(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化されているが、腫瘍形成能のないトリ細胞からなり、該細胞のゲノムがＳＶ４０Ｔ＋ｔ遺伝子を含み、該細胞が抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸分子を含み、発現することを特徴とする、前記トリ細胞系。
【請求項２】
該抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸分子が、細胞のゲノムに組み込まれていることを特徴とする、請求項１に記載のトリ細胞系。
【請求項３】
該抗アポトーシスタンパク質がｂｃｌ−２である、請求項１に記載のトリ細胞系。
【請求項４】
トリ組織の細胞から得られることを特徴とする請求項１に記載のトリ細胞系。
【請求項５】
線維芽細胞または上皮細胞に由来することを特徴とする請求項４に記載のトリ細胞系。
【請求項６】
該ＳＶ４０Ｔ＋ｔ遺伝子が、ＭＴＩプロモータの制御下にあることを特徴とする、請求項１に記載のトリ細胞系。
【請求項７】
下記のものから成る群から選択される、不死化されているが、腫瘍形成能のないトリ細胞系：
−  ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ［Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］）に参照番号Ｉ−１７０９として寄託されている細胞系ＴＤＦ−２Ａ  ｂｃｌ−２；
−  参照番号Ｉ−１７１０としてＣＮＣＭに寄託されている細胞系ＴＣＦ−４．１０；
−  参照番号Ｉ−１７１１としてＣＮＣＭに寄託されている細胞系ＴＣＦ−４．１０  ｂｃｌ−２。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞系に由来する不死化トリ細胞。
【請求項９】
該細胞が異種ヌクレオチド配列を発現する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列が、ウイルスペプチド、タンパク質または糖タンパク質をコードするか、もしくはタンパク質分子をコードすることを特徴とする請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
該細胞が、該細胞中で増殖することができるウイルスによって感染されていることを特徴とする請求項８に記載の細胞。
【請求項１２】
該細胞が、ヒトアデノウイルスからのｐ１９Ｅ１Ｂ、エプステイン・バールウイルスからのＬＭＰ−１、エプステイン・バールウイルスからのＢＨＲＦ１、単純ヘルペスウイルスからのＩＣＰ３４．５、およびバクロウイルスからのｐ３５から成る群から選択される抗アポトーシス遺伝子を含有することを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
【請求項１３】
該細胞が、ウイルス受容体をコードする遺伝子を含むベクターを含むことを特徴とする請求項８に記載の細胞。
【請求項１４】
該細胞が、ウイルスのための細胞受容体をコードする遺伝子を含むベクターを含むことを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
【請求項１５】
該細胞が、癌遺伝子産物をコードする遺伝子を含むベクターを含むことを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項８〜１５のいずれか１項に記載の細胞を選択すること；
該細胞にヌクレオチド配列を挿入すること；該細胞を培養すること；および
ウイルス、またはウイルスペプチド、タンパク質若しくは糖タンパク質、あるいはタンパク質分子を作製するように、該ヌクレオチド配列を発現すること
を含む、ウイルス、またはウイルスペプチド、タンパク質若しくは糖タンパク質、あるいはタンパク質分子を作製するための方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、トリ細胞系およびそれらの誘導体に関する。
トリ種から採取される器官から、哺乳類に由来するいくつかの器官においてはなされるようには、自生的に細胞系を確立することはできない。
これまで、入手可能な唯一の細胞系は、トリ白血病群のレトロウイルスまたはマレック病ウイルスのような発ガン性を有するある種のトリウイルス、またはメチルコラントレンおよびジエチルニトロースアミンのようなある種の化学分子の、形質転換特性を使用して得られた。
ほとんどの場合、これらの細胞系はあまりにも形質が転換され、これらをワクチンウイルス増殖のために適さないものにしている。
著者らは、発ガン性を示さないが、不死化を誘発する能力を有するように選択される遺伝子を細胞中に組み込むことができるベクターを、細胞に導入することから成る新規方法を適用している。
最初の試験は、ｅｒｂＡおよびｅｒｂＢのようなトリレトロウイルス遺伝子を組み込むベクターを使用して行われた。
フランス特許出願第ＦＲ−Ａ−２５９６７７０号は、トリまたは哺乳類細胞の培養物を、該細胞に対して発ガン性ではないが、ｖ−ｍｙｂ、ｖ−ｅｔｓおよびｖ−ｅｒｂＡから選択される遺伝子をこれらの細胞に組み込むことができるベクターまたは系で感染させる不死化方法を提案している。ＡＭＶ、Ｅ２６、およびＸＪ１２ウイルス（後者は発ガン性ｖ−ｅｒＢ遺伝子が欠失されたＡＥＶウイルスのウイルス誘導体である）が、適切なベクターになりうる。
実際には、これらの試験は造血細胞系の細胞から確立した細胞系を得ることを可能にしたが、一方、それらは付着培養において、線維芽細胞または上皮細胞のようなニワトリ胚細胞の場合に、期待される結果を示さなかった。
ガン遺伝子ｍｙｂを使用して、骨髄芽球様細胞型（血液細胞）の非形質転換トリ細胞系が得られた（国際特許出願第ＷＯ９１／１８９７１号）。
同時に、著者らは、種々の哺乳類組織に由来する細胞を不死化するために、サルウイルスＳＶ４０の初期ｔおよびＴ遺伝子を使用することを提案している（Ｄ．Ｓ．Ｎｅｕｆｅｌｄら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７年８月，２７９４−２８０２，Ｏ．ＫｅｌｌｅｒｍａｎｎおよびＦ．Ｋｅｌｌｙ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １９８７，３２：７４−８１およびフランス特許出願第ＦＲ−Ａ−２６４９７２１号）。
それに関して、フランス特許出願第ＦＲ−Ａ−２６４９７２１号は、従来法の高度特異性の欠点（特定の種及び／又は特定の細胞系への限定）を改善することを目的として、どの細胞型に関しても、およびどの種においても使用できると開示している条件付き不死化方法を提案している：形質転換ウイルスを用いる細胞の形質転換（アデノウイルス、エプスタインバールウイルス、ＳＶ４０ウイルスまたはポリオーマウイルスのようなある種のパポーバウイルス、例えば、ＳＶ４０ウイルスのみが、ネズミ細胞およびヒト細胞を形質転換するものとして示されている）；ウイルスプロモーターに結合されている形質転換遺伝子を含有する構成物でのトランスフェクション；細胞プロモーターに結合されている形質転換遺伝子でのトランスフェクション。この特許出願が選択しているのは、ビメンチンの調節配列からのＤＮＡ断片と不死化遺伝子をコードするＤＮＡ断片とを組み合わせた構成物であり、この構成物は、ビメンチンの誘導プロモーターの制御下のＳＶ４０ウイルスのＴ抗原であってもよい。この特許出願は、トリ種に関して記載していない。
そのようなウイルスガン遺伝子の実際の使用は、ウズラ上皮細胞の不死化を可能にするヒトアデノウイルス５のＥ１Ａタンパク質の１２Ｓ形の使用以外には（Ｇｕｉｌｈｏｔら（１９９３），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：６１９−６２４）、トリ種において記載されていない。
全ての予測に反して、発明者らは、非形質転換トリ不死細胞系の作製に成功した。
より一般に、発明者らは、トリ組織の細胞からでさえ、即ち、循環血液細胞または造血細胞以外の細胞から、アポプトシスに抵抗性の非形質転換トリ不死細胞系を作製できることを見い出した。
従って、本発明は、アポプトシスに抵抗性であり、および特にトリ組織に由来する、即ち、血液細胞または造血細胞以外の細胞に由来する、特に、例えば胚からの線維芽細胞または上皮細胞に由来する、非形質転換トリ不死細胞に関する。
本発明は特に、下記のものから成る群から選択される非形質転換トリ不死細胞系に関する：
−  ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ［Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］）に参照番号Ｉ−１７０９として寄託されている細胞系ＴＤＦ−２Ａ  ｂｃｌ−２；
−  参照番号Ｉ−１７１０としてＣＮＣＭに寄託されている細胞系ＴＣＦ−４．１０；
−  参照番号Ｉ−１７１１としてＣＮＣＭに寄託されている細胞系ＴＣＦ−４．１０  ｂｃｌ−２。
ｂｃｌ−２は、アポプトシスに対する抵抗性を細胞に付与するｂｃｌ−２遺伝子を機能的に組み込む細胞系の細胞を意味する（ＷＯ−Ａ−９３／２０２００、これは参照により本発明に取り込まれる）。
当然のことであるが、本発明はこれらの細胞系から誘導される細胞をも包含する。従って、指定番号においてＣＮＣＭに寄託されている本発明に含まれる細胞だけでなく、これらの寄託細胞の子孫を構成する細胞、即ち、一方において、簡単な増殖によって得られる細胞、これらの増幅の間に突然変異を受ける細胞、他方において、意図的な改質後に得られる細胞（従って、これらの細胞は誘導細胞と称される）、および当然のことであるが２種類の改質を受けた細胞も包含されると理解すべきである。
従って、本発明は、前記細胞の改質によって得られる細胞をも包含する。これらの改質は、下記のものを含む：
−  産業関連の分子をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を各々が含んで成る、１つまたはそれ以上の発現カセットを挿入することであって、これらの発現カセットは、本発明の細胞内への挿入後にこの分子を生成することができる。当業者はこの技術に充分に精通している。挙げることができる工業関連の分子は、特に、ワクチンまたは診断試薬に使用するためのペプチド、タンパク質、または糖タンパク質型のウイルスサブユニット、ホルモンのようなタンパク質分子などである。
−  ウイルスまたはワクチン製造を目的として、このウイルスに対する感受性の前改質を行うかまたは行わずに、これらの細胞中で増殖することができるウイルスに慢性的に感染させる。感染は、慢性的であってもよいが、ウイルス増殖のために選択される細胞のバッチにおいて行うこともできる。
（下記に記載される改質は、前記の２種類の改質と組み合わせるのが好ましく、好都合であると理解すべきである。）
−  これらの細胞系を、培養条件に対してより抵抗性にするために、特に、集密を維持するために、ヒトアデノウイルスｐ１９Ｅ１Ｂ（Ｒａｏら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７７４２−７７４６）、エプステイン・バールウイルス  ＬＭＰ−１（Ｇｒｅｇｏｒｙら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：６１２−６１４）およびＢＨＲＦ１（Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８７），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：１５１−１６１）、単純ヘルペスウイルス  ＩＣＰ３４．５（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｒｏｉｚｍａｎ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３２６６−３２７０）、およびバクロウイルス  ｐ３５（Ｃｌｅｍら（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１３８８−１３９０）タンパク質、をコードする遺伝子のような、ｂｃｌ−２以外の生存または抗アポプトチック遺伝子（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃｇｅｎｅｓ）を導入する。
−  増殖の速度を増加するのに適したベクターを使用して、細胞周期を制御するのに関与する遺伝子を過剰発現させる。従って、ある場合には、サイクリンをコードする遺伝子の過剰発現が、細胞周期を短縮させ、従って、増殖速度を増加させることが示された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９５），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：１５０１−１５０９；Ｑｕｅｌｌｅら（１９９３），Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．７：１５５９−１５７１）。
−  関心のウイルスの増殖のために、これらのウイルスの受容体をコードする遺伝子を組み込むことによって、細胞系のウイルス感受性スペクトルを改質する。
マウス細胞（通常、このウイルスを許容しない）による麻疹ウイルス（ＣＤ４６）の受容体の発現が、これらの細胞をこのウイルスに対して感受性にし、それを複製することができるようにする哺乳動物種を参照することができる（Ｎａｎｉｃｈｅら（１９９３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６０２５−６０３２）。特に興味深いことは、細胞をウイルスに対して感受性にして、これらの細胞においてウイルスを作製することである。
−  細胞増殖を促進させることができるガン遺伝子を組み込む。
本発明の誘導細胞が、１つまたはそれ以上の前記改質を含むことができることは自明である。
本発明は、産業関連の分子またはウイルスを製造する方法にも関し、該方法は、前記細胞を培養することを含む。
本発明は、特に、診断試薬またはワクチンを製造するための分子またはウイルスを製造することに関し、または治療関連の分子を製造することに関する。
非制限的例であると理解すべき実施態様によって、および図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。
図１は、細胞系ＴＤＦ−２Ａを作製するために使用されるベクターｐＤＡＭＴの構造を示し、該構造中、
ＬＴＲ：  直列反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）
ＬＴＲ：  欠失ＬＴＲ
ＭＴＩ：  マウスメタロチオネインＩプロモーター
ＳＶ４０  Ｔ＋ｔ：  ＳＶ４０初期領域
ＳＶ４０：  ＳＶ４０プロモーター。
図２は、細胞系ＴＣＦ−４．１０を作製するために使用されるベクターｐｐｈＭＴの構造を示し、該構造中、
ＬＴＲ：  直列反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）
ｐｈｌｅｏ：  フレオマイシンへの抵抗性のための遺伝子
ＳＶ４０ｐＡ：  ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ
ＭＴＩ：  マウスメタロチオネインＩプロモーター
ＳＶ４０  Ｔ＋ｔ：  ＳＶ４０初期領域。
実施例１：  ＴＤＦ−２Ａ細胞系の作製
Ｉ．  その起源およびその特性の説明
１．１  使用されるベクターの説明：ベクターｐＤＡＭＴ
マウスメタロチオネインＩプロモーター（ＢｇｌＩＩ部位がＨｉｎｄＩＩＩ部位に形質転換されているＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片）（Ｄｕｒｎａｍら（１９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６５１１−６５１５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）の制御下の、ＳＶ４０ウイルス初期領域（Ｔおよびｔ抗原をコードする）（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片）（Ｆｉｅｒｓら（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３−１２０）を含んで成る。
ベクターｐＭＴＳＶｎｅｏ（Ｐｅｄｅｎら（１９８９），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１８５：６０−７２）から誘導される、この転写単位を含有するＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ベクターｐＤＡ１（Ａｕｂｅｒｔら（１９９１），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１３：４９７−５０６）のＸｂａＩ部位に挿入した。後者のベクターは、本質的に、３’ＬＴＲの改質後のＲｏｕｓ肉腫関連ウイルス２（ＲＡＶ−２）のゲノムから誘導される。従って、ＲＡＶ−２  ３’ＬＴＲのＵ３領域が欠失し、ラウス肉腫関連ウイルス１（ＲＡＶ−１）ＬＴＲから単離されるＲおよびＵ５領域に結合される。該ベクターは、ベクターｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１）から誘導されるＳＶ４０プロモーターの制御下の、ネオマイシンへの抵抗性のための遺伝子を含有する転写単位も担持している。図１を参照。
１．２．  細胞系の確立、および不死化の立証
生後１４日のバリケン（Ｍｕｓｃｏｖｙ  ｄｕｃｋ）胚に由来する細胞を、ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ（１９８４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２−１１７４に記載されているジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）法を用いて、ベクターｐＤＡＭＴを用いてトランスフェクションした。次に、ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）Ｇ４１８（１５０μｇ／ｍＬ）を１５日間適用することによって、トランスフェクションされた細胞を選択する。次に、抵抗性クローンを、１〜２継代／週の割合で、規則的に継代培養する。この３ヶ月間の活性増殖後に、ほとんどの細胞が死亡する危機期間に入った。約２ヶ月間継続するこの期間後に、数個のクローンが活性増殖を再開し、それらが不死化されたことを示唆した。
ＴＤＦ−２Ａ細胞系がこのようにして２つの培養物から誘導される。これをさらに詳しく調査した。
ＴＤＦ−２Ａ細胞は、２００継代、即ち約４６０世代を達成し、従って、培養において６００日以上連続的に維持された。これと比較して、ＳＶ４０ウイルス初期領域を発現しない対照細胞は、培養物において２０継代以上維持することができない。
１．３．  増殖特性
不死化細胞を、３８℃において、ローラーボトル中、６％１０×ＨＡＭ  Ｆ−１０、４％１０×１９９ＨＡＮＫＳ、２．９５％〜４％のトリプトースブロス燐酸、５．６％〜２．５％の炭酸水素ナトリウム、０．１％１００×ビタミンＢＭＥ、３％ウシ胎児血清、５％〜１％カナマイシン、および０．５％〜１％バンコマイシンを含有する培地中で、培養する。
これらの条件下において、それらの倍加速度は２４時間毎に１回である。
１．４．  Ｔ抗原の発現
Ｔ抗原に特異的な抗体（Ｐａｂ  １０１：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｆ．  ｓｃ１４７）を使用する、間接免疫蛍光または間接免疫フォスファターゼによって、全ての細胞が、それらの核中にＴ抗原を発現することが立証され、それらが全てベクターを組み込んでいたことが示された。
この組み込みは、サザンブロット法によっても示された。不死化線維芽細胞のゲノムＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩおよびＢｓｔＸＩで消化させた。不死化遺伝子を発現し、ＴＤＦ−２Ａ細胞に挿入された転写単位が、大きな再配置を受けなかったことが、Ｔ抗体に特異的なプローブ（ｐｒｏｂｅ）（１０１８ｂｐ  ＮｄｅＩ／ＮｄｅＩ断片）でのハイブリダーゼーションによって立証された。これは、得られたハイブリダーゼーション断片の大きさが、予測された大きさと一致していたという事実によって示された。
１．５．  腫瘍形成能力の不存在
不死化細胞は、腫瘍形成能力を示さない。それらは、半固形培地中にコロニーを形成することができず、あるいはニワトリまたはカモの卵の漿尿膜に腫瘍を形成することができない。それらは、ヌードマウス、および生後１日のＳＰＦ（病原体非含有）子ガモまたはヒヨコに腫瘍を形成することもできない。
１．６．  核型
ＴＤＦ−２Ａ細胞の核型を、第１１４継代および第１３５継代において調査した。この調査は、この種のミクロ染色体特性が存在したことによって、細胞が実際にトリ由来であることを立証した。さらに、観察された染色体は、一次カモ胚細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｕｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｅｌｌｓ）に見られる染色体を表しており、それによって細胞系の起源が確認される。
ＩＩ．  特性
ＴＤＦ−２Ａ細胞は特に、一次カモ胚細胞において慣例的に複製されるアデノウイルス、パルボウイルス、およびレオウイルスのようなカモ特異性ウイルスに対して感受性を示す。従って、これらのウイルスは、この細胞系において作製することができる。
実施例２：  組み込み部位の同定による、ＴＤＦ−２Ａ細胞系の特性決定
第１１４継代および第１３５継代に由来する細胞から作製されたＴＤＦ−２Ａ細胞のゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩで消化した。次に、このように処理したＤＮＡをゲル電気泳動にかけ、続いてナイロン半透膜に移動させ、次に、Ｔ抗原に特異的なプローブ（１０１８  ｂｐ  ＮｄｅＩ／ＮｄｅＩ断片）を用いてハイブリダーゼーションした。例えば、ＢｇｌＩＩでの消化は、大きい２つのハイブリダーゼーションバンドを生じ（約１５および２３ｋｂ）、２つの組み込み部位の存在を示唆する。ＫｐｎＩでの消化は、大きい１つの主要バンド（約２０ｋｂ）、および少なくとも１つの小バンドを生じ、それによって少なくとも２つの組み込み部位の存在を確認する。
実施例３：  ＴＣＦ−４．１０細胞系の作製
１．  その起源およびその特性の説明
１．１  使用されるベクターの説明：ベクターｐｐｈＭＴ
マウスメタロチオネインＩプロモーター（ＢｇｌＩＩ部位がＨｉｎｄＩＩＩ部位に形質転換されているＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片）（Ｄｕｒｎａｍら（１９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６５１１−６５１５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）の制御下の、ＳＶ４０ウイルス初期領域（Ｔおよびｔ抗原をコードする）（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片）（Ｆｉｅｒｓら（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３−１２０）を含んで成る。
ベクターｐＭＴＳＶｎｅｏ（Ｐｅｄｅｎら（１９８９），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１８５：６０−７２）から誘導される、この転写単位を含有するＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ベクターｐＵＴ５０７（ＣＡＹＬＡ−ＦＲＡＮＣＥによって市販されている）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、フレオマイシンに抵抗性の遺伝子を発現する領域の３’に配置する（図２）。ベクターｐＵＴ５０７の構造は、Ｍｕｌｓａｎｔら（１９８８），Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：２４３−２５２に記載されている。
１．２．  細胞系の確立、および不死化の立証
ヒヨコ胚由来の線維芽細胞を、ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ（１９８４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２−１１７４に記載されているジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）法を用いて、ベクターｐｐｈＭＴでトランスフェクションした。次に、フェロマイシンを漸進的に（１０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ）１５日間適用することによって、トランスフェクションされた細胞を選択する。次に、抵抗性クローンを、１〜２継代／週の割合で、規則的に継代培養する。約２ヶ月間の活性増殖期間の後に、細胞増殖が非常に弱く、非常に高い率の死亡が存在する危機期間に入った。約３〜４ヶ月継続するこの期間後に、ＴＣＦ−４．１０クローンの数個の細胞が活性増殖を再開し、それらが不死化されたことを示唆した。
このようにしてＴＣＦ−４．１０細胞が、培養において、２００継代、即ち約４００世代を達成し、培養において３年間維持された。これと比較して、ＳＶ４０ウイルス初期領域を発現しない対照線維は、培養において２０〜３０継代以上維持することができない。
１．３．  増殖特性
不死化線維芽細胞を、３８℃において、６％１０×ＨＡＭ  Ｆ−１０、４％１０×１９９ＨＡＮＫＳ、２．９５％〜４％のトリプトースブロス燐酸、５．６％〜２．５％の炭酸水素ナトリウム、０．１％１００×ビタミンＢＭＥ、３％ウシ胎児血清、５％〜１％カナマイシン、および０．５％〜１％バンコマイシンを含有する培地中で、培養する。これらの条件下において、それらの倍加率は２４時間につき０．７倍である。
２．２．  Ｔ抗原の発現
Ｔ抗原に特異的な抗体（Ｐａｂ  １０１：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｆ．  ｓｃ１４７）を使用する、間接免疫蛍光または間接免疫フォスファターゼによって、全ての細胞が、それらの核中にＴ抗原を発現することが立証され、それらが全てベクターを組み込んでいたことが示された。
２．３．  腫瘍形成能力の不存在
不死化線維芽細胞は、腫瘍形成能力を示さない。それらは、ニワトリまたはカモの卵の漿尿膜に腫瘍を形成することができない。
３．  特性
ＴＣＦ−４．１０細胞は特に、トリウイルスに対する感受性を示す。特に挙げられるウイルスは、カナリア痘または鶏痘のようなトリポックスウイルス、またはマレック病ウイルス（１、２および３（ＨＶＴ）血清型）、またはガムボロ病ウイルス（Ｇｕｍｂｏｒｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）である。従って、これらのウイルスは、この細胞系において作製することができる。
実施例４：  ＴＣＦ−４．１０細胞におけるカナリア痘の増殖
ＴＣＦ−４．１０細胞を、ローラーボトルに接種する。カナリア痘を、定着ローンに植え付ける。ウイルスによって生じる細胞変性効果が普遍化したときに、細胞ローンを引き離すために振ることによって、収穫する。従って、収穫された混合物は、細胞ローンおよび培養上澄みから成る。Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて１分間、１３，５００ｒｐｍで処理することによって（Ｔ２５型ＩＫＡ装置）、全体を均質化する。
感染性ウイルス力価を、９６穴プレート上で行われるミクロ法によって測定する。ウイルス希釈物を、二次ヒヨコ胚細胞から製造したローンに植え付ける。各ウイルス希釈物を６穴に植え付ける。プレートを、ＣＯ2インキュベーター中で８日間培養する。穴中のウイルスの存在を、顕微鏡下における特徴的な細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察することによって調査する。感染力価を、ＫＡＲＢＥＲ法によって計算し、５０％ＣＰＥを与えるウイルス希釈の逆数の対数によって表す［力価＝ｄ＋ｒ／Ｎｘ（ｎ＋Ｎ／２）］［式中、ｄは、全穴が陽性である場合の、対数で表される希釈であり、ｒは希釈率であり、Ｎは希釈についての穴の数であり、ｎは０〜１００％の陽性穴の数である］
結果：  得られるウイルス力価は、一次カモ胚細胞において得られる力価と同等である。
実施例５：  ｂｃｌ−２遺伝子の組み込み
従来のトランスフェクション法（ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ（１９８４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２−１１７４に記載されているＤＭＳＯ法、または供給者（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）の推奨によるリポフェクタミン法）を使用して、ＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）プロモーターの制御下にｂｃｌ−２遺伝子の発現を可能にするベクターを、ＴＤＦ−２ＡおよびＴＣＦ−４．１０細胞に導入する。
トランスフェクションされた細胞を選択した後に、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現をウエスタンブロット法によって検出する。
次に、Ｂｃｌ−２タンパク質を発現する細胞を、アポプトシス過程（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ）が観察される培養条件下におけるそれらの生存能力（集密における細胞の維持）に関して試験する。
ＴＤＦ−２Ａ  ｂｃｌ−２細胞の場合は、集密に達する細胞によって生じるアポプトシス過程が、ＴＤＦ−２Ａ細胞と比較して、３〜４日引き延ばされる。ＴＣＦ−４．１０細胞と比較して、ＴＣＦ−４．１０  ｂｃｌ−２細胞において、集密における細胞密度の増加が観察される。
【図１】
0004149518.tif 000002
【図２】
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