(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子チップの調製方法において、下記式で示されるシランカップリング剤によって無機材料に官能基を導入する工程を含む、遺伝子チップの調製方法。
【化１】
0004150201.tif 000007
「式中、Ｙは-O-,-NH-,NR-を、；Ｘは-NH2 ,-OHを、；ａとｄは１〜１００、ｂとｃは０〜１００の整数を、；ｎは１〜１００の整数を、；Ｒは低級アルキルをそれぞれ意味する。」
【請求項２】
ａとｄは１〜１０、ｂとｃは０〜１０の整数であり、ｎが１〜１０である請求項１の遺伝子チップの調製方法。
【請求項３】
無機材料上にオリゴヌクレオチドプローブを官能基を介して固定化する工程をさらに含む、請求項１又は２の遺伝子チップの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のシランカップリング剤を用いた遺伝子チップの調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シランコート剤は、無機材料と有機材料を結合させるために用いられる。シランカップリング剤は水により加水分解されてシラノールとなり、部分的に縮合してオリゴマー状態になる。続いて、無機材料表面に水素結合的に吸着し、さらに脱水縮合により強固に結合する。このことにより、無機材料上にシランカップリング剤を介して有機材料と結合する官能基、例えばアミノ基、COOH基等を導入することができる。
これまでのシランカップリング剤は、１分子に１つの官能基しか持っていなかった。このため、官能基の単位面積当たりの導入密度は低く、無機材料上に結合させることのできる有機材料の量には限界があった。
（従来のシランカップリング剤）
【化２】
0004150201.tif 000002
「ここでＸは-NH2,-OH、Ｒは低級アルキルをそれぞれ意味する」
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、特定のシランカップリング剤を用いることによって、官能基の単位面積当たりの導入密度を高くし、無機材料上に結合させることのできる有機材料の量を大幅に上昇させた遺伝子チップの調製方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、1分子に複数の官能基をもつシランカップリング剤を用いることによって、
無機材料上への官能基の導入密度を高めた遺伝子チップの調製方法を開発し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
１．遺伝子チップの調製方法において、下記式で示されるシランカップリング剤によって無機材料に官能基を導入する工程を含む、遺伝子チップの調製方法。
【化１】
0004150201.tif 000003
「式中、Ｙは-O-,-NH-,NR-を、；Ｘは-NH2 ,-OHを、；ａとｄは１〜１００、ｂとｃは０〜１００の整数を、；ｎは１〜１００の整数を、；Ｒは低級アルキルをそれぞれ意味する。」
２．ａとｄは１〜１０、ｂとｃは０〜１０の整数であり、ｎが１〜１０である請求項１の遺伝子チップの調製方法。
３．無機材料上にオリゴヌクレオチドプローブを官能基を介して固定化する工程をさらに含む、請求項１又は２の遺伝子チップの調製方法。
からなる。
【０００６】
本発明の、シランカップリング剤のイメージ図は、以下である。
【化４】
0004150201.tif 000004
「ここでＸは-NH2,-OH、Ｒは低級アルキルをそれぞれ意味する」
Ｘを-NH2にすることで無限に官能基が増えていく可能性がある。
【０００７】
本発明のシランカップリング剤の一般式は以下である。
【化５】
0004150201.tif 000005
式中、式中、Ｙは-O-,-NH-,NR-を意味し、好適には、-NH-が例示される。Rは低級アルキル基を意味し、炭素数１〜３である。Ｘは、有機材料例えば塩基配列等と結合する官能基（アミノ基、COOH基）の末端であり、-NH2,-OHを意味する。ａ，ｂ，ｃ，ｄは各１〜１００の整数を意味するが（ｂとｃは０でもよい）、一般的には各１〜１０の整数である。より一般的には１〜５の整数である。ｎは２〜１００の整数を意味するが、一般的には２〜１０の整数である。より一般的には２〜５の整数である。
【０００８】
本発明のシランカップリング剤の調製は、自体公知方法に準じて達成できる。複数の官能基を有するシランカップリング剤は、例えば以下のようにして合成出来る。
(CH3O)3Si(CH2)3Cl  ＋    N(CH2CH2NH2)3
オートクレーブ
―――――――→  (CH3O)3Si(CH2)3NHCH2CH2N(CH2CH2NH2)2
100℃  20hrs
【０００９】
かくして提供されるシランカップリング剤は、公知の方法で例えば水により加水分解されてシラノールとなり、オリゴーマー状態から、無機材料表面に水素結合的に吸着し、さらに脱水縮合されて固着され、無機材料への官能基の導入の方法が提供される。導入された官能基は無機材料との結合１に対して少なくとも２つ以上の官能基を保有しており、極めて官能基密度の高い材料を提供する。この材料に、種々遺伝子情報を担持する有機材料を官能基を介して固定化すれば、極めて密度の高い効率的な例えば遺伝子チップの調製方法を提供する。
【実施例】
【００１０】
実施例１ シランカップリング剤の合成
以下の反応式で処理を行った。
(CH3O)3Si(CH2)3Cl  ＋    N(CH2CH2NH2)3
――――――――→    (CH3O)3Si(CH2)3NHCH2CH2N(CH2CH2NH2)2
オートクレーブ（100℃  20hrs）
【００１１】
合成例として上記反応式で官能基の枝が2つあるものの合成を示す。
合成法：
(3-Chloropropyl)trimethoxysilane 2.0g(0.01mole)をメタノール20mlにとかし、tri(2-aminoethyl)amine  3.0g(0.02mole)を加える、オートクレーブ中で100℃、20時間攪拌反応させる。反応液を水に投入し、苛性ソーダ水溶液でアルカリ性にした後、エーテル抽出する。エ-テル層をボウ硝で乾燥後、溶媒を留去する。得られた油状物をカラムクロマトで溶出し、目的物を単離した。目的物は以下にように元素分析により確認された。
Anal.  Calcd.for C12SiH32O3N4； C:46.75  Si:9.09  H:10.39  N:18.18
Found C                      ；47.09  Si:9.03  H:10.01  N:17.69
【００１２】
官能基の枝が１個のものはN(CH2 CH2 NH2 )3の代わりにNH2 CH2 CH2 NHCH2 CH2 NH2  3g(0.03mole)を用い10時間反応で行った（その他の操作は同様）。得られたものは(CH3 O)3Si(CH2 )3 NHCH2 CH2 NHCH2 CH2 NH2 である。（従来品レベル）
【００１３】
実施例２  無機材料への固定化
実施例１で合成した分子式
【化６】
0004150201.tif 000006
のシランカップリング剤を2％水溶液とし1時間攪拌後、これに顕微鏡用スライドガラスを浸漬した。１時間後スライドガラスを洗浄し、余剰なシランカップリング剤を除去した後、110℃で10分間焼いて、固定化した。
【００１４】
実施例３  有機材料の導入
このスライドガラスに5'末端にヒドロキシスクシンイミド基を、鎖内にCy5導入した0.5mMのオリゴヌクレオチドプローブを1μlずつ滴下し、１時間静置することによってスライドガラス上にオリゴヌクレオチドプローブを固定化した。また対照として、従来のシランカップリング剤(▲１▼KBM-603:N-β(アミノエチル）γ-アミノプロピルトリメトキシシラン、▲２▼KBM-903：γ-アミノプロピルトリメトキシシラン）で処理したスライドガラスを用いても行った。
未反応の余剰のプローブを洗浄除去し、有機材料の導入を完了した。
【００１５】
実施例４  評価
実施例３で得た、スライドガラス上に固定化されているCy5標識プローブの密度を蛍光強度によって評価した。その結果を図１に示す。本発明のシランカップリング剤で処理することにより、従来のシランカップリング剤に比べて、約1.8倍の蛍光強度が観察された。すなわち、スライドガラス上に導入された官能基の密度が増したことが明らかとなった。
【発明の効果】
本発明は、従来のシランカップリング剤に比べて、スライドガラス上に導入された官能基の密度が増した試薬を提供することに成功した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４のスライドガラス上に固定化されているCy5標識プローブの密度の蛍光強度で表した比較図である。
【図１】
0004150201.tif 000008