(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0004118357.tif 000008
［式中、Ｒは炭素数４〜２０の直鎖または分枝状アルキルである］
で示されるＡＭＰアルキルエステル誘導体を有効成分とする分化誘導剤。
【請求項２】
Ｒが、オクチル、ドデシルまたはヘキサデシルである、請求項１記載の分化誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はＡＭＰアルキルエステル誘導体の製造方法およびＡＭＰアルキルエステル誘導体を有効成分とする分化誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ＡＭＰ(アデノシン一リン酸)がリン酸二つと結合してＡＴＰ(アデノシン三リン酸)となり、細胞内情報伝達系の一端を担う蛋白質リン酸化反応の基質となったり、ＡＭＰ自体が３',５'−環状エステルである、ｃＡＭＰ(cyclic  ＡＭＰ)になり生体内のホルモン作用の仲介に働くことが知られていることから、そのＡＭＰアナログを合成しようとした。その際、酵母などに外からＡＭＰをあたえても、細胞内に取り込まれないため、長鎖のアルキル基を結合させることで外から与えても細胞内に取り込まれるようなＡＭＰの誘導体の合成を試みた。
【０００３】
ＡＭＰのリン酸基に疎水性の強い長鎖のアルキル基を結合させ、細胞膜透過性を向上させたＡＭＰ誘導体(ＡＭＰＣ８、ＡＭＰＣ１２、ＡＭＰＣ１６)を合成した。これらのＡＭＰ誘導体について、分化誘導活性を調べたところ、優れた分化誘導活性を有することが判明した。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
【０００４】
ＡＭＰの誘導体の合成については、ＴＭＰ(チミジン一リン酸)のリン酸基にグルコースの六位炭素の水酸基が結合したリン酸２−エステル化合物と長鎖のハロゲン化アルキルの求核置換反応を用いてリン酸３−エステル化合物を合成する反応が知られているが、本発明の製造方法は１段階で反応が終了するという非常に簡便なものである。
【０００５】
当初ＡＭＰ誘導体を合成するためにＤＣＣ(dicyclohexylcarbodiimido)を縮合剤として用いて、ＡＭＰと直鎖高級アルコール(オクタノール、ドデカノール、ヘキサデカノール)を反応させていた。この方法で合成を行うとＡＭＰ誘導体も合成されてくるが、同時に極性の良く似た副生成物も生じることが判明し、合成はできるが精製に数段階のステップを必要とし手間が掛かかる。そこでＤＣＣなどの縮合剤を用いずにＡＭＰのリン酸基にアルキル基を結合できる方法を検索し、ハロゲン化アルキルの反応を用いるようになった。この反応の利点は、極性の良く似た副生成物が生じにくいことである。
【０００６】
分化誘導活性については、１９８８年に、腫瘍細胞が前骨髄球の段階で分化が停止した急性前骨髄球性白血病に対して、オールトランスレチノイン酸が緩解をもたらしたと報告され(Huangら、Blood，72, 567-572(1988))、またビタミンＤ3の生理活性代謝物である１α,２５−ジヒドロキシコレカルシフェノールがヒト・リンパ腫培養細胞系において分化誘導作用を有するとの報告がある(Olssonら、Cancer Res.，43(12pt1),5862-5867(1983))。さらに、マウス骨髄球性白血病の培養細胞系を用いて、ゲラニル・ファルネソール(３,７,１１,１５,１９−ペンタメチル−２,６,１０,１４,１８−エイコサペンタエン−１−オール)が分化誘導作用を有することが報告された(石倉ら、Leukemia Res.，8(5),843-852(1984))。さらに、ブファリン(Bufalin)がヒト白血病細胞の培養細胞系であるHL60、U937およびML1において分化誘導作用を示したことが報告された(Zhangら、Biochem.Biopys.Res.Commun.，178(2),686-693(1991)およびCancer Res.52(17)，4634-4641(1992))。なおまた、上記以外にも分化誘導作用を有する化合物として、シトシン・アラビノシド(Ara-C)(Baccaraniら、Br.J.Haematol.，42,485-487(1979))、アクラシノマインＡ(Morinら、Cancer Res.，44,2807-2812(1991))、インターフェロン−α(森屋ら、臨床血液32,170-172(1991))、五環式トリテルペノイド化合物(特開平４−５００２０９号(1992))、植物活性配糖体であるコレチニンＣ(特開平１−１４９１３３(1992))、ブファジェノリド型分化誘導剤(特開平５−２０１８６８号(1993))、２６,２７−ジメチル−△２２−１α,２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール(特開平６−１７９６２２号(1994))、ゲラニル・ゲラニルアセトン(６,１０,１４,１８−テトラメチル−５,９,１３,１７−ノナデカテトラエン−２−オン)(特開平６−１９２０７３号(1994))、ビタミンＤ−２２−フェニルスルホン誘導体(特開平７−４８３４３号(1995))などが報告された。しかし、ＡＭＰ誘導体に細胞分化誘導活性があるとの報告は未だなされていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の態様は、式Ｉ：
【化３】
0004118357.tif 000002
［式中、Ｒは炭素数４〜２０の直鎖または分枝状アルキルである］
で示されるＡＭＰアルキルエステル誘導体の製造方法であって、有機溶媒中１−ブロモアルカンとＡＭＰを反応させることを特徴とする方法である。好ましくは、この方法は(Ｃ4Ｈ9)4Ｎ+の存在下で行われる。
【０００８】
本発明の第２の態様は、式Ｉ：
【化４】
0004118357.tif 000003
［式中、Ｒは炭素数４〜２０の直鎖または分枝状アルキルである］
で示されるＡＭＰアルキルエステル誘導体を有効成分とする分化誘導剤であり、好ましくは、Ｒが、オクチル、ドデシルまたはヘキサデシルである。
なお、本発明のＡＭＰアルキルエステル誘導体には一般に生体内において実質的に同様の生理活性または薬理活性を発揮するもの、例えば、本発明の化合物の誘導体および医薬的に許容される塩、付加塩、水和物などは本発明の技術的範囲に含まれるものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
炭素数４〜２０の直鎖または分枝状アルキルは、具体的には、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、エイコシルなどの直鎖またはゲラニル、ファルネシルなどの分枝状のアルキルをいう。好ましくはヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシルであり、より好ましくは、オクチル、ドデシルまたはヘキサデシルであり、最も好ましくは、それらの直鎖状のものである。
【００１０】
本発明のＡＭＰアルキルエステル誘導体は一般にＡＭＰ(アデノシン ５'−モノホスフェート)を(Ｃ4Ｈ9)4Ｎ+溶液(ＴＢＡ；テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液)に溶解し、中和、脱水、乾固した後、有機溶媒中種々のハロゲン化アルキルを反応させて得られる。
【００１１】
有機溶媒の例としては、ジメチルホルムアルデヒド、ジメチルアセトアミド、などの極性溶媒またはアセトニトリルなどの透電率の高い不活性溶媒を挙げることができ、好ましくは、ジメチルアセトアミド、アセトニトリルであり、最も好ましくは、ジメチルアセトアミドである。
【００１２】
上記の反応は、ＡＭＰをエチル、プロピル、ブチルなどの低級アルキル第４級アンモニウムヒドロキシドの水溶液に溶解し、中和、脱水、乾固してＡＭＰとテトラ低級アルキルアンモニウム塩を形成させて行う。
【００１３】
また、上記の反応は６０℃〜１００℃、好ましくは、７０℃〜９０℃、最も好ましくは、約８０℃にて行う。
【００１４】
反応時間は２〜１８時間であり、反応時間が長くなると目的生成物も増加するが副産物も増加してくる。従って、好ましくは、２〜６時間である。より好ましくは、約４時間である。
【００１５】
ハロゲン化アルキルのハロゲンとしては、ふっ素、塩素、臭素およびよう素が含まれる。好ましくは臭素またはよう素であり、最も好ましくは、臭素である。
【００１６】
例えば、ＡＭＰＣ８、ＡＭＰＣ１２およびＡＭＰＣ１６はＡＭＰ(アデノシン ５'−モノホスフェート)をテトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液に溶解し、ジメチルアセトアミド中で１−ブロモオクタン(Ｃ８)、１−ブロモドデカン(Ｃ１２)、１−ブロモヘキサデカン(Ｃ１６)などを反応させて得られる。これらの化合物の単離精製操作を下記に示す。
【化５】
0004118357.tif 000004
【００１７】
単離精製したＡＭＰＣ８、ＡＭＰＣ１２及びＡＭＰＣ１６について種々の機器分析を用い、その構造決定を行った。始めに1Ｈ、13ＣＮＭＲにより、ＡＭＰのリン酸基に長鎖のアルキル基がエステル結合したものであることが決定された。次に元素分析を行ったところ、それぞれのＡＭＰ誘導体について、一水和物の形をとったときの理論値が非常に実測値と相同性があったため先の構造を強く支持するものであると考察された。これらの機器分析により決定されたＡＭＰＣ８、ＡＭＰＣ１２及びＡＭＰＣ１６についての構造を下記に示す。
【化６】
0004118357.tif 000005
【００１８】
【実施例】
実施例１
ＡＭＰ誘導体(ＡＭＰＣ８)の合成
ＡＭＰ(アデノシン ５'−モノホスフェート；８００μmol：２７８mg)を(Ｃ4Ｈ9)4Ｎ+溶液(ＴＢＡ；テトラブチルアンモニウム４０％水溶液；１.６mmol：９００μl)に溶解し、中和した。減圧下に脱水し、デシケーター中、Ｐ2Ｏ5存在下で乾固した。生じたＡＭＰテトラブチルアンモニウム塩を１−ブロモオクタン(４.０mmol；８００μｌ)とともに溶媒のジメチルアセトアミド（１０ml）に溶解し、８０℃で４時間反応させた。反応終了後、反応液にＣ6Ｈ14／（ＣＨ3）2ＣＯ（１：１、v/v）の溶液を約６０ml加え、アンモニアでpＨを８に調節し、−２０℃で一晩放置した。生じた沈澱を遠心分離で集め、同溶液でさらに２回洗浄することによってジメチルアセトアミドおよび１−ブロモオクタンを可及的に除去した。沈澱をＣＨＣl3／ＭeＯＨ（９０：１０）の溶液に溶解し、同溶液で十分に平衡化したシリカゲルカラム（Ｗakogel（登録商標）Ｃ２００）によるクロマトグラフィーに供した。カラムを同溶液１５０ml程度で洗浄し、次いで、溶媒中のＭeＯＨ濃度をＣＨＣl3／ＭeＯＨ（８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６０：４０）と段階的に上げていき副生成物と目的物を分離した。ＣＨＣl3／ＭeＯＨ（７０：３０）の画分を集め、ロータリーエバポレーターを用いて減圧乾燥した結果、白色の粉末が得られた。その粉末を５０％ＭeＯＨに溶解し、その溶液中に陰イオン交換樹脂（Ａmberlite（登録商標）ＩＲ−１２０）を加えて脱塩した。この溶液を減圧下に乾燥した結果、白色の粉末としてＡＭＰＣ８が得られた。ＡＭＰＣ８の収率は１６.５％であった。
【００１９】
元素分析値（１水和物として）
計算値：  Ｃ；４５.２８    Ｈ；６.７０    Ｎ；１４.６７
測定値：  Ｃ；４７.３１    Ｈ；７.６８    Ｎ；１４.０７
1Ｈ ＮＭＲ（DMSO−d6，ppm）：８.３９（s，adenine ring ２−Ｈ）；５.９１（d，Ｊ＝５.５，１'−ＣＨ）；４.５７（t，Ｊ＝５.２，２’−ＣＨ）；４.２３（br，Ｊ＝４.９，３'−ＣＨ）；４.０３（br，Ｊ＝３.７，４'−ＣＨ）；３.８７（m，２Ｈ，５'−ＣＨ）；３.６４（q，２Ｈ，Ｊ＝６.７，ＣＨ2−Ｏ−Ｐ）；１.２１−１.２４（ＣＨ2）；０.８３（t，３Ｈ，Ｊ＝６.７，ＣＨ3）
13Ｃ ＮＭＲの測定値を表１に示す。
【００２０】
実施例２
ＡＭＰＣ１２の合成
１−ブロモオクタン８００μｌを用いる代わりに、１−ブロモドデカン１ｍｌ(４.０mmol)を用いて、実施例１と同様にして行った。ＡＭＰＣ１２の収率は１７.５％であった。
【００２１】
元素分析値（１水和物として）
計算値：   Ｃ；４９.５３    Ｈ；７.５０    Ｎ；１３.１３
測定値：  Ｃ；５０.３１    Ｈ；７.５１    Ｎ；１１.８９
1Ｈ ＮＭＲ（DMSO−d6，ppm）：８.３８（s，adenine ring ２−Ｈ）；５.９２（d，Ｊ＝５.２，１'−ＣＨ）；４.５７（t，Ｊ＝５.２，２’−ＣＨ）；４.２３（brt，Ｊ＝４.９，３'−ＣＨ）；４.０３（brq，Ｊ＝３.７，４'−ＣＨ）；３.８７（m，２Ｈ，５'−ＣＨ）；３.６５（q，２Ｈ，Ｊ＝６.７，ＣＨ2−Ｏ−Ｐ）；１.２１−１.２４（ＣＨ2）；０.８５（t，３Ｈ，Ｊ＝６.７，ＣＨ3）
13Ｃ ＮＭＲの測定値を表１に示す。
【００２２】
実施例３
ＡＭＰＣ１６の合成
１−ブロモオクタン８００μｌを用いる代わりに、１−ブロモヘキサデカン１.２２ｍｌ(４.０mmol)を用いて、実施例１と同様にして行った。ＡＭＰＣ１６の収率は２０.７％であった。
【００２３】
元素分析値（１水和物として）
計算値：  Ｃ；５２.９７    Ｈ；８.１５    Ｎ；１１.８８
測定値：  Ｃ；５２.５１    Ｈ；８.５３    Ｎ；１２.２６
1Ｈ ＮＭＲの測定値を図１に示す。
13Ｃ ＮＭＲのチャートを図２に示す。
13Ｃ ＮＭＲの測定値を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0004118357.tif 000006
【００２５】
薬理学的実験
アデノシン一リン酸(ＡＭＰ)のリン酸基に疎水性の強い長鎖のアルキル基を結合させることで、細胞膜透過性を向上させたＡＭＰ誘導体(ＡＭＰＣ８、ＡＭＰＣ１２、ＡＭＰＣ１６)について、細胞障害性及び分化誘導活性を調べた。
材料
１.細胞
ヒト骨髄性白血病細胞(ＨＬ−６０)
２.薬剤
ＡＭＰＣ８、ＡＭＰＣ１２、ＡＭＰＣ１６
３.主な試薬及び機器
１)ＲＰＭＩ１６４０培地(ギブコ製)
２)牛胎児血清(ＦＣＳ)(和光純薬製)
３)アラマブルー(岩城硝子製)
４)ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)(和光純薬製)
５)ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート(ＴＰＡ)(和光純薬製)
６)ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)(和光純薬製)
７)サイトフロー２３００(Fluorescence Measurement System)(ミリポア製)
【００２６】
測定方法
１.細胞毒性
１)ＨＬ−６０細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養後、９６ウェルマイクロプレートに１×１０４細胞／ｍｌの濃度で２００μｌずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター(５％ＣＯ２、３７℃)で３日間前培養した。
２)ＡＭＰ誘導体は、ＤＭＳＯにて２０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、冷蔵保存していたものをメタノールで希釈し、１ウェルあたり５μｌ添加した。メタノールのみを同様に添加したウェルをコントロールとした。
３)ＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。
４)アラマブルーを１ウェルあたり２０μｌ添加し、ＣＯ２インキュベーター内に３時間放置した。
５)サイトフロー２３００により、励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて蛍光を測定した。コントロールウェルの蛍光強度を１００とした時の薬剤を添加したウェルの蛍光強度の比を細胞の生存率(％)とした。
【００２７】
２.分化誘導活性
ＨＬ−６０細胞の分化誘導の主なマーカーとしては、形態、貧食能、ＮＢＴ還元能、エステラーゼ活性などが知られている。今回の実験では、これらのうち、形態とＮＢＴ還元能を指標とした。ＮＢＴは、分化した細胞において、主としてスーパーオキシド産生オキシダーゼの作用により、ＮＡＤＰＨ由来の水素を受容した難溶性青紫色のホルマザンとなり、酵素活性の発現した細胞の部位に沈着し、顕微鏡下で観察が可能となる。
なお、今回の実験では、ＨＬ−６０細胞の分化誘導剤(陽性コントロール)としてＤＭＳＯを用いたが、ＤＭＳＯは、ＨＬ−６０細胞を顆粒球様細胞へと分化誘導することが知られている。
１)細胞毒性の測定と同じ条件で、ＨＬ−６０細胞を９６ウェルマイクロプレートで３日間前培養した。
２)ＡＭＰ誘導体をメタノールで希釈し、１ウェルあたり５μｌ添加した。陽性コントロールとして、ＤＭＳＯを１８０ｍＭの濃度となるように、また、陰性コントロールとしてメタノールを５μｌ添加した。
３)ＣＯ２インキュベーターで４〜５日培養後、顕微鏡で形態の変化を観察した。
４)細胞を懸濁してエッペンドルフチューブに移し、１，０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離を行い、上清を除去した。ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌに再懸濁し、遠心分離後、上清を除去した。この操作を２回繰り返し、細胞を洗浄した。
５)１ｍｇ／ｍｌＮＢＴ、０.１μｇ／ｍｌＴＰＡを含む２０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地０.５ｍｌに細胞を懸濁し、３７℃で３０分間反応させた。
６)遠心分離で細胞を回収し、少量のＰＢＳに懸濁したものをスライドガラス上で十分乾燥させた。
７)スライドガラスをメタノールに２〜３分浸して細胞を固定し、顕微鏡下で青紫色に染まった細胞数を計測して、ＮＢＴ還元能とした。
【００２８】
結果
１.細胞毒性
結果を図３に示した。これらの化合物のＩＣ50(μｇ／ｍｌ)は、それぞれ、ＡＭＰＣ８：３２０.６、ＡＭＰＣ１２：１８４.３およびＡＭＰＣ１６：５８.２であった。
ＡＭＰ誘導体のＨＬ−６０細胞に対する毒性は低く、ＡＭＰＣ８は２００μｇ／ｍｌ以下、ＡＭＰＣ１２は１５０μｇ／ｍｌ以下、ＡＭＰＣ１６は２５μｇ／ｍｌ以下の濃度で１００％の生存率を示した。アルキル基の長鎖が長いほど毒性が増大する傾向が見られた。
【００２９】
２.分化誘導活性
結果を下記の表に示した。ＤＭＳＯを１８０ｍＭ添加した陽性コントロールでは、ＮＢＴ還元能陽性細胞数は８４.５％あった。ＡＭＰＣ８を添加した時のＮＢＴ還元能陽性細胞数は、薬物濃度５０〜１５０μｇ／ｍｌの範囲において薬物濃度の上昇に伴って増加し、１５０μｇ／ｍｌの濃度では９３.５％となり、この付近の濃度においてＡＭＰＣ８が分化誘導活性を持つことが示された。ＡＭＰＣ１２では７５〜１５０μｇ／ｍｌの濃度において４２.５〜８１.１％の細胞が、ＡＭＰＣ１６では３０〜５０μｇ／ｍｌの濃度において５７.４〜７１.７％の細胞がＮＢＴ還元活性を有しており、ＡＭＰＣ１２、ＡＭＰＣ１６もＨＬ−６０細胞に対する分化誘導活性を持つことが示された。
【００３０】
【表２】
0004118357.tif 000007
【００３１】
ＡＭＰ誘導体がＨＬ−６０細胞に対して分化誘導活性を示す薬物濃度は、アルキル基の長鎖が短い誘導体、即ち、ＨＬ−６０細胞に対する毒性が低いものほど高く、活性を示す濃度の範囲も広くなる傾向にあった。また、ＡＭＰ誘導体のＥＤ50値を比較したところ、ＡＭＰＣ８：８４.７μｇ／ｍｌ、ＡＭＰＣ１２：７８.１μｇ／ｍｌおよびＡＭＰＣ１６：２８.８μｇ／ｍｌであった。
ＡＭＰ誘導体の添加によりＮＢＴ還元活性を示した細胞の形態は、陽性コントロール同様、未処理の細胞に比較して変化が認められた。
【００３２】
以上のように、ＡＭＰＣ８、ＡＭＰＣ１２、ＡＭＰＣ１６は、ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０を顆粒球様細胞へと分化誘導する活性を有することが判明した。更に、ＡＭＰ及びアデノシンについても同様の方法で分化誘導活性の有無を検討した。その結果、ＡＭＰでは、５０μｇ／ｍｌの濃度で最大値となり２５.８％の細胞が、アデノシンでは、２００μｇ／ｍｌの濃度で最大値となり１６.７％の細胞がＮＢＴ還元活性を示した。しかし、その値は、ＡＭＰ誘導体に比較してかなり低いものであったことから、ＡＭＰのリン酸基に長鎖のアルキル基を導入することで、ＨＬ−６０細胞に対する分化誘導活性が付与されるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＡＭＰＣ１６の1Ｈ ＮＭＲの帰属を示す図である。
【図２】  ＡＭＰＣ１６の13Ｃ ＮＭＲのチャートである。
【図３】  ＨＬ−６０細胞の生存率に対するＡＭＰ誘導体の効果を示す折れ線グラフである。
【図１】
0004118357.tif 000009
【図２】
0004118357.tif 000010
【図３】
0004118357.tif 000011