(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
数平均分子量が３４０から４０００の範囲にあるカードラン加水分解物を有効成分とする免疫賦活剤。
【請求項２】
加水分解物が酸加水分解物である請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
加水分解物が蟻酸による加水分解物である請求項２記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
加水分解物がβ−１，３−グルカナーゼによる加水分解物である請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
免疫賦活作用がリンパ球共刺激作用である請求項１〜４いずれか１項記載の免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、副作用がない、食品の他、飼料および餌料にも、利用可能な免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御に重要な役割を果しており、その主要な機構は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原特異的に活性化し、これらの異物を排除する能力を高めることである。常に微生物に曝され、また、細胞が変異している生体内では、こうしたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化は常時起こっている。また、抗原特異的な活性化の他に、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の活性化には、菌体成分やレクチン等を認識する受容体を介する抗原非特異的な活性化がある。
抗原特異的および抗原非特異的のいずれの活性化においても、他からの刺激、すなわち、共刺激が加わるとＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化はさらに促進される。
現在の免疫賦活剤は、免疫担当細胞を非特異的に活性化することにより、微生物感染、腫瘍に対する生体の防御機構を高めているが、有効性において満足しうるものは少なくまた、これらの免疫賦活剤は、単独で免疫担当細胞を活性化するため、生体にとって好ましくない免疫応答を誘導し、種々のアレルギー反応の増悪をはじめとする副作用を引き起こす。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、免疫賦活作用が高く、さらに他の免疫賦活物質と併用することにより、より強い免疫賦活作用を示し、副作用がなく食品の他、飼料および餌料にも利用可能な免疫賦活剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖類および免疫に関する研究を進める上で、直鎖のβ−１,３グルカンが、リンパ球共刺激作用を示すことを見いだした。
かかるβ−１,３グルカンは、▲１▼抗原受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させ、また、▲２▼菌体成分あるいはレクチンを認識する受容体を介する刺激により抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させた。しかし、▲３▼β−１,３グルカン単独ではＴリンパ球およびＢリンパ球をほとんど活性化しなかった。
かくして、β−１,３グルカンは、抗原受容体を介するＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化を上昇させることから、生体内で常時起こっている、微生物および腫瘍細胞に対する排除反応を高め、単独でＴリンパ球およびＢリンパ球を活性しないことから、生体にとって好ましくない免疫応答を誘導せず、抗原非特異的なＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化上昇させることから、他の免疫賦活剤との併用が有効であり、β−１,３グルカンが、副作用がなく常用に適した免疫賦活剤であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、β−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫賦活剤を提供するものである。
用いるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類としては、カードラン加水分解物が挙げられる。特に、酸加水分解物、とりわけ蟻酸加水分解物またはβ−１,３−グルカナーゼのような酵素による加水分解物で、数平均分子量が３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
本発明の免疫賦活剤は、副作用がなく、常用に適しており、免疫力を高めるための医薬はもとより、食品にも利用できる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫賦活剤の有効成分であるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類としては、グルコース分子が分岐せずに、β−１,３−グルコシド結合により結合したオリゴ糖ないしは多糖であり、代表的な例としては、アルカリゲネス（Alkaligenes）属又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌が産生する、β−１,３−グルコシド結合を有する多糖類であるカードランの加水分解物が挙げられる。
以下、カードランの加水分解物を例として本発明を説明する。
カードランの加水分解物は、自体公知の多糖類の加水分解法により調製できるが、得られる加水分解物の免疫賦活活性から、蟻酸、酢酸のような有機酸、塩酸、硫酸のような無機酸、特に、蟻酸あるいはβ−１,３−グルカナーゼのような酵素で行うことが好ましく、数平均分子量が、３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
【０００７】
本明細書における数平均分子量は、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定したものである。
測定装置としては、東ソー（株）製の高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。
検出器：ＲＩ−８０２２
ポンプ：ＣＣＰＭ−ＩＩ
カラムオーブン：ＣＯ−８０２０
脱気装置：ＳＤ−８０２２
オートサンプラー：ＡＳ−８０２０
測定カラムは、ＴＳＫゲルのカラム（Ｇ−ＯＬＩＧＯ−ＰＷまたはＧ−３０００ＰＷＸＬ、７.８φmm×３０cm）を用い、流速０.６〜０.７ml／分、温度４０℃で測定した。試料の０.０２％水溶液を調製し、その２００μlを用いた。溶出は純水で行った。
一方、分子量既知のプルラン標準品を同様に測定して較正曲線を作成し、この較正曲線を基に、東ソー（株）ＧＰＣ−ＬＡＬＬＳプログラムとマイクロソフト（株）の計算プログラム「エクセル」によって分子量分布関数を求め、数平均分子量として算出した。
【０００８】
酸加水分解は、例えば、１〜８５重量％程度の酸を含有するカードランの０.５〜５.０重量％水溶液を、７０〜１００℃にて１０分〜３時間加熱することにより行うことができる。加水分解反応液を水酸化ナトリウム等のアルカリ剤で中和し、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活性炭処理、透析、溶媒分画、加熱によるホルミル基の除去等の自体公知の方法で精製することにより、所望の加水分解物が得られる。
酵素による加水分解は、例えば、用いる酵素に適したpＨ、温度で所定時間、カードランの０.５〜３重量％水溶液を酵素処理することにより行うことができる。ついで、酵素を失活させた後、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活性炭処理、透析、溶媒分画等の自体公知の方法で精製することにより、所望の加水分解物が得られる。
【０００９】
得られたカードラン加水分解物は、液体または固体の状態で、そのまま本発明の免疫賦活剤として使用できる。また、自体公知の医薬担体または賦形剤あるいは食品、飼料、餌料や、それら各々の成分と自体公知の方法で合して、免疫力を高める医薬、食品、飼料および餌料とすることができる。
用いる、医薬担体または賦形剤あるいは食品、飼料、餌料や、各々の成分は特に限定するものではなく、当該免疫賦活剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できる。また、免疫賦活剤の形態も特に限定する物ではなく、具体的用途に応じて、種々の固体や液体の形態とすることができる。
本発明の免疫賦活剤は、医薬として用いる場合、経口投与、非経口投与いずれでもよく、その投与量は、カードラン加水分解物の固形分量として１日当たり４mg〜４０gである。
本発明の免疫賦活剤を食品として用いる場合、調味料、畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ステープル、調味食品、調理済食品、デザート類、乳油製品、菓子、スナック菓子等の形態で提供することも可能である。
【００１０】
【実施例】
つぎに、実施例および試験例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
実施例１
酵素によるカードラン加水分解物の調製
カードラン４gを０.０５Ｍ酢酸緩衝液２００mlに分散し、ヒイロタケ酵素１８ユニット／mlを添加した。これを４０℃に昇温し、４時間インキュベートした後沸騰水浴中に１５分間保持して酵素を失活させた。ついで、冷却、遠心分離して沈澱部分を除去し、上澄を直径５cmの高さ３０cmのカラムに詰めた活性炭に吸着させ、１０００mlの水で洗浄後、さらに４％エタノール２０００mlで洗浄した。ついで、２０％エタノール２０００mlで吸着成分を溶出し、これをエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥した。
このものはＨＰＬＣで測定したときの数平均分子量が３４０（プルラン換算値）であり、そのまま本発明の免疫賦活剤として使用できるものであった。
【００１１】
実施例２
蟻酸によるカードラン加水分解物の調製
カードラン３０グラムを８５％蟻酸３０００ml中に分散し、９０℃まで加温して２０分間保持した。ついで、容器ごと冷水にさらして室温まで冷却し、エバポレーターで濃縮した後、５Ｎ ＮaＯＨで中和してpＨ７とし、遠心分離した。上澄はホルミル基を除去するため沸騰水浴中で１２０分間加熱したが、このとき、pＨが低下したので、２Ｎ ＮaＯＨを添加して７に戻した。このものをビスキングチューブ中にいれ純水１０リットルに対して一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。
このものをＨＰＬＣで測定したときの数平均分子量はプルラン換算で約２８００であり、そのまま本発明の免疫賦活剤として使用できるものであった。
【００１２】
試験例１
実施例１で得たカードラン酵素分解物および実施例２で得たカードラン蟻酸分解物を用いて、マウス脾臓リンパ球の抗原受容体を介する増殖反応に対するカードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物のリンパ球共刺激効果を検証した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、８週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの節に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を１×１０7／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレート１穴当たり５０マイクロリットルを播種した。抗マウスイムノグロブリンＭ（anti−ＩgＭ）を２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、無刺激群とした。Ｔリンパ球刺激群は、細胞播種前に、抗マウスＣＤ３抗体（anti−ＣＤ３）を１０マイクログラム／mlの濃度でほう酸緩衝液に溶解した液を１穴当たり１００マイクロリットル加え３７℃で３時間放置し、anti−ＣＤ３を各穴に付着させ、３時間後に各穴をＲＰＭl １６４０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地を１穴当たり５０マイクロリットル加えた穴に、細胞を播種した。
【００１３】
この３群にＲＰＭＩ１６４０培地（対照）あるいはカードラン酵素分解物を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、カードラン蟻酸分解物を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり１００マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養を終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭl １６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃で１日放置後、脾臓細胞の増殖反応をマイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定することにより求めた。表１にその結果を示す。
【００１４】
【表１】
0004091136.tif 000002
【００１５】
カードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物は抗原受容体を介したＴリンパ球増殖反応およびＢリンパ球増殖反応を強力に促進し、カードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物の抗原受容体を介したリンパ球増殖に対する共刺激効果が認められた。また、カードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物は単独ではほとんどリンパ球増殖反応を促進しなかった。
【００１６】
試験例２
実施例１および２で得られたカードラン酵素分解物およびカードラン蟻酸分解物を用いて、マウス脾臓リンパ球抗原非特異的増殖反応に対するカードラン酵素分解物およびカードラン蟻酸分解物のリンパ球共刺激効果を検証した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、８週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの節に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を１×１０7／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレート１穴当たり５０マイクロリットルを播種した。Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナバリンＡ（ＣonＡ）を８マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭl １６４０培地に溶解した液、Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｔリンパ球刺激群、Ｂリンパ球刺激群とした。
【００１７】
この２群にＲＰＭＩ１６４０培地（対照）あるいはカードラン酵素分解物を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、カードラン蟻酸分解物を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培養に溶解した液をそれぞれ１穴当たり１００マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養を終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加え、３７℃で１日放置後、脾臓細胞の増殖反応をマイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定することにより求めた。表２にその結果を示す。
【００１８】
【表２】
0004091136.tif 000003
【００１９】
カードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物は抗原非特異的なＴリンパ球増殖反応および抗原非特異的なＢリンパ球増殖反応を促進し、カードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物の抗原非特異的リンパ球活性化に対する共刺激効果が認められた。
【００２０】
試験例３
本試験例では、実施例１で得られたカードラン酵素分解物を用いて、マウスの免疫応答反応におけるカードラン酵素分解物の抗体産生促進作用を試験した。
１５週齢、雌性のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群６匹）に、生理食塩水で２×１０8／ｍｌに調製した羊赤血球溶液をマウス１匹当たり０.５ｍｌ腹腔内投与し、マウスを羊赤血球で一次免疫した。一次免疫の３日後に生理食塩水で２×１０9／ｍｌに調製した羊赤血球溶液をマウス１匹当たり５０μｌ足蹠内投与し、マウスを羊赤血球で二次免疫した。二次免疫の４日後にマウスの眼底静脈から採血し、血漿を分離し、抗羊赤血球ＩｇＭ抗体価および抗羊赤血球ＩｇＧ抗体価をエンザイムイムノアッセイにより測定した。
カードラン酵素分解物は、羊赤血球の一次免疫当日から連続して５日間毎日、カードラン酵素分解物を２０ｍｇ／ｍｌの濃度に生理食塩水で調製した溶液をマウス１匹当たり０.５ｍｌ腹腔内投与した。対照群には同様のスケジュールで生理食塩水をマウス１匹当たり０.５ｍｌ腹腔内投与した。
【００２１】
エンザイムイムノアッセイは、羊赤血球をホウ酸緩衝液で１×１０8／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え５℃で３日間放置し羊赤血球を各穴に付着させたプレートを用いて行った。分離した血漿をウシ血清アルブミンを１％含有するホウ酸緩衝液で１０倍希釈し１穴当たり５０μｌ加え室温で９０分間放置し、血漿の抗羊赤血球抗体をプレートに付着した羊赤血球と結合させた。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＭ抗体あるいは抗マウスＩｇＧｌ抗体を加え、プレートに結合させた抗羊赤血球抗体のＩｇＭ抗体あるいはＩｇＧｌ抗体に結合させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオルトフェニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝液を１穴当たり１００μｌ加え３７℃で３０分間反応させ、反応を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４９２ｎｍを測定することにより血漿抗羊赤血球ＩｇＭ抗体価あるいはＩｇＧｌ抗体価を求めた。
その結果を表３に示す。
【００２２】
【表３】
0004091136.tif 000004
【００２３】
表３から明らかなごとく、カードラン酵素分解物を投与したマウスの血漿抗羊赤血球ＩｇＭ抗体価あるいはＩｇＧｌ抗体価はカードラン酵素分解物の投与により上昇した。カードラン酵素分解物は、Ｔリンパ球に依存しないＢリンパ球のＩｇＭ抗体産生およびＴリンパ球に依存したＢリンパ球のＩｇＧｌ抗体産生のいずれも上昇させたことから、カードラン酵素分解物のＢリンパ球賦活作用およびＴリンパ球賦活作用が認められた。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫賦活作用が高く、他の免疫賦活物質と併用することにより、より強い免疫賦活作用を示し、副作用がなく、医薬はもとより、食品の他飼料・餌料にも利用できる免疫賦活剤が提供される。