(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル混合物に、該化合物に対して立体選択的脱クロル化活性を有するエンテロバクター属に属する微生物または該微生物の産生物を作用させ、一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを残存させると共に、他方の光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成せしめる方法において、アンモニア水の存在下該微生物または該微生物の産生物を作用させることを特徴とするクロロヒドリンの光学分割法。
【請求項２】
ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル混合物に、該化合物に対して立体選択的脱クロル化活性を有するエンテロバクター属に属する微生物または該微生物の産生物を作用させ、一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを残存させると共に、他方の光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成せしめ、ついで該光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを単離する方法において、アンモニア水の存在下該微生物または該微生物の産生物を作用させることを特徴とする方法。
【請求項３】
ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル混合物に、該化合物に対して立体選択的脱クロル化活性を有するエンテロバクター属に属する微生物または該微生物の産生物を作用させ、一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを残存させると共に、他方の光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成せしめ、ついで該光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを単離する方法において、アンモニア水の存在下該微生物または該微生物の産生物を作用させることを特徴とする方法。
【請求項４】
残存する光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルがＲ体であり、生成する光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンがＳ体である請求項１−３記載のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬・農薬・生理活性物質などの光学活性化合物の合成における有用なキラルビルディングブロックおよび中間体となりうる光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル並びに光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの微生物処理による改良製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品等の光学活性化合物の中間体として有用な光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルと光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンのより簡便で、安価で、工業的に有利な製法が望まれている。
既に本発明者らは、ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルのようなクロロヒドリンに微生物菌体あるいはその菌体産生物を作用させ、立体選択的脱クロル化反応により、一方の光学活性体を該光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換し、残存するもう一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを同時に回収する方法（特開平9-47296、US Patent 5,776,766、Suzuki et al. Enzyme and Microb. Technol., 24, 13-20 (1999)）を見出している。
【０００３】
しかし、この方法では、脱クロル化反応の進行に伴って生成する塩化水素酸により、反応液中のｐＨが低下し微生物菌体あるいはその菌体産生酵素の至適ｐＨからずれるため、反応効率が劣る。そのために中和剤として、炭酸カルシウムや水酸化ナトリウムを添加し、反応を行うことも本発明者らは報告している（特開平9-47296、US Patent 5,776,766、Suzuki et al. Enzyme and Microb. Technol., 24, 13-20 (1999)）。
中和剤として炭酸カルシウムを用いる場合、立体選択性上昇に効果が得られるが、低溶解度であるため、工業的にスケールアップすることが難しい。即ち
１）正確なｐＨ調整が難しく、
２）光学活性体の回収時に、残存する炭酸カルシウムを除去しなければならず、そして
３）中和に要した塩基の添加量から基質分解量を推測し、流加反応の基質流加シグナルとして利用できない。即ち、光学分割反応は使用する微生物菌体やその産生物が基質濃度の影響を受けやすく、仕込み基質量を多くする場合は基質を逐次添加することが有効な反応法である。そこで中和に要した塩基量を基に基質添加量を決定することは有効な手段であるが、炭酸カルシウムは殆ど不溶性のため中和に要した塩基量を正確に定量することは難しく、炭酸カルシウムをアルカリ源とする場合には効果的な基質添加を行うことができず、工業的にスケールアップすることが難しい。
一方、水酸化ナトリウムは水溶性アルカリ源であり、取り扱いは比較的容易であるが、ラセミ体ブタン酸エステルを基質とするこの反応では、立体選択性が低く、反応終了液からの光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルおよび光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを回収する工程において、生成する３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度が低くなるなど実際的でないばかりか、効率的でない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の通り、ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルのようなクロロヒドリンに微生物菌体あるいはその菌体産生物を作用させ、立体選択的脱クロル化反応により、一方の光学活性体を該光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換し、同時に残存するもう一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを回収する方法を見出しているが、それらの工業生産において実際的な製法を確立するために、そしてそれらの生産性の向上並びに高光学純度のものを得るため鋭意研究した結果、立体選択的な脱クロル化反応に伴い生成する塩化水素酸によるｐＨの低下に対して、水溶性弱塩基性化合物により、その反応ｐＨを微生物あるいはその産生酵素の至適ｐＨで制御することにより、高光学純度の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルおよび３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを効率的に得る方法を見出し、本発明を完成したのである。
【０００５】
即ち、本発明はラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル混合物に、該化合物に対して立体選択的脱クロル化活性を有する微生物または該微生物の産生物を作用させ、一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを残存させると共に、他方の光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成せしめる方法において、水溶性弱塩基性化合物の存在下該微生物または該微生物の産生物を作用させることを特徴とするクロロヒドリンの光学分割法を提供することにある。
本発明はまた、ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル混合物に、該化合物に対して立体選択的脱クロル化活性を有する微生物または該微生物の産生物を作用させ、一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを残存させると共に、他方の光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成せしめ、ついで該光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを単離する方法において、水溶性弱塩基性化合物の存在下該微生物または該微生物の産生物を作用させること特徴とする方法、
並びに、ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル混合物に、該化合物に対して立体選択的脱クロル化活性を有する微生物または該産生物を作用させ、一方の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルを残存させると共に、他方の光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成せしめ、ついで該光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを単離する方法において、水溶性弱塩基性化合物の存在下該微生物または該微生物の産生物を作用させること特徴とする方法に関する。
【０００６】
【発明の具体的説明】
本発明で用いられる水溶性弱塩基性化合物としては、アンモニア水、炭酸アンモニウム塩、炭酸水素アンモニウム塩、炭酸アルカリ金属塩または炭酸水素アルカリ金属塩が挙げられ、具体的には、アンモニア水の他、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムの水溶液を挙げることができる。好ましい水溶性弱塩基性化合物としてはアンモニア水、炭酸アンモニウム塩、炭酸水素アンモニウム塩、またはそれらの水溶液が挙げられる。
本発明に使用される微生物は、４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルに対して、立体選択的な脱ハロゲン化反応を触媒する酵素を産生する菌株であれば特に制限されず、例えばエンテロバクター属(Enterobacter)に属する微生物、 キトロバクター属(Citobacter)に属する微生物、バシラス属(Bacillus)に属する微生物が例示される。
基質に対しエンテロバクター属(Enterobacter)に属する微生物または キトロバクター属(Citobacter)に属する微生物を作用させると、Ｒ体の４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルが残存し、Ｓ体の３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンが生成する。
一方、バシラス属(Bacillus)に属する微生物を作用させると、Ｓ体の４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルが残存し、Ｒ体の光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンが生成する。
【０００７】
具体的には、本発明者らにより土壌から分離されたEnterobacter sp DS-S-75株、Citrobacter freundii DS-S-13株、Citrobacter freundii DS-K-40株、Bacillus sphaericus DS-ID-819株を挙げることができる。これらの微生物は、既に特許生物寄託センターに寄託番号 (FERM BP-5494：寄託日1996．3.12)、寄託番号 (FERM BP-5492：寄託日1996．3.12)、寄託番号 (FERM BP-5493：寄託日1996．3.12)、寄託番号 (FERM BP-5495：寄託日1996．3.12)としてそれぞれ寄託されている。
【０００８】
上記微生物を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育する培地ならば特に制限されない。例えば炭素源としてグリセロール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール等のアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸等の有機酸またはそれらの塩類、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース等の炭水化物またはそれらの混合物を、窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩，マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩等、更に必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨを５〜９、好ましくは６．５〜７．０、培養温度は２０〜４０ｏＣ、好ましくは２５〜３７ｏＣの範囲で好気的に１０〜９６時間行なうことが好ましい。
【０００９】
ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステル化合物に微生物またはその微生物の産生物を作用させて光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルおよび光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを得るには、本発明に係る微生物を
１）上記培養方法により得た微生物の培養液、
２）１）の培養液から遠心分離もしくは膜分離により得た菌体あるいはその菌体処理物（菌体破砕物あるいは菌体抽出液）、または
３）２）を常法により固定化したものとし、緩衝液に混合した微生物菌体混合液に、
基質を添加する方法がある。
反応温度は１５〜５０ｏＣが好ましく、そして反応ｐＨはｐＨ６〜９が好ましいが、使用する基質の安定なｐＨや、使用する微生物酵素の至適ｐＨの範囲で行なうと更に効果的である。反応液中の基質濃度は０．１〜２０％（ｖ／ｖ）が好ましく、基質は初期に一括して加えてもよいし、分割添加してもよい。分割添加する場合に中和に要した塩基の量を指標として、最適添加基質量を計算し、分解活性に応じて基質を添加してもよい。
反応は通常、撹拌あるいは振盪しながら行い、反応時間は基質濃度、反応に供する微生物量あるいはその産生物量等により異なるが２４〜１２０時間で終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィー等の分析により残存基質量が初期基質濃度に比して５０％で反応を終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィー等の分析により、生成あるいは残存する光学活性体の光学純度を測定し終点を決定するのがよく、その生成物あるいは残存物の光学純度が最大になった時を終点とする。
反応中に立体選択的な脱クロル化反応に伴い生成する塩化水素酸によるｐＨの低下に対して、水溶性弱塩基性化合物水溶液、またはアンモニア水溶液により、その反応ｐＨを微生物あるいはその酵素の至適ｐＨで制御することによる高光学純度の光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルと３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを効果的に得ることができる。
【００１０】
このようにして反応させ、反応液中に残存する光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルと３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを一般的な方法で単離・精製できる。
例えば菌の培養液または菌体を用いた場合には、反応液から菌体を遠心分離で除いた後、上清をエバポレーターにより濃縮し、酢酸エチル等の溶媒で抽出する。抽出液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去し光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルと光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの粗シロップを得ることができる。これを蒸留やシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより分離精製してもよい。
以下実施例をもって、本発明を詳細に説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り（Ｗ／Ｖ）を表す。
【実施例】
【００１１】
実施例１
ペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％含む栄養培地（ｐＨ７．２）３．０Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンター（培養器）を１２１℃で１５分間滅菌した。予め供試菌であるEnterobacter sp. DS-S-75株をペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％含む栄養培地１００ｍｌ（ｐＨ７．２）で３０℃で、１６時間振盪培養して種菌を調製し、上記培地に２％（ｖ／ｖ）量（６０ｍｌ）無菌的に接種した。そして温度３０℃で、通気量１．０Ｌ／ｍｉｎ、回転数５００ｒｐｍの条件で約２４時間、通気攪拌培養を行なった。
培養終了後、培養液を取り出し遠心分離にて集菌し、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、湿重量１００ｇの休止菌体を調製した。その休止菌体５０ｇを上記同緩衝液２５００ｍｌを入れた同５Ｌ容のジャーファーメンターに懸濁し（９．５ ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度））、２００ｇのラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルを加え、３０℃で攪拌しながら２０時間光学分割反応を行った。このとき立体選択的な脱クロル化反応の進行に伴い生成する塩化水素酸により低下するｐＨは、７％アンモニア水溶液により中和を行い、ｐＨ６．７に制御した。
その時の反応液中に残存する４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステル並びに生成する３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをガスクロマトグラフィー（カラム担体：ＰＥＧ２０Ｍ，６０−８０メッシュ）で分析した結果、その残存率は４８％であった。また、生成した３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの変換率は４８％であった。
【００１２】
反応終了後、菌体を除去し、約１６０ｍｌまで濃縮し、等量の酢酸エチルで抽出した。無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下溶媒を除去し、９６ｇの４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルと６４ｇの３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの混合物を得た。
これらの物質の同定および定量は同ガスクロマトグラフィーにより行ない、リテンションタイムより確認した（公開特許公報  特開平９−４７２９６参照）。このシロップ中の４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルをアステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（０．２５ｍｍ  ｘ  ３０ｍ）を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。一方、３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは無水トリフルオロ酢酸によりトリフルオロアセチル化した後、上記ガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行った（公開特許公報  特開平９−４７２９６参照）。その結果、回収した４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルは光学純度１００％ｅｅのＲ体であることが判明した。また、回収した３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは光学純度９５．１％ｅｅのＳ体であることが判明した。このときの立体選択性を示す値であるＥ値は３００であった。
【００１３】
対照として中和に用いる塩基を２５％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム（比較例１）および炭酸カルシウム（比較例２）で行った場合と比較した。２０時間後の光学純度並びにＥ値を表１に示す。
Ｅ値は以下の式により算出した。
Ｅ値=ｌｎ［１−Ｃ（１+ｅｅｐ）]／ｌｎ［１−Ｃ（１−ｅｅｐ）］
Ｃ：生成物の変換率
ｅｅｐ：生成物の光学純度
【００１４】
実施例２−６
脱クロル化反応に伴い生成する塩化水素酸を中和する塩基を代えた以外は実施例１と同様の方法で行った。その結果を実施例１、比較例２の値と共に表１に示す。
【表１】
0004061862.tif 000002
【００１５】
実施例７−１２
基質をラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルからラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルに変え、そして中和に要する塩基を表２に示す化合物に代えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行なった。なお、比較例３についても同様にして行なった。
【表２】
0004061862.tif 000003
【００１６】
実施例１３−１５
使用する微生物をエンテロバクター属細菌（Enterobacter sp. DS-S-75株）からキトロバクター属細菌（Citrobacter freundii DS-S-13株あるいはCitrobacter freundii DS-K-40株）、バシラス属細菌（Bacillus sphaericus DS-ID-819株）に変更し、基質として４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを使用した以外は実施例１と同様の方法で行った。なお、使用した休止菌体は５０ｇとした。なお、比較例４−６についても同様にして行なった。
【００１７】
使用菌株Citrobacter freundii DS-S-13株
【表３】
0004061862.tif 000004
【００１８】
使用菌株Citrobacter freundii DS-K-40株
【表４】
0004061862.tif 000005
【００１９】
使用菌株Bacillus sphaericus DS-ID-819株
【表５】
0004061862.tif 000006
【００２０】
実施例１６
ペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％含む栄養培地（ｐＨ７．２）２．５Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンター（培養器）を１２１℃で１５分間滅菌した。予め供試菌であるEnterobacter sp. DS-S-75株をペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％含む１００ｍｌの栄養培地（ｐＨ７．２）で３０℃で、１６時間振盪培養して種菌を調製し、上記培地に２％（ｖ／ｖ）量（５０ｍｌ）を無菌的に接種した。そして温度３０℃で、通気量１．０Ｌ／ｍｉｎ、回転数５００ｒｐｍの条件で約２４時間、通気攪拌培養を行なった。
培養終了後、培養液中の微生物濃度は約１５ ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度：湿重量約７５ｇの休止菌体に相当）、培養液のｐＨは６．２であった。ついで反応液にｐＨ電極とｐＨコントローラーを装着し、中和用塩基源として１５％アンモニア水溶液を用い、ｐＨ６．７に制御し、また反応温度は３０℃に制御した。
【００２１】
その反応液に２％量（５０ｇ）のラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルを添加し、光学分割反応を開始した。反応が進むにつれて遊離する塩酸を１５％アンモニア水で中和し、中和に要したアンモニア水を天秤で定量し、その定量値を基に添加流加するラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルの量を決定した。その値を次式により求めた。
一定時間内に流加添加するラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステル（モル数）＝（一定時間内に中和に要した１５％アンモニア量（ｇ）ｘ ０．１５）／１７ｘファクター値
：なお今回のファクター値は４．５で行い、この場合流加添加反応中の残存４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルの光学純度は約７０％ｅｅ（Ｒ体）であった。
最終的に流加添加したラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルは３００ｇであった。約２４時間で反応を終了し、その時の残存Ｒ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルの光学純度は１００％ｅｅであった。一方、生成したＳ体３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度は９５．３％ｅｅであった。得られた反応液からの光学活性体の回収は実施例１と同様の方法で行い、１４１ｇのＲ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルと９５ｇのＳ体３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの混合シロップを得た。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によればエンテロバクター属に属する微生物（Enterobacter sp. DS-S-75株）、キトロバクター属に属する微生物（ Citrobacter freundii DS-S-13株あるいはCitrobacter freundii DS-K-40株）、バシラス属に属する微生物（Bacillus sphaericus DS-ID-819株）を利用した脱クロル化反応によるラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの光学分割反応において、その中和反応において水溶性弱塩基性化合物を用いることにより、高光学純度のＲ体あるいはＳ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸アルキルエステルとより光学純度の高いＳ体あるいはＲ体３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを効果的に同時に生産することができる。