(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００〜５００kg/cm2の加圧下でノニオン界面活性剤と混合し、攪拌処理されてなることを特徴とする生理活性物質固定化用担体。
【請求項２】
担体がアルキル化シリカゲルである請求項１記載の生理活性物質固定化用担体。
【請求項３】
ノニオン界面活性剤がショ糖脂肪酸エステルである請求項１又は２記載の生理活性物質固定化用担体。
【請求項４】
生理活性物質が、酵素、抗体、レクチン、およびレセプターからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれか１項記載の生理活性物質固定化用担体。
【請求項５】
担体を、１００〜５００kg/cm2の加圧下でノニオン界面活性剤と混合し、攪拌処理することを特徴とする生理活性物質固定化用担体の製造法。
【請求項６】
担体がアルキル化シリカゲルである請求項５記載の生理活性物質固定化用担体の製造法。
【請求項７】
ノニオン界面活性剤がショ糖脂肪酸エステルである請求項５又は６記載の生理活性物質固定化用担体の製造法。
【請求項８】
生理活性物質が、酵素、抗体、レクチン、およびレセプターからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項５〜７のいずれか１項記載の生理活性物質固定化用担体の製造法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載の生理活性物質固定化用担体に酵素が吸着保持されていることを特徴とする固定化酵素製剤。
【請求項１０】
酵素がコレステロールオキシダーゼまたはリパーゼである請求項９記載の固定化酵素製剤。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載の生理活性物質固定化用担体の懸濁液と、酵素溶液を混合することにより酵素を担体に吸着保持せしめることを特徴とする請求項１０記載の固定化酵素製剤の製造方法。
【請求項１２】
酵素がコレステロールオキシダーゼまたはリパーゼである請求項１１記載の固定化酵素製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、固定化用担体、固定化酵素製剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生理活性物質、とりわけ酵素、例えば、コレステロールをコレスト−５−エン−３−オン（コレステノン）に変換する際に使用する、コレステロールオキシダーゼ（以下「ＣＯＤ」ともいう）は、例えば Sepharose 4B のようなポリマーに固定化された形態で使用されている。このような固定化酵素製剤は、水系の反応系ではＣＯＤ活性を発揮するが、非水系有機溶剤中では酵素活性を殆ど又は全く発揮しない。ＣＯＤの基質であるコレステロールは、本来脂溶性であるため、水系での反応効率は悪い。従って、酵素等の生理活性物質を固定化して、有機溶剤中でもその生理活性を充分に発揮させることができる生理活性物質固定化用担体、それを利用した生理活性物質固定化製剤の開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、有機溶剤中でもその生理活性を充分に発揮させることができる生理活性物質固定化用担体、それを利用した固定化製剤、特に固定化酵素製剤、及びその製造方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ノニオン界面活性剤で処理されてなることを特徴とする生理活性物質固定化用担体を提供するものである。
好ましい担体は、アルキル化シリカゲルであり、好ましいノニオン界面活性剤は、ショ糖脂肪酸エステルである。また好ましい生理活性物質は、酵素、抗体、レクチン、およびレセプターからなる群から選ばれる少なくとも１種である。
本発明はまた、酵素が、上記生理活性物質固定化用担体に吸着保持されていることを特徴とする固定化酵素製剤を提供するものである。
好ましい酵素としては、コレステロールオキシダーゼが挙げられる。
本発明はまた、担体を酵素吸着剤処理し、該酵素吸着剤処理された担体に酵素を吸着保持せしめることを特徴とする固定化酵素製剤の製造方法を提供するものである。
本発明の方法において、好ましくは、酵素吸着剤処理された担体の懸濁液と、酵素溶液を混合することにより酵素を担体に吸着保持せしめる。
また、担体の懸濁液と酵素吸着剤の溶液とを混合し、加圧下で攪拌処理することにより、担体を酵素吸着剤で処理することも好ましい。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明に使用する担体としては、固定化酵素製剤の担体として使用されているもの、例えば、シリカゲル、けいそう土、セライト、ゼオライト、多孔性ガラス、イオン交換樹脂等が挙げられる。これらのうち、シリカゲル、とりわけアルキル化シリカゲル、特に長鎖アルキル化シリカゲル、又はシクロデキストリン結合アルキル化シリカゲルが好ましい。アルキル基としては、炭素数８〜１８程度のもの、例えば、オクタデシル基やオクチル基等が好適である。
【０００６】
本発明に使用する酵素吸着剤としては、ノニオン界面活性剤が好ましく、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、マンニトールジアルキルエーテル、ソルビトールジアルキルエーテル、グリセリンモノアルキルエーテル等が挙げられる。これらのうち、ショ糖脂肪酸エステル、特に炭素数１２〜１８の脂肪酸のエステル、例えば、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル等が好ましい。
【０００７】
本発明の、酵素吸着剤で処理した担体は、処理前の担体１００重量部に対して好ましくは１０〜５０重量部、さらに好ましくは２０〜４０重量部の酵素吸着剤を含むものである。本発明の、酵素吸着剤で処理した担体は、例えば、処理前の担体の懸濁液（例えば、メタノール水懸濁液）と酵素吸着剤の溶液（例えば、水溶液）を混合し、加圧下（例えば、１００〜５００kg/cm2、好ましくは３００〜４００kg/cm2）で、１０〜４０℃で、１０〜２０時間、好ましくは１２時間〜１６時間攪拌混合することにより製造できる。
【０００８】
本発明の固定化酵素製剤の酵素としては、任意の酵素が使用できるが、好ましいものとしては、ＣＯＤ（例えば、微生物由来の東洋紡（株）製造のＣＯＤ）及びリパーゼが挙げられる。
酵素吸着剤で処理した担体に酵素を吸着保持させるには、例えば、酵素吸着剤で処理した担体を、リン酸緩衝液等に懸濁し、リン酸緩衝液や酢酸アンモニウム緩衝液等に溶解した酵素（例えば、ＣＯＤのリン酸緩衝液、リパーゼの酢酸アンモニウム緩衝液）と接触させ、吸着させる。接触は、通常は液温０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で、１２時間以上、好ましくは１５時間以上攪拌混合すればよい。酵素吸着剤で処理した担体に対する酵素の担持量は、担体１００重量部に対して５〜２０重量部程度が好ましく、酵素の量が２０重量部を越えると、吸着率が低下する。
【０００９】
こうして得られた本発明のＣＯＤ固定化酵素製剤を使用して、非水系有機溶剤中でコレステロールをコレスト−５−エン−３−オン（コレステノン）に変換する際に使用する溶剤としては、ヘキサン、イソオクタン等の炭化水素系溶剤、酢酸エチル、クロロホルム、アルコール系の溶剤等が挙げられる。しかし、ショ糖脂肪酸エステルで被覆した長鎖アルキル化シリカゲルから調製したＣＯＤ固定化酵素製剤を、非水系有機溶剤中で反応させる際には、ヘキサン、イソオクタン等の炭化水素系溶剤が好ましく、酢酸エチル、クロロホルム、及びアルコール系の溶剤は、酵素吸着剤としてのショ糖脂肪酸エステルの脱着が起こるため好ましくない。
また、こうして得られた本発明のリパーゼ固定化酵素製剤を使用して、非水系有機溶剤中でエステル分解またはエステル合成を行う際に使用する溶剤としては、ヘキサン、イソオクタン等の炭化水素系溶剤、酢酸エチル、クロロホルム、アルコール系の溶剤等が挙げられる。
【００１０】
【発明の効果】
本発明の固定化酵素製剤は、酵素を、酵素吸着剤で処理した担体（例えば、ショ糖脂肪酸エステルで被覆した長鎖アルキル化シリカゲル、又はシクロデキストリン結合アルキル化シリカゲル）と共に時間をかけて充分接触させ、吸着させているため、非水系有機溶剤中で使用しても酵素活性を充分に発揮させることができる。
【００１１】
実施例１、２、比較例１
担体（オクタデシルシリカゲル）（以下「ＯＤＳ」と略す）１０ｇを、５０％メタノール水溶液中に懸濁し、これに酵素吸着剤（ショ糖パルミチン酸エステル）2.５ｇを水５０mlに溶解したものを加え振とうした。これをパッカー（内容積15mlのステンレス製の筒）内に入れ、５０％メタノール水溶液を用いて、表１に示す圧力下、温度２０℃で１６時間定圧通液（リサイクル）した。ろ過して懸濁物を回収し、５０％メタノール水溶液で洗浄後、乾燥し、生成したショ糖脂肪酸エステルを吸着させたＯＤＳの重量（Ａ）を求めた。ろ液から回収したショ糖パルミチン酸エステルの重量から、吸着したショ糖パルミチン酸エステルの重量（Ｂ）を求め、ショ糖パルミチン酸エステルの吸着率を次式より求めた。
吸着率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
更に、酵素吸着剤を吸着させたＯＤＳ0.1 ｇをヘキサン５ml中に懸濁し、温度２０℃で６時間攪拌した後、溶出したショ糖パルミチン酸エステルの重量（Ｃ）を測定し、吸着しているショ糖パルミチン酸エステルが溶出してくる割合（Ｃ／Ｂ×１００）を求め、脱着率とした。結果を表１に示す。
【００１２】
【表１】
0004061415.tif 000002
比較例１に示すように、１kg／cm2 の圧力下では、ショ糖パルミチン酸エステルの吸着率は低く、脱着率は高いのに対して、実施例１及び２に示すように、４００kg／cm2 以上の圧力下では、ショ糖パルミチン酸エステルの吸着率は高く、脱着率は極めて低くなる。
【００１３】
実施例３〜６
実施例１で得られた、酵素吸着剤を吸着させたＯＤＳ0.５６ｇをリン酸緩衝液（pH7.０）１０ml中に分散し、氷冷下で、リン酸緩衝液３mlに溶解したＣＯＤを0.０５ｇ、0.１ｇ、0.２５ｇ、0.５ｇ加え、一昼夜（１５時間）攪拌した。生成物（固定化酵素製剤）をろ過し、同一溶媒で洗浄後、乾燥して秤量した。ろ液中のＣＯＤ量を分光学的に求め、ＣＯＤの吸着率を求めた。結果を表２に示す。
【００１４】
【表２】
0004061415.tif 000003
【００１５】
試験例１〜７
基質であるコレステロール（１０μ mol）に、実施例５で得られた本発明の固定化酵素製剤0.１ｇを添加し、溶媒としてメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル、又はヘキサンを用いて、４０℃で１０分間反応させた。また、固定化していないＣＯＤを用いて、同様にヘキサン中で反応を行った（試験例７）。生成するコレステノンをHPLCにより定量し、収率を求めた。結果を表３に示す。
【００１６】
【表３】
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実施例５で得られた本発明の固定化酵素製剤は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル中では酵素活性が低いが、酢酸エチル、又はヘキサン中では酵素活性が高い。しかし、固定化していないＣＯＤは、ヘキサン中で酵素活性を全く発揮しないことがわかる。
【００１７】
試験例８〜１２
試験例６で使用した固定化酵素製剤を、濾過、又は吸引濾過で回収し、試験例６と同一の条件で、酵素反応に用いる操作を繰り返し、生成するコレステノンを同様に定量した。結果を表４に示す。
【表４】
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本発明の固定化酵素製剤は、繰返し使用しても、高い酵素活性を維持することがわかる。
【００１８】
実施例７〜９
実施例１で得られた、酵素吸着剤を吸着させたＯＤＳ0.4 ｇを酢酸アンモニウム緩衝液（pH5.6)10ml中に分散し、氷冷下で、酢酸アンモニウム緩衝液10mlに溶解したリパーゼ( 東洋紡績株式会社製、商品名ＬＰＬ−３１１) を0.05ｇ、0.1 ｇ、0.2 ｇ加え、一昼夜 (20時間) 攪拌した。濾過にて回収し、洗浄後乾燥して秤量した。回収したリパーゼ量を分光学的に求め、吸着したリパーゼ量を吸着率として算出した。結果を表５に示す。
【００１９】
【表５】
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【００２０】
試験例１３〜１９
基質である（±）−フェニルエタノール（50mM/0.1ml=5μmol)に、実施例７で得られた本発明の固定化酵素製剤0.02ｇを添加し、溶媒としてエメタノール、イソプロパノール、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、又はイソオクタンを用いて、４０℃で１０分間反応させ、生成するエステルをHPLCにより定量して、反応率を求めた。また、固定化していないリパーゼを用いて、同様にイソオクタン中で反応を行った（試験例１９）。結果を表６に示す。
【００２１】
【表６】
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実施例７で得られた本発明の固定化リパーゼ製剤は、すべての溶剤中で高い酵素活性を示すのに対して、固定化していないリパーゼはイソオクタン中で酵素活性を全く発揮しないことがわかる。
【００２２】
試験例２０〜２４
試験例１８で使用した固定化リパーゼ製剤を、濾過、又は吸引濾過で回収し、試験例１８と同一の条件で、酵素反応に用いる操作を繰り返し、生成するエステルを同様に定量した。結果を表７に示す。
【表７】
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本発明の固定化酵素製剤は、繰返し使用しても、高い酵素活性を維持することがわかる。