(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインまたはプレイオトロフィンを有効成分として含有する、薬物性腎障害または薬物性肝障害を治療または予防するための薬剤組成物。
【請求項２】
抗腫瘍薬の投与によって引き起こされる薬物性腎障害を治療または予防するための、請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】
抗腫瘍薬がシスプラチンである請求項２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
薬物性腎障害または薬物性肝障害を治療または予防するための薬剤組成物の調製のための、ミッドカインまたはプレイオトロフィンの使用。
【請求項５】
薬物性腎障害が抗腫瘍薬の投与によって引き起こされる、請求項４記載のミッドカインまたはプレイオトロフィンの使用。
【請求項６】
抗腫瘍薬がシスプラチンである、請求項４記載のミッドカインまたはプレイオトロフィンの使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は薬物性腎障害または肝障害を軽減する薬剤に関する。
背景技術
疾患の治療または診断を目的として、薬物が使用される頻度は、年々増加し、使用される薬物も、多様化の一途をたどっている。これらの薬物から多大な恩恵を得ている反面、有害作用が存在することも事実であり、特に、腎は障害を受けやすい。その理由は、以下の腎の働きにある。
腎は、重量で体重のわずか１％にも満たない臓器であるにもかかわらず、心拍出量の２５％の血液が流入し、１日当たり、全血漿量の約５０倍に及ぶ１５０リットルの原尿が糸球体で濾過され、さらに、構造的・機能的に不均一性に富んだ尿細管を通して、再吸収・分泌・代謝が行われ、最終尿がつくられる、という生理学的特徴を有する。そのため、腎では、血液中の薬剤、またはその代謝産物が、たえず循環しており、さらに、それらが腎内で濃縮・代謝を受ける結果、本来の薬剤をはじめとしたさまざまな代謝産物が、高濃度に分布することになる。すなわち、薬物への曝露が非常に高頻度かつ密に起こりやすい臓器であるということができる。そして、薬物性腎障害をきたす薬物として、抗菌薬、非ステロイド薬、造影剤、及び抗腫瘍薬の４種類が挙げられている。
また、肝も薬物により障害を受けやすい。薬物性肝障害には、その発生機序から、薬物、或いはその中間代謝産物が、直接、肝を傷害する中毒性障害と、アレルギー反応、特にＴ細胞が関与するIV型の遅延型アレルギー反応によるアレルギー性肝障害がある。薬物性肝障害として、抗生物質が最も頻度が高く、ついで、中枢神経系用薬、循環器用薬、抗腫瘍薬、ホルモン剤、診断用薬、などが挙げられている。
薬物による障害を軽減させる試みとして、γ-グロブリン、チトクロームC、アデニン、SH化合物、ビタミンＢ群、などが用いられているが、その効果は不十分である。薬物による障害（副作用）は、治療の中断を余儀なくさせ、また、患者のクオリティ・オブ・ライフ（Ｑ.Ｏ.Ｌ.）の重要視から、臨床の場において、解決すべき非常に重要な課題である。
発明の開示
従って、本発明は、さまざまな薬物、とりわけ、抗腫瘍薬による障害を、軽減或いは抑制させるのに有効な薬剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、ミッドカイン（midkine: ＭＫ）、プレイオトロフィン（pleiotrophin: ＰＴＮ）などのミッドカインファミリーに属するタンパク質が、１）神経突起伸長能、２）線溶系の亢進、３）ヒト癌部での強い発現、４）創傷治癒、などの多機能をもつ成長分化因子であることに着目し、さらに、それに加うるに、新たな薬理作用を見出すべく鋭意研究を進めてきた。
ＭＫは、レチノイン酸によるマウス胚性腫瘍細胞の分化過程で早期に発現が誘導される遺伝子の産物として発見された（Kadomatsu, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 1312-1318, 1988）。また、ＰＴＮは、神経突起伸長能を持つヘパリン結合性タンパク質として、新生ラットの脳に発見された（Rauvaa, H., EMBO J., 8: 2933-2941, 1989）。ＭＫとＰＴＮは、45％の相同性を示すヘパリン結合性の新しいクラスの成長分化因子で、ＭＫファミリーと呼ばれている（Muramatsu, T., Int. J. Dev. Biol. 37:183-188, 1993; Muramatsu, T., Develop. Growth & Differ. 36(1):1-8, 1994; Muramatsu, T., Int. J. Dev. Biol.37:183-188, 1993; Muramatsu, T., Develop. Growth & Differ. 36(1):1-8, 1994）。ＭＫとＰＴＮは、発生過程では、それぞれ、特徴的な発現パターンを示し、分化の遂行に重要な生理活性を担うことが予想される。
本発明者らは、インビトロ系において、ＭＫが、抗腫瘍薬による細胞死を抑制すること、また、ＭＫ遺伝子の機能を破壊したノックアウトマウスに対する抗腫瘍薬の投与実験により、ＭＫ遺伝子が、抗腫瘍薬による障害の軽減に作用していること、さらにまた、野生型マウスに対し、ＭＫ、或いはＰＴＮを投与することにより、抗腫瘍薬による障害が軽減されること、などを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、特許請求の範囲に記載の各請求項の発明からなる。
本発明において、ノックアウトマウスを使用することの意義は、薬物投与による障害に対して、生体内のＭＫ遺伝子がどのように関与しているか、また、ＭＫの強制投与に対して、ノックアウトマウスがどのように反応するかを個体レベルで解析することが期待できることにある。現在、ＭＫの作用機序について詳細は明らかになっていないが、もし、ＭＫがサイトカイン、もしくは成長因子の作用カスケード上で、トリガー（引き金）タンパク的な役割を果たしているとすると、ＭＫの量は極く微量でよいと考えられ、ここでノックアウトマウスを用いる意義は、さらに深まると考えられる。最近、ＭＫが特異的に高親和性で結合する細胞表面レセプター（分子量：250＋kDa）が見出され、その特性から、腫瘍細胞増殖のＭＫによるオートクリン刺激が、該レセプターによって仲介され、ＪＡＫ/ＳＴＡＴパスウエイを活性化するかもしれないということが示唆されている（Edward, A.R. et al., J. Biol. Chem. 273:3654-3660, 1998）。
ＭＫと個体発生とのかかわりを明らかにするために、図１に示すように、ＭＫ遺伝子のエクソン２の一部と３の一部を破壊した、ホモ接合体のＭＫ遺伝子ノックアウトマウスが作製されている（生化学7、平成８年・第６８巻、pp.1239, 4-P-1244）。このノックアウトマウスは、胎生期に、致死的とはならず、ヘテロ接合体、或いは野生型に比して、有意に体重が少ない（生化学7、平成８年・第６８巻、pp.1239,4-P-1244）。
該ノックアウトマウス（単にノックアウトマウスという）と野生型マウスに、抗腫瘍薬を投与し、投与後の障害の指標として、それぞれの生存率、及び血中尿素窒素値（blood urea nitrogen:ＢＵＮ）、或いはクレアチン値を比較することにより、抗腫瘍薬による障害に対する生体内ＭＫ遺伝子の軽減作用を見出すことができる。ＢＵＮ、及びクレアチン値は、腎排泄能の低下により、血液中へ尿素が蓄積するため、腎機能障害の指標として用いられている。
本発明においては、ノックアウトマウスと、野生型マウスに対して、シスプラチンを投与後、それぞれのＢＵＮ及び生存率を比較した場合、ＢＵＮについては、ノックアウトマウスは野生型よりも統計学的に有意に高いことが明らかであり、生存率については７日目までにノックアウトマウスの死亡数が増し、明らかに有意な差が生じた。さらに、ＭＫをノックアウトマウスに強制的に投与した場合、ＢＵＮに異常が生じる割合は生理食塩水を投与した群に比べ、３日目までに統計学的に有意に低いことが明らかとなった。更に、シスプラチンによる腎細胞障害の抑制にＭＫが有効であることを、ヒト小児腎癌由来細胞株を用いたインビトロの実験系においても確認した。また、野生型マウスを用いた実験によって、四塩化炭素による急性肝障害に対しても、ＭＫは軽減作用を示すこと、ＰＴＮもＭＫと同様シスプラチンによる腎障害の抑制に有効であることが明らかである。
これらのことから、ＭＫファミリーに属するタンパク質が薬物による腎障害や肝障害を軽減、或いは抑制する効果のあることが、本発明により明らかである。
本発明の薬剤組成物の有効成分として用いられるＭＫタンパク質（単にＭＫともいう）は、例えば次の文献に記載されている（ヒトＭＫ遺伝子：特開平5-91880；ヒトＭＫ遺伝子及び蛋白質の配列：特開平6-217778；ＭＫタンパク質：特開平5-229957；Muramatsu, T., Develop. Growth & Differ. 36(1), 1-8, 1994）。更に、本発明の薬剤組成物の有効成分として用いられるＰＴＮタンパク質は、例えば次の文献に記載されている（Muramatsu, T., Develop. Growth & Differ. 36(1):1-8, 1994; Andreas, K. et al., Critical Reviews in Oncogenesis, 6(2):151-177, 1995）。本発明の有効成分として用いられるＭＫファミリーに属するタンパク質は、ヒト、マウス、或いはその他の哺乳動物由来の天然タンパク質、化学合成及び遺伝子組換えによる人工タンパク質等を包含する。また、本発明のＭＫファミリーに属するタンパク質は、上記した生物学的活性の変化をもたらさないでアミノ酸の数／または配列において天然由来のタンパク質とある程度異なっているタンパク質またはポリペプチド類をも包含する。すなわち、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列の一部を欠損したもの、一部が他のアミノ酸で置換されたもの、または、他のアミノ酸の挿入または付加されたもの、あるいは種々異なる長さのポリペプチドが含まれる。置換あるいは挿入されるアミノ酸は天然型に限定されない。
本発明の有効成分であるＭＫファミリーに属するタンパク質を遺伝子操作で得るには、大腸菌による発現系（Studier, F.W. & Moffatt, B.A., J. Mol. Biol.189:113-130, 1986; Studier, F.W. et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990）、バキュロウイルスによる発現系（0’Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Mannual, Oxford University Press, 1992, Ausubel, F.M. et al. eds., Current Protocol in Molecular Biology, Unit 16.11, Wiley Interscience, 1994）などを用いることができる。なお、本発明者らは、メチルアルコール依存性酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）による発現系を用いてＭＫタンパク質を得ている（特開平9-95454号参照）。
本発明の薬剤組成物は、薬物により引き起こされる腎障害または肝障害を予防または治療するのに有効な量の、ＭＫファミリーに属するタンパク質を有効成分として含有する。本発明の有効成分は、通常用いられる薬学的に許容できる担体、賦形剤、希釈剤、保存剤、安定剤、緩衝剤等と混合することによって、所望の投与形態とすることができる。
本発明の薬剤組成物は、経口、非経口いずれの手段でも投与することができる。経口用の製剤としては例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。非経口用の製剤としては、注射剤、経直腸剤、経皮用剤などが挙げられ、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与経路により投与される。
しかしながら、ＭＫ、或いはＰＴＮのような生理活性ペプチドは、経口投与された場合、消化管内のプロテアーゼにより、非常に速やかに分解されることが多いので、ＭＫ、或いはＰＴＮに対し、生体内安定性を付与するために、水溶性高分子［（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）］を結合させ、ハイブリッド化ＭＫ、或いはハイブリッド化ＰＴＮとすることが好ましい。このような例として、ＩＬ-６やＴＮＦ-αなどのハイブリッド化が試みられ、至適なハイブリッド条件を選択することによって、作用の増強が達成されることが明らかにされている（Tsutsumi, Y. et al., Br. J. Cancer. 74:1090-1095; Tsutsumi, Y. et al., Thoromb. Haemostasis, 77:168-173, 1997; Tsutsumi, Y. et al., J. Control Release, 33:447-451, 1995）。
本発明の薬剤組成物の有効成分であるＭＫファミリーに属するタンパク質は、薬物により引き起こされる腎障害または肝障害の予防または治療に用いられる場合、引き起こす薬物の投与量、腎障害または肝障害の程度、患者の年齢、性別、体重等により変化するが、１日当たり約１μg／kg〜約１００mg／kgの範囲の投与量で、１回または数回に分けて投与される。
【図面の簡単な説明】
図１は、129/Sv系マウスのＭＫ遺伝子のエクソン２とエクソン３の一部を破壊したノックアウトマウスの変異型染色体を示す図である。
図２は、129/Sv系ＭＫノックアウトマウスと野生型マウスの双方に、シスプラチンを投与した場合の各々の生存率を示す図である。
図３は、129/Sv系ＭＫノックアウトマウスと野生型マウスの双方に、シスプラチンを投与後、0、３、及び５日目の血中尿素窒素値を示す図である。
図４は、ＭＫ、或いは生理食塩水をしみ込ませた徐放性カプセルを、129/Sv系ＭＫノックアウトマウスの腹腔内に埋め込み後、シスプラチンを１４mg/kg投与し、０、３及び５日目の血中尿素窒素値異常の発生率を示す図である。
図５は、四塩化炭素による急性肝障害を起こしたマウスに、種々の濃度のＭＫ、或いは生理食塩水を投与した場合の該マウスの血清中GOT値を示す図である。
図６は、図５と同様のマウスの血清中GPT値を示す図である。
図７は、２×104個/wellのG401細胞を、培地のみ、ＭＫが２μg、或いはＭＫ10μg/ml含む培地で培養する途中でブリプラチン（シスプラチン）処理した場合の、該細胞の生存率を示す図である。
図８は、６×104個/wellのG401細胞を、図７と同様に処理した場合の、該細胞の生存率を示す図である。
図９は、ＰＴＮ、或いは生理食塩水投与途中のマウスに、ブリプラチン（シスプラチン）を投与した場合の、ブリプラチン投与前と投与後の血中尿素窒素値（ＢＵＮ）を示す図である。
図10は、図９における血清クレアチニン値を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＭＫのインビボにおける腎障害軽減効果
図１に示す、ＭＫ遺伝子のエクソン２の一部と３の一部を破壊した129/Sv系ノックアウトマウス（生化学7、平成８年・第６８巻、pp. 1239, 4-P-1244）を使用した。図２は、該ノックアウトマウス、或いは野生型マウスに、シスプラチン（商品名：ブリプラチン、ブリストル・マイヤーズスクイブ株式会社）を14mg/kg腹腔内投与しその後の該ノックアウトマウス、或いは野生型マウスの生存率を示し、図３は、該シスプラチン投与後の、０、３、５日目のＢＵＮを示す。ここでシスプラチンを取り上げたのは、現在もっとも固形癌に対して効き目がシャープな抗腫瘍薬であり、頻繁に使用されていること、シスプラチンの副作用は急性腎不全等の腎障害であること、一方、ＭＫは、成体マウスでは、腎臓のみに発現していること、などの理由による。
図３に示したノックアウトマウスと野生型マウスのそれぞれのＢＵＮについて、スチューデントt検定の結果、ノックアウトマウスのＢＵＮは、野生型マウスのそれに比して有意に高いことが明らかである。
図４は、ＭＫ投与群と生理食塩水投与群、各群７匹ずつのノックアウトマウスに、ＭＫ投与群では、ＭＫを計207mgしみ込ませた徐放性カプセルを、生理食塩水投与群では、同量の生理食塩水をしみ込ませた徐放性カプセルを、腹腔内に埋め込み後、シスプラチン１４mg/kg投与し、０、３、５日目のＢＵＮの異常率を示す図である。ここで、異常率とは、ＢＵＮ５０以上を異常値とした場合のＢＵＮ異常の発生する割合を示す。
実施例２：ＭＫの肝障害軽減効果
野生型のマウスを用いて、四塩化炭素急性肝障害モデルを作製し、ＭＫ投与による急性肝障害軽減効果を調べた。各群５匹ずつのマウスに対し、食用油脂であるパナセート800（日本油脂株式会社）で10％に調製した四塩化炭素を投与すると同時に、絶食状態にした。24時間後に、生理食塩水、或いはＭＫ（特開平9-95454）0.017mg、1.7mgを腹腔投与、さらに、８時間後に再度、生理食塩水、或いはＭＫ0.017mg、1.7mgを腹腔投与、16時間後に採血し、血清中GOT及びGPT値を測定した（図５および図６）。
ｔ検定を行った結果、図５および図６に示すように、GOT値について、生理食塩水群と1.7mgのＭＫ投与群の間では、有意な差は出なかったが、GPT値については、５％の危険率で有意な差が認められた。すなわち、ＭＫは、四塩化炭素による急性肝障害を有意に軽減することが明らかとなった。
実施例３：ＭＫの腎障害軽減効果
抗腫瘍薬シスプラチンの腎臓への副作用を考慮し、ヒト小児腎癌（Wilms腫瘍)由来細胞株G401細胞を使用した。
ヒト小児腎癌（Wilms腫瘍）由来細胞株G401細胞を、10%FBS/DME培養液にて、１×105個/ml、或いは３×105個/mlとなるように調整した。96穴プレート（COSTAR:3596）に、２×104個/well、６×104個/well播種し、37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。
次いで、ＭＫを２μg/mL、或いは10μg/mL含む0.1％FBS/DME培養液と交換し、６時間培養した。対照群として、ＭＫを含まない該培養液を用いた。培養後、100μMの濃度のシスプラチン（商品名：ブリプラチン、ブリストル・マイヤーズスクイブ株式会社）を含む培地と交換し、２時間培養した。
培養後、培地で４回洗浄した。次いで、上記と同様に、ＭＫを２μg/mL、或いは10μg/mL含む培地と交換し培養を続けた。
Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System（TaKaRa）で、生細胞の増殖活性を測定し、ＭＫの腎障害軽減効果を評価した。測定原理は、MTTアッセイと同様、細胞内のミトコンドリアの分裂増殖を、吸光度に（450nm、対照655nm）に反映させるものである。
すなわち、シスプラチン処理後、２、３、或いは４日目に、培養液の1/10量のPremix WST-1試液を各wellに添加し、４時間培養した。培養後、プレートリーダー（BIO-RAD;Model 3550）で各wellの吸光度を測定した（図７及び図８）。図７及び図８から、ＭＫが、２〜10μg/mL存在すると、シスプラチン（抗腫瘍薬）の影響で死んでいくG401細胞の数を約２倍弱減少させることが明らかである。
実施例４：ＰＴＮの薬物性腎障害の軽減効果
ICRマウス（オス、8〜10週令）を、生理食塩水投与群とＰＴＮ投与群の２群（各11匹ずつ）に分けた。ＰＴＮ（Merenmies, J. and H. Rauvala.: J. Biol. Chem. 265:16721-16724, 1990）の投与量は、500μg/kgとし、生理食塩水の投与量は、生理食塩水投与群のマウスの番号に対応するＰＴＮ投与群のマウスのＰＴＮ投与量に合わせた。シスプラチンとして、ブリプラチン（ブリストル・マイヤーズスクイブ株式会社）を使用した。
ＰＴＮ、或いは生理食塩水を、上記２群の各マウスに３日間連続腹腔内投与した。４日目に、ＰＴＮ投与群、生理食塩水投与群の各3匹ずつのマウスについて、全採血を行い血清を調製した。これらの血清をブリプラチン投与前の血清サンプルとした。
同日（４日目）の午後に、残りの、２群の各マウスに、ブリプラチン15mg/kgを腹腔内に投与した。引き続いて７日目まで、毎日、ＰＴＮ、或いは生理食塩水を連続投与した。６日目、及び８日目に、すべてのマウスについて、全採血を行い血清を調製した。これらの血清を、ブリプラチン投与後２日目、及び４日目の血清サンプルとした。
これらのサンプルについて、代表的な腎機能マーカーである血中尿素窒素値（ＢＵＮ）（図９）と血清クレアチニン値（図１０）を測定した。ＢＵＮの測定には、イアトロクロムUN（株式会社ダイアヤトロン）を、クレアチニンの測定には、クレアチニン-テストワコー（和光純薬工業株式会社）を使用した。図９及び図１０から、ＰＴＮ投与群のＢＵＮ値、及びクレアチニン値に比較して、生理食塩水投与群の方がＢＵＮ、及びクレアチニン値が高い傾向にあることが明らかである。これらの結果は、ＰＴＮにもＭＫと同様の薬物による腎障害を緩和する作用があることを示している。
産業上の利用可能性
本発明によって、ＭＫファミリーに属するタンパク質が、薬物による腎障害や肝障害に対して有効な軽減作用を示すことが明らかにされた。従って、ＭＫファミリーに属するタンパク質を有効成分として含む本発明の薬剤組成物は、薬物による腎障害や肝障害、とりわけ抗腫瘍薬による障害の軽減に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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