処理細胞は次いで、適切に標的となった細胞を確認、単離するために正確な標的をスクリーニングする。
胚幹細胞において遺伝子を標的とすることは、実際、ＨＩＰゲノム配列と相同な組換えを受けるように設計された標的導入遺伝子の使用を通して、ＨＩＰ遺伝子機能を中断する手段として本発明が期待する計画である。標的とする構築物はＨＩＰ遺伝子の要素との組換えに基づき、陽性の選択マーカーが標的ＨＩＰ遺伝子のコード配列に挿入（または置換）されるように配列することができる。挿入された配列はＨＩＰ遺伝子を機能的に中断し、一方で、正の選択特徴を提供する。
一般に、ノックアウト動物を作製するために使用する胚幹細胞（ＥＳ細胞）は生成するノックアウト動物と同じ種のものである。かくして、例えば、マウス胚幹細胞は通常ＨＩＰノックアウトマウス生成のために使用される。
胚幹細胞は、デッチマン（Doestwschman）ら（１９８５）J.Embryol.Exp. Morphol. ８７：２７〜４５）に記載されているように、当業者周知の方法により生成され、維持される。ＥＳ細胞はいずれの系列も使用し得るが、選ばれる系列は一般に該細胞能力が生育下の胚の生殖系列に組み入れられ、かつ、その一部となるように選択し、その結果、ノックアウト構築物の生殖系列伝達を引起こすものである。かくして、この能力を有すると信じられるＥＳ細胞系はこの用途に適している。該細胞は当業者周知の方法によりノックアウト構築物挿入のために培養し調製されるが、その方法は以下のものに述べられている：ロバートソン（Robertson）、奇形癌と胚幹細胞：実践方法、ロバートソン（E.J.Robertson）編纂、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ（１９８７）；ブラッドレイ（Bradley）ら（１９８６）Current Topics in Devel. Biol. ２０：３５７〜３７１；およびホーガン（Hogan）ら（マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８６））。
ノックアウト構築物のＥＳ細胞への挿入は、技術上周知の種々の方法により実施し得るが、該方法は例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびリン酸カルシウム処理である。好ましい挿入法はエレクトロポレーションである。
細胞に挿入すべき各ノックアウト構築物は先ず線状型でなければならない。従って、もしノックアウト構築物がベクターに挿入されているなら、直線性を達成するために、ベクター配列内のみで切断し、ノックアウト構築物配列内では切断しないように選択された適切な制限エンドヌクレアーゼで該ＤＮＡを消化する。
挿入のためにには、当業者既知の、選択した挿入方法にとって適切な条件下でノックアウト構築物をＥＳ細胞に加える。１以上の構築物をＥＳ細胞に導入すべきである場合、各ノックアウト構築物を同時にまたは１度に１ケ導入することができる。
ＥＳ細胞をエレクトロポレーションに付すには、エレクトロポレーション装置を用い、メーカーの使用案内書に従ってＥＳ細胞とノックアウト構築物に電気パルスを当てる。エレクトロポレーション処理後、ＥＳ細胞は一般に適当な培養条件下で回収される。該細胞は次いでノックアウト構築物の存在についてスクリーニングする。
スクリーニングは様々な方法により実施し得る。マーカー遺伝子が抗生物質抵抗性である場合には、ＥＳ細胞をそれ以外のものが致死濃度である抗生物質の存在下に培養する。生存するＥＳ細胞は恐らくノックアウト構築物を組込んでいる。もしマーカー遺伝子が抗生物質抵抗性遺伝子以外のものであるならば、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡのサザーン・ブロットはマーカー配列にのみハイブリッド形成するように設計したＤＮＡ配列により精査することができる。別法として、ＰＣＲを用いることができる。最後に、もしマーカーが検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）をコード化する遺伝子であるならば、適切な条件下、細胞に酵素基質を加え、その酵素活性を測定することができる。当業者は他の有用なマーカーおよび所定の細胞にそれらが存在することを検出する手段につき熟知している。かかるマーカーはすべて本発明の教示範囲内に包含されると思考する。
ノックアウト構築物はＥＳ細胞ゲノムのいくつかの位置に組込み可能であり、ランダムな挿入事象の発生率によって、各ＥＳ細胞のゲノムの異なる位置に組込まれることもある。挿入の望ましい場所はノックアウトされるべきＤＮＡ配列に相補的な位置、例えば、ＨＩＰコード配列、転写制御配列などにある。一般に、ノックアウト構築物を取り込む約１〜５％のＥＳ細胞が所望の位置にノックアウト構築物を組込んでいる。ノックアウト構築物を適切に組込んでいるＥＳ細胞を同定するために、標準法を用いて総ＤＮＡをＥＳ細胞から抽出し得る。該ＤＮＡは、特定の制限酵素で消化したゲノムＤＮＡに特異的な様式でハイブリッド化するように設計した１ケまたは複数個のプローブによるサザーン・ブロットに基づき精査することができる。別法として、あるいは追加として、該ゲノムＤＮＡは特定のサイズおよび配列のＤＮＡフラグメントを増幅するように特異的に設計したプローブでのＰＣＲにより増幅することができる（すなわち、適当な位置にノックアウト構築物を含む細胞が適当なサイズのＤＮＡフラグメントを産生する）。
適切な位置にノックアウト構築物を含む適当なＥＳ細胞を同定した後、該細胞は胚中に挿入することができる。挿入は当業者既知の様々な方法で実施できるが、好ましい方法はマイクロインジェクションによる。マイクロインジェクションでは、約１０〜３０ケの細胞をミクロピペットに採り、胚に注射するが、その際、該胚はノックアウト構築物含有外来ＥＳ細胞を発育途上の胚へ組込むのを可能とする適切な段階にある。例えば、形質転換ＥＳ細胞は未分化胚芽細胞に微小注射することができる。
ＥＳ細胞を胚に導入した後、胚を疑似妊娠養母の子宮に移植し、妊娠させる。養母の使用は可能であるが、一般に該養母はその飼育と生殖能力が良好で、そのコドモの世話をする能力に応じて選択する。かかる養母は一般に同一種の精管切断したオスと交配させることにより作製する。疑似妊娠養母の段階は移植を成功させるのに重要であるが、それは種依存性である。
養母に生まれる子孫は最初ＨＩＰ分断物についてスクリーニングし、該子孫の組織からのＤＮＡをノックアウト構築物の存在下、上記のサザーン・ブロットおよび/またはＰＣＲによりスクリーニングする。モザイクと見える子孫は次いで、もしそれらが生殖系列にノックアウト構築物を担持していると信じ得るならば、同型接合のノックアウト動物を生成させるために、互いに交差させる。ホモ接合体は等価量のゲノムＤＮＡのサザーン・ブロッティングにより同定するが、該ＤＮＡはこの交差の産物であり、同様に既知のヘテロ接合体である動物および野生型動物からのＤＮＡである。
ノックアウト子孫を同定および特徴づける他の手段が利用可能である。例えば、ノーザン・ブロットはＨＩＰ遺伝子またはマーカー遺伝子または双方の転写物が存在するか存在しないかについて精査するのに用い得る。加えて、ウエスターン・ブロットは子孫の種々の組織においてノックアウトしたＨＩＰ遺伝子の発現のレベル（損失）を評価するために用いることができるが、該評価はウエスターン・ブロットをこの遺伝子が発現する個所のＨＩＰタンパクに対する抗体で、または、マーカー遺伝子産物に対する抗体で精査する。最後に、子孫からの種々の細胞についてのin situ分析（細胞の固定および抗体での標識）および/またはＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）分析が適切な抗体またはＨＩＰリガンド、例えば、ヘッジホッグタンパクを用いて実施し、ノックアウト構築物遺伝子産物の存在または不存在を探査する。
１以上のノックアウト構築物および/または１以上の導入遺伝子発現構築物を有する動物はいくつかの方法のいずれかで作製される。作製の好ましい方法は、それぞれが所望の導入遺伝子表現型を含む一連の動物を生成させることである。かかる動物は一連の交雑、戻し交雑および選別を経て共に繁殖させ、最終的にすべてのノックアウト構築物および/または発現構築物を含む単一の動物を生成させるが、この場合、該動物はさもなければ、ノックアウト構築物および/または導入遺伝子の存在する場合は別として、野生型に類遺伝子性（遺伝的に同一）である。かくして、形質転換トリの種は第一形質転換トリを繁殖させることにより生成させるが、この場合、野生型ＨＩＰ遺伝子は第二形質転換トリで中断し、該第二形質転換トリは殆どの他の生物学的レセプター機能を保持する変異体ＨＩＰを発現するように設計されている。
本発明の形質転換した動物、その子孫、および細胞系は、当業者に容易に理解されるいくつかの重要な用途を提供する。
例証するに、形質転換動物と細胞系は、ＨＩＰ遺伝子の異常な発現または欠失、または、レセプターシグナリングの異常な、または所望されない活性化などをともなう可能性のある疾患の予防的または治療的処置法として特に有用である。有用な薬物に対するスクリーニングは、形質転換動物に対してある範囲の投与量にわたって候補的薬物を投与し、さまざまの時点で、評価される疾患または障害に対する該薬物の効能についてアッセイすることを伴うであろう。これに代わって、またはこれに加えて、該薬物を、適切ならば、疾患を誘発する前に、またはそれと同時に投与することも可能であろう。
１つの実施の形態において、候補的化合物は、形質転換した動物にある範囲の投与量にわたって投与し、ある期間にわたって該化合物に対する該動物の生理的応答を評価することによって、スクリーニングされる。投与は経口投与でもよく、または適切な注射によってでもよく、評価される化合物の化学的性質に依る。場合によっては、該化合物はその効果を高めると思われる補助因子と共に投与するのが適切であることもある。
種々の障害の処置に有用な化合物に対する、形質転換対象動物から誘導した細胞系のスクリーニングにおいて、適時に試験化合物を細胞培養基に添加し、適切な生物化学的および／または組織学的アッセイを使い、該化合物に対する細胞応答を、ある期間にわたって評価する。場合によっては、該化合物の効果を高めると思われる補助因子と共に、培養基に対象化合物を塗布するのが適切であることもある。
上記の文献および刊行物は、すべて参照によってここに組み込まれる。
均等物
当業者には、ここで述べた特異ポリペプチド、核酸、方法、アッセイ、および試薬についての多くの均等物を、通常の実験以外の実験を実施せずとも容易に認識、または確認することができるであろう。したがって、かかる均等物は本発明の範囲に含まれると考えられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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