(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の目的タンパク質と立体構造が既知の参照タンパク質とのアライメントを行い、選定された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて目的タンパク質の立体構造を構築する方法において、該アライメントを高ホモロジー用アライメントおよびプロファイルアライメント用の２種類のソフトウエアを用いて行い、参照タンパク質およびアライメントの該選定は、該２種類のソフトウエアで検出されたすべての参照タンパク質とのアライメントについて、参照タンパク質同士を該高ホモロジー用アライメントソフトウエアを用いて再アライメントを行い、該参照タンパク質同士のホモロジーが高い場合には、該目的タンパク質とのｅ値が高い参照タンパク質ならびにアライメントを排除することを特徴とするタンパク質の立体構造構築方法。
【請求項２】
高ホモロジー用アライメントのソフトウエアがＦＡＳＴＡであり、プロファイルアライメント用のソフトウエアがＰＳＩ−ＢＬＡＳＴである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数のアライメントが、ソフトウエアによって候補として選ばれてきた場合、個々に選定された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて目的タンパク質のＣα原子座標を算出し、Ｃα原子座標同士で立体構造のフィッティングを行い、各座標の根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）が一定の値以下の場合は同一の立体構造であると判断して、目的タンパク質との間でｅ値の高い方の参照タンパク質およびアライメントを排除して、さらに参照タンパク質およびアライメントが選定される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）が３．０Åである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
立体構造の作成が、選定されたアライメントの情報に基づいて、アミノ酸中のＣα原子について選定された参照タンパク質の立体構造から座標を取得し、目的関数を最小化するようにＣαの原子座標を最適化し、最適化されたＣαの原子座標に主鎖の他の原子を付加して目的関数を最小化するように主鎖の原子座標を最適化し、最適化された主鎖の原子座標に側鎖の他の原子を付加し目的関数を最小化するように最適化することにより行われる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、タンパク質の立体構造作成方法に関し、さらに詳しくは、特定の方法でアライメントおよび参照タンパク質を選定し、それらの情報に基づいて目的タンパク質の立体構造を構築する方法に関する。
世界中でゲノムの配列の決定が急速に行われてきており、ゲノムのコードするアミノ酸配列も同様に多数決定されてきている。本発明の方法は、アミノ酸配列の立体構造が精度良く得られるものであり、医農薬の分子設計等を中心に生物情報の解析を行う分野（バイオインフォマティックス）において極めて有用である。
背景技術
立体構造が既知のタンパク質に関する情報を利用し、立体構造が未知の目的タンパク質とのアライメントを得て、このアライメント情報に基づいて目的タンパク質の立体構造を、コンピュータを用いて作成することが可能であり、この手法は、通常ホモロジーモデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）と呼ばれている。ホモロジーモデリングにより構築される立体構造の精度は、近年目覚ましく向上しているが、未だ解決すべき問題点も多い。
ホモロジーモデリングにおいて、精度の高い真の構造に近い立体構造を得るためには、信頼性の高いアライメントを得ることが先ず重要である。任意の配列が与えられたとき、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）やＳＣＯＰ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）のような立体構造データベースから類似性の高いタンパク質を単数もしくは複数選び出し、アライメントを与える方法として、従来のアライメントを行うソフト、例えばＦＡＳＴＡおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等のコンピュータソフトを用いる方法がある。ＦＡＳＴＡは２０種類の天然アミノ酸を意味する２０種のアルファベット文字配列のマッチングを行うプログラムであり、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴでは、同じように文字配列のマッチングを行うが、文字が一致しているか否かの情報ではなく、プロファイルと呼ばれる文字の一致の度合いを類縁タンパク質の文字配列上の部位ごとの置換行列として算出し、更に繰り返し計算を行うことによりアライメントを最適化する性質を持っている。これらを用いることにより、ある程度信頼性のあるアライメントを供給すると言われている。
あるアライメントが存在したとき、直ちに立体構造の情報に変換する技術に関しては、モデリングソフトＦＡＭＳ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  １８，２５８−２７２，２０００）等を用いることにより可能であると言われている。しかしながら、上記のようなソフトの出力結果であるアライメントでそのままモデリングソフトを使って立体構造に変換しようとすると、タンパク質の構造形成の単位であるαヘリックスやβシート等の二次構造を分断し、真の構造から大きく外れる可能性が高くなる。また、二次構造のみならず、タンパク質の立体構造の主たる形成要因である疎水性相互作用を司る疎水性のアミノ酸残基等が、溶媒に対して露出してしまった不安定な形が存在したりする。このため、文字配列のみを考慮した方法では、作成されるタンパク質の立体構造に明らかに真の構造とはいえないような状況であった。
また、ホモロジーモデリングにおいて、前記の通り、精度の高い真の構造に近い立体構造を得るためには、信頼性の高いアライメントを得ることが先ず重要である。任意のタンパク質のアミノ酸配列が与えられたとき、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）や３次構造構成単位であるドメイン構造データベース（ＳＣＯＰなど）のような立体構造データベースから類似性の高いタンパク質を単数もしくは複数選び出し、アライメントを与える方法として、例えばＦＡＳＴＡおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等のコンピュータソフト用いる方法がある。ＦＡＳＴＡは２０種類の天然アミノ酸を意味する２０種のアルファベット文字配列のマッチングを行うプログラムであり、高ホモロジー（アミノ酸の一致度約３０％以上、ＦＡＳＴＡのｅ値では約０．０１以下に相当）の参照タンパク質に対して立体構造構築をすると、信頼性の高いモデルが構築出来るとされている。しかしながら、低ホモロジーの参照タンパク質（アミノ酸の一致度約２０％以下）に対しての信頼性は保証していない。
一方、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴでは、同じように文字配列のマッチングを行うが、文字が一致しているか否かの情報ではなく、プロファイルと呼ばれる文字の一致の度合いを類縁タンパク質の文字配列上の部位ごとの置換行列として算出し、更に繰り返し計算を行うことによりアライメントを最適化する性質を持っている。これにより、低ホモロジー領域であってもＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのｅ値で０．１以上であれば、ある程度信頼性のあるアライメントを供給すると言われている。
このようにＦＡＳＴＡおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは一つの任意配列に対し、別々の参照タンパク質とのアライメントの単数もしくは複数のアライメントを算出してくる。このアライメントは、双方共に文字配列のみを考慮したものであり、立体構造の情報は含まれていない。これらのソフトウエアもしくはその類縁のソフトウエアがアライメントを複数選んできたとき、どのアライメントに従って立体構造を構築すべきかの一般的な指針は今のところ存在しない。
また、あるアライメントが存在したとき、直ちに立体構造の情報に変換する技術に関しては、前記の通り、例えばモデリングソフトＦＡＭＳを用いることにより可能であると言われている。しかしながら、上記２つのソフトウエアが算出するアライメントは、モデリングソフトで処理可能な長さ以上のアミノ酸配列断片の挿入（挿入部分配列）を含んでいる場合が数多くあり、この長い挿入領城は現在のところ、モデリングは不可能であるとされていた。
発明の開示
本発明は、上記の状況に鑑みて、ホモロジーモデリングにより、任意のタンパク質の立体構造を、コンピュータを用いて精度良く効率的に構築する方法の提供を目的としてなされたものである。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、タンパク質のホモロジーモデリングにおいて、任意のアライメントと参照タンパク質の立体構造座標が与えられたとき、適切な立体構造モデル作成のためのアライメントを提供すべく検討を重ねた結果、与えれれたアライメントを、参照タンパク質の二次構造情報等に基づいて修正すれば、タンパク質の二次構造およびその近傍にアミノ酸配列断片の挿入および欠損が入らないようにすることが可能となり、真の構造により近く精度の高い立体構造が構築可能であることを見出した。
また、本発明者らは、タンパク質のホモロジーモデリングにおいて、性質の異なるアライメントソフトウエアを組み合わせて用い、また特定の方法により挿入部分配列の処理を行えば、精度良く立体構造の構築が可能であることを見出した。
更に、本発明者らは、ドメイン区切りが未知の立体構造の配列について、特定の方法で、既知の立体構造データベースを利用して効率的にドメイン区切りができることを見いだした。
更にまた、本発明者らは、任意のアミノ酸配列と参照タンパク質をアライメントするときに、任意のアミノ酸配列を介しても参照タンパク質の探索が可能でることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
即ち、本発明の第一の態様により、（１）任意の目的タンパク質と立体構造が既知の参照タンパク質とのアライメントを行い、選定された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて目的タンパク質の立体構造を構築する方法において、与えられたアライメントを、参照タンパク質の座標から得られる立体構造情報に基づいて修正し、修正されたアライメント情報に基づいて立体構造を構築することを特徴とするタンパク質の立体構造構築方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、（２）アライメントにプロファイルアライメント法を用いた場合は、そのプロファイル情報も考慮し更にアライメントを修正する上記（１）に記載の方法、（３）立体構造情報が、二次構造情報、疎水コア値情報および疎水コア距離情報である上記（１）または（２）に記載の方法、（４）立体構造の構築が、アミノ酸中のＣα原子について参照タンパク質の立体構造から座標を取得し、目的関数を最小化するようにＣα原子座標を最適化し、最適化されたＣαの原子座標に主鎖の他の原子を付加して目的関数を最小化するように主鎖の原子座標を最適化し、最適化された主鎖の原子座標に側鎖の他の原子を付加し目的関数を最小化するように最適化することにより行われる上記（１）〜（３）にいずれかに記載の方法が提供される。
以下、本発明の第一の態様を「アライメント修正法」と呼ぶことがある。
本発明の第二の態様により、（５）任意の目的タンパク質と立体構造が既知の参照タンパク質とのアライメントを行い、選定された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて目的タンパク質の立体構造を構築する方法において、該アライメントを高ホモロジー用アライメントおよびプロファイルアライメント用の２種類のソフトウエアを用いて行い、その結果に基づいて参照タンパク質およびアライメントを選定することを特徴とするタンパク質の立体構造構築方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、（６）参照タンパク質およびアライメントの選定が、２種類のソフトウエアで算出された複数のアライメント間で、高ホモロジー用ソフトウエアを用いて再アライメントを行い配列を較べ、互いにホモロジーが高い場合には目的タンパク質との間でｅ値の高い方の参照タンパク質およびアライメントを排除することにより行われる上記（５）に記載の方法、（７）高ホモロジー用アライメントのソフトウエアがＦＡＳＴＡであり、プロファイルアライメント用のソフトウエアがＰＳＩ−ＢＬＡＳＴである上記（５）または（６）に記載の方法、（８）複数のアライメントが、ソフトウエアによって候補として選ばれてきた場合、個々に選定された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて目的タンパク質のＣα原子座標を算出し、Ｃα原子座標同士で立体構造のフィッティングを行い、各座標の根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）が一定の値以下の場合は同一の立体構造であると判断して、目的タンパク質との間でｅ値の高い方の参照タンパク質およびアライメントを排除して、さらに参照タンパク質およびアライメントが選定される上記（５）〜（７）のいずれかに記載の方法、（９）根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）が３．０Åである上記（８）に記載の方法、（１０）立体構造の作成が、選定されたアライメントの情報に基づいて、アミノ酸中のＣα原子について選定された参照タンパク質の立体構造から座標を取得し、目的関数を最小化するようにＣαの原子座標を最適化し、最適化されたＣαの原子座標に主鎖の他の原子を付加して目的関数を最小化するように主鎖の原子座標を最適化し、最適化された主鎖の原子座標に側鎖の他の原子を付加し目的関数を最小化するように最適化することによ行われる上記（５）〜（９）のいずれかに記載の方法が提供される。
本発明の第三の態様より、（１１）任意の目的タンパク質と立体構造が既知の参照タンパク質とのアライメントを行い、選定された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて目的タンパク質の立体構造を構築する方法において、アライメントに予め作成された部分アミノ酸配列の座標データベースから得られる長さ以上の挿入部分配列（ｎ）がある場合、（ｉ）目的タンパク質の挿入部分配列を上記データベースから得られる長さに削除して参照タンパク質とのアライメントを行い、（ｉｉ）このアライメントを元に削られた目的タンパク質のＣα原子座標を構築し、（ｉｉｉ）削られた目的タンパク質の削除部分の末端から一定数のアミノ酸残基を削除し、ここで、削除するアミノ酸残基数は、上記データベースから得られる長さより少ない数とする、（ｉｖ）この削られた目的タンパク質と目的タンパク質とのアライメントを基に目的タンパク質のＣα原子座標を構築し、（ｖ）挿入部分配列（ｎ）から、削られた目的タンパク質の元の挿入部分配列（ｎ）に相当する部分に残存する削除後の残基数を引いた残基数が、上記データベースから得られる長さ以下となるまで上記操作を繰り返してＣα原子座標を構築することを特徴とするタンパク質の立体構造構築方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、（１２）立体構造の作成が、構築されたＣα原子座標について選定された参照タンパク質の立体構造から座標を取得し、目的関数を最小化するようにＣαの原子座標を最適化し、最適化されたＣαの原子座標に主鎖の他の原子を付加して目的関数を最小化するように主鎖の原子座標を最適化し、最適化された主鎖の原子座標に側鎖の他の原子を付加し目的関数を最小化するように最適化することにより行われる上記（１１）に記載の方法が提供される。
以下、本発明の第二および第三の態様をまとめて、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳ」と称することがある。
上記発明の別の態様により、（１３）立体構造が既知の参照タンパク質が、ドメイン単位に区切った立体構造データベースより選ばれる上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法が提供される。
本発明の第四の態様により、（１４）ドメイン区切りが未知の立体構造の配列について、ドメイン区切りが既知の立体構造の配列に対して配列上の相同性検索を行い、得られたドメイン毎の相同性配列のコンセンサスに基づいて、ドメイン区切りを決定することを特徴とするタンパク質のドメイン区切り方法が提供される。
この発明の好ましい態様により、（１５）得られたドメイン毎の相同性配列が識別子を有している場合、更に、識別子のコンセンサスに基づいて、決定されたドメインの識別子を決定する上記（１４）に記載の方法が提供される。
この発明の別の態様により、（１６）上記（１４）または（１５）に記載の方法により構築されたドメイン単位に区切った立体構造データベースが提供される。
上記発明の別の態様により、（１７）ドメイン単位に区切った立体構造データベースが、上記（１６）に記載の立体構造データベースである上記（１３）に記載の方法が提供される。
本発明の第五の態様により（１８）（ｉ）任意の目的タンパク質について、アミノ酸配列データベースに対して相同性検索を行い、目的タンパク質の配列と相同性を有するアミノ酸配列データベースの配列を検出し、（ｉｉ）検出されたアミノ酸配列について、立体構造データベースの配列に対して相同性検索を行い、検出されたアミノ酸配列データベースの配列と相同性を有する立体構造データベースの配列を検出し、（ｉｉｉ）検出された立体構造データベースの配列と目的タンパク質の配列とのアライメントを得て、該立体構造デーベースの配列を参照タンパク質とすることを特徴とするアミノ酸配列データベースを介した参照タンパク質探索方法が提供される。
この発明の好ましい態様により、（１９）相同性検索が、アライメントソフトを用いて行われる上記（１８）に記載の方法、（２０）目的タンパク質の配列と相同性を有するアミノ酸配列データベースの配列が複数検出された場合、高ホモロジーアライメントソフトを用いて配列冗長性の排除を行う上記（１８）または（１９）に記載の方法、（２１）配列冗長性の排除が、段階的に可変にした判断基準で行われる上記（２０）に記載の方法、（２２）検出されたアミノ酸配列データベースの配列が１０個となるまで配列冗長性の排除が行われる上記（２０）または（２１）に記載の方法、（２３）検出された立体構造データベースの配列と目的タンパク質の配列とのアライメントが複数得られた場合、各アライメント間の一致部分はそのままとし、不一致部分はそれらのコンセンサスに基づいて確定させ、単一のアライメントを得る上記（１８）〜（２２）のいずれかに記載の方法、（２４）目的タンパク質について、立体構造データベースに対して相同性検索を行い、目的タンパク質と相同性を有する立体構造データベースの配列が検出されなかった場合に行われる上記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の方法が提供される。
この発明の別の態様により、（２５）参照タンパク質の選定が、上記（１８）〜（２４）のいずれかに記載の方法により行われる上記（１）〜（１３）および（１７）のいずれかに記載の方法が提供される。
本発明の第六の態様により、（２６）上記（１）〜（１３）、（１７）および（２５）のいずれかに記載の方法により得られるタンパク質の立体構造を規定する原子座標が提供される。
本発明の第七の態様により、（２７）上記（２６）に記載の原子座標が記録されていることを特徴とするコンピュータ読みとり可能な記録媒体が提供される。
本発明の第八の態様により、（２８）上記（２６）に記載の原子座標を含むことを特徴とするデータベースが提供される。
本発明の第九の態様により、（２９）上記（２６）に記載の原子座標、または、（２７）若しくは（２８）に記載の記録媒体若しくはデータベースの原子座標を用いて作成されたタンパク質の立体構造と、薬物候補分子の立体構造との相互作用に基づいて、目的とする薬物分子を同定、検索、評価または設計することを特徴とする薬物分子設計方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本明細書において幾つかの用語を使用するが、特に明記しない限り、次の意味を有する。
「目的タンパク質」とは、Ｘ線結晶解析やＮＭＲ解析等により完全な立体構造が決定されておらず、本発明において立体構造構築の対象とするタンパク質を意味する。このタンパク質のアミノ酸配列を「目的配列」または「目的アミノ酸配列」と称することがある。この目的タンパク質には、部分構造は解析されているが完全な立体構造が得られていないもの、また、既に機能が特定されているもの、機能が推定されているもの、アミノ酸配列は決定されているが機能は全く不明のものも含まれる。「参照タンパク質」とはその立体構造の詳細がＸ線結晶解析やＮＭＲ解析により既に決定されており、アライメントや原子座標の最適化のために参照するタンパク質を意味する。「アライメント」とは、２種類以上のタンパク質のアミノ酸配列の対応関係をつけることを意味し、その方法は以下の各ステップの説明において詳述する。
「原子座標」とは、三次元空間上で立体構造を記述するものである。それは空間上のある点を原点とする互いに垂直な三方向の相対的な距離であり、タンパク質中に存在する水素原子を除く原子一つあたりに３個の数字からなるベクトル量である。
「二次構造」とは、タンパク質立体構造の構成単位である、αヘリックス、βシート、それ以外の二次構造を意味する。二次構造が判別されない領域はループと呼ぶ。「疎水コア」とは、疎水性のアミノ酸残基、例えばＡｌａ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ等の側鎖で構成される疎水性相互作用の空間を意味し、「疎水コア値」とはそのアミノ酸の周りにいくつ疎水性残基があるかを示す。また、「疎水コア距離」とは疎水性残基と疎水コア間の距離を示し、その距離が大きいほど、その残基は疎水コアから離れていることを示す。疎水コア、疎水コア値、疎水コア距離等の詳細な定義については、Ｕｍｅｚａｗａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｕｍｅｙａｍａ  Ｈ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）Ｖｏｌ  ３６，４６５２−４６５８，Ｋａｎｅｋｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）Ｖｏｌ  ２，３７−５４に記載されている。
「プロファイル」とは、アミノ酸配列中の文字について、その文字の位置を特徴付ける情報を付加したものであり、これは行列を意味する。この行列はアミノ酸の総当りの組み合わせであり２０＊２０の要素を持つ。この行列は、アミノ酸の保存の度合い、置換のしやすさ、アミノ酸同士の類似度の情報の意味を併せ持つ。
Ｉ．アライメント修正法によるタンパク質の立体構造の構築
先ず、本発明の第一の態様であるアライメント修正法について説明する。第１図は本発明のアライメント修正法による立体構造の構築の一例を示すフローチャートである。
第１図に示す通り、この方法においては、先ず、ステップＩ−１０において目的のタンパク質のアミノ酸配列と参照タンパク質のアミノ酸配列との関係を示したアライメントを用意する。ステップＩ−２０において、適当な立体構造データベースから参照タンパク質の座標を用意する。ステップＩ−３０において、ステップＩ−２０において用意された参照タンパク質座標から二次構造の判別を行う。ステップＩ−４０において、ステップＩ−２０において用意された参照タンパク質座標から疎水コア値、及び疎水距離の計算を行う。ステップＩ−５０において、アライメントの領域が参照タンパク質における疎水コアの領域を含んでいるかどうかを確認する。ステップＩ−６０では、アライメント上の参照タンパク質の配列に沿って、上記の二次構造情報、疎水コア値情報、疎水コア距離情報を並置する。ステップＩ−７０において、アライメントの修正を行う。ステップＩ−７０において得られたアライメントを元にＦＡＭＳ等のモデリングソフトを用いて立体構造を構築し、ステップＩ−９０においてモデルが完成する。ステップＩ−１００において、出来上がったモデルの疎水コアが形成されているかどうかを検査し、ステップＩ−１１０の最終構造に至る。
以下、各ステップについて更に詳細に説明する。
ステップＩ−１０：アミノ酸配列のアライメント
先ず、ステップＩ−１０において目的タンパク質のアミノ酸配列と参照タンパク質のアミノ酸配列との関係を示したアライメントを用意する。
用いられる目的タンパク質のアミノ酸配列としては、データベースに登録されているもの、配列が始めて解析されたもの等如何なる由来の配列であってもよい。また部分構造のみが解析されているタンパク質の配列も完全な立体構造の情報を得るために、本発明における立体構造の構築対象とすることができる。
用いられるデータベースとしては、例えば、″Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ｒｅｖｉｅｗ：ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ｓｃｏｕｒｓ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ．″Ｂｌｏｏｍ  ＦＥ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６；２７４（５２９０）：１１０４−９に詳細が記載されているＧＣＲＤｂ（Ｔｈｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｒｄｂ．ｕｔｈｓｃｓａ．ｅｄｕ／、ＧＰＣＲＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｐｃｒ．ｏｒｇ／７ｔｍ／、ＥｘＰＡＳｙ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｍ−ｇｐｃｒ．ｐ１、ＯＲＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｙｃｍｉ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｓｅｎｓｅｌａｂ／ｏｒｄｂ／、ＧｅｎｅＢａｎｋ：ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ｇｅｎｏｍｅｓ／、ＰＩＲ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｎｂｒｆ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／ｐｉｒ／（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ））、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｌｏｔ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｓｐｒｏｔ−ｔｏｐ．ｈｔｍｌ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ），Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ））、ＴｒＥＭＢＬ（ＵＲＬ及び管理者ともにＳｗｉｓｓ  Ｐｌｏｔと同じ）、ＴｒＥＭＢＬＮＥＷ（ＵＲＬ及び管理者ともにＳｗｉｓｓ  Ｐｌｏｔと同じ）、ＤＡＤ：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ（日本ＤＮＡデータパンク）等のデータベースに登録されているヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃ．ｅｌａｇａｎｓ）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）等を挙げることができる。これらのデータベースは単なる例示であり、タンパク質のアミノ酸配列が登録されているものであれば如何なるデータベースを用いることもできる。
参照タンパク質の選定に用いられる立体構造データベースとしては、例えばＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／、ＣＣＤＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｒｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｄｃ．ｃａｍ．ａｕ．ｕｋ／、ＳＣＯＰ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）：ｈｔｔｐ：／／ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−１ｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ、ＣＡＴＨ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｃａｔｈ等を挙げることができる。これらの立体構造データベースは、単独または組み合わせて用いることことができる。上記データベース中、ＳＣＯＰおよびＣＡＴＨは、ドメイン単位に区切った立体構造データベース（「以下これを「ドメイン構造データベース」と略称することがある）である。ここで、「ドメイン」とは、タンパク質の立体構造で、３次構造の単位を意味する。ＳＣＯＰは、３次構造の単位を手作業で判別して、３次構造の区切りを決定して構築されたものである。ＣＡＴＨはほぼ全自動にて３次構造の単位を決めて構築されたものである。ドメイン構造データベースとしては、後述する本発明の方法で構築された立体構造データベースを組み合わせて用いるのが好ましい。
アライメント用ソフトウエアとしては、例えばＦＡＳＴＡもしくはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ）を使うのが好ましい。ＦＡＳＴＡは目的配列と一致度の高い配列を立体構造データベースから探索し、最終的な目的配列と参照タンパク質との一致度をｅ値として算出するプログラムである。ＦＡＳＴＡの詳細は″Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．″Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲ，（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ；２６６：２２７−５８に記載されている。
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴはプロファイルアライメントを行うようにプログラムされている。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの詳細は、″Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ．″Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｗｏｌｆ  ＹＩ，Ｐｏｎｔｉｎｇ  ＣＰ，Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ，Ａｒａｖｉｎｄ  Ｌ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９９９，１２，１０００−１１に記載されている。
プロファイルアライメントを実行するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは配列の類似度を検出することについて、現時点で最高の性能を備えたツールである。このプログラムは、プロファイルのデータベース中の有意なアライメント関係のみから情報を引き出し、アミノ酸配列の部位特異的スコア行列を作成する。次にプログラム内部では目的タンパク質の配列の替わりに作成された部位特異的スコア行列と一致度の高い配列をデータベースから探索し、その部位特異的スコア行列はより有意なアライメントが検出されなくなるまで回数を重ねる毎に逐次更新されてゆく。そして最終的な部位特異的スコア行列と参照タンパク質との一致度をｅ値（Ｅ  ｖａｌｕｅ）として算出する。また、下記に示すようにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの替わりにＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）を使用しても同等の効果が得られる。
ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴとは、上記のプロセスにおいて、予めアミノ酸配列のみを集めたある大きな配列データベースに対して各々の参照タンパク質のプロファイルを作成しておいて、目的タンパク質がどの参照タンパク質に小さなｅ値（Ｅ  ｖａｌｕｅ）を持つかで調べる。ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの実行形態の一つである。ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴの詳細は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｓｅｐ  １；２５（１７）：３３８９−４０２″Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．″に記載されてる。
ｅ値（Ｅ  ｖａｌｕｅ）は配列間の適合の間に存在するランダムなバックグラウンドノイズを定量的に記述したものである。それは二つの配列がどれだけマッチしているかを示すものでもありスコアに対し指数関数的に減少する性質を持ち、結果の有意な閾値を設定する方法として有用である。本発明においては、そのアライメントが、通常９８％以上、好ましくは９９％以上の信頼性を持つとき、目的タンパク質はＧＰＣＲｓのようなある機能を持ったタンパク質ファミリーであるとして立体構造を作成するように判断するのが適当である。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにおいては、ｅ値（Ｅ  ｖａｌｕｅ）が、統計的に通常０．１以下、好ましくは０．０１以下の値を持つときがそれに相当する。
ステップＩ−２０：参照タンパク質の準備
ステップＩ−２０において、適当な立体構造データベース、例えばＰＤＢから参照タンパク質の座標を用意する。この段階では、参照タンパク質のＰＤＢ形式の座標ファイルを用意する。さらに詳細には、タンパク質全域ではなく上記アライメント用ソフトウエアが高ホモロジーと判断したアライメント領域部分のみを抽出した座標ファイルとタンパク質全域の両方を用意する。
ステップＩ−３０：二次構造情報の判別
ステップＩ−３０において、ステップにＩ−２０で用意された参照タンパク質座標から二次構造の判別を行う。二次構造決定はステップＩ−２０で用意されたアライメント領域部分のみを抽出した座標とタンパク質全域の両方に対して適用される。具体的なソフトウエアとしては、ＤＳＳＰ，ＳＴＲＩＤＥ等が好ましいが、基本的にはタンパク質の主鎖のねじれ角と水素結合のパターンから判別される方法を用いる。ここでは、例えば、発明者らが開発したＣ語で書かれたｓｅｑ２３ｄプログラムを用いるのが好ましい。但し、水素結合の水素をはさんでの酸素や窒素の距離は２．９Å〜３．５Å程度まで定義に幅があるので、ここではその距離として３．０５Å、３．１０Å、３．５０Åを採用した。
ここで、「ＤＳＳＰ（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」とは、ＰＤＢの書式のファイルを入力ファイルとして、主鎖の水素結合のパターンと、内部回転角等を解析しαヘリックスとβシートを判定するソフトウエアである。この詳細は、Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．＆  Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９８３）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：２５７７−２６３７．に記載されている。「ＳＴＲＩＤＥ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）」とは、ＰＤＢの書式のファイルを入力ファイルとして、主鎖の水素結合のパターンと、内部回転角等を解析し二次構造を判定するソフトウエアである。この詳細は、Ｆｒｉｓｈｍａｎ，Ｄ  ＆  Ａｒｇｏｓ，Ｐ．（１９９５）Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２３，５６６−５７９．に記載されている。
ステップＩ−４０：疎水コア値・疎水コア距離の計算
ステップＩ−４０において、ステップＩ−２０で用意された参照タンパク質座標から疎水コア値、及び疎水コア距離の計算を行う。この段階もステップＩ−３０と同様、ステップＩ−２０において用意されたアライメント領域部分のみを抽出した座標とタンパク質全域の両方に対して適用される。具体的なソフトとしては、例えばＢＩＯＣＥＳＳ（ＮＥＣ社製）のｈｐｏｃｏｒｅ，ｈｐｏｄｉｓｔ等が好ましい。
ここで「ｈｐｏｃｏｒｅ」とは、原子座標をＢＩＯＣＥＳＳ独自の書式にしたファイルを入力として、そのファイルに疎水コア値の情報を書き込むソフトウエアである。疎水性残基の側鎖が形成する疎水性相互作用の空間を判別し、各疎水性残基の側鎖がいくつの疎水性残基の側鎖と空間的に接触しているかの数（疎水コア値：０または正の整数）を算出している。また、「ｈｐｏｄｉｓｔ」とは、原子座標をＢＩＯＣＥＳＳ独自の書式にし、且つｈｐｏｃｏｒｅで算出された疎水コア値が既に書き込まれたファイルを入力として、そのファイルに疎水コア距離の情報を書き込むソフトウエアであり、「ｈｐｏｃｏｒｅ」で算出された疎水コア値と、原子座標から各残基がどの程度、疎水性相互作用の空間から離れているかの定量的な距離（疎水コア距離）を算出するソフトウエアである。但し、ここでは発明者がプログラムの自動化に対応できるようにＣ言語でソースを書き直して使っている。
ステップＩ−５０：参照タンパク質中のアライメント領域の確認
ステップＩ−５０において、アライメントの領域が参照タンパク質における疎水コアの領域を含んでいるかどうかを確認する。ここで、疎水コア領域が含まれていない場合は、このアライメントでは疎水性相互作用を用いてタンパク質が折れたたまれることは不可能であると判定され、以下の操作は行わない。
ステップＩ−６０：二次構造・疎水コア値・疎水コア距離情報のアライメント
ステップＩ−６０では、アライメント上の参照タンパク質の配列に沿って、上記の二次構造情報、疎水コア値情報、疎水コア距離情報を並置する。
ステップＩ−７０：アライメントの修正
ステップＩ−７０において、アライメントの修正を行う。アライメントの情報に二次構造、疎水コア値、疎水コア距離等の情報を加味した状態で、アライメントを修正する。また、参照タンパク質の活性残基の場所が既知の場合は、その情報を含めるのが好ましい。またＰＳＩ−ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによってアライメント実行時にプロファイル情報も得られ、それらの場所はアライメントを動かさない方が元来のプログラムの有益情報を欠落させないことになる。そこで後記実施例１のアライメント修正法の効果に示されているようにして、プロファイル情報を含めることが好ましい。
第２図は、アライメントの修正方法の一例を示すフローチャートである。以下、第２図に基づいて、アライメントの修正方法について詳細に説明する。
１）挿入・欠損の位置がαヘリックスもしくはβシート内にあった場合
挿入・欠損の位置がαヘリックスもしくはβシート内にあった場合でも、その２本のαヘリックス領域の続いた境界、２本のβシート領域の続いた境界、またはαヘリックス領域とβシート領域の続いた境界に存在する場合は修正せずに終了とする。
１−１）αヘリックスの場合
欠損の位置がαヘリックスの末端部から３残基の場合は変更無く終了する。この場合に当てはまらない場合のみ、挿入・欠損に対しＮ末端側及びＣ末端側のαヘリックス・βシート以外の領域での疎水コア値を比較する。疎水コア値に大きな差が認められた場合、疎水コア値の小さな方のαヘリックス・βシート以外の領域で且つ最大の疎水コア距離を持つ場所へ、挿入・欠損を移動させる。大きな差が認められない場合、最近傍のαヘリックス・βシート以外の領域で且つ最大の疎水コア距離を持つ場所へ、挿入・欠損を移動させる。
（ｉ）更にはステップＩ−１０において、アライメントを用意する際にアライメントソフト、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによって、ホモロジーが高いと指定する領域に挿入・欠損の位置が相当する部分か否かを判断する。
（ｉｉ）更に参照タンパク質の活性部位の情報が得られている場合には、挿入・欠損の位置が相当する部分か否かを判断する。
上記（ｉ）、（ｉｉ）の場合には、相当する領域を避けて且つ疎水コア距離の最大の位置に移動する。移動後、また（ｉ）、（ｉｉ）の各項目について判断を行い、相当する領域を避けて且つ疎水コア距離の最大の位置に移動する。この操作を、（ｉ）、（ｉｉ）の項目が否になるまで繰り返す。
１−２）βシートの場合
挿入・欠損に対しＮ末端側及びＣ末端側のαヘリックス・βシート以外の領域での疎水コア値を比較する。疎水コア値に大きな差が認められた場合、疎水コア値の小さな方のαヘリックス・βシート以外の領域で且つ最大の疎水コア距離を持つ場所へ、挿入・欠損を移動させる。大きな差が認められない場合、最近傍のαヘリックス・βシート以外の領域で且つ最大の疎水コア距離を持つ場所へ、挿入・欠損を移動させる。
（ｉ）更にはステップＩ−１０において、アライメントを用意する際にアライメントソフト、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによって、ホモロジーが高いと指定する領域に挿入・欠損の位置が相当する部分か否かを判断する。
（ｉｉ）更に参照タンパク質の活性部位の情報が得られている場合には、挿入・欠損の位置が相当する部分か否かを判断する。
上記（ｉ）、（ｉｉ）の場合には、相当する領域を避けて且つ疎水コア距離の最大の位置に移動する。移動後、また（ｉ）、（ｉｉ）の各項目について判断を行い、相当する領域を避けて且つ疎水コア距離の最大の位置に移動する。この操作を、（ｉ）、（ｉｉ）の項目が否になるまで繰り返す。
２）挿入・欠損がそれ以外の二次構造にあった場合
近傍のループが存在する場合はループの中央に、挿入・欠損を移動させる。さらに移動後の場所から疎水コア距離の最大の位置に移動する。
３）挿入・欠損がループ内にあった場合
ステップＩ−１０において、アライメントを用意する際にアライメントソフト、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによって、ホモロジーが高いと指定する領域に含まれるか否かを、また参照タンパク質の活性残基の場所に相当するか否かを判断し、両方とも否になるよう疎水コア距離の最大の位置に移動し、もともと否ならば修正せず終了する。
ステップＩ−８０：モデリング
ステップＩ−７０において得られた修正アライメントを元に、適当なモデリングソフト、例えばＦＡＭＳを用いて立体構造を構築し、ステップＩ−９０においてモデルが完成し、ステップＩ−１００において、出来上がったモデルの疎水コアが形成されているかどうかを検査し、ステップＩ−１１０の最終構造に至る。
次にモデリング（立体構造の構築）手法の好適な一例として、前記ＦＡＭＳの各ステップについて説明する。なお、下記のステップＩ−８１〜Ｉ−８３における計算回数、定数、カットオフ値等は、本発明者が考えている好ましいパラメーターの一例を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものでない。
ステップＩ−８１：Ｃα原子の初期座標の構築及び最適化
ステップＩ−８０からのアライメントの結果を受けて、参照タンパク質から挿入および欠損のあるアミノ酸残基についての情報をえる。アライメントにおいて連続して三残基以上のアミノ酸が対応しているギャップの無い領域を選び出し、その領域においては、これらの残基ペアにおいて、目的タンパク質のＣα原子は参照タンパク質と同一のものを当てはめておく。Ｃα原子が求められなかった場合には、予め作成してある断片のデータベースから座標を当てはめる（第３図参照）。ここで、本明細書においてＣα原子とは、各アミノ酸の骨格の中心となる炭素原子を意味する。Ｃβ原子とは、Ｃα原子の側鎖側に結合する炭素原子を意味する。また、Ｃ原子とは、カルボニル基の炭素原子を意味する。
ステップＩ−８１（１）：Ｃα原子のシミュレーティッドアニーリング法による構築
上記ステップＩ−８１で作成されたＣα原子は、シミュレーティッドアニーリングのプロセスを用いて参照タンパク質の座標から構成される関数を用いて最適化される。この目的関数は下記式（１）のとおりである。
0004118680.tif 000002
ここでＵｌｅｎは、配列上隣の残基およびＣｙｓ残基のペアのＣα原子間の距離に関するもので下記式（２）のように設定される。
0004118680.tif 000003
ここでＤｉ，ｉ＋１は残基ｉと残基ｉ＋１のＣα間距離である。ＤｉＳＳはジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基のペア同士の距離である。Ｋ１とＫＳＳは定数でありそれぞれ２および５と設定される。
ＵａｎｇはＣα原子の結合角の関数であり下記式（３）のとおりである。
0004118680.tif 000004
ここでθｉ（ｒａｄ）はｉ，ｉ＋１，ｉ＋２番目の残基Ｃα原子の角度である。θ０はＰＤＢのＸ線構造から（１００／１８０）・π（ｒａｄ）と設定される。Ｋａは定数であり１とする。
Ｕｐｏｓは、Ｃα原子の位置に関する関数であり、下記式（４）のとおりである。
0004118680.tif 000005
ここで‖・‖が意味する所はノルムであり、Ｍｉは構造を基にしたアライメント上で構造的に等価な位置にあるＣα原子間の平均距離である。残基ｉについてＭｉの値が求められないとき、Ｍｉの値は１０と設定される。ここでは、Ｃα原子の平均座標であり下記式（５）のとおりである。
0004118680.tif 000006
ここでＸｊｉはｊ番目の参照タンパク質のｉ番目の残基のＣαの原子座標である。ｗｊｉは、ｊ番目の参照タンパク質のｉ番目の残基の重みである。この重みは目的タンパク質の大体の形を決定するため重要なパラメータであるが、これはローカルスペースホモロジー（ＬＳＨ）と呼ばれる着目部位の１２Å以内の空間的近傍の局所的な値によって決定している（第４図参照）。ＬＳＨと構造がよく保存されている部位（ＳＣＲｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）に存在する残基のペアの比率との相関は第５図に示されているように非常に高い。これは、高いＬＳＨ値を持つときは統計的にＣα原子の位置が参照タンパク質構造と比べて１．０Å以内にあることを意味する。Ｕｖｄｗは下記式（６）のとおりである。
0004118680.tif 000007
ここでＫｖｄｗは０．０１（Ｄｉ，ｊ＜３．２Å）と０．００１（Ｄｉ，ｊ＞３．２Å）と設定され６Åをカットオフ値とした。
Ｃα原子は式（１）に従って、シミュレーティッドアニーリング法を用いて最適化される。この最適化の段階でＣα原子の摂動は１．０Å以内になるように設定する。またこのアニーリングの段階は全てのＣα原子について、１００回づつ計算される。そして、温度に相当するパラメータは、２５から０．５回ごとに０．０１減らし、そのパラメータは以後一定とする。
この大きな２つの段階、構造情報の取得とＣα原子の構築は１０回繰り返され、最小の目的関数値をもつＣα原子の座標が最適解として算出される。
ステップＩ−８２：主鎖原子座標の構築及び最適化
ステップＩ−８１（１）のＣαの原子座標に主鎖の他の原子を付加し、シミュレーティッドアニーリング法によって目的関数を最小化するようにする。まず、Ｃα原子の立体的な重ねあわせを行い、Ｃαの原子間距離が２．５Å以下の残基が取り上げられる。Ｃαを除く主鎖の原子座標はＣα原子間距離が最小になるように参照タンパク質の座標から取得しモデル構造とする。
参照タンパク質の中に相当する残基が無い場合、主鎖の原子座標はデータベース中の相当する４残基のタンパク質断片から作成される。この過程の中で、残基ｉの主鎖原子はｉ−１番目からｉ＋２番目までのＣα原子間の最小のｒｍｓｄ値を持つ残基から選ばれる。その際Ｎ末端の残基では、Ｃα原子座標の重ね合わせ範囲がｉ番目からｉ＋３番目までとなり、Ｃ末端の残基およびそのひとつ前の残基では同様にｉ−３番目からｉ番目までおよびｉ−２番目からｉ＋１番目までとなる。
主鎖原子の目的関数を基にシミュレーティッドアニーリング法によって主鎖原子座標が最適化される。
目的関数は下記式（７）のとおりである。
0004118680.tif 000008
となる。
Ｕｂｏｎｄは下記式（８）のとおりである。
0004118680.tif 000009
ここでｂｉ０は、標準の結合長でありそれぞれの化学結合の種類によって異なる。Ｋｂは定数であり２２５とする。
Ｕａｎｇは結合角の関数で、下記式（９）のとおりである。
0004118680.tif 000010
ここでθｉはｉ番目の結合角であり、化学結合の種類によって異なる。Ｋａは定数で４５と設定される。
Ｕｎｏｎ−ｂｏｎｄは非結合の相互作用の関数で、下記式（１０）のとおりである。
0004118680.tif 000011
ここでεｉ，ｊとｒｉ，ｊ＊は定数で原子の種類によって異なる。
Ｋｎｏｎは定数で０．２５とし、カットオフは８Åとする。
ＵＳＳはＣｙｓ残基が生成するジスルフィド結合の関数で、下記式（１１）のとおりである。
0004118680.tif 000012
ここでＫＳＳＣαおよびＫＳＳＣβは定数であり７．５である。
Ｕｐｏｓは原子の位置に関する関数で、下記式（１２）のとおりである。
0004118680.tif 000013
ここで＜ＷｉＸｉ＞は下記式（１３）のように与えられる。
0004118680.tif 000014
式（１２）の＜ＷｉＸｉ＞は、目的タンパク質および参照タンパク質の間の構造の重ねあわせから求める。
Ｋｐｏｓは定数であり０．３である。
Ｕｔｏｒは主鎖のねじれ角のものであり、下記式（１４）のとおりである。
0004118680.tif 000015
ここでφｉ０とφｉ０はＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎマップ上での最も近いねじれ角のθｉおよびψｉとする。またωｉ０は０としてｃｉｓ−Ｐｒｏ残基の場合のみπ（ｒａｄｉａｎ）とする。ＫｔおよびＫωは定数であり、それぞれ１０および５０とする。
ＵｃｈｉはＣαのキラリティーに関するものであり、下記式（１５）のとおりである。
0004118680.tif 000016
ここでτｉはＮ−Ｃα−Ｃβ−Ｃで定められるねじれ角でありＫｃｈｉは５０とする。Ｕｈｙｄｒはホモロガスなタンパク質中で保存された主鎖の水素結合に関するもので、下記式（１６）のとおり定められる。
0004118680.tif 000017
水素結合は、Ｎ原子とＯ原子の距離が２．９±０．５Åにあるときに設定される。複数の参照タンパク質中で水素結合があるか否かを判定するときは、７５％以上の参照タンパク質が存在すると認めた場合に水素結合ありと判定する。Ｋｈｙｄｒは定数であり０．６である。
次にＣβを含む主鎖原子の最適化がシミュレーティッドアニーリングによって行われる。このアニーリングの過程で主鎖とＣβの原子の摂動が初期の位置に対して１．０Å以内になるようにする。このアニーリングの段階は主鎖とＣβの原子に対して２００回行われる。温度に相当するパラメータは５０もしくは２５から始まり一回毎に０．５倍にしてゆき０．０１になるまで続け、その後一定値とする。
主鎖の立体配置を幅広くサンプリングするために、本発明の方法では、好ましくは上記の方法を６回行い、最小の目的関数値を持つ主鎖の原子座標を最適解とする。そして、温度に相当するパラメータは、はじめの２回は５０からスタートして３回目から２５からスタートすることとする。
ステップＩ−８３：側鎖原子座標の構築及び最適化
側鎖の構築は、大きく２段階に分かれており、「構造保存部位の側鎖構築」（スッテプＩ−８３（１））と「全体の側鎖構築」（スッテプＩ−８３（２））に分けられる。
ステップＩ−８３（１）：構造保存部位の側鎖構築
算出された主鎖原子に対して、以前の研究における方法を用いてホモロガスなタンパク質から側鎖のねじれ角を得る。この方法の詳細は、″Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｙｅｄ  ｂｙ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｔｏｒｓｉｏｎａｌ  ａｎｇｌｅｓ    ｗｉｔｈｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．″Ｏｇａｔａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｕｍｅｙａｍａ  Ｈ，Ｐｒｏｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８，３１，２５５−３６９に記載されている。
この方法の中でホモロガスなタンパク質の中で保存されている側鎖の割合を算出し、この情報を基にして側鎖のモデリングを行う。側鎖の保存された部位の側鎖の原子座標は固定した主鎖原子に対して置かれる。例えば、ホモロガスなタンパク質中でアルギニン残基のχ１角が保存されていれば、Ｃγ原子の座標を置くことができ、Ｐｈｅ残基でχ１とχ２角が保存されていれば、全ての側鎖原子を置くことができる。式（７）を用いたシミュレーティッドアニーリングの最適化の過程は、主鎖とＣβの原子のみ行われて、原子の摂動は１．０Å以内となるようにした。この主鎖とＣβの原子のアニーリングの段階は２００回行われる。そして、温度に相当するパラメータは２５からスタートして一回毎に０．５倍にしてゆき０．０１になるまで小さくなるようにする。式（７）中のＵｎｏｎ−ｂｏｎｄは主鎖原子と部分的に作成された側鎖原子について行われる。そのとき側鎖原子の座標は最適化の過程を通じて保存されるようにする。
構造の情報であるＭｉと水素結合のＮ−Ｏのペアは最適化の過程で用いられる。主鎖原子の配置を得るために、上記プロセスを３回繰り返し、目的関数の最小の主鎖原子の座標を算出構造とする。
ステップＩ−８３（２）：全体の側鎖の構築
側鎖の構築は固定した主鎖およびＣβ原子のもとで行う。これは上記したＯｇａｔａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｕｍｅｙａｍａ  Ｈ，Ｐｒｏｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８，３１，２５５−３６９に開示されている研究成果をもって行われ、それを用いることにより短時間で正確なモデルを与えることができる。次に主鎖構造は低温におけるモンテカルロ法によって最適化され、温度は０．００１に設定され式（７）の目的関数Ｕｎｏｎ−ｂｏｎｄを用い、全ての主鎖と側鎖の原子で計算される。そして、Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｃβ原子の最適化の過程で側鎖のねじれ角を最適化された状態を保つように側鎖の座標を再配置する。原子の摂動は０．５Å以内とする。次に側鎖は削除され、上記の側鎖構築が繰り返される。このプロセスは２．４Åの原子同士のぶつかり合いがなくなり、且つＮ−Ｃα−Ｃβ−Ｃのねじれ角が−１２０±１５°の範囲に収まるまで繰り返される。
ステップＩ−９０：立体構造の完成
上記の通りステップＩ−７０において得られたアライメントを基にステップＩ−８０においてＦＡＭＳ等のモデリングソフトを用いて立体構造を構築し、モデルが完成する。上記ステップＩ−８０で示す方法をＦＡＭＳと称することがある。この方法の詳細は、Ｋｏｊｉ  Ｏｇａｔａ  ａｎｄ  Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｕｍｅｙａｍａ，″Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ″Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  １８，２５８−２７２，２０００に記載されている。
ステップＩ−１００：立体構造の検査
ステップＩ−１００において、出来上がった立体構造モデルの疎水コアが形成されているかどうかを検査し、ステップＩ−１１０の最終構造に至る。
ステップＩ−１１０：最終構造の構築
かくして目的タンパク質の立体構造を規定する原子座標を得ることができる。
本発明の方法（アライメント修正法）によれば、ホモロジーモデリングによるタンパク質の立体構造構築において、アミノ酸配列の並置（アライメント）が与えられた場合において、参照タンパク質の座標から立体構造情報を得てアライメントが修正されるため、より正確な立体構造の構築が可能となる。アライメントの修正は、タンパク質の二次構造情報、疎水コア値情報、疎水コア距離情報等に基づいて行われ、これによりタンパク質立体構造の構成単位である二次構造およびその近傍にアミノ酸配列断片の挿入および欠損が入らないモデルを得ることができる。また本発明の方法は、アライメントを修正する際に、タンパク質の立体構造を形成する物理的な疎水性相互作用を考慮した方法であり、疎水性相互作用の働く空間およびその近傍にアミノ酸配列断片の挿入および欠損が入らないようにすることが可能である。
ＩＩ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳによる立体構造の構築法
次に、本発明の第二および第三の態様であるＡｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳについて説明する。
第６図は、本発明のＡｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳによる立体構造構築方法の一例を示すフローチャートである。以下、第６図の各ステップを例としてこの発明を詳述する。
ステップＩＩ−１０：目的タンパク質のアミノ酸配列
先ず、立体構造の構築対象となる目的タンパク質のアミノ酸配列を入力する。用いられるアミノ酸配列としては、上記で詳述した通り、データベースに登録されているもの、配列が始めて解析されたもの等如何なる由来の配列であってもよい。また部分構造のみが解析されているタンパク質の配列も完全な立体構造の情報を得るために、本発明における立体構造の構築対象とすることができる。
ステップＩＩ−２０：高ホモロジー用アライメントソフトによるデータベース検索及び配列アライメント
ステップＩＩ−１０において入力されたアミノ酸配列を、高ホモロジー用アライメントを行うソフトウエア、例えばＦＡＳＴＡを用いてアライメントを行う。即ち、ＦＡＳＴＡにより立体構造データベース、例えばＰＤＢから参照タンパク質を選定し、選定された参照タンパク質のアミノ酸配列とのアライメント（並置）が行われる。
ここでいう参照タンパク質とは立体構造データベースから取得される配列と座標のデータベースでありプロテインデータバンク（ＰＤＢ）として登録された公共データベースから得られるものである。ＰＤＢのデータベースには２６２４３個の立体構造が登録されているが（２０００年８月時点）、９５％以上の配列の一致度があるものは同じカテゴリーと判断し、カテゴリー中からもっとも長い配列のものを、更に同じ長さの場合はＸ線の分解能の最も高い構造をそのカテゴリーの代表とした。本発明で用いた立体構造データベースはこの代表を集めたデータベースである。３９２２個の代表構造を本発明においてＰＤＢデータベースとして用いている。
ここで、高ホモロジー用アライメントソフトＦＡＳＴＡの詳細は、前記の通り、″Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．″Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲ，（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ；２６６：２２７−５８に記載されている。このプログラムは、目的配列と一致度の高い配列を立体構造データベースから探索し、最終的な目的配列と参照タンパク質との一致度をｅ値として算出する。
ｅ値は配列間の適合の間に存在するランダムなバックグラウンドノイズを定量的に記述したものである。それは二つの配列がどれだけマッチしているかを示すものでもありスコアに対し指数関数的に減少する性質を持ち、結果の有意な閾値を設定する方法として有用である。このステップにおいては、例えばＦＡＳＴＡで算出されたｅ値が０．０１以下の値を持つとき有意なアライメントであると判断している。
ステップＩＩ−３０：プロファイルアライメントソフトによるデータベース検索及び配列アライメント
ステップＩＩ−１０において入力されたアミノ酸配列を、低ホモロジー領域のアライメントを行うソフトウエア、即ちプロファイルアライメントを行うソフトウエア、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いてアライメントを行う。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴはプロファイルアライメントを行うようにプログラムされている。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの詳細は、前記の通り、″Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ．″Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｗｏｌｆ  ＹＩ，Ｐｏｎｔｉｎｇ  ＣＰ，Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ，Ａｒａｖｉｎｄ  Ｌ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９９９，１２，１０００−１１に記載されている。
プロファイルとして用いるアミノ酸配列としては、例えば、公開データベースであるＰＩＲ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｎｂｒｆ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ｅｄｕ／ｐｉｒ／（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ））等のアミノ酸配列を用いればよい。
このプログラム（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）は、プロファイルのデータベース中の（ここではＰＩＲ中の）有意なアライメント関係のみから情報を引き出し、アミノ酸配列の部位特異的スコア行列を作成する。次にプログラム内部では目的配列の変わりに作成された部位特異的スコア行列と一致度の高い配列をデータベースから探索し、その部位特異的スコア行列は、より有意なアライメントが検出されなくなるまで回数を重ねる毎に逐次更新されてゆく。そして最終的な部位特異的スコア行列と参照タンパク質との一致度をｅ値として算出する。
前記の通り、ｅ値は配列間の適合の間に存在するランダムなバックグラウンドノイズを定量的に記述したものである。それは二つの配列がどれだけマッチしているかを示すものでもありスコアに対し指数関数的に減少する性質を持ち、結果の有意な閾値を設定する方法として有用である。
下記第１表および第２表に、ＣＡＳＰ４（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｗｉｄｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｃｅｎｔｅｒ．１１ｎｌ．ｇｏｖ／ｃａｓｐ４／Ｃａｓｐ４．ｈｔｍｌ）において、正しいフォールドでモデリングできたもののリストおよび間違ったフォールドでモデリングしたもののリストとｅ値を示す。正しいフォールドを正しくモデリングできたものが０．１以下である確立は８４％で、間違ってモデリングしたものの内０．１以下である確立は４４％である。ここで、正しくモデリングできたものとしての定義は、タンパク質のフォールドの仕方と二次構造が正しく予測されているものとしている。従ってＲＭＳＤ値が大きくても正しいとしているものもある（Ｔ００８９）。下記第１表および第２表の比較によってｅ値が０．１以下ならかなり正しいモデリングが可能と言える。
タンパク質フォールドを正しくモデリングした第１表においてｅ値が３．２（ＦＡＳＴＡ）と７．１のような大きな数値もあるが、タンパク質フォールドを間違ってモデリングした第２表において０．０３１、０．０４２、０．４８、０．９６のような０．１の近傍のｅ値が存在するので、０．１のｅ値の閾値は妥当と考えられる。またｅ値が５×１０−１７や７×１０−２２のような小さい値でも、タンパク質フォールドの評価にエラーを起こすことがあることから、ｅ値がかなり小さいことが正しいフォールドを完全に保証するものではないことに注意する必要がある。なお、第１表および第２表中の「○」又は「◎」は不等式「ｅ＜０．１」又は「Ｉ．Ｄ＞２０」を満たすことを示す。
0004118680.tif 000018
0004118680.tif 000019
ステップＩＩ−４０：参照タンパク質間の高ホモロジー用アライメントソフトによる再アライメント及び配列的冗長性排除
ステップＩＩ−２０およびＩＩ−３０において、高ホモロジー用アライメントソフトウエア（ＦＡＳＴＡ）およびプロファイルアライメント用ソフトウエア（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）において算出された複数のアライメント間で、高ホモロジー用アライメントソフトウエア（ＦＡＳＴＡ）のアライメントを行い、参照タンパク質同士のアミノ酸配列を総当りで比べ冗長性を排除し、目的配列との間でｅ値の高い方のアライメント及び参照タンパク質を排除している。その際、具体的には、例えばＦＡＳＴＡおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが同じＰＤＢのＩＤの参照タンパク質をアライメントの対象としている場合には、そのＰＤＢのＩＤについてＦＡＳＴＡのアライメントを採用し、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのアライメントを排除する。
このステップにおいてどれだけ冗長性を排除するかが、後のステップにおいて非常に重要となる。本発明では、ＦＡＳＴＡのｅ値がある値以下のもの同士を同じクラスターとして、３９２２個のＰＤＢデータベースがいくつのクラスターに分けられるかを調査した。その結果を第７図に示す。第７図から明らかな通り、ｅ値が０．０１より大きくなるとクラスター数が急激に減少し、構造に多様性が無くなることが分かる。この結果に基づきｅ値が０．０１以下の場合を同じクラスターとして冗長であると判断している。この様に、冗長性の判断において、ｅ値を適切に設定することが重要である。このｅ値を低く設定しすぎれば、似たような配列が多くなりこのステップを行う意味が無くなる。逆に高く設定しすぎれば、クラスターの数が激減し構造に多様性がなくなる。第７図から、冗長性判断のためｅ値を０．０１以下と設定すればこのようなことが起こらず、適切に判断が可能であることがわかる。
更に詳述すれば、例えばプロファイルアライメントを行うＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのｅ値０．１以下で立体構造データベースであるＰＤＢに対して検索を行うと、通常の場合、複数のアライメントの候補が得られることが多い。それらに対して全て次のステップＩＩ−５０にあるＣα原子座標の構築を行うことは、大変な時間を要し、且つ同じような立体構造が多数出来ることになる。このようないわば大量に出来る文字配列上「似たようなアライメント」を削除するのがこのステップの目的である。アライメントは目的配列と参照タンパク質の配列との関係を示したものであり、大量に出来たとしても目的配列の部分は同一である。つまりこの場合アライメントが似ているか否かは、参照タンパク質側の配列が似ているか否かで決まる。文字配列上似ているか否かの判定の為に参照タンパク質のアミノ酸配列同士の高ホモロジー用のアライメント例えばＦＡＳＴＡを行う。例えばＦＡＳＴＡでｅ値が０．０１以下であるならば、それは立体構造的に似たようなタンパク質同士の関係があり、それらを参照タンパク質としてモデリングすることは、同じようなタンパク質座標が構築されることを意味する。
そこで参照タンパク質同士は高ホモロジー用アライメントで行い、互いに似ていると判断された場合、どちらを捨てるかの判断は、低ホモロジー用アライメント（プロファイルアライメント）ソフト、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴで「目的配列とより似ていない（ｅ値がより高い）」と判断された方を捨てる。このことによりこのステップの目的が達成できる。
ステップＩＩ−５０：Ｃα原子の初期座標の構築・最適化及び立体構造的冗長性排除
ステップＩＩ−４０からの配列的な冗長性を排除したアライメントの結果を受けて、参照タンパク質との挿入および欠損のあるアミノ酸残基についての情報をえる。アライメントにおいて連続して三残基以上のアミノ酸が対応しているギャップの無い領域を選び出し、その領域においては、これらの残基ペアにおいて、目的タンパク質のＣα原子は参照タンパク質と同一のものを当てはめておく。Ｃα原子が求められなかった場合には、予め作成してある断片のデータベースから座標を当てはめる（第３図参照）。
ステップＩＩ−５１：Ｃα原子のシミュレーティッドアニーリング法による構築  上記ステップ５０で作成されたＣα原子はシミュレーティッドアニーリングのプロセスを用いて参照タンパク質の座標から構成される関数を用いて最適化される。この目的関数等は前記ステップＩ−８１（１）の通りであり、同様の方法で行われる。
ステップＩＩ−５２：立体構造的冗長性排除
ステップＩＩ−５１で算出されたＣαの座標を用いて参照タンパク質間の立体構造フィッティングを行う。上記ステップによって複数のアライメントが、候補として選ばれてきた場合、個々に選定された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて目的タンパク質のＣα原子座標を算出し、Ｃα原子座標同士で立体構造をフィッティングを行い、各座標の根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）が一定の値以下の場合は同一の立体構造であると判断して、目的タンパク質との間でｅ値の高い方の参照タンパク質およびアライメントを排除して、さらに参照タンパク質およびアライメントが選定される。この場合、根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）の値が３．０Å以下の場合は基本的に同一の立体構造であると判断し、目的配列との間でｅ値の高い方の参照タンパク質及びアライメントを排除するのが好ましい。ここで参考資料としてＣＡＳＰ４のターゲットについてモデリングの際にＣα原子座標のみ算出した場合と側鎖まで構築した場合のずれを示すと下記第３表の通りであり、平均は０．４０４±０．１６２Åとなっており、Ｃαのみでおおよその評価が可能である。
0004118680.tif 000020
このステップにより、更に不必要な参照タンパク質およびアライメントが排除され、立体構造の構築上有用なもののみが選定される。このステップは上記ステップＩＩ−４０から得られる参照タンパク質およびアライメントのみならず、他の如何なる手法で得られたものに対しても適用することができる。
ステップＩＩ−６０：アライメントにアミノ酸配列の挿入部分配列がある場合のＣα原子の構築
得られたアライメントに、挿入部分配列がある場合、予め作成された部分アミノ酸配列の座標データベースから適切な配列を読み込みＣα原子座標が構築される。データベースから得られる長さ以上の挿入部分配列（ｎ）がある場合、次の通りＣα原子座標を構築することができる。
即ち、（ｉ）目的タンパク質の挿入部分配列を上記データベースから得られる長さに削除して参照タンパク質とのアライメントを行い、（ｉｉ）このアライメントを元に削られた目的タンパク質のＣα原子座標を構築し、（ｉｉｉ）削られた目的タンパク質の削除部分の末端から一定数のアミノ酸残基を削除し（但し、削除するアミノ酸残基数は、上記データベースから得られる長さより少ない数とする）、（ｉｖ）この削られた目的タンパク質と目的タンパク質とのアライメントを基に目的タンパク質のＣα原子座標を構築し、（ｖ）挿入部分配列（ｎ）から、削られた目的タンパク質の元の挿入部分配列（ｎ）に相当する部分に残存する削除後の残基数を引いた残基数が、上記データベースから得られる長さ以下となるまで上記操作を繰り返し行う。
上記方法の一例を示す第８図を用いてより具体的にこの方法を説明する。即ち、アライメントに挿入部分配列ｎ残基がある場合、モデリングソフト、例えばＦＡＭＳの場合では最大２４残基の断片部分配列のデータベースを用いて挿入する。モデリングソフトとしてＦＡＭＳを用いた場合ｎ＞２４の場合には、従来ではその挿入部分のモデリングが不可能であったが、第８図の方法によって構築できる。
まず、挿入部分配列ｎ残基の中央部分の配列を除き、挿入部分配列を２４残基に削る。この削られたアライメントを基にＦＡＭＳのＣα原子を構築する機能を用いて、削られた目的配列のＣαの座標を構築する。次に、削られた目的配列の座標を参照とするアライメントを作成する。ただし、削られた目的配列の挿入された２４残基の部分は真の構造ではなく、あくまで中央部分が削られたものであり、中央部分を次の段階でモデリングしなくてはならない。そのまま、中央部分の構築を行うと挿入部分が歪な形になるので、例えば末端部分を７残基程度両末端では１４残基分削る必要がある。
この例では１４残基削っているが、この数が２４残基以上ではいけない。２４残基挿入し１４残基削った後、１０残基分挿入部分がモデルされている。従って、モデリングを要する挿入部分、即ち、挿入部分配列（ｎ）から、削られた目的タンパク質の元の挿入部分配列（ｎ）に相当する部分に残存する削除後の残基数を引いた残基数（１０）は、ｎ−１０残基となる。ｎ−１０＜２５であれば、ＦＡＭＳの機能から立体構造の構築を行う。ｎ−１０＞２４であれば、再び２４残基に削って上記操作を繰り替えす。
上記の操作を行うことにより、何残基の挿入部分配列があっても立体構造の構築が可能である。
このステップＩＩ−６０は、上記ステップから得られる参照タンパク質およびアライメント等を対象とするのみならず、他のいかなる手法で得られたものに対しても適用することができる。
上記で選定されたアライメント、参照タンパク質、Ｃα原子座標等の情報に基づく立体構造の構築方法は特に限定されないが、例えば次のステップ７０〜９０の方法で行うのが好ましい。ここで、本明細書の各ステップにおいて記載されている計算回数、定数、カットオフ値等のパラメーターは、本発明者が最も好ましいと考えているものの一例であり、本発明の範囲を何ら限定するものでない。
ステップＩＩ−７０：主鎖原子座標の構築及び最適化
ステップＩＩ−５２又はステップＩＩ−６０のＣαの原子に主鎖の他の原子を付加し、シミュレーティッドアニーリング法によって目的関数を最小化するようにする。アライメントにモデリングソフトでの処理が不可能な挿入部分配列がない場合はステップＩＩ−５２で構築されたＣα原子に主鎖の他の原子の付加が行われる。
まず、Ｃα原子の立体的な重ねあわせを行い、Ｃαの原子間距離が２．５Å以下の残基が取り上げられる。Ｃαを除く主鎖の原子座標はＣα原子間距離が最小になるように参照タンパク質の座標から取得しモデル構造とする。
参照タンパク質の中に相当する残基が無い場合、主鎖の原子座標はデータベース中の相当する４残基のタンパク質断片から作成される。この過程の中で、残基ｉの主鎖原子はｉ−１番目からｉ＋２番目までのＣα原子間の最小の根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）値を持つ残基から選ばれる。その際Ｎ末端の残基では、Ｃα原子座標の重ね合わせ範囲がｉ番目からｉ＋３番目までとなり、Ｃ末端の残基およびそのひとつ前の残基では同様にｉ−３番目からｉ番目までおよびｉ−２番目からｉ＋１番目までとなる。
主鎖原子の目的関数を基にシミュレーティッドアニーリング法によって主鎖原子座標が最適化される。この目的関数等は前記ステップＩ−８２の通りであり、同様の方法で行われる。
ステップＩＩ−８０：側鎖原子座標の構築及び最適化
側鎖の構築は、大きく２段階に分かれており、「構造保存部位の側鎖構築」（スッテプＩＩ−８１）と「全体の側鎖構築」（スッテプＩＩ−８２）に分けられる。
ステップＩＩ−８１：構造保存部位の側鎖構築
算出された主鎖原子に対して、以前の研究における方法を用いてホモロガスなタンパク質から側鎖のねじれ角を得る。この方法の詳細は、″Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｙｅｄ  ｂｙ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｔｏｒｓｉｏｎａｌ  ａｎｇｌｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．″Ｏｇａｔａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｕｍｅｙａｍａ  Ｈ，Ｐｒｏｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８，３１，２５５−３６９に記載されている。
このステップＩＩ−８１は前記ステップＩ−８３（１）と同様に行われる。
ステップＩＩ−８２：全体の側鎖の構築
側鎖の構築は固定した主鎖およびＣβ原子のもとで行う。これは上記したＯｇａｔａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｕｍｅｙａｍａ  Ｈ，Ｐｒｏｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８，３１，２５５−３６９に開示されている研究成果をもって行わる。
このスッテプＩＩ−８２は前記ステップＩ−８３（２）と同様に行われる。
ステップＩＩ−９０：最終構造の構築
かくしてステップＩＩ−１０〜ＩＩ−８０を行うことにより、目的タンパク質の立体構造を規定する原子座標を得ることができる。前記ステップＩＩ−５２迄の過程でアミノ酸配列的および立体構造的に冗長性を排除したアライメントが得られており、効率的な立体構造の構築が可能である。
前記したアライメント修正法は、上記Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳに組み合わせて用いることができる。また、上記各ステップは、コンピュータプログラムにより、全自動で実行することができる。かくして、目的タンパク質の配列が与えられれば全自動のホモロジーモデリング（立体構造の構築）が可能となる。
ＩＩＩ．ドメイン単位に区切った立体構造データベース
次に、本発明の第四の態様である立体構造配列のドメイン区切り方法およびドメイン単位に区切った立体構造データベースについて説明する。
この発明において、「ドメイン」とは、前記の通り、タンパク質の３次構造の単位を意味する。
本発明のドメイン区切り方法は、ドメイン区切りが未知の立体構造の配列について、ドメイン区切りが既知の立体構造の配列に対して配列上の相同性検索を行い、得られたドメイン毎の相同性配列のコンセンサスに基づいて、ドメイン区切りを決定することを特徴とする方法である。
ドメイン区切りが既知の立体構造の配列としては、前記したドイン単位に区切った立体構造データベース（ドメイン構造データベース）、例えば、ＳＣＯＰ、ＣＡＴＨ等の配列が用いられる。相同性の検索は、これらデータベースに対して行い、ドメイン区切りが未知の立体構造の配列と相同性を有する配列を検出する。ここで「相同性」とは、配列の一致度や類似度を意味する。相同性の検索は、適当なアライメントソフト、例えば、前記ＦＡＳＴＡやＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等が用いられる。
これらアライメントソフトを用いて検出されたドメイン毎の相同性配列のコンセンサスに基づいて、ドメイン区切りが未知の立体構造の配列について、ドメイン区切りを決定する。ここで、コンセンサスとは、一致意見または合意を意味する。ドメイン区切りのコンセンサスは、多数決法を採用して行えばよい。
また、ＳＣＯＰに登録されている各ドメインには、その性質を表す識別子（ＩＤ）が付与されている。ドメイン区切りと同時に、この識別子（ＩＤ）についても、コンセンサスに基づいて新たな識別子を付与するのが好ましい。これにより、新たに決定されたドメインについて、その帰属を推定することができる。
上記方法を用いて、ドメイン区切りが未知の立体構造の配列について、ドメイン立体構造データベースを構築することができる。
ＳＣＯＰ等のドメイン構造データベースの更新頻度は、ＰＤＢ等の立体構造データベースとの更新頻度より少ない（更新のスピードにタイムラグがある）。このため、ＰＤＢ等の立体構造データベース中には、ドメイン区切りが決定されていない新規な配列の登録が数多く含まれる。本発明の方法により、これら新規な構造の登録に対しても効率的に対応することができる。
かくして得られるドメイン構造データベースを用いて参照タンパク質を選定することにより、ドメイン単位の立体構造の構築が可能となる。立体構造の構築は、例えば前記した方法により行うことができる。
また、ドメインとは、前記の通り、タンパク質の立体構造で３次構造の単位であり、本発明の方法を用いれば、効率的にドメイン単位の立体構造が得られ、ドメイン間相互作用の研究の良いデータセットの提供も可能となる。
ＩＶ．アミノ酸配列データベースを介した参照タンパク質探索方法
次に、本発明の第五の態様であるアミノ酸配列データベースを介した参照タンパク質の探索方法について説明する。
この発明の、参照タンパク質の探索方法は、
（ｉ）任意の目的タンパク質について、アミノ酸配列データベースに対して相同性検索を行い、目的タンパク質の配列と相同性を有するアミノ酸配列データベースの配列を検出し、
（ｉｉ）検出されたアミノ酸配列について、立体構造データベースの配列に対して相同性検索を行い、検出されたアミノ酸配列データベースの配列と相同性を有する立体構造データベースの配列を検出し、
（ｉｉｉ）検出された立体構造データベースの配列と目的タンパク質の配列とのアライメントを得て、該立体構造デーベースの配列を参照タンパク質とすることを特徴とする方法である。
先ず、相同性検索に用いられるアミノ酸配列データベースとしては、特に限定されないが、例えば、前記したＧＣＲＤｂ、ＧＰＣＲＤ、ＥｘＰＡＳｙ、ＯＲＤＢ、ＰＩＲ、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｌｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＴｒＥＭＢＬＮＥＷ、ＤＡＤ等が挙げられる。これらの中で、使いやすさの観点からＰＩＲを用いるのが好ましい。
相同性の検索は、適当なアライメントソフト、例えば、前記したＦＡＳＴＡやＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて行われる。
かくして検出される目的タンパク質の配列と相同性を有する酸配列データベースの配列について、立体構造データベースの配列に対する相同性検索が行われ、アミノ酸配列データベースの配列と相同性を有する立体構造データベースの配列が検出される。用いられる立体構造データベースとしては、特に限定されないが、例えば、前記したＰＤＢ、ＣＣＤＣ、ＳＣＯＰ、ＣＡＴＨ等が挙げられる。これらのデータベースは単独で用いても、組み合わせて用いても良い。相同性の検索は、上記の通り、適当なアライメントソフトを用いて行えば良い。
かくして、アミノ酸配列データベースの配列を介して、目的タンパク質の配列と立体構造データベースの配列とのアライメントを得ることができる。このアライメントに基づき参照タンパク質が選定される。
用いるアミノ酸配列データベースは、似たような配列が検出されるのを防ぐために、あらかじめ、似ているものを排除しておく（冗長性を排除しておく）ことが好ましい。この場合、排除の基準となる配列の一致度（類似度）は特に限定されないず、配列の検出数、処理の効率に基づいて決定すれば良く、例えば、配列の類似度（一致度）が９５％以上のものを省くのが好ましい。
アミノ酸配列データベースから相同性を有する複数（多数）の配列が検出されることがある。この場合、処理の効率化を計るために、これらの配列の冗長性を排除しておくことが好ましい。
冗長性の排除は、高ホモロジーアライメントソフト、例えばＦＡＳＴＡを用いて、閾値を段階的に下げてゆくクラスター解析により行うのが好ましい。具体的には、閾値は初め９０％から５％刻みで下げてゆく。クラスターの代表としては、もともとのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）のシーケンスに対し最も低いｅ値を持つ配列を採用する。クラスター数が１０以下になるクラスター解析の閾値のところでやめる。但し、この数は自動解析に適応する数であれば１０にこだわらない。特に、大量なアミノ酸配列データベースの配列に対して自動モデリングを実行する為にはこのようにデータベースの配列数を少なくする必要がある。
検出された立体構造データベースの配列と目的タンパク質の配列とのアライメントが複数得られた場合、各アライメント間の一致部分はそのままとし、不一致部分はそれらのコンセンサスに基づいて確定させ、単一のアライメントを得る。即ち、複数のアライメントのコンセンサス（一致意見）に基づいて、単一のアライメントを算出する。アライメントのコンセンサスは、多数決法等を利用して行えばよい。
このアライメントのコンセンサスを取る場合、前記ドメイン区切りや識別子（ＩＤ）の場合と異なり、考慮すべき事項が多く、別のプログラムを用いて行うのが好ましい。この場合、アルゴリズムは、多数の要素の集合から一つを選び出すことに相当し、統計手法として平均値、中央値、最頻値、最大値、最小値等が考えられる。多数決とは、最頻値に相当するが、中央値、平均値の意味も少し含んでいる。特に大小関係が無い場合は、最頻値を選択するのが好ましい（自然である）。
この発明は、目的タンパク質を立体構造データベースに対して相同性検索を行っても、相同性を有する立体構造データベースの配列が検出されなかった場合に行うのが特に好ましい。即ち、この発明により、ＯＲＦの立体構造探索において、通常のアライメントソフト、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＲＳ−ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等で立体構造の精度が保証された類似のアミノ酸配列（参照タンパク質）を立体構造データベースから探し出せない場合においても、アミノ酸配列データベースを介することにより、参照タンパク質を探し出すことができる。このことは、第３５図に示す通り、モデリングにより立体構造が構築可能なＯＲＦ数が格段に増加したことを意味する。
かくして探索された参照タンパク質およびアライメント情報に基づいて、例えば、前記した方法により立体構造を構築することができる。
Ｖ．本発明の特に好ましい態様
上記した本発明の第一〜第五の態様は、ホモロジーモデリングを行うことができる適当なプログラムが動作するコンピュータを用いて、単独で或いは互いに組み合わせて実施することができる。本発明の最も好ましい態様の一例を第９図に示す。この発明の態様における各ステップの詳細は、前記の通りである。これにより、適当なコンピュータを用いて、如何なるＯＲＦの配列についても、漏らさずに、網羅的に立体構造の構築（モデリング）が可能である。第９図に示す方法は、特に自動化に適した方法である。これにより、目的タンパク質の配列が与えられれば、大量なアミノ酸配列データベースの如何なる配列に対してもコンピュータを用いた自動モデリングを実行することができる。近年ＯＲＦの配列情報は加速度的に増加しており、本発明の方法により、大量のＯＲＦの配列情報について、効率的なモデリングが可能となる。
ＶＩ．タンパク質の立体構造を規定する原子座標が記録されている記録媒体、データベース
上記方法で得られたタンパク質の立体構造を規定する原子座標をコンピュータが利用可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより目的タンパク質の立体構造データベースが構築できる。本発明のデータベースは、好ましくは、上記原子座標とともに参照タンパク質と目的タンパク質のアライメント情報を含む。また、データベースには、所望によりコード番号、参照タンパク質の参照領域の情報、目的タンパク質の情報、Ｃα原子間距離等が含まれる。
本発明においてデータベースとは、上記原子座標を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピュータシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フロッピーディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体；ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
ＶＩＩ．薬物の分子設計方法
薬物分子設計を行うことができる適当なプログラムが動作するコンピュータで、上記方法で得られた薬物分子の標的となるタンパク質（以下これを「標的タンパク質」と称することがある）の構造座標の全て又は一部、又はそれらが記録されたデータベース若しくは記録媒体の構造座標を使用して、標的タンパク質と相互作用をする薬物分子（拮抗薬または作動薬）を同定、検索、評価又は設計等を行うことができる。
薬物分子の同定、検索、評価又は設計は、本発明の方法で得られた立体構造座標と薬物分子の立体構造座標との相互作用の有無やその程度に基づいて行われる。本明細書において、薬物分子の同定、検索、評価又は設計等を、単に薬物の分子設計ということがある。
タンパク質の立体構造座標と薬物候補分子の立体構造座標との相互作に基づいて分子設計を行う際に用いられるコンピュータとしては、適当なプログラムが動作するように調整されているコンピュータであれば特に制限はない。また、コンピュータの記憶媒体にも特に制限はない。分子設計に用いるプログラムは、例えばモレキュラーシミュレーション社製のコンピュータ・プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ等を挙げることができる。特に、この目的のために特別に作成されたＬｕｄｉやＤＯＣＫといったプログラムを単独又は組み合わせて用いることで、より容易に同定、検索、評価又は設計することができる。また、タンパク質の立体構造座標と薬物分子とのドッキング評価は、例えば、ＮＥＣ社製のＢＩＯＣＥＳ（バージョン３．１０）を用いて行うことができる。
ここで、薬物分子は、既知のものであっても、新たに合成された新規な化学構造を有する薬物分子であっても、その立体構造が得られるものであれば、いずれの薬物分子も本発明の方法で用いることができる。薬物分子の立体構造座標は、Ｘ線結晶解析やモデリング等のいずれの方法で得られたものでも良い。３次元構造座標が決定されているものは、適当なデータベース、例えばＣＣＤＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｒｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｄｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）やＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から収得することができる。
更には、特開２０００−１７８２０９号公報に記載されている方法によっても、薬物分子を設計することができる。この様に、本発明の方法で得られたタンパク質の立体構造座標を用いることで、薬物分子のコンピュータによる分子設計が可能となる。ただし、本発明の分子設計方法は、これらのプログラムや手法を用いるものに限定されるものではない。
薬物の分子設計には、通常、概念的に２つの段階がある。最初の段階は、リード化合物を見つけだすものであり、次の段階はリード化合物の最適化である。どちらの段階も、標的タンパク質の立体構造座標を使用して、それ自体既知の方法により行うことができる。これにより最適な医農薬候補分子を得ることができる。
ＶＩＩＩ．分子設計方法により得られる医農薬候補分子のスクリーニング方法
上記方法により同定、検索、評価又は設計された医農薬候補分子は、その分子の性質に応じて、例えばそれ自体既知の化学合成法により得ることができる。しかしながら、薬物分子は、天然化合物、合成化合物のいずれでも良く、また、高分子化合物、低分子化合物のいずれでも良い。得られた医農薬候補分子は、更に、それ自体既知の方法により、試験管内や生体内における薬理学的または生理学的試験によりその活性を調べ、所望の活性を有する医農薬候補分子を選抜することにより実際に医農薬として応用可能なものを得ることができる。
ＩＸ．医農薬組成物の製造方法
上記スクリーニング方法により選択された医農薬、例えば医薬分子は、それ自体単独で治療対象となる疾患等の患者に投与することができるが、これらの有効成分の１種又は２種以上を混合して投与することもできる。また、薬理学的に許容される製剤用添加物等を用いて該物質を医薬品組成物として製剤化し、これを投与するのが好ましい。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、マイクロカプセル剤、リポソーム製剤、トローチ、舌下剤、液剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁剤等として経口的に、あるいは無菌の水性液もしくは油性液として製造した注射剤や、座剤、軟膏、貼付剤等として非経口的に使用できる。これらは、例えば、該物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和し、充填又は打錠等の当業界で周知の方法を用いて製造することができる。これらの医薬組成物における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
農薬分子について、実際に農薬として使用する場合には、担体若しくは希釈剤、添加剤および補助剤等と公知の方法で混合して、通常農薬として用いられている製剤形態（組成物）、例えば粉剤、粒剤、水和剤、乳剤、水溶剤、フロアブル剤等に調製して使用される。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、下記の実施例は、本発明の具体的な認識を得る一助と見なすべきものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。なお、下記の実施例において、立体構造モデルの構築、アライメント、参照タンパク質の探索等は、ＤＥＬＬ社製パーソナルコンピュータ（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ＸＰＳ  Ｔ４５０，ＣＰＵ：ＰｅｎｔｉｕｍＩＩＩ  ４５０ＭＨｚ，Ｒｅｄ  Ｈａｔ  Ｌｉｎｕｘ  ７．１Ｊ、メモリ：３８４Ｍｂｙｔｅｓ）を用いて行った。
実施例１ アライメント修正法の効果
大腸菌ゲノムの立体構造データベースＰＤＢ（２００１年３月時点）に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの検索結果、第１位のホモロジーが１００％（即ちＸ線解析などによる立体構造が存在する）だったものの第２位についてアライメント修正プログラムを実行した結果を示す。第２位のアライメントの修正前および修正後の両方に対してアライメントを基にしてＣαの原子座標のみモデル構築を行い、第１位で構築した正解のモデル構造に対し立体構造フィッティングを行った。
修正時のパラメータとしては次の２つである。
（ｉ）二次構造判定に用いる最大水素結合長（３．０５Å、３．１０Åおよび３．５０Å）。
（ｉｉ）プロファイルの認識方法（ここではＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いたがＦＡＳＴＡ等でもよい）：プロファイルの情報の連続した領域が何残基続いたときに、アライメントを固定するか（０：プロファイル無視、１：１残基以上、２：２残基以上、３：３残基以上のプロファイル情報が続いている場合にアライメント上のその部分を固定する）。
下記第４表に示すように修正後は、９８個中７４個（７５．５％）ものＯＲＦについてアライメントがＲＭＳＤが良くなるように小さな数値に修正されることが示された。約４分の３が数値上改良されたモデリング精度を示すことは発明者らの提案しているアライメント修正法が有用であることを示す。この表におけるモデリングに使われた参照タンパク質はＯＲＦのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによる通常のＰＤＢデータベース検索においてｅ値が０．００１以下を示すもののみを用いた。
0004118680.tif 000021
0004118680.tif 000022
0004118680.tif 000023
0004118680.tif 000024
0004118680.tif 000025
0004118680.tif 000026
0004118680.tif 000027
0004118680.tif 000028
上記第４表中のＯＲＦ名ｃｌｐＰを例に改良された立体構造を示す（第１０図〜第１２図参照）。このタンパク質では、修正前のアライメントでは９．５４２Åなのに対し、二次構造を判定する最大水素結合長を３．１Åとして、二残基以上のプロファイルの情報が連続する場合を固定したアライメント修正後は８．２７９Åに改善された。第１０図〜第１２図から明らかな通り、修正後のモデルは正解構造の二次構造を良く予測している。
上記ｃｌｐＰを例にアライメント修正の詳細について述べる。
修正前のアライメントは、第１３図に示す通りである。
具体的な修正の中身は第１４図〜第１８図に示す通りであり、修正部分は３箇所である。
１箇所目と２箇所目の修正前の修正部分を第１４図に示す。第１４図の５行目はプロファイルの情報を示し、６行目は二次構造情報、７行目は、疎水コア値、および疎水コア距離を示す。第１４図では２箇所挿入がある。そして、それぞれβシート（６行目の文字「Ｅ」に相当）とαヘリックス（同様に「Ｈ」に相当）の中に入っている。本発明のアライメント修正法を適用すると第１５図に示す通り２次構造を分断しないように修正される。
３箇所目の修正前は、第１６図に示す通りであり、ヘリックスを分断していたのに対し、第１７図に示す通りαヘリックスに挿入が入らないようになった。
その結果として、最終的なアライメントは第１８図の通りとなる。
このように修正することにより、ＯＲＦ名ｃｌｐＰについてＲＭＳＤが９．５４２Åから８．２７９Åになる、だけでなく二次構造を保持した構造を算出し、より真実に近い構造を算出することができる。ここでのプログラムのアルゴリズムはすべて自動化が可能なものとなっている。
実施例２ ドメイン単位に区切った立体構造データベースの効果
ここでは立体構造データベースであるＰＤＢをＳＣＯＰにしたがってドメイン単位に区切ったデータベースを利用している。これはドメイン単位にモデルが構築されることを意味する。
大腸菌ゲノムのタンパク質鎖伸張因子でｔｕｆＢと呼ばれるタンパク質を例にこのデータベースを使用したモデリングの利点を示す。このタンパク質は次に示すアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）を持つ。
0004118680.tif 000029
0004118680.tif 000030
このタンパク質は、上記実施例１のアライメント修正法の効果の表中にも示したが、公開されているＰＤＢに当てたとき第１９図に示すアライメントを持ちＲＭＳＤが１０．５２７Åであった。配列の相同性が７３．３％程度あるときは、通常において立体構造はもっと似ていてＲＭＳＤはもっと低くあるべきである。
立体構造を調べてみると第２０図および第２１図の様になっており３個のドメインの相対対置が異なるのために全体のＲＭＳＤを下げていることがわかる。
これを、発明者がＳＣＯＰのデータベースを拡張したドメイン区切りしたデータベース中で検索を行うと第２２図〜第２４図に示す三つのアライメントに分けることが出来る。参照された三つの参照タンパク質（ＩＥＸＭ−Ａの三つのドメイン構造タンパク質）がＯＲＦのｔｕｆＢの別々の場所に並置される。
さらにこのアライメントでモデル構築を行い、それぞれ立体構造フィッティングを行うと、正解構造に対してＲＭＳＤはそれぞれ１．５８６Å、１．０１３Å、３．５９９Åとなった。ドメイン区切りでモデルを構築することにより、ドメイン同士の相対配置によって悪く評価されてしまいがちな、ＲＭＳＤを精度良く妥当な数字で評価することが可能となる。同様の傾向はｔｕｆＢのみならず、同じ大腸菌の中のｔｕｆＡおよびｐｙｒＩにも見られる。
実施例３ Ａｄｖａｎｅｅｄ  ＦＡＭＳによるデータベースサーチの効果
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳで効果的に参照タンパク質が選ばれることを、２０００年に行われたＣＡＳＰ４のターゲットでもあったタンパク質ＦｔｓＡ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来）、Ｔ００８９について述べる。この立体構造は現在１Ｅ４ＦというＰＤＢコードで公開されているが、この構造含まないデータベースを用いて立体構造予測を行った。
このタンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）は、次の通りである。
0004118680.tif 000031
0004118680.tif 000032
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチの結果、下記第５表の３９個のＰＤＢが配列的な相同性があるものとして検出された（プロファイルとして２０００年７月時点のＰＩＲを、検索対象として２０００年７月時点のＰＤＢ用いた、さらにＰＤＢデータベースは９５％以上配列相同性のあるものを除いた）。３９個のうちｅ値が０．１以下のものは下記第５表のように７個であった。
0004118680.tif 000033
この検索結果に対してＡｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳの機能である配列的及び立体構造的な冗長性を排除した後、下記第６表の３個のＰＤＢが候補として残った。
0004118680.tif 000034
下記第７表の様に効果的にターゲットを絞ることが出来る。
正解構造であるＰＤＢ  １Ｅ４Ｆに対して、立体構造フィッティングを行い正解構造とのＲＭＳＤを算出した。下記第７表の中でＲＭＳＤ値が小さいほど、正解構造に近いことを示す。
0004118680.tif 000035
上記の結果をみると、７ＨＳＣのＡ鎖を参照タンパク質としてモデリングした構造がもっとも正解と近い構造であることがわかる。これはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴでは７位にヒットしていたものである。Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳで３位にヒットしている。Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳで最も低いｅ値を持って１位にヒットしている参照タンパク質を使ってモデリングしたものが正解構造に必ずしも最も近いとは保証されないことに注目すべきである。即ち前記ＩＩで詳述したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳの手法は正解構造に最も近いモデリング構造を算出する有益な手段ということになる。
この方法を遺伝子配列の集まりであるゲノム等に適用することにより、極めて正解構造に近い構造を網羅的に且つ効率的に算出することが可能となる。
実施例４ アミノ酸配列データベースを介した参照タンパク質探索の効果（その１）
アミノ酸配列データベース（ＰＩＲなどのデータベース）を介した参照タンパク質探索法を用いることにより効果的に参照タンパク質が選ばれることを、２０００年に行われたＣＡＳＰ４のターゲットでもあったタンパク質ＹＢＡＢ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来）、Ｔ００９１について述べる。２００１年１１月現在、立体構造はまだＰＤＢに登録されていない（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｃｅｎｔｅｒ．１１ｎｌ．ｇｏｖ／ｃａｓｐ４／ｔａｒｇｅｔｓ／ｔｅｍｐｌａｔｅｓ／ｔ００９１．ｄｏｃ．ｈｔｍｌ）。
この配列に対しアミノ酸配列データベース２００１年５月のＰＩＲをプロファイルとして用いたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて２００１年５月時点のＰＤＢ中から類似アミノ酸配列を探索した。但し、ＰＤＢのシーケンスそのものではなく、ＰＤＢのドメイン毎に区分けしたデータベースを使用した。配列中でドメイン区切りの判断は、ＳＣＯＰ（ｈｔｔｐ：／／ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−１ｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／）によるものである。ＳＣＯＰにまだ登録されていないＰＤＢについては発明者がＦＡＳＴＡを使ってＳＣＯＰに従って分類した。さらにドメイン区分けしたＰＤＢからアミノ酸配列が９５％以上の似ているものは省いている。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索の１位はｅ値が０．２６であった。ｅ値が低いことはアミノ酸配列の相同性が高いことを意味し、０．１以下であるとフォールドが正しい可能性が高いと考えて良いのだが、上記に得られた参照タンパク質からモデリングしたとしてもモデルの精度について信頼に乏しい。
このような状況下でＰＩＲなどのアミノ酸配列データベースを介してのＯＲＦに対する立体構造検索に関する本発明を適用した詳細を以下に示す。
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて２００１年５月時点のＰＩＲ（アミノ酸配列が９５％以上の似ているものは省いている。１８３０１６シークエンス配列）に対し探索し、ｅ値が０．１以下かつアライメント領域長が３０残基以上のもの（今回は２６配列が該当）のみ取り出した。
次に、検索されてきた２６のＰＩＲの配列を１０以下の数に絞り込むために、ＦＡＳＴＡを用いて閾値を段階的に下げてゆくクラスター解析を行った。大量なＯＲＦに対して自動モデリングを実行する為にはこのようにＰＩＲの配列の数を少なくする必要がある。具体的には、閾値は初め９０％から５％刻みで下げてゆく。クラスターの代表としては、もともとのＯＲＦのシーケンスに対しもっとも低いｅ値を持つ配列を採用した。クラスター数が１０以下になるクラスター解析の閾値のところでやめた。但し、この数は自動解析に適応する数であれば１０にこだわらない。ここでは具体的には４０％のところでクラスター数が７個になったのでクラスタリングをやめ、それぞれのクラスター内から課題の配列（ｔ００９１．ｓｅｑ）に対し最も低いｅ値をもつアミノ酸配列をクラスターの代表にした。それらは以下の通りである。
0004118680.tif 000036
このクラスターの代表の７配列について、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて前述のドメイン単位に加工しなおしたＰＤＢデータベースの配列中から類似タンパク質配列を再探索した。その結果、上記７配列中、次の３配列
0004118680.tif 000037
に対してｅ値が０．１以下の配列が上記のドメイン区切り毎の立体構造データベースから検出された。ＰＤＢのＩＤは３つのいずれのアミノ酸配列に対しても１Ｇ８Ｋ＿Ｇであった。これら３つのアミノ酸配列ついて、ＯＲＦの配列とＰＩＲの配列とのアライメントを第２５図〜第２７図に、ＰＩＲの配列とＰＤＢの配列とのアライメントを第２８図〜第３０図に、それぞれ示す。
ＣＡＳＰ４の課題（ｔ００９１．ｓｅｑ）の配列とアミノ酸配列データベースＰＩＲ中の配列とのアライメント、およびＰＩＲの配列と立体構造の配列とのアライメントから、課題（ｔ００９１．ｓｅｑ）のＯＲＦの配列と立体構造の配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）とのアライメントを作成した。
ＰＩＲの配列（Ａ８６４９６）を介したアライメントを第３１図に、ＰＩＲの配列（Ｅ７０１５７）を介したアライメントを第３２図に、ＰＩＲの配列（Ｈ６４２１４）を介したアライメントを第３３図に、それぞれ示す。
上記３つのアライメントから明らかなように、どのＰＩＲを介しているかによってアライメントが若干異なる。さらに若干異なるアライメントに対する調整として、発明者が開発したＣ言語のプログラムである多数決法などの方法を利用して第３４図に示すような最終アライメントを得た。ここで採用された多数決法プログラムはすべて自動モデリングに対応して書かれている。
このように、ＯＲＦの立体構造探索において、ＰＩＲなどのアミノ酸配列を介することにより、通常のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索では、立体構造の精度が保証された類似のアミノ酸配列を立体構造データベースから探し出せない場合においても、探し出せることが示された。
このことは第３５図に示すように立体構造構築可能なＯＲＦ数が増加したことになる。この場合ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの替わりにＲＰＳ−ＢＬＡＳＴを利用しても同様のことが言える。
実施例５ アミノ酸配列データベースを介した参照タンパク質探索の効果（その２）
アミノ酸配列データベースを介した参照タンパク質探索法を用いることにより効果的に参照タンパク質が選ばれることを、２０００年に行われたＣＡＳＰ４のターゲットでもあったタンパク質ＰＰＸ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来）、Ｔ００８７について述べる。立体構造はＰＤＢに１Ｉ７４として登録されている。
この配列に対しアミノ酸配列データベース２００１年５月のＰＩＲをプロファイルとして用いたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて２００１年５月時点のＰＤＢ中から類似アミノ酸配列を探索した。但し、ＰＤＢの配列そのものではなく、ＰＤＢのドメイン毎に区分けしたデータベースを使用した。さらにドメイン区分けしたＰＤＢからアミノ酸配列が９５％以上の似ているものは省いている。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索の結果０．１以下のｅ値で検出されたＰＤＢはなかった。このような状況下で本発明を適用した詳細を以下に示す。
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて２００１年５月時点のＰＩＲ（アミノ酸配列が９５％以上の似ているものは省いている。１８３０１６配列）に対し探索し、ｅ値が０．１以下かつアライメント領域長が３０残基以上の８２個のＰＩＲ配列を取り出した。
次に検索されてきた８２のＰＩＲの配列を１０以下の数に絞り込むために、ＦＡＳＴＡを使って段階的クラスター解析を行った。具体的には閾値は初め９０％から５％刻みで下げてゆく。クラスターの代表としては、もともとのシーケンスに対しもっとも低いｅ値を持つ配列を採用した。クラスター数が１０以下になるところでやめるべきであるが、３５％のところでクラスター数が３２個であった。候補が１０以下に絞れていないが、これより閾値を下げることはクラスターの間でホモロジーの低いＰＩＲを候補として残すことになる。そこでこの問題をクリアーするため、この３５％の時点でクラスタリングをやめ、３２個のクラスターの中でｅ値の低いものの順に上位１０個を選択した。もちろん各々のクラスターの代表はｅ値の最も低いアミノ酸配列を選んでいる。このようにＣＡＳＰ４の課題の配列（ｔ００９１．ｓｅｑ）に対しアミノ酸配列データベースから１０個を選択した。
それらを次に示す。
0004118680.tif 000038
0004118680.tif 000039
このクラスターの代表の１０配列について、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて前述のＰＤＢ配列中から類似タンパク質配列を再探索した。その結果、上記１０配列中３配列が０．１以下のｅ値を持つ立体構造ドメインデータベースのＰＤＢ配列を釣ってきた。
それらを次に示す。
0004118680.tif 000040
これらのアミノ酸配列について、ＯＲＦの配列（Ｔ００８７）とＰＩＲの配列とのアライメントを第３６図〜第３８図、ＰＩＲの配列とＰＤＢの配列とのアライメントを第３９図〜第４１図に、それぞれ示す。、
最終的に、ＣＡＳＰ４の課題（ｔ００８７．ｓｅｑ）の配列とアミノ酸配列データベースＰＩＲ中の配列とのアライメント、ＰＩＲの配列とＰＤＢの立体構造の配列とのアライメントから、第４２図〜第４４図に示す様に課題（ｔ００８７．ｓｅｑ）の配列と立体構造の配列とのアライメントを作成した。
さらにこのアライメントに基づきモデルを構築し、正解構造であるＰＤＢ：１Ｉ７４＿Ａと立体構造フィッティングしてみた。その結果、それぞれＲＭＳＤの値が、１５．８６２Å、１３．６０６Å、１３．１５９Åとなっていた。この結果でもってＣＡＳＰ４に提出していたとしたら、かなりの好成績として認められているだろう。ちなみに１３．１５９ÅはＣＡＳＰ４コンテスト参加グループ７３チーム中１３位に位置している。
また、通常のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴで検出することの出来ないターゲットについて自動的に算出したアライメントによって国際コンテストのレベルで正解に迫ることができることを示した。
産業上の利用可能性
従来の方法等と比較し、本発明の優れた点は次の通りである。
（１）ホモロジーモデリングによる立体構造の構築において、アミノ酸配列のアライメント（並置）が与えられた場合において、参照タンパク質の座標から立体構造情報を得てアライメントが修正されるため、より正確な立体構造の構築が可能となる。
（２）アライメントの修正は、タンパク質の二次構造情報、疎水コア値情報、疎水コア距離情報等に基づいて行われ、これにより、タンパク質の立体構造の構成単位である二次構造およびその近傍にアミノ酸配列断片の挿入および欠損が入らない立体構造モデルを得ることができる。
（３）また、アライメントを修正する際に、タンパク質の立体構造を形成する物理的な疎水性相互作用の働く空間およびその近傍にアミノ酸配列断片の挿入および欠損が入らないようにすることができる。
（４）ホモロジーモデリングの手法を用いる際に、２種類の性質の異なるアライメントソフト、例えばＦＡＳＴＡおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの出力結果を用いることにより、高ホモロジーから低ホモロジーのいずれの目的タンパク質に対しても、精度の良い立体構造の構築が可能である。
（５）上記（４）のアライメントソフトが複数のアライメントを算出してきた場合に、例えば（ｉ）参照タンパク質の同士のＦＡＳＴＡマッチングを行い、候補となる参照タンパク質のアミノ酸配列の冗長性を排除する、（ｉｉ）アライメントからタンパク質中のＣα原子の座標を作成し、立体構造マッチッグを行い、候補となる参照タンパク質の立体構造的な冗長性を排除する等の明確な基準によりアライメントの選定が可能となった点である。これにより、不必要な参照タンパク質およびアライメントの排除ができ効率的な立体構造の構築が可能となる。
（６）アライメントが、データベースから得られる以上のアミノ酸配列部分断片を含む場合においても、精度良く立体構造の構築が可能である。
（７）ドメイン区切りが未知の立体構造の配列についても、ドメイン区切りが可能となり、立体構造情報の最新の知見に基づいて、３次構造毎の立体構造の構築が可能となった点である。
（８）ＯＲＦの立体構造探索において、通常のアライメントソフトによる検索では、立体構造の精度が保証された類似のアミノ酸配列（参照タンパク質）を立体構造データベースから探し出せない場合においても、アミノ酸配列データベースを介することにより、参照タンパク質が探し出せることになった点である。これにより、立体構造が構築可能なＯＲＦ数が格段に増加する。
（９）かくして、立体構造の構築対象となる任意の目的アミノ酸配列が与えられた場合において、コンピュータプログラムにより全自動でホモロジーモデリング（立体構造の構築）が可能となる。
上記の通り、本発明は、任意のタンパク質のより真に近い立体構造を精度よく効率的に構築することができる方法である。また、かくして得られたタンパク質の立体構造を規定する原子座標を含む本発明のデータベースは、特に医薬、農薬等の分子設計に極めて有用に用いることができる。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２０００年１２月１日の日本特許出願（特願２０００−３６７００７）、２０００年１２月４日の日本特許出願（特願２０００−３６８４１５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【配列表】
0004118680.tif 000041
0004118680.tif 000042
0004118680.tif 000043
0004118680.tif 000044
0004118680.tif 000045
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のタンパク質の立体構造構築方法（アライメント修正法）の一例を示すフローチャートである。
第２図は、アライメント修正法において、与えられたアライメントを、二次構造、疎水コア値、疎水コア距離等の情報に基づいて修正する方法の一例を示すフローチャートである。
第３図は、ステップＩ−８１のＣα原子座標の構築方法を示す図である。アライメントの一致部分は参照タンパク質から取得し、無い部分はＮ，Ｃ両端それぞれ重なった２残基の重ね合わせの根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）が最小のものをデータベースから取得する。
第４図は、ローカルスペースホモロジー（ＬＳＨ）を示す図である。図中のＴ残基に関する計算では、網をかけた（灰色の）残基が考慮される。図中下のアライメントにおける四角で囲った部分が考慮される残基ペアであり、＊のマークがあるところの比率がＬＳＨである。この場合ＬＳＨは５６．２％である。
第５図は、ＬＳＨと構造保存部位（ＳＣＲｓ）にある比率との関係を示す図である。ＬＳＨは目的タンパク質と参照タンパク質とのＣα原子の重ね合わせから計算され、ＳＣＲｓにある比率は目的タンパク質の全残基数に対するＳＣＲｓ中の残基数である。
第６図は、本発明の目的タンパク質の立体構造構築方法（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＦＡＭＳ）の一例を示すフローチャートである。
第７図は、ＦＡＳＴＡのｅ値の対数とクラスター数との関係を示す図である。
第８図は、アライメントに予め作成された部分アミノ酸配列の座標データベースから得られる長さ以上の挿入部分配列（ｎ）がある場合のＣα原子座標の構築方法の一例を示す説明図である。
第９図は、本発明の特に好ましい態様の一例の基本的な流れを示す図である。
第１０図は、修正前のアライメントのモデルを示すディスプレイのプリントアウトした写真である。
第１１図は、修正後のアライメントのモデルを示すディスプレイのプリントアウトした写真である。
第１２図は、第１位の正解構造モデルを示すディスプレイのプリントアウトした写真である。
第１３図は、修正前のアライメントを示す図である。
第１４図は、１箇所目と２箇所目の修正の中身を示す図である。
第１５図は、１箇所目と２箇所目の修正後の中身を示す図である。
第１６図は、３箇所目の修正の中身を示す図である。
第１７図は、３箇所目の修正後の中身を示す図である。
第１８図は、最終的なアライメントを示す図である。
第１９図は、ＯＲＦの配列（ｔｕｆＢ）とＰＤＢの配列とのアライメントを示す図である。
第２０図は、ｔｕｆＢの第２位のモデルを示すディスプレイのプリントアウトした写真である。
第２１図は、ｔｕｆＢの第１位のモデルを示すディスプレイのプリントアウトした写真である。
第２２図は、ＯＲＦの配列（ｔｕｆＢ）とドメイン単位に区切ったデータベースの配列とのアライメント（１）を示す図である。
第２３図は、ＯＲＦの配列（ｔｕｆＢ）とドメイン単位に区切ったデータベースの配列とのアライメント（２）を示す図である。
第２４図は、ＯＲＦの配列（ｔｕｆＢ）とドメイン単位に区切ったデータベースの配列とのアライメント（３）を示す図である。
第２５図は、ＯＲＦの配列（Ｔ００９１）とＰＩＲの配列（Ａ８６４９６）とのアライメント（１）を示す図である。
第２６図は、ＯＲＦの配列（Ｔ００９１）とＰＩＲの配列（Ｅ７０１５７）とのアライメント（２）を示す図である。
第２７図は、ＯＲＦの配列（Ｔ００９１）とＰＩＲの配列（Ｈ６４２１４）とのアライメント（３）を示す図である。
第２８図は、ＰＩＲの配列（Ａ８６４９６）とＰＤＢの配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）とのアライメント（１）を示す図である。
第２９図は、ＰＩＲの配列（Ｅ７０１５７）とＰＤＢの配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）とのアライメント（２）を示す図である。
第３０図は、ＰＩＲの配列（Ｈ６４２１４）とＰＤＢの配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）とのアライメント（３）を示す図である。
第３１図は、ＰＩＲの配列（Ａ８６４９６）を介したＯＲＦの配列（Ｔ００９１）立体構造の配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）とのアライメントを示す図である。
第３２図は、ＰＩＲの配列（Ｅ７０１５７）を介したＯＲＦの配列（Ｔ００９１）と立体構造の配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）とのアライメントを示す図である。
第３３図は、ＰＩＲの配列（Ｈ６４２１４）を介したＯＲＦの配列（Ｔ００９１）と立体構造の配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）とのアライメントを示す図である。
第３４図は、ＯＲＦの配列（Ｔ００９１）と立体構造の配列（１Ｇ８Ｋ＿Ｇ）との最終的なアライメントを示す図である。
第３５図は、本発明のアミノ酸配列データベースを介した参照タンパク質探索方法により、立体構造が構築可能なＯＲＦ群が拡大することを模式的に示す図である。
第３６図は、ＯＲＦの配列（Ｔ００８７）とＰＩＲの配列（Ｅ８４０４６）とのアライメントを示す図である。
第３７図は、ＯＲＦの配列（Ｔ００８７）とＰＩＲの配列（Ｇ６４５０３）とのアライメントを示す図である。
第３８図は、ＯＲＦの配列（Ｔ００８７）とＰＩＲの配列（Ｓ７４９４０）とのアライメントを示す図である。
第３９図は、ＰＩＲの配列（Ｅ８４０４６）とＰＤＢの配列（１ＩＢＪ＿Ｃ）とのアライメントを示す図である。
第４０図は、ＰＩＲの配列（Ｇ６４５０３）とＰＤＢの配列（１ＶＰＥ）とのアライメントを示す図である。
第４１図は、ＰＩＲの配列（Ｓ７４９４０）とＰＤＢの配列（１Ｇ６Ｓ＿Ａ）とのアライメントを示す図である。
第４２図は、ＰＩＲの配列（Ｅ８４０４６）を介したＯＲＦの配列（Ｔ００８７）と立体構造の配列（１ＩＢＪ＿Ｃ）とのアライメントを示す図である。
第４３図は、ＰＩＲの配列（Ｇ６４５０３）を介したＯＲＦの配列（Ｔ００８７）と立体構造の配列（１ＶＰＥ＿）とのアライメントを示す図である。
第４４図は、ＰＩＲの配列（Ｓ７４９４０）を介したＯＲＦの配列（Ｔ００８７）と立体構造の配列（１Ｇ６ＳＡ１）とのアライメントを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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