(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・テンダエ(Streptomyces tendae)が産生するα−アミラーゼ阻害酵素であるテンダミスタット(Tendamistat (HOE467))のα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドを用い、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の非存在下でα−アミラーゼの活性を阻害させるに際して、
前記α−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドとして、次の化１に示されたTen(16-22)，化２に示されたTen(15-23)の何れかから選ばれた１つ以上を用いることを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤の使用法。
【化１】
0004155531.tif 000012
【化２】
0004155531.tif 000013
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はα−アミラーゼ阻害剤の使用法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ストレプトマイセス・テンダエ(Streptomyces tendae)によって生産されたテンダミスタット(Tendamistat (HOE467))は、ブタ膵臓のα−アミラーゼに対して、阻害定数Ｋi ＝0.2 ｎＭもの強い阻害活性を示す細胞外酵素で、７４アミノ酸からなるタンパク質である(Vertesy,L.,Oeding,V.,Bender,R.,Zepf,K. and Nesemann,G.(1984) Eur.J.Biochem.141,505-512)。
【０００３】
強いα−アミラーゼ抑制の為にテンダミスタットは糖尿病治療のために適用されることが期待されている。このテンダミスタット自身の構造と、膵臓のα−アミラーゼとの複合体構造上の分析は、幾つかの文献に示されるように、Ｘ線結晶学とＮＭＲ分光学とによって成し遂げられている(Pflugrath,J.W., Wiegand,G., Huber,R. and Vertesy,L.(1986) J.Mol.Biol.189,383-386.)(Kline,A.D., Braun,W. and Wuthrich,K.(1986) J.Mol.Biol.189,367-382.)(Wiegand,G., Epp,O. and Huber,R.(1995) J.Mol.Biol,247,99-110.)(Occonnell,J.F., Bender,R., Engels,J.W., Koller,K.P., Scharf,M. and Wuthrich,K.(1994) Eur.J.Biochem.220,763-770.)。
【０００４】
これらの文献の結果から、テンダミスタットは、ジスルフィド結合によって架橋された小さいループと大きなループと（各々、Cys11-Cys27とCys45-Cys73）からなり、小さいループは、Trp18-Arg19-Tyr20というアクティブな配列（即ち、阻害活性部位）を含んでいるβ−シート中の２つの繋がりを連結するβ−ターンからなることが知られている。
【０００５】
ところで、最近ではβ−ターンの小さいループが注目されている。線状と環状とのペプチドの小さいβ−ターンのモデルについて、設計と形態と活性に関する幾つかの注目すべき報告がある(Blanco,F.J., Jimenez,M.A., Rico,M., Santoro,J., Herranz,J. and Nieto,J.L.(1991) Eur.J.Biochem.200,345-351.)(Etzkorn,F.A., Guo,T., Lipton,M.A., Goldberg,S.D. and Bartlett,P.A.(1994) J.Am.Chem.Soc.116,10412-10425.)(Matter,H. and Kessler,H.(1995) J.Am.Chem.Soc.117,3347-3359.)(Blanco,F.J., Jimenez,M.A., Herranz,J., Rico,M., Santoro,J. and Nieto,J.(1993) J.Am.Chem.Soc.115,5887-5888.)(Tian,Z.Q. and Bartlett,P.A.(1996) J.Am.Chem.Soc.118,943-949.)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、阻害活性とループサイズ及び構造との間の関係を調べるために、アクティブな配列を持っている５つの短い環状化ペプチドを合成し、互いを比較した(Hirano,T., Ono,S., Yamazaki,I., Morita,H., Yoshimura,T., Shimazaki,C., Yasutake,H. and Kato,T.(1997)Peptide Chemistry 1996,273-276.)。
【０００７】
具体的には、次の化６に示されたTen(16-22)，化７に示されたTen(15-23)，化８に示されたTen(14-24)，化９に示されたTen(13-25)，化１０に示されたTen(12-26)を合成し、５つの環状化ペプチドの円二色性（The circular dichroism；CD）スペクトルと阻害活性とを計測し、互いを比較した。
【０００８】
【化６】
0004155531.tif 000002
【０００９】
【化７】
0004155531.tif 000003
【００１０】
【化８】
0004155531.tif 000004
【００１１】
【化９】
0004155531.tif 000005
【００１２】
【化１０】
0004155531.tif 000006
【００１３】
しかしながら、合成した環状化ペプチド自体の阻害効果が低く、実用に供することができないと考えられた。
【００１４】
本発明者らでは、鋭意努力の結果、テンダミスタット及びテンダミスタットのα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた前述の環状化ペプチドの阻害物質をつきとめ、本発明に至った。
【００１５】
本発明は、α−アミラーゼ阻害剤としてのテンダミスタット及びテンダミスタットのα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドを使用する際に、充分なα−アミラーゼ阻害効果を得ることのできる使用法を得ることを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本請求項１に記載された発明に係るα−アミラーゼ阻害剤の使用法は、
ストレプトマイセス・テンダエ(Streptomyces tendae)が産生するα−アミラーゼ阻害酵素であるテンダミスタット(Tendamistat (HOE467))のα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドを用い、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の非存在下でα−アミラーゼの活性を阻害させるに際して、
前記α−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドとして、前述の化６に示されたTen(16-22)，化７に示されたTen(15-23)の何れかから選ばれた１つ以上を用いるものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明においては、α−アミラーゼ阻害剤としてのテンダミスタット及びテンダミスタットのα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた環状化ペプチドの活性を阻害する物質が、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）であることをつきとめた。
【００１９】
ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）は、水をはじめとして、エタノール、クロロホルム、エーテルなどの有機溶媒と任意の割合で混和し、多くの有機化合物を溶解するため、非プロトン性高極性溶剤として有機反応の溶媒に繁用されている。そのため、生化学の実験等には、必ず添加される物質である。
【００２０】
本発明では、ストレプトマイセス・テンダエが産生するα−アミラーゼ阻害酵素であるテンダミスタット又は該酵素のα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドを用い、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の非存在下でα−アミラーゼの活性を阻害させることにより、ジメチルスルフォキシドの存在下で行うのに比べて、約１００倍もの阻害効果が得られた。
【００２１】
本発明でのα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドとしては、Trp-Arg-Tyr という阻害活性部位を含み、これをほぼ中心にしてβ−シート中の２つの繋がりを連結するβ−ターンからなるペプチドであればよく、具体的には、前述の化６に示されたTen(16-22)，化７に示されたTen(15-23)の何れかから選ばれた１つ以上を用いるものである。
【００２２】
【実施例】
次に本発明を具体的な実施例を用いて説明するが、本発明ではこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１．環状化ペプチド（合成酵素）の合成
環状化ペプチドは、樹脂(ＳＡＬ樹脂；Watanabe Chemical社製)を使ったＦｍｏｃ法(Fluorenylmethoxycarbonyl法)によって、固相法の定法に沿ってペプチド合成装置で合成された。図１は前述の化１０に示すTen(12-26)の合成の手順を示すフロー図である。図１に示す通り、ペプチドの Ｎ-末端とＣ-末端とへのターミナル影響を取り除くために、acetyl基とamide基とによって保護した。
【００２４】
脱保護と、ペプチドとリンカーレジンとの切り離し（クリーベイジ）との後、生産物は、環状化の前に逆相ＨＰＬＣによって純化された。環状化ペプチドは、空気による酸化によって、３〜７日で得られる。これは分子中のチオール基（システイン残基中のSH基）が酸化され、分子の中の２つのチオール基が互いに結合（S-S結合）することにより環状化するためである。最終的な生産物は、逆相ＨＰＬＣで不純物を取り除き、ＦＡＢ及びＴＯＦ−質量分析器 によって分析された。
【００２５】
前述の化６〜化９に示す他の環状化ペプチドも同様の手順で行った。尚、ここで合成された環状化ペプチドTen(16-22)，Ten(15-23)，Ten(14-24)，Ten(13-25)，Ten(12-26)のアミノ酸配列は、後述する配列表の配列番号１〜５に示す。
【００２６】
実施例２．環状化ペプチドのＣＤスペクトルの検証
互いの環状化ペプチドの構造を比較するために、100mM Tris-HCl バッファ（ｐＨ 7.0）でのＣＤスペクトルが測定された。図２は５つの環状化ペプチドのＣＤスペクトル図である。図２に示す通り、Ten(14-24)は、202nmで５つの環状化ペプチドの中で最も深くなり、220nm当たりでなだらかとなっている点で、比較的に異なるＣＤスペクトルを示した。Ten(13-25)と Ten(16-22)が 204 nm で浅くなっているが、Ten(15-23)では、特徴的なＣＤバンドは観察されなかった。
【００２７】
一方、それぞれ自然のテンダミスタットの小さいループに対応しているTen(12-26)が、 200nmと230nmの当たりの低い正の、そして浅い谷があるようであった。これらの CD パターンからこれらの環状のペプチドには CD スペクトルに貢献するジスルフィド結合があるので、構造は、直接推定することができない。しかしながら、 CD の変化が、５つの環状化ペプチドの構造における相違を示している。
【００２８】
実施例３．環状化ペプチドのＤＭＳＯ存在下での阻害活性の検証
ブタ膵臓由来のα−アミラーゼに対抗する５つの環状化ペプチドの阻害活性を測定した。
【００２９】
具体的には、合成ペプチドをＤＭＳＯに溶解させ、それぞれ３ｍＭのストック溶液を調製した。ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ（シグマ社製）は緩衝液(100mM Tris-HCl,pH7.0)に溶解させ、２μＭのストック溶液を調製した。アミラーゼ活性の測定には、グルコース定量キットであるダイヤカラーリキッドＡＭＹ（小野薬品社製）を使用した。このキット中には酵素試液と基質試液が入っている。
【００３０】
先ず、酵素試液４８０μｌを反応用チューブに入れ、ペプチドストック溶液の適量（０〜７０μｌ）と、α−アミラーゼストック溶液２０μｌを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応液に基質試液２００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベート後、４１５ｎｍでのＵＶスペクトルの吸収強度の増加を測定した。この実験でＤＭＳＯ含量は０〜１０％になる。また対照として、それぞれ同量のＤＭＳＯを含むα−アミラーゼの活性を測定した。α−アミラーゼの最終濃度は約６０ｎＭである。
【００３１】
図３は５つの環状化ペプチドを添加した際のブタ膵臓由来のα−アミラーゼの残存活性を示す線図である。図３に示す通り、Ten(16-22)とTen(15-23)は、７５μＭで、それぞれ40%と60%の阻害活性を示した。Ten(13-25)もまた、弱い阻害作用を示した。一方、Ten(14-24)は示さなかった。
【００３２】
しかし、この実施例では、どのような再現性のある結果も、Ten(12-26)に関しては、得られなかった。これはバッファに対するTen(12-26)の低い溶解性のためであると考えられた。
【００３３】
Ten(16-22)とTen(15-23)との阻害定数（Ｋｉ）は、それぞれ１２７μＭと１２１μＭであった。これらの阻害定数（Ｋｉ）は、アクティブなシーケンスを持っている線型や環状の類似物に似ている(Matter,H. and Kessler,H.(1995) J.Am.Chem.Soc.117,3347-3359.)。
【００３４】
実施例４．テンダミスタット及び環状化ペプチドのＤＭＳＯ非存在下での阻害活性の検証
実施例３で示した通り、最も阻害活性の高い環状化ペプチドTen(16-22)及びTen(15-23)でも、阻害定数（Ｋｉ）は、それぞれ１２７μＭと１２１μＭであった。これは、天然のテンダミスタットの阻害定数Ｋi＝0.2ｎＭと比べても、遙かに低いものであった。そこで、ＤＭＳＯを合成ペプチドの溶媒として使用しない方法を用いた。
【００３５】
先ず、Ten(15-23)を緩衝液(20mM Tris-HCl,pH7.0)に溶かし、０．５〜１０μＭのストック溶液を調製した。ブタ膵臓由来のα−アミラーゼも同じ緩衝液に溶解させ、２０ｎＭのストック溶液を調製した。アミラーゼ活性の測定には、先の実施例３に示したものと同様のキットを用いた。
【００３６】
即ち、α−アミラーゼストック溶液３０μｌとペプチドストック溶液８３μｌを反応用チューブに入れ、３７℃で１０分間インキュベートした。これに酵素試液４８０μｌを加え、２分間インキュベートした。更に、基質試液２４０μｌを添加して、３７℃で４分間インキュベートした後、４１５ｎｍでのＵＶスペクトルの吸収強度の増加を測定した。α−アミラーゼの最終濃度は０．７ｎＭである。他のペプチドについても、同様の操作を行った。
【００３７】
図４は５つの環状化ペプチドを添加した際のブタ膵臓由来のα−アミラーゼの残存活性を示す線図である。図４に示す通り、Ten(15-23)は１μＭで９５％もの阻害活性を示した。Ten(16-22)は１．６μＭで、５０％の阻害活性を示すものの、４μＭでもその阻害活性は増加しなかった。他の合成ペプチドTen(12-26),Ten(13-25),Ten(14-24)は全て、この条件では阻害活性を示さなかった。
【００３８】
以上のように、テンダミスタット又は該酵素のα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドで、α−アミラーゼを阻害させる際に、ＤＭＳＯの非存在下で行うことにより、ＤＭＳＯの存在下で行うのに比べて、約１００倍もの阻害効果が得られた。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は以上説明したとおり、α−アミラーゼ阻害剤としてのテンダミスタット及びテンダミスタットのα−アミラーゼ阻害活性部位を備えた合成ペプチドを使用する際に、充分なα−アミラーゼ阻害効果を得ることのできる使用法を得ることができるという効果がある。これはおそらく、ＤＭＳＯによる環状化ペプチドの構造変化が起こり、α−アミラーゼ阻害効果が抑制されることが原因と考えられる。
【００４０】
【配列表】
0004155531.tif 000007
【００４１】
0004155531.tif 000008
【００４２】
0004155531.tif 000009
【００４３】
0004155531.tif 000010
【００４４】
0004155531.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は環状化ペプチドTen(12-26)の合成の手順を示すフロー図である。
【図２】環状化ペプチドTen(16-22)，Ten(15-23)，Ten(14-24)，Ten(13-25)，Ten(12-26)のＣＤスペクトル図である。
【図３】ＤＭＳＯ存在下での環状化ペプチドTen(16-22)，Ten(15-23)，Ten(14-24)，Ten(13-25)，Ten(12-26)を添加した際のブタ膵臓由来のα−アミラーゼの残存活性を示す線図である。
【図４】ＤＭＳＯ非存在下での５つの環状化ペプチドを添加した際のブタ膵臓由来のα−アミラーゼの残存活性を示す線図である。
【図１】
0004155531.tif 000014
【図２】
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【図３】
0004155531.tif 000016
【図４】
0004155531.tif 000017