(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有する、グラム陰性桿状細菌に属する微生物Ｄ１株（Bacterium  Ｄ１）（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８１）により産生されるジスルフィドレダクターゼＤ１。
（１）基質特異性：タンパク質あるいはペプチドに含まれるＳ−Ｓ結合に対して還元活性を有し、ケラチン等の非水溶性タンパク質に対してはプロテアーゼＤ１との混合により良好にケラチンを分解する。
（２）ケラチン基質として、ｐＨ６．５〜８．０で反応を行った場合に、最大活性温度は３０℃である。
（３）ケラチン基質として、３０℃、３０分間反応を行った場合に、至適ｐＨ６．５〜８．０である。
（４）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で分子量が１５ＫＤａである。
（５）等電点（ｐＩ）は７．２である。
（６）Ｎ末１５残基の配列は
-Pro-Val-Asp-Ile-Ala-Ala-Asp-Cys-Glu-Arg-Leu-His-Ala-Leu-Ser-NH２である。
【請求項２】
以下の酵素学的性質を有する、グラム陰性桿状細菌に属する微生物Ｄ１株（Bacterium  Ｄ１）（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８１）により産生されるプロテアーゼＤ１と請求項１記載のジスルフィドレダクターゼＤ１とを混合して用いることを特徴とするケラチンの分解方法。
［プロテアーゼＤ１の酵素学的性質］
（１）基質特異性：水溶性タンパク質に対して活性を有し、ケラチン等の非水溶性タンパク質に対してはジスルフィドレダクターゼＤ１、あるいはジチオスレイトール等の還元剤との混合により良好な活性を有する。
（２）カゼイン基質として、ｐＨ８．０〜９．５で反応を行った場合に最大活性温度は、４０℃である。
（３）カゼイン基質として、３０℃、３０分間反応を行った場合に至適ｐＨ８〜９．５の範囲であり、ｐＨ６．５〜１０の範囲にて最大活性の８０％以上の活性を有する。
（４）阻害剤PMSF（フェニルメタンスルオニルフルオリド）にて活性阻害効果が小さい。
（５）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で分子量が４０ＫＤａである。
（６）等電点（ｐＩ）は７．５である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グラム陰性桿状細菌の一菌株を培養することによって得られる新規プロテアーゼＤ１と新規ジスルフィドレダクターゼＤ１との組合わせにより高いケラチン分解活性が得られる酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
髪、爪、羽毛等の主成分であるケラチンは、Ｓ−Ｓ結合を有し、不溶性タンパク質の中でも特に硬い構造を有していることが知られている。
従って、従来からこのような非水溶性タンパク質に対しても、ケラチン分解活性の高い新規プロテアーゼへの期待が高かった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者等は、動物の羽根や、毛の含んだ土壌からの集積培養を試みることにより、寒天培地上に複数のコロニーを得て、そのスクリーニングにより、ケラチン分解活性の高い新規細菌株を得ることができ、先に特許出願した。（特願２００１−２６５１８１号）
このケラチン分解活性を有する新規細菌Ｄ１株（Bacterium  Ｄ１）は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８１である。
【０００４】
本願発明者等は、このBacterium  Ｄ１株の培養により得られる酵素について、詳細に調査研究を行った結果、上記酵素は、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーによる精製やポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定により、新規プロテアーゼＤ１と新規ジスルフィドレダクターゼＤ１の２つの酵素の存在が明らかになり、本発明の完成に至ったものである。
即ち、本発明は、新規プロテアーゼＤ１と新規ジスルフィドレダクターゼＤ１とを組合わせてケラチン等の非水溶性タンパク質を分解する新規酵素の提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ケラチン含有寒天培地にて好気的にBacterium  Ｄ１を２５０時間培養し、その上清を限外濾過によって濃縮し、陰イオン交換クロマトグラフィーにて、最も高いケラチン分解活性を示すフラクションをゲル濾過クロマトグラフィーにかけることにより、プロテアーゼＤ１とジスルフィドレダクターゼＤ１の２つのフラクションが得られる。
以下、このようにして得られたプロテアーゼＤ１とジスルフィドレダクターゼＤ１について説明する。
上記新規プロテアーゼは、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）−PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）を用いてその分子量及び、等電点電気泳動による等電点を測定した結果、図１に示すように、プロテアーゼＤ１の分子量約４０ＫＤａ、等電点（ｐＩ）７．５であった。
次に、この新規プロテアーゼＤ１の酵素学的性質を説明する。
図２（Ａ）に、カゼイン基質におけるプロテアーゼＤ１の至適温度調査結果を示し、図２（Ｂ）に、各温度にて時間経過に伴う残存活性度（％）の変化を示す。
比較のために、常温プロテアーゼの１つである市販のセリンプロテアーゼ（Savinase）の値も示す。
この結果、プロテアーゼＤ１の最大活性温度が４０℃であり、１０℃以下の低温でも比較的高い活性を有している。
また、４０℃で６０分間インキュベーション後に約４０％失活性している。
従って、この結果、常温プロテアーゼと比較して低温酵素であることが明らかになった。
【０００６】
図３にプロテアーゼＤ１の至適ｐＨ及びｐＨ安定性に関する調査結果を示す。
なお、図３に示す緩衝液の略号は、次のとおりである。
AA：acetic  acid（酢酸）、
MES：２−（N-morpholino）ethanesulfonic  acid（２−エヌ−モルフォリノ  エタンスルフォン酸）、
MOPS：３−（N-morpholino）propanesulfonic  acid（３−エヌ−モルフォリノ
プロパンスルフォン酸）、
TAPS：N−［Tris（hydroxymethyl）-methyl］−３−aminopropanesulfonic  acid（エヌ−トリスヒドロキシメチルメチル−３−アミノプロパンスルフォン酸）、
CHES：２−（N-cyclohexylamino）ethanesulfonic  acid（２−エヌ−シクロヘキシルアミノエタンスルフォン酸）、
CAPS：３−（cyclohexylamino）−１−propanesulfonic  acid（３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルフォン酸）、
GLY：glycine（グリシン）
図３（Ａ）は、それぞれの緩衝液を用いて各ｐＨに調整後にカゼイン基質の下で、３０分間酵素反応させた相対活性度をグラフに表したものである。
図３（Ｂ）は、それぞれの緩衝液中に３０分間プロテアーゼＤ１を放置後に、３０分間酵素反応させて活性度を調査したものである。
なお、活性度の測定は、ホーリンチオカルト法を用いて遊離アミノ酸を呈色させて６６０ｎｍの吸光度を測定した。
この結果から、プロテアーゼＤ１の至適ｐＨが８〜９．５であり、８０％以上の活性を有するｐＨ安定性は、６．５〜１０であることが明らかになった。
【０００７】
図４に示す表は、プロテアーゼＤ１に対する種々の阻害剤の影響を調査したものである。
その結果、特徴的なのは、従来知られているケラチン分解酵素の殆どがセリンタイプのものであることからすると、PMSF（フェニルメタンスルオニルフルオリド）による阻害効果は小さく、従来にない酵素であることが言える。
【０００８】
本発明に係るプロテアーゼＤ１は、後述するbacterium  Ｄ１を培養して得られたジスルフィドレダクターゼＤ１と共存させると非常に高いケラチン分解活性を示すのが特徴的であり、このプロテアーゼＤ１の基質特異性の調査結果を図５に示す。
水溶性タンパク質は、S-S結合を殆ど含まないため、プロテアーゼＤ１のみでも活性を示し、ジスルフィドレダクターゼＤ１を添加しても活性の向上が認められない。
一方、それに対してケラチン等の非水溶性タンパク質に対しては、プロテアーゼＤ１のみでは分解活性が低いが、ジスルフィドレダクターゼＤ１を混合すると６〜２０倍以上活性が高くなっている。
【０００９】
次に、ジスルフィドレダクターゼＤ１について説明する。
図６に、SDS−PAGE及び等電点電気泳動により、分子量と等電点を測定した結果を示し、ジスルフィドレダクターゼＤ１の分子量は、約１５Ｄａであり、等電点（ｐＩ）７．２であった。
ジスルフィドレダクターゼＤ１のアミノ基末端側のアミノ酸配列を解析した結果、Ｎ末１５残基が明らかになり、以下にその配列を示す。
-Pro-Val-Asp-Ile-Ala-Ala-Asp-Cys-Glu-Arg-Leu-His-Ala-Leu-Ser-NH２
なお、他のタンパク質との相同性を調査した結果、以下にアミノ酸配列を示すArabidopsis  thaliana由来のチオレドキシン様タンパク質と約５０％相同性が認められたものの、他の多くの生物種から得られたチオレドキシンとはほとんど相同性が認められなかった。
（Arabidopsis  thaliana由来のチオレドキシン様タンパク質のＮ末アミノ酸配列）
-Met-Val-Asp-Ile-His-Ser-Thr-Glu-Glu-Phe-Leu-Ser-Ala-Leu-Ser-NH２
図７（Ａ）に、ケラチン基質（ケラチンパウダー）を用いた温度変化に対するジスルフィドレダクターゼＤ１の相対活性を示し、図７（Ｂ）にその温度安定性を示す。
この結果、ジスルフィドレダクターゼＤ１の最大活性温度は、約３０℃であり、４０℃以上に対して不安定であることから、低温特性を有していることが明らかになった。
【００１０】
図８に、ジスルフィドレダクターゼＤ１の至適ｐＨ及びそのｐＨ安定性の調査結果を示す。
調査方法は、基本的に先に述べたプロテアーゼＤ１に準ずるが、活性度はエルマン法を用いて遊離チオールをDTNB試薬に呈色反応させ、その吸光度を測定した。
その結果、ジスルフィドレダクターゼの至適ｐＨは、６．５〜８．０であり、ｐＨ６．０〜８．５の範囲にてｐＨ安定性を示した。
【００１１】
図９には、ジスルフィドレダクターゼＤ１に対するNADH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及びNADPH（還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸）の影響を調査した結果を示す。
図９に示すグラフの値は、プロテアーゼＤ１とジスルフィドレダクターゼを混合した状態にてNADH及びNADPHの濃度を変化させた場合の発生チオール濃度変化を調査したものであり、NADH、NADPHがともにジスルフィドレダクターゼＤ１の電子供与体になることが明らかになった。
【００１２】
ジスルフィドレダクターゼＤ１のＳ−Ｓ結合に対する還元特異性を各種の基質を用いて調査した結果を図１０に示す。
この結果、ケラチンの様なタンパク質基質から、グルタチオンの様なペプチド基質まで広範囲に基質特異性を有していることが明らかになった。
【００１３】
図１１に、ジスルフィドレダクターゼＤ１と各種プロテアーゼを組合わせたときのケラチン分解活性の増大効果に関する調査結果を示す。
このグラフで「ＫＵ」とは、６６０ｎｍ波長吸光度が１時間に０．０１上昇する値を示す。
その結果、本発明に係るプロテアーゼＤ１とジスルフィドレダクターゼＤ１を組合わせると非常に高いケラチン分解活性を示すことが明らかになった。
【００１４】
プロテアーゼＤ１とジスルフィドレダクターゼＤ１との関係をさらに詳細に調査した結果を図１２及び図１３のグラフに示す。
図１２のグラフは、プロテアーゼＤ１（０．６μｇ）及び比較としてプロテネースＫ（０．６μｇ）に対して、ジスルフィドレダクターゼＤ１の添加量を変化させた際のケラチン分解活性変化を調査したものである。
その結果、プロテネースＫに比較してプロテアーゼＤ１の方がよりジスルフィドレダクターゼＤ１の作用を受けたケラチンに対して高活性になることが明らかになった。
【００１５】
図１３に示すグラフは、各種濃度のプロテアーゼＤ１又はプロテネースＫのケラチン分解活性に対して、それぞれに及ぼすジスルフィドレダクターゼＤ１（０．３μｇ）添加の効果を調査したものでその結果、ジスルフィドレダクターゼＤ１との組合せにより、ケラチン分解活性が非常に高くなることが明らかになった。
【００１６】
図１４のグラフは、プロテアーゼＤ１のケラチン分解活性が一般的な還元剤の影響を受けるか否かを調査したものである。
その結果、本発明に係るプロテアーゼＤ１は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のような還元剤との組合せにてもケラチン分解活性が高くなることが明らかになった。
【００１７】
【発明の効果】
本発明に係るプロテアーゼＤ１及びジスルフィドレダクターゼＤ１は、混合状態で協同的に作用して非常に高いケラチン分解活性を示し、各種のケラチン分解酵素としての適用のみならず、従来、分解処理が困難とされていた毛髪や羽毛等の分解酵素としても利用出来る。
なお、プロテアーゼＤ１は、ジチオスレイトール等の一般的還元剤の下でも高いケラチン分解活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】プロテアーゼＤ１の分子量及び等電点の測定結果を示す。
KDaの１が分子量マーカーを示し、２がプロテアーゼＤ１の値を示す。
【図２】プロテアーゼＤ１の至適温度調査結果を示す。
【図３】プロテアーゼＤ１の至適ｐＨ調査結果を示す。
【図４】プロテアーゼＤ１に対する阻害剤の影響調査結果を示す。
【図５】プロテアーゼＤ１の基質特異性を示す。
【図６】ジスルフィドレダクターゼＤ１の分子量及び等電点の測定結果を示す。KDaの１が分子量マーカーを示し、２がジスルフィドレダクターゼＤ１の値を示す。
【図７】ジスルフィドレダクターゼＤ１の至適温度調査結果を示す。
【図８】ジスルフィドレダクターゼＤ１の至適ｐＨ調査結果を示す。
【図９】ジスルフィドレダクターゼＤ１に対するNADH、NADPHの影響調査結果を示す。
【図１０】ジスルフィドレダクターゼＤ１の基質特異性を示す。
【図１１】各種プロテアーゼに対するジスルフィドレダクターゼＤ１の混合効果調査結果を示す。
【図１２】プロテアーゼＤ１に対するジスルフィドレダクターゼＤ１の混合量のケラチン分解活性の影響調査結果を示す。
【図１３】ジスルフィドレダクターゼＤ１の有無に対するプロテアーゼＤ１の混合量のケラチン分解活性の影響調査結果を示す。
【図１４】プロテアーゼＤ１に対するジチオスレイトールの混合効果調査結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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