(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸結合型ジャスモン酸を有効成分として含有するファイトアレキシン誘導剤であって、前記アミノ酸結合型ジャスモン酸が、フェニルアラニン結合型ジャスモン酸、ロイシン結合型ジャスモン酸及びイソロイシン結合型ジャスモン酸からなる群から選択される、前記誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸結合型ジャスモン酸を有効成分として含有するファイトアレキシン誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物はストレスや病害に対する自己防御反応の一つとしてファイトアレキシンと呼ばれる抗菌性物質を生産する。ファイトアレキシンは低分子量の二次代謝産物であり、数多くの植物から様々な骨格を有するファイトアレキシンが単離・同定されている。例えば、イネいもち病菌感染に対するファイトアレキシンとしてオリザレキシン類やサクラネチンが単離・同定されている（Phytochemistry,31,3807-3809(1992); Tetrahedron,49, 2025-2032(1993)）。
【０００３】
イネ葉での外的ストレスによるファイトアレキシンの生産は、ジャスモン酸の生成を介して起こることが知られている（Biosci.Biotech.Biochem.,60,1046-1048(1996)）。すなわち、エリシタとして塩化銅を処理したイネ葉では、内生ジャスモン酸が速やかに増加し、又ジャスモン酸を外部から与えたイネ葉では、サクラネチンが大量に生成される（前出）。また、イネ葉において、サクラネチンはその前駆体であるナリンゲニン（図２）のメチル化反応によって生合成され、このメチル化反応をナリンゲニン-7-O- メチルトランスフェラーゼ( NOMT )が触媒していることが知られている（Biochem.Biophys.Res.Commun.,222, 732-735(1996)）。この酵素は、塩化銅、紫外線照射等のストレスや、ジャスモン酸によって誘導される。
【０００４】
このようにジャスモン酸は、ファイトアレキシンの生産において重要な役割を果たしている。ジャスモン酸は、リノレン酸カスケードにおいて生合成されるので、そのカスケードにおける上流及び下流化合物もジャスモン酸と同様にファイトアレキシンの生産に関与している可能性がある。しかし、そのようなジャスモン酸関連化合物とファイトアレキシン生産との関係について論じた報告は皆無である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からジャスモン酸関連化合物とファイトアレキシン生産との関係を明らかにし、新規なファイトアレキシン誘導剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、アミノ酸結合型ジャスモン酸がエリシタ活性を有し、ファイトアレキシン誘導剤として極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、アミノ酸結合型ジャスモン酸を有効成分として含有するファイトアレキシン誘導剤である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のファイトアレキシン誘導剤は、以下の一般式：
【０００８】
【化１】
0004041186.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒはアミノ酸残基である）
で示されるアミノ酸結合型ジャスモン酸を有効成分として含有する。
ここで、アミノ酸結合型ジャスモン酸とは、ジャスモン酸（図１）のカルボキシル基とアミノ酸のアミノ基とがアミド結合した化合物を意味する。
【００１０】
アミノ酸結合型ジャスモン酸において、ジャスモン酸とアミド結合するアミノ酸は特に限定されず、いかなるアミノ酸でもよいが、植物に対する毒性が低いという点から、フェニルアラニン、ロイシン又はイソロイシンが好ましく、フェニルアラニンが最も好ましい。
【００１１】
アミノ酸結合型ジャスモン酸の調製法としては、公知の方法を用いることができ、いずれの方法で調製したものをも本発明のファイトアレキシン誘導剤の有効成分して用いることができる。例えば、ジャスモン酸を酸無水物にし、該酸無水物とアミノ酸とを反応させることによりアミノ酸結合型ジャスモン酸を得ることができ、該アミノ酸結合型ジャスモン酸を本発明のファイトアレキシン誘導剤の有効成分として用いることができる。
【００１２】
本発明のファイトアレキシン誘導剤を用いることにより、ファイトアレキシンを誘導することができ、これによりファイトアレキシンの持つ抗菌活性を発揮させることができる。この抗菌活性を利用して、本発明のファイトアレキシン誘導剤を、例えば、作物に散布して植物病害防除剤として使用したり、カット野菜等に噴霧して植物鮮度保持剤等として使用することができる。
【００１３】
【実施例】
〔実施例１〕ジャスモン酸およびその誘導体の調製
▲１▼ジャスモン酸（化合物１）を以下のようなジャスモン酸メチルの脱エステル化により調製した。
ジャスモン酸メチル 1.0g と炭酸カリウム 0.71gとを70% メタノール水 10ml に溶解し、7 時間煮沸した。反応混合物に希塩酸水を加え、クロロホルムで抽出した。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで脱水後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、ジャスモン酸 0.93gを得た。
【００１４】
また、対掌体分割は、 Kamell,R., Schneider,G., Schmidt,J., Sembdner,G. 及び Schreiber,Kらの記載（Z.Naturforsch.B Chem.Sci.45,377-81(1990)）に従って、以下のように行なった。
【００１５】
ジャスモン酸 0.82g、トリエチルアミン 0.58ml 及びイソブチルクロロホルメート 0.55ml の THF溶液を 0℃で 1時間反応させた。反応後、 (＋) マンデル酸 0.46gを溶解した THF溶液に上澄を加え、 0℃で24時間反応させた。反応物に水を加え、クロロホルムで抽出した。クロロホルム相を脱水し濃縮した後、得られたジアステレオマーをカラムクロマトグラフィーで分離した。溶出には、クロロホルム：酢酸エチル：ヘキサン：酢酸＝15 : 3 : 5 : 0.5の溶媒を用いた。ジアステレオマーを分離後、1N NaOH で加水分解し、目的の (-)ジャスモン酸 100mgを得た。
【００１６】
▲２▼ジヒドロジャスモン酸（化合物２）を、Buchi,G.及びEgger,B らの記載（J.Org.Chem.36,2021-2023.(1971)）に従って、2-ペンチル-2- シクロペンタン-1- オンから以下のように合成した。
2-ペンチル-2- シクロペンタン-1- オン 10gをメタノールに溶解し、0.33mmolのMeONa の存在下で、ジメチルマロン酸と 0℃で一晩反応させた。反応物を抽出し、得られた抽出液を脱水し濃縮した後、生成物をジメチルスルフォキシドに溶解した。NaClの存在下で煮沸することにより脱炭酸し、目的のジヒドロジャスモン酸メチルエステル 5g を得た。このエステルを炭酸カリウムの存在下で加水分解し、ジヒドロジャスモン酸 3.0g を得た。
【００１７】
▲３▼7-イソクルルビン酸（化合物３）を、Yamane,H., Sugawara,J., Suzuki,Y., Shimamura,E. 及びTakahashi,N.らの記載（Agric.Biol.Chem.44, 2857-2864.(1980)）に従って、ジャスモン酸から以下のように合成した。
ジャスモン酸 0.21gをメタノールに溶解し、 0℃で水素化ホウ素ナトリウム 0.4g を加えた。反応後、反応物を抽出し、得られた抽出液を濃縮し、メチルエステル 0.51gを得た。このエステルを炭酸カリウムの存在下で加水分解し、7-イソクルルビン酸 0.3g を得た。
【００１８】
▲４▼ジャスモン酸のアルコール誘導体（化合物４）を、メチルジャスモン酸から以下のように合成した。
ジャスモン酸 1.0g をエチレングライコール 1.0g とベンゼン中で水を除去しながら煮沸反応させた。反応物を抽出し、得られた抽出液を濃縮して油状物を得た。この生成物をリチウムアルミニウムハイドライドで還元し、加水分解した後、目的のアルコール誘導体 0.5g を得た。
【００１９】
▲５▼アミノ酸結合型ジャスモン酸として、 N-[(-)-ジャスモノイル]-S-イソロイシン（化合物５：イソロイシン結合型ジャスモン酸）、 N-[(-)-ジャスモノイル]-S-フェニルアラニン（化合物６：フェニルアラニン結合型ジャスモン酸）、 N-[(-)-ジャスモノイル]-S-ロイシン（化合物７：ロイシン結合型ジャスモン酸）、及び N-[(-)-ジャスモノイル]-S-トリプトファン（化合物８：トリプトファン結合型ジャスモン酸）、並びにそれらの (＋) 体を、 Kamell,R., Schmidt,G., Schneider., Sembdner,G. 及び Schreiber,Kらの記載（Tetrahedron 44,5791-5807. (1988)）に従って、以下のように合成した。
【００２０】
ジャスモン酸 210mgをテトラヒドロフラン中で、トリエチルアミン 0.15ml の存在下でイソブチルクロロフォルメート 0.14ml と反応させた。 0℃で 3時間反応させた後、アミノ酸のリチウム塩を加えたテトラヒドロフラン中に上澄を滴下した。 5時間反応させた後、HCL でpHを3.0 に調整し、クロロホルムで目的物を抽出し、得られた抽出液を濃縮し精製した後、目的のアミノ酸結合型化合物を得た。
上記化合物１、２、３、４、５、６、７及び８の構造式を図１に示す。
【００２１】
〔実施例２〕ジャスモン酸とその誘導体とのサクラネチンの誘導活性の比較
〔実施例１〕で調製した各化合物（化合物１、２、３、４、５、６、７及び８）を 0.5 mM の濃度に調製し、各々20μl ずつイネ葉付傷部に滴下した。26℃、高湿度下で72時間インキュベートした後、付傷部を切り取り、滴下液と共に70% メタノール中で 3分間煮沸した。遠心濃縮によりメタノールを除去した水溶液を酢酸エチルで抽出し、サクラネチン抽出液とした。なお、サクラネチンの構造式を図２に示す。得られた抽出液をSep-Pak Kight Slica カートリッジ( Waters製 )で精製した後、ＨＰＬＣ（カラム, LichroCART, RP-C18( Merck 製 )；溶媒, メタノール：水= ６：４；検出，ＵＶ(285nm) ）でサクラネチン産生量を定量した。サクラネチンの保持時間は流量が1ml/分で約 8分であった。その結果、化合物２〜４及び８は、ジャスモン酸（化合物１）よりも低いサクラネチン誘導活性しか有さないことが示された（図３Ａ及びＢ）。それとは対照的に、化合物５〜７は、ジャスモン酸（化合物１）よりも高いサクラネチン誘導活性を有することが示された（図３Ｂ）。特に、化合物６及び７は顕著に高い活性（約35％増加）を有することが示された（図３Ｂ）。
【００２２】
なお、アミノ酸結合型ジャスモン酸の（＋）対掌体及び遊離のアミノ酸（フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン及びトリプトファン）はサクラネチン誘導活性を示さなかった（結果は示していない）。
【００２３】
〔実施例３〕ジャスモン酸（化合物１）とフェニルアラニン結合型ジャスモン酸（化合物６）とのサクラネチン誘導活性の比較
▲１▼化合物１及び６を 0.5 mM の濃度に調製し、各々20μl ずつイネ葉付傷部に滴下した。24、48、72及び96時間インキュベートした後、実施例２と同様にしてサクラネチン産生量を定量した。その結果、サクラネチンの誘導は各化合物の滴下24時間後に確認され、フェニルアラニン結合型ジャスモン酸（化合物６）はジャスモン酸（化合物１）よりも高いサクラネチン誘導活性を有することが示された（図４Ａ）。
【００２４】
▲２▼化合物１及び６を20、100 、500 μM の濃度に調製し、各々20μl ずつイネ葉付傷部に滴下した。72時間インキュベートした後、実施例２と同様にしてサクラネチン産生量を定量した。その結果、サクラネチンの誘導の閾値は約20μM であることが確認され、フェニルアラニン結合型ジャスモン酸（化合物６）はジャスモン酸（化合物１）よりも高いサクラネチン誘導活性を有することが示された（図４Ｂ）。
【００２５】
〔実施例４〕ジャスモン酸（化合物１）とアミノ酸結合型ジャスモン酸（化合物５〜８）とのナリンゲニン-7-O- メチルトランスフェラーゼ( NOMT )の誘導活性の比較
実施例１で調製した各化合物（化合物５、６、７及び８）を 0.5μM の濃度に調製し、各々20μL ずつイネ葉付傷部に滴下した。なお、対照として蒸留水20μL のみをイネ葉付傷部に同様に滴下した。その後、上記実施例２と同様にして抽出したサクラネチン抽出液 35 μl 、375 μM ナリンゲニンを含む 0.1M グリシン-NaOH 緩衝液( pH9.5 、5mM DTT 及び 1mM EDTA を含む) 100 μl 、92.5 Bq/μl に希釈した S-[14C]アデノシルメチオニン 10 μl を、1.5ml 容量のねじ口付きポリプロピレン製ミクロチューブに入れ、27℃で20分間反応させることにより、サクラネチンをラベル化した。 6N 塩酸 25 μl を反応液に加え、反応を停止させた後、トルエンシンチレーター(4g の 2,5- ジフェニルオキサゾールを 1lのトルエンに溶解) 1ml を加え、よく攪拌し、ミクロチューブを直接液体シンチレーションカウンター用バイアルに入れ、液体シンチレーションカウンターによりラベル化したサクラネチンの放射活性を測定し、NOMT活性を算出した。
【００２６】
その結果、化合物８はジャスモン酸（化合物１）よりも低いNOMT誘導活性しか有さないことが示された。それとは対照的に、化合物５〜７はジャスモン酸（化合物１）よりも高いNOMT誘導活性を有することが示された（図５）。
【００２７】
〔実施例５〕ジャスモン酸（化合物１）とアミノ酸結合型ジャスモン酸（化合物５〜７）とのイネ幼苗の生育に対する阻害活性の比較
各々 18 〜 204μg の化合物５〜７をアセトン 3mlに溶解した。各アセトン溶液及びアセトン（対照として用いた）をペトリ皿に敷いた直径5.5cm の濾紙にしみ込ませた。アセトンが蒸発した後、３mlの蒸留水を加えた。その濾紙の上に４粒の発芽したイネ（日本晴）の種子を置き、蛍光灯下25℃で生育させた。７日後、その芽の伸長を測定し、対照に対する阻害率を計算し、各化合物の植物毒性を比較した。その結果、ロイシン結合型ジャスモン酸（化合物７）はジャスモン酸（化合物１）と同様の植物毒性を示したが、イソロイシン結合型ジャスモン酸（化合物５）及びフェニルアラニン結合型ジャスモン酸（化合物６）は、ジャスモン酸（化合物１）よりも植物毒性が弱かった（図６）。
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、植物病害防除剤、植物鮮度保持剤等として利用できる新規なファイトアレキシン誘導剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ジャスモン酸及びその誘導体の構造式を示す図である。
【図２】ナリンゲニン及びサクラネチンの構造式を示す図である。
【図３】図３ａ及び図３ｂは、ジャスモン酸とその誘導体とのサクラネチン誘導活性を比較した図である。
【図４】図４ａは、ジャスモン酸及びフェニルアラニン結合型の処理時間とサクラネチン誘導活性との関係を示す図である。
図４ｂは、ジャスモン酸及びフェニルアラニン結合型の処理濃度とサクラネチン誘導活性との関係を示す図である。
【図５】ジャスモン酸とアミノ酸結合型ジャスモン酸とのナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ誘導活性を比較した図である。
【図６】ジャスモン酸とアミノ酸結合型ジャスモン酸とのイネ幼苗の生育に対する阻害活性を比較した図である。
【図１】
0004041186.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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