(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０）および／またはその培養物を、ＣＯＤ上昇の原因となる化合物、悪臭の原因となるアミン系化合物もしくは硫黄化合物、ヌメリの原因となる多糖類、または富栄養化の原因となるリン化合物のうち少なくとも１種を含むか、これらのうち少なくとも１種を発生する被処理物と接触させ、上記ＣＯＤ上昇の原因となる化合物、アミン系化合物、硫黄化合物、多糖類またはリン化合物のうち少なくとも１種を低減することを特徴とする環境浄化方法。
【請求項２】
リン化合物を低減するものである請求項１に記載の環境浄化方法。
【請求項３】
悪臭原因物質を低減するものである請求項１または２に記載の環境浄化方法。
【請求項４】
ヌメリを低減するものである請求項１〜３のいずれかに記載の環境浄化方法。
【請求項５】
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０）および／またはその培養物を含有することを特徴とする環境浄化剤。
【請求項６】
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０）および／またはその培養物が、溶媒中に分散しているものである請求項５に記載の環境浄化剤。
【請求項７】
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０）および／またはその培養物が、担体に担持されているものである請求項５に記載の環境浄化剤。
【請求項８】
上記担体が、米糠，コーヒー粕，大豆粕，椰子ガラ，活性炭，シリカ多孔体，ガーゼ，不織布，布帛からなる群より選択される１または２以上である請求項７に記載の環境浄化剤。
【請求項９】
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】本発明は、環境の浄化方法および当該方法に用いる環境浄化剤、並びにこれら浄化方法と環境浄化剤に使用できる細菌に関するものである。
【背景技術】  近年、産業技術の発達や人工の増加に伴って、環境に対する影響が問題となっている。例えば、生活廃水や食品工場からの廃水などに含まれる窒素化合物やリン化合物は、河川や海において富栄養化の原因となり、赤潮などを引き起こす。また、屎尿や畜産汚水は、河川等を汚染するのみでなく、悪臭の原因にもなる。さらに、家庭などから出る生ゴミは、水分含量が多いことから焼却には多大なエネルギーを要するのみならず、悪臭を発するという問題がある。
上記環境問題のうち、生活廃水や工場などからの廃水の処理には、大きく分けて物理化学処理と生物処理とが用いられる。これら方法のうち、凝集，沈殿，濾過，吸着などの物理化学処理は処理スピードに優れる。その一方で、生物処理は、汚染物質を高濃度に含む廃水に対して処理効率が悪く、また、おしなべて時間がかかるといった問題はあるものの、穏和な条件で安価に実施でき、省エネルギーの観点からも優れていることから、生物処理方法が採用される場合が多い。
しかし、従来、リン化合物を分解できる細菌は見出されておらず、生物処理によっては、廃水中のリン化合物を低減することはできないと考えられていた。また、生物処理方法による廃水処理においては、汚染物質を効率的に処理できる細菌の探索が、大きなテーマの一つとなっている。
また、悪臭の発生も問題である。特に、下水設備がない地域での汲み取り式便所や、客席から近い場所に設置せざるを得ない列車内の便所では、悪臭の原因となるアミン系化合物や硫黄系化合物を速やかに低減する必要がある。
悪臭を低減する方法としては、原因物質を活性炭等の多孔体に吸着する方法や、化学的に分解する方法がある、しかし、多孔体の吸着能は飽和するため、その脱臭能力は限定的である。また、化学的な分解方法は、家庭での使用が危険な場合がある。そこで、細菌を利用して悪臭を低減する方法が、種々検討されている。
例えば特開平１１−１３７９５３号公報には、微生物を担持する担体と、この担体に散水する散水設備と、散水した水を回収する貯水タンクであって硝化細菌を有するものとを備える脱臭装置が開示されている。しかし、散水設備や貯水タンクを設けるのは設備費用の点で問題があるのみでなく、列車内など限られたスペースには装置を設置することが困難である。この点に関して、特に脱臭作用等に優れる細菌を用いることによって、設備の問題の解決を図っている技術もある。
特開平５−１５３９７１号公報には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種に属する細菌を使った悪臭発生抑制剤が記載されている。しかし、この文献の実施例に記載されている当該細菌の作用効果は、「悪臭の発生が抑えられた」といった定性的なものであり、実際にどの程度効果があるのか不明である。
一方、特開２００１−７０４２４号公報にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ種などのＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌を担持した生物脱臭剤の製造方法が開示されており、実施例にはアンモニア等の具体的な処理データも開示されている。しかし、添付されている図を参照すれば明らかな様に、当該技術はあくまで空気中の揮発性化合物を処理するものであって、悪臭の直接の原因である物質を処理するものではない。
さらに、特開平６−１９００２８号公報と特開平１０−２４８５５６号公報には、それぞれ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｉｍ属とＴｈｅｒｍｕｓ属細菌を含む脱臭剤と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を含む脱臭剤が開示されており、悪臭原因物質である硫化メチルと二硫化メチルを処理した実験例が記載されている。
また、身近な環境汚染例として、台所の排水口や排水溝，浴室の排水口，浴槽，便所の水洗用タンク，水槽などに発生する「ヌメリ」がある。このヌメリの正体は、主に雑菌やカビ、藻類が産生する多糖類である。従って、ヌメリの抑制には殺菌作用を有する化合物等が用いられる。しかし、殺菌剤では効果が緩慢である場合があり、また、家庭での使用は危険な場合がある。
ところで、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓ等のＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌は、不飽和脂肪酸に水酸基を付加する等の生物変換反応に用いられるものとして知られている（特開平１５−１４４１８６号公報）。しかし、従来、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌を廃水処理などの環境浄化に用いた例はない。
【発明の開示】
上述したように、細菌を用いた廃水や悪臭の処理は、従来から行なわれていた。また、ヌメリを抑制する技術も知られている。しかし、有害な有機化合物や無機化合物、特に廃水ＣＯＤの上昇の原因となる化合物や、悪臭の原因となるアミン系化合物や硫黄化合物、ヌメリの原因となる多糖類の生物処理については、より効率的な技術が求められている。特に、河川等の富栄養化の原因となるリン化合物を処理できる細菌は見出されていないことから、リン化合物の処理能力を有する細菌が切望されている。
そこで、本発明が解決すべき課題は、細菌により有害な有機化合物や無機化合物を処理する環境浄化方法、および当該方法に用いる環境浄化剤、並びにこれら環境浄化方法と環境浄化剤に用いることができる細菌を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、環境浄化に有用な細菌を探索したところ、これまで環境浄化に用いられた例のないＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌が、廃水のＣＯＤや悪臭成分等のみならず、リン化合物濃度も低減できる能力を有することを見出して、本発明を完成した。
即ち、本発明の環境浄化方法は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を被処理物と接触させることを特徴とする。
また、本発明の環境浄化剤は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を含有することを特徴とする。
さらに、本発明に係る環境浄化方法と環境浄化剤で、特に優れた効果を発揮するＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌は、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０）である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株の脂肪酸組成を示すクロマトグラフィー結果である。
【図２】ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株とその近縁菌株を含む分子系統樹である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明に係る細菌であるＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌のうち、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：  日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６
（ｉｉ）  寄託日：  平成１６年（２００４年）６月３０日
（ｉｉｉ）  寄託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０
なお、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、上記寄託機関に平成１６年６月３０日付で国内寄託された後（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１０８）、本願出願前に国内寄託から国際寄託へ移管されたものである。
光学顕微鏡（オリンパス製，Ｕ−ＬＨ１０００）を用いて観察した、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株の細胞形態，グラム染色性，胞子の有無，鞭毛による運動性の有無、およびｎｕｔｒｉｅｎｔ  ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ製）上３０℃で２４時間培養したコロニーの形態、更には、Ｂａｒｒｏｗ，Ｇ．Ｉ．とＦｅｌｔｈａｍ，Ｒ．Ｋ．Ａ．，Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．（１９９３年）に従ったカタラーゼ反応，オキシダーゼ反応およびブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）の試験結果は、表１に示す通りである。
【表１】
0004041519.tif 000002
また、細菌同定検査試薬であるＡＰＩシステム（ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ製）を用いて、生化学的性状試験を行なった結果を表２に示す。
【表２】
0004041519.tif 000003
以上の形態や性状に関して、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に分類される菌群と類似するが、属種の特定には至らなかった。しかし、後述する実施例の結果より、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の中でもＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属に分類される細菌であると結論付けられる。
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、廃水のＣＯＤ，ＢＯＤ，窒素化合物やリン化合物の低減と共に、悪臭の原因となるアミン系化合物や硫黄系化合物の発生抑制、ヌメリの原因となる多糖類の抑制について、優れた作用を有する。従って、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株の他のＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌も、これら作用を有すると考えられ、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株と同様に、環境浄化のために用いることができる。また、複数のＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌を併用して用いてもよい。
本発明の環境浄化方法は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を被処理物と接触させることを特徴とする。本発明方法によって、環境中における有害化合物、特に河川等の富栄養化の原因となる有機化合物，窒素化合物やリン化合物；悪臭の原因となるアミン系化合物や硫黄系化合物；ヌメリの原因となる多糖類；カビの発生を抑制することができる。
本発明方法で用いるＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌は、上記で説明した通りである。Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌の培養物とは、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌の培養に用いた培地と、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌の生育に伴って当該培地に放出された化合物や酵素等を含むものをいう。Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌自体が、有害化合物を分解できるが、細菌が産生する酵素等が同様の作用効果を有することも考えられる。
当該培地は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌の培養に適するものであれば特に制限されない。例えば、純水，精製水，蒸留水などの水へ、糖類等の炭素栄養源、尿素やペプトン等の窒素栄養源、酵母エキス等の微量元素源などを適量添加したものを用いることができる。
本発明方法の被処理物は、有害な化合物を含むもの、或いは有害な化合物を発生させるものであれば、特に制限されない。例えば、生活廃水や食品工場廃水など河川等の富栄養化の原因となる廃水，悪臭源である屎尿や畜産汚水，生ゴミ等の食品残渣，微生物汚泥などを挙げることができる。また、悪臭が問題となるトイレ室内，便器，犬猫の糞尿場，灰皿，生ゴミ容器；ヌメリやカビが問題となる浴室の排水口や排水溝や壁，浴槽，便所の水洗用タンク，水槽，冷房機の室外機，生ゴミ容器などへ、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を直接作用させてもよい。
本発明方法で用いる環境浄化剤は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を含有することを特徴とする。本発明の環境浄化剤によって、環境中における有害化合物、特に河川等の富栄養化の原因となる有機化合物，窒素化合物やリン化合物；悪臭の原因となるアミン系化合物や硫黄系化合物；ヌメリの原因となる多糖類を抑制することができる。従って、本発明の環境浄化剤は、廃水処理剤，悪臭抑制剤または脱臭剤，ヌメリ抑制剤または多糖類発生抑制剤，カビ発生抑制剤等として有用である。
本発明の環境浄化剤は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を被処理物へ直接投与するものであってもよいが、被処理物の種類に応じた形態としてもよい。
例えば、被処理物がトイレ室内や生ゴミ自体である場合には、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を溶媒中に分散させ、これを被処理物へ散布してもよい。この場合に用いることができる溶媒は、水；エタノール等のアルコール；水とアルコールとの混合溶媒を挙げることができる。斯かる分散液の濃度は特に制限されないが、例えば、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌に対して溶媒を５０００〜１００００質量倍程度加えたものとすることができる。また、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌の作用効果を著しく減ずるものでない限り、菌床になり得るもの及びその組成物，ｐＨ調整剤，色素，消毒剤などを併用してもよい。なお、この分散液には、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌の培養液も含むものとする。
被処理物が廃水である場合には、浄化槽など従来の廃水処理設備へＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を投入してもよい。その際には、培養物を投入する場合には特にその必要はないが、細菌自体を投与する場合には、炭素源，窒素源，微量元素源など、上記細菌の生育に適した栄養源を添加し、その他の条件も上記細菌の生育条件に即したものにする。また、栄養源として植物系の残渣を加えてもよい。植物系残渣は細菌の栄養源として優れるのみでなく、本来廃棄されるべきものの再利用を図ることができるからである。斯かる植物系残渣としては、例えば、米糠，おから，鋸くず，コーヒー粕，油粕，大豆粕，ヤシガラ，サトウキビバガス等を挙げることができ、本発明細菌に対しては、米糠とコーヒー粕が最適である。
上述した植物系残渣中で本発明細菌を培養したものは、そのまま廃水処理に用いることができるものとして有用である。その作成方法は、例えば、植物系残渣に本発明細菌と他の栄養源等を添加した後、十分に水分を与えて３７〜３９℃程度でインキュベートし、数日間発酵させる。これをそのまま被処理物に加えてもよいし、或いは一旦乾燥したものを被処理物に添加してもよい。
また、本発明の環境浄化剤は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物を担体に担持したものであってもよい。使用できる担体としては、米糠，コーヒー粕，大豆粕，椰子ガラ，活性炭，シリカ多孔体，ガーゼ，不織布，布帛からなる群より選択される１または２以上を挙げることができる。この環境浄化剤は、例えば、担体にＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌の培養液を加えた上で、適度に乾燥することにより製造することができる。
本発明に係る環境浄化剤細菌の添加量は、例えば、廃水のＣＯＤ、悪臭の発生度合い、生ゴミなど固形成分の存在などに応じて適宜調整すればよい。被処理物が廃水である場合、一般的には、廃水１Ｌに対して菌体重量で０．３ｍｇ程度添加すればよい。被処理物がトイレ室内や生ゴミである場合には、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌および／またはその培養物の分散液である環境浄化剤を、悪臭が発生しない程度に適度散布すればよい。また、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は上述した通り３０℃と３７℃で生育するため、特に温度制御する必要はなく常温で処理してもよいが、寒冷地での実施など、場合によっては適温でインキュベートしてもよい。具体的な処理条件は、予備実験により決定すればよい。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】  実施例１  １６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６０）の菌体について、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、Ｉｎｓｔａ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ  ＲＡＤ製）を使用し、プロトコールはＢＩＯ  ＲＡＤ社のものに従った。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６ＳｒＤＮＡのうち５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅された塩基配列をシーケンシングし、塩基配列を決定した。ＰＣＲとサイクルシークエンスにはＭｉｃｒｏ  Ｓｅｑ  ５００  １６ＳｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を、サーマルサイクラーにはＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を、ＤＮＡシーケンサーにはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用した。また、ＰＣＲからサイクロシークエンスまでの基本的操作は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコール（Ｐ／Ｎ４３４６２９６  Ｒｅｖ．Ｂ）に従った。
次に、得られた塩基配列情報を用いて、属種の同定を行なった。先ず、各属種の基準株のデータベースであるＭｉｃｒｏ  Ｓｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、解析ソフトウェアとしてＭｉｃｒｏ  Ｓｅｑ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１．４．１を、アルゴリズムとしてＢＬＡＳＴを使用して、既知細菌との相同率を求めた。相同率上位５位までの結果を表３に示す。
【表３】
0004041519.tif 000004
相同率が９７％以下であれば、両者は異なる種に属するといえる（参照：Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ  Ｅ，  Ｇｏｅｔｅｌ  ＢＭ  （１９９４），  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｎｏｔｅ；  ａ  ｐｌａｃｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−ＤＮＡ  ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  １６ＳｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ４４，  ｐｐ８４６−８４９）。従って、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、何れの既知細菌の属種にも属さない新規なものであることが分かった。
また、念のために国際塩基配列データベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）による同定も行なった。相同率上位５位までの結果を表４に示す。
【表４】
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当該結果の通り、国際塩基配列データベースを用いた場合でも、基準株であるＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓとの相同性は９５％であり、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株はＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓ種に属するものではないといえる。また、相同率が高いものも見られたが、これらは基準株ではなく、且つ、たとえ１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列の相同性が１００％であっても必ずしも同一株である証拠とはならない。
以上の結果から、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株はＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属とＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属への近縁性が示唆されるものの、これら属に分類される基準株への相同性は認められなかったことから属種レベルで全く新規の細菌であり、これら属が含まれるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に分類されるものであると結論付けた。
実施例２  脂肪酸組成分析
ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株をＴｒｉｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ（ＳＣＤ）Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）平板培地に植菌し、３０℃で２４時間培養した。この平板４枚分の菌体をセルスクレイパーでかき取り、１３ｍＬ容のガラスバイアルの底部に擦り付けた。
この菌体に鹸化液（水酸化ナトリウム４５ｇ，メタノール１５０ｍＬ，蒸留水１５０ｍＬを均一混合したもの）１ｍＬを加え、１００℃のウォーターバスによってガラスバイアルを恒温状態で静置した。反応開始５分後に一旦ウォーターバスから取り出し、軽く攪拌してから戻し、菌体の鹸化を更に３０分間行なった。鹸化した試料液中にメチル化試薬（６．０Ｍ塩酸３２５ｍＬとメタノール２７５ｍＬを均一混合したもの）２ｍＬを加え、８０℃に設定したウォーターバス中で１０分間反応させ、鹸化により生じた脂肪酸をメチルエステル化した。
試料液中に抽出液（ヘキサン２００ｍＬとｔ−ブチルメチルエーテル２００ｍＬとの混合溶液）１．２５ｍＬを加え、シェーカーで１０分間攪拌した後静置した。二層分離した水層をパスツールピペットで除去した。残った有機層に洗浄液（水酸化ナトリウム１０．８ｇと蒸留水９００ｍＬを均一混合したもの）３ｍＬを加えてシェーカーで５分間攪拌したところ、エマルジョン状態になったため、飽和食塩水を数滴滴下することによって二層分離させた。分離した有機層の上部２／３をパスツールピペットで取り出し、これをガスクロマトグラフィー用サンプルバイアルに移し、測定用試料とした。
上記試料について、ガスクロマトグラフィーシステム  ＨＰ６８９０（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ製）を用いて脂肪酸組成を測定した。結果を図１に示す。また、この結果について、Ｓｈｅｒｌｏｃｋ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、既知菌種との相同性検索を行なった。結果を表５に示す。
【表５】
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上記表中、「Ｓｕｍ  Ｉｎ  Ｆｅａｔｕｒｅ  ３」は、リテンションタイムがほぼ同一であるＣ１６：１  ｗ７ｃとＣ１５：０  ｉｓｏ  ２ＯＨの何れかである。また、「類似度」は、菌種間で全く同一の組成を持つ場合は１．０００となり、目安として当該値が０．５００以上であれば、検索された菌種の脂肪酸組成と類似しているといえ、０．３００以下では、類似する脂肪酸組成を有する菌種はないと考えられる。
当該結果より、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に分類されるＥｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓとの近縁性が示唆されるものの、既知の菌種とは一致しないものであることが明らかとなった。
実施例３  分子系統樹
上記実施例１で得られた１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果から推定されたＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株の近縁菌群に含まれる基準菌株について、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）から１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の上流側を取得し、分子系統樹を作成した。その際、アラインメント（塩基配列間の対応が最も良くなる様に配列データへ適当なギャップを挿入する処理）には、アラインメントソフトであるＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら，「Ｔｈｅ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｗｉｎｄｏｗｓ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｉｄｅｄ  ｂｙ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ，２４，ｐｐ．４８７６−４８８２（１９９７））を用い、分子系統樹の作成には、コンピューターソフトウェアであるＭＥＧＡ  ２（Ｋｕｍａｒ，Ｒ．ら，「ＭＥＧＡ  ２：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７，ｐｐ．１２４４−１２４５（２００１））を使用した。なお、分子系統樹の推定には近隣結合法（Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ら，「Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅｓ」，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ，４，ｐｐ．４０６−４２５（１９８７））を用い、樹形の妥当性を示すブートストラップ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，「Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｏｎ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ：ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｏｏｔｓｔｒａｐ．」，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，３９，ｐｐ．７８３−７９１（１９８５））は１０００回発生させた。また、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株を含むクラスターは、ブートストラップ値９９％と１００％で支持された。結果を図２に示す。
当該結果より、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓの１６ＳｒＤＮＡ塩基配列が形成するクラスターに含まれることが分かる。従って、上記実施例１と２の結果も合わせて考察すると、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属に分類される新規な菌株であると結論付けることができる。
実施例４  脱臭能力試験
先ず、米糠にＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株とコーヒー粕と尿素とを加え、地下水を吹き付けたものを３７〜３９℃で５日間インキュベートし、次いで適度に自然乾燥することによって、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株を含む植物系残渣を作成した。次に、１２Ｌ容の密閉真空デシケーターに屎尿処理場原水１０Ｌを取り、この原水１Ｌ当たり１０ｇの割合（合計１００ｇ）で当該植物系残渣を添加した。このデシケーターを密閉し、震蕩しつつ２５℃でインキュベートした。所定時間毎に、シリンジにより気相部分の空気を抜出し、ＪＩＳ  Ｋ００９９の規定に基づいてインドフェノール吸光度法によって、気相部分のアンモニア濃度（ｖ／ｖ  ｐｐｍ）を測定した。結果を表６に示す。
【表６】
0004041519.tif 000007
当該結果より、本発明のＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、一般の屎尿原水から発生する悪臭の原因となるアンモニアの濃度を１時間でほぼ半分まで低減することができ、その後においてもアンモニウム濃度を低いレベルに維持した。従って、本発明のＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、高い脱臭能力を有することが実証された。
実施例５  廃水処理試験
先ず、グリストラップで処理された後に排出されている食品（かまぼこ）製造工場由来の廃水（放流量：２５ｍ３／日）について、ｐＨ、化学的酸素要求量、生物化学的酸素要求量、浮遊物質量、全窒素含有量、全リン含有量およびｎ−ヘキサン抽出物質量（鉱油類と動植物油脂類）を測定した。
次に、当該グリストラップに、上記実施例４で用いたＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株を含む植物系残渣を１日当たり５００ｇ加えて攪拌する処理を２０日間連続して行なった。その後における廃水について、同様の条件でｐＨ等を測定した。結果を表７に示す。
【表７】
0004041519.tif 000008
当該結果の通り、本発明のＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、化学的酸素要求量（ＣＯＤ）や生物化学酸素要求量（ＢＯＤ）、悪臭の原因となる窒素化合物、環境汚染の原因となるリン化合物などを低減できることが実証された。特に、従来、生物処理では廃水のリン化合物を低減できないと考えられていたことから、本発明のＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、廃水処理のための微生物として極めて優れているといえる。
実施例６  廃水処理試験
先ず、機械部品製造工場に設置されている浄化槽（３５０人槽）の流入水と放流水について、ｐＨ、化学的酸素要求量、生物化学的酸素要求量、浮遊物質量、窒素化合物含有量およびリン化合物含有量を、表７に示す方法により測定した。この浄化槽は、食堂からの生活廃水と屎尿を合わせた廃水を１日当たり４６ｍ３処理しているものであり、通常の活性汚泥処理方式を採用したものである。しかし、当該浄化槽の汚泥負荷と流量負荷を過小設定したことによると推測される、放流水中のＣＯＤとＢＯＤ等の浄化不十分などのトラブルが頻発していた。
上記測定後、当該浄化槽へ上記実施例４で用いたＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株を含む植物系残渣を５０ｋｇ投入し、投入４日後において、同様の測定を行なった。さらに、最初の投入から１週間ごとに植物系残渣を４ｋｇずつ計１６ｋｇ投入し、最後の投入を行なった後で再度同様の測定を行なった。結果を表８に示す。
【表８】
0004041519.tif 000009
当該結果の通り、従来の浄化槽へ本発明に係るＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株を投入したところ、廃水のＣＯＤ、ＢＯＤおよび浮遊物質を顕著に低減することができた。また、悪臭の原因となるアンモニア性窒素、環境汚染の原因となる硝酸性窒素、亜硝酸性窒素およびリン化合物も、従来の浄化槽で処理された廃水に比して、それぞれ０．６％、１８．５％、２．０％、３．７％まで低減されている。これら化合物中、アンモニア性窒素とリン化合物がいったん増加する理由は明らかではないが、従来の浄化槽による処理ではアンモニア性窒素とリン化合物が増加していることから、投入した植物系残渣がＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株以外の微生物により分解された結果ではないかと考えられる。斯かる結果からも、従来の浄化槽では、悪臭や環境汚染物質を必ずしも低減できないことが分かる。これに対して、本発明のＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株は、悪臭や環境汚染物質を顕著に低減できることが証明された。
実施例７  悪臭抑制試験
水４０００質量部に、ＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株０．５質量部、グルコース１０質量部、ペプトン５質量部および酵母エキス２．５質量部を添加し、３０℃で５日間培養した。当該培養液５ｍＬを水５００ｍＬに添加した。これを環境浄化剤Ａとする。当該環境浄化剤Ａを、猫の糞尿場所である砂場に１０日間にわたり毎朝８時に約２〜３ｍＬ散布し、悪臭の発生状態を、毎朝７時に３人でチェックした上での合意により判定した。環境浄化剤Ａの散布前と散布後における悪臭の発生状態を、悪臭がある場合を×、悪臭が少ない場合を△、悪臭がない場合を○として表９に示す。
【表９】
0004041519.tif 000010
当該結果の通り、本発明に係る環境浄化剤Ａの使用前には悪臭が有ったにもかかわらず、使用開始１日後から効果が表れ始め、２〜１０日においては悪臭の発生は認められなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤の悪臭抑制作用が実証された。
実施例８  悪臭抑制試験
上記実施例７の環境浄化剤Ａを、家族３人が使用する汲み取り式便所のタンクへ、２０日間にわたり毎朝８時に約１５〜２０ｍＬ投入し、便器蓋を除いた際における悪臭の発生状態を、毎朝７時に３人でチェックした上での合意により判定した。環境浄化剤Ａの散布前と散布後における悪臭の発生状態を、悪臭がある場合を×、悪臭が少ない場合を△、悪臭がない場合を○として表１０に示す。
【表１０】
0004041519.tif 000011
当該結果の通り、本発明に係る環境浄化剤Ａの投入１日後までは悪臭が有ったものの、投入後２日目から効果が表れ始め、４〜２０日においては悪臭の発生は認められなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤の悪臭抑制作用が証明された。
実施例９  悪臭抑制試験
上記実施例７で調製した培養液４０００質量部に、米糠１００００質量部、コーヒー粕１０００質量部、尿素１００質量部、蜂蜜２質量部、砂糖２質量部を添加した。培養に伴う発熱による昇温に注意し、５５℃を超えない様に時々攪拌しつつ、５日間静置培養した。その後、培養液を自然乾燥してＳＩＩＤ２９２６−１ｂ株を仮死状態とし、環境浄化剤Ｂを得た。当該環境浄化剤Ｂの水分を米穀水分計により測定したところ、１３％だった。
この環境浄化剤Ｂを、上記実施例８と同様の方法により便所タンクへ約２０〜２５ｇ投入し、悪臭抑制作用を調べた。環境浄化剤Ｂの散布前と散布後における悪臭の発生状態を、悪臭がある場合を×、悪臭が少ない場合を△、悪臭がない場合を○として結果を表１１に示す。
【表１１】
0004041519.tif 000012
当該結果の通り、本発明に係る環境浄化剤Ａの投入１日後までは悪臭が有ったものの、投入後２日目から効果が表れ始め、５〜２０日においては悪臭の発生は認められなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤の悪臭抑制作用が証明された。
実施例１０  悪臭抑制試験
上記実施例９で得た環境浄化剤Ｂを、家族３人の台所生ゴミを一時保存する容量１００Ｌの蓋付ポリバケツへ、３０日間にわたり毎朝８時に約８〜１０ｇ散布して攪拌し、毎日朝、昼、晩の３食分の生ゴミをその上に蓄積した。蓋を除いた際における悪臭の発生状態を、毎朝７時に３人でチェックした上での合意により判定した。環境浄化剤Ｂの散布前と散布後における悪臭の発生状態を、悪臭がある場合を×、悪臭が少ない場合を△、悪臭がない場合を○として表１２に示す。
【表１２】
0004041519.tif 000013
当該結果の通り、本発明に係る環境浄化剤Ａの投入１日後までは悪臭が有ったものの、投入後２日目から効果が表れ始め、３〜３０日においては悪臭の発生は認められなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤の悪臭抑制作用が証明された。
実施例１１  悪臭抑制試験
上記実施例７の環境浄化剤Ａを、自家用車の灰皿に、２０日間にわたり毎晩２０時に約５〜７ｍＬ散布し、悪臭の発生状態を、毎朝７時に３人でチェックした上での合意により判定した。環境浄化剤Ａの散布前と散布後における悪臭の発生状態を、悪臭がある場合を×、悪臭が少ない場合を△、悪臭がない場合を○として表１３に示す。
【表１３】
0004041519.tif 000014
当該結果の通り、本発明に係る環境浄化剤Ａの投入前までは悪臭が有ったものの、投入後１日目から効果が表れ始め、２〜２０日においては悪臭の発生は認められなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤の悪臭抑制作用が証明された。
実施例１２  カビおよびヌメリの発生抑制試験
上記実施例７で調製した培養液１０質量部を、水１０００質量部に加えて分散混合した。これを環境浄化剤Ｃとした。当該環境浄化剤Ｃを、いったん洗浄した浴室の壁と浴槽へ、６０日にわたり１日当たり３〜５ｍＬ散布した。６０日後の実験後において、浴室壁にも浴槽にも、カビやヌメリは全く見られなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤のカビおよびヌメリの発生抑制作用が実証された。
実施例１３  カビおよびヌメリの発生抑制試験
上記実施例１２の環境浄化剤Ｃを、６０日にわたって３日に１回３〜５ｍＬずつ便所の水洗用タンクへ添加した。６０日後の実験後において、水洗用タンクにも便器にも、カビやヌメリは全く見られなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤のカビおよびヌメリの発生抑制作用が証明された。
実施例１４  ヌメリ抑制試験
上記実施例９で得た環境浄化剤Ｂ５０ｇを、ポリエステル繊維不織布の袋に入れて袋口部を封じ、これを家族３人が使用する台所の排水口のプラスチック製カゴに入れた。３ヵ月後にわたって、上記プラスチック製カゴのヌメリの発生状態を、３人でチェックした上での合意により毎日判定したところ、一度もヌメリは発生しなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤のヌメリ抑制作用が証明された。
実施例１５  ヌメリ抑制試験
上記実施例７で調製した培養液１００００質量部に多孔性炭（平均粒子径：２〜５ｍｍ）１０００質量部を浸漬し、３０℃で時々攪拌しつつ５日間静置した。その後、多孔性炭のみを取り出し、自然乾燥することによって、水分１２％の環境浄化剤Ｄを得た。当該環境浄化剤Ｄをポリエステル繊維不織布の袋に１５０ｇ入れて袋口部を封じ、２４時間風呂のフィルター部に合わせて成形し、装着して使用した。３ヵ月後にわたって、フィルター部におけるヌメリの発生状態を、毎朝７時に３人でチェックした上での合意により毎日判定したところ、一度もヌメリは発生しなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤のヌメリ抑制作用が証明された。
実施例１６  ヌメリ抑制試験
上記実施例７で調製した培養液１００００質量部に活性炭素繊維（平均繊維径：１００μｍ，平均繊維長：５０ｍｍ）３００質量部を浸漬し、３２℃で時々攪拌しつつ５日間静置した。その後、活性炭素繊維のみを取り出し、自然乾燥することによって、水分１４％の環境浄化剤Ｅを得た。当該環境浄化剤Ｅをポリエステル繊維不織布の袋に１５０ｇ入れて袋口部を封じ、上記実施例１７と同様に２４時間風呂のフィルター部に装着して使用した。２ヵ月後にわたって、フィルター部におけるヌメリの発生状態を、毎朝７時に３人でチェックした上での合意により毎日判定したところ、一度もヌメリは発生しなかった。従って、本発明に係る環境浄化剤のヌメリ抑制作用が証明された。
実施例１７  有機化合物分解試験
上記実施例９で得た環境浄化剤Ｂを、ペットの犬の糞尿を蓄積している土中の容器に、１ヵ月にわたり毎日１回３０ｇ程度を投入し、同時に水を適量散布し、３〜５日に１回攪拌した。その間、容器は通常通り使用し、犬の糞尿を蓄積した。また、比較のために、別途、環境浄化剤を用いない以外は同様の試験を行なった。糞尿は逐一半分とし、実施例と比較例へそれぞれ等量ずつ蓄積した。
試験開始後１ヵ月経過後、本発明の環境浄化剤Ｂを用いた場合には、糞尿の蓄積増加がほとんどない上に、悪臭の発生も極めて少なかった。一方、環境浄化剤Ｂを用いなかった場合は、糞尿の蓄積は数倍多く、悪臭も発生した。従って、本発明に係る環境浄化剤は、有害な有機化合物を分解できることが実証された。
実施例１８  有機化合物分解試験
上記実施例９で得た環境浄化剤Ｂを、台所の生ゴミを蓄積している土中の容器に、１ヵ月にわたり毎日１回生ゴミと共に２５ｇ程度を投入し、同時に水を適量散布し、３〜５日に１回攪拌した。また、比較のために、別途、環境浄化剤を用いない以外は同様の試験を行なった。生ゴミは１日分を蓄積しておき、それを半分にし、実施例と比較例へそれぞれ等量ずつ蓄積した。
試験開始後１ヵ月経過後、本発明の環境浄化剤Ｂを用いた場合には、生ゴミの蓄積増加がほとんどない上に、悪臭の発生も極めて少なかった。一方、環境浄化剤Ｂを用いなかった場合は、生ゴミの蓄積は数倍多く、悪臭も発生した。従って、本発明に係る環境浄化剤は、有害な有機化合物を分解できることが実証された。
【産業上の利用可能性】  本発明の細菌は、有害な化合物に対して優れた処理能力を有する。例えば、河川や海の富栄養化の原因となる有機化合物、窒素化合物、リン化合物の低減、悪臭の抑制、およびヌメリの原因物質の抑制といった極めて優れた効果を発揮できる。よって、当該細菌を用いる本発明は、環境を浄化できるものとして、産業上極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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