(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合を測定する方法であって、
ｄｓＤＮＡを有する標的を提供する工程と；
前記標的の少なくとも１部分に不完全に相補的なｓｓＤＮＡまたはＲＮＡを有するプローブを提供する工程と；
１，１’‐（４，４，８，８‐テトラメチル‐４，８‐ジアザ‐ウンデカメチレン）‐ビス‐４‐（３‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐（ベンゾ‐１，３‐オキサゾール）‐２‐メチリデン）‐キノリニウムテトラヨーダイドである挿入剤を提供する工程と；
ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を添加して、測定用試料を提供する工程と；
前記挿入剤に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試料を照射する工程と；
前記プローブと前記標的間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光放射線の強度を検出する工程と；
前記強度から、前記プローブと前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と；
前記方法が、ＰＣＲ増幅も前記標的の変性工程も伴わずに実施される均質測定法であることと
から成る方法。
【請求項２】
前記決定工程は、前記標的および前記挿入剤と結合させた他のプローブによって示された強度に対して前記強度を較正することにより遂行され、前記他のプローブの各々は、少なくとも１つの塩基が前記プローブと異なるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的に比べて、前記プローブと前記他のプローブの各々は、完全対合、１塩基誤対合、２塩基誤対合、３塩基誤対合、１塩基欠失、２塩基欠失および３塩基欠失から成る群より選択された異なるメンバーである（前記プローブは前記完全対合でないと仮定する）、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は前記標的上または前記プローブ上にシグナル消光剤を提供せずに行われる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが三本鎖を形成するために前記標的と特異的にハイブリダイズする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブはｓｓＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記励起放射線はアルゴンイオンレーザーから２００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長で放射される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記測定用試料は、１０フェムトモルの標的と１０フェムトモルのプローブを含む２０マイクロリットルの体積を有する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料中の前記標的及びプローブの濃度のうちの少なくとも一方は、多くて５×１０−１０Ｍである、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
結合を測定する方法であって、
ｄｓＤＮＡを有する標的を提供する工程と；
ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡを有するプローブを提供する工程と；
１，１’‐（４，４，８，８‐テトラメチル‐４，８‐ジアザ‐ウンデカメチレン）‐ビス‐４‐（３‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐（ベンゾ‐１，３‐オキサゾール）‐２‐メチリデン）‐キノリニウムテトラヨーダイドである挿入剤を提供する工程と；
ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を添加して、測定用試料を提供する工程と；
前記挿入剤に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試料を照射する工程と；
前記プローブと前記標的間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光放射線の強度を検出する工程と；
前記標的および前記挿入剤と結合させた他のプローブによって示された強度に対して前記強度を較正する工程であって、前記標的に比べて、前記プローブと前記他のプローブの各々は、完全対合、１塩基誤対合、２塩基誤対合、３塩基誤対合、１塩基欠失、２塩基欠失および３塩基欠失から成る群より選択された異なるメンバーである工程と；
前記較正工程から、前記プローブと前記標的間の対合の程度を決定する工程と；
前記方法が、ＰＣＲ増幅も前記標的の変性工程も伴わずに実施される均質測定法であることと
から成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の属する技術分野
本発明は、核酸を配列決定または測定する方法に関し、詳細には、蛍光強度測定値を使用して三本鎖および二本鎖核酸ハイブリッド形成複合体を測定する方法に関する。
【０００２】
２．関連技術の記載
蛍光染料は核酸を検出および定量化するために過去数十年間使用されてきた。蛍光染料の最も基本的な形式において、蛍光強度に基づく測定は、通常、蛍光発色団を含むプローブと標的分子を接触させ、結合プローブから非結合プローブを除去し、洗浄した試料の蛍光を検出することから成る。均質測定法は、洗浄ステップや非液相支持体の設置を必要としない点で、そのような基本的測定法を改善している。
【０００３】
例えば、Ｌｉｖａｋらに付与された米国特許第５，５３８，８４８号およびＭａｇｇｉｏに付与された第４，２２０，４５０号は、溶液中でオリゴヌクレオチドプローブを使用した、ヌクレオチド配列の均質蛍光に基づく測定法を開示している。しかしながら、これらの特許では、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていないプローブによって生成される信号を区別するために、消光剤をリポーター剤と組み合わせて使用することが必要である。Ｌｉｖａｋらは、開示した方法において、酵素の使用も必要としている。消光剤と酵素によって、開示した方法に複雑さと費用が増している。
【０００４】
Ｋｉｄｗｅｌｌに付与された米国特許第５，３３２，６５９号は、少なくとも２つの蛍光発色団部分を有するプローブを使用して、溶液中のヌクレオチド配列を検出する方法を開示している。蛍光発色団は、自身のスペクトルの波長依存性を変えるのに十分なほど接近している時に互いに電子的に相互作用するように、選択されなければならない。ハイブリダイズしていないプローブは標的配列にハイブリダイズしたプローブよりもはるかに柔軟性がある。従って、各プローブ上の２つの蛍光発色団部分は、プローブがハイブリダイズしている時よりもプローブがハイブリダイズしていない時に、互いに接近する可能性が高い。したがって、自由プローブに関連する放射波長の変化を、試料中の自由プローブの量の指標としてモニタすることが可能である。
【０００５】
Ｗｕらに付与された米国特許第５，８４６，７２９号も、核酸ハイブリッド形成のための均質蛍光に基づく測定法を開示している。
測定法の中には、ハイブリダイゼーション複合体中の核酸の鎖間への蛍光発色団の結合能に基いて、核酸ハイブリッド形成を検出するインターカレータ（挿入剤）蛍光発色団を使用しているものもある。
【０００６】
例えばＢｕｒｋｅらに付与された米国特許第５，８２４，５５７号は、核酸分子を検出し定量化する方法およびキットを開示している。好ましい実施形態は、二本鎖核酸ヘリックスあるいは一本鎖核酸に染料を挿入することに依存している。染料は挿入後に蛍光を発するが、その強度は試料中に存在する核酸の量の直接測定値である。Ｂｕｒｋｅらの方法は、試料中の核酸の量を測定するのに役立つと伝えられているが、該方法の基礎となっている挿入剤と核酸間の非特異的結合は、該方法を（特に標的でない核酸二本鎖が存在する条件下での）特異的結合の検出に対して非実用的なものとしている。
【０００７】
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらに付与された米国特許第５，８１４，４４７号は、Ｂｕｒｋｅらの測定法のような挿入剤と核酸二本鎖間の非特異的相互作用に基づく測定法や、Ｉｓｈｉｇｕｒｏらによって日本国特許公報第２３７０００号（１９９３年）に記述された以前の測定法よりも優れた改良を与える測定法を開示している。初期の開発は、標的核酸の特定領域がＰＣＲによって増幅する前に試料溶液に挿入された時に蛍光強度の増大を示す傾向を有する挿入剤蛍光色素を添加することと、増幅前に標的核酸を検出かつ定量化するために反応溶液からの蛍光強度を所定の時間間隔で測定することから成っていた。’４４７特許は、プローブが挿入剤蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであり、該挿入剤蛍光色素は、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ間の相補的結合部分に挿入されることを特徴とする、改良された特異性を有する測定法を与えることにより、以前の開発より優れた改良を行うことを試みた。
【０００８】
蛍光強度を検出する上述の開発に加えて、ある者は、蛍光偏光測定法の利点を推薦した。しかしながら、偏光に基づく測定法には重大な欠点がある。結合の関数としての偏光の変化の程度は予測不能であることがあり、一貫しないデータを理論期待値に一致させるデータの解釈では、特に該方法が自動化される場合、分析法で望まれる努力よりも多くの努力が要求され得る。
【０００９】
以上の開発にもかかわらず、核酸および／または核酸類似体の間の相互作用を分析するための、単純で、感度が非常に高く、有効で、迅速な方法が当該技術分野では依然として必要とされている。
【００１０】
本明細書に引用した参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
（発明の概要）
本発明は、
少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と；
前記標的の少なくとも１部分に対して不完全に相補的な核酸または核酸の類似体配列を有するプローブを提供する工程と；
挿入剤を提供する工程であって、前記プローブか前記挿入剤のいずれかが蛍光発色団を有する工程と；
ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を加えて、測定用試料を提供する工程と；
前記蛍光発色団に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試料を照射する工程と；
前記プローブおよび前記標的の間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光性の放射線の強度を検出する工程と；
前記強度から前記プローブおよび前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と；から成る、結合を測定する方法を提供する。
【００１１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、標的とプローブ間の結合を測定する、迅速で、感度が高く、環境にやさしくて、安全な方法を提供する。標的は核酸配列または核酸類似体配列を有し、プローブは核酸配列または核酸類似体配列を有する。
【００１２】
特定の先行技術と異なり、本発明はハイブリダイゼーションの存在を検出するだけでなく、プローブと標的間のハイブリダイゼーションの性質に関する定性的・定量的情報を提供する。従って、従事者は、完全対合、１つの塩基対誤対合、２つの塩基対誤対合、３つの塩基対誤対合、１つの塩基対欠失、２つの塩基対欠失および３つの塩基対欠失を、本発明によって区別することができる。
【００１３】
本発明の実施形態は、第１のプローブ標的混合物について測定した蛍光強度を、同じ標的および同じ挿入剤と結合した他のプローブによって示された強度に対して較正することから成る。ここで、他のプローブの各々は、少なくとも１つの塩基だけ、第１のプローブと異なっている。本発明の方法で検出される蛍光強度は、プローブと標的間の結合親和性が増すにつれて増大する。本発明の方法は、蛍光異方性の方法とは異なり、蛍光の偏光の測定を必要としない。
【００１４】
強度が標的とプローブ間の結合親和性の関数である検量線を生成することが可能である。標的と複数の異なるプローブ間の結合親和性は、誤対合塩基の数、誤対合の性質（Ａ−Ｇ対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、ハイブリダイゼーション複合体の内部の誤対合の位置等と共に変化するために、本発明の測定方法を、標的の配列決定を行うために使用することが可能である。
【００１５】
本発明はプローブと標的間の結合親和性の定量化を可能にする。そのような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬を設計することを含めた様々な用途に有用であり得る。
【００１６】
先行技術の方法と異なり、本発明の測定法は好ましくは均質である。測定は、蛍光強度検出に先立って自由プローブおよび標的からプローブ標的複合体を分離せずに行うことが可能である。測定はゲル分離ステップを必要としないため、試験のスループットの大きな増加を可能にする。定量分析は単純かつ正確である。さらに、測定は、均質な溶液で好ましくは行われ、これは非結合プローブから、ろ過と多数回の洗浄ステップまたはゲル電気泳動により結合複合体を分離する必要をなくす。従って、結合測定法は、多くの時間と費用を節約し、容易に自動化できる。さらに、結合測定法は、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベーション時間、プローブ配列と標的配列の相対濃度、挿入剤濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、および考えられる補因子の必要条件のような結合変数を、速やかに決定することを可能である。
【００１７】
さらに、本発明の測定法は、標的上のまたはプローブ上にシグナル消光剤を提供せずに、好ましくは行われる。
本発明の好ましい実施形態は、特にプローブと二本鎖標的間の三本鎖ハイブリダイゼーションを検出し、標的を変性する必要性をなくす。ＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブは、特定のクラスの標的と共に三本鎖を形成することが知られているが（例えばＥｇｈｏｌｍら、３６５  Ｎａｔｕｒｅ  ５６６  （１９９３）、Ｔｏｍａｃら、１１８  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ５５４４（１９９６）参照）、本願発明者は該ＰＮＡプローブが一本鎖核酸（例えばｓｓＤＮＡおよびＲＮＡ）プローブと二本鎖核酸（例えばｄｓＤＮＡ）標的との間に形成された三本鎖を特に測定できることに驚いた。
【００１８】
本発明の測定法に使用される適切なプローブには、例えばｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、荷電していないバックボーンを有する他の核酸類似体が含まれる。８個から２０個までの塩基の長さを有するプローブ配列が好まれる。なぜならそれが、原始核生物および真核生物のうちの最小の固有ＤＮＡ配列が見出される範囲だからである。１２〜１８個の塩基から成るプローブは、ヒトゲノムにおける最小の固有配列の長さであるので、特に好ましい。ある実施形態では、６〜３０塩基から成るプローブが好まれ、１５塩基が最も好まれる。しかしながら、ヌクレオチド配列を固有に識別するために結合する複数の非固有の標的配列を有するヌクレオチド配列を検出するためには、複数のより短いプローブを使用してもよい。
【００１９】
本発明は、危険で、労力を要し、かつ使用に時間がかかる放射性のプローブの使用を必要とせず、常に再生される必要はない。本発明のプローブは、好ましくは、安全に使用でき、何年も安定している。従って、プローブを多量に作成または注文し、保存することが可能である。
【００２０】
本願発明者は、平行ＰＮＡプローブが従来通りに合成された逆平行ＰＮＡプローブよりも優れた性能を有することを発見したことにも驚いた。核酸標的配列の長さがＰＮＡプローブの３倍を超える場合、平行・逆平行ＰＮＡプローブは、完全対合の核酸ハイブリッド形成複合体と、１塩基対、２塩基対または３塩基対誤対合を含む核酸ハイブリッド形成複合体とを区別するのに等しく有効であった。しかしながら、標的ＤＮＡ配列の長さがＰＮＡプローブ配列の長さと同じだった場合（つまり１５ヌクレオチド長）、完全対合複合体と１または２塩基誤対合複合体との間に観察された蛍光強度の差がより大きいが故に、平行ＰＮＡプローブが逆平行ＰＮＡプローブよりもずっと好まれた。
【００２１】
そのような条件下で平行ＰＮＡプローブが好まれる正確なメカニズムはわかっていないが、上記の観察は、誤対合平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション複合体は、類似の誤対合逆平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドほど安定しておらず、そのため核酸挿入剤の挿入が少なく、観察される蛍光強度の値がより低いことを示唆している。
【００２２】
プローブと標的は共に標識されていないことが好ましい。しかし、代替実施形態では、プローブに挿入剤が共有結合により結び付けられる。そのような実施形態では、挿入剤は、プローブのいずれかの端部に好ましくは結び付けられる。
【００２３】
別の実施形態では、挿入剤はプローブに共有結合によっては結び付けられないが、非共有結合の様式でプローブに結合するという意味で、挿入剤を測定中にプローブと標的の間に挿入することができる。
【００２４】
本発明で使用される好ましい挿入剤としては、例えばＹＯＹＯ−１（登録商標、一般名：１，１’‐（４，４，８，８‐テトラメチル‐４，８‐ジアザウンデカメチレン）‐ビス‐４‐［３‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐（ベンゾ‐１，３‐オキサゾール）‐２‐メチリデン）‐キノリニウムテトラヨーダイド］、ＴＯＴＯ−１（登録商標、一般名：１，１’‐（４，４，８，８‐テトラメチル‐４，８‐ジアザウンデカメチレン）‐ビス‐４‐［３‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐（ベンゾ‐１，３‐チアゾール）‐２‐メチリデン）‐キノリニウムテトラヨーダイド］、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２、およびアクリジンが含まれる。一般に、挿入剤は、二本鎖および／または三本鎖の核酸複合体の鎖の間に挿入可能な部分である。好ましい実施形態では、挿入剤（またはその構成要素）は、核酸がない状態では本質的に非蛍光性であり、適切な波長の放射線によって挿入および励起された時には蛍光を発し、二本鎖または三本鎖の核酸複合体に挿入された時には１００倍〜１０，０００倍の蛍光の増強を示す。
【００２５】
代替実施形態では、挿入剤は、適切な波長の放射線により挿入および励起された時に、蛍光波長の変化を示し得る。正確な蛍光波長は、挿入される核酸の構造に依存し得る（例えば、ＤＮＡ対ＲＮＡ、二本鎖対三本鎖等）。
【００２６】
励起波長は、使用されている蛍光発色団の励起最大値に対応させるために、（日常的な実験および／または慣習的な知識によって）選択され、好ましくは２００〜１０００ｎｍである。挿入剤は２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するように好ましくは選択される。好ましい実施形態では、４００〜５４０ｎｍの波長を有する光で蛍光発色団を照射するためには、アルゴンイオンレーザーが使用され、蛍光の放出は５００〜７５０ｎｍの範囲で検出される。
【００２７】
本発明の測定法は、例えば５〜８５℃のような種々の温度にわたって行うことが可能である。ある先行技術の測定法では、高い温度が必要とされるため、測定のコストと遅れを増すこととなっている。他方、本発明は室温またはそれより低い温度（例えば２５℃未満の温度）で行うことが可能である。
【００２８】
本発明の信頼性は、前記標的中のグアニン・シトシン含量には依存しない。Ａ−Ｔ塩基対が２つの水素結合しか形成しない一方でＧ−Ｃ塩基対は３つの水素結合を形成するため、より高いＧまたはＣ含量を有する標的配列およびプローブ配列は、より高い溶融温度を有し、より安定している。従って、完全に対合したハイブリッド中に存在するＧＣ含量よりも、ハイブリダイズしたプローブおよび標的領域のＧＣ含量を増加させる塩基対誤対合は、誤対合プローブに付随する結合の弱さを相殺し得る。プローブと標的間の考えられるすべての塩基対誤対合を含むハイブリダイゼーション複合体は、完全に対合したハイブリッドよりも不安定であることが分かっており、その結果、常に、完全に相補的なハイブリッドよりも蛍光強度が低い。
【００２９】
本発明の測定法は非常に感度が高く、そのため、標的のＰＣＲ増幅を行う必要性がない。例えば、体積が約２０μｌの測定用試料（約１０フェムトモルの標的と約１０フェムトモルのプローブを含む）を測定することが可能である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃度の標的を測定するのに十分な程度に感度が高い。本発明の実施形態は５Ｘ１０−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃度のプローブを使用するように十分な程度に感度が高い。上記の値が、該方法がそれより高い濃度を検出できないことを示唆する意味ではないことは言うまでもない。
【００３０】
ハイブリダイゼーション媒質はヌクレオチドを保存するのに適していることで知られている任意の従来の媒質であってよい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，”第２巻（１９８９年）を参照されたい。例えば、液体媒質には、ヌクレオチド、水、緩衝液および標準塩濃縮液が含まれ得る。
【００３１】
相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度および緩衝液組成を変化させた、種々の条件下で起こる。そのような条件と、該条件を適用する方法は、当該技術分野で周知である。
【００３２】
約１５℃〜約２５℃の温度、約１分〜約５分間で、ハイブリダイゼーション複合体を形成することが好まれる。それより長い反応時間は必要でないが、数時間インキュベーションしたとしてもハイブリダイゼーション複合体には悪影響を及ぼさないだろう。
【００３３】
適切な蛍光挿入剤が反応混合物に含まれていると仮定すれば（先に論じたように）、ほとんどの場合では、他の促進試薬は要求されない。しかしながら、ある試薬の使用によって、溶液でのハイブリダイゼーションを促進することは可能である。そのような試薬の好ましい例としては、Ｒｅｃ  Ａタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合タンパク質、核酸主溝または核酸小溝結合タンパク質；二価イオン；多価イオン；ビオロゲン；ならびに臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシン等の挿入物質が含まれる。そのような促進試薬は、例えば異常なｐＨレベルや極端な高温下での、極端な操作条件において有用であることが判明し得る。
【００３４】
本発明の測定法は、例えば、折り畳まれたヌクレオチド配列中のアクセス可能な領域を同定したり、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合塩基対の数を決定したり、ゲノム地図を作成したりするために使用可能である。
【００３５】
本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことを理解すべきである。
本発明を、同様な参照数字が同様な要素のことを指す以下の図面に関連付けて説明する。
【００３６】
（実施例）
実施例１
ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０由来のセンスとアンチセンス５０ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ標的配列（Ｎａｔｕｒｅ  ３８０  ２０７（１９９６年））を、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モルの量の相補的オリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわたって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、１  ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００３７】
野生型標的ＤＮＡのセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号１）：５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００３８】
野生型標的ＤＮＡのアンチセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号１）：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’。
【００３９】
５０ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０７位置の野生型配列ＣＡＴがＣＧＴに変化する１つの塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１と同じになるように調製した。
【００４０】
この５０ｍｅｒ標的配列のセンス鎖は、以下の配列を有していた（配列番号２）：５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００４１】
この５０ｍｅｒ標的配列のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた（配列番号２）：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’。
【００４２】
５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０６，５０７位置の野生型配列ＣＡＴがＡＣＴに変化する連続する２つの塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
【００４３】
この標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号３）；５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００４４】
この標的配列のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号３）：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’。
【００４５】
５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０６，５０７位置の野生型配列ＣＡＴがＡＣＧに変化する連続する３つの塩基対変化（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
【００４６】
この標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号４）：５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００４７】
この標的配列のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた（配列番号４）：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’
【００４８】
４７ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０７，５０８位置での野生型配列ＣＴＴが欠失する連続する３つ塩基対欠失（省略記号で示した）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
【００４９】
この４７ｍｅｒ標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号５）：５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ・・・ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００５０】
この４７ｍｅｒ標的配列のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号５）：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡ・・・Ａ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’。
【００５１】
実施例で使用するＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブを合成し、ＨＰＬＣで精製し、Ｃｏｍｍｏｎｗｅｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国バージニア州リッチモンド所在）の質量分析法により確認した。ＰＮＡプローブは、最初、１０ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）に溶解し、次に、ｄｄＨ２Ｏの追加により１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。最終ＰＮＡ溶液は１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度（ｄｄＨ２Ｏ溶液）に調製した。
【００５２】
第１番プローブは、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるよう設計された１５ｍｅｒ逆平行ＰＮＡプローブだった。第１番プローブは、アミノ酸５０５〜５１０位置（Ｎａｔｕｒｅ  ３８０、２０７（１９９６年）がオーバラップしている。第１番プローブは以下の構造（配列番号６）を有していた：５’−Ｈ−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
【００５３】
第２番プローブは、第１番プローブと配列が同じ１５ｍｅｒＰＮＡプローブであったが、逆平行方向の配置ではなく、平行方向の配置であった。第２番プローブは以下の構造（配列番号７）を有していた：５’−Ｈ−ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＣＡＣ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
【００５４】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は下記を含有していた：４ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅｓのＰＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥ、および５００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン所在）。反応混合物は変性するために５〜１０分間、９５℃でインキュベートし、次に、測定まで８０℃に維持した。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、温度が経時的に減少するにつれ、蛍光放出について繰り返しモニタした。同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プローブにより達成された。最大蛍光強度は５４０ｎｍの波長で生じたが、これはＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへＹＯＹＯ−１が挿入されたことを示している。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【００５５】
ＤＮＡまたはＰＮＡが存在しない時（ＹＯＹＯ−１のみ）、または野生型配列番号１、変異型配列番号２もしくは変異型配列番号３が第１番の逆平行ＰＮＡプローブの番号１または第２番の平行ＰＮＡプローブと反応した時に観察される蛍光強度を図１Ａ，１Ｂにそれぞれ示す。完全に相補的な配列（配列番号１＋第１番のプローブ）から成るＳＳＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、最大のＹＯＹＯ−１挿入を許容し、これにより最も高い蛍光強度が生じた。この蛍光強度は、温度の減少とともに増加した（図１Ａ）。１つの塩基対が誤対合したｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号２＋第１番プローブ）および２塩基対が誤対合したｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号３＋第１番プローブ）の蛍光強度は、６０℃では完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドよりもそれぞれ８１％および８９％だけ低かった（図１Ａ）。同様に、第２番の平行ＰＮＡプローブを標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズした場合には、１塩基対および２塩基対誤対合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、６０℃では完全に相補的なｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号１＋第２番プローブ）よりもそれぞれ７０％および８６％だけ低い蛍光強度を示した（図１Ｂ）。プローブと標的間の誤対合の程度が増加するにつれて、ＹＯＹＯ−１による挿入のレベルは減少した。従って、蛍光強度のレベルは減少した。使用されたプローブが逆平行であったか平行であったかに関係なく、この関係は保持された。
【００５６】
興味深いことに、標的ＤＮＡ配列がＰＮＡプローブ配列と同じ長さだった時（つまり１５ヌクレオチド長の時）は、完全対合複合体と１または２塩基対誤対合複合体との間に観察される蛍光強度の差がより大きくなるために、平行ＰＮＡプローブが逆平行ＰＥＡプローブよりもずっと好まれた（データは図示しない）。
【００５７】
平行ＰＮＡプローブがそのような条件下で好まれる正確なメカニズムはわかっていないが、以上の観察は、誤対合平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション複合体は類似の誤対合逆平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドほど安定でなく、核酸挿入剤の挿入が減少し、それ故により低い蛍光強度が観察されることを示唆している。
【００５８】
（実施例２）
図２は、本発明のハイブリダイゼーション測定法により、平行ＰＮＡプローブを使用した場合に、完全対合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドと、１，２，３ｂｐ誤対合および３ｂｐ欠失を含むｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドとを区別することができることを実証する。測定条件は、実施例１に記述したのと同じであった。１ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号２＋第２番プローブ）、連続する２ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号３＋第２番プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号４＋第２番プローブ）、３ｂｐ欠失のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号５＋第２番プローブ）の蛍光強度は、完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号１＋第２番プローブ）よりも、６０℃では、４１％、７１％、８７％、９５％だけ低かった。７０℃から６０℃まで温度が下がるにつれて、完全対合ハイブリッドと種々の塩基対誤対合ハイブリッド間の差の程度は増加した。実施例１のように、プローブと標的間の誤対合の程度の増加により、蛍光強度のレベルは次第に小さくなった。さらに、変異型配列が野生型配列よりも高いＧＣ含量を示した時でさえ、この蛍光パターンは一貫していた（図２）。
【００５９】
平行ＰＮＡプローブを使用した場合、離散型２ｂｐ誤対合ハイブリッド（２つの１ｂｐ誤対合を３塩基対だけ離した）は、連続型２ｂｐ誤対合ハイブリッドより蛍光強度がわずかに低かった（データは図示しない）。同様に、離散型３ｂｐ誤対合ハイブリッド（３つの１ｂｐ誤対合を３つの塩基対だけ各々離した）は、連続型３ｂｐ誤対合ハイブリッドより蛍光強度がわずかに低かった（データは図示しない）。これらの結果は、離散型塩基対誤対合では連続型塩基対誤対合よりも、ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド形成がより崩壊し易いことを示唆している。
【００６０】
（実施例３）
配列番号８は、第１番プローブに完全に相補的になるように設計された、配列番号１に由来する１５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標的配列であった。配列番号９〜配列番号１７は、１塩基対の変化（下線）を除いて野生型の配列番号８と同一な、１５ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。センスとアンチセンスの１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ配列を、上述のように合成し、精製し、アニールした。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００６１】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号８）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号８）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６２】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号９）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号９）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６３】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１０）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１０）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６４】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１１）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１１）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６５】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６６】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６７】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１４）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１４）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６８】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１５）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１５）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００６９】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１６）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１６）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００７０】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１７）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１７）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００７１】
１５ｍｅｒ野生型目標ｄｓＤＮＡ（配列番号８）および考えられるあらゆるタイプの１ｂｐ誤対合を生成する種々の１５ｍｅｒ  １ｂｐ変異ｄｓＤＮＡ（配列番号９〜配列番号１７）と第２番の平行ＰＮＡプローブを反応させることにより、ハイブリダイゼーションアッセイの特異性についてさらに試験した（図３）。測定条件は実施例１に記述したのと同一にした。
【００７２】
最も高い蛍光強度を、すべての試験温度で、完全に相補的な配列から成るｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドに関して達成した。温度の減少とともに、蛍光は増大した。１ｂｐのＴ−Ｔ、Ｃ−Ｃ、Ｇ−Ｇ、Ａ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｇ−ＴおよびＣ−Ｔ誤対合を生じるｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドはすべて、完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドで観察された蛍光強度よりも低い蛍光強度を生じた（図３Ａおよび３Ｂ）。１ｂｐ誤対合に対する蛍光強度は、完全対合で観察された蛍光強度よりも、５５℃と７５℃のそれぞれにおいて、６４％〜９６％だけ、および５７％〜９５％だけ低かった。平行ＰＮＡプローブを使用した場合（図３）、種々の１ｂｐ誤対合間で観察された蛍光強度の変化は、変異型配列のＧＣ含量パーセントの変化よりも特定の塩基対誤対合の方に依存していた。同様の実験で第１番の逆平行ＰＮＡプローブを試験した場合、完全対合と種々の１ｂｐ誤対合間で観察される蛍光強度の差は、第２番の平行ＰＮＡプローブを用いて達成される蛍光強度の差ほど劇的ではなく、温度の影響を受けるようであった（データは図示しない）。逆平行ＰＮＡプローブを使用した時、測定は４０℃と６０℃の間で最良の結果を生じた。したがって、標的ＤＮＡ配列がＰＮＡプローブ配列と同じ長さである場合には、平行ＰＮＡプローブが好まれる。
【００７３】
図３の結果により、あらゆる１ｂｐ誤対合を高い精度で同定するための、ハイブリダイゼーション測定法の信頼性が確認された。
（実施例４）
実施例１〜３のハイブリダイゼーションアッセイを、ｄｓＤＮＡ標的配列の変性と、ｄｓＤＮＡ標的の融点（Ｔｍ）を超える温度でのｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド形成測定後に行った。この実施例では、予めの変性を必要とせずに完全対合と塩基対誤対合と区別するための、本発明のアッセイの信頼性を実証する。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応混合物（１２０μｌ）は下記のものを含んでいた：６ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、６ｐｍｏｌｅｓの第２番平行ＰＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥおよび５００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１。反応量は実施例１〜３のものよりもわずかに大きかったが、ＤＮＡ、ＰＮＡ、およびＹＯＹＯ−１の量は、試料の濃度を一定に維持するように対応して調節された。反応量が４０μｌ、８０μｌまたは１２０μｌの時、同一の結果が得られた。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、加熱室で温度が経時的に増加するにつれて蛍光放出について繰り返しモニタした。試料の同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プローブにより達成された。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【００７５】
図４は、野生型５０ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標的配列（配列番号１）を３０℃〜８５℃で１５ｍｅｒの第２番平行ＰＮＡプローブと反応させた時に、前もって変性しなくても最も高い蛍光強度が達成されたことを説明する。５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡのＴｍである６５℃より低い温度では、ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖が形成された。６５℃を超えて温度が上昇されるにつれて、三本鎖構造が、ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡ二本鎖に変換された。ＹＯＹＯ−１を三本鎖構造と二本鎖構造の両方で効率的に挿入できることは明らかであった。従って、１ｂｐ誤対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋第２番プローブ）、連続する２ｂｐ誤対合三本鎖（配列番号３＋第２番プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合三本鎖（配列番号４＋第２番プローブ）および３ｂｐ欠失三本鎖（配列番号５＋第２番プローブ）の蛍光強度は、完全対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号１＋第２番プローブ）よりも、それぞれ８３％、９３％、９９％、９９．５％だけ低かった。温度が３０℃から８５℃まで増加するとともに、完全対合と塩基対誤対合間の差の程度が減少した。８５℃で、１ｂｐ誤対合、２ｂｐ誤対合、３ｂｐ誤対合および３ｂｐ欠失ハイブリッドの蛍光強度は、完全に相補的な配列で観察された蛍光強度よりも、それぞれ６５％、７６％、９４％、９５％だけ低かった。したがって、本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、配列を予め変性しなくても、野生型配列と、１ｂｐ、２ｂｐまたは３ｂｐ変異もしくは欠失を含む配列とを区別することができる。
【００７６】
（実施例５）
第３番プローブは、第１番の１５ｍｅｒ逆平行ＰＮＡプローブと配列および方向が同じ１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡプローブであった（配列番号６）。第３番プローブは５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴー３’の構造を有していた。
【００７７】
ハイブリダイゼーションアッセイの特異性を、予め変性を行わずに、５０ｍｅｒ野生型および変異型ｄｓＤＮＡ標的配列と第３番ｓｓＤＮＡプローブを反応させることにより、さらに検査した。アッセイ条件は、実施例４に記述したのと同じにした。
【００７８】
ＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１で増強し、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖を３０℃〜６５℃の間で形成した。配列番号１＋第３番プローブから成る完全対合のＤＮＡ三本鎖は、最も高い蛍光強度を生じた（図５）。これに対して、１ｂｐ誤対合（配列番号２＋第３番プローブ）、連続する２ｂｐ誤対合（配列番号３＋第３番プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合（配列番号４＋第３番プローブ）および３ｂｐ欠失（配列番号５＋第３番プローブ）を生成する不完全に相補的なプローブと標的の組み合わせでは、完全対合の配列で観察されたのよりも、３０℃でそれぞれ５７％，９４％，９７％，９８％，６５℃で４７％，７９％，９２％，９１％だけ蛍光強度が低下した（図５）。温度が６５℃を超えて増加するとともに、完全対合と塩基対誤対合間の差の程度は減少した。これはＤＮＡ三本鎖構造の徐々の分解を示す。８５℃で、１ｂｐ誤対合、２ｂｐ誤対合、３ｂｐ誤対合、および３ｂｐ欠失によって達成された蛍光強度は、完全対合によって得られた蛍光強度よりも、４０％，６３％，９２％，８３％だけ低かった（図５）。ＹＯＹＯ−１の存在によって、予め変性を行う必要なく、完全に相補的な配列と１ｂｐ、２ｂｐまたは３ｂｐ誤対合または欠失を含む配列とを区別するために、ＰＮＡプローブの代りにｓｓＤＮＡプローブを使用することができた。
【００７９】
（実施例６）
予め変性を行わずにｓｓＤＮＡプローブおよびｄｓＤＮＡ標的を使用して行うハイブリダイゼーションアッセイが劇的に異なるＧＣ含量パーセント（従って異なる溶融温度）を有するプローブと標的ＤＮＡにも適用されることを保証するために、新たな１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡプローブと５０ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標的配列を、上述のように合成、精製、アニールした。ｓｓＤＮＡプローブとｄｓＤＮＡ標的は共に１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００８０】
配列番号１８は、配列番号１から改変（ＧＣ含量パーセントを３０％から５２％に変更）した５０ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１８）のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００８１】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１８）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−  ３’であった。
【００８２】
配列番号１９は、配列ＣＡＴをＣＧＴに変更した１つの塩基対変化（下線）を除いて配列番号１８と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列だった。
変異型配列番号１９のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００８３】
変異型配列番号１９のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００８４】
配列番号２０は、配列ＣＡＴをＡＣＴに変更した連続する２つの塩基対変化（下線）を除いて配列番号１８と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列だった。
【００８５】
変異型配列番号２０のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００８６】
変異型配列番号２０のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００８７】
配列番号は、配列番号１から改変（ＧＣ含量パーセントを３０％から７２％まで変更）した５０ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号２１）のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧ−３’であった。
【００８８】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号２１）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００８９】
配列番号２２は、配列ＣＧＴをＣＡＴに変更した１つの塩基対変化（下線）を除いて配列番号２１と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異型配列番号２２のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧ−３’であった。
【００９０】
変異型配列番号２２のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００９１】
配列番号２３は、配列ＣＧＴをＡＴＴに変更した連続する２つの塩基対変化（下線）を除いて配列番号２１と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００９２】
変異型配列番号２３のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧ−３’であった。
【００９３】
変異型配列番号２３のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００９４】
第４番のプローブは、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号１８）のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡプローブであった。該プローブは以下の構造（配列番号２４）を有していた：５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ−３’。
【００９５】
第５番のプローブは、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号２１）のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡプローブであった。該プローブは以下の構造（配列番号２５）を有していた：  ５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＣＣＧ−３’。
【００９６】
ハイブリダイゼーションアッセイ条件は実施例４に記述したのと同一とした。
第４番ｓｓＤＮＡプローブ（ＧＣ含量５３％）を、５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１８）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１９および配列番号２０）にハイブリダイズさせた時、非変性条件下の低温でｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖が生じた（図６Ａ）。
【００９７】
完全対合のＤＮＡ三本鎖が最も高い蛍光強度を達成する一方で、１ｂｐ誤対合（配列番号１９＋第４番プローブ）および２ｂｐ誤対合（配列番号２０＋第４番プローブ）を有する不完全に相補的な三本鎖は、完全対合の配列で観察される蛍光強度よりも、３０℃でそれぞれ６３％，９５％だけ低い蛍光強度を生じた（図６Ａ）。温度が増加するにつれて、ＤＮＡ三本鎖構造の分解が徐々に起こり、蛍光強度が減少し、完全対合と塩基対誤対合間の蛍光強度の差が小さくなった。８５℃では、完全対合配列と塩基対誤対合を含む配列の間には、蛍光の差はほとんど見い出されなかった（図６Ａ）。
【００９８】
同様に、ＹＯＹＯ−１の存在下で、第５番ｓｓＤＮＡプローブ（ＧＣ含量７３％）を対応する５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２１）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２２および配列番号２３）と反応させた時、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖が形成された。
【００９９】
１ｂｐの誤対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号２２＋第５番プローブ）および連続する２ｂｐの誤対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号２３＋第５番プローブ）の蛍光強度は、完全対合配列より得られる蛍光強度よりも、３０℃でそれぞれ４８％，６％だけ低かった（図６Ｂ）。温度が３０℃から８５℃ｐまで増加するとともに、すべての試料の蛍光は減少したが、これはＹＯＹＯ−１の挿入が減少し、ＤＮＡ三本鎖が分解したことを示している。
【０１００】
ｓｓＤＮＡプローブおよびｄｓＤＮＡ標的のＧＣ含量パーセントにかかわらず、ＹＯＹＯ−１は非変性条件下でのＤＮＡ三本鎖の形成を促進することができ、完全に相補的な配列間と、１または２ｂｐの変異を含む配列との間の、正確な区別を可能にした。
【０１０１】
（実施例７）
実施例５，６におけるハイブリダイゼーションアッセイは、ｓｓＤＮＡプローブを使用して、予め変性する必要なく、野生型ＤＮＡ配列と、塩基対誤対合または欠失を含む配列との間を識別する本発明の信頼性の高さを証明した。そのようなアッセイは、ｄｓＤＮＡ標的の融点未満のＤＮＡ三本鎖の形成を測定した。さらに、野生型配列と変異配列間の最適な差は、測定した中で最も低温である３０℃で達成された。３０℃より低い温度がアッセイに対してさらに有益かどうか決定するために、第３番１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡプローブを、５℃〜３０℃の間で５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）または５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２）と反応させた。
【０１０２】
図７Ａでは、２ｐｍｏｌｅｓのｄｓＤＮＡ標的を、０．５×ＴＢＥおよび５００ｎＭのＹＯＹＯ−１を含む４０μｌ反応混合物中の２ｐｍｏｌｅｓの第３番ｓｓＤＮＡプローブと反応させた。図７Ｂでは、５００ｆｍｏｌｅｓ（つまり１０−１５モル）のｄｓＤＮＡ標的を、０．５×ＴＢＥおよび２５０ｎＭのＹＯＹＯ−１を含む４０μｌ反応混合物中の５００ｆｍｏｌｅｓの第３番ｓｓＤＮＡプローブと反応させた。反応混合物を、５分間室温（２１℃）でインキュベートし、石英キュベットに移し、実施例４〜６で行ったように３０℃でアルゴンイオンレーザービームで照射した。続けて、試料を含むキュベットを氷上に置いた。各試料の温度が２０℃（各試料内に直接入れた温度プローブによって決定）に達したら、試料を測定チャンバに移し、温度が５℃から３０℃まで増加するにつれて蛍光放出に対して繰り返しモニタした。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【０１０３】
完全に相補的なＤＮＡ三本鎖（配列番号１＋第３番プローブ）と１ｂｐ誤対合を含むＤＮＡ三本鎖（配列番号２＋プローブ３番）との間の最適な差は、試験した両方のＤＮＡ濃度について５℃で観察された（図７Ａ，７Ｂ）。しかしながら、温度が５℃〜３０℃まで増加するにつれ、完全および不完全に相補的なＤＮＡ三本鎖間の蛍光強度の差は、劇的には変わらなかった。プローブと標的が共に１ｐｍｏｌｅ／２０μｌ濃度の場合、１ｂｐ誤対のＤＮＡ三本鎖の蛍光強度は、完全対合配列で得られる蛍光強度より８４％，７７％低かった（図７Ａ）。同様に、プローブと標的が４倍低い濃度の場合、完全対合のＤＮＡ三本鎖と誤対合ＤＮＡ三本鎖間で、５℃と３０℃で、蛍光強度の６３％，５０％の差が観察された（図７Ｂ）。５℃まで冷却する前後に３０℃で測定されたすべての試料の蛍光強度は、非常に類似していた（データは図示しない）。最大の差は５℃に認められるが、便宜上、非変性ハイブリダイゼーションアッセイは室温でも高い信頼性で行える。
【０１０４】
（実施例８）
ハイブリダイゼーションアッセイの感度を、減少濃度の第２番の平行ＰＮＡプローブまたは第３番のｓｓＤＮＡプローブを、２７℃と３２℃の非変性条件下で、減少濃度の５０ｍｅｒの野生型または変異型ｄｓＤＮＡ標的（それぞれ配列番号１および配列番号２）と反応させることにより試験した（図８）。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は下記を含んでいた：２０ｆｍｏｌｅｓ〜２ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、２０ｆｍｏｌｅｓ〜２ｐｍｏｌｅｓの第３番ｓｓＤＮＡプローブまたは第２番平行ＰＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥ、および２．５ｎＭ〜５００ｎＭのＹＯＹＯ−１。すべての試料において、標的配列およびプローブ配列は、同一濃度に維持した。アッセイ条件は実施例４に記述したものと同一とした。
【０１０６】
１ｐｍｏｌｅ／２０μｌの第２番の平行ＰＮＡプローブまたは第３番のｓｓＤＮＡプローブを、５００ｎＭの正常なＹＯＹＯ−１濃度で、１ｐｍｏｌｅ／２０μｌのｄｓＤＮＡ標的配列とハイブリダイズすると、１ｂｐ誤対合によって生じるｄｓＤＮＡ：ＰＮＡおよびｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖は、完全対合の三本鎖で観察される２７℃〜３２℃より、各々９３％〜９４％までおよび５６％〜５４％低い範囲の蛍光強度を生じる（データは図示しない）。
【０１０７】
１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌ濃度のプローブおよび標的（つまり１００倍低い濃度）では、１  ｂｐ誤対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、２５ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を使用した時、２７℃〜３２℃の完全に相補的な三本鎖から得られる蛍光強度よりも８５％〜８３％だけ低い蛍光強度を達成した（図８Ａ）。同様に、１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌの第３番のｓｓＤＮＡプローブを、１０ｎＭのＹＯＹＯ−１の存在下で１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌのｄｓＤＮＡ標的配列と反応させると、１ｂｐ誤対合によって生成される蛍光強度は、２７℃〜３２℃での完全対合ＤＮＡ三本鎖により生成される蛍光強度よりも８４％〜９０％だけ低かった（図８Ｂ）。これはプローブと標的の濃度が非常に低いときでもハイブリダイゼーションアッセイの感度が極端に高いことを証明している。
【０１０８】
試験した各プローブおよび標的濃度で、広範囲のＹＯＹＯ−１濃度が許容された。１０ｆｍｏｌｅｓ／２０ｐｌのプローブと１０ｆｍｏｌｅｓ／２０ｐｌの標的をハイブリダイズさせた時、ＹＯＹＯ−１の最適濃度は、２５ｎＭ〜２．５ｎＭ（平行ＰＮＡプローブ）および１０ｎＭ〜２．５ｎＭ（ｓｓＤＮＡプローブ）であり、完全対合配列と誤対合配列間には９０％〜７１％に及ぶ蛍光強度の差が生じた（データは図示しない）。総括すると、上記結果によって、野生型配列と、様々な塩基対変異を含む配列とを区別するための、非変性ハイブリダイゼーションアッセイの極端に高い感度と信頼性が確認された。
【０１０９】
本発明を詳細かつその特定の例を参照しながら説明してきたが、当業者には、種々の変更および改変を、本発明の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに行い得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図１Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図２】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図３Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図３Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図４】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図５】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図６Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図６Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図７Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図７Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図８Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図８Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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