(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄栢皮とオミナエシとの混合抽出物を治療的有効量含有する肝硬変治療用組成物であって、該混合抽出物が、黄栢皮とオミナエシとを混合し、ついで黄栢皮とオミナエシとの混合物を抽出することにより調製される組成物。
【請求項２】
前記黄栢皮とオミナエシとの混合物における黄栢皮とオミナエシとの重量比が、乾燥重量基準で１：０．２ないし１：５である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
第１項において、黄栢皮とオミナエシとの混合抽出物を成人体重の１ｋｇ当り１０ないし５０ｍｇの量で投与する組成物。
【請求項４】
第１項において、錠剤、カプセル剤、溶液剤、懸濁剤またはシロップ剤の形態で製剤学的に許容される賦形剤を加えて剤形化した組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、黄栢皮とオミナエシ（敗醤）との混合抽出物からなるＢ型肝炎及び肝硬変治療に効果のある医薬組成物に関し、より詳しくは、黄栢皮（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ  ａｍｕｒｅｎｓｅ  ＲＵＰＲＣＨＴ  ｃｏｒｔｅｘ）とオミナエシ（Ｐａｔｒｉｎｉａ  ｓｃａｂｉｏｓａｅｆｌｌｉａ  ＦＩＳＣＨ．）との混合抽出物を有効成分とするＢ型肝炎ウィルス活性及び肝硬変治療に効果のある物質で抗ウィルス効果、免疫増強作用、繊維化した肝細胞を再生させる効果を奏する医薬組成物とその製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、ＤＮＡウィルスであるにも拘わらず、変異し易いウィルスである。ＨＢＶゲノムは、約３．２ｋｂの二本鎖環状（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡであり、極めて圧縮された構造となっている。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、それぞれ一つのＯＲＦが他のＯＲＦと全体的に、或いは一部分が重なり合い、それぞれ異なる遺伝情報を保持するように巧妙に作られている。ＨＢＶは、他のＤＮＡウィルスとは異なって、感染された細胞内で複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）される時、逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）過程を経由する。即ち、元のゲノムの長さより長い３．５ｋｂのプレゲノム（ｐｒｅｇｅｎｏｍｅ）と呼ばれる複製中間体を作り出し、ウィルス自体の逆転写酵素／ＤＮＡ活性による二本鎖ＤＮＡを複製する。
【０００３】
このような複製様式は、ＤＮＡ鎖をそのまま複製する通常のＤＮＡウィルスとの異なって、先ず宿主の逆転写酵素によりＤＮＡ鎖からＲＮＡ鎖に転写され、ウィルス固有のＲＮＡポリメラーゼにより反応が進められる。そのため、ＨＢＶは、ＤＮＡウィルスでありながらも、一般のＲＮＡウィルスに匹敵するほどの高い変異性を示す。ＨＢＶ遺伝子の変異は任意に起こるが、増殖速度と頻度が一定である。
【０００４】
一方、宿主側でもＨＢＶ由来の蛋白質に対し体液性及び細胞性免疫反応を示すため、そのような反応から残存したウィルスの変異が持続的に起こる。逆転写酵素活性を有するＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼがプレゲノムＲＮＡを逆転写し、ウィルスＤＮＡを複製している。一連の複製は、宿主染色体とは独立して行われる。しかし、ウィルスＤＮＡの一部は、宿主の染色体に入り込むことが明らかになった。ＨＢＶ  ＤＮＡが宿主の染色体に入り込むと、遺伝子が不安定となり、そこから発現するＸ蛋白質により宿主細胞の転写が促進し、Ｐ５３遺伝子機能が低下する可能性が高い。かかる状況が持続的に進むと、肝細胞がんに発展しかねない。
【０００５】
原発性肝細胞がんの多くは、ウィルス性肝炎から始まる。肝炎ウィルス種は、Ａ型からＥ型の５種であったが、最近、ウィルス遺伝子がクローニングされ、Ｇ型を合わせて６種が知られているが、このうち、疫学的に肝臓の発がんとの関係が指摘されているものはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）とＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の２種である。ＨＢＶの外皮は、ウィルス粒子表面に露出されており、宿主の免疫系と直接関係する部分である。
【０００６】
それで、宿主の免疫反応から離脱し、存続するために、ＨＢＶは、表面抗原の構造を変化させている。抗原構造の変化は様々に起こり、病気の進展や持続感染を決める重要な因子となっている。ウィルスに対する宿主の免疫反応が適切でないかＴ細胞の機能欠如、ステロイドのような内分泌機能、薬物などの要因により急性肝炎から慢性肝炎に発展する。
【０００７】
肝炎の症状が６ヶ月以上持続し、生化学的検査と血清学的検査の改善がないと慢性肝炎と呼ぶ。慢性肝炎は、更に慢性持続性肝炎と慢性活動性肝炎とに分けられ、そのうちの慢性活動性肝炎は、肝組織の損傷が漸進的に進み、肝硬変、肝機能不全、致死に至るようになる。Ｂ型やＣ型肝炎ウィルスによる慢性肝炎は、肝硬変に罹患する割合が高く、ここから更に進展すると肝細胞がんに発展する。肝硬変の原因は様々で、ウィルス感染、寄生虫、後天性梅毒、飲酒、薬物や化学物質の毒性、胆管閉鎖、鬱血、血色素症、ウィルソン病などである。
【０００８】
種々の原因により肝硬変に進むと、肝実質組織細胞が損失し、血管湾曲を伴う網状組織の崩れと繊維組織の増殖、そして残留肝細胞の増殖と広範囲に分布した結合組織の増殖が起こり、漸進的に萎縮する。肝蛭が増殖する一方、実質には壊死と再生が起こる肝は、正常的な構造を失い、蘇葉が結合組織の増殖により分割するか、または合併などにより改築する。この改築は、門脈における中心静脈の血流路を妨害するため、循環障害を起こして門脈圧亢進症を誘発して腹水、側副循環（食道静脈瘤または臍静脈の拡張により、いわゆるメズサの頭を形成する）、脾腫などを引き起こす。ＨＢＶ陽性の肝硬変結節は、増殖パターンが緊密な細胞で構成され、前がん状態とみなし得る段階で既にクローンのような細胞群が存在することが見られる。しかし、この状態では、がんの始発（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）に係る遺伝子の異常はない。
【０００９】
ＨＢＶによるＢ型慢性肝炎の治療に使用されている薬剤としては、作用機序によって抗ウィルス製剤と免疫増強剤とがある。抗ウィルス製剤としては、Ａｒａ−Ａ、Ａｒａ−Ａｍｐ、アシクロビル、スラミンなどがある。Ｂ型慢性肝炎に対する新しい治療法として、最近、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ、３ＴＣ）が臨床試験に使用されている。ラミブジンは、ヘキサン誘導体としての経口抗ウィルス剤であり、ＨＩＶ（後天性免疫欠乏症ウィルス）の逆転写酵素の活性を特異的に阻害し、ＡＩＤＳ治療剤として１９９５年から欧米で使用されてきた。ラミブジンは、最初にジエンスタス（Ｄｉｅｎｓｔａｓ）などによりＢ型慢性肝炎患者に試験的に使用されたところ、投与中にＨＢＶ  ＤＮＡが陰性化し、１９％の患者でＡＬＴ値が正常化して、持続的な血中ＨＢＶ  ＤＮＡの陰性化が認められた。しかし、ラミブジンは、薬物自体の毒性のため、長期間使用し難いという短所があり、薬の服用を中止すると、抑えられていたウィルスの増殖が継続し、元の状態に戻ってしまう。最近、６ヶ月〜１２ヶ月の長期間のラミブジン投与に対する抵抗性を示した患者から、この薬物に対して耐性を示すＨＢＶ変異種が出現するという事実が明らかになった。
【００１０】
免疫増強剤のインターフェロンもＢ型肝炎治療に使用しているが、その有効性は極めて少ない。しかし、３ヶ月乃至６ヶ月間の投与が標準となっており、長期間の投与時により有用な結果が予想されるが、副作用が大きく、薬物投与を中断すると、ウィルスの増殖が再び増加して元の状態に戻ってしまう。Ｂ型慢性肝炎の治療に当たって、ＡＬＴ値の改善と同時にＨＢｅ抗原の陰性化が治療の指標となる。しかし、そのうちには、血中のＨＢｅ抗原が陰性であるにも拘わらず、活動性肝炎の状態が継続する場合もある。
【００１１】
ところが、現在まで知られている如何なる医療的方法においても、肝硬変に対する実質的な治療方法は知られていない実情である。
【００１２】
そこで、本発明の目的は、Ｂ型慢性肝炎に治療効果を示す組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、肝硬変に治療効果を示す組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、抗体の力価の増加とＴ細胞の増殖に効果を奏する組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、Ｂ型肝炎治療用組成物を製造する方法を提供することである。
【００１６】
このような本発明の目的は、黄栢皮とオミナエシとの混合抽出物を治療的有効量含有するＢ型肝炎治療用組成物により達成することができる。また、本発明により黄栢皮とオミナエシとの混合抽出物を治療的有効量含有する組成物は、肝硬変治療用組成物として有用であり、抗体生成時に力価の増加及びＴ細胞の増殖効果を有する医薬組成物として有用である。
【００１７】
本発明に使用されるオミナエシは、一名を敗醤とも呼ばれており、オミナエシ（Ｐａｔｒｉｎｉａ  ｓｃａｂｉｏｓａｅｆｏｌｉａ  ＦＩＳＣＨ．）、オトコエシ（白花敗醤；Ｐａｔｒｉｎｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ  ＪＵＳＳ．）、チシマキンレイカ（イワ敗醤；Ｐａｔｒｉｎｉａ  ｓｉｂｉｒｉｃａ  ＪＵＳＳ．）などの種類がある。オミナエシは、韓国を始めとして世界各地の温帯地方の山野で自生する多年生の草本植物である。全草を使用し、漢方では、眼疾患、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｓ）、浮腫、帯下症などの消炎に用いる。
【００１８】
また、オミナエシの熱抽出物は、  抗腫瘍効果（例えば、子宮がん、食道がん、胃がん、腸がん、肺がんなど）があるということが報告されたところがあり、試験管内の試験で黄色ぶどう状球菌、連鎖球菌などの発育を強力に抑える。そして、損傷された肝細胞の再生能を有しているためその変性を防止し、門脈の循環を改善して肝細胞の再生を促進する効果を奏するものとして知られている。中枢神経系にも作用して神経を安定させ、強力な鎮痛効果を示し、血圧降下効果と抗利尿（ａｎｔｉｄｉｕｒｅｔｉｃ）効果を有するものとして知られている。
【００１９】
オミナエシの根には、精油、多様なサポニン、炭水化物及びキューマリン（ｃｕｍａｒｉｎ）のような微量のアルカロイドが入っている。根の真皮層には、酢酸、ホルム酸、吉草酸などがあり、カチニン（Ｃｈａｔｉｎｉｎｅ）及びバレリアニン（ｖａｌｅｒｉａｎｉｎｅ）などのアルカロイドが含有されている。このうちで吉草酸（ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）は、非常に強力な鎮痛効果を有するものとして知られている。乾燥された種子には、１９．４〜１９．９％の蛋白質と３０〜３４．４％の脂肪が含有されている。しかし、未だオミナエシの活性成分やそれによる薬理効果に対する具体的な研究がなされていない。
【００２０】
本発明に使用されるさらに異なる植物である黄栢皮は、日本、韓国、中国などで自生するオオバキハダあるいは黄栢木の幹の皮であり、黄栢木の代表的なものは、キハダ（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ  ａｍｕｒｅｎｓｅ  ＲＵＰＲＥＣＨＴ）である。その変種としては、ラチホリオラトムナカイカワモト、ジャポニカムオイ、フェロデンドロンインシュラルナカイ、フェロデンドロンモレナカイ、フェロデンドロンサカリネンスサルジェンドなどがある。黄栢皮には、黄色あるいは黄褐色の色素物質と数種のアルカロイド成分が１．５〜４．５％含まれている。アルカロイドの主成分は、ベルベリン（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）である。その他に、パルマチン（ｐａｌｍａｔｉｎｅ）、マグノフロリン（ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ）、グアニジン（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ジャテオリジン（ｊａｔｅｏｒｒｉｚｉｎｅ）、フェロデンドリン（ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｉｎｅ）、カンジシン（ｃａｎｄｉｃｉｎｅ）、メニスぺリン（ｍｅｎｉｓｐｅｒｉｎｅ）などが含まれており、苦味質としては、オウバクノン（ｏｂａｋｕｎｏｎｅ）及びオウバクラクトン（ｏｂａｋｕｌａｃｔｏｎｅ）、β−シトステロール（β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）などが含まれているものとして知られている。これら成分は、強い抗菌作用、血圧降下作用、中枢神経抑制作用、アセチルコリン増強作用及び抗炎作用があって、本草綱目や薬学では、骨疾患及び黄疸に使用された。更に、腸チフス、コレラにも効果があり、健胃、整腸にも効果的である。一方、これらの樹皮は、苦味健胃剤、整腸剤消炎性収斂薬として胃腸炎、腹痛、黄疸などにも使用されてきた。
【００２１】
本発明は、生薬剤であって、Ｂ型肝炎ウィルスを減少させるのみならず、肝硬変に対しても効果を示す重要な特徴を有する。オミナエシと黄栢皮との混合抽出物を用いた本発明の組成物は、Ｂ型肝炎ウィルスの感染による肝炎に対して直接的な抗ウィルス効果を示すと同時に炎症を治療し、宿主の免疫体系のうちのＴヘルパー細胞（ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ）を強化させる効果がある。また、繊維化した肝組織のうちの肝細胞の再生を通じて肝細胞内の中心静脈を回復させることにより、肝硬変に対する治療効果を示す。
【００２２】
本発明による組成物は、黄栢皮とオミナエシとの混合抽出物を治療的有効量含有する。ここで、混合抽出物は、黄栢皮とオミナエシとを混合してこれらを抽出することも可能であり、黄栢皮の抽出物とオミナエシの抽出物とを混合してもよい。
【００２３】
本発明は、これら２種の植物の抽出物が混合された状態における相乗効果により卓越した治療効果を示すため、これら２種の植物の黄栢皮とオミナエシの組成比は、２：５ないし５：２の重量比の範囲にするのが好ましい。この範囲でこれらの２種の植物の有効成分の抽出物が混合される時、本発明の抗ウィルス、肝硬変及び免疫増強の効果を極大化させることができる。
【００２４】
本発明の組成物は、直接的なａｎｔｉ−ＨＢＶ効果を有すると同時にＴ細胞が関与する免疫体系を強化させることにより、Ｂ型肝炎に対する治療効果が高く、繊維化した肝細胞を再生させる効果がありながら毒性は極めて低く、最も理想的な薬物として評価される。
【００２５】
本発明の他の特徴により、黄栢皮とオミナエシを水性溶媒で混合抽出して濾過し；濾液を高圧下で飽和させ、生成された凝固蛋白質の沈殿物を遠心分離して除去し；濾液に有機溶媒を加えて有機溶媒−可溶性物質を除去した後、水層を分離して乾燥させるステップ；を含む医薬組成物の製造方法が提供される。
【００２６】
本発明の組成物において有効成分として使用される黄栢皮とオミナエシの総抽出物は、オミナエシと黄栢皮とを１：１（重量比）に混合して粉末化した後、上水または蒸留水を使用して高圧下で加熱抽出した後、抽出物を遠心分離して沈殿物を除去し、この抽出物は、再び高圧下で沸かして残存する蛋白質を凝固させた後、濾過して除去する。濾液を再び蒸気圧下で飽和させて残存の蛋白質を凝固させ、遠心分離して沈殿物を除去した後に濾過する。濾液に溶媒、例えばクロロホルムとヘキサンを加えて濾液に溶解された状態で残存する樹脂、繊維質などの溶媒で抽出できる全ての抽出物を除去した後に、水層をタルクなどを用いて精製し、凍結乾燥させて総抽出物の粉末を収得する。
【００２７】
前記のような方法により収得した本発明による混合抽出物は、治療学的有効量を単独であるいは薬剤学的に許容される担体と共に適する薬剤学的組成物の形態に剤形化し、経口投与するか注射することによりＢ型肝炎及び肝硬変に対する治療剤として使用することができる。
【００２８】
本発明による混合抽出物の有効量の範囲は、目的とする効果が何かに応じて異なり得るが、一般には、成人に対する経口投与の場合、体重１ｋｇ当り一日に５ないし５０ｍｇ、好ましくは、１０ないし４０ｍｇの用量を投与することができる。更に、本発明による抽出物は、必要に応じて肝炎治療剤、抗炎症剤、抗ウィルス剤などのような薬剤と配合あるいは併用することができる。本発明による組成物と併用できる薬剤としては、ＤＤＢ（ジフェニルジメチルジカルボキシレート（ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ））やニンニク油（ｇａｌｉｃ  ｏｉｌ）、グリチルリチン、シリマリンなどを挙げることができる。
【００２９】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例及び実験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、これらは単に本発明を説明するために提供されるものであり、本発明がこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３０】
実施例１：混合抽出物の製造
乾燥した黄栢皮（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ  ａｍｕｒｅｎｓｅ  ＲＵＰＲＥＣＨＴ）とオミナエシ（Ｐａｔｒｉｎｉａ  ｓｃａｂｉｏｓａｅｆｏｌｉａ  ＦＩＳＣＨ．）とを重量基準で１：１に混合して粉砕機で粉砕した。この混合粉末から１００ｇを分取し、ここに蒸留水３，０００ｍｌを加えて高圧下で５０分間飽和抽出した後、抽出液は分取し、残渣は除去した。抽出液は遠心分離して沈殿物を除去し、水液は濾過した後に全量が１，５００ｍｌになるように濃縮し濾過した。更に高圧（１２１℃、１５ｐｏｕｎｄ／ｉｎ  ａ２）下で１５分間飽和させ生成された凝固物質、特に蛋白質を含む沈殿物を遠心分離して除去した後に濾過した。濾液を分液漏斗に入れ、クロロホルム４００ｍｌを加えて樹脂及び繊維質などを溶出させてクロロホルム層を分離除去した。このような方法を２回繰り返した後、水層に再びｎ−ヘキサン２００ｍｌを加えて残存する蛋白質、樹脂、繊維質及びｎ−ヘキサン可溶性物質などを溶出させた。水層を回収して６０ないし８０℃で加温した後にタルク５００ｇを加えて攪拌した。これを再び減圧濾過してタルクを除去し、濾液は再び徐々に濾過し、該濾液を凍結乾燥させて粉末化した。この方法によって黄栢皮とオミナエシとの混合物より約１５％の歩留まり（乾燥重量基準）で混合抽出物約１５ｇを収得した。
【００３１】
実施例２：アルコールによる抽出物の製造
乾燥した黄栢皮とオミナエシとを重量基準で１：１に混合したものを粉砕機で粉砕した粉末１００ｇを分取し、ここに７０％メタノール１，５００ｍｌを加えて度々攪拌しながら６０時間放置した後、これを減圧濾過し、残渣を除去してアルコール抽出物を収得した。還流冷却装置を用いてアルコールを回収し、残留するアルコール抽出物に蒸留水１，０００ｍｌを加えて混合し、水溶化するために１００℃で５分間加熱した。この混濁抽出物に適量のタルクを加えて攪拌した後、減圧濾過して１次精製した。精製された濾液を分液漏斗に入れ、クロロホルム３００ｍｌを加えて樹脂及び繊維質などを溶出させ、クロロホルム層を分離除去した後、水層に再びｎ−ヘキサン２００ｍｌを加えて残存する蛋白質、樹脂、繊維質及びｎ−ヘキサン可溶性物質などを溶出させた。水層を回収して６０〜８０℃で加温した後に再び適量のタルクを加えて攪拌した後、減圧濾過してタルクを除去し、濾液を再び徐々に濾過させた後、凍結乾燥させて粉末化した。この方法によって黄栢皮とオミナエシとの混合抽出物より約１０％の歩留まり（乾燥重量基準）で混合抽出物約１０ｇを収得した。
【００３２】
組成例１：錠剤
実施例１で製造された本発明の凍結乾燥された粉末状の混合抽出物２５０ｍｇを賦形剤直打用ラクトース２６０ｍｇとアビセル（微細結晶セルロース）３５ｍｇ、崩壊助剤であるナトリウム澱粉グリコネート（ｇｌｙｃｏｎａｔｅ）１５ｍｇ、結合剤である直打用Ｌ−ＨＰＣ（Ｌｏｗ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）８０ｍｇを掻き混ぜてＵ型混合機に入れて２０分間混合した。混合完了後、滑沢剤であるマグネシウムステアレート１０ｍｇを更に加えて３分間混合した。定量試験と耐湿性試験を経て打錠しフィルムコーティングして、１錠当り混合抽出物２５０ｍｇを含有する錠剤を製造した。
【００３３】
組成例２：シロップ剤
一定量の水に適当量の白糖を溶解させ、そこに保存剤としてパラオキシメチルベンゾエート８０ｍｇ及びパラ−オキシプロピルベンゾエート１６ｍｇを加え、実施例１で製造された本発明の凍結乾燥された粉末状の混合抽出物４．５ｇを入れ、６０℃に維持しながら完全に溶解させた後、冷却させ、蒸留水を加えて１５０ｍｌにつくってシロップ剤を製造した。
【００３４】
組成例３：カプセル剤
実施例１で製造された本発明の凍結乾燥された粉末状の混合抽出物５００ｍｇを硬質ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００３５】
組成例４：飲料
実施例１で製造された本発明の凍結乾燥された粉末状の混合抽出物５００ｍｇを適当量の水に溶解させた後に補助成分としてビタミンＣ、矯味剤としてクエン酸、クエン酸ナトリウム、高果糖を適当量加え、保存剤として適当量の安息香酸ナトリウムを加えた後に水を加え、全量を１００ｍｌにつくって飲料用組成物を製造した。
【００３６】
組成例５：注射剤
実施例１で製造された本発明の凍結乾燥された粉末状の混合抽出物２００ｍｇを１％のポリオキシエチレン水素化ヒマシ油を含有する生理食塩水２００ｍｇに加熱溶解させ、混合抽出物を０．１％の濃度含有する注射製剤を製造した。
【００３７】
臨床例１：本発明の組成物をＢ型肝炎患者に投与
実施例１で製造された本発明の組成物を含むカプセルを３８才の男子の慢性的なＢ型肝炎患者に１日に２回２カプセルずつ経口投与した。その結果を図１に示す。図１は、ａｎｔｉ−ＨＢＶ抗体をＲＩＡ（放射性同位元素分析）方法にて調査した結果であって、本発明のＢ型肝炎に対する治療効果を示す（図１ａ：ＨＢｅ抗原、図１ｂ：ＨＢｓ抗原）。
【００３８】
臨床例２：Ｂ型慢性肝炎患者に対する投与
Ｂ型慢性肝炎と診断された３６才の男性患者に本発明の組成物カプセルを１日に２回２カプセルずつ（１日に２，０００ｍｇ）１１ヶ月間経口投与した結果、Ｂ型肝炎ウィルスに対する抗体が生成され、ＨＢｅ抗原とＨＢｓ抗原のいずれもが殆どなくなり、抗原力価（ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｉｔｅｒ）が０近くに落ちるか減少することを見ることができる。臨床例２（図２ａ、図２ｂ）の場合には、Ｂ型慢性肝炎であり、治療前に抗原が多く検出されたが、本発明の組成物を投与した結果、ＨＢｅ抗原に対する抗体が生成され、ＨＢｅ抗原が減少し、これと同様にＨＢｓ抗原も減少して６ヶ月後は、０近くに落ちたことが観察された。
【００３９】
臨床例３
ＨＢＶによる慢性肝炎患者（３４才、男子）に本発明の組成物カプセルを１日に２回２カプセルずつ（１日に２，０００ｍｇ）８ヶ月間経口投与した。その結果を図３ａ及び図３ｂに示す。この図面から、ＨＢＶに対する抗原値が０近くに落ちたことが分かる。
【００４０】
これらの臨床例の結果からみて、本発明の組成物は、Ｂ型肝炎治療に卓越した効果を奏することが分かる。
【００４１】
実験例１：本発明品の肝硬変に対する治療効果
本発明による組成物の肝硬変に対する効果を調査するために、白鼠を対象にしてＤＭＮ（Ｎ−ニトロソジメチルアミン）４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に１回注射して肝硬変を誘発した。ＤＭＮは、人間の肝硬変と最も類似する組織の変化をもたらす物質であって、肝硬変実験に多く使用されるモデルである。
【００４２】
２４匹の白鼠を６匹ずつ４つの群に分け、１群は対照群、２群には、ＤＭＮ４０ｍｇ／ｋｇだけを投与し、３群には、ＤＭＮ４０ｍｇ／ｋｇを投与し、更に本発明の組成物を１５０ｍｇ／ｋｇ用量で２週間にかけて投与し、４群には、ＤＭＮ４０ｍｇ／ｋｇを投与し、更に本発明品を５００ｍｇ／ｋｇ用量で２週間投与した。対照群とＤＭＮだけを投与した群には、生理食塩水を同一期間投与した。
【００４３】
２週後、全ての動物を犠牲して血液を採取し、肝を摘出して４％のホルマリン溶液に固定した。血液からは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、アルブミンなどの指標を調査し、肝組織は、病変の進行過程による組織のモルフォロジーを観察するために、硝子質変性（ｈｙａｌｉｎｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、繊維素（ｆｉｂｒｉｎ）などのような病的産物に染色されるＡＺＡＮ染色を施して顕微鏡下で観察した。
【００４４】
ＡＺＡＮ（アゾカルミン）染色を施すために、媒染剤（ｍｏｒｄａｎｔ：１０％重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）水溶液５０ｍｌ＋１０％トリクロロアセト酸（ＣＣｌ２ＣＯＯＨ）水溶液５０ｍｌ）に浸漬した後、アゾカルミン溶液で高温下で処理した。染色後、冷ましてアニリン−アルコール溶液で核が明らかに区別できるまで分別し、酢酸−アルコールにて停止させた。アニリンブルー−オレンジＧ溶液で処理した後、１００％エタノールで分別及び脱水させ、封じ込んでスライドを完成した。
【００４５】
顕微鏡下で検査した結果を図４に示す。図４−１は、正常的な肝組織であって、中心静脈がはっきりと見える。図４−２は、ＤＭＮを与えて肝硬変を誘発したものであって、繊維化された肝組織が青い色を示す。図４−３は、本発明の組成物１５０ｍｇ／ｋｇを投与した時、肝硬変の程度が緩和して青い色に染色された部分が減少した。図４−４は、本発明品５００ｍｇ／ｋｇを投与した時、繊維化した部分がほぼ正常に戻ったことが観察できる。中心静脈も徐々に回復していく様子を示した。
【００４６】
以上の結果から、本発明の組成物が繊維化した肝細胞の再生能力があり、肝硬変に対する治療効果があることが明らかに立証された。
【００４７】
実験例２：本発明による組成物の構成成分である黄栢皮とオミナエシの単独抽出物と本発明の組成物の免疫増強効果の比較（生体内でのＴ細胞依存性抗体生成反応に対する上昇効果）
体重が１７〜２０ｇ程度のＢａｌｂ／ｃマウス２５匹を各群当り５匹ずつ５群に分け、ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）２．４×１０８細胞を腹腔内に移植し、本発明の組成物の構成物質である黄栢皮とオミナエシのそれぞれの抽出物及び本発明の組成物粉末を水に溶かし、移植初日から３日間、体重１ｋｇ当り３〜１００ｍｇの量を経口投与した（０、１、２日）。
【００４８】
対照群には、生理食塩水を経口投与した。４日後、動物を犠牲させて無菌的に脾臓を摘出した後、組織を細かく切り、メッシュ（ｍｅｓｈ）を使用して脾臓細胞を分離し、ＨＢＳＳ（ハンクスの平衡食塩水（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））３ｍｌが入っているペトリ皿で注射器のプランジャ（ｐｌｕｎｇｅｒ）を利用して細胞を遊離させた。
【００４９】
細胞懸濁液を１５ｍｌのコニカルチューブに移して５分間放置した後、２ｍｌの上澄液を取り、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液を捨て残留物を再びＥＢＳＳ２ｍｌに懸濁させた後、ＥＢＳＳで３０倍希釈し、この脾臓細胞希釈液を一回にプラーク形成細胞分析に１００μｌずつ使用した。かくして収得した脾臓細胞希釈液１００μｌをＥＢＳＳで洗浄したＳＲＢＣ（２５μｌ、標的細胞）、ＥＢＳＳで２倍希釈したギニアブタ補体（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ２５μｌ）及びアガロース（ＥＢＳＳ中０．８５％、３５０μｌ）と混合した後、ペトリ皿に注ぎ固化させて３７℃のＣＯ２培養器で約１時間放置した。その後、抗体生成細胞（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の数は、変形されたジャニプラーク分析方法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｊｅｒｎｅ  ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）を使用して測定した。プラーク数及び細胞数を計数し、その結果を、１０６細胞当り抗体生成細胞の数で示した。
【００５０】
その結果、表１に示すように、本発明の組成物を投与した場合の抗体生成細胞の数が、構成成分のそれぞれを投与した場合のそれより遥かに増加したことが分かる。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
実験例３：本発明による組成物のＴ細胞活性化反応に対する効果
本発明による組成物のＴ細胞活性化反応に対する効果を混合免疫細胞反応法で測定した。主組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）抗原が相互異なる２種のマウスから免疫細胞を分離して混合すると、相手方の細胞の抗原を認識するＴ細胞は増殖をする。
【００５３】
主組織適合性遺伝子複合体抗原が相互異なるＢ６Ｃ３Ｆ１（Ｈ−２ｋ）とＢＤＦ１（Ｈ−２ｄ）の２種のマウスから脾臓を無菌的に摘出し、脾臓細胞を遊離させた。分離した免疫細胞は、２．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌになるように調節した後に９６ウェルプレートにそれぞれウェル当り１００μｌずつ入れ、最終的に２００μｌにつくった。
【００５４】
ここに、本発明の組成物を０．０１ないし１００μｇ／ｍｌの濃度で処理した後、３７℃、ＣＯ２培養器で３日間培養した。培養が終わる１８時間前に各ウェル当り１μＣｉの［３Ｈ］チミジンを添加した。自動細胞回収機（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｏｒ）を用いて細胞を収去した後に、［３Ｈ］チミジンの吸収程度を測定することにより免疫細胞の増殖程度を測定した。
【００５５】
その結果、表２に示したように、本発明品の濃度に応じてＴ細胞の増殖が増加した。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
実験例４：急性毒性実験
正常ＩＣＲマウス（♀、１９±１ｇ）３０匹を１群当り６匹ずつＡないしＥの５群に分け、最初のＡ群には体重１ｋｇ当り３ｇを投与することから等差的に量を増加させ、Ｂ群には６ｇ、Ｃ群には９ｇ、Ｄ群には１２ｇ及びＥ群には１５ｇずつそれぞれ経口投与し、ベーレンスカルバー（Ｂｅｈｒｅｎｓ−Ｋｒｂｅｒ）法（参考文献：高木敬次郎外：薬物実験、南山堂、日本、ｐ１３１、１９６０）によって本発明の混合抽出物の経口（ｐ．ｏ．）投与によるＬＤ５０値を測定した。ＬＤ５０（致死量）は、薬物の急性毒性を示す指標となる重要な意味のある数値であって、本発明品の安全度を示すものである。
【００５８】
結果は、下記の表３から分かるように、本発明品を体重１ｋｇ当り１５ｇを経口投与した群からは１匹の動物も死亡せずＬＤ５０値を測定することができなかった。従って、本発明の混合抽出物の経口投与によるＬＤ５０値は、１５ｇ／ｋｇ体重以上であり、本発明品が生体に非常に安全であることを立証する。即ち、本発明の混合抽出物は、毒性の殆どない安全投与できるものであることが明らかに分かる。
【００５９】
剖検及び病理組織学的試験方法は、以下の通りである。試験終了の際に全生存動物に対してエーテル麻酔後に放血致死させた後、臓器を摘出して肉眼的に全ての臓器の異常を検査した。病理組織検査のために剖検した全臓器を１０％中性ホルマリン溶液に１０以上固定させた後、脱水過程を経てパラフィン包埋機（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈｉｓｔｏｍａｔｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、１６６Ａ）により包埋した後、ロタリーミクロトーム（ＡＯ  Ｒｏｔａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）で５μｌ切片をつくりヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）とエオシン（Ｅｏｓｉｎ）染色して観察した。
【００６０】
各群の全ての動物を解剖して顕微鏡で調査した病理組織学的所見は、以下の通りである。本発明の組成物をマウス体重１ｋｇ当り１５ｇまで投与した時、肝組織における薬物の投与による異常所見は観察されなかった。また、腎臓と心筋細胞、胃腸菅、膵臓、肺臓、脾臓、副腎、脳、睾丸、卵巣、骨髄などにおいても薬物投与による異常所見は観察されず、本発明による組成物をマウスに投与できる最大用量である体重１ｋｇ当り１５ｇの投与時にも全臓器に対して急性毒性による副作用がなく、またいかなる毒性も誘発しない安全な薬物であるものと判断される。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
実験例５．ＵＶ吸光度による本発明の抽出物の特性
本発明のオミナエシと黄栢皮との混合抽出物を紫外線分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００）とＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０）を使用して調査した結果は、以下の通りである。図５は、オミナエシ抽出物（０．５ｍｇ／ｍｌ）のＵＶ吸光度検索結果を示すが、２８２ｎｍで吸光度が上昇する結果を示す。図６は、黄栢皮抽出物（０．２５ｍｇ／ｍｌ）のＵＶ吸光度を測定した結果であるが、黄栢皮抽出物は、２７８ｎｍ、３２５ｎｍで吸光度が増加する。図７は、本発明のオミナエシと黄栢皮との混合抽出物（０．５ｍｇ／ｍｌ）のＵＶスペクトルであって、２８１ｎｍ、３１６ｎｍで吸光度が増加する結果を示した。
【００６３】
実験例６．ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィ）分析による本組成物の特性  本発明のオミナエシと黄栢皮との混合抽出物及びオミナエシと黄栢皮のそれぞれの抽出物をＨＰＬＣで分離するために、各抽出物を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶かした。溶解された抽出物溶液１０μｌを取り、ＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０）を使用して分析した。
【００６４】
（分析条件）
カラム：Ｌｕｎａ  ５ｕ  Ｃ１８；４．６  ｍｍ  ｉ．ｄ．×２５０ｍｍＬ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
移動相：２％アセト酸とメタノールの勾配システム
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：フォトジオイドアレイ検出器（ｐｈｏｔｏｄｉｏｉｄ  ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）により２５４ｎｍで測定
【００６５】
繰り返しの実験で各抽出物における特徴的なピークが観察された。図８は、オミナエシ抽出物のＨＰＬＣプロフィールであって、オミナエシ抽出物は、上記の分析条件下において、１０．２４５分、１２．７７２分、１４．１０４分、１７．０８７分、１８．７６９分に特徴的なピークが観察された。そのうち、１０．９５２分に示したピークは、３，４−ジヒドロキシ安息香酸で、その含量が０．０２２％であって、１７．０８７分に示したピークは、クロロゲン酸で、その含量が０．２３８％であった。１８．７６９分に検出されたピークは、カフェイン酸で、その含量は０．１０７％であった。同じ条件下において、本発明の組成物をＨＰＬＣにて分析した結果は、図９に示したように、オミナエシからの前記の３種の物質が、それぞれ３，４−ジヒドロキシ安息香酸を０．０２０％、クロロゲン酸を０．２７０％、カフェイン酸を０．０４４％含有しており、その他に、１７．２９９分、２２．０４８分、２２．４４９分で特徴的なピークが表れた。
【００６６】
黄栢皮抽出物に多量含有されているアルカロイドのベルベリンとパルマチンを分析するために、以下のような条件を使用した。
【００６７】
（分析条件）
カラム：Ｌｕｎａ  ５ｕ  Ｃ１８；４．６  ｍｍ  ｉ．ｄ．×２５０ｍｍＬ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
移動相：アセトニトリル：水：ＫＨ２ＰＯ４：ＳＤＳ＝５００：５００：３．４：１．７
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：フォトジオイドアレイ検出器により２５４ｎｍで測定
【００６８】
ＨＰＬＣ分析の結果、黄栢皮抽出物には、図１０に示したように、パルマチンは、１０．６２９分で検出され、その含量が０．９８８％、ベルベリンは１１．３１４分で検出され、その含量が１．９６３％であったが、本発明の組成物では、パルマチンが１１．７５１分で検出され、その含量が０．２２９％で、ベルベリンは１２．６５０分で検出され、その含量が０．４０５％であって、混合抽出する時に歩留まりが減少する傾向を示した（図１１）。
【００６９】
【産業上の利用可能性】
本発明による組成物は、Ｂ型肝炎ウィルスを抑制し、肝硬変により繊維化した肝細胞を再生する効果を奏する。特に、副作用がなく、薬物耐性も誘発しないため、長期間投与することもでき、長期間の投与によっても組成物の活性が持続するという特徴がある。従って、Ｂ型肝炎及び肝硬変の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  図１ａは、臨床例１（ＨＢｅ抗原）の治療効果を示すグラフである。
【図１ｂ】  図１ｂは、臨床例１（ＨＢｓ抗原）の治療効果を示すグラフである。
【図２ａ】  図２ａは、臨床例２（ＨＢｅ抗原）の治療効果を示すグラフである。
【図２ｂ】  図２ｂは、臨床例２（ＨＢｓ抗原）の治療効果を示すグラフである。
【図３ａ】  図３ａは、臨床例３（ＨＢｅ抗原）の治療効果を示すグラフである。
【図３ｂ】  図３ｂは、臨床例３（ＨＢｓ抗原）の治療効果を示すグラフである。
【図４】  図４ａないし４ｄは、対照群、ＤＭＮ投与群、ＤＭＮ＋本発明の組成物１５０ｍｇ／ｋｇ投与群及びＤＭＮ＋本発明品５００ｍｇ／ｋｇ投与群に対する肝硬変の治療効果を示す写真である。
【図５】  図５は、オミナエシ抽出物のＵＶ検索図である。
【図６】  図６は、黄栢皮抽出物のＵＶ検索図である。
【図７】  図７は、本発明のオミナエシと黄栢皮との混合抽出物のＵＶ検索図である。
【図８】  図８は、オミナエシ抽出物のＨＰＬＣ分析図である。
【図９】  図９は、本発明によるオミナエシと黄栢皮との混合抽出物のＨＰＬＣ分析図である。
【図１０】  図１０は、黄栢皮抽出物のＨＰＬＣ分析図である。
【図１１】  図１１は、本発明によるオミナエシと黄栢皮との混合抽出物のＨＰＬＣ分析図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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