(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１からなる群から選択される、ＴＴウイルスに特異的なプローブまたはプライマー。
【請求項２】
前記プローブまたはプライマーが、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、および配列番号６３からなる群から選択される、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項３】
前記プローブまたはプライマーが、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、および配列番号６７からなる群から選択される、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項４】
前記プローブまたはプライマーが、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１からなる群から選択される、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項５】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルから抽出した核酸と１）配列番号６０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と１）配列番号６２および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマー対は工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出して、前記試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在を示す工程
を包含する、試験サンプル中に存在し得る標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在の検出法。
【請求項６】
前記工程（ａ）のプライマー対が、配列番号６０および配列番号６１からなり、前記工程（ｂ）のプライマー対が、配列番号６２および配列番号６３からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルから抽出した核酸と１）配列番号６４および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と１）配列番号６６および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマー対は工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出して、前記試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在を示す工程
を包含する、試験サンプル中に存在し得る標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在の検出法。
【請求項８】
前記工程（ａ）のプライマー対が、配列番号６４および配列番号６５からなり、前記工程（ｂ）のプライマー対が、配列番号６６および配列番号６７からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルから抽出した核酸と１）配列番号６８および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と１）配列番号７０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマー対は工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出して、前記試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在を示す工程
を包含する、試験サンプル中に存在し得る標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在の検出法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）のプライマー対が、配列番号６８および配列番号６９からなり、前記工程（ｂ）のプライマー対が、配列番号７０および配列番号７１からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列に特異的なプライマー対を含むコンテナと、（ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる）
（ｂ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列に特異的なプライマー対を含むコンテナ（ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６２および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる）
を包含する試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の検出用試験キット。
【請求項１２】
前記工程（ａ）のプライマー対が、配列番号６０および配列番号６１からなり、前記工程（ｂ）のプライマー対が、配列番号６２および配列番号６３からなる、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１３】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列に特異的なプライマー対を含むコンテナと、（ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６４および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる）
（ｂ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列に特異的なプライマー対を含むコンテナ（ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６６および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる）
を包含する試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の検出用試験キット。
【請求項１４】
前記工程（ａ）のプライマー対が、配列番号６４および配列番号６５からなり、前記工程（ｂ）のプライマー対が、配列番号６６および配列番号６７からなる、請求項１３に記載の試験キット。
【請求項１５】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列に特異的なプライマー対を含むコンテナと、（ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６８および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる）
（ｂ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列に特異的なプライマー対を含むコンテナ（ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号７０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる）
を包含する試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の検出用試験キット。
【請求項１６】
前記工程（ａ）のプライマー対が、配列番号６８および配列番号６９からなり、前記工程（ｂ）のプライマー対が、配列番号７０および配列番号７１からなる、請求項１５に記載の試験キット。
【請求項１７】
（ａ）ドナーとなる可能性があるヒトまたは動物由来の標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる組織または器官の生体サンプルから抽出した核酸と配列番号６０および配列番号６１に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と配列番号６２および配列番号６３に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマー対は工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出する工程
を包含し、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在は前記生体サンプルおよび前記組織または器官におけるＴＴＶ感染を示す、組織または器官の移植または異種移植前の組織または器官におけるＴＴＶ感染の決定法。
【請求項１８】
（ａ）ドナーとなる可能性のあるヒトまたは動物由来の標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる組織または器官の生体サンプルから抽出した核酸と配列番号６４および配列番号６５に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と配列番号６６および配列番号６７に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマー対は工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出する工程
を包含し、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在が前記生体サンプルおよび前記組織または器官におけるＴＴＶ感染を示す、組織または器官の移植または異種移植前の組織または器官におけるＴＴＶ感染の決定法。
【請求項１９】
（ａ）ドナーとなる可能性のあるヒトまたは動物由来の標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる組織または器官の生体サンプルから抽出した核酸と配列番号６８および配列番号６９に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と配列番号７０および配列番号７１に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマー対は工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出する工程
を包含し、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在が前記生体サンプルおよび前記組織または器官におけるＴＴＶ感染を示す、組織または器官の移植または異種移植前の組織または器官におけるＴＴＶ感染の決定法。
【請求項２０】
前記生体サンプルが血液、組織、および器官からなる群から選択される、請求項１７、請求項１８、または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルから抽出した核酸と配列番号６０および配列番号６１に記載のプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と配列番号６２および配列番号６３からなる群から選択される少なくとも１つのＴＴＶプローブとを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマープローブは工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出して、前記試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在を示す工程
を包含する、試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在の検出法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのプローブが検出可能なシグナル発生化合物と結合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能なシグナル発生化合物が、化学発光化合物、フルオレセイン、および酵素からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのプローブが抗体に結合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルから抽出した核酸と配列番号６４および配列番号６５に記載のプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と配列番号６６および配列番号６７からなる群から選択される少なくとも１つのＴＴＶプローブとを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマープローブは工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出して、前記試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在を示す工程
を包含する、試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在の検出法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのプローブが検出可能なシグナル発生化合物と結合している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出可能なシグナル発生化合物が、化学発光化合物、フルオレセイン、および酵素からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのプローブが抗体に結合している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルから抽出した核酸と配列番号６８および配列番号６９に記載のプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と配列番号７０および配列番号７１からなる群から選択される少なくとも１つのＴＴＶプローブとを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマープローブは工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出して、前記試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在を示す工程
を包含する、試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在の検出法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのプローブが検出可能なシグナル発生化合物と結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出可能なシグナル発生化合物が、化学発光化合物、フルオレセイン、および酵素からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのプローブが抗体に結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルから抽出した核酸と１）配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、および配列番号７０からなる群から選択されるプライマーおよび２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させ、該標的ＴＴＶヌクレオチド配列を増幅して増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列を生じる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列と１）配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、および配列番号７０からなる群から選択されるプライマーおよび２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ここにおいて前記ＴＴＶプライマー対は工程（ａ）の前記増幅された標的ＴＴＶヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、前記標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含む増幅産物を生じる）
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出して、前記試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在を示す工程
を包含する、試験サンプル中に存在し得る標的ＴＴＶヌクレオチド配列の存在の検出法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、ＴＴウイルスおよびその使用法に関する。より詳細には、本発明は、ＴＴウイルスの検出に有用な核酸プライマー、ＴＴウイルスのベクターとしての使用、ヒトおよび動物診断用のＴＴウイルスの使用、および移植または異種移植前の試験用のＴＴウイルスの使用に関する。さらに、本発明は、個体間のウイルス伝染の監視手段としてのＴＴウイルス配列の多様性の使用を含む。
【０００２】
（発明の背景）
最近、日本人の特発性肝炎患者（イニシャルＴ．Ｔ．）の血清から、新規のヒトＤＮＡウイルスが単離された（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７）。ＰＣＲを用いて、非Ａ型患者からＧＢＶ−Ｃ肝炎患者までの５人中３人の血清中からＴＴウイルス（ＴＴＶ）が検出された。次いで、より感度の高いＰＣＲアッセイによる血清中のウイルスの検出により、３７３９塩基を含むＴＴＶゲノムのほぼ完全なヌクレオチド配列が報告された（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）。さらに、二本鎖特異的でなく一本鎖特異的なエンドヌクレアーゼへの感受性に基づくと、このウイルスは一本鎖ＤＮＡゲノムを有しているようである。ゲノムサイズ、一本鎖であること、および界面活性剤耐性に関するデータにより、ＴＴＶはパルボウイルスに類似することが示唆された（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）。しかし、ＣｓＣｌ中の浮遊密度（１．３１〜１．３２ｇ／ｍｌ）は、パルボウイルスについて報告されたものより低かった。
【０００３】
種々の集団中のこのウイルスの蔓延率を評価するために、いくつかのＰＣＲ研究が行われている。Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）に記載の１つのアッセイにより、血友病患者（６８％）、静脈内薬物中毒者（４０％）、血液透析維持患者（４６％）、および特発性肝炎および／または慢性肝疾患患者（４６〜４８％）にＴＴＶ  ＤＮＡが検出された。さらに、日本人の正常な血液ドナーのＴＴＶ感染は、１２％であることが見出された。英国におけるＴＴＶ感染率は、２つのプライマーセットを用いて１．９％（１０００人の血液ドナー中１９人）（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）およびＯｋａｍｏｔｏ（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）のＰＣＲストラテジーを用いて１０％（３０人の健常コントロール中３人）（Ｎａｏｕｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、３５２、１９５〜１９７、１９９８）であることが最近報告されている。これらの両レポートは、後天性非経口伝染ウイルスの危険性のある患者（２７〜３９％）および／または肝炎患者（１９〜２２％）におけるＴＴＶ  ＤＮＡを特定した。これらの研究により、ＴＴＶは血液または血液産物を介して伝染し、特発性肝炎のいくつかの症例にも関連し得ることが示唆される。
【０００４】
上記のＴＴＶの疫学的予備的研究では、いくつかの異なる第１世代のＰＣＲプライマー対が利用された。Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中））は、２つの第１世代のＴＴＶＰＣＲプライマーセットの感受性を比較して、大部分のＴＴＶ陽性サンプルが２つのプライマーセットのうちの１つのみによって検出されたことを示した。したがって、１つのＰＣＲプライマー対を利用した以前の報告では、真のウイルス蔓延率を有意に過小評価していたかもしれない。ＴＴＶについての第２世代のＰＣＲアッセイにより、ＴＴＶ蔓延率の過小評価が確認されたようである。特に、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）によって記載されたアッセイよりも１０〜１００倍感度の高いＴａｋａｈａｓｈｉらによって記載されたＰＣＲアッセイ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１２、２３３〜２３９、１９９８）により、通常の集団検診のために日本の病院に訪れた１００人の健常な個体中９２人にＴＴＶの存在が認められた。したがって、正常な日本人におけるＴＴＶ蔓延率は、最初に報告された１２％よりもはるかに高いようである。
【０００５】
正常な集団における高いＴＴＶキャリア率は、排他的非経口伝染経路と適合し得ない。感染したヒトの糞便中のＴＴＶの存在を示した研究により、糞便−経口伝染経路の可能性が示唆された（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１２８〜１３２、１９９８）。さらなる非腸管外感染経路により、健常な個体の高いＴＴＶ蔓延率を説明することができよう。最後に、限定的な蔓延率の研究および正常な集団における高いＴＴＶの割合（Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８、８３９〜８４２、１９９８、Ｎａｏｕｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、３５２、１９５〜１９７、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、３５２、１９１〜１９４、１９９８）に基づくと、ＴＴＶ感染とヒト肝炎との間に関連があるかどうかは疑わしい。
【０００６】
試験サンプル中に存在するＤＮＡ標的ヌクレオチド量は微量であるので、試験サンプル中のＴＴＶの検出を、プライマーとしてＤＮＡオリゴマーを使用するＤＮＡ増幅アッセイの使用によって増強することができる。試験サンプル中に存在し得る標的核酸配列の増幅および検出法は、当該分野で周知である。このような方法には、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼ連鎖反応、欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−３２０  ３０８に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−４３９  １８２号および米国特許第５，４２７，９３０（本明細書中に参照して取込まれる）に記載のギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）、国際特許公開第ＷＯ９３／２０２２７号に記載の多重ＬＣＲなどが含まれる。これらの方法は、医学診断分野ならびに遺伝学、分子生物学、および生化学分野で広範に適用されている。
【０００７】
ＴＴＶ由来のＤＮＡオリゴマープライマー、およびこのプライマーを使用した診断薬および試験キットを得るのは有益であろう。このようなプライマーは、より正確なＴＴＶ感染の検出およびウイルスの伝染経路の追跡能力を非常に向上させることができる。
【０００８】
ウイルス検出の利点に加えて、ウイルスは、培地でのクローン化遺伝子の発現および遺伝子治療による疾患治療法の開発用のベクターとして役立つ潜在能力を有する。ベクターとして開発されたウイルスには、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８、９７から１２９、１９９２、およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５、７９３〜８０１、１９９４を参照のこと）、アデノウイルス（例えば、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５７、２６４〜２７４、１９８６およびＢｅｒｋｎｅｒ  Ｋ．Ｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６、６１９〜６２９、１９８８を参照のこと）、ヘルペスウイルス（例えば、Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．、３、２０３〜２１８、１９９１およびＷｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１、３７９〜３８４、１９９２を参照のこと）、およびパルボウイルス（例えば、Ｇｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１０２、２７５〜２８３、１９８８およびＭｉｌａｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４、１５５１〜１５６０、１９８４を参照のこと）などのＤＮＡゲノムを有するもの、ならびに修飾レトロウイルス（例えば、Ｇａｚｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６０、１９〜２８、１９８６およびＰａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、１０５５〜１０５９、１９８７を参照のこと）などのＲＮＡゲノムを有するものが含まれる。
【０００９】
ＴＴＶなどの小さなゲノムを有するＤＮＡウイルスは、典型的には、比較的少数のタンパク質をコードし、ほとんどの複製および発現機能を宿主に依存するので、宿主とのその相互作用の複雑さは減少される。さらに、ある正常なヒト集団のほぼ１００％にＴＴＶが存在していることが証明されているので、ＴＴＶ感染は、いずれの疾病も伴わないようである。その高い蔓延率は、多数の株による同時感染により示唆されるように、感染は容易に起り、再感染は一般的であることを示唆している。これら全ての特性は、無併発性であり、非病原性であり、および容易に伝達され、複数の治療に潜在能力を有し、長期間維持されるべきである遺伝子治療用のベクターに望ましい。
【００１０】
多数のＴＴＶゲノムの比較により、高い配列多様性および地理的局在化の明らかな喪失が示されている。これは、レプリカーゼの低い忠実度による高い変異率または広範な進化による変化を受けた祖先ウイルスファミリーのいずれかを意味する。ＨＩＶの研究者は、疫学的研究の基本としておよびある個体から別の個体へのウイルス感染の特定の伝染を示すために、その配列多様性を使用している。同様に、ＴＴＶの多様性は、一次感染経路および個体間の接触を示すことを意図する有利な調査法（法医学など）の確立の一助となり得る。
【００１１】
全ての米国特許および刊行物は、その全体がここに参照して取込まれる。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、ＴＴウイルス（ＴＴＶ）に特異的なプライマーまたはプローブを含む。これらのプライマーまたはプローブを、配列番号２９、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１に示す。上記群内で特に興味あるものは、配列番号６０〜７１である。
【００１３】
さらに、本発明は、試験サンプル中に存在し得るＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在の検出法を含む。この方法は、（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルと１）配列番号６０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させて産物が作製される反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物と１）配列番号６２および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、ここにおいて前記選択プライマーのヌクレオチド配列は前記（ａ）の反応混合物の産物とハイブリッド形成し、（ｃ）前記試験サンプル中のＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含する。工程（ａ）のプライマー対は、例えば配列番号６０および配列番号６１からなり、工程（ｂ）のプライマー対は、例えば配列番号６２および配列番号６３からなる。
【００１４】
さらに、本発明はまた、（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルと１）配列番号６４および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させて産物が作製される反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物と１）配列番号６６および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、ここにおいて前記選択プライマーのヌクレオチド配列は前記（ａ）の反応混合物の産物とハイブリッド形成し、（ｃ）前記試験サンプル中のＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含する、試験サンプル中に存在し得るＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在の検出法を含む。工程（ａ）のプライマー対は、例えば配列番号６４および配列番号６５からなり、工程（ｂ）のプライマー対は、例えば配列番号６６および配列番号６７からなる。
【００１５】
さらに、本発明はまた、試験サンプル中に存在し得るＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在の検出法を含む。この方法には、（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルと１）配列番号６８および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させて産物が作製される反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物と１）配列番号７０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、ここにおいて前記選択プライマーのヌクレオチド配列は前記（ａ）の反応混合物の産物とハイブリッド形成し、（ｃ）前記試験サンプル中のＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含する。工程（ａ）のプライマー対は、例えば配列番号６８および配列番号６９からなり、工程（ｂ）のプライマー対は、例えば配列番号７０および配列番号７１からなる。上記のいずれの方法においても、試験サンプルをヒトまたは動物から単離することができるので、この方法はヒトおよび動物の診断目的で使用することができる。
【００１６】
さらに、本発明は、（ａ）ＴＴＶ標的ヌクレオチドに特異的なプライマー対を含むコンテナと、ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなり、
（ｂ）ＴＴＶに特異的なプライマー対を含むコンテナと、ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６２および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる、試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド検出用試験キットを含む。工程（ａ）のプライマー対は、例えば配列番号６０および配列番号６１からなり、工程（ｂ）のプライマー対は、例えば配列番号６２および配列番号６３からなる。
【００１７】
本発明はまた、（ａ）ＴＴＶ標的ヌクレオチドに特異的なプライマー対を含むコンテナと、ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６４および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなり、（ｂ）ＴＴＶに特異的なプライマー対を含むコンテナと、ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号６６および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる、試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド検出用試験キットを含む。工程（ａ）のプライマー対は、例えば配列番号６４および配列番号６５からなり、工程（ｂ）のプライマー対は、例えば配列番号６６および配列番号６７からなる。
【００１８】
さらに、本発明は、（ａ）ＴＴＶ標的ヌクレオチドに特異的なプライマー対を含むコンテナと、例えば前記プライマー対は、１）配列番号６８および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなり、（ｂ）ＴＴＶに特異的なプライマー対を含むコンテナと、ここにおいて前記プライマー対は、１）配列番号７０および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなる、試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチド検出用試験キットを含む。工程（ａ）のプライマー対は、例えば配列番号６８および配列番号６９からなり、工程（ｂ）のプライマー対は、例えば配列番号７０および配列番号７１からなる。いずれの試験サンプルもヒトまたは動物から単離することができる。
【００１９】
さらに、本発明はまた、１）プロモーター、２）異種ＤＮＡ配列、および３）ＴＴＶをコードするヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列のフラグメント、または前記ヌクレオチド配列もしくは前記フラグメントの相補物を含み、前記異種ＤＮＡ配列は、前記プロモーターに機能的に連結している、ＴＴＶに基づくベクターを含む。プロモーターは、ＴＴＶまたは異種供給源に由来し得る。異種ＤＮＡ配列は、標的化ＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列をコードし得る。例えば、異種ＤＮＡ配列はタンパク質をコードし得る。ベクターを、前記異種ＤＮＡ配列の安定な維持または発現のために、ＴＴＶ粒子中に包入することができる。
【００２０】
本発明はまた、上記ベクターを含む宿主細胞を含む。宿主細胞は、真核細胞であり得る。
【００２１】
さらに、本発明は、宿主中で異種ＤＮＡ配列または前記異種ＤＮＡ配列によってコードされる産物の発現法であって、前記異種ＤＮＡ配列またはそれによってコードされる産物の発現に十分な条件下で、前記宿主にベクターを一過性に移入する工程を包含する方法を含む。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）ＴＴＶを有する個体から生体サンプルを得る工程と、（ｂ）前記生体サンプルからＴＴＶ  ＤＮＡ配列を単離する工程と、（ｃ）ＴＴＶを有する第２の個体から生体サンプルを得る工程と、（ｄ）前記第２の個体の生体サンプルからＴＴＶ  ＤＮＡ配列を単離する工程と、（ｅ）前記第１の個体のＴＴＶ  ＤＮＡ配列と前記第２の個体のＴＴＶ  ＤＮＡ配列とを比較する工程とを包含し、前記第１の個体のＤＮＡ配列と前記第２の個体のＤＮＡ配列の同一性はある個体から別の個体へのＴＴＶ伝染を示す、ある個体から別の個体へのＴＴＶの伝染の検出法を含む。
【００２３】
本発明はまた、（ａ）潜在的なドナー動物由来のＴＴＶ標的ヌクレオチド配列を含むと疑われる生体サンプルと配列番号６０および配列番号６１に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物と配列番号６２および配列番号６３に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、（ｃ）前記試験サンプル中のＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含し、前記ヌクレオチドの存在は前記生体サンプルおよび前記組織または器官におけるＴＴＶ感染を示す、組織または器官の移植または異種移植前の組織または器官におけるＴＴＶ感染の決定法を含む。
【００２４】
本発明はまた、（ａ）潜在的なドナー動物由来のＴＴＶ標的ヌクレオチド配列を含むと疑われる生体サンプルと配列番号６４および配列番号６５に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物と配列番号６６および配列番号６７に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ｃ）前記試験サンプル中のＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含し、前記ヌクレオチドの存在は前記生体サンプルおよび前記組織または器官におけるＴＴＶ感染を示す、組織または器官の移植または異種移植前の組織または器官におけるＴＴＶ感染の決定法を含む。
【００２５】
さらに、（ａ）潜在的なドナー動物由来のＴＴＶ標的ヌクレオチド配列を含むと疑われる生体サンプルと配列番号６８および配列番号６９に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物と配列番号７０および配列番号７１に記載のＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ｃ）前記試験サンプル中のＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含し、前記ヌクレオチドの存在は前記生体サンプルおよび前記組織または器官におけるＴＴＶ感染を示す、組織または器官の移植または異種移植前の組織または器官におけるＴＴＶ感染の決定法。
【００２６】
さらに、本発明は、（ａ）標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルと配列番号６０および配列番号６１に記載のプライマー対とを接触させて、反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物と配列番号６２および配列番号６３からなる群から選択される少なくとも１つのＴＴＶプローブとを接触させる工程と、（ｃ）前記試験サンプル中の前記標的ＴＴＶヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含する、試験サンプル中の標的ＴＴＶヌクレオチドの存在の検出法を含む。本方法のさらに別の実施形態では、試験サンプルを、配列番号６４および配列番号６５に記載のプライマー対と接触させ、得られた反応混合物を配列番号６６および配列番号６７からなる群から選択される少なくとも１つのＴＴＶプローブと接触させることができる。さらに別の実施形態では、試験サンプルを、配列番号６８および配列番号６９に記載のプライマー対と接触させ、得られた反応混合物を配列番号７０および配列番号７１からなる群から選択される少なくとも１つのＴＴＶプローブと接触させることができる。上記の実施形態では、少なくとも１つのＴＴＶプローブを、検出可能なシグナル発生化合物と結合させることができる。このような化合物は、化学発光化合物、フルオレセイン、および酵素からなる群から選択される。あるいは、ＴＴＶプローブを、いずれかの抗体と結合させることができる。
【００２７】
本発明はまた、標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルと１）配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、および配列番号７０からなる群から選択されるプライマーおよび２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマーからなるＴＴＶプライマー対とを接触させて産物が作製される反応混合物を形成させる工程を含む。別の実施形態では、本方法はさらに、ａ）前記反応混合物と１）配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、および配列番号７０からなる群から選択されるプライマー、ここにおいて前記選択プライマーのヌクレオチド配列は前記反応混合物の産物とハイブリッド形成し、および２）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１からなる群から選択されるプライマー、ここにおいて前記選択プライマーのヌクレオチド配列は前記反応混合物の産物とハイブリッド形成し、からなるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、ｂ）前記試験サンプル中のＴＴＶ標的ヌクレオチドの存在を検出する工程とを包含する、試験サンプル中に存在し得るＴＴＶ標的ヌクレオチドの検出法を含む。
【００２８】
本発明は、新規のＴＴウイルス（ＴＴＶ）ＤＮＡオリゴマーのプライマーおよびプローブを提供する。これらのＤＮＡプライマーおよびプローブを、配列番号６０〜７１に示す。
【００２９】
本発明はまた、（ａ）標的ＴＴＶ  ＤＮＡ配列を含むと疑われる試験サンプルと、配列番号６０および配列番号６１の対、その後の配列番号６２および配列番号６３の対または配列番号６４および配列番号６５の対、その後の配列番号６６および配列番号６７の対、または配列番号６８および配列番号６９の対、その後の配列番号７０および配列番号７１からなる群から選択されるＴＴＶプライマー対とを接触させる工程と、（ｂ）前記試験サンプル中の標的ＤＮＡの存在を検出する工程とを包含する、試験サンプル中のＴＴＶの存在の同定アッセイを提供する。ＴＴＶプライマーを、シグナル発生化合物と結合させることができる。このシグナル発生化合物を、化学発光化合物、フルオレセイン、および酵素からなる群から選択することができる。反応を、固相で行うことができる。各プライマーを、アダマンタンおよびカルバゾールなどの異なるハプテンと結合させることができる。
【００３０】
また、（ａ）ＴＴＶプライマーを含むコンテナ、ここにおいて前記プライマーは、配列番号６０および配列番号６１の対、その後の配列番号６２および配列番号６３の対または配列番号６４および配列番号６５の対、その後の配列番号６６および配列番号６７の対、または配列番号６８および配列番号６９の対、その後の配列番号７０および配列番号７１からなる群から選択され、および（ｂ）検出試薬を含むコンテナを含む、試験サンプル中の標的ＴＴＶ  ＤＮＡの検出用試験キットを提供する。ＴＴＶプライマーを、シグナル発生化合物と結合させることができる。このシグナル発生化合物を、化学発光化合物、フルオレセイン、および酵素からなる群から選択することができる。反応を、固相で行うことができる。各プライマーを、アダマンタンおよびカルバゾールなどの異なるハプテンと結合させることができる。
【００３１】
培地または遺伝子治療におけるクローン化遺伝子の発現用のベクターを構築するための、ＴＴＶゲノムまたはその一部の使用も提唱している。ベクターは、修飾または野生型のいずれかのウイルスゲノムからなり得る。これはまた、複製起点、特異的遺伝子、プロモーター、またはＴＴＶ配列自体または非ＴＴＶ配列との組み合わせによる他の調節エレメントなどのゲノムの部分からなり得る。ベクターファミリーもまた提唱される。このファミリーは、以前に感染した宿主の再感染を防止する可変領域以外の同一の配列からなるものであろう。この可変領域は、共有の免疫性を示さないＴＴＶ単離物由来のエピトープをコードし得るので、多数のまたは延長された治療プロトコールが可能になる。
【００３２】
個体間のウイルス伝染を追跡するための追跡マーカーとしてのＴＴＶゲノムの多様性の使用をさらに提供する。このような追跡可能性は、疫学的または法医学的研究に使用される。
【００３３】
（図面の簡単な説明）
図１は、リョクトウヌクレアーゼに対するＴＴＶゲノムの感受性を示す図である。コントロールＭＢＮ消化物中に存在する一本鎖プラスミドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖プラスミドＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の対数コピー数を表示している。
【００３４】
図２は、ＴＴＶ環状ゲノムを示す図である。（Ａ）はＮｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．が記載したＮ２２クローン配列（灰色のボックス）、Ｎ２２から上流（ｕ１）および下流（ｄ１）にわたるアンカーＰＣＲ伸長クローン、固定ＰＣＲ産物に重複する逆ＰＣＲ産物（ｕｄ）、およびＧＨ１中に同定された１１３個のヌクレオチド配列（斜交平行線模様のボックス）を示し、（Ｂ）は、分析された最初の２６０塩基（実施例５）、ゲノム伸長中に得られたアンプリコン（細線）、および変換されたＯＲＦの適切な位置および方向を示す。
【００３５】
図３は、１５７個のＴＴＶヌクレオチド配列間で認められた２つ一組のゲノムの距離の分布を示す図である。
【００３６】
図４は、１６３個のＴＴＶ単離物由来の２６０個のヌクレオチドのコンセンサス系統樹（無根）を示す図である。ゲノム群を、遺伝子型１、２、および３、ならびにサブタイプ２．１および２．２と示す。１人の個体から単離された配列を小文字ａ、ｂ、またはｃの後に単離数を用いて示す。地理的命名（ＡＲ、アルゼンチンン；ＥＧ、エジプト；ＧＥ、ギリシャ；ＧＨ、ガーナ；ＪＡ、日本；ＮＬ、オランダ；ＮＺ、ニュージーランド；ＵＳ、合衆国）およびデータの１０００の再サンプリング用の節でのブートストラップ値を示す。
【００３７】
図５は、５０の位置での分析のスライディングウィンドウ内の７個の全長ＴＴウイルスヌクレオチド配列のアラインメントをプロットした同一性％を示す。点線は分析した全長の平均同一性を示す。
【００３８】
図６は、７つの全長および４つのほぼ全長ＴＴウイルスヌクレオチド配列のアラインメントから作製した無根系統樹を示す図である。ブートストラップ値を、データの１０００の再サンプリングについての適切な節の付近に示し、遺伝子型１ａ、１ｂ、および３を示す。
【００３９】
図７は、実施例７に記載のＴＴウイルスプライマーの保存セットで作製してＴＴウイルス配列の遺伝子群を示す系統樹を示す図である。ヒト単離物（ガーナ、ＧＨ；日本、ＪＡ；Ｈ、血友病、合衆国、ＵＳ）、非ヒト単離物（ウシ、Ｂ；ニワトリ、Ｃ；Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ＣＨ；ブタ、Ｐ；Ａｏｔｕｓ  ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ、ＯＷ；ヒツジ、Ｓ；Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｌａｂｉａｔｕｓ、Ｔ）、およびブートストラップ値を示す。
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規ＤＮＡオリゴマーのプライマーおよびプローブ、これらのプライマーおよび／またはプローブの使用法、これらのプライマーおよび／またはプローブを含む試験キット、ならびにヒトおよび動物中のＴＴＶ標的ヌクレオチド配列の存在を決定するための診断的方法に関する。核酸ベクターとしてのＴＴＶヌクレオチド配列の使用、移植または異種移植前の試験用のＴＴＶヌクレオチド配列の使用、および個体間のＴＴＶ伝染経路の決定用のマーカーとしてのＴＴＶヌクレオチド配列の使用もまた提供する。
【００４１】
より詳細には、ＴＴＶ由来のヌクレオチド配列の一部は、試験サンプル中のＴＴＶの存在の決定および天然に存在する変異型の単離用のプライマーまたはプローブとして有用である。これらの配列はまた、ＴＴＶゲノム内にコードされるＴＴＶ抗原のポリペプチド配列を入手可能にし、診断試験の基準もしくは試薬および／またはワクチン成分として有用なポリペプチドの生産を可能にする。ＴＴＶゲノムの他の部分の単離および配列決定も、これらの核酸配列由来のプライマーおよび／またはプローブを利用してＴＴＶのさらなるプライマー、プローブ、およびポリペプチドの確立によって行うことができ、これは、予防薬および治療薬の両方として、ＴＴＶの診断および／または治療に有用である。これらの核酸プライマーおよびプローブを、配列番号５２〜５９および６７〜７１として示す。これらのプライマーおよびプローブを、配列保存性の高い領域中のＴＴＶ配列またはその相補物とハイブリッド形成させる。したがって、これらのプライマーおよびプローブを、プライマーのミスマッチによって複製が失敗した類似性の低いＴＴＶ配列（および偽陰性アッセイの結果）を特異的かつ有効に増幅するためのＰＣＲアッセイに使用することができる。
【００４２】
本発明はまた、ＴＴＶ由来のポリヌクレオチドの存在および／または量の検出用に使用することができる試薬を含む試験キットを提供する。試験キットは、例えば、バイアルまたはボトルなどの１つまたは複数のコンテナ（各コンテナは核酸プライマー、プローブ、または核酸プライマーまたはプローブのカクテルなどを含む）を含み得る。当業者に公知の緩衝液、コントロールなどの他の成分を、このような試験キットに含めることができる。
【００４３】
本明細書中で使用される、用語「ＴＴウイルス」または「ＴＴＶ」は、ウイルス種、弱毒化株、またはそれ由来の不完全干渉粒子を集合的に示す。このウイルスは、ヒト同士の接触（性的感染、気道、および非経口経路）または静脈内薬物の使用を介して伝染し得る。本明細書中に記載の方法によってＴＴＶ感染個体の同定を可能にする。本明細書中に記載のように、ＴＴＶゲノムはＤＮＡからなっている。ＴＴＶのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の分析によって、この群のウイルスはＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅファミリーと類似するが異なるゲノム編制を有することが明らかとなっている。Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅと似て、ＴＴＶは一本鎖環状ＤＮＡゲノムを含む非エンベロープウイルスである。しかし、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた核酸または推定アミノ酸配列の比較に基づくと、ＴＴＶはＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅのメンバーと類似の配列を示さず、ＴＴＶビリオンおよびゲノムはＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅで見出されたゲノムよりはるかに大きいことに留意すべきである。したがって、上記と照らして、本発明の目的では、ＴＴＶをＣｉｒｃｉｎｏｖｉｒｉｄａｅのファミリーまたは属に割り当てた。
【００４４】
用語「類似性」および／または「同一性」を、本明細書中では、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の関連性の程度を記載するために使用する。アミノ酸配列の「類似性」および／または「同一性」の決定技術は当該分野で周知であり、これには、例えば、アミノ酸配列の直接的同定および本明細書中で得られた配列との比較；ＴＴＶのゲノム物質のヌクレオチド配列の決定およびそれにコードされるアミノ酸配列の決定、および対応する領域の比較が含まる。一般に、「同一性」は、核ゲノムの適切な位置でのＴＴＶのヌクレオチド配列および別の株のヌクレオチド配列またはＴＴＶのアミノ酸配列および別の株のアミノ酸配列の正確な適合を意味する。また、一般に、「類似性」は、適切な位置でのＴＴＶのアミノ酸および他の株のアミノ酸の適合を意味し、アミノ酸が同一であるかまたは電荷または疎水性などの科学的および／または物理的性質を保有する。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン９（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、５３７１１で市販）において入手可能なプログラム、例えばＧＡＰプログラムは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方を計算することができる。特に、ＧＡＰプログラムは、ギャップ作製およびギャップ伸長のためにヌクレオチドアラインメントについてそれぞれ５０および３のデフォルトペナルティーを設定し、ギャップ作製およびギャップ伸長のためにアミノ酸アラインメントについてそれぞれ１２および４にデフォルトペナルティーを設定した、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８、４４３〜４５３、１９７０）のアルゴリズムを使用する。ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、２４４４４〜２４４８、１９９８）およびＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３〜４１０、１９９０）などの２つの配列間の同一性および類似性についての他の計算プログラムが、当該分野で公知である。
【００４５】
さらに、ＴＴＶ株同定におけるいくつかのパラメーターを単独または組み合わせて利用可能である。例えば、現在、ＴＴＶ株は好ましくは約６０％またはそれ以上、より好ましくは約８０％またはそれ以上遺伝的に関連すると考えられているので、ＴＴＶ株間のゲノムの全ヌクレオチド配列同一は、約４５％またはそれ以上であると予想される。
【００４６】
また、ＴＴＶ株は好ましくは約４０％またはそれ以上、より好ましくは約６０％またはそれ以上、さらにより好ましくは約８０％またはそれ以上遺伝的に関連すると考えられているので、ＴＴＶ株間のゲノムのアミノ酸レベルでの全ヌクレオチド配列同一は、約４５％またはそれ以上であると予想される。さらに、少なくとも約１３個のヌクレオチドの対応する連続配列が存在し、これは、１つを超える連続配列の組み合わせによって得ることができる。
【００４７】
指定の配列、例えば、ＴＴＶ  ＤＮＡ、またはＴＴＶゲノム「由来の」ポリヌクレオチドは、少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド、示されたヌクレオチド配列の領域に対応する配列、および類似する配列、または相補的な配列をいう。好ましくは、ポリヌクレオチド由来領域の配列は、ＴＴＶゲノムに固有の配列に類似するか、相補的である。ＴＴＶゲノムに固有の配列に類似するか、相補的であるかどうかを、当業者に公知の技術で同定することができる。例えば、データバンクの配列との比較を、指定の配列の唯一性の同定法として使用することができる。配列が由来し得る領域には、特異的エピトープをコードする領域および非翻訳および／非転写領域が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
誘導されたポリヌクレオチドは、ＴＴＶのヌクレオチド配列に必ずしも物理的に由来しないが、ポリヌクレオチドが誘導される領域中の塩基配列から得られる情報に基づいた任意の方法（化学合成、逆転写または転写の複製が含まれるが、これらに限定されない）で作製することができる。さらに、指定配列領域に対応する領域の組み合わせにより、意図する用途に一致する当該分野で公知の方法で修飾することができる。
【００４９】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、および「オリゴヌクレオチド」を、本明細書中では交換可能に使用する。本明細書中で使用される、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。この用語は、分子の一次構造についてのみいう。したがって、この用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが含まれる。これはまた、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャップ形成のいずれかによる修飾ならびに未修飾形態が含まれる。
【００５０】
「ＤＮＡに対応する配列を含むＴＴＶ」は、ＴＴＶが指定のＤＮＡ中の配列に類似するか相補的なポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。ＤＮＡに対する類似度または相補度は、約５０％またはそれ以上、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％である。対応する配列は、少なくとも約７０個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約８０個のヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも約９０個のヌクレオチド長である。ＴＴＶとＤＮＡとの間の対応を当該分野で公知の方法によって同定することができ、これには、例えば、配列決定した物質と記載したＤＮＡとの直接的比較、またはハイブリッド形成および一本鎖ヌクレアーゼでの消化およびその後の消化フラグメントのサイズ同定が含まれる。
【００５１】
「精製ウイルスポリヌクレオチド」は、このウイルスポリヌクレオチドが天然において伴っているポリペプチドを本質的に有しない、すなわち、約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含む、ＴＴＶゲノムまたはそのフラグメントをいう。ウイルスポリヌクレオチドの精製技術は当該分野で周知であるが、例えば、カオトロピック剤を用いた粒子の破壊ならびにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度による沈殿によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分離が含まれる。したがって、「精製ウイルスポリペプチド」は、このウイルスポリペプチドが天然において伴っている細胞成分を本質的に有しない、すなわち、約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含む、ＴＴＶポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。精製法は、当業者に公知である。
【００５２】
本明細書中で使用される、「ポリペプチド」は、アミノ酸の分子鎖を示すが、産物の特定の長さをいわない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。しかし、この用語は、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）をいうことを意図しない。
【００５３】
用語「読み取り枠」または「ＯＲＦ」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域をいい、この領域は、コード配列の一部または全コード配列を示し得る。
【００５４】
「コード配列」は、適切な制御配列の調節下で存在する場合、ｍＲＮＡに転写され、そして／またはポリペプチドに翻訳される、ポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界を、５’末端での翻訳開始コドンおよび翻訳３’末端での終止コドンによって特定する。コード配列には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
用語「〜と免疫学的に同一な」は、指定のポリペプチド（通常、ＴＴＶタンパク質）中に存在し、かつ固有であるエピトープおよびポリペプチドの存在をいう。免疫学的同一性を、抗体結合および／または結合の競合によって同定することができる。これらの技術は当業者に公知であり、本明細書中にも記載されている。エピトープの唯一性を、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列についてＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）などのデータバンクのコンピュータ検索および他の公知のタンパク質とのアミノ酸配列の比較によって同定することもできる。
【００５６】
本明細書中で使用される、「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。おそらく、エピトープは、エピトープに固有の空間的配置で３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、通常、少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。空間的配置の試験法は当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。
【００５７】
本明細書中で使用される、用語「個体」は、脊椎動物、特に、哺乳動物種のメンバーをいい、家畜、競技用動物、霊長類、およびヒトを含むが、これらに限定されない。より好ましくは、この用語はタマリン、チンパンジー、およびヒトをいう。
【００５８】
本明細書中で使用される、用語「プラス鎖」（または「＋」）は、ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を示す。用語「マイナス鎖」（または「−」）は、「プラス」鎖と相補的な配列を含む核酸を示す。
【００５９】
「正鎖ゲノム」ウイルスは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかで、ゲノムが一本鎖であり、ウイルスポリペプチドをコードすることを意味する。
【００６０】
「負鎖ゲノム」ウイルスは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかで、ゲノムが一本鎖であり、「プラス」鎖と相補的であることを意味する。
【００６１】
用語「試験サンプル」は、分析物（目的の抗体、目的の抗原、または目的のポリヌクレオチドなど）の供給源である個体の体内成分をいう。これらの成分は、当該分野で周知である。これらの試験サンプルには、本明細書中に記載の本発明の方法によって試験することができる生体サンプルが含まれ、ヒトおよび動物の体液（全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液）および気道、腸管、および尿生殖器管の種々の外分泌液、涙、唾液、ミルク、白血球、骨髄腫など；細胞培養上清などの生物学的流動物；固定組織検体；および固定細胞検体が含まれる。
【００６２】
「精製ＴＴＶ」は、通常ウイルスが伴う細胞成分および感染組織に存在し得る他のウイルス型から単離されたＴＴＶの調製物をいう。ウイルスの単離技術は当業者に公知であり、例えば、遠心分離およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【００６３】
「固相」（「固体支持体」）は当業者に公知であり、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリップ、メンブラン、ラテックス粒子などの微粒子、ヒツジ（または他の動物）の赤血球、ジュラサイトなどが含まれる。「固相」は重要ではなく、当業者が選択することができる。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、メンブラン、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の適切な動物）の赤血球、およびジュラサイトは全て適切な例である。適切な捕獲試薬の固相への適切な固定法には、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用などが含まれる。本明細書中で使用される、用語「固相」は、不溶性の任意の物質をいうか、その後の反応によって不溶性にさせることができる。固相を、捕獲試薬を引きつけて固定するその固有の能力について選択することができる。あるいは、固相は、捕獲試薬を引きつけて固定したさらなるレセプターを保持することができる。さらなるレセプターは、捕獲試薬自体または捕獲試薬に結合した荷電基質について反対の電荷を帯びた荷電基質を含み得る。あるいは、レセプター分子は、固相に固定（結合）して特異的結合反応によって捕獲試薬を固定する能力を有する任意の特異的結合メンバーであり得る。レセプター分子は、アッセイ前またはアッセイ中の固相物質への捕獲試薬の間接的結合が可能である。したがって、固相は、プラスチック、誘導プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターの壁、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の適切な動物）の赤血球、ジュラサイト、および当業者に公知の他の構造物であり得る。
【００６４】
固相はまた、抗体またはポリヌクレオチドの通過に十分な空隙率および抗原またはポリヌクレオチドが結合するための適切な表面親和性を有する任意の適切な多孔質物質も含み得ることが意図され、これらは本発明の範囲内である。一般に、細孔隙構造が好ましいが、水和状態のゲル構造を有する物質をウェルとして使用することができる。このような有用な固体支持体には、以下が含まれるが、これらに限定されない：天然高分子炭水化物およびその合成修飾物、架橋もしくは置換誘導体（寒天など）、架橋アルギン酸。置換および架橋グアールガム、セルロースエステル、硝酸およびカルボン酸を特異的に含むセルロースエステル、混合セルロースエステル、およびセルロースエーテル；窒素を含む天然高分子；適切な多孔質構造物（ビニルポリマー）で調製することができる合成高分子；アルカリ金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩などのの多孔質無機物質（硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ金属およびアルカリ土類金属（アルミニウムおよびマグネシウム）のケイ酸塩など）；およびアルミニウムまたはケイ素の「酸化物または水和物（クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、またはガラス（これらの物質を上記の高分子物質のフィルターとして使用することができる）など）；および上記クラスの混合物またはコポリマー（現存の天然高分子に対する合成ポリマーの重合の開始によって得られるグラフトコポリマーなど）。これらの全物質を、フィルム、シート、ビーズ、またはプレートなどの適切な形態で使用することができ、これらを紙、ガラス、プラスチックフィルム、または布などの適切な不活性キャリアにコートまたは結合させるかラミネートすることができる。
【００６５】
ニトロセルロースの多孔質構造は、広範な種々の試薬に対して優れた吸収および吸着特性を有する。ナイロンもまた類似の特徴を有し、適切である。上記のこのような多孔質固体支持体は、約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態であることが好ましいことが意図される。孔径は、広範囲で変化してよく、好ましくは、約０．０２５〜１４ミクロン、特に約０．１５〜１５ミクロンである。このような支持体の表面を、支持体に抗原、抗体、またはポリヌクレオチドを共有結合させる化学的処理によって活性化することができる。抗原または抗体が不可逆的に結合されるが、これは一般に、あまり理解されていない疎水力による多孔質物質編吸着による。適切な固体支持体は、米国特許第５，０７５，０７７号にも記載されている。
【００６６】
「指示試薬」は「シグナル発生化合物」（「標識」ともいう）を含み、これは、ＴＴＶの特異的結合メンバーに結合（付着）した外的手段によって検出可能な測定可能シグナルを発する。本明細書中で使用される、「特異的結合メンバー」は、特異的結合対のメンバーを意味する。すなわち、第１の分子が化学的または物理的手段で第２の分子に特異的に結合した２つの異なる分子である。ＴＴＶの特異的結合対の抗体メンバーであることに加えて、指示試薬はまた、任意の特異的結合ペア（ビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターまたはレセプター分子、酵素の穂因子および酵素、酵素インヒビターまたは酵素など）のメンバーであり得る。さらに、特異的結合対には、元の特異的結合メンバーのアナログ（例えば、分析物アナログ）であるメンバーを含み得る。免疫反応性特異的結合メンバーは、抗体またはそのフラグメント、抗原またはそのフラグメント、または抗体／抗原複合体（サンドイッチアッセイとしてのＴＴＶ、競合アッセイにおける捕獲試薬、または間接的アッセイにおける付随的特異的メンバーのいずれかに結合する組換えＤＮＡ分子によって形成されたものを含む）であり得る。
【００６７】
意図される種々の「シグナル発生化合物」（標識）には、色素原、触媒（酵素など）、発光化合物（フルオレセインおよびローダミンなど）、化学発光化合物（ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム、およびルミノールなど）、放射性同位元素、および直接的視覚標識が含まれる。酵素の例には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが含まれる。特定の標識の選択は重要ではないが、それ自体または１つまたは複数のさらなる物質との組み合わせによってシグナルを発生することができる。
【００６８】
用語「検出標識」は、検出することができる性質または特徴を有する分子または部分をいう。検出標識は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア、ケミルミノフォア、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子などを用いて直接検出することができるか、例えば、特異的結合メンバーを用いて間接的に標識を検出することができる。直接的標識は、例えば、標識を検出することができる基質、誘発試薬、光などのさらなる成分が必要であり得ることが理解される。間接的標識を検出に使用する場合、典型的には、結合物と組み合わせて使用する。「結合物」は、典型的には、検出標識に直接付着または結合した特異的結合メンバーである。固相試薬の合成と類似して、結合物合成用のカップリング化学物質が当該分野で周知であり、例えば、特異的結合メンバーの特異的結合能力または標識の検出能力を破壊しない任意の化学的手段および／または物理的手段を含み得る。
【００６９】
本明細書中で使用される、用語「ハプテン」は、抗体に結合するがキャリアタンパク質に結合しない限り抗体形成を惹起しない部分的抗原または非タンパク質結合メンバーをいう。ハプテンの例には、ビオチン、アビジン、アダマンタン、およびカルバゾールが含まれる。
【００７０】
本明細書中で使用される、用語「分析物」は、試験サンプル中に存在し得る検出されるべき物質である。分析物は、天然に存在する特異的結合メンバー（抗体など）であるが、特異的結合メンバーを調製することができる（ポリヌクレオチドなど）任意の物質であり得る。したがって、分析物は、アッセイにおける１つまたは複数の特異的結合メンバーに結合することができる物質である。「分析物」には、標的ヌクレオチド配列および任意の抗原性物質（ハプテンなど）、抗体、およびその組み合わせも含まれる。特異的結合対のメンバーとして、分析物を、天然に存在する特異的結合パートナー（対）（ビタミンＢ１２の同定用の特異的結合対のメンバーとしての固有の因子タンパク質の使用、葉酸同定用の葉酸結合タンパク質の使用、または炭水化物同定用の特異的結合対のメンバーとしてのレクチンの使用など）によって検出することができる。分析物には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的などを含み得る。
【００７１】
欧州特許出願第０３２６１００号および同第０４０６４７３号に記載の負電荷ポリマーを使用した固定可能な反応複合体の固定用のイオン捕獲を利用した実施形態を、本発明にしたがって使用して、迅速な液相免疫化学反応を行うことができる。固定可能な免疫複合体を、反応混合物の残存物から、負電荷のポリアニオン／免疫複合体と予め処理した正電荷の多孔質基質との間のイオン相互作用によって分離し、上記の種々のシグナル発生系（欧州特許公開第０２７３１１５号に記載の化学発光シグナル測定法に記載のもの）の使用によって検出する。
【００７２】
また、本発明の方法を、固相が微粒子（磁性または非磁性）を含む自動および半自動系に含まれる微粒子技術を利用する系での使用に適用することができる。このような系には、公開欧州出願番号第０４２５６３３号および同第０４２４６３４号にそれぞれ対応する米国特許第５，２４４，６３０号、同第５，０８９，４２４号に記載の系が含まれる。
【００７３】
分析物検出に走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を適用可能である。走査プローブ顕微鏡では、特に原子間力顕微鏡では、捕獲相を固相に接着させ、走査プローブ顕微鏡を使用して固相の表面上に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。走査トンネル顕微鏡の使用により、通常、抗原／抗体複合体の検出に多くの免疫アッセイ系を使用しなければならない標識の必要性が排除される。このような系は、米国特許出願第０７／６６２，１４７号（現在放棄）に記載されている。
【００７４】
ＴＴＶ群のウイルスを全ＴＴＶに共通の合成、組換え、または天然のプライマーまたはプローブ（「普遍」プライマーまたはプローブと呼ぶ）の使用によるアッセイにおいて検出することができることが意図され、これは本発明の範囲内である。ＴＴＶゲノム由来の異なる合成、組換え、または天然のプライマーまたはプローブをアッセイに使用することができることもまた本発明の範囲内である。このようなアッセイ形態は当業者に公知であり、上記に記載されている。
【００７５】
基本として単離ＴＴＶ核酸配列の同定部分を使用して、約８個のヌクレオチドまたはそれ以上のオリゴマーを、切り出しまたは合成のいずれかによって調製することができ、これは、ＴＴＶゲノムとハイブリッド形成する。このようなオリゴマーは、ウイルス因子の同定、ウイルスゲノムのさらなる特徴づけ、ならびに罹患した個体におけるウイルスの検出に有用である。ＴＴＶポリヌクレオチドの天然または誘導プライマーまたはプローブは、固有のウイルス配列が検出可能な長さである。６〜８個のヌクレオチドが実行可能な長さであるが、１０〜１２個のヌクレオチド配列が好ましく、約２０個のヌクレオチド配列が最も好ましいであろう。これらの配列を、好ましくは、異種遺伝子を欠く診断キットにプライマーまたはプローブをパッケージングすることができる。これらのプライマーまたはプローブを、自動化オリゴヌクレオチド合成法を含む日常的で標準的な方法を用いて調製することができる。ＴＴＶゲノムの任意の固有の部分の相補鎖は十分である。プライマーまたはプローブとしての使用には完全な相補性が望ましいが、プライマーまたはプローブの長さの増加は必要ではないであろう。
【００７６】
診断薬として使用する場合、分析される試験サンプル（血液または血清など）を、サンプルに含まれる核酸の抽出などのために処理することができる。サンプル由来の得られた核酸を、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−βレプリカーゼ、ＮＡＳＢＡなどの増幅技術に供することができる。
【００７７】
プライマーまたはプローブはＴＴＶゲノムに完全に相補的にすることができる。したがって、偽陽性を回避するために、通常高度にストリンジェントな条件が望ましい。しかし、プライマーまたはプローブが異種性を欠くＴＴＶゲノムの領域に相補的な場合のみ高度にストリンジェントな条件を使用すべきである。アニーリングのストリンジェンシーは、多数の他の要因（温度、イオン強度、プライマーまたはプローブの強度、およびプライマーまたはプローブ濃度を含む）によって特定する。
【００７８】
ＴＴＶゲノム配列は、比較的低いレベル（例えば、約１０２〜１０３個の配列／ミリリットル）で感染個体の血清中に存在し得ることが意図される。このレベルは、ＬＣＲまたはＰＣＲなどの増幅技術を検出アッセイに使用する必要があり得る。ついで、増幅配列を、当該分野で公知のアッセイなどを用いて検出することができる。プライマーまたはプローブを、プライマーまたはプローブ核酸配列を含む診断キットにパッケージングすることができ、この配列は標識することができるか、プライマーまたはプローブは標識することができず、標識用の成分をキットに含めることができる。キットはまた、適切にパッケージングされた他の試薬および特定の増幅プロトコール（例えば、アッセイを行うための基準および説明）に必要であるか望ましい物質を含むことができる。
【００７９】
本明細書中で使用することができる公知の他の増幅技術には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７、１８７４〜１８７８、１９９０に教示のいわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」技術（Ｎａｔｕｒｅ、３５０、６３１３、９１〜９２、１９９１にも記載されている）、およびＱ−βレプリカーゼ。
【００８０】
ＰＣＲ増幅はまた、本明細書中に記載の試薬を使用してｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＣＲは、遺伝子情報の特定の一部の存在を示すための核酸増幅工程による、生態学的にインタクトな組織、細胞または染色体の獲得が含まれる。これは、細胞の均一化および標的配列の抽出が必要ではないので、細胞集団中の配列の正確な位置および分布が得られる。ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅により、配列を含む細胞に集中した目的の配列を同定することができる。配列を、目的の配列を含む異種細胞集団中の細胞の型およびフラクションも同定することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡを共に検出することができる。
【００８１】
本明細書中に記載のアッセイは、任意のクローン含有ＴＴＶ核酸配列、これらのクローン中のＴＴＶ核酸配列由来の複合体核酸配列、またはこれらのクローン中の核酸配列が由来するＴＴＶゲノム由来の１つのウイルス抗原を使用することができる。または、免疫アッセイは、これらの供給源由来のウイルス抗原を使用することができる。これはまた、例えば、同一のウイルス抗原に指向するモノクローナル抗体または異なるウイルス抗原に指向するポリクローナル抗体を使用することができる。アッセイには、競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づくアッセイが含まれるが、これらに限定されない。アッセイは固相を使用することができ、免疫沈降または固相を使用しない任意の他の方法によって行うことができる。シグナル発生化合物としての標識を使用するアッセイの例は、本明細書中に記載されている。ビオチンおよびアビジン、酵素標識またはビオチン−抗ビオチン系（係属中の米国特許出願バング０８／６０８，８４９号（現在放棄）、０８／０７０，６４７号（現在放棄）、０８／４１８，９８１号（現在放棄）、０８／６８７，７８５号などに記載）の使用によってシグナルを増幅することもできる。
【００８２】
本明細書中に記載の任意の診断アッセイはヒトまたは動物に使用することができることに留意すべきである。例えば、動物（例えば、ヤギ、イヌ、ネコ、ウシ、またはウマ）がウイルスに曝露されたかどうかを決定することが望まれようし、抗ウイルス薬の投与によって作用するかどうかを決定することが望まれよう。さらに、動物にベクターを投与し、遺伝子治療を行うことが望まれよう。動物が多数のヒトと同一の治療要求および物理的条件を有するので、動物およびヒトに対して本明細書中に記載の方法の適用が非常に明白であり、これは、本発明の範囲内である。
【００８３】
ＴＴＶ核酸配列を使用して、ＴＴＶ薬の同定および単離用のＴＴＶゲノム配列に関するさらなる情報を得ることもできることを留意すべきである。したがって、この知識がＴＴＶゲノムの性質、ウイルス粒子の構造、および構成される抗原の性質の特徴づけの一助となることが意図される。同様に、この情報により、さらなるポリヌクレオチドプライマー、ＴＴＶゲノム由来緒ポリペプチド、ＴＴＶ感染の診断および／または治療に有用なＴＴＶエピトープに指向する抗体を得ることができる。
【００８４】
合成オリゴヌクレオチドを、Ｗａｒｎｅｒ、ＤＮＡ、３、４０１，１９８４、に記載の自動化オリゴヌクレオチド合成機などを使用して調製することができる。所望ならば、合成鎖を、標準的な反応条件を用いた３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でのポリヌクレオチドキナーゼでの処理によって３２Ｐで標識することができる。ゲノムまたはライブラリーから単離した鎖を含むＤＮＡ配列を、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０、６４８７、１９８２に記載の部位特異的変異誘発を含む公知の方法によって修飾することができる。簡単に述べれば、修飾するＤＮＡを一本鎖配列としてファージ中にパッケージングし、修飾されるＤＮＡの一部に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、それ自体の配列中に含まれる所望の修飾を有するＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＤＮＡに変換する。ファージの各鎖の複製物を封組む形質転換最近の培養物を、寒天にプレートして、プラークを得る。理論的には、５０％の新規のプラークが変異配列を有するファージを含み、残りの５０％が元の配列を有する。プラークの複製物を未修飾鎖ではない正確な鎖とのハイブリッド形成に適切な温度および条件で標識合成プローブとハイブリッド形成させる。ハイブリッド形成によって同定された配列を回収してクローン化する。
【００８５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、核酸またはその混合物中に含まれる任意の所望の核酸配列（標的）の増幅技術である。ＰＣＲでは、一対のプライマーを過剰に使用して標的核酸の相補鎖の外側の末端にハイブリッド形成させる。プライマーを、テンプレートとして標的核酸を用いたポリメラーゼによってそれぞれ伸長させる。元の標的鎖から分離後、伸長産物は、それ自体が標的配列となる。次いで、ポリメラーゼによって新規のプライマーをハイブリッド形成させ、標的配列分子数を幾何学的に増加させるためにサイクルを繰り返す。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に開示されている。
【００８６】
ＬＣＲは、標的増幅の別の機構である。ＬＣＲでは、２つのセンス（第１および第２）プローブおよび２つのアンチセンス（第３および第４）プローブを標的よりも過剰に使用する。第１のプローブは標的鎖の第１のセグメントとハイブリッド形成し、第２のプローブは標的鎖の第２のセグメントとハイブリッド形成し、第１のプローブが融合産物にライゲートするように第１および第２のセグメントを配置する。さらに、類似のライゲート可能な様式で、第３（第２）のプローブは、第１のプローブの一部とハイブリッド形成することができ、第４（第２）のプローブは第２のプローブの一部にハイブリッド形成することができる。標的が最初から二本鎖である場合、第２のプローブはまた、第１の例の標的相補物にハイブリッド形成する。一旦センスおよびアンチセンスプローブの融合鎖が標的鎖から分離されると、ライゲートし得る第３および第４のプローブにハイブリッド形成して、相補的な第２の融合産物を形成する。融合産物は、標的またはその相補物のいずれかに機能的に等価である。ハイブリッド形成およびライゲーションの反復サイクルによって、標的配列の増幅が行われる。この技術は、欧州特許第３２０，３０８号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ＬＣＲ技術の他の態様は、欧州特許第４３９，１８２号（本明細書中で参考として援用される）に開示されている。
【００８７】
１つの実施形態では、本発明は、一般に、標的ＴＴＶヌクレオチド配列を含むと疑われる試験サンプルとＴＴＶ配列の領域とハイブリッド形成することができる増幅プライマー対を含む増幅反応試薬と接触後、別のプライマーセットで増幅する工程を包含する。（あるいは、プライマー対の使用後、プローブを使用する。）本明細書中に記載の方法を用いたプタイマーおよびプローブを、捕獲および検出ラベルで標識することができる。これは、第１のプライマー対の１つを１つの型の標識で標識し、第２のプライマー対（単独のプローブ）を他の型の標識で標識する。
【００８８】
アンプリコン産物を形成後、これらを、当該分野で公知のように、ゲル電気泳動で検出し、臭化エチジウムで視覚化する。あるいは、標準的な異質アッセイ形式は、プライマー上に存在する検出標識および捕獲標識を使用する検出法に適切である。産物を、捕獲標識によって固相試薬に結合させ、検出標識によって検出することができる。検出ラベルが直接検出可能な場合、固相上の産物の存在を、標識の検出可能なシグナルの発生および必要ならばシグナルの検出によって検出することができる。標識が直接検出可能である場合、一般に直接的に検出可能な標識に結合させた結合メンバーを含む結合物に接触させることができる。結合物が複合体に結合し、複合体上の結合物の存在を、直接的に検出可能な標識で検出することができる。したがって、固相試薬上の産物の存在を同定することができる。当業者は、洗浄工程を使用して非獲得アンプリコンまたはプライマーならびに非結合結合物を洗浄除去することができることを認識する。
【００８９】
試験サンプルは、典型的には、標的配列を含むと疑われるもの全てである。試験サンプルを、個体からの検体の獲得、必要ならば標的核酸を放出させるための配列が含まれる細胞の破壊などによる当該分野で周知の方法論を用いて調製することができる。標的配列を一本鎖として記載しているが、標的配列が実際は二本鎖であるが増幅プライマー配列でのハイブリッド形成前にその相補鎖から単位分離した場合も含まれることも意図される。好ましい方法においてＰＣＲを使用した場合、通常、標的配列の末端は公知である。好ましい方法においてＬＣＲまたはその修正形態を使用する場合、通常全標的配列が既知である。典型的には、標的配列は核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）である。
【００９０】
本明細書中に記載の方法を、サーマルサイクリング反応混合物を使用する周知の増幅反応（特に、ＰＣＲおよびＧＬＣＲ）で使用することができる。増幅反応は、典型的には、プライマーを使用して標的核酸配列のコピーを反復的に作製する。この標的配列は、通常、非常に大きな核酸配列の小さな領域である。プライマー自体が、標的配列領域に相補的な核酸配列である。増幅条件下で、これらのプライマーは、標的配列の相補領域とハイブリッド形成するか結合する。典型的には、標的配列のコピーを、ハイブリッド形成したプライマーに添加し、そして／または隣接するプローブ対をライゲートするためにポリメラーゼ活性またはリガーゼ活性を有する酵素を単独または組み合わせて使用するプライマー伸長および／またはライゲーション工程によって作製する。モノマーまたは予め形成させたオリゴマーとしてプライマーまたはプローブに添加したヌクレオチドはまた、標的配列に相補的である。一旦プライマーまたはプローブが十分に伸長および／またはライゲートすると、これらは例えば反応混合物の相補核酸鎖が分離する「融解温度」への加熱によって標的配列から分離される。したがって、標的配列との配列相補性が形成される。
【００９１】
次いで、任意の二本鎖配列の分離によって新規の増幅サイクルが起こり、プライマーまたはプローブがそのそれぞれの標的とハイブリッド形成し、ハイブリッド形成したプライマーまたはプローブが伸長および／ライゲートし、再分離する。増幅サイクルによって作製される相補配列は、プライマーの伸長または標的配列数をさらに増幅させるための２つのプローブのギャップ充填用のテンプレートとして作用し得る。典型的には、反応混合物は２０回と１００回との間で繰り返され、より典型的には、反応混合物は２５回と５０回との間で繰り返される。サイクル数を、当業者が決定することができる。この様式では、標的配列およびその相補鎖の多数のコピーが作製される。したがって、プライマーは、増幅条件下で存在する場合に標的配列の増幅を開始させる。
【００９２】
一般に、標的鎖およびその相補鎖の一部に相補的な２つのプライマーをＰＣＲで使用する。ＬＣＲでは、一般に、４つのプローブ（２つは標的配列に相補的であり、２つは標的の相補鎖に類似の相補性を示す）を使用する。前記のプライマーセットおよび酵素に加えて、核酸増幅反応混合物はまた、周知の他の試薬を含み、これには、以下が含まれるが、これらに限定されない：マンガンなどの酵素の補因子、マグネシウム、塩、ニコンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（例えば、デオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、およびデオキシチミン三リン酸など）。
【００９３】
典型的には、ＰＣＲプライマー配列またはＬＣＲプローブ配列は、２０個と５０個との間のヌクレオチド長、より典型的には２０個と３０個との間のヌクレオチド長の範囲である。
【００９４】
プライマーおよびプローブの種々の合成法は、当該分野で周知である。同様に、プライマーまたはプローブへの標識の結合法もまた、当該分野で周知である。例えば、これは、従来のヌクレオチドホスホラミダイド化学およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｆｏｒｄ、ＭＡ）から販売されている装置を用いた所望の核酸プライマーまたはプローブを合成するための日常の問題である。本発明のプライマーまたはプローブなどのオリゴヌクレオチドの標識について、多くの方法が記載されている。Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）は共に、オリゴ標識技術を記載し、市販している。例えば、第一級アミンを３’−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ  ＣＰＧＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて３’オリゴ末端に結合させることができる。同様に、第一級アミンをＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ  ＩＩ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて５’オリゴ末端に結合させることができる。アミンを、従来の活性化および架橋化学を使用して種々のハプテンと反応させることができる。さらに、米国特許出願第０８／６２５，５６６（現在放棄）および米国特許第５，２９０，９２５号（本明細書中に参照して取込まれる）は、オリゴのその５’および３’末端それぞれへの標識法を教示している。１９９２年６月２５日に公開された公開ＷＯ９２／１０５０５号は、オリゴのその５’および３’末端それぞれへの標識法を教示している。公知のオリゴヌクレオチド標識法にしたがって、標識−ホスホラミダイド試薬を調製し、これを使用してその合成中に標識をオリゴヌクレオチドに添加する。例えば、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、２９（４６）、５９０５〜５９０８、１９８８またはＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，公開された米国特許出願０７／２４６，６８８号（ＮＴＩＳオーダー番号ＡＰＰＬ−７−２４６，６８８）、１９８９を参照のこと。好ましくは、オリゴの３’および５’末端に標識する。
【００９５】
捕獲標識は、１つまたは複数のプライマー（またはプローブ）が保有し、固相試薬に特異的な結合メンバーを用いて結合対を形成させる特異的結合メンバーであり得る。勿論、１つまたは複数のプライマーおよび／またはプローブ自体が捕獲標識として作用し得ることが理解される。例えば、固相試薬結合メンバーが核酸配列である場合、プライマーまたはプローブの相補部分に結合してプライマーまたはプローブが固相に固定されるように選択することができる。プライマーまたはプローブ自体が捕獲標識として作用する場合、プライマーまたはプローブの少なくとも一部が固相上の核酸配列とハイブリッド形成するように遊離状態である。
【００９６】
一般に、アンプリコンメンバーを、異質免疫アッセイを行うために使用される共通の技術を用いて検出することができる。好ましくは、この実施形態では、市販のＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（登録商標）装置で使用されるプロトコールに従って検出を行う。
【００９７】
本明細書中で開示のプライマーは、典型的なＰＣＲアッセイで有用であり、これは、試験サンプルをプライマー対と接触させ、増幅を行い、ついで、別のプライマー対（またはプローブを使用する）を用いて増幅し、産物を検出する。
【００９８】
本明細書中で提案された別の方法は、細胞培養または遺伝子治療の分野のいずれかでのクローン化遺伝子の発現に適切な核酸ベクター中でのＴＴＶゲノムまたはその一部の使用に関する。多数の供給源由来の核酸配列が組み込まれた広範な種々のキメラＴＴＶベースのベクターが、当業者によって構築可能である。（Ｍａｎｉａｔｉ、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」）。特に、他の所望の性質を付与する核酸配列と組み合わせた特異的ウイルス機能（例えば、複製、発現、ビリオン形成）を担うＴＴＶゲノムの一部を、プラスミドクローンとして増殖させることができる。次いで、目的のＴＴＶ配列を、適切な制限酵素を用いてプラスミドクローンから切り出して、ゲルで精製することができる。次いで、他の所望の性質（複製能力、原核細胞中での選択性）を付与する同様に調製した非ＴＴＶ核酸配列と組み合わせた、ゲル精製ＴＴＶ配列を含むライゲーション反応を行うことができる。次いで、所望のライゲーション産物を、クローン精製し、ＤＮＡ配列決定によって確認することができる。このようなベクター中のＴＴＶの存在量は、２０ヌクレオチドの少なさから完全なＴＴＶゲノムまでの範囲であり得る。さらに、使用したＴＴＶ配列は野生型または市販のｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発キットを用いて修飾して、特異的性質（ベクター容量、複製効率、宿主細胞範囲、伝染など）を変化させても良い。
【００９９】
あるいは、野生型または修飾してベクター容量、複製効率、宿主細胞範囲、伝染などを変化させた全ＴＴＶゲノムを使用することができる。
【０１００】
細胞培養中のＴＴＶの増殖条件に関して、種々の細胞株（例えば、線維芽細胞、肝細胞、ＨｅＬａ細胞）および増殖培地を、ウイルスの増殖能力について試験することができる。さらに、種々の組織中のＴＴＶ「プラス」鎖（すなわち、非ゲノム鎖）の存在についての試験によって、動物およびヒトにおけるＴＴＶ増幅部位を確立するための研究を行うことができる。ベクターが複製および／または伝染についてＴＴＶ配列に依存する場合、この情報は有意である。ベクターが宿主細胞内もしくは細胞間の伝染で複製されない場合、またはこのような情報が他の非ＴＴＶ配列によって得られる場合、このような情報は重要ではない。
【０１０１】
細胞への精製ＤＮＡの形質転換またはマイクロインジェクションを含む当業者に公知の一般的ないくつかの方法によって、細胞培養物へのベクターの移入を行うことができる。同様に、動物またはヒトへのベクターの投与を、いくつかの方法によって行うことができる。精製ベクターＤＮＡまたは感染ビリオンを、生物に直接注射することができる（例えば、筋肉内または静脈内注射）。あるいは、予めベクターを移入した細胞（上記）を生物に注射するか、感染性ビリオンを、粘膜を介して移入することができる（例えば、肺のライニングを介したエアロゾル形態）。
【０１０２】
ＴＴＶに基づいたベクターの潜在的な適用は、既に使用されているベクターと同一である。これには、有用なタンパク質（ワクチンまたは診断試験用の抗原など）の細胞培養による産生および臨床または研究に価値のある酵素が含まれる。欠陥遺伝子の置換（例えば、高コレステロール血症のＬＤＬレセプターへの置換）（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７、２２３〜２３２、Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、「Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＬＤＬ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ」、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、５、４５７〜４６０）またはヤギのヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｄａｖｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、「Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  ａ  Ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｇｏｕｔ（ＨＰＲＴＡＳＨＶＩＬＬＥ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４、５２０〜５２５）の遺伝子治療（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２、「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、８０８〜８１３）は、ＴＴＶベースのベクターで治療可能なほんの数例の条件（Ｓｃｈｗａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、「Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ」、Ｉｎｔｅｒｎｉｓｔ、３０、５４７〜５５５）である。
【０１０３】
本明細書中で使用される、用語「ベクター」は、他の核酸配列にライゲートして、これらの配列に以下のいくつかまたはすべてを付与することができる核酸をいう：細胞への移入能力、細胞内での複製能力、細胞内での発現能力、または細胞間での伝染能力。
【０１０４】
密接に関連するＴＴＶベクターファミリーも提案する。このファミリーのメンバーは、主に、宿主の免疫系によって認識されるエピトープをコードするＴＴＶゲノムの領域内で変化して、このベクターの排除をもたらす。各ベクターのエピトープコード領域は、ベクターファミリーの任意の他のメンバーと免疫性を共有しないＴＴＶ単離物由来である。このような非交叉反応性ＴＴＶ単離物の存在は、ヒトにおける同時感染および高い蔓延レベルを示すことにより強く示唆される。実験的に感染させたチンパンジーで検出可能なＴＴＶの出現および消滅、ならびにヒトにおける第２ラウンドを首尾よく反復するためのＤＮＡウイルスベースの遺伝子治療の共通の非能力は、免疫性が潜在的関心事であることを示唆している。したがって、上記のベクターパネルを使用して最初のベクターに対して免疫性を示した個体の治療を維持または反復することができよう。
【０１０５】
ＴＴＶゲノムの高度な配列多様性に依存するさらなる方法を提案する。この方法では、ＴＴＶゲノムＤＮＡを、２人またはそれ以上の個体から単離し、部分的または全てを増幅して配列決定する。次いで、既知の高度な可変性領域についての配列の比較を行う。さらに、正確なまたはほぼ正確な核酸配列を有する２つの単離物の機会を最小にするように、領域は十分に巨大であるべきである。ＴＴＶ配列が別の配列と類似するほど、関連する個体は共通の供給源から感染されたか、ある個体が他の個体から感染したかのいずれかであろう。したがって、高レベルの既存のＴＴＶ感染集団においてさえ、社会集団内または調節された条件下でのＴＴＶの特異的な伝染様式について研究を行うことができる。
【０１０６】
この情報は、疫学的観点から有用であるだけでなく、法医学などの分野への適用もある。この実施形態では、ＴＴＶゲノム配列を使用して、個体間の以前の接触および伝染様式に依存し接触がどんな性質であるかを確立することができる。特に、既存のデータにより、ＴＴＶは非経口の曝露によって伝染し得ることが示唆される。（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、１〜１６、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８、Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中）、１９９９）。さらに、糞便サンプル中で検出されたＴＴＶの存在（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１２８〜１３２，１９９８）により、このウイルスは、糞便−経口経路でも蔓延することが示唆される。さらに、他の伝染経路（例えば、性的接触またはエアロゾル）が可能であることが考えられる。これらの可能性に取り組むために、さらなる研究が必要である。勿論、どのようにＴＴＶが蔓延したのかとは関係なく、現在同定された単離物（実施例５）から留意される高度な配列多様性レベルは、ヒトの間での感染を確証するためにＴＴＶゲノムの可変性を使用することができることを意味する。例えば、ＴＴＶは非経口で伝染するので、静脈内薬物中毒者は汚染した針を共有しているかどうかを潜在的に同定することができる。同様に、ＴＴＶが性的に伝染する場合、２個体間の何ヶ月も前の性的接触をＴＴＶ配列の比較によって潜在的に示すことができる。したがって、ＴＴＶウイルスを、法医学的目的で使用することができる。
【０１０７】
さらに、ＴＴＶアッセイが有用であることを証明することができる別の領域は異種移植である。異種組織移植片が現在の器官供与不足の解決の一助となり得るにもかかわらず、移植器官由来のウイルスの人獣共通伝染病の可能性が考えられる（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０、５３９〜５４２、１９９８）。特に、移植組織中の動物ウイルスの存在により、移植片拒絶が起こり得るか、移植レシピエントの免疫抑制状態のために疾患の悪化および死を招き得る。したがって、組織供与用の無ＴＴＶ動物の同定は賢明であろう。したがって、実施例７に詳述のアッセイと類似のものを使用した潜在的な器官ドナーのＴＴＶのスクリーニング法は本発明の範囲内である。血清または血漿中のゲノムＴＴＶが陽性の動物を、適切な場合、可能なドナーとして拒絶することができる。
【０１０８】
本発明は、実施例によって説明されるが、これは例示であって、本発明の精神および範囲の制限を意味しない。
【０１０９】
実施例
実施例１
ＴＴＶの非ヒト霊長類への伝染
いくつかの研究により、非経口伝染ウイルス感染の危険がある個体において高いＴＴＶの蔓延率が認められており、これは、ＴＴＶウイルスは血液および／または血液産物によって伝染可能であることを示唆する。しかし、現在までの文献にはＴＴＶ伝染の症例は報告されていない。ＴＴＶが伝染可能な因子であるかどうかを調査するために、ＴＴＶが非経口で伝染し得る場合、ＴＴＶ感染が公知の慢性非Ａ−ＧＢＶ−Ｃ型肝炎患者由来の血清または血漿を、チンパンジーに静脈内接種した。
【０１１０】
Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、Ｔｅｘａｓにて、非ヒト霊長類伝染研究を行った。全ての動物を、承認された施設でヒトの治療および霊長類の倫理的な使用のための全ての関連する要求を満たすプロトコールにしたがって、維持および監視した。肝臓特異性酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）についての赤血球の基底レベルを確立した。動物に、慢性非Ａ−Ｅ型肝炎と診断された個体由来のＴＴＶ含有ヒト血清または血漿を接種し、一週間に２回上記の肝臓特異的酵素の血清レベルについて監視した。チンパンジー（ＣＨ３１４）に患者Ａ由来の２０ｍｌのヒト血漿を接種し、チンパンジー３０６（ＣＨ３０６）に患者Ｂ由来の２．０ｍｌのヒト血清を接種した。
【０１１１】
ＴＴＶウイルス血症を、最初にＳｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８に記載された、修飾プライマーセットを使用するネステッドＰＣＲによって同定した。第１ラウンドのプライマーはＡ５４３０（配列番号１）および修飾Ａ５４２７プライマー（配列番号２）であり、第２ラウンドのプライマーは、Ａ８７６１（配列番号３）であり、Ａ５４３２（配列番号４）を第１ラウンドの増幅で使用した。ＰＣＲでは、製造者の説明のように、ＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて１００μｌのチンパンジー血清から抽出した全核酸を使用した。核酸をエタノール沈殿し、２５μｌの水に懸濁させた。第１ラウンドのＰＣＲは、２０μｌの反応体積中４μｌの抽出核酸を使用した。第１ラウンド（４５サイクル）および第２ラウンド（４０サイクル）増幅のサイクリング条件は、９４℃１分間、９４℃／２０秒間、５５℃／３０秒間、７２℃／３０秒間、および７２℃／５分間の最終伸長。産物を、アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム蛍光での視覚化を行った。ヒト接種材料中のＴＴＶのおよその力価を、抽出した拡散の連続２倍希釈物の作製および上記のＰＣＲの実施によって同定した。
【０１１２】
糞便物質を、ＰＢＳ（１５％ｗ：ｖ）中に懸濁し、渦巻撹拌して、３０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を清潔なチューブに入れ、８０００×ｇ、４℃、５分間遠心分離にかけた。核酸を、ＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔを用いて得られた２００μｌの上清から抽出した。核酸をエタノール沈殿し、１５μｌの水に再懸濁した。上記のように、ＴＴＶ  ＰＣＲを行った。
【０１１３】
２０ｍｌの第１の患者由来の血漿（およそのＴＴＶ力価：２×１０３ゲノムコピー／ｍｌ）を、チンパンジー３１４（ＣＨ３１４）に接種した。２ｍｌの第２の患者由来の血清（およそのＴＴＶ力価：２×１０３ゲノムコピー／ｍｌ）を、チンパンジー３０６（ＣＨ３０６）に接種した。接種後２８日目〜９３日のＣＨ３１４血清中にＴＴＶ  ＤＮＡが検出された（ＰＩ、表１）。
【０１１４】
【表１】
0004087569.tif 000002
【０１１５】
１２１日目と２２６日ＩＰとの間にサンプルを利用できなかったので、ウイルス血症の持続時間は不明である。しかし、２２６日目以後に回収した血清は陰性である。開始から１４９日目のＰＩでＣＨ３０６血清にＴＴＶ  ＤＮＡが検出され、２１９日目ＰＩまで陽性が継続するが、この時点ではウイルスＤＮＡは検出不可能になった。ＣＨ３１４と比較して（１４９日目対９３日目ＰＩ）、ＣＨ３０６におけるその後のＴＴＶウイルス血症の出現は、使用した接種材料の体積および力価がより低くなったことによるであろう。接種から１３３〜１７５日後にわたるＣＨ３０６の糞便サンプルから抽出した核酸を、ネステッドＰＣＲによってＴＴＶについて試験したが、ＴＴＶ  ＤＮＡは検出されなかった。したがって、ＴＴＶは、（ａ）ＣＨ３０６の糞便中に出ないか、（ｂ）試験した時間枠中の糞便中に存在しないか、または（ｃ）検出限界未満である。ヒト接種材料および対応するチンパンジーレシピエント中に存在するＴＴＶ配列は、１００％同一であることが認められ、２つのヒト接種材料由来のＴＴＶ  ＰＣＲ産物の配列は９１％だけ同一であった（データ示さず）。供給源とレシピエントの間の完全なＴＴＶの保存により、ＴＴＶ感染はその対応する接種材料に由来することが示されたので、接種材料の感染性およびウイルスの非経口伝染性を示すことが証明された。チンパンジーは肝炎のいかなる生化学的または組織学的証拠を示さなかった。
【０１１６】
実施例２
ＴＴＶの生物物理学的特徴づけ
ＴＴＶウイルスのさらなる特徴づけを行うために、Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．およびＯｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．の研究（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）を、ウイルスの生物物理学的特徴づけにより拡大して繰り返した。本発明のデータによりＤＮＡゲノムの一本鎖性が確認され、これにより、ＴＴＶは環状であり、以前に考えられていたような線状ではないことが強く示唆される。さらに、鎖特異的プローブを用いたヌクレアーゼ保護アッセイにより、ＴＴＶは負の鎖ゲノムを保有していることが示唆される。
【０１１７】
実施例２．１  ＴＴＶ粒子サイズの評価
推定ビリオンのおおよそのサイズを同定するための濾過研究に、パルボウイルスＢ１９含有ヒト血清（１０６ウイルス粒子）と組み合わせた５０μｌのＴＴＶ陽性血清を使用した。サンプルをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１．０ｍｌに希釈し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間スピンした。上清を、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、３０ｎｍ、および１５ｎｍに孔サイズを順次減少させた１３ｍｍポリカーボネートフィルター（Ｃｏｓｔａｒ）で連続的に濾過した。０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（１００μｌ）を、使用前に全てのフィルターで濾過した。濾過していない血清および得られた濾過物のアリコート（１００μｌ）を、ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用い、製造者の指示にしたがって、全核酸を抽出した。ＴＴＶおよびＢ１９配列を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）および各抽出サンプルを使用したＰＣＲ（最終反応体積２０μｌ）によって検出した。ＴＴＶプライマーは、実施例１に記載のものであった（配列番号７および８）。パルボウイルスＢ１９プライマーは、Ｂ１９−正方向（配列番号９）およびＢ１９−逆方向（配列番号１０）であった。反応物を、９４℃で８分間、その後９４℃／２０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒を４０サイクルに加熱し、その後７２℃で３分間の最終伸長を行った。第１ラウンドの産物のアリコートおよび同一のプライマー（Ｂ１９、配列番号５および６）またはネステッドプライマー（ＴＴＶ、配列番号３および４）のいずれかを用いて上記のように第２ラウンドの増幅を行った。産物を、アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム蛍光によって視覚化した。
【０１１８】
予想通り、パルボウイルスＢ１９粒子（直径１８ｎｍ〜２２ｎｍと報告されている包膜で被覆していない、一本鎖ＤＮＡウイルス）は、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、および３０ｎｍの濾過物で検出されたが、１５ｎｍの濾過物では検出されなかった。ＴＴＶは、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍの濾過物で検出されたが、３０ｎｍの濾過物では検出されなかった。したがって、ＴＴＶウイルスは、３０ｎｍと５０ｎｍとの間の粒子直径で血清中に存在するようである。
【０１１９】
実施例２．２  ＴＴＶ浮遊密度の同定
ＴＴＶウイルス（２０μｌ）またはパルボウイルスＢ１９（２０μｌ、約２ｎｇ  Ｂ１９  ＤＮＡ）を含むヒト血清を混合し、４℃の１４，０００×ｇで１５分間、遠心分離した。上清を合わせ、１１．５ｍｌ  ＣｓＣｌ（１．３０２ｇ／ｍｌ）と混合した。３５，０００ｒｐｍ（１５０，０００×ｇ）、６℃で６５分間のＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１Ｔｉローターでの遠心分離によって等密度勾配を作製した。各勾配の下部から画分（約８００μｌ）を回収し、屈折率を測定して密度を同定し、各画分の２００μｌをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＤ）を用いて全核酸を抽出した。１／１０の単離核酸を、製造者の指示にしたがったＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたＰＣＲによってＴＴＶまたはＢ１９について試験した。ＰＣＲ反応（２０μｌ）につき、１μＭのプライマー（ＴＴＶ：配列番号７および８、Ｂ１９：配列番号９および１０）を使用した。反応物をサーモサイクラー（９４℃で９分間、その後９４℃／２０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒を４０サイクル、その後７２℃で１０分間の最終伸長）に供し、各反応由来の１０μｌをアガロースゲル電気泳動で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に毛細管現象によって移し、アンプリコン特異的３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリッド形成によって視覚化した。
【０１２０】
勾配画分のＰＣＲ分析により、密度１．３１〜１．３４ｇ／ｍｌの画分中にＴＴＶが存在した（データ示さず）。これは、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）が報告したＣｓＣｌ浮遊密度と類似する。それに対して、パルボウイルスＢ１９は、密度１．３８〜１．５１ｇ／ｍｌの画分で認められなかった（データ示さず）。したがって、ＴＴＶは、パルボウイルスＢ１９よりも有意に低い浮遊密度を有する。
【０１２１】
実施例２．３  ＴＴＶゲノムの一本鎖の性質の証明
ＴＴＶゲノムが一本鎖であるか二本鎖であるかを調査するために、ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＵＳＢ）を用いて得た血清核酸を、最終濃度１．０Ｕ／μｌのリョクトウヌクレアーゼ（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＢＡ）（体積１０μｌ）と３０℃で処理した。１０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．９）を添加して、サンプルを９９℃に５分間加熱した。次いで、サンプルを、ＰＣＲ反応混合物で１００μｌに希釈して１×濃縮物を作製し、ＴＴＶ特異的プライマー（配列番号１１および１２）を用いて３５サイクル（９５℃で２０分間、５５℃で３０秒、５２℃で３０秒）で増幅した。次いで、配列番号１３および１２を用いた５μｌの第１ラウンドの産物を用いて、ヘミネステッドＰＣＲ反応を行った。ＴＴＶ陽性および陰性血清の両方を試験し、ＴＴＶ由来の１．３ｋｐｂのインサートを含む二本鎖プラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および同一のプラスミドの一本鎖プラスミドを用いて実験を制御した。Ｒ４０８ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用い、記載（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）のようにファージミドを産生させた。一本鎖ファージミドＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて単離し、ＵＶ吸収によって定量した。
【０１２２】
これらの核酸のＰＣＲ増幅により、ＭＢＮ消化前であるが後ではないウイルスＤＮＡの存在が明らかとなった（図１）。同一の反応条件で、１．３ｋｂｐのＴＴＶゲノムを含む二本鎖プラスミドＤＮＡはＭＢＮ消化に耐性を示す一方で、同一のプラスミド由来の一本鎖ファージミドＤＮＡは耐性を示さなかった。この結果は、少なくともこれらの実験でのウイルス検出に使用したプライマーによって増幅された領域内で、ＴＴウイルスゲノムは一本鎖であることを示す。
【０１２３】
実施例２．４  ＴＴＧゲノム極性の同定
ＴＴＶゲノムの極性を確証するために、同一であるが逆方向のＴＴＶ配列を含むプラスミドから作製したＴＴＶ  ＤＮＡおよび鎖特異的ＲＮＡランオフ転写物を含む血清の全核酸を用いて、ハイブリッド形成／ヌクレアーゼ保護アッセイを行った。ＤＮアーゼＩでの反復消化およびＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）での有機的抽出によって、検出限度以下までのプラスミドＤＮＡ濃度の減少を達成した。コントロール実験では、プラスまたはマイナス鎖、同一のプラスミドから作製した一本鎖ファージミドＤＮＡを使用した。
【０１２４】
全核酸を、上記のように、分析される領域を越えるクローン化ＴＴＶと同一の配列を有するＴＴＶ陽性ヒト血清（１００μｌ）から抽出し、４０μｌの水に再懸濁した。プラスまたはマイナス鎖ＲＮＡ転写物（２ｎｇ、１０１０コピー）を、別の反応で、（ａ）プラスまたはマイナス鎖ファージミドＤＮＡ（３００コピー）、（ｂ）１０μｌの抽出核酸、および（ｃ）ＤＮＡを含まない水と混合した。サンプルを減圧乾燥し、８μｌの３ｍＭ  ＥＤＴＡを含む３０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ８．１）中に溶解し、鉱物油で重層し、９９℃で３分間加熱した。２μｌのＮａＣｌ（５Ｍ）添加後、このサンプルを６７℃で２１時間ハイブリッド形成させた。各ハイブリッド形成物の半分（５μｌ）を、リョクトウヌクレアーゼ（６単位／反応）を含むか含まない４５μｌの緩衝液（３３．３ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、１．４４ｍＭ  ＺｎＳＯ４、５．５％グリセロール）に添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。ヌクレアーゼを、６μｌの４６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）、１４ｍＭ  ＥＤＴＡの添加および９９℃で５分間の加熱によって失活させた。核酸をエタノール沈殿し、２０μｌの水に再懸濁した。４μｌの各サンプルを、上記のようにネステッドＰＣＲ（２０μｌ）およびアガロースゲル電気泳動によってＴＴＶ配列の存在について試験した。第１ラウンドのプライマーは、Ａ８７６１（配列番号３）およびＡ１（配列番号１４）であり、第２ラウンドのプライマーはＳ２（配列番号１５）およびＡ２（配列番号１６）であった。これらのプライマーは、ランオフ転写物およびファージミドが作製されるクローン化ＴＴＶ領域に特異的であり且つその中に含まれる。
【０１２５】
ヌクレアーゼの非存在下で、ＲＮＡのみのハイブリッド形成物以外においてＴＴＶは常に検出された（表２）。しかし、ヌクレアーゼの存在下では、ＴＴＶウイルスＤＮＡは、プラス鎖ＲＮＡを含むハイブリッド形成物においてのみ検出された。ＴＴＶ含有ファージミドＤＮＡコントロールは、ハイブリッド形成物が反対の鎖ＲＮＡを含む場合のみ検出された。これらの結果により、ＴＴＶは負の鎖ＤＮＡウイルスであることが強く示唆される
【０１２６】
【表２】
0004087569.tif 000003
【０１２７】
実施例３  ＴＴＶのゲノム抽出および環状性の証明
ゲノム配列を得るために、製造者が支持するようにＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔ、ＩＬ）を用いて、西アフリカ人の個体（ＧＨ１）から全核酸を抽出した。最初のアンカーＰＣＲ伸長産物を、アンカーＰＣＲ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．、６７、７１１８〜７１２４、１９９３、Ｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、４８、６０〜６７、１９９６）によってＮ２２クローン領域（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７）の上流および下流を作製した。Ｎ２２領域の上流配列を得るために使用したＴＴＶ特異的プライマーは、Ｎ２２−Ａ１（配列番号１７）およびＮ２２−Ａ２（配列番号１８）であった。Ｎ２２領域の下流配列を得るために使用したＴＴＶ特異的プライマーは、Ｎ２２−Ｓ１（配列番号１９）およびＮ２２−Ｓ２（配列番号２０）であった。ＴＴＶゲノムが環状である可能性を試験するために、以下のプライマーを用いて製造者の説明どおりにＴａｋａｒａ  ＬＡ  ＴＡＱ（ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、アンカーＰＣＲ産物由来のネステッドプライマーを用いた逆ＰＣＲを行った：ＵＦＧＨ１−Ａ１（配列番号２１）、ＵＦＧＨ１−Ａ２（配列番号２２）、ＤＦＧＨ１−Ｓ１（配列番号２３）、およびＤＦＧＨ１−Ｓ２（配列番号２４）。ウイルスの環状性を、Ｎ２２領域由来のプライマーおよびＬＡ  ＴＡＱ（第１ラウンド、ＵＦＴＴＶ１（配列番号２５）およびＤＦＴＴＶ１（配列番号２６）；第２ラウンド、ＵＦＴＴＶ２（配列番号２７）およびＤＦＴＴＶ１（配列番号２８））を用いたネステッドゲノム長ＰＣＲによって確認した。全ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローン化し、２〜４クローンを配列決定した。配列決定反応を、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  ＤｙｅまたはＰｒｉｓｍ  ｄＧＴＰ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行った。反応物を変性条件下で電気泳動し、配列データを製造者の指示にしたがってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７  ＤＮＡ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒによって回収した。配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒバージョン３．０（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてコンパイルおよび編集し、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．０−を用いて分析した。ゲノム配列ＴＴＶ−ＧＨ１は、配列番号２９である。
【０１２８】
ＴＴＶのゲノム長配列を得るために、西アフリカ人個体（ＧＨ１）の血清から抽出した核酸に対してアンカーＰＣＲを行った。ＴＴＶ−ＴＡ２７８（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７）のＮ２２領域由来の上流（１７６６ｂｐ）および下流（８８２ｂｐ）の増幅ゲノムフラグメントを作製した。ＴＴＶゲノムが環状であると仮定して、上流アンチセンスプライマーおよび下流センスプライマーを用いた逆ＰＣＲを行い、ゲノムの残余物を示す１３００ｂｐ産物が作製された。約３７００ｂｐの予想される産物を作製したＮ２２由来のネステッドゲノム長ＰＣＲによって、再現性のあるウイルスゲノムの環状構造が確認された。この単離物のゲノム配列（ＧＨ１と呼ぶ）は、ＴＴＶ−  ＴＡ２７８（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）より１１３ヌクレオチド長い３８５２ヌクレオチド（図２）を含む。直鎖ＴＡ２７８配列の３’末端に存在するさらなる配列（３７４０〜３８５２位、配列番号２９）は、８９％のＧまたはＣ残基からなり、多数の逆方向反復を保有する。ＴＴＶ−ＧＨ１とＴＴＶ−ＴＡ２７８とのアラインメントにより、全配列の９３％が同一であることが示された。最も低い保存度を有する領域は１４４０と１８２７との間の塩基（配列番号２９）に存在し、７３．６％しか同一でない。最も高い同一性を示す領域は、２２４０と２９１１との間の塩基（配列番号２９）に存在し、９９．５％の同一性を示す。ＴＴＶ−ＴＡ２７８（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＢ００８３９４）およびＴＴＶ−ＧＨ１（配列番号２９）は、２つの大きな読み取り枠（２０３アミノ酸（配列番号３０）および７７０アミノ酸（配列番号３１））（図２）をコードし、それぞれ、単離物との間に９５％および９６％の同一性を示す。両単離物のＯＲＦ１タンパク質は、そのアミノ末端にアルギニンリッチな領域を有する（最初の８２アミノ酸中４４個、配列番号３１）。アミノ酸１〜２７４由来のＯＲＦ１領域は、１００％の同一性を示すが、２７５〜４０５位は、６９％の同一性しか示さない。ＯＲＦ１の残存物は、２つの単離物の間で１００％保存されている。ＧｅｎＢａｎｋまたはＳＷＩＳＰＲＯＴデータベースに対するＴＴＶ−ＧＨ１のＢＬＡＳＴ分析によれば、非ＴＴＶ配列の有意な同一性は得られなかった。
【０１２９】
生物物理学的および分子データの以前の解釈では、ＴＴウイルスはＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅのメンバーに類似していると示唆された（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１２８〜１３２、１９９８、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）。実施例２では、本発明者らは、ＴＴＶはＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅと一致する一本鎖ＤＮＡゲノムを保有することを確認した。しかし、ＴＴＶのＣｓＣｌ中の浮遊密度（１．３１〜１．３４ｇ／ｃｍ３）および濾過（３０〜５０ｎｍ）によって同定されたその粒子サイズは、他のパルボウイルスと類似しない（１．３９〜１．４２ｇ／ｃｍ３）。最も注目すべきは、ＴＴＶウイルスゲノムは環状であって、以前の報告（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）のように線状ではないことが見出されたことである。このことを、逆ＰＣＲおよび約１３００ｂｐのアンプリコンを作製するために元のＮ２２配列の上流および下流に存在するアンカーＰＣＲ産物の末端に存在するプライマーを用いて示した（図２）。ゲノムが線状である場合、アンプリコンは産生されない。さらに、Ｎ２２領域由来のプライマーを用いた逆ＰＣＲによって、ほぼ５’および３’末端に存在すると最初に考えられていた配列を含む全ゲノムを含む３７００ｂｐの産物を産生させることができた。他のＴＴＶ陽性サンプルから類似の産物が作製された（データ示さず）。ＧＨ１（配列番号２９）と呼ばれるこのＴＴＶ単離物のゲノム配列は、以前に報告された配列（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）より１１３ヌクレオチド長い３８５２ヌクレオチド長であることが見出された。新規に発見された領域はＧＣリッチ（８９％）で、いくつかの潜在的なステム−ループ構造を含む。この領域の増幅は、７００ｂｐを超えるＰＣＲ産物を含む場合のみ可能であった。これらの所見は、推定末端付近に存在するプライマーを用いた逆ＰＣＲを用いたゲノムの環状性を同定する以前の試みの失敗（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）を説明している。
【０１３０】
一本鎖ゲノムおよびエンベロープの欠失以外は、ＴＴＶはＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅの他のいかなる特徴も共有しない。ＴＴウイルスは、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅのいくつかの性状を共有する。このファミリーのメンバーには、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、オウムの嘴および羽の疾患ウイルス、およびブタシルコウイルス（ＰＣＶ）（Ｌｕｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ：Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、１９９５）が含まれる。シルコウイルスは、エンベロープを持たず、１５〜２２ｎｍの直径で、１．３３〜１．３７ｇ／ｍｌのＣｓＣｌのバンド中に存在する。そのゲノムは、環状の単一の分子で、１．７〜２．３ｋｂ長の一本鎖ＤＮＡを有し、正の極性または両極性のいずれかである（Ｌｕｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ：Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、１９９５、Ｎｉａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３、１７２３〜１７４４、１９９８）。ＴＴウイルスゲノムは、ヌクレアーゼ／ハイブリッド形成保護アッセイによれば約４ｋｂｐ長であり、相補鎖にコードされるＣＲＦ１遺伝子に関して負の鎖または正の鎖でキャプシド形成する（図２）。ＴＴＶの粒子サイズおよび環状ＤＮＡゲノムがＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅについて報告されたものより長いにもかかわらず、ＴＴウイルスおよびシルコウイルスは類似のＣｓＣｌ中での密度を有し、これは類似のタンパク質：ＤＮＡ比を示唆する。
【０１３１】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データベース検索では、以前に報告されているように（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）、ＴＴＶ−ＧＨ１と他のウイルスとの間の有意な配列類似性を同定できなかった。ゲノム構造の類似性およびＴＴＶとＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅとの間の比較により、より詳細に比較される。シルコウイルスは、ループが植物および動物シルコウイルスの間で保存されている非ヌクレオチドモチーフを保有する、ＤＮＡ複製に必須のステム−ループ構造を含む。しかし、ＣＡＶは、非ヌクレオチドモチーフが半保存性であるがステム−ループ構造とは関連しないという点で例外である（Ｎｉａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３、１７２３〜１７４４、１９９８）。このモチーフは、ＴＴウイルスでは同定されなかった。ＴＴＶでは、同定された３つの最も大きなステム−ループ構造は、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の外側に存在し、これらのステム−ループのうちの２つは、ＴＴＶ−ＧＨ１からクローン化された１１３個のヌクレオチド領域内に存在する。
【０１３２】
ＴＴＶは２つの大きなＯＲＦ（２０３および７７０アミノ酸、それぞれ、配列番号３０および３１）およびいくつかの小さなＯＲＦ（３３〜１０５個のアミノ酸）をコードする。シルコウイルスは、ローリングサークル複製に関連するＲｅｐタンパク質を含む７個までのＯＲＦ（Ｂａｓｓａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２４９、４３５〜４５９、１９９８）をコードする（Ｎｉａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３、１７２３〜１７４４、１９９８）。Ｒｅｐタンパク質は、多数の植物および動物シルコウイルスおよびバクテリオファージΦＸ−１７４の間で保存されている４つまでのアミノ酸配列を保有する（Ｎｉａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３、１７２３〜１７４４、１９９８）。保存モチーフ１（ＦＴＬ）および３（ＹＸＸＫ）が、ＴＴＶ−ＧＨ１のＯＲＦ１で同定された。モチーフ３中の活性部位チロシンは、ＴＴＶ−ＧＨ１およびＴＴＶ−ＴＡ２７８のＯＲＦ１タンパク質中に保存されていた。モチーフ４もＰ−ループ（推定ＡＴＧ／ＧＴＰ結合モチーフ）も認められなかった。このモチーフもまた、ＣＡＶの推定Ｒｅｐタンパク質（ＯＲＦ１によってコードされる）中に存在しない。ほとんどのシルコウイルスのキャプシドまたは被覆タンパク質は異なる遺伝子によってコードされ、高度の塩基性である（アルギニンまたはリジンが豊富）（Ｎｉａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３、１７２３〜１７４４、１９９８）。しかし、ＣＡＶは、そのＯＲＦ１タンパク質が塩基性の高いアミノ末端を含み、カルボキシ末端により近い４つの保存Ｒｅｐタンパク質モチーフ中３つを保有するという点で例外である。ＴＴＶのＯＲＦ１は最初の１００個のアミノ酸の４４個のアルギニン残基をコードし、ＯＲＦ１のカルボキシ末端に向かって４つの保存されたＲｅｐタンパク質モチーフのうちの２個を有する。したがって、ＴＴＶ  ＯＲＦ１はＣＡＶ  ＯＲＦ１タンパク質に類似するようであり（Ｎｉａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３、１７２３〜１７４４、１９９８）、ＴＴＶ  ＯＲＦ１のこれらの保存された特徴の存在により、ＴＴＶはローリングサークル機構によって複製することができることが示唆される。しかし、ウイルス転写物およびそのコードされた遺伝子産物が同定されるまで、ＴＴＶの実際のコード領域およびその機能を確実に同定することは困難である。
【０１３３】
本明細書中および実施例２（上記）に示したデータから、ＴＴウイルスを現存のウイルスファミリー内に分類することができないことが明らかである。ビリオンサイズ、浮遊密度、および配列同一性の欠失に加えて、ゲノムＤＮＡの環状性によりＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅの間のメンバーから除外する。しかし、その負の鎖（環状ＤＮＡゲノム）によって、ＴＴウイルスはＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅに最も密接に関連するにもかかわらず、ＴＴＶはこのファミリーのメンバーに比べて、大きなゲノムおよびウイルス粒子を有する。さらに、ローリングサークル複製に関連するモチーフの可能な保存を超えるＴＴＶとシルコウイルスとの間の有意な配列類似性が存在せず、これはＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ中にＴＴＶを含めることを支持しない。したがって、ＴＴＶは、「環状」を示すラテン語のｃｉｒｃｉｎａｔｉｏ由来のＣｉｒｃｉｎｏｖｉｒｉｄａｅと暫定的に命名した、ヒトに感染させる新規のウイルスファミリーのメンバーであることを提案する。
【０１３４】
実施例４  公開されたプライマーセットを用いたＴＴＶの検出
患者および正常な個体の広範な検体由来の血清パネルを、ＴＴＶの存在について研究した。これらには、正常なボランティアドナー（米国ウィスコンシン南東部、ＵＳＡ）、市販の血液ドナー（米国中央および南部）、静脈内薬物中毒者（ＩＶＤＡ、米国イリノイ州シカゴ）、血清アラニンアミノトランスフェラーゼレベルが上昇した血液ドナー（米国東部）、血友病（オランダ）、および無作為に選択した日本人の血清が含まれ、そのいくつかはＨＴＬＶ−Ｉに血清陽性であった。さらに、ガーナの児童由来の血清（Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、４８、２７８〜２８３、１９９６）および非Ａ−Ｅ−型肝炎と診断された個体（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、５０、９７〜１０３、１９９６、Ｒｏｃｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２５、４７８〜４８３、１９９７）を試験した。
【０１３５】
ＰＣＲによるＴＴＶ  ＤＮＡ配列の検出
ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて、全核酸を２５μｌの血清から抽出した。核酸を２５μｌの無ヌクレアーゼ水中に溶解し、４μｌを増幅反応のテンプレートとして使用した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｎｉｓｈｉｚａｗａ（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７）が記載したプライマー（ＲＤ０３７およびＲＤ０３８、それぞれ配列番号３２および３３）、その後ＲＤ０５１およびＲＤ０５２（それぞれ配列番号３４および３５）、またはＳｉｍｏｎｄｓ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）が記載したプライマー（配列番号１および２、その後配列番号３および４）（以下で「セット１」または「セット２」と呼ぶ）を使用した。
【０１３６】
増幅反応（２０μｌ）を３０サイクル（９４℃で２０行、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒）で行い、これには、最終濃度１．０μｌの核プライマーおよび１．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含んでいた。上記と同一の増幅条件を用いて１．０μｌの最初のＰＣＲ反応物に対してネステッドＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を、２５アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム蛍光によって視覚化した。増幅産物の同一性を、配列を確認したプローブ（ネステッドまたはヘミネステッドＰＣＲ産物）へのサザンハイブリッド形成によって確認した。
【０１３７】
結果
ＴＴＶウイルス血症は、トランスアミナーゼレベルが上昇しているか上昇していない合衆国の約１０％のボランティアドナーで検出され（表３）、市販の血液ドナーではわずかに高かった（１３％）。
【０１３８】
【表３】
0004087569.tif 000004
【０１３９】
ＨＣＶのＮＳ５抗原のみに対する抗体を有することが以前に認められているボランティアドナーの小さなパネルでは（Ｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、５６、１１９〜１２１、１９９６）、約５％がＴＴＶ  ＤＮＡ陽性であった。したがって、合衆国での全蔓延率は１０．３％であった。これらの結果は、英国および米国の正常な血液ドナーの最近報告された蔓延率１．９％（１０００人中１９人）および１％（１００人中１人）（Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８、８３９〜８４２、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、３５２、１９１〜１９４、１９９８）と異なる。しかし、Ｎａｕｏｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｏｕｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、３５２、１９５〜１９７、１９９８）は、英国の正常な血液ドナーの蔓延率を１０％（３０人中３人）と報告した。これらの各研究では、異なる核酸伸長法ならびにＰＣＲ条件およびプライマーを使用していた。さらに、おそらく陽性サンプルが同定されるサザンハイブリッド形成を行わずに臭化エチジウム蛍光によって視覚化していた。したがって、真の蔓延率を過小評価していたかもしれない。本研究における各サンプルを、２つの異なるプライマーセットを用いて試験したが、全ての陽性サンプルがプライマーセット２によって同定されたわけではない（表４）。
【０１４０】
【表４】
0004087569.tif 000005
【０１４１】
セット２は各群内でより多くのサンプルを検出したが、プライマーセット１はセット２プライマーで陰性であったさらなるサンプルを検出した。セット１のみでは、２００〜６００％ＴＴＶ感染の蔓延率を過小評価していたが、セット２のみでは１〜４０％の蔓延率を過小評価していた。これらのデータは、ＰＣＲプライマーセット２はより優れた感度を有する一方で、全てのＴＴＶ  ＤＮＡ陽性血清を同定するわけではないことを明らかに示す。この結果は、ＴＴＶ  ＤＮＡ配列が４０％もの相違示すことと合わせて、現在のプライマーセットを使用した研究では真のＴＴＶ蔓延率を有意に過小評価し得ることを示唆している。これらの結果はまた、全ＴＴＶ変異株検出用の最適なオリゴヌクレオチドプライマーの開発の必要性を示す。最適なプライマー設計用の保存領域の同定に多数の変異株由来の全長ゲノム配列が必要である。
【０１４２】
ウイルス因子が経口的に伝染している「危険な状態」であると考えられる個体由来の血清も試験した。ＴＴＶ  ＤＮＡは、ＵＳＡの静脈内薬物中毒者の１７％（１５／８７）およびオランダの血友病患者の５６％（９５／１６９）で認められた。
【０１４３】
【表５】
0004087569.tif 000006
【０１４４】
これに対して、合衆国の患者中の非Ａ−Ｅ型肝炎と診断された患者は、非常に低い蔓延率を示した（２．１％）。合衆国での、血液ドナーと非Ａ−Ｅ型肝炎患者との間ＴＴＶ感染率の矛盾（表３）の理由は不明であるが、非Ａ−Ｅ型肝炎患者のサンプル数の少なさが影響しているのかもしれない。しかし、ＩＶＤＡと血友病患者の高い感染率は、感染リスクの増加と血液または血液産物への高い曝露率との間の関連を示す。
【０１４５】
試験した無作為に選択した日本人の血清では、６１人中３２人（５２％）がＴＴＶ陽性であることが認められた。この比率は、日本で最初に報告された血液ドナー（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）よりも高いが、このパネルには、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性の何人かの個体が含まれているので、血液由来ウイルスに感染している危険性が高いかもしれない。６〜１８歳のガーナの児童では、試験した個体の５８％でＴＴＶが検出された（表５）。この群は、非経口曝露の比率が非常に低く、刺青も、耳のピアスも、ワクチン接種による注射針の共有もなく、性的活動もない。この集団は、少なくとも１つのＨＢＶ感染マーカーについて６１％、ＨＢｓＡｇについて１６％、ＨＣＶについて５．４％（Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、４８、２７８〜２８３、１９９６）、およびＧＢＶ−Ｃ  ＲＮＡについて１５％（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、５０、９７〜１０３、１９９６）の血清全体蔓延率を示した。ガーナでは、ＨＣＶまたはＧＢＶ−Ｃと比較してＴＴＶ感染率が比較的高く、これは、ＴＴＶが非経口曝露でより伝染力が強いか、ＴＴＶが他の手段でも伝染することを示し得る。
【０１４６】
市販の血液ドナーおよび静脈内薬物中毒者（ＩＶＤＡ）におけるＧＢＶ−ＣおよびＴＴＶの同時感染の発生は、これらの集団における２つのウイルスについての感染率はほぼ等しい（すなわち、１３〜１８％）のに拘らず０．７〜３．６％と非常に低い（表６）。
【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
これにより、ＧＢＶ−ＣおよびＴＴＶ感染は異なる伝染経路を介して発生し得ることが示唆される。ＧＢＶ−Ｃが排他的に非経口伝染することが認められている（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、５０、９７〜１０３、１９９６）。一方、ＴＴＶ感染は、感染血液または血液産物への曝露によることもあり得、また、集団の感染も（すなわち、糞便−経口経路）あり得る。この伝染様式で、日本（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）、米国、およびガーナ（表３および表５）におけるＴＴＶ蔓延率が比較的高いことを説明することができよう。実際、低開発国におけるＴＴＶウイルス血症は、ナイジェリア、ガンビア、ブラジル、およびエクアドルの原住民で７〜７４％であることが認められており（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３９、７７７、１９９８）、最近の研究ではヒト糞便物質中のＴＴＶ  ＤＮＡの存在が示されている（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１２８〜１３２、１９９８）。したがって、開発途上国における高いＴＴＶ感染率は、この因子の糞便−経口伝染を招く不十分な衛生条件によるのであろう。
【０１４９】
非Ａ−Ｅ型肝炎患者での低い蔓延率およびトランスアミナーゼレベルが高いまたは低いボランティアドナーの比較的高い率を考慮すると、肝炎におけるＴＴＶの因果関係は疑わしい。Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７）が示したＴＴＶ感染と輸液後の肝炎との関連は、輸液後トランスアミナーゼレベルが上昇した５人の選択患者のうち３人にＴＴＶウイルス血症が存在すると結論付けていた。これらの患者は臨床的に明らかな肝炎ではなく、ＴＴＶは食道癌または胆嚢癌と診断された３人の患者のうち２人に認められたことを留意すべきである。したがって、先進国（すなわち、英国、米国、および日本）由来の集団における現在の研究により、ＴＴＶ蔓延率は非経口伝染病の危険性のある個体においてより高いことが示されている（Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８、８３９〜８４２、１９９８、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、３５２、１９１〜１９４、１９９８）一方で、疾患、特に輸液後肝炎との関連は疑わしい。
【０１５０】
示したデータに基づくと、現在使用されているプライマーは、全てのウイルス血症サンプルを検出せず、結果として、真のＴＴＶウイルス蔓延率より過小評価することが明らかである。世界中のＴＴＶゲノムのクローニングおよび配列決定により、ＨＣＶ（Ｂｕｋｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１８７〜１９１、１９９２）およびＧＢＶ−Ｃ（Ｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５６、１１９〜１２１、１９９６、Ｍｕｅｒｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６２、５５〜６２、１９９６）において成されたように、普遍ＰＣＲプライマーを設計することができる保存領域を同定可能であろう。このような研究により、ウイルスゲノムの機構がさらに理解され、そのコードタンパク質が解明される。免疫原性タンパク質の同定は、ＴＴＶ検出用の血清学的スクリーニングアッセイの開発に必要であり、それによって、ＴＴＶ感染の天然における経緯、疫学、もしあれば疾患との関連の実験のための別のツールが得られる。
【０１５１】
実施例５  ＴＴＶ配列の系統発生分析
ＴＴＶの配列可変度を測定するために、本発明者らは１５１人の世界中の個体から増幅させたゲノムの２６０ｂｐ領域（ＰＣＲに使用したプライマー配列は含まない）を試験した。ＰＣＲ産物を、以下のヘミネステッドＰＣＲ法によって、実施例１に記載のプライマーを用いて、実施例４（上記）に記載のサイクリング法により作製した：第１ラウンドの増幅用にプライマーＡ５４３０およびＡ５４２７ｍ（配列番号１および２）、その後の第２ラウンドの増幅用にＡ８７６１およびＡ５４２７ｍ（配列番号３および２）。産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、Ｑｉａｅｘ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いてゲルを精製した。精製産物を、直接配列決定した。解釈できない配列（あいまい度が高い）が得られた産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にクローン化し、各ＰＣＲ産物の少なくとも６クローンを配列決定した。
【０１５２】
本研究で同定したＴＴＶ配列および増幅領域に重複するＧｅｎＢａｎｋに寄託された配列を、プログラムＰＩＬＥＵＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．０）を用いて整列させた。ＰＣＲプライマー配列を配列アラインメントに含めなかった。１６３個の配列の最終アラインメント（２６０ヌクレオチド長）を使用し、ＰＨＹＬＩＰパッケージバージョン３．５ｃ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ、１９９３）によって単離物の間の進化的関連を決定した。ヌクレオチド配列距離を、ＤＮＡＤＩＳＴを用いて決定した。アミノ酸配列距離をＰＲＯＴＤＩＳＴを用いて決定し、計算した距離をＮＥＩＧＨＢＯＲにより使用して無根系統樹を作製した。中間点ルーティングオプションを用いるＲＥＴＲＥＥプログラムを使用して系統樹をプロットした。ＳＥＱＢＯＯＴを、ヌクレオチド配列についてＤＮＡＤＩＳＴをまたはアミノ酸配列についてＰＲＯＤＩＳＴを、最後にＣＯＮＳＥＭＳＥを用いてアミノ酸配列の１００個の再サンプリングおよびヌクレオチド配列の１０００個の再サンプリングにおいてブートストラップ値を決定し、多数決原理コンセンサス系統樹を作製した。７０％を超えるブートストラップ値は観測による分類を支持すると考えられた。最終的にＴＲＥＥＶＩＥＷで系統樹を視覚化した（Ｐａｇｅ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１２、３５７、１９９６）。
【０１５３】
配列決定した１５１個のＰＣＲ産物のうち、５４個が１０％を越えるヌクレオチド配列多義性を有し、混合感染が示唆される。これは、１人の個体からクローン化した配列間の３６％までのＤＮＡ配列可変性が明らかとなった５４個の産物のうち１２個の産物の配列のクローニングおよび配列決定によって確認された。本発明者らが決定した配列を、以前に特徴づけられた（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）代表的な推定遺伝子型（１ａ、２ｂ、２ａ、２ｂ）を含むＧｅｎＢａｎｋから得た３６個のＴＴＶ配列と整列させた。整列させた１６３個全ての配列について計算した二つ一組（ｐａｉｒｗｉｓｅ）の遺伝距離は、明らかに配列多様性の２つの力価（図３）を示し、明らかな遺伝子群および遺伝子型の存在が示唆される。このウイルスの推定コード領域内で、位置あたり０．６２まで（または４４％の不正確な距離）の高い可変性が存在する。一般に、０．２６未満の二つ一組の距離は群内距離を示し、０．３４を超える値は群間距離を示す。
【０１５４】
これらの二つ一組の距離を使用して無根系統樹を作製した（図４）。互いにほぼ等しい距離を有する３つの主要な群が認められた。これらの主要な群は、ブートストラップ分析によって強く支持されている：群１または群３の配列は系統樹において１００％関連するが、群２の配列は系統樹の８５％にグループ分けされる。亜群１ａおよび１ｂが以前に認められていたが（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）、および群１の配列の系列の分岐は２つの亜群の存在を示唆するが、関連するブートストラップ値は４４％未満である。したがって、群１のサブタイプの支持はなかった。二つ一組の距離に基づいて、サブタイプ２．２を構成する２つの配列（表４）（共に日本人由来）は、群１または群３よりサブタイプ２．１単離物に密接に関連しているので（表７）、それ自体の主要な群よりもむしろ群２のサブタイプに分類される。
【０１５５】
【表７】
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【０１５６】
群２内のこれらの亜群の存在について強力なブートストラップ（それぞれ少なくとも８５％の支持）支持が存在する。サブタイプ２．１および２．２は以前に主張された２ａおよび２ｂ亜群（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）と一致せず、後者はブートストラップ分析で分類できなかった。遺伝子型３配列間の亜群の支持は得られなかった。さらに、３つの群はそれぞれ世界中の単離物を含むので、遺伝子型と由来国との間の明白な相関関係は存在しなかった。
【０１５７】
分析したＴＴＶゲノム領域内のヌクレオチド配列の可変度が高く、サブタイプを支持するブートストラップ値が得られない場合、真の系統発生の関係を同義置換率の高さによって不明瞭になる可能性がある。この可能性を試験するために、ＴＴＶ単離物の推定アミノ酸配列について系統発生分析を行った。アミノ酸配列の３つの主要な群への分類は、ブートストラップ分析によって系統樹の９６％で支持された（データ示さず）。ヌクレオチド配列分析と同様に、群１または群３のサブタイプについて有意なブートストラップによる支持はなかったが、系統樹の８９％で２つの群２のサブタイプについて支持が得られた。ヌクレオチド配列に認められるように、二つ一組のアミノ酸配列は、２つのサブタイプ２．２配列は、群１または群３における単離物よりもサブタイプ２．１単離物と密接に関連していることを示す（表７）。
【０１５８】
ブートストラッピングを用いた系統発生学的分析により、ほぼ等しい分岐を示すＴＴＶ配列の３つの主要な群の存在が強力に支持された。他の研究者によりＴＴＶサブタイプの存在が示唆されたが（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）、以前に報告された１ａおよび１ｂ配列または本発明者らが同定した他の群１配列のいずれも亜群への分類についてはブートストラップの支持が得られなかった。これは、主張された２ａおよび２ｂ遺伝子型についても真であった。第１および第２のコドンのみまたは推定アミノ酸配列のみの分析による、高い確率の同義的置換によるサブタイプの潜在的な不明瞭さを排除する試みでは、サブタイプの支持を得ることはできなかった。しかし、分析した領域は鎖の短さ（２６０ヌクレオチド）および／または可変性の高さによってサブタイプの同定が不十分であるという可能性が残される。本発明者らの結果の確認には、より長いゲノムセグメントまたは理想的には全長ゲノム配列の分析が必要である。
【０１５９】
１２人の個体由来の３０個のクローン化ＴＴＶ配列についての配列分析により、１０人の個体が２つの異なるＴＴＶ遺伝子型に感染し、２人の個体が代表的な３つの遺伝子型のすべての代表に感染していることが示された（図４）。これらの混合感染は、静脈内薬物中毒者、血友病患者、および非Ａ−Ｅ型肝炎患者などの非経口伝染ウイルスの感染の危険性のある個体に起こった。これに対して、３６人のＴＴＶ陽性米国人ドナーのうちの１人のみが同時感染していた。この所見が、種々の遺伝子型の反復感染によるのか、個体内での急速なウイルスの変異によるのか、または他の機構によるのかを、決定する余地がある。
【０１６０】
ＴＴＶ−ＧＨ１およびＴＡ２７８は、全ゲノム中９３％同一であるが、局所的領域でより低いかより高い同一性が存在する。これら２つの単離物は、２６０塩基の領域内で系統発生学的関係について９２％の同一性を示す。試験した世界中に分布した単離物の間のこの領域における遺伝的多様性は、ヌクレオチドレベルで４４％およびアミノ酸レベルで３６％までであった。地理的に離れた単離物間のこの可変度は、サーコウイルスについては以前に観察されていない。ＧｅｎＢａｎｋに存在する４つのＣＡＶゲノム配列の比較により、多様性は最大４％であることが明らかとなった。ＧｅｎＢａｎｋ由来の１１個のＣＡＶ  ＶＰ１配列の分析により、配列の相違はたった１．５％であることが明らかとなった。ＰＣＶ配列の比較でも類似の結果が得られている（Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７９、２１７１〜２１７９、１９９８）。最近の報告には、８個の単離物の比較に基づく１３個のアミノ酸にわたるＣＡＶのＯＲＦ１内の超可変領域（３８％までの相違）が記載されている（Ｒｅｎｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．、７０、８８７２〜８８７８、１９９６）。これに対して、ＴＴＶ−ＧＨ１およびＴＡ２７８のＯＲＦ１は５％の相違を示し、のみならず３１％相違する１２６アミノ酸にわたる超可変領域も含む。したがって、ＴＴＶは、ＣＡＶまたはＰＣＶよりもさらに高い可変性を示す。
【０１６１】
実施例６  いくつかの全長ＴＴＶゲノムの分析
数百のＴＴＶウイルス単離物が、４００未満のヌクレオチド配列を増幅するＰＣＲアッセイを用いて同定されたにもかかわらず、たった１つの全長配列（単離物ＧＨ１、３８５２個のヌクレオチド、配列番号２９）およびたった２つのほぼ全長配列（単離物ＴＡ２７８およびＴＴＶＣＨＮ１、３７３９個のヌクレオチド、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＢ００８３９４およびＡＦ０７９１７３）か報告されただけである。これら３つの配列は全てウイルスの単一のサブタイプを示す（１ａ）。ＴＴＶウイルスゲノムをより完全に理解するために、いくつかの相違する単離物を、全長またはほぼ全長に伸長した。これらの配列は３０％までのヌクレオチドの相違、３つの保存されたＯＲＦ、同定可能な調節エレメントの欠失、および明らかな遺伝子型およびサブタイプを示す。
【０１６２】
実施例６．１  ゲノム伸長
以前に、本発明者らは、世界中に分布した１５１個のＴＴＶ単離物由来の２６０個のヌクレオチド配列の単離について述べ、少なくとも３つの主要なウイルス遺伝子型の存在を示した（実施例５を参照のこと）。この群ともっとも相違するいくつかの配列を、ゲノム長までまたはほぼゲノム長に伸長させた（表８）。
【０１６３】
【表８】
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【０１６４】
上流のアンチセンスプライマーおよび下流のセンスプライマーの単離物特異的ネステッド対を、ウイルスゲノムの環状性を利用した逆ＰＣＲアッセイで使用した（図２）。簡単に述べれば、ＲＮＡ／ＤＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用い、製造者の指示にしたがって２５μｌｎ血清から全核酸を抽出した。核酸ペレットを、２５μｌの水中に再懸濁した。第１ラウンドのＰＣＲ反応（体積２０μｌ）には、単離物特異的プライマー（表９を参照のこと）、４μｌの全核酸、および製造者が特定したＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用した。
【０１６５】
【表９】
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【０１６６】
ネステッドＰＣＲ反応物（１００μｌ）にも、単離物特異的プライマー、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑおよびテンプレートとしての５μｌの第１ラウンドのＰＣＲ産物を使用した。５’および３’の２６０個の塩基領域を伸長させるために特異的およびコンセンサスプライマーの組み合わせを用いて、いくつかのさらなる単離物のほぼ全長ゲノムが得られた（図２および表１０）。
【０１６７】
【表１０】
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【０１６８】
増幅産物を０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分離し、ついで切り出し、これをＧｅｎｃｌｅａｎ  ＩＩ（Ｂｉｏ１０１、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）で精製した。精製産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にライゲートし、各鎖をＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅで配列決定し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７７ＤＮＡシークエンサーによって分析した。
【０１６９】
全長ゲノム配列の分析により、ＴＴＶウイルスゲノムは３８３９〜３８３５ヌクレオチド長の範囲であることが明らかとなった。本発明者らは、遺伝子型３の全長配列を作製することはできなかった。したがって、３５３７〜３５３９ヌクレオチド長の部分的ゲノム配列を作製した。これらの配列は、全長ＴＴＶウイルス配列（配列番号２９）の９２位から始まり、全長配列よりも約２１０塩基短い位置で終る。これらの９個の異なる単離物を使用したＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索では、いかなる他の公知の配列とも有意な類似性は明らかとならなかった。
【０１７０】
実施例６．２  ヌクレオチド分析
ヌクレオチド配列比較を、実施例３および実施例５に記載のように行った。７個の全長ＴＴＶゲノムは、互いに７３．８％と９６．５％との間の同一性を示した。
【０１７１】
【表１１】
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【０１７２】
部分的ゲノムは、重複領域について７２．２％から９７．７％同一であった。７個の全長ゲノムのアラインメントおよび比較のスライディングウィンドウ内での同一性％のプロッティングによって行った詳細な領域の比較により、全等と約８０％の同一性が示された（図５）。これらのゲノム内で、非常に類似性の高い（９０％を超える）多数の領域およびいくつかの超可変（７０％未満）領域が存在した。４つの部分配列を含めたことによってこれらの結果は劇的に変化しなかった。
【０１７３】
７個の全長ゲノム配列および４個のほぼ全長ゲノム配列の遺伝的関係を決定するために、系統発生的分析を行った。配列を整列させ、重複領域について分析を行った。遺伝距離は４つの異なる群の存在を支持した。単離物ＴＡ２７８（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＢ００８３９４）、ＴＴＶＣＨＮ１（ＢｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ０７９１７３）、ＧＨ１（配列番号２９）、およびＪＡ９（配列番号５２）は、位置あたり０．０２３９〜０．０８０５個の置換の距離で互いに密接してグループ化された。単離物ＪＡ１（配列番号５４）、ＪＡ４（配列番号５５）、ＵＳ３２（配列番号５６）、およびＵＳ３５（配列番号５７）は位置あたり０．０３５２〜０．０９５個の置換の距離で互いにグループ化されたが、これらの配列は０．３８７９より長い距離を有する以前の群から分岐している。単離物ＪＡ２ｂ（配列番号１８）およびＪＡ１０（配列番号５９）は、０．３９１９個を超えるの置換の距離を有する上記配列から独立してグループ化された。これら２つの単離物は０．０４９１の二つ一組の距離を有する。最後の単離物ＪＡ２０は、他の全単離物と０．１６３５と０．３９４１との間の遺伝距離を有する固有の群を形成した。
【０１７４】
無根系統樹は、これらの配列の相互間の関係を示し、４つのクラスターの形成を明白に示し、これらは全て８９％を超えるブートストラップ値によって支持された。これらの第１（ＴＡ２７８（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＢ００８３９４）ＴＴＶＣＨＮ１、（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ０７９１７３）、ＧＨ１（配列番号２９）、およびＪＡ９（配列番号２５））は、以前に遺伝子型１として特徴づけられている単離物を示した。報告された部分ＴＴＶウイルス配列との比較により、これらはサブタイプ１ａのメンバーであり得ることが示唆された。第２のクラスター（ＪＡ１（配列番号５４）、ＪＡ４（配列番号５５）、ＵＳ３２（配列番号５６）、およびＵＳ３５（配列番号５７））は、遺伝子型２の配列を示し、サブタイプ２ｂに最も類似する。単離物ＪＡ２ｂ（配列番号５８）およびＪＡ１０（配列番号５９）は、実施例５で定義の遺伝子型３を示す。最後の単離物ＪＡ２０（配列番号５３）は、遺伝子型１配列に最も密接に関連するが、これらの配列とは独立してグループ化された。部分配列との比較により、この単離はサブタイプ１ｂを示すことが示された。この観察された分類は４個のほぼ全長ゲノムの不存在の場合も同じであったので、この４個のほぼ全長ゲノムの存在によってもこれらの結果は変更されなかった。
【０１７５】
実施例６．３  読み取り枠の分析
多数の多様な単離物の利用可能性により、保存ＯＲＦの同定を可能にした。ウイルスタンパク質の単離ができない状況下で、高度に保存されたＯＲＦの存在はＯＲＦから合成される実際のウイルスタンパク質の可能性の支持に役立つ。巨大な読み取り枠（配列番号２９、残基５８９〜２８９８、７７０個のアミノ酸タンパク質をコードする、実施例３）が１９個の単離物のうちの１個を除く全てに７６５〜７７０アミノ酸長の範囲で保存されていた（表８）。ＵＳ３２  ＯＲＦ１は、インフレームで終止コドンによって中断されていた。これはアーチファクトである可能性があるが、一方多数のクローンの分析により同一の配列が明らかとなった。メチオニンが、終止コドンの直後に存在していた。したがって、この単離物は２つの異なるタンパク質を産生することが可能である。さらなる実験で、この問題に取り組む必要がある。全長単離物の間で、ＯＲＦ１のアミノ酸配列は、６５．１％〜９５．６％同一であった（表１１）。保存されたメチオニン開始コドン（ＧＨ１の５８９位（配列番号２９））は、真核生物タンパク質合成の有効な開始のためのＫｏｚａｋモチーフ（Ｋｏｚａｋ、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０８、２２９〜２４１、１９８９）内に存在していた。さらに、ＯＲＦ１終止コドン（ＧＨ１の２８９９位（配列番号２９））から１７７ヌクレオチド下流に保存された真核生物ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）が存在した。これは、全ＴＴ配列中に保存された唯一のポリアデニル化シグナルであった。
【０１７６】
第２のＯＲＦ（２０２個のアミノ酸タンパク質をコードする配列番号２９のヌクレオチド１０７〜７１２位）は、試験した１１個のＴＴＶ単離物全てで保存されていなかった。ＯＲＦ２は全ての遺伝子遺伝子型１配列に存在しているにもかかわらず、フレームシフトを引き起こすヌクレオチド欠失が全ての遺伝子型２および３配列に存在した。ＯＲＦ２のより小さな変形形態（配列番号２９、ヌクレオチド２６３〜７１２、１４９〜１５１個のアミノ酸タンパク質をコードする）は１１個全ての単離物に保存されていた。この短縮ＯＲＦ（ＯＲＦ２ｔ）の比較により、４７．０％ほどしかアミノ酸同一性を示さない（表１１）高い配列多様性が示された。ＯＲＦ１と違って、保存メチオニンコドンは、最高Ｋｏｚａｋ配列内（Ｋｏｚａｋ、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０８、２２９〜２４１、１９８９）に存在しなかった。しかし、この部位で真核生物の翻訳開始に不適合な残基は認められなかった。
【０１７７】
５７個のアミノ酸から構成される第３の読み取り枠（ヌクレオチド２９０４〜３０７４（配列番号２９））が、１１個全部の単離物で見出された。このＯＲＦ（ＯＲＦ３）はＯＲＦ１のすぐ下流に存在し、保存されたポリアデニル化シグナルで終止する。アミノ酸配列の比較によって、ＯＲＦ３は７０．７％を超えて保存され、３つの保存ＯＲＦ（表１１）の内、可変性が最も少ないことが示された。１１個全部の全長配列およびほぼ全長の配列の６個の読み枠のいずれにおいても、３０ヌクレオチドより長い保存されているＯＲＦは存在しないようであった。
【０１７８】
実施例６．４  プライマー設計
ＴＴＶウイルス単離物が同定されつづけているので、研究者らは、ＰＣＲアッセイの感度を改善する試みにおいて新規のＰＣＲプライマーの設計を試みた。これらの大部分はＯＲＦ１内に存在するプライマーを使用する。これらのプライマーでＴＴウイルスの多数の遺伝子型およびサブタイプの同定が成功しているにもかかわらず、ＯＲＦ１のプライマー領域内の高い可変度（１０％を超える多様性）によって、多数の未検出の陽性サンプルが存在し得る。実際、第１世代または第２世代のＰＣＲの使用には、ＴＴウイルスの蔓延率を評価するためにいくつかの異なるアッセイを行う必要がある（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）。最近、ゲノムの最初の２００ヌクレオチド内で設計したプライマーを使用するＰＣＲアッセイにより、９２％の健常な日本人の個体がＴＴウイルス陽性であることが示されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１２、２３３〜２３９、１９９８）。これらのプライマーが以前のセットよりもはるかに高い感度を示す一方で、このプライマーは遺伝子型１単離物のみに対して設計され、遺伝子型２特異的配列を増幅しない（データ示さず）。遺伝子型２および３単離物もまた日本で発生するので、３つ全ての遺伝子型を示す配列のアラインメントから設計されたコンセンサスプライマーを用いて、さらなるＴＴウイルス陽性個体が同定されるであろう。この研究由来の全長および部分的ゲノムのアラインメントを使用して（図５）、遺伝子型１、２、および３配列を検出することができる３セットのコンセンサスオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマーおよびその使用を、実施例７に示す。
【０１７９】
実施例７  第３世代のＴＴＶ  ＰＣＲプライマー
第１世代および第２世代のプライマーを使用して同定したＴＴウイルス蔓延率は、最近まで試験された集団における真のＴＴウイルス蔓延率を過小評価していると考えられる（実施例４を参照のこと）。最近、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８）およびＳｉｍｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）よりも１０〜１００倍感度が高いオリゴヌクレオチドプライマーがＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１２、２３３〜２３９、１９９８）。これらのプライマーが遺伝子型１配列のみを検出するにもかかわらず（Ｌｅａｒｙ  ａｎｄ  Ｅｒｋｅｒ、未発表の所見）、９２％の健常な日本人の個体がこのアッセイによって陽性であった。本明細書中で、本発明者らは、こうちのＴＴウイルスの最も相違する単離物を検出することができるネステッドＰＣＲアッセイを示す。これらの第３世代のアッセイは、以前に記載した全てのＰＣＲアッセイよりも感度が優れている。さらに、本発明者らは、これらのアッセイを使用して、ＴＴウイルスが異なる種々の動物の血清中に存在することを示した。これは、ＴＴウイルスがヒトウイルスのみとすることを除外し、ヒト肝疾患の病原因子としての役割に疑いを投げかけた。
【０１８０】
プライマー設計
異なる単離物間の保存領域を同定するために、実施例６由来のゲノム長配列（配列番号２９、５２〜５７）を使用して、ヌクレオチド配列アラインメントを行った。３つのウイルスゲノム領域に対してオリゴヌクレオチドのネステッド対を設計し、現存のデータベースに存在する部分的ＴＴウイルス配列に対する同一性について試験した。選択したプライマーを、高力価であることが公知である以前に同定されたいくつかの血清サンプルを使用して有用性および感度についてＰＣＲによって試験した。３セットのＰＣＲプライマーは、以下の伸長試験に供したプライマーであった：セットＡ正方向１（配列番号６０）、セットＡ逆方向１（配列番号６１）、セットＡ正方向２（配列番号６２）、セットＡ逆方向２（配列番号６３）、セットＢ正方向１（配列番号６４）、セットＢ逆方向１（配列番号６５）、セットＢ正方向２（配列番号６６）、セットＢ逆方向２（配列番号６７）、セットＣ正方向１（配列番号６８）、セットＣ逆方向１（配列番号６９）、セットＣ正方向２（配列番号７０）、セットＣ逆方向２（配列番号７１）。
【０１８１】
ＰＣＲアッセイ
ＲＮＡ／ＤＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用い、製造者の指示にしたがって２５または５０μｌｎ血清から全核酸を抽出した。乾燥核酸ペレットを、最初の血清体積に対応する２５または５０μｌの水中に再懸濁した。第１ラウンドのＰＣＲ反応（体積１０μｌ）には、最終濃度１．０μＭの各プライマー、２μｌの全核酸、および製造者が特定するように、２．０ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ２を用いたＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した。ネステッドＰＣＲ反応（２５μｌ）には、最終濃度０．５μＭの各プライマー、テンプレートとしての１μｌの第１ラウンドのＰＣＲ産物、および上記の条件を使用した。増幅は、３５サイクル（９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒）および７２℃で１０分であった。ネステッドＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離し、ナイロンメンブランにブロットし、サザンハイブリッド形成によって分析して正の結果が得られた。
【０１８２】
系統発生学的分析
ネステッドＰＣＲ産物をゲルで単離して、切り出しを行い、これをＧｅｎｃｌｅａｎ  ＩＩ（Ｂｉｏ１０１、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）で精製した。精製産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にライゲートし、各鎖をＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅで配列決定し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７７ＤＮＡシークエンサーによって分析した。配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒバージョン３．０（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて編集しおよび組合せ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて分析した。ギャップ作製および伸長に替えてデフォルト設定したＧＡＰプログラムを使用して、配列アラインメントを行った。ヌクレオチド対の間の系統発生距離をＤＮＡＤＩＳＴで決定し、アミノ酸の間の系統発生距離をＰＨＹＬＩＰパッケージ（バージョン３．５ｃ）のＰＲＯＤＩＳＴプログラム（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ、１９９３）で決定した。これらのコンピュータ処理した距離を、プログラムＮＥＩＧＨＢＯＲおよびＲＥＴＲＥＥを使用した系統樹の構築に使用した。ＴＲＥＥＶＩＥＷ（Ｐａｇｅ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１２、３５７、１９９６）を用いて最終出力を行った。ブートストラップ値を、それぞれＳＥＱＢＯＯＴ、ＤＮＡＤＩＳＴまたはＰＲＯＤＩＳＴ、ＮＥＩＧＨＢＯＲ、およびＣＯＮＳＥＮＳＥを用いたヌクレオチドまたはアミノ酸の１００個の再サンプリングについて同定した。７０％を超える値は、認められた分類を支持すると考えた。
【０１８３】
第３世代ＰＣＲアッセイ産物の性能
本発明者らは、第１世代および第２世代のＴＴＶ  ＰＣＲアッセイによって約２５％がＴＴウイルス陽性であると認められている４８人の正常なドナーの血清パネルの試験によって、ＴＴウイルスの検出について以前に報告されたＰＣＲアッセイに対してこのプライマーセットを比較した。表１２に示すように、少なくとも１つの第３世代アッセイによって３８個（７９．２％）、２つまたはそれ以上のアッセイによって２４個（５０．０％）のサンプルが陽性であると認められた。
【０１８４】
【表１２】
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【０１８５】
セットＡでは１３個（２７．１％）のサンプル、セットＢでは２９個（６０．４％）のサンプル、およびセットＣでは２３個（４７．９％）のサンプルが検出された。Ｎｉｓｈｉｚａｗａ、Ｏｋａｍｏｔｏ、およびＳｉｍｍｏｎｄｓによって以前に記載されたＴＴウイルスについてのＰＣＲアッセイでは、それぞれ３個（６．３％）、８個（１６．７％）、および９個（１８．８％）のサンプルが検出された。全てのアッセイにおいてこのサンプルは陽性でないが、セットＢおよびセットＣアッセイは、任意の他のいずれよりも明らかに優れている。セットＢでは７６．３％の陽性サンプルが検出された一方で、セットＣでは６０．５％であった。セットＢおよびセットＣを組み合わせると、３８個中３６個（９４．７％）の陽性サンプルが検出されたにもかかわらず、両アッセイによって４２．１％しか検出されない。ＴＴウイルスは核酸レベルで有意な多様性を有することが以前から認められているので、これらの結果は驚くべきことではないが、分子ベースのアッセイに対して劇的な効果を有しうることを見い出している。さらに、上記のプライマーの異なる組み合わせを使用することが可能である。特に、本発明者らは、ネステッドＰＣＲにおいてセットＡ由来の正方向プライマーおよびセットＢ由来の逆方向プライマー（配列番号６４および配列番号６９、その後配列番号６６および非亜列番号７１）を使用して、表１２で検出された３８個のＴＴＶ陽性サンプルの１４個（３６．８％）を検出した。
【０１８６】
上記の新規のプライマー対が以前に報告されたものより優れているようであるので、ＴＴウイルスの存在について先に評価した多数の集団（実施例４）を、セットＢプライマーを用いて再試験した（表１３）。
【０１８７】
【表１３】
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【０１８８】
正常なＡＬＴレベルのボランティア血液ドナーのうち、３１人（３４．１％）がＴＴウイルス陽性であることが認められた。これは、２つの別のプライマー対を用いて陽性であることが認められた以前の１０．７％と比較される。ＡＬＴ値の高いボランティア血液ドナーを試験した場合、この集団について以前に同定された９．１％と比較して１１人（１５．９％）が陽性であった。２つのプライマー対によって１２．８％陽性であった市販の血液ドナーは、セットＢプライマーを用いると現在３９．６％陽性である。さらに、以前の研究で１７．２％陽性であった注射による薬物使用者は、セットＢプライマーを用いると８１．７％陽性であった。最後に、試験した４８人の非Ａ−Ｅ型肝炎患者のうちで、２つのプライマー対を使用した場合はたった１人のみ陽性であったが、本アッセイにおいては５９．６％が陽性であった。
【０１８９】
さらに、本発明者らは、多数の他の集団を試験して、２つの異なるプライマー対での以前の合計の基準とこの結果を比較した。２つの以前のアッセイの組み合わせによって５６．２％が陽性であった血友病患者は、セットＢプライマーアッセイでは９５．９％陽性であった。以前３５．０％陽性であった日本人の血液ドナーは、現在１００％陽性であり、セットＢプライマーアッセイを使用したニュージーランドの児童のパネルにおいて比率は２倍（１１．１％と比較して２２．２％）であった。これらの比較で最も注目すべきは、ＴＴウイルス陽性であると以前に同定された事実上全てのサンプルが、セットＢプライマーアッセイで検出されたことである。これは、これらのプライマーで最初に行った限定研究における事実と異なった（表１２）。非ヒト霊長類のいくつかの種由来の限定サンプルも試験した。ＴＴウイルスは、タマリン（２３．５％）、ヨザル（２０．０％）、およびチンパンジー（５０．０％）で検出された一方で、カリスリックス、ミスタックス、またはマカクウイルス配列は検出されなかった。以下の多数の理由で、これらのデータの評価には注意を払わなければならない：１）各種由来の試験サンプル数は非常に限定されていること、２）試験された動物がヒト由来の物質を一度で接種された可能性を取り除けないこと、および３）これらのサンプルは、２つのウイルスに存在する高度に保存された領域の結果として検出された関連ウイルスを接種されたと考え得ること。これらの動物から増幅された産物は、検出されたヒト単離物に対する配列分析結果と非常に類似しているにもかかわらず、これらの配列が増幅配列を超えて伸長されていないので、この最終ポイントを取り除くことができない。
【０１９０】
高いウイルス蔓延率の結果として、本発明者らは、ヒト感染源の決定に興味を持った。ボランティア血液ドナーと非Ａ−Ｅ型肝炎患者との間の感染率が実質的に異ならないので、供給源は地理的位置に無関係に共通であると推測した。したがって、セットＢプライマーアッセイを用いた家畜血清中のＴＴウイルスの存在について試験することを決定した。表１４に示したように、２０％のブタ、２５％のウシ、３０％のヒツジ、および１９％のニワトリにおけるＴＴウイルスの存在が陽性であった。
【０１９１】
【表１４】
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【０１９２】
配列決定および系統発生分析により、これらの配列はセットＢプライマーで検出した他の配列と類似しているにもかかわらず、配列はこの領域内でヒト単離物から独立してクラスター形成していないことが示された（図７）。実際、動物単離物は、ヒト配列同士よりもヒト配列にさらにより密接に関連している。３つの以前に記載されたＰＣＲアッセイ（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、１０、１〜１６、１９９８、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）を用いて試験した場合、３匹の動物のうち１匹のみが陽性であるという事実は重要である。
【０１９３】
実施例８  ウイルス伝染を追跡するためのＴＴＶ配列多様性の使用
本方法の実際の適用を、実施例１に示す。ヒトＴＴＶの感染性およびウイルスのチンパンジーへの非経口伝染性を、供給源とレシピエントとの間のＴＴＶ配列の完全な保存によって示し、これにより、ＴＴＶ感染がその対応する接種材料に由来することが示された。以下の予言的な実施例では、個体間のＴＴＶ伝染を、関連する個体から得たＴＴＶ  ＤＮＡ配列の比較によって監視する。
【０１９４】
血清中の全核酸（２５μｌ）を、ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて、２人またはそれ以上の目的の個体から抽出する。核酸を、２５μｌの無ヌクレアーゼ水中に溶解し、増幅反応のテンプレートとして使用する。オリゴヌクレオチドは、Ｎｉｓｈｉｚａｗａ（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４１、９２〜９７、１９９７）に記載のもの（配列番号３２および３３、その後配列番号３４および３５）、またはＳｉｍｍｏｎｄｓ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．、３５２、１９１〜１９４、１９９８）（配列番号１および２、その後配列番号３および４）または実施例７（配列番号６０および６１、その後配列番号６２および６３、または配列番号６４および６５、その後配列番号６６および６７、または配列番号６８および６９、その後配列番号７０および７１）に記載のものであり得るが、これらに限定されない。増幅反応（２０μｌ）を、３５サイクル（９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒）で行い、これには、最終濃度１．０μｌの各プライマーおよび１．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含んでいる。上記と同一の増幅条件を用いて１．０μｌの最初のＰＣＲ反応物に対してネステッドＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム蛍光によって視覚化し、切り出しおよびＤＮＡを抽出によって精製する。増幅産物は公知の可変性の高い領域を含み、正確またはほぼ正確な核酸配列を有する２つの単離物の機会を最小にするように十分に巨大である。増幅産物の部分的または全部を配列決定し、配列をプログラムＰＩＬＥＵＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．０）を用いて整列させる。ＰＣＲプライマー配列は、単離物の間の同一性％を同定するために使用した配列アラインメント中に含まれない。ＴＴＶ配列が別の配列と類似するほど、関連する個体は共通の供給源から感染されたか、ある個体が他の個体から感染したかのいずれかであろう。
【０１９５】
この実施例はまた、法医学などの分野に適用される。この実施形態では、ＴＴＶゲノム配列の比較を使用し、伝染様式に依存して、接触の性質がどのようなものであるかについて個体間の以前の接触を確証する。
【０１９６】
実施例９  ベクターとしてのＴＶＶの使用
この実施例では、ＴＴＶベクターの構築を、真核細胞中での外来核酸および／またはタンパク質の発現におけるその使用と合わせて記載する。他の手段およびＴＴＶベクターの構築および適用手段は、この開示を考慮した場合当業者に明白である。
【０１９７】
アンカーＰＣＲを用いた単離物ＧＨ１について実施例３に記載のように、全ＴＴＶゲノムを二本鎖形態で、単一片として、または多フラグメントとしてクローン化する。多クローンとして得られた場合、ＴＴＶゲノムは、細菌中で増殖および選択できるプラスミドレプリコンを含む単一のクローンに再組立する。多クローニング部位を含むプラスミドレプリコンおよびポリリンカー領域のＴＴＶゲノム配列内の位置をＴＴＶの生物学的性質によって決定する。例えば、部位はベクターの所望の性質（細胞への感染能力、複製能力、ビリオン形成能力、および感染の増殖能力など）を妨害すべきではない。他の配列もまたベクター機能のために必要であり、これらは、ＴＴＶまたは他の供給源のいずれかから由来する。これらには、転写制御配列（例えば、プロモーター、終止配列、ポリアデニル化配列、およびエンハンサー配列）および発現制御配列（例えば、Ｋｏｚａｋ配列）が含まれる。ＴＴＶのこれらのさらなる配列を保有する能力および機能性を維持する能力を、許容真核細胞株への実験ベクター構築物のトランスフェクションによって評価する。同様に、ベクター機能に必須ではないＴＴＶ配列を除くことによって、外来ＤＮＡ量を増加させることができる。
【０１９８】
目的のＤＮＡフラグメント（例えば、タンパク質結合部位を含むかＲＮＡまたはタンパク質をコードする）を、ＴＴＶベクタークローニング部位に挿入し、連結した産物を細菌中で増幅させ、次いで細胞培養物中に移入する。細胞に対してクローン化インサートが有する効果を研究するか、発現産物（例えば、酵素、抗原、または組換えワクチンタンパクなどの目的の任意のタンパク質）を単離する。
【０１９９】
あるいは、家畜（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、またはウシ）、霊長類、またはヒトなどの宿主の遺伝子治療を、細胞培養物から単離し、宿主を感染させるのに使用されたビリオンを使用して行うことができる。宿主の感染はまた、精製ＤＮＡベクターの動物への直接注射によっても可能であろう。感染宿主を、ベクターインサートの効果（例えば、発現したワクチン抗原に対する抗体の出現、正確な遺伝子発現による遺伝子欠失の補足、アンチセンスＲＮＡの産生による有害な宿主遺伝子の抑制、医学的または商業的に有用な産物の産生）について監視する。
【０２００】
この実施例の他の実施形態を以下に示す。
【０２０１】
（ａ）複製起点、転写調節、遺伝子、パッケージングシグナルなどのＴＴＶゲノム部分を、他の真核生物ベクターの成分として使用する。
【０２０２】
（ｂ）ベクターを感染不能ビリオンとし、したがって伝染不能とする欠失を含む、ＴＴＶに基づくエピソームベクターを構築する。
【０２０３】
（ｃ）片方または両方のメンバーがＴＴＶ由来であり、および、一方のベクターが他方のベクターからビリオン産生のために必要とする機能を供給する、ＴＴＶに基づくヘルパーウイルス系を構築する。
【０２０４】
（ｄ）密接に関連するＴＴＶベクターのファミリーを上記のように構築する。ファミリーのメンバーは、宿主の免疫系によって認識されるエピトープをコードするＴＴＶゲノムの領域内で変化していて、ベクターの除去を引き起す。各ベクターのエピトープコード領域は、他のすべてのベクターファミリーのメンバーと免疫性を共有しないＴＴＶ単離物から由来している。このような非交叉反応性ＴＴＶ単離物の存在は、ヒトにおける同時感染および高い蔓延レベルの証明によって強く示唆される。最初のベクターへの免疫を呈した個体を、免疫を呈していないベクターファミリーの他のメンバーで処置する。上記のベクターパネルの異なるメンバーでの連続的処置を使用して、ＤＮＡウイルスに基づく共通の問題である治療を維持し、および反復する。
【０２０５】
本明細書中に記載の本発明のプライマーは、個体におけるＴＴＶの検出に有用である。本発明の他の用途または変形形態は、本開示を考慮すれば当業者に明白である。
【０２０６】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  リョクトウヌクレアーゼに対するＴＴＶゲノムの感受性を示す図である。
【図２】  ＴＴＶ環状ゲノムを示す図である。
【図３】  １５７個のＴＴＶヌクレオチド配列間で認められた２つ一組のゲノムの距離の分布を示す図である。
【図４】  １６３個のＴＴＶ単離物由来の２６０個のヌクレオチドのコンセンサス系統樹（無根）を示す図である。
【図５】  ５０の位置での分析のスライディングウィンドウ内の７個の全長ＴＴウイルスヌクレオチド配列のアラインメントをプロットした同一性％を示す。
【図６】  ７つの全長および４つのほぼ全長ＴＴウイルスヌクレオチド配列のアラインメントから作製した無根系統樹を示す図である。
【図７】  実施例７に記載のＴＴウイルスプライマーの保存セットで作製してＴＴウイルス配列の遺伝子群を示す系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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