(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、ＩＬ−６ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
【請求項２】
ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、自己免疫疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
【請求項３】
ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、関節炎を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
【請求項４】
ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、慢性関節リウマチを予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
【請求項５】
ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、抗炎症薬のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
【請求項６】
前記ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、ＳＨＰ２を介するｇｐ１３０依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されている、請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、ｇｐ１３０依存性シグナル伝達経路のＳＯＣＳ−３による負の制御が損なわれている、請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換または欠失を含んでいる、請求項１〜７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記ｇｐ１３０変異体における、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換が、ｇｐ１３０遺伝子の点変異によるものである請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記点変異によって、チロシンに代えてフェニルアラニンがコードされる、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、トランスジェニックマウスまたはその一部を用いる、ＩＬ−６ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、多発性関節炎を主病変とする慢性炎症性疾患であり、有病率の高い膠原病である（世界人口の約１％）。原因は不明で、遺伝学的素因に感染症などの環境因子が加わって発症すると考えられている。発症とＨＬＡ  ＤＲ４との相関や、滑膜組織におけるＴ細胞の存在から、病態におけるＴ細胞異常の関与が示唆されている。また、Ｂ細胞の多クローン性活性化による高免疫グロブリン血症や自己抗体の出現といった免疫異常が認められる。これまで、関節炎を伴う自己免疫疾患マウスや誘発関節炎モデルマウスが病態の解析に利用され、近年、関節炎を発症するトランスジェニックマウスや自然発症マウスが報告されている。これまでに報告されている主な関節炎モデルマウスには、例えば以下のものがある。
１．抗原感作などによる誘発関節炎モデルマウス
関節内自己抗原を強力なアジュバントで免疫したり、関節自己抗原と交差し得る微生物抗原を接種して関節炎を誘発する。感作後短期間で発症するところは、ＲＡと異なる。使用される微生物抗原は、疫学上ヒトＲＡとは無関係である。
（１）ＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）誘発関節炎マウス（Ｎａｔｕｒｅ，６６６−６６８，１９８０．Ｊ．Ｓ．Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ  ｅｔ  ａｌ．）
作製方法：ＤＢＡ／１ＪマウスにウシＩＩＣと完全フロイントアジュバントで作製したエマルジョンを免疫する。３週後にウシＩＩＣと不完全フロイントアジュバントで追加免疫するとその１〜２週後に関節炎を発症する。
特徴：ラットのアジュバント関節炎（ヒトのＲｅｉｔｅｒ症候群に近い）と異なり、皮膚粘膜と臓器症状を欠く点でよりＲＡに近いモデルと考えられ、組織所見はヒトＲＡと酷似している。細胞性免疫と体液性免疫の両方が関与し、抗コラーゲンモノクローナル抗体を用いて誘発することも可能である。ＩＬ−６が増悪因子である（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，４６１−４６８，１９９８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔ．４２，１６３５−１６４３，１９９９）。このモデルマウスは、種々のノックアウトマウスを作製して関節炎を増悪あるいは寛解させる遺伝子産物を同定するのに有用なモデルマウスである。
問題点：非生理的な免疫操作が必要である。ヒトＲＡのような寛解増悪傾向が認められない。リウマチ因子（ＲＦ）が産生されない。
（２）抗原誘発関節炎マウス（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２０，８４１．８５０，１９７７）
作製方法：マウスをメチル化ウシ血清アルブミンなどの抗原で感作したのちに、関節内に抗原を再投与することによって関節炎を誘発する。
特徴：ＩＬ−６が増悪因子である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，８２２２−８２２６，１９９８）。Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃマウスが用いられる。
（３）ＣｐＧ誘発関節炎マウス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，７０２−７０５，１９９９，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４３，３５６−３６４，２０００）
作製方法：免疫刺激作用を持つ細菌ＤＮＡ、ＣｐＧをマウスの関節内に注入することにより関節炎を誘発する。
特徴：マクロファージが関節炎に関与している。関節局所におけるＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳの産生、血中ＩｇＧとＩＬ−６の産生亢進を伴う。Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスなどにおいて関節炎を誘発することが可能である。
２．関節炎自然発症モデルマウス
（１）ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒおよびｇｌｄマウス
特徴：Ｔ細胞異常増殖、ＳＬＥ様の病変、関節炎とＲＦの産生はヒトＲＡと似ている。主たる異常は、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンドによることが明らかにされている。
問題点：遺伝的背景の影響も関与しており（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ、ＡＫＲなどでは発症しない）、ＦＡＳ／ＦＡＳリガンドの異常だけで関節炎が発症するのではない。Ｔ細胞の異常増殖により約６ヶ月齢で死ぬため、長期経過の観察・解析が困難である。
（２）ＳＫＧマウス（参考；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ  ３４，臨時増刊号  免疫  １９９７−１９９８，ｐ２１４−２２１）
特徴：関節炎はＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスより著明である。Ｔ細胞の異常増殖はない。高免疫グロブリン血症を呈し、抗ＩＩＣ抗体、ＩｇＭクラスのＲＦなどの自己抗体を産生する。発症マウスのＴ細胞を正常マウスに移入すると関節炎を発症することから、Ｔ細胞異常が主な原因と考えられている。このＳＫＧマウスは、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来である。
問題点：発症の原因が不明である。
３．遺伝子操作モデルマウス
遺伝子操作（遺伝子導入、ノックアウト、ノックイン）によって関節炎を発症することから、発症の原因が明らかである。
（１）ＴＮＦαトランスジェニックマウス（ＥＭＢＯ  Ｊ．１０，４０２５，１９９１）
特徴：サイトカイン過剰産生による関節炎モデルマウスである。抗ＴＮＦ抗体で関節炎が軽快することが示された。ＤＢＡ／１の遺伝的背景では、関節炎はより重症である（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，２８６７−２８７６，１９９７）。滑膜細胞は、ＩＬ−１βとＩＬ−６を産生する。滑膜の細胞は、主に好中球、その他線維芽細胞、内皮細胞であり、リンパ球の関与は少ないと考えられている。
（２）ＨＴＬＶ−１ｔａｘ  トランスジェニックマウス（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１０２６−１０２８，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５，１５８８−１５９８，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１，６５９２−６５９８，１９９８）
特徴：ヒトＴ細胞白血病細胞ウイルス１型ｔａｘ遺伝子の過剰発現により、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６などのサイトカインの産生が亢進する。高免疫グロブリン血症を呈し、ＲＦ、抗ＩＩＣ、抗ＤＮＡ抗体を産生する。関節炎の発症はＨ−２ハプロタイプと関係ない。Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６の順に発症率が低下する。
（３）ＩＬ−１受容体アンタゴニストノックアウトマウス：（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，３１３−３２０，２０００）
特徴：Ｂａｌｂ／ｃの遺伝的背景で関節炎を発症する。Ｃ５７ＢＬ／６では発症率が低い。サイトカインシグナルを抑制性に制御する分子の欠損により、関節炎が発症する。関節局所でのＩＬ−６、ＩＬ−１βの産生が亢進する。高免疫グロブリン血症を呈し、ＲＦ、抗ＩＩＣ、抗ＤＮＡ抗体を産生する。
（４）Ｔ細胞抗原受容体トランスジェニックマウス（Ｃｅｌｌ，８７，８１１−８２２，１９９６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０，４５１−４６１，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，１７３２−１７３５，１９９９）
特徴：Ｉ−Ａｋ拘束性にウシ膵臓リボヌクレアーゼペプチドＲ４１−６１を認識するＴ細胞抗原受容体（α、β）のトランスジェニックマウスをＮＯＤマウスと交配することによって関節炎が発症する。関節腔内に好中球浸潤がみられる。高免疫グロブリン血症、抗ＤＮＡ抗体が観察されるが、ＲＦは認められない。発症マウスの血清中の抗体を移入することによって健常マウスに関節炎を発症させることが可能で、この抗体と発症マウスのＴ細胞によって認識される抗原が、グルコースー６ーリン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）という普遍的な抗原であることが明らかにされた。リボヌクレアーゼに特異的なＴ細胞が、ＮＯＤマウス固有のＩ−Ａｇ７に結合したＧＰＩを認識して活性化され、関節に特異的な炎症反応を惹起する機序に興味が持たれている。
上述したこれらのモデルマウスは、ヒトＲＡの病因が多くの因子からなることを反映するかのように、それぞれ異なった機序により関節炎を発症している。これらモデルマウスにおいて発症する病態はいずれも、ヒトＲＡの病態と完全に一致するものではないが、ＲＡの発症に複数の因子が関与していることを考慮すると、新しい関節炎モデルマウスの出現がＲＡの病態のある側面を解析することに役立つことは明らかである。
ＩＬ−６が関節炎の病態に関与していることは、臨床的知見のみならず、上記のモデルマウスにおいても示されている。しかしながら、これまでに報告されたＩＬ−６関連遺伝子操作マウスにおいて実際に関節炎を発症した例はない。また、遺伝子操作によりサイトカインの産生やその作用を増強することによって発症するモデルマウスも多数作製されているが、これらのモデルマウスには、Ｔ細胞の機能異常を解析するのに適したモデルが少ない。前述のＴ細胞抗原受容体トランスジェニックマウスでは、Ｔ細胞レパートリーの中から、どのようにして自己反応性Ｔ細胞クローンが選別され自己寛容が破綻するのかは分からない。ＳＫＧマウスではＴ細胞選択などの異常が関与する可能性があるが、自然発症のため病因の追及は困難である。
ｇｐ１３０は、ＩＬ−６ファミリーサイトカインに共通の受容体サブユニットである約１３０ＫＤａの膜タンパク質である。ｇｐ１３０は、ＩＬ−６のシグナル伝達だけでなく、他のＩＬ−６ファミリーサイトカインである白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭ（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ；ＯＳＭ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、およびカーディオトロフィン−１（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１；ＣＴ−１）のシグナル伝達にも関与する（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．８，２４１−５２）。
ＩＬ−６ファミリーのサイトカインが受容体に結合すると、ｇｐ１３０タンパク質のホモダイマー形成またはｇｐ１３０タンパク質と他のｇｐ１３０関連因子とのヘテロダイマー形成が誘導される。ｇｐ１３０タンパク質のチロシン残基がリン酸化されると、そのリン酸化されたチロシン残基にＳＨＰ２（ＳＨ２ドメイン含有プロテイン・チロシン・ホスファターゼ２）が会合し、さらにこのＳＨＰ２がリン酸化されてシグナルが下流に伝達される。このＳＨＰ２のリン酸化には、ヒトｇｐ１３０の７５９番目のチロシン残基のリン酸化が必須である（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．８，２４１−５２）。さらに、このヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に、サイトカインシグナルをフィードバック制御するＳＯＣＳ−３（ｓｕｐｐｕｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−３）と呼ばれる分子が結合することが最近報告された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７，６４９３−８）。
ヒトｇｐ１３０タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており、ヒトｇｐ１３０タンパク質をコードするｃＤＮＡも報告されている（Ｈｉｂｉ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３，１１４９−５７）。また、マウスｇｐ１３０タンパク質のアミノ酸配列も既に知られており、マウスｇｐ１３０タンパク質をコードするｃＤＮＡも報告されている（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，４０６６−７１）。
発明の開示
本発明は、ＩＬ−６ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質をスクリーニングするための、新しい病態モデルを用いる方法を提供する。
本発明は、ＳＨＰ２（ＳＨ２ドメイン含有プロテイン・チロシン・ホスファターゼ２）を介するｇｐ１３０依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されたトランスジェニックマウスが、ＩＬ−６ファミリーサイトカイン受容体の機能異常の結果として、自己免疫疾患、関節炎、慢性関節リウマチなどに特徴的な病態を示すという発見に基づいている。
即ち、本発明は、
１）ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、ＩＬ−６ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
２）ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、自己免疫疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
３）ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、関節炎を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
４）ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、慢性関節リウマチを予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
５）ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、抗炎症薬のスクリーニング方法であって、該ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
６）前記ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、ＳＨＰ２を介するｇｐ１３０依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されている、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
７）前記ｇｐ１３０変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、ｇｐ１３０依存性シグナル伝達経路のＳＯＣＳ−３による負の制御が損なわれている、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
８）前記ｇｐ１３０変異体が、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換または欠失を含んでいる、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
９）前記ｇｐ１３０変異体における、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換が、ｇｐ１３０遺伝子の点変異によるものである上記（８）に記載のスクリーニング方法、および
１０）前記点変異によって、チロシンに代えてフェニルアラニンがコードされる、上記（９）に記載のスクリーニング方法
に関する。
本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症する疾患は、ＳＨＰ２を介するｇｐ１３０依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されているということだけでなく、ＳＯＣＳ−３の結合によるサイトカインシグナルのフィードバック制御が作動しないということにも起因している可能性が考えられる。また、ヒトｇｐ１３０の７５９番目のチロシン残基（またはこれに対応するチロシン残基）を必要とする未知のさらなるシグナル伝達分子も、本発明のトランスジェニックマウスにおける疾患の発症に関与しているかもしれない。本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症する疾患は、これら可能性のあるシグナル伝達分子のうちのいずれか１つまたは任意の複数のシグナル伝達分子が作動しない、ということに起因していると考えられる。
これまで報告されたモデルマウスにおいてＩＬ−６が関節炎の病態に関与していることが示されているにもかかわらず、実際に関節炎を発症した例がないことを考えると、ＩＬ−６ファミリーサイトカインに共通の受容体サブユニットであるｇｐ１３０の遺伝子の点変異によって関節炎が発症したという本発明者らの知見は、貴重な情報をもたらしたといえる。さらに、サイトカイン受容体は、複数の、ときには拮抗するようなシグナルをも同時に伝達しているという本発明者らのこれまでの研究結果に基づけば、本発明のトランスジェニックマウスは、その複数のシグナルのバランスが崩れるだけで病気になるということを示すユニークなモデルマウスといえる。
また、本発明のトランスジェニックマウスは点変異でも発症するということから、実際のＲＡ類縁疾患症例の中に同様の機序で発症したものが存在する可能性が極めて高いといえる。さらに、リンパ球のないＲＡＧ２ノックアウトマウスに、本発明のトランスジェニックマウスの脾臓細胞を移入することによって関節炎を誘発することができるということ、そしてこのＲＡＧ２ノックアウトマウスにおいて、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の生存・増殖が認められたことから、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症した関節炎は、Ｔ細胞を中心とする免疫異常による可能性が高いといえる。事実、本発明のトランスジェニックマウスの胸腺において、ＣＤ４およびＣＤ８を共に発現しているＴ細胞（ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞）が減少し、ＣＤ４を単独で発現しているＴ細胞（ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞）が増えること、そして胸腺や末梢リンパ節に活性化抗原を表面発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が増加してくることからその可能性が示唆される。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において用いられる「ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基」とは、ヒトｇｐ１３０タンパク質において７５９番目に位置するチロシン残基に対応する、本発明トランスジェニックマウスのｇｐ１３０タンパク質におけるチロシン残基を意味する。「ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む領域」とは、前記ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む、本発明トランスジェニックマウスのｇｐ１３０タンパク質におけるアミノ酸残基の領域を意味する。本発明のトランスジェニックマウスが発現するｇｐ１３０変異体は、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換または欠失している、および／または該対応するチロシン残基を含む領域において１もしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる。
本発明のスクリーニング方法に使用するトランスジェニックマウスにおいて発現するｇｐ１３０変異体は、ＳＨＰ２およびＳＯＣＳ−３の結合、並びにヒトｇｐ１３０の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を必要とする他の任意の未知のシグナル伝達分子の機能を阻害するいかなる変異も有し得る。したがって、本発明のスクリーニング方法に使用するトランスジェニックマウスにおいては、ＳＨＰ２を介するｇｐ１３０依存性シグナル伝達経路は選択的に破壊され、ＳＯＣＳ−３の結合によるサイトカインシグナルのフィードバック制御は作動せず、ヒトｇｐ１３０の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を必要とする任意の未知のシグナル伝達分子の機能は阻害される。
本発明では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するｇｐ１３０変異体は、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む領域において、１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含んでいる。ヒトｇｐ１３０の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基自身は、該チロシン残基を必要とするシグナル伝達分子の機能を阻害する限り、変異していても変異していなくてもよい。
本発明の好ましい態様では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するｇｐ１３０変異体は、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換または欠失している。
本発明のさらに好ましい態様では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するｇｐ１３０変異体は、ｇｐ１３０遺伝子の点変異によって、ヒトｇｐ１３０タンパク質の７５９番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換されている。「点変異」とは、ＤＮＡ上の１つの塩基対が他の異なる塩基対に置き換わった変異を意味する。この点変異は、マウスのゲノムｇｐ１３０遺伝子に直接導入したものでも、このような点変異を含む変異ｇｐ１３０遺伝子断片とマウスのゲノムｇｐ１３０遺伝子との相同的組換えにより導入されたものでもよい。本発明の方法における特に好ましい点変異は、例えば、フェニルアラニンをコードするような点変異である。本明細書においては、この点変異を有する変異ｇｐ１３０遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスを「ｇｐ１３０Ｆ７５９マウス」と呼び、この変異ｇｐ１３０遺伝子のホモ接合体について言及する場合は特に「ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウス」と呼ぶ。また、野生型ｇｐ１３０遺伝子とこの変異ｇｐ１３０遺伝子とのヘテロ接合体を「ｇｐ１３０ＷＴ／Ｆ７５９マウス」と呼び、野生型ｇｐ１３０遺伝子のホモ接合体を「ｇｐ１３０ＷＴ／ＷＴマウス」と呼ぶ。
本発明のスクリーニング方法において使用するトランスジェニックマウスは、マウスのゲノムｇｐ１３０遺伝子に上記の変異を直接導入するか、または上記の変異ｇｐ１３０遺伝子の断片とマウスのゲノムｇｐ１３０遺伝子との相同的組換えにより、変異ｇｐ１３０遺伝子を得た後、この変異ｇｐ１３０遺伝子を、当分野で知られた方法を用いてマウスのＥＳ細胞に導入し、ｇｐ１３０ゲノムに変異を有するＥＳ細胞を樹立する。その後、他のマウスより採取した胚盤胞にこのＥＳ細胞を注入し、胚盤胞を偽妊娠マウスの子宮に移植し、この偽妊娠マウスの出仔によって得られたキメラマウスを野生型マウスと交配させて第１世代のヘテロマウスを得る。そして、この第１世代のヘテロマウスどうしを交配させ、第２世代のホモ接合型マウスを得る。本発明のスクリーニング方法において使用するトランスジェニックマウスの作製は、例えば、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．１２，９５−１０５，Ｊａｎｕａｒｙ，２０００に記載されている方法により行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法に用いることができる試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、血清などが挙げられ、これら試験物質は新規の物質でも、公知の物質でもよい。
本発明のスクリーニング方法における試験物質の投与方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、皮内注射、筋肉注射などが挙げられる。当業者は、試験物質の投与量を、投与経路、試験物質の性質などより適宜選択することができる。試験物質の投与は、予防薬のスクリーニングについては免疫異常が始まる時期より前あるいは疾患の発症時期より前に、治療薬のスクリーニングについては肉眼的に発症が認められてから開始すればよい。
本発明のスクリーニング方法では、野生型マウスと本発明のトランスジェニックマウスの雄あるいは雌をそれぞれ群に分け、試験物質の投与あり、なしで肉眼的にマウスを観察し、症状の重症度についてスコア化する。また、マウスから血液を採取して血球数計測や血清生化学的検査を行ない、尿検査なども行なう。一定期間の観察後、Ｘ線画像解析、病理学的解析、免疫学的解析を行う。試験期間中に原因不明の死亡マウスがでれば、病理解剖を行い原因を明らかにする。
本発明のトランスジェニックマウスから組織または細胞を単離し、その組織または細胞を培養後にまたは直接使用することによって、試験物質の予防効果および治療効果、遺伝子改変による細胞表現型の変化、例えば細胞増殖能やサイトカインの産生能等の変化について、試験管内で分析することもできる。
さらに、本発明のトランスジェニックマウスは、交配を行なって種々の遺伝的背景を有するマウスを作製し、発症における影響を調べたり、種々の誘発モデルを試みることにより、治療薬や予防薬のスクリーニングをより短期間で行える実験系をつくりあげることも可能である。
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであって、本発明の範囲を制約するものと解釈すべきではない。
実施例
ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの作製
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．１２，９５−１０５，Ｊａｎｕａｒｙ，２０００に記載されている方法に従い、７５９番目のチロシンに代えてフェニルアラニンをコードする点変異（ＴＡＴからＴＴＴの変異）を有するヒトｇｐ１３０ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片（Ｙａｍａｎａｋａ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５，１５５７−６５）（ＸｈｏＩ部位はサブクローニングにより作製）をマウスｇｐ１３０遺伝子に導入し、マウス−ヒト型キメラｇｐ１３０構築物を得た。この構築物を含むターゲティングベクターを電気穿孔法によりマウスのＥＳ細胞に導入し、ｇｐ１３０ゲノムに変異を有するＥＳ細胞を樹立した。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスより胚盤胞を採取し、マイクロインジェクション法により、遺伝子導入されたＥＳ細胞を胚盤胞に注入した。精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス（ＩＣＲ系統）の子宮に、ＥＳ細胞を注入した胚盤胞を移植した。偽妊娠マウスの出仔によって得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６系統の野生型マウスと交配させ、第１世代のヘテロマウスを得た。この第１世代のヘテロマウスどうしの交配により、第２世代のホモ接合型マウス（ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウス）を得た。
ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの病態解析
自己抗体の産生：
５、９、１２ヶ月齢のｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスより採血後、血清を分離し、血清中の免疫グロブリン、抗ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）、抗ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）、抗ｎＲＮＰ（リボ核タンパク質）抗体、リウマチ因子などの自己抗体の産生についてＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは、９ヶ月齢以降に抗ｓｓＤＮＡ、抗ｄｓＤＮＡなどの自己抗体の産生が認められた。５、９、１２ヶ月齢のマウスにおける測定結果を図１に示す。
関節炎の発症：
ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスを関節炎の発症について生後２０ヶ月齢まで観察した。ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの２０％が８〜１０ヶ月齢で関節炎を発症し、２０ヶ月齢では関節炎の発症率がほぼ１００％となった（図２）。図３にｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウス（９．５ヶ月齢）における関節炎の肉眼所見を示す。ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは、四肢の近位指関節の腫脹、可動域制限に始まり、徐々に関節炎が大関節にも波及し、強直性変化を来した。関節炎を発症したｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスを屠殺後、関節、胸腺、脾臓、肝臓あるいはリンパ節を採取し、ホルマリン固定を行った。その後常法にしたがって病理標本を作製した後、ヘマトキシリン−エオジン染色を行い、光学顕微鏡にて病理学的検査を行った。図４〜６に、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの病理組織所見を示す。ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは、関節腔におけるフィブリン析出、好中球浸潤、滑膜の線維芽細胞増生を伴う関節構造の破壊が著明であった（図４および５）。また、肝臓のグリソン梢の周囲に形質細胞の浸潤が認められ（９．５ヶ月齢：図６右上段）、肝細胞の変性も認められた（１５．５ヶ月齢：図６右中段）。さらに、リンパ節における形質細胞の浸潤も認められた（図６右下段）。
リンパ組織における異常（フローサイトメーターによる解析）：
リンパ組織（胸腺、リンパ節）から細胞を採取し、細胞表面解析装置を用いて各特異的表面抗原に対する抗体と種々の細胞表面マーカーを解析した。胸腺では、ＣＤ４およびＣＤ８を共に発現しているＴ細胞（ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞）が減少し（対照８３％に対し、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスでは２％に減少：図７上段）、ＣＤ４あるいはＣＤ８を単独で発現しているＴ細胞（ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞、ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞）が増えていた（対照８％および４％に対し、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスでは３１％および１４％にそれぞれ増加：図７上段）。さらに、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの胸腺では、正常の胸腺では認められないＢ細胞（ＩｇＤ＋ＩｇＭｌｏ（低度のＩｇＭ発現））が異常に増殖していた（３２％に増加：図７下段）。ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスのリンパ節では、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋の顆粒球が増加した（６％に増加：図８下段）。ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスのリンパ節のＣＤ４シングルポジテイブ細胞についてさらに詳しく調べたところ、活性化していることを示すマーカーＣＤ６９あるいはＣＤ２５が陽性である細胞が増加していた（図９：上段）。ＣＤ６２ＬとＣＤ４４の発現を解析した結果から、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスのリンパ節のＣＤ４シングルポジテイブ細胞では、ナイーブＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４−）の減少（対照５８％に対し、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは３％）、および活性化・メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋）の増加（対照２５％に対し、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは７１％）が認められた（図９中段）。リンパ節ＣＤ８シングルポジティブ細胞でも、ナイーブＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４−）の減少が認められた（対照４９％に対し、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは２％：図９下段）。これらの解析結果より、関節炎を発症したｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスはリンパ節においてはＴ細胞が異常に活性化されていることが示された。
試験例１
関節炎薬のスクリーニング試験
モデルマウスとして、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスまたはこのマウスをバッククロスして得られたマウス（ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９関連マウス）を用いる。試験物質として、ブシラミン、メトトレキセート等の抗リウマチ剤、ジクロフェナク等の非ステロイド性抗炎症剤あるいはデキサテサゾン等のステロイド剤を投与する。予防薬のスクリーニングについては免疫異常が始まる時期より前あるいは関節炎の発症時期より前に、治療薬のスクリーニングについては肉眼的に関節炎が明らかになってから投与を開始する。以下、試験物質としてメトトレキセートを用いた関節炎薬のスクリーニング試験について詳細に述べるが、他の試験物質のスクリーニング試験についても同様の手順に従って行なう。
メトトレキセートを０．４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で９ヶ月齢より週５日間マウスに経口投与した。野生型マウスまたはｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの雄もしくは雌の各２〜３匹を一群とし、関節炎の予防効果あるいは改善効果について、肉眼で経過を観察した。関節炎の重症度を、手足首の可動域制限、指趾関節の腫脹・発赤、強直の有無などについてスコア化し、２週間以上継続して関節炎の症状が認められたマウスを発症とし、経時的に発症率と重症度を評価した。
その結果、対照群（メトトレキセート投与なし）では４０週齢（約１０ヶ月齢）より関節炎の発症が認められ、４６週齢では全例において関節炎が発症した。関節炎を発症したマウスの関節炎スコアをさらに経時的に評価したところ、対照群では４８週齢（１２ヶ月齢）で４．３３±１．８６、５３週齢で４．６７±０．６７であったのに対して、メトトレキセート（０．４ｍｇ／ｋｇ）を投与した群では４８週齢（１２ヶ月齢）で１．３３±０．３３、５３週齢で０．６７±０．３３を示し、メトトレキセートは本発明のモデルマウスにおける関節炎を抑制することが示された。
試験例２
抗炎症薬のスクリーニング試験
ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスまたはその関連マウスを用いて、ａｉｒ  ｐｏｕｃｈモデルを作製し、抗炎症作用を有する物質のスクリーニングを行う。常法に従って作製したａｉｒ  ｐｏｕｃｈモデルに、炎症の惹起前あるいは惹起後、抗炎症作用を有する候補物質を投与し、ａｉｒ  ｐｏｕｃｈ中の好中球およびマクロファージの浸潤について調べる。さらに、他の炎症惹起物質等によるｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの表現型の変化について、試験例１と同様の方法を用いて解析を行なう。
試験例３
抗感染症薬のスクリーニング試験
ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは、リステリアに対する感受性が亢進しており感染症により死亡することが多いため、感染症に対して治療効果を有する物質のスクリーニングにも応用することができる。たとえば、当該マウスにリステリアを感染させた後、試験物質を投与して、生存率を指標として治療効果を調べる。
試験例４
ＩＬ−６ファミリーサイトカインシグナル制御薬のスクリーニング試験
ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスは、ＩＬ−６によるシグナル伝達に関与するＳＴＡＴ３の過剰発現により疾患を引き起こすことが考えれられる。従って、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスを用いて、ＳＴＡＴ３が関与するシグナル伝達の異常により発症する疾患を予防または治療する物質をスクリーニングすることが可能である。また、このマウスの組織、細胞、遺伝子並びにタンパク質を用いて種々のシグナル制御薬のスクリーニングが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、１２ヶ月齢マウスにおける、抗ｓｓＤＮＡ抗体および抗ｄｓＤＮＡ抗体の抗体価を示したグラフである。白丸印：ｇｐ１３０ＷＴ／ＷＴマウス（ｎ＝６）、三角印：ｇｐ１３０ＷＴ／Ｆ７５９マウス（ｎ＝５）、黒丸印：ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウス（ｎ＝１１）。平均値を横棒で示した。
図２は、マウスにおける関節炎の発症率を示す棒グラフである。
図３は、ｇｐ１３０Ｆ７５９／７５９マウスにおける関節炎の肉眼所見である（９．５ヶ月齢のマウス足関節の写真の模写図）。左側：対照マウス（ｇｐ１３０ＷＴ／ＷＴマウス）の足関節。右側：ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの足関節。
図４は、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの足関節の病理組織写真の模写図である（１５ヶ月齢：滑膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色（×４０））。左側：対照マウス（ｇｐ１３０ＷＴ／ＷＴマウス）。右側：ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウス。矢頭は線維芽細胞の増生を示し、矢印は好中球の浸潤を示す。
図５は、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの膝関節の病理組織写真の模写図である（１５ヶ月齢：滑膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色（×１００））。左側：対照マウス（ｇｐ１３０ＷＴ／ＷＴマウス）。右側：ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウス。ＪＳ：関節腔。矢頭は、フィブリン析出を伴う好中球浸潤を示し、矢印は、好中球浸潤と線維芽細胞の増生を伴う滑膜の肥厚を示す。
図６は、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの肝臓およびリンパ節の病理組織写真の模写図である（ヘマトキシリン・エオジン染色（×１００））。左上段：対照マウス（ｇｐ１３０ＷＴ／Ｆ７５９マウス）の肝臓（９．５ヶ月齢）。右上段：ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの肝臓（９．５ヶ月齢）。右中段：ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの肝臓（１５．５ヶ月齢）。矢印は肝細胞の変性を示す。右下段：ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスのリンパ節（１５．５ヶ月齢）
図７は、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスの胸腺のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスの胸腺細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。パネルの縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原（縦軸および横軸方向）に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段：ＣＤ４およびＣＤ８発現の解析結果。下段：ＩｇＤおよびＩｇＭ発現の解析結果。左側（ＷＩＬＤ／Ｆ７５９）は対照マウス（ｇｐ１３０ＷＴ／Ｆ７５９マウス）、右側（Ｆ７５９／Ｆ７５９）はｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた、あるいは十字線で仕切られた区画に属する細胞集団の頻度（％）を示したものである。
図８は、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスのリンパ節のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスのリンパ節細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。パネルの縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原（縦軸および横軸方向）に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段：ＣＤ８およびＣＤ４発現の解析結果。中段：ＩｇＤおよびＩｇＭ発現の解析結果。下段：Ｇｒ−１およびＣＤ１１ｂ発現の解析結果。左側（ＷＩＬＤ／Ｆ７５９）は対照マウス（ｇｐ１３０ＷＴ／Ｆ７５９マウス）、右側（Ｆ７５９／Ｆ７５９）はｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた区画に属する細胞集団の頻度（％）を示したものである。
図９は、ｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスのリンパ節のＣＤ４およびＣＤ８シングルポジティブ細胞のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスのリンパ節のＣＤ４シングルポジティブ細胞またはＣＤ８シングルポジティブ細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原（縦軸および横軸方向）に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段：ＣＤ４シングルポジティブ細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５発現の解析結果。中段：ＣＤ４シングルポジティブ細胞におけるＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４発現の解析結果。下段ＣＤ８シングルポジティブ細胞におけるＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４発現の解析結果。左側（ＷＩＬＤ／Ｆ７５９）は対照マウス（ｇｐ１３０ＷＴ／Ｆ７５９マウス）、右側（Ｆ７５９／Ｆ７５９）はｇｐ１３０Ｆ７５９／Ｆ７５９マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた、あるいは十字線で仕切られた区画に属する細胞集団の頻度（％）を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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