(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスのＰＣＲアッセイを介してテストされる血液蛋白を含有するサンプルから妨害汚染物質を除去する方法であって、
（１）血液蛋白及び、ＰＣＲアッセイを妨害する汚染物質を含有する水溶液を遠心分離管に導入する工程、
（２）水性血液蛋白溶液を遠心分離に掛けて、遠心分離管中の溶液を、妨害汚染物質を含有する上澄み液とペレットとに分離する工程、
（３）実質的に全ての上澄み液を、遠心分離管から、ペレットを損わずに除去する工程、
（４）水性洗浄緩衝溶液を、ペレットを含有する遠心分離管に添加して、残留上澄み液を希釈して、妨害汚染物質を希釈上澄み液中に存在させる工程、
（５）希釈上澄み液を遠心分離に掛けて、最終上澄み液と洗浄ペレットとを用意する工程、及び
（６）大部分の最終上澄み液とそこに含まれる汚染物質を遠心分離管から除去して、残留上澄み液とＰＣＲ分析用の洗浄ペレットを回収する工程、
を含む事を特徴とする方法。
【請求項２】
水性洗浄緩衝溶液が、０．０５Ｍリン酸ナトリウムと０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する、６〜８の範囲のｐＨのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リン酸塩緩衝生理食塩水溶液のｐＨが６．８である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
初期遠心分離工程前に、（１）水性血液蛋白溶液の蛋白濃度を推定する工程、及び、（２）水性血液蛋白溶液を水で希釈して、希釈溶液の推定蛋白濃度を０．０２ｇ／ｍｌ〜０．０５ｇ／ｍｌの範囲内とする工程、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
水性血液蛋白溶液の蛋白濃度が、６ｇ／１００ｍｌより多く推定された場合に、０．５ｍｌの水性血液蛋白溶液を、１．０ｍｌの水と混合して蛋白濃度を減少させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
水性血液蛋白溶液の蛋白濃度が、６ｇ／１００ｍｌ未満と推定された場合に、１ｍｌの水性血液蛋白溶液を、０．２５ｍｌの水と混合して溶液を希釈する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
水性血液蛋白溶液が、ＰＣＲを介して分析されるウイルスをペレット化するのに十分な条件下で遠心分離に掛けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
水性血液蛋白溶液が、２３，０００ｘｇで、１６０〜１９０分間、１６±４℃で遠心分離に掛けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
希釈上澄み液が、２３，０００ｘｇで、３０分間、１６±４℃で遠心分離に掛けられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血液蛋白が、アルブミン、ファクターＩＩ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、ファクターＸ及びＸａ、フィブリノゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、トランスフェリン、ハプトグロビン、ガンマグロブリン、フィブロネクチン、プロテインＣ，プロテインＳ、α−１−プロティナーゼ抑制剤、Ｃ1エステラーゼ抑制剤、トロンビン及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
血液蛋白が、血清由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
血液蛋白が、全血由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
血液蛋白が、血漿寄付サンプル由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
血漿寄付サンプルが、多数の血漿寄付から形成されたプールから採取される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
阻害汚染物質が、ウイルスフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
妨害汚染物質が、可溶性又は懸濁性化学試薬又は分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
汚染物質がヘパリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
汚染物質がヘムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
最終上澄み液の８０〜９０容量％が、洗浄ペレットから除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスのＰＣＲを介してテストされるサンプルが、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスのＰＣＲアッセイを介してテストされる血液蛋白を含有するサンプルからウイルスフラグメントを除去する方法であって、
（１）血液蛋白及びウイルスフラグメントを含有する水溶液を遠心分離管に導入する工程、
（２）水性血液蛋白溶液を遠心分離に掛けて、遠心分離管中の溶液を、ウイルスフラグメントを含有する上澄み液とペレットとに分離する工程、
（３）実質的に全ての上澄み液とそこに含まれるウイルスフラグメントを、遠心分離管から、ペレットを損わずに除去する工程、
（４）水性洗浄緩衝溶液を、ペレットを含有する遠心分離管に添加して、残留上澄み液を希釈して、ウイルスフラグメントを希釈上澄み液中に存在させる工程、
（５）希釈上澄み液を遠心分離に掛けて、ウイルスフラグメントを含有する最終上澄み液と洗浄ペレットとを用意する工程、及び
（６）大部分の最終上澄み液とそこに含まれるウイルスフラグメントを遠心分離管から除去して、残留上澄み液とＰＣＲ分析用の洗浄ペレットを回収する工程、を含む事を特徴とする方法。
【請求項２２】
水性洗浄緩衝溶液が、６〜８の範囲のｐＨで、０．０５Ｍリン酸ナトリウムと０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
水性洗浄緩衝溶液のｐＨが６．８である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
初期遠心分離工程前に、（１）水性血液蛋白溶液の蛋白濃度を推定する工程、及び、（２）水性血液蛋白溶液を水で希釈して、希釈溶液の推定蛋白濃度を０．０２ｇ／ｍｌ〜０．０５ｇ／ｍｌの範囲内とする工程、を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
水性血液蛋白溶液の蛋白濃度が、６ｇ／１００ｍｌより多く推定された場合に、０．５ｍｌの水性血液蛋白溶液を、１．０ｍｌの水と混合して蛋白濃度を減少させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
水性血液蛋白溶液の蛋白濃度が、６ｇ／１００ｍｌ未満と推定された場合に、１．０ｍｌの水性血液蛋白溶液を、０．２５ｍｌの水と混合して溶液を希釈する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
水性血液蛋白溶液が、ＰＣＲで分析されるウイルスをペレット化するのに十分な条件下で遠心分離に掛けられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
水性血液蛋白溶液が、２３，０００ｘｇで、１６０〜１９０分間、１６±４℃の温度で遠心分離に掛けられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
希釈上澄み液が、２３，０００ｘｇで、３０分間、１６±４℃の温度で遠心分離に掛けられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
血液蛋白が、アルブミン、ファクターＩＩ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、ファクターＸ及びＸａ、フィブリノゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、トランスフェリン、ハプトグロビン、ガンマグロブリン、フィブロネクチン、プロテインＣ，プロテインＳ、α−１−プロティナーゼ抑制剤、Ｃ1エステラーゼ抑制剤、トロンビン及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
血液蛋白が、血漿寄付サンプル由来のものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
血漿寄付サンプルが、多数の血漿寄付から形成されたプールから採取される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
血液蛋白が、血清由来のものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
血液蛋白が、全血由来のものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
ＰＣＲを介して分析されるウイルスフラグメントが、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２から成る群から選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスのＰＣＲアッセイを介してテストされる血液蛋白を含有するサンプルを調製する方法であって、
（１）血液蛋白を含有する水溶液を遠心分離管に導入する工程、
（２）水性血液蛋白溶液を遠心分離に掛けて、遠心分離管中の溶液を、上澄み液とペレットとに分離する工程、
（３）実質的に全ての上澄み液を遠心分離管から、ペレットを損わずに除去する工程、
（４）水性洗浄緩衝溶液を、ペレットを含有する遠心分離管に添加して、残留上澄み液を希釈する工程、
（５）希釈上澄み液を遠心分離に掛けて、最終上澄み液と洗浄ペレットとを用意する工程、及び
（６）大部分の最終上澄み液を遠心分離管から除去して、残留上澄み液とＰＣＲ分析用の洗浄ペレットを回収する工程、を含む事を特徴とする方法。
【請求項３７】
水性洗浄緩衝溶液が、０．０５Ｍリン酸ナトリウムと０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する、６〜８の範囲のｐＨのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
リン酸塩緩衝生理食塩水溶液のｐＨが６．８である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
初期遠心分離工程前に、（１）水性血液蛋白溶液の蛋白濃度を推定する工程、及び、（２）水性血液蛋白溶液を水で希釈して、希釈溶液の推定蛋白濃度を０．０２ｇ／ｍｌ〜０．０５ｇ／ｍｌの範囲内とする工程、を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
水性血液蛋白溶液の蛋白濃度が、６ｇ／１００ｍｌより多く推定された場合に、０．５ｍｌの水性血液蛋白溶液を、１．０ｍｌの水と混合して蛋白濃度を減少させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
水性血液蛋白溶液の蛋白濃度が、６ｇ／１００ｍｌ未満と推定された場合に、１．０ｍｌの水性血液蛋白溶液を、０．２５ｍｌの水と混合して溶液を希釈する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
水性血液蛋白溶液が、ＰＣＲを介して分析されるウイルスをペレット化するのに十分な条件下で遠心分離に掛けられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＢＶ、ＨＡＶ及びＨＩＶの為のＰＣＲを介して分析されるサンプルを調製する為に、水性血液蛋白溶液を、２３，０００ｘｇで、１６０〜１９０分間、１６±４℃の温度で遠心分離に掛ける、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
汚染物質含有洗浄緩衝溶液を、２３，０００ｘｇで、３０分間、１６±４℃の温度で遠心分離に掛ける、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
血液蛋白が、アルブミン、ファクターＩＩ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、ファクターＸ及びＸａ、フィブリノゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、トランスフェリン、ハプトグロビン、ガンマグロブリン、フィブロネクチン、プロテインＣ，プロテインＳ、α−１−プロティナーゼ抑制剤、Ｃ1エステラーゼ抑制剤、トロンビン及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
血液蛋白が、血清由来のものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
血液蛋白が、血漿寄付サンプル由来のものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
血液蛋白が、全血由来のものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
血漿寄付サンプルが、多数の血漿寄付から形成されたプールから採取される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
上澄み液の８０〜９０容量％が、洗浄ペレットから除去される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
ＰＣＲを介して分析されるウイルスが、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２から成る群から選ばれる、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ＰＣＲテストサンプル製剤からの汚染物質の除去に関し、特に、本発明は、擬似陽性ＰＣＲ結果を与えてしまうウイルスフラグメントの除去法及び擬似陰性結果を与えてしまう妨害化学試薬及び分子の除去に関する。
発明の背景
血液、血漿、及び生物学的液体寄付（donation）プログラムは、生体の品質を改善し、様々な立場において生命を維持する為に使用される薬剤並びに血液製品の製造における本質的な第一段階である。その様な製品は、例えば、免疫疾患の治療、血友病の治療及び、外科手術及び他の治療プロトコルでの血液容量を維持し貯蔵する為に使用される。血液、血漿及び生物学的液体の治療的使用は、出来るだけウイルス汚染の無いそれらの材料の寄付を必要とする。一般に、各個人の血液、血漿、又はその他の液体寄付からの血清学テストサンプルは、特定のウイルス、例えば、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）及び二形態の人間の免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）に対する応答を誘発する様々な抗体に対してテストされる。更に、血清学テストサンプルは、特定のウイルス、例えば、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）に対して指定された抗原及びその様なウイルスの応答を誘発する抗体に対してテストしても良い。サンプルが、特定の抗体又は抗原の存在に対して血清学陽性である場合は、その寄付は、更なる使用から排除される。
或る種のウイルス、例えば、Ｂ型肝炎に対する抗原テストは、感染と極めて近い関係にあると考えられるので、抗体テストではない。血漿ドナーが、事実、そのウイルスに関連した抗体に対する血清学陰性をテストしながら、ウイルスで感染される事が長い間知られてきている。例えば、ドナーがウイルスに感染するかも知れない時間と、そのドナー系において、そのウイルスに対する応答を誘発する抗体の発現との間には一つの窓が存在する。従って、抗体検出の為のテストが、若しその窓の期間中に行われると、即ち、ウイルス感染と抗体産生の間に行われると、感染ドナーに対して擬似表示を与える事になる。更に、ＨＢＶに対する通常のテストが、抗体及び抗原の両方のテストを含むものであっても、より感応性のある方法によるテストが、ＨＢＶ抗原テストでは陰性であったサンプル中にＨＢＶウイルスの存在を確認している。初期ウイルス汚染からそれらの自由度を高める為に、利用できる抗体及び抗原テストをパスした寄付をテストする一つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によるその寄付のテストを含む。ＰＣＲは、ウイルスゲノムを増幅させる事によって、生物学的材料における対象ウイルスに関連する特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在を検出する為の高度に感応的方法である。ＰＣＲテストは、ウイルスそれ自身の本質的成分の存在を検出するテストであるので、ドナー中のウイルスの存在は、感染後、殆ど直ぐに見付けられる。従って、理論的には、その期間中にテストが、感染の自由度の擬似表示を与えるかも知れない窓の期間は存在しない。ＰＣＲテストの方法論及び実際的適用に就いての適当な記述は、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、第４，６８３，２０２号明細書、及び第５，１７６，９９５号明細書に含まれており、この記述は、参照として、ここに明白に導入される。
ＰＣＲテストの非常に敏感な性質の故に、ウイルスゲノムを増幅する事によって特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在を同定する事に関しては、ＰＣＲテストは、全体ではないけれども、即ち、感染性ウイルスがそのテストサンプル中に存在するとしても、ウイルス活性について擬似陽性表示を与えるかも知れない。ウイルスゲノム増幅は、その基体が、単に、テストサンプル中に存在する多数のウイルスフラグメントであっても引き起す事が出来る。
一般に、血漿寄付から造られる血液製品は、ＰＣＲテストサンプルを調製する前に、ウイルス不活性化処理に掛られる。幾つかの公知の方法が、ウイルス不活性化、例えば、溶剤／洗浄剤の使用又は少なくとも６０℃で少なくとも１０時間、製品を加熱する様なウイルス不活性化の為に利用できる。これらの方法は、一般に、「ｌｏｇ単位」の数で、ウイルスの濃度を減少させる事の出来るものである。例えば、溶剤／洗浄剤方法は、少なくとも１０7／ｍｌ又は「７ｌｏｇ単位」で、製品のウイルス汚染（例えば、Ｃ型肝炎）を減少させる事が出来る。例えば、血漿寄付から由来のファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ又はプロトロンビンコンプレックスの様な血漿製品は、存在が考えられる汚染ウイルスを不活性化する為に、加熱処理及び／又は溶剤／洗浄剤方法で、日常的に処理される。
ウイルスを不活性化するのに有効であっても、その様なウイルス不活性化方法は、全体のウイルスをフラグメント化させてしまい、それによって、その製品中にウイルスフラグメントを残しながら製品に非感染性を与えることとなる。これは、特に、製品が、その使用前にその後の処理工程なしに最終容器で、凍結乾燥状態で加熱処理される時に起きる。この様に、製品がウイルス不活性化に掛けられる時は、特に熱処理による場合は、ウイルスフラグメントが、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、会合したＲＮＡ又はＤＮＡと一緒にその製品中に残留する。非感染ウイルスフラグメント由来のウイルスゲノムの増幅は、ウイルス汚染の擬似表示をもたらす。前述の観点から、ＰＣＲテスト前で、ウイルスフラグメントの除去なしにウイルス不活性化の為に製品を熱処理する事は、好ましい方法ではないことが分かる。
ＰＣＲテスト結果における不確定性の更なる源は、血液、血漿、血清又は血液製品（例えば、血液又は血漿から造られたファクターＶＩＩＩ、又はファクターＩＸ）サンプルが、ＰＣＲ阻害剤と命名するのがベストかも知れないものを著しい濃度で含む事の事実に起因する。（ウイルスフラグメント及びＰＣＲ阻害剤の両方を、ここでは、ＰＣＲ方法の「妨害汚染物質」と呼ぶ）。最も一般的なＰＣＲ阻害剤としては、ヘム、ヘパリン、ＥＤＴＡの様な金属キレート化剤等が挙げられる。確かに、多くのサンプルは、日常的にヘパリン中に集められ、全サンプル人口の１０％程度が、少なくとも一つの形態のＰＣＲ阻害剤を含んでいるものと推定されている。
ＰＣＲ阻害剤含有サンプルは、ウイルスフラグメントの顕著な濃度を含むサンプルよりも尚一層問題がある。寄付人口からの収率を最大にする事が望ましいが、擬似陽性ＰＣＲウイルス表示は、製品の流れから排除されている、一つ又は多数の非汚染寄付を唯一結果としてもたらす。経済的立場からは極めて望ましいものではないが、この結果は、製品の流れの最終の人間の消費者に対して何ら実質的なリスクを与えるものではない。一方、テストサンプル中のＰＣＲ阻害剤に起因する擬似陰性ＰＣＲウイルス表示は、ウイルスで汚染された寄付を製品の流れに入れる事を潜在的に許すものである。
従って、ウイルスフラグメントの除去に加えて、ＰＣＲサンプル調製方法は、同様に、ＰＣＲ阻害剤を有利に除去出来るであろう。
発明の要旨
ＰＣＲ阻害剤及びウイルスフラグメントを含めて、血液蛋白含有ＰＣＲアッセイサンプルから妨害汚染物質を除去する方法が提供される。この方法は、血液蛋白を含有し、又、感染性ウイルス及び／又は汚染物質、例えば、ＰＣＲアッセイを妨害する、ウイルスフラグメント及び／又は溶解性又は懸濁性化学試薬又は分子の形態にあるＰＣＲ阻害剤を含有しても良い水溶液を遠心分離管に導入する工程を含む。水性血液蛋白溶液は、遠心分離に掛けられて、遠心分離管中の溶液を、潜在的な汚染物質を含有する上澄み液と固体ペレットに分離する。このペレットは、若し存在すれば、感染性ウイルスを含み、及び／又は、サンプルの性質によって不溶性蛋白又は細胞細片等を含む。実質的に全ての上澄み液は、ペレットを損なう事無しに、遠心分離管から除去される。水性洗浄緩衝溶液をこの遠心分離管に添加し、残留上澄み液を希釈して、潜在的妨害汚染物質を希釈上澄み液中に存在させる。次いで、この希釈上澄み液を、遠心分離に掛けて、最終の上澄み液と洗浄ペレットを用意する。この最終上澄み液の大部分とそこに含まれる汚染物質が遠心分離管から除去され、一方、残留上澄み液と洗浄ペレットは、ＰＣＲ分析の為に回収される。
詳細な説明
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ウイルス増幅テスト方法で使用する為のサンプル、特に、全血、血漿、血清又は血漿由来の血液製品のサンプルの製造並びに精製方法に関する。本発明で有利に使用される血液製品としては、アルブミン、ファクターＩＩ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、ファクターＸ及びＸａ、フィブリノゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、トランスフェリン、ハプトグロビン、ガンマグロブリン、フィブロネクチン、プロテインＣ、プロテインＳ、α−１−プロティナーゼ抑制剤、Ｃ1エステラーゼ抑制剤、及びトロンビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＰＣＲサンプルの調製の為の一般的方法
ＰＣＲを介してテストされるサンプル、即ち、ウイルス不活性化工程に掛けられた全血、血漿、血清又は再構成凍結乾燥血液ファクター製品は、最初に、テストの為に実験室に受け入れられる。製品の蛋白濃度は、当該技術分野において公知の方法を使用して決定される。サンプルが全血であり、抗凝固剤が存在する場合、サンプルは、最初に、穏やかな遠心分離、例えば、１５００〜１６００ｘｇで５分間の遠心分離に掛けられ、次いで、上澄み液血漿が蛋白濃度をテストされる。サンプルが全血で、抗凝固剤が存在しない場合、赤血球クロットは、穏やかな遠心分離、例えば、１５００〜１６００ｘｇで５分間の遠心分離に掛けられ、次いで、上澄み液血清が蛋白濃度をテストされる。サンプルの蛋白濃度が、サンプル溶液の１００ｍｌ当たり６ｇ未満であると決定された場合は、１ｍｌの製品サンプルが、遠心分離管中で、０．２５ｍｌの分子生物学等級水と混合される。サンプルの蛋白濃度が、サンプル溶液の１００ｍｌ当たり６ｇより多いと決定された場合は、０．５ｍｌの製品サンプルが、２つの管のそれぞれで、１ｍｌの分子生物学等級水と混合され、有効なＰＣＲテストに適した値（一般に、約０．０２〜約０．０５ｇ／ｍｌの範囲）まで下げた蛋白濃度に調整される。この遠心分離管をキャップして、次いで、数回反転してその内容物を混合し、次いでこの管を、存在するかも知れないウイルスであって、ＰＣＲ法を介して分析されるウイルスをペレット化するのに十分な条件下で遠心分離に掛ける。例えば、テストされるウイルスが、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、及び人間の免疫不全ウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２を含む場合は、管を、２３，０００ｘｇで、１６０分間、約１６°±４℃の温度で遠心分離に掛ければ十分である事が分かった。勿論、その他の時間及びｇ力も、ペレットが、与えられる特定のウイルス沈降速度及びその他のファクターがテストされるウイルスを含む事を高める結果をもたらす限りにおいて選択する事が出来る。遠心分離によって、蛋白溶液は、存在するかも知れない可溶性の妨害汚染物質を含む上澄み液と、存在するかも知れない目標ウイルスを含むペレット及び不溶性蛋白及び細胞細片等に分離される。
出来るだけ多くの上澄み液を、管の底部に触れる事無しに、又はペレットを損わずに遠心分離管からピペットで吸い取る。一般に、１０μｌ〜２０μｌの上澄み液を管中に残す。次いで、水性洗浄緩衝溶液を、ペレットを含む遠心分離管に添加する。好ましい実施態様では、緩衝溶液は、０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ4）と０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）から成り、約６〜約８、好ましくは約６．８の範囲のｐＨである。実施例では、凡そ５００μｌのリン酸塩緩衝液が、管の側面を下って、ペレットを損わずに、ゆるやかに添加される。洗浄緩衝液の添加は、管中に残る１０〜２０μｌの上澄み液を希釈して、存在するかも知れない妨害汚染物質を、希釈上澄み液中に存在させる為のものである。
希釈上澄み液及び一緒にされたペレットは、次いで、２３，０００ｘｇで、約３０分間、約１６℃±４℃で遠心分離に掛けられる。この第二の遠心分離は、ペレットが不用意に取除かれてしまった場合に、ペレットを、遠心分離管の底部に再度加える為に行われる。
１６℃±４℃が、遠心分離工程での好ましいサンプル温度であるが、約２℃〜約３７℃の範囲の温度も本発明の実施に適当である事に注意すべきである。然しながら、サンプルが前述の温度のいずれかであるのは極端な場合の時である事に注意すべきである。特に、約３７℃を超える温度は、サンプル中に存在するかも知れない全てのウイルスを、例えば、サンプル中に存在するかも知れないプロテアーゼ又はヌクレアーゼの活性によって、フラグメント化或いは劣化させる原因になるかも知れない。本発明方法によるウイルスの劣化及び得られる劣化ウイルスフラグメントのその後の除去の両方が、その後のＰＣＲテストから擬似陰性ウイルス表示の可能性を増加させる。一方、周囲温度が冷た過ぎると、生物学的物質及び付随のウイルスは、冷凍又は結晶化して、等しく不利なＰＣＲテスト結果となる。従って、約２℃〜約３７℃の範囲の温度が、本発明の実施には受け入れ可能であるが、１６℃±４℃の温度が好ましい。
遠心分離に続いて、上澄み液の大部分が遠心分離管から除去される。実施例では、約８０〜９０％の上澄み液が管から除去される一方で、１０〜２０％の上澄み液及びペレットが採取されて、十分に理解され且つ確立されているＰＣＲ方法論によるＰＣＲ分析の為に再懸濁される。
本発明の洗浄工程は、在るかも知れない汚染非感染性ウイルスフラグメント及びその他の在るかも知れない妨害汚染物質、例えば、ＰＣＲ阻害剤、ヘパリン、ヘム、ＥＤＴＡ等を除去する結果をもたらす。
リン酸塩緩衝生理食塩水洗浄溶液が好ましいが、その他の洗浄溶液も本発明の実施には有効である事も理解されるであろう。特に、薬学的等級生理食塩水を、リン酸塩緩衝生理食塩水溶液に対して置換しても良く、ハンクバランスソルト溶液（Hanks Balance Salt Solution）等を置換えても良い。然しながら、洗浄溶液は、ウイルスフラグメントを懸濁状態に保持する事が出来るのと同時に、ＰＣＲ阻害剤、例えば、ヘム、ヘパリン、又はＥＤＴＡの様な金属イオンキレート化剤の通常クラスに対する可溶性を用意する事が重要である。
実施例１
ウイルス不活性化の為の溶剤／洗浄剤及び加熱−処理でのＰＣＲテスト用ファクターＶＩＩＩコンプレックスの調製
本発明の実施の一実施例では、ファクターＶＩＩＩコンプレックスのＰＣＲサンプルを用意する為の出発物質は、ＨＩＶウイルスで汚染された寒冷沈降物である。この寒冷沈降物は、集められた人間の血漿から回収され、米国食品及び医薬局（U.S. Food and Drug Administration）によって保証された方法によってテストされた。血漿は、約−２０℃で冷凍し、その後、０℃〜５℃で解凍した。解凍工程中に、沈殿物が形成し（「寒冷沈降物」）、これは遠心分離で除去されて、更なる精製並びに濃縮の為に回収された。
一つの実施態様では、この寒冷沈降物を、水１ｍｌ当たり約３０〜１５０単位のヘパリンを含む蒸留水から成るヘパリン溶液に溶解した。次いで、この溶液を、約２０℃〜約３０℃の温度で混合（凡そ１０分）して、寒冷沈降物を完全に溶解し、寒冷沈降物／ヘパリン溶液を用意した。好ましくは、混合中の温度は、約３０℃に維持し、使用するヘパリン溶液の容量は、寒冷沈降物１ｋｇ当たり約２〜約１０リットルである。寒冷沈降物が溶解した後、寒冷沈降物／ヘパリン溶液のｐＨを、例えば、０．１ＭＨＣｌを使用して約７±０．１に調整し、この溶液を更に２０〜３０分間攪拌した。
次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）粉末、好ましくは約２０００〜約６０００の範囲の分子量を有するポリエチレングリコール粉末を、寒冷沈降物／ヘパリン溶液に添加して、最終ＰＥＧ濃度が約１％〜約５％（重量／容量）のＰＥＧ溶液を用意した。ここで使用する「重量／容量」とは、溶液の出発容量の１００ｍｌ当たり添加された材料の重量を意味する。ここで引用する百分率は、特段の指示が無い限り、全て重量／容量である。
ＰＥＧ溶液を形成する為のＰＥＧの添加は、ファクターＶＩＩＩコンプレックスを溶液中に残して、様々な蛋白、例えば、フィブロネクチン及びフィブリノゲンの様な蛋白の沈殿をもたらす。フィブロネクチン及びその他の沈殿した蛋白、即ち、ＰＥＧ沈殿物は、ファクターＶＩＩＩコンプレックス含有溶液（ＰＥＧ上澄み液）から、遠心分離によって分離される。ＰＥＧ上澄み液、即ち、ファクターＶＩＩＩコンプレックス含有不純蛋白画分は、回収されて、ファクターＶＩＩＩコンプレックスを精製する為に、更に本発明方法によって処理される。
一つの実施態様では、有機溶剤と洗浄剤の両方から成る溶液が、存在するかも知れないウイルスを不活性化する為に、ＰＥＧ上澄み液に添加される。添加される有機溶剤と洗浄剤の量は、約０．３％の有機溶剤と約１％の洗浄剤を含む溶液となるのが好ましい。実施例では、洗浄剤は、フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Sientific, of Springfield, New Jersey）から販売されている「Tween80」であり、溶剤は、トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）である。ウイルス不活性化ＰＥＧ上澄み溶液、即ち、ファクターＶＩＩＩコンプレックス含有不純蛋白画分は、濾過によって清澄化され、次いで、更に、ファクターＶＩＩＩコンプレックスの精製の為に、アフィニティークロマトグラフィーで処理された。
本発明の実施の実施例では、ウイルス不活性化工程からのファクターＶＩＩＩコンプレックス溶液（ファクターＶＩＩＩコンプレックス含有不純蛋白画分）が、この溶液をカラムを通して注入する事によって、ヘパリン結合クロマトグラフ媒体を含むクロマトグラフィーカラムに適用された。
ヘパリン結合クロマトグラフ媒体は、それに結合したファクターＶＩＩＩコンプレックスと一緒に洗浄されて、全ての未結合蛋白が除去される。一つの実施態様では、洗浄は、例えば、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ又はＫＣｌの塩溶液を約０．１Ｍ〜０．１５Ｍ含む、ｐＨが６．５〜７．５の、約０．０１〜０．０５Ｍ緩衝溶液、例えば、イミダゾール緩衝溶液から成る溶液の約５〜１０容量を適用する事によって効果的に行われ、カラムからの溶出液が集められる。
ファクターＶＩＩＩコンプレックスは、カラムから、即ち、ヘパリン結合クロマトグラフ媒体から、例えば、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＳｒＣＬ2等のカルシウム、マグネシウム、ストロンチウム又はその他の二価金属イオンを含む緩衝水溶液をカラムに適用する事によって溶出される。カラムは、この緩衝溶液で洗浄されて、全てのファクターＶＩＩＩコンプレックスがカラムから洗浄される。ヘパリン結合クロマトグラフ媒体から溶出されたファクターＶＩＩＩコンプレックスは、限外濾過によって、凡そ２０−ｆｏｌｄに濃縮され、カルシウム濃度が、約０．００２Ｍ〜約０．００５Ｍに減少される。ヒスチジンバッファー及びグリシン安定剤が、限外濾過したファクターＶＩＩＩコンプレックス溶液に添加され、ヒスチジンを約０．０２５Ｍの濃度に、そしてグリシンを約０．２８Ｍの濃度とし、ｐＨを，約１Ｍ〜約６ＭＨＣｌを使用して、凡そ７．３に調整する。この溶液を、次いで、別々のバイアルに分割し、各バイアルには、ファクターＶＩＩＩ：Ｃ活性の所望の数の単位を含ませた。この溶液を、次いで、凍結乾燥して、精製したファクターＶＩＩＩコンプレックス濃縮物の別々のバイアルを用意した。
凍結乾燥したファクターＶＩＩ１製剤を、最終ウイルス不活性化工程として、６０℃で７２時間の乾燥加熱処理に掛けた。
ＰＣＲテストサンプルを用意する為に、凍結乾燥したファクターＶＩＩＩ濃縮物を、ファクターＶＩＩＩ及び現に不活性化されたＨＩＶウイルス及び、例えば、残さのヘパリンの様な存在するかも知れないＰＣＲ阻害剤を含む水溶液として射出する為に、水で再構成した。
この凍結乾燥した再構成ファクターＶＩＩＩの蛋白濃度をテストし、サンプル溶液の１００ｍｌ当たり６ｇ未満である事が分かった。生成サンプルの１ｍｌを、遠心分離管中で、０．２５ｍｌの分子生物学的等級水と混合した。この遠心分離管を、数回反転して、一緒に材料を混合し、次いで、２３，０００ｘｇで、１６０分間、１６℃で遠心分離に掛けた。不溶性蛋白を含有するペレットが、この遠心分離管の底部で形成された。
この遠心分離管から、管中の上澄み液の約２０μｌを残して、管の底部に触れる事無しに、上澄み液を注意深くピペットで吸い上げた。５００μｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ4）、及び０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５）を、ペレットを損わない様に、管の側面を下ってゆっくりと遠心分離管に添加した。洗浄バッファー及びペレットを含むこの管を、次いで、２３，０００で、３０分間、１６℃で超遠心分離に掛けた。遠心分離後、上澄み液の一部を、１００μｌを残して（管の側面の容積計を使用して）管から除去した。
このサンプルを、ＰＣＲ分析、即ち、核酸抽出の為の第一工程の為に用意した。核酸抽出が、上澄み液の除去後８時間以内に開始される場合は、テストサンプルは、テストが始るまで、１００μｌのアリコート中に、２℃〜８℃で貯蔵される。テストが８時間以内に開始されない場合は、サンプルは−１５℃で、或いはクーラーで貯蔵される。凍結したサンプルは、次いで、テスト直前に解凍される。
実施例２
ＰＣＲテスト用血清の調製
ＨＩＶウイルスで汚染されている血漿寄付を、当該技術分野において公知の方法を使用して処理し、凝固赤血球細胞から血清を分離した。４ｍｌの血清サンプルを、ＨＩＶウイルスに対するＰＣＲテストの為に用意した。当該技術分野において公知の方法を使用して、血清の蛋白濃度が１００ｍｌ当たり６ｇより多くなる様に決定した。この血清サンプル０．５ｍｌを、２つの遠心分離管のそれぞれにおいて、１ｍｌの分子生物学的等級水と混合した。この遠心分離管を数回反転させて材料を一緒に混合し、次いで、２３，０００ｘｇで、１６０分間、約１６℃の温度で遠心分離に掛けて、各遠心分離管の底部においてＨＩＶウイルスを含むペレットを形成した。
出来るだけ多くの上澄み液を、管の底部に触れる事無しに、各遠心分離管からピペットで吸い上げた。約２０μｌの上澄み液を管中に残す。５００μｌのリン酸塩緩衝生理食塩水を、ペレットを損わない様に、各遠心分離管の側面を下ってゆっくりと添加した。この管を、２３，０００で、３０分間、１６℃で超遠心分離に掛けた。第二の超遠心分離後、上澄み液を、各管中に５０μｌを残してピペットで吸い上げた。
各管中のサンプルを、次いで、１００μｌ容量の単一管の中で一緒にして、サンプルを、標準ＰＣＲテスト方法を使用してＨＩＶウイルスに対するＰＣＲ分析に掛けた。
全血、血清、血漿、血漿プール又は血漿製品からのＰＣＲテストサンプルを調製する為の方法に就いての実施例の上記記述は、例示目的のものである。その変形は当業者にとって明らかであるから、本発明は、上記の特定の実施態様に限定されるべきものではない。例えば、本発明方法は、ウイルス不活性化工程を受けていないサンプルに適用しても良い。ＰＣＲサンプル調製方法がペレット、洗浄、及びその後の希釈上澄み液の除去を含む限り、本発明は、何らの前要素或いは上記の工程の存在なしに実施する事が出来る。
従って、本発明は、ここに開示の特定の実施態様に限定されるものではなく、添付のクレームの範囲によって定義されるものである。