(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２で示される塩基配列、またはその相補鎖を有する２０塩基から成るオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用フォワード側プライマー。
【請求項２】
配列表の配列番号４で示される塩基配列、若しくはその相補鎖を有する２０塩基から成るオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用リバース側プライマー。
【請求項３】
配列表の配列番号６で示される塩基配列、またはその相補鎖を有する２５塩基から成るオリゴヌクレオチドに、ドナー蛍光色素と、アクセプター蛍光色素とが結合されており、前記ドナー蛍光色素は、該ドナー蛍光色素が前記アクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記アクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用プローブ。
【請求項４】
前記ドナー蛍光色素はフルオレッセイン系蛍光色素であり、前記アクセプター蛍光色素はローダミン系蛍光色素である請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
請求項１に記載のフォワード側プライマーと、請求項２記載のリバース側プライマーと、請求項３記載のプローブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、 Ｂ型肝炎ウイルス（本願明細書において「ＨＢＶ」という）の核酸のリアルタイム検出ＰＣＲ法による測定に用いられるプライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清等の試料中のＨＢＶの核酸を定量的に検出する方法としては、ＨＢＶのＤＮＡをプローブＤＮＡで捕捉し、プローブＤＮＡに分岐ＤＮＡプローブを反応してシグナルを増幅し、化学発光で検出する分岐プローブ法や、 ＨＢＶのＤＮＡをＲＮＡに変換し、ＲＮＡとして増幅した後、ＤＮＡプローブを反応して化学発光で検出するＴＭＡ法が行われているが、ＤＮＡの増幅法であるＰＣＲ法に基づいたＨＢＶ核酸の検出法と比較して、検出感度では劣っていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＢＶの核酸の定量は、ＨＢＶ感染者の治療効果の観察や、輸血用血液あるいは移植用臓器を介したレシピエントのＨＢＶ感染を防ぐため、ドナーのＨＢＶ感染の有無をチェックする手段として重要である。しかしながら、上記の分岐ＤＮＡプローブ法やＴＭＡ法では、ウイルス濃度の低い検体では、検出感度不足になる場合がある。また、ＨＢＶＤＮＡの測定は、短時間かつ、数あるＨＢＶの遺伝子型の違いに依らず、高感度で多数の検体を処理できる方法が必要であり、これが可能となれば非常に有利である。
従って、本発明の目的は、ＨＢＶを高感度で迅速に測定する手段を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、高感度なＤＮＡの増幅法であるＰＣＲ法に基づくＤＮＡの定量法である、リアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemistry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いることにより、従来法よりも高感度にＨＢＶ由来の核酸を定量的に検出できるのではと考えた。しかしながら、このリアルタイム検出ＰＣＲ法においても、用いるプライマー及びプローブの選択の如何によっては、測定の感度及び／又は再現性について必ずしも満足できないことが判明した。そこで、鋭意研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いることにより、リアルタイム検出ＰＣＲ法の性能を最大限に引き出し、非常に高感度に、高い再現性をもってＨＢＶを正確に定量することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示される４１塩基からなる配列、若しくはその相補鎖のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用フォワード側プライマーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号３で示される４２塩基からなる配列、若しくはその相補鎖のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用リバース側プライマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号５で示される３９塩基からなる配列、若しくはその相補鎖のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに、ドナー蛍光色素と、アクセプター蛍光色素とが結合されており、前記ドナー蛍光色素は、該ドナー蛍光色素が前記アクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記アクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用プローブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のフォワード側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマーと、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定方法を提供する。
【０００６】
本発明のフォワード側プライマーは、ＨＢＶ遺伝子のＣおよびＰ領域の重複領域中の一部を増幅するためのフォワード側プライマーであり、配列表の配列番号１で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３０塩基、好ましくは１７塩基ないし２５塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好ましいものとして、配列番号２に示される２０塩基から成る塩基配列を有するものを挙げることができる。
【０００７】
本発明の第１のリバース側プライマーは、ＨＢＶ遺伝子のＣおよびＰ領域の重複領域中の一部を増幅するためのリバース側プライマーであり、配列表の配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３０塩基、好ましくは１７塩基ないし２５塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好ましいものとして、配列番号４に示される、２０塩基から成る塩基配列を有するものを挙げるこができる。
【０００８】
本発明のプローブは、オリゴヌクレオチドに後述するドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素が結合したものである。本発明のプローブは、増幅されたＨＢＶのＣおよびＰ領域の重複領域中の一部の領域を検出するためのものであり、そのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番号５で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基、好ましくは２０塩基ないし３０塩基、から成る塩基配列を有する。該オリゴヌクレオチドの特に好ましい例として、配列番号６に示される２５塩基から成るものを挙げることができる。
【０００９】
前記ドナー蛍光色素は、該ドナー蛍光色素が前記アクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記アクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。ドナー蛍光色素、アクセプター蛍光色素の種類は、蛍光共鳴エネルギー転移を示す蛍光色素のペアであれば特に制限されないが、ドナー蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、アクセプター蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これら蛍光色素を結合したプローブは、当該業者ならば容易に知ることが出来る、プローブ合成の受託業者に合成を依頼して入手することが出来る。
【００１０】
発明の方法では、上記本発明のフォワード側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマーと、上記本発明のプローブとを用い被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【００１１】
鋳型となる ＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶを含有する疑いのある検体、たとえば、血清、血漿等の体液から従来のＰＣＲの場合と同様の方法で抽出、精製したものが使用でき、例えば、スマイテストEX-R&D（商品名、ゲノムサイエンス研究所製）などを用いて抽出した遺伝子を使用することができる。
【００１２】
反応では、まず、ＨＢＶのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡは、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド部分に結合されているドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素とがバラバラになり、アクセプター蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたドナー蛍光色素からの蛍光強度（Ｆ１）が増加する。同時に、アクセプター蛍光色素に由来する蛍光強度（Ｆ２）は、ドナー蛍光色素からのエネルギー転移を得られなくなり減少する。一方、被検試料中にＨＢＶのＤＮＡが存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、ドナー蛍光色素からの蛍光は、アクセプター蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は変化しない。従って、蛍光強度の変化を測定することにより、被検試料中にＨＢＶのＤＮＡを検出することが可能である。
【００１３】
本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定されるドナー色素に由来する蛍光強度（Ｆ１）は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中のＨＢＶＤＮＡの量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、DNA量が未知の試料のＤＮＡの定量は、５０回の増幅サイクルにおいて、蛍光強度（Ｆ１）が一定の基準値（Threshhold:Th)を越えたサイクル数（Ｔｈサイクル数）を求め、DNA濃度既知の試料の希釈系列を同時に測定して作製した、ＤＮＡ量vsＴｈサイクル数の検量線に外挿することによって求めることができる。
【００１４】
このとき、ＰＣＲ反応液の液量のばらつきにより蛍光強度（Ｆ１）にばらつきがある場合、蛍光強度としてＦ１をＦ２で除した値、Ｆ１／Ｆ２を採用することにより、 ＰＣＲ反応液の液量のばらつきを補償して、より正確なDNA量の定量が可能である。
従って、本発明の方法によれば、従来のＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調べなくとも、非常に簡便、迅速にDNAの定量が可能である。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
プライマーの合成
配列番号２に示される２０塩基から成る塩基配列を有する２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード側プライマーとした。また、配列番号４に示される２０塩基から成る塩基配列を有する２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、リバース側プライマーとした。
【００１７】
プローブの調製
配列番号６に示される２５塩基から成る塩基配列を有する２５ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
【００１８】
反応液の調製
上記プライマー、プローブ及びLightCycler-FastStart DNAマスターハイブリダイゼーションプローブ （商品名、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用いて、反応キャピラリー32本あたり、下記表１に示す反応液を調製した。
【００１９】
0004061459.tif 000002
【００２０】
検体由来HBV DNAの調製
ウイルス濃度既知のＢ型肝炎ウイルス陽性血清（8×104コピー/ml）をＢ型肝炎ウイルス陰性血清を用いて希釈し、ウイルス濃度8×104、8×103、8×102、8×101コピー/mlの検体を調製した。各検体100μｌに対して、スマイテストEX-R&D( 商品名、ゲノムサイエンス研究所社製ＤＮＡ抽出試薬）の酵素溶液15μｌ、共沈剤溶液5μｌ、検体希釈液380μｌを加え撹拌し、55℃で45分間反応した。次に蛋白溶解液250μｌを加え撹拌後55℃で20分間反応した。同チューブにイソプロパノール600μｌを加えて撹拌し、4℃で20分間静置後、12000 x g で10分間遠心した。次いで、500μｌの70％エタノールで2回洗浄後乾燥し、上記のPCR反応溶液20μｌで溶解し、測定用キャピラリーに充填した。
【００２１】
キャピラリーをLightCycler（商品名、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）にセットし、以下の条件で反応を行なった。ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定した。
【００２２】
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このＰＣＲサイクルは50回繰り返した。
【００２３】
サイクル数を横軸に、蛍光強度比（Ｆ１／Ｆ２）を縦軸にとってプロットした結果を図１に実線で示す。図１より、それぞれの被検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料中のＨＢＶのＤＮＡコピー数が大きいほど小さいことがわかる。出発検体のウイルス濃度の常用対数を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットした図を図２に示す。図２に示すように、検体のウイルス濃度（コピー/ml）の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間にはウイルス濃度が8×104〜8×101コピー/mlと非常に低濃度の範囲でも直線関係が得られ（相関係数1.000) 、このことは、極低濃度のウイルス濃度の検体まで、非常に精度よくウイルスDNAの定量が可能であることを示している。
【００２４】
比較例１(ＨＢＶのＳ領域のプライマー、およびプローブ)
配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワード側プライマーとして用い、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバース側プライマーとして用い、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、実施例１と同じ操作を行った。サイクル数を横軸に、蛍光強度比（Ｆ１／Ｆ２）を縦軸にとってプロットした結果を図１に点線で示す。
【００２５】
図１に示したように、比較例１のプライマー、プローブを用いた場合、HBV核酸の増幅に由来する蛍光の上昇高が、実施例１のプライマー、プローブを用いた場合に比べて全体に小さく、蛍光強度が対数的に増加する領域が狭かった。そのため、ウイルス濃度の定量性が乏しく、8×101コピー/mlの検体に至っては、蛍光の対数的な増幅が認められず、ウイルス核酸の検出が妨げられた。
【００２６】
以上の結果は、リアルタイムPCRにおいては、プライマー、プローブの選択の如何によって、蛍光のエネルギー転移の効率が異なり、核酸の検出感度が左右されることを示しており、 本発明により得られたプローブ、プライマーを用いることによって、リアルタイムPCR法の最高性能の感度でHBV核酸を検出することができることを示している。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、ＨＢＶ由来の核酸を高感度で正確に、かつ、簡便に定量することが可能になった。
【００２８】
【配列表】
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【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるＰＣＲ結果をサイクル数を横軸に、蛍光強度比（Ｆ１／Ｆ２）を縦軸に示したグラフ
【図２】実施例１における出発検体のウイルス濃度の常用対数を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を縦軸に示したグラフ
【図１】
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【図２】
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