(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・ディエルンホファール ｐ−１０１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４５９）に属する微生物。
【請求項２】
マイコバクテリウム・ディエルンホファール ｐ−１０１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４５９）に属する微生物を、石油系炭化水素類を含有する土壌又は水に接触させることを特徴とする、石油系炭化水素類含有土壌又は水の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、石油系炭化水素を含む土壌や水の生物的な浄化方法及びこれに用いる微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
石油系の炭化水素を含む土壌や水を浄化する技術として、微生物による浄化技術が検討されている〔ウイリアム C. アンダーソン編、『バイオレメディエーション』、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社（1997）：八木修身、バイオサイエンスとインダストリー、Vol.55、p30 (1997)〕。土壌や水中には石油系炭化水素を分解する微生物が含まれていることはよく知られている。しかしながら一般的に微生物による石油系炭化水素の分解速度は比較的遅く、石油系炭化水素を含む土壌や水の浄化を行うためには数ヶ月から数年の期間が必要となっており、短期間で浄化する方法が渇望されているのが現状である。
【０００３】
石油系炭化水素の分解速度が遅い理由としては、石油に含まれる一部の成分、特に分枝構造を有するイソアルカンの分解が遅い点を挙げることができる。石油系炭化水素の微生物分解については、April や、Marinによる特定の微生物による分解〔April T.M., ら、Degradation of hydrocarbons in crude oil by the ascomycete Pseudallescheria boydii (Microascascaceae). Can. J. Microbiol., 44: 270-278. (1998)、Marin M. et al., Study of factors influencing the degradation of heating oil by Acinetobacter calcoaceticus MM5. International Biodeterionation & Biodegradation.  p.69-75. (1996) 〕や、Chaineauや川田らによる土壌に含まれる混合微生物による分解〔Chaineau C.H. et al. Microbial degradation in soil microcosmos of fuel oil hydrocarbons from drilling cuttings. Environ. Sci. Technol. 29: p.1615-1621 (1995) 、川田邦明ら、新潟県内の海岸に漂着した重油中の有機化合物II. 環境化学 7: p.831-840 (1997)〕等をはじめとして多くの検討がなされているが、いずれも、プリスタン、フィタン等の石油系炭化水素を構成するイソアルカンの分解性がｎ−アルカンに比べて低いことを報告している。
【０００４】
この様なイソアルカンは微生物により全く分解を受けない訳ではなく、例えばプリスタンを分解する微生物について、これまでにいくつかの微生物種について報告がされており、プリスタン等のイソアルカンを微生物が分解すること自体は公知である。しかしながら、Pirnikらの報告（Pirnik M.P. et al. hydrocarbon metabolism by Brevibacterium erythrogenes: Normal and branched alkanes. J. Bacteriol. 119: p.868-878 (1974)）にあるように、ｎ−アルカンと、イソアルカンが共存する場合には、ｎ−アルカンの分解だけが起こり、イソアルカンを分解する能力を有する微生物であっても、イソアルカンの分解はなされないと考えられている。
【０００５】
土壌や水中の石油系炭化水素には、ｎ−アルカンとイソアルカンとの両方が含まれるという特徴を有するため、先に述べた様に、イソアルカンの分解は遅くなり、結果として石油系炭化水素による土壌や水の浄化効率を低いものにしている。
従って、本発明の目的はｎ−アルカンとイソアルカンの両者を含む石油系炭化水素を効率良く分解する微生物、及びこれを用いた土壌や水の浄化方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような状況に鑑み、既知の微生物及び未知の微生物を日本国内各地の土壌からスクリーニングした結果、マイコバクテリウム属に属する微生物が石油系炭化水素の中でも特に、イソアルカンに対する分解能力が高く、ｎ−アルカンが共存する環境下においてもプリスタン等のイソアルカンを効率良く分解でき、これを用いれば土壌や水を効率良く浄化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、マイコバクテリウム属に属し石油系炭化水素類を分解する能力を有する微生物を、石油系炭化水素類を含有する土壌又は水に接触させることを特徴とする、石油系炭化水素類含有土壌又は水の浄化方法を提供するものである。
また、本発明は石油系炭化水素類を分解する能力を有するマイコバクテリウム・ディエルンホファールに属する微生物を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の浄化方法に用いられる微生物はマイコバクテリウム属に属し、石油系炭化水素類を分解する能力を有する微生物であれば特に制限されないが、ｎ−アルカン類及びイソアルカン類を含む石油系炭化水素類を分解する能力を有する微生物が好ましい。また、前記の如く土壌や水中に含まれる石油系炭化水素類には、ｎ−アルカンとイソアルカンの両者が含まれているので、本発明に用いる微生物としては、これら両者の共存下におけるｎ−アルカン及びイソアルカンに対する分解率が１００：１〜１：１、特に３０：１〜１：１であるものがより好ましい。ここで、分解率の測定は、ｎ−アルカンとしてｎ−ヘキサデカンを、イソアルカンとしてプリスタン又はフィタンを用いて行なわれる。
【０００９】
また、本発明において石油系炭化水素類とは、ガソリン、灯油、軽油、重油、潤滑油に含まれる炭化水素類を言い、例えば、ｎ−アルカン、イソアルカン、シクロパラフィン、芳香族炭化水素などが挙げられる。また、ｎ−アルカンとしては、炭素数８〜１８のｎ−アルカンが挙げられ、イソアルカンとしては炭素数８〜２０の分枝状アルカン、例えばプリスタン、フィタン等が挙げられる。
【００１０】
本発明の浄化方法に用いられる微生物としては、マイコバクテリウム・ディエルンホファール（Mycobacterium diernhoferl）が好ましく、このうち本発明者らが埼玉県内の土壌から単離したｐ−１０１株が特に好ましい。当該ｐ−１０１株は次の菌学的性質を有する。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
【表２】
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【００１３】
【表３】
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【００１４】
これらの菌学的性質を長谷川武治著：「微生物の分類と同定（上）」改訂版（１９８５）学会出版センター；JOHN P. BUTLER ed.; "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (1986 )、ALBERT BALOWS ed. ; "The Prokaryotes" (1991) International Journal of Systematic bacteriology vol.47 p. 479 - 491 (1997)等に照らし合わせて検討した結果、および、リボソームの小サブユニットのＤＮＡの塩基配列およびその相同性から、ｐ−１０１株はマイコバクテリウム・ディエルンホファールに属すると同定された。しかしながら、マイコバクテリウム・ディエルンホファールに属する微生物にはこれまでに石油系炭化水素の分解性に関する知見はないことから、新規な微生物であると同定しマイコバクテリウム・ディエルンホファール  ｐ−１０１として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４５９）。
【００１５】
本発明に用いる微生物を培養するための培地としては、当該微生物が良好に生育し、かつ、石油系炭化水素の分解を妨げない培地であれは、いかなる組成の培地でもよく、炭素源としては炭素鎖長８から１８のｎ−アルカンやプリスタン、フィタン等のイソアルカン、酢酸等の有機酸を挙げることができる。窒素源は特に制限されず、硫酸アンモニウムや硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素源や、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキス、カゼイン等の有機窒素源が利用できる。更に無機塩類などの微量成分を適宜添加することもできる。
【００１６】
本発明に用いる微生物は１０〜４０℃で好気的に培養すればよく、培地のpHは４〜９とすることが好ましい。
【００１７】
本発明の浄化方法としては、上記微生物を石油系炭化水素類を含む土壌又は水と接触させればよく、この際には土壌改良剤やpH緩衝剤、微生物の増殖に用いられる培地成分などと共に接触させることもできる。より具体的には、石油系炭化水素類を含む土壌又は水中に添加すればよい。使用する微生物は増殖期菌体、定常期菌体のいずれでも良く、培養により得られた培養液をそのまま使用しても、遠心分離機などの装置により集菌してから用いてもよい。更に、凍結乾燥処理や、セライト、カオリン、活性炭等に担持させた状態で用いてもよい。土壌又は水への添加量は、土壌又は水に含まれる石油系炭化水素類の量にもよるが、通常、乾燥菌体重量に換算して、０．１〜５０ｇを土壌ならば乾燥重量１kgあたり、水ならば１Ｌあたり添加するのが好ましい。
【００１８】
本発明においては、前記の微生物を単独で用いることも、複数の微生物を混合して用いることもできる。汚染を受けた土壌や水には多くの場合、すでに多種の微生物が含まれているが、これらの微生物に加えて浄化を行うことも可能である。更に公知の石油系炭化水素分解菌と混合して使用することも可能である。
【００１９】
【実施例】
次に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
菌の取得：
表４に示す培地１を内径２１mmの試験管に１０mL入れ、更に単一炭素源としてプリスタンを１００μＬ添加後滅菌して液体培地を作成した。これに埼玉県内、群馬県内、長野県内で採取した５００試料の土壌をそれぞれ０．５ｇ添加し、試験管振とう機により、３０℃、２５０rpm の条件で好気的に４日間培養を行った。それぞれの培養液を新たな同培地に０．１mL添加し、同様に４日間培養を行った。培養液をそれぞれ滅菌水で１０8倍に希釈し、これを培地１に更に寒天を１リットルあたり１５ｇ加えて調製した寒天平板培地に塗布し、プリスタンを２００μＬ添加して、３０℃にて７日間静置培養を行った。出現したコロニーをそれぞれ白金耳に拾い、上記の液体培地に植菌し、同様に２日間培養を行った。生育の認められた試料については、再び滅菌水で希釈して寒天培地に塗布し、単一なコロニーを形成させた。この様にして、石油系炭化水素に対する分解能力の高い微生物としてｐ−１０１株を取得した。
【００２１】
【表４】
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【００２２】
実施例２
イソアルカンの分解試験：
培地１に、表５に基質として示したイソアルカンを炭素源として容量あたり１％添加した培地を全容２リットルの三角フラスコに２００mL調製した。これにｐ−１０１株を接種して、３０℃、１４０rpm にて７日間好気的に培養を行った。その後、培養液に含まれる残存した基質を測定することによりイソアルカンの分解力を測定した。
【００２３】
基質の残存量は、培養後の培養液から等量のジクロロメタンにより、５cmの振幅で、３００回／分の振とう速度により１時間抽出を行い、ジクロロメタン層をガスクロマトグラフィーにより分析することにより定量して求めた。基質の残存量と添加量を比較して、その減少率から分解率を求めた。その結果、表５に示す通りｐ−１０１株はイソアルカンに対して高い分解能力を有することが示された。
【００２４】
【表５】
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【００２５】
実施例３
ｎ-アルカンの分解試験：
基質として添加したｎ−アルカンが表６に示した基質であること以外は実施例２と同様に試験を行った結果、表６に示す通り、ｐ−１０１株はｎ−アルカンに対しても高い分解能力を有することが示された。
【００２６】
【表６】
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【００２７】
実施例４
ｎ−アルカンとイソアルカンが共存する場合の分解：
基質として添加したｎ−アルカンとイソアルカンを表７に示す割合で同時に添加したこと以外は実施例２と同様に試験を行った結果、表７に示す通り、ｐ−１０１株はｎ−アルカンが共存する環境下においてもに対してもイソアルカンに対して高い分解能力を有することが示された。
【００２８】
【表７】
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【００２９】
実施例５
石油系炭化水素により汚染を受けた土壌の浄化：
篩により２mm以上の組成物を除去した土壌（クロボク土、群馬県榛名山周辺より採取、石油系炭化水素による汚染を受けていない土壌）を乾燥土壌あたり５００ｇ計り取り、これにｎ−アルカンとして２．５ｇのｎ−ヘキサデカンおよびイソアルカンとして２．５ｇのプリスタンを同時に添加して十分に混合し、更に１００mLの３６０mM硝酸アンモニウムを含む５０mM燐酸カリウム緩衝液（pH７．２）を添加して再度十分に混合した。これに予め培養して、遠心分離により集菌したｐ−１０１株を乾燥菌体重量として１０ｇに相当する量をそれぞれ添加して石油系炭化水素分解能力を評価した。また、ｐ−１０１株の添加を行わない以外は同様な試験を対照試験として実施した。すなわち、対照試験はもともと土壌に含まれている一般微生物による石油系炭化水素の分解能力を指し示している。実験は全て３０℃の恒温室内で実施した。３０日間の分解試験中、３日ごとに土壌の水分量を調整し、その含水比を８０から１２０％に保つと共に、攪拌、混合することにより酸素の供給を行った。土壌中の石油系炭化水素の定量は、土壌試料５ｇを乾燥させた後に、２０mLのジクロロメタンにより抽出を行い、ガスクロマトグラフィーにより求めた。抽出の振とう条件は実施例２と同様に行った。３０日後の石油系炭化水素の残存量を測定した結果、ｐ−１０１株を添加することにより、ｎ−アルカンおよびイソアルカンの分解が促進され、効率よく浄化が可能であることが示された。表中の数値は添加した基質に対する減少量を百分率で示している。
【００３０】
【表８】
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【００３１】
【発明の効果】
本発明方法によれば、ｎ−アルカン及びイソアルカンの両者の共存する石油系炭化水素類を含む土壌や水が効率よく浄化できる。