(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フトモモ科ユーカリ属植物の植物体から抽出された、Euglobal-Bl-1（化学式Ａ）、Euglobal-Ib（化学式Ｂ）、Euglobal-Ic（化学式Ｃ）、Euglobal-IIa（化学式Ｄ）の少なくともいずれかにより表されるユーグロバール類を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【化１】
0004178800.tif 000008
【化２】
0004178800.tif 000009
【化３】
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【化４】
0004178800.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品分野に属する新規なヒアルロニダーゼ阻害剤に関する。より詳細には、優れた薬理活性を有し、しかも安全性の高いヒアルロニダーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は哺乳動物の結合組織に広く存在するマトリックス成分の一種であり、皮膚の保水、関節の潤滑など物理的な機能を果たしている。通常、生体内では、ヒアルロン酸合成酵素と分解酵素の活性の平衡が保たれているが、老化等に伴い分解酵素であるヒアルロニダーゼ活性が亢進すると、組織の柔軟性や潤滑性が失われ、関節の痛みや皮膚のしわ等の原因となる。一方、ヒアルロニダーゼは起炎酵素としても知られており、炎症部位で活性の亢進が確認されていることや、ガン細胞が血管新生を誘導する際に、ヒアルロニダーゼ活性が亢進することも報告されていることなどから、ヒアルロニダーゼ阻害剤は老化に伴う変化や炎症の改善・予防剤、ガンの転移抑制剤として期待されている。また、アトピー性皮膚炎等による皮膚の炎症やそれに伴うかゆみの軽減・予防剤としても検討されている。
【０００３】
思春期の若者の顔面に多く発生するニキビは、皮脂分泌が増加することで皮脂を栄養とするアクネ菌が毛包内で増殖することで起こるが、この原因菌であるアクネ菌はリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼなどの酵素を産生することが知られている。ヒアルロニダーゼにより炎症が惹起されると、丘疹や膿疱などの炎症性のニキビを引き起こす。従って、ヒアルロニダーゼ活性を抑制することで、炎症反応を防ぎ、ニキビの治療にも有効と考えられている。
【０００４】
これまでグリチルリチン酸、クロモグリク酸ナトリウム、バイカリン、インドメタシン、アスピリン等に高いヒアルロニダーゼ活性阻害作用が確認され、これらは現在抗炎症剤として使用されている。しかしながら、グリチルリチン酸およびバイカリンは用途および使用濃度に制限があり、クロモグリク酸ナトリウムは妊婦に対しては厳重な使用上の注意を要する。さらに、インドメタシンおよびアスピリンは、局所的な使用で発疹・痒み等の副作用が認められておりそれぞれに問題点を抱えている。
一方、このような問題点を克服するため、天然物からヒアルロニダーゼ阻害活性を有する物質の探索も精力的に行われており、キイチゴ、ラカンカ、エンメイソウ、サルビア、（特開平10-053532号公報）オトギリソウ、ボダイジュ（特開平9-157176号公報）エラジタンニン（特開平9-124497号公報）、マメ科植物の抽出物（特開平7-010768号公報）などが提案されている。
しかし、これらは高価な生薬を原料としていたり、安全性が確認されていない植物であったり、効果が弱い等の問題を有している。また、安全なハーブ類からヒアルロニダーゼ阻害物質を探索した研究もあり、シソ科のハーブ類に含まれるロズマリン酸が有効成分であること（野菜及びハーブのヒアルロニダーゼ阻害作用、日本農芸化学会誌臨時増刊号73、138、1999）が報告されているが、効果が弱い。
【０００５】
特開平8-053360号公報においては、ユーカリプタス・グロブラス(Eucalyptus globulus)の有機溶剤抽出物にヒアルロニダーゼ阻害活性があるとされているが、有効成分は特定されてなく、また、数百種に及ぶグロブラス以外のユーカリ種については記載がない。一般にユーカリ抽出物は安全性が高いとされているが、精油成分は決して無毒ではない。また、ユーカリ抽出物中に含有されるフェノール性化合物の中には皮膚に炎症を起こす成分が存在するため、高濃度のユーカリエキスは用いることが出来ない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明に於いては、薬理活性が高く、天然物を原料とし、副作用が無く、安全性の高いヒアルロニダーゼ阻害剤を得ることを目的とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する為、鋭意研究した結果、オーストラリア原産で、世界各地で植栽されているフトモモ科ユーカリ属（Eucalyptus属）の各種植物の葉抽出物に強いヒアルロニダーゼ阻害活性があり、その活性本体がアシルフロログルシノールの一種、ユーグロバール類であることを初めて明らかにし、安全性も高いことから、このユーグロバール類を有効成分として含有させたヒアルロニダーゼ阻害剤は極めて有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、「フトモモ科ユーカリ属植物の植物体から抽出された、Euglobal-Bl-1（化学式Ａ）、Euglobal-Ib（化学式Ｂ）、Euglobal-Ic（化学式Ｃ）、Euglobal-IIa（化学式Ｄ）の少なくともいずれかにより表されるユーグロバール類を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。」である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成について詳述する。本発明に用いるアシルフロログルシノール類及びその誘導体の原料としては、Eucalyptus属に属する植物、例えば、代表的な植林ユーカリであるEucalyptus globulus、Eucalyptus maidenii、Eucalyptus bicostataなど、本化合物類を含有している植物体自体若しくはその粉砕物の抽出物、その精製物又は部分精製物などを挙げることができる。Eucalyptus属に属する植物の部位は葉、樹木、樹皮などいずれも用いることができる。
【００１２】
本発明に用いられるアシルフロログルシノール類及びその誘導体とは、フロログルシン骨格におけるベンゼン核の水素原子が複数のホルミル基、アセチル基、マロニル基などに置換された誘導体類であって、それらは水溶性、脂溶性のどちらでもよい。
本化合物の一例として、例えばユーグロバール-III、グランディノール、ユーカリプチン、マクロカルパール類などを挙げることができる。それらの中でも、特に好適なものとして、ヒアルロニダーゼ阻害活性が強く、しかも、原料植物体の生産量が多くその植物体中の含有率も高いユーグロバール類を挙げることができる。ユーグロバール類は脂溶性が強い為、生体に対する吸収効率の高さも期待される。
【００１３】
アシルフロログルシノール類の生産手段としては、Eucalyptus属植物の葉を有機溶媒などで抽出することで、アシルフロログルシノール類の濃度を高める方法が好適である。使用する有機溶媒としては、例えばメタノ−ル、エタノ−ル、アセトン、酢酸エチル、又はそれらの含水物、クロロホルム、ジクロロメタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどを挙げることができる。本発明において用いられるアシルフロログルシノール類は、これら有機溶媒の中でも、エタノ−ル、アセトン、ヘキサンなどにより抽出したものが好ましい。これらの有機溶媒を用いて抽出物を得るには、公知の方法に従えばよく、例えば前記した植物の葉、樹木、樹皮を適当に破砕した後、それらの粉砕物、また該植物の樹液を前記した有機溶媒で公知の方法を用いて処理する。具体的には、原料の1〜100倍（質量比）、好ましくは3〜20倍（質量比）の有機溶媒で温度0℃以上、好ましくは10℃からその有機溶媒の沸点以下の温度条件下で、1分〜8週間、好ましくは10分〜1週間抽出処理をする。
【００１４】
前記した条件の中でも、特にヒアルロニダーゼ阻害活性が高いユーグロバール類を選択的に得るためには、例えば、８０％以上のエタノール水を用いて抽出し、その抽出物を更に、無極性溶媒で抽出する方法が好ましい。この方法により、アシルフロログルシノールのうち極性の高いものがまざらず、極性の低いユーグロバール類を選択的に得ることができる。
【００１５】
超臨界ガスを用いて効率良く抽出ことも可能であり、例えば超臨界ガスとして炭酸ガスなどを用い、これにエントレーナーとしてエタノール、水などを加え、0〜100℃、好ましくは20〜40℃、5〜2000kg/cm2、好ましくは20〜800kg/cm2、5分〜4日間、好ましくは30分〜20時間などの条件を適宜組み合わせて行なうことができる。
【００１６】
上記のごとくして得られた抽出処理物自体を精製に用いてもよいが、好ましくは有機溶媒を通常の方法、例えばロータリエバポレーターなどを使用して除去するのがよい。或いは更に、凍結乾燥や加熱乾燥処理を施してもよい。
【００１７】
上記抽出物からアシルフロログルシノール類を精製するには、公知の天然有機化合物類の分離・精製法を採用すればよい。例えば、活性炭、シリカ、化学修飾シリカ、ポリマー系担体などを用いた吸脱着、あるいはクロマトグラフィー、液−液抽出、分別沈澱などの手法により、不純物を除き精製する。具体的には、上記抽出物をＯＤＳ−カラムクロマトグラフィーに供し、60〜100％（以下全て質量％）エタノール溶液または適宜の濃度のメタノール或いはアセトニトリルを溶離液として溶出・分画する。これらのクロマトグラフィーによって分離される成分を集め、濃縮・結晶化するとユーグロバール類を含むアシルフロログルシノール誘導体が得られる。
【００１８】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の用途としては、一般的な炎症による痛みやかゆみの改善及び抗老化を目的とした医薬品、医薬部外品及び化粧品等の薬用化粧品の他に、アトピー性皮膚炎の皮膚の炎症に伴うかゆみや炎症及び花粉症に伴う炎症の軽減を目的とした医薬品、医薬部外品、化粧品及び機能性食品としても使用することが出来る。また、汎用化粧品成分による炎症予防を目的とした成分としても用いることが出来る。更に、紙おむつを構成するセンターシートや吸収体等の吸収性物品、お尻ふきやウエットティッシュ等のシート状製品に適当な方法で含浸させることにより、おむつかぶれの予防・改善等の抗炎症機能を付加した製品を得ることも出来る。
【００１９】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の投与量は、治療すべき症状、年令、体重などにより異なるが、例えば通常、成人１日あたり、本誘導体として10mg〜10g、好ましくは50mg〜5g程度である。
【００２０】
本発明に係わるヒアルロニダーゼ阻害剤には、本発明の効果を損なわない範囲内で、医薬品、医薬部外品、化粧品、機能性食品、吸収性物品及びシート状製品等に配合し得る油脂類、界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子類、顔料、色素、防腐剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤等を含有させることができる。また、例えば、オキシベンゾン、トラネキサム酸、感光素３０１号、４０１号、塩酸ジフェンヒドラジン、アデノシン酸、カラミン、水溶性アズレン、紫根エキス、当帰エキス、ワレモコウエキス、アミノカプロン酸、サリチル酸、ビサボロール等を配合して、抗炎症作用を相乗的に強化することも出来る。
【００２１】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の剤型は任意であり、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム、軟膏、エアゾール剤、カプセル剤、吸収性物品及びシート状製品等の形態の医薬品、医薬部外品、化粧品、機能性食品及び紙おむつ等の雑貨とすることが出来る。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明について参考例及び実施例により詳説する。本発明はこれにより限定されるものではない。まず、ユーグロバール類含有画分の調製（参考例１）、ユーグロバール類の同定（参考例２）、各種ユーカリ属植物のユーグロバール類の定量値（参考例３）を示す。
【００２３】
＜参考例１、ユーグロバール類含有画分の調製＞
ユーグロバール類含有画分は、Eucalyptus bicostataの乾燥葉より、以下の方法で調製した。乾燥葉1kgにヘキサン5Ｌを注入、10分後に溶媒除去によりワックス類を除いた後、88％エタノール18Ｌを注入し、2日後に溶媒留去により抽出残渣を得た。得られた抽出物約40gを更にヘキサン1Ｌで再抽出し、ユーグロバール類含有画分約10gを得た。
【００２４】
得られたユーグロバール類含有画分100ppm（アセトニトリル溶液）の分析用HPLC（カラム：資生堂ＵＧ８０、4.6mm×250mm、移動相：アセトニトリル）によるクロマトグラムを図１に示す。Ａ〜Ｄの４ピークが検出された。
【００２５】
＜参考例２、ユーグロバール類の同定＞
更に、分取HPLC（カラム：資生堂ＵＧ８０、１０ｍｍ×２５０ｍｍ、移動相：アセトニトリル−水（９：１〜１０：０）グラジエント）を用いることで、図１に於けるピークＡ〜Ｄの化合物を単離した。得られた化合物Ａ〜Ｄは、NMR及びFT-IR、FAB-MS等の機器を用いて分析した。その結果、判明した構造と名称を下記の化１〜化４に示す。４化合物共にユーグロバール類（以下、ユーグロバール類Ａ〜Ｄと表示する）であった。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
【化２】
0004178800.tif 000003
【００２８】
【化３】
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【００２９】
【化４】
0004178800.tif 000005
【００３０】
＜参考例３、ユーカリ属植物のユーグロバール類の定量値＞
８種のユーカリ属植物葉に於けるユーグロバール類の含有量を、参考例１記載の方法で抽出・分析し、ユーグロバール類Ａ〜Ｄから算出した検量線回帰式を用いて定量した。表１に定量値（対絶乾葉質量％）を示す。用いた８種全てのユーカリ属植物にユーグロバール類が含まれていることが分かった。
【００３１】
【表１】
0004178800.tif 000006
【００３２】
次に、ユーグロバール類のヒアルロニダーゼ阻害活性試験（実施例１）及び安全性試験（実施例２）の概要及び結果を示す。また、ユーグロバール類を含有する皮膚外用剤の調製例（実施例３）を示す。
【００３３】
＜実施例１、ヒアルロニダーゼ阻害活性試験＞
ユーグロバール類Ａ〜Ｄのヒアルロニダーゼ阻害活性試験は、文献（Alexander V. Maksimenko et.al. European J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 51 33-38 、2001）を一部改変して実施した。ヒアルロン酸のような多糖類が多糖類分解酵素で分解されると反応液の粘度が低下する為、その粘度低下を指標とし、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定することが出来る。なお、粘度は、常法によりキャノン−フェンスケ型粘度測定器を用いて37℃で測定した。
【００３４】
具体的には、まず、0.15Ｍ塩化ナトリウムを含む0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ5.45）に、ヒアルロン酸カリウム（和光純薬（株）製）を0.02％となるように溶解し、反応液とした。反応液５ｍｌに、ユーグロバール類のサンプル溶液（溶剤：ＤＭＳＯ）200μｌを入れた後、反応前の粘度を測定した。次に、上記反応液に、0.2mg/mlヒアルロニダーゼ溶液（和光純薬（株）製、60Ｕ／ｍｌ、溶剤：上記リン酸緩衝液）10μｌを注入・混合し、37℃で5分間反応させた。沸騰水浴中で反応停止後、再び粘度を測定し、ヒアルロニダーゼ阻害活性（IC50）を算出した。なお、対照としては、グリチルリチン酸ジカリウム（陽性）とＤＭＳＯ（陰性）を用いた。その結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
0004178800.tif 000007
【００３６】
ユーグロバール類Ａ〜Ｄは、何れも強いヒアルロニダーゼ阻害活性を有することがわかった。特に、ユーグロバール類Ｃには非常に強い阻害活性が認められた。
【００３７】
＜実施例２、安全性試験＞
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（雄、５週齢、日本チャールズリバー（株）製）の背毛を剃毛後、背皮にユーグロバール類Ａ〜Ｄ（0.1％、溶剤：70％エタノール）100μｌを１日１回２週間塗布したが、炎症等の異常は観察されなかった。従って、皮膚に対する安全性は極めて高いと考えられる。
【００３８】
＜実施例３、ユーグロバールを含有する皮膚外用剤の調製例＞
参考例１及び参考例２記載の方法で得たユーグロバール類を乳鉢で微粉末とし、以下の処方で配合して全量を100ｍｌとし、皮膚外用剤を調製した。
処方：（１）エタノール、50.0％  （２）ポリエチレングリコール、10.0g  （３）ヒドロキシエチルセルロース、0.1g（４）トリエタノールアミン、2.0ｇ  （５）精製水、47.0％  （６）ユーグロバール類Ａ、1.0ｇ
製法：室温にて（１）に（６）を溶解し、（５）を加え、溶解した後、（２）、（３）、（４）を順次添加して撹拌して完全に混合した。
【００３９】
【発明の効果】
本発明で得られるヒアルロニダーゼ阻害剤は、強い炎症阻害作用を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品、機能性食品及び雑貨等の成分として、抗炎症、抗かゆみなどの効果が期待でき、また、アトピー性皮膚炎によるかぶれやかゆみの予防・改善にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ユーグロバール含有画分の高速液体クロマトグラムを示す図、横軸は保持時間、縦軸は２８０ｎｍにおけるシグナル強度を示す。
【図１】
0004178800.tif 000012