(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミン−６−リン酸、グルコサミン−６−硫酸またはＮ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンを有効成分とする抗Ｉ型アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグルコサミンあるいはグルコサミン誘導体の低親和性ＩｇＥリセプター（ＣＤ２３またはＦｃεＲII）への作用に基づく、抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、気管支喘息、蕁麻疹などの疾患の他、花粉症などのアレルギー性鼻炎や食品によるアトピー性疾患などのアレルギーが深刻な問題となっている。これらのアレルギー疾患に対しては、ステロイド剤に代表される薬剤による治療法があるが、望ましい効果が得られなかったり強い副作用が起こることもあり問題である。また、少量の抗原を投与させる減感作療法が行われているが、治療に長期間かかり、副作用が現れたり、望ましい効果が得られない場合もあるなど課題は多い。
【０００３】
上記のアレルギー性疾患はＩ型アレルギーに分類されるが、このＩ型アレルギー原因抗体がＩｇＥ抗体であることはよく知られている。
低親和性のＩｇＥリセプター（ＦｃεＲIIあるいはＣＤ２３、以下ＣＤ２３と略す）は分子サイズが、４５キロダルトンの膜たんぱく質で、Ｎ末端側が細胞の内側にあり、Ｃ末端側が細胞の外に出ている。ＣＤ２３は、一次構造からＣａ2+依存性（Ｃ−ｔｙｐｅ）レクチンのメンバーの一つとされ、ＣＤ２３のＩｇＥ結合領域は、レクチン領域とほぼ一致する。しかしながら、ＩｇＥとの結合には糖鎖を介せず、比較的低い親和性（Ｋａ＝約１０7 ）で結合する。ＣＤ２３の細胞外領域のＣ末端側は切断され、３７キロダルトンのフラグメントが生じる。これはさらに切断され、３３キロダルトン、２５キロダルトン、１２キロダルトンの分子種が生じる。これらの可溶性ＣＤ２３（以下ｓＣＤ２３と略す）のうち２５キロダルトン以上の分子サイズの分子種はＩｇＥ結合能を有する。
【０００４】
ＣＤ２３は、主に活性化されたＢ細胞で発現するが、Ｔ細胞、樹枝状細胞、単球、ランゲルハンス細胞、好塩基球でも発現する。ＣＤ２３やｓＣＤ２３は、アトピー性疾患などのアレルギーの原因となるＩｇＥ合成の調節に関与する。ＣＤ２３は、ＩｇＥの他に、ＣＤ２１とも結合し、ＩｇＥ合成を調節する他、単球上のＣＤ１１ｂあるいはＣＤ１１ｃとも結合し炎症反応にも関与していると考えられている。
【０００５】
近年、抗ＣＤ２３モノクローナル抗体がＩｇＥの合成を抑制し（Bonnefoy et al.,  1990, Eur. J. Immunol. 20, 139; Flores-Romo et al., 1993, Science, 261, 1038）、特にＣＤ２３のＩｇＥ結合領域に結合する抗ＣＤ２３モノクローナル抗体が、ＩｇＥの生産を抑制することから（Wakai et al., 1993, Hybridoma 12, 25）、ＣＤ２３のＩｇＥ結合領域（レクチン領域）の作用を抑制する物質を見いだすことができれば、ＩｇＥの合成を抑制することが可能であると考えられてきた。グルコサミンは、関節炎の治療薬として用いられてきた（Setnikar et al., 1991, Arzneim.-Forsch./Drug Res., 41, 542）。また、炎症、自己免疫疾患、ガン転移等の疾患に有効な抗炎症薬等としてグルコサミン誘導体が開発されてきた（特開平９−３０１９８８号公報）。さらに、グルコサミンのポリマーであるキトサンは免疫賦活作用、抗腫瘍作用や抗菌作用などが報告され（キチン、キトサン研究会編、キチン、キトサンの応用、技報堂出版、１９９０年）、最近では、抗凝結作用を持つスルホン化キトサンが開発されている（化学工業日報、１９９８年１月６日記事）。しかしながら、グルコサミンあるいはグルコサミン誘導体に、アレルギー、特にＩ型アレルギーを抑える作用のあることは知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、アレルギー疾患が問題となっているのにも関わらず、有効な抗アレルギー剤は未だ開発されていない。
また、ＣＤ２３がアレルギーに関与するＩｇＥ抗体の生産を調節していることがわかっているが、ＣＤ２３の作用を抑制する物質は見出されていない。本発明は、ＣＤ２３の作用を抑制し、副作用を伴わず、Ｉ型アレルギーの予防、治療に有効な組成物を提供せんとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、この目的のために鋭意検討を続けてきた結果、特定のグルコサミン誘導体が、ＣＤ２３に対して作用し、ＩｇＥとの結合を阻害し、抗アレルギー剤として利用できることを見いだし、本発明を完成した。
従って、本発明の抗アレルギー剤は、一般式（Ｉ）：
【化２】
0004178584.tif 000002
［式中、Ｒ1 は糖類の残基、炭素原子数１ないし２０のアルキル基または水素原子を表し、Ｒ2 およびＲ3 は互いに独立してベンジル基または水素原子を表し、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は互いに独立して硫酸基、リン酸基あるいは水素原子を表す。］
で表されるグルコサミン誘導体もしくはそれらの塩のなかで、グルコサミン−６−リン酸、グルコサミン−６−硫酸またはＮ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンを有効成分として含有することを特徴とするものである。
【０００８】
上記置換基の定義において、糖類の残基としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、アラビノースおよび上記の一般式（Ｉ）と同一構造を繰り返し構造単位とするもので、例えば該構造単位が１ないし５個、好ましくは１ないし３個結合したものなどが挙げられる。
炭素原子数１ないし２０のアルキル基としては、直鎖または枝分かれ鎖のいずれのものでもよい。好ましくは、炭素原子数１〜１２、更に好ましくは１〜６のアルキル基である。
【０００９】
好ましい化合物としては、例えば、Ｒ1 が糖類の残基、アルキル基または水素原子を表し、Ｒ2 およびＲ3 が水素原子を表し、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 が互いに独立して硫酸基、リン酸基あるいは水素原子を表す化合物、または、Ｒ1 が糖類の残基、アルキル基または水素原子を表し、Ｒ2 およびＲ3 がベンジル基を表し、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は水素原子を表す化合物などが例示できる。
【００１０】
本発明のグルコサミンあるいはグルコサミン誘導体は、ＣＤ２３中の活性領域に対して作用し、アレルギーと関係するＩｇＥやＣＤ２１とＣＤ２３の結合を抑制することにより抗アレルギー作用を発揮するものと考えられる。さらにＣＤ２３は、単球上の糖蛋白質であるＣＤ１１ｂやＣＤ１１ｃと結合し、炎症作用に関わるが、この作用もグルコサミンあるいはグルコサミン誘導体が阻害するものと考えられる。
【００１１】
本発明の抗アレルギー剤として使用できる化合物は、グルコサミンあるいはグルコサミン誘導体であり、天然あるいは合成品のいずれも使用できる。本発明品を得るための製造法にはなんら制限がなく、化学的、酵素的、あるいは生物学的に製造することができる。例えば、キチンやキトサン、糖蛋白質糖鎖、グリコサミノグリカンなどの天然物の化学的あるいは酵素的な分解により得ることができ、天然物の分解物をさらにリン酸化や硫酸化、エステル化、グリコシル化などの化学処理することによって得ることができる。天然物の場合、その由来は制限されない。例えば、かに殻などから得られるキチンを酸により加水分解して得られるグルコサミンなどを利用することができる。
【００１２】
グルコサミン誘導体の製造法は特に限定されないが、例えば、グルコサミン−６−硫酸の場合、Bruce らの方法（Bruce et al., 1985, Eur. J. Biochem. 152, 75-82 ）で化学合成することができる。また、グルコサミン−６−リン酸の場合、Szymona らの方法（Szymona et al., 1980, Ann. Univ. Mariae Curie-Sklodowska, Sect. D. 35, 1-6）で酵素合成できる。
また、Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンの場合は、例えば次の方法で合成できる。Ｄ−グルコサミン塩酸塩１ｍｍｏｌ（２１６ｍｇ）、ベンズアルデヒド２ｍｍｏｌ（２１２ｍｇ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム３ｍｍｏｌ（１８９ｍｇ）を５０％メタノール水溶液５ｍｌに溶解し、２５℃で１６時間振とうし、生成物を逆相クロマトグラフィーで精製して、目的物１９０ｍｇ（収率５３％）を得る。これらの化合物の構造はプロトンＮＭＲで確認した。
【００１３】
本発明にかかるグルコサミンの塩型は、特に限定されず、例えばグルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩などが使用できる。さらに、グルコサミン誘導体の場合においても、塩型は何ら限定されない。例えば、リン酸化グルコサミン、硫酸化グルコサミンの塩型は限定されず、ナトリウム、カリウム、バリウム、カルシウムなどの塩が利用される。グルコサミンは自然界に広く存在するため、安全性が極めて高い。従って、医薬品として利用できるだけでなく、健康食品、栄養素食品、機能性食品などのほか広く一般食品に添加することができる。
【００１４】
本発明による組成物は、有効成分としてグルコサミンあるいはグルコサミン誘導体が含まれていることが重要であって、他の医薬品、化学薬品、成型用の助剤、食品成分や食品添加物が含まれていても差し支えない。例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアガム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等を添加しても構わない。また、ｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤、或いは必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて製品化することができる。
【００１５】
また、必要に応じて、他の抗アレルギー作用を有する成分、消炎作用を有する成分、免疫賦活作用を有する成分、ビタミン類、タンパク質、糖類、トリグリセライド、脂肪酸、ステロールなどの油脂、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤などの成分を配合することもできる。
【００１６】
本発明品を投与する形態は、食品に用いる場合は経口であるが、その他薬として利用する場合は、経口の他、経皮投与、あるいは注射による投与が可能である。食品に添加する場合以外の投与剤型としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤などの経口製剤、軟膏、貼付剤等の外用剤および注射剤が考えられる。本発明の有効成分を摂取あるいは投与する場合の量は、症状、年齢などにより異なり、特に限定されないが、通常成人一日当たり５０ｍｇ〜５０００ｍｇであり、好ましくは１００ｍｇ〜３０００ｍｇ、さらに好ましくは２００ｍｇ〜２０００ｍｇである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の態様を示すが、本発明の趣旨はもとよりこれらに限定されるものではない。
【００１８】
【性能評価】
１．ＣＤ２３とＩｇＥの結合阻害試験
(1) 試験方法
ＣＤ２３とＩｇＥの結合阻害試験は、佐藤らの方法（Sato et al., 1997, J. Immunol. Methods, 209, 59-66）によって行った。この方法は、ＣＤ２３分子を多く発現する細胞とＩｇＥおよび被験サンプルを混合し、結合したＩｇＥの量を比較することで、被験サンプルがどの程度ＩｇＥとＣＤ２３の結合を阻害するかをみる方法である。以下、試験方法を簡単に説明する。
本試験には着脱可能なメンブレンフィルターカップ付きのマイクロ遠心チューブを利用する。試験前に次の溶液を準備する。
▲１▼５０μｌのＩｇＥ溶液（５μｇ  ＩｇＥ／ｍｌＴＢＳ（トリス塩酸緩衝液）：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．３／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／２ｍＭ  ＣａＣｌ2 ／ｌ  ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ）、
▲２▼被験サンプル溶液  ５０μｌ、
▲３▼Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓによって形質転換されたヒトＢ細胞株Ｌ−ＫＴ９の懸濁液（１．５×１０5 細胞／１００μｌＴＢＳ）。
【００１９】
▲１▼のＩｇＥ溶液を５０μｌ、▲２▼のサンプル溶液を５０μｌ、▲３▼のＬ−ＫＴ９細胞懸濁液を１００μｌフィルターカップ内で混合し、４℃で２時間放置した。インキュベーション後、２０００×Ｇにて５分間遠心し、細胞と結合していない余分なＩｇＥを除去した。さらに、細胞を洗浄するために２００μｌのＴＢＳを加え、すぐに遠心した。この洗浄操作を２度繰り返した後、２００μｌの０．１ＭＥＤＴＡ／０．１Ｍ  ＰＢＳ（リン酸緩衝液ｐＨ７．３）により細胞上のＣＤ２３と結合しているＩｇＥを溶出した。溶出されたＩｇＥの量をＥＬＩＳＡによって分析した。▲２▼の被験サンプル溶液のかわりに、ＴＢＳだけを使用したものをコントロールとし、コントロールの結果と被験サンプルの結果を比べて結合がどれだけ阻害されたかを観察した。
被験サンプルとして、抗ＣＤ２３モノクローナル抗体（９Ｐ２５）（コスモバイオ社製）、マンノース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、グルコサミン、グルコサミン−６−リン酸、グルコサミン−６−硫酸、Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンを試験した。
【００２０】
(2) 試験結果
試験結果を図１に示す。図１の結果から、ＣＤ２３とＩｇＥの結合が、グルコサミン、グルコサミン誘導体、特にリン酸化グルコサミン、硫酸化グルコサミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンによって阻害されることがわかる（図中に阻止率として表示）。
ＣＤ２３がレクチン領域をもつことから、本性能評価の対照としては糖類を中心に調べた。しかしながら、マンノース、ガラクトース、グルコース、ラクトースでは、ＣＤ２３とＩｇＥの結合に影響を与えなかった。一方、抗ＣＤ２３モノクローナル抗体と同様、本発明のグルコサミン、グルコサミン−６−リン酸、グルコサミン−６−硫酸およびＮ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンによって、ＣＤ２３とＩｇＥの結合は明確に阻害された。この結果により、グルコサミンおよびグルコサミン誘導体が、アレルギーの原因となるＩｇＥ抗体生産に関わるＣＤ２３に作用することが明確となった。
【００２１】
２．ＰＣＡ（ラット受動皮膚アナフィラキシー）反応試験
グルコサミン誘導体の一つであるＮ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンをマウスに投与し、トリニトロフェニル−アスカリス（ＴＮＰ−Ａｓ）を水酸化アルミニウムＬゲル（Alum）とともに感作した際のＩｇＥ抗体産生能に対する作用を、ラットＰＣＡ反応による漏出色素班を指標に検討した。
【００２２】
(1) 試験方法
感作動物として日本チャールズ・リバー株式会社より８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ  Ｃｒｊ系雌性マウスを、ＰＣＡ反応用の受身動物として日本エスエルシー株式会社より８週齢のＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを購入して使用した。入荷後、一週間以上の検疫訓化期間中に一般状態の観察および体重測定を行い、健康と判断した動物を試験に使用した。マウスの感作は１群５匹とし、Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンの２０および１００ｍｇ／ｋｇと媒体（生理食塩水）投与の対照群の計３群を設定した。Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンの投与は、注射針を用いて腹腔内に投与し、投与容量はいずれも１０ｍｌ／ｋｇとした。群分けは感作のためのマウスは被検物質投与前の体重を基に層別連続無作為化法で、惹起試験のラットは皮内投与前に体重の重い方から使用した。
【００２３】
マウスにＴＮＰ−Ａｓ  ５μｇを吸着させたＡｌｕｍ  １ｍｇを含む生理食塩水０．２ｍｌを腹腔内に１回投与して感作した。被検物質投与群および対照群では感作直後から１日１回５日間被検物質または媒体を投与し、感作１０日後に採血した。得られた血清を用いてラットＰＣＡ反応（一定倍率希釈血清法：タイター）により、ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の産生量を求めた。
【００２４】
抗ＴＮＰ−Ａｓマウス血清を生理食塩液で２の倍乗となるように希釈し、予め、刈毛されたラットの背部に０．０５ｍｌ／ｓｉｔｅ皮内投与した。なお、各血清とも２匹のラットを用いた。皮内投与の２４時間後、ＴＮＰ−ＢＳＡ１ｍｇとエバンスブルー５ｍｇを含む生理食塩液１ｍｌを尾静脈より投与して反応を惹起した。ＰＣＡ反応惹起３０分後にエーテル麻酔下で放血致死させ、背部皮膚を剥離して反応部位の青染円の長径および短径を測定し、平均直径［（長径＋短径）／２］が５ｍｍ以上のものを陽性と判定した。ＰＣＡ反応陽性を示す最高希釈倍数をＰＣＡ反応抗体価とした。
得られた試験成績は、平均値および標準誤差で表し、対照群と各被検物質群については分散分析を行い、群間の差が有意な場合は Dunnett’multiple test を行った。いずれの検定においても有意水準は５％以下とした。
【００２５】
(2) 試験結果
試験結果を下表に示す。
【表１】
0004178584.tif 000003
コントロール（投与量０）と比較して有意差あり（Dunnett's multiple test ）
【００２６】
対照群（投与量０）のマウス血清（抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体）のラットＰＣＡ抗体価は１６６倍であった。Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンの２０および１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与ではＰＣＡ抗体価が１２２および１０９倍と用量依存的に抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体産生を抑制した。
このことから、Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミンが、Ｉ型アレルギーの原因となる特異的ＩｇＥの産生を抑制することが明らかとなった。
Ｎ，Ｎ−ジベンジルグルコサミン以外の他のグルコサミン誘導体も同様の結果を示した。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１
0004178584.tif 000004
これらを混合した後、ゼラチンを用いてカプセル化する。
【００２８】
実施例２
0004178584.tif 000005
これらを混合した後、打錠して錠剤とする。
【００２９】
実施例３
0004178584.tif 000006
【００３０】
実施例３
0004178584.tif 000007
【００３１】
【発明の効果】
本発明に従って処方された抗アレルギー剤は、グルコサミンあるいはグルコサミン誘導体を含み、ＣＤ２３の作用を抑制することにより、良好な抗アレルギー作用が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ２３とＩｇＥの結合阻害試験の結果を示すグラフである。
【図１】
0004178584.tif 000008