(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロステンジオン（アンドロスト−４−エン−３，１７−ジオン）およびアンドロスタジエンジオン（アンドロスタ−１，４−ジエン，３，１７−ジオン）を製造するためにフィトステロール組成物を醗酵させる方法であって、
栄養媒体にマイコバクテリウムＭＢ３６８３（受託番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５２）培養体を増殖させ；
シリコーン及びポリプロピレングリコールから選択される可溶化剤を使用して前記フィトステロール組成物を溶解して溶液にし、
前記溶液がアンドロステンジオンおよびアンドロスタジエンジオンに変換するのに十分な時間、前記培養体と前記溶液とをバイオリアクターに置くことからなる方法。
【請求項２】
前記フィトステロール組成物がタル油セッケン由来のものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フィトステロール組成物が適当に選択された植物性油由来のものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記植物性油がダイズ油、ナタネ油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、オリーブ油、亜麻仁油、または米糠油よりなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記栄養媒体が精製糖蜜および無機塩を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記醗酵が好気的に行われる請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には醗酵方法、および特にフィトステロール組成物のアンドロステンジオンおよび／またはアンドロスタジエンジオンへの生物転換(bio-conversion)に関する。
【０００２】
発明の背景
種々の細菌株によるフィトステロール（最も多くにはダイズ油由来の）の微生物による転換は、１９７０年代半ばからアンドロステンジオン（ＡＤ）およびアンドロスタジエンジオン（ＡＤＤ）の商業的な製造に対して使用されてきたよく知られた方法である。一般に、公知の醗酵方法は適当な栄養媒体におけるマイコバクテリウム（Mycobacterium)の突然変異体の増殖、フィトステロールを含むバイオリアクターへの前記培養体の移送および大よそ１２０時間にわたってＡＤおよび／またはＡＤＤへ生物的変換（biotransformation)させることを含む。醗酵ブロス(fermentation broth)の収集、前記醗酵ブロスの有機溶媒による抽出、および次いで有機溶媒中における結晶化は、一般に白色結晶粉末としての生産物ＡＤおよび／またはＡＤＤを与える。公知の方法を議論し、およびより早期の研究を要約する直接関係ある参照文献は以下に示される：
0004038643.tif 000002
【０００３】
公知のフィトステロール生物転換方法に関する問題の一つ（その問題は全てのステロイド工業を悩ませている）は、水性栄養媒体おける、基質、この場合フィトステロール組成物、の乏しい溶解性に関係する。不適切な溶解性は栄養媒体における基質の比較的低い濃度のみの存在を規定し、微生物との乏しい接触という結果を生じおよび一般に最終生産物の低収率をもたらす。いずれかの十分な程度の生物転換を達成するために長い醗酵時間もまた代表的には必要とされる。
【０００４】
公知のフィトステロール生物転換方法に関連する他の問題はフィトステロール（またはフィトステロールの組成物）からの生物転換の最終生産物は典型的にはＡＤとＡＤＤとの両方をかなりの量で含む。ＡＤとＡＤＤの類似の化学構造を示すので、次いでこれらの２つのステロイド生成物を互いに分離することは困難で費用のかかることである。
【０００５】
公知のフィトステロールの生物転換方法に関連する他の問題は、生物転換を行うために使用される微生物（代表的にはマイコバクテリウムの突然変異体）は代表的には製造するのに高価な栄養媒体において生長および増殖することである。
【０００６】
発明の要約
溶解性の問題に対する解決は、フィトステロール組成物を溶解して透明な溶液を形成させおよびそれにより生物転換に利用する微生物と非常によく接触させ得る、選択された適当な可溶化剤（solubilizing agents)の使用を含む。ヒマワリ油のような従来から知られた可溶化剤は、ほんの僅かに有効であることが見出されている。本発明の第一の態様は様々なフィトステロール組成物のＡＤおよび／またはＡＤＤへの生物転換のための、大いに有効な可溶化剤の開発および使用に関する。フィトステロール組成物自体は木材パルプ化法の副産物（"タル油セッケン（Tall Oil soap)"として知られる）から、いずれかの一般的な植物性油（例えばダイズ油、ナタネ油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、オリーブ油、亜麻仁油、および米糠油を含む）から、あるいは上述の資源の混合物から得ることができる。
【０００７】
グリコール族のメンバーおよびシリコーン族のメンバーを含むこれらの選択された適当な可溶化剤は、栄養媒体に溶解されるフィトステロールを高濃度にする。これは微生物との非常によい接触を与え、醗酵時間を減少させ、および最終生産物の比較的高収率を与える。
【０００８】
本発明の他の態様によれば、フィトステロール組成物のＡＤおよび／またはＡＤＤへの生物転換を行うのにマイコバクテリウムＭＢ３６８３（受託番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５２）を利用することである。フィトステロール組成物をＡＤに醗酵させるマイコバクテリウムＭＢ３６８３（受託番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５２）を利用する生物転換はＡＤＤをほどんど含まない最終生産物を得るが；これとは逆に、フィトステロール組成物をＡＤＤに醗酵させるマイコバクテリウムＭＢ３６８３（受託番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５２）を使用する生物転換はＡＤをほとんど含まない最終生産物を得ることが見出された。
【０００９】
本発明のより別の見地によれば、生物転換を行うのに使用される微生物は精製糖蜜（Refiners molasses)および無機塩を含む栄養媒体において生長および増殖させる。
【００１０】
図面の簡単な説明
本発明を以下に示す限定しない図面によって説明する：
図１は１２の実験例にわたるフィトステロールのＡＤへの生物転換の百分率を示す棒グラフである。
【００１１】
発明の詳細な記載
一つの好ましい方法によれば特別な可溶化剤はグリコールの族内にある。ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなグリコール族内にある可溶化剤は、フィトステロールの高濃度を可溶性にし、そして次に、それらの効率的なＡＤおよび／またはＡＤＤへの生物転換を可能にする。例えば図１に示されるように様々な条件下においてフィトステロールのＡＤへの生物転換は好結果に完了した。夫々の試験においてはフィトステロール組成物の濃度は栄養媒体１リットル当たり５から３０ｇまで変化させた。フィトステロール組成物と微生物の相互作用を改良するために、フィトステロール組成物をＰＰＧの選択された量に溶解し（例えば、ＰＰＧ１リットル当たり１００ｇまたは１ｋｇ）、ＡＤへの転換収率は図１に示すように測定された。
【００１２】
この方法において特に著しいのはＡＤに転換できるフィトステロール組成物の非常に高い濃度（栄養媒体１リットル当たり３０ｇまたはそれ以上）である。公知のフィトステロール生物転換方法による工業的醗酵において採用される通常の濃度は栄養媒体１リットル当たり１０ｇである。
【００１３】
実施例１および３はＰＰＧが可溶化剤として利用される場合、本発明の方法は異なる資源由来のフィトステロールの種々の組成物を転換させることを示す。実施例１はパルプおよび製紙工業の副産物である”タル油セッケン”から得られたフィトステロール組成物を利用する好結果なＡＤへの転換を記載し、一方実施例３はナタネ油から得られたフィトステロール組成物の転換を示す。
【００１４】
上記実施例はまた、ＭＢ３６８３として設計されたマイコバクテリウムの突然変異体（受託番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５２）が、フィトステロール組成物の主成分（例えばベータ−シトステロール、カンペステロール、スチグマスタノール、スチグマステロール、ブラジカステロールを含む）の相対比において一様でない、これらの様々なフィトステロール組成物をＡＤに転換できることを明らかにする。パルプおよび製紙工業から誘導された副産物由来および／またはその全てが異なる比率でこれらの一般的なフィトステロールを含む一般的な植物性油由来の種々のフィトステロール組成物が、ＡＤへの生物転換のために利用できることはこれらの実施例から明らかである。
【００１５】
実施例２で例示するように別の好ましい方法において、特定の可溶化剤はシリコーン族内にある。グリコール族内の可溶化剤の場合と同様にシリコーン族内の可溶化剤はフィトステロールの高濃度を可溶性にし、次いでＡＤおよび／またはＡＤＤへの効率的な生物転換を可能にする。
【００１６】
引用した全ての実施例において、微生物の接種体は生物転換が行われるバイオリアクターに移送する前に最初に精製糖蜜および無機塩を含む栄養媒体で生長させる。
【００１７】
好結果の生物転換はフィトステロール組成物を選択された適当な可溶化剤の存在下で加熱してペースト様の粘稠物(consistency)を形成しそして該粘稠物は次いで微生物および適当な無機塩媒体を含むバイオリアクターに添加される場合に達成される。
【００１８】
醗酵工程の間に、約３０−３５℃の範囲に温度を維持することは重要である。醗酵の間のｐＨを観測することにより、ｐＨが初期のおおよそ７．０から収集時ではおおよそ４．７までの範囲に変化できることが明らかになる。
【００１９】
表１に示すように、最終生産物に生物転換されるフィトステロール組成物の量（バイオリアクター中の媒体１リットル当たりのグラム数）にある程度依存して、醗酵期間は約６ないし２５日に変化できる。
【００２０】
生産されたＡＤの収率は醗酵条件に依存して変化するが、８０−９０％の収率は図１に示されるように容易に達成され得る（実験例番号７−１０）。特に媒体１リットル当たりフィトステロール組成物３０ｇのレベルでＡＤ８０％の収率を有する実験例番号１０は特に印象的である。上記のように、公知のフィトステロール組成物の生物転換方法において採用されるフィトステロール組成物のレベルは一般に媒体１リットル当たり１０ｇである。
【００２１】
可溶化剤として植物油（例えばヒマワリ油）の使用（実験例番号１，２、５）は、一般にＡＤの非常に低い収量を導く。もっとはっきり言えば可溶化剤としての植物性油の使用は、それが可溶化剤としてＰＰＧと混合される（実験例番号１１）場合においてもＡＤの収率を損なうことが見出された。
【００２２】
下記の実施例１ないし５は特別に好結果の実験室規模の試験を示す。しかし、各実施例から、本明細書に記載した発明を実施するために公知の工業技術を使用する工業的規模の適用を推測できる。
【００２３】
【実施例】
実施例１
マイコバクテリウムＭＢ３６８３（受託番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５２）の接種体を、各々下記の媒体（ｇ／リットル）：精製糖蜜（５４ｍｌ），ＮａＮＯ3 （５．４ｇ），ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 （０．６ｇ），グルコース（６．０ｇ）、５００ｍｌを含む４個の２リットル・エルレンマイヤーフラスコ中で調製する。前記媒体のｐＨは７．０である。
この混合物を２〜３日の間、生長させる。
【００２４】
ポリプロピレングリコール（０．８〜１リットル）中の”タル油セッケン(Tall Oil soap) ”（１００ｇ）から得られたフィトステロール組成物を、クリーム状のペースト様溶液が得られるまで、１００〜１３０℃に加熱する。この溶液を、下記のもの：ＮＨ4 ＮＯ3 （２ｇ），ＫＨ2 ＰＯ4 （１ｇ），Ｎａ2 ＨＰＯ4 （２ｇ），ＫＣｌ（０．２ｇ），ＭｇＳＯ4 （０．２ｇ），ＣａＣｌ2 （０．３ｇ）、ならびに塩媒体に１ｍｌ／リットルのレベルで添加され、かつ下記の代表的な貯蔵溶液（ｇ／リットル）：ＺｎＳＯ4 （１１ｇ），ＭｎＳＯ4 （６ｇ），ＦｅＳＯ4 （１ｇ），ＣｏＣｌ2 （０．３ｇ），ＣｕＳＯ4 （０．０４ｇ），Ｈ3 ＢＯ3 （０．０３ｇ），ＫＩ（０．０１ｇ）から抜き取られた微量要素を含む塩媒体１５リットルを含む５０リットルのバイオリアクターに添加する。
【００２５】
前記バイオリアクター中の全含有量を１２０℃で滅菌し、次いで室温に冷却する。上記接種体をここで前記バイオリアクターに添加し、次いで３５℃で１２０〜１４４時間、発酵を進行させる。この期間中、７．０の初期ｐＨは、収集時に４．７〜５．５に変化する。ＧＬＣ（例えば、図１の実験例６及び実験例７を参照）。クロロホルムを用いて発酵混合物から抽出することにより、ポリプロピレングリコールを含み、そして各々９：１ないし７：３の変動比率におけるＡＤ／ＡＤＤ混合物である抽出物を得る。
【００２６】
実施例２
上記媒体５００ｍｌを含む単一の２リットルフラスコ中で、一層短い生長期間（２日）を用いること以外は実施例１の方法と同様にして、接種体を調製する。前記接種体を次いで、下記の”種”媒体（ｇ／リットル）：糖蜜（５４ｇ），ＫＮＯ3 （５．４ｇ），ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 （０．６ｇ），ヒマワリ油（２０ｍｌ）、５リットルを含む１０リットルのバイオリアクターに移す。１２〜１６時間バイオリアクター中で生長させた後、前記接種体の一部（１．５リットル）を、次いで、以下に示すような既に滅菌されたフィトステロール組成物を含む別の５０リットルのバイオリアクターに添加する。
【００２７】
ナタネ油から得られたフィトステロール組成物（１００ｇ）を、シリコーン（１．６リットル）と混合し、次いで１００〜１３０℃に加熱してペーストを得る。前記ペーストを次いで、実施例１における組成物と同じ組成物からなる塩媒体１５リットルを含む５０リットルのバイオリアクターに移す。この全含有量を１２０℃で滅菌し、次いで室温に冷却する。上記の接種体の一部（１．５リットル）をここで、前記バイオリアクターに移し、次いで４８時間、３５℃で発酵を進行させる。ＧＬＣ観測は、この期間に、前記フィトステロール組成物の９０％生物転換が起こったことを示した。７．２の初期ｐＨは、７．４の値にわずかに変化した。
【００２８】
ＡＤを含む分離シリコーン層をアセトニトリルを用いて抽出し（３×０．７リットル）、次いで溶媒を蒸発させて粗生成物を得た。ｎ−ブタノール（２〜５％）またはイソプロパノール（２〜５％）を含む炭化水素溶媒（ｎ−ペンタンまたはｎ−ヘキサン）を用いて粗ＡＤを結晶化して、純粋なＡＤ（純度＞９６％）を優れた回収率（＞９０％）で得た。
ここで、上記において調製された残りの接種体（３．５リットル）は、実施例３で使用する。
【００２９】
実施例３
実施例２の残りの接種体（３．５リットル）を、本大規模実験に使用する。
ナタネ油から得られたフィトステロール組成物（９００ｇ，濃度３０ｇ／リットル）を、５０リットルのバイオリアクター中に置き、１００〜１３０℃に加熱することにより、ポリプロピレングリコール（８リットル）に溶かす。前記接種体（３．５リットル）を添加し、次いで１８〜２５日間、発酵を進行させる（表１の実験例１０参照）。実施例１の如く、本大規模実験は同様に、７．０の初期ｐＨから収集時のｐＨ５．５までの変化を示す。ＧＬＣ観測は８０％生物転換を示した。クロロホルムを用いて前記発酵混合物を抽出することにより、ポリプロピレングリコール及びＡＤを含む抽出物を得た。
【００３０】
実施例４
マイコバクテリウムＭＢ３６８３（受託番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５２）の接種体を、各々下記の媒体（ｇ／リットル）：グルコース（１０ｇ），ペプトン（１０ｇ），イースト抽出物（３ｇ）及び麦芽抽出物（２０ｇ）、５００ｍｌを含む６個の２リットル・エルレンマイヤーフラスコ中で調製し、次いで２日間生長させ、この間、ｐＨを７．０に保つ。
【００３１】
前記エルレンマイヤーフラスコからの接種体（２リットル）を、次いで実施例１の精製糖蜜−無機塩媒体２０リットルを含む３０リットルのバイオリアクターに移し、そして１６時間生長させる。後者の接種体（２０リットル）を、次いで実施例１の無機塩媒体２００リットルを含む４００リットルのバイオリアクターに移した。
【００３２】
ナタネから得られたフィトステロール組成物（１ｋｇ，栄養媒体１リットルあたり５ｇの濃度）を、１１５℃に加熱してＰＰＧ（１０リットル，１リットルあたり１００ｇの濃度）に溶かしてペーストを形成する。前記ペーストを次いで、４００リットルのバイオリアクターに移し、そして下記の条件下：１分間あたり１リットルの空気吹き込み，２００ｒｐｍでの攪拌，温度３５℃、で全部で１１５時間、発酵を進行させる。ｐＨは６．４５から収集時に６．６まで変化した。
【００３３】
生物転換の速度を評価するために、前記発酵混合物のアリコットを抜き出し、そして分析した。下記のＡＤの生物転換のレベルが観察された：２０時間（１０％），４４時間（２０％），６８時間（５０％），９１時間（８０％），１１５時間（９０％）。実施例１のようにクロロホルムを用いて抽出して、ＰＰＧおよびＡＤを含む抽出物を得る。
【００３４】
実施例５
本実験は、可溶化剤がＰＰＧの代わりにシリコーンであること以外は実施例４を繰り返す。
フィトステロール組成物（１ｋｇ）を、１３０℃に加熱してシリコーン（２０リットル）に溶かしてペーストを形成する。前記ペーストを次いで、実施例４の如く栄養媒体２００リットルを含む４００リットルのバイオリアクターに移す。実施例４で要約した条件下及び１２０時間に及ぶ発酵は、生物転換を完結させてＡＤを与える。実施例２の如く、アセトニトリルを用いて前記シリコーン層を抽出し、次いで結晶化して、９０％の収率でＡＤを得る。
【００３５】
特別な観点から本発明の態様及び用途が示されかつ記載されているけれども、特に従来技術に詳しい、適用技術における当業者により変形が行われ得るので、勿論、本発明はこれらに限定されないと理解すべきであろう。添付された特許請求の範囲は、それらの範疇に、適用技術における当業者には明らかであろう処の、本文中に記載された本発明の実施態様のこのような変形及び変法を包含する。
【００３６】
0004038643.tif 000003
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0004038643.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は１２の実験例にわたるフィトステロールのＡＤへの生物転換の百分率を示す棒グラフを示す。
【図１】
0004038643.tif 000005