(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）２．５〜１１グラム／リットルの濃度である、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸の誘導体、およびそれらの組合せから選ばれた第１の化合物と；
ｂ）イミダゾール、イミダゾール誘導体、およびそれらの組合せから選ばれた第２の化合物と；
ｃ）アルカリ金属塩化物と；
ｄ）酒石酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびピルビン酸塩、および、それらの組合せから選ばれた有機酸のアルカリ金属塩、およびアルカリ金属硫酸塩から選ばれた第３の化合物とを含み；
該第１の化合物および第２の化合物が、１２．８℃〜４０．５℃の温度範囲にわたる再現性あるヘモグロビンおよび細胞体積測定を与えるために有効な量で存在し；且つ、前記希釈剤は、それが血液細胞体積を安定化させて、中性のｐＨを有するように等張性で、電流を流すことができる電解質である；
血液試料中の赤血球、白血球、血小板、およびヘモグロビン濃度分析に有用な、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジンを含まない多目的血液希釈剤。
【請求項２】
前記イミダゾール誘導体が、フェニルイミダゾール、メチルイミダゾール、エチルイミダゾールおよび、ブチルイミダゾールから選ばれる請求項１の希釈剤。
【請求項３】
前記希釈剤が、更に細胞安定化剤を含む請求項１の希釈剤。
【請求項４】
前記希釈剤が、０．５重量％未満の濃度の保存剤組成を更に含む請求項１の希釈剤。
【請求項５】
前記希釈剤が、血小板凝集を防ぐために有効な量で更に細胞安定化剤を含む請求項４の希釈剤。
【請求項６】
前記細胞安定化剤が、４−アミノ安息香酸エステル、およびその誘導体である請求項５の希釈剤。
【請求項７】
前記保存剤組成が、ｎ−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（１，３−ジヒドロキシメチル−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）−Ｎ’−（ヒドロキシメチル）尿素；２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと５−クロロ―２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン；およびそれらの組合せである請求項４の希釈剤。
【請求項８】
前記希釈剤が、２５０〜３８０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度を有する請求項１の希釈剤。
【請求項９】
前記希釈剤が６．５〜７．６のｐＨを有する請求項１の希釈剤。
【請求項１０】
ａ）血液細胞を含む血液試料を多目的血液希釈剤と混合し、
ｂ）前記希釈された血液試料を分析して、血液細胞の少くとも１つの物理的なパラメータを計測する方法であって；
その希釈剤が、ｉ）２．５〜１１グラム／リットルの濃度である、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸の誘導体、および、それらの組合せから選ばれた第１の化合物と；
ii) イミダゾール、イミダゾール誘導体、および、それらの組合せから選ばれた第２の化合物と；
iii ）アルカリ金属塩化物と；
iv）酒石酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびピルビン酸塩、および、それらの組合せから選ばれた有機酸のアルカリ金属塩、およびアルカリ金属硫酸塩から選ばれた第３の化合物とを含み；
前記希釈剤はヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジンを含まず；該第１の化合物および第２の化合物は、１２．８℃〜４０．５℃の温度範囲にわたって再現性あるヘモグロビンおよび細胞体積測定を与えるために有効な量で含有され；且つ、前記希釈剤が、それが血液細胞体積を安定化させて、中性のｐＨを有するように等張性で、電流を流すことができる電解質である；
血液細胞を含む血液試料を分析するための方法。
【請求項１１】
前記血液細胞が赤血球を含む請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記希釈した血液試料を細胞溶解性の試薬と混合して、その希釈した血液試料の前記分析に先行して赤血球を溶解させることを含む請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記血液細胞が白血球を含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記血液細胞の少くとも１つの物理的なパラメータを計測するための希釈した血液試料の分析が、白血球の少くとも３つの部分母集団を計測するための、白血球の自動化された示差（differential）分析を含む請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記細胞溶解性の試薬が、少くとも１つの四級アンモニウム塩の水溶液を含む請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記血液細胞の少くとも１つの物理的なパラメータを計測するための希釈した血液試料の分析が、前記赤血球の平均細胞体積を計測するための分析を含む請求項１１の方法。
【請求項１７】
前記血液細胞の少くとも１つの物理的なパラメータを計測するための希釈した血液試料の分析が、血小板の数を計測するための分析を含む請求項１２の方法。
【請求項１８】
前記血液細胞の少くとも１つの物理的なパラメータを計測するための希釈した血液試料の分析が、ヘモグロビン含量を計測するための分析を含む請求項１２の方法。
【請求項１９】
白血球の５つの部分母集団の計測のための集束フローサイトメトリーにおけるシース流体として前記多目的血液希釈剤を使用することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の技術分野
【０００２】
本発明は、血液学および免疫学の分野に、および血液細胞を分析するために用いられる試薬における改良に関する。より詳しくは、本発明は、適当な電子的計測機器（instrumentation ）の手段により単一の血液細胞試料中の、血液細胞の計数およびサイズ分類（sizing）、ヘモグロビン・パラメータの計測、および白血液細胞部分母集団の識別に特に適するように改善された希釈剤に関する。
先行技術の検討
【０００３】
血液試料に関してある種の古典的な測定を行うために患者の血液試料を分析することは、通常の医学的な診断法である。この手順は、医師のための重要なツールである。重要なパラメータは、赤血球計数（ＲＢＣ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、平均血球体積（ＭＣＶ）、平均血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板計数（ＰＬＴ）、および平均血小板体積（ＭＰＶ）と称される。これらのパラメータは、全血液細胞計算値（ＣＢＣ）に含められる。他の重要な計測は、白血球計数（ＷＢＣ）、および白血球の少なくとも３つの部分母集団への識別である。
【０００４】
一般に、血液細胞分析は、希釈剤として機能する流体で血液試料を希釈し、希釈された血液試料の一部を赤血球および血小板パラメータについて分析し、および希釈された血液試料の他の部分を細胞溶解性の（lytic ）試薬と接触させて、赤血球および血小板を除去し、白血球の計数および識別を可能とする。報告された最も初期の希釈剤の１つは、生理的食塩水であった。全血試料のためのより進歩した希釈剤は、典型的には、ある種の生理的な塩、特定の緩衝剤、および保存剤を含んでいた。加えて、血液細胞分析における他の試薬（血液試料中の抗凝血剤、洗浄剤、モノクローナル抗体、染料および着色剤を含む）の使用は、生物学的な試料と化学的試薬との間で、特に変動する操作温度にわたって、予測できない相互作用を生じる。
【０００５】
化学的試薬に対する赤血球、白血球、血小板、およびヘモグロビン濃度の感受性のために、分析されるべき細胞の特性およびヘモグロビン・パラメータを、特に変動する操作温度条件にわたって、劣化させまたは望ましくなく変化させない化学剤試薬の組合せを見出すことは非常に困難であった。しばしば、ある成分、例えば試薬の安定性を維持する保存剤が加えられるが、しかしながらそれは、重大に、および、有害にその細胞の物理的なパラメータに影響を及ぼすかもしれない。または、ある成分がある機能的な性質のために希釈剤に加えられるが、しかしながら、その成分は他の血液細胞計測に悪影響を及ぼす。このような一つの例において、白血球を安定させるための成分の添加が、ヘモグロビン濃度計測に影響を及ぼすことが見出された。
【０００６】
細胞の物理的なパラメータは、任意の希釈剤の成分により、および分析方法により影響を受けるため、自動化、半自動化、または手動かどうかに関係なく、先行技術の希釈剤は、特定の検査および特定の機器との使用のために、特別に配合されたていた。これらの先行技術の希釈剤は、種々の検査方法において、または種々の検査機器とともに使用可能という意味においては、それらは普遍的または多目的でなかった。例えば、一般に、血液学分析のために用いられる商業的な希釈剤は、希釈剤の蛍光の問題、またはその希釈剤の蛍光プローブまたはモノクローナル抗体への適合性（compatibility ）のために、蛍光フローサイトメーターに用いられるものと異なる。
【０００７】
先行技術の希釈剤の多くは、機器、操作温度、試料の熟成、および特定の計測されるべき試料のパラメータに依存する１つ以上の短所を有する。自動化された血液学的機器において用いるための希釈剤は、アームストロングへの米国特許第３，９６２，１２５号；ランカスター（Lancaster ）への第４，１８５，９６４号；クルーズ（Crews ）らへの第４，２１３，８７６号；ラルセン（Larsen）への第４，５２９，７０５号；マツダらへの第４，６１７，２７５号；ラピコラ（Lapicola）らへの第４，７４５，０７１号；レディス（Ledis ）らへの第４，４８５，１７５号；カーターらへの４，３４６，０１８号；第４，５２１，５１８および４，９６２，０３８号；ラピコラへの第４，９６８，６２９号；および、ライアン（Ryan）への第５，２５０，４３８号に記述されている。加えて、以下の特許は、血液希釈剤およびそれらの使用に関して追加的な情報を提供する。
【０００８】
ストロ−プ（Stroupe ）らへの米国特許第４，２５５，３８５号は、血液試料中のヘモグロビンを計測するための方法および試薬を記述している。この文献は、細胞分析のために全血試料を溶解させ、および希釈するための試薬を開示している。この試薬は、ヘモグロビン計測のためのフェリシアン化カリウムを含む。
【０００９】
ノースへの米国特許第４，５０６，０１８号は、希釈剤において使用されている界面活性剤および保存剤の効果をバランスさせることによって、血液細胞体積変化を避けるための血液希釈剤を記述している。
【００１０】
マツダらへの米国特許第４，６５６，１３９号は、ホウ酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および（２−ピリジルチオ−１−オキシド）ナトリウムを含む希釈剤で、血液試料を希釈する段階を含む、血液分析のための細胞調製方法を記述している。その（ピリジルチオ−１−オキシド）ナトリウムは、ヘモグロビン計測を可能にするために使用される。
【００１１】
エドモンドソン（Edmondson ）らへの米国特許第５，００８，２０２号は、血液細胞分析において用いるための血液希釈剤および血液の希釈方法を開示している。その血液希釈剤は、一般に有機緩衝剤、細胞安定化剤、無機塩、溶媒およびＥＤＴＡ（ＥＤＴＡは抗菌剤の役割を果たす）、またはＥＤＴＡおよびフッ化ナトリウムの混合物（それらが一緒に抗菌剤の役割を果たす）を含む。
【００１２】
ウォング（Wong）への米国特許第５，２２７，３０４号は、「セルダイン（Cell Dyn）」（登録商標）ブランドの血液分析機における血液細胞の計数およびサイジングのための複雑な試薬系を記述している。この試薬系は、等張性の希釈剤および洗浄剤を含み、その希釈剤はイミダゾール有機緩衝剤、抗菌剤、無機塩およびｐＨ調整剤を含む。その明細書において、ウォングは、キレート化剤としてのＥＤＴＡ、および希釈剤の抗菌特性を高めることを教示し、その抗菌剤は、「オマジン」（omadine ）ナトリウム（２−ピリジンチオール−１−オキシド）、および、「トリアデン」（Triadene）−３［ヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジン］またはトリアデン−１０［６０％トリアデン−３、および、６％のオマジンナトリウムの混合物）。（オマジンナトリウムは、オリン社（Olin Corporation）の登録商標である。）
【００１３】
サカタへの米国特許第５，２４２，８３２号は、ヘモグロビン安定化剤としてのイミダゾールおよびイミダゾール誘導体を含む細胞溶解性試薬を記述している。
【００１４】
キムらへのＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９５／２４６５１号は、溶解誘発剤としてのラウリルジメチルアミンオキシドと、ヘモグロビン安定化剤としてのイミダゾールおよびその誘導体を含む、全ヘモグロビン計測において使用するための細胞溶解性の試薬を記述している。この細胞溶解性の試薬は、シアン化物を用いることなく、ヘモグロビン計測のために赤血球を溶解するために使用される。しかしながら、この試薬系は、ＷＢＣまたは白血球識別等の他のいずれの血液細胞分析にも使用されない。
更に、先行技術に関して、ＥＰＯ第０４６７３３７号が言及される、それは２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、クロロアセタミド、（Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス−（Ｎ−（１−ヒドロキシメチル−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル））−尿素、および５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン含む群から選ばれる少なくとも２つの成分の内容によって特徴づけられた診断検査の保存のための組合せを開示している。ＥＰＯ第０４６７３３７号は、検査試薬と；２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、クロロアセタミド、（Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス−（Ｎ−（１−ヒドロキシメチル−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル））−尿素、および５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン含む群から選ばれる少なくとも２つの保存剤とを含む維持された診断検査キットをも開示している。
更にまた、先行技術に関して、ＷＯ  ６８  ０７１８７号が言及され、それは、全血試料からの迅速な単離、同定および／又は白血球の分析のための方法および試薬系を開示している。全血の選択的な化学処理のための細胞溶解性の試薬系は、希釈剤と、ギ酸、酢酸およびそれらのそれぞれの混合物からなる群から選ばれる細胞溶解性の試薬と、約０．０５〜約０．２０パーセント（ｗ／ｗ）の範囲におけるサポニンの浄化に有効な量とから本質的になる酸性の水溶液を含み；その酸性の水溶液中の細胞溶解性の試薬の相対的な濃度は、全血試料を溶解された赤血球分画と、本質的に無損傷の白血球分画とへ、このような白血球の少くとも５つの部分母集団の示差分析を可能とするような状態に分割するのに充分であるようなものである。
【００１５】
先行技術の希釈剤にもかかわらず、数種の希釈剤のためのニーズを最小にし、且つ、変動する温度環境において使用可能な多目的希釈剤のニーズは、なお存在する。多目的希釈剤は、特定の血液学的分析機またはフローサイトメーター分析機の必要条件、および、このような個々の分析機において実行される特定の分析に適応させるために、与えられた臨床検査室内で種々の異なる希釈剤をストックすることによって生じるコスト、不便さおよび潜在的な混乱を避ける。
発明の概要
【００１６】
上述した観点から、本発明の目的は、血液試料中のヘモグロビン濃度および血小板を含む、赤血球パラメータを計測するための改良された希釈剤、および改良された希釈剤を用いる方法を提供することにある。本発明の更なる目的は、血液試料中の白血球計数および白血球の部分母集団を計測するための改良された希釈剤、および改良された希釈剤を用いる方法を提供することにある。
【００１７】
したがって、本発明は、血液試料中の赤血球、白血球、血小板、およびヘモグロビン濃度分析に有用な、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジンを含まない多目的な血液希釈剤を提供する。この希釈剤は、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸の誘導体、および、それらの組合せから選ばれる第１の化合物と；イミダゾール、イミダゾール誘導体、および、それらの組合せから選ばれる第２の化合物と；アルカリ金属塩化物と；酒石酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびピルビン酸塩、および、それらの組合せから選ばれる有機酸のアルカリ金属塩、およびアルカリ金属硫酸塩から選ばれる第３の化合物とを含み；該第１の化合物および第２の化合物は、１２．８℃〜４０．５℃の温度範囲にわたって再現性あるヘモグロビンおよび細胞体積測定を与えるために有効な量で含有され；且つ、前記希釈剤は、それが血液細胞体積を安定させて、中性のｐＨを有するように等張性で、電流を流すことができる電解質である。
【００１８】
本発明は、更に、
ａ）血液細胞を含む血液試料を多目的血液希釈剤と混合し、および
ｂ）前記希釈された血液試料を分析して、血液細胞の少くとも１つの物理的なパラメータを計測する方法であって；
【００１９】
その希釈剤が、ｉ) エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸の誘導体、および、それらの組合せから選ばれる第１の化合物と；ii）イミダゾール、イミダゾール誘導体、および、それらの組合せから選ばれる第２の化合物と；iii ）アルカリ金属塩化物と；iv）酒石酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびピルビン酸塩、および、それらの組合せから選ばれる有機酸のアルカリ金属塩、およびアルカリ金属硫酸塩から選ばれる第３の化合物とを含み；前記希釈剤はヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジンを含まず；該第１の化合物および第２の化合物は、１２．８℃〜４０．５℃の温度範囲にわたって再現性あるヘモグロビンおよび細胞の体積測定を与えるために有効な量で含有され；且つ、前記希釈剤は、それが血液細胞体積を安定させて、中性のｐＨを有するように等張性で、電流を流すことができる電解質である；
血液細胞を含む血液試料を分析するための方法を提供する。
好ましい態様の詳細な説明
【００２０】
本発明の多目的希釈剤は、血液試料の分析において有用である。第１の態様において、その希釈剤は、赤血球、ヘモグロビンおよび血小板測定の計測に有用である。測定は、細胞のサイズ、形状、含有量および体積を含む。測定は、光散乱、低周波電流、高周波電流、蛍光、およびそれらの組合せを用いて、行うことができる。第２の態様において、その希釈剤は、ＷＢＣの計測、および白血球の３つの部分母集団への識別に有用である。第３の態様において、その希釈剤は、白血球の５つの部分母集団の計測のための集束（focused ）フローサイトメトリーにおけるシース流体として有用である。第４の態様において、その希釈剤は、蛍光プローブまたは抗体を用いる際の蛍光フローサイトメトリー分析のために有用である。
【００２１】
希釈剤は、保存安定性であり（shelf stable）、操作温度の広い範囲にわたって使用可能である。加えて、それは新鮮なまたは熟成した血液試料で使用可能である。本発明の希釈剤を用いることにより得られた測定は、市販の希釈剤を用いることにより得られた測定と同等（comparable）である。
【００２２】
上記の希釈剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡ誘導体、およびそれらの組合せから選ばれる第１の化合物を含む。ＥＤＴＡの誘導体は、ＥＤＴＡジナトリウム等のＥＤＴＡの塩、およびエチレングリコール−ビス−（３−アミノエチルエーテル）−Ｎ−Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む。好ましい第１の化合物は、ジナトリウムＥＤＴＡである。第１の化合物の範囲は、リットルにつき２．５グラム（ｇ／Ｌ）〜１１ｇ／Ｌである。第１の化合物の好ましい量は、３〜８ｇ／Ｌまである。
【００２３】
その希釈剤は、イミダゾール、イミダゾール誘導体、および、それらの組合せから選ばれる第２の化合物をも含む。イミダゾール誘導体は、フェニルイミダゾール、メチルイミダゾール、エチルイミダゾール、およびブチルイミダゾールを含む。第２の化合物の範囲は、０．５ｇ／Ｌ〜９ｇ／Ｌである。第２の化合物の好ましい量は、２〜４ｇ／Ｌである。第２の化合物が、多目的希釈剤中の両立性を有する（compatible）ｐＨ緩衝剤であることが判明した。
【００２４】
本発明は如何なる理論によって束縛されることも欲しないが、現時点では、第１の化合物および第２の化合物の組合せが個々の血液細胞に影響を与えて、血液試料が１以上の測定のために分析される際に、１２．８℃〜４０．５℃（好ましくは１５．５℃〜３２．２℃）の温度範囲にわたって血液試料が一貫して同じ測定を与えるようにすると考えられる。機器標準の操作温度からの温度変動が測定における変動を引き起こす可能性があるため、この広い温度範囲にわたる性能の安定性は本発明の重要な特徴である。
【００２５】
その希釈剤は、更にアルカリ金属塩化物を含む。適当なアルカリ金属塩化物は、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選ばれる金属を含む。アルカリ金属塩化物の範囲は、０．１〜５．０ｇｍ／Ｌである。アルカリ金属塩化物の好ましい量は、０．５〜３．５ｇｍ／Ｌである。
【００２６】
希釈剤は、ｉ）アルカリ金属硫酸塩、およびｉｉ）酒石酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、および、ピルビン酸、およびそれらの組合せから選ばれる有機酸のアルカリ金属塩、から選ばれる第３の化合物をも含む。適当なアルカリ金属硫酸塩は、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選ばれる金属を含む。第３の化合物の範囲は、８〜３５ｇｍ／Ｌである。第３の化合物の好ましい量は、１０〜２５ｇｍ／Ｌでからある。好ましい第３の化合物は、アルカリ金属硫酸塩である。最も好ましい第３の化合物は、硫酸ナトリウムである。
【００２７】
アルカリ金属塩化物およびアルカリ金属硫酸塩は、細胞体積に悪影響を及ぼさないように適当な浸透圧モル濃度（osmolality）を与えるために使用される。一般に、多目的希釈剤は等浸透圧（iso-osmotic ）である。より具体的には、その浸透圧モル濃度は、約２００〜４００のミリオスモル（ｍＯｓｍ）、および、好ましくは２５０〜３８０ｍＯｓｍ、および最も好ましくは２９０〜３５０ｍＯｓｍであろう。しかしながら、多目的希釈剤の浸透圧モル濃度は、細胞溶解性の試薬組成物とともに使用されるとき、変化することが可能である。多目的希釈剤の体積は、細胞溶解性の試薬体積に対して、血液試料混合物の最終的な浸透圧モル濃度が約２９０〜３５０ｍＯｓｍ、好ましくは３１０〜３３０ｍＯｓｍの間になるように調整することができる。加えて、流動機器においてシース流体として使用されるとき、シース流体の浸透圧モル濃度および伝導度と、コア流体の浸透圧モル濃度および伝導度の関係は、維持されるべきである。例えば、希釈剤は、典型的には約１５〜２３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するであろう。
【００２８】
多目的希釈剤のｐＨは、使用されるべき機器および検査のために選ばれる。一般に、その希釈剤は、約６〜約７．８のｐＨを有するであろう。体積分布計数を実行する自動化または半自動化された機器のために、そのｐＨはｐＨ６．５〜ｐＨ７．６、好ましくはｐＨ６．６〜７．４まで変化する。フローサイトメトリー機器のために、シース流体として使用されるとき、ｐＨ約７．０〜約７．２の範囲でｐＨは変化する。
【００２９】
上記のｐＨ範囲の希釈剤のｐＨ値を得るために、ｐＨ調整剤を使用可能である。必要とされるｐＨを付与するために適したｐＨ調整剤の例は、酸（典型的には塩酸または硫酸）、およびアルカリ金属水酸化物等の塩基を含む。それらが血液試料の分析を妨害しないという条件で、他の酸で置き換えてもよい。許容可能なアルカリ金属水酸化物の例は、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムを含む。
【００３０】
試薬組成物は、それが意図された使用に適合性を有するように、他の特性をも有するべきである。第一に、多目的希釈剤において使用される化合物は、その製品の貯蔵寿命の間に分解すべきではない。製品の貯蔵寿命は、製品の製造からその製品の顧客使用までの時間を考慮に入れる。この間に、その製品の化学的官能性は、維持される必要がある。好ましくは、希釈剤は１２ヵ月を超える貯蔵寿命を有する。本発明の配合における化合物の組合せは、この必要条件を満たすこが判明した。
【００３１】
第二に、多目的希釈剤は、その希釈剤の物理的な特性または官能性に悪影響を与える可能性のある菌類または細菌の成長を避けるための保存剤組成物をも含むであろう。多目的希釈剤は、ナトリウム２−ピリジンチオール−１−オキシド（オマジンナトリウム）、ヘキサヒドロ−１，３，５  トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジン（トリアジン−３）、１−ヒドロキシピリジン−２−チオン、２−ピリジチオール−１−オキシドのナトリウム塩、１，３−ジメチル尿素、１，３−ジメチロール尿素またはフッ化ナトリウムを含まないことが好ましい。ナトリウムオマジンは、光および製品の官能性に悪影響を与える可能性のある酸化剤に対して不安定であることが判明した。同様に、１，３−ジメチル尿素および１，３−ジメチロール尿素は、それがヘモグロビンと好ましくない反応を生じて分光光度法的な特性を変化させるため、ヘモグロビン濃度の再現性ある計測を与えない。フッ化ナトリウムの使用は、それがガラスキュベットと反応することが判明したため、適当な保存剤ではない。
【００３２】
保存剤の量は、全血試料の分析に悪影響を与えるべきではない。保存剤組成物の量は、当業者によるルーチンの実験によって決定可能であり、および、典型的には、その希釈剤の０．５重量％未満である。
【００３３】
適当な保存剤は、１）ソルビン酸、安息香酸、サリチル酸、デヒドロ酢酸等の有機および無機酸；２）ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル（パラベン）等のエステルおよび塩；３）６−アセトキシ−２，４−ジメチル−１，３−ジオキサン、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン等の１，３−ジキサンの置換された脂肪族ジオール誘導体；４）１，３−ジ（ヒドロキシメチル）−５−５−ジメチル−２，４−ジオキソイミダゾール，Ｎ−Ｎ”−メチレンビス［５’−[ １−ヒドロキシメチル］−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素］、モノおよびジメチロールジメチルヒダントイン等のイミダゾール誘導体；５）５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンゾイソチアゾリン−３−オン等のイソチアゾロン類；および、ナトリウム  ヒドロキシメチルグリシネート；および、シス−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニア（azonia）アダマンタン  クロリドを含む。好ましい保存剤は、ｎ−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（１，３−ジヒドロキシメチル−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）−Ｎ’−（ヒドロキシメチル）尿素、および２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンとともに５−クロロ−２−メチルイソチアゾリン−３−オンである。
【００３４】
所望により、希釈剤は細胞安定化剤として作用する麻酔剤を含むことができる。細胞安定化剤は、血小板凝集を防ぐ等の、細胞サイズ、形状、血液細胞成分の保全性（integrity ）を安定化させるために使用される。使用された細胞安定化剤の正確な量は、化学的配合によって規定されたように、変化する可能性がある。典型的には、細胞安定化剤は、その希釈剤の０．５重量％未満である。適当な細胞安定化剤は、ＲＨＮ−Ｃ6 Ｈ4 −ＣＯＯＲ’またはＲＨＮＣ6 Ｈ4 −ＣＯＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｒ’の構造（式中、Ｒは水素および低級アルキルであり、Ｒ’は低級アルキル、ジアルキルアミノアルキル、およびジアルキルアミノである）を有する４−アミノ安息香酸エステルおよびその誘導体を含む。このような化合物の例は、ベンゾカイン、プロカイン、ブタカイン、テトラカインおよびブテタミン（butethamine ）を含む。これらの化合物は、塩基として、またはその塩として、例えば、その塩酸塩、酪酸塩、硝酸塩またはホウ酸塩として有用である。他の希釈剤成分と適合性を有することが判明した細胞安定化剤のいくつかの具体例は、４−アミノ安息香酸−（２−ジエチルアミノ）エチルエステル塩酸塩、および、２−（ジエチルアミノ）−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）アセトアミドを含む。好ましい細胞安定化剤は、４−（ブチルアミノ）安息香酸−２−（ジメチルアミノ）エチルエステル塩酸塩である。
【００３５】
本発明に従う多目的希釈剤組成は、以下の表１において説明される：
【００３６】
0004153162.tif 000002
【００３７】
例１
表１に挙げられた成分および好ましい範囲を用いて、ＥＤＴＡ濃度をそれぞれ０、３、および７．５ｇ／Ｌで変化させることにより、３種の多目的希釈剤を製造した。商業的な血液学的コントロール、商業的な血液学キャリブレータ、および３種の新鮮血を、COULTER COUNTER S Plus IV diff血液学的分析機上でテストした。その機器は、１５．５℃で制御された温度の環境室中に配置した。表２は、細胞体積とＥＤＴＡ濃度とにおける関係を示し、それは、ＥＤＴＡ濃度が１５．５℃で細胞体積に影響を及ぼすことを証明している。
【００３８】
0004153162.tif 000003
【００３９】
例２
ＭＣＶ等のある種の赤血球パラメータは、２３．９℃未満の温度で変化する。表３Ａ中の商業的な希釈剤コントロ−ルを、表３Ｂ中の本発明の希釈剤と比較した。テスト試料は、COULTER COUNTER S Plus IV diff血液学的分析機上でテストした。本発明の希釈剤は、コントロ−ル、キャリブレータ、および新鮮血の血液細胞体積を、１５．５℃における変化に対して、より低感受性とする。
【００４０】
0004153162.tif 000004
【００４１】
0004153162.tif 000005
【００４２】
例３
表１の希釈剤は、特にフロリダ州マイアミのコールター社（Coulter Corporation ）によって製造されたタイプの血液学分析機に通される血液試料との使用に適している。赤血球のある種の物理的なパラメータ、および白血球のリンパ球、単球、および顆粒球の少なくとも３つの部分母集団への体積識別を得るために、その血液試料を分析する。表１の多目的希釈剤を用いる際に、以下の成分の混合物からなり、シアン化物を含まない溶解誘発剤を用いた：
【００４３】
0004153162.tif 000006
【００４４】
この試薬系を用いる、３つの部分母集団への白血球の識別を含む、ＷＢＣ、ＲＢＣ、および血小板パラメータは、１５．５〜２９．４℃の温度範囲にわたって一貫している。
【００４５】
例４
表１に挙げられた成分および好ましい範囲を用いて、多目的希釈剤を製造した。正常なドナーからの新鮮血および臨床的に異常な試料を、COULTER （登録商標） STKS 血液学分析機上でテストした。その機器を、コントロ−ルされた温度１５．５℃環境の室に配置して、新鮮な血液試料の一部をテストした。その後、温度を２９．４℃に上昇させ、その新鮮血試料の他の部分をテストした。加えて、極端な温度で実施した各テストについて、新鮮な血液試料の他の部分を用いて、コンパレータ機器を２３．９℃で動作させた。以下の表４は、回収したヘモグロビンについての値の平均値、および温度によって観察された差異を示す。その結果は、ヘモグロビンが広い温度範囲にわたって安定であることを示した。
【００４６】
0004153162.tif 000007
【００４７】
例５
表１に挙げられた成分および好ましい範囲を用いて、多目的希釈剤を製造した。商業的な血液学コントロ−ル、商業的な血液学キャリブレータ、および正常なドナーからの新鮮血を、COULTER STKS血液学分析機上でテストした。その機器をコントロ−ルされた温度１５．５℃の環境室に配置して、新鮮な血液試料の一部をテストした。その後、温度を３２．２℃に上昇させ、その新鮮血試料の他の部分をテストした。加えて、極端な温度で実施した各検査について、新鮮な血液試料の他の部分を用いて、コンパレータ機器を２３．９℃で動作させた。以下の表５は、回収したヘモグロビンについての値の平均値、および温度によって観察された差異を示す。その結果は、ヘモグロビンが広い温度範囲にわたって安定であることを示した。
【００４８】
0004153162.tif 000008
【００４９】
本発明は、特に好ましい態様について記述した。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく種々の変形が可能であり、このような変化は、添付の請求項範囲の範囲内に入ることが意図されていると認識されるであろう。