(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の光源からの反射モード光を、核酸アレー、タンパク質アレー、ポリペプチド・アレーおよび炭水化物アレーよりなる群から選択される散乱標識で標識された生体高分子アレーに投射し；
第２の光源からの散乱モード光を該生体高分子アレーに投射し；ついで
検出器によって、該第１の光源からの光の適用に応答して該生体高分子アレーから鏡面反射した光および該第２の光源からの光の適用に応答して散乱した光を別々に検出し、次いで、反射モードイメージングおよび散乱モードイメージングの組合せを用いてイメージングを行うことを含む、核酸アレー、タンパク質アレー、ポリペプチド・アレーおよび炭水化物アレーよりなる群から選択される生体高分子アレーをイメージングする方法。
【請求項２】
さらに、該生体高分子アレーから反射した該検出する光に基づいて第１の信号を得；
該第１の信号を第１の電圧に変換し；
Ａ／Ｄコンバータによって該第１の電圧をデジタル化し；
該デジタル化した第１の電圧をイメージとしてコンピュータに保存し；
該生体高分子アレーから散乱した該検出する光に基づいて第２の信号を得；
該第２の信号を第２の電圧に変換し；
Ａ／Ｄコンバータによって該第２の電圧をデジタル化し；ついで
該デジタル化した第２の電圧をイメージとしてコンピュータに保存することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
光源からの光を、核酸アレー、タンパク質アレー、ポリペプチド・アレーおよび炭水化物アレーよりなる群から選択される散乱標識で標識された生体高分子アレーに投射し；
該光源からの光の適用に応答して該生体高分子アレーから鏡面反射した光を第１の検出器によって検出し；
該光源からの光の適用に応答して該生体高分子アレーから散乱した光を第２の検出器によって検出し、次いで、反射モードイメージングおよび散乱モードイメージングの組合せを用いてイメージングを行うことを含む、核酸アレー、タンパク質アレー、ポリペプチド・アレーおよび炭水化物アレーよりなる群から選択される生体高分子アレーをイメージングする方法。
【請求項４】
該散乱標識が金属コロイドを含む請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
該生体高分子アレーが核酸アレーである請求項３記載の方法。
【請求項６】
反射モード光および散乱モード光を、核酸アレー、タンパク質アレー、ポリペプチド・アレーおよび炭水化物アレーよりなる群から選択される散乱標識で標識された生体高分子アレーに連続して供する第１の光源および第２の光源；および
該第１の光源からの光の適用に応答して該生体高分子アレーから鏡面反射した光および該第２の光源からの光の適用に応答して散乱した光を連続して検出するための検出器を含む、請求項１記載の方法に直接使用する核酸アレー、タンパク質アレー、ポリペプチド・アレーおよび炭水化物アレーよりなる群から選択される生体高分子アレーをイメージングするための装置。
【請求項７】
反射モード光および散乱モード光を生体高分子アレーに同時に供する光源；および
該光源からの光の適用に応答して該生体高分子アレーから鏡面反射した光および散乱された光を平行して検出するための２つの検出器
を含む、請求項３記載の方法に直接使用する核酸アレー、タンパク質アレー、ポリペプチド・アレーおよび炭水化物アレーよりなる群から選択される生体高分子アレーをイメージングするための装置。
【請求項８】
該第１の光源が該生体高分子アレーに対して垂直な線から第１の角度で位置する請求項６記載の装置。
【請求項９】
該検出器が該生体高分子アレーに対して垂直な線から第２の角度で位置する請求項８記載の装置。
【請求項１０】
該第１の光源が該生体高分子アレーに対して垂直な線の１の側に位置する請求項９記載の装置。
【請求項１１】
該検出器が該生体高分子アレーに対して垂直な線の反対側に位置する請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
該第２の角度が該第１の角度と同じ数値である請求項１１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明の発明者らは、出典明示して本明細書の一部とみなす１９９７年９月８日に出願された米国仮特許出願番号６０／０５８，１８３号および１９９７年１１月２４日に出願された米国仮特許出願番号６０／０６６，４３２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明はイメージングの分野に関する。特に、本発明は、強力な光散乱および／または反射特性を有する材料、例えば金属コロイドマーカー、で標識されている試料の高分解能イメージング用の方法および装置を提供する。本発明によれば、光散乱および反射光を用いたイメージングを行うことにより、特異的結合分析物が検出される。
【０００３】
本発明は、検出が必要である種々の適用において有用である。例えば、１つの有用な適用には、生体高分子アレーとの使用が含まれる。例えば、高密度核酸アレーを作製する先駆的な技術は、米国特許第５,４４５，９３４号に記載されている。本発明は、強力な光散乱および反射特性を有する標識を目的の分子に付着することができるいずれの適用においても有用である。
【０００４】
発明の背景
本発明は、ポリマーアッセイのごとき試料を分析するための方法および機器を提供する。かかるポリマーアッセイの例には、核酸アレー、タンパク質またはポリペプチド・アレー、炭水化物アレーなどが含まれる。加えて、本発明は固定化された試料および溶液中の試料の双方とともに用いることができる。かなりの数の可能な試料を本発明で用いることができる。種々のタイプのスキャナーを用いて、試料から情報が抽出されてきた。例えば、従前の試料判読機器は、特異的な相互作用またはハイブリダイゼーションを明らかにするために、蛍光に対して応答性である検出スキームを用いていた。
【０００５】
蛍光標識を用いるよりもむしろ、光を効率的に散乱して核酸アレーを標識する粒子の溶液を用いることが知られている。例えば、金属コロイドと呼ばれる金属粒子の溶液を用いることができる。光を散乱するいずれの他の粒子を用いても、試料を標識することができる。より詳細には、特異的結合タンパク質と対応する結合性物質との間の反応の１またはそれを超える要素を検出することが知られており、そこにおいては、“Ｍｅｔａｌ  Ｓｏｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”なる標題の米国特許第４，３１３，７３４号に開示されているごとき、金属、金属化合物またはポリマー核の分散粒子をカップリングさせることによって得られる１またはそれを超える標識成分が用いられている。
【０００６】
さらに、Ｄｏｎ  Ｉ．Ｓｔｉｍｐｓｏｎ，Ｊｏａｎｅｌｌ  Ｖ．Ｈｏｉｊｅｒ，ＷａｎｇＴｉｎｇ  Ｈｓｉｅｈ，Ｃｙｎｔｈｉａ  Ｊｏｕ，Ｊｕｌｉａｎ  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔｏｍ  Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ，Ｒｏｎ  ＧａｍｂｌｅおよびＪｏｈｎ  Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒによる“Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｗａｖｅ  Ｇｕｉｄｅｓ”に記載されているごとく、ＤＮＡアレー上の捕捉ゾーンで光散乱および反射標識のリアルタイムの結合または融解を測定することができる二次元光導波路を用いる検出方法を利用することができる。
【０００７】
前記ドキュメントでは、典型的には内面全反射に依存するスキャン技術を利用する特異的結合分析物を検出するための技術を利用している。この技術は、エバネッセント波検出としても当該技術分野で知られている。例えば第１図に参照して、核酸アレーのベースの透明アレー基体表面の断面図を示す。したがって、核酸アレー中で用いているガラスおよび水性緩衝液の界面からの内面全反射を達成するためには、スキャナーからの光の内部入射角度を９０°に近づけなければならない。空気から重ガラスチップに入る際に照射光線は垂線入射方向に向けて曲がるため、単に透明アレー基体の面に対してほぼ平行に照射させることによっては、かかる浅い内部入射角を達成することは不可能である。
【０００８】
内面全反射技術を用いれば、透明アレー基体のエッジを通して試料を照射することが可能である。しかしながら、このアプローチは扱いにくく、かつ高価である。さらに、プラスチック製カートリッジ中に存在する試料とともに透明アレー基体のエッジを照射することは可能となり得るが、かかる配置には基体の１のエッジ面がかなり高い光学的品質のものであることが必要であろう。このことは、より高い梱包コストを生じるであろう。
【０００９】
核酸アレーから遺伝情報を判読するために内面全反射技術の使用を可能にするであろうもう１つの可能な解決法には、平面表面のエッジ近くに付けたカップリングプリズムの使用が含まれる。かかるカップリングプリズムにより、垂直入射により近い角度で透明重アレー基体に照射を入れることができる。カップリングプリズムを用いる内面全反射技術には、プローブ用の空間を排除するカップリングプリズム用の空間を提供することが必要である。
【００１０】
内面全反射技術は、洗浄によって残りの標識の濃度が実用的に検出不可能なレベルまで低下する試料で用いることができるが、かかる適用においては、内面全反射技術はガラス／水性界面およびガラス／空気界面の両方から望ましくないバックグラウンド散乱を生じる。
【００１１】
加えて、散乱標識を用いて標識する他の知られている技術は、核酸アレー上の不適当な場所で結合または反応する傾向がある。例えば、金属コロイドがブロットアッセイ、例えば家庭用妊娠検査キットで用いられている。一般的に、かかるキットは、コロイド凝集が白色の基体上で起こる比色アッセイを用いている。検査結果は、色を導入する金属コロイドによる光減衰によって判定される。
高散乱特性を有する散乱標識で標識されている試料をイメージングする装置および方法に対して要望が存在する。
【００１２】
発明の概要
本発明は、新規な光散乱および反射技術を用いることにより核酸アレーのごとき試料をスキャンするためのスキャナー機器および方法に指向される。特に、反射イメージングと散漫散乱イメージングとの組合せ使用が、散乱標識で標識され、かつ核酸アレーに結合した試料に対するダイナミックレンジおよび検出限界を最大限化することを見出した。この新規な光散乱および反射技術は、種々の適用において首尾よく用いることができる。なぜならば、かかる適用は、以下に記載するごとく、特定の光学特性を示す透明アレー基体を用いるからである。本発明による試料は強力な光散乱および反射特性を有する散乱標識で標識されている。かかる散乱標識の１つの例は金属コロイドであるが、本発明は金属コロイドの使用に限定されるものではなく、実際に、強力な光散乱および反射特性を有するいずれの材料をも用いることができる。本発明は、エバネッセント波または内面全反射技術に依存するものではない。本発明の光散乱および反射光技術は、従前の方法よりも優れた光学的結果を、極めてより低いコストで供するものである。
【００１３】
本発明の好ましい具体例によれば、試料上の遺伝情報を検出するために光散乱および反射照射技術を用い、そこにおいては反射モードイメージングのみを用いる。本発明のもう１つの具体例において、反射モードイメージングと散乱モードイメージングとの新規な組合せを介して試料をイメージングする。用いる光の外部入射角度は、典型的には表面垂線に対して測定してほぼ０°から４５°を超える範囲の角度であるが、いずれの角度をも用いることができる。
加えて、前記の新規な照射および採取技術によるイメージングを提供する機器を開示する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明によれば、核酸アレーのごとき試料をイメージングするための、光散乱および反射光を用いる新規な方法および装置が提供される。本発明の好ましい具体例によれば、反射モードイメージング単独を用いて試料をイメージングする。第２の具体例において、反射モードイメージングと散乱モードイメージングとの組合せを用いる。
【００１５】
反射モードイメージングとして知られているイメージング技術は、試料に照射し、それから反射された光を試料から集めるものである。反射モードイメージングにおけるそのもう１つの方法では、集める光は鏡面反射である。反射モードイメージングは、金属ゾル標識のごとく光を散乱させる強力な能力を有する散乱標識の平面凝集物の信号を取出すことによってダイナミックヘッドルームを高める。その結果、反射モードイメージングは強度スケールの高端部において最もよく作動する。反射モードイメージングは幾分かの反射バックグラウンドを生じるが、本発明者らは反射モードイメージングの使用によってイメージング試料を単独で検出することに成功した。一方、散乱モードイメージングにおいては、集めるいずれかの光は、反射されたもの以外の光である。したがって、散乱モードイメージングで集めた光は再放射光であって非−鏡面である。散乱モードイメージングは、ガラス／水性界面からのバックグラウンド信号を最小限化することによってダイナミック“レッグルーム”を高める。したがって、散乱モードイメージングは、強度スケールの低端部において最もよく作動する。この技術の不利な点は、高粒子密度における散乱等方性の損失によるダイナミックヘッドルームの損失である。したがって、反射および散乱モードイメージングを組合せて使用することにより、最大理論ダイナミックレンジを生じる。本発明者らはイメージング技術のかかるユニークな組合せが良好な結果を提供することを見出した。
【００１６】
散乱標識と呼ばれる強力な光散乱および反射特性を示す粒子は、その直径が極めて小さい、例えば散乱波長の１／１０もと小さい場合でさえも可視光を強力に散乱するであろう。本発明によりスキャンする試料は非常に高い光学的品質を有する透明アレー基体上に常に位置し、さらには、該透明アレー基体は多くの光を散乱しない水性緩衝液と接触しているため、本発明による透明アレー基体および水性緩衝液の界面の結果としていずれの種類の拡散光散乱もほぼ全く発生しない。
【００１７】
ガラス／水性界面からのバックグラウンドは散漫散乱モードでは無視できるが、反射散乱を用いれば測定可能である。生じ得るガラス／水性界面からのいずれの散乱バックグラウンドをも最小限化するためには、ガラス／水性界面からの鏡面反射がスキャン機器の採取光学素子に入るのを妨ぐことが必須である。散漫散乱ジオメトリーは、金属ゾル標識のごとき極めて低い表面密度の散乱標識の検出を許容する。かかるアプローチの欠点は、増大してゆく高粒子密度においては、散乱光の空間分布がより低い等方性となるかまたは散乱することである。１００％充填率の限界においては、結合した金粒子の層は、純鏡面反射として試料から出た全“散乱”光でもって、金鏡のごとくふるまう。したがって、散漫散乱のみを検出する光学構造では、金属粒子の非常に高度の被覆の存在を有効に検出することができず、ダイナミックヘッドルームを失ってしまう。
【００１８】
本発明の方法を図２および図３に参照して説明する。図２に示す２つの励起経路または図３に示す２つの検出経路のいずれかを使用することができる。オフ−オクシス（ｏｆｆ−ａｘｉｓ）光路は４５°の入射角で図示されているが、この値に限定されるものではない。これらの構造のいずれを用いても、散漫散乱（“Ｓ”モード）および鏡面反射（“Ｒ”モード）の双方をイメージングすることができる。Ｓモードで遭遇する低バックグラウンド散乱は、低粒子密度を有する特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）の検出を最適化する。Ｒモードにおいては、観察される信号レベルは、最高の達成可能な密度で粒子密度によりずっと密接に比例していると予想される。したがって、ＲおよびＳ検出モードは互いに相補物として考察することができ、一緒になって測定プロセスのダイナミックレンジを増大させる。
【００１９】
２チャンネルのアプローチにおいては、少なくとも３つの方法でイメージデータを獲得し分析することができる。最初に、ＲおよびＳ光源からの同時照射で単一のイメージが作り出される（図２）。この場合において、Ｒ光源の強度は、バックグラウンド反射に対するその寄与を最小限化するためにＳ光源のものよりも実質的に低くすべきである。Ｒ光源によって発生したバックグラウンドは、それを面内（ｉｎ−ｐｌａｎｅ）偏光させることによってさらに低減することができる。２番目および３番目のアプローチにおいて、独立したイメージがＳおよびＲモードで作り出される。該ＲおよびＳイメージは単一の検出アレーを用いて連続して（図２）か、または２つの検出アレーを用いて平行して（図３）獲得することができる。アルゴリズムによって、２つのイメージから強度データが選択される。
【００２０】
反射および散乱モードイメージングを利用して実験を行った。本発明者らは、反射モードイメージが５個／μｍ2よりも実質的に低い粒子密度でさえ信号における非常に大きな増強を生じることを見出した。この増強は１個／μｍ2よりもずいぶん低い密度まで持続する。これらの知見は、１個／μｍ2の範囲の密度でさえも散乱標識のクラスター化が起こっており、この現象を利用して信号レベルを押し上げ得るという概念を支持している。したがって、本発明者らは反射モードイメージング単独を用いてアッセイの最大限のダイナミックレンジにわたり十分な信号対雑音を達成し得ることを見出した。図４は強力な光散乱特性を有する散乱標識の反射モードイメージングが蛍光標識を用いて行うイメージングもと良好である結果を供することを示すグラフデータを供している。
【００２１】
本発明を用いて得ることができるピーク散乱波長は粒子サイズの関数である。直径においてほぼ５０ｎｍまでの粒子に関しては、散乱断面は粒子半径の６乗に比例し、非常に大きく、すなわち従来技術の発蛍光団よりも〜１０5大きい。より大きな粒子に関しては、本発明者らはより弱い依存性を見出している。例えば、１００ｎｍの粒子は８０ｎｍの粒子よりもほぼ２倍強いことが測定により判定されている。
【００２２】
本発明の発明者らは、適用に依存して、用いる粒子の最小限の数が５０である場合に良好な結果が得られるが、用いる粒子の数は１０ないし１００個の粒子の範囲とし得ると判断した。粒子の数、特徴サイズおよびダイナミックレンジに関する結果は図１０に見出される。作製するのに最も簡便な粒子は金粒子である。しかしながら、他の金属および非−金属も用いることができる。粒子に関する必須の基準は、それが強力な光散乱および反射特徴を示すことである。金は用いる金属の典型的な例であり；強力な光散乱および反射特徴を示す非−金属の例には、大部分の半導体材料および半金属が含まれる。前記の散乱標識をスキャンすることによって発生する信号は蛍光標識を用いて発生する信号よりも大きいため、本発明は、例えばＬＥＤ、アーク灯およびレーザーダイオードのごとき励起用の弱い光源を用いて利用することができる。
【００２３】
本発明によれば、光散乱粒子は試料に最初に付着させることができない。その代わりに、例えば、光散乱粒子を抗体で標識し、標的試料をその抗体に対して相補的な抗原で標識する。典型的には、標的はビオチンで標識する。光散乱粒子はストレプトアビジンまたはヤギ抗−ビオチン抗体で共有的に標識する。
【００２４】
示したごとく、本発明者らは反射モードイメージング単独で最良の結果を達成し得ることを見出した。一般的にいえば、粒子を互いから独立させた場合、それらは全方向に等しく光を散乱する傾向がある。しかしながら、本発明者らは、粒子は試料の最も稠密な領域で互いにクラスター化する傾向があることを注記する。クラスター化は１個／μｍ2領域未満の密度においても存在する。この粒子のクラスター化は、全方向で光を反射するというよりも入る光が出る光に対して相反関係になるように、より鏡面様式で光を散乱させるより鏡−様に作用する傾向がある透明アレー基体上の平面アレーで島を生成する。図５ａおよび５ｂに図示するこの現象は、得ることができるダイナミックレンジを大きく制限している。
【００２５】
さらに、本発明者らは、入射光の角度が検出角度と同一である粒子の反射モードイメージングを見出した。本発明による反射モードイメージングを用いれば、優れたスキャン機器感度を生じるダイナミックレンジの増強ならびに使用の簡便性が供される。図７は表面垂線に対して０°および３０°の角度の照射を用いてイメージングした場合（各々、散漫散乱モード反射および反射モードイメージングという）に得られた強度における差異を示すグラフである。
【００２６】
色彩多重発色（ｃｏｌｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）は、各粒子のピーク散乱波長に対応するように選択した光源によって励起した異なるサイズまたは組成の粒子を用いることによって達成することができる。散乱バンド幅は広く、よってクロストークを最小限化し、散乱最大の間の波長スペクトル分離は好ましくは用いるバンドパスフィルターの幅の２倍とすべきである。より広いバンドパスは信号の増大を生じる。採取検出器も同一のバンドパスフィルターを用いて濾す。球形散乱標識は散乱の際の入射光の偏光を実質的に維持し、偏光方向は粒子の方向ではなく入射光子の偏光に依存する。したがって、各励起チャンネルを直交的に偏光することができる。直交偏光はチャンネル間のクロストークを低減するであろう。チップ上の欠陥、傷および汚染物も光を散乱し、検出信号における雑音を出すであろう。しかしながら、散乱のスペクトルは粒子サイズの関数であり、欠陥は異なる外形を有し、したがって異なる散乱スペクトルを有するにちがいない。したがって、検出チャンネルで受光した信号を相関させて、バックグラウンド散乱ノイズを最小限化することができる。
【００２７】
ガラス／空気およびガラス／水界面からの反射は散乱信号と同程度に強力にすることができる。典型的には、ガラス／空気界面からの反射は最も強力である。加えて、プラスチック製であるカートリッジの背面からかなりの散乱が発生する。この反射は光学系の励起および／または採取ボリュームを低下することによって空間的に排除しなければならない。意義深いことに、本発明者らはオフ−アクシス照射がこの反射を効果的に排除することを見出した。オフ−アクシス照射を用いれば、投光照射およびＣＣＤ、ビデオカメラ、フィルムほかのごとき広視野イメージングを用いるいずれのイメージング方法に対しても、バックグラウンド干渉が顕著に低減される。
【００２８】
図６は、本発明のスキャナー結合構造の具体例を示している。本発明者らは、優れた深度分解能を供する機器構成要素の新規な組み合せを発見した。２つの光源、そのうちの１つは反射モード光源として作用し、もう１つは散漫散乱光源として作用する、が該装置に配されている。照射は界面からの望ましくない反射を空間的に排除するのに十分に狭い線に集束される。本発明の機器には励起用の集束系およびビーム形成光学構成が含まれていてもよい。
【００２９】
散乱光を集め、平行とし、所望により偏光アナライザーおよびバンドパスフィルターを通過させてもよい。しかしながら、単なる設計上の好みである偏光子およびバンドパスフィルターを用いなくても良好な結果を得ることができる。集める深度は５００μ未満のＦＷＨＭに維持して、ガラス／空気およびプラスチック／水性界面からの散乱および反射を排除すべきである。その結果、本発明の機器は他の界面、例えばガラス／空気界面からの散乱光を集めることを回避し、優れた深度分解能を許容する。本発明を用いれば、ＤＮＡ表面から出る光を集め、他の表面からの散乱光を排除し、優れた感度を生じる。
【００３０】
単一の検出器、線形ＣＣＤアレーを用いて散乱光イメージを電気信号に変換し、各フィルター／アナライザアセンブリを移動ステージまたはホイールによって適所に移動させることができる。多重線形または領域（ａｒｅａ）ＣＣＤアレーを用いることもできる。標識表面は移動ステージを用いて入射ビームを横切ってスキャンする。検光器からの電流を電圧に変換し、それをＡ／Ｄコンバータによってデジタル化する。ついで、そのデジタル信号をイメージとしてコンピュータに保存する。コンピュータは機器のすべての機能を制御する。
【００３１】
本発明の機器で光散乱および反射検出を用いる場合には、ダイナミックレンジを向上させることが可能である。１００ｎｍの金粒子による光散乱および反射はおおよそ等方性であり、粒子が結合する界面からの鏡面反射を排除する採取角度を選択することを可能とし、それによって低い粒子密度で良好な信号−バックグラウンド比を供することができる。コロイド状金を検出するためのプロトタイプ機器は、アレー表面垂線から４５°の照射および表面垂線に沿った検出、またはその逆を利用する。
【００３２】
走査型電子顕微鏡写真と４５°のスキャン角度を利用する光散乱イメージの相互関係は、粒子当たりの有効散乱断面が約５個／μｍ2まで一定であることを確立し、その上ではそれはかなり鋭敏に落ちる。電子顕微鏡によってこの挙動が高密度の粒子の平面凝集が形成された結果であることが明らかになった。凝集サイズが増大するにしたがって、散乱の方向依存性は、独立した粒子のほぼ等方性の散乱特性から金金属の平面層の純鏡面反射特性へと変化する。散乱光は鏡面反射角度上に集中した円錐部にますます“濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）”されるようになり、鏡面反射角度から離れた観察角度における粒子密度に対しての見かけの飽和に通じる。このダイナミックレンジ飽和は、反射モードイメージングを用いることによって実質的に低下することが見出されている。
【００３３】
図９は投光照射散乱モードイメージングを用いてフィルムに記録したイメージであり、本発明で用いる強力な光散乱粒子がいかにして光を散乱するかを示している。図９は、単純なカメラを用いて粒子の空間分布を記録することができることも示している。
【００３４】
本発明者らは、等しくかつ反対の角度、すなわち反射と採取の法則に従って照射を用いることは、蛍光イメージングに関して信号線形のほぼ完全な回復を示すことを見出した。その照射法を特定の適用、例えば遺伝子発現のごとき低信号適用に応じて作ることもできることは、拡散モードに有利となり、高信号適用は反射モードから恩恵を受け得る。
【００３５】
先に注記したごとく、オリゴヌクレオチド・アレーに対するハイブリダイゼーションによる試料の分析は生物学における広範な適用を見出しつつある。アレーに対する核酸結合の検出は、分析物ＤＮＡの蛍光標識および共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡によって慣例的になされている。本発明は散乱光に対して強力な能力を有する材料で標識した試料をイメージングするための新規な装置および方法を提供する。
本発明者らは、本願明細書中に参照したすべての特許および刊行物を出典明示して本明細書の一部とみなす。
【図面の簡単な説明】
【図１】  内面全反射検出技術を図示する透明アレー基体の断面図である。
【図２】  本発明による２励起経路の反射イメージング技術を示す図である。
【図３】  本発明による２検出経路の反射イメージングを示す図である。
【図４】  蛍光イメージング、散乱モードイメージング、および反射モードイメージングを用いて得られた結果を比較するグラフである。
【図５ａ】  粒子を粗に充填した場合の粒子の光散乱／反射特性を示す図である。
【図５ｂ】  粒子を稠密に充填した場合の粒子の光散乱／反射特性を示す図である。
【図６】  本発明によるスキャニング機器を示す概略図である。
【図７】  散漫散乱モード反射と反射モードイメージングとの間の差異を示すグラフである。
【図８】  本発明により集めたイメージである。
【図９】  散漫散乱モードイメージングでイメージした遺伝子プローブアレーを示すカメラで撮影した写真である。
【図１０】  粒子数、特徴サイズおよびダイナミックレンジに関する結果を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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