(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取する、Ｌ−システインの製造法であって、前記エシェリヒア属細菌が、Ｌ−システイン生産能を有し、Ｌ−システインによるフィードバック阻害に非感受性のセリンアセチルトランスフェラーゼを保持し、かつ、シスタチオニン−β−リアーゼ活性及びトリプトファナーゼ活性が低下又は欠失するように改変されたエシェリヒア属細菌であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記エシェリヒア属細菌は、シスタチオニン−β−リアーゼをコードする遺伝子及びトリプトファナーゼをコードする遺伝子が破壊されたエシェリヒア属細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エシェリヒア属細菌はエシェリヒア・コリである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
エシェリヒア属細菌のシスタチオニン−β−リアーゼ活性もしくはトリプトファナーゼ活性、又はこれらの両方の活性を低下又は消失させ、さらにＬ−システインによるフィードバック阻害に非感受性のセリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることによって、同細菌のＬ−システイン生産能を高めることを特徴とする、エシェリヒア属細菌のＬ−システイン生産菌の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−システインの製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な微生物、及びそれを用いたＬ−システインの製造法に関する。Ｌ−システイン及びＬ−システインの誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。
【０００３】
さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。例えば、本発明者らは、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」ともいう）を保持するエシェリヒア属細菌を用いたＬ−システインの製造法を開示している（特許文献１）。Ｌ−システイン分解系を抑制する手段としては、細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ（以下、「CD」ともいう）活性を低下させることが開示されている。同様に、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された特定の変異を有するSATをコードするＤＮＡ配列により脱制御されたシステイン物質代謝を有する微生物を用いた、Ｌ−システインの製造法が知られている（特許文献２）。
【０００４】
また、非特許文献１には、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のSATアイソザイムをコードする遺伝子を導入したエシェリヒア・コリを用いたＬ−システインの製造法が開示されている。
【０００５】
一方、抗生物質又は微生物に毒性の物質を細胞から直接放出するために好適である蛋白質をコードする遺伝子を過剰発現する微生物を用いたＬ−システインの製造法が報告されている（特許文献３）。
【０００６】
上記のように、SAT等のＬ−システイン生合成酵素の活性の増強、及び、Ｌ−システイン排出系を改変したＬ−システイン生産菌に関し、多くの研究がなされている。それに対し、Ｌ−システイン分解系については、特にエシェリヒア属細菌においては、詳細な検討がなされていない。
【０００７】
エシェリヒア・コリにおいて多少なりともCD活性をもつ酵素として、シスタチオニン−β−リアーゼ（metC産物。以下、「CBL」ともいう）（非特許文献２）、及びトリプトファナーゼ（tnaA産物。以下、「TNase」ともいう）（非特許文献３）が報告されている。しかし、CBLはシスタチオニンをホモシステインに変換する反応を、TNaseはトリプトファンを分解する反応をそれぞれ触媒する酵素であるとされており、実質的にＬ−システイン分解系を担う酵素であるか否かについては知られていなかった。また、特許文献１には、CD活性が低下した変異株が記載されているが、CD活性を担う酵素の本体に関しては報告されていない。
【０００８】
【特許文献１】
特開平11-155571号
【特許文献２】
特表2000-504926号
【特許文献３】
特開平11-56381号
【非特許文献１】
FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459
【非特許文献２】
Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069
【非特許文献３】
Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、CD活性を担う酵素及びその遺伝子を明らかにし、同遺伝子をＬ−システイン生産菌の育種に利用し、新たなＬ−システインの製造法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、CBL及びTNaseがエシェリヒア・コリの主要なCD活性を担う酵素であることを見出し、これらの酵素活性を低下又は消失させることにより、Ｌ−システイン生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１１】
（１）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下又は欠失するように改変されたエシェリヒア属細菌。
（２）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、シスシスタチオニン−β−リアーゼ活性及びトリプトファナーゼ活性が低下又は欠失するように改変されたエシェリヒア属細菌。
（３）シスタチオニン−β−リアーゼをコードする遺伝子が破壊された(1)のエシェリヒア属細菌。
（４）シスシスタチオニン−β−リアーゼをコードする遺伝子及びトリプトファナーゼをコードする遺伝子が破壊された(2)のエシェリヒア属細菌。
（５）さらにＬ−システイン生合成系酵素活性が増強されるように改変された(1)〜(4)のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（６）セリンアセチルトランスフェラーゼが増強されるように改変された(5)のエシェリヒア属細菌。
（７）Ｌ−システインによるフィードバック阻害に非感受性のセリンアセチルトランスフェラーゼを保持する(6)のエシェリヒア属細菌。
（８）エシェリヒア・コリである(1)〜(7)のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（９）(1)〜(8)のいずれかのエシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取する、Ｌ−システインの製造法。
（１０）エシェリヒア属細菌のシスシスタチオニン−β−リアーゼ活性もしくはトリプトファナーゼ活性、又はこれらの両方の活性を低下又は消失させることによって、同細菌のＬ−システイン生産能を高めることを特徴とする、Ｌ−システイン生産菌の製造方法。
【００１２】
本発明においてＬ−システイン生産能とは、本発明のエシェリヒア属細菌を培地に培養したときに、培地から回収することができる量のＬ−システインを培地中に蓄積する能力をいう。また、「Ｌ−システインによるフィードバック阻害に非感受性」とは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減又は解除された場合に加えて、元来フィードバック阻害を受けない場合を含む。
尚、本発明においてＬ−システインとは、特記しない限り、還元型Ｌ−システインもしくはＬ−シスチンまたはこれらの混合物を指す。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のエシェリヒア属細菌の第一の形態は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、CBL活性が低下又は欠失するように改変されたエシェリヒア属細菌である。本発明のエシェリヒア属細菌の第二の形態は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、CBL活性及びTNase活性が低下又は欠失するように改変されたエシェリヒア属細菌である。また、本発明のエシェリヒア属細菌は、前記第一の形態又は第二の形態において、さらにＬ−システイン生合成系酵素活性が増強されるように改変されたエシェリヒア属細菌である。このようなエシェリヒア属細菌は、CBL活性、又はCBL活性及びTNase活性が低下又は欠失したエシェリヒア属細菌において、Ｌ−システイン生合成系酵素活性を増強することによって得られる。また、Ｌ−システイン生合成系酵素活性を増強したエシェリヒア属細菌において、CBL活性、又はCBL活性及びTNase活性を低下又は欠失させることによっても、本発明のエシェリヒア属細菌を取得することができる。
【００１４】
＜１＞CBL活性又はTNase活性の低下又は消失
エシェリヒア属細菌のCBL活性又はTNase活性を低下又は消失させるには、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、CBL活性又はTNase活性が低下した変異株を選択する方法が挙げられる。また、CBL活性又はTNase活性が低下したエシェリヒア属細菌は、変異処理の他に、遺伝子破壊によっても取得することができる。CBL活性又はTNase活性を確実に低下又は消失させるためには、遺伝子破壊による方法が好ましい。エシェリヒア・コリでは、CBLはmetC遺伝子、TNaseはtnaA遺伝子によってそれぞれコードされている。
【００１５】
エシェリヒア・コリのmetC遺伝子（GenBank accession M12858、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 867-871 (1986)）及びtnaA遺伝子（GenBank accession K00032、J. Bacteriol. 147, 787-796 (1981)、J. Bacteriol. 151, 942-951 (1982)）の塩基配列は報告されており、それぞれの配列の基づいて合成したプライマーを用い、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡを鋳型とするPCR（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、各々の遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することができる。また、CBLをコードする遺伝子の内部を欠失し、正常に機能するCBLを産生しないように改変したmetC遺伝子（欠失型metC遺伝子）、及びTNaseをコードする遺伝子の内部を欠失し、正常に機能するTNaseを産生しないように改変したtnaA遺伝子（欠失型tnaA遺伝子）は、実施例に示したプライマーを用いたPCRにより取得することができる。
参考として、metC遺伝子の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を、配列番号１０及び１１に示す。また、tnaA遺伝子の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を、配列番号１２及び１３に示す。
【００１６】
以下に、CBLをコードする遺伝子を破壊する方法を説明するが、同様にしてTNaseをコードする遺伝子を破壊することができる。
CBLをコードする遺伝子の内部を欠失し、正常に機能するCBLを産生しないように改変したmetC遺伝子（欠失型metC遺伝子）を含むＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、欠失型metC遺伝子と染色体上のmetC遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上のmetC遺伝子を破壊することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
【００１７】
欠失型metC遺伝子を、宿主染色体上のmetC遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と、欠失型metC遺伝子と、アンピシリン又はクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とをベクターに挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
【００１８】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するmetC遺伝子配列との組換えを起こし、染色体metC遺伝子と欠失型metC遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では正常なmetC遺伝子が優性であるので、形質転換株は正常なmetCを発現する。
【００１９】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型metC遺伝子のみを残すために、２個のmetC遺伝子の組換えにより１コピーのmetC遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なmetC遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型metC遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型metC遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なmetC遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上のmetC遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型metC遺伝子が残った株を選択することによって、metC遺伝子が破壊された株を取得することができる。
【００２０】
遺伝子破壊株又は変異株のCBL活性が低下又は消失していることは、候補株の菌体抽出液について、Guggenheim,S.の方法（Methods Enzymol., 17, 439-442 (1971）の方法等によりCBL活性を測定し、親株のCBL活性と比較することにより確認することができる。
【００２１】
エシェリヒア・コリ用の温度感受性複製起点を含むプラスミドとしては、例えばpMAN031（Yasueda, H. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)）、pMAN997（WO 99/03988号）、及びpEL3（K. A. Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 331-347）が挙げられる。
【００２２】
上記と同様にして、tnaA遺伝子破壊株を取得することができる。tnaA遺伝子破壊株又は変異株のTNase活性が低下又は消失していることは、候補株の菌体抽出液について、Newton, W. A. らの方法（J. Biol. Chem., 240, 1211-1218 (1965)）の方法等によりTNase活性を測定し、親株のTNase活性と比較することにより確認することができる。
遺伝子破壊に用いる欠失型metC遺伝子及び欠失型tnaA遺伝子は、目的とするエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上のmetC遺伝子及びtnaA遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよい。このような相同性は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
【００２３】
＜２＞SAT活性の増強
エシェリヒア属細菌細胞内のSAT活性の増強は、SATをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、SATをコードする遺伝子断片を、エシェリヒア属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを宿主エシェリヒア属細菌に導入して形質転換すればよい。
【００２４】
SAT遺伝子は、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子および他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。エシェリヒア・コリのSATをコードする遺伝子として、cysEが野生株及びＬ−システイン分泌変異株よりクローニングされ、塩基配列が明らかになっている（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。したがって、その塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア属細菌の染色体DNAを鋳型とするPCRによって、SAT遺伝子を取得することができる（特開平11-155571号参照）。他の生物のSATをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。
参考として、配列番号１４及び１５に、報告されている野生型cysEの塩基配列及びコードされるSATのアミノ酸配列（Denk, D. and Bock, A., J. general Microbiol., 133, 515-525 (1987)）を示す。
SAT遺伝子としては、野生型SAT遺伝子の他に、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは２から５０個、より好ましくは２から４０個、特に好ましくは２から３０個である。
【００２５】
上記のようなSATと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１４の塩基番号２２３〜１０４７からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつSATと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２６】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００２７】
PCR法により増幅されたSAT遺伝子を含むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌に導入するには、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いることができる。このようなベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００２８】
SAT遺伝子を含む組換えベクターをエシェリヒア属細菌に導入するには、D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等、エシェリヒア属細菌の形質転換に通常用いられている方法により行うことができる。
【００２９】
SAT遺伝子のコピー数を高めることは、SAT遺伝子をエシェリヒア属細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。エシェリヒア属細菌の染色体DNA上にSAT遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、SAT遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００３０】
SAT活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のSAT遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換によっても行うことができる。
【００３１】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、SAT遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりSAT遺伝子の発現が増強され、SAT活性が増強される。これら発現調節配列の改変は、SAT遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３２】
さらに、SAT遺伝子の発現に抑制機構が存在する場合には、抑制が解除又は低減されるように、発現調節配列又は抑制に関与する遺伝子を改変することによっても、SAT遺伝子の発現を増強することができる。
【００３３】
エシェリヒア属細菌細胞内のSAT活性は、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減又は解除されたSAT（以下、「変異型SAT」ともいう）をエシェリヒア属細菌に保持させることによっても、上昇させることができる。変異型SATとしては、野生型SATの２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有するSATが挙げられる。前記リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基としては、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基及びロイシン残基を除く１７種類のアミノ酸残基が挙げられる。より具体的にはイソロイシン残基が挙げられる。野生型SAT遺伝子に所望の変異を導入する方法としては、部位特異的変異が挙げられる。変異型SAT遺伝子としては、エシェリヒア・コリの変異型SATをコードする変異型cysEが知られている（WO 97/15673号国際公開パンフレット、特開平11-155571号参照）。２５６位のメチオニン残基をグルタミン酸残基に置換した変異型SATをコードする変異型cysEを含むプラスミドpCEM256Eを保持するエシェリヒア・コリJM39-8株（E. coli JM39-8(pCEM256E)、プライベートナンバー：AJ13391）は、平成９年11月20日より工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、FERM P-16527の受託番号のもとで寄託され、2002年７月８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-8112が付与されている。
【００３４】
また、シロイヌナズナのSATは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないことが知られており、本発明に好適に用いることができる。シロイヌナズナ由来のSAT遺伝子含有プラスミドとして、pEAS-m（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）が知られている。
【００３５】
変異型SATとしては、上記のＬ−システインによるフィードバック阻害を低減する変異に加えて、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。そのような変異を有するSATにおいては、２５６位のメチオニン残基の位置が変わっている場合もあるが、そのような場合であっても、２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減した変異型SATが取得され得る。
【００３６】
また、エシェリヒア属細菌に変異型SATを保持させるには、細胞内のSAT遺伝子に、コードされるSATのＬ−システインによるフィードバック阻害が解除されるような変異を導入することによって行うことができる。変異の導入は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常の突然変異に用いられている変異剤による処理によって行うことができる。
【００３７】
＜３＞Ｌ−システインの生産
上記のようにして得られる本発明のエシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−システインを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することにより、Ｌ−システインを効率よく、かつ、安定に製造することができる。尚、本発明の方法により製造されるＬ−システインには、還元型のシステインに加えてシスチンも含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物にはシスチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物も含まれる。
【００３８】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００３９】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４０】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００４１】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００４２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４３】
＜１＞エシェリヒア・コリにおけるCD活性を担う酵素の同定
（１）エシェリヒア・コリ菌体抽出液の電気泳動及びCD活性染色
エシェリヒア・コリのSAT欠損株であるエシェリヒア・コリJM39（F+ cysＥ51 tfr-8）（Denk, D. and Bock, A., J. Gene. Microbiol, 133, 515-525(1987)）、及び、CD活性低下株JM39-8（特開平11-155571号）の細胞抽出液を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE）に供し、CD活性染色を行い、CD活性の主体について解析した。JM39-8株は、JM39株をＮＴＧ処理し、Ｌ−システイン非資化性株として分離された変異株である（特開平11-155571号）。
【００４４】
各菌株を、0.3%のＬ−システイン添加、あるいは無添加のLB培地（トリプトン 10g/L、Yeast Extract 5g/L、NaCl 5g/L (pH7.0)）に植菌後、37℃、終夜培養した。菌体を遠心集菌後0.85％NaClで洗浄し、得られた湿菌体を約3ml菌体破壊用Buffer（10mM Tris-HCl (pH8.6)、10μM PLP、100μM DTT）に懸濁してCOSMOBIO社Bioruptorで30分超音波菌体破壊を行った。12,000rpm、10分間遠心し、得られた上清を菌体抽出液とした。Protein Assay Kit (Bio-Rad社)を使用してタンパク濃度を定量した。
【００４５】
各菌体抽出液（各々30μgタンパク質）を、2×Native-PAGE buffer（Glycine 14.43g/L、Tris 3.0 g/L、pH8.6(HCl)）に懸濁し、定法に従い非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE）を実施した。得られた電気泳動ゲルを用い、CD活性染色を実施した。反応溶液（Tris・HCl 100mM、EDTA 10mM、PLP（Pyridoxal-5-phosphate） 20μM、L-Cys 50mM、pH8.6に調製後、100mlにフィルアップし、塩化ビスマス（BiCl3)を50mg加えた）に、ゲルの両端のレーンのみを切り出して浸し、室温で振盪してバンドが見えてくるまで放置したところ、主なバンドが２本検出された（図１Ａ）。なお、ゲルの中央部のレーンは、アミノ酸配列決定に用いた。JM39-8株では、上記の２つのバンドのうち、分子量が大きい方のバンドが、JM39株に比べて弱かった。
【００４６】
（２）CBLのCD活性を担う酵素としての同定
エシェリヒア・コリにおいてCD活性をもつ酵素として、CBL（metC産物)が報告されている（Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069）。上記バンドがCBLである可能性を検証するため、metC欠損株及びmetC遺伝子をマルチコピープラスミドにて増幅したエシェリヒア・コリを用いて、上記と同様な実験を実施した。
【００４７】
metC欠損株EZ5（metC:Tn10Tets rpsL add-uid-man uraA:Tn10）、及びmetCを搭載したプラスミドpIP29（フランス・パスツール研究所のSaint-Girons博士より供与された。Belfaiza et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83 (1986) 867-871参照）をEZ5に導入した菌株を用いて、Native-PAGE、及びCD活性染色を実施した。その結果、metC欠損株では、分子量の小さい方のバンドが欠失しており、pIP29の導入によってそのバンドが大きく増幅されることが判明した（図１Ｂ）。この結果より、分子量の小さい方のバンドは、CBLであると結論付けた。
【００４８】
（３）TNaseのCD活性を担う酵素としての同定
活性染色で認められた前記２本のバンドのうち分子量の大きい方のバンドに相当するタンパク質の精製を行った。電気泳動ゲルから、分子量の大きい方のバンドをゲルより切り出し、定法により抽出、濃縮した。得られたCD活性を持つ画分をについてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行い、染色は行わずに、PVDF膜（Bio-Rad）にブロッティングを行った。転写が終わった膜を蒸留水で5分間洗浄し、0.025% CBB（クマシーブリリアントブルー）R-250を含む40%メタノールで5分間染色した。脱色は50%メタノールで行い、確認した目的酵素のバンドを切り取って、Protein Sequencer 476A（Applied Biosystems 社）を用いた自動エドマン分解法により、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。
【００４９】
結果を配列番号１に示す。この配列を、若干のCD活性を有することが報告されている（Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）エシェリヒア・コリのTNaseのアミノ酸配列と比較したところ、１５残基中１４残基が一致した。配列番号１のアミノ酸配列において１０位のメチオニンは、報告されているアミノ酸配列ではプロリンであった。この結果から、分子量の大きい方のバンドは、TNaseである可能性が高いと考えられた。また、この結果から、JM39-8株ではTNaseの発現が低下していると推定された。
【００５０】
＜２＞エシェリヒア・コリのtnaA欠損株及びmetC欠損株の構築
上記のようにして、エシェリヒア・コリにおけるCD活性を担う酵素としてCBL及びTNaseが同定されたので、それらの活性低下のＬ−システイン生産に対する効果を調べるために、CBLをコードする遺伝子metC又はTNaseをコードする遺伝子tnaAの破壊株、及びこれらの両方の遺伝子の破壊株を作製した（図２）。具体的には、以下のようにして行った。
【００５１】
（１）tnaA欠損株の構築
エシェリヒア・コリJM109株の染色体DNAを鋳型に、配列番号２及び３に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号４及び５に示す塩基配列を有するプライマーとを用いて、それぞれPCRを実施した。次に、各PCR産物をHindIIIで切断した後ライゲーションした。この反応液を鋳型として、配列番号２及び５に示す塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを実施し、約1.6kbの断片を得た。この断片をBamHIにて消化し、温度感受性プラスミドpEL3（K. A. Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 331-347）のBamHIサイトに組み込み、tnaA破壊用プラスミドpEL3ΔtnaAを構築した。
【００５２】
JM39株を、プラスミドpEL3ΔtnaAを用いて形質転換し、30℃にてアンピシリン耐性を示すクローンを得た。本クローンの培養液を適宜希釈してアンピシリン添加LB寒天培地に塗布し、42℃にて一夜培養し、pEL3ΔtnaAがJM39株染色体に組み込まれた株を得た。次いで、本株をアンピシリン無添加LB培地にて37℃経代培養し、アンピシリン感受性のクローンを分離した。分離クローンについて、ゲノミックPCRによって染色体上のtnaA遺伝子周辺を解析し、野生型のtnaAは有しておらず、pEL3ΔtnaA上にクローニングされた破壊型tnaA遺伝子のみを有する株を選択した。こうして、JM39株由来のtnaA遺伝子破壊株JM39ΔtnaAを得た。
【００５３】
（２）metC欠損株の構築
エシェリヒア・コリJM109株の染色体DNAを鋳型に、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するプライマー、及び配列番号８及び９に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、それぞれPCRを実施した。次に、各PCR産物をKpnIで切断した後ライゲーションした。この反応液を鋳型として、配列番号６及び９に示す塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを実施し、約1.4kbの断片を得た。この断片をBamHIにて消化し、pEL3のBamHIサイトに組み込み、metC破壊用プラスミドpEL3ΔmetCを構築した。
【００５４】
JM39株又はJM39ΔtnaAを、プラスミドpEL3ΔmetCを用いて形質転換し、30℃にてアンピシリン耐性を示すクローンを得た。本クローンの培養液を適宜希釈してアンピシリン添加LB寒天培地に塗布し、42℃にて一夜培養し、pEL3ΔmetCがJM39株染色体に組み込まれた株を得た。次いで、本株をアンピシリン無添加LB培地にて37℃経代培養し、アンピシリン感受性のクローンを分離した。分離クローンについて、ゲノミックPCRによって染色体上のmetC遺伝子周辺を解析し、野生型のmetCは有しておらず、pEL3ΔmetC上にクローニングされた破壊型metC遺伝子のみを有する株を選択した。こうして、JM39株由来のmetC遺伝子破壊株JM39ΔmetC、及びJM39ΔtnaA株由来のmetC遺伝子破壊株JM39ΔtnaAΔmetCを得た。
【００５５】
（３）遺伝子破壊の確認
次に、JM39ΔtnaA株及びJM39ΔmetC株について、電気泳動及び活性染色によって、CD活性を有するバンドの有無を調べた (図３)。その結果、tnaA破壊株では分子量の大きな方のバンドが、metC破壊株では分子量の小さな方のバンドが、tnaA/metC 両破壊株では両方のバンドが完全に消失していた。
【００５６】
＜３＞フィードバック阻害非感受性SAT遺伝子の導入
上記で得られた各遺伝子破壊株に、シロイヌナズナ由来のフィードバック阻害非感受性SAT遺伝子を導入した。
【００５７】
シロイヌナズナ由来のSAT遺伝子含有プラスミドpEAS-m（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）を使用した。プラスミドpES-mは、特開平11-155571号公報に記載されているE. coli由来cysE遺伝子の導入に用いたプラスミドpCEをベースとして、E. coli由来cysE遺伝子の代わりにシロイヌナズナ由来フィードバック阻害非感受性SAT遺伝子を挿入したものであり、以下のような方法で構築可能である。まず、FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459に記載された方法で、pCEのcysE遺伝子の開始コドンの直前及び終止コドンの直後にNcoIサイトを導入したプラスミドpCE(NcoI)を構築する。このプラスミドのNcoI消化によってcysE遺伝子を除去し、代わりにシロイヌナズナのSAT遺伝子にNcoIリンカーを付加したものを導入する。シロイヌナズナのSAT遺伝子はその構造が既知であり（Plant Molecular Biology, 30, 1041-1049, 1996）、化学合成又はPCR等によって取得することができる。pEAS-mは、Plant Molecular Biology, 30, 1041-1049, 1996のFig.2に記載されている塩基配列中189−1201位の配列の前後にNcoIサイトを付加したDNA断片をpCEのNcoIサイトに導入して得られたものである。
【００５８】
JM39、JM39ΔtnaA、JM39ΔmetC、及びJM39ΔtnaAΔmetCを、上記プラスミドpEAS-mで形質転換した。得られた各形質転換株を、アンピシリン50mg/Lを含むLBプレート培地で30℃、24時間培養した後、菌体１白金耳を、アンピシリン50mg/Lを添加したC1培地（グルコース 30g/L、NH4Cl 10g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、MnCl2・4H2O 10mg/L、CaCO3 20g/L）20mlを入れた坂口フラスコに接種し、30℃で48時間および72時間培養した。培養後の上清のＬ−システイン含量をバイオアッセイで定量したところ、全ての破壊株で野生株を上回り、tnaA及びmetCの破壊がＬ−システイン生産性の向上に効果のあることが確認された（図４）。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、エシェリヒア属細菌のＬ−システイン生産性を向上させることができる。
【００６０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  エシェリヒア・コリ細胞抽出液Native-PAGEのCD活性染色の結果を示す図。
Ａ：SAT欠損株JM39、及び、CD活性低下株JM39-8
Ｂ：metC欠損株EZ5、及びmetCを搭載したプラスミドpIP29を導入したEZ5
【図２】  エシェリヒア・コリのmetC破壊株、tnaA破壊株、及びmetC/tnaA破壊株の構築過程を示す図。「Ａ」、「Ｂ」は遺伝子の末端領域、「Ｘ」は欠失領域を示す。
【図３】  metC破壊株、tnaA破壊株、及びmetC/tnaA破壊株の遺伝子破壊を確認する電気泳動及びCD活性染色の結果を示す写真。
【図４】  metC破壊株、tnaA破壊株、及びmetC/tnaA破壊株のＬ−システイン生産性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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