(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）のカルボキシル末端に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）断片のアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目のセリン残基（Ｓｅｒ）がアラニン残基（Ａｌａ）またはグリシン残基（Ｇｌｙ）に置換された変異体が融合した融合蛋白質であって、前記融合蛋白質が下記アミノ酸配列（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかを有することを特徴とする融合蛋白質。
アミノ酸配列（Ａ）
【化１】
0004035400.tif 000018
アミノ酸配列（Ｂ）
【化２】
0004035400.tif 000019
アミノ酸配列（Ｃ）
【化３】
0004035400.tif 000020
アミノ酸配列（Ｄ）
【化４】
0004035400.tif 000021
【請求項２】
請求項１に記載の融合蛋白質をコード化することを特徴とする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含む組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、悪性貧血治療剤である、生体内(in vivo)でのヒトのエリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」とも略する）活性が増進した融合蛋白質に関するものである。より具体的には、本発明は、インビボで自然に生じる(naturally occurring)特定ペプチドにＥＰＯ分子が融合されてなる、糖鎖含量を増加させずに、それ自体のアミノ酸配列により生体内(in vivo)半減期を増加することによって、エリスロポエチン活性が増進された融合蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＰＯは、分子量３０，０００〜３４，０００の糖蛋白質であり、赤血球の生成及び分化を促進する造血因子である。この糖蛋白質は、赤血球系前駆細胞の受容体に結合して造血作用を開始して、細胞内のカルシウムイオン濃度の増加、ＤＮＡ生合成の促進及びヘモグロビン生成の刺激などを引き起こす。また、組換え型のヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）は、腎不全、未熟児、甲状腺機能不全、栄養失調などに関連する貧血の治療剤として使われてきた。一方、ｒｈＥＰＯは、半減期が短く、週に３回程度の投与を必要とするので、不便であり、また、コストも高い。このため、ｒｈＥＰＯの広範な使用は制限されている。したがって、これらの生体内活性をより長期間維持させることにより、治療のためのｒｈＥＰＯの投与頻度を減少させうる。
【０００３】
ＥＰＯの生体内での生物活性は生体内半減期に比例し、この生体内半減期はＥＰＯの糖鎖の末端に位置するシアル酸の含量と相関関係があることが知られている。したがって、ＥＰＯの生体内での生物活性は、糖鎖の存在あるいは不存在により大きく左右される。ところが、糖鎖の形態は細胞のタイプによって各々異なるので、同じ糖蛋白質を相異なる細胞で発現させると、蛋白質の糖鎖の形態は、細胞のタイプによってそれぞれ異なるものとなる。細菌、例えば、大腸菌(E. coli)は蛋白質に糖鎖を付加できないことが知られている。一般に、大腸菌で発現する蛋白質には糖が付加されていないために、大腸菌で発現したＥＰＯは糖鎖を含まない。このような場合でのＥＰＯは、試験管内(in vitro)では活性が確認されるが、生体内では全く活性を有さない。その理由は、糖鎖のないＥＰＯは、糖鎖を有するものに比べて、体内から迅速に除去され、その半減期が非常に短いからである。ゆえに、ＥＰＯにおける糖鎖の存在は、ＥＰＯの生物学的活性に非常に重要な役割を果たしている。
【０００４】
現在まで、ＥＰＯの活性を増加させるために多くの研究が盛んに行われてきた。そのうち主流をなしたのは、突然変異誘発技術を用いてＥＰＯ遺伝子に突然変異を誘導することによっていくつかのアミノ酸を置換させる方法である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２５７（発明の名称：Erythropoietin Analogs、出願人：Amgen Inc.）には、突然変異誘発によりＥＰＯの糖鎖含量を増加させることによって生体内半減期を増進させる方法が開示されている。また、ＥＰＯの二量体形成により生体内半減期を増加させようとする試みもあった(A.J. Sytkowski et al., J.B.C. vol.274, No.35, pp.24773-24778)。その他にも、遺伝子操作を用いてＥＰＯ分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させて、ＥＰＯの糖鎖含量、具体的には、シアル酸の含量を増加させることによって、ＥＰＯの生体内活性を増進させる方法がある。しかしながら、上記方法に使用されるアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片の種類が非常に制限される。多くの場合、このような遺伝子の修飾は、蛋白質の特定の活性を低下または失活させたり、またはこれらの物質を生体内で使用する際にしばしば生じる抗原性の問題を引き起こす可能性がある。
【０００５】
一方、ＥＰＯに関するものではないが、融合蛋白質またはキメラ蛋白質に関する研究が行なわれており、これらの例としては、例えば、性ホルモンの一種の卵胞刺激ホルモンに対するものがある(Furuhashi et al., 1995, Mol.Endocrinol.)。しかしながら、このような蛋白質は、遺伝子操作を用いて遺伝子が修飾された蛋白質には問題があるため、実際に適用された例はなかった。また、修飾された蛋白質自体を得ることは容易ではなく、高度の技術が要求される。加えて、新しいアミノ酸の付加または置換によって、蛋白質の活性が減少したりまたは失われたりすることが多かった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ＥＰＯ分子をそのカルボキシル末端にＨＣＧβサブユニットのＣＴＰ変異体に融合されてなる、ヒトＥＰＯの生体内活性が増進した融合蛋白質を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、当該融合蛋白質をコード化する核酸、当該核酸を含有する組換えベクター、及び当該組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞系を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる他の目的は、当該形質転換またはトランスフェクションされた細胞系を培養することによる増進したヒトＥＰＯ活性を有する融合蛋白質を製造する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＥＰＯ分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質（断片）を融合することによって、ＥＰＯの生体内活性を増進させうる新規な方法を開発することに鋭意検討を行なった結果、ＥＰＯに、インビボで自然に生じる(naturally occurring)蛋白質であるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（本明細書中では、「ＨＣＧ」とも称する）のβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（本明細書中では、「ＣＴＰ」とも称する）断片を融合することによって得られる融合蛋白質が、ＥＰＯの生体内活性を劇的に促進することを見出した。また、この際のＥＰＯは、ＥＰＯの固有の活性を維持しつつ糖鎖部位を増加させる機能を有するアミノ酸を含むものであった（韓国特許出願第１０−２０００−００７５２３０号を参照）。
【００１０】
上記知見に加えてさらに鋭意検討を行なった結果、本発明者らは、驚くべきことに、ペプチド中の糖鎖部位を予め除去したＣＴＰ変異体はＥＰＯの生体内半減期を画期的に増加させることを見出した。この知見により、ＥＰＯの糖鎖含量を増加させることなく、アミノ酸配列を用いてＥＰＯの生体内安定性を増加できるＣＴＰ変異体を開発するに至り、このような知見に基づいて、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、配糖化部位を予め除去したＣＴＰ変異体を利用する本発明は、ＥＰＯの糖鎖含量の増加により生体内半減期を増加させる従来の方法とは有意に異なるものであり、本発明はＥＰＯの生体内安定性を増加できるＣＴＰ変異体の発見に基づくものである。
【００１２】
すなわち、上記諸目的は、下記（１）〜（６）によって達成される。
【００１３】
（１）  ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）のカルボキシル末端に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）断片のアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目のセリン残基（Ｓｅｒ）がアラニン残基（Ａｌａ）またはグリシン残基（Ｇｌｙ）に置換された変異体が融合した融合蛋白質であって、前記融合蛋白質が下記アミノ酸配列（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかを有することを特徴とする融合蛋白質。
【００１４】
アミノ酸配列（Ａ）
【化５−１】
0004035400.tif 000002
アミノ酸配列（Ｂ）
【化５−２】
0004035400.tif 000003
アミノ酸配列（Ｃ）
【化５−３】
0004035400.tif 000004
アミノ酸配列（Ｄ）
【化５−４】
0004035400.tif 000005
【００１７】
（２）  前記（１）に記載の融合蛋白質をコード化することを特徴とする核酸。
【００１８】
（３）  前記（２）に記載の核酸を含む組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の第一は、ヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＨＣＧβサブユニットのＣＴＰ断片のアミノ酸が１〜４個置換された変異体（本明細書中では、「ＡＴＰ」とも称する）が融合された、生体内ヒトＥＰＯ活性が増進した融合蛋白質を提供するものである。本発明の融合蛋白質は、従来のものと異なり、ＥＰＯの糖鎖含量を増加させずに生体内ＥＰＯ活性を増進させることができる。前記ＣＴＰ断片は、下記配列番号：１に記載されたＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１１２〜１４５番目のアミノ酸またはその一部、特に好ましくは１１８〜１４５番目のアミノ酸を含むことが望ましい。なお、下記アミノ酸配列（配列番号：１）は、ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１１２〜１４５番目のアミノ酸に相当するため、例えば、配列番号１のアミノ酸配列の１番目のアミノ酸は、ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１１２番目のアミノ酸に相当し、配列番号１のアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸は、ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１４５番目のアミノ酸に相当する。
【００２０】
＜ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１１２〜１４５番目のアミノ酸配列（配列番号：１）＞
0004035400.tif 000006
0004035400.tif 000007
ＣＴＰ断片の変異体であるＡＴＰは、そのアミノ酸配列により、即ち、ＥＰＯの糖鎖含量を増加させることなく、ＥＰＯ分子の生体内半減期を増加させて、ゆえに生体内ＥＰＯ活性を増進させる機能を有するものである。したがって、ＡＴＰにおける変異が起こるアミノ酸置換の特定位置及び置換されるアミノ酸の種類は、融合蛋白質の生体内エリスロポエチン活性増進作用に悪影響がないかぎり、特に制限されるものではない。すなわち、融合蛋白質がエリスロポエチンの生体内活性を増進させる活性を維持するかぎり、該当位置範囲内のアミノ酸はいずれの位置でいずれのアミノ酸でも置換が可能である。
【００２１】
例えば、ＡＴＰは、配列番号：１に記載されるＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目の位置のアミノ酸（Ｓｅｒ残基）のうち一つ以上が置換されたものであることがより好ましく、最も望ましくは、当該配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目の位置のセリン残基（Ｓｅｒ）がアラニン残基（Ａｌａ）またはグリシン残基（Ｇｌｙ）、特に望ましくは図１に示されるようにＡｌａ（ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目の位置のアミノ酸（Ｓｅｒ残基）は配列番号：１の１０、１６、２１、及び２７番目のＳｅｒ残基であり、それぞれ、図１中の４、１０、１５及び２１番目のＡｌａに相当）に置換されたものである。本実施態様による融合蛋白質は、下記配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する。即ち、配列番号２に記載されるアミノ酸配列は、本発明の特に好ましい一実施態様によるＥＰＯとＡＴＰとの融合蛋白質（本明細書中では、「ＥＡＴＰ」とも称する）のアミノ酸配列を示すものである。ここでは、配列番号：２の１９６、２０２、２０７及び２１３番目の位置のアミノ酸が、それぞれ、配列番号：１のアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目の位置のアミノ酸に相当し、ＳｅｒがＡｌａに置換されている。前記位置のＳｅｒがＡｌａに置換されうる事実からみて、Ａｌａと類似した大きさ及び電荷を有する他のアミノ酸、例えば、Ｇｌｙも、Ａｌａと同様にして、置換が可能である。
【００２２】
＜ＥＰＯおよびＨＣＧβサブユニットのＣＴＰ断片の変異体（ＡＴＰ）との融合蛋白質（ＥＡＴＰ）アミノ酸配列（配列番号：２）＞
0004035400.tif 000008
0004035400.tif 000009
本発明の第二は、本発明の融合蛋白質をコード化する核酸、当該核酸を含む組換えベクター、及び当該組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞系、望ましくはＣＨＯ(chinese hamster ovary)細胞株を提供するものである。
【００２３】
本発明の第三は、本発明の細胞系（細胞株）を培養することによる、増進したヒトＥＰＯ活性を有する融合蛋白質を製造する方法を提供するものである。
【００２４】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２５】
本発明の融合蛋白質は、ＥＰＯのカルボキシル末端に所望のＡＴＰが融合されたものであれば、その製造方法は、特に制限されず公知の方法が使用でき、また、これをコード化する核酸、当該核酸を含む組換えベクター、及び当該組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞系もまた、特に制限されず公知の方法が使用できる。一般的には、本発明は、目的とする融合蛋白質の遺伝子の確保及びクローニング、目的とする遺伝子の発現ベクターの作製、当該ベクターの動物細胞への形質転換／トランスフェクション及びＥＡＴＰの発現、ならびに発現されたＥＡＴＰの分離（精製）及び活性度測定の段階を経る。
【００２６】
以下、各工程ごとに説明する。
【００２７】
（１）  遺伝子の確保及びクローニング
ＥＰＯの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、特に制限されず、公知の方法を用いて得られる。一実施態様によると、ヒト胎児の肝のｃＤＮＡライブラリー(Invitrogen Corp.)からあらかじめ調製されたＥＰＯ  ｃＤＮＡの両末端と相補的なプライマーＥＰ１、ＥＣ２を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  Ｋｉｔ(Bioneer)を用いた公知のＲＴ−ＰＣＲ(reverse transcription-polymerase chain reaction)技術によって得られる。上記実施態様において使用されるプライマーＥＰ１及びＥＣ２の塩基配列を以下に示す。
【００２８】
ＥＰ１：ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ（配列番号：３）
ＥＣ２：ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴ（配列番号：４）
次に、このようにして得られたＥＰＯ  ｃＤＮＡを、クローニングベクターのｐＧＥＭ−Ｔ(Promega Corp.)にクローニングして、ｐＧＥＭＴ−ＥＰＯを得、その塩基配列を確認した後、次の操作における鋳型として使用する。なお、上記実施態様においては、特定のクローニングベクターを使用したが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の公知のクローニングベクター及びクローニング方法を使用してもよい。
【００２９】
本発明で使用されるＨＣＧβサブユニットのＣＴＰ遺伝子変異体の製造方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、ＨＣＧβサブユニットのＣＴＰ遺伝子変異体は、合成及びセルフプライミングＰＣＲ(self-priming PCR)によって得られる。合成された遺伝子断片を、ＥＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４と称し、その塩基配列を以下に示す。下記塩基配列において、太字で表示した部分は、アミノ酸置換を誘導するための部分である。
【００３０】
【化１】
0004035400.tif 000010
【００３１】
上記４つの遺伝子を、それぞれ、１μｌずつ取り（５０ｐｍｏｌｅ／μｌ）、高正確度Ｔａｑシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)を使用してＰＣＲを行なう。
【００３２】
１％アガロースゲルで、約１００ｂｐの遺伝子断片（修飾ＣＴＰ遺伝子）を確認・同定する。これらの遺伝子は、ＨＣＧβサブユニット（配列番号：１）の１１８〜１４５番目の位置の２８個のカルボキシル末端アミノ酸のうち１２１、１２７、１３２及び１３８番目の４つのＳｅｒ残基をＡｌａ残基に置換して得られた遺伝子をコード化するものである（図１を参照）（ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目の位置のアミノ酸（Ｓｅｒ残基）は配列番号：１の１０、１６、２１、及び２７番目のＳｅｒ残基であり、それぞれ、図１中の４、１０、１５及び２１番目のＡｌａに相当）。
【００３３】
ｐＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型としてならびに上記ＥＰ１及びＥＣ２をプライマーとして使用して、ＰＣＲを行なうことによって、ＥＰＯ遺伝子のみを得る。次に、このＥＰＯ遺伝子及び修飾ＣＴＰ遺伝子双方を鋳型としてならびにプライマーＥＰ１１及びＥＰ２２を使用して、高正確度Ｔａｑシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)によるＰＣＲをさらに行なうことによって、約６３０ｂｐの遺伝子断片を有する所望の融合遺伝子（「ＥＡＴＰ遺伝子」と称する）を得る。なお、ここで使用されたプライマーＥＰ１１及びＥＰ２２の塩基配列を以下に示す。
【００３４】
ＥＰ１１：ＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号：９）
ＥＰ２２：ＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＧＧＧＴ（配列番号：１０）
これらの遺伝子をクローニングベクターであるｐＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認する（これを、本明細書中では、「ｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰ」と称する）（図３を参照）。
【００３５】
（２）  発現ベクターの構築
所望の融合遺伝子（ＥＡＴＰ遺伝子）を発現させるための発現ベクターは、特に制限されず、発現宿主の種類によって、公知の発現ベクターから適宜選択されて使用できる。例えば、ｐｃＤＮＡ３.１ベクター(Invitrogen)が、発現ベクターとして使用される。上記（１）で作製されたｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰのＥＡＴＰ遺伝子の両末端は、プライマーＥＰ１１及びＥＰ２２由来のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素部位を有する。これを利用して、発現ベクターとしてのｐｃＤＮＡ３.１及び上記（１）で得られたｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで処理する。線形化されたｐｃＤＮＡ３.１及びＥＡＴＰ遺伝子を、Ｑｉａｇｅｎ溶出キットを用いてアガロースゲルから得た後、ライゲーション（連結）して、これを大腸菌  ＮＭ５２２株に形質転換する。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一晩インキュベートした後、現れたコロニーからプラスミドを単離し、このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで処理する。さらに、ＥＡＴＰ遺伝子が挿入されたプラスミドを、１％アガロースゲル電気泳動によって選択する。このプラスミドをｐｃＤＮＡ３.１−ＥＡＴＰと命名する（図３中では、単に「ｐｃＤＮＡ−ＥＡＴＰ」）。
【００３６】
（３）  ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション（形質転換）及びＥＡＴＰの発現
上記（２）で調製された発現プラスミドからの所望のＥＡＴＰの発現のために使用される宿主細胞やそれからの所望のＥＡＴＰの発現方法は、特に制限されず、使用された宿主細胞によって公知の方法が適宜選択できる。以下に、宿主細胞としてＣＨＯ(chinese hamster ovary)細胞株を使用する場合の実施態様を記載する。ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）を、６０ｍｍ細胞培養皿で生育させて、４０〜８０％コンフルエントな細胞（１〜４×１０5細胞／６０ｍｍ皿）を調製する。スーパーフェクション試薬(superfection reagent)(Boehringer Manheim Corp.)３μｌ及び細胞培地（培養基(media)を含むが、血清及び抗生物質を含まないα−ＭＥＭ）９７μｌをよく混合する。この混合液に、上記（２）で得られたプラスミドｐｃＤＮＡ３.１−ＥＡＴＰ（０.１μｇ／μｌ以上）約２μｇ及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含むベクターｐＬＴＲｄｈｆｒ２６（ＡＴＣＣ３７２９５）０.２μｇを添加して、室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製されたＣＨＯ細胞に加える。１日経過後、培地を、１０％ＦＢＳを有する培養基(media)を含まないα−ＭＥＭ（５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む）培地に交換する。細胞を、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８が添加される培養基(media)を補充して、７〜１０日間培養する。ここで、Ｇ４１８耐性遺伝子を持たない細胞及び陰性対照群の細胞はすべて死滅する。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、培地で発現したＥＡＴＰ蛋白質を、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット(Boehringer Manheim Corp.)を用いて確認する。
【００３７】
（４）  発現したＥＡＴＰ蛋白質の精製
上記（３）で作製されたＥＡＴＰ蛋白質を発現する細胞からの所望のＥＡＴＰ蛋白質の精製方法は、特に制限されず、アフィニティクロマトグラフィー等の公知の方法が使用できる。以下に、その一実施態様を説明する。
【００３８】
まず、抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社）を用いて、分離精製用のアフィニティ樹脂を下記のようにして調製する。
【００３９】
０．３ｇのＣＮＢｒで活性化されたセファロース４Ｂ(Sepharose 4B)を、１ｍＭ  ＨＣｌ中で２０分間、膨潤させて、樹脂をカラムに移した後、１ｍＭ  ＨＣｌで洗浄する。次に、このようにして得られた樹脂をさらに４ｍｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で洗浄し、チューブに移した後、直ちにカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（５００μｇ／バイアル）とチューブ内で混合して、室温で２時間反応させる。この時、チューブを十分振盪する。さらに、このようにして得られた反応産物を、ブロッキング緩衝液（０．２Ｍグリシン、ｐＨ８．０）で置換した後、攪拌しながら室温で２時間反応させる。このようにして得られた樹脂を、６．５ｍｌのカップリング緩衝液、６．５ｍｌのアセテート緩衝液（０．１Ｍ  酢酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４）及び６．５ｍｌのカップリング緩衝液で順次洗浄する。このように調製された樹脂をカラムに充填して、次のように精製を実施する。
【００４０】
上記（３）で得られた細胞を、無血清培養液で一日生育させた後、培養液だけをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Millipore Corp.製、カットオフ１０，０００）を用いて約５倍濃縮する。次に、この濃縮液を、約２０ｍｌ／ｈｒの流速でＰＢＳで平衡化させたカラムにのせて、再びＰＢＳで洗浄する。所望の蛋白質を溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８）で溶出させた後直ちに、１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）溶液でｐＨ７．５になるように滴定する。ＥＡＴＰの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色で確認したとところ、９７％以上である（図４）。
【００４１】
（５）バイオアッセイ法による活性測定及び生化学的分析
上記（４）で精製されたＥＡＴＰ及びコントロールとしてのＥＰＯの生物学的活性の測定及びそれらの生化学的分析が行なわれるが、その際の測定及び分析方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。以下に、その一実施態様を記載する。
【００４２】
発現され及び適当に精製されたＥＰＯ及びＥＡＴＰの生物学的活性を、フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾細胞を用いたバイオアッセイによって測定する。その結果、ＥＡＴＰの活性がＥＰＯのものより高く現れることから、ＥＡＴＰで添加されたカルボキシル末端の存在がＥＰＯの活性自体を阻害しないことが示唆される。
【００４３】
（６）薬物動態試験
調製された候補物質、即ち、ＥＡＴＰが実際より長い生体内での半減期を有するかどうかを確認するために、薬物動態試験を、例えば、マウスを対象で実施する。この際使用できる確認方法は、特に制限されず公知の方法が使用でき、その対象動物もまたマウスに制限されず、ラットやウサギ等の他の動物が使用できる。以下に、その確認方法の一実施態様を示す。候補物質を、４匹のマウスに１匹当り２０ユニットの投与量で静脈内投与する。経時的血中濃度を確認するために、血液をマウスから集め、ＥＩＡキット(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、血中濃度を決定する。マウスで行なわれた薬物動態試験から、候補物質であるＥＡＴＰはコントロール物質であるＥＰＯよりかなり長い半減期を有することが分かる（図５を参照）。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例を参照しながらより具体的に説明するが、本発明の範囲は下記実施例によって制限されない。
【００４５】
実施例１：遺伝子の確保
ＥＰＯのｃＤＮＡを、ヒト胎児の肝臓のｃＤＮＡライブラリー(Invitrogen Corp.)であらかじめ調製されたＥＰＯ ｃＤＮＡの両末端と相補的なプライマーＥＰ１、ＥＣ２を使用した、ＲＴ−ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  Ｋｉｔを用いた公知のＲＴ−ＰＣＲ技術(Bioneer Corp., Korea)によって得た。なお、ＰＣＲ反応は、５５℃で３５秒（アニーリング）、７２℃で４０秒、及び９４℃で２０秒の条件下で、３０サイクル行なわれ、これによりＥＰＯ  ｃＤＮＡが調製された。また、この際使用されるプライマーＥＰ１及びＥＣ２の塩基配列は、下記のとおりである。
【００４６】
ＥＰ１：ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ（配列番号：３）
ＥＣ２：ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴ（配列番号：４）
次に、このようにして得られたＥＰＯ  ｃＤＮＡを、クローニングベクターのｐＧＥＭ−Ｔ(Promega Corp.)にクローニングした。より詳細に述べると、上記操作で得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルから溶出して、ｐＧＥＭ−Ｔに連結した後、大腸菌ＮＭ５２２に形質転換させた。Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧを塗り付けたＬＢ−アンピシリン固体培地で一晩インキュベートした後、白色コロニーらからプラスミドＤＮＡを単離し、これを制限酵素ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩで処理して、ＥＰＯ  ｃＤＮＡが挿入されているコロニーを選別した。得られたベクターをｐＧＥＭＴ−ＥＰＯと命名して、その塩基配列を確認した後、次の操作における鋳型として使用した。
【００４７】
ＨＣＧβサブユニットの修飾されたＣＴＰ遺伝子を、合成及びセルフプライミングＰＣＲを利用して得た。合成された遺伝子断片は、ＥＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４を、ＥＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４と称し、その塩基配列を以下に示す。
【００４８】
ＥＡ１：ＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＧ（配列番号：５）
Ａ２：ＧＧＡＡＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡ（配列番号：６）
Ａ３：ＣＣＧＣＣＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＣＣ（配列番号：７）
Ａ４：ＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＣＧ（配列番号：８）
これら４つの遺伝子を１μｍずつとって（５０ｐｍｏｌｅ／(ｌ）、高正確度Ｔａｑシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、５５℃で４０秒（アニーリング）、７２℃で４０秒及び９４℃で２０秒の条件下で計１５サイクルのＰＣＲを行なった。１％アガロースゲルで約１００ｂｐの遺伝子断片を確認した（修飾されたＣＴＰ遺伝子）。
【００４９】
この遺伝子は、ＨＣＧβサブユニットの２８個のカルボキシル末端のアミノ酸の１２１、１２７、１３２及び１３８番目の４個のＳｅｒ残基がＡｌａに置換されたペプチドをコード化するものである（図１）（ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番目の位置のアミノ酸（Ｓｅｒ残基）は配列番号：１の１０、１６、２１、及び２７番目のＳｅｒ残基であり、それぞれ、図１中の４、１０、１５及び２１番目のＡｌａに相当）。
【００５０】
ｐＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型としてならびに上記ＥＰ１及びＥＣ２をプライマーとして使用して、前記と同じ条件でＰＣＲを行なうことによって、ＥＰＯ遺伝子だけを得た。次に、このＥＰＯ遺伝子及び上記で得られた修飾されたＣＴＰ遺伝子双方を鋳型としてならびにプライマーＥＰ１１及びＥＰ２２を使用して、高正確度Ｔａｑシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)を用いて、５７℃で４２秒（アニーリング）、７２℃で１分、及び９４℃で２０秒の条件下で３０サイクルのＰＣＲをさらに行なうことによって、約６３０ｂｐの融合遺伝子断片（「ＥＡＴＰ遺伝子」と称する）が得られた。なお、ここで使用されたプライマーＥＰ１１及びＥＰ２２の塩基配列を以下に示す。
【００５１】
ＥＰ１１：ＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号：９）
ＥＰ２２：ＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＧＧＧＴ（配列番号：１０）
これらの遺伝子を、前記と同じ方法でクローニングベクターであるｐＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、その塩基配列を確認する（ｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰと称する）（図３）。
【００５２】
実施例２：発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＥＡＴＰの構築
本実施例では、ｐｃＤＮＡ３.１ベクター(Invitrogen)を、発現ベクターとして使用した。実施例１で作製されたｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰのＥＡＴＰ遺伝子の両末端は、プライマーＥＰ１１及びＥＰ２２由来のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素部位を有する。
【００５３】
これを利用して、発現ベクターとしてのｐｃＤＮＡ３.１及び実施例１で得られたｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化した。線形化されたｐｃＤＮＡ３.１及びＥＡＴＰ遺伝子を、Ｑｉａｇｅｎ溶出キットを用いてアガロースゲルから得た後、ライゲーション（連結）して、これを大腸菌  ＮＭ５２２株に形質転換した。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一晩インキュベートした後に現れたコロニーからプラスミドを単離し、このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで処理した。さらに、ＥＡＴＰ遺伝子が挿入されたプラスミドを、１％アガロースゲル電気泳動によって選択した。このようにして得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ３.１−ＥＡＴＰと命名する（図３参照；ただし、図３中では、単に「ｐｃＤＮＡ−ＥＡＴＰ」として示される）。
【００５４】
実施例３：ＣＨＯ細胞の形質転換及びＥＡＴＰ発現
ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）を、６０ｍｍ細胞培養皿で生育させて、４０〜８０％コンフルエントな細胞（１〜４×１０5細胞／６０ｍｍ皿）を調製した。スーパーフェクション試薬(superfection reagent)(Boehringer Manheim Corp.)３μｌ及び細胞培地（培養基(media)を含むが、血清及び抗生物質を含まないα−ＭＥＭ）９７μｌをよく混合した。この混合液に、実施例２で得られたプラスミドｐｃＤＮＡ３.１−ＥＡＴＰ（０.１μｇ／μｌ以上）約２μｇ及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含むベクターｐＬＴＲｄｈｆｒ２６（ＡＴＣＣ３７２９５）０.２μｇを添加して、室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製されたＣＨＯ細胞に加えた。１日経過後、培地を、１０％ＦＢＳを有する培養基(media)を含まないα−ＭＥＭ（５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む）培地に交換した。細胞を、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む培養基を補充して、７〜１０日間培養する。ここで、Ｇ４１８耐性遺伝子を持たない細胞及び陰性対照群の細胞はすべて死滅した。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、培地で発現したＥＡＴＰ蛋白質を、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット(Boehringer Manheim Corp.)を用いて確認した。
【００５５】
実施例４：発現されたＥＡＴＰの精製
まず、抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ）社を用いて、分離精製用のアフィニティ樹脂を下記のようにして調製した。
【００５６】
０．３ｇのＣＮＢｒで活性化されたセファロース４Ｂ(Sepharose 4B)を、１ｍＭ  ＨＣｌ中で２０分間、膨潤させて、この樹脂をカラムに移した後、１ｍＭ  ＨＣｌで洗浄した。次に、このようにして得られた樹脂をさらに４ｍｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で洗浄し、チューブに移した後、直ちにカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（５００μｇ／バイアル）とチューブ内で混合して、攪拌しながら室温で２時間反応させた。この時、チューブを十分振盪した。さらに、このようにして得られた反応産物を、ブロッキング緩衝液（０．２Ｍグリシン、ｐＨ８．０）で置換した後、室温で２時間反応させた。このようにして得られた樹脂を、６．５ｍｌのカップリング緩衝液、６．５ｍｌのアセテート緩衝液（０．１Ｍ  酢酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４）及び６．５ｍｌのカップリング緩衝液で順次洗浄した。このように調製された樹脂をカラムに充填して、次のように精製を実施した。
【００５７】
実施例３で得られた形質転換ＣＨＯ細胞を、無血清培養液で一日生育させた後、培養液だけをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Millipore Corp.製、カットオフ１０，０００）を用いて約５倍濃縮した。次に、この濃縮液を、約２０ｍｌ／ｈｒの流速でＰＢＳで平衡化させたカラムにのせて、再びＰＢＳで洗浄した。所望の蛋白質を溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８）で溶出させた後直ちに、１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）溶液でｐＨ７．５になるように滴定した。ＥＡＴＰの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色で確認したとところ、９７％以上であった（図４）。
【００５８】
実施例５：バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンを、マウスに１日１回の割合で２日間、６０ｍｇ／ｋｇ、投与した。３日後、肥大した脾臓をマウスから単離し、ホモゲナイザーで破砕して、脾細胞を得た。この脾細胞を６×１０6細胞／ｍｌに希釈して、この希釈サンプルを９６ウェルのプレートに１００μｌずつ分取した。それぞれのウェルに、標準ＥＰＯ（０〜５００ｍＵ／ｍｌ）及び発現されたＥＰＯ及びＥＡＴＰ（実施例４）を、それぞれ、１００ｍＵ／ｍｌの濃度で加えた後、プレートを、３７℃に維持されたＣＯ2インキュベーターで２２時間、放置した。各ウェルにジメチル−3［Ｈ］−チミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）を５０μずつ添加した。このプレートを、さらに同じインキュベーターで２時間反応させた後、各ウェルのサンプル溶液をガラスフィルター(Nunc 1-73164)に吸着させた。このフィルターを生理食塩水で３回洗浄して、ベータ（β）カウンターを用いて各フィルターの放射能量を測定して、ＥＰＯ及びＥＡＴＰの活性を測定した。測定結果から、ＥＡＴＰの活性はＥＰＯのものと実質的に同等であるあるいは若干高いことが示された。これから、ＥＡＴＰに添加されたカルボキシル末端の存在はＥＰＯの活性を阻害しないことが示唆される。
【００５９】
実施例６：薬物動態試験
本実施例では、候補物質が実際より長い生体内での半減期を有するかどうかを確認するために、薬物動態試験をマウスで行なった。すなわち、実施例５で調製・精製された融合蛋白質（ＥＡＴＰ）を、４匹のマウスに１匹当り２０ユニットの投与量で静脈内投与した。経時的血中濃度を確認するために、始めは３０分間隔でおよび２時間以後では２時間間隔でマウスから採血した後、ＥＩＡキット(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、血中濃度を測定した。その結果を図５に示す。図５に示されるように、候補物質であるＥＡＴＰは、コントロール物質であるＥＰＯより、２．５倍以上という有意により長い半減期を有する。
【００６０】
【発明の効果】
本発明は、（１）ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）のカルボキシル末端に、ＨＣＧβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）断片のアミノ酸が１〜４個置換された変異体が融合されることを特徴とする融合蛋白質；（２）当該融合蛋白質をコード化することを特徴とする核酸；ならびに（３）当該核酸を含む組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法を提供するものである。したがって、本発明によれば、そのアミノ酸配列によるＥＰＯ固有の活性自体には影響を与えずに、即ち、ＥＰＯの糖鎖含量の増加させることなく、生体内での半減期を画期的に増加させることによって、ＥＰＯの生体内での活性が増進できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、本発明の特に好ましい一実施態様によるＨＣＧ変異体であるＡＴＰ（修飾ＣＴＰ遺伝子）の塩基及びアミノ酸配列を示すものである。
【図２】は、本発明の特に好ましい一実施態様によるＥＰＯとＡＴＰとの融合蛋白質（ＥＡＴＰ）の塩基及びアミノ酸配列を示すものである。
【図３】は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＥＡＴＰの作製過程を示す模式図である。
【図４】は、精製されたＥＡＴＰの電気泳動写真である。
【図５】は、ＥＡＴＰ及びＥＰＯの薬物動態結果を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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