(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）“11Y”と称される、NCIMB40820として寄託されたロドコッカス−ロドクラウス11Y菌株の細胞、及び
（ｂ）（ａ）の細胞の変異体であって、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）を分解してニトライトを遊離する細胞、
から選択される単離バクテリア細胞。
【請求項２】
“11Y”と称される、NCIMB40820として寄託されたロドコッカス−ロドクラウス11Y菌株の単離バクテリア細胞。
【請求項３】
（ａ）“11Y”と称される、NCIMB40820として寄託されたロドコッカス−ロドクラウス11Y菌株の細胞、及び
（ｂ）（ａ）の細胞の変異体であって、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）を分解してニトライトを遊離する細胞、
から選択された単離バクテリア細胞からの細胞抽出物であって、
ジチオスレイトール（DTT）の存在下でヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）を分解してニトライトを遊離する酵素活性を有する、前記細胞抽出物。
【請求項４】
前記バクテリア細胞が、11Y”と称される、NCIMB40820として寄託されたロドコッカス−ロドクラウス11Y菌株である、請求項３記載の細胞抽出物。
【請求項５】
請求項３又は請求項４記載の細胞抽出物を生成する方法であって、
前記バクテリア細胞を培養し、前記バクテリア細胞を破壊し、破壊された前記細胞からRDXを分解する酵素活性を有する細胞抽出物を抽出することを含む、前記方法。
【請求項６】
サンプル中のヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）を検出する方法であって、前記サンプルを、ジチオスレイトール（DTT）存在下で請求項３又は請求項４記載の細胞抽出物に接触させ、それによって生成されたニトライトを検出することを含む、前記方法。
【請求項７】
ニトライトが比色的に検出される請求項６記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）を検出する方法であって、前記サンプルを、ジチオスレイトール（DTT）存在下で請求項３又は請求項４記載の細胞抽出物に接触させ、それによって生成されたホルムアルデヒドを検出することを含む、前記方法。
【請求項９】
ホルムアルデヒドが比色的に検出される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞抽出物が請求項５記載の方法によって生成される、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中のヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）の検出用バイオセンサーであって、
（ａ）サンプルを、請求項３又は請求項４記載の細胞抽出物と接触させ、前記細胞抽出物を接触させた前記サンプルをヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）を分解してニトライト及び/又はホルムアルデヒドを生成するのに適切な条件下に保持するための手段、並びに
（ｂ）それによって生成した前記ニトライト及び/又はホルムアルデヒドを検出するための手段を含む、バイオセンサー。
【請求項１２】
サンプル中のヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）の検出用バイオセンサーであって、
（ａ）サンプルに請求項１又は請求項２記載のバクテリア細胞の培養物を接種し、前記接種サンプルをヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）を分解してニトライト及び/又はホルムアルデヒドを生成するのに適切な条件下に保持するための手段、並びに
（ｂ）それによって生成した前記ニトライト及び/又はホルムアルデヒドを検出するための手段を含む、バイオセンサー。
【請求項１３】
前記ニトライト及び/又はホルムアルデヒドを検出するための手段が比色指標を含む、請求項11又は請求項12記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
ヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）で汚染された環境をバイオレメディエーション処理する方法であって、前記環境に請求項３又は請求項４記載の細胞抽出物を添加する工程、及び、前記細胞抽出物を添加した前記環境を、前記環境中に存在するヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（RDX）の分解に適切な条件下に保持する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、爆発物(explosive)の検出及び生分解の分野に関するものであり、特に新規なバクテリア単離物(bacterial isolate)及びそれらから誘導された新規な酵素活性物質(activity)に関するものである。本発明は、更に、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（以降、通常用いられる略語RDXとして言及する）の好気性生分解、及びRDX分解酵素活性物質を利用するRDX検出についての方法及び装置に関する。
新規な酵素活性物質により、RDX、ヘテロ環式ニトラミンからニトライトが遊離されることが示された。
ニトラミンは、自然界に極微量でしか存在しないことが明らかであるが、化学工業により有意量(significant quantity)生成され、かつ、例えば爆発物及び噴霧剤として適用される、重要なクラスのエネルギー性材料を含み、RDXは、現在、米国において最も重要な軍事的爆発物である。RDXの製造、取り扱い及び処分の全てが、RDXでの環境汚染の原因になり得る。ニトラミンは比較的取り扱いにくいことからその環境破壊について関心が高まり、従って、他の不本意な汚染物質を生成することなく環境からそのような汚染物を取り除く手段が求められる。また、現在意図されている分析システムは、大抵、高速液体クロマトグラフィーなどの装置のかさ高い及び高性能の(sophisticated)部品に依存し、及び／又はその適用のために特に熟練した検査技師を必要とするので、RDXを検出するよりよい方法が急いで求められる。
本発明の目的は、RDXの生分解を触媒可能であり、かつ、RDX汚染物質の環境汚染に対するバイオレメディエーションシステムにおいて使用可能な酵素を提供することである。本発明の更なる目的は、RDX検出システムに有用な酵素を提供することである。
従って、本発明の第１の態様によれば、RDXからのニトライトの除去を触媒する酵素活性物質が提供される。この酵素活性物質は、類似のヘテロ環式ニトラミンオクタヒドロ-1,3,5,7-テトラニトロ-1,3,5,7-テトラゾシン(tetrazocine)(HMX)に対してより低い活性を示し、かつ、ニトレートエステルペンタエリスリトールテトラニトレート(PETN)に対してより低い活性を示す。その活性物質は、膜関連のものであることが分かり、かつ、５％トリトンで膜から可溶化できる。
酵素活性物質のためのNADPH、NADH、PES又はFADなどのコファクターは要求されず、酵素活性物質は、比較的高濃度の変性剤の存在に対して安定性であり、その活性物質は、ウレアの存在により高められる。酵素活性物質は、また、熱変性に対しても比較的安定性である。更に、酵素活性物質の大部分は、pHが氷酢酸により3.5に低減されたときに溶解性を保持する。
本発明での酵素活性物質は、自然から単離(isolate)した菌株から得られる。この菌株は、ロドコッカス−ロドクラウスの株（本件明細書において11Yと称する）である。この新規なバクテリア単離物は、本発明の更なる態様である。新規な単離物のサンプルは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約下にインダストリアル及びマリンバクテリアのUK国内的コレクション、23 St.Machar Drive,Aberdeen,AB2 1RY,Scotlandに1996年８月７日付けで寄託番号NCIMB40820として寄託されている。
寄託されたバクテリア11Yの更なる特徴を以下に記載する。
グラム染色                  ＋ｖｅ
胞子                        −ｖｅ
運動性                      −ｖｅ
成長  37℃                  ＋ｖｅ
41℃                        ＋ｖｅ
45℃                        −ｖｅ
カタラーゼ                  ＋ｖｅ
オキシダーゼ                −ｖｅ
グルコースOF中の発酵性      変化なし
細胞壁及び脂肪酸の分析により以下の情報が提供された。
ミコール酸が存在する。
細胞壁ジアミノ酸はメソDAPである。
脂肪酸プロフィールにより、存在する主要な酸は直鎖状の飽和又は不飽和酸であり、10-メチル分枝酸、即ちツベルクロステアリン酸は少量であることが示される。
酵素活性物質は、窒素源としてのRDX又はNH4Cl上においてR.ロドクラウスを培養することにより生じ得る。酵素活性物質を得るために、細胞を従来の方法のいずれかにおいて崩壊させてもよい。首尾よくは、無細胞抽出物を得る。抽出物を、その後、超遠心分離分画し、ペレットを取り出して活性膜画分を得ることができる。
あるいはまた、超遠心分離からの上清により、活性的な溶解性タンパクが得られる。溶解性タンパクは、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて部分精製することができ、0〜2M塩化ナトリウムから直線状塩グラジエントで溶出できる。そのタンパクは、単一ピークとして、約350mM塩化ナトリウムで溶出する。
細胞抽出物として得られた酵素活性物質は、RDX分解酵素活性のために、ジチオスレイトール(DTT)の存在を必要とする。
寄託された出発微生物自体の代わりに、例えばγ線照射若しくは化学的変異誘導物質の使用により誘導されたそれらの変異体、他の培地などにおいて誘導されたそれらの変異体、又はほかのバクテリア若しくは人工的に製造された変種(variant)とのそれらの接合固体を使用してもよい。酵素活性物質を提供するそのような微生物の能力は、当業者により容易に測定され得る。
RDXからのニトライトの除去を触媒する、新規な酵素活性物質の能力により、酵素活性物質がRDXの検出において使用可能となる。従って、本発明の更なる態様によれば、サンプル中のRDXの存在を検出する方法であって、該サンプルをRDX分解酵素活性物質に付すこと、及び該サンプルから遊離したニトライトを検出することを含む該方法が提供される。首尾よくは、そのような検出は、当該技術分野において周知の比色法の手段によるものであろう。
RDXからのニトライトの除去により、その後に自然発生的に分解して、ホルムアルデヒド及びアンモニアを含む、より低分子範囲のものを生じる不安定な中間体が生じ得る。従って、本発明の更なる態様においては、サンプル中のRDXの存在を検出する方法であって、該サンプルをRDX分解酵素活性物質に付すこと、及び生成されたホルムアルデヒドを検出することを含む該方法が提供される。そのような検出は、また、当該技術分野において公知の比色法の手段によるものであってもよい。
更なる態様において、本発明により、また、サンプル中のRDXの検出のためのバイオセンサーであって、該サンプルをRDX分解酵素活性物質と接触させるための手段、及びRDXがサンプル中に存在する場合のRDXの反応（酵素活性物質により触媒される）の発生を検出するための手段を含む該バイオセンサーが提供される。反応の発生を検出するための手段は、首尾よくは、比色トランスデューサーを含み得る。そのようなセンサーは、環境内のRDX汚染物質の汚染程度を分析するための、効率よく持ち運び可能な検出器のベースとして使用することができる。
本発明の更なる態様は、RDXで汚染された環境のバイオレメディエーション処理(bioremedial treatment)のための方法の提供であり、その方法は、汚染された環境に、酵素活性物質を含む多量の細胞抽出物(a quantity of cell extract)を添加する工程、及び該混合物を、材料中に存在するRDXが消耗されるような、酵素活性物質によるRDXの分解に適切な条件下で保持する工程を含む。
消耗される材料は、例えば、RDXを含む爆発物充填物(explosives charge)の破壊により生じるRDXを含む材料の廃棄物流、又はRDX汚染土壌若しくはその他の材料のサンプルであってもよい。前者のケースにおいては、バイオレメディエーション処理を首尾よく、反応容器内において行うことができ、後者のケースにおいては、酵素活性物質を該材料に直接導入することができる。その他の適切な、効果的処理法は、当該技術分野における当業者に明らかであろう。
本発明の更なる態様によれば、上述したようにRDXを分解する酵素活性物質の能力により、RDX汚染環境のバイオレメディエーション処理の代替法が提供される。この方法には、名称11Yのロドコッカス-ロドクラウスのバクテリア単離物のサンプルを環境に加える工程、及び該単離物による環境中に存在するRDXの消耗を可能にする工程が含まれる。環境は、例えば、RDXを含む材料の廃棄物流、又はRDX汚染土壌若しくは他の材料のサンプルであってもよい。前者のケースにおいては、バイオレメディエーション処理を首尾よく、反応容器内において行うことができ、後者のケースにおいては、単離物を、汚染土壌に加えることにより直接的に環境に導入することができる。その他の適切な、効果的処理法は、当該技術分野における当業者に明らかであろう。
本発明を、以下の図を用い、単に例として更に記載する。
図１は、ロドコッカス−ロドクラウス11Yからの細胞抽出物とRDXのインキュベーションの間に生じたニトライトを示す。
図２は、RDXとロドコッカス−ロドクラウス11Yの細胞の全細胞(whole cell)インキュベーションの間に生じたニトライト及びホルムアルデヒドを示す。
図３は、ジチオスレイトールの濃度に対する、ロドコッカス−ロドクラウス11Yからの部分精製抽出物のインキュベーションの間に生じたニトライトの変化を示す。
図４は、変性剤濃度変化に対する、部分精製抽出物とRDXのインキュベーションにより放出されたニトライトを示す。
図５は、熱処理した部分精製抽出物とRDXのインキュベーションのボイル時間に対する、放出ニトリルを示す。
図６は、部分精製抽出物とRDXのインキュベーションからのニトライトの放出、及びRDXの自然発生的加水分解のpHプロフィールを示す。
図７は、部分精製抽出物とRDXのインキュベーション工程の間に遊離したニトライト及びホルムアルデヒドを示す。
図８は、部分精製抽出物と、種々のニトライト含有爆発物のインキュベーションにより遊離したニトライトを示す。
実施例１
１．菌株ロドコッカス−ロドクラウス11Yからの酵素活性物質の製造
ロドコッカス−ロドクラウス11Yを、当該技術分野における技術標準(techniques standard)を用いて、窒素源としてのRDXが豊富な天然源から収集したサンプルから単離した。
ロドコッカス−ロドクラウス11Yを、0.4％グルコース(w/v)、痕跡元素(Pfenning及びLippertのArch.Microbiology,1966,55,726-739に記載されたようなもの)及び1mMのRDX又は6mMのNH4Clのいずれかを含む、pH7.0の、KH2PO41.325g/l及びNa2HPO42.17g/lからなる所定の培地１リットル中において成長させた。フラスコを、180r.p.m.で振とう培養器中において30℃でインキュベートした。
無細胞抽出物を、上述のように成長させた細胞から得た。細胞を、GS-3ロターが備え付けられたSorval RC-5C遠心機中において４℃で15分間10,000ｇで回転させることによりペレット化した。これらの細胞を、湿潤細胞重量グラムあたり、2mlの50mMトリシンバッファー(pH8.0)中において再懸濁した。細胞を、溶解した氷中における30秒の冷却で置きかえられた、15秒の６×12μｍバースト(burst)を用いて、MSE Soniprep(Fisons,Instruments,FSA Ltd.)中において超音波処理することにより破壊した。細胞の破片及び未分解細胞を、マイクロ遠心機(microcentrifuge)(Sigma)中において４℃で１分間、13,000ｇでの遠心分離により除去した。この上清を無細胞抽出物として使用した。膜分画を、４℃で１時間、109,000ｇでの超遠心分離（Beckman Optima TLX Ultracentrifuge TLA 45 rotor）により細胞抽出物から得、ペレットを洗浄し、50mMトリシンバッファー(pH8.0)中において再懸濁して、タンパク濃度を2mg/mlとした。
２．化学物質
RDXは純度が最も高いものとし、他の化学物質は分析用のものとし、別に記載のない限り、BDH Ltd.(Poole,UK.)、Sigma Chemical Company Ltd.(Poole,UK.)、又はAldrich(Gillingham,UK)から得たものである。
３．アッセイ
RDX分解
RDX分解を、最終容量１ml中にRDX(最終濃度50μM)、5mM DTT、及び40μlの無細胞抽出物又は膜画分を含む、50mMトリシン(pH8.0)中におけるHPLCによりRDXの消失をモニターすることにより測定した。
あるいはまた、RDX分解を、グリース試薬を用いてニトライトの放出をモニターすることにより追跡した（Rosenblatt,Burrows,Mitchell及びPartner.1991:環境的化学3(G)のハンドブックの"Organic Explosives and Related Compounds",O.Hutzinger，Springer-Verlag編集）。アッセイは上述のように行った。スルファニル酸（最終濃度0.6mM）を添加し、15分間放置し、その後N-1-ナフチルエチレンジアミン（最終濃度0.4mM）を添加し、かつ、５分後に、展開された色彩を分光光度的に540nmで測定した。
タンパク
タンパクは、商業的に入手可能な試薬及び牛血清アルブミン標準(Pierce Ltd.-Life Science Labs Ltd.,Lutonから得られた)を用いてブラッドフォードのクーマシー色素結合法(Anal.Biochem.(1976)72,248-254)により通常通りにアッセイした。0.2〜１mgタンパク/mlを含むサンプルのアリコート(20μｌ)を、試薬１ｍｌに添加し、その反応により、バッファー(20μl)と試薬(1ml)のブランク(brank)に対する595nmでの吸光度を読み取る前の、室温で５分間の展開が可能となった。標準値（10〜１mg/ml）検量線と比較することにより、サンプル中におけるタンパク濃度の計算が可能となった。
４．結果
RDX分解
天然の抽出物を、5mM DTT及び50μM RDXを含む50mMトリシンを用いて30℃で０〜60分間インキュベートした。RDXの濃度を、HPLCを用いて測定した。RDXの濃度が低減されることが観察された。
膜画分を、5mM DTT及び50μM RDXを含む50mMトリシンを用いて30℃で０〜60分間インキュベートした。RDXの濃度を、HPLCを用いて測定した。RDXの濃度が経時的に低減されることが観察された。
ニトライト生成
天然の抽出物を、5mM DTT及び50μM RDXを含む50mMトリシンを用いて30℃で０〜60分間インキュベートした。その後、ニトライトの濃度を、グリース試薬を用いて測定した。ニトライトの濃度は、図１に示したように増加することが観察された。
コファクターNADH、NADPH、PES又はFADのいずれの添加も、ニトライト生成の速度に影響を与えず、消耗可能なコファクター非依存性酵素活性が示される。
30℃で50μM RDXを用いてインキュベートされた膜画分により、また、ニトライトが生成された。この活性物質の可溶化は、5％トリトンで可能であった。
実施例２
R.ロドクラウス株11Yの細胞を、0.4％グルコース(w/v)、6mM窒素原子、及び痕跡元素を含み、pH7.0の、Na2HPO42.17g/l及びKH2PO41.325g/lからなる培地中において成長させた（前述のPfenning及びLippert)。培養物を30℃で、回転振とう機において170r.p.m.でインキュベートした。
11Yの全細胞を、GS3ローターを用いるSorvall RC5C遠心分離機において10分間7000gでの対数増殖後期の培養物(late exponential culture)の遠心分離により収集した。細胞を、洗浄し、pH8.0の50mMトリシン中において懸濁して、細胞の湿潤重量濃度を0.5g/mlとした。
11Yの全細胞インキュベーションにおけるRDXの分解を、最終容量１ml中にRDX（最終濃度300μM）及び全細胞10μlを含む、pH8.0の50mMトリシン中においてアッセイした。RDXの消失を、薄層クロマトグラフィー(TLC)を用いて、グリース試薬での検出によりモニターした（前述のRosenblattら)。あるいはまた、ホルムアルデヒドの生成を、標準ハンツシュ分光光度アッセイを用いてモニターし、サンプル500μlをホルムアルデヒド試薬と混合した（20mMアセチルアセトン、2mM酢酸アンモニウム、及び50mM酢酸）（Nash,1953,Biochemical Journal,Vol.55,p416)。その後、サンプルを、58℃で10分間インキュベートし、ダイオードアレー分光光度計を用いて418nmで黄色形成を測定した。既知濃度のホルムアルデヒド（１〜500μM）を用いて検量線を形成した。
全細胞サンプルを、30℃で、12時間インキュベートした。ニトライトの濃度が、図２に示されたように増加することが観察された。図２により、また、ホルムアルデヒドの濃度も増加することが示される。
全細胞を、11,000p.s.i.の圧力で、ミニセルを用いて、フレンチ加圧細胞プレスで破壊した。細胞破壊物及び未破壊細胞を、マイクロ遠心分離機における４℃で１分間13,000r.p.m.での遠心分離により除去し、上清を天然の細胞抽出物として使用した。
天然抽出物のRDX分解及びニトライト生成活性物質を、以下のようにアッセイした：アッセイは、最終容量１ml中にRDX(最終濃度50μM)、5mM DTT及び40μlの天然抽出物を含む、pH8.0の50mMトリシンバッファー中において行った。RDX分解を、グリース試薬を用いる検出でのTLCによりRDXの消失をモニターすることにより測定した。生成されたニトライトを測定するために、タンパクを、２μlの氷酢酸の添加により沈澱させ、その後、マイクロ遠心分離機における遠心分離（５分、13,000r.p.m.）により除去した。ニトライトについて標準グリース反応を行った。RDX分解及び同時に生じるニトライト生成を観察した。
細胞成分分画を、109,000gで１時間４℃での天然抽出物の超遠心分離（Beckman Optima TLX Ultracentrifuge TLA 45 rotor）により達成したが、上清は溶解性タンパクを示し、ペレットは膜画分を示す。ペレットを洗浄し、pH8.0の50mMトリシンバッファー中において再懸濁して、活性研究前にタンパク濃度を2mg/mlとした。
RDX分解能力を、両画分について（主には膜画分について）観察した。
溶解性タンパク中のRDX分解酵素活性物質を、０〜２M NaClの塩グラジエント及びpH8.5の50mMトリスバッファーを用いて、Ｑ-セファローズカラム(Q-sepharose column)により部分的に精製した。タンパクは、350mM塩化ナトリウム周辺の単一ピークとして溶離された。部分精製されたタンパクは、熱安定性であり、かつ、6Mウレアにおいて変性されたが、2Mウレアに希釈されるとリフォールディングされた。
実施例３
１．R.ロドクラウスの成長及び酵素の部分精製
16LのR.ロドクラウス11Yを、30℃で、唯一の窒素源としての1mM RDX及び痕跡元素2ml(前述のPfenning及びLippert)、0.4％グルコース(w/w)及び20mM KH2PO4中において培養した。細胞を、2Lフラスコ中において成長させ、かつ、それらが、4℃で15分間、10,000gでのGS3ローターを用いたSorvall RC5C遠心分離機中において成長停止相に達したときに遠心分離により収集した。細胞ペレット（細胞の湿潤重量57g）を、pH8.0の50mMトリス120ml中に再懸濁した。懸濁物は、フレンチ加圧細胞を用いて35,000p.s.i.（３パス）で均質化し、その後遠心分離（4℃で30分、30,000gでSS-34ローターを用いるSorvall RC5C遠心分離）して、細胞破壊物をペレット化した。上清を除去し、再び遠心分離(4℃で２時間、25,000gでTi-70ローターを用いるBeckman XL-90超遠心分離）して、細菌の膜をペレット化した。上清及びペレットの双方が、グリースアッセイにより測定されるように、ニトライトの遊離を伴うRDX分解をする能力を有することが分かった。高速遠心分離工程からの上清を更なる精製のために用いた。
上清サンプルのpHを、氷酢酸により3.5に下げ、サンプルを氷上で30分間インキュベートした。高速遠心分離の上清からのタンパク〜60％が凝集し、更なる遠心分離（4℃で30分、30,000gでSS-34ローターを用いるSorvall RC5C遠心分離）により除去されたことが分かった。その後、上清のpHを、1M水酸化ナトリウムを用いて8.0に移行させ、抽出物を、実施例１に記載したような、RDX関連ニトライト放出についてアッセイした。主要活性物質は、氷酢酸での処理後に溶解性を保持することが分かった（〜75％)。このサンプルを、その後の全アッセイにおいて使用した。
２．基質条件
部分精製タンパクを用いて、コファクターの条件について調べた。NADPH又はNADHなどのコファクターが必要でないことが分かった。ジオチオスレイトール(DTT)の濃度についてのRDX分解の依存性を以下のようにアッセイした;部分精製したタンパク26μgを、4Mウレア、0.3mM RDX、pH8.5の50mMトリシンの存在下において37℃で10分間インキュベートした。DTT濃度が変化し、最終容量は200μlで維持した。放出されたニトライト量を、実施例１に記載したような分光光度アッセイを用いて測定した。DTT濃度に対する放出ニトライト量を図３に示す。これにより、DTTの存在が好ましく、〜3mMのDTTが最大活性を達成するために必要とされることが示される。DTTを用いることにより、細胞が破壊された際の低減環境が維持される。
３．溶解性及び安定性
アミコン(Amicon)限外ろ過ユニット（膜の3kDaカット、70p.s.i.、４℃）を用いる部分精製酵素溶液の濃縮により、タンパク凝集及び活性の低減が導かれる。凝集したタンパクは、8Mウレア、5mM DTT及びpH8.0の50mMトリス中に再溶解(resolubilise)可能であり、活性が回復されることが分かった。
強変性剤の存在下での酵素活性物質の安定性を、ウレア又は塩酸グアニジンを有するタンパクサンプルの存在下でのRDXからのニトライト放出についてアッセイすることにより測定した。アッセイ条件は、タンパク26μgについて、pH8.5の50mMトリシン、0.3mM RDX、5mM DTT、37℃、10分間とし、ニトライト放出を、実施例１に記載したような分光光度アッセイにより測定した。変性剤の濃度に対するRDX活性物質の依存性を図４に示す。
酵素が、高濃度の変性剤の存在に対して、異常に高い安定性を示すことが分かった。タンパク及び塩酸グアニジン内の水素結合及び疎水性相互作用を崩壊させることにより主に作用し、主にイオン性相互作用を崩壊させ、かつ疎水性相互作用をより低い程度のものとする、ウレアについて観察される活性における差から、イオン相互作用が酵素活性物質の安定性について非常に重要な役割を果たし得ることが示される。
RDX分解活性はウレアの存在により強化されるので、その後の全アッセイを、4Mウレアの存在下において行った。
酵素活性物質の熱安定性を測定するために、部分精製されたタンパクサンプルを、100℃に加熱し、サンプルを種々のインターバルで取り出し、20μlの沸騰サンプル、pH8.5の50mMトリシン、4Mウレア、5mM DTT及び0.3mM RDXを用いて37℃で10分間アッセイした。ニトライトの放出を、分光光度的に測定し、結果を図５に示す。
酵素活性物質は、熱に対して比較的安定のものであり、100℃、10分後にほんの〜20％の活性損失であった。
４．pHプロフィール
部分精製した抽出物のpHプロフィールを調べた。アッセイ条件は、50mMの適切なバッファー、4Mウレア、0.3mM RDX及び5mM DTTとした。サンプルを、37℃で10分間、26μgの部分精製タンパクを用いてインキュベートした。また、3mMのRDXのアルカリ加水分解を、同一条件下で測定し、その結果を図６に示す。酵素活性物質により、pH範囲中、自然発生的分解と比べて、RDXからのニトライト放出が有意に高められることが分かった。
５．ニトライト及びホルムアルデヒド生成
RDXの酵素的分解からのニトライト及びホルムアルデヒド生成を、pH8.5の50mMトリシン、4Mウレア、0.15mM RDX及び5mM DTT中において、37℃で、26μgの部分生成された抽出物を用いてアッセイし、遊離されたニトライト及び生成されたホルムアルデヒドの量を、実施例１に記載したような標準分光光度アッセイを用いて経時的に測定した。
結果を図７に示す。放出されたニトライトとホルムアルデヒドの量は、同程度であり、RDXの酵素的分解のメカニズムは、RDXのアルカリ加水分解について意図されたもの(Croce及びOkamoto,1978,Journal of Organic Chemistry,Vol.44,pp2100-2103;Heilmannら,1996,Environmental Science Technology,Vol.30,No.5,pp1485-1492）と同様であることが示され、ここで、RDXからのニトライト基の除去により、自然発生的に分解して、ホルムアルデヒドを含む低分子量範囲のものを生じる非安定性の中間体が形成される。
６．基質特異性
基質特異性を、酵素活性物質により、HMX又はPETN（双方ともにニトライト含有爆発物）が分解されたかについて試験することにより調べた。アッセイを、50mMトリシン、4Mウレア、0.3mMの適切な爆発物及び5mM DTT中において、37℃で、20分間、部分精製された抽出物26μgを用いて行い、結果をRDXと比較した。結果を図８に示す。酵素的活性は、試験した全爆発物に対して活性的であったが、RDXに対して明らかに好ましいものである（より活性的である）ことが分かる。
【図１】
0004083226.tif 000002
【図２】
0004083226.tif 000003
【図３】
0004083226.tif 000004
【図４】
0004083226.tif 000005
【図５】
0004083226.tif 000006
【図６】
0004083226.tif 000007
【図７】
0004083226.tif 000008
【図８】
0004083226.tif 000009