(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm/kg・H2O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H2O より高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒト血液試料中のヒトメダラシンを定量することを特徴とする血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
【請求項２】
ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm/kg・H2O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H2O より高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシン抗体及び標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標識を定量することにより、ヒト血液試料中のヒトメダラシンを定量することを特徴とする血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
【請求項３】
前記抗ヒトメダラシン抗体の少なくとも一つが抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体である請求項１又は２に記載のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
【請求項４】
前記水性液体が、水混和性有機溶媒を含んでいてもよい精製水及び／又は緩衝液である請求項１又は２に記載のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中のヒトメダラシンを正確に測定するための血液試料の前処理を含むヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼの一種であるメダラシンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じていると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性疾患の増悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性硬化症の患者では増悪する数日前に著増し、寛解に先行して正常化することが認められている。多発性硬化症は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシスの出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行し、多くは、10〜15年の経過で死亡すると云う慢性炎症性の難病であり、原因については、未だ、はっきりとは解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺激して抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の一種ではないかと考えられている。また、その診断法はなかなか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によって行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、経費もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把握、予後の推定等が行なえる方法の開発が検討され、血液中の顆粒球メダラシン活性の測定方法が研究され、簡便に測定できるメダラシンの免疫学的測定方法の開発が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヒトメダラシンの免疫学的測定方法において、血液試料を水性媒体で稀釈して測定する際に、顆粒球中に存在するメダラシンを完全に顆粒球の外に放出させるような処理を施すことなく測定を行うとその測定値の再現性が必ずしも良くなく、測定値にばらつきを生じる現象が認められた。従って、血液中のヒトメダラシンを免疫学的に再現性良く定量する測定方法の開発が望まれていたが、本発明は上記事情に鑑みなされたもので、ヒト血液試料に特定の前処理を施すことを含むヒト血液中のヒトメダラシンを再現性良く正確に測定できる免疫学的測定方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ヒト血液試料をヒト血液の浸透圧と異なる特定の浸透圧を有する水性液体で血液を処理して白血球を完全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラシンを免疫学的に測定することにより、血液中のヒトメダラシンを再現性良く正確に測定できることを見い出し、これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものである。
【０００５】
従って、本発明の第一は、ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm/kg・H2O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H2O より高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒト血液試料中のヒトメダラシンを定量することを特徴とする血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
【０００６】
また、本発明の第二は、ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm/kg・H2O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H2O より高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシン抗体及び標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標識を定量することを特徴とする血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
更に、本発明によれば、抗ヒトメダラシン抗体の少なくとも一つが抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体である血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法を提供することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明において測定されるべきヒト血液試料中のヒトメダラシンの大部分は、血液中に存在する白血球成分の一つである顆粒球の内部に存在しているので、顆粒球を完全に破壊してヒトメダラシンを全て細胞外に放出させてから測定することが正確な測定値を得るための必須要件である。従って、この必須要件が完全に満たされない場合には測定値はバラツキが大きく、再現性の乏しいデータしか得られない。
【０００８】
血液試料中の顆粒球を完全に破壊する方法としては、機械的方法、超音波による方法、凍結融解を繰り返す方法、及び浸透圧の異なる水性液体で処理する方法等が考えられるが、血液と異なる浸透圧を有する水性液体で処理する方法が最も簡便で実用的である。ヒト血液の浸透圧は約 280〜290mOsm/kg・H2Oの範囲にあるので、 250〜310mOsm/kg・H2Oの範囲の水性液体では血液中に存在する顆粒球を完全に破壊することは難しい。従って、ヒト血液中の顆粒球の完全な破壊は浸透圧が 250mOsm/kg・H2O より低い水性液体、又は 310mOsm/kg・H2O より高い水性液体で血液を稀釈することで達成することができる。このような水性液体としては、水混和性有機溶媒を含んでいてもよい精製水、無機酸塩、有機酸塩、糖類、糖アルコール類、アミノ酸類、及び蛋白質等の水溶性物質からなる溶質の濃度が非常に高い水溶液、又はこれらの溶質の濃度が非常に低い水溶液等の水性液体であり、顆粒球を完全に破壊し得る浸透圧を有する水溶液及び緩衝液などを用いることができる。また、該水性液体の使用量は、血液試料に対して容積単位で50〜10万倍、好ましくは100〜1万倍、特に好ましくは500〜2千倍である。
【０００９】
このようにして得られた顆粒球を完全に破壊したヒト血液試料の水性稀釈液を試料とするヒトメダラシンの免疫学的測定方法は、測定試料を標識化した抗原又は抗体の存在下に抗ヒトメダラシン抗体と接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて測定する検出段階とからなる。免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方法は任意である。
【００１０】
例えば、
▲１▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原を捕捉させた後に標識抗体を反応させるサンドイッチ法、
▲２▼サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンドイッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第二抗体を反応させる二抗体法、
▲３▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる競合法、
▲４▼測定すべき抗原を含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離により免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法、更に、
▲５▼ビオチン標識抗体に標識アビジンを反応させるビオチン−アビジン法等
を非限定的に用いることができる。
【００１１】
本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において不溶性担体を用いる場合には、不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００１２】
尚、本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において用いられる抗体類のクラスは任意であるが、IgG クラスの抗体が好適に用いられる。また、抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であるが、モノクローナル抗体が好ましい。それらの形態としては全抗体又は F(ab')2、Fab 等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。
【００１３】
次に、このようにして捕捉されたヒトメダラシンの標識化免疫複合体を検出段階で測定するための標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが好適である。このような酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、フルオレッセインイソシアネート、フィコビリプロテイン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等、放射性物質としては、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、99mＴｃ等を非限定的に挙げることができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を用い、発色剤として2,2'−アジノジ[3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、 5−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン、 4−アミノアンチピリン、 3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン等、蛍光剤としては 4−ヒドロキシフェニル酢酸、 3−(4−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等、発光剤としてはルミノール類、ルシゲニン電荷移動錯体等、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、基質として 4−ニトロフェニルホスフェート、 4−メチルウムベリフェリルホスフェート、コルチゾール−21−ホスフェート等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、 2−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、 4−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、 3− (2'−スピロアダマンタン)− 4−メトキシ− 4(3''−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル)−1,2 −ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることができる。
【００１４】
本発明のヒトメダラシンの免疫学的方法において使用することができるポリクローナル抗体は、従来公知の方法でヒトメダラシンを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒトメダラシン抗血清の抗体成分として分離精製されたものが好ましい。なかでも例えば、山羊抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体、兎抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体等が好適に用いられる。また、本発明に使用することができるモノクローナル抗体及びその製造方法については、先に出願された特開平11−151085（発明の名称「抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法」）の特許出願明細書に詳細に説明されている。
【００１５】
即ち、本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において使用することのできる抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽出したヒトメダラシンで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造される。
【００１６】
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、抗原としてメダラシンを用いて免疫した動物から採取した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させることにより得られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、該ハイブリドーマから検索しクローニングにより製造することができる。
【００１７】
上記の抗体産生細胞としては、例えばヒトメダラシン又はこれを含有する組成物又は細胞を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に約１μｇ〜１ｍｇ／回を１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００１８】
細胞融合の方法は任意でり、限定されるものではないが、例えばダルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在で混合することにより行なうことができる。
細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択する。次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取する。モノクローナル抗体を大量に製造するには、該ハイブリドーマをミエローマ細胞の由来細胞と同種の動物腹腔内に投与し、その腹水中にモノクローナル抗体を蓄積させ、腹水から採取する方法を採ればよい。
【００２０】
培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離は、IgG 精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
このようにして得られた抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマの種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体は、いずれもグロブリンクラスはIgG で、サブクラスはIgG1であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダラシンと特異的に反応する。従って、上記抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法には有用である。
【００２１】
【実施例】
以下、参考例と共に、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等により限定されるものではない。尚、実施例中の％は重量％を意味する。
【００２２】
〔参考例１〕
精製ヒトメダラシンの調製
健常人血液 400mlに、デキストラン（分子量 200,000〜300,000)の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混ぜてから、 4〜8 ℃の温度で約１時間静置した後、沈殿した赤血球を上清と分離し、この上清を 15,000rpmで遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この白血球に1mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、1mM ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）を含むpH7.0 の1Mリン酸カリウム緩衝液（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、撹拌下に37℃の温度で20分間インキュベートした後、15秒間超音波破砕機にかけて完全に細胞を破砕した。更に、37℃の温度で20分間インキュベートしてから、 4℃の温度において 12,000rpmで10分間遠心分離して上清を採取し、この上清を蒸留水に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回繰り返して抽出を行なった。次いで、この抽出液を50mMＰＫＢ(pH6.0）で平衡化したＣＭ−セファロースゲルカラムに通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、1MPＫＢ(pH6.0）で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮することにより、精製ヒトメダラシン 1.5mgが得られた。
【００２３】
〔参考例２〕
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造
(1) 抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハイブリドーマの調製
参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、 7週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に50μg/匹の量で投与した。そして、 4週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追加免疫を行ない、 7日後に血中に抗体量が増大したことを確認した後、更に、その 7日後に最終免疫として抗原を腹腔に50μg/匹の量で投与した。一方、20％の牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地中で、マウスミエローマ細胞 P3-X63-Ag8-U1（Ｐ３Ｕ１）を維持培養しておき、最終免疫の 3日後、このマウスから脾臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコール4000を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させ、96穴マイクロプレートに撒いた。細胞融合後、培地を 100μM ヒポキサンチン、 0.4μM アミノプテリン、16μM チミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に置換して、 2〜3 週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細胞との融合体であるハイブリドーマが得られた。
【００２４】
(2) 抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマのスクリーニング
次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でスクリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ用のマイクロプレートに吸着させ、 pH7.4の10mMリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に 2％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なった後、ハイブリドーマ培養液50μl をこのマイクロプレートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山羊抗マウス IgG−Fc特異抗体の 2μg/mlＰＢＳ溶液 100μl を添加し、37℃で１時間反応させた。次いで、この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、0.05％ＡＢＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む0.1Mリン酸クエン酸緩衝液 (pH4.6)を 200μl 添加して発色させることにより抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選別した。
【００２５】
(3) 抗体産生株のクローニング及びモノクローナル抗体の調製
この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。このハイブリドーマを、それぞれプリスタン投与ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に50％飽和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰＢＳに溶解させ、3MNaCl含有50mMトリス−塩酸緩衝液 (pH7.8)に対して透析してから、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた後、吸着した抗体を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液 (pH5.0)で溶出し中和して精製することにより3F03、3GO3、2E04、及び1G12からなる 4種類のモノクローナル抗体を得た。
【００２６】
(4) モノクローナル抗体の性質〔ウェスタンブロッティング法〕
モノクローナル抗体に特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblotting ）法を用いて固定した。
先ず、ヒト顆粒球由来メダラシンをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに25mMグリシン、及び20％メタノールを含む溶液を用い、電圧傾斜が 7V/cm、 2時間の条件でスラブゲルから蛋白をニトロセルロースシートへ移した。次に、ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し、一方のシートをアミドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。即ち、 2％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を加え、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識山羊抗マウス IgG−Fc特異抗体を加えて反応させ、洗浄してから、0.04％ 3,3'-ジアミノベンジジン、及び0.0034％過酸化水素を含むＰＢＳからなる基質溶液を加えて発色させることにより、 4種のマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識することが確認された。
【００２７】
〔インヒビション・アッセイ法〕
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対して、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼを反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法により、いずれの 2つの組み合わせにおいてもビオチン化抗体の反応量に変化がないことより、 4種のモノクローナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部位）を認識することが確認された。
【００２８】
〔実施例１〕
ヒトメダラシン測定用検量線の作成
(1) モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径 6mm）をよく洗浄してから、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）10μg/mlを含むＰＢＳ(pH7.4）溶液中に 4℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、 1％ＢＳＡ水溶液に 4℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られた。
【００２９】
(2) ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の調製
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）1.0mg/mlを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の 10mg/mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液 0.1mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.O) でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の1.0mg/mlのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の 10mg/mlの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、10mM酢酸緩衝液(pH4.5) でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約10倍に濃縮した。次に、これに0.1Mジチオスレイトールを含有する 0.1M 酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5) １mlを添加して、25℃の温度で30分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分が得られた。
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、 4℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ44（SEPRACOR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。
【００３０】
(3) ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免疫測定方法
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン（標準物質）0,1,10,100,200ng/ml の濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液50μl と 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液350 μl を加え37℃の温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、0.05％ＡＢＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む0.1Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.6) を 400μl ずつ各試験管内に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした後、反応停止剤として0.1Nシュウ酸水溶液を１mlずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示されるような濃度依存性の良い検量線が得られた。
【００３１】
〔実施例２〕
酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者の血液をそれぞれ採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取して精製水（浸透圧＝0mOsm/kg・H2O）2ml 中に加えボルテックスミキサーを用いて十分混合して検体溶液とした後、その10μl を試験管に添加し、これに 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(pH7.4)390μl を加えて希釈した。次に、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個を加え37℃の温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に 5回行った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度は、第１表に示すように非常に良好な再現性を示すことが確認された。
【００３２】
【表１】
0004037586.tif 000002
【００３３】
〔比較例１〕
酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者の血液をそれぞれ採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取しＰＢＳ（pH7.4)（浸透圧＝約290mOsm/kg・H2O）2ml 中に加えて均一に混合して検体溶液とした後、その10μl を試験管に添加し、これに 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(pH7.4)390μl を加えて希釈した。次に、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個を加え37℃の温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に 5回行った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度の測定値は第２表に示すように再現性が必ずしも良好とはいえないデータを示した。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
【発明の効果】
以上説明した本発明の構成により、ヒト血液試料中のヒトメダラシン量を再現性よく正確に測定することが可能となり、慢性炎症性疾患、特に多発性硬化症の血液診断等への利用の可能性が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】    実施例１記載の酵素免疫測定方法を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシン測定用の検量線である。
【図１】
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