(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質：
（１）50℃で測定する場合、pH3.5〜6.5のpH範囲でイソアミラーゼ活性を有し、約pH５に最適pHを有する；
（２）少なくとも30℃〜89℃の温度範囲でイソアミラーゼ活性を有し、約85℃において最適温度を有する；
（３）SDS-PAGEで測定する場合、約80kDの分子量を有する；
（４）5.2〜5.8の範囲に等電点を有する；及び
（５）ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）種に由来する；
を有するイソアミラーゼ酵素。
【請求項２】
前記ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）種がDSM 4252株である、請求項１に記載のイソアミラーゼ酵素。
【請求項３】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ酵素。
【請求項４】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ酵素。
【請求項５】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ酵素。
【請求項６】
配列番号：３の位置１〜2178に示されるヌクレオチド配列を有する核酸に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるイソアミラーゼ酵素。
【請求項７】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ酵素をコードするDNA。
【請求項８】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ酵素をコードするDNA。
【請求項９】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ酵素をコードするDNA。
【請求項１０】
イソアミラーゼ酵素をコードし、そして配列番号：３の位置１〜2178に示されるヌクレオチド配列を有する核酸に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするDNA。
【請求項１１】
請求項７〜10のいずれか１項に記載のDNAを含んでなる発現ベクター。
【請求項１２】
請求項７〜10のいずれか１項に記載のDNA、又は請求項11に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
真核細胞である、請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
菌類細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
酵母細胞または糸状菌細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）である、請求項15に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidini）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、フザリウム（Fusarium）ATCC 20334、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）またはトリコデルマ・リーシエ（Trichoderma reesie）の株である、請求項16に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
原核細胞である、請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
細菌細胞である、請求項18に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
バシラス（Bacillus）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、ブレヴィバシラス（Brevibacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、エシェリキア（Escherichia）である、請求項19に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・レンツス（Bacillus lentus）または大腸菌（Escherichia coli）の株である、請求項20に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１又は２に記載のイソアミラーゼ酵素の製造方法において、ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）種に属し、そして前記イソアミラーゼ酵素を生産することが出来る微生物を培養し、所望により培養物から前記イソアミラーゼ酵素を採取する、ことを含んでなる方法。
【請求項２３】
前記ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）種がDSM 4252株である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のイソアミラーゼ酵素の製造方法において、請求項12〜21のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、そして所望により培養物から前記イソアミラーゼ酵素を採取する、ことを含んでなる方法。
【請求項２５】
プロセス条件において活性である請求項１〜６のいずれか１項に記載のイソアミラーゼを澱粉の脱分枝鎖に使用することを特徴する、分枝鎖切断工程を含む澱粉転化法。
【請求項２６】
前記イソアミラーゼ酵素がα−アミラーゼと一緒に液化工程の間に活性であることを特徴とする、液化工程および糖化工程を含む澱粉解重合法である、請求項25に記載の澱粉転化法。
【請求項２７】
液化工程を4.5〜6.5、好ましくは約5.5のpH値、105〜11O℃の温度において５〜10分間実施し、次いで90〜l00℃において、１〜３時間、好ましくは約２時間実施する、請求項25又は26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
液化工程を4.5〜6.5、好ましくは約5.5のpH値、70〜110℃、好ましくは約80℃の温度において30〜180分間、好ましくは約80分間、α−アミラーゼ、必要に応じてイソアミラーゼの存在において実施する、請求項25又は26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
液化に引き続いて、糖化工程を50〜80℃の温度、pH4.5〜6.5、好ましくは4.5の範囲のpHにおいて、24〜72時間、好ましくは48時間、AMGおよび必要に応じてイソアミラーゼの存在において実施する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
カルシウムをO.75〜1.25mM、例えば、約１mMの量で添加する、請求項25〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
糖化工程後に、液化α−アミラーゼを不活性化する、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
α−アミラーゼがバシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼまたはバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のα−アミラーゼまたはピロコッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）のα−アミラーゼである、請求項25〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
糖化工程に引き続いて、異性化工程を実施する、請求項25〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
高フルクトースシロップを製造する、請求項25〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
脂肪代替物を製造する、請求項25〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
澱粉の液化のためにα−アミラーゼと組み合わせた請求項１〜６のいずれか一項に記載のイソアミラーゼの使用。
【請求項３７】
澱粉の糖化のためのAMGと組み合わせた請求項１〜６のいずれか一項に記載のイソアミラーゼの使用。
【請求項３８】
高フルクトースシロップを製造する、請求項37に記載の使用。
【請求項３９】
α−アミラーゼがバシラス（Bacillus）属、例えば、バシラス・リヘニフォルミス（B. licheniformis）の株に由来する、請求項36〜38のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
澱粉から脂肪代替物を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のイソアミラーゼの使用。
【請求項４１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のイソアミラーゼ酵素を含んでなる組成物。
【請求項４２】
澱粉の転化のための請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素の使用。
【請求項４３】
請求項25〜35のいずれか一項に記載の方法における請求項42に記載の使用。
【請求項４４】
寄託された大腸菌（E.coli）DSM11971株の単離された実質的に純粋な生物学的培養物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、分枝鎖切断（debranting）工程を含む型の澱粉転化法に関する。本発明は、また、澱粉を分枝鎖切断するための熱安定性イソアミラーゼの使用に関する。さらに、本発明は、ロドテルムス（Rhodothermus）属の株から得られる単離されたイソアミラーゼ、ロドテルムス（Rhodothermus）またはスルホロブス（Sulfolobus）の株に由来するイソアミラーゼをコードするクローニングされたＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列からなる発現ベクター、このような発現ベクターを含む宿主細胞、および最後に前記イソアミラーゼを製造する方法に関する。
発明の背景
澱粉、例えば、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、カッサバおよびイネの澱粉は、糖、例えば、フルクトースシロップ、高マルトースシロップ、マルトデキストリン、アミロース、トレハロース、Ｇ２−Ｇ８オリゴ糖（分画オリゴ糖を包含する）および他の炭水化物産物、例えば、脂肪代替物の商業的大規模生産における出発材料として使用される。
澱粉の分解
澱粉は通常約８０％のアミロペクチンおよび２０％のアミロースから成る。アミロペクチンは、直鎖状α−１，４−Ｄ−グルコース残基がα−１，６−グルコシド結合により結合された、分枝鎖状多糖である。アミロペクチンはα−アミラーゼにより部分的に分解される。α−アミラーゼはα−１，４−グルコシド結合を分枝鎖状および直鎖状オリゴ糖に加水分解する。α−アミラーゼにより延長した分解はいわゆるα−限界デキストリンを生成し、α−限界デキストリンはα−アミラーゼによるそれ以上の加水分解に感受性ではない。分枝鎖状オリゴ糖を分枝鎖切断酵素により直鎖状オリゴ糖に加水分解することができる。残りの分枝鎖状オリゴ糖をグルコアミラーゼによりＤ−グルコースにゆっくり解重合することができる。グルコアミラーゼは直鎖状オリゴ糖をＤ−グルコースに急速に加水分解する。
アミロースは、α−１，４−グルコシド結合により一緒に結合されたＤ−グルコピラノース単位から構成された直鎖状多糖である。アミロースはα−アミラーゼにより直鎖状オリゴ糖に分解される。α−アミラーゼはグルコアミラーゼによりＤ−グルコースに解重合される。
酵素
α−アミラーゼ
α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、系統的名称１，４−α−Ｄ−グルカングルカノフドロラーゼを有し、澱粉および直鎖状および分枝鎖状１，４−グルコシドのオリゴ糖および多糖を加水分解することができる。α−アミラーゼはランダムに基質に作用する。還元性基はα−立体配置で遊離される。
分枝鎖切断酵素
分枝鎖切断酵素は、アミロペクチンを攻撃することができ、２つのクラス、それぞれ、イソアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６８）およびプルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）に分類される。イソアミラーゼはアミロペクチンおよびβ−限界デキストリン中のα−１，６−グルコシド分枝鎖状結合を加水分解し、そしてプルランを攻撃するイソアミラーゼの能力およびα−限界デキストリンに対する制限された作用によりプルラナーゼと区別することができる。
グルコアミラーゼ
グルコアミラーゼまたはグルカン１，４−α−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）は、連鎖の非還元性末端から連続的に末端の１，４−結合α−Ｄ−グルコース残基を加水分解して、β−Ｄ−グルコースを解放する。この酵素は、また、イソマルトース、パノースおよび関係するオリゴ糖中の１，６−α−Ｄ−グリコシド結合をゆっくり加水分解することができる。
澱粉の転化
澱粉を低分子量の炭水化物成分、例えば、糖または脂肪代替物に分解する「伝統的」澱粉転化法は、分枝鎖切断工程を含む。
澱粉転化に対する澱粉
澱粉を糖に転化する場合において、澱粉は解重合される。このような解重合する方法は、前処理工程および２またはそれ以上の工程、すなわち、液化、糖化、および所望の最終生成物に依存して、必要に応じて異性化から成る。
天然の澱粉の前処理
天然の澱粉は、室温において水中に不溶性の微視的顆粒から成る。水性澱粉スラリーを加熱するとき、顆粒は膨潤し、究極的に破裂し、澱粉分子を溶液の中に分散させる。この「ゲル化」の間に、粘度は劇的に増加する。典型的な工業的方法において、固形分レベルは３０〜４０％であるので、澱粉を希釈するか、あるいは「液化」し、こうしてそれを取扱うことができるようにする。今日、この粘度の減少は主として酵素的分解により得られる。
液化
液化工程の間に、長鎖の澱粉はα−アミラーゼ（例えば、TermamylTM）により分枝鎖状および直鎖状のより短い単位（マルトデキストリン）に分解される。液化は１０５〜１１０℃において５〜１０分間、次いで９５℃において１〜２時間実施される。pHは５．５〜６．２である。これらの条件下に最適な酵素安定性を保証するために、１mMのカルシウムを添加する（４０ppmの遊離カルシウムイオン）。この処理後、液化された澱粉は１０〜１５の「デキストロース当量」（ＤＥ）を有するであろう。
糖化
液化において、マルトデキストリンは、グルコアミラーゼ（例えば、AMGTM）および分枝鎖切断酵素、例えば、イソアミラーゼ（米国特許第4,335,208号）またはプルラナーゼ（例えば、PromozymeTM）（米国特許第4,560,651号）の添加により、デキストロースに転化される。この工程の前に、pHを４．５以下の値に低下させ、高温度（９５℃以上）を維持して、液化α−アミラーゼを不活性化して、分枝鎖切断酵素により適切に加水分解できない「パノーズ前駆体」と呼ぶ短いオリゴ糖の生成を減少させる。
温度を６０℃に低下させ、そしてグルコアミラーゼおよび分枝鎖切断酵素を添加する。糖化を２４〜７２時間進行させる。
通常、糖化生成物の約０．２〜０．５％は、プルラナーゼにより分解することができない三糖類６2−α−グルコシルマルトース（パノース）である。液化工程からの活性アミラーゼが糖化（すなわち、非変性）の間に存在する場合、このレベルは１〜２％程度に高いことがあり、これは糖化収率を有意に低下させるので、高度に望ましくない。
異性化
所望の最終糖生成物が、例えば、高フルクトースシロップであるとき、デキストロースシロップをフルクトースに転化することができる。糖化後、pHを６〜８の範囲、好ましくはｐＨ７．５に増加させ、イオン交換によりカルシウムを除去する。次いで、例えば、固定化グルコースイソメラーゼ（例えば、SweetzymTM）を使用して、デキストロースシロップを高フルクトースシロップに転化する。
脂肪代替物への澱粉の転化
「脂肪代替物」は、食物における脂肪の機能的代替物として使用される、脂肪様炭水化物である。脂肪代替物は、典型的には、α−１，４−Ｄ−グリコシド結合により結合した約１５〜６５アンヒドログルコース単位を含有する、直鎖状ポリマーの短鎖アミロースから成る。このような脂肪代替物は、澱粉の酵素的分枝鎖切断により製造することができる。分枝鎖切断酵素を使用することによって、澱粉のα−１，６−Ｄ−グルコシド結合を分解して短鎖低分子量アミロースを生成する方法は、例えば、米国特許第3,730,840号（Sugimoto）、米国特許第3,881,991号（Kurimoto）および米国特許第3,879,212号（Yoshida）に記載されている。脂肪代替物として使用すべき短鎖アミロースを製造する他の方法は、EP0,486,936-A1号（National Starch and Chemical Investment Holding Corpotation）に記載されている。
発明の要約
本発明の目的は、望ましくない三糖類のパノースの生成を減少させる分枝鎖切断工程を含む型の澱粉転化法を提供することである。本発明は、また、本発明の澱粉転化法において使用するために適当な、新規な熱安定性イソアミラーゼに関する。
本発明によれば、用語「澱粉転化法」は、澱粉をより低い分子量を有する炭水化物成分に分解する、すべての方法を包含する。
本発明者らは、本発明の前述の目的の達成には、支配的なプロセス条件において活性であるイソアミラーゼ分枝鎖切断酵素を必要とすることを発見した。
それ以上の面において、本発明は、支配的なプロセス条件において活性であるイソアミラーゼを澱粉の分枝鎖切断に使用することを特徴する、分枝鎖切断工程を含む型の澱粉転化法に関する。
第２の面において、本発明は、澱粉転化法における熱安定性イソアミラーゼの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）イソアミラーゼからなるプラスミド、pRI5Aの制限酵素地図を示す。
第２図は、ロドテルムス・マリナス（R.marinus）イソアミラーゼのpH曲線を示す。
第３図は、ロドテルムス・マリナス（R.marinus）イソアミラーゼの温度曲線を示す。
第４図は、発現ベクター、pFSI82を示す。
第５図は、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）イソアミラーゼのpH曲線を示す。
第６図は、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）イソアミラーゼの温度曲線を示す。
第７図は、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３およびＤＰ４＋の収率に対する澱粉転化の間のロドテルムス・マリナス（R.marinus）イソアミラーゼの添加の効果を示す。
発明の詳細な説明
本発明のの目的は、望ましくない三糖類パノースの生成を減少させる分枝鎖切断工程を含む型の澱粉転化法を提供することである。本発明は、また、本発明の澱粉転化法において使用するために適当な、新規な熱安定性イソアミラーゼに関する。
本発明者らは、本発明の前述の目的の達成には、支配的なプロセス条件において活性であるイソアミラーゼ分枝鎖切断酵素を必要とすることを発見した。
澱粉解重合法の場合において、イソアミラーゼは液化の間に活性であるべきである。これはイソアミラーゼが９５〜１１０℃の範囲の温度、特に約１０５℃、４．５〜６．５の範囲のpH、特に約pH５．５において、実質的に活性であることを意味する。
本発明の関係において、「実質的に活性」は、イソアミラーゼの相対酵素活性が、最適な温度における相対活性に比較して、１００℃、pH５．５において、少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、ことに少なくとも７０％、特に少なくとも９０％、または少なくとも９５％、例えば、９９％であることを意味する。
α−アミラーゼの活性と一緒に液化の間に分枝鎖切断が起こるとき、パノーズ前駆体の生成は減少される。パノーズ前駆体の生成の減少とは、より少ないパノースが最終生成物の中に存在し、全体の糖化収率を増加させることを意味する。
熱安定性イソアミラーゼは、糖化工程の前に、液化および分枝鎖切断の同時の実施を可能とする。
熱安定性分枝鎖切断酵素の特定の例は、好熱性細菌、例えば、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）ATCC33909（Maruta、K.et al.、Biochemica et Biophysica Acta 1291、p.177-181（1996））、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）ATCC35092（受け入れ番号：Y08256）およびロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252に由来する熱安定性イソアミラーゼである。これらについて、後述される。
方法
第１の面において、本発明は、支配的なプロセス条件において活性であるイソアミラーゼを澱粉の分枝鎖切断に使用する、分枝鎖切断工程を含む型の澱粉転化法に関する。
本発明の態様において、澱粉転化法は、イソアミラーゼがα−アミラーゼと一緒に液化工程の間に活性である、澱粉解重合法である。
好ましい態様において、支配的なプロセス条件において活性である分枝鎖切断酵素は熱安定性イソアミラーゼである。
本発明によれば、伝統的澱粉解重合法における酵素的分解パターンが変化された。このような酵素プロセスの変化は従来不可能であった。なぜなら、すべての既知のイソアミラーゼは熱不安定性であり、６０℃以上の温度において不活性化されるからである。
本発明によれば、液化工程は４．５〜６．５、好ましくは約５．５〜６．２に調節されたpH値、１０５〜１１０℃の温度において１〜３時間、好ましくは約２時間、例えば、水酸化ナトリウムを使用して実施される。
必要に応じて、α−アミラーゼがカルシウム依存性である場合、カルシウムを３０〜５０ppm、例えば、約４０ppm（または0.75〜1.25mM、例えば、約１mM）の量で液化工程において添加して、酵素を安定化させる。
本発明によれば、液化工程後にパノースの生成を減少させるために、α−アミラーゼを不活性化することは不必要である。
液化工程において使用することができる特定のα−アミラーゼの例は下記のものを包含する：バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ、例えば、商業的に入手可能な製品TermamylR、SpezymeRAA、SpezymeRDelta AA、MaxamylR、KeistaseRおよびWO96/23874号（Novo Nordisk）およびPCT/DK97/00197（Novo Nordisk）に記載されているα−アミラーゼ突然変異体。
本発明に従い使用することができるイソアミラーゼは、好熱性始原細菌スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）および好熱性真性細菌ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）に由来する熱安定性イソアミラーゼを包含する（詳細に後述される）。
本発明によれば、、糖化工程は５５〜６５℃の温度、好ましくは約６０℃においてグルコアミラーゼにより２４〜７２時間実施される。適当なグルコアミラーゼの例は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、例えば、AMGTM（例えば、Novo Nordiskから入手される）である。
所望の最終糖生成物が、例えば、ほぼ５０％のフルクトースのシロップの高フルクトースシロップである場合において、生成したＤ−グルコースをpH約６〜８、好ましくはpH７．５においてイソメラーゼにより異性化する。
液化工程前に添加する場合、カルシウムを除去する。
適当なイソメラーゼの例は、グルコースイソメラーゼ、例えば、ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）に由来するグルコースイソメラーゼである。イソメラーゼは、固定化されたグルコースイソメラーゼ、例えば、SweetzymR（Novo Nordiskから入手可能である）であることができる。
使用
第２の面において、本発明は、澱粉転化法、例えば、フルクトースシロップ転化法および脂肪代替物の製造のための熱安定性イソアミラーゼの使用に関する。
澱粉転化法が澱粉解重合法である場合において、液化工程の間にα−アミラーゼと組み合わせて熱安定性イソアミラーゼを使用する。熱安定性イソアミラーゼは、好熱性始原細菌スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）またはスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）またはロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）に由来する。
澱粉をグルコースシロップへの液化工程またはフルクトースシロップ転化法の間に、熱安定性イソアミラーゼ使用することができる。熱安定性イソアミラーゼは、また、澱粉から脂肪代替物を産生する方法において使用することができる。
本発明の利点
伝統的澱粉転化法、例えば、澱粉解重合法において、望ましくない副生物であるパノースの生成は、全体の糖化収率に対する有意な影響を及ぼす。したがって、パノースの生成を減少させて糖化収率を増加することが望ましい。
熱安定性イソアミラーゼの添加により、いくつかの利点が得られる。
例えば、澱粉解重合の液化工程においてα−アミラーゼと一緒に澱粉の分枝鎖切断を実施するとき、大量のパノーズ前駆体の生成の危険なしに、液化を拡張することができる。
分枝鎖切断酵素は熱安定性イソアミラーゼであるので、糖化の間のプルラナーゼによる分枝鎖切断を省略することができる。プルラナーゼはマルトースをパノーズ前駆体、６2−α−マルトシルマルトースに縮合する傾向があり、この６2−α−マルトシルマルトースはグルコアミラーゼによりパノースに加水分解されるので、これは有利である。
液化工程を延長することによって、ＤＥを１０〜１５から、例えば、１５〜２０に増加させて、グルコアミラーゼ（例えば、AMGTM）の必要性を減少させる。グルコアミラーゼの要件を減少させることは、イソマルトースはグルコアミラーゼにより直鎖状オリゴ糖の解重合から生ずるＤ−グルコースから生成し、非還元性連鎖末端からＤ−グルコースを除去する。同時に、グルコアミラーゼ活性はグルコースの収率を増加させる。
さらに、本発明の方法におけるグルコアミラーゼの節約は、蒸発コストを減少できるので有利である、より高い基質濃度における糖化工程の実施を可能とする。
さらに、解重合のために本発明の方法を使用するとき、液化において使用するα−アミラーゼを不活性化／変性することは不必要である。
また、糖化の反応時間を短縮することができ、これにより製造容量を増加することができる。
本発明の１つの目的は、パノースの生成を減少させることである。
澱粉解重合法において、液化工程の間に活性であるイソアミラーゼの添加は生成するパノーズ前駆体の量を減少させるので、これは糖化収率を増加させる。
液化の前に熱安定性イソアミラーゼを使用するとき、液化はα−アミラーゼの特異性およびパノーズ前駆体の生成に対する依存性がより低い。この変化は液化のプロセス時間を増加させ、ＤＸ１０〜１２の正常値より高いＤＸが得られる。より多い強い液化が許されかつ熱安定性分枝鎖切断酵素の使用により、より高いＤＸ値が得られる場合、乾燥物質（ＤＳ）の濃度を正常の３０〜３５％からより高い百分率に増加させることができる。高フルクトースのトウモロコシシロップ（HFCS）プロセスにおける下流において、蒸発コストが減少するので、このようなＤＳ％の増加は有利である。
適当な熱安定性イソアミラーゼを同定する方法
適当な熱安定性イソアミラーゼは、実施例１に記載されているように、まず有効なイソアミラーゼ配列を整列させアミノ酸配列の保存された範囲を同定することによって、同定することができる。保存された範囲に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計する。次いで多数の細菌株のゲノムＤＮＡのストックをＰＣＲに付し、期待したサイズのフラグメントを生ずる株を選択する。フラグメントを精製し、配列決定し、整列させて、発表されたイソアミラーゼ配列との相同性を確証する。同定された株の中で、最高の最適な成長温度を有する株をさらに選択する。
このアプローチを使用して、ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252およびロドテルムス・オバメンシス（Rhodothermus obamensis）JCM9785からのイソアミラーゼを選択し、そしてロドテルムス・マリナス（R.marinus）イソアミラーゼを実施例２に記載されているようにさらにクローニングした。
ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252から得られる新規なイソアミラーゼ
また、前述したように、本発明者らは、ロドテルムス（Rhodothermus）属、さらに詳しくはロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）、特にロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252の株から、イソアミラーゼ活性を示す酵素を得ることができることを発見し、そして前記酵素をコードするＤＮＡ配列のクローニングに成功した。
先行技術との比較
ヌクレオチドおよびタンパク質のデータベースに対する本発明のイソアミラーゼの相同性のサーチを実施した。
0004087463.tif 000002
相同性のサーチにおいて、最も関係する１または２以上の既知の配列はスルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）およびスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）からのイソアミラーゼであることが示された。イソアミラーゼをコードする本発明のＤＮＡ配列（配列番号：３）は、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）およびスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）からの既知のイソアミラーゼ配列に対して約５１〜５２％のＤＮＡの相同性を示し、そして本発明のイソアミラーゼの対応するアミノ酸配列（配列番号：４）は前述の既知のＤＮＡ配列をベースとして推定されたアミノ酸配列に対して約５４〜５５％の相同性を示す。
これが示すように、本発明のイソアミラーゼのＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列は、いかなる既知のＤＮＡおよび／またはイソアミラーゼをコードする１または２以上のアミノ酸配列と事実区別される。
相同性の計算を、この明細書において後述するように実施した。
定義
本発明をさらに詳細に説明する前に、下記の用語をまず定義する：
「クローニングされたＤＮＡ配列」：用語「クローニングされたＤＮＡ配列」は、遺伝子工学において使用される標準的クローニング手法に従いクローニングして、ＤＮＡのセグメントをその天然の位置から、それが再現される異なる部位に再配置したＤＮＡ配列を意味する。クローニング法は、所望のＤＮＡセグメントの切除および単離、ＤＮＡ片のベクター分子の中への挿入および組換えベクターを細胞の中に組込み、ここでＤＮＡセグメントの多数のコピーまたはクローンを複製させることを包含する。
本発明の「クローニングされたＤＮＡ配列」は、また、「ＤＮＡ構築物」または「単離されたＤＮＡ配列」と命名される。
「から得られる」：本発明の目的に対して、用語「から得られる」は、特定の微生物源に関して本明細書において使用するとき、酵素が特定の源により産生されるか、あるいは前記源からの遺伝子が挿入された細胞により産生されることを意味する。
「単離されたポリペプチド」：本明細書において定義するとき、用語「単離されたポリペプチド」または「単離されたイソアミラーゼ」は、本発明のイソアミラーゼについて使用するとき、SDS-PAGEにより測定して、少なくとも２０％の純度、好ましくは少なくとも約４０％の純度、より好ましくは少なくとも約６０％の純度、なおより好ましくは少なくとも約８０％の純度、最も好ましくは少なくとも約９０％の純度、なお最も好ましくは少なくとも約９５％の純度を有するイソアミラーゼまたはイソアミラーゼの部分である。用語「単離されたポリペプチド」は、互換的に、「精製されたポリペプチド」と呼ぶことができる。
「相同的不純物」：本明細書において使用するとき、用語「相同的不純物」は、本発明の酵素が本来得られた、相同的細胞に由来する不純物（例えば、本発明の酵素以外の他のポリペプチド）を意味する。本発明において、相同的細胞は、例えば、ロドテルムス（Rhodothermus）の株である。
「イソアミラーゼをコードする部分」：  本明細書において使用するとき、用語「イソアミラーゼをコードする部分」は、ポリペプチド配列に翻訳される領域に対応するＤＮＡ配列の領域を意味する。
配列番号：３に示すＤＮＡ配列において、それは第１「ＡＴＧ」開始コドン（mRNA中の「ＡＵＧ」コドン）と引き続く停止コドン（「ＴＡＡ」、「ＴＡＧ」または「ＴＧＡ」）との間の領域である。換言すると、これはは翻訳されたポリペプチドである。
本発明の関係における「イソアミラーゼ」は、ＥＣ番号：３．２．１．６８を有するとして、酵素分類（ＥＣ）に従い定義される。
ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）からの新規な熱安定性イソアミラーゼの特性決定
単離されたイソアミラーゼ
したがって、第３の面において、本発明は、ロドテルムス（Rhodothermus）属の株から得られ、そして
ｉ）５０℃において測定して、３．５〜６．５のpH範囲、最適にはpH約５においてイソアミラーゼ活性；
ｉｉ）SDS-PAGEにより測定して、約８０kDaの分子量；および
ｉｉｉ）５．２〜５．８の範囲の等電点（ｐＩ）；
を有する、イソアミラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
ロドテルムス（Rhodothermus）種から得られる本発明のイソアミラーゼは、集中的に特性決定された。
好ましい態様において、本発明の第１面に従う酵素は、ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）、特にロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252の株から得られる。
好ましい態様において、第１面による酵素は、配列番号：４中の位置１〜７２６として示す成熟アミノ酸配列を有する。
単離された酵素
第４の面において、本発明は、
（ａ）大腸菌（E.coli）DSM11971の中に存在するプラスミドpUC19の中にクローニングされたＤＮＡ配列のイソアミラーゼ酵素をコードする部分によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）配列番号：４中の位置１〜７２６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ）前記ポリペプチドと少なくとも７０％相同性である、（ａ）または（ｂ）において規定されるポリペプチドのアナローグ；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメント；
から成る群より選択される、イソアミラーゼ活性を示す単離された酵素に関する。
本発明のこの面に従う酵素は、微生物、例えば、細菌、酵母、または糸状菌から得ることができる。好ましくは、それは細菌から得られる。
適当な微生物の例は、節「微生物源」（下文参照）に記載されている。
ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）からクローニングされたＤＮＡ配列
第５の面において、本発明は、イソアミラーゼ活性を示す酵素をコードし、
（ａ）大腸菌（E.coli）DSM11971の中に存在するプラスミドpUC19の中にクローニングされたＤＮＡ配列のイソアミラーゼをコードする部分；
（ｂ）配列番号：３中の位置１〜2178に示すＤＮＡ配列またはその相補的ストランド；
（ｃ）前記ＤＮＡ配列と少なくとも７０％相同性である、（ａ）または（ｂ）において規定されるＤＮＡ配列のアナローグ；
（ｄ）配列番号：３中の位置１〜2178に示す配列（酵素の成熟部分をコードする）からなる二本鎖ＤＮＡのプローブに対して低いストリンジェンシイにおいてハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列；
（ｅ）遺伝暗号のデジェネラシーのために、（ｂ）または（ｄ）の配列とハイブリダイゼーションしないが、これらのＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；または
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）において特定したＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列；
からなるクローニングされたＤＮＡ配列に関する。
現在、DSM11971の中に存在するプラスミドpUC19の中にクローニングされたＤＮＡ配列のイソアミラーゼをコードする部分は配列番号：３に示すＤＮＡ配列のイソアミラーゼをコードする部分と同一であると考えられる。
したがって、用語「DSM11971の中に存在するプラスミドpUC19の中にクローニングされたＤＮＡ配列のイソアミラーゼをコードする部分」および「配列番号：３に示すＤＮＡ配列のイソアミラーゼをコードする部分」は互換的に使用することができる。
ＤＮＡ配列はゲノム、cDNA、または合成由来またはそれらの任意の組合わせであることができる。
本発明は、また、配列番号：４の成熟部分（すなわち、位置１〜７２６）として記載されるアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ活性を示す酵素をコードするクローニングされたＤＮＡ配列を包含し、前記ＤＮＡ配列は遺伝暗号のデジェネラシーにより配列番号：３と異なる。
本発明の配列番号：３に示すＤＮＡ配列および／またはアナローグＤＮＡ配列は、微生物、例えば、細菌、酵母、または糸状菌から得ることができる。好ましくは、それは糸状菌から得られ、そして適当な微生物の例は、節「微生物源」（下文参照）に記載されている。
また、類似の配列は配列番号：３のイソアミラーゼをコードする部分として提示されるＤＮＡ配列をベースとして構築することができ、例えば、そのサブ配列であることができ、および／またはＤＮＡ配列によりコードされるイソアミラーゼの他のアミノ酸配列を生じないが、酵素の生産に意図される宿主生物のコドンの使用に対応するヌクレオチド置換の導入により、あるいは異なるアミノ酸配列（すなわち、本発明のイソアミラーゼの変異型）を発生することができるヌクレオチド置換の導入により、構築することができる。
ヌクレオチド置換を実施するとき、アミノ酸の変化は好ましくは小さい特質を有する、すなわち、タンパク質のフォルディングまたは活性に有意に影響を与えない保存的アミノ酸置換、小さい欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸までの欠失；小さいアミノ末端またはカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基；約２０〜２５残基の小さいリンカーペプチド；または精製を促進する小さいエクステンション、例えば、ポリ−ヒスチジントラクト；結合ドメインの抗原性エピトープである。
保存的置換の例は下記のものを包含する：塩基性アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性アミノ酸、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸；極性アミノ酸配列、例えば、グルタミンおよびアスパラギン；疎水性アミノ酸、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン；芳香族アミノ酸配列、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；および小さいアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン。ヌクレオチド置換の一般的説明については、下記の文献を参照のこと：例えば、Ford.et al.（1991）、Protein Expression and Purification、２、95-107。
当業者にとって明らかなように、このような置換は分子の機能に対して重大な領域の外側において行われ、そしてなお活性ポリペプチドを生ずる。本発明のクローニングされたＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの活性に対して必須であり、したがって好ましくは置換に暴露されない、アミノ酸は、この分野において知られている手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（CunninghamおよびWells、（1989）、Science 244、1081-1085参照）に従い同定することができる。後者の技術において、突然変異は分子中のすべての残基において導入し、そして生ずる分子を生物学的（すなわち、イソアミラーゼ）活性について試験して、分子の活性に対して重大であるアミノ酸残基を同定する。基質−酵素の相互作用部位は、また、核磁気共鳴分析、結晶学または光アフィニティー標識化のような技術により決定することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：de Vos et al. 、（1992）、Science 255、306-312；Smith et al.、（1992）、J. Mol. Biol. 224、899-904；Wlodaver et al.、（1992）、FEBS Lett. 309、59-64）。
本発明のポリペプチドは、また、他のポリペプチドがポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ−末端またはＣ末端において融合された、融合されたポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドを包含する。他のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその部分）を本発明の核酸配列（またはその部分）に融合することによって、融合されたポリペプチドは製造される。融合ポリペプチドを製造する技術はこの分野において知られており、そして、ポリペプチドをコードするコーディング配列を、それらがインフレームでありかつ融合されたポリペプチドの発現が１または２以上の同一プロモーターおよびターミネーター制御下である、結合することを包含する。
ＤＮＡ配列の相同性
前述のＤＮＡ配列の相同性は、第２配列からの第１配列の偏りを示す２つの配列の間の同一性の程度として決定される。相同性は、適当には、この分野において知られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰにより決定することができる（Program Manual for the Wisconsin Package、Version８、August 1994、Genetics Computer Group、575 Science Drive、Madison、Wisconsin、USA 53711）（Needleman、S.B.およびWunsch、C.D.、（1970）、Journal of Molecular Biology、48、443-453）。ＤＮＡ配列の比較のための下記の設定、すなわち、５．０のＧＡＰ開設ペナルティーおよび０．３のＧＡＰエクステンション、を有するＧＡＰを使用すると、前述の類似のＤＮＡ配列のコーディング領域は、配列番号：３に示すＤＮＡ配列のイソアミラーゼをコードする部分と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の同一性の程度を示す。
ハイブリダイゼーション
配列番号：３中の位置１〜2178に示す配列（すなわち、配列番号：４のイソアミラーゼをコードする部分）からなる二本鎖ＤＮＡプローブに、少なくとも低いストリンジェンシイ条件、しかし中程度または高いストリンジェンシイ条件において、ハイブリダイゼーションする、上記ｄ）において定義した類似のＤＮＡ配列を定義するために前述したハイブリダイゼーション条件を下記において詳細に説明する。
ヌクレオチドのプローブと相同性ＤＮＡまたはＲＮＡ配列との間の低い、中程度の、または高いストリンジェンシイにおけるハイブリダイゼーションを決定する適当な実験条件は、ＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡを含有するフィルターを５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Sambrook et al. 1989）中で１０分間前ソーキングし、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Sambrook et al. 1989）、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／mlの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ（Sambrook et al. 1989）中でフィルターを前ハイブリダイゼーションし、次いで１０ng／mlの濃度のランダムプライムド（Feinberg、A.P.およびVogelstein、B.（1983）Anal. Biochem. 132：6-13）、32Ｐ−dCTP標識化（比活性＞１×１０9cpm／μｇ）プローブを含有する同一溶液中で約４５℃において１２時間ハイブリダイゼーションすることを包含する。次いでフィルターを２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ中で少なくとも＊５５℃（低いストリンジェンシイ）、より好ましくは少なくとも６０℃（中程度のストリンジェンシイ）、なおより好ましくは少なくとも６５℃（中程度／高いストリンジェンシイ）、なおさらにより好ましくは少なくとも７０℃（非常に高いストリンジェンシイ）、最も好ましくは少なくとも７５℃（非常に高いストリンジェンシイ）において３０分間２回洗浄する。
オリゴヌクレオチドのプローブがこれらの条件下にハイブリダイゼーションする分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出される。
２つの所定のＤＮＡ配列がある種の特定した条件下にハイブリダイゼーションするか否かを理論的に予測することができることが見出された。
したがって、前述の実験方法に対する別法として、類似ＤＮＡ配列が前述のヌクレオチドのプローブにハイブリダイゼーションするか否かの決定は、２つの異種ＤＮＡ配列が既知の配列と特定した条件（例えば、カチオン濃度および温度に関して）下にハイブリダイゼーションするＴｍ（溶融温度）の理論的計算に基づくことができる。
異種ＤＮＡ配列についての溶融温度（Ｔｍ（異種））を決定するために、まず相同ＤＮＡ配列についての溶融温度（Ｔｍ（相同））を決定することが必要である。
２つの完全に相補性のＤＮＡストランド（ホモ二本鎖の形成）の間の溶融温度は、下記の式を使用して計算することができる：
Ｔｍ（相同）＝81.5℃＋16.6（logM）＋0.41（GC％）−0.61（ホルム％）−500/L（″Current Protocols in Molecular Biology″、John Wiley and Sons、1995）、式中
「Ｍ」は洗浄緩衝液中のモルカチオン濃度であり、
「ＧＣ％」はＤＮＡ配列中の塩基の総数のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の％であり、
「ホルム％」は洗浄緩衝液中のホルムアミドの％であり、そして
「Ｌ」はＤＮＡ配列の長さである。
この式および前述の実験の洗浄条件を使用して、配列番号：３に示すＤＮＡ配列に対応するヌクレオチドのプローブ、すなわち、ヌクレオチド１〜2178のホモ二本鎖の形成についてのＴｍ（相同）は、次の通りである：
Ｔｍ（相同）＝81.5＋16.6（log0.30）＋0.41（65）−0.61（0）−500/2178）
Ｔｍ（相同）＝99.2℃
「Ｍ」：２×ＳＳＣは０．３Ｍのカチオン濃度に対応する。
「ＧＣ％」配列番号：３中のＧＣ％は６５である。
「ホルム％」：洗浄緩衝液の中にホルムアミドは存在しない。
「Ｌ」：配列番号：３の長さは2178である。
上記式により決定されるＴｍは、２つの完全に相補性のＤＮＡ配列の間のホモ二本鎖形成のＴｍ（Ｔｍ（相同））である。Ｔｍ値を２つの異種ＤＮＡ配列のそれに適合させるために、２つの異種配列の間のヌクレオチド配列の１％の差はＴｍの１℃の減少に等しいことが仮定される（″Current Protocols in Molecular Biology″、John Wiley and Sons、1995）。したがって、異種二本鎖の形成のためのＴｍ（異種）は、問題の類似配列と前述のヌクレオチドのプローブとの間の相同性の差％をＴｍ（相同）から減ずることによって見出される。減ずるべきＤＮＡ相同性％は、本明細書において記載するように計算される。
前述の実験条件および＊５５℃の洗浄温度（低いストリンジェンシイ）を使用すると、55.8％（１００−（99.2−５５）＝55.8）の相同性をもつ類似配列は、前述のヌクレオチドのプローブにハイブリダイゼーションすることが考えられるであろう。より好ましい洗浄温度６５℃（中程度のストリンジェンシイ）を使用すると、65.8％の相同性をもつ類似配列はハイブリダイゼーションするであろう、およびその他。
アミノ酸配列に対する相同性
本発明の前述のポリペプチドの相同性（性質（ｃ））は、第２配列からの第１配列の誘導を示す、２つの配列の間の同一性の程度として決定される。相同性は、適当には、この分野において知られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰにより決定することができる（Program Manual for the Wisconsin Package、Version８、August 1994、Genetics Computer Group、575 Science Drive、Madison、Wisconsin、USA 53711）（Needleman、S.B.およびWunsch、C.D.、（1970）、Journal of Molecular Biology、48、443-453）。ＤＮＡ配列の比較のための下記の設定、すなわち、３．０のＧＡＰ開設ペナルティーおよび０．１のＧＡＰエクステンション、を有するＧＡＰを使用すると、本発明の類似ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの成熟部分は、配列番号：４に示すアミノ酸配列の成熟部分、すなわち、配列番号：４に示す位置１〜７２６と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の同一性の程度を示す。
本発明は、また、配列番号：４に記載するアミノ酸配列の成熟部分と、３アミノ酸以下、好ましくは２アミノ酸以下、より好ましくは１以下だけ異なるアミノ酸配列を有するイソアミラーゼ変異型に関する。
免疫学的交差反応性
免疫学的交差反応性を決定において使用すべき抗体は、精製された酵素Ｘを使用して製造することができる。さらに詳しくは、下記の文献に記載されている手順に従い、ウサギ（または他の齧歯類）を免疫化することによって、酵素Ｘに対する抗血清を発生させることができる：N. Axelsen et al. 、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、1973、Chapter 23、またはA. JohnstoneおよびR. Thorpe、Immunochemistry in Practice、Blackwell Scientific Publications、1982（さらに詳しくは、ｐ．２７−３１）。得られた抗血清から、例えば、塩沈降（（NH4）2SO4）、次いで透析およびイオン交換クロマトグラフィー、例えば、DEAE−Sephadex上のイオン交換クロマトグラフィーにより、精製された免疫グロブリンを得ることができる。タンパク質の免疫化学的特性決定を、Outcherlony二重拡散分析（O. Outcherlony、Handbook of Experimental Immunology（D.M. Weir、編）、Blackwell Scientific Publications、1967、pp.655-706）、交差免疫電気泳動（N. Axelsen et al. 、supra、Chapter３および４）、またはロケット免疫電気泳動（N. Axelsen et al. 、Chapter２）により実施することができる。
微生物源
本発明の優先権主張日において、下記において適用した分類学はワールド・ワイド・ウェブ（World Wide web）（ＷＷＷ）NCBI分類学ブラウザーに従う。
相同酵素をコードするＤＮＡ配列、すなわち、類似ＤＮＡ配列を他の微生物から得ることができることが期待される。例えば、他の微生物、特に細菌、例えば、シトファガレス（Cytophagales）目の株、例えば、ロドテルムス（Rhodothermus）種の株、特にロドテルムス・マリナス（R. marinus）またはロドテルムス・オバメンシス（R.obamensis）、ことにロドテルムス・マリナス（R.marinus）DSM4252の株のｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることによって、ＤＮＡ配列を誘導することができる。
寄託された株
ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252からクローニングされたイソアミラーゼをコードする、完全な全長のＤＮＡ配列は、細菌の大腸菌（E.coli）DH12S株の中に形質転換され、プラスミドpUC19中で構築された。前記形質転換体は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認についてのブダベスト条約の規定に従い、ＤＳＭ（Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmb H.、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig Federal Republic of Gemany）に本発明者らにより寄託された。
寄託日：1998年１月29日
寄託機関の参照：NN049374
ＤＳＭ表示：大腸菌（Escherichia coli）DSM11971
ブダベスト条約の規定に従い国際寄託機関であるＤＳＭは、ブダベスト条約の規則および法規、特に規則９に従い受託物の永続性を付与する。この特許の係属の間に、米国特許および商標局の局長により３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．Ｐａｒ．１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．Ｐａｒ．１２２に従い権利を与えられたものに、２つの受託物に対するアクセスは可能である。また、前述の受託物は規則28EPCに従う微生物に関する欧州特許出願の要件を満足する。
前述の受託物は、単離された細菌の実質的に純粋な培養物を表す。この出願の対応出願、または後続出願が提出された国における外国特許による要求に応じて、受託物は入手可能である。しかしながら、受託された株の入手可能性は、政府の決定により許可された特許権の適用制約において、本発明の実施に対する実施許諾を構成しない。
配列番号：３に示すヌクレオチド配列を有する本発明のＤＮＡ配列は、標準的クローニング技術、例えば、下記の文献に記載されている技術に従い、前述の大腸菌（Escherichia coli）DSM11971からクローニングすることができる：Sambrook et al. 、（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY。
本発明のＤＮＡ配列は、また、下記の工程を含む、任意の一般的方法によりクローニングすることができる：
・適当なベクター中で、問題のイソアミラーゼを産生することが期待される、任意の生物からのゲノムｃＤＮＡライブラリーをクローニングし、
・前記ベクターで適当な大腸菌（E.coli）宿主細胞を形質転換し、
・宿主細胞を適当な条件下に培養して、ゲノムcDNAライブラリー中のクローンによりコードされる問題の酵素を発現させ、
・このようなクローンから酵素をコードするＤＮＡを単離する。
スクリーニング法のより詳細な説明は、下記の実施例（下文参照）に記載されている。
また、よく知られている手順に従い、本明細書において記載するＤＮＡ配列をベースとして製造された合成オリゴヌクレオチドのプローブに対するハイブリダイゼーションを使用して、適当な源、例えば、節「微生物源」に記載する生物の任意のものから、本発明のイソアミラーゼをコードするＤＮＡを好都合にクローニングすることができる。例えば、適当なオリゴヌクレオチドのプローブは、配列番号：３として表されるヌクレオチド配列のイソアミラーゼをコードする部分またはそれらの任意の適当なサブ配列をベースとして製造することができるか、あるいはそれであることができるか、あるいは配列番号：４のアミノ酸配列をベースとして製造することができる。
また、ＤＮＡ配列は本明細書において開示するＤＮＡ配列をベースとして製造されたＰＣＲプライマー使用してクローニングすることができる。
組換え発現ベクター
本発明の酵素をコードするＤＮＡ構築物からなる組換えベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付すことができる、任意のベクターであることができ、そしてベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞にしばしば依存する。したがって、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実在物として存在するベクターであることができ、ベクターの複製は染色体の複製に対して独立であり、例えば、プラスミドである。また、ベクターは、宿主細胞の中に導入したとき、宿主細胞のゲノムの中に一部分またはその全体において組込まれ、それが組込まれた１または２以上の染色体と一緒に複製するベクターであることができる。
ベクターは好ましい発現ベクターであり、このベクターにおいて、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡの転写に要求される追加のセグメントに作用可能に連鎖されている。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスのＤＮＡに由来されるか、あるいは双方の因子を含有することができる。用語「作用可能に連鎖された」は、セグメントがそれらの意図する目的と協力して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始され、酵素をコードするＤＮＡ配列を通して進行するように、配置されていることを示す。
プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す、任意のＤＮＡ配列であることができ、そして宿主細胞に対して相同または異種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導することができる。
細菌の宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のマルトース発生アミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ遺伝子、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子、またはバシラス・プミラス（Bacillus pumilus）のキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはファージラムダＰRまたはＰLプロモーター、または大腸菌（E.coli）のｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターを包含する。
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、また、必要に応じて適当なターミネーターに接続させることができる。
本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞中でそのベクターの複製を可能とするＤＮＡ配列をさらに含むことができる。
ベクターは、また、選択マーカー、例えば、その産物が宿主細胞における欠陥を補足する遺伝子、または抗生物質、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、またはその他に対する耐性をコードする遺伝子、または重金属または除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含むことができる。
本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列または前配列として知られている）を組換えベクターの中に設けることができる。分泌シグナル配列を酵素をコードするＤＮＡ配列に正しいリーディングフレームで結合させる。分泌シグナル配列は、酵素をコードするＤＮＡ配列に対して普通に５’に位置する。分泌シグナル配列は通常酵素とアソシエートした配列であるか、あるいは他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子であることができる。
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよび必要に応じてターミネーターおよび／または分泌シグナル配列を、それぞれ、結合する方法、あるいは適当なＰＣＲ増幅のスキームによりこれらの配列を組立てる方法、および複製または組込みに必要な情報を含有する適当なベクターの中にそれらを挿入する方法は、当業者によく知られている（例えば、Sambrook et al. 、前掲、参照）。
宿主細胞
宿主細胞の中に導入された本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、問題の宿主に対して相同または異種であることができる。宿主細胞に対して相同である、すなわち、事実宿主細胞により産生される場合、ＤＮＡ配列は典型的には他のプロモーター配列に作用可能に連鎖されているか、あるいは、適用可能ならば、その天然の環境におけるよりも他の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列に作用可能に連鎖されているであろう。用語「相同」は、問題の宿主に対して自然の酵素をコードするＤＮＡ配列を包含することを意図する。用語「異種」は、事実宿主細胞により発現されないＤＮＡ配列を包含することを意図する。したがって、ＤＮＡ配列は他の生物から由来するか、あるいは合成配列であることができる。
本発明のＤＮＡ構築物または組換えベクターの中に導入する宿主細胞は、本発明の酵素を産生することができる任意の細胞であることができ、そして細菌、酵母、菌類および高等真核細胞を包含する。
培養するとき、本発明の酵素を産生することができる細菌の宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えば、バシラス（Bacillus）の株、例えば、バシラス・サチリス（B. subtilis）、バシラス・リヘニフォルミス（B. licheniformis）、バシラス・レンツス（B. lentus）、バシラス・ブレビス（B. brevis）、バシラス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、バシラス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バシラス・アミロリクファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バシラス・サーキュランス（B. circulans）、バシラス・ラウツス（B. lautus）、バシラス・メガテリウム（B. megaterium）またはバシラス・スリンジエンシス（B. thuringiensis）の株、あるいはストレプトマイセス（Streptomyces）、例えば、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）またはストレプトマイセス・ムリヌス（S. murinus）の株、あるいはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌（Escherichia coli）である。細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、接合、またはそれ自体知られている方法におけるコンピテント細胞の使用により実施することができる（Sambrook et al. 、supra、参照）。
細菌、例えば、大腸菌（E.coli）中で酵素を発現させるとき、酵素は細胞質の中に、典型的には不溶性顆粒（封入体として知られている）として保持されるか、あるいは細菌の分泌配列により周辺質空間に向けられる。前者の場合において、細胞を溶解し、顆粒を回収し、変性した後、変性剤を希釈することによって、酵素をリフォルディングさせる。後者の場合において、細胞を、例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより、崩壊して、周辺質空間の内容物を解放し、酵素を回収することによって、酵素を周辺質空間から回収することができる。
酵素をグラム陽性細菌、例えば、バシラス（Bacillus）またはストレプトマイセス（Streptomyces）の株中で発現させる場合、酵素は細胞質の中に保持されるか、あるいは細菌の分泌配列により細胞外媒質に向けられる。後者の場合において、酵素を後述するように媒質から回収することができる。
適当な真核細胞は特に菌類細胞、例えば、酵母細胞である。
適当な酵母細胞の例は、サッカロマイセス（Saccharomyces）種、特にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomycesuvarum）、またはシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）種、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）の株を包含する。
酵母細胞を異種ＤＮＡで形質転換し、それから異種ポリペプチドを生産する方法は、例えば、米国特許第4,599,311号、米国特許第4,931,373号、米国特許第4,870,008号、米国特許第5,037,743号および米国特許第4,845,075号（それらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている。選択可能なマーカー、普通に薬物耐性または特定の栄養、例えば、ロイシンの非存在において成長する能力により決定される表現型により、形質転換された細胞を選択する。酵母において使用するために好ましいベクターは、米国特許第4,931,373号に開示されているPOT1ベクターである。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の前に、シグナル配列および必要に応じてリーダー配列、例えば、前述したように、存在することができる。
適当な酵母細胞の他の例は、カンジダ（Candida）種、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidini）の株、またはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）種、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（K. lactis）の株、またはハンゼヌラ（Hansenula）種、例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（H. polymorpha）の株、またはピキア（Pichia）種、例えば、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ヤロウィア（Yarrowia）種、例えば、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）の株を包含する（Gleeson et al.、J. Gen. Microbiol. 132、1986、pp. 3459-3565；米国特許第4,882,279号参照）。
イソアミラーゼを製造する方法
本発明は、酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された、適当な宿主細胞を酵素の産生を可能とする条件下に培養し、そして生ずる酵素を培養物から回収する、本発明による単離された酵素を製造する方法を提供する。
酵素をコードするＤＮＡ配列からなる発現ベクターを異種宿主細胞の中に形質転換すると、本発明の酵素の異種組換え体を製造が可能となる。
これにより、相同的不純物を含有しないことを特徴とする、高度に精製されたイソアミラーゼ組成物を製造することができる。
本発明によれば、異種宿主細胞は、例えば、大腸菌（E.coli）、バシラス（Bacillus）種、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）の株であることができる。
形質転換された宿主細胞を培養するために使用する培地は、問題の宿主細胞を成長させるために適当な、任意の慣用の培地であることができる。発現されたイソアミラーゼは好都合に培地の中に分泌され、そしてよく知られている手順、例えば、遠心または濾過により培地からの細胞の分離、塩、例えば、硫酸アンモニウムによる培地のタンパク質成分の沈降、および引き続くクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはその他により、培地から回収することができる。
単離された純粋な培養物
本発明は、また、細菌のロドテルムス（Rhodothermus）の株から得られるイソアミラーゼをコードするＤＮＡ配列（大腸菌（Escherichia coli）DSM11971の中に存在するプラスミドpUC19の中にクローニングされたＤＮＡ配列のイソアミラーゼをコードする部分）を収容する大腸菌（Escherichia coli）DSM11971株の単離された実質的に純粋な生物学的培養物（イソアミラーゼをコードする容量を保持した前記大腸菌（E.coli）の任意の突然変異体は本発明に包含されると考えられることが理解されるであろう）、および配列番号：３として表されるＤＮＡ配列が得られた、ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252の単離された実質的に純粋な生物学的培養物（イソアミラーゼをコードする容量を保持した前記ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）株の任意の突然変異体は本発明に包含されると考えられることが理解されるであろう）に関する。
スルホロブス（Sulfolobus）の株からのＤＮＡ配列のクローニング
本発明は、また、スルホロブス（Sulfolobus）の株に由来するイソアミラーゼ活性をもつ酵素をコードする、クローニングされたＤＮＡ配列に関する。ＤＮＡ配列は、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）のスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）の株から誘導可能である。
配列はBiochim. Biophys. Acta、1291、p.177-181（1996）に開示されているスルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）からのイソアミラーゼをコードするＤＮＡ配列であることができ、それは遺伝子バンク（GeneBank）において受け入れ番号：Y08256で入手可能なスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）からのＤＮＡ配列であることができる。
さらに、本発明は、前述したようにスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）に由来するクローニングされたＤＮＡ配列、特にBiochim. Biophys. Acta、1291、p.177-181（1996）に開示されているＤＮＡ配列および遺伝子バンク（GeneBank）において受け入れ番号：Y08256で入手可能なＤＮＡ配列からなる組換え発現ベクターに関する。
さらに、本発明は、本発明のスルホロブス（Sulfolobus）からのクローニングされたＤＮＡ配列を含む宿主細胞または本発明のスルホロブス（Sulfolobus）からのＤＮＡ配列からなる組換え発現ベクターに関する。
本発明の宿主は、真核細胞、特に菌類細胞，例えば、酵母細胞または糸状菌細胞であることができる。
詳しくは、宿主細胞は、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）の株、特にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidini）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、フザリウム（Fusarium）ATCC 20334、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）またはトリコデルマ・リーシエ（Trichoderma reesie）の株を包含する群から選択することができる。
最後に、本発明は、本発明のクローニングされたＤＮＡ配列によりコードされるイソアミラーゼ活性を示す酵素を生産する方法、および酵素の産生を可能とする条件下に、本発明の宿主細胞を培養し、そして酵素を培養物から回収することからなる方法に関する。
Biochim. Biophys. Acta、1291、p.177-181（1996）に開示されているスルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）のＤＮＡ配列のクローニングは後述される。
材料および方法
酵素：
PromozymeR：バシラス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）に由来するプルラナーゼ（Novo Nordiskから入手可能である）（EP63,909に記載されている）。
ＡＭＧ：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグルコアミラーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手可能である）。
α−アミラーゼ：下記の突然変異を有するバシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ：Ａ１＊＋Ｎ２＊＋Ｌ３Ｖ＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H35I＋H156Y＋A181T＋N190F＋A209V＋A264S（Novo Nordisk A/SからのWO97/41213号参照）。
受託された１または２以上の微生物：
形質転換体株：
ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252からクローニングされた全長のイソアミラーゼからなる大腸菌（E.coli）DH12Sは、ブダベスト条約の規定に従い、ＤＳＭ（Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. 、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig Federal Republic of Germany）に寄託された。
寄託日：1998年１月29日
寄託機関の参照：NN049374
ＤＳＭ表示：大腸菌（Escherichia coli）DSM11971
大腸菌（E.coli）Top 10（Invitrogen）
プラスミド：
pBAD/Myc-His  Ａ、Ｂ、Ｃ（Invitrogen）
pUC19（Invitrogen）
溶液および培地：
ＬＢ培地：１％のバクトトリプトン、０．５％のバクト酵母エキス、１％のNaCl、pH７。
ＳＯＢ培地：２％のバクトトリプトン、０．５％のバクト酵母エキス、0.05％のNaCl、２．５mMのＫＣｌ、１０mMのMgSO4、pH７。
ヨウ素溶液：２mlの蒸留水、４０mlの０．２％のＩ2、２．０％のＫＩおよび０．２％のH2SO4。
方法
一般的微生物学的方法
特記しない限り、ＤＮＡ操作および形質転換は、微生物学の標準的方法に従い実施した（Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Lab. 、Cold Spring Harbor、NY；Ausubel、F.M. et al.（編）″Current Protocols in Molecular Biology″、John Wiley and Sons、1995；Harwood、C.R.およびCutting、S.M.（編）″Molecular Biological Methods for Bacillus″、John Wiley and Sons、1990）。
ＤＮＡ操作のための酵素
特記しない限り、ＤＮＡ操作のためのすべての酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼおよびその他は、ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs Inc.）から入手した。
実施例
実施例１
イソアミラーゼについてのＰＣＲスクリーニング
ａ）ＰＣＲ条件
熱安定性イソアミラーゼを準備するために、タンパク質配列のデータが入手可能である、５つの既知のイソアミラーゼの整列を行った（表１参照）。
0004087463.tif 000003
多過ぎる縮重を含まない２つの保存された領域（下記のｉ６およびｉ７参照）が同定された。
ｉ６：RFNPNKL（V）L（シュードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas amyloderamosa）のイソアミラーゼの残基１３６−１４３）
ｉ７：NYWGYMT（シュードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas amyloderamosa）のイソアミラーゼの残基２７２−２７８）
前記保存された領域をベースとして、ＰＣＲプライマーを設計した。
0004087463.tif 000004
多数の細菌株のゲノムＤＮＡストックを下記の文献に記載されている方法に従い調製した：″Current Protocols in Molecular Biology, unit 2.4 Preparation of Genomic DNA from Bacteria″。
ＰＣＲ条件を下に示す：
0004087463.tif 000005
H2Oを合計１００μｌに添加した。
ＰＣＲサイクルを下記のプログラムで実施した：９４℃、５分間、５０℃、１．５分間、７２℃、３分間、および９４℃、１．５分間、５０℃、１．５分間、７２℃、３分間を２４回反復し、次いで９４℃、１．５分間、５０℃、１．５分間、７２℃、１５分間。
各ＰＣＲの１０mlのアリコートを１．５％のアガロースゲル上に適用して、期待した４５０ｂｐのフラグメントを可視化する。
ｂ）陽性の配列決定
ＤＮＡ結合キット（Takara Ver2.）を使用して、精製されたフラグメントをＴ−ベクター（Novagen）に結合した。
結合混合物を使用して、コンピテント大腸菌（E.coli）JM109の形質転換をハナハン（Hanahan）法により実施した。フラグメントを有する形質転換体を培養し、QIAgenミニプレプキットを使用してプラスミドを調製した。ユニバーサル（Universal）プライマーを使用する双方のストランドのサイクル配列決定反応（PRISM Dyedeixy Terminator Cycle Sequencing Mix）において、精製されたプラスミドを鋳型ＤＮＡとして使用した。配列をABI PRISM310遺伝分析装置（Perkin Elmer）で決定し、そして配列をソフトウェアMEgAlign（DNA Star、Laser gene）で整列させた。
５つのストランドは約４５０ｂｐの期待されたサイズのフラグメントを生じ、これらを精製し、配列決定し、整列させた。フラグメントは発表されたイソアミラーゼ配列との相同性を有した（表２）。前述したように、相同性の計算を実施した。
0004087463.tif 000006
表２に示す酵素のアミノ酸配列を、下記の配列のリストに示す：
0004087463.tif 000007
５つのうちで、最高の最適な成長温度（６５〜７０℃）を有するロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）DSM4252（配列番号：４）およびロドテルムス・オバメンシス（Rhodothermus obamensis）JCM9785（配列番号：１４）を選択した。２つのフラグメントの配列はほとんど同一であるので、それらの１つのみ、ロドテルムス・マリナス（R. marinus）DSM4252をクローニングおよび発現のためにさらに使用した。
実施例２
熱安定性イソアミラーゼをコードする遺伝子のクローニングおよび大腸菌（E.coli）におけるその発現
前述のイソアミラーゼのＰＣＲスクリーニング方法を使用して、６０℃以上の成長温度を有するロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）はイソアミラーゼをコードする遺伝子を有することが見出された。ロドテルムス・マリナス（R. marinus）DSM4252からのイソアミラーゼ遺伝子を、次のようにしてコロニーハイブリダイゼーション技術によりクローニングした：
ａ）サザンハイブリダイゼーション
ロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）ゲノムＤＮＡを、″Current Protocols in Molecular Biology、unit 2.4 Preparation of Genomic DNA from Bacteria″に記載されている方法に従い調製した。、″Current Protocols in Molecular Biology、unit 2.9.1 Southern blotting″に記載されている方法に従い、サザンブロッティングを実施した。ゲノムＤＮＡフラグメントをもつ膜をハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、０．５％のブロッキング試薬（Boehringer Mannheim）、０．１％のＮ−ラウロイルサルコシン、および0.02％のＳＤＳ）中で６８℃において１時間前ハイブリダイゼーションした。次いで、それをＤＩＧ  ＤＮＡ標識化混合物（Boehringer Mannheim）で標識された、ＰＣＲスクリーニングにより得られたプローブの１０ng／mlを含有するハイブリダイゼーション溶液中の６８℃において１２ハイブリダイゼーションした。次いで、プローブをＤＩＧ核酸検出キット（Boehringer Mannheim）で検出した。
サザンハイブリダイゼーションにより、ゲノムＤＮＡの約７kbpのEcoRI消化フラグメントはプローブとハイブリダイゼーションすることが示された。EcoRI消化ゲノムＤＮＡ（６〜８kbp）を、ゲル抽出キット（QIAgen）で１％のアガロースゲルから抽出した。
ｂ）クローニングハイブリダイゼーション
EcoRIで消化したフラグメントをpUC19の中に結合して、ゲノムＤＮＡライブラリーを作った。それを大腸菌（E.coli）DH12SのElectromax（GIBCO BRL）にエレクトロポレーションにより形質転換し、そして２００mg／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートした。３７℃において一夜培養した後、これらのコロニーをナイロン膜に複製させた。それを変性溶液（１．５ＭのNaClおよび０．５ＭのNaOH）の中にソーキングし、次いで中和溶液（１．５ＭのNaCl、０．５ＭのTris-HCl、ｐＨ７.２）の中にソーキングした。ハイブリダイゼーション条件はサザンハイブリダイゼーションと同一であった。
コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした1000の形質転換体の中で、３つのコロニーはプローブとハイブリダイゼーションした。
ｃ）陽性のクローンの制限による分析
プラスミドを３つの形質転換体から調製し、そしてサザンハイブリダイゼーションは３つの形質転換体がプローブとハイブリダイゼーションした７kbpのEcoRIフラグメントの同一のインサートを有することを示した。
pRI5Aと命名する陽性のクローンの１つの制限酵素地図を決定し、第１図に示す。
ｄ）イソアミラーゼ遺伝子の配列決定
ABI PRISMTM 310遺伝分析装置により、イソアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。色素ターミネーターサイクル配列決定ＦＳレディー反応キット（P/N402135）を使用して、配列決定反応を実施した。ＰＥアプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）に記載されているプロトコールにより、反応を追跡した。
決定されたプローブ位置の配列から、プライマーを設計した。決定された2178bpのＯＲＦおよび推定されたアミノ酸配列を配列番号：３に示す。ハイブリダイゼーションのためのプローブの配列は、配列番号：３のヌクレオチド３４２〜７７０である。
ｅ）発現ベクター
pBAD/Myc-His Bを発現に使用した。
ｆ）発現のためのイソアミラーゼ遺伝子のクローニング
pRI5AからＰＣＲにより、ロドテルムス・マリナス（R.marinus）イソアミラーゼ遺伝子をクローニングした。プライマー
0004087463.tif 000008
プライマーＮにおいて、NcoI部位を設計した。NcoIに示すのＡＴＧを開始コドンとして使用した。NcoI部位（ccatgg）のために、第２アミノ酸のセリンはアラニンに変化した。プライマーＢＸ２において、XbaIに示すを停止コドンの後に設計した。
下記の条件下にプライマーＮおよびプライマーＢＸ２を使用して、ＰＣＲを実施した。
0004087463.tif 000009
H2Oを合計１００μｌに添加した。
ＰＣＲサイクルを下記のプログラムで実施した：９４℃、５分、６０℃、１．５分、７２℃、３分、次いで９４℃、１．５分、６０℃、１．５分、７２℃、３分を２４回反復し、および９４℃、１．５分、６０℃、１．５分、７２℃、１５分。
得られたフラグメント（約２kbp）をNcoIおよびXbaIで処理し、次いでそれをpBAD/Myc-His Bと結合させ、そしてpBX2と命名するプラスミドを収容する形質転換体が得られた。発現のための宿主は大腸菌（E.coli）Top10であった。
ｇ）発現条件
２００mg／mlのアンピシリンを含む１００mlのＬＢ培地中で３７℃において一夜、pBX2をもつ形質転換体を培養した。２００mg／mlのアンピシリンを含む１００mlのＳＯＢ培地に１mlの種子培養物を接種し、３７℃において２．５時間培養した。次いで１００mlの２０％のアラビノースを添加して、組換えタンパク質を誘導した。次の日に、細胞を遠心により収集した。細胞を５０mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH５．０）で洗浄した。次いで、１mg／mlのリゾチームを含む同一緩衝液で細胞を懸濁させ、４℃において１時間貯蔵した。リゾチーム処理後、細胞を超音波処理により崩壊させた。18,000rpmの３０分間の遠心により、上清を得た。デブリを再び超音波処理により崩壊した。超音波処理をもう一度反復した。最後に、上清を集め、７０℃に１時間加熱して、タンパク質を宿主株から除去した。18,000rpmにおいて３０分間遠心し、そして上清は粗製のイソアミラーゼ試料を構成した。
実施例３
クローニングされたロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）イソアミラーゼの特性決定
ａ）アッセイ方法
下記のアッセイ法により、イソアミラーゼの特性を研究した。２５０mlの蝋状イネからの１％のアミロペクチンおよび５０mlの５０mMのクエン酸塩緩衝液を、５分間前インキュベートした。５０mlの酵素溶液の添加により、反応を開始させた。１０分間インキュベートした後、４０mlの反応混合物をヨウ素溶液（２mlの蒸留水および４０μｌの０．２％のＩ2、２．０％のＫＩおよび０．２％のH2O2）の中に入れた。ブランクにおいて、酵素溶液の代わりに蒸留水を添加した。
ｂ）５０℃におけるpH最適値
ロドテルムス（Rhodothermus）イソアミラーゼのpH最適値を測定した。反応を５０℃において実施した。pH最適値はpH５．０であると測定された。pH曲線を第２図に示す。
ｃ）pH５．０における温度最適値
ロドテルムス（Rhodothermus）イソアミラーゼの温度最適値を測定した。反応をpH５において３０℃〜８９℃において実施した。最適温度は約８５℃であると測定された。温度曲線を第３図に示す。
ｄ）分子量およびｐＩ
ロドテルムス（Rhodothermus）の分子量をSDS-PAGEにより測定した。勾配ゲル１０〜１５（Pharmacia Biotech.）を使用するファスト（Phast）システムにより、SDS-PAGEを実施した。組換えタンパク質の分子量は８０kDaであると計算された。
ｅ）組換えタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列
組換えタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を決定した。結果はヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列と同一であった（プライマーＮのために、セリンはアラニンに変化した）。
実施例４
ロドテルムス（Rhodothermus）siaを使用する澱粉の転化
澱粉転化法におけるグルコース収率に対するロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）イソアミラーゼの効果を試験するために、液化工程および糖化工程においてイソアミラーゼを添加するか、あるいは添加しないで、標準的２工程の澱粉転化法を実施した。
標準的澱粉転化法
普通のトウモロコシ澱粉から製造された３０％（ｗ／ｗ）DE10マルトデキストリンを出発物質として使用した。
α−アミラーゼ変異型（８μｇ／ｇ乾燥固体）の存在において、液化工程を８０℃、pH５．５において９０分間実施した。
ＡＭＧ（0.18 AGU／ｇ乾燥固体）の存在において、プルラナーゼ（PromozymeR）（0.06PUN／ｇ乾燥固体）を添加するか、あるいは添加しないで、糖化工程を６０℃、pH４．５において４８時間実施した。
第７図に示す表３において、試験を実施し、そしてＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３およびＤＰ４＋の収率に対するイソアミラーゼの効果を記載する。
液化工程におけるイソアミラーゼの添加
表３から理解できるように、５０または２００μｇ／ｇの乾燥固体のロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）イソアミラーゼを試験３、４、８および９において液化の間に添加した。試験１、５および７において、９０分の液化後、８０℃においてpHを３．０に１５分間調節することによって、α−アミラーゼを不活性化した。
イソアミラーゼを添加したすべての試験において、ＤＰ４＋のより低い収率が得られる。これにより示されるように、基質はα−アミラーゼおよびＡＭＧに対していっそうアクセス可能であった。
試験２（すなわち、イソアミラーゼを添加しない）を試験３および４（すなわち、イソアミラーゼを添加した）と比較することによって、理解できるように、ＤＰ３（すなわち、パノース）の収率は１．２％から、それぞれ、１．０％および０．９％に減少し、そしてＤＰ１（すなわち、グルコース）の収率は96.3％から、それぞれ、96.5％および96.8％に増加する。
糖化工程においてイソアミラーゼの添加
試験において、イソアミラーゼを糖化工程の間に添加した。試験７を試験５と比較することによって、理解できるように、ＤＰ３（すなわち、パノース）の収率は０．５％から０．４％に減少し、そしてＤＰ１（すなわち、グルコース）の収率は93.2％から94.8％に増加する。
結論：
澱粉転化の間にロドテルムス・マリナス（Rhodothermus marinus）イソアミラーゼを添加すると、グルコースの収率は増加する。
実施例５
スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）イソアミラーゼのクローニングおよび発現
ａ）イソアミラーゼ遺伝子のクローニング
スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）からのイソアミラーゼ遺伝子をＰＣＲによりクローニングした。
表１に示す配列をベースとして、プライマーを設計した。
0004087463.tif 000010
実施例２−ｆに記載されている手順により、ＰＣＲを実施した。
正しいサイズのフラグメント（約２ｋｂ）が得られ、そしてそれをＰＣＲ精製キット（QIAgen）で精製した。精製されたフラグメントをHindIIIおよびXbaIで処理した。
ｂ）発現ベクターの構築
ＴＰＩプロモーターを有するpJSO26（Annals New York Academy of Sciences、Vol.1782、p.202、J.S. Okkels）から、発現ベクターを構築した。カセットとして下記の２つのオリゴヌクレオチドを使用して、pJSOHXをpJSO26から作って、BamHI部位を欠失させ、HindIII部位を付加した。
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スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）からのクローニングした遺伝子をpJSOHXのHindIIIおよびXbaI部位の中に挿入し、そしてpFSI82と命名する発現ベクターが得られた。pFSI82をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）YNG318に形質転換した。pFSI82地図を第４図に示す。
ｂ）発現手順
pFSI82を収容する形質転換体を８００mlのＹＰＤ中で２日間培養した。細胞を5,000rpmにおいて５分間遠心することによって収集し、基本的プロトコール（Bio manual serise 10、Yodosha）を使用して、スフェロプラストを調製した。スフェロプラストを遠心により崩壊し、細胞抽出物を７０℃において３０分間熱処理した。14,000rpmにおいて３０分間の遠心により、デブリを除去し、そして上清は粗製のイソアミラーゼ試料を構成した。
実施例６
スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）イソアミラーゼの特性決定
実施例３−ａに記載されているアッセイを使用して、組換えイソアミラーゼを特性決定した。
ａ）７０℃におけるpH最適値
スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）イソアミラーゼのpH最適値を測定した。反応を７０℃において実施した。検査したpHはpH３．５〜７．５であった。pH最適値はpH５．５であると測定された。pH曲線を第５図に示す。
ｂ）pH５．５において温度最適値
スルホロブス（Sulfolobus）イソアミラーゼの温度最適値を測定した。反応をpH５．５において４０〜９０℃において実施した。最適温度は約７０であると測定された。温度曲線を第６図に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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