(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(i)又は(ii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAを含有するベクターで形質転換された酵母によって産生される、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質。
(i) 配列番号３に示されるアミノ酸配列
(ii) 配列番号３に示されるアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号３に示されるアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の(c)又は(d)のDNAを含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子。
(c) 配列番号２に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号２に示される塩基配列からなるDNAとナトリウム濃度が50〜300mM、温度が50〜68℃の条件下でハイブリダイズし、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項４】
請求項２記載の遺伝子とナトリウム濃度が50〜300mM、温度が50〜68℃の条件下でハイブリダイズし、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを含み遺伝子。
【請求項５】
遺伝子が、ムコール属に属する微生物由来のものである請求項２〜４のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項６】
ムコール属に属する微生物がムコール・ヒエマリスである請求項５記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを採取することを特徴とするエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子に関するものである。詳しくは該遺伝子がMucor属由来の遺伝子に関するものである。更に本発明は、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該プラスミドにより形質転換された生物、該形質転換体を用いた新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖タンパク質は動植物の組織、真核微生物の細胞膜、壁などに広く存在している。
近年、糖タンパク質の糖鎖が、細胞の分化、癌化、細胞間の認識などの機構に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあり、その機構解明のため糖鎖の構造と機能との相関について研究が進められている。その目的達成のための手段として、糖タンパク質から糖鎖を切り出す際、あるいは糖鎖の構造の同定の際に様々なグリコシダーゼが用いられている。その中でも、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質に存在するアスパラギン結合型糖鎖（N-結合型糖鎖、N型糖鎖）に作用して、糖鎖中に存在するジアセチルキトビオース部分を切断し糖鎖を遊離する作用を有する。
【０００３】
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質の糖鎖部分をタンパク質部分より遊離することができるため、糖タンパク質糖鎖の構造、機能の解析に重要であると考えられる。
アスパラギン結合型糖鎖は、その構造から高マンノース型（マンナン型糖鎖）、ハイブリッド型及びコンプレックス型に分類される。
【０００４】
従来知られているエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼとしては、Endo H（A. L. Tarentino and F. Maley, １J. Biol. Chem.０, 249, 811 (1974)）、Endo F（K. Takegawa, et al.,１Eur. j. Biochem.０, 202, 175 (1991)）、EndoA（K. Takegawa, et al.,１Appl. Environ. Microbiol.０, 55, 3107 (1989)）等が挙げられるが、これらの酵素は特定の構造の糖鎖に対してのみ作用し、また糖タンパク質に対しては変性剤の存在下でなければ作用しない。
【０００５】
ムコール・ヒエマリス(Mucor hiemalis)由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、高マンノース型（マンナン型糖鎖）、ハイブリッド型のみならず、コンプレックス型についても三分岐複合糖鎖まで切断能があり、また脱シアル型であれば四分岐複合糖鎖まで切断能があり、さらに、タンパク質を変性処理することなく、糖タンパク質から糖鎖を遊離することができることが知られている（S. Kadowaki, et al.,１Agric. Biol. Chem.０, 54, 97 (1990) ）。従って、ムコール・ヒエマリス由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質の糖鎖及びタンパク質の機能的、生理的役割を研究する上で有用であるといえる。
【０００６】
一方、酵母由来のマンナン型糖鎖からヒト適応型糖鎖に変換することは物質生産の面では非常に意義があることである。その変換方法としては、酵母の糖鎖生合成系を遺伝子操作により改変するというin vivoでの変換とともに、トランスグリコシレーション反応を利用したin vitroでの変換が考えられる。糖変換を目的とするエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの特性として、１）基質特異性としてマンナン型、複合型の両方に対して切断能力を持つこと、２）分解反応の逆反応であるトランスグリコシレーション反応を行う能力を持つことが要求される。従って、Mucor hiemalis由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは上記変換を行うためにふさわしい酵素であるといえる。
【０００７】
なお、本発明者らは、酵母型糖鎖をヒト適応型に変えることができるMucor hiemalis由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを用いた糖鎖変換技術を提案している（特開平7-59587号公報）。
【０００８】
以上の様な糖鎖変換を行うためには大量かつ精製度の高い酵素標品が必要となる。この場合、カビの菌体を用いた従来の育種法により酵素生産性の向上を目指すことも考えられる。しかし、従来の育種方法は、主として、紫外線や変異誘発剤によって得られる変異株から選択する方法に限られていたため、安定な変異体を単離するのが困難であった。また、従来法による育種の場合、好まざる形質変化を伴うことも多い。更に、一般的にカビは様々なタンパク質分解酵素を生成するため、糖変換を目的とした酵素を生産するには好ましいものではない。従って、これらの問題点を除去するには多段の精製ステップを踏まねばならないため、作業が繁雑となり、かつ酵素の収量も少ない。例えば、毛カビの一種であるMucor属に属する微生物を培養し、その培養上清より酵素の精製を行っても、プロテアーゼの混入を除くことができず、かつ菌体の酵素生産性が低いため大量調製をすることが困難であり、実用上の価値は少なかった。
【０００９】
以上のことから、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを大量生産するためには、該酵素の遺伝子を取得し、遺伝子工学的にそれを生産することが望まれている。さらに、遺伝子を取得出来れば、蛋白工学の技術を用いて、耐熱性、耐pH性の向上、反応速度が増大された酵素を得ることも期待できる。しかしながら遺伝子クローニングを試みられているが現在までにその報告はない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、公知エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの部分アミノ酸配列情報をもとに、当該酵素の生産菌であるムコール・ヒエマリス(Mucor hiemalis)から調製したcDNAライブラリーより当該酵素をコードする遺伝子を取得することに成功し、さらに酵母での発現にも成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質である。
(a) 配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号３に示されるアミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質
【００１３】
さらに、本発明は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子、及び該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子である。
(a) 配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号３に示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質
【００１４】
さらに、本発明は、以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子である。
(c) 配列番号２に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号２に示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
上記遺伝子としては、ムコール属に属する微生物（例えばムコール・ヒエマリス）由来のものが挙げられる。
【００１５】
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを採取することを特徴とするエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを生産する菌を培養し、得られる培養物からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを精製した後、該酵素の部分アミノ酸配列から縮重プローブを設計し、PCRを行うことにより該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、さらにエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを生産する菌のcDNAライブラリーより該酵素をコードする遺伝子をクローニングすることを特徴とする。また、本発明は、クローニングされた遺伝子をベクターに組込んで組換えベクターを得るとともに、該組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることを特徴とする。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養することにより、大量にエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを生産することを特徴とする。
【００１７】
１．エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを生産する菌の培養
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを生産する菌としては、ムコール属(Mucor属)に属する菌体、好ましくはムコール・ヒエマリス(Mucor hiemalis)、より好ましくは工業技術院生命工学技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に寄託されているMucor hiemalis(受託番号FERM BP-4991)が挙げられる。
【００１８】
これらの菌株の培養に用いる培地組成は通常の微生物の培養に用いられるものであればどのようなものでもよい。
炭素源としては、例えばグルコース、シュークロース、マンノース、ガラクトース、マルトース、可溶性デンプン、デキストリン等の糖質、窒素源としては酵母エキス、トリプトン等が挙げられる。無機塩としては上記の窒素源に含有する無機塩の他に、各種ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩等の塩類が用いられ、場合によってはビタミン類などを添加してもよい。
【００１９】
培養は培地を通常の方法で滅菌し、菌株を接種後、20〜30℃、pH５〜７で２〜４日間振とう又は通気撹拌培養を行う。
本発明においては、温度が２５〜３０℃、pHが６、炭素源としてガラクトース、窒素源として酵母エキス、トリプトンを用い、炭素源、窒素源の濃度がともに２〜３％、炭素源と窒素源との比が２：３で３〜４日間、良好な通気条件で培養することがより好ましい。このような培養条件で培養した場合は、酵素の生産量が最大となり、公知の方法〔S. Kadowaki, et al.,Agric. Biol. Chem.        , 54, 97 (1990) ;グルコース0.5％、酵母エキス１％、ペプトン１％〕と    比較して約１０倍の酵素生産性を得ることができる。
なお、本発明においては、微生物を培養する際に通気条件を確保するため、ジャーファーメンターを用いることが好ましい。
【００２０】
２．エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの精製
上記菌株が生産するエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、以下の活性の保持を特徴とするものである。すなわち、糖タンパク質に存在するアスパラギン結合型糖鎖に作用して、糖鎖中に存在するジアセチルキトビオース部分を切断し、糖鎖を遊離する活性で特徴付けられる。
【００２１】
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの精製は、公知の分離、精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ-ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
【００２２】
本発明においては、前述の通り公知の方法(S. Kadowaki, et al.,１Agric. Biol. Chem.０, 54, 97 (1990))を改良した培養法を採用し、かつ多段の精製ステップを経ることによりエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを効率よく精製することができ、遺伝子を取得するために必要なアミノ酸配列を得る十分量のタンパク質を得ることができる。得られる酵素は、酵素精製の結果、及び後述の遺伝子解析の結果、分子量約85,000で単一の遺伝子産物によって構成され、遺伝子の翻訳後の限定分解を経て少なくとも分子量約60,000及び14,000のペプチドを含む２つ以上のサブユニットから構成されることを見出した。
【００２３】
３．新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニング
Mucor hiemalisより得られるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは少なくとも２つ以上のペプチドより構成されていることがわかった。
一般に、ある特定のタンパク質をコードする遺伝子を単離する場合、タンパク質の部分アミノ酸配列を決定し、その縮重コドンからなる混合オリゴヌクレオチドをプローブとして、遺伝子ライブラリーから目的の遺伝子を単離することが可能である。また、本発明において実施したようなPCRによる部分断片の取得後、その断片をプローブとして遺伝子ライブラリーから目的の遺伝子を単離することも可能である。
【００２４】
しかしながら、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、２種類以上のサブユニットからなるヘテロオリゴマー分子であるため、それぞれのサブユニットがそれぞれ異なる遺伝子に独立してコードされる可能性がある。また、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼがひとつの遺伝子から由来するにしても２つのサブユニットをコードする領域が構造遺伝子のなかでどのような位置関係となっているかなど、その構造については明らかではない。
【００２５】
そこで、発明者らは２つのサブユニットの部分アミノ酸配列を決定し、さらにPCRによる部分断片の取得の後、該断片をプローブとしたcDNAのクローニングに成功し、遺伝子構造を解析することによって、これら２つのサブユニットが同一の遺伝子にコードされることを明らかにした。すなわち、新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、該酵素をコードする遺伝子から１つのポリペプチドとして生成され、部分分解を受けることにより２つ以上のサブユニットへとプロセスされていることが明らかにされた。
【００２６】
本発明の遺伝子は、例えば以下のようにしてクローニングされる。
(1) エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニング
本発明において、新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼをコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片の具体例としては、図２に示される制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片が挙げられる。この断片は、Mucor属に属する菌体、好ましくはMucor hiemalis株、より好ましくは工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-４９９１の番号のもとに寄託されているMucor hiemalis株より調製されるmRNAを鋳型としたcDNAライブラリーから遺伝子工学的な手法を用いて単離することができる(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatisら、 Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))などに記載の方法を参照）。
【００２７】
mRNAの調製は、通常の手法により行うことができる。例えば、mRNAの供給源であるMucor hiemalisを培養した後、市販のキット（ISOGEN（ニッポンジーン社））で処理して全RNAを得、市販の精製キット（mRNA Purification Kit （Pharmacia Biotech））を用いて精製することができる。なお、mRNAの調製にはmRNAの分解を抑制する意味で培養時間を短くすることが好ましい。
【００２８】
このようにして得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。得られた二本鎖cDNAを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。得られる組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、cDNAのライブラリーを得ることができる。
【００２９】
ここで、大腸菌の形質転換は、Hanahanの方法[Hanahan,D.： J. Mol. Biol. 166：557-580(1983)]などに従って行うことができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合はテトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばλファージ等を用いることもできる。
【００３０】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のDNAを有する株を選択(スクリーニング)する。スクリーニング方法としては、例えば、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのアミノ酸配列に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う方法が挙げられる。例えば、鋳型DNAとしては、ゲノムDNA、又は前記mRNAから逆転写反応により合成されたcDNAが挙げられ、プライマーとしては、例えばセンス鎖についてはアミノ酸配列：PSLQLQPDDK (配列番号４）に基づいて合成した5'- CARTTRCARCCNGAYGAYAA-3'(配列番号５)及びアミノ酸配列：SYRNPEIYPTDQNIK (配列番号６）に基づいて合成した5'-CCHACNGAYCARAAYATYAA-3' (配列番号７)を用いることができる。また、アンチセンス鎖についてはアミノ酸配列:
SYRNPEIYPTDQNIK (配列番号６）に基づいて合成した3'-GGDTGNCTRG TYTTRTARTT-5'(配列番号８)及びアミノ酸配列：GQRFNHRESHDVETEI (配列番号９)に基づいて合成した3'-TTYCCDGTYGCDAARTTRGT -5'(配列番号10)を用いることができる。但し、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではない。
このようにして得られたDNA増幅断片を、32P、35S又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のcDNAライブラリーを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００３１】
(2) 塩基配列の決定
得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はジデオキシ法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-ELMER社製377A DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
【００３２】
配列番号１にエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の全配列を示す。このうち、本発明の遺伝子の好ましい具体例としては、配列番号１に示される塩基配列の71番目から2305番目までの塩基配列（配列番号２）が挙げられる。また、本発明の遺伝子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列又は後述する等価配列を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列をもつもののほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体をも包含するものである。
【００３３】
なお、等価配列を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法などを利用して調製することができる。すなわち、Kunkel法若しくは Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）、Mutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００３４】
また、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子には、配列番号1又は２に示される塩基配列からなるDNAのほか、該DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が50〜300mM、好ましくは150mMであり、温度が50〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
【００３５】
一旦エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１）が確定すると、該塩基配列の71番から2305番までの配列を有するＤＮＡ断片（オープンリーディングフレーム）の塩基配列が定まっていることから（配列番号２）、その後は化学合成によって、又は当該オープンリーディングフレーム（配列番号２）の5'および3'末端の塩基配列（例えば5'-ATGCCTTCACTTCAATTGCA ACC-3'(配列番号11）及び5'-CTAGTTTAATGACAAATCTATGC-3'(配列番号12）)をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいはエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を得ることができる。
【００３６】
なお、本発明の遺伝子を含有するプラスミドpZL-Endo（後述する実施例３参照）は、大腸菌E.coli DH10Bに導入され(名称：DH10BpZL-Endo)、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成10年4月28日付でFERM BP-6335として寄託されている。
【００３７】
本発明において、組換え新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの好ましい具体例としては、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはその等価配列を含んでなるポリペプチドが挙げられる。ここで、「等価配列」とは、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、少なくとも1個のアミノ酸の挿入、置換若しくは欠失又は両末端への付加がなされたものであって、且つ上記した新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を依然として保持する配列をいう。その等価配列における新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性の保持とは、その活性を利用した実際の使用態様において、配列番号３に示される配列を全て有するポリペプチドと同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいうものとする。このような等価配列は、配列番号３に示されている配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難なしに選択し、製造可能であることは明らかである。例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号３に示されるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加又は挿入してもよく、あるいは、配列番号３に示されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。従って、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列において２番から７４４番までに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(配列番号３に示されるアミノ酸配列の第１番目のメチオニンが欠失したもの）も本発明のタンパク質に含まれる。
【００３８】
ここで、本発明による部分アミノ酸配列分析、および遺伝子構造解析によって前駆体ポリペプチドが少なくとも配列番号３に示されるアミノ酸配列の５１０番目のヒスチジン、及び６２７番目アスパラギン酸のアミノ酸のＣ末端側で切断されることにより、天然体の２つ以上のサブユニットが生じたものであることが明らかにされた。
【００３９】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明においては、本発明の遺伝子を含んだＤＮＡ分子、特に発現ベクターが提供される。このＤＮＡ分子は、ベクター分子に本発明による新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。従って、本発明の新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に発現ベクターの形態として宿主細胞の形質転換を行なえば、宿主細胞において本発明の新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを産生させることができる。
この発明によるＤＮＡ分子の作成は前掲のMolecular Cloning:A Laboratory Manualに記載の方法に準じて行なうことができる。
【００４０】
(1) 組換えベクターの作製
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。
例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ系（pBR322, pBR325等)、ｐＵＣ系(pUC118, pUC119等）のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド（pUB110等)、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系のベクター(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)、あるいは後記する実施例で使用されるpG-3-Notが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４１】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を使用することができる。
さらに、本発明の発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有しているものが好ましい。
【００４２】
(2)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、キャンディダ・ボイジニイ(Candida boidinii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の酵母が挙げられる。
【００４３】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母以外に、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1、DH5α、JM109などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MI 114、207-21などが挙げられる。枯草菌にはタンパク質を菌体外へ分泌する株が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。
【００４４】
プロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中でも機能することができるプロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン（lac）、トリプトファンオペロン（trp）等のプロモーターが挙げられる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４５】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・ウティリス(Candida utilis)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、酸性フォスファターゼ（PHO）、ガラクトース遺伝子（GAL）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（GAPDH）等のプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、AOX1プロモーター等を好ましく用いることができる。
【００４６】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００４７】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００４８】
４．本発明のタンパク質の生産
本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するものである。
本発明のタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４９】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
【００５０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で12〜72時間行う。培養期間中、pHは4〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００５２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で2〜10日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。
【００５３】
組換え新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの精製は、公知の分離、精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ-ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
【００５４】
本発明においては、後記する実施例に示すように、サッカロミセス・セレビシエを宿主としてGAPDHプロモーターの支配下にこの遺伝子を発現させたところ、細胞抽出液中に高い酵素活性が認められた。このことにより、組換え体において本発明の遺伝子を発現することによって活性型の新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを大量に生産可能であることが示された。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。なお、操作手順は特に記載しない限りMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatisら、 Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))に記載の方法に従った。
【００５６】
〔実施例1〕酵素活性の測定
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性は基本的に、S. Kadowaki, et al.,１Agric. Biol. Chem.０, 54, 97 (1990) に示された方法に従った。すなわち、ダンシル化されたヒトアシアロトランスフェリングリコペプチド（DNS-GP）を基質として用い、pH6.0のリン酸カリウム緩衝液中37℃で反応を行い、以下に示す条件で薄層クロマトグラフィー(TLC)、またはHPLCにより測定した。
【００５７】
TLCでの分析条件
展開相：HPTLCシリカゲル60（メルク）
溶媒：ブタノール：酢酸：水＝２：１：１
検出：蛍光法による検出
HPLCでの分析条件
カラム：TSK-gel ODS80TM（東ソー）
移動相：２５mMホウ酸ナトリウム緩衝液pH７.５+１１％アセトニトリル
カラム温度：５０℃
流速：０.５ml/分
検出器：蛍光検出器
活性の定義は上記HPLCによる測定で条件下で、１分間に１μmolのダンシル化アセチルグルコサミンを生成する酵素量を１ユニットと定義した。
【００５８】
〔実施例2〕Mucor hiemalisの培養
５００ml容坂口フラスコに１００ml培地（ガラクトース２％、酵母エキス３％）を仕込み、スラント３〜５分の１本分のMucor hiemalis胞子を接種し、２８℃で２日間培養を行った。mRNAの調製にはこの培養液を吸引ろ過して分離した菌体を用いた。
また酵素の調製については、上記培養液を培養後３リットル容ジャーファーメンターに２リットルの培地を仕込んだものに移し替え、２８℃、回転数３００〜４００rpm、通気量２リットル/分の条件で４日間培養を行った。
【００５９】
〔実施例3〕新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの精製
実施例２で得られた培養液４リットル分（３リットル容ジャーファーメンター培養２回分）を吸引ろ過して菌体を分離し、限外ろ過（分子量１３０００カット）にて２００mlまで濃縮したものを粗酵素液とした。これを５mMＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア社Q Sepharose FF、５００ml）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、引き続き９００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配でエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを溶離した。活性画分に最終濃度が１Ｍ硫酸アンモニウム、５mMＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７.０）となるように試薬を加え、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（東ソー社 Phenyl-TOYOPEARL 650S２００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に１ｍＭのＥＤＴＡを含む硫酸アンモニウム６００ｍｌを用いて、１Ｍ〜０Ｍの線状勾配でエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを溶離した。
【００６０】
得られた溶離液を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて５mlまで濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）にて洗浄、脱塩した。次に同緩衝液にて平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社Sephacryl S300）に載せ、同緩衝液にてエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを溶出した。
【００６１】
活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）にて洗浄、脱塩した。次に同緩衝液にて平衡化したヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（東ソー社TSK-gel HA1000）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸カリウム（ｐＨ７.０）３０ｍｌを用いて、０Ｍ〜０．３Ｍの線状勾配でエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを溶離した。
【００６２】
活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続きイミノジ酢酸にてpH７.１に調製された２５mMビス-トリス緩衝液で洗浄、脱塩した。次に同緩衝液にて平衡化した等電点クロマトグラフィー（ファルマシア社MonoP）に通した。カラムを同緩衝液で洗浄し、次いで５０ｍｌのイミノジ酢酸にてpH３.９に調製された１０％ポリバッファー７４（ファルマシア社）でエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを溶離した。
【００６３】
活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）で洗浄、脱塩した。次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア社MonoQ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３０ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配でエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを溶離した。
【００６４】
活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）で洗浄、脱塩したものを酵素サンプルとした。なお、各カラムクロマトグラフィーはファルマシア社FPLCを用いて行った。
タンパク質量はバイオラッド社プロテインアッセイキットを用いて、または吸光度（２８０nm）により測定した。タンパク質の分子量、等電点はSDS-PAGE(15-25％グラジエント）、ゲル濾過クロマトグラフィー、IEF-PAGE等により測定した。
Native-SDSPAGE、IEF-SDSPAGEによる２次元電気泳動、及び上記クロマトグラフィーにおける各画分の活性とSDS-PAGE分析の結果から、SDS-PAGE上で少なくとも６０kDa (p60と称する)、及び１４kDa(p14)のバンドが検出された（図１）。
【００６５】
〔実施例4〕新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの部分アミノ酸配列の決定
部分アミノ酸配列分析は岩松（生化学 63、139〜143(1991))の方法により行なった。精製酵素を泳動用緩衝液（１０％グリセロール、２.５％ＳＤＳ、２％ ２-メルカプトエタノール、６２ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６.８））に懸濁させて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、エレクトロブロッティングにより当該酵素をゲルより10cm x 7cmのＰＶＤＦ膜((ProBlot)アプライドバイオシステムズ）へ転写した。エレクトロブロッティング装置としてはザルトブロットＩＩｓ型（ザルトリウス社）を用い、エレクトロブロッティングを１６０ｍＡで１時間行なった。
【００６６】
転写後、当該酵素の転写された部分の膜を切り取り、その一部を直接気相プロテインシークエンサーで分析し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。また残りの膜は約３００μｌの還元用緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸、０.５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）、０.３％ＥＤＴＡ、２％アセトニトリル）に浸し、１ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、アルゴン下で２５℃、約１時間の還元を行なった。これに３.０mgのモノヨード酢酸を０.５Ｎ水酸化ナトリウム液１０μｌに溶かしたものを加え、遮光下で２０分攪拌した。ＰＶＤＦ膜をとりだし、２％アセトニトリルで充分洗浄した後、０.５％ポリビニルピロリドン-４０を含む１００ｍＭ酢酸に浸し、３０分間静置した。こののち、ＰＶＤＦ膜を水で充分洗浄し、１ｍｍ四方に切断した膜を消化用緩衝液（８％アセトニトリル、９０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０））に浸し、アクロモバクタープロテアーゼＩ（和光純薬）を１pmol加え、室温で１５時間消化した。その消化物をＣ１８カラム（和光純薬  Wakosil AR II C18 300Å 2.0X150mm）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（日立 L6200）により分離し、各サブユニットについて７種類のペプチド断片を得た。
【００６７】
ペプチドの溶出溶媒としてはＡ溶媒（０.０５％トリフルオロ酢酸）、Ｂ溶媒（０.０２％トリフルオロ酢酸を含む２-プロパノール/アセトニトリル  ７：３）を用い、溶出は、Ｂ溶媒に関し２〜５０％の直線濃度勾配で、０.２５mL/minの流速のもと４０分間溶出させることにより行なった。
新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ候補タンパク質から得られた断片化ペプチドについてアミノ酸配列分析を行なった。p６０由来の断片をp６０-ＡＰ、p１４由来の断片をp１４-ＡＰと命名した。得られた断片化ペプチドについてのアミノ酸配列決定試験を、気相プロテインシークエンサーＰＰＳＯ-１０型（島津製作所）を用いマニュアルに従って自動エドマン分解法により行なった。
得られた部分アミノ酸配列を表１に記す。
【００６８】
【表１】
表１  エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ候補タンパクの部分アミノ酸配列
0004160652.tif 000002
【００６９】
表１に記載のアミノ酸配列において、アルファベットの小文字で表されたアミノ酸は、アミノ酸配列上、不確定なアミノ酸を意味する。
部分アミノ酸配列に用いたアクロモバクタープロテアーゼＩはリジン残基のカルボキシル基側を特異的に切断する為、以下の配列にＮ末端側に括弧書きでＫ（リジン）を記す。p60-AP-5はＮ末端アミノ酸配列であることが判明したため、括弧書きのＫ（リジン）を除いた。p６０及びp１４のアクロモバクタープロテアーゼＩ消化物については、Ｃ１８カラム（ジーエルサイエンス Inertsil ODS-3 0.5x40mm）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（日立Ｌ6200）をオンライン化した質量分析機（ＰＥ  Sciex API-III）で質量分析も合わせて行なった。分析結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0004160652.tif 000003
【００７１】
表２中、質量（Ｍ+Ｈ＋）において実測値が701.50を有する断片はp60-AP-7、実測値が1541.50を有する断片はp14-AP-3の分子量にほぼ一致し、そのC末端のアミノ酸がＫ（リジン）でないことが分かった。アクロモバクタープロテアーゼＩで消化した断片は、その酵素の基質特異性により、サブユニット自身のC末端断片以外の断片はＫ（リジン）がC末端アミノ酸残基となることから、この断片化ペプチドがp６０及びp１４のサブユニットのC末端断片であると推定した。
決定されたp６０及びp１４の部分アミノ酸配列をタンパク質データベースBLASTPを用いてホモロジー検索を行ったところ、得られた配列は新規であることが示された。以上の結果からp６０及びp１４をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ候補とし、遺伝子クローニングを行った。
【００７２】
〔実施例5〕Mucor hiemalis株cDNAライブラリーの作製
まず実施例２で得られた菌体５ｇよりISOGEN（ニッポンジーン社）を用いてトータルRNAを抽出した。抽出したトータルRNAからmRNA Purification Kit （Pharmacia Biotech）を用いてmRNAを精製した。mRNAよりSuperScriptTM  Lambda System for cDNA Synthesis and λ Cloningキット（GIBCO BRL）を用いてcDNAを合成し、Sal Iアダプターを接続した後、λZipLoxTMSal I-Not I Arms（GIBCO BRL）に接続（ライゲーション）した。Gigapack III Gold Packaging Extract（Stratagene）を用いてパッケージングを行い、E. coli Y1090株に感染させcDNAライブラリーを完成させた。
【００７３】
〔実施例6〕新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼcDNAのクローニング
部分アミノ酸配列p60-AP-5、p60-AP-6、p60-AP-11をもとにＰＣＲプライマーを設計した。以下にその配列を示す。使用している記号は全てIUPAC-IUBに基づく。
p60-AP-5
p60-AP-5F      5' CARTTRCARCCNGAYGAYAA 3'（センスプライマー）（配列番号５）
p60-AP-6
p60-AP-6F      5' CCHACNGAYCARAAYATYAA 3'（センスプライマー）（配列番号７）
p60-AP-6R      3' GGDTGNCTRGTYTTRTARTT 5'（アンチセンスプライマー）（配列番号８）p60-AP-11
p60-AP-11R     3' TTYCCDGTYGCDAARTTRGT 5'（アンチセンスプライマー）（配列番号10）
【００７４】
Mucor hiemalis培養菌体よりフェノール法によりゲノムDNAを調製し、ゲノムPCR（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分、３０サイクル）を行ったところ、特異的に増幅するバンドが確認された。p６０についてはp60-AP-5Fとp60-AP-11Rとのプライマーの組み合わせで１.７kb、p60-AP-5Fとp60-AP-6Rとのプライマーの組み合わせで１.５kb、p60-AP-6Fとp60-AP-11Rとのプライマーの組み合わせで０.２kbのPCR断片が得られた。この断片についてpCR-Scriptクローニングキット（Strategene）を用いてpCR-Script Ampにサブクローニングを行なった。制限酵素消化による解析でp60-AP-5Fとp60-AP-11Rとの増幅断片がp60-AP-5Fとp60-AP-6R、及びp60-AP-6Fとp60-AP-11Rとの増幅断片を含んでいることが推定されたので、p60-AP-5Fとp60-AP-11Rとの増幅断片の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社PRISM Ready Reactionキット、及び同社PRISM３７７DNAシークエンサーを用いて行った。遺伝子解析は日立ソフトウェアエンジニアリングDNASIS等を用いて行った。
【００７５】
その結果、p60-AP-5Fとp60-AP-11Rとの増幅断片は、決定された他の部分アミノ酸配列を含んでいた。よってこのDNA断片はp６０遺伝子の一部であることが判明したので、更にPCR増幅断片の内側の配列を元に新たにDNAプライマーを作成し、実施例５で得たmRNAを鋳型とし、Access RT-PCR System（Promega）を用いてRT-PCR（条件はゲノムPCRに同じ）を行った。新たに作成したDNAプライマーの配列は以下のとおりである。
p60-AP-5NF     5' CACTTAAGTCTATGAATGAG 3'（センスプライマー）（配列番号13)
p60-AP-6NR     3' CGATAGCTTTAGGTCTCTAA 5'（アンチセンスプライマー）（配列番号14)
【００７６】
その結果、約１.２ｋｂの断片が増幅された。増幅された断片の塩基配列を決定したところイントロンを含まない断片が得られたので、この断片をプローブとしてcDNAのクローニングを行った。プローブはMegaprime DNA labelling systems (Amersham）を用いα-32P dCTP(110TBq/mmol)でラベルを行った。
実施例５で得られたcDNAライブラリーからの遺伝子全長の取得はプラークハイブリダイゼーションにより行った。その結果、２０万個プラークから５個のポジティブクローンが得られた。そのうち４個のクローンについて２次スクリーニングを実施してシングルプラークを得た。更にプラークから得られたファージ液をE. coli DH10B株に感染させ、ファージからpZL1由来のプラスミドを回収した。これらのクローンについて制限酵素解析を行い、上流領域を最も長く含むクローンについて塩基配列の解析を行なった。なお、このプラスミドをpZL-Endoと命名する（図２）。
【００７７】
挿入されていた約２.３ｋｂのSal I-Not I断片について塩基配列の決定を行なった。すなわち、pBluescript II KS+ (Strategene)、またはpUC118(宝酒造)に細分化した断片をサブクローニングし、さらにエキソヌクレアーゼIIIおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた連続した欠失変異体を作製することにより、種々の変異欠失をもつプラスミドを作製し、DNAシークエンサーを用いて2370bpからなるSal I-Not I 断片の配列を決定した（図３〜４、配列番号１）。
【００７８】
予想される構造遺伝子の領域の解析を行なったところ、744個から構成されるアミノ酸配列（推定分子量８５kDa）をコードするオープンリーディングフレームが存在し（図５〜７、配列番号2）。このアミノ酸配列は決定したp６０、及びp１４の部分アミノ酸配列の全てを含んでいることがわかった。p60-AP-5のN末端側のとなりのアミノ酸がリジンではなくメチオニンであったことから、このメチオニンをコードするATGが翻訳のスタートコドンであることを確認した。よって、本発明の酵素のN末端はプロリンであることが明らかにされた。
【００７９】
一方、質量分析の結果と同様に、p14-AP-3が本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質のC末端であることがわかった。また質量分析の結果とも併せp１４のN末端の少なくとも一種は、配列番号２に示しているアミノ酸配列の６２８番目のセリンであると推定した。
以上のことから、本発明の遺伝子は５'領域にp６０、３'領域にp１４をコードすることがわかった。アミノ酸配列からN末端シグナル配列は見い出されなかったため、本発明の酵素は細胞内タンパク質であると考えられるが、図１において複数のバンドが存在することから、本発明の酵素は、菌体の溶菌が原因と思われるタンパク質分解酵素の作用を受けていると考えられた。
【００８０】
〔実施例7〕エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
本実施例では、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子、及びGAPDH遺伝子プロモーター-PGKターミネーターを含む、TRP1遺伝子を相補するサッカロミセス・セレビシエ組み込み用発現ベクターの構築を行った。
実施例３で確認した744アミノ酸をコードしているオープンリーディングフレームを得るために、両端にNot Iサイトを付加したN末端、C末端のアミノ酸配列に相当するDNA配列に基づくDNAプライマーを合成し、pZL-Endoを鋳型としてＰＣＲを行ない増幅断片を得た。以下にセンス、アンチセンスのプライマー配列を記す。
【００８１】
Endo-Not-F（センスプライマー）
5' GGGGCGGCCGCTTTTATTTTACATAAATATGCCTTCACTTC 3' （配列番号15）
Endo-Not-R    （アンチセンスプライマー）
5' CCCGCGGCCGCCTAGTTTAATGACAAATCTATGCTACC 3'（配列番号16）
増幅された断片をアガロースゲル電気泳動にて分離後、Prep-A-Gene DNA Purification System（Bio-Rad）を用いて回収、精製した。更にこの断片をNot Iで消化後、精製し、pBluescript II KS+のNot Iに挿入し、pBlue-Endo-Notを作製した。
【００８２】
新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子はカビ由来の遺伝子であることから酵母での発現が適していると考え、サッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子のプロモーター、３-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）遺伝子ターミネーター、及びトリプトファン合成遺伝子TRP1遺伝子を含む、trp1遺伝子を選択マーカーとするサッカロミセス・セレビシエ用の発現プラスミドを、発現ベクターpG-3（Methods in Enzymology Vol. 194 p.389）をベースに作製した。pG-3をBamH Iで消化し、クレノウ処理により平滑末端とし、Not Iリンカーを付加してpG-3-Notを作製した。
前述のpBlue-Endo-NotをNot Iで消化し、約２.３kbの挿入断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製し、これをpG-3-NotのNotI部位に挿入し、pGEndo-SCを構築した（図８）。
【００８３】
〔実施例８〕新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのサッカロミセス・セレビシエでの発現
宿主として酵母サッカロミセス・セレビシエ  YPH５００株（Strategene）のpep4遺伝子破壊株を用いた。pep4遺伝子破壊株についてはSikorski, R. S.とHieter, Pの方法（Genetics 122巻 19-27 (1989)）により作成した。１０μｇのpGEndo-SCを用いて上記株を形質転換した。形質転換は酢酸リチウム法(WO/95/32289号参照）により行い、形質転換体はトリプトファンを含まない培地プレート（酵母ニトロゲンベース０.６７％、カザミノ酸０.５％、グルコース１％）にて選択した。
【００８４】
得られた形質転換について、菌体内の新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの活性確認を行なった。５ｍＬのYPD培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）中、３０℃で２日間培養した菌について、１５００ｇ、５分間、４℃で遠心を行い培養上清と菌体を分離し、菌体は蒸留水で洗浄した。菌体に、50mMリン酸カリウムバッファー(pH 6.0)と 5mM EDTAとの混合液を１００μリットル加えよく懸濁した。更に５０mgのグラスビーズを加え、激しく攪拌した後遠心し、上清を細胞抽出液とした。
【００８５】
活性測定は、基質としてDNS-GPを用いてTLCまたはHPLCで行った。TLCでの結果を図９に示す。Mucor hiemalis培養上清より精製した酵素と反応させたサンプルと同様に、pGEndo-SC生成物であるダンシル化アセチルグルコサミン(DNS-GlcNAc)と一致するピークが得られた。一方、ネガティブコントロールである、pG-3-Notで形質転換した株の培養上清を用いたものからはDNS-GlcNAcに対応するピークは検出されなかった。そこでpGEndo-SCの細胞抽出液を１０倍濃縮し、脱塩を行ったものを粗酵素として、DNS-GPと反応させ、DNS-GlcNAcに対応するピークを上記条件のHPLCを用いて分取した。分取したサンプルをエバポレーターで濃縮し、マススペクトル分析を行った。その結果、分取したサンプルの分析結果がDNS-GlcNAcの分析結果と一致することを確認した。従って、pGEndo-SCの挿入断片にコードされている遺伝子産物は、新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼであることが分かった。
表３に培地１ｍＬあたりの本新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの活性（生産量）を示す。この活性はMucor hiemalisの値の48倍であった。
【００８６】
【表３】
表３  新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの活性
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【００８７】
【発明の効果】
本発明により、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの製造方法が提供される。
本発明の遺伝子を含有するベクターを宿主に導入し、遺伝子を発現させることによってエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを効率的、大量に生産することができる。
本発明の酵素は、糖鎖の分析、解析、及び糖鎖の改変を行う上で産業上重要な酵素であり、本発明によって得られた形質転換体は本酵素を著量に生産し、これら酵素を用いる産業界に大いに貢献することができる。
【００８８】
【配列表】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９７】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの精製結果を示す電気泳動写真である。
【図２】新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の全長を含むpZL-Endoの制限酵素地図である。
【図３】新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の全長を含むpZL-EndoのSal I-Not I部位に挿入された断片の全塩基配列を示した図である。
【図４】新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の全長を含むpZL-EndoのSal I-Not I部位に挿入された断片の全塩基配列を示した図である（図３の続き）。
【図５】新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子から推定されるアミノ酸配列、および該アミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である。
【図６】新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子から推定されるアミノ酸配列、および該アミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である（図５の続き）。
【図７】新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子から推定されるアミノ酸配列、および該アミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である（図６の続き）。
【図８】
新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を含むサッカロミセス・
セレビシエ用の発現ベクターpGEndo-SCの構造を表す図である。
【図９】
新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が導入された酵母での該
酵素の発現を示すクロマトグラフの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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