(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列からなる寄生蠕虫核酸分子。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする核酸配列からなる寄生蠕虫核酸分子。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列からなる寄生蠕虫蛋白質。
【請求項４】
配列番号１の核酸配列によってコード化される寄生蠕虫蛋白質。
【請求項５】
請求項３に記載の寄生蠕虫蛋白質に選択的に結合可能な抗体。
【請求項６】
請求項３に記載の寄生蠕虫蛋白質を生成する方法であって、該方法は、請求項３の寄生蠕虫蛋白質を生成可能な組換え形質発現系であって、少なくとも一つの制御配列に有効に連結された前記蛋白質をコード化する核酸配列を備える組換え形質発現系を含む組換え宿主細胞を有効な培地中で培養することからなる、方法。
【請求項７】
請求項３に記載の寄生蠕虫蛋白質に選択的に結合可能な抗体を生成する方法であって、前記方法は前記抗体を生成するために、有効量の前記寄生蠕虫蛋白質を非ヒト動物に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は新たな寄生蠕虫蛋白質（Parasitic helminth proteins）、同蛋白質をコード化する核酸配列、及び同蛋白質に対抗して形成される抗体に関する。更に、本発明は前記の核酸配列及び蛋白質を得るための方法と、動物を感染から保護するための前記の核酸配列、抗体及び蛋白質の使用方法とに関する。特に、本発明はディロフィラリア・インミティス（Dirofilaria immitis）（以下、Ｄ．インミティスと称する）の核酸配列及び蛋白質と、動物をイヌ糸状虫による感染から保護するための同核酸配列及び蛋白質の使用とに関する。
発明の背景
効果的なワクチンが実質的に存在しないため、人間を含む動物における寄生蠕虫による感染は一般的に化学薬剤によって治療されている。化学薬剤に関する問題点の１つとしては、同薬剤の頻繁な投与の必要性が挙げられる。例えば、イヌ糸状虫に感染し易い犬は保護に必要な薬剤濃度を維持すべく処置を月毎に受けている。しかし、寄生蠕虫による感染を治療すべく薬剤を反復投与することにより、治療に反応しない耐性種が発生する。更に、化学薬剤の多くは治療を受ける動物にとって有害なうえ、寄生虫の抵抗力の増大により更に多くの投与量が必要となり、副作用が増大する。
寄生虫のライフサイクルの複雑さと、寄生虫または寄生虫抗原の投与により多くの抗体反応が生じる一方で、動物を感染から保護する免疫反応が不十分なこととに起因して寄生蠕虫による感染に対抗するワクチンの開発は特に困難である。
多くの寄生虫同様に、イヌ糸状虫症を引き起こす蠕虫であるＤ．インミティスのライフサイクルは各種の生物形態（Life form）を含み、各生物形態は免疫処置における異なる標的及び攻撃の存在を意味する。寄生中の成虫はかなり大きく、動物の心臓及び肺動脈に好んで生息している。雄は長さが約１２〜２０ｃｍであり、幅が約０．７〜０．９ｍｍである。雌は長さが約２５〜３１ｃｍであり、幅が１．０〜１．３ｍｍである。性的に成熟した成虫は交尾の後に僅か約３００μｍの長さ及び約７μｍの幅を備えたミクロフィラリア（Microfilariae）を産む。ミクロフィラリアは犬の毛細血管床を横切り、さらには脈管系内を循環する。そして、血液１ｍｌ中には約１０3〜１０5匹のミクロフィラリアが含まれる。犬の感染を立証する１つの方法としては、脈管系内を循環するミクロフィラリアの検出が挙げられる。
犬を昆虫の全く存在しない環境下に維持した場合、寄生虫のライフサイクルは進展不可能である。しかし、雌の蚊が感染した犬の血を摂取するのと同時にミクロフィラリアを摂取した場合、ミクロフィラリアは蚊の体内において幼虫へと発育する。ミクロフィラリアは２つの幼虫ステージ（Ｌ１及びＬ２）を経て、約１．１ｍｍの長さを備えた第３ステージの幼虫（Ｌ３）へと成長する。蚊が犬を刺すことにより第３ステージの幼虫は犬の体内へ戻される。従って、初期感染はＬ３ステージにおいて生じる。感染から早くも３日後に、Ｌ３は第４幼虫（Ｌ４）ステージへと脱皮し、次いで第５ステージまたは幼い成虫へと脱皮する。幼い成虫は心臓及び肺動脈へと移動し、そこで成長し、かつ繁殖してミクロフィラリアを血液中に産み落とす。イヌ糸状虫による犬の“隠れた”感染（“Occult”infection）とは、ミクロフィラリアの検出が全く不可能な一方、成虫のイヌ糸状虫の存在が胸部診断により決定し得るものと定義できる。
イヌ糸状虫は一般的に感染後に免疫を形成できない犬（即ち、犬は化学療法によって完治しても再び感染し得る）にとって大きな問題であるばかりか、猫及びケナガイタチ等の他の親しい動物にも徐々に大きく広がっている。人体へのイヌ糸状虫の感染も報告されている。他の寄生蠕虫による感染も広がっており、これらの感染は全て予防ワクチン・プログラムを含む更に優れた治療を必要とする。
多くの研究者が特定の抗原に基づくワクチンの開発を試みているが、抗体の形成を刺激する抗原の能力が、感染、特に寄生蠕虫による感染から動物を保護し得る免疫反応を刺激する抗原の能力とは必ずしも関係しないことは周知である。多数の物質が免疫原性を備え、さらには血清の形成を招来する。しかし、これによって形成された血清は免疫を誘発する抗原との反応能力を調べる免疫測定において陽性を示す一方で、感染から宿主を保護することができない。生体外での測定において感染因子（Infective agent）を中立化する抗体は、攻撃に対する防御性を生体内において更に強く示す傾向にある。従って、単に免疫処置または寄生蠕虫による感染によって形成された血清を有望なワクチンのスクリーニングに使用しても、防御性を備えた免疫原を同定するための十分な特異性は得られない。その一方、感染に対する明白な防御性を示す免疫化された動物から得られた血清または他の血液成分は、治療用組成物（Therapeutic compositions）として使用された際に、攻撃に対する防御をもたらす免疫反応を引き出し得る抗原に対して選択的に結合できる抗体、細胞または他の因子を含み得る。
最も感染性の強い疾病、特に、長く複雑な成長過程を有する寄生虫による感染等による疾病において、感染した動物から得られた血清またはＴ細胞をスクリーニング試薬（Screening reagent）として使用すべく同血清またはＴ細胞の防御効果を確かめることは困難である。第１に、感染因子を用いて宿主の動物を最初に攻撃し、次いで血清の抗体成分を例えばスクリーンとして使用し得ることを立証する以前に、前記の動物が防御されていることを立証する必要があるため、攻撃に対する防御性の確認は長い時間を要する。このような支配下における防御性の定義は複雑な場合が多い。第２に、攻撃に対する防御効果が立証されたとしても、同防御効果が免疫システムのいづれの成分に起因するものかが不明確である。防御効果は抗体、細胞、免疫システムの媒介物質、及びこれらの組み合わせのうちのいづれか１つに起因することが考えられる。従って、スクリーニング試薬を得る前記の方法は時々使用されるが、しかし時間を要するとともに、防御性成分（Protective components）の同定を許容しない。
体外における免疫処置プロトコールの有効性を断定する方法には、感染因子を含む拡散チャンバ（Diffusion chambers）を免疫化された動物の体内に移植し、免疫化が移植された感染物質に対して及ぼす影響を決定することが含まれる。１９８８年に発行された米国熱帯医療衛生学会誌（Am. J. Trop. Med. Hyg.）の第３９巻の３７３〜３７９頁に記載されているグリーブ他の記述には、Ｄ．インミティスによる感染について免疫化された犬に対して感染性を備えた幼虫を含む拡散チャンバを移植したことが開示されている。そして、以前に実施された免疫化の効果を確認すべくチャンバ内に含まれる幼虫を評価し得る。１９８８年に発行された寄生虫学誌（J. Parasit.）の第７４巻の２７５〜２８２頁に記載されているアブラハム他の記述には、Ｌ３を用いて免疫化したマウスに対してＤ．インミティスの第３ステージの幼虫を内包する拡散チャンバを移植したことが開示されている。そして、これらの幼虫に対する影響は、前記の免疫化による免疫形成が推定されるマウスの免疫性の決定に使用された。従って、これらの記述は、免疫化された動物に対して感染因子を内包する拡散チャンバを移植することが、特定の直接加えられた活性免疫処置プロトコール（Certain directly administered active immunization protocols）の効果に関する都合の良い評価を提供する点を開示している。しかし、これらの記述には、ターゲットである宿主の血流のうちの選択された分量に含まれる受動的に移入された防御効果（Passively transferred protective effects）を監視するための拡散チャンバの使用は開示されていない。
前記したように、寄生虫感染の複雑さは予防接種に用いる免疫原の選択を非常に困難にしている。このため、寄生蠕虫による感染に対する防御は実現が困難である。Ｄ．インミティスに以前に感染したか、または現在感染している犬は再度感染し得るため、自然に付与された免疫の存続を保証することもできない（例：１９８３年に発行された疫学レビュー（Epidemiologic Reviews）の第５巻の２２０〜２４６頁に記載されているグリーブ他の記述を参照のこと）。しかし、このレビューには感染した犬に含まれる成熟した寄生虫の数を明らかに制限する自然発生の防御免疫反応に関する幾つかの証拠の存在が開示されている。
更に、防御免疫を人工的に誘発することも可能である。１９７４年に発行された寄生虫学実験（Exp. Parasitol）の第３５巻の４６５〜４７４頁に記載されているウング他の記述には、放射線照射により毒性を低下させた感染性の幼虫を用いた犬の免疫処置が開示されている。犬は攻撃時に異なる度合いにて防御された。１９８２年にカナダのトロントで開催された第五回国際寄生虫学会議（International Congress of Parasitology）において、ブレアー他は効果的な免疫処置を開示している。同免疫処置では、犬を最初に感染させ、次いで化学療法を用いることにより同感染を第４幼虫ステージにおいて終結させている。
１９８９年に発行されたイヌ糸状虫症の過程（Proc. Heartworm Symp.）の１８７〜１９０頁に記載されているグリーブの記述には、犬の体内に存在するイヌ糸状虫に対抗するワクチンの形成に関する努力の現状が開示されている。この記述には、犬及びマウスに対する接種プロトコールの効果を評価するために不活性拡散チャンバ（Inert diffusion chamber）内に内包された感染性を備えた幼虫の使用に関する概略が開示されている。不活性拡散チャンバは宿主の細胞及び血清のうちの少なくとも一方が同チャンバ内へ流入することを許容するとともに、寄生虫から出された物質が同チャンバから流出することを許容している。感染性を備えた幼虫を用いた免疫処置の使用は、続いて行われる攻撃に対する防御に部分的な効果を示すことが立証されている。
例えば、イヌ糸状虫ワクチンを発見するための別のアプローチとしては、Ｄ．インミティスの感染期において優れた抗原を同定する試みが挙げられる。１９８６年に発行された免疫学誌（J. Immunol.）の第１３６巻の２６２１〜２６２７頁に記載されているフィリップ他の記述では、Ｄ．インミティスの第３ステージの幼虫から得られた３５キロダルトン（ｋＤ）の分子量を備えた主な表面抗原が開示されており、同表面抗原は実験的にＤ．インミティス感染に曝された犬から得られた血清、または放射線照射を受けた第３ステージの幼虫によって免疫化された犬から得られた血清との間で免疫沈降反応を示し得る。これに加えて、このグループはＬ４から得られた３つの主な表面蛋白質を開示しており、同表面蛋白質はそれぞれ１５０ｋＤ、５２ｋＤ及び２５ｋＤの分子量を備えている（１９８８年に開催された米国熱帯医療衛生学会（Am. Soc. Trop. Med. Hyg.）の第３７回年次総会の要約４０４頁に記載のデービス他の記述参照）。２５ｋＤの分子はＬ４の幼虫に特異的な分子とみられる。
１９８９年に発行された寄生虫学（Parasitol.）の第９９巻の８９〜９７頁に記載されているイブラヒム他の開示は、125Ｉによって標識付けされたＤ．インミティスのＬ３の幼虫を使用し、３５ｋＤ及び６ｋＤの成分が寄生虫の生育によって培養基中に加えられたことを示している。更に、イブラハム他は免疫化されたラビット及び感染した犬から得られた抗体が３５ｋＤの成分を免疫沈降させた一方、６ｋＤの成分については免疫沈降させなかったことを開示している。
１９９０年に発行されたアクタ・トロピカ（Acta Tropica）の第４７巻の３３９〜３５３頁に記載されているスコット他の記述は、放射性同位体による標識付け技術及びドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）を用いたＤ．インミティスのＬ２、Ｌ３及びＬ４の表面に付随する分子の特徴づけを開示している。スコット他はヨウ素による標識付けが行われたＬ２及びＬ３からの抽出物中に含まれた３５ｋＤ及び６ｋＤの標識付けされた主な成分を発見した。ラクトペルオキシダーゼによる触媒作用を受けた標識は、それぞれ６６ｋＤ、４８ｋＤ、２５ｋＤ、１６．５ｋＤ及び１２ｋＤの見掛け分子量を備えた成分を明らかにした。Ｌ４の表面に付随する分子に対するヨウ素による標識付けにより、それぞれ５７ｋＤ、４０ｋＤ、２５ｋＤ、１２ｋＤ及び１０ｋＤの見掛け分子量を備えた分子が明らかになった。ラクトペルオキシダーゼによる触媒作用を受けた標識はそれぞれ４５ｋＤ、４３ｋＤ及び３ｋＤの別のバンド（Band）を明らかにした。しかし、これらの抗原は特徴づけされていない血清源を用いて同定された。
一般的に、寄生虫に対抗するワクチンを得る別のアプローチは中立化をもたらす抗体（Neutralizing antibodies）の形成に焦点を絞っている。例えば、１９８１年に発行された王立協会熱帯医療衛生学会誌（Trans. Roy. Soc, Trop. Med. Hyg.）の第７５巻の１７３〜１７４頁に記載のターナー他の記述及び１９８２年に発行された王立協会熱帯医療衛生学会誌の第７６巻の３６２〜３７０頁に記載のサイモン他の記述にみられる生体外実験、並びに１９８８年に発行された免疫学（Immunol.）の第６４巻の１６９〜１７４頁に記載されているパラブ他の記述に開示されている生体内実験では、抗体は単独で使用するか、または他の免疫成分とともに使用した場合に、ジペタロネーマ（アカントケイロネマ）ヴィティアエ（Dipetalonema（Acanthocheilonema）viteae）またはブルギア  マレー（Brugua malayi）から得られた糸状虫のＬ３を殺すのに効果的であることが示されている。更に、スキストソーマ  マンソーニ（Schistosoma mansoni）に対する受動免疫は免疫性を備えたラットまたは人から正常なマウスの体内へと移された（例：１９７５年に発行された寄生虫学（Parasitol.）の第７０巻の３４７〜３５７頁に記載されているシャー他の記述及び１９８９年に発行された米国熱帯医療衛生学会誌の第４１巻の５５３〜５６２頁に記載されているジュオ他の記述を参照）。これらの研究のうちのいづれも防御抗原（Protective antigen）の同定に効果を発揮するスクリーニングの道具としての血清成分または細胞成分の能力を決定する生体内評価分析（In vivo assay）の使用を開示していない。しかも、これらの研究はいづれも効果的なワクチンを同定していない。
発明の概要
本発明はストリンジェント条件（Stringent conditions）下で、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４（D. immitis nucleic acid sequence p4）及びＤ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕのうちの少なくとも一方の少なくとも一部に対して混成可能な寄生蠕虫の分離された核酸配列（以下、分離核酸配列と称する）を含む。好ましい分離核酸配列は蠕虫の成長を抑制し得る免疫血清の少なくとも１つの成分に対して選択的に結合可能な蛋白質をコード化する。別の好ましい核酸配列は、ハイブリッド形成のためのストリンジェント条件（Stringent hybridization conditions）下においてＤ．インミティス核酸配列の少なくとも１つに対して混成可能なオリゴヌクレオチドを含む。更に、本発明は本発明の分離核酸を含む組換え分子（Recombinant molecules）及び組換え細胞を含む。これに加えて、本発明は本発明の分離核酸配列を形成する方法を含む。
本発明の別の形態は蠕虫の成長を抑制し得る免疫血清の少なくとも１つの成分に対して選択的に結合可能な寄生蠕虫の分離された蛋白質（以下、分離蛋白質と称する）、または同蛋白質のミメトープ（Mimetope）を含む。前記の蛋白質はストリンジェント条件下で、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４及びＤ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕのうちの少なくとも一方の少なくとも一部に対して混成可能な寄生蠕虫の分離核酸配列によってコード化されている。好ましい免疫血清は蠕虫による感染に対する免疫性を備えた動物、好ましくは第３ステージの幼虫及び第４ステージの幼虫のうちの少なくとも一方を用いて免疫化された動物に由来する。本発明は本発明の分離蛋白質及びミメトープを形成する方法を含む。
本発明の別の実施の形態は寄生蠕虫の蛋白質または同蛋白質のミメトープに対して選択的に結合可能な抗体を含み、同抗体は本発明の分離蛋白質またはミメトープの有効量を動物に対して投与することを含む方法によって形成される。本発明は前記の抗体を形成する方法を更に含む。
本発明の別の形態としては、動物に対して効果的な方法で投与した際に寄生蠕虫による感染から動物を保護し得る治療用組成物が挙げられる。治療用組成物は本発明の分離核酸配列、本発明の分離蛋白質またはミメトープ、及び本発明の抗体のうちの少なくとも１つの治療用化合物を含む。組成物は賦形剤、アジュバント及び担体（Carrier）のうちの少なくと１つを含む。好ましくは、治療用組成物は動物をイヌ糸状虫から保護する。本発明は治療用組成物を投与することにより動物を寄生蠕虫による感染から保護する方法を含む。
本発明の別の形態には、動物に対して効果的に投与した際に寄生蠕虫による感染から同動物を保護し得る治療用組成物が含まれ、同治療用組成物には寄生蠕虫のＬＤＬ受容体に関連した蛋白質のクラスＡのシステインの豊富なモチーフ（Parasitic helminth LDL receptor-related protein class A cysteine-rich motif）の機能を実質的に阻害し得る化合物が含まれる。好まし治療用組成物はストリンジェント条件下で、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４の少なくとも一部への混成が可能な分離核酸配列によってコード化された蛋白質である。本発明は前記の治療用組成物を用いることにより寄生蠕虫による感染から動物を保護する方法を含む。本発明の好ましい寄生蠕虫には、線虫（Nematodes）、条虫（Cestodes）及び吸虫（Trematodes）が含まれ、更に好ましくは線虫のうちの糸状虫（Filarial nematodes）、回虫（Ascaride）、円虫（Strongyle）及び毛様線虫（Trichostrongyle）が含まれる。本発明の更に好ましい寄生蠕虫としては、糸状虫のうちのディロフィラリア、オンコセルカ（Onchocerca）、ブルギア（Brugia）、ブケレリア（Wuchereria）、ロア（Loa）、アカントケイロネマ（Acanthocheilonema）、ジペタロネーマ（Dipetalonema）、セタリア（Setaria）、パラフィラリア（Parafilaria）及びステファノフィラリア（Stephanofilaria）が含まれ、更に好ましくはイヌ糸状虫症を引き起こすＤ．インミティスが含まれる。
本発明は哺乳動物に寄生する線虫のＬ３幼虫ステージまたはＬ４幼虫ステージから分離可能な生物学的に純粋な蛋白質、または同蛋白質のフラグメントを含む。これらの蛋白質またはフラグメントは免疫性を備えた宿主の体内において防御性を示すことが確認された成分との間で免疫反応を示す。生物学的に純粋な蛋白質は、（ａ）トリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Tris-glycine SDS-PAGE）によって測定された約３９ｋＤの分子量を備えたＰ３９蛋白質、（ｂ）トリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定において約２２ｋＤの分子量を示し、かつトリス−トリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Tris-tricine SDS-PAGE）による測定において約１９ｋＤの分子量を示すＰ２２Ｌ蛋白質、及び（ｃ）トリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定において約２０．５ｋＤの分子量を示し、かつトリス−トリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定において約１６ｋＤの分子量を示すＰ２０．５蛋白質のうちのいずれか１つであることを特徴とする。線虫は好ましくは糸状虫であって、更に好ましくはＤ．インミティスである。本発明の１つの実施の形態は前記の蛋白質との間で免疫反応を示す抗体を含む。
本発明は前記の特性を備えたＰ３９蛋白質，Ｐ２２Ｌ蛋白質及びＰ２０．５蛋白質のうちの少なくとも１つまたは同蛋白質のフラグメントをコード化する核酸配列を含む。更に本発明は、これらの核酸配列のうちの少なくとも一部に対する相補性を備えたオリゴヌクレオチドを含む。本発明は前記の核酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも一部分を含む組換えベクター（Recombinant vector）を含む。
本発明の別の実施の形態は前記の蛋白質のうちの少なくとも１つを形成し得る組換え発現システム（Recombinant expression system）を含み、同システムは少なくとも１つの制御配列（Control sequence）に対して機能し得るよう結合された蛋白質をコード化する核酸配列を有する。更に、本発明は前記の組換え発現システムを備えた組換え宿主細胞（Recombinant host cell）を含む。
本発明の１つの態様は前記の特性を備えたＰ３９蛋白質、Ｐ２２Ｌ蛋白質及びＰ２０．５蛋白質のうちの少なくとも１つまたは同蛋白質のフラグメントを形成する方法を含む。この方法は（ａ）発現に対する互換性を備えた条件下において前記の蛋白質を形成可能な組換え宿主細胞を培養することと、（ｂ）カルチャーから蛋白質またはフラグメントを回収することとを含む。本発明はこの方法によって形成された蛋白質を含む。
更に、本発明は感染し易い哺乳動物である宿主を寄生線虫に対抗して免疫化するのに効果的な製薬組成物（Pharmaceutical composition）を含み、同組成物はＰ９３９蛋白質、Ｐ２２Ｌ蛋白質及びＰ２０．５蛋白質のうちの少なくとも１つまたは同蛋白質のフラグメントを薬事的に許容し得る適切な賦形剤との混合物として含む。これに加えて、本発明は哺乳動物である宿主を寄生線虫に対抗して免疫化する方法を含み、同方法は宿主に対して蛋白質、フラグメント、またはこれらの製薬組成物の有効量を投与することが含まれる。線虫は糸状虫であることが好ましい。線虫は更に好ましくはＤ．インミティスであり、その宿主は犬科の動物である。
本発明の別の態様は哺乳動物である宿主を寄生線虫に対抗して免疫化するために使用する製薬組成物を含み、同組成物は前記の組換え発現システムを薬事的に許容される賦形剤との混合物として含む。本発明の態様には、哺乳動物である宿主を寄生線虫に対抗して免疫化する方法が含まれ、同方法は発現システムはたは同システムの製薬組成物の有効量を宿主に対して投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
図１は陽イオン交換クロマトグラフィー（Cation exchange chromatography）による幼虫のＥＳの分離のクロマトグラムを示す。
図２はＣ18逆相クロマトグラフィーによるＰ２２Ｕのトリプシン  フラグメントの分離のクロマトグラムを示し、Ｐ２２Ｕは陽イオン交換及びＣ4逆相クロマトグラフィーによって純化された。
図３は親水性プロット（Hydrophilicity plot）及びＰ２０．５（２０ｋＤとも称する）蛋白質及びＰ２２Ｌ（２２Ｌ kDとも称する）蛋白質の配列に対して計算された蛋白質特性を示している。
発明の詳細な説明
本発明は蠕虫による感染に対する免疫性を備えた動物から採取された血清の成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合可能な寄生蠕虫の分離蛋白質及び同蛋白質のミメトープを含み、前記の血清は蠕虫の成長を抑制可能である。即ち、前記の蛋白質は例えば１９９２年８月に公開になったグリーブ他による国際特許出願公開第ＷＯ９２／１３５６０号に開示されている方法を用いることにより免疫性を備えた宿主の体内における防御性が実証された成分との間に免疫反応を示す。前記の血清中の成分に対して選択的に結合する前記の蛋白質及びミメトープの能力は、同蛋白質及びミメトープのうちの少なくとも一方が動物に対して効果的に投与された際に寄生虫感染から動物を保護する同蛋白質及びミメトープの能力を示すと考えられる。
寄生蠕虫による感染に対する免疫性を備えた動物としては、同感染から動物を保護するのに十分な免疫反応を示す動物が挙げられる。一般的に、免疫性を備えた動物としては、好ましくは放射線照射された蠕虫または化学的に短縮された感染プロトコール（Chemically-abbreviated infection protocol）を用いる防御反応の誘発に効果的な方法で蠕虫の幼虫、成虫及びミクロフィラリアのうちの少なくとも１つの投与を受けた動物が挙げられる。例えば、化学的に短縮されたＤ．インミティスの幼虫による感染を受けた犬は感染を攻撃する強力な免疫性を示す。更に、前記の犬から得られた血清は、幼虫を殺す能力及び幼虫を気絶させる能力をマウスの体内へ受動的に移すのに効果的である。本発明では、動物の体内へ投与されたＬ３幼虫が成虫の寄生虫に成長することを防止することが特に好ましい点から、免疫性を備えた好ましい動物としては、蠕虫の幼虫、特にＬ３幼虫及びＬ４幼虫のうちの少なくとも一方に対抗して免疫化された動物が挙げられる。しかし、免疫性を備えた動物は防御抗体を形成する自然に感染した動物を排除するものではない。
本発明に基づき、寄生蠕虫の分離蛋白質または寄生蠕虫の生物学的に純粋な蛋白質は、同蛋白質自身の自然の環境から取り出された蛋白質である。ここに示す“分離”または“生物学的に純粋な”という用語は、蛋白質が精製された状態を必ずしも意味しない。寄生蠕虫の分離蛋白質は同蛋白質自身の天然の存在場所から得ることができる。これに代えて、寄生蠕虫の分離蛋白質はＤＮＡ組換え技術または化学合成を用いることによって形成し得る。分離蛋白質は完全な長さの蛋白質及び同蛋白質を修飾した蛋白質が含まれる。前記の修飾蛋白質には、アミノ酸の削除（例えばペプチド等、蛋白質を切り詰めたもの）、アミノ酸の挿入、アミノ酸の反転、アミノ酸の置換及びアミノ酸の誘導体の形成（例：グリコシル化、リン酸化、アセチル化）のうちの少なくとも１つの処置が加えられている。この結果、修飾蛋白質は天然蛋白質の機能にほぼ類似した生物学的機能を有している（即ち、機能的に天然蛋白質と同等である）。蛋白質の直接的修飾または同蛋白質をコード化する遺伝子の修飾を含む従来用の技術によって修飾を行うことができる。例えば、遺伝子の修飾には、無作為突然変異生成または定まった標的に対する突然変異生成（Targeted mutagenesis）を実施すべく古くから用いられている技術またはＤＮＡ組換え技術を使用できる。本発明の分離蛋白質には同蛋白質の修飾蛋白質が含まれ、これらの蛋白質は抗寄生蠕虫免疫血清（Anti-parasitic helminth immune serum）の成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合する蛋白質の能力によって直接的に同定し得る。ここで述べる免疫血清とは、蠕虫に対する免疫性を備えた動物に由来し（由来の１つの例としては動物から直接的に採取することが挙げられる）、かつ蠕虫の成長を抑制し得る血清を意味する。本発明の分離蛋白質の最小限の寸法は、エピトープの形成に十分な大きさを備え、かつ一般的に少なくとも約７〜９個のアミノ酸からなる長さを有する。当業者が予想し得るように、エピトープは自然の状態において互いに接触し合うアミノ酸と、天然蛋白質の三次元構造のためにエピトープを形成するのに十分に互いに近接するアミノ酸とを含み得る。
本発明において、ミメトープは抗寄生蠕虫免疫血清の成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合する本発明の分離蛋白質の能力を真似し得る全ての化合物を意味する。ミメトープは減成に対する自身の感受性を低減すべく修飾されている一方、自身の選択的結合能力を保持するペプチドであり得る。ミメトープの別の例としては、分離蛋白質の１つ以上のエピトープを真似る少なくとも１つの結合部位と、分離蛋白質のうちの非蛋白質である免疫原性部分（例：炭水化物構造）と、本発明の分離蛋白質の少なくとも１つのエピトープに類似した構造を備える人工または天然の有機分子（核酸を含む）とを含む抗イディオタイプ抗体（Anti-idiotypic antibodies）または同抗体のフラグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、このようなミメトープは本発明の免疫血清または本発明の分離蛋白質に対抗して形成された抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィー技術によって得られる。
ここで“選択的に結合する”とは、寄生蠕虫による攻撃（自然感染または蠕虫の投与を介した攻撃）に曝された動物から得られた血清に対して結合する一方、標準的な検出技術（１９８９年にコールド・スプリング・ハーバー・ラボ出版社（Cold Spring Harbor Labs Press）から出版された研究室マニュアルに記述されているサムブルック他による分子クローニングに開示されている技術）に基づく検出により、寄生蠕虫に曝されていない動物（即ち、影響を受け易い動物）から採取された血清に対して結合しないことが確認された分離蛋白質及び同蛋白質のミメトープの能力を意味する。好ましくは、分離蛋白質及びミメトープは高い親和力をともなって抗寄生蠕虫免疫血清に対して結合し得る。抗寄生蠕虫免疫血清に対する分離蛋白質または同蛋白質のミメトープの選択的結合能力はイムノブロット検定法（Immunoblot assays）、免疫沈降検定法（Immunoprecipitation assays）、酵素免疫定量法（Enzyme immunoassays）（例：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（Radioimmunoassays）、蛍光抗体法（Immunofluorescent antibody assays）及び免疫電子顕微鏡法（Immunoelectron microscopy）を含む当業者に周知の各種の方法を使用して測定し得る。蠕虫の成長の特定の段階に対抗して形成された免疫血清に対する分離蛋白質または同蛋白質のミメトープの選択的結合能力は、蠕虫の成長の別の段階に対抗して形成された免疫血清に対して同分離蛋白質またはミメトープが結合することを妨げない。例えば、抗幼虫免疫血清（Anti-larval immune serum）に対する分離蛋白質または同蛋白質のミメトープの選択的結合能力は、抗ミクロフィラリア免疫血清（Anti-microfilarial immune serum）及び抗成虫免疫血清（Anti-adult immune serum）のうちの少なくとも一方に対して同分離蛋白質またはミメトープが結合することを妨げない。
ここで“蠕虫による感染に対する免疫性を備えた動物から採取され、かつ蠕虫の成長を抑制し得る血清の成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合可能である”という文章と、“免疫性を備えた宿主の血清または組織の確認済み成分に対して特に免疫反応を示す”という文章とは互いに類似した意味を有する。“確認済み成分”とは、既に同成分の投与を受けた中立宿主（Neutral host）に対して拡散チャンバ内に含まれる同成分を移植した際に、寄生線虫に対して有害な影響を及ぼす本発明の方法に示す成分である。ここで、“特に免疫反応を示す”とは免疫原が免疫性を備えた感染に弱い宿主に由来する確認済み成分に対して結合可能である一方、同一種のうちの免疫性を備えていない対照体（Nonimmune counterparts）の成分に対して結合できないことを意味する。“感染に弱い宿主”とは、問題の寄生線虫による侵襲に対して一般的に弱い宿主種（Host species）を意味する。感染に弱い宿主種の各メンバーは前記の侵襲に対する獲得免疫を有し得る。
本発明の１つの実施の形態は、本発明の分離蛋白質及びミメトープを同定するための抗寄生蠕虫免疫血清の使用を含み、以下、この技術を免疫血清スクリーニング検定法（Immune serum screening assay）と称する。免疫反応を誘発する条件下において動物に蠕虫を投与することにより、免疫血清を寄生蠕虫に対抗して形成し得る。免疫血清は蠕虫の幼虫、ミクロフィラリア及び成虫のうちの少なくとも１つ、好ましくはこのうちの幼虫、更に好ましくはＬ３幼虫及びＬ４幼虫のうちの少なくとも一方に対抗して形成し得る。本発明の免疫血清は免疫反応を誘発した蠕虫種のみならず、免疫血清に対して免疫学的に交差反応する蠕虫種の成長をも抑制し得る。蠕虫間の類似性に起因して、本発明の免疫血清は多くの種類の蠕虫と反応し得る。蠕虫の成長の抑制とは、蠕虫を殺すことと、蠕虫の成長を低下させることと、蠕虫の成熟を阻止することと、蠕虫の形態（Morphology）を変更することと、蠕虫の代謝を変更することと、蠕虫に対して有害であることのうちの少なくとも１つを含む。
蠕虫による感染から自身を保護すべく免疫反応を開始し得る動物とは、蠕虫の投与が可能であって、さらには免疫血清を採取できる適切な動物である。例えば、Ｄ．インミティスの成長を抑制し得る血清を採取する好ましい動物としては、免疫反応を誘発する条件下においてＤ．インミティスのＬ３幼虫及びＬ４幼虫のうちの少なくとも一方を投与された犬が挙げられる。
寄生蠕虫の成長を抑制する本発明の免疫血清の能力は数多くの方法で決定し得る。感染因子の成長を抑制する免疫血清の能力を監視する好ましい方法はグリーブ他によって開示されている（前記の国際特許出願公開第ＷＯ９２／１３５６０号参照）。同国際特許出願公開第ＷＯ９２／１３５６０号に開示されているように、例えば、幼虫の成長を抑制する抗寄生蠕虫幼虫免疫血清（Anti-parasitic helminth larval immune serum）の能力は以下の要領で決定できる。影響を受け易い動物（即ち、以前に寄生蠕虫の幼虫に対して曝されていない動物）は、蠕虫の幼虫、好ましくはＬ３幼虫を含有する少なくとも１つの拡散チャンバを移植される。更に、この動物は試験対象となる抗幼虫免疫血清またはコントロールとしての非免疫血清（Control non-immune serum）を好ましくは拡散チャンバ付近において投与される。マウスの体内に移植されたＤ．インミティス幼虫が例えば約３〜４週間といった適切な時間を経過した後、拡散チャンバを除去し、例えば、抗幼虫免疫血清に曝されたチャンバ内における幼虫の成長及び生存を非免疫血清に曝された拡散チャンバ内における幼虫の成長及び生存と比較することにより幼虫の成長及び発達に対する免疫血清の効果が決定される。非免疫血清に曝された幼虫と比較して、抗幼虫免疫血清に曝された幼虫のうちのかなりの数が殺されたか、または気絶された。
前記のグリーブ他による国際特許出願公開第ＷＯ９２／１３５６０号には、免疫血清に対して選択的に結合する所望の蛋白質をスクリーニングし、かつ同定するための免疫血清スクリーニング検定法の使用が更に開示されている。免疫血清は同免疫血清中に含まれる成分に対して所望の蛋白質が選択的に結合することを許容する条件下において蛋白質を含有する組成物に対して接触させ得る。蛋白質及び血清成分からなるコンプレックスを回収し、次いで蛋白質が血清成分から分離され、かつ分析される。蛋白質をコード化する核酸配列は、例えば前記のサムブルック他の記述に開示されている周知のＤＮＡ組換え技術を使用して同定される。
別の実施の形態において、免疫血清スクリーニング検定法は、免疫血清に対して選択的に結合し得る各クローンによって発現された蛋白質を同定すべく本発明の免疫血清を用いて寄生蠕虫のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより、本発明の分離蛋白質をコード化する核酸配列を同定するために使用できる。免疫血清スクリーニング検定法は抗Ｌ３幼虫免疫血清（Anti-L3 larval immune serum）及び抗Ｌ４幼虫免疫血清（Anti-L4 larval immune serum）のうちの少なくとも一方に代表される免疫血清に対して選択的に結合し得るミメトープの同定に使用し得る。ミメトープは免疫血清スクリーニング検定法によって同定された蛋白質に由来する情報を使用して設計または改良できる。血清のみならず、蠕虫による感染に対する免疫性を備えた動物から採取された体液に含まれる細胞、特定の抗体及びこれらのフラグメント等に代表される他の免疫原性物質を免疫血清スクリーニング検定法に使用できる。
前記のグリーブ他による国際特許出願公開第ＷＯ９２／１３５６０号に開示されているように、抗幼虫免疫血清はＬ３及びＬ４のうちの少なくとも一方において発現した線虫蛋白質を同定するために使用されており、同線虫蛋白質はトリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって測定した際における移動パターンからそれぞれ６６ｋＤ、６５ｋＤ、５９ｋＤ、３９ｋＤ、３３ｋＤ、２３／２４ｋＤ、２２／２０．５ｋＤ及び１４ｋＤの分子量を有することが確認された。これらの蛋白質をコード化する核酸配列は、線虫の幼虫のｃＤＮＡ発現ライブラり（Lraval nematode cDNA expression libraries）をスクリーニングすべく抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清のうちの少なくとも一方を使用して同定し得る。
本発明の１つの実施の形態は本発明の分離蛋白質をコード化する寄生蠕虫の分離核酸配列を含む。ここで述べる寄生蠕虫の分離核酸配列とは、自身の自然の環境から取り出された核酸配列を意味する。“分離”とは核酸が純化された状態を示すものではない。分離核酸配列はＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体であり得る。本発明の分離核酸配列は本発明の免疫血清に選択的に結合し得る少なくとも１つのエピトープ及びオリゴヌクレオチドをコード化する配列を含み、同オリゴヌクレオチドは、例えばアンチセンスに関する技術（Antisense-based technology）、トリプレックス形成に関する技術（Triplex formation-based technology）及びリボザイムに関する技術（Ribozyme-based technology）のうちの少なくとも１つを使用するプローブ、プライマー及び治療用薬剤を含む各種の機能を有し得るが、同オリゴヌクレオチドの機能はこれらに限定されない。寄生蠕虫の分離核酸配列は自身の天然の存在場所から遺伝子全体または同遺伝子の一部分として回収でき、同一部分の大きさはストリンジェント条件下において、類似した核酸配列を備えた安定したハイブリッドを形成し得る大きさである。この際、分離核酸配列は対応するコード領域（例：転写調節領域、転写調節配列、翻訳調節領域、翻訳調節配列）の発現を調節する調節領域を含むことができ、同調節領域は同コード領域の全ての長さ若しくは一部の長さ、または同一部の長さを組合わせた長さの発現を調節できる。寄生蠕虫の分離核酸配列はＤＮＡ組換え技術（例：複製連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、クローニング）または化学合成を用いて形成し得る。寄生蠕虫の分離核酸配列には、天然核酸配列と機能的に均等な物が含まれる。この機能的に均等な物には天然対立遺伝子変異体及び修飾核酸配列が含まれるが、同機能的に均等な物はこれらに限定されない。本発明の免疫血清によって認識されたエピトープをコード化する核酸配列の能力を実質的に阻害しないか、またはストリンジェント条件下において天然の分離核酸とともに安定したハイブリッドを形成する核酸配列の能力を実質的に阻害しないように前記の天然対立遺伝子変異体及び修飾核酸配列内においてヌクレオチドの挿入、削除、置換及び反転のうちの少なくとも１つが実施されている。ここに述べるハイブリッド形成のためのストリンジェント条件とは、標準的なハイブリッド形成条件を意味し、同条件下において、オリゴヌクレオチドを含む核酸配列は類似した配列を同定するために使用される。例えば、この標準的条件は前記したサムブルック他の記述に開示されている。更に、この条件の例については以下の“例”を記載したセクションにおいて詳述する。
機能的に均等な核酸配列は当業者に周知の方法で得られる（前記のサムロック他の記述を参照）。例えば、核酸配列は古くから用いられている突然変異生成技術またはＤＮＡ組換え技術等を使用して修飾し得る。これらの技術には、部位を特定した突然変異誘発（Site-directed mutagenesis）、突然変異を誘発する核酸の化学処理、核酸フラグメントの制限酵素による切断、核酸フラグメントの連結、核酸配列のうちの選択された領域に対する複製連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅及び／または突然変異生成、オリゴヌクレオチド混合物の形成及び核酸配列の混合を形成するための混合物グループの連結、並びにこれらの組合せが含まれる。機能的に均等な核酸は、核酸配列によってコード化された蛋白質の機能（例：免疫血清に結合する能力）をスクリーニングすることと、ストリンジェント条件下において天然核酸配列を用いてハイブリッド形成を行うことのうちの少なくとも一方を使用することにより修飾核酸配列の混合物から選択可能である。
寄生蠕虫のゲノム間における類似性に起因して、本発明の分離蛋白質及び同蛋白質に対応する核酸配列はあらゆる寄生蠕虫に由来するものであり得る。好ましい蠕虫には、線虫、条虫及び吸虫が含まれる。更に好ましい蠕虫には線虫のうちの糸状虫、回虫、円虫（Strongyle）及び毛様線虫が含まれる。更に好ましい蠕虫としては、糸状虫のうちのディロフィラリア、オンコセルカ、ブルギア、ブケレリア、ロア、アカントケイロネマ、ジペタロネーマ、セタリア、パラフィラリア及びステファノフィラリアが含まれる。本発明の特に好ましい寄生蠕虫はイヌ糸状虫症を引き起こすＤ．インミティスである。
他の適切な寄生蠕虫にはジペタロネーマ  ペルスタンス（Dipetalonema perstans）、ジペタロネーマ  ストレプトセルカ（Dipetalonema streptocerca）、ブケレリア  バンクロフティ（Wuchereria bancrofti）、ブルギア  マレー、マンソネラ  オザルディ（Mansonella ozzardi）、ロア  ロア（Loa loa）、オンコセルカ  ボルブフス（Onchocerca volvulus）、ストロンギロイデス属の種（Strongyloides spp.）、ストロンギルス属の種（Strongylus spp.）、ヘモンカス属の種（Haemonchus spp.）、トリコストロンジラス属の種（Trichostrongylus spp.）、オステルタジア属の種（Ostertagia spp.）、クーペリア属の種（Cooperia spp.）、ディクチオカウルス属の種（Dictyocaulus spp.）、ネマトディラス属の種（Nematodirus spp.）、シアソストミナエ（Cyathostominae）（馬に寄生する小さな円虫）、エソファゴストマム属の種（Oesophagostomum spp.）、カベルティア  オビナ（Chabertia ovina）、アンシロストマ属の種（Ancylostoma spp.）、ウンシナリア属の種（Uncinaria spp.）、ブノストマム属の種（Bunostomum spp.）、フィラロイデス属の種（Filaroides spp.）、エルロストロンジラス  アブストラサス（Aelurostrongylus abstrusus）、回虫目（Ascaridida）に属する線虫、トリキネラ  スピラリス（Trichinella spiralis）、トリクリス属の種（Trichuris spp.）、アンジェオストロンジラス属の種（Angiostrongylus spp.）及びエンテロビウス  ベルミキュラリス（Enterobius vermicularis）が含まれる。
本発明の１つの実施の形態には、ストリンジェント条件下においてＤ．インミティス核酸配列ｐ４の少なくとも一部への混成が可能な寄生蠕虫の分離核酸配列が含まれる。このような核酸配列によってコード化される蛋白質は抗寄生蠕虫免疫血清、更に好ましくは抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清の少なくとも一方に含まれる成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合し得ることが好ましい。Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４はＤ．インミティスｐ４とも称される。同Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４は反復して実施された化学的に短縮された感染（例：約２００匹のＬ３によって感染させ、約６０日間後にイベルメクチンによって処理し、次いで約６０日間経過後に再度感染させた）により免疫化された犬から採取された免疫血清を使用してＤ．インミティスＬ３のｃＤＮＡ発現ライブラリ及びＬ４のｃＤＮＡ発現ライブラリのうちの少なくとも一方から分離された約９１３個のヌクレオチドからなる長さの核酸配列である。ｐ４コード配列（p4 coding sequences）を含むゲノム配列は、１つ以上のイントロンを含む約７１０個のヌクレオチドを明らかに含む。
Ｄ．インミティスｐ４のｃＤＮＡ配列は、配列同定番号（即ち、配列番号）１に示す核酸配列をもたらす。配列化技術（Sequencing technology）はエラーを全く含まない技術ではない。従って、配列同定番号１はＤ．インミティスの見掛け核酸配列（Apparent nucleic acid sequence）を示すものである。配列同定番号２に示される配列同定番号１の推定される翻訳は、Ｄ．インミティスｐ４が約３０３個の核酸の読み取り枠（Open reading frame）を含み、遺伝子のコード配列全体の一部分のみを表していることを意味する。しかし、Ｄ．インミティスｐ４に含まれる核酸は核酸配列の分離を含む方法によって実証されたように、抗Ｄ．インミティス幼虫免疫血清に対して選択的に結合する蛋白質をコード化するのに十分である。配列同定番号１の推定される翻訳は、Ｄ．インミティスｐ４によってコード化された蛋白質が約３５．５キロダルトン（ｋＤ）の分子量及び４．２６の推定ｐＩを有することを示している。
Ｄ．インミティスｐ４によってコード化された蛋白質はＬＤＬ受容体に関連した蛋白質（ＬＤＬｒ）のクラスＡのシステインの豊富なモチーフを有し、同モチーフは約９個のアミノ酸を含むとともに、他の幾つかの蛋白質中にも存在することによって特徴づけられる。この他の蛋白質には、哺乳動物の低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）受容体、ＬＤＬ受容体に関連した蛋白質、人間及びマウスのアルファ−２−マクログロブリン受容体並びにラットの腎臓のＧＰ３３０糖蛋白質が含まれる。Ｄ．インミティスｐ４を含め、これらの各蛋白質はＤＤＣＧＤＧＳＤＥ（即ち、アスパラギン酸−−アスパラギン酸−−システイン−−グリシン−−アスパラギン酸−−グリシン−−セリン−−アスパラギン酸−−グルタミン酸）からなる配列を有している。９個のアミノ酸のうちの８個からなる保存範囲（Conserved stretch）は自由生活の線虫（即ち、寄生虫でない線虫）であるカエノハーブディティス  エレガンス（Caenorhabditis elegans）のＬＤＬ受容体に関連した蛋白質及びシー．エレガンス（C. elegans）の基底膜のプロテオグリカンにも含まれている。このＬＤＬｒのクラスＡのシステインの豊富なモチーフは他の蠕虫のｐ４に関連した配列（即ち、ストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティスｐ４とともにハイブリッドを形成する核酸配列）によってコード化された蛋白質中に保存され得る。従って、ｐ４に関連した核酸配列はＬＤＬｒのクラスＡのモチーフをコード化するオリゴヌクレオチド・プローブ（Oligonucleotide probes）を使用して同定できる。さらに、ｐ４に関連する蛋白質中のＬＤＬｒのクラスＡのモチーフは、寄生蠕虫による感染から動物を保護するための前記の治療用組成物の開発におけるターゲットを意味する。
本発明はストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４の少なくとも一部分に対して混成されるあらゆる種類の寄生蠕虫から得られた核酸配列を含み、蛋白質の最小限の寸法はハイブリッド形成条件によって決定される。前記したように寄生蠕虫間における類似性に基づき、ストリンジェント条件下においてＤ．インミティスｐ４の少なくとも一部分に対して混成し得る他の寄生蠕虫核酸配列を獲得すべくＤ．インミティスｐ４配列を使用できる。好ましい蠕虫については前記の通りである。
本発明の特に好ましい核酸配列には、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４、Ｄ．インミティスｐ４を備えた核酸配列、及びＤ．インミティスｐ４のフラグメントを備えた核酸配列が含まれる（これらの核酸配列のうちのいずれか１つに対する機能的均等物を含む）。Ｄ．インミティスｐ４の配列を知ることにより、当業者は同配列のコピーの形成と、Ｄ．インミティスｐ４を含む核酸配列及びＤ．インミティスｐ４のフラグメントを含む核酸配列の獲得とが可能になる。従って、特に好ましい分離核酸配列は、配列同定番号１が正確であると仮定した場合に、配列同定番号１あるいはその機能的均等物、配列同定番号１の少なくとも一部を含む核酸配列あるいはその機能的均等物、及び配列同定番号１のフラグメントあるいはその機能的均等物を含む。
本発明はストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４の少なくとも一部に対して混成可能な寄生蠕虫核酸配列によって少なくとも一部がコード化された寄生蠕虫の分離蛋白質及び同蛋白質のミメトープを含む。この蛋白質または同蛋白質のミメトープは好ましくは抗寄生蠕虫免疫血清、更に好ましくは抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清のうちの少なくとも一方に含まれる成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合し得る。好ましい寄生蠕虫の分離蛋白質または同蛋白質のミメトープは動物に対して有効な方法で投与された際に同動物を蠕虫による感染から保護し得る。好ましい蠕虫については前記した通りである。特に好ましい分離蛋白質はＤ．インミティス核酸配列ｐ４、Ｄ．インミティスｐ４を含む核酸配列及びＤ．インミティスｐ４のフラグメントを含む核酸配列のうちのいずれか１つによってコード化された蛋白質を含む。従って、特に好ましい分離蛋白質は、配列同定番号１及び配列同定番号２が正確であると仮定した場合に、配列同定番号１あるいはその均等物、配列同定番号１の少なくとも一部を含む核酸配列あるいはその機能的均等物、及び配列同定番号１のフラグメントあるいはその機能的均等物のうちのいずれか１つによってコード化された蛋白質と、配列同定番号２の少なくとも一部を有する蛋白質を含む。
本発明の１つの実施の形態は、ストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部に対して混成可能な寄生蠕虫の分離核酸配列を含む。この核酸配列によってコード化される蛋白質は抗寄生蠕虫免疫血清、更に好ましくは抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清のうちの少なくと一方に含まれる成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合し得ることが好ましい。Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２ＵはＤ．インミティスｐ２２Ｕとも称され、同Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２ＵはＤ．インミティスＰ２２Ｕ蛋白質と称されるＤ．インミティスの基本蛋白質の少なくとも実体部分（Substantial portion）をコード化し、同蛋白質はトリス−グリシン  ＳＤＳ−  ポリアクリルアミド電気泳動で試験した際に約２２ｋＤの見掛け分子量で移動する。Ｄ．インミティスＰ２２Ｕ蛋白質は幼虫のＥＳ（排泄−分泌）抽出物と、Ｌ３、Ｌ４及び成虫の抽出物とに含まれていることが確認された。Ｄ．インミティスｐ２２Ｕは約１０１６個のヌクレオチドからなる長さを有している。Ｄ．インミティスｐ２２Ｕの配列化は配列同定番号３に開示する核酸配列をもたらす。配列化技術はエラーを全く含まない技術ではない。従って、配列同定番号３はＤ．インミティスｐ２２Ｕの見掛け核酸配列を示すものである。配列同定番号４に示される配列同定番号３の推定される翻訳は、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕが終止コドン（Stop codon）の直前に約２０８個の核酸の読み取り枠を含むことを示している。配列同定番号４の核酸配列に対応するアミノ酸１３付近及びアミノ酸１９付近（付近と記載しているのは、これらが推定に基づくため）には、“フレーム内（in-frame）”に含まれる２つの潜在的な開始コドン（Start codon）が存在するにもかかわらず、翻訳開始部位（Translation start site）については未だ不明である。推定されたアミノ酸配列は、約２２ｋＤの分子量及び約９．６の推定されたｐＩを有する蛋白質を示す。
Ｄ．インミティスｐ２２Ｕは、Ｌ３、Ｌ４及び成虫のうちのいずれか１つの発現ｃＤＮＡライブラリを適切な免疫血清、またはＤ．インミティスＰ２２Ｕ蛋白質に対抗して形成された抗体を用いてスクリーニングすることを含む数多くの方法による分離が可能であり、この方法は前記のスクリーニングに限定されるものではない。これに代えて、アミノ酸情報は純化されたＤ．インミティスＰ２２Ｕ蛋白質から得ることができ、同蛋白質はオリゴヌクレオチド・プローブ及びオリゴヌクレオチド・プライマーのうちの少なくとも一方をデザインするために使用できる。そして、前記のオリゴヌクレオチド・プローブ及びオリゴヌクレオチド・プライマーは適切なｃＤＮＡライブラリまたはゲノム・ライブラリから得られた配列をスクリーニングすることと、同配列を増幅することのうちの少なくとも一方を実施するために使用し得る。
本発明はストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部に対して混成されるあらゆる種類の寄生蠕虫から得られた核酸配列を含み、蛋白質の最小限の寸法はハイブリッド形成条件によって決定される。前記したように寄生蠕虫間における類似性に基づき、ストリンジェント条件下においてＤ．インミティスｐ２２Ｕの少なくとも一部に対して混成し得る他の寄生蠕虫核酸配列を獲得すべくＤ．インミティスｐ２２Ｕを使用できる。好ましい蠕虫については前記の通りである。
本発明の特に好ましいｐ２２Ｕに関連する核酸配列には、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを有する核酸配列、及びＤ．インミティスｐ２２Ｕのフラグメントを有する核酸配列が含まれる（これらの核酸配列のそれぞれに対する機能的均等物を含む）。Ｄ．インミティスｐ２２Ｕの配列を知ることにより、当業者は同配列のコピーの形成と、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを含む核酸配列及びＤ．インミティスｐ２２Ｕのフラグメントを含む核酸配列の獲得とが可能になる。従って、特に好ましい分離核酸配列は、配列同定番号３が正確であると仮定した場合に、配列同定番号３あるいはその機能的均等物、配列同定番号３の少なくとも一部を含む核酸配列あるいはその機能的均等物、及び配列同定番号３のフラグメントあるいはその機能的均等物を含む。
本発明はストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部に対して混成可能な寄生蠕虫核酸配列によって少なくとも一部がコード化された寄生蠕虫の分離蛋白質及び同蛋白質のミメトープを含む。蛋白質または同蛋白質のミメトープは抗寄生蠕虫免疫血清、更に好ましくは抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清のうちの少なくとも一方に含まれる成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合し得ることが好ましい。好ましい寄生蠕虫の分離蛋白質または同蛋白質のミメトープは、動物に対して効果的な方法で投与された際に同動物を蠕虫による感染から保護し得る。好ましい蠕虫については前記した通りである。特に好ましい分離蛋白質はＤ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを含む核酸配列及びＤ．インミティスｐ２２Ｕのフラグメントを含む核酸配列のうちのいずれか１つによってコード化された蛋白質を含む。従って、特に好ましい分離蛋白質は、配列同定番号３及び配列同定番号４が正確であると仮定した場合に、配列同定番号３あるいはその均等物、配列同定番号３の少なくとも一部を含む核酸配列あるいはその機能的均等物、及び配列同定番号３のフラグメントあるいはその機能的均等物のうちのいずれか１つによってコード化された蛋白質と、配列同定番号４の少なくとも一部を有する蛋白質を含む。
本発明の分離核酸配列はストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４及びＤ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕの両方の少なくとも一部に対してそれぞれ混成可能な核酸を含む。このような核酸配列はＰ４及びＰ２２Ｕの一部をそれぞれ含む蛋白質をコード化できる。これに代えて、このような核酸配列はＰ４に関連する蛋白質及びＰ２２に関連する蛋白質の両方をコード化し得る。
本発明はストリンジェント条件下において、本発明の他の核酸配列（好ましくは更に長い核酸配列）の相補領域（Complementary region）に対して混成可能なオリゴヌクレオチドを含み、前記の相補領域の例としては、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４の相補領域、Ｄ．インミティスｐ４の少なくとも一部を含む核酸配列の相補領域、ストリンジェント条件下においてＤ．インミティスｐ４に対して混成される核酸配列の相補領域、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕの相補領域、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕの少なくとも一部を含む核酸配列の相補領域、及びストリンジェント条件下においてＤ．インミティスｐ２２Ｕに対して混成される核酸配列の相補領域が挙げられる。オリゴヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡまたは前記のうちのいずれか一方の誘導体とすることができる。オリゴヌクレオチドの最小限の寸法は、任意のオリゴヌクレオチド及び本発明の別の核酸配列上の相補配列の間に安定したハイブリッドを形成するのに必要な寸法である。従って、前記の寸法は核酸成分、オリゴヌクレオチド及び相補配列の間における相同の百分率、並びにハイブリッド形成条件（例：温度、塩濃度等）に依存している。Ｄ．インミティスの核酸配列等、ＡＴを豊富に含む核酸配列の場合、オリゴヌクレオチドは一般的に少なくとも約１５〜１７個の塩基を含む長さを有する。オリゴヌクレオチドの寸法は、本発明に基づくオリゴヌクレオチドの使用に十分な寸法であることを要する。本発明のオリゴヌクレオチドは各種の用途に使用可能である。例えば、この用途としては別の核酸配列を同定するためのプローブ、または核酸配列を増幅または延長するためのプライマーとしての使用が挙げられる一方、例えば寄生虫のライフサイクルにとって重要な寄生蠕虫蛋白質内への核酸配列の発現を抑制する治療用途が挙げられる。治療用途にはアンチセンスに関する技術、トリプレックス形成に関する技術及びリボザイムに関する技術のうちの少なくとも１つにおいてオリゴヌクレオチドを使用することが含まれる。
例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（Antisense oligonucleotides）は所望の蛋白質をコード化するメッセンジャーＲＮＡの補体として一般的にデザインされる。補体はワトソン−クリック型塩基対を介してｍＲＮＡに対して結合し、かつ翻訳を妨げる。翻訳の妨げは、リボヌクレアーゼＨによるｍＲＮＡの分解を助けることと、ＲＮＡを完成させるプロセスを防止または抑制することと、翻訳を防止することのうちのいずれか１つによって行われる。オリゴヌクレオチドは翻訳された領域またはｍＲＮＡ内の調節配列に対して結合し得る。
同様に、ＤＮＡの転写が二重螺旋構造の部分的な解離を含むため、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは転写を抑制すべくＤＮＡの転写済みの領域または転写の済んでいない領域にも結合可能である。ターゲット配列及びアンチセンス配列の間の完全な相同は好ましいが、転写の抑制には必要とされない。ホルト，ジェー．ティ．他，国立科学学会報告書（Proc Natl Acad Sci）（１９８６年）８３：４７９４頁参照。
オリゴヌクレオチドは特定の結合規則に基づいて、無傷の二重鎖遺伝子（Duplex gene）とともにトリプレックスＤＮＡ構造（Triplex DNA structure）を形成すべくデザインできる。モファット，エイ．エス．，サイエンス（１９９１年）２５２：１３７４〜１３７５頁参照。このトリプレックス構造が遺伝子のプロモーター領域内に形成された場合、同遺伝子の転写を中断することが確認されている。オルソン，エフ．エム．他，核酸リサーチ（Nuc Acids Res）（１９９１年）１９：３４３５〜３４４１頁参照。トリプレックスを形成すべくデザインされたオリゴマーは調節領域、転写済み領域、またはこれら両方の領域内において二重鎖遺伝子に対して結合すべくデザインできる。
従って、本発明はアンチセンス技術または三重螺旋構造形成技術の使用により寄生蠕虫蛋白質の形成を妨げる方法を含む。このコントロールを実施するために寄生虫を有する宿主に対して適切なオリゴマーを投与し得る。
ストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティスｐ４またはＤ．インミティスｐ２２Ｕとともにハイブリッドを形成する核酸配列等の本発明の分離核酸配列は各種の方法で得ることができる。例えば、Ｌ３発現ライブラリ及びＬ４発現ライブラリのうちの少なくとも一方を、同ライブラリによってコード化される幼虫蛋白質の形成を促進する条件下において誘発することと、Ｌ３及びＬ４のうちの少なくとも一方による感染に対する免疫性を備えた動物から採取された免疫血清に前記のライブラリを接触させることと、前記の血清に対して選択的に結合し得る蛋白質をコード化する核酸配列を含むコロニーまたはファージプラークを選択することとを含む方法によって本発明の分離核酸配列を得ることができる。従来の培養方法及び選択方法は、例えば前記のサムブルック他の記述内に開示されている。この方法の例については以下の“例”を記載したセクションにおいて詳述する。
別の実施の形態では、Ｄ．インミティスＰ４及びＤ．インミティスＰ２２Ｕのうちの少なくとも一方の少なくとも一部をコード化する核酸配列をオリゴヌクレオチドに含有させるように、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成を行うためのストリンジェント条件下において寄生蠕虫のｃＤＮＡライブラリに対して接触させることと、ストリンジェント条件下においてオリゴヌクレオチドとともにハイブリッドを形成する核酸配列を有するコロニーまたはファージプラークを選択することとを含む方法により分離核酸配列が得られる。これに代えて、複製連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を用いてＤ．インミティスｐ４及びＤ．インミティスｐ２２Ｕのうちの少なくとも一方の少なくとも一部を含む核酸を増幅すべくＤ．インミティスＰ４及びＤ．インミティスＰ２２Ｕのうちの少なくとも一方の少なくとも一部をコード化する核酸配列を含むオリゴヌクレオチド・プライマーを使用できる。これらの方法の例については以下の“例”を記載したセクションにおいて詳述する。
別の実施の形態において、寄生蠕虫のｃＤＮＡライブラリ等の核酸配列の集合体をハイブリッド形成のためのストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティスｐ４若しくはその一部、またはＤ．インミティスｐ２２Ｕ若しくはその一部と接触させることと、同ストリンジェント条件下においてＤ．インミティスｐ４若しくはその一部、またはＤ．インミティスｐ２２Ｕ若しくはその一部に対して混成される核酸配列を同定することとを含む方法によって分離核酸配列を得ることができる。この技術は標準的なハイブリッド形成技術を用いた核酸配列のクローニング、または複製連鎖反応による増幅を用いた核酸配列の増幅に使用できる。これに代えて、Ｄ．インミティスＰ４またはＤ．インミティスＰ２２Ｕに対抗して形成された血清をｃＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングに使用できる。
本発明は哺乳動物に寄生する線虫のＬ３幼虫ステージ及びＬ４幼虫ステージから分離可能な（即ち、分離された）免疫原を更に含み、同免疫原は約３９ｋＤ、約２２ｋＤ及び約２０．５ｋＤの分子量のうちのいづれか１つを有し、さらには前記したグリーブ他による国際特許出願公開第ＷＯ／９２／１３５６０号に開示されている方法を使用することにより同定し得る。更に、本発明はこれらの蛋白質の対応する組換え体の態様、並びに同蛋白質の免疫原性フラグメント及びその組換え体の態様に関する。
本発明のこの実施の形態は、本発明の方法によって確認された血清を使用して、Ｄ．インミティスから得られた３９ｋＤ、２２ｋＤ及び２０．５ｋＤの免疫原を同定することを含む。免疫原をコード化する遺伝子を回復することにより、哺乳動物の宿主の体内に寄生可能な関連する線虫内の対応する蛋白質をコード化する遺伝子の回復に使用する適切なプローブが形成される。従って、本発明は前記した３９ｋＤ、２２ｋＤ及び２０．５ｋＤの分子量を備えたＤ．インミティス蛋白質及び同蛋白質に関連する対応物に関するものであり、同対応物としては標準条件下において前記の各Ｄ．インミティス蛋白質をコード化するＤＮＡに対して混成可能なＤＮＡによってコード化されたものが挙げられる。従って、本発明は、Ｄ．インミティスＰ３９と、Ｄ．インミティスＰ２２Ｌと、Ｄ．インミティスＰ２０．５と、Ｄ．インミティスＰ３９、Ｄ．インミティスＰ２２Ｌ及びＤ．インミティスＰ２０．５のうちのいづれか１つに対して高い相同性を示す別の寄生蠕虫蛋白質と、前記のいずれか１つの蛋白質をコード化する核酸配列と、前記のいずれか１つの蛋白質のミメトープと、前記のいずれか１つの蛋白質に選択的に結合する抗体と、前記の蛋白質、ミメトープ、核酸配列及び抗体の使用とを含む。
“３９ｋＤ蛋白質”及びＰ３９は、Ｄ．インミティスまたは関連する他の線虫のＬ３幼虫ステージ若しくはＬ４幼虫ステージ、または哺乳動物に寄生する他の蠕虫から分離可能であって、さらにはトリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって決定された３９ｋＤの見掛け分子量を有する寄生蠕虫蛋白質をともに意味する。Ｄ．インミティスから分離可能な３９ｋＤ蛋白質は以下に示すアミノ酸配列を有している。計算によって得られた同Ｄ．インミティス蛋白質の分子量は僅かに３９，８２０であるが、見掛け分子量は使用される特定の測定装置に基づいて異なり得る。特に、トリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動におけるＰ３９の移動は約３９ｋＤの分子量を示す。
“２２／２０．５ｋＤ蛋白質”という用語は、Ｄ．インミティス若しくは関連する線虫のＬ３幼虫ステージ若しくはＬ４幼虫ステージ、または哺乳動物の体内に寄生する他の蠕虫から分離可能な２２／２０．５ｋＤの見掛け分子量を備えた寄生蠕虫蛋白質を示す。Ｄ．インミティスから分離可能な２２／２０．５ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列については以下に改めて示す。以下に示すように、２０．５ｋＤ蛋白質は２２ｋＤ蛋白質の分裂による生成物である。この場合、リーダー配列の２１個のアミノ酸は更に小さな蛋白質を形成すべく削除されている。計算によって得られたこれらのＤ．インミティス蛋白質の分子量は大きい方の蛋白質が１７．５ｋＤであって、小さい方の蛋白質が１５．３ｋＤであるが、見掛け分子量は使用される特定の測定装置に基づいて更に高くなり得る。本明細書中において、２２ｋＤ蛋白質及び２０．５ｋＤ蛋白質は、それぞれＰ２２Ｌ及びＰ２０．５とも称される。トリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分離された際に、約２２ｋＤにおいて移動し、かつトリス−トリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による測定において約１９ｋＤの分子量を有する２つのバンドのうちのＰ２２Ｌは下方（Lower）であり、Ｐ２２Ｕは上方（Upper）である。Ｐ２０．５はトリス−グリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による測定で約２０．５ｋＤの分子量を有し、トリス−トリシン  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による測定で約１６ｋＤの分子量を有する。
Ｄ．インミティスから得られたＰ３９，Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５は本発明の方法によりその防御性が実証された免疫性を備えた犬の血清の成分に対して特に免疫反応性を示す。同様に、哺乳動物に寄生する他の線虫及び他の蠕虫の種に含まれる対応する蛋白質は、本発明の方法によって確認された適切な哺乳動物の種の免疫性を備えたメンバーの防御性成分（Protective components）に対して特に免疫反応性を示す。従って、本発明は哺乳動物に寄生する線虫のＬ３幼虫ステージまたはＬ４幼虫ステージに含まれ、さらにはこれらの寄生虫に対する防御性を示すワクチンの準備に有用な蛋白質群に対するアクセスを提供する。
本発明はＰ３９、Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５を提供するのみではなく、これらの各蛋白質をコード化する寄生蠕虫核酸配列も提供する。これらの核酸配列の入手の可能性は、関連する線虫及び他の蠕虫の種から得られた相同蛋白質（Homologous proteins）の回復を可能にする。核酸配列またはその蛋白質は、前記の関連する種に含まれる対応する蛋白質をコード化するＤＮＡを分離すべくプローブのライブラリ及び長さに基づいて標準的ストリンジェンシーの条件下（即ち、前記したストリンジェント条件下）においてプローブとして使用できる。更に、Ｄ．インミティスのＰ３９との間、またはＰ２２Ｌ及びＰ２０．５との間で免疫反応性を示す抗体は、関連する種から準備された発現ライブラリ内に含まれる前記の蛋白質をコード化する核酸配列を同定するスクリーニングの道具として使用できる。
本発明の１つの実施の形態はストリンジェント条件下においてＤ．インミティス核酸配列ｐ３９の少なくとも一部に対して混成可能な寄生蠕虫の分離核酸配列を含む。このような核酸配列によってコード化された蛋白質は抗寄生蠕虫免疫血清、更に好ましくは抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清のうちの少なくとも一方に含まれる成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合し得ることが好ましい。Ｄ．インミティスｐ３９とも称されるＤ．インミティス核酸配列ｐ３９は前記の要領で免疫化された犬から採取された免疫血清を使用して、Ｄ．インミティスＬ３のｃＤＮＡ発現ライブラリまたはＤ．インミティスＬ４のｃＤＮＡ発現ライブラリのうちのいずれか一方から分離された約１１００〜１２００個のヌクレオチドからなる長さを有する核酸配列である。ｐ３９コード配列を含むゲノム配列は１つ以上のイントロンを備えた約１２８０個のヌクレオチドを明らかに含む。
Ｄ．インミティスｐ３９のｃＤＮＡ分離物の配列化により、以下の見掛けコード領域の推定された核酸配列が得られた（別の隣接配列（Flanking sequences）は以下の“例”の中に示されている）。
0004150421.tif 000002
配列化技術はエラーを全く含まない技術ではない。従って、前記の核酸配列はＤ．インミティスｐ３９の見掛け核酸配列を示すものである。約３００個のアミノ酸からなる推定されたＤ．インミティスＰ３９アミノ酸配列（Deduced D. immitis P39 amino acid sequence）と称される核酸配列の推定された翻訳を以下に示す。
0004150421.tif 000003
本発明の別の実施の形態はストリンジェント条件下においてＤ．インミティスｐ２２Ｌの少なくとも一部に対して混成可能な寄生蠕虫の分離核酸配列を含む。この核酸配列によってコード化された蛋白質は、抗寄生蠕虫免疫血清、更に好ましくは抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清のうちの少なくとも一方に含まれる成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合し得ることが好ましい。Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２ＬはＤ．インミティスｐ２２Ｌとも称され、同Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｌは、前記の要領にて免疫化された犬から採取された免疫血清を使用してＤ．インミティスＬ３のｃＤＮＡ発現ライブラリ及びＤ．インミティスＬ４のｃＤＮＡ発現ライブラリのうちの少なくとも一方から分離された約４５３個のヌクレオチドからなる長さを有する。
Ｄ．インミティスｐ２２ＬのｃＤＮＡの配列化は、以下の見掛けコード領域の核酸配列を示した。
0004150421.tif 000004
配列化技術はエラーを全く含まない技術ではない。従って、前記の核酸配列はＤ．インミティスｐ２２Ｌの見掛け核酸配列を示すものである。約１５０個のアミノ酸からなる推定されたＤ．インミティスＰ２２Ｌアミノ酸配列（Deduced D. immitis P22L amino acid sequence）と称される核酸配列の推定された翻訳を以下に示す。
0004150421.tif 000005
Ｐ２２ＬのＣ末端の半分は各種のホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ２）のアミノ酸配列と少なくとも幾つかのアミノ酸配列が相同をなすことによって更に特徴づけられる。類似性はシステイン及び活性部位を有するアミノ酸に関して特に良好に保存されている。推定されたＰ２２Ｌアミノ酸配列のアミノ酸８０〜１０４（即ち、DGKMK HCKTH EACYD QREPQ SWCIL）を使用したＮＣＢＩ非冗長データー・ライブラリ（NCBI non-redundant data library）（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのバージョン２３．０、ＰＩＲのバージョン３４．０、ジェネバンク（GenBank）から入手したＧｅｎＰｅｐｔ  ＣＤＳトランスレーションのリリース７３．１）のＢＬＡＳＴサーチ（BLAST search）により４０個のレコードが得られ、このうちの３９個はＰＬＡ２配列であった。ＳＷＩＳＳ−ＰＬＯＴの２９個の整合配列（Match sequence）のうちの２５個は各種の蛇から得られたＰＬＡ２毒を示しており、残りの４個は哺乳動物の膵臓のＰＬＡ２配列であった。非哺乳動物及び非節足動物である真核生物のエントリーは全く発見されなかった。ＰＬＡ２はｓｎ−３−グリセロ隣脂質（sn-3-glycerophospholipids）の２−アシル・エステル・グループ（2-acyl ester group）の加水分解において触媒作用を及ぼす。寄生虫におけるＰＬＡ２作用の潜在的役割は、脂質の代謝、膜形成、再造形（Remodeling）及び／または分離（例：脱皮プロセスの一部として）、並びに移動（例：ＰＬＡ２はＬ４において生じる組織移動の際に宿主の細胞膜の破壊に寄与し得る）のうちの少なくとも１つが含まれる。従って、Ｐ２２Ｌ（そして、本質的にＰ２０．５も含め）のＣ端末及びＰＡＬ２の間の相同配列の発見は、ＰＬＡ２作用をブロックして動物を寄生蠕虫による感染から保護する抗寄生虫治療法の開発において同配列を標的とすることを示唆する。
本発明の更に別の実施の形態は、ストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２０．５の少なくとも一部に混成可能な寄生蠕虫の分離核酸配列を含む。この核酸配列によってコード化された蛋白質は抗寄生蠕虫免疫血清、更に好ましくは抗Ｌ３幼虫免疫血清及び抗Ｌ４幼虫免疫血清のうちの少なくとも一方に含まれる成分のうちの少なくとも１つに対して選択的に結合し得ることが好ましい。Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２０．５はＤ．インミティスｐ２０．５とも称され、同Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２０．５は前記の要領で免疫化された犬から採取された免疫血清を使用してＤ．インミティスＬ３のｃＤＮＡ発現ライブラリ及びＤ．インミティスＬ４のｃＤＮＡ発現ライブラリのうちの少なくとも一方から分離された約３９０個のヌクレオチドからなる長さの核酸配列である。Ｄ．インミティスｐ２０．５の配列化は、以下の見掛けコード領域の核酸配列を示す。
0004150421.tif 000006
配列化技術はエラーを全く含まない技術ではない。従って、前記の核酸配列はＤ．インミティスｐ２０．５の見掛け核酸配列を示すものである。約１２９個のアミノ酸からなる推定されたＤ．インミティスＰ２０．５アミノ酸配列（Deduced D. immitis P20.5 amino acid sequence）と称される核酸配列の推定された翻訳を以下に示す。
0004150421.tif 000007
核酸配列ｐ４及びｐ２２Ｕに関して既に詳述したように、Ｐ３９、Ｐ２２Ｌ及びＬ２０．５をそれぞれコード化する本発明の核酸配列ｐ３９、ｐ２２Ｌ及びｐ２０．５は対立遺伝子変異体及びそのフラグメントを含み、この中には各種の用途を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。核酸配列ｐ３９、ｐ２２Ｌ及びｐ２０．５、並びにこれらの核酸配列によってコード化された蛋白質の分離及び使用方法は、ｐ４及びｐ２２Ｕの分離及び使用に用いられた方法に類似している。選択された例については以下の“例”を記載したセクションにおいて詳述する。
本発明は組換えベクターを含み、同組換えベクターは宿主細胞内へ核酸を搬入し得るあらゆるベクター内に挿入された本発明の寄生蠕虫核酸配列を含む。ベクターはヘテロロガス核酸配列（Heterologous nucleic acid sequences）を含む。ヘテロロガス核酸配列とは自然の状態において本発明の寄生蠕虫核酸配列に隣接して発見されることがなく、しかも同寄生蠕虫核酸配列の由来する種以外の種に由来することが好ましい核酸配列である。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡであって、原核生物（Prokaryotic）または真核生物（Eukaryotic）であって、さらには一般的にウィルスまたはプラズミドである。組換えベクターはクローニング、配列化、及び本発明の核酸配列の操作のうちの少なくとも１つに使用できる。組換えベクターのうちの１つの種類は組換え分子と称される。組換え分子については以下に更に詳述するが、同組換え分子は本発明の核酸配列の発現に使用できる。好ましい組換えベクターは形質転換細胞内における複製が可能である。本発明の組換えベクター内に組み込む好ましい核酸配列には、ストリンジェント条件下において、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４の少なくとも一部、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ３９の少なくとも一部、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｌの少なくとも一部、及びＤ．インミティス核酸配列ｐ２０．５の少なくとも一部のうちのいずれか１つに対して混成可能な寄生蠕虫核酸配列が含まれる。組換えベクター内に組み込むことが特に好ましい核酸配列には、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ４、Ｄ．インミティスｐ４を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ４のフラグメントを有する核酸配列、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｕ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを有する核酸配列、及びＤ．インミティスｐ２２Ｕのフラグメントを有する核酸配列が含まれる。組換えベクター内に組込むことが特に好ましい更に別の核酸配列には、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ３９、Ｄ．インミティスｐ３９を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ３９のフラグメントを有する核酸配列、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２２Ｌ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌを有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌのフラグメントを有する核酸配列、Ｄ．インミティス核酸配列ｐ２０．５、Ｄ．インミティスｐ２０．５を有する核酸配列、及びＤ．インミティスｐ２０．５のフラグメントを有する核酸配列が含まれる。
本発明の分離蛋白質は種々の方法で生成可能であり、これには天然蛋白質の生成及び回収、組換蛋白質の生成及び回収並びに化学合成がある。一実施例において、本発明の分離蛋白質は、同蛋白質を生成するのに効果的な条件下にて蛋白質を発現させることができる細胞を培養するとともに、蛋白質を回収することによって生成される。培養するのに好ましい細胞は蛋白質を発現させることがでる組換細胞であり、この組換細胞は本発明の１つ又は複数の核酸配列により宿主細胞を形質転換することにより生成される。核酸配列を宿主細胞に形質転換するには、核酸配列を細胞に挿入できる如何なる方法によっても可能である。形質転換技術にはトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション（lipofection）、吸着及びプロトプラスト融合があるが、これらに限定されるものではない。組換細胞は単細胞のままでもよいし、組織、器官又は多細胞有機体に生育することもできる。本発明の形質転換された核酸配列は、その発現能力が維持されるようにして、染色体外に存在し続けることができ、或いは宿主細胞の染色体内における１つ又は複数の部位に同化することができる。細胞を形質転換するのに好ましい核酸配列には、ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌの少なくとも一部又はＤ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５の少なくとも一部と混成可能な寄生蠕虫の核酸配列がある。細胞を形質転換するのに特に好ましい核酸配列には、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ４、Ｄ．インミティスｐ４を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ４のフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを有する核酸配列及びＤ．インミティスｐ２２Ｕのフラグメントからなる核酸配列がある。細胞を形質転換するのに特に好ましい核酸配列には更に、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９、Ｄ．インミティスｐ３９を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ３９のフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌを有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌのフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５、Ｄ．インミティスｐ２０．５を有する核酸配列及びＤ．インミティスｐ２０．５のフラグメントからなる核酸配列がある。
形質転換するのに好適な宿主細胞には形質転換可能な如何なる細胞も含まれる。宿主細胞は形質転換されていない細胞又は少なくとも１つの核酸配列により既に形質転換された細胞のいずれかである。本発明の宿主細胞は、本発明の分離蛋白質を内生的に（即ち、自然に）生成可能であるか、或いは本発明の少なくとも１つの核酸配列により形質転換された後に分離蛋白質を生成可能であるかのいずれかである。本発明の宿主細胞は本発明の分離蛋白質を生成可能であれば如何なる細胞でもよく、これには細菌、酵母、他の菌、昆虫、動物及び植物の細胞がある。好ましい宿主細胞には細菌、ミコバクテリア、酵母、昆虫及び哺乳類の細胞があり、更に好ましい宿主細胞にはサルモネラ属、エシェリヒア属、バチルス属、酵母菌属、スポドプテラ属（Spodoptera）、ミコバクテリウム属、トリコプルジア属（Trichoplusia）、ＢＨＫ（幼生ハムスターの腎臓）の細胞、ＭＤＣＫ細胞（イヌ科のヘルペスウイルス培養用の普通のイヌの腎臓の細胞系）、ＣＲＦＫ細胞（猫科のヘルペスウイルス培養用の普通の猫の腎臓の細胞系）及びＣＯＳ細胞がある。特に好ましい宿主細胞には、大腸菌のＫ−１２派生物を含む大腸菌、チフス菌、ＵＫ−１  x３９８７及びＳＲ−１１  x４０７２等の減毒された菌株を含むネズミチフス菌、スポドプテラ  フルージペルダ（Spodoptera frugiperda）、トリコプルジア  ニ（Trichoplusia ni）、ＭＤＣＫ細胞及びＣＲＦＫ細胞がある。
適切な哺乳類の更なる宿主細胞には、他の腎臓の細胞系（例えば、ＣＶ−１猿の腎臓の細胞系）、他の繊維芽細胞の細胞系（例えば、ヒト、ネズミ又はニワトリの胚の繊維芽細胞の細胞系）、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスのＮＩＨ／３Ｔ３及び／又はＬＭＴＫ31細胞がある。また、免疫グロブリンプロモータを用いて、蛋白質は骨髄腫の細胞系における異種構造の蛋白質として発現される。
好ましくは、組換細胞は１つ又は複数の組換分子により宿主細胞を形質転換すすることによって生成される。各組換分子は１つ又は複数の転写調節配列を有する発現ベクターに有効に結合された本発明の１つ又は複数の核酸配列を備えている。細胞は１つ又は複数の組換分子により形質転換可能である。有効に結合され、即ち作用可能に結合されたという言い回しは、核酸配列が宿主細胞に形質転換された時に発現可能であるように、核酸配列を発現ベクターに挿入することをいう。本明細書中で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、宿主細胞内にて自己複製し、特定の核酸配列の発現をなすことが可能なＤＮＡ又はＲＮＡベクターである。発現ベクターは原核生物又は真核生物のいずれかであり、通常はウイルス又はプラスミドである。本発明の発現ベクターには、細菌、酵母、他の菌、昆虫、動物及び他の植物の細胞等の本発明の組換細胞において機能する（即ち、遺伝子の発現を指定する）如何なるベクターも含まれる。本発明の好ましい発現ベクターは細菌、酵母、昆虫及び哺乳類の細胞において、更に好ましくは、前記細胞型において、遺伝子の発現を示すことができる。
また、本発明の発現ベクターは、発現させられる寄生蠕虫の蛋白質が宿主から分泌されるように分泌信号を有し、或いは挿入される本発明の核酸配列を融合蛋白質として発現させることになる融合配列を有している。真核生物の組換分子は寄生蠕虫の核酸配列の周囲の、或いはその核酸配列内にある干渉配列及び／又は未翻訳配列を有する。
本発明の核酸配列は、宿主細胞と和合し、かつ核酸配列の発現を調節するプロモータ、オペレータ、リプレッサ、エンハンサ、終了の配列等の調節配列、複製源及び他の調節配列を有する発現ベクターに有効に結合可能である。特に、本発明の組換分子は転写調節配列を有している。転写調節配列は転写の開始、延長及び終了を調節する配列である。特に重要な転写調節配列は、プロモータ、エンハンサ、オペレータ及びリプレッサの配列のような転写の開始を調節する配列である。好適な転写調節配列には、本発明の少なくとも１つの組換細胞において機能可能であれば如何なる転写調節配列も含まれる。この種の様々な転写調節配列は当業者には周知である。
好ましい転写調節配列には、細菌、酵母、蠕虫、蠕虫の細胞、昆虫及び哺乳類の細胞中にて機能する配列があり、これらの配列には、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、オキシ・プロ（oxy-pro）、バクテリオファージラムダ（ラムダｐL及びラムダｐR等）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１，金属結合性蛋白質、アルファ交配因子、ピキア（Pichia）アルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモータ（シンドビス（Sindbis）ウイルスサブゲノムプロモータ等）、バクロウイルス（baculovirus）、ヘリオシス  ジーア（Heliothis zea）昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルス作用、ニワトリ肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸塩及び硝酸塩の転写調節配列並びに原核生物又は真核生物の細胞中にて遺伝子の発現を調節可能な他の配列があるが、これらに限定されるものではない。本発明の転写調節配列には、分離前に核酸配列に関与し、自然に生じる転写調節配列もある。
本発明の組換分子は、形質転換される細胞中の核酸配列の発現を効果的に調節できる転写調節配列に有効に結合された前記の核酸配列であれば如何なる核酸配列でもよい。
好ましい組換分子は、ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌの少なくとも一部又はＤ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５の少なくとも一部と混成可能な寄生蠕虫の核酸配列を有している。特に好ましい組換分子は、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ４、Ｄ．インミティスｐ４を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ４のフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを有する核酸配列及びＤ．インミティスｐ２２Ｕのフラグメントからなる核酸配列を有している。更に特に好ましい組換分子は、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９、Ｄ．インミティスｐ３９を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ３９のフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌを有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌのフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５、Ｄ．インミティスｐ２０．５を有する核酸配列又はＤ．インミティスｐ２０．５のフラグメントからなる核酸配列を有している。更に好ましい組換分子はｐβｇａｌ−ｐ４、ｐＨｉｓ−ｐ４、ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635、ｐβｇａｌ−ｐ２２Ｕ、ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ及びｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ608を有している。更に好ましい組換分子はｐＨｉｓ−ｐ３９900、ｐ７６−８０．Ｂ３、ｐ１０５−７２．５Ｃ、ｐ１０５−４２．１Ａ、ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417、ｐ７６−７９−Ａ６、ｐ７６−７９．Ｃ２及びｐ８８−３６．１Ｂを有している。諸例部分でこの種の組換分子の派生物について説明している。
本発明の組換細胞には、本発明の核酸配列により形質転換される如何なる細胞も含まれる。好ましい組換細胞は、ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌの少なくとも一部又はＤ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５の少なくとも一部と混成可能な寄生蠕虫の核酸配列を少なくとも１つ有する組換分子により形質転換される。更に好ましい組換細胞は、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ４、Ｄ．インミティスｐ４を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ４のフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを有する核酸配列及び／又はＤ．インミティスｐ２２Ｕのフラグメントからなる核酸配列を有する組換分子により形質転換される。更に特に好ましい組換細胞は、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９、Ｄ．インミティスｐ３９を有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ３９のフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌ、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌを有する核酸配列、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌのフラグメントからなる核酸配列、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５、Ｄ．インミティスｐ２０．５を有する核酸配列又はＤ．インミティスｐ２０．５のフラグメントからなる核酸配列を有する組換分子により形質転換される。この種の組換細胞は、前記のような寄生蠕虫の蛋白質及び／又はＤ．インミティスＤｉ２２等の１つ又は複数の寄生蠕虫の蛋白質並びにＬ３及び／又はＬ４幼虫において発現させられるＤ．インミティスのプロテアーゼと、この種の蛋白質と多大な相同性を有する他の寄生蠕虫の蛋白質とをコード化する核酸配列を有する組換分子により共に形質転換することもできる。Ｄｉ２２をコード化する核酸配列がジェンバンク（GenBank）のデータベースのＭ８２８１１に開示されている。このプロテアーゼは１９９３年５月２７日に公開されたグリーブ（Grieve）らによるＰＣＴ国際特許出願公開第９３／１０２２５号に開示されている。特に好ましい組換細胞には、大腸菌：ｐβｇａｌ−ｐ４、大腸菌：ｐＨｉｓ−ｐ４、大腸菌：ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635、大腸菌：ｐβｇａｌ−ｐ２２Ｕ、大腸菌：ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ及び大腸菌：ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ608がある。更に特に好ましい組換細胞には、大腸菌：ｐＨｉｓ−ｐ３９900、Ｓ．フルージペルダ：ｐ１０５−７２．５Ｃ、ＢＨＫ：ｐ１０５−４２．１Ａ、大腸菌：ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417、Ｓ．フルージペルダ：ｐ７６−７９−Ａ６ｐ７６−７９−Ａ６及びＢＨＫ：ｐ８８−３６．１Ｂがある。
例えば、１つの宿主細胞内の核酸配列のコピー数、これら核酸配列が転写される効率、その転写が翻訳される効率及び翻訳後に修正する効率を操作することによって、組換ＤＮＡ技術を利用することにより、形質転換される核酸配列の発現を向上させることができることを当業者は理解されよう。本発明の核酸配列の発現を高めるのに有用な組換技術では、コピー数が多いプラスミドに核酸配列を有効に結合し、これらの核酸配列を１つ又は複数の宿主の染色体に同化させ、ベクター安定配列をプラスミドに付加し、転写調節信号を置き換え、或いは修正し（例えば、プロモータ、オペレータ、エンハンサ）、翻訳調節信号を取り換え、或いは修正し（例えば、リボソームの結合部位、シャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列）、宿主細胞のコドン使用に応じるように本発明の核酸配列を修正し、転写を不安定にする配列を削除し、発酵中に組換細胞の成長を組換酵素の生成から一時的に分離する調節信号を使用するが、これらに限定されるものではない。本発明の発現させられる組換蛋白質の活性は、この種の蛋白質をコード化する核酸配列をフラグメント化させ、修正し、或いは派生させることにより向上できる。
本発明に基づき、寄生蠕虫の蛋白質を生成するのに効果的な条件下にて組換細胞を培養して蛋白質を回収することにより、これら組換細胞を利用して少なくとも１つの本発明の寄生蠕虫の蛋白質を生成することができる。蛋白質を生成するのに効果的な条件には、蛋白質の生成を可能にする適正な培地、バイオリアクタ、温度、ｐＨ及び酸素に関わる条件があるが、これらに限定されるものではない。適正な培地とは、本発明の細胞が培養時に寄生蠕虫の蛋白質を生成可能な如何なる培地をも指す。通常、効果的な培地はビタミンのような適切な塩、鉱物、金属及び他の滋養物のみならず、同化可能な炭水化物、窒素及びリン酸塩の供給源も備えた水様培地である。培地は複雑な滋養物を備えることができ、或いは最小限に規定された培地でもよい。本発明の細胞は従来の発酵バイオリアクタにおいて培養可能であり、このバイオリアクタにはバッチ、供給されるバッチ、細胞の再生利用及び継続的発酵槽が含まれるが、これらに限定されるものではない。培養はシェークフラスコ、試験管、微量測定皿及びペトリ皿においても実施可能である。培養は組換細胞に適した温度、ｐＨ及び酸素含量にて実施される。この種の培養条件は充分に当業者の技術範囲内にある。好適条件の例については諸例部分にて示す。
生成に使用されるベクター及び宿主の体系に応じ、結果として生じる蛋白質は組換細胞内に残留し、発酵培地に分泌され、大腸菌の周辺質空間のような２つの細胞膜間の空間に分泌されるか、或いは細胞の外面、即ちウイルス膜上に保持される。「蛋白質を回収する」という言い方は単に蛋白質を含有する発酵培地を全て収集することをいい、更なる分離又は精製ステップを意味する必要はない。本発明の寄生蠕虫の蛋白質は、アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動法、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー及び差異可溶化のような種々の標準的蛋白質の精製技術を利用することにより精製可能であるが、これらの精製技術に限定されるものではない。分離される寄生蠕虫の蛋白質は「ほぼ純粋」な形態にて回収されることが好ましい。ここで「ほぼ純粋」とは治療上或いは診断上の組成物として蛋白質を効果的に使用できる純度のことをいう。例えば、動物用のワクチンは実質的な毒性を示さず、かつワクチン接種される動物の体内にて抗体の生成を刺激できるものとする。
本発明の一実施例では、融合部分に付着した寄生蠕虫の蛋白質を有する融合蛋白質として、寄生蠕虫の蛋白質を発現させている。この種の融合部分は、アフィニティー・クロマトグラフィーを利用して、結果として生じる融合蛋白質を精製できるようにして、蛋白質の精製に役立つ場合が多い。寄生蠕虫の蛋白質のカルボキシル基及びアミノ基の端末の双方或いはいずれかに付着した融合部分を有する蛋白質をコード化する融合核酸配列により形質転換される組換細胞を培養することによって、融合蛋白質を生成できる。好ましい融合部分には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシラーゼ、二価金属イオンに結合可能なポリ−ヒスチジン部分、マルトース結合蛋白質及び免疫グロブリン結合領域（例えば、蛋白質Ａ又はその複数部分）があるが、ポリ−ヒスチジン部分がより好ましく、又、これらに限定されるものではない。本発明の融合蛋白質の例には、ｐβＧＡＬ−Ｐ４、ＰＨＩＳ−Ｐ４、ＰＨＩＳ−Ｐ４635、ｐβＧＡＬ−Ｐ２２Ｕ、ＰＨＩＳ−Ｐ２２Ｕ、ＰＨＩＳ−Ｐ２２Ｕ608、ＰＨＩＳ−Ｐ３９900及びＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417（ＰＨＩＳ−Ｐ２２Ｌ417とも表す）がある。
本発明には寄生蠕虫の蛋白質又はそのミメトープ（mimetope）に選択的に結合可能な抗体も含まれ、この蛋白質又はミメトープは抗寄生蠕虫性の免疫血清の少なくとも１つの成分に選択的に結合できる。この種の抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかである。本発明の抗体は単鎖抗体を含む抗体片及び遺伝子操作された抗体のような機能的均等物を有し、これらは抗体を得るのに使用される少なくとも１つの蛋白質のエピトープ又はミメトープに選択的に結合可能である。好ましい抗体は、ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌの少なくとも一部又はＤ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５の少なくとも一部と混成可能な核酸配列によって、少なくとも部分的にコード化される蛋白質又はそのミメトープに応じて育成される。
本発明の抗体を生成するのに好ましい方法では、分離蛋白質又はそのミメトープの有効量を動物に投与して抗体を生成し、回収する。ここで、蛋白質は寄生蠕虫感染に免疫があり、かつその成長を抑止できる動物の血清の少なくとも一成分に選択的に結合可能である。蛋白質は、ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ３９の少なくとも一部、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｌの少なくとも一部又はＤ．インミティスの核酸配列ｐ２０．５の少なくとも一部と混成可能な寄生蠕虫の核酸配列によって少なくとも部分的にコード化されることが好ましい。規定の蛋白質又はミメトープに対して育成された抗体は、治療組成物にて使用されると診断検定を妨害したり、或いは副作用を生じるおそれがある他の物質に対して抗体に汚染されるということはないため、効果的である。
本発明の抗体は本発明の範囲内にある種々の使用可能性を有している。例えば、この種の抗体は、（ａ）寄生蠕虫から防御するために動物を受動免疫化させるためのワクチン、（ｂ）寄生蠕虫による感染を検出するための検定試薬及び／又は（ｃ）蛋白質と他の汚染物質との混合物から所望の寄生蠕虫の蛋白質を回収するためのツール、として利用可能である。
更に、本発明の抗体は、抗体により選択的に結合される蛋白質を発現させる寄生蠕虫を直接殺すために、細胞毒剤を寄生蠕虫に向けるのに使用される。この目標を定めるには、抗体を細胞毒性剤に接合する（即ち、安定するように結合する）ことによって可能である。好適な細胞毒剤には、ジフテリア毒素、リシン毒素、シュードモナス外毒素、モデクシン（modeccin）毒素、アブリン毒素及びシガ（shiga）毒素のような二重鎖毒素（即ち、Ａ鎖及びＢ鎖を有する毒素）、ヨウシャヤマゴボウの抗ウイルス蛋白質、α−アマニチン及びリボソーム抑制蛋白質のような単鎖毒素並びにメルファラン、メトトレキサート、窒素イペリット、アドリアマイシン及びダウノマイシンのような化学毒素があるが、これらに限定されるものではない。好ましい二重鎖毒素は、毒素領域及び毒素の転座領域を有しながらも毒素固有の細胞結合領域を有さないように変異させられている。
本発明の一実施例は、投与された時に寄生蠕虫症から動物を防御することができる治療組成物に関する。この種の組成物は以下の防御化合物を少なくとも１つ有している。それは、（ａ）好ましくは蛋白質がストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部と混成可能な核酸配列によって少なくとも部分的にコード化されるように、抗寄生蠕虫性の免疫血清の少なくとも１つの成分に選択的に結合可能である分離された寄生蠕虫の蛋白質又はそのミメトープ、（ｂ）好ましくは蛋白質がストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部と混成可能な核酸配列によって少なくとも部分的にコード化されるように、抗寄生蠕虫性の免疫血清の少なくとも１つの成分に選択的に結合可能である分離された寄生蠕虫の蛋白質又はそのミメトープ、（ｃ）好ましくは蛋白質がストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部と混成可能な核酸配列によって少なくとも部分的にコード化されるように、抗寄生蠕虫性の免疫血清の少なくとも１つの成分に選択的に結合可能な寄生蠕虫の蛋白質又はそのミメトープに選択的に結合可能な抗体、（ｄ）好ましくは蛋白質がストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部と混成可能な核酸配列によって少なくとも部分的にコード化されるように、抗寄生蠕虫性の免疫血清の少なくとも１つの成分に選択的に結合可能な寄生蠕虫の蛋白質又はそのミメトープに選択的に結合可能な抗体、（ｅ）ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ４の少なくとも一部と混成可能な分離された寄生蠕虫の核酸配列、及び／又は（ｆ）ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの少なくとも一部と混成可能な分離された寄生蠕虫の核酸配列である。本発明に更に含まれるのは、分離された寄生蠕虫の蛋白質Ｐ３９、Ｐ２２Ｌ及び／又はＰ２０．５、これらの蛋白質の少なくとも１つに選択的に結合する抗体、並びに／或いは、ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスの核酸配列ｐ３９、ｐ２２Ｌ及び／又はｐ２０．５の少なくとも一部と混成可能な核酸配列、の少なくとも１つを有する治療組成物である。
複数の寄生蠕虫を目標とした複数の防御化合物を含有する治療組成物を動物に投与することにより、寄生蠕虫症から動物を防御することができる。同様に、所定の寄生蠕虫の異なる様相を目標とした治療組成物を投与することにより、動物をより一層防御できる。例えば、Ｐ４及び／又はＰ２２Ｕを有する本発明の治療組成物は以下の化合物を少なくとも１つ更に有することもできる。それは、Ｄ．インミティスＰ３９、Ｄ．インミティスＰ２２Ｌ、Ｄ．インミティスＰ２０．５、Ｄ．インミティスＤｉ２２、Ｌ３及び／又はＬ４幼虫において発現させられるＤ．インミティスのプロテアーゼと、Ｄ．インミティスＰ３９、Ｄ．インミティスＰ２２Ｌ、Ｄ．インミティスＰ２０．５、Ｄ．インミティスＤｉ２２、Ｌ３及び／又はＬ４幼虫において発現させられるＤ．インミティスのプロテアーゼとの多大な相同性を有する他の寄生蠕虫の蛋白質と、このような蛋白質のミメトープと、この種の蛋白質又はそのミメトープに選択的に結合する抗体と、このような蛋白質をコード化する核酸配列とである。
ここで使用される防御化合物とは、効果的に動物に投与された時、寄生蠕虫による感染を治療し、改善し、かつ／或いは防止できる化合物のことをいう。好ましい寄生蠕虫については前述した。
本発明の治療組成物は如何なる動物にも投与できるが、好ましくは哺乳類に投与され、更に好ましくはイヌ、ネコ、ヒト、イタチ、ウマ、ウシ、ヒツジ並びに他の愛玩動物及び／又は経済的食用動物に投与される。防御するのに好適な動物はイヌ、ネコ、ヒト及びイタチであるが、イヌ及びネコが特に好ましい。
本発明の治療組成物は処置動物が耐性を有する賦形剤にて調剤できる。この種の賦形剤の例には水、塩類、リンガー氏液、デキストロース液、ハンク氏液（Hank’s solution）及び他の平衡生理的食塩水がある。不揮発性油、ゴマ油、エチルオレアート又はトリグリセリドのような非水性賦形剤も使用できる。他の有用な製剤にはカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのような粘性増強剤を含有する懸濁液がある。賦形剤は等張性及び化学的安定度を高める物質のような添加剤を少量だけ含有することもできる。緩衝液の例にはリン酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液及びトリス緩衝液があり、防腐剤の例にはチメロサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールがある。標準的製剤は液状注射可能物質或いは注射用の懸濁液又は溶液として好適な液体にて得られる固体のいずれかである。このようにして、非液体状製剤において、賦形剤はデキストロース、ヒトの血清アルブミン、防腐剤等を備え、投与前にこれらに無菌の水又は塩類を添加することができる。
本発明の一実施例において、治療組成物にはアジュバント又はキャリアのような免疫強化剤も含有できる。通常、アジュバントは抗原に対する動物の免疫応答を総体的に高める物質である。好適なアジュバントには、フロイトのアジュバント、他の細菌の細胞壁の成分、アルミニウムベースの塩、カルシウムベースの塩、シリカ、ポリヌクレオチド、トキソイド、血清蛋白質、ウイルス性被膜蛋白質、他の細菌化から抽出した製剤、ガンマインターフェロン、ハンターのタイターマックス（Hunter’s Titermax）アジュバント（米国ジョージア州ノークロス（Norcross）に所在する企業製のバックスセル（Vaxcel）（商標名））のようなブロック共重合体、リビアジュバント（米国モンタナ州ハミルトン（Hamilton）に所在するリビ・イミューノケム・リサーチ社（Ribi ImmunoChem Research, Inc.）にて入手可能）並びにサポニン及びクイル（Quil）Ａ（デンマークに所在するスーパーフォス・バイオセクタ社（Superfos Biosector A/S）にて入手可能）のようなその派生物質があるが、これらに限定されるものではい。通常、キャリアは処置動物における治療組成物の半減期を延ばす化合物である。好適なキャリアには、高分子調節の剥離製剤、生物分解性移植組織、リポソーム、細菌、他のウイルス、油、エステル及びグリコールあるが、これらに限定されるものではない。
寄生蠕虫症から動物を防御するために、本発明の治療組成物は感染から動物を防御できるように、効果的に動物に投与される。例えば、分離蛋白質又はそのミメトープは効果的に動物に投与された時、好ましくは体液性及び細胞性の双方の反応を含むとともに感染から動物を防御できる程度の免疫応答を引き出す（即ち、誘発する）ことができる。同様に、本発明の抗体は効果的に動物に投与された時、少なくとも一時的に感染から動物を防御する程度の滴定量にて動物の体内に存在するような量にて投与される。寄生蠕虫の成長を妨害するために、本発明の核酸配列、好ましくはオリゴヌクレオチドも効果的に投与され、寄生蠕虫の蛋白質の発現を低減できる。
本発明の治療組成物は感染防止のために寄生蠕虫の感染前に動物に投与でき、かつ／或いは寄生蠕虫を原因とする疾患を治療するために寄生蠕虫の感染後に動物に投与できる。例えば、蛋白質、そのミメトープ及びその抗体を免疫治療剤として使用できる。
効果的に治療組成物を投与するのに許容されるプロトコルには、個々の投与量の規模、投与回数、投与頻度及び投与方式がある。この種のプロトコルは当業者により決定できる。適正な一回の投与量は適正な時間にわたり１回又は複数回投与された時、寄生蠕虫症から動物を防御できる投与量である。例えば、蛋白質、ミメトープ又は抗体の治療組成物の一回の投与量は、イヌの大きさほどの動物では約１マイクログラム（μｇ）〜１０ミリグラム（ｍｇ）である。最初の投与の約２週間〜数年後にブースタワクチン接種を実施できる。ブースタワクチン接種は、動物の免疫応答が寄生蠕虫症から動物を防御するのに不十分になった時に行われるのが好ましい。好ましい投与計画は、動物の重量ｋｇ当り約１０μｇ〜１ｍｇのワクチンを約２週間〜１２カ月の時期にわたり約１〜２回、投与するものである。投与方式には、皮下、皮内、静脈内、鼻、口部、経皮及び筋肉内の経路があるが、これらに限定されるものではない。
一実施例において、本発明の核酸配列は、動物体内の防御蛋白質に発現させられるのを寄生蠕虫症から防御できるように、動物に投与することもできる。核酸配列は組換ウイルス粒子のワクチンとしてパッケージされ、かつ組換細胞のワクチンとしてパッケージされた直接注入（例えば、１９９０年発行のサイエンス誌第２４７巻の１４６５〜１４６８頁におけるヴォルフ（Wolff）らにより開示されたような「裸出」ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）等の種々の方法にて射出可能であるが、この直接注入法に限定されるものではない。
本発明の組換ウイルス粒子のワクチンは、ウイルス被膜にてパッケージされ、かつ投与後に動物体内にて発現可能な本発明の組換分子を有している。
組換分子はパッケージが不完全であることが好ましい。幾つかの組換ウイルス粒子を用いることができ、この中にはアルファウイルス、ボックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びレトロウイルスに基づいたものがあるが、これらに限定されるものではない。好ましい組換粒子のウイルスはアルファウイルスに基づいたものであるが、シンドビスウイルス、セムリキウイルス及びロスリバー（Ross River）ウイルスがより好ましい。組換ウイルス粒子のワクチンの生成及び使用方法が、１９９３年２月８日付け出願の米国特許出願第０８／０１５／４１４号の発明の名称「組換ウイルス粒子のワクチン（Recombinant Virus Particle Vaccines）」に開示されている。
組換ウイルス粒子のワクチンは動物に投与された時、免疫動物内の細胞に感染するとともに、寄生蠕虫による感染から動物を防御可能な寄生蠕虫の蛋白質又はＲＮＡの生成を指令する。例えば、寄生蠕虫の蛋白質がＤ．インミティスの蛋白質である時、組換ウイルス粒子のワクチンは、心糸状虫症から自身を防御する程度の免疫応答を生じる動物になるプロトコルに基づいて投与される。本発明の組換ウイルス粒子のワクチンの好適な一回の投与量は、動物の体重量キログラム当り約１×１０4〜１×１０5のウイルスプラーク形成ユニット（ｐｆｕ）である。投与プロトコルは蛋白質ベースのワクチンにて説明したプロトコルに類似している。
本発明の組換細胞のワクチンは、少なくとも１つの寄生蠕虫の蛋白質を発現させる本発明の組換細胞を有している。好ましい組換細胞にはサルモネラ属、大腸菌及びミコバクテリウム属の細胞があるが、サルモネラ属の組換細胞がより好ましい。この種の組換細胞は種々の方法にて投与可能であるが、好ましくは体重量キログラム当り約１０8〜１０12の範囲の投与量で口部にて投与可能であるという利点を有している。投与プロトコルは蛋白質ベースのワクチンにて説明したプロトコルに類似している。大部分の腸の病原体と同様に、通常、サルモネラ属の菌株は口部から宿主に侵入する。サルモネラ属の菌株は腸内に侵入すると、粘膜面と相互作用を起こし、通常、侵襲性感染を生じさせる。大部分のサルモネラ属の感染は上皮にて調節され、サルモネラに誘発された典型的な胃腸炎を生じさせる。チフス菌の分離株及び一部のネズミチフス菌の分離株等のサルモネラ属の菌株の中には、宿主の奥深くに浸透する能力を発展させ、散在性の全身感染を引き起こすものもある。この種の菌株はマクロファージ及び他の免疫細胞の死滅作用に抵抗する能力を有するようである。チフス菌は条件的細胞内寄生菌として長期間、存在可能である。生きたワクチンの菌株の一部も単核食細胞系において長期間、存続可能である。このように感染した宿主は、粘膜性免疫応答に加え、サルモネラ属に対する細胞・血清の全身性抗体反応を発達させる。こうして、侵入するサルモネラ属は毒性・減毒性を問わず、局部的な非侵襲性腸内感染のみを引き起こす他の多くの腸の病原体とは異なり、激しい免疫応答を刺激することができる。生きたサルモネラ属は有効な免疫原性を有するために、寄生蠕虫の蛋白質を免疫系に伝達するのに適正な候補となっている。
好ましい組換細胞ベースのワクチンは、細胞が減毒されたワクチンである。例えば、ネズミチフス菌の菌株は生体内での成長及び存続に肝要な遺伝子に突然変異体を導入することにより減毒可能である。例えば、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）受容体の蛋白質又はアデニル酸シクラーゼをコード化する遺伝子が、非病原性のワクチン菌株を生成するために欠失される。この種の菌株は腸内のリンパ性組織に抗原を伝達できるが、脾臓及び腸間膜のリンパ節に侵入する能力が減退したことを示す。これらの菌株は依然として哺乳類の宿主における体液性及び細胞性の双方の免疫質を刺激することができる。
組換細胞のワクチンは本発明の分離蛋白質を動物の免疫系に導入するのに使用される。例えば、サルモネラ属において機能する発現ベクターに有効に結合された本発明の寄生蠕虫の核酸配列を備えた組換分子は、サルモネラ属の宿主細胞に形質転換可能である。そして、生じた組換細胞は防御される動物に導入される。好ましいサルモネラ属の宿主細胞は、組換分子を維持する能力にその存続を依存する細胞である（平衡致死宿主ベクター系）。この種の好適な宿主／組換分子の組合せの例に、アスパラギン酸β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを生成することが不可能なサルモネラ属菌株（例えば、ＵＫ−１  x３９８７又はＳＲ−１１  x４０７２）と、酵素をコード化することも可能な組換分子との組合せがある。ａｓｄ遺伝子によりコード化されたアスパラギン酸β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を生成するために、経路における重要な酵素である。ＤＡＰはサルモネラ属のようなグラム陰性細菌の細胞壁のペプチドグリカンの必須成分であり、こうして、細胞の存続に必要である。こうして、機能的ａｓｄ遺伝子を有さないサルモネラ属が存続できるのは、サルモネラ属が機能的ａｓｄ遺伝子を発現させることも可能な組換分子を維持する場合のみである。寄生蠕虫による感染から動物を防御するための本発明の治療組成物の効力は、種々の方法にて試験可能である。これらの方法では、保護抗体を検出し（例えば、本発明の蛋白質又はミメトープを使用する。）、処置動物体内の細胞免疫質を検出し、或いは処置動物が耐感染性を有するか否かを判定するために寄生蠕虫又はその抗原により処置動物を攻撃するが、これらに限定されるものではない。この種の技術は当業者には周知のものである。
本発明の好ましい一実施例では、心糸状虫症から動物を防御するためにＤ．インミティスの核酸及び蛋白質を使用している。中間宿主の蚊を介して動物に運ばれるＬ３幼虫が成虫になるのを防ぐことが特に好ましい。このように、好ましい治療組成物は、Ｌ３幼虫、３回目の脱皮、Ｌ４幼虫、４回目の脱皮、未成熟な成虫等の寄生虫の成長周期の一部における少なくとも１ステップを、循環系に侵入する前に阻止できる組成物である。イヌではこの成長周期部分は約７０日である。このように、動物を心糸状虫症から防御するのに好適な核酸配列、蛋白質及び抗体には、Ｄ．インミティスｐ４及びＤ．インミティスｐ２２Ｕと、Ｄ．インミティスｐ４及び／又はＤ．インミティスｐ２２Ｕの少なくとも一部を有する核酸配列と、これらの配列によりコード化された蛋白質と、この種の蛋白質のミメトープと、この種の蛋白質に選択的に結合する抗体がある。特に好ましい治療組成物は、Ｄ．インミティスＰ４及び／又はＤ．インミティスＰ２２Ｕのエピトープを少なくとも幾つか共有する蛋白質を有している。この種の組成物は心糸状虫症から動物を防御するのに効果的であるように動物に投与される。Ｄ．インミティスＰ３９、Ｄ．インミティスＰ２２Ｌ、Ｄ．インミティスＰ２０．５、Ｄ．インミティスＤｉ２２のような他のＤ．インミティスの抗原並びに／或いはＬ３及び／又はＬ４幼虫において発現させられたＤ．インミティスのプロテアーゼを有する保護化合物を追加投与することにより、一層の防御が可能になる。
本発明の別の実施例では、心糸状虫症から動物を防御するのに好適な核酸配列、蛋白質及び抗体には、Ｄ．インミティスｐ３９、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌ及び／又はＤ．インミティスｐ２０．５と、Ｄ．インミティスｐ３９、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌ及び／又はＤ．インミティスｐ２０．５の少なくとも一部を有する核酸配列と、これらの配列によりコード化された蛋白質と、この種の蛋白質のミメトープと、この種の蛋白質に選択的に結合する抗体がある。特に好ましい治療組成物は、Ｄ．インミティスＰ３９及び／又はＤ．インミティスＰ２２Ｌ／Ｐ２０．５のエピトープを少なくとも幾つか共有する蛋白質を有している。この種の組成物は心糸状虫症から動物を防御するのに効果的であるように動物に投与される。Ｄ．インミティスＰ４、Ｄ．インミティスＰ２２Ｕ、Ｄ．インミティスＤｉ２２のような他のＤ．インミティスの抗原並びに／或いはＬ３及び／又はＬ４幼虫において発現させられたＤ．インミティスのプロテアーゼを有する保護化合物を追加投与することにより、一層の防御が可能になる。寄生蠕虫の分離蛋白質、ミメトープ、核酸配列及び抗体を診断剤として使用することも本発明の範囲内にある。この種の診断剤は蠕虫の生活環の他の相を検出可能な更なる化合物により補充されるのが好ましい。
本発明の一実施例は、効果的に動物に投与された時、寄生蠕虫症から動物を防御することができる治療組成物に関するものである。この治療組成物は、好ましくは蛋白質のステロール取込み能力を減退させることにより、寄生蠕虫の蛋白質ＬＤＬｒのクラスＡの濃厚システインモチーフの機能に実質的に干渉することが可能な化合物を有している。ここで、寄生蠕虫の蛋白質ＬＤＬｒのクラスＡの濃厚システインモチーフ、即ちＬＤＬｒのクラスＡのモチーフとは、Ｄ．インミティスＰ４において特定される蛋白質と相同の寄生蠕虫の蛋白質における濃厚システインモチーフのことをいう。この種のモチーフはＬＤＬ受容体関連の蛋白質及びα2−マクログロブリン受容体を含む前述した幾つかの他の蛋白質においても生じる。ここで、「実質的に干渉する」とは、化合物が寄生蠕虫の成長を抑止する能力のことをいう。
好ましい治療組成物は、ストリンジェント条件下にてＤ．インミティスｐ４の少なくとも一部と混成可能な核酸配列により少なくとも部分的にコード化されたＤ．インミティスＰ４及び他の寄生蠕虫の蛋白質により共有されたＬＤＬｒのクラスＡのモチーフを目標にした組成物である。適正な化合物は、無機分子及び有機分子をふるい分ける周知の方法、並びにモチーフの作動部位が特定され、この作動部位に干渉する化合物が設計される合理的薬物分子設計法等の種々の方法により特定可能である。適正な化合物は、多くの場合、ＬＤＬｒのクラスＡのモチーフに選択的に結合することによって、寄生蠕虫によるステロールの取込みに干渉することが可能なステロールミメトープを有することが多い。
寄生蠕虫、一部の原生動物及び一部の昆虫はスクアレン及びステロールを新たに合成することはできない。こうして、寄生蠕虫はステロイドホルモン用の前駆物質及び細胞膜の構成成分としてステロールを必要とする。寄生蠕虫が新たに生成することが不可能なステロールの１つであるコレステロールは、複数のプロテインキナーゼ、蛋白質受容体及びイオンポンプと相互作用することにより、細胞の機能、成長及び分化を規制する。コレステロールは昆虫のステロイド性脱皮ホルモンであるエクジステロイドの前駆物質でもあり、寄生蠕虫においても同様な機能を果たすものと考えられる。理論には拘束されないが、周知のＬＤＬｒのクラスＡのモチーフは明らかステロールの取込みに関与しているため、寄生蠕虫（線虫、吸虫及び条虫等）及び新たにステロールを合成しない他の有機体（例えば、寄生体質の原生動物及び昆虫）の成長にＬＤＬｒのクラスＡのモチーフは重要であると考えられている。例えば、ＬＤＬ受容体におけるこの種のモチーフは、陽電荷を与えられたリガンドのアポリポ蛋白質Ｂ（アポＢ）及びアポリポ蛋白質Ｅ（アポＥ）をリポ蛋白質の粒子内にて結合する原因となるものである（例えば、１９８８年ＥＭＢＯ誌第７巻４１１９〜４１２７頁のヘルツ（Herz）らの論文を参照されたい。）。アポＥはトリグリセリドに富むリポ蛋白質のクリアランス及びコレステロールの逆運搬に関与している。アポＥは哺乳類のリンパ球並びに脳及び他の組織における細胞の成長の調節にも関与していると考えられている。このように、ＬＤＬｒのクラスＡのモチーフと相互作用をする能力を有することにより、寄生蠕虫によるステロールの取込みと相互作用をする能力を有する化合物は、本発明の治療組成物として好ましい。
この種の治療組成物は、寄生蠕虫症から動物を防御するために効果的に動物に投与可能である。有効量及び投与量の摂生については、当業者には周知の技術を用いることにより決定できる。
以下の例は例示することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
例
例１
この例では本発明の免疫血清を生成し、かつ評価するための処置を説明している。
化学的に簡略化されたＤ．インミティスの幼虫感染症により４頭のイヌが免疫にされ（１９８８年同上、グリーブらの論文に開示された方法を利用）、化学処理された対称標準として２頭のイヌが用いられた。これらのイヌは約２２℃の温度及び約４０〜６５％の湿度にて、屋内における蚊が存在しない個々の檻の中に収容された。当初の免疫化後の５３２日目において、１９８８年同上、グリーブらの論文に開示された方法を利用し、それぞれが約２０匹のＬ３Ｄ．インミティスの幼虫を有する拡散チャンバを１頭当りに５つ移植することにより、各イヌは約１００匹のＬ３Ｄ．インミティスの幼虫の攻撃を受けた。チャンバの移植に付随して、各イヌは５０匹のＬ３Ｄ．インミティスの幼虫により皮下注射され、予期される特許前期間を過ぎて感染が進行するようにした。当初の免疫化後の５８８日目において、それぞれが約２０匹のＬ３Ｄ．インミティスの幼虫を有する拡散チャンバを１頭当りに５つ移植し、かつ１頭当りに約３０匹のＬ３Ｄ．インミティスの幼虫を皮下接種することにより、攻撃感染が繰り返された。研究期間中にわたり数多くの時点において、免疫にされたイヌから血清サンプルが採取された。１９８８年同上、グリーブらの論文に開示されているように、間接的蛍光抗体検定法を利用し、Ｌ３及び／又はＬ４の表面上の抗原に選択的に結合された抗体について血清サンプルを分析し、かつ間接的ＥＬＩＳＡを利用し、Ｌ３の可溶性抗原、Ｌ４の可溶性抗原及び／又は抗原の排泄／分泌部分に選択的に結合された抗体について血清サンプルを分析した。免疫にされるとともにＤ．インミティスの幼虫に攻撃されたイヌからの血清は、Ｄ．インミティスの幼虫の表面上の抗原及び可溶性抗原の双方に対して抗体を生成するという結果を示した。血清はプールされ、幼虫に対して免疫にされたイヌから得られた血清（即ち、抗幼虫免疫血清）は、幼虫の成長を抑止することが示された。例えば、例２を参照されたい。免疫血清は、トリスグリシン（Tris-glycine）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、約１５ｋＤ、２３／２４ｋＤダブレット、３１ｋＤ、３３ｋＤ、３９ｋＤ、４２ｋＤ、５５ｋＤ、５９ｋＤ、６６ｋＤ、７０ｋＤ、９７ｋＤ及び２０７ｋＤの分子量を有するＬ３及び／又はＬ４の幼虫の蛋白質に選択的に結合することも示された。
例２
この例では、例１において説明したように生成される、幼虫に対して免疫にされたイヌから採取された血清は寄生虫の成長を抑止できるが、免疫にされなかったイヌから採取された血清は寄生虫の成長を抑止できないことを示す。
生後約１０週間の約３〜６匹の各Ｂａｌｂ／Ｃ  ＢＹＪマウスに１つの皮下ポケットが形成された。２０匹のＬ３Ｄ．インミティスの幼虫を有する１つの拡散チャンバが、例１に説明したように生成される、免疫にされたイヌ、又は免疫にされなかったイヌから採取された０．５ｍｌの血清とともに各ポケットに移植された。拡散チャンバは２週間後又は３週間後に回収された。チャンバ中の生きた幼虫は計算されて氷酢酸中に置かれ、次に５％のグリセリンを含有する７０％のエタノール中に置かれた。エタノールは気化され、グリセリン中に幼虫を残した。マッキントッシュのコンピュータ上のマックメジャー画像分析システムにおける映像を用いて、幼虫を測定した。
互いに異なる血清サンプルが拡散チャンバ中の幼虫に晒される３つの実験を行った。実験１では、攻撃後５６日、７７日及び１１７日目にて個々のイヌから採集された血清の同等部分を比較した。実験２及び３では、当初の攻撃後１１７日目に免疫にされたイヌから採集された血清を対照基準の血清と比較した。実験２において、対照基準の血清は実験による投薬をされなかった１２匹のイヌから採集された血清プールであり、実験３において、対照基準の血清は１匹の非投薬イヌから採集された。各実験には幼虫が血清に晒されなかった対照基準も含まれた。
実験１において、チャンバは接種後２週間して回収された。免疫にされた（即ち、免疫性の）イヌから血清を受けるマウスに移植されたチャンバから回収された幼虫の数は、非投薬イヌの血清を受けるマウスに移植されたチャンバ中の幼虫の数よりも少なかったが、この差異は統計上重要ではなかった。また、どの血清が使用されるかに拘らず、幼虫の長さの間に差異は見られなかった。
実験２及び３において、チャンバは感染後３週間して回収された。非投薬イヌから血清を受けるマウスと免疫性イヌから血清を受けるマウスとの間には、幼虫の回収率に大きな差異が見られた。非投薬イヌの血清にて処理されたマウスから回収された幼虫のほうが、免疫血清にて処理されたマウスから回収された幼虫よりも約３４％多かった。幼虫の長さについても、非投薬イヌの血清に晒されたチャンバ中の幼虫と比較し、免疫性イヌからの血清に晒されたチャンバ中の幼虫のほうが顕著に短かった。このように、この例では、非投薬のイヌから収集された血清と比較し、Ｄ．インミティス症に免疫のあるイヌから採集された血清は幼虫の成長を抑制することを示す。
例３
この例では、Ｄ．インミティスＰ２２Ｕ、Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５の精製、並びにトリプシン作用による蛋白質の消化と、複数のトリプシンフラグメントの部分的なアミノ酸配列化とを説明する。
幼虫及びＥＳの蛋白質は、１９９２年発行の寄生虫誌（J. Parasitol）第７７巻、フランク（Frank）らによる論文の９５０〜９５６頁に記載されているように、パルスチェイス（pulse chase）と標識化された。２２及び２０．５ｋＤの蛋白質は、特にＬ３及びＬ４に存在し、かつ発達上規制された蛋白質であることが示された。
第３ステージの幼虫が採集され、同上フランクらによる論文に記載のように器内で培養された。これらの幼虫は約４８時間後に血清蛋白質を洗い落とされ、培養物中に置き戻され、幼虫のＥＳ生成物を含有する血清を含まない媒質が４８〜１４４時間後に培養物中にて採集された。週毎のＥＳ収量が採集され、０．４５μｍのフィルタ（米国ミシガン州アンアーバー（Ann Arbor）に所在するゲルマンサイエンシズ（Gelman Sciences）社製のアクロディスク（Acrodisk）（商標名））を介してろ過され、約−７０℃にて凍結され、更なる処理を行った。この処理は約４℃又は氷上にて行われ、ＥＳを解凍し、かつ０．５ＭのＥＤＴＡ・Ｎａ2（ｐＨ８．０）を添加して最終的に濃度を５ｍＭにした。幼虫のＥＳにおいて見出されたのはメタロプロテアーゼの作用のみであったために、使用したプロテアーゼ抑制剤はＥＤＴＡのみであった（１９９２年発行の実験寄生虫誌（Exp. Parasit.）第７５巻２１３〜２２２頁におけるリッチャー（Richer）らの論文を参照されたい。）。ＥＳは凝縮され、緩衝液はセントリプレップ（Centriprep）−１０及びセントリコン（Centricon）−１０（米国マサチューセッツ州ベヴァリー（Beverly）に所在するアミコン（Amicon）社の製品）を用いて交換された。
クロマトグラフィーは全てシステムゴールド（System Gold）のヴァージョン３．１０のクロマトグラフィーソフトウェアを用いて、ベックマン（Beckman）の３３８二成分系において実施された（米国カリフォルニア州サンラモン（SanRamon）に所在するベックマンインスツルメンツ社（Beckman Instruments, Inc.）の製品）。分離及びフラグメントの採集は室温にて行われ、これらのフラグメントは各実行直後に約４℃にて配置された。サンプル部分が代謝的に標識化された時、ベックマンモデルＬＳ１８０１の液体シンチレーションカウンタ（ベックマンインスツルメンツ社製）により、採集されたフラグメントの部分標本がシンチレーション流体において分析された。
最初の精製は約３８，６５０匹の幼虫から行われ、この内、３，５５０匹は約４８〜１４４時間後にトランスラベル（Translabel）（商標名）を用いて代謝的に標識化された。ＥＳ蛋白質は２０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ・Ｎａ2、ｐＨ７．２（緩衝液Ａ）にて１７５μｌに濃縮され、７，４５０ｃｐｍ／μｌの35Ｓの取込みとともに１．３μｇ／μｌの蛋白質を含有した。精製の第１ステップとして陽イオン交換クロマトグラフィーが用いられた。シンクロパック（SynChropak）ＣＭ３００−ＧＲＤの４．６×５０ｍｍのカラム（米国インディアナ州ラフィエット（Lafayette）に所在するシンクロム社（Synchrom, Inc.）の製品）が使用された。サンプルは、３００μｌの緩衝液Ａにより希釈され、１２，０００ｇにて遠心分離され、この上澄みが０．５ｍｌ／ｍｉｎの緩衝液Ａにてカラムに射出された。５分間の洗浄後、吸着された蛋白質は０．１分にわたり１００％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１ＭのＫＣＬ）に至る急勾配にて溶離され、一方、２００μｌのフラグメントが隈なく採集された。蛋白質の検出は２８０ｎｍであった。図１はクロマトグラムの結果を示す。４，５，６，２３，２４，２５，２６と示された箱入フラグメントがＳＤＳ  ＰＡＧＥにより評価された。
汚染性蛋白質の大部分は最初のピークにおいて溶離した。これとは対照的にＰ２２Ｕ並びにＰ２２Ｌ及びＰ２０．５は第２のピーク、即ちフラグメント２３，２４，２５，２６において溶離した。
ヴァイダック（Vydac）Ｃ4の０．２１×２５ｃｍの５μｍの粒子サイズのカラム（米国カリフォルニア州ヘスペリア（Hesperia）に所在するザ・セパレーションズグループ（The Separations Group）社製のヴァイダック２１４ＴＰ５２）を用いた逆相クロマトグラフィーを使用して、Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５からＰ２２Ｕを分離した。緩衝液Ｃは、ミリＱプラス（Milli-Q Plus）水システム（米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford）に所在するミリポア社（Millipore Corp.）の製品）を介して１８メガオームの水を処理することにより生成されるミリＱ水中の０．１％のトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）、０．０８５％のトリエチルアミン（ＴＥＡ）からなり、一方、緩衝液ＤはミリＱ水中の０．０８５％のＴＦＡ、０．０８５％のＴＥＡ、８０％のＣＨ3ＣＮからなった。蛋白質の検出は２２０ｎｍであった。陽イオン交換の実行によるフラグメント２３，２４がカラムに射出され、続いて２分後にフラグメント２５，２６が射出された。当初の流量は１２．５％のＤ、８７．５％のＣにおいて０．２５ｍｌ／ｍｉｎであった。流量は４分後に０．１７ｍｌ／ｍｉｎに低減され、２００分にわたり６２．５％のＤに至る勾配が６分後に開始された。０．７５分のフラグメントが採集された。
ピーク時フラグメントの部分標本がＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試され、銀汚染及びオートラジオグラフィーにより分析された。
最初にＰ２０．５が現れ、フラグメント９９〜１０２において優位を占めた（溶離時間は約７４．２５〜７６．５分）。Ｐ２２Ｌはフラグメント１０３〜１０７において優位を占めたが（溶離時間は約７７．２５〜８０．２５分）、Ｐ２０．５による汚染が顕著であった。Ｐ２２Ｕは他よりも遥かに遅く、フラグメント２２９〜２３５において溶離した（溶離時間は約１７１．７５〜１７６．２５分）。Ｃ４逆相クロマトグラフィーから回収されるＰ２２Ｕ、Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５は、例１のように調製されたイヌの免疫血清を用いて、イムノブロット（immunoblot）分析（その方法については、例えば１９９２年発行の免疫学誌（J. Immunol.）第１４８巻、２５１１〜２５１５頁におけるグリーブらの論文を参照されたい。）により、各々が免疫血清により特異に識別されることが示された。
Ｐ２２Ｕ、Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５の分子量は、１９８７年発行の分析生化学誌（Analyt. Biochem.）第１６６巻、３６８〜３７９頁におけるシャガール（Schagger）及びフォン  ヤゴー（von Jagow）による論文の方法に基づき、トリストリシン（Tris-tricine）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定された。このトリストリシン系は他の蛋白質の分子量を更に精密に評価すると報告されている。例えば、１９９１年発行の分析生化学誌第１９７巻、２５〜３３頁におけるパットン（Patton）らによる論文を参照されたい。ここで用いた分子量の規格はＳＤＳ−ＰＡＧＥ規格、ローレンジ（Low Range）（バイオラド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）製）及びＭＷ−ＳＤＳ−１７Ｓ（米国ミズーリ州セントルイスに所在するシグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）製）であった。２０及び２２Ｌ  ｋＤの蛋白質はトリストリシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを低減することにより、１６．１及び１８．８ｋＤとして分解した。１）別のトリストリシンのゲルにおいて電気泳動をかけられたこの同サンプルは１５．３及び１７．７ｋＤの分子量になり、２）トリスグリシンのゲルにおいて電気泳動をかけられた同サンプルは２１．９及び２３．２ｋＤの分子量になった。
Ｃ4逆相クロマトグラフィーから得られたＰ２２Ｌ及びＰ２０．５を含有するフラグメントは、この２つの蛋白質を更に分離しようとして、０．２１×２５ｃｍの５μｍの粒子サイズのカラム（ヴァイダック  ２１８ＴＰ５２）を用いて、Ｃ18逆相クロマトグラフィーに供試された。１１．１％の緩衝液Ｆ（ミリＱ水中の０．０８５％のＴＦＡ、９０％のＣＨ3ＣＮ）、８８．９％の緩衝液Ｅ（ミリＱ水中の０．１％のＴＦＡ）にて、６５分にわたり８３．３％の緩衝液Ｆに至る勾配において、流量は０．２ｍｌ／ｍｉｎであった。３〜８３分後において１分単位のフラグメントが採集された。最初にＰ２０．５が溶離し、続いてＰ２２Ｌが溶離した。
Ｃ4逆相クロマトグラフィーから得られた精製Ｐ２２Ｕのサンプル、及びＣ18逆相クロマトグラフィーから得られた精製Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５のサンプルは、標準的処理により変性され、低減され、ピリジルエチル化された（例えば、１９８９年発行のマツダイラ  ピー．ティー．（Matsudaira, P.T.）（編）、「微配列化のための蛋白質及びペプチド精製の手引き（A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing）」を参照されたい。）。ピリジルエチル化されたＰ２２Ｕ、Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５の各サンプルはトリプシン作用による消化に晒され、１９８９年発行のマツダイラ  ピー．ティー．（編）、「微配列化のための蛋白質及びペプチド精製の手引き」における３１〜４７頁のストーン（Stone）ら（著）に基づく処理により、０．２１×２５ｃｍの５μｍの粒子サイズのカラム（ヴァイダック  ２１８ＴＰ５２）を用いて、トリプシン作用によるペプチドはＣ18逆相クロマトグラフィーにより分離された。
Ｐ２０．５、Ｐ２２Ｌ及びＰ２２Ｕのトリプシン作用によるフラグメントを示すクロマトグラムが図２に示され、それぞれ「２０  ｋＤａ」、「２２Ｌ  ｋＤａ」、「２２Ｕ  ｋＤａ」と標識化されている。図２から見て取れるように、Ｐ２２Ｕのトリプシン図は少なくとも幾つかのフラグメントを共有するＰ２２Ｌ及びＰ２０．５のトリプシン図とは全く異なっている。
星印で示されたフラグメントは配列化のために供試された。配列化は全て、米国コロラド州フォートコリンズ（Fort Collins）に所在するコロラド州立大学（Colorado State University）、生化学部（Department of Biochemistry）、高分子資源室（Macromolecular Resources）において行われた。ペプチドはスピードバック（Speedvac）（商標名）を用いて５０μｌ以下に濃縮され、配列化するまで約−２０℃にて凍結された。パルス液状化学及びオンライン・マイクログラディエントＰＴＨアミノ酸分析を利用して、ＡＢＩモデル４７３Ａ蛋白質／ペプチドシーケンサシステム（米国カリフォルニア州フォスターシティー（Foster City）に所在するアプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems, Inc.）の製品）において、Ｎ端末配列化が行われた（例えば、１９８１年発行の生化学誌（J. Biol. Chem.）第２５６巻、７９９０〜７９９７頁におけるヒューイック（Hewick）らの論文、１９８９年発行のフィンドリー  ジェー．ビー．シー．（Findlay, J.B.C.）及びエム．ジェー．ゲイソー（M.J. Geisow）（編）による「蛋白質の配列化−実際的アプローチ−（Protein Sequencing: A Practical Approach）」におけるゲイソー及びエイトケン（Aitken）（著）８５〜９８頁を参照されたい。）。
エレクトロブロットされたＰ２２Ｌ及びＰ２０．５のＮ端末アミノ酸配列は、元々は１９８７年発行の生化学誌第２６２巻、１００３５〜１００３８頁におけるマツダイラによる論文に記載されたように、かつ１９８９年発行のマツダイラ  ピー．ティー．（編）、「微配列化のための蛋白質及びペプチド精製の手引き」における４９〜６９頁のルジャンドル（LeGendre）ら（著）により概説されたように行われた。Ｐ２０．５は配列を生じさせたが、Ｐ２２ＬはＮ端末をブロックされたと判断された。
４４分後に溶離するＰ２２Ｕのトリプシンフラグメント（４４ｍｉｎＰ２２Ｕトリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、アミノ酸の一文字コードを用いてＭＡＱＤＡＦＰＮＡＣＡＱＧＥＰＫであった。５８分後に溶離するＰ２２Ｕのトリプシンフラグメント（５８ｍｉｎＰ２２Ｕトリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、ＡＩＡＰＣＱＬＴＡＶＱＳＶＬＰＣＡＤＱＣＱＫであった。６０分後に溶離するＰ２２Ｕのトリプシンフラグメント（６０ｍｉｎＰ２２Ｕトリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、ＬＧＳＣＳＰＤＣＧＬＤＬＰＳＤＮＶＭＶＱＤＶであった。
３５分後に溶離するＰ２２Ｌのトリプシンフラグメント（３５ｍｉｎＰ２２Ｌトリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、ＨＶＥＴＨＥＡＣＹＤＱＲであった。３８分後に溶離するＰ２２Ｌのトリプシンフラグメント（３８ｍｉｎＰ２２Ｌトリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、ＧＥＦＶＥＳＤＧＫであった。４４分後に溶離するＰ２２Ｌのトリプシンフラグメント（４４ｍｉｎＰ２２Ｌトリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、Ｎ−ＷＱＣＳＹＤであった。５８分後に溶離するＰ２２Ｌのトリプシンフラグメント（５８ｍｉｎＰ２２Ｌトリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、ＥＰＱＳＷＣＩＬＫＰＨＱＳ−ＴＱＲであった。
Ｐ２０．５のＮ端末の最も可能性が高い配列は、ＥＴＱＥＥＴＶ−ＦＥＥ−Ｄ−Ｄであった。３１分後に溶離するＰ２０．５のトリプシンフラグメント（３１ｍｉｎＰ２０．５トリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、ＦＶＥＳＤＧＫであった。３２分後に溶離するＰ２０．５のトリプシンフラグメント（３２ｍｉｎＰ２０．５トリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、Ｔ−ＥＡＣＹＤＱＲであった。４２分後に溶離するＰ２０．５のトリプシンフラグメント（４２ｍｉｎＰ２０．５トリプシンフラグメントと呼ぶ）の最も可能性が高い配列は、ＦＮＷＱＣＳＹＤであった。
例４
この例ではＤ．インミティスの核酸配列ｐ４のクローニング及び配列化について説明している。Ｄ．インミティスｐ４は、Ｄ．インミティスの幼虫により免疫にされたイヌから採集された免疫血清の少なくとも１つの成分に選択的に結合する蛋白質をコード化する能力により特定された。
Ｄ．インミティスＬ３は、標準的な技術を用いて蚊から採収され、３７℃にて５％の二酸化炭素により４８時間、２０％の血清により補充された５０：５０のＮＣＴＣ−１３５／ＩＭＤＡ（ＮＩ）媒質（シグマ）中において器内にて培養された。分析生化学誌第１６２巻、１５６〜１５９頁におけるチョムジンスキー（Chomczynski）及びサツキ（Sacchi）による記載に類似した酸・グアニジニウム・フェノール・クロロホルム法を用いることにより、幼虫から全ＲＮＡが抽出された。ＲＮＡの調製において、約１５，０００〜３０，０００匹の幼虫が使用された。米国マサチューセッツ州ウォルサム（Waltham）に所在するコラボラティブ・リサーチ社（Collaborative Research）製のオリゴｄＴセルロースを用いて、製造業者が要望する方法に基づき、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによりポリＡ＋選択ＲＮＡが全ＲＮＡから分離された。
ラムダ（λ）ユニザップ（Uni-ZAP）（商標名）ＸＲベクター（米国カリフォルニア州ラホーヤ（La Jolla）に所在するストラタジーン・クローニング・システムズ（Stratagene Cloning Systems）社から入手可能）において、同ストラタジーン社製のＺＡＰｃＤＮＡ合成キット（ZAP-cDNA Synthesis Kit）（商標名）のプロトコル及び約５〜６μｇのＬ３ポリＡ＋を用いて、Ｄ．インミティスＬ３の幼虫のｃＤＮＡ発現ライブラリが構成された。この結果、ライブラリは約９７％の組換体を有する、約４．８８×１０9のｐｆｕ／ｍｌの滴定量に拡充された。
ストラタジーン社のピコブルー（picoBlue）免疫スクリーニングキットに記載されたプロトコルを用いて、Ｌ３幼虫のｃＤＮＡ発現ライブラリは例１に記載のように調製されたイヌの免疫血清によりスクリーニングされた。「梯子形蛋白質」（１９９２年発行の分子生化学寄生虫学誌（Mol. Biochem. Parasitol.）第５４巻、５１〜６２頁におけるカルペッパー（Culpepper）らの論文を参照されたい。）と名付けられた高免疫反応性の蛋白質専用の抗体が、組換ＧＳＴ梯子融合蛋白質を用いてアフィニティー・クロマトグラフィーにより、この血清から吸着された。同一の血清を用いたｃＤＮＡライブラリの複製プラークリフトの免疫スクリーニングにより、４つのポジクローンが特定され、この中の１つはＤ．インミティスの核酸配列ｐ４を有した。他の３つのクローンは少なくともＰ３９を部分的にコード化することが示され、例８において更に詳細に説明されている。Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ４を有するプラーク除去されたクローンは、ストラタジーン社製のＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットに記載された生体内切除プロトコルに基づき、Ｒ４０８介助ファージ及びＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌を用いて、二重鎖組換分子に転換され、ここではｐβｇａｌ−ｐ４と示される。二重鎖プラスミドＤＮＡは、同上誌におけるサムブルック（Sambrook）らの論文に記載のようなアルカリ溶菌プロトコルを用いて調製された。プラスミドＤＮＡはＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、約５８０及び３２０のヌクレオチドの２つのＤ．インミティスのＤＮＡフラグメントを放出し、Ｄ．インミティスｐ４のフラグメント全体の大きさは約９００のヌクレオチドであった。
ｐ４核酸プローブによりサザンブロットにおいてＤ．インミティスの特定のデノミックＤＮＡ制限フラグメントが検出され、ｐ４ｃＤＮＡクローンのＤ．インミティス起源を確認した。
Ｄ．インミティスｐ４を含有するプラスミドは、同上誌におけるサムブルックらの論文に記載のように、サンガージデオキシ鎖端末法を用いて配列化された。配列分析用の欠失クローンを発生させるのに、プロメガ塩基消去（Promega Erase a Base）法（米国ウィスコンシン州マディソンに所在するプロメガ社（Promega Corp.）にて入手可能）が用いられた。全Ｄ．インミティスｐ４ＤＮＡフラグメントの約９１３のヌクレオチドの共通塩基配列が測定され、配列同定番号１として供される。９１３のヌクレオチド全体が、配列同定番号２にて供される、約３０３のアミノ酸のアミノ酸配列をコード化する転写解読枠を形成する。この配列内の最初のＡＴＧコドンは約４１７から４１９のヌクレオチドに及ぶ。このように、配列同定番号１は蛋白質の全長をコード化しないが、イヌの免疫血清の少なくとも１つの成分と選択的に結合する蛋白質をコード化する。配列同定番号１によりコード化される蛋白質の大きさは約３５．５ｋＤであると予想され、ｐＩは約４．２６であると推定される。
ＢＬＡＳＴネットワークを使用して国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じ、非重複蛋白質配列データベースの相同性探索が実施された。このデータベースはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＳＰＵｐｄａｔｅ＋ＧｅｎＰｅｐｔ＋ＧＰＵｐｄａｔｅを有している。この探索は配列同定番号２を用いて実施され、配列同定番号２と周知の配列とに共有される顕著な相同性は９個のアミノ酸、即ちＤＤＣＧＤＧＳＤＥの連続性のみであることを示し、この連続性はヒトのＬＤＬ受容体関連の蛋白質、ヒト及びマウスのアルファ２マクログロブリン受容体及びネズミの腎臓のＧＰ３３０糖蛋白質においても見出された。９個のアミノ酸の内の８個のアミノ酸の保存連続性が、セノーハブディティス  エレガンス（Caenorhabditis elegans）のＬＤＬ受容体関連の蛋白質及び基底膜のプロテオグリカンにおいても見出される。
例５
この例では、Ｄ．インミティスｐ４が免疫血清に選択的に結合する蛋白質をコード化する能力を示す。組換蛋白質はウサギにおいても免疫応答を生じさせることが可能である。バクテリオファージＴ７ｌａｃ転写調節配列と、１０個のヒスチジンを備えたポリヒスチジン部分をコード化する融合配列とに有効に結合された、Ｄ．インミティスｐ４の約１〜６３５のヌクレオチドを含有する組換分子ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635が以下のように生成された。約１〜６３５に及ぶヌクレオチドを含有する約６３５のヌクレオチドの配列同定番号１のＤＮＡフラグメントはｐ４635と呼ばれ、プライマ５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ  ＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＴＣＧ３′（３９４−５′と示す。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている。）及び５′ＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣ  ＴＧＣＡＣＣＧ３′（３９４−３′と示す。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている。）を用いて、Ｄ．インミティスｐ４を含有するクローンからＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、ゲル精製され、ＢａｍＨＩにより開裂された発現ベクターｐＥＴ１９ｂ（米国ウィスコンシン州マディソンに所在するノヴァジェン社（Novagen Inc.）にて入手可能）にサブクローン化された。この結果としての組換分子ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635は大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換され、大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635を形成した。大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳはｌａｃ転写調節配列の調節下にあるバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有している。
大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635は、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピリシン及び０．０３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する細菌生育用濃縮媒質を有するシェークフラスコ中において、約３７℃にて培養された。細胞が約６００ナノメートル（ＯＤ600）にて約０．８１９の最適密度に達した時、約１ｍＭのイソプロピルβＤチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、Ｄ．インミティスｐ４の発現が誘発された。蛋白質の生成は組換細胞の溶解物のＳＤＳ  ＰＡＧＥにより監視され、続いて標準的技術を用いてクーマシブルーステイニングが行われた。大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635は約３７ｋＤの見掛分子量にて移動し、かつＰＨＩＳ−Ｐ４635と表される蛋白質を生成した。この種の蛋白質は、Ｄ．インミティスのＤＮＡインサートに欠けるｐＥＴ１９ｂプラスミドにより形質転換される細胞によっては生成されなかった。
大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635の溶解物のイムノブロット分析では、３７ｋＤ蛋白質がイヌの免疫血清に選択的に結合可能であり、従って、Ｄ．インミティスの幼虫の成長を抑制することが可能な血清の少なくとも１つの成分に結合可能であることを示す。
ニッケルキレート化クロマトグラフィー及びイミダゾールグラジエントにより、大腸菌のｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635のヒスチジン融合ペプチドが大腸菌の可溶性蛋白質から分離された。大腸菌のｐＥＴ１９ｂ−ｐ４635の総溶解物、カラムの溶離液及びカラムの空間量のイムノブロット分析では、３７ｋＤの蛋白質がニッケルカラムにおいて分離可能であり、イヌの免疫血清に選択的に結合可能であり、従って、Ｄ．インミティスの幼虫の成長を抑制することが可能な血清の少なくとも１つの成分に結合可能であることを示す。カラムの溶離液は同一の免疫イヌからの免疫前の血清によっては検出されなかった。
前記において開示されたような標準的技術に基づき、組換ＰＨＩＳ−Ｐ４635によりウサギが免疫にされた。免疫にされたウサギから採取された抗体は蟻酸開裂されたＰＨＩＳ−Ｐ４635に結合可能であり、抗体が非溶融Ｐ４635を検出可能であることを示した。
例６
この例ではＤ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの分離及び配列について説明する。例４において記載した方法に類似した方法を用いて、Ｄ．インミティスの雌の成虫からＲＮＡが抽出され、ポリＡ＋ＲＮＡが調製され、Ｄ．インミティスの雌の成虫のｃＤＮＡライブラリが生成された。
少なくとも一部のＰ２２Ｕをコード化可能な核酸配列を特定する際に使用されるＤＮＡ部分は、同上誌におけるサムブルックらによる論文に記載のような標準的技術を利用し、ＰＣＲ増幅により生成された。簡潔に説明すると、ネズミ感染性白血病ウイルスの逆転写酵素（ストラタジーン社にて入手可能）及びストラタジーン社製のＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットのリンカ・プライマを使用することにより、雌の生体のポリＡ＋ＲＮＡから第１ｃＤＮＡ鎖、即ち５′ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ  ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ  ＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧ  ＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３′が合成された。例３に記載された６０ｍｉｎトリプシンフラグメントの部分的アミノ酸配列に基づき、２組の縮退プライマのプールが生成された。ＧＲＦ１１と表記される第１組の縮退プライマは、５′ＴＧＹ  ＴＣＮ  ＣＣＮ  ＧＡＹ  ＴＧＹ  ＧＧ３′という配列を有し、ＹはＣ又はＴのいずれでもよく、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴのいずれでもよい。ＧＲＦ１２と表記される第２組の縮退プライマは、５′ＴＧＹ  ＡＧＴ  ＣＣＮ  ＧＡＹ  ＴＧＹ  ＧＧ３′という配列を有している。縮退プライマのプールをアンチセンスのプライマとしてのストラタジーン社製のリンカープライマと組み合わせて使用するＰＣＲ増幅を利用してＤＮＡ部分を増幅した。適正部分が増幅されたことを検証するにはサザンブロット分析を行った。サザンブロット分析では、６０ｍｉｎトリプシンフラグメント、即ち５′ＴＧＮ  ＡＣＣ  ＡＴＮ  ＡＣＲ  ＴＴＲ  ＴＣ３′という配列を有するＧＲＦ３のＣ端末性アミノ酸配列に基づき、縮退プローブを用いた。ここで、ＲはＡ又はＧのいずれかでもよい。
増幅部分はゲル精製されるとともに電気溶離され、製造業者の指示に従って、ｐＣＲ  ＩＩクローニングベクター（米国カリフォルニア州サンディエゴに所在するインヴィトロジェン社（Invitrogen）にて入手可能）にクローン化された。２つのクローンが部分的に配列化され、６０ｍｉｎトリプシンフラグメントのアミノ酸配列に対応する配列を含む核酸配列を生成した。この核酸配列は配列同定番号３の約４４４〜６９６のヌクレオチドを有し、これについては以下に詳述する。
雌の生体のｃＤＮＡライブラリは、同上誌におけるサムブルックらによる論文に記載されているようなストリンジェント（即ち、標準的）ハイブリダイゼーション条件を利用して、アンチセンスプローブによりスクリーニングされた。ＧＲＦ１４と表記されるアンチセンスプローブは増幅部分から得られるＤＮＡ配列に基づき、５′ＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣ  ＣＡＴＡＡＣＡＴＴＡ  ＴＣＡＧＡＴＧＧ３′という配列を有している。プローブと混成したプラークは再度スクリーニングされるとともにプラーク粗製され、Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕを含有するクローン（即ち、アンチセンスプローブと混成し、かつ配列同定番号３において示された見掛核酸配列を有するクローン）は、例４に記載のような核酸配列化に供された。
Ｄ．インミティスの核酸配列ｐ２２Ｕの約１０１６のヌクレオチドの共通塩基配列が測定され、配列同定番号３として供される。導出される翻訳生成物は配列同定番号３を供せられるとともに、配列同定番号４に供される。配列同定番号３は約２０８のアミノ酸の蛋白質を見掛上コード化し、配列は約６２７〜６２９のヌクレオチドに及ぶ停止コドンを有している。約３９〜４１のヌクレオチドに及ぶとともに、約５７〜５９のヌクレオチドに及ぶ２つのＡＴＧコドンが存在する。配列同定番号３はほぼ予想される大きさ（即ち、予測される大きさは約２２ｋＤ）の蛋白質をコード化するが、実際の蛋白質の翻訳開始部位はまだ明らかではない。
部分的に配列化された３つのトリプシン作用によるペプチドの全てをコード化する核酸配列は配列同定番号３に含まれ、配列がＰ２２Ｕの少なくとも一部をコード化することを示している。配列化された４４ｍｉｎトリプシンフラグメントの一部は配列同定番号４の約７７〜９２のアミノ酸に及び、１つのアミノ酸を除く全てのアミノ酸において導出配列に一致する。配列化された５８ｍｉｎトリプシンフラグメントの一部は配列同定番号４の約２７〜４８のアミノ酸に及び、１つのアミノ酸を除く全てのアミノ酸において導出配列に一致する。配列化された６０ｍｉｎトリプシンフラグメントの一部は配列同定番号４の約１４５〜１６６のアミノ酸に及び、１つのアミノ酸を除く全てのアミノ酸において導出配列に一致する。ＢＬＡＳＴネットワークを使用して国立生物工学情報センターを通じ、非重複蛋白質配列データベースの相同性探索が実施された。このデータベースはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＳＰＵｐｄａｔｅ＋ＧｅｎＰｅｐｔ＋ＧＰＵｐｄａｔｅを有している。この探索は配列同定番号４を用いて実施され、周知の蛋白質との顕著な相同性は示されなかった。
例７
この例では、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕが免疫血清及び自然ｐ２２Ｕに対する抗体に選択的に結合する蛋白質をコード化する能力を示す。
ｔｒｃ転写調節配列と、６個のヒスチジンを備えたポリヒスチジン部分をコード化する融合配列とに有効に結合された、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕの約４１〜６４９のヌクレオチドを含有する組換分子ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ608が以下のように生成された。約４１〜６４９に及ぶヌクレオチドを含有する約６０８のヌクレオチドの配列同定番号３のＤＮＡフラグメントはｐ２２Ｕ608と呼ばれ、プライマ５′ＧＴＴＧＣＡＡＴＡＴ  ＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴ  ＧＡＧＣＣ３′（２２ＵＳＥＮと示す。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている。）及び５′ＣＧＣＴＡＧＴＧＣＡ  ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡ  ＴＡＣＴＣ３′（２２ＵＡＮＴと示す。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている。）を用いて、Ｄ．インミティスｐ２２Ｕを含有するクローンからＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、ゲル精製され、ＢａｍＨＩにより開裂された発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インヴィトロジェン社にて入手可能）にサブクローン化された。この結果としての組換分子ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ608は大腸菌に形質転換され、大腸菌の組換細胞ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ608を形成した。組換細胞は０．１ｍｇ／ｍｌのアンピリシンを含有する細菌生育用濃縮媒質を有するシェークフラスコ中において、約３７℃にて培養された。細胞が約０．３のＯＤ600に達した時、約１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによりＤ．インミティスｐ２２Ｕ608の発現が誘発された。蛋白質の生成は組換細胞の溶解物のＳＤＳ  ＰＡＧＥにより監視され、続いて標準的技術を用いてクーマシブルーステイニングが行われた。大腸菌の組換細胞ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ608は約２７ｋＤの見掛分子量にて移動し、かつここではＰＨＩＳ−Ｐ２２Ｕ608と表される蛋白質を生成した。この種の蛋白質は、Ｄ．インミティスのＤＮＡインサートに欠けるｐＴｒｃＨｉｓＢプラスミドにより形質転換される細胞によっては生成されなかった。
大腸菌の組換細胞ｐＨｉｓ−ｐ２２Ｕ608の溶解物のイムノブロット分析では、２７ｋＤの蛋白質がイヌの免疫血清に選択的に結合可能であり、従って、Ｄ．インミティスの幼虫の成長を抑制することが可能な血清の少なくとも１つの成分に結合可能であることを示す。イヌの免疫血清はｐＴｒｃＨｉｓＢプラスミドのみにより形質転換される細胞の溶解物に本質的には結合しない。標準プロトコルに基づき、ＰＨＩＳ−Ｐ２２Ｕ608によりネコが免疫にされた。
自然Ｄ．インミティスＰ２２Ｕが精製され、ウサギを免疫にして抗体試薬を得るために使用された。免疫にされたウサギから採取された抗血清は、生後６日のＬ４幼虫から得られる自然２２Ｕ蛋白質と、ＰＨＩＳ−Ｐ２２Ｕ608組換蛋白質との双方をウエスタンブロットにより検出した。
例８
この例ではＤ．インミティスの核酸配列ｐ３９のクローニング及び配列について説明している。Ｄ．インミティスｐ３９は、Ｄ．インミティスの幼虫により免疫にされたイヌから採集された免疫血清の少なくとも１つの成分に選択的に結合する蛋白質をコード化する能力により特定された。
λＺａｐＩＩ（１９８８年発行の核酸研究誌（Nucleic Acids Res）第１６巻、７５８３〜７６００頁におけるショート  ジェー．エム．（Short,J.M.）らの論文を参照されたい。）におけるゲノム及びｃＤＮＡの発現ライブラリと、λｇｔ１１の派生物とは、標準的処理（１９８９年発行のアウスーベル  エム．エフ．（Ausubel, M.F.）ら（編）、「分子生物学におけるショートプロトコル（Short Protocol in Molecular Biology）」を参照されたい。）を利用し、それぞれ全ゲノミックＤＮＡ或いはＬ４又はＬ３幼虫ステージのｍＲＮＡから調製された。この例において、例４に記載の方法に類似した方法にて、ＺＡＰｃＤＮＡ合成キット（商標名）のプロトコル（ストラタジーン社製）を使用し、ラムダ（λ）ユニザップ（商標名）ＸＲベクター（ストラタジーン社製）において、Ｄ．インミティスの雌の成虫、雄の成虫、４８時間後の第３ステージ（Ｌ３）及び６日後の第４ステージ（Ｌ４）の幼虫のｍＲＮＡから、４つのｃＤＮＡ発現ライブラリが調製された。各ライブラリには約５〜６μｇのｍＲＮＡが使用された。この結果生成されたライブラリは一度増幅された。各々の滴定量については、雄の成虫では９９％の組換体を有する１．１５×１０10ｐｆｕ／ｍｌであり、雌の成虫では９７％の組換体を有する１．４×１０9ｐｆｕ／ｍｌであり、４８時間後のＬ３幼虫では９７％の組換体を有する４．８８×１０9ｐｆｕ／ｍｌであり、６日後のＬ４幼虫では９８％の組換体を有する１．０５×１０9ｐｆｕ／ｍｌであった。
これらのライブラリは例４の記載に類似した方法にて、プールされたイヌの免疫血清によりスクリーニングされた。４８時間後のＬ３ライブラリは、３９ｋＤ蛋白質とのほぼ独占的な反応性に起因し、例１に記載のように調製されたイヌの免疫血清によりスクリーニングされた。「梯子形蛋白質」と名付けられた高免疫反応性の蛋白質専用の抗体が、例４に記載のようにアフィニティー・クロマトグラフィーにより、この血清から吸着された。
吸着された血清により雌の蠕虫並びにＬ３又はＬ４幼虫の蛋白質の溶解物を含有するイムノブロットが発達したことにより、予め識別された３９ｋＤ蛋白質と、他の１つの＞１００ｋＤ蛋白質とに対する反応性は幼虫の溶解物においてのみ示された。４８時間後のＬ３ライブラリの複製プラークリフトをこの血清により免疫スクリーニングすることにより、ｐ３９−１〜ｐ３９−４と称される４つのポジクローンが特定された。ｐ３９−４はｐ４と改称され、上記にておいて詳述されている。ｐ３９−１、ｐ３９−２及びｐ３９−３は各々、ここで規定されるようなＰ３９蛋白質をコード化するｐ３９核酸配列を表す。
ｐ３９−１及びｐ３９−３用のクローン専用の抗体を得るために、抗体選択技術（１９８４年発行のネイチャー誌第３１１巻、３７９〜３８２頁におけるホール（Hall）らの論文を参照されたい。）が用いられた。ライブラリ免疫スクリーニング用に記載されたプロトコルを用いて、各々が１．５×１０4の精製ファージを含有する２枚の９０ｍｍ寒天平板が、予め１０ｍＭのＩＰＴＧに浸されたニトロセルロースフィルタをかけられた。プラークリフトは、例１に記載のように調製されたイヌの免疫血清をＴＢＳ１％のゼラチン中にて１：２００に希釈させてその中で一晩培養され、ＴＢＳＴ（２０ｍＭのトリスＨＣＬ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のトゥイーン（Tween）２０）中にて４回、かつＴＢＳ（トゥイーン２０が存在しないＴＢＳＴ）中にて２回、洗浄された。クローン専用の抗体を溶離するために、同様のフィルタが氷上にて１５分間、２．０ｍｌのグリシン緩衝液（０．１ＭのグリシンＨＣＬ、ｐＨ２．６、０．１５ＭのＮａＣＬ）により処理された。ｐＨ８．０の１Ｍのトリスを滴状添加することにより、酸性溶離液は即座に中和された。クローン専用の抗体はアミコン・セントリコン・３０マイクロコンセントレータ（Amicon centricon 30 microconcentrator）において濃縮され、Ｄ．インミティスの雌の成虫並びにＬ３及びＬ４幼虫の蛋白質のイムノブロットを発達させるために使用された。クローンｐ３９−１及びＰ３９−３から溶離されたクローン専用の抗体は、イヌの免疫血清により選択的に結合される幼虫の３９ｋＤ自然蛋白質と同一の位置において移動する、幼虫の３９ｋＤ特定蛋白質を１つ検出した。非組換ファージから選択される抗体はＤ．インミティスの蛋白質に対する反応性を全く示さなかった。これらのデータは、これらｐ３９組換クローンがイヌの免疫血清により選択的に検出される３９ｋＤ蛋白質をコード化することを示している。免疫血清と免疫反応性があると特定されるクローンにより、所望の蛋白質をコード化するＤＮＡの供給源が得られる。クローンｐ３９−１、ｐ３９−２及びｐ３９−３の二重鎖プラスミドＤＮＡが例４に記載のように調製された。ｐ３９−１及びｐ３９−２を含有するプラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、約１０００及び２００のヌクレオチドの２つのＤ．インミティスのＤＮＡフラグメントを放出し、Ｄ．インミティスのフラグメント全体の大きさは、各々約１２００のヌクレオチドであった。ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼにより、ｐ３９−３を含有するプラスミドＤＮＡを消化することによって、約１０００及び６０のヌクレオチドの２つのＤ．インミティスのＤＮＡフラグメントを放出し、Ｄ．インミティスのフラグメント全体の大きさは約１０６０のヌクレオチドであった。
二重鎖のｐ３９−１、ｐ３９−２及びｐ３９−３核酸配列は例４に記載のように配列化された。ｐ３９−１及びｐ３９−２は次の核酸配列を有している（導出される開始及び停止コドンには下線が引かれている。）。
0004150421.tif 000008
ｐ３９−３はｐ３９−１及びｐ３９−２に類似している。但し、ｐ３９−３はｐ３９−１及びｐ３９−２の最初の１２５のヌクレオチドを欠いており、２０３番目のヌクレオチドの後に更なる「Ａ」を有している（ｐ３９−１及びＰ３９−２の配列の番号付けについて説明している。）。３つのｐ３９核酸配列は全て、約２１６〜２１８のヌクレオチドに及ぶ開始コドンと、約１１１６〜１１１８のヌクレオチドに及ぶ停止コドンとを有し、約３００のアミノ酸の蛋白質をコード化する様相を呈する（同一の配列について説明している。）。Ｐ３９蛋白質の導出アミノ酸配列は上記されている。
例９
この例では、Ｄ．インミティスｐ３９の核酸配列が免疫血清に選択的に結合する蛋白質をコード化する能力を示す。
例８に記載のように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ発現ベクターのＥｃｏＲＩ部位中にフレームにて挿入されるＤＮＡによりコード化される蛋白質は、ＩＰＴＧによる誘発と同時にＮ端末に付着されるベータガラクシトーゼペプチドを更に４ｋＤだけ有している。このペプチドはベクターによりコード化され、結果的に生じる融合蛋白質がアフィニテイー・クロマトグラフィーにより精製可能になる。各ｐ３９のクローンの大腸菌培養物は、各クローンにより生成される融合蛋白質の大きさ及び量を測定するために、ＩＰＴＧにより誘発された。サンプルが収集されたのは、誘発前と誘発の１時間、２時間、３時間及び４時間後である。クローンｐ３９−１及びｐ３９−３は約４０〜４３ｋＤの融合蛋白質をコード化したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離される蛋白質のクーマシブルーステイニングにより実証されているように、ｐ３９−３はｐ３９−１よりも細胞重量当りの蛋白質の生成量が多かった。
最初にクローンを分離するのに使用されるイヌの免疫血清と反応させられるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されるＰ３９融合蛋白質を確認するため、ｐ３９−１又はＰ３９−３のいずれかの大腸菌溶解物を含有するウェスタンブロットが、例１のように生成される免疫血清とともに発達させられた。約４０〜４３ｋＤの蛋白質が双方のクローンの溶解物において検出されたが、非組換ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいては検出されなかった。
例１０
この例でも、Ｄ．インミティスｐ３９の核酸配列が免疫血清に選択的に結合する蛋白質をコード化する能力を示す。
更に、組換Ｐ３９蛋白質に結合する能力により選択される単一特異的な抗体は、３９ｋＤのＬ３及びＬ４抗原にも結合可能である。ウサギ、ネコ及びイヌがこの組換Ｐ３９蛋白質により免疫にされた。
ｔｒｃ転写調節配列と、６個のヒスチジンを備えたポリヒスチジン部分をコード化する融合配列とに有効に結合された、Ｄ．インミティスｐ３９−１の約２１６〜１１１８のヌクレオチド（例８において呈示されたｐ３９−１及びｐ３９−２核酸配列における番号付けについて説明している。）を含有する組換分子ｐＨｉｓ−ｐ３９900が、例７における組換分子ｐ２２Ｕ608の生成について記載された方法に類似した方法にて生成された。簡略すると、特定されたｐ３９核酸配列はＤ．インミティスｐ３９−１を含有するクローンからＰＣＲ増幅され、この生成物は発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢにサブクローン化された。この結果としての組換分子ｐＨｉｓ−ｐ３９900は大腸菌に形質転換され、大腸菌の組換細胞ｐＨｉｓ−ｐ３９900を形成した。この詳細については例１１を参照されたい。組換細胞は例７に記載のように培養されるとともに、誘発された。蛋白質の生成は組換細胞の溶解物のＳＤＳ  ＰＡＧＥにより監視され、続いて標準的技術を用いてクーマシブルーステイニングが行われた。大腸菌の組換細胞ｐＨｉｓ−ｐ３９900は、ここでＰＨＩＳ−Ｐ３９900と表され、かつ約４６ｋＤの見掛分子量にて移動する蛋白質を生成した。この種の蛋白質は、Ｄ．インミティスのＤＮＡインサートに欠けるｐＴｒｃＨｉｓＢプラスミドにより形質転換される細胞によっては生成されなかった。
大腸菌の組換細胞ｐＨｉｓ−ｐ３９900の溶解物のイムノブロット分析では、４６ｋＤの蛋白質がイヌの免疫血清に選択的に結合可能であり、従って、Ｄ．インミティスの幼虫の成長を抑制することが可能な血清の少なくとも１つの成分に結合可能であることを示す。イヌの免疫血清はｐＴｒｃＨｉｓＢプラスミドのみにより形質転換される細胞の溶解物に本質的には結合しなかった。
精製されたｐＨｉｓ−ｐ３９900の融合蛋白質は、例１に記載のように生成されたイヌの免疫血清により培養され、単一特異的な抗体が蛋白質から溶離し、Ｄ．インミティスの生命段階における特定の抗原のウエスタンブロットと反応した。クローン専用の抗体は０時間のＬ３、４８時間のＬ３及び６日のＬ４抗原プレパラートにおいて３９ｋＤの幼虫専用の抗原を識別したが、雄、雄の成虫又はマイクロフィラリアのプレパラートにおいてはこの蛋白質を検出しなかった。これらのデータにより、イヌの免疫血清により識別される幼虫専用の３９ｋＤ蛋白質を３９ｃＤＮＡが符号化することが実証されている。
上記のような標準プロトコルに基づき、ＰＨＩＳ−Ｐ３９900融合蛋白質により、一匹のウサギ及び２匹のイヌが免疫にされた。ＰＨＩＳ−Ｐ３９900融合蛋白質により、複数のネコも免疫にされた。
例１１
この例では、真核細胞におけるＰ３９蛋白質の生成と、Ｐ３９を発現可能な組換ウイルス粒子ワクチンの生成とを示す。
プライマ３９ＣＴ（５′ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣ  ＧＣＡＡＡＴＧＡＧＡ  ＴＣＡＴＧ３′）及び３９ＣＯＯＨ（５′ＧＣＣＡＡＣＧＧＡＴ  ＣＣＡＴＴＣＡＧＴＣ  ＡＡＣＡＴＡＣＣ３′）を用いて、Ｐ３９−３Ｕｎｉｚａｐ  ＸＲファージＤＮＡからＰＣＲ生成物が生成された（例８を参照されたい。）。これらのプライマはＢａｍＨＩ部位（下線）を組み込んでいる。このほぼ９００ｂｐのＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩにより消化され、ＢａｍＨＩ消化ＣＩＰ（子ウシの腸のホスファターゼ）処理のｐＴｒｃＨｉｓＢベクター（インヴィトロジェン社にて入手可能）にサブクローン化された。ｐ３９インサートのベクター内における適正な５′〜３′配向が実証された。このクローンはｐＨｉｓ−ｐ３９900と称される。
ＸｈｏＩ制限部位をｐＳＰ６４ベクター（プロメガ社にて入手可能）に付加するには、ＳｍａＩによりｐＳＰ６４を線形化させ、ＸｈｏＩリンカを一端に結紮し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによりベクターを再円形化させてｐＳＰ６４−Ｘｈｏを形成した。ｐＳＰ６４−ＸｈｏベクターはＢａｍＨＩにより消化され、ＣＩＰ処理され、ｐＨｉｓ−ｐ３９900から開裂されたｐ３９を含有するＢａｍＨＩに対して適正な配向にて結紮された。この結果として生じる分子はｐ７６−８０．Ｂ３と称される。
バクロウイルス又はシンドビス発現ベクター中にｐ３９をサブクローン化するために、ｐ３９配列の下流に位置するｐＳＰ６４と相同のアンチセンスなプライマ７６−５８．Ｂ（５′ＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴ  ＧＡＧＣＧＧ３′）と、ｐ３９配列から設計されて個々のシステムにおける発現を高めるように修正されたＮ−端末プライマとを使用し、ｐ３９を含有するフラグメントはｐ７６−８０．Ｂ３からＰＣＲ増幅された。詳述すると、バクロウイルスのシャトルプラスミドＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インヴィトロジェン社にて入手可能）にサブクローン化させるため、Ｎ端末プライマ１０５−４７．Ａ（ＢａｍＨＩ部位（下線）を有する５′ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴ  ＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡ  ＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡ  ＧＡＡＧ３′）を使用され、ｐ３９を含有するＰＣＲ生成物（ＢＶｐ３９と称される）を生成した。シンドビスウイルスのシャトルプラスミドＴｏｔｏ２Ｊ１−マイナスにサブクローン化させるため、Ｎ端末プライマ１０５−０８．Ａ（ＸｂａＩ部位（下線）を有する５′ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣ  ＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴ  ＴＧＡＡＧＡＡＧ３′）を使用され、ｐ３９を含有するＰＣＲ生成物（ＳＶｐ３９と称される）を生成した。
Ｐ３９900の生成を指示可能なバクロウイルス組換分子を生成するため、ＢＶｐ３９はＢａｍＨＩにより消化されるとともに、ＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インヴィトロジェン社にて入手可能）シャトルプラスミドの特異なＢａｍＨＩ部位に結紮された。インサートの配向が確認され、結果として生じる組換分子はｐ１０５−７２．５Ｃと表記される。この組換分子及び線形バクロゴールド（Baculogold）バクロウイルスＤＮＡ（米国カリフォルニア州サンディエゴに所在するファーミンジェン社（Pharmingen）にて入手可能）が、スポドプテラ  フルージペルダＳｆ９宿主細胞（米国コロラド州フォートコリンズに所在するコロラド・バイオプロセッシング・センター（Colorado Bioprocessing Center）から供与）に同時トランスフェクションされ、スポドプテラ  フルージペルダｐ１０５−７２．５Ｃを形成した。インサートを適正に配向するために、１０５−９２．１と表記される組換ウイルスが確認され、組換ウイルスの生成量を増大させ、かつウエスタンブロットによりＰ３９900の発現を確認するために、この組換ウイルスは培養された。イムノブロット分析では、バクロウイルスベクターを用いて生成されるＰ３９900は免疫血清により選択的に結合可能であることを示している。
Ｐ３９の発現がシンドビスウイルスプロモータの調節下にある組換ウイルス粒子ワクチンを生成するため、シンドビスウイルスベクターＴｏｔｏ２Ｊ１におけるＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限部位からクロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を除去した後に、同ベクターのこの部位にＳＶｐ３９が方向性をもって結紮された。この結果としての組換分子はｐ１０５−４２．１Ａと表記される。Ｔｏｔｏ２Ｊ１は、ヌクレオチド１１４５２においてＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモータと、ＮｓｉＩに達するシンドビスウイルスの全ゲノムと（即ち、各非構造的ポリペプチド遺伝子、サブゲノミックプロモータ及び各構造ポリペプチド遺伝子）を含有するシンドビスウイルスの発現ベクターであり、同発現ベクターは、サブゲノミックプロモータ、サブゲノミックｍＲＮＡの５′未翻訳配列の１４のヌクレオチド、ＣＡＴ遺伝子、シンドビスウイルスの３′未翻訳配列の６２のヌクレオチド及びシンドビスウイルスのポリＡ配列を有するＴＲＣＡＴ６２からＳｓｐＩ（ヌクレオチド部位７４９９）／ＳｓｔＩ制限フラグメントに結紮されていることに留意されたい（１９８９年発行のサイエンス誌第２４３巻、１１８８〜１１９１頁におけるシュン（Xiong）らの論文を参照されたい。）。
同上誌におけるシュンらの論文に記載されているような技術を用いて、組換分子ｐ１０５−４２．１ＡはＭｌｕＩによる消化により線形にされ、感染性組換シンドビスの写しがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼにより生成されるとともにＢＨＫ（ハムスターの子どもの腎臓）の宿主細胞を感染させるのに用いられ、こうしてＢＨＫｐ１０５−４２．１Ａが生成された。結果として生じる組換ウイルス（１０５−４２．１Ａ）はその生成量を増大させるために培養され、ウエスタンブロットにより発現を分析される。イムノブロット分析により、この組換ウイルスにより生成されるＰ３９900は免疫血清により選択的に結合可能であることが示されている。感染性組換ウイルスはＰ３９を生成するために生ワクチンとして、或いは発現系において使用可能である。
例１２
この例では、ｐ２２Ｌ及びｐ２０．５核酸配列のクローニング及び配列化について説明する。
コロラド州立大学の生化学部によるＤＮＡエクスプレスにより、オリゴマーＤＮＡプライマ及びプローブが生成された。シアン−エチル−ホスホアミディン化学作用を利用するＡＢＩ型３９２ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザを用いて、合成が行われた。低圧逆相クロマトグラフィーを用いて、生成物が精製された。１９８５年発行の分析生化学誌第１５１巻、２１１〜２２４頁におけるコリンズ（Collins）及びハンセーカー（Hunsaker）による論文に記載されているように、（32Ｐ）−デオキシシチジンによるテーリングにより、核酸オリゴヌクレオチドプローブが３′端末標識化された。製造業者の指示に基づき、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（プロメガ社にて入手可能）が使用された。
ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（商標名）合成キット及びＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクター（双方ともストラタジーン社にて入手可能）を用いて、ポリＡ＋選択ＲＮＡから構成された４８時間Ｌ３ｃＤＮＡライブラリが例４に記載のように生成された。最終的なライブラリは９６．４％の組換体を有する４．８８×１０6のプラーク形成ユニット（ｐｆｕ）／ｕｌを含有した。ライブラリプレーティング及びプラークリフトはＸＬ１Ｂｌｕｅ大腸菌を用いて、本質的に製造業者の指示（ストラタジーン社）に準拠して行われた。同上誌におけるサムブルックらの論文を参照されたい。
０．４５μｍ１３７ｍｍのナイトラン（Nytran）膜（米国ニューハンプシャー州キーン（Keene）に所在するシュライヒャー−シューエル社（Schleicher and Schuell)にて入手可能)上にリフトされたプラークは、ストリンジェント条件下にて（同上誌におけるサムブルックらの論文を参照されたい。）約５ピコモルの標識化ＧＲＦ６プローブ（約１．５×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）と混成させられた。このプローブは、例３に記載し、かつ示されたＰ２０．５及びＰ２２Ｌ蛋白質のそれぞれ３２及び３５ｍｉｎトリプシンペプチドから得られるアミノ酸配列ＥＡＣＹＤＱに基づき、合成された。ＧＲＦ６のＤＮＡ配列は５′ＧＡＡ  ＧＣＩ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＣＡＡ３′であり、Ｉは４つの全塩基と対をなすことが可能なイノシンである。グルタミン酸（Ｅ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン（Ｑ）のウォッブル（wobble）塩基選択は、先の報告にあるＤ．インミティスの２つの蛋白質のコドン使用法に準拠した（ジェンバンク登録番号Ｍ２９７３３及びＭ８２８１１）。スクリーニングされた１０２，０００個のプラークの内、プローブと混成したのは約２５２個（０．２５％）であった。ポジプラークを含有する１６個のプラグが除去され、この内の５つは標準的技術を用いてプラーク精製された。ｐ２２Ｌ又はｐ２０．５核酸配列を有するクローンの二重鎖プラスミドＤＮＡが例４に記載のように調製され、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼにより制限酵素開裂に供された。インサートの大きさは３３４ｂｐ（クローン１）、４４２ｂｐ（クローン２）、６０３ｂｐ（クローン３）、５８９ｂｐ（クローン４）及び４４２ｂｐ（クローン５）であると推定され、この内の３２ｂｐはベクター配列であった。クローンのＤＮＡ配列化は例４に記載のようになされた。クローン１、２、３及び５の部分ＤＮＡ配列が決定され、クローン４の蛋白質コード化領域の完全二重鎖配列が決定された。ｐ２２Ｌ及びｐ２０．５のコード化領域の核酸配列と、Ｐ２２Ｌ及びＰ２０．５の導出アミノ酸配列とが上記にて呈示されている。アミノ酸の翻訳、蛋白質の分子量及び等電点の計算並びに親水性の計算には、（マックベクター（MacVector）（商標名）のバージョン３．５の配列分析ソフトウェア（米国コネチカット州ニューヘーヴン（New Haven）に所在するインターナショナル・バイオテクノロジーズ社（International Biotechnologies, Inc.）製）が使用された。）
図３ＡはＰ２２Ｌ及びＰ２０．５の導出アミノ酸配列の親水性グラフを示す。１９８２年発行の分子生物学誌（J. Mol. Biol.）第１５７巻、１０５〜１３２頁におけるカイト（Ｋｙｔｅ）らの論文の方法に基づき、ウインドの大きさを７個のアミノ酸として親水性が計算された。Ｐ２２Ｌの全配列の分子量、等電点（ＰＩ）及びアミノ酸の組成物（図３Ｂ、２２Ｌ  ｋＤ）と、部位２２におけるグルタミン酸にて始まるＰ２０．５の企図開裂生成物（図３Ｃ、２０ｋＤ）とが示されている。
ｐ２２Ｌによりコード化される蛋白質は親水性が高いが、Ｐ２０．５から見掛上開裂されるＮ端末の２１個のアミノ酸の疎水性リーダーは例外である。この２１個のアミノ酸部分の分子量を計算すると２．２ｋＤであった。このＰ２２ＬとＰ２０．５との関係により、２つの分子のクロマトグラフィー反応及び免疫応答が共に類似していることが明らかである。Ｐ２２Ｌの分子量及びｐＩを計算すると、それぞれ１７，５２７．７、４．５８であり、Ｐ２０．５の分子量及びｐＩを計算すると、それぞれ１５，３２８、４．５２であった。これらの計算値は低減条件下での定常のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られる値とは異なる。分子量の計算値はトリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥから計算される範囲内にある。
１５．３及び１７．５ｋＤ（２０及び２２Ｌ  ｋＤ）蛋白質の等電点の計算値は、それぞれ４．５２、４．５８であった。２０及び２２ｋＤ蛋白質（同上誌、フランクらの論文を参照されたい。）の当初の予測では、２０ｋＤ蛋白質は酸性であり、２２ｋＤ蛋白質は塩基性であった。これは、２２ｋＤ領域における２つの蛋白質、即ちＰ２２Ｕ及びＰ２２Ｌの存在を判断する前であった。
例１３
この例では、ｐ２２Ｌの一部に対応するプローブを用いた、Ｄ．インミティスのＬ３及びＬ４ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
例４に記載のように、Ｄ．インミティスの０時間Ｌ３、４８時間Ｌ３及び６日Ｌ４の幼虫が採収されるとともに、これらの幼虫から全ＲＮＡが精製された。蠕虫が液体窒素中にて微粉末に粉砕された後に、雌の成虫のポリＡ＋ＲＮＡが同様にして調製された。本質的には同上誌におけるサムブルックらの論文に記載されたものを、１９８８年発行のフォーカス誌（Focus）第１０巻、５〜６頁におけるフォーニ（Forney）らの論文に記載のように僅かに修正し、ＲＮＡはアガロース・ホルムアルデヒドゲルを介して電気泳動にかけられ、ナイトラン膜（シュライヒャー−シューエル社にて入手可能）に転移させられた。約１０マイクログラムの幼虫の全ＲＮＡと、約１．８μｇの雌の成虫のポリＡ＋ＲＮＡとのサンプルが分析された。当初のハイブリダイゼーション処理により、標準的技術により剥離される必要があるプローブの非特異的結合が過剰に生じた。そして、膜上に固定化されたＲＮＡ種は、標準的ノーザンブロット条件を利用し、約５２時間、約５×１０5ｃｐｍ／ｍｌの標識化ＧＲＦ１０と混成させられた。ＧＲＦ１０は、ｐ２２Ｌのコード化領域（以下の約１５〜３７ヌクレオチドに及ぶ）のヌクレオチド５′ＣＡＴＡＧＴＴＣＴＴ  ＧＧＣＴＴＡＧＣＧＣ  ＴＴＣ３′に対応するアンチセンスなオリゴマーＤＮＡであった。洗浄及び露出の後、４８時間Ｌ３レーンにおいて強力な信号が見られ、６日Ｌ４レーンにおいて、これより微弱な信号が見られ、各々約７２０〜７３０の塩基のＲＮＡ種に対応した。ＧＲＦ１０は本質的に０時間Ｌ３又は雌の成虫のＲＮＡとは混成しなかった。
１．８μｇのみのＲＮＡが雌の成虫のレーンにロードされたが、この場合、ポリＡ＋選択に起因し、１レーン当り１０μｇの幼虫の全ＲＮＡよりも遥かに多くのメッセージを有すると考えられた。４８時間Ｌ３においては多量にメッセージが見出され、６日Ｌ４においては見出されるメッセージの量はこれより少なく、０時間Ｌ３、成虫及び恐らくはマイクロフィラリアにおいてはメッセージが全く見出されないことにより、同上誌におけるフランクらの論文に記載のパルスチェイス代謝標識化パターンが実証されるとともに、成虫からの２２Ｕ  ｋＤ蛋白質を精製しながらも、これらの分子が見掛上不足していることが実証されている。
例１４
この例では、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌ（Ｄ．インミティスＰＬＡ２とも表記）が、細菌において発現させられた時に免疫血清に選択的に結合する蛋白質をコード化する能力を示す。更に、組換蛋白質により、心糸状虫の自然及び組換体の抗原を相応じるように認識可能な抗体の生成が、ウサギ及びイヌにおいて誘発される。ネコがこの組換蛋白質により免疫にされた。
Ｔ７ｌａｃ転写調節配列と、１０個のヒスチジンを備えたポリヒスチジン部分をコード化する融合配列とに有効に結合された、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌの約５８〜４７４塩基のヌクレオチドを含有する組換分子ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417が、以下のように生成された。上記のｐ２２Ｌの導出コード化領域の核酸配列の約５８〜４７４に及ぶヌクレオチドを含有する約４１７のヌクレオチドのＤＮＡフラグメントはＰＬＡ２417と呼ばれ、プライマ５′ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴ  ＴＣＣＧＣＡＴＣＡＧ  ＡＡＴＣＡＣＡＡＧＡ  ＡＧ３′（２０ＮＨ２と表記。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている。）及び５′ＣＧＡＡＧＧＡＡＴＧ  ＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡ  ＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴ  ＣＧ３′（２０ＣＯＯＨ′と表記。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている。）を用いて、Ｄ．インミティスｐ２２Ｌを含有するクローンからＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、ゲル精製され、ＢａｍＨＩにより開裂された発現ベクターｐＥＴ１９ｂ（ノヴァジェン社にて入手可能）にサブクローン化された。この結果としての組換分子ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換され、大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417を形成した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳはｌａｃ転写調節配列の調節下にあるバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有している。
例５に記載のように、大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417は培養され、発現が誘発された。蛋白質の生成は組換細胞の溶解物のＳＤＳ  ＰＡＧＥにより監視され、続いて標準的技術を用いてクーマシブルーステイニングが行われた。大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417は約２６ｋＤの見掛分子量にて移動し、かつＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417と表される蛋白質を生成した。この種の蛋白質は、Ｄ．インミティスのＤＮＡインサートに欠けるｐＥＴ１９ｂプラスミドにより形質転換される細胞によっては生成されなかった。
大腸菌の組換細胞ｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417の溶解物のイムノブロット分析では、２６ｋＤ蛋白質がイヌの免疫血清に選択的に結合可能であり、従って、Ｄ．インミティスの幼虫の成長を抑制することが可能な血清の少なくとも１つの成分に結合可能であったことを示す。
ニッケルキレート化クロマトグラフィー及びイミダゾールグラジエントにより、大腸菌のｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417のヒスチジン融合ペプチドが大腸菌の可溶性蛋白質から分離された。大腸菌のｐＥＴ１９ｂ−ＰＬＡ２417の総溶解物、カラムの溶離液及びカラムの空間量のイムノブロット分析では、ＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417２６ｋＤの蛋白質がニッケルカラムにおいて分離可能であり、イヌの免疫血清に選択的に結合可能であり、従って、Ｄ．インミティスの幼虫の成長を抑制することが可能な血清の少なくとも１つの成分に結合可能であったことを示す。カラムの溶離液は同一の免疫イヌからの免疫前の血清によっては検出されなかった。
キレート化クロマトグラフィー及び引き続いてのＣ４逆相クロマトグラフィーにより精製されたＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417を用いて、ウサギが２回、免疫にされた。このウサギから採集された抗血清は抗ＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417抗血清と表記され、幼虫における蛋白質を特徴づけるのに使用された。
イムノブロット分析は１５００のマイクロフィラリア、マルピーギ細管からの蚊から得られた７日Ｌ２、ヘッドからの蚊から得られた１０日Ｌ３、ヘッドから得られた蚊からの１５日Ｌ３、器内にて培養され、２５℃にて採収された０時間Ｌ３、器内にて培養され、３７℃にて採収された０時間Ｌ３、器内にて培養された４８時間Ｌ３、器内にて培養された６日Ｌ４、器内にて培養された１０日Ｌ４、器内にて培養された１３日Ｌ４、３μｇの雄の成虫の抗原及び３μｇの雌の成虫の抗原の各々１５０に対して行われた。Ｄ．インミティスＰＬＡ２に対する免疫応答（抗ＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417抗血清を用いて検出されたように）は検査対象の全てのＬ３及びＬ４サンプルにおいて見出されたが、マイクロフィラリア、Ｌ２或いは雄又は雌の成虫においては見出されなかった。２２ｋＤ形態から２０．５ｋＤ形態へのプロセッシングも観察された。２２ｋｄ形態は蚊において早くも１０日にてＬ３において現れ、蚊において１５日にて器内培養するために採収されるまで、同じ状態を維持した。２０ｋＤ形態は蚊からの除去後４８時間にして早くも見出された。その後の器内培養により２２ｋＤ形態は徐々に縮小して培養物中における１３日までにはかろうじて確認できる程度になったが、２０．５ｋＤ形態は依然として明確に確認できた。
抗ＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417抗血清を用いて、Ｄ．インミティスの幼虫の排出−分泌生成物から精製されたＰ２２Ｌ及びＰ２０．５の双方に対してイムノブロット分析が行われ、双方とも免疫学的に識別されることを示した。
キレート化クロマトグラフィーにより精製されたＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417を用いて、２頭のイヌが３回、免疫にされた。これらのイヌから採集された抗血清は４８時間Ｌ３Ｄ．インミティスにおいてＰ２２Ｌ及びＰ２０．５の双方を識別した。
キレート化クロマトグラフィーにより精製されたＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417を用いて、１５匹のネコが２回、免疫にされた。これらのネコは各々４０匹のＬ３により攻撃され、その防御性が評価される。
例１５
この例では、真核細胞におけるＰ２２Ｌ蛋白質（ＰＬＡ２とも称される）の生成と、免疫血清に選択的に結合可能なＰ２２Ｌを発現可能な組換ウイルス粒子ワクチンの生成とを示す。
約１〜４７５のヌクレオチド（ｐ２２Ｌコード化配列に基づく）からのｐ２２Ｌ配列を有する約４７５のヌクレオチドのＰＣＲ生成物が、各々がＢａｍＨＩ部位（下線部）を組み込んだプライマ７６−４０．Ｂ（５′ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡ  ＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡ  ＡＣＴＴＴＴＣＡＴＡ  ＧＴＴＣ３′）及び２０ＣＯＯＨ（５′ＣＧＡＡＧＧＡＡＴＧ  ＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡ  ＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴ  ＣＧ３′）を用いて、例１２のｐ２２Ｌ含有クローンから生成された。ＢａｍＨＩ消化されたｐ２２Ｌ475ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩ消化され、かつＣＩＰ処理されたｐＳＰ６４ベクター（プロメガ社にて入手可能）にサブクローン化され、ベクターｐ７６−５２．Ｈ３を形成した。インサートの適正な配向が確認された。
バクロウイルスシャトルプラスミドＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インヴィトロジェン社にて入手可能）へのサブクローン化には、ｐ７６−５２．Ｈ３プラスミドＤＮＡがＢａｍＨＩにより消化され、ｐ２２Ｌ475インサートＤＮＡがＢｌｕｅＢａｃＩＩＩの特異的ＢａｍＨＩ部位にサブクローン化された。結果として生じる組換分子はｐ７６−７９．Ａ６と表記される。インサートの配向が確認され、ｐ７６−７９．Ａ６プラスミドＤＮＡは、線形バクロゴールドバクロウイルスＤＮＡ（ファーミンジェン社にて入手可能）及び切込みカチオンリポソーム（インヴィトロジェン社にて入手可能）と共にＳｆ９宿主細胞（米国コロラド州フォートコリンズに所在するコロラド・バイオプロセッシング・センターから供与）にトランスフェクションされ、スポドプテラ  フルージペルダｐ７６−７９．Ａ６を形成した。結果的に生じる組換ｐ２２Ｌ475／バクロウイルスは８９−１１と表記される。例１４に記載のように生成されるウサギの抗ＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417抗血清を用いたウエスタンブロットにより、組換バクロウイルス８９−１１によりトランスフェクションされる昆虫の細胞がｐ２２Ｌ475、即ちＰＬＡ２475とも称されるＰ２２Ｌ475によりコード化される蛋白質を発現させ、かつ処理することが示された。蛋白質の２２及び２０．５ｋＤ形態の双方とも全細胞溶解物において特定されたが、２０．５ｋＤ形態のみが細胞の培地に分泌された。この結果により、Ｄ．インミティスＰ２２Ｌの分泌信号が昆虫の細胞により識別され、かつ分子がこの系において自然に処理されることが示された。
シンドビスウイルスシャトルプラスミドＴｏｔｏ２Ｊ１（例１１に記載）へのサブクローン化には、ｐ７６−５２．Ｈ３  ＤＮＡがＢａｍＨＩにより消化され、例１１に記載のように生成されるｐＳＰ−ＸｈｏＩベクターの特異的ＢａｍＨＩ部位にサブクローン化されるｐ２２Ｌ475インサートＤＮＡを放出した。ベクター内におけるインサートの５′〜３′の適正な配向が確認された。組換分子はｐ７６−７９．Ｃ２と称される。ｐ７６−７９．Ｃ２  ＤＮＡはＸｂａＩ及びＸｈｏＩにより消化され、例１１に記載のようなＴｏｔｏ２Ｊ１シンドビスウイルスシャトルプラスミドのＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位に配向的にサブクローン化されるｐ２２Ｌ475インサートを放出した。この結果として生じる組換分子はｐ８８−３６．１Ｂと称される。
組換分子ｐ８８−３６．１Ｂは特異なＭｌｕＩ部位において線形にされた。例１１に記載のように、感染性組換シンドビスの写しがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼにより生成されるとともにＢＨＫ（ハムスターの子どもの腎臓）の宿主細胞を感染させるのに用いられ、こうしてＢＨＫｐ８８−３６．１Ｂが生成された。組換ウイルス粒子（４８−８７と表記）はその生成量を増大させるように培養された。例１４に記載のように生成されるウサギの抗ＰＨＩＳ−ＰＬＡ２417抗血清を用いた、感染細胞の溶解物のウエスタンブロット分析により、組換シンドビスウイルス粒子４８−８７によりトランスフェクションされる哺乳類の細胞が、ｐ２２Ｌ475、即ちＰＬＡ２475とも称されるＰ２２Ｌ475によりコード化される蛋白質を発現させたが、明らかにこの蛋白質を処理しないことが示される。
例１６
この例では、成虫の心糸状虫においてＰ２２Ｕが発現させられ、Ｐ２２Ｌ又はＰ２０．５は明らかに発現させられないことが示される。
−７０℃にて保存された２８匹の雌の成虫のＤ．インミティスが、ＰＢＳにより３回洗浄され、粉砕され、４０ｍＭのＮａＣｌ、７．５ｍＭのｐＨ６．０のリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２ｍＭのＤＴＴ、８０μｇ／ｍｌのルーペプチン（leupeptin）、８０μｇ／ｍｉのペプスタチン及び１ｍｇ／ｍｌのＴＡＭＥ中において、ガラス／テフロンホモジナイザにより均質化された。Ｗ−３８０超音波処理装置（米国ニューヨーク州ファーミントン（Farmington）に所在するヒート・システム−アルトラソニックス社（Heat System-Ultrasonics, Inc.）にて入手可能）に取り付けられた４１８プローブを用いて、ホモジネートは総時間にして１分間だけ超音波処理されるとともに、１０分間、５，０００ｇにて遠心分離され、上澄み液が収集された。
−７０℃にて保存された２４匹の雄の成虫のＤ．インミティスが、ＴＢＳ（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）により３回洗浄され、液体窒素中にて凍結され、モルタル及び乳棒により微粉末に粉砕された。この粉末は４０ｍｍのＮａＣｌ、２０ｍｍのトリス（ｐＨ７．２）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌのルーペプチン、５μｇ／ｍｌのペプスタチン及び１ｍｇ／ｍｌのＴＡＭＥ中において均質化された。ホモジネートは２０分間、１０，０００ｇにて遠心分離され、上澄み液が収集された。
結果として生じる雄及び雌の双方の蠕虫の上澄み液物質は更に凝縮され、緩衝液はセントリプレップ−１０及びセントリコン−１０（アミコン社にて入手可能）を用いて、２０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）に交換された。ここに記載の全てのステップは４℃又は氷上にて行われた。
幼虫のＥＳについて記載したような処理に類似した精製処理を行い、トリプシン消化用の蛋白質を調製するための処理（例えば、例３における記載のような逆相クロマトグラフィーに引き続いての陽イオン交換）が、雄及び雌の双方の成虫の体細胞の可溶性抽出物上にて行われ、成虫の心糸状虫においてＰ２２Ｕ、Ｐ２２Ｌ又はＰ２０．５が見出されるか否かを判断した。
Ｃ4逆相クロマトグラフィー後にＰ２２Ｕ蛋白質と整合する蛋白質が見出されたが、溶離液中にてＰ２２Ｌ及びＰ２０．５のいずれも見出されなかった。
例３に記載のように、溶離蛋白質がトリプシン消化に晒され、フラグメントが分離された。幼虫のＥＳ、雌及び雄の成虫源からのＰ２２Ｕのトリプシンフラグメントマップは、同一部位にて溶離する選択トリプシンフラグメントのＮ端末配列と同様に、ほぼ同一であった。従って、Ｐ２２Ｕは成虫のＤ．インミティスにおいても見出されるが、Ｐ２２Ｌ又はＰ２０．５のいずれかが成虫の体細胞の可溶性プレパラートにおいて存在することを示す明証は全くないように思われる。
例１７
特異的に反応する血液成分を得る目的で、イヌを免疫にするために組換又は自然の幼虫のペプチドが用いられた。皮下、筋肉内、皮内又は静脈内の経路により、アジュバントの有無に拘りなく組換抗原がイヌに投与される。単一又は多重免疫化後、定常的な静脈穿刺によりイヌから血液を採集した。血清は凝固血液から収集され、即座に使用されるか、或いは使用前に凍結保存される。密度勾配遠心法により抗凝固剤処理された血液から白血球が収集され、即座に使用されるか、或いは１℃／分にて凍結し、液体窒素中に保存される。
配列一覧表
以下の配列一覧表を米国特許法第１条８２１に準拠して提出する。コンピュータ読取り書式のコピーも提出する。この配列一覧表の書面及びコンピュータ読取り書式は同一のものである。
（１）概説
（ｉ）出願人：  トリップ、シンシア  エイ．（Tripp, Cynthia A.）
フランク、グレン  アール．（Frank, Glenn R.）
グリーブ、ロバート  ビー．（Grieve, Robert B.）
（ｉｉ）発明の名称：  新たな寄生蠕虫蛋白質
（ｉｉｉ）配列数：  ４
（ｉｖ）通信用住所：
（Ａ）受信人：  シェリダン  ロス  アンド  マッキントッシュ（Sheridan Ross & McIntosh）
（Ｂ）通り：  １７００  リンカーン  ストリート、３５００番
（Ｃ）市：  デンバー
（Ｄ）州：  コロラド
（Ｅ）国：  アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：  ８０２０３
（ｖ）コンピュータ読取り書式：
（Ａ）媒体の種類：  フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：  ＩＢＭ互換性ＰＣ
（Ｃ）運用システム：  ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：  パテントイン  リリース（PatentIn Release）ナンバー１、バージョン１．２５
（ｖｉ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：  米国では未付与
（Ｂ）出願日：  １９９３年８月１９日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先行出願データ：
（Ａ）出願番号：  米国特許出願第０８／００３，２５７号
（Ｂ）出願日：  １９９３年１月１２日
（ｖｉｉ）先行出願データ：
（Ａ）出願番号：  米国特許出願第０８／００３，３８９号
（Ｂ）出願日：  １９９３年１月１２日
（ｖｉｉ）先行出願データ：
（Ａ）出願番号：  米国特許出願第０７／６５４，２２６号
（Ｂ）出願日：  １９９１年２月１２日
（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：  コバリック、ジョセフ  イー．（Kovarik, Joseph E.）
（Ｂ）登録番号：  ３３，００５
（Ｃ）照会／証明番号：  ２６１８−１３
（ｉｘ）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：  （３０３）８６３−９７００
（Ｂ）テレファクシミリ：  （３０３）８６３−０２２３
（Ｄ）テレックス：  ４６７３７７
（２）配列同定番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：  ９１３の塩基対
（Ｂ）種類：  核酸
（Ｃ）鎖：  単一
（Ｄ）トポロジー：  線形
（ｉｉ）分子の種類：  ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：  なし
（ｉｖ）アンチセンス：  なし
（ｖｉ）根本原料：
（Ａ）有機体：  Ｄ．  インミティス
（Ｄ）成長ステージ：  幼虫
（ｖｉｉ）直接的原料：
（Ａ）ライブラリ：  Ｌ３及び／又はＬ４  Ｄ．インミティス幼虫のｃＤＮＡ発現ライブラリ
（Ｂ）クローン：  ｐ４
（ｉｘ）特性：
（Ａ）名前／キー：  ＣＤＳ
（Ｂ）位置：  ３．．９１１
（ｘｉ）配列表記：  配列同定番号１
0004150421.tif 000009
0004150421.tif 000010
（２）  配列同定番号２の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：  ３０３のアミノ酸
（Ｂ）種類：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  線形
（ｉｉ）分子の種類：  蛋白質
（ｘｉ）配列表記：  配列同定番号２
0004150421.tif 000011
（２）  配列同定番号３の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：  １０１６の塩基対
（Ｂ）種類：  核酸
（Ｃ）鎖：  単一
（Ｄ）トポロジー：  線形
（ｉｉ）分子の種類：  ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：  なし
（ｉｖ）アンチセンス：  なし
（ｖｉ）根本原料：
（Ａ）有機体：  Ｄ．インミティス
（ｖｉｉ）直接的原料：
（Ａ）ライブラリ：  雌の成虫のＤ．インミティスのｃＤＮＡ発現ライブラリ
（Ｂ）クローン：  ｐ２２Ｕ
（ｉｘ）特性：
（Ａ）名前／キー：  ＣＤＳ
（Ｂ）位置：  ３．．６２９
（ｉｘ）特性：
（Ａ）名前／キー：  ３′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：  ６３０．．１０１６
（ｘｉ）配列表記：  配列同定番号３
0004150421.tif 000012
（２）  配列同定番号４の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：  ２０８のアミノ酸
（Ｂ）種類：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  線形
（ｉｉ）分子の種類：  蛋白質
（ｘｉ）配列表記：  配列同定番号４
0004150421.tif 000013
本発明の種々の実施態様を詳細に説明したが、これら実施態様の改変及び改作は当業者には明らかである。しかし、こうした改変及び改作は添付した請求の範囲に示すように、本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【図１】
0004150421.tif 000014
【図２Ａ】
0004150421.tif 000015
【図２Ｂ】
0004150421.tif 000016
【図２Ｃ】
0004150421.tif 000017
【図３Ａ】
0004150421.tif 000018
【図３Ｂ】
0004150421.tif 000019
【図３Ｃ】
0004150421.tif 000020