(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトース並びにガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース、及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトテトラオースからなる群から選ばれる少なくとも１種のガラクトシル−オリゴ糖が共存するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖（以下、原料混合物という）に、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素を作用させて、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを製造する方法であって、ラクトースを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素と上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を優先的に加水分解するβ−ガラクタナーゼとを、上記原料混合物又はβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物に作用させて、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を低分子化する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を低分子化して得られた生成物からβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを分離して高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを得る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素が、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
β−ガラクトシダーゼが、β−ガラクトシル−マルトース難分解性酵素である請求項１〜３のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項５】
β−グルコシダーゼが、乳糖分解能を有するβ−グルコシダーゼである請求項１〜４のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項６】
β−ガラクタナーゼが、β−１，４−ガラクタナーゼである請求項１〜５のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項７】
原料混合物がガラクトシル残基を有する糖及びマルトオリゴ糖に、β−ガラクトシダーゼを作用させて得られるものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
β−ガラクトシダーゼがラクトース残基をβ−１，４−ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖の非還元性末端グルコース残基に転移し得る酵素である請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
ガラクトシル残基を有する糖が重合度２以上のβ−１，４−ガラクトシルオリゴ糖又は乳糖である請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１０】
マルトオリゴ糖が、グルコースの重合度３〜７の直鎖マルトオリゴ糖、又はこれらの混合物である請求項７〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、β-1,4-ガラクトシル−マルトースの製造方法に関する。詳しくは、工業規模で容易に効率よく、かつ、安価にβ-1,4-ガラクトシル−マルトースを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療現場で各種検査が行われるようになり、膵臓や尿中に含まれるα−アミラーゼ活性も測定されるようになった。α−アミラーゼ活性の測定は重要な検査事項であり、疾病診断の一助になっている。近年、α−アミラーゼの活性測定用基質として、共役酵素を使用しない高感度の基質が開発されている。そのような基質の一つとして、マルトースの還元性末端にフェニル基、ナフチル基又はそれらの誘導体をアグリコンとして結合させたマルトース誘導体であって、その非還元性末端の４位がガラクトースで修飾された構造を持つ化合物が知られている（特開平６−３１５３９９号）。この化合物の化学構造式を以下（化１）に示す。
【０００３】
【化１】
0004109343.tif 000002
式中、Ｘ1及びＸ2の少なくとも一方はガラクトシル残基であり、他方は水素原子であり、Ｒはフェニル基、ナフチル基等の修飾基を示す。
上記化合物は、β−１，４−ガラクトシル−マルトースの還元末端に、Ｒで示されるフェニル基、又はナフチル基等の修飾基を付加したものであり、この基質は、例えば、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを原料として製造することができる。
【０００４】
また、このβ−１，４−ガラクトシル−マルトースは、ガラクトシルマルトビオノラクトンの原料としても用いられる。ガラクトシルマルトビオノラクトンは、α−アミラーゼの阻害剤として有効であることが知られている（特開平８−２９１１９２号）。このようにβ−１，４−ガラクトシル−マルトースは、医療現場において欠く事のできないα−アミラーゼ基質やα−アミラーゼ阻害剤の原料となる化合物であるが、その製造方法は実用的に十分確立されているとはいえない。
【０００５】
β−１，４−ガラクトシル−マルトースの一般的な製造方法は、２つある。第一の方法は、マルトース及びガラクトースにβ−ガラクトシダーゼを作用させて、ガラクトシル−マルトースを得る方法である。この方法は、１段階で目的物を生成することができる方法である。第二の方法は、ガラクトースとマルトオリゴ糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させ、ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得、得られたガラクトシル−マルトオリゴ糖にタカアミラーゼを作用させ、ガラクトシル−マルトースを生成する方法（特開平８−１７３１８０号）である。
【０００６】
第一の方法は、ガラクトシダーゼ糖転移反応を利用して、マルトースの非還元末端の４位を１分子のガラクトースで修飾する方法であるが、重大な欠点がある。この製造方法では、例えば、供与体基質である乳糖存在下、β−ガラクトシダーゼの糖転移反応を行った場合、マルトースへのガラクトシル基転移生成物と乳糖への転移生成物が、同時に生成する。これらの生成物は、ゲル濾過などによる分画において、溶出時間が非常に似通っているため、分画が困難であった。従って、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを生成しても、その後精製することが実質的に不可能であった。
【０００７】
一方、第二の方法にも、２つの問題があった。この方法は、詳しくは、マルトトリオース以上の重合度を持つ直鎖マルトオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース等）とガラクトシル残基を含む糖の混合物に、β-ガラクトシダーゼを作用させ糖転移反応を行い、マルトオリゴ糖の非還元末端の４位をガラクトースで修飾したガラクトシル−マルトオリゴ糖を調製し、得られたガラクトシル−マルトオリゴ糖にタカアミラーゼを作用させてガラクトシル−マルトオリゴ糖３糖類のみを遊離させて、ガラクトシル−マルトースを得るというものである。
【０００８】
第一の問題は、生成物にβ−１，６−ガラクトシルマルトースが混在し、分離が困難であることである。即ち、マルトオリゴ糖の非還元末端の４位をガラクトースで修飾して得られた生成物には、目的とするβ−１，４−ガラクトシル-マルトオリゴ糖は約１０％（Ｗ／Ｗ）程度しか生成しない。更に、上記反応において、ガラクトースが非還元末端にあるグルコシル基の６位に結合した構造異性体も生成する。このような生成物（混合物）にタカアミラーゼを作用させると、タカアミラーゼはガラクトースが６位に結合した異性体にも作用するためβ-1,４-ガラクトシルマルトースに加えてβ-1,6-ガラクトシルマルトースも生成してしまう。β−１，４体とβ−１，６体とは分子量に差がなく、両者の分画は極めて困難である。
【０００９】
第二の問題は、上記糖転移反応の生成物には、更に主として原料由来の乳糖、転移反応生成物であるガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、及び／又はガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖等も含まれていることである。これらの糖は、β−１，４−ガラクトシル−マトースと分子量等が近似しているため、これらの糖から目的物を分離し、精製することも容易ではなかった。
【００１０】
第一の問題の解決法として、ガラクトシル−マルトオリゴ糖から、ガラクトースが６位に結合した異性体は遊離することなく、β−１，４−ガラクトシル−マルトースのみ遊離する酵素の使用が考えられる。サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼは、β-1,6-ガラクトシル−マルトオリゴ糖には作用せず、β-1,4-ガラクトシル−マルトースのみを遊離させることが知られている（糖質関連酵素シンポジウム vol.30, p213-221, 1996）。従って、本発明者らは、この酵素を上記タカアミラーゼの代わりに用いることにより、異性体であるβ−１，６−ガラクトシル−マルトースの生成を阻止することができると考えた。
【００１１】
一方、第二の問題の解決法として考えられる方法として、ゲル濾過精製法を挙げることができる。この精製法は一般的にマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を得る場合に用いられる方法である。しかし、このゲル濾過精製法は、分離能力は高いが処理能力が低く、ゲル自体の価格が高い等の欠点がある。
更に、β−１，４−ガラクトシル-マルトースの誘導体がα-アミラーゼ基質として用いられる際には、９８％以上という高純度を要求される。そのため、β-1,4-ガラクトシル-マルトースの高純度品を得るためには、このゲル濾過精製が二回以上必要であった。従って、工業的規模でβ-1,4-ガラクトシルマルトースあるいはその誘導体の高純度品を製造する場合、生産量が制限され、高価にならざるを得なかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、α−アミラーゼ活性測定の基質の原料及びα−アミラーゼ阻害剤の原料として有用な、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースの製造方法であって、構造異性体であるβ−１，６−ガラクトシル−マルトースを生成することなく、また、高価で処理能力の低いゲル濾過精製法を用いることなく、工業的規模で簡便に行うことができる製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ラクトース並びにガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース、及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトテトラオースからなる群から選ばれる少なくとも１種のガラクトシル−オリゴ糖が共存するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖（以下、原料混合物という）に、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素を作用させて、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを製造する方法であって、
【００１４】
ラクトースを優先的に加水分解する酵素と上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を優先的に加水分解する酵素とを、上記原料混合物又はβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物に作用させて、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を低分子化する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
従来の方法においては、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを生成する際、構造異性体であるβ−１，６−ガラクトシル−マルトースも同時に生成することがあった。本発明では、「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」をもちいることにより、異性体の生成を排除することに成功した。「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」としては、例えば、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼＴＦ９０（日本食品化工（株）製）を使用することができる。この糖化型α−アミラーゼは、ガラクトシル−マルトオリゴ糖から、ガラクト−スが６位に結合した異性体は遊離することなく、β−１，４−ガラクトシル−マルトースのみ遊離することが知られている。従って、同じ分子量を持つため分離が不可能である異性体を生成することがない。これは、後のβ−１，４−ガラクトシル−マルトース精製工程においてその工程を簡便にするという利点がある。「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」が、例えば、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼＴＦ９０の場合、基質であるガラクトシル−オリゴ糖１ｇに対して、３０〜２００Ｕを使用することが好ましい。反応は、４５〜６５℃で、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で行うことが好ましい。
【００１６】
なお本発明において「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」は、上記糖化型α−アミラーゼに限定されるものではなく、異性体を生成することなく、ガラクトシル−マルトオリゴ糖から目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成することができる酵素であればいずれも使用可能である。
【００１７】
原料混合物中のラクトース及び上記ガラクトシルーオリゴ糖は、目的物のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースと分子量が近似している。そのため、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトース得るために、これらの化合物をβ−１，４−ガラクトシル−マルトースから分離することが困難であった。本発明では、これらの化合物を、酵素を用いて加水分解することにより低分子化することに着目した。その結果、β−ガラクトシル−マルトオリゴ糖及びβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを分解せず、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖を優先的に加水分解する酵素群を見出した。これらの酵素を用いることにより、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖を低分子化することができるようになった。低分子化されたこれらの化合物は、β−１，４−ガラクトシル−マルトースとその分子量が明らかに異なるため、簡易に分離することができる。
【００１８】
低分子化の具体的な方法としては、「ラクトース優先的に加水分解する酵素」及び「上記ガラクトシル−オリゴ糖を優先的に加水分解する酵素」を、上記「原料混合物」又はβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物に作用させることにより行うことができる。酵素としては、目的物であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを加水分解せずにラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖を低分子化するものを使用することができる。
【００１９】
「ラクトースを優先的に加水分解する酵素」としては、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素等を用いることができる。
【００２０】
原料混合物に含まれるラクトースを加水分解するには、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいは目的物であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースには作用せずに乳糖を加水分解するβ−ガラクトシダーゼを使用することができる。そのようなβ−ガラクトシダーゼとしては、例えば、β−１，４−ガラクトシル−マルトース難分解性のβ−ガラクトシダーゼを挙げることができる。具体的には、β−ガラクトシダーゼとしては、例えば、クリベロマイセス・フラギルス（Kluyvermyces fragilis）起源の酵素製剤「ラクトザイム」（ノボノルディスクバイオインダストリー（株）製）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精（株））等を挙げることができる。これらの酵素は市販品として容易に入手可能である。β−ガラクトシダーゼは、基質であるラクトース１ｇに対して、５〜５０Ｕの量の範囲で使用することが好ましい。その反応は、温度３０〜５０℃でｐＨ５〜８の範囲において行うことができる。
【００２１】
原料混合物中のラクトースを加水分解するためには、乳糖分解能を有するβ−グルコシダーゼを使用することができる。ラクトースを加水分解するために使用することができるβ−グルコシダーゼとしては、例えば，乳糖分解能力を有するアーモンドやサーマス(Thermus)属由来のβ-グルコシダーゼ等を挙げることができる。β−グルコシダーゼは、基質であるラクトース１ｇに対して、５〜１００Ｕの範囲で使用することが好ましい。また、その反応は、温度３０〜６０℃で、ｐＨ５〜８の範囲で行うことができる。
【００２２】
なお本発明において「ラクトースを優先的に加水分解する酵素」はβ−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼに限定されるものではなく、目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを実質的に分解することなく、ラクトースを分解し得る酵素であればいずれも使用可能である。
【００２３】
「上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を優先的に加水分解する酵素」としては、例えば、β−ガラクタナーゼ等を挙げることができる。
【００２４】
β−ガラクタナーゼは、一般的には、ガラクトース重合体を加水分解する酵素である。本発明においては、β-1,4-ガラクトシル-マルトースあるいはその誘導体を分解せずにガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたは２個以上のガラクトース残基が非還元末端側に結合したマルトオリゴ糖あるいはその誘導体を分解する種類のβ−ガラクタナーゼを使用する。そのようなβ−ガラクタナーゼとして、例えば、β−１，４−ガラクタナーゼを挙げることができる。具体的には、β−ガラクタナーゼとしては、例えば、Bacillus subtilis起源のもの（J.M.Labavitchら，J. Biol.Chem.,251,5904-5910）、Penicillium citrinum起源のもの（澱粉科学，第３６巻, P131-140,1989年）、Aspergillus  pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬（株）製） Aspergillus niger起源の酵素製剤「ペクチネックス」（ノボノルディスクバイオインダストリー（株）製）等を挙げることができる。これらの酵素は一般的に入手可能である。β−ガラクタナーゼは、基質である上記ガラクトシル−オリゴ糖１ｇに対して、５〜５０Ｕの範囲で使用することが好ましい。またその反応は、温度３０〜６０℃で、ｐＨ３〜６の範囲で行うことができる。
【００２５】
上記に例示したβ−ガラクタナーゼについては、文献等においてガラクトースの重合体からなる高分子やガラクトース残基からなるガラクトオリゴ糖を加水分解できることは記載されている。しかし、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖を加水分解することができることは記載されていない。β−ガラクタナーゼが、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖を加水分解することは、本発明で初めて見いだされたものである。
【００２６】
なお本発明において「上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１つを優先的に加水分解する酵素」はβ−ガラクタナーゼに限定されるものではなく、目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを実質的に分解することなく、上記ガラクトシル−オリゴ糖を分解し得る酵素であればいずれも使用可能である。
【００２７】
本発明において、必要に応じて、上記の方法により「ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を低分子化して得られたβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物」からβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを分離することもできる。この分離工程により、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを得ることができる。
【００２８】
β−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物は、異性体であるβ−１，６体を含まず、残存原料及び副生成物が低分子化されているため、ゲル濾過精製及び逆浸透膜等の工程により精製が可能である。ゲル濾過精製では一般に分子量の大きさによる分離モードが使用されている。単糖とオリゴ糖とでは分子量が相違するためβ−１，４−ガラクトシル−マルトースと他の低分子化された糖化合物を分離することが可能である。従って、上記混合物はゲル濾過精製を用いて容易に分離することができる。一方、逆浸透膜においても、オリゴ糖と単糖類は大量にかつ簡便に分離することができる。この方法を用いてもβ−１，４−ガラクトシル−マルトースと他の低分子化された糖化合物を分離することが可能である。従って、ゲル濾過精製の前処理として逆浸透膜を組み込めば、目的物質の含量が向上しゲル濾過精製工程の生産性の大幅な向上が可能である。また、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを得るために高価なゲル濾過精製工程を２回繰り返す必要性も排除することができる。
【００２９】
上記β−１，４−ガラクトシル−マルトースの製造方法の「原料混合物」は、例えば、ガラクトシル残基を有する糖及びマルトオリゴ糖に、β−ガラクトシダーゼを作用させて得ることができる。β−ガラクトシダーゼを用いて、マルトオリゴ糖の非還元末端にガラクトースを結合し、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得ることができる。これは、β−ガラクトシダーゼの糖転移反応によるものである。
【００３０】
糖転移反応に用いることができるβ−ガラクトシダーゼとしては、ラクトース残基をβ−１，４−ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖の非還元末端グルコース残基に転移し得る酵素を挙げることができる。一般的に、β−ガラクトシダーゼは各種β-ガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離する酵素として知られているが、本方法においては、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を生成させる転移活性の強いβ−ガラクトシダーゼを使用することができる。この酵素は、ラクトース残基をβ−１，４−ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖の非還元末端グルコース残基に転移する。その結果、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得ることができる。
【００３１】
β-ガラクトシダーゼとしては、具体的には、特開平３-２６４５９６に述べられているようにバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）起源の酵素製剤「Biolacta」（大和化成（株)製）、アスペルギルス・オリゾエ（Aspergillus oryzoe）起源の酵素製剤「Lactase Fアマノ」（天野製薬（株）製）、同じく「Lactase Y-AO」（ヤクルト（株））、あるいは特開昭６２-１３０６９５記載のクリプトコッカス（Cryptococcus）属起源のものを挙げることができる。更に、ガラクトース残基を主にβ-1,4-結合でマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の非還元末端グルコース残基に転移し得るバチルス属あるいはクリプトコッカス属由来の酵素が使用可能であるが、好ましくは温度安定性が高いバチルス属由来の酵素を使用することができる。
【００３２】
ガラクトシル残基を有する糖としては、重合度２以上のβ−１，４−ガラクトシルオリゴ糖又は乳糖等を用いることができる。マルトオリゴ糖としては、グルコースの重合度３〜７の直鎖マルトオリゴ糖、又はこれらの混合物を用いることができる。例えば、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオース等を挙げることができる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の製造法は、高純度のβ−１，４−ガラクトシル-マルト−ス精製することを容易にする。詳しくは、β−１，４−ガラクトシル−マルトースと近似する分子量を持つ、β−１，６体（異性体）を生成することなく、残存原料及び副生成物を低分子化して、分子量による分離工程によりβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを精製することを容易にした。従って、高価で処理能力の低いゲル濾過精製法を用いることなく、工業的規模で簡便に高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを製造することができるようになり、精製工程の効率が極めて向上した。これは、実用上多大な効果をもたらすものである。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に説明する。
下記の実施例における糖組成は試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、ピーク面積より算出した。ＨＰＬＣは以下の条件で行った。カラム；Shodex RS-pak DC-613 ( 6 I.D.mm×150mm），溶離液；アセトニトリル／水＝70/30(v/v)，流速；0.9 ml/min，カラム温度；室温，検出器；ＲＩモニターまたはＵＶ検出器（310nm）。
また酵素活性測定法は以下のようにして行った。
【００３５】
β-ガラクトシダーゼの活性測定法
0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニルβ-ガラクトシドと25mMリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭酸ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。遊離したpNP量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光純薬工業（株）製)を用いて作成した検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する酵素量を1単位（U）とした。
【００３６】
β-グルコシダーゼの活性測定法
0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニルβ-グルコシドと25mMリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭酸ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。pNP量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光純薬工業(株)製)を用いて検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する酵素量を1Uとした。
【００３７】
β-ガラクタナーゼの活性測定法
0.5mlの1.0%大豆アラビノガラクタンと50mMの酢酸緩衝液(pH4.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlにDNS試薬1ml添加し、10分間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光度を測定した。遊離した還元糖量はガラクトースを標準として用いて作成した検量線から求めた。なお上記条件で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとした。
【００３８】
サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼの活性測定法
0.35mlの100mMの酢酸緩衝液(pH6.0)に1.0%になるように可溶性澱粉溶解しし、55℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して55℃、10分間反応させた後、反応液1mlにDNS試薬を1ml添加し、10分間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光度を測定した。遊離した還元糖量はグルコースを標準として用いて作成した検量線から求めた。なお上記条件で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとした。
【００３９】
実施例１
各種酵素剤の選択
乳糖19.85g(58.0mmol)及びマルトテトラオース38.7g(58.0 mmol)を100mlの50mMリン酸緩衝液中(pH7.0)に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成（株）製, Bacillus circulans起源）を200 U添加し40℃で5時間反応させて、β-1,4-ガラクトシル−マルトテトラオースを生成させた。次いで5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5に調整した後、5分間煮沸し、酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、β-1,6-ガラクトシルマルトテトラオース1.0%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は6.7%であった。
【００４０】
上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼＴＦ９０（日本食品化工(株)）50 Uと各種酵素剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表１に示した。
また次に表１の結果から本発明の目的に合致したβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」「ＢＧＨ−１０１」（アーモンド由来，東洋紡（株）製）およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を選択し、β-1,4-ガラクタナーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ2種類の酵素剤を順次作用させた場合の加水分解について検討した。上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、まずβ-1,4-ガラクタナーゼ剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた後、酵素を煮沸失活させた。次いでβ-ガラクトシダーゼをそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表２に示した。
【００４１】
【表１】
0004109343.tif 000003
＋＋：70〜100%程度分解する
＋  ：10〜70%程度分解する
±  ：〜10%程度分解する
−  ：分解しない
【００４２】
【表２】
0004109343.tif 000004
【００４３】
実施例２
β-1,4-ガラクトシル-マルトースの調製
乳糖2.0kg(5.8mol)及びマルテトラオース3.9kg(5.8mol)を10リットルの50mMリン酸緩衝液中（pH 7.0）に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤（Biolacta、5.4 U/mg,大和化成（株）製）を2 X 104 U添加し40℃で5時間反応させ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースを生成させた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、β-1,6-ガラクトシル-マルトテトラオースは1.0%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は6.7%であった。
【００４４】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 6.0に調整し、β-1,4-ガラクトシル-マルトースを生成させるためにサーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼを5 X 104 U、反応原料のマルトテトラオース及びアミラーゼの作用により生ずるマルトオリゴ糖を分解するために、Rhizopus nives起源グルコアミラーゼ（生化学工業（株）製）を5 X 105 Uおよびガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースを分解するためにAspergillus  pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬（株）製）を2 X 105 U添加し、37℃で24時間反応させた。
【００４５】
次に本反応失活液のpHを6.5に調整し、原料の乳糖を分解させるために、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精（株））を1 X 105 U添加し、40℃で24時間反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトースは12.2 %、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは1.5%、グルコースが62%、ガラクトースが22%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は2.3%であった。
【００４６】
上記酵素反応液を逆浸透膜モジュール（ＤＫ４０４０ＣＤＡ，デサリネイション社製）を用いて圧力20 kgf/cm2で10時間処理したところ、本液の糖組成は、β-1,4-ガラクトシル-マルトースは57.4%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは5.3%、グルコースが8.8%、ガラクトースが5.5%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は27.5%であった。
【００４７】
本操作により目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトースは最初の反応終了液の含量に比較して５．５倍に向上した。本液250ml（40%,w/v，固形物として100g）をToyopeal HW-40S（トーソー(株)製）を充填したカラム（13cm,I.D×95cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；5ml/min、検出器：ＲＩモニターでゲル濾過により精製し、純度98.5%のβ-ガラクトシル-マルトース49.5g（固形物）を得た。
【００４８】
実施例３
β-1,4-ガラクトシル-マルトースの調製（その２）
実施例２で調製したβ-1,4-ガラクトシル-マルトースは12.2 %の反応液を、さらに高純度にするために、この反応液を原糖液として、樹脂分画法を行った。樹脂は、アルカリ土類金属型強カチオン交換樹脂（ダウケミカル社製造、商品名ダウエックス５０Ｗ×４、Ｍｇ++型、架橋度４％）を使用し、内径５．４ｃｍのジャケット付ステンレス製カラムに水懸け濁液で充填し、その液が直列に流れるようにカラム６本を連結して、樹脂槽全長が３０ｍになるように充填した。カラム内温度を７５℃で維持しつつ、原糖液を樹脂に対して、６．６ｖ／ｖ％加え、これに７５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で流して分画した。得られた分画品を溶出順にサイドカラムにかけて分画し、純度90%以上ののβ-ガラクトシル-マルトース高含有画分を58.5g採取した。