(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する方法であって、(a) カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体存在下で、当該基準となる単鎖核酸分子とその相補鎖とからなる二重鎖核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子と共存させる工程、(b)当該基準となる単鎖核酸分子の相補鎖が、当該試料とする単鎖核酸分子と置換する速度又は率を測定する工程、(c)工程(a)において、試料とする単鎖核酸分子の代わりに、基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用い、工程(b)と同様に置換速度又は置換率を測定し、その測定値と工程(b)における測定値を比較し、（１）試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換速度と基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換速度が等しければ、ミスマッチが存在しないと判定し、（２）基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換速度が、試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換速度の１０〜１０００倍であれば、ミスマッチが存在すると判定し、（３）試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換率と基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換率が等しければ、ミスマッチが存在しないと判定し、（４）試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換率が基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換率よりも低ければ、ミスマッチが存在すると判定する工程を含むことを特徴とする単鎖核酸分子間のミスマッチ判定方法。
【請求項２】
試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する方法であって、(a)当該基準となる単鎖核酸分子に当該試料とする単鎖核酸分子を接触させ、二重鎖核酸分子を形成させる工程、(b) カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体存在下で、(a)で形成させた二重鎖核酸分子と当該基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を共存させる工程、(c)当該試料とする単鎖核酸分子が、当該基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖と置換する速度又は率を測定する工程、(d)工程(a)において、試料とする単鎖核酸分子の代わりに、基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用い、工程(c)と同様に置換速度又は置換率を測定し、その測定値と工程(c)における測定値を比較し、（１）試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換速度と基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換速度が等しければ、ミスマッチが存在しないと判定し、（２）試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換速度が、基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換速度の１０〜１０００倍であれば、ミスマッチが存在すると判定し、（３）試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換率と基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換率が等しければ、ミスマッチが存在しないと判定し、（４）試料とする単鎖核酸分子を用いた場合の置換率が基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた場合の置換率よりも高ければ、ミスマッチが存在すると判定する工程を含むことを特徴とする単鎖核酸分子間のミスマッチ判定方法。
【請求項３】
カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーが、ポリリジン又はポリアリルアミンであることを特徴とする請求項１又は２記載の単鎖核酸分子間のミスマッチ判定方法。
【請求項４】
親水性高分子が、デキストラン又はポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の単鎖核酸分子間のミスマッチ判定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する方法に関する。この方法は、配列のミスマッチが一塩基だけであっても、正確にその存在を判定することができるので、ＤＮＡ診断法などに利用することができる。
背景技術
ある特定の塩基配列を有する核酸分子を特異的に検出する方法としてハイブリダイゼーション法が広く用いられてきた。この方法は、特定の細菌やウイルスの検出、特定の遺伝子の単離などに利用されてきたが、最近では、ヒトゲノムＤＮＡ中の微小な変異を検出し、個人の疾患易罹患性や薬剤反応性などを判定するいわゆる遺伝子診断などの分野にも利用されている。疾患易罹患性や薬剤反応性の違いは、ゲノムＤＮＡ中の１塩基の差異に起因する場合が多い。従って、遺伝子診断においては、プローブとして用いるＤＮＡが、完全に相補的な核酸分子にだけハイブリダイズし、少しでもミスマッチを含む核酸分子にはハイブリダイズしないような条件を設定する必要がある。このような厳格なハイブリダイゼーションを実施するため、従来、完全に相補的な二重鎖核酸分子及びミスマッチを含む二重鎖核酸分子の融解温度（Ｔｍ）を予め予想し、この温度に基づきハイブリダイゼーション時の温度と塩濃度を調整していた。
しかし、検出対象となる核酸分子が短い場合には、このような温度等の調整により、ある程度の特異性を保持したハイブリダイゼーションは可能であったが、核酸分子が長い場合には、完全に相補的な二重鎖核酸分子及びミスマッチを含む二重鎖核酸分子の融解温度の差が小さくなるため、両者を区別したハイブリダイゼーションを行うのは困難であった。
ところで、カチオン性ポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体が、核酸分子を安定化させること（特開平１０−４５６３０号公報、特開平１０−１５８１９６号公報）、核酸分子間の交換反応を促進すること（特開２００１−７８７６９号公報）については知られているが、上述したようなミスマッチを含む核酸分子とのハイブリダイゼーションを排除する目的で、このグラフト重合体を使用することについては何ら知られていない。
以上のように、遺伝子診断においては、ある核酸分子がプローブと一塩基のミスマッチも含まず、完全に相補的であるかどうか、という情報は非常に重要である。
本発明は、以上のような技術的背景のもとになされたものであり、その目的は、試料とする単鎖核酸分子とプローブとの間に配列のミスマッチが存在するかどうかを正確に判定する手段を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、上述したグラフト重合体などのカチオン性高分子の存在下で、二重鎖ＤＮＡを、一方の鎖と相補的な単鎖ＤＮＡと共存させた場合、その相補的な単鎖ＤＮＡがミスマッチを含むかどうかにより、ＤＮＡ間の置換速度及び率に大きな差異が生じることを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する方法であって、（ａ）カチオン性高分子存在下で、当該基準となる単鎖核酸分子とその相補鎖とからなる二重鎖核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子と共存させる工程、（ｂ）当該基準となる単鎖核酸分子の相補鎖が、当該試料とする単鎖核酸分子と置換する速度又は率を測定する工程を含むことを特徴とする単鎖核酸分子間のミスマッチ判定方法である。
また、本発明は、試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する方法であって、（ａ）当該基準となる単鎖核酸分子に当該試料とする単鎖核酸分子を接触させ、二重鎖核酸分子を形成させる工程、（ｂ）カチオン性高分子存在下で、（ａ）で形成させた二重鎖核酸分子と当該基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を共存させる工程、（ｃ）当該試料とする単鎖核酸分子が、当該基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖と置換する速度又は率を測定する工程を含むことを特徴とする単鎖核酸分子間のミスマッチ判定方法である。
更に、本発明は、試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する方法であって、（ａ）カチオン性高分子存在下で、当該基準となる単鎖核酸分子に、その完全相補鎖及び当該試料とする単鎖核酸分子を接触させる工程、（ｂ）当該基準となる単鎖核酸分子とその完全相補鎖とからなる二重鎖核酸分子、及び当該基準となる単鎖核酸分子と当該試料とする単鎖核酸分子とからなる二重鎖核酸分子の形成比を求める工程を含むことを特徴とする単鎖核酸分子間のミスマッチ判定方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、カチオン性高分子を利用して、試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する方法である。
カチオン性高分子は、上述した置換速度又は率に、測定可能な程度な差異を生じさせるようなものであればどのようなものでもよく、以下に詳述する（Ａ）カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体や（Ｂ）ホスホリルコリン類似基含有単量体、およびカチオン性基を有するカチオン性単量体を重合してなる重合体（以下、「ＰＣ重合体」と略記する。）などを例示することができる。
（Ａ）カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体
このグラフト共重合体において、カチオン性基を形成し得るモノマーとしては、リジン、アルギニン、ヒスチジン等のアミノ酸、グルコサミン等の糖、アリルアミン、エチレンイミン、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート等の合成モノマー等を例示することができる。また、カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーとしては、ポリリジン、ポリアリルアミンなどを例示することができる。親水性高分子としては、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、アミロース、アラビノカラクタン等の水溶性多糖、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等の親水性アミノ酸を含む水溶性ポリアミノ酸、アクリルアミド及びその誘導体をモノマーとして用いて合成される水溶性高分子、メタクリル酸及びアクリル酸並びにその誘導体（例、ヒドロキシエチルメタクリレート）をモノマーとして用いて合成される水溶性高分子、ポリビニルアルコール及びその誘導体などを例示することができる。より好ましいカチオン性高分子としては、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，９，２９２−２９９（１９９８）に記載されている下記の一般式で表されるデキストラン側鎖修飾α−ポリ（Ｌ−リジン）〔以下、「α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する〕、デキストラン側鎖修飾ω−ポリ（Ｌ−リジン）〔以下、「ω−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する〕、デキストラン側鎖修飾型ポリアリルアミン〔以下、「ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する〕を挙げることができる。
α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ
0004178194.tif 000002
ω−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ
0004178194.tif 000003
ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘ
0004178194.tif 000004
このようなカチオン性高分子の分子量、側鎖及び主鎖の長さ、グラフトの程度などは特に限定されず、具体的な使用目的に応じて決めればよい。また、このようなカチオン性高分子の製造は、既知の方法（例えば、特開平１０−４５６３０号公報に記載されている方法）に従って行うことができる。
（Ｂ）ＰＣ重合体
この重合体において、ホスホリルコリン類似基含有単量体（以下、「ＰＣ単量体」と略記する。）は、下記の一般式（Ｉ）で表される。
0004178194.tif 000005
ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子もしくはＲ５−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（但しＲ５は炭素数１〜１０のアルキル基又は炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。また、Ｒ１は水素原子もしくはメチル基を示し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同一もしくは異なる基であって、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数である。
式（Ｉ）中のＸの２価の有機残基としては、例えば、−Ｃ６Ｈ４−、−Ｃ６Ｈ１０−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−、−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ６Ｈ４−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−等が挙げられる。
式（Ｉ）のＹは、炭素数１〜６のアルキレンオキシ基であり、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシツオキシ等の基が挙げられる。
式（Ｉ）中のＺは、水素原子もしくはＲ５−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−基を示す（ただし、Ｒ５は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す。）。
ここで、炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。
また、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、２−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、２−ヒドロキシヘキシル基、７−ヒドロキシヘプチル基、２−ヒドロキシヘプチル基、８−ヒドロキシオクチル基、２−ヒドロキシオクチル基、９−ヒドロキシノニル基、２−ヒドロキシノニル基、１０−ヒドロキシデシル基、２−ヒドロキシデシル基等が挙げられる。
ＰＣ単量体としては、具体的には例えば、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（（メタ）アクリオイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（（メタ）アクリオイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（（メタ）アクリオイルオキシ）ペンチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（（メタ）アクリオイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリシクロヘキシルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリフェニルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリメタノールアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）ペンチル−２’（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンゾイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（スチリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アクリロイルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルカルボニルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ヒドロキシエチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、ヒドロキシエチル−（２‘−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート等を挙げることができる。
この中でも２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートが好ましく、さらに２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート｛＝２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリンともいう、以下、「ＭＰＣ」と略記する｝が入手性等の点でより好ましい。
ＰＣ単量体は、公知の方法で製造できる。例えば、特開昭５４−６３０２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示された公知の方法等に準じて製造することができる。
本発明に用いられるカチオン性基を有するカチオン性単量体としては、例えば、１級のアミノ基を有する単量体、２級のアミノ基を有する単量体、３級のアミノ基を有する単量体、あるいは４級のアンモニウム基を有する単量体を挙げられる。前記の１級のアミノ基を有する単量体としては、具体的には、アリルアミン（塩酸塩）、アミノエチル（メタ）アクリレート（塩酸塩）、２−メチルアリルアミン、４−アミノスチレンなどが挙げられる。また、２級のアミノ基、３級のアミノ基、あるいは４級のアンモニウム基を有する単量体としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタアクリルアミド（塩酸塩）、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（塩酸塩）、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（塩酸塩）、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、（塩酸塩）、［３−（メタクリロイルオキシアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（アクリロイルオキシアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、［２−（メタクリロイルオキシアミノ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、［２−（アクリロイルオキシアミノ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（以下、「ＱＡ」と略記する）、２−ヒドロキシ−３−アクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドなどが挙げられる。
なかでも、ＰＣ単量体とカチオン性単量体との組み合わせで好ましくは、ＭＰＣと１級のアミノ基を有するアミノエチルアクリレート（塩酸塩）と、ＭＰＣと４級のアンモニウム基を有するＱＡの組み合わせが好ましく挙げられる。
本発明における単鎖核酸分子とは、主として単鎖のＤＮＡを意味するが、ＲＮＡや核酸類似分子（例えば、ＰＮＡなど）なども含む。試料とする単鎖核酸分子の長さは特に限定されないが、一塩基ミスマッチの存在を判別しにくい、１２ｂ以上の長さの核酸分子を試料とするのが好ましい。
本発明の判定方法としては、例えば、以下の第一から第三の方法を例示することができる。
（１）第一の方法
第一の方法は、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むものである。
工程（ａ）では、カチオン性高分子存在下で、当該基準となる単鎖核酸分子とその相補鎖とからなる二重鎖核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子と共存させる。試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在しない場合、当該基準となる単鎖核酸分子の相補鎖は、高い速度及び率で試料とする単鎖核酸分子と置換する。一方、配列のミスマッチが存在する場合、前記相補鎖は、試料とする単鎖核酸分子とほとんど置換しない。
使用するカチオン性高分子の量は特に限定されないが、核酸分子のリン酸基に対するカチオン性高分子のカチオン性基の比が０．１〜１０００になるようにするのが好ましい。二重鎖核酸分子と試料とする単鎖核酸分子を共存させる時間も特に限定されないが、１分〜１６時間程度が好ましい。
基準となる単鎖核酸分子と二重鎖を形成させる単鎖核酸分子は、完全な相補鎖でなく、１から数個のミスマッチを含んでいるものでもよい。この場合、試料とする単鎖核酸分子が基準となる単鎖核酸分子と完全に相補的であれば、置換速度及び率はより高いものになる。
工程（ｂ）では、当該基準となる単鎖核酸分子の相補鎖が、当該試料とする単鎖核酸分子と置換する速度又は率を測定する。上記のように、基準となる単鎖核酸分子の相補鎖が、試料とする単鎖核酸分子と置換する速度及び率は、ミスマッチを含まない場合の方がミスマッチを含む場合よりも著しく高くなる。従って、この置換速度又は率を測定することにより、二本の単鎖核酸分子間にミスマッチが存在するかどうかを判定することができる。ミスマッチを含まない場合、置換速度はミスマッチを含む場合の１０〜１０００倍程度となる。したがって反応時間及び条件を適宜設定すると、置換率の値は、通常、ミスマッチを含まない場合は４０〜１００％程度になり、１塩基のミスマッチを含む場合は０〜１０％程度になる。
より正確な判定を行うためには、試料とする単鎖核酸分子の代わりに、基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた対照実験を行うのが好ましい。この場合、試料とする単鎖核酸分子の置換速度及び率が完全相補鎖の置換速度及び率と等しければ、配列にミスマッチが存在しないと判定することができる。
工程（ｂ）は、（ａ）の工程と同時になされてもよく、むしろ同時になされた方が置換速度を計測する上で好ましい。
置換速度および率を測定する方法は特に限定されないが、酵素、蛍光物質、発光物質を用いて測定することができ、特に蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）を利用して測定するのが好ましい。即ち、基準となる単鎖核酸分子をドナー蛍光色素（例えば、フルオレスセインイソチオシアネート）で標識し、その相補鎖をアクセプター蛍光色素（例えば、テトラメチルローダミン）で標識する。ドナー蛍光色素で標識した核酸分子とアクセプター蛍光色素で標識した核酸分子とが二重鎖を形成している状態では、ドナー蛍光色素は蛍光を発しないが、アクセプター蛍光色素で標識した核酸分子が試料とする単鎖核酸分子と置換すると、ドナー蛍光色素は蛍光を発する。従って、ドナー蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、置換速度及び率を間接的に測定することができる。この測定は、置換反応が進行中あるいは、終了後に、キャペラリー電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）などの電気泳動に供して連続的に測定してもよく、また、９６穴プレート、３８４穴プレート、１５３６穴プレートなどのタイタープレートを用いて同時に多数を測定してもよい。
（２）第二の方法
第二の方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むものである。
工程（ａ）では、当該基準となる単鎖核酸分子に当該試料とする単鎖核酸分子を接触させ、二重鎖核酸分子を形成させる。二重鎖核酸分子の形成は、通常のハイブリダイゼーション法と同様に行うことができる。また、基準となる単鎖核酸分子は担体に固定しておいてもよい。
工程（ｂ）では、カチオン性高分子存在下で、工程（ａ）で形成させた二重鎖核酸分子と当該基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を共存させる。試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在する場合、試料とする単鎖核酸分子は、非常に高い速度及び率で基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖と置換する。一方、ミスマッチが存在しない場合も置換するが、その速度及び率はミスマッチが存在する場合に比べ低い。
使用するカチオン性高分子の量は第一の方法と同様でよい。また、二重鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を共存させる時間も第一の方法と同様でよい。
工程（ｃ）では、試料とする単鎖核酸分子が、当該基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖と置換する速度又は率を測定する。上記のように、試料とする単鎖核酸分子が、当該基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖と置換する速度及び率は、ミスマッチを含む場合の方がミスマッチを含まない場合よりも著しく高くなる。従って、この置換速度又は率を測定することにより、二本の単鎖核酸分子間にミスマッチが存在するかどうかを判定することができる。ミスマッチを含む場合、通常、置換速度はミスマッチを含まない場合の１０〜１０００倍程度になる。したがって反応時間及び条件を適宜設定することにより、置換率の値は、通常、ミスマッチを含まない場合は０〜１０％程度になり、１塩基のミスマッチを含む場合は４０〜１００％程度になる。
より正確な判定を行うためには、第一の方法と同様に、試料とする単鎖核酸分子の代わりに、基準となる単鎖核酸分子の完全相補鎖を用いた対照実験を行うのが好ましい。
工程（ｃ）は、（ｂ）の工程と同時になされてもよく、むしろ同時になされた方が置換速度を計測する上で好ましい。
置換率を測定する方法は、第一の方法と同様にＦＥＲＴを利用するのが好ましいが、これに限定されない。
（３）第三の方法
第三の方法は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含むものである。
工程（ａ）では、カチオン性高分子存在下で、当該基準となる単鎖核酸分子に、その完全相補鎖及び当該試料とする単鎖核酸分子を接触させる。これにより、基準となる単鎖核酸分子とその完全相補鎖が二重鎖を形成する（対照二重鎖）。また、試料とする単鎖核酸分子も基準となる単鎖核酸分子と一定の相補性があれば、二重鎖を形成する（試料二重鎖）。試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間にミスマッチが存在しない場合、対照二重鎖と試料二重鎖の形成量はほぼ等しくなる。一方、配列のミスマッチが存在する場合、対照二重鎖の方が試料二重鎖よりも形成量が多くなる。
二重鎖核酸分子の形成は、通常のハイブリダイゼーション法と同様に行うことができる、また、基準となる単鎖核酸分子は担体に固定しておいてもよい。
使用するカチオン性高分子の量は第一の方法と同様でよい。
工程（ｂ）では、当該基準となる単鎖核酸分子とその相補鎖とからなる二重鎖核酸分子（対照二重鎖）、及び当該基準となる単鎖核酸分子と当該試料とする単鎖核酸分子とからなる二重鎖核酸分子（試料二重鎖）の形成比を求める。上記のように、対照二重鎖と試料二重鎖の形成量は、配列にミスマッチが存在しない場合はほぼ等しくなり、ミスマッチが存在する場合は、対照二重鎖の方が試料二重鎖よりも形成量が多くなる。従って、対照二重鎖と試料二重鎖の形成比を求めることにより、配列間にミスマッチが存在するかどうかを判別することができる。対照二重鎖と試料二重鎖の形成比の値は種々の条件によって変動するが、核酸分子濃度を等しくすれば、通常、ミスマッチを含まない場合はほぼ１：１であり、１塩基のミスマッチを含む場合は１．５〜５：１程度である。
工程（ｂ）は、（ａ）の工程と同時になされてもよく、むしろ同時になされた方が二重鎖形成速度を計測する上で好ましい。
形成比を求める方法は、第一の方法と同様にＦＥＲＴを利用するのが好ましいが、これに限定されない。
発明を実施するための最良の形態
〔合成例１〕  ＰＣ重合体１の合成
単量体として、ＭＰＣ１．１ｇおよび、２−アミノエチルメタクリレート・塩酸塩（以下、「ＡＥＭＡ」と略記する。）０．６ｇを、開始剤として、２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩｛和光純薬工業（株）社製、以下、「Ｖ−５０」と略記する。｝０．４ｇを、重合溶媒として蒸留水１２．９ｇを重合管にとり、均一に溶解させた。この溶液にアルゴンを１０分間吹き込み、封管した。封管終了後６０℃で８時間重合反応を行った。重合終了後、室温に冷却し、重合管を開封した後に、この溶液を透析膜（商品名「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／ｐｏｒ．ｍｅｍｂｒａｎｓ  Ｍｗ  Ｃｏ，６０００〜８０００」スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社製）に挿入し、重合溶液の１０倍の体積の蒸留水を用いて透析操作を行い、１日１回の蒸留水交換を７日間続け、未反応の単量体および開始剤を除去した。この溶液を凍結乾燥してＰＣ重合体１を１．５ｇ得た。
また、得られた粉末２０ｍｇを重水（Ｄ２Ｏ）１．５ｍＬに溶解させた。得られた重水溶液を日本電子（株）製ＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、ＰＣ単量体とカチオン性単量体のモル比を求めた。
更に、１０ｍｇのＰＣ重合体１をＤｕｌｂｅｃｏ’ｓリン酸緩衝液（以下、「ＤＰＢＳ」と略記する。）１．０ｍＬに溶解させ、これに、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」と略記する。）に溶解させた１．０ｍｇ／ｍＬのプロピオン酸スクシンイミドエステル（和光純薬工業（株）製）を加えて、室温で３時間インキュベートした。インキュベート終了後、この溶液を透析膜（商品名「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／ｐｏｒ．ｍｅｍｂｒａｎｓ  Ｍｗ  Ｃｏ，６０００〜８０００」スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社製）に挿入し、重合溶液の１０倍の体積の蒸留水を用いて透析操作を行い、１日１回の蒸留水交換を７日間続けた。この溶液を凍結乾燥してプロピル化ＰＣ重合体１を８．５ｍｇ得た。このプロピル化した重合体粉末を０．５重量％の塩化リチウムを含むクロロホルム：メタノール＝６：４（Ｖ／Ｖ）に溶解させて、０．５重量％の重量体溶液を調製した。更に、この溶液を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、試験溶液とした。
ＧＰＣ分析は、ＭＩＸＥＤ−Ｃ（２本）（ポリマーラボラトリーズ社製）を、溶出溶媒としては０．５重量％の塩化リチウムを含むクロロホルム：メタノール＝６：４（Ｖ／Ｖ）を、標準物質としてはポリメチルメタクリレート（ポリマー・ラボラトリー社製）を、検出は視差屈折計を、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量測定（Ｍｎ）、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は東ソー社製インテグレーター内蔵分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）を用いて、流速は１．０ｍＬ／分、試料溶液使用量は１００μＬ、カラム温度４０℃で求めた。
以上の分析より、ＰＣ重合体１のモル比は６５／３５（ＭＰＣ／ＡＥＭＡ）、Ｍｎ＝３９３０００，Ｍｗ＝５１５０００，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３であることがわかった。
〔合成例２〕  ＰＣ重合体２の合成
合成例１で用いたＡＥＭＡの代わりに２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（以下、「ＱＡ」と略記する。）の５０％水溶液０．８ｇに、Ｖ−５０を０．１２ｇに、蒸留水６．０ｇに変えた以外は合成例１と同様に行い。ＰＣ重合体２を１．４ｇ得た。
また、得られた粉末２０ｍｇを重水（Ｄ２Ｏ）１．５ｍＬに溶解させた。得られた重水溶液を日本電子（株）製ＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、ＰＣ単量体とカチオン性単量体のモル比を求めた。
得られた共重合体水溶液を０．５重量％になるよう蒸留水で希釈し、この溶液を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、試験溶液とした。
ＧＰＣ分析は、カラムとしてはＧ３０００ＰＷｘｌ×２本（東ソー社製）を、溶出溶媒としては蒸留水を、標準物質としてはポリエチレングリコール（ポリマー・ラボラトリー社製）を、検出は視差屈折計を、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量測定（Ｍｎ）、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は東ソー社製インテグレーター内蔵分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）を用いて、流速は１．０ｍＬ／分、試料溶液使用量は１００μＬ、カラム温度４０℃で求めた。
以上の分析より、ＰＣ重合体２のモル比は７０／３０（ＭＰＣ／ＱＡ）、Ｍｎ＝２９５０００，Ｍｗ＝３８９０００，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３であることがわかった。
〔実施例１〕  オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）および二重鎖配列の調製
表１に示す配列のＯＤＮをニップン（株）より購入し、逆相クロマトグラフィーにより精製した。また、二鎖鎖ＤＮＡはＴＥ緩衝液中相補的配列を等モル量混合し、９０℃に加熱後冷却することで得た。
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各ＯＤＡについて、以下に簡単に説明する。
（１）Ｍ２シリーズ
Ｆ２およびＴ２は完全に相補的な２０塩基配列であり、それぞれ３’末端および５’末端がフルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識されている。Ｍ２はＴ２と同等の未標識配列である。Ｍ２ｍｉｓＧ、Ｍ２ｍｉｓＡ、およびＭ２ｍｉｓＣはＭ２の中央部分に一塩基変異を持つ配列である。Ｍ２ｍｉｓＧ２および、Ｍ２ｍｉｓＧ３はＭ２の５’から数えてそれぞれ４塩基目および、１塩基目に一塩基変異を持つ配列である。
（２）Ｍ１シリーズ
Ｆ１およびＴ１は完全に相補的な２０塩基配列であり、それぞれ３’末端および５’末端がＦＩＴＣおよびＴＡＭＲＡで標識されている。Ｍ１はＴ１と同等の未標識配列である。Ｍ１ｍｉｓＡ、Ｍ１ｍｉｓＴ、およびＭ１ｍｉｓＣはＭ１の中央部分に一塩基変異を持つ配列である。
（３）Ｍ５０シリーズ
Ｍ５０はＴ２と相補的な配列を中央部に有する５０塩基配列であり、Ｍ５０ｍｉｓ１は、Ｍ５０の中央部に一塩基変異を持つ配列である。
（４）Ｍ３シリーズ
Ｆ３およびＴ３は完全に相補的な１９塩基配列であり、それぞれ３’末端および５’末端がＦＩＴＣおよびＴＡＭＲＡで標識されている。また、Ｍ３はＴ３と同等の未標識配列である。Ｍ３ｍｉｓ１はＭ３の中央部に一塩基変異を持つ配列である。
〔実施例２〕  融解温度の測定
Ｆ２とＭ２、Ｍ２ｍｉｓＧ、Ｍ２ｍｉｓＡ、およびＭ２ｍｉｓＣよりそれぞれ完全相補的二重鎖および一塩基変異を含む二重鎖を調製した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に二重鎖濃度０．８３μＭになるように希釈し、マイクロＴｍ測定装置を装着したベックマン可視紫外分光光度計により融解温度を測定した。測定温度範囲は３０℃〜１１０℃で昇温速度は１℃／ｍｉｎとした。また、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ）をチャージ比（ＤＮＡのリン酸基に対するＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘのアミノ基量）で２になるように加えて同様に測定した。
結果を図１に示す。太線は融解曲線、細線はその一次微分曲線である。ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ不在下では５０℃から７０℃に、一方ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ存在下では７０℃から９０℃に二重鎖の融解が観察される。各条件下での融解温度を表１に纏めた。
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ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘの存否にかかわらず融解温度はいずれも近接しており、最大でもその差は７℃であった。また、融解の転移幅はいずれの配列も重複している。つまり、融解温度測定や通常のハイブリダイゼーション法では、これらの配列を厳密に区別することが困難であることを示す。
〔実施例３〕  完全相補二重鎖と単鎖間の鎖交換（その一）
完全相補鎖と単鎖間の鎖交換に及ぼす一変異塩基の影響を調べた。Ｆ２およびＴ２より調製した二重鎖を１２ｎＭになるようにＰＢＳに溶解し、チャージ比で３．３になるようにＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘを加えた。この溶液を３７℃に保ち、単鎖としてＭ２、Ｍ２ｍｉｓＧ、Ｍ２ｍｉｓＡ、およびＭ２ｍｉｓＣをそれぞれ１２ｎＭになるように加え、鎖交換を開始させた。鎖交換の進行は、ＴＡＭＲＡにより消光されていたＦＩＴＣの蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）の回復により検出した。
結果を図２に示す。完全相補配列との鎖交換は速やかに進行するのに対し、変異を持つ単鎖との鎖交換は緩慢であることがわかる。それぞれの鎖交換速度定数を算出し相対値として表した結果を表３に示す。
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完全相補鎖に対し変異配列との鎖交換速度は百分の１程度であった。一方、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ不在下では完全相補配列ともほとんど鎖交換が生起しなかった（図３）。つまり、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘにより加速される鎖交換により、変異配列を高感度で検出できることがわかる。
〔実施例４〕  完全相補二重鎖と単鎖間の鎖交換（その二）
実施例３と同様に鎖交換を開始し、３分後および５分後の蛍光強度を求めた結果を表４に示す。
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３分および５分の反応で変異配列の検出が可能であることがわかる。
〔実施例５〕  完全相補二重鎖と単鎖間の鎖交換（その三）
単鎖としてＭ２、Ｍ２ｍｉｓＧ、Ｍ２ｍｉｓＧ２、およびＭ２ｍｉｓＧ３を用いた点、並びに、カチオン性高分子としてＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘのほかに、ＰＣ重合体１およびＰＣ重合体２を用いた点以外は、実施例３と同様に鎖交換実験を行い、各条件における実験開始から３分後の蛍光強度を測定した。結果を表５に示す。
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この表から、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘだけではなく、ＰＣ重合体でも変異配列の検出が可能であることがわかる。更に、中央部の一塩基変異だけではなく、末端の一塩基変異も容易に検出できることがわかる。
〔実施例６〕  完全相補二重鎖と単鎖間の鎖交換（その四）
以下の（１）〜（３）の点を除き、実施例３と同様に鎖交換実験を行い、各条件における蛍光強度を測定した。
（１）２５℃、３０℃、及び３７℃の３種類の温度で実験を行った。
（２）交換反応を９６穴プレートを用いて行い、測定を９６穴蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて行った。
（３）Ｆ２とＴ２からなる二重鎖とＭ２、Ｍ２ｍｉｓＧ、Ｍ２ｍｉｓＡ、及びＭ２ｍｉｓＣとの鎖交換実験に加え、Ｆ１とＴ１からなる二重鎖とＭ１、Ｍ１ｍｉｓＡ、Ｍ１ｍｉｓＴ、及びＭ１ｍｉｓＣとの鎖交換実験を行った。
蛍光強度の測定結果を図５に示す。
〔実施例７〕  完全相補二重鎖と単鎖間の鎖交換（その五）
チャージ比を５．０にした点、並びに、単鎖としてＭ５０、およびＭ５０ｍｉｓｓ１を用いた点を除き、実施例３と同様に鎖交換実験を行い、二重鎖と単鎖間の置換率の経時的変化を調べた。この結果を図６に示す。
〔実施例８〕  完全相補二重鎖と単鎖間の鎖交換（その六）
チャージ比を３にした点、Ｆ３とＴ３からなる二重鎖を用いた点、並びに、単鎖としてＭ３およびＭ３ｍｉｓｓ１を用いた点を除き、実施例３と同様に鎖交換実験を行い、蛍光強度の経時的変化を調べた。この結果を図７に示す。
〔参考例１〕  アニーリング工程を含めたハイブリダイゼーションによる変異配列の検出
Ｆ２（１２ｎＭ）に対して等モル量のＴ２とＭ２を加え９０℃に加熱後除冷（アニーリング）し、蛍光強度を測定した。また、Ｍ２を変異を持つ配列に変え同様に測定を行った。蛍光強度の相対値を表６に示す。
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完全相補配列に対し変異配列も最低でも６０％以上の蛍光強度を示し、アニーリング工程を含む通常のハイブリダイゼーションでは一塩基変異配列の検出が困難であることがわかる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００１−２５３７８９号の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明は、試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子との間に配列のミスマッチが存在するかどうかを判定する新規な方法を提供する。この方法は、配列のミスマッチが一塩基だけであっても、正確にその存在を判定することができるので、ＤＮＡ診断法などに利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、完全に相補的な二重鎖及び一塩基変異を含む二重鎖の融解曲線を示す図である。
第２図は、二重鎖（Ｆ２／Ｔ２）と単鎖（Ｍ２，Ｍ２ｍｉｓＧ，Ｍ２ｍｉｓＡ，Ｍ２ｍｉｓＣ）間の鎖置換率の経時的変化を示す図である。
第３図は、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘの存在と、二重鎖（Ｆ２／Ｔ２）と単鎖（Ｍ２，Ｍ２ｍｉｓＧ）間の置換率との関係を示す図である。
第４図は、二重鎖と単鎖の鎖交換実験の概要を示す図である。
第５図は、温度及び単鎖の変異状態と、二重鎖と単鎖間の置換率との関係を示す図である。
第６図は、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘの存在と、二重鎖（Ｆ２／Ｔ２）と単鎖（Ｍ５０，Ｍ５０ｍｉｓｓ１）間の置換率との関係を示す図である。
第７図は、二重鎖（Ｆ３／Ｔ３）と単鎖（Ｍ３，Ｍ３ｍｉｓｓ１）間の鎖置換率の経時的変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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