(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトスポリジウム(Cryptosporidium) のオーシスト外皮表面に露出した生体成分、又は、クリプトスポリジウムのスポロゾイド表皮に露出した生体成分を標的分子とし、前記標的分子に結合しうる抗クリプトスポリジウム・モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体を蛍光物質のＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で修飾した蛍光プローブを被験水に添加して蛍光偏光度を計測し、該蛍光偏光度の変化量から被験水中に含まれるクリプトスポリジウムの濃度を定量することを特徴とするクリプトスポリジウムのオーシスト濃度の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
最近、原虫クリプトスポリジウムや病原性大腸菌Ｏ−１５７などを原因としたの新興もしくは再興の水系感染症の発生が大きな社会問題となっている。これら感染症の集団発生を未然に防止するためには、食品製造プロセスや水処理プロセスにおける原因微生物のモニタリングが必要不可欠である。また、病原微生物を除去して安全な浄水を供給するための新水処理プロセスを開発する場合においても、原因微生物の存否を評価する必要がある。本発明は、迅速かつ簡便な水中の微生物の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
新興の水系感染症の原因微生物として、例えばクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類がある（総説として例えば、保坂三継（１９９８）「水系原虫感染症―原因微生物と流行発生―」、用水と廃水、第４０巻、第２号、１１頁；金子光美（１９９８）「原虫類やその他の病原微生物の検出とその除去技術」、用水と廃水、第１０巻、第４号、３２頁など）。これら原虫類は環境水中においてはオーシストもしくはシストと呼ばれる嚢胞状の殻に包まれた形態で存在しており、クリプトスポリジウムのオーシストやジアルジアのシストが検査の対象となっている。従来の検査法としては、顕微鏡観察法、免疫学的検査法、遺伝子検査法がある。
【０００３】
まず、顕微鏡観察法は、色素もしくは蛍光色素で微生物細胞を染色し、顕微鏡もしくは蛍光顕微鏡によって染色された微生物数を計数する方法であり、微生物の種を問わず、非特異的に細胞を染色するために、形態や大きさの点から他の微生物（酵母や細菌など）との識別は可能であるが、近縁種のオーシストとの識別には熟練を要するため、一般には誤判定を招きやすいとされている。
ついで、免疫学的検査法としては、蛍光抗体染色、フローサイトメーター分析、蛍光分光分析、酵素抗体法、ウェスタン分析等が挙げられる。免疫学的検査法は、対象とする微生物もしくはその生体成分に対して特異的に結合する抗体を用いることによって、検査対象の微生物のみを特異的に検出することが可能であるが、顕微鏡による目視観察、高額なフローサイトメーター分析機器、染色操作が煩雑、多量の微生物を含んだ試料が必要など、操作性や定量性の点で満足のゆく検査方法とはいえない。
【０００４】
さらに、遺伝子検査法としては、サザン分析、ノーザン分析、ＲＣＲ[polymerase chain reaction] 分析、ＲＴ−ＰＣＲ [逆転写ＰＣＲ] 分析等が挙げられる。遺伝子検査法は、着目する遺伝子に十分配慮すれば、検査対象の微生物を特異的に検出することが可能であるが、遺伝子解析に関する専門知識が必要、試験操作が煩雑な上に、存在の有無は判定できても、存在量についての定量的な評価が困難である。
【０００５】
ところで、タンパク質や核酸分子等の生体分子間の結合特性を検出する方法として蛍光偏光度法が知られている（総説として例えば、Checovich, W. J. et al., (1995) Fluorescence polarization: a new tool for cell and molecular biology, Nature, vol.375, p254 ）。この方法は、１９２６年にPerrinによって最初に報告され（Perrin, F. (1926) J. Phys. Rad., vol.1, p390）、最近、再び注目されるようになった。蛍光偏光度法の測定原理は、蛍光分子を懸濁した溶液に、振幅方向が均一な蛍光を入射光として照射すると、蛍光分子の自由運動によって入射光が散乱されあらゆる振幅方向の反射光を生じるが、標的分子との結合等の固定化によって蛍光分子の自由運動が拘束された状態では、入射光に対して特定の振幅面に偏光された反射光が生じるという現象に基づき、偏光の程度（偏光度）を指標として蛍光分子と標的分子との結合状態（結合量や結合強度）を調べることができる。つまり、蛍光分子と結合しうる標的分子が被験水中に存在しなければ、蛍光分子は自由運動状態となり偏光度は微小であるが、蛍光分子と結合する標的分子が被験水中に存在する場合には、蛍光分子と標的分子との結合によって蛍光分子が固定化され運動状態が低減するために偏光度が高くなることから、偏光度の変化を計測することによって被験水中の標的分子の存在量を推定できる。
【０００６】
この蛍光偏光度法の適用例（総説として例えば、Mineno, J. (1997) 蛋白質・核酸・酵素，第４２巻，第１号，７７頁）としては、抗体とその抗原タンパク質の結合測定やタンパク分解酵素とその基質タンパク質分子との反応性測定などのタンパク質分子間の相互作用分析、ＤＮＡハイブリダイゼーションなど核酸分子間の相互作用分析、ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質との結合測定やタンパク質と糖鎖との結合測定など異種分子間の相互作用分析などがある。しかしながら、いずれも単離精製した生体分子に関する事例であり、微生物の細胞のような巨大分子に適用した例は報告がない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来知られている微生物（とりわけクリプトスポリジウム等の原虫類）の検査方法は、前記したように、操作の簡便さや検出精度の点で満足のゆく方法がない。また、蛍光偏光度法については単離精製した生体分子に関する適用例はあるが、微生物の細胞のような巨大分子に適用した例はない。そこで、本発明においては、蛍光偏光度法の原理に基づいた、被験水中の原虫類や病原性細菌など微生物の存否や濃度を簡便かつ迅速に検査する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
従来は単離精製した生体分子についてのみ適用されていた蛍光偏光度法に関して、蛍光プローブの選定、被験水の前処理条件、結合溶媒条件、偏光度測定条件等を最適化することによって、被験水中の微生物や細胞等の生物体を検出・定量することができる。すなわち、本発明は、クリプトスポリジウムのオーシスト外皮表面に露出した生体成分、又は、クリプトスポリジウムのスポロゾイド表皮に露出した生体成分を標的分子とし、前記標的分子に結合しうる抗クリプトスポリジウム・モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体を蛍光物質のＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で修飾した蛍光プローブを被験水に添加して蛍光偏光度を計測し、該蛍光偏光度の変化量から被験水中に含まれるクリプトスポリジウムの濃度を定量することを特徴とするクリプトスポリジウムのオーシスト濃度の検査方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の説明に先立ち、まずは用語を説明する。
・標的分子：検査したい微生物細胞の表面に露出したタンパク質や糖鎖、もしくは、微生物細胞内に存在するタンパク質、核酸、糖質、脂質等の生体成分のうち、検査に用いるプローブが特異的に結合しうる生体成分を意味する。
・プローブ：標的分子と結合しうる化合物。具体的には、抗体、レクチン、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
・蛍光プローブ：フルオレセイン、ＦＩＴＣ[fluorescein isothiocyanate]、ローダミン、テキサスレッド等の蛍光化合物で修飾したプローブ。
本発明は、上下水道分野で特に問題視されている原虫クリプトスポリジウムについて、検査手順の流れに沿って以下に記載する。
【００１０】
（１）標的分子の選定：クリプトスポリジウムは環境水中においては、スポロゾイドと呼ばれる感染性虫体を内包したオーシストの形態で存在しており、標的分子としては、▲１▼オーシスト外皮表面に露出した生体成分、▲２▼スポロゾイド表皮に露出した生体成分、▲３▼オーシストもしくはスポロゾイドの細胞破砕物から抽出した生体成分等が挙げられる。環境水中のクリプトスポリジウムの存在量を検査するためには▲１▼を標的分子として選定すればよいが、感染能力を保持したクリプトスポリジウムの存在量を評価するためには▲２▼を標的分子として選定すればよい。▲３▼の生体成分としては、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、タンパク質、糖質、脂質等が挙げられるが、クリプトスポリジウムを限定的に検出するためには、標的分子の選定に熟慮する必要があり、例えば、クリプトスポリジウムに特徴的な遺伝子の塩基配列を選定すればよい。また、脱嚢時や感染・発症時に特徴的に発現する遺伝子やタンパク質を標的分子として選定すれば、感染能力を保持したクリプトスポリジウムの存在量を評価することができる。これらのうち、検査の容易さを考慮すると、▲１▼ないしは▲２▼が簡便である。
【００１１】
（２）蛍光プローブの選定：前記した標的分子に特異的に結合するプローブとしては、抗体が挙げられる。抗体についてはクリプトスポリジウムのオーシスト外皮を抗原とした抗体が種々市販されており、入手の容易さや特異性の点で好適である。さらに、蛍光偏光度法においては、標的分子に対してできる限り多くの蛍光プローブが結合した方が検出感度が高まる可能性があるため、モノクローナル抗体よりはむしろポリクローナル抗体の方が好適である。
【００１２】
プローブを標識する蛍光化合物は、ＦＩＴＣ[fluorescein isothiocyanate]が挙げられる。プローブへの蛍光化合物の修飾は公知の方法で行うことができる。あるいは、蛍光染色等の他の用途のために市販されている蛍光抗体を用いることもできる。
【００１３】
（３）被験水の調製：被験水中のクリプトスポリジウム・オーシスト濃度が10,000個／Ｌよりも低いことが予想される場合には、遠心分離、ろ過捕集、化学凝集沈殿などの公知の方法によって被験水中のクリプトスポリジウムを濃縮することが望ましい。
スポロゾイドもしくはその抽出物を標的分子として選定した場合には、公知の方法（例えば、Upton,S.J. (1994) ^A simple and reliable method of producing in vitro infection of Cryptosporidium parvum (Apicoplexa)", FEMS Microbiol. Lett, vol.118, p45 ）で被験水を処理して、被験水中のオーシストをあらかじめ脱嚢させ、オーシスト中のスポロゾイドを遊離させればよい。
【００１５】
（４）検査試薬の添加：被験水へ蛍光プローブを添加して、結合反応に供する。被験水へは、結合反応を助長・安定化する目的で種々の化合物（例えば、アルブミン、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコール、エチレンジアミン四酢酸塩、プロテアーゼインヒビター、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ヘペス緩衝液など）を必要に応じて添加してもよい。
【００１６】
（５）結合反応：結合反応の条件は、標的分子とプローブの組合せを考慮して、至適な温度・時間を選定することができる。検査試薬を加えた後に速やかに蛍光偏光度計測を実施してもよいが、室温〜３７℃に加温、もしくは、氷温〜１５℃に冷却して、数分〜数時間反応させた後に蛍光偏光度を計測することで、結合反応を促進・安定化させることができ、所望の標的分子とプローブの組合せに応じて至適な条件を選定することができる。蛍光プローブの添加濃度は、予備検討によって至適化した濃度で添加することができる。核酸を標的分子とし、オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、加熱とそれに続く徐冷によってアニーリングさせることができる。
【００１７】
（６）蛍光偏光度の計測：蛍光偏光度の計測は、市販の蛍光偏光度計を使用することができる。
（７）データ解析：濃度が既知のオーシスト懸濁液を被験水として検量線を作成し、調べたい試料を被験水とした場合の蛍光偏光度の計測値と検量線とを比較することによって試料中のオーシスト濃度を推定することができる。
【００１８】
【実施例】
既知量のクリプトスポリジウム・パルバム・オーシストを含んだ水試料を被験水として、抗クリプトスポリジウム抗体をプローブとして検査した。
クリプトスポリジウム懸濁液をＰＢＳ緩衝液で順次希釈して、１ｍＬあたり０〜１０，０００個の範囲でオーシスト希釈懸濁液を調整した。該希釈懸濁液１ｍＬに対して、ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液［１ｍｇ−ウシ血清アルブミン；ＰＢＳ緩衝液］を０．１ｍＬ添加して、更に、ＦＩＴＣ標識した抗クリプトスポリジウム・モノクローナル抗体（和光純薬）を終濃度１００ｐｇ／ｍＬで添加し、３７℃にて１分間保温した後に蛍光偏光度計（米国ＰａｎＶｅｒａ社  ＢＥＡＣＯＮ（商標））を用いて蛍光偏光度を測定した。
【００１９】
結果を図１に示す。図１では、横軸にクリプトスポリジウム・オーシスト濃度を示し、縦軸に蛍光偏光度をオーシストを含まない被験水の計測値に対する相対値としてプロットした。本図から明らかなように、オーシストの濃度に依存して蛍光偏光度が高まった。
本実施例の結果より、クリプトスポリジウム・オーシスト数が１０，０００個以下の範囲においてその濃度に応じた定量評価が可能であることが明らかである。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、従来法に比べて極めて簡便に水中の微生物量を定量・評価することができる。
本発明は、抗体をプローブとして目的の微生物の存在量を検査できるばかりでなく、微生物細胞もしくはその生体成分に結合可能な蛍光化合物をプローブとして用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】クリプトスポリジウムに関して本願の検査方法を用いて検出した実施例を示す。
【図１】
0004197797.tif 000002