(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点蛍光顕微鏡のビーム路中に配置された光学装置であって、少なくとも１つのレーザ光源（１，２）と、照明/検知ビーム路（３，４，５）に配置され、対象物（７）で反射された励起光（８）を対象物（７）により放射された蛍光光（９）から分離するための装置（６）と、前記分離装置（６）と対象物（７）との間に配置された対物レンズ（１０）と、検知ビーム路（５）中に前記分離装置（６）に後置された検知器（１１）とを有する光学装置において、
前記分離装置（６）はミラー（１３）を有し、
該ミラー（１３）は照明/検知ビーム路（３，４，５）に次のように配置され構成されていること、すなわち
当該ミラーが、対象物（７）を暗視野照明するための、レーザ光源（１，２）から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズ（１０）へ反射し、対象物（７）から到来した蛍光光（９）を全開口数で、−検知ビーム路（５）で作用するミラー（１３）の横断面積分だけ減少されて−検知器（１１）の方向へ通過させるように配置および構成されていること、及び
対象物（７）でレーザ光源（１，２）に戻る励起光（８）の再帰反射を抑圧するために、対象物（７）は斜めに、すなわち光軸（２３）に直交しないように配置されていること
を特徴とする光学装置。
【請求項２】
該ミラー（１３）は、検知すべき蛍光光（９）に対して検知ビーム路（５）で１％の損失を引き起こすように構成されている、請求項１記載の装置。
【請求項３】
該ミラー（１３）は独立の構成部材として構成されている、請求項１または２記載の装置。
【請求項４】
該ミラー（１３）はホルダにより支持されている、請求項３記載の装置。
【請求項５】
該ミラー（１３）は、ビームスプリッタの反射性領域として構成されている、請求項１または２記載の装置。
【請求項６】
該ミラー（１３）は、ビームスプリッタの中央に配置ないし構成されている、請求項５記載の装置。
【請求項７】
該ミラー（１３）は円形に構成されている、請求項５または６記載の装置。
【請求項８】
該ミラー（１３）は楕円形に構成されている、請求項５または６記載の装置。
【請求項９】
ビームスプリッタ（６）の非反射性領域は検知器（１１）の方向に、１０％の反射と９０％の透過を有する、請求項５から８までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１０】
ビームスプリッタの非反射性領域の光学的特性は温度に依存しない、請求項５から９までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１１】
再帰反射された励起光（１９）に対して、照明ビーム路（２０）に対して僅かにずらされた当該励起光のビーム路（２１）に光ストップ（２２）が設けられている、請求項１から１０までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１２】
対象物（７）は、対象物の照明領域が常に対物レンズ（１０）に対して同じ間隔を有するように可動であるよう配される、請求項１から１１までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１３】
該ミラー（１３）は、対象物（７）により散乱された励起光（８）を吸収するための吸収領域（１８）を有する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１４】
該ビームスプリッタは、反射性領域の他に、対象物（７）により散乱された励起光（８）を吸収するための吸収領域（１８）を有している、請求項５から１２までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
ビーム拡散と、使用されるレーザ光源（１，２）の波長との関係を適切に選択することにより、同じ焦点位置が実現可能である、請求項１から１４までのいずれか１項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路中に配置された光学装置であって、少なくとも１つのレーザ光源と、照明/検知ビーム路に配置され、対象物で反射された励起光を対象物により放射された蛍光光から分離するための装置と、前記分離装置と対象物との間に配置された対物レンズと、検知ビーム路中に前記分離装置に後置された検知器とを有する光学装置に関する。
【０００２】
【従来の技術及び問題点】
実際にはすでに長い間、対象物で反射された励起光を対象物から照射された蛍光光から分離するために二色性ビームスプリッタを使用することが公知である。多色を同時に使用する場合には相応に多数の二色性ビームスプリッタを使用する。反射された励起光を含まない蛍光光は、ビームスプリッタにより分離した後、別個の検知器により検知される。実際に使用されるビームスプリッタは一般的に高価である。さらにこのビームスプリッタは、測定ダイナミックスの大きい量的比較測定を高精度で行う場合には適さない。とりわけこのビームスプリッタは温度にも依存する。さらに二色性ビームスプリッタは検知器に対して約１０％の透過損失を有する。
【０００３】
例えば波長に依存しないビームスプリッタを使用することになれば、コストは間違いなく低下することとなる。しかしここでの欠点は、励起光の散乱光をその検知の前に、例えば阻止フィルタを使用して、除去ろ波しなければならないことである。このこともまた構造的観点から大がかりであり、再度コストのかかる原因ともなる。さらにこのことにより蛍光の効率が低下する。しかも多色の同時使用は不可能である。
【０００４】
単純なビームスプリッタを使用すれば、励起光の散乱光反射がレーザ光源に戻り、そこで行われている誘導放射を妨げる。このことはまた不所望のレーザ光強度変動として現れる。
【０００５】
高解像度の使用に対しては照明ないしスキャンのために全開口数を使用する。そのため照明フォーカスがラテラル方向に非常に小さくなり、従って比較的に長い記録時間が必要となる。解像度がそれほど重要でない使用に対しては、この手法は記録時間が延長されるので不利である。
【０００６】
共焦点蛍光顕微鏡については単に例として、Engelhardt und Knebel,“Physik in unserer Zeit”,24.Jahrg.,1993,Nr.2,“Konfokale Laserscanning-Mikroskopie”およびD.K.Hamilton und T.Wilson in Appl.Phys.B 27,1982,211-213,“Three-Dimensional Surface Measurement Using the Confocal Scanning Microscope”を挙げておく。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における光学装置を、従来の二色性ビームスプリッタを有する上位概念記載の構成体に対して、構造が簡単であり蛍光効率が向上されるように構成および改善することである。
【０００８】
【解決手段】
共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における本発明の光学装置は、前記の課題を請求項１の特徴によって解決する。これによれば冒頭に述べた光学装置において、分離装置はミラーを有し、該ミラーは照明/検知ビーム路に次のように配置され構成されている、すなわち当該ミラーが、対象物を暗視野照明するために、レーザ光源から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズへ反射し、対象物から到来した蛍光光を全開口数で、−検知ビーム路で作用するミラーの横断面積分だけ減少されて−検知器の方向へ通過させるように配置および構成されていること、及び対象物でレーザ光源に戻る励起光の再帰反射を抑圧するために、対象物は斜めに、すなわち光軸に直交しないように配置されていることを特徴とする（形態１・基本構成）。
【０００９】
本発明では、分離装置はミラーを有し、該ミラーは照明/検知ビーム路に次のように配置され構成されている、すなわち当該ミラーが、対象物を暗視野照明するために、レーザ光源から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズへ反射し、対象物から（放射されて）到来した蛍光光を全開口数で、−（但し、検知ビーム路で作用するミラーの横断面積分だけ減少されて）−検知器の方向へ通過させるように配置および構成されている。
【００１０】
本発明ではさらに、対象物で反射された励起光を対象物から放射された蛍光光から分離するための分離装置は、従来の二色性ビームスプリッタではなく照明ビーム路／検知ビーム路に配置されたミラーとすることができる。このミラーは十分に小型であり、対象物を暗視野照明するために、レーザ光源から到来する拡散されていない励起ビームを対象物に向けて反射すると共に、対象物から到来する蛍光光は全開口数で検知器の方向に通過させる。ここで蛍光光は検知ビーム路において作用するミラーの（有効）断面積だけ低減される。対象物により反射された励起光の主反射は有利にはミラーで検知ビーム路から除去されるよう反射される。
【００１１】
ミラーないし反射性面を十分に小さく構成することにより、拡散されていない励起光だけが対象物に反射される。この種の“小さな”開口数（その他は通常の開口の例えば１０％）による照明によって“暗視野照明”が達成される。この照明は光軸に沿って延長された焦点領域を有し、この焦点領域は良く定義された横方向の焦点直径を備える。本発明では、対象物位置で光軸に沿った十分な照明公差が達成される。このことは共焦点蛍光顕微鏡での特別な適用に特に有利に作用する。さらに高いシーン内ダイナミックスを備えた照明が保証される。このようなシーン内ダイナミックス（intraszenische Dynamik）が高いことの利点は、例えば直接隣接する２つの対象物を異なる絶対蛍光強度により、例えば対象物Ａを１００％により対象物Ｂを０．０５％により同じ共焦点面で、明るい対象物をオーバ照明（ueberleuchten）することなしに相互に分離して測定できることである。
【００１２】
特に有利にはミラーは、検知すべき蛍光光に対して検知ビーム路における損失が約１％であるように構成ないし小型に構成される。このことにより効率的な検知が特に高いダイナミックレンジで可能である。
【００１３】
ここで使用されるミラーは特に簡単な実施例の枠内で、独立の構成部材として構成することができる。この場合ミラーはまたホルダにより支持される。このような実施例の枠内で、従来のビームスプリッタは完全に省略される。なぜならここではビーム路に相応の箇所で単に小型のミラーが配置されているだけだからである。さらに別の実施例の枠内で、ミラーは、（その他の点では従来の）ビームスプリッタの、有利には一体的な、反射性領域として構成することができる。ここでミラーないし反射性領域は少なくともビームスプリッタのほぼ中央に配置ないし構成する。この小型の一体的ミラーはほぼ円形または楕円形ないしは卵形に構成することができる。最終的にここでは、ビームスプリッタの中央にあり、独立したミラーと同じように拡散されていない励起ビームを対象物に反射する反射性領域が取り扱われる。ここでも照明は、ダイナミックスを有利にするため極端に小さな開口数により行われる。
【００１４】
ビームスプリッタの非反射性領域は、検知器の方向に約１０％の反射と９０％の透過を有することができる。ここで具体的には、ビームスプリッタの検知器側に反射防止（ＡＲ）被覆を設けることができる。このようなビームスプリッタは蛍光光を、通常の（無限）のビーム路に従って全開口数で−反射性領域に当たる蛍光光の分だけ低減されて−検知器の方向に通過させる。反射性領域により発生する、検知すべき蛍光光に対する損失は、すなわちミラーの大きさに依存して、極端に小さい。ここでは僅か１％の損失が実現され、このことは前に述べた高いダイナミックスにつながる。
【００１５】
さらにビームスプリッタの非反射性領域は、ビームスプリッタの非反射性領域の光学的特性が少なくともほぼ温度に依存しないように構成ないし被覆されている。測定の再現性がこのことにより有利になる。
【００１６】
対象物から蛍光光だけが検知ビーム路に到達するのではなく、励起光の再帰反射（逆方向への反射）も到達する。このような再帰反射は不所望のものである。対象物での励起光がレーザ光源に再帰反射するのを抑圧するために、対象物を傾けて配置することができる。このことは、対象物自体が光軸に対して直交していないことを意味し、そのため再帰反射された励起光に対しては別個のビーム路が生じる。このビーム路は照明ビーム路に対して少なくとも僅かに−空間的に−ずらされている。この別個のビーム路には簡単に従来の光ストップ手段  （Lichtfalle）を配置し、これにより再帰反射された励起光を効果的に絞り除去することができる。
【００１７】
対象物のシフトが所望される場合、ないし別の対象物を見つけ出すためには、対象物がその平面で、照明される対象物領域が常に対物レンズに対して同じ間隔を有しながら可動であるように構成すると特に有利である。このことにより、対象物で反射される光および／または散乱される光が、前記の実施例にしたがってレーザ光源に戻らないのではなく、別個のビーム路を介して光ストップ手段に到達する。
【００１８】
光ストップ手段による措置に代り、ミラーは、独立した構成部材としての実施例の枠内で、対象物により散乱および／または反射された励起光を吸収するための吸収領域を有することができる。別個の光ストップ手段による措置はここではもはや不要である。このことにより装置が空間的に小型化される。ミラーは、円形または楕円形ないし卵形の実施例の枠内で反射性の領域と吸収性の領域を有する。
【００１９】
同じようにビームスプリッタは、反射性領域の近傍に、対象物により散乱および／または反射された励起光を吸収するための吸収領域を有することもできる。このような実施例の枠内でも、別個の光ストップ手段による措置は省略することができ、この構成によって装置を最小の空間スペースにより製作できるという利点が得られる。
【００２０】
最後に、ビーム拡散と使用されるレーザ光源の波長との関係を適切にすることによって、少なくとも近似的に同じ軸方向の焦点位置が可能であると特に有利である。このことにより一方では対象物位置での光軸に沿った所要の照明公差が得られ、他方では高いシーン内ダイナミクスを備えた照明が保証される。これについては繰り返しを避けるために前の実施例を参照されたい。
【００２１】
本発明の思想を有利に構成および改善する種々の手段がある。これについて一方では請求項１の従属請求項を、他方では以下の図面に基づいた本発明の実施例の説明を参照されたい。図面に基づいた本発明の有利な実施例の説明と関連して、一般的に有利な実施形態および改善形態を説明する。
なお、以下に、上記基本構成を形態１として、従属請求項の対象でもある本発明の好ましい実施の形態をまとめておく：
（２）  上記形態１の装置において、該ミラーは、検知すべき蛍光光に対して検知ビーム路で約１％の損失を引き起こすように構成されていることが好ましい（形態２）。
（３）  上記形態１又は２の装置において、該ミラーは独立の構成部材として構成されていることが好ましい（形態３）。
（４）  上記形態３の装置において、該ミラーはホルダにより支持されていることが好ましい（形態４）。
（５）  上記形態１又は２の装置において、該ミラーは、ビームスプリッタの有利には一体的な反射性領域として構成されていることが好ましい（形態５）。
（６）  上記形態５の装置において、該ミラーは、ビームスプリッタの少なくともほぼ中央に配置ないし構成されていることが好ましい（形態６）。
（７）  上記形態５又は６の装置において、該ミラーはほぼ円形に構成されていることが好ましい（形態７）。
（８）  上記形態５又は６の装置において、該ミラーはほぼ楕円形に構成されていることが好ましい（形態８）。
（９）  上記形態５〜８の装置において、ビームスプリッタの非反射性領域は検知器の方向に、約１０％の反射と９０％の透過を有することが好ましい（形態９）。
（１０）  上記形態５〜９の装置において、ビームスプリッタの非反射性領域の光学的特性は少なくとも十分に温度に依存しないことが好ましい（形態１０）。
（１１）  上記形態１〜１０の装置において、再帰反射された励起光に対して、照明ビーム路に対して僅かにずらされた当該励起光のビーム路に光ストップが設けられていることが好ましい（形態１１）。
（１２）  上記形態１〜１１の装置において、対象物はその平面内において、対象物の照明領域が常に対物レンズに対して同じ間隔を有するように可動であるよう配されることが好ましい（形態１２）。
（１３）  上記形態１〜１２の装置において、該ミラーは、対象物により散乱された励起光を吸収するための吸収領域を有することが好ましい（形態１３）。
（１４）  上記形態５〜１２の装置において、該ビームスプリッタは、反射性領域の他に、対象物により散乱された励起光を吸収するための吸収領域を有していることが好ましい（形態１４）。
（１５）  上記形態１〜１４の装置において、ビーム拡散と、使用されるレーザ光源の波長との関係を適切に選択することにより、少なくとも近似的に同じ焦点位置が実現可能であることが好ましい（形態１５）。
【００２２】
【実施例】
図１は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における光学装置の実施例が概略図である。この光学装置は、ここで選択された実施例では２つのレーザ光源１，２、照明ビーム路/検知ビーム路３，４，５に配置され、対象物７により反射された励起光７を対象物７から放射された蛍光光９から分離するための分離装置６、分離装置６と対象物７との間に配置された対物レンズ１０、および検知ビーム５中で分離装置６に後置された検知器１１を有する。
【００２３】
図１から、励起光８がビーム統合器（入射結合器）１２を介して装置６に達し、これから対物レンズ１０へ反射され、そこから対象物７に達することがわかる。蛍光光９も対物レンズ１０を通過して装置６に達し、本発明によりミラー１３として構成された反射性領域を除いてこの装置６を通過し、円筒レンズ１４，阻止フィルタホイール（ディスク）１５および検知ホール絞り１５を介して検知器１１に達する。
【００２４】
本発明では分離装置６はミラー１３を有しており、このミラー１３は照明ビーム路/検知ビーム路３，４，５に次のように配置および構成されている。すなわちこのミラーが、対象物７を暗視野照明するために、レーザ光源１，２から到来し、拡散されない励起ビームないし励起光８を対物レンズ１０へ反射し、対象物７から到来した蛍光光９を全開口数で、（但し、検知ビーム路４，５で作用するミラー１３の横断面積分だけ減少されて）検知器１１の方向へ通過させるように配置および構成されている。
【００２５】
図１と図２に示された実施例では、分離装置６はビームスプリッタとして構成されており、その中央にはミラー１３が組み込まれている。
【００２６】
図３は、分離装置６の択一的構成を示しており、ここでは分離装置６は簡単で単純に、ただ１つのミラー１３として構成されている。ここでこのミラー１３は自立的な構成部材である。ミラー１３は、図３に示したように全体反射面を有することができる。
【００２７】
図４に示した実施例でもミラー１３は同じように別個の構成部材として構成されている。ここではミラー１３の面は、反射性のミラー面１７と吸収性面１８とに分割されている。この手段により、反射されて戻る励起光１９に対して別個の光ストップ手段を設ける措置が不要になる。
【００２８】
分離装置６として、例えば図１と図２の図示のようなビームスプリッタ、または図３と図４の実施例を適用すれば、再帰反射、ないし再帰反射された励起光１９が次のようにして「無害化」される。すなわち試料ないし対象物７を斜めに調整し、光軸２３に対して直交しないように配置するのである。このことにより、再帰反射された励起光１９が励起光８の照明ビーム路２０ないしビーム路に対して僅かにずらされ、再帰反射される励起光１９は固有のビーム路２１に沿って再帰反射されるようになる。そして適切な箇所に光ストップ手段２２を配置する。この光ストップ手段は、ビーム路２１の配向に基づき、照明ビーム路２０ないし励起光の反対側にある。
【００２９】
本発明の別の有利な構成については、繰り返しを避けるために明細書の一般的部分に記載した実施形態を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における本発明の光学装置の基本構成の概略図である。
【図２】  図２は、中央ミラーを有するビームスプリッタの概略図である。
【図３】  図３は、ビームスプリッタの代わりに別個の構成部材として使用されるミラーの概略図である。
【図４】  図４は、一体的に反射領域と吸収領域を有するミラーの概略図である。
【符号の説明】
１  レーザ光源
２  レーザ光源
３  照明ビーム路
４  照明/検知ビーム路
５  検知ビーム路
６  対象物で反射された励起光を対象物により放射された蛍光光から分離するための装置
７  対象物
８  励起光
９  蛍光光
１０  対物レンズ
１１  検知器
１２  ビーム統合器
１３  ミラー
１４  円筒レンズ
１５  阻止フィルタホイール
１６  検知ホール絞り
１７  ミラー面
１８  吸収性面
１９  再帰反射された励起光
２０  照明ビーム路
２１  再帰反射された励起光のビーム路
２２  光ストップ手段
２３  光軸
【図１】
0004197395.tif 000002
【図２】
0004197395.tif 000003
【図３】
0004197395.tif 000004
【図４】
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