(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄飽和度が50〜 100％である鉄結合型ラクトフェリンを有効成分とするコレラ菌、毒素原性大腸菌により生産される細菌性エンテロトキシンの中和剤。
【請求項２】
鉄飽和度が50〜 100％である鉄結合型ラクトフェリンを配合してコレラ菌、毒素原性大腸菌により生産される細菌性エンテロトキシンの中和機能を賦与した医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コレラ菌、毒素原性大腸菌により生産される細菌性エンテロトキシンの新規な中和剤に関する。また、本発明は、コレラ菌、毒素原性大腸菌により生産される細菌性エンテロトキシンの中和機能を賦与した新規な医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、コレラ菌による食中毒は、腹痛を伴う激しい下痢症状を引き起こす。このため、コレラ菌に感染した患者は、下痢による極端な脱水症状を呈し、死亡する場合もある。このコレラ菌による食中毒にみられる激しい下痢は、コレラ菌が菌体外に産生するコレラトキシンと呼ばれる細菌性エンテロトキシンによることが知られている。コレラトキシンは、分子量84,000のタンパク質で、Ａサブユニット１個とＢサブユニット５個からなっている。そして、コレラトキシンのＢサブユニットが、小腸粘膜細胞に存在するレセプターに結合して、細胞内のサイクリックＡＭＰ量を増大させることにより、膜透過性が変化し、細胞内の水分及び塩分が細胞外に浸出して下痢を引き起こすといわれている。なお、コレラトキシンのような細菌性エンテロトキシンは、毒素原性大腸菌やサルモネラ菌等からも分離されており、食中毒の原因となっている。
【０００３】
ところで、上述した小腸粘膜細胞に存在するレセプターは、糖脂質であることが確認されており、コレラトキシンのレセプターとしてガングリオシドＧＭ１が同定されている。そして、既に、このガングリオシドＧＭ１をコレラトキシンの中和剤として利用する試みがなされている。例えば、コレラトキシンの中和機能を有するガングリオシドＧＭ１等のガングリオシドをラテックス等に固定した細菌毒素中和剤 (特開昭 56-501381号公報) や乳脂肪球被膜を熱処理し、乳脂肪球被膜に含まれるガングリオシドＧＤ３やガングリオシドＧＭ３等を抽出することなく使用した細菌毒素中和剤 (特開昭60-72819号公報) 等が提案されている。しかし、ガングリオシドＧＭ１は、ウシ等の脳から微量しか得られないという問題があり、また、乳脂肪球被膜中のガングリオシド含量は一定でなく、かつ組成も安定しないという問題もあった。
【０００４】
また、細菌毒素がラクトフェリン等のシアル酸含有複合糖質に結合し、中和活性を示すことを利用した細菌毒素中和剤（特開平2-207089号公報）が提案されている。なお、ラクトフェリンは、鉄２分子をその分子内に結合することができる分子量約80,000の糖蛋白質であるが、鉄を結合した場合と鉄を結合していない場合とでは、分子の３次構造が異なることが知られている。しかし、ラクトフェリンの細菌性エンテロトキシン中和機能に関しては、３次構造の差異、すなわち、鉄結合性の有無による違いについて全く明らかにされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来より、ラクトフェリンのもつ薬理作用に注目し、鋭意研究を進めていたところ、コレラ菌、毒素原性大腸菌、サルモネラ菌等の産生する細菌性エンテロトキシンを中和する機能に関しては、鉄非結合型ラクトフェリンに殆ど活性がないのに対し、鉄結合型ラクトフェリンに強い活性があることを見出した。そして、この活性は、鉄結合型ラクトフェリンの鉄飽和度に依存することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
したがって、本発明は、コレラ菌、毒素原性大腸菌、サルモネラ菌等の産生する細菌性エンテロトキシンの新規な中和剤、あるいは、このような細菌性エンテロトキシンの中和機能を賦与した新規な医薬及び飲食品を提供することを課題とする。具体的には、本発明は、鉄結合型ラクトフェリンを有効成分とする細菌性エンテロトキシン中和剤を提供することを課題とし、また、本発明は、鉄結合型ラクトフェリンを配合して細菌性エンテロトキシン中和機能を賦与した医薬及び飲食品を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では、細菌性エンテロトキシン中和剤の有効成分として、あるいは、細菌性エンテロトキシン中和機能を医薬や飲食品に賦与するために、鉄結合型ラクトフェリンを使用することを特徴とする。
【０００８】
本発明で使用する鉄結合型ラクトフェリンは、ウシやヒト等の哺乳動物の乳、あるいは、これらの脱脂乳やホエー等を原料として、イオン交換クロマトグラフィー等の処理を施すことにより得られるラクトフェリンに、例えば、塩化第二鉄を溶解したクエン酸ナトリウム等の溶液中で鉄イオンをキレートさせた後、透析して脱塩することにより調製することができる。また、ラクトフェリンに鉄をキレートさせる際には、遺伝子組み換えの技術により得られたラクトフェリンを使用しても良いし、市販のラクトフェリンを使用しても良い。
【０００９】
ウシやヒト等の哺乳動物の乳、あるいは、これらの脱脂乳やホエー等から、ラクトフェリンを得る方法としては、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体を使用する方法 (特開昭 60-166619号公報、特開昭 60-145200号公報) 、ヘパリンを固定化した架橋型のセルロースやキトサンを担体として使用する方法 (特開昭 63-255299号公報) 、架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル化物を担体として使用する方法 (特開昭 63-255300号公報) 、スルホン基を導入した多糖類アフィニティ担体を使用する方法 (特開平3-109400号公報) 、陽イオン交換体を担体として使用し、イオン強度及びpHを調整することにより溶出する方法 (特開平5-202098号公報) 等が知られている。
【００１０】
なお、本発明で使用する鉄結合型ラクトフェリンの鉄飽和度としては、好ましくは20％以上であり、より好ましくは50〜 100％である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の細菌性エンテロトキシン中和剤は、鉄結合型ラクトフェリンを有効成分としたものである。そして、好ましくは、この細菌性エンテロトキシン中和剤の剤型として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤等とし、経口的に投与する。これらの剤型は、従来より知られている方法により製造することができ、例えば、製剤製造上許容される担体や賦形剤等と混合して成型することができる。また、本発明の細菌性エンテロトキシン中和機能を賦与した医薬及び飲食品は、鉄結合型ラクトフェリンを種々の剤型を有する医薬に配合したり、牛乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品、あるいは、各種粉乳の他、乳児、幼児、低出生体重児等を対象とする栄養組成物に配合したものである。これらの医薬や飲食品は、細菌性エンテロトキシン中和機能を有するので、コレラ菌、毒素原性大腸菌、サルモネラ菌等に感染することにより発症する食中毒等を予防し、あるいは、治療する用途に使用することができる。
【００１２】
なお、本発明で、細菌性エンテロトキシン中和機能を発揮させるためには、成人の場合、鉄結合型ラクトフェリンを１日当たり 0.1〜5,000mg 摂取できるように配合量等を調整すれば良い。
【００１３】
次に、実施例及び試験例を示し、本発明を詳しく説明する。
【００１４】
【実施例１】
鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度 100％) の調製
市販のラクトフェリン (オレオフィナ社製) の１％水溶液に１／５量の0.003M塩化鉄(III) を含む0.1Mクエン酸三ナトリウム溶液を加えて１時間撹拌し、鉄飽和度 100％の鉄結合型ラクトフェリン溶液を調製した。なお、この溶液に含まれるラクトフェリンについては、全てのラクトフェリン分子に鉄イオンが結合して鉄飽和度が 100％になっていることを確認した。次に、この鉄結合型ラクトフェリン溶液を透析チューブに封入し、蒸留水に対して透析して余分な塩類を除去した後、凍結乾燥して、鉄飽和度 100％の鉄結合型ラクトフェリン粉末を得た。
【００１５】
鉄非結合型ラクトフェリン (鉄飽和度０％、アポラクトフェリン) の調製
市販のラクトフェリン (オレオフィナ社製) の１％水溶液を透析チューブに封入し、20倍量の0.05％ＥＤＴＡを含む0.1Mクエン酸水溶液に対して４℃で30時間透析した。引き続き、この透析チューブを取り出して、蒸留水に対して24時間透析し、鉄飽和度０％の鉄非結合型ラクトフェリン（アポラクトフェリン）溶液を調製した。なお、この溶液に含まれるラクトフェリンについては、全てのラクトフェリン分子に鉄イオンが結合しておらず鉄飽和度が０％になっていることを確認した。次に、透析を完了した溶液を凍結乾燥して、鉄飽和度０％の鉄非結合型ラクトフェリン粉末を得た。
【００１６】
鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度20％及び鉄飽和度50％) の調製
得られた鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度 100％) 粉末を水に溶解し、濃度が 10mg/mlの鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度 100％) 水溶液を調製すると共に、得られた鉄非結合型ラクトフェリン (鉄飽和度０％) 粉末を水に溶解し、濃度が 10mg/mlの鉄非結合型ラクトフェリン (鉄飽和度０％) 水溶液を調製した。
【００１７】
そして、この鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度 100％) 水溶液と鉄非結合型ラクトフェリン (鉄飽和度０％) 水溶液を２：８の割合で混合することにより、鉄飽和度20％の鉄結合型ラクトフェリン溶液を調製し、凍結乾燥して、鉄飽和度20％の鉄結合型ラクトフェリン粉末を得た。
【００１８】
また、この鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度 100％) 水溶液と鉄非結合型ラクトフェリン (鉄飽和度０％) 水溶液を５：５の割合で混合することにより、鉄飽和度50％の鉄結合型ラクトフェリン溶液を調製し、凍結乾燥して、鉄飽和度50％の鉄結合型ラクトフェリン粉末を得た。
【００１９】
【試験例１】
実施例１に示した方法で調製した各鉄飽和度の鉄結合型ラクトフェリン及び鉄非結合型ラクトフェリンを試料として、毒素原性大腸菌エンテロトキシン又はコレラトキシンによるチャイニーズハムスター卵巣細胞形態変化に対する阻止効果を調べた。なお、試験は次のように行った。
【００２０】
(1) チャイニーズハムスター卵巣細胞形態変化の活性を測定する際に用いる毒素原性大腸菌エンテロトキシン又はコレラトキシン濃度の決定
抗原性の異なる２種類のエンテロトキシンであるＣＦＡ／Ｉ（ＬＴ−Ｉ）及びＣＦＡ／ＩＩ（ＬＴ−ＩＩ）を産生する毒素原性大腸菌 H-10407-p株（都立衛生研究所より分与）を普通ＣＡＹＥ培地で振盪培養した後、培養液を遠心分離し、得られた上清を1/10〜1/1,000 まで段階的に希釈した。次に、それぞれの希釈液を氷上に置いた Lab-Tek8 チャンバー (フローラボラトリーズ社製) に入れた。また、コレラトキシンＣＴ (リストバイオロジカルラボラトリーズ社製) についても同様に希釈して Lab-Tek8 チャンバーに入れた。そして、 Lab-Tek8 チャンバーの各穴に１％牛胎仔血清を含むダルベッコ培地 (ＦＣＳ／ＤＭＥＭ)400μl を入れ、これに、10％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで培養したチャイニーズハムスター卵巣Ｋ１細胞 (ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ATCC-CCL6)を 5,000cells/mlとなるよう10％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中に懸濁させた細胞懸濁液50μl を入れて、５％二酸化炭素濃度のインキュベーター中で37℃、１夜培養した。その後、培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水 (ＰＢＳ(-))でチャンバー内を洗浄し、さらに、チャンバー内の細胞を染色し、風乾した。
【００２１】
顕微鏡により、一つの試料について 200〜400 個の細胞を観察し、変形した細胞数の割合を数え、各毒素について、各濃度当たりのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形態変化率を算出した。その結果、コレラトキシンＣＴでは10μg/mlで、毒素原性大腸菌エンテロトキシンＬＴ−Ｉ及びＬＴ−ＩＩでは培養上清そのもので、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を少なくとも70％以上形態変化させることが判った。そこで、以下の実験においては、この濃度の各毒素を用いることにした。
【００２２】
(2) ＣＨＯ−Ｋ１細胞形態変化に対する阻止効果の確認
10μg/ml濃度のコレラトキシンＣＴ、あるいは、毒素原性大腸菌エンテロトキシンＬＴ−Ｉ及びＬＴ−ＩＩを含む培養上清をそれぞれ10μl ずつ、氷上に置いた Lab-Tek8 チャンバーに入れ、これに、鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度20％、50％及び 100％) 及び鉄非結合型ラクトフェリン (鉄飽和度０％) の各試料を必要濃度となるようＰＢＳ(-) に溶解した溶解液50μl を加えて振盪し、反応させた。その後、メタノール固定及びギムザ染色を行い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形態変化率を算出した。その結果を図１〜３に示す。
【００２３】
これによると、鉄結合型ラクトフェリンは、鉄非結合型ラクトフェリンと比較し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞形態変化に対する阻止効果を有しており、コレラトキシンＣＴ、毒素原性大腸菌エンテロトキシンＬＴ−Ｉ及びＬＴ−ＩＩの毒性を強く中和することが判った。また、このＣＨＯ−Ｋ１細胞形態変化に対する阻止効果の強さは、鉄結合型ラクトフェリンの鉄飽和度に依存しており、鉄飽和度が大きい程、強いことが判った。
【００２４】
(3) コレラトキシンＣＴのＢサブユニットとガングリオシドＧＭ１との結合に対する阻止効果の確認
先に述べたように、コレラトキシンＣＴにおいては、Ｂサブユニットが細胞表面のガングリオシドＧＭ１レセプターを介して細胞に結合した後、細胞内にＡサブユニットが侵入し、毒性が発現する。そこで、コレラトキシンＣＴ・ＢサブユニットとガングリオシドＧＭ１との結合に対する阻止効果を調べた。
【００２５】
すなわち、96穴平底プラスチックプレートにガングリオシドＧＭ１のエタノール溶液(1μg/ml）50μl を入れた後、エタノールを蒸発乾固し、ガングリオシドＧＭ１をプレートに吸着させた。次に、このガングリオシドＧＭ１を吸着させた96穴平底プラスチックプレートに１％牛血清アルブミンのＰＢＳ溶液（ＢＳＡ／ＰＢＳ）を満たし、１時間放置した後、0.05％ツィーン20を含むＰＢＳ（ＰＢＳツィーン20）で３回洗浄した。
【００２６】
一方、鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度20％、50％及び 100％) 及び鉄非結合型ラクトフェリン (鉄飽和度０％) の各試料を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液とし、これらの各試料25μl とパーオキシダーゼラベルコレラトキシンＣＴ・Ｂサブユニットの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液(1μg/ml）25μl とを予め混合し、30分間室温でインキュベートして混合液を調製した。
【００２７】
そして、この混合液を上述のガングリオシドＧＭ１を吸着させた96穴平底プラスチックプレートに加え、30分間放置した後、ＰＢＳツィーン20で６回洗浄し、２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６スルホン酸）−２アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を0.3mg/ml濃度となるように溶解した 0.006％過酸化水素を含む0.2Mクエン酸緩衝液(pH 4.0) 100μl を加え、10分後、 405nmの吸光度を測定することでコレラトキシンＣＴ・ＢサブユニットとガングリオシドＧＭ１との結合率を算出した。その結果を図４に示す。
【００２８】
これによると、鉄結合型ラクトフェリンは、鉄非結合型ラクトフェリンと比較し、コレラトキシンＣＴ・ＢサブユニットとガングリオシドＧＭ１との結合を強く阻止することが判った。また、この効果は、鉄結合型ラクトフェリンの鉄飽和度に依存しており、鉄飽和度が大きい程、強いことが判った。
【００２９】
【実施例２】
表１に示した配合により原料を混合した後、打錠機で打錠して、細菌性エンテロトキシン中和機能を賦与したタブレットを製造した。
【００３０】
【表１】
────────────────────────────────
鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度 100％)       10.0 (重量％)
還元麦芽糖                                    52.0
砂糖                                          15.0
乳糖                                          18.7
クエン酸                                       2.0
香料                                           1.0
滑沢剤                                         1.3
────────────────────────────────
【００３１】
【実施例３】
表２に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、細菌性エンテロトキシン中和機能を賦与した飲料を製造した。
【００３２】
【表２】
────────────────────────────────
鉄結合型ラクトフェリン (鉄飽和度 100％)        2.0 (重量％)
果糖ブドウ糖液糖                               8.0
クエン酸                                       0.6
リンゴ果汁                                    10.0
水                                            79.4
────────────────────────────────
【００３３】
【発明の効果】
本発明の細菌性エンテロトキシン中和剤や細菌性エンテロトキシン中和機能を賦与した医薬及び飲食品は、細菌性エンテロトキシンに対して優れた中和効果を示す。しかも、鉄飽和度を高めた鉄結合型ラクトフェリンを使用するので、比較的安価に大量供給が可能であり、かつ極めて安全性が高いという特徴も有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１における鉄結合型ラクトフェリン及び鉄非結合型ラクトフェリンのコレラトキシンＣＴによるＣＨＯ−Ｋ１細胞形態変化に対する阻止効果を示す。
【図２】試験例１における鉄結合型ラクトフェリン及び鉄非結合型ラクトフェリンの毒素原性大腸菌エンテロトキシンＬＴ−ＩによるＣＨＯ−Ｋ１細胞形態変化に対する阻止効果を示す。
【図３】試験例１における鉄結合型ラクトフェリン及び鉄非結合型ラクトフェリンの毒素原性大腸菌エンテロトキシンＬＴ−ＩＩによるＣＨＯ−Ｋ１細胞形態変化に対する阻止効果を示す。
【図４】試験例１における鉄結合型ラクトフェリン及び鉄非結合型ラクトフェリンのコレラトキシンＣＴ・ＢサブユニットとガングリオシドＧＭ１との結合に対する阻止効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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