(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精液にＡＴＰを加えて、次にヘキソキナーゼを加えて精液中のフラクトースをフラクトース−６−燐酸に変換し、次にホスホグルコースイソメラーゼを加えて変換されたフラクトース−６−燐酸をグルコース−６−燐酸に変換し、続いてＮＡＤとグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼを加えてグルコース−６−燐酸を６−ホスホグルコネートに換え、グルコース−６−燐酸から６−ホスホグルコネートへの反応に基づくエネルギー放出によってＮＡＤからＮＡＤＨを生じ、生じたＮＡＤＨにフラビンモノヌクレオチドの添加とＦＭＮレダクターゼを加えて生成ＮＡＤＨを利用してＦＭＮからＦＭＮＨ２を生成させ、次にミリステイックアルデヒドを加え、さらにＮＡＤＨによって発光するＦＭＮ依存ルシフェラーゼを添加することからなるヒト精子数測定キット。
【請求項２】
ＡＴＰ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、ＮＡＤ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮレダクターゼ、ミリステイックアルデヒド、ＦＭＮ依存ルシフェラーゼおよび緩衝液からなる組成を有するヒト精子数測定キットに用いる反応液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なヒト精子数の検出方法および新規なヒト精子数の測定キットに使用する試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、環境ホルモンの問題からヒト精子数の減少が叫ばれるようになってきた。精子数の測定には、臨床検査室で精液中の精子を顕微鏡下で測定するのが一般的に知られている。しかしながら顕微鏡を用いての測定には熟練が必要とされることと顕微鏡を必要とするので臨床検査室以外の場所では測定は不可能である。広く一般的な測定を可能にするためには、精液を用いての化学的検出方法が便利である。化学的な検出方法としては精液中にのみ存在している特殊な蛋白質の測定、核酸の測定等が知られている。
ところで精液中のフラクトースは精襄由来であって精子数と比例するので、フラクトースの測定が無精子症の診断に使われてきた。しかしながらこの反応はＮＡＤＨの生成量を測定するものであるため分光光度計を必要とし簡単な測定法とは言えない、また前記測定法のなかでＡＴＰのＡＤＰへの変換反応が使われているのでこれを用いて残存ＡＴＰ量からルシフェラーゼ反応等を利用して発光させて測定することができるが、しかしこの場合には正常人ほど発光が弱く、そして異常人ほど強く発光することになるので、一般人からみて感覚的に良〈ない、やはり精子数が多くて生殖力の高い人ほどキラキラと強く発光する精子数測定キットでなければならないがこのような技術はこれまで知られていなかった。」
【０００３】
【発明の解決すべき課題】
上記従来技術についての記述から明らかなように、本発明者の課題は、精液中の精子数の簡便な測定方法の開発であり、測定にはルシフェラーゼ反応を利用し、かつ正常人ほど強く発光し異常者は弱く発光する精子数測定方法の開発である。
【０００４】
【発明の課題を解決する手段】
かかる要請に応えるべく鋭意研究の結果、本発明者らは、ＮＡＤＨの生成反応を利用したフラクトースの測定方法とＮＡＤＨに依存したルシフェラーゼ反応を組み合わせることによって、精子数の多い人ほど強く発光し、少ない人つまり生殖能力の弱い人ほど弱く発光する新規の精子数測定キットを完成させた。
本発明を具体的に説明すると、精液にＡＴＰを０．１〜３ｍＭの濃度好ましくは０．５〜２ｍＭの濃度に添加してヘキソキナーゼ０．０１〜１０単位／ｍｌ反応液好ましくは０．５〜２単位／ｍｌ反応液を加えて精液中のフラクトースをフラクトース−６−燐酸に変換する。次にホスホグルコースイソメラーゼの０．０１〜１０単位／ｍｌ反応液好まし〈は０．５〜２単位／ｍｌ反応液を加えて変換されたフラクトース−６−燐酸をグルコース−６−燐酸に変換する、続いてＮＡＤの０．１〜１０ｍＭ好ましくは１〜２ｍＭとグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの００１単位／ｍｌ反応液好ましくは０．５〜２単位／ｍｌ反応液を添加してグルコース−６−燐酸を６−ホスホグルコネートに換え、グルコース−６−燐酸から６−ホスホグルコネートへの反応に基づくエネルギー放出によって、グルコース−６−燐酸のエネルギーがＮＡＤに移されてＮＡＤＨを生じる。生じたＮＡＤＨにフラビンモノヌクレオチド（以降はＦＭＮと呼称）の０．１〜５ｍＭ好ましくは０．２〜１ｍＭの添加とＦＭＮレダクターゼの０．００１〜５単位／ｍｌ反応液好ましくは０．０５〜０．２単位／ｍｌ反応液を加えて生成ＮＡＤＨを利用してＦＭＮからＦＭＮＨ２を生成させる。次にミリステイックアルデヒドを０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ反応液好ましくは０．２〜２ｍｇ／ｍｌを加え、さらにＦＭＮ依存ルシフェラーゼを０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ反応液好ましくは０．３〜１ｍｇ／ｍｌ反応液加える。こうして精液中のフラクトースの濃度に応じて発光が行われ、発光の程度は精液中の精子数を反映することが判明し本発明を完成した。
【０００５】
本発明の原理を反応チャートで以下に示す。
0004186016.tif 000002
上記反応において、反応液は精液以外は全て前もって混合しておくこともできる、こうして精液を添加することによって上記カスケード反応がスタートし発光が起きる。
再度、本発明の要点のみを述べると、精液中の精子を測定するために、精子数と同じ挙動をとるフラクトースを測定し、精液中のフラクトースは以下のように測定する、まずフラクトースから酵素と試薬を使ってＮＡＤＨを生成させる、次にＮＡＤＨで発光を行うことが出来るルシフェラーゼを添加して発光を行いフラクトース量を測定する。
【０００６】
反応液の基本組成は従って以下のようなものである。
ＡＴＰ０．１〜３ｍＭ（好ましくは０．５〜２ｍＭ）、ヘキソキナーゼ０．０１〜１０単位／ｍｌ反応液（好ましくは０．５〜２単位／ｍｌ反応液）、ホスホグルコースイソメラーゼ０．０１〜１０単位／ｍｌ反応液（好ましくは０．５〜２単位／ｍｌ反応液）、ＮＡＤ０．１〜１０ｍＭ（好ましくは１〜２ｍＭ）、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ０．０１単位／ｍｌ反応液（好ましくは０．５〜２単位／ｍｌ反応液）、フラビンモノヌクレオチド（以降はＦＭＮと呼称）０．１〜５ｍＭ（好ましくは０．２〜１ｍＭ）、ＦＭＮレダクターゼ０．００１〜５単位／ｍｌ反応液（好ましくは０．０５〜０．２単位／ｍｌ反応液）、ミリステイックアルデヒドを０．０１〜１０ｍｇ／ｍＩ反応液（好ましくは０．２〜２ｍｇ／ｍｌ）さらにＦＭＮ依存ルシフェラーゼ０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ反応液（好ましくは０．３〜１ｍｇ／ｍｌ反応液）、さらに緩衝液を添加してｐＨを６から８とする。
【０００７】
【実施例】
反応液の調製と測定に下記のものを含む反応液を調製した。
ＡＴＰ１ｍＭ、ヘキソキナーゼ１．０単位／ｍｌ反応液、ホスホグルコースイソメラーゼ１．０単位／ｍｌ反応液、ＮＡＤ１．５ｍＭ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ１．０単位／ｍｌ反応液、ＦＭＮ０．５ｍＭ，ＦＭＮレダクターゼ０．１単位／ｍｌ反応液、ミリステイックアルデヒドを１ｍｇ／ｍｌ反応液ＦＭＮ依存ルシフェラーゼ０．１ｍｇ／ｍｌ反応液、５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．０，０．１ｍＭＥＤＴＡ、血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍＭメルカプトエタノール。
このうちＦＭＮレダクターゼは１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１ｍＭジチオスライトールを含む４０％グリセリン中に保存したものを使用した。またミリステックアルデヒドは５％血清アルブミンと１％トライトンＸ１００を含む溶液に保存したものを使用した。
上記組成は、安定化のためにいくつかの成分を分割して保存し、精液を添加直前に混合して反応をスタートさせ発光させることもできる。  また安定化のためにＥＤＴＡ、血清アルブミン、２−メルカプトエタノール、ジチオスライトール、界面活性剤、グリセロール等を添加して保存することもできる。
上記反応液３ｍｌに採取後約３０分すぎて液化した精液０．１ｍｌを添加すると黄色の発光が観察された。
【０００８】
【発明の効果】
本発明は反応液は非常に高度で複雑であるが、操作は極めて簡便であり、分光光度計や顕微鏡がなくとも測定でき、しかも精子数が多い生殖力の高い人ほど発光の程度が高いという結果が得られる。やはり生殖力の強い人ほど発光が強いほうが結果を見た人は気分も良く一層はりきるであろう。