(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液、血漿、血清由来の試料中の目的とする遺伝子をＰＣＲ法によって増幅する核酸合成法において、遺伝子増幅反応液に血液、血漿、血清由来の試料及び０．４μｇ／ｍｌ〜３．２μｇ／ｍｌのヘパリン及びその塩を添加することを特徴とする核酸合成法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸合成法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１−２７４６９７号公報に述べられている。
【０００３】
ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【０００４】
ＰＣＲ法の１つの欠点は、色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が阻害されることである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることが広く知られている。
【０００５】
そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立って、被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。
最近では核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全な除去は困難であり、かつ試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。
従って、これらの問題点を解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれる。
【０００７】
そこで、本発明は、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
通常、血液抗凝固剤として用いられるヘパリンはＰＣＲ阻害物質として知られ、試料に添加するのに好ましくない物質とされる。しかし我々はこれらの現象を鋭意検討した結果、ヘパリンが生体試料中のＰＣＲ阻害物質の作用を抑制することを見いだした。また、ヘパリンのみでなくデキストランサルフェイト等硫酸化多糖が同様の作用を示すことをも見いだし本発明をなすに至ったのである。本発明は、上記課題を解決するため、血液、血漿、血清由来の試料中の目的とする遺伝子をＰＣＲ法によって増幅する核酸合成法において、遺伝子増幅反応液に血液、血漿、血清由来の試料及び０．４μｇ／ｍｌ〜３．２μｇ／ｍｌのヘパリン及びその塩を添加することを特徴とする。
【０００９】
ここで、ヘパリン及びその塩は、試料に加えてから、遺伝子増幅反応液に添加しても、遺伝子増幅反応液に直接添加してもよい。また、ヘパリン及びその塩は、遺伝子増幅反応液に均一に入っていない状態（たとえば試料に硫酸化多糖を加えて、この試料を反応液に攪拌せずに添加した場合など）でも同様の効果がある。
【００１０】
本発明において、試料は生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは、細胞、細菌、ウィルス等をいう。体液には血液、唾液、髄液、尿、乳が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは生体由来試料は、特別な前処理なしに直接遺伝子増幅反応液に添加される。
【００１１】
遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇＣｌ２、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び耐熱酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、ジメチルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加される場合がある。
【００１２】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −hydroxypropanesulfonic acid ）あるいはＣＨＥＳ（2ー（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液は、遺伝子増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００１３】
プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法により合成することができるし、また、生物界から単離することもできる。
【００１４】
耐熱酵素は、プライマー付加による核酸を合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味する。適切な耐熱酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明では遺伝子増幅反応液のｐＨを調節することにより、相乗効果が得られる。例えば、ｐＨは、２５℃の温度条件下で８．１以上、好ましくは８．５〜９．５である。
また、本発明では、遺伝子増幅反応液にポリアミンを添加してもよい。
【００１６】
なお、本発明の核酸合成法の手順は、ヘパリン及びその塩を添加する以外、通常の方法と何ら変わらない。すなわち、先ず、増幅しようとする目的の2本鎖ＤＮＡ断片を熱変性により、1本鎖のＤＮＡにする（ディナチュレーション工程）。次に増幅させたい領域を挟むプライマーをハイブリダイズさせる（アニーリング工程）。次に４種類のデオキシリボヌクレオチド類（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の共存下にＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プライマーの伸長反応を行う（ポリメライゼーション工程）。
【００１７】
【実施例】
（実験例１）
ＰＣＲ反応液（50μｌ）にヒトクエン酸処理したヒト血漿を１μｌ添加し、ＰＣＲを行った。また、ＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡ３fgをＰＣＲ反応液（50μｌ）に添加し鋳型ＤＮＡとした。ＰＣＲのプライマーはＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡのplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＲＶ−Ｍ；配列番号１）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（Ｍ１３−４７；配列番号２）であり、配列は次の通りである。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、１５０bp の増幅産物を得ることができる。
ＲＶ−Ｍ：    ５’ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ３’
Ｍ１３−４７：５’ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ３’
【００１８】
ＰＣＲ反応液には、10mM Tris-HCl, 50mM KCl,1.5mM MgCl2 , 200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP, 各0.4 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Japan）反応液を用いた。
ＰＣＲは、９４℃、３分のプレヒーティングの後、９４℃  ３０秒間、５５℃１分間、７２℃  １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃  ７分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含む、０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) 液中で電気泳動を行い検出した。
【００１９】
ヘパリンナトリウム（和光純薬製）をＰＣＲ反応液に直接添加して、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図１に示す。図中Ｍはサイズマーカー（HincIIで切断した250ng のφ X174-RF DNA）、１はヘパリン無添加、２は0.025μｇ／ｍｌ添加、３は0.05μｇ／ｍｌ添加、４は0.1μｇ／ｍｌ添加、５は0.2μｇ／ｍｌ添加、６は0.4μｇ／ｍｌ添加、７は0.8μｇ／ｍｌ添加、８は1.6μｇ／ｍｌ添加、９は3.2μｇ／ｍｌ添加、１０は6.4μｇ／ｍｌ添加、１１は12.8μｇ／ｍｌ添加、１２は25.6μｇ／ｍｌ添加、１３は51.2μｇ／ｍｌ添加、１４は102.4μｇ／ｍｌ添加したものを示している。
結果、ヘパリンを添加することによって、ＰＣＲ増幅産物が得られることがわかった。ヘパリンを0.1μｇ／ｍｌ以上、特に0.4μｇ〜25.6μｇ／ｍｌ添加するのが良好である。
【００２０】
（実験例２）
本例は、実験例１で増幅効率の良かったヘパリン0.8μｇ／ｍｌを反応液に加えた場合と加えない場合において、血液を段階希釈してＰＣＲを行った実験である。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。
【００２１】
ＰＣＲのプライマーはヒトのβ−グロビン遺伝子領域内に位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＧＨ２０；配列番号３）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＧＨ２１；配列番号４）であり、配列は次の通りである。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、４０８bp の増幅産物を得ることができる。
ＧＨ２０：５’ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ３’
ＧＨ２１：５’ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ３’
【００２２】
実験結果（電気泳動図）を図２に示す。図２中Ｍは分子量マーカー、１、５は血液0.5%添加、２、６は血液0.25%添加、３、７は血液0.125%添加、４、８は血液無添加のものを示す。なお１〜４はヘパリン無添加、５〜８はヘパリン添加したものである。
図より、本発明では、ヘパリンを添加することによって、血液を直接に鋳型として用いてもＰＣＲ阻害物質の作用を抑制し、高感度に検出できることがわかる。
【００２３】
（実験例３）
本例は、ＰＣＲ反応液（50μｌ）にヒト血清を１μｌ添加し、ＰＣＲを行った。また、ＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡ３fgをＰＣＲ反応液（50μｌ）に添加し鋳型ＤＮＡとした。ＰＣＲのプライマーは実験例１と同様にＲＶ−Ｍ、Ｍ１３−４７を用いた。0.0023ng から 100μg までの様々な量のデキストランサルフェイト（平均分子量５、５００）を添加して、ヒト血清によるＰＣＲ反応の阻害をデキストランサルフェイトが抑制し、反応を回復させる効果を検討した。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。ＰＣＲは９４℃、４分３０秒間のプレヒーティングの後、９４℃を３０秒間、５８℃を１分間、７２℃を１分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃のポリメライゼーションを７分間行った。実験結果（電気泳動図）を図３に示す。
【００２４】
その結果、ヒト血清、デキストランサルフェイトの両方とも添加しない１４の場合には、pUC18 plasmid DNAが鋳型となって、１５０塩基対の反応産物が得られる。この５０μｌの反応液に１μｌのヒト血清を添加した１３場合には反応が阻害されて産物は検出されていない。更にデキストランサルフェイトを１２の場合の0.023ng、１１の場合の0.095ng、１０の場合の0.38ng、９の場合の1.52ngを添加しても、産物は検出されていないが、８の場合の6.1ng、７の場合の24ng、６の場合の97ng、５の場合の390ngを添加した場合には、デキストランサルフェイトの効果により、反応産物が検出されている。更に４の場合の1.6μg、３の場合の6.3μg、２の場合の25μg、１の場合の100μgを添加した場合には、産物は検出されていない。
以上の結果から、デキストランサルフェイトが血清の反応阻害の作用を抑制し、反応を回復させる効果のあることが明らかとなった。
【００２５】
この実施例で効果の認められた濃度は、0.12μg/ml から7.8μg/mlの範囲であったが、他の実験から、使用するデキストランサルフェイトの分子量や血清の添加量で、有効な濃度範囲が変動することを確認しているので、効果のある濃度範囲を前記の範囲に限定するのもではない。
【００２６】
（実験例４）
５０μｌのＰＣＲ反応液に、0.05μｌのヒト血液と様々な濃度のデキストランサルフェイトを添加して、血液に含まれるヒトのＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応において、デキストランサルフェイトがその反応効率を高める効果を検討した。
ＰＣＲのプライマーは実験例２と同様にＧＨ２０、ＧＨ２１を用いた。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。
【００２７】
この反応液に0.05μｌのヒト血液と0.61ng から 10μg までの様々な量のデキストランサルフェイト（平均分子量１０、０００）を添加した。ＰＣＲは９４℃、４分３０秒間のプレヒーティングの後、９４℃を３０秒間、５５℃を１分間、７２℃を１分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃のポリメライゼーションを７分間行った。実験結果を図４（電気泳動図）に示す。
【００２８】
その結果、血液を0.05μｌとデキストランサルフェイトを加えない２の場合、１０の0.61ngを添加した場合には反応産物は得られていないが、９の場合の2.44ng、８の場合の9.76ng、７の場合の39ng、６の場合の156ngを添加した場合には、血液中に含まれるヒトＤＮＡを鋳型にして、４０８塩基対の反応産物が得られている。更に５の場合の0.625μg、４の場合の2.5μg、３の場合の10μgを添加した場合には、産物は検出されていない。１の場合は血液も添加していないので反応産物は得られるはずはない。
【００２９】
以上の結果から、血液を試料とするＰＣＲにおいて、デキストランサルフェイトが反応の効率を高める効果のあることが明らかとなった。
この実施例で効果の認められた濃度は、0.049μg/ml から3.1μg/mlの範囲であったが、他の実験から、使用するデキストランサルフェイトの分子量や血液の添加量で、有効な濃度範囲が変動することを確認しているので、効果のある濃度範囲を前記の範囲に限定するものではない。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、核酸の分離・精製の過程を経ずに、血清・血漿・血液等のＰＣＲ阻害物質を多く含んだ試料から、直接、目的のＤＮＡを効率よく増幅することが可能となった。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成の操作を行えるようになり、コンタミネーションの機会の軽減が可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ反応液（50μｌ）にヒトクエン酸処理したヒト血漿を１μｌ、および濃度の異なるヘパリンを添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図２】実験例１で増幅効率の良かったヘパリン0.8μｇ／ｍｌを反応液に加えた場合と加えない場合において、血液を段階希釈してＰＣＲを行った電気泳動図
【図３】ＰＣＲ反応液（50μｌ）にヒト血清を１μｌ、および濃度の異なるデキストランサルフェイトを添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図４】ＰＣＲ反応液（50μｌ）にヒト血液を0.05μｌ、および濃度の異なるデキストランサルフェイトを添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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