(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元性糖質と尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させて、エルソン−モルガン反応陽性物質を生成せしめ、これを採取することを特徴とするエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項２】
還元性糖質が、Ｄ−アルドース、Ｌ−アルドース、Ｄ−ケトース及びＬ−ケトースから選ばれる一種又は二種以上の還元性糖質であることを特徴とする請求項１に記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項３】
還元性糖質と尿素とを含有する溶液が、還元性糖質と尿素とをそれぞれ１％（ｗ／ｗ）以上の濃度で含有することを特徴とする請求項１又は２に記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項４】
還元性糖質と尿素とを含有する溶液が、還元性糖質と尿素とを無水物換算で合計５乃至６０％（ｗ／ｗ）含有することを特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項５】
ウレアーゼが、動物、植物及び微生物由来の天然型ウレアーゼ、及び遺伝子組換え型ウレアーゼから選ばれる一種又は二種以上のウレアーゼであることを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項６】
エルソン−モルガン反応陽性物質を温度０乃至１００℃の範囲から選ばれる温度条件下で生成せしめることを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項７】
エルソン−モルガン反応陽性物質を採取する方法が、活性炭による脱色・濾過、薄層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、濃縮及び結晶化から選ばれる一種又は二種以上を含む精製方法であることを特徴とする請求項１乃至６の何れかに記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項８】
イオン交換クロマトグラフィーが、生成させたエルソン−モルガン反応陽性物質をＨ形強酸性カチオン交換樹脂と接触させて吸着させ、次いで水洗した後、これを酸で溶出し、得られるエルソン−モルガン反応陽性物質を採取するものであることを特徴とする請求項７記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項９】
還元性糖質がＤ−フラクトースであって、エルソン−モルガン反応陽性物質がＤ−グルコサミンであることを特徴とする請求項１乃至８の何れかに記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れかに記載のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法により得られるエルソン−モルガン反応陽性物質を含有せしめることを特徴とする組成物の製造方法。
【請求項１１】
組成物が、飲食物、化粧品、医薬品又は化学品である請求項１０記載の組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、エルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法、エルソン−モルガン反応陽性物質を含んでなる組成物の製造方法、及び還元性糖質にアミノ基を導入する方法に関する。
背景技術
従来、アミノ基を含有する糖誘導体として知られる、例えば、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−マンノサミン、Ｄ−アロサミン、Ｄ−フコサミン、Ｄ−グルコサミヌロン酸、Ｄ−フルクトサミン、Ｄ−ガラクトサミヌロン酸などのアミノ糖は、細菌の細胞壁、糖蛋白質、糖脂質、ムコ多糖類などの生体組織の重要な構成成分として、又、天然界では、カニやエビなどの甲殼類の外皮を形成するキチンなどの構成成分として広く分布している。これらアミノ糖は、「生化学辞典」、１９５頁、株式会社東京化学同人発行（１９８４年）に記載されているように、アルカリ性でアセチルアセトンと加熱縮合させた後、塩酸酸性条件下でｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（エールリッヒ試薬）と反応（エルソン−モルガン反応）させると赤紫色を呈する物質であることが知られている。これらアミノ糖の内、例えば、既に工業化されているＤ−グルコサミンの製造方法としては、前記キチンを強アルカリ条件下で加熱処理して脱セチル化してキトサンとし、このキトサンを塩酸や硫酸などの鉱酸により加水分解してＤ−グルコサミンを得る方法、キトサンを微生物由来のキトサナーゼで加水分解してＤ−グルコサミンを得る方法などを例示できる。しかしながら、前者の化学的手法の場合、原料としての天然由来のキチン、キトサンを工業的に大量かつ安価に入手することは甚だ困難である上、強アルカリや強酸などの劇薬を用いることから、作業上、危険を伴うこと、耐アルカリ性や耐酸性の容器、装置を必要とすることから、操作が煩雑となり製造コスト高となる欠点があった。又、後者の生化学的手法の場合、キトサナーゼによるキトサンの加水分解率が低く、工業的な製造方法としては不適であった。
発明の開示
本発明者等は斯かる従来技術に鑑み、糖質を主原料として得ることのできるエルソン−モルガン反応で陽性を呈する物質、より詳細には、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上でエルソン−モルガン反応に供したとき、赤紫色を呈する物質（以下、単に「エルソン−モルガン反応陽性物質」と言う。）を工業的に安価、容易かつ安定して製造し得る新規な製造方法、エルソン−モルガン反応陽性物質を含んでなる組成物の製造方法、及び還元性糖質にアミノ基を導入する方法を提供することを課題とする。
本発明者等は、糖質にアミノ基を直接導入する方法に着目して鋭意研究した結果、意外にも、還元性糖質と尿素とを含有する溶液にウレアーゼ（ＥＣ３．５．１．５）を作用させるか、又は還元性糖質とアンモニアとを接触させることにより、還元性糖質にアミノ基を直接導入でき、エルソン−モルガン反応陽性物質が容易に生成することを見出し、より好適には、前者のウレアーゼを作用させてエルソン−モルガン反応陽性物質を生成させる場合には、反応生成物の種類が比較的少ない上、エルソン−モルガン反応陽性物質以外の副産物の生成も少ないことから、所望のエルソン−モルガン反応陽性物質を単離し、精製することが容易で、工業的に実施する上で優れていることを見出し、このエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法を確立すると共に、斯かる製造方法により得られるエルソン−モルガン反応陽性物質を含有せしめる組成物の製造方法、及び還元性糖質と尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させるか、又は還元性糖質とアンモニアとを接触させて、還元性糖質にアミノ基を導入する方法を確立して本発明を完成した。
発明を実施するための最良の形態
本発明に於いて用いる還元性糖質について先ず述べる。斯かる還元性糖質とは、還元性を示す糖質を意味し、それがアルドースであろうとケトースであろうと、又Ｄ形、Ｌ形の何れの形態のものであっても、尿素と共にウレアーゼを作用させるか、アンモニアと接触させたとき、エルソン−モルガン反応陽性物質を生成し得る還元性糖質全てを包含する。具体的には、トレオース、エリスロースなどのテトロース、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロースなどのペントース、グルコース、フラクトース、ガラクトース、マンノース、プシコース、ソルボース、ラムノース、タガトースなどのヘキソース、更にはマルトース、ラクトース、パラチノース、マルツロース、ツラノースなどの還元力を示す各種オリゴ糖を例示でき、これら還元性糖質に於ける結合様式として、α−結合、β−結合の何れの結合を有するものであってもよい。例えば、構成糖質が単一の糖質からなるホモオリゴ糖や、構成糖質が二種以上の糖質からなるヘテロオリゴ糖であってもよい。本発明で用いるこれら還元性糖質は、試薬特級や医薬品級及び最高純度の還元性糖質から、食品級の比較的高純度乃至低純度の製品であってもよく、通常、純度１０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは、５０％（ｗ／ｗ）以上、更に好ましくは、８０％（ｗ／ｗ）以上のものを適宜選択して用いることができる。本発明に於ける最終製品としての組成物が、化粧品、医薬品、試薬を含む化学品である場合には、純度８０％（ｗ／ｗ）以上の比較的高純度の還元性糖質を用いるのが望ましい。
又、本発明で用いるウレアーゼは、還元性糖質共存下で尿素に作用してエルソン−モルガン反応陽性物質を生成し得る限り、その由来、起源、純度は特に問わず、動物、植物、微生物由来の天然型及び遺伝子組換え型の何れのものであってもよい。例えば、市販されているタチナタマメ由来のウレアーゼ、バチルス属に属する微生物由来のウレアーゼ、更には、土壌から分離して得られる各種微生物由来のウレアーゼ、或いは遺伝子組換え技術により得られるウレアーゼの一種又は二種以上を適宜用いることができる。これらウレアーゼは、必要に応じて適宜担体に固定化して用いることもできる。
本発明で用いる尿素は、前記ウレアーゼが前記還元性糖質共存下で尿素に作用してエルソン−モルガン反応陽性物質を生成し得る限り、その由来、給源、純度は特に問わない。一般的には、試薬特級の最高純度の尿素製品、工業級の比較的高純度の尿素、又は飼料や肥料など比較的低純度の尿素含有製品であってもよく、通常、純度１０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは、５０％（ｗ／ｗ）以上、更に好ましくは、８０％（ｗ／ｗ）以上のものを適宜選択して用いることができる。前記還元性糖質と同様、本発明に於ける最終製品としての組成物が、化粧品、医薬品、試薬を含む化学品である場合には、純度８０％（ｗ／ｗ）以上の比較的高純度の尿素を用いるのが望ましい。
本発明で用いる還元性糖質と尿素とを含有する溶液は、還元性糖質と尿素とを、エルソン−モルガン反応陽性物質が生成し得る量含んでいるものであればよく、通常、還元性糖質と尿素とをそれぞれ１％（ｗ／ｗ）以上の濃度、好ましくは、それらを合計で５乃至６０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む溶液を適宜選択して用いることができる。還元性糖質と尿素とは、通常、モル比で１：９９乃至９９：１の範囲で用いる。又、ウレアーゼを還元性糖質と尿素とに作用させるときの温度は、ウレアーゼがそれらに作用する温度であればよく、通常、０℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、２０乃至１００℃以上、更に好ましくは、２０乃至８０℃の範囲の温度から選ばれる。尚、一般に高すぎる温度、例えば、１００℃を越える温度に於いては、ウレアーゼの失活が著しくなることから好ましくない。ウレアーゼを作用させるｐＨは、ウレアーゼが作用するｐＨであればよく、通常、ｐＨ５乃至１２、好ましくは、ｐＨ６乃至１１の範囲のｐＨから適宜選択して用いる。又、ウレアーゼを作用させる際の媒体は、ウレアーゼが作用してエルソン−モルガン反応陽性物質を生成し得る限り特に問わない。工業的に好適な媒体としては水を例示できる。
本発明で用いるアンモニア（ＮＨ３）は、前記した還元性糖質と直接反応してエルソン−モルガン反応陽性物質を生成し得る限り、その由来、給源、純度は特に問わない。具体例には、純アンモニアガス、液体アンモニア、圧縮アンモニア、アンモニア水、更には、媒体中でアンモニアを発生するアンモニア含有化合物などから選ばれる一種又は二種以上のアンモニアを適宜用いることができる。一般的には、試薬特級の最高純度のアンモニア、工業級の比較的高純度のアンモニア、又は飼料や肥料など比較的低純度のアンモニア含有製品などを用いることができる。本発明で用いるアンモニアの純度は、通常、ガス状の場合、１０％（ｖ／ｖ）以上、好ましくは、５０％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは、８０％（ｖ／ｖ）以上のものを、液状の場合、純度１０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは、５０％（ｗ／ｗ）以上、更に好ましくは、８０％（ｗ／ｗ）以上のものが望ましい。前記還元性糖質及び尿素と同様、本発明に於ける最終製品としての組成物が、化粧品、医薬品、試薬を含む化学品である場合には、純度８０％（ｗ／ｗ）以上の比較的高純度のアンモニアを用いるのが望ましい。
本発明で用いる還元性糖質とアンモニアとの配合割合は、モル比で１：９９乃至９９：１の範囲から適宜選択して用いられる。還元性糖質とアンモニアとの反応温度は、それらが反応してエルソン−モルガン反応陽性物質を生成する温度であればよく、通常、０℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、２０乃至１００℃、更に好ましくは、２０乃至８０℃の範囲から適宜選ばれる。尚、還元性糖質とアンモニアとの反応は、低温よりも高温の方がよく進行するところ、１００℃を越える高温に於いては、副産物の生成量が増加することから好ましくない。又、還元性糖質とアンモニアとを接触させる反応系としては、エルソン−モルガン反応陽性物質が生成し得る条件であればよく、液相系又は固相系の何れをも採用することができる。しかしながら、反応効率及び反応生成物の分離のし易さの点で、適宜の媒体中で還元性糖質とアンモニアとを接触させるのが望ましい。媒体としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコールなどの炭素数１乃至１０程度の直鎖又は分岐アルコール類、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、トルエン、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、ジメチルスルフォキシド、エチルセロソルブ、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒から選ばれる一種又は二種以上の溶媒を単独又は適宜組み合わせて用いることができる。媒体中で還元性糖質とアンモニアを接触させる際の反応ｐＨは、通常、ｐＨ５乃至１４、好ましくは、ｐＨ８乃至１３の範囲から適宜選択される。又、無用な酸化物の生成を抑制するために、嫌気的条件下、脱酸素条件下、不活性ガス存在下で、還元性糖質とアンモニアとを接触させることも有利に実施できる。
還元性糖質と尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させるか、還元性糖質とアンモニアとを接触させて生成するエルソン−モルガン反応陽性物質を採取する方法としては、前記反応により得られるエルソン−モルガン反応陽性物質を含有する溶液を、活性炭による脱色、濾過、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、吸着クロマトグラフィー、濃縮、結晶化などの一種又は二種以上の精製方法を適宜採用することができる。より好適には、前記反応により得られるエルソン−モルガン反応陽性物質を含有する溶液を、Ｈ形カチオン交換樹脂と接触させて、エルソン−モルガン反応陽性物質を吸着させて水洗した後、塩酸、酢酸、クエン酸、硝酸、硫酸等の酸でカラムから溶出し、濃縮して採取するか、必要に応じて、更に結晶化して採取する。又、塩形の強酸性カチオン交換樹脂及び／又はシリカゲルＯＤＳを充填したカラムに前記反応により得られるエルソン−モルガン反応陽性物質を含有する溶液をチャージした後、水又はメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール等の各種有機溶媒をカラムに流して、エルソン−モルガン反応陽性物質をカラムから溶出、分離し、濃縮して、更に、必要に応じて、結晶化して、高純度のエルソン−モルガン反応陽性物質を採取することも随意である。
又、本発明の製造方法により得られるエルソン−モルガン反応陽性物質自体は、安全性の高い還元性糖質のアミノ誘導体として、それら単独で使用することも、又、水、アルコールなどの適宜の溶媒、賦形剤、増量剤、着香料、着色料、甘味料、呈味料、保存料、安定剤、ｐＨ調節剤、品質改良剤、防腐剤、ビタミン類、ホルモン類、エキス類、薬効成分、生理活性物質などの一種又は二種以上の成分と併用して、健康食品を含む飲食品、化粧品、医薬品、化学品などの各種組成物にして有利に用いることができる。これら各種組成物中のエルソン−モルガン反応陽性物質の含有量は、組成物重量当たり、０．００１％以上、好ましくは、０．１％以上、更に好ましくは、１％以上とするのが好適である。又、これら各種組成物の形態としては、液状、シラップ状、ペースト状、固体状、粉末状、顆粒状、カプセル状などの各種形態のものを例示できる。
以下、実験に基づいて、本発明をより詳細に説明する。
実験１  ウレアーゼ又はアンモニア作用による糖質からのエルソン−モルガン反応陽性物質の生成試験
Ｄ−グルコース又はＤ−フラクトースを１１０ｍｇと試薬特級尿素（和光純薬工業（株）製）１１０ｍｇとを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）２ｍｌに溶解し、これにタチナタマメ由来ウレアーゼ『タイプＣ−３』（シグマ社製）を尿素グラム当り１，０００単位加え、４０℃で２４時間作用させた。このウレアーゼ反応液を限外濾過膜『ウルトラフィルターユニットＵＳＹ−１型』（アドバンテック（株）製）を用いて濾過し、ウレアーゼを除去して酵素作用を止めた。
一方、アンモニア作用による場合は、１００ｍｌ容三角フラスコに、Ｄ−グルコース又はＤ−フラクトースを２．５ｇとり、これに脱イオン水を５０ｍｌ加え、室温下、穏やかに攪拌しつつ、アンモニアガスを常圧にて約３０分間吹き込んだ。用いたアンモニアガスの生成は、２００ｍｌ容三角フラスコに１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌをとり、これに３０％（ｖ／ｖ）アンモニア水を滴下して発生させ、これを前記個々の糖質水溶液内にガラス管を通じて導入した。
ウレアーゼ及びアンモニア作用前後の溶液のＴＬＣ上でのエルソン−モルガン反応と、ウレアーゼ及びアンモニア作用後の溶液中に於ける原料糖質と生成物の組成（％（ｗ／ｗ））についてＨＰＬＣにより調べた。ＴＬＣの分析条件は、薄層プレートとして『キーゼルゲルＦ６０』（メルク社製）を、展開溶媒としては２−プロパノール：ピリジン：水：酢酸（＝８：８：３：１（体積比））を用い、ウレアーゼ及びアンモニア作用前後の溶液を、薄層プレートに２μｌスポットして１回展開した後、エルソン−モルガン反応に供した。ＨＰＬＣ分析条件は、高速液体クロマトグラム装置『８０２０ＨＰＬＣシステム』（東ソー（株）製）、カラムとして『アサヒパック  ＮＨ２Ｐ−５０（Φ６ｍｍ×２５０ｍｍ）』を、溶離液としてアセトニトリル／０．１Ｍ水酸化テトラプロピルアンモニウム−酢酸緩衝液（ｐＨ１０）（＝８０：２０（体積比））を用い、室温下、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで、ウレアーゼ及びアンモニア作用前後の溶液２０μｌをカラムに注入し、内容物を示差屈折計『ＥＲＣ−７５２１』（エルマ光学（株）製）で検出すると共に、前記ＴＬＣ分析によりエルソン−モルガン反応陽性物質の存在の有無を調べた。ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析結果を表１にまとめた。
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表１中、「＋」は、ＴＬＣ上でエルソン−モルガン反応陽性のスポットが検出されたことを、「−」は、ＴＬＣ上でエルソン−モルガン反応が陰性であったことを示す。又、ＨＰＬＣでのウレアーゼ及びアンモニア作用後の溶液に於ける原料糖質と生成物の組成（％（ｗ／ｗ））は、ＨＰＬＣチャートに於けるピーク面積に基づいて求めた。その結果を表１に示す。又、Ｄ−グルコースについてのウレアーゼ及びアンモニア作用後の溶液のＨＰＬＣチャートをそれぞれ第１図及び第２図に、Ｄ−フラクトースについてのウレアーゼ及びアンモニア作用後の溶液のＨＰＬＣチャートをそれぞれ第３図及び第４図に示す。
第１図乃至第４図から明らかなように、アンモニアを接触させる場合と比較して、ウレアーゼを作用させる場合には、生成物の種類が少なく、かつ、目的とするエルソン−モルガン反応陽性物質以外の副産物の生成も少ないことが判明した。したがって、アンモニアを接触させる場合と比べ、ウレアーゼを作用させる場合の方が、目的とするエルソン−モルガン反応陽性物質を単離し精製する上で優れていることが判明した。
実験２  ウレアーゼ作用による各種糖質からのエルソン−モルガン反応陽性物質の生成試験
下記に示す何れかの糖質（無水物）１１０ｍｇと試薬特級尿素（和光純薬工業（株）製）１１０ｍｇとを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）２ｍｌに溶解し、これにタチナタマメ由来ウレアーゼ（『タイプＣ−３』（シグマ社製））を尿素グラム当り１，０００単位加え、４０℃で２４時間作用させた。この酵素作用液を限外濾過膜『ウルトラフィルターユニットＵＳＹ−１型』（アドバンテック（株）製）を用いて濾過し、ウレアーゼを除去して酵素反応を止めた。本酵素作用液に於いては、Ｄ−エリスロース、Ｄ−トレオース、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−アラビトール、リビトール、キシリトール、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−マンノース、Ｄ−プシコース、Ｄ−タガトース、Ｌ−ソルボース、ガラクチトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、トレハロース（α，α−トレハロース）、スクロース、マルチトール、マルトース、ラクトース、ツラノース、パラチノースの市販されている試薬２９種類の糖質を用いた。ウレアーゼ作用前後の溶液をＴＬＣ上でのエルソン−モルガン反応に供し、ウレアーゼ作用後の溶液をＨＰＬＣに供した。ＴＬＣとＨＰＬＣの分析条件は、実験１と同様の条件で行った。その結果を表２に示した。
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表２から明らかなように、エルソン−モルガン反応陽性物質は、ポリオール及び非還元性糖質からは生成せず、還元性糖質から生成することが判明した。又、還元性糖質の中でも、ケトースよりアルドースの方がエルソン−モルガン反応陽性物質の生成量が多く、この傾向は単糖類だけでなく２糖類についても同様であった。還元性糖質の代表例として、Ｄ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンノース、マルトース及びラクトースを用いた場合のウレアーゼ作用後の溶液のＨＰＬＣチャートを第５図乃至第１０図にそれぞれ示す。
以下、実施例Ａ及び実施例Ｂにより、本発明のエルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法、及びエルソン−モルガン反応陽性物質を含有してなる組成物の製造方法についてそれぞれ説明する。
実施例Ａ−１  Ｄ−フラクトースからのエルソン−モルガン反応陽性物質の製造
試薬特級Ｄ−フラクトース（和光純薬工業（株）製）と試薬特級尿素（和光純薬工業（株）製）の各々１０ｇを脱イオン水２００ｍｌに溶解し、タチナタマメ由来のウレアーゼ（『Ｔｙｐｅ３』（シグマ社製））を１ｍｌ（５，０００Ｕ／ｍｌ相当）加え、３０℃で４６時間作用させた。このウレアーゼ作用液を限外濾過膜『ＳＥＰ−００１３（分子量カットオフ３，０００）』（旭化成（株）製）で濾過した。得られた濾液１９５ｍｌをＨ形強酸性カチオン交換樹脂『ＳＫ−１Ｂ』（三菱化成工業（株）製）１００ｍｌを充填したカラムにチャージし、次いで、３００ｍｌの脱イオン水で水洗した。その後、０．２Ｎ−塩酸３００ｍｌをカラムに流して分画し、エルソン−モルガン反応陽性物質含有画分を回収した。この回収画分をエバポレーターで濃縮し、次いで、濃縮液の４倍量のエタノールを加え、４℃で３日間保持し、次いで、濾過して固形物当たりの純度が約９５％（ｗ／ｗ）の結晶標品約１００ｍｇを回収した。
得られた結晶標品は、下記に示すように、試薬Ｄ−グルコサミン・塩酸塩（キシダ化学（株）販売）をグルコサミン標準物質として比較することにより同定した。
（１）ＴＬＣ分析
本結晶標品とグルコサミン標準物質とを前記したと同様のＴＬＣ条件で、エルソン−モルガン反応に供したところ、本結晶標品は、グルコサミン標準物質と同じＲｆ値で、又同じ赤色のスポットとして検出された。
（２）ＨＰＬＣ分析
本結晶標品とグルコサミン標準物質とを前記ＨＰＬＣ条件と同じ条件で分析した。その結果、本結晶標品は、グルコサミン標準物質と同じ保持時間（１３．１分）の位置に溶出した。
（３）赤外線吸収スペクトル
ＫＢｒ錠剤法で測定した本結晶標品の赤外線吸収スペクトルを第１１図に示した。このスペクトルは、第１２図に示したグルコサミン標準物質の赤外線吸収スペクトルとよく一致した。
これらの結果から、本実施例で得られたエルソン−モルガン反応陽性物質は、Ｄ−グルコサミンと同定された。
実施例Ａ−２  Ｄ−フラクトースからのエルソン−モルガン反応陽性物質の製造
試薬特級Ｄ−フラクトース（和光純薬工業（株）製）２５ｇを脱イオン水５００ｍｌに溶解した。アンモニアガスは、１０Ｎ−カセイソーダ水溶液に３０％アンモニア水を３００ｍｌ滴下して発生させた。発生したアンモニアガスは室温下、常圧でＤ−フラクトースの水溶液に約１時間吹き込んだ。得られた反応液５００ｍｌをＨ形強酸性カチオン交換樹脂『ＳＫ−１Ｂ』（三菱化成工業（株）製）５００ｍｌを充填したカラムにチャージし、次いで、１Ｌの脱イオン水で水洗した。その後、０．２Ｎ−塩酸１．５Ｌをカラムに流して分画し、エルソン−モルガン反応陽性物質含有画分を回収した。この回収画分をエバポレーターで濃縮し、次いで、濃縮液の４倍量のエタノールを加え、４℃で７日間保持し、生成した結晶を濾別して結晶標品約８０ｍｇ（固形物当たりの純度約９６％（ｗ／ｗ））を回収した。
本品をＨＰＬＣで分析すると共に、その赤外線吸収スペクトルを調べたところ、実施例Ａ−１の方法で得たＤ−グルミサミンと同様の結果を得た。
これらの結果から、本例で得られたエルソン−モルガン反応陽性物質は、Ｄ−グルコサミンと同定された。
実施例Ａ−３  Ｄ−フラクトースからのエルソン−モルガン反応陽性物質の製造
試薬特級Ｄ−フラクトース（和光純薬工業（株）製）と試薬特級尿素（和光純薬工業（株）製）の各々１ｋｇを２０Ｌの脱イオン水に溶解し、これにバチルス属に属する微生物由来のウレアーゼ（シグマ社製）を２５ｇ加え、４０℃で４８時間作用させた。この酵素反応液を限外濾過膜『ＡＩＰ−１０１０（分画分子量６，０００）』（旭化成（株）製）で濾過した。得られる濾液２５ＬをＨ形強酸性カチオン交換樹脂『ＳＫ１１６』（三菱化成工業（株）製）１０Ｌを充填したカラムにチャージし、次いで、３０Ｌの脱イオン水で水洗した。その後、０．２Ｎ−塩酸５０Ｌをカラムに流して分画し、エルソン−モルガン反応陽性物質含有画分を回収した。この回収画分をエバポレーターで２Ｌまで濃縮し、次いで、濃縮液の６倍量のエタノールを加え、１５℃で１０日間保持した。生成した結晶をバスケット型遠心分離機で濾過して結晶を回収し、４０℃で１夜真空乾燥して純度約９６％（ｗ／ｗ）のエルソン−モルガン反応陽性物質を約２５ｇ得た。ウレアーゼ作用後の反応液中に含まれるエルソン−モルガン反応陽性物質に対する本品の回収率は３５％であった。
本品をＨＰＬＣで分析すると共に、その赤外線吸収スペクトルを調べたところ、実施例Ａ−１で得たＤ−グルミサミンと同様の結果を得た。
これらの結果から、本実施例で得られたエルソン−モルガン反応陽性物質は、Ｄ−グルコサミンと同定された。
実施例Ａ−４  Ｄ−マンノースからのエルソン−モルガン反応陽性物質の製造
試薬特級Ｄ−マンノース（和光純薬工業（株）製）と試薬特級尿素（和光純薬工業（株）製）の各々１００ｇを２，０００ｍｌの脱イオン水に溶解し、これにタチナタマメ由来のウレアーゼ（『Ｔｙｐｅ３』（シグマ社製））を１ｇ加え、２５℃で２５時間作用させた。得られた酵素作用液を限外濾過膜『ＡＩＰ−１０１０（分画分子量６，０００）』（旭化成（株）製）を用いて濾過した。この濾液をエバポレーターで３００ｍｌまで濃縮した。本濃縮液は、エルソン−モルガン反応陽性物質を無水物換算で７０％（ｗ／ｗ）以上含有していた。
実施例Ａ−５  Ｄ−グルコースからのエルソン−モルガン反応陽性物質の製造
試薬特級Ｄ−グルコース（和光純薬工業（株）製）と試薬特級尿素（和光純薬工業（株）製）の各々１ｋｇを２０Ｌの脱イオン水に溶解し、これにタチナタマメ由来のウレアーゼ（『Ｔｙｐｅ３』（シグマ社製））を１０ｇ加え、２５℃で２５時間作用させた。この酵素作用液を限外濾過膜『ＡＩＰ−１０１０（分画分子量６，０００）』（旭化成（株）製）で濾過した。得られる濾液をエバポレーターで３Ｌまで濃縮した。本濃縮液は、エルソン−モルガン反応陽性物質を無水物換算で５０％（ｗ／ｗ）以上含有していた。
実施例Ｂ−１  錠菓
実施例Ａ−１の方法で得たエルソン−モルガン反応陽性物質（Ｄ−グルコサミン、純度約９５％（ｗ／ｗ））６０重量部を、バナナ香料粉末２４重量部、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸２０重量部、結晶性トレハロース粉末（登録商標『トレハ』、固形分重量当りのトレハロース含量９８％以上、株式会社林原商事販売）４重量部、クエン酸０．４重量部及び結晶セルロース９０重量部からなる混合物と混合し、流動造粒し、打錠成形してＤ−グルコサミン含有錠菓（２ｇ／錠）を得た。
本品は、トレハロースによりＤ−グルコサミンが安定化された保存性の優れた風味良好な錠菓である。
実施例Ｂ−２  飲料
実施例Ａ−２の方法で得たエルソン−モルガン反応陽性物質（Ｄ−グルコサミン、純度約９６％（ｗ／ｗ））０．５重量部、α−グルコシルルチン０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．０５重量部、結晶性トレハロース粉末（登録商標『トレハ』、固形分重量当りのトレハロース含量９８％以上、株式会社林原商事販売）１５重量部、蔗糖２重量部、少量のレモン香料及び脱イオン水９０重量部を混合し、滅菌濾過して飲料を得た。
本品は、適度の酸味を有する喉ごし良好な飲料である。
実施例Ｂ−３  健康食品
脱脂乳１０重量部を８０℃で２０分間加熱殺菌した後、４０℃に冷却し、これに乳酸菌のスターター０．３重量部を加えて３５乃至３７℃で１０時間発酵させた。次いで、これをホモゲナイズした後、結晶性トレハロース粉末（登録商標『トレハ』）、固形分重量当りのトレハロース含量９８％以上、株式会社林原商事販売）６重量部、蔗糖１重量部、実施例Ａ−３の方法で得たエルソン−モルガン反応陽性物質（Ｄ−グルコサミン、純度約９５％（ｗ／ｗ））０．５重量部及び脱イオン水４０重量部を加え、７０℃に保って殺菌した。これを冷却した後、少量のバナナ香料を加えビン詰めして乳酸菌飲料を得た。
本品は、呈味、風味共に良好で、健康を維持・増進するための健康食品、疲労回復剤などとして有利に利用できる。
実施例Ｂ−４  粉末エキス
実施例Ａ−４の方法で得たエルソン−モルガン反応陽性物質含有濃縮液０．１重量部を薬用人参エキス０．５重量部、結晶性無水マルトース粉末１．５重量部及びα−グリコシル  ヘスペリジン０．５重量部とを混捏した後、ブロック化し、粉末化して粉末薬用人参エキスを得た。次いで、この粉末薬用人参エキスを適量のビタミンＢ１およびビタミンＢ２粉末と共に顆粒成型機にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスを得た。
本品は、長期間に亘って薬用人参エキスの有効成分が安定に保持された、エルソン−モルガン反応陽性物質含有薬剤として有利に利用できる。
実施例Ｂ−５  化粧用クリーム
実施例Ａ−５の方法で得たエルソン−モルガン反応陽性物質含有濃縮液０．５重量部、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、無水トレハロース１重量部、α−グリコシル  ルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部、及び精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し化粧用クリームを製造した。
本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、肌の老化防止剤、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明は、還元性糖質と尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させるか、又は還元性糖質とアンモニアとを接触させて、エルソン−モルガン反応陽性物質を生成させる新規な製造方法、当該製造方法により得られるエルソン−モルガン反応陽性物質を含有せしめる組成物の製造方法、及び還元性糖質にアミノ基を導入する方法を提供する発明である。本発明によれば、斯界に於いて有用なエルソン−モルガン反応陽性物質、及びこれを含有せしめた健康食品を含む飲食品、化粧品、医薬品、化学品等の各種組成物を工業的に安価、容易かつ安定して製造することが可能になった。とりわけ、ウレアーゼを用いるエルソン−モルガン反応陽性物質を製造する場合には、反応生成物の種類が比較的少ない上、エルソン−モルガン反応陽性物質以外の副産物の生成も少ないことから、所望のエルソン−モルガン反応陽性物質を単離し精製し易く、高品質のエルソン−モルガン反応陽性物質を工業的に容易、安価かつ安定して製造できると共に、これを含有せしめた高品質の各種組成物を工業的に容易、安価かつ安定して製造できるようになった。
本発明は、斯くも優れた産業上の有用性を具備する発明であり、斯界に与える影響には多大なものがある。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｄ−グルコースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第２図は、Ｄ−グルコースとアンモニアガスとを接触させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第３図は、Ｄ−フラクトースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第４図は、Ｄ−フラクトースとアンモニアガスとを接触させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第５図は、Ｄ−アラビノースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第６図は、Ｄ−ガラクトースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第７図は、Ｌ−ラムノースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第８図は、Ｄ−マンノースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第９図は、マルトースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第１０図は、ラクトースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させた後の溶液のＨＰＬＣチャートを示す図である。
第１１図は、Ｄ−フラクトースと尿素とを含有する溶液にウレアーゼを作用させて生成するエルソン−モルガン反応陽性物質の結晶標品の赤外線吸収スペクトルを示す図である。
第１２図は、グルコサミン標準物質の赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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