(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［1］
【化１】
0004197815.tif 000003
で示される３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールのＲ体の資化能を有し、該Ｒ体を単一炭素源として生育しうるシュードモナス属に属する微生物を、３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール［１］のラセミ体を基質として含有する培地中で培養し、該培養物より３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール［１］のＳ体を分取することを特徴とする該Ｓ体の製法。
【請求項２】
３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール［１]のラセミ体を単一炭素源とする培地中で培養することを特徴とする請求項１の３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール［１］のＳ体の製法。
【請求項３】
基質として３−クロロもしくはブロモ−１，２−プロパンジオールを用いる請求項１または２の３−クロロもしくはブロモ−１，２−プロパンジオールのＳ体の製法。
【請求項４】
微生物がシュードモナス（Pseudomonas） sp. DS-SI-5株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５９６）である請求項１、２または３に記載のＳ体の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は下記式
【化２】
0004197815.tif 000002
で示される３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールのＲ体(以下単にＲ体［１]と記すこともある。）を単一炭素源として資化増殖する能力を有する微生物を用いて、３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールのラセミ体(以下単にラセミ体［１]と記すこともある。）より、そのＳ体を分取する方法に関するものであり、本発明により得られる３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールのＳ体(以下単にＳ体［１]と記すこともある。）は、医薬品・農薬・生理活性物質などの光学活性化合物の製造の中間体として極めて重要、かつ有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
微生物あるいは酵素による光学活性Ｓ体［１］の製法に関して以下のような方法が知られている。
ラセミ体［１］に微生物を作用させ、Ｒ体［１］を分解し、残存するＳ体［１］を回収する製法としては高橋らの製法（特開昭６２−１２２５９６、特開昭６３−３６７９８）と二階堂らの製法（特開平６−２０９７８１）が知られている。両方法とも、使用する微生物がラセミ体［１］よりＲ体［１］を立体選択的に分解代謝する能力を有するが、Ｒ体［１］を炭素源として資化増殖する能力を有しておらず、ラセミ体［１］を単一炭素源とし、硫酸アンモニウムや硝酸アンモニウムなどの無機窒素体を窒素源とする完全合成培地では生育増殖することはできない。従って、これらの方法においては、ラセミ体［１］よりＳ体［１］を得るには、用いる微生物が生育することができる栄養培地にて菌体を別途多量に増殖させた後、ラセミ体［１］に作用させるか、または微生物が生育することができる栄養培地にラセミ体［１］を添加して作用させなければならない。
【０００３】
特に前者の高橋らの方法は、Ｒ体［１］が酸化的に分解代謝される反応を利用した方法であり、反応を効率的に進行させるためには、グルタチオンや水硫化ナトリウムあるいは水硫化カリウムなどのＳＨ基含有化合物を添加する必要がある。
一方、後者の二階堂らの方法は、本発明方法と同じくシュードモナス属に属する菌を用いる方法であるが、その菌はＲ体［１］の資化増殖能力を有しておらず、ラセミ体［１］を単一炭素源とする完全合成培地中ではその菌の生育増殖反応を伴うＲ体［１］の分解資化反応が起きず、従ってＳ体［１］を得ることができない。
よってこれら両方法は、いずれも、ラセミ体［１］の光学分割、および得られるＳ体［１］の回収、精製という観点から簡便かつ実際的な方法ではなく、工業生産の観点からも経済的な製法とは言い難い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこれら従来の方法に比べ、より経済的に安価で、かつ技術的に簡便な方法により、ラセミ体［１］からＳ体［１］を製造することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ラセミ体［１］よりＲ体［１］を優先的に資化分解する能力を有し、さらにＲ体［１］を単一炭素源として資化増殖することのできる微生物を求め、鋭意研究した結果、目的とする微生物の単離に成功し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールのＲ体の資化能を有し、該Ｒ体を単一炭素源として生育しうるシュードモナス属に属する微生物（以下本発明に係る微生物と記すこともある。）を、３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール［１］のラセミ体を基質として含有する培地中で培養し、該培養物より３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール［１］のＳ体を分取することを特徴とする該Ｓ体の製法に関する。
本発明で基質として用いることのできるラセミ体［１］のハロゲン原子の種類としては、クロル原子もしくはブロム原子が好ましい。
【０００６】
本発明につき、さらに具体的に説明する。
ラセミ体［１］を単一炭素源とし、各種アンモニウム塩や硝酸塩等の無機態窒素を窒素源として、その他微量の金属塩やリン酸塩等の無機塩類を加えた完全合成培地に本発明に係る微生物を接種し、培養或いは作用させ、Ｒ体[１]を資化せしめ、培養液より残存するＳ体［１］を分取するか、
あるいはラセミ体［１］を基質として含有するブイヨン培地やペプトン培地等の有機態炭素源ならびに窒素源、そして必要により、無機塩、微量の金属塩、ビタミン類などを含む通常一般によく用いられる栄養培地中で本発明に係る微生物を培養し、Ｒ体[１]を資化せしめ、培養物より残存するＳ体［１］を分取してもよい。
【０００７】
本発明は、つまり本発明に係る微生物によるラセミ体［１］からの優先的なＲ体［１］の資化分解反応により、反応液あるいは培養液にＳ体［１］を残存させ回収する方法である。
資化反応は用いる微生物の至適ｐＨ、至適温度の範囲内で行うのがよい。なお、本発明に係る微生物は、Ｒ体［１］を炭素源として利用し資化増殖するに当たり、脱ハロゲン化反応により分解されるＲ体［１］と等量のハロゲン化水素酸を生成する。
資化反応の進行に伴いＲ体［１］より遊離するハロゲン化水素酸によりｐＨが徐々に低下する場合、適当なアルカリ源を添加することにより反応液中のｐＨを至適範囲内にコントロールする必要がある。
例えば、炭酸カルシウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、炭酸カリウム、炭酸アンモニウムなどの炭酸アルカリ水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液、あるいはアンモニア水溶液など通常、酸を中和させることができるものを用いて、ｐＨを至適範囲内にコントロールするのがよい。
【０００８】
本発明に係る微生物を培養し、Ｒ体の資化反応を惹起させるための培地としては、ラセミ体［１］を単一炭素源とし、各種アンモニウム塩や硝酸塩等の無機態窒素を窒素源として、その他微量の金属塩やリン酸塩等の無機塩類を加えた完全合成培地を使用することは経済的見地から好ましいが、ラセミ体［１］を基質として含有する通常この種の微生物が生育する培地ならば何でも使用することができる。例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物、グリセロール、ソルビトール、マンニトール等のアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸などの有機酸またはその塩類、またはそれらの混合物を炭素源として用いることができる。
【０００９】
窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。
その他、無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、さらに必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨを４〜１０、好ましくは５〜９、培養温度は１５〜５０℃、好ましくは２０〜３７℃の範囲で振とう培養あるいは通気撹拌培養等の方法を用いて好気的に２０〜９６時間行なうことが好ましい。
本発明に係る微生物は、予めブイヨン培地やペプトン培地等の有機態炭素源ならびに窒素源、そして必要により、無機塩、微量の金属塩、ビタミン類などを含む通常一般によく用いられる栄養培地中で予め培養してもよい。また、高酵素活性を持った菌体を得るための酵素誘導添加物として、上記培地、ペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地にラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオール、ラセミ体３−ブロモ−１，２−プロパンジオール等の３−ハロゲノー１，２−プロパンジオールを添加してもよい。
【００１０】
反応液中のラセミ体［１］の基質濃度は０．１‐１５％(v/v)が好ましく、基質は初期に一括して加えてもよいし、分割添加してもよい。反応は通常、攪拌あるいは振とう、あるいは通気撹拌培養等の方法を用いて好気的に行われる。反応時間は基質濃度ならびにその他の反応条件により異なるが２４〜１２０時間で終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィー等の分析によりラセミ体［１］の残存基質量が初期基質濃度に比して５０％で反応を終了するか、あるいは目的とする光学活性体の光学純度を測定して終点を決定するのがよい。すなわち基質であるラセミ体［１］中のＲ体［１］が全て分解資化された時点で反応を停止するのがよい。
この様にして反応液中に残存するＳ体［１］は一般的な方法で回収および精製できる。例えば反応液から菌体を遠心分離で除いた後、上清をエバポレーターにより濃縮し、酢酸エチル等の溶媒で抽出する。次いで抽出液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去しＳ体［１］のシロップを得ることができる。さらに蒸留により精製してもよい。
【００１１】
本発明に使用される微生物は、Ｒ体［１］の資化能を有し、Ｒ体［１］を単一炭素源として資化増殖することのできるシュードモナス（Pseudomonas )属に属する微生物であり、具体的にはシュードモナスsp.ＤＳ−ＳＩ−５株を挙げることができる。本菌株は生理学的、菌学的諸性質からシュードモナス(Pseudomonas)属に属する菌と同定され、既に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号 FERM  Ｐ−１７５９６として寄託されている。
以下実施例をもって、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り％（W/V）を表す。
【００１２】
【発明の実施の形態】
実施例１
下記の組成:
硫酸アンモニウム               0.5％
リン酸第２ナトリウム          0.02％
リン酸第２カリウム            0.02％
リン酸第１ナトリウム          0.04％
硫酸マグネシウム              0.05％
硫酸鉄                       0.001％
硫酸銅                      0.0001％
硝酸マンガン                0.0001％
炭酸カルシウム                0.45％
ｐＨ                          6.9
【００１３】
からなる培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコを１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌後、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを１ｍｌ（１．３ｇ）を添加し、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする完全合成培地を作製した。次いで、ペプトン、酵母エキス、Ｄ−グルコース各１％からなる傾斜寒天栄養培地にて予め培養した微生物シュードモナスsp.ＤＳ−ＳＩ−５株を一白金耳、上記完全合成培地に無菌的に接種し、３０℃、１３０ｒpｍの振とう条件で２日間培養した。その時の反応液中に残存する３−クロロ−１，２−プロパンジオールをガスクロマトグラフィー（GLサイエンス社製のカラム担体：ＰＥＧ２０Ｍ，６０−８０メッシュ（０．３１−０．４２ｍｍ）で分析した結果、その残存率は４５％であった。培養終了後、培養液を取り出し、遠心操作により菌体を除去し、上清液を得た。この上清液をエバポレーターで２ｍｌにまで濃縮し、酢酸エチルにより抽出した。続いて無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下で酢酸エチルを除去し、３−クロロ−１，２−プロパンジオールのシロップを０．５１ｇ得た。
【００１４】
本物質の光学純度の測定は、得られた３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学異性体を水酸化ナトリウム水溶液を用いたアルカリ処理により相当するグリシドールの光学異性体に変換後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ［（０．２５ｍｍ(ID)ｘ３０ｍ(Length)]を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった［ Suzuki et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 40, 273-278 (1993)]。
その結果、得られた３−クロロ−１，２−プロパンジオールは光学純度９９％eeのＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールであった。
光学異性体の分析条件：カラム温度，４５℃；検出器温度，２００℃；キャリアーガス，窒素；流速，０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出器，ＦＩＤ；スプリット比，２００／１。グリシドールのリテンションタイム：Ｒ体，80.6分；Ｓ体，82.1分。
【００１５】
参考例
ペプトン、酵母エキス、Ｄ−グルコース各１％からなる組成の栄養培地１００ｍｌ（ｐＨ7.2）を入れたバッフル付きの三角フラスコ（５００ｍｌ容）を１２１℃、１５分間、加圧蒸気滅菌し、液体栄養培地を作製した。予め上記組成の傾斜寒天栄養培地にて培養した微生物シュードモナスsp.ＤＳ−ＳＩ−５株の一白金耳量を上記液体栄養培地に接種し、３０℃、１３０ｒpｍの振とう条件で２４時間培養した。得られた菌体を遠心分離操作により集菌し、菌体を５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ7.2）にて２回洗浄し、洗浄菌体を調製した。次いでこの菌体を実施例１に示したラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地１０１ｍｌに懸濁し、３０℃、１３０ｒpｍで２日間反応させた。反応液に残存する３−クロロ−１，２−プロパンジオールの残存率を実施例１と同様の方法で測定した結果、４６％であった。反応終了後、遠心分離操作により菌体を除去し上清液を得た。上清液からの３−クロロ−１，２−プロパンジオールの回収は実施例１と同様に行い、０．５２ｇを分取した。得られた本物質の光学純度を実施例１と同様の方法で分析した結果、光学純度９９％eeのＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールであった。
【００１６】
実施例２
下記の組成：
硫酸アンモニウム               0.5％
リン酸第２ナトリウム          0.02％
リン酸第２カリウム            0.02％
リン酸第１ナトリウム          0.04％
硫酸マグネシウム              0.05％
硫酸鉄                       0.001％
硫酸銅                      0.0001％
硝酸マンガン                0.0001％
ｐＨ                          6.9
からなる培地２．５Ｌを入れた５Ｌ容培養器（ジャーファーメンター、ミツワ理化学社製、Model KMJ5B）を１２１℃、１５分間加圧蒸気滅菌後、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを２５ｍｌ（３２．５ｇ）添加し、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする完全合成培地を作製した。次いで微生物シュードモナスsp.ＤＳ−ＳＩ−５株を予めペプトン、酵母エキス、Ｄ−グルコース各１％からなる栄養培地で３０℃、２４時間振とう培養し、この培養液５０ｍｌ[２％（ｖ／ｖ）量]を上記ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする完全合成培地に無菌的に接種した。そして以下の条件で３日間通気撹拌培養を行った。
温度      ３０℃
通気量    0.5Ｌ／ｍｉｎ
回転数    ５００ｒpｍ
【００１７】
なお、ｐＨの測定および制御は連動させたｐＨコントローラーを用いて行い、3mol/L濃度の水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．９に制御した。また、本物質の定量ならび同定は実施例１と同様の方法により行った。
培養終了後、培養液より遠心分離操作により生育した菌体を除去し、上清液を得た。上清液からの３−クロロ−１，２−プロパンジオールの回収は実施例１と同様に行い、１３．７ｇを分取した。実施例１と同様の方法で本物質の光学純度を測定したところ、９９％eeのＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールであった。
【００１８】
実施例３−４
実施例１−２におけるラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールをラセミ体３−ブロモ−１，２−プロパンジオールに替えて実験を行った。実験方法ならびにその他の操作はそれぞれ実施例１−２に従って行い、それぞれ分取された３−ブロモ−１，２−プロパンジオールの光学純度の測定ならびに立体配置の測定は、実施例１と同様の方法で行った。その結果、得られた３−ブロモ−１，２−プロパンジオールはいずれも光学純度９６％eeのＳ体３−ブロモ−１，２−プロパンジオールであった。Ｓ体３−ブロモ−１，２−プロパンジオールの残存量はそれぞれ０．２４ｇ、６．２ｇであった。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によればＲ体３−ハロゲノ−１，２−ブロパンジオールの資化能を有するシュードモナス属に属する微生物、殊にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-SI-5株を、ラセミ体３−ハロゲノ−１，２−ブロパンジオールを基質として含有する培地中、殊に該ラセミ体を単一炭素源とする培地中で培養することにより、Ｒ体３−ハロゲノ−１，２−ブロパンジオールを優先的に資化分解させ、 Ｓ体３−ハロゲノ−１，２−ブロパンジオールを安価で、かつ工業的に簡便な方法で製造することができる。
また、本発明によれば、Ｓ体３−ハロゲノ−１，２−ブロパンジオールの工業的スケールで大量生産を行う場合にも、多量の菌体を別途に培養し調製する必要がなく、種菌（スターター）としての分量だけを培養し、接種するだけでよい。つまり極言するならば一細胞の微生物がいればよい。