(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み込まれたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列を含有する、第５染色体のｑ１２〜ｑ１３領域に位置付けられるヒトゲノムヌクレオチド断片を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
組み込まれたＡＡＶ核酸配列を含有する、第２染色体のｐ１６〜ｐ２１領域に位置付けられるヒトゲノムヌクレオチド断片を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
組み込まれたＡＡＶ核酸配列を含有する、Ｄ群染色体のｑ２〜ｑ３領域に位置付けられるヒトゲノムヌクレオチド断片を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ヒト第２染色体のｐ１６〜ｐ２１領域、ヒト第５染色体のｑ１２〜ｑ１３領域、またはヒトＤ群染色体のｑ２〜ｑ３領域に核酸配列を組み込む方法であって、ヒト培養細胞に組換えＡＡＶベクターをトランスフェクトすることを含み、ここで該組換えＡＡＶベクターが、（ｉ）ＡＡＶの左側ＩＴＲ配列及び右側ＩＴＲ配列と、（ii）目的とするタンパク質をコードする核酸配列とを含み、かつ（iii）以下：
a）ＡＡＶのＣＡＰコード領域、
b）ＡＡＶのＣＡＰプロモーターおよびＡＡＶのＲＥＰコード領域、または
c）ＡＡＶのＣＡＰコード領域およびＲＥＰコード領域、
のいずれか１つを欠失しているものである、前記方法。
【請求項５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が組み込まれているゲノムヌクレオチド配列を含む単離されたヒト細胞であって、該ゲノムヌクレオチド配列が第５染色体のｑ１２〜ｑ１３領域に位置付けられるものである、前記ヒト細胞。
【請求項６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が組み込まれているゲノムヌクレオチド配列を含む単離されたヒト細胞であって、該ゲノムヌクレオチド配列が第２染色体のｐ１６〜ｐ２１領域に位置付けられるものである、前記ヒト細胞。
【請求項７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が組み込まれているゲノムヌクレオチド配列を含む単離されたヒト細胞であって、該ゲノムヌクレオチド配列がＤ群染色体のｑ２〜ｑ３領域に位置付けられるものである、前記ヒト細胞。
【請求項８】
生殖細胞および体細胞が、ヒト第２染色体のｐ１６〜ｐ２１領域、ヒト第５染色体のｑ１２〜ｑ１３領域、またはヒトＤ群染色体のｑ２〜ｑ３領域内に組み込まれた組換えＡＡＶを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
１．緒言
本発明は、新規な組換えAAV（アデノ随伴ウイルス）ベクターに関し、このウイルスはヒトの宿主ゲノムの特異的領域への組換えDNA配列の組込みを指令するのに使用することができる。これらのベクターは、欠損遺伝子遺伝情報を正常な遺伝情報と置換するかまたは補うために設計された遺伝子治療において使用することができる。本発明はまた、ここで宿主標的配列といわれる、特定の細胞宿主配列の単離と特徴決定に関し、この配列は宿主ゲノムの特異的領域にAAV組換えDNA配列の組込みをシグナリングする。作製された標的配列を含むトランスジェニック動物は、AAVに基づく遺伝子治療を試験するためのモデル系として使用することができる。
２．発明の背景
2.1.遺伝子治療
現在のところ、殆どの遺伝性疾患の治療は、その遺伝性疾患に関連する症状をほとんど緩和せず、新しい、安全かつ効果的な治療方法を開発するために、現在かなりの努力が払われている。分子生物学および遺伝子工学の分野における最近の進歩により、遺伝性疾患にの関連する遺伝子の単離と特徴決定とが行われた。このことはまた、遺伝子治療の概念、すなわち、欠損遺伝子の情報を正常な機能を有する遺伝子と置換するかまたは補うという概念を発展させること、および遺伝的障害の治療のための使用の可能性につながった。
新しい遺伝情報の導入と病気の表現型の矯正のための最も良く開発されたモデル系では、RNAおよびDNA腫瘍ウイルスなどの組換え病原性ウイルスの使用が含まれる。これらのウイルスの多くは病原性でありかつ疾病を惹起する能力を有するが、これらのウイルスを、安定で、遺伝かつ機能し得る遺伝情報の、感染した哺乳類の細胞中への導入についての有用性を保持したまま、有害な特徴を除くように遺伝子操作することが可能なことが提案されている。
レトロウイルスは遺伝子治療における使用のためのあるクラスのウイルスとして広範に研究された（Miller, A.D., 1990, Human Gene Ther. 1:5-14）。残念ながら、レトロウイルスの使用に関しては、多くの欠点があり、例えば、ウイルスDNAの宿主染色体中へのランダムな組込みが挙げられるが、これは、挿入突然変異を生じさせる可能性がある。さらに、レトロウイルスゲノムの両末端に位置する長い末端反復配列（long terminal rpeat: LTR）構造はプロモーター／エンハンサー活性を有し、この活性は組込まれたウイルスDNAに隣接して位置する遺伝子座の活性化を生じさせ得る。例えば、プロトガン遺伝子付近へのレトロウイルスDNAの組込みは、プロトガン遺伝子の発現の意図的でない活性化を生じさせ、その結果、形質転換および腫瘍発生を生じさせるかもしれない。
レトロウイルスに加えて、アデノ随伴ウイルスもまた、安定な遺伝情報を細胞内に送達するための別の系として研究されている。AAV転写プロモーターの制御下にAAVのDNAと異種遺伝子とを含む組換えベクターの構築は、Carterらの米国特許第4,797,368号に記載されている。Muzyczkaらの米国特許第5,139,942号には、AAVプロモーター以外のプロモーターの制御下に、異種DNAが、少なくとも最初および最後の145塩基対の末端反復配列を含むベクターにライゲートした組換えベクターが記載されている。
ヒト細胞中への機能性遺伝子の効率的かつ安定な導入における使用のためのウイルスベクターの開発は、依然として、ヒトの疾患の遺伝子による修正を研究している者にとっての主要な目的である。
2.2.アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、4680ヌクレオチドの線状一本鎖DNA分子からなる欠陥性パルボウイルスであり、REP（複製）タンパク質とCAP（キャプシド）タンパク質とをコードする主要オープンリーディングフレームを含む。REPタンパク質はウイルスゲノムの複製の際に機能するが、CAPタンパク質は集合して、ウイルスのゲノムをパッケージングするウイルスキャプシド分子を形成する。AAVコード領域に隣接するのは、２つの145ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（inverted terminal repeat sequence（ITRs））であり、この配列には、折りたたまれてヘアピン構造を形成しDNA複製開始の際に、プライマーとして機能するパリンドローム配列が含まれる。それらのDNA複製における役割に加えて、ITR配列がウイルスの組込み、宿主ゲノムからのレスキューおよび成熟ビリオンへのウイルス核酸のキャプシド包み込みにとって必要であることが示された（Muzyczka, N., 1992, Current Topics in Microbiology & Immunology 158:97-129）。
ヘルパーウイルスの存在下において、AAVは溶菌化経路に入り、それによってウイルスゲノムが転写され、複製され、キャプシド包み込みされて、新たにウイルス粒子が形成される。ヘルパーウイルス機能の非存在下では、AAVゲノムは、AAVの両末端と宿主細胞配列との間の組換えによりプロウイルスとして宿主細胞のゲノム中に組み込まれる（Cheung, A.ら, 1980, J. Virol. 33:739-748; Berns, K.I.ら,1982, in Virus Persistence, Mahey, B.W.J.ら編（Cambridge Univ. Press, Cambridge）, pp. 249-265）。プロウイルスの組込み部位の特徴決定と隣接する細胞の配列の分析とから、野生型AAVウイルスDNAの第19染色体の長腕中への特異的なターゲティングが示唆される（Kotin, R.M.ら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2211-2215; Samulski, R.J.ら, 1991, EMBO J. 10:3941-3950）。
近年、無傷のAAVウイルスゲノムを、ヘルパーウイルスの存在下に、原核細胞ベクター中にクローニングして細胞にトランスフェクトした場合、AAVがプラスミドベクターからレスキューされて溶菌経路に入り、成熟ビリオンを産生するということが実証された。ヘルパーウイルスの非存在下では、組換えAAVベクターは宿主細胞ゲノム中に組込まれ、その後細胞がヘルパーウイルスに感染するまでプロウイルスとして残る。
3.発明の概要
本発明は、所望の宿主中に目的とする異種遺伝子を導入し、および/または該所望の宿主中でこれを発現させるために設計された、遺伝子操作したベクターに関する。本発明の組換えベクターは組換えDNAのヒト宿主ゲノムの特異的領域中への組込みをターゲティングするために使用することができる。
本発明は、第19染色体中への組込みをターゲティングする野生型のAAVベクターとは対照的に、ここで記載された新規ベクターが第２染色体、第12染色体、第22染色体およびD-群染色体を含むゲノムの他のユニークな部位への組込みをターゲティングするという発見に、一部分基づく。組込まれた異種DNA配列の発現は、それらの染色体環境に影響され、このために、宿主ゲノム中におけるユニークな部位にターゲティングするベクターを所望の発現レベルに応じて選択してもよい。例えば、ゲノム中の幾つかの部位は、実際には組込まれた遺伝子の低レベルの発現に都合がよいが、他の部位は、その遺伝子の調節されない発現を可能にするかもしれない。さらに、１つの特定の部位における発現レベルは、組込みが起こった細胞型または組織に依存するかもしれない。特定の染色体の位置に効率的に組込む標的ベクター（targeting vector）の構築は、レトロウイルスなどの遺伝子治療での使用のために開発された他のウイルスベクター系と比べて著しい改良となり、そこにおいて、宿主ゲノム中への組込みは完全にランダムである。
本発明のベクターでは、目的の遺伝子が両端においてAAVウイルス配列で挟まれている。標的ベクターは、環状二本鎖DNA分子を、共有結合した閉鎖末端を有する線状の複製型分子に変換するため、およびキャプシドに包み込んでAAVビリオンにするか、あるいは宿主ゲノムの特定の領域中へ組み込むために必要なすべての情報がシス位置で含まれる。
この新規組換えベクターの複製と成熟AAVビリオンへのパッケージングのための系が記載されている。得られた組換えウイルスのストックは、選択したいずれかの細胞または組織中への遺伝情報の導入のための簡便で有効な手段を提供する。本発明のベクターは遺伝子治療で使用され、ここにおける所望の目的は、欠陥遺伝子の正常型または野生型の相補体のヒトゲノムの特定の領域への導入と発現とによる遺伝子の欠陥の修正である。
本発明はまた、上記新規AAVベクターの組込みのための宿主の標的部位として作用する特定の細胞宿主の配列に関する。例えば、上記新規AAVベクターが組込まれる第２染色体、第12染色体、第22染色体およびＤ染色体の特定の領域は、宿主の標的部位を表す。これらの部位は、組込まれたAAVベクターDNAの付近に見出されるDNA配列の単離と特徴決定とによって同定することができる。一度同定されると、そのヒトの標的配列を用いて、ヒトの標的部位をゲノム中に取込んだ状態で含むトランスジェニック動物を作製することができる。このようなトランスジェニック動物は、新たなAAVに基づく遺伝子治療の開発と試験のために使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、野生型AAV潜伏細胞系のin situ染色体分析である。AAV特異的プローブを用いた、潜伏細胞系H3（パネルA、赤色シグナル）、G11およびD5（パネルBおよびC、黄色シグナル）における１つの染色体の先端におけるAAVプロウイルスの検出。AAV特異的プローブおよび第19染色体特異的プローブの両方を用いたin situ分析によるAAVプロウイルスの第19染色体へのコロカリゼーション（colocalization）（パネルD、EおよびH、二重ドット）。パネルAおよびDの染色体はDAPI（青）を用いて対比染色し、一方、パネルB、E、CおよびFは、ヨウ化プロピジウム（赤）を用いて対比染色した。パネルAおよびDで用いたAAVプローブ以外の全てのDNAプローブは、FITCで非直接的に標識し、そのAAVプローブはCy3（赤色のローダミン様の色素）で標識した。
図２は、突然変異REP- CAP- neo AAV潜伏細胞系のin situ染色体分析である。これらの染色体は、全てのパネルにおいて、neoプローブとハイブリダイズした。さらに他の染色体特異的プローブも、特定の染色体を検出するのに用いた。矢印の頭部は、neoAAVプロウイルスを強調する。細胞系S102は、第19染色体上のパネルAおよびCに示し、細胞系S110は第12染色体上のパネルCおよびDに示し、細胞系S101は第22染色体上に示し、細胞系S111は第２染色体のパネルGおよびHに示し、細胞系neo２Sc ＃２および＃３は、D群染色体のパネルI、JおよびKに示した。
図３は、突然変異REP+ CAP- neo AAV組込みのin situハイブリダイゼーションである。パネルA、C、E、G、I、K、M、0、QおよびSでは、neoプローブを用いてneo-AAVを検出した。パネルB、D、F、H、J、L、N、P、RおよびTでは、neoプローブおよび第19染色体プローブの両方を用いて第19染色体を同定した。HN63（AおよびB）およびXHN-4（CおよびD）の２種の細胞系では、AAVプロウイルスは第19染色体上で検出された。他の細胞系では、AAVプロウイルスは第19染色体上には検出されなかった。
図４は、突然変異REP- CAP+ neo AAV組込みのin situハイブリダイゼーションである。パネルA、C、EおよびGでは、neoプローブを用いてneo-AAVを検出した。パネルB、D、FおよびHでは、neoプローブおよび第19染色体プローブの両方を用いて、第19染色体を同定した。１種の細胞系XCB-2（AおよびB）では、AAVプロウイルスは、第19染色体上で検出された。他の細胞系であるXCB-5（パネルCおよびD）、XCB-7（EおよびF）、XCH-2（GおよびH）では、AAVプロウイルスは第19染色体上には検出されなかった。
図５は、複数の別個の潜伏細胞系における突然変異neo AAV組込みの分析である。各レーンは、Bam HIで消化し、かつ1%アガロースゲル上で分割された（fractionated）、別個に誘導された種々のAAV潜伏細胞系から単離した５μgのゲノムDNAを含有する。フィルターを、まず最初に、細胞配列（Samulskiら、1992）をプローブとして用いて釣り上げ（「結合プローブ」と示したパネル）、次いで、ストリップし、neo特異的配列をプローブとして用いて再度釣り上げた（「neoプローブ」と示したパネル）。分子量マーカー（kb）を示す。
図６は、pNeo2SC2と命名された組換えベクターに含有されるアデノ随伴ウイルスDNA配列およびSV40−neor配列である。
図７は、pXCBN-1と命名された組換えベクターに含有されるアデノ随伴ウイルスDNA配列およびTK−neor配列である。
図８は、組換えベクターpXCBN-1に含有されるアデノ随伴ウイルスDNA配列およびTK−neor配列である。
図９は、pDD16Bのプラスミド地図である。
図１０は、pDD16のプラスミド地図である。
図１１は、pDD-Neoプロウイルスを含有する潜伏細胞系からのDNAのサザン・ブロット分析である。用いたプローブは、pDD-Neoの左側結合部および9.5kbのプロウイルス・クローンpDD16Bから誘導された染色体からの500塩基対のDNA断片である。レーン１：1.6kbのｐBR322 DNA断片。レーン２：pDD-Neoの3.9kbのEcoRI断片。レーン３：pDD16BからのDNA、pDD-Neoを含有するDD-16からの9.5kbのプロウイルス・クローン、および5.5kbのゲノムDNA。レーン４：空。レーン５〜１１：pDd-Neoプロウイルスを含有する潜伏細胞系からのゲノムDNAのBgl II消化物。レーン５：細胞系DD1．レーン６：細胞系DD2．レーン７：細胞系DD5。レーン８:細胞系Dd13．レーン９:細胞系DD14。レーン１０:細胞系DD16・レーン１１：細胞系DD18。レーン１０は、クローンpDD16Bが最初に誘導されたゲノムDNAを含有する。
図１２は、BamHI消化DNAを含有する個々のヒトの染色体からのDNA（Oncor, Inc. Gaithersburg, MD）を含有する体細胞ハイブリッド・パネルのサザン・ブロット分析である。使用したプローブは、図１で記載したものと同じ500塩基対のプローブである。レーン１：全ゲノムDNA、ヒト男性。レーン２：全ゲノムDNA、ヒト女性。レーン４：全ゲノムDNA、マウス。レーン５：全ゲノムDNA、ハムスター。レーン６：ヒト第１染色体DNA。レーン７：ヒト第２染色体DNA。レーン８〜２９（ハイブリダイゼーションなし）は、第３〜第22染色体（XおよびY）からのDNAを含有している。
図１３Aおよび１３Bは、pDD16Bの左結合部の配列および制限地図である。
図１４Aおよび１４Bは、pDD16Bの右結合部の配列および制限地図である。
５．発明の詳細な説明
本発明は、概して、目的とする異種遺伝子を哺乳動物細胞に挿入および発現するために設計された、操作ベクター（enginerred vectors）に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒト染色体のユニークな特定領域への組換えベクターDNAの組込みを知れする新規なAAVウイルス配列を含有する組換えベクターに関する。本発明は、ヒト第１９染色体へ組込まれる野生型AAV配列を含有する組換えベクターとは対照的に、ウイルス・コーディング領域を欠く組換えAAVベクターは、ヒトゲノムの別の染色体領域に高い頻度で組込まれる、という発見に一部基づく。特に、本発明の操作ベクターは、第２、第12、第22およびD群染色体上に位置する部位を含むヒト・ゲノムのユニークな領域への組換えベクターDNAの組込みを指令する。
本発明は、実施例によって説明され、その実施例では、AAVウイルスREPおよびCAPコーディング領域の欠損を含む組換え発現ベクターを構築した。組込みの好ましい部位は、in situハイブリダイゼーションおよびサザン・ブロット分析等の技法を用いて分析され、第19染色体以外の染色体上の部位であることがわかった。本発明のAAVベクターは、遺伝子治療での使用のための開発されている他のウイルス系（例えば、レトロウイルス系）への生存可能な代替品として用いてもよい。本明細書において記載される組換えベクターは、遺伝的情報をヒト・ゲノムの特定の領域に組み込むように、およびあらゆる所与の欠陥遺伝子の野生型相補体を発現するように設計され、遺伝子操作されてもよい。
さらに、この新規なヒトAAV組込み部位またはヒト標的部位は、標的配列をゲノムに組込まれて含有するトランスジェニック動物を生物工学的に作製するのに用いることが可能である。その結果得られるトランスジェニック動物は、遺伝子欠陥を修正するための組換えAAVベクターの使用を当てにする遺伝子治療の試験用動物モデル系として使用してもよい。
5.1.組換えAAV組込みの特徴決定
ヒト第19染色体への野生型AAVの部位特異的組込みを実証するかなりの証拠が得られている。これらの結果を確認するために、蛍光in situハイブリダイゼーションにより、野生型AAVに感染させた３種の潜伏細胞系を試験した。デトロイト（Detroit）５と命名された１種の細胞系（Bernsら、1975）は、17年前に、ヒト肺癌細胞系から樹立された。他の２種の細胞系であるG11およびH3は、AAV感染HeLa細胞から誘導された。予想どおり、試験した３種の細胞系の全てにおいて、AAVウイルスDNAは、第19染色体のｑ腕の先端にシグナルを生じた（図１）。
第19染色体への野生型AAVの特異的組込みに関するシス・エレメントとトランス・ファクターとの同一性についてはほとんどわかっていない。部位特異的組込みにおけるウイルスREPおよびCAPタンパク質の可能性のある役割を調査するために、幾つかのウイルス・ベクター突然変異体を構築し、分析した。単一細胞クローニングの便宜上、G418を選別するための有力なマーカーとしてneo耐性遺伝子をその突然変異ベクターに組込んだ。組換えウイルス・ストックを用いて、宿主細胞ゲノムへの組込みの好ましい部位を決定した。この組込み部位は、初めに、例えばビオチンまたは蛍光標識Neor配列を用いたin situ蛍光ハイブリダイゼーションを行うことによって、まず特徴決定して、その組換え体を野生型AAVから区別した。
本明細書に記載されているように、１つの特定の態様では、組換えAAV構築体は、全REPおよびCAP遺伝子の欠失、またはREPまたはCAPタンパク質の維持のいずれかによって作製した。結果として得られるベクターは、さらなる140塩基対の非コーディングAAV配列と共に、２つのウイルスITR配列の間に挿入されたneor遺伝子も含有していた。ウイルス・ストックは、REPおよびCAPタンパク質をコードするヘルパー・プラスミドを用いて調製した。細胞を、この組換えウイルスに感染させ、組織培養培地にG418を添加することによってネオマイシン耐性クローンを選別した。別個の（independent）neo耐性細胞系をin situ蛍光ハイブリダイゼーションに供して、AAVベクターがどの染色体上に組込まれているかを調べた。
REP- CAP-組換えAAV構築体は、REPおよびCAP遺伝子の全体を欠失させ、それらをネオマイシン耐性（neor）遺伝子で置換することによって作製した。この得られた組換え体は、左側に１個のITRを、中央部にneor遺伝子を、そして右側に１個のITRおよび140塩基対の非コーディングAAV配列を含有している。このウイルス・ストックは、ヘルパーｐAAV/Adを用いて調製し、これは、ITRを含有しないが、REPおよびCAP遺伝子をコードする。デトロイト６細胞は、上記ウイルスに感染させ、G418耐性クローンについて選別を行った。
５種の別個のG418耐性細胞クローンを、ビオチン標識neoプローブ単独またはneoプローブ＋第19染色体プローブのいずれかを用いたin situ蛍光ハイブリダイゼーション（Epsteinら、1987）に供した。試験した上記５種の細胞系の中の１種は野生型AAVと同様に、第19染色体に組込まれたneo−AAVを有していた（図２、細胞系S102についてはパネルAおよびB）。残りの細胞系は、染色体特異性プローブによって、または染色体結合および形態学によって同定したところ、異なる染色体上に組込まれたneo−AAVを有していた。これらの結果を、図２で、第12染色体上のクローンS110についてはパネルCおよびD；第22染色体上のクローンS101についてはパネルEおよびF;第２染色体上のクローンS111についてはパネルGおよびH；およびD群染色体上のクローンD5neo Sc#3についてはパネルIおよびJ、およびクローンD5neo Sc#2についてはパネルKのそれぞれに示す。パネルI、JおよびKからのクローンは、デトロイト５細胞に由来する１種のオリジナル細胞系からの異なるサブクローンであるので、それらは１つであると考えるべきである。パネルKでは、neoおよびAAVプローブは同時に用いられ、野生型AAVは第19染色体上に容易に観察することができたが、一方、neo−AAVは非常に微弱なシグナルを有しており、このことは、neo−AAVのコピー数が少なかったことを示唆する。上記の結果から、逆方向末端反復配列が、in situハイブリダイゼーションによって明らかにされるように２０％（1/5）という低い頻度ではあるが、部位特異的な組込みを媒介可能なシス配列を含有することが示唆される。
Rep+ Cap- neo−AAV突然変異ベクターは、Cap遺伝子をneor遺伝子で置換し、Rep遺伝子を十分に機能性のままとしておくことによって作製した（HermonatおよびMuzyczka, 1984）。REP+ CAP- neo−AAV細胞クローンは、G418選別によって作製し、in situハイブリダイゼーションに供した。１０種の細胞系をアッセイした。それらの中の２種は、第19染色体に組込まれたneoウイルスを有していた（図３、クローンHN63についてはパネルAおよびB、およびクローンXNR-4についてはパネルCおよびD）。残りの８種のクローンでは、REP+ CAP- neo−AAVは、第19染色体には組込まれていなかった（図３、パネルE〜T）。例えば、クローンXNR-2（パネルGおよびH）は、形態学的に第５染色体に類似する染色体の動原体の付近にある部位にneoウイルスを有していた。クローンXNR-3（パネルIおよびJ）は、クローンS111の場合と同様に、第２染色体に類似する染色体のｐ腕の中心部に該ウイルスを有していた（REP+ CAP-、図３０、パネルGおよびH）。クローンNH21（パネルSおよびT）は、neoウイルスをDM（doouble minute）上に有しており、この場合、共通する（common）AAV組込み標的配列は、サザン・ブロットにより事前に判明しているように、上記ウイルスによって分断（disrupt）されている（Kotinら、1990）。19q13上の共通の虚弱部位はすでに報告されている（YunisおよびSoareng、1984；Yunisら、1987）という事実に基づいて、このDMは、薬剤選択に基づいて第19染色体から誘導することができた。
これらの結果から、突然変異neo−AAVウイルス中の機能性Rep遺伝子は、第19染色体への組込み効率を増加させなかったことが実証された。REP CAP- neo−AAVについても同様に、REP+ CAP- neo−AAVによる第19染色体特異性組込み効率は約２０％（2/10）であり、HN21の場合が陽性の結果であるとカウントされる場合には、おそらくは３０％（3/10）である。これとは対照的に、野生型AAVは、８０％より高い特異性を有していた。２種の突然変異構築体は、Rep遺伝子をneo遺伝子で置換し、キャプシド遺伝子を無傷のままとしておくことによって作製した。一方のプラスミドはｐXCHN-1と呼ばれ、このプラスミドでは、p40プロモーターが欠失しており、その結果、プロモーターのないキャプシド遺伝子となる（図８）。もう一方のプラスミドは、機能性p40プロモーターを保持しており、このプラスミドをpXCBN-1と呼ぶ（図７）。Rep- Cap+ neo−AAVウイルスは、慣用の方法により調製した。ヒト・デトロイト６細胞を上記組換えウイルスに感染させ、G418耐性の単一クローンを単離した。機能性p40プロモーターを有するウイルスから得たクローンをXCB-1〜XCB-12と命名し、プロモーターを欠くキャプシド・ウイルスから得たクローンをXCH-1〜-10と命名する。
５種のG418耐性クローンを、in situ染色体ハイブリダイゼーションによって試験し、蛍光in situハイブリダイゼーションにより約２５％（1/4）の同様の第19染色体への特異的組込み効率を有することが判明した（図４）。
蛍光in situハイブリダイゼーションは、染色体上での物理的位置を顕微鏡レベルで直接視覚化できるが、サザン・ブロット解析と比較した場合、分子レベルでの感度および解像度（resolution）を有さない。
in situ蛍光ハイブリダイゼーションの結果を確認するために、in situハイブリダイゼーションによって既に分析されているneo−AAV潜伏細胞系を、ゲノム・サザン・ブロットによってさらに特徴決定した。種々のneo−AAV細胞からのゲノムDNAを制限酵素BamHIで消化し、第19染色体上に位置するクローン化した共通のAAV細胞の結合断片で釣り上げ、これは、母細胞におけるサザン・ブロットにより単一の2.6kbのBamHIバンドとして示されるが、野生型潜伏細胞系の約８０％では分断されている（Kotinら、1990, Samulskiら、1991）。結合断片で釣り上げた後、同じブロットを水酸化ナトリウムでストリップし、neoプローブを用いて再度釣り上げた。この突然変異AAV細胞系のサザン・ハイブリダイゼーションの結果を図５に示し、in situ蛍光ハイブリダイゼーションの結果を確認する。Iin situハイブリダイゼーションおよびサザン・ブロット分析のまとめたものを、表１に示す。
0004083799.tif 000002
5.2.修飾AAVベクター
無傷のAAVゲノムを含有する組換えベクターを、ヘルパー・ウイルスで感染させた細胞へトランスフェクとすることにより、プラスミド・ベクターからAAVゲノムがレスキューされ、続いてウイルス・ゲノムの複製および成熟ビリオンへのウイルスＤＮＡのキャプシド包み込みが行われる。ＡＡＶコーディング領域が組換えウイルス・ベクターから欠失しており、異種ＤＮＡ配列によって置換されている場合、この組換えＡＡＶベクターは、依然としてウイルス溶菌サイクルを完了することができるが、但し、ＡＡＶ標的配列が無傷であり、かつREPおよびCAPタンパク質がトランス位置で付与されるという条件付きである。
ヘルパー・ウイルスの不在下では、AAV組換えDNAは、宿主染色体に組込まれ、細胞が次にヘルパー・ウイルスに感染されるまでそこに存在しつづけるであろう。野生型AAV配列を含有し、かつ第19染色体に組込まれ組換えベクターとは対照的に、ウイルス・コーディング配列を欠く組換えAAVベクターは、ゲノムの別の領域に組込まれる。
当業者には、AAVウイルス配列を含有する種々の宿主組換えベクター系が同様によく用いられる。本発明の組換えAAVベクターは、様々な量のAAVウイルス配列を含有してもよい。例えば、該ベクターは、REPおよび／またはCAP遺伝子を欠くAAVウイルス配列を含有してもよい。さらに、その組換えベクターは、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質に対する耐性を付与するのに必要な細菌プラスミド配列、および大腸菌（E.coli）中での複製に必要な配列を含有するであろう。該ベクターは、さらに、適当な転写／翻訳制御配列の間に挿入されている、目的とする異種遺伝子をコードするDNA配列や、ポリアデニル化シグナルも含有する。所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて種々のプロモーター／エンハンサー・エレメントを用いてもよい。哺乳動物の細胞のゲノムから誘導される、あるいは組換えDNAまたは合成技術によって得られるプロモーターを用いて、目的とする挿入遺伝子の転写を行ってもよい。
挿入したタンパク質コーディング配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要である。ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれていてもよいこれらの外因性の翻訳制御配列は、種々の起源のものであってよく、天然に存在するものであっても、合成されたものであってもよい。さらに、ポリアデニル化シグナルを含んで、転写されたmRNAの安定性を増加させてもよい。
真核性発現ベクターを得るのに、標準的な組換えDNA法を用いてもよい。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技法、合成技法およびin vivo組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら、1989、Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.およびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.に記載されている技法を参照されたい。例えば、AAVウイルス配列は、増幅されたウイルスDNA断片の各末端に適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を加えるオリゴヌクレオチド・プライマーを用いたPCR反応により増幅してもよい。あるいはまた、所望のあらゆる切断部位は、制限エンドヌクレアーゼ配列をコードするヌクレオチド配列を、増幅した標的配列の両末端にライゲートすることにより得てもよい。この標的配列は、次いで、相補的な付着末端を有する発現ベクターに挿入してもよい。
挿入AAV配列を含有する組換えベクターは、当業者に周知の技法を用いた突然変異誘発の研究用の鋳型として役立つであろう。そのような技法としては、部位指向性突然変異誘発、欠失突然変異体の構築、または上記AAV配列を改変するためのPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）の使用が挙げられるが、それらに限定されない。本発明に従って使用可能な改変ヌクレオチド配列としては、複製、キャプシド包み込み、組込み、および宿主細胞ゲノムからの組換えDNAのレスキューのための情報をシス位置で付与する能力を保持するという点において機能的に同等な、上記AAV配列の誘導体および類似体が挙げられる。本発明のAAVベクターは、野生型AAVベクターの特徴であるような第19染色体への組込みを必ずしも必要とせず、むしろ、ヒトゲノムの他の特定の領域に組み込んでもよい。
5.3.組換えウイルスストックの作製
組換えウイルス・ストックを作製するために、上記組換えベクターを、ヘルパー・ウイルス機能を付与し、かつAAV REPおよびCAPタンパク質をトランス位置で供給する能力を有する宿主細胞系にトランスフェクトする。このREPおよびCAPタンパク質は、線状の組換えDNAの複製および突然変異ウイルス粒子へのキャプシド包み込みに必要であり、該タンパク質の各々のコード化に必要な遺伝的情報を含有する組換えプラスミドで宿主細胞系をトランスフェクションすることによってトランス位置で供給されてもよい。DNAトランスフェクションは、当業者にとって周知である幾つかの方法のいずれを用いて行ってもよく、結果として、REPおよびCAPタンパク質の一時的な、あるいは安定な発現が行われる。宿主細胞へのDNAのトランスフェクションを行うための技法としては、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈降によるによるDNAトランスフェクションが挙げられる［Ausubelら、1989, Current Protocols for Molecular Biology］。AAV REPおよびCAPタンパク質の安定な発現のためである。
宿主細胞系は、ウイルスREPおよびCAPタンパク質の発現に加えて、ヘルパー・ウイルス機能を付与できなければならない。アデノウイルスおよび単純ヘルペスウイルスの双方が、AAV標的配列を含有するDNA断片を複製するためのヘルパー・ウイルスとして役立つであろう。本発明の実施においては、これらの２種のウイルスのいずれか、またはAAVのヘルパー・ウイルスとして作用するいずれかのウイルスによる感染を許容する如何なる宿主細胞を用いてもよい。使用可能なヘルパー・ウイルスとしては、単純ヘルペス（HSV）、帯状ヘルペス状水疱（varicella zoster）、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バール（Epstein-Barr）ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。感染多重度（MOI）および感染時間の持続性は、用いられるウイルスの種類および採用される細胞系に依存するであろう。
本明細書に記載されるある特定の態様では、組換えAAV発現ベクターでトランスフェクトしてある２９３個の細胞を、10のMOIでAd5に感染させた。４８時間後、それらの細胞を３回にわたって凍結・解凍し、56℃で１時間にわたってインキュベートして、アデノウイルスを不活性にした。得られた細胞の溶解物は、組換えウイルス粒子を含有しており、これを、続いて、選択した細胞または組織を感染させるのに用いられる。
5.4.宿主標的DNA配列の特徴決定
宿主標的DNA配列の単離および特徴決定を行うために、当業者には日常的に用いられている種々の技法が用いられる。例えば、λgt10バクテリオファージ・ライブラリーは、別の潜伏感染した細胞系からのゲノムDNAから構築してもよい。AAV配列と物理的に結合しているゲノムDNAの挿入物を含有するファージ粒子を同定するために、標識AAV ITR配列で構成されるプローブを用いてライブラリーをスクリーニングしてもよい。陽性のクローンが一度単離されてしまえば、組換えファージは増殖可能であり、挿入物のDNA配列は、当業者によって一般的に用いられる技法を用いて決定することができる。
あるいはまた、他の方法を用いて、ゲノム標的配列を同定し回収（retreive）してもよい。細胞結合物（cellular junctions）を回収するためのそのような１つの戦略としては、タンパク質フィルター結合操作が挙げられ、この操作は、λリプレッサータンパク質と、そのオペレーター配列であるOR1およびOR2との特異的な相互作用を用いる。AAV組換えベクターは、λバクテリオファージ・オペレーター部位であるOR1およびOR2を含有する４７塩基対の配列を含有するように作製される（すなわち、AAV−OR1−OR2）。これらの配列は、AAVベクターに挿入した場合に、ウイルスDNA複製にもウイルス産生にも影響を及ぼさない。
AAV−OR1−OR2感染潜伏細胞系は、細胞を組換えウイルスに感染させることによって樹立してもよい。樹立した潜伏細胞系から単離したゲノムDNAは、ウイルス配列を認識しない制限酵素で消化してもよい。消化したDNAは、精製したλリプレッサー・タンパク質と一緒にインキュベートし、OR1およびOR2配列を含有するあらゆるゲノム断片は、このλリプレッサー・タンパク質に結合する。このゲノムDNAは、次いで、フィルター結合アッセイにおいてニトロセルロース膜を通して処理してもよい。非結合DNAは、このフィルターを通して洗い流されるが、DNA／タンパク質複合体は保持される。ニトロセルロース膜上に保持されたDNA断片は、次いで、クローニングし、配列決定を行って、細胞DNA結合配列を決定してもよい。
あるいはまた、ゲノムDNAは、neo耐性細胞系から調製してもよい。ゲノムDNAは、次いで、AAV組換えベクター配列内は切断しない制限エンドヌクレアーゼで切断する。次に、このDNAを再度ライゲートし、細菌にトランスフェクトし、アンピシリン耐性について選別する。元のAAV組換えベクターは、細菌のamp耐性遺伝子と細菌のori配列を含有するので、結果として得られる如何なる細菌コロニーも、ベクター配列およびフランキング宿主配列とを含有するであろう。これらのベクターは配列決定を行って、宿主配列のヌクレオチド配列を決定してもよい。
本明細書に記載されているある特定の態様では、デトロイト６細胞を、pDD-Neoと命名した組換えベクターから産生した組換えウイルス・ストックに感染させた。Neo耐性クローンを単離し、さらに分析を行うために、クローン細胞系DD-16を選択した。DD-16細胞系からの全ゲノムDNAは、pDD-Neoベクター中では切断しないBgl II制限酵素で消化した。消化したゲノムDNAを希釈し、再ライゲートし、大腸菌に形質転換した。クローンｐDD16（図１０）を単離し、さらに特徴決定を行って、AAV配列が、宿主ゲノムのどの領域に組み込まれているのかを決定した。サザン・ブロット分析を行ったところ、ゲノム配列は、第２染色体からのDNAに強くハイブリダイズし、第１染色体からのDNAにはほんのわずかしかハイブリダイズしなかった（図１２）。ｐDD16ベクターに含有される宿主ゲノムDNAの配列決定を行い、それらの配列を図１３に示す。
5.5.トランスジェニック動物の作製
本発明は、ヒト染色体標的配列を、自身のゲノムに組み込まれて担持するトランスジェニック動物を提供する。本発明は、全細胞中に標的配列を有する動物、および自身の細胞の全部ではなく幾つかに標的配列を担持する動物、すなわちモザイク動物を提供する。この標的配列は、単一のユニットとして、あるいはコンカテマーで（例えば、頭−頭縦列、あるいは頭−尾縦列で）組込まれてもよい。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタおよび非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、リスザルおよびチンパンジー等）等のあらゆる種の動物を用いて、本発明のトランスジェニック動物を作製してもよいが、これらの種の動物に限定されない。当業界で公知である如何なる技法を用いて特定のヒト標的配列を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始細胞系を作製してもよい。そのような技法としては、前核マイクロインジェクション（Hoppe, P.C.およびWagner, T.E., 1989,米国特許第4,873,191号）、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Van der Puttenら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:6148-6152）；胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Thompsonら、1989,cell, 56:313-321）、胚のエレクロポレーション（Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814）；および精子媒介遺伝子導入（Labitranoら、1989, Cell 57:717-723）等が挙げられるが、それらに限定されない。そのような技法を検討するために、Gordon、1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229（その全文は、引用することにより本明細書の一部を構成するものとする）を参照されたい。
本明細書で記載されている方法を用いて作製されたトランスジェニック動物はスクリーニングし、評価して、ヒト標的配列をゲノムに組み込まれた状態で含有する動物を選別する。導入遺伝子（transgene）の組込みが起こっていることを確認するための最初のスクリーニングは、サザン・ブロット分析によって、あるいはPCR技法を用いて達成してもよい。
作製される創始動物は、交配、同系（近親）交配、異系交配、または交雑育種して、特定の動物のコロニーを作製してもよい。そのような育種（交配）戦略としては、別の系統を樹立するための、２個以上の組込み部位を有する創始動物の異系交配；複合トランスジェニックを作製するための、別の系統の異系交配；および、所与の組込み部位についてホモ接合であるマウスを作製するための、ヘテロ接合トランスジェニック・マウスの交雑育種（crossing）が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、本発明が提供するトランジェニック動物は、交配して、ヒトの遺伝的疾患のモデルとして役立つように生物学的に操作されている異なるトランスジェニック動物にしてもよい。結果として得られる子孫は、特定のヒトの遺伝的疾患の治療に用いるためのＡＡＶ系ベクターの効力を解明するための動物モデル系として役立つであろう。
5.6.AAVウイルスベクターの使用
目的とする遺伝子を含有している本発明の組込みAAVベクターは、遺伝的疾患の治療に有用である。目的とする遺伝子は、あらゆる突然変異させた遺伝子、あるいは欠陥のある遺伝子の野生型相補体であってもよく、また、組換えAAVベクターに挿入して、その発現がそれ自身の内因性の天然のプロモーターによって制御されるように（例えば、発現が正常に調節されるように）、あるいは異型プロモーターによって制御されるようにしてもよい。さらに詳細には、本発明は、ベクターDNAおよび両側がAAV配列によって挟まれている目的の遺伝子の、ヒト・ゲノムの特定の領域への組込みを指令する特定のAAV配列からなるベクターの使用に関する。ベクターの選別（すなわち、調節された転写のための特定のプロモーター／エンハンサー・エレメントを有するベクターの選別）は、標的とする細胞型、および転写調節の所望のレベルに依存する。
本発明は、さらに、標的配列を含有するベクターによる組込みのための宿主標的配列として作用するヒト・ゲノムDNA配列の単離および特徴決定にも関する。その標的細胞は、一旦同定されてしまえば、ヒト染色体標的配列をゲノムに組み込まれた状態で含有するトランスジェニック動物の開発に用いることが可能である。これらのトランスジェニック動物は、AAVに基づく遺伝子治療を開発し、試験するための動物モデル系を提供する。さらに、例えば、導入された遺伝子の発現によって、あるいは挿入的突然変異誘発によって、特定のヒトの遺伝的疾患用の動物モデルとして開発されているトランスジェニック動物は、交配して、ヒト標的配列を含有するトランスジェニック動物にしてもよい。結果として得られる子孫は、特定の遺伝的疾患を治療するためのAAVベクターの使用を試験するのに用いてもよい。
6.実施例：新規なAAV組換えベクターの構築および宿主標的配列の特徴決定
以下のサブセクションは、ヒト・ゲノムのユニークな特定の部位への組換えベクターDNAの組込みを指令するAAV標的配列を含有する新規なAAV組換えベクターの構築および特徴決定を説明する。組込みの特定の部位は、in situハイブリダイゼーションおよびサザン・ブロット分析等の方法によって分析した。
6.1.材料および方法
6.1.1.組織培養
ヒトHeLa293デトロイト６（D6）細胞を、10%ウシ胎児血清（Hyclone）を含有するダルベッコ（Dulbecco）改良イーグル培地（GibcoまたはHazelton）中の単層培養物中で増殖させた。D5細胞は、野生型AAV2で潜伏感染させたD6クローン細胞系であり、D6細胞と同様にして維持した。HeLaスピナー（spinner）細胞を、５％ウシ血清（Gibco）を含有するMEM中での懸濁培養物として増殖した。
6.1.2.ウイルスの調製
アデノウイルス５型d1301株は、293またはHeLa細胞のいずれかを、感染多重度（MOI）１０で感染させることによって増殖した。細胞変性効果が十分に生じた後48時間にわたってポスト感染させた時点で、細胞を培地と共に回収した。このウイルス調製物を３回にわたって凍結・解凍し、アリコートを取り（aliquoted）、−２０℃で保存して使用に供した。
所与のアデノウイルス・ストックの感染性または力価を測定するために、このウイルス溶解物の一連の10倍希釈物を、無血清DMEM培地で調製し、各希釈物からの100μlのアリコートを、密集した（confluent）293細胞を含有する６cm径のシャーレに添加した。吸着を１時間にわたって進行させ、その細胞に、フェノール・レッドを含有しないDMEM中に溶解した２％FCS、0.64%ノーブル・アガー（Noble Agar：Difco）および25mM MgC2を含有する5mlのプラーク・アッセイ溶液を上層し、42℃〜45℃に冷却した。その寒天溶液を室温で固化した後、細胞を37℃で５％CO2で５日間にわたってインキュベートし、プラーク・アッセイ溶液のもう１つの層を該シャーレ上に上層して、細胞に栄養を与えた。最初の感染の約１週間後にプラークが出現しはじめ、２週間でプラトーに達した。プラークを直接カウントすること、あるいはシャーレを中性レッドで染色してカウント前とのコントラストを増加させることのいずれかによって最終力価を測定した。
CsCl勾配精製アデノウイルス・ストックでは、単純な方法を用いて、ウイルスの力価を推定した。簡単に説明すると、ウイルス溶液の少量のアリコート（５μl）を、295μlの0.5%SDS溶液で60倍に希釈して、60℃で10分間にわたってインキュベートした。光学密度を260nmで測定した。最初のウイルス・ストック溶液のOD260ユニットが１であることは、１ml当たり約50ｘ１０12個のウイルス粒子があることと等しい。通常、２０個のウイルス粒子が、感染ユニットまたはプラーク形成ユニット（p.f.u.）１と等しい。
AAV２型は、ATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手して、293またはHeLa細胞のいずれかをAd5に10のMOIで感染させることによってヘルパー・ウイルスとして維持した。48時間のポスト感染の後、細胞を培地と共に回収し、３回にわたって凍結・解凍した。ウイルス溶解物を55℃まで１時間にわたって加熱して、アデノウイルスを不活性にし、アリコートを取り、−20℃で保存した。
AAVは感染の間にはプラークを形成しないので、AAVウイルス・ストックの力価は、所与のAAVストック＋アデノウイルスに感染させた細胞の抗キャプシド抗体による免疫染色によって、あるいは所与のAAVウイルス・ストックのアリコートからのAAV DNAの抽出を行い、そのDNAを既知量のプラスミドDNAでサザン・ブロット分析することによって定量し、そのDNAの量をウイルス粒子の数に換算することによって非直接的に測定した。通常は、５〜100個のウイルス粒子が１感染ユニットに等しい（Samulskiら、1987, J.Virologyを参照）。
突然変異AAVストックは、突然変異AAVプラスミド構築体をヘルパープラスミドPad/Ad（Samulski, 1989）と共にAd5感染293細胞に同時トランスフェクトすることによって作製した。48時間のポスト・トランスフェクションの後、突然変異AAVウイルス調生物を野生型AAVのように正確に取り扱った（handled）。この突然変異ウイルス・ストックの力価は、neor−AAVについて薬剤耐性コロニーをカウントすることによって測定した。
AAVウイルスおよび／またはアデノウイルスによる感染は、以下のようにして行った。すなわち、細胞の10cm径のシャーレでは、適当量のAAV（10 m.o.i.）および／またはアデノウイルス（10 p.f.u.、プラーク形成ユニット）を含有する0.5mlのDMEMを細胞に塗布し、室温で１〜２時間にわたって時々振りながらインキュベートした。このDMEMの0.5mlを、２％FCSを含有する新たなDMEMと置き換えた。細胞を37℃で５％CO2で48時間または所望に時間にわたってインキュベートした。
組換えAAVベクターDNAのトランスフェクションは、リポソームまたはDEAEデキストラン法によって達成した。リポソーム法では、５μgのDNAを2mlのOpti-MEM（Gibco）と共に室温で５〜10分間にわたってインキュベートした。このDNA−リポソーム混合物を、２〜３ｘ１０6個の細胞および３mlのOpti-MEMを含有する10cm径のシャーレに添加した。細胞を37℃で４時間または一夜にわたってインキュベートした。４％FCSを含有する５mlのDMEMを添加し、インキュベーションを48時間にわたって継続した後で、細胞を収集した。
DEAEデキストラン法では、５μgのDNAを、５％DEAEデキストランを含有する2mlのPBSと共に室温で５分間にわたってインキュベートした。このDNA混合物を上記細胞に添加し、10分間にわたって室温でインキュベートした。次に、このDNA混合物を捨て、細胞を3mlのPBSで２回洗浄し、続いて２％FCSを含有する20mlのDMEMを添加した。インキュベーションを48時間にわたって行った後で、細胞を収集した。
6.1.3.組換えプラスミドの構築
プラスミドｐXCBN-1は、プラスミドpsub201（Samulskiら、1987）のバックボーンに、キャプシド遺伝子を、その機能性プロモーターp40および選択マーカーTK-neor遺伝子と共に含有する（図７）。このプラスミドは、ゲノムの中心部におけるBstE II消化によって構築し、付着末端をKlenow酵素で充填した。この線状プラスミドは、さらに、AAVゲノムの左側部位上でXbaIで部分消化して、REP遺伝子を欠失させた。この部位では、TK-neor遺伝子を含有するｐDD-neoからのSbaI−HindIII（HindIII付着末端はKlenow酵素で充填した）断片が挿入されてREP遺伝子と置き換わった。TK-neor遺伝子の推定上の転写方向は、欠失させたREP遺伝子と同じであった。このプラスミドを用いて、REP- CAP+ neor−AAVウイルス・ストックを作製した。
プラスミドpd152-91-Neoは、CAP遺伝子がneor遺伝子で置換されているが、REP遺伝子は無傷のままにしてあるものであり、このプラスミドはHermonatおよびMuzyczka、1984に記載されている。
プラスミドｐXCHN-1はプラスミドpsub201（Samulskiら、1987）のバックボーンにプロモーターのないキャプシド遺伝子および選択マーカーTK-neor遺伝子を含有する（図８）。このプラスミドは、ゲノムの中心部においてHindIIIで消化し、かつAAVゲノムの左側部位でXbalで部分消化して、REP遺伝子を欠失させることによって構築した。この部位では、TK-neor遺伝子を含有するpDD−neoからのXbal−HindIII断片が挿入されて、REP遺伝子に置き換わった。TK-neor遺伝子の推定上の転写方向は、欠失させたREP遺伝子と同じであった。このプラスミドもまた、REP- CAP+ neor−AAVウイルス・ストックを作製するのに使用した。
プラスミドｐNeo2は、REP遺伝子およびCAP遺伝子の全体を欠失させ、それらをネオマイシン耐性（neor）遺伝子で置換することによって作製した。その結果得られたプラスミドは、２個のAAV180塩基対の末端反復配列および右側のITRに隣接する140塩基対を含有する。
プラスミドｐDD-Neoは、以下のようにして構築した。すなわち、AAVおよびAd5感染細胞からの低分子量のDNAを、AAVのD配列から誘導した単一のプライマーを用いたPCR反応のための鋳型として用いた。このPCRは、20mM Tris-HCl（ｐH8.8）、1.5mM MgCl、50mM KCl、2.5%ホルムアミド、100μM dATP、dCTPおよびdTTP、75μM ７−デアゾ−ｄGTP（7-deazo-dGTP）、25μM ｄGTP、1.5U AmpliTaq（Perkin Elmer Cetus）、１ng AAV DNAおよび100pmoleプライマーTR-1（５′-GGAATTCAGGAACCCCTAGTGATGG3-３′）（配列番号３）を含有する50μlの反応溶液中で、94℃で１分間、45℃で30秒間、および72℃で１分間で35回行った。このPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、EcoRIで切断し、EcoRI切断物および脱リン酸化処理したｐGEM３Zプラスミド（Promega）とライゲートした。このライゲートしたプラスミドを、大腸菌Sure株（Stratagene）に形質転換した。ｐDDと命名した陽性のコロニーは、二重D（double-D）末端反復配列の存在についてスクリーニングし、ｄGTPの代わりに７−デアゾ−dGTPを用いたジデオキシ配列決定法（Sanger,F.ら、1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467）によって確認した。続いて、neo遺伝子をｐDD-2のSalI部位にクローニングして、プラスミドpDD-neoを得た。
6.1.4.ゲノムDNAおよびウイルスDNAの単離
単純な塩析法を用いて、ゲノムDNAを組織培養細胞から抽出した（Millerら、1988）。簡単に説明すると、１枚の10cm径のシャーレから回収した細胞を、3mlの核溶解緩衝液（nuclei lysis buffer）（10mM Tris-HCl、400mM NaCl、および2mM EDTA、ｐH8.2）を有する15ml容ポリプロピレン製遠心チューブ中で再懸濁した。この細胞溶解物を、0.2mlの10% SDSおよび0.5mgのプロテイナーゼKを添加することによって、一夜にわたって37℃で消化した。消化に続いて、1mlの飽和NaCl（6M）を添加し、該チューブを15秒間にわたって激しくボルテックス処理した。3,500rpmで15分間にわたって遠心分離することによってタンパク質沈殿物をペレット化し、DNAを含有する上清を別のチューブに移した。２倍容の室温の100％エタノールをそのチューブに添加し、何度か反転させた。繊維状のDNA沈殿物をパスツール・ピペットの先端で取り出し、1.5ml容マイクロフュージ（microfuge）チューブに移し、75%エタノールで洗浄し、続いて、95%エタノールで１回洗浄した。残存するエタノールを可能な限り十分に除去した。このサンプルを１分間にわたって減圧乾燥し（DNAを完全に乾燥しない）、200μl TE（pH8.0）に37℃で数時間にわたって溶解した。このゲノムDNAは清浄で（clean）、制限酵素による消化に好適なものであった。
Hirt法は、ウイルスまたはトランスフェクトしたプラスミドDNA等の低分子量DNAを組織培養細胞から単離するための目的で行った。組織培養培地を6cm径シャーレから除去し、0.85mlのHirt溶液（0.6% SDS、10mM Tris-HCl, pH8.0、および100mM Na2 EDTA, pH8.0）をその細胞に添加した。このシャーレを約10回にわたって渦巻きを描くようにして攪拌し（swirled）、粘着性のある細胞溶解物を1.75ml容マイクロフュージ・チューブに注いだ。0.25mlの5M NaClを添加し、該チューブを数回にわたって反転させることによって混合した。このサンプルを４℃で一夜にわたって放置し、ソーバール（Sorvall）高速遠心機で14,000rpmで30分間にわたって遠心分離した。上清を2ml容マイクロフュージ・チューブに移し、フェノール、フェノール−クロロホルム、およびクロロホルムでそれぞれ１回ずつ抽出した。DNAを同量のイソプロパノールで沈殿させ、４℃でエッペンドルフ遠心機で30分間にわたって遠心分離した。このDNAを、75%エタノールで１回洗浄し、10μg/mlのRNアーゼAを含有する50μlのTE（pH7.5）に溶解した。
ウイルスDNAの精製では、3,000ｘｇで10分間にわたって遠心分離することによって完全c.p.e.（細胞変性効果）が観察された後、１枚の10cm径シャーレからのアデノウイルスおよび／またはAAV感染細胞を回収した。細胞のペレットを1.4mlの50mM Tris-HCl（pH9.0）に再懸濁し、続いて100μlの100%エタノールおよび10μlの20%デオキシコレート（deoxycholate）を添加した。このチューブを数回反転させ、室温で１時間にわたってインキュベートし、４℃で10,000rpmでエッペンドルフ遠心機で15分間にわたって遠心分離した。上清を回収し、15μlのRNアーゼA（Sigma）（10mg/mlストック）、3μlの1M CaCl2およびMgCl2、および15μlのDNアーゼI（Sigma）（1mg/ml）を添加した。このチューブを数回反転させて十分に混合し、37℃で１時間にわたってインキュベートした。80μlの10%サルコシン（Sarcosine）（Sigma）を添加した後、サンプルを10分間にわたって70℃で加熱し、２時間にわたって37℃に冷却した。1/20倍容の3M NaAcを添加し、フェノール、フェノール−クロロホルム、およびクロロホルムで抽出した後、DNAを2.5倍容のエタノールで沈殿させ、75%エタノールで２回洗浄した。乾燥したDNAペレットを50μlのTE（pH8.0）に溶解した。
6.1.5.in situハイブリダイゼーション
スライドガラスをメタノール中で約30分間にわたって洗浄し、次いで蒸留水で２回濯いだ。このスライドガラスが清浄かどうかを試験するためには、容器から取り出した後、表面には均一な水膜の薄い層が観察されなければならない。疎水性のスポットが見えてはならない。この清浄にしたスライドガラスを、使用前に氷冷水中に浸漬した。
適当な細胞を、10cm径シャーレに蒔き、約80%密集する（-80% confluence）まで増殖した。コルセミド（Colcemid）（Gibco）を、最終濃度が0.02μg/mlとなるように添加し、細胞を37℃で２〜４時間にわたってインキュベートを続けた。インキュベートした後、多くの細胞が丸い形状になったが、これは、これらの細胞が有糸分裂期に入ったことによるものであった。この培養培地を取り出し、細胞を3mlのPBSで濯いだ。濯ぎを行った後、3mlのPBS/EDTAを細胞に添加した。シャーレを組織培養フードの縁に10〜20回ぶつけた。この時、多くの細胞が培地に浮いていなければらならない。細胞を懸濁することが困難な場合には、EDTAをPBSに最終濃度が0.1〜0.5mMで添加してもよい。細胞は、所望の細胞が浮くまでインキュベートする。シリコン処理した（siliconized）パスツール・ピペットを用いて、上記溶液を、シリコン処理したガラス・チューブに移し、細胞を卓上遠心機で900rpmで８分間にわたって遠心分離した。上清を捨て、約0.5mlの溶液を該チューブ内に残した。細胞を、残りの溶液に再懸濁した。予め37℃に温めておいた低張液（水に溶解した0.075M KCl）を約1.5mlまで細胞に滴下した。さらに６mlの同じ溶液を該チューブに添加し、渦を描くようにして混合した。チューブを水浴中で37℃で15分間にわたってインキュベートした。低張液を添加し始めた時点から時間の計測を開始した。細胞を遠心分離し、固定液および約0.5mlの溶液をチューブに残した。細胞を残った溶液中に再懸濁した後、新鮮な氷冷固定液（3:1,メタノール：酢酸）を約1.5mlまで細胞に滴下した。同じ固定液の追加の６mlを該チューブに添加し、渦を描くように混合した。チューブを氷上で約30分間にわたってインキュベートし、900RPMで８分間にわたって遠心分離した。上清を捨て、約0.5mlの溶液をチューブに残した。これらの固定工程は、２回以上繰り返した。固定した細胞を、約１〜２mlの氷冷固定液中で再懸濁し、氷中に放置して、染色体を展開した（spreading）。
固定した細胞を氷冷した湿ったスライドガラス上に滴下した。通常、２〜４滴で十分である。必要ならば、スライドガラスは直ちに火炎処理して、展開を促進した。この染色体展開物を風乾し、一夜にわたって室温で放置した。最後に、このスライドガラスは、さらに使用するまで、−80℃で乾燥しながら保存した。
DNAプローブの高効率標識化のために、２段階ニックトランスレーション法を用いて、ビオチンまたはジゴキシンゲニン結合ｄATPまたはｄUTPのいずれかを有する非放射活性標識化DNAプローブを調製した。このプロトコールにおいて、ニッキング工程および鎖置換標識（chain displacement labeling）工程は別々に行った。まず最初に、ニッキング反応は、90μlのニック・トランスレーション緩衝液（50mM Tris-HCl,pH7.5、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT）に溶解した30μgのDNAのアリコートを、54ngのDNアーゼIの３倍の連続希釈物と共にインキュベートすることによって行った。このインキュベーションは、37℃で15分間にわたって行い、氷上で停止した。次いで、反応混合物を65℃で１時間にわたって加熱した。DNアーゼI処理サンプルのサイズは、アルカリ性アガロース電気泳動によって調べた。500〜800ヌクレオチドのDNA断片の分布を有するこのサンプルは最適サイズを有し、次の標識化反応に用いた。
ビオチン標識化反応では、3μgのDNアーゼI処理DNA、10μlの0.4mMビオチン-14-dATP（BRL）、1.5μlの1mM ｄCTP、ｄGTPおよびｄTTT、３ユニットのDNAポリメラーゼI（DNアーゼI活性なし、BRL）、15μlの10ｘニツクトランスレーション緩衝液（500mM Tris-HCl, pH7.5、500mM NaCl、100mM MgCl2、10mM DTT）を、最終反応体積が150μlとなるように添加した。反応は、16℃で一夜にわたって行った。
ジゴキシンゲニン標識化反応では、３μgのDNアーゼI処理DNA、15μlの0.35mMDig-dUTP（Borihinger Mannheim）、1.5μl 0.65mM DTTP、1mM ｄCTP、および1mM DGTP、３ユニットのDNAポリメラーゼI（DNアーゼI活性なし、BRL）、15μlの10ｘニックトランスレーション緩衝液（500mM Tris-HCl, pH7.5、500mM NaCl、100mM MgCl2、10mM DTT）を、最終反応体積が150μlとなるように添加した。反応は、16℃で一夜にわたって行った。
この標識化反応は、５μlの0.5M EDTAおよび17μlの0.3M NaAcを添加することによって停止させた。DNAを2.5倍容のエタノールで沈殿させ、75%エタノールで２回洗浄した。標識化プローブは、0.1％のSDSを含有する60μlのTE（pH8.0）に溶解し、使用に供した。
蛍光insituハイブリダイゼーションは、Lawrenceらの方法（Lawrenceら、1988）に改良を加えたものに従って行った。最初に、スライドガラスを65℃で２時間にわたってインキュベートして、染色体を硬化させた。このスライドガラスを、次に、新たに調製した0.1Mトリエタノールアミン（Sigma）および0.25%無水酢酸（Sigma）溶液中で室温で10分間にわたってアセチル化した。スライドガラスを２ｘSSCで２回濯いだ後、染色体を70%ホルムアミド-2ｘSSC（HClでpHを7.0に調製した）中で、70℃で２分間にわたって変性した。変性したスライドガラスは、直ちに、氷冷した70%、95%および100%のエタノール浴に各々５分間ずつ通すことによって脱水し、ヘアドライヤーで風乾した。
各スライドガラスに対して、150ngのビオチン標識化またはジゴキシンゲニン標識化AAVまたはneorDNAプローブ、50ngのビオチン標識化第19染色体プローブ（染色体の二重標識用）、15μgの超音波処理したサケ精子DNA、60μgのtRNA（Sigma）を含有する30μlのハイブリダイゼーション溶液を用いた。マイクロフージチューブ中の上記成分は、凍結乾燥し、15μlの脱イオン化ホルムアミド中で再懸濁し、70℃で10分間にわたって加熱した。変性した後、20%のデキストランサルフェート、1%のBSAおよび4ｘSSCを含有する同量（15μl）の溶液を該チューブに添加し、ボルテックス処理により混合した。このハイブリダイゼーション溶液をスライドガラスに塗布し、カバーガラスで被覆し、ゴム製結合剤で密封した。ハイブリダイゼーションは、一夜にわたって湿潤チャンバー内で37℃で行った。この湿潤チャンバーが50%のホルムアミドおよび2ｘSSCからなるものである場合には、スライドガラスを密封する必要はない。ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスを、50%ホルムアミドおよび２ｘSSCを含有する洗浄溶液中に５分間にわたって浸漬して、カバーガラスを緩めて剥した。次いで、このスライドガラスを、上記洗浄溶液中で２回にわたって、37℃で各々３０分間洗浄し、最後に1ｘSSC中で室温で３０分間にわたって洗浄した。
このスライドガラスを300μlのRNアーゼH緩衝液（100mM KCl、20mM Tris-HCl, pH7.5、1.5mM MgCl2、0.7mM EDTA、50μg/ml BSA、1mM DTTおよび13mM HEPES pH7.5）で濯いだ。８U/mlのRNアーゼH（BRL）および10μg/mlのRNアーゼA（Sigma）を含有する200μlのRNアーゼH緩衝液を各スライドガラスに塗布し、パラフィルムで被覆し、温水の湿潤チャンバー内で37℃で１時間にわたってインキュベートした。スライドガラスを、1ｘSSCで室温で10分間にわたって２回濯いだ。
このスライドガラスを、4ｘSSC、3% BSAおよび0.1% Tween 20（またはTritonX 100）を含有する200μlのブロッキング溶液で室温で10分間にわたってブロックした。ビオチン標識化プローブの検出では、５μg/mlの蛍光（FITC）標識化アビジン（Vector laboratoriesから入手可能なDCSまたはDN等級）、４ｘSC、1%BSAおよび0.1% Tween 20を含有する200μlの検出溶液をスライドガラスに塗布した。ジゴキシゲニン標識化プローブの検出では、４ｘSSC20中で1:25,000倍に希釈した抗ジゴキシン・モノクローナル抗体（Sigma）、1% BSAおよび0.1% Tweenを含有する200μlの検出溶液をスライドガラス上に塗布した。このサンプルをパラフィルムで被覆し、アビジンについては室温で、または抗体については37℃で、30分間にわたって暗所でインキュベートした。4ｘSSC中に溶解した0.1% Tween 20で37℃で各々10分間にわたって２回洗浄した後、抗ジゴキシン抗体で処理したスライドガラスを、Cy3結合抗マウス抗体（Dr. Alan Waggoner（Carnergie Mellon University Fluorescent Center）から寄贈）と共に、30分間にわたってさらにインキュベートし、上記のようにして洗浄した。最後の洗浄を行った後、Cy3またはFITCの双方で処理したスライドガラスは、ヨウ化プロピジウム（PI）またはDAPIのいずれかをPBS中（pH8.0）0.2μg/mlの濃度で用いて、５分間にわたって対比染色し、PBSで軽く濯いだ。最後に、そのスライドガラスに25μlの退色防止溶液をのせ、縁部をゴム製結合剤で密封した。このスライドガラスは、直ちに写真撮影してもよく、あるいは−20℃で１週間以上保存してから写真撮影してもよい。上記の退色防止溶液は、100mgのｐ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（Sigma）を10mlのPBSに溶解し、pHを0.1N NaOHでpH8.5に調節し、90mlのグリセロール（Fisher,酵素等級）と混合することによって調製した。アリコート（1ml）の該退色防止溶液を−80℃で暗所に保存し、これは１年以上安定であった。
蛍光標識化染色体は、ニコン・ラボフォト（Nikon Labophot）２表面蛍光（epifkuorescent）顕微鏡またはツァイス・アキオフォト（Zeiss Axiophot）表面蛍光顕微鏡で可視化した。FITC標識化ウイルス・シグナル（緑）とヨウ化プロピジウムで対比染色した染色体（赤）とを同時に観察するために、励起フィルター（exiter）485nm、二色フィルター（dichroic）510nm、およびバリア（barrier）420nmのフィルターの組み合わせを用いた。Cy3標識化ウイルスシグナル（赤）では、フィルターの組み合わせは、励起フィルターが546nm、二色フィルターが580nm、およびバリアが590nmであった。DAPI対比染色染色体では、フィルターの組み合わせは、励起フィルターが365nm、二色フィルターが390nm、およびバリアが420nmであった。写真は、コダカラー・ゴールド（Kodacolor Gold）ASA400フィルムを用いて30秒〜１分間の露光時間で撮影した。
6.1.6.ランダム・プライマー標識化プローブを用いたサザン・ブロット
サザン・ブロットは、約10μgのゲノムDNAを適当な制限酵素で、DNA1μg当たり50〜10ユニットの酵素、および反応溶液１マイクロリットル当たり0.2μg未満のDNAで消化することによって行った。消化を行った後、エタノール沈殿によりDNAを濃縮し、0.02%のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール追跡用色素の各々を含有する20〜30μlのTBE電気泳動緩衝液中に再懸濁した。消化したDNAは、TBE緩衝液での1%アガロース電気泳動（電圧：＜2V/cm）によって分離した。電気泳動が完了した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、そのゲルの写真を撮影した。続いて、そのゲルを0.2N HClで５〜10分間にわたって処理し、蒸留水で濯ぎ、0.4N NaOHおよび0.6N NaCl中で30分間にわたって一定に振盪しながら変性した。同時に、１枚のジーンスクリーン・プラス・メンブラン（GeneScreen Plus membrane）（DuPont）を蒸留水で予め湿らせておき、0.4N NaOHおよび0.6N NaCl溶液中に浸漬した。移した後、そのナイロン膜を0.2Ｍ Tris-HCl、2ｘSSCで10分間にわたって中和し、風乾した。
プレハイブリダイゼーションを、1M NaCl、1% SDS、10%デキストランサルフェートを含有する10ml溶液中で65℃で少なくとも30分間にわたって行った。32−P標識DNAプローブは、ランダム・プライマー・キット（Boehringer Mannheim）を用いて作製し、100μg/mlのサケ精子DNAを1mlの水中で沸騰させ、氷上で素早く冷却した。このプローブ混合物を、ハイブリダイゼーション容器中の上記プレハイブリダイズした膜に添加し、65℃で一夜にわたってインキュベートした。この膜を、1%SDSを含有する2ｘSSCで室温でそれぞれ５分間にわたって３回洗浄し、0.2%SDSを含有する0.2ｘSSCで65℃でそれぞれ30分間にわたって２回洗浄し、最後に、0.1%SDSを含有する0.1ｘSSCで室温でそれぞれ５分間にわたって２回洗浄した。この膜をサランラップ（Saran Wrap）で包み、強化スクリーン（intensifying screen）（DuPont）を用いて、あるいは用いずに、X線フィルム（Kodak）に暴露した。
γ−32P-ATP末端標識化ITRオリゴヌクレオチド・プローブA-1（ITRのA領域から誘導した5'TTGGCCACTCCCTCTCTGCG3'）および／またはTR-1（5'GGAATTCAGGAACCCCTAGTGATGG3'）を用いたハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。すなわち、上記膜を、5ｘSSC、１０ｘDenhardtの溶液、10%デキストランサルフェートおよび5%SDSを含有する10mlの溶液中で、60℃で少なくとも１時間にわたってプレハイブリダイズした。0.5mlのH2Oに入れた25ngの32P−末端標識オリゴプローブおよび200μgの熱変性サケ精子DNAを添加した。ハイブリダイゼーションを、60℃で一夜にわたって行った。該膜を、60℃で、3ｘSSCに溶解した5%SDSを用いて、それぞれ10分間わたって２回濯ぎ、それぞれ30分間にわたって２回洗浄した。その膜を0.2ｘSSC中で室温で10分間にわたって１回濯ぎ、サランラップで包み、X線フィルムに暴露した。
6.1.7.特異的宿主標的配列のクローニングおよび特徴決定
組換えベクターpDD-Neoを、デトロイト６細胞のヒト・ゲノムに組込んだ。Neo耐性クローン細胞系を選別し、細胞系DD16を選択して、さらに分析した。クローンｐDD16Bは、精製したDD16細胞系からの全ゲノムDNAをBgl IIで消化することによって誘導した。このゲノムDNAは希釈し、再ライゲートし、大腸菌を形質転換するのに用いた。形質転換体は、アンピシリンの存在について選別した。元のクローンpDD16（図９）は、長さが14kbであり、長さが8.5kbおよび5.5kbの２つの断片を生ずる２つのBgl II切断部位を含有していた。pDD16Bは、その5.5kbのBgl II断片を欠失させることによって誘導した。pDD16Bプラスミド挿入物は、サンガー（Sanger）らの方法（1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5463-5467）を用いて配列決定した。
Ssp I部位（nt 190）からSma I部位（左側結合のnt 515）までの左側結合（left-hand junction）のための326塩基対のプローブ、および右側結合からSma I部位（右側結合のnt77）までの184塩基対のプローブは、pDD16Bを制限酵素により消化し、続いて、DNA断片をゲル精製することによって得た。このDNA断片を標識し、サザン・ブロット解析に用いて、pDD-neo組込み部位の特徴決定を行った。
6.2.結果
6.2.1.AAV組込みのin situ分析
In situハイブリダイゼーションは、遺伝子のマッピングにとって非常に強力な手段である。サザン・ブロット分析と比較した利点は、標的遺伝子または断片を、染色体上にで直接可視化できる点である。蛍光in situハイブリダイゼーションは、古典的な同位体in situ法よりも、蛍光in situハイブリダイゼーションの方が、微細な解像度および高い信頼性を有しており、かつ複数の色のプローブを同時に使用することを可能にする、という点において優れている（Tranks, 1991）。
野生型AAVに感染させた３種の潜伏細胞系を、蛍光in situハイブリダイゼーションによって調べた。デトロイト５（D5）と命名した１種の細胞系（Bernsら、1975）は、17年前に、母細胞であるデトロイト６細胞（ヒト肺癌細胞系）から樹立された。他の２種の細胞系であるG11およびH3は、AAV感染HeLa細胞から誘導した。実験において、ビオチン−dATPで標識したAAVプローブおよびジオキシンゲニン−ｄUTPまたはビオチン−ｄATPで標識したSstプローブ（第19染色体および第４染色体上のｑ腕の中心部に位置するDNA断片）（Epsteinら、1987）を別々に、あるいは同時に用いて、染色体展開物とハイブリダイズした。続いて、蛍光標識したアビジン（緑）およびCy3で標識した抗dig抗体（赤）を用いて、AAVシグナルおよび／または第19染色体シグナルを検出した（図29）。試験した３種の細胞系の全てにおいて、AAVウイルスDNAは、１個の第19染色体のｑ腕の先端にシグナルを生じた（同じ腕上でのSstプローブの同時局在化（co-localization）によって確認した）。
これらの結果から、AAVが第19染色体のｑ腕の先端へ優先的に組込まれる、という明らかな結果が実証され、確認される。ウイルスREPおよびCAP遺伝子が部位特異的組込みにおいて何らかの役割を果たすか否かという疑問に取り組むために、REPおよびCAP遺伝子の全体を欠失させ、それらをネオマイシン耐性（neor）遺伝子で置き換えることによってREP- CAP-組換えAAV構築体を作製した。その結果得られたウイルスは、左側に１つのTRを、中心部にneor遺伝子を、そして右側に１つのTR＋140bpの非コーディングAAV配列を含有している（McLaughlinら、1988）。ウイルス・ストックは、ヘルパー・プラスミドpAAV/Adを用いて調製し、それは、REPおよびCAP遺伝子以外はITRを含有していない。デトロイト６細胞をそのウイルスに感染させ、G418耐性クローンについて選別した。
５種の独立したG418耐性細胞クローンを、ビオチン標識neoプローブ単独、またはneoプローブ＋第19染色体プローブのいずれかを用いたin situ蛍光ハイブリダイゼーション（Epsteinら、1987）に供した。試験したこの５種の細胞系の中の１種が、野生型AAVと同様に、第19染色体上に組込まれたneo−AAVを有していた（図２、細胞系S102についてのパネルAおよびB）。残りの細胞系は、染色体特異的プローブ、または染色体結合および形態学のいずれかによって同定したところ、別の染色体上に組込まれたneo−AAVを有していた。これらの結果は、図２の、パネルCおよびD（第12染色体上でのクローンS110について）、パネルEおよびF（第22染色体上でのクローンS101について）、パネルGおよびH（第２染色体上でのクローンS111について）、およびパネルIおよびJ（D群染色体上での、クローンD5 neo Sc#3について）とパネルK（D群染色体上での、クローンD5 neo Sc#2について）もそれぞれ示す。パネルI、JおよびKからのクローンは、１つの起源（original）細胞系からの異なるサブクローンであるので、それらは、同一であると考えるべきである。
パネルKでは、neoおよびAAVプローブが同時に用いられたおり、野生型AAVは第19染色体上に容易に観察することができたが、一方、neo−AAVは非常に微弱なシグナルを有しており、このことは、neo−AAVのコピー数が少ないことを示唆する。上記の結果から、逆方向末端反復配列は、in situハイブリダイゼーションによって明らかにしたところ、20%（1/5）という低い頻度ではあるものの、部位特異的組込みを媒介可能なシス配列を含有することが示唆される。
REP- CAP- AAVは、第19染色体への組込み頻度が野生型AAVよりも低く、Rep遺伝子は部位特異的組込みに含まれるので、REP+ CAP- neo−突然変異AAVは、CAP遺伝子をneor遺伝子で置き換え、REP遺伝子を十分に機能的なままにしておくことによって作製した（HermonatおよびMuzyczka、1984）。REP+ CAP- neo−AAV細胞クローンは、G418選択によって作製し、in situハイブリダイゼーションに供した。10種の細胞系をアッセイした。それらの２種は、第19染色体に組込まれたneoウイルスを有していた（図３、クローンHN63についてのパネルAおよびB、およびクローンXNR-4についてのパネルCおよびD）。残りの８種のクローンでは、REP+ CAP- neo−AAVは第19染色体に組込まれなかった（図３、パネルE〜T）。例えば、クローンXNR-2（パネルGおよびH）は、第５染色体に形態学上類似する染色体の動原体の付近の部位にneoウイルスを有していた。クローンXNR-3（パネルIおよびJ）は、クローンS111の場合と同様に、第２染色体に類似する染色体のｐ腕の中心部に該ウイルスを有していた（REP- CAP-、図２、パネルGおよびH）。クローンHN21（パネルSおよびT）は、DM上にneoウイルスを有しており、その場合、共通するAAV組込み標的配列は、サザン・ブロットにより事前に判明していたように（Kotinら、1990）、該ウイルスによって分断されていた。19q13上の共通する脆弱部位は報告されている（YunisおよびSoreng,1984；Yunisら、1987）、という事実に基づいて、このDMは、薬剤選別のもとに第19染色体から誘導できた。この考察を確認するためには、さらなる調査が必要である。
上記の結果から、突然変異neo−AAVウイルスの機能性REP遺伝子は、第19染色体への組込み効率を高めることができなかったことが実証される。REP- CAP- neo−AAVと同様に、REP+ CAP- neo−AAVによる第19染色体特異的組込み効率は約20%（2/10）であり、HN21の場合を陽性の結果であるとカウントした場合にはおそらくは30%（3/10）である。これに対して、野生型AAVは、80%より高い特異性を有していた（Kotinら（1990）およびSamulskiら（1991）から公表された結果を編集することによる。本発明者らは、18種の野生型AAV細胞系の中の15種が第19染色体配列に組込まれたプロウイルスを有していたことに注目した）。
キャプシド遺伝子が、AAVによる第19染色体への高効率の組込みにおいて何らかの役割を果たすか否か、という問題に取り組むために、REP遺伝子を、neo遺伝子で置き換え、キャプシド遺伝子を無傷のままとしておくことによって、２種の突然変異構築体を作製した。一方のプラスミドでは、キャプシド遺伝子は、天然のp40プロモーターによって作動する。もう一方のプラスミドでは、このp40プロモーターが欠失しており、その結果、プロモーターを欠くキャプシド遺伝子となる。REP- CAP+ neo−AAVウイルスは、慣用の方法によって調製した。ヒト・デトロイト６細胞を組換えウイルスに感染させ、G418耐性の単一クローンを単離した。機能性p40プロモーターを有するウイルスから作製したクローンをXCB-1〜XCB-12と命名し、プロモーターを欠くキャプシド・ウイルスから作製したものをXCH-1〜-10と命名する。
5種のG418耐性クローンを、in situ染色体ハイブリダイゼーションによって調べた。それらの１種はXCB-2であり、これは、プライマーJus-3（AAV組込みホットスポットからの細胞結合プライマー）およびneo−３（neoウイルスの左末端にあり、外側を指すプライマー）を用いたPCRによって陽性として前もってスクリーニングされていた。他の４種のクローンは、XCB-5、XCB-7、XCH-2およびXCH-3であり、それらはPCRで陰性であった。本発明者らがin situハイブリダイゼーションによってウイルス・シグナルを検出できなかったXCH-3を除いて、他の４種の細胞系は、それぞれ、１つの染色体上にウイルス・シグナルを示した。XCB-2は、第19染色体に組込まれたウイルスを有していた（図33、パネルAおよびB）。XCB-5は、同定されていない染色体の長腕の先端上に該ウイルスを有していたが（図33、パネルCおよびD）、XCB-7は、別の染色体の長腕の中心部上に該ウイルスを有していた（図33、パネルEおよびF）。XCH-2は、或る染色体（形態学上から、おそらくは第５染色体）の長腕にある動原体に近い部位に組込まれた該ウイルスを有していた（図33、パネルGおよびH）。注目すべきことに、前もって行ったREP+ CAP- neo−AAV細胞系を用いたin situハイブリダイゼーション（XNR-2、図32、パネルGおよびHを参照）から、非常に類似した結果が示された。すなわち、neo−ウイルスは、XCH-2と（同じではないとしても）類似する染色体の細胞遺伝的位置にある、という結果である（図４、パネルGおよびH）。したがって、REP- CAP+ neo−AAVウイルスは、蛍光in situハイブリダイゼーションにより判明したように、同様の第19染色体への特異的組込み効率（約25%（1/4））を有していた。
6.2.2.ゲノム・サザン分析
蛍光in situハイブリダイゼーションは、染色体上での物理的位置を顕微鏡レベルで直接可視化できるが、その方法は、サザン・ブロット分析と比較した場合、分子レベルでの感度および解像度は有さない。
このin situ蛍光ハイブリダイゼーションの結果を確認するために、in situハイブリダイゼーションにより既に分析されたneo−AAV潜伏細胞系を、ゲノム・サザン・ブロットによりさらに特徴決定した。均一性（consistency）および容易な判定の理由から、種々のneo−AAV細胞からのゲノムDNAを、制限酵素BamHIで消化した。その理由は、この酵素が、同じ22種の潜伏AAV細胞系の組込みを特徴決定するための先の研究で用いられていたからである（Kotinら、1990）。その研究では、ゲノム・ブロットは、第19染色体上に位置するクローン化した共通するAAV細胞結合断片をプローブとして用いて釣り上げ、それは、母細胞におけるサザン・ブロットにより単一の2.6kbのBamHIバンドとして現れるが、野生型AAV潜伏細胞系の約80%においては分断されている（Kotinら、1990、Samulskiら、1991）。同じ形態学を用いて、突然変異neo−AAV細胞系を分析した。その結合断片をプローブとして釣り上げた後、同じブロットをナトリウムでストリップした。
試験した９種のREP+ CAP-細胞系において、それらの中の３種が、neo断片と同時に泳動する第19染色体結合断片を有しており（XNR-4、XNR-5およびHN-63、図５のレーン４、５および９を参照）、このことは、該ウイルスと細胞結合配列との物理的ライゲートを示唆する。これらの３種の細胞系の中で、XNR-4およびXHN-63（レーン４および９）は、単一のneoバンドと同時に泳動する、単一の、上方にシフトした細胞結合バンドを有していた。サザンによる結果と一致して、これらの２種の細胞系中のプロウイルスも、in situハイブリダイゼーションにより、１つの第19染色体のｑ腕の先端で可視化した。これに対して、クローンXNR-5中のプロウイルスは、in situハイブリダイゼーションにより、第19染色体とは異なる染色体の長腕の先端に位置していたが（図３、パネルKおよびL）、サザン・ブロットは、ウイルス配列および第19配列の同時泳動を示した（図５、レーン５）。さらに、neoプライマーおよび共通する結合プライマーを用いたPCRからは、この細胞系およびXNR-4における陽性の結果が得られ（データは示さず）、このことは、物理的連結を示唆する。この細胞系からの染色体展開物を注意深く調べても、第19染色体上でのneoシグナルは判明しなかった。上記の観察、および２つの上方にシフトした細胞結合バンドが２つのneoバンドと同時に泳動し、他のneoバンドは全く見出されない、というサザンの結果に基づけば、２通りの解釈ができるであろう。まず第１に、細胞系XNR-5において、neo−AAVウイルスが、第19染色体の共通組込み部位に実際に組込まれていたと、いう解釈である。第２に、本発明者らには、ウイルス組込みの前に起こったのか、あるいは後で起こったのかわからないが、幾つかの転座事象が起こっていたかもしれない、という解釈である。
細胞系HN21では、in situハイブリダイゼーションから、neo−AAVがDM上に位置することが実証された。しかし、サザン・ブロットからは、細胞結合フラグメントが切断されていることがわかった（Kotinら、1990）。したがって、DMを第19染色体から薬剤選別のもとに誘導することは可能である。
細胞系XBR-3では、結合断片とハイブリダイズする、下方にシフトしたバンドが存在している（図５、レーン３）。しかし、このバンドは、シグナルneoバンドと同時に泳動しない。一貫して、in situハイブリダイゼーションからは、第19染色体以外の第２染色体上のneo−AAVプロウイルスが明らかになる（図３、パネルIおよびJ）。したがって、この細胞系では、neo−AAVは、第19染色体部位には組込まれなかった。さらに、AAVキャプシド・プローブを用いたこの細胞系のドット・ブロットからは、野生型AAVの存在が明らかになり、これは、neo−AAVの調製の際に生ずる野生型AAVヘルパー・ウイルスに由来していた。neo−AAV組込みの代わりに野生型の組込みを行うことにより、改変した細胞バンドをもたらすことができるかもしれない。
以上のことをまとめると、サザン・ブロットの結果は、in situハイブリダイゼーションの結果とよく合致する。つまり、10種の細胞系の中の８種からのアッセイは、完全に一致する（この８種とは、２種の19特異的組込み（XNR-4およびHN-65）、および６種の19非特異的組込み（XNR-1、-2、-3、-6、-7および-8）である）。残りの２種の場合では、幾つかの新たな現象が判明した。すなわち、転座やDM等の細胞遺伝的再配置（rearrangement）である。現在、これらの再配置が、AAV組込みの前に起こっているのか、あるいは後で起こっているのかということ、およびそれらが薬剤選別によって引き起こされたのか、あるいは単にAAV組込みによって引き起こされたのか、ということはわかっていない。
In situハイブリダイゼーションによって調べた５種のREP- CAP- neo−AAV細胞系の中で、neo−AAVは、たった１種の細胞系'S102）において、第19染色体に組込まれていたことがわかった。その結果は、S102のサザン分析からは、単一の上方にシフトした細胞結合バンドが、単一のneoバンドと同時に泳動することを実証することによって確認された（図５、レーン14）。結合プライマーと、右側ITRまたは左側ITRのいずれかを指す２種のneoプライマーとを用いたPCR反応からも、肯定的な結果が得られた（データは示さず）。他の４種の細胞系は、in situハイブリダイゼーションにより、第19染色体ではない染色体に組込まれたneo−AAVを有していたことがわかり、サザン・ブロットによっても、第19染色体およびneo配列との同時泳動についての肯定的な結果は得られなかった（図５）。例えば、細胞系S110（図５、レーン15）およびS111（Kotinら、1990）では、ゲノムブロットでは、第19染色体配列の分断は全くない。一貫して、in situの結果は、それぞれ第12および第２染色体上でneo−AAVプロウイルスを可視化した。細胞系D5 neo Sc#3では、母細胞D5は、野生型AAVの組込みにより生ずる２種の改変した第19染色体細胞バンドを有していた（Kotinら、1989）。REP- CAP- neo−AAVで重感染させた後、細胞断片のサザン・ブロットのパターンは変わらないままであり（図５、レーン12）、このことはneo−AAVによるさらなる分断がないことを示唆している。結合体またはneo断片をプローブとして釣り上げたフィルムの注意深いスーパーインポジション（superimposition）および位置合わせ（alignment）により、単一のneoバンドが最大の細胞バンドと同時に泳動する可能性が取り除かれる。In situハイブリダイゼーションも、D群染色体上のneo−AAVを示した。細胞系S101の場合、単一のneoバンドは、分断された19配列と同時に泳動しなかった。この細胞系に共存する野生型AAV（Mclaughlinら、1988）は、おそらく、第19染色体部位の改変を起こすことができたであろう。
REP- CAP+ neo−AAV細胞系は、同じような結果を示す。In situハイブリダイゼーションの結果およびサザン・ブロットの結果は、互いに一致している。細胞系XCB-2（図34、レーン16）では、３つのバンドのうちの２つが、２つの上方にシフトした細胞バンドと同時に泳動し、in situハイブリダイゼーションーからは、neo−AAVプロウイルスが第19染色体上に位置していることがわかった。19組込みのない残りの４種の細胞系では、第19染色体配列は全く分断されておらず、プロウイルスは第19染色体上で可視化されなかった。
結論として、確認したサザン・ブロットの結果およびin situハイブリダイゼーションの結果を表１にまとめた（本明細書の第13頁）。
野生型AAVは、第19染色体に高効率で組込まれる。In situハイブリダイゼーションによってアッセイした５種の細胞系の全てが、野生型AAVを第19染色体上に有する。これらの結果は、サザン・ブロット実験との一致し（Kotinら、1990；Samulskiら、1991）、そこにおいて、AAVプロウイルス配列は、細胞結合配列と同時に泳動することがわかっており、これは、部位特異的組込みを示すものである。
20%という低い効率ではあるが、どのようなウイルス・コーディング配列も有さない二重突然変異（double-mutant）AAV（REP- CAP-）は、依然として第19染色体に組込むことが可能であり、このことは、逆方向末端反復配列が、部位特異的組込みに必要な、そしておそらくは十分なシス配列を含有することを示唆している。
突然変異AAV（REP- CAP-）中の機能性REP遺伝子は、特異的組込みの効率を著しく増加させず、このことは、REP遺伝子単独では高頻度の特異的組込みに対して役割を果たさないことを示唆する。
同様に、突然変異AAV（REP- CAP+）中の機能性CAP遺伝子も、特異的組込みの効率を増加させず、このことはREP遺伝子もCAP遺伝子も単独では、第19染色体への高効率での組込みに寄与しないであろうことを示唆する。したがって、組込み事象は、REPおよびCAPタンパク質の双方が共働的に機能することを必要とすると考えられる。
6.2.3.特定の標的宿主配列のクローニングおよび特徴決定
pDD16Bは、低コピーまたは単一コピーでデトロイト６細胞系においてヒト・ゲノムに組込まれている組換えAAVプロウイルスpDD-Neoのクローンの誘導体である。ｐDD16Bの配列決定から、左側結合部または右側結合部のいずれにおいても、AAV末端反復配列が完全に無傷ではないことが示される。左側結合部は50塩基対の末端反復配列を含有しており、一方、右側結合部は80塩基対の末端反復配列を含有していた（図13および14）。pDD16Bは、末端反復配列に加えて、pDD-Neoを有する右側結合部上に175塩基対のゲノムDNAを、そして、pDD-Neoを有する左側結合部に約4.3kbのゲノムDNAを含有する。
Ssp I部位からの左側結合部のための326塩基対のプローブ（左側結合部のStriderマップのnt 515）、およびSma I部位からの右側結合部のための184塩基対のプローブ（右側結合部のStriderマップのnt 77）を、pDD16Bの制限酵素による消化、および切断断片のゲル精製によって作製した。これらのプローブを用いて、pDD-Neoの組込み部位の位置の特徴決定を行った。
図11は、低コピーまたは単一コピーのpDD-Neoプロウイルスを含有する潜伏デトロイト６細胞系からのBgl II消化ゲノムDNAのサザン・ブロットを示す。このブロットは、先述のpDD-Neoの左側結合部からのDNA断片をプローブとして用いて釣り上げた。全ての細胞系において、このプローブは、7kbの前段階組込みDNA断片にハイブリダイズした。さらに、このプローブは、レーン８および10の8.5kbのDNA断片ともハイブリダイズした。レーン10は、pDD16Bが最初に誘導されたゲノムDNAである。レーン10において左側結合プローブがハイブリダイズするこの追加のDNA断片のサイズは、pDD16Bプラスミドと同じである。レーン８において左側結合プローブがハイブリダイズする追加のDNA断片のサイズは、レーン10で見られるDNA断片よりもわずかに大きいように見え、このことは、潜伏細胞系（レーン８）に存在する別個のプロウイルスが、レーン10から誘導されたプロウイルスと同じ染色体配列も標的とすることを示唆し、これが、好ましい組込み部位であることを示す。
図12は、Bam HIからの消化による個々のヒト染色体からのDNAを含有する体細胞ハイブリッド・パネルのサザン・ブロットを示す。このブロットは、左側結合部から誘導されたDNA断片をプローブとして用いても釣り上げられた。このプローブは、ヒト男性および女性全DNA中の単一のBam HI DNA断片とハイブリダイズし（レーン１および２）、マウスまたはハムスターからのDNAとはハイブリダイズしなかった。このことは、この配列がユニークであることを示す。このプローブは、第２染色体からのDNAと強くハイブリダイズし、第１染色体からのDNAとはわずかにハイブリダイズするだけであった。左側結合プローブは、他のヒト染色体以外とは顕著なハイブリダイゼーションを示さなかった。これらのデータから、この配列が、ヒトゲノム全体に存在しないこと、およびこのベクターが、本実施例において、主に第２および第１染色体上に存在するユニークな、または低コピーの細胞配列に標的とすることが強く示唆される。
微生物の寄託
以下の細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection：ATCC）（Rockville, Maryland）に寄託されており、以下の受託番号が指定されている。
0004083799.tif 000003
本発明は、本明細書において記載されている特定の具体例による範囲に限定されず、それらの特定の態様は、本発明のそれぞれの態様の単なる説明のためのものにすぎず、機能的に等価な方法および成分は本発明の範疇内である。事実、本明細書に示されている、あるいは記載されているものに加えて、本発明の種々の改変は、上述の記載および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付の請求項の範囲内であると意図される。
【図１】
0004083799.tif 000004
【図２】
0004083799.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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