(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の何れかのポリペプチドからなる可溶型メルトリンα：
１）配列番号１１に示されるGlu（156）からIle（686）のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、
２）配列番号１１に示されるGly（1）からIle（686）のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項1のポリペプチドをコードする塩基配列を含有するDNA。
【請求項３】
以下の何れかのDNA：
１）配列番号１１に示される塩基番号１から２０５８の塩基配列を含有するDNA、
２）配列番号１１に示される塩基配列を含有するDNA。
【請求項４】
請求項２または３のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項５】
請求項２または３のＤＮＡを含有する形質転換体。
【請求項６】
請求項２もしくは３のＤＮＡ、請求項４のベクターまたは請求項５の形質転換体を用いる、請求項１のポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項５の形質転換体によって産生される、請求項２または３のDNAによってコードされるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１のポリペプチドのC末端領域である、配列番号１１に示されるGlu（653）からIle（686）のアミノ酸配列部分を特異的に認識する抗体。
【請求項９】
骨粗鬆症または高カルシウム血症の予防または治療剤である、メルトリンαを特異的に認識する中和抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞、特に筋原細胞の融合又は接着又は凝集活性を有するメルトリン及びその各領域ポリペプチド、それらをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、これらメルトリン及びその各領域ポリペプチドに対する各種抗体、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクターによる形質転換体、該形質転換体を使用する上記メルトリン及びその各領域ポリペプチドの製造方法及びメルトリンもしくはメルトリンアンタゴニストを有効成分として含有する医薬組成物に関するものである。
背景技術
筋形成において、未分化中胚葉細胞由来の筋肉形成細胞から分裂・増殖して分化した筋原細胞は、最終回の分裂以後、ミオシンやアクチン等の筋肉特異的物質の合成を開始するとともに、隣接する同種の細胞との間でお互いの細胞質膜が接着・癒合し、接着面での細胞境界を失って、筋管と呼ばれる多核のシンシチウムに変わる。
これまでに、Ｎ−カドヘリン（Knudsen, K.A. et al., Expl. Cell Res., 188, 175-184（1990）, Merge, R.M. et al., J.Cell Sci., 103, 897-906（1992）），及びＭ−カドヘリン（Donalies,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 88, 8024-8028（1991），Ｎ−ＣＡＭｓ（Merge, R.M. et a1., J.Cell Sci., 103, 897-906（1992）及びその他），Ｖ−ＣＡＭｓ及びインテグリン類（Rosen,G.D. et al., Cell 69, 1107-1119（1992）その他）等を含む幾種類かの膜蛋白質がこの筋管形成に関与していることが報告されている。
しかしながら、筋原細胞同士のお互いの細胞質膜が接着・癒合して筋管と呼ばれる多核のシンシチウムに変わる過程の分子的な機序については、未だ充分に理解されてはいない。
一方、ウイルスが細胞に感染する際に関与する接着因子として、「融合ペプチド」と呼ばれる物質も知られている（Morrison,T.G. Virus Res., 10, 113-136（1988）その他）。卵と精子との接着に関与する分子として最近単離されたファーテリンは、ルベラウイルスの融合ペプチドに類似する配列を含んでいることが判った（Biobel,C.P. et al., Nature 356, 248-252（1992）その他）。
このように、接着活性を有する分子は多く知られており、インテグリン類等については、それを阻害する物質が医薬品として開発・研究されている。
今回、本発明者は新規な接着に係わる分子の単離を試みた。特に上記筋管形成の過程に於ける筋原細胞同士の接着・融合には、卵と精子との接着と同様に、融合ペプチド様の接着因子が関与しているのではないかとの仮定に立って、ファーテリンαおよびβで保存性の高い配列をプローブとして使用して、細胞の接着にかかわる新規な物質のクローニングに成功して、これをメルトリンと命名し本発明を完成させた。
発明の開示
即ち、本発明は、新規な物質であるメルトリンに係わる。メルトリンの１つの特徴は筋細胞の分化誘導過程で発現され、ファーテリンα、βと保存性の高い配列を有することである。また、メルトリンの他の特徴は細胞の融合または接着または凝集に関わる蛋白質であるということにある。すなわち、メルトリンを介して筋細胞等ある種の細胞では、細胞間の融合、接着もしくは凝集が生じる。
細胞の融合とは、２つ以上の細胞が互いに１つの細胞のように融合し、多核細胞が形成されることである。細胞の接着とは、２つ以上の細胞が互いに接着することである。また、凝集とは２つ以上の細胞（特に液体中に存在している細胞）が集合し細胞塊を形成することである。細胞間で接着が生じ、それに引き続く現象として、融合および凝集が観察されるとも考えられる。
本発明のメルトリンは、その起源は特に限定されない。したがって、特記しない限り、本明細書においてメルトリンとは、前記特徴を有するいかなる動物由来のポリペプチドをも含む。また、後の実施例で示すように、同一の動物種から前記特徴を有する少なくとも３種の分子種（α、β、γ）が単離されている。本明細書においては、メルトリンとは、特記しない限り、これらのいずれの分子種をも含む。
本発明のメルトリンの具体例はマウスのメルトリンα、β及びγであり、それらは、それぞれ、図２ａ〜図２ｊ、図３ａ〜図３ｊ及び図４ａ〜図４ｉに示されるアミノ酸配列、もしくはその部分配列で特徴づけることができる。
その他の具体例として、ヒトのメルトリンα、β、γがある。ヒトのメルトリンα、β、γは、それぞれ、図１２ａ〜図１２ｂまたは図１５ａ〜図１５ｆまたは図２３ａ〜図２３ｂのいずれか、図１６または図１７ａ〜図１７ｃのいずれか、図１３ａ〜図１３ｄに示されたアミノ酸配列もしくはその部分配列を含有することを特徴とする。
尚、上記のアミノ酸配列は、本発明のメルトリンの一具体例にすぎず筋細胞で発現しファーテリンα、βと保存性の高い配列を有する、もしくは、細胞の融合または接着または凝集に関わる限り、上記アミノ酸配列において、アミノ酸の欠失、変更、追加及び挿入等によって、その一部が異なるものも、本発明のメルトリンに含まれるものである。今回、本発明者が明らかにしたように、図２ａ〜図２ｊに示したマウス由来のアミノ酸配列のデイスインテグリン領域からシステイン・リッチ領域にかけての部分と図１２ａ〜図１２ｂのヒト由来のアミノ酸配列とは高いホモロジーをしめす。このように、上記のアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上のホモロジーを示す物質は、メルトリンとしての機能を残していると考えられる。特にマウスもしくはヒトのメルトリンα、β、γのメタロプロテアーゼ領域からデイスインテグリン領域にかけての領域と、約８０％以上、好ましくは約９０％以上のホモロジーを示す配列を有する物質は、その前後の配列が全て異なっていても同様の活性を有するものと考えられる。したがって、上記アミノ酸配列もしくはその一部と高いホモロジーを示し、ヒトもしくはマウスメルトリンと同様の活性を示す物質は本発明のメルトリンに含まれる。
いいかえると、本発明のメルトリンは、図２ａ〜図２ｊ、図３ａ〜図３ｊおよび図４ａ〜図４ｉ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃまたは図２３ａ〜図２３ｂのいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な配列と、ハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するものとして特徴づけることができる。
メルトリンは、後に記載する実施例に示されるように、細胞内領域、膜貫通領域、細胞外領域からなる膜蛋白質および膜貫通領域を持たない可溶型蛋白質として生体内に存在している。細胞外領域には、前駆体領域、メタロプロテアーゼ領域、ディスインテグリン領域、システイン・リッチ領域が含まれており、メルトリンαについては、そのシステイン・リッチ領域中に、融合ペプチド様配列が含まれている（図８参照）。
このうち、ディスインテグリン領域は、細胞の接着、融合もしくは凝集というメルトリンの機能に必要不可欠な領域である。一方、前駆体領域やメタロプロテアーゼ領域は、メルトリンが特定の臓器や組織、条件下において活性を発揮するために、調節的な働きをする配列であると考えられる。ヘビ毒中に発見されたディスインテグリンは、血小板IIｂ／IIIａに結合することが知られている。したがって、メルトリンのディスインテグリン領域もそれ自体、細胞に結合する作用を有することが予想される。また、メタロプロテアーゼ領域はそれ自体で、その名の通り、蛋白分解酵素としても働きうる。
したがって、本発明は、メルトリンの任意の一部を含むポリペプチドにも係わる。当該ポリペプチドには、メルトリンの各領域部分そのもの、メルトリンの各領域を少なくとも含むポリペプチド、メルトリンの任意の一部分、メルトリンの任意の一部分の配列を少なくとも含むポリペプチド、およびメルトリンの任意の各領域もしくはメルトリンの任意の一部分が任意の順番で結合した配列を少なくとも含むポリペプチドが含まれる。また、本発明には、上記ポリペプチドに化学的修飾を施したり、塩を形成させたものも含まれる。
本発明のポリペプチドの好ましい例は、ディスインテグリン領域の一部からなるポリペプチド、ディスインテグリン領域そのものからなるポリペプチド、少なくともディスインテグリン領域を含むポリペプチド、少なくともディスインテグリン領域とシステインリッチ領域を含むポリペプチドである。他の好ましい例は、メタロプロテアーゼ領域とディスインテグリン領域とシステインリッチ領域を少なくとも含むポリペプチドである。また、メルトリンのメタロプロテアーゼ領域の一部からなるポリペプチド、メタロプロテアーゼ領域そのものからなるポリペプチドも好ましい例である。
また、他の好ましい例は、メルトリンのディスインテグリン領域とシステインリッチ領域を少なくとも含み、かつ膜貫通領域もしくは膜貫通領域と細胞内領域の両方を含まないポリペプチド、および、メタロプロテアーゼ領域とディスインテグリン領域とシステインリッチ領域を少なくとも含み、かつ膜貫通領域もしくは膜貫通領域と細胞内領域の両方を含まないポリペプチドである。このような膜貫通領域を含まないポリペプチドは、細胞膜を通り、細胞外へ分泌される可溶型ポリペプチドである。可溶型ポリペプチドは、細胞の培養上清中から回収することが可能であり、たとえば、必要に応じて、適当なシグナル配列の下流に接続させて遺伝子工学的に細胞に発現させると、可溶型ポリペプチドは、培養上清中に分泌され、培養上清中から効率よく回収することができるという利点がある。
マウスおよびヒトのメルトリンα、β、γにおいて、前駆体領域、メタロプロテアーゼ領域、ディスインテグリン領域、システインリッチ領域、膜貫通領域、細胞内領域が、図２ａ〜図２ｊ、図３ａ〜図３ｊ、図４ａ〜図４ｉ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃ、図２３ａ〜図２３ｂに示したアミノ酸配列のどの部分にあたるかは実施例で考察した。しかしながら、それらのアミノ酸配列で規定されたポリペプチドは、本発明のポリペプチドの一具体例にすぎず、それらのアミノ酸配列を本質的に含むポリペプチドも本発明に属する。即ち、例えば、各領域の境目は、これに限定されるものでなく実施例で考察した各領域の境目から、１個〜約２０個分Ｎ末端方向またはＣ末端方向、もしくはその両方にずれた領域を含むポリペプチドも、それが上記アミノ酸配列で規定したポリペプチドと同様の機能を有する限り、本発明のポリペプチドに含まれる。同様に、各領域と同様の機能を有する限り、該アミノ酸配列において、アミノ酸の欠失、変更、追加及び挿入等によって、その一部が異なるものも、本発明のポリペプチドに含まれるものである。
例えば、上記図中の各領域のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明のポリペプチドと同様の機能を有すると予測され、本発明のポリペプチドに含まれる。
本発明のメルトリンは、細胞同士や細胞とプレート等の器具を接着させるために使用することができる。また、本発明のメルトリンと他の任意の物質を融合して、筋細胞の培養系や組織、生体に投与すれば、その成分を筋細胞へ効率的に運搬させることができる。
一方、メルトリンの一部を少なくとも含むポリペプチドは、培養系に添加することによって、細胞同士の接着、または凝集、もしくは融合を競合的に阻害することが可能である。特にディスインテグリン領域の一部、ディスインテグリン領域そのもの、もしくはディスインテグリンを含む可溶型のポリペプチドは、細胞の接着を阻止するための医薬組成物の有効成分として使用することができる。例えば、血小板の接着を阻止し、血栓形成や血液凝固を抑制する抗凝固剤として、血栓症やＤＩＣ、多臓器不全の治療薬として使用することが可能である。また、癌細胞の転移にはインテグリンファミリーをはじめとする接着因子が関与していると考えられているので、当該ディスインテグリン領域を含むポリペプチドは、癌の発育を抑制したり癌細胞が他の細胞へ接着するのを抑制して転移を予防するための薬剤としても使用しうる。さらに、破骨細胞の形成においても細胞同士の接着が重要な役割を担っていることが知られている。実施例で示すように、本発明者等は、その接着を担う分子の１つがメルトリンであり、抗メルトリン抗体によって、破骨細胞の形成を抑制し、骨吸収の亢進を抑制できることを明らかにしている。したがって、本発明のメルトリンのディスインテグリン領域を含むポリペプチド、特にメルトリンαもしくはβのディスインテグリン領域を含むポリペプチドは、抗メルトリン抗体と同様に、骨吸収を抑制するための医薬組成物の有効成分として使用することが可能である。
また、メルトリンの一部を少なくとも含むポリペプチドのうち、メタロプロテアーゼ領域を含むポリペプチドは、それ自身蛋白分解酵素として、もしくは生体内で他の蛋白分解酵素を競合的に阻害するポリペプチドとして使用することができ、炎症性疾患の治療薬として利用することが可能である。
本発明のメルトリンおよびポリペプチドは、これらの利用法のみでなく、抗体作成の際の抗原としても使用できる。
本発明は、また、本発明のメルトリンまたはメルトリンの任意の一部を含むポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡにも係わる。かかるＤＮＡは、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ等のいかなるＤＮＡをも包含する。
本発明のＤＮＡは、その起源は特に限定されない。本発明のＤＮＡの具体例はマウスのメルトリンα、β及びγもしくはそれらの一部を含むポリペプチドをコードするＤＮＡであり、それらは、それぞれ、図５ａ〜図５ｊ、図６ａ〜図６ｈ、図７ａ〜図７ｅのコーディング領域もしくはその部分配列で特徴づけることができる。その他の具体例としては、ヒトのメルトリンα、β、γもしくはそれらの一部を含むポリペプチドをコードするＤＮＡであり、それぞれ図１２ａ〜図１２ｂまたは図１５ａ〜図１５ｆまたは図２３ａ〜図２３ｂのいずれか、図１６または図１７ａ〜図１７ｃのいずれか、図１３ａ〜図１３ｄに示された塩基配列のコーディング領域もしくはその部分配列で特徴づけることができる。
なお、これらの図において、前駆体領域、メタロプロテアーゼ領域、ディスインテグリン領域、システインリッチ領域の各領域、膜貫通領域、細胞内領域をコードする塩基配列が、図の配列のどの部分に相当するかについては実施例で考察した。しかしながらそこで規定した部分は一具体例に過ぎず、それらの塩基配列を本質的に含むＤＮＡも本発明に属する。即ち、各領域の境目はこれらに限定されるものではなく、例えば、リーディングフレームがはずれない限り、実施例で考察した各領域の境目から１個〜約６０個分、５’末端方向、３’末端方向、もしくはその両方にずれた塩基配列で規定されたＤＮＡも、それが、前駆体領域、メタロプロテアーゼ領域、ディスインテグリン領域、システインリッチ領域、膜貫通領域、細胞内領域と実質的に同様の機能を有するポリペプチドをコードするものであれば本発明のＤＮＡに含まれる。
さらに、上記図で示された塩基配列以外にも、遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作成される同一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部を含むＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。また、今回発明者らが明らかにしたように、マウスとヒトのメルトリンとは、互いに高いホモロジーを有することから、上記アミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは９０％以上のホモロジーを示す物質はメルトリンとしての機能を残していると考えられる。そして、このようなホモロジーのあるポリペプチドをコードするＤＮＡは、互いにハイブリダイズすることが予想される。したがって、上述の図で示した塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用い、ハイストリージェンシーな条件下でハイブリダイゼーションを行った場合に得られるＤＮＡ断片は本発明のＤＮＡに含まれる。
マウスメルトリンα、β、γ、ヒトメルトリンα、β、γをコードするＤＮＡもしくはその一部は、後述の実施例に記載されているように、プラスミドベクターに組み込まれ、それで形質転換した大腸菌は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
本発明のＤＮＡは公知の方法で作成することが可能である。例えば、該ｃＤＮＡは、従来公知の方法によって、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、図２ａ〜図２ｊ、図３ａ〜図３ｊ、図４ａ〜図４ｉ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃもしくは図２３ａ〜図２３ｂに示したアミノ酸配列の一部のポリペプチドに対する重鎖プライマーを使用してＰＣＲ（例えば、Michael A.I.等, PCR Protocols, a guide to method and application, Academic Press, 1990，参照）により得ることが出来る。例えば、ディスインテグリン領域のアミノ酸配列をコードする重鎖プライマーを使用してＰＣＲを行う。または、得られた増幅断片の塩基配列をもとにプローブを作製し、ハイブリダーゼション法によっても、本発明のＤＮＡを得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーを得るための材料としては、実施例で示すように、筋芽細胞を分化誘導させたもの、骨髄、胎児肺細胞が好ましい。また、この他に、ｃＤＮＡライブラリーとしては、胎盤や絨毛細胞、胎児細胞から作製した公知のライブラリー等を利用することも可能である。
本発明のＤＮＡのうち、メルトリンの任意の一部を任意の順序で結合させたポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば以下の方法で作成することができる。すなわち、メルトリンの任意の一部をコードする各ＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅させる。このとき、必要があれば適当な制限酵素認識配列を有するようにプライマーを設定しても良い。リーディングフレームがずれないように注意し、得られた断片をＤＮＡリガーゼを使用して連結させる。
本発明のＤＮＡは、本発明のメルトリンもしくは本発明のポリペプチドを、遺伝子工学的に生産するために使用することができる。当該ＤＮＡを使用した、本発明のメルトリンもしくはポリペプチドの生産は、公知方法を参考にして行うことができる（例えば、（Sambrook J.）等、Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989参照）。
本発明のＤＮＡは、適当なベクターに組み込んで遺伝子治療等に使用することも可能である。例えば、任意の生理活性物質をコードする塩基配列を本発明のＤＮＡの下流に融合させたＤＮＡを作成し、適当なウイルス由来のベクターに組み込んで、生体内の細胞を形質転換させると、該生理活性物質は、本発明のメルトリンとの融合蛋白質として発現される。そして、該生理活性物質は、メルトリンが接着する生体内の細胞の周辺に集積させることができる。
更に、本発明は、本発明のメルトリンまたはメルトリンの任意の一部を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体に係わるものである。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、メルトリンをコードする塩基配列もしくはその一部に相補的な塩基配列を有するか、メルトリンもしくはその一部を含むポリペプチドの発現を阻止する機能を有することで特徴づけられる。後者のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体には、メルトリンをコードする塩基配列もしくはその一部に相補的に結合して発現を阻止するものの他、メルトリンのコーディング領域の上流、下流のノンコーディング領域に相補的に結合するものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体の具体例は、本発明のＤＮＡもしくはその一部に相補的な塩基配列を有する。特に好ましくは、図５ａ〜図５ｊ、図６ａ〜図６ｈ、図７ａ〜図７ｅ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃおよび図２３ａ〜図２３ｂのいずれかに記載のＤＮＡもしくはその一部の相補鎖を有するオリゴヌクレオチドもしくはその誘導体である。アデニン（Ａ）に対する相補的塩基としてはチミン（Ｔ）のかわりにウラシル（Ｕ）であってもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体には、その立体構造や機能がオリゴヌクレオチドと類似するものすべてが含まれる。たとえば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した物や、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて、置換や、修飾が生じた物質、天然には存在しないような、塩基、糖、リン酸を有する物や、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有するもの等である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体のは、公知方法で製造することができる（例えば、スタンレー  Ｔ．クルーク（Stanley T. Crooke）およびベルナルド  レブロー（Bernald Lebleu）編、in Antisense Research and Applications, ＣＲＣ出版、フロリダ，１９９３年）。
天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、目的とする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の５’末端、３’末端に相補的な配列をもつセンスプライマー、アンチセンスプライマーを化学合成し、メルトリン遺伝子もしくはメルトリンをコードするＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には、化学合成機（たとえばパーキンエルマージャパン（株）、３９４型）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体はラジオアイソトープや蛍光物質、酵素、発光物質で標識して、試料中にメルトリンもしくはその一部が存在するか否かを測定するためのプローブとして使用することができる。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、生体におけるメルトリンの発現を阻止するための医薬品として使用することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、メルトリンもしくはその一部の発現を阻止するには、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
前述のように、メルトリンは骨格筋形成に加え破骨細胞の形成や癌の発育・転移に関与すると考えられる。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いてメルトリンの発現を阻止することにより、癌の治療及び癌転移の予防や、骨吸収を抑制して骨粗鬆症や高カルシウム血症を治療することが可能である。
更に、本発明は、本発明のメルトリンもしくはその任意の一部を少なくとも含む本発明のポリペプチドを認識する抗体に係わる。言い換えると、該抗体は、本発明のメルトリンのみを認識する抗体、本発明のポリペプチドのみを認識する抗体、もしくはそれらの両方を認識する抗体である。
該抗体には、本発明のメルトリンもしくは本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体に加え、他のポリペプチドと交叉反応するような抗体も含まれる。また、メルトリンα、β、γのいずれかの分子種を特異的に認識する抗体、メルトリンα、β、γの２つ以上の分子種を認識する抗体のいずれもが含まれる。さらに、特定の動物種（例えばヒトもしくはマウス）由来のメルトリンもしくはその一部を少なくとも含むポリペプチドのみを認識する抗体、２つ以上の動物種由来のメルトリンもしくはその一部を少なくとも含むポリペプチドを認識する抗体いずれもが含まれる。
本発明の抗体は、好ましくは、図２ａ〜図２ｊ、図３ａ〜図３ｊ、図４ａ〜図４ｉ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃおよび図２３ａ〜図２３ｂのいずれかに記載のアミノ酸配列もしくはその一部を認識する抗体である。
さらに好ましくは、図２ａ〜図２ｊ、図３ａ〜図３ｊ、図４ａ〜図４ｉ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃおよび図２３ａ〜図２３ｂのいずれかに記載のアミノ酸配列もしくはその一部を少なくとも有するポリペプチドを、必要があれば適当なキャリアと結合させて投与抗原として動物に免役して得られる抗体である。例えば、図５ａ〜図５ｊ、図６ａ〜図６ｈ、図７ａ〜図７ｅ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃ、図２３ａ〜図２３ｂに記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、該ベクターで適当な宿主を形質転換して、該メルトリンを生産させる。そして、形質転換体の菌体もしくは培地からメルトリンを精製して、それを投与抗原として得られる抗体である。更に、該形質転換体の菌体そのものもしくはメルトリンを発現している任意の細胞そのものを投与抗原として得られたものであってもよい。このような形質転換体および細胞は、メルトリンα、メルトリンβ、メルトリンγのいずれか１種を発現しているものであっても、２種以上を発現しているものであってもよい。また、メルトリンの一部のアミノ酸配列からなるポリペプチドを化学合成し、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）等のキャリアと結合させ、それを投与抗原として得られる抗体であってもよい。
抗原としてメルトリンの一部を使用しても、メルトリンの全体を認識する抗体を得ることができるし、マウスメルトリンもしくはその一部を抗原として使用しても、ヒトメルトリンもしくはその一部を少なくとも含むポリペプチドを認識する抗体を得ることが可能である。
本発明の抗体にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれもが含まれる。また、該抗体は、いずれのクラス、サブクラスに属するものであってもよい。
該抗体は、公知方法によって（（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）作製することができる。以下に、その一例を簡単に説明する。
まず、図５ａ〜図５ｊ、図６ａ〜図６ｈ、図７ａ〜図７ｅ、図１２ａ〜図１２ｂ、図１３ａ〜図１３ｄ、図１５ａ〜図１５ｆ、図１６、図１７ａ〜図１７ｃ、図２３ａ〜図２３ｂに記載の塩基配列のコーディング領域もしくはその一部を組み込んだ発現ベクターで、適当な宿主を形質転換して、これを抗原とするか、もしくは当該形質転換体に該メルトリンを生産させ、形質転換体の菌体もしくは培地からメルトリンを精製し、これを抗原とするか、上記図に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを化学合成し、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）等のキャリアと結合させ、精製して抗原とする。抗原を、もしくはフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントと抗原とを、動物に接種し、２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。免疫する動物は、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用する。ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明のメルトリンに結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養する。選択されたクローンの培養上清から、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせてモノクローナル抗体を生成する。
本発明の抗体は、さらに、メルトリンが有する、細胞の融合または接着または凝集活性を阻害する、所謂、中和抗体であり得る。該中和抗体には、メルトリンの活性を完全に抑制するもの、部分的に抑制するもののいずれもが含まれる。
中和抗体のスクリーニングの１つの方法は、抗血清や、ハイブリドーマの培養上清を、メルトリン発現細胞の培養系に加え、細胞の融合や凝集の阻害を指標に行う方法である。スクリーニングの結果、選別された血清やハイブリドーマ培養上清から公知方法を組み合わせて目的の抗体を精製する。
本発明の抗体には、本発明のポリペプチドもしくはその一部を認識して結合するものであれば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦｖも含まれる。また、Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを一本鎖となるように連結させたシングルチェインＦｖをコードするような遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させて得られるシングルチェインＦｖも本発明の抗体に含まれる。さらに、本発明のポリペプチドもしくはその一部を認識するものであれば、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体も本発明に含まれる。
例えば、キメラ抗体は、本発明のメルトリンまたはポリペプチドを認識するマウス抗体の定常部をコードする遺伝子を、ヒト抗体の定常部をコードする遺伝子と置きかえ、再構成された遺伝子を動物細胞で発現させることにより得ることができる。ヒト抗体はin vitro sensitization法（Borrebaeck, C.A.K.J. Immunol, Meth., 123, 157, 1989参照）やＳＣＩＤマウスを用いた方法（工藤俊雄，組織培養，19, 61-65, 1993参照）等の方法で得ることができる。また、ヒト化抗体は、相補性決定部位（ＣＤＲ）がマウス抗体のＣＤＲと置き換えられた抗体をコードするように遺伝子を再構成させ、それを動物細胞で発現させることにより得ることができる（Carter等、Pro. Nat. Acad. Sci．８９巻、４２８５頁、１９９２年）。
必要に応じ、再構成されたヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するするように可変領域のフレームワークを、マウスのフレームワークとホモロジーが高い配列となるようにアミノ酸の置換をしても良い。このようなヒト化抗体の好ましい例は、後述の中和抗体Ｆ９３２−１５−２やＦ９３７−９−２と同一のＣＤＲを有するものである。当該好ましいヒト化抗体を得るには、実施例で示したハイブリドーマＦ９３２−１５−２やＦ９３７−９−２から抗体をコードするＤＮＡを作製し、ＣＤＲ部分以外がヒト由来の配列となるようにヒト抗体をコードするＤＮＡと連結させる。さらに必要に応じてフレームワーク部分をコードするＤＮＡに変異を導入する。得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで、適当な細胞を形質転換させ、形質転換体の培養上清から精製する。
本発明の抗体は、蛍光物質、酵素、発光物質もしくはラジオアイソトープで標識して体液中や組織中に存在するメルトリンもしくはその分解産物を検出するために使用することができる。先述のように、メルトリンは、筋管形成、骨吸収、癌の転移と係わっていると考えられるので、各組織や体液中におけるメルトリンの有無を検出できれば、疾患の進行度や、予後の予測、治療効果の確認をすることが可能になる。該抗体は、また、メルトリンを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のメルトリンを検出するために使用することができる。
また、本発明の抗体のうち中和抗体は、細胞の融合または接着または凝集を阻害するため、更に、骨吸収の抑制や、炎症の抑制、血液凝固の抑制、癌転移の抑制を目的とした医薬組成物の有効成分となる。又、培養中の細胞のアグリゲーションを阻止する培養用の試薬としても使用可能である。抗体を医薬組成物の有効成分として用いる場合には、抗原性の点から前述のようにして得られるヒト抗体やヒト化抗体が好ましい。
又、本発明は、先述した本発明のＤＮＡを含有するベクターに係わる。本発明のベクターは、上記ＤＮＡに加え、必要に応じて、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等を含んでいてもよい。
該ベクターは、先述した本発明のＤＮＡを、当業者に公知の方法（例えばサムブルックJ.（Sambrook J.）等、Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク（New York），1989年、参照）で、任意のベクターに組み込むことにより作製できる。メルトリンもしくはその一部をコードするＤＮＡの好適な例は、本発明のＤＮＡに対する説明の欄ですでに開示している。当該ＤＮＡを組み込むベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等から適宜選択して使用しうるが、その好適な例は、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II、ＰＨＩＬ−Ｓ１、λＺａｐ II、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、ＹＲＰ１７、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＦＮ−II等である。
本発明のベクターの好適な例は、メルトリンもしくはその一部を少なくとも含有するポリペプチドをコードするＤＮＡに加え、必要に応じて複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、当該メルトリンもしくはポリペプチドの発現に使用しうるベクターである。複製開始点は、大腸菌用ベクターの場合は、ＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子等を使用し、動物細胞用のベクターにはＳＶ４０やアデノウイルス由来のもの等を使用し、酵母用にはＡＲＳ１由来のもの等を使用することができる。プロモーターとしては、大腸菌用にはｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃプロモーター等が利用でき、動物細胞用にはＳＶ４０由来のもの、サイトメガロウイルス由来のもの、アデノウイルス由来のもの、エロンゲーションファクター１αのプロモータ領域などヒトや動物の遺伝子上に本来存在するプロモーター配列が利用できる。また、酵母用にはαプロモーター等が使用でき、ピキア属酵母の場合にはＡＯＸ１プロモーターが使用できる。当該ベクターを真核細胞の形質転換に使用する場合には、上記配列に加え、必要に応じて、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等を付加する。該発現ベクターは、メルトリンもしくはその一部を遺伝子工学的に生産するために使用することができる他、メルトリンが関与する疾患の遺伝子治療にも利用できる。
本発明は、上記ベクターを使用して形質転換させた形質転換体に係わる。
該形質転換体は、適当な宿主細胞を公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック1991年3月20日発行、羊土社、参照）に従い、上記ベクターで形質転換することによって得ることができる。使用する宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の原核細胞、もしくは酵母や昆虫細胞、動物細胞等の真核細胞から適宜選択することができる。本発明の形質転換体の好適な例は、大腸菌または酵母、またはＣＨＯ細胞を宿主として得られた形質転換体であり、本発明のメルトリンもしくは本発明のポリペプチドを発現する形質転換体である。
本発明は更に、かかる形質転換体を培養する工程を含む、本発明のメルトリンもしくはその一部を少なくとも含むポリペプチドの製造方法に係わる。
該製造方法では、まず、本発明の形質転換体を培養し、必要に応じて、遺伝子の増幅や発現誘導をおこなう。形質転換体の培養や発現誘導は、公知方法（たとえば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参照）に従って行うことができる。次に、培養混合物、すなわち培養上清もしくは細胞を回収し、それらを材料として、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行い、本発明のメルトリンもしくはその一部を含むポリペプチドを精製する。当該ポリペプチドの精製は、上記のような通常の蛋白質の精製方法を適宜組み合わせて行うことができるが、本発明の抗体を用いたアフィニティーカラムを使用すれば効率的に精製することができる。
当該製造方法において、本発明のポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼ等の他のポリペプチドとの融合蛋白として形質転換体に生産させてもよい。当該蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白として発現させた場合には、精製工程のいずれかのステップにおいて、融合蛋白質をブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理して当該蛋白質を切り出す操作を行う。
本発明は、また、新規な有効成分を含有する医薬組成物に係わる。本発明の医薬組成物は本発明のメルトリンを有効成分とするか、メルトリンアンタゴニストを有効成分とするものである。ここでいうメルトリンアンタゴニストとは、メルトリンを介した細胞の融合、接着または凝集を阻害できる分子のことである。例えば、メルトリンを認識する本発明の抗体のうち中和活性を有するもの、もしくは該抗体のフラグメント、メルトリンの一部もしくはメルトリンの任意の一部が任意の順序で結合したポリペプチド、メルトリンをコードするＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその誘導体である。
メルトリンを認識する抗体は、本発明の抗体の説明の欄で既に説明した方法で得ることができるので、その中から筋細胞、破骨細胞もしくは癌細胞の接着、融合もしくは凝集を完全もしくは部分的に中和する抗体を選択し、本発明の医薬組成物の有効成分とする。該抗体は、ヒトメルトリンを認識し、ヒトの筋細胞もしくは破骨細胞、癌細胞の接着、融合もしくは凝集を阻止するものであれば、いかなるポリペプチドを投与抗原をとして得られた抗体であってもよく、またいかなる動物を免疫して得られたものであってもよい。さらにポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明の医薬組成物をヒトに投与することを考えると、当該医薬組成物の有効成分とする抗体は、好ましくは、ヒト抗体もしくはヒト化抗体である。メルトリンを認識するヒト抗体もしくはヒト化抗体の作成方法は、既に記載した通りである。
本発明の医薬組成物の有効成分として使用する上記抗体のフラグメントとしては、上記中和抗体のＦａｂやＦ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖが挙げられる。
本発明の医薬組成物の有効成分として使用するメルトリンの一部もしくはメルトリンの任意の一部が任意の順序で結合したポリペプチドは、細胞の接着もしくは融合、もしくは凝集を阻止する活性を有するものであれば、メルトリンのいかなる一部を含むポリペプチドであってもよい。好適な例は、メルトリンのディスインテグリン領域の一部もしくはディスインテグリン領域の全体、もしくはメルトリンのメタロプロテアーゼ領域とディスインテグリン領域およびシステインリッチ領域を有するポリペプチド、メルトリンのディスインテグリン領域を含みかつメルトリンの膜貫通領域を含まないポリペプチド、メルトリンのメタロプロテアーゼ領域とディスインテグリン領域を少なくとも含みかつメルトリンの膜貫通領域を含まないポリペプチドである。これらのポリペプチドは化学合成して得ることもできるし、本発明のポリペプチドについての説明の欄で示したように、遺伝子工学的に生産することもできる。
本発明の医薬組成物の有効成分として使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、メルトリンをコードする遺伝子に相補的に結合し、その発現を完全もしくは部分的に抑制するもので、ヒトに投与するのに適したものであれば、いかなる塩基配列を有するものであってもよく、いかなる構造を有する者であっても良い。
既に述べたように、メルトリンは破骨細胞の形成や癌細胞の転移に関与すると考えられる。したがって、メルトリンアンタゴニストを有効成分とする医薬組成物は、骨吸収の抑制や癌の転移抑制の目的で使用できる。骨吸収抑制のための医薬の有効成分としてより好ましいものは、ヒトメルトリンαもしくはβに対するアンタゴニストであり、癌転移抑制のための有効成分としてより好ましいものはヒトメルトリンγに対するアンタゴニストである。
なお、本発明の医薬組成物が有効成分とするメルトリンおよびメルトリンアンタゴニストは、その基本的な活性を失わない限り、薬理学的に許容されうる化学修飾が施されたものや塩を形成させたものであってもよい。例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩や、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸等の有機酸との塩などである。
本発明の医薬組成物には、経口投与、経皮投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹空内投与、皮下投与、皮内投与、経腸投与等、あらゆる投与経路で使用される医薬組成物が含まれる。
また、投与方法や、投与期間も特に限定されない。本発明の医薬組成物は投与経路に応じ、薬理学的に許容されうる補助成分（賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等）を含むことが可能である。例えば、当該医薬組成物が注射剤である場合には、ゼラチンやヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖などのアルコールや糖類、ポリソルベート８０（ＴＭ）等の界面活性剤を含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物は、主として、骨粗鬆症や高カルシウム血症の治療・予防、癌の浸潤や転移を予防するために使用することができる。
本発明の医薬組成物のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢、あるいは投与方法により異なるが、例えば、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、特に好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で使用することができ、患者の病態に応じて、点滴等で持続的に投与したり、適当な回数に分割して投与したり、単回投与したりすることができる。
本発明の医薬組成物は定法にしたがって製剤化することが可能である。例えば、注射用製剤であれば、薬理学的に許容されうる程度に精製され、無菌状態で調整されたメルトリンもしくはメルトリンアンタゴニストを生理食塩水、緩衝液等に溶解し、必要があればゼラチンやヒト血清アルブミンを添加する。また、このような液剤を凍結乾燥して、使用時に注射用蒸留水や、生理食塩水に溶解しても良い。
本発明のメルトリン、各種ポリペプチド、及びそれらをコードするＤＮＡ等を使用して、メルトリンに結合する物質やメルトリンの活性を阻害する物質、メルトリンの発現を調節する物質のスクリーニングを実施することも出来る。
【図面の簡単な説明】
図１ａ〜図１ｂは、マウスメルトリンα、β、γ（それぞれＭα、Ｍβ、Ｍγ）の一部と公知の配列（macrophage specific antigen（MS2）、Jararhagin（JR）、fertilin−α（fα））との比較を示す図である。
図２ａ〜図２ｊは、マウスメルトリンαのアミノ酸配列と対応するＤＮＡ配列を示す図である。
図３ａ〜図３ｊは、マウスメルトリンβのアミノ酸配列と対応するＤＮＡ配列を示す図である（図中、Ｎはその部位の塩基が未確定であることを示す）。
図４ａ〜図４ｉは、マウスメルトリンγのアミノ酸配列と対応するＤＮＡ配列を示す図である。
図５ａ〜図５ｊは、ｐＢＳＭｅｌα中に組み込まれている、マウスメルトリンαをコードする塩基配列を含むＤＮＡのＤＮＡ配列の解析結果を示す図である（図中、Ｎ、Ｍ、Ｗ、Ｓはその部位の塩基が未確定であることを示す。）
図６ａ〜図６ｈは、ｐＢＳＭｅｌβ中に組み込まれている、マウスメルトリンβをコードする塩基配列を含むＤＮＡのＤＮＡ配列の解析結果を示す図である（図中、Ｎ、Ｍ、Ｗ、Ｓはその部位の塩基が未確定であることを示す。）
図７ａ〜図７ｅは、ｐＢＳＭｅｌγ中に組み込まれている、マウスメルトリンγをコードする塩基配列を含むＤＮＡのＤＮＡ配列の解析結果を示す図である（図中、Ｎ、Ｍ、Ｗ、Ｓはその部位の塩基が未確定であることを示す。）
図８は、メルトリンα、β、γ、δＭＰ、δＰｒｏの構造を模式的に示した図である。
図９は、ウエスタンブロッティングの結果を示す電気泳動の写真である。
図１０は、ノーザンブロッティングの結果を示す電気泳動の写真である。
図１１ａ〜図１１ｂは、筋芽細胞におけるメルトリンの融合促進活性を示す図である。
図１２ａ〜図１２ｂは、ｐＢＳｈｕＭα３００に組み込まれた、ヒトメルトリンαをコードするＤＮＡの塩基配列の解析結果を示す図である（図中、Ｎはその部位の塩基が未確定であることを示し、Ｘはその部位のアミノ酸が未確定であることを示す）。
図１３ａ〜図１３ｄは、ｐＢＳｈｕＭγＧ２３８に組み込まれた、ヒトメルトリンγをコードするＤＮＡの塩基配列の解析結果を示す図である。
図１４ａは、ヒトメルトリンαのクローニングにおける、クローニング領域を模式的に示す図である。
図１４ｂは、ヒトメルトリンβのクローニングにおける、クローニング領域を模式的に示す図である。
図１５ａ〜図１５ｆは、pMelα-26N、pMelα-25Cに組み込まれたＤＮＡの解析結果をもとに決定したヒトメルトリンαの部分アミノ酸配列と対応する塩基配列を示す図である。
図１６は、ヒトメルトリンβ部分のアミノ酸配列と対応する塩基配列を示す図である。
図１７ａ〜図１７ｃは、pMelβ-24C、pMelβ-24Nに組み込まれたＤＮＡの解析結果をもとに決定したヒトメルトリンβの部分アミノ酸配列と対応する塩基配列を示す図である。
図１８ａは、投与抗原に使用したペプチドの、マウスメルトリンαにおける部位を模式的に示す図である。
図１８ｂは、投与抗原に使用したペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
図１９は、抗マウスメルトリンα抗体を使用したウエスタンブロティングの結果を示す電気泳動の写真である。
図２０は、抗マウスメルトリン抗体による筋管形成の抑制を示す図である。
図２１は、抗マウスメルトリン抗体の、マウス全骨細胞による骨吸収窩形成に及ぼす作用を示す図である。
図２２は、抗マウスメルトリン抗体の低Ｃａ食マウスにおける血清Ｃａ値に対する作用を示す図である。
図２３ａ〜図２３ｂは、ヒトメルトリンαの膜貫通領域を含むアミノ酸及びそれに対応する塩基配列を示す図である。
図２４ａ〜図２４ｅは、pMelβ-24C、pMelβ-24Nに組み込まれたＤＮＡの塩基配列の解析結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の最良の実施の形態を示す実施例により、本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を何等限定するものではない。
実施例
以下の記載において用いる略号は、当該技術分野における慣用略号に基づくものである。
なお、以下に示す実施例中の諸操作は、主にサムブルック等編〔モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版〕コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９年；ハーロー・レイン著［抗体  ア  ラボラトリーマニュアル］コールドスプリングハーバー等を参考として実施した。
実施例１：  ＲＴ−ＰＣＲによるマウスメルトリンをコードするＤＮＡの取得
（１）ＲＮＡ、ｃＤＮＡの調製
胎児性線維芽細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２由来の筋芽細胞（筋分化制御因子ｍｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子をトランスフェクトし、発現させたクローン）を１０％ウシ胎児血清（モアゲート）を含むＤＭＥＭ中で１０6細胞／φ１０ｃｍプレートまで増殖させ、分化培地（２％ウマ血清ギブコを含むＤＭＥＭ）で３７℃にて２日間培養し、分化誘導した。グアニジンイソチオシアネート／アシッドフェノール法（コムシンスキーP.（Chomczynski P.）およびサシーN.（Sacchi N.）, Anal. Biochem., 162巻、156-159頁、1987年）によって総ＲＮＡを分離した後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフィーを２回繰り返しポリ（Ａ）ＲＮＡを選択的に分離した。このポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマー（Ｎ６，ファルマシア）を用い、ｃＤＮＡを合成した。合成にはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬのＭＬＶ逆転写酵素を用い、その合成マニュアルに従った。このｃＤＮＡを次のＰＣＲの鋳型として用いるとともに、さらに二重鎖ＤＮＡを合成し、ファージ（λＺａｐII（stratagene））に組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
（１）で調製したｃＤＮＡを鋳型として以下の手順でＲＴ−ＰＣＲを行った。センスプライマーとしてアミノ酸配列ＥＤＣＤＣＧもしくはＥＥＣＤＣＧをコードする重複プライマー（degenerative primer）を合成して使用した。また、アンチセンスプライマーとして、アミノ酸配列（ＫＣＧＫＬＩＣ）をコードする重複プライマーを合成して使用した。
まず、プライマーと前述のｃＤＮＡ、Ｔａｑポリメラーゼ、およびその反応試薬（ベーリンガーマンハイム）と混合し、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー・シータス）にて９５℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間反応させ、この操作を３６サイクル行い、４５０ｂｐ付近の増幅産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動して回収した。
得られた増幅断片をプラスミドｐＢＳ−ＳＫII（−）（Stratagene）のＳｍａＩサイトに組み込み、ＤＮＡシーケンサー（３７０Ａ型、アプライドバイオシステムズ）を使用して、ＤＮＡ配列を解析した。その結果、３種の分子種が存在することが判明した（図１参照）ので、これら３種のＤＮＡフラグメントをプローブとして、先に述べたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、それぞれ９０３，９２０，８４５アミノ酸残基のオープンリーディングフレーム（図２ａ〜図２ｊ、図３ａ〜図３ｊ、図４ａ〜図４ｉ）を有するｃＤＮＡを単離し、それぞれの遺伝子産物（図５ａ〜図５ｊ、図６ａ〜図６ｈ、図７ａ〜図７ｅ）をメルトリン（meltrin）−α、β、γと命名した。これらのｃＤＮＡをｐＢＳ−ＳＫII（−）に挿入したプラスミドをそれぞれｐＢＳＭｅｌα、ｐＢＳＭｅｌβ、ｐＢＳＭｅｌγと命名した。
公知方法で大腸菌株ＪＭ１０９をｐＢＳＭｅｌα、ｐＢＳＭｅｌβ、ｐＢＳＭｅｌγで形質転換し、得られた形質転換体ＪＭ１０９（ｐＢＳＭｅｌα）、ＪＭ１０９（ｐＢＳＭｅｌβ）、ＪＭ１０９（ｐＢＳＭｅｌγ）を、1996年２月19日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４５１、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４５２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４５３）。尚、それらは、1996年10月８日付でブタペスト条約に基づく寄託に移管され、夫々、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７０１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７０２及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５７０３が付されている。
（３）メルトリンの構造の解析
上記（２）で決定したＤＮＡ配列をもとに、メルトリンの構造を解析した。その結果、メルトリンα、β、γは、膜貫通型蛋白質と推定され、細胞外ドメイン、膜貫通（Transmembrane, TM）領域、細胞内ドメインからなり、細胞外ドメインはシグナルペプチド様配列を含む前駆体様領域（Pro region）と、メタロプロテアーゼ（Metalloproteinase）領域、ディスインテグリン（Disintegrin）領域とそれに続くＣｙｓｔｅｉｎに富むシステイン・リッチ（Cystein Rich）領域からなり、メルトリンαの場合は、システイン・リッチ領域の中に融合ペプチド（Fusion peptide, FP）様配列をもつことがわかった（図８参照）。
ヘビ毒Ｊａｒａｒｈａｇｉｎ等との相同性に基づき、メルトリンαでは、前駆体様領域は図２ａ〜図２ｊのＮ末端から２０５番目のＡｒｇまで（対応する塩基配列は、塩基番号２２１〜８３５）、メタロプロテアーゼ領域は、２０６番目のＧｌｕから４１４番目Ｐｒｏまで（対応する塩基配列は、塩基番号８３６〜１４６２）、ディスインテグリン領域は、４２０番目のＰｈｅから５０９番目Ｇｌｙまで（対応する塩基配列は、塩基番号１４７８〜１７４７）、システイン・リッチ領域は、５１０番目のＨｉｓから７０６番目のＧｌｙまで（そのうち融合ペプチド様配列は５８５番目Ｇｌｙから６０７番目のＧｌｕまで）（対応する塩基配列は、それぞれ塩基番号１７４８〜２３３８、１９７３〜２０４１）、膜貫通領域は７０７番目のＬｅｕから７２７番目のＬｅｕまで（対応する塩基配列は、塩基番号２３３９〜２４０１）と考えられた。
メルトリンβでは、前駆体様領域はＮ末端から２０４番目のＡｒｇまで（対応する塩基配列は、塩基番号６３〜６７４）、メタロプロテアーゼ領域は２０５番目のＧｌｕから４０９番目Ｐｒｏまで（塩基番号６７５〜１２８９）、ディスインテグリン領域は４１５番目のＴｙｒから５０４番目のＧｌｙまで（塩基番号１３０５〜１５７４）、システイン・リッチ領域は５０５番目のＴｈｒから７０６番目のＰｒｏまで（塩基番号１５７５〜２１８０）、膜貫通領域は７０７番目のＶａｌから７２９番目のＡｒｇもしくは７０７番目のＶａｌから７２４番目のＬｅｕまで（塩基番号２１８１〜２２４９もしくは２１８１〜２２３４）と考えられた。
メルトリンγでは、前駆体様領域はＮ末端から２０５番目のＡｒｇまで（塩基番号６９〜６８３）、メタロプロテアーゼ領域は２０６番目のＡｌａから４０６番目のＰｒｏまで（塩基番号６８４〜１２９２）、ディスインテグリン領域は４１２番目のＴｙｒから５０２番目のＧｌｙまで（塩基番号１３０２〜１５７４）、システイン・リッチ領域は５０３番目のＴｙｒから６９４番目のＡｌａまで（塩基番号１５７５〜２１５０）、膜貫通領域は６９５番目のＬｅｕから７１４番目のＩｌｅまで（塩基番号２１５１〜２２１０）と考えられた。
実施例２：  抗メルトリンα抗体の取得
（１）投与抗原の調製
グルタチオン−Ｓ−トランフェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith, D. B. & Johnson, K. S.、Gene、67巻、31-40、1988年）のＣ末端に、図２ａ〜図２ｊに示したメルトリンαのアミノ酸配列のＮ末端より数えて４８３番目のＳｅｒから６３５番目のＬｙｓまでを有するキメラポリペプチドを以下の方法で作成した。まず、ＧＳＴに対するｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＥＸ２Ｔ（ファルマシア）をＢａｍＨＩで消化し、ベクターとした。一方、ＰＣＲにより、図２ａ〜図２ｊのメルトリンαの４８３番目のＳｅｒから６３５番目のＬｙｓに対応するｃＤＮＡをｐＢＳＭｅｌαから増幅させ、ＢａｍＨＩリンカーを、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした。これと、先に得られたベクターをＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションし、プラスミドを作成した。このプラスミドを使用して、公知の方法で大腸菌株ＮＭ５２２を形質転換した。
得られた大腸菌トランスフォーマントを０．１ｍＭＩＰＴＧを含むＬ−ブロスで培養し、発現誘導することによって、菌内で大量のキメラペプチドを産生させた。この菌をＭＴＰＢＳ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１６ｍＭＮａ2ＨＰＯ４、４ｍＭＮａＨ2ＰＯ４、０．１ｍＭＰＭＳＦ）に懸濁し、超音波処理したのち、１％Ｔｒｉｔｏｎにて溶解し、上清を回収した。その上清にグルタチオンアガロース（シグマ）を加えてキメラペプチドを吸着させ、溶出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭグルタチオン）で溶出し抗原とした。
（２）抗血清の調製
（１）で作成した投与抗原１ｍｇ／０．５ｍｌＰＢＳと等量のＲＩＢＩをＰＢＳでもどしたもの（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  フナコシ）とを混合し、ウサギ（１２週齢、雌）の皮下・皮内に投与した。その４週間後さらに４週間間隔で２回、５００μｇ追加投与を行い、抗血液を採取し、血清を分離して、抗血清を得た。
（３）抗血清のアフィニティー精製
（１）において大腸菌で発現させ可溶化したキメラポリペプチド、あるいはペプチドを融合していないＧＳＴをグルタチオン−アガロースビーズに結合させたあと、０．２Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）で洗浄し、ディメチルピメリミデート（終濃度２０ｍＭ）を加え、抗原をビーズに不可逆的に結合させて、夫々、キメラポリペプチド−アフィニティービーズおよびＧＳＴ−アフィニティービーズを作成した。
次に、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０倍希釈した抗血清を、まず、ＧＳＴ−アフィニティービーズと混合し、抗ＧＳＴ抗体を吸着除去したのち、上清をキメラペプチド−アフィニティビーズと混合し、抗メルトリンα抗体を吸着させた。これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５  ５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄ののち１００ｍＭグリシンで溶出し、精製抗メルトリンα抗体を回収した。
（４）ウエスタンブロッティング
Ｃ２細胞を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで１０6細胞／φ１０ｃｍプレートまで増殖させた。さらに分化培地（２％のウマ血清を含むＤＭＥＭ）で３７℃にて培養し、２日目の細胞（Ｃ２ＤＭ  ｄ２）、および４日目の細胞（Ｃ２ＤＭ  ｄ４）を回収した。
また、以下の実施例５（３）の方法で作成したｐＢＯＳＭｅｌα（＋）の形質転換体Ｃ２を、１５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で、３７℃、３日間培養した。培養後、直径６ｃｍのプラスチックディッシュに２×１０5/ディッシュとなるように植え込み、さらに１日培養したのち前述の分化培地に交換し、分化誘導を行った。２日間培養後、細胞を回収した。
回収したＣ２ＤＭ  ｄ２、Ｃ２ＤＭ  ｄ４およびｐＢＯＳＭｅｌα（＋）の形質転換体をＳＤＳ可溶化バッファー（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール）と混合後、超音波破砕を行い、遠心してその上清をサンプルとして用いた。
次にメンブレンを洗浄液で２回洗浄した。ＴＢＳ−Ｔにとかした５％スキムミルクで、（３）で得られた抗血清を２０倍に希釈し、これにメンブレンを浸してと３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液で２回洗浄した。上記スキムミルクで、ビオチン標識抗ウサギイムノグロブリンズ抗体（ダコ）を４０００倍に希釈し、これにメンブレンを浸して３７℃で１時間反応させた。メンブレンを洗浄液で２回、洗浄ののち５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビシンで１時間反応させ、２回洗浄し、ＭＢ試薬（Ｃａｔ．ＴＭ９１２、シック）で発色させ、ＥＣＬシステム（アマーシャム）で測定した。
結果を図９に示した。
ウエスタンブロッティングの結果、約１１５ＫＤ、８６ＫＤ、６７ＫＤ、５８ｋＤの位置にバンドが認めれた。分子量から、メルトリンαは糖蛋白として発現されていると推定された。また、８６ＫＤの分子は、前駆体様領域配列が欠損したもの、６７ｋＤ、５６ｋＤの分子は、更にメタロプロテアーゼ領域までが欠損したものと考えられた。
実施例３：  ノーザンブロッティング
ファルマシアのｍＲＮＡ分離キットを用い、マウス各組織（成年マウスの骨、脳、肝臓、心臓、骨格筋および新生児マウスの骨、骨格筋、胎児マウスの骨、骨格筋）から実施例１の方法でポリ（Ａ）ＲＮＡを調製した。５０％ホルムアミド中で６５℃５分間加熱しＲＮＡを変性させ、６．６％のホルマリンを含む１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ、アマーシャム）に転写させた。
一方、実施例１で得られたメルトリンα、β、γのディスインテグリン領域及びシステイン・リッチ領域の一部（図２ａ〜図２ｊのＮ末端から数えて４３４番目のＧｌｕから５８３番目のＣｙｓ、図３ａ〜図３ｊのＮ末端から数えて４２９番目のＧｌｕから５７８番目のＣｙｓ、図４ａ〜図４ｉのＮ末端から数えて４２６番目のＧｌｕから５７５番目のＣｙｓをコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより調製し、ランダムプライマーラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ、アマーシャム）によって32Ｐ標識した。また、コントロール用のプローブとしてＧ３ＰＤＨ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，グリセルアルデヒド  ３−フォスフェート  デハイドロゲナーゼ）に対するｃＤＮＡを同様に32Ｐ標識した。これらプローブを使用し、前述の各組織からのｍＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行った。ブロッティングの操作は、ハイストリンジェンシー（high stringency）の条件下でサムブルック  J.（Sambrook J.）らの方法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク（New York）, 1989年）を用いた。
結果を図１０に示した。メルトリンα、βは成年および新生児マウスの骨、新生児マウス、胎児マウスの骨格筋でのみ発現していた（胎児マウスの結果は図１０には示していない）。またメルトリンγの発現は、組織特異性は認められず、普遍的に発現していた。
実施例４：  メルトリンの接着活性の確認
（１）プラスミドｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（＋）およびｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（−）の作成
メルトリンαの細胞外ドメインのうち、前駆体様領域とメタロプロテアーゼ領域部分を欠失させた、欠失型メルトリンδＭＰを以下の方法で作成した。
まず、プラスミドｐＢＳＭｅｌαをＭｓｃＩで部分消化し、１％アガロースゲル電気泳動に供し、直鎖状プラスミドＤＮＡを得た。これをＮｈｅＩで部分消化したのち、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントにて平滑末端としたのち、分子内ライゲーションを行なった。そして、正しい欠失をもつものを選択し、ＤＮＡ配列を確認した。ベクターのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで消化し、約５．８ｋｂの欠失型δＭＰフラグメントを得た。
一方、プラスミドｐＥＦＢＯＳ（Mizushima S. & Nagata S、Nucleic Acid Res. 18巻、5322頁、1990年）を制限酵素ＸｂａＩで消化し、脱リン酸化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントにて平滑末端としたのち、１％アガロースゲル電気泳動に供して直鎖型ベクターＤＮＡを得た。これと、先述の５．８ｋｂｐの断片とを、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションし、プラスミドｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（＋）およびｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（−）を得た。これらは、メルトリンαアミノ酸配列のＮ末端より数えて５５番目のＩｌｅから３９９番目Ｇｌｕの欠失したδＭＰをコードするインサートＤＮＡを、それぞれセンス方向、アンチセンス方向に組み込んだコンストラクトである。
（２）プラスミドｐＢＯＳＭｅｌα（＋）の作成
プラスミドｐＢＳＭｅｌαをＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで消化し、約７ｋｂのフラグメントを得た。先述のプラスミドｐＥＦＢＯＳを制限酵素ＸｂａＩで消化し、脱リン酸化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントにて平滑末端としたのち、１％アガロースゲル電気泳動に供して直鎖型ベクターＤＮＡを得た。これと、先述の約７ｋｂｐの断片とを、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションし、得られた発現プラスミドｐＢＯＳＭｅｌα（＋）と命名した。
（３）プラスミドｐＢＯＳＭｅｌαδＰｒｏ（＋）の取得
メルトリンαの前駆体様領域とメタロプロテアーゼ領域の境界付近にはＡｆｌIIサイトがあり、メタロプロテアーゼ領域とディスインテグリンドメインの境界付近にはＮｈｅＩサイトがある。一方、（１）で作成したｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（＋）において、シグナルペプチド様領域とディスインテグリン領域の境界にはＮｈｅＩ部位が残してある。そこで、ｐＢＯＳＭｅｌαをＡｆｌIIで消化し、メタロプロテアーゼドメインの直前にＮｈｅＩリンカーを結合したのち、ＮｈｅＩで消化してメタロプロテアーゼドメインを切り出した。これを、ｐＢＯＳＭｅｌδＭＰ（＋）のシグナルペプチド様配列とディスインテグリンドメインの間のＮｈｅＩ部位に挿入し、前駆体様領域付近（メルトリンαのアミノ酸配列のＮ末端より数えて５５番目のＩｌｅから２０６番目のＧｌｕまで）が欠失したδＰｒｏに対する発現プラスミドｐＢＯＳＭｅｌαＰｒｏ（＋）を得た。
（４）筋芽細胞融合促進活性の確認
プラスミドｐＢＯＳＭｅｌα（＋）あるいはｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（＋）とプラスミドｐＳＶ２ＮＥＯとをモル比で２０：１に混合したものを、リポフェクトアミン（ギブコＢＲＬ）を用いてそのプロトコールに従って、筋芽細胞Ｃ２に導入し、トランスフェクション後の細胞を、直径１０ｃｍのコラーゲンコートしたプレート（イワキ）あたり１０−２０個の形質転換体が得られるように希釈して蒔き、これを２０％のウシ胎児血清および５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ギブコＢＲＬ）を含有するＤＭＥＭ中で１２日間培養し、形質転換体を単離した。
筋芽細胞の融合活性を調べるため、得られたトランスフォーマント及び親株のＣ２細胞をｂＦＧＦ非存在下で３−４日間培養した後、直径６ｃｍのプラスティックディッシュに２Ｘ１０5/ディッシュとなるように植え込み、さらに一日培養した。これを前述の分化培地に移して分化誘導を行い、さらに４日間培養した。分化誘導を行うとＣ２は筋管を形成し始めた。４日後、メタノールで固定し、ギムザ、ライトの染色液（メルク）にて染色後、各ディッシュ中の任意の４カ所について１ｍｍ2あたりの核数を測定し、以下の式によって融合率を求めた。
0004118336.tif 000002
また、分化誘導後、１日ごとに５日間、細胞融合率の時間経過を調べた。
これらの実験結果を図１１ａ〜図１１ｂに示した。図から明らかなように、メルトリンαの全長を発現させた形質転換体（ｐＢＯＳＭｅｌα（＋）、図中ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）は、親株に比べてその融合能が低下し、従って何らかの形で細胞融合に阻害的にはたらくと考えられたが、これに対し、ｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（＋）（図中δＭＰ）を発現させた場合には、融合能の顕著な促進がみられた。なお、ｐＢＯＳＭｅｌαδＰｒｏ（＋）でＣ２細胞を形質転換し、得られた形質転換体でも融合促進活性が認められた。
一方、メルトリンβの全長を（３）の要領でｐＥＦＢＯＳに組み込んだプラスミドｐＢＯＳＭｅｌβ（＋）でＣ２細胞を形質転換して、メルトリンβを発現させた場合、筋細胞の融合能に大きな変化はみとめられなかった。しかし、ｐＢＯＳＭｅｌα（＋）とｐＢＯＳＭｅｌβ（＋）をＣ２細胞にコトランスフェクトして得られた形質転換体を調べると、親株に比べて細胞融合が促進されることがわかった。
これに対し、メルトリンγの全長を（３）の要領でｐＥＦＢＯＳに組み込んだプラスミドｐＢＯＳＭｅｌγ（＋）でＣ２細胞を形質転換して、メルトリンγを発現させた場合、あるいは、ｐＢＯＳＭｅｌα（＋）とｐＢＯＳＭｅｌγ（＋）をＣ２細胞にコトランスフェクトして得られた形質転換体は、いずれも筋細胞の融合能に大きな変化はみとめられなかった。
以上の結果から、メルトリンαは筋細胞融合に関与し、そのプロセシングによって細胞融合を促進する活性を示すことが明らかになった。さらに、メルトリンαとβとをともに発現するような形質転換体で筋細胞の融合が促進されたことから、メルトリンαおよびβは単独で機能しているのではなく、メルトリンαとβがヘテロマーを形成して機能するものと推定された。
（５）非筋細胞におけるメルトリンの機能の検討
マウス線維芽細胞Ｌ９２９をｐＢＯＳＭｅｌα（＋）あるいはｐＢＯＳＭｅｌβ（＋）で形質転換し、メルトリンαあるいはβを発現する形質転換体を単離した。これらの形質転換体では、いずれの場合も同種細胞同士の凝集あるいは融合は認められなかった。また、メルトリンαおよびメルトリンβの両方を発現させた細胞でもこうした変化はみられなかった。
これに対し、Ｌ９２９をｐＢＯＳＭｅｌγ（＋）で形質転換した形質転換体は、カルシウムイオンを含まない培地で細胞をプレートからはがし、これをカルシウムイオン添加培地に戻すと、顕著な凝集活性を示した。
この結果から、メルトリンγには細胞凝集能のあることが示されるとともに、分子の相同性から考えて、メルトリンα、βの筋芽細胞融合促進活性も、筋芽細胞凝集活性によって引き起こされたことが示唆された。
実施例５：  アンチセンスによる接着活性の抑制
実施例４（１）で作成したプラスミドｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（−）を、プラスミドＰＳＶ２ＮＥＯとモル比で２０：１に混合し、実施例４（４）に述べた方法でＣ２細胞を形質転換し、アンチセンスＲＮＡを発現している形質転換体を単離した。この形質転換体の接着活性を実施例４の方法で測定した。結果を図１１ａ〜図１１ｂに示した（図中のＡＳ）。その結果、δＭＰに対するアンチセンスＲＮＡの発現により、Ｃ２細胞の融合が抑制されることが確認された。
このことから、メルトリンαが筋細胞の融合には不可欠な役割を示すことが明らかとなった。
実施例６：  ヒトメルトリンαおよびγをコードするｃＤＮＡ断片の取得方法
ヒト骨髄細胞から精製されたｍＲＮＡ（クローンテック）を鋳型として、実施例１（１）に記載の方法でｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、実施例１（２）で作製した重複プライマーを用いて３６サイクルのＰＣＲを行った。増幅産物をクローニングし、ｐＢＳ−ＳＫII（−）のＥｃｏＲＶサイトに挿入し、ｐＢＳｈｕＭα３００と命名した。解析したＤＮＡ配列を図１２ａ，図１２ｂに示した。
解析の結果、ヒトメルトリンαのディスインテグリンの途中からシステインリッチ領域の途中までをコードする塩基配列を含むことがわかった（図１２ａ〜１２ｂ中のアミノ酸配列のうち、３６番目のＧｌｙまでがディスインテグリン領域であり、３７番目以降はシステインリッチ領域である）。
一方、マウスメルトリンγと相同性を有する機能不明のヒト配列がデータベースに登録されていた（Ｄ−１４６６５）ため、その一部の配列を利用して、センスプライマー（５′−ＣＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＧ−３′）およびアンチセンスプライマー（３′−ＣＡＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴＣ−５′）を合成した。上述の方法でＰＣＲを行い、増幅産物をクローニングし、ｐＢＳ−ＳＫII（−）のＥｃｏＲＶサイトに挿入し、ｐＢＳｈｕＭγＧ２３８と命名した。解析したＤＮＡ配列を図１３ａ，図１３ｂに示した。
解析の結果、ヒトメルトリンγのメタロプロテアーゼ領域の途中からシステインリッチ領域の途中までをコードする塩基配列が含まれていることがわかった（図１３ａ〜図１３ｂ中のＮ末端からアミノ酸番号４０番目のＰｒｏまでがメタロプロテアーゼ領域、４１番目のＬｙｓから１３６番目のＧｌｙもしくは４６番目のＴｙｒから１３６番目のＧｌｙまでがディスインテグリン領域、１３７番目のＴｙｒ以降がシステインリッチ領域である）。公知方法に従い、大腸菌株ＪＭ１０９を、これらのプラスミドで夫々形質転換し、得られた形質転換体ＪＭ１０９（ｐＢＳｈｕＭα３００）及びＪＭ１０９（ｐＢＳｈｕＭγＧ２３８）を1996年２月19日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４５４およびＰ−１５４５５）。尚、それらは、1996年10月８日付でブタペスト条約に基づく寄託に移管され、夫々、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７０４およびＦＥＲＭ ＢＰ−５７０５が付されている。
実施例７：  ヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリーを使用したヒトメルトリンαをコードするｃＤＮＡ断片の取得−１
（１）１stスクリーニング
実施例６で得られたメルトリンαcDNAの配列をもとに、センスプライマーMA-1、アンチセンスプライマーMA-2（表1参照）を合成した。ヒト胎盤λgt 11 cDNAライブラリー（クローンテック社code No. CLHL1008b）をLBプレート（φ10cm）上に１万プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、ＳＭバッファーを5ml加え、室温下４時間静置することでプレートごとにファージを回収した（プレートライセート法）。回収したそれぞれのファージ溶液を鋳型としてPCRを行った。即ち、先に合成したMA-1、MA-2プライマーと、Ex Taqポリメラーゼ（TaKaRa社）、およびその反応試薬（TaKaRa社）を混合し、DNAサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）にて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間反応させ、この操作を３５サイクル行った。増幅産物の一部をアガロースゲル電気泳動に供することにより、メルトリンαcDNAが組み込まれたクローンを含むファージ液を選択した。
（２）2nd．スクリーニング
1stスクリーニングで得られた、目的とするクローンを含むファージ液を400プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、上記と同様の手法によりファージを回収し、目的クローンを含むファージ液を選択した。
（３）3rd．スクリーニング
2ndスクリーニングで得られた、目的とするクローンを含むファージ液を40プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、上記と同様の手法によりファージを回収し、目的クローンを含むファージ液を選択した。
（４）4th．スクリーニング
3rdスクリーニングで得られた、目的とするクローンを含むファージ液を10プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、上記と同様の手法によりファージを回収し、目的クローンを含むファージ液を選択した。
（５）finalスクリーニング
4thスクリーニングで得られた、目的とするクローンを含むファージ液を20プラーク/plateになるよう播種し、プラークを形成させた。単一プラークそれぞれを楊枝で穿刺し、鋳型としてPCR反応液中に懸濁した。MA-1,MA-2プライマーによる３５サイクルのPCRにより、目的プラークの判別を行ったところ、最終的に２つの陽性クローンが得られた。この目的クローンを含む単一の陽性プラークをSM Buffer中に回収し、ファージを溶出させた。
更に、このファージを鋳型として、λgt11 Forward primer、同Reverse primer（表１参照）によりPCRを行いファージベクター中のヒトメルトリンαcDNA断片を回収した。
この断片の末端塩基配列を一部解析したところ、実施例６で得られたヒトメルトリンαをコードする塩基配列を含んでおり、マウスメルトリンの約650アミノ酸（clone 23）と約500アミノ酸（clone 25）に対応するヒトcDNA断片であることが予想された（図１４参照）。
実施例８：  ヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリーを使用したヒトメルトリンαをコードするｃＤＮＡ断片の取得−２
実施例７で明らかとなったclone 23中のcDNA配列のN末端側の配列をもとにセンスプライマーMel α-5’S（表１参照）を設定した。センスプライマーMel α-5’SとアンチセンスプライマーMA-2を用いて、ヒト胎盤λgt 11 cDNAライブラリーをスクリーニングした。その結果、約700アミノ酸をコードするcDNA（clone 26）が得られた。（図１４ａ参照）。
メルトリン遺伝子の塩基配列解析のためにλgt11 Forward-Eco、λgt11 Reverse-Eco、MA-1-Eco、MA-2-Eco、計４種のプライマーを合成した。（表1参照）
0004118336.tif 000003
Clone 25をtemplateとし、MA-1-Eco、λgt11 Reverse-Ecoプライマーを用いたPCRによりメルトリン遺伝子の後半部を、Clone 26をtemplateとし、MA-2-Eco、λgt11 Forward-Ecoプライマーを用いたPCRにより、メルトリン遺伝子の前半部を増幅した。これらのcDNA断片をEcoRI消化後、それぞれpUC 118のEco RI siteにクローニングし、それぞれ、pMelα-26N、pMelα-25Cと命名した。これらのプラスミドについて常法により塩基配列解析を行いメルトリンαcDNA配列を決定した。
これらのプラスミドで、大腸菌ＪＭ１０９株をハナハン等の方法で形質転換し、得られた形質転換体（大腸菌ＪＭ１０９（pMelα-26N）、大腸菌ＪＭ１０９（pMelα-25C））を日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号  ３０５）の工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づき１９９６年１０月３日付で寄託した（受託番号：ＢＰ−５６８９、ＢＰ−５６８８）。
pMelα-25CおよびpMelα-26Nの塩基配列の解析から明らかになった、ヒトメルトリンαの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を図１５ａ〜図１５ｆに示す。
実施例６で得られたＤＮＡの塩基配列と比較したところ４カ所において塩基が異なっていた。そのうちの３カ所はサイレントミューテーションであり、残りの１カ所については、対応するアミノ酸が実施例６ではグルタミン酸であったのに対し、今回解析した配列ではアスパラギン酸（図１５ａ〜図１５ｆに示したアミノ酸番号の５０５番目）であった。
また、得られた塩基配列の構造を解析したところ、今回得られたＤＮＡはヒトメルトリンαの前駆体領域の途中からＣ末端までをコードするものであると思われた。すなわち、図１５ａ〜図１５ｆに示したアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のＧｌｙから１５５番目のＡｒｇ（対応する塩基配列は、塩基番号１〜４６５）までが前駆体領域のＣ末端側部分配列であり、１５６番目のＧｌｕから３６４番目のＰｒｏ（対応する塩基配列は塩基番号４６６〜１０９２）までがメタロプロテアーゼ領域であり、３６５番目のＧｌｕから４５９番目のＧｌｙもしくは３７０番目のＰｈｅから４５９番目のＧｌｙ（対応する塩基配列は塩基番号１０９３〜１３７７もしくは１１０８〜１３７７）までがディスインテグリン領域であり、４６０番目のＨｉｓから６５６番目のＧｌｎもしくは４６０番目のＨｉｓから６５２番目のＡｌａ（対応する塩基配列は塩基番号１３７８〜１９６８もしくは１３７８から１９５６）までがシステイン・リッチ領域（そのうち融合ペプチド様配列は５３５番目のＧｌｙから５５７番目のＧｌｎ（対応する塩基配列は塩基番号１６０３〜１６７１））である。一方、今回得られたヒトメルトリンαには膜貫通領域が存在していなかった。これはヒトメルトリンαが、生体内で、膜貫通領域を持たない可溶型蛋白質として存在することを示唆している。すなわち、図１５ａ〜図１５ｆのアミノ酸配列を有するメルトリンαは、生体内で細胞外に分泌され血液や体液中に存在するものと考えられる。このような可溶型のメルトリンαは、生体内で、細胞の接着、融合、凝集を調節する役割を担っていると考えられる。
図１５ａ〜図１５ｆのアミノ酸配列を有するメルトリンは、遺伝子のオルタネイティブスプライシングによって生じたものと考えられる。おそらく今回得られた配列のシステインリッチ領域よりも後の部分をコードするＤＮＡと、膜貫通領域から細胞内領域をコードするＤＮＡとは異なるエクソン上にあって、それらのいずれかがスプライシングアウトすることで可溶型メルトリンと、膜結合型メルトリンが生じるのであろう。
実施例９：  ヒトメルトリンβをコードするcDNA断片の取得
（１）ヒトメルトリンβをコードするｃＤＮＡ断片のディスインテグリン領域の一部の取得
ヒト骨髄細胞から精製されたｍＲＮＡ（クローンテック）を鋳型として実施例１（１）に記載の方法でｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として実施例１（２）で作製した重複プライマーを用いて３６サイクルのＰＣＲを行った。増幅産物をクローニングし、ｐＢＳ−ＳＫII（−）に挿入した。得られたＤＮＡ配列を解析したところ、メルトリンβの部分配列であることが確認された。解析したＤＮＡ配列を図１６に示した。
（２）ヒト胎児肺由来ｃＤＮＡライブラリーを使用した１stスクリーニング
（１）で得られたメルトリンβcDNA部分配列をもとに、センスプライマーMA-3、アンチセンスプライマーMA-4（表２参照）を合成した。ヒト胎児肺λgt 11 cDNAライブラリー（クローンテック社 code No. CLHL1072）をLBプレート（φ10cm）上に１万プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、ＳＭバッファーを5ml加え、室温下４時間静置することでプレートごとにファージを回収した（プレートライセート法）。回収したそれぞれのファージ溶液を鋳型とし、先に合成したMA-3、MA-4プライマーと、Ex Taqポリメラーゼ（TaKaRa社）、およびその反応試薬（TaKaRa社）を混合し、DNAサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）にて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間反応させ、この操作を３５サイクル行った。増幅産物の一部をアガロースゲル電気泳動に供することにより、メルトリンβcDNAが組み込まれたクローンを含むファージ液を選択した。
（３）2nd．スクリーニング
1stスクリーニングで得られた、目的とするクローンを含むファージ液を1000プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、上記と同様の手法によりファージを回収し、目的クローンを含むファージ液を判別した。
（４）3rd．スクリーニング
2ndスクリーニングで得られた、目的とするクローンを含むファージ液を100プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、上記と同様の手法によりファージを回収し、目的クローンを含むファージ液を判別した。
（５）4th．スクリーニング
3rdスクリーニングで得られた、目的とするクローンを含むファージ液を10プラーク/plateになるよう播種した。プラーク形成後、上記と同様の手法によりファージを回収し、目的クローンを含むファージ液を判別した。
（６）ｃＤＮＡ部分配列を含むＤＮＡ断片の回収および確認
4thスクリーニングで得られた目的クローンを含むファージ液（＃24）を鋳型として、λgt11 Forward primer（表１参照）とＭＡ-4プライマーによるＰＣＲ、およびλgt11Reverse primer（表１参照）とＭＡ-3プライマーによるPCRを行い、それぞれ約500bp（24-F/4）および約2kbp（24-R/3）の増幅産物を得た。これら２種のＤＮＡフラグメントの末端塩基配列を一部解析したところ、（１）で得られた配列を含むことが確認された。
（７）塩基配列解析
ヒトメルトリンβｃＤＮＡ部分配列を含むDNAフラグメントをサブクローニングするために、新たにMA-3-Eco、MA-4-Eco、計2種のプライマーを合成（表２参照）した。ファージ液＃24をtemplateとして、MA-4-Eco、λgt11 Forward-Ecoプライマー（表１参照）を用いたPCR、およびMA-3-Eco、λgt11 Reverse-Ecoプライマー（表２参照）を用いたPCRを行い、それぞれ得られた増幅産物をEcoRI消化後、pUC 118のEco RI siteにクローニングした（図１４ｂ参照）。これらのプラスミドpMelβ-24C、pMelβ-24Nについて常法により塩基配列解析を行いメルトリンβcDNA配列を決定した。
なお、これらのプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をハナハン等の方法で形質転換し、得られた形質転換体を、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づき1996年10月３日付で寄託した（微生物識別のための記号大腸菌ＪＭ１０９（pMelβ-24C）受託番号ＢＰ−５６９０、微生物識別のための記号ＪＭ１０９（pMelβ-24N）受託番号ＢＰ−５６９１）。pMelβ-24CおよびpMelβ-24Nに組み込まれたＤＮＡの塩基配列から明らかになったヒトメルトリンβの塩基配列および対応するアミノ酸配列を図２４ａ〜図２４ｅに示す。
（１）で得られたＤＮＡの塩基配列と比較したところ１カ所において塩基が異なっていたが、これはサイレントミューテーションであり、対応するアミノ酸に違いはなかった。
また、得られた塩基配列の構造を解析したところ、今回得られたＤＮＡはヒトメルトリンβのメタロプロテアーゼ領域の途中からＣ末端までをコードするものであると思われた。すなわち、図２４ａ〜図２４ｅに示したアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のＧｌｙから３６番目のＰｒｏ（対応する塩基配列は、塩基番号２〜１０９）までがメタロプロテアーゼ領域のＣ末端側部分配列であり、３７番目のＡｓｐから１３１番目のＧｌｙもしくは４２番目のＴｙｒから１３１番目のＧｌｙ（対応する塩基配列は塩基番号１１０から３９４もしくは１２５〜３９４）までがディスインテグリン領域であり、１３２番目のＴｈｒから３３０番目のＰｒｏ（対応する塩基配列は塩基番号３９５〜９９１）までがシステイン・リッチ領域であり、３３１番目のＶａｌから３４８番目のＭｅｔもしくは３３１番目のＶａｌから３５３番目のＡｒｇ（対応する塩基配列は塩基番号９９２〜１０４５もしくは９９２〜１０６０）は膜貫通領域である。３４９番目のＴｙｒ以降もしくは３５４番目のＧｌｎ以降からＣ末端のＨｉｓまでが細胞内領域に相当すると考えられるが、マウスメルトリンβとのホモロジー検索によると、３９５番目のＰｒｏ以降でホモロジーが極めて低くなることから、ヒトメルトリンβの細胞外領域としての機能に係わる配列は３９４番目のＬｙｓまでであろうと予測された。この部分（すなわち、図２４ａ〜図２４ｅのアミノ酸番号３９５のＰｒｏまで）を、別図として図１７ａ〜図１７ｃに示した。
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実施例１０：  抗メルトリンαモノクローナル抗体の作製
（１）ペプチド配列の選択
実施例１で決定したマウスメルトリンαのアミノ酸配列に基づき、エピトープの解析を行った。メルトリンαとβでアミノ酸配列の異なる部分、またnon-ＲＧＤ領域と推定される領域、メタロプロテアーゼが切断されると考えられる領域から、二次構造を考慮し、エピトープ領域と推定されるペプチド配列８種類を選択した（図１８ａ、１８ｂ参照）。キャリアーと結合させるために、選択した配列のＣ末端にシステインを有するよう、これら８種のペプチドをペプチド合成機（ＡＢＩ  ４３２Ａ）を用いて合成し、クリベージ後、逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ）によりＨＰＬＣで精製した。
（２）抗血清の作製
（１）で得られたペプチドを凍結乾燥した後、各々のペプチド０．５５mgを0.1M  リン酸バッファー（pH7.0）５５μｌに溶解した。また、マレイミド化ＫＬＨ（ベーリンガーマンハイム社）０．７７mgを蒸留水７７μｌで溶解した。両者を混合し、室温にて２時間反応させた後、生理食塩水で平衡化したＮｉｃｋカラム（ファルマシア社）で精製し、これを投与抗原として、以下の実験に使用した。
各投与抗原５０μgを生理食塩水で0.1mlに希釈し等量のフロイント完全アジュバント（DIFCO社）と混合し，Wistar rat（5週令、雌）の腹腔に投与した。２週間後、同量をフロイント不完全アジュバント（DIFCO社）と混合し同様に投与した。
（３）抗血清の評価（プレートアッセイ）
投与1週間後眼底より採血し、投与したペプチドに対する抗体価の上昇を固相化したペプチドと抗血清との反応性を以下の方法でプレートアッセイにより確認した。まず、アミノプレート（住友ベークライト社）に0.5mg/mlのSulfo-SMCC（Pierce社）を0.9%ＮａＣｌを含む50ｍＭリン酸緩衝液（pH7.2）に溶解し各ウエルに分注した。３７℃で2時間反応後イオン交換水で５回洗浄し各ペプチドを同じ緩衝液を用いて０．５μｇ／ｍｌに溶解したものを添加した。３７℃で1時間反応後０．１％ＢＳＡと４ｍｇ／ｍｌシステアミンを０．４５％ＮａＣｌを含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下、ＰＢＳと記載する）でブロッキングした。ブロッキング剤を除去後、各抗血清をＰＢＳで1000倍から10000倍に希釈し各ウエルに添加して37℃で１時間反応させた。次に0.005％Tween20を含む0.9％NaClで2回洗浄し、１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社）を各ウエルに添加し37℃で1時間反応させた。反応終了後、洗浄液で5回、イオン交換水で2回洗浄し、3mg/mlオルトフェニレンジアミンと0.027％過酸化水素を含む0.1M  マッキルベインバッファー（pH5.0）を添加し5分間反応後、1N塩酸で反応を停止し490nmの吸光度を測定した。結果を表３に示す。表３において、（＋＋）は強く反応したことを示し、（＋）は弱く反応したことを示す。
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（４）抗血清の評価（ウエスタンブロッティング）
（２）で作製した抗血清がメルトリンに結合するか否かを確認するため、ウエスタンブロッティングを行った。
まず、実施例４と同様に、マウス筋芽細胞（Ｃ２）をｐＢＯＳＭｅｌαδＰｒｏ（＋）とｐＢＯＳＭｅｌβ（＋）で形質転換させた細胞（以後、＃９−３と称する）とＣ２細胞をｐＢＯＳＭｅｌαδＭＰ（＋）で形質転換させた細胞（以後、＃３−５と称する）を準備した。各細胞１×１０7個をＰＢＳ−（GIBCO BRL社）で遠心洗浄し細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ−で５×１０6cells/mlに調製し、蛋白分解阻害剤Cφmplete（ベーリンガーマンハイム社）を２５分の１量添加し、さらに最終濃度０．２％となるようにＳＤＳを添加した。室温で３０分間放置し、４℃下で１０秒間（１秒×１０回）ソニケーションを行い、遠心後の上清を回収し、細胞抽出液とした。陰性コントロールとして繊維芽細胞Ｌ９２９（ATCC No.CCL-1）より同様の方法で細胞抽出液を調製した。
得られた細胞抽出液10μlをゲルローディングバッファー（0.25M Tris-HCl、2%SDS、30%Glycerol、0.01%BPB（pH6.8））と等量混合し、この溶液6μlを4〜20T％のSDS-PAGE（テフコ社）にアプライし、25mAにて室温で約1時間泳動した。泳動終了後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社）に4℃にて150mA、45分の条件で転写した。メンブレンを4%スキンミルク（明治乳業（株））で室温1時間振とうしブロッキングを行ったのち、各レーンを裁断した。各レーンを4%スキンミルクを添加した0.05％Tween20を含む50m Ｍ  Tris-HCl（pH7.2）（以下、T-TBSと記す）で500倍に希釈した抗血清1mlに浸し、室温にて1時間振とうした。反応終了後、各レーンをT-PBSで2回洗浄し、次に４％スキンミルクを添加したT-PBSで500倍に希釈したHRPO標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社）1mlに浸し、室温にて1時間反応させた。T-PBSで5回洗浄後、ＥＣＬシステム（アマーシャム社）で検出した。結果を表４に示す。ウエスタンブロッティングでは3種類の抗血清でバンドが検出された。
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（５）モノクローナル抗体の作製
投与抗原（ＰｒｏＡ、ＭＰ−Ｂ、ＤＣ−Ｃ、ＤＥＡ）それぞれ50μgを生理食塩水400μlに希釈し、（３）（４）で抗体価の上昇が確認されたラットの尾静脈に投与した。３日後、公知方法（「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」参照）に従い、ミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１を使用して細胞融合を行った。６日後、培養上清を回収して、（３）の方法でプレートアッセイを行った。ここで抗原ペプチドとの反応性の得られたウェルを限界希釈法（「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」参照）によりクローニングした。クローニング後、再度、プレートアッセイによるスクリーニングを行い、抗原ペプチドと反応する抗マウスメルトリンαモノクローナル抗体を産生ハイブリドーマ２７クローンを得た。表５に得られたクローンの内訳を記した。
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樹立した抗メルトリンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから以下の方法により精製抗体を得た。
ハイブリドーマを１ng／mlのヒトIL６を含む１０％牛胎児血清／ＲＰＭＩ１６４０中で培養し、２×１０5cells/mlになった時点で無血清培地（Hybridoma-SFM, GIBCO BRL）に交換し細胞が死ぬまで培養を行った。得られた培養上清を濾紙で濾過して細胞を除去した後プロテインＧカラムProsep-G（Bioprocessing INC）を用いて精製した。すなわち培養上清１ＬをProsep-Gカラム（２０ml）に１０ml／minの流速で添加し、次に０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した。２８０nmの吸光度が低下した後、０．ｌＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）により結合したモノクローナル抗体を溶出した。溶出液のｐＨを中性に戻した後、ダイアフロー（グレースジャパン社）により濃縮し、０．４５％のＮａＣｌを含む０．０７６Ｍりん酸緩衝液（pH６．４）で透析した。得られた精製抗体の蛋白濃度を２８０nmの吸光度より算出した。
（６）モノクローナル抗体の評価
＃９−３細胞の抽出液を使用し、（４）の方法に準じてウエスタンブロッティングを行い、（６）で得られた精製抗体７ロット（抗体濃度１０μg/ml）のメルトリンに対する結合活性を確認した。結果を図１９に示す。F933-4-3（サブクラスIgG2a）、F933-10-26（サブクラスIgG2a）、F934-17-6（サブクラスIgG2a）、F934-3-23（サブクラスIgG2a）、F934-4-33（サブクラスIgG2a）、F934-6-3（サブクラスIgG2a）、F934-20-5（サブクラスIgG2C）でそれぞれ約６７ｋＤａ付近に、＃９−３細胞抽出液に特異的なバンドが検出された。Ｌ９２９の抽出液ではこれらのバンドは確認されなかったことから、（６）で得られたモノクローナル抗体はメルトリンと結合していることが確認された。
実施例１１：  抗マウスメルトリンモノクローナル抗体の作製
（１）投与抗原の調製及び及びラットの免疫
＃９−３細胞と＃３−５細胞を投与抗原として、以下の方法でラットを免役した。投与抗原として使用した各細胞は、それぞれ、ｂＦＧＦ非存在下で次のように培養した。まず、約５×１０5ｃｅｌｌｓ／直径１０ｃｍのデイッシュの細胞を4枚から20枚に分配し、この細胞密度に達した時点で、40枚の直径１５ｃｍのデイッシュに分配し、約５〜６×１０6ｃｅｌｌｓ／デイッシュになるまで培養した。これを、分化培地（２％の馬血清を含むＤＭＥＭ）で更に２日間培養し、筋管を形成させた。これらをシリコン性ラバーポリスマンで剥がし、ＰＢＳで2回洗浄した後１０％ＤＭＳＯを含む培地で懸濁し−８０℃で保存した。
まず、初回投与として＃９−３細胞、＃３−５細胞をそれぞれ1×１０7ｃｅｌｌｓ／ラットとなるよう、200μlの生理食塩水に懸濁し、等量のフロイント完全アジュバント（DIFCO社）と混合し，Wistar Rat（5週令、雌）の腹腔に投与した。２週間後、同量を等量のフロイント不完全アジュバント（DIFCO社）と混合し同様に投与した。
（２）抗血清の評価
追加投与1週間後に眼底より採血し、抗血清とメルトリンの結合を、細胞抽出液を使用し、実施例１０（３）の方法に準じたプレートアッセイにより測定した。＃９−３、＃３−５またはＬ９２９の細胞の細胞抽出液は実施例１０（４）の方法で調整した。ただし、界面活性剤としてはＮＰ−４０（ナカライテスク社）最終濃度０．５％を使用した。
まず、各細胞抽出液をPBSで40μg/mlに希釈し、各50μl／ウエルづつイムノプレート（Maxisorp、Nunc社）に分注し、５６℃で30分間処理し抗原を結合した。イオン交換水で5回洗浄後、20％ブロックエース（雪印乳業社）/PBS100μlを各ウエルに添加し室温で30分間ブロッキングした。ブロッキング液を廃棄した後、培養上清50μlを添加し、37℃で1時間反応後2回洗浄液で洗浄した。次に１０％ブロックエース／PBSで1000倍に希釈したHRPO標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社）を50μl添加し37℃で1時間反応した。洗浄液で5回洗浄後、さらにイオン交換水で２回洗浄し、0.027％過酸化水素を含む3mg/mlのオルトフェニレンジアミン／0.1Mマッキルベインバッファー（pH5.0）を50μl添加し10分間反応させ、1N塩酸50μlで反応を停止した。吸光度計により490nmの吸光度を測定した。
また、以下の（４）に示したＬ４−３細胞の細胞抽出液を用いてウエスタンブロティングを行いメルトリンとの結合を確認した。結果を表６に示した。
＃９−３および＃３−５で免役したラットから得られた抗血清はそれぞれの細胞抽出液と反応し、ウエスタンブロティングでメルトリンと結合することが確認された。
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（３）モノクローナル抗体の作製
１×１０7ｃｅｌｌｓの＃９−３細胞、＃３−５細胞をそれぞれ、生理食塩水２００μｌに懸濁し、抗体価の上昇が認められたラットの腹腔内に投与し、3日後、公知方法（「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」参照）に従い、ミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１を使用して細胞融合を行った。6日後、固相化した細胞抽出液との反応性により培養上清のスクリーニングを行った。細胞抽出液と反応の認められたウェルを限界希釈法（「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」参照）によりクローニングし、再度上記方法でスクリーニングを行いメルトリンと反応するハイブリドーマ１３クローンを得た。内訳は＃９−３（δＰｒｏ）投与ラットから５クローン（ハイブリドーマ番号Ｆ９３２）、＃３−５（δＭＰ）投与ラットから８クローン（ハイブリドーマ番号Ｆ９３７）であった。
（４）モノクローナル抗体の評価
（３）で得られたモノクローナル抗体のうち、細胞抽出液との反応性が高かった抗体Ｆ９３２−１５−２（サブクラスＩｇＧ１）とＦ９３７−９−２（サブクラスＩｇＧ１）を用いて抗体の評価を行った。
まず、細胞蛍光染色法を用いてＣ２細胞に形成させた筋管が染色されるか検討した。Ｃ２細胞を３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭに懸濁し各100μｌをチャンバースライド（Ｌａｂ−ＴＥＫ，Ｎｕｎｃ社）のウエルに分注した。３７℃、５％ＣＯ２下で２日間培養後培地を2%馬血清／ＤＭＥＭに交換し2日後に形成された筋管を用いて細胞染色を行った。細胞をＰＢＳ-で2回洗浄後、４％ホルムアルデヒドを添加し室温で30分間反応させ細胞を固定した。次にＰＢＳ-で３回洗浄後２０％ブロックエース／Ｔ−ＰＢＳでブロッキングを行った。ブロッキング剤を除去し、２０％ブロックエース／Ｔ−ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した抗体を添加し室温で1時間反応させた。ＰＢＳ-で３回洗浄し、１０％ウサギ血清／Ｔ−ＰＢＳで２０倍に希釈した抗ラットイムノグロブリンＦＩＴＣ（ダコ社）を添加し室温で1時間反応させた後、ＰＢＳ-で３回洗浄し蛍光を蛍光顕微鏡により観察した。その結果、両抗体とも筋管が染色され、陰性コントロールに用いたラットＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社）では染色は認められなかった。
次に抗体の特異性を確認するため、Ｌ９２９細胞にマウスメルトリンαまたはβを発現させた細胞を作製し、細胞染色により特異性の確認を行った。細胞は以下のように調製した。すなわち、実施例４で作製したプラスミドｐＢＯＳ  Ｍｅｌα（＋）およびｐＢＯＳ  Ｍｅｌβ（＋）とプラスミドｐＳＶ２ＮＥＯとをモル比で１２：１２：１に混合したものを、リポフェクトアミン（GIBCO BRL社）を用いそのプロトコールにしたがって繊維芽細胞Ｌ９２９に導入し、Ｌ４−３（マウスメルトリンα、βを発現）を単離した。同様にｐＢＯＳ  Ｍｅｌβ（＋）とプラスミドｐＳＶ２ＮＥＯとをモル比で２０：１に混合したものをＬ９２９に導入し、Ｌ２−１０（マウスメルトリンβを発現）を単離した。同様な方法でＬ９２９にプラスミドｐＢＯＳ  Ｍｅｌα  δＰｒｏ（＋）を導入し、Ｌ８−５（Meltrin α  δＰｒｏを発現）を単離した。
各細胞はコラーゲンコートしたデイッシュ中で１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭにより培養し、チャンバースライドに継代した。Ｌ９２９、Ｌ４−３、Ｌ２−１０、Ｌ８−５を用いて特異性の確認を細胞染色により行った。結果を表７に示した。この結果により、Ｆ９３２−１５−２はメルトリンαおよびβと、Ｆ９３７−９−２はメルトリンαと結合するものと考えられた。
尚、モノクローナル抗体Ｆ９３２−１５−２を産生するハイブリドーマは、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づき1996年10月３日付で寄託した（受託番号ＢＰ−５６８７）。
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（５）中和活性の測定
（３）で得られたモノクローナル抗体の中和活性を確認するため、Ｃ２細胞の筋管の形成を抑制するか否かを検討した。Ｃ２細胞を１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭでコラーゲンコートディッシュで培養し８０％コンフルエントになったとき、０もしくは４００μｇ／ｍｌの抗体を含む２％馬血清／ＤＭＥＭに培地を交換し、筋管が形成されるか観察し、筋管中の核の割合を算定した。図２０に示すように２日後の筋管形成は抑制されＦ９３２−１５−２およびＦ９３７−９−２ともに中和活性を有していた。
実施例１２：  メルトリン中和抗体のマウス全骨細胞における骨吸収窩形成抑制作用
13日齢ICRマウスより摘出した大腿骨および頚骨を５％牛胎児血清含有MEM α培地（GIBCO）中で細切した。２分間静置して沈んだ骨片を除去後、上清の細胞浮遊液を１×１０7cells/mlに調整し、象牙片をセットした96穴マイクロプレートに100μlずつ添加した。象牙片は、象牙を薄切し６mm径に打ち抜いた後、７０％エタノールで洗浄、滅菌したものを用いた。実施例１１で得られたマウスメルトリン中和抗体（Ｆ９３２−１５−２）あるいはラットIgGを、終濃度がそれぞれ5、50、500μg/mlとなるように５%牛胎児血清含有MEM α培地で希釈し、各ウェルに100μlずつ添加した。５％ＣＯ2下３７℃にて３日間培養した後、ポリスマンで細胞を除去し、酸ヘマトキシリン溶液（SIGMA）で約７分間染色した後、染色された吸収窩を接眼ミクロメーターを用いて顕微鏡下計数した。計数は吸収窩の含まれるマス目をカウントした。
結果を図２１に示す。図から明らかなように、形成された吸収窩数はマウスメルトリン中和抗体により用量依存的に抑制された。
この結果より、メルトリン中和抗体が破骨細胞に直接あるいは間接的に作用し、骨吸収を抑制することが示唆された。
実施例１３：  骨吸収亢進モデルマウスにおけるメルトリン中和抗体の血清Ca値低下作用
７週齢ICR雄性マウスにCa含有量0.02%以下の低Ca食を与えて５日間飼育した。これを１群５匹として、実施例１１で作製したマウスメルトリン中和抗体（Ｆ９３２−１５−２）を0.1、1mg/匹、あるいは対照としてラットIgGを1mg/匹あるいはリン酸緩衝生理食塩水のみを尾静脈注射により投与した。投与前および１日後に眼下静脈より採血し、血清分離後にカルシウム測定用キット（カルシウムHR−II、和光純薬）を使用し、自動分析装置（COBAS FARAII、ROCHE）で血清中Ca値を測定した。結果を図２２に示す。
図から明らかなように、投与1日後のマウスメルトリン中和抗体投与群の血清Ca値は、リン酸緩衝生理食塩水あるいはラットIgG投与群に比べて低値を示した。これらの結果から、メルトリン中和抗体は副甲状腺機能の亢進や悪性高Ca血症などにより病的に亢進した骨吸収を抑制することが示唆された。
実施例１４：  膜貫通領域を含むヒトメルトリンαをコードするｃＤＮＡ断片の取得
実施例８で得られたヒトメルトリンαｃＤＮＡ部分配列をもとに、センスプライマーＳ−hMelα−ＴＭ５′（表１参照）を、マウスメルトリンαｃＤＮＡをもとに、アンチセンスプライマーＡ−mMelα−３′（表１参照）を合成した。
ヒト胎盤λgt 11 ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社code No. CLHL 1008b）を鋳型とし、先に合成したＳ−hMelα−ＴＭ５′、Ａ−mMelα−３′プライマーと、Ex Taqポリメラーゼ（TaKaRa）、およびその反応試薬（TaKaRa）を混合し、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）にて９４℃で５分間加熱後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間反応させ、この操作を３５サイクル行った。得られた増幅断片（clone ＴＭ）の塩基配列を解析したところ、マウスメルトリンの膜貫通領域を含む約２２０アミノ酸に対応するヒトｃＤＮＡ断片であることが予想された。
得られた塩基配列および対応するアミノ酸配列を図２３ａ〜図２３ｂに示した。
実施例１５：  急性毒性試験
７週齢ＩＣＲ雄性マウスを１群５匹とし、実施例１１で作製した抗マウスメルトリン中和抗体（Ｆ９３２−１５−２）を、それぞれ１mg／匹、３mg／匹の用量で各群のマウスに投与した。またコントロール群にはリン酸緩衝生理食塩水を投与した。投与後、各群のマウスの状況を観察したが、いずれの群においても、著しい体重減少や顕著な副作用、死亡例は認められなかった。
参考例１  ヒトメルトリンを認識するモノクローナル抗体の作製
（１）ヒトメルトリン由来のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原とした抗体の作製
実施例１０の結果を参考にして、実施例８で得られたヒトメルトリンαのアミノ酸配列からＤＣ−Ｃに相当する部分の配列ＧＫＶＳＫＳＳＦＡＫＣＥＭＲＤＡＫＣを実施例１０（１）と同様に合成し、精製後マレイミド化ＫＬＨと結合し投与抗原を調製した。投与抗原２０μｇを０．１mlの生理食塩水に溶解し等量のＦＣＡと混合してｄｄｙマウス（５週齢、メス）に投与した。２週間後同量をＦＬＡと混合後投与した。１週間後眼底より採血し抗血清を得た。得られた抗血清のペプチドとの反応性を測定するため、実施例１０（３）にしたがって抗血清を評価したところ投与したペプチドと特異的に反応した。したがって、該ペプチドを投与抗原として、マウス、ラット、ハムスター等を免疫し、実施例１０（５）の方法でモノクローナル抗体を作成することができる。また、このような抗体はウエスタンブロッティングにも使用することができる。
なお、図１５ａ〜図１５ｆに示したアミノ酸配列は可溶型のメルトリンαであると予想されるので、Ｃ末端付近のアミノ酸配列から作製したペプチドを抗原とした場合には、生体内の可溶型メルトリンを測定するのに有効な抗体を得ることができる。
同様に、図１７ａ〜図１７ｃもしくは図１３ａ〜図１３ｄで示したアミノ酸配列から適当な部位を選択して、そのアミノ酸配列を有するペプチドを化学合成し、それで動物を免役することにより、それぞれヒトメルトリンβ、ヒトメルトリンγを認識する抗体をえることができる。いずれの場合もアミノ酸配列は、細胞外領域から選択する。
また、α、β、γにそれぞれ特異的な抗体を作製する場合には、当然のことながら、３者でホモロジーの低い部分を選び出し、その部分に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを合成して、実施例１０（２）と同様に動物を免役する。動物としては、マウス、ラット、ハムスターが適している。
上記いずれの場合も、モノクローナル抗体は、実施例１０（５）と同様の方法で作成する。
（２）ヒトメルトリン発現細胞を抗原とした抗メルトリンモノクローナル抗体の作成方法
図１５ａ〜図１５ｆに示したアミノ酸配列のメタロプロテアーゼ領域もしくはディスインテグリン領域からシステイン・リッチ領域までの配列の下流に、図２３ａ〜図２３ｂに示したアミノ酸配列の膜貫通領域以降のアミノ酸配列が融合したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを作製し、発現ベクターｐＥＦＢＯＳに組み込み、得られたベクターでＣ２細胞を形質転換する。得られた形質転換を実施例１１（１）と同様に処理し、それを抗原として動物を免役する。動物は、ラット、マウス、ハムスターが適している。実施例１１（２）と同様の方法で、目的とするヒトメルトリンαを認識する抗体をスクリーニングし、実施例１１（３）と同様にモノクローナル抗体を作製する。
同様に図１７ａ〜図１７ｃに示したアミノ酸配列もしくはディスインテグリン領域以降の配列をコードするＤＮＡを作製し、発現ベクターｐＥＦＢＯＳに組み込み、得られたベクターでＣ２細胞を形質転換する。得られた形質転換を実施例１１（１）と同様に処理し、それを抗原として動物を免役する。動物は、ラット、マウス、ハムスターが適している。実施例１１（２）と同様の方法で、目的とするヒトメルトリンβを認識する抗体をスクリーニングし、実施例１１（３）と同様にモノクローナル抗体を作製する。
同様に図１３ａ〜図１３ｄに示したアミノ酸配列もしくはディスインテグリン領域以降の配列をコードするＤＮＡを作製し、発現ベクターｐＥＦＢＯＳに組み込み、得られたベクターでＣ２細胞を形質転換する。得られた形質転換を実施例１１（１）と同様に処理し、それを抗原として動物を免役する。動物は、ラット、マウス、ハムスターが適している。実施例１１（２）と同様の方法で、目的とするヒトメルトリンβを認識する抗体をスクリーニングし、実施例１１（３）と同様にモノクローナル抗体を作製する。
配列表
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図２ｊ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図３ｊ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図５ｈ】
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【図５ｉ】
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【図５ｊ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図６ｈ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
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