(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−（１′−ヒドロキシ−２′−プロピル）−２−メチル−５−トリフルオロエチルベンゾイルグアニジン、またはその医薬上許容しうる塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、式Ｉ
【化３】
0004160650.tif 000002
〔式中、Ｒ(１)はＣＦ3であり、置換基Ｒ(２)およびＲ(３)のうちの一つは水素であり、そして各場合におけるもう一方の置換基Ｒ(２)またはＲ(３)は、−Ｃ(ＯＨ)(ＣＨ3)−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ(ＣＨ3)−ＣＨ2ＯＨまたは−Ｃ(ＯＨ)(ＣＨ3)2であり、Ｒ(４)はメチル、メトキシ、ＣｌまたはＣＦ3である〕
のベンゾイルグアニジンおよびその医薬上許容しうる塩に関する。
【０００２】
好ましい式Ｉの化合物は、式中、Ｒ(１)がＣＦ3であり、置換基Ｒ(２)およびＲ(３)のうちの一つが水素であり、そして各場合におけるもう一方の置換基Ｒ(２)またはＲ(３)が、−Ｃ(ＯＨ)(ＣＨ3)−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ(ＣＨ3)−ＣＨ2ＯＨまたは−Ｃ(ＯＨ)(ＣＨ3)2であり、Ｒ(４)がメチルであるものおよびその医薬上許容しうる塩である。
特に好ましい式Ｉの化合物は、式中、Ｒ(１)がＣＦ3であり、置換基Ｒ(２)およびＲ(３)のうちの一つが水素であり、そして各場合におけるもう一方の置換基Ｒ(２)またはＲ(３)が、−ＣＨ(ＣＨ3)−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ(４)がメチルであるものおよびその医薬上許容しうる塩である。
特に大変好ましい式Ｉの化合物は、式中、Ｒ(１)がＣＦ3であり、Ｒ(２)が−ＣＨ(ＣＨ3)−ＣＨ2ＯＨであり、Ｒ(３)が水素であり、Ｒ(４)がメチルであるものおよびその医薬上許容しうる塩である。
置換基Ｒ(２)またはＲ(３)の一方が不斉中心を含む場合は、ＳまたはＲの配置をとることができる。化合物は、光学異性体として、ジアステレオマーとして、ラセミ体として、またはそれらの混合物として存在することができる。
【０００３】
さらに、本発明は、式II
【化４】
0004160650.tif 000003
〔式中、Ｒ(１)〜Ｒ(４)は上記意味を有し、Ｌは容易に求核置換できる残基である〕の化合物をグアニジンと反応させることからなる、式Ｉの化合物の製造方法に関する。
【０００４】
式II（式中、Ｌはアルコキシ基、好ましくはメトキシ基、フェノキシ基、フェニルチオ基、メチルチオ基または２−ピリジルチオ基、窒素複素環、好ましくは１−イミダゾリルである）の活性化された酸誘導体は、ベースとなるカルボン酸塩化物（式II、Ｌ＝Ｃｌ）からそれ自体知られている方法で都合よく得られ、この塩化物は、ベースとなるカルボン酸（式II、Ｌ＝ＯＨ）から、順にそれ自体知られている方法で、例えばチオニルクロリドを使用して得られる。
【０００５】
式II（Ｌ＝Ｃｌ）のカルボン酸塩化物の他に、式IIの別の活性化された酸誘導体も、ベースとなる安息香酸誘導体（式II、Ｌ＝ＯＨ）から、それ自体知られている方法で、例えばＬ＝ＯＣＨ3の式IIのメチルエステルをメタノール中でガス状のＨＣｌで処理して、式IIのイミダゾリドをカルボニルジイミダゾール〔Ｌ＝１−イミダゾリル、Staab，Angew．Chem．Int．Ed．Engl.１，351−367(1962)〕で処理して、混合された無水物IIを不活性溶剤中トリエチルアミンの存在下でＣｌ−ＣＯＯＣ2Ｈ5またはトシルクロリドを用いて、並びにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いてまたはＯ−〔（シアノ（エトキシカルボニル）メチレン）アミノ〕−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロボレート（“TOTU”）（Proceedings of the 21st European Peptide Symposium，Peptides 1990，Editors E.Giralt and D.Andreu，Escom，Leiden，1991）を用いて安息香酸を活性化させて製造することができる。式IIの活性化されたカルボン酸誘導体を製造する適切な方法の多くは、J．March，Advanced Organic Chemistry、第三版（John Wiley & Sons，1985）第350頁の出典文献に詳細に記載されている。
【０００６】
式IIの活性化されたカルボン酸誘導体とグアニジンとの反応は、プロトン性または非プロトン性の極性であるが不活性の有機溶剤中で、それ自体知られている方法で実施する。安息香酸メチル（式II、Ｌ＝ＯＭｅ）とグアニジンとの反応において、メタノール、イソプロパノールまたはＴＨＦで、２０℃からこれらの溶剤の沸点までの温度が適切であることがわかっている。化合物IIと塩を含まないグアニジンとのほとんどの反応は、非プロトン性の不活性溶剤、例えばＴＨＦ、ジメトキシエタンまたはジオキサン中で実施するのが都合がよい。しかしながら、例えばＮａＯＨのような塩基を使用する時は、水を式II化合物とグアニジンとの反応における溶剤として使用できる。
【０００７】
Ｌ＝Ｃｌの時、ハロゲン化水素酸を捕捉するために、例えば過剰のグアニジンの形態で、酸スカベンジャーを添加して反応を実施するのが都合が良い。
以下にある式IIの安息香酸誘導体のいくつかは知られており、文献に記載されている。式IIの知られていない化合物は、文献で知られている方法によって製造することができる。得られた安息香酸は、上記の様々な方法の一つにより反応させて、本発明の式Iの化合物を得る。
【０００８】
２−、３−、４−および５−位に置換基を入れるのは、パラジウムを媒介として、アリールハライドまたはアリールトリフレートを例えば有機スズ、有機硼酸もしくは有機ボラン、または有機銅もしくは有機亜鉛化合物と交叉カップリングさせる、文献で知られている方法によって実施する。
一般に、ベンゾイルグアニジンＩは弱塩基であり、酸と結合して塩を形成することができる。可能な酸付加塩は、医薬上許容しうるすべての酸の塩、例えばハロゲン化物、特に塩酸塩、乳酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、燐酸塩、メチルスルホン酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩である。
式Iの化合物は置換されたアシルグアニジンである。
【０００９】
本発明の式Ｉの化合物に類似の化合物は、欧州公開明細書６４０ ５８８中に開示されており、この式のもとで本発明の化合物は得られる。しかしながら、本化合物は、知られている化合物と比べて、優れた水溶性に関して、Ｎａ+／Ｈ+交換の阻害に並はずれた驚くべき高活性であることを特徴としている。
【００１０】
知られている化合物のように、本化合物は望ましくないおよび不都合な利尿性がなく、非常に良好な抗不整脈性を有しており、これは、例えば酸素欠乏症の場合に生じる病気の治療に重要である。本化合物は、その薬理学的性質のため、梗塞の予防および梗塞の治療並びに狭心症の治療のための心臓保護成分を有する抗不整脈薬剤として著しく適しており、この場合、虚血によって誘発される損傷の形成、特に虚血により誘発される心臓の不整脈の顕現における病態生理学的なプロセスを、予防的に阻害または著しく低下させる。病理学上の低酸素および虚血状態に対して保護作用があるため、本発明の式Ｉの化合物は、細胞のＮａ+／Ｈ+交換機構を阻害するので、虚血またはそれによって一次的もしくは二次的に誘発される病気によって引き起こされるすべての急性または慢性の損傷の治療のための薬剤として使用することができる。これは、外科的な介入、例えば臓器移植の薬剤としての使用に関連し、この場合、本化合物は、除去前および除去中のドナーの臓器の保護、並びに、例えば生理学的浴の流体を用いた処理またはその中での臓器の保存の間および受容者への体に移す間の、除去された臓器の保護の両方に使用できる。本化合物は、例えば心臓または末梢の血管における、血管形成の外科的な介入を実施する時にも同様に、有用な保護薬剤である。虚血により誘発される損傷に対する保護作用のため、本化合物は、神経系、特に中枢神経系の虚血の治療用の薬剤としても適当であり、例えば発作または大脳浮腫の治療に適当である。さらに、本発明の式Ｉの化合物は、ショック、例えばアレルギー性、心臓の、血液量減少のおよび細菌性のショックの状態の治療にも同様に適当である。
【００１１】
さらに、本発明の式Ｉの化合物は、細胞の増殖、例えば繊維芽細胞の増殖および血管の平滑筋細胞の増殖における強力な阻害作用を特徴としている。したがって、式Ｉの化合物は、細胞の増殖が一次的または二次的原因である病気の有用な治療薬として適当であり、このため抗アテローム性動脈硬化剤として、あるいは糖尿病末期の合併症、癌腫症疾患、繊維症疾患、例えば肺繊維症、肝臓繊維症または腎臓繊維症、臓器の肥大および過形成、特に前立腺の過形成および前立腺の肥大に対する薬剤として使用することができる。
【００１２】
本発明の化合物は、多くの疾患（本態性高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病など）で上昇する、細胞のナトリウム−水素交互輸送機構（Ｎａ+／Ｈ+交換）の有用な阻害剤であり、これは、これらの細胞中、例えば赤血球、血小板または白血球中で容易に測定することができる。したがって、本発明の化合物は、例えば高血圧、またアテローム性動脈硬化症、糖尿病、増殖性の疾患等の、ある種の形態の確定および区別のための診断剤としての使用における、優れた、簡単な科学的道具として適当である。さらに、式Ｉの化合物は、高血圧、例えば本態性高血圧の発症を予防するための予防治療に適している。
【００１３】
さらに、式Ｉの化合物は、血清のリポ蛋白質において良好な効果を有することがわかった。一般に、動脈硬化症の血管の変化、特に冠状動脈の心臓疾患の形成では、非常に高い血中脂質値、いわゆる低リポ蛋白血症は著しく危険な因子であると考えられている。従って、上昇した血清のリポ蛋白質を下げることは、アテローム性動脈硬化症の変化の予防および緩和にとって極めて重要である。血清の総コレステロールを減少させるほかに、この総コレステロールのうちの特定のアテローム発生性の脂肪画分、特に低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および非常に低密度のリポ蛋白質（ＶＬＤＬ）の割合を低下させることは特に重要であり、これはこれらの脂肪画分がアテローム発生の危険因子であるからである。一方、高密度リポ蛋白質は、冠状動脈の心臓疾患に対して、保護機能を有する。従って、低脂質症では、総コレステロールだけでなく、特にＶＬＤＬおよびＬＤＬ血清コレステロール画分を低下させることができなければならない。式Ｉの化合物は、血清の脂質のレベルに影響を与えることに関して、治療に利用できる有用な性質を有することがわかった。つまり、本化合物は、上昇した血清のＬＤＬおよびＶＬＤＬの濃度を著しく低下させるものであり、このことは、例えばコレステロールおよび脂質の豊富な食餌の摂取量を高めることによって、または病理学的代謝の変化、例えば遺伝に関連した低脂質症の場合に観察される。このため、本化合物は、その原因となる危険因子を停止させることによってアテローム性動脈硬化症の変化の予防および症候の緩解に使用することができる。これらには、一次的な低脂質症だけでなく、例えば糖尿病で生じるようなある種の二次的な低脂質症も含まれる。さらに、式Ｉの化合物は、代謝異常によって引き起こされた梗塞をはっきりと低減させ、特に引き起こされた梗塞のサイズおよびその重篤度を著しく低減する。さらに、式Ｉの化合物は、代謝異常によって引き起こされた内皮の損傷に対して効果的に保護する。内皮の機能不全症候群に対する血管の保護では、式Ｉの化合物は、冠状動脈の血管痙攣、アテローム発生およびアテローム性動脈硬化症、左心室肥大および拡張型心筋症、および血栓症の疾患の予防並びに治療のための有用な薬剤である。
【００１４】
従って、記載した化合物は、高コレステロール血症の治療用の医薬の製造、アテローム発生を予防するための医薬の製造、アテローム性動脈硬化症の予防および治療のための医薬の製造、コレステロールレベルの上昇によって生じる病気の予防および治療のための医薬の製造、内皮の機能不全によって生じる病気の予防および治療のための医薬の製造、アテローム性動脈硬化症に誘発された高血圧の予防および治療のための医薬の製造、アテローム性動脈硬化症に誘発された血栓症の予防および治療のための医薬の製造、高コレステロール血症および内皮の機能不全に誘発された虚血性損傷および虚血後の再灌流による損傷の予防および治療のための医薬の製造、高コレステロール血症および内皮の機能不全に誘発された心臓の肥大および心筋疾患の予防および治療のための医薬の製造、高コレステロール血症および内皮の機能不全に誘発された冠状動脈の血管痙攣および心筋梗塞の予防および治療のための医薬の製造、降圧物質、好ましくはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤およびアンギオテンシンレセプター拮抗薬と組み合わせて、式ＩのＮＨＥ阻害剤を血中脂質レベルを低下させる活性化合物と組み合わせて、好ましくはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばロバスタチンまたはプラバスタチン）と組み合わせて記載した症状を治療するための医薬の製造に使用するのが都合よく、この場合、後者は脂質低下作用があるので、式ＩのＮＨＥ阻害剤の脂質低下性を高め、活性化合物の作用を高め、使用を低減させる望ましい組み合わせであることがわかった。
【００１５】
式Ｉのナトリウム−水素交換阻害剤の投与は、上昇した血中脂質レベルを低下させるための新規な医薬として、並びにナトリウム−水素交換阻害剤と血圧降下性および／または脂質低下性の医薬との組み合わせとして特許請求の範囲に請求している。
式Ｉの化合物を含む医薬は、経口、腸管外、静脈内、直腸からまたは吸入によって投与することができ、好ましい投与法は、疾患の特定の形態による。化合物Ｉは、それ自体で、または医薬補助剤と一緒に、すなわち獣医学およびヒトの医薬の両方で使用できる。
【００１６】
当業者は、その専門的な知識に基づいて、所望の医薬処方物に適した補助剤についてよく知っている。溶剤、ゲル形成剤、坐剤ベース、錠剤補助剤、および他の活性化合物キャリヤーの他に、例えば酸化防止剤、分散剤、乳化剤、消泡剤、矯味剤、防腐剤、可溶化剤または着色剤を使用することが可能である。
【００１７】
経口投与の形態では、活性化合物をそれに適した添加剤、例えば賦形剤、安定剤または不活性希釈剤と混合して、慣用の方法で適当な投与形態、例えば錠剤、コーティングされた錠剤、硬いカプセル剤、水性、アルコール性または油性の溶液にする。使用できる不活性キャリヤーは、例えばアラビアガム、マグネシウム、炭酸マグネシウム、燐酸カリウム、ラクトース、グルコースまたは澱粉、特にトウモロコシの澱粉である。調製は、乾いたおよび湿った顆粒の両方として実施できる。適当な油性の賦形剤または溶剤は、例えば植物性油または動物性油、例えばヒマワリ油またはタラ肝油である。
【００１８】
皮下または静脈内投与では、活性化合物は、所望により慣用の物質、例えば可溶化剤、乳化剤または他の補助剤を用いて、溶液、懸濁液またはエマルジョンにする。可能な溶剤は、例えば水、生理食塩水溶液またはアルコール、例えばエタノール、プロパノール、グリセロールであり、そしてさらに、糖溶液、例えばグルコースもしくはマンニトール溶液、または記載した種々の溶剤の混合物である。
【００１９】
エアゾールまたはスプレーの形態での投与に適した医薬処方物は、例えば、医薬上許容しうる溶剤、特にエタノールもしくは水、またはこのような溶剤の混合物中の反応性の式Ｉの化合物の溶液、懸濁液またはエマルジョンである。
必要に応じて、処方物には、別の医薬補助剤、例えば界面活性剤、乳化剤および安定剤並びに噴射剤を含ませることができる。このような調製物には、活性化合物が慣用的には約０.１〜１０重量％、特に約０.３〜３重量％の濃度で含まれる。
【００２０】
投与される式Ｉの活性化合物の投与量および投与回数は、使用する化合物の作用の効能および持続時間、さらにまた治療する病気の性質および重篤度、並びに治療する哺乳動物の性別、年齢、体重および個々の反応性による。
平均的には、約７５kgの体重の患者の場合、式Ｉの化合物の一日の投与量は、少なくとも０.００１mg／体重kg、好ましくは０.０１mg／体重kgであり、多くとも１０mg／体重kg、好ましくは１mg／体重kgである。病気が急に発現した場合、例えば心筋梗塞にかかった直後では、より多くの、そして特別に頻繁な投与、例えば１日当たり４回までの個別投与が必要である。特に静脈内投与の場合、例えば集中治療部の梗塞患者の場合、２００mg／日まで必要である。
【００２１】
略号のリスト
ＭｅＯＨ      メタノール
ＤＭＦ        Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＲＴ          室温
ＥＡ          酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）
ＥＩ          電子衝撃
ＥＳ          エレクトロスプレーイオン化
ｍｐ          融点
ＴＨＦ        テトラヒドロフラン
ｅｑ          当量
【００２２】
〔実験部分〕
ベンゾイルグアニジン(Ｉ)を製造するための一般的方法
安息香酸からの方法Ａ（II、Ｌ＝ＯＨ）
式IIの安息香酸誘導体１.０当量を無水ＴＨＦ（５ml／ミリモル）中に溶解または懸濁し、次いで、カルボニルジイミダゾール１.１当量で処理した。室温で２時間撹拌した後、グアニジン５.０当量を反応溶液中に入れた。一夜にわたって撹拌した後、ＴＨＦを減圧下（ロータリーエバポレータ）で留去し、残留物を水で処理し、２Ｎ ＨＣlを用いて、混合物をｐＨ６〜７に調節し、そして対応するベンゾイルグアニジン（式Ｉ）をろ別した。このようにして得たベンゾイルグアニジンを、水性、メタノール性もしくはエーテルを含んだ塩酸または他の医薬上許容し得る酸で処理することによって対応する塩に変換することができる。
【００２３】
ベンゾイルグアニジン(Ｉ)を製造するための一般的方法
安息香酸アルキルからの方法Ｂ（II、Ｌ＝Ｏ−アルキル）
式IIの安息香酸アルキル１.０当量およびグアニジン（遊離塩基）５.０当量をイソプロパノール中に溶解するか、またはＴＨＦ中に懸濁し、変換が完了（薄層でチェック）するまで、沸点に加熱する（典型的な反応時間２〜５時間）。減圧下（ロータリーエバポレータ）で溶剤を留去し、残留物をＥＡ中にとり、混合物をＮａＨＣＯ3溶液で３回洗浄した。これをＮａ2ＳＯ4で乾燥し、溶剤を真空下で留去し、適当な溶離剤、例えばＥＡ／ＭｅＯＨ５：１を用いて、残留物をシリカゲル上でクロマトグラフィーにかける。（塩形成を方法Ａと比較）
【００２４】
〔実施例〕
４−（１′−ヒドロキシ−２′−プロピル）−２−メチル−５−トリフルオロエチルベンゾイルグアニジン塩酸塩、無色結晶、１００℃から分解、ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ+＋Ｈ＝３０４。
【化５】
0004160650.tif 000004
【００２５】
合成経路：
ａ)  ４−ヒドロキシ−２−クロロ−５−ヨード安息香酸メチル
５当量のトリフルオロメタンスルホン酸中で、１当量のＮ−ヨードスクシンイミドを用いて、室温で２４時間、４−ヒドロキシ−２−クロロ安息香酸メチルをＯｌａｈヨード化することによって得た。
無色結晶、ｍｐ.１８８〜８９℃、ＭＳ(ＥＩ)：Ｍ+＝３１２。
ｂ)  ４−ベンジルオキシ−２−クロロ−５−ヨード安息香酸メチル
無水ＤＭＦ中１.５当量の炭酸カリウムの存在下、室温で１ａ）を１当量のベンジルブロミドと反応させ、水性処理に続いてｉ−プロパノールから再結晶して得た。
無色結晶、ｍｐ.１０７〜０８℃、ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ+＋Ｈ＝４０３。
ｃ)  ４−ベンジルオキシ−２−クロロ−５−トリフルオロメチル安息香酸メチル
還流下、ＤＭＦ中で１ｂ）を１当量のトリフルオロ酢酸カリウムおよび１.１当量のヨウ化銅（Ｉ）と反応させ、カラムクロマトグラフィー処理をして得られる。
無色固体、ｍｐ.１２７〜２８℃、ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ+＋Ｈ＝３４５。
ｄ)  ４−ベンジルオキシ−２−メチル−５−トリフルオロエチル安息香酸メチル
０.１当量の酢酸パラジウム（II）触媒、０.２当量のトリフェニルホスフィンおよび０.１１当量のヨウ化銅（Ｉ）の存在下、還流下で、ＴＨＦ／ＤＭＦ中で１ｃ）を５当量の塩化メチル亜鉛と交叉カップリングさせ、水性処理し、酢酸エチルで抽出し、次いでシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーにかけて得た。
無色固体、ｍｐ.１０５℃、ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ+＋Ｈ＝３２５。
ｅ)  ４−ヒドロキシ−２−メチル−５−トリフルオロメチル安息香酸メチル
室温で、メタノール中パラジウム／カーボン（１０％）の存在下で、１ｄ）を水素化分解し、シクロヘキサンを添加し、無色固体を結晶させた。
ｍｐ.１６２〜６３℃、ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ+＋Ｈ＝２３５。
ｆ)  ４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−２−メチル−５−トリフルオロメチル安息香酸メチル
無水塩化メチレン中１.１当量のトリエチルアミンの存在下、０℃で、１ｅ）を１.１当量のトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させ、カラムクロマトグラフィーにかけ、アモルファス固体を得た。
ｇ)  ４−イソプロペニル−２−メチル−５−トリフルオロメチル安息香酸メチル
０.１当量の酢酸パラジウム（II）触媒、０.２当量のトリフェニルホスフィンおよび０.１１当量のヨウ化銅（Ｉ）の存在下、還流下で、ＴＨＦ／ＤＭＦ中で１ｆ）を５当量の塩化イソプロペニル亜鉛と交叉カップリングさせ、水性処理し、酢酸エチルで抽出し、次いでシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーにかけて無色油状物を得た。ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ+＋Ｈ＝２５９。
ｈ)  ４−（１′−ヒドロキシ−２′−プロピル）−２−メチル−５−トリフルオロメチル安息香酸メチル
１.０５当量のボラン／テトラヒドロフラン錯体を用いて、１ｇ）をヒドロホウ素化し、次いで酸化反応処置を施し（アルカリ性過酸化水素）、水性処理後、カラムクロマトグラフィー精製して、無色油状物を得た。ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ+＋Ｈ＝２７７。
ｉ)  ４−（１′−ヒドロキシ−２′−プロピル）−２−メチル−５−トリフルオロメチルベンゾイルグアニジン塩酸塩
一般的方法の方法Ｂに従って１ｈ）から得た。
【００２６】
〔薬理学的データ〕
ウサギの赤血球のＮａ+／Ｈ+交換体の阻害：
Ｎａ+／Ｈ+交換体を活性化し、Ｎａ+／Ｈ+交換を経た赤血球中へのＮａ+の流入を炎光光度法によって測定することができるようにするために、白色のニュージーランドウサギ（Ivanovas）に、２％コレステロールで標準的な食餌療法を６週間施した。血液を耳の動脈から採取し、カリウム−ヘパリン２５ＩＵによって凝固しないようにした。各試料の一部を遠心分離によって、ヒューマトクリトの重複測定に使用した。各場合の１００μlのアリコートを赤血球の最初のＮａ+含量の測定に使用した。
【００２７】
アミロリド感受性のナトリウム流入を測定するために、各血液試料の１００μlを、ｐＨ７.４および３７℃で、各場合、過浸透の塩−蔗糖培地（ミリモル／ｌ：１４０ＮａＣｌ、３ＫＣｌ、１５０蔗糖、０.１ウアバイン、２０トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン）５ml中で、温置した。次いで、赤血球を氷冷ＭｇＣｌ2−ウアバイン溶液（ミリモル／ｌ：１１２ＭｇＣｌ2、０.１ウアバイン）で三回洗浄し、蒸留水２.０ml中に溶解した。細胞内にあるナトリウム含量を炎光光度法によって測定した。
【００２８】
ナトリウムの最初の値と温置後の赤血球のナトリウム含量との間の差から、Ｎａ+の正味の流入を計算した。アミロリドで阻害可能なナトリウムの流入は、アミロリド３×１０-4モル／ｌを用いた温置後の赤血球のナトリウム含量と用いなかった場合の差から得られる。また、本発明の化合物の場合も方法は同じである。
結果：
Ｎａ+／Ｈ+交換体の阻害
実施例            ＩＣ50（モル／ｌ）
１              ０.００１２×１０-6