(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、及び該金属膜上に配置される厚さ10〜200Åの有機硫黄層であって、下記の式
式：ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｃ（ＮＨ2）3
で表される化合物を含む有機硫黄層を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項２】
前記有機硫黄層は、上記式で表される化合物の他に、メルカプト基と他の官能基を有する他の化合物を含むことを特徴とする、請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項３】
前記メルカプト基と他の官能基を有する他の化合物が下記の式（１）、式（２）、式（４）又は式（５）；
式（１）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2
式（２）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
式（４）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＣＨＯ
式（５）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＳＨ
で表される化合物であることを特徴とする、請求項２記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項４】
透明基板上に金属膜を配置した後、該金属膜の上に下記の式
式：ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｃ（ＮＨ2）3
で表される化合物を含む有機硫黄層を厚さ10〜200Åで配置することを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。
【請求項５】
前記有機硫黄層を、上記式で表される化合物の他に、メルカプト基と他の官能基を有する他の化合物を用いて形成させることを特徴とする、請求項４記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。
【請求項６】
前記メルカプト基と他の官能基を有する他の化合物が下記の式（１）、式（２）、式（４）又は式（５）；
式（１）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2
式（２）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
式（４）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＣＨＯ
式（５）：ＨＳ−（ＣＨ2）n−ＳＨ
で表される化合物であることを特徴とする、請求項５記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、臨床検査等で免疫反応を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサーが使用されている。
【０００３】
このような表面プラズモン共鳴を利用した測定装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）で一般的に使用される測定チップは、図１に示すような構造を有する。即ち、ガラス基板１'上に成膜された金属膜２'の上に、多孔性材料４が形成されており、この多孔性材料４の表面及び内部に酵素、抗体等の生理活性物質が担持又は固定されている。この多孔性材料４としては、例えば合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織物、編物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが使用される（特開平3-164195号公報参照）。また、市販品（BIAcore 2000用，ファルマシアバイオセンサー社製）では、この多孔性材料４としてカルボキシメチルデキストランが用いられている。
【０００４】
しかしながら、測定対象物と実質的にかつ効率的に相互作用する生理活性物質は、多孔性材料４の表面に存在するものだけであるため、多孔性材料４の内部に担持又は固定されている生理活性物質は有効に機能せず、その分感度が低下することとなる。
【０００５】
また、生理活性物質を金属膜２'に固定する方法として、ＬＢ（Langmuir-Blodgett ）法が用いられる場合もあるが（特開平5-288672号公報参照）、ＬＢ膜と金属膜との結合が弱く、ＬＢ膜が生理活性物質と共に脱落するという問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、固定化する生理活性物質が少量であっても、良好な感度が得られ、かつ製造が容易な表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は、金属膜上に有機硫黄層を形成し、該有機硫黄層に生理活性物質を固定化すれば、使用する生理活性物質が少量であっても良好な感度が得られることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、及び該金属膜上に配置される有機硫黄層を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップである。
【０００８】
また、本発明は、透明基板上に金属膜を配置した後、該金属膜の上に有機硫黄層を配置することを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ（以下、単に「測定チップ」という）とは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材をいい、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００１０】
本発明の測定チップは、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、及び該金属膜上に配置される有機硫黄層を備えている。ここで、「透明基板上に配置される金属膜」とは、金属膜が直接接して透明基板上に配置されている場合のほか、金属膜が透明基板に直接接することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意である。「金属膜上に配置される有機硫黄層」も上記と同様の意味である。
【００１１】
本発明の一例による測定チップの断面概略図を図２に示す。
本実施例による測定チップは、透明基板１と、透明基板１上に形成された金属膜２と、金属膜２上に形成された有機硫黄層３とを有する。
透明基板１としては、通常表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるものであればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
【００１２】
金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金属膜２に使用することのできる金属の種類としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独で又は組み合わせて使用することができる。また、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１３】
金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるのが好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。3000Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが好ましい。
【００１４】
金属膜２の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いるのが好ましい。
【００１５】
有機硫黄層３は、硫黄原子を介して金属膜２中の金属原子と結合し、少なくとも一つの有機官能基を有する物質からなる層である。有機硫黄層３の厚さは、10〜200 Åであるのが好ましく、特に10〜50Åであるのが好ましい。
【００１６】
有機硫黄層３は、メルカプト基と他の官能基を有する化合物（以下、単に「チオール化合物」という）を用いて形成させることができる。ここで、好ましいチオール化合物としては、下記の式（１）、式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）で表される化合物を例示できる。
【００１７】
式（１）：ＨＳ−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ2 
式（２）：ＨＳ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯＯＨ
式（３）：ＨＳ−（ＣＨ2 ）n −Ｃ（ＮＨ2 ）3 
式（４）：ＨＳ−（ＣＨ2 ）n −ＣＨＯ
式（５）：ＨＳ−（ＣＨ2 ）n −ＳＨ
【００１８】
これらの化合物の中でも、式（３）で表される化合物を用いるのが好ましい。この化合物は、１分子中に複数のアミノ基を有するので、より多くの生理活性物質を固定化することができるからである。
【００１９】
式（１）で表される具体的な化合物としては、メルカプトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカプト−１−アミノブタンを例示することができ、式（２）で表される具体的な化合物としては、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉草酸などを例示することができ、式（３）で表される具体的な化合物としては、１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパンなどを例示することができ、式（４）で表される具体的な化合物としては、メルカプトアセトアルデヒド、２−メルカプトプロピルアルデヒド、３−メルカプトブチルアルデヒド、４−メルカプトバレルアルデヒドなどを例示することができ、式（５）で表される具体的な化合物としては、ジメルカプトメタン、１，２−ジメルカプトエタン、１，３−ジメルカプトプロパン、１，４−ジメルカプトブタン、１，５−ジメルカプトペンタンなどを例示することができる。
【００２０】
チオール化合物を用いて有機硫黄層を形成する方法としては、チオール化合物の飽和蒸気中に金属膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、チーオル化合物を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラビア法）などを例示することができる。
【００２１】
なお、シランカップリング剤もチオール化合物と同様に金属膜２上に有機官能基を持つ分子層を形成することができるが、シランカップリング剤では、カルボキシル基を持つ分子層を形成することはできない。従って、チオール化合物は、カルボキシル基を導入する場合に特に有用である。
【００２２】
本発明における有機硫黄層３は、以下のような利点を有する。
▲１▼  生理活性物質を金属膜２に極めて近い位置に固定化することができるので、従来の測定チップを使用する場合よりも大幅に測定感度を向上させることができる。
▲２▼  成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理ができる。
▲３▼  チオール化合物の種類を変えることにより、膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾が可能となる。
本発明の測定チップは、有機硫黄層３に、直接又は水溶性多価性試薬を介して、生理活性物質を固定して使用する。
【００２３】
生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸等が挙げられる。免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００２４】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００２５】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも使用できる。
生理活性物質の厚さは、使用する生理活性物質自体の大きさにもよるが、100 〜3000Åであるのが好ましく、特に100 〜1000Åであるのが好ましい。
【００２６】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質である場合、その固定化は、所定量の生理活性物質を有機硫黄層３に所定時間接触させることにより行い得る。例えば、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測定チップを設置して一定流量の生理活性物質を所定時間（所定量）流すことによって固定化できる。
【００２７】
生理活性物質が核酸である場合、その固定化は、図３に示すように、有機硫黄層３上の有機官能基にアビジン51を結合させ、そのアビジン51にビオチン52で標識した核酸53を結合させることにより行い得る。核酸53をビオチン52で標識する方法としては、ビオチン52を結合させたプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。
【００２８】
水溶性多価性試薬は、生理活性物質を共有結合的に強固に固定化できるものであれば特に限定されず、有機硫黄層３上の有機官能基に応じて使用すればよい。例えば、有機硫黄層３上の有機官能基がアミノ基であれば、システイン、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ［２−（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸で例示されるマレイミド化合物及びＮ−スクシニシジルピリジルジチオカルボキシレートなどを使用することができ、有機官能基がメルカプト基であれば、システイン、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ［２−（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸で例示されるマレイミド化合物及びＮ−スクシニシジルピリジルジチオカルボキシレートなどを使用することができ、有機官能基がカルボキシル基及びアルデヒド基であれば、システイン、シュウ酸ヒドラジド、コハク酸ヒドラジド、アジピン酸ヒドラジド、セバシン酸ヒドラジド、シュウ酸ジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジドなどを使用することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２９】
このように水溶性多価性試薬を介して生理活性物質を強固に固定化することにより、当該測定チップを洗浄しても生理活性物質の固定化を維持できるため、繰り返し測定に使用することができるという利点が得られる。
【００３０】
水溶性多価性試薬の有機硫黄層３への固定化は、所定量の水溶性多価性試薬を有機硫黄層３に所定時間接触させることにより行い得る。例えば、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測定チップを設置して一定流量の水溶性多価性試薬を所定時間（所定量）流すことによって固定化できる。生理活性物質の水溶性多価性試薬への固定化は、生理活性物質を有機硫黄層３に固定化する場合と同様にして行うことができる。
【００３１】
本発明の測定チップは、例えば、図４に示されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用することができる。
この表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測定チップ６を設置して使用する。測定チップ６は、透明基板が上になるように設置する。カートリッジブロック７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測定チップ６とで測定セル71が構成される。測定セル71は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出される。
【００３２】
光源８からは、測定チップ６の透明基板に向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ６の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を検出することができる。
【００３３】
上記のような構造によって、ある入射角θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ６の透明基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるため、測定対象物質と生理活性物質との相互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強度曲線の谷のずれによって、測定対象物質の濃度の変化を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の測定チップは、製造が容易であり、また、固定化する生理活性物質が少量であっても、良好な感度で測定対象物質を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の測定チップの概略断面図である。
【図２】本発明の測定チップの一実施例の概略断面図である。
【図３】核酸を固定した本発明の測定チップの一実施例の概略断面図である。
【図４】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの概念図である。
【符号の説明】
１，１'…透明基板
２，２'…金属膜
３…有機硫黄層
４…多孔性材料
51…アビジン
52…ビオチン
53…核酸
６…測定チップ
７…カートリッジブロック
71…測定セル
72，73…流路
８…光源
80…入射光
９…検出器
90…反射光
【図１】
0004087471.tif 000002
【図２】
0004087471.tif 000003
【図３】
0004087471.tif 000004
【図４】
0004087471.tif 000005