(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染症患者から採取した自己由来末梢血を密度遠心し、得られたリンパ球層を集めて細胞懸濁液としたものを固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより、該細胞懸濁液に含まれる自己由来リンパ球を増殖させて得た、自己由来リンパ球を主成分とするウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤。
【請求項２】
ウイルス感染症患者から採取した自己由来リンパ球が、免疫不全あるいは免疫低下状態である患者由来である請求の範囲第１項記載のウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤。
【請求項３】
ウイルス感染症患者から採取した自己由来末梢血を密度遠心し、得られたリンパ球層を集めて細胞懸濁液とし、該細胞懸濁液を固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより、該細胞懸濁液に含まれる自己由来リンパ球を増殖させるようにしたことを特徴とする、該自己由来リンパ球を主成分とするウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ウイルス感染症患者のリンパ球を固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより、増殖させた自己由来リンパ球を主成分として、これをウイルス感染症の治療もしくは予防に用いて、ウイルス感染症の治療もしくは予防効果の向上、ならびに各種手術や移植後のウイルス感染の十分な予防を可能にするようにしたウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤、及びその製造方法に関する。
背景技術
生体は、免疫系により種々の感染症や癌等から自らの身を守っている。ここにいう免疫系には、液性免疫と細胞性免疫が一般的に知られている。血清タンパク質の一種である補体やリゾチィーム、抗体等は液性免疫を担い、マクロファージやＮＫ細胞、Ｔ細胞等の細胞は、細胞性免疫を担っている。癌に対する免疫反応としては、ＮＫ細胞やＴ細胞を主体とする細胞性免疫が一般的に重要であると考えられている。
細胞は、細胞の表面に発現している表面マーカーにより分類されている。成熟したＴ細胞には、表面マーカーとしてＣＤ３が発現している。成熟したＴ細胞は、ＣＤ３を表面マーカーとして発現するだけでなく、抗腫瘍活性や抗ウイルス活性を有するキラーＴ細胞はＣＤ８を、各種の免疫系細胞の活性化に密接に関係しているヘルパーＴ細胞はＣＤ４を発現している。また、成熟したＴ細胞には、Ｔ細胞レセプターが発現しており、本レセプターは、特定の抗原に対する親和性が高い。Ｔ細胞は、単一のＴ細胞レセプターのみを発現し、本レセプターを介して抗原特異的なＴ細胞の活性化が行なわれている。さらに、Ｔ細胞レセプターは、非常に多様性に富んでおり、生体内には異なる多種類のＴ細胞が存在している。一方、ウイルス感染防御としては、初期においては、ウイルスを非特異的に不活化する補体やリゾチィーム及びウイルスを貧食するマクロファージが重要である。ウイルス感染数日後からウイルス特異的な抗体の急速な上昇が始まり、本抗体が感染防御に重要な役割を担い始める。ウイルス特異的な抗体としては、ウイルス自体を不活化する中和抗体や、そのもの自体にはウイルスを不活化する能力を持たないがＴ細胞等との連携によりウイルス感染細胞を特異的に排除するＡＤＣＣ活性を担う特異抗体がある。そのため、ウイルス感染防御反応では、液性免疫と細胞性免疫の両者が重要な役割を担っている。このように、免疫系を介する生体防御反応であっても、癌に対する生体防御反応とウイルス感染症に対する生体防御反応とでは大きく異なる。
ウイルスは、もともと外来性のものであり、ホストの細胞に寄生して増殖を行う性質をもつ。この場合一つの感染細胞から何千、何万というウイルス粒子が一挙に産生されるために、その増殖速度は爆発的である。これに対して癌は、もともとホスト由来の細胞が変異して生じたものであり、二分裂に有する時間は、早いものでも２０時間前後である。また、ウイルスによっては、感染細胞中に潜んだ状態で生体内に存在する潜伏感染をするものもある。潜伏感染するウイルスとしては、各種ヘルペスウイルス属ウイルスやレトロウイルスが知られている。これらのウイルスは、ホストの免疫能が低下した場合に病原性を示す場合がある。このように癌とウイルス感染症では、その生体防御機構、増殖速度、増殖メカニズム、由来がまったく異なる。そのため癌治療で有効な治療方法が、必ずしもウイルス感染症の予防や治療に有効であるとは限らない。実際、臨床上で使用される抗癌剤と抗ウイルス剤とでは多くの場合異なっている。さらに癌患者のリンパ球、特にＴ細胞、ＮＫ細胞をインターロイキン２で刺激し、これが抗腫瘍活性を有することは、ローゼンバーグらにより最初に報告されている〔Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９，１６７８（１９８８）〕。また、癌患者自身のリンパ球を抗ＣＤ３固相化抗体及びインターロイキン２で刺激増殖させたリンパ球の増殖刺激法についても、本発明者らによりすでに報告されている（特開平３−８００７６号公報参照）。
さらに、本リンパ球を使用した癌の治療についても報告されている〔ＨＵＭＡＮ  ＣＥＬＬ，７，ｐｐ．１２１−１２３（１９９４）〕。さらにＫｌｉｏｎａ  Ｍ  Ｒｏｏｎｅｙらは、インターロイキン２及びＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス形質転換リンパ球の刺激により増殖させた骨髄細胞提供者由来のリンパ球が、骨髄移植時に出現するＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスに関係したリンパ球増殖に対して有効であることを報告している〔Ｌａｎｃｅｔ，３４５，９（１９９５）〕。さらにＥｌｉｚａｂｅｔｈ  Ａ  Ｗａｌｔｅｒらは、抗ＣＤ３抗体とサイトメガロウイルス感染繊維芽細胞およびインターロイキン２の刺激により増殖させた骨髄細胞提供者由来のリンパ球が、骨髄移植時のサイトメガロウイルス感染症に対して有効である報告をしている〔Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３（１６）１０３８（１９９５）〕。しかしながら、抗ＣＤ３固相化抗体及びインターロイキン２で刺激増殖させた患者自身の自己リンパ球を使用したウイルス感染症患者の治療報告はない。Ｓｃｏｔｔらは、ＰＨＡ、インターロイキン２、フィーダー細胞、ＯＫＴ−３を使用して患者自身のリンパ球からＨＩＶに特異的なリンパ球を調製してＨＩＶの治療検討を行っているが、ＨＩＶ感染症の治療に成功していない（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１（４），ｐｐ．３３０−３３６（１９９５））。
しかしながら特開平３−８００７６号公報に開示されたものは、ＣＤ３抗体およびインターロイキン２により刺激・増殖させたリンパ球による癌の治療に関するものであり、ＣＤ３抗体およびインターロイキン２による刺激・増殖させたリンパ球による感染症癌についての効果を明らかにするものではない。
またリンパ球を使用した癌の治療に関する〔ＨＵＭＡＮ  ＣＥＬＬ〕の報告についても、上記したのと同様にＣＤ３抗体およびインターロイキン２により刺激・増殖させたリンパ球による癌の治療に関するものであり、ＣＤ３抗体およびインターロイキン２による刺激・増殖させたリンパ球による感染症についての効果を明らかにするものではない。
さらにウイルス形質転換リンパ球の刺激により増殖させた骨髄細胞提供者由来のリンパ球が、骨髄移植時に出現するＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスに関係したリンパ球増殖に対して有効であるとするＫｌｉｏｎａ  Ｍ  Ｒｏｏｎｅｙらの報告についても、使用しているリンパ球は、患者自身のものではなく、骨髄細胞提供者のものであり、しかも治療しようとする感染症を発病していない健常人のものである。そのため、既に感染症におかされて発病している患者自身のリンパ球を刺激・増殖させたリンパ球が、感染症に有効であるか否かを明らかにするものではない。さらにリンパ球の刺激・増殖過程において固層化した抗ＣＤ３抗体を使用しておらず、基本的にリンパ球の刺激・増殖方法が異なっている。
抗ＣＤ３抗体とサイトメガロウイルス感染繊維芽細胞およびインターロイキン２の刺激により増殖させた骨髄細胞提供者由来のリンパ球が、骨髄移植時のサイトメガロウイルス感染症に対して有効であるとするＥｌｉｚａｂｅｔｈ  Ａ．Ｗａｌｔｅｒらの報告についても、上記したのと同様に、使用しているリンパ球は、患者自身のものではなく、骨髄細胞提供者のものであり、しかも治療しようとする感染症を発病していない健常人のものである。そのため、既に感染症におかされて発病しているか、あるいは、免疫能が低下している患者自身のリンパ球を刺激・増殖させたリンパ球が、感染症に有効であるか否かを明らかにするものではない。さらにリンパ球の刺激・増殖過程において固層化した抗ＣＤ３抗体を使用しておらず、基本的にリンパ球の刺激・増殖方法が異なっているところから、ウイルス感染症の患者に対する治療には不向きである。
そこで、本発明の目的は、ウイルス感染症の治療もしくは予防効果のより一層の向上、ならびに各種手術や移植後のウイルス感染の十分な予防を可能にするのみならず、リンパ球増殖の著しい効率化をはかることができるウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤、その製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、具体的にはウイルス感染症患者から採取した自己由来末梢血を密度遠心し、得られたリンパ球層を集めて細胞懸濁液としたものを固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより、該細胞懸濁液に含まれる自己由来リンパ球を増殖させて得た、自己由来リンパ球を主成分とするウイルス感染症の治療もしくは予防剤を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、ウイルス感染症患者が、免疫不全あるいは免疫低下状態にある場合に使用して著効を発揮するウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤を提供することにある。
本発明の更にその他の目的は、ウイルス感染症患者から採取した自己由来末梢血を密度遠心し、得られたリンパ球層を集めて細胞懸濁液とし、該細胞懸濁液を固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより、該細胞懸濁液に含まれる自己由来リンパ球を増殖させるようにした、該自己由来リンパ球を主成分とするウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤の製造方法を提供することにある。
ウイルス感染症患者からリンパ球を採取し、これを固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうと、培養直後から増殖を開始し、以後約２週間経過後には、リンパ球の数はおよそ１，０００倍〜１０，０００倍になる。
発明の開示
本発明によるウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤は、ウイルス感染症患者から採取した自己由来リンパ球を主成分とし、前記自己由来リンパ球を固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なって増殖させてなることを特徴とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明によるウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤は、ウイルス感染症患者から採取した自己由来末梢血を密度分離し、得られたリンパ球層を集めて細胞懸濁液としたものを固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行って該細胞懸濁液に含まれる自己由来リンパ球を増殖させて得た自己由来リンパ球を主成分としたもので、ここでのウイルス感染症とは、本発明の治療もしくは予防の施療投与時にウイルス感染を起こしている、あるいは、ウイルス感染症を発症する可能性がある免疫低下状態にある場合を指す。
一般的に細胞は、細胞の表面に発現している表面マーカーにより分類されている。成熟したＴ細胞には、表面マーカーとしてＣＤ３が発現している。成熟したＴ細胞は、ＣＤ３を表面マーカーとして発現するだけでなく、抗腫瘍活性や抗ウイルス活性を有するキラーＴ細胞はＣＤ８を、各種の免疫系細胞の活性化に密接に関係しているヘルパーＴ細胞はＣＤ４を発現している。また、成熟したＴ細胞には、Ｔ細胞レセプターが発現しており、本レセプターは、特定の抗原に対する親和性が高い。Ｔ細胞は、単一のＴ細胞レセプターのみを発現し、本レセプターを介して抗原特異的なＴ細胞の活性化が行なわれている。さらに、Ｔ細胞レセプターは、非常に多様性に富んでおり、生体内には異なる多種類のＴ細胞が存在している。
一方ウイルス感染症としては、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、バリセロゾスターウイルスを代表例とする各種ヘルペスウイルス属のウイルス、ヒトイムノデフィシェンシィーウイルス、ＨＴＬＶを代表とする各種レトロウイルス属のウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｆ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルスを代表とする各種肝炎ウイルス、その他、インフルエンザウイルス等を起因菌とした感染症が挙げられる。特に、ヘルペスウイルス属によるウイルス感染症に有効である。しかしながら、本発明は、列挙したウイルスのみに限定されない。
患者が免疫不全や免疫低下状態にある場合は、本発明が特に有効である。免疫不全としては、先天性あるいは後天性のものがあげられる。先天性としては、ウイスコットアルドリッチ症候群等が、後天性としては、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ等があげられる。また、免疫低下状態としては、臓器や骨髄移植のための免疫抑制剤投与時、あるいは、担癌時、火傷、手術後、薬の免疫細胞系などへの副作用時などが挙げられる。免疫不全や免疫低下状態に陥る原因としては、列挙したものに限定されない。本発明は、原因がどのようなものであっても、ウイルス感染症患者が医学的に免疫不全あるいは免疫低下状態にあると考えられる場合に、特に有効である。
ウイルス感染症患者からのリンパ球の採取は、末梢血あるいは、リンパ節、胸腺などから採取することができる。ウイルス感染症患者から採取した患者由来のリンパ球であれば、いずれの組織あるいは臓器由来のものであっても良い。特に、静脈からの末梢血の採取は、患者の負担、簡便性の点で優る。末梢血は、凝集を防ぐ目的でヘパリン加採血あるいはクエン酸加採血などで行えるが、本方法に限定されない。末梢血からのリンパ球の分離は、本実施例においては、密度遠心分離により行っている。密度遠心分離としては、フィコールハイパック、モノポリレゾルーション等が使用できる。しかしながら、本方法に限定されるものではない。
また、一回に採血する血液量としては、０．１〜５００ｍｌで行なうことができる。より好ましくは、１〜１００ｍｌで行なうことができる。さらに好ましくは１０〜５０ｍｌで行なうことができる。本方法は、大量の血液あるいは小量の血液を材料として実施できるが、特に小量の血液の場合、ウイルス感染症患者の負担を最小限におさえることができる。そのため、一回の採血量は、５０ｍｌ程度が好ましい。一回の採血により数回分の投与に使用できる細胞が調製できるが、投与回数あるいは投与間隔に応じて適宜採血を行い、細胞を調製することができる。
抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３を認識する抗体であれば、どのようなものでも使用できるが、例えばＯＫＴ３抗体（オーソファーマスーティカル社製）等も使用できる。さらに抗ＣＤ３抗体を固相化する支持体としては各種フラスコ、シャーレ、プレート、バッグが使用できる。抗体の固相化方法は、非特異的吸着や化学結合による方法で行えるが、抗ＣＤ３抗体によりリンパ球が刺激できる固相化方法であればいずれの方法でも良い。また、インターロイキン２は、リンパ球、特にＴ細胞を活性化できるものならば、どのようなものでも使用可能である。インビトロでの細胞の培養は、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、各種無血清培地が使用できる。必要により本培地に、血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、抗生物質を添加してリンパ球の培養をすることができる。
インビトロで増殖させたリンパ球は、生理食塩水やリン酸緩衝液を代表例とする各種緩衝液に懸濁させて投与することができる。リンパ球は、１×１０4個／ｍｌから１×１０8個／ｍｌの細胞濃度で使用できる。より好ましくは、１×１０6個／ｍｌから１×１０8個／ｍｌの細胞濃度で使用できる。細胞懸濁液には、細胞の凝集や容器への吸着を防ぐ目的で、タンパク質等を添加することが望ましい。タンパク質としては、例えば０．１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％濃度のヒトアルブミン等が使用できる。
投与経路としては、腹腔内、動脈内、筋肉内、皮下等どのような経路でも投与できるが、便宜性の点から、特に静脈投与が推奨される。また投与時期については、感染症の発症時あるいは、発症前のいずれでも投与できる。特に、本実施例においては、本発明の治療予防剤の効果が明瞭な感染症発症時に投与を行っている。また、治療効果を有する場合は、予防効果も有することは当業者であれば容易に推測できるものである。そのため、本発明の治療予防剤は、治療剤および予防剤として使用できる。
投与には、固相化ＣＤ３抗体とインターロイキン２で刺激増殖させたリンパ球や、刺激後、適当な培養液中で拡大培養を行なったリンパ球が使用できる。拡大培養を行なう培養液中には、必要に応じてインターロイキン２を添加したものが使用できる。なお本発明は、ウイルス感染症患者から採取したリンパ球を固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより増殖させているが、必要により各種サイトカイン、増殖因子等を添加したり、特定の抗原で刺激することによりリンパ球を増殖させることもできる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明は実施例に例示したもののみに限定されない。
〔実施例１〕ＯＫＴ３抗体固相化フラスコの調製
５μｇ／ｍｌ濃度のＯＫＴ３抗体を含むＰＢＳ（−）溶液３０ｍｌを底面積２２５平方ｃｍの培養フラスコ（住友ベークライト社製）に加え、底面が溶液で覆われる状態で室温にて２時間放置し、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。これを使用時まで、４℃で保管する。
〔実施例２〕リンパ球の調製
ヘルペスシンプレックス感染及びＥＢウイルス感染症であるウイスコット・アルドリッチ症候群患者の静脈より、ヘパリン加末梢血として５０ｍｌを採血した。これに等量のＲＰＭＩ１６４０培地を加え、予め数本の１５ｍｌの遠心管に分注しておいたリンホセパールＩ（免疫生物研究所製）に重層し、１８００ｒｐｍで１５分間遠心した。遠心後、リンパ球層をピペットにより集め、ＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍｌと混和後、遠心分離を行なった（１８００ｒｐｍ、１０分間）。上清を除去後、細胞ペレットを良くほぐし、これに培養液（カナマイシン６０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌ、グルタミン２ｍＭ、オキザロ酢酸１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、インスリン０．２Ｕ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地にヒト血清１０％およびインターロイキン２を７００Ｕ／ｍｌ添加したもの）５０ｍｌを加え、細胞懸濁液を調製する。
実施例１で作製したＯＫＴ３固相化フラスコをＰＢＳ（−）により２回洗浄した。洗浄後、上記細胞懸濁液をＯＫＴ３固相化フラスコに接種し、５％炭酸ガス、飽和湿度下、３７℃で培養を行なった。３日後に培養液５０ｍｌを加え、４日後にさらに培養液１５０ｍｌを加え、懸濁後、フラスコ中の培養液１２５ｍｌを新たなＯＫＴ３固相化フラスコに移し、培養を行なった。６日後にフラスコ中の培養液約２５０ｍｌをＬＬ−７培養液（日研生物医学研究所製）７５０ｍｌに加え、ガス透過性培養バッグを用いて、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した。８日目に１リットルの培養液を加え、これを２バッグのガス透過性培養バッグで培養した。同様にして１０日目には４バッグで、１２日目には６バッグで培養を行なった。１４日目に細胞を遠心分離により集め、これを２％ヒトアルブミンを含む生理食塩水約２５０ｍｌに懸濁し、リンパ球懸濁液を調製した。
〔実施例３〕リンパ球の投与
実施例２で調製したリンパ球懸濁液をリンパ球を採取したウイルス感染症患者の静脈より５回投与した。一回目の投与に約１．２×１０10個のリンパ球を使用した。その結果、ヘルペスシンプレックスウイルスによる目の病巣が治癒した。これによりリンパ球投与がヘルペスシンプレックスウイルス感染症に有効であることが明かとなった。
〔実施例４〕血中ＥＢウイルス量の測定
実施例３に示したリンパ球投与を行なった患者血中のＥＢウイルス量をＰＣＲ法により測定した結果、リンパ球投与回数が増えるに従って、血中のＥＢウイルス量が低下していた。このことよりリンパ球投与がＥＢウイルス感染症に有効であることが明かとなった。
〔実施例５〕
ウイスコット・アルドリッチ症候群患者の静脈から採血する代わりにＨＩＶ感染患者の静脈から採血する以外は実施例２と同様にしてリンパ球の調製、培養を行った。ＨＩＶ感染患者のリンパ球もウイスコット・アルドリッチ症候群の患者のリンパ球と同様に増殖させることができ、１４日後に細胞数は９×１０9個に達した。
産業上の利用可能性
本発明は、ウイルス感染症患者から採取した自己由来末梢血を密度遠心し、得られたリンパ球層を集めて細胞懸濁液としたものを、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうことにより、該細胞懸濁液に含まれる自己由来リンパ球を増殖させて得ることを内容とした、該リンパ球を主成分とするウイルス感染症の治療剤もしくは予防剤、あるいはそれらの製造方法であるために、ウイルス感染症の治療もしくは予防に対して著効を発揮できるだけでなく、各種手術や移植後の予防用としても使用することが可能である。
本発明の治療剤もしくは予防剤は、最も治療や予防が困難なウイルス感染症に有効であることから、細菌、真菌、原虫等の治療および予防のために使用できる。更に、本発明の治療剤もしくは予防剤から特定のタイプのリンパ球を選別したり、ある種の細胞を加えたり、あるいは、インターロイキン１２等のサイトカインで活性化したりしてウイルス感染症の治療および予防に使用することができる。また、本発明による治療剤もしくは予防剤の投与時にインターロイキン１２等のサイトカインや、各種抗ウイルス剤を併用することによりウイルス感染症の治療および予防を行うことができる。