(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和脂肪酸またはこれを含有する脂質の製造方法であって、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物を、大豆から得られる窒素源を添加した微生物培養用培地において、培地中のリン酸イオンを10〜45mM、カリウムイオンを10〜45mM、ナトリウムイオンを５〜40mM、マグネシウムイオンを１〜６mM、およびカルシウムイオンを１〜９mMの範囲に培地を調製することによって培養中の糸状菌の菌学的な形態を制御しながら、培養することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記リン酸イオンが、リン酸一水素二カリウム、リン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二ナトリウム及びリン酸二水素一ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１つ以上の塩類によって供給され、前記カリウムイオンが、リン酸一水素二カリウム、リン酸二水素一カリウム及び塩化カリウムからなる群より選ばれた少なくとも１つ以上の塩類によって供給され、前記ナトリウムイオンが、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸二水素一ナトリウム、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１つ以上の塩類によって供給され、前記マグネシウムイオンが、塩化マグネシウム及び／又は硫酸マグネシウムの塩類によって供給され、前記カルシウムイオンが、塩化カルシウム及び／又は炭酸カルシウムの塩類によって供給されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオンが、リン酸二水素一カリウム（KH2PO4）、無水硫酸ナトリウム（Na2SO4）、塩化マグネシウム六水和物（MgCl2・6H2O）及び塩化カルシウム二水和物（CaCl2・2H2O）の組合せによって供給される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記不飽和脂肪酸がアラキドン酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸及び／又はエイコサペンタエン酸であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物が、モルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物である請求項１乃至４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記モルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）又はモルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記大豆から得られる窒素源の、水分を除く成分当りの窒素含量が２重量％以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記大豆から得られる窒素源が、脱脂大豆、未脱脂大豆、及びこれらに加工を施したものからなる群より選ばれた少なくとも一つ以上である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記脱脂大豆又は未脱脂大豆に施される加工が、熱処理；酸処理；アルカリ処理；酵素処理；化学修飾；又は該処理を含む化学的及び／又は物理的処理による変性及び／又は再生；水及び／又は有機溶媒を用いた一部成分の除去；濾過及び／又は遠心分離による一部成分の除去；凍結；粉砕；乾燥；及び／又は篩い分けである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記大豆から得られる窒素源が、脱脂大豆に少なくとも熱変性を施したものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらに前記培地に酵母エキスを添加する、請求項１乃至10のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
10〜45mMのリン酸イオン、10〜45mMのカリウムイオン、５〜40mMのナトリウムイオン、１〜６mMのマグネシウムイオンおよび１〜９mMのカルシウムイオンの、大豆から得られる窒素源を添加したモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物培養用培地への使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な微生物培養用培地、並びに該培地中で不飽和脂肪酸生産能を有するモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物を培養して得られる不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法に関する。
背景技術
アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ミード酸等の不飽和脂肪酸は強力かつ多彩な生理活性を有するプロスタグランジン、トロンボキサン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン等の前駆物質といわれ、近年注目されている。例えばアラキドン酸は、特に乳児の発育に必要な成分として、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）とともに急速に研究が進められており、Ｌａｎｔｉｎｇらは生後３週間以上母乳で育てた乳児と育児用粉乳で育てた乳児を９歳まで追跡調査し、行動面などから脳神経の小さな障害の発生率を検討した結果、育児粉乳で育った子供の脳障害発生率は母乳で育った子供の２倍であると報告（ＬＡＮＣＥＴ、ｖｏｌ．３４４、１３１９−１３２２（１９９４））した。
このショッキングな結果は母乳には存在するが育児用粉乳にはほとんど存在しないＤＨＡやアラキドン酸などの不飽和脂肪酸が脳の発達に関係したためだろうと推測されている。この他にも、不飽和脂肪酸が新生児の脳および網膜の発達に関係しているだろうとする結果が相ついで報告されるようになり、未熟児および新生児栄養の領域においてホットな話題として注目されている。
これら、不飽和脂肪酸は動物界に広く分布しており、例えば、アラキドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離されている。しかしながら不飽和脂肪酸の含量は少なく、大量供給方法としては不十分であったことから、種々の微生物を培養して不飽和脂肪酸を得る方法が考案されてきた。中でもモルティエレラ属に属する微生物は、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸等の不飽和脂肪酸を生産する微生物として知られており、この微生物を用いた発酵法による該脂肪酸を製造する方法が開発されている（特開昭６３−４４８９１、特開昭６３−１２２９０、特開昭６３−１４６９６、特開昭６３−１４６９７）。
さらにモルティエレラ属微生物に変異処理を施して得られる、Δ１２不飽和化活性が低下又は欠失している変異株を用いてミード酸を製造する方法も知られている（特開平５−９１８８８）。また、モルティエレラ属微生物に変異処理を施して得られる、Δ５不飽和化活性が低下又は欠失している変異株を用いて、ジホモ−γ−リノレン酸を著量製造する方法も知られている（特開平５−９１８８７）。
しかし、モルティエレラ属のような糸状菌を用いて液体培地で発酵生産を行なう場合、往々にして菌体増殖による培養液粘度の増加とそれに伴う酸素供給不足が起こり、その対策として開発された溶存酸素濃度制御法（特開平６−１５３９７０）は生産性向上に大きく貢献しているものの、工業規模での培養で経済的に優れた高生産を実現するのにこれで十分とはいえず、より安価な培地や微量栄養素の探索、培養液流動性改善のための菌形態の制御法等の幅広い培養技術開発が不可欠である。
このような技術開発の方策として、微量栄養素として塩類の添加が不飽和脂肪酸生産性や菌形態に及ぼす影響が検討されており、中でもカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸の各イオンについては、添加効果に関して種々の報告が成されている（国際出願ＷＯ９６／２１０３７、特開平８−２１４８９３、Appl.Microbiol.Biotechnol.,vol.39,p.450（1993）、Biotechnology Lett.,vol.12,no.6,p.455（1990）、油化学,vol.37,no.3,p.241（1989）、油化学,vol.42,no.11,p.893（1993））。しかし、一方でこれら主なイオンを全て栄養補給という概念を上回る０．５ｍＭ以上の濃度で添加して、より積極的な不飽和脂肪酸生産性向上効果を求めた検討を行ない、なおかつ添加イオンバランスが及ぼす菌形態や脂質組成への影響までも検討した報告は成されておらず、イオン添加法の最適化が望まれるところである。
発明の開示
従って本発明は、モルティエレラ属に属する微生物の発酵法による不飽和肪酸含有油脂の製造方法であって、培地に塩類を添加することによって、不飽和脂肪酸生産性、具体的には菌の増殖、不飽和脂肪酸の蓄積、総脂質の蓄積の全てを向上をさせ経済的かつ安定的に不飽和脂肪酸含有油脂を提供しようとするものである。また本発明は例えば不飽和脂肪酸が高収率で得られるなどの利点を有し、かつ安価な微生物培養用培地を提供しようとするものである。
本発明者等は、上記課題を解決するために培地への塩類添加効果について、不飽和脂肪酸収率のみならず、菌形態、脂質組成変化に関して総合的に検討した結果、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸の全イオンを所定の濃度でかつバランス良く添加することが極めて有効であることを見出し本発明を完成した。
従って本発明は、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンが、それぞれ５〜６０ｍＭ、５〜６０ｍＭ、２〜５０ｍＭ、０．５〜９ｍＭ、０．５〜１２ｍＭの範囲にあることを特徴とする微生物培養用培地、並びに当該培地中での糸状菌、特にモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物の培養による、生産性の向上した不飽和脂肪酸またはこれを包含する脂質の製造方法を提供する。
本発明において、不飽和脂肪酸とは炭素数が１６以上でかつ二重結合が１個以上の脂肪酸をいい、またこの中で炭素数が１８以上でかつ二重結合が２個以上の脂肪酸を一般に高度不飽和脂肪酸といい、例えばγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ミード酸、６、９−オクタデカジエン酸、８、１１−エイコサジエン酸等を挙げる事ができる。
発明を実施するための形態
本発明の微生物培養用培地は、培地中のリン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンが、それぞれ５〜６０ｍＭ、５〜６０ｍＭ、２〜５０ｍＭ、０．５〜９ｍＭ、０．５〜１２ｍＭの範囲、好ましくはそれぞれ１０〜４５ｍＭ、１０〜４５ｍＭ、５〜４０ｍＭ、１〜６ｍＭ、１〜９ｍＭの範囲にあり、微生物、例えば、糸状菌を培養する際に用いることができる。
本発明の培地を用いることによって、不飽和脂肪酸生産能を有するモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物の場合、その培養物から不飽和脂肪酸を高収率で得ることが可能となる。なお本発明の培地は、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオン以外の成分（例えば炭素源、窒素源、微量栄養源等）を、使用する微生物に応じて適宜配合することができる。
本発明において、不飽和脂肪酸含有油脂を製造する際使用する微生物は、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物であればすべて使用することができる。このような微生物としては、例えばMYCOTAXON,Vol.XLIV,No.2,pp.257-265（1992）に記載されている菌株を使用することができ、具体的にはモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物や、モルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物を挙げることができる。
これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）、及び米国American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、及びオランダCentraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手することができる。また、本発明者らが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を使用することもできる。これらタイプカルチャーに属する菌株、あるいは自然界から分離した菌株はそのまま用いる事ができるが、増殖及び／又は単離を１回以上行なう事によって得られる元の菌株とは性質の異なる自然変異株を用いる事もできる。
また本発明に用いる微生物は、モルティエレラ属に属する微生物（野生株）の変異株又は組み換え株、即ち同じ基質を用いて培養した時に、元の野生株が産生する量と比べて、油脂中の特定の及び／又は全部の不飽和脂肪酸含量が多くなるように、又は総油脂量が多くなるように、あるいはその両方を意図して設計されたものが含まれる。例えば、特定の不飽和脂肪酸含量が多くなるように設計された変異株として、Δ１２不飽和化活性の欠失したモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研条寄第３５９０号、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５９０）や、Δ５不飽和化活性の欠失したモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工研条寄第３５８９号、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５８９）を挙げる事ができる。
さらに費用効率の優れた基質を効率良く用いて、対応する野生株と同量の不飽和脂肪酸を産生するように設計された微生物も含まれる。
上記モルティエレラ属に属する微生物は、培地中のリン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの濃度を所定の範囲に調製すること以外は、常法に従って培養することができる。例えば、上記菌株の胞子、菌糸又は予め培養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、クエン酸、コーンスターチ等の一般に使用されているものが何れも使用できるが、特にグルコース、マルトース、フラクトース、コーンスターチ、グリセロール、クエン酸が好ましい。
窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー尿素等の有機窒素源、並びに硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いる事ができるが、特に大豆から得られる窒素源を単独または複数で、あるいは前記窒素源と組み合わせて用いることにより、より好ましい塩類添加の相乗効果が得られる。大豆から得られる窒素源としては、水分を除く成分当りの窒素含量が２％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上である事が望ましい。
また、大豆から得られる窒素源としては、脱脂大豆又はこれに熱処理；酸処理；アルカリ処理；酵素処理；化学修飾；又は該処理を含む化学的及び／又は物理的処理による変性及び／又は再生；水及び／又は有機溶媒を用いた一部成分の除去；濾過及び／又は遠心分離による一部成分の除去；凍結；粉砕；乾燥；及び／又は篩い分け等の加工を施したもの、あるいは未脱脂大豆に同様の加工を施したものを単独であるいは複数組み合わせて使用することができ、一般的なものとしては大豆、脱脂大豆、大豆フレーク、食用大豆タンパク、おから、豆乳、きな粉等が挙げられるが、特に、脱脂大豆に熱変性を施したもの、より好ましくは脱脂大豆を約７０〜９０℃で熱処理しさらにエタノール可溶成分を除去したものが好ましい。
この他必要に応じて、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン以外に、鉄、銅、亜鉛、マンガン、ニッケル、コバルト等の金属イオンやビタミン等を微量栄養源として使用できる。不飽和脂肪酸の収率を増加せしめるために、不飽和脂肪酸の前駆体として、例えば、ヘキサデカン若しくはオクタデカンのごとき炭化水素；オレイン酸若しくはリノール酸のごとき脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸エステル、例えばエチルエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル；又はオリーブ油、大豆油、なたね油、綿実油若しくはヤシ油のごとき油脂類を単独で、又は組み合わせて使用できる。基質の添加量は培地に対して０．００１〜１０％、好ましくは０．５〜１０％である。またこれらの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。
本発明において培地中のリン酸イオンは５〜６０ｍＭ、カリウムイオンは５〜６０ｍＭ、ナトリウムイオンは２〜５０ｍＭ、マグネシウムイオンは０．５〜９ｍＭ、カルシウムイオンは０．５〜１２ｍＭの範囲とし、好ましくは培地中のリン酸イオンは１０〜４５ｍＭ、カリウムイオンは１０〜４５ｍＭ、ナトリウムイオンは５〜４０ｍＭ、マグネシウムイオンは１〜６ｍＭ、カルシウムイオンは１〜９ｍＭの範囲とする。
これらイオンの調製は、リン酸イオンは、例えば、リン酸一水素二カリウム、リン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二ナトリウム及び／又はリン酸二水素一ナトリウム等の塩類、またカリウムイオンは、例えばリン酸一水素二カリウム、リン酸二水素一カリウム及び／又は塩化カリウム等の塩類、ナトリウムイオンは、例えばリン酸一水素二ナトリウム、リン酸二水素一ナトリウム、塩化ナトリウム及び／又は硫酸ナトリウム等の塩類、マグネシウムイオンは、例えば塩化マグネシウム及び／又は硫酸マグネシウム等の塩類、カルシウムイオンは、例えば塩化カルシウム及び／又は炭酸カルシウム等の塩類を培地に添加することにより行うことができるが、これに限られるものではなく菌の生育を阻害しない物であれば特に制限しない。
なおこれらの塩類は水和物又は無水物のいずれであってもよい。また前記の塩類は、本発明のイオン濃度の範囲内となるよう適宜、組合せて使用される。例えば、リン酸二水素一カリウム（KH2PO4）、無水硫酸ナトリウム（Na2SO4）、塩化マグネシウム六水和物（MgCl2・6H2O）及び塩化カルシウム二水和物（CaCl2・2H2O）の４種類を配合して所定量添加することにより、本発明のイオンを所定濃度に調製することができる。
本発明ではこのような塩類添加により、不飽和脂肪酸収率が大幅に増大する。さらに、液体培養における菌形態への影響は、塩類以外の培地成分及び使用する菌株の影響があるため一概には特定し得ないが、例えばリン酸添加量増加に伴ってパルプ形態の菌の割合が増え、ナトリウム、カルシウム、又はマグネシウム添加量増加に伴ってペレット形態の菌の割合が増える。パルプ状での増殖は、培養液粘度を上昇させ、流動性、溶存酸素濃度低下の原因となり収率低下を引き起こす。
一方ペレット状での増殖は粘度上昇が起こりにくく流動性は高いが、ペレット壁が酸素移動の律速となり収率低下を引き起こす。しかし、該イオンを所定濃度でかつバランス良く添加することによって過度のパルプ化、及び過度のペレット化が抑えられ、パルプとペレットの混合状態が維持されることを我々は発見した。この技術によって菌形態の制御が容易になり、非常に高い収率を得る事が可能となる。
上記のようにして得られた不飽和脂肪酸含有脂質は、その大部分がトリグリセリドであるが、培地へのリン酸添加量増加に伴ってリン脂質の割合が増加する。しかし、リン酸以外に、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンを全てバランス良く添加する事によって、菌体脂質中トリグリセリドの割合を９０％以上に維持する事ができることを我々は発見した。目的脂質がトリグリセリドの場合、添加塩類を本発明範囲でバランスさせることによって高回収率を維持することができる。
上記の炭素源、窒素源、その他の培地成分は培養開始前の培地及び／又は培養中の培養液に添加することができる。これらの培地成分は一度に添加することもでき、又は連続的に、若しくは複数回に分けて経時的に添加することもできる。これらの培地成分は各々単独で、又は予め混合して殺菌、添加することができ、その殺菌方法、添加順序は特に制限しない。好ましくは、炭素源と窒素源は別々に殺菌するのが望ましく、塩類は対数増殖終了までに、より好ましくは対数増殖中期より前に添加するのが望ましい。リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン濃度に影響を与えない他の培地成分は菌の生育を阻害しない濃度であれば特に制限しない。
実用上、一般に炭素源の総添加量は０．１〜４０重量％、好ましくは１〜２５重量％、窒素源の総添加量は０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の濃度とするのが望ましく、より好ましくは初発の炭素源添加量を１〜５重量％、初発の窒素源添加量を０．１〜６重量％として、培養途中で炭素源及び窒素源を、さらにより好ましくは炭素源のみを流加して培養する。培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃とし、また２０〜３０℃にて菌体を増殖せしめた後５〜２０℃にて培養を続けて不飽和脂肪酸を生産せしめることもできる。
培地ｐＨは４〜１０、好ましくは５〜８として通気撹拌培養、振とう培養、又は静置培養を行う。培養は通常２〜２０日間行う。このように培養して、菌体内に不飽和脂肪酸を含有する脂質が生成蓄積される。不飽和脂肪酸の製造においては、液体培地による通気撹拌培養が好ましい。
目的とする脂質は、培養によって脂質を製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、または培養終了後の培養液若しくはその殺菌した培養液、またはそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物から、常法に従って得る事ができる。培養菌体から、例えば次の方法により目的とする脂質の採取を行う。
培養終了後、培養液より遠心分離及び／又は濾過等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。培養菌体は好ましくは、水洗、破砕、乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、またメタノールと石油エーテルの交互抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができ、好ましくはヘキサンを用いて抽出する。
抽出物から減圧下で有機溶剤を留去することにより、高濃度の不飽和脂肪酸含有脂質を得ることができる。また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うことができる。この場合にはメタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他の溶媒とからなる水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。培養物から採取した不飽和脂肪酸含有脂質から不飽和脂肪酸含有トリグリセリドを分離精製するには、常法により、溶媒抽出、脱溶媒の後、脱酸、脱色、脱臭、脱ガム処理、あるいは冷却分離などにより行なう事ができる。
実施例
次に、実施例によりこの発明を具体的に説明する。
実施例１．
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）CBS754.68を用いた。グルコース２％、大豆油０．１％及び表１の組成の窒素源、塩類成分を含む培地５Ｌを４種類、１０Ｌ培養槽に調製し、初発ｐＨを６．０に調製した。前培養液５０ｍＬを接種し、温度28℃、通気量１．０vvm、撹拌３００rpmで８日間の通気撹拌培養を行なった。グルコース濃度を４日目までは流加法によって１〜２％に、それ以降は０．５〜１％に維持した。
培養の結果、酵母エキス培地に５種類のイオン全てを添加するとアラキドン酸生成量が１．３５倍に、大豆タンパク培地に添加すると１．６８倍に増大し塩類添加の有効性が確認された。リン酸水素カリウムのみ添加した場合は、アラキドン酸生成量増加は認められなかった。
アラキドン酸生成量に加えて、得られた菌体よりヘキサンで脂質を抽出した後、分離条件（ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝４２：２８：０．３）でＴＬＣ法で脂質組成毎に分画し、各組成含量をＴＬＣ／ＦＩＤアナライザー（ヤトロン社製イアトロスキャン）で定量した。
その結果、リン酸水素カリウムのみの添加によって、ヘキサンで抽出された菌体脂質中のリン脂質の割合が増えること、一方、リン酸水素カリウムを含む４種類の塩類を全て添加することによって、塩類無添加の場合と同等の脂質組成が得られることが判り、目的生産物がトリグリセリドの場合は、全イオンをバランス良く添加することによってトリグリセリド含量の高い脂質が得られることを確認した。
0004197744.tif 000002
実施例２．
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）CBS754.68を用いた。グルコース２％、きな粉１．５％、大豆油０．１％及び表２の組成の塩類成分を含む培地２５Ｌを４種類、５０Ｌ培養槽に調製し、初発ｐＨを６．２に調製した。前培養液５０mLを接種し、温度２８℃、通気量１．０vvm、撹拌３００rpm、槽内圧２００kPaの条件で８日間の通気撹拌培養を行なった。グルコース濃度を４日目までは流加法によって１〜２％に、それ以降は０．５〜１％に維持した。
培養の結果、塩類添加によってアラキドン酸生成量が増大し、塩類添加の有効性とより効果的な濃度範囲が確認された。
0004197744.tif 000003
実施例３．
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）CBS754.68を用いた。グルコース２％、脱脂大豆粉１．５％、大豆油０．１％及び表３の組成の塩類成分を含む培地２５Ｌを４種類、５０Ｌ培養槽に調製し、初発ｐＨを６．０に調製した。前培養液５０mLを接種し、温度２８℃、通気量１．０vvm、撹拌３００rpm、槽内圧２００kPaの条件で８日間の通気撹拌培養を行なった。グルコース濃度を４日目までは流加法によって１〜２％に、それ以降は０．５〜１％に維持した。
塩類無添加培地では、菌形態がペレットとパルプの混合状態で増殖し、ペレットの大部分は米粒型で約０．５〜１．５mmであった。リン酸塩のみを加えた培地では、非常に細かいパルプ状に増殖し、培地流動性が大きく低下した。一方、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム塩を加えた培地では菌の殆どが球状で約１〜２mm径のペレットとなり、流動性は高いが菌体当たりの脂質含量が低い結果となった。しかし、４種類の塩の全てを添加した培地では、細かい球状ペレットとパルプの混合培養となり、流動性が損なわれることなく、脂質含量が高い菌体が得られ、その結果、アラキドン酸収率向上が達成された。
0004197744.tif 000004
実施例４．
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941を用いた。グルコース２％、食用大豆タンパク（味の素社製、エスサンプロテインＳＳ）１．５％、なたね油０．１％及び表４の組成成分を添加した６種類（２種類×３菌株）の培地２５Ｌを各々５０Ｌ培養槽に調製し、初発ｐＨを５．８に調製した。温度２４℃、通気量１．０vvm、撹拌２００rpm、槽内圧１．０kg/cm2Gの条件で通気撹拌培養を開始し、７日間培養を行った。流加法によりグルコース濃度を５日目までは１．５％に維持し、その後はグルコースを流加しなかった。培養７日目の終了時にはグルコースが枯渇した。
その結果、塩類添加によるアラキドン酸収率増大が確認された。
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実施例５．
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）CBS754.68を用いた。初発グルコース２％、大豆油０．１％及び培養途中流加も含む表５の組成の窒素源及び塩類成分の培地２５Ｌを６種類、５０Ｌ培養槽に調製し、初発ｐＨを６．０に調製した。前培養液１００mLを接種し、温度２４℃、通気量１．０vvm、撹拌２００rpm、槽内圧２００kPaで８日間の通気撹拌培養を行なった。
グルコース濃度を４日目までは流加法によって１〜２％に、それ以降は０．５〜１％に維持した。窒素源を流加した場合は溶存酸素濃度を維持するために、表５の条件３及び４は撹袢を３００rpmまで、条件５及び６は４００rpmまで上昇させた。
培養の結果、塩類添加によるアラキドン酸生成量が確認された。さらに、栄養源を多量添加して比較的高い濃度で培養を行った場合でも、塩類添加効果が確認された。
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実施例６．
ミード酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナSAM1861（微工研条寄第3590号、FERM BP-3590）を、ジホモ−γ−リノレン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナSAM1860（微工研条寄第3589号、FERM BP-3589）を用いた。初発グルコース２％、大豆タンパク（味の素社製、エスサンミート特等）１．５％、オリブ油０．１％及び表６の組成の塩類成分を含む培地５Ｌを４種類（２種類×２菌株）、１０Ｌ培養槽に調製し、初発pHを６．０に調製した。前培養液１００mlを接種し、温度２８℃、通気量１．０vvm、攪拌３００rpmで８日間の通気攪拌培養を行った。培養温度は２日目に２０℃に下げた。また、グルコース濃度を流加法によって１〜２％に維持した。
その結果、塩類添加によるミード酸及びジホモ−γ−リノレン酸収率増大が確認された。
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実施例７．
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）CBS754.68を用いた。初発グルコース２％、食用大豆タンパク４％、大豆油０．１％、KH2PO4  ０．３％、Na2SO4  ０．１％、MgCl2・6H2O  ０．０５％、CaCl2・2H2O  ０．０５％の培地６０００Ｌを１０ｋＬ培養槽に調製し、初発pHを６．１に調整した。前培養液３０Ｌを接種し、培養温度２６℃、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌３０ｒｐｍ、槽内圧２００ｋＰａで通気撹拌培養を開始した。培養１日目から、溶存酸素濃度を維持するように通気量、回転数を調整しながら培養を続けた。また、１８％のグルコースを培養１日目から５日目にかけて複数回に分けて添加した。
１０日間の通気撹拌培養を行った結果、アラキドン酸生成量は１３ｇ／Ｌであった。
第１３規則の２に規定する寄託された微生物への言及
国際寄託当局
名称：工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日及び寄託番号：
（1）  寄託微生物の名称：モルティエレラ・エロンガタ  SAM0219
寄託日：  1986年３月19日
寄託番号：FERM BP-1239
（2）  寄託微生物の名称：モルティエレラ・アルピナ  SAM186O
寄託日：  1991年９月30日
寄託番号：FERM BP-3589
（3）  寄託微生物の名称：モルティエレラ・アルピナ  SAM1861
寄託日：  1991年９月30日
寄託番号：FERM BP-3590