(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ（乾燥重量ベースによる）：硫黄１２．５〜１５％、フコース４３〜５７％、ウロン酸２〜９％、分子量１４０００〜２９０００ダルトン、比施光度−１３０°〜−１７０°、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）力価４０〜８０  I.U.／mgおよびＴＴ（トロンビン時間）力価１８〜３０ I.U.／mgで特徴づけられる低分子量を有するフカン硫酸塩。
【請求項２】
次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ（乾燥重量ベースによる）：硫黄１４〜１５％、フコース４４〜５６％、ウロン酸２〜３．５％、比施光度−１６０°〜−１７０°、分子量１７０００〜２５０００ダルトン、ＡＰＴＴ力価６０〜８０ I.U.／mgおよびトロンビン時間力価２３〜３０ I.U.／mgである請求項１によるフカン硫酸塩。
【請求項３】
原料がカッソウあるいはフェオフィシー(Pheophycee)、特にフカス・ベシクロサス(Fucus vesiculosus)である請求項１〜２の何れか１つによるフカン硫酸塩。
【請求項４】
ＡＰＴＴ活性／凝固の全メカニズムと抗トロンビン活性の両方による有効な抗凝固活性とさらに有効な抗血栓活性を有する請求項１〜３の何れか１つによるフカン硫酸塩。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１つによるフカン硫酸塩を有効成分として含有することからなる医薬組成物。
【請求項６】
抗凝固剤または抗血栓剤として使用される請求項５による医薬組成物。
【請求項７】
非経口（特に皮下）、経口または局所投与用の製剤の型である請求項５または６による医薬組成物。
【請求項８】
次の工程
ａ）カッソウあるいはフェオフィシーの粉砕粉末を温または熱水で抽出し、
ｂ）ろ過し、そのろ液を強酸性にｐＨ調節し、沈殿物をろ別し、その上澄液を中性に調節し、
ｃ）上澄液を、１００，０００ダルトンのカットオフを有するメンブレンを備えた限外ろ過装置で濃縮し、次で水で透析しかつ任意に最終液を濃縮し、
ｄ）前工程の終わりに得られる溶液を加塩しかつ水混和性有機溶媒を添加して沈殿した粗抽出物を回収し、
ｅ）粗抽出物を水溶液中、無機の銅塩と過酸化水素水溶液の存在下、高められた温度下でかつ弱酸性もしくは中性のｐＨで、１４，０００〜２９，０００ダルトンの分子量を有する化合物を得るのに必要な時間分解もしくは脱高分子化し、
ｆ）得られる溶液をろ過後に加塩し、低級アルカノールを添加して溶質を沈殿させ、
ｇ）得られる化合物を水に溶解し、イオン交換Ｎａ+樹脂で処理し、
ｈ）溶出液をろ過、弱酸性にｐＨを調節、加塩し、低級アルカノールを添加して化合物を沈殿させることからなる請求項１〜４の何れか１つに記載のフカン硫酸塩を得る方法。
【請求項９】
ａ）工程の抽出が撹拌下約１６時間行われ、
ｂ）工程の強酸性のｐＨ調節が、２〜２．５であり、
ｃ）工程の第１の濃縮が上澄液の約１／４〜１／５にされ、水での透析が約３倍の水で行われ、
ｄ）工程の水混和有機溶媒の添加が約２倍のエタノールまたはアセトンで行われ、
ｅ）工程で、使用される過酸化水素水溶液が８％水溶液で、高められた温度が約５５℃で、弱酸性もしくは中性のｐＨが約６．０〜７．５で、無機銅塩の銅イオンと粗抽出物の重量比が１．３％で、８％過酸化水素水溶液のｍｌと粗抽出物のｇの比が５．５〜３６であり、
ｆ）工程で、低級アルカノールが、エタノール、かつ溶質の２倍量用いられ、
ｈ）工程で、弱酸性のｐＨが６．０〜６．５であり、低級アルカノールがエタノールでかつ溶質の２倍量用いられる請求項８による方法。
【請求項１０】
請求項８または９の工程ａ）〜ｄ）によって得ることができ、次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ（乾燥重量による）：硫黄６〜８％、フコース３１〜３６％、ウロン酸２３〜２７％、分子量４５０，０００〜８００，０００ダルトン、ＡＰＴＴ力価４０〜６０ I.U.／mgを有する粗抽出物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗凝固活性、抗トロンビン活性及び抗血栓活性を有する新規のフカン、カッソウ又はフェオフィシー(Pheophycee)からのそれらの製造方法及び非経口、経口ならびに局所投与用の製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
カッソウから抽出されたフカンが抗凝固活性を有することは、ここ何年かのあいだに知られている(Springer G.F.ら、‘Isolation of anticoagulant fractions from crude fucoidin’ Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1957, 94, 404-409) 。この技術分野での知識は、これらの物質の構造と薬理学的活性の関係の幾つかの態様を理解するために割かれてきた。抗凝固活性は直接には硫酸塩の含有量に依存し、その他にウロン酸の含有量の減少とともに増加することが、立証されている(T.Nishinoら、‘Isolation, purification and characterization of fucosec-ontaining sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kuro-me and their blood-anticoagulant activities’Carbohyd.Res., 186, 119(1989); H.Mori ら、‘Sugar constituents of some sulfated polysaccharides f-rom the sporophylls of wakame (Undaria pinnatifida) and their biologicalactivities’Mar.Algae Pharm.Sci., 2, 109 (1982))。
【０００３】
さらに、凝固時間ＡＴＰＰ（活性化部分トロンボプラスチン時間）とトロンビン時間ＴＴは、分子量が１００００〜５００００ダルトンのフカン抽出物でともに増加することが見いだされている(Nishinoら、‘The relationship between  the molecular weight and the anticoagulant activity of two types of fuc-an sulfates from the brown seaweeds Ecklonia kurome’Agr.Biol.Chem., 55, 791, 1991)。ほかの研究者(V.Grauffelら、‘New natural polysaccharides with potent antithrom-botic activity: fucans from brown alagae’Biomaterials, 10, 363, 1989)は、エイ・ノドソム(A.nodosum)、ピー・カナリキュレータ(P.canaliculatae)、エフ・ベシクロス(F.vesiculosus) から得られたフカン製品について、上記範囲がより広範囲で、１８０００〜８００００ダルトンに拡大することを指摘している。この後者の化合物では、抗凝固活性と同様に分子量に依存する抗トロンビン活性（トロンビン国際単位／化合物ｍｇで示す）が、さらに立証されている。
【０００４】
このために、フカンの薬理学的特性とその構造ならびに薬理学的活性の相関係の両方についてのこの分野での知見は、もっとも活性な製品が、８０，０００ダルトンより低い分子量を有し、さらに高い硫酸含有量を有するもののなかに見いだされることを示している。このことから、フカンの潜在的な治療上の興味を理解することができる。
【０００５】
それらの特定の製造方法に関しては、実質的に２つの異なる手段に対応する方法が、多くの分野の文献に記載されている。もっとも行われているのは、粗抽出物における、フカンのポリマーの異なる物理特性をそれぞれ活用した連続的な分画工程である。通常用いられる分画技術は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、第四アンモニム界面活性剤又は水混和性有機溶媒（例えばエタノール、アセトン）の添加による分別沈殿である。第二の方法は、高分子量のフカンについて、つまり前述の粗抽出物よりも化学的観点で物質をより均一にする、分子量を低くする方法である。第一の方法に関しては、必要な工程の数が、最終産物に存在すべき薬理学的活性の量との直接的に関連して増加することが、当該分野の文献でしばしば認められることを付加えなければならない。この適切な実施例は、以下に要約する２つの刊行物で提示されている。
【０００６】
S.Maurayら（‘Venous antithrombotic and anticoagulant activities of a fucoidan frac-tion’Thromb. and Haemost., 74(5), 1280 (1995))には、化学的ならびに物理化学的観点から特徴づけられるアスコフィラム・ノドソム(Ascophyllum nodosum) から単離したフカンが記載されている：平均分子量２０，０００ダルトン、フコース４８．６％、ウロン酸５．８％、硫黄９％。その製造方法は（ａ）水性媒体中での植物物質の抽出、（ｂ）第四アンモニウム塩による分画、（ｃ）排除クロマトグラフィーでの分画からなる。このようにして得られる化合物は、２０ｍｃｇ／ｍｌの用量で開始するＡＰＴＴ及びＴＴ試験でともに時間の有為な延長を誘導した。ヘパリンと同一のＡＰＴＴ及びＴＴ値を得るために、ヘパリンに用いられる３０〜４０倍量のフカン量が必要とされた。さらに、記載されている血栓実験モデルで得たＥＤ50値の試験によれば、該化合物の活性は、１７倍少ない重量のヘパリンによる活性と同じであった。
【０００７】
T.Nishino らの刊行物(Carbohyd. Res., 186 (1989), 119 (上記参照)には、（ａ）Ecklonia kurome の乾燥粉砕粉末の沸騰水中での抽出、（ｂ）セチルピリジニウムクロライドでの沈殿と４Ｍ-ＮａＣｌ中での沈殿物の溶解、（ｃ）エタノールの添加による沈殿と水中での溶解、（ｄ）塩化カルシウムによる沈殿、上澄液の回収及び凍結乾燥、（ｅ）イオン交換分画カラム及び樹脂床にそれぞれ０．９５Ｍ  ＮａＣｌと２Ｍ  ＮａＣｌ溶液を使用することによる画分の回収、（ｆ）酢酸カルシウムを含むエタノールを加えて行う回収溶液での分画沈殿、（ｇ）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーからなる製造方法が記載されている。２つのフカン製品は、それぞれ物理化学的および化学的パラメーターで特徴づけた：分子量３２，０００ならびに２１，０００ダルトン、硫黄１４．６ならびに１３．３％、フコース５０．１ならびに４９．５％、ウロン酸１．５ならびに３．９％、比旋光度−１４２°ならびに−１２９°。化合物のＡＰＴＴとＴＴ活性は、反対の傾向が立証された。１６７ I.U. ／mgでアッセイしたヘパリン製剤を参照標準として単位／ｍｇで示したＡＰＴＴ力価は、１３６と１４２で標準にかなり近かった。ＴＴ力価は非常に低く、それぞれ１３ならびに１１ I.U.／mg量であった。
【０００８】
他の点では、この化合物は、凝固の全メカニズムの阻害に非常に活性であるが、凝固の最終段階に関与する酵素であるトロンビンの阻害にはほとんど作用しない。それは脱高分子方法に関し、ヨーロッパ特許第４０３，３７７号は、原料物質として硫黄含有量が高いフカンを用いる、フカンの分子量を低くする方法を開示している。この化合物は、塩化カルシウムの存在下の酸性条件（０．０１Ｎ-ＨＣｌ）で海藻の乾燥粉砕粉末を抽出して製造される。次いで、抽出物からの上澄液を中和し、溶質をセチルピリジニウムクロライドの沈殿で回収する。脱高分子化は、化学的方法で、４５℃の温度で高分子量の化合物を酸性条件（１Ｎ-硫酸）に付すことにより、又はHaliotis tuberculataもしくはAplysia californi-ca由来の粗抽出物に含まれる特異的な酵素により、又は選択的に全体的に11.5メガラド（Ｍｒａｄ）の用量を用いるγ照射により行うことができる。最後に得られる化合物は、１３〜２３キロダルトンの分子量と７．８〜１１％の硫黄含有量を有する画分を単離するために、ゲルろ過工程に付される。その発明の生成物は、原料のフカンより２〜２０％の割合で高い硫黄含有量を有しなければならいことが、導き出せる。
【０００９】
ヨーロッパ特許に記載の薬理学的試験によれば、ＡＰＴＴ力価（又はカオリン−ケファリン時間）は、７ I.U.／mg以下であることから非常に低い。記載の表から、ヘパリンとほぼ同一のトロンビン時間を得るためには、参照標準より少なくとも１５倍高いフカンの量が必要とされることが考えられる。さらに、この分野で刊行された別の刊行物(S.Colliecら、‘Anticoagulant properties of a fucoidan fraction’Thromb. Res., 64, 143, 1991)のフカンの脱高分子化については、ＡＰＴＴとＴＴ試験（前記ヨーロッパ特許で示唆されるような酸性条件の脱高分子化と連続的な分画工程により得た、平均分子量が２０，０００のフカンの製品で行った試験）で得た結果が示されている。さらに、試験でヘパリンと同一の活性を得るために、５０倍高い重量のフカンが必要とされたことが言及されている。
【００１０】
A.Nardellaらの刊行物（‘Anticoagulant low molecular weight fucans pro-duced by radical process and ion exchange chromatography of high molecu-lar weight fucans extracted from the brown seaweed Ascophyllum nodosum’Carbohyd.Res., 289, 1996, 201-208)では、５時間６０℃の温度での過酸化水素と銅塩の存在下における、以下の分析データと薬理学的活性を有する２つの高分子量のフカン（Ｆ１とＦ２として示す）のラジカル脱高分子方法が記載されている；製剤Ｆ１：硫黄８．１％、フコース３１．３％、ウロン酸５．７％、分子量５５６，０００ダルトン、ＡＰＴＴ活性９．１ I.U.／mg；製剤Ｆ２：硫黄５．７％、フコース３５．８％、ウロン酸１１．６％、分子量５１６，０００ダルトン、ＡＰＴＴ活性１２．１ I.U.／mg。刊行物でＤＦ１として同定された、Ｆ１から得られる脱高分子化生成物は、以下のとおり特徴づけられた：硫黄９．２％、フコース３６．４％、ウロン酸２．６％、分子量８，３００ダルトン、ＡＰＴＴ活性８．２ I.U.／mg。Ｆ２（ＤＦ２）から得た脱高分子生成物は、硫黄の含有量が９．３％、フコース３２．２％、ウロン酸６．５％、分子量７，８００ダルトン、ＡＰＴＴ活性７．３ I.U.／mgであった。
【００１１】
前記先行技術を要約すると、以下の結論を導くことができる。凝固段階の阻害剤として有用であり得る低分子量かつ高ＡＰＴＴ活性のフカン製品を得るためには、T.Nishino ら（上記）の教示にしたがうべきであるが、そこで開示される単離方法は多くの分画工程からなるので工業的にほとんど使用できない。他方、より高いトロンビン阻害活性又は抗トロンビン活性（ＴＴ）を有する低分子量のフカンの製品が必要であれば、ヨーロッパ特許第４０３，３７７号に開示される脱高分子化方法を選択することが好ましい。しかし、立証されているとおり、このようにして得られる物質のＡＰＴＴ活性はかなり低い。
【００１２】
上記結果として、抗凝固剤として用いられ、より良いＡＰＴＴと抗トロンビン活性のバランスを示し、かつ同時にヘパリンにより匹敵する低分子量のフカンを利用可能にする問題は、この技術分野において以前未解決のままである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の目的は、次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ（乾燥重量ベースによる）：硫黄１２．５〜１５％、フコース４３〜５７％、ウロン酸２〜９％、分子量１４，０００〜２９，０００ダルトン、比施光度−１３０°〜−１７０°、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）力価４０〜８０  I.U.／mgおよびＴＴ（トロンビン時間）力価１８〜３０ I.U.／mgで特徴づけられ、ＡＰＴＴ活性／凝固の全メカニズムと抗トロンビン活性の両方による有効な抗凝固活性とさらに有効な抗血栓活性を有する、カッソウあるいはフェオフィシー、特にフカス・ベシクロサスより得られる低分子量のフカン硫酸塩を提供することである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
硫黄含有量が１４〜１５％、フコース４４〜５６％、ウロン酸２〜３．５％、比施光度−１６０°〜−１７０°、分子量１７，０００〜２５，０００ダルトン、ＡＰＴＴ力価６０〜８０ I.U.／mgおよびＴＴ力価２３〜３０ I.U.／mgである低分子量のフカン硫酸塩の画分が、好ましい。
【００１５】
本発明の化合物は、先行技術の化合物に対して以下の相違点を示すことに留意すべきである：
−トロンビン時間が、 T.Nishinoらの刊行物(Carbohyd.Res., 186, 119, 1989（上記))で開示される低分子量のフカン画分と比較して１．５〜２．５倍高い、
−ＡＰＴＴ活性と硫黄含有量が、ヨーロッパ特許第４０３，３７７号に開示される物質の相当するそれらよりも高い。
【００１６】
さらに、本発明の目的は、該化合物を有効成分として使用する医薬組成物、特に抗凝固剤及び抗血栓剤である。
抗凝固活性は、後述の方法にしたがってＡＰＴＴとＴＴ活性で測定した。
また、皮下投与後のヘパリンに対するＡＰＴＴの生体利用性を試験し、その生体利用性が、参照標準のヘパリンカルシウムに対して２０％（ＡＰＴＴ力価１８６ I.U.／mg）であり、本発明（実施例参照）によればそれぞれＶＯ２６４．ＡとＶＯ２６４．Ｂの製品に対し３９％と４０％であることが見いだされた。クレームした物質は、ヘパリン（重量ベースで）と比較して、ヘパリンカルシウムの生体利用性の２倍であることが立証された。このために、ＡＰＴＴ単位で投与した新規のフカンの生体内の抗凝固活性は、ヘパリンカルシウムの投与後に得られる活性と同じオーダーである。
【００１７】
抗血栓活性は、後述の静脈鬱血の血栓の実験モデルで測定した。アッセイで、１０ｍｇ／Ｋｇ用量のＶＯ２４６．Ｂの製品には血栓は生じなかった。同じ実験条件で、血栓の形成を妨げたヘパリンカルシウム（参照標準）の最少用量は１ｍｇ／Ｋｇで、わずか１０倍低かった。
フカンの特徴づけに用いた分析方法は、以下のとおりであった。
【００１８】
フコースの測定は、参照標準にＬ（−）フコースを用いる R.J.WinzlerのBio-chem.Anal., vol.2, 294, 1955の方法にしたがった。
ウロン酸の測定は、参照標準にＤ（−）グルクロン酸を用いるT.Bitter、H.  MuirのAnal.Biochem., 4, 1962, 330 の方法にしたがった。
硫黄は、参照標準として公知の量の硫黄を含む水溶液（バッチ３０２２６７Ｅ、Ｃ．Ａ．２２８３１、Johnson Matthey-ALFA)を用い、内部標準として０．５Ｍ-ＨＮＯ3に１０００ｍｇ／ｌ濃度で溶解したコバルト硝酸塩水和物ＣＯ（ＮＣＯ3)2・６Ｈ2Ｏ（メルクカタログ、１９７８５０５００号）を用いて、ＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合血漿−原子放出スペクトメトリー）の技術にしたがってアッセイした。硫黄の参照標準（溶液Ａ）と内部標準（溶液Ｂ）の溶液それぞれで満たした２つのビュレットで、さらに溶液Ａのアリコート：１０ｍｌ、８ｍｌ、６ｍｌ、４ｍｌ、２ｍｌを加えて、５つの異なる１００ｍｌ量のフラスコに硫黄濃度が１００、８０、６０、４０ならびに２０ｍｇ／ｌの溶液を調製した。次いで、各メスフラスコに０．８ｍｌの溶液Ｂを加えた。次に、５つの溶液を蒸留水で増量した。
【００１９】
未知の硫黄含有量を含むサンプル溶液は、約６０ｍｇの１００ｍｌメスフラスコに計って調製した。次いで約５０ｍｌの蒸留水を加え、透明な溶液が得られるまで混合した。蒸留水で増量する前に、０．８ｍｌの溶液Ｂをメスフラスコに注いだ。
サンプルの硫黄含有量の測定は、標準溶液で得た検量線（横座標にｍｇ／ｌの硫黄の濃度、縦座標に波長１８２．０３７ｎｍでアッセイした硫黄放出の強度と２２２．６１６ｎｍの波長でアッセイした内部標準（コバルト）の強度の比を示す）用いて行い、未知の力価のサンプルを読んだ。
【００２０】
分子量は、屈折率検出器を備え、容積が30cm x 7.5mm（容積が7.5cm x 7.5mm のTSK-SW(登録商標) のプロジェルプレカラムを有する）のSupelco Progel TSK-G 4000SW(登録商標) とSupelco Progel TSK-G 3000SW(登録商標) を一列につないだ２つのカラムで行うゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した。緩衝液は、０．２Ｍの硫酸ナトリウム水溶液（１０００ｍｌ中２８．４ｇ）であった。流速は０．５ｍｌ／分で、注入容量は５０μl であった。アッセイで用いた分子量標準は、以下のとおりである：マルトヘプトース  分子量１１５３ｇ／モル（シグマ（登録商標）コード番号Ｍ−７７５３）、デキストランＴ−１０（ファーマシアバイオテック（登録商標）コード番号１７−０２５０−０１）、分子量１０，０００（Ｍw) 、デキストランＴ−４０（ファーマシアバイオテック  コード番号１７−０２７０−０１）、分子量４０，０００（Ｍw) 、デキストランＴ−７０（ファーマシアバイオテック  コード番号１７−０２８０−０１）、分子量６９，１００（Ｍw) 、デキストランＴ−５００（ファーマシアバイオテック  コード番号１７−０３２０−０１）、分子量４６０，５００（Ｍw) 。上記各化合物とサンプルの５０ｍｇは、５ｍｌのメスフラスコで計り、溶出溶媒に溶解した。次いで、得た溶液を増量して０．２２μm 孔のミリポア（登録商標）メンブレンでろ過した。測定は、もっとも高分子量の溶液から開始した。注入を３回繰り返し、平均的な保持時間をとった。サンプルは、最後及び相当する測定の保持時間に注入した。
【００２１】
このようにして検量線を作成し、これからサンプルを注入して得られる平均の保持時間を得た。
平均分子量（Ｍ）と保持時間（ｔ）は、ｌｏｇＭ＝Ａｔ3＋Ｂｔ2＋Ｃｔ＋Ｄの方程式による。検量線を用いるフカンの硫酸塩サンプルの保持時間から、ソフトウエアプログラムによってサンプルの平均分子量を測定した。
【００２２】
比旋光度は、ナトリウムＤ線で２０℃の温度で、パーキンエルマーモデルの２４１ポラリメーター(polarimeter)で測定した。
I.U.／mgで示すＡＰＴＴ力価は、 Hemodiagnostica Stago Kit（登録商標）の２６５５１号と羊の血漿（DITTA Glo.Ros., Vercelli) を用いる米国薬局方XXIII-1995（ヘパリンナトリウム、７３７頁参照）にしたがって測定した。参照ヘパリンは、国際標準のIII(NIBSC-ロンドン) であった。後述の試験では、ＶＯ２６４．ＢとＶＯ２６４．Ａのフカンの硫酸塩製品を用い、参照化合物として本出願人が製造したヘパリンカルシウム（バッチ番号９、ＡＰＴＴ力価１８６ I.U.／mg）を用いた。
【００２３】
製品のＡＰＴＴ活性の生体利用性は、皮下投与後にアッセイした抗凝固活性の値を同一化合物の静脈投与後アッセイした値で割って測定した。両方の場合に、活性値は、血液サンプルを動物から採取した時間（横座標）に対する各投与方法のＡＰＴＴ時間（縦座標）をプロットして得た曲線の領域として算出した。ＡＰＴＴ試験は、上記診断キットの折り込みの説明書にしたがって行った。
【００２４】
皮下投与による放出は、２０ｍｇ／０．２ｍｌ濃度に本発明のフカンを生理溶液に溶解して行った。ヘパリンカルシウムには４ｍｇ／０．２ｍｌ濃度を用いた。試験する各化合物には、４匹のウサギ（ニュージーランドシロウサギ−Allevamento del Verbano di Conelli, Arona - イタリア）を用いた。皮下投与方法は、あらかじめ毛を剃った動物の背の一部に上記溶液０．２ｍｌ／Ｋｇを注射して行った。基本条件の耳の末梢静脈から血液（２ｍｌ）を採取し（０時間）、次いで３０分後、さらに１時間の間隔を空けて採取し、実験の開始から全部で８時間になるまで連続して採取した。血漿抗凝固剤として３．８％のクエン酸ナトリウム溶液を用い、クエン酸１部：血液９部の比率で血液と混合した。図１で、試験した各化合物により得た曲線は、以下の記号で示した：ＶＯ２６４．Ｂの製品：＋、ＶＯ２６４．Ａの製品：＊、ヘパリンカルシウム：■。各曲線の実験ポイントは、４つのデータの平均である。活性は、各曲線と参照（ドット）ラインのあいだの領域から算出した。図から分かるように、参照ラインは横座標に平行で、ＡＰＴＴの基本値に相当するポイントで縦軸に交差している。図１は、本発明の化合物の生体利用性が系統的に推測され、最後の血液のサンプリング時間に相当するポイントの領域は参照の線に近いことを、立証している。
【００２５】
静脈投与後の活性のアッセイに５ｍｇ／ｍｌ濃度の上記フカン溶液を調製し、ヘパリンには１ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製した。次いで、この各容液をウサギ（４匹）の耳の末梢静脈に注入した（１ｍｌ容量／Ｋｇ）。血液サンプル（２ｍｌ容量、上記と同一比で３．８％クエン酸ナトリウム溶液のアリコートを加えた）を、それぞれ２、５、１０、１５、２０、３０、６０、９０、１２０分で、次いで一様に１時間の間隔をあけて基本条件の他の耳の末梢静脈から採取した。血液のサンプリング時間に対するＡＰＴＴ値をグラフにプロットして、図２の曲線を得た。領域は、前に詳述したのと同じ方法で算出した。図２の３つの曲線それぞれに特徴的な記号の意味は、図１の記号と同じである。
【００２６】
試験化合物の生体利用性は、皮下投与と静脈投与に関するグラフから、以下の式を適用してそれぞれ得た曲線の領域から得た：
0004149545.tif 000002
I.U.／mgで示すトロンビン時間（ＴＴ）は、 Hemodiagnostica Stago Kitアート番号１２６５９４で測定した。試験は、ＡＰＴＴ試験についての米国薬局方の記載と同じ方法にしたがって行った。
【００２７】
静脈鬱血からの血栓の実験モデルは、基本的に以下の刊行物にしたがって行った：P.Bacherら、‘The thrombolytic potency of LMW heparin compared to u-rokinase in a rabbit jugular vein lysine model’Thromb.Res., 66, 151-158, 1992 ; I.Reyerら、‘Stasis-induced venous thrombosis’in Standardisat-ion of animal models of thrombosis. 17版、Angiological Symposium Kitz-buhel -Proceedings K.Breddin, R.Zimmermann, F.K.Schattiner編集、Stuttga-rt 1983, 99-104 頁;I.Reyerら、‘Failure at different doses of aspirin to modify experimental thrombosis in rats’Thromb.Res., 18, 669-674, 1980。生理溶液（１０ｍｌ容量）に、それぞれ次の化合物を溶解した：２ｍｇ／ｍｌ濃度のヘパリンカルシウム（ロット９、Crinosで製造) 及び１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＶＯ２６４．Ｂのフカン硫酸塩の製品。動物（ニュージーランドシロウサギ−Allevanmento del Verbano di Conelli, Arona -イタリア）を３群（４匹／群）に分け、麻酔後に挿管法で気管を切開した。右の頸静脈の周辺組織は、すべて３ｃｍ遠位に注意深く単離し、結紮糸で血液の流れを減少させた。１０分後に、以下の計画にしたがって１ｍｌ／ｋｇの静脈注射用の丸薬を耳の末梢静脈に投与した：  対照の群：生理溶液、
ヘパリン処置群：２ｍｇ／Ｋｇ、
ＶＯ２６４．Ｂ処置群：１０ｍｇ／Ｋｇ。
【００２８】
２ｃｍの長さの内皮障害を生じるために、結紮糸の上方に注射してから５分後に、静脈を曲がった止血鉗子で挟んだ。直後に遠位に第二の鉗子を用いて、完全に血液の流れを停止させた。曲がった止血鉗子を３０分後に取り除いた。６０分後に、第二の鉗子を同様にした。代わりに、結紮糸は静脈にそのままにした。血栓は、第二の鉗子を除いてから１時間に相当する、実験の開始から２時間後に回復した。血栓は、２４時間８０℃でオーブンで乾燥させ、重量をはかった。この血栓の実験モデルは、実際の血栓の病状に生じるのとかなり近い現象を示す。このモデルでは、静脈の狭窄は、生体内で血栓が生じるのと似た管で完全には血液の流れを妨げない。第二の鉗子を除去して１時間では、最初の狭窄は幾らかの血液を流れさせるために、依然として血栓が生長し得ることに留意すべきである。
【００２９】
この発明のさらなる目的は、新規な低分子量ポリマーを得る方法で、次の工程からなる：
ａ）工程
カッソウあるいはフェオフィシーの粉砕粉末を温水または熱水（例えば９２〜１００℃）で抽出する。この抽出は、撹拌下１６時間程度行うのが好ましい。この工程は、W.A.P.Blackらの刊行物（‘Manufacture of algal chemicals IV. Laboratory scale isola-tion of fucoidin from brown marine algae’J.Sci.Food Agric. 3 (1952)122 〜129）で知られている。
【００３０】
ｂ）工程
得られる懸濁液をろ過し、ろ液のｐＨを強酸性（例えば２〜２．５）に調節させる。この時点で、抽出物中に含有されるアルギン酸塩の一部で構成された沈澱物が生成する。この沈澱物はゼリー様の固体で、ろ過によって上澄液から分離される。ろ過のｐＨは中性に調節する。
【００３１】
ｃ）工程
次いで溶液を、１００，０００ダルトンのカットオフを有するメンブレンを備えた限外ろ過装置を用いて濃縮（例えばもとの容量の約１／４〜１／５）する。次いで、同じ装置で保留液を水（約３倍量）で透析し、必要により最終容量を減少させるため濃縮する。
【００３２】
ｄ）工程
上記の工程の最後で得られる保留液を予め加塩(salting)し、次いで水混和性有機溶媒（例えばエタノール、アセトンなど）を添加（約２倍量）して沈澱させることによって粗抽出物を回収する。
【００３３】
ｅ）工程
次いで、粗抽出物を水溶液とし、無機銅塩と過酸化水素水溶液（例えば８％程度）の存在下、高められた温度下（約５５℃）で、弱酸性もしくは中性のｐＨで、分解と同時に脱高分子化を行う。予備実験で、分子量１４，０００〜２９，０００ダルトンのフカンを得るのに必要な反応時間を定めた。銅イオンと粗抽出物の比（重量％）は１．３％で、過酸化水素８％ｗ／ｖ容量（ｍｌ）と粗抽出物の重量（ｇ）の比は５．５〜３６であるのが好ましい。工程のあいだのｐＨは、約６．０〜７．５が好ましい（米国特許第４０８０３０号；N.Volpiの刊行物‘Analytical techniques for studying structures of dermatan sulfate as low malecular weight heparin’Il Farmaco, 47 (No.5),841 〜853(1992) 参照）。
【００３４】
ｆ）工程
上記反応の工程が終了してから、溶液をろ過し、塩を加え、２倍量の低級アルカノール（例えばエタノール）を添加して溶質を沈澱させる。次いで、溶質を脱水 、乾燥し、この発明による生成物のナトリウム塩と銅（II）の混合塩を回収する。
【００３５】
ｇ）工程
次いで、上記化合物を、Ｎａ+樹脂でイオン交換処理して対応するナトリウム塩に転換する。これは、化合物を水に溶解（５〜７％の濃度）させるためであり、得られた溶液はイオン交換樹脂含有カラムに充填するか、溶液にイオン交換樹脂を混合して、カチオン交換が起こるのに必要な時間撹拌される。この工程は、銅イオン選択電極でモニターできる。樹脂と溶液の容量比は１／２〜２／３に変化させることができる。
【００３６】
ｈ）工程
最後に、溶液をろ過し、ろ液のｐＨを弱酸性（例えば６．０〜６．５）にし、塩を添加し、低級アルカノール（例えばエタノール）を添加（２倍量）し、この発明の化合物を沈澱させる。この沈澱物を回収することにより、この発明のフカンのナトリウム塩を得ることができる。
【００３７】
この発明の他の目的は、カッソウまたはフェオフィシーから上記の工程ａ〜ｄで得ることができる次のパラメータ（乾燥重量ベースによる）：硫黄６〜８％、フコース３１〜３６％、ウロン酸２３〜２７％、分子量４５０，０００〜８００，０００ダルトン、ＡＰＴＴ力価４０〜６０ I.U.／mgを示す粗抽出物を提供することからなる。
【００３８】
この発明の方法により、植物材料から抽出し、酸沈澱によるアルギン酸塩の除去後の粗抽出物を脱高分子化させることができる。従ってヨーロッパ特許第４０３，３７７号に開示の方法によるごとき、より精製した高分子量のフカンを単離する必要がない。
本出願人の実験によれば、粗抽出物ＶＯ２４６．Ｂから得た分子量６５２，０００ダルトン（ＡＰＴＴ力価６７．５ I.U.／mg）の精製フカンを、酢酸ナトリウム／過酸化水素で２４時間、つまり同じ粗抽出物から製品ＶＯ２６４．ＡとＶＯ２６４．Ｂ（それぞれ実施例７と９参照）を得たのと同じ条件下で、脱高分子化することによって単離した低分子量（８，８００ダルトン）のポリマーは、この発明の製品に比較して、薬理活性が減少（ＡＰＴＴ力価２２．１ I.U.／mg）していることが分かった（実施例６）。これは、純粋に高分子量のフカンからは、本発明の生成物を得ることができないことを意味している。
【００３９】
当該分野で利用可能な脱高分子化法が、この発明の方法の工程ａ〜ｄにより単離される粗抽出物を原料として使用すると異なる化合物を生じることは、価値のあることである。粗抽出物を酸性条件（ｐＨ２．２、６０℃、１６時間（実施例４参照））で脱高分子化すると、フコースの量より高いウロン酸の量を含有する化合物が得られる。粗抽出物にγ線照射をして脱高分子化（実施例５参照）すると、硫黄含有量が非常に低く、大量の分解物を含有する化合物が単離される。この発明の化合物は、中間物の分子量を無機銅塩と過酸化水素の存在下で低下させる（実施例７参照）ことによってのみ得ることができる。
【００４０】
この発明によれば、この発明の低分子量のフカン硫酸塩を活性成分として含有することからなる医薬組成物が提供される。このフカン硫酸塩は医薬的に受容な塩の形で使用できる。医薬組成物は、非経口（例えば皮下）、経口または局所投与用の剤型で使用できる。
局所投与用の製剤（実施例１６参照）は、非医薬的な使用であってもよく、そのような目的に適切な組成物を有する。
【００４１】
非経口投与用の服用製剤は、密閉したアンプルの発熱物質を含まない殺菌溶液であってもよく、又は殺菌した水性溶媒にすぐに溶解した、密閉したボトルに含まれる凍結乾燥物であってもよい。水性溶媒としては、公知の保存剤と混合した従来の緩衝液（クエン酸、リン酸など）からつくった等張溶液を用いることができる。経口製剤は、錠剤、コーティングした錠剤、ゼラチンカプセル及び顆粒剤の型で利用可能である。
【００４２】
服用する剤型は、公知の技術にしたがって製造することができる。例えば、特に経口服用する剤型に関しては、通常の技術、例えば粉末又は顆粒の直接圧縮で製造することができ、結合剤、滑剤及び離解剤を含んでいてもよい。
非経口投与用の服用剤型は、１〜９０ｍｇ／ｍｌの活性成分を含んでいてもよく（凍結乾燥については、殺菌溶媒中の化合物の最終濃度についてである）、経口投与用の服用剤型は、２０〜４００ｍｇ／服用単位の活性成分を含んでいてもよい。
【００４３】
局所投与用の組成物は、活性成分を０．１〜２０重量％含むゲル、クリーム、軟膏、溶液の型で用いることができる。
以下の実施例に示す分析データは、乾燥重量に基づいて算出している。
【００４４】
【実施例】
本発明のより良い理解のために以下に実施例を示すが、これらが本発明を限定するものと解されるべきではない。
実施例１：粗フカン硫酸塩の製品ＶＯ２４６．Ａの抽出
１ｋｇのフカス・ベシクロサス乾燥粉末を冷却装置を備えた１５Ｌの反応容器の中で７Ｌの蒸留水に攪拌下懸濁した。懸濁された後（約１５分）、１００℃にて１６時間油浴中で加熱を行なった。懸濁液はその後４０℃で冷却し、１Ｌ遠心分離用大試験管を４個使用して３０００ｒ．ｐ．ｍ．にて２０分間遠心分離を行なった。大試験管の底に残っていたゼリー様固体を、再び６０℃の水に１５分間攪拌下懸濁した。遠心分離を再び行い、次いでオパールのような光彩を放っている上澄液に２００ｍｇのクレアセル(Clarcel) ＦＬＯ／ＭＡ（登録商標、粉末にした焼きパーライト）を加えた。
【００４５】
ろ過を行って６．３Ｌを回収し、約２．１の値にｐＨを下げるために５０ｍｌの３７％塩酸を加えた。遠心分離を再び行い、ゼリー様固体（重量４４．４ｇ  製品コード番号０１９５／９５００５−Ｄ  硫黄０．７％、ウロン酸５１％）を廃棄し、上澄液に３０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを中性にした。その後、１００，０００ダルトン分子量のカット−オフメンブレンを備えた限外ろ過装置アミコン（登録商標）ＣＨ２−Ａにて１．５Ｌの一定容量に保ちながら濃縮を行なった。濃縮の後、同じメンブレンで溶液を３倍量の蒸留水に透析した。保留液（１．６Ｌ）に無水酢酸ナトリウム１１２ｇ（７％ｗ／ｖ）を加え，ついで均一の溶液が得られるまで攪拌した。２倍量のエタノールを加えると溶質は沈殿した。一晩のデカンテーションののち、その固体を脱水して乾燥させた。７９．６８ｇ（収率約８％）の以下の乾燥重量ベースの分析結果を有する化合物（製品ＶＯ２４６．Ａ）が最終的に得られた：硫黄６．５  ％、フコース３１．７％、ウロン酸２３．８％、分子量４９３，０００ダルトン、ＡＰＴＴ力価５３．４ I.U.／mg、ＴＴ力価１８．２ I.U. ／mg。
【００４６】
実施例２：粗フカン硫酸塩の製品ＶＯ２４６．Ｂの抽出
３００Ｌの反応容器に１７５Ｌの蒸留水を注入した。２５ｋｇのフカス・ベシクロサス乾燥粉末を加え、蒸気ジャケットで、９２℃の温度で１６時間加熱した。その後温度を３０℃に下げ、５ｋｇのクレアセルＦＬＯ／ＭＡを加えた。ろ過は、ザイツ(Seitz) Ｋ８００（登録商標）セルロースフィルターを備えたフィルタープレス装置で行なった。ろ液を集め、固形物は６０℃で水（２０Ｌ）に攪拌しながら分散させ、その後それを１時間維持した。ザイツＫ８００フィルターでろ過を再び行ない、ろ液をその後一つに集めて全体で２２０Ｌ得た。溶液を反応容器に移して５．５ｋｇのクレアセルＣＢＲ（登録商標）（粉末にした焼き珪藻土）を加え、その後２５〜３０℃で冷却し、約１．５Ｌの３７％塩酸を添加してｐＨを２に下げ、沈殿を行なった。
【００４７】
攪拌を再びはじめて１５分間継続し、スラリーをザイツＫ８００フィルターでろ過した。次いで、ろ過物の塊を２０Ｌの酸性溶液（ｐＨ２）で洗ったところ、あとに集められた液体は全体で２２０Ｌであった。溶液は、１００，０００分子量カット−オフ  ミリポアカートリッジを備えた限外ろ過アルファラバル（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ）（登録商標）装置へ充填した。まず、溶液を５０Ｌの容量にまで減らすよう濃縮し、次いで３倍量の水に一定の容量で透析を行なった。工程が終わった後、溶液の容量を更に２５〜３０Ｌに減らした。溶液を容器から取り出し、塩化ナトリウムで２％ｗ／ｖの濃度まで加塩し、２倍量のアセトンを加えた。この結果生成した懸濁液をデカンテーションし、沈殿物を回収、脱水し、粉末化して乾燥した。１６６５ｇの粗抽出バッチＶＯ２４６．Ｂ（収率６．７％）が得られた。乾燥重量ベースのの分析結果は以下のとおりである：硫黄７．１％、フコース３２．０％、ウロン酸２５．０％、分子量８００，０００ダルトン、ＡＰＴＴ力価５５ I.U.／mg。
【００４８】
実施例３：粗フカン硫酸塩の製品ＶＯ２４６．Ｃの抽出
先の実施例の実験方法を２５ｋｇの他のバッチのフカス・ベシクロサスを原料として繰り返した。この場合の中間沈殿物のｐＨは２．５であった。２１００ｇ（収率８．４％）の製品ＶＯ２４６．Ｃが得られ、以下の分析データで特徴づけられた：硫黄７．６％、フコース３５．８％、ウロン酸２６．１％、分子量４７０，０００ダルトン、ＡＰＴＴ力価４４ I.U.／mg。
【００４９】
実施例４：粗フカン硫酸塩の製品ＶＯ２４６．Ｂの酸性条件下での脱高分子化
５ｇのＶＯ２４６．Ｂを冷却装置に接続した１Ｌのメスフラスコ中で５００ｍｌの蒸留水に溶かした。１０ｍｌの１Ｎ（規定）塩酸をｐＨを２．２に下げるため加え、加熱を油浴中で６０℃にて１６時間行なった。その後溶液を冷却し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７に中和した。溶液は、アミコンＣＨ２−Ａ限外ろ過装置で一定の容量で、３連続工程で、各工程につき５倍量の蒸留水に透析を行なった。
【００５０】
第一の相（工程Ａ）では、使用した透析メンブレンは３，０００ダルトン分子量カット−オフメンブレンであった。第二の相（工程Ｂ）では、メンブレンは１０，０００ダルトン分子量  カット−オフメンブレンで、第三の相（工程Ｃ）では、メンブレンは１００，０００ダルトン分子量カット−オフメンブレンであった。工程Ａ、ＢおよびＣの透過での溶質は、溶液を減圧濃縮した後に沈殿し、塩化ナトリウムで２％ｗ／ｖの塩濃度まで加塩し、次いで２倍量のアセトンを加えた。このようにして回収した３つの異なる画分の重量を各々測定したところ、５７ｍｇ（製品０１９５／９５０２６−Ａ）、６．５ｍｇ（製品０１９５／９５０２６−Ｂ、これはその後廃棄）および４９６ｍｇ（製品０１９５／９５０２６−Ｃ）であった。
【００５１】
ウロン酸およびフコースの分析は以下のとおりであった：製品０１９５／９５０２６−Ａ  ウロン酸３８．０％、フコース８．９％；製品０１９５／９５０２６−Ｃ  ウロン酸２０．１％、フコース２１．２％。
最後の透析工程（工程Ｃ）から得られた保留液を塩化ナトリウムで２％ｗ／ｖの塩濃度まで加塩し、次いで２倍量のアセトンを加え、溶質を沈殿させた。３２．５％のウロン酸および１６．２５％のフコースを含む２．４ｇ（製品０１９５／９５０２６−Ｄ）が得られた。
【００５２】
実施例５：粗抽出物ＶＯ２４６．Ｂのγ線脱高分子化
１．５ｇの粗抽出物を１５０ｍｌのメスフラスコ中でｐＨ７の０．１Ｍのリン酸緩衝液に物質が溶ける容量まで加えて溶かした。その溶液を３０ｍｌのバイアル５個に分配し、密封し、γ線処理のためガンマトン(Ganmmaton) 社(Guanzate-Como) へ送った。２個のバイアルは２．５メガラドのγ線照射を行い、他の２個は２０メガラドで行なった。２つの処理したサンプルの各々について、１つのバイアルに塩化ナトリウムで２％の塩濃度まで加塩し、次いで２倍量のアセトンを加え溶質を沈殿させた。
【００５３】
２．５メガラドで処理した溶液から、５１％ｗ／ｗのリン酸エステル力価の物質を有する４６０ミリグラムの化合物（製品０１９５／９６０４１−Ａ）を得た。含有されていた粗抽出物の重量はそれ故２２５ｍｇで、原料の粗抽出物から計算すると収率７５％であった。純粋な化合物に基づく分析データは以下のとおりである：硫黄５．１％、ウロン酸１６．１％、フコース１９．３％、分子量３８，５００ダルトン。
【００５４】
２０メガラドのγ線照射処理を行なった溶液（製品０１９５／９６０４１−Ｄ）から回収した製造物の重量は２１１ｍｇで、リン酸エステル含有量７１％ｗ／ｗの物質を含んでいた。その結果、含有されていた粗抽出物の真の重量は６１．２ｍｇ（原料の粗抽出物をもとにすると収率２０％）であった。分析結果は以下のとおりである（純粋な化合物を参照）：硫黄５．５５％、ウロン酸３．３８  ％、フコース５．７９％、分子量５，６００ダルトン。
【００５５】
実施例６：精製した高分子量のフカン硫酸塩（製品ＶＯ２４８．Ａ）の製造およびその後の過酸化水素存在下における酢酸銅中での２４時間の脱高分子化（製品ＶＯ２６９．Ａ）
２００ｇの粗抽出製品ＶＯ２４６．Ｂを１０Ｌの水に溶かした。２００ｇの塩化ナトリウムを次いで加え、均一な溶液が得られるまで攪拌を行なった。７．５Ｌ（０．７５容量）のアセトンを加え、一晩放置した。沈殿物を集め、脱水および乾燥後に１２６．５ｇを得た。ついで上澄液に１２．５Ｌのアセトン（全体の溶媒の２倍量）を加え、以下の分析値を有する６８．３ｇの精製フカン硫酸塩（製品ＶＯ２４８．Ａ）を回収した：硫黄８．９％、フコース４８．５％、ウロン酸９．７％、分子量６５２，０００ダルトン、比施光度−１１２．８°、ＡＰＴＴ力価６７．５ I.U.／mg。
【００５６】
得られた化合物の１０ｇを２００ｍｌの蒸留水に溶解した。溶液は、容器に移し、ついで油浴により５５℃での加熱を攪拌しながら行なった。酢酸銅一水和物４００ｍｇを加え、その後１Ｎ水酸化ナトリウムを２、３滴を加えて溶液のｐＨを７．５に中和した。
ペリスタポンプにより８％ｗ／ｖ過酸化水素溶液を２．３ｍｌ／時間の流速で加えた。反応時間は２４時間で、ｐＨは６．０〜６．５である（添加した過酸化水素の全体の容量：５５ｍｌ）。次いで、ザイツＫ８００フィルターでろ過を行い、４００ｍｌの透明な溶液を得、２８ｇの無水酢酸ナトリウムを加えてその後、２倍量のエタノールを加えた。ゴム状の沈殿物を７０ｍｌの蒸留水に溶解し、それに３０ｍｌのアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）（登録商標）ＩＲＣ７１８樹脂（Ｎａ+型）を加え、６時間攪拌しながら放置した。最終的に溶液は、無色−わずかにオパールのような光彩を放ってみえ、その溶液に１０ｇのクレアセルＣＢＲを加えたのち、溶液を半融ガラスろ過器でろ過した。氷酢酸を幾滴か加えることにより、ｐＨを６．５にし、溶液を無水酢酸ナトリウムで７％ｗ／ｖの塩濃度まで加塩し、次いで２倍量のエタノールを加え溶質を沈殿させた。脱水および乾燥後に、１２．９％の硫黄、５３．２％のフコース、２．５％のウロン酸を含み、分子量８，８００ダルトン、比施光度−１４．８°、ＡＰＴＴ力価２２．１ I.U.／mgの２．９０ｇの脱高分子化された製造物（製品ＶＯ２６９．Ａ−収率２９％）を得た。
【００５７】
実施例７：異なる時に製品ＶＯ２６０．Ａ、ＶＯ２６４．Ａおよび０１９５／９６０４４−Ｃを生じる、粗抽出物ＶＯ２４６．Ｂの銅塩による脱高分子化
５０ｇのＶＯ２４６．Ｂを１Ｌの水に溶解した。溶液は５５℃で加熱し、２ｇの酢酸銅一水和物を加え、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に合わせた。この段階で、４６ｍｌ／時間の流速に設定したペリスタポンプを使用して８％ｗ／ｖ過酸化水素溶液を加え、３０％水酸化ナトリウム溶液を加えることによりｐＨを６〜６．５に保った。６時間後、１／３容量（４２５ｍｌ）の溶液を取り出し、無水酢酸ナトリウムで５％ｗ／ｖの塩濃度まで加塩し、次いで２倍量のエタノールを加えた。そのようにして得られた沈殿物（９ｇ）を水に溶解し濃度を５％ｗ／ｖ（１８０ｍｌ）とし、残渣を溶解するために使用した水の容量の約半分のベッドを有するアンバーライトＩＲＣ７１８（Ｎａ+型）樹脂で充填したカラムで精製した。流速は４０ｍｌ／時間とした。カラム溶出液は、無水酢酸ナトリウムにて加塩し、その後既に先に述べた工程に従い、エタノールにて沈殿させた。以下の分析結果を有する製品バッチＶＯ２６０．Ａ７．０ｇ（収率４２％）を得た：硫黄９．９％、フコース３８．３％、ウロン酸１５．１％、分子量８８，５００ダルトン、比施光度−１１９．６°、ＡＰＴＴ力価５８．１ I.U.／mg、ＴＴ力価１４．８ I.U.／mg。
【００５８】
２４時間後、溶液の容量は２Ｌであった。１Ｌに、さきに述べた製品ＶＯ２６０．Ａを得のと同じ工程を行ない、１４．５％の硫黄、５６．２％のフコース、２．３％のウロン酸、分子量２２，５００ダルトン、比施光度−１６５．０°、ＡＰＴＴ力価７４．９ I.U.／mg、ＴＴ力価２３ I.U.／mgの２．６ｇ（収率１５．６％）の製品バッチＶＯ２６４．Ａを得た。
【００５９】
残った脱高分子化溶液のさらなるアリコートに、さらに２４時間かけて過酸化水素を加えた（全体としての脱高分子化時間は４８時間）。最終的に、溶液は上述のように２つのアリコートとして処理し、この場合、濃酢酸を添加して溶液のｐＨを６．７にあわせ、直ちにエタノールにて沈殿させた。１ｇ（収率６．２％）の沈殿物のバッチ０１９５／９６０４４−Ｃが得られた。化合物は、以下の分析パラメーターにより特徴づけた：硫黄１５％、分子量９，７００ダルトン、ＡＰＴＴ力価２３．６ I.U.／mg、ＴＴ力価６．７ I.U.／mg。
【００６０】
実施例８：粗フカン製品ＶＯ２４６．Ｃの６時間での脱高分子化および製品ＶＯ２６０．Ｃの単離
２００ｇのその化合物を４Ｌの蒸留水に溶解した。先の実施例６に開示の方法と同様に行なわれた予備試験により、反応時間は６時間とした。溶液は５５℃で攪拌しながら加熱し、８ｇの酢酸銅一水和物を加えた。約８ｍｌの３０％水酸化ナトリウムを加えることにより、ｐＨは７．５に合わせた。この時、８％ｗ／ｖ過酸化水素溶液を流速約１８３．３ｍｌ／時間（全体で約１．１Ｌ）で加えた。反応の間、少量の３０％水酸化ナトリウム溶液を適当に加えることにより、ｐＨは６．５〜７．０の値に保った。最終的に溶液を酢酸ナトリウム三水和物で１１％ｗ／ｖの塩濃度まで加塩し、その後２倍量のエタノールを加えた。沈殿物を集め、脱水して乾燥させた。
【００６１】
７９ｇの固体をこのようにして回収し、１．２Ｌの蒸留水に溶解した。溶液の濁りを少なくとも幾分取り除くために、３，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて遠心分離を行なった。８００ｍｌのアンバーライトＩＲＣ７１８（Ｎａ+型）を加え、スラリーを攪拌しながら一晩放置した。溶液を回収し、樹脂を２倍量の蒸留水で洗った。あらかじめ１５ｇのクレアセルＣＢＲを積層したブフナーろうとでろ過を行い、容量が約２．８ＬでｐＨが８．９の透明な溶液を得た。その後氷酢酸を２、３滴加えることによりｐＨを６．５に合わせた。その後溶液を無水酢酸ナトリウムで７％ｗ／ｖの塩濃度まで加塩し、その後２倍量のエタノールを加えることにより沈殿させた。脱水および乾燥後、以下の分析結果を有する６０．１ｇ（収率３０．１％）の製品ＶＯ２６０．Ｃを得た：硫黄１２．６％、フコース４７％、ウロン酸８．１％、分子量２９，０００ダルトン、比施光度−１３８．２°、ＡＰＴＴ力価４９．６ I.U.／mg、ＴＴ力価２１ I.U.／mg。
【００６２】
実施例９：粗フカン硫酸塩製品ＶＯ２４６．Ｂの銅塩による２４時間での脱高分子化および製品ＶＯ２６４．Ｂの単離
１００ｇのＶＯ２４６．Ｂを２Ｌの水に溶解させた。先の実施例６に開示の方法と同様に行った予備試験により、反応時間は２４時間とした。４ｇの酢酸銅一水和物を加えた。ｐＨを３０％水酸化ナトリウム溶液にて７．５に中和し、次いで５５℃で加熱した。ペリスタポンプを使用して、ｐＨを６〜６．５の間に保ちながら８％ｗ／ｖ過酸化水素溶液を加えた（流速４５．８ｍｌ／時間）。２４時間後、過酸化水素の添加容量は１１００ｍｌであった。最終的な溶液はオパールのような光彩を放ってみえ、それを遠心分離した。上澄液に無水酢酸ナトリウムを塩濃度が７％ｗ／ｖになるまで加えた。
【００６３】
溶質を２倍量のエタノールで沈殿させ、脱水して乾燥した。２３．２５ｇを回収し、それを４００ｍｌの水に溶解した。２６０ｍｌのアンバーライトＩＲＣ７１８（Ｎａ+型）樹脂を加えて攪拌を開始し、一晩続けた。ろ過を半融ろうとにて行い、その後フィルターを１００ｍｌの蒸留水で洗った。酢酸を加えることにより、ろ液のｐＨを７に合わせ、無水酢酸ナトリウムを塩濃度が７％ｗ／ｖになるまで加え、２倍量のエタノールを次いで加えた。脱水および乾燥後、１６．４ｇの固形物（製品ＶＯ２６４．Ｂ  収率１６．４％）を得た。以下の分析結果がみられた：硫黄１４．３％、フコース４４．２％、ウロン酸３．４％、分子量１７，５００ダルトン、比施光度−１６８．６°、ＡＰＴＴ力価６９．５ I.U.／mg、ＴＴ力価２８ I.U.／mg。
【００６４】
実施例１０：粗硫酸塩ＶＯ２４６．Ｃの銅塩による４８時間での脱高分子化および製品ＶＯ２６７．Ａの単離
２００ｇの粗抽出物を４Ｌの水に溶解させた。先の実施例６に開示の方法と同様に行なわれた予備試験により、反応時間は４８時間とした。５５℃で加熱を行い、その後攪拌しながら８ｇの酢酸銅一水和物を加えた。ｐＨを３０％水酸化ナトリウム溶液８ｍｌにて７．５に中和した。この時、８％ｗ／ｖ過酸化水素溶液を、流速２３ｍｌ／時間で加えた（全体の量は１．１Ｌ）。少量の３０％水酸化ナトリウム溶液を加えることにより、反応中のｐＨを６．０〜６．５の間に保った。４８時間後、ザイツＫ８００フィルターを使用してろ過した。酢酸ナトリウム三水和物を塩濃度が１１％ｗ／ｖになるまで加え、溶質を２倍量のエタノールで沈殿させた。ガム状の残渣を脱水および乾燥して５７．５ｇを得た。それを再び９００ｍｌの蒸留水に溶解し、６００ｍｌのアンバーライトＩＲＣ７１８（Ｎａ+型）樹脂を加えた。
【００６５】
スラリーを攪拌しながら一晩放置した。あらかじめクレアセルＣＢＲを積層した半融ろうとにてろ過を行い、得られた溶液を再び同じろ過器に通してろ過した。濃酢酸を２、３滴加えることにより、ろ液のｐＨを６．５に合わせ、無水酢酸ナトリウムを塩濃度が７％ｗ／ｖになるまで加え、溶質を２倍量のエタノールを加えて沈殿させた。固形物（製品ＶＯ２６７．Ａ）を集め、脱水および乾燥して４２．８ｇ（粗抽出物をもとにした収率２１．４％）を得た。化合物の分析結果は以下のとおりである：硫黄１４．２％、フコース４９．８％、ウロン酸５．３％、分子量１４，７００ダルトン、比施光度−１３９．６°、ＡＰＴＴ力価４５ I.U.／mg、ＴＴ力価１９ I.U.／mg。
【００６６】
実施例１１：粗フカン硫酸塩ＶＯ２４６．Ａの銅塩による１８時間での脱高分子化および化合物ＶＯ２４６．Ａ／１の単離
５０ｇのＶＯ２４６．Ａ化合物を水に溶解した。先の実施例６に開示の方法と同様に行なわれた予備試験により、反応時間は１８時間とした。反応中のｐＨを少量の３０％水酸化ナトリウム溶液を加えて７．０〜７．５に保った。その後、同量の酢酸銅および８％ｗ／ｖの過酸化水素溶液を加えて（全体の添加量は２７７５ｍｌ）、実施例６の工程を行なった。以下の分析結果を有する１１．５ｇの化合物（ＶＯ２４６．Ａ／１）を得た：硫黄１４．８％、フコース４９．３％、ウロン酸２．１％、分子量２５，０００ダルトン、比施光度−１６２°、ＡＰＴＴ力価２７ I.U.／mg。
【００６７】
薬理学的使用又はそうでないもの両方の製剤を開示する以下の実施例１２〜１５では、「低分子量フカン硫酸塩」の表現は、まさに本発明の限定範囲内のフカン硫酸塩の製品を意味する。
【００６８】
実施例１２：皮下投与用製剤
低分子量フカン硫酸塩  ２０ｍｇ
蒸留(bidistilled) 水  ０．２ｍｌ
【００６９】
実施例１３：静脈投与用製剤
低分子量フカン硫酸塩  ８０ｍｇ
蒸留水  ４ｍｌ
【００７０】
実施例１４：経口投与（錠剤）用の製造
低分子量フカン硫酸塩  １８０ｍｇ
マンニトール  ３００ｍｇ
サッカロース  ２４０ｍｇ
ポリビニルピロリドン  １４ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ９ｍｇ
【００７１】
0004149545.tif 000003
上記に香料と保存剤および蒸留水を加えて１００ｇとした。
【００７２】
実施例１６：局所投与用の他の製剤
化粧用の水性ローション：
低分子量フカン硫酸塩  ０．５〜５ｇ
プロピレングリコール  １．５ｇ
エチルアルコール  １５ｍｌ
上記に香料と保存剤および蒸留水を加えて１００ｇとした。
洗浄活性がある乳濁液：
低分子量フカン硫酸塩  ４ｇ
ＰＥＧ  １５グリセリル  リシノール酸エステル  １４ｇ
ポリソルベート２１  ７ｇ
アーモンド油  ３ｇ
上記に香料と保存剤および蒸留水を加えて１００ｇとした。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によれば、トロンビン時間が、従来の低分子量のフカン画分と比較して１．５〜２．５倍高く、ＡＰＴＴ活性と硫黄含有量も従来より高い、ＡＰＴＴ活性／凝固の全メカニズムと抗トロンビン活性の両方による有効な抗凝固活性、ならびにさらに有効な抗血栓活性を有する低分子量のフカン硫酸塩を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】血液サンプルをウサギの末梢静脈から採取した時間（横座標）に対する製品の皮下投与のＡＰＴＴ時間（縦座標）をプロットした図である。
【図２】血液サンプルをウサギの末梢静脈から採取した時間（横座標）に対する製品の静脈投与のＡＰＴＴ時間（縦座標）をプロットした図である。
【図１】
0004149545.tif 000004
【図２】
0004149545.tif 000005