(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子を導入して形質転換されたＣＨＯ細胞株を硫酸化多糖類の存在下において培養し、その培養液から肝実質細胞増殖因子を採取することを特徴とする肝実質細胞増殖因子の生産方法。
【請求項２】
硫酸化多糖類が硫酸基を含むプロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルカン、それらの誘導体から選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子を導入して形質転換されたＣＨＯ細胞株の培養液中に硫酸化多糖類を共存させることを特徴とする肝実質細胞増殖因子の分解抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はヘパリン結合性増殖因子を生産する方法に関するものであり、詳しくは硫酸化多糖類またはそのアゴニストの存在下においてヘパリン結合性増殖因子を産生する形質転換細胞を培養することにより、その培養上清から該増殖因子を高産生で効率よく取得する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
近年、種々の細胞増殖因子がクロ−ニングされているが、それらの中で、ヘパリンに強い親和性を有する一群の増殖因子が見出されている。これをヘパリン結合性増殖因子と総称するが、この中には線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、プレイオトロフィン、顆粒球／マクロファ−ジ・コロニ−形成刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インタ−ロイキン３及び７、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等、種々の既知または未同定の増殖因子が含まれる（実験医学，９（１４），１７７２（１９９１））。これらの因子は、ヘパリンやヘパラン硫酸に代表されるグリコサミノグリカンと結合することが知られており、中でもＦＧＦは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合により細胞表面や細胞外基質に貯蔵されること、及びＦＧＦの有する生物学的活性がヘパリンによって調節され得ることが確認された（Ｃｅｌｌ，６４，８４１（１９９１））。  最近、肝実質細胞を生体内より取り出して生体外においてその増殖を促進させうるヒト由来の蛋白性因子、即ちヒト肝細胞増殖因子（以下「ｈＨＧＦ」と略す。）が劇症肝炎患者血漿より見い出され（特開昭６３−２２５２６号公報）、さらにｈＨＧＦ蛋白質をコ−ドするアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の配列（特開平３−７２８８３号公報）、さらにこのｃＤＮＡを用いたｈＨＧＦ蛋白質の生産方法及び形質転換体（特開平３−２８５６９３号公報）が報告されている。かかる方法により生産される組み換えｈＨＧＦ蛋白質は、生体外において肝実質細胞の増殖を促進する働きがみとめられている。また、ヒトに限らずＨＧＦ蛋白は、ヘパリンに強い親和性を有する上記ヘパリン結合性増殖因子の一種であることが判明している。本発明者らは、標的細胞におけるＨＧＦ結合・消費に硫酸化多糖類が及ぼす影響について調べたところ、ＨＧＦと種々の硫酸化多糖類とを混合することにより、ＨＧＦの標的細胞への結合および標的細胞によるｈＨＧＦの消費が強く抑制され、結果としてＨＧＦの作用が持続かつ安定化することを見出した（欧州公開特許公報第５１７１８２号）。
【０００３】
一方、一般に増殖因子の生産手段として、大腸菌などの微生物や哺乳動物由来細胞に該増殖因子のｃＤＮＡを導入する方法が広く利用されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，１６．３−１７．４０，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。ｈＨＧＦに代表されるような、糖鎖を持ち且つ分子内に多くのジスルフィド結合を有する複雑な構造の蛋白質の場合、専ら動物細胞がその生産に利用される。その中でも特に汎用されているのがチャイニ−ズ・ハムスタ−卵巣由来の上皮系細胞株ＣＨＯである。
【０００４】
他方、ヘパリン結合性増殖因子の標的細胞上のレセプタ−分子も明らかになりつつあり、例えばＨＧＦのレセプタ−分子は癌原遺伝子ｃ−ｍｅｔ産物（Ｃ−Ｍｅｔ蛋白質）であることが判明しており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，８０２（１９９１））、また酸性型及びアルカリ型ＦＧＦやＫＧＦのレセプターとして既に数種類のＦＧＦレセプターファミリーが明らかにされている（実験医学，１０，２５（１９９２））。さらにそれ以外のレセプターとして、細胞表層のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）も、分子内グリコサミノグリカンを介してヘパリン結合性増殖因子を捕捉することが知られている（蛋白質・核酸・酵素，３４，８５３（１９８９））。ＨＳＰＧは、極めて多くの細胞上に大量に発現する。  さらに、一般に増殖因子が細胞上の特異的レセプタ−に結合してその生理活性を惹起する際には、増殖因子自身が速やかに細胞内に取り込まれ、消費されることが広く認められている。ＨＧＦにおいても、本発明者らは、既に上皮系細胞株を用いた解析から、ｈＨＧＦがレセプタ−に結合後極めて速く細胞内に取り込まれ（インタ−ナリゼ−ション）（ｔ1/2 ：５−１０分）、分解を受けて培養上清中に放出される（デグラデ−ション）（ｔ1/2 ：３０−６０分）ことを明らかにしている（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｓｕｐｐｌ  ０（１６ｐａｒｔＢ），１８４（１９９２））。
【０００５】
従来の技術では、ヘパリン結合性増殖因子のｃＤＮＡを有する発現ベクタ−を適当な宿主細胞に導入して該増殖因子を生産した場合、発現した該増殖因子の一部が産生細胞自身の増殖因子レセプタ−及びＨＳＰＧ分子を介して分解・消費されることを防げなかったため、産生細胞培養上清中から回収される該増殖因子の量は比較的低値であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、該増殖因子産生細胞（形質転換体）の培養系に各種硫酸化多糖類を添加し、該増殖因子産生量を比較検討した。例えば、ｈＨＧＦｃＤＮＡを導入したＨＧＦ産生ＣＨＯ細胞（特開平３−２８５６９３号公報）の培養液中に硫酸化多糖類を１〜１０００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、経時的に培養上清を回収してＨＧＦ含量を定量した。その結果、興味深いことに、硫酸化多糖類の添加によって約１．５〜５倍のＨＧＦ産生増強が認められた。
【０００７】
一方、本発明者らは、ＨＧＦ発現に用いた宿主ＣＨＯ細胞のＨＧＦ応答性を検討したところ、該宿主細胞がＣ−Ｍｅｔ蛋白質を持ち実際にＨＧＦ添加によってＤＮＡ合成が促進されること、及び宿主細胞がＨＧＦを消費・分解することを見出した。さらに、本発明者らは、宿主細胞のＨＧＦ結合・分解に及ぼす硫酸化多糖類の影響について調べたところ、ＨＧＦと硫酸化多糖類とを混合することにより、ＨＧＦの宿主細胞への結合および宿主細胞によるＨＧＦの消費が強く抑制されることを見出した。
【０００８】
以上の結果から、ＨＧＦ産生細胞培養系において、硫酸化多糖類を培養系に添加することで産生細胞自身によるＨＧＦ結合・消費・分解が回避され、培養上清からのＨＧＦ回収量が大幅に増強することが判明し、本発明を完成するに至った。    すなわち本発明の要旨は、ヘパリン結合性増殖因子をコードする遺伝子を導入して形質転換された細胞株を硫酸化多糖類またはそのアゴニストの存在下において培養し、その培養液からヘパリン結合性増殖因子を採取することを特徴とするヘパリン結合性増殖因子の生産方法、及びヘパリン結合性増殖因子をコードする遺伝子を導入して形質転換された細胞株の培養液中に硫酸化多糖類またはそのアゴニストを共存させることを特徴とするヘパリン結合性増殖因子の分解抑制方法に存する。
【０００９】
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明で定義されるヘパリン結合性増殖因子とは、硫酸化多糖類に親和性を有する全てのヘパリン結合性増殖因子が該当する。具体的には、全アミノ酸配列が明らかとなっている酸性型ＦＧＦ、アルカリ型ＦＧＦ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４７，１２０（１９８７））、ＫＧＦ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，７５２（１９８９））、ＨＧＦ等の蛋白性因子等が挙げられる。
【００１０】
本発明で使用する該増殖因子産生細胞は、その表層にＨＳＰＧに代表される硫酸化多糖構造を有する細胞で、かつ組換え法により上記のような増殖因子ｃＤＮＡを導入されたものである。具体的には、特開平３−２８５６９３号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコ−ドするｃＤＮＡを含む発現ベクタ−を構築し、その発現ベクタ−をＣＨＯ細胞等の宿主に導入した産生株などが挙げられる。かかるＨＧＦ産生細胞系では、硫酸化多糖類添加によって約１．５〜５倍以上のＨＧＦ回収増大が認められる。かかる細胞株の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地としては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等が使用され、５−１０％血清の存在下、もしくは適当量のインスリン、デキサメサゾン、トランスフェリン等の存在下において培養する。
【００１１】
本発明において、上記ヘパリン結合性増殖因子を産生する形質転換細胞培養系に添加する硫酸化多糖類としては、天然グリコサミノグリカンを含むプロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルカン、それらの誘導体が挙げられる。硫酸化多糖類は、糖がグリコシド結合によって脱水縮合して生じる炭水化物、すなわちグリカンに硫酸基が付加したものであり、かかる多糖類とは、グリコサミノグリカンのごとく二糖類単位が繰り返してできた構造を有し、その二糖類の１つがグルコサミンまたはガラクトサミンから成るもの（生命の科学，３９（４），３０６（１９８８））や、グルカンのように多糖類が硫酸エステル化されたもの、さらにはこれらの誘導体が含まれる。具体的には、例えばコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デキストラン硫酸等が挙げられる。またこれら硫酸化多糖類のアゴニストも、本発明の培養系に添加することができる。
【００１２】
上記硫酸化多糖類またはそのアゴニストは、ヘパリン結合性増殖因子を産生する細胞培養液中に少なくとも１種類添加される。添加量としては、産生細胞の増殖に強い影響を与えない範囲であるならば特に制限はされないが、通常１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲で好適に利用される。また添加する時期は、通常培養の当初から加え、培地を交換する毎に新たに添加する方法が採用されるが、培養の途中で加えても差し支えない。
【００１３】
かかる培養により、ヘパリン結合性増殖因子はその形質転換細胞培養系の培養上清中に産生され、従ってこの培養上清から目的とするヘパリン結合性増殖因子を常法に従って分離・精製することができる。具体的には、培養上清を各種のクロマトグラフィー、例えばＳ−セファロース、硫酸化セルロファイン等の使用により容易に単離・精製することができる。
【００１４】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１  ＣＨＯ細胞上のＨＧＦレセプタ−の検出
精製された組換えｈＨＧＦ標品（特開平３−７２８８３号公報に記載の方法に従って調製）を、クロラミンＴ法（Ｎａｔｕｒｅ，１９４，４９５（１９６２））にてヨ−ド標識した。すなわち、１００μｌの０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したｈＨＧＦ  ２０μｇに１ｍｇ／ｍｌ  クロラミンＴ  １００μｌを添加して反応を進行させ、次いで２．５ｍｇ／ｍｌ  ピロ亜硫酸ナトリウム  １００μｌを加えて反応を停止した。反応液を０．２５％  ゼラチン、５ｍＭ  ヨウ化カリウム含有ＰＢＳ（−）にて平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社）カラムに添加し、標識されなかったヨ−ドを除いた。 125Ｉ標識ｈＨＧＦ（以下、「標識ｈＨＧＦ」と略す）は、０．２μｍフィルタ−を通過させて無菌化し、分注して使用時まで−２０℃にて保存した。
【００１５】
底面積７８．５ｃｍ2 のプラスチックディッシュ（コ−ニング社）にＣＨＯ細胞を培養し、ほぼ飽和密度に達した（セミコンフレント）ものを実験に使用した。細胞をディッシュに付着させた状態で、０．２５％  ゼラチン、２５ｍＭ  ヘペス含有ＤＭＥＭ培地（ギブコ社）ｐＨ７．４（以下、「結合培地」と略す）にて３回洗浄し、次いで０−２００ｐＭ標識ｈＨＧＦを含む結合培地１０ｍｌと共に４℃にて４時間ゆるやかに振とう培養した。対照として、２００ｐＭ標識ｈＨＧＦにさらに２ｎＭ非標識ｈＨＧＦを加えたディッシュも用意した。上清を除去し、氷冷結合培地、次いで氷冷ＰＢＳ（−）にて各４回洗浄後、５ｍｌの架橋緩衝液（１００μｇ／ｍｌ  ビススベレ−ト含有１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．３））中で４℃にて３０分間反応させて、標識ｈＨＧＦと細胞表面のｈＨＧＦ結合蛋白とを化学架橋した。５ｍｌの２５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた後、細胞をスクレ−パ−にて剥離し、４００μｌの可溶化液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、１％  ノニデットＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  フェニルメチルスルフォン酸フルオライド）を加え、氷上で１時間反応させて細胞を可溶化した。細胞可溶化液から、１２０００×ｇ，４℃、３０分間の遠心分離にて上清を得て、その一部を免疫沈降法、電気泳動及びオ−トラジオグラフィーに供した。
【００１６】
上記細胞可溶化画分から、ＨＧＦの機能的レセプタ−分子の一つとして知られるｃ−Ｍｅｔ蛋白質を分離する目的で、免疫沈降を行った。すなわち、細胞可溶化液に５μｌの抗マウスｃ−Ｍｅｔ抗血清（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０４，８５７（１９９２））と２０μｌのプロテイン−Ａ  セファロ−ス（ファルマシア社）を加えて、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質／ＨＧＦ複合体を免疫沈降させた。沈降物は、ＳＤＳ−サンプル緩衝液（０．１Ｍ  トリス−塩酸（ｐＨ６．８）、１０％  グリセロ−ル、１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））中で煮沸後、６％  ポリアクリルアミド濃度の非還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、ゲルを固定・乾燥後、オ−トラジオグラフィにて標識ｈＨＧＦの結合する蛋白質を検出した。
【００１７】
図１に結果を示す。図１においてレ−ン１、２、３、４はそれぞれ標識ｈＨＧＦ添加量５０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、２００ｐＭ＋非標識ｈＨＧＦ２ｎＭのサンプルの結果を表す。左側の数字は、分子量マ−カ−の移動度をキロダルトン（ｋＤａ）で示してある。非還元下では７０ｋＤａ付近に標識ｈＨＧＦ単独のバンドを認め、さらに２５０ｋＤａ付近に特異的バンドを検出した。このバンドは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体で特異的に沈降すること、ｈＨＧＦの分子量を差し引くと約１８０ｋＤａの大きさであることから、ｈＨＧＦとｃ−Ｍｅｔ蛋白質の複合体であると結論される。
【００１８】
以上の結果から、ｈＨＧＦ産生細胞株の親株であるＣＨＯ細胞上には、既にＨＧＦの機能的レセプタ−の構成分子として知られるＣ−Ｍｅｔ蛋白質が存在し、実際にｈＨＧＦがＣＨＯ細胞表面のｃ−Ｍｅｔ蛋白質に特異的に結合することが判明した。
【００１９】
実施例２  ＣＨＯ細胞培養系における添加ｈＨＧＦ分子の残存量の測定
次にＣＨＯ細胞におけるｈＨＧＦの分解速度を調べる目的で、以下の実験を行った。すなわち、培養上清中に一定量のｈＨＧＦを添加し、経時的に上清中の残存ＨＧＦ量をエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法にて測定し、硫酸化多糖類の有無によるＨＧＦ分解速度の違いを比較検討した。
【００２０】
ＣＨＯ細胞を０．０２％トリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）含有の１０ｍＭ  リン酸緩衝液−生理食塩水  ｐＨ７．４（ＰＢＳ（−））にて剥離し、低速遠心にて３回洗浄後、細胞濃度５×１０5 個／ｍｌとなるよう１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社）にて懸濁した。この細胞液を、１ｍｌずつ１２ウェルマイクロプレ−ト（コスタ−社）に添加して、５％炭酸ガス含有空気気相下、３７℃で１昼夜培養した。１６時間後、培養ウェルの培養液を除き、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄後、２μｇ／ｍｌのヒトリコンビナントＨＧＦを含む新鮮な培地を１ｍｌずつ添加した。この時、一部のウェルには最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようヘパリン（分子量４０００−６０００、シグマ社）を加えた。５％炭酸ガス含有空気気相下、３７℃で培養を続け、１、２、５、２４、６８時間後に５０μｌずつ上清を採取して、ＥＬＩＳＡ法にて上清中の残存ＨＧＦ量を測定した。上清は、測定直前まで−８０℃にて凍結保存した。  上記被検培養上清中の残存ＨＧＦ量を、ｈＨＧＦ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。すなわち、被検上清を０．１％  ＣＨＡＰＳ、０．４Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社、ＲＩＡグレ−ド）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて５０、１００、２００倍に希釈した。ＥＬＩＳＡ用プレ−トとして、９６ウェルマルチプレ−ト（ヌンク社、ＥＬＩＳＡ用）に予め抗ｈＨＧＦモノクロ−ナル抗体を吸着させ（０．５μｇ／５０μｌ−５０ｍＭ  炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）／ウェル）、次いで１％  ＢＳＡ、０．０５％  アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（−）を１昼夜以上反応させてウェル壁をブロッキングしたものを用いた。
【００２１】
被検希釈液をＥＬＩＳＡプレ−トウェルに５０μｌずつ加え、４℃で１昼夜静置した。翌日、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）（ＰＢＳＴ）にてウェルを４回洗浄後、二次抗体としてペルオキシダ−ゼ共役化抗ｈＨＧＦポリクロ−ナル抗体を添加し、室温にて２時間以上反応させた。二次抗体は、ヒトリコンビナントＨＧＦを免疫したウサギ血清よりプロテインＡカラムにてアフィニティ−精製し、過ヨウ素酸法にてペルオキシダ−ゼを共役化して（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２２，１０８４（１９７４））作製した。
【００２２】
インキュベ−ト後、ウェルをＰＢＳＴにて６回洗浄し、発色液（０．０４％  オルソフェニレンジアミン、０．０２％  過酸化水素水含有リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０））を５０μｌ／ウェル添加して、室温で数分−数十分放置した。適度な発色の得られた時点で４．５Ｎ硫酸を加えて（５０μｌ／ウェル）反応を停止し、イムノリ−ダ−（日本インタ−メッド社）にて４９０ｎｍの吸光を測定した。検量線作成のために、予め濃度を吸光係数から算出しておいたｈＨＧＦ標準品を０−４０ｎｇ／ｍｌの範囲で段階希釈して使用した。なお、ここで使用したＥＬＩＳＡ法がＨＧＦ分解産物を全く検出しないことを、酵素消化後ｈＨＧＦの電気泳動のバンドとの対応から確認した。
【００２３】
図２に結果を示す。横軸は培養開始後の時間を、縦軸は培養上清中のｈＨＧＦ（μｇ／ｍｌ）を表している。培養上清中にヘパリン無添加群（●）では速やかにｈＨＧＦ量が減少したのに対し、添加群（■）ではｈＨＧＦの減少速度が極めて遅延することが確かめられた。グラフの傾きから、上清中ｈＨＧＦの減少速度ｔ1/2 は、ヘパリン無添加群で約１２時間、添加群で約１３５時間と算出された。  以上の結果から、酸化多糖類の一種であるヘパリンを培養液に添加することによって、ｈＨＧＦのＣＨＯ細胞における分解が著しく抑制されることが判明した。
【００２４】
実施例３  ｈＨＧＦ産生ＣＨＯ細胞株のｈＨＧＦ産生に及ぼすヘパリンの影響
実際のｈＨＧＦ産生株において培養液中に硫酸化多糖類を加え、ｈＨＧＦの回収量を検討した。
特開平３−２８５６９３号公報に記載の方法に従って、ＣＨＯ細胞にｈＨＧＦｃＤＮＡを含む発現ベクタ−を導入し、ｈＨＧＦを恒常的かつ安定して産生する形質転換ｈＨＧＦ生産株ＫＢＥ、ＫＴ４−３およびＧＥ４３−１９を得た。
ｈＨＧＦ生産株を細胞濃度４×１０4 個／ｍｌで５％ＦＢＳ含有ｅＲＤＦ培地に懸濁し、１ｍｌずつ１２ウェルマイクロプレ−トに播種した。ここに最終濃度０−１０００μｇ／ｍｌになるようヘパリン（シグマ社）を加えて培養を開始し、一定時間後に上清の一部を採取してｈＨＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ法（実施例２参照）にてｈＨＧＦ含量を測定した。
【００２５】
図３及び図４に結果を示す。図３は、ＫＢＥ細胞培養開始後２−３日毎に培地交換して上清を採取し、培養１１日目まで経時的にｈＨＧＦ量を追跡したものである。横軸に培養日数を、縦軸に培養上清中のｈＨＧＦ累積量をＥＬＩＳＡユニット（Ｕ；ＯＤ490 ×希釈倍率）で示してある。本条件下では、培養４日目に細胞はほぼ飽和密度に達し、以降徐々に細胞数を減じて培養１３日目には細胞生存率は３０％以下であった。ヘパリン添加群において１μｇ／ｍｌという低濃度の添加から顕著なｈＨＧＦ量の上昇が認められ、１０−１００μｇ／ｍｌヘパリン存在下でいずれの培養期間においても２−３倍のＨＧＦ量の増加が明らかとなった。図４は、ＫＢＥ細胞が飽和密度に達した直後に培地交換をし、２日後の上清を採取してｈＨＧＦ含量を測定したものである。横軸はヘパリン濃度を、縦軸はｈＨＧＦ含量をヘパリン無添加群を１．０としたときの相対値で表す。ヘパリン添加群では、無添加群に比べて１０μｇ／ｍｌの添加で既に２倍以上のｈＨＧＦ量の上昇が認められ、１０００μｇ／ｍｌまでの添加において２−２．５倍のｈＨＧＦ量上昇が示された。
【００２６】
次に、３種類のｈＨＧＦ生産株において、ヘパリン添加による上清中ｈＨＧＦ量の変化を測定した結果を表１に示す。被検上清は、細胞飽和直後に培地交換して２日後のものを測定した。ヘパリン無添加群のｈＨＧＦ含量を１．００として、ヘパリン１０μｇ／ｍｌ添加群のｈＨＧＦ含量を相対値として示した。いずれの株においても、２−５倍のｈＨＧＦ回収量の増大が認められた。
【００２７】
【表１】
0004098372.tif 000002
【００２８】
以上の結果、ｈＨＧＦ産生細胞株の培養液中にヘパリンを添加することにより、回収されるｈＨＧＦ量が数倍に増大することが判明した。
【００２９】
実施例４  ｈＨＧＦ産生ＣＨＯ細胞株のｈＨＧＦ産生に及ぼす各種硫酸化多糖類の影響
次に、ヘパリン以外の硫酸化多糖類についても同様の検討を行った。
ＫＢＥ株を４×１０5 個／ｍｌ／ウェルで１２ウェルマイクロプレ−トに播種し、培養５日後の上清を採取して、上述のＥＬＩＳＡ法にて培養上清中のｈＨＧＦ量を測定した。添加多糖類として、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン（以上シグマ社）、デキストラン硫酸及びコンドロイチン硫酸（以上生化学工業社）を用いた。
【００３０】
表２に結果を示す。ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のいずれにおいてもｈＨＧＦ含量の増大が認められた。ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸では１０−１００μｇ／ｍｌの添加範囲で最大効果が得られ、２倍ないしそれ以上の上昇が示された。一方、コンドロイチン硫酸では効果は認められるものの、その増大効果はやや低く、有効必要用量も高用量側にシフトしていた。硫酸基を持たないデキストランでは、全く効果が認められなかった。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
ＫＢＥ株は、マイクロキャリア−（ファルマシア社）を用いた浮遊培養法によって数カ月以上ＨＧＦ産生を維持させることが可能であるが、その場合も、硫酸化多糖類は同様の効果を数カ月間維持した。種々の培養形態・培養スケ−ルの検討においても、硫酸化多糖類の作用は付着培養（Ｔフラスコ、ディッシュ、ロ−ラ−ボトルなど）・浮遊培養（マイクロキャリア−を用いた、あるいは用いないスピナ−培養）に関わりなく、また９６ウェルプレ−トのマイクロウェル培養から数リットル以上の培養規模において、同様に認められた。
【００３３】
以上の結果から、ＨＧＦ生産細胞の培養系に種々の硫酸化多糖類を加えることにより、回収されるＨＧＦ量が２倍ないし数倍に増大することが判明した。この効果は低用量の硫酸化多糖類添加で生じ、培養の方法や硫酸化多糖類の種類に関わりなく、培養数時間から数カ月間の長期に渡って維持され、ＨＧＦ生産株で広く認められた。この効果の原理は、硫酸化多糖類がその硫酸基を介してＨＧＦを結合し、ＨＧＦ産生細胞上のレセプタ−（ｃ−Ｍｅｔ蛋白質及びヘパラン硫酸プロテオグリカンなど）へのＨＧＦ結合・消費・分解を著しく遅延させるためと理解された。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の生産方法によれば、ヘパリン結合性増殖因子の生産及び回収量を数倍に高めることが可能であり、その結果、該増殖因子の生産におけるコストを著しく軽減できるようになった。本発明を基にヘパリン結合性増殖因子を生産することにより、医療分野での広範な利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＨＯ細胞におけるｈＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ蛋白質複合体の形成についてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示した図面である。
【図２】ＣＨＯ細胞におけるｈＨＧＦの消費速度について、ヘパリン存在下及び非存在下での比較を示した図面である。
【図３】ｈＨＧＦ生産株における培養上清中のｈＨＧＦ量について、ヘパリン存在下及び非存在下での比較を経時的に示した図面である。
【図４】ｈＨＧＦ生産株における培養上清中のｈＨＧＦ量について、ヘパリン添加用量の影響を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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