(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列と、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列とを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡ。
【請求項２】
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡが、配列表配列番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列表配列番号５に示すアミノ酸配列において１もしくは２以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３】
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列が、配列表配列番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号９に示すアミノ酸配列において１もしくは２以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞中の活性が増強されたコリネ型細菌。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡが導入されたことにより形質転換された請求項４記載のコリネ型細菌。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸などの発酵生産に用いられているコリネ型細菌に遺伝子操作の手法を用いて改変を加え、該微生物を培養することによるＬ−リジンの製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
飼料添加物として用いられているＬ−リジンは通常、コリネ型細菌のＬ−リジン生産変異株を使って発酵法により生産されている。現在知られている種々のＬ−リジン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変異により作られている。
【０００３】
一方、コリネ型細菌において、菌体内で自律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベクタープラスミド（米国特許第4514502号参照）、遺伝子の菌体への導入方法（特開平2-207791号等）が開示されており、これらの技術を用いたＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシン生産菌育成の可能性が開示されている（米国特許第4452890号、及び米国特許第4442208号参照）。また、Ｌ−リジン生産菌育成に関しても、ベクタープラスミドにＬ−リジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、菌体内で増幅させる技術（特開昭56-160997号などがある）がある。
【０００４】
Ｌ−リジン生合成遺伝子として、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（特開平7-75578）やジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)）のように、Ｌ−リジン生合成に関与する遺伝子をクローニングした例や、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-87788）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（特公平6-55149）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-62994）のように、遺伝子の増幅がＬ−リジン生産性に影響を与える例が知られている。
【０００５】
上記のように、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増幅によって、Ｌ−リジン生産性向上に一定の成果が得られている場合がある。しかし、遺伝子によっては、Ｌ−リジン生産性が向上するものの生育が低下し、結果としてＬ−リジン生産速度が低下することがある。
【０００６】
一方、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増強により生育の改善が図られた例は報告されていない。また、コリネ型細菌においては、Ｌ−リジン生合成遺伝子を複数個組み合わせ、生育を抑制せずにＬ−リジン収率の大幅な改善に成功した例は知られていないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、コリネ型細菌においてＬ-リジン生合成遺伝子を複数個組み合わせて増強し、生育を抑制せずにＬ−リジン収率を改善することを課題とする。
【０００８】
微生物を用いた物質の発酵生産を行なう場合、投入した原料に対する目的物質の収率と並んで、生産速度は極めて重要な因子であり、設備当りの生産速度を上げることにより目的物質を大幅に安価に製造することが出来る。そのため、発酵収率と生産速度を両立させることは工業的に極めて重要である。本発明は、コリネ型細菌を用いたＬ−リジンの発酵生産を行なうに当たり、以上の様な課題の解決方法を提示するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、コリネ型細菌において、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列（以下、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを「ＤＤＣ」、ＤＤＣ蛋白をコードする遺伝子を「lysA」ともいう。）と、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列（以下、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを「ＤＤＨ」、ＤＤＨ蛋白をコードする遺伝子を「ddh」ともいう。）とを併せて増強することにより、これらを単独で増強した場合と比べ、生育が改善され、Ｌ−リジン生産速度を向上させることができることにある。
【００１０】
すなわち本発明は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列と、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列とを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを提供する。
【００１１】
また本発明は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列、及びジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列が増強されたコリネ型細菌を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、前記コリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供する。
【００１３】
尚、本発明においてコリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属細菌、及び従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明に用いられるＬ−リジン生合成遺伝子の取得
本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子は、ＤＮＡ供与体である細菌から染色体ＤＮＡを調製し、プラスミドベクター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから所望の遺伝子を保持する株を選択し、選択された株からその遺伝子が挿入された組換えＤＮＡを回収することによって得られる。本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子のＤＮＡ供与体としては、所望のＬ−リジン生合成遺伝子がコリネ型細菌細胞中で機能する酵素タンパク質を発現するものであれば、特に制限されないが、コリネ型細菌が好ましい。
【００１５】
コリネ型細菌由来のlysA及びddh遺伝子は、いずれも配列が知られているので、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によって増幅することにより取得することができる。
【００１６】
以下に、本発明に用いる各Ｌ−リジン生合成遺伝子を取得する方法を例示する。
【００１７】
（１）lysAの取得
コリネ型細菌染色体からlysAを単離するには、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によりlysAを増幅することによって行なうことができる。染色体ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
【００１８】
コリネ型細菌においては、lysAはargS（アルギニル−tRNAシンターゼ遺伝子）とともにオペロンを形成しており、argSの下流にlysAが存在している。lysAの発現は、argSの上流にあるプロモーターによって調節を受ける（Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362 (1993)参照）。これらの遺伝子の塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知であり（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号１（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)に記載されている塩基配列において塩基番号１１〜３３に相当する）及び配列番号２（Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)に記載の塩基配列において塩基番号１３７０〜１３９２に相当する）に示す塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
後記実施例では、lysAを増強するために、プロモーター、argS及びlysAを含むＤＮＡ断片を用いたが、argSは本発明に必須ではなく、lysAがプロモーターの直下に連結されたＤＮＡ断片を用いてもよい。
【００２０】
argS及びlysAを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号３に示す。また、argSがコードするアミノ酸配列の一例を配列番号４に、lysAがコードするアミノ酸配列の一例を配列番号５に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号５に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＣ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。
【００２１】
ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により 指定された方法に従って行うことができる。
【００２２】
ＰＣＲ法により増幅されたlysAは、E. coli及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをE. coli細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。E. coli細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００２３】
また、これらのベクターにコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片を挿入すると、E. coli及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００２４】
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示した。
【００２５】
0004035855.tif 000002
【００２６】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２７】
E. coliにプラスミドを導入して形質転換するには D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００２８】
（２）ddhの取得
ddhを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
【００２９】
DDH遺伝子は、コリネバクテリウム  グルタミカムにおいて既知であり（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)）、これを基にしてPCR用プライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号６及び７に記載の塩基配列を有する各々20merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたddhを含むプラスミドの調製等は、前記のlysAの場合と同様にして行うことができる。
【００３０】
ddhを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号９に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号９に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＨ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。
【００３１】
＜２＞本発明の組換えＤＮＡ及びコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ（lysA）及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（ddh）が増強されたものである。ここでＤＮＡ配列の「増強」とは、遺伝子のコピー数を高くする、プロモーターを強力なものを使用する、比活性の高い酵素をコードする遺伝子を使用する、あるいはこれらを組み合わせるなどして、そのＤＮＡによりコードされる酵素の細胞中の活性を高くすることをいう。
【００３２】
上記ＤＮＡを導入するコリネ型細菌は、Ｌ−リジン生産性を有するコリネ型細菌であり、Ｌ−リジン生産性の野生株又は人工変異株、遺伝子工学的にＬ−リジン生産性を増強されたコリネ型細菌等が挙げられる。Ｌ−リジン生産性の低い菌株であってもlysA及びddhを増強すれば、Ｌ−リジン生産性を向上させることができる。また、Ｌ−リジン生産性の高い菌株においても、lysA及びddhを増強することによって、一層Ｌ−リジン生産効率を高めることができる。
【００３３】
（１）コリネ型細菌のＬ−リジン生産性菌株
lysA及びddhを導入するＬ−リジン生産性のコリネ型細菌の例としては、例えば次のような菌株が挙げられる。
【００３４】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム    ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム      ATCC15806
コリネバクテリウム・カルナエ                ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミクム            ATCC13032
（ブレビバクテリウム・ディバリカタム）      ATCC14020
（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869
（コリネバクテリウム・リリウム）            ATCC15990
（ブレビバクテリウム・フラバム）            ATCC14067
コリネバクテリウム・メラセコーラ            ATCC17965
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム      ATCC14066
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム      ATCC14068
ブレビバクテリウム・ロゼウム                ATCC13825
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス          ATCC19240
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム      ATCC15354
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス      AJ12340(FERM BP-1539)
【００３５】
また、上記菌株以外にも、これらの菌株から誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、lysA及びddhを増強する宿主として利用できる。この様な人工変異株としては次の様なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参照））、その成長にＬ−ホモセリン等のアミ ノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特 開昭53-9394号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号）。
【００３６】
（２）遺伝子組換え技術によりＬ−リジン生産性が増強されたＬ−リジン生産性コリネ型細菌
Ｌ−リジン生合成に関与する酵素のうち、野生型ではフィードバック阻害を受ける酵素について、フィードバック阻害が解除された変異を有する酵素遺伝子を導入したり、lysA、ddh以外のＬ−リジン生合成遺伝子を増強することによって、遺伝子工学的にＬ−リジン生産性を増強されたコリネ型細菌であっても、lysA及びddhを増強することによって、一層Ｌ−リジン生産速度を向上させることができる。
【００３７】
上記のようなＬ−リジン生産性が増強されたコリネ型細菌としては、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ（以下、アスパルトキナーゼを「ＡＫ」ともいう。ＡＫ蛋白をコードする遺伝子を「lysC」、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたＡＫ蛋白をコードする遺伝子を「変異型lysC」ともいう。）を保持し、さらにジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（以下「ＤＤＰＲ」ともいう。ＤＤＰＲ蛋白をコードする遺伝子を以下「dapB」ともいう。）をコードするＤＮＡ配列が増強されたコリネ型細菌、及び該コリネ型細菌において、さらにジヒドロジピコリン酸シンターゼ（以下「ＤＤＰＳ」と略す。ＤＤＰＳ蛋白をコードする遺伝子を以下「dapA」ともいう。）をコードするＤＮＡ配列が増強されたものが挙げられる。以下に、上記の各Ｌ−リジン生合成遺伝子を取得する方法を例示する。
【００３８】
（ｉ）変異型lysCの取得
変異型lysCを含むＤＮＡ断片は、ＡＫ活性に対するＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除された変異株から調製することができる（WO94/25605国際公開パンフレット）。このような変異株は、例えば、コリネ型細菌野生株に、通常の変異処理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異剤処理を施し、変異処理した細胞群の中から取得することができる。ＡＫ活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法を用いることができる。このような変異株として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）野生株ATCC13869株（現在の名称は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に変更されている）より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産菌AJ3445（FERM P-1944）が最も好ましいものとして挙げられる。
【００３９】
また、変異型lysCは、野生型lysCを含むプラスミドＤＮＡをインビトロ変異処理することによっても得られる。さらに、ＡＫのＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害を解除する変異が具体的に知られている（WO94/25605国際公開パンフレット）ので、この情報に基づいて部位特異的変異法等により、野生型lysCから調製することもできる。
【００４０】
コリネ型細菌の染色体DNAからのlysCの単離は、例えば、ＰＣＲ法によってlysCを増幅することによって行うことができる。ＤＮＡプライマーとしては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991),5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にして、lysCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配列表配列番号１０及び配列番号１１に示す塩基配列を有する23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたlysCを含むプラスミドの調製等は、前記のlysAの場合と同様にして行うことができる。
【００４１】
上記のようにしてＡＫ野生株からlysCを単離すれば野生型lysCが得られ、ＡＫ変異株からlysCを単離すれば変異型lysCが得られる。
野生型lysCを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を、配列表配列番号１２に示す。この塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号１３に、アミノ酸配列のみを配列番号１４に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号１５に、アミノ酸配列のみを配列番号１６に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００４２】
本発明に用いる変異型lysCとしては、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解除されたＡＫをコードするものであれば特に制限されないが、野生型ＡＫのアミノ酸配列において、αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化する変異が挙げられる。ここで、野生型ＡＫのアミノ酸配列としては、具体的にはαサブユニットでは配列表配列番号１４に示すアミノ酸配列が、βサブユニットでは配列表配列番号１６に示すアミノ酸配列が挙げられる。
【００４３】
また、上記のアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基として好ましいものは、スレオニン残基、アルギニン残基、システイン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基及びバリン残基が挙げられる。
【００４４】
尚、置換されるアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫのアミノ酸配列がわずかに相異するものがあると予想される。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するＡＫも本発明に使用することができる。さらに、ＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、他の１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するＡＫも使用できる。
【００４５】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株であるAJ12036株（FERM BP-734）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM-P12918として寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。
【００４６】
dapAを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
【００４７】
（ii）dapBの単離
dapBを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
【００４８】
ＤＤＰＲをコードするＤＮＡ配列は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいて既知であり（Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたdapBを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００４９】
dapBを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２３に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２４に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号２４に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＰＲ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。
【００５０】
E. coliJM109株に後記実施例で得られたdapBを含むプラスミドpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００５１】
（iii）dapAの単離
ＤＤＰＳをコードするＤＮＡ配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知であり（Nucleic Acids Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL accession No.X53993参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号１７及び１８に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたdapAを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００５２】
dapAを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号１９に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２０に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号２０に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＰＳ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。
【００５３】
E. coliJM109株に後記実施例で得られたdapAを含むプラスミドpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００５４】
以上示したようなＬ−リジン生産性のコリネ型細菌においてlysA及びddhを増強するには、具体的な例としては、これらの遺伝子をプラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクター等を用いて宿主に導入する。その際、低コピー型のベクターを用いてもある程度の増強は期待できるが、マルチコピー型のベクターを用いることが好ましい。そのようなベクターとして、上記pAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148及びpAJ440等のプラスミドベクターが挙げられる。また、コリネ型細菌由来のトランスポゾンは、WO92/02627国際公開パンフレット、WO93/18151国際公開パンフレット、欧州特許公開0445385号、特開平6-46867号、Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994)、Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994)、Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)、Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995)、特開平7-107976号、特開平7-327680号等に記載されている。
【００５５】
本発明のlysA及びddhが増強されたコリネ型細菌は、具体的には、例えばlysA及びddhを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを宿主コリネ型細菌に導入することによって、得られる。このような組換えＤＮＡは、例えば、前述のプラスミドベクター、トランスポゾン又はファージベクター等のベクターに、lysA及びddhを挿入することによって得られる。
【００５６】
lysA及びddhの各遺伝子の導入は、それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順次導入してもよく、単一のベクターを用いて２種類の遺伝子を共に導入してもよい。別個のベクターを用いる場合には、遺伝子の導入の順序は問わないが、宿主での安定な分配保持機構を有し、互いに共存可能なベクターを用いることが好ましい。
【００５７】
宿主への組換えＤＮＡの導入の方法は、プラスミドの場合、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によって行うことができる。トランスポゾンを用いた遺伝子の増幅は、プラスミドにトランスポゾンを搭載させて細胞内に導入し、トランスポゾンの転位を誘導することにより行なうことができる。
【００５８】
コリネ型細菌に変異型lysC、dapA及びdapBを導入する場合においても、これらの各遺伝子及びlysA及びddhの宿主細胞への導入は、それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順次導入してもよく、単一のベクターを用いて２種類又は３種類以上の遺伝子を共に導入してもよい。
【００５９】
＜３＞Ｌ−リジンの製造法
上記のようにしてＬ−リジン生合成遺伝子が増強されたコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造することができる。
【００６０】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００６１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００６２】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００６３】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−リジンの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００６４】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００６５】
【実施例１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムlysAの取得
＜１＞lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロンのプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）を基にしてアルギニル−tRNAシンターゼ及びＤＤＣをコードする約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号１及び２に記載の塩基配列を有する各々23merの合成ＤＮＡを用いた。
ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成した。
【００６６】
PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。増幅された３５７９ｂｐの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅されたlysAを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にして取得したATCC13869由来のlysAを有するプラスミドをp399LYSAと命名した。
【００６７】
更に、p399LYSAをKpnI（宝酒造(株)製）とBamHI（宝酒造(株)製）で切断することにより、lysAを含むＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片を、pHSG299をKpnIとBamHIで切断したものと連結した。得られたプラスミドをp299LYSAと命名した。p299LYSAB構築の過程を図１に示す。
得られたp299LYSAに、コリネバクテリウム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片（以下「Brevi.-ori」と記す）を導入し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なlysAを搭載したプラスミドを作製した。Brevi.-oriは、これを含み、エシェリヒア・コリと、コリネバクテリウム属細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターpHK4から調製した。pHK4は、pHC4をKpnI（宝酒造（株）製）及びBamHI（宝酒造（株）製）で切断し、Brevi.-ori断片を抽出し、同じくKpnI及びBamHIにて切断したpHSG298に接続することによって構築される（特開平5-7491号公報参照）。pHK4は、宿主にカナマイシン耐性を付与する。尚、pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB101は、エシェリヒア・コリ AJ13136と命名され、１９９５年８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5186として寄託されている。
【００６８】
pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをKpnIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp299LYSAに接続し、コリネ型細菌中で自律複製可能でかつlysAを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpLYSABと命名した。pLYSAB構築の過程を図２に示す。
【００６９】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムlysAの塩基配列の決定
p299LYSAのプラスミドDNAを調製し、サンガーらの方法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）により塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、この塩基配列のうち、argSがコードするアミノ酸配列及びlysAがコードするアミノ酸配列を、各々配列番号４及び５に示す。
【００７０】
【実施例２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムddhの取得
ddh遺伝子は、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のddh遺伝子の既知のヌクレオチド配列（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号６、７）を用いたＰＣＲ法により、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム ATCC13869 の染色体ＤＮＡからddh遺伝子を増幅することによって得た。得られた増幅ＤＮＡ断片をEcoT22IとAvaIで切断し、末端を平滑化した後、pMW119のSmaI部位に挿入し、プラスミドpDDHを得た。
【００７１】
次に、pDDHをSalIとEcoRIにて切断し、平滑末端化した後、得られた断片をSmaIで切断したpUC18と連結した。こうして得られたプラスミドをpUC18DDHと命名した。
【００７２】
pUC18DDHにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なddhを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みPstIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHSG299のPstI部位に挿入した。このようにして作製したプラスミドをpPK4と命名した。次に、pUC18DDHをXbaIとKpnIで切断し、生じたddh断片をKpnIとXbaIで切断したpPK4に接続した。このようにして、コリネ型細菌中で自律複製可能で、かつ、ddhを含むプラスミドを作製し、このプラスミドをpPK4Dと命名した。pPK4D構築の過程を図３に示す。
【００７３】
【実施例３】
ddh及びlysAを併せ持つプラスミドの作製
ddhを有するプラスミドpUC18DDHをEcoRIおよびXbaIにて切断し、ddhを含むＤＮＡ断片を抽出した。このddh断片を、lysAを有するプラスミドp399LYSAをBamHIおよびXbaIにて切断した後、切断面を平滑末端化したものと連結した。得られたプラスミドをp399DLと命名した。p399DL構築の過程を図４に示す。
【００７４】
次に、p399DLにBrevi.-oriを導入した。pHK4をXbaIおよびBamHIにて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化後、リン酸化済みXbaIリンカーを接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をXbaIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをXbaIにて切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくXbaIで切断したp399DLに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつddhおよびlysAを含むプラスミドを作製し、pDLと命名した。pDLの構築の過程を図５に示す。
【００７５】
【実施例４】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム変異型lysC、dapA及びdapBの取得
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型lysC遺伝子及び変異型lysC遺伝子の取得
（１）野生型及び変異型lysCの取得、及びそれらを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株、及びATCC13869株より変異処理により得られたＬ−リジン生産性変異株AJ3445（FERM P-1944）を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。AJ3445株は、変異によりlysCがリジン及びスレオニンによる競争阻害が実質的に解除されている（Journal of Biochemistry 68, 701-710 (1970)）。
【００７６】
染色体DNAよりPCR法（polymerase chain reaction；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によりlysCを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にしてlysCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配列番号１０及び配列番号１１に示す塩基配列を有する23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００７７】
増幅された1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。
【００７８】
遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅されたlysC断片と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたlysC断片が接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13869株由来のlysCを有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リジン生産菌であるAJ3463由来のlysCを有するプラスミドをp399AK9と命名した。
【００７９】
p399AKYおよびp399AK9に、それぞれBrevi.-oriを導入し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なlysCを搭載したプラスミドを作製した。
pHK4を、制限酵素KpnI及びBamHIにて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-ori ＤＮＡ断片を同じくBamHIにて切断したp399AKY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能でかつlysC遺伝子を含むプラスミドを作製した。
【００８０】
p399AKY由来の野生型lysC遺伝子を含むプラスミドをp399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型lysC遺伝子を含むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399AK9B、p399AKYB構築の過程を図６に示す。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株であるAJ12036株（FERM BP-734）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。
【００８１】
（２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型lysC及び変異型lysCの塩基配列の決定
野生型lysCを含むプラスミドp399AKY及び変異型lysCを含むプラ スミドp399AK9を各々の形質転換体から調製し、野生型及び変異型lysCの塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）によった。
【００８２】
p399AKYにコードされている野生型lysCの塩基配列を配列表の配列番号１２に示す。一方、p399AK9にコードされている変異型lysCの塩基配列は野生型lysCと比べ、配列番号１２において１０５１番目のＧがＡに変化しているという１塩基の変異のみを有していた。コリネバクテリウム・グルタミカムのlysCは、同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていることが知られているが（Kalinowski,J et al;Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていると考えられる。
【００８３】
ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号１３に、アミノ酸配列のみを配列番号１４に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号１５に、アミノ酸配列のみを配列番号１６に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００８４】
一方、変異型lysC配列上の変異は、野生型ＡＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４、１６）において、αサブユニットでは２７９番目のアラニン残基がスレオニン残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がスレオニン残基にというアミノ酸残基置換を起こしていることを意味する。
【００８５】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapBの取得
（１）dapBの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRによりdapBを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいて既知となっている配列（Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)参照）を基にしてＤＤＰＲをコードする約2.0kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡ断片を合成した。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された２００１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpCR-Script（Invitrogen社製）を用い、増幅したdapB断片と接続した。この様にしてpCR-Scriptにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapB断片２００１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のdapBを有するプラスミドをpCRDAPBと命名した。E. coliJM109株にpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００８６】
更に、pCRDAPBをEcoRVとSphIで切断する事により、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を抽出した。この断片を、pHSG399をHincIIおよびSphIにて切断したものと連結したプラスミドを作成した。この作成したプラスミドをp399DPRと命名した。
【００８７】
作製したp399DPRにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なdapBを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて切断したp399DPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapBを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpDPRBと命名した。pDPRB構築の過程を図７に示す。
【００８８】
（２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapBの塩基配列の決定
p399DPRを保持するAJ13107株からプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２３に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２４に示す。
【００８９】
＜３＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapAの取得
（１）dapAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRによりdapAを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Nucleic Acids Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL accession No.X53993参照）を基にしてＤＤＰＳをコードする約1.5kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号１７及び１８に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された１４１１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpCR1000（invitrogen社製；Bio/Technology 9, 657-663 (1991)参照）を用い、増幅したdapA断片と接続した。DNAの接続はDNAライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpCR1000にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapA断片１４１１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のdapAを有するプラスミドをpCRDAPAと命名した。
【００９０】
E. coliJM109株にpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００９１】
作製したpCRDAPAにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なdapAを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みSmaIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をSmaIIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをSmaIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくSmaIにて切断したpCRDAPAに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapAを含むプラスミドを作製した。このプラスミドをpDPSBと命名した。pDPSB（Kmr）の構築過程を図８に示す。
【００９２】
（２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapAの塩基配列の決定
pCRDAPAを保持するAJ13106株からプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１９に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２０に示す。
【００９３】
＜４＞変異型lysC及びdapAを併せ持つプラスミドの作製
dapAを有するプラスミドpCRDAPAと変異型lysC及びBrevi.-oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lysC、dapAおよびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを作製した。p399AK9BをSalIにて完全分解した後、平滑末端化し、EcoRIリンカーを接続する事によりSalI部位をEcoRI部位に改変したプラスミドを作製した。得られたプラスミドをp399AK9BSEと命名した。p399AK9BSEをEcoRIにて部分分解することよって変異型lysCとBrevi.−oriを一つのフラグメントとして切り出した。このフラグメントをpCRDAPAをEcoRIにて切断したものと連結した。得られたプラスミドをpCRCABと命名した。このプラスミドはE. coliとコリネ型細菌中で自律増殖可能で、かつ宿主にカナマイシン耐性を付与し、変異型lysCとdapAを併せ保持しているプラスミドである。pCRCABの作製過程を図９に示す。
【００９４】
＜５＞変異型lysC及びdapBを併せ持つプラスミドの作製
変異型lysCを有するプラスミドp399AK9とdapBを有するプラスミドp399DPRより、変異型lysC、dapBを含むプラスミドを作製した。p399DPRをEcoRVとSphIで切断することにより、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIで切断した後平滑末端化し、更にSphIにて切断したものと結合し、変異型lysCとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。このプラスミドをp399AKDDPRと命名した。
【００９５】
次に、得られたp399AKDPRにBrevi.-oriを導入した。Brevi.-oriを含むプラスミドpHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて切断したp399AKDDPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysCおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pCBと命名した。pCBの構築の過程を図１０に示す。
【００９６】
＜６＞dapA及びdapBを併せ持つプラスミドの作製
dapAを有するプラスミドpCRDAPAをKpnIおよびEcoRIにて切断し、dapAを含むＤＮＡ断片を抽出し、ベクタープラスミドpHSG399をKpnIおよびEcoRIにて切断したものと接続した。得られたプラスミドをp399DPSと命名した。
【００９７】
一方、dapBを有するプラスミドpCRDAPBをSacIIおよびEcoRIにて切断し、ＤＤＰＲをコードする領域を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片を抽出し、SacIIおよびEcoRIにて切断したp399DPSと接続し、dapAとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。得られたプラスミドをp399ABと命名した。
【００９８】
次に、p399ABにBrevi.-oriを導入した。Brevi.-oriを含むpHK4を制限酵素BamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをKpnIIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp399ABに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapAおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pABと命名した。pABの構築の過程を図１１に示す。
【００９９】
＜７＞変異型lysC、dapA及びdapBを併せ持つプラスミドの作製
p399DPSをEcoRI、SphIにて分解し、平滑末端化した後、dapA遺伝子断片を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIにて切断し平滑末端化したものとライゲーションし、変異型lysCとdapAが共存したプラスミドp399CAを構築した。
【０１００】
dapBを有するプラスミドpCRDAPBをEcoRIにて切断、平滑末端化した後、SacIにて切断し、dapBを含む2.0kbのＤＮＡ断片を抽出した。dapA及び変異型lysCを有するプラスミドp399CAをSpeIにて切断、平滑末端化した後、SacIにて切断し、抽出したdapB断片と接続し、変異型lysC、dapA及びdapBを含むプラスミドを得た。このプラスミドをp399CABと命名した。
【０１０１】
次に、p399CABにBrevi.-oriを導入した。Brevi.-oriを有するプラスミドpHK4を制限酵素BamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをKpnIIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp399CABに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapAおよびdapBを併せ持つプラスミドを作製し、pCABと命名した。pCABの構築の過程を図１２に示す。
【０１０２】
＜８＞変異型lysC、dapA、dapB及びlysAを併せ持つプラスミドの作製
lysAを有するプラスミドp299LYSAをKpnI及びBamHIにて切断し、平滑末端化した後、lysA遺伝子断片を抽出した。この断片を、pCABをHpaI（宝酒造（株）製）にて切断し平滑末端化したものとライゲーションし、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapA、dapB、及びlysAを併せ持つプラスミドを作製し、pCABLと命名した。pCABL構築の過程を図１３に示す。尚、pCABL中で、lysA遺伝子断片はdapB遺伝子を含むＤＮＡ断片内のHpaI部位に挿入されているが、このHpaI部位は、dapB遺伝子のプロモーターよりも上流（配列番号２３中塩基番号６１２〜６１７）に位置しており、dapB遺伝子は分断されていない。
【０１０３】
＜９＞変異型lysC、dapA、dapB、ddh及びlysAを併せ持つプラスミドの作製
pHSG299をXbaI及びKpnIにて切断し、ddh及びlysAを有するプラスミドp399DLをXbaI及びKpnIで切断したものと連結した。作製されたプラスミドをp299DLと命名した。このp299DLをXbaI及びKpnIで切断し、平滑末端化した。平滑末端化後、ddh及びlysAを含むDNA断片を抽出した。このDNA断片を、変異型lysC、dapAおよびdapBを併せ持つプラスミドpCABをHpaIにて切断し平滑末端化したものと連結し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びddhを併せ持つプラスミドを作製し、pCABDLと命名した。pCABDL構築の過程を図１４に示す。
【０１０４】
【実施例５】
Ｌ−リジン生合成遺伝子を含むプラスミドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌への導入
上記のようにして作製されたＬ−リジン生合成遺伝子を有するプラスミドpLYSAB（Cmr）、pPK4D（Cmr）、p399AK9B（Cmr）、pDPSB（Kmr）、pDPRB（Cmr）、pCRCAB（Kmr）、pAB（Cmr）、pDL（Cmr）、pCB（Cmr）、pCAB（Cmr）、pCABL（Cmr）、pCABDL（Cmr）をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌であるＡＪ１１０８２（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７０）に導入した。ＡＪ１１０８２株は、ＡＥＣ耐性の性質を有する。プラスミドの導入の方法は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によった。形質転換体の選択は各々のプラスミドが持つ薬剤耐性マーカーによった。クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合は５μg/mlのクロラムフェニコールを含む完全培地にて、また、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合には２５μg/mlのカナマイシンを含む完全培地にて形質転換体の選択を行なった。
【０１０５】
【実施例６】
Ｌ−リジンの製造
実施例５で取得した各形質転換体をＬ−リジン生産培地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。
【０１０６】
〔Ｌ−リジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。
【０１０７】
グルコース              100 g
（ＮＨ4）2ＳＯ4          55 g
ＫＨ2ＰＯ4                1 g
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        1 g
ビオチン                500 μg
チアミン               2000 μg
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        0.01 g
ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        0.01 g
ニコチンアミド            5 mg
蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml
炭酸カルシウム           50 g
【０１０８】
上記組成の培地に各種形質転換体及び親株を植菌し、31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養４０時間、７２時間後のＬ−リジン生成量、及び７２時間後の生育（OD562）を表１に示す。表中、lysC*は変異型lysCを表す。生育は１０１倍希釈した後、560nmにてＯＤを測定することにより定量した。
【０１０９】
【表１】
0004035855.tif 000003
【０１１０】
以上に示すように、lysA、ddh、変異型lysC、dapA、又はdapBの単独の増強では、培養７２時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多いか同等であるが、４０時間後では親株よりも生産量が少なく、すなわち短期間培養におけるＬ−リジン生産速度は低下した。同様に、変異型lysC及びdapA、又はdapA及びdapBを組み合わせて増強した場合には、培養７２時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多いが、４０時間後では親株よりも生産量が少なく、L−リジン生産速度は低下した。
【０１１１】
これらに対し、lysA及びddhのみを組み合わせて増強した場合には、生育が改善され、短期間培養におけるＬ−リジン生産速度を回復させることができた上、長期間培養でのＬ−リジン蓄積量も向上した。
【０１１２】
また、変異型lysCとともにdapBが増強された株、あるいはこれらの遺伝子に加えてdapAが同時に増強された株は、親株に比べて生育が改善され、Ｌ−リジン生産速度も向上したが、これら３種の遺伝子を増強された株は、さらにlysA、ddhを増強することによって、より一層Ｌ−リジンの生産速度及び蓄積量が向上した
【０１１３】
。
【発明の効果】
本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジン生産能を向上させることができ、生育速度も改善される。本発明は、通常のＬ−リジン生産菌に適用できる他、Ｌ−リジン高生産株にも適用することができる。
【０１１４】
【配列表】
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【０１１５】
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【０１１６】
0004035855.tif 000006
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
0004035855.tif 000025
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  lysAを有するプラスミドp299LYSAの構築の過程を示す図。
【図２】  lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpLYSABの構築の過程を示す図。
【図３】  ddh及びBrevi.ori-を有するプラスミドpPK4Dの構築の過程を示す図。
【図４】  ddh及びlysAを有するプラスミドp399DLの構築の過程を示す図。
【図５】  ddh、lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDLの構築の過程を示す図。
【図６】  変異型lysCを有するプラスミドp399AK9B及びp399AKYB構築の過程を示す図。
【図７】  dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPRBの構築の過程を示す図。
【図８】  dapA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPSBの構築の過程を示す図。
【図９】  lysC、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCRCABの構築の過程を示す図。
【図１０】  変異型lysC、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCBの構築の過程を示す図。
【図１１】  dapA、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpABの構築の過程を示す図。
【図１２】 変異型lysC、dapA、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCABの構築の過程を示す図。
【図１３】 変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCABLの構築の過程を示す図。
【図１４】 変異型lysC、dapA、dapB、ddh、lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCABDLの構築の過程を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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