(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液を含む生体由来試料中の目的とする遺伝子をＰＣＲ法によって増幅する核酸合成法において、遺伝子増幅反応液に血液を含む生体由来試料及び０．２５〜２ｍＭのジチオスレイトール（dithiothreitol:略称ＤＴＴ）を添加することを特徴とする核酸合成法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸合成法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１−２７４６９７号公報に述べられている。ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【０００３】
ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることが広く知られている。
【０００４】
そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立って、被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。
最近では核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全な除去は困難であり、かつ試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。
従って、これらの問題点を解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれる。
【０００６】
そこで、本発明は、更に改良を加え、試料の種類に関係なく、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、血液を含む生体由来試料中の目的とする遺伝子をＰＣＲ法によって増幅する核酸合成法において、遺伝子増幅反応液に血液を含む生体由来試料及び０．２５〜２ｍＭのジチオスレイトールを添加することを特徴とする。ここで、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、試料に加えてから、遺伝子増幅反応液に添加しても、遺伝子増幅反応液に直接添加してもよい。また、ＤＴＴは、遺伝子増幅反応液に均一に入っていない状態（たとえば試料にＤＴＴを加えて、この試料を反応液に攪拌せずに添加した場合など）でも同様の効果がある。
【０００８】
本発明において、試料は生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは、細胞、細菌、ウィルス等をいう。体液には血液、唾液、髄液、尿、乳が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものは、特別な前処理なしに直接遺伝子増幅反応液に添加される。
【０００９】
遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇＣｌ２、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び耐熱酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、ジメチルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加される場合がある。
【００１０】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −hydroxypropanesulfonic acid ）あるいはＣＨＥＳ（2ー（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液は、遺伝子増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００１１】
プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法により合成することができるし、また、生物界から単離することもできる。
【００１２】
耐熱酵素は、プライマー付加による核酸を合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味する。適切な耐熱酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００１３】
また、本発明では遺伝子増幅反応液のｐＨを調節することにより、相乗効果が得られる。例えば、ｐＨは、２５℃の温度条件下で８．１以上、好ましくは８．５〜９．５である。
また、本発明では、遺伝子増幅反応液にポリアミンを添加してもよい。
【００１４】
なお、本発明の核酸合成法の手順は、ＤＴＴを添加する以外、通常の方法と何ら変わらない。すなわち、先ず、増幅しようとする目的の2本鎖ＤＮＡ断片を熱変性により、1本鎖のＤＮＡにする（ディナチュレーション工程）。次に増幅させたい領域を挟むプライマーをハイブリダイズさせる（アニーリング工程）。次に４種類のデオキシリボヌクレオチド類（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の共存下にＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プライマーの伸長反応を行う（ポリメライゼーション工程）。
【００１５】
【実施例】
ＰＣＲ反応液（50μｌ）にクエン酸処理したヒト血液を２または１μｌ添加し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲのプライマーはヒトのβ−グロビン遺伝子領域内に位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＧＨ２０）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＧＨ２１）であり、配列は次の通りである。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、４０８bp の増幅産物を得ることができる。
ＧＨ２０：５’ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ３’
ＧＨ２１：５’ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ３’
【００１６】
ＰＣＲ反応液には、pH8.3 に調節した10mM Tris-HCl、50MKCl,1.5mMMgCl2, 200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP, 各0.4 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Japan）反応液を用いた。
ＰＣＲは、９４℃、３分のプレヒーティングの後、９４℃  ３０秒間、５５℃１分間、７２℃  １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃  ７分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含む、０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH8.0) 液中で電気泳動を行い検出した。
【００１７】
ＤＴＴを反応液に直接添加して、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図１に示す。図中Ｍはサイズマーカー（HincIIで切断した250ng のφ X174-RF DNA）、１、８はＤＴＴが０％、２、９はＤＴＴを０．１２５ｍＭ添加、３、１０はＤＴＴを０．２５ｍＭ添加、４、１１はＤＴＴを０．５ｍＭ添加、５、１２はＤＴＴを１ｍＭ添加、６、１３はＤＴＴを２ｍＭ添加、７、１４はＤＴＴを４ｍＭ添加したものを示している。また、１〜７は血液を２μｌ添加、８〜１４は血液を１μｌ添加したものである。
結果、ＤＴＴを添加することによって、ＰＣＲ増幅産物が得られることがわかった、特にＤＴＴを１ｍＭ添加するのが良好である。
【００１８】
【発明の効果】
本発明により、核酸の分離・精製の過程を経ずに、血液等のＰＣＲ阻害物質を多く含んだ試料から、直接、目的のＤＮＡを効率よく増幅することが可能となった。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成の操作を行えるようになり、コンタミネーションの機会の軽減が可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ反応液（50μｌ）にヒトクエン酸処理したヒト血液を２または１μｌ、濃度の異なるＤＴＴを添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図１】
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