(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応し、それぞれＥＢＮＡ−１配列の位置３９４から位置４２０のアミノ酸配列、位置４２４から位置４５２のアミノ酸配列、および配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
適切な担体もしくはラベル化物に結合している請求項１に記載のペプチドを含む免疫化学的試薬。
【請求項３】
検査液中のエプスタイン−バールウイルスに対する抗体を検出するための方法であって、請求項２に記載の免疫化学的試薬を検査液と接触させ、更に、検査液中において形成される免疫複合体の存在を検出することを特徴とする前記方法。
【請求項４】
検査液中のエプスタイン−バールウイルスを検出するための方法であって、請求項２に記載の免疫化学的試薬を検査液及びエプスタイン−バールウイルスに対する抗体とに接触させ、その後、形成される免疫複合体を検出し、更に、これにより検査液中のエプスタイン−バールウイルスの存在を検出することを特徴とする前記方法。
【請求項５】
請求項２に記載の免疫化学試薬が固定化された固相及び形成された任意の免疫複合体を検出するための手段を含む、請求項３または４に記載の方法を実施するための検査キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）に対する抗体に対して免疫化学的な反応を示すペプチド、これらのペプチドに対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗イディオタイプ抗体を産生することが可能な細胞系に関する。本発明は、更に、ＥＢＶもしくは抗ＥＢＶ抗体の検出のための免疫学的試薬及び方法にも関する。
ＥＢＶは遍在性のヒト・ヘルペスウイルスであり、これは最初バーキットリンパ腫（ＢＬ）のアフリカ形態（風土性もしくはｅ）に関連して発見された。その後、このウイルスは、鼻咽頭の癌腫（ＮＰＣ）に関連しても発見され、更に、感染性単核細胞症（ＩＭ）の原因物質であることが示された。感染は通常は初期幼年期に起こり、一般的には症状を発現しないという結果を生じるが、時として軽い症状を生じる場合もある。しかしながら、青年期もしくは成人になってからの感染は、末梢における異型リンパ球の存在により特徴付けられるＩＭを生じることがある。これらのリンパ球の大半はＴリンパ球であるが、その数にはＥＢＶによる感染を受けている少集団のＢリンパ球が含まれている。Ｂリンパ球の感染をインビトロにおいて実行することもできる。このような細胞は形質転換を起こして培養系内で漠然と増殖し、「不死化した」、「潜伏的に感染した」、もしくは、「増殖的に形質転換した」と称される。知られている限りでは、ＥＢＶに感染した全ての固体は一生涯潜伏的に感染したままとなる。このことは、循環性末梢血リンパ球中における少数のＥＢＶゲノム陽性形質転換Ｂ細胞が一生涯を通して継続的に存在すること、及び、口腔咽頭部における継続的であり但し周期的なウイルスの発散により表される。
大多数の症例においては、ＥＢＶ感染の結果リンパ球増殖性疾患を生じ、この疾患は一過的には衰弱を招くことがあるものの常に良性でありかつ自己限定性のものである。しかしながら、ある種の免疫抑制状態にある個体においては、この結果は完全に発達した悪性疾患となることがある。これは、意図的に免疫抑制状態に置かれている個体、特に、サイクロスポリンＡで治療を行っている臓器移植を受けた子供、あるいは、ＨＩＶに感染している個体での場合におけるように便宜的に免疫抑制状態に置かれている個体、あるいは、ＸＬＰ（ｘ−関連性リンパ球増殖性症候群）遺伝子を保持している男性患者のように遺伝子的に免疫抑制状態に置かれている場合に生じる。これらの症例においては、結果として生じる悪性疾患の原因はＥＢＶ−感染Ｂ細胞のポリクローナルな増殖である。更に、このような患者においては、ウイルスの上皮上での非抑制的複製を口部の毛様白斑症の病変中に検出することができる。従って、ＥＢＶ感染の抑制においては免疫反応が中心的な役割を演じている。
細胞もしくは組織中のＥＢＶの存在は、ウイルスのゲノムの検出、もしくは、ＥＢＶ感染細胞中に普遍的に発現される唯一の潜状関連性蛋白質産物であるＥＢＮＡ−１蛋白質の証明により実証することができる。
上述したように、ＥＢＶはヘルペスウイルスの一員である。これは以下に記載するような構造特性を有する。
−ＥＢＶゲノムは直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子（１７２，０００塩基対）からなる。
−ビリオンは正十二面体カプシドにより囲まれているコア（蛋白質及びＤＮＡ）からなり、更に、膜エンベロープがカプシドを被覆している。この正十二面体カプシドは六量体及び五量体のカプソマーから構成されている。膜エンベロープは、外側表面にスパイクをもつ蛋白質／脂質二重層膜でできている。カプシド殻とエンベロープとの間の隙間は被包と呼ばれる無定形蛋白質で埋められている。
−全てのヘルペスウイルス同様、ＥＢＶは初期感染後に、潜伏性の一生涯を通じる感染を定着させることが可能である。この潜伏性は、宿主の免疫系により抑制されている、ＥＢＶとヒト宿主との間の完全な平衡状態を表すものである。
現在までに、ＥＢＶの３つの基本型、つまり、Ｂ９５−８（マーモセット細胞系中に産生される形質転換性ウイルス）、Ｐ３ＨＲ１（バーキットリンパ腫腫瘍細胞系により産生される非形質転換性ウイルス）、及び、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫腫瘍細胞系内における潜伏性ウイルス）、についてはほとんどの生化学的研究及び生物学的研究が行われている。
最近の２、３年の間に、基本型ウイルス株、Ｂ９５−８の完全ＤＮＡ配列が決定されている。この配列の解析の結果、８０を越す読み取り枠が同定された（Baer et al.、１９８４、Nature 310、p.207−211）。
ＥＢＶの生物学研究によりある特別の問題が研究者達に投げかけられたが、それは、そのウイルスの生物学的特性（潜伏性感染）が古典的ウイルス分析結果に当てはまらないためである。更に、その細胞及び宿主範囲はヒト（及び、幾つかのより高等な霊長類）のＢ細胞及び上皮細胞に実際上限定されているが、これらの細胞は一般的にはインビトロにおける培養を容易に行うことができない。更に、完全な許容細胞種中ではウイルスが細胞を溶解しながら複製を行うが、この完全な許容細胞種が不在であるということが大量のウイルスを産生する能力に厳しい制約を課している。
Ｂ９５−８、Ｐ３ＨＲ１−、及び、Ｒａｊｉ−単離物のＤＮＡ分子は、詳細な制限酵素エンドヌクレアーゼマッピングのため、及び、大腸菌（E.coli）プラスミド内へのクローニング及びバクテリオファージラムダー内でのクローニングのため、及び、ヌクレオチド配列決定のための基本型となっている。
ＥＢＶ−ゲノムは、非反復ＤＮＡ構成要素及び縦並びに反復するＤＮＡ構成要素で構成されている単一の二本鎖ＤＮＡ分子でできている。このＤＮＡ分子の各末端には多重末端配列が含まれており、この配列は共有結合を可能にし、ゲノムの環状化を起こす。ウイルス粒子中においては、ＥＢＶ−ゲノムは線状形態のもののみが検出されてくる。それに反して、潜伏感染細胞の核内ではそのＥＢＶ−ゲノムは環状のエピソームとして存在しており、時としては宿主細胞染色体内に取り込まれる。
内部反復配列であるＩＲ１からＩＲ４までが、ＥＢＶ−ゲノムを５つの非反復領域に分断している。Ｕ２及びＵ３領域は異なるＥＢＶ単離物中では激しく変化しており、前者はＥＢＶのＰ３ＨＲ−１株中においてはほとんど完全に欠損している。
ＥＢＶの読み枠についての命名法はウイルスゲノム中におけるそれらの位置に基づいている。名前は、発現が開始されるＢａｍＨ１もしくはＥｃｏＲ１制限断片の頭文字で始まる。名前中の第３番目の文字はＬもしくはＲであり、これは発現が標準地図の左側か右側かによって決まる。（つまり、ＢＬＬＦ２は、ＢａｍＨ１制限断片Ｌ中で開始される第２の左側の読み枠である。）
ＥＢＶの産生周期におけるウイルス抗原の血清学的分類は様々な蛍光技術に基づいている。
固定させた潜伏感染Ｂ−細胞（例えば、Ｒａｊｉ−細胞）の核内において抗補体蛍光抗体技術の手段により特異的に検出される抗原は、エプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）として分類される。
化学的因子もしくはウイルス性因子によるウイルス遺伝子発現の活性化の際にはあるクラスの初期抗原（ＥＡ）が検出されるが、これらの合成はウイルス性ＤＮＡ合成の阻害によっては阻止されない。使用する固定液の種類によって（メタノールもしくはアセトン）２つの別個のＥＡセット、すなわちＥＡR及びＥＡDを検出することができる。ＥＡは、刺激化された細胞の細胞質及び核内において間接的蛍光抗体法により検出される。ウイルスＤＮＡ合成の開始後に（かつ、それに依存して）ウイルス構造蛋白質（ＶＣＡ）が合成されるが、この蛋白質は、ウイルス産生性細胞（例えば、Ｐ3ＨＲ1細胞）の細胞質及び核内において間接的蛍光抗体法により検出される。生存可能な感染細胞表面においては、ウイルス産生の目的で刺激化を行うと一連の抗原（ＭＡ）が間接的蛍光抗体法により検出される。これらの抗原はウイルスエンベロープ上においても見い出すことができ、更に、ウイルス中和のための重要な標的である。
ヒト血清中におけるＥＢＶ特異的抗体の検出は、Heule and Heule（Human Pathology、５、５５１−５６５、１９７４）により記載されているように、血清学的技術により日常的な作業として実施することができる。
生化学的データ及び蛍光抗体法のデータに基づき、５つの異なる種類の抗原分子を認識することが可能である。異なるウイルス性ポリペプチドはそれらの分子量により表示され、それらの特徴を表現するという目的での全てのＥＢＶ−蛋白質についての共通の命名法は確立されていない。
５つの異なる抗原群とは下記のものである。
Ａ．潜伏状態における際に発現される抗原群（ＥＢＮＡ及びＬＭＰ）。
Ｂ．ゲノムの活性化及びウイルス複製の初期誘導に関わる抗原群（ＩＥＡ）。
Ｃ．ＩＥＡ−遺伝子産物により誘導され、かつ、ウイルス性ＤＮＡの複製に必要な抗原群であり、これらの抗原は大概ウイルス性酵素である（ＥＡ）。
Ｄ．ウイルス粒子の構造構成物であり、かつ、ウイルスのＤＮＡ合成開始後のウイルスの複製周期において後期に発現される抗原群（ＶＣＡ）。
Ｅ．感染細胞の細胞膜内に発現される抗原群（ＭＡ）。
エプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）
読み取り枠ＢＫＲＦ  １中にコードされているエプスタイン・バール核抗原１（ＥＢＮＡ−１）は、インビボ及びインビトロにおいて、潜伏感染細胞及び腫瘍関連性細胞の全てにおいて普遍的に発現される唯一のＥＢＶコード蛋白質であり、かつ、ＤＮＡ複製及び遺伝子活性化の機構を研究するための重要な標的分子を形成している。
ＥＢＶ−陽性細胞においてはイムノブロッティング及び放射線免疫電気泳動によりＥＢＮＡ−１を同定したが、３つのＥＢＶ−陰性細胞系においては同定されなかったため、４つのＥＢＶ−陽性ヒト血清を２つのＥＢＶ−陰性ヒト血清と対比させて使用している。分析を行った様々な細胞系において同定された抗原には様々な分子量が存在しており、それらは６５，０００から７３，０００の範囲にわたるものであった。補体固定性抗原は２００倍を上回るまでに部分精製され、かつ、イムノブロッティングにより同定される６５ｋＤａのＥＢＮＡと一緒に同時精製されることを発見した。ＥＢＮＡは抗補体蛍光抗体法（ＡＣＩＦ）によって定義されるため、６５ｋＤａ抗原がＥＢＮＡの主要成分であるということが示唆された。
ＥＢＮＡ遺伝子については、ＥＢＶＤＮＡの、クローン化ＢａｍＨＩ  Ｋ制限酵素断片を有するマウス細胞をトランスフェクションすることにより遺伝子地図を作成した。主要選択マーカーと一緒にこの断片を有するマウス繊維芽細胞系をトランスフェクションすることにより、ＥＢＮＡ−陰性ヒト血清においては同定されないが、ＥＢＮＡ−陽性ヒト血清を使用する場合にＡＣＩＦにおいて同定される核抗原を安定に発現させることができる。後続の研究においては、Ｂａｍ  Ｋ−トランスフェクション細胞が、Ｂ９５−８細胞のＥＢＮＡ−１ポリペプチドと一緒に移動する７８ｋＤａのポリペプチドを発現することを発見した。
より最近の研究によって、通常はｐ６２もしくはｐ１０７と呼称されるグリシン−アラニン反復領域内の免疫優勢領域が明らかになり、この領域はヒト血清と強い反応を示す。しかしながら、このｇｌｙ−ａｌａ断片は正常なヒト蛋白質内に含まれていることが明らかになり、更に、これは自己抗体のための標的であることを発見した。更に、より詳細な研究により、進行性ＣＭＶ、ＨＳＶ、もしくは、トキソプラズマ感染の患者からの血清中のＩｇＭ抗体は特に、時としてこのペプチドと交差反応性を示すことを明らかにした。更に、ＥＢＮＡ−１のＡＡ４６１−６４１をコードする２８ｋＤのＣ末端断片は大腸菌内で発現されるが、このＣ末端断片がヒト血清抗体と反応することを明らかにした。今のところまでの追加的研究では、診断の際に無傷のＥＢＮＡ−１蛋白質に置き換えて使用することができるＥＢＮＡ−１蛋白質断片を確定することには成功していない。
ＥＢＮＡ−１の分子サイズは種（ｓｔｒａｉｎ）の同定（ＥＢＮＯ−タイピング）に使用することができるが、それは、ｇｌｙ−ａｌａ反復領域のサイズが個々のウイルス種間で顕著な違いを示すことがあるためである。
ＥＢＮＡ−１は、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌腫の細胞、及び、ホジキン氏病において見い出されるリード−ステルンベルク（Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）細胞中において免疫学的に検出されている。
更に、ＥＢＮＡは、移植及びＡＩＤＳ患者におけるポリクローナルなリンパ球増殖性病変内においても検出され、ＥＢＮＡは細胞培養物中におけるＢリンパ球の同定用の初期マーカーになっている。
ＥＢＮＡ−１分子について、ＤＮＡ結合性（Ｏｒｉ−Ｐ）ドメイン、核局在ドメイン、トランスアクチベーションドメイン、ＤＮＡループ形成ドメイン、及び、二量体形成ドメインのようないくつかの機能性ドメインを同定した。ＥＢＮＡ−１は、ホモ二量体分子としてそのＤＮＡ結合機能を発揮する。
現在では、ＥＢＶ特異的血清学的診断はかなり本質的な蛍光抗体テストにより行なわれる。標準的なウイルス産生性細胞系を使用する場合にはウイルス抗原の大量産生及び精製は不可能であるため、より簡便で画一的な診断法（例えば、ＥＬＩＳＡ）への進展は妨げられている。
これを行うための唯一の方法は、別の方法により調製されたＥＢＶ抗原を使用することであると思われる。これらのＥＢＶ抗原は、遺伝子工学技術もしくは合成ペプチド技術のいずれかを用いて調製することが可能である。
ＥＢＶでの感染の様々な段階において行う信頼性の高い診断法を可能にするための特異的かつ感度の良い方法を開発するためには、免疫優勢ウイルス蛋白質及びそれらのエピトープを確定することが非常に重要である。
本発明は、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ（配列番号）：１に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を含むペプチドを提供する。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１において示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその断片は、従って、本発明の一部である。
本発明のペプチドは、試料中のＥＢＶもしくはＥＢＶ−抗体の存在を決定するための診断法への使用に特に適することを発見した。更に、本発明のペプチドは、ＥＢＶ関連疾患の治療における適切な薬剤学的投与形態中に使用することができる。活性成分としてペプチドもしくはその断片を含むものとして得られるワクチンの調製法は、当業者には知られている。
天然のＥＢＶと対比して、本発明のペプチドは、これらが安全な非感染起源のものであるという重要な利点を有している。
本発明はまた、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と依然として免疫化学的に反応する当該ペプチドの断片も含む。
ＥＢＮＡ−１の当該ペプチド領域に特有の特徴により、この領域がＥＢＮＡ−１蛋白の天然の構造であれ変成した構造であるとともに抗体に近づき易くなる。
本明細書において使用されている用語「ペプチド」は、生物学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を意味し、産物の特定な長さを意味するのではない。従って、中でも、蛋白質、融合−蛋白質もしくは−ペプチド、オリゴペプチド、及び、ポリペプチドがこれに含まれる。必要であれば、本発明に記載のペプチドを、インビボもしくはインビトロにおいて、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、もしくは、リン酸化により修飾することができる。本発明に記載のペプチドの、例えば、酸付加塩、アミド、エステル及び具体的にはＣ末端エステル、及び、Ｎ−アセチル誘導体のような機能的変異体も、従って、本発明の一部分とみなされる。本明細書に包含される特別な蛋白質もしくはポリペプチドについては、天然の変異体も存在することが理解できるはずである。これらの変異体は、配列全体におけるアミノ酸の違い、あるいは、当該配列内におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位、もしくは、付加により証明することができる。アミノ酸置換によっては生物学的及び免疫学的活性は本質的には変化しないことを期待することができると言われている。関連するアミノ酸間でのアミノ酸置換、あるいは、進化中に頻繁に起こった置換は、中でも、Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Valである（Dayhof、M.D.、Atlas of protein sequence and structure、Nat.Biomed.Res.Found.、Washington D.C.、1978、vol.5、suppl.3を参照せよ）。この情報に基づき、LipmanとPearsonが、迅速かつ高感度の蛋白質比較のための（Science 227、1435-1441、1985）、及び、同類蛋白質間の機能的類似性の決定のための方法を開発した。
本明細書中で使用されている用語「断片」は、本発明のペプチドの配列を含むアミノ酸配列を意味する。当該断片は、ＥＢＮＡ−１蛋白質の１つ以上の免疫原決定基を有するペプチドである。断片は、中でも、ＤＮＡについては制限酵素を使用し、更に、ポリペプチドについてはプロテアーゼを使用する前駆体分子の酵素的開裂により産生することができる。他の方法には、断片の化学的合成、あるいは、ＤＮＡ断片によるペプチド断片の発現がある。
エピトープ（一つもしくは複数）を含む本発明に記載の適切な免疫原性断片は、いわゆるペプスキャン（pepscan）法に基づき、特許公開公報WO 86/06487、Geysen、H.M.et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.81、3998-4002、1984）、Geysen、H.M.et al.（J.Immunol.Meth.102、259-274、1987）に記載されている方法により見い出すことができるが、これらの文献においては、検討中の完全なポリペプチドの部分配列に相当する一連の部分的重複ペプチドが合成されており、かつ、それらの抗体との反応性が検討されている。
更に、ペプチドの数々の領域は理論的研究に基づいて指定されるエピトープである可能性があるが、これらの理論的研究の推定的評価には限界がある。これらの領域の決定は、HoppとWoods（Proc.Natl.Acad.Sci.78、3824-3828、1981）による親水性度（hyolrophilicity）基準、及び、ChouとFasman（Advances in Enzymology 47、45-148、1987）による二次構造予測に基づいている。
本発明による好ましいペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２から６に示される推定配列のうちの少なくとも一つを含むペプチドである。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２−４に示される配列を有するペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドの断片であり、それぞれ、ＥＢＮＡ−１配列のアミノ酸  番号  ２６８−３９１、３９５−４２５、及び、４１９−４４９に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の配列の断片（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２−４）の組み合わせ物を含むペプチドである。
本発明に記載のペプチドもしくはその断片の調製は、ペプチド合成のための既知の有機化学的方法の内の一つを用いることにより、あるいは、組換えＤＮＡ技術を用いて実施することができる。
ペプチド合成のための有機化学的方法は、均一相において、あるいは、いわゆる固相を用いてのいずれかで、縮合反応により必要なアミノ酸をカップリングさせることを含むものと考えられる。
縮合反応は、以下に記載するように行うことができる。
ａ）遊離のカルボキシル基及び保護されている他の反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離のアミノ基及び保護されている他の反応基と有する化合物（アミノ酸、ペプチド）との、縮合試薬の存在下における縮合、
ｂ）活性化されているカルボキシル基及び遊離のもしくは保護されている他の反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離のアミノ基及び遊離のもしくは保護されている他の反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合。
カルボキシル基の活性化は、中でも、カルボキシル基を、酸ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾリド、あるいは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはｐ−ニトロフェニルエステルのような活性化エスチルに変換させることにより行うことができる。
上記縮合反応のための最も一般的な方法は、The Peptides、Analysis、Synthesis、Biology Vol.1-3（Ed.Gross、E.とMeienhofer、J.）1979、1980、1981（Academic Press、Inc.）において記載されているような、カルボジイミド法、アジド法、混合酸無水物法、及び、活性化エステルを使用する方法である。
「固相」を使用する、本発明に記載の、上述のペプチドの適切な断片の調製は、例えば、J.Amer.Chem.Soc.85、2149（1963）、及び、Int.J.Peptide Protein Res.35、161-214（1990）に記載されている。調製すべきペプチドのアミノ酸のカップリングは、通常、カルボキシル端側から開始する。この方法のためには固相が必要であり、この固相上に反応基が存在するか、あるいは、そのような反応基をこの固相上に導入することができる。これは、例えば、ベンゼンと反応性クロロメチル基を有するジビニルベンゼンのコポリマー、あるいは、ヒドロキシメチル官能基もしくはアミン官能基に対して反応するようになっているポリマー固相であることができる。
特に適切な固相は、例えば、Wang（1974年）によりJ.Am.Chem.Soc.95、1328に記載されているｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（４−ヒドロキシ−メチル−フェノキシ−メチル−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）である。合成後に、ペプチドを緩和な条件下においてこの固相から分断することができる。
所望のアミノ酸配列の合成後、例えば、トリフルオロ酢酸中に溶解させたトリフルオロメタンスルフォン酸もしくはメタンスルフォン酸を用いてペプチドを樹脂から切り離す。ペプチドは、低級アルコール、好ましくは、メタノールもしくはエタノールを用いるエステル交換反応により担体から取り外すこともでき、この場合、ペプチドの低級アルキルエステルが直接形成される。同様に、アンモニアによる分離の場合には、本発明に記載のペプチドのアミドが生じる。
縮合反応に関与しないと思われる反応基は、記載したように、酸、塩基、もしくは、還元による加水分解によって非常に容易に再度取り外すことができる基により、効果的に保護される。従って、カルボキシル基は、例えば、メタノール、エタノール、第３級ブタノール、ベンジルアルコール、もしくは、ｐ−ニトロベンジルアルコールを用いるエステル化、及び、固体支持体に結合しているアミンにより効果的に保護することができる。
効果的にアミノ基を保護することができる基は、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）、もしくは、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、あるいは、ベンゼンスルフォニルもしくはｐ−トルエンスルフォニル基のようなスルフォン酸から誘導される酸性基であるが、他の基も使用することができ、それらは、例えば、ベンジル及びトリフェニルメチルのような置換されたもしくは置換されていないアリールもしくはアラルキル基、あるいは、オルト−ニトロフェニルスルフェニル及び２−ベンゾイル−１−メチルビニルのような基である。特に適切なα−アミノ保護基は、例えば、塩基感受性の９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である［Carpino & Han（1970）J.Amer.Chem.Soc.92、５７４８］。
可能な保護基についての広範囲な記述は、The Peptides、Analysis、Synthesis、Biology、Vol.1-9（Eds.Gross、UdenfriendとMeienhofer）1979-1987（AcademicPress、Inc.）に見い出すことができる。
リシンのε−アミノ基を保護することも必要であり、更に、アルギニンのグアニジン基も保護することを勧める。この関係で習慣的に用いる保護基は、リシンについてはＢｏｃ−基であり、アルギニンについてはＰｍｃ−もしくはＰｍｓ−もしくはＭｂｓ−基、あるいは、Ｍｔｒ−基である。
保護基は、特定の基の性質によって異なるが、例えば、トリフルオロ酢酸の助けを借りたり、あるいは、例えば水素及びパラジウムのような触媒を用いる、あるいは、氷酢酸中のＨＢｒを用いる緩和な還元によるような、様々な慣用法により脱離させることができる。
既に前述したように、本発明に記載のペプチドは組換えＤＮＡ技術を用いて同様に調製することができる。この可能性は、特に、ペプチドが反復配列（「縦列している（in tandem）」）内に取り込まれる場合、あるいは、ペプチドを、（より大きな）蛋白質もしくはポリペプチドの構成成分として、又は、例えば、β−ガラクトシダーゼ（の一部分）との融合蛋白質として調製することができる場合には重要なものである。従って、この種のペプチドは同様に本発明の範囲内に含まれる。この目的のためには、組換えＤＮＡの構成成分として核酸配列を使用するが、その核酸配列は、本発明に記載のペプチドをコードする配列、及び、天然ＥＢＶゲノム中において先に示した核酸配列をフランク（flank）する核酸セグメントを実質的に含まない配列である。
この後述の方法には、宿主としての適切な微生物内において、問題のペプチドの一つもしくは複数をコードする核酸配列を有する組換えポリヌクレオチドを発現させることによる所望のペプチドの調製法が含まれる。
本発明のペプチドをコードする核酸配列を、天然においては会合したり結合したりしていない様々の複製可能なＤＮＡ配列と連結させることができ、その結果、適切な宿主の形質転換のために用いることができるいわゆる組換えベクター分子が生じる。有用な組換えベクター分子は、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、あるいは、ウイルスに由来するものであることが好ましい。
核酸配列をクローン化するのに使用することができる特別なベクターもしくはクローニング用ベヒクルは当業者に知られるものであり、かつ、中でも、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドベクター、様々なｐＵＣ、ｐＧＥＭ、及び、ブルースクリプト（Bluescript）プラスミド、例えばｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ  ２８のようなバクテリオファージ、及び、Ｍ１３由来のファージ、あるいは、ＳＶ４０、アデノウイルス、もしくはポリオーマウイルスのようなウイルス性ベクターを含む（Rodriques、R.L.とD.T.Denhardt,ed.、Vectors:Asurvey of molecular cloning vectors and their uses、Butterworths、1988;Lenstra、J.A.et al.、Arch.Virol.110、1-24、1990）。組換えベクター分子の構築のために使用すべき方法は当業者に知られているものであり、かつ、これらは中でも、Maniatis、T.ら（Molecular Cloning A Laboratory Manual、second edition;Cold Spring Harbor Laboratory、1989）において説明されている。
例えば、本発明のペプチドをコードする核酸配列のクローニングベクター内への挿入は、遺伝子及び所望のクローニング用ベヒクルの両方が、相補的なＤＮＡ末端が産生されるような同一の制限酵素で切断された場合に簡単に実施することができる。
組換えベクター分子は、所望の形質転換体を選択するのに使用することができるｐＢＲ３２２内におけるアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のようなマーカー活性の一つもしくは複数を追加的に含むことができ、その例は、ｐＵＣ８内におけるアンピシリン耐性及びβ−ガラクシトダーゼのα−ペプチドである。
当然のことながら、クローニングベクターの選択された部位に挿入されるヌクレオチド配列は、形質転換した宿主が少なくとも一つもしくは複数の免疫原決定基を有するポリペプチドを産生する限り、本発明のペプチドをコードする完全な核酸配列の断片のみを含んでいてもよいということが理解できるはずである。
本発明に記載のペプチドに対する抗体も、本発明の一部分である。
調製しかつ上記したペプチドもしくはその断片は、ポリクローナル及びモノクローナルの両抗体を産生するのに使用することができる。本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体は、当業者により簡単に作製できる。
本発明の以前には、ＥＢＮＡ−１なるこの特定のペプチド断片に対して作製された抗体についての報告はなかった。この時まで当業者の誰もが、抗体に結合するエピトープの入手可能性を知らなかったのである。
従って、本発明に記載のモノクローナル抗体は、ＥＢＶ感染の診断のための新しい手段を提供する。
本発明に記載の好ましい抗体は、受託番号92071613として、Porton Down（英国）のEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託してあるハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体と同一の、ＥＢＮＡ−１に対する反応性を有するモノクローナル抗体である。
本発明の新規（モノクローナル）抗体はＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘと表示されるが、これは、Ｇｌｙ−Ａｌａ反復領域を欠損しているバキュロウイルス由来のＥＢＮＡ−１蛋白質でマウスを免疫化することにより作製した。大腸菌内で発現されるＥＢＮＡ−１からの欠損断片を使用することにより、ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘの結合性エピトープが、推定上の核局在シグナル（nuclear localization signal）の近くの位置４３０−４３８内に位置することを突き止めた（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６に示されている推定配列）。
ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘを免疫沈降研究に使用した。ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘはまた、ウエスタンブロット研究及び間接的検出技術を使用する固定した透過処置済み細胞上での蛍光抗体法（ＦＡＣＳ）において使用する際には変成させたＥＢＮＡ−１に対しても結合し、更に、広範囲のウイルス株及びウイルス感染した標的細胞からのＥＢＮＡ−１とも反応する。ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘは多様なＥＢＶ−単離物からのＥＢＮＡ−１に対して結合し、更に、様々なヒトの腫瘍組織における免疫組織化学的染色法に使用することができる。
本発明のモノクローナル抗体を分泌することが可能な、不死化細胞系も、本発明の一部分である。
モノクローナル抗体を産生する細胞系の調製は、例えば、KohlerとMilstein技術（KohlerとMilsteinはモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成する技術を考案した（G.KohlerとC.Milstein、1975、Nature 256:495-497;1976、Eur.J.Immunol.6:511-519））、エプスタイン−バールウイルスを用いる形質転換、あるいは、発癌性ＤＮＡを用いるＢリンパ球の直接的形質転換技術、あるいは、ヒトもしくはマウス−ヒトのハイブリッド型骨髄腫細胞系のいずれかである融合相手を用いるヒトＢリンパ球の直接的融合、あるいは、当該骨髄腫細胞系を使用するＥＢＶ−形質転換済みＢ細胞系の直接的融合により実施することができる。
本発明に記載の好ましい細胞系は、受託番号92071613として、Porton Down（英国）のEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託してある細胞系である。
このハイブリドーマ細胞系は、本発明に記載のＥＢＮＡ−１ペプチドを使用して予め接種してあるマウスに由来するリンパ球と骨髄腫細胞を融合させることにより作製した。（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５に示されているアミノ酸配列を有するペプチド）
本発明は更に、検査液もしくは組織検体中に含まれる全長蛋白質を検出するための免疫学的方法及び生化学的方法への、当該ペプチドに対する抗体の使用を含む。
現在までのところ、ＥＢＶ感染細胞中におけるＥＢＮＡ−１の検出は、抗ＥＢＮＡ−１抗体源としてヒト血清を使用する抗補体蛍光抗体法（ＡＣＩＦ）を使用することにより実施されていた。間接的蛍光抗体技術では、ヒト血清中のＥＢＮＡ−１結合抗体を検出することができなかった。ＡＣＩＦは、余分な補体−インキュベーション段階、及び、補体自体の不安定性により複雑なものになっている。更に、ＡＣＩＦ用に使用される試薬が正しく用いられていない場合には、偽陽性及び偽陰性を示す反応が頻繁に出現する。
一方では、ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘ抗体はこれらの問題を排除し、かつ、間接的蛍光抗体法により様々なＥＢＶ感染細胞内のＥＢＮＡ−１の高感度検出を可能にする。
インビボ及びインビトロの両方において細胞核内にＥＢＮＡ−１が存在するということは、細胞内に潜伏性ＥＢＶ−感染の特質（hallmark）があることの証拠となる。
ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘは細胞内に浸入していくことが可能であり、そのため、ＥＢＶ感染細胞内におけるＥＢＮＡ−１の細胞内における検出を可能にする。ＥＢＶ．ＯＴ１ｘ抗体は、Slaper-Cortenbachら（Blood、72、1639-1644、1988）により記載されているように、緩衝化させたフォルマリン−アセトン（ＢＦＡ）固定により透過処理したＥＢＶ感染細胞内における核染色の蛍光活性化細胞用選別機（ＦＡＣＳ）分析に適用することができる。この方法は簡便で迅速であるという利点を有し、かつ、インビトロにおいて培養したＥＢＶ感染Ｂ−リンパ球の検出を可能にする。この技術はまた、ＥＢＶ関連性リンパ球増殖性疾患及びリンパ腫の検出及びモニタリングにも適用することもできる。
本発明に記載のペプチドに対するモノクローナル及びポリクローナルの両抗体は、診断、及び、組織検体中におけるその場（in situ）の検出のための免疫化学的手法に非常に適している一方で、中和を行うこれらの抗体は、受動免疫療法に非常に有用である。
本発明に記載の抗体はまた、異なるＥＢＶ単離物のＥＢＮＯタイピング（種類分け）にも有用である。前に記述したように、ＥＢＶ単離物（株）は、産生されるＥＢＮＡ−１分子の分子量により特徴付けることができるが、その理由は、この蛋白質内のグリシン−アラニン反復領域の長さが広範囲にわたって異なるためである。先述した試薬は主にヒト血清であったがこれとは異なり、ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘモノクローナル抗体は安定かつ再現性の得られる試薬であり、ＥＢＶファミリー内において高度に保存されている結合性エピトープを検出するため、これは、ＥＢＶ株のＥＢＮＯ−タイピングに非常に適している。
本発明の一部分はまた、問題のモノクローナル抗体の「人体適用性（humanizing）」でもある。「人体適用化（humanized）」されたモノクローナル抗体の産生のための技術は当業者に知られている。
特に、モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を作成するのに使用することができる。抗イディオタイプ抗体を作成するための技術は当業者に知られている。
本発明に記載のモノクローナル抗体と反応する抗イディオタイプ抗体は先に記載したように本発明の一部分である。
抗イディオタイプ抗体は免疫グロブリンの可変部に対する抗体である。抗イディオタイプ抗体の亜集団は、「抗イディオタイプβ」、もしくは、「内部像（interhal images）」として知られている。これらの抗イディオタイプβ抗体は、抗原との構造的類似性もしくは３次元的類似性のいずれかを有する（Uytdehaag、F.G.C.M.et al.Immunol.Rev.;90;93-113;1986）。この種類の抗イディオタイプ抗体は、動物モデルにおける感染性疾患に対するワクチンとして広く用いられている（Hiernaux J.R.;Infect.Immun.;56;1407-1413;1988、Kennedy、R.C.et al.;Science 232;220-223;1986）。アッセイへの使用のために抗イディオタイプ抗体を大量に作成することができる。
抗イディオタイプ抗体を作成する技術は当業者に知られている。例えば、本発明に記載の抗イディオタイプ抗体は、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、標準的な文献による方法に従いグルタルアルデヒドを用いてＫＬＨに対して結合させフロインドの完全アジュバントと混合したモノクローナル抗体で免疫することにより取得することができる。これらのマウスの脾臓細胞を不死化させることができ、更に、このようにして取得されたハイブリドーマを抗イディオタイプ抗体産生についてスクリーニングすることができる。ハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、本発明に記載のモノクローナル抗体を固相（マイクロタイタープレートのウエル）に対して結合させ、増殖しているハイブリドーマの培養上清と一緒にこの固相をインキュベートすることにより実施することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたＥＢＶペプチドを添加することができる。培養上清中に含まれる抗イディオタイプ抗体の存在は、その後、固相上にコートされたモノクローナル抗体に対するこのペプチド結合体の結合の阻害により示される。
抗イディオタイプ抗体は、例えば、ＥＢＶ抗体を使用する免疫アッセイにおけるヒト及び／または動物のＥＢＶ抗原の結合の阻害に使用することができる。別の方法では、抗イディオタイプ抗体を、本明細書中でこれ以降に記載される免疫化学的試薬の模擬的薬剤として使用することができる。
前記抗イディオタイプ抗体はまた、ＥＢＶの診断及び治療、並びに、ＥＢＶ抗原の重要なエピトープ領域の解明のためにも有用である。
本発明に記載の一つもしくは複数のペプチドもしくは抗体を含む免疫化学的試薬も本発明の一部分である。
本発明に記載の用語「免疫化学的試薬」は、通常は、一つもしくは複数の本発明に記載のペプチド、及び、適切な支持体もしくはラベル化用物質からなる。
使用することができる支持体は、例えば、マイクロテスト用ウエルもしくはキュベットの内部壁、チューブもしくは毛細管、膜、フィルター、検査用細片、あるいは、例えば、ラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、ゾル粒子としての金属ゾルもしくは金属化合物、ＢＳＡもしくはＫＬＨのような担体蛋白質のような粒子の表面である。
使用することができるラベル化用物質は、中でも、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、染料ゾル、ゾル粒子としての金属ゾルもしくは金属化合物である。
試料中に含まれるＥＢＶに対する抗体の検出のための方法においては、本発明に記載の免疫化学的試薬を試料と接触させる。この後、ペプチドと試料中に含まれる抗体との間に形成される免疫複合体の存在が検出され、この検出により、試料中に含まれるＥＢＶ抗体の存在が明らかになり、かつ、定量的な測定を行うことができる。
生じる免疫化学反応は免疫化学的試薬の性質及び更に詳しい特徴によって異なり、いわゆるサンドイッチ反応、凝集反応、競合反応、あるいは、阻害反応である。
試料中に含まれるＥＢＶの検出のためには、一つもしくは複数の本発明に記載のペプチドを含む本発明に記載の免疫化学的試薬を試料及び抗ＥＢＶ抗体に接触させることができ、この後、形成される免疫複合体の存在を検出することができ、それにより、試料中に含まれるＥＢＶの存在を決定することができる。
試料中に含まれるＥＢＶの検出に特に適切な方法は、ラベル化用物質と共に提供される本発明のペプチドとＥＢＶ抗原（試料中に存在する）との間の競合反応に基づいており、この反応により、ペプチドと抗原は固体支持体に結合してあるＥＢＶに対する抗体と競合するのである。
本発明は更に、本発明に記載の抗体を試料に接触させ、その後、形成される免疫複合体の存在を検出し、それが、試料中に含まれるエプスタイン−バールウイルスの存在についての測定値になるという特性を有する、試料中に含まれるエプスタイン−バールウイルスの検出のための方法も含む。
本発明に記載の検査用キットは、主要な構成成分として上述の免疫化学的試薬を含む。サンドイッチ反応を行ってＥＢＶ抗体を検出するためには、その検査用キットは、例えば、固体支持体（一例としてはマイクロテスト用ウエルの内部壁）にコートされている本発明に記載のペプチド、及び、本発明に記載のラベル化ペプチドもしくはラベル化抗−抗体のいずれかを含むことができる。
競合反応を行うためには、キットは、固体支持体にコートされいる本発明に記載のペプチド、及び、ＥＢＶに対するラベル化抗体、好ましくは当該ペプチドに対するラベル化モノクローナル抗体を含むことができる。
凝集反応においては、検査用キットは、粒子もしくはゾルにコートされている本発明に記載のペプチドを含むことができる免疫化学的試薬を含む。
検査用キットの他の実施態様は、例えば、固体支持体にコートされている、ＥＢＶに対する抗体上の結合部位について検出されるべきＥＢＶ抗原との競合反応への、免疫化学的試薬としての本発明に記載のラベル化ペプチドの使用である。
【図面の簡単な説明】
図１：ヒト血清を使用したペプスキャン分析の結果。Ｘ軸上にＥＢＮＡ−１配列上の個々の各１２ｍｅｒペプチドの相対的開始位置を示し、例えば、“０”はＡＡ３４８で開始する１２ｍｅｒペプチドを表わす等々である。Ｙ軸上には、４５０nmにおける相対的吸光度単位を示す。
ラインｎｏ．１は、各１２ｍｅｒペプチドに対するＥＢＶ陰性ヒト血清の免疫反応性を示す。
ラインｎｏ．２−６は、１２ｍｅｒペプチドに対するＥＢＶ陽性ヒト血清の免疫反応性を示す。
図２：ＥＢＮＡ−１蛋白質に由来する選択された合成ペプチドに対するＩｇＧ−反応性についての検査を行った４６個のヒト血清試料のＥＬＩＳＡ反応性（４５０nmにおける光学密度）。
△は、標準的な血清学的分析により陰性を示す血清を表す。
□は、標準的な血清学的分析により陽性を示す血清を表す。
ｘは、ＥＢＮＡ−１のみに対するイムノブロットにおいて陽性を示す血清を表す。
□、＊は、イムノブロットでは抗ＥＢＮＡ−１抗体を検出できないが、他の方法（例えば、抗ＶＣＡ抗体）ではＥＢＶ−血清陽性を示す。
Ａ＝ペプチド３４８−３６９
Ｂ＝ペプチド３６８−３８７
Ｃ＝ペプチド３９４−４２０
Ｄ＝ペプチド４２４−４５２
Ｅ＝ペプチドＧｌｙ−Ａｌａ
Ｆ＝コンビ（combi）−ペプチド
Ｇ＝ＥＢＮＡ−１  Ｂａｃｕｌｏ
図３：マウスモノクローナル抗体及びウサギ血清を使用するＰＥＰＳＣＡＮ（ペプスキャン）分析の結果。Ｘ−軸上に示されるのはＥＢＮＡ−１配列上の個々の各１２ｍｅｒペプチドの相対的開始位置であり、例えば、「０」はＡＡ３４８で開始する１２ｍｅｒペプチドを示す等々という具合である。Ｙ−軸上に示されるのは４５０nmにおける相対的吸光度単位である。
ライン１は、陰性対照として使用した、ＥＢＮＡ−１由来ペプチドに対する抗ＥＢＶ  ＶＣＡ  ｐ４０モノクローナル抗体（ＥＢＶ．ＯＴ４１Ａ）の反応性を表す。
ライン２−４は、異なる濃度（各々、５μg/ml、１０ng/ml、及び、１ng/ml）における抗ＥＢＮＡ−１マウスモノクローナル抗体ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘの反応性を表す。
ライン５は、免疫していないウサギ血清の反応性を表す。
ライン６は、組換えＥＢＮＡ−１で免疫したウサギ血清の反応性を表す。
図４：ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘモノクローナル抗体を使用した、ＥＢＶ−感染細胞中におけるＥＢＮＡ−１の検出についての間接的蛍光抗体法。Ａ：ＥＢＶに潜伏的に感染しているＸ５０−７細胞。Ｂ：ＥＢＶ陰性ＢＪＡＢ細胞と１：１で混合した、ＥＢＶ発現のために誘導化させたＨＨ５１４．ｃ１６細胞。
図５：様々なリンパ細胞及び細胞系における核内ＥＢＮＡ−１染色のＦＡＣＳ分析：
Ａ：ＥＢＶ陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞の分析、
Ｂ：ＥＢＶ陽性ヒトバーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ）の分析、
Ｃ：ＥＢＶ血清陰性ドナーからの末梢血リンパ球の分析、
Ｄ：ポリクローナルＥＢＶ形質転換ヒトＢ−リンパ球の分析、
Ｅ及びＦ：樹立されたクローン化Ｂ−細胞（ＥＢＶ−陽性）の分析。
Ｙ−軸は計数した細胞数を表し、一方でＸ−軸は細胞あたりの蛍光強度を表す。
各グラフ中の点線は、対照抗体（抗ＨＩＶ−ｐ２４）を表す。
図６：
Ａ：モノクローナル抗体ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘを使用した、異なるＥＢＶ株のＥＢＮＯタイピングの結果。
Ｂ：ヒト血清を使用した、異なるＥＢＶ株のＥＢＮＯタイピングの結果。
１＝ＢＪＡＢ
２＝ＣＲ＋Ｂ９５．８
３＝ＣＲ＋ＱＩＭＲ−ＷＩＬ
４＝ＰＢ−ＬＣＬ
５＝ＣＲ＋ＢＬ７２
６＝ＣＲ＋Ｍｗｉｋａ
７＝ＣＲ＋ＡＧ８７６
８＝ＣＲ＋Ａｍｂｏｂｉ
９＝ＣＲ＋ＷＷ１
１０＝ＣＲ＋ＷＷ２
本発明を、以下に示す実施例により更に詳しく説明する。
実施例１：
ＰＥＰＳＣＡＮによる免疫反応性ドメインの位置決定
１２アミノ酸（ＡＡ）の長さを有するペプチド、及び、ＯＲＦ  ＢＫＲＦ１のＡＡ配列の１１ＡＡの重複部分、位置３４８−４７０を、Geijsenら（P.N.A.S.、USA、83、3998-4002、1984）により元来記載されているように、化学的に活性化させたポリエチレン製のピン上に自動固相ペプチド合成により合成した。
ＥＢＶ特異抗体についての免疫反応性を、MiddeldorpとMeloen（J.Virol.Meth.21、147-159、1988）により記載されているように決定した。６個の各ヒト血清についてのこのようなＰＥＰＳＣＡＮ分析の結果を図１に示す。
この図から、反応性領域は、１２ｍｅｒペプチドではＡＡ２０−３１、４３−６５、７４−８５、及び、９０−９８で開始することが明らかになり、これは、各々、ＥＢＮＡ−１配列上のＡＡ３７２−３８１、３９１−４１３、４２２−４３３、及び、４３８−４４６を表す。類似した反応性が、追加的に一連のヒト血清を使用した場合にも明らかになった。図１中のラインｎｏ．１により示されるように、ＥＢＶ−血清陰性血清を使用した際には顕著な反応は見られなかった。
実施例２：
免疫反応性合成ペプチドの選択
コンピューター分析による、ＢＫＲＦ1によってコードされるＥＢＮＡ−１蛋白質に由来する合成ペプチドの選択、及び、これらのペプチドの、正常ヒトドナー血清との免疫反応性の分析を以下に要約する。
合成ペプチドは、ｔ−ＢＯＣ化学的手法を使用する標準的固相合成により作成した。ＢＫＲＦ1によってコードされるＥＢＮＡ−１蛋白質のＡＡ３４８−４７０断片からのペプチドを、JamesonとWolf（CABIOS 4、181-186、1988）により開発されたコンピュータープログラム「ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ」を使用する推定される高抗原性に基づくか［これに基づきペプチド３４８−３６９及び３６８−３８７が選択された］、あるいは、実施例１に記載したようにＰＥＰＳＣＡＮにおける機能的高抗原反応性に基づくか［これに基づきペプチド３９４−４２０及び４２４−４５２が選択された］、のいずれかにより選択した。
更に、ＰＥＰＳＣＡＮにより同定された４つの最も反応性の高いドメイン（図１のＢ−Ｅ）の組み合わせ物を示すコンビ−ペプチドを作成した。このコンビ−ペプチドをSEQ ID. No:5に示す。
対照用には、A.Lindeら（J.Infect.Dis．、161、903-910、1990）により記載されているように、Ｐ１０７グリシン−アラニンコポリマーペプチドを使用した。このペプチドは、ＥＢＮＡ−１蛋白質について以前に公表された免疫反応性ドメインを示す。更に、グリシン−アラニンドメインを除くＥＢＮＡ−１配列の全長を含む、ＥＢＮＡ−１蛋白質の組換え形を使用した。この組換え蛋白質を、FrappierとO′Donnell（J.Bioi.Chem.、266、7819-7826、1991）により記載されているように、組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞から精製した。
上述のペプチド及び蛋白質を、固相つまりポリスチレン製のマイクロタイタープレートの壁上に、４℃において一晩という条件及びpH９．６の０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ3緩衝液中、１mlあたり１μｇという濃度でコートした。pH７．４のリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄した後、このウエルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で１：１００に希釈した１００μlのヒト血清で満たし、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３度洗浄した後、ＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体を、ＰＢＳＴ中で適切に希釈して添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３度洗浄した後、結合した酵素活性を、基質としてＴＭＢを用いて検出した。反応は、３０分してから１００μlの１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加することにより停止させた。吸光度は、マルチスキャン光度計を使用して４５０nmにおいて測定した。血清は、標準的な免疫蛍光血清学的方法、あるいは、MiddeldorpとHerbrink（J.Virol.Meth.、21、133-146、1988）により記載されているイムノブロット分析法を使用してＥＢＶ抗体の存在について検査した。
図２は、固相にコートされている各々のＥＢＮＡ−１試薬、及び、３６種のＥＢＶ−血清学的陽性血清（□）と１０種のＥＢＶ−血清学的陰性血清（△）からなるパネルを使用したＥＬＩＳＡ実験の結果を示している。この図から、イムノブロットによって検出されるＥＢＮＡ−１に対する抗体を含まない血清は、コンビ−ペプチド及びバキュロウイルス誘導のＥＢＮＡ−１蛋白質を除く全てのＥＢＮＡ由来ペプチドに関して陰性を示したことを理解することができる。
上述の実験から、「ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ」に基づくコンピューターによる推定は、自然に感染した個体からの血清に対する免疫原性に関しては推定価値を持たないことが明らかであり、それは、かなり高い荷電状態にあるペプチド３４８−３６９及び３６８−３８７に対してほぼ全ての血清は陰性であるためである。
ペプチド３９４−４２０（図１のドメインＢ＋Ｃの組み合わせ）及び４２４−４５２（ドメインＤ＋Ｅの組み合わせ）についてＰＥＰＳＣＡＮに基づいて選択されたペプチドは、血清の８０−９０％に対して良好な反応性を示す。驚くべきことに、コンビ−ペプチドは、検査したＥＢＶ−血清学的陽性血清の１００％に対して陽性の反応性を示す。ＥＢＶ血清学的陰性血清はコンビ−ペプチドに対しては反応性を示さないが、それに反し、このような血清の一つが、バキュロウイルス誘導ＥＢＮＡ−１蛋白質に対して偽陽性の反応性を示している。
実施例３：
マウスモノクローナル抗体を使用するＥＢＮＡ−１上の免疫反応性エピトープの位置決定
マウスモノクローナル抗体及びウサギ血清を用いる、ＥＢＮＡ−１断片３４８−４７０上の免疫反応性エピトープの位置決定について用いられる方法は、ヒト血清を用いるエピトープの位置決定のために、既に実施例１において記載してある。
ピンに結合しているペプチドに対するマウス抗体の結合はペルオキシダーゼでラベル化したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して測定し、一方、ウサギ抗体の結合はペルオキシダーゼでラベル化したヒツジ抗ウサギ抗体を使用して測定した。
結果を図３に示す。これらの結果より、ＥＢＮＡ蛋白質に対して特異的でないモノクローナル抗体（抗ＥＢＶ  ＶＣＡ−ｐ４０、あるいは、免疫していないウサギの血清）は、検査したＥＢＮＡ−１ペプチドのいずれのものとも反応しないことが理解できる。
マウスモノクローナルＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘは、高濃度で使用した際にＡＡ４２０−４４５におけるエピトープを認識するが、ＡＡ４３０−４３８におけるエピトープに対して抗体を希釈するとこの作用は減衰していく。バキュロウイルス誘導ＥＢＮＡ−１蛋白質で免疫することにより得られたウサギ血清１２１−３は、分析を行ったＥＢＮＡ−１領域内における３つのエピトープを認識する。
実施例４：
ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘを使用する、ＥＢＶ−感染細胞中のＥＢＮＡ−１の検出のための間接的蛍光抗体法
Ａ．  ＥＢＶに潜伏感染しているＸ５０−７細胞を１２ウエルのガラス製スライド板上に、アセトン−メタノール（１：１）で固定し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝塩水、pH７．４（ＰＢＳ）中の２μg/mlのＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘ抗体で、３７℃で１時間染色した。ＰＢＳで４度洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でラベル化したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈し、更に、３７℃において１時間インキュベートした。更にＰＢＳで４度洗浄した後、ＦＩＴＣでラベル化したヤギ抗ウサギ抗体を添加し、先と同様にインキュベートした。最後に、ＰＢＳで４度洗浄した後、このスライド板を固定液（５０％グリセロール、pH９．０）で被覆し、更に、カバーグラスで密閉した。
Ｂ：  ＥＢＶ−産生性細胞株Ｐ３ＨＲ１からの超誘導クローンであるＨＨ５１４．ｃ１６細胞を、ＴＰＡ及びブチレートを使用して、６日間、ＥＢＶ−発現に関して誘導化させ、これを、ＥＢＶ−陰性ＢＪＡＢ細胞と１：１で混合し、更に、１００％アセトンを使用して１２ウエスのガラス製スライド板上に固定した。ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘをＡにおいて記載したように添加し、ＰＢＳで４度洗浄した後、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ）−ＦＩＴＣ抗体を添加し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで適切に希釈し、更に、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで４度洗浄した後、このスライド板を固定液で被覆し、更に、カバーグラスで密閉した。
全てのインキュベーション（Ａ及びＢにおけるもの）は加湿型チェンバー内で行って試薬の蒸発を防いだ。蛍光染色は、Ｚｅｉｓｓ社のＡｘｉｏｓｃｏｐｅ蛍光顕微鏡（倍率４００×）を使用して可視化させた。
図４Ａ及び４Ｂにおいて示される結果は、感度を上昇させるために二重ＦＩＴＣ−染色技術を用いた場合では、パネルＡ中に示されるＸ５０−７細胞系について見い出されるような、
ＥＢＶに潜伏感染している細胞の１００％において特徴的な核ＥＢＮＡ染色パターンを示している。パネルＢにおける結果は、ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘによる染色の特異性を示しているが、それは、大部分の小さいＥＢＶ−陰性ＢＪＡＢ細胞が染色を全く示さないのに対して、大きいＥＢＶ−産生性細胞は、細胞の約５０％において強い核染色パターンを示すためである。
実施例５：
蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）分析
ＥＢＶ−陰性ヒトＴ−細胞（Ｊｕｒｋａｔ）、ＥＢＶ−陽性ヒト・バーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ）、ポリクローナルＥＢＶ−形質転換ヒトＢ−リンパ球、樹立型クローン化Ｂ−細胞系、あるいは、ＥＢＶ−血清学的陰性ドナーからの末梢血リンパ球をＢＦＡ−法に従って固定し、更に、４℃において、２×１０6／mlの細胞濃度で、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中のＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘ（１μg/ml）と共にインキュベートした。ＰＢＳで３度洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ−ＢＳＡで適切に希釈したＦＩＴＣでラベル化したヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆ（ａｂ）2抗体と共にインキュベートした。再度洗浄段階を行った後、１０4個の細胞を流動血球計数器（ＦＡＣＳＣＡＮ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用して分析した。陰性対照として、各実験を、無関係なモノクローナル抗体（抗ＨＩＶ−ｐ２４抗体、ＩｇＧ）との同一細胞の独立したインキュベーションも並行して行った。
上述の実験の結果を図５Ａ−Ｆに示す。各グラフ中の点線は対照モノクローナル抗体を表す一方、実線は、ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘモノクローナル抗体について得られた結果を示している。これらの実験から、Slaper-Cortenbachら（Blooｄ、72、1639-1644、1988）により記載されている固定法としてＢＦＡを用いた場合に、ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘは細胞内に浸透して行くことが可能であり、このため、ＥＢＶ−感染細胞における細胞内のＥＢＮＡ−１検出が可能となるという結論を得ることができた。
実施例６：
イムノブロット染色及びＥＢＮＯタイピング
イムノブロット染色の手法による変成させたＥＢＮＡ−１の検出、及び、本発明に記載のＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘ抗体を使用する異なるＥＢＶ単離物のＥＢＮＯ−タイピングへのその応用を、以下に説明する。
図６においては、世界中の異なる地理的領域から取得したＢ−細胞系中に存在する様々な異なるＥＢＶ株を使用する分析の例を示してある。
図６Ａ及び６Ｂの各ラインにおいては、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で沸騰させることにより変成させた、５×１０4個のＥＢＶ−感染細胞もしくは対照（ＢＪＡＢ）細胞の試料を、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びニトロセルロースに対するブロッティングに供した。
パネルＡ（図６Ａ）はＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘモノクローナル抗体を使用するＥＢＮＡ−染色を示す一方、パネルＢは、ＥＢＮＡ−１染色について単一特異性を示すヒト血清を使用した同一分析（つまり、余計なＥＢＮＡ分子とは反応しない）を示す。強度は異なるものの、両試薬についての染色パターンは同一であり、個々のＥＢＶ−単離物間に分子量の違いがあることを示している。ＢＪＡＢは、ＥＢＶ−陰性細胞系抽出物を表す。
これらの実験から、ＥＢＮＡ．ＯＴ１ｘは複数のＥＢＶ−株と反応し、かつ、ＥＢＮＯ−タイピングにおける試薬として使用することができるということが結論付けられる。
配列表
（１）一般的情報
（i）出願人
（A）名称：Ａｋｚｏ  Ｎ．Ｖ．
（B）通り名：Ｖｅｌｐｅｒｗｅｇ  ７６
（C）市名：Ａｒｎｈｅｍ
（E）国名：Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
（F）郵便番号（ZIP）：６８２４  ＢＭ
（ii）発明の名称：エプスタイン・バールウイルスのペプチド及びこれらのペプチドに対する抗体
（iii）配列の数：６
（iv）コンピュータ読み取り形態：
（A）媒体の型：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  互換性
（C）オペレーティングシステム：PC-DOS／MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.25（EPO）
（vi）先願データ：
（A）出願番号：ＥＰ  ９２２０２７９７．４
（B）出願日：１４−ＳＥＰ−１９９２
（２）配列番号：１の情報
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：１２３アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004155591.tif 000002
（２）配列番号：２の情報
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：２４アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004155591.tif 000003
（２）配列番号：３の情報
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：３１アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004155591.tif 000004
（２）配列番号：４の情報
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：３１アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004155591.tif 000005
（２）配列番号：５の情報
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：５８アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004155591.tif 000006
（２）配列番号：６の情報
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：１２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004155591.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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