(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、ロイコアントシアニジン及びルチンからなる群から選択される少なくとも一種のポリフェノールが、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンのアミノ基と結合していることを特徴とするポリアミン−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項２】
【化１】
0004035597.tif 000014
［式中、Ｒは、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、クエルセチン、プロシアニジン、ロイコアントシアニジン及びルチンからなる群から選択される少なくとも一種のポリフェノールから３,４-ジヒドロキシフェニル基を除いた一価の基を示す］のポリフェノールが、
【化２】
0004035597.tif 000015
又は、
【化３】
0004035597.tif 000016
又は、
【化４】
0004035597.tif 000017
の少なくともいずれか１つの構造で、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンのアミノ基と結合している請求項１記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項３】
ポリアミンがポリアリルアミン、ポリリシン及びポリアミドアミンデンドリマーからなる群から選択される少なくとも一種である請求項２記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項４】
ポリアミンの分子量が５００〜１０，０００，０００である請求項１〜３項のいずれか１項に記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項５】
ポリフェノールがフェノール性水酸基を四つ以上有するフェノール類である請求項１〜４項のいずれか１項に記載のポリアミノ−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項６】
チロシナーゼ又はラッカーゼの存在下、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンと、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、ロイコアントシアニジン及びルチンからなる群から選択される少なくとも一種のポリフェノールとを反応させることを特徴とする請求項１記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの製造方法。
【請求項７】
チロシナーゼ又はラッカーゼの存在下、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンと、前記［化１］のポリフェノールとを反応させることを特徴とする請求項６記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの製造方法。
【請求項８】
ポリアミンがポリアリルアミン、ポリリシン及びポリアミドアミンデンドリマーからなる群から選択される少なくとも一種である請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ポリアミンの分子量が５００〜１０，０００，０００である請求項６〜８項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリフェノールがフェノール性水酸基を四つ以上有するフェノール類である請求項６〜９項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリアミン−ポリフェノールハイブリッド及びその製造方法に関するものである。詳しくは抗酸化剤、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料、消臭剤等に有用なポリアミン−ポリフェノールハイブリッド及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、植物に含まれるカテキン、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、ルチン等のポリフェノール類に抗酸化性や殺菌作用があることが知られている。さらに抗ガン作用、抗炎症作用、紫外線吸収作用、毛細血管の強化、血圧上昇抑制、血圧降下作用、記憶力向上、肝機能向上、脂肪吸収抑制、ストレス抑制、女性ホルモンバランス調整、抗腫瘍作用、突然変異抑制、血中コレステロール抑制、整腸作用等の効果も知られており、生医学分野への応用が期待されている。これらポリフェノールを高分子と結合させることにより、細胞での滞在時間が低分子ポリフェノールよりも延長し、これら生化学活性が増大することが期待される。
【０００３】
例えば、ポリアクリルアミドあるいはポリメタクリルアクリルアミドにカテキン等のポリフェノールを結合させたポリマー及びその製造方法が知られている(特開平８−２７２２６)。
【０００４】
【課題を解決するための課題】
しかし、ポリフェノール類を高分子に共有結合させたハイブリッド材料はほとんど知られていない。上述のポリアクリルアミドにカテキン等のポリフェノールを結合させたポリマーは、ポリアクリルアミドあるいはポリメタクリルアクリルアミドに限定される手法であり、しかもポリマー（またはモノマー）とポリフェノールを結合させるためにポリマーまたはモノマーに特殊な誘導化が必要であるため、一般性が欠如しているという問題がある。
【０００５】
天然に存在するポリフェノール類には水溶性で分子量１万以上のものも知られているが、その構造は明らかではない。一方、生化学活性が詳細に調べられているカテキン、エピガロカテキンガレート、ルチンといった低分子量ポリフェノールを既存の幅広い高分子に導入して高分子化する技術開発が望まれていた。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、広く一般性を有するポリアミン−ポリフェノールハイブリッド及びその製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ポリアミン−ポリフェノールハイブリッド及びその製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、ロイコアントシアニジン及びルチンからなる群から選択される少なくとも一種のポリフェノールが、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンのアミノ基と結合していることを特徴とする。
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの好ましい実施態様において、
【化５】
0004035597.tif 000002
［式中、Ｒは、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、クエルセチン、プロシアニジン、ロイコアントシアニジン及びルチンからなる群から選択される少なくとも一種のポリフェノールから３,４-ジヒドロキシフェニル基を除いた一価の基を示す］のポリフェノールが、
【化６】
0004035597.tif 000003
又は、
【化７】
0004035597.tif 000004
又は、
【化８】
0004035597.tif 000005
の少なくともいずれか１つの構造で、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンのアミノ基と結合していることを特徴とする。
【０００９】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの好ましい実施態様において、ポリアミンがポリアリルアミン、ポリリシン及びポリアミドアミンデンドリマーからなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする。
【００１０】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの好ましい実施態様において、ポリアミンの分子量が５００〜１０，０００，０００であることを特徴とする。
【００１１】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの好ましい実施態様において、ポリフェノールがフェノール性水酸基を四つ以上有するフェノール類であることを特徴とする。
【００１３】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの製造方法は、チロシナーゼ又はラッカーゼの存在下、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンと、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、ロイコアントシアニジン及びルチンからなる群から選択される少なくとも一種のポリフェノールとを反応させることを特徴とする。
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの製造方法の好ましい実施態様において、チロシナーゼ又はラッカーゼの存在下、側鎖に一級アミノ基を有するポリアミンと、前記［化１］のポリフェノールとを反応させることを特徴とする。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様において、ポリアミンがポリアリルアミン、ポリリシン及びポリアミドアミンデンドリマーからなる群から選択される少なくともであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、ポリアミンの分子量が５００〜１０，０００，０００であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様において、ポリフェノールがフェノール性水酸基を四つ以上有するフェノール類であることを特徴とする。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、
【化９】
0004035597.tif 000006
のポリフェノールが、
【化１０】
0004035597.tif 000007
又は、
【化１１】
0004035597.tif 000008
又は、
【化１２】
0004035597.tif 000009
の少なくともいずれか１つの構造でポリアミンと結合している。すなわち、ポリフェノールとポリアミンは、[化２〜４]で示すいずれか1つの構造を有する。ポリフェノールとポリアミンとは、[化２]の構造のみ、[化３]の構造のみ、[化４]の構造のみで結合していても良く、[化２〜４]の構造をいずれか1つを含んでいれば良い。[化２〜４]の種々の組み合わせによる結合構造により、ポリアミンとポリフェノールとがハイブリッドを形成してもよい。要するに、[化２]、[化３]、又は[化４]の少なくともいずれか1つの構造でハイブリッドを形成していればよく、[化２]、[化３]及び[化４]の構造をすべて含んでも良く、[化２]と[化３]との組み合わせ、[化２]と[化４]との組み合わせ、[化３]と[化４]との組み合わせで形成されていても良い。
【００２１】
本発明のハイブリッドを構成するポリアミンは、特に制限されるものではない。ポリフェノールと酵素の反応によって生じるキノン中間体に対する高い反応性という観点から、一級および／または二級アミノ基を含むポリマーが好ましい。また、これらアミノ基はポリマー主鎖、側鎖、末端いずれに導入されていても良い。ポリアミンの具体例として、分岐ポリエチレンイミン、線状ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリシン、タンパク質、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、キチン部分加水分解物、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリプロピレンイミンデンドリマー等が挙げられる。
【００２２】
上述のポリアミンの分子量は特に制限されるものではないが、５００以上１０，０００，０００以下が好ましく、より好ましくは５００以上、５，０００，０００以下である。
【００２３】
また、ポリフェノールは、特に制限されるものではない。ハイブリッドの生医学分野での応用に必要な水溶性付与という観点から、フェノール性水酸基を四つ以上含む化合物が好ましい。また、生成ハイブリッドへの高い抗酸化性付与という観点から、ポリフェノールは、フラボノイド骨格を有すること好ましい。ポリフェノールの具体例としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、ロイコアントシアニジン、ルチン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用され、ポリアミン１グラムに対して、１ｍｇ〜３０グラムの範囲で用いることが望ましい。
【００２４】
次に、本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの製造方法について、説明する。本発明のハイブリッドの製造方法は、酵素触媒の存在下、ポリアミンとポリフェノールとを反応させる。反応は以下の通りである。
【００２５】
【化１３】
0004035597.tif 000010
酵素触媒とは、酵素を利用した触媒を意味する。酵素とは生体における化学反応の触媒をいい、本発明においては、これらの酵素を触媒に利用する。酵素触媒としては、例えば、酸化酵素、加水分解酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素等を例示することができる。ポリフェノール類の酸化触媒機能という観点から、触媒としては、好ましくは、酸化酵素である。
【００２６】
本発明で使用される酸化酵素は、フェノール類の酸化を起こすのに十分な酸化能を有するものであればよく、特に制限はない。具体例としては、チロシナーゼ（ＥＣ  １．１４．１８．１）、フェノラーゼ、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼが挙げられる。これらの酸化酵素は種々の起源のものが使用でき、特に制限はないが、例えば植物由来、細菌由来、坦子菌類由来の酸化酵素を挙げることができる。
【００２７】
上記酸化酵素の中で、チロシナーゼが特にマッシュルーム由来のチロシナーゼは酸化能が高く、しかも量産されて比較的安価であり、好ましく使用することができる。
【００２８】
酵素量はポリアミン１ｇに対して１ユニット〜１、０００，０００ユニット、好ましくは３ユニット〜５００，０００ユニット、さらに好ましくは５ユニット〜２００，０００ユニットである。
【００２９】
重合に用いる溶媒としては、ポリアミンとポリフェノールと酵素触媒が共に溶解するものが好ましく、水または有機溶媒と水の混合溶媒が挙げられる。水は蒸留水や脱イオン水でもよいが、水の代わりに緩衝液を用いてもよい。緩衝液を用いる場合はｐＨ２〜１２の範囲が望ましい。緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が望ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
混合溶媒を用いる場合の有機溶媒は水と相溶する溶媒がより好ましい。水と相溶する有機溶媒として、メタノール、エタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ピリジン、１，４−ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。また、有機溶媒−水の混合比はポリアミンとポリフェノールと酵素触媒が共に溶解する任意の量を用いることができる。好ましくは０．０１：９９．９９〜９０：１０、特に好ましくは１：９９〜８０：２０の範囲が望ましい。
【００３１】
反応温度は、酵素触媒が不活性化しない温度が望ましい。好ましくは−２０〜１００℃の範囲であり、より好ましくは０〜６０℃の範囲である。反応温度が高い場合は、一般に酵素は失活するが、混合溶媒系によっては酵素を安定化するので、その場合は高い反応温度も採用可能となる。
【００３２】
本発明によって得られるポリアミン−ポリフェノールハイブリッドのポリフェノール含有量は、原料ポリアミンのアミノ基に対して０．０１モル％〜１００モル％の範囲であるが、好ましくは０．０５〜１００モル％、より好ましくは０．１〜１００モル％である。
【００３３】
なお、本発明の製造方法に用いるポリアミン、ポリフェノールについては、上述の本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドについて説明したものを用いることができる。
【００３４】
本発明において得られるポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、生化学機能の知られたポリフェノール類をポリマーに導入したものである。ポリフェノールの高分子化により生体内での滞在時間が延長できることから、抗酸化剤、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料剤、化粧品素材等の各種用途に幅広く使用できる。
【００３５】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
５０ミリリットルナスフラスコに、１．７グラムの３０％分岐ポリエチレンイミン（分子量７０，０００）水溶液を取り、５ミリリットルの蒸留水を加えて室温で攪拌した。６規定塩酸を用いて、該溶液のｐＨを７．５に調整した後、０．１７グラムのカテキンを溶解させたメタノール溶液５ミリリットルを加えた。１０００ユニットのマッシュルームチロシナーゼを溶解させた水溶液１００マイクロニットルを加えて反応を開始させた。反応中は反応液を緩やかに攪拌した。４８時間後、反応液を分子量２万のカットオフ膜を用いた限外濾過により未反応のカテキンや塩類を除去し、凍結乾燥によりポリマーを単離し、ポリエチレンイミン−カテキンハイブリッドを０．５６グラム得た（ハイブリッド−１）。ＮＭＲ、ＵＶ−可視スペクトル分析によりカテキンユニットの導入が確認された。また、化２〜４の構造が、例えばAdvances in Insect Physiology, Vol.21, 179 (1988)に記載されているようにカテコールやドーパから得られるキノン誘導体とアミンの反応で観測されるものであるため、これらの文献を参照して前記カテキンユニットの導入を確認した。得られたハイブリッドの理化学的性質を以下に示す。
1H NMR(DMSO-d6, ppm) 2.5-4.2 (br, NCH2CH2N), 6.1-7.1 (br, Ar)
【００３６】
図１は、ポリアミン−カテキンハイブリッドのＵＶ特性を示す。図1中、ＰＥＩ−カテキンがハイブリッド−1のＵＶ特性を示す。280nmのピークは芳香族に見られるπ−π*遷移によるものであり、カテキンの吸収と比べて拡がっていることから、[化2〜４]の構造が示唆される。
【００３７】
また、元素分析によりカテキン導入を求めたところ、導入量はポリエチレンイミンの全アミノ基に対して２．３モル％であった。
【００３８】
比較例１
実施例１の操作において、チロシナーゼを使用しないで反応を行ったところ、原料が未反応で回収された。
【００３９】
実施例２
カテキンを０．３４グラム用いた以外は実施例−１と同様の実験を行った。得られた試料は０．５９グラムであった（ハイブリッド−２）。元素分析より求めたカテキン導入量は２．７モル％であった。
【００４０】
実施例３
カテキンを０．６７グラム用いた以外は実施例１と同様の実験を行った。得られた試料は０．４４グラムであった。元素分析より求めたカテキン導入量は７．７モル％であった。
【００４１】
実施例４
１０％ポリアミドアミンデンドリマー（第４世代）メタノール溶液  ３．０グラム
カテキン  ０．０８７グラム
蒸留水  １０ミリリットル
メタノール  ３ミリリットル
チロシナーゼ  ２０００ユニット
を用いて実施例−１と同様の操作を行った。尚、反応液のｐＨは８に調整した。反応後、カットオフ分子量５００の透析膜を用い、未反応のカテキンや塩類を除去し、凍結乾燥によりポリマーを単離し、デンドリマー−カテキンハイブリッドを０．４０グラム得た（ハイブリッド−３）。元素分析より求めたカテキン導入量（デンドリマーの表面の一級アミノ基に対する）は１７モル％であった。図１は、ポリアミン−カテキンハイブリッドのＵＶ特性を示し、図1中、デンドリマー−カテキンがハイブリッド−３のＵＶ特性を示す。得られたハイブリッドの理化学的性質を以下に示す。
【００４２】
1H NMR(DMSO-d6, ppm) 2.0-3.5 (br, NCH2CH2N、NCH2CH2C(=O)), 6.1-7.7 (br, Ar、NH)、7.9-8.8 (br, Ar、NH2+)
UV（λmax（蒸留水））280nm（[化2〜４]の構造由来の芳香族由来のπ−π*遷移）、435nm（[化3、4]の構造由来の芳香族由来のｎ−π*遷移）
【００４３】
実施例５
反応液のｐＨを７に調整した以外は、実施例４と同様の操作を行ったところ、デンドリマー−カテキンハイブリッドを０．３１グラム得た（ハイブリッド−４）。元素分析より求めたカテキン導入量（デンドリマーの表面の一級アミノ基に対する）は１１モル％であった。
【００４４】
実施例６
酵素触媒としてチロシナーゼの代わりに微生物ラッカーゼを５ユニット用いた以外は、実施例４と同様の操作を行ったところ、デンドリマー−カテキンハイブリッドを０．３６グラム得た（ハイブリッド−５）。元素分析より求めたカテキン導入量（デンドリマーの表面の一級アミノ基に対する）は１５モル％であった。
【００４５】
実施例７
２０％ポリアリルアミン（分子量１００，０００）水溶液  ２．８５グラム
カテキン  ０．１４５グラム
蒸留水  ７．７ミリリットル
メタノール  ５ミリリットル
を用いて調整した溶液に６規定 塩酸を用いて、該溶液のｐＨを８に調整した。２０００ユニットのマッシュルームチロシナーゼを溶解させた水溶液１００マイクロニットルを加えて反応を開始させた。２４時間後、反応液を分子量１万のカットオフ膜を用いた限外濾過により未反応のカテキンや塩類を除去し、凍結乾燥によりポリマーを単離し、ポリアリルアミン−カテキンハイブリッドを０．９３グラム得た。元素分析より求めたカテキン導入量は３．５モル％であった。図１は、ポリアミン−カテキンハイブリッドのＵＶ特性を示し、図1中、ＰＡＡ−カテキンがハイブリッド−1のＵＶ特性を示す。得られたハイブリッドの理化学的性質を以下に示す。
【００４６】
1H NMR(D2O, ppm) 0.8-2.0 (br, CH2CH), 2.6-3.1 (br, CH2CH), 6.1-7.1 (br, Ar)
UV（λmax（蒸留水））280nm（[化2〜４]の構造由来の芳香族由来のπ−π*遷移）、435nm（[化3、4]の構造由来の芳香族由来のｎ−π*遷移）。
【００４７】
実施例８
ｐＨを7に調整した以外は実施例−７と同様の実験を行った。得られた試料は１．０グラムであった。元素分析により求めたカテキン導入量は１．５％であった。
UV（λmax（蒸留水））280nm、435nm。
【００４８】
実施例９
チロシナーゼの代わりに、微生物由来のラッカーゼ２ユニットを用いた以外は実施例−７と同様の実験を行った。得られた試料は０．７８グラムであった。元素分析により求めたカテキン導入量は４．１％であった。
UV（λmax（蒸留水））280nm、435nm。
【００４９】
実施例１０
次に、ポリアミンとして、ゼラチン(コラーゲン)を用いてハイブリッドを作製した。具体的には、
コラーゲン（ＰＡ−１００、ニッピ製）  １．０グラム
カテキン  ０．０５８グラム
ｐＨ７リン酸緩衝液  ３０ミリリットル
メタノール  ５ミリリットル
チロシナーゼ  ２０００ユニット
を用いて実施例−１と同様の操作を行った。反応後、カットオフ分子量５００の透析膜を用い、未反応のカテキンや塩類を除去し、凍結乾燥によりポリマーを単離し、ゼラチン−カテキンハイブリッドを０．９３グラム得た。元素分析より求めたカテキン導入量は１.７モル％であった。図１は、ポリアミン−カテキンハイブリッドのＵＶ特性を示し、図1中、ゼラチン−カテキンが本実施例で得られたハイブリッドのＵＶ特性を示す。
UV(λmax（蒸留水）)280nm、400nm。
【００５０】
実施例１１
次に、ポリフェノールとして変性ルチンを用いて、同様の試験を行なった。具体的には、
３０％分岐ポリエチレンイミン（分子量７０，０００）水溶液  １．７グラム変性ルチン（Ｇ−ルチン、東洋精糖製、[化１４]と[化１５]の混合物（９３：７モル％））  ０．４４グラム
【化１４】
0004035597.tif 000011
【化１５】
0004035597.tif 000012
チロシナーゼ  １０００ユニット
蒸留水  １０ミリリットル
を用いて実施例１と同様の操作を行った。４８時間反応を行った。得られた試料は０．８５グラムであった（ハイブリッド−６）。図２は、蒸留水中でのポリアミン−ルチンハイブリッドのＵＶ特性を示す図である。図2中、ＰＥＩ―ルチンが、ハイブリッドのＵＶ特性を示す。280nmの吸収は[化2〜４]の構造由来の芳香族由来のπ−π*遷移に帰属されるものであり、400nmの吸収は[化3、4]の構造由来の芳香族由来のｎ−π*遷移によるものである。特に後者はハイブリッド化物に特有のピークである。
【００５１】
元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は４．２モル％であった。得られたハイブリッドの測定結果を以下に示す。
1H NMR(D2O, ppm) 0.8-2.0 (br, CH2CH), 2.6-3.1 (br, CH2CH), 3.1-3.8 (糖部位のCH, CH2), 6.7-6.9 (br, Ar), 7.0-7.5 (br, Ar)
【００５２】
実施例１２
変性ルチンを０．８７グラム用いた以外は実施例１１と同様の実験を行った。得られた試料は０．５７グラムであった（ハイブリッド−７）。元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は４．５モル％であった。
【００５３】
実施例１３
変性ルチンを１．７４グラム用いた以外は実施例4と同様の実験を行った。得られた試料は０．６５グラムであった（ハイブリッド−８）。元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は８．２モル％であった。
【００５４】
実施例１４
ポリアリルアミン（分子量６０，０００）水溶液  ０．５グラム
変性ルチン  ０．２０グラム
蒸留水  １０ミリリットル
を用いて調整した溶液に１規定 水酸化ナトリウムを用いて、該溶液のｐＨを７に調整した。１０００ユニットのマッシュルームチロシナーゼを溶解させた水溶液１００マイクロニットルを加えて反応を開始させた。上記以外は実施例１と同様の操作を行った。得られた試料は０．５２グラムであった。元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は１．３モル％であった。図２は、ポリアミン−ルチンハイブリッドのＵＶ特性を示す図である。図２中のＰＡＡ−ルチンのＵＶ特性が、ハイブリッドの特性を示す。280、360nmの吸収は[化2〜４]の構造由来の芳香族由来のπ−π*遷移に帰属されるものである。当該ハイブリッドのNMRの測定結果を以下に示す。
【００５５】
1H NMR(D2O, ppm) 0.8-2.0 (br, CH2CH), 2.6-3.1 (br, CH2CH), 3.1-3.8 (糖部位のCH, CH2), 6.7-6.9 (br, Ar), 7.0-7.5 (br, Ar)
【００５６】
実施例１５
変性ルチンを０．４０グラム用いた以外は実施例７と同様の実験を行った。得られた試料は０．４３グラムであった。元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は２．０モル％であった。
【００５７】
実施例１６
変性ルチンを０．８０グラム用いた以外は実施例７と同様の実験を行った。得られた試料は０．５５グラムであった。元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は３．０モル％であった。
【００５８】
実施例１７
次に、ゼラチン(コラーゲン)−ルチンのハイブリッドの作製を試みた。具体的には、
コラーゲン（ＰＡ−１００、ニッピ製）  １．０グラム
変性ルチン  １．０グラム
チロシナーゼ  ３０００ユニット
リン酸緩衝溶液（ｐＨ  ７．４）  １０ミリリットル
を用いて実施例１と同様の操作を行った。反応終了後、反応溶液をメタノールに投じ、目的合成物を単離した。得られた試料は１．６５グラムであった（ハイブリッド−９）。元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は１０．１モル％であった。図２は、蒸留水中でのポリアミン−ルチンハイブリッドのＵＶ特性を示し、図2中、ゼラチン―ルチンが、ハイブリッド−９のＵＶ特性を示す。
【００５９】
実施例１８
キチン部分加水分解物（加水分解率８０ｍｏｌ％）  １．０グラム
変性ルチン  ０．６４グラム
チロシナーゼ  ３００００ユニット
蒸留水  １００ミリリットル
を用いて調整したけん濁溶液に６規定  塩酸を用いて、ｐＨ２の均一溶液を調整した。この該溶液に１Ｎ水酸化ナトリウムを加え、ｐＨ６の溶液を調整した。３０００ユニットのマッシュルームチロシナーゼを溶解させた水溶液１００マイクロニットルを加えて反応を開始させた。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて反応溶液のｐＨを７にし、目的化合物を沈殿させた。上記以外は実施例−１と同様の操作を行った。得られた試料は１．１３グラムであった。元素分析より求めたＧ−ルチン導入量は１０．５モル％であった。
【００６０】
スーパーオキシド消去能（ＳＯＤ様活性）の検討
キサンチン／キサンチンノキシダーゼ系で発生させたスーパーオキシドをハイブリッド抗酸化剤により消去させ、その効果を評価した。評価系中に酸化型のチトクロームＣを加えると、発生したスーパーオキシドにより酸化型のチトクロームＣが還元され、その際に５５０ｎｍにおける吸光度が上昇する。この原理を利用して、ＳＯＤ様活性を測定した。具体的には石英セルに３ミリリットルのリン酸緩衝溶液、キサンチン（１ミリグラム／ｍｌ）１００マイクロリットル、チトクロームＣ（３．９ミリグラム／ｍｌ）１００マイクロリットル、所定濃度のポリアミン−ポリフェノールハイブリッド１００マイクロリットルを加え、均一溶液を調製した。この溶液にキサンチンノキシダーゼ（０．６ミリグラム／ｍｌ）１００マイクロリットルを加えた後、５５０ｎｍの吸光度変化を経時的に測定した。抗酸化性（％）は以下の式より求めた。
【数１】
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【００６１】
（比較試験例−１）ポリフェノールを導入していないポリアミン類の抗酸化性を評価した。ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、コラーゲン及びキチン部分加水分解物の抗酸化性は全て５％以下であった。
【００６２】
（比較試験例−２）比較として、ハイブリッド化原料のカテキン、Ｇ−ルチンの抗酸化性を評価した。
【００６３】
図３にポリアミン−カテキンハイブリッド、図４にポリアミン−Ｇ−ルチンハイブリッドの濃度と抗酸化性の相関結果を示す。全てのポリアミン−ポリフェノールハイブリッドに優れたＳＯＤ様活性が見られ、原料のカテキン、ルチンと同等以上の抗酸化性を示した。
【００６４】
【発明の効果】
本発明では、ポリアミンとポリフェノールの反応を酸化酵素触媒存在下に行うことにより、ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドが製造された。このようにして得られたポリアミン−ポリフェノールハイブリッドはポリフェノールの高分子化による抗酸化機能が向上し、生分解性材料、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料、酸化防止剤、化粧品素材等の用途に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ポリアミン−カテキンハイブリッドのＵＶ特性を示す。
【図２】  図２は、蒸留水中でのポリアミン−ルチンハイブリッドのＵＶ特性を示す。
【図３】  図３は、ポリアミン−カテキンハイブリッドの濃度と抗酸化性の相関結果を示す。
【図４】  図４は、ポリアミン−Ｇ−ルチンハイブリッドの濃度と抗酸化性の相関結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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