(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトース、ガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｂとを含む混合物に、化合物Ｂを優先的に加水分解する、β−ガラクタナーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を作用させて化合物Ｂを低分子化し、次いで、低分子化した化合物Ｂと化合物Ａとを分離することを特徴とするガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
【請求項２】
β−ガラクタナーゼが、β−１，４−ガラクタナーゼである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
β−ガラクトシダーゼが、ラクトース分解能を有し、かつガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体に対して難分解性のβ−ガラクトシダーゼである請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
低分子化した化合物Ｂと化合物Ａとの分離を逆浸透膜法および／または強酸性カチオン交換樹脂分画法により行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
化合物Ａと化合物Ｂとを含む混合物が、β−ガラクトシル残基を有する糖とマルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体の混合物にβ−ガラクトシダーゼを作用させて生成される請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
β−ガラクトシル残基を有する糖が、重合度２以上のβ−１，４−ガラクトオリゴ糖またはラクトースである請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
マルトオリゴ糖が、グルコースの重合度が２〜７のマルトオリゴ糖またはこれらの混合物である請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
マルトオリゴ糖誘導体が、グルコースの重合度が２〜７のマルトオリゴ糖またはその混合物の還元性末端にαまたはβ−結合で無置換または置換フェニル基を有するマルトオリゴ糖誘導体である請求項５記載の製造方法。
【請求項９】
置換フェニル基がｐ−ニトロフェニル基または２−クロロ−４−ニトロフェニル基である請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
β−ガラクトシダーゼが、ガラクトース残基を、主としてβ−１，４−ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端グルコース残基に転移し得る酵素である請求項５記載の製造方法。
【請求項１１】
ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトースとを含む混合物に、ラクトースを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを作用させてラクトースを低分子化することを特徴とするラクトースの低分子化方法。
【請求項１２】
β−ガラクトシダーゼが、ラクトース分解能を有し、かつガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体に対して難分解性のβ−ガラクトシダーゼである請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法により得られた低分子化したラクトースと化合物Ａとを含む混合物から低分子化したラクトースを分離することを特徴とするガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
【請求項１４】
低分子化したラクトースと化合物Ａとの分離を逆浸透膜法および／または強酸性カチオン交換樹脂分画法により行う請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｃとを含む混合物に、化合物Ｃを優先的に加水分解するβ−ガラクタナーゼを作用させて化合物Ｃを低分子化することを特徴とするガラクトシル−オリゴ糖誘導体の低分子化方法。
【請求項１６】
β−ガラクタナーゼが、β−１，４−ガラクタナーゼである請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法により得られた低分子化した化合物Ｃと化合物Ａとを含む混合物から低分子化した化合物Ｃを分離することを特徴とするガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
【請求項１８】
低分子化したラクトースと化合物Ａとの分離を逆浸透膜法および／または強酸性カチオン交換樹脂分画法により行う請求項１７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はα-アミラーゼ活性測定用基質として有用なガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、従来法に比べてより簡便な精製方法を利用して、高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を製造することができる方法に関する。特に、反応混合液中の出発原料や副生成物であるラクトース（乳糖）や重合度２以上のβ-1,4-ガラクトオリゴ糖を酵素の加水分解作用により選択的に分解することで精製をより容易にする、工業的に有用な製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの体液、例えば血液、尿等に含まれるα-アミラーゼ活性を測定し、臨床診断に応用することが広く行われている。本発明者らは、α-アミラーゼの活性測定の際に、共役酵素（α-グルコシダーゼあるいはグルコアミラーゼ等）の加水分解作用を受けない安定で鋭敏な基質として、マルトオリゴ糖（グルコース重合度４〜７）あるいはその誘導体の非還元末端グルコース残基にガラクトシル基が結合した誘導体を開発した［特開平３−２６４５９６号］。この公報には、これらの誘導体の製造方法、及びそれを用いるアミラーゼ活性測定法も開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記公報に記載されたガラクトシル−マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の製造方法は、原料としてマルトオリゴ糖あるいはその誘導体とラクトースあるいはβ-1,4-ガラクトオリゴ糖の混合物を緩衝液中に溶解し、β-ガラクトシダーゼを作用させてβ-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を製造するものである。しかし、その反応終了液中に含まれる、目的とするガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の量は、約10%(w/w)程度である。残りは、主に、原料由来のラクトースや転移反応生成物であるガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖等である。
【０００４】
一方、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体がα-アミラーゼ基質として用いられる際には９８％以上という高純度を要求される。そのため、ゲル濾過精製法を用いて高純度品を製造する必要がある。ゲル濾過精製法は、一般的にマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を得る場合に用いられる方法であり、分離能力は高いが、処理可能量が少なく、ゲル自体の価格が高い等の欠点を有している。
特に、上記公報に記載の製造方法においては、出発物質のマルトオリゴ糖あるいはその誘導体及び目的物質であるガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を得るためには、ゲル濾過精製が二回以上必要である。さらに、反応終了液中のガラクトシル−マルトオリゴ糖含量が低いため、工業的規模でガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を製造する場合、生産量が制限され、高価にならざるを得なかった。
【０００５】
そこで本発明の目的は、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体をゲル濾過精製法を用いることなし、またはゲル濾過精製法とその他の簡便な精製方法とを組み合わせて精製することを可能にできる方法、及びこの方法を利用した高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供することにある。
【０００６】
さらに本発明は、上記目的達成のため、反応終了液中に含まれる副生成物または原料物質を、目的生成物を実質的に分解することなく酵素的に分解して低分子化することで、ゲル濾過精製法以外のより簡便で効率の良い精製方法を利用して、またはゲル濾過精製法とそれ以外のより簡便で効率の良い精製方法とを組み合わせて、高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供することが可能な方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた。その結果、β-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体を分解せず、かつ原料として用いられるラクトースや副生物であるガラクトシル−オリゴ糖類等の不純物のみを加水分解する酵素群を見出し、さらにこれらの酵素で加水分解して低分子化した糖類をゲル濾過精製法以外の精製法で分離して目的物であるβ-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体を精製することができることを見いだして本発明を完成した。
【０００８】
本発明のガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体の製造方法は、ガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトース、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース及びガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｂとを含む混合物に、化合物Ｂを優先的に加水分解する酵素を作用させて化合物Ｂを低分子化し、次いで、低分子化した化合物Ｂと化合物Ａとを分離することを特徴とする方法である［請求項１］。
【０００９】
さらに本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトースとを含む混合物に、ラクトースを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを作用させてラクトースを低分子化することを特徴とするラクトースの低分子化方法に関する［請求項１１］。また、本発明は、上記方法により得られた低分子化したラクトースと化合物Ａとを含む混合物から低分子化したラクトースを分離することを特徴とするガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関する［請求項１３］。
【００１０】
加えて本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｃとを含む混合物に、化合物Ｃを優先的に加水分解するβ−ガラクタナーゼを作用させて化合物Ｃを低分子化することを特徴とするガラクトシル−オリゴ糖誘導体の低分子化方法に関する［請求項１５］。また、本発明は、上記方法により得られた低分子化した化合物Ｃと化合物Ａとを含む混合物から低分子化した化合物Ｃを分離することを特徴とするガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関する［請求項１７］。
【００１１】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載の製造方法
請求項１に記載の製造方法では、ガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトース、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース及びガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｂとを含む混合物に、化合物Ｂを優先的に加水分解する酵素を作用させて化合物Ｂを低分子化する。
【００１２】
ここで、化合物Ｂを優先的に加水分解する酵素としては、β-ガラクタナーゼ及びβ-ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を例示することができる。但し、本発明ではこれらの酵素以外の酵素であっても、目的物質を実質的に分解することなく、出発原料及び副生成物を分解し得る酵素であればいずれも使用可能である。
【００１３】
β-ガラクタナーゼはガラクトース重合体を加水分解する酵素であり、一般的に入手可能である。本発明には目的物質であるβ-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を分解せずにガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたは２個以上のガラクトース残基が非還元末端側に結合したマルトオリゴ糖あるいはその誘導体を分解する酵素が必要である。そのようなβ-ガラクタナーゼとしては、例えば、β-1,4-ガラクタナーゼを挙げることができる。β-1,4-ガラクタナーゼとしては、例えば、Bacillus subtilis起源のもの（J.M.Labavitchら，J. Biol.Chem.,251,5904-5910）、Penicillium citrinum起源のもの（澱粉科学，第３６巻, P131-140,1989年）、Aspergillus  pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬製）Aspergillus niger起源の酵素製剤「ペクチネックス」（ノボノルディスクバイオインダストリー製）等のβ-1,4-ガラクタナーゼが挙げられる。
【００１４】
これらの酵素群については文献等ではガラクトースの重合体からなる高分子やガラクトース残基からなるガラクトオリゴ糖の加水分解の記述はみられるが、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖を加水分解することができることは本発明で初めて見いだされた。
【００１５】
β-ガラクトシダーゼは、各種β-ガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離する酵素として知られているが、２種類のβ-ガラクトシダーゼに大別される。第一の群は、ラクトース分解能を有し、かつガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体に対して難分解性のβ-ガラクトシダーゼである。第２の群のβ-ガラクトシダーゼは、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を生成させる転移活性の強いβ-ガラクトシダーゼである。
【００１６】
第１の群のガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体には作用せずにラクトースを加水分解するβ-ガラクトシダーゼとしては、クリベロマイセス由来のβ-ガラクトシダーゼを挙げることができる。そのようなβ-ガラクトシダーゼとして、例えば、クリベロマイセス・フラギルス（Kluyvermyces fragilis）起源の酵素製剤「ラクトザイム」（ノボノルディスクバイオインダストリー製）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精）等が挙げられる。
【００１７】
第２の群のβ-ガラクトシダーゼは、具体的には特開平３-２６４５９６号に述べたようにバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）起源の酵素製剤「Biolacta」（大和化成製）、アスペルギルス・オリゾエ（Aspergillus oryzoe）起源の酵素製剤「Lactase Fアマノ」（天野製薬製）、同じく「Lactase Y-AO」（ヤクルト）あるいは特開昭６２-１３０６９５記載のクリプトコッカス（Criptococcus）属起源のものが挙げられる。ガラクトース残基を主にβ-1,4-結合でマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の非還元末端グルコース残基に転移し得るバチルス属あるいはクリプトコッカス属由来の酵素が使用可能であるが、バチルス属由来の酵素の方が温度安定性が高いので好ましい。
【００１８】
上記化合物Ａと化合物Ｂとを含む混合物は、例えば、特開平３-２６４５９６号に記載されているようなβ-ガラクトシル残基を有する糖（代表的にはマルトース）とマルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体の混合物にβ-ガラクトシダーゼを作用させるで生成させた反応生成物であることができる。
【００１９】
ここで、「β-ガラクトシル残基を有する糖」は、重合度２以上のβ-1,4-ガラクトオリゴ糖またはラクトースであることができる。「マルトオリゴ糖」は、グルコースの重合度が２〜７のマルトオリゴ糖またはこれらの混合物であることができる。「マルトオリゴ糖誘導体」は、グルコースの重合度が２〜７のマルトオリゴ糖またはその混合物の還元性末端にαまたはβ-結合で無置換または置換フェニル基を有するマルトオリゴ糖誘導体であることができる。置換フェニル基は、p-ニトロフェニル基または2-クロロ-4-ニトロフェニル基であることができる。「マルトオリゴ糖誘導体」の具体例として、例えば、p-ニトロフェニルα−マルトペンタオシドや2-クロロ-4-ニトロフェニルβ−マルトテオラオシド等を挙げることができる。
【００２０】
また、β-ガラクトシダーゼは、ガラクトース残基を、主としてβ-1,4-ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端グルコース残基に転移し得る酵素であり、前述の第２の群に分類されるβ-ガラクトシダーゼである。
【００２１】
化合物Ａとしては、具体的には、以下の一般式（１）で表されるガラクトシル−マルトオリゴ糖を挙げることができる。
【００２２】
【化１】
0004109336.tif 000002
【００２３】
式中、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換若しくは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。
【００２４】
また、化合物Ｂの内、ラクトースは、上記で説明した反応原料として使用される糖である。さらに、化合物Ｂには、ラクトース以外の反応原料として使用される重合度２以上のβ-1,4-ガラクトオリゴ糖が含まれていてもよい。そのようなβ-1,4-ガラクトオリゴ糖としては、例えば、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、ガラクタン等が含まれる。また、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖は、上記反応の副生物である。これらガラクトシル-ラクトース等の反応副生物は、大半がβ-1,4-体があるが、少量のβ-1,6-体も含まれる。
【００２５】
本発明の方法では、上記酵素群からなる酵素を少なくとも１種類選択し、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を含む上記反応液に作用させることにより、不純物として含まれるラクトースやガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖等を加水分解させて、グルコースやガラクトースにまで低分子化する事ができる。尚、この酵素反応の条件（温度、ｐＨ、時間等）は、使用する酵素の種類と低分子化される糖の種類や量を勘案して適宜決定することができる。
【００２６】
次いで、低分子化した化合物Ｂと化合物Ａとを分離する。低分子化した化合物Ｂは、主にグルコースやガラクトースであり、オリゴ糖である化合物Ａとの分離は、例えば、逆浸透膜法により行うことができる。オリゴ糖と単糖類との分離は、逆浸透膜および／または強酸性カチオン交換樹脂分画法を用いれば大量にかつ簡便に行うことができる。また、一般にゲル濾過精製では分子量の大きさによる分離モードであるため、単糖とオリゴ糖とでは分離が容易になるので、上記分離をゲル濾過精製法により行うこともできる。また、逆浸透膜法および／または強酸性カチオン交換樹脂分画法で精製した糖をさらにゲル濾過精製することもできる。これにより、目的物質の含量が向上した糖についてゲル濾過精製を行えるため、生産性の大幅な向上が可能である。
尚、逆浸透膜法、強酸性カチオン交換樹脂分画法及びゲル濾過以外の方法も、分子量により物質を分離する方法であれば同様に使用することができる。
【００２７】
請求項１１に記載の方法
本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトースとを含む混合物に、ラクトースを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを作用させてラクトースを低分子化することを特徴とするラクトースの低分子化方法を包含する。
【００２８】
この方法における化合物Ａは、上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。また、β-ガラクトシダーゼは、ラクトース分解能を有し、かつガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体に対して難分解性のβ-ガラクトシダーゼであることができ、上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。また、酵素反応の条件（温度、ｐＨ、時間等）は、使用する酵素の種類と低分子化される糖の種類や量を勘案して適宜決定することができる。
【００２９】
請求項１３に記載の方法
上記の方法により得られた低分子化したラクトースと化合物Ａとを含む混合物から低分子化したラクトースを分離することでガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を製造することができる。低分子化したラクトースは、グルコースとガラクトースであり、オリゴ糖である化合物Ａとの分離は、上記請求項１に記載の製造方法と同様に、例えば、逆浸透膜法、強酸性カチオン交換樹脂分画法、ゲル濾過法等により行うことができる。
【００３０】
請求項１５に記載の方法
本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｃとを含む混合物に、化合物Ｃを優先的に加水分解するβ−ガラクタナーゼを作用させて化合物Ｃを低分子化することを特徴とするガラクトシル−オリゴ糖誘導体の低分子化方法も包含する。
【００３１】
ここで、化合物Ａは上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。また、化合物Ｃは、上記化合物Ｂからマルトースを除いたものである。β-ガラクタナーゼは、β-1,4-ガラクタナーゼであることができ、上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。酵素反応の条件（温度、ｐＨ、時間等）は、使用するβ-ガラクタナーゼの種類と低分子化される糖の種類や量を勘案して適宜決定することができる。
【００３２】
請求項１７に記載の製造方法
上記の方法により得られた低分子化した化合物Ｃと化合物Ａとを含む混合物から低分子化した化合物Ｃを分離することにより、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を製造することができる。低分子化した化合物Ｃは、主にグルコースとガラクトースであり、オリゴ糖である化合物Ａとの分離は、上記請求項１に記載の製造方法と同様に、例えば、逆浸透膜法、強酸性カチオン交換樹脂分画法、ゲル濾過法等により行うことができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
下記の実施例における糖組成は試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、ピーク面積より算出した。  ＨＰＬＣ条件，カラム；Shodex RS-pak DC-613 ( 6 I.D.mm×150mm），溶離液；アセトニトリル／水＝70/30(v/v)，流速；0.9 ml/min，カラム温度；室温，検出器；ＲＩモニターまたはＵＶ検出器（310nm）。
また酵素活性測定法は以下のようにして行った。
【００３４】
β-ガラクトシダーゼ活性測定
0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニル β-ガラクトシドと25mMリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間プレインキュベイションした。  適当濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭酸ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。pNP量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光純薬工業製)を用いて検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する酵素量を1Uとした。
【００３５】
β-ガラクタナーゼ活性測定
0.5mlの1.0%大豆アラビノガラクタンと50mMの酢酸緩衝液(pH4.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間プレインキュベイションした。  適当濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlにDNS試薬1ml添加し、10分間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光度を測定した。遊離した還元糖量はガラクトースを用いて検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとした。
【００３６】
実施例１  各種酵素剤の選択
ラクトース19.85g(58.0mmol)及びマルトテトラオース38.7g(58.0 mmol)を100mlの50mMリン酸緩衝液中(pH7.0)に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製, Bacillus circulans起源）を200 U添加し40℃で5時間反応させて、目的とするβ-1,4-ガラクトシル−マルトテトラオースを生成させた。ついで5%塩酸溶液で反応液のpH 3.5にした後、5分間煮沸し、酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は7.7%であった。
【００３７】
上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、各種酵素剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表１．に示した。
また次に表１の結果から本発明の目的に合致したβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を選択し、β-1,4-ガラクタナーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ2種類の酵素剤を順次作用させた場合の加水分解について検討した。上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、まずβ-1,4-ガラクタナーゼ剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた後、酵素を煮沸失活させた。次いでβ-ガラクトシダーゼをそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表２に示した。
【００３８】
【表１】
0004109336.tif 000003
【００３９】
【表２】
0004109336.tif 000004
【００４０】
実施例２  p-ニトロフェニルβ-ガラクトシル-α-マルトオリゴシドに対する加水分解
マルトテトラオースの代わりにp-ニトロフェニルα-マルトシド（Ｇ２Ｐ以下同様），Ｇ３Ｐ，Ｇ４Ｐ，Ｇ５Ｐ，Ｇ６Ｐ，Ｇ７Ｐをそれぞれ用い実施例１記載と同様の条件で反応を行い、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＰを含む反応混合液を得た。  本反応液に上記と同様の条件でそれぞれβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を添加し、糖組成を分析した結果を表３に示した。なお本表ではガラクトシル-ガラクトシル-ＧｎＰ、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ラクトースに対する分解は表１と同様であったので省略し、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＰに対する分解のみを記した。
【００４１】
【表３】
0004109336.tif 000005
【００４２】
実施例３  2-クロロ-4-ニトロフェニルβ-ガラクトシル-β-マルトオリゴシドに対する加水分解
マルトテトラオースの代わりに2-クロロ-4-ニトロフェニルβ-マルトシド（Ｇ２Ｃ以下同様），Ｇ３Ｃ，Ｇ４Ｃ，Ｇ５Ｃ，Ｇ６Ｃ，Ｇ７Ｃをそれぞれ用い実施例１記載と同様の条件で反応を行い、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＣを含む反応混合液を得た。  本反応液に上記と同様の条件でそれぞれβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を添加し、糖組成を分析した結果を表３に示した。  なお本表ではガラクトシル-ガラクトシル-ＧｎＣ、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ラクトースに対する分解は表１と同様であったので省略し、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＣに対する分解のみを記した。
【００４３】
【表４】
0004109336.tif 000006
【００４４】
実施例４  β-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースの調製
ラクトース2.0kg(5.8mol)及びマルトトリオース2.9kg(5.8mol)を10リットルの50mMリン酸緩衝液中（pH 7.0）に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製）を20,000 U添加し40℃で5時間反応させ、目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースを生成させた。  次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。  本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースは10.1%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは2.8%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.2%、ガラクトシル-ラクトースは2.0%、マルトトリオースは29.8%、ラクトースは25.4%、グルコースは12.0%、ガラクトースは3.4%でその他オリゴ糖は7.3%であった。
【００４５】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 5.0に調整し、反応液中に含まれるマルトテリオースを分解するために、Rhizopus nives起源グルコアミラーゼ（生化学工業製）を50,000 Uおよびガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースを分解するためにBacillus subtilis起源β-1,4-ガラクタナーゼ（日本食品化工製）を200,000 U添加し、40℃で24時間で反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。
次に本反応失活液のpHを6.5に調整し、原料の残りのラクトースを分解させるために、「ラクトザイム」（ Kluyvermyces fragilis起源）を100,000 U添加し、40℃で24時間反応させた。  反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。  本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースは9.9%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは1.2%、グルコースが59%、ガラクトースが25%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は4.9%であった。
【００４６】
上記酵素反応液6リットル（40%,w/v，固形物として2.4kg）を強酸性カチオン交換樹脂Dowex XFS-43278(ダウケミカル社製)を充填したカラム(26cm,I.D.×267cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；1500ml/min、検出器：ＲＩモニターで精製した。その結果、精製液の糖組成は、β-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースは62.3%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは6.1%、グルコースが2.3%、ガラクトースが2.5%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は26.8%であった。本操作により目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースの純度は最初の反応終了液の含量に比較して6.3倍に向上した。
本液250ml（40%,w/v，固形物として100g）をToyopeal HW-40S（トーソー製）を充填したカラム（13cm,I.D×95cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；5ml/min、検出器：ＲＩモニターでゲル濾過により精製し、純度98.5%のβ-ガラクトシル-マルトトリオース48.5g（固形物）を得た。
【００４７】
実施例５  β-1,4-ガラクトシル-マルテトラオースの調製
ラクトース2.0kg(5.8mol)及びマルテトラオース3.9kg(5.8mol)を10lの50mMリン酸緩衝液中（pH 7.0）に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製）を20 KU添加し40℃で5時間反応させ、目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースを生成させた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は7.7%であった。
【００４８】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 5.0に調整し、反応原料の残りのマルトテリオースを分解するために、Rhizopus nives起源グルコアミラーゼ（生化学工業製）を50,000 Uおよびガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースを分解するためにAspergillus  pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬製）を200,000 U添加し、30℃で24時間で反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。
【００４９】
次に本反応失活液のpHを6.5に調整し、原料の残りのラクトースを分解させるために、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精）を100,000 U添加し、40℃で24時間反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。  本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルテトラオースは10.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは1.5%、グルコースが62%、ガラクトースが22%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は4.3%であった。
【００５０】
上記酵素反応液を逆浸透膜モジュール（ＤＫ４０４０ＣＤＡ，デサリネイション社製）を用いて圧力20 kgf/cm2で10時間処理したところ、本液の糖組成は、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは57.4%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは5.3%、グルコースが8.8%、ガラクトースが5.5%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は27.5%であった。
【００５１】
本操作により目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトテラオースは最初の反応終了液の含量に比較して５．５倍に向上した。本液250ml（40%,w/v，固形物として100g）をToyopeal HW-40S（トーソー製）を充填したカラム（13cm,I.D×95cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；5ml/min、検出器：ＲＩモニターでゲル濾過により精製し、純度98.5%のβ-ガラクトシル-マルトテトラオース49.5g（固形物）を得た。
【００５２】
実施例６  p-ニトロフェニル  β-ガラクトシル-α-マルトペンタオシドの調製ラクトース20g及びp-ニトロフェニル  α-マルトペンタオシド（Ｇ５Ｐ）10gを100mlの50mMリン酸緩衝液（pH7.0）中に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製）を200 U添加し40℃で5時間反応させ、目的とするp-ニトロフェニルβ-1,4-ガラクトシル-α-マルトペンタオシド（Ｇａｌ-Ｇ５Ｐ）を生成させた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＵＶ検出器（310nm）を備えたＨＰＬＣにより分析したところ、Ｇａｌ-Ｇ５Ｐは15.0%、p-ニトロフェニルβ-ガラクトシル-ガラクトシル-α-マルトペンタオシド（Ｇａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐ）は5.5%であった。  またこの場合はガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ラクトース、ラクトース等の中性糖はゲル濾過精製時にｐＮＰ誘導体と大きく分離するため、分解する必要はなかった。
【００５３】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 3.5に調整し、Ｇａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐを分解するために酵素製剤「ペクチネックス」（ノボノルディスクバイオインダストリー製）を200 U添加し、40℃で24時間で反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＵＶ検出器（310nm）を備えたＨＰＬＣにより分析したところ、Ｇａｌ-Ｇ５Ｐは14.5%、Ｇａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐは0.5%であった。本液はゲル濾過精製カラム（実施例４，５記載と同様）によりＧａｌ-Ｇ５Ｐ含量98%以上の純度まで精製が可能であった。本ガラクタナーゼ処理を行わない場合は、同様の精製法を試みたところ、Ｇａｌ-Ｇ５ＰとＧａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐの分離が困難なため、Ｇａｌ-Ｇ５Ｐ含量は92%までしか向上しなかった。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体をゲル濾過精製法を用いることなしに、またはゲル濾過精製法とその他の簡便な精製方法とを組み合わせて精製することを可能にできる方法、及びこの方法を利用した高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供するができる。
さらに本発明によれば、反応終了液中に含まれる副生成物または原料物質を、目的生成物を実質的に分解することなく酵素的に分解して低分子化することで、ゲル濾過精製法以外のより簡便で効率の良い精製方法である逆浸透膜法を利用して、またはゲル濾過精製法と逆浸透膜法とを組み合わせて、高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供することができる。