(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Saccharomyces diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ１）において、S. cerevisiaeのもつヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２の少なくとも一方ときわめて相同性の高い配列を含む領域から選択した以下の塩基配列：
５'−ＣＡＡＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡ−３'  または
５'−ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧ−３'
を有するオリゴヌクレオチドと、S. cerevisiaeのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＧＡのヌクレオチド配列ときわめて相同性の高い配列を含む領域から選択した以下の塩基配列：
５'−ＧＡＴＧＧＴＧＡＣＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡ−３'
を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせからなり、試料中にS. diastaticusの遺伝子が存在する場合には遺伝子増幅反応により特異的増幅反応産物を与えるが該試料中に同時にS.cerevisiaeの遺伝子が存在してもS.cerevisiaeの遺伝子の増幅反応を与えないことを特徴とする、S. diastaticusの検出のための遺伝子増幅用プライマー。
【請求項２】
Ｓ１およびＳ２の少なくとも一方ときわめて相同性の高い配列を含む領域に由来するオリゴヌクレオチドが、以下の塩基配列：
５'−ＣＡＡＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡ−３'
を有する、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
Ｓ１およびＳ２の少なくとも一方ときわめて相同性の高い配列を含む領域に由来するオリゴヌクレオチドが、以下の塩基配列：
５'−ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧ−３'
を有する、請求項１に記載のプライマー。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載のプライマーを用いて試料中のＤＮＡの増幅反応を行い、プライマーの対に挟まれたS. diastaticusグルコアミラーゼ遺伝子領域とほぼ同じ長さの増幅産物を与える場合、該試料中にS. diastaticusが存在するとする、S. diastaticusの検出方法。
【請求項５】
試料中に含まれる可能性のあるS. diastaticusの細胞を支持体に捕捉し、こうして捕捉された細胞からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡの増幅反応を行うことを特徴とする、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
試料がビールであることを特徴とする、請求項４または５に記載の検出方法。
【請求項７】
試料中のＤＮＡの増幅反応がＰＣＲ反応である、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品、特にビールの品質に悪影響を及ぼすSaccharomyces diastaticusの検出法に関し、詳しくはオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した増幅反応によるS. diastaticusの検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
S. diastaticusは食品、特にビール醸造において最も問題となる有害微生物の１つであり、その特異的かつ迅速な検出法が望まれてきた。しかしながら、S. diastaticusは醸造に用いるS. cerevisiaeと極めて近縁な酵母であるため、両者は形態上酷似しており、その区別は非常に困難であるという問題があった。従来は炭素源の資化性と発酵性からS. diastaticusの検出を行っていたが、この方法によると識別に数日以上を要していた。一方、菌体内ATPを抽出し、ルシフェラーゼ−ルシフェリンを用いて蛍光分析を行う方法（バイオルミネッセンス法；特開平2-163098号公報）や、それを応用して微生物迅速検出装置；RMD System（日本ミリポア(株)製）を用いて微生物を検出する方法（以下RMDS法と略す；平成５年度日本生物工学会大会講演要旨集p.146、平成５年12月２日付日本工業新聞）を用いると、従来の培養法に比べて短期間で微生物（生菌）検出が可能である。しかしながらこれらの方法では有害酵母であるS. diastaticusを醸造に用いるS．cerevisiaeと識別することができない。さらに、核酸配列の相補性を利用したハイブリダイゼーション法などの方法も、両者の遺伝子配列が近似しているため満足のいく結果を得るのが難しい。このように、従来より種々の方法が開発されているものの、迅速性、検出感度、特異性のいずれもが優れたS. diastaticusの検出方法は未だ存在しない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、S. diastaticusをS．cerevisiaeと区別して検出するための遺伝子増幅反応に用いる新規プライマーを提供することを目的とする。
【０００４】
本発明はまた、前記新規プライマーを用いて遺伝子増幅反応を行い、ビール等の食品・飲料に含まれる恐れがあるS. diastaticusを検出する方法を提供することを目的とする。本発明により、食品等の微生物検査に有用な、S. diastaticusの簡便、迅速かつ高感度な検出法が提供される。また、RMDS法で微生物の検出を行った後の検体を使用して、引き続き迅速にS. diastaticusを効果的、選択的に検出することが可能となった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
新規プライマーの製造
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、S. diastaticusとS．cerevisiaeのグルコアミラーゼ遺伝子の遺伝子構造の相違に着目して、遺伝子増幅反応によりS. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子の特定領域のみを特異的に増幅させて検出することに初めて成功した。
【０００６】
より詳細には、S. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＴＡ１は、S. cerevisiaeにおいては異なる位置にある３つのＤＮＡ領域（Ｓ２、Ｓ１およびＳＧＡ）が進化の過程で融合したものと考えられており、それぞれの領域には酵素分泌のためのシグナル配列、スレオニンとセリンを多く含むＴＳ領域、およびS. cerevisiaeのグルコアミラーゼの触媒領域とほとんど同じ配列がコードされている（以下、S. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＴＡ１の各領域の定義はYamashita I, et al., J. Bacteriol., 169, 2142-2149 (1987)に基づく）。本発明は、このようにS. diastaticusのＳＴＡ１遺伝子はＳ２−Ｓ１−ＳＧＡの構造をとっており、Ｓ２、Ｓ１に相当する領域とＳＧＡに相当する領域とが隣接するが、S. cerevisiaeではこれらの領域が離れて存在するという遺伝子構造の相違を利用する（図１に示すとおり、S. cerevisiaeのヌクレオチド配列Ｓ２、Ｓ１およびＳＧＡ中のＡ〜Ｄの領域は分離して存在するが、S. diastaticusのＳＴＡ１中では、相当するＡ’〜Ｄ’の領域は連続している）。したがって、本発明ではプライマーとする領域の一方を、Saccharomyces diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ１）において、S. cerevisiaeのもつヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２の少なくとも一方に相当する領域（配列番号７の塩基番号１〜９９２）、好ましくはＳ１に相当する領域（配列番号７の塩基番号２２２〜９９２）から、もう一方をS. cerevisiaeのもつＳＧＡに相当する領域（配列番号７の塩基番号９９３〜２７５３）から、以下の条件を満たすように選定する。
【０００７】
１）各部分の長さが９−３０塩基、好ましくは１５−２５塩基であること；
２）各部分のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
３）各部分のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの分布が部分的に大きく偏らないこと；
４）一方の部分と他方の部分の間の距離がS. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子中において５０−２０００塩基であること；
５）各部分中、各部分間またはS. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子中におけるこれらの部分に挟まれた領域中に相補的な配列部分が存在しないこと。
【０００８】
Ｓ１またはＳ２に相当する領域から選定した核酸配列由来のプライマーを５’末端プライマー、ＳＧＡに相当する領域から選定した核酸配列に相補する配列由来のプライマーを３’末端プライマーとして使用する。即ち、５’末端プライマーは−鎖を、３’末端プライマーは＋鎖をそれぞれ認識してハイブリダイズする。
【０００９】
なお、Ｓ２に相当する領域から５’末端プライマーおよびＳ１に相当する領域から３’末端プライマーを選定することもできる。
【００１０】
プライマーの配列が選定されれば市販のＤＮＡ合成機（例えば、ＰＥＲＫＩＮＥＬＥＭＥＲのＭｏｄｅｌ３９１−０４）により慣用された方法により、プライマーとなる一本鎖を合成できる。
【００１１】
上記１）−５）の条件を満たす好ましいプライマーの組の特定の例として次のものがある。
【００１２】
【化４】
組み合わせ１
ＳＤ-５Ａ；  5'-CAACTACGACTTCTGTCATA-3'  （配列番号１）
ＳＤ-６Ｂ；  5'-GATGGTGACGCAATCACGA-3'   （配列番号２）
組み合わせ２
ＳＤ-１Ａ'； 5'-CCATCTTCAACTCCATTCAGCTCTG-3' （配列番号３）
ＳＤ-６Ｂ；  5'-GATGGTGACGCAATCACGA-3'
なお、S. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ１）中におけるＳＤ−５Ａ、ＳＤ−６ＢおよびＳＤ−１Ａ’のそれぞれの位置も、図１中に示されている。ＳＤ−１Ａ’にダッシュを付したのは、３’末端が修飾されているためである。
【００１３】
現在判明している最も好ましいプライマーの組み合わせは、組み合わせ１である。この組み合わせを用いて遺伝子増幅反応を行った場合、S. diastaticusが存在すれば約８７０塩基長のバンドが現れるが、S．cerevisiaeが存在しても遺伝子の増幅は観察されない。したがって、S. diastaticusのみを特異的に検出することが可能となる。さらに、ＳＤ−５Ａ、ＳＤ−６ＢおよびＳＤ−１Ａ’の全長でなくとも、そのうちの最低９塩基連続したものであればプライマーとして使用可能である（実施例５）。
【００１４】
しかしながら、本発明のプライマーは上述した組み合わせ１および２に限られない。即ち、プライマーＳＤ−５Ａ、ＳＤ−６ＢまたはＳＤ−１Ａ’に基づき、これらに塩基の付加、削除、変更等により修飾したものも、S. diastaticusのＳＴＡ１塩基配列にハイブリダイズする性質を失わない限り遺伝子増幅用のプライマーとして選択しうる。また、S. diastaticusのＳＴＡ１遺伝子配列において上記プライマーを選定した箇所から５’側または３’側に例えば数塩基ずれた配列も、ＳＴＡ１遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする性質を失わないものはプライマーとして採用しうる。
【００１５】
プライマーＳＤ−５Ａ、ＳＤ−６ＢまたはＳＤ−１Ａ’に基づいて上述のような改変プライマーを採用することは当業者にとって容易になしうることであり、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００１６】
さらに、プライマーＳＤ−５Ａ、ＳＤ−６ＢまたはＳＤ−１Ａ’以外の配列でも、ＳＴＡ１の他の領域から上述した選定条件を満たすように選定したもの、およびそれらの配列をＳＴＡ１遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする性質を失わないように、塩基の追加、削除、変更等により修飾した配列も本発明の範囲に含まれる。
【００１７】
遺伝子増幅反応
本発明のプライマーによる遺伝子増幅は、限定されるわけではないが、例えば Polymerase Chain Reaction法（Science 230, 1350(1985)、以下、ＰＣＲ法と略す）に基づいて行うことができる。ＰＣＲ法では、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合は S. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子）を増幅しようとする場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いることにより行う。まず、熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対してプライマーをハイブリダイズ（アニーリング）させ、続いてポリメラーゼ重合反応を行い、生成した２本鎖核酸を熱変性により再び１本鎖に分離した後、同様な反応を再度起こさせるものである。このような、アニーリング、重合、熱変性を１サイクルとする操作を繰り返すことにより、２つのプライマーに挟まれた領域を約１０7倍にまで増幅させることができる。
【００１８】
ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性細菌由来のＴａｑポリメラーゼが一般に用いられるが、９０〜９５℃の温度で活性を有していれば、どの生物種由来であっても良い。必ずしも以下の条件に拘束されるわけではないが、例えばアニーリング反応は３７〜６５℃、好ましくは４０〜６０℃で、０．１〜３分、好ましくは０．５〜２分行う。重合反応は５０〜７５℃、好ましくは７０〜７５℃で、０．１〜４分、好ましくは０．５〜３分行う。熱変性温度は９０〜９５℃で、０．２〜５分行う。サイクル数は、１０〜６０回、好ましくは２０〜４０回である。ＰＣＲ反応は市販のＰＣＲ用自動機器（例えば、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００）を用いて行うことができる。
【００１９】
本発明のプライマーによる遺伝子増幅はまた、ＰＣＲ反応以外の公知の遺伝子増幅反応、例えば鎖置換反応（Strand Displacement Amplification; SDA）を用いて行うこともできる。
【００２０】
試料中にS. diastaticusが存在する場合、上記遺伝子増幅反応を行って得られた反応液中には所定の遺伝子領域の核酸断片が増幅されている。これを検出するためには、反応液をそのままアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、増幅された核酸断片の存在およびその長さを確認することができる。S. diastaticusが存在しない場合、該当する核酸断片は検出されない。このように、試料中のS. diastaticusの存否を容易に判定することが可能である。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーを用いてもよい。
【００２１】
以下、本発明を説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
実施例１
S. diastaticusのコロニー１白金耳を前処理液（０.１ｍｇ／ｍｌ  ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）２０μｌに懸濁し、５５℃で２０分間処理して溶菌し、９４℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。これにクロロホルム２０μｌを添加し、３０秒程度撹拌した後軽く遠心分離し、その上清を検体とした。
プライマーの設計とＰＣＲ反応
上述したように、S. diastaticusのグルコアミラーゼ遺伝子においては、S. cerevisiaeのヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２に相当する領域がS. cerevisiaeのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＧＡのヌクレオチド配列に相当する領域と隣接しているという特質を利用し、一方のプライマーがＳ１およびＳ２の少なくとも一方に相当する領域に、他方のプライマーがＳＧＡに相当する領域に由来するようにプライマー対を設計し、市販のＤＮＡ合成装置で合成した。こうして得られたプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った（組み合わせ１および２）。また対照としてＳ１に相当する領域から２箇所の領域を選択してプライマー対としたＰＣＲ反応も行った（組み合わせａ−ｃ）。以下、表１に使用したプライマー対を示す。
【００２３】
【表１】
0004037926.tif 000002
ＰＣＲ反応の反応用バッファー、ｄＮＴＰ溶液及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは(株)パーキンエルマージャパン製または宝酒造(株)製のものをそれぞれの説明書に準じて用いた。反応は、熱変性１：９４℃、４０秒を１サイクル行った後、［熱変性２：９４℃、２０秒、アニーリング：５４℃、３０秒、重合反応１：７２℃、３０秒］を３５サイクル繰り返し、最後に重合反応２：７２℃、７分を１サイクル行った。
【００２４】
S. diastaticusの検出
検体から増幅されたヌクレオチド断片を検出する方法として、３％  NuSieve3:1 Agarose gel電気泳動を行った。ＰＣＲ処理後の反応液の５〜１０μｌを使用し、電気泳動を行った。なお、電気泳動はＴＡＥ溶液（４０ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ／１ｍＭＥＤＴＡ  (ｐＨ８.０)）を用い、１００Ｖで３０分間行った。その後、ゲルを臭化エチジウム溶液にて染色し、紫外線照射下でインスタントカメラにより写真を撮影した。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較により、ヌクレオチドの長さを算出した。
結果
本発明のプライマー対（組み合わせ１および２）および対照のプライマー対（組み合わせａ−ｃ）を用いた場合の、遺伝子の核酸配列から予測される増幅断片の大きさ（ｂｐ）およびＰＣＲ反応の結果得られたデータを表２に示す。
【表２】
0004037926.tif 000003
【００２５】
S.diastaticus，BH-302（IFO 1046）... 検出あり
S.diastaticus，BH-227（NCYC 625）... 検出あり
S.diastaticus, BH-64             ... 検出なし
S.diastaticus                    ... 検出なし
＊＊＊条件によっては鮮明に検出される場合がある。
上記表２および図２から明らかなように、組み合わせ１および２の本発明のプライマー対を使用した場合、遺伝子配列から推定された通りの核酸配列が増幅され、S.diastaticusを特異的に検出できることがわかった。組み合わせ２の場合、菌種によっては検出できないものもあるが、数種類のS. diastaticusをS. cerevisiaeと区別して検出でき、本発明のプライマー対として使用可能である。
【００２６】
対照とした組み合わせａ−ｃのプライマー対を使用した場合は、いずれもS.diastaticusを特異的に検出することは不可能であった。即ち、組み合わせａの場合は強弱の差はあるもののいずれも２本の同じバンドが増幅され、判定が困難である。組み合わせｂの場合は、増幅断片の数（ＳＤ；１本、ＳＣ；２本）により両者の識別は可能であるが、両者が混在する場合におけるＳＤの検出は困難である。また、組み合わせｃの場合は条件によってＳＣも鮮明に検出される場合があり、S.diastaticusのみを特異的に検出できない。
【００２７】
実施例２
S. diastaticusのコロニーより一白金耳とり無菌水に縣濁した。菌数を計測の上、種々希釈水準の菌液１ｍｌを調製し、メンブレンフィルター（直径４７ｍｍ、孔径０．４μｍ）で吸引ろ過した。この後直ちにＲＭＤＳ法の抽出試薬で処理し、Bacterial Genomic DNA Purification Kit（Advanced Genetic Technologies Corp. 製）を用いて操作説明書に準じて上記メンブランフィルター全体からＤＮＡを抽出・調製した。以後、実施例１の方法に準じて組み合わせ１のプライマー対を使用してＰＣＲ法を行った。その結果を図３に示す。
【００２８】
図３に示される通り、検体１ｍｌ中にS. diastaticusが１０5個または１０3個のオーダーで存在した場合は勿論のこと１０1個程度しか存在しない場合でも、８６８ｂｐの鮮明なバンドにより検出可能であった。
【００２９】
実施例３
本法を工場の製品検査に用いることを考えた場合、まず製品から菌体を捕捉・濃縮する必要がある。そこで以下の検討を行った。
【００３０】
１００ｍｌに対し、計算上１−２個のS. diastaticusを含むような製品ビール１００ｍｌをメンブレンフィルター（直径４７ｍｍ、孔径０.４μｍ）で吸引ろ過した後、フィルターをプレート培地上にのせ、２８℃で２４時間培養した。この後、ＲＭＤＳ法を用いて微生物を検出した。なお、対照として通常のプレート培養法で６０時間培養したもののコロニー数を目視で計測した。こうして添加量に見合った１−２個前後のマイクロコロニーが輝点として検出されたことを確認した。この方法は原理上、S. diastaticus以外の微生物も検出してしまうため微生物検出の第１段階として使用した。そこで第２段階として、S. diastaticusの特定を行った。すなわち、この分析後のフィルターからBacterial Genomic DNA Purification Kit（Advanced Genetic Technologies Corp. 製）を用いて操作説明書に準じてＤＮＡを抽出・調製し実施例１の方法に準じて組み合わせ１のプライマー対を使用してＰＣＲ法により検出した。その結果を図４に示す。
【００３１】
図４から明らかなように、図２、３の場合と同様に、８６８ｂｐの長さのヌクレオチドの増幅がみられ、３輝点、２輝点は勿論、１輝点の場合でも検出できた。すなわち元のビール１００ｍｌ中にわずか１菌体存在しているだけで検出できることがわかった。
【００３２】
実施例４
実施例１−３で得られた結果がS. diastaticusに対し選択的なものかどうかを確かめるため、表３に示すようなS. diastaticusおよびその他の種々菌株について比較検討した。これらは食品（ビール）などから分離された出願人の保存する菌株や菌株保存機関より分譲を受けた菌株である。方法は実施例１に示したものと同様であり、組み合わせ１のプライマー対を使用した。結果を表３に示す。表３において、８６８ｂｐの長さのヌクレオチドの増幅がみられたものは＋、増幅がみられなかったものは−と表示した。調べたS. diastaticusについてはすべて８６８ｂｐの長さのヌクレオチドの増幅が認められるが、その他の微生物については増幅が認められないことからS. diastaticusを容易に識別し、選択的に検出できることがわかった。
【００３３】
【表３】
0004037926.tif 000004
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実施例５
プライマーとしての機能を果たしうる最小限の長さを求めるため、組み合わせ１のプライマー、ＳＤ−５ＡおよびＳＤ−６Ｂの３’末端を含む種々の長さのオリゴヌクレオチドを合成し、それを用いて実施例１の方法に準じてＰＣＲ法を実施した。その結果、いずれのプライマーでも最低９塩基が連なっている場合に検出できた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明では、S. diastaticusの検出において高い感度が得られ、複数のプライマーで反応が規定されることによる高い選択性を得ることができ、S. cerevisiaeと容易に識別することが可能である。また、高い検出感度のため多量の検体を必要とせず、しかも検体の前処理が簡便で済む。その上、本発明によれば、反応時間が短く、大掛かりな装置を必要とせず、操作も容易なため、菌種識別までの時間を大幅に短縮できる。例えば実施例３の場合、ＰＣＲ反応時間が約２.７時間、検出にかかる時間が約１.５時間である。また、S. diastaticusの検出にアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動と臭化エチジウムまたはＳＹＢＲグリーンによる核酸染色法を用いることで、プライマー等に標識せずに検出を行うことができる。しかも、核酸の長さが確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。さらに、ＲＭＤＳ法と組み合わせることにより、より高い検出精度が期待でき、１００ｍｌ中に１細胞しか存在しない検体でも２日以内に検出を行うことが可能である。
【配列表】
【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、S. diastaticusおよびS.cerevisiaeのグルコアミラーゼ遺伝子の遺伝子構造を示す。
【図２】  図２は、実施例１，組み合わせ１の場合のアガロースゲル電気泳動の写真であり、レーンＭ：ＤＮＡサイズマーカー（ｐＨＹ  Ｍａｒｋｅｒ  、宝酒造(株)製）、Ｎ：ネガティブコントロール、１：S. diastaticusの抽出ＤＮＡである。
【図３】  図３は、実施例２のアガロースゲル電気泳動の写真であり、レーンＭ：ＤＮＡサイズマーカー（ΦＸ１７４／ＨｉｎｃＩＩ消化物）、Ｎ：ネガティブコントロール（菌数０）、Ｐ：ポジティブコントロール、１：S. diastaticusの菌数１０5個、２が同菌数１０3個、３が同菌数１０1個の検体である。
【図４】  図４は、実施例３のアガロースゲル電気泳動の写真であり、レーンＭ：ＤＮＡサイズマーカー（ｐＨＹ  Ｍａｒｋｅｒ、宝酒造(株)）、Ｐ：ポジティブコントロール、３、４、７、８：S. diastaticusの１輝点検体、１、２、６、９、１０：同２輝点検体、５：同３輝点検体である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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