(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質を有するタンパク質：
（１）知覚神経軸索伸長活性を有する分泌タンパク質である；
（２）ヘパリンカラムに結合し、５００ｍＭ ＮａＣｌにより溶出される；
（３）標的細胞の液性因子である；
（４）ＦＧＦ２およびＮＴ−３のいずれとも相違する；
（５）骨格筋不死化細胞に由来する；
（６）骨格筋不死化細胞を０．５％ウシ胎児血清を含むダルベッコＭＥＭで培養し、知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質を培養上清中に産生し、該培養上清から分離、精製することにより得られる。
【請求項２】
知覚神経軸索伸長活性がＮＴ−３よりも強力である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
骨格筋不死化細胞を０．５％ウシ胎児血清を含むダルベッコＭＥＭで培養し、知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質を培養上清中に産生し、該培養上清から知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質を分離、精製することを特徴とする、請求項１または２に記載のタンパク質の調製法。
【請求項４】
前記培養上清をヘパリンカラムを用いて精製することを特徴とする請求項３に記載の調製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質、それを含む溶液、およびその調製法に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
ヒトを含めた高等脊椎動物の神経系は、発生過程において種々のシグナル分子との相互作用によって複雑で特異的な神経回路が形成される。特異的な回路を形成するためには、神経支配する標的に由来する因子が軸索の伸長を誘導すること、たとえば筋へ投射する神経軸索は筋に由来する因子によって誘導されることが必要不可欠である。知覚神経系は光・音・味・臭い・触覚・痛み・温度などの外部からの情報を脳へ伝える最初の神経回路を担っている。末梢の知覚神経は後根神経節（あるいは脊髄神経節）とよばれる神経細胞の塊が脊椎に沿って節状に並んでいて、その中にある知覚神経の末梢側の軸索は各知覚器官へ、中枢側の軸索は脊髄へと軸索を伸ばしそれぞれ特異的な神経支配をすることによって、末梢から中枢へと情報を伝える回路ができあがるのである。
【０００３】
これまでの神経科学研究によって、神経栄養因子のような神経細胞を栄養し、かつ神経軸索を伸長させうる活性のある分子が見つかってきており、種々の神経疾患に対する医薬品として臨床的に応用が期待されている。しかし、筋知覚神経に着目してみると、筋に由来する軸索伸長に関与する分子はこれまで神経栄養因子のひとつであるNT-3しか見つかっていない。しかし、NT-3という分子だけでは筋知覚神経の回路形成は不可能であることが指摘されている。すなわち、筋知覚の神経回路を構築するためには別の分子群の作用が必要である。
【０００４】
本発明者は、これまで行ってきた知覚神経の再生・機能的再建技術確立のための研究を通じて、NT-3以外の筋知覚神経の軸索を伸長する活性を有する分子の探索を行ってきた。その結果、骨格筋細胞株（不死化細胞）の培養上清に、知覚神経の軸索伸長・再生活性があることを見出した。すなわち、本発明は知覚神経軸索を伸長させる活性剤、およびその調製法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、骨格筋由来株細胞の培養上清中にNT-3とは異なる知覚神経軸索伸長を促進する因子を見出した。
【０００６】
本発明は、以下の知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質、それを含む溶液、およびその調製法に関する。
項１．  以下の性質を有するタンパク質：
(1)知覚神経軸索伸長活性を有する分泌タンパク質である；
(2)ヘパリンカラムに結合し、500mM NaClにより溶出される；
(3)標的細胞の液性因子である；
(4)ＦＧＦ２およびＮT-３のいずれとも相違する。
項２．  骨格筋不死化細胞に由来する項１に記載のタンパク質。
項３．  知覚神経軸索伸長活性がＮＴ−３よりも強力である項１に記載のタンパク質。
項４．  項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む培養上清または細胞溶解液。
項５．  骨格筋不死化細胞を誘導培地で培養し、知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質を培養上清中に産生し、該培養上清から知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質を分離、精製することを特徴とする知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質の調製法。
項６．  前記培養上清をヘパリンカラムを用いて精製することを特徴とする請求項５に記載の調製法。
項７．  骨格筋不死化細胞を誘導培地で培養し、知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質を培養上清を分離することを特徴とする。知覚神経軸索伸長活性を有する細胞上清の調製法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質は、知覚神経軸索伸長活性を有する。該タンパク質は、抗ＮＴ−３中和抗体の共存下でもその活性を失わないことから、NT-3ではないことが明らかである。
【０００８】
また、ヘパリン結合性を有することが知られているFGF2は知覚神経軸索伸長活性を実質的に有しないことから、FGF2とも相違している。
【０００９】
さらに、該タンパク質は、細胞上清中に存在する分泌タンパク質であり、１週間程度の培養により培養上清中に多量に蓄積させることができ、この培養上清から分離・精製することができる。
【００１０】
該タンパク質を分泌するＬ６細胞は、知覚神経軸索の標的組織である骨格筋の細胞を不死化したＬ６細胞であり、標的由来の液性因子である。知覚神経軸索の伸長因子としては、知覚神経軸索を標的細胞に導く作用を有するこのような標的由来の液性因子と細胞接着性因子の２種類が知られている。これらの因子のうち、細胞接着性因子（例えばラミニン、フィブロネクチン、NCAMなど）は数多く知られているが、標的由来の液性因子はあまり知られていない。
【００１１】
知覚神経の標的としては、骨格筋の他に、表皮、真皮などの皮膚組織（痛覚、温感、冷感、針で刺した痛みなどの表在知覚に関与）、結合組織（圧迫刺激に関与）などが例示される。
【００１２】
該タンパク質は、骨格筋不死化細胞から調製することが可能であるが、他の細胞から調製してもよい。骨格筋不死化細胞としては、ラット由来のＬ６細胞、マウス由来のＣ２Ｃ１２細胞、ヒト由来のTIG-2M-30細胞、H-EMC-SS細胞が例示される。
【００１３】
本発明の知覚神経軸索伸長タンパク質の好ましい具体例を以下の(1)〜(7)に示す。
（１）ラット骨格筋由来不死化細胞L6（以下L6細胞）を培養する。
（２）L6細胞の増殖にはダルベッコMEMに１０％ウシ胎児血清を加えた培地を用いる。
（３）知覚神経軸索伸長タンパク質発現誘導にはダルベッコMEMに0.5％ウシ胎児血清を加  えた誘導培地を用いる。
（４）知覚神経軸索伸長タンパク質は上記誘導培地に置き換えて４日〜７日間行ったのち、  上清を回収することで得られる。
（５）抗ウシ胎児血清タンパク質抗体を結合させたアフィニティカラムを用いて、培養上清  に含まれるウシ胎児血清タンパク質を取り除く。
（６）ヘパリンカラムに結合したのち20mM Hepes / 500mM NaCl によって溶出される分画に  知覚神経軸索伸長タンパク質は濃縮される。
（７）知覚神経軸索伸長活性はより生体に近いコラーゲンゲル内3次元培養法により評価す  る。
【００１４】
このような方法により、本発明のタンパク質を得ることができる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１
（L6細胞の培養法）
ラット骨格筋由来の細胞株L6を培養皿あるいは培養フラスコにて培養する。まず、L6細胞を増殖させるため以下の培養液を用いた。
【００１６】
ダルベッコMEM
ウシ胎児血清(最終濃度10%)
抗生物質（10U/mlペニシリン・10μg/mlストレプトマイシン・5μg/mlゲンタマイシン）
凍結保存していたL6細胞はまず細胞培養皿（60ｍｍφ）に106個撒いて増殖培地にて増殖させた。コンフルエントに達したら、培養フラスコ（25ｃｍ2、75ｃｍ2、125ｃｍ2）に順に継代し、細胞を増やしていく。増殖中のL6細胞の培養上清には知覚神経軸索伸長活性はほとんど認められなかった。各スケールアップにおいては約3日間の培養でL6細胞は増殖しコンフルエントに達する。
（知覚神経軸索伸長活性を有するタンパク質を含む培養上清の調整法）
１２５ｃｍ2のフラスコで培養したL6細胞がコンフルエントに達した時点で、筋管形成を誘導する培地に交換した。誘導には以下の培地を用いて４日〜７日培地交換を行わずに培養を行った。
【００１７】
ダルベッコMEM
ウシ胎児血清(最終濃度0.5%)
抗生物質（10U/mlペニシリン・10μg/mlストレプトマイシン・5μg/mlゲンタマイシン）
誘導培地においてはL6細胞は増殖を停止し、知覚神経軸索伸長タンパク質の産生が亢進し、培地に分泌され、培養上清に蓄積してゆく。この培養上清を回収し、遠心分離（3000rpm、1500g）によって細胞死骸、ゴミ等を取り除いて、知覚神経軸索伸長タンパク質を含む培養上清を調製した。
（培養上清の保存）
抗生物質を培養液に加えているために採取した培養上清も同様にコンタミネーションのおそれが無い。また、凍結保存は凍結融解の過程でタンパク質が変性することを避けるために、以下の神経軸索伸長評価に用いるまで冷蔵庫（４℃）にて保存した。
（3次元コラーゲンゲル培養法を用いた知覚神経軸索伸長活性の評価法）
知覚神経軸索伸長活性の評価にはニワトリ後根神経節知覚神経細胞を用いた。具体的には、３8℃にて7日間転卵しながらふ卵させた鶏卵より取り出したニワトリ胚をペトリ皿中のダルベッコPBS(-)（以下PBS(-)と表記）にて周囲の血液、および卵黄などを洗浄した。首から上、および、胸部・腹部内臓を取り出し、PBS(-)を満たした解剖皿に載せた。先鋭（INOX #5）なピンセット２本を用いて、腰部に残っている余分な結合組織、後腹膜臓器である腎臓などを取り除いた。腰部椎体の両側に走る交感神経幹および付着している血管・結合組織・脂肪組織を取り除いた。これによって露出した後根神経節を根元から切断し、個々の後根神経節を取り出し、ダルベッコMEM培地の中に一時保存した、さらに血液などを洗浄した。余分な神経束を眼科用微少手術ハサミあるいはタングステン針を用いて切り離し、球状の後根神経節を分離した。１個体から５対の腰部後根神経節を取り出した。ガラスベース３５ｍｍ培養皿（イワキ社製、ガラス部１２ｍｍφ）の凹部にコラーゲン中性溶液（KOKEN社製、0.2％中性コラーゲン（タイプI）／DMEM溶液、80μL〜９０μL）を氷温のまま加え、ゲルが固化する前に分離した後根神経節コラーゲンゲル中に移植した。３７℃、５％CO2インキュベータ内にて１〜2時間静置し、コラーゲンゲルを固化させた。0.22μｍフィルター（ミリポア社製）にてフィルター滅菌したL6細胞培養上清、ヘパリンカラム分画を培養皿、対照実験として、培地（DMEM培地のみ、DMEM培地＋10％FBS、DMEM培地＋２％FBS、DMEM+10％HS（馬血清））を培養皿に１ｍL加えゲルを覆い、かるく攪拌したのち、５％CO2インキュベータ内に戻し、36時間〜40時間培養した。添加物を加える場合には（抗NT3ブロッキング抗体、ヒトリコンビナントb-FGF等）を加えて同様に培養した。コラーゲンゲルは体の組織内に豊富にある細胞外基質タンパク質で、生体において神経軸索が伸長するとき足場を提供している基質のひとつである。したがって、この系ではより生体に近い状態で神経軸索の伸長を評価することができると考えられている。また、これまで知られている神経成長因子（NGF、NT-3 1-100ng/m）を加えることで軸索伸長が認められることから、この系における軸索伸長の評価が可能であることを確認している。
（伸長した軸索の可視化）
上記評価系において伸長した神経軸索は位相差顕微鏡を用いて観察できる。しかし、平面培養法と異なりコラーゲンゲル中であるため神経軸索の走行は立体的であり、観察が困難であった。また、伸長した線維が本当に神経軸索であることを示す必要もある。さらに、伸長した神経軸索の長さ、数等を定量的に評価するにあたり、神経に特異的な細胞骨格分子チューブリンβ（タイプIII）を認識するモノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学的に神経軸索を可視化した。この方法によって神経軸索は黒色の不溶性沈殿によって染色され、実体顕微鏡下で容易に観察することができた。まず、上記培養後、移植された後根神経節および伸長した神経軸索をコラーゲンゲルごと4％パラホルムアルデヒド／0.1M 燐酸緩衝液中にて1−2時間、氷上にて固定した。PBS(-)にて3回、各1時間洗浄し、ブロッキング溶液（トリス緩衝液／3％ウシ胎児血清／1% Tween20）にて6時間〜半日、抗体の非特異的結合をブロックした。１次抗体（抗神経特異的βチューブリン （Type III）モノクローナル抗体、1/500〜1/1000希釈、BAbCO社製）を用いて12時間〜16時間反応した。トリス緩衝液／１％ Tween20にて3回、各1時間洗浄し、2次抗体（抗マウスIgGビオチン標識、ABCキットelite (mouse)、Vector社製）、6〜８時間、それぞれ室温にて反応させた。同様に洗浄したのち、アビジン−ビオチン増感法（ABCキットVector社製）を用い、Ni-DAB溶液（0.02% DAB, 0.5% 硫酸ニッケルアンモニウムin TB）にて発色（室温で１０分以内）を行った。実体顕微鏡（ＭＺＦＬIII、ライカ社）あるいは正立顕微鏡（ＢＸ６０，オリンパス社、水深レンズ使用）にてNi-DABの金属錯体によって青黒色に染色された後根神経節知覚神経の細胞体あるいは伸長した神経軸索を観察し、冷却ＣＣＤカメラ（DP-50、オリンパス社製、CoolSnap、フォトメトリック社製）にて撮影した。MetaMorphデジタルイメージングソフトを用いて伸長した軸索の長さをピクセルとしてカウントし、伸長した軸索を定量化した。
【００１８】
得られた結果を図１に示す。
コラーゲンゲルの中に移植された後根神経節は平面解離培養とは異なり、生体内にあるときと同様に神経節（神経細胞の塊）を保持したまま生存する。このとき、神経軸索を伸長させる作用のある分子を培養液中に加えることによって知覚神経軸索がコラーゲンゲルの中に伸びてくる。これは、あたかも発生期において、神経節から伸び出した神経軸索が、3次元空間である生体内を標的に向かって伸長する現象を反映しているものと考えられている。
【００１９】
図１において、
DME＋2％ FBS： ダルベッコMEM培養液に２％ウシ胎児血清のみ加えた場合（ここでは２％FBSの一例を示している）、知覚神経細胞軸索は神経節（アステリスク）の中からコラーゲンゲルの中に伸長することはない。
【００２０】
DME＋10％ FBS： ダルベッコMEM培養液に１０％ウシ胎児血清のみ加えた場合（ここでは２％FBSの一例を示している）、知覚神経細胞軸索は神経節（アステリスク）の中からコラーゲンゲルの中に伸長することはない。この２つからウシ胎児血清は知覚神経細胞に対して神経軸索伸長活性は含まれない。
【００２１】
L6 CM： 培養液を骨格筋由来細胞株L6細胞の培養上清を用いると多数の知覚神経軸索がコラーゲンゲルの中に伸長してくる様子を示したもの。神経軸索は抗神経特異的チューブリン抗体を用いて免疫組織化学を行い、黒い線として見ることができる。矢印は神経節（アステリスク）から一番長く伸長した軸索を示している。
【００２２】
L6 CM＋αNT-3:  L6細胞の培養上清に十分量（１μｇ/ml）抗NT-3中和抗体を加えて培養しても、この伸長活性はほとんど阻害されない。矢印は神経節（アステリスク）から一番長く伸長した軸索を示している。
【００２３】
NT-3： 神経栄養因子のひとつであるNT-3（20 ng/ml）を培養液に加えると、（B）と同様に知覚神経軸索がコラーゲンゲルの中に伸長してくる。矢印は神経節（アステリスク）から一番長く伸長した軸索を示している。
【００２４】
NT-3＋αNT-3: 培養液に20ng/ml NT-3と1μｇ/mｌを加えて培養すると、NT-3による知覚神経軸索伸長活性は完全に阻害される
以上の結果をまとめると、20ngのNT-3という神経軸索伸長活性を十分に持つ量のNT-3の効果を完全に抑制する十分量の抗NT-3中和抗体によって、L6培養上清中の神経軸索伸長活性はまったく抑制されないことから、L6培養上清に含まれる知覚神経軸索伸長活性因子はNT-3とは異なる分子であると結論付けられる。
【００２５】
また、骨格筋由来細胞株培養上清の知覚神経軸索伸長活性の定量化の結果を図２に示す。
【００２６】
具体的には、L6細胞培養上清１つの後根神経節からコラーゲンゲル中に伸長した神経軸索の総長をデジタルイメージングによって計算し、比較した結果を図２に示す。図２において、ｎは個々の実験回数を示し、縦軸は総軸索長の平均を示している。対照実験（DME+FBS）に比べて約40倍の効果があることがわかる。L6細胞培養上清中の神経軸索伸長活性はこれまでに知られている筋知覚神経作用する神経栄養因子NT-3の最大効果と同等以上であり、非常に強力な活性を有していることがわかる。NT-3中和抗体でこの活性が抑制されないことから、NT-3とは異なる分子である。
【００２７】
（ヘパリンカラムによる知覚神経軸索伸長因子の粗精製法）
L6細胞培養上清から知覚神経軸索伸長活性を分離するために、ヘパリンカラム（HiTrap Heparin、アマシャム・ファルマシア社製）を用いた。まず、培養上清中に含まれるウシ胎児血清タンパク質を取り除くために、抗ウシ胎児血清ポリクローナル抗体をシアノジンブロマイド（CNBr）活性化セファロースに結合させて作製したアフィニティーカラムに培養上清を通して、含まれるウシ胎児血清タンパク質を取り除いた。次に、培養上清10mlをヘパリンカラムに結合させ、20mM Hepes (pH7.0)にて洗浄したのち、20mM Hepes (pH7.0)に200mM NaCl, 500mM NaCl, 1M NaCl, 2M NaClをそれぞれ加えた溶出バッファーにて溶出を行い、1ml ずつ分画を集めた。集めた分画はそれぞれPD-10カラムを用いて脱塩し、ダルベッコMEM培地に置き換え、0.22μmフィルターによって滅菌した。これを上記の知覚神経軸索伸長評価法によって評価した。
【００２８】
ヘパリンカラムクロマトグラフィーによって分けられたそれぞれの分画における神経軸索伸長活性の定量し、その結果を図３に示す。
【００２９】
具体的には、L6細胞上清に含まれる知覚神経軸索伸長活性因子がタンパク質でありヘパリンカラムによって濃縮できることを示す。図３において、元のL6細胞培養上清、200mM, 500mM, 1M, 2M NaCl溶出の各分画、ヘパリンに結合しなかったタンパク質を含む分画をコラーゲンゲル３次元知覚神経軸索伸長評価法を用いて評価した。定量は図２と同様、１つの後根神経節からコラーゲンゲル中に伸長した神経軸索の総長をデジタルイメージングによって計算し、比較した。ｎは個々の実験回数を示し、縦軸は軸索長の平均を示している。このグラフから500mM NaCl分画に約80％の活性が濃縮されていることがわかる。活性因子はその結果、20mM Hepes/500 mM NaClで溶出される分画に濃縮されていることが明らかになった。結合組織で発現しているヘパリン結合成長因子としては、線維芽細胞増殖因子FGF2 (basic FGFとも呼ばれる)が知られているが、この因子の本体である可能性を考え20 ng/ml rh FGF2を培養液中に加えてもまったく効果は認められなかった。したがって、L6細胞上清に含まれる因子はFGF2とは異なる分子である。
【００３０】
【発明の効果】
本発明は、知覚神経軸索伸長活性因子を骨格筋由来細胞株中に見出し、その粗精製法を示した。本発明によれば、知覚神経の軸索伸長を促進、障害を受けた知覚神経の再生を促す薬剤として有用である。また、この活性をもたらす細胞は骨格筋由来細胞株（不死化）細胞であるため、無限に増殖可能であり、細胞培養技術によって容易に大量調製することができる。
【００３１】
添付の図面から、本発明の知覚神経軸索伸長因子は：
（１）骨格筋由来細胞株であるL6細胞の培養上清に知覚神経軸索伸長活性があること；
（２）この知覚神経軸索伸長活性をもたらす因子はヘパリンカラムに結合するタンパク質で  、500 mM NaClによって溶出される分画に濃縮されることから粗精製されること；
（３）これまで知られている筋知覚神経の神経栄養因子NT-3とは異なること；及び
（４）これまで知られているヘパリン結合性因子FGF2 (basic FGF)とは異なること
が明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 コラーゲンゲル3次元培養法による知覚神経軸索の伸長を示す。
【図２】骨格筋由来細胞株培養上清の知覚神経軸索伸長活性の定量化
【図３】ヘパリンカラムクロマトグラフィーによって分けられたそれぞれの分画における神経軸索伸長活性の定量
【図１】
0004096089.tif 000002
【図２】
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【図３】
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