(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸塩又は重炭酸塩を添加して調製した反応液であって、これらの塩から炭酸イオン又は重炭酸イオンが供給される反応液中で、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属する好気性コリネ型細菌又はその処理物を、溶存酸素濃度０〜０．１ｐｐｍの嫌気的条件でグルコースに作用させることを特徴とする乳酸又はコハク酸の製造方法。
【請求項２】
反応液を密閉容器に収容し、かつ無通気とすることにより、コリネ型細菌又はその処理物を嫌気的条件でグルコースに作用させることを特徴とする請求項１記載の乳酸又はコハク酸の製造方法。
【請求項３】
反応液を密閉容器に収容し、かつ不活性ガスを供給することにより、コリネ型細菌又はその処理物を嫌気的条件でグルコースに作用させることを特徴とする請求項１記載の乳酸又はコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は乳酸又はコハク酸の製造方法に関する。詳しくは、好気性コリネ型細菌又はその処理物を用いて、乳酸又はコハク酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、好気性コリネ型細菌は、アミノ酸、有機酸等の有用物質の製造に広く用いられている。これらの有用物質の製造においては、微生物を増殖させる発酵法や、培養後に菌体を回収し、反応させる菌体反応方法、或いは菌体を破砕して得られた酵素を用いる酵素反応方法等いろいろな方法が用いられている。
好気性コリネ型細菌を利用して有用物質を製造する場合、例えば発酵法によるグルタミン酸の生産等のように、発酵槽内に、空気又は酸素を供給しながら、即ち、いわゆる好気的条件下で反応が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
好気性コリネ型細菌を好気的条件下で用いる従来の方法は、多くのアミノ酸、有機酸等の生産には有効であるが、乳酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸等の或る種の有機酸の製造においては必ずしも有効ではなく、好気性コリネ型細菌を用いてこれらの化合物を効率よく製造する方法は今まで知られていない。
本発明は、好気性コリネ型細菌を用いて乳酸又はコハク酸を効率よく且つ高収
率で製造する方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、好気性コリネ型細菌又はその処理物を嫌気的に有機原料に作用せさることにより、乳酸又はコハク酸を迅速に効率よく生産することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明の要旨は、炭酸塩又は重炭酸塩を添加して調製した反応液であって、これらの塩から炭酸イオン又は重炭酸イオンが供給される反応液中で、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属する好気性コリネ型細菌又はその処理物を、溶存酸素濃度０〜０．１ｐｐｍの嫌気的条件でグルコースに作用させることを特徴とする乳酸又はコハク酸の製造方法、にある。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる好気性コリネ型細菌又はその処理物については、通常の好気的条件で増殖可能なコリネ型細菌又はその処理物であれば特に限定はされない。
その具体例としては、例えば、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属等のコリネ型細菌又はその処理物が挙げられる。これらの中、特にブレビバクテリウム  フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム  アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム  グリタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９等のコリネ型細菌又はその処理物が好適に用いられる。
【０００７】
また、その処理物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物を指す。
なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収し、次に示す反応に用いられる。
【０００８】
反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、適当な無機塩を含有した培地が最も好ましい。培地には、例えばグルコース、エタノール等の有機原料と、炭酸塩又は重炭酸塩を含有させ、これらから供給される炭酸イオン、重炭酸イオンの存在下に、嫌気的条件で反応させることが特徴である。本発明に用いられる有機原料としては、特に限定されることなく、目的とする有機酸に応じて一般的な有機原料から選択することができる。具体的には、安価であり、目的の有機酸の生成速度の速いグルコースやエタノールが好適に用いられる。この場合、グルコースの添加濃度は、０．５〜５００ｇ／ｌが好ましく、エタノール添加濃度は、０．５〜３０ｇ／ｌが好ましい。
【０００９】
炭酸塩又は重炭酸塩の具体例としては、例えば炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。これらの塩は、炭酸イオン、重炭酸イオンが、１〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度となるように添加する。
【００１０】
また、本発明にいう嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応させることを指す。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等が用いうる。
反応の温度は、通常１５〜４５℃、好ましくは２５〜３７℃で行う。ｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８の範囲で行う。反応は、通常５時間から１２０時間行う。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／ｌが用いられる。
【００１１】
以上の様な方法で製造した乳酸又はコハク酸は、必要に応じて、反応液から通常の分離、精製方法で分離、精製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠心分離等により菌体及びその処理物と分離した後、カラム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させることにより、結晶として採取する方法等が挙げられる。これらの化合物は、酸素含有雰囲気では、好気性コリネ細菌又はその処理物で効率的に製造できない化合物である。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明の方法を具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
尿素：４ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：１４ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＢ−４１菌株を植菌し、３３℃にて２４時間振盪培養した（好気的培養）。培養終了後、遠心分離（８０００ｇ、２０分）により菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に供試した。（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：２３ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ／ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく（２００ｒｐｍ）攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が３３．５ｇ／ｌと酢酸が５ｇ／ｌ、コハク酸が１０ｇ／ｌ、リンゴ酸が０．５ｇ／ｌ生成していた。
【００１５】
比較例１
炭酸イオン無添加以外は実施例１と同様に反応を行った。
即ち、実施例１と同様に培養した菌体を、以下の反応に供試した。
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：２３ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、３０℃で２４時間ゆるく（２００ｒｐｍ）攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が１５ｇ／ｌと酢酸が３ｇ／ｌ、コハク酸が２ｇ／ｌ生成していた。
【００１６】
比較例２
好気的条件以外は実施例１と同様に反応を行った。
即ち、実施例１と同様に培養した菌体を、以下の反応に供試した。
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：２３ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ／ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、３０℃で２４時間ゆるく（１０００ｒｐｍ）攪拌し、空気を０．１ｖｖｍの速度で供給しながら（溶存酸素濃度３．０ｐｐｍ）反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が５ｇ／ｌと酢酸が１ｇ／ｌ、コハク酸が０．５ｇ／ｌ生成していた。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、培養法或いは酵素法により、効率よく、且つ高収率で乳酸、又はコハク酸を製造することができる。