(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有し、かつヒトエリスロポエチンおよび、1個から6個のグリコシル化部位の付加または少なくとも1個のグリコシル化部位の転位（rearrangement）によって修飾されたヒトエリスロポエチンの一次構造を有するその類似体とからなる群より選択されるエリスロポエチン糖タンパク質を含む接合体であって、以下のような接合体：
該糖タンパク質は、1個から3個の低級アルコキシポリ(エチレングリコール)基に共有結合し、各ポリ(エチレングリコール)基は、リンカーのC(O)が該アミノ基のうちの1個とアミド結合を形成している、式-C(O)X-S-Y-のリンカーを介して糖タンパク質に共有結合し、
Xは-(CH2)k-または-CH2(O-CH2-CH2)k-であり、
kは1から10であり、
Yは、
【化４】
0004190184.tif 000043
であり、各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量は20キロダルトンから40キロダルトンであり、該接合体の分子量は51キロダルトンから175キロダルトンである。
【請求項２】
式
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n
である、請求項1記載の接合体：
式中、XおよびYは請求項1で定義された通りであり、mは450から900であり、nは1から3であり、Rは低級アルキルであり、かつPは、Xとアミド結合を形成する1つまたは複数のアミノ基が欠如したエリスロポエチン糖タンパク質である。
【請求項３】
式
【化６】
0004190184.tif 000044
である請求項1または2記載の接合体：
式中、P、R、X、m、およびnは請求項2で定義された通りである。
【請求項４】
Xが-(CH2)k-である、請求項1〜3のいずれか一項記載の接合体。
【請求項５】
kが1から4である、請求項4記載の接合体。
【請求項６】
Xが-CH2-である、請求項1〜5のいずれか一項記載の接合体。
【請求項７】
mが550から800の整数である、請求項2〜6のいずれか一項記載の接合体。
【請求項８】
mが650から700の整数である、請求項2〜7のいずれか一項記載の接合体。
【請求項９】
nが1である、請求項2〜8のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１０】
Rがメチルである、請求項2〜9のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１１】
各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量が、24キロダルトンから35キロダルトンである、請求項1〜10のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１２】
各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量が30キロダルトンである、請求項1〜11のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１３】
糖タンパク質が、低級アルコキシがキャッピングしている（capped）、1個または2個の、ポリ(エチレングリコール)部分に共有結合している、請求項1〜12のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１４】
ポリ(エチレングリコール)部分がメトキシによってキャッピングされた、請求項1〜13のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１５】
Xが-CH2-であり、mが650から700の整数であり、nが1であり、Rがメチルであり、かつ各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量が30キロダルトンである、請求項2〜14のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１６】
エリスロポエチン糖タンパク質がヒトエリスロポエチンである、請求項1〜15のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１７】
エリスロポエチン糖タンパク質が内因性遺伝子活性化により発現される、請求項1〜16のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１８】
エリスロポエチン糖タンパク質が、図1（配列番号：1）または図2（配列番号：2）に記載された配列を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の接合体。
【請求項１９】
エリスロポエチン糖タンパク質が、図1（配列番号：1）に記載された配列を含む、請求項18記載の接合体。
【請求項２０】
糖タンパク質が、1個から6個のグリコシル化部位の付加によって修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を含む、請求項1から15のいずれか一項記載の接合体。
【請求項２１】
糖タンパク質が、
30位のアミノ酸がAsn且つ32位のアミノ酸がThrに置換され；
51位のアミノ酸がAsn且つ53位のアミノ酸がThrに置換され；
57位のアミノ酸がAsn且つ59位のアミノ酸がThrに置換され；
69位のアミノ酸がAsnに置換され；
69位のアミノ酸がAsn且つ71位のアミノ酸がThrに置換され；
68位のアミノ酸がSer、69位のアミノ酸がAsn且つ71位のアミノ酸がThrに置換され；
87位のアミノ酸がVal、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換され；
87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換され；
87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn、89位のアミノ酸がGly且つ90位のアミノ酸がThrに置換され；
87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn、90位のアミノ酸がThr且つ92位のアミノ酸がThrに置換され；
87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn、90位のアミノ酸がThr且つ162位のアミノ酸がAlaに置換され；
69位のアミノ酸がAsn、71位のアミノ酸がThr、87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換され；
30位のアミノ酸がAsn、32位のアミノ酸がThr、87位のアミノ酸がVal、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換され；
89位のアミノ酸がAsn、90位のアミノ酸がIle且つ91位のアミノ酸がThrに置換され；
87位のアミノ酸がSer、89位のアミノ酸がAsn、90位のアミノ酸がIle且つ91位のアミノ酸がThrに置換され；
136位のアミノ酸がAsn且つ138位のアミノ酸がThrに置換され；
138位のアミノ酸がAsn且つ140位のアミノ酸がThrに置換され；
125位のアミノ酸がThrに置換され；および
124位のアミノ酸がPro且つ125位のアミノ酸がThrに置換されること
からなる群より選択される修飾により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を含む、請求項1から5、請求項7、および請求項9のいずれか一項記載の接合体。
【請求項２２】
糖タンパク質が、
a）カルボキシ末端から伸びているアミノ酸配列SerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIleLeuProGln（配列番号：3）を含むヒトエリスロポエチン；
b）87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換されることにより修飾された（a）における配列；および
c）30位のアミノ酸がAsn、32位のアミノ酸がThr、87位のアミノ酸がVal、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換されることにより修飾された（a）における配列
からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の接合体。
【請求項２３】
糖タンパク質が、少なくとも1個のグリコシル化部位の転位により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を含む、請求項1から15のいずれか一項記載の接合体。
【請求項２４】
転位が、ヒトエリスロポエチンにおける任意のN結合炭水化物部位（N-linked carbohydrate site）の欠失及び、ヒトエリスロポエチン配列の88位におけるN結合炭水化物部位の付加を含む、請求項22記載の接合体。
【請求項２５】
糖タンパク質が、
24位のアミノ酸がGln、87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換されたEPO；
38位のアミノ酸がGln、87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換されたEPO；および
83位のアミノ酸がGln、87位のアミノ酸がSer、88位のアミノ酸がAsn且つ90位のアミノ酸がThrに置換されたEPO
からなる群より選択される修飾により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を含む、請求項13記載の接合体。
【請求項２６】
接合体を含む組成物であって、以下のような組成物：
少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、かつ骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有し、かつヒトエリスロポエチン及び、1個から6個のグリコシル化部位の付加または少なくとも1個のグリコシル化部位の転位によって修飾されたヒトエリスロポエチンの一次構造を有するその類似体とからなる群より選択されるエリスロポエチン糖タンパク質を、該接合体のそれぞれが含み、糖タンパク質は、1個から3個の低級アルコキシポリ(エチレングリコール)基に共有結合し、各アルコキシポリ(エチレングリコール)基は、リンカーのC(O)が該アミノ基のうちの1個とアミド結合を形成している、式-C(O)X-S-Y-のリンカーを介して該糖タンパク質に共有結合し、
Xは-(CH2)k-または-CH2(O-CH2-CH2)k-であり、
kは1から10であり、
Yは、
【化１０】
0004190184.tif 000045
であり、各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量は20キロダルトンから40キロダルトンであり、該接合体の分子量は51キロダルトンから175キロダルトンであり、かつnが1である接合体の割合は少なくとも90％である。
【請求項２７】
nが1である接合体の割合が少なくとも90％である、請求項1から24のいずれか一項記載の接合体を含む組成物。
【請求項２８】
nが1である接合体の割合が少なくとも92％である、請求項25または26記載の組成物。
【請求項２９】
nが1である接合体の割合が少なくとも96％である、請求項27記載の組成物。
【請求項３０】
nが1である接合体の割合が90％から96％である、請求項26または29記載の組成物。
【請求項３１】
請求項1から25のいずれか一項記載の接合体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項26から30のいずれか一項記載の組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
慢性腎不全患者（CRF）、AIDSにおける貧血に関連する疾患を治療または予防するための薬物（medicament）および、化学療法を受けているガン患者を治療するための薬物の調製のための、請求項1から30のいずれか一項記載の接合体または組成物の使用。
【請求項３４】
チオール基をエリスロポエチン糖タンパク質に共有結合させる段階及び、得られた活性化エリスロポエチン糖タンパク質をポリ(エチレングリコール)（PEG）誘導体と結合させる段階を含む、請求項1から30のいずれか一項記載の接合体または組成物を調製するための方法。
【請求項３５】
請求項34記載の方法により調製された、請求項1から25のいずれか一項記載の接合体。
【請求項３６】
請求項34記載の方法により調製された、請求項26から30のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３７】
慢性腎不全患者（CRF）、AIDS、および化学療法を受けているガン患者における貧血に関連する疾患を治療するための、請求項1から25のいずれか一項記載の接合体。
【請求項３８】
慢性腎不全患者（CRF）、AIDS、および化学療法を受けているガン患者における貧血に関連する疾患を治療するための、請求項26から30のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
エリスロポエチン誘導体
発明の背景
赤血球形成(erythropoiesis)とは、赤血球(RBC)の産生であり、これは、細胞破壊の相殺を生じる。赤血球形成は、適当な組織の酸化に赤血球を十分利用できるようにする制御された生理的機構である。天然のヒトエリスロポエチン(hEPO)は腎において生成される165アミノ酸を含む糖タンパク質であり、これは赤血球産生を刺激する液性血漿因子である(Carnot, PおよびDeflandre, C、C.R. Acad. Sci.、143:432(1906)；Erslev, AJ、Blood、8:349(1953)；Reissmann, KR、Blood、5:372(1950)；Jacobson, LO、Goldwasser, E、Freid, WおよびPlzak, LF、Nature、179:6331-4(1957))。ヒトEPOは、骨髄における方向づけられた委任赤血球前駆細胞(committed erythroid progenitor)の分裂および分化を刺激する。ヒトEPOは赤血球系前駆細胞(erythroid precursor)上の受容体に結合することによりその生理活性を発揮する(Krantz, BS、Blood、77:419(1991))。天然のヒトエリスロポエチンは血漿中に低濃度存在し、加齢によって失われる赤血球細胞の補充を刺激する。
【０００２】
エリスロポエチンは、組換えDNA技法を用い生合成的に製造されており(Egrie, JC、Strickland, TW、Lane, Jら、Immunobiol.、72:213-224(1986))、これはチャイニーズハムスター卵巣組織細胞(CHO細胞)中に挿入されかつ発現されたクローニングされたヒトEPO遺伝子産物である。天然のヒトEPOはまず、アルギニン166をもつポリペプチド鎖を含む166aaに翻訳される。翻訳後修飾において、アルギニン166はカルボキシペプチダーゼにより切断される。ヒトEPO（165aa）の一次構造を、図1に示す。ヒトEPO（166aa）の一次構造を、図2に示す。そこには、Cys7-Cys161 およびCys29-Cys33の間に2個のジスルフィド架橋がある。EPOポリペプチド鎖の糖部分を除いた分子量は18,236 Daである。完全なヒトEPO分子においては、分子量のおよそ40％を糖質基が占めている(Sasaki, H、Bothner, B、Dell, AおよびFukuda, M、J. Biol. Chem.、262:12059(1987))。
【０００３】
エリスロポエチンは赤血球の形成において必須であるので、このホルモンは、赤血球産生の低下または欠損を特徴とする血液疾患の治療において有用である。臨床的には、EPOは、例えば慢性腎不全患者(CRF)における貧血の治療に使用され(Eschbach, JW、Egri, JC、Downing, MRら、NEJM、316:73-78(1987)；Eschbach,JW、Abdulhadi, MH、Browne, JKら、Ann. Intern. Med.、111:992(1989)；Egrie, JC、Eschbach, JW、McGuire, T、Adamson, JW 、Kidney Intl.、33: 262(1988)；Lim, VS、Degowin, RL、Zavala, Dら、Ann. Intern. Med.、110:108-114(1989))、ならびにAIDSおよび化学療法を受けている癌患者において使用される(Danna, RP、Rudnick, SA、Abels, RIの著書、MB, Garnick編、エリスロポエチンの臨床応用−内科的展望(Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective)、ニューヨーク:Marcel Dekker；1990年：301-324ページ)。しかしながら、EPOのような市販のタンパク質療法の生体利用性は、それらの血漿半減期が短く、プロテアーゼによる分解を受けやすいことにより、制限されたものである。これらの欠点は、これらが最大の臨床上の効力に到達することを妨げている。
【０００４】
発明の概要
従って、本発明は、EPOの新規の種類のPEG誘導体である。本発明の、生理学的に活性なPEG-EPO接合体は、少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、かつ骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有し、かつヒトエリスロポエチンと、1個から6個のグリコシル化部位の付加によって修飾されたヒトエリスロポエチンの一次構造を有するその類似体とからなる群より選択されるエリスロポエチン糖タンパク質を含む。該糖タンパク質は、1個から3個の低級アルコキシポリ(エチレングリコール)基に共有結合し、各ポリ(エチレングリコール)基は、リンカーのC(O)がアミノ基のうちの1個とアミド結合を形成している、式-C(O)X-S-Y-のリンカーを介して該糖タンパク質に共有結合し、Xは-(CH2)k-または-CH2(O-CH2-CH2)k-であり、kは1から10であり、Yは、
【化１１】
0004190184.tif 000002
；
【化１２】
0004190184.tif 000003
；
【化１３】
0004190184.tif 000004
；
又は
【化１４】
0004190184.tif 000005
であり、各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量は、約20キロダルトンから約40キロダルトンであり、接合体の分子量は、約51キロダルトンから約175キロダルトンである。本発明は更に、nが1である組成物中の接合体の割合が少なくとも90％であるような、本明細書記載の接合体を含む組成物を提供する。
【０００５】
未修飾EPO（すなわち、PEGが結合していないEPO）および従来のPEG-EPO接合体と比較して、本発明の接合体は、循環半減期（circulating half-time）および血漿滞留時間が増大し、クリアランスが減少し、インビボでの臨床的活性が増大している。本発明の接合体はEPOと同じ用途をもつ。特に、本発明の接合体は、患者を治療するためにEPOを用いるのと同じやり方で、骨髄における委任赤血球前駆細胞の分裂および分化を刺激することにより患者を治療するのに有用である。
【０００６】
本発明はまた、ヒトにおける貧血を治療するための方法を含む。本発明はまた、エリスロポエチンタンパク質のアミノ酸であるリジンのε-アミノ基と二機能性（bi-functional）試薬を共有結合的に反応させて、アミド結合を有する中間体を形成する段階を含む、エリスロポエチン糖タンパク質産物を調製するための方法を含む。二機能性試薬は、反応基および保護されたチオール基を含む。次に、アミド結合された中間体と活性化ポリエチレングリコール誘導体を共有結合的に反応させて、本発明のエリスロポエチン糖タンパク質産物を形成する。
【０００７】
発明の詳細な説明
定義
以下の用語は、以下に説明された定義を有する。
【０００８】
「エリスロポエチンタンパク質」、「エリスロポエチン」、「EPO」、または「エリスロポエチン糖タンパク質」という用語は、図1(配列番号：1)もしくは2(配列番号：2)に示された配列を有する糖タンパク質、またはそれと実質的に相同的なタンパク質もしくはポリペプチドを意味し、それらの生物学的特性は、赤血球産生の刺激ならびに骨髄における方向づけられた委任赤血球前駆細胞の分裂および分化の刺激に関係している。本明細書において使用されたEPOタンパク質という用語は、例えば位置指定突然変異により意識的に、もしくは、突然変異により偶発的に修飾されたタンパク質を含む。これらの用語は更に、1〜6個のグリコシル化部位の付加を有する類似体を含み、これはタンパク質のカルボキシ末端の端に少なくとも1個の更なるアミノ酸を有し、更なるアミノ酸（または複数）が少なくとも1個のグリコシル化部位を有する類似体と、少なくとも1個のグリコシル化部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似体、例えば欧州特許出願第640 619号とを含む。これらの用語は、天然および組換えにより製造されたヒトエリスロポエチンの両方を含む。
【０００９】
「実質的に相同である」という用語は、それらの正味の効果が参照配列と対照となる配列との間に不利益な機能上の相違点をもたらさないような、一つ又は複数の置換、欠失、または付加により、対照となる特定の配列（例えば、変異配列）が参照配列と異なることを意味している。本発明のために、95％を上回る相同性、同等の生物学的特性及び、同等の発現特徴を有する配列が実質的に相同であるとみなされる。相同性を決定するために、成熟配列の切断は無視されるべきである。下回る程度の相同性、匹敵する生物活性及び、同等の発現特徴を有する配列は、実質的な等価物とみなされる。
【００１０】
EPOタンパク質の「断片」という用語は、EPOタンパク質の一部または断片のアミノ酸配列を有し、かつEPOの生体活性を有する、任意のタンパク質またはポリペプチドを意味する。断片には、EPOタンパク質のタンパク質分解性分解により産生された、または当技術分野において日常的な方法による化学的合成により産生された、タンパク質またはポリペプチドが挙げられる。EPOタンパク質またはその断片のヒトへの投与が、骨髄における、赤血球の産生の刺激ならびに委任赤血球前駆細胞の分裂および分化の刺激をもたらした場合、このタンパク質または断片は生体活性である。EPOタンパク質のこのような生体活性の測定を、一つ又は複数の哺乳動物種においてこのような目的に用いられる従来の周知の試験により行うことができる。このような生体活性を示すために用いることができる適切な試験を本明細書で説明する。
【００１１】
「治療上有効量」という用語は、骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性に必要なエリスロポエチン糖タンパク質産物の量である。エリスロポエチン糖タンパク質産物の正確な量は、治療される疾患の正確な種類、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの要因によって決まる、好みの問題である。エリスロポエチン糖タンパク質産物を含む薬学的組成物は、少ないまたは不完全な赤血球産生により特徴付けられる血液疾患に罹患しているヒト患者に様々な手段で投与するのに有効な強さで製剤化されうる。エリスロポエチン糖タンパク質産物の平均治療上有効量は変化してもよく、特に、有資格医師の推奨および処方箋に基づいていなければならない。
【００１２】
本発明は、以下の式1：
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n      1
により表される、骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有するエリスロポエチン糖タンパク質産物に関する。式中、XおよびYは上記で定義された通りであり、mは450〜900であり、nは1〜3であり、Rは低級アルキルであり、かつPは、Xとアミド結合を形成する一つ又は複数のアミノ基が欠如したエリスロポエチン糖タンパク質である。以下で詳細に説明するように、EPOの調製および精製は当技術分野で周知である。EPOとは、例えば組織などの任意の従来の供給源、タンパク質合成、天然または組換えの細胞による細胞培養から得られた、好ましくはヒトの、天然または組換えのタンパク質を意味する。例えば、ムテインまたは別の方法で修飾されたタンパク質などのEPOの活性を有する任意のタンパク質が含まれる。組換えEPOを、CHO、BHK、もしくはHeLa細胞株における発現を介して、組換えDNA技術により、または内因性遺伝子活性化により調製することができ、すなわち内因性遺伝子活性化によりエリスロポエチン糖タンパク質が発現される。エリスロポエチン糖タンパク質産物の調製に好ましいEPO種はヒトEPO種である。より好ましくは、EPO種は、図1（配列番号：1）または図2（配列番号：2）に示されたアミノ酸配列を有するヒトEPOであり、最も好ましくは、図1（配列番号：1）に示されたアミノ酸配列を有するヒトEPOである。
【００１３】
ヒトエリスロポエチンタンパク質はまた、少なくとも1個のグリコシル化部位、これらに限定されるわけではないが、以下に示すアミノ酸配列などの、例えば1個から6個のグリコシル化部位の更なる付加によって修飾されうる。以下の表記は、アミノ酸を指定するために示された上付き数字の位置にある天然アミノ酸を、上付き数字の左にあるアミノ酸に置換することにより、図1に示された配列が修飾されていることを意味する。
0004190184.tif 000006
【００１４】
ヒトエリスロポエチンタンパク質は、更に糖タンパク質のカルボキシ末端の端に少なくとも1個の更なるアミノ酸を有する類似体であってよく、更なるアミノ酸は、少なくとも1個のグリコシル化部位を含み、すなわち糖タンパク質は、ヒトエリスロポエチン配列の配列およびヒトエリスロポエチン配列のカルボキシ末端の第二配列を含む配列を有する。
【００１５】
更なるアミノ酸は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端の端に由来するペプチド断片を含むことができる。好ましくは、この糖タンパク質は、(a) アミノ酸配列、Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (配列番号：３)を有し、カルボキシ末端から伸びている、ヒトエリスロポエチン；(b)更にSer87 Asn88 Thr90 EPOを含む(a)の類似体；および、(c)更にAsn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPOを含む(a)の類似体からなる群より選択された類似体である。
【００１６】
ヒトエリスロポエチンタンパク質はまた、少なくとも1個のグリコシル化部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似体であってよい。転位は、ヒトエリスロポエチンのN結合糖質部位の欠損、およびヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列の88位でのN結合糖質部位の付加を含みうる。好ましくは、糖タンパク質は、Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO；Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO；および、Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPOからなる群より選択される類似体である。
【００１７】
更なるグリコシル化部位を有するエリスロポエチン類似体は、Elliotの、1995年3月1日に公開された欧州特許出願第640 619号に開示されており、その内容は参照として本明細書に組み入れられている。
【００１８】
式1において、Rは任意の低級アルキルでよく、これは、メチル、エチル、イソプロピルなどの、1個から6個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルキル基を意味する。好ましいアルキルはメチルである。
【００１９】
式1において、Xは、-(CH2)k-または-CH2(O-CH2-CH2)k-であり、式中、kは1〜約10である。好ましくは、kは1〜約4であり、より好ましくは、kは1または2である。最も好ましくは、Xは-(CH2)である。
【００２０】
式1において、Yは、
【化１５】
0004190184.tif 000007
；
【化１６】
0004190184.tif 000008
；
【化１７】
0004190184.tif 000009
；
又は
【化１８】
0004190184.tif 000010
である。
【００２１】
好ましくは、Yは、
【化１９】
0004190184.tif 000011
；又は
【化２０】
0004190184.tif 000012
である。
【００２２】
最も好ましくは、Yは、
【化２１】
0004190184.tif 000013
である。
【００２３】
式1において、数値mは、得られる式1の接合体が、未修飾EPOに匹敵する生理活性を有するように選択される。この生理活性は、未修飾EPOの対応する活性と同じか、それを上回るか、またはその一部であってもよい。mは、PEG単位におけるエチレンオキシド残基の数を示している。-(O-CH2-CH2)-である1個のPEGサブユニットは、約44ダルトンの分子量を有する。従って、接合体の分子量（EPOの分子量を除く）は、数値mに依存する。「約」特定数である分子量とは、従来の分析技術によって決定される数値の理にかなった範囲内であることを意味する。mは、約450〜約900（20kDa〜40kDaの分子量に相当する）の範囲の整数であり、好ましくは、mは、約550〜約800（約24kDa〜35kDa）であり、最も好ましくは、mは、約650〜約700（約29kDa〜31kDa）である。
【００２４】
式1において、数値nは、アミド結合を介してPEG単位に共有結合したエリスロポエチンタンパク質におけるアミノ酸であるリジンのε-アミノ基の数である。本発明の接合体は、EPO一分子あたり1個、2個、または3個のPEG単位を有してもよい。nは1〜3の範囲の整数であり、好ましくはnは1または2であり、より好ましくはnは1である。
【００２５】
好ましいエリスロポエチン糖タンパク質産物は、式
【化２２】
0004190184.tif 000014
；及び
【化２３】
0004190184.tif 000015
により表され、式中、P、R、X、m、およびnは、上記で定義された通りである。
【００２６】
最も好ましいエリスロポエチン糖タンパク質産物は、式
【化２４】
0004190184.tif 000016
により表され、式中、P、R、X、M、およびnは、上記で定義された通りである。
【００２７】
他の好ましいエリスロポエチン糖タンパク質産物は、式
【化２５】
0004190184.tif 000017
；及び
【化２６】
0004190184.tif 000018
により表され、式中、Pおよびnは、上記で定義された通りである。
【００２８】
より好ましいエリスロポエチン糖タンパク質産物は、式
【化２７】
0004190184.tif 000019
により表され、式中、Pおよびnは、上記で定義された通りである。
【００２９】
好ましい化合物は、Xが-(CH2)k-である化合物であり、特に、kが1〜4である化合物であり、最も好ましくは、Xが-CH2-である化合物である。
【００３０】
本発明はまた、mが550〜800の整数であり、好ましくは、mが650〜700の整数である上記接合体に関する。
【００３１】
本発明の好ましい化合物は、nが1であり、および/またはRがメチルである化合物である。
【００３２】
さらに、本発明は、各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量が約24キロダルトン〜約35キロダルトン、より好ましくは、約30キロダルトンである上記化合物に関する。
【００３３】
さらに本発明は、糖タンパク質が、1個または2個の低級アルコキシがキャッピングしているポリ(エチレングリコール)部分、より好ましくは1個の低級アルコキシがキャッピングしているポリ(エチレングリコール)部分に共有結合している化合物に関する。
【００３４】
好ましい態様では、ポリ(エチレングリコール)部分にメトキシがキャッピングしている。
【００３５】
最も好ましい態様では、本発明は、Xが-CH2-であり、mが650〜700の整数であり、nが1であり、Rがメチルであり、かつ各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量が約30キロダルトンである上記化合物に関する。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、式1により表される治療上有効量のエリスロポエチン糖タンパク質産物をヒトに投与する段階を含む、ヒトの貧血を治療するための方法に関する。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有するエリスロポエチン糖タンパク質産物を調製するための方法に関する：
（a）式P-[NH2]nにより表されるエリスロポエチン糖タンパク質のアミノ酸であるリジンのε-アミノ基と、式Z-CO-X-S-Qにより表される二機能性試薬を共有結合的に反応させて、式P-[NH-CO-X-S-Q]nにより表されるアミド結合を有する中間体を形成する段階：
式中、Pは、アミド結合を形成するアミノ基が欠如したエリスロポエチン糖タンパク質であり、nは1〜3の整数であり、Zは、例えばカルボキシル-NHSエステルなどの反応基であり、Xは-(CH2)k-または-CH2(O-CH2-CH2)k-であり、式中、kは1〜約10であり、かつQは、例えばアセチルなどのアルカノイルのような保護基である；
（b）段階（a）からのアミド結合を有する中間体と、式W-[OCH2CH2]m-ORにより表される活性化ポリエチレングリコール誘導体を共有結合的に反応させて、式
【化２８】
0004190184.tif 000020
により表されるエリスロポエチン糖タンパク質産物を形成する段階とを含む：
式中、WはYのスルフヒドリル反応形態であり、mは約450〜約900の範囲の整数であり、Rは低級アルキルであり、Yは、
【化２９】
0004190184.tif 000021
；
【化３０】
0004190184.tif 000022
；
【化３１】
0004190184.tif 000023
；
又は
【化３２】
0004190184.tif 000024
である。本態様では、二機能性試薬は、好ましくは、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオネートまたはN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテートであり、Zは、好ましくは、N-ヒドロキシスクシンイミドであり、活性化ポリエチレングリコール誘導体であるW-[OCH2CH2]m-ORは、好ましくは、ヨード-アセチル-メトキシ-PEG、メトキシ-PEG-ビニルスルホン、およびメトキシ-PEG-マレイミドからなる群より選択される。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、接合体を含む組成物に関する。上記接合体のそれぞれが、少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、かつ骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有し、かつヒトエリスロポエチン及び、1個から6個のグリコシル化部位の付加または少なくとも1個のグリコシル化部位の転位によって修飾されたヒトエリスロポエチンの一次構造を有するその類似体とからなる群より選択されるエリスロポエチン糖タンパク質を含む。上記糖タンパク質は、1個から3個の低級アルコキシポリ(エチレングリコール)基に共有結合し、各ポリ(エチレングリコール)基は、リンカーのC(O)が該アミノ基のうちの1個とアミド結合を形成している、式-C(O)X-S-Y-のリンカーを介して糖タンパク質に共有結合し、Xは-(CH2)k-または-CH2(O-CH2-CH2)k-であり、kは1〜10であり、Yは、
【化３３】
0004190184.tif 000025
；
【化３４】
0004190184.tif 000026
；
【化３５】
0004190184.tif 000027
；
又は
【化３６】
0004190184.tif 000028
であり、
各ポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量は約20キロダルトンから約40キロダルトンであり、接合体の分子量は約51キロダルトンから約175キロダルトンであり、nが1である接合体の割合は少なくとも90％である。好ましくは、組成物は、nが1である接合体の割合が少なくとも90％であり、より好ましくは、nが1である接合体の割合が少なくとも92％であり、さらにより好ましくは、nが1である接合体の割合が少なくとも96％であり、かつ最も好ましくは、nが1である接合体の割合が90％から96％である、上記で定義された接合体を含む。
【００３９】
さらに、本発明は、上記で定義されたような接合体または組成物及び薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物、ならびに慢性腎不全患者（CRF）、AIDSにおける貧血に関連する疾患を治療または予防するための薬物および化学療法を受けているガン患者を治療するための薬物を調製するための、上記で定義されたような接合体または組成物の使用に関する。さらに、本発明は、上記で定義された組成物を患者に投与する段階を含む、慢性腎不全患者（CRF）、AIDS、および化学療法を受けているガン患者における貧血を伴う疾患を予防的および/または治療的に処置するための方法に関する。
【００４０】
本発明はまた、上記で定義された接合体または組成物を調製するための手順に関する。上記手順は、チオール基をエリスロポエチン糖タンパク質に共有結合させる段階及び、得られた活性化エリスロポエチン糖タンパク質をポリ(エチレングリコール)（PEG）誘導体と結合させる段階を含む。さらに、本発明は、上記の手順により調製された上記で定義されたような接合体および組成物、ならびに慢性腎不全患者（CRF）、AIDS、および化学療法を受けているガン患者の貧血に関連する疾患を治療するための、上記で定義されたような接合体および組成物に関する。
【００４１】
EPOタンパク質発現法
エリスロポエチン(EPO)は、赤血球の形成を刺激するヒト糖タンパク質である。その調製および治療適応は、詳細に、例えば米国特許第5,547,933号および第5,621,080号、欧州特許第EP-B 0 148 605号、Huang, S.L.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2708-2712(1984)、欧州特許第EP-B 0 205 564号、欧州特許第EP-B 0 209 539号および欧州特許第EP-B 0 411 678号、更にはLai, P.H.ら、J. Biol. Chem. 261:3116-3121(1986)、およびSasaki, H.ら、J. Biol. Chem.262: 12059-12076(1987)に開示されている。治療の用途のためのエリスロポエチンは、組換え法により製造することができる(欧州特許第EP-B 0 148 605号、欧州特許第EP-B 0 209 539号およびEgrie, J.C.、Strickland, T.W.、Lane, J. ら、Immunobiol.72:213-224(1986))に開示されている。内因性遺伝子活性化による、EPOを含むタンパク質の発現は、当該技術分野において周知であり、例えば米国特許第5,733,761号、米国特許第5,641,670号、および米国特許第5,733,746号、ならびに国際公開公報第93/09222号、国際公開公報第94/12650号、国際公開公報第95/31560号、国際公開公報第90/11354号、国際公開公報第91/06667号および国際公開公報第91/09955号に開示されており、それら各々の内容は本明細書に参照として組み入れられている。
【００４２】
血清を含まない培地におけるエリスロポエチンの発現および調製の方法は、例えば1996年11月14日に公開されたBurgの国際公開公報第96/35718号、および1992年6月12日に公開されたKochの欧州特許出願第513 738号に開示されている。
【００４３】
ヒトEPOタンパク質の精製法
前述の参照に加えて、EPO 遺伝子を含む組換えCHO細胞の血清非含有発酵を実行することができることがわかっている。このような方法は、例えば、欧州特許公開第EP-A 0 513 738号、欧州特許公開第EP-A 0 267 678号、および一般的な形でKawamoto, T.ら、Analytical Biochem.130:445-453(1983) 、欧州特許公開第EP-A 0 248 656号、Kowar, J.およびFranek, F.、Methods in Enzymology 421:277-292(1986)、Bavister, B.、Expcology 271:45-51(1981)、欧州特許公開第EP-A 0 481 791号、欧州特許公開第EP-A 0 307 247号、欧州特許公開第EP-A 0 343 635号、国際公開公報第88/00967号に開示されている。
【００４４】
欧州特許公開第0 267 678号において、透析後の血清非含有培養中に生成されたEPOの精製について、S-セファロース上でのイオン交換クロマトグラフィー、C8カラム上での分取逆相HPLCおよびゲルろ過クロマトグラフィーが開示されている。この組合せにおいて、ゲルろ過クロマトグラフィー段階は、S-セファロース・ファストフロー上でのイオン交換クロマトグラフィーに置き換えることができる。更に、イオン交換クロマトグラフィーの前に、ブルー・トリスアクリル(Blue Trisacryl)カラム上での色素クロマトグラフィーを行うことができることが提唱されている。
【００４５】
組換えEPOの精製手順は、Nobuo, I. ら、J. Biochem.107:352-359(1990)に記されている。しかしこの方法においては、EPOは、精製段階の前に、Tween（登録商標）20、フェニルメチルスルホニルフルオリド、エチルマレイミド、ペプスタチンA、硫酸銅およびオキサミド酸の溶液によって処理される。
【００４６】
Burgの1996年11月14日に公開された国際公開公報第96/35718号などの多くの参照が、血清非含有発酵法によるエリスロポエチン(EPOsf)の調製法を開示している。ペガレーション（pegylation）のための開始材料などのEPOを製造するためのある方法は、以下で例示的に説明される。
【００４７】
EPO及びEPO接合体の固有の活性の決定のための生物学的アッセイ法
本発明のEPOまたはEPO複合体の比活性は、当該技術分野において公知の様々なアッセイ法により測定することができる。本発明の精製されたEPOタンパク質の生体活性は、ヒト患者への注射によるEPOタンパク質の投与によって、対象の非注射群または対照群と比べて、骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生を増大を引き起こすようなものである。本発明において得られかつ精製されたEPOタンパク質、またはそれらの断片の生体活性は、Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoetin BRP Bio、1997(2)）による方法で試験されうる。
【００４８】
EPOタンパク質の活性を測定するための別の生物学的アッセイ法である、正赤血球性貧血(normocythaemic)マウスアッセイ法については、実施例４に示した。
【００４９】
PEG化EPOを調製するための手順
式1により表されたエリスロポエチン糖タンパク質産物を調製するための手順は、チオール基をEPOに共有結合させる段階（「活性化」）及び、得られる活性化EPOをポリ(エチレングリコール)（PEG）誘導体と結合させる段階を含む。本発明によるPEG化EPOを調製するための第1の段階は、EPOのNH2基を介したチオール基の共有結合を含む。このEPO活性化は、保護されたチオール基及び、例えば、活性エステル（例えば、スクシンイミジルエステル）、無水物、スルホン酸エステル、カルボン酸およびスルホン酸それぞれのハロゲン化物などの更なる反応基とを有する二機能性試薬を用いて行われる。チオール基は、例えばアセチル基など当技術分野で周知の基により保護される。これらの二機能性試薬は、アミド結合を形成することによりアミノ酸であるリジンのξ-アミノ基と反応することができる。反応の第1の段階を以下に示す。
【化３７】
0004190184.tif 000029
EPO、n、およびXは上記で定義された通りであり、Zは、当技術分野で周知の反応基、例えば、式
【化３８】
0004190184.tif 000030
のN-ヒドロキシ-スクシンイミド（NHS）置換基である。
【００５０】
好ましい態様において、リジンε-アミノ基の活性化は、スクシンイミジル部分を有する二機能性試薬との反応により行われる。二機能性試薬は、異なるスペーサー種、例えば-(CH2)k-または-CH2-(O-CH2-CH2-)k-部分を有しうり、式中、kは1〜約10、好ましくは1〜約4であり、より好ましくは1または2、かつ最も好ましくは1である。これらの試薬の例は、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオプオピオネート（SATP）およびN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート（SATA）であり、kは上記で定義された通りである：
【化３９】
0004190184.tif 000031
又は
【化４０】
0004190184.tif 000032
様の
【化４１】
0004190184.tif 000033
；
【化４２】
0004190184.tif 000034
。
【００５１】
二機能性試薬の調製は当技術分野で周知である。2-(アセチルチオ)-(エトキシ)k-酢酸-NHS-エステルの前駆体はDE-3924705に記載されており、一方、アセチルチオ化合物への誘導体化は、マーチ（March）,J.「上級有機化学（Advanced Organic Chemistry）」、マグローヒル（McGraw-Hill）、1977、375-376に記載されている。SATAは市販されている（Molecular Probes、Eugene、OR、USAおよびPierce、Rockford、IL）。
【００５２】
EPO分子に付加されるべきチオール基の数を、反応パラメーター、すなわち、タンパク質（EPO）濃度およびタンパク質/二機能性試薬の比を調節することにより選択することができる。好ましくは、EPO一分子あたり1個〜5個のチオール基、より好ましくはEPO一分子あたり1.5個〜3個のチオール基を共有結合することによりEPOが活性化される。これらの範囲は、EPOタンパク質集団にわたるチオール基の統計的分布を意味する。
【００５３】
反応は、例えば、pH6.5〜8.0の水性緩衝液、例えば10mMリン酸カリウム、50mM NaCl、pH7.3中で行われる。二機能性試薬をDMSOに添加してもよい。反応が完了した後、好ましくは30分後、リジンを添加することにより反応を止める。過剰な二機能性試薬を、当技術分野で周知の方法、例えば透析またはカラム濾過により分離することができる。EPOに付加されるチオール基の平均数を、例えば、グラセティ（Grasetti）,D.R.およびミュレイ（Murray）,J.F.、J.Appl.Biochem.Biotechnol.、119、41-49（1967）に記載の光度測定法（photometric method）により決定することができる。
【００５４】
上記の反応の後に、活性化ポリエチレングリコール（PEG）誘導体を共有結合させる。適切なPEG誘導体は、約20kDa〜約40kDa、より好ましくは約24kDa〜約35kDa、最も好ましくは約30kDaの平均分子量を有する活性化PEG分子である。
【００５５】
活性化PEG誘導体は当技術分野で周知であり、例えば、モルプルゴ（Morpurgo）,M.ら、J.Bioconj.Chem.（1996）7、p363 ffに、PEG-ビニルスルホンについて記載されている。直鎖状および分枝状のPEG種が、式1の化合物の調製に適している。反応性PEG試薬の例は、ヨード-アセチル-メトキシ-PEGおよびメトキシ-PEG-ビニルスルホン：
【化４３】
0004190184.tif 000035
；
又は
【化４４】
0004190184.tif 000036
である。
【００５６】
これらのヨード活性化物質の使用は当技術分野で周知であり、例えば、ハーマンソン（Hermanson）,G.T.「バイオコンジュゲート技術（Bioconjugate Techniques）」、アカデミックプレス（Academic Press）、サンディエゴ（San Diego）（1996）p147〜148に記載されている。
【００５７】
最も好ましくは、PEG種は、メトキシ-PEG-マレイミド（MW30000；Shearwater Polymers社）などの（アルコキシ-PEG-マレイミド）を用いて、マレイミドにより活性化される。アルコキシ-PEG-マレイミドの構造は、以下の通りであり、Rおよびmは上記で定義された通りである：
【化４５】
0004190184.tif 000037
；
又は
【化４６】
0004190184.tif 000038
。
【００５８】
最も好ましい誘導体は、
【化４７】
0004190184.tif 000039
であり、式中、Rおよびmは上記で定義された通りである。
【００５９】
水性緩衝液、例えば10mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA、pH6.2中でチオール保護基がインサイチュで切断された後に、アルコキシ-PEG-マレイミドとの結合反応が起こる。保護基の切断を、例えば、DMSO中で、25℃、pH6.2で約90分間、ヒドロキシルアミンを使用して行うことができる。PEG修飾のために、活性化EPO/アルコキシ-PEG-マレイミドのモル比は、約1：3〜約1：6、好ましくは1：4であるべきである。システインの添加及び、残りのチオール（-SH）基のN-メチルマレイミドまたはジスルフィド結合を形成できる他の適切な化合物との反応により、反応を止めることができる。残りの任意の活性チオール基が、N-メチルマレイミドなどの保護基または他の適切な保護基と反応するために、本発明の接合体におけるEPO糖タンパク質は、このような保護基を含むことができる。一般的に、本明細書に記載された手順により、PEG-マレイミドに結合されなかった糖タンパク質上の活性化チオール基の数に応じて、様々な数の保護基で保護された様々な数のチオールを有する分子の混合物が産生されると考えられる。
【００６０】
PEG化タンパク質上の残りのチオール基をブロック（block）するために使用された場合、N-メチルマレイミドは同じ種類の共有結合を形成するが、ジスルフィド化合物は、分子間スルフィド/ジスルフィド交換反応において、ブロック試薬のジスルフィド架橋結合をもたらすと考えられる。この種類のブロック反応に関して好ましいブロック試薬は、酸化型グルタチオン（GSSG）、システイン、およびシスタミンである。システインを使用するとさらなる正味の電荷はPEG化タンパク質に導入されないが、ブロック試薬GSSGまたはシスタミンを使用すると、さらなる負電荷または正電荷がもたらされる。
【００６１】
一PEG化EPO種、二PEG化EPO種、および三PEG化EPO種の分離を含む、式1の化合物のさらなる精製を、当技術分野で周知の方法、例えばカラムクロマトグラフィーにより行うことができる。
【００６２】
薬学的組成物
本発明に従って調製されたエリスロポエチン糖タンパク質産物を、当技術分野で周知の方法により、薬学的に許容される担体またはビヒクルを伴う注射に適した薬学的組成物に調製することができる。例えば、適切な組成物が、国際公開公報第97/09996号、国際公開公報第97/40850号、国際公開公報第98/58660号、および国際公開公報第99/07401号に記載されている。本発明の産物の製剤化に好ましい薬学的に許容される担体の中には、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物は、例えば132mM塩化ナトリウムなどの張性剤（tonicity agent）を含む10mMリン酸ナトリウム/カリウム緩衝液pH7中で製剤化されうる。任意で、薬学的組成物は保存剤を含んでもよい。薬学的組成物は、例えば10〜1000μg/ml、例えば50μgまたは400μgなど、様々な量のエリスロポエチンを含みうる。
【００６３】
少ないまたは不完全な赤血球産生により特徴付けられる血液疾患の治療
本発明のエリスロポエチン糖タンパク質産物の投与により、ヒトにおける赤血球形成がもたらされる。従って、エリスロポエチン糖タンパク質産物の投与により、赤血球産生に重要な、このEPOタンパク質が補給される。エリスロポエチン糖タンパク質産物を含む薬学的組成物を、少ないまたは不完全な赤血球産生により特徴付けられる血液疾患に、単独で、または症状もしくは疾患の一部として、罹患しているヒト患者に様々な手段で投与するのに有効な強さで処方することができる。皮下注射または静脈内注射などの注射により薬学的組成物を投与することができる。エリスロポエチン糖タンパク質産物の平均的な量は変化してもよく、特に、有資格医師の推奨および処方箋に基づいていなければならない。接合体の正確な量は、治療される症状の正確な種類、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの要因によって決まる、好みの問題である。例えば、0.01〜10μg/kg体重、好ましくは0.1〜1μg/kg体重を、例えば週1回、投与することができる。
【００６４】
本出願の全体にわたって様々な刊行物が参照される。技術の様子をさらに十分に説明するために、これらの刊行物における開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【００６５】
本発明の化合物および組成物の調製を説明する目的のために示されるが、これらに限定されない、以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
【００６６】
実施例
実施例１：ヒトEPOの発酵および精製
a) 接種材料の調製および発酵
EPO-産生CHO細胞株(欧州特許第EP 411 678号(Genetics Institute)において開示されたATCC CRL8695を使用することができる)を起源とする、Working Cell Bankの1種のウイルスを、液体窒素貯蔵タンクの気相から採取した。細胞を、ガラス製の回転フラスコに移し、かつ加湿したC02培養装置中の炭酸水素で緩衝された(hydrogen carbonate-buffered)培地において培養した。接種材料の調製および発酵のために使用した代表的な血清非含有培地は、1992年6月12日に公表されたKochの欧州特許出願第513 738号または1996年11月14日に公表されたBurgの国際公開公報第96/35718号に開示されており、例えば、培地DMEM/F12 (例えば、JRHバイオサイエンス/ハゼルトン・バイオロジックス社(JRH Biosciences/Hazleton Biologics)、デンバー、米国、注文番号57-736)、および更に炭酸水素ナトリウム、L+グルタミン、D+グルコース、組換えインスリン、亜セレン酸ナトリウム、ジアミノブタン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄(II)、アスパラギン、アスパラギン酸、セリンおよび哺乳動物細胞の安定剤、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリデキストラン、ポリエチレングリコール、プルロッニクF68、血漿増量剤ポリゲリン(HEMACCEL（登録商標）)またはポリビニルピロリドン(国際公開公報第96/35718号)を含む。
【００６７】
この培養物を、微生物の混入の有無について顕微鏡でチェックし、細胞密度を決定した。これらの試験は各分離(splitting)段階で行った。
【００６８】
最初の増殖期間の後、細胞培養物を、新鮮な培地で出発時の細胞密度に希釈し、別の増殖サイクルを施した。この手順を、培養容量がガラス製回転フラスコ1個につきおよそ2Ｌになるまで繰り返した。およそ12倍になった後、この培養物1〜5Lを利用し、その後10Lの接種発酵槽への接種材料として使用した。
【００６９】
3〜5日後、10Lの発酵槽中の培養物を、100L接種発酵槽のための接種材料として用いることができた。
【００７０】
更に3〜5日間培養し、100Lの発酵槽中の培養物を、1000Lの生成発酵槽のための接種材料として使用した。
【００７１】
b) 回収および細胞分離
バッチ再供給(refeed)法を用い、すなわち、望ましい細胞密度に到達した時点で培養物の約80%を回収した。残りの培養物に新鮮な培地を再び満たし、かつ次の回収まで培養した。1回の製造の試行は、最大10の連続する回収からなり：これは、9回の部分回収および最終発酵時の1回の全回収であった。回収は、3〜4日毎に行った。
【００７２】
決定した回収容量を、冷却容器に移した。細胞を、遠心またはろ過により除去し、かつ廃棄した。遠心段階のEPO含有上清を、インラインでろ過し、かつ第二の冷却容器に収集した。各回収物を、精製時に個別に処理した。
【００７３】
EPOタンパク質の精製の代表的方法は、1996年11月14日に公表されたBurgの国際公開公報第96/35718号に開示されている。この精製法を、以下に説明する。
【００７４】
a) ブルーセファロースクロマトグラフィー
ブルーセファロース（ファルマシア社）は、表面にシバクロンブルー色素が共有結合したセファロースビーズからなる。EPOは、ほとんどの非タンパク質性混入物、いくつかのタンパク質性不純物およびPVAよりも、ブルーセファロースに強力に結合するので、EPOはこの段階で濃縮することができる。ブルーセファロースカラムの溶離は、塩濃度に加えpHを上昇することで行った。
【００７５】
カラムにブルーセファロース80〜100Lを充填し、NaOHで再生し、かつ平衡緩衝液(塩化ナトリウム/塩化カルシウムおよび酢酸ナトリウム)で平衡化した。酸性化され、かつろ過した発酵槽上清を負荷した。負荷が完了した後、カラムをまずより高い塩化ナトリウム濃度を有する平衡緩衝液に類似の緩衝液で洗浄し、引き続きTrisに基づく緩衝液で洗浄した。生成物を、Trisに基づく緩衝液で溶離し、主要な溶離プロフィールに従って単一の画分中に回収した。
【００７６】
b) ブチルトヨパールクロマトグラフィー
ブチルトヨパール(Butyl Toyopearl)650 C (TOSOハス社) は、脂肪族ブチル残基が共有結合したポリスチレンを主成分にしたマトリックスである。EPOは、このゲルにほとんどの不純物およびPVAよりもより強力に結合するので、これはイソプロパノールを含有する緩衝液で溶離しなければならない。
【００７７】
カラムに、ブチルトヨパール650 Cの30〜40Lを充填し、 NaOHで再生し、Trisに基づく緩衝液で洗浄し、かつイソプロパノールを含有するTrisに基づく緩衝液で平衡化した。
【００７８】
ブルーセファロース溶離液を、カラム平衡化緩衝液中のイソプロパノール濃度に調節し、カラムに負荷した。その後、このカラムを、イソプロパノールの濃度を漸増しながら平衡緩衝液で洗浄した。生成物を、溶離緩衝液（高イソプロパノール含量のTrisに基づく緩衝液）で溶離し、主要な溶離プロフィールに従って単一の画分中に回収した。
【００７９】
c)ヒドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトウルトロゲル(バイオスペラ社)は、力学的特性を向上するためにアガロースマトリックスに組込まれたヒドロキシアパタイトからなる。EPO は、ヒドロキシアパタイトに対する親和性が低く、その結果タンパク質不純物よりもより低いリン酸濃度で溶離することができる。
【００８０】
このカラムにヒドロキシアパタイトウルトロゲル30〜40Lを充填し、リン酸カリウム/塩化カルシウム緩衝液およびNaOHで再生し、その後Trisに基づく緩衝液で再生した。その後、少量のイソプロパノールおよび塩化ナトリウムを含有するTrisに基づく緩衝液で平衡化した。
【００８１】
ブチルトヨパノールクロマトグラフィーのEPO含有溶離液を、カラムに負荷した。引き続き、カラムを平衡緩衝液で洗浄し、イソプロパノールおよび塩化ナトリウムを含まないTrisに基づく緩衝液で洗浄した。生成物を、低濃度のリン酸カリウムを含有するTrisに基づく緩衝液で溶離し、主要な溶離曲線（elutiogram）に従って単一の画分中に収集した。
【００８２】
d)Vydac C4上での逆相HPLC
RP-HPLC材料Vydac C4 (Vydac社)は、シリカゲル粒子からなり、その表面にC4-アルキル鎖を保持している。タンパク質性不純物からのEPOの分離は、疎水性相互作用の強度の様々な差を基にしている。溶離は、希釈したトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて行った。
【００８３】
分取HPLCは、ステンレス鋼製のカラム(2.8〜3.2LのVydac C4シリカゲルを充填した)を用いて行った。ヒドロキシアパタイトウルトロゲルの溶離液を、トリフルオロ酢酸を添加することにより酸性とし、Vydac C4カラムに負荷した。洗浄および溶離のために、希釈したトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いた。画分を回収し、かつリン酸緩衝液で迅速に中和した。IPC限界内の EPO画分をプールした。
【００８４】
e) DEAEセファロースクロマトグラフィー
DEAEセファロース(ファルマシア社)物質は、セファロースビーズの表面に共有結合したジメチルアミノエチル(DEAE)基からなる。EPOのDEAE基への結合は、イオン相互作用により媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されずに、カラムを通過した。これらの物質を洗浄除去した後、微量の不純物を、カラムを低pHの酢酸緩衝液で洗浄することによって除去した。その後、カラムを中性リン酸緩衝液で洗浄し、かつイオン強度を増大した緩衝液でEPOを溶離した。
【００８５】
カラムにDEAEセファロース・ファストフローを充填した。カラム容量を、EPO負荷が、3〜10mg EPO/mlゲルの範囲に確実に納まるように調節した。カラムを水および平衡緩衝液(リン酸ナトリウム/リン酸カリウム)で洗浄した。HPLC溶離液のプールした画分を負荷し、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。その後、カラムを洗浄緩衝液(酢酸ナトリウム緩衝液)で洗浄し、その後平衡緩衝液で洗浄した。引き続き、EPOを、溶離緩衝液(塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム/リン酸カリウム)でカラムから溶離し、かつ主要な溶離プロフィールに従って単一の画分中に回収した。
【００８６】
DEAEセファロースカラムの溶離液は、特定の伝導度に調節した。得られる医薬物質は、テフロン瓶中に滅菌ろ過し、-70℃で保管した。
【００８７】
実施例2：EPOへのチオール基の共有結合
本実施例は、チオール基をEPOに共有結合するための反応条件の決定を開示する。条件を決定するために、様々な量の、ブロックされたチオール基を含む試薬、ここではSATAまたはSATP（DMSOに10mg/mlまで溶解）を、EPO溶液、ここでは10mMリン酸カリウム、50mM NaCl（pH7.3）中の5mg/ml EPO 1mlに添加した。反応物を約30分間（25℃）攪拌し、1Mリジン溶液を10mMで添加することにより反応を止めた。余分な量のSATAおよびSATPを、10mMリン酸カリウム、50mM NaCl、および2mM EDTA pH6.2に対する透析により除去した。ヒドロキシルアミンを用いて保護アセチル基を除去した後、EPOに共有結合したチオール基の数を、グラセティ（Grasetti）,D.R.およびミュレイ（Murray）,J.F.、J.Appl.Biochem.Biotechnol.119、p41〜49（1967）に記載の方法に従いジチオジピリジンを使用して光度測定的に決定した。
【００８８】
EPO一分子あたり共有結合したチオール基の数を以下に示す。
【表１】
0004190184.tif 000040
【００８９】
実施例3：メトキシ-PEG-マレイミドを用いた活性化EPOの修飾
A）EPOの活性化：
実施例1により産生された100mgのEPO（190,000IU/mg、正赤血球性貧血マウスアッセイ法により決定した）を、実施例2に従ってSATAを用いて活性化した（モル比：EPO/SATA＝1/5）。ブロックされ、共有結合されたチオール基を有する、得られたEPO（「活性化EPO」）を、実施例1に記載の透析により、N-ヒドロキシ-スクシンイミドのような副産物または反応しなかったSATAから分離した。10mMリン酸カリウム、50mM NaCl、および2mM EDTA（pH6.2）に溶解した4.5mg/ml活性化EPOの溶液を得た。
【００９０】
B）活性化EPOのPEG化：
上記で説明した「最も好ましい」構造を有する、380mgのメトキシ-PEG-マレイミド（MW30,000；Shearwater Polymers社、Huntsville（Alabama、USA））を、95mg活性化EPO（10mMリン酸カリウム、50mM NaCl、および2mM EDTA pH6.2中で4.5mg/ml）を含む上記の溶液中に溶解させた。溶液中の活性化EPOとメトキシ-PEG-マレイミド間の得られたモル比は1：4であった。上記の溶液に1Mヒドロキシルアミン水溶液を30mM pH6.2まで添加することにより、活性化EPOの、共有結合しされブロックされたチオール基を脱ブロック（de-blocked）した。溶液の反応混合物中の、得られた活性化EPOは、遊離チオール（-SH）基を含んでいた。チオール基の脱ブロックの直後に、遊離チオール（-SH）基を含む活性化EPOとメトキシ-PEG-マレイミドとの結合反応を90分間（25℃で攪拌しながら）行った。反応混合物に0.2Mシステイン水溶液を2mMまで添加することにより、結合反応を止めた。30分後、DMSOに溶解した0.5M N-メチルマレイミド溶液を5mMの濃度に達するように添加することにより、メトキシ-PEG-マレイミドと反応しなかった活性化EPOの余分な遊離チオール基をブロックした。30分後、PEG化EPO種を含む、得られた反応混合物を、10mMリン酸カリウムpH7.5に対して15時間以上透析した。
【００９１】
C）PEG化EPO種の精製
反応混合物からPEG化EPO種を分離するために、以下の精製手順を行った。50ml Q-Sepharose ffカラムを、10mMリン酸カリウムpH7.5で平衡化した。段階B)で得られた反応混合物をカラムにロードした（流速：1時間あたり3カラム体積（CV））。反応しなかったメトキシ-PEG-マレイミド試薬を分離するために、5CVの10mMリン酸カリウムpH7.5で、カラムを洗浄した。5CVの緩衝液A（10mMリン酸カリウムpH7.5）及び5CVの緩衝液B（10mMリン酸カリウム、500mM NaCl pH7.5）からなる漸増塩勾配（increasing salt gradient）を用いて3CV/時間の流速で溶出することにより、PEG化EPO種を分離した。NaCl勾配に基づいて、PEG化EPO種（三PEG化EPO種、二PEG化EPO種、および一PEG化EPO種）が最初に溶出され、続いて、PEG化されていないEPO種が溶出された。PEG化EPO種（三PEG化EPO種、二PEG化EPO種、および一PEG化EPO種）を含む溶出液の画分をプールし、濾過した（0.2μmフィルターを用いた滅菌濾過）。
【００９２】
三PEG化EPO種、二PEG化EPO種、および一PEG化EPO種の含有量および純度を、クマシー染色したSDS-PAAゲル（Laemmli、Nature 277、680-685（1970））により評価し、一方タンパク質濃度を、ベール・ランバートの法則に従って280nmで測定した。SDS-PAA電気泳動により決定されたEPO種の見かけの分子量は、約68kDa（一PEG化EPO種）、約98kDa（二PEG化EPO種）、および約128kDa（三PEG化EPO種）であった。
【００９３】
三PEG化EPO種、二PEG化EPO種、および一PEG化EPO種を、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex、pg200；Pharmacia）によりさらに分離することができる。
【００９４】
三PEG化EPO種、二PEG化EPO種、および一PEG化EPO種を含む溶出液のインビボ生体活性を、実施例4に記載の方法により決定した。
【００９５】
実施例４：正赤血球性貧血マウスアッセイ法によって測定したPEG化されたEPOのインビボ活性
正赤血球性貧血マウスのバイオアッセイ法は当該技術分野において(Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))、およびPh. Eur. BRP.のエリスロポエチン専門書の方法として公知である。試料を、BSA-PBSに希釈する。7〜15週齢の通常の健常マウスに、実施例２に記載された、三PEG化EPO、二PEG化EPO、および一PEG化EPOを含有するEPO画分0.2 mlを皮下(s.c.)投与する。投与後72時間から始まる4日間にわたって、尾静脈の穿刺により採血し、0.15μmolアクリジンオレンジ染色液1ml中に、血液1μLが存在するように希釈する。染色時間は3〜10分である。フローサイトメーターにおいて赤色蛍光のヒストグラムを分析することにより、微量蛍光定量法的に網状赤血球のカウントを行う。網状赤血球の数は、絶対数(absolute figures) (分析した血球30,000個あたり)により与えられる。提示されたデータに関して、各群は、マウス5匹/日からなり、これらのマウスは1回のみ採血された。
【００９６】
実施例3によりメトキシ-PEG-マレイミドが結合したEPO、未修飾EPO、および緩衝液をマウスに投与した。結果を図3に示す。マウスあたり同じ用量を使用し、網状赤血球の量が有意に増加し、網状赤血球の最大数がシフトしたことから分かるように、結果は、PEG化EPO種の優れた活性及び延長された半減期を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトEPOの一次構造（165アミノ酸）を示す。
【図２】  ヒトEPOの一次構造（166アミノ酸）を示す。
【図３】  正赤血球性貧血マウスアッセイ法により測定されたPEG化EPOのインビボ活性を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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