(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物、またはそれらの互変異性体、溶媒和物もしくは塩：
0004098356.tif 000026
ここで、R1は
0004098356.tif 000027
であり、
ここでD2が、独立してヒドロキシル、アセチル置換基によって保護されたヒドロキシル、モノホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェート、あるいは他の場合は塩基Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＣのみを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドであり；そして
D3がＨまたはOHであり；
ａは１であり、ｂは０であり；
Ａは独立してＮまたはＣであり；
Ｘは独立してＳまたはＯであり；
ＺはCH-Aと一緒になって、ベンゼン環、ナフタレン環またはピリジン環構造を形成する。
【請求項２】
前記ａが１であり、そして前記ＸがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ＡがＣである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＡがＮである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記ＡがＣであり、そして前記ＸがＯまたはＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＡがＮであり、そして前記ＸがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
以下の構造を有する化合物、またはそれらの互変異性体、溶媒和物、もしくは塩：
0004098356.tif 000028
ここで、ＤはOHまたはアセチル置換基によって保護されたOHであり；
D1はオリゴヌクレオチドカップリング基またはOHであり；
X1は、独立してフラノース環の2’位または3’位に結合したホスホジエステル結合またはホスホジエステル置換結合であり、そして残りの2’位または3’位はR21で置換されており；
R21は、Ｈ、OH、Ｆ、-O-アルキル（C1-C12）、-S-アルキル（C1-C12）、OC3H5、またはSC3H5であり；
ｎは０から98までの整数であり；そして
Ｂは、プリンまたはピリミジン塩基、あるいはそれらのアナログであり、但し、ここで少なくとも１つのＢは以下の副構造を有し、
0004098356.tif 000029
ここで、ａは１であり、ｂは０であって、
ＡはＮまたはＣであり；
ＸはＳまたはＯであり；
ＺはCH-Aと一緒になって、ベンゼン環、ナフタレン環またはピリジン環構造を形成する。
【請求項８】
前記隣接するＢ基が副構造（30）を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
核酸を非ヒト動物においてまたはインビトロで請求項７に記載の化合物と接触させる工程を包含する、二重鎖を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は標識の分野に関連し、特に診断用途の標識に関する。特に、本発明は、相補的配列に対してそのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させ、そしてさらに容易に検出可能な特性を有するように改変されるオリゴヌクレオチドに関する。
オリゴヌクレオチドが、一本鎖RNAおよびDNA、ならびに二本鎖DNAの両方に配列特異的に結合することは周知である。この現象は非常に多くの種類の診断、製剤、および治療目的に利用されている。これまで、当該分野における研究のひとつの目標は、このようなオリゴヌクレオチドのそれらの相補的配列に対する親和性を増大することであった。例えば、Froehlerらは、５個の置換されたピリミジン塩基を含むオリゴヌクレオチドが、相補的塩基に対するオリゴヌクレオチド結合のTmを実質的に増大すると記載している（国際公開番号第93/10820号）。
蛍光シトシン誘導体は、標識DNAプローブの調製における用途で公知である。Inoueら、日本国公開特許公報第JP 62059293号（1987）を参照のこと。さらに、蛍光標識ヌクレオチドはDNAシーケンシングに用いられている。Proberら、「Sciensce」，238:336-341（1987）を参照のこと。
ホスホジエステラーゼの阻害剤としての1,3-ジヒドロ-2H-イミダゾ［4,5-b］-キノリン-2-オン誘導体がRaeymaekersらにより開示されている（EP第541,153号）。
発明の目的
本発明の目的は、オリゴヌクレオチドのそれらの相補的配列に対する親和性を増大することである。
本発明の別の目的は、診断アッセイに使用するための改善された検出可能な標識を提供することである。
本発明のさらなる目的は、オリゴヌクレオチドを用いる診断的アッセイを向上させることである。
本発明のまたさらなる目的は、オリゴヌクレオチドの治療的有効性を改善することである。
本発明のこれらおよびその他の目的は、本明細書全体を考慮することにより明らかとなる。
構造式
構造式は、括弧付きの数字で命名される。本明細書中の炭素環および複素環に関連する芳香族性の命名は、任意の高度に共鳴性の不飽和環構造を包含することが理解される。あるいは２重結合の配置（示される場合）は、記載される化合物の１つの可能性のある構造を表すが、その化合物の他の共鳴状態、ならびにプロトン化した種および荷電した種を包含し、それらの１つのみが示されることが理解される。
発明の要旨
目的に従って、以下の構造を有する化合物、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、および塩が本明細書中に提供される：
0004098356.tif 000002
ここで、R1は結合パートナー、リンカー、またはＨであり；
ａおよびｂは０または１であり（但し、ここでａおよびｂの合計は０または１である）；
ＡはＮまたはＣであり；
ＸはＳ、Ｏ、-C（O）-、NH、またはNHCH2R6であり；
Ｙは-C（O）-であり；
ＺはCH-Aと一緒になって、５個もしくは６個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造を形成し、ここで、ヘテロアリール環は、１個のＯ環ヘテロ原子、１個のＮ環ヘテロ原子、１個のＳ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＯおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＳおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている２個のＮ環ヘテロ原子、またはそのうちの少なくとも２個が炭素原子により隔てられている３個のＮ環ヘテロ原子を含み、そしてここでアリールまたはヘテロアリール環炭素原子は未置換であるか、あるいは少なくとも１個の非架橋環炭素原子はR6または=Oで置換されており；
R3は保護基またはＨであり；
R6は、独立してＨ、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、NO2、N（R3）2、C≡Nまたはハロであるか、あるいはR6は隣接するR6と一緒になって、５個もしくは６個の環原子を含む環を完成し；但し、ここで、ａが０であり、ｂが１であり、かつR1が
0004098356.tif 000003
であり；
ここでD2が、独立してヒドロキシル、保護（blocked）ヒドロキシル、モノホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェート、あるいは他の場合は塩基Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＣのみを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドであり；そして
D3がＨまたはOHである場合には、
CH-Aと一緒になったＺは、未置換のフェニルではない。
結合パートナーR1がオリゴマーである場合、本発明の化合物の実施態様は、以下の構造（8）を有する：
0004098356.tif 000004
ここで、ＤはOHまたは保護OHであり；
D1は、オリゴヌクレオチドカップリング基またはOHであり；
X1は、独立してフラノース環の2’位または3’位に結合したホスホジエステル結合またはホスホジエステル置換結合であり、そして残りの2’位または3’位はR21と置換されており；
R21はＨ、OH、Ｆ、-O-アルキル（C1-C12）、-S-アルキル（C1-C12）、OC3H5、またはSC3H5であり；
ｎは、０から98までの整数であり；そして
Ｂは、プリンまたはピリミジン塩基あるいはそれらのアナログであり、但し、ここで少なくとも１つのＢは以下の構造を有する：
0004098356.tif 000005
ここで、ａ、ｂ、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、および但し書きは、構造（1）と同様である。
構造（1）の化合物は、いくつかの新規な中間体を通って作製される。4-ピリドンは以下の構造（2）を有する中間体、ならびにそれらの互変異性体、塩、および溶媒和物から得られる：
0004098356.tif 000006
ここで、R1はＨまたはリンカー基であり；
Ｊは、５個もしくは６個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造であり、ここで、ヘテロアリール環は、１個のＯ環ヘテロ原子、１個のＮ環ヘテロ原子、１個のＳ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＯおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＳおよび１個のＮ環ヘテロ原子、または炭素原子により隔てられている２個のＮ環ヘテロ原子を含み、そしてここで上記アリールまたはヘテロアリール環炭素原子は未置換であるか、あるいは少なくとも１個の非架橋環炭素原子がR6で置換されており；そして
R6は上記のように定義される。
2-ピリドンは、以下の構造（3）および（6）の中間体、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、および塩から合成される：
0004098356.tif 000007
ここで、R1はＨまたはリンカー基であり；
R22はC1-C3アルキルであり；そして
J’は、５個もしくは６個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造であり、ここで、ヘテロアリール環は、１個のＯ環ヘテロ原子、１個のＮ環ヘテロ原子、１個のＳ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＯおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＳおよび１個のＮ環ヘテロ原子、または炭素原子により隔てられている２個のＮ環ヘテロ原子を含み、そしてここで上記アリールまたはヘテロアリール環炭素原子は未置換であるか、あるいは少なくとも１個の非架橋環炭素原子は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、NO2、N（R3）2、またはハロで置換されており；
R3は保護基またはＨである。
0004098356.tif 000008
ここで、Ａは、独立してＳ、Ｏ、Ｎ、またはCR6であり；
R6は上記のように定義されており；そして
R26はC1-C4アルキルであり；そしてそれらの互変異性体、塩、および溶媒和物である。
フェノキサジンおよびオキサジアジンはまた、ピリジノピロリン、チアジン、およびオキサジンであるような、以下の新規な中間体（5）、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、および塩から作製される。
0004098356.tif 000009
ここで、R1はＨまたはリンカー基であり；
R24は、独立してハロまたはC1-C2ハロアルキルであり；
R25は、独立して-SH、-OH、=S、または=Oであり；
Ａは、独立してＮまたはＣであり；そして
Ｍは、-A-C（-R25）基と一緒になって、５個もしくは６個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造を完成し、ここで、ヘテロアリール環は、１個のＯ環ヘテロ原子、１個のＮ環ヘテロ原子、１個のＳ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＯおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＳおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている２個のＮ環ヘテロ原子、またはそのうちの少なくとも２個が炭素原子により隔てられている３個のＮ環ヘテロ原子を含み、そしてここで、アリールまたはヘテロアリール環炭素原子は未置換であるか、または少なくとも１個の非架橋環炭素原子はR6で置換されており；そして
R6は、上記のように定義されている。
フェノピロリンは、以下の構造（4）の中間体、ならびにそれらの互変異性体、塩、および溶媒和物を使用することにより作製される：
0004098356.tif 000010
ここで、R1はＨまたはリンカー基であり；
Ｊは、５個もしくは６個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造であり、ここで、ヘテロアリール環は、１個のＯ環ヘテロ原子、１個のＮ環ヘテロ原子、１個のＳ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＯおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＳおよび１個のＮ環ヘテロ原子、または炭素原子により隔てられている２個のＮ環ヘテロ原子を含み、そしてここで、アリールまたはヘテロアリール環炭素原子は未置換であるか、または少なくとも１個の非架橋環炭素原子はR6で置換されており；
R6は、上記のように定義されており；
R23は保護基である。
【図面の簡単な説明】
図中pR1は、ヒドロキシル基が（例えば、アセチル置換により）保護されたR1基を表し、そして他の置換基は上記で定義される。通常、図１〜10のスキームは、R1（リンカー基またはＨである）を用いて行われ；以下により詳細に記載されるように、ポリマーとの任意の共有結合はスキームに示される工程の後に達成される。
図１〜10は、それぞれ、本発明の化合物の調製方法を示す。便宜上、スキームは、ピリミジン基に縮合される全体または一部の環構造により命名される。図１〜10は、本発明の化合物である、ジアジン（図１）、トリアジン（図２）、2-ピリドン（図３）、4-ピリドン（図４、4-2、および4-3）、フェノピロリン（図５）、ピリジノピロリン（図６）、チアジンおよびオキサジン（図７）、フェノキサジン（図8-1〜8-2）、ナフチルオキサジン（図９）、およびオキサジアジン（図10-1および10-2）のための方法を示す。
図11は、リンカー置換チアジン誘導体を調製するためのスキームを示す。
図12-1〜12-2は、誘導されたホスホジエステル結合を含む本発明のオリゴマーを調製するための合成方法を示す。
発明の詳細な説明
構造（1）の化合物は２つの相互に機能する部分（interfunctional portion）を含有する。R1以外の構造（1）の部分は、多環式副構造と呼ばれ；これは蛍光性であり、ワトソン−クリック塩基対形成およびスタッキング相互作用に関与する。本発明の化合物の残りの部分であるR1は、水素原子、リンカー基、または結合パートナーを示す。多環式副構造、リンカー基、および結合パートナーは、引き続き以下に記載される。
構造（1）の化合物−多環式副構造
多環式副構造は、実質的に平面の縮合ヘテロアリールまたはアリール官能性であり、一般に塩基対形成においてシトシンの代理として機能し、そして多環式副構造を有する他の化合物と、あるいは多環式副構造を有さない発蛍光団または色原体のいずれかと共にエネルギー伝達に関与する能力を有する。多環式副構造はグアノシンと塩基対を形成し、一般に核酸またはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする際にシトシンとして機能する。さらに、下記のジアジン構造（9）の互変異性体は、シトシンアナログ（N*がプロトン化される場合）またはチミンアナログ（N3がプロトン化される場合）のいずれとしても機能し得る。
0004098356.tif 000011
構造（9）において、Ｘ、ａ、およびR1は上記で定義され、そして両方のR3’基は環化され、５個または６個の環原子を含有するヘテロアリール環構造を形成する。ここでヘテロアリール環は、１個のＯ環ヘテロ原子、１個のＮ環ヘテロ原子、１個のＳ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＯおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている１個のＳおよび１個のＮ環ヘテロ原子、炭素原子により隔てられている２個のＮ環ヘテロ原子、またはそのうちの少なくとも２個が炭素原子により隔てられている３個のＮ環ヘテロ原子であり、そしてここでアリールまたはヘテロアリール環炭素原子は未置換であるかまたは少なくとも１個の非架橋環炭素原子はR6で置換され；そして
R6は上記で定義されている。
多環式副構造は２つまたはそれ以上の縮合ヘテロ環またはアリール環に縮合したピリミジン基からなる。典型的には、ピリミジン基に縮合される環構造は、以下の構造（10）〜（17）を包含する；ここで（Ｎ）はピリミジンのＮとの結合を示す。
0004098356.tif 000012
Ｚを含む縮合環構造は重要ではない。典型的には、Ｚは隣接する環のC-CまたはC-Nと一緒になって、単環アリールあるいは５個または６個の環原子を含有するヘテロアリール基を完成するが、他の実施態様では隣接する環炭素原子上の複数のR6基は一緒になって、５個または６個環原子を有するさらなる環（通常はフェニル）を完成し、それにより縮合した二環（bicycle）が生じる。ＺがC-CまたはC-Nと一緒になってヘテロアリール基である場合の実施態様では、ヘテロ原子は、１〜３個のＮ原子、１個の酸素原子、１個のＳ原子、少なくとも１個の炭素原子により隔てられている１個の酸素または１個のＮ原子、少なくとも１個の炭素原子により隔てられている１個のＮ原子または１個のＳ原子からなる群より選択される。Ｚ環構造は、未置換であるか、または少なくとも１個の非架橋環炭素原子が=O（またはその互変異性体）またはR6で置換されるかのいずれかである。
通常、ＺはCH-Aと一緒になって、以下の構造（18）〜（20）の１つを形成する：
0004098356.tif 000013
ここでR6は上記で定義され；
A1はＮまたはCR6であり；そして
ＧはCH、Ｓ、Ｏ、またはNR4であり、R4は以下で定義される。
構造（19）の実施態様は、構造（21）である：
0004098356.tif 000014
ここでR4はＨまたはC1〜C6アルキルであり；そして
R5はＨ、NO2、またはC1〜C6アルキルである。
構造（18）の実施態様は、構造（22）である：
0004098356.tif 000015
ここでR2はC1〜C6アルキルであり、そしてR6はＨである。
構造（20）の実施態様は、構造（23）〜（25）である：
0004098356.tif 000016
ここでＡおよびR6は上記で定義される。
通常、前記の構造において、R6はＨ、C1〜C6アルキル（ｎ、ｓ、またはｔ）、NO2、NH2、CNまたはハロゲンであり、あるいは隣接するR6は一緒になってフェニルを完成するが、隣接するR6はまた一緒になってチアゾール、イミダゾール、オキサゾール、ピリジン、またはピリミジン環を完成する。R6アミノ基は、多環式副構造が中間体として用いられる場合、特にR1がオリゴヌクレオチドを調製するために使用が意図されるリンカーである場合には、保護基（典型的には塩基に不安定（base labile））を用いて求電子剤に対して保護される。
置換基R1−リンカー
R1リンカー基は、多環式副構造を選択された結合パートナーに共有結合するために用いられるが、これはリンカーの官能性の唯一の利用ではないことが理解される。それゆえ、R1リンカーに存在する基は、主に多環式副構造を結合パートナーに共有結合させるための部位として、典型的には、グラフト化または共重合によるポリマー性結合パートナーにリンカー残基を介して多環式副構造を取り込むことによって機能する。
R1リンカーはまた、通常は結合パートナーへの結合に関与しない置換基（例えば、ハロ、アジド、および保護されたヒドロキシル）により、任意に置換される。一般に、リンカー基は２〜約50原子を含有する。環を有する場合には、その環官能性は、典型的には酸素、イオウ、またはリンを含有する飽和または不飽和ヘテロ環である。このヘテロ環は、合計約５〜７個の環原子、および１〜３個のヘテロ原子を有する。ほとんどの場合、環は糖であり、典型的にはフラノース、あるいはリン酸、保護されたホスフェート、ヒドロキシル、または保護されたヒドロキシルで置換されたフラノースである。通常、R1は、塩基のない（abasic）ヌクレオチド残基、またはオリゴヌクレオチドへの取り込みが可能なように誘導された残基である。それゆえ、R1リンカーは、しばしば活性化された基あるいは多環式副構造で標識されるようにポリマーまたは他の結合パートナーと反応し得る他の基を含む。例えば、一般的に利用されるオリゴヌクレオチド合成化学に適合する下記の置換基が有用である。共有結合による標識のための反応基の他の例には、診断分野からのものが周知であり、以下で十分に述べるように、タンパク質およびオリゴヌクレオチドプローブの標識にこれまで一般に使用されている。
１つの実施態様では、R1はアルキル、アルケン、アルキン、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、アルコキシ、飽和または不飽和ヘテロ環などのような有機リンカー基である。これらは、任意にポリマーに架橋されるかまたは取り込まれ得る少なくとも１つの基（例えば、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、ビニル、ホスフェート、ホスホネート）で置換される。このようなリンカーの典型的な例には以下が挙げられる：
0004098356.tif 000017
ここでＤはオリゴヌクレオチドカップリング基であり；
D1は独立してＦ、Ｈ、O-アルキル、S-アルキル、またはオリゴヌクレオチドカップリング基であるが、１個のD1のみがカップリング基であり；
Ｑは-C（R12）2-CH2-、C（R12）2-O-、-CR12=CR12-、または-C≡C-であり；
R7は独立してＨまたはC1〜C4アルキルであり；
R8はＨ、あるいはC1〜C4アルキル、C2〜C4アルケニル、またはアザイドメチルであり；
R9はハロ、Ｈ、またはOR20であり；
R10はＯ、CH2、または共有結合であり；
R11はＯ、Ｓ、CH2、CHF、またはCF2であり；
R12は独立してＨまたはハロゲンであり；
R13はＨ、ハロゲン、OR20、CH3、CH2OR20、またはC3〜C6アシルオキシアルキルであり；
R14はＨ、ハロゲン、OR20、CH3、CH2OR20、C3〜C6アシルオキシメチル、またはC2〜C6アシルオキシであり；
R15はCH2、CHF、またはＯであり；
R16はCHまたはＳであるが、但し、R19がＯまたはＳであり、あるいはR15がCHである場合には、R16はＳでない；
R17はＨ、OR20、ハロゲン、N3、C1〜C4アルキル、またはC1〜C4アルコキシであり、あるいはR16がＳの場合には存在しない；
R18はＨ、OR20、ハロゲン、N3、C1〜C4アルキル、またはC1〜C4アルコキシであり；
R19はＯ、Ｓ、CH2、CHF、またはCF2であり；
R20はＨまたは保護基であり；
m1は独立して０または１〜４の整数であり；そして
ＥはOH、OR20、-PO2-、または-OP（O）2である。
本発明のいくつかの実施態様では、リンカー基は、HOCH（CHR13）CH2-またはECH2OCH（CHR13）CH2-である。本発明の実施態様において構造（1）の化合物がオリゴヌクレオチドの調製においてモノマーとして使用される場合には、R1は上記の副構造（29）であり、ここでＤまたはD1はオリゴヌクレオチドカップリング基である。本明細書中で用いられる用語「カップリング基」は、ヌクレオチド塩基またはそれらのアナログの間で結合またはホスホジエステル置換結合を生じるに適切な任意の基を意味する。これらのカップリング基はオリゴヌクレオチドの調製のために一般的であり周知であり、そして本明細書中においても同様の態様で調製および使用される。これらは副構造（29）において示されるようなβアノマーとしてまたはαアノマーとして形成され得る。一般に、副構造（29）を含む各々の化合物は２個のカップリング基を含有する：ＤまたはD1、しかし１個のD1のみがカップリング基である。カップリング基は公知の方法に従った3’-5’、5’-3’、5’-2’、および2’-5’ヌクレオチド間結合の調製における中間体として用いられる。
ホスホジエステル結合のための適切なカップリング基は以下を包含する：OH、H-ホスホネート（図12-1）；（アミダイト化学用）アルキルホスホンアミダイトまたはホスホルアミダイト（例えば、β-シアノエチルホスホルアミダイト）（図12-2および12-3）、N,N-ジイソプロピルアミノ-β-シアノエトキシホスフィン、N,N-ジイソプロピルアミノ-メトキシホスフィン、N,N-ジエチルアミノ-メトキシホスフィン、N,N-ジエチルアミノ-β-シアノエトキシホスフィン、N-モルホリノ-β-シアノエトキシホスフィン、N-モルホリノメトキシホスフィン、ビス-モルホリノ-ホスフィン、N,N-ジメチルアミノ-β-シアノエチルメルカプト-ホスフィン、N,N-ジメチルアミノ-2,4-ジクロロベンジルメルカプト-ホスフィン、およびビス（N,N-ジイソプロピルアミノ）-ホスフィン；および（トリエステル化学用）2-、または4-クロロフェニルホスフェート、2,4-ジクロロフェニルホスフェート、または2,4-ジブロモフェニルホスフェート。米国特許第4,725,677号；第4,415,732号；第4,458,066号；および第4,959,463号；ならびにPCT第92/07864号を参照のこと。D1がカップリング基の場合には、Ｄは典型的には、２量体形成よりむしろモノマーのオリゴマーへの付加を確実にするために適切な基でブロックされたヒドロキシルとなる。このような基は周知であり、DMT、MMT、FMOC（9-フルオレニルメトキシカルボニル）、PAC（フェノキシアセチル）、TBDMS（t-ブチルジフェニルシリル）およびTMS（トリメチルシリル）のようなシリルエーテルを包含する。明らかに、逆方向（5’→3’）のオリゴマーの合成が所望される場合は逆が適用される。通常、ＤはDMTであり、D1は3’炭素に位置し、残りのD1はＨであり、そしてD1基はαアノマー配座にある。
置換基R1−結合パートナー
結合パートナーは、検出されることが望まれる任意の物質（被検体（analyte））または被検体に非共有的に結合する物質である。結合パートナーはイムノアッセイ分野で周知であり、そしてEMITまたはELISA技術を用いた薬物イムノアッセイにおいて利用されるようなハプテン−抗体対が包含される。結合パートナーは酵素学において分析的に用いられ、ここで基質または酵素が標識される。結合パートナーはまたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション分野でも公知であり、オリゴヌクレオチド−核酸結合パートナー（診断プローブまたは治療アンチセンスオリゴヌクレオチドとして）またはオリゴヌクレオチド−タンパク質結合パートナー（アプタマー（aptamer））が包含される。本発明に従い、多環式副構造は、R1で任意の結合パートナーにより置換される。結合パートナーは薬物、ハプテン、基質などのような低分子であり得るが、通常はポリマーである。
R1がポリマーである場合の構造（1）の化合物は、本発明の重要な特徴である。大部分において、R1がポリマーである場合、R1リンカー基は（モノマーユニットとしてまたは既存のポリマーへのグラフト化によるのいずれかで）ポリマー構造に含まれている。それゆえR1がポリマーである場合、ポリマーは、リンカー基の残基を含有し得ることが理解される。ここで、リンカー残基はモノマーサブユニットにより生成したか、あるいはポリマーのモノマーサブユニットとは別に生成したものであった。多環式副構造がポリマーに共有結合され得ることが、必要とされるすべてである。
ポリマーの性質は、重要ではない。典型的にはR1ポリマーは、オリゴヌクレオチド、タンパク質（抗体、酵素、細胞膜タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、および核タンパク質を包含する）、ペプチド、核酸、あるいはグリカンまたはその他の多糖類または炭水化物のような生体高分子を包含する。特定の実施態様では、ポリマーは、オリゴヌクレオチドアナログである。このオリゴヌクレオチドアナログにおいて、糖またはホスホジエステルサブユニットのいずれかまたは両方は、多環式副構造が塩基対合を許容し続け得る基により置換されているが、このオリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホジエステル結合の負電荷をマスクしているもの、またはホスホジエステル結合を別の基に置き換えているもの）は、元々の置換基には分配されていない他の所望される特性を有している。
構造（1）の多環によるポリマー置換の部位は重要ではない。一般に、ポリマー上の任意の反応基は、既存ポリマーにリンカー−置換多環式副構造をグラフト化することが所望される場合の要件を満たす。明らかに置換部位は、多環式副構造がポリマーのために意図されている官能基を干渉する位置にあるべきではない（例えば、当業者に理解されるような酵素活性部位、抗体CDRなど）。リジン、グルタミン酸、セリン、アスパラギンなどの側鎖のようなアミノ酸側鎖は（αアミノ基にように）、タンパク質R1にグラフト化するための要件を満たす。但し、この場合問題のアミノ酸は、標識タンパク質が使用されるアッセイに含まれる結合パートナーまたはリガンド/基質相互作用に関与しない。同様の理由が、結合部位、あるいは糖、グリカン、脂質などのような他の被検体上の部位の選択に使用される。例えば、リボースまたはデオキシリボースの1’位は、多環式副構造によるオリゴヌクレオチドの置換部位としての要件を満たす。適切な部位は、特に多環式副構造が従来用いられている他の蛍光標識に置換することが意図される場合には、当業者に公知である。
本発明の多環式塩基による置換の程度は重要ではない。当業者は、生じる標識ポリマーが所望される分析的、治療的、または調製的手順における使用を容易にするに十分な多環式副構造のモル比率で置換されるように反応条件を選択する。これは標識ポリマーの調製を種々の従来の一般的な条件（例えば、標識反応の時間、温度、または期間）下で調製することにより達成され、複数箇所標識されたポリマーのマトリックスを生じる。次いで、この標識ポリマーは意図される適用における適切性についてスクリーニングされる。ポリマーに対する約1:1〜10:1の標識のモル比が一般に適切である。標識ポリマーがモノマー取り込みにより調製される場合は、生じるポリマーは約１%〜100%の多環式副構造置換を含み得る。この実施態様において、本発明のそれぞれの多環式塩基は、（たとえポリマーがシントン当たり２またはそれ以上の本発明の多環式副構造を含有する中間体シントンから構築されていても）モノマーユニットであると考えられる。
オリゴマーは、少なくとも２個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含有するポリマーであり、これらの少なくとも１個は、本発明の多環式副構造を含有する。本発明のほとんどの実施態様において、少なくとも１個の多環式副構造は、ヌクレオチド塩基に、あるいは同一または異なる多環式副構造に、塩基および単数または複数の副構造が相補的塩基にハイブリダイズし得るに十分な自由度のある有機部分により共有結合される。この結合は、通常のホスホジエステル結合であり得、ここで多環式構造（R1がデオキシリボシルまたはリボシルである）を含有するヌクレオチドアナログが一般的な方法でオリゴヌクレオチドに取り込まれる。あるいは、他の基が、ホスホジエステル結合、またはある場合ではホスホジエステル結合および糖基の両方を置換するために使用される。これらの置換基は本明細書中の目的のために置換結合と称される。
置換結合は先行文献において周知である。これらは例えば、以下が挙げられる。ホスホロジチオエート（Marshal，「Science」259:1564, 1993）、ホスホロチオエートおよびアルキルホスホネート（Kibler-Herzog，「Nucleic Acids Research」［以降「NAR」］19:2979, 1991；PCT第92/01020号；EP第288,163号；図12-1）、ホスホロアミデート（Froehler，「NAR」16:4831, 1988）、ホスホトリエステル（Marcus-Sekura，「NAR」15:5749, 1987）、ボラノホスフェート（Sood，「J. Am. Chem. Soc.」［以降JACS］112:9000, 1991）、3’-O-5’-S-ホスホロチオエート（Mag，「NAR」19:1437, 1991）、3’-S-5’-O-ホスホロチオエート（Kyle，「Biochemistry」31:3012, 1992）、3’-CH2-5’-O-ホスホネート（Heinemann，「NAR」19:427, 1991）、3’-NH-5’-O-ホスホネート（Mag，「Tet. Ltt.」33:7323, 1992）、スルホネートおよびスルホンアミド（Reynolds，「J. Org. Chem.」［以降「JOC」］57:2983, 1992）、スルホン（Huie，「JOC」57:4519, 1992）、スルホキシド（Huang，「JOC」56:3869, 1991）、スルフィド（Schneider，「Tet Ltt.」30:335, 1989）、スルファメート、ケタール、およびホルムアセタール（Matteucci，「JACS」113:7767, 1991，PCT第92/03385号およびPCT第90/06110号）、3’-チオホルムアセタール（Jones，「JOC」58:2983, 1993）、5’-S-チオエーテル（Kawai，「Nucleosides Nucleotides」10:1485, 1991）、カルボネート（Gait，「J. Chem. Soc. Perkin Trans 1」1389, 1979）、カルバメート（Stirchak「JOC」52:4202, 1987）、ヒドロキシルアミン（Vasseur，「JACS」114:4006, 1992）、メチルアミン（メチルイミン）およびメチレンオキシ（メチルイミノ）（Debart，「Bioorg. Med. Chem. Lett.」2:1479, 1992）、およびアミノ（PCT第91/06855号）を包含する。ヒドラジノおよびシロキサン（米国特許第5,214,134号）結合もまた重要である。
置換結合それ自体はまた、通常のオリゴヌクレオチドの全体のホスホリボシル結合の置換について知られている。これらとしては、例えばモルフォリノ−カルバメート（Stirchak，「NAR」17:6129, 1989）、ペプチド（Nielsenら、「Science」254:1497, 1991；U.S.S.N第07/892,902号および第07/894,397号）、およびリボアセタール結合（PCT第92/10793号）が挙げられる。
置換結合のさらなる開示は、PCT第91/08213号、第90/15065号、第91/15500号、第92/20702第、第92/20822号、第92/20823号、第92/04294号、第89/12060号、および第91/03680号；Mertes，「J. Med. Chem.」12:154, 1969；Mungall，「JOC」42:703, 1977；Wang，「Tet Lett」32:7385, 1991；Stirchak，「NAR」17:6129, 1989；Hewitt，「Nucleosides and Nucleotides」11:1661, 1992；および米国特許第5,034,506号および第5,142,047号に見られる。
本明細書中のホスホジエステルまたは置換結合は、リボースまたはリボースアナログの2’または3’炭素原子を隣接するリボースまたはリボースアナログの5’炭素原子に結合するために用いられる。通常、オリゴヌクレオチドにおける結合は、5’末端オリゴヌクレオチドの3’原子を次の3’-隣接ヌクレオチドまたはそのアナログの5’炭素に結合するために用いられる。
下記の表１に、本発明の多環式ヌクレオチドアナログ塩基との使用に適切な置換結合の種々の例を示す。D（5’）およびD1（3’または2’）と名付けられた欄は、それ自体が当該分野に公知でありU.S.S.N.第07/892,902号およびその他の上記の引用文献に記載されている方法を使用して、構造（8）のX1結合（右の欄に記載）を生成させるために使用される副構造（29）の置換基を示す。表１中の出発物質または表１の出発物質を調製するために使用される物質は、一般にR1が5’ヒドロキシル基および3’または2’ヒドロキシル基を含有するリボースまたはリボースアナログである構造（1）を有し、本明細書中または引用文献に記載されるように調製され、多環式塩基は引用文献において使用される塩基の代わりに用いられる。続いて生成する有用な出発物質を矢印で示す。カッコのモノマーが反応して、X1置換結合を有するジヌクレオチドアナログを形成する。反応は、トリマー、テトラマー、または約98塩基までを包含するより大きなオリゴマーを生成するために、繰り返されるかまたはホスホジエステル結合と連結される。
B1はブロッキング基を意味する。本明細書中で用いられる「ブロッキング基」はＨ以外の置換基を意味し、この基は、通常保護基、合成のためのカップリング基、PO3-2、または固体支持体のような他の一般的な複合体のいずれかとして、オリゴマーまたはヌクレオチドモノマーに通常付加される。本明細書中で用いられる「ブロッキング基」は単にヌクレオチド保護基として解釈されるだけでなく、例えばホスホン酸水素、ホスホルアミダイトおよび上記のような他のカップリング基もまた包含することも意図する。従って、ブロッキング基は「保護基」属の種であり、本明細書中で用いられるように、それが付加されるO-原子またはN-原子が構造（1）の中間化合物を含む反応に関与すること、あるいは望ましくない共有結合を形成することを防止し得る任意の基を意味する。このようなヌクレオチドモノマーまたはヌクレオシドモノマーにおけるO-およびN-原子のための保護基は記載されており、そしてこれらの導入の方法は当該分野で一般的に公知である。保護基はまた、当業者に理解されるように、カルボン酸、チオールなどにおける反応および結合の防止に有用である。
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本発明のオリゴマーは、天然に存在するヌクレオチドまたはその誘導体を包含する。いくつかのオリゴヌクレオチド実施態様では、随伴の（companion）ヌクレオチド残基は、遠位で他の原子（例えば、1-アルケニル、1-アルキニル、ヘテロ芳香族、ならびに1-アルキニル-ヘテロ芳香族基）にPi結合される炭素原子により５位で置換されたピリミジンヌクレオチド（例えば、5-プロピニル-シトシンおよび-ウリジンヌクレオチド）を含有する。（US第92/10115号および米国出願第08/050,698号を参照のこと）。本明細書中で使用する他の天然塩基アナログは、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、あるいは他のプリンまたはピリミジン塩基のアナログならびにそれらのアザアナログおよびデアザアナログを包含する。これらは例えば、N4,N4-エタノシトシン、7-デアザキサントシン、7-デアザグアノシン、8-オキソ-N6-メチルアデニン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、N6-イソペンテニル-アデニン、1-メチルアデニン、2-メチルグアニン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メトキシウラシル、疑似ウラシル（pseudouracil）、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-（1-プロピニル）-4-チオウラシル、5-（1-プロピニル）-2-チオウラシル、5-（1-プロピニル）-2-チオシトシン、2-チオチミジン、および2,6-ジアミノプリンを包含する。これらの塩基アナログに加えて、6-アザシトシン、6-アザチミジン、および5-トリフルオロメチルウラシルを包含するピリミジンアナログ（Cook,D. P. ら、国際公開第WO 92/02258号）が、都合良く本発明のオリゴマーに取り込まれ得る。
好ましい塩基は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、5-メチルシトシン、5-（1-プロピニル）ウラシル、5-（1-プロピニル）シトシン、8-オキソ-N6-メチルアデニン、7-デアザ-7-メチルグアニン、7-デアザ-7-メチルアデニン、および7-デアザキサントシンを包含する。
本発明のオリゴマーの実施態様は、オリゴマーと核酸２本鎖または１本鎖との間に少なくとも１つの共有結合することができる部分を含む。複数の共有結合もまたこのような架橋部分を複数提供することにより形成され得る。共有結合は標的鎖中の塩基残基に対してであることが好ましいが、他の標的部分（サッカリドまたはホスホジエステルを包含する）によっても形成され得る。好ましい架橋部分は、アシル化およびアルキル化剤を含み、特に、鎖中の標的位置と反応し得るように、配列特異性を与える部分に関係して配置される。例示的な架橋部分はPCT第91/03680号に開示され請求される。Praseuth（「P.N.A.S. USA」85:1349, 1988）、Fedorova（「FEBS」228:273, 1988）、Meyer（「J. Am. Chem. Soc.」111:8517, 1989）、Lee（「Biochemistry」27:3197, 1988）、Horne（「J. Am. Chem. Soc.」112:2435, 1990）、Shaw（「J. Am. Chem. Soc.」113:7765, 1991）もまた参照のこと。
逆方向性のオリゴマーもまた本発明の範囲である。「逆方向性（Inverted polarity）」は反対の方向性を有する縦列配列を含むオリゴマー、すなわち5’→3’の方向性を有する配列とそれに続く3’→5’の方向性を有する別の配列、またはその逆、を意味する。これらの配列は、効果的な3’-3’ヌクレオシド間連結（どのように結合が達成されても）、または効果的な5’-5’ヌクレオシド間連結とみなされ得る結合により接続される。このようなオリゴマーを作製するために適切な方法のさらなる記載についてはPCT第92/10115号を参照のこと。3’-3’反転または5’-5’反転のいずれかを用いるAT結合によって固定されるヘアピンを形成させるように設計される、「並行鎖DNA」の組成物は、van de Sande（「Science」241:551, 1988）により合成されている。さらに、3’-3’結合を含むオリゴマーが記載されている（Horne,前出；およびFroehler「Biochemistry」31:1603, 1992）。これらのオリゴマーは、標的遺伝子発現の発現阻害法として、２本鎖核酸の結合パートナーとして３重らせん（triplex）複合体を形成するために有用である（PCT第89/05769号および第91/09321号）。
合成方法
R1がリンカーまたはＨである構造（1）の化合物は、それ自体当該分野で公知の方法により調製され、そして以下により十分に記載される。典型的に、このような化合物は図１から10の合成スキームに示されるようなシトシンまたはシトシン-1-イルリンカー置換誘導体から調製され、ここで出発物質はあらかじめR1で置換され、そしてその後の反応は多環式環を閉じるよう方向付けられる。これらの実施態様において、ヒドロキシル基、アミノ基、および他のあらゆるR1の不安定基は、スキームに要求されるように保護される。別のアプローチでは、出発物質のR1はＨであり、そしてリンカーはスキームに示される閉環段階の後に付与される。このアプローチは、抗ウィルス化合物としての使用が意図されるピリミジン塩基のアルキル化において従来用いられている同じ様式である。例えば一般的な手順は、予め形成したR1副構造を有する適切な有機リンシントンを用いるピリミジン塩基のアルキル化について存在する。これらの化学は非環状および環状ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびヌクレオチドホスホネートアナログの調製のために既に周知である。これらは、R1がリンカーまたはＨである構造（1）の化合物を調製するために本明細書中に記載されたスキームを用いる使用に容易に適合される。
図６のスキームは縮合ピロリン化合物に好適であり、ここでピリミジン基に直接縮合される環は、N-含有ヘテロ環である；この環がアリールである場合、図５のスキームが好ましい。
図11のスキームは、Nielsenら、前出、において開示される種類のペプチド置換結合のための、あるいはタンパク質またはポリペプチドへの架橋結合または組み込みのためのカルボキシアルキルリンカーを調製するための出発物質の調製に有用である。
R1がポリマーのような結合パートナーである実施態様では、本発明の化合物は、本発明のリンカー修飾多環式塩基を結合パートナーに共有結合的に架橋することにより、または（結合パートナーがポリマーの場合は）本発明の多環式塩基により置換されるモノマーユニットをポリマーに組み込むことにより合成される。
第１の実施態様（ポリマーグラフト化）では、リンカー置換多環式副構造は通常の架橋剤によってポリマーに共有結合される。最も一般的には、R1がヒドロキシル置換またはアミノ置換されたアルキルである構造（1）の化合物は上記のように標識される分子に存在する反応基に容易に架橋される。代表的な架橋剤としては、無水コハク酸、DCC、EDC、BOP、およびグルタルアルデヒドが挙げられる。臭化シアンで活性化された炭水化物もまた使用される。架橋剤は、従来ポリマーがリガンド（例えば、ヒドロキシルまたはアミノを有する部分）に架橋されるのと同様の様式で、リンカー置換された多環のポリマーをポリマーに結合させるために、使用される。適切な方法の例はそれ自体Cookら、米国特許第5,218,105号に記載されている。この方法は、アミノ置換R1リンカーをオリゴヌクレオチドの5’末端に共有結合することに容易に適用される。
第２の実施態様（共重合）では、リンカーは、他のモノマーユニットとの共重合のためにモノマーとして機能し得、このモノマーユニットは、構造（1）の多環式副構造により置換され得ているかまたはされ得ていない。いくつかの実施態様では、R1リンカーは、アルキルカルボキシレート、アルキルアミン、またはインビトロ方法によりペプチドに取り込むためのアミノ酸である。しかし、代表的な実施態様では、R1ポリマー性結合パートナーは、構造（8）で示されるようなオリゴヌクレオチドであり、そしてこれらは、都合良く、多環式副構造で置換されたヌクレオチドアナログとの共重合により作製される。構造（8）の合成のための出発物質は、一般に、R1が上でさらに記載された適切なブロッキング基およびカップリング基で置換されたリボースまたはデオキシリボースである、構造（1）化合物である。置換結合を有するオリゴヌクレオチドのための適切な開始モノマーは表１に記載され、そしてこのモノマーは、文献に記載される他のヌクレオチドアナログ塩基と同様の様式で調製される。同様に、一般的なホスホジエステル結合は上記のカップリング基ＤおよびD1を含有するヌクレオチドアナログから調製される。次いで本発明の化合物は、文献の方法に記載されるインビトロ合成の公知の方法により、所望のオリゴヌクレオチドに取り込まれる。あるいは、多環式副構造置換されたヌクレオチド三リン酸は、シトシンアナログとしてDNAポリメリラーゼまたは逆転写酵素を用いてインビボまたはインビトロでオリゴヌクレオチドに取り込まれ得る（Ward、米国特許第4,711,955を参照のこと）。この場合において、R1はリボシルまたはデオキシリボシル三リン酸、あるいはDNAポリメリラーゼまたは逆転写酵素によって認識されるそれらの三リン酸化アナログであり、次いで鋳型に従った転写によりオリゴヌクレオチドに取り込まれる。
約３個またはそれ以上のヌクレオチド残基を含有するオリゴマーの合成は、好ましくは、二量体（置換結合またはジエステル結合を含む）または三量体（それぞれがアミダイト、H-ホスホネート、またはトリエステル化学を用いる使用に適切な末端カップリング基を有する）のようなシントンを用いて達成される。次いでシントンは、ホスホジエステルまたはリン含有置換結合を介してオリゴマーまたは他のシントンに結合される。
メチルホスホネートおよびホスホジエステル結合を含むオリゴマーは、固相オリゴマー合成技術により容易に調製される。ホスホロチオエート結合オリゴマーの合成において有用な修飾の記載は、例えばEP第288,163号に見られ、ここでアミダイト化学を用いる固相自動化合成における酸化段階は、ホスホロチオエートを得るために任意の段階で独立して調整され得る。ホスホロチオエート結合を有するオリゴマーの合成のための別の方法（ホスホン酸水素化学による）もまた記載されている（Froehler「NAR」14:5399, 1986）。硫酸化はテトラエチルチウラムジスルフィド、ジベンゾイルテトラスルフィド、チオホスホン酸ジスルフィド、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドなどの試薬を使用して記載のように（Vu，「Tet Lett」26:3005, 1991；Rao，「Tet Lett」33:4839, 1992；米国特許第5,151,510号；Iyer，「JOC」55:4693, 1990；Dahl，「Sulfur Reports」11:167, 1991）達成される。これらの硫酸化試薬は、ホスホルアミダイトまたはホスホン酸水素化学のいずれかを用いて使用される。制御された立体化学を有するホスホロチオエートオリゴマーの合成は、立体規則性の本発明のオリゴマーを生じるために記載のように（EP第506,242号）使用される。チオノメチルホスホネートはメチルホスホンアミダイトとそれに続く硫酸化によって記載されるように（Roelen，「Tet Lett」33:2357, 1992）、または上記の硫酸化試薬を用いて調製される。
本発明の化合物の使用
本発明の化合物は、診断、分析、および治療分野における使用、またはこのような分野に有用な化合物の調製における中間体としての使用が見出される。
リンカー置換した構造（1）の化合物は、構造（1）の標識した生体高分子の調製における中間体として有用である。ここで、生体高分子は蛍光を発するようになるか、または他の場合は、多環式副構造に結合することにより検出可能に標識される。しかし、最も便利なのは、適切な構造（1）の化合物を、構造（1）の核酸またはオリゴヌクレオチドの調製におけるモノマーとして使用することである。標識した生体高分子は、他の発蛍光団標識した生体高分子と同様の様式で診断アッセイまたは予備的手順（例えば、蛍光偏光法における、蛍光活性化細胞選別、競争型EMIT免疫アッセイなど）に用いられる。
モノマーは、診断的使用または治療的使用のためのオリゴヌクレオチドを調製する際に特に用いられる。多環式副構造を有する２またはそれ以上の隣接するヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを有する、オリゴヌクレオチドは、非常に増加したTmを示すので、このようなオリゴヌクレオチドは、非常に安定な二重らせんハイブリダイゼーション構造が所望される治療的用途または診断的用途において有用である。これらのオリゴヌクレオチドは蛍光を発するので、オリゴヌクレオチドの蛍光の変化は、オリゴヌクレオチドが相補的核酸またはオリゴヌクレオチド配列に結合するのに続いて生じ得る。これらの変化（change）は、エネルギー移動の変化（modification）（例えば、蛍光クエンチング、あるいは１つもしくは複数の活性化または発光波長のシフト）として検出可能である。
多環式副構造を標識したオリゴヌクレオチドは、他の標識したオリゴヌクレオチドと同様の様式で診断方法または分析方法に用いられる。例えば、オリゴヌクレオチドは、塩基対構造（1）を結合し得る抗体が用いられることにより、オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との結合を検出するハイブリダイゼーション法に用いられる。さらに、蛍光の特徴の変化は、上記のようにアッセイされ得る。EP第70,685号の一般的な方法に従って、多環式副構造を標識した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションアッセイに用いられる。１つのオリゴヌクレオチドには、その3’末端でヌクレオチドを含む多環式副構造が標識され、一方で、他のヌクレオチドにはその5’末端で同一または他の多環式副構造が、あるいはエネルギー移動し得るフルオレセインまたはローダミンのような異なる発蛍光団が標識される。２つのオリゴヌクレオチドは、標的配列の3’末端が3’末端の発蛍光団を有するオリゴヌクレオチドに結合しそして該標的の隣接する5’配列が5’末端の発蛍光団を有するオリゴヌクレオチドに結合する、相補的な配列を認識する。結合は、オリゴマーが例示したモデルに従ってタンデムに結合する際に、オリゴマーのいずれかまたは両方の蛍光の変化を測定することによりアッセイされる。他の実施態様においては、１つの標識したオリゴヌクレオチドのみがハイブリダイゼーション法に用いられる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、液相ハイブリダイゼーション診断に有用である。すなわち、標識したオリゴヌクレオチドの結合を検出するために相分離を行うことは必要ではない。
構造（1）のモノマー（三リン酸化され、そして鎖の末端にR’リボースまたはデオキシリボース誘導体を含む場合（例えば、ここで、R17、R18、および両方のD1はヒドロキシルでない））は、他のリンカーを付与した発蛍光団を有するddNTPと同様の一般的様式の蛍光鎖終結ジデオキシヌクレオチド配列決定の方法に有用である。
構造（1）の化合物は、ワトソン-クリック塩基対合に関与し得るので、それらは核酸に結合し、それ故、グアノシンを含有する核酸の存在を検出するのに有用である。
相補的配列と高融解二重らせんを形成し得る構造（1）のオリゴヌクレオチドは、多くのプロセスに有用である。このプロセスには、インビボまたはインビトロのアンチセンスまたはコードブロッキング用途および診断が挙げられる。高融解二重らせんは、通常、天然に存在する塩基（例えば、アデノシン、シチジン、ウリジン、グアノシン、チミジンなど）を含む同様の配列のオリゴヌクレオチドまたは核酸二重らせんの融解温度を実質的に上回る融解温度を有するものである。「実質的に上回る」とは、誘導体オリゴヌクレオチドが、その相補的配列とハイブリダイズされる際に、温度が約２℃〜40℃、通常は約８℃〜40℃、類似の通常のＡ、Ｃ、Ｕ、Ｇ、またはＴ塩基を有する同様のオリゴヌクレオチドの解離温度を上回るが、約95℃よりも高くない温度を生じるまで二重らせんから解離しないことを意味する。これはΔTmとして知られている。通常、ΔTmは、Jonesら、「JOC」58:2983（1993）に記載の方法に従って、相補的RNAへのコントロールオリゴヌクレオチドの結合と、同じRNAへのテストオリゴヌクレオチドの結合とを比較することにより測定される。
高融解二重らせんを形成する本発明の化合物の能力を、以下のデータに示す。本発明の多環式シチジン誘導体を、従来のリン酸ジエステル化学により２つのテスト15マーオリゴヌクレオチドに取り込んだ。テスト配列は、Jonesら、「JOC」前述に記載の「化合物26」RNAの配列に相補的である。１つのテストオリゴヌクレオチド（「homo-3」）においては、３つの指定された多環式物を、オリゴヌクレオチド内にタンデムに、すなわち、XXX（テストオリゴ内のＣトリプレット）として挿入した。他のオリゴヌクレオチド（「alt-3」）においては、３つの多環式物は隣接していないが、代わりに１個〜５個の塩基（テストオリゴ内の非隣接シチジン塩基）により隔てられていた。残りの塩基は、参照の配列から推定すると、ＣおよびＴであった。（本発明の塩基を含有するhomo-3オリゴヌクレオチド「5-プロピンdC（homoＣ）」に類似する）5-プロピンデオキシＣトリプレットを含有する比較オリゴヌクレオチドを調製し、そして同様のアッセイ系でテストした。ΔTmを、同様の配列を含むコントロールオリゴヌクレオチドのTmに対して計算したが、テストオリゴヌクレオチドのシチジン塩基の代わりに5-メチルデオキシＣを用いた。テスト多環式物の構造を、以下の表に示すTmの呼称（例えば、「ベンゼン三環式Ｃ」）のように、以下に示す（「dR」はデオキシリボースである）。
0004098356.tif 000020
0004098356.tif 000021
このデータは、本発明のオリゴヌクレオチド、特に新規な塩基のタンデム配置を有するオリゴヌクレオチドにより得られた融点の増大を示す。一般に、このようなタンデム配置は、２個〜約10個の多環式塩基を含む。これらは同一または異なる多環式物であり得るが、一般に同一の多環式物である。それらはまた、必要に応じて公知のアルキニル置換基を含有するプリンまたはピリミジン塩基（PCT 92/10115号およびUSSN 08/050,698号）（特に、Pi結合により他の原子に結合する炭素原子と5位で置換されたピリミジン塩基）、またはInoueら（前出）の蛍光シチジン誘導体と共重合される。
フェノチアジンおよびフェノキサジンデオキシリボシド化合物は、それぞれEx380nm/EM492nmおよびEx360nm/EM450nmの励起および発光波長を有し、そして強い蛍光を発する。これらの化合物は、オリゴヌクレオチド内への取り込みにおいて蛍光を発したままであり、そして公知の方法により直接注入された後、標的配列に結合する場合には細胞内において可視的である。テストフェノキサジンオリゴヌクレオチドは、直接注入の際に５〜10μＭのIC50で影響を及ぼさないβ-ガラクトシダーゼコントロールと共に標的に結合する。従って、標的RNAの翻訳を阻害するためのアンチセンス法に有用である。
本発明の化合物、または高融解二重らせんを形成し得る他のオリゴヌクレオチド（例えば上記のPi結合塩基）は、核酸のポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）またはリガーゼ連鎖反応（「LCR」）による増幅および検出の方法を改良するのに有用である。１つの実施態様では、高融解オリゴヌクレオチドは、古典的PCRの一方または双方のプライマーとして、あるいはLCRのプローブとして用いられる。特にPCRプロセスでは、二重らせんと高融解プライマーとの融解温度が高められたため、反応に熱的サイクルを与える必要性がなくなる。なぜなら、これらの高温（約68℃〜95℃、好ましくは約75℃以上）では、誘導体プライマーは、少なくともある程度標的にアニールし続けるが、伸長産物はアニールしないからである。通常のプライマーはハイブリダイズせず、そしてポリメラーゼは、プライマーが標的配列にアニールするレベル（通常、約55℃）に反応混合物が冷却されるまで、転写を開始しない。高融解誘導体オリゴヌクレオチドと共に用いるために選択される高温（アニーリング、伸長、および融解の全てに適切な温度）は、伸長したプライマー集団の実質的な割合（約10〜90モル％）が標的から解離されて見出されるが、充分に伸長していないプライマーは、結合して伸長する温度である。最適には、これは約85℃〜95℃であり、通常は92℃〜95℃である。あるいは、最適温度は、伸長した配列の融解範囲内であるが、誘導体プライマーのアニーリング範囲内の温度範囲を単に選択し、そして診断または予備的プロセスに対して満足するレベルを手近に達成するための増幅産物の量を測定することにより経験的に決定される。
最適温度は、選択された誘導体塩基、誘導体塩基が隣接するかまたは他の塩基により分離されるかどうか、プライマー中の塩基の数（最も高いアニーリング温度は約18個以上の塩基または塩基アナログを有するプライマーを用いて見出される）、ピリミジンおよびプリンの割合などにかなり依存して変化することが理解される。この系に有用な熱安定性ポリメラーゼとしては、例えば、Taqポリメラーゼまたは他の適切な熱安定性酵素がある。従って、どのような最適温度が選択されたとしても、増幅およびプライミング反応は従来通りであるが、実質的に一定の温度で行われる。
本発明のオリゴマーがPCRまたはLCRプロセスを容易にするだけでなく、プライマーの蛍光特性もまた伸長産物の検出を容易にする。伸長産物は、非伸長プライマーから（例えば、分子量に基づいて）容易に分離され、そしてそれらの蛍光により検出される。それにより、臭化エチジウムのような薬剤を用いて染色する必要がない。いくつかの実施態様では、蛍光は、蛍光を発するNTPが伸長産物内に同様に取り込まれるように、プライマー伸長時に本発明の蛍光を発する副構造を含むNTPを用いることにより増強される。その結果、NTPに用いられる多環式副構造は、プライマーに取り込まれるものと同様または異なり得る。
全ての引用物は、これにより背景技術として引用される。以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
図５のスキームの代表的応用
Ａ．5-（2-N-tert-ブトキシカルボニルアニリン）5’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン（DMT-AU）
N-（tert-ブトキシカルボニル）-2-（トリメチルスタンニル）アニリン（BocSnA）の合成を、SalituroおよびMcDonald、J. Org. Chem. 53、6138-6139、1988の報告のように行った。
1.5gの5-ヨード-2’-デオキシウリジン、5gのBocSnA、および50mgのパラジウムジクロライドビストリフェニルホスフィンを、5mlのDMFに溶解し、そしてN2下で密封した。反応物を50℃で16時間加熱した。この反応物を冷却し、EtOHで希釈し、1mlのトリエチルアミンを添加し、そしてセライトで濾過した。次いで、透明な溶液を減圧下で濃縮し、そして塩化メチレン中のメタノールのグラジエント（０％〜10％）を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにかけた。濃縮の際、ヌクレオシドをピリジンの添加および蒸留により無水にし、その後、10mlのピリジン中の880mgのジメトキシトリチルクロライドと20℃で１時間反応させた。反応物をメタノールでクエンチし、そして塩化メチレンおよびH2O中に分配させた。有機相を減圧下で濃縮し、そして塩化メチレン中のイソプロパノールのグラジエント（０％〜４％）により溶出するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。720mgのDMT-AUを得た。
Ｂ．ジメトキシトリチルベンゾピリミジン多環式ヌクレオシド
700mgのDMT-AUを、3mlのCH3CN中の3mlのトリメチルシリルジメチルアミンを用いて20℃で２時間処理し、続いて、減圧下での蒸留によりCH3CN中の再溶解と再蒸留とを２回行った。次いで、残渣を、7mlのCH3CNおよび0.67mlのトリエチルアミンに溶解して、11mgの4-ジメチルアミノピリジンおよび420mgのメシチレンスルホニルクロライドをN2下で添加し、そして20℃で４時間撹拌した。0.72mlの1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデカ-7-エンを添加し、そして20℃で30分間撹拌し、続いて0.015mlのH2Oを添加し、そして１時間撹拌した。塩化メチレンと0.5Mの二塩基リン酸ナトリウム水溶液との間の分配からなる後処理を行った。有機相を減圧下で蒸留し、続いて塩化メチレン中のイソプロパノールグラジエント（０％〜５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより300mgの三環式ヌクレオシドを得た。このヌクレオシドを3’リン酸水素誘導体に変換し、そして標準の手順（Jonesら、J. Org. Chem. 58、2983-2991、1993を参照のこと）によりオリゴヌクレオチドに取り込んだ。
実施例２
図６のスキームの代表的応用
Ａ．2-フルオロ8-トリメチルスタンニル-ピリジン（FSnP）
2-フルオロピリジンの金属化を、Estel、Marsais、およびQueguiner、J. org. Chem. 53、2740-2744、1988に記載のように行った。リチウムアニオンを、THF（1M）中の１当量のトリメチルスズクロライドを用いて-78℃でクエンチし、そして30分間撹拌し、1Mの重炭酸ナトリウムでクエンチし、そして酢酸エチルで抽出した。Na2SO4による乾燥および減圧下での蒸留後、得られるオイルをさらなる精製を行うことなく使用した。
Ｂ．デオキシシチジン-5-（3-（2-フルオロピリジン））-5’ジメトキシトリチル-2’-デオキシシチジン（DMT-FPdC）
500mgの5-ヨード-2’-デオキシシチジンを、4mlのDMFおよび2mlのDMFジメチルアセタール中で100℃で加熱した。２時間後、反応物を冷却し、そして減圧下で濃縮した。残渣を4mlのDMF、2mlのFSnPに溶解し、そしてパラジウムクロライドビストリフェニルホスフィンをN2下で添加し、そして50℃で16時間加熱した。反応物を冷却し、そして4mlのアンモニア飽和メタノールを添加し、そして20℃で４時間撹拌した。反応物を減圧下で濃縮し、そして無水エチルエーテル内で沈殿させた。沈殿物を乾燥させ、そしてピリジンに溶解し、減圧下で蒸発させ、そして4mlのピリジンに再溶解した。400mgのジメトキシトリチルクロライドを添加し、そして20℃で30分後、反応物をMeOHでクエンチし、塩化メチレンおよびH2Oで抽出した。有機相を濃縮し、そして塩化メチレン中のメタノールグラジエント（５％〜10％）を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
Ｃ．ジメトキシトリチル-2-ピリジン多環式ヌクレオシド
0.3mlの乾燥ジイソプロピルアミンを、N2下で4mlの乾燥THFと合わせ、そして０℃まで冷却した。THF中の1.7Mブチルリチウム1.2mlを滴下し、そして反応物を５分間撹拌した。次いで、10mlの乾燥THF中の200mgのDMT-FPdCを滴下添加した。０℃で１時間後、反応物を1Mの重炭酸ナトリウムでクエンチし、そして酢酸エチルで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、そして塩化メチレン中のメタノールのグラジエント（５％〜10％）を用いたシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。減圧下で濃縮後、この化合物を、標準の手順（Jonesら、「JOC」58、2983-2991、1993を参照のこと）により、H-ホスホネート誘導体に変換した。
実施例３
図8-1および図8-2のスキームの代表的応用
Ａ．3’,5’-ジアセチル-5-ブロモ-2’-デオキシウリジン
5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（7.3ｇ；23.7mmol）をピリジン（30ml）中に溶解し、そして無水酢酸（10ｇ；95mmol）を用いて室温で３時間処理した。反応物をメタノールでクエンチし、そして濃縮した。残渣を、CH2Cl2と飽和NaHCO3水溶液との間で分配させた。有機層を分離し、MgSO4で乾燥させ、次いで濃縮して目的の化合物を多量に得た。
B.1．5-ブロモ-3’,5’-ジアセチル-N4-（2-ヒドロキシフェニル）-2’-デオキシシチジン
3’,5’-ジアセチル-5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（8.5ｇ；21.7mmol）、塩化メチレン（100ml）、トリエチルアミン（8.8ｇ；87mmol）、およびDMAP（0.13ｇ）の溶液に、2-メシチルスルホニルクロライド（9.5g；43.4mmol）を添加した。室温で18時間撹拌後、DBU（6.6ｇ；43.5mmol）および2-アミノフェノール（9.5ｇ；87mmol）を添加し、そしてこの溶液を１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、そして残渣を酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配させた。有機層を、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物を得た．
B.2．5-ブロモ-3’,5’-ジアセチル-N4-（2-ヒドロキシ-m-ニトロフェニル）-2’-デオキシシチジン
3’,5’-ジアセチル-5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（4.8ｇ；12mmol）、塩化メチレン（50ml）、トリエチルアミン（5.0ｇ；50mmol）、およびDMAP（0.10ｇ）の溶液に、2-メシチルスルホニルクロライド（5.2ｇ；24mmol）を添加した。室温で４時間撹拌後、DBU（3.6ｇ；24mmol）および2-アミノ-4-ニトロフェノール（7.4ｇ；48mmol）を添加し、そしてこの溶液を３時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、そして残渣を酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウムとの間で分配させた。有機層をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。単離した生成物はいくらか不純物を有しており、そしてこの生成物を酢酸エチルで粉にした。黄色がかった沈殿物を濾別し、そして塩化メチレンで洗浄して目的の化合物を得た。
B.3．5-ブロモ-3’,5’-ジアセチル-N4-（2-ヒドロキシ-3,5-ジメチルフェニル）-2’-デオキシシチジン
反応物として2-アミノ-4-ニトロフェノールの代わりに2-アミノ-4,6-ジメチルフェノールを用いたこと以外は、化合物3.B.1.の合成と同様にして目的の化合物を合成した。反応混合物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、いくらか不純物を含有する所望の化合物を得、そしてさらなる精製を行うことなく、次の反応に用いた。
B.4．5-ブロモ-3’,5’-ジアセチル-N4-［2-（3-ヒドロキシナフチル）］-2’-デオキシシチジン
3’,5’-ジアセチル-5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（4.0ｇ；10mmol）、塩化メチレン（50ml）、トリエチルアミン（4.0ｇ；40mmol）、およびDMAP（0.1ｇ）の溶液に、2-メシチルスルホニルクロライド（4.4ｇ；20mmol）を添加した。室温で６時間撹拌後、DBU（3.0ｇ；20mmol）および3-アミノ-2-ナフトール（6.4ｇ；40mmol）を添加し、そしてこの溶液を室温で４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液を用いて洗浄した。しかし、目的の化合物は溶液から沈殿した。沈殿物を濾別し、そして酢酸エチル、次いで塩化メチレンを用いて充分に洗浄し、そして乾燥させた。少量の目的の化合物が濾過物からもまた得られた。
C.1．5-ブロモ-N4-（2-ヒドロキシフェニル）-2’-デオキシシチジン
5-ブロモ-3’,5’-ジアセチル-N4-（2-ヒドロキシフェニル）-2’-デオキシシチジン（実施例3.B.）（4.3ｇ；8.9mmol）を、メタノール中の飽和アンモニウムを用いて室温で３時間処理し、乾燥するまで濃縮した。残渣を塩化メチレン／ヘキサン（1/1）で粉にした。オフホワイトの固体を濾別し、塩化メチレン／ヘキサンを用いて充分に洗浄し、そして乾燥させた。
C.2．5-ブロモ-N4-（2-ヒドロキシ-m-ニトロフェニル）-2’-デオキシシチジン
化合物3.C.1.の合成と同様にして、化合物3.B.2から目的の化合物を調製した。
C.3．5-ブロモ-N4-（2-ヒドロキシ-3,5-ジメチルフェニル）-2’-デオキシシチジン
3.C.2.の粗化合物を、メタノール中の飽和NH3100mlを用いて室温で５時間処理し、次いで、乾燥するまで濃縮した。残渣を、塩化メチレンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配させた。有機相を単離し、乾燥させ、そしてシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して目的の化合物を得た。
C.4．5-ブロモ-N4-［2-（3-ヒドロキシナフチル）］-2’-デオキシシチジン
実施例3.B.4.で生成した化合物（3.1ｇ；5.8mmol）を、メタノール中の飽和NH3（150ml）を用いて室温で６時間処理した。反応混合物を濃縮し、そして残渣を塩化メチレン／酢酸エチルで粉にした。沈殿物を濾別し、塩化メチレンを用いて充分に洗浄し、乾燥させて2.5ｇ、96％を得た。
D.1．2’-デオキシフェノキサジン三環式dC
フッ化カリウム（4.3ｇ；75mmol）を、実施例3.C.1.で調製した化合物（3.0ｇ；7.5mmol）のエタノール溶液（150ml）に添加した。得られた溶液を３日間還流した。この溶液を室温まで冷却し、いくらかの沈殿物を濾別し、濾過物を乾燥するまで濃縮し、そしてさらなる精製を行うことなく、実施例3.F.1.に使用した。
D.2．2’-デオキシ-p-ニトロフェノキサジン三環式dC
実施例3.C.2.の化合物（2.4g；5.4mmol）、フッ化カリウム（3.1ｇ；54mmol）、エタノール（100ml）、およびDMSO（30ml）の溶液をボンベ（bomb）内に置き、そして120℃で３日間反応させた。反応混合物を濃縮し、そしてシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。粗生成物をさらなる精製を行うことなく、実施例3.E.に使用した。
D.3．2’-デオキシ2,4-ジメチルフェノキサジン三環式dC
実施例3.C.3.のジメチルフェニル化合物を出発物質として用いたこと以外は、実施例3.D.1.と同様の手順で目的の化合物を合成した。
D.4．2’-デオキシ-ナフトキサゼン三環式dC
実施例3.C.4.の化合物（2.4ｇ；5.3mmol）およびフッ化カリウム（3.1ｇ；53mmol）を、エタノール（100ml）中で４日間還流した。反応混合物を室温まで冷却し、そして乾燥するまで濃縮して目的の化合物を得た。
Ｅ．3’,5’-ジアセチル-2’-デオキシ-p-ニトロフェノキサジン三環式dC
実施例3.D.2.の粗生成物（0.3ｇ）をピリジン（10ml）に溶解し、そして無水酢酸（3ml）と室温で３時間反応させた。混合物をメタノールでクエンチし、濃縮し、そして塩化メチレンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配させた。有機相をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物を得た。
F.1．5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシフェノキサジン三環式dC
実施例3.D.1.の粗生成物をピリジン（35ml）に溶解し、そして4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（５ｇ；14.7mmol）で1.5時間室温で処理して濃縮した。残渣を塩化メチレン中に溶解し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を単離し、乾燥させ、濃縮し、次いで、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して目的の化合物を得た。ヌクレオシドをその3’リン酸水素誘導体に変換し、そして標準的な手順によりオリゴヌクレオチドに取り込んだ。
F.2．5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-4-ニトロフェノキサジン三環式dC
実施例3.E.の化合物（0.27ｇ；0.608mmol）を、メタノール中の飽和NH3（20ml）で４時間室温で処理し、次いで、濃縮した。残渣をピリジン（10ml）に溶解し、続いて4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（0.25ｇ；0.73mmol）を添加した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、次いで、塩化メチレンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配させた。有機相を乾燥させ、そしてシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的の化合物を得た。
F.3．5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-2,4-ジメチルフェノキサジン三環式dC
実施例3.D.3の化合物（0.3ｇ；0.87mmol）をピリジン（5ml）中に溶解し、続いて4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（0.4ｇ；1.2mmol）およびDMAP（10mg）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮し、次いで、塩化メチレンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配させた。有機相を単離し、乾燥させ、そしてシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的の化合物を得た。未反応の化合物（85mg）を水溶液から回収した。
F.4．5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-2-ナフトキサゼン三環式dC
実施例3.D.4.の化合物をピリジン（15ml）中に溶解し、続いて4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（3.1ｇ；9.1mmol）およびDMAP（15mg）を添加した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、次いで、塩化メチレンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配させた。有機溶液を単離し、MgSO4を用いて乾燥させ、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的の化合物を得た。
Ｇ．5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-フェノキサジン三環式dC
ヌクレオシド（3.F.1.、3.F.2.、3.F.3.、3.F.4.）をそれらの3’リン酸水素誘導体に変換し、そして標準的な手順によりオリゴヌクレオチドに取り込んだ。
実施例４
図７のスキームの代表的応用
A.1．5-ヨード-3’,5’-ジアセチル-N4-（2-メルカプトフェニル）-2’-デオキシシチジン
3’,5’-ジアセチル-5-ヨード-2’-デオキシウリジン（2.19ｇ；5.00mmol）、アセトニトリル（ACN、75ml）、トリエチルアミン（TEA、6.96ml、50.0mmol）、およびDMAP（0.15ｇ、1.25mmol）の溶液に、メシチルスルホニルクロライド（2.19ｇ、10.0mmol）を添加した。室温で18時間撹拌した後、DBU（2.14ml、10.0mmol）および2-アミノチオフェノール（2.14ｇ、20.0mmol）を添加し、そしてこの溶液を１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、そして粗生成物を、酢酸エチル（EA、200ml）と飽和重炭酸ナトリウム水溶液（SASB、200ml）との間で分配させた。有機層を乾燥（Na2SO4）させ、そしてロータリーエバポレーターで濃縮した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー［１％〜５％ 2-プロパノール／ジクロロメタン（DCM）］により精製し、生成物を得た。
0004098356.tif 000022
A.2．5-ブロモ-3’,5’-ジアセチル-N4-（2-ヒドロキシフェニル）-2’-デオキシシチジン
3’,5’-ジアセチル-5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（1.79ｇ；5.00mmol）、アセトニトリル（ACN、75ml）、トリエチルアミン（TEA、6.96ml、50.0mmol）、およびDMAP（0.15ｇ、1.25mmol）の溶液に、メシチルスルホニルクロライド（2.19ｇ、10.0mmol）を添加した。室温で１時間撹拌した後、DBU（2.14ml、10.0mmol）および2-アミノフェノール（2.18ｇ、20.0mmol）を添加し、そしてこの溶液を１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、そして粗生成物を酢酸エチル（EA、200ml）と飽和重炭酸間ナトリウム水溶液（SASB、200ml）との間で分配させた。有機層を乾燥（Na2SO4）させ、そしてロータリーエバポレーターで濃縮した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー［20-40-60-80-100％EA／ヘキサン］により精製した。生成物画分を濃縮し、そして生成物をEAで粉にした。
Ｂ．2’-デオキシフェノチアジン
工程Ａのジアセテート（600mg、1.10mmol）、カリウムtert-ブトキシド（THF中の1.0Ｍ、2.20ml、2.20mmol）、および無水エタノール（25ml）の溶液を加熱して、0.5時間還流した。この溶液を室温まで冷却し、そして酢酸（0.5ml）で処理した。この溶液を濃縮し、トルエン（50ml）を添加し、そして溶液を再び濃縮した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（２％〜１０％メタノール（ME）／DCM）により精製し、フェノチアジンを得た。
0004098356.tif 000023
これらの化合物を標準的な手順によりジメトキシトリチル化Ｃし、そしてホスフィチル化Ｄした。
Ｃ．5’-O-DMT-2’-デオキシフェノチアジン（図７より）
0004098356.tif 000024
Ｄ．5’-O-DMT-3’-H-ホスホネート-2’-デオキシフェノチアジン、トリエチルアンモニウム塩
0004098356.tif 000025
以下の請求の範囲は、本発明の日付において、適法および司法権限下で特許可能でない任意の要件を排除するように解されるべきである。
【図１】
0004098356.tif 000030
【図２】
0004098356.tif 000031
【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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