(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号DSM ACC2286として寄託されているハイブリドーマR3A12によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）由来のエピトープYPYDVPDYAに対する１０9−１０10M-1の親和性を有するモノクローナル抗体の製造方法であって、HAペプチドを合成し、これを使用して哺乳類小動物を免疫し、Ｂリンパ球をその動物の脾臓から単離してマウスP3x63−Ag8.653骨髄腫細胞と融合し、HAペプチドおよびHA融合タンパク質に結合するクローンを作製して選択し、上記の高い親和性を有するクローンをこれらの中から選択してハイブリッド細胞系として樹立することを含む、上記方法。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を用いて、ヒトインフルエンザウイルスの天然のヘマグルチニン、修飾ヘマグルチニンまたはHA融合タンパク質を検出または単離する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニン由来のエピトープYPYDVPDYAに対するモノクローナル抗体であって、ヒトインフルエンザウイルスの天然のヘマグルチニン、修飾ヘマグルチニンまたはヘマグルチニン融合タンパク質の検出および単離に好適であり、かつ１０8M-1より大きい、特に１０9〜１０10M-1の親和性を有するモノクローナル抗体に関する。
ヘマグルチニンは、赤血球凝集能を有する物質であり、通常は糖タンパク質である。これらは、例えばミクソウイルスまたはポックスウイルスのようなウイルスの成分として生成する。（−）RNAゲノムを有する膜被覆型ウイルスであるインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）は、特に重要なものである。インフルエンザヘマグルチニンは、電子顕微鏡写真で見ることのできるスパイクの形状で球状脂質外皮から突き出した膜貫通型表面抗原である。HAスパイクは三量体であり、その単量体は２本のポリペプチド鎖、HA1（46,000−65,000D）およびHA2（21,000−30,000D）から構成される。インフルエンザウイルスの膜中のヘマグルチニンにより、ウイルスは、例えば気道の、感染しやすい宿主細胞中に侵入できる。
ヘマグルチニンに対する抗体がウイルス感染の効果的な阻害剤であることは知られている。しかしながら、該抗体の特異的親和性は概して巨大分子であるタンパク質全体に対するものではなく、特殊なエピトープのみに対するものである。
今日、エピトープタグ付け（tagging）の技術、すなわち分子生物学的な技術によるタンパク質へのエピトープの結合が、タンパク質を分析するためにしばしば使用される方法であり、これは原理的には使用するエピトープに依存しない方法である。この方法において、組換え技術を使用して、任意のタンパク質の一次配列に数個のアミノ酸が付け足される。決定因子は、特異的で、かつ高い親和性のある、既知の認識配列を有する抗体の存在のみである。このタンパク質の伸長部分に対して特異的指向性を有する抗体を使用して、この方法により、例えばタンパク質の分子量、その細胞内の位置、翻訳後修飾または他の因子との相互作用の解析を、タンパク質特異的抗体の存在を必要とすることなく行うことができる。
細胞エピトープと比較したウイルスエピトープの利点は、これらのタンパク質配列が通常は細菌および真核生物のタンパク質中には生じず、したがって細菌または細胞系における交差反応が予想されないということである。
こうした解析のために使用される、文献中にしばしば記載されるウイルスエピトープは、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニン由来のものである。このエピトープはアミノ酸配列YPYDVPDYA（98−106）を有する（Field,J.ら(1988),Mol.Cell.Biol.Vol.8,No.5,2159-2165およびWilsonら,Cell 37,767-778,(1984)）。このエピトープに対するモノクローナル抗体（mAB）が報告され,例えばmAB 12CA5(P.A.KolodziejおよびYoung,R.A.,Meth.Enzymol.(1991),Vol.194,508-519;Chen,Y.-T.ら、(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.90,6508-6512)および抗HA−BabCoなどが利用できる。
しかしながら、これらの抗体の欠点は、その親和性が十分高いものではなく、したがって相当する融合タンパク質の高感度の検出のためには、このエピトープ特異的抗体を高濃度で使用しなければならず、これが例えばウエスタンプロットにおける交差反応として顕在化する非特異的相互作用につながり得る(Chenら、p.6510を参照のこと)。
不適当な親和性はまた、既知の抗HA mABの感度の低下にもつながる。
したがって本発明の目的は、より高い親和性を有し、したがって高感度のヘマグルチニン試験またはHA融合タンパク質試験に好適であり、再現性のある結果を与える、ウイルスエピトープYPYDVPDYAに対するモノクローナル抗体を提供することである。
本発明に従い、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのアミノ酸配列YPYDVPDYA（98−106）を有するエピトープおよびこれに相当するその断片を認識し、かつ１０8M-1より大きい、特に１０9〜１０10M-1の親和性を有するモノクローナル抗体が提供される。ここで、エピトープ断片は、特に配列YPYDVPDYAの少なくとも７０％に相当するか、または少なくとも1個から2個の末端アミノ酸が短くなっているアミノ酸配列のものとして理解される。
モノクローナル抗体を作製するために、哺乳類小動物、好ましくはLou/Cラットなどのラット、BalbCマウスなどのマウス、またはウサギを、標準的な方法で合成したHAペプチドで免疫化する。未結合HAペプチド、場合によってN−末端もしくはC−末端でキャリアータンパク質に結合したHAペプチド、またはHA融合タンパク質を抗原として使用する。キャリアータンパク質として、好ましくはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）またはウシ血清アルブミン（BSA）を使用する。次に動物の脾臓からBリンパ球を単離し、好適な骨髄腫細胞との細胞融合または癌遺伝子の利用（Jonak,Z.L.ら,(1988)Adv.Drug Rev.2:207-228）もしくは電気的手段（Zimmermann,U.(1982),Biochim.Biophys.Acta 694:227-277）などの他の既知の方法によって不死化させる。細胞融合は、好ましくはLou/Cラットの脾臓細胞およびマウスP3x63−Ag8,653系由来の骨髄腫細胞（Kearney,J.F.ら(1979),J.Immunol.123,1548-1550）とを用いて本発明にしたがって行う。
この過程において、リンパ球と骨髄腫細胞を既知の方法、特にポリエチレングリコール融合（PEG）、ウイルス融合または電気融合によって融合し、形成したハイブリッド細胞（細胞クローン）も既知の方法、例えば選択培地の使用によって選択する。
こうして陽性クローンは、例えばまずHAペプチドで、次いでHA融合タンパク質で試験した。第1のスクリーニングにおいては、ビオチン化HAペプチド、例えばBio-C-HA（アセチル−YPYDVPDYAGSGSK（ε−ビオチノイル）−アミド）またはBio-N-HA（ビオチノイル−ε−Aca−SGSGYPYDVPDYA−アミド）を使用し、第2のスクリーニングにおいてはHA−タグ付きグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）を使用した。再度陽性であったクローンについて、次にBiaCoreシステムにおけるプラスモン共鳴（plasmon resonance）を使用してその親和性について調べ、選択した。
ハイブリッド細胞を既知の方法にしたがってクローニングし、培養して増殖させ、場合により液体窒素中に保存した。
細胞系R 3F10、R 3A12およびR 6D12を安定な抗体産生をする最も活性のある細胞クローンとして樹立した。ハイブリドーマR 3A12は「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen（DSMZ）」,Mascheroder Weg 1b,38124 Braunschweigに受託番号DSM ACC2286として1996年10月8日に寄託した。
抗体の単離のために、ハイブリッド細胞を更に細胞培養物中、または場合によっては腹水腫瘍として移植することによってin vivoで増殖させた。細胞培養上清から、または場合によっては腫瘍担持実験動物の腹水からmABを単離した。
ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのエピトープYPYDVPDYA、または相当するエプトープ断片に対する特異性および結合強度が優れていることを特徴とする、ハイブリッド細胞によって高濃度に産生されるmABが、本発明にしたがって得られる。このmABによって、ヘマグルチニンならびにHAエピトープYPYDVPDYAが結合しているタンパク質の高感度の検出および単離が可能になる。
本発明に係るmABの親和性は１０8M-1より大きいものである。したがって１０10M-1におけるmAB 3F10の親和性は、既知の抗体である12CA5（１０8M-1）およびBabCo（１０7M-1）のそれよりもおよそ30倍高い。本発明に係るmAB 3A12および6D12の親和性は１０9M-1であり、したがってこれも、既知の抗体のそれよりも高い。本発明に係るmABは非常に低濃度で使用可能であり、交差反応をほとんど完全に除外することができる。これらのmABにより、検出感度を改善することが可能である。これらはインフルエンザウイルスの天然のHA、修飾HAおよびHA融合タンパク質を認識することが明らかになっている。したがって、これらは、例えば固相２方向（two−side）結合試験などのような既知の検出反応におけるタンパク質の測定に非常に良好に使用することができる。
図面の説明
図１：
mAB 12CA5および抗HA-BabCoと比較した本発明に係るmABの親和性。
図２：
HA修飾グルタチオン−S−トランスフェラーゼタンパク質の、本発明に係るmAB（クローン3F10）および先行技術の抗HA（クローン12CA5）とのイムノブロット分析；ａ）抗ラットペルオキシダーゼを用いた検出、ｂ）抗ラットビオチン／ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いた検出。
図３：
HA修飾グルタチオン−S−トランスフェラーゼタンパク質の、本発明に係るmAB（クローン3F10）および先行技術の抗HA（クローン12CA5）とのイムノブロット分析。
図４：
HA修飾グルタチオン−S−トランスフェラーゼタンパク質の、本発明に係る抗体（クローン3F10）および先行技術の抗体（クローン12CA5）の酵素（ペルオキシダーゼ）コンジュゲートとのイムノブロット分析。
図５：
HA修飾緑色蛍光（GFP−HA）タンパク質の、本発明に係るmAB（クローン3F10）および先行技術の抗HA（クローン12CA5）との免疫沈降。
次に、以下の実施例によって本発明を更に説明する。
実施例１：
クローンR 3F10、R 3A12およびR 6D12の製造
HAペプチドの調製
以下のペプチドを合成した：
Bio−C−HA（アセチル−YPYDVPDYAGSGSK(ε−ビオチノイル)−アミド）
Bio−N−HA（ビオチノイル−ε−Aca−SGSGYPYDVPDYA−アミド）
KLH−MPS−CUZU−HA−C
KLH−MPS−CUSU−HA−N
哺乳類小動物の免疫化
以下のスキームにしたがって、KLH−結合HAペプチドでLou／Cラットを腹腔内で免疫感作した：
第1免疫化のために、動物に完全フロイントアジュバント中のKLH−結合HAペプチド５０μ1を注射した。
更なる免疫化は、不完全フロイントアジュバント中のKLH−結合HAペプチド５０μｇで行った。
融合
次に、Kremmerら（1990）Hybridoma 9,309-317にしたがって、PEGの存在下でマウスP3x63-Ag8,653を使用して、Lou／Cラットの脾細胞との融合を行った。
クローンの選択
スクリーニングスキーム：
第1のスクリーニング
−SA−被覆マイクロタイタープレート（MTP）をBio-C-HAまたはBio-N-HA１μｇ／ｍｌで被覆した、
−ハイブリドーマ上清を希釈せずに使用し、被覆MTPに添加した、
−結合した抗体を、抗ラットPODコンジュゲート／TMB基質を使用して検出した。
第2のスクリーニング
−マキシソーブMTPをHAタグ付きGST（炭酸緩衝液中１μｌ／ｍｌ）で被覆した、
−第1のスクリーニングで選択されたハイブリドーマ上清を再び希釈せずに使用し、被覆MTPに添加した、
−結合した抗体を、抗ラットPODコンジュゲート／TMB基質を使用して検出した。
第３／第４のスクリーニング
−類似体被覆物を使用してBiaCore測定を行った。
結果
BiaCoreシステムにおけるプラスモン共鳴を使用して、最も高い親和性と最も長い解離半減期を有する５つのクローンを選択した。これらをR 3F10、R 3A12、R 6D12、R 4H10およびM5B9と命名した。親和性は、ペプチドのビオチノイル化の位置（C末端またはN末端、図１を参照のこと）によってわずかに異なるのみであった。
クローンR 3F10、R 3A12およびR 6D12を細胞系として樹立した。これらは良好な増殖、安定な抗体産生を示し、産生された抗体は先行技術のモノクローナル抗体12CA5および抗HA BabCoよりも10倍から100倍高い親和性を有する。
図１はmAB 12CA5および抗HA BabCoと比較した本発明に係るmABの親和性を示す。
実施例２：
産生された抗体の親和性定数ならびに会合および解離の速度定数の測定
産生された抗体の親和性定数、ならびに会合および解離の速度定数を、Pharmacia Biosensor CompanyのBIAcore（登録商標）を使用して測定した（BIAは生物特異的相互作用分析(Biospecific Interaction Analysis)を表す）。測定原理は表面プラスモン共鳴に基づくものである。測定はバイオセンサー、いわゆるセンサーチップ上で行う。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン被覆センサーチップに非共有性の高親和性結合によって結合させる。調べるべき抗体の溶液を、非共有相互作用力によって抗体を固定化ペプチドに結合させる過程でセンサーチップ上を通過させる。
個々の成分の結合によってセンサーチップ表面上の質量密度が増加し、これが装置によって比例する測定シグナルに変換される。これによって誘導される会合および解離の速度定数および親和性定数は、時間に対するシグナルの変化、センサーグラム（sensorgram）から算出することができる。
抗体−ペプチド複合体は表面に結合したペプチドを損なうことなく単純な試薬で再び離すことができ、これによって同一の結合条件下、同じセンサーチップ上で更なる結合実験を行うことができる。
ビオチン化ペプチドをセンサーチップ（SA,Pharmacia Biosensor）に結合させるために、HBS（HEPES１０mmol／ｌ、NaCl150mmol／ｌ、EDTA3.4mmol／ｌ、P20  0.05％  ｐＨ7.4）中に50nmol／ｌの濃度で含有する溶液を、流速５ｍｌ／分でセンサーチップ上を通過させる。
その後、HBS中で抗体を添加し、ペプチドへの結合を流速１０μｌ／分でモニターする。抗体のペプチドへの結合の会合および解離の速度定数を製造者のソフトウェア（BIA評価2.1、Pharmacia Biosensor）を使用してセンサーグラムから算出する。親和性定数はKa＝kon/koffから算出する。抗原としてのBio-C-HAおよびBio-N-HAに対する本発明に係る抗体についてこの方法で測定した値を表１にまとめる。
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実施例３
本発明に係る抗体および先行技術から既知の抗体を使用したHA修飾タンパク質の比較イムノブロット分析
３．１  抗原の変化
HAエピトープで修飾したグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST−HA）を所定の量まで順次希釈し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の手段で分離し、ナイロン膜上にトランスファーした後、一次抗体である所定濃度の所定の抗体と反応させた（クローン12CA5 １μｇ／ｍｌ；クローン３F10  0.1μｇ／ｍｌ；ウエスタンブロット分析）。次に、結合した抗HA抗体を、抗マウスペルオキシダーゼ（クローン12CA5の場合）、抗ラットペルオキシダーゼ（クローン３F10,ａ）の場合）、または抗ラットビオチン／ストレプトアビジンペルオキシダーゼ(クローン3F10,ｂ）の場合）を使用し、化学発光検出によって検出した。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
厚さ0.75ｍｍの８×７ｃｍのゲルを使用した（BIO−RAD，Mini-ProteanIITM)。１５％のゲルのために、６ｍｌの分離用ゲル溶液（１×）をプレート間に注いだ。分離用ゲルの上端を水１ｍｌの層で注意深く被覆した。３０分間の重合の後、水を除き、２ｍｌの回収用ゲル溶液（１×）で満たした。試料を2倍に濃縮したLaemmli緩衝液1容量と混合し、６０℃で10分間インキュベートし、すすいだゲルのポケット部にピペットで入れた。電気泳動は、移動用（mobile）緩衝液中、約１５ｍＡの電流で行った。
溶液:
４×分離用ゲル溶液：
1.5M  Tris/HCl、ｐＨ8.8
0.4％  SDS
４×回収用ゲル溶液：
0.5M  Tris/HCl、ｐＨ6.8
0.4％  SDS
２×Laemmli緩衝液：
1.52ｇ  Tris          １００ｍｌ中
10ml  グリセロール  １ＮのHClでｐＨ6.8に調整
2.0ｇ  SDS
2.0ｍｌ  ２−メルカプトエタノール
１ｍｇ  ブロモフェノールブルー
５×移動用緩衝液：
15.1ｇ  Tris          １ｌ中
72.0ｇ  グリシン
5.0ｇ  SDS
ナイロン膜上へのトランスファー
タンパク質試料を電気泳動で分離した後、ゲルサイズに相当するナイロンフィルターを水で湿らせ、ゲル上に置いた。より良好な接触を確実にするために、2枚の正確に切断したWhatman（登録商標）３MMペーパーをゲルの両側のそれぞれの上に置き、この構成物（construction）をBIO−RADエレクトロブロット装置中にはさんだ。チャンバーをトランスファー用緩衝液で満たした後、氷上で冷却し、かつ攪拌しながら、７０Ｖ（電流強度I=250-350mA）の電圧を45-60分間かけることによって、膜上にタンパク質をトランスファーした。
溶液：
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検出
膜を注意深くはずした後、未結合である結合部位を飽和させるために１％のブロッキング試薬（PBS/PR;Boehringer Mannheim）が添加されたPBS溶液中、フィルターを室温で60分間インキュベートした。0.1％Tween20を含有するPBS緩衝液（PBST）で10分間の洗浄を2回行い、所定濃度の相当する抗HA抗体と室温で60分間反応させた。PBST緩衝液で3回洗浄（それぞれ5分間、室温）した後、抗種（species）IgG−ペルオキシダーゼコンジュゲート（抗ラットペルオキシダーゼ、２０ｍＵ/ｍｌ  PBS/BR;抗マウスペルオキシダーゼ、４０ｍＵ/ｍｌ  PBS/BR）と共に、フィルターを室温で更に60分間インキュベートした。上記のようにして再度洗浄し、吸収布で緩衝液を除去した後にフィルター膜を検出試薬A+B（Boehringer Mannheim）の1:100混合液中で1分間インキュベートし、吸着した試薬を除去した。次に家庭用フォイルで被覆したフィルターを１−１０分間X線フィルムに暴露させた。
結果
クローン12CA5などの既知の抗体と比較して、クローン３F10などの本発明に係る抗体を使用した場合、およそ10倍低い抗体濃度を使用して、30倍低い量のGST−HAを検出することが可能である（図２）。
３．２  一次抗体の濃度の変動
HAエピトープで修飾したグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST−HA）４ｎｇをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でそれぞれの列で分離し、ナイロン膜上にトランスファーした後、一次抗体である所定濃度の所定の抗体（クローン12CA5および3F10；2.0-0.008ng/ml）と反応させた。次に結合した抗HA抗体を、抗マウスペルオキシダーゼ（クローン12CA5の場合）および抗ラットペルオキシダーゼ（クローン3F10の場合）を使用し、化学発光検出によって検出した。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、ナイロン膜上へのトランスファーおよびそれに続く検出は実施例３．１に記載のようにして行った。
結果：
上記の実験において、クローン12CA5（先行技術）は抗体濃度2000ng/ml以下において制限的因子となったが、一方本発明に係るクローン3F10では、およそ125ng/mlの抗体濃度でシグナル飽和が観察される（図３）。
クローン3F10の場合には、およそ20倍低い抗体濃度で同様のシグナルが得られる。
実施例４
抗体コンジュゲートを使用したHA修飾タンパク質の比較イムノブロット分析
HAエピトープで修飾したグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST−HA）を所定の量まで順次希釈し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の手段で分離し、ナイロン膜上にトランスファーした後、所定濃度の所定の抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート（100ng/ml(クローン12CA5)；20mU/ml(クローン3F10)）を用いて反応させた。次に結合した抗HA抗体を化学発光検出を使用して検出した。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、ナイロン膜上へのトランスファーおよびそれに続く検出は実施例３．１に記載のようにして行った。
結果：
この系において、クローン12CA5（先行技術）のペルオキシダーゼコンジュゲートの検出限界はおよそ１ｎｇのGST−HAであるが、一方クローン3F10の相当する誘導体では、同じ条件下で４０ｐｇのGST-HAをも検出することができる。
実施例５
HA修飾タンパク質の比較免疫沈降
HAエピトープで修飾した緑色蛍光タンパク質（GFP-HA）を所定量（μｇ単位）の抗HA抗体（クローン12CA5およびクローン３F10）と反応させ、プロテイン−G−アガロースの添加後に免疫沈降させた。得られた沈降物を可溶化し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ナイロン膜上にトランスファーした後、抗−HA−ペルオキシダーゼコンジュゲート（クローン12CA5）を使用して、化学発光検出によって検出した。
免疫沈降
HAエピトープで修飾した緑色蛍光タンパク質（GFP-HA）５０ｎｇを洗浄用緩衝液200μｌ中で希釈し、所定量の抗HA抗体を添加し、オーバーヘッド振とう器で４℃で1時間インキュベートした。次いで５０％プロテイン−G−セファロース懸濁液２５μｌを該混合液に添加し、上記と同様にして1時間再度インキュベートした。プロテインGを介してゲルマトリクスに結合したタンパク質を洗浄用緩衝液１ｍｌで3回洗浄し、それぞれの洗浄段階において、混合液を上記のように４℃で2分間インキュベートした。次いで混合液をベンチ型遠心分離機で2分間遠心処理し（15,000rpm、室温）、ペレットを１０ｍｌの１×Laemmli適用用緩衝液中に取った。次に、免疫沈降させたタンパク質を、変性ゲル電気泳動（SDSポリアクリルアミドゲル）によって分離した。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、ナイロン膜上へのトランスファーおよびそれに続く検出は実施例３．１に記載のようにして行った。
結果：
クローン12CA5（先行技術）と比較して、クローン3F10は上記の実験において20倍以上低い抗体量を使用して抗原を沈降させることができる（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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