(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ポリ （エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーの存在しないＰＥＧポリマーを含み、少なくとも１つの該ＰＥＧポリマーが分岐ポリオール部分を有し、該ＰＥＧポリマーが互いに反応性の基を介して架橋されており、該ＰＥＧポリマー間に少なくともいくつかは加水分解に不安定な結合を含む、架橋されたポリマーであって、該加水分解に不安定な結合が、該架橋されたポリマー中の隣接するＰＥＧポリマー部分の間の結合の少なくとも一部であり、該加水分解に不安定な結合が、エステル、イミン、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれ、式
【化１】
0004083384.tif 000014
から成る群から選ばれる式を有する架橋されたポリマーであって、ｍは重合度を示し、ｐは３〜１０で、該架橋されたポリマーを形成するポリマー上のアームの数を表しており、Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリトリトール、ソルビトール、トリメチオールプロパン、およびジ（トリメチロールプロパン）から成る群から選ばれた部分であり、Ｒ′は１〜１０の炭素を有する炭化水素のフラッグメントであり、Ｗは、エステル、イミン、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれる結合を含む加水分解に不安定な結合であり、Ｘは、アミド、ウレタン、尿素、アミン、およびスルホンアミドから成る群から選ばれた結合を含む加水分解に安定な結合である、架橋されたポリマー。
【請求項２】
上記ポリマーが、加水分解を受けるＰＥＧヒドロゲルを水の存在下で形成している、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
【請求項３】
上記形成されるＰＥＧヒドロゲルが、上記ＰＥＧポリマー間の構造によって決められる加水分解速度を有する、請求項２に記載の架橋されたポリマー。
【請求項４】
上記ＰＥＧポリマー間の結合が、上記加水分解に不安定な結合に隣接した一以上のメチレン基を含む、請求項３に記載の架橋されたポリマー。
【請求項５】
上記加水分解速度が、上記メチレン基の数が増加するにつれて減少する、請求項４に記載の架橋されたポリマー。
【請求項６】
上記加水分解に不安定な結合が、カルボン酸エステルおよびリン酸エステルから成る群から選ばれる結合を含む、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
【請求項７】
上記加水分解に不安定なカルボン酸エステル結合が、ＰＥＧアルコールとＰＥＧカルボン酸との反応生成物であり、上記加水分解に不安定なリン酸エステル結合が、ＰＥＧアルコールとＰＥＧホスフェートとの反応生成物である、請求項６に記載の架橋されたポリ マー構造体。
【請求項８】
上記イミンが、アミンとアルデヒドとの反応生成物であり、上記ヒドラゾンが、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であり、上記アセタールが、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であり、上記オルトエステルが、ホルメートとアルコールとの反応生成物であり、上記加水分解に不安定なペプチド結合が、アミンおよびカルボキシルで終結したＰＥＧ−ペプチド接合体の反応生成物であるペプチド結合並びにカルボン酸およびアミンで終結したＰＥＧ−ペプチド接合体との反応生成物であるペプチド結合からなる群から選ばれた結合を含み、上記加水分解に不安定なオリゴヌクレオチド結合が、ホスホルアミダイトと５'−ヒドロキシで終結したＰＥＧオリゴヌクレオチドとの反応生成物である、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
【請求項９】
上記アミド結合が、エステルとアミンとの反応生成物であり、上記ウレタン結合が、イソシアナートとアルコールとの反応生成物であり、上記尿素結合が、イソシアナートとアミンとの反応生成物であり、上記加水分解に安定なアミン結合が、還元剤の存在下でのアルデヒドとアミンとの反応生成物およびエポキシドとアミンとの反応生成物から成る群から選ばれ、上記スルホンアミド結合がアミンとスルホン酸エステルとの反応生成物である、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
【請求項１０】
上記アミド結合が、カルボン酸エステルとアミンとの反応生成物である、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
【請求項１１】
上記加水分解に不安定な結合Ｗが、アルコールとカルボン酸との反応生成物であるカルボン酸エステル結合、アルコールとホスフェートとの反応生成物であるリン酸エステル結合、アミンとアルデヒドとの反応生成物であるイミン結合、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合、ホルメートとアルコールとの反応生成物であるオルトエステル結合、アミンおよびカルボキシルで終結しているＰＥＧ−ペプチド接合体との反応生成物であるペプチド結合ならびにカルボン酸およびアミンで終結しているＰＥＧ−ペプチド接合体との反応生成物であるペプチド結合、およびホスホルアミダイトと５'−ヒドロキシルで終結しているＰＥＧオリゴヌクレオチドとの反応生成物であるオリゴヌクレオチド結合を含む、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
【請求項１２】
式
【化２】
0004083384.tif 000015
を有する架橋されたポリマーであって、ｍは重合度を示し、ｐは約３〜１０で、該架橋されたポリマーを形成するポリマー上のアームの数を表しており、Ｒは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリトリトール、ソルビトール、トリメチオールプロパン、およびジ（トリメチロールプロパン）から成る群から選ばれた部分であり、そしてｎは約１〜１０である、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
【請求項１３】
非ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーの存在しないＰＥＧポリマーを含み、該ＰＥＧポリマー間に少なくともいくつかは加水分解に不安定な結合を含む架橋されたポリマーの製造方法であって、線状ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を分岐ＰＥＧと反応させて少なくともいくつかは加水分解に不安定な結合を有する架橋ポリマーを提供することを含み、上記加水分解に不安定な結合が、エルテル、イミン、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれる、架橋されたポリマーの製造方法。
【請求項１４】
式Ｚ−ＰＥＧ−Ｚの線状ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーを式Ｒ（ＣＨ2−Ｏ−ＰＥＧ−Ｙ）pの分岐ＰＥＧポリマーと反応させて式｛Ｒ［ＣＨ2−Ｏ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−Ｗ−］p｝mの架橋されたポリマーを提供することを含む架橋されたポリマーの製造方法であって、ｍは重合度を示し、ｐは約３〜１０で、該架橋されたポリマーを形成するポリマー上のアームの数を示し、Ｒは複数アームの付いたＰＥＧを作るのに適した分岐ポリオール部分であり、ＺはＹと反応して加水分解に不安定な基Ｗを生成し、ＺおよびＹはアルコール、カルボン酸、アミン、アルデヒド、ヒドラジド、アルデヒド、ホスフェート、ホルメート、カルボキシルで終結したＰＥＧ−ペプチド、アミンで終結したＰＥＧ−ペプチド、ＰＥＧホスホルアミダイト、および５′−ヒドロキシルで終結したＰＥＧオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれ、Ｗは、エステル、イミン、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれる、架橋されたポリマーの製造方法。
【請求項１５】
線状ポリ （エチレングリコール）（ＰＥＧ）を次の式により分岐ＰＥＧポリマーと反応させることを含む架橋されたポリマーの製造方法であって、
【化４】
0004083384.tif 000016
Ｗは、エステル、イミン、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれ、Ｕは、Ｖと反応してＸを生成し、ＵおよびＶは、活性エステル、アミン、イソシアナート、アルデヒド、エポキシド、および硫酸エステルから成る群から選ばれ、Ｘは、アミド、ウレタン、尿素、アミン、およびスルホンアミドから成る群から選ばれ、ｍは重合度を示し、ｐは、３〜１０で、該架橋されたポリマーを形成するポリマーのアームの数を示し、Ｒは、複数アームを持ったＰＥＧを作るのに適した分岐ポリオール部分である、架橋されたポリマーの製造方法。
【請求項１６】
線状ポリ （エチレングリコール）（ＰＥＧ）を次の式により分岐ＰＥＧポリマーと反応させることを含む架橋されたポリマーの製造方法であって、
【化５】
0004083384.tif 000017
Ｒ′は、１〜１０の炭素を有する炭化水素フラッグメントであり、Ｗは、エステル、イミン、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれ、Ｕは、Ｖと反応してＸを生成し、ＵおよびＶは、活性エステル、アミン、イソシアナート、アルデヒド、エポキシドおよび硫酸エステルから成る群から選ばれ、Ｘは、アミド、ウレタン、尿素、アミン、およびスルホンアミドから成る群から選ばれ、ｍは重合度を示し、ｐは、３〜１０で、該架橋されたポリマーを形成するポリマーのアームの数を示し、Ｒは、複数のアームを持ったＰＥＧを作るのに適した分岐ポリオール部分である、架橋されたポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）ヒドロゲル、その前駆体、該前駆体およびヒドロゲルの作製方法、ならびに該前駆体およびヒドロゲルの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、その最も一般的な形態において、各末端がヒドロキシル基で終わる線状ポリマーである：
【化６】
ＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ
このポリマーは、簡略化された形ではＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すことができる。この場合、−ＰＥＧ−は下記の構造単位を表していることが理解される：
【化７】
−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−
ｎは、典型的には、約１０〜２０００の範囲である。
【０００３】
ＰＥＧは生物工学において非常に利用されており、そして様々な適用において有用である。このような適用は、ヒドロゲルとしての適用が含まれるが、薬物送達のため、そして表面を改変して非付着性を促進させるために行われ、そして様々な薬物および表面に共有結合させるために行われる。ＰＥＧは毒性がなく、免疫応答を促進する傾向を有さず、そして水および多くの有機溶媒に溶解し得る。
【０００４】
ＰＥＧポリマーは、不溶性分子に共有結合させて、得られるＰＥＧ−分子の結合体を可溶性にすることができる。例えば、グリーンワルド（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ）、ペンドリ（Ｐｅｎｄｒｉ）およびボリカル（Ｂｏｌｉｋａｌ）は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０、３３１頁から３３６頁（１９９５年）において、水に溶けない薬物のタキソールは、ＰＥＧに結合させたとき、水に溶解し得ることを記載している。
【０００５】
デービス（Ｄａｖｉｓ）他は、米国特許第４，１７９，３３７号において、ＰＥＧに結合させたタンパク質は、腎臓クリアランス速度の低下および低下した免疫原性のために血中循環半減期が増大していることを記載している。ポリマーに毒性がないことおよび身体からのそのクリアランス速度は、薬学的適用での重要な検討事項である。薬学的適用および多くの主要な参考が、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）による書籍（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編、「ポリ（エチレングリコール）化学の生物医学的および生物工学的な適用（Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene Glycol Chemistry)」、Plenum、New York、１９９２年）に記載されている。
【０００６】
ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（あるいは、簡便には、ｍＰＥＧ）として広く使用されている。これは、一方の末端が比較的不活性なメトキシ基であり、そしてもう一方の末端が、化学的改変が容易に行われるヒドロキシル基である。
【化８】
ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ    ｍＰＥＧ
【０００７】
ＰＥＧは、また、エチレンオキシドを様々なポリオール類（これにはグリセロール、ペンタエリトリトールおよびソルビトールが含まれる）に付加することにより調製することができる分岐状の形態で広く使用されている。例えば、ペンタエリトリトールから調製される４アーム型の分岐状ＰＥＧを下記に示す：
【化９】
0004083384.tif 000002
【０００８】
分岐状ＰＥＧは、一般形ではＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）nと表すことができる：この場合、Ｒは、グリセロールまたはペンタエリトリトールを含むことができる中心のコア分子を表し、そしてｎはアームの数を表す。
【０００９】
ＰＥＧを分子に結合させるためには、ＰＥＧの「活性化誘導体」を使用することが必要である。ＰＥＧ末端に位置するヒドロキシル基または化学的改変が容易に行われる他の基は、そのような基を、タンパク質、表面および酵素などが含まれる別の分子の基との反応に好適な官能基で修飾または置換することによって活性化される。例えば、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジル「活性エステル」は、イワサキ（Ｋ．Ｉｗａｓａｋｉ）およびイワシタ（Ｙ．Ｉｗａｓｈｉｔａ）により米国特許第４，６７０，４１７号に記載されているように、タンパク質表面のアミノ基との共有結合を形成する。
【００１０】
米国特許第４，６７０，４１７号に記載されている合成を、タンパク質のアミノ基と反応する活性エステルとともに下記に示す：この場合、スクシンイミジル基はＮＨＳと表され、タンパク質はＰＲＯ−ＮＨ2と表されている：
【化１０】
0004083384.tif 000003
【００１１】
ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ2−ＮＨＳなどのスクシンイミジル「活性エステル」は、活性化されたカルボン酸ＰＥＧの形態で広く使用されている。これらは、様々なカルボン酸ＰＥＧをＮ−ヒドロキシルスクシンイミドと反応することにより調製される。
【００１２】
様々な問題がこの分野で生じている。ＰＥＧを活性化するために使用されている官能基の中には、インビボでの薬物送達のために使用したときに、毒性の残基またはそうでなければ望ましくない残基を生じさせ得る官能基がある。官能基をＰＥＧに結合させるために工夫されている結合の中には、望ましくない免疫応答を生じさせ得る結合がある。いくつかの官能基は、タンパク質表面の特定の基との反応に十分な選択性またはそうでなければ適切な選択性を有さず、タンパク質を不活性化させ易い傾向を有し得る。
【００１３】
水で膨潤したゲルであるＰＥＧヒドロゲルが、外傷被覆および薬物送達のために使用されている。ＰＥＧヒドロゲルは、水の添加によって不溶性の膨潤ゲルが得られるように、化学的に架橋された網目構造体またはマトリックスに可溶性の親水性ポリマーを取り込むことによって調製される。薬物として有用な物質は、典型的には、インビボでの送達を行うためにＰＥＧヒドロゲルに共有結合していない。その代わりに、物質が架橋マトリックスの内部に捕捉され、そして物質はマトリックス内のすき間を通過する。この不溶性マトリックスは身体内に限りなく留まることができ、そして薬物放出の制御は、典型的にはあまり精密ではあり得ない。
【００１４】
このようなヒドロゲルを調製する１つの方法が、エンブレイ（Ｅｍｂｒｅｙ）およびグラント（Ｇｒａｎｔ）により米国特許第４，８９４，２３８号に記載されている。線状ポリマーの末端が、様々な強固で非分解性の化学的結合により連結されている。例えば、線状ＰＥＧは、トリオールおよびジイソシアネートを反応させて、水中で分解しない加水分解に安定なウレタン結合を形成させることによって架橋網目構造体に組み込まれる。
【００１５】
ＰＥＧヒドロゲルの調製に関する関連の方法が、ギャエット（Ｇａｙｅｔ）およびフォーティエ（Ｆｏｒｔｉｅｒ）によりＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、３８、１７７頁から１８４頁（１９９６年）に記載されている。この場合、線状のＰＥＧが、ｐ−ニトロフェニルカーボネートとして活性化され、そしてタンパク質（ウシ血清アルブミン）との反応により架橋された。形成された結合は加水分解に安定なウレタン基であり、そしてこのヒドロゲルは水中で分解しない。
【００１６】
チュウ（Ｎ．Ｓ．Ｃｈｕ）により米国特許第３，９６３，８０５号に記載されている別の方法において、非分解性のＰＥＧ網目構造体が、多官能性モノマーと混合されたフリーラジカル開始剤を使用することにより形成された他のポリマーとのＰＥＧ鎖の不規則な絡み合いによって調製されている。キング（Ｐ．Ａ．Ｋｉｎｇ）は、米国特許第３，１４９，００６号において、高分子量のＰＥＧを放射線誘導で架橋することにより調製された非分解性のＰＥＧヒドロゲルを記載した。
【００１７】
ナガオカ（Ｎａｇａｏｋａ）他は、米国特許第４，４２４，３１１号において、ＰＥＧメタクリレートを、メタクリル酸メチルなどの他のコモノマーと共重合することによってＰＥＧヒドロゲルを調製した。実質的な非ＰＥＧポリマー成分がこの方法によって導入される。ビニル重合することにより、ＰＥＧが結合したポリエチレン骨格が得られる。メタクリル酸メチルコモノマーは、さらなる物理的強度をゲルに与えるために加えられている。
欧州特許出願ＥＰ０５９３２８４号には、鎖の末端において、光化学的または熱化学的に活性化した架橋基を用いる、ポリ（エチレングリコール）の合成と使用について開示されている。光または熱に、それぞれ暴露することで、これらの架橋基はアルキル化またはアシル化し、ポリマーの骨格の種々の結合（bonds）と無作為的に反応する。このポリマーは、生分解可能なペプチドを含みうる。これらのペプチドは、酵素が触媒する反応によって分解される。
欧州特許出願ＥＰ０７９４２１１号および欧州特許出願ＥＰ０７７１８３２号は、ポリマーが高温溶解重合（high temperature melt polymerization）によって生成される、コポリマーおよびポリエステルと他の成分とのブレンドに関する。このエステルは、−Ｏ−ＣＨ2ＣＯ2−部分を含むアセテートエステルである。これらのエステルは、加水分解し、毒性のある化合物であるエチレングリコールを生成すると考えられる。
【００１８】
サウニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）、パサク（Ｐａｔｈａｋ）およびハベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６、５８１頁（１９９３年）において、下記に示されているように、アクリレート基の末端を有するポリグリコリドまたはポリラクチドおよびＰＥＧのブロックコポリマーの調製を記載している。
【００１９】
【化１１】
0004083384.tif 000004
上式において、グリコリドブロックは−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ユニットであり；メチル基をメチレンに加えることによってラクチドブロックが得られ；ｎは２の倍数であり得る。アクリレート基のビニル重合によって、ポリエチレン骨格を有する不溶性の架橋ゲルが得られる。
【００２０】
実質的に非ＰＥＧ成分がヒドロゲルに導入される。エステル基である上記ポリマー骨格のポリラクチドまたはポリグリコリドのセグメントは、ゆっくりと加水分解的に分解されやすく、その結果として、架橋ゲルは、ゆっくり分解して溶解する。
【００２１】
非ＰＥＧ成分は、ヒドロゲルに複雑さを持ち込み易く、そしてマトリックスの分解および溶解によって、ヒドロゲルが薬物送達のためにインビボで使用されたときに、望ましくない成分または毒性成分が血流中に放出され得る。
【００２２】
薬物送達に好適であり、そして薬物送達システムを増強し得る特徴的な特性を有する代替可能なＰＥＧヒドロゲルを提供することが望ましい。
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、制御された分解が可能な化学的に架橋された分解性のＰＥＧヒドロゲル、および非ＰＥＧ成分の非存在下でこのようなＰＥＧヒドロゲルを作製するための方法を提供する。架橋が加水分解により分解され、そしてマトリックスの内部に捕捉され得る薬物分子を放出する弱い化学的結合がヒドロゲルに導入される。ゲルは実質的に非毒性のＰＥＧフラグメントに分解され、そしてこのフラグメントは典型的には身体から除去される。加水分解に不安定な結合の周りの原子を変化させることによって、加水分解による分解速度および薬物放出を精密に制御することができる。加水分解に不安定な結合の例には、カルボン酸エステル、リン酸エステル、アセタール、イミン、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴペプチドが含まれる。このような弱い結合は、下記に示されているように、異なる末端基を有する２つのＰＥＧを反応することによって得られる：
【化１２】
−ＰＥＧ−Ｚ  ＋  Ｙ−ＰＥＧ−  →  −ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−
上記において、−Ｗ−は、加水分解に不安定な弱い結合を表す。Ｚ−およびＹ−は、互いに反応して弱い結合−Ｗ−を形成し得るＰＥＧ分子の末端に位置する基を表す。
【００２４】
例えば、Ｚ基およびＹ基の下記の組合せを使用して、上記のＷ基のいくつかを得ることができる：
【化１３】
0004083384.tif 000005
【００２５】
本発明のＰＥＧヒドロゲルは、２工程または１工程のいずれかの方法で作製することができる。１工程の方法では、適切な末端基を有する２つの異なるＰＥＧを１段階で反応させる。本発明による１工程法の具体例を、線状のＰＥＧ酸を、ヒドロキシル基の末端を有する３アーム型ＰＥＧと連結することに関する下記の式で示す。弱いエステル結合が形成される。
【化１４】
0004083384.tif 000006
【００２６】
重合度はｍによって示され、これは、「マトリックス」を示し、そして固体の集合物として架橋ポリマーが形成されることを示すことを目的とする。ｎは約１から約１０の整数であり、ゲルが加水分解する速度を制御するために変化させることができる。一般的には、Ｎを大きくすることで、加水分解する速度は減少する。重合度は、架橋の形成により、大きくなり、そして不明確になることを理解しなければならない。形成されるＰＥＧヒドロゲルは、水中で膨潤する目に見える固体の集合物であり、この集合物は、理論的には、すべての可能な架橋が形成されている。しかし、通常、生じた架橋度を測定することはできない。
【００２７】
マトリックス内に捕捉された薬物分子の放出速度は、加水分解によるゲルの分解速度を制御することによって制御される。加水分解によるゲルの分解速度は、ヒドロゲルマトリックスを形成するＰＥＧの結合度を制御することによって調節することができる。１０本の分岐またはアームを有する多アーム型ＰＥＧは、３アーム型ＰＥＧよりもゆっくり分解して、薬物分子を放出する。
【００２８】
加水分解による分解速度および薬物放出の十分に精密な制御は、加水分解に不安定な結合の周りの原子を変えることによって得ることができる。典型的には、上記の構造におけるｎ値（メチレン基の数）を大きくすると、エステルの加水分解速度は低下し、そしてゲルの分解に要する時間は増大する。上記の例においてｎが１である場合、ゲルのエステル結合は、ｐＨ７および３７℃で約４日の半減期で加水分解される。ｎが２である場合、エステル結合の加水分解による分解の半減期は、ｐＨ７および３７℃で約４３日である。
【００２９】
リン酸エステル、アセタール、イミンおよび他の加水分解に不安定な結合を同様に形成させることができ、そしてその加水分解速度は、加水分解に不安定な結合に隣接するメチレン基の数を制御し、そしてＰＥＧ分岐度を制御することによって同様に制御することができる。
【００３０】
本発明の分解性ヒドロゲルはまた、２工程プロセスで作製することができる。最初の工程において、加水分解に不安定な結合をその骨格に有する可溶性の未架橋ＰＥＧが調製される。次工程において、加水分解に不安定な結合をその骨格に有するこのようなＰＥＧが、加水分解に安定な結合によって、他のＰＥＧと連結される。例えば、下記のＰＥＧは、加水分解に不安定なエステル結合をその骨格に２つ有する：
【化１５】
0004083384.tif 000007
【００３１】
上記のＰＥＧは、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド分子（ＮＨＳ）により各末端で活性化される：この場合、活性なスクシンイミジルエステル部分はＮＨＳ−ＣＯ2−であり、これがアミノ基と反応し得る。このＰＥＧを多アーム型ＰＥＧアミンと連結させた場合、活性なエステルとアミンとの反応から形成される安定なアミド結合、および骨格に既に存在する加水分解に不安なエステル結合によって繋がれた架橋された網目構造体が得られる。前記の例の場合のように、ゲルの分解速度は、エステル結合に隣接するメチレン基の数を変えることにより制御される。
【００３２】
ＰＥＧヒドロゲルを作製するための上記の２段階方法を使用して、注射可能な薬物システムのために、インシチュウで、生体組織内でゲルを作製し、そして物質を捕捉することができる。薬物は、ヒドロゲルの１つの反応性ＰＥＧ成分と一緒にすることができ、そしてゲルを形成する別の反応性ＰＥＧ成分と一緒に注射することができる。薬物は、反応系に近いために形成されたマトリックス内に捕捉される。
【００３３】
従って、本発明は、特に、不安定な結合の加水分解速度が制御され得る加水分解に不安定な結合を有する分解性のＰＥＧヒドロゲルを提供する。本発明のＰＥＧヒドロゲルは、精密に制御されたインビボでの放出を行うために、共有結合の非存在下で、タンパク質、酵素および様々な他の物質を含む薬物を物理的に捕捉することができる。分解したゲルは、著しく分解していないゲルが除去され得るよりも容易に身体から除去され得る。
【００３４】
【課題を解決するための手段】
本発明の前記および他の目的、利点および特徴、ならびにそれらが達成される方法は、例示的な実施形態を表している添付した図面と組み合わせて、本発明の下記の詳細な説明を検討したときに、より容易に明らかになる。
【００３５】
図１は、加水分解に不安定な結合Ｗまたは弱い結合Ｗによって繋がれたポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）マトリックスを示す。図１に示すＰＥＧは、３つの分岐またはアームを有する。分岐度は、ゲルの物理的強度および圧縮性を制御するために、本発明のヒドロゲルにおいて変えることができる。一般に、分岐度が大きいほど、そして分岐が短いほど、ゲルの強度（耐圧縮性または耐伸長性）は大きくなる。同様に、分岐度が大きいほど、そして分岐が短いほど、空隙は小さくなり、そして水分含有量は低くなる。
【００３６】
加水分解に不安的なＰＥＧを有する分解性のＰＥＧヒドロゲルは、下記の一般式で示されているように、１工程で調製することができる：
【化１６】
0004083384.tif 000008
上式において、ｍは「マトリックス」を意味し、そして固体の集合体である架橋ポリマーが形成されるような重合度を示す。ｍは大きく、不明確である。ｐは３から１０であり、反応物である分岐状ＰＥＧのＲ（ＣＨ2−Ｏ−ＰＥＧ−Ｙ）pの分岐度（アーム数）を示す。ＰＥＧゲルの加水分解速度は、典型的には、ｐが増大することによって長くなる。Ｒは、複数アーム型ＰＥＧを作製するのに適切な中心の分岐基であり、これには、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリトリトール、ソルビトール、トリメチオールプロパン(trimethyolpropane)およびジ（トリメチロールプロパン）からなる群から選択される基が含まれる。ＺおよびＹは、反応して加水分解に不安定な結合Ｗを形成する基である。反応して加水分解に不安定な結合Ｗを形成し得るＺ基およびＹ基の組合せの例には、下記の群から選択される組合せが含まれる：カルボン酸エステルを形成するために反応するアルコールおよびカルボン酸、イミンを形成するために反応するアミンおよびアルデヒド、ヒドラゾンを形成するために反応するヒドラジドおよびアルデヒド、リン酸エステルを形成するために反応するアルコールおよびホスフェート(phosphate)、アセタールを形成するために反応するアルデヒドおよびアルコール、オルトエステルを形成するために反応するアルコールおよびホルメート(formate)、ＰＥＧアミンをカルボキシル末端のＰＥＧ−ペプチドと反応させて新しいペプチド結合を形成することによって形成されるペプチド、ＰＥＧカルボン酸をアミン末端のＰＥＧ−ペプチドと反応させて新しいペプチドを形成することによって形成されるペプチド、ならびにＰＥＧホスホルアミダイト(phosphoramidite)を５’−ヒドロキシル末端のＰＥＧオリゴヌクレオチドと反応させることによって形成されるオリゴヌクレオチドからなる群。
【００３７】
Ｚ基は線状ＰＥＧに示され、そしてＹ基は分岐状ＰＥＧに示されていることに注意しなければならない。しかし、同じ弱い結合Ｗが形成される線状ＰＥＧのＹ基および分岐状ＰＥＧのＺ基により、反応は進行し、そしてゲルが形成される。
【００３８】
ＰＥＧカルボン酸基およびＰＥＧヒドロキシル基（それぞれ、Ｚ基およびＹ基）の反応により形成される加水分解に不安定なカルボン酸エステル結合を有するＰＥＧヒドロゲルを作製するための１工程方法の具体例は、下記の式によって表される：
【化１７】
0004083384.tif 000009
【００３９】
上式において、ｍ、ｐおよびＲは、上記に示されている通りである。ｎは約１から１０であり、ゲルの加水分解速度を制御するために変化させることができる。ｎの増大は、典型的には、加水分解速度を低下させる。
【００４０】
この例において、ヒドロキシル基は分岐状ＰＥＧに存在し、そしてカルボン酸基は線状ＰＥＧに存在することに留意すること。あるいは、ヒドロキシル基は線状ＰＥＧに存在することができ、そしてカルボン酸基は分岐状ＰＥＧに存在することができる。
【００４１】
分解性のＰＥＧヒドロゲルはまた、２工程で調製することができる。最初の工程において、１つまたは複数の加水分解に不安定な結合Ｗをその骨格に有する線状ＰＥＧが作製される。この線状ＰＥＧは、Ｕ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−Ｕの一般式を有する：ただし、Ｕは反応性の末端基を表し、そしてＷは加水分解に不安定な結合である。
【００４２】
次工程において、加水分解に不安定な結合をその骨格に有するＰＥＧを別のＰＥＧと反応させる。第２のＰＥＧは、Ｒ（ＣＨ2−Ｏ−ＰＥＧ−Ｖ）pの一般式で示される分岐状ＰＥＧである：ただし、Ｖは反応性の末端基を表す。ｐは３から１０であり、反応物である分岐状ＰＥＧのＲ（ＣＨ2−Ｏ−ＰＥＧ−Ｖ）pの分岐度（アーム数）を示す。ＰＥＧゲルの加水分解速度は、典型的には、ｐを大きくすることによって長くなる。Ｒは、複数アームのＰＥＧを作製するのに適切な中心の分岐基であり、これには、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリトリトール、ソルビトール、トリメチオールプロパンおよびジ（トリメチロールプロパン）からなる群から選択される基が含まれる。
【００４３】
第１のＰＥＧおよび第２のＰＥＧにおけるそのＰＥＧポリマー鎖の末端に位置する官能基のＵおよびＶは反応して、加水分解に安定な架橋Ｘが形成される。これは、下記の式によって表される：
【化１８】
0004083384.tif 000010
【００４４】
再度ではあるが、ｍは「マトリックス」を意味し、そして固体の集合物である架橋ポリマーが形成されるような重合度を示す。Ｗは、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、リン酸エステル、アセタール、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを含む加水分解に不安定な基である。ＵおよびＶは、互いに反応し得る基であって、アミンと反応する活性エステル（炭酸エステルを含む）、アルコールと反応するイソシアナート、アミンと反応するイソシアナート、アミンおよび還元剤と反応するアルデヒド、アミンと反応するエポキシド、ならびにアミンと反応するスルホン酸エステルを含む基である。
【００４５】
ＵおよびＶの反応によって形成される加水分解に安定な結合Ｘには、活性エステルとアミンとの反応から得られるアミド、イソシアナートとアルコールとの反応から得られるウレタン、イソシアナートとアミンとの反応から得られる尿素、アルデヒドとアミンおよび還元剤との反応から得られるアミン、エポキシドとアミンとの反応から得られるアミン、ならびにスルホン酸エステルとアミンとの反応から得られるスルホンアミドが含まれる。
【００４６】
２工程方法の具体例は、下記の式において示されているように、加水分解に安定なアミド結合Ｘと、活性エステルＵおよびアミンＶの反応から形成される加水分解に不安定なカルボン酸エステル結合Ｗとを有する分解性のＰＥＧヒドロゲルの調製である。
【化１９】
0004083384.tif 000011
【００４７】
上記の記号ｎ、ｍ、ｐおよびＲは、既に記載されている通りである。Ｗは、−Ｏ−（ＣＨ2）r−ＣＯ2−の式による加水分解に不安定なエステル結合である：ただし、ｒは約１から１０である。
【００４８】
アミノ基Ｖは分岐状ＰＥＧに存在し、そして活性エステルＵは線状ＰＥＧに存在する。この２つの基は、アミノ基が線状ＰＥＧに存在し、そして活性エステルが分岐状ＰＥＧに存在するように交換できることを認識しなければならない。
【００４９】
別の２段階方法において、ポリマー鎖末端基Ｕ−Ｒ’の近くに加水分解に不安的な結合Ｗを有する反応物の線状ＰＥＧが最初の工程で調製される。別の工程において、ポリマー鎖末端基Ｕ−Ｒ’の近くに加水分解に不安的な結合Ｗを有するＰＥＧを、反応性基Ｖを有する分岐状ＰＥＧと反応させて、加水分解に安定な架橋Ｘを形成させる。
【００５０】
【化２０】
0004083384.tif 000012
【００５１】
上記の記号ｍ、ｐおよびＲは、既に定義されている通りである。Ｒ’は、約１〜１０個の炭素を有する小さな炭化水素フラグメントである。Ｗは、既に定義されているように、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、リン酸エステル、アセタール、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが含まれる加水分解に不安定な基である。ＵおよびＶは、互いに反応し得る基であって、アミンと反応する活性エステル（炭酸エステルを含む）、アルコールと反応するイソシアナート、アミンと反応するイソシアナート、アミンおよび還元剤と反応するアルデヒド、アミンと反応するエポキシド、ならびにアミンと反応するスルホン酸エステルを含む基である。
【００５２】
ＵおよびＶの反応により形成される加水分解に安定な結合はＸである。Ｘには、活性エステルとアミンとの反応から得られるアミド、炭酸エステルとアミンとの反応から得られるウレタン、イソシアナートとアルコールとの反応から得られるウレタン、イソシアナートとアミンとの反応から得られる尿素、アルデヒドとアミンおよび還元剤との反応から得られるアミン、エポキシドとアミンとの反応から得られるアミン、ならびにスルホン酸エステルとアミンとの反応から得られるスルホンアミドが含まれる。
【００５３】
下記の式によって示されている具体例は、加水分解に不安定なカルボン酸エステル基Ｗと、活性エステルＵおよびアミンＶの反応により形成される加水分解に安定なアミドＸとを含有するＰＥＧヒドロゲルの形成である：この場合、加水分解に不安定なカルボン酸エステル基Ｗは、前駆体の線状ＰＥＧにおける小さな炭化水素フラグメントによりＵ基および／またはＶ基から離れている。
【００５４】
【化２１】
0004083384.tif 000013
【００５５】
上式において、ｉは約１〜１０であり、小さな炭化水素フラグメントＲ’の長さを規定する。記号ｎ、ｍ、ｐおよびＲは、上記に定義されている通りである。アミノ基は分岐状ＰＥＧに示され、そして活性エステルは線状ＰＥＧに示されている。この２つの基は、アミノ基が線状ＰＥＧに存在し、そして活性エステルが分岐状ＰＥＧに存在するように交換できることを認識しなければならない。
【００５６】
当業者は、Ｙ基と反応するＺ基に対して、あるいはＶ基と反応するＵ基に対して言及されるとき、場合に応じて所望する結合Ｗまたは結合Ｘを得るために、一般に受け入れられている化学的手順および標準的な手順に従って、さらなる試薬または工程を用いることができることを認識しなければならない。採用することでき、そして当業者には容易に明らかであり得る可能な経路が、多すぎるためにここで述べることはできないが、数多く存在する。例えば、当業者は、アルコールおよびカルボン酸を反応させる場合、酸を、典型的には、別の形態（酸化物の形態）に変換し、その後、アルコールと反応させることを理解していることが予想され得る。いくつかの例を下記の実施例において明らかにする。
【００５７】
本発明の架橋ＰＥＧポリマー構造体から作製されるヒドロゲルは、薬物送達システムにおいて、そして外傷の手当て用品のために使用することができる。外傷の手当て用品は、体内で時間とともに分解する手当て用品を提供するために体内で使用することができる。本発明のヒドロゲルは、治療薬剤を火傷に適用するために、火傷に対する薬物送達システムにおいて有用に適用することができる。薬物成分の制御された放出が得られるように、ヒドロゲルの加水分解速度が制御されている薬物送達システムを調製することができる。「薬物」は、ヒトおよび他の動物における疾患の診断、治療、軽減、処置または防止を行うこと、あるいはそうでなければ身体的または精神的な満足度を高めることを目的とする任意の物質を意味する。本発明は、一般に、生体組織において、あるいは生体組織から取り出された物質において何らかの活性または機能を有する生物学的に活性な物質を送達するために使用することができる。
【００５８】
「基（ｇｒｏｕｐ）」、「官能基」、「部分、基（ｍｏｉｅｔｙ）」、「活性基」、「反応性部位」および「ラジカル」の各用語はすべて、完全ではないが、化学の分野では同義的であり、そして分子の異なる特徴的な部分またはユニット、および何らかの機能または活性を発揮し、そして他の分子または分子の他の部分と反応し得るユニットを示すためにこの分野および本明細書中において使用されている。
【００５９】
用語「結合」は、化学反応の結果として通常形成され、そして典型的には共有結合である基を示すために使用されている。加水分解に安定な結合は、そのような結合が水中で安定であり、そして有用なｐＨの水と長時間（潜在的には、限りなく）反応しないことを意味する。加水分解に不安定な結合は、水と反応して、典型的には、ヒドロゲルの分解およびマトリックス内に捕捉された物質の放出をもたらす結合である。そのような結合は、加水分解に曝され、そして加水分解性であると言われる。架橋されたポリマー構造体の分解に要する時間は、加水分解速度として示され、通常、その半減期に関して測定される。
【００６０】
当業者は、Ｙ基と反応するＺ基に対して、あるいはＶ基と反応するＵ基に対して言及されるとき、場合に応じて所望する結合Ｗまたは結合Ｘを達成するために、一般に受け入れられている化学的手順および標準的な手順に従って、さらなる試薬または工程を用いることができることを認識しなければならない。採用することができ、そして当業者には容易に明らかであり得る可能な経路が、多すぎるためにここで述べることはできないが、数多く存在する。例えば、当業者は、アルコールおよびカルボン酸を反応させる場合、酸を、典型的には、別の形態（酸化物の形態）に変換し、その後、アルコールと反応させることを理解していることが予想され得る。いくつかの例を下記の実施例において明らかにする。
【００６１】
下記の実施例は、本明細書中の様々な例の合成を示す。
【００６２】
【実施例】
実施例１
実施例１は、加水分解に不安定なエステル結合を有する分解性ＰＥＧヒドロゲルの調製を示す。直径１インチのアルミニウムの鍋で、二官能性ＰＥＧ２０００酸（６００ｍｇ，０．６ｍｍｏｌの末端基、アラバマ州ハンツビルのＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から入手可能）と１等量の８アーム型ＰＥＧ１０，０００（７５０ｍｇ，シアウォーター・ポリマーズ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）社）を３０ｍｇの２−エチルヘキサン酸第一スズ（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社）と混合し、溶解した。使用したＰＥＧ酸には、ＰＥＧカルボキシメチル酸（−ＰＥＧ−ＯＣＨ2ＣＯＯＨ）、ＰＥＧプロピオン酸（−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）、およびＰＥＧコハク酸（−ＰＥＧ−ＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）が含まれていた。その溶融物の薄い膜が鍋の表面を均一に覆った後、その鍋を１３０℃および１００ミリトルの真空下で６から２４時間にわたり加熱した。堅い、透明なゲルが生成した。窒素流で冷却すると、ゲルは半透明になった。そして薄い円盤に切断して、次の手順で精製した。
【００６３】
その粗ゲルを氷酢酸中で膨張させ、２から３日の間に、この溶媒で３回洗浄した。膨張の程度が低いヒドロゲルの場合には、高度に架橋されたゲルの破壊を防止するために、氷酢酸で洗浄する前にジオキサンで膨張させた。洗浄後、ゲルを真空乾燥した。そのゲルのスズ含有量を誘導結合プラズマ分光法で６０  ｐｐｍ未満と測定した。
【００６４】
実施例２
実施例２は、加水分解に不安定なイミン結合を有する分解性ＰＥＧヒドロゲルの調製を示す。試験管中で、二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド３４００（１００ｍｇ，５８．８μｍｏｌ，Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）および８アーム型ＰＥＧアミン１０，０００（７４ｍｇ，５８．８μｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社）に溶解した。その試験管を油浴で７０℃に約２時間加熱した。次いで、そのゲルを室温で減圧乾燥した。
【００６５】
使用したＰＥＧアルデヒドには、ＰＥＧプロピオンアルデヒド（−ＰＥＧ−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ）、ＰＥＧアセトアルデヒド（−ＰＥＧ−ＯＣＨ2ＣＨＯ）、およびＰＥＧベンズアルデヒド（−ＰＥＧ−Ｏ−Ｃ6Ｈ4−ＣＨＯ）が含まれていた。
【００６６】
下記の実施例３および４は、本発明の分解性ヒドロゲルの調製に使用する、加水分解に不安定な結合を有するＰＥＧ誘導体の調製を示す。
【００６７】
実施例３
実施例３は、加水分解に不安定な骨格結合とその各末端にＮＨＳ活性炭酸を有するＰＥＧ誘導体の合成を示す。そのＰＥＧ誘導体は、ＮＨＳ−ＯＯＣＯ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−ＯＣＯＯ−ＮＨＳと表すことができる。ここで、Ｗは加水分解に不安定な結合を表す。１００ｍｌの丸底フラスコで、ベンジルオキシ−ＰＥＧカルボキシメチル酸３４００（３．４ｇ，１ｍｍｏｌ，Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）を２時間トルエン中で共沸蒸留し、それから室温まで冷却した。塩化チオニル（２Ｍ，４ｍｌ，８ｍｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ社）の塩化メチレン溶液を注入し、その混合物を窒素雰囲気下で一晩撹拌した。その溶媒を回転蒸発によって濃縮し、そのシロップを五酸化二リン（Ｐ2Ｏ5）粉末の上で約４時間真空乾燥した。その残留分に、無水塩化メチレン（５ｍｌ）と、トルエン（２０ｍｌ）中で共沸乾燥したベンジルオキシ−ＰＥＧ  ３４００（２．５５ｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。そのベンジルオキシ−ＰＥＧ塩化アシルを溶解した後、新たに蒸留したトリエチルアミン（０．６ｍｌ）を添加した。その混合物を一晩撹拌して、トリエチルアミン塩をろ過して取り除き、生成物をエチルエーテルで沈殿させて収集した。それを水に溶解して塩化メチレンで抽出することによってさらに精製した。その有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空濃縮し、そしてエチルエーテル中に沈殿させた。その沈殿物を真空中で乾燥した。その生成物の高速液体クロマトグラフィー（ゲル透過クロマトグラフィー）は、ベンジルオキシ−ＰＥＧの１００％がＰＥＧエステルに転換し、ベンジルオキシ−ＰＥＧ酸の約１５重量％が残ったことを示した。
【００６８】
その混合物を、イオン交換カラム（ジエチルアミノエチルセファローズの高速流、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）でクロマトグラフィーにより精製して、ベンジルオキシ−ＰＥＧ酸を除いた。純度１００％のα−ベンジルオキシ−ω−ベンジルオキシＰＥＧエステル６８００が得られた。収量は、４．１グラム（８０％）であった。
【００６９】
１，４−ジオキサン（２０ｍｌ）中のα−ベンジルオキシ−ω−ベンジルオキシＰＥＧエステル６８００（２ｇ，０．５９ｍｍｏｌ）の溶液を水素（圧力２気圧）およびＰｄ／Ｃ（１ｇ，１０％  Ｐｄ）を用いて一晩水素化分解した。触媒をろ過して除き、大部分の溶媒を回転蒸発器で除いた後生成物をエチルエーテル中に沈殿させた。ろ過によってα−ヒドロキシ−ω−ヒドロキシＰＥＧエステル６８００を収集し、真空乾燥した。収量は、１．５グラム（７５％）であった。
【００７０】
α−ヒドロキシ−ω−ヒドロキシＰＥＧエステル６８００（１．５ｇ，０．４４ｍｍｏｌ末端基）を１００ｍｌのアセトニトリルと共沸乾燥してから、室温まで冷却した。この溶液にジサクシミディル炭酸（ＤＳＣ）（０．８８ｍｍｏｌ，Ｆｌｕｋａ社）とピリジン（０．１ｍｌ）を添加した。そして、その溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除き、シロップを真空中で乾燥した。その生成物を３５ｍｌの乾燥塩化メチレンに溶解し、不溶性固形物をろ過して除き、そしてろ液を塩化ナトリウムが飽和したｐＨ４．５の酢酸緩衝液で洗浄した。その有機相を無水硫酸ナトリウムの上で乾燥し、真空濃縮し、そしてエチルエーテル中に沈殿させた。その沈殿物をＰ2Ｏ5の上で真空乾燥した。収量は、１．４ｇ（９３％）であった。ＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ6）の結果は次の通りであった。（１）ベンジルオキシ−ＰＥＧプロピオン酸からの生成物は、δ 3.5(br m, PEG)、2.55(t, -OCH2CH2COOPEG-)、4.13(t, -PEG-COOCH2CH2O-)、4.45(t, -PEGOCH2CH2OCO-NHS)、2.80(s, NHS, 4H)、(2)ベンジルオキシシ-PEGカルボキシメチル酸からの生成物は、δ 3.5(br m, PEG)、4.14(s, -OCH2COOPEG-)、4.18(t, -OCH2COOCH2CH2-)、4.45(t, -PEGO-CH2CH2OCONHS)、2.81[s, NHS, 4H]。
【００７１】
実施例４
実施例４は、加水分解に不安定な骨格結合と末端のＮＨＳ活性エステルを有するＰＥＧ誘導体の合成を示す。そのＰＥＧ誘導体は、式ＮＨＳ−ＯＯＣ−（ＣＨ2）n−Ｏ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＮＨＳで表すことができる。ただし、Ｗは加水分解に不安定な結合である。１００ｍｌの丸底フラスコで、α−ヒドロキシ−ＰＥＧ酸２０００（４ｇ，２ｍｍｏｌ，Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）と二官能性ＰＥＧプロピオン酸２０００（４ｇ，２ｍｍｏｌ，Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）を、窒素雰囲気下で７０ｍｌのトルエンと共沸蒸留した。２時間後に、その溶液を室温まで冷却して、２−エチルヘキサン酸第一スズ（２００ｍｇ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加した。次いで、その溶液を窒素雰囲気下で２４時間還流させた。それから、その溶媒を真空下で濃縮し、シロップを１００ｍｌのエーテル中に沈殿させた。その生成物を、ろ過して収集し、真空乾燥し、そしてｐＨ  ５．０の酢酸ナトリウム緩衝溶液に溶解した。そのすこし乳状の溶液を遠心分離機にかけて、上部の透明な溶液を塩化メチレンで３回抽出した。その有機相を無水硫酸ナトリウムの上で乾燥し、ろ過し、真空濃縮し、そしてエーテル中に沈殿させた。その生成物をろ過して収集し、そして真空乾燥した。収量は、７ｇ（８８％）であった。高速液体クロマトグラフィーの結果は、生成物が７０％、二酸の反応物が１５％、そして一塩基酸が１５％であった。その混合物を、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル透過クロマトグラフィーでさらに精製した。1ＨＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ6）の結果は次の通りであった。（１）ＰＥＧカルボキシメチル酸からの生成物は、δ 3.5(br m, PEG)、4.15(s, -OCH2COOCH2-)、4.18(t, -OCH2COOCH2CH2-)、(2)PEGプロピオン酸からの生成物は、δ 3.5(br m, PEG)、2.58(t, -OCH2CH2COOCH2-)、4.13(t, -OCH2CH2COOCH2CH2-)。
【００７２】
丸底フラスコで、弱い結合を有する二官能性酸（前の段階で得られた）（２ｇ、ほぼ１ｍｍｏｌの末端基）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（１２６ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの乾燥塩化メチレンに溶解した。この溶液に、５ｍｌの乾燥塩化メチレンに入れたジシクロヘキシルカルボジイミド（２４０ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を窒素雰囲気下で一晩撹拌した。その溶媒を濃縮し、シロップを１５ｍｌの無水トルエンに再溶解した。不溶性の塩をろ過で除き、ろ液を２００ｍｌの乾燥エチルエーテル中に沈殿させた。その沈殿物をろ過して収集し、真空中で乾燥した。収量は、１．８８ｇ（９４％）であった。1ＨＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ6）の結果は次の通りであった。δ 3.5(br m, PEG)、2.8(s, NHS, 4H)、4.6(s, -PEG-O-CH2-COONHS)、または2.85(t, -PEG-O-CH2CH2-COONHS)。
【００７３】
実施例５
実施例５は、分岐ＰＥＧアミンおよび実施例３に従って作られたＰＥＧ誘導体からの分解性ＰＥＧヒドロゲルの調製を示す。実施例３でのＰＥＧ誘導体は加水分解に不安定な骨格結合とＮＨＳ−ＯＯＣＯ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−ＯＣＯＯ−ＮＨＳで表すことができる末端がＮＨＳの活性炭酸とを有する。試験管中で、１００ｍｇ（４．７μｍｏｌ）の二官能性ＰＥＧ活性炭酸６８００（実施例３で調製されたＮＨＳ−ＯＯＣＯ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−ＯＣＯＯ−ＮＨＳ）を０．７５ｍｌの水に溶解し、０．１５ｍｌの８アーム型−ＰＥＧ−アミン１０，０００の緩衝液（０．１Ｍのホスフェート、ｐＨ  ７）（２５０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。急速に振とうしてから置くと、数分でゲルが生成した。緩衝液の適当なｐＨ範囲は５．５から８であることが分かった。
【００７４】
実施例６
実施例６は、分岐ＰＥＧアミンおよび実施例４に従って作られたＰＥＧ誘導体からの分解性ＰＥＧヒドロゲルの調製を示す。実施例４でのＰＥＧ誘導体は加水分解に不安定な骨格結合とＮＨＳ−ＯＯＣ−（ＣＨ2）n−Ｏ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＮＨＳで表すことができる末端がＮＨＳの活性炭酸とを有する。１００ｍｇ（約５０μｍｏｌ）の二官能性ＰＥＧ活性エステル（実施例４で調製されたＮＨＳ−ＯＯＣ−（ＣＨ2）n−Ｏ−ＰＥＧ−Ｗ−ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＮＨＳ）を０．７５ｍｌの水に溶解し、０．２５ｍｌの８アーム型−ＰＥＧ−アミン１０，０００の緩衝溶液（０．１Ｍのホスフェート、ｐＨ７）（２５０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。急速に振とうしてから置くと、数分でゲルが生成した。緩衝液の適当なｐＨ範囲は５．５から８であることが分かった。
【００７５】
実施例７
実施例７は、実施例８の反応性ＰＥＧを調製するのに使われるＨＯＯＣ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−ＯＯＣ−（ＣＨ2）n−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−ＣＯＯＨと表すことができる二官能性ＰＥＧ−ヒドロキシ酪酸（ＨＢＡ）の合成を示す。ＰＥＧ酸２０００（２．０ｇ，１ｍｍｏｌ、カルボキシメチル酸（ＣＭ）またはプロピオン酸（ＰＡ））を窒素雰囲気下において６０ｍｌのトルエンで共沸乾燥した。２時間後、その溶液を室温まで冷却し、塩化チオニル（塩化メチレン中、３ｍｌ、６ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、その混合物を室温で一晩撹拌した。そして、その溶液を回転蒸発により濃縮した。その残留分を、Ｐ2Ｏ5粉末を用いて真空中で約４時間乾燥した。３−ヒドロキシ酪酸（０．３０ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を７０ｍｌの１，４−ジオキサンで、約２０ｍｌの溶液が残るまで共沸乾燥した。次に、その溶液を窒素雰囲気下で室温まで冷却し、前段階からの乾燥したＰＥＧ塩化アシルを加えた。そのＰＥＧが溶解した後、０．６ｍｌの乾燥トリエチルアミンをその系に注入して、その反応混合物を一晩撹拌した。その塩を溶液からろ過し、溶媒を回転蒸発器で濃縮し、そしてシロップを真空中で乾燥した。その粗生成物を、１００ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを３．０に調整した。その生成物を、合計８０ｍｌの塩化メチレンで３回抽出した。その有機相を無水硫酸ナトリウムの上で乾燥し、ろ過し、真空濃縮し、そして１００ｍｌのエチルエーテル中に沈殿させた。その生成物をろ過して収集し、真空乾燥した。収量は、１．８４ｇ（９２％）であった。1ＨＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ6）の結果は次の通りであった。δ 3.5(br m, PEG)、2.54(d, PEGCOOCH(CH3)CH2COOH)、5.1(h, PEGCOOCH(CH3)CH2COOH)、1.21(d, PEG-COOCH(CH3)CH2COOH)、2.54(t, PEGOCH2CH2COO(PA))、4.05(s,PEGOCH2COO (CM))。
【００７６】
実施例８
実施例８は、本発明のＰＥＧヒドロゲルを調製するのに使われるＮＨＳ−ＯＯＣ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−ＯＯＣ−（ＣＨ2）n−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−ＣＯＯＮＨＳと表すことができる二官能性ＰＥＧ−ＨＢＡ−ＮＨＳ二重エステルの合成を示す。ＰＥＧ−３−酪酸（１ｇ，約０．５ｍｍｏｌ、実施例７で調整された）および６４ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（０．５３ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの乾燥塩化メチレンに溶解し、続いて５ｍｌの乾燥塩化メチレンに入れたジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，１２６ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を添加した。その溶液を窒素雰囲気下で一晩撹拌し、溶媒を回転蒸発により除去した。その残留分を１０ｍｌの乾燥トルエンと一緒に４５℃で撹拌し、不溶性固形物をろ過により除去した。その生成物を、１００ｍｌの乾燥エチルエーテル中に沈殿させ、その沈殿物をろ過して収集し、真空乾燥した。収量は、０．９４ｇ（９４％）であった。1ＨＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ6）の結果は次の通りであった。δ 3.5(br m, PEG)、3.0−3.2(m, -COOCH(CH3)CH2COONHS)、5.26(h, -COOCH(CH3)CH2COONHS)、1.3(d, -CO-OCH(CH3)CH2COONHS)、2.54(t, -PEGOCH2CH2COO-(PA))、4.1(s, -PEGOCH2COO-(CM))。
【００７７】
実施例９
実施例９は、分岐ＰＥＧアミンと、ＮＨＳ−ＯＯＣ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−ＯＯＣ−（ＣＨ2）n−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−ＣＯＯＮＨＳと表すことができる実施例８のＰＥＧ−ＨＢＡ−ＮＨＳ二重エステルとから分解性のＰＥＧヒドロゲルの調製を示す。ＰＥＧ−ＨＢＡ−ＮＨＳ二重エステル２０００（１００ｍｇ、  約０．１ｍｍｏｌ、実施例８）を０．５ｍｌの水に溶解し、８アーム型−ＰＥＧ−アミン１０，０００の緩衝液（０．５ｍｌ，２５０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。急速に振とうしてから置くと、数分でゲルが生成した。緩衝液の適当なｐＨ範囲は５．５から８であることが分かった。
【００７８】
本発明を特別に例示された実施例で説明した。しかしながら、前述の説明は、本発明を例示された実施例に限定することを意図するものではなく、熟練した技術者は、前述の明細書に記述された本発明の範囲および精神の範囲内で変形形態が可能であることを理解するはずである。  
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＰＥＧが３つの分岐またはアームを有するＰＥＧヒドロゲルの概略図である。
【図１】
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