(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４７、及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４８よりなる群から選ばれたいずれかであるハイブリドーマにより産生される、４０％濃度以下の有機溶媒を含む水溶液中において５０％以上の抗原結合能を保持することが可能なビスフェノールＡに特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
受託番号が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４７、及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４８よりなる群から選ばれたいずれかであるハイブリドーマであり、請求項１記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項３】
請求項１記載のモノクローナル抗体と、以下の式（Ｉ）で表される構造（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）で表される構造を有することを特徴とするハプテン化合物に標識物質を結合させることにより得られた標識抗原とを用いることを特徴とするビスフェノールＡの測定方法。
【化１】
0004035754.tif 000006
【請求項４】
測定対象物をメタノールを溶媒に用いた固相抽出法にて予め濃縮を行う請求項３記載のビスフェノールＡの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビスフェノールＡのハプテン化合物、ハイブリドーマ、ビスフェノールＡを特異的に認識するモノクローナル抗体及びそれらを用いたビスフェノールＡの免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビスフェノールＡは耐熱性食器やほ乳ビンに使われているポリカーボネート樹脂の原料や安定化剤、酸化防止剤として使用され、また缶詰の内側のコーティングに使用されるエポキシ樹脂や歯科治療に使用されているコンポジットレジンやシーラントの原料としても使用されている。ビスフェノールＡは年間約３０万トン程度生産されているが、発ガン性等の毒性が低いことからこれまではあまり問題とされていなかった。しかしながら、近年ある種の化合物が人や野生動物の内分泌機能を撹乱する作用を持つという、いわゆる「内分泌撹乱物質」がグローバルな環境問題としてクローズアップされ、ビスフェノールＡもエストロジェン活性を有する内分泌撹乱物質の一つである疑いがあることが判明したことから、大きな注目を集めるようになった。特に、乳がん細胞を用いた実験では数ｐｐｂ程度のごく微量な量でエストロジェンと同様な作用を発揮することが確認されており、マウスに対するビスフェノールＡ投与実験でも、精子運動性低下等といった生殖機能異常が報告されている。また、環境庁が実施した化学物質の環境中の安全性調査においても、ビスフェノールＡが大都市周辺の河川や港湾の水質や底質等から検出されたことから、ビスフェノールＡによる汚染が広範囲に広がっていることが明らかとなり、環境中の暴露量を把握することが急務となっている。
【０００３】
ビスフェノールＡ等の内分泌撹乱物質の測定は高い精度の分析値が求められ、抽出、濃縮、精製といった各種のクロマトグラフィーや高価な質量分析装置等の機器を用いる公定分析法に従って行われている。これらの分析法は高感度で、構造の類似する複数の化合物を一度に同定、定量できる多成分分析が可能であるが、環境試料からの目的物質の抽出、分離、精製が煩雑で、化合物によっては誘導体化が必要といった問題があり、従って高価な機器に対する多大な設備投資や、分析技術者の習熟、その他分析に時間がかかるといった問題を抱えているのが現状である。このため精度が高くかつ簡便な測定方法の開発が望まれており、このような問題を解決すべく、抗体を用いた免疫測定法による環境汚染物質の検出技術が注目されつつある。
【０００４】
この免疫測定法は１９８０年代に米国において地下水や河川水の除草剤の分析に適用され、近年、カナダ、ヨーロッパ並びに我が国においても免疫測定法を用いた環境汚染物質の開発が行われている。免疫測定法とは、抗体が抗原を特異的に認識する能力を用いて微量の抗原を検出する方法であり、抗体の抗原に対する高い親和性と高い特異性により抗原を高感度に測定することができる。また測定方法が簡易で迅速に結果が得られる、多検体、多成分の同時測定が可能である、測定目的に適した検出感度、測定レンジを有する、測定試料の精製が不要である、測定に要するコストが低いといった種々のメリットを持ち、医学、生化学、薬学、農学など広い分野で利用されている。免疫測定法において測定対象物質を検出するには、抗体または抗原を標識する必要があるが、その標識方法としては酵素を用いる方法、放射性物質を用いる方法、蛍光物質を用いる方法、金属原子を用いる方法などが挙げられる。中でも、酵素を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は臨床検査や生化学分野での生体試料中の目的成分の定量に応用されている。ＥＩＡ法は、抗原抗体反応の形式により、競合法と非競合法に大別できる。非競合法は複数の抗原結合部位を持つ多価抗原に適用でき、蛋白質など高分子の抗原や抗体の測定が可能であるが、ビスフェノールＡのような低分子化合物は競合法によって測定する。
【０００５】
ＥＩＡ法においては、抗原に対していかに特異性が高く、かつ親和性の高い抗体が得られるか重要であるが、ビスフェノールＡは低分子化合物であるため、通常それ自体では抗体産生を誘導する能力を持たない。そこで、抗体産生誘導能のある高分子化合物と結合させることにより、ビスフェノールＡと特異的に反応する抗体産生を誘導することが可能となる。このような低分子化合物の物質をハプテンと呼び、ハプテン分子に対し特異的な抗体を産生させるためには、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、ＯＶＡ（卵製アルブミン）、ＫＬＨ（スガシガイヘモシアニン）といった免疫原性を有する高分子化合物にビスフェノールＡ分子を導入することが必要となる。
【０００６】
抗ハプテン抗体の性能はハプテン抗原の作製方法に大きく影響され、ハプテン分子の設計が抗体の特異性と親和性を決定する。ビスフェノールＡに対する抗体を得るためにも、このようなハプテン設計は重要な要因であるが、これまでに作製されたハプテン抗原によって得られた抗体とビスフェノールＡ以外の関連物質との交差反応性が高いという問題点があった。また環境試料を測定する際には、測定感度を上げるために有機溶媒を用いた固相抽出を行う場合があるが、固相抽出を行った場合、抽出後の試料には有機溶媒が混入してしまうため、有機溶媒に耐性を有する抗体が望まれていた。しかしながら、これまでに得られたモノクローナル抗体は有機溶媒に対する耐性が低く、試料中に有機溶媒が混入すると著しく抗原結合活性が低下する場合が多かった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ビスフェノールＡを高感度に測定するために、交差反応性が低くかつ有機溶媒に対して耐性を有する抗体とその抗体を産生するハイブリドーマ、及びその製造法を提供することを目的とする。さらに本発明は、ビスフェノールＡと高感度かつ特異的に反応する抗体を得るためのビスフェノールＡ誘導体とその製造法を提供することを目的し、当該化合物はビスフェノールＡと特異的に反応するための抗体を産生するハイブリドーマを作製する際の免疫原及びビスフェノールＡを競合的に測定する際の標識抗原となる。
【０００８】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、ビスフェノールＡを高感度で測定でき、かつ有機溶媒に耐性を有する抗体を開発すべく鋭意検討した結果、ビスフェノールＡに特定の長さを有するスペーサー化合物を導入したハプテン抗原で免疫を行うことにより、前記化合物に高感度かつ特異的に反応する抗体が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）４０％濃度以下の有機溶媒を含む水溶液中において５０％以上の抗原結合能を保持することが可能なビスフェノールＡに特異的に反応するモノクローナル抗体。
（２）受託番号が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４７、及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４８よりなる群から選ばれたいずれかであるハイブリドーマにより産生される（１）記載のモノクローナル抗体。
（３）受託番号が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４７、及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４８よりなる群から選ばれたいずれかであるハイブリドーマであり、（１）記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
（４）以下の式(Ｉ) で表される構造（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）で表される構造を有することを特徴とするハプテン化合物。
【化２】
0004035754.tif 000002
（５）（４）記載のハプテン化合物に高分子化合物をキャリアー化合物として結合させることにより得られることを特徴とする免疫抗原。
（６）高分子化合物が蛋白質である（５）記載の免疫抗原。
（７）（４）記載のハプテン化合物に標識物質を結合させることにより得られることを特徴とする標識抗原。
（８）標識物質が酵素である（７）記載の標識抗原。
（９）（４）記載のハプテン化合物のカルボキシル基末端を活性化し、高分子化合物と結合させることを特徴とする免疫抗原及び標識抗原の製造方法。
（１０）（５）または（６）に記載の免疫抗原を動物に免疫することにより得られる（１）記載のモノクローナル抗体の製造方法。
（１１）（１）記載のモノクローナル抗体と請求項７記載の標識抗原を用いることを特徴とするビスフェノールＡの測定方法。
（１２）測定対象物をメタノールを溶媒に用いた固相抽出法にて予め濃縮を行う（１１）記載のビスフェノールＡの測定方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ビスフェノールＡの末端に特定の長さを有するスペーサー化合物を導入したハプテン化合物に高分子化合物を結合せしめ、本複合体を免疫原としてマウス等に免疫した後、免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を調製し、該ハイブリドーマ細胞から免疫原と結合する抗体を産生する細胞を単離し、さらに該ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体を精製することにより得ることができるものである。
【００１１】
本発明のハプテン化合物は、以下の式(Ｉ)により表される化合物であり、ビスフェノールＡの末端の水酸基にカルボキシル基を有するスぺーサーを結合させることにより得られる。式(Ｉ)中、ｎは１〜１０の整数を示す。更に該ハプテン化合物のカルボキシル基をイミドエステル化等で活性化し、高分子化合物と結合させることにより、免疫用抗原及びビスフェノールＡを競合的に測定する際の標識抗原とすることができる。
【００１２】
【化３】
0004035754.tif 000003
【００１３】
以下に、本発明のハプテン化合物、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体の作製、及びビスフェノールＡの免疫化学的測定法について説明する。
【００１４】
ビスフェノールＡハプテン化合物の作製
本発明の式（Ｉ）で示されるハプテン化合物は公知の方法により作製することができる。例えば、ビスフェノールＡの片側の水酸基とスぺーサーとなるハロゲン化アルキルエステルとを有機溶媒中にて反応させ、エステル部分をアルカリ等の塩基によって加水分解することにより得ることができる。該スぺーサーの長さは特に限定されるものではないが、該ハプテン化合物にキャリアーとなる高分子化合物を結合させ免疫原とする場合、抗体はキャリアーとの結合部位より離れた部分を認識する場合が多く、ある程度の長さを有することが望ましい。しかし、長すぎる場合スぺーサー部分を認識する抗体が得られる場合もあることから、スぺーサー長としては炭素数で１〜１０、好ましくは３〜６、さらに好ましい炭素数は５である。例えば、スぺーサーとしては３−ブロモプロピオン酸メチル、３−ブロモプロピオン酸エチル、γ−ブロモ酪酸エチル、５−ブロモ吉草酸エチル、６−ブロモヘキサン酸エチルなどのハロゲン化アルキルエステルが挙げられるが、特に好ましいスぺーサー化合物は、炭素数５の６−ブロモヘキサン酸エチルである。
【００１５】
反応時のビスフェノールＡとハロゲン化アルキルのモル比は１：１〜１：０．５が好ましく、特に等モルで反応させるのが好ましい。反応に使用する溶媒としては、ＤＭＳＯ、ＤＭＥ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン等の有機溶媒が挙げられるが、特に限定されるものではない。また、塩基としてはナトリウムアミド、炭酸カリウム、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、酸化バリウム、酸化銀、水素化ナトリウム等を用いることができる。反応温度は０〜９０℃、好ましくは室温ないしは９０℃、更に好ましくは８０〜８５℃で、反応時間は０．５〜６時間、好ましくは１〜３時間の間で攪拌しながら行うことが望ましい。得られた化合物は、必要に応じてシリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶等の精製操作によって高純度化し、ハプテン化合物とすることができる。
【００１６】
免疫用抗原の作製
上述のハプテン化合物はそれ自身免疫原性を持たないため、単独で免疫しても目的とする抗体が得られない場合が多い。そこで免疫原性を有する高分子化合物をキャリアー化合物として結合させ複合体とすることにより免疫原とすることができる。
【００１７】
該キャリアー化合物として用いられる高分子化合物は、１万以上の分子量であることが望ましく、例えばヘモシアニン、卵白アルブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン等の蛋白質、ＭＡＰレジン、ポリアミド、ポリアクロレイン等の合成高分子、デキストラン、アガロース等の多糖、不活化した細菌等が挙げられる。なかでも、スガシガイヘモシアニン及び牛血清アルブミンが、操作性、免疫原性の点で好ましい。
【００１８】
ハプテン化合物とキャリアー化合物との結合は、ハプテン化合物のカルボキシル基と高分子担体上の反応性官能基とを反応させればよく、方法は特に限定されないが、公知の方法として混合酸無水物法や活性エステル法等が挙げられる。混合酸無水物法は、ハプテン化合物のカルボキシル基をクロル炭酸ブチル、クロロ炭酸エチル等のクロロアルキルホルメートと反応させ、活性のある混合酸無水物に誘導した後、高分子担体上のアミノ基中に反応させアミド結合を生成する方法である。これに対し活性エステル法は、ハプテン化合物のカルボキシル基をカルボジイミド型縮合剤を使用して、活性エステル型に変換してから高分子担体のアミノ基に反応させる方法である。いずれの方法でもハプテン化合物を結合させることができるが、混合酸無水物法の場合、ビスフェノールＡの水酸基とも反応する場合があり、水酸基を保護しておく必要があるのに対し、活性エステル法は水酸基と反応せず、また得られたイミドエステルの安定性も高く、乾燥した状態で長期間、冷凍庫中で保存することができることから特に好ましい。
【００１９】
活性エステル法はハプテン化合物と活性エステル類で最も水溶性の高いＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを有機溶媒中でジシクロヘキシルカルボジイミドや水溶性カルボジイミド等のカップリング剤の存在下にて反応させ、カルボキシル基をイミドエステル化することにより行う。反応時のハプテン化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドのモル比は１：１〜１：５の範囲が好ましく、特に好ましくは１：１である。反応温度は０〜４０℃、好ましくは１０〜２０℃である。反応時間は２〜１０時間、好ましくは５時間である。また反応時の有機溶媒としてはＤＭＳＯ、ＤＭＥ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ヘキサン、酢酸エチル等の有機溶媒が挙げられるが、特に限定されるものではない。得られたイミドエステル化ハプテン化合物は、必要に応じてシリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶等の精製操作によって高純度化する。
【００２０】
得られたイミドエステル化ハプテン化合物とキャリアーとの結合は、通常含水有機溶媒中で行う。まずイミドエステル化ハプテンをメタノール、ＤＭＳＯ有機溶媒に溶解する。同様に牛血清アルブミン、スガシガイヘモシアニン等の担体をリン酸緩衝液、生理食塩水等のアミノ基を含有しない緩衝液に溶解し、イミドエステル化ハプテン溶液中に緩衝液に溶解した担体溶液を徐々に添加し、反応を行う。反応溶液中の有機溶媒濃度は５〜８０％、好ましくは２０〜５０％である。緩衝液はアミノ基を含まないものであれば特に限定されず、緩衝液濃度は、１０〜５００mmol、好ましくは５０〜１００mmol、また緩衝液のｐＨは５〜１０の間であればよく、好ましくは６〜８の間である。イミドエステル化ハプテンとキャリアーのモル比は２００：１〜１０：１の範囲が好ましく、特に好ましくは１００：１〜５０：１の間である。反応温度は０〜５０℃の間で行うことが好ましく、特に好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は１〜２４時間の間で行えばよく、好ましくは５〜１５時間の間である。このようにして得られた免疫用抗原は、必要に応じてゲルろ過、透析等により緩衝液に置換し精製する。
【００２１】
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製
上記の方法により得られた免疫原を用い、公知の方法によりモノクローナル抗体を作製することができる。以下に例を示すが、方法は特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明で使用されるような可溶性物質を抗原として免疫する際は、通常アジュバンドとともにエマルジョン状態にする。アジュバンドとしてはフロインド・アジュバンド、ミョウバン及び百日咳死菌体が用いられる。
【００２３】
免疫する動物としては、通常BALB/cマウスを用いるが、Ｆ１マウスやハムスター等を用いても良い。１匹のマウスに免疫する抗原量としては、３０〜５０μｇ／回でよく、生理食塩水で１００〜５００μｇ／ｍｌになるように調製した免疫用抗原と完全フロインドアジュバンドを２本の注射器等を用いて等量ずつ混合してエマルジョンを作製し、０．１〜０．２ｍｌ／匹ずつ注射する。エマルジョンの投与は注射する部位によって、(1)腹腔内注射(ｉｐ)、(2)皮下注射(ｓｃ)、静脈内注射(ｉｖ)、筋肉内注射(ｉｍ)などがあるが、腹腔内注射及び皮下注射が望ましい。１〜２週間おきに数回免疫する。免疫したマウスは数日後採血し、十分に抗体価が上昇した３〜４日前には、同量の抗原を静脈内または腹腔内に注射する。
【００２４】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞には、マウス、ラット由来のものがあるが、多くの場合Balb/cマウス由来のＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２、Ｘ６３．６．５．３の骨髄腫細胞が用いられる。
【００２５】
細胞の融合法としてはＨＶＪウイルスや電気パルスを利用する方法があるが、現在では細胞毒性も比較的少なく、融合操作の簡便なポリエチレングリコール(ＰＥＧ)法が用いられている。一般によく用いられるＰＥＧの平均分子量は１０００〜６０００で、３０〜５０％（ｖ／ｖ）濃度で使用する。
【００２６】
摘出した脾臓より回収した脾細胞は、無血清培地でよく洗浄した後、対数増殖期にあるミエローマ細胞と混合し、細胞融合を行う。ミエローマ細胞と脾細胞の混合比は１：１０〜１：１の範囲であればよく、混合した脾細胞とミエローマ細胞を遠心してペレットにし、ＰＥＧ溶液を加え、攪拌と振とうによって融合させる。融合後、遠心洗浄してＨＡＴ添加増殖培地に移し、９６穴培養プレートにて培養する。ＨＡＴ培地はサルベージ回路をもたないミエローマ細胞は生存できず、脾細胞と融合したハイブリドーマのみが生育する。融合して数日後よりコロニーが形成し始めるため、コロニーの増殖が認められたウエルの培養上清を採取し、抗原であるビスフェノールＡとの反応性をＥＬＩＳＡ法により確認し、目的の抗体産生の有無でスクリーニングを行う。スクリーニングは、５０％有機溶媒（例えば、メタノール）中で抗原抗体反応を行い、抗原結合活性を有するクローンを取得し、さらに該有機溶媒中での反応性評価を行いクローンの選抜を行う。この際、キャリアー担体由来の抗体を排除するため、スクリーニング用抗原は免疫用抗原として使用したハプテン複合体とは別の担体で複合体を作製し、スクリーニング用抗原とする。例えば免疫用抗原を牛血清アルブミンで作製した場合、スクリーニング用抗原は卵白アルブミンやスガシガイヘモシアニンで作製する。スクリーニング後、抗体産生が確認されたウエルを選び、限界希釈法にてクローニングを行い、単一の抗体産生ハイブリドーマを得る。
【００２７】
本発明のハイブリドーマは、有機溶媒耐性を有しかつビスフェノールＡを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであれば特に限定されないが、例えば、工業技術院生命工学研究所に寄託された、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７１４６(識別表示  ＢＰＡ３Ｂ９)、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４７(識別表示  ＢＰＡ１７Ｂ４)、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４８(識別表示  ＢＰＡ１０Ｅ５)などのハイブリドーマが挙げられる。
【００２８】
樹立したクローンからモノクローナル抗体を調製するには、ハイブリドーマ細胞をプレートやフラスコで培養し、その培養上清を取得することにより得られるが、炭酸ガス培養器に収納できる簡易フォローファイバー型培養装置でも培養することができる。更にハイブリドーマ細胞をプリスタン前投与マウスの腹腔内に移植し増殖させ、移植後１０〜１４日で腹腔に溜まった腹水を回収することによっても得ることができる。
【００２９】
このようにして得られた培養液及び腹水は、イオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー、またプロテインＡもしくはプロテインＧを固定化したアフィニティークロマトグラフィーにより必要に応じて精製し、モノクローナル標品とすることができる。こうして得られたモノクローナル抗体は、４０％濃度の有機溶媒を含む水溶液中において８０％以上の抗原結合能を保持するものであり、実施例に記載された方法により性能評価を実施した。ここで、有機溶媒とは、メタノール、エタノール、アセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリルなどを指すものであるが、特に限定はされない。
【００３０】
抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体を用いたビスフェノールＡ測定法
本発明によって得られた抗ビスフェノールＡ抗体を用いて、ビスフェノールＡの測定を行うことができる。免疫測定法には競合型測定法、非競合型測定法、均質法等があるが、ビスフェノールＡは低分子化合物であるため、競合法により行う。競合法には主にマイクロプレートのウエル、チューブ、磁性粒子等に抗原を固定化する間接競合法と、ウエルやチューブに抗体を固定化する直接競合法がある。
【００３１】
間接競合法では、ウエルに固定化する抗原として免疫原に用いた抗原もしくは他の担体とハプテン化合物の複合体を用いる。まずハプテン複合体をマイクロプレート等のウエルに固相化する。次いでウエルに抗原が結合していない部分を牛血清アルブミン、カゼイン等の市販のブロッキング剤でブロックする。このウエルに検体と一次抗体である抗ビスフェノールＡ抗体を加えて、検体と固相化抗原を抗体に対して競合反応させる。固相化抗原と結合しなかった抗体を洗浄除去後、同ウエルに二次抗体としてヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体をペルオキシダーゼ（ＰＥＯ）やアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素で標識した酵素標識抗体を加えて、固相化抗原と結合した一次抗体と結合させる。緩衝液で数回洗浄した後、酵素基質を加えて発色した酵素反応生成物の吸光度を測定する。
【００３２】
酵素にペルオキシダーゼを用いる場合は、基質に過酸化水素、発色剤にｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジンを使用する。アルカリフォスファターゼでは基質にｐ−ニトロフェニルリン酸が一般的に用いられる。また基質の反応生成物が蛍光であったり、酵素標識抗原に酵素の代わりに、蛍光物質を標識して用いる場合には蛍光測定器で測定する。これに化学発光物質を用いると化学発光測定器での測定が可能となり、より感度のよい測定法となる。
【００３３】
直接競合法は、ウエルに抗体を固相化してブロッキングした後、別途調製したハプテン化合物と酵素を結合した酵素標識抗原と検体を加え、固相抗体と検体及び酵素標識抗体とを競合反応させる。抗体と結合しなかった標識抗原を洗浄除去し、酵素基質を加えて反応生成物の吸光度を測定する。この方法でも標識物質を変えることにより、より感度の高い測定法を構築することができる。
【００３４】
競合測定法に使用する酵素標識抗原は、免疫抗原と同様の方法で作製することができる。すなわち免疫抗原作製時に用いた牛血清アルブミン等のキャリアー担体の代わりに、ペルオキダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素を使用することにより標識抗原を得ることができる。また上述のように、ローダミン等の蛍光物質や化学発光物質で標識体を作製することもできる。
【００３５】
競合測定法の場合、得られた標識抗原が検体よりも抗体と強い親和性を有する場合、検体と標識抗原との競合反応が起こりにくくなる。その結果測定感度が低くなる場合があり、標識抗原の作製方法によって測定感度は左右される。一般に標識抗原の親和力が小さいほど感度としては高くなる傾向があり、標識酵素に導入されるハプテン化合物数の量に応じて親和性は変化する。このため、標識抗原作製時の標識用酵素とハプテン化合物の反応モル比は１：１〜１：５０で行うことが好ましく、更に好ましくは１：１０〜１：２０である。
【００３６】
上述の測定方法において、検体を添加しない反応溶液の吸光度に対し、検体を添加した反応溶液の吸光度の減少を阻害率として測定する。その際、既知濃度のビスフェノールＡ標準溶液より検量線を作成し、得られた検量線からビスフェノールＡ濃度を算出することができる。なお、この測定を行う前に、測定対象物を予めメタノールを溶媒として用いた固相抽出法により濃縮を行っておくことも好ましい。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
実施例１  ビスフェノールＡハプテン化合物の合成
ビスフェノールＡ (1) ５１ｇ（２２４mmol）と、５−ブロモヘキサン酸エチルエステル ５０ｇ(２２４mmol)をジメチルホルムアミド５００ｍｌに溶解し、炭酸カリウム４６ｇ(３３６mmol)を加えて８０〜８５℃で２時間反応させた。反応液は水にクエンチ後、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄を行った後、シリカゲルカラム（酢酸エチル：ヘキサン＝１：６）で精製し、ビスフェノールモノヘキサン酸エチルエステル (2)を ３７ｇ(収率４４．７％)得た。次いで、得られたビスフェノールモノヘキサン酸エチルエステル(2) ３７ｇを７０％エタノール水溶液２２０ｍｌに溶解し、８５％水酸化カリウム溶液を１３．２ｇ(２００mmol)加えた後、７５〜８０℃で1時間攪拌した。反応混合物を水にクエンチした後、６規定の塩酸でｐＨを１に調整し、酢酸エチルで抽出し、温水で洗浄後、クロロホルムで再結晶を行い、ビスフェノールＡハプテン(3)を２６．１ｇ(収率７６．３％)得た。以下に反応スキームを示す。
【００３９】
【化４】
0004035754.tif 000004
【００４０】
実施例２  免疫用抗原の作製
実施例１により作製したビスフェノールＡハプテン化合物を用い、活性エステル法により免疫用抗原を作製した。以下に反応スキームを示す。まず、実施例１で得られたハプテン化合物(3)３０．８ｇ(９０mmol)をジメチルホルムアミド３００ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１０．４ｇ(９０mmol)とジシクロヘキシルカルボジイミド１８．６ｇ(９０mmol)を加えて、室温で５時間攪拌した。反応混合物を氷水にクエンチ後、酢酸エチルで抽出を行い、温水で洗浄後、シリカゲルカラム(酢酸エチル：ヘキサン＝１：５)で精製し、イミドエステル化ビスフェノールＡハプテン(4)を１０．０ｇ(収率２４．７％)得た。
【００４１】
【化５】
0004035754.tif 000005
【００４２】
得られたイミドエステル化ハプテンとキャリアー担体である牛血清アルブミンとの結合は以下の方法により実施した。まず牛血清アルブミン０．２ｇ(３．０２μmol)を１００mmolのホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０) １０ｍｌに溶解した後、５ｍｌの無水ＤＭＦを添加しキャリアー蛋白質溶液とした。次いで本溶液中に５ｍｌのＤＭＦに溶解したイミドエステル化ビスフェノールＡ  ６８ｍｇ(０．１５４mmol)を徐々に添加し、２５℃で１８時間攪拌し反応を行った。反応終了後、モノエタノールアミン２．５ｍｌを添加し、２５℃で２時間攪拌を行い残存する活性エステルをブロックした後、ＰＢＳに対して透析を行い、ビスフェノールＡ−ＢＳＡ複合体を得た。ビスフェノールＡ−ＢＳＡ複合体に導入されたハプテン数は、ＴＮＢＳ法によりアミノ基の定量を行うことにより算出したところ４０個であった。
【００４３】
実施例３  動物への免疫
実施例２で作製した免疫用抗原２ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、等量の完全アジュバントと混和し１ｍｇ／ｍｌ濃度のエマルジョン溶液を作製した。このエマルジョン溶液を６匹のBalb/cマウスに一匹に対し総量０．１ｍｌになるよう各々２箇所に腹腔内投与した。同様の操作で２週間おきに３回追加免疫を行った。各回の免疫一週間後に採血を行い、血液を室温１時間放置後、血餅を分離し抗血清を得た。
【００４４】
実施例４  抗体価の測定
実施例２に記載した免疫用抗原の作製法と同様に牛血清アルブミンの代わりに、卵白アルブミンを用いて抗体価測定用の抗原を作製した。この抗原を０．１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解し９６ウエルマイクロプレートに１００μｌ／ウエルになるよう分注し、３７℃、２時間インキュベートし固相化を行った。抗原溶液を除去後、０．０５％ Tween20を含むＰＢＳにて３回洗浄し、５倍希釈のブロッキング溶液(ナカライテスク製)を３００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗体価測定用プレートを作製した。
【００４５】
このプレートにＰＢＳで４倍希釈系列で希釈した抗血清を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、２時間反応させた。同プレートを、Tween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、１時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下、３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定し抗体価を求めた。
【００４６】
実施例５  ハイブリドーマ及び抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体の作製
抗体価が最も高かったマウスについて最終免疫として１ｍｇ／ｍｌ濃度の免疫用抗原１００μｌを腹腔内投与した。最終免疫の３日後、常法に従って無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を分散させて、ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、脾細胞浮遊液を調製した。細胞数をカウントし、予め培養していたＳｐ／２ミエローマ細胞と脾細胞が１：１０の割合になるよう混合し、遠心後、上清を除去した。上清除去後、ＰＥＧ溶液を０．５ｍｌ加え、細胞を攪拌し、更に２〜３分かけて徐々に２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え細胞融合を行った。次に遠心により上清を除去し、ＨＡＴ培地を加えた後、細胞を浮遊させ、９６穴培養プレートに撒種し３７℃の炭酸ガス培養器内で培養を行った。
【００４７】
培養開始後１週間目より、細胞の増殖の見られたウエルの培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは、卵白アルブミンを用いて作製した抗体価測定用の抗原を、０．１mg/mlになるようにＰＢＳに溶解し９６ウエルマイクロプレートに１００μｌ／ウエルになるよう分注し、３７℃、２時間インキュベートし固相化を行った。抗原溶液を除去後、０．０５％ Tweenを含むＰＢＳにて３回洗浄し、５倍希釈のブロッキング溶液(ナカライテスク製)を３００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗体価測定用プレートを作製した。得られたハイブリドーマの培養上清は等量のメタノールを添加しメタノール濃度５０％になるよう調製した。このサンプルを、採取した培養上清を５０μl／ウエルになるように上記抗体価測定用プレートに添加し、３７℃、２時間反応させ、抗ビスフェノールＡ抗体を産生しているかどうか調べた。同プレートをTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、１時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol/Lの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定し抗体結合活性を有するクローンを選抜した。高い抗体価が確認されたハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを３回行い、モノクローン化ハイブリドーマを得た。
【００４８】
これらのハイブリドーマは０．５％ ウルトラ-Low IgGウシ胎児血清含有Hybridoma-SFM(GIBCO BRL社製)中で炭酸ガス培養器内で３７℃、１週間培養し培養上清を取得した。培養上清はプロテインＡカラムでアフィニティー精製後、ＰＢＳに対して透析を行いモノクローナル抗体とした。得られたモノクローナル抗体を用いて以下の実施例に示す各種試験を行った。
【００４９】
実施例６  各モノクローナル抗体の交差反応評価
各モノクローナル抗体のビスフェノールＡ関連化合物に対する交差反応性を間接競合法により検討した。検討に用いた化合物はビスフェノールＡ及びビスフェノールＡの構造類似物質であるフェノール、p-tert-butyl phenolの３種類を選定した。まず各抗体を１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲になるようにＰＢＳで希釈し、この抗体溶液と０〜１０μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製した抗原溶液を等量混合し、ビスフェノールＡハプテンを固相した抗体価測定用プレートに５０μｌ／ウエルずつ分注して、３７℃で２時間反応させた。検討に用いた抗原はビスフェノールＡとその構造類似物質であるTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、１時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。抗原を添加していないサンプルの吸光度を１００％として、各抗原の阻害率を算出し交差反応性の評価を行った。その結果、ビスフェノールＡと選択的反応し、他の構造類似物との反応性が低いクローンとして３Ｂ９、５Ｇ９、１０Ｅ５、１７Ｂ４、の４クローンを選定した。
【００５０】
実施例７  各モノクローナル抗体の有機溶媒耐性評価及びハイブリドーマの選定有機溶媒を含有した条件で各モノクローナル抗体を反応させ、どの程度の有機溶媒中での反応性評価を行った。まず各抗体を１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲になるようにＰＢＳで希釈し、この抗体溶液と０〜１００μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製したメタノール水溶液を等量混合し、ビスフェノールＡハプテンを固相した抗体価測定用プレートに５０μｌ／ウエルずつ分注して、３７℃で２時間反応させた。Tween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、1時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。メタノールを含有していないサンプルの吸光度を１００％として、各メタノール濃度での抗原結合活性を算出した。図１にその結果を示した。３Ｂ９、１０Ｅ５、１７Ｂ４の抗原結合活性は、４０％メタノール濃度においても、それぞれ５３％、８２％、８８％であり、いずれも５０％以上の抗原結合活性を有していた。５Ｇ９については、４０％メタノール共存下での抗原結合活性は１％であった。
【００５１】
実施例８  各モノクローナル抗体のサブクラスの決定
各モノクローナル抗体のサブクラスはMouse MonoAB ID KIT（Zymed社製）を用いて決定した。タイピングした結果、５Ｇ９抗体のサブクラスはＩｇＧ2bであり、３Ｂ９抗体、１０Ｅ４抗体、１７Ｂ４抗体のサブクラスはいずれもＩｇＧ1であった。
【００５２】
実施例９  メタノール存在下での直接競合法によるビスフェノールＡ量の測定
各モノクローナル抗体を用いて直接競合法によるビスフェノールＡ量測定を検討した。またこの測定系でのメタノールの影響も同時に検討した。結果をそれぞれ図２、図３、図４、図５に示した。
【００５３】
直接競合法で使用したペルオキシダーゼ標識ビスフェノールＡは以下の方法により作製した。まず西洋ワサビペルオキシダーゼ１００ｍｇ(２．５μmol)を１００mmolのリン酸緩衝液(ｐＨ８．０) ４ｍｌに溶解した後、３ｍｌの無水ＤＭＦを添加しペルオキシダーゼ溶液とした。次いで本溶液中に１ｍｌのＤＭＦに溶解したイミドエステル化ビスフェノールＡ  １１ｍｇ(０．０２５mmol)を徐々に添加し、２５℃で１８時間攪拌し反応を行った。反応終了後、モノエタノールアミン２．５ｍｌを添加し、２５℃で２時間攪拌を行い残存する活性エステルをブロックした後、ＰＢＳに対して透析を行い、ペルオキシダーゼ標識ビスフェノールＡを得た。
【００５４】
直接競合法は以下の方法により行った。まず各抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体２５０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解し９６ウエルマイクロプレートに１００μｌ／ウエルになるよう分注し、３７℃、２時間インキュベートし抗体の固相化を行った。抗体溶液を除去後、０．０５％ Tween20を含むＰＢＳにて３回洗浄し、５倍希釈のブロッキング溶液(ナカライテスク製)を３００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗体固相化プレートを作製した。
【００５５】
次に上記のペルオキシダーゼ標識ビスフェノールＡを５ｎｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈し、０．５ｍｌずつ試験管に分注した。この標識抗原溶液に０〜６０％濃度のメタノールを含むＰＢＳで０〜１０μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製したビスフェノールＡ溶液を０．５ｍｌ添加し、この混合溶液を上記の抗体固相化プレートに５０μｌ／ウエルずつ分注して、２５℃で１時間反応させた。反応後、Tween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果からもわかるように、実施例７で有機溶媒耐性の高かった３クローンについては、０〜４０％濃度のメタノールを含有した状態で２〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲でビスフェノールＡの量を測定することができたが、３Ｂ９については、メタノール濃度が高くなるにつれ測定感度が大きく低下することがわかった。環境試料を測定する場合、固相抽出等の前処理工程により試料を濃縮するが、濃縮後はメタノール等の有機溶媒に置換されているため、有機溶媒に耐性を有することは大きなメリットであると言える。
【００５６】
実施例１０  メタノール存在下での直接競合法による交差反応性評価
有機溶媒耐性の高かった３クローンについて、５０％メタノール存在下で直接競合法によるビスフェノールＡ及びビスフェノールＡ構造類似物の反応性を検討した。抗原はビスフェノールＡ及びビスフェノールＡの構造類似物質であるフェノール、p-tert-butyl phenolの計３種類を用いた。抗原液はサンプル０〜５０％濃度のメタノールを含むＰＢＳで０〜１０μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製し、他は実施例９に記載の方法に従い、反応性の検討を行った。結果をそれぞれ図６、図７、図８に示した。３Ｂ９抗体、１０Ｅ５抗体、１７Ｂ４抗体のいずれも、ビスフェノールＡの測定が可能な範囲では構造類似物であるフェノール、 p-tert-butyl phenolとはほとんど反応しなかった。
【００５７】
【発明の効果】
上述したように、本発明のモノクローナル抗体は有機溶媒に対する耐性を有することから、有機溶媒存在下でも高感度でビスフェノールＡを測定することができ、環境分析等に広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各モノクローナル抗体のメタノール耐性を示す図である。
【図２】３Ｂ９抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図３】１０Ｅ５抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図４】１７Ｂ４抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図５】５Ｇ９抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図６】３Ｂ９抗体のメタノール存在下での交差反応性を示す図である。
【図７】１０Ｅ５抗体のメタノール存在下での交差反応性を示す図である。
【図８】１７Ｂ４抗体のメタノール存在下での交差反応性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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