(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチドを認識する被検液中の抗体を決定することを特徴とするＩｇＡ腎症の検査法。
【請求項２】
ヒンジ部コアペプチドが、Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列の少なくとも一部を構成し、かつ少なくとも３つ以上のアミノ酸からなることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のＩｇＡ腎症の検査法。
【請求項３】
抗体の決定において、ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチド固相を用いることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の検査法。
【請求項４】
固相がマイクロタイタープレートあるいはラテックス粒子である、請求の範囲第３項に記載の検査法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ＩｇＡ腎症の新規な検査法に関し、更に詳細には、ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチドを認識する被検液中の抗体を決定することにより、受診者に与える精神的苦痛、腎周囲出血等の危険性および経済的負担が少ない、ＩｇＡ腎症の迅速・簡便な検査法および抗体の決定方法に関するものである。
従来の技術
ＩｇＡ（免疫グロブリンＡ）腎症は、Ｂｅｒｇｅｒら（Ｊ．Ｕｒｏｌ．，７４，ｐｐ６９４〜６９５（１９６８年）により提唱された疾患概念で、臨床的には持続的尿蛋白、血尿以外に臨床症状に乏しく、組織学的には糸球体メサンギウム領域にＩｇＡを主体とする沈着物が認められることを特徴とする原発性糸球体腎炎である。
わが国でのＩｇＡ腎症の頻度は高く、慢性腎炎の約３０％を占める。近年その長期予後は必ずしも良好ではなく、１０年の経過で１０〜１５％、２０年の経過で約３０％の患者が末期腎不全に陥ることが明らかになってきた。このため、ＩｇＡ腎症は末期腎不全に至る原因疾患として特に注目されてきている。
現在のところ、ＩｇＡ腎症の検査法としては、腎生検による方法しかない。しかしながら、この検査法は、受診者に大きな精神的苦痛を与える他、検査後に腎周囲出血等が起こる危険性がある。さらに、腎生検検査後は２４時間以上の絶対安静が必要で、受診者に数日間の入院を強いることになり、受診者の経済的負担も大きいのが現状である。また、この検査法には多くの設備が必要で、検査に長時間要するという欠点がある。
従って、より簡便な操作で、短時間に実施でき、かつ受診者に与える精神的苦痛、腎周囲出血等の危険性および経済的負担が少ない、ＩｇＡ腎症の検査法が望まれている。
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、ＩｇＡ腎症の検査法としてこれまで必須とされてきた腎生検によらない、ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチドを認識する被検液中の抗体を決定することにより、受診者に与える精神的苦痛、腎周囲出血等の危険性および経済的負担が少ない、ＩｇＡ腎症の迅速・簡便な検査法を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者らは上記課題について種々検討した結果、ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチドを認識する被検液中の抗体を決定することにより、ＩｇＡ腎症の検査が容易にでき、受診者に精神的苦痛、腎周囲出血等の危険性、経済的負担が少ない、ＩｇＡ腎症の迅速・簡便な検査法および抗体の決定方法を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は：
ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチドを認識する被検液中の抗体を決定する、ＩｇＡ腎症の検査法に関するものである。本発明の好ましい実施態様によれば、ヒンジ部コアペプチドが、Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列の少なくとも一部を構成し、かつ少なくとも３つ以上のアミノ酸からなる検査法に関する。更に本発明の好ましい実施態様によれば、抗体の決定において、ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチド固相を用いる検査法に関し、該固相がマイクロタイタープレートあるいはラテックス粒子である検査法に関する。
本発明において抗体を決定する方法としては、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、免疫比ろう測定法、ラテックススライド凝集法、免疫比濁法、発光免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、蛍光免疫測定法またはラジオイムノアッセイ法に基づく、ＩｇＡ腎症の検査法が用いられる。
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
第１図は、ＩｇＡ１分子構造の概略を示す模式である。
ＩｇＡ腎症の成因に関与すると考えられるＩｇＡとは、免疫グロブリンの一種である。ＩｇＡ分子は、２本の重鎖と２本の軽鎖から成り、重鎖構造の違いからＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブタイプに分類される。
ＩｇＡ腎症において、糸球体内に沈着するＩｇＡはＩｇＡ１サブタイプが主体である（Ｃｏｎｌｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、第６６巻、１４３２〜１４３６頁、１９８０年）ことから、ＩｇＡ腎症患者と健常者または非ＩｇＡ腎症患者のＩｇＡ１の性質に差があることが推定される。
ＩｇＡ１とＩｇＡ２との最も大きな構造上の違いは重鎖のヒンジ部にあり、ＩｇＡ１のヒンジ部（基礎免疫学（上）第１５８〜１６２頁（１９８６年）東京大学出版会）に対してＩｇＡ２のヒンジ部では、１３個のアミノ酸が欠損している（Ｆｒａｎｇｉｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第６９巻、３６７３〜３６７６頁、１９７２年）。
一方、Ｂａｅｎｚｉｇｅｒらは、ＩｇＡ１分子のヒンジ部にＯ結合型糖鎖が５ヶ所のセリン残基に結合していると報告している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２４９巻、７２７０−７２８１頁、１９７４年）。
本発明者らは、ＩｇＡ１ヒンジ部の合成ペプチドをウサギに対して免疫して得られた抗体とＩｇＡ腎症患者血清ＩｇＡ１との結合能は、健常者等の非ＩｇＡ腎症患者血清ＩｇＡ１との結合能と比較して、高くなっていることを示し、ＩｇＡ腎症患者のＩｇＡ１は、ヒンジ部に結合するＯ結合型糖鎖に異常があり、その結果、ヒンジ部コアペプチド（ヒンジ部コアペプチドとは、ヒンジ部を構成するペプチドのことを言う）が露出した状態にあることを報告している（アメリカ腎臓学会誌、第８巻、５３８Ａ頁、１９９７年）。
このヒンジ部コアペプチドは、アミノ酸としてプロリン、セリン、スレオニンを多く含む点でムチンと構造上類似している。
既にヒトムチンコアペプチドには免疫活性化能が存在することが知られている。
例えば、Ｋｏｔｅｒａらは、ある種の癌細胞に高頻度に発現しているムチンは糖鎖が少ないためにコアペプチドが露出しており、その結果、宿主においてはコアペプチドに対する免疫反応が生じていることを報告している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第５４巻、２８５６〜２８６０頁、１９９４年）。
本発明者らは、上記の知見に基づいて鋭意研究した結果、ＩｇＡ腎症患者においては、ＩｇＡ１のヒンジ部に結合するＯ結合型糖鎖が減少し、ヒンジ部のコアペプチドが露出することでＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドに対する免疫反応が生じ、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体価が上昇していること、かつこの知見はＩｇＡ腎症の検査に利用することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに達した。
即ち、受診者の体液等を被検液として、その中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を決定することにより、ＩｇＡ腎症の迅速な検査が可能となる。すなわち、本発明は、ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチドを認識する被検液中の抗体を決定することに基づくＩｇＡ腎症の検査法である。
本発明において、ＩｇＡ１ヒンジ部とは、ＩｇＡ１分子を構成する重鎖中で、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域を指し、適宜Ｎ末端側にＰｒｏ−Ｖａｌ−を付加したものであってもよい。
この領域は、重鎖間のジスルフィド結合部分を含み、アミノ酸としてプロリン、セリン、スレオニンを多く含む。
本発明において、抗原であるＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドとしては、ＩｇＡ１ヒンジ部を構成するペプチドまたはその一部を使用できる。
好ましくは、アミノ酸配列が、Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓで示されるペプチド、またはその一部を構成し、かつ３つ以上のアミノ酸からなるペプチドを使用することが望ましく、例えばＶａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ、Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ、Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ、Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ、Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ、Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ、Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  ＳｅｒあるいはＰｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒで示されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられ、より好ましくは、５つ以上のアミノ酸からなるペプチド、例えば、Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ、Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ、Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ、Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ、Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  ＴｈｒあるいはＰｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓで示されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
また、本発明においては、実施可能な限り、ＩｇＡ１ヒンジ部またはその一部を構成するペプチドを含むすべてのペプチドまたは蛋白質等を使用できる。
さらに、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを種々のもの、例えば糖、脂質、官能基、保護基、あるいは架橋剤等で修飾したものであってもよく、また該ペプチドを蛋白質、プラスチック、またはラテックス粒子等の担体に結合せしめたものであってもよい。
本発明において、抗原であるＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドは、いかなる方法によって生成したものであってもよく、例えば合成によって生成したもの、患者または健常者等の非ＩｇＡ腎症患者に由来するＩｇＡ１から生成したもの、遺伝子組み換え技術によって生成したもの等を使用できる。
本発明において、被検液としては、血液、血漿、血清、唾液または尿等の生体体液、生体組織抽出液、組織培養上清液等が挙げられる。
本発明に関わる抗体の決定法の原理、検出感度、測定レンジあるいはその他の要因を考慮して、被検液原液で、あるいは被検液原液を緩衝液等により適宜希釈して使用される。
被検液中には、例えばＥＤＴＡ−ナトリウム、クエン酸ナトリウム、あるいはヘパリンナトリウム等に代表される抗血液凝固剤、被検液の安定化のために添加された物質、またはその他の物質を含んでいてもよい。
本発明に使用される緩衝液は、自体公知の抗原抗体反応を利用した抗体の免疫学的決定方法において通常用いられる緩衝液を使用することができるが、好ましくはｐＨ５〜９の範囲である緩衝液を使用することが望ましい。
例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝液（例えばヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、メス（ＭＥＳ）緩衝液等）等を使用できる。
また、本発明に関わる決定方法において使用されるマイクロタイタープレート、ラテックス粒子等の担体への蛋白質の非特異的吸着を防ぐ等の目的で、添加剤として、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンまたはスキムミルク等の蛋白質、界面活性剤、糖、キレート剤、還元剤、あるいは塩等を緩衝液中に適宜添加することは任意である。
その濃度範囲等は、例えば自体公知の抗原抗体反応を利用した抗体の免疫学的決定方法において通常用いられる濃度範囲等から適宜選択すればよい。
本発明において、決定される抗体としては、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドと反応する被検液中に存在するすべての抗体が挙げられるが、より好ましい抗体クラスとしては、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラスまたはＩｇＡクラスが挙げられる。
本発明において、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを抗原として被検液中の該抗原を認識する抗体を免疫学的に決定する方法は、抗原抗体複合体を形成せしめる条件下で、前述のＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドと被検液とを反応させ、形成された抗原抗体反応の生成物を測定することに基づいて被検液中のＩｇＡ１ヒンジ部コアペブチドを認識する抗体を定性または定量することにより特徴づけられる。
例えば、一般的に広く用いられている酵素免疫測定（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）法（蛋白質核酸酵素、別冊第３１号  酵素免疫測定法、１３〜２６頁、１９８７年）を用いることができる。
具体的には、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化した担体と被検液とを反応させ、次いで、標識抗体（抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体または抗原との結合活性をもつそれらのフラグメント等と標識酵素の複合体）を反応させ、次いで、抗原抗体複合体を介して担体に結合した標識酵素による反応を利用して発色を生じさせるための発色剤（基質）を加え反応させる。
必要に応じて酵素反応停止剤を反応させた後、生じた発色を任意の波長にて吸光度を測定することに基づいて被検液中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性または定量する方法を例として挙げることができる。
より具体的には、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチド、例えばＰｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓで示されるアミノ酸配列から適宜選択されるアミノ酸３つ以上、好ましくはアミノ酸５つ以上のペプチドよりなる合成ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に１：１〜１５：１（ペプチド：ＢＳＡ）の結合比で、好ましくは１：１〜１０：１（ペプチド：ＢＳＡ）の結合比で結合させたものを抗原として用いた場合、通常０．０１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲になるよう濃度調整した抗原を、プラスチック製のマイクロタイタープレートにウエルあたり通常２５μｌ〜２００μｌ添加し、通常４℃〜４０℃の温度範囲で、通常１０分間〜４８時間の範囲で静置した後、適当な緩衝液で洗浄して抗原を固相化する。
さらに、適当な緩衝液で希釈した被検液（例えば受診者の血清）を抗原を固相化したマイクロタイタープレートに通常２５〜２００μｌ添加し、通常４℃〜４０℃の温度範囲で、通常５分間〜４８時間の範囲で静置した後、適当な緩衝液で洗浄する。
次に、適当な緩衝液で希釈した自体公知の標識抗体（抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体または抗原との結合活性をもつそれらのフラグメント等と標識酵素、例えば酵素免疫測定法において通常使用されるペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼ等との複合体）を、通常２５μｌ〜２００μｌ添加し、通常４℃〜４０℃の温度範囲で、通常１０分〜４８時間の範囲で反応させた後、適当な緩衝液で洗浄する。
さらに、用いられた標識酵素による反応を利用して発色を生じさせるための発色剤（基質）を通常２５〜２００μｌ添加し、通常４℃〜４０℃の温度範囲で、通常１分間〜４８時間の範囲で反応させる。
必要に応じて酵素反応停止液を反応させた後、標識酵素と用いた基質との関係による酵素反応での発色を吸光度として任意の波長にて測定することに基づいて、被検液中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性または定量する方法を例として挙げることができる。
上記において、例えば標識酵素としてペルオキシダーゼを選択した場合には、基質としてオルトフェニレンジアミン等を用いることができ、酵素反応の結果生じた発色の程度を、例えば波長４９０ｎｍでの吸光度としてとらえればよい。
また、例えば標識酵素としてアルカリフォスファターゼを選択した場合には、基質として、パラニトロフェニルリン酸等を用いることができ、酵素反応の結果生じた発色の程度を、例えば波長４０５ｎｍでの吸光度としてとらえればよい。
上記の吸光度の値は、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体価（ＩｇＧクラス抗体価、ＩｇＭクラス抗体価もしくはＩｇＡクラス抗体価）が高い程、高い値となる。
例えば、健常者等の非ＩｇＡ腎症患者群の吸光度、あるいは得られた吸光度を標準物質から求められた検量線と比較することによって定量された濃度等の平均値＋２×標準偏差値を越える場合を陽性、越えない場合を陰性とする判断基準を用いて、受診者の吸光度値、あるいは上記と同様にして求められた濃度等の定量値からＩｇＡ腎症かどうかの検査を行うことが可能である。
酵素免疫測定法に限らず、抗ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を決定できる方法は、すべてこの検査法に用いることが可能である。例えば
（イ）一般的に広く用いられているラテックス凝集免疫測定（ｌａｔｅｘ  ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＬＡＰＩＡ）法（櫻林郁之介ら、日本臨床、第４８巻、増刊号、１３５６〜１３６１頁、１９９０年）に準じて、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化したラテックス粒子と被検液とを混合し、抗原抗体反応の結果生じる濁度を吸光度としてとらえ、その変化量を測定することに基づいて被検液中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性または定量する方法；
（ロ）免疫比ろう測定（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＮＩＡ）法（山岸安子、臨床検査、第２３巻、臨時増刊、１２８６〜１２８９頁、１９７９年）に準じて、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペブチドを固相化したラテックス粒子と被検液とを混合することによって生じた抗原抗体複合体に光（レーザー光）を照射し、その散乱光の強度の変化量を測定することに基づいて被検液中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性または定量する方法；
（ハ）ラテックススライド凝集法（柴田里美ら、機器・試薬、第１１巻、３３８〜３４２頁、１９８８年）に準じて、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化したラテックス粒子と被検液とを判定板上で混合し、抗原抗体反応の結果生じるラテックス粒子の凝集の有無またはその度合いを目視で確認することによって、被検液中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性する方法；あるいは
（ニ）カウンティングイムノアッセイ（ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＣＩＡ）法（橋本好一ら、検査と技術、第２２巻、第５号、６７〜６８頁、１９９４年）に準じ、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化したラテックス粒子と被検液とを混合し、抗原抗体反応の結果生じる凝集物の大きさおよび数を測定することに基づいて被検液中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性または定量する方法等を用いることができる。
（ホ）免疫比濁測定（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＴＩＡ）法（富山哲雄、臨床病理、第３５巻、８６８〜８７３頁、１９８７年）に準じ、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドと被検液とを混合し、抗原抗体反応の結果生じる濁度を吸光度としてとらえ、その変化量を測定することに基づいて被検液中に存在するＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性または定量する方法等を用いることができる。
（ヘ）発光免疫測定（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＬＩＡ）法（蛋白質核酸酵素、別冊第３１号  酵素免疫測定法、２５２〜２６３頁、１９８７年）；
（ト）蛍光偏光免疫測定（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＰＩＡ）法（倉田邦夫、免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用、経営教育出版１９８５年６月２０日発行、９１〜１０２頁）；
（チ）免疫電気泳動法（漆崎一朗、新津洋司郎、幸田久平、免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用、経営教育出版１９８５年６月２０日発行、６３〜７２頁）；
（リ）スピンイムノアッセイ（ｓｐｉｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＳＩＡ）法（佐用博照、免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用、経営教育出版１９８５年６月２０日発行、５２〜６２頁）；
（ヌ）蛍光免疫測定（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＩＡ）法（橋本琢磨ら、検査と技術、第２２巻、第５号、６１〜６６頁、１９９４年）；および
（ル）ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）法（倉田邦夫、免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用、経営教育出版１９８５年６月２０日発行、３３〜４１頁）等を用いることができる。
本発明における抗原抗体反応の生成物を定性または定量する方法は、用手法に限らず、自動分析装置を利用した方法であってもよい。
酵素免疫測定法により、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化したマイクロタイタープレート等を用いて被検液中のＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を決定する場合においては、例えば被検液分注、試薬分注、洗浄操作、吸光度測定、データ処理等を自動システム化した装置である、ＢＥＣＫＭＡＮ  Ｂｉｏｍｅｋ  １０００  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ベックマン社製）またはＣＥＬＬ  ＡＳＳＡＹ−２０００  ＲＯＢＯＴＩＣ  ＡＳＳＡＹ  ＳＹＳＴＥＭ（モリテックス社製）等が利用できる。
詳しくは、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化したマイクロタイタープレートに被検液、酵素標識抗体および基質液を洗浄操作をはさんで順次反応させ、必要に応じて酵素反応停止液を反応させた後、標識酵素と用いた基質との関係による酵素反応での発色を公知の測定条件から選択された任意の波長にて吸光度を測定することに基づいて被検液中のＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を定性または定量することができる。
また、ラテックス凝集免疫測定法により、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化したラテックス粒子を用いて被検液中のＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を決定する場合においては、例えば被検液分注、試薬分注、吸光度測定およびデータ処理等を自動システム化した装置である日立７０５、７０５０、７１５０、７３６、７０７０等の自動分析装置が利用できる。
詳しくは、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化したラテックス粒子と被検液とを反応セル中で混合し、公知の測定条件から選択された任意の波長、好適には４００ｎｍ〜９５０ｎｍの適宜な波長にて、ブランク補正を行い、一定時間後の吸光度変化量を測定することによって被検液中のＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する抗体を決定できる。
本発明の方法は、本発明の実施に必要な試薬類をキットにしておくと、操作がさらに容易となる。また、自動分析装置を使って本発明を実施する場合においても有利である。
本発明で用いられる試薬キットは、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを固相化した担体（例えばマイクロタイタープレートあるいはラテックス粒子等）と本発明を実施するに必要なその他の試薬類等、例えば緩衝剤、標準物質、標識抗体、基質、基質溶解剤あるいは反応停止剤等を適宜組合わせてなるキットを挙げることができる。
発明の実施の形態
以下、本発明の実施例を図面に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
実施例１
（１）抗原の調製方法
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＳＩＧＭＡ社から購入）をＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２））で１３．４ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、その１．５ｍｌを１５ｍｌプラスチック遠心管（住友ベークライト社から購入）に添加した。
この液にＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、同仁化学研究所から購入）をＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、和光純薬工業社から購入）にて１００ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解した液を１００μｌ添加し、室温にて６０分間反応させた。
反応後、ＰＢＳにて平衡化したＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から購入）に全量をかけ、ＰＢＳにて溶出させた。溶出液を１ｍｌずつ１５ｍｌプラスチック遠心管（住友ベークライト社から購入）に分画し、２８０ｎｍの吸光度を測定して蛋白質画分を集めた。
上記集められた蛋白質画分３ｍｌに、合成ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチド（Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ（分子量＝２０３１．３）、アコード社にて合成）をＰＢＳで２０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した液を２５０μｌ添加し、４℃にて３６時間反応させた。
反応後、ＰＢＳにて平衡化したＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラムに全量をかけ、ＰＢＳにて溶出させた。その溶出液を１ｍｌずつ１５ｍｌプラスチック遠心管（住友ベークライト社から購入）に分画し、２８０ｎｍの吸光度を測定して蛋白質画分を集め、１９．３ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度の液３ｍｌを得た。得られた液を抗原液として以下の実験に使用した。
（２）抗体価の測定
上記抗原液を、０．０１５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に１０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、９６穴マイクロタイタープレート（Ａ  Ｆｌｏｗ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製  Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  ＥＩＡ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ、Ｃａｔ．ｎｏ．７６−３８１−０４）の各ウエルに１００μｌずつ加え、４℃で一晩、インキュベーション（静置）した。
各ウエルに１％ウシ血清アルブミン（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、ＳＩＧＭＡ社から購入）含有のＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を２００μｌずつ加え、４℃で一晩、インキュベーションした。各ウエルを２００μｌのＰＢＳで洗浄を行った。
ＩｇＡ腎症患者群３２例の血清および非ＩｇＡ腎症患者群（ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者群）３２例の血清を、ＰＢＳで１／１００に希釈し、この希釈液を各ウエルに１００μｌずつ添加した。室温で３時間インキュベーションした後、各ウエルを２００μｌの０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ（以下ＰＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎと略す）で３回洗浄を行った。
各ウエルに、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｋｎｉｋａ社から購入）もしくはペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｋｎｉｋａ社から購入）を１／２００にＰＢＳで希釈したものを１００μｌずつ添加した。
室温で１時間、インキュベーションした後、各ウエルを２００μｌのＰＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行った。
発色剤（オルトフェニレンジアミン２０ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム１２水１．７９５ｇ、クエン酸０．５２５ｇ、過酸化水素１５μｌを、水５０ｍｌに溶解したもの）を、各ウエルに１００μｌずつ加え、室温で１時間、インキュベーションした。
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４５０）を用いて、波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。
（３）ＩｇＧクラス抗体価の結果
第２図は、抗ヒトＩｇＧを添加した場合の、ＩｇＡ腎症患者群（第２図中、ＩｇＡＮ群）および非ＩｇＡ腎症患者群（第２図中、非ＩｇＡＮ群）各３２例の４９０ｎｍの吸光度をプロットしたグラフである。
この場合、非ＩｇＡ腎症患者群３２例の平均値（０．３１６）＋２×標準偏差値＝０．６０６以上の吸光度のものを陽性とした。
実験の結果、非ＩｇＡ腎症患者群では、３２例すべてが陰性であるのに対して、ＩｇＡ腎症患者群では３２例中、１６例が陽性となり、両２群間で、陽性率に統計学的な有意差が確認された。
（４）ＩｇＭクラス抗体価の結果
第３図は、抗ヒトＩｇＭを添加した場合の、ＩｇＡ腎症患者群（第３図中、ＩｇＡＮ群）および非ＩｇＡ腎症患者群（第３図中、非ＩｇＡＮ群）各３２例の４９０ｎｍの吸光度をプロットしたグラフである。
この場合、非ＩｇＡ腎症患者群３２例の平均値（０．１３４）＋２×標準偏差値＝０．２７２以上の吸光度のものを陽性とした。
実験の結果、非ＩｇＡ腎症患者群では、３２例すべてが陰性であるのに対して、ＩｇＡ腎症患者群では３２例中、１３例が陽性となり、両２群間で、陽性率に統計学的な有意差が確認された。
実施例２
（１）抗原の調製方法
前記の実施例１（１）に記載の方法に従って、抗原を調製した。
（２）各種合成ペプチドの反応阻害活性の測定
上記抗原液を、０．０１５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に１０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、９６穴マイクロタイタープレート（Ａ  Ｆｌｏｗ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製  Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  ＥＩＡ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ、Ｃａｔ．ｎｏ．７６−３８１−０４）の各ウエルに１００μｌずつ加えて、４℃で一晩、インキュベーション（静置）した。
各ウエルに１％ウシ血清アルブミン（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、ＳＩＧＭＡ社から購入）含有のＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を２００μｌずつ加え、４℃で一晩、インキュベーションした。各ウエルを２００μｌのＰＢＳで洗浄を行い、抗原を固相化した。
一方で、実施例１において、陽性を示したＩｇＡ腎症患者１例の血清をＰＢＳで１／５０に希釈した液と合成ペプチド〔Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ（以下、ＰＶＰＳＴと称する）、Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ（以下、ＰＳＴＰＰと称する）、Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ（以下、ＴＰＰＴＰと称する）、Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ（以下、ＰＴＰＳＰと称する）、Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ（以下、ＰＳＰＳＴと称する）、Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ（以下、ＰＳＰＳＣと称する）；
以上ＩｇＡ１ヒンジ部の一部を構成するコアペプチドおよび
Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ（以下、ＳＰＤＬＰと称する）、Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ（以下、ＬＫＰＤＰと称する）、Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ（以下、ＬＰＰＬＴと称する）、Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ（以下、ＴＰＶＥＳと称する）、Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ（以下、ＴＰＤＥＴと称する）；
以上ウシ血清アルブミンの一部を構成するコアペプチド〕を１μｇ／ｍｌの濃度になるようＰＢＳに溶解した液あるいは合成ペプチドを含まないＰＢＳ（以下ブランク液という）とを等容量（１：１）混合し、室温で３時間インキュベーションした。
インキュベーション終了後、この液を抗原を固相化した９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに１００μｌずつ添加し、室温で３時間インキュベーションした。
各ウエルを２００μｌの０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ（以下ＰＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎと略す）で３回洗浄を行った。
次に各ウエルに、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｋｎｉｋａ社から購入）を１／２００にＰＢＳで希釈したものを１００μｌずつ添加した。
室温で１時間、インキュベーションした後、各ウエルを２００μｌのＰＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行った。
さらに、発色剤（オルトフェニレンジアミン２０ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム１２水１．９５ｇ、クエン酸０．５２５ｇ、過酸化水素１５μｌを、水５０ｍｌに溶解したもの）を、各ウエルに１００μｌずつ加え、室温で１時間、インキュベーションした。
インキュベーション終了後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４５０）を用いて、波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。
（３）各種合成ペプチドの反応阻害活性測定の結果
第４図は、各種合成ペプチドあるいはブランク液を予め反応させたＩｇＡ腎症患者血清とＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドとの反応性を４９０ｎｍの吸光度としてプロットしたグラフである。
実験の結果、ウシ血清アルブミンの一部を構成するコアペプチド（第４図中、ＳＰＤＬＰ、ＬＫＰＤＰ、ＬＰＰＬＴ、ＴＰＶＥＳ、ＴＰＤＥＴ）を添加した場合には反応阻害は認められず、いずれもブランク液の吸光度値に対して１０％未満の差であった。
一方、ＩｇＡ１ヒンジ部の一部を構成するコアペプチド（第４図中、ＰＶＰＳＴ、ＰＳＴＰＰ、ＴＰＰＴＰ、ＰＴＰＳＰ、ＰＳＰＳＴ、ＰＳＰＳＣ）を添加した場合には反応阻害が認められ、いずれもブランク液（第４図中、Ｂｌａｎｋ）の吸光度値に対して１０％以上の差が確認された。
以上の結果より、本発明による検査法はＰｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓのアミノ酸配列で表されるＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドを認識する被検液中の抗体を特異的に測定していること、および、ＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドの一部を構成し、かつ少なくとも５つ以上のアミノ酸からなるペプチドを抗原として用いれば検査が実施できることが判明した。
なお、参考のために、ＩｇＡ１のヒンジ部コアペプチド及びウシ血清アルブミンの一部を構成するコアペプチドの配列表を後記に示す。
発明の効果
本発明の検査法は、これまでの腎生検による検査法と比較して、受診者に与える精神的苦痛、腎周囲出血等の危険性および経済的負担が少なく、より簡単な操作で、短時間に検査が実施可能となるため、ＩｇＡ腎症の迅速・簡便な検査法として適している。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図はＩｇＡ１分子の構造の概略を示す模式図である。
第２図は抗ヒトＩｇＧを添加した場合の、ＩｇＡ腎症患者群および非ＩｇＡ腎症患者群各３２例の波長４９０ｎｍの吸光度をプロットしたグラフである。
第３図は抗ヒトＩｇＭを添加した場合の、ＩｇＡ腎症患者群および非ＩｇＡ腎症患者群各３２例の波長４９０ｎｍの吸光度をプロットしたグラフである。
第４図は各種合成ペプチドあるいはブランク液を予め反応させたＩｇＡ腎症患者血清とＩｇＡ１ヒンジ部コアペプチドとの反応性を４９０ｎｍの吸光度としてプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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