(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドであって、植物中で過剰発現した場合に植物の色が変化するポリヌクレオチド、又はその相補鎖。
【請求項２】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドであって、植物中で過剰発現した場合に植物の色が変化するポリヌクレオチド、又はその相補鎖。
【請求項３】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１又は２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：１で示される核酸配列、又はその相補鎖を含んでなる、請求項１又は２のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１又は２の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる植物形質転換ベクター。
【請求項６】
請求項５のベクターを含んでなるトランスジェニック植物細胞。
【請求項７】
野生型から修飾された葉の色、花の色、又は果実の色を有する植物を産する方法であって、植物の前駆細胞へ請求項５に記載の植物形質転換ベクターを導入し、トランスジェニック植物を産するように該形質転換前駆細胞を生育させることを含んでなり、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドが発現し、前記トランスジェニック植物が野生型から修飾された葉の色、花の色、又は果実の色を有する前記方法。
【請求項８】
請求項７の方法によって得られる植物。
【請求項９】
請求項８に記載の植物から得られる植物部分。
【請求項１０】
最初のポリヌクレオチドを含んでなる形質転換植物を選択する方法であって、
(a)植物の前駆細胞へ、最初のポリヌクレオチド及び請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含んでなる植物形質転換ベクターを導入する工程：及び
(b)野生型から修飾された葉の色、花の色、又は果実の色を有する植物を産するように前駆細胞を生育する工程：
を含み、野生型から修飾された葉の色、花の色、又は果実の色を有する植物が、最初のポリヌクレオチドも含む形質転換植物として選択される、前記方法。
【請求項１１】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドであって、植物中に蓄積、増加した場合に植物の色が変化するポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
（出願に関連する参考文献）
【０００１】
本出願は、２０００年１０月３０日に出願された米国仮特許出願番号60/244,685に対して優先権を主張し、その内容は、その全体がここで取り入れられている。
（発明の分野）
【０００２】
本発明は、アントシアニン１（ANT1)と命名される植物表現型、それと関連するDNA及びポリペプチド配列に関する。
（本発明の背景）
【０００３】
機能変異体の損失をスクリーニングするために用いられる、化学突然変異誘発、照射及びT-DNA挿入を含む遺伝子発見の伝統的方法には限界がある。これらのような突然変異誘発法は、ゲノムで余分な遺伝子を殆ど同定せず、遺伝子キャラクタリゼーションは時間を浪費し骨の折れるものである。
【０００４】
活性化タギングとは、特定の表現型がスクリーニングされて選択された後に、遺伝子がゲノム上で広範囲にランダムにそして強くアップレギュレーションされる方法である。活性化タギングによる変異体の単離が報告されてきた（Hayashiら, 1992）。活性化T-DNAタギングコンストラクトは、植物成長ホルモンが存在しなくても細胞が成長するように、タバコ細胞培養の遺伝子を修飾するために利用さた（Waldenら, 1994）。遺伝子は、T-DNAタグの側方の植物ゲノム配列から単離され、植物成長ホルモン応答を担うと推定されてきた（例えば、Miklashevichsら. 1997, Harlingら, 1997；Waldenら, 1994；及び関連する研究を論じているSchellら, 1998を参照せよ）。
【０００５】
活性化タグを利用してシロイナズナで最初に特徴付けられた遺伝子は、サイトカイニンシグナル伝達経路に関わるヒストンキナーゼをコードする遺伝子である。その遺伝子配列は、プラスミドレスキューによって植物ゲノムDNAから単離され、植物におけるサイトカイニン応答における遺伝子CKI1の役割は、シロイナズへの再導入によって確かめられた（Kakimoto, 1996）。これは、Ds転移因子の他に類似の手法を用いて、TINY、LHY及びSHI等の幾つかのドミナント変異体の報告に従った（Wilsonら, 1996, Schafferら,1998, Fridborg ら, 1999）。より最近の報告では、活性化T-DNAタギング及び早期開花表現型に関する植物のスクリーニングは、FT遺伝子の単離につながった（Kardailskyら, 1999）。
【０００６】
遺伝子発見のためのハイスループット技術のような、活性化タギングの潜在的用途は、耐病性だけでなく、光レセプター、ブラシノステロイド、ジベレリン及び開花シグナル経路に関わる幾つかのドミナント変異体のスクリーニングに基づいて示されてきた（例えば、Weigelら, 2000, Christensenら,1998；Kardailskyら, 1999）。
【０００７】
シロイナズは、長角果状型の果実を有するアブラナ種等の植物の植物改良のモデルとして広く利用されてきた。しかしながら、シロイナズは、多肉果を有する植物のモデルとしては役目を果たさない。
【０００８】
果実を産する植物での修飾された遺伝子の発現に基づく遺伝子を同定し特徴付ける方法は、PCT公開公報国際公開0053794に記載されている。果実産生植物の矮化種、特にトマトの矮化種は、１つ又は複数の植物遺伝子の過剰発現、及びその過剰発現を特定の表現型と関連させることにとって有用である。
【０００９】
矮化トマトは、植物を小型にする、それらの短い節間によって特徴付けられる。小型トマト栽培品種（Lycopersicon esculentum cultivar）である、マイクロトム（Micro-Tom)は、高密度（1357植物/ｍ−２まで）で生育する比例的な矮化植物であり、短いライフサイクル（播種から果実の成熟まで７０-８０日）を有し、そして果実の大きさ、及び葉の大きさは、遺伝的に低くされてきた（Meissnerら, 1997；Scott及びHarbaugh, 1989）。さらには、マイクロトムは、多くの病害に対して耐性を示し、子葉のアグロバクテリウム媒介形質転換を介して８０％までの頻度で形質転換できる（Meissnerら, 1997）。マイクロトムに類似のフロリダペティテ（Florida Petite）（Fla. Agr. Expt. Sta. Circ. S-285）、タイニーティム（Tiny Tim）及びスモールフライ（Small Fry）は、短いライフサイクル、そして果実の大きさ、葉の大きさが遺伝的に小さくされてきたトマトの矮化種である。
【００１０】
特定の特性を有する改良植物を開発するために、特定の植物特性又は特徴に関連する遺伝子を同定する手法を開発するための努力が産業界及び学術界でおこなわれている。本発明は、天然植物遺伝子の修飾発現に関連する植物表現型を提供する。
【００１１】
マイクロトムでの活性化タギングスクリーニングでは、我々は、色素生産に関わる遺伝子を同定した。アントシアニンは、植物の多くの赤及び青色を担う色素である。アントシアニン生合成の遺伝的基礎は、トウモロコシ、ペチュニア、及びキンギョソウでよく特徴付けられてきている（Doonerら, 1991；Jayaram及びPeterson, 1990；Quattrocchio Fら, 1999）。
（本発明の概要）
【００１２】
本発明は、修飾された葉、花、又は果実色として示された植物のアントシアニン１（「ANT1」）表現型と関連する核酸及びアミノ酸配列を提供する。
【００１３】
一側面では、本発明は、配列番号：２として示されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又はそれより大きい配列同一性を有するANT1ポリペプチドをコードする配列をコードする又はそれと相補的な核酸配列を含んでなる１つ又は複数の単離されたANT1核酸配列を提供する。
【００１４】
その他の側面では、ポリヌクレオチドは、高度、中度、又は低度のストリンジェントな条件下で、配列番号：１、又はその相補鎖として示される核酸配列、又はその断片とハイブリダイズする核酸配列を含む。
【００１５】
関連する側面では、植物における１つ又は複数のそのようなANT1ポリヌクレオチドの発現は、ANT1表現型と関連している。
【００１６】
本発明は、さらに、植物形質転換ベクター、植物細胞、ANT1核酸配列を含む植物の部分及び植物を提供する。
【００１７】
植物におけるそのようなANT1核酸配列の発現は、修飾された葉、花又は果実色素表現型として示されるANT1表現型と関連している。
【００１８】
ANT1核酸配列の発現は、装飾用植物、果実及び野菜産生植物、穀物産生植物、油産生植物及び木の実産生植物、並びに他の作物植物で修飾することができ、結果としてANT1表現型となる。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、ANT1核酸配列を植物前駆細胞へ導入し、トランスジェニック植物を産するようにその細胞を生育することによる、植物におけるANT1表現型の修飾の方法を提供する。
（本発明の詳細な説明）
定義
【００２０】
他に示されないのならば、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の分野における熟練者に対するのと同じように同じ意味を有する。
熟練者は、当該分野の定義及び用語に関しては、特に、Sambrookら, 1989, 及びAusubel FMら, 1993に従う。この発明が、特定の方法論、プロトコール、及び記載の試薬に限定されるものではく、これらは変わり得ることが理解されるべきである。
【００２１】
ここで引用され、実施例の後に下に即座に列挙されているすべての刊行物は、本発明との関連で使用され得る組成物及び方法論を記載し開示する目的で、参考文献によって明確に取り入れられている。引用ウェブサイトのすべての特許、特許公報、及び配列と他の情報も、参考文献によって取り入れられている。
【００２２】
ここで使用されるように、「ベクター」という用語は、 異なる宿主細胞の間を転移するように設計した核酸コンストラクトを指す。「発現ベクター」とは、外来細胞に異種DNA断片を取り入れ、それを発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核及び真核発現ベクターが商業的に入手可能である。適切な発現ベクターの選択は、当該分野に熟練している者が有する知識の範囲内にある。
【００２３】
「非相同的」核酸コンストラクト又は配列は、植物細胞にとって自然ではないが、その中で発現する配列の一分部を有する。コントロール配列に関する非相同性とは、コントロール配列が現在は発現を制御しているのと同じ遺伝子を制御するように自然界で機能しないコントロール配列（すなわち、プロモーター又はエンハンサー）を指す。一般的に、非相同的核酸配列は、それらが存在する細胞又はゲノムの一部分に対して内因的ではなく、感染、形質移入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等によって細胞へ加えられてきている。「非相同的」核酸コンストラクトは、天然の植物に見出されるコントロール配列/DNAコード化配列組み合わせと同じ又は異なるコントロール配列/DNAコード化配列組み合わせを含み得る。
【００２４】
ここで使用される「遺伝子」という用語は、個々のコード化セグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）だけでなく、コード化領域の前後、例えば、５' 非翻訳（５' UTR)又は「リーダー」配列及び３' UTR又は「トレイラー」配列を含むことができるし、含まないこともある、ポリペプチド鎖を産することに関わるDNAのセグメントを意味する。
【００２５】
ここで使用されているように、対象の配列、又は対象の配列の特定部分に関する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、すべての検索パラメーターをデフォルト値に設定し、プログラムWU-BLAST-2.0a19（Altschulら, J. Mol. Biol.(1997)215: 403-410；http://blast.wustl.edu/blast/README.html ウェブサイト）によって作製した、対象配列（又はその特定部分）のヌクレオチド又はアミノ酸と同一である候補誘導配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージとして定義される。HSP S及びHSP S2パラメーターは動的値であり、特定配列の組成物、及び興味ある配列が検索される特定のデータベースの組成物に依存し、プログラムそのものによって確立される。％同一性値は、一致する同一のヌクレオチド又はアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告されている配列長によって割ることで決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性を決定するのと同じような計算をするが、計算で同一のアミノ酸の他に保存的アミノ酸置換を含めることによって決定される。
【００２６】
「％ホモロジー」という用語は、ここでは、「％同一性」という用語と交換可能に用いられる。
【００２７】
核酸配列は、中度から高度のストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、２つの配列が互いに特異的にハイブリダイズするならば、引例の核酸配列と「選択的にハイブリダイズが可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融点温度（Tm)に基づいている。例えば、「最高ストリンジェント」は、通常は、約Tm-５℃（プローブのTmより５℃低い）で起こる；「高度ストリンジェント」は、Tmより約５-１０℃低い；「中度ストリンジェント」は、プローブのTmより約１０-２０℃低い；そして「低度ストリンジェント」は、Tmより約２０-２５℃低い。機能的に、最高度ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができる；一方で、高度ストリンジェント条件は、プローブと約８０％又はそれより高い配列同一性を有する配列を同定するために用いられる。
【００２８】
中度及び高度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当該分野で良く知られている（例えば、Sambrook, ら, 1989, 第９及び１１章，及びAusubel, F. M., ら, 1993, ここで、参考文献として明確に取り入れられている）。高度ストリンジェント条件の例は、５０％ホルムアミド、５X SSC、５Xデンハート溶液、０．５％SDS及び１００μｇ/ｍｌ変性担体DNA中において約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて室温で２X SSC及び０．５％ SDSによる２回、及び４２℃で０．１X SSC及び０．５％ SDSによるさらに２回の洗浄を含む。
【００２９】
ここで使用される「組み換え体」は、非相同的核酸配列の導入によって修飾されている細胞又はベクター、又はさらに修飾された細胞から誘導される細胞の言及を含む。従って、例えば、組み換え体細胞は、意図的なヒトの介入の結果として発現される又は発現されない下で、細胞の天然（非組み換え体）型の同一型では見出されない遺伝子を発現するか、又は、そうでなければ異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００３０】
ここで使用される、植物細胞に関する「形質転換された」、「安定に形質転換された」又は「トランスジェニック」という用語は、植物細胞が、２又はより多い世代を通して維持される、そのゲノムへ組み込まれた非天然（非相同的）核酸配列を有することを意味する。
【００３１】
ここで使用される「発現」という用語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産せられるプロセスを指す。このプロセスは、転写及び翻訳の双方を含む。
【００３２】
核酸配列を細胞へ挿入するという文脈での「導入される」という用語は、「形質移入」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアDNA）へ取り込まれ、自律複製レプリコンへ転換、又は一過性発現（例えば、形質移入mRNA）し得る真核又は原核細胞への核酸配列の取り込みの言及を含む。
【００３３】
ここで使用される「植物細胞」は、植物種子、花粉、プロガグレス（progagules）及び胚だけでなく、未分化組織（例えば、カルス）からの細胞を含む、植物から誘導される任意の細胞を指す。
【００３４】
ここで使用される、与えられた植物の特性又は表現型に関連する「天然」及び「野生型」という用語は、その特性又は表現型が自然界の同じような種々の植物に見出される形態を指す。
【００３５】
ここで使用される、植物特性に関する「修飾される」という用語は、自然界に見出されるような、非トランスジェニック植物に関連するトランスジェニック植物の表現型の変化を指す。
【００３６】
ここで使用される「Ｔ１」という用語は、Ｔ０植物の種子からの植物の発生を指す。Ｔ１世代は、選択剤、例えば抗生物質又は除草剤の応用によって選択することができる形質転換植物の最初のセットであり、トランスジェニック植物が対応する耐性遺伝子を含んでいる。
【００３７】
ここで使用される「Ｔ２」という用語は、以前には、トランスジェニックとして選択された、Ｔ１植物の花の自己受精による植物の発生を指す。
【００３８】
ここで使用される「植物部分」という用語は、限定されることなく、種子、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含む、任意の植物器官又は組織を含む。植物細胞は、それから調製される任意の植物器官又は組織及び培養から得ることができる。本発明の方法で使用が可能な植物部門は、一般的に、単子葉及び双子葉植物の双方を含む、形質転換技術を施せる高等植物部門のように幅広い。
【００３９】
ここで使用される「トランスジェニック植物」は、そのゲノム内に非相同的ポリヌクレオチドを含む植物についての言及を含む。一般的に、非相同的ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが次の世代に受け継がれるように、ゲノムへ安定的に組み込まれる。この非相同的ポリヌクレオチドは、ゲノムのみへ、又は組み換え体発現カセットの一部として組み込まれる。「トランスジェニック」は、ここでは、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分又は植物、最初のトランスジェニックから雄雌交配又は無性繁殖によって発生させたのと同様に、最初にそのように改変されたトランスジェニックを含む非相同的核酸の存在によって改変された遺伝子型を含むように使用される。
【００４０】
従って、その細胞内に非相同的ポリヌクレオチドを有する植物は、ここでは、「トランスジェニック植物」と呼ばれている。その非相同的ポリヌクレオチドは、ゲノムへ安定に取り込まれることができるか、又は染色体外である可能性がある。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが次の世代へ受け継がれるように、安定的にゲノムへ組み込まれる。このポリヌクレオチドは、ゲノムのみ又は組み換え体発現カセットの一部として、ゲノムへ組み込まれる。「トランスジェニック」は、ここでは、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分又は植物、最初のトランスジェニックから雄雌交配又は無性繁殖によって発生させたのと同様に、最初にそのように改変されたトランスジェニックを含む非相同的核酸の存在によって改変された遺伝子型を含むように使用される。
【００４１】
発現コンストラクトを含有する組み換え体DNAコンストラクトが導入された植物細胞、組織、器官、又は植物は、「形質転換された」、「形質移入された」、又は「トランスジェニック」と考えられる。トランスジェニック又は形質転換細胞又は植物は、また、細胞又は植物の子孫、及び組み換え体核酸配列の存在から生じる改変された表現型の交配及び提示することの親として、そのようなトランスジェニック植物を用いる繁殖プログラムから産せられる子孫を含む。従って、本発明の植物は、配列が直接に形質転換手法を介して導入されたのか、又は直接の形質転換によって最初にコンストラクトを受け取った前駆細胞からの世代転移によって導入されたのかどうかに関わらず、導入核酸配列を有するコンストラクトを含有する細胞を有する任意の植物を含む。
【００４２】
ここで使用されている「アントシアニン１」及び「ANT1」という用語は、天然アントシアニン１（ANT1）核酸及びアミノ酸配列、相同体、その変異体及び断片を含む。
【００４３】
「単離された」ANT1核酸分子は、通常は、ANT1核酸の天然ソースに付随している、少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定し分離される。単離ANT1核酸分子は、自然界で見出された形態又は設定より他のものである。しかしながら、単離ANT1核酸分子は、例えば、核酸分子がその自然界の細胞とは異なる染色体位置にあり、通常はANT1を発現する細胞に含まれるANT1核酸分子を含む。
【００４４】
ここで使用されているように、ポリヌクレオチド配列に関連する「変異体」という用語は、対応する野生型ポリヌクレオチド配列又は配列又は発現の観点の遺伝子とは異なり、違いが修飾植物表現型又は特性に貢献する。植物又は植物系統に関連して、「変異体」という用語は、修飾表現型又は特性が、野生型ポリヌクレオチド配列又は遺伝子の修飾発現と関連している、修飾植物表現型又は特性を有する植物又は植物系統を指す。
【００４５】
一般的に、「変異体」ポリヌクレオチド配列は、参考文献のペプチド配列の１つ又は複数のアミノ酸によって改変される「変異体」アミノ酸配列をコードする。この変異体ポリヌクレオチド配列は、「保存的」又は「非保存的」置換を有する変異体アミノ酸配列をコードし得る。変異体ポリヌクレオチドは、アミノ酸挿入又は欠損、又は双方を有する変異体アミノ酸配列をもコードし得る。
【００４６】
ここで使用されているように、「表現型」という用語は、「特性」という用語と交換可能に使用され得る。この用語は、容易に観察できるか、又は測定可能な植物の特徴を指し、植物の遺伝的性質とそれが生育する環境との相互作用から生じる。そのような表現型は、植物の形態的変化となり得る又はなり得ないが、当該分野の熟練者に既知の解析技術を使用して測定可能な、増幅した遺伝子発現から生じる、植物性質の化学的変化を含む。
【００４７】
ここで使用されているように、ここで記載されている方法によって産せられる植物に関する「興味ある表現型」という用語は、形質転換されていなくて（及び／又は形質転換されている植物の子孫ではない）、植物の改良を示す植物によって示されない、Ｔ１及び／又は後の世代の植物によって示される容易に観察可能又は測定可能な表現型を指す。「改良」とは、植物に独特の性質を提供することによって、植物種又は変種の利用を促進することのできる特徴である。独特の性質によって、与えられた特徴又は特性における定量的変化（増加又は減少）又は定性的変化である、植物種の現存の特徴に対する新規な特徴又は変化を意味される。
同定されたANT1表現型及び遺伝子
【００４８】
本発明の遺伝子及び表現型は、活性化タギングを用いるスクリーニングで同定された。活性化タギングとは、核酸コントロール配列、例えばエンハンサーを含む非相同的核酸コンストラクトが植物ゲノムに挿入されることによるプロセスである。このエンハンサー配列は、１つ又は複数の天然の植物遺伝子の転写を高めるように作用する（例えば、Walden R.ら, 1994；Weigel Dら, 2000を参照せよ）。
【００４９】
手短に言うと、多くのトマト（Lycopersicum esculentum）cv. マイクロトム（Micro-Tom)植物は、T-DNA（すなわち、アグロバクテリウム感染の間に植物細胞宿主へ転移させるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）のTiプラスミドから誘導した配列）、エンハンサーエレメント及び選択可能なマーカー遺伝子を含む、活性化タギングベクターpSKI015（Weigelら, 2000）の修飾型で形質転換した。コンストラクトであるpAG3202は、実施例にさらに記載されている。形質転換した植物のゲノムへのpAG3202のランダム挿入の後、エンハンサーエレメントは、通常は、挿入の５-１０キロベース（kb）内のT-DNA挿入の近傍のアップレギュレーション遺伝子となる可能性がある。Ｔ１世代では、植物は、選択可能なマーカーを発現し、それによって活性化タギングベクターの挿入を有した植物を特異的に回収するために、選択剤に曝される。形質転換植物は、一般的にＴ１、Ｔ２及び／又はＴ３世代で同定される、興味ある表現型について観察される。興味ある表現型は、形態学、生化学的スクリーニング、除草剤耐性試験、除草剤標的同定、糸状菌又は細菌耐性試験、昆虫又は線虫耐性試験、乾燥、塩又は抗生物質耐性等のストレス耐性に関するスクリーニング、及び油、澱粉、色素又はビタミン組成物等の産出特性に基づいて同定され得る。T-DNA挿入を囲むゲノム配列は、興味ある表現型を担う遺伝子を同定するために分析される。そのような表現型を起こすことを担う遺伝子は、農業、食品、装飾植物、及び／又は医薬産業に関する操作のための魅力ある標的として同定される。
【００５０】
修飾表現型がタグ遺伝子の増幅した発現から生じる場合、殆どのケースでは、その表現型はドミナントである。ある場合では、与えられた天然植物遺伝子又はその断片の増幅した発現は、その相同体又はその他の天然植物遺伝子の低下した発現又は不活性化となり得て、興味ある表現型を引き起こす。T-DNA挿入は、また、表現型が一般的には劣性である、天然植物遺伝子の破壊（「機能の損失」）を引き起こす結果となる。
【００５１】
本発明は、紫色及び紫根を有するカルスの段階で観察されたACTTAGマイクロトム系統で同定される修飾葉、花又は果実色表現型を提供する。紫植物は、培養の紫色のカーロジェニックカルス（caulogenic callus）から誘導された。クローン植物系統（すなわち、同じ紫色のカーロジェニックカルス（caulogenic callus）から、又は組織培養又はグリーンハウスでの裁断によるかいずれかによる最初の紫植物から増殖させたものに起源のあるさらなる苗条）を、葉、萼片及び花に紫天然色を有するとして同定した。この植物は、また、野生型マイクロトム植物と比べて深紅色と記載された修飾果実色を示すことが観察された。その表現型及び関連遺伝子は、アントシアニン１（「ANT1」）と命名された。
【００５２】
本発明は、ANT1表現型と関連するT-DNA挿入の周囲のゲノムDNA配列の分析によって同定された、新しく同定及び単離された核酸配列を提供する。特に、出願人は、ANT1表現型を有する植物で特異的に過剰発現し、配列番号：１で提供されているANT1遺伝子のオープンリーディングフレームを同定し、特徴付けた。ANT1の単離及びキャラクタリゼーションの詳細な説明は、実施例に示されている。
【００５３】
本発明の組成物
ANT1核酸
ANT1遺伝子は、所望する表現型を有するトランスジェニック植物の開発に用いることができる。これは、天然ANT1配列、その変異体ANT1配列、又は相同体、又は断片を使用して完遂することができる。
【００５４】
本発明のANT1核酸配列は、ゲノムDNA、cDNA又はmRNAから誘導したDNA又はRNA配列であり得る。この核酸配列は、例えば、適切なソースからゲノムDNAを単離し、PCRを使用して興味ある配列を増幅してクローニングすることでクローンすることができる。あるいは、核酸配列は、特に植物が好む配列を提供することが望まれる場合に、完全に又は部分的のいずれかで合成され得る。従って、所望する構造遺伝子のすべて又は一部分（ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子の一部分）は、選択された宿主に好ましいコドンを使用して合成することができる。
【００５５】
本発明は、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を有するANT1ポリペプチド、及び配列番号：１に示されているANT1核酸配列とその全配列が同一であるポリヌクレオチド配列をコードする配列をコードするか、又は相補的な核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。本発明は、また、成熟ANT1ポリペプチド、その変異体又は断片に関するコード化配列、並びに、リーダー又は分泌配列、プレ、プロ、又はプレプロタンパク質配列をコードするような、他のコード化配列とのリーディングフレームにある成熟ポリペプチド又はその断片に関するコード化配列を提供する。
【００５６】
ANT1ポリヌクレオチドは、例えば、限定されるものではないが、非コード化５' 及び３' 配列、例えば、転写、非翻訳配列、末端シグナル、リボゾーム結合部位、mRNAを安定化させる配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、及び付加的なアミノ酸をコードする付加的なコード化配列を含む、非コード化配列をも含む。例えば、マーカー配列は、融合ポリペプチドの精製を促進するために含めることができる。本発明のポリヌクレオチドは、また、構造遺伝子及び遺伝子発現をコントロールする自然に関連している配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００５７】
本発明の単離されたポリペプチドが、非ANT1核酸配列が隣接するANT1核酸配列を含む場合、組み合わさったポリヌクレオチドの全長は、典型的には２５kbよりも小さく、及び通常は２０kbより低く、又は１５kb、及び幾つかの場合には１０kb又は５kbより低い。
【００５８】
ここに記載のANT1核酸及び一致するポリヌクレオチド配列の他に、ANT1変異体が調製できることが考えられる。ANT1変異体は、適切なヌクレオチド変化をANT1核酸配列へ導入することによって；所望するANT1ポリペプチドの合成によって、又は植物におけるANT1遺伝子の発現レベルを改変することによって調製することができる。当該分野に熟練している者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるか、又は膜固着特性を改変すること等、ANT1ポリペプチドの翻訳後プロセッシングを改変し得ることを評価する。
【００５９】
一側面では、好ましいANT1コード化配列は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はより高い配列同一性を有するANT1ポリペプチドをコードする配列をコードするか、又はそれと相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
その他の側面では、好ましい変異体は、配列番号：１に示すANT1核酸配列とその全長が少なくとも５０％から６０％同一であるANT1ポリヌクレオチド配列、及びそのようなANT1配列と相補的な核酸配列を含む。より好ましいのは、配列番号：１に示すANT1配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％又はそれより高い配列同一性を有する領域を含むANT1ポリヌクレオチド配列である。
【００６１】
関連する側面では、好ましい変異体は、配列番号：１に示すANT1ポリヌクレオチド配列と「選択的にハイブリダイズ可能な」ポリヌクレオチドを含む。
【００６２】
配列変異体は、また、ここで記載のような、ANT1ポリヌクレオチド配列によってコードされているのと同じポリペプチドをコードする核酸分子を含む。従って、同定された核酸分子のコード化フレームが知られている場合、例えば、既知の遺伝子に対する相同性によって、又は配列の伸張によって、遺伝子コードの縮重の結果のように、コード化配列の多くを産することができる。例えば、トリプレットCGTは、アミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、あるいは、CGA、CGC、CGG、AGA、及びAGGによってコードされている。従って、コード化領域のそのような置換は、本発明の範囲にある配列変異体内に入ることが好まれる。これら配列変異体の任意及びすべては、ここで記載されてているのと同じように、配列番号：１の同定されたANT1親配列のために使用することが可能である。
【００６３】
そのような配列変異体が、親配列と選択的にハイブリダイズしてもしなくてもよいことがさらに好まれる。これは、例えば、配列変異体が、親ヌクレオチドによってコードされる各アミノ酸に対する異なるコドンを含む場合に可能であろう。そのような変異体は、それでもなお、本発明によって特異的に考慮され、包含される。本発明に従うと、同じく包含されているのは、そのような縮重誘導配列変異体と少なくとも７０％の同一性である配列である。
【００６４】
ANT1ヌクレオチド配列変異体は、好ましくは、中程度に高度又は高度にストリンジェントな条件下でここで引用されているヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるが、ある状況では、上記のようなコードの縮重を基礎とする変異体を用いることに利点がある。例えば、コドンは、特定の宿主生物によって決定付けられる最適コドンの利用に従って、ペプチドの発現が特定の原核生物又は真核生物で起こる速度を増すように選択することができる。あるいは、引用されている配列によって産せられるmRNAよりも長い半減期を有するRNAを産することが望ましいであろう。
【００６５】
ここに記載の天然完全長ANT1核酸配列における変異は、例えば、保存的及び非保存的変異に関するいずれかの技術及びガイドラインであって、当該分野で一般的に知られている、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発を用いて作製することができる。部位特異的突然変異（Kunkel TAら, 1991）；カセット突然変異誘発（Crameri Aら, 1995）；制限選択突然変異誘発（Haught Cら, 1994）、又は他の既知の技術をクローンDNAに施して、ANT1変異体をコードする核酸配列を産することが可能である。
【００６６】
特に、宿主が好む配列を提供することが望ましい場合に、ANT1表現型と関連する遺伝子配列を、完全に又は部分的のいずれかで合成することができる。従って、所望される構造遺伝子のすべて又は一部分（タンパク質をコードする遺伝子の一部分）は、選択される宿主によって好まれるコドンを使用して合成することができる。宿主が好むコドンは、例えば、所望される宿主種で発現されるタンパク質で最も頻繁に使用されるコドンから決定することができる。
【００６７】
ANT1ポリヌクレオチドが、配列番号：１（すなわち、植物で過剰発現されるとANT1表現型となる）として示されているポリヌクレオチドによってコードされている成熟ANT1ポリペプチドと同じ生物学的機能又は活性を実質的に保持するANT1ポリヌクレオチドをコードすることが好まれる。
【００６８】
変異体は、本発明のANT1ポリヌクレオチドの断片をも含み、完全長ANT1ポリヌクレオチドを合成するために用いることができる。好ましい実施態様は、本発明のANT1ポリペプチド配列の５から１０，１から５，１から３，２，１又は非アミノ酸残基が、任意の組み合わせで置換、付与又は欠損している、ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。特に好ましいのは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの特性又は活性を改変しないような、置換、付与、及び欠損である。
【００６９】
ANT1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、さらなる遺伝的解析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するためにも使用できる。選択プローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、Sambrookら, 1989に記載のような標準的手法を用いておこなうことができる。中度にストリンジェント及び高度にストリンジェントを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら,に提供されている。
【００７０】
そのプローブ又は一部分は、極めて関連しているANT1配列の同定のための配列のプールを作製するために、PCR技術でも用いられ得る。ANT1配列がプローブとしての用途が意図される場合、ANT1コード化配列の特定部分、例えば、コード化配列の高度に保存された部分が使用され得る。
【００７１】
例えば、配列番号：１に開示のANT1ヌクレオチド配列と所望するレベルの配列同一性を有する、他の植物種からのANT1の天然発生変異体をコードする遺伝子を単離するために、例えば、ANT1ヌクレオチド配列をcDNAライブラリのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。例示的プローブは、約２０から約５０塩基長を有する。
【００７２】
その他の例示的手法では、ここに開示の推定アミノ酸配列を使用して選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、そして必要ならば、Sambrookら, 上掲に記載の常套的なプライマー伸張法を使用してcDNAへ逆転写され得ないANT1前駆体及びmRNAのプロセッシング中間体を検出することによって、ANT1ポリペプチドをコードする核酸を得ることができる。
【００７３】
上で論じたように、この発明の核酸配列は、ゲノム、cDNA又はmRNA配列を含み得る。「コード化」によって、センス又はアンチセンス方向のいずれかの特定のアミノ酸配列に一致する配列が意味される。「染色体外」によって、配列が天然に随伴している植物ゲノムの外側にあることを意味している。「組み換え体」によって、配列が、突然変異誘発、制限酵素等による操作を通して遺伝子操作による修飾を含むことが意味される。
【００７４】
一度、ANT1核酸配列、相同体、その変異体又は断片の所望する型が得られると、それは、種々の方法で修飾することができる。配列が非コード化フランキング領域を含む場合、そのフランキング領域は制限、突然変異誘発等に供せられる。従って、転移、塩基転換、欠損、及び挿入は、天然発生配列上でおこなわれ得る。
【００７５】
そのような修飾があってもなくても、ANT1核酸配列、相同体、その変異体又は断片の所望する型は、植物細胞の形質転換のために植物発現ベクターへ取り込まれる。
【００７６】
ANT1ポリペプチド
１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号：２に示す配列を含んでなる天然成熟又は完全長ANT1ポリペプチド配列を有するANT1ポリペプチドを提供する。本発明のANT1ポリペプチドは、成熟ANT1ポリペプチド、配列番号：２に示すANT1ポリペプチド配列の融合タンパク質の一部分又は断片又は変異体である可能性がある。
【００７７】
通常は、本発明のANT1ポリペプチドは、ANT1アミノ酸配列の全長と少なくとも５０％から６０％の同一性を有する。より好ましいのは、配列番号：２のANT1ポリペプチド配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％又はより高い配列同一性を有する領域を含むANT1ポリペプチド配列である。
【００７８】
配列番号：２のANT1ポリペプチド配列の断片及び変異体も、本発明の一部分であると考えられる。断片は、前出に記載のポリペプチドのアミノ酸配列とすべてではないが一部分がすべて同じであるアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドである。例示的断片は、配列番号：２の少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，又は１００連続アミノ酸を含む。この断片は、「独立している」又は断片が一部分又は領域、最も好ましくは単一で連続する領域であるより大きなポリペプチド内に含まれる。好ましい断片は、生物学的に活性な断片であって、それらが、類似の活性又は向上した活性又は減少した活性を有するものを含む本発明のポリペプチドの活性を媒介する。また、含まれるのは、動物、特にヒトで抗原性又は免疫原性の断片である。
【００７９】
本発明のANT1ポリペプチドは、配列番号：２のANT1ポリペプチド配列から変化するポリペプチドを含む。これら変異体は、置換的、挿入的又は欠損変異体であり得る。変異体は、さらに下記のような修飾された特徴を有するとして選択されることも可能であるが、この変異体は、典型的には、天然発生類似体と同じような定性的な生物学的活性を示す。
【００８０】
「置換」は、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸を異なるヌクレオチド又はアミノ酸でそれぞれ置き換えることから生じる。
【００８１】
「挿入」又は「付加」とは、天然発生配列と比較して、それぞれ、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加を引き起こす、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化である。
【００８２】
「欠損」とは、それぞれ、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基が無い、ヌクレオチド又はアミノ酸配列のいずれかの変化として定義される。
【００８３】
アミノ酸置換は、典型的には、１つの残基である；かなり大きな挿入は耐えられるが、挿入は、通常は、およそ約１から２０アミノ酸である。ある場合、欠損はより大きい可能性があるが、欠損は、約１から約２０残基の範囲である。
【００８４】
置換、欠損、挿入又はそれらのいずれかの組み合わせは、最終の誘導体に至るように使用され得る。一般的に、これらの変化は、分子の改変を最小にするように僅かのアミノ酸に関しておこなわれる。しかしながら、より大きな変化は、ある環境下で許容され得る。
【００８５】
アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の構造及び／又は化学特性を有するその他のアミノ酸で置換すること、例えば、ロイシンのセリンによる置換、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果である可能性がある。挿入又は欠損は、場合によっては、１から５アミノ酸の範囲にある。
【００８６】
置換は、一般的には、既知の「保存的置換」に従って作製される。「保存的置換」とは、１つのクラスのアミノ酸を同じクラスのアミノ酸によって置換することを指し、クラスとは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の特性 、及び自然界で見出される相同タンパク質の高い置換頻度によって定義される（例えば、標準Dayhoff交換頻度マトリックス又はBLOSUMマトリックスによって決定されるように）。（一般的に、Doolittle, R. F., 1986を参照せよ。）
【００８７】
「非保存的置換」とは、１つのクラスのアミノ酸をその他のクラスのアミノ酸で置換することを指す。
【００８８】
ANT1ポリペプチド変異体は、典型的には、また、選択されて、必要とされるようにANT1ポリペプチドの特徴を修飾されるが、天然発生類似体と同じような定性的な生物学的活性を示す。例えば、グリコシル化部位、及びより特異的には、１つ又は複数のＯ-結合又はＮ-結合グリコシル化部位は、改変されるか又は除かれる。当該分野の熟練者は、グリコシル化部位の数や位置を変化させる、又は膜固着特性を改変する等のANT1ポリペプチドの翻訳後プロセスを改変し得るアミノ酸変化を評価する。
【００８９】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等の当該分野で知られている方法を用いて作製することができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, 1986；Zollerら,1987］、カセット突然変異誘発［Wellsら, 1985］、制限選択突然変異誘発［Wellら, 1986］又は他の既知の技術をクローンDNA上でおこない、ANT1ポリペプチドコード化変異体DNAを産することができる。
【００９０】
同じくANT1ポリペプチドの定義に含まれるのは、他の関連したANT1ポリペプチドである。従って、プローブ又は縮重PCRプライマー配列を使用して他の関連しているポリペプチドを見出すことができる。有用なプローブ又はプライマー配列は、ANT1ポリペプチド配列のすべて又は一部分、又はコード化領域の外側の配列に対して設計することができる。当該分野で一般的に知られているように、好ましいPCRプライマーは、約１５から３５ヌクレオチド長であり、約２０から約３０が好ましく、必要とされているようにイノシンを含むことができる。PCR反応の条件は、一般的に当該分野で知られている。
【００９１】
ANT1ポリペプチドの共有結合的修飾も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、本発明は、成熟タンパク質であり、付加的アミノ又はカルボキシル末端アミノ酸を含み得るANT1ポリペプチド、又は成熟ポリペプチド内のアミノ酸を提供する（例えば、タンパク質の成熟型が１つより多いポリペプチド鎖を有する場合）。そのような配列は、例えば、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセッシングで役割を担い、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質半減期を短く又は長くし、又はアッセイ又は生産でのタンパク質の操作を促進することができる。細胞酵素を使用して、成熟タンパク質から任意の付加的アミノ酸を除くことができる［例えば、Creighton, TE, 1983を参照せよ］。
【００９２】
好ましい実施態様では、ANT1ポリペプチド又はその変異体の過剰発現は、ANT1表現型と関連している。
【００９３】
抗体
本発明は、さらに、抗ANT1ポリペプチド抗体を提供する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性又は異種コンジュゲート抗体であってもよい。
【００９４】
ポリクローナル抗体を調製する方法は、熟練者に知られている。そのようなポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤、そして好ましくはアジュバントの１つ又は複数の注入の後に、哺乳動物で産することが可能である。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントは、一連の皮下又は腹膜内注射によって哺乳動物へ注入される。免疫剤は、ANT1ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。抗原を免疫化される動物において免疫原性であることが知られているタンパク質とコンジュゲートさせることは有用であり得る。免疫化プロトコールは、標準プロトコールに基づいて一人の熟練者によって、又は日常的な実験によって決定することが可能である。
【００９５】
あるいは、抗ANT1ポリペプチド抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物が、免疫剤と特異的に結合する抗体を産する、又は産することが可能なリンパ球を誘発するために免疫剤で免疫化される、ハイブリドーマによって産することができる［Kohlerら, 1975］。モノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載のような組み換えDNA法によっても作製することができる。
【００９６】
本発明の抗ANT1ポリペプチド抗体は、さらに、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む。「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体から誘導した配列のある部分を含むキメラ抗体、その免疫グロブリン鎖又は断片（例えば、Fv，Fab，Fab'，F(ab')２又は抗体の他の抗原結合部分配列）である非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型を指す。非ヒト抗体をヒト化する方法は、Jonesら, 1986；Riechmannら, 1988；Verhoeyenら, 1988にさらに詳しくあるように、当該分野で良く知られている。ヒト抗体を産する方法も、当該分野で知られている。例えば、Jakobovits, A,ら, 1995；Jakobovits, A, 1995を参照せよ。
【００９７】
１つの例示的手法では、抗ANT1ポリクローナル抗体は、遺伝子単離に使用される。ウェスタンブロット解析は、ANT1又は関連タンパク質が特定の植物種の粗抽出物に存在していることを確かめるためにおこなわれ得る。反応性が観察されると、関連するタンパク質をコードする遺伝子は、特定の植物種を表す発現ライブラリをスクリーニングすることによって単離することができる。発現ライブラリは、Sambrook, ら, 1989に記載のように、ラムダgt11を含む種々の商業的に入手可能なベクターで構築することが可能である。
【００９８】
ANT1表現型及び遺伝子の用途
前記より、ANT1ヌクレオチド配列、タンパク質配列及び表現型は、ANT1タンパク質の修飾発現、及びそのような修飾発現に関連する非天然表現型の開発に用途を見出すことができる。
【００９９】
ANT1表現型は、変異型から野生型植物を区別する特徴を有し、それには、修飾された葉の色、修飾された花の色及び修飾された果実色を含む。
【０１００】
アントシアニンは、葉の色、花の色及び果実色に貢献する。アントシアニンは、ピンクから紫色を葉及び他の器官を分け与える水溶性フラボノイドの一群である（Harboneら, 1988）。アントシアニンは、植物の多くの重要な生理学的及び発生的機能に関わってきており、それらには、限定されるものではないが：(1)捕獲した光の量及び質の修飾（Barkerら, 1977）；(2)UV-B照射の作用からの保護（Burger及びEdwards, 1996及びKlaperら, 1996）；(3)草食動物に対する防御（Coley及びKusar, 1996）；(4)光阻害からの保護（Gouldら, 1995及びDoddら, 1998）；及び(5)ストレス環境下での活性酸素中間体の除去（Furutaら, 1995；Sherwinら, 1998；及びYamasaki 1997)が含まれる。アントシアニンは、抗オキシダント活性を示し、これは、癌、心臓及び肝臓疾患に対する防御の役割を示唆している（Kameiら, 1993；Sudaら, 1997；及びWangら,2000）。www. pslgroup. com/dg/39fb2.htm，www.wellweb.com/nutri/phytochemicals.htm，及びwww.nal.usda.gov/ttic/tektran/data/000007/19/0000071970.html.のウェブサイトも参照せよ。
【００１０１】
これを考慮すると、ここに記載のANT1表現型は、色彩豊かで、それ故に装飾植物、花及び食物の装飾価値を高めることに用途が見出されるだけでなく、ANT1表現型が植物種で発現して食品又は食品添加物として利用される場合には、健康に有益な潜在力をも与える。
【００１０２】
一側面では、ANT1表現型を有する植物の修飾葉、花、及び果実色には、改良装飾植物、果実及び／又は切花の開発に用途が見出せる。
【００１０３】
その他の側面では、ANT1表現型を有する植物に含まれる修飾アントシアニンには、植物誘導食品及び食品添加物において用途が見出せる。
【００１０４】
その他の側面では、実施例にさらに記載のように、ANT1遺伝子は、遺伝子組み換え植物における形質転換マーカーとしての用途を有する。
【００１０５】
本発明を実行することにおいては、ANT1表現型及び修飾ANT1発現は、一般的に、さらに下で詳細に示されているように、どんな型の植物にも応用可能である。
【００１０６】
ここに記載の方法は、一般的に、すべての植物へ応用可能である。活性タギング及び遺伝子同定は、核酸配列及び関連する表現型の同定に続いて、トマトで実行されるが、選択された遺伝子、相同体、その変異体又は断片は、どんな型の植物でも発現することができる。一側面では、本発明は、果実及び野菜を産する植物に関する。
【００１０７】
本発明は、一般的に、新鮮な果実を産する植物へ応用可能である；例えば、限定されるものではないが、トマト（Lycopersicum)；ブドウ（Vitas）；イチゴ（Fragaria）；ラズベリー、ブラックベリー、ローガンベリー（Rubus）；カラント及びグースベリー（Ribes）；ブルーベリー、コケモモ、ハイデルベリー、クランベリー（Vaccinium）、キーウィフルーツ及びチャイニーズ・グースベリー（Actinida)；リンゴ（Malus)；西洋ナシ（Pyrus）；プルナス・ジェネラ（Prunus genera）のメロン（Cucumis sp.）のメンバー、例えば、西洋スモモ、桜、ズバイモモ及びモモ；アカテツ科の木（Manilkara zapotilla）；マンゴー；アボカド；アンズ；モモ類；桜；パイナップル；パパヤ；パッションフルーツ；柑橘類；ナツメヤシ；バナナ；オオバコ；及びイチジク。
【００１０８】
同じように、本発明は、野菜植物へ応用可能であり、それには、限定されるものではないが、砂糖大根、青いサヤインゲン、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、セロリ、フダンソウ、キュウリ、ナス、コショウ、カボチャ、大黄、冬カボチャ、ペボカボチャ、ズッキーニー、レタス、ダイコン、ニンジン、エンドウマメ、ジャガイモ、トウモロコシ、ゲッキツ及びハーブが含まれる。
【００１０９】
関連した側面では、本発明は、切花産業、穀物産生植物、油産生植物及びナッツ産生植物、並びに、限定されるものではないが、綿花（Gossypium）アルファルファ（Medicago sativa）、アマ（Linum usitatissimum）、タバコ（Nicotiana）、芝草（Poaceae 科）、及び他の飼料作物を含む他の作物に関する。
【００１１０】
これら及び他の植物に関する適切な形質転換技術を記載している参考文献は、特許出願連番第09/846,758号に列挙されている。
【００１１１】
熟練者は、幅広い種々の形質転換技術が当該分野に存在していることを認識していて、新しい技術が継続して入手可能になっている。標的宿主植物にとって適した任意の技術を、本発明の範囲内で用いることが可能である。例えば、コンストラクトを、DNAの鎖に限定されるものではないが、プラスミド、又は人工染色体を含む種々の形態へ導入することが可能である。標的植物細胞へのコンストラクトの導入は、限定されるものではないが、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル・ボンバード・リン酸カルシウムDNA共沈殿、又はANT1コード化配列を含む非相同的核酸コンストラクトのリポソーム媒介形質転換を含む、種々の技術によって完遂することが可能である。植物の形質転換は、すなわち、導入発現コンストラクトの宿主植物ゲノムへの組み込みによって、好ましくは永久的なものであり、導入コンストラクトは、次の植物世代へ受け継がれる。
【００１１２】
一実施態様では、二元Tiベースベクター系を、同定した遺伝子の増幅発現を特定の植物特性又は表現型へ転移されたり、その間の関連を確かめたりするために用いることができる。ｐBI121等の標準的アグロバクテリウム二元ベクターは、当該分野の熟練者に知られており、その多くは商業的に入手可能である（Clontech Laboratories, パロ・アルト, カリフォルニア）。
【００１１３】
アグロバクテリウムベクターによる植物の形質転換にとって最適な手法は、形質転換される植物の型によって変化する。アグロバクテリウム媒介形質転換に関する例示的方法には、不稔性の若木及び／又は苗木から誘導した胚軸、茎頂、茎又は葉組織の外植片の形質転換が含まれる。そのような形質転換植物は、性的に、又は細胞又は組織培養によって再生されることが可能である。アグロバクテリウム形質転換は、以前、多くの異なる型の植物に関して記載されていて、そのような形質転換に関する方法は、科学的文献に見出すことができる。
【００１１４】
意図された用途によって、ANT1表現型に関連した核酸配列を含み、全タンパク質、又は、植物細胞の形質転換及びトランスジェニック植物の作製に関するその生物学的活性部分をコードする、非相同的な核酸コンストラクトが作製され得る。
【００１１５】
ANT1核酸配列又は相同体、その変異体又は断片の発現は、構成性、誘導性又は制御可能なプロモーターのコントロールの下でおこなうことができる。ある場合には、ANT1核酸配列又は相同体、その変異体又は断片の発現は、発生段階又は組織関連又は組織特異的な様式で制御され得る。従って、ここに記載の核酸コード化配列の発現は、発現のレベル、発現が起こる組織型及び／又はANT1コード化配列の発現が植物で調節される幅広い範囲の応用につながる発生段階の発現に関して制御され得る。
【００１１６】
エンハンサーを有する強力なプロモーターは、高いレベルの発現を引き起こすことができる。低レベルの基礎的活性が所望される場合、弱いプロモーターは、より良い選択である。ANT1核酸配列又は相同体、その変異体又は断片の発現は、植物発現ベクターでの細胞型特異的プロモーター又はプロモーターエレメントの使用によって、転写レベルでもコントロールすることができる。
【００１１７】
非相同的遺伝子発現にとって有用な多くのプロモーターが入手可能である。例示的な構成性プロモーターは、ラズベリーE4プロモーター（米国特許第5,783,393号及び第5,783,394号）、35SCaMV（Jones JDら, 1992）CsVMVプロモーター（Verdaguer Bら, 1998）及びメロンアクチンプロモーターを含む。例示的な組織特異的プロモーターは、トマトE4及びE8プロモーター（米国特許第5,859,330号）及びトマト2AII遺伝子プロモーター（Van Haaren MJJら, 1993）を含む。
【００１１８】
ANT1配列がプローブとしての用途が意図される場合、ANT1コード化配列の特定の部分、例えば、コード化配列の高度に保存された部分が使用され得る。
【００１１９】
さらにその他の側面では、ある場合には、宿主細胞内で内因性ANT1配列の発現を阻害することが所望されるであろう。本発明のこの側面を実行するための例示的方法は、限定されるものではないが、アンチセンス抑制（Smith, ら, 1988）；同時抑制（Napoli,ら, 1989）；リボザイム（PCT公開公報国際公開第97/10328号）；及びセンス及びアンチセンスの組み合わせ（Waterhouseら, 1998）が含まれる。宿主細胞での内因性配列の抑制に関する方法は、通常は、少なくとも抑制されるべき配列の一部分の転写、又は転写及び翻訳を用いる。そのような配列は、内因性配列の非コード化領域だけでなくコード化領域と相同的であり得る。ある場合は、ANT1ヌクレオチド配列の発現を阻害することを所望してもよい。これは、ここで提供されているANT1ヌクレオチド配列をともない、当該分野の熟練者によって一般的に用いられている手法を利用して完遂することができる。
【００１２０】
クローン遺伝子と観察される表現型の間の関連を解析するために、標準的分子及び遺伝的試験をおこなうことができる。植物での遺伝子又は遺伝子産物の機能を決定する（予想すること又は確かめること）のに有用な多くの他の技術は、下に記載されている。
【００１２１】
DNA/RNA解析
変異体植物から取得したDNAを配列決定して、ヌクレオチドレベルでの変異を同定することができる。変異表現型は、野生型（WT）遺伝子を過剰発現させることによって救済することができる。例えば、インサイツハイブリダイゼーションによって、変異体対WT株の段階及び組織特異的遺伝子発現パターンを決定することができる。遺伝子、特にフランキング制御領域のメチル化体質の解析をおこなうことができる。他の適切な技術には、過剰発現、異所性発現、他の植物種及び遺伝子ノックアウトでの発現（逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（VIGS, Baulcombe D, 1999を参照せよ）が含まれる。
【００１２２】
好ましい応用では、発現プロファイリング又は転写プロファイリングとしても知られているマイクロアレイ解析は、多くの異なる遺伝子の異なる、又は誘導変化を同時に測定するのに使用される。マイクロアレイ解析に関する技術は、当該分野で良く知られている（Schena Mら, Science(1995) 270: 467-470；Baldwin Dら, 1999；Dangond F, Physiol Genomics（2000）2:53-58；van Hal NLら,J Biotechnol(2000) 78: 271-280；Richmond T及びSomerville S, Curr Opin Plant Biol (2000)3:108-116）。個々のタグ株のマイクロアレイ解析を、特に遺伝子が単離されたものについておこなうことができる。そのような解析は、対象の遺伝子の過剰発現の結果として、協調的に制御されている他の遺伝子を同定することが可能であり、それは、未知の遺伝子を特定の経路に配することを補助し得る。
【００１２３】
遺伝子産物解析
遺伝子産物の解析には、組み換えタンパク質発現、抗血清産生、免疫局在性、触媒又は他の活性に関する生化学的アッセイ、リン酸化状況の解析、及び酵母ツーハイブリッドアッセイを介する他のタンパク質との相互作用の解析が含まれる。
【００１２４】
経路の解析
経路の解析には、遺伝子又は遺伝子産物の過剰発現の表現型に基づいて、又は関連遺伝子との配列相同性によって、特定の生化学的又はシグナル伝達経路内に遺伝子又は遺伝子産物を配することを含めることができる。あるいは、解析には、経路に遺伝子を順付けるため、又は経路の下流の「レポーター」遺伝子の発現に対する変異の効果を確かめるためのWT株と他の変異株（二重変異を作製すること）の遺伝的交差を含めることができる。
【００１２５】
他の解析
特定の代謝又はシグナル伝達経路への単離された遺伝子及びその産物の関与を測定し確認するため、そして遺伝子機能の測定を補助するために、他の解析をおこなってもよい。
【００１２６】
すべての刊行物、特許及び特許出願は、ここで明確にそれらのすべてが参考文献として取り入れられている。
【００１２７】
本発明は、特定の方法及び実施態様に関連して記載されているが、種々の修飾及び変化は、本発明から離れることなく作製され得ることが理解されるであろう。
【００１２８】
実施例１
活性化タギングコンストラクトでの形質転換による、ANT1表現型を有する植物の作製
I. アグロバクテリウムベクターの調製
活性化タギング「ACTTAG」ベクターの修飾形であるpSKI015（GenBank Identifier［GI］6537289；Weigel Dら,2000）を使用することで、変異体を作製した。pAG3202と呼ばれるこの二元ベクターは、次の成分を有する：pSKIバックボーン； タンデムに４つのAlu1-EcoRV断片を含むCaMV35Sプロモーターのエンハンサー領域の４つのタンデムリピート、各タンデムAlu1-EcoRVリピートと結合している129bpのCaMV配列、及び天然CaMVゲノムの35Sエンハンサー領域には無い付加的な7bp繰り返し配列で構成される4X 35Sエンハンサー；ラズベリーE4（RE4)プロモーターのコントロール下のnptII選択可能マーカー；プラスミドの左境界域に近接する、nptII遺伝子の下流に位置するアグロバクテリウム遺伝子7終止エレメント。pAG3202配列は、配列番号：３に提供されている。
【００１２９】
二元プラスミドpAG3202を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株EHA 105/EHA 101/GV3101の単一コロニーは、ｐH5.4で、終夜にわたってMGL培地で生育し、MGL又は液体植物同時培養培地でおよそ５ｘ１０８細胞/mlに希釈された。
【００１３０】
長期の貯蔵のために、PCRポジティブコロニーを選択培地で生育させ、３０％の最終濃度となるようグリセロールを添加し、培養を素早く凍結させ、そして-８０℃で貯蔵した。植物形質転換のための密度の高いアグロバクテリウム培養の開始のために、貯蔵培養を選択培地で生育させ、３０％の最終濃度となるようにグリセロールを添加し、そして、幾らかの２０μｌアリコートを液体窒素で素早く凍結させて、-８０℃で貯蔵した。
【００１３１】
II. マイクロトム変異体の形質転換及び選択
活性化タギング変異体を、アグロバクテリウム媒介形質転換を利用して、トマトcv. マイクロトムで作製した。不稔性の若木及び苗木を、外植片の起源として用いた。より特異的には、胚軸組織を形質転換した。
【００１３２】
（Lycopersium esculentum）の種子は、１５分間、 ツイーン -２０を含む２５％漂白剤で表面を殺菌し、必要だとして、オーキシン及び／又はサイトカイン及びジベレリン酸の添加によって修飾した種子発芽培地（MS塩類、Nitschビタミン類、３％スクロース及び０．７％寒天，pH５．８）に配する前に無菌水で洗浄した。この培養は、２４℃で１６時間の光期間によってインキュベートした（５０-６０μmol. m−２s−１）。７から１０日齢の若木及び一月齢のインビトロ植物を胚軸外植片として使用した。
【００１３３】
胚軸を３-５mmのセグメントに切り、次いで、細菌懸濁液に浸し、無菌フィルターぺーパー上にブロットし、そして同時培養培地に配した。この外植片を細菌懸濁液に浸し、無菌フィルターペーパー上にブロットし、そして２-３日の間、同時培養培地に配した（MS塩類、LSビタミン類、３％スクロース、０．１mg/lキネチン、０．２mg/l 2,4-D、２００mg/l リン酸カリウム、５０μM アセトシリンゴン及び０．７％寒天、pH５．４）。
【００１３４】
２から３日の同時培養の後、nptII発現形質転換体を選択するために抗生物質である７５-４００mg/lのカナマイシンを補充した、pH５．８のMS塩類、Nitschビタミン類、３％スクロース、２mg/lゼアチン、５００mg/lカルベニシリン、２００mg/Lチメチン（timetin）及び０．７％寒天を含有する苗条再生培地へ外植片を移植した。抗生物質の選択レベルを、組織応答に基づいて、徐々に８週間にわたって上昇させた。
【００１３５】
２週間毎に、外植片を新鮮な培地へ移植した。初期の苗条の兆候をともなうカルスの開始は、外植片の型によって３-６週間の間観察できる。カルス化及び苗条の再生は、外植片組織が衰退した後でおよそ４ヶ月にわたって継続することが観察された。紫カルスは、選択培地上で生育する組織の中に観察された。再生した苗条は、様々な色の表現型を示し、すべてが緑、すべてが紫、又は様々な程度で緑と紫の混合であった。はっきりとした苗条成長点をともなうおよそ１cmの大きさの緑の苗条をカルスから切り取り、MS塩類、Nitschビタミン類、３％スクロース、１mg/l IBA、５０mg/lカナマイシン、１００mg/lカルベニシリン又は１００mg/Lチメチン（timetin）及び０．７％寒天、ｐH５．８を含有する根誘導培地へ移した。根を下ろした植物を、バイオセーフティーな温室の土壌へアウトプラントした。
【００１３６】
植物は、温室施設へ輸送されて、植物同定のための3.5'' ポットタッグに植え付けられた。
【００１３７】
形質転換体は、カルスの段階で、また、Ｔ１植物が温室で、野生型マイクロトム植物と比較して、表現型変異体に関して確立された後で観察された。これに到達するまでに、野生型植物をトランスジェニック植物の極めて近くに置いた。各植物は、週に２回、しっかりと観察して写真で観察を注記し記録した。
【００１３８】
８つの植物の各プールのイメージを、デジタルカメラ（DC-260）を使用して記録し、形態観察は、植えた後の約４週目におこなった。
【００１３９】
１１のマイクロトム株を、そのカーロジェニックな段階（caulogenic stage）での紫色及び紫根によって元々は同定されたカルスから発生した。このクローン植物株は、葉の上の深い紫のカストを有する修飾葉、花弁及び萼片及び花冠の標準黄色と混合した紫カストを有する花の上の紫筋によって特徴付けられる修飾花を有するとして同定される。この植物は、また、野生型マイクロトム植物と比較して深紅色として記載される修飾果実色を示すことが観察されている。このクローン植物株（変異体）は、アントシアニン１（「ANT1」）と命名された。
【００１４０】
このANT1変異体は、二元プラスミドpAG3202による組織培養形質転換、そしてカナマイシン含有培地上での選択によって開発した２０００より少ない個々のマイクロトムトマトACTTAG株から同定された。
【００１４１】
観察をおこない、写真が撮られたANT1表現型を示すクローンＴ１ANT1植物株を、H000001484、H000001624、H000001708、H000001709、H000001710、H000001711、H000001712、H000001713、H000001715、H000001716及びH000001717と命名した。
【００１４２】
種子は、株H000001624のＴ１植物から収集し、生育させてＴ２植物を発生させた。発芽した１８の種子のうちの１１から、８つの植物が紫色を示し、ANT1はドミナント変異体であることが確かめられた。
【００１４３】
この結果は、ANT1が、天然遺伝子の活性化タギングを基礎とする過剰発現から期待される機能特性の獲得であることを示した。
【００１４４】
実施例２
ANT1表現型を示す植物の特徴付け
マイクロトムゲノムDNAを、最初にカルスの段階で同定され、下記の手法を用いて活性化タグ植物株のプラスミドレスキューに関して十分な産生及び質として同定された活性化タギング変異体H000001484クローンから抽出された。さらなる解析を、H000001624、H000001708、H000001709、H000001710、H000001711、H000001712、H000001713、H000001715、H000001716及びH000001717植物株から誘導した混合組織を用いておこなった。
【００１４４】
I. マイクロトムトマトゲノムDNA抽出物
アマシャム（商品名）のNucleon（商品名）PhytoPure（商品名）システム（植物及び糸状菌DNA抽出キット）を、ゲノムDNAの抽出に用いた。方法は、基本的に次の通りである：
【００１４５】
H000001484クローンの１．０gの新鮮な組織を液体窒素ですりつぶして自由に漂う粉体にし、次いで、１５mlのポリプロピレン遠心分離管に移した。Nucleon Phytopureキットの４．６mlの試薬１を十分な混合によって添加し、均一な混合物が得られるまで反転させることによってNucleon Phytopureキットの１．５mlの試薬２の添加を続けた。この混合物を６５℃で、１０分間にわたって振盪ウォーターバスでインキュベートし、２０分間氷上に配した。この試料を氷から取り除き、２mlの-２０℃のクロロホルムを添加し、混合して、１０分間、１３００gで遠心分離した。その上澄みを２mlの冷クロロホルム、２００μｌのNucleon Phytopure DNA抽出樹脂懸濁液を添加した新鮮な試験管へ移し、その混合物を室温で１０分間、チルトシェーカー上で振盪し、次いで１０分間、１３００gで遠心分離した。Nucleon樹脂懸濁層を撹拌せずに、上層のDNA含有相を新鮮な試験管へ移し、上相に曇りがあるならば、３０分間、９５００rpmで遠心分離して移した水相を透明にし、等量の冷イソプロパノールを添加し、そしてその試験管をDNAが沈殿するまで緩やかに反転させた。その後で、それを遠心分離によってペレットにし、冷７０％エタノールで洗浄し、再びペレットにし、そして空気乾燥させた。
【００１４６】
DNAをリボヌクレアーゼを含有するTE緩衝液（１０mMトリス、HCl、pH７．４、１mM EDTA）に懸濁させ、１５分間、５５℃でインキュベートし、さらにフェノール/クロロホルム、次いでクロロホルムで抽出し、１％アガロースゲルに流してDNAの質を確かめ、そのDNA濃度をDNA蛍光光度計（Hoeffer DyNA Quant 200）で測定した。
【００１４７】
カーロジェニックカルスな段階（caulogenic callus stage）にあり、野生型植物からのH000001484ANT1クローンの苗条から抽出したDNAを、35Sエンハンサー配列を増幅するプライマー、及びpAG3202のpBluescriptベクター配列の領域を増幅するプライマーを使用してPCR増幅した。35Sエンハンサー領域を測るプライマーを使用した増幅は、はしご状の産物を生じ、これは、35Sエンハンサーのすべて４つのコピーが存在していたことを示す。pBluescriptベクターに対するプライマーを使用する増幅は、形質転換植物のT-DNA挿入を検出するために主におこなわれ、次の条件のために最適化された：アニーリング温度：５７℃、３０サイクル［９４℃、３０秒；５７℃、１分；７２℃、１分］１サイクル［７２℃、７分］。
【００１４８】
ACTTAG（商品名）株であるH000001484（ANT1)は、PCRによって、35Sエンハンサー及びpAG3202ベクター配列の存在に関してポジティブ、ACTTAGDNAのゲノムへの組み込み、及びクローントランスジェニック株での単一T-DNAの挿入の存在を示すサザンハイブリダイゼーションに関してポジティブであることが確かめられた。
【００１４９】
II. プラスミドレスキュー
H000001484クローン株のゲノムDNAを、サザンハイブリダイゼーションで使用する制限酵素によって消化した。その制限断片を自己ライゲーションし、大腸菌細胞を形質転換するために使用した。完全長pBluescriptベクター、４X 35Sエンハンサーを含有するプラスミド、及び右境界域T-DNAフランキングゲノムDNA断片を救済した。
【００１５０】
より具体的には、ゲノムDNAを、３７℃で一晩、標準反応条件下でHindIII及びXhoIにより消化した。
【００１５１】
ライゲーション反応を以下を含めて設定し、１６℃で一晩放置した：
消化ゲノムDNA                        ４０μｌ
５Xライゲーション緩衝液              ５０μｌ
リガーゼ（Gibcol, １U/μl）          １０μｌ
ddＨ２Ｏ                           １５０μｌ
【００１５２】
ライゲーションしたDNAを沈殿させ、ddＨ２Ｏに再懸濁させ、１０pgのpUC18プラスミドをコントロールとして、エレクトロポレーションによって大腸菌SURE細胞（ストラタジーン）を形質転換するのに使用した。
【００１５３】
この形質転換混合物を、１００μg/mlのアンピシリンを含有する２つのLBプレートに拡散し、３７℃で一晩インキュベートした。そのプレートから単一コロニーを拾い上げ、３７℃で一晩培養することによる、各コロニーの５ml LB-アンピシリン液体培養を開始した。プラスミドを培養から抽出し制限消化をしてゲノム挿入物の大きさを確かめた。
【００１５４】
III. レスキュープラスミドのシーケンシング
ABI Prism BigDye（商品名）Terminator Cycle シーケンシングReady Reactionキット（PEアプライド・バイオシステム）、AmpliTaq DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー）、ABI Prism（商品名）310 Genetic Analyzer（パーキン・エルマー）、及び配列解析ソフト、例えば、Sequencer（商品名）3.1.1又はMac Vector6.5.3を使用して、シーケンシングを完遂した。シーケンシングは、基本的には、製造者指示書に従っておこなわれた。
【００１５５】
救済されたプラスミドの左末端を、右T-DNA境界域を越えてシーケンシングした。
【００１５６】
救済した配列を、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTウェブサイトのBLAST配列比較プログラムを使用する解析に供した。基礎的なBLASTNによる探索によって、配列がペチュニア・インテグリフォリア（Petunia integrifolia）（GI 7673087及び7673085）のアントシアニン２（An2)のmRNAと３１％の同一性であることを同定した。オープンリーディングフレーム（即ち、ANT1 cDNA）の存在は、BLASTXプログラムを使用して予測された。
【００１５７】
RT-PCR解析によって、ヌクレオチド配列が配列番号：１（ANT1）に存在する遺伝子は、ANT1表現型を有する植物の組織で特異的に過剰発現していることが確かめられた。特に、RNAを、ANT1表現型を示すH000001624クローン植物株から誘導した混合組織、及び野生型植物から抽出した。RT-PCRは、配列番号：１として示される配列、及び構成的に発現するアクチン遺伝子（ポジティブコントロール）に対して特異的なプライマーを使用しておこなった。この結果は、ANT1表現型を示す植物がANT1遺伝子のmRNAを過剰発現することを示し、これは、ANT1遺伝子の増大した発現が、ANT1表現型と関連していることを示す。
【００１５８】
ANT1核酸配列から予測されたアミノ酸配列は、ベクターNTI（InforMax，ノースベセズダ，メリーランド）を使用して決定され、配列番号：２に示されている。ncbi.nlm.nih.gov/BLASTウェブサイト及び予測ANT1アミノ酸配列を使用するBasic BLASTP 2.0.11探索をおこなった。結果は、予測ANT1タンパク質配列が、ペチュニア・インテグリフォリア（Petunia integrifolia）のAn2タンパク質配列（GI 7673088及び7673086）と４９％の同一性、及び配列番号：２のおよそアミノ酸１-１２０のN末端領域の幾つかのMyb関連転写因子と６５％-８５％の同一性を有することを示唆した。これらMyb関連タンパク質は、ペチュニアｘハイブリッド（GI 7673084）のAn2、トウモロコシC1-I（GI22214)、トウモロコシPL転写因子（GI2343273）及びシロイナズ転写因子（GI3941508）を含む。ペチュニアAn2遺伝子は、アントシアニン生合成経路の制御因子である（Quattrocchioら, 1999）。
【００１５９】
これらの結果は、ANT1が、マイクロトマトの修飾葉、花、果実色と関連していることを示唆する。
【００１６０】
実施例３
マイクロトマトの表現型/遺伝子型の検証
ANT1表現型と配列番号：１に示すANT1遺伝子の間の関連をさらに確かめるために、配列番号：４に提供したANT1遺伝子を含むゲノム断片を、野生型マイクロトム植物で過剰発現させた。特に、ANT1コード化領域を含むこの１０１２bpゲノム断片を、二元ベクターpAG2370のマルチクローニング部位（MCS)へクローニングした。配列が配列番号：５に提供されているpAG2370は、二元ベクターpBIN19（GI1256363）のベクターバックボーン、T-DNA左及び右境界域断片、及び、境界域断片の間では、挿入遺伝子の発現をコントロールするCsVMVプロモーター配列及びNos終止配列 、発現がRE4プロモーター（米国特許第6054635号）及びG7終止配列によってコントロールされていて、カナマイシン耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPTII)遺伝子を含む。このANT1断片をpAG2370のSmaI/SpeI部位へクローニングし、ゲノム断片の５' 末端に近接するCsVMVプロモーター領域と、ゲノム断片の３' 末端に近接するNos終止配列の間に挿入した。このpAG2370-ANT1コンストラクトをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）へエレクトロポレーションによって形質転換した。
【００１６１】
基本的に実施例１に記載のように、上記のpAG2370-ANT1コンストラクトを、アグロバクテリウム媒介形質転換によって野生型マイクロトム植物へ導入した。要約すると、外植片をマイクロトムの苗木から切り取った。外植片を１５から１２０分にわたってアグロバクテリウム懸濁液中に浸すことによって播種し、無菌フィルターペーパー上にブロットして過剰な細菌を取り除いて配した。外植片を、１６時間の明期、２４℃で２-４日にわたって非選択培地で同時培養し、その後に、選択培地（カナマイシンを含む）へ移し、生育室へ戻した。外植片は、苗条が０．５から１cmの高さになるまで２週間毎に新鮮培地へ移した。苗条を外植片から切り出し、Phytatrays（シグマ）中のカナマイシンを含有する選択培地へ配し、２から４週間、生育室へ戻した。苗条には発根が観察され、根がついた苗条は、土壌に根を下ろし、温室に順応した。この形質転換過程は、６４の独立したＴ０事象を生じた。形態学的な観察によって、４５のトランスジェニック植物がANT1紫色表現型を示し、部分的に又は全てが紫のいずれかであったことが示された。ANT1表現型を示す６つのＴ１植物から組織が収集され、野生型をコントロールに使用して、RT-PCRをおこなった。ANT1遺伝子発現では野生型コントロールで検出されなかったが、ANT1表現型を示す６つの植物のうちの５つは、ANT1転写物を過剰発現した。構成的に発現されるアクチン遺伝子を使用した内部コントロール実験は、すべての試料が同じレベルのアクチン発現を有することを示した。
【００１６３】
実施例４
シロイナズでの表現型/遺伝子型の検証
マイクロトム以外の植物でのANT1表現型とANT1遺伝子の間の関連をさらに確かめるために、ANT1遺伝子を野生型シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)に導入し、過剰発現させた。
【００１６４】
上記のpAG2370-ANT1コンストラクトを、標準真空浸潤法を使用するアグロバクテリウム媒介形質転換によって野生型シロイナズ植物へ導入した。すべての浸透種子を、カナマイシン含有選択培地へプレートし、カナマイシン耐性Ｔ１植物を７２細胞フラットへ移植した。この形質転換プロセスは、１０の独立したＴ０事象を発生させ、そのうちの７つは、少なくとも植物の一部分にANT1紫色表現型を示した。ANT1表現型を示す４つのＴ１植物から組織を収集し、野生型をコントロールとして使用し、RT-PCRをおこなった。ANT1遺伝子発現では野生型コントロールで検出されなかったが、ANT1表現型を示すすべての植物が、ANT1転写物を過剰発現した。構成的に発現されるアクチン遺伝子を使用した内部コントロール実験は、すべての試料が同じレベルのアクチン発現を有することを示した。
【００１６５】
実施例５
タバコでの表現型/遺伝子型の検証
【００１６６】
マイクロトム以外の植物でのANT1表現型とANT1遺伝子の間の関連をさらに確かめるために、ANT1遺伝子を野生型タバコ(Nicotiana tabacum)（タバコ、ウイスコンシン-３８型）に導入し、過剰発現させた。
【００１６７】
上記のpAG2370-ANT1コンストラクトを、基本的に以下の方法を用いるアグロバクテリウム媒介形質転換によって、野生型タバコ植物へ導入した。形質転換のためのタバコ植物を生成するために、タバコ種子を次のように発芽させた：種子を、約１．３％から２．１％の次亜塩素酸ナトリウム及び１００ミリリッター当たり１滴のトゥイーン-２０（ポリオキシエチレンソルビタン・モノラウリン酸）を含有する溶液で、約１０分間、実験室シェーカーで振盪した。次いで、種子を無菌水で洗浄し、容器当たり１０-５０種子で、ペトリ皿又はPhytatrays（シグマ）のTbSG培地（4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類、Phytotech；１ml/l MSビタミン類、シグマ；30g/l スクロース；８g/l寒天、シグマ；pHを〜5.8に調整）の表面へ無菌的に移し、光の下で２５℃でインキュベートした。タバコ植物を、無菌な、脱イオン水又は液体TbCo培地（4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類、Phytotech；１ml/l MSビタミン類、シグマ；30g/l スクロース；200mg/l KH2PO4 ；2mg/l インドール-3-酢酸；0.25mg/l キネチン；0から100μM (薬品)アセトシリンゴン；7g/l寒天、シグマ；pHを5.4-5.6へ調整）で湿らせた無菌フィルターペーパー上で切り裂いた。すべての側面上に切り口を有する外植片は、葉を植物から切り出すこと、中央葉脈を切り裂きそして捨てること、そして３から５mm2 に葉のラミナを切ることによって作り出すことができた。あるいは、花盤は、無菌のコークボーラー（cork borer）を使用して、ラミナから切り出すことができる。
【００１６８】
外植片を、pAG2370-ANT1コンストラクトで調製したアグロバクテリウム懸濁液（OD６００が0.175と0.225の間）中に１５-１２０分間浸すことによって播種し、次いでTbCo培地上にブロットしてプレートした。外植片は、１６時間の明期、２４℃で２-４日間にわたって同時培養し、次いで、カナマイシンを含有するTb選択培地（4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類；1ml/l Nitsch及びNitschビタミン類、Duchefa；30g/l スクロース；0.5から2mg/l 6-ベンジルアミノプリン；0から1mg/l ナフチル酢酸；0から750mg/l カルベニシリン；0から300mg/l チメンチン（Timentin）；0から500mg/l カナマイシン；7から8g/l寒天、シグマ；pHを〜5.8に調整）へ移し、苗条が０．５から１cmの高さになるまで２週間毎に再移植をした。苗条は、外植片から切り出し、Phytatrays中のカナマイシンを含有するTbR培地（4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類及び1ml/l Nitschビタミン類、Duchefa；30g/l スクロース；0から1mg/l インドール-3-酪酸；0から１mg/l ナフチル酢酸；0から100mg/l カルベニシリン；0から200mg/l チメンチン（Timentin）；0から100mg/l カナマイシン；7から8g/l寒天、シグマ；pHを〜5.8に調整）に配し、２から４週間生育させて、その後で根を付けた苗条は土壌に植えられた。
【００１６９】
この形質転換プロセスは、８９の独立したＴ０事象を発生させ、そのうち５４が、少なくとも植物の一部分でANT1紫色表現型を示した。ANT1表現型を示す５つのＴ１植物から組織を収集し、野生型をコントロールとして使用し、RT-PCRをおこなった。ANT1遺伝子発現では野生型コントロールで検出されなかったが、ANT1表現型を示すすべての植物が、ANT1転写物を過剰発現した。構成的に発現されるアクチン遺伝子を使用した内部コントロール実験は、すべての試料が同じレベルのアクチン発現を有することを示した。
【００１７０】
実施例６
トマト及びタバコでのANT1遺伝子の形質転換マーカーとしての用途
【００１７１】
上記のようにして、トマト及びタバコでANT1表現型を成功裏に再利用し、我々は、ANT1遺伝子の特徴的紫色に基づいて、これらの種で、ANT1遺伝子の形質転換マーカーとしての用途を試験した。我々は、上の実施例に記載の方法を利用して、タバコ及びマイクロトム外植片をpAG2370-ANT1ベクターで形質転換し、抗生物質（カナマイシン）の存在及び非存在下で外植片を生育させ、培地中の抗生物質の存在下での発根に基づく形質転換頻度を紫色に基づく形質転換頻度と比較した。結果は、下の表に示してある。
【００１７２】
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【００１７３】
この結果は、ANT1遺伝子が、トマト及びタバコの培養における、ポジティブな形質転換のスクリーニングに成功裏に利用でき、他の植物でも有用であり得ることを示した。
【００１７４】
参考文献
Altschul, S. F. ら, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990.
Altschul, S. F. ら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997.
Ausubel F M ら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993.
Baldwin D ら, Cur Opin Plant Biol. 2(2):96-103, 1999.
Barker D H ら, Plant Cell and Environment 20: 617-624, 1977.
Baulcombe D, Arch Virol Suppl 15:189-201, 1999.
Behringer 及び Medford, Plant Mol. Biol. Rep. 10(2):190-198, 1992.
Burger J 及び Edwards G E. Plant and Cell Physiology 37: 395-399, 1996. Carter ら, Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986.
Christensen S ら, 9th International Conference on Arabidopsis Research. Univ. of Wisconsin-Madison, June 24-28, 1998. Abstract 165.
Coley P D 及び Kusar T A. In: Mulkey S S, Chazdon R L, Smith A P, eds. TROPICAL FOREST PLANT ECOPHYSIOLOGY. New York: Chapman and Hall 305-335, 1996.
Cough, S J 及び Bent, A F, the Plant Journal 16(6): 735-743, 1998.
Crameri A 及び Stemmer W P, Bio Techniques 18(2):194-6, 1995.
Creighton, T. E., PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTES, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86, 1983.
Dodd I Cら,Journal of Experimental Botany 49: 1437-1445, 1998.
Doolittle, R. F., OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986.)
Dooner ら, 1991, Ann.Rev.Genet. 25:179-199.
Fang G ら, Plant Cell., 1(1): 141-50, 1989.
Feldman ら, Science 243: 1351-1354, 1989.
Fridborg I ら, Plant Cell 11: 1019-1032, 1999.
Furuta S ら, Sweetpotato Res Front (KNAES, Japan) 1:3, 1995.
Geest A H 及び Hall T C, Plant Mol Biol 32(4):579-88, 1996).
Gelvin, S. B., Schilperoort, R. A., Varma, D. P. S., eds. Plant Molecular Biology Manual 1990.
Glick, B R 及び Thompson, J E, Eds. METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, p. 213-221, CRC Press, 1993.
Gould K S, ら, Nature 378: 241-242, 1995.
Harling ら, EMBO J. 16: 5855-66, 1997.
Haught C ら, BioTechniques 16(1):47-48, 1994.
Hayashi H ら, Science 258: 1350-1353, 1992.
Harbone J B, The Flavonoids: Recent Advances. In: Goodwin T W, ed. PLANT PIGMENTS. London: Academic Press, 299-343, 1988.
Jakobovits, A, ら, Ann N Y Acad Sci 764:525-35, 1995.
Jakobovits, A, Curr Opin Biotechnol 6(5):561-6, 1995.
Jayaram 及び Peterson, 1990, Plant Breeding Reviews 2:91-137; Coe, 1994, In `The Maize Handbook`, Freeling and Walbot, eds. Springer Verlag New York Inc., p. 279-281
Jensen, L. G., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3487-3491, 1996.
Jones ら, Nature 321:522-525, 1986.
Jones J D ら, Transgenic Res 1:285-297 1992.
Kakimoto, Science 274: 982-5, 1996.
Kamei H ら,J  Clin Exp Med 164: 829, 1993.
Kardailsky I ら, Science 286: 1962-1965, 1999.
Klaper R ら, Photochemistry and Photobiology 63: 811-813, 1996.
Kohler 及び Milstein, Nature 256:495, 1975.
Kunkel T A ら, Methods Enzymol. 204:125-39, 1991.
Liu ら,  Plant Journal 8(3) 457-463, 1995.
Marks 及び Feldman, Plant Cell 1:1053-1050, 1989.
Meissner ら, The Plant Journal 12(6) 1465-1472, 1997.
Miklashevichs ら, Plant J. 12: 489-98, 1997.
Napoli, ら, Plant Cell 2:279-289, 1990.
Novak, J 及び Novak, L, Promega Notes Magazine Number 61:27, 1997.
Omirulleh ら, Plant Mol Biol. 21(3):415-28, 1993.
Quattrocchio F ら, 1999, Plant Cell 11: 1433-1444
Riechmann ら, Nature 332:323-327, 1988.
Sambrook ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989.
Schaffer R, ら, Cell 93: 1219-1229, 1998.
Schell ら, Trends Plant Sci. 3: 130, 1998.
Scott, J W 及び Harbaugh, B K, University of Fla. Circular S-370, Dec. 1989.
Sherwin H W 及び Farrant J M., Plant Growth Regulation 24: 203-210, 1998.
Smith, ら, Nature 334:724-726, 1988.
Suda I, ら, 1997. Sweetpotato Res Front (KNAES, Japan) 4:3, 1997.
Van Haaren M J J ら, Plant Mol Bio 21:625-640, 1993.
Verdaguer B ら, Plant Mol Biol 37:1055-1067, 1998.
Verhoeyen ら, Science 239:1534-1536, 1988.
Walden ら, EMBO J. 13: 4729-36, 1994.
Walden ら, Plant Mol. Biol. 26: 1521-8, 1994.
Wang C J, ら, H Food Chem Toxicology 38: 411-416, 2000.
Waterhouse, ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964, 1998.
Wells ら, Gene 34:315, 1985.
Wells ら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415,1986.
Weigel D, ら, Plant Physiology, 122:1003-1013, 2000.
Wilson K ら, Plant Cell 8: 659-671, 1996.
Xu Y L, ら, Plant Cell, 11: 927-36, 1999
Yamasaki H Trends in Plant Science 2:7-8, 1997
Zollerら, Nucl. Acids Res. 10: 6487, 1987
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