(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉの化合物：
0004155599.tif 000040
ただし、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル基、ハロゲンまたは（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基を表し；
Ｒ3は、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは一般式  −ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸ［但し、ｎは０〜３の数であり、Ｘは水酸基または以下の親水性基：
0004155599.tif 000041
の一を表す］の必要であれば修飾されてもよいカルボキシル含有基、または一般式  −ＣＯＲ［但し、Ｒは（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルキル基を表す］のアシル基を表し；
Ｒ4は、水素原子、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは一般式  −ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸ［但し、ｎは０〜３の数であり、Ｘは水酸基または以下の親水性基：
0004155599.tif 000042
の一を表す］の必要であれば修飾されてもよいカルボキシル含有基を表し；
Ｒ3及びＲ4が結合する炭素原子とともに（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルケン環を形成してもよく；
Ｙ及びＺの一方はα−またはβ−連結糖残基、またはリン酸基またはカルボキシレート（Ｒ5ＣＯＯ−）基であり、この際、Ｒ5は（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基である、を表し、Ｙ及びＺの他方は水素原子を表す；
またはこれらの適当な塩または水和物。
【請求項２】
前記Ｙ及びＺの一方はβ−連結糖残基であり、前記β−連結糖残基はβ−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ−キシロース、β−Ｄ−グルクロン酸またはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンである、請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項３】
以下の１以上を独立に有する、または矛盾なく組み合わせた、請求の範囲第１項に記載の化合物：
Ｒ1が塩素または水素である；
Ｒ2が塩素または水素である；
Ｒ3が（Ｃ1−Ｃ4）アルキルまたはベンジルである；
Ｒ4が（Ｃ1−Ｃ4）アルキル；または、−ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸであり、この際、ｎは０〜３の数であり、およびＸは水酸基または以下の親水性基：
0004155599.tif 000043
の一を表す；
Ｒ3及びＲ4が結合する炭素原子とともに（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルケン環を形成する；
ＹまたはＺによって表される酵素により切断可能な基がα−またはβ−連結糖残基、またはリン酸基またはカルボキシレート（Ｒ5ＣＯＯ−）基であり、この際、Ｒ5は（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基を表す。
【請求項４】
前記ＹまたはＺによって表される酵素により切断可能な基がβ−連結糖残基であり、前記β−連結糖残基はβ−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ−キシロース、β−Ｄ−グルクロン酸またはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンである、請求の範囲第３項に記載の化合物。
【請求項５】
以下のいずれかである、請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の化合物：
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトシド
0004155599.tif 000044
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルコシド
0004155599.tif 000045
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルクロニド
0004155599.tif 000046
３−ベンジル−４−メチルエスクレチン−β−Ｄ−グルコシド
0004155599.tif 000047
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−Ｎ−アセチルーβ−グルコサミニド
0004155599.tif 000048
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−キシロシド
0004155599.tif 000049
３−ｎ−ブチル−４−メチルエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトシド
0004155599.tif 000050
３−ｎ−ブチル−４−メチルエスクレチン−β−Ｄ−グルコシド
0004155599.tif 000051
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−６（７）−リン酸
0004155599.tif 000052
【請求項６】
一般式ＩＩの必要であれば保護されてもよい化合物を６または７位で誘導体に変換し、
0004155599.tif 000053
その後、必要であれば一般式Ｉの化合物を一般式Ｉの他の化合物を形成するように変換することからなる、請求の範囲第１項に規定される一般式Ｉの化合物の調製方法：
ただし、一般式ＩＩ中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル基、ハロゲンまたは（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基を表し；
Ｒ3は、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは一般式  −ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸ［但し、ｎは０〜３の数であり、Ｘは水酸基または以下の親水性基：
0004155599.tif 000054
の一を表す］の必要であれば修飾されてもよいカルボキシル含有基、または一般式  −ＣＯＲ［但し、Ｒは（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルキル基を表す］のアシル基を表し；
Ｒ4は、水素原子、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは一般式  −ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸ［但し、ｎは０〜３の数であり、Ｘは水酸基または以下の親水性基：
0004155599.tif 000055
の一を表す］の必要であれば修飾されてもよいカルボキシル含有基を表し；
Ｒ3及びＲ4が結合する炭素原子とともに（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルケン環を形成してもよい。
【請求項７】
一般式Ｉの化合物を形成するための一般式ＩＩの化合物の誘導体への変換が配糖化、リン酸化及び／またはエステル化である、請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の一般式Ｉの化合物及び必要であれば微生物学的に許容できる希釈剤、賦形剤または基質からなる組成物。
【請求項９】
該基質が成長支持体である、請求の範囲第８項に記載の組成物。
【請求項１０】
該成長支持体が固体、半固体または液体である、請求の範囲第９項に記載の組成物。
【請求項１１】
該成長支持体が寒天である、請求の範囲第９項または第１０項に記載の組成物。
【請求項１２】
該成長支持体が一以上の必須栄養素、ミネラル、ビタミンおよび／または抗生物質をさらに含む、請求の範囲第９項から第１１項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
請求の範囲第８項から第１２項のいずれかに記載の組成物を含む培養皿。
【請求項１４】
以下の段階からなる、サンプルにおける微生物の検出および／または同定方法：
（ａ）サンプルから単離された微生物を請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の一般式Ｉの化合物を含む成長支持体上で成長させ、および
（ｂ）前記一般式Ｉの化合物の加水分解後に同定可能な着色または蛍光マーカーの放出を検出する。
【請求項１５】
該サンプルが生体試料、食用物質、水または他の飲用液である、請求の範囲第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
該生体試料が唾液、尿、血液、便、胃の内容物または生検サンプルである、請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の一般式Ｉの化合物を含む増殖培地および必要であれば培養皿からなるキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なエスクレチン誘導体および微生物の特異的な検出を目的とする基質としてのその用途に関するものである。
エスクレチンは、エスクリンの及びシコリイン（cichoriin）のアグリコンであり、これらの分子の加水分解によって得られる。エスクレチンは下記化学式を有する：
0004155599.tif 000002
エスクレチンの正式な化学名称は、６，７−ジヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンである（また、６，７−ジヒドロキシクマリンまたはシコリゲニン（cichorigenin）としても知られている）。
β−Ｄ−グルコシダーゼの存在は、長い間、微生物の同定に重要な診断マーカーとして見なされてきた。この酵素の検出に最も一般的に使用される基質は、天然に生じるグリコシドであるエスクリン（６，７−ジヒドロキシクマリン−６−グルコシドまたは６−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン）である。
0004155599.tif 000003
エスクリンの加水分解によって、β−Ｄ−グルコース及びエスクレチン（６，７−ジヒドロキシクマリン）が生成し、後者の化合物は鉄塩の存在下での茶色／黒複合体（brown/black complex）の形成によって検出される。この試験は初めはエンテロコッカスの同定に適用され、その後、他の属の同定に広範に適用されることが分かった（スワン，エージェー（Swan, A.J.）、クリニカル  パソロジー（Clinical Pathology）、７、１６０〜１６３（１９５４年）、トレペタ（Trepeta）ら、アントニー  バン  リーウェンヘック（Antonie van Leewenhoek）、５３、２７３〜２７７（１９８７年））。この基質の主な欠点は、寒天に含ませると、得られる形成された複合体が培地全体に広がることである（ジェームズ（James）ら、ズブル  バクト  ハイグ（Zbl. Bakt. Hyg.）、Ａ２６７、１８８〜１９３（１９８７年））。このことは、混合培養物内に存在するとβ−グルコシダーゼを産生するコロニーを識別することを困難にする。
合成基質はまた、加水分解時に色素産生または蛍光化合物を産生してβ−Ｄ−グルコシダーゼを検出するのに利用される（マナフィ（Manafi）ら、ミクロバイオル  レビューズ（Microbiol. Reviews）、５５、３３５〜３４８（１９９１年））。例えば、蛍光化合物である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド（4-methylumbelliferyl-β-D-glucoside）が、寒天培地に含ませると様々な欠点があるものの、広範に使用された。これらとしては、コロニーの認識が長波長の紫外線の存在下でのみ行われ、また、加水分解によって基質から放出されるグルコースが生物によって酸を産生するのに利用されることが挙げられる。これにより、低いｐＨでの分子の非解離形態の優勢により４−メチルウンベリフェロン（4-methylumbelliferone）によって製造される蛍光が減少する。加えて、放出されたウンベリフェロンは寒天に拡散しやすいため、標的となる酵素を産生する個々のコロニーを識別しにくくする。一般的に使用される他の基質としては、ニトロフェノールのβ−Ｄ−グルコシド誘導体が挙げられる（トレペタ（Trepeta）ら、アントニー  バン  リーウェンヘック（Antonie van Leewenhoek）、５３、２７３〜２７７（１９８７年））。しかしながら、広範な撹拌がまた、このような基質を固体培地中に含ませた際にかなりの限定因子である（マナフィ（Manafi）ら、ミクロバイオル  レビューズ（Microbiol. Reviews）、５５、３３５〜３４８（１９９１年））。
β−ガラクトシダーゼもまた、微生物の同定における重要な診断マーカーである。これは、恐らく、すべての微生物の酵素のうち、最も広く研究され、その存在は有益な分類マーカーとして長い間認められていた。これは、β−ガラクトシダーゼのアッセイが長年非ラクトース発酵種とゆっくりとした（slow）あるいは遅延した（late）ラクトース発酵槽との識別に使用されてきた細菌の科である腸内細菌科では特に真実である（ジェームズ，エーエル（James, A.L.）、イン  ケミカル  メソッズ  イン  プロカリオティック  システマティックス（In Chemical Methods in Prokaryotic Systematics）、４７１〜４９２、グッドフェロー  アンド  オー’ドネル（Goddfellow and O’Donnell）著、ウィレイ  アンド  サンズ（Wiley & Sons）（１９９４年））。数多くの基質がβ−ガラクトシダーゼの検出に利用され、最も一般的なものは加水分解時に黄色のｏ−ニトロフェノールを放出するオルソ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシド（ortho-nitrophenyl β-D-galactoside）（ＯＮＰＧ）である（ロイ，ジーエッチ（Lowe, G.H.）、ジェー  メディカル  ラボラトリー  テクノロジー（J. Medical Laboratory Technology）、１９、２１（１９６２年））。発蛍光性（fluorogenic）基質もまた、レゾルフィン（resorufin）、フルオレセイン及び４−メチルウンベリフェロン（4-methylumbelliferone）等の標識を利用して使用された（マナフィ（Manafi）ら、ミクロバイオル  レビューズ（Microbiol. Reviews）、５５、３３５〜３４８（１９９１年）、プロヴィンス（Plovins）ら、アプライド  アンド  エンバーロメンタル  ミクロバイオル（Applied and Environmental Microbiol.）、６０、４６３８〜４６４１（１９９４年））。
β−ガラクトシダーゼアッセイの重要な用途は、水や食物サンプルにおける「大腸菌型（coliforms）」の検出である。これにより、β−ガラクトシダーゼを直接検出するのに適当な基質を含ませる膜濾過技術（membrane filtration technique）が開発できた（ブレナー（Brenner）ら、アプライド  アンド  エンバーロメンタル  ミクロバイオル（Applied and Environmental Microbiol.）、５９、３５３４〜３５４４（１９９３年）、セネッシー（Ceneci）ら、ミクロバイオス（Microbios）、７６、４７〜５４（１９    年））。上記を目的として最も広範に使用される基質は、４−メチルウンベリフェロン  β−Ｄ−ガラクトシド（4-methylumbelliferone β-D-galactoside）である。例えば、この基質は、６時間に１００ｍｌ当たり１個という少ない糞便の大腸菌型を検出できる迅速アッセイ（rapid assay）に使用された（バーグ（Berg）ら、アプライド  アンド  エンバーロメンタル  ミクロバイオル（Applied and Environmental Microbiol.）、５４、２１１８〜２１２２（１９８８年））。この基質を制限するものは、放出される４−メチルウンベリフェロンが容易にフィルターに拡散して、産生される蛍光が紫外線下でしか目視できないことである。
β−グルコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを同定するためのこれらの基質の制限により、加水分解時に不溶性の産物を生産する色素産生化合物が使用されてきた。このような基質には、放出される色原体が培地中に拡散せずに細菌コロニー周辺に局在化し続けるという利点がある（コダカ（Kodaka）ら、ジェー  クリニカル  ミクロバイオル（J. Clinical Microbiol.）、３３、１９９〜２０１（１９９５年））。β−グルコシダーゼを検出するためのこれらの例としては、インドキシルβ−Ｄ−グルコシド（indoxyl β-D-glucoside）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  β−Ｄ−グルコシド（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucoside）が挙げられ、β−ガラクトシダーゼを検出するための例としては、インドキシルのガラクトシド類及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  β−Ｄ−ガラクトシド（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside）（Ｘ−ｇａｌ）等のそのハロゲン化誘導体が挙げられる（コダカ（Kodaka）ら、ジェー  クリニカル  ミクロバイオル（J. Clinical Microbiol.）、３３、１９９〜２０１（１９９５年））。これらの基質から加水分解によって放出されるアグリコンは迅速に空気によって酸化されて、コロニー塊上に紫色／青色のインジゴイド系色素を形成する（ジェームズ，エーエル（James, A.L.）、イン  ケミカル  メソッズ  イン  プロカリオティック  システマティックス（In Chemical Methods in Prokaryotic Systematics）、４７１〜４９２、グッドフェロー  アンド  オー’ドネル（Goddfellow and O’Donnell）著、ウィレイ  アンド  サンズ（Wiley & Sons）（１９９４年））。これらの基質は非常に有効であるものの、比較的調製しづらく、市販されてはいるが、非常にコストが高いため大量に診断に使用することができなかった。８−ヒドロキシキノリン  β−Ｄ−グルコシド（8-hydroxyquinoline β-D-glucoside）の使用もまた、β−グルコシダーゼを検出するためのエスクリンの代替品として記載された（ジェームズ（James）ら、ズブル  バクト  ハイグ（Zbl. Bakt. Hyg.）、Ａ２６７、１８８〜１９３（１９８７年））。すばらしい結果が得られたものの、毒性の問題が特にグラム陽性菌であった（アルバート（Albert）ら、ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  エックスペリメンタル  パソロジー（British Journal of Experimental Pathology）、３４、１１９〜１３０（１９５３年））。
本発明は、上記したようなすべての欠点を受けることなく寒天または他の水性環境に拡散しにくい、蛍光性、鉄キレート化エスクレチン部分に微生物により加水分解可能であるエスクレチン（６，７−ジヒドロキシクマリン）の特定の新規な６−または７−置換誘導体に関するものである。
本発明の第一の概念によると、一般式Ｉの化合物を提供するものである：
0004155599.tif 000004
ただし、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素またはハロゲン原子または後の鉄のキレート化を妨害しない他の基を表し；
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは一般式  −ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸ［但し、ｎは０〜３の数であり、Ｘは水酸基または他の親水性基を表す］の必要であれば修飾されてもよいカルボキシル含有基を表し；
および、Ｒ3は、または、一般式  −ＣＯＲ［但し、Ｒは（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ6若しくはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルまたは（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルキル基を表す］のアシル基を表してもよく；
この際、Ｒ3及びＲ4の間のＲ3及びＲ4は少なくとも３炭素原子を含み；
またはＲ3及びＲ4が結合する炭素原子を含むＲ3及びＲ4が一緒に（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルケン環を形成し；および
Ｙ及びＺの一方は酵素により切断可能な基を表し、Ｙ及びＺの他方は水素原子を表す；
またはこれらの適当な塩または水和物。
本明細書において以降、「化合物」ということばは、特記しない限り、「塩」または「水和物」を包含するものとする。
本明細書中に使用される、「ハロゲン」ということばまたはその略称である「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨードを意味するものである。
「鉄のキレート化を妨害しない原子または基」という表現は、一般式Ｉのアグリコンの場合の検出の主な手段の一つがクマリン環システムの６及び７位の水酸基によるキレート化によるという事実を意味する。このキレート化を妨害しない基は、Ｒ1および／またはＲ2で置換されてもよい。例えば、水素、ヒドロキシル、ハロゲンまたは（Ｃ1-8）アルキルが挙げられる。ハロゲン原子はフッ素原子または塩素原子であってもよく、低級アルキル基はメチル、エチル、プロピル、ブチルまたはベンジルであってもよい。
本明細書中に使用される、「（Ｃ1-8）アルキル」ということばは、１から８炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基を意味する。このようなアルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル及びオクチルがある。１〜４炭素原子が好ましい。
本明細書中に使用される、「（Ｃ1−Ｃ10）アルキル」ということばは、１から１０炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基を意味する。このようなアルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル及びデシルがある。１〜６炭素原子が好ましい。
「（Ｃ6またはＣ10）アリール」ということばは、フェニル及びナフチルを包含する。
本明細書中に使用される、「（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルキル」ということばは、５〜８炭素原子を有する脂環式基を意味する。このようなシクロアルキル基の例としては、シクロペンチル及びシクロヘキシルがある。
本明細書中に使用される、「（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルケン環」ということばは、５〜８炭素原子を有しかつ一以上の二重結合をさらに有する脂環式基を意味する。このようなシクロアルケニル基の例としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル及びシクロオクテニルがある。
本発明の化合物において、不斉炭素原子の存在により鏡像異性体が生じる。様々な不斉炭素原子の存在により、それぞれが、各キラル中心に適当なＲまたはＳの立体化学を有する、２個の鏡像異性体から構成される、ジアステレオ異性体が生じる。本発明は、すべてのこのようなジアステレオ異性体、光学活性鏡像異性体及びこれらの混合物を含むと解される。
「適当な塩」ということばは、式Ｉの化合物をその対イオンが化合物の所期の用途を妨げない酸または塩基と接触させることによって調製される塩を意味する。例としては、リン酸誘導体のナトリウム塩若しくはマグネシウム塩または一般式Ｉの化合物がカルボン酸である際には第１級、第２級または第３級アミンから形成される塩が挙げられる。第１級アミン塩の例としてはシクロヘキシルアンモニウム塩があり、適当な第２級アミン塩としてはピペリジン塩があり、第３級アミン塩としてはトリエチルアミン塩がある。
一般式Ｉの好ましい化合物としては、以下を個々のまたは矛盾なく組み合わせたものが挙げられる：
Ｒ1が塩素、または好ましくは水素である；
Ｒ2が塩素、または好ましくは水素である；
Ｒ3が（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、特にブチル、またはベンジルである；
Ｒ4が（Ｃ1−Ｃ4）アルキル；または、−ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸであり、この際、ｎは０〜３の数であり、およびＸは水酸基または以下の親水性基の一を表し、すなわち：
0004155599.tif 000005
Ｒ3及びＲ4が結合する炭素原子を含むＲ3及びＲ4が一緒に（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルケン環、好ましくはシクロペンテニル若しくはシクロヘキセニル環を形成し；
Ｒ3が−ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＯＸ（但し、ｎは０〜３の数である）である際には、基Ｘは上記定義と同様であり、
ＹまたはＺによって表される酵素により切断可能な基は、β−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ−キシロース、β−Ｄ−グルクロン酸若しくはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンなどの、α−または、好ましくは、β−連結糖残基、またはリン酸基（phosphate）またはカルボキシレート（carboxylate）（Ｒ5ＣＯＯ−）基であり、この際、Ｒ5は（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基を表す。糖酸基、特にグルコース及びがラクトース由来のものが最も好ましい化合物である。
Ｒ3及びＲ4が結合する炭素原子を含むＲ3及びＲ4が一緒にシクロペンテンたはシクロヘキセン環を形成する化合物が特に好ましい。
一般式Ｉのアグリコン部分は、置換エスクレチンである。Ｙがグルコース部分でありかつＺが水素である際には（即ち、エスクレチン環システムが７−位で置換される際には）、一般式Ｉの化合物はシコリイン（cichoriin）である。Ｙが水素原子でありかつＺがグルコース部分である際には（即ち、エスクレチン環システムが６−位で置換される際には）、一般式Ｉの化合物はエスクリンである。グルコース以外の糖残基が７−位の水酸基で置換されるシコリイン（cichoriin）、及びその類似体が好ましい。これは、エスクレチン環システムの蛍光能が７−位の糖置換基の存在によって抑制されることによるものである；したがって、蛍光性ではなく、発蛍光性（fluorogenic）シコリイン（または他の糖類似体）の加水分解によるエスクレチンの放出が蛍光の増加によって観察できる。エスクリン（及び他の糖類似体）は予め７−水酸置換基を有していないので、複合状態でさえ蛍光を発し、このため、遊離したアグリコンとの識別が蛍光のみによっては観察できない。
一般式Ｉの化合物が有機エステルである際には、ＹまたはＺのそれぞれは、独立して、（Ｃ1−Ｃ10）アルキルカルボニル基を表す。好ましいエステルとしては、オクタン酸及び酪酸エステルが挙げられる。エステル誘導体は、微生物の酵素がエステラーゼである際には、有用である。
好ましい一般式Ｉの化合物は以下のとおりである：
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-galactoside）
0004155599.tif 000006
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルコシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-glucoside）
0004155599.tif 000007
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルクロニド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-glucuronide）
0004155599.tif 000008
３−ベンジル−４−メチルエスクレチン−β−Ｄ−グリコシド（3-benzyl-4-methylesculetin-β-D-glucoside）
0004155599.tif 000009
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−Ｎ−アセチル−β−グルコサミニド（3,4-cyclohexenoesculetin-N-acetyl-β-D-glucosaminide）
0004155599.tif 000010
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−キシロシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-xyloside）
0004155599.tif 000011
３−ｎ−ブチル−４−メチルエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトシド（3-n-butyl-4-methylesculetin-β-D-galactoside）
0004155599.tif 000012
３−ｎ−ブチル−４−メチルエスクレチン−β−Ｄ−グルコシド（3-n-butyl-4-methylesculetin-β-D-glucoside）
0004155599.tif 000013
Ｎ（−７（６）−オクタノイルオキシ−６（７）−ヒドロキシクマリン−４−アセチル）グリシルグリシン［N(-7(6)-octanoyloxy-6(7)-hydroxycoumarin-4-acetyl)glycylglycine］
0004155599.tif 000014
Ｎ（−７（６）−ブチリルオキシ−６（７）−ヒドロキシクマリン−４−アセチル）グリシルグリシン［N(-7(6)-butyryloxy-6(7)-hydroxycoumarin-4-acetyl)glycylglycine］
0004155599.tif 000015
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−６（７）−リン酸（3,4-cyclohexenoesculetin-6(7)-phosphoric acid）
0004155599.tif 000016
シクロヘキシルアンモニウム  ３−アセテート−６−ヒドロキシ−７−オクタノイルクマリン（cyclohexylammonium 3-acetate-6-hydroxy-7-octanoylcoumarin）
0004155599.tif 000017
本発明の第二の概念によると、一般式ＩＩの必要であれば保護されてもよい化合物を６または７位で誘導体に変換し（derivatize）、その後、必要であれば一般式Ｉの化合物を一般式Ｉの他の化合物を形成するように変換することからなる、一般式Ｉで規定される化合物の調製方法を提供するものである。
0004155599.tif 000018
一般式Ｉの化合物を形成するために一般式ＩＩの化合物を誘導体に変換する（derivatize）こととしては、配糖化、リン酸化及びエステル化が挙げられる。
一般式ＩＩの化合物のグリコシド誘導体は、適当な条件下で化合物をグリコシドで処理することによって形成されてもよい。エスクレチン誘導体の糖付加は、７−位が遮断されていない場合にはクマリン環の７−位で起こり、７−位が遮断されている際には、糖付加は６−位で起こる。適当な遮断基の例としては、塩化ベンジル、臭化ベンジル、ヨウ化ベンジル等のハロゲン化ベンジル（benzylic halide）、ベンジルシアニド（benzyl cyanide）等の他の基がある（グリーン（Greene）、プロテクティブ  グループス  イン  オルガニック  シンテシス（Protective Groups in Organic Synthesis）、発行ウィレイ−インターサイエンス（Wiley-Interscience）、９７〜９９（１９８１年））。次に、糖付加の後に、適当な処理による脱ベンジルが続く。
グリコシドの水酸基はアセチル部分等の除去可能な保護基（protector group）の付加によって保護されることが好ましい。適当な保護されたグリコシド化合物の例としては、β−グリコシドまたはβ−ガラクトシドのテトラアセチル形態（tetraacetyl form）がある。テトラアセチル（tetraacetyl）誘導体は、相当するα−アセトブロモヘキソース（alpha-acetobromohexose）から誘導される。水酸基の脱保護は、特定の時間になされてもよいが、実際には、これは目的とする化合物の形成における最終段階であろう。脱保護は、保護基（protector group）がアセチル部分である際にはメタノールにおけるナトリウムメトキシドの溶液による処理を含むものであってもよい。糖付加条件は、過度の実験を伴うことなく当業者によって選択される。しかしながら、適当な条件は、水性アセトンにおける水酸化カリウムの溶液中でエスクレチンの保護されたグリコシドを処理した後、脱保護を行うことからなってもよい。
有機エステルは、一般式ＩＩの適当な６，７−ジヒドロキシクマリンカルボン酸から形成されてもよい。ジヒドロキシクマリンカルボン酸は、必要であれば、初めにアセチル化して、６−及び７−水酸基を保護した後、塩化チオニルの添加によって酸塩化物に変換されうる。モノ−、ジ−、またはトリ−アミノアシルは、酸塩化物と適当なアミノアシル化合物との共役（conjugation）によって形成できる。アミノアシル共役物（conjugate）は、ピリジンの存在下での（Ｃ1−Ｃ10）アルキルカルボニルハリドによる処理によってエステル化されてもよい。適当なアルキルカルボニルハリドの例としては、塩化カプリロイルまたは塩化ブチリル（butyryl chloride）が挙げられる。
リン酸エステル誘導体の形成は、ピリジン（または他の適当な一リン酸化剤）の存在下でエスクレチン誘導体をオキシ塩化燐（ＰＯＣｌ3）で処理することによって達成されてもよい。
上述したように、一般式Ｉの化合物は、必要であれば、他の一般式Ｉの化合物に修飾されてもよい。例えば、ＹまたはＺのいずれかが、グリコシド残基などの、酵素で切断可能な基を表す場合には、グリコシドを本来の位置で（in situ）修飾してもよい；例えば、グルコース残基を白金触媒及び炭素の存在下で酸素によりグルクロン酸残基に修飾してもよい。同様にして、他のグリコシドをその６−カルボキシル誘導体（グリクロン酸）に酸化してもよい。加えて、７−置換基質、例えば、Ｙがグルコースである一般式Ｉのβ−グリコシドは、空いているフェノール基（６−ヒドロキシル）での適当な反応によって、他の基質、例えば、カルボキシルエステルを形成し、さらに、スィートアーモンド（Sweet Almond）のβ−グルコシダーゼで７−置換体を脱保護してもよい。これにより、エスクリンシリーズ（esculinic series）の誘導体が得られる。
一般式ＩＩの化合物は、ペヒマン縮合において一般式ＩＩＩの適当な直鎖状または環状β−ケトン酸エステル（β-ketoester）（置換または非置換）を一般式ＩＶの化合物で処理することによって調製されてもよい。
一般式ＩＩＩのβ−ケトン酸エステル（β-ketoester）は下記のとおりである：
0004155599.tif 000019
ただし、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、アセチル（ＣＨ3ＣＯ−）または式  Ｘ（ＣＨ2）nＣＯ−のアシル基を表し、この際、ｎは０から６の数であり、およびＸは以下を表す：
（ｉ）  水素、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルキルまたは（Ｃ6またはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、
（ｉｉ）  −ＣＯ2ＣＨ3または−ＣＯ2Ｃ2Ｈ5、または
（ｉｉｉ）  Ｃ2Ｈ5ＯＯＣＣＨ2ＣＯ−、但し、ｎは１である；
または、
Ｒ7は、水素、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ5−Ｃ8）シクロアルキルまたは（Ｃ6またはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、または（Ｃ6またはＣ10）アリール（Ｃ1−Ｃ8）アルキルアロイル基を表し、
または、
Ｒ6及びＲ7は、一緒に環状ケトン  −（ＣＨ2）nＣＯ−を形成し、この際、ｎは４〜７の数であり、
および、
Ｒ8は、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、フェニルまたはメチルフェニルを表す。
Ｒ6及びＲ7が環状ケトンを形成する際の、一般式ＩＩＩのβ−ケトン酸エステルのうち、シクロペンタノン及びシクロヘキサノンが好ましい。また、Ｒ8がブチルまたはメチルフェニルであることが好ましい。
一般式ＩＶの化合物は以下のとおりである：
0004155599.tif 000020
ただし、Ｒ9は、独立して、水素または（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−ＣＯを表し；
Ｒ1及びＲ2は、前記と同様である。
一般式ＩＶの好ましい化合物は、１，２，４−トリヒドロキシベンゼン誘導体
0004155599.tif 000021
または、１，２，４−トリアセトキシベンゼン誘導体
0004155599.tif 000022
ただし、Ｒ1及びＲ2は、前記と同様である、である。
しかしながら、実際には、１，２，４−トリヒドロキシベンゼンは相対的に不安定であり、したがって、好ましい出発材料は１，２，４−トリアセトヒドロキシベンゼンである。１，２，４−トリアセトヒドロキシベンゼンは、相当するベンゾキノン化合物のシール−ウィンターアセチル化（Thiele-Winter acetylation）によって合成されてもよい。
好ましいβ−ケトン酸エステルは下記がある：
エチル−２−ｎ−ブチルアセトアセテート、
エチル−２−ベンジルアセトアセテート、
エチル−２−シクロヘキサノンカルボキシレート、および
エチル−２−シクロペンタノンカルボキシレート。
上記段階の生成物は上述したような一般式ＩＩの化合物である。上記他の化合物は、当該分野において既知の方法によって普通に合成可能である。
一般式ＩＩに含まれる６，７−ジヒドロキシクマリンカルボン酸の形成は、Ｘが
（ａ）  −ＣＯ2ＣＨ3、または−ＣＯ2Ｃ2Ｈ5（但し、ｎは０〜６の数である）、または
（ｂ）  Ｃ2Ｈ5ＯＯＣＣＨ2ＣＯ−、但し、ｎは１である
である一般式ＩＩＩの適当なβ−ケトン酸エステルを上記した一般式ＩＶの適当な化合物と処理することによって行われてもよい。
好ましい出発化合物としては、ジエチルアセトンジカルボキシレート（diethylacetone dicarboxylate）、ジメチル２−アセチルグルタレート（dimethyl 2-acetylglutarate）またはジエチルアセチルグルタレート（diethyl acetylglutarate）が挙げられる。ジエチルアセトンジカルボキシレート（diethylacetone dicarboxylate）を１，２，４−トリアセトキシベンゼンで処理する際には、加水分解後の生成物は６，７−ジヒドロキシクマリン−４−酢酸（6,7-dihydroxycoumarin-4-acetic acid）である。
0004155599.tif 000023
前記していない出発材料は、当該分野において既知の方法によって普通に合成可能である。
本発明の第三の概念によると、一般式Ｉの化合物及び必要であれば微生物学的に許容できる希釈剤、賦形剤または基質からなる組成物を提供する。基質は、固体若しくは半固体の成長支持体（growth supportmedium）または液状成長支持体であってもよい。
寒天は、微生物の成長を目的として微生物学で使用される伝統的な支持体である。これは、無水寒天（dehydrated agar）を水中で必要であれば他の成分と共にオートクレーブすることによって調製される。１００℃を超える温度でのオートクレーブプロセスにより、寒天が再度含水して、ゲル状液体寒天溶液が形成される。形成される液体寒天を徐々に冷却した後、液状のまま、培養皿またはペトリ皿等の適当な容器中に注ぐ。寒天はゲル化して、さらに冷却すると支持体を形成する。寒天の選択は、成長させる微生物の株によって異なるが、下記調製物の一つから選ばれてもよい：バクテリア用の寒天、コロンビア寒天（Columbia agar）、ノーブル寒天（noble agar）、選択寒天（select agar）、脳−心臓浸出物寒天、ＬＢ寒天若しくはレノックスブロス寒天（Lennox Broth agar）、ルリア寒天（Luria agar）、イースト抽出物またはトリプトン消化物。培地の他の選択は、サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラークローニング（Molecular Cloning）、第２版、Ａ１−Ａ３、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８９年）におよびディフコ  マニュアル（Difco Manual）、第１０版、ディフコ  ラボラトリーズ（Difco Lacoratories）、デトロイト、エムアイ、米国に記載される。
本発明の化合物は、別の成分としての無水寒天（dehydrated agar）と混合されてもあるいは必要であれば混合粒子として調製されてもよい。
具体的には、選択された増殖培地はまた、特定の微生物の成長を選択、促進若しくは補助するためにまたは特定の微生物の同定若しくは列挙を補助するために、一以上の必須栄養素、ミネラル、ビタミンおよび／または抗生物質を含んでもよい。微生物の増殖培地に一般的に使用される抗生物質としては：アンピシリン、クロラムフェニコール、Ｄ−サイクロセリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ナリジクス酸、リファンピシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン及びテトラサイクリンが挙げられる。必須栄養素としては、成長させる微生物が炭化水素等の生育欠乏性または発酵性炭素源であるようなアミノ酸が挙げられる。また、例えば、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウムまたは鉄などの、特定のミネラル、を適当な塩の形態で、あるいはアンモニウム若しくはリン酸塩を添加する必要がある。
寒天等の固体支持体上での微生物の成長は、適当な容器内で行われ、実際には、これはペトリ皿または培養皿であろう。具体的には、容器は、プレートをインキュベートしている際に好気性細菌に酸素が供給できるように張り出し型の蓋（overhanging lid）を有するベースからなる。嫌気性細菌を培養している際には、この蓋はベースを密閉するまたはプレートを嫌気性インキュベーター中でインキュベートしてもよい。
本発明の第四の概念によると、（ａ）サンプルから単離された微生物を一般式Ｉの化合物を含む成長支持体上で成長させ、さらに一般式Ｉの化合物の加水分解後の同定可能な色素産生または蛍光マーカーの放出を検出する段階からなる、サンプルにおける微生物の検出および／または同定方法を提供するものである。この微生物はまた、液状の成長支持体または分析される液体サンプル中に存在していてもよい。
本発明による方法は、グラム陰性及びグラム陽性細菌の双方を検出するのに使用できる。上記方法は、以下に制限されるものではないが、下記属の検出に適用される：エンテロコッカス（Enterococcus）、リステリア（Listeria）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、シトロバクター（Citrobacter）、エンテロバクター（Enterobacter）、エシェリキア（Escherichia）、ハフニア（Hafnia）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、プロビデンシア（Providencia）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、シゲラ（Shigella）及びエルシニア（Yersinia）。
上記方法で検出された蛍光または、鉄と組み合わせた、着色マーカーがエスクレチン部分を遊離した一般式Ｉの化合物の加水分解の結果である。この化合物の加水分解は、検出される微生物の存在に特徴的である。
微生物の特異的な検出は、臨床診断及び医療処置の適当な期間の有効な評価に補助するのに病院で必要である。臨床医がその微生物含量についての分析を望むであろう一般的な生体試料は、唾液、尿、血液、便、胃の内容物または生検サンプルである。食物及び飲料工業はまた、製品の質及び安全性をモニター、維持するために、微生物の特異的な検出を必要とする。同様にして、水工業ではまた、水供給中に存在する微生物の存在及び量をモニター可能である必要がある。したがって、本発明の上記概念による方法における適当な分析用サンプルは、食用物質、水または他の飲用液であろう。
好ましい形態の本方法は、様々な新規なエスクレチン誘導体を寒天培地に含ませることによって特定の酵素活性の指標として利用するものである。形成される鉄キレート化合物が実質的に広がらない特性を有するため、コロニーを目視でき、さらに、培地が適当に選択性である際には、同定できる。本方法は、ニトロセルロース膜フィルターを良好に使用できるため、コロニーの計測に良好に適用できる。
本発明の化合物は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、適当には０．２ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、および好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌ〜０．８ｍｇ／ｍｌの範囲の有効濃度で成長支持体中に存在する。成長支持体がコロンビア寒天（Columbia agar）である際には０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を使用することが好ましい。
したがって、本発明はまた、一般式Ｉの化合物を含む増殖培地からなるキットにまで拡張する。上記キットは、さらに、ペトリまたは培養皿等の容器を有していてもよい。
本発明の第二の概念に関する好ましい態様及び続く態様は、必要であれば変更を加えて（mutatis mutandis）、第一の概念と同様である。
本発明を添付した実施例を参照しながら実施例によって説明するが、添付した実施例は詳細に説明することを目的とするものであり、本発明を制限するものではないと解する。
実施例１〜４：置換エスクレチン（６，７−ジヒドロキシクマリン）の合成
材料
コロンビア寒天（Columbia agar）は、ラブ  エム（Lab M）、バリー（Bury）、英国から得た。エスクレチン誘導体の合成に関わる化学物質はすべて、アルドリッチ  ケミカル  カンパニー  リミテッド（Aldrich Chemical Company Ltd）、ギリングハム（Gillingham）、英国から得た。
実施例１：６，７−ジヒドロキシ−３，４−シクロヘキセノクマリン（6,7-dihydroxy-3,4-cyclohexenocoumarin）の合成
0004155599.tif 000024
均質な粘性液体が得られるまで、小フラスコ中で一緒に加熱した、１，２，４−トリアセトキシベンゼン（1,2,3-triacetoxybenzene）（６．３ｇ、２５ミリモル）及びエチルシクロヘキサノン−２−カルボキシレート（ethyl cyclohexanone-2-carboxylate）（４．２５ｇ、２５ミリモル）を得た。可能な限り低温を使用した。加熱液体をいくらか冷却し、マグネチックスターラーを入れた。３０℃未満に冷却することによって固化させた後、この温度で１０℃に冷却した７５％（ｗ／ｗ）の硫酸（３５ｍｌ）をこの撹拌液に素早く添加した。均質性を保ちながら、温度を下げた。反応を周囲温度で６時間続けたところ、約３時間後、白色の懸濁液が形成した。
この懸濁液を迅速に撹拌された氷／水（３００ｍｌ）中に薄い流れで（in a thin stream）注ぎ、クリーム色の固体の懸濁液を得た。１０分間撹拌した後、この固体を真空瀘過によって除去し、大量の水で洗浄し、吸引乾燥させ、さらに４０〜５０℃で空気乾燥した。この未精製材料を加熱エタノールで結晶化した。冷却すると、薄黄色の針状物が分離された。これらを真空瀘過によって除去して、空気乾燥した（５．２ｇ（８９％））。
実施例２：６，７−ジヒドロキシ−３−ベンジル−４−メチルクマリン（6,7-dihydroxy-3-benzyl-4-methyl coumarin）の合成
0004155599.tif 000025
１，２，４−トリアセトキシベンゼン（６．３ｇ、２５ミリモル）及びエチル２−ベンジルアセトアセテート（ethyl 2-benzylacetoacetate）（５．５ｇ、２５ミリモル）を、実施例１と同様にして一緒に加熱した。７５％硫酸（３５ｍｌ）をこの撹拌液に添加し、さらに１６時間撹拌し続けた。薄黒い色の懸濁液を、よく撹拌しながら、氷／水（３５０ｍｌ）中に注いで、灰色の懸濁液を濾過し、残渣を大量の水で洗浄した。残った固体を空気乾燥し、少量の水をさらに添加して結晶化を助けて、加熱エタノールで再結晶化した。エスクレチン誘導体は、小さな白色の針状物を形成した（５．５ｇ、７５．３％）。
実施例３：６，７−ジヒドロキシ−３−アセチル−４−メチルクマリン（6,7-dihydroxy-3-acetyl-4-methyl coumarin）の合成
0004155599.tif 000026
１，２，４−トリアセトキシベンゼン（６．３ｇ、２５ミリモル）及びエチルジアセトアセテート（ethyl diacetoacetate）（４．３ｇ、２５ミリモル）を、前記と同様にして一緒に加熱し、７５％硫酸（３５ｍｌ）で処理した。１６時間後、未精製物を氷／水（３５０ｍｌ）中に注ぐことによって、単離した。空気乾燥された材料を、熱水を結晶化を目的として添加しながら、加熱エタノールで結晶化した。冷却すると、薄黄色の針状物が形成された（３．５ｇ、６０％）。
実施例４：６，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン酸（6,7-dihydroxy-4-methyl coumarin-3-propionic acid）の合成
0004155599.tif 000027
１，２，４−トリアセトキシベンゼン（６．３ｇ、２５ミリモル）及びジメチル２−アセチルグルタレート（dimethyl 2-acetylglutarate）（５．７５ｇ、２５ミリモル）を、前記と同様にして一緒に加熱し、７５％硫酸（３５ｍｌ）で処理した。２０時間撹拌した後、未精製材料を氷／水（３５０ｍｌ）中に注ぐことによって単離し、生成物を水で洗浄した後集めた。生成物（エチル６，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオネート（ethyl 6,7-dihydroxy-4-methyl coumarin-3-propionate））を、加熱エタノールで結晶化した（４．１ｇ、５６％）。
このエステルを、水（９０ｍｌ）及びエタノール（１０ｍｌ）からなる水酸化カリウム（３％ｗ／ｖ）の水溶液と共に撹拌することによって加水分解した。数時間後、試験サンプルは、残存エステルを示さなかった（酢酸エチル：トルエン（３：１）を用いたＴＬＣ−ＵＶ検査）。アルカリ溶液を撹拌して、塩酸（２Ｍ）を用いてｐＨ２〜３まで酸性にした。沈殿した酸を真空瀘過によって除去し、水で洗浄し、加熱メタノール／水混合液（１：１）で再結晶化した（２．９５ｇ、４４．６％）。
同源調製：６，７−ジヒドロキシクマリン−４−酢酸（6,7-dihydroxy coumarin-4-acetic acid）の合成
0004155599.tif 000028
これは、エステルの代わりに、ジエチルアセトンジカルボキシレート（diethyl acetone dicarboxylate）（５．０５ｇ、２５ミリモル）を使用することによって、実施例４と同様にして調製した。２０時間の反応の温度を１０〜１５℃に維持して、加水分解及び脱カルボキシル化の可能性を防止した。単離された酸の量は２．４ｇ（４７％）であった。
上記合成方法で使用されたトリアセトキシベンゼンは、購入された（ランカスター  シンテシス  リミテッド（Lancaster Synthesis Ltd）、モレカンベ、ランクス（Morecambe, Lancs））あるいは無水酢酸を使用したｐ−ベンゾキノンのシール−ウィンターアセチル化（Thiele-Winter acetylation）によって作製した。
実施例５〜１０：グリコシド及び関連化合物の合成
実施例５：３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルコピラノシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-glucopyranoside）の合成
0004155599.tif 000029
３，４−シクロヘキセノエスクレチン（3,4-cyclohexenoescletin）（６，７−ジヒドロキシ−３，４−シクロヘキセノクマリン）（３．５ｇ、１５ミリモル）を水酸化カリウム水溶液；１０％ｗ／ｖ  ＫＯＨ（２９ミリモル）１６ｍｌ中に溶解した。撹拌すると、エスクレチンは素早く溶解した。これに、アセトン（１８ｍｌ）に溶解したα−アセトブロモグルコース（６．２５ｇ、１５ミリモル）を添加した。この溶液は均一で、撹拌すると色がより明るくなった。１０〜１５℃で１８時間後、黄色の沈殿物が形成した。これを瀘過によって除去して、黄色のケーク（３．０ｇ乾燥重量）を得た。
濾液を撹拌された氷−水（２００ｍｌ）中にゆっくり注いだ。形成した沈殿物をブーフナー漏斗で濾過し、水で洗浄し、乾燥することによって、ゴム状の塊を得た。これを加温しながらジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶かした。冷却すると形成したわずかな沈殿物を除去した。ＴＬＣから、これが３，４−シクロヘキセノエスクレチンであることが示された。濾液は、テトラアセチルグリコシド及び微量のエスクレチンを含んでいた。
黄色のケークを粉末状にし、加熱ジクロロメタンで抽出し、懸濁液を濾過すると、エスクレチンの残渣（１．４ｇ）が後に配糖化されるために維持された。この濾液を先のジクロロメタン抽出物と合わせて、硫酸マグネシウム（無水）で乾燥し、ロータリーエバポレーションすることによって、青白い固体を得た。これを加熱メタノールに溶解し、これで再結晶化することによって、純粋なテトラアセチル化合物の少量の無色の結晶を得た（２．５ｇ、２９％）。
脱アセチル化をメタノールにおけるナトリウムメトキシドを用いて行った。新たに採取した（cut）ナトリウム１．０ｇをメタノール（１００ｍｌ）に溶解した。
テトラアセチル化合物（２．５ｇ）をメタノール（５０ｍｌ）に溶解して、ナトリウムメトキシド溶液（２０ｍｌ）で処理し、この脱アセチル化工程後、基準材料（溶媒−酢酸エチル／アセトン、３：１）のみが維持されるまで、ＴＬＣを行った。メタノール溶液を、アンバーライトアイアール１２０（Ｈ+）（Amberlite IR120（H+））、分析用、のアリコートを添加することによって、ｐＨ６．５にし、酸で処理した後洗浄した。上清液を樹脂からデカンテーションし、後者をメタノールで洗浄した（３×１０ｍｌ）。メタノールを３０〜４０℃でロータリーエバポレーションすることによって除去し、残った固体をメタノール／水で結晶化した（１．５ｇ、８６％）。
実施例６：３−ベンジル−４−メチルエスクレチン−β−Ｄ−グルコピラノシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-glucopiranoside）の合成
0004155599.tif 000030
３−ベンジル−４−メチルエスクレチン（実施例２）（４．２５ｇ、１５．６ミリモル）を撹拌しながら水酸化カリウム水溶液（１０％ｗ／ｖ  ＫＯＨ（２９ミリモル）１６．５ｍｌ）中に溶解した。
黄色の固体である、カリウム塩がすぐに分離した。アセトン（２０ｍｌ）に溶解したα−アセトブロモグルコース（６．６ｇ、１６ミリモル）の溶液を撹拌溶液に添加した。さらにアセトン（３〜４ｍｌ）を加えて、均一にした。明るい茶色の溶液を一晩（１６時間）撹拌した。得られたペーストを吸引により濾過し、残渣を吸引乾燥した後、室温で空気乾燥した。このテトラアセチルグルコシドを、加熱クロロホルムで抽出し（３×３０ｍｌ）、得られた懸濁液をわずかな沈殿物から濾過した。クロロホルム溶液を冷希釈（３％）炭酸ナトリウム溶液（３×３０ｍｌ）でさらに水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションすることによって、白色固体を得た。これを加熱エタノール（１００ｍｌ）に溶解し、一晩０℃で冷却した。この結晶を吸引瀘過及び加圧によって除去した。真空オーブン中で乾燥した後、生成物の重量は３．０ｇ（３２％）であった。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液を用いたテトラアセチルグルコシド（３．０ｇ）の脱アセチル化を、実施例５に記載されるのと同様にし、β−グルコシドを得た（１．８ｇ、８１．４％）。
実施例７：３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-galactopyranoside）の合成
0004155599.tif 000031
３，４−シクロヘキセノエスクレチン（3,4-cyclohexenoescletin）（６．９５ｇ、３０ミリモル）を水酸化カリウム水溶液（１０％ｗ／ｖ  ＫＯＨ（６２．５ミリモル）３５ｍｌ）中に溶解した。α−アセトブロモガラクトース（１３．６ｇ、３３ミリモル）をアセトン（３６ｍｌ）に溶解し、この溶液を撹拌エスクレチン水溶液に添加した。均一な溶液を得るために、少量のアセトンをさらに添加する必要があった。この反応混合物を一晩（１０〜１５℃）撹拌した。４時間後沈殿し始めた。この懸濁液を１６時間後に濾過した。残渣（＜１ｇ）は、主にそのままのエスクレチンであることが示され、拒否された。濾液は、粘性のある低相及び水性の上相から構成される、２相であった。低相を、分離した後、よく撹拌された氷／水（２５０ｍｌ）中にゆっくり注ぐことによって、大量の白色の沈殿物を得た。これを吸引瀘過により除去して、冷水で洗浄、乾燥した。乾燥固体をジクロロメタンに溶解した。ＴＬＣから、テトラアセチルガラクトシドの大きな移動の早い（fast-running）スポットが示され、また、エスクレチンはほとんど認められなかった。
この反応混合物の水性の上相を、３０〜４０℃のロータリーエバポレーションによって濃縮し、氷水に注いだ。生成物は、低相のものに比べると非常に少なかったが、かなりの量の目的産物を含んでいた。沈殿した固体を吸引瀘過によって除去し、乾燥し、さらにジクロロメタンに溶解した。
これらのジクロロメタン溶液を合わせたものを希釈炭酸ナトリウム水溶液（２×５０ｍｌ）でさらに水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を３０℃でロータリーエバポレーションによって除去することにより、粘性のある油を得たがこれは固化しなかった。
油状のテトラアセチルガラクトシドを、実施例５に記載されるのと同様にしてメタノールに溶解しナトリウムメトキシドのメタノール溶液（１％溶液３０ｍｌ）を添加することによって脱保護した。メタノールを蒸発させた後、ガラクトシドは油を形成したが、これは素早く白色固体の塊に固化した（５．２ｇ、４４．８％）。
実施例８：３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルクロニド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-glucuronide）の合成
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新たに蒸留したキノリン（２０ｍｌ）における３，４−シクロヘキセノエスクレチン（２．３２ｇ、１０ミリモル）及びメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチルグルコピラノシルブロミドウロネート（methyl 2,3,4-tri-O-acetyl glucopyranosyl bromide uronate）（３．９７ｇ、１０ミリモル）の撹拌溶液に、新たに調製した酸化銀（Ｉ）（１．８６ｇ、１５ミリモル）を添加した。この混合物を光をあてずに２４時間周囲温度で撹拌した。得られたスラリーを吸引しながら濾過し、残渣を色が明るい灰色になるまで冷アセトンで洗浄した。濾液を撹拌冷塩酸（２００ｍｌ、２Ｍ）にゆっくり加えて、密な灰色の沈殿物を得、これを吸引瀘過によって集めて、より大量の２Ｍ塩酸で洗浄し（２×３０ｍｌ）、残渣を吸引乾燥し、周囲温度で真空乾燥オーブンで乾燥した。メタノールによる再結晶化により、わずかに灰色がかった白色の固体が得られた（０．８２ｇ、１５％）。
アセチル化メチルウロネート（acetylated methyl uronate）を、メタノールに溶解し１／５モル比の水酸化ナトリウムのメタノール溶液（９５％メタノール／５％水）を添加することによって脱保護した。５時間撹拌した後、メタノールをロータリーエバポレーションによって除去した。水（１０ｍｌ）を添加し、溶液を２Ｍ塩酸で中和した。水を６０℃でロータリーエバポレーションによって除去し、残渣をアセトンに懸濁し、１時間撹拌した。懸濁したグルクロニドを吸引瀘過によって除去し、アセトンをロータリーエバポレーションによって除去して、非晶質の明るい茶色の粉末を得た（０．４１ｇ、６５％）。
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−キシロピラノシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-xylopyranoside）及び３，４−シクロヘキセノエスクレチン−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（3,4-cyclohexenoesculetin-N-acetyl-β-D-glucosaminide）
上記したのと同様の方法によって、下記グリコシドを、純粋な状態での単離ではなかったものの、合成した。
３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−キシロピラノシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-xylopyranoside）
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３，４−シクロヘキセノエスクレチン−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（3,4-cyclohexenoesculetin-N-acetyl-β-D-glucosaminide）
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実施例９：３，４−シクロヘキセノエスクレチン−６（７）−リン酸（3,4-cyclohexenoesculetin-6(7)-phosphoric acid）の合成
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ピリジン（５ｍｌ）及びトルエン（１０ｍｌ）における３，４−シクロヘキセノエスクレチン（２．３２ｇ、１０ミリモル）の撹拌溶液に、塩化ホスホリル（１．８４ｇ、１２ミリモル）を０℃で添加した。この撹拌溶液を室温まで加温した後、２時間６０℃でオイルバスで加熱した。冷却した反応混合物をよく撹拌しながら水中に注ぎ、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加することによってアルカリ（ｐＨ１２）にした。
５℃で一晩貯蔵した後、トルエンをジクロロメタン抽出によって除去し、水層のｐＨを塩酸で８に調節し、５０〜６０℃でロータリーエバポレーションすることにより、薄黄色の残渣を得た。これを熱水に溶かして、０℃で冷却すると、リン酸エステル（phosphate）のナトリウム塩がわずかに灰色がかった白色の粉末として分離された。ＴＬＣ（溶媒−酢酸エチル／トルエン、３：１）から、主に基準材料が示された（ＵＶ吸収）が、いくらかの混入エスクレチンが依然として残っていることが示された。これは、エーテルによる抽出を繰り返すことによって、ほとんど除去される。
実施例１０：Ｎ（−７（６）−オクタノイルオキシ−６（７）−ヒドロキシクマリン−４−アセチル）グリシルグリシン（N(-7(6)-octanoyloxy-6(7)-hydroxycoumarin-4-acetyl)glycylglycine）の合成
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６，７−ジヒドロキシクマリン−４−酢酸（6,7-dihydroxycoumarin-4-acetic acid）（２．０４ｇ、１０ミリモル）を、過剰の無水酢酸（１０ｍｌ）に溶解し、緩やかに加温しながら２〜３滴の硫酸（ｄ＝１．８４）を添加することによってアセチル化し、やや発熱が生じた。４０℃でさらに３０分たった後、反応混合物を冷却し、氷／水（１００ｍｌ）中に注いだ。ゆっくり形成した白色固体を吸引瀘過によって除去し、冷水で洗浄し、周囲温度で真空オーブン中で乾燥した。
生成物（ジアセテート）は再結晶化しなかったが、塩化チオニル（１０ｍｌ）を添加しさらに１時間再混合することによって、酸塩化物に変換した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去し、少量を乾燥エーテルにで繰り返し蒸発させることによって除去した。
油状の酸塩化物を直接テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解し、ベースとして作用する水（２０ｍｌ）及びピリジン（２ｍｌ）の混合液に溶解されたグリシルグリシン（１．３２ｇ、１０ミリモル）のよく撹拌された溶液中にゆっくりした気流中で（in a slow stream）導入した。３時間後、溶液をロータリーエバポレーションして、テトラヒドロフランを除去し、濃縮アンモニア（５ｍｌ）を添加することによって脱保護した。１時間後、脱アセチル化を終了して、溶媒を５０〜６０℃で減圧下でロータリーエバポレーションによって除去した。生成物には、過剰のグリシルグリシン及び塩が混入していたので、メタノール／水で再結晶化して、生成物、Ｎ（６，７−ジヒドロキシクマリン−４−アセチル）グリシルグリシン（N(6,7-dihydroxycoumarin-4-acetyl)glycylglycine）を得た。
エステル化
グリシルグリシン共役物（glycylglycine conjugate）（１．６８ｇ、５ミリモル）をピリジン（１０ｍｌ）に溶解して、この撹拌溶液に塩化カプリロイル（０．９ｇ、５．５ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した後、効率的に撹拌しながら氷／水（９０ｍｌ）及び濃塩酸（１０ｍｌ）の混合液中に注いだ。分離されたガム状固体を酢酸エチルに溶かして、濃塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を分離し、乾燥（無水硫酸ナトリウム）し、ロータリーエバポレーションによって、親水性エスクレチンのオクタン酸エステルの蝋状の固体が得られた。Ｎ（７（６）−ブチリルオキシ−６（７）−ヒドロキシクマリン−４−アセチル）グリシルグリシン（N(7(6)-butyryloxy-6(7)-hydroxycoumarin-4-acetyl)glycylglycine）
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エステル化プロセスで塩化ブチリル（０．５８ｇ、５．５ミリモル）を代わりに使用する以外は、同様の方法によって、相当する酪酸エステル（Ｎ（７（６）−ブチリルオキシ−６（７）−ヒドロキシクマリン−４−アセチル）グリシルグリシン（N(7(6)-butyryloxy-6(7)-hydroxycoumarin-4-acetyl)glycylglycine)）が得られた。
実施例１１：実施例１〜１０で前記で合成された化合物を用いた試験方法
細菌学的な調査を、修飾エスクレチンのグリコシドまたは他の誘導体を含ませた寒天平板上で行った。グラム陽性ストレプトコッカス及び関連生物の識別を目的とした、およびエスクリン陽性コロニーの目視化を目的とした３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルコシド（3,4-cyclohexenoesculetin-β-D-glucoside）を用いた下記説明は、これらの新規な化合物の総合的な用途を詳細に説明するためのものである。
エスクリン寒天を以下のようにして調製した：コロンビア寒天（４５ｇ）、クエン酸アンモニウム鉄（０．５ｇ）及びエスクリン（１．０ｇ）を、蒸留水（１リットル）中で沸騰させることによって溶解した後、この培地のｐＨを７．５に調節し、培地を１１６℃で１０分間オートクレーブすることによって滅菌した。この培地を、２０ｍｌ容注ぐ前に５５℃まで冷却した。３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−グルコシドを含む寒天は、上記新規なグルコシド（ＣＨＥ−β−Ｄ−ｇｌｕｃ）（０．５ｇ）をエスクリンの代わりに使用する以外は同様にして調製した。
広範な臨床及び環境サンプルから集められたエンテロコッカス１５０株を、ファックラム（Facklam）及びコリンズ（Collins）（ジェー  クリニカル  ミクロバイオル（J. Clinical Microbiol.）、２７、７３１〜７３４（１９８９年））のスキームを用いて同定した。上記菌株をそれぞれ生理食塩水に接種し、約１０8生物／ｍｌの接種材料を作製した。これは、マックファーレンスタンダード０．５（McFarlane Standard 0.5）との比較を行うことによって達成された。マルチポイントイノキュレーター（multi-point inoculator）（デンレイ（Denley））を用いて、１μｌの各懸濁液を、１枚のプレート当たり１２菌株以下が接種されるように双方の試験培地に接種した。上記エンテロコッカスに加えて、４０ストレプトコッカスの選択株及びリステリア種（Listeria sp.）の１２菌株を集め、示唆される場合には相補性試験を用いてエーピーアイ３２エスティアールイーピー（API 32 STREP）で同定した。これらもまた、同様にして接種した。腸内細菌科の２５０菌株もまた、広範な源から集めて、その同一性をエーピーアイ２０イーシステム（API 20 E system）（バイオメリュークス（Biomerieux））によって確認した。これらを上記と同様にしてエスクリン及びＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシド培地の双方に接種した。
最終的には、エンテロコッカスの７菌株及びストレプトコッカスの２菌株をナショナル  コレクション  オブ  タイプ  カルチャーズ（the National Collection of Type Cultures）（ＮＣＴＣ）、ロンドンから得た。これらは以下である：エンテロコッカス  フェシウム（Enterococcus faecium）ＮＣＴＣ７１７１、エンテロコッカス  フェカーリス（Enterococcus faecalis）ＮＣＴＣ７５５、エンテロコッカス  ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＮＣＴＣ１１４２８、エンテロコッカス  ムンドティ（Enterococcus mundtii）ＮＣＴＣ１２３４３、エンテロコッカス  カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ＮＣＴＣ１２３４１、エンテロコッカス  デューランス（Enterococcus durans）ＮＣＴＣ８３０７、エンテロコッカス  ラフィノシス（Enterococcus raffinosis）ＮＣＴＣ１２１９２、ストレプトコッカス  アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）ＮＣＴＣ８１８１及びストレプトコッカス  ボビス（Streptococcus bovis）ＮＣＴＣ８１７７。これらの１０菌株の懸濁液を１０8生物／ｍｌで上記と同様にして調製し、標準的な方法によって滅菌蒸留水で希釈して、約１生物／ｍｌの懸濁液を作製した。次に、３×１００ｍｌ容の各懸濁液を標準的な瀘過方法を用いて３枚のニトロセルロース膜フィルター（サルトリウス（Sartorius））に濾過した。これらのフィルターの一枚をＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシド平板上に置き、２枚目のエスクリン平板上に置き、３枚目を基質を含まないコロンビア寒天平板上に置いた。ストレプトコッカスを接種した平板は５％二酸化炭素を供給した空気中でインキュベートした以外は、すべての平板を、ちょうど１８時間３７℃で空気中でインキュベートした。インキュベーション後、平板について、黒色または茶色のコロニーの存在を試験し、コロニーの計測を膜フィルター上で行った。
結果
本研究に使用したすべての菌株は、ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシド及びエスクリン含有培地上で良好に成長した。これらの２基質は、寒天における拡散の点で顕著に相違した。エスクリンの加水分解によって広範に拡散する黒色の複合体が得られたが、ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドの加水分解では細菌の成長に非常に制限される黒色の複合体が産生した。表１から、ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドの加水分解はエスクリンの加水分解と非常に密接に相関することが分かる。これは、すべての試験株が２基質間に完全な相関関係を示すグラム陽性細菌で特にいえることであった。例えば、エンテロコッカス１５０菌株及びリステリア種（Listeria sp.）１２菌株のうち、すべての菌株がエスクリン及びＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシド双方を加水分解して黒色コロニーを形成した。また、優れた相関関係が試験したグラム陰性細菌で上記２基質間で得られた。４菌株（１０％）がＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドを加水分解すると考えられたがエスクリンは加水分解できなかった大腸菌（E. coli）の場合が、上記の一つの例外であった。
膜瀘過実験において、すべてのエンテロコッカスのＮＣＴＣ株及びストレプトコッカス  ボビス（S. bovis）の菌株がＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシド培地で黒色コロニーを形成した。エスクリン培地に置かれたフィルター上では、すべての菌株が、フィルターの表面全体にさらには膜の下の寒天中にも広がった明るい茶色の拡散性の複合体を産生した。試験した生物のいずれについてもＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシド、エスクリンまたは脳心臓浸出物でコロニー計測数の統計学的な相違はなかった（データ示さず）。ストレプトコッカス  アガラクティエ（S. agalactiae）ＮＣＴＣは、ネガティブコントロールとして機能し、いずれの物質の加水分解も示さなかった。
ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドの主な利点は、放出されたシクロヘキセノエスクレチンが鉄と合わさると、得られた黒色複合体が非常に不溶性であり、寒天培地に拡散しないことである。これにより、黒色コロニーが離れて形成するため、混合培養物内で容易に識別できる。これに対して、エスクリンが加水分解されると、放出されたエスクレチンは鉄と合わさり、茶色／黒色の複合体を形成し、これは迅速に寒天に拡散する。この拡散により、混合培養物内のエスクリン陽性コロニーが識別しづらくなる。これらの２基質間の相違は、ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシド培地及び伝統的なエスクレチンを基礎とした選択寒天上でのリステリア  モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（ＮＣＴＣ１１９９４）の菌株を示す図１で強調される。ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドを使用する際には黒色複合体の拡散が存在しないことはまた、多数の菌株が各平板に塗布される際にマルチポイントイノキュレーション（multi-point inoculation）技術を用いることにより細菌を同定する場合にかなりの利点がある。
本研究から示されるＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドの他の非常に有用な性状としては、糞のストレプトコッカス／エンテロコッカスの膜瀘過研究への適用の可能性がある。エスクリンは、長い間、このような目的のかなり有用な基質として見なされてきたが、エスクレチン複合体の拡散に関連した問題はかなりの努力がなされてきたにもかかわらず解消されなかった（ダオウスト（Daoust）ら、アプライド  ミクロバイオロジー（Applied Microbiology）、２９、５８４〜５８９（１９７５年））。この拡散の問題は、多数のエンテロコッカスが存在し、膜全体が黄褐色のエスクレチン複合体で染色される際に特に深刻である（ブロドスキー（Brodsky）ら、アプライド  アンド  エンバーロメンタル  ミクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、３１、６９５〜６９９（１９７６年））。ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドが基質として使用される際には、エンテロコッカスは膜上で離れた黒色コロニーとして成長するため、混合した集団で容易に識別可能である。これは、コロニー内に形成される黒色複合体が膜に及び寒天中に拡散できず、これにより産生された色素は実際のコロニーを非常に制限するためである。エスクリンの場合には、形成されるより小さな複合体が膜に及び寒天中に容易に拡散し、産生する茶色の着色が広範に拡散するため目視しづらい。これらの２基質間の上記相違は、図２に強調される。
エスクリンの加水分解は、鉄塩の存在下での加水分解中に、天然基質蛍光の消失をモニターすることによって迅速に検出されることが報告された（エドベルグ（Edberg）ら、ジェー  クリニカル  ミクロバイオロジー（J. Clinical Microbiology）、４、１８０〜１８４（１９７６年））。ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドは、エスクリンと異なり、シクロヘキセノエスクレチン分子の７−水酸基の置換により蛍光を放たない。しかしながら、この基質が加水分解されると、放出されるシクロヘキセノエスクレチンは蛍光を発する。したがって、ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドを用いた蛍光アッセイの別のストラテジーにより、鉄塩の不存在下での蛍光物質の形成が期待されるであろう。結論としては、ＣＨＥ−β−Ｄ−グルコシドは、鉄の存在下でのβ−Ｄ−グルコシダーゼの加水分解時の黒色の非拡散性産物を生じる非常に有用な基質である。この基質は非阻害性であると考えられ、また、その合成は比較的簡単である。
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実施例１２：血液寒天におけるＣＨＥ−グルコシド
シクロヘキセノエスクレチン−グルコシド（ＣＨＥ−グルコシド）を、溶血性及びグルコシダーゼを産生する生物の検出および同定を目的として血液寒天ベース中に含ませた。生物を嫌気的にインキュベートすると、ＣＨＥ−グルコシド血液寒天ベースは、バクテロイデス  フラギリス（Bact. fragilis）等のグルコシダーゼを産生する嫌気性細菌の存在を検出するのに使用できる。
４４１ｇのコロンビア寒天ベース（実験１）を秤量して、フラスコ内に、０．５ｇのＣＨＥ−グルコシド、０．９５ｇのグルコン酸第２鉄、０．０５ｇの酢酸亜鉛と共に、仕込んだ。１リットルの水を添加、混合して、１２１℃で１５分間オートクレーブした。このフラスコを４７℃に冷却して、１００ｍｌのウマの血液を添加、混合して、ペトリ皿に注いだ。
試験細菌：
ストレプトコッカス  ピオゲネス          −  ３菌株
（Streptococcus pyogenes）
ストレプトコッカス  ミレリイ            −  １菌株
（Streptococcus milleri）
エンテロコッカス亜種                    −  ５菌株
（Enterococci spp.）
C群連鎖球菌                             −  ２菌株
（group C Streptococci）
ストレプトコッカス  サングイス          −  １菌株
（Streptococcus sanguis）
シュードモナス  アエルギノーザ          −  １菌株
（Pseudomonas aeruginosa）
大腸菌（E. coli）                       −  １菌株
クロストリジウム  パーフリンジェンス    −  １菌株
（Clostridium perfringens）
バクテロイデス  フラギリス              −  １菌株
（Bacteroides fragilis）
結果：
以下の菌株が黒色コロニーを形成した：
エンテロコッカス（Enterococci）、ストレプトコッカス  サングイス（Streptococcus sanguis）、ストレプトコッカス  ミレリィ  グループＦ（Streptococcus milleri Group F）、バクテロイデス  フラギリス（Bacteroides fragilis）のすべての菌株。
ストレプトコッカス  ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、Ｂ、Ｃ及びＦ群に属する連鎖球菌、及び特定のエンテロコッカス（Enterococci）のすべての菌株が幾分溶血性を産する。
要約すると、血液寒天ベース中に含ませたＣＨＥ−グルコシドにより、溶血性パターンは妨げることなく、グルコシダーゼ酵素が明瞭に検出される。これらの２種の指標及び適当な選択剤と使用することによって、上記重要な病原体を、１次培養プレートで単離し、一時的に同定可能である。