(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）に属し、ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子が導入された形質転換体を除く細菌の菌体またはその処理物とビタミンＤ類とを水性媒体中で接触させて、２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生成蓄積させ、該水性媒体から、これを採取することを特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法。
【請求項２】
ビタミンＤ類がビタミンＤ３であり、２５−ヒドロキシビタミンＤ類が２５−ヒドロキシビタミンＤ３である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法に関し、更に詳しくは、バチルス属に属する細菌等を用いて、ビタミンＤ類より２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生物学的に製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＤ類は体内でのカルシウムの吸収、骨のカルシウム代謝促進や細胞の分化誘導、免疫調節に関する重要なビタミンであり、その活性は肝臓で２５位、腎臓で１α位に水酸化を受けて発現することが知られている（Ｈ．Ｆ．デルカおよびＨ．Ｋ．ジョーンズ：アニュアルレビューオブバイオケミストリー第５２巻、４１１ページ（１９８３））。ところが、２５−ヒドロキシビタミンＤ3は肝機能障害を持つ患者では生体内での生合成量が不足している。従って、この様な患者に対する２５−ヒドロキシビタミンＤ3の投与は生体内での不足分を補うという観点から有効である。また１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3は特に活性が強く上記と同様の意味で腎不全患者には特に有効である。従って２５−ヒドロキシビタミンＤ3および１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3の安価な製造法は工業上極めて有益である。
【０００３】
ビタミンＤ類の１αおよび／または２５位に水酸基を直接導入する有機化学的方法は知られていない。一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により原料のビタミンＤ類の１α及び／または２５位に直接水酸基を導入することは従来から知られていたが非効率的で工業的に実用的な方法ではなかった。近年、微生物を用いた酵素化学的方法によりビタミンＤ類の１α位および／または２５位を水酸化する方法として、放線菌を用いる方法が開示された（特開平２−４６９号および特開平２−２３１０８９号）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記微生物を用いた酵素化学的方法によるビタミンＤ類からの２５位水酸化ビタミンＤ類および１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造は開示された方法（特開平２−４６９号および特開平２−２３１０８９号）によれば、例えば基質ビタミンＤ3から２５−ヒドロキシビタミンＤ3、あるいはビタミンＤ3から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3への水酸化活性は非常に弱く、基質特異性も低い、また微生物や反応液の調製に手間がかかる等の工業用製造法としては解決すべき問題点が残されており、遺伝子組換え等による酵素の大量発現も視野に入れた、より遺伝子組み換えに適した酵素源となる新規な微生物源の探索が望まれていた。
【０００５】
本発明は従来報告されていない微生物あるいは微生物由来の酵素を用いた生物学的方法によるビタミンＤ類から２５−ヒドロキシビタミンＤ類の効率的な製造方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物を用いたビタミンＤ類から２５−ヒドロキシビタミンＤ類への変換において、新たな微生物源の探索を目的として鋭意検討を重ねた結果、バチルス属細菌を利用することによりビタミンＤ類の２５位に直接水酸基を効率的に導入することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明により、バチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類を水酸化しうる能力を有する細菌の菌体またはその処理物とビタミンＤ類とを水性媒体中で接触させて、２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生成蓄積させ、該水性媒体から、これを採取することを特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法が提供される。
【０００８】
また、本発明の別の態様により、バチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する細菌から、ビタミンＤ類を２５−ヒドロキシビタミンＤ類に変換する酵素をコードする遺伝子を単離し、得られた遺伝子をベクターに挿入し、該遺伝子の挿入されたベクターを宿主に導入することを特徴とする、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する形質転換体の作成方法、該方法で得られる形質転換体、および、該形質転換体またはその処理物とビタミンＤ類とを水性媒体中で接触させて、２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生成蓄積させ、該水性媒体から、これを採取することを特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される微生物は、バチルス属に属し、ビタミンＤ類を酸化、すなわちビタミンＤ類の２５位の水素原子を水酸基に変換し、２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生成し得る能力を有する細菌であれば如何なるものであってもよい。具体的には、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＦＯ１２１０８、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＦＯ１５３０８、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)ＩＡＭ１１１１、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１１６６、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)ＩＡＭ１２４５等が挙げられる。これらの中で、ＩＦＯ番号を有するものは財団法人発酵研究所、ＩＡＭ番号を有するものは東京大学分子細胞生物学研究所の保存株であり、容易に入手することができる。また、その菌学的性状は既に明らかにされている。
【００１０】
本発明の方法は、バチルス属細菌の菌体またはその処理物を含有する溶液中で、基質ビタミンＤ類を好気的条件下で反応させることにより行う。具体的には、前述の微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を有機溶媒処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の処理物を用いることができる。また、これらの菌体または処理物から、ビタミンＤ類に作用してその２５位の水素原子を水酸化する能力を有する酵素画分を粗精製物、あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、精製された酵素をもとにして特定化された単一あるいは複数の遺伝子をベクターに組み込んで得られる大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、酵母などを宿主とした組み換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を用いることもできる。さらにはこの様にして得られた菌体、処理物、酵素画分、形質転換体等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで、本明細書において「菌体またはその処理物」の用語は上述の菌体、処理物、酵素画分、およびそれらの固定化物等のすべてを含有する概念として用いることとする。
【００１１】
本発明のビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する形質転換体は、上記バチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する細菌から、ビタミンＤ類を２５−ヒドロキシビタミンＤ類に変換する酵素をコードする遺伝子を単離し、得られた遺伝子をベクターに挿入し、該遺伝子の挿入されたベクターを宿主に導入することにより得ることができる。この形質転換体は、それ自体既知の通常用いられる方法、例えば以下の方法により作成できる。
【００１２】
まず、バチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する細菌から、ビタミンＤ類を２５−ヒドロキシビタミンＤ類に変換する酵素（以下これを「ビタミンＤ類２５位水酸化酵素」と略称することがある。）をコードする遺伝子（以下これを「ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子」と略称することがある。）の単離は、例えば以下の方法で行うことができる。
【００１３】
ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子は、上記のバチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する細菌から酵素タンパク質を精製し、そのアミノ酸配列をもとにＤＮＡプローブを合成し、バチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する細菌からクローニングすることができる。その供給源となる微生物としては、バチルス属に属し、ビタミンＤ類を酸化し、２５−ヒドロキシビタミンＤ類を精製し得る能力を有する細菌であれば如何なるものであってもよい。具体的には、上記バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＦＯ１２１０８、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＦＯ１５３０８、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)ＩＡＭ１１１１、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１１６６、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)ＩＡＭ１２４５等が挙げられる。
【００１４】
ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子は、通常上記の供給源微生物の染色体上に存在し、染色体由来のＤＮＡバンクから以下に述べるハイブリダイゼーション法により分離・取得することができる。
（１）ビタミンＤ類２５位水酸化酵素の精製及びそのアミノ酸配列の部分的決定とそれに基づくＤＮＡプローブの作製：
上記菌株等の菌体かビタミンＤ類２５位水酸化酵素の精製は、それ自体公知の菌体を破壊して、破壊物より酵素を精製する方法を使用できる。
【００１５】
菌体の破壊法としては、例えば、超音波破砕；フレンチプレス、ホモジナイザーなどを用いた機械的破壊法；リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用いることができる。ビタミンＤ類２５位水酸化酵素は、この菌体破壊物より可溶性画分を分離することにより、粗酵素液として得ることができる。
得られた粗酵素液からのビタミンＤ類２５位水酸化酵素の精製法としては、通常、（イ）沈澱法による分離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによる分離法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等、（ハ）電気泳動による分離法等を組み合わせることによって実施することがでる。
【００１６】
上記精製過程におけるビタミンＤ類２５位水酸化酵素の検出は、ビタミンＤ類２５位水酸化酵素活性を血液中からビタミンＤ類を検出する一般的な方法であるBligh & Dyerの方法（Can. J. Biochem., 37, 911(1959)）に従い、反応溶液中のビタミンＤ類と２５−ヒドロキシビタミンＤ類を定量することにより行うことができる。
【００１７】
精製されたビタミンＤ類２５位水酸化酵素を、Davis法［B.J.Davis，Ann.N.Y.Acad.Sci.，Vol.121，p.404(1964)］またはLaemmli法［U.K.Laemmli，Nature，Vol.227，p.680(1970)］によるポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブルー色素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸］、あるいは銀染色キット（和光純薬製）等を用いて酵素タンパク質を染色することにより、精製純度およびビタミンＤ類２５位水酸化酵素の分子量等を知ることができる。
【００１８】
精製されたビタミンＤ類２５位水酸化酵素のアミノ酸配列の部分的決定は、同酵素をこれを構成するサブユニットに分離後、各サブユニットのＮ末端からのアミノ酸配列、あるいは適当なタンパク質分解酵素により各サブユニットを消化して得られるペプチド断片のＮ末端からのアミノ酸配列を、エドマン分解法によるアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定することにより、行うことができる。
【００１９】
次いで、得られたアミノ酸配列から予想される塩基配列を持ったプローブをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用いて合成する。
プローブＤＮＡの設計は、上記のように精製酵素のアミノ酸配列をもとに設計することもできるが、また、既知のビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子の塩基配列（ＷＯ９４／００５７６）から設計することもできる。（２）ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片の単離：
上記菌株等の菌体から、ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡを単離する方法は、遺伝子の単離に関する公知のいずれの方法もが使用できる。以下にその一例を説明する。
【００２０】
（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用することも可能である。
【００２１】
得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＸｈｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｑＩ等を用いて部分分解し、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等の宿主−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えばλＦＩＸII（東洋紡績（株）製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ１５（Stratagene社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２２】
上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクターλＦＩＸII（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な制限酵素、例えばＸｈｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｑＩ等で開裂したベクターと部分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮＡライブラリーが得られる。
【００２３】
（Ｂ）ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を含むベクターの選別：
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡライブラリーからビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を含むベクターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の形質導入あるいは形質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体から、適当な手段によりビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を保持するクローンを選別すればよい。
【００２４】
具体的には、上記ファージベクターをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、例えばＰ２３９２株［Ausubel et al.，Nucleic  Acid  Res.Vol.7，p.1513(1979)］に感染させ、これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成させる。
次いでこのプラーク中のファージＤＮＡをニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを該ニトロセルロース膜に固定し、前記（１）項で作製したプローブ、例えば合成オリゴヌクレオチドを用いたプラークハイブリダイゼーション［Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］を行う。
【００２５】
ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、上記のように精製酵素のアミノ酸配列をもとに設計することもできるが、また、既知のビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子の塩基配列（ＷＯ９４／００５７６）から設計することもできる。
こうして、対象菌株の染色体ＤＮＡ由来のビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を有するファージベクターを含む形質導入体を検出し、選別することが可能である。  あるいは上記プラスミドベクターを用いて染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このライブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109（宝酒造製）を形質転換し、得られた形質転換体から前記（１）で作製したプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション法［R．Bruce Wallace，et al.，Nuc.Acid.Res.，Vol.9，p.879(1981)］を行うことによっても選別可能である。
【００２６】
更に、上記のようにして選別された形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを含むＤＮＡ断片を取得することができる。
上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片につき、前記（１）で作製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション［E.M.Southern，J.Mol.Biol.，Vol.98，p.503(1975)］を行うことにより、ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在することを再確認できる。
【００２７】
（３）塩基配列の決定：
前記（２）項で得られたＤＮＡ断片の全塩基配列は、例えばプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Stratagene社製）、同ｐＵＣ１１８ベクター（宝酒造（株）社製）等を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法［dideoxy chain termination法 Sanger,F.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.74，P.5463(1977)］により決定することができる。
【００２８】
このようにして決定された上記ＤＮＡ断片の塩基配列中から、オープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）の存在を検索し、各株のビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子の存在を推定することができる。また、得られた塩基配列を、前記（１）で決定した酵素タンパク質のアミノ酸配列から予想される塩基配列に相当する配列の存在の検索をかけることにより、得られたＤＮＡ断片中に該遺伝子が含まれていることを確認することができる。
【００２９】
上記の塩基配列を包含するビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子は、天然の細菌の染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。
バチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する細菌から、ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子は適当なベクター中に組み込んで組換えベクターとして使用することができる。
【００３０】
ベクターは宿主との組み合わせを考えて選択することができ、好ましくは宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明の遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。本発明の細菌を宿主細胞として用いる場合は、ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３１】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrP2、pBTac1、pBTac2(いずれもべ一リンガーマンハイム社より市販)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescrlpt II SK(+)、pBluescript II SK(-)(Stratagene社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pRSET、pTrcHis、pTrcHis2(いずれもInvitrogen社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pPA1(特開昭63-233798)、pEG400〔J. Bacterio1., 172, 2392(1990)〕等を例示することができる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、trcプロモーター(P trc)、T7プロモーター(P T7)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
【００３２】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、pYES2(インビトロジェン社製)、pESC、 pESP(いずれもストラタジーン社製)、pAUR (宝社製)、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００３３】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcＤＮＡI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3-3 (特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(1987)〕、pcＤＮＡI/AmP(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAGE210等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
【００３４】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕等を例示することができ、植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕等を挙げることができる。
【００３５】
バチルス（Bacillus）属に属し、ビタミンＤ類の２５位を水酸化しうる能力を有する細菌から、ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を有する形質転換体は、上記した組換えベクターを宿主に導入することにより作製することができる。
細菌の宿主細胞の具体例としては、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospiri11um属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas属等に属する微生物をあげることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
【００３６】
酵母宿主の具体例としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。
【００３７】
酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
動物細胞宿主としては、Hela細胞、ナマルバ細胞、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等を挙げることができる。
【００３８】
動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
また、植物細胞に形質転換する場合には、その宿主としては、その形質転換体の使用目的に応じて任意に選択できる。ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子を導入することができる植物の種類は特には限定されないが、例えばナタネ、ダイズ、ヒマワリ、パーム椰子などの油量作物；例えばイネ、トウモロコシ、コムギなどの禾穀類；例えばキャベツ、レタスなどの各種の野菜類；樹木類あるいは花卉などが例示される。
【００３９】
本明細書において、形質転換植物源としては、種子、芽生え、苗、カルス、培養細胞、植物体などが挙げられ、例えば、ナタネの場合には芽生えまたはプロトプラスト；ダイズの場合には芽生え、カルスまたは培養細胞；ヒマワリの場合には芽生え；パーム椰子の場合にはカルスまたは培養細胞；イネの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；トウモロコシには、芽生え、苗、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；コムギの場合には、芽生え、カルスまたは培養細胞；キャベツの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；レタスの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト等と言ったように、当業者が通常行うように、対象植物によって適宜好ましい部位を選択して行えばよい。
【００４０】
植物への形質転換法は常法に従って行うことができ、例えば、アグロバクテリアによる方法、エレクトロポーレイション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法などを用いた細胞へのＤＮＡ直接導入法を挙げることができる。組み込む発現カセットは公知のプラスミドを用い、常法により作製することができる。
【００４１】
上記のとおり、本発明において「形質転換体」とは、ビタミンＤ類２５位水酸化酵素遺伝子が導入された細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、植物体等を意味する。
本発明の２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法において、反応に必要な菌体あるいは形質転換体の取得は、通常、培養により行われる。菌体の培養は、それ自体既知の通常用いられる方法により行うことができる。培養に使用する培地は主として液体培地を用い、炭素源としてはグルコース、マルトース、フルクトース、シュクロース、グリセリン等を単独または混合して用いる。窒素源としてはポリペプトン、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー、などの有機窒素源や硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素源を単独または混合して用いる。また、これらの成分以外にも本微生物の生育を助け２５位に水酸基が導入されたビタミンＤ類の生成を促進する有機物および無機塩を必要に応じて添加することができる。培養は、培地のｐＨを４〜１０の範囲に調整し、温度２０〜４５℃で１〜１０日間の範囲で活性が最大になるまで行うことが好ましい。
【００４２】
この培養により得られた菌体またはその処理物とビタミンＤ類とを水性媒体中で接触させて反応させ、反応生成物として２５−ヒドロキシビタミンＤ類を得る。ここで用いられる水性媒体としては水、緩衝液または培養液等が挙げられるが、この水性媒体には、水溶性有機溶媒または脂溶性有機溶媒を適宜含有させることも可能である。また反応に際して反応液にグルコース、シュークロース、フルクトース等の炭素源をエネルギー源として添加し、収量が向上する場合はそれらの炭素源を適宜添加することも可能である。その他溶液には目的の２５−ヒドロキシビタミンＤ類の生産を促進するシクロデキストリン類、界面活性剤、有機物および無機塩等を必要により添加することができる。
【００４３】
シクロデキストリン類としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、β−ジメチルシクロデキストリン、β−トリメチルシクロデキストリン、部分メチル化シクロデキストリン、分岐メチル化シクロデキストリン等が挙げられる。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、シグマ社製Ｔｗｅｅｎ８０）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、シグマ社製Ｓｐａｎ８５）、その他ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ／シグマ社製）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ／シグマ社製）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４５、および陰イオン性界面活性剤としてダイレックス（日本油脂社製）、トラックス（日本油脂社製）などを用いることができる。
【００４４】
添加するシクロデキストリン類の濃度としては、培地もしくは反応液中の０．１〜１５重量％、好ましくは、０．１〜２重量％が適当である。また、添加する界面活性剤の濃度としては、培地もしくは反応液中の０．０１〜５重量％、好ましくは、０．０５〜０．５重量％が適当である。
本発明の製造方法は前記菌体及び／またはその処理物を含有する溶液中で振とう操作、通気撹拌操作などに付して好気条件下で行う事が適しており、ｐＨ４〜１０、２０〜４０℃で５分間〜１週間撹拌振とうする。また、酸素気流下で反応することができる。基質のビタミンＤ類は撹拌振とう開始時に適量添加するが、必要に応じて反応中に逐次添加することができる。また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は基質ビタミンＤ類を添加後、更に同じ条件下で２４〜１６８時間培養して水酸化反応を行う。添加時のビタミンＤはそのまま添加する他、メタノール、エタノール等の水溶性低分子有機化合物にあらかじめ溶解させたものを添加させてもよい。
【００４５】
添加する基質ビタミンＤ類の濃度としては、１０〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは、５０〜５００μｇ／ｍｌの範囲で添加することが望ましい。
本発明の製造方法はビタミンＤ類の２５位に直接一工程で水酸基を導入する方法である。基質として用いられるビタミンＤ類としては、２５位に水素原子を有するものであれば如何なるビタミンＤ類であってもよく、ビタミンＤ類の２５位以外に例えばフッ素原子などのハロゲン原子、水酸基や低級アルキル基などを有するものでもよい。具体的には、例えばビタミンＤ2系、及び、ビタミンＤ3系の化合物であり、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3、１α―ヒドロキシビタミンＤ3、１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3などを挙げることができる。
【００４６】
生成物を後記実施例で述べるＨＰＬＣ等で確認して反応時間をきめることも可能である。これらの反応により製造されたビタミンＤ類を単離するには、血液中からビタミンＤ類を検出する一般的な方法であるBligh & Dyerの方法（Can. J. Biochem., 37, 911(1959)）に準じて行えばよい。たとえば、反応終了後、遠心分離等にて菌体またはその処理物を除去した後、反応液を有機溶媒、例えば酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム等により抽出し、濃縮する。これを適当な溶媒に溶解し遠心分離により不溶物を除いた後、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の公知の方法を利用して目的のヒドロキシビタミンＤ類を単離することができる。
【００４７】
上記製造方法は、主に細菌の菌体またはその処理物を用いる場合について説明したが、酵母、動物細胞、植物細胞、植物体等の形質転換体を用いても、それ自体既知の方法及び上記方法に準じて２５−ヒドロキシビタミンＤ類を製造することができる。
本発明の方法により、ビタミンＤ類の２５位へ直接水酸基を効率的に導入することが可能になった。すなわち、例えばバチルス属細菌を用いる方法では、微生物菌体や反応溶液などの調製に手間がかからず、極めて容易かつ能率的に２５−ヒドロキシビタミンＤ類を製造することができる。また、遺伝子組み換え等の手法により得られる形質転換体を用いることで、２５−ヒドロキシビタミンＤ類の生産性が飛躍的に向上させることが可能である。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
グルコース０．５%、酵母エキス０．５%、ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．８％、炭酸カルシウム０．２%、ｐＨ７．０の無菌液体培地（以下「Ａ培地」と称す）８ｍｌの入った２１φ試験管１本にバチルス・メガテリウムＩＦＯ１２１０８株を１白金耳接種し、３０℃で２０時間振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して無菌的に培地６ｍｌを除去し、再び懸濁させた。この濃縮菌体培養液に滅菌済み４０％グルコース溶液０．１ｍｌを添加し、さらに２０μｌのエタノールに溶解した基質ビタミンＤ3 ０．４ｍｇを添加し３０℃で９６時間培養を継続した。生成物の確認はシリカゲル（キーゼルゲル６０Ｆ２５４，メルク社製）の薄層クロマトグラフィーで行った（展開溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝１５：１、紫外部吸収にてスポットを検出）。標準化合物として市販の２５−ヒドロキシビタミンＤ3（試薬名カルシフェジオール、和光純薬製）を用いた。
【００４９】
この反応液を酢酸エチル５ｍｌで抽出し、室温で窒素ガス置換をしながら濃縮乾固し、直ちにヘキサン／エタノール＝９５／５の混合溶媒１００μｌに溶解し順相ＨＰＬＣ分析［カラム；コスモシル５ＳＬ−II（ナカライテスク製）、溶離液；ヘキサン／エタノール＝９５／５、流速；１ｍｌ／分、ＵＶ；２６５ｎｍ、カラム温度；３０℃］を行った。標準化合物の保持時間との比較によりビタミンＤ3の代謝物を同定した。その結果２５−ヒドロキシビタミンＤ3の蓄積濃度は、０．６μｇ／ｍｌであった。
【００５０】
実施例２
実施例１で用いたＡ培地（８ｍｌ／２１φ試験管）にてバチルス・メガテリウムＩＦＯ１２１０８株を３０℃、２０時間振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集めた。この菌体をグルコース２％を含むｐＨ７の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下「緩衝液Ａ」と略す）８ｍｌに懸濁し再度遠心分離し菌体を集めた。このバチルス・メガテリウムＩＦＯ１２１０８株の洗浄菌体に２ｍｌの緩衝液Ａを加え、さらに２０μｌのエタノールに溶解した基質ビタミンＤ3 ０．４ｍｇを添加し３０℃で９６時間反応させた。生成反応終了後、この反応液を酢酸エチル５ｍｌで抽出し、室温で窒素ガス置換をしながら濃縮乾固し、２５−ヒドロキシビタミンＤ3の蓄積濃度を実施例１に記載の方法で確認したところ１．１μｇ／ｍｌの値を得た。
【００５１】
実施例３
実施例１で用いたＡ培地（１０ｍｌ／２１φ試験管）にてバチルス・メガテリウムＩＦＯ１２１０８株を３０℃、２０時間振とう培養を行い、この培養液中に５％メチル−β−シクロデキストリン溶液１ｍｌ及びＴｗｅｅｎ８０を２０ｍｇ及び４０％グルコース溶液０．５ｍｌを添加しさらに１００μｌのエタノールに溶解した基質ビタミンＤ3 ２ｍｇを添加して３０℃で７２時間培養を継続した。この反応液を酢酸エチル２５ｍｌで抽出し、室温で窒素ガス置換をしながら濃縮乾固し、２５−ヒドロキシビタミンＤ3の蓄積濃度を実施例１に記載の方法で確認したところ３．５μｇ／ｍｌの値を得た。
【００５２】
実施例４
使用菌株として、表１に記載のバチルス・メガテリウム菌株を用いて、実施例１で用いたＡ培地（１０ｍｌ／２１φ試験管）にて３０℃、２０時間振とう培養を行い、この培養液中に５％メチル−β−シクロデキストリン溶液１ｍｌ及びＴｗｅｅｎ８０を２０ｍｇ及び４０％グルコース溶液０．５ｍｌを添加しさらに１００μｌのエタノールに溶解した基質ビタミンＤ3 ２ｍｇを添加して３０℃で９６時間培養を継続した。この反応液を酢酸エチル２５ｍｌで抽出し、室温で窒素ガス置換をしながら濃縮乾固し、実施例１に記載の方法で確認した２５−ヒドロキシビタミンＤ3の蓄積濃度を使用菌株と共に表１に示す。
【００５３】
【表１】
菌株番号 ２５−ヒドロキシビタミンＤ3蓄積量（μｇ／ｍｌ）
ＩＦＯ１２１０８                ９．５
ＩＦＯ１５３０８                ４．１
ＩＡＭ１１１１                  ２．０
ＩＡＭ１１６６                  ７．３
ＩＡＭ１２４５                  ９．５
表１の結果から明らかなとおり、ビタミンＤ3にバチルス・メガテリウム菌株を接触させることにより、２５−ヒドロキシビタミンＤ3が効率よく生産されていることがわかる。