(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリーの中のサンプルを透過した光の光量を測定するための光量測定方法であって、
キャピラリーに光を照射する光源と、キャピラリーを透過した光を受光する光検出器と、光源と光検出器との間に設置され光の幅を制限するスリットとを備える光量測定装置を用いて、
第一の幅（ｗ1）の前記スリットを設置した場合の、光がキャピラリー中のサンプルを透過する長さに相当する実効光路長（Ｌ１）を求め、
当該実効光路長（Ｌ１）に基づき、前記スリットで制限される第一の光の制限幅（２ｘ1）を求め、
最適な信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を与える第二の光の制限幅（２ｘ2）を求め、
前記第一の光の制限幅（２ｘ1）と前記第二の光の制限幅（２ｘ2）との比を用いて、最適な信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を与えるスリットの第二の幅（ｗ２）を求め、
前記第二の幅（ｗ２）のスリットを用いて、光量測定を行うことを特徴とする光量測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キャピラリーの中のサンプルを透過した光の光量を測定するための光量測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
キャピラリー１は、図８に示すように、ガラス管で形成されており、内部の中空円筒１ａの中にサンプルが挿入される。
このサンプルを透過した光Ｌの光量を測定する場合、サンプルを透過しない光（図８に破線で示す）が屈折して迷光となってスリット窓９を通り、光検出器に入り込むことがある。この迷光がサンプル透過光の光量を多めにして、サンプルの吸収を信号として検出するときに、信号量を相対的に減らす可能性がある。
【０００３】
信号量の相対的な減少を防ぐために、従来はキャピラリの中心を通過する光のみを検出しようとすることが行われてきた。
しかしそのことによる光量の低下で露光時間が増えて、検出器の積算回数が減り、ノイズが相対的に増大し信号対雑音比Ｓ／Ｎとしては必ずしも最良の状態で測定できていなかった。
【０００４】
そこで、本発明は、キャピラリーの中のサンプルを透過した光の光量を測定する場合、Ｓ／Ｎを従来よりも改善することができる光量測定方法を実現することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の光量測定方法は、キャピラリーに光を照射する光源と、キャピラリーを透過した光を受光する光検出器と、光源と光検出器との間に設置され光の幅を制限するスリットとを備える光量測定装置を用いて、第一の幅（ｗ1）の前記スリットを設置した場合の、光がキャピラリー中のサンプルを透過する長さに相当する実効光路長（Ｌ１）を求め、当該実効光路長（Ｌ１）に基づき、前記スリットで制限される第一の光の制限幅（２ｘ1）を求め、最適な信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を与える第二の光の制限幅（２ｘ2）を求め、前記第一の光の制限幅（２ｘ1）と前記第二の光の制限幅（２ｘ2）との比を用いて、最適な信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を与えるスリットの第二の幅（ｗ２）を求め、前記第二の幅（ｗ２）のスリットを用いて、光量測定を行う方法である。
【０００６】
図１及び図２は、キャピラリーに光を照射した状態を示す断面図である。キャピラリー内における光の制限幅を２ｘ、キャピラリーの試料を満たした円柱部分（以下「試料部分ＳＭ」という）の半径をｒとする。図１は、光の制限幅２ｘが直径２ｒよりも小さな場合、図２は光の制限幅２ｘが直径２ｒよりも大きな場合を示す。図１においてｘ／ｒをsinθとおく。なお、断面に垂直な方向には、一様であるとする。キャピラリーを通る光は、実際はレンズで絞られているので、図１及び図２に示すように放射状であり平行光線でないが、キャピラリー中では十分平行光線とみなせるので、以下では、平行光線であるとして説明を進める。
【０００７】
図１、図２において、照射光のうち試料部分ＳＭを通過する光を紙面に投影した面積を斜線で示している。図１の場合は、試料部分ＳＭの上下が光の制限幅２ｘで切り取られるが、図２の場合は切り取られることはない。以下、この斜線の部分を「試料部分ＳＭと交わる光の面積Ａ」または単に「面積Ａ」という。図１の場合、面積Ａは、２ｒ2 θ＋２ｘｒcosθに等しく、図２の場合、面積Ａはπｒ2に等しい。
【０００８】
ここで実効光路長Ｌを、「試料部分ＳＭと交わる光の面積」を「光の制限幅２ｘ」で割ったものと定義する。数式で表すと、
0004035250.tif 000002
となる。
【０００９】
この実効光路長Ｌは、本発明では、光検出器が検出する信号の強度に比例するものと考える。
一方、サンプリングタイム（露光時間）が自動的に設定される光検出器では、ノイズＮは、光量の平方根に逆比例する。すなわち、
Ｎ∝１／（光量）1/2
また光量は、スリットの形状を細溝状とすれば、光の制限幅２ｘに比例するから、ノイズＮは、
Ｎ∝１／（２ｘ）1/2                                   (3)
と書ける。
【００１０】
以上の考察から、光検出器における信号対雑音比Ｓ／Ｎは、ｘ≦ｒの場合、
ｒ（θ／sinθ＋cosθ）（２ｘ）1/2                     (4)
で表され、ｘ＞ｒの場合
πｒ2／（２ｘ）1/2                             (5)
で表される。後者の場合、光の制限幅２ｘが小さくなるほど、Ｓ／Ｎが大きくなるから、Ｓ／Ｎが最大となるｘの最適解は、ｘ≦ｒの範囲で見つかりそうである。
【００１１】
図３は、キャピラリの試料部分ＳＭの直径（キャピラリの内径）を７５μｍとしたときの、光の制限幅２ｘと実効光路長Ｌとの関係を破線で、光の制限幅２ｘとＳ／Ｎとの関係を実線でグラフ化したものである。光の制限幅２ｘの単位はμｍ、Ｓ／Ｎは、対数でなくリニアスケール（任意メモリ）で表示している。
図３のグラフから、光の制限幅２ｘを０に近づければ、実効光路長Ｌは、キャピラリの内径に近づいていることが確認できる。光の制限幅２ｘを長くとるほど、実効光路長Ｌは、ゆるやかに減少する。Ｓ／Ｎは、光の制限幅２ｘのある値（図３では７０μｍの付近）でピークをとる。
【００１２】
そこで、前記(4)式を解析し、又は数値計算して、光の制限幅２ｘの最適値を見い出し、スリットの制限幅ｗを、当該最適値２ｘを実現する値に設定すればよい。
また、Ｓ／Ｎが最も大きくなるスリットの制限幅が存在することが理論的に確認できたので、その上で、Ｓ／Ｎが最も大きくなるようなスリットの制限幅ｗを、実験的に決定してもよい。
【００１３】
なお、スリットの制限幅ｗをＳ／Ｎが最も大きくなる値に固定できなくても、当該値を含む一定の範囲内で設定すれば、実用上、十分にノイズの少ない信号が観測できる。図３のグラフから、Ｓ／Ｎのカーブは、光の制限幅２ｘが大きくなればゆるやかに減少し、小さくなれば早く減少している。そこで、スリットの制限幅ｗの一定の範囲として、Ｓ／Ｎが最も大きくなる値から＋５０％、−２０％程度の範囲を設定すれば、実用的である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、キャピラリーの中に試料を満たして電気泳動させる場合の、本発明の実施の形態を、添付図面を参照しながら詳細に説明する。
図４は、電気泳動システムの構成例を示す。溶融石英製中空キャピラリー１の中に泳動液２を注入し、さらに一部（キャピラリー１の左端）に試料溶液を注入する。その状態でキャピラリー１の両端を、泳動液２の入った容器５，６に漬け、容器５，６に高電圧Ｖを印加する。また、光源と光検出器からなる検出部３を、試料溶液とは距離Ｌ離れたキャピラリー１の所定部位に置く。
【００１５】
検出部３は、ハロゲンランプなどからなる光源３ａ、スリット３ｂ、光電子増倍管ＰＭＴ、フォトダイオード、ＣＣＤ(charge-coupled device)などの光子積算型光検出器３ｃを含んでいる。
図５は、光源３ａ、スリット３ｂ、光検出器３ｃと、キャピラリー１との位置関係を示すＸ−Ｘ線断面図であり、光源３ａから出た光は、キャピラリー１の被覆の剥離されている部分に当たり、試料溶液の入っている「試料部分」を透過し、スリット３ｂの溝を透過し、光検出器３ｃによって検出される。光検出器３ｃは凹面回折格子７と、平面光検出器８とを含んでいる。
【００１６】
図６は、キャピラリー１とスリット３ｂとの位置関係を示す斜視図であり、スリット３ｂの溝の寸法は、キャピラリー１の中心軸方向にｙ、中心軸と垂直な方向にｗとなっている。
この幅ｗの決定方法として、本発明ではいろいろな幅ｗを持つスリット、又は可変の幅を持つスリットを用意し、幅を１回１回変えながら最もＳ／Ｎが良好になる条件を見つけるという方法がある。
【００１７】
しかし、このような手順が煩雑であるならば、ある幅（ｗ1とする）のスリットについて実効光路長Ｌ1を実験的に求め、当該値Ｌ1を図３の破線のグラフに当てはめて横軸の値２ｘ1を求め、一方最適なＳ／Ｎを与える２ｘ2をグラフから求め、ｗ1をこれらの２ｘ1，２ｘ2を使って最適なスリット幅ｗ2に逆算し、その値ｗ2のスリットを使うという方法がある。ｗ2を求める逆算の方法として、式
ｗ1／２ｘ1＝ｗ2／２ｘ2                         (6)
を用いればよい。
【００１８】
実際には、求められた最適スリット値ｗ2が一定の範囲内にあれば、実用的にはＳ／Ｎとして適切な値になる。
実効光路長Ｌを実験的に求めるには、キャピラリの中空部分にモル吸光係数がε、濃度がｃの溶液、又はεｃが既知の溶液を満たし、これと泳動溶媒を満たしたときとの吸光度の差ΔＡを求め、式
ΔＡ＝εｃＬ
に基づいて実効光路長Ｌを求めるとよい。
【００１９】
【実施例】
図４の構成により試験を行った。溶融石英製キャピラリーは、内径75μｍ、外径375μｍ、全長７２．５cm（注入端から検出器までの有効長Ｌは６０cm）のもので、２０ｋＶの電界をかけた。スリット３ｂは、
(1) 溝の幅ｗが２００μｍのものをキャピラリーから１ｍｍ離した場合
(2) 溝の幅ｗが４５μｍのものをキャピラリーに密着させた場合
の２つ用意した。図５から分かるように、キャピラリからの透過光は進むにしたがって広がるので、(1)(2)ともキャピラリ内での光の制限幅は、ｗよりも狭くなっている。
【００２０】
試料溶液として、無機陽イオン標準化合物１１種を０．５ppmずつ含む水溶液を用意し、泳動液として、5mM ４−メチルベンジルアミン、5mM β−ヒドロキシイソ酪酸(HIBA)を酢酸でｐＨ４．４に調整したものを使用した。試料溶液の導入は、落差法で25mm、６０秒行い、分光器を使って２１５ｎｍの波長を観測した。検出されたピークは、順にＮＨ4 +，Ｋ+，Ａｇ+，Ｃａ2+，Ｎａ+，Ｍｇ2+，Ｃｏ2+，Ｎｉ2+，Ｚｎ2+，Ｌｉ+，Ｐｂ2+であった。
【００２１】
図７は、得られたエレクトロフェログラムを示す。図７(a)はスリット幅が(1)の場合、図７(b)は(2)の場合を示す。図７(a)では信号値は小さいが、全体としての光量は多くノイズは大幅に減少しＳ／Ｎは向上している。特に、図７(b) はキャピラリの中心の部分ＳＭに絞っているので信号量の変化は大きいが、透過光を絞り過ぎてノイズ分が増え、Ｓ／Ｎが悪くなっている。
【００２２】
【発明の効果】
以上のように本発明の光量測定方法によれば、キャピラリーの中のサンプルを透過した光の光量を良好なＳ／Ｎで測定することができるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】キャピラリーに狭い幅の光を照射した状態を示す断面図である。
【図２】キャピラリーに広い幅の光を照射した状態を示す断面図である。
【図３】キャピラリの試料部分ＳＭの直径（キャピラリの内径）を７５μｍとしたときの、光の制限幅２ｘと実効光路長Ｌとの関係を破線で表し、光の制限幅２ｘとＳ／Ｎとの関係を実線で表したグラフである。
【図４】電気泳動システムの構成図である。
【図５】光源３ａ、スリット３ｂ、光検出器３ｃと、キャピラリー１との位置関係を示すＸ−Ｘ線断面図でる。
【図６】キャピラリー１とスリット３ｂとの位置関係を示す斜視図である。
【図７】実施例で得られたエレクトロフェログラムである。
【図８】キャピラリーの要部を示す斜視図である。
【符号の説明】
１  中空キャピラリー
２  泳動液
３  検出部
３ａ  光源
３ｂ  スリット
３ｃ  光検出器
５，６  容器
【図１】
0004035250.tif 000003
【図２】
0004035250.tif 000004
【図３】
0004035250.tif 000005
【図４】
0004035250.tif 000006
【図５】
0004035250.tif 000007
【図６】
0004035250.tif 000008
【図７】
0004035250.tif 000009
【図８】
0004035250.tif 000010