(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0004197750.tif 000025
（式中、Ｒ１およびＲ２のうち一方は水素を示し、他方は式（２）
【化２】
0004197750.tif 000026
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の製造方法であって、一般式（３）
【化３】
0004197750.tif 000027
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ３およびＲ４のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【化４】
0004197750.tif 000028
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖の１−ヒドロキシ誘導体と、３−クロロ−４−フルオロニトロベンゼンとを、誘電率１５以上、双極子モーメント２．５Ｄ以上の非プロトン性極性溶媒を反応溶媒として、有機塩基の存在下に反応させる工程、および該工程で得られる一般式（５）
【化５】
0004197750.tif 000029
（式中、Ａｃ、Ｒ３、Ｒ４およびｎは前記と同じである。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖のグリコシド誘導体より、アセチル基を脱離させる工程を含む方法。
【請求項２】
一般式（５）
【化６】
0004197750.tif 000030
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ3 およびＲ4 のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【化７】
0004197750.tif 000031
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖のグリコシド誘導体よりアセチル基を脱離させる工程において、低級アルコールを含有する溶媒中で、アンモニア、アルカリ金属アルコキシドおよびアルカリ金属水酸化物から選ばれた一種ないし二種以上のアルカリの存在下で部分的に脱アセチル化し、次いでプロトン酸の存在下で完全に脱アセチル化することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はα−アミラーゼの活性測定用基質として有用なマルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
膵液や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断が行われている。α−アミラーゼの活性測定法として広く用いられる方法の一つとしてマルトオリゴ糖の還元性末端にｐ−ニトロフェノールなどの発色する化合物残基をアグリコンとして結合させた基質を用いる方法がある。例えば、特開昭５４−５１８９２号公報に記載のあるｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドを基質に用いる方法、特公昭５７−５３０７９号公報に記載のあるｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドまたはｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシドを基質に用いる方法などである。これらはα−アミラーゼ含有試料に上記基質とα−グルコシダーゼとを作用させて基質から遊離したアグリコンを光学的に測定することにより、α−アミラーゼの活性値を求める方法であり、α−グルコシダーゼが三糖以下のオリゴ糖には作用し易く四糖以上のオリゴ糖には作用しにくい性質を利用したものである。
【０００３】
しかし、この方法ではα−グルコシダーゼがわずかながら基質に直接作用するためブランク値が上昇する欠点がある。
【０００４】
このような欠点を解消するためマルトオリゴ糖の非還元性末端のグルコースを化学修飾したタイプの基質を用いる方法が提案されている。例えば、非還元性末端のグルコースの６位の水酸基を例えばハロゲン原子、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＳＯ2 Ｒ、−ＮＨＲ（Ｒはアルキル基、フェニル基、ピリジル基など）で置換し、還元性末端のグルコースに置換または未置換のフェニル基がアグリコンとして結合したもの（特開昭６０−２３７９９８号公報）、非還元性末端のグルコースの４位、および６位の水酸基をアルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換し還元性末端のグルコースにアグリコンを結合させたもの（特開昭６０−５４３９５号公報）、さらに３−ケトブチリデン基、２−ケトブチリデン基、２−ケトプロピリデン基、４−ケトペンチリデン基、メチルスルフィニルエチリデン基、エチルスルフィニルエチリデン基、メタンスルホニルエチリデン基、エタンスルホニルエチリデン基のような水溶性の高い修飾基を非還元性末端グルコースに導入した基質（特開平１−１５７９９６号公報参照）などがある。
【０００５】
これらの基質のように、非還元性末端グルコースを化学修飾するとα−グルコシダーゼによる分解は起こらない。しかし、澱分やアミロース等のグルコース鎖を認識してその結合を切断するというα−アミラーゼ本来の作用様式を純粋に反映していない欠点がある。
【０００６】
そこで、マルトオリゴ糖の非還元性末端のグルコースの４位もしくは６位にガラクトース残基をβ結合させた基質を用いる方法が提案されている（特開平３−２６４５９６号公報）。しかし、この中に示されている基質の製造法は、原料として不安定なｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドを用いて、β−ガラクトシダーゼにより原料の非還元性末端にガラクトースを導入する方法のため、収率が悪く、また未反応のｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドと生成物であるｐ−ニトロフェニル４−Ｏ−β−ガラクトピラノシルα−マルトペンタオシドの極性が似ているため、分離が困難である。
【０００７】
また、ｐ−ニトロフェノールは、α−アミラーゼの活性測定領域ｐＨ７．０付近で発色能が悪く、僅かなｐＨ変動や温度上昇、塩化ナトリウム濃度上昇、アルブミン濃度上昇でも最大モル吸光係数が大きく変化する欠点を有する。そこで、アグリコンとして２−クロロ−４−ニトロフェノールを用いるとより高い性能を得られるが、従来の製造法ではｐ−ニトロフェノールの場合と異なりα結合でのグリコシド化が難しく、ほとんどβ結合の化合物が得られる。したがって、臨床検査薬としてこれらの基質を測定に用いる場合、共存酵素としてβ−グルコシダーゼを加える必要が生じる。
【０００８】
よって、あらかじめその非還元性末端グルコースの４位もしくは６位にガラクトース残基がβ結合したマルトオリゴ糖にアグリコンとして２−クロロ−４−ニトロフェノールをα結合で収率よく直接導入する製造法が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、α−アミラーゼ活性測定等に用いられる一般式（１）
【００１０】
【化８】
0004197750.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のうち一方は水素を示し、他方は式（２）
【００１２】
【化９】
0004197750.tif 000003
【００１３】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表される基質を収率よく簡単な操作により得る方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究に努力した結果、あらかじめその非還元性末端グルコースの４位もしくは６位にガラクトースをβ結合させたマルトオリゴ糖誘導体の還元性末端に、アグリコンとして２−クロロ−４−ニトロフェノールをα結合で収率よく簡単な操作により導入する方法を見いだした。
【００１５】
すなわち、本発明は、
１：  一般式（１）
【００１６】
【化１０】
0004197750.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のうち一方は水素を示し、他方は式（２）
【００１８】
【化１１】
0004197750.tif 000005
【００１９】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の製造方法において、
一般式（３）
【００２０】
【化１２】
0004197750.tif 000006
【００２１】
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ3 およびＲ4 のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【００２２】
【化１３】
0004197750.tif 000007
【００２３】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖の１−ヒドロキシ誘導体と、３−クロロ−４−フルオロニトロベンゼンとを、有機塩基の存在下に反応させる工程、および該工程で得られる一般式（５）
【００２４】
【化１４】
0004197750.tif 000008
【００２５】
（式中、Ａｃ、Ｒ3 、Ｒ4 およびｎは前記と同じである。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖のグリコシド誘導体より、アセチル基を脱離させる工程を含むことを特徴とする一般式（１）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
【００２６】
２：  一般式（３）
【００２７】
【化１５】
0004197750.tif 000009
【００２８】
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ3 およびＲ4 のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【００２９】
【化１６】
0004197750.tif 000010
【００３０】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖の１−ヒドロキシ誘導体と、３−クロロ−４−フルオロニトロベンゼンとを、有機塩基の存在下に反応させる工程において、反応溶媒として非プロトン性極性溶媒を用いることを特徴とする上記１の製造方法。
【００３１】
３：  一般式（５）
【００３２】
【化１７】
0004197750.tif 000011
【００３３】
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ3 およびＲ4 のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【００３４】
【化１８】
0004197750.tif 000012
【００３５】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖のグリコシド誘導体よりアセチル基を脱離させる工程において、低級アルコールを含有する溶媒中で、アンモニア、アルカリ金属アルコキシドおよびアルカリ金属水酸化物から選ばれた一種ないし二種以上のアルカリの存在下で部分的に脱アセチル化し、次いでプロトン酸の存在下で完全に脱アセチル化することを特徴とする上記１の製造方法。
【００３６】
本発明の製造方法において、Ｒ1 が水素、Ｒ2 がβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基である一般式（１）のマルトオリゴ糖誘導体は、対応するＲ3 がアセチル基、Ｒ4 が２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基である一般式（３）の誘導体から製造される。同様に、Ｒ1 がβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基、Ｒ2 が水素である（１）のマルトオリゴ糖誘導体は、対応するＲ3 が２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基、Ｒ4 がアセチル基である一般式（３）の誘導体から製造される。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明のマルトオリゴ糖誘導体の製造方法に使用される原料（以下、単に、原料糖誘導体という）は、一般式（３）
【００３８】
【化１９】
0004197750.tif 000013
【００３９】
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ3 およびＲ4 のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【００４０】
【化２０】
0004197750.tif 000014
【００４１】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖の１−ヒドロキシ誘導体である。この原料糖誘導体は対応する一般式（６）
【００４２】
【化２１】
0004197750.tif 000015
【００４３】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のうち一方は水素を示し、他方は式（２）
【００４４】
【化２２】
0004197750.tif 000016
【００４５】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体をアセチル化し、その還元末端グルコースの１位のアセチル基のみをハロゲンで置換した一般式（７）
【００４６】
【化２３】
0004197750.tif 000017
【００４７】
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｘはハロゲン原子、Ｒ3 およびＲ4 のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【００４８】
【化２４】
0004197750.tif 000018
【００４９】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表される糖誘導体を、含水アセトンを溶媒とし、炭酸銀を加えて反応させることにより得られる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．，第１巻（１９６２年）３７２〜３７３頁、またはＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第６６巻（１９４４年）３４９〜３５０頁参照）。
【００５０】
この原料糖誘導体と、３−クロロ−４−フルオロニトロベンゼンとを、縮合させる際に用いられる有機塩基としては、ピリジン、トリエチルアミン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの第三級アミンが用いられ、中でも１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの環状ジアミンが特に好ましい。また、反応溶媒として用いられる非プロトン性極性溶媒は、例えば溶剤ハンドブック（浅原照三ほか編、講談社発行）２５頁に記載されているように誘電率１５以上、双極子モーメント２．５Ｄ以上のものが好適に使用される。例えばジメチルスルホキシド、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル尿素、２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、スルホラン、ヘキサメチル燐酸トリアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、ベンゾニトリル、α−トルニトリル（シアン化ベンジル）、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、ブチルメチルケトン、メシチルオキシド、シクロヘキサノン、アセトフェノンなどが挙げられるが、特にジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、スルホラン、ヘキサメチル燐酸トリアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンが望ましい。
【００５１】
また、原料糖誘導体１モルに対する３−クロロ−４−フルオロニトロベンゼンおよび有機塩基の使用量はそれぞれ１〜１．５モル程度で十分である。非プロトン性極性溶媒の使用量については、反応物の攪拌性や経済性を考慮して決めれば良い。反応温度に厳しい制限はないが、好ましくは０〜５０℃である。反応は０．５〜２４時間で完結する。フェニルグリコシド結合の生成は、理論量の９０％前後であり、α−グリコシドとβ−グリコシドの生成比は非プロトン性極性溶媒の種類により異なるが、およそ８５：１５程度である。反応終了後、反応物をトルエン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エーテル等の有機溶剤で希釈した後、希酸、希アルカリ、および水で有機層を洗浄し、溶剤を留去すると一般式（５）
【００５２】
【化２５】
0004197750.tif 000019
【００５３】
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ3 およびＲ4 のうち一方はアセチル基を示し、他方は式（４）
【００５４】
【化２６】
0004197750.tif 000020
【００５５】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表される、ガラクトシルマルトオリゴ糖の全ての水酸基がアセチル基により保護されたグリコシド誘導体（以下、単に、グリコシド誘導体という）が得られる。
【００５６】
このグリコシド誘導体よりアセチル基を脱離させる際に用いられる低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられるが特にメタノール、エタノールが好ましい。これらの低級アルコールは単独で用いても良いが、出発原料の溶解性や生成物質の析出性等を考慮に入れ、水や他の有機溶媒、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トルエン、テトラヒドロフラン等との混合溶媒として用いても良い。
【００５７】
アルカリ触媒として用いられるアンモニアは、濃アンモニア水でもよいが無水のアンモニアがより好ましい。アルカリ金属アルコキシドとしてはナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド等が挙げられる。アルカリ金属水酸化物としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられる。これらのアルカリ触媒の最適使用量はグリコシド誘導体の種類により異なるが、グリコシド誘導体１モルに対し０．０１〜１００モル、より好ましくは０．１〜１０モル程度である。アルカリ存在下での脱アセチル化反応は室温以下で実施するのが望ましい。反応の終点は例えば薄層クロマトグラフィー等の手段により原料のスポットが消失したことを確かめれば良い。アルカリ存在下での反応が終了した後、生成した部分脱アセチル化物を単離しても良いが、工業的には通常その必要はない。
【００５８】
アルカリ存在下での反応が終了したら反応物にプロトン酸を加えアルカリを中和し、さらに所定量のプロトン酸を添加して反応を続ければ良い。中和後、さらに添加するプロトン酸の量はグリコシド誘導体のアセチル基１モルに対し、０．１〜１００当量、好ましくは０．５〜５０当量である。反応温度は５０℃以下が望ましい。
【００５９】
プロトン酸としては、塩酸、硫酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、リン酸、次亜リン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸などが挙げられる。特に硫酸、塩酸が好ましい。
【００６０】
反応の終点を薄層クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー等で確認した後、反応液をアンモニア、重曹、酢酸ソーダ等のアルカリで中和し、析出した塩類を除去し、溶媒を留去すると一般式（１）
【００６１】
【化２７】
0004197750.tif 000021
【００６２】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のうち一方は水素を示し、他方は式（２）
【００６３】
【化２８】
0004197750.tif 000022
【００６４】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の粗生成物が得られる。再結晶やカラムクロマトグラフィー等の公知の手段によってさらに精製すれば高純度の目的物が得られる。以下、実施例を挙げさらに具体的に説明する。
【００６５】
【実施例】
実施例１
ａ．  Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−１，２，３，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノース（以下、Ｇａｌ−Ｇ４（１７Ａｃ）と略す。）の合成
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−トリス［Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−Ｄ−グルコピラノース１０ｇおよび無水酢酸ナトリウム３．１ｇを無水酢酸４０ｍｌに懸濁し、１３５℃で２時間加熱した。反応終了後、トルエン６０ｍｌを加え数回水洗した後、溶剤を減圧で留去することにより、標記化合物を白色粉末１８．６ｇとして得た（収率９９．９％）。
【００６６】
ｂ．  Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース（以下、Ｇａｌ−Ｇ４（１６Ａｃ）ＯＨと略す。）の合成Ｇａｌ−Ｇ４（１７Ａｃ）１８．６ｇをジクロロメタン２００ｍｌに溶解し、０℃に冷却後、臭化アルミニウム３．２ｇを加え、２時間攪拌する。反応終了後、数回水洗した後、溶剤を減圧で留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；トルエン／酢酸エチル＝１／２）により精製することにより、標記化合物を白色粉末１１．４ｇとして得た（収率６３．０％）。
【００６７】
ｃ．  ２−クロロ−４−ニトロフェニル  Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下、Ｇａｌ−Ｇ４（１６Ａｃ）αＣＮＰと略す。）の合成
Ｇａｌ−Ｇ４（１６Ａｃ）ＯＨ１１．４ｇおよび３−クロロ−４−フルオロニトロベンゼン２．１ｇをジメチルスルホキシド２３ｍｌに溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン１．８ｇを加え、室温で一晩攪拌した。反応終了後、トルエン２００ｍｌ、酢酸エチル５０ｍｌを加え、数回水洗した。高速液体クロマトグラフィー分析により求めたこの反応混合物のα：β比は８２：１８であった。その後、溶剤を減圧で留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；トルエン／酢酸エチル＝１／１）により精製することにより、標記化合物を淡黄色粉末８．５ｇとして得た（収率６７．４％）。
【００６８】
ｄ．  ２−クロロ−４−ニトロフェニル  Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−トリス［Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）］−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成
Ｇａｌ−Ｇ４（１６Ａｃ）αＣＮＰ８．５ｇにメタノール１７０ｍｌ、２５％アンモニア水２．２ｍｌを加え、氷冷下で８時間攪拌した。次いで３５％硫酸−メタノール溶液３３．２ｍｌを加え室温で一晩攪拌した。反応終了後、２５％アンモニア水で中和し、析出した硫酸アンモニウムを濾過により除去した。濾液を減圧濃縮し、残渣をＯ．Ｄ．Ｓ．カラムクロマトグラフィー（溶出液；１０％アセトニトリル水）により精製することにより、標記化合物を淡黄色粉末３．０ｇとして得た（収率５９．４％）。
【００６９】
実施例２
ａ．  ２−クロロ−４−ニトロフェニル  Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下、Ｇａｌ−Ｇ２（１０Ａｃ）αＣＮＰと略す。）の合成
実施例１のａ、ｂと同様の方法によって得られるＯ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノース（以下、Ｇａｌ−Ｇ２（１０Ａｃ）ＯＨともいう。）１２．９ｇおよび３−クロロ−４−フルオロニトロベンゼン３．７ｇをジメチルスルホキシド２０ｍｌに溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン３．２ｇを加え、室温で数分攪拌した後、一晩放置した。高速液体クロマトグラフィー分析により求めたこの反応混合物のα：β比は８２：１８であった。反応終了後、反応混合物をジクロロメタン２００ｍｌに溶解し、数回水洗した後、溶剤を減圧で留去し、残渣を酢酸エチルを用いて再結晶することにより、標記化合物を白色粉末７．５ｇとして得た。（収率４９．８％、ｍ．ｐ．２２７℃）
【００７０】
ｂ．  ２−クロロ−４−ニトロフェニル  Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成
Ｇａｌ−Ｇ２（１０Ａｃ）αＣＮＰ７．５ｇをメタノール１５０ｍｌとクロロホルム６０ｍｌの混合溶媒に懸濁し、アンモニア水１．９ｍｌを加え、氷冷下一晩攪拌した。次いで、３６％塩酸１７．２ｍｌを加え４０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、２５％アンモニア水で中和し、析出した塩化アンモニウムを濾過により除去した。濾液を濃縮し、残渣をＯ．Ｄ．Ｓ．カラムクロマトグラフィー（溶出液；１５％アセトニトリル水）により精製することにより、標記化合物を淡黄色粉末３．０ｇとして得た（収率６５．５％）。
質量分析：６６０（Ｍ＋Ｈ）（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ、４００ＭＨｚ、図１）、13Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ、４００ＭＨｚ、図２）、ＩＲ（ＫＢｒ、図３）により標記化合物と同定した。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によると、α−アミラーゼの活性測定用基質として有用な一般式（１）
【００７２】
【化２９】
0004197750.tif 000023
【００７３】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のうち一方は水素を示し、他方は式（２）
【００７４】
【化３０】
0004197750.tif 000024
【００７５】
を示し、ｎは０または１〜７の整数を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法が提供される。本発明の製造方法によれば、あらかじめ非還元性末端グルコースの４位もしくは６位にガラクトース残基がβ結合したマルトオリゴ糖の還元性末端に、２−クロロ−４−ニトロフェニル基をα−結合で収率よく直接導入することができる。また本発明の製造方法は、生成物と未反応原料との分離が容易である。従って、一般式（１）のマルトオリゴ糖誘導体を容易に且つ高収率で得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシドの 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図２】実施例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図３】実施例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシドの赤外線吸収スペクトル図（ＩＲチャート）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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