(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）下記構造Ｉａを有する物質および構造Ｉｂを有する物質の混合物、
【化１】
0004150071.tif 000022
（ｂ）バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株由来のバチルス関連農薬、および
（ｃ）農薬的に有効な担体
を含む農薬組成物。
【請求項２】
農薬組成物の病虫害抑制に有効な量に病害虫を暴露させる段階を含み、
前記農薬組成物が
（ａ）下記構造Ｉａを有する物質および構造Ｉｂを有する物質の混合物、
【化２】
0004150071.tif 000023
（ｂ）バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株由来のバチルス関連農薬、および
（ｃ）農薬的に有効な担体
を含む、鞘翅目の種の病害虫の抑制方法。
【請求項３】
（ａ）下記構造Ｉａを有する物質および構造Ｉｂを有する物質の混合物、
【化３】
0004150071.tif 000024
（ｂ）バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株由来のバチルス関連農薬、および
（ｃ）農薬的に有効な担体
を組み合わせる段階を含む、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株由来のバチルス関連農薬の農薬活性を強化する方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９５年３月１４日出願の出願番号０８／４０４０７６号の一部継続出願であり、該出願は１９９４年３月１４日出願の出願番号０８／２１２４６２号の一部継続出願であって、これらは本願に引例として添付されている。
発明の属する技術分野
本発明は、新規なバチラスチューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）株に関するものであって、該株においては、該株の農薬活性の実質的に全てが該株の発酵上清にある。本菌株は、鞘翅目病害昆虫に対する活性を有し、バチルス関係農薬の農薬活性を強化する物質を産生する。本発明はさらに、該物質および農薬用担体；あるいは該物質とバチルス関係農薬、化学農薬および／または農薬的性質を有するウィルス；さらにはそれら農薬組成物を用いて病害生物を抑制する方法に関するものでもある。
発明の背景
毎年、食品、テキスタイルおよび各種仮定用植物などの世界の商業的に重要な農作物のかなりの部分が、病害生物の害によって失われ、結果的に数百万ドルの損失を生じている。そのような病害生物を抑制する試みにおいて、各種戦略が用いられてきた。
一つの戦略は、広いスペクトルを持つ農薬、すなわち広範囲の活性を有する化学農薬の使用である。しかしながら、そのような化学農薬の使用には、多くの欠点がある。具体的には、広い活性スペクトルのため、それらの農薬は益虫および破壊性病害生物の寄生虫などの標的外の生物を死滅させる可能性がある。さらにそれらの化学農薬は、動物およびヒトに対して有毒である場合が非常に多く、そのような物質に対して繰り返し曝露されることで、標的病害生物が抵抗性を形成する場合が非常に多い。
別の戦略では生物農薬の使用が関与するものであり、天然病原体を用いて作物の昆虫、菌および雑草による害を抑制するものである。生物農薬は、有毒物、すなわち病害生物に対して有毒な物質を産生する細菌を含有するものである。生物農薬は全般的に、化学農薬と比較して、標的外生物や環境に対する害が少ない。
最も広く使用される生物農薬は、Bacillus thuringiensis（B.t.）である。B.t.は広く分布する桿状で好気性の胞子形成性微生物である。胞子形成サイクル中、B.t.は結晶デルタ・エンドトキシンとして知られる、昆虫の幼虫を殺す蛋白質を産生する。従ってB.t.は、農薬として非常に有用である。
Bacillus thuringiensis亜種kurstakiおよびBacillus thuringiensis亜種aizawaiなどのいくつかの株は、鱗翅目に対して特異的であることが認められている。Bacillus thuringiensis亜種israelensisは、双翅目に対して特異的であることが認められている（Goldberg、米国特許４１６６１１２号）。Bacillus thuringiensis亜種tenebrionis（Kriegら、1988年、米国特許４７６６２０３号）などの他の株は、鞘翅目に対して特異的であることが認められている。別の鞘翅目毒性を有するBacillus thuringiensis株の単離が、１９８６年に報告されている（Hernnstadt et al., Bio/Technology vol.4, 305-308, 1986、米国特許４７６４３７２号（１９８８））。この「Bacillus thuringiensis亜種san diego」Ｍ−７と称される菌株は、受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−１５９３９下に寄託されている（米国Northern Regional Research Laboratory）。しかしながら、‘３７２特許の譲受人であるミコゲン社（Mycogen, Corp.）は、Bacillus thuringiensis亜種san diegoがBacillus thuringiensis亜種tenebrionisであることを公式に認めている。さらに、’３７２特許は、ノボ・ノルディスク社（Novo Nordisk A/S）に譲渡されている。さらに、鱗翅目および鞘翅目に対して有毒なB.t.株が開示されている（ＰＣＴ出願WO９０／１３６５１号）。ＰＣＴ出願WO９０／１３６５１号に開示の毒物は、分子量８１ｋｄを有する。
胞子形成サイクル中、B.t.は、摂取すると昆虫の幼虫を殺す分子量２７〜１４０ｋｄの結晶デルタ・エンドトキシンとして知られる結晶体の蛋白質を産生する。毒性活性は、ある種のB.t.株中のそのようなデルタ・エンドトキシン１種以上にあると考えられる。ほとんどのデルタ・エンドトキシンは、標的昆虫の中腸中で蛋白分解的に変換されてより小さい有毒な（切断）ポリペプチドとなるプロトキシンである
0004150071.tif 000002
デルタ・エンドトキシンは、cry（結晶蛋白質）遺伝子によってコードされる。cry遺伝子は、構造的類似性および農薬的特異性に基づいて６つの綱と７つの亜綱に分けられている。主要な綱としては、鱗翅目特異的（cryI）；鱗翅目および双翅目特異的（cryII）；鞘翅目特異的（cryIII）；双翅目特異的（cryIV）
0004150071.tif 000003
鞘翅目および鱗翅目特異的（テイラーらによってcryV遺伝子と称される（Tailor et al., 1992, Molecular Microbiology 6:1211-1217））；ならびに線虫特異的（フェイテルソンらによってcryVおよびcry VIと称される（Feitelson et al., 1992 Bio/Technology 10:271-275）遺伝子である。
デルタ・エンドトキシンは、組換えDNA法によって生産されている。組換えDNA法によって生産されるデルタ・エンドトキシンは、結晶体であったり、そうでなかったりする。
B.t.デルタ・エンドトキシンは、アルカリ性ｐＨ以外では水に不溶であり、ほとんど常にプラスミドにコードされている。Bacillus thuringiensisの菌株の中には、単独で農薬活性を持つβ−エキソトキシンもしくはチュリンギエンシン（thuringiensin）として知られる熱安定性の農薬活性アデニン−ヌクレオチド類縁物を産生することが明らかになっているものがある（Sebesta et al., H.D.Burges(ed),Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York, p.249-281, 1981）。β−エキソトキシンは、一部のBacillus thuringiensis培養液の上清において認められている。その分子量は７８９であり、アデノシン、グルコースおよびアラル酸（allaric acid）を有する
0004150071.tif 000004
その宿主には、Musca domestica、Mamestra configurata Walker、Tetranychus urticae、DrosophilamelanogasterおよびTetranychus cinnabarinusなどがあるが、それらに限定されるものではない。β−エキソトキシンの毒性は、ＡＴＰとの競合によるＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼの阻害によるものであると考えられる。β−エキソトキシンは５種類のBacillus thuringiensis（B.t.）株におけるCryプラスミドによってコードされ、β−エキソトキシンをＩ型もしくはＩＩ型β−エキソトキシンに分類することができることが明らかになっている（Levinson et al., 1990, J.Bacteriol. 172:3172-3179）。β−エキソトキシンＩ型は、B.t.亜種thuringiensis血清型１、B.t.亜種tolworthi血清型９およびB.t.亜種darmstadiensis血清型１０によって産生されることが認められている。β−エキソトキシンＩＩ型はB.t.亜種morrisoni血清型８ａｂによって産生されることが認められ、Leptinotarsa decemlineata（コロラドハムシ）に対して活性である。B.t.から単離されている他の水溶性物質には、Muscadomesticaの幼虫に対して毒性を有するアルファ・エキソトキシン
0004150071.tif 000005
レシチナーゼ類、キチナーゼ類およびプロテアーゼ類などの各種蛋白分解性酵素であって、ベータ・エキソトキシンもしくはデルタ・エキソトキシンとの併用でのみ発現される毒性効果を有するガンマ・エキソトキシン（Forsberg et al., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena）；ベータ・エキソトキシンと類似の構造を有し、やはりLeptinotarsa decemlineataに対して活性であるシグマ・エキソトキシン（Argauer et al., 1991, J.Entomol.Sci.26:206-213）；ならびにアンヒドロチューリンギエンシン（anhydrothuringiensin）（Coll.Czechoslovak Chem.Comm.40, 1775, 1975）などがある。
ＷＯ９４／０９６３０には、Bacillus thuringiensis亜種kurstakiおよびBacillus thuringiensis亜種aizawaiの活性を高める水溶性物質が開示されている。
ストナルドら（Stonard et al., 1994,Natural and Engineered Pest Management Agents, Paul A.Mann, Robert M.Hollingworth, eds., ACS, Washington, D.C., pp.25-36）は、下記構造を有するジアブロチシン類（diabroticin）を開示している。
0004150071.tif 000006
ジアブロチシン類は枯草菌から単離され、Diabroticaundecimpunctata、Leptinotarsa decemlimeata、Anthomusgrandis Boheman、蚊幼虫、Staphylococcus aureusおよびMicrococcus luteaに対して活性を有するが、アワノメイガ、大腸菌、枯草菌およびPseudomonas aeruginosaに対して活性を持たない。他の病害生物に対する活性は、ストナルドら（Stonard et al.）には開示されていない。ジアブロチシンAも、セレウス菌の発酵肉汁から単離されている。
当業界では、B.t.製剤の致死率を上昇させるための努力が行われてきた。その手段としては、高い致死率を有する新たな菌株の研究、既存の菌株の操作ならびにB.t.の胞子および／または結晶と新規な農薬用担体もしくは化学農薬との併用によるさより有効な製剤の設計などがあった。
そこで本発明の一つの目的は、既知B.t.製剤の殺虫活性を向上させることにある。
さらに本発明の目的は、農薬の農薬活性を高め、しかも既知農薬製品の新規な用途を見いだすことにもある。
Bacillus thuringiensisの新たな菌株を単離して新規物質を製造することで、所定の病害昆虫に関してより広いスペクトルの生物農薬を存在させることは有利である。
発明の概要
本発明は、Bacillus thuringiensis株の実質的に全ての農薬活性が該菌株の発酵上清にある新規Bacillus thuringiensis株に関するものである。本発明のBacillus thuringiensis株の発酵から得られる結晶蛋白質および胞子は農薬活性を持たない。具体的な実施態様において該菌株は、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９０の識別特性を有するＥＭＣＣ−００７７もしくはＥＭＣＣ−００７７と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９１の識別特性を有するＥＭＣＣ−００７８もしくはＥＭＣＣ−００７８と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９２の識別特性を有するＥＭＣＣ−００７９もしくはＥＭＣＣ−００７９と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９３の識別特性を有するＥＭＣＣ−００８０もしくはＥＭＣＣ−００８０と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株；ならびにＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９４の識別特性を有するＥＭＣＣ−００８１もしくはＥＭＣＣ−００８１と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株からなる群から選択される。
鞘翅目の病害昆虫に対する農薬活性を有し、例えば病害生物に対する別のバチルス関連農薬とともに強化剤もしくは相乗剤として共働する物質は、前記菌株の発酵上清から得られる。好ましい実施態様において該物質は、Leptinotarsa texanaに対して、総材料１ｇ当たり有効成分１２６μｇというＬＣ50（ＬＣ50は、病害生物の５０％を殺すのに必要な所定の農薬物質の濃度である）を有する。該菌株発酵のペレットのＬＣ50は、バイオアッセイによるアッセイ値として、総材料１ｇ当たり有効成分約３０００μｇ超である。
別の実施態様において該物質は、鞘翅目の病害昆虫に対する農薬活性を有する。非常に具体的な実施態様において該物質は、Diabrotica undecimpunctata種、Leptinotarsa texana種、Anthomus grandia種の病害昆虫に対する農薬活性、ならびに驚くべきことに鞘翅目のIps calligraphus種、Popilliajaponicus種、Epilachna varivastis種、Leptinotarsadecemlineata種およびDendroctonus frontalis種という病害昆虫に対する活性をも有する。
ある具体的実施態様において該物質は、Bacillus thuringiensis結晶デルタ・エンドトキシンの病害昆虫に対する殺虫活性を高める。ある具体的実施態様において該物質は、Bacillus thuringiensis亜種tenebrionis結晶デルタ・エンドトキシンの鞘翅目病害昆虫に対する殺虫活性を高める。
本明細書での定義では「バチルス関連農薬」とは、バチルス（例えば、Bacillus thuringiensisまたはBacillus subtilis）菌株もしくは胞子である。バチルス関連農薬にはさらに、病害生物に対する活性を有するかもしくは病害生物を殺す蛋白質もしくは蛋白質断片などのバチルス由来の物質；摂食抑制物質などの植物保護を行う物質；あるいは病害生物に対する活性を有するかもしくは病害生物を殺すバチルス蛋白質もしくは該蛋白質断片（例：Bacillus thuringiensisデルタ・エンドトキシン）をコードするバチルス遺伝子を発現することができる微生物と許容される担体（組成物に関しては次のセクションを参照）があり得る。病害生物には例えば、昆虫、線虫、ダニまたはマキガイなどがあり得る。葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根を取り巻く土壌）および／または水系環境に棲む病害生物に対する活性を有するかもしくは該病害生物を殺すバチルス蛋白質もしくは該蛋白質の断片をコードするバチルス遺伝子を発現することができる微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫の生育地）で野生型微生物と良好に競合することができ、病害生物に対する活性を有するかもしくは該病害生物を殺すバチルス蛋白質もしくは該蛋白質の断片をコードするバチルス遺伝子を安定に維持および発現する上での準備を行うものである。そのような微生物の例としては、バチルス属、シュードモナス属、エルウイニア属、セラチア属、クレブシェラ属、ザントモナス属、ストレプトミセス属、根粒菌属、ロドソイドモナス属、Methylophilius属、アグロバクテリウム属、酢酸菌属、乳酸桿菌属、アルスロバクター属、アゾトバクター属、リューコノストック属、アルカリゲネス属、クロストリジウム属などの細菌；ランソウ類、Prochlorophyceae類、紅藻類、うずべん毛藻類、黄色鞭毛藻類、Prymnesiophyceae類、Xanthophyceae類、Raphidophyceae類、珪藻類、Eustigmatophyceae類、褐色鞭毛藻類、ミドリムシ類、プラシノ藻類および緑ソウ類などのソウ類；酵母菌属、クリプトコックス属、Kluyveromyces属、Sporobolomyces属、ロドトルラ属およびAureobasidium属などの真菌類特には酵母などがあるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において「農薬活性」とは、病害生物を殺すかもしくは病害生物の成長の抑制すること、あるいは病害生物侵襲から植物を保護することによる病害生物に対する活性の量を評価するものである。
本発明はさらに、該物質およびバチルス関連農薬を含有する農薬組成物ならびに該農薬組成物を用いて病害生物を抑制する方法に関するものである。
本発明はさらに、以下の段階を有してなる本発明の「実質的に純粋な」物質を取得する方法に関するものでもある。
（ａ）好適な成長培地でのBacillus thuringiensis株の培養、
（ｂ）（ａ）の上清の回収、および
（ｃ）段階（ｂ）の上清に対するカラムクロマトグラフィーによる該物質の精製。
本明細書において「実質的に純粋な」物質とは、例えばデルタ・エンドトキシン蛋白質などの汚染物含有率が５％未満である物質を意味する。
【図面の簡単な説明】
本発明のこれらおよびその他の特徴、態様および利点については、以下の説明、添付の請求の範囲および添付図面との関係でより良く理解されることになろう。
図１は、構造Ｉを得るための合成図式を示す図である。
図２はLeptinotarsa decemlineataに対するＩａ／ＩｂおよびNOVODOR（商標）の相乗効果の効力を示す図である。
発明の詳細な説明
当該物質の取得
当該物質は、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９０の識別特性を有するB.t.菌株ＥＭＣＣ−００７７もしくはＥＭＣＣ−００７７と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株、ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９１の識別特性を有するＥＭＣＣ−００７８もしくはＥＭＣＣ−００７８と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株；ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９２の識別特性を有するＥＭＣＣ−００７９もしくはＥＭＣＣ−００７９と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株；ＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９３の識別特性を有するＥＭＣＣ−００８０もしくはＥＭＣＣ−００８０と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株；ならびにＮＲＲＬ  Ｂ−２１０９４の識別特性を有するＥＭＣＣ−００８１もしくはＥＭＣＣ−００８１と実質的に同一性質を有するそれの突然変異株などのBacillus thuringiensis発酵上清から得ることができる。
該物質は鞘翅目の病害昆虫に対する農薬活性を有し、例えばバチルス関連農薬とともに強化剤もしくは相乗剤として共働する。ある具体的実施態様において該物質は、下記式（Ｉ）を有する。
0004150071.tif 000007
式中、
Ｒ1はアミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステル、ハロゲン、Ｃ1〜5アルコキシまたはアラニル，バリニル，ロイシニル，イソロイシニル，フェニルアラニル，グリシニルおよびフェニルグリシニルなど（これらに限定されるものではない）のアミノ酸であり、
Ｒ2はアミノもしくはＣ1〜10アルキルであり、
Ｒ3は水素、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステル、ハロゲン、Ｃ1〜5アルコキシ、メチルアミン、ジメチルアミン、チオニル、メチルチオニル、シアノまたはリン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩および硝酸塩など（これらに限定されるものではない）のそれらの塩であり、
Ｒ4は水素、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステル、ハロゲン、Ｃ1〜5アルコキシまたはリン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩および硝酸塩など（これらに限定されるものではない）のそれらの塩であり、
Ｒ5は水素、メトキシ、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステル、ハロゲンまたはＣ1〜5アルコキシであり、
Ｒ6は水素、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、アルキル、エステル、ハロゲンまたはＣ1〜5アルコキシであり、
Ｒ7は水素、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステル、ハロゲン、Ｃ1〜5アルコキシまたはリン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩および硝酸塩など（これらに限定されるものではない）のそれらの塩であり、
Ｒ8は水素、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステル、ハロゲン、Ｃ1〜5アルコキシ、メチルアミン、ジメチルアミン、チオニル、メチルチオニル、シアノまたはリン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩および硝酸塩など（これらに限定されるものではない）のそれらの塩であり、
Ｒ9はアミノもしくはＣ1〜10アルキルであり、
Ｒ10はアミノ、ヒドロキシ、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステル、ハロゲン、Ｃ1〜5アルコキシまたはアラニル，バリニル，ロイシニル，イソロイシニル，フェニルアラニル，グリシニルおよびフェニルグリシニルなど（これらに限定されるものではない）のアミノ酸である。
ピラジン窒素は、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ1〜10アルキルエステル、アリール（例：ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ハロベンゾイル）エステルまたは酸素によって置換されていても良い。
本発明が構造Ｉの化合物の各立体異性体ならびにラセミ体をも含むことは理解しておくべき点である。
ほとんどの具体的実施態様において該物質は、構造Ｉａ（以下、「Ｉａ」と称する）もしくはＩｂ（以下、「Ｉｂ」と称する）を有する。
0004150071.tif 000008
Bacillus thuringiensisは、当業界で公知の培地および発酵法を用いて培養することができる（例えば、Rogoff et al., 1969, J.Invertebrate Path. 14:122-129; Dulmage et al., 1971, J.Invertebrate Path. 18:353-358; Dulmage et al., Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D.Burges, ed., Academic Press, N.Y., 1980）。発酵サイクル終了時に、B.t.胞子および結晶を、例えば遠心および／または限外濾過などの当業界で公知の手段によって発酵ブロスから分離することによって回収することができる。該物質は、限外濾過、溶媒留去およびスプレー乾燥などの当業界で公知の手段によって回収できる上清中に含まれる。
別法として、本発明の物質は、当業界で公知の手順を用いて化学合成によって得ることができる。
構造Ｉを得るため、適切な置換基および保護基を有する簡単なピラジン環を、α−アミノカルボニル化合物の自己縮合などの多くの反応によって形成することができる。ジヒドロピラジン中間体が生成するが、それは容易に酸素による酸化を受けてピラジンとなる。この方法による１個のα−アミノカルボニル化合物の二量化によって１個のピラジンが生じることになり、２個の異なるα−アミノカルボニル化合物による反応によって３つの生成物が得られると考えられる。当該物質は、クロマトグラフィー分離によって単離されることになると考えられる（図１参照）。後者の反応によって、環の各側に異なる置換基を有するピラジン類を合成することができる。
該物質の精製は、クロマトグラフィー（例：イオン交換、アフィニティー、立体排除クロマトグラフィー）、電気泳動法、溶解度差、抽出その他の当業界で標準的な方法（例えば、Protein Purification, eds. J-C.Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989参照）など（これらに限定されるものではない）の当業界で公知の各種方法によって実施することができる。
当該物質の活性は、人工飼料取り込み、人工飼料オーバーレイ、葉塗布、葉浸漬および葉面散布などの当業界で公知の方法によってバイオアッセイすることができる。そのようなバイオアッセイの具体例は、後述の実施例セクションに挙げてある。
当該物質を含む組成物
当該物質は、単独であるいは上述の定義のように病害生物に対する活性を有するかもしくは病害生物を殺すバチルスの菌株、胞子、蛋白質もしくは蛋白質断片であるバチルス関連農薬および適宜に許容される担体との併用で製剤して、例えば懸濁液、液剤、乳濁液、粉剤、分散粒剤、水和剤、乳剤、エアロゾルまたは含浸粒剤などの農薬組成物とすることができる。そのようなバチルス株の例としては、Bacillus thuringiensis亜種kurstaki（Abbott Laboratories, Inc.からDIPEL（登録商標）として、SandozからJAVELIN（登録商標）として、Novo Nordisk A/SからBIOBIT（登録商標）として、Novo Nordisk A/SからFORAY（登録商標）として、MycogenからMVP（登録商標）として、Novo Nordisk A/SからBACTOSPEINE（登録商標）として、SandozからTHURICIDE（登録商標）として販売）；Bacillus thuringiensis亜種aizawai（Novo Nordisk A/SからFLORBAC（登録商標）として、Abbott Laboratories, Inc.からXENTARI（登録商標）として販売）；Bacillus thuringiensis亜種tenebrionis（Novo Nordisk A/SからNOVODOR（登録商標）として、SandozからTRIDENT（登録商標）として、MycogenからM-TRAK（登録商標）およびM-ONE（登録商標）として販売）；Bacillus thuringiensis亜種israelensis（Novo Nordisk A/SからBACTIMOS（登録商標）もしくはSKEETAL（登録商標）のいずれかとして、SandozからTEKNAR（登録商標）として、Abbott Laboratories, Inc.からVECTOBAC（登録商標）として販売）；Bacillus sphaericus（Novo Nordisk A/SからSPHERIMOS（登録商標）として販売）；Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis（EcogenからFOIL（登録商標）として販売）；Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai（EcogenからCONDOR（登録商標）として、Ciba-GeigyからＡＧＲＥＥ（登録商標）として販売）；ならびにBacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki（EcogenからCUTLASS（登録商標）として販売）などがあるが、これらに限定されるものではない。バチルス関係蛋白質は、CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryVおよびCryVIを含む（これらに限定されるわけではない）群から選択することができる。
該物質は、本願に引用によって組み入れた１９９３年７月２０日出願の出願番号０８／０９５２４０号に開示の外毒素および／または促進因子など（これらに限定されるものではないが）のバチルス上清から得られる他の因子もしくは物質とともに製剤することもできる。該製剤には適宜に、バチルス関連農薬、化学農薬および／または農薬的性質を有するウィルスと、許容される担体を含有させることができる。
ある具体的実施態様におい該組成物の成分は、相乗的な形で作用し得る。その結果該組成物は、各個別の成分で得ることができるものより高い効果を持つことができる。相乗効果はさらに、各個別の成分について必要と考えられるより低用量および／または低頻度施用で同等もしくはより大きい効力が得られることで明らかになる場合もある。別法として、該物質はバチルス関連農薬の効果を高める作用を行うことができる。
該物質およびバチルス関連農薬を含む組成物では該物質はＬＴＵ当たり約０．００１〜約３００ｇの量で存在する。本明細書での定義では「ＬＴＵ」とは、バイオアッセイによって測定されるLeptonotarsa texana単位である。バイオアッセイは、Leptinotarsa texana又はその他の病害生物を標準被験生物として用いて、標準的バチルス基準材料に対してサンプルを比較するものである。効力は、基準標準ＬＣ50値を割り、次に基準標準効力を掛けることによって求められる。
別の実施態様において該組成物は、実質的に純粋な形での該物質または乾燥、濃縮もしくは液体の形態でのバチルスからの上清と好適な農薬担体（この例は以下に開示する）とを含有することができる。この組成物は、植物（例：トランスジェニック植物）に対して別個に施用することができる。具体的には、予めBacillus thuringiensis遺伝子を含ませた植物に組成物を施用することができる。別の実施態様では、予めBacillus thuringiensis組成物に曝露した植物に対して組成物を施用することができる。該物質は組成物中に、約０．００１％〜約６０％（重量基準）の濃度で存在する。
上記で開示されたような組成物は、界面活性剤、不活性担体、保存剤、湿潤剤、摂取刺激剤、誘引剤、包埋剤、結合剤、乳化剤、染料、紫外線保護剤、緩衝剤、流動剤、その他の製品取扱いおよび特定の標的病害虫への施用を容易にするための成分を加えることによって得ることができる。
好適な界面活性剤には、長鎖脂肪酸の金属カルボン酸塩などのカルボン酸化合物；Ｎ−アシルサルコシン化合物；リン酸の脂肪族アルコールエトキシレートとのモノもしくはジエステルまたはそのようなエステルの塩；ドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムもしくはセチル硫酸ナトリウムなどの脂肪族アルコール硫酸塩；エトキシ化脂肪族アルコール硫酸塩；エトキシ化アルキルフェノール硫酸塩；リグニンスルホン酸塩；石油スルホン酸塩；アルキルベンゼンスルホン酸塩などのアルキルアリールスルホン酸塩またはブチルナフタレンスルホン酸塩などの低級アルキルナフタレンスルホン酸塩；スルホン化ナフタレン−ホルムアルデヒド縮合物の塩；スルホン化フェノール−ホルムアルデヒド縮合物の塩；あるいはオレイン酸とＮ−メチルタウリンのスルホン化縮合生成物などのアミドスルホネートまたはスルホン酸ナトリウムもしくはコハク酸ジオクチルなどのスルホコハク酸ジアルキルのようなより複雑なスルホン酸化合物などのアニオン系化合物などがあるが、これらに限定されるものではない。非イオン系界面活性剤には、脂肪族エステル、脂肪族アルコール、脂肪酸アミドまたは脂肪族アルキルもしくはアルケニル置換フェノールとエチレンオキサイドとの縮合生成物、ソルビタン脂肪酸エステルなどのポリヒドロキシアルコールエーテルの脂肪酸エステル、ポリプロピレンソルビトール脂肪酸エステルなどのエステルとエチレンオキサイドとの縮合生成物、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのブロック共重合体、２，４，７，９−テトラエチル−５−デシン−４，７−ジオールなどのアセチレングリコール類、あるいはエトキシ化アセチレングリコール類などがあるが、これらに限定されるものではない。カチオン系界面活性剤の例としては、例えば酢酸塩、ナフタレン酸塩またはオレイン酸塩としての脂肪族モノ、ジもしくはポリアミン；ポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキサイドなどの酸素含有アミン；カルボン酸とジもしくはポリアミンとの縮合によって製造されるアミド結合アミン；あるいは４級アンモニウム塩などがあるが、これらに限定されるものではない。
不活性材料の例としては、カオリン、雲母、石膏、肥料、フィロケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩もしくはリン酸塩などの無機物；糖、デンプンもしくはシクロデキストリンなどの有機物；あるいは木材製品、コルク、粉末状トウモロコシ穂軸、もみ殻、落花生殻およびクルミ殻などの植物材料などがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物は、直接施用に好適な形態としたり、あるいは施用に先だって好適な量の水その他の希釈剤による希釈を必要とする濃縮液もしくは原組成物であることができる。農薬の濃度は特定製剤の性質によって変わり、具体的にはそれが濃縮液であるか直接使用されるかによって変わる。組成物は、１〜９８重量％の固体もしくは液体の不活性担体と０〜５０％、好ましくは０．１〜５０％の界面活性剤を含有する。これらの組成物は、市販製品についてラベル表示された量で施用され、好ましくは乾燥品の場合にはエーカー当たり約０．０１〜５．０ポンド、液体の場合はエーカー当たり約０．０１〜２５パイントである。
さらに別の実施態様においては、前処理がバチルス関連の農薬もしくは物質に対して有害でない限りにおいて、バチルス関係の農薬および／または物質を製剤前に処理して、標的病害生物の環境に施用した場合の農薬活性を長続きさせることができる。そのような処理は、その処理が組成物の性質に悪影響を与えない限りにおいて化学的および／または物理的手段によって行うことができる。化学試薬の例としては、ハロゲン化剤；ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド；塩化ベンザルコニウム（zephiran chloride）などの抗感染症薬；イソプロパノールおよびエタノールなどのアルコール；ブアン固定液およびヘリー固定液などの組織固定液（例えば、Humason, Animal Tissue Techniques, W.H.Freeman and Co., 1967参照）などがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物は、病害生物が植物上に出現し始めた時点もしくは予防的手段として病害生物が出現する前に、例えば散布もしくは散粉することによって植物に直接施用することができる。本発明の範囲内で保護されるべき植物には、穀類（小麦、大麦、ライ麦、カラスムギ、稲、モロコシおよび関連作物）、ビート類（砂糖大根および飼料ビート）、石果類、仁果類および軟果実（リンゴ、ナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリおよびキイチゴ）、マメ科植物（アルファルファ、豆、レンズマメ、エンドウマメ、大豆）、油料植物（西洋あぶらな、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、トウゴマ、カカオ豆、落花生）、キュウリ科植物（キュウリ、ペポカボチャ、メロン）、線維植物（棉、亜麻、大麻、ジュート）、柑橘類（オレンジ、レモン、グレープブルーツ、マンダリン）、野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツおよびその他のアブラナ科、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ）、クスノキ科（アボガド、シナモン、樟脳）、落葉樹および針葉樹（例：菩提樹、イチイの木、オークの木、ハンノキ、ポプラ、かばの木、もみの木、カラマツ、マツ）、あるいはトウモロコシ、芝、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ぶどうの木、ホップ、バナナおよび天然ゴムの木ならびに装飾植物などの植物などがあるが、これらに限定されるものではない。当該物質は、葉面散布、うね間散布、広範囲の散粒、「レイバイ」施用または土壌潅注施用によって施用することができる。植物成長の初期段階は植物が最もひどい損害を受け得る時期であることから、その段階で病害生物の良好な抑制を行うことが重要である。散布液または粉剤は状況に応じて、必要と考えられる場合は別の農薬を含有することができる。好ましい実施態様において本発明の組成物は、植物に直接施用される。
本発明の組成物は、Leptinotarsa種（例：Leptinotarsa texana、Leptinotarsa decemlineata）、Diabrotica undecimpunctata、Dendroctonus frontalis、Anthonomus grandis、Acanthoscelidesobtectus、Callosobruchus chinensis、Epilachna varivestis、Pyrrhalta luteola、Cylas formicarius elegantulus、Listronotus oregonensis、Sitophilus種、Cyclocephalaborealis、Cyclocephala immaculata、Macrodactylussubspinosus、Popillia japonica、Rhizotrogus majalis、Alphitoblus diaperinus、Palorus ratzeburgi、Tenebriomolitor、Tenebrio obscurus、Tribolium castaneum、Triboliumconfusum、Tribolius destructorなどの鞘翅目害虫に対して有効であり得る。本発明の組成物はさらに、Achroia grisella、Acleris gloverana、Acleris variana、Adoxophyes orana、Agrotis ipsilon、Alabama argillacea、Alsophila pometaria、Amyelois transitella、Anagasta kuehniella、Anarsialineatella、Anisota senatoria、Antheraea pernyi、Anticarsia gemmatalis、Archips種、Argyrotaenia種、Athetis mindara、Bombyx mori、Bucculatrix thurberiella、Cadra cautella、Choristoneura種、Cochylls hospes、Colias eurytheme、Corcyracephalonica、Cydia latiferreanus、Cydia pomonella、Datanaintegerrima、Dendrolimus sibericus、Desmia funeralis、Diaphania hyalinata、Diaphania nitidalis、Diatraeagrandiosella、Diatraea saccharalis、Ennomos subsignaria、Eoreuma loftini、Ephestia elutella、Erannis tilaria、Estigmene acrea、Eulia salubricola、Eupocoellia ambiguella、Eupoecilia ambiguella、Euproctis chrysorrhoea、Euxoamessoria、Galleria mellonella、Grapholita molesta、Harrisinaamericana、Helicoverpa subflexa、Helicoverpa zea、Heliothisvirescens、Hemileuca oliviae、Homoeosoma electellum、Hyphantria cunea、Keiferia lycopersicella、Lambdinafiscellaria fiscellaria、Lambdina fiscellaria lugubrosa、Leucoma salicis、Lobesia botrana、Loxostege sticticalis、Lymantria dispar、Macalla thyrsisalis、Malacosoma種、Mamestra brassicae、Mamestra configurata、Manducaquinquemaculata、Manduca sexta、Maruca testulalis、Melanchrapicta、Operophtera brumata、Orgyia種、Ostrinia nubilalis、Paleacrita vernata、Papilio cresphontes、Pectinophoragossypiella、Phryganidia californica、Phyllonorycterblancardella、Pieris napi、Pieris rapae、Plathypena scabra、Platynota flouendana、Platynota stultana、Platyptiliacarduidactyla、Plodia interpunctella、Plutella xylostella、Pontia protodice、Pseudaletia unipuncta、Pseudoplasiaincludens、Sabulodes aegrotata、Schizura concinna、Sitotrogacerealella、Spilonota ocellana、Spodoptera種、Thaurnstopoeapityocampa、Tineola bisselliella、Trichoplusia ni、Udearubigalis、Xylomyges curialis、Yponomeuta padellaなどの鱗翅目；Aedes種、Andes vittatus、Anastrepha ludens、Anastrepha suspensa、Anopheles barberi、Anophelesquadrimaculatus、Armigeres subalbatus、Calliphora stygia、Calliphora vicina、Ceratitis capitata、Chironomus tentans、Chrysomya rufifacies、Cochliomyia macellaria、Culex種、Culiseta inornata、Dacus oleae、Delia antigua、Delia platura、Delia radicum、Drosophila melanogaster、Eupeodes corollae、Glossina austeni、Glossina brevipalpis、Glossina fuscipes、Glossina morsitans centralis、Glossina moristans morsitans、Glossina moristans submorsitans、Glossina pallidipes、Glossina palpalis gambiensis、Glossina palpalis palpalis、Glossina tachinoides、Haemagogus equinus、Haematobiusirritans、Hypoderma bovis、Hydoderma lineatum、Leucopisninae、Lucilia cuprina、Lucilia sericata、Lutzomyialonglpaipis、Lutzomyia shannoni、Lycoriella mali、Mayetioladestructor、Musca autumnalis、Musca domestica、Neobellieria種、Nephrotoma suturalis、Ophyra aenescens Phaeniciasericata、Phlebotomus種、Phormia regina、Sabethes cyaneus、Sarcophaga bullata、Scatophaga stercoraria、Stomaxyscalcitrans、Toxorhynchites amboinensis、Tripteroidesbambusaなどの双翅目；Oligonychus pratensis、Panonychusulmi、Tetranychus urticaeなどのマダニ；Iridomyrmex humilis、Solenopsis invictaなどの膜翅目；Reticulitermes hesperus���Reticulitermes flavipes、Coptotermes formosanus、Zootermopsis augusticollis、Neotermes connexus、Incisitermes minor、Incisitermes immigransなどの等翅類；Ceratophyllus gallinae、Ceratophyllus niger、Nosopsyllusfasciatus、Leptopsylla segnis、Ctenocephalides canis、Ctenocephalldes felis、Echicnophaga gallinacea、Pulexirritans、Xenopsylla cheopis、Xenopsylla vexabilis、Tungapenetransなどのノミ類；Melodidogyne incognita、Pratylenchus penetransなどのハリセンチュウ類に対しても有効であり得るが、これらに限定されるものではない。
以下に説明を目的として実施例を示すが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例
実施例１：各種B.T.単離物の培養
栄養肉汁寒天斜面培地に維持したＥＭＣＣ−００７７、ＥＭＣＣ−００７８、ＥＭＣＣ−００７９、ＥＭＣＣ−００８０およびＥＭＣＣ−００８１の継代培養液を用いて、以下の組成を有する培地５０ｍＬが入った２５０ｍＬバッフル付き振盪フラスコに接種を行う。
コーンスティープリカー                １５ｇ／Ｌ
マルトリン−１００（Maltrin-100）     ４０ｇ／Ｌ
ジャガイモでんぷん                    ３０ｇ／Ｌ
ＫＨ2ＰＯ4                            １．７７ｇ／Ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                            ４．５３ｇ／Ｌ
培地のｐＨは、１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて７．０に調節する。接種後、振盪フラスコを回転式振盪器で２５０ｒｐｍにて７２時間、３０℃でインキュベーションする。全培養ブロスを用いて、Diabrotica undecimpunctataに対する試験を行う。
実施例２：各種B.t.単離物からの全培養ブロスにおけるDiabrotica undecimpunctata活性
上記発酵から得られる全培養ブロス２．５ｍＬを取り、振盪フラスコから５０ｍＬのポリプロピレン製バイオアッセイ管に移す。Diabrotica undecimpunctata飼料を各管に加え、最終容量を２５ｍＬとする。次に、飼料および試験材料を激しく混和し、バイオアッセイ用にバイオアッセイトレー中に分散させる。Diabrotica undecimpunctataの卵３〜６個を「飼料」表面に乗せる。バイオアッセイトレー上にマイラーテープをアイロンで貼り付け、トレーを光周期を設けずに２８℃でインキュベーションする。７日目に評点を行う。インキュベーション後７日目に死亡率を評点する。ＳＳ７は、ＳＳ７と同日に生存対照幼虫を４とし、それと比較した場合の第７日目の死亡幼虫の大きさである。ＳＳ７＝３、ＳＳ７＝２およびＳＳ７＝１はそれぞれ、幼虫の大きさが、４である生存対照幼虫の７５％、５０％および２５％であることを表す。
結果を以下の表１に示してある。これらの結果は、調べた５株全てにおいて、死亡率は１００％であることを示している。さらに、死亡幼虫は生存対照幼虫の大きさの１２．５％であった。
0004150071.tif 000009
実施例３：Diabrotica undecimpunctata活性の局在
Diabrotica undecimpunctata活性がデルタ・エンドトキシン／胞子と関連するものであるか又は上清と関連するものであるかを調べるため、ＥＭＣＣ−００７７、ＥＭＣＣ−００８０、ＥＭＣＣ−００８１およびＮＢ１２５（同一条件下で成長させたBacillus thuringiensis亜種tenebrionis）からの全培養ブロス２．５ｍＬを遠心機（Sorvall RC-5B遠心機）中、１５０００ｒｐｍ（Sorvall SS34ローター）にて１５分間遠心して、上清とペレットを分離する。結晶デルタ・エンドトキシンおよび胞子がペレットに回収される。Diabrotica undecimpunctata活性B.t.単離物EMCC-0077によって産生されるデルタ・エンドトキシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、６６ｋＤ、２９ｋＤおよび１２ｋＤの分子量を持つ。Diabrotica undecimpunctata活性B.t.単離物EMCC-0078によって産生されるデルタ・エンドトキシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、１５３ｋＤ、７７ｋＤ、６７ｋＤ、６１ｋＤ、５０ｋＤ、４２ｋＤ、３４ｋＤ、３０ｋＤおよび２４ｋＤの分子量を持つ。Diabrotica undecimpunctata活性B.t.単離物EMCC-0079によって産生されるデルタ・エンドトキシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、１３５〜１４５ｋＤの分子量を有する。Diabrotica undecimpunctata活性B.t.単離物EMCC-0080によって産生されるデルタ・エンドトキシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、９４ｋＤおよび４０ｋＤの分子量を有する。Diabrotica undecimpunctata活性B.t.単離物EMCC-0081によって産生されるデルタ・エンドトキシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、１２９ｋＤおよび３２ｋＤの分子量を有する。
上記遠心から得られる各上清（２．５ｍＬ）を５０ｍＬポリプロピレン製バイオアッセイ管に移し入れる。次にペレットを無菌蒸留水２．５ｍＬ中に再懸濁し、別の５０ｍＬポリプロピレン製バイオアッセイ管に写し入れる。次にDiabrotica undecimpunctata飼料を、上清もしくは再懸濁ペレットを含むバイオアッセイ管に加えて、最終容量を２５ｍＬとする。以後のバイオアッセイ段階は、前述のものと同様である。評点も前述と同様である。
表２に示した結果から、ＥＭＣＣ−００７７、ＥＭＣＣ−００８０およびＥＭＣＣ−００８１からのDiabrotica undecimpunctata活性はいずれの上清にもあるが、公知のBacillus thuringiensis亜種tenebrionisからのわずかなDiabrotica undecimpunctata活性はペレットに濃縮される（胞子および結晶）ことが明らかである。
0004150071.tif 000010
実施例４：Leptinotarsa texanaに対する活性
０．２μ膜による濾過の後、実施例１から得られたＥＭＣＣ−００８０の上清を用いて甲虫活性のアッセイを行う。
濾過上清を容量２０ＧＰＡ（エーカー当たりガロン数）でナスノキ茎葉に施用する。希釈度は０、１；１、１：４、１：８である（上清：脱イオン水、容量基準）。
標準法に従って、Leptinotarsa texana幼虫を処理茎葉に曝露する。各植物にLeptinotarsa texana幼虫２０匹を負荷する。
以下の表３に表としてまとめた結果から、EMCC-0080の濾過上清がLeptinotarsa texanaに対して活性であることが明らかである。
0004150071.tif 000011
実施例５：EMCC-0080とNOVODOR（商標）との相乗効果
上記の表３に示した結果は、EMCC-0080の上清が1:8希釈（容量基準）のみで活性を持たないことを示している。しかしながら、ナスノキ茎葉を１０倍濃度のEMCC-0080上清１．２５％もしくは２．５％と１ｍＬ当たり２００μｇのNOVODOR（商標）（Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）との併用で処理すると、NOVODOR（商標）のＬＣ50およびＬＣ90の急峻な低下によって明らかな相乗効果が得られる。データを以下の表４に示してある。
0004150071.tif 000012
実施例６：B.t.菌株EMCC-0080によって産生される鞘翅目活性物質の精製
B.t.菌株EMCC-0080を、ｐＨ７．０で１リットル当たりグラム数で以下の組成を有する培地で、３０℃にて２４時間成長させる。
マルトデキストリン    40g
大豆蛋白質            40g
KH2PO4                1.8g
K2HPO4                4.5g
MgSO4-7H2O            0.3g
微量金属              0.2mL
遠心とそれに続く取得上清のセライトおよび０．２μ膜での濾過によって、B.t.菌株EMCC-0080の全培養ブロスから細胞および他の不溶物を除去する。得られた透過液を溶媒留去によって１０倍に濃縮する。
１０倍濃度透過液からの鞘翅目活性物質の精製を、４段階精製法を用いて行う。精製時に、以下に記載のDiabrotica undecimpunctata表面バイオアッセイによって活性をモニタリングし、実施例８に記載の方法に従ってキャピラリ電気泳動法によって純度を測定する。いずれのクロマトグラフィー段階でも波長２２６ｎｍでの検出を行う。
具体的には、表面バイオアッセイを以下のようにして行う。１ウェル当たり固体人工昆虫飼料２００μＬを入れたミクロタイタープレートの個々のウェルに、１０倍濃縮透過液サンプルを加え、風乾する。Diabrotica undecimpunctataの新生虫（ハムシモドキ幼虫、ＣＲＷ）２〜４匹を絵筆を用いて各ウェルに丁寧に入れる。次に、ミクロタイタープレートを、換気用の穴を開けたマイラーテープで封じ、３０℃および湿度８０％でインキュベーションする。死亡率パーセントについての評点を５日後に行う。
第１段階では、１０倍濃縮透過液を最初にカラムクロマトグラフィーで精製する（Pharmacia SP Sephadex（登録商標）C-25（カチオン交換）カラムクロマトグラフィー（５×３０ｃｍ））。１０倍濃縮透過液サンプル４５０ｍＬを脱イオン水で希釈して１８リットルとし、ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で予め平衡状態としておいたカラムに負荷する。カラムを毎分１８ｍＬで、ｐＨ５．０で２０ｍＭから０．５Ｍへの連続濃度勾配を有する酢酸アンモニウム緩衝液５．０リットルで溶離する。１０ｍＬずつの画分を集め、バイオアッセイし、純度を調べる。活性画分を蓄積し（約１５０ｍＬ）、凍結乾燥し、脱イオン水に再溶解して最初の容量の約１／５とする。
第２段階では、第１段階からのサンプル２５ｍＬを、脱イオン水で予め平衡としておいた立体排除カラム（５×１００ｃｍ）（BioRad P2（超微粒）立体排除カラム）に負荷する。カラムを脱イオン水で毎分１ｍＬの流量にて溶離する。１０ｍＬずつの画分を集め、バイオアッセイし、キャピラリ電気泳動法によって純度を調べる。活性画分を蓄積する（約４００ｍＬ）。
第３段階では、第２段階からの蓄積液４００ｍＬを脱イオン水で希釈して１６リットルとする。その溶液を、ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で予め平衡としておいたカラム（Pharmacia S Sepharose（登録商標）Fast Flow（強カチオン交換）カラム）に負荷する。カラムを毎分１７ｍＬで、ｐＨ５．０で２０ｍＭから０．５Ｍへの連続濃度勾配を有する酢酸アンモニウム緩衝液５．０リットルで溶離する。２０ｍＬずつの画分を集め、バイオアッセイし、純度を調べる。活性画分を蓄積し（約２５０ｍＬ）、凍結乾燥して、揮発性の酢酸アンモニウム緩衝液を除去する。
第４段階では、第３段階からの凍結乾燥蓄積物を脱イオン水４００ｍＬに溶かす。溶液をｐＨ４．０の２０ｍＭギ酸アンモニウムで予め平衡としておいたカラム（０．９×３０ｃｍ）（BioRad Chelex（登録商標）100カラム）に負荷する。ｐＨ４．０で０．０２→０．１→０．２→０．３５→０．５→１．０Ｍの段階的勾配を持つギ酸アンモニウム緩衝液２．４リットルで毎分５ｍＬの流量で溶離する。画分２０ｍＬずつを回収し、バイオアッセイし、純度を調べる。活性画分を蓄積し（約３００ｍＬ）、次に凍結乾燥して、揮発性のギ酸アンモニウム緩衝液を除去する。
キャピラリ電気泳動法は、精製した鞘翅目活性材料が２つの化合物ＩａおよびＩｂを含有することを示している。
実施例７：鞘翅目活性物質の構造解明
化合物ＩａとＩｂの構造を、それらのアセチル化誘導体（誘導体ＡおよびＢ）について収集したスペクトルデータから解明する。
ＩａおよびＩｂの混合物１１４ｍｇを、ピリジン５ｍＬ中無水酢酸５．０ｍＬおよび触媒としての４−ジメチルアミノピリジン結晶により、室温で２４時間かけてアセチル化し、セミ分取用ＲＰ−Ｃ18ＨＰＬＣによって精製する。サンプル５ｍｇの入った２５μＬ溶液をカラムに負荷し、水８０％−アセトニトリル２０％の溶液で毎分４ｍＬにて溶離する。検出は２５４ｎｍで行う。
誘導体Ａについて得られるＮＭＲスペクトルデータは、１４個の炭素と１７個のプロトンの存在を示している。しかしながら、質量スペクトルデータは分子量６５２と式Ｃ28Ｈ40Ｎ6Ｏ12（正確な質量６５３．２８０１、ＭＨ＋計算値６５３．２７８２）を示唆している。従って、この化合物は、信号の半分のみがＮＭＲで認められる対称構造を有するものと決定される。
いくつかのスピン系がＮＭＲによって認められる。２位および５位が置換された中央のピラジン環が、環の全ての炭素および側鎖の最初の炭素（Ｃ−７）に対して長い範囲のカップリングを示す８．６ｐｐｍの高磁場プロトンシングレット（Ｈ−３およびＨ−６）によって示される。炭素数３の側鎖は、７位と８位の両方でアセチル化され、９位にメチレンを有する。９位の炭素は、エステルのカルボニルと長い範囲の相互作用を持つことが認められ、そのエステルは、アミノ基がアセチル化されたアラニンの一部であることが決定された。
誘導体Ｂの構造が誘導体Ａのものと異なるのは１ヶ所のみである。誘導体Ｂの側鎖の一つにおいて、Ｃ−７炭素はアセチル化されておらず、酸素に結合もしていないが、メチレンであることが認められる。他方の側鎖は、誘導体Ａのものと同一である。このただ１個の酸素の相違は、質量スペクトルデータにも認められる。質量スペクトルデータは、誘導体Ｂについては正確な質量５９５．２７２２（ＭＨ＋、計算値５９５．２７２７）で得られ、式Ｃ26Ｈ38Ｎ6Ｏ10を示している。誘導体ＡおよびＢの光学密度は以下の通りである。誘導体Ａ［α］D27＝−６．９°および誘導体Ｂ［α］D27＝＋３２°。デカップリング実験、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣに基づいて、1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲデータの完全な割当が行われる。割当を表５に示してある。
0004150071.tif 000013
化合物ＩａおよびＩｂの混合物の質量スペクトルデータは、２つの分子イオン４００および３８４を与える。このデータから、化合物Ｉａの分子式がＣ16Ｈ28Ｎ6Ｏ6であり、化合物Ｉｂの分子式がＣ16Ｈ28Ｎ6Ｏ5であると決定される。ＩａおよびＩｂの構造は、ＩａとＩｂの混合物のＮＭＲデータと誘導体Ａおよび誘導体ＢのＮＭＲデータを比較することで決定される。ＩａとＩｂの構造を以下に示す。
0004150071.tif 000014
化合物ＩａおよびＩｂならびにそれらのアセチル化誘導体の性質を以下にまとめた。
誘導体Ａ：
分子量：      652
経験式：      C28H40N6O12
UV(MeOH)：    275, 310nm
MS(FAB)：     (M+H) m/z 653.2801、計算値653.2782
誘導体B：
分子量：      594
経験式：      C26H38N6O10
UV(MeOH)：    275, 310nm
MS(FAB)：     (M+H) m/z 595.2722、計算値595.2727
Ia：
分子量：      400
経験式：      C16H28N6O6
UV(H2O)：     275, 310nm
MS(FAB)：     (M+H) m/z 401
Ib：
分子量：      384
経験式：      C16H28N6O5
UV(H2O)：     275, 310nm
MS(FAB)：     (M+H) m/z 385
実施例８：発酵ブロス中の化合物ＩａおよびＩｂの定量
B.t.菌株EMCC-0080を、実施例１に記載の方法に従って成長させる。発酵ブロス中の化合物ＩａおよびＩｂの濃度を、キャピラリ電気泳動法によって測定する。
具体的には、コーティングされていないキャピラリ（５０μｍ×５０ｃｍ）を装着した電気泳動システム（BioRad Biofocus 3000キャピラリ電気泳動システム、ｐＨ２．５の０．１Ｍリン酸液、電圧２０ＫＶ、陽性から陰性への極性、２００ｎｍでの検出）を用いて定量を行う。サンプル容量は３０μＬで、５ｐｓｉ秒で注入する。分析時間は１０分間であり、鞘翅目活性化合物ＩａおよびＩｂについて溶離時間はそれぞれ６．０分および５．９分である。
別法として、コーティングされていないキャピラリ（５０μｍ×４７ｃｍ）を装着した電気泳動システム（Beckman P/ACE 2100キャピラリ電気泳動システム、ｐＨ２．５の０．１Ｍリン酸液、電圧２０ＫＶ、陽性から陰性への極性、２００ｎｍでの検出）を用いて定量を行う。サンプル容量は３０μＬで、１０秒圧で注入する。分析時間は１０分間であり、鞘翅目活性化合物ＩａおよびＩｂについて溶離時間はそれぞれ７．０分および６．７分である。
遠心とそれに続く取得上清のセライトおよび０．２μ膜での濾過によって、B.t.菌株EMCC-0080の全培養ブロスから細胞および他の不溶物を除去する。得られる上清を前述の方法に従って、キャピラリ電気泳動法によって分析する。得られた結果は、鞘翅目活性化合物ＩａおよびＩｂがそれぞれ培養ブロス１リットル当たり約９０ｍｇのレベルで存在することを示していた。
実施例９：化合物ＩａおよびＩｂの効力測定
化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物（重量基準で約１：１）の相対的効力を、試験昆虫としてLeptinotarsa texanaを用い、Bacillus thuringiensis亜種tenebrionisの内部標準製剤に関連する死亡率と比較することで求める。
葉面バイオアッセイを行って、Leptinotarsa texanaに対する化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物の効力を求める。葉面バイオアッセイを行うには、試験材料と標準を５０ｍＬ遠心管中に秤取し、０．１％Tween（登録商標）20を含む脱イオン水で懸濁させる。Bacillus thuringiensis亜種tenebrionis標準１２００ｍｇを秤取し、懸濁させて、最終濃度１２０００μｇ／ｇとする。施用量決定バイオアッセイによって、施用用量が高すぎるか低すぎるために十分な数の有効データ点が得られない場合を除き、試験サンプル（すなわち、NOVODOR（商標）ならびにNOVODOR（商標）と化合物ＩａおよびＩｂとの併用）を同様の方法で処理する。そのような事態が生じた場合は、原ストック液に加える希釈剤の量を変えることによってそのストック液の濃度を増減させる。次に、ビルティス（Virtis）ホモジナイザーを用いて各サンプルを３０秒間均質化し、ブラウンソニック（Braunsonic）１５１０超音波ホモジナイザーを用いて１００ワットで２０秒間超音波処理する。次に、これら各ストック液をハミルトン・マイクロラブ（Hamilton Microlab）１０００を用いて希釈して、総量１６ｍＬの３０００、２０００、１３３３、８５７、５４５、３６４および２４５μｇ／ｍＬからなる７つの連続希釈液を得る。これら各１６ｍＬ溶液を、エーカー当たり２０ガロンを散布するよう較正された散布機（Devries Linear Track散布機）を用いてナスノキ葉約２８８平方インチに施用する。対照葉には、脱イオン水１６ｍＬを散布する。葉は風乾し、５匹の第二齢Leptinotarsa texana幼虫の入った１オンスの透明プラスチックカップの縁部上に置く。次に、葉の上に厚紙のフタを乗せ、フタを押し込んで、４ｃｍの葉の円板を切り取り、それをカップ内で密閉するようにする。次にカップの上下を逆転させ、幼虫を葉の被処理表面上に落とす。７つの連続希釈液それぞれについて８個のカップを準備する。それらのカップはテープでひとまとめとし、ラベル表示し、ラックに置き、３０℃・相対湿度６５％で３日間インキュベーションする。これら５６個の実験カップと８個の対照カップで一つのバイオアッセイが構成される。
３日後、昆虫の死亡率を評価する。各カップを強く吹いて、動かなかった幼虫を死亡幼虫として数える。死亡率パーセントを計算し、データを並列プロビット解析によって解析する。ＬＣ50、ＬＣ90、回帰直線の勾配、変動係数および効力を推定する。
効力を求めるため、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物を希釈し、バイオアッセイし、２００００ＬＴＵ／ｇ（Leptinotarsa texana単位／グラム）という効力が割り当てられているBacillus thuringiensis亜種tenebrionis標準と比較する。
効力の結果を以下の表６に示すが、この結果は、化合物ＩａとＩｂの粗混合物（重量基準で１：１）が有効成分１ｇ当たり７５５５５ＬＴＵの効力を持ち、ＬＣ50が７０μｇ／ｍＬ（１ｍＬ当たり総有効成分１．８ｍｇ）であることを示している。
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実施例１０：化合物ＩａおよびＩｂと併用したBacillus thuringiensis亜種tenebrionis結晶デルタ・エンドトキシンの効力
化合物ＩａおよびＩｂがLeptinotarsa texanaに対するBacillus thuringiensis亜種tenebrionisからの結晶デルタ・エンドトキシンの殺虫活性を強化する能力を、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物をNOVODOR（商標）に加え、並列プロビット解析によってＬＣ50を測定することで求めた。
葉面バイオアッセイを実施例９に記載の方法に従ってLeptinotarsa texanaに対して行い、化合物ＩａおよびＩｂをNOVODOR（商標）に加えることで得られる強化のレベルを求める。化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物をNOVODOR（商標）に加える。ハミルトン・マイクロラブ１０００を用いて溶液を連続希釈して、濃度１０００．０、６６６．７、４４４．４、２８５．７、１８１．８、１２１．２および８０．０μｇ／ｇでNOVODOR（商標）を含むストック溶液を得る。ＩａおよびＩｂの混合物について２つの異なる希釈液を調製することで、７２．０、４８．０、３２．０、２０．６、１３．１、８．７および５．８μｇ／ｇ（１０００μｇ／ｇのNOVODOR（商標）で２．５容量％）ならびに３６．０、２４．０、１６．０、１０．３、６．５、４．４および２．９μｇ／ｇ（１０００μｇ／ｇのNOVODOR（商標）で１．２５容量％）を含む７つの連続希釈液とする。未希釈サンプル（化合物ＩａおよびＩｂを含まない）と基準物質も調製する。一対の未希釈サンプルのＬＣ50を、強化ＬＣ50値で割って、化合物ＩａおよびＩｂの混合物に関連するＬＣ50の低下倍率（fold reduction）を得る。
結果を以下の表７に示すが、この結果は、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物がLeptinotarsa texanaに対するNOVODOR（商標）の殺虫活性を強化することを示している。
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実施例１１：甲虫Ips calligraphusおよびDendroctonus frontalisに対する化合物ＩａおよびＩｂの混合物の活性
化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物の毒性を、甲虫Ips calligraphusおよびDendroctonus frontalisに対して求める。化合物ＩａおよびＩｂの粗溶液３ｍＬ（１ｍＬ当たり有効成分１．８ｍｇ）を凍結乾燥ロボリ（Lobolly）マツ篩部５ｇと蒸留水７ｍＬに加える。対照飼料を水１０ｍＬを用いて調製する。飼料を３枚のシャーレに入れ、未成熟成虫Ipsもしくは成虫になったばかりのDendroctonus甲虫５〜１０匹を各シャーレに入れる。処理飼料および対照飼料の３つの異なるバッチを１０〜２０匹の昆虫でコロニー化する。シャーレを暗所にて２５℃でインキュベーションし、死亡昆虫の数を飼料上への載置から４日後、７日後および１０〜１２日後に計数する。提供データは、各昆虫種についての２もしくは３回の別個の追試からの平均である。
Ips calligraphusについての結果は以下の表８に示してあり、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物が殺虫活性を有することを示している。
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Dendroctonus frontalisのバイオアッセイについての結果は以下の表９に示してあり、化合物ＩａおよびＩｂの混合物が殺虫活性を有することを示している。
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実施例１２：Popillia japonica（マメコガネ）に対する活性
化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物について、第三齢Popillia japonicaに対する農薬活性を調べる。ペレニアルライグラスの根（１１日齢）を化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物に浸漬し（１ｍＬあたりＩａおよびＩｂが１．８ｍｇ）、部分乾燥する。第三齢Popillia japonica幼虫を数本の処理済み根とともにスズ容器に入れる。２４時間後、根および幼虫をウースター（Wooster）沈泥壌土で覆う。対照根は水に浸漬し、未処理対照は第１日に壌土に直接入れる幼虫とする。スズ容器を暗所にて２５℃でインキュベーションし、７日、１０日、２１日、２８日および３６日後に死亡幼虫数を調べ、対照補正死亡率を報告する｛（対照生存数−処理虫生存数）／（対照生存数）×１００％｝。各処理について計２５匹の幼虫を用いる。表１０に示した結果から、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物が第三齢Popillia japonicaに対して有効であることがわかる。
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実施例１３：Epilachna varivestis（マダラテントウムシ）に対する活性
化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物（１ｍＬ当たり１．８ｍｇ）について、第三齢Epilachna varivestis幼虫に対する農薬活性を調べる。Epilachna varivestis成虫のケージに入ったコロニーを、８０°Ｆおよび相対湿度５０％で光周期１６：８下に飼育室でバーピーのブッシュアオイマメ（Burpee′s bush lima beans）上に維持する。卵塊を集め、湿った綿芯とアオイマメ葉の入ったシャーレで孵化させる。２日後、第二齢幼虫を集め、葉浸漬バイオアッセイに使用する。バイオアッセイを行うため、マメ葉を採取し、１枚の葉の葉柄を水４ｍＬの入った草花用管のゴム隔膜に突き刺す。次に葉を、化合物ＩａおよびＩｂを含む粗材料を容量基準で０〜１２％の範囲で含んだ連続希釈液に浸漬する。葉が乾燥したら、８〜１０匹の第二齢幼虫を各葉に乗せる。昆虫、葉および草花用管を２２オンスの紙コップに入れ、細かいメッシュで覆う。カップを、甲虫コロニー飼育に用いるのと同じ飼育室に入れる。２日ごとに、カップを飼育室から取り出し、幼虫を調べ、葉を新鮮な処理済み葉と交換する。試験は８日目に終了する。
表１１に示した結果は、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物がEpilachna varivesis幼虫に対して活性であることを示している。
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実施例１４：Leptinotarsa decemlineata（コロラドハムシ）に対する圃場試験
Leptinotarsa decemlineataについて、エーカー当たり０．５および１．０クォートで施用のNOVODOR（商標）との併用でエーカー当たり５０、１００、１５０および３００ｇで施用する化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物を用いて、ジャガイモ（Katahdin品種）における抑制を調べる試験を行う。NOVODOR（商標）については単独で、エーカー当たり０．５、１．０および２．０クォートでも施用する。処理は、畝当たり３個のスプレーシステムTXVX-12中空コーンノズルを装着し、３ｍｐｈおよび５６ｐｓｉで３２ＧＰＡを散布するよう較正された背負式CO2散布機を用いて、７日間の間隔を設けて２回行う。各処理は、無作為ブロック方式で、試験区２畝（３４インチ間隔）を２５フィートだけ４回繰り返す。畝／試験区５０フィートにわたって葉面に外乱を加えず、Leptinotarsa decemlineataの成虫及び幼虫の計数を上から行う。
図３に示した結果から、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物がジャガイモに対してNOVODOR（商標）と有意な相乗活性を与えることが明らかである。エーカー当たりNOVODOR（商標）０．５クォートで２１％抑制が認められ、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物５０ｇでは１３％抑制が得られる。しかしながら、NOVODOR（商標）と化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物の両方をこれらの施用量で併用して施用すると、抑制パーセントは８１％まで上昇した。同様に、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物をエーカー当たり１００ｇで施用すると２８％抑制が認められ、NOVODOR（商標）０．５クォートでは２１％抑制が認められるが、NOVODOR（商標）と化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物をこれらの施用量にて併用で施用すると、抑制パーセントは８１％まで上昇した。さらに、化合物ＩａおよびＩｂの粗混合物５０ｇ／エーカーおよびNOVODOR（商標）１．０クォート／エーカーを併用すると、抑制パーセントは８８％まで上昇した。
微生物の寄託
以下のBacillus thuringiensis菌株を、ブダペスト条約に従って、ＮＲＲＬ（Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA）に寄託した。
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これら菌株は、37 C.F.R.§1.14および35 U.S.C.§122下に特許商標庁長官が適格と判断する者に対して本特許出願係属中に当該培養物を閲覧することが可能であることを保証する条件下に寄託された。本寄託は、各寄託菌株の実質的に純粋な培養物を提供するものである。寄託物は、本出願の対応出願またはその後継出願が出願される場合に、各諸外国特許法による要求に応じて入手できるものである。しかしながら、寄託物が入手可能であることは、政府措置によって賦与される特許権に損害を与えるような形で本発明を実施する実施権を構成するものではないことは理解しておくべき重要な点である。
本明細書に開示の具体的実施態様は本発明のいくつかの側面を説明することを意図してのものであることから、本願明細書に記載および特許請求された発明は、それら実施態様によってその範囲を限定されるべきではない。均等な実施態様は、本発明の範囲に含まれるものである。実際、本明細書に明示および記載したもの以外の本発明の各種変法は、前記説明から当業者には明らかになるであろう。そのような変法も、添付した請求の範囲の範囲に含まれるものである。
本願においては各種引例を引用しており、それらの開示内容の全体は引用によって組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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