(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する天然ＯＢタンパク質よりも長い血漿半減期および／または遅いクリアランスを持ち、治療される個体の体重および／または食物摂取量を減少させる能力を持つ、ＯＢタンパク質の共有結合的誘導体であって、
該誘導体は、免疫グロブリン配列に結合した、天然ＯＢレセブターに結合できるＯＢタンパク質アミノ酸配列を含んでなるＯＢ-免疫グロブリンキメラポリペプチドであり、
さらに親水性の非タンパク質ポリマーで修飾されている、誘導体。
【請求項２】
前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１の誘導体。
【請求項３】
前記免疫グロブリン配列が定常ドメイン配列である、請求項１の誘導体。
【請求項４】
前記ＯＢタンパク質がヒト由来である、請求項１の誘導体。
【請求項５】
ＯＢ遺伝子の異常発現または異常機能に関係する状態を治療するための、またはＯＢレセプターによって媒介される生物学的反応を誘発するための、有効量の請求項１の誘導体を含有する組成物。
【請求項６】
体重減少または食欲減退に有効な請求項５記載の組成物。
【請求項７】
上昇したインスリンレベルの低下に有効な請求項５記載の組成物。
【請求項８】
有効量の請求項１記載の誘導体を製薬的に許容し得る担体と組み合わせて含有してなる請求項５記載の組成物。
【請求項９】
ＯＢ遺伝子の異常発現または異常機能に関係する状態を治療するための、またはＯＢレセプターによって媒介される生物学的反応を誘発するための方法において使用するための、請求項１の誘導体。
【請求項１０】
前記状態が肥満症、過食症およびＩ型またはＩＩ型糖尿病からなる群より選択される、請求項９の誘導体。
【請求項１１】
患者における体重減少または食欲減退を誘発するための方法において使用するための、請求項１記載の誘導体。
【請求項１２】
免疫グロブリン配列に結合した、天然ＯＢレセブターに結合できるヒトＯＢタンパク質アミノ酸配列を含んでなり、２つのＯＢポリペブチド−ＩｇＧ重鎖融合物が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結されて、ホモ二量体免疫グロブリン様構造をとっているキメラポリペプチド。
【請求項１３】
該ＯＢポリペプチド−ＩｇＧ重鎖融合物の少なくとも一方が、免疫グロブリン軽鎖と結合している請求項１２のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
少なくとも２つのＯＢタンパク質−免疫グロブリン融合物をコードする単離された核酸配列。
【請求項１５】
請求項１４の核酸を含む複製可能な発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５の複製可能な発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
ＯＢタンパク質−免疫グロブリン融合物をコードする核酸を発現させるように請求項１６の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項１８】
該細胞がさらに、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸で形質転換されている請求項１７の方法。
【請求項１９】
（ｉ）ＯＢタンパク質を免疫グロブリンドメインと融合させること、または（ｉｉ）＿ＯＢタンパク質−免疫グロブリンキメラを親水性の非タンパク質ポリマーと共有結合させることによる、増大した効力を有するＯＢタンパク質の誘導体の製造方法。
【請求項２０】
前記誘導体が体重減少または食欲減退においてより高い効力を有する請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記誘導体が食物摂取量の減少においてより高い効力を有する請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記ＯＢタンパク質が天然のＯＢタンパク質である、請求項１９〜２１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２３】
前記天然のＯＢタンパク質が天然のヒトＯＢタンパク質である請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
前記ポリマーが合成ポリマーである、請求項１９〜２３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２５】
前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項２４記載の製造方法。
【請求項２６】
前記ＯＢタンパク質が天然ＯＢタンパク質レセプターに結合可能であり、免疫グロブリンドメインと融合している、請求項１９〜２５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリン配列が定常ドメイン配列である、請求項２６の製造方法。
【請求項２８】
前記定常ドメインが免疫グロブリン重鎖のドメインである、請求項２７の製造方法。
【請求項２９】
前記ＯＢタンパク質がヒト由来である、請求項２８の製造方法。
【請求項３０】
２つのＯＢポリペブチド−ＩｇＧ重鎖融合物が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結されて、ホモ二量体免疫グロブリン様構造をとっている請求項２９の製造方法。
【請求項３１】
前記ＯＢポリペプチド−ＩｇＧ重鎖融合物の少なくとも一方が、免疫グロブリン軽鎖と結合している請求項３０の製造方法。
【請求項３２】
前記誘導体の有効量を製薬的に許容し得る担体と混合する、請求項１９記載の製造方法。
【請求項３３】
ＯＢ遺伝子の異常発現または異常機能に関係する状態を治療するため、またはＯＢレセプターによって媒介される生物学的反応を誘発するための医薬の製造のための請求項１の誘導体の使用。
【請求項３４】
前記状態が肥満症、過食症およびＩ型またはＩＩ型糖尿病からなる群より選択される請求項３３の使用。
【請求項３５】
前記処置が、有効量の請求項１記載の誘導体を患者に投与することを含んでなる該患者における体重減少または食欲減退を誘発することによるものである、請求項３３記載の使用。
【請求項３６】
前記処置が上昇したインスリンレベルの低下に有効である、請求項３３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、OBタンパク質の長半減期誘導体に関する。特に本発明は、OBタンパク質-免疫グロブリンキメラおよびその他の長半減期OBタンパク質誘導体と、それらを含む組成物およびそれらの投与法に関する。さらに本発明は、OBタンパク質-免疫グロブリンキメラのようなOBタンパク質の長半減期変種を投与することによって肥満を治療する方法にも関係する。
発明の背景
肥満は、最近の疫学調査によると20歳以上の全アメリカ人の約3分の1を冒す最も一般的な栄養障害である。Kuczmarskiら，J. Am. Med. Assoc. 272, 205-11(1994)。肥満は、心血管障害、II型糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧、高トリグリセリド血症、異常リポタンパク質血症および数種類の癌を含む種々の深刻な健康問題の原因となる。Pi-Sunyer, F.X., Anns. Int. Med. 119, 655-60(1993); Colfitz, G.A., Am. J. Clin. Nutr. 55, 503S-507S(1992)。マウスの肥満とII型糖尿病は、単一遺伝子突然変異（糖尿病突然変異または"ob"突然変異）によってもたらされることが示されている。Friedman, Genomics 11, 1054-1062(1991)。マウスob遺伝子およびそのヒト相同体のクローニングと配列決定は、最近、Zhangら，Nature 372, 425-431(1994)によって報告されており、それによるとob遺伝子産物は、体脂肪貯蔵量を調節するように作用する脂肪組織からの情報伝達経路の一部として機能するらしい。20年以上前に行われた並体結合実験によると、ob遺伝子の突然変異型コピーを2つ含有する遺伝性肥満マウス（ob/obマウス）は、その食物摂取量を調節する満腹因子を産生せず、また糖尿病（db/db）マウスは満腹因子を産生するが、それに反応しないと予想された。ColemanおよびHummal, Am. J. Physiol. 217, 1298-1304(1969); Coleman, Diabetol 9, 294-98(1973)。組換えOBタンパク質を毎日注射すると、甚だしく肥満したob/obマウスでは食物摂取が抑制され、その体重と脂肪が減少するが、db/dbマウスではそうならないことが、3つの独立した研究チームが行なった最近の報告によって示されており（Pelleymounterら，Science 269, 540-43［1995］; Halaasら，Science 269, 543-46［1995］; Campfieldら，Science 269, 546-49［1995］）、このことはobタンパク質が初期の交差循環実験で提案されたような満腹因子であることを示唆している。これら最初の研究結果はまだ多くの疑問に答えていないし、まだ未解決の矛盾もいくつか認められる。例えば痩躯マウスにobタンパク質を毎日注射した場合の食物摂取量と体重に対する効果はわずかだと報告されているが、体重の減少が同等であるにもかかわらず、これらのうちある報文（Halaasら，前掲）では、屠体組成で評価した体脂肪が有意に減少しており、また他の報文（Pelleymounterら，前掲）では体脂肪の減少が認められていない。またPelleymounterら（前掲）の観察では、その理由はわからないが、0.1mg/kg/日のOBタンパク質で処置したob/obマウスの体重は実際に17.13％増大し、一方、1mg/kg/日のobを投与した肥満マウスの体重の減少はわずかだった。obタンパク質のレセプターまたはレセプター群はまだ同定されていない。末梢レセプターが存在する可能性は現時点で排除できないものの、視床下部に損傷を持つマウスの脂肪組織中ではob遺伝子の発現が増大しても、痩躯表現型が生じないという最近の報告から、OBタンパク質は脂肪細胞に直接作用するわけではないと思われる。Maffeiら，Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6957-60(1995)。研究者らは、少なくとも1種類のOBレセプターが脳内に局在するとしている。Tartagliaら，Cell 83, 1263-71(1995)には、あるレプチンレセプター（OB-R）の同定と発現クローニングが報告されている。Cioffiら，Nature Medicine 2, 585-89（1996）には、レプチンレセプターの様々なイソ型が記述されている。1996年3月21日に公開されたPCT出願公開番号WO96/08510には、OBタンパク質のレセプターであるかもしれないヒト・ヘマトポエチン（hematopoetin）レセプターが記述されている。Tartagliaら，Cell 83, 1263-71(1995)には、OBタンパク質のレセプターが開示されている。
発明の要旨
本発明は、OBタンパク質は皮下持続注入として送達する方が、同じ投与量を毎日皮下注射した場合よりも、体重と脂肪組織重量の減少に有意に有効だという観察結果に基づいている。また本発明は、OBポリペプチドが免疫グロブリン定常ドメインに融合してなるキメラタンパク質と天然のヒトOBを、それぞれ1日1回の皮下注射によって投与した場合、キメラタンパク質の方が天然のヒトOBよりも、体重と脂肪貯留量を減少させる効力が著しく高いという予想外の発見にも基づいている。OBタンパク質-免疫グロブリンキメラはその分子量が大きいために、それが血液脳関門を横切って、脳内に位置すると考えられているOBレセプターに到達できるとは思われないので、後者の観察結果はとりわけ意外である。
一側面として、本発明は、処置される個体の体重および/または食物摂取量を減少させることができるOBタンパク質の長半減期誘導体に関する。さらに本発明は、そのような誘導体を含有する組成物ならびに体重および/または食物摂取量を減少させるためのそれらの投与に関する。
もう1つの側面として、本発明は、天然OBレセプターに結合する能力を持つOBタンパク質アミノ酸配列が免疫グロブリン配列に連結してなるキメラポリペプチド（OB-免疫グロブリンキメラまたは免疫アドヘシンと略称する）に関する。具体的一態様として、本キメラポリペプチドは、天然OBレセプターに結合する能力を持つOBアミノ酸配列が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合したものからなる。本発明キメラのOB部分は、天然OBレセプターに結合し、それを介して情報伝達する能力が保たれるよう、天然OBタンパク質由来のアミノ酸配列を十分に持つことが好ましい。またそのOBタンパク質は、肥満したヒトまたはヒト以外の対象に投与した場合に、体重を減少させる能力を保っていることが、最も好ましい。OBポリペプチドはヒト由来であることが好ましく、融合は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列との融合であることが好ましい。ある態様では、2つのOBポリペプチド-免疫グロブリン重鎖融合物が（例えばジスルフィド結合による共有結合で）会合することにより、ホモ二量体免疫グロブリン様構造をもたらす。さらに免疫グロブリン軽鎖が、そのジスルフィド結合した二量体中のOB-免疫グロブリンキメラの一方または両方と会合して、ホモ三量体またはホモ四量体構造を与えてもよい。
さらに本発明は、本発明のキメラポリペプチド鎖をコードする核酸、その分子をコードするDNAを含有する発現ベクター、形質転換された宿主細胞、形質転換宿主細胞を培養することによるその分子の生産法にも関する。
本発明の長半減期誘導体は体重および/または食物摂取量を減少させるのにとりわけ有用であるが、これらはOB遺伝子の異常な発現または異常な機能に関係する状態の治療に、かつ/または、OBレセプターによって媒介される生物学的反応を誘発するために、広く使用することができる。したがって本発明のOB誘導体は、過食症を治療するために、あるいは（例えばI型またはII型糖尿病患者の）インスリンレベルを低下させるために、あるいはOBレセプターを発現させる種々の細胞タイプの有糸分裂促進剤として、使用することができる。これらの用途と、関連するその他の用途はいずれも本発明の範囲に包含される。
もう1つの態様として、本発明は、OBタンパク質-免疫グロブリンキメラを用いるOBレセプターの精製に関する。
【図面の簡単な説明】
図1（上）：痩躯雌マウスに、マウスOBタンパク質を皮下持続注入するか、もしくは毎日皮下注射した。この図のデータは各群の平均体重をグラム数で表わしている（n=4匹/点）。
図1（下）：後腹膜脂肪パッドの平均重量を示す。OBの皮下持続注入は、脂肪組織重量の減少についても、毎日の皮下注射より有効だった。
図2（上）：肥満雌ob/obマウスを、ヒトOBタンパク質（hOB）またはヒトOB-IgG-1融合タンパク質（hOB-IgG-1）で処置した。この図のデータは、各処置群について実験初日から最終日までの体重の平均変化をグラム数で表わしており、n=3マウス/バーである。ただし、hOB 0.19mg/kg/日注射群はn=4、PBS注射群はn=1である。
図2（下）：この図のデータは、各処置群について、24時間の実験期間6回の平均食物摂取量をグラム/マウス/日の単位で表わしたものである（n=1/バー）。
図3（上および下）：肥満（ob/ob）雌マウスに、hOBまたはhOB-IgG-1融合タンパク質を7日間毎日皮下注射した。データは図2と同様に表示したもので、いずれの処置群についてもn=4である。
図4（上）：肥満雌ob/obマウスをヒトタンパク質（hOB）またはPEG-hOBで処置した。この図のデータは、各処置群について実験初日から最終日までの体重の平均変化をグラム数で表わしたもので、n=3〜4マウス/バー（ただしPBS注射群はn=1）である。これらの物質は毎日皮下注射した。「PEG 1×」と「PEG 2×」は、その分子の製剤中のタンパク質に対するPEG試薬の比率を表わす。
図4（下）：この図のデータは、各処置群について、24時間の実験期間6回の平均食物摂取量をグラム/マウス/日の単位で表わしたものである（n=3〜4/バー）。
図5：肥満（ob/ob）雌マウスに、hOB-IgG融合タンパク質、天然hOB、またはhCD4-IgGを、7日間毎日皮下注射した。n=2とした3.8mg/kg/日のhOB群を除いて、いずれの処置群についてもn=6である。ここでも、融合タンパク質は、体重（上図および中図）および食物摂取量（下図）の減少に関して天然のhOBタンパク質よりも有効だった。
図6：実施例1のヒトOB-IgG-1キメラのヌクレオチド配列（配列番号1）とアミノ酸配列（配列番号2）である。
発明の詳細な説明
A．定義
「肥満」という用語は、過剰な体脂肪を伴う体重超過状態を指す。ある個体に関する望ましい体重は、性別、身長、年齢、全体的な体つきなどを含むいくつかの要因に依存する。ある個体をいつ肥満であるとみなすのかも、同じ要因によって決定される。ある与えられた個体にとって最適な体重の決定は、通常の医師には周知の技術である。
「長半減期」という表現および文法上これから派生する表現をOB誘導体に関して使用する場合、それは、対応する天然OBタンパク質よりも長い血漿半減期および/または遅いクリアランスを持つOB誘導体に関する。この長半減期誘導体は、天然OBタンパク質よりも少なくとも約1.5倍長い半減期を持つことが好ましく、より好ましくは天然OBタンパク質より少なくとも約2倍長い半減期を持ち、さらに好ましくは天然OBタンパク質より少なくとも約3倍長い半減期を持つ。天然OBタンパク質は、治療しようとするその個体のものであることが好ましい。
「OB」「OBポリペプチド」「OBタンパク質」という用語および文法上これらから派生する用語は相互に交換可能であって、「天然」または「天然配列」OBタンパク質（「レプチン」とも呼ばれる）とそれらの機能的誘導体を指す。OBポリペプチドは、サイトカイン類、すなわちある細胞集団によって放出され、別の細胞に対して細胞間媒介因子として作用するポリペプチド類（例えば成長ホルモン、インスリン様増殖因子、インターロイキン、インスリン、糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、腫瘍壊死因子αおよびβ（TNF-αおよび-β）、NGF-βなどの神経成長因子、PDGF、トランスフォーミング増殖因子（TGF；TGF-αやTGF-βなど）、インスリン様増殖因子-1および-2（IGF-1およびIGF-2）、エリスロポエチン、骨誘導因子、インターフェロン（IFN；IFN-α、INF-β、IFN-γなど）、コロニー刺激因子（CSF；M-CSF、GM-CSF、G-CSFなど）、インターロイキン（IL；IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8など）、その他のポリペプチド因子）に典型的な構造上の特長を持つ。
「天然」OBポリペプチドや「天然配列」OBポリペプチドとは、任意の動物種（例えばヒト、ネズミ、ウサギ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ニワトリ、ブタ、ウマなど）に由来するOBポリペプチドであって、自然界に存在するものを指し、OBレセプターに結合する能力を保持し、好ましくはOBレセプターを介して情報伝達する能力を保っている限り、現在知られているもしくは将来同定されうる天然に存在する対立遺伝子、欠失、置換および/または挿入変異種を含む。したがって天然ヒトOBポリペプチドには、図6に示すアミノ酸配列のN-末端と位置167のシステイン（Cys）の間のアミノ酸配列（配列番号2とZhangら（前掲）の図6をも参照のこと）、およびそのタンパク質の現在知られているもしくは将来同定されうる天然に存在する変異種が含まれる。この定義には特に、Zhangら（前掲）のアミノ酸番号でアミノ酸位置49のグルタミンを持つ変異種またはこれを持たない変異種が含まれる。「天然」OBポリペプチドおよび「天然配列」OBポリペプチドという用語には、開始N-末端メチオニン（Met）を持つまたは持たない、また天然のシグナル配列を持つまたは持たない、単量体型または二量体型の天然タンパク質が含まれる。当技術分野で知られている天然ヒトOBポリペプチドと天然ネズミOBポリペプチドは、167アミノ酸長であり、保存された2つのシステインを含有し、分泌タンパク質の特徴を持つ。このポリペプチドは主として親水性であり、予想されるシグナル配列切断部位は、Zhangら（前掲）のアミノ酸番号で言えば位置21である。ヒト配列とネズミ配列の総合配列相同性は約84％である。これら2つのタンパク質は、成熟タンパク質のN-末端領域に、より多くの同一性を示し、シグナル配列切断部位と位置117の保存されたCysの間にある残基中には、保存的置換が4つと非保存的置換が3つ存在するだけである。OBタンパク質の分子量は単量体型で約16kDである。
ある天然ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、生物特性がその天然ポリペプチドと定性的に共通する化合物をいう。OBポリペプチドの機能的誘導体は、天然（ヒトまたはヒト以外の）OBポリペプチドと定性的に共通する生物特性を持つ化合物である。「機能的誘導体」には、任意の動物種（ヒトを含む）に由来する天然ポリペプチドの断片、天然（ヒトおよびヒト以外の）ポリペプチドの誘導体、およびそれらの断片（ただし、それらは対応する天然ポリペプチドと共通する生物活性を持つものとする）が含まれるが、これらに限らない。
「断片」は、成熟型天然OBポリプチドの配列内の領域を含む。OBポリペプチドの好ましい断片には、成熟タンパク質のC末端が含まれ、その分子のN末端およびレセプター結合および/または構造の保全に必要でないその分子の他の部分に、比較的短い欠失を含有してもよい。
「誘導体」という用語は、天然ポリペプチドのアミノ酸配列変種と共有結合的修飾体を指し、一方、「変種」という用語は、この定義に含まれるアミノ酸配列変種を指す。
「機能的誘導体」の定義に関して「生物特性」とは、1）天然ポリペプチド（例えば任意の種の天然OBポリペプチド）の少なくとも1エピトープとの免疫学的交差反応性、または2）天然ポリペプチドと定性的に共通する少なくとも1つの接着機能、調節機能またはエフェクター機能の保持と定義される。
機能的誘導体は、ある天然ポリペプチドと好ましくは約65％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは約75％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約85％のアミノ酸同一性、最も好ましくは少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を持つポリペプチドである。本発明に関して、天然配列ヒトOBポリペプチドの機能的誘導体は、その天然OBタンパク質と少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を示し、かつ、ヒト内で免疫原性を示さないことが好ましい。
本発明において、アミノ酸配列の同一性または相同性とは、必要なら配列を相同性率が最大になるようにギャップを挿入して整列させた後に、対応する天然ポリペプチド配列の残基と同一になる候補配列中のアミノ酸残基の百分率をいい、保存的置換は配列同一性の一部とみなさない。N末端またはC末端の伸長部分と挿入部分は、いずれも同一性または相同性を減じるものとは見なさないものとする。
本明細書において免疫学的交差反応性とは、対応する天然ポリペプチドがその既知活性分子に対して生じさせたポリクローナル抗体または抗血清との間に持つ定性的生物活性を、その候補（ポリ）ペプチドが拮抗的に阻害できることを意味する。このような抗体および抗血清は、従来の方法により、ヤギまたはウサギなどの動物に、例えばフロイント完全アジュバント中の既知天然OBタンパク質を皮下注射した後、フロイント不完全アジュバント中の追加抗原を腹腔内または皮下に注射することによって調製される。
「単離されたOBポリペプチド」という用語および文法上これから派生する用語は、ヒトその他の動物種またはそのポリペプチドを単離した他の供給源に存在する夾雑ポリペプチドから分離された（上述の）OBポリペプチドを指す。
一般に「アミノ酸配列変種」とは、ある参照ポリペプチド（例えば天然配列ポリペプチド）と比較してそのアミノ酸配列にいくつかの相違を持つ分子を指す。そのアミノ酸酸変化は天然アミノ酸配列内の置換、挿入、欠失のいずれであってもよいし、また、そのような変化の所望の組合わせであってもよい。
置換変種とは、天然配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を除去し、その残基に代えて同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されているものである。置換は分子中の一アミノ酸だけが置換されている単一型であってもよいし、同じ分子内で2以上のアミノ酸が置換されている多重型であってもよい。
挿入変種は、天然アミノ酸配列内の特定の位置にあるアミノ酸のすぐ隣りに1個またはそれ以上のアミノ酸が挿入されているものである。あるアミノ酸のすぐ隣りにとは、そのアミノ酸のα-カルボキシ官能基またはα-アミノ官能基につながっていることを意味する。
欠失変種は、天然アミノ酸配列内の1個またはそれ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失変種ではその分子の特定の領域内のアミノ酸が1個または2個欠失しているだろう。
「共有結合的誘導体」には、有機タンパク質性または有機非タンパク質性誘導体化試薬による天然ポリペプチドまたはその断片の修飾と、翻訳後修飾が含まれる。共有結合的修飾は伝統的に、標的とするアミノ酸残基を選択した部位または末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることによって、もしくは選択した組換え宿主細胞内で機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。ある種の翻訳後修飾は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基とアスパラギニル残基は、しばしば翻訳後修飾によって、対応するグルタミル残基とアスパルチル残基に脱アミド化される。また、これらの残基は温和な酸性条件下でも脱アミド化される。これらの残基はどちらの形態でも、OB-免疫グロブリンキメラ中に存在できる。他の翻訳後修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル残基、チロシン残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化がある［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co.,サンフランシスコ，79-86頁（1983）］。
「〜をコードするDNA配列」「〜をコードするDNA」および「〜コードする核酸」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらデオキシリボヌクレオチドの順序は、そのポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、そのDNA配列は、そのアミノ酸配列をコードする。
「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」という用語は、（通常は二本鎖の）DNA断片を指し、そこには外来DNAの断片が挿入されていてもよい。外来DNAとは、本来ならその宿主細胞中には認められないDNAである異種DNAと定義される。ベクターは適当な宿主細胞内に外来または異種DNAを輸送するのに使用される。いったん宿主細胞に入れば、そのベクターは宿主染色体DNAとは独立して複製することができ、そのベクターとそこに挿入された（外来）DNAのコピーがいくつか作成されうる。そのようにして、その外来DNAによってコードされるポリペプチド分子が数多く迅速に合成されうる。
「制御配列」という用語は、その宿主生物において機能的に連結したコード配列の発現に必要なDNA配列を指す。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、リポソーム結合部位、あるいはまだよくわかっていないその他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することが知られている。
核酸がもう1つの核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、その核酸は「機能的に連結（operably linked）」されるという。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのDNAは、それがあるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現するならば、そのポリペプチドのDNAに機能的に連結しており、プロモーターやエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響を与えるならば、そのコード配列に機能的に連結しており、また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置にあるならば、コード配列に機能的に連結している。一般に、「機能的に連結」とは、連結されるDNA配列が連続的であり、分泌リーダーの場合は、連続的かつ解読位相が一致していることを意味する。しかし、エンハンサーは連続していなくてもよい。結合は、都合のよい制限部位でのライゲーション（連結）によって達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来通り、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたは合成オリゴヌクレオチドリンカーを使用する。
本発明に関して使用される「細胞」「細胞系」および「細胞培養」という表現は相互に交換可能であって、いずれの場合も子孫を含む。したがって「形質転換体」と「形質転換（宿主）細胞」という用語には、その初代対象細胞とそこから得られる培養が、その継代数にかかわらず含まれる。また、意図的な突然変異もしくは意図しない突然変異のために、すべての子孫がDNAの内容に関して厳密には同一でない場合もあることは言うまでもない。最初に形質転換された細胞に求めたものと同じ機能または生物活性を持つ突然変異子孫が含まれる。明瞭な指摘を意図するところは、その文脈から明らかになるだろう。
天然の免疫グロブリンは通常、2つの同じ軽（L）鎖と2つの同じ重（H）鎖からなる約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は1つの共有結合性のジスルフィド結合によって重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は重鎖の免疫グロブリンイソタイプが異なると異なる。各重鎖および軽鎖は、一定の間隔で鎖内ジスルフィド橋をも持つ。各重鎖は一端に可変ドメイン（VH）を持ち、その後にいくつかの定常ドメインが続いている。各軽鎖は一端に可変ドメイン（VL）を持ち、他端に定常ドメインを持つ。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第1定常ドメインと並列しており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの界面を形成すると考えられてる（Clothiaら，J. Mol. Biol. 186, 651-663(1985); NovotnyおよびHaber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596［1985］）。
重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5種類の主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちいくつかはさらにサブクラス（イソタイプ）（例えばIgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4や、IgA-1とIgA-2など）に分割することができる。各免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、デルタ、イプシロン、γおよびμと呼ばれている。各免疫グロブリンクラスのサブユニット構造と三次元立体配置はよく知られている。IgA-1とIgA-2はIgAの単量体サブクラスであって、通常は二量体またはそれ以上の多量体の形態をとっている。腸の免疫細胞は主として多量体型IgA（二量体とそれ以上の多量体を含めてポリIgAともいう）を産生する。このようなポリIgAは「連結」鎖または「J」鎖と呼ばれるジスルフィド結合ポリペプチドを含有し、5つのサブユニットからなるJ含有多量体型IgM（ポリIgM）と共に腺上皮を通して輸送されうる。
ハイブリダイゼーションは「厳密な条件」下に行なうことが好ましい。「厳密な条件」とは、（1）洗浄に低イオン強度と高温（例えば50℃で、0.015塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1％硫酸ドデシルナトリウム）を使用すること、もしくは（2）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤（例えば42℃で、750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを含む0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％ポリビニルピロリドン/50nMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）と50％（v/v）ホルムアミド）を使用することを意味する。もう1つの例は、42℃で50％ホルムアミド、5×SSC（0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH6/8）、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波処理サケ精子DNA（50μg/ml）、0.1％SDSおよび10％硫酸デキストランを使用し、0.2×SSCおよび0.1％SDS中42℃で洗浄することである。
B．OBタンパク質-免疫グロブリンキメラ（免疫アドヘシン）
免疫アドヘシンは、結合タンパク質（通常はレセプター、細胞接着分子またはリガンド）の機能ドメインと免疫グロブリン配列を併せ持つキメラ抗体様分子である。このタイプの融合タンパク質の最も一般的な例は、免疫グロブリン（Ig）のヒンジおよびFc領域と、特定のリガンドを認識する細胞表面レセプターのドメインとを組み合わせたものである。このタイプの分子は［免疫」機能と「接着」機能を併せ持つので、「免疫アドヘシン」と呼ばれる。また、「Ig-キメラ」「Ig-融合タンパク質」「Fc-融合タンパク質」「レセプター-グロブリン」という名称もよく使用される。
当技術分野では現在までに50種類を超える免疫アドヘシンが報告されている。文献に開示された免疫アドヘシンには、例えば、T細胞レセプター（Gascoigneら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936-2940［1987］）、CD4（Caponら，Nature 337, 525-531［1989］; Trauneckerら，Nature 339, 68-70［1989］; Zettmeisslら，DNA Cell Biol. USA 9, 347-353［1990］; Byrnら，Nature 344, 667-670［1990］）、L-セレクチン（ホーミングレセプター）（Watsonら，J. Cell. Biol. 110, 2221-2229［1990］; Watsonら，Nature 349, 164-167［1991］）、E-セレクチン（Mulliganら，J. Immunol. 151, 6410-17［1993］; Jacobら，Biochemistry 34, 1210-1217［1995］）、P-セレクチン（Mulliganら，前掲；Hollenbaughら，Biochemistry 34, 5678-84［1995］）、ICAM-1（Stautonら，J. Exp. Med. 176, 1471-1476［1992］; Martinら，J. Virol. 67, 3561-68［1993］; Roepら，Lancet 343, 1590-93［1994］）、ICAM-2（Damleら，J. Immunol. 148, 665-71［1992］）、ICAM-3（Holnessら，J. Biol. Chem. 270, 877-84［1995］）、LFA-3（Kannerら，J. Immunol. 148, 2-23-29［1992］）、L1糖タンパク質（Dohertyら，Neuron 14, 57-66［1995］）、TNF-R1（Ashkenaziら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-539［1991］; Lesslauerら，Eur. J. Immunol. 21, 2883-86［1991］; Peppelら，J. Exp. Med. 174, 1483-1489［1991］）、TNF-R2（Zackら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2335-39［1993］; Wooleyら，J. Immunol. 151, 6602-07［1993］）、CD44（Aruffoら，Cell 61, 1303-1313［1990］）、CD28とB7（Linsleyら，J. Exp. Med. 173, 721-730［1990］）、CTLA-4（Lisleyら，J. Exp. Med. 174, 561-569［1991］）、CD22（Stamenkovicら，Cell 66, 1133-1144［1991］）、NPレセプター（Bennettら，J. Biol. Chem. 266, 23060-23067［1991］）、IgEレセプターα（RidgwayおよびGorman, J. Cell. Biol. 115, abstr. 1448［1991］）、HGFレセプター（Mark, M.R.ら，1992, J. Biol. Chem.投稿済）、IFN-γRα-およびβ-鎖（Marstersら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5401-05［1995］）、trk-A、-Bおよび-C（Sheltonら，J. Neurosci. 15, 477-91［1995］）、IL-2（Landolfi, J. Immunol. 146, 915-19［1991］）、IL-10（Zhengら，J. Immunol. 154, 5590-5600［1995］）の融合物が含まれる。
最も単純で最も簡単な免疫アドヘシンは、「アドヘシン」タンパク質の結合領域と、免疫グロブリン重鎖のヒンジ及びFc領域とを併せ持つ。本発明のOB-免疫グロブリンキメラを製造する場合、通常は、所望のOBポリペプチドをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端融合するが、N末端融合も可能である。通常、そのような融合物では、コードされるキメラポリペプチドが、少なくとも、免疫グロブリン重鎖定常領域の機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持しているだろう。融合は、定常ドメインのFc部分のC末端や、重鎖のCH1または軽鎖の対応する領域のすぐN末端側に対しても行われる。融合を行なう正確な位置は重大な問題ではない。特定の部位はよく知られており、そのOB-免疫グロブリンキメラの生物活性、分泌または結合特性が最適になるように選択することができる。
好ましい態様として、天然成熟OBポリペプチドの配列を、免疫グロブリン（例えばIgG-1）のエフェクター機能を含有する抗体のC末端部分（具体的にはFcドメイン）のN末端に融合する。全重鎖定常領域をOB配列に融合することもできるが、より好ましくは、IgG Fcを化学的に規定するパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を114として［Kobetら，前掲］、残基216）または他の免疫グロブリンの類似する部位のすぐ上流にあるヒンジ領域から始まる配列を融合物に用いる。特に好ましい態様として、OBポリペプチド配列を、IgG-1、IgG-2またはIgG-3重鎖のヒンジ領域とCH2およびCH3、もしくはCH1、ヒンジ、CH2およびCH3ドメインに融合する。融合を行なう正確な部位は重大な問題ではなく、日常的な実験で最適な部位を決定することができる。
いくつかの態様では、OB-免疫グロブリンキメラを多量体（特にホモ二量体またホモ四量体；WO91/08298）として会合させる。一般に、これらの会合免疫グロブリンは、既知の単位構造を持つだろう。基本的な四鎖構造単位は、IgG、IgDおよびIgEがとる形態である。より高分子量の免疫グロブリンでは四鎖単位が繰り返される。IgMは一般に、ジスルフィド結合で互いに結合した基本四鎖単位の五量体として存在する。IgAグロブリンは（時にはIgGグロブリンも）、血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合は、四鎖単位のそれぞれが同じ場合もあるし、異なる場合もある。
本発明の範囲に包含される種々の代表的会合型OB-免疫グロブリンキメラを次に略記する：
（a）ACL-ACL；
（b）ACH-［ACH, ACL-ACH, ACL-VHCHまたはVLCL-ACH］；
（c）ACL-ACH-［ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACHまたはVLCL-VHCH］；
（d）ACL-VHCH-［ACHまたはACL-VHCHまたはVLCL-ACH］；
（e）VLCL-ACH-［ACL-VHCHまたはVLCL-ACH］；
（f）［A-Y］n-［VLCL-VHCH］2
（ただし、
各Aは同一のもしくは異なるOBポリペプチドアミノ酸配列を表わし、
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメイン、
ｎは1より大きい整数であり、
Yは共有結合性架橋剤の残基を表わす。）
簡潔をむねとするため、上述の構造は重要な特徴だけを示しており、免疫グロブリンの結合（J）ドメインやその他のドメインは示していないし、ジスルフィド結合も示されていない。しかし、そのようなドメインが結合活性に必要な場合、それらは、それらがその免疫グロブリン分子中で占める通常の位置に存在するものと見なされる。
また、OBアミノ酸配列を、キメラ重鎖を含有する免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリンの重鎖配列と軽鎖配列の間に挿入してもよい。この態様では、OBポリペプチド配列を、免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリン重鎖の3'末端に、ヒンジとCH2ドメインの間か、CH2ドメインとCH3ドメインの間に融合する。同様の構築物は、Hoogenboom H. R.ら，Mol. Immunol. 28, 1027-1037（1991）に報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明の免疫アドヘシンには必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖が、OBタンパク質-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合しているか、もしくはOBポリペプチドに直接融合していてもよい。前者の場合は、通常、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、OB-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時に発現させる。分泌されると、重鎖と軽鎖は共有結合して、ジスルフィド結合した2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造をとるだろう。このような構造の調製に適した方法は、例えば米国特許第4,816,567号（1989年3月28日発行）に開示されている。
好ましい態様として、IgG免疫グロブリン重鎖定常ドメイン由来の免疫グロブリン配列を本発明の免疫アドヘシンの構築に使用する。ヒト免疫アドヘシンの場合、ヒトIgG-1およびIgG-3免疫グロブリン配列を使用することが好ましい。IgG-1を使用することの主な利点は、IgG-1免疫アドヘシンを固定化プロテインAで効率よく精製できるということである。これに対して、IgG-3の精製にはプロテインGが必要であり、これはかなり汎用性の低い媒体である。しかし、特定の免疫アドヘシン構築に使用するIg融合パートナーを選択する際には、免疫グロブリンの他の構造的特徴と機能的特徴をも考慮すべきである。例えば、IgG-3ヒンジは長く、柔軟なので、IgG-1に融合したのでは正しく折りたたまないか、正しく機能しないかもしれない大きな「アドヘシン」ドメインを適合させることもできる。考えうるIgG系免疫アドヘシン構造を図3a〜cに示す。IgG免疫アドヘシンは通例一価または二価であるが、IgAやIgMのような他のIgサブタイプは、それぞれ基本Igホモ二量体単位の二量体または五量体を生じうる。典型的なIgM系多量体型免疫アドヘシンを図3dに示す。多量体型免疫アドヘシンは、それらがそれぞれの標的に、対応するIgG型より強い親和力で結合できるという点で有利である。このような構造の例としてはCD4-IgM（Trauneckerら，前掲）、ICAM-IgM（Martinら，J. Virol. 67, 3561-68［1993］）およびCD2-IgM（Arulanandamら，J. Exp. Med. 177, 1439-50［1993］）が報告されている。
生体内で応用すべく設計されるOB-Ig免疫アドヘシンの場合は、そのFc領域によって特定されるエフェクター機能と薬物動態学的性質も重要である。IgG-1、IgG-2およびIgG-4は、いずれも21日間の生体内半減期を持つが、補体系を活性化する際のそれらの相対効力は異なる。IgG-4は補体を活性化せず、IgG-2は補体活性化に関してIgG-1よりかなり弱い。また、IgG-1とは異なり、IgG-2は単核細胞または好中球上のFcレセプターに結合しない。IgG-3は補体活性化には最適であるが、その生体内半減期は他のIgGイソタイプの3分の1程度である。ヒト用治療薬として使用するために設計される免疫アドヘシンにとって重要なもう1つの問題は、特定のイソタイプのアロタイプ変種の数である。一般に、血清学的に定義されるアロタイプが少ないIgGイソタイプが好ましい。例えば、IgG-1は血清学的に定義されるアロタイプ部位を4つしか持たず、そのうちの2つ（G1mと2）がFc領域に位置する。これらの部位のうちの一つ（G1m1）は非免疫原性である。これに対して、IgG-3には血清学的に定義されるアロタイプが12あって、それらは全てFc領域内にあり、非免疫原性のアロタイプを持つのは、これらの部位のうちの3つ（G3m5、11および21）に過ぎない。したがって、γ3免疫アドヘシンの潜在的免疫原性は、γ1免疫アドヘシンより高い。
本発明のOB-Ig免疫アドヘシンを設計するにあたって、その分子のレセプター結合性、構造の保全（例えば適切な折りたたみ）および/または生物活性に必要でない領域は削除してもよい。このような構造では、誤って折りたたまれるのを避けるために、融合接合部をドメイン間に位置する残基に置くことが重要である。親免疫グロブリンに関して、有用な結合点は、2つの重鎖間にジスルフィド結合を形成するヒンジのシステインのすぐ上流である。よく使用される設計では、その分子の「アドヘシン」（OB）部分のC末端残基をコードするコドンを、IgG1ヒンジ領域のDKTHTCPPCP配列をコードするコドンのすぐ上流に置く。
OB-Ig免疫アドヘシンを構築する最も便利な方法は、OB部分をコードするcDNA配列を、Ig cDNA配列に、枠を合わせて融合することである。しかし、ゲノムIg断片への融合も使用できる（例えばGascoigneら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936-2940［1987］；Aruffoら，Cell 61, 1303-1313［1990］；Stamenkovicら，Cell 66, 1133-1144［1991］を参照のこと）。後者のタイプの融合物は、発現にIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓または末梢血リンパ球由来のcDNAライブラリーから、公表された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術により単離することができる。例えばマウスOB cDNAは、Zhangらの配列に基づいて設計したプライマーを用いて、マウス脂肪組織cDNAライブラリー（Clontech社）からPCRによって得ることができる。ヒトOB cDNAも同様の方法で得ることができる。また、マウスOB遺伝子は、ヒト脂肪組織cDNAクローン（Clontech社）を例えばλgtIIライブラリーなどからZhangらが記述した方法で単離するためのプローブとして使用することもできる。「アドヘシン」をコードするcDNAと免疫アドヘシンのIg部分をコードするcDNAを、選択した宿主細胞内で効率のよい発現を指令するプラスミドベクターに、直列に挿入する。哺乳動物細胞内での発現には、pRK5系ベクター（Schallら，Cell 61, 361-370［1990］）、pRK7ベクターおよびCDM8系ベクター（Seed, Nature 329, 840［1989］）が好ましい。（pRK7は、ClaIとHindIIIの間のポリリンカー領域内のエンドヌクレアーゼ制限部位の順序が逆である点以外は、pRK5と同じである。米国特許第5,108,901号（1992年4月28日発行）を参照のこと）。正確な接合部は、予定した接合部コドン間の余分な配列を、オリゴヌクレオチド特異的欠失突然変異導入法（ZollerおよびSmith, Nucleic Acids Res. 10, 6487［1982］；Caponら，Nature 337, 525-531［1989］）で除去することにより、作成できる。各半分が所望の接合部の両側の配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いることができる。理想的には、これらは36〜48マーである。別法として、PCR技術により、その分子の2つの部分を適当なベクターと共に枠を合わせて結合することもできる。
免疫アドヘシンは、骨髄腫細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サルCOS細胞、ヒト胚腎臓293細胞およびバクロウイルス感染昆虫細胞を含む種々の宿主細胞で効率よく発現させることができる。これらの系では、免疫アドヘシンポリペプチドが組立てられ、細胞培養培地中に分泌される。サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）やピチア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母と、細菌細胞（好ましくは大腸菌）も、宿主として使用できる。OB-免疫グロブリンキメラは、例えばLeiberら，Crit. Res. Food Sci. Nutr. 33, 351（1993）や、FriedmanおよびLeibel, Cell 69, 217（1992）、あるいはBeavisおよびChait, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6873（1990）に記述されているOB-タンパク質の発現法と同様にして、酵母中で発現させることができる。例えば、そのコード配列を酵母発現プラスミドpPIC.9（Invitrogen社）のような酵母プラスミドにサブクローニングすることができる。このベクターは、異種タンパク質を酵母から培養培地に分泌させる。Halaasら（前掲）によれば、このベクターで形質転換されたサッカロミセス・セレビシェ中でマウスおよびヒトOB遺伝子を発現させると、シグナル配列を欠く加工されていないOBタンパク質である16kDの分泌タンパク質が得られる。大腸菌でのマウスまたはヒトOB-免疫グロブリンキメラの発現は、例えば、Halaasら（前掲）に記述されている方法から類推して行なうことができる。マウスおよびヒトOB-免疫グロブリンキメラのコード配列をPET15b発現ベクター（Novagen社）にサブクリーニングし、T7大腸菌RNAポリメラーゼ系を使用することにより、それを大腸菌（BL21(DE3)pIYsS）内で発現させることができる。また、コード配列を大腸菌アルカリ性ホスファターゼプロモーターの下流に大腸菌熱安定エンテロトキシンIIの分泌配列と枠を合わせて挿入することにより、当該融合タンパク質を大腸菌内で発現させることもできる（Changら，Gene 55, 189-96［1987］）。
OB-Ig免疫アドヘシン発現用の宿主細胞の選択は、主として発現ベクターに依存する。考慮すべきもう1つの問題は、必要とされるタンパク質量である。ミリグラム量は、しばしば、一過性トランスフェクションによって生産できる。例えば、アデノウイルスEIA形質転換293ヒト胚腎臓細胞系を、リン酸カルシウム法の変法によって、pRK-5系およびpRK7系ベクターで一時的にトランスフェクションすると、免疫アドヘシンを効率よく発現させることができる。この方法は実施例に例示する。CDM8系ベクターは、DEAE-デキストラン法によるCOS細胞のトランスフェクションに使用できる（Aruffoら，Cell 61, 1303-1313［1990］；Zettmeisslら，DNA Cell Biol. （US) 9, 347-353［1990］）。より大量のタンパク質を望むのであれば、宿主細胞系の安定なトランスフェクション後に、免疫アドヘシンを発現させることができる。例えば、pRK5系またはpRK7系ベクターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードしG418に対する耐性を付与する追加プラスミドの存在下に、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に導入することができる。G418に耐性なクローンを培養から選択することができる。これらのクローンを、DHFR阻害因子メトトレキセートのレベルを増大させつつ生育し、DHFR配列と免疫アドヘシン配列をコードする遺伝子コピーの数を同時に増幅させる。免疫アドヘシンが疎水性のリーダー配列をそのN-末端に含有する場合、それはトランスフェクションされた細胞によって加工され、分泌される可能性がある。より複雑な構造を持つ免疫アドヘシンの発現には、特別に適合させた宿主細胞が必要かもしれない。例えば、軽鎖やJ鎖のような成分は、ある種の骨髄腫またはハイブリドーマ細胞宿主によって供給することができる（Gascoigneら，前掲；Martinら，J. Virol. 67, 3561-3568［1993］）。
より複雑なオリゴマー構造を持つ免疫アドヘシンの発現には、特別に適合させた宿主細胞が必要かもしれない。例えば、軽鎖やJ鎖のような成分は、ある種の骨髄腫またはハイブリドーマ細胞宿主によって供給することができる（Gascoigneら，前掲；Martinら，J. Immunol. 67, 3561-3568［1993］）。
免疫アドヘシンは、アフィニティークロマトグラフィーによって都合よく精製できる。アフィニティーリガンドとしてプロテインAが適当であるかどうかは、そのキメラに使用される免疫グロブリンFcドメインの種とイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、γ2またはγ4重鎖に基づく免疫アドヘシンの精製に使用できる（Lindmarkら，J. Immunol. Meth. 62, 1-13［1983］）。プロテインGは、全てのマウスイソタイプとヒトγ3に推奨される（Gussら，EMBO J. 5, 15671575［1986］）。アフィニティーリガンドを結合させる基盤は、たいていアガロースであるが、他の基盤も利用できる。制御された細孔ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのように機械的に安定な基盤を使用すれば、アガロースの場合よりも流速を早くし、処理時間を短くすることができる。プロテインAまたはGアフィニティーカラムに免疫アドヘシンを結合させる条件は、もっぱら、そのFcドメインの特徴（つまりその種とイソタイプ）によって決まる。一般に、適切なリガンドを選択すれば、無調節の培養液から直接的に、効率のよい結合が起こる。免疫アドヘシンのきわだった特徴の一つは、ヒトγ1分子の場合、プロテインAに関する結合能が、同じFcタイプの抗体よりもいくらか減少するということである。結合した免疫アドヘシンは、酸性pH（3.0またはそれ以上）か、温和なカオトロピック塩を含有する中性pH緩衝液で、効率よく溶出させることができる。このアフィニティークロマトグラフィー操作によって、＞95％純粋な免疫アドヘシン調製物を得ることができる。
免疫アドヘシンの精製には、プロテインAまたはGでのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、あるいはそれらに加えて、当技術分野で知られているその他の方法を使用することもできる。免疫アドヘシンは、親硫黄性ゲルクロマトグラフィー（HutchensおよびPorath, Anal. Biochem. 159, 217-226［1986］）や固定化金属キレートクロマトグラフィー（Al-MashikhiおよびMakai, J. Dairy Sci. 71, 1756-1763［1988］）において、抗体と同様の挙動を示す。しかし抗体とは対照的に、イオン交換カラムにおけるそれらの挙動は、それらの等電点だけでなく、そのキメラ性ゆえにその分子中に存在する電荷双極子にも左右される。また免疫アドヘシンのアドヘシン部分がグリコシル化されていて、シアル酸を含有する場合は、電荷の微小不均一性も要因となる。精製手順の一例を実施例に記述する。
現在までに作成された数多くの免疫アドヘシンで得られた結果によれば、Fc領域に対するアドヘシン部分の融合は、通常、個々のドメインの折りたたみに摂動を起させない。アドヘシン領域と免疫グロブリン領域はどちらも正しく折りたたまれるようであり、そのFc部分は抗体に特有なエフェクター機能（例えばFcレセプターに対する結合性など）の多くを保持している。
免疫アドヘシンの構築、発現および精製に広く適用できる方法は、例えば米国特許第5,225,538号（1993年7月6日発行）や同第5,455,165号（1995年10月30日発行）などに記述されており、これらの特許は参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。免疫アドヘシンの構築、発現、精製および様々な免疫アドヘシン設計は、AshkenaziおよびChamow, Meethods in Enzymology 8, 104-115（1995）やPeachおよびLinsley, Methods in Enzymology 8, 116-123（1995）の総説にも記述されており、これらの開示はそこに引用されている文献と共に、参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。
C．その他の長半減期OB誘導体
天然分子よりも長い半減期を持つOBタンパク質のもう1つの誘導体は、非タンパク質ポリマーに共有結合したOBタンパク質またはOB-免疫グロブリンキメラからなる。その非タンパク質ポリマーは通常、親水性合成ポリマー、すなわち本来天然には認められないポリマーである。しかし、自然界に存在するポリマーや組換え法または試験管内法によって生産されるポリマーも、天然の供給源から単離されるポリマーと同様に有用である。本発明の範囲には、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンのような親水性ポリビニルポリマーが含まれる。ポリエチレングリコール（PEG）のようなポリアルキレンエーテル類；ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（プルロニック）；ポリメタクリレート；カーボマー（carbomer）；単糖類D-マンノース、D-およびL-ガラクトース、フコース、フルクトース、D-キシロース、L-アラビノース、D-グルクロン酸、シアル酸、D-ガラクツロン酸、D-マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸やアルギン酸）、D-グルコサミン、D-ガラクトサミン、D-グルコースおよびノイラミン酸からなる分枝状または非分枝状多糖（ホモ多糖とヘテロ多糖を含む）、例えば乳糖、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、あるいは酸性ムコ多糖（ヒアルロン酸など）の多糖サブユニット；ポリソルビトールやポリマンニトールのような糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパロンなどは、とりわけ有用である。架橋前のポリマーは水溶性であることが好ましいものの、水溶性である必要はない。しかし、最終的な複合体は水溶性でなければならない。またこのポリマーは複合体型とした時に高度に免疫原性であってはならないし、また静脈内に注入または注射しようとする場合は、そのような投与経路に不向きな粘性を持ってはならない。
このポリマーは反応基を一つだけ含有することが好ましい。これは、タンパク質分子の架橋を避けるのに役立つ。しかし、架橋が減少するように反応条件を最適化することや、実質上均一な誘導体が回収されるように反応生成物をゲルろ過やクロマトグラフィーによるふるい分けで精製することも、本発明の範囲に含まれる。
このポリマーの分子量は約100から500,000までの範囲であることが望ましく、約1,000から20,000までであることが好ましい。選択する分子量はそのポリマーの性質と置換の程度に依存する。一般的には、そのポリマーの親水性が高く、置換の程度が高いほど、使用できる分子量は低くなる。最適な分子量は、日常的な実験によって決定することになるだろう。
上記のポリマーは一般に、結合しようとする当該ポリマーおよびOBタンパク質またはOB-免疫グロブリンキメラの1またはそれ以上のアミノ酸残基または糖残基と反応する多官能性架橋剤によって、OBタンパク質またはOB-免疫グロブリンキメラに共有結合される。しかし、誘導体化したポリマーを当該ハイブリッド分子と反応させることによってポリマーを直接架橋すること、もしくはその逆も、本発明の範囲に包含される。
OBタンパク質またはOB-Ig上の共有結合的架橋部位としては、N-末端アミノ基とリジン残基上のイプシロンアミノ基、あるいは他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル、その他の親水性基が挙げられる。ポリマーは多官能性（通常は二官能性）架橋剤を使用せずにハイブリッド分子に直接共有結合させてもよい。アミノ基への共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（PEGアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；PEG＋DMSOおよび酢酸無水物またはPEGクロリド＋4-ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオカーボネートPEG、2,4,5-トリクロロフェニルクロロホルメートまたはP-ニトロフェニルクロロホルメート活性化PEG）に基づく公知の化学で行われる。カルボキシル基はPEG-アミンをカルボジイミドを使ってカップリングすることによって誘導体化される。
ポリマーは、ビオチンまたはアビジンによるオリゴ糖の標識についてHeitzmannら，P.N.A.S, 71, 3537-41（1974）やBayerら，Methods in Enzymology 62, 310（1979）に記述されているのと同じ方法で、メタ過ヨウ素酸などの化学品か、グルコースまたはガラクトースオキシダーゼなどの酵素を用いる酸化反応（どちらの場合も炭水化物のアルデヒド誘導体が生成する）の後、ヒドラジドまたはアミノ誘導体化ポリマーとの反応を行なうことによって、オリゴ糖基に結合される。さらに、オリゴ糖を結合するのにこれまでに使用されてきた他の化学法や酵素法もとりわけ有利である。なぜなら一般に、アミノ酸部位よりも誘導体化に利用される置換基が少ないために、オリゴ糖生成物の方がより均一になるからである。また、ポリマー誘導体化に先立って、オリゴ糖置換基をノイラミニダーゼ消化などの酵素消化による糖除去によって修飾してもよい。
ポリマーは、連結するポリペプチドのアミノ酸側鎖やN末端またはC末端と直接反応する基、もしくは多官能性架橋剤と反応する基を持つだろう。一般に、そのような反応性基を持つポリマーは固定化タンパク質の調製用として知られている。このような化学法を使用するには、これまでにタンパク質固定化に使用されてきた不溶性ポリマーと同じ方法で誘導体化された水溶性ポリマーを使用するべきである。臭化シアン活性化法は、多糖類の架橋に使用するにはとりわけ有用な方法である。
出発ポリマーに関して「水溶性」という場合、これは複合体化に使用するポリマーもしくはその反応性中間体が誘導体化反応に参加できるほどに水溶性であることを意味する。
ポリマー複合体に関して「水溶性」という場合、これは血液のような生理学的液体中にその複合体が溶解しうることを意味する。
このようなポリマーによる置換の程度はそのタンパク質上の反応性部位の数、そのタンパク質全体を使用するのか、それともその断片を使用するのか、そのタンパク質が異種タンパク質との融合物（例えばOB-免疫グロブリンキメラ）であるかどうか、そのポリマーの分子量、親水性その他の特性、および選択したタンパク質誘導体化部位に依存して変動するだろう。異種配列は所望の活性が有意に有害な影響を受けない限り基本的に何個のポリマー分子で置換されていてもよいのであるが、一般的には、複合体は約1個から10個までのポリマー分子を含有する。最適な架橋の程度は、時間、温度その他の反応条件を変えて、置換の程度を変化させた後、その複合体が所望の様式で機能する能力を決定する一連の実験によって、容易に決まる。
PEGなどのポリマーは、PEGのような非タンパク質ポリマーでタンパク質を共有結合的に修飾するための様々な（それ自体は公知の）方法によって、架橋される。しかしこれらの方法のいくつかは本発明には好ましくない。シアヌロン酸クロリド（cyanuronic chloride）はタンパク質架橋を含む多くの副反応をもたらす。また、これはスルフヒドリル基を含有するタンパク質の不活化につながる可能性もある。カルボニルジイミダゾール化学（Beauchampら，Anal Biochem. 131, 25-33［1983］）は高pH（＞8.5）を必要とし、それはタンパク質を失活させることになりうる。さらに、「活性PEG」中間体は水と反応しうるので、タンパク質に対して極めて大モル過剰の「活性PEG」が必要である。このカルボニルジイミダゾール化学に必要な高濃度のPEGは精製の面でも問題がある。ゲルろ過クロマトグラフィーも親水性相互作用クロマトグラフィーも有害な影響を受けるからである。さらに、高濃度の「活性PEG」がタンパク質を沈殿させることもあり、この問題自体は既に認められている（Davis，米国特許第4,179,337号）。これに対してアルデヒド化学（Royer，米国特許第4,002,531号）は、40倍モル過剰のPEGと1〜2時間の保温しか必要としないので、より効率がよい。しかし、Royerが提案したPEGアルデヒド調製用の二酸化マンガンは「PEGが金属系酸化剤と錯体を形成する傾向が著しいために」（Harrisら，J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, 341-52［1984］）問題が多い。DMSOと酢酸無水物を用いるMoffatt酸化を使えば、この問題を回避することができる。また、Royerが提案したホウ水素化ナトリウムは高pHで使用しなければならず、ジスルフィド結合を還元する傾向がかなり高い。これに対して、中性pHで有効であり、ジスルフィド結合を還元する傾向がほとんどないシアノホウ水素化ナトリウムは好ましい。
本発明のOBタンパク質またはOB-Igキメラを修飾するための機能性PEGポリマーは、Shearwater Polymers社（アラバマ州ハンツヴィル）から入手できる。このような市販のPEG誘導体には、アミノ-PEG、PEGアミノ酸エステル、PEG-ヒドラジド、PEG-チオール、PEG-スクシネート、カルボキシメチル化PEG、PEG-プロピオン酸、PEGアミノ酸、PEGスクシンイミジルスクシネート、PEGスクシンイミジルプロピロネート、カルボキシルメチル化PEGのスクシンイミジルエステル、PEGのスクシンイミジルカーボネート、アミノ酸PEGのスクシンイミジルエステル、PEG-オキシカルボニルイミダゾール、PEG-ニトロフェニルカーボネート、PEGトレシレート（PEG tresylate）、PEG-グリシジルエーテル、PEG-アルデヒド、PEGビニルスルホン、PEG-マレイミド、PEG-オルトピリジル-ジスルフィド、ヘテロ官能性PEG、PEGビニル誘導体、PEGシラン、およびPEGホスホリド（PEG phospholide）などがあるが、これらに限るわけではない。これらのPEG誘導体をカップリングするための反応条件は、タンパク質、所望するPEG化の程度、および使用するPEG誘導体によって変動するだろう。PEG誘導体の選択に関わる要因には、所望する結合点（リジンまたはシステイン）、その誘導体の加水分解的安定性と反応性、その結合の安定性、毒性および抗原性、分析しやすさなどがある。ある特定の誘導体に関する具体的使用法は、その製造社から入手することができる。
本発明の長半減期複合体は、ゲルろ過によって未反応の出発物質から分離される。その複合体の異種成分も同じ方法で互いに精製される。またポリマーは親水性ゲルのように水不溶性であってもよい。
また本複合体はイオン交換クロマトグラフィーで精製することもできる。親電子的に活性化されたPEGを使用すると、多くの場合、PEG化された生成物のアミノ基電荷が減少する。したがって高分解能イオン交換クロマトグラフィーを使用して、遊離のタンパク質と複合体化したタンパク質を分離することができ、またPEG化のレベルが異なる分子種を分割することができる。実際のところ、未反応のアミノ酸のイオン特性の相違により、異なる分子種（例えばPEG残基を1つまたは2つ含有する種）を分割することもできる。
D．OB-免疫グロブリンキメラとその他の長半減期誘導体の使用
本発明のOB-免疫グロブリンキメラとその他の長半減期誘導体は、減量、特に肥満その他のOB遺伝子の発現または機能の異常に関係する障害の治療に有用である。我々の研究によれば、OB-免疫グロブリンキメラとその他の長半減期OB誘導体（例えばPEG化OB）は、処置した動物の食物摂取量を減じ、そのエネルギー使用量を増大させるので、肥満動物と正常動物のどちらの体重を減少させるのにも極めて有効である。試験を行なうには、本発明の分子をリン酸緩衝食塩水（PBS）（pH7.4）に溶解し、静脈内または皮下に注射もしくは注入することにより投与すればよい。
本発明の持続性OB誘導体はさらに、糖尿病や過食症などといった他の代謝障害の治療にも使用できる。OBタンパク質は動物内のインスリンレベルを減少させることが示されており、人間の患者の過剰なインスリンを減少させるのにも有用だろう。肥満患者または非肥満患者（例えばI型またはII型糖尿病）のインスリンレベルを減少すれば、その患者のインスリン感受性が復旧もしくは改善されるだろう。
また、本長半減期OB誘導体は腎臓病、高血圧、肺気腫のような肺機能不全の治療にも使用できる。また、OBタンパク質は、レセプター保持組織の有糸分裂促進反応を引き起こして、それらの細胞にとって増殖因子として作用するかもしれない。
本発明の治療用製剤を貯蔵するには、所望の純度を持つ活性成分を医薬的に許容できる随意の担体、賦形剤または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol, A.編（1980））と、凍結乾燥製剤または水溶液の形態に混合する。許容できる担体、賦形剤または安定化剤は、使用する用量と濃度でその受容者にとって無毒であり、これには、リン酸、クエン酸その他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンなどの単糖類、二糖類その他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および/またはツィーン、プルロニック、PEGなどの非イオン界面活性剤が含まれる。
例えばコアセルベーション法もしくは界面重合などによって調製したマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルと、ポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）や、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションに活性成分を封入してもよい。そのような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences（前掲）に開示されている。
生体内投与に使用する製剤は、滅菌状態でなければならない。これは、凍結乾燥と復元の前または後に、滅菌ろ過膜を通してろ過することによって、容易に達成される。
この治療用組成物は一般に、滅菌注入口を持つ容器（例えば皮下注射針を突き刺せる栓を持つ静脈内溶液バッグやバイアル）に入れられる。
投与経路は、静脈内経路や腹腔内経路による注射または注入のような公知の方法に従う。また、徐放性製剤も考えられる。徐放性製剤の好適例としては、フィルムやマイクロカプセルなどの成型品の形態にある半透過性ポリマー基盤が挙げられる。徐放性製剤基盤には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー（U. Sidmanら，1983, "Biopolymers" 22(1): 547-556）、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langerら，1981, "J. Biomed. Mater. Res." 15:167-277およびR. Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105）、エチレンビニルアセテート（R. Langerら，同上）またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP133,988A）がある。徐放性組成物には、リポソームも含まれる。本発明の範囲に包含される分子を含有するリポソームは、それ自体は公知の方法DE3,218121A； Epsteinら，1985, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82: 3688-3692; Hwangら，1980, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 77: 4030-4034; EP 52322A; EP 36676A; EP88046A; EP143949A; EP142641A;特願昭58-118008；米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号；ならびにEP102,324Aの方法によって調製される。リポソームは通常小さな（約200〜800オングストローム）単層型で、その脂質含量は約30モル％コレステロール以上であって、その治療法が最適となるように調節した比率が選択される。
治療的に使用される本発明の分子の有効量は、例えば治療対象、投与経路、患者の状態などに依存するだろう。したがって治療者は、最適な治療効果を得られるように必要に応じて用量を滴定し、投与経路を改良する必要がある。典型的な日用量は、上述の要因によって約1μg/kg〜100mg/kgまたはそれ以上となるかもしれない。一般的には、臨床医は、投与量が必要な生物効果を与える量に達するまで本発明の分子を投与することになる。この治療の進行は、従来のアッセイ技術によって容易にモニターできる。治療の目的が減量であるなら、その治療は通常、所望の体重に達するまで続けられる。
本発明のOBタンパク質-免疫グロブリン融合物の治療以外の用途としては、OBレセプターを同定し精製するための使用がある。OBタンパク質-免疫アドヘシンを用いたOBレセプターの同定と発現クローニングについては、後述の参照例に説明する。
以下、限定を意図しない実施例により本発明をさらに例証する。
実施例1
OB-免疫アドヘシンの発現
タンパク質工学を用いて、ヒトOBタンパク質をIgG-1のヒンジ、CH2およびCH3ドメインとの融合体として発現させた。ヒトOBタンパク質とIgG-l FcドメインのキメラをコードするDNA構築物を、ヒトIgG-1のFc領域クローンを使って作成した。ヒトOB cDNAはPCRによりヒト脂肪細胞dscDNA（Clontech Buick-Clone cDNA製品）から得た。IgG-1 cDNAの供給源はプラスミドpBSSK-CH2CH3である。このキメラは、完全長OBタンパク質（図5のアミノ酸1〜167）のコード配列と、重鎖-軽鎖結合に関与するシステイン残基後のIgG-1ヒンジの第1残基であるアスパラギン酸216から始まり、残基441で終わり、IgG-1のCH2およびCH3 Fcドメインを包含するヒトIgG-1配列（ただし重鎖定常領域の第1残基をアミノ酸114とする；Kabatら，Sequences of Proteins of Immunological Interest第4版［1987］）とを含有する。OBコード配列とIgG-1コード配列の間には3アミノ酸（Gly Val Thr）のコドンが挿入されている。必要であれば、OBタンパク質のコード配列とIgG-1ヒンジ領域のコード配列の間に正確な接合部を作成するために、この短いリンカー配列を、例えば部位特異的欠失突然変異導入法により、容易に除去することができる。このOB-IgG-1免疫アドヘシンのコード配列をネオマイシン選択マーカーを含有するpRK5系ベクターpRK5tk-neoにサブクローニングし、リン酸カルシウム法を用いて、293細胞での一過性発現に使用した（Suvaら，Science 237, 893-896［1987］）。293細胞を、10％FBSと2mM L-Glnを含むHAM：低グルコースDMEM培地（50:50）で培養した。OB-IgG-1キメラを精製するため、トランスフェクション後に細胞を無血清生産培地PS24に移し、3日後に培地を集めた。その培養培地をろ過した。
組換えヒトOB-IgG-1を含有するろ過済293細胞上清（400ml）を、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドと2μg/mlアプロチニンにした。これを、100mM HEPES pH8で平衡化した1×4.5cmのプロテインAアガロースカラム（Pierce社カタログ番号20365）に4℃で充填した。流速は75ml/時間とした。試料を充填し終えたら、そのカラムを平衡化緩衝液でA280がベースラインに達するまで洗浄した。OB-IgG-1タンパク質を、流速15ml/時間の3.5M MgCl2＋2％グリセロール（非緩衝液）で溶出させた。その溶出液を時折混合しながら10mlの100mM HEPES pH8中に集めることにより、MgCl2濃度を約半分に減らし、pHを上げた。次に、溶出したタンパク質をリン酸緩衝食塩水中に透析し、濃縮し、4℃で保存するか、−70℃で凍結保存した。この方法で調製したOB-IgG-1免疫アドヘシンは、SDS-PAGEにより、純度90％以上と見積もられる。
実施例2
動物実験
A．  材料と方法
OBタンパク質生産：マウスOB cDNAをPCRにより脂肪細胞cDNAライブラリーから、Zhangら（前掲）の配列に基づくプライマーを用いて得た。大腸菌アルカリ性ホスファターゼプロモーターの下流に、OBコード配列を大腸菌熱安定エンテロトキシンIIの分泌配列と枠を合わせて挿入することにより、成熟OBタンパク質（アミノ酸22〜167）を大腸菌中で発現させた。Changら，Gene 55, 189-96（1987）。細胞を溶解した後、不溶性画分を25mM DTTの存在下に8M尿素緩衝液pH8.35中に可溶化した。還元型OBタンパク質をサイズ排除および逆相HPLCで精製した後、グルタチオンの存在下に再生させた。再生したOBタンパク質を逆相HPLCで精製し、SDS-PAGE、アミノ酸分析および質量スペクトル分析によって分析した。
PEG-hOBの調製：逆相クロマトグラフィーによって精製したhOBを、10kDの公称分子量を持つPEGプロピオン酸のスクシンイミジル誘導体（SPA-PEG；Shearwater Polymers社（アラバマ州ハンツヴィル）から入手したもの）と反応させることにより、ヒトPBタンパク質のPEG誘導体を調製した。逆相クロマトグラフィーによってhOBタンパク質を精製した後、0.1％トリフルオロ酢酸と約40％アセトニトリルに溶解した約1〜2mg/mlの当該タンパク質を、1/3〜1/2体積の0.2Mホウ酸緩衝液で希釈し、NaOHでpHを8.5に調節した。その反応混合物にSPA-PEGを加えて、タンパク質とSPA-PEGのモル比を1:1および1:2にし、その混合物を室温で1時間保温した。反応とゲル電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィーによる精製の後、試料をリン酸緩衝食塩水に対して十分に透析し、0.22ミクロンフィルターを通してろ過することにより滅菌した。試料は4℃で保存した。この条件下に、タンパク質とSPA-PEGのモル比が1:1の反応から得たPEG-hOBは、主として1分子の10kD PEGが結合した分子からなり、2分子のPEGを含有する分子種も少量存在した。1:2モル反応から得られたPEG-hOBは、SDSゲル電気泳動によれば、hOBに2分子のPEGが結合した生成物と、3分子のPEGが結合した生成物がほぼ等量であった。どちらの反応でも、未反応のタンパク質が少量検出された。この未反応タンパク質は必要に応じてゲルろ過またはイオン交換により効率よく除去することができる。ヒトOBタンパク質のPEG誘導体は、EP372,752（1990年6月13日公開）に記述されているアルデヒド化学に基本的に従って調製することもできる。
動物実験：動物が関与する操作はすべて、Genentech's Institutional Animal Care and Use Committee（ジェネンテック社実験動物飼育使用委員会）による検閲と認可を受けた。7〜8週齢の遺伝性肥満C57BI/6J-ob-ob（ob/ob）雌マウスをJackson Labs（メイン州バーハーバー）から購入した。同じ遺伝的バックグラウンド（C57BI/6）を持つ痩躯雌マウスはHarlan Sprague Dawley（カリフォルニア州ホリスター）から購入した。温度、湿度および照明（点灯06:00、消灯18:00）を制御した飼育室で、マウスを3〜6匹ずつのグループに分けて飼育し、水と標準マウス飼料（Purina 5010; Purina Mills社（インディアナ州リッチモンド））を自由に摂取させた。
ミニ浸透圧ポンプ（Alzetモデル2002；Alza Corp.（カリフォルニア州パロアルト））に、滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）中の精製組換えOBタンパク質（100μg/kg/日）またはPBSのみを、製造者の指示に従って滅菌条件下に充填し、マウスに移植する前に、室温の滅菌食塩水中で終夜保温した。マウスをケタミン/キシラジンで麻酔し、ミニ浸透圧ポンプを中肩甲部の皮下に移植した。精製組換えOBタンパク質、hOB-IgG-1融合タンパク質またはPBSを、意識のあるマウスの中肩甲部に毎日皮下注射した。注射は消灯の1時間以内に行なった。各マウスの体重（0.1グラム単位）と各カゴの飼料箱に含まれる飼料の重量（0.1グラム単位）を1〜2日毎に消灯の1時間以内に記録した。データを平均±SEMとして表わす。動物の数は下記および図の説明に記載の通りである。
B．  OBタンパク質の皮下持続注入の結果
痩躯雌マウスにマウスOBタンパク質を皮下持続注入または毎日皮下注射した。その結果を図1に示す。上側の図は、OBタンパク質を持続注入として投与した場合の方が、同じ投与量を毎日皮下注射として与えた場合よりも、体重の減少に有意に有効であることを示している。下側の図は、OBタンパク質が脂肪組織重量を減少させる能力に関して、同様の相違を示している。
C．  OB-IgG-1キメラの結果
肥満雌ob/obマウスをヒトOBタンパク質またはヒトO B-IgG-1キメラで処置した。そのデータを図2に示す。上側の図に示すデータは、hOB-IgG-1融合タンパク質と天然のhOBタンパク質を毎日皮下注入することにより同様に投与した場合、hOB-IgG-1融合タンパク質の方が、天然のhOBタンパク質よりも、体重を減少させる効力が強いことを示している。OB-IgG-1キメラはその約3分の1しかOBタンパク質に由来していないので、このデータをモル量に変換すれば、効力の増大はなお明白になる。またこのデータは、hOBタンパク質の皮下持続注入（ポンプ）が毎日の皮下注射（注射）よりも体重の減少に有効であるという先の観察結果を確認するものでもある。
図2の下側の図に示すデータは、hOB-IgG-1融合タンパク質が食物摂取量を本質的に減少させることを示している。融合タンパク質は血管脳関門を通過してその作用を発揮するには大きすぎるだろうと思われたので、これは予想外の結果だった。
肥満（ob/ob）雌マウスを、7日間毎日皮下注射することにより、hOBまたはhOB-IgG-1キメラで処置した。図3に示すデータもやはり、キメラの方が天然OBタンパク質よりも体重（上図）および食物摂取量（下図）の減少に有効であるということを示している。
さらなる実験として、肥満（ob/ob）雌マウスを、7日間毎日皮下注射することにより、hOB-IgG-1融合タンパク質、天然hOBまたはhCD4-IgG-1（対照）で処置した。図5に示す結果は、hOB-IgG-1融合タンパク質の方が天然hOBタンパク質よりも、体重（上図と中図）と食物摂取量（下図）の減少に有効であることを支持している。
D．  PEG-hOBの結果
肥満雌ob/obマウスをヒトOBタンパク質またはヒトOBのPEG誘導体で処置した。そのデータを図4に示す。上側の図に記載のデータは、PEG-hOBと天然hOBタンパク質を毎日皮下注入することにより同様に投与した場合、PEG-hOBの方が天然hOBタンパク質よりも体重を減少させる効力が強いことを示している。
図4の下側の図に記載のデータは、PEG-hOBタンパク質の方が無修飾の天然hOBよりも食物摂取量を減少させる効果が本質的に高いことを示している。
参照例
OBレセプターの同定とクローニング
実施例1のOBタンパク質-免疫アドヘシンを用いて、OBレセプターを検出し、発現クローニングした。まずレセプター源を同定するために、いくつかの細胞系を、1μg/ml OB-IgG-1融合物を使ってフローサイトメトリーでスクリーニングした。ビオチンを結合した二次抗体と、それに続くストレプトアビジン-フィコエリトリンとからなる検出系は、シグナルの劇的な増幅をもたらし、少数のレセプターを発現させる細胞の検出を可能にする。2つの細胞系、ヒト胚腎臓293細胞とヒト肺A549細胞は、OB-IgG-1を結合するが、Flt-4対照免疫アドヘシンを結合しないことがわかった。これらの細胞に対するOB-IgG-1の特異的結合は、細菌に発現させた過剰のヒトOBタンパク質を添加することによっても立証された。10μg/mlのヒトOBを添加すると、293細胞に対するOB-IgG-1の結合が完全に遮断された。
OBレセプターをコードするcDNAを単離するために、COSN細胞を、pRK5B中に作成したオリゴdTプライムド293細胞cDNAライブラリー約105クローンのプールで一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞をOB-IgG-1と共に培養した後、抗ヒトFc抗体で覆ったプレートでのパニングによって濃縮した。濃縮を3回行なった後、30プール中1プールが、OB-IgG-1が媒介するCOSN細胞の結合プレートへの接着であって、ヒトレプチンと競合するものを与えた。この3回目の濃縮後に無作為に拾い上げたcDNAクローンを10〜20づつのプールとしてトランスフェクションさせた。パニングによって陽性であった10プール中の1プールを破壊することにより、最終的に個々のクローンを同定した。
配列分析により、896アミノ酸のタンパク質をコードする読み取り枠を持つ約5300bpのクローンが明らかになった。その配列は22アミノ酸長のシグナルペプチド、819アミノ酸の細胞外ドメイン、21アミノ酸の膜貫通ドメインおよび短い34アミノ酸の細胞内ドメインを持つ1型膜貫通タンパク質に相当した。この配列は本質的にTartagliaら（前掲）が同定単離したヒトOBレセプターに相当することがわかった。この配列は、同時係属中の出願番号08/585,005（1996年1月11日出願）に開示するヒトレセプター配列と同一である。
ここに本発明を例示し終えたが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。本発明の総合的な概念から逸脱することなく、さらに改良や変更を施しうることは言うまでもない。そのような変更はすべて本発明の範囲の包含されるものとする。
本明細書（実施例を含む）に引用した文献とそこに引用されている文献はすべて、参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。
配  列  表
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７１２７  塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１：
0004037905.tif 000002
0004037905.tif 000003
0004037905.tif 000004
0004037905.tif 000005
0004037905.tif 000006
0004037905.tif 000007
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0004037905.tif 000008
0004037905.tif 000009
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0004037905.tif 000011
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
0004037905.tif 000018
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
0004037905.tif 000020
【図６Ａ】
0004037905.tif 000021
【図６Ｂ】
0004037905.tif 000022
【図６Ｃ】
0004037905.tif 000023
【図６Ｄ】
0004037905.tif 000024
【図６Ｅ】
0004037905.tif 000025
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
0004037905.tif 000028
【図６Ｉ】
0004037905.tif 000029
【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
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【図６Ｔ】
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【図６Ｕ】
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【図６Ｖ】
0004037905.tif 000042