(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが、E2F転写因子のDNA結合ドメインと網膜芽腫（RB）ポリペプチドの機能的な増殖抑制ドメインとの融合体を含み、ここで、該融合ポリペプチドは、該E2F転写因子の機能的サイクリンＡ-キナーゼ結合ドメインを欠く、核酸。
【請求項２】
アデノウイルスベクターに挿入されている、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
融合ポリペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターであって、該ポリペプチドが、E2F転写因子のDNA結合ドメインと網膜芽腫（RB）ポリペプチドの機能的な増殖抑制ドメインとの融合体を含み、ここで、該融合ポリペプチドは、該E2F転写因子の機能的サイクリンＡ-キナーゼ結合ドメインを欠く、発現ベクター。
【請求項４】
前記融合体をコードするDNAに作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記組織特異的プロモーターが平滑筋アクチンプロモーターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
ウイルスベクターである、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項７】
アデノウイルスベクターである、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項３に記載のベクター。
【請求項１０】
前記アクチンプロモーターがαアクチンプロモーターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項１１】
融合ポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが、E2F（配列番号１）のアミノ酸95〜194とRB（配列番号４）のアミノ酸379〜928との融合体を含む、核酸。
【請求項１２】
ベクターをさらに含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
組織特異的プロモーターをさらに含む、請求項１１に記載の核酸であって、前記融合ポリペプチドが該組織特異的プロモーターの制御下で発現される、核酸。
【請求項１７】
前記組織特異的プロモーターが平滑筋アクチンプロモーターである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
前記平滑筋プロモーターがαアクチンプロモーターである、請求項１７に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
網膜芽腫遺伝子（RB）および転写因子E2Fは共に、細胞増殖制御において重要な役割を果たす（概説については、Adams,P.およびKaelin,W. Seminars in Cancer Biology 6: 99-108（1995）を参照）。RB遺伝子座は、種々のヒト腫瘍細胞において頻繁に不活化される。RBneg/RBmut細胞への野生型RB遺伝子（例えば、Booksteinら、Science 247: 712-715（1990））またはRBタンパク質（pRB）（例えば、Antelmanら、Oncogene 10: 697-704（1995））の再導入は、培養における増殖およびインビボでの腫瘍形成性を抑制し得る。
E2FはＳ期遺伝子の転写を活性化するように働くが、その活性はRBにより抑えられる。RBは、Ｇ期からＳ期への出ること（exit）をブロックすることによって細胞を停止させる（例えば、Dowdyら、Cell 73: 499-511（1993））が、停止の正確な経路は不明のままである。
E2FはRBと複合体を形成するが、複合体形成は、E2F関連タンパク質DP-1が存在する場合に、より効率的である。E2F-1およびDP-1は、DNAに結合する安定なヘテロダイマーを形成する（例えば、Qinら、Genes and Dev. 6-: 953-964（1992））。DP-1-E2F複合体は、E2F依存性遺伝子の転写を共同的に活性化するように働く。このような転写は、E2F-1またはDP-1活性化転写と同様な様式で、pRBにより抑制され得る。
RBによる遺伝子の転写抑制は、いくつかの例において、pRBをプロモーターに係留することにより達成され得る。例えば、GAL4-pRB融合体は、GAL4 DNA結合ドメインに結合し、p53、Sp-1またはAP-1エレメントからの転写を抑制する（Adnaneら、J.Biol.Chem. 270: 8837-8843（1995）；Weintraubら、Nature 358: 259-261（1995））。Sellersら（Proc.Natl.Acad.Sci. 92: 11544-11548（1995））は、E2Fのアミノ酸残基1〜368とRBのアミノ酸379〜792または379〜928との融合体を開示した。
Changら（Science 267: 518-521（1995））は、過剰増殖性障害である再狭窄の２つの動物モデルにおける新内膜形成（neointima formation）の減少に複製欠損アデノウイルス-RB構築物を使用することを開示した。
発明の要旨
本発明は、E2FポリペプチドとRBポリペプチドとの融合体が、E2Fプロモーターの転写を抑制することにおいて、RB単独より効率的であり、そしてこのような融合体は、種々の細胞型において細胞周期の停止を引き起こし得るという驚くべき結果を提供する。したがって、このような融合体は、ガンを含む過剰増殖性障害の治療に関する緊急の必要性と取り組み得る。
本発明の１つの局面は、転写因子と網膜芽腫（RB）ポリペプチドとの融合体を含むポリペプチドである。ここで、転写因子はDNA結合ドメインを含み、RBポリペプチドは増殖抑制ドメインを含む。本発明の別の局面は、このような融合ポリペプチドをコードするDNAである。DNAはアデノウイルスベクターに挿入され得る。
本発明のいくつかの実施態様において、転写因子はE2Fである。E2FのサイクリンＡ結合ドメインは、欠失され得るか、または非機能的であり得る。E2Fは、いくつかの実施態様において、アミノ酸残基約95〜約194または約95〜約286を含み得る。
網膜芽腫ポリペプチドは野生型RB、RB56、またはこれらの改変体もしくはフラグメントであり得る。いくつかの実施態様において、網膜芽腫ポリペプチドは、約379〜約928のアミノ酸残基を含む。RBポリペプチドの好ましいアミノ酸置換は、残基２、608、788、807、および811を含む。
本発明の別の局面は、ポリペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターであり、このポリペプチドは、転写因子および網膜芽腫（RB）ポリペプチドとの融合体を含む。ここで、転写因子はDNA結合ドメインを含み、RBポリペプチドは増殖抑制ドメインを含む。いくつかの実施態様において、組織特異的プロモーターは、融合ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結される。組織特異的プロモーターは、平滑筋αアクチンプロモーターであり得る。
本発明の別の局面は、過剰増殖性障害の処置のための方法であって、患者に治療有効用量のE2F-RB融合ポリペプチドを投与する工程を包含する。過剰増殖性障害はガンであり得る。いくつかの実施態様において、過剰増殖性障害は再狭窄である。融合ポリペプチドおよびこの融合ポリペプチドをコードする核酸は、血管形成に使用されるデバイスをコートするために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
図1Aは、E2Fの推定アミノ酸配列を示す。
図1Bは、転写因子E2Fのヌクレオチド配列を示す。
図2Aは、Leeら（Nature 329: 642-645（1987））によって開示された、pRBのヌクレオチド配列を示す。
図2Bは、pRBの推定アミノ酸配列を示す。
図３は、pCTMの模式図である。
図４は、プラスミドpCTMのヌクレオチド配列を示す。
図５は、pCTMIの模式図である。
図６は、pCTMIのヌクレオチド配列を示す。
図７は、プラスミドpCTMIEの模式図である。
図８は、pCTMIEのヌクレオチド配列を示す。
図９は、実施例において用いたE2F-RB融合構築物を示す図である。全てのE2F構築物は、アミノ酸95で始まり、そしてサイクリンＡ結合ドメインの一部を欠失した。E2F-437は、DNA結合ドメイン（黒）、ヘテロダイマー化ドメイン（白）、およびトランス活性化ドメイン（縞）を含有した。E2F-194は、DNA結合ドメインのみを含有した。E2F-286は、DNA結合ドメインおよびDP-1ヘテロダイマー化ドメインを含有した。E2F-194-RB56-5sおよびE2F-286-RB56-5sを生成するために、E2F構築物をRBのコドン379にインフレームに融合した。C706Fは、不活化点変異である。
図１０は、E2F-RB融合構築物による転写抑制を示す図である。
図１１（Ａ〜Ｄ）は、哺乳動物細胞株におけるE2F-RB融合タンパク質の発現を示す。抽出物を、E2-CATレポーターアッセイまたはFACSアッセイにおいて使用した細胞から調製し、そして抗RBモノクローナル抗体を用いて分析した。パネルＡでは、（3）RB56-H209、（4）RB56野生型、（5）RB56-5s、（6）E2F286-5s、（7）E2F194-5s、（8）E2F194、（9）E2F286、（10）E2F437でトランスフェクトしたC33A細胞からの結果を示す。レーン（1）は、RB56タンパク質標準である。レーン（2）は、偽トランスフェクションである。パネルＢでは、Saos-2細胞の（1）RB56、（2,3）E2F194-5s、および（4,5）E2F286-5sでのトランスフェクションについての結果を示す。パネルＣでは、5637細胞の（2,3）RB56野生型、（4,5）RB56-5s；（6,7）E2F194-5s；（7,8）E2F286-5sでのトランスフェクションについての結果を示す。レーン（1）は、RB56タンパク質標準である。パネルＤでは、（3）RB56、（4）E2F286-5s、（5）E2F194-5sでトランスフェクトしたNIH-313についての結果を示す。レーン（1）は、RB56標準であり；レーン（2）は、RB110標準である。
図１２は、RB発現NIH-3T3細胞のフローサイトメトリーのヒストグラム分析を示す。
図１３のパネルＡは、ラット平滑筋細胞株A7R5での3Hチミジン取り込みアッセイにおける、ヒト平滑筋αアクチン駆動E2F-p56融合構築物（p56（RB cDNAのアミノ酸379〜928）に直接かつインフレームに連結されたE2Fのアミノ酸95〜286からなる）の２つの単離物を伴うCMV駆動組換えアデノウイルス（ACN56）の効果と、コントロールウイルス（ACN）の効果との比較を示す。パネル（B）は、ラット平滑筋細胞株A10における同じ構築物の効果を示す。
図１４は、非筋細胞における図１３に記載のウイルスの効果の比較を示す。パネル（A）は、乳ガン細胞株MDA MB468における結果を示す。パネル（B）は、非小細胞胚細胞ガン株H358における結果を示す。
図１５の上部パネルは、CMVプロモーターにより駆動されるβ-galを発現する等量の組換えアデノウイルスでの感染後のβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）染色のレベルにより判断されるような、異なる細胞株のアデノウイルスによる相対的感染度を示す。H358は、非小肺細胞ガン細胞株である；MB468は、乳ガン細胞株である；A7R5およびA10は、平滑筋細胞株である。図の下方の部分は、組換えアデノウイルスACN56に感染させたときの同じ細胞で発現されたp56タンパク質の相対的レベルを示す。ここでは、p56 cDNAは非組織特異的CMVプロモーターにより駆動される。
図１６は、平滑筋αアクチンプロモーター駆動E2F-p56融合構築物（ASN286-56）に感染させた細胞における相対的タンパク質レベルを示す。UNは、非感染を示す；50、100、250、および500は、感染多重度（MOI）をいう。
図１７は、損傷され、そしてβ-gal、RB（ACNRB）またはp56（ACN56）（これらは全て、CMVプロモーターの制御下にある）のいずれかを発現する組換えアデノウイルスで処置されたラット頸動脈の横断切片（n＝9）からの中膜領域に対する内膜の比を示す棒グラフである（新内膜形成の阻害の測定として）。
図１８は、ラット血管形成モデルにおける再狭窄を示す一連の３つの写真である。左のパネルは、正常動物からのデータを示す；中央のパネルは、損傷され、次いでβ-gal発現組換えアデノウイルスで処置された動物からのデータを示す；右のパネルは、損傷され、次いでp56を発現する組換えアデノウイルス（ACN56）で処置された動物からのデータを示す。
図１９は、筋細胞においてβ-galトランスジーンを発現するが、非筋細胞では発現しないその選択的な能力により示されるような、平滑筋αアクチンプロモーターの組織特異性を示す。左のパネルは、CMV駆動β-gal（ACNBGAL）でMOI＝１で感染させた乳細胞ガン株MB468におけるβ-gal発現と平滑筋プロモーター構築物（ASNBGAL）でMOI＝100で感染させた乳細胞ガン株MB468におけるβ-gal発現とを比較している。右のパネルは、MOI＝１のACNBGALまたはMOI＝50のASNBGALに感染したラット平滑筋細胞株A7R5のβ-gal発現を示す。ASNBGALからの発現は、筋細胞株で見られるが、細胞のより高い感染度にもかかわらず、非筋細胞株には存在しない。
図２０は、RBを発現する組換えアデノウイルスのラット頸動脈に形質導入する能力を示す。組換えアデノウイルス処置動脈（１×109pfu）をバルーン損傷および感染の２日後に採集した。横断切片を固定し、そしてRB特異的抗体を用いて組織中のRBタンパク質の存在を検出した。用いたコントロールウイルスはACNであった。RBタンパク質染色は、ACNRB処理サンプルにおいて、特により高い倍率で明らかであった。
図２１は、CMV駆動p56組換えアデノウイルス（ACN56E4）と、ヒト平滑筋αアクチンプロモーター駆動E2F-p56融合構築物（ASN286-56）と、下流トランスジーンのないCMVプロモーターまたは平滑筋αアクチンプロモーターのいずれかを含有するコントロールアデノウイルス構築物（それぞれ、ACNE3またはASBE3-2単離物として示される）との効果の比較を示す。アッセイは、平滑筋細胞株（A7R5）または非筋細胞株（MDA-MB468、乳ガン）のいずれかにおける3Ｈチミジン取り込みであった。結果は、平滑筋αアクチンプロモーターを用いる筋組織特異性、およびそれらのそれぞれのコントロールに対するp56およびE2F-p56の両トランスジーンによる特異的阻害を示した。
好ましい実施態様の説明
本発明は、融合ポリペプチドおよびこれらをコードするベクターを含むRB融合構築物およびこのような構築物を過剰増殖性疾患の治療に使用する方法を提供する。本発明のいくつかの好ましい実施態様では、RBポリペプチドは、E2Fポリペプチドに融合される。どんなE2F種でも使用し得るが、代表的にはE2F-1、-2、-3、-3、または-5（例えば、WuらMol. Cell. Biol. 15:2536-2546（1995）; Ivey-Hoyleら、Mol. Cell. Biol. 13:7802（1993）; Vairoら、Genes and Dev、9:869（1995）; Beijersbergenら、Genes and Dev、8:2680（1994））; Ginsbergら、Genes and Dev、8:2665（1994）; Buckら、Oncogene 11:31（1995））、より典型的にはE2F-1を使用し得る。代表的に、EF2ポリペプチドは、少なくともEF2のDNA結合ドメインを含み、サイクリンA結合ドメイン、ヘテロニ量体化ドメイン、および／またはトランス活性化ドメインを任意に含み得る。サイクリンA結合ドメインは、機能性ではないことが好ましい。本明細書において引用したE2Fのヌクレオチドおよびアミノ酸は、図1Aおよび図1Bに示すGenbank HUME2Fのものである。EF2ポリペプチドなどをコードする核酸、好ましくはDNAをリーディングフレームでRBポリペプチドに融合する。RBポリペプチドは、保存的アミノ酸誘導体、対立遺伝子改変体、アミノ酸置換、欠失、または挿入突然変異体またはその断片を含むRBポリペプチドであり得る。RBドメインの成長抑制ドメイン、すなわち、アミノ酸残基379〜928は、機能性であることが好ましい（Hiebert、ら、MCB 13:3384-3391（1993）；Qin、ら、Genes and Dev、6:953-964（1992））。幾つかの実施態様では、野生型pRB110を使用する。短縮型RBのRB56を使用するのがより好ましい。RB56は、pRB110のアミノ酸残基379〜928を含む（Hiebert、ら、MCB 13:3384-3391（1993）；Qin、ら、Genes and Dev、6:953-964（1992））。いくつかの実施態様において、２、608、612、788、807または811位におけるRBのアミノ酸改変体を単独または組み合わせて使用する。改変体RB56-5sは、部位608、612、788、807および811にアラニン置換を有する野生型RB56を含む。RBアミノ酸およびヌクレオチドの番号付けは、Leeが開示したRB配列（Nature 329:642-645（1987））に従い、この全文を全ての目的のために、参考として本明細書に援用する（第２図）。
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、DNAまたはRNAであり得る。「コードする核酸配列」という語句は、特異的タンパク質またはペプチドの発現を指向する核酸を指す。この核酸配列は、RNAに転写されるDNA鎖配列およびタンパク質に翻訳されるRNA配列の両方を有する。核酸配列は、完全長核酸配列および完全長タンパク質から得た非完全長配列の両方を有する。さらに、この配列は、天然配列、または特定の宿主細胞でコドン偏好を提供するために導入され得る配列の縮重コドンを含むことが理解される。
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、ウイルス発現システム、自律性自己複製環状DNA（プラスミド）を指し、発現および非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」をホストすると記載される場合、これは、染色体外環状DNAおよび宿主染色体に取り込まれたDNAが含まれる。ベクターが宿主細胞により維持される場合、ベクターを自律性構造として有糸分裂中に、細胞により安定に複製され得るか、または宿主ゲノム内に取り込まれる。ベクターは、位置的および連続的に方向付けられた、すなわち、他の必要なエレメントと作動可能に連結された複数遺伝子エレメントを含有し、その結果、本発明の構築物をコードするベクターの核酸は、トランスフェクト細胞において、転写され、必要であれば、翻訳され得る。
本明細書において使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列に言及することが意図される。この定義には、種々の配列多型、変異、および／または配列改変体が含まれる。このような変化は、遺伝子生成物の機能に影響を及ぼさない。「遺伝子」という用語は、コード配列だけでなく、プロモーター、エンハンサーおよび終始止領域などの調節領域も含むことが意図される。さらに、この用語は、全イントロン、およびオルタナティブスプライス部位から生じる改変体と共にmRNA転写物からスプライシングされた他のDNA配列を含むことが意図される。
「プラスミド」という用語は、細胞で複製し得る自律性環状DNA分子を指し、発現および非発現型の両方を含む。組換え微生物または細胞培養物を「発現プラスミド」をホストすると記載される場合、これは、染色体外DNA分子および宿主染色体に取り込まれたDNAの両方を含む。プラスミドが宿主細胞により維持される場合、プラスミドは、ベクターを自律性構造として有糸分裂中に、細胞により安定に複製され得るか、または宿主ゲノム内に取り込まれる。
「組換えタンパク質」または「組換え産生されたタンパク質」という語句は、非天然性細胞を使用して生成されるペプチドまたはタンパク質を指す。非天然性細胞は、DNAの内因性コピーを有しないため、タンパク質を発現できない。この細胞は、タンパク質を生成するが、これは、細胞を適当な核酸配列の導入により、遺伝子的に変性させたためである。組換えタンパク質は、このタンパク質を産生する細胞と通常関連するタンパク質および他の副細胞性成分と関連して見出されない。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
一般的に、本発明の構築物は、機能的発現のための適切な距離で連続して結合した以下のエレメントを含んで発現ベクター中に提供される：組織特異的プロモーター、転写用開始部位、3’非翻訳領域、5’mRNAリーダー配列、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列およびポリアデニル化信号。このような連結を「作動可能に連結した」と表現する。エンハンサー配列、および発現および／または分泌を目的とする他の配列もまた、発現ベクターに含まれ得る。薬物耐性をコードするようなさらなる遺伝子が含まれ、組換えベクターの存在について選択またはスクリーニングが可能になり得る。このようなさらなる遺伝子は、例えば、ネオマイシン耐性、多剤耐性、チミジンキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む。
本発明において、本発明のRB構築物の組織特異的発現は、目的の組織により優先的に使用されるプロモーターの使用により好適に達成される。組織特異的プロモーターの例として、クレアチニンキナーゼ用プロモーターがあり、これを使用して筋肉および心臓組織でジストロフィンcDNA発現を発現させ（Cox、ら、Nature 364:725-729（1993））、そして、免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖プロモーターは、B細胞で自殺遺伝子を発現させる（Maxwell、ら、Cancer Res. 51:4299-4304（1991））。内皮細胞特異的調節領域もまた特徴付けられた（Jahroudi、ら、Mol. Cell. Biol.14:999-1008（1994））。アンホトロピックレトロウイルスベクターが、アルブミンまたはα-フェトプロテインプロモーター（Huber、ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8039-8043（1991））のいずれかの制御下で肝臓系統および肝ガン細胞の標的細胞にそれぞれ単純性疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を保有して構築された。このような組織特異的プロモーターは、レトロウイルスベクター（Hartzoglou、ら、J. Biol. Chem. 265:17285-17293（1990））およびアデノウイルスベクター（Friedman、ら、Mol. Cell. Biol. 6:3791-3797（1986）; Willら、Cancer Gene Therapy 3:191-197（1995））で使用され得るが、それらの組織特異性を依然として保持する。
本発明では、外因性遺伝子の組織特異的発現に好ましいプロモーターは、ヒト平滑筋α−アクチンプロモーターである。Reddy、ら（J. Cell. Biology 265:1683-1687（1990））は、このプロモーターの単離、およびヌクレオチド配列を開示し、一方、Nakanoら（Gene 99:285-289（1991））は、ヒト平滑筋（大動脈型）α-アクチン遺伝子の5’上流および第一イントロン領域における転写調節エレメントを開示した。
Petropoulosら（J. Virol、66:3391-3397（1992））は、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターまたは細胞質β−アクチンプロモーターのいずれかに作動可能に連結した細菌性クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）の発現比較について開示した。これらの構築物をレトロウイルスベクターに提供し、これを使用してニワトリ卵を感染させた。
肝臓の例示的な組織特異的発現エレメントには、HMG-CoA還元酵素プロモーター（Luskey、Mol. Cell. Biol. 7（5）:1881-1893（1987））；ステロール調節要素１（SRE-1; SmithらJ. Biol. Chem. 265（4）:2306-2310（1990）;ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）プロモーター（EisenbergerらMol. Cell. Biol. 12（3）:1396-1403（1992））;ヒトC-反応性タンパク質（CRP）プロモーター（LiらJ. Biol. Chem. 265（7）:4136-4142（1990））;ヒトグルコキナーゼプロモーター（TanizawaらMol. Endocrinology 6（7）:1070-81（1992）;コレステロール７−αヒドロキシラーゼ（CYP-7）プロモーター（LeeらJ. Biol. Chem. 269（20）:14681-9（1994））;β−ガラクトシダーゼα-2、6シアリルトランスフェラーゼプロモーター（SvenssonらJ. Biol. Chem. 265（34）:20863-8（1990）;インシュリン様成長因子結合タンパク質（IGFBP-1）プロモーター（BabajkoらBiochem Biophys. Res. Comm. 196（1）:480-6（1993））;アルドラーゼBプロモーター（BingleらBiochem J. 294（Pt2）:473-9（1993））;ヒトトランスフェリンプロモーター（MendelzonらNucl. Acids Res. 18（19）:5717-21（1990）;コラーゲンI型プロモーター（HouglumらJ. Clin. Invest. 94（2）:808-14（1994））があるが、これらに限定されない。
前立腺の例示的な組織特異的発現エレメントには、前立腺性酸性ホスファターゼ（PAP）プロモーター（BanasらBiochem. Biophys. Acta. 1217（2）:188-94（1994）；前立腺性分泌タンパク質94（PSP 94）プロモーター（NoletらBiochem. Biophys. ACTA 1098（2）:247-9（1991））;前立腺特異的抗原複合体プロモーター（CasperらJ. Steroid Biochem. Mol. Biol. 47（1-6）:127-35（1993））;ヒト腺カリクレイン遺伝子プロモーター（hgt-1）（LiljaらWorld J. Urology 11（4）:188-91（1993）があるが、これらに限定されない。
消化管組織の例示的な組織特異的発現エレメントには、ヒトH+/K+-ATPaseαサブユニットプロモーター（TanuraらFEBS Letters 298（2-3）:137-41（1992））があるが、これらに限定されない。
膵臓の例示的な組織特異的発現エレメントには、膵臓炎関連タンパク質プロモーター（PAP）（DusettiらJ. Biol. Chem. 268（19）:14470-5（1993））；エラスターゼ１転写エンハンサー（KruseらGenes and Development 7（5）:774-86（1993））;膵臓特異的アミラーゼおよびエラスターゼエンハンサープロモーター（WuらMol. Cell. Biol. 11（9）:4423-30（1991）;KellerらGenes & Dey、 4（8）:1316-21（1990）;膵臓コレステロールエラスターゼ遺伝子プロモーターFontaineらBiochemistry 30（28）:7008-14（1991））があるが、これらに限定されない。
子宮内膜の例示的な組織特異的発現要素には、子宮グロブリンプロモーター（HelftenbeinらAnnal. NY Acad. Sci. 622:69-79（1991））が含まれるが、これに限定されない。
副腎細胞の例示的な組織特異的発現要素には、コレステロール側鎖切断（SCC）プロモーター（RiceらJ. Biol. Chem. 265:11713-20（1990）が含まれるが、これに限定されない。
全身性神経系の例示的な組織特異的発現要素として、γ-γエノラーゼ（ニューロン特異的エノラーゼ、NSE）プロモーター（Forss-PetterらNeuron 5（2）:187-97（1990））が含まれるが、これに限定されない。
脳の例示的な組織特異的発現要素として、神経フィラメント重鎖（NF-H）プロモーター（SchwartzらJ. Biol. Chem. 269（18）:13444-50（1990））が含まれるが、これに限定されない。
リンパ球の例示的な組織特異的発現要素として、ヒトCGL-1/グランザイムBプロモーター（HansonらJ. Biol. Chem. 266（36）:24433-8（1991））、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（TdT）、λ５、VpreB、および1ck（リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼp561ck）プロモーター（LoらMol. Cell. Biol. 11（10）:5229-43（1991））;ヒトCD2プロモーターおよびその3’転写エンハンサー（LakeらEMBO J. 9（10）:3129-36（1990））、ならびにヒトNKおよびT細胞特異的活性化（NKG5）プロモーター（HouchinsらImmunogenetics 37（2）:102-7（1993））が含まれるが、これに限定されない。
結腸の例示的な組織特異的発現要素として、pp60c-srcチロシンキナーゼプロモーター（TalamontiらJ. Clin. Invest. 91（1）:53-60（1993））、器官特異的新抗原（OSN）、分子量40kDa（p40）プロモーター（IlantzisらMicrobiol. Immunol. 37（2）:119-28（1993））;結腸特異的抗原-Ｐプロモーター（SharkeyらCancer 73（3補遺）864-77（1994））が含まれるが、これに限定されない。
乳房細胞の例示的な組織特異的発現要素として、ヒトα-ラクトアルブミンプロモーター（TheanらBritish J. Cancer、61（5）:773-5（1990））が含まれるが、これに限定されない。
目的の組織における発現の特異性を援助する他の要素として、分泌リーダー配列、エンハンサー、核局在化シグナル、内方浸透性（endosmolytic）ペプチドなどが含まれる。好ましくは、これらの要素は、特異性を援助するための目的の組織由来である。
ポリペプチドをコードする核酸配列を発現ベクターにサブクローニングする工程、プローブの標識化、DNAハイブリダイゼーションなどのような、本発明の核酸配列の核酸操作技術は、全般的にSambrookら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual（第２版）、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、（1989）に述べられており、本明細書中に参照として援用される。このマニュアルは、本明細書中以下「Sambrookら」という。
一旦目的の配列をコードするDNAが単離されそしてクローン化されると、種々の組換え的に操作された細胞において、コードされたタンパク質を発現し得る。当業者は、コードされたDNAの発現に利用し得る多数の発現系に精通しているもことが期待される。原核生物または真核生物におけるタンパク質の発現について公知の種々の方法を詳細に記載することは試みない。
簡単に要約すると、目的の配列をコードする天然または合成の核酸の発現は、DNAまたはcDNAをプロモーター（これは、構成的または誘導可能のいずれかである）に作動可能に連結し、続いて、発現ベクターへの組込みによって代表的に達成される。ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかにおいて複製および組込みに適切であり得る。代表的な発現ベクターは、転写終結因子および翻訳終結因子、開始配列、および目的のポリヌクレオチド配列の発現の調節に有用なプロモーターが含まれる。クローン化遺伝子の高レベル発現を得るために、少なくとも、転写を指令する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳終結因子を含む発現プラスミドを構築することが望ましい。また、発現ベクターは、少なくとも一つの独立した終結因子配列、原核生物および真核生物の両方におけるプラスミドの複製を可能にする配列（すなわち、シャトルベクター）、ならびに原核生物系および真核生物系の両方についての選択マーカーを含む遺伝子発現カセットを含み得る。Sambrookらを参照。
E2F-RB融合発明構築物は、目的の組織にインビボまたはエクスビボで種々の方法により導入され得る。本発明のいくつかの実施態様において、核酸、好ましくはDNAは、微量注入、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合、または微粒子銃のような方法により、細胞に導入される。さらなる実施態様において、DNAは、目的の組織に直接取り込まれる。他の実施態様において、構築物は、細胞への導入を容易にするためにウイルスベクター系にパッケージングされる。
本発明の実施に有用なウイルスベクター系には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウスの小型ウイルス（MVM）、HIV、シンドビスウイルス、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）、およびMoMLVが含まれる。代表的に、本発明の構築物はこのようなベクターに挿入され、E2F-RB発現構築物（代表的にウイルスDNA、感受性宿主細胞の感染、およびE2F-RB遺伝子の発現と共に）のパッケージングを可能にする。特に有利なベクターは、Willsら、Human Gene Therapy 5:1079-1088（1994）に開示されるアデノウイルスベクターである。
本発明のなお他の実施態様において、発明の組換えDNA構築物は、DNA連結部分を介する取り込み（例えば、被覆窩（coated pit）の陥入およびエンドソームの内部移行）を容易にするために、細胞レセプターリガンドに結合される（Wu、ら、J.Biol. Chem. 263:14621-14624（1988）;WO 92/06180）。例えば、本発明のDNA構築物は、ポリリジン部分によりアシアロ-オロムコシド（asialo-oromucocid）に連結され得る。アシアロ-オロムコシドは、肝細胞のアシアロ糖タンパク質レセプターのリガンドである。
同様に、本発明の構築物のパッケージングに使用されるウイルスエンベロープは、レセプターリガンドまたはレセプターに特異的な抗体の添加により修飾され、特定の細胞へのレセプター媒介性エンドサイトーシスを可能にする（例えば、WO 93/20221、WO 93/14188; WO 94/06923）。本発明のいくつかの実施態様では、本発明のDNA構築物は、ウイルスタンパク質（例えば、アデノウイルス粒子）に連結され、エンドサイトーシスを促進させる（Curiel、らProc. Natl. Sci. U.S.A. 88:8850-8854（1991））。他の実施態様において、本発明の分子結合体は、微小管インヒビター（WO 94/06922）;インフルエンザウイルス赤血球凝集素擬態性合成ペプチド（PlankらJ. Biol. Chem. 269:12918-12924（1994））;およびSV40 T抗原などの核局在化シグナル（WO 93/19768）を含み得る。
本発明のいくつかの実施態様では、本発明のRBポリペプチドは、処置を必要とする患者に直接投与される。「治療有効な」用量は、過剰増殖性障害を予防するか、またはその重篤度を軽減するのに十分なポリペプチド用量である。本明細書中では、用語「過剰増殖性細胞」は、自律性成長（すなわち、正常な調節機構とは無関係に存在および再生する能力を有する）細胞を含むが、これに限定されない。過剰増殖性疾患は、構成疾患について特徴づける病理学的（すなわち、正常細胞からの分離）として分類され得るか、または非病理学的（すなわち、正常からの分離であるが、疾患状態に関連しない）として分類され得る。病理的過剰増殖性細胞は、以下の疾病状態の特徴である：再狭窄、糖尿病網膜症、甲状腺過形成、グレーブス病、乾癬、良性前立腺肥大、リー-フラウメニ症候群（乳ガン、肉腫、および他の新生物を含む）、膀胱ガン、結腸ガン、肺ガン、種々の白血病およびリンパ腫。非病理学的過剰増殖性細胞の例は、例えば、授乳発育中の哺乳動物管内皮細胞、およびまた創傷修復に関連する細胞にも認められる。病理学的過剰増殖性細胞は、接触阻害の損失および選択的に接着する能力の低下を特徴的に示す。選択的に接着する能力の低下は、細胞間コミュニケーションにおいてさらに損傷を示す。これらの変化には、タンパク質分解性酵素を分解する刺激および分泌する能力が含まれる。
本発明の構築物は、様々なガンおよびRB投与が有利な他の状態（末梢血管病および糖尿病網膜症が含まれるが、これらに限定されない）の治療に有用である。任意の組織は、いくつかの組織特異的発現要素（例えば、プロモーター）が同定され得るために標的化され得るが、再狭窄などの過剰増殖性障害にRB構築物を組織特異的に投与することが特に興味深い。これには、平滑筋アクチンプロモーターが好ましい。
本発明の組成物は、哺乳動物被検体（好ましくはヒト）への投与に適切な当該分野で公知の様式による投与のために受容可能である。本発明のいくつかの実施態様において、本発明の組成物は、注射または血管への供給により直接組織に投与され得、目的の組織を供給する。本発明のさらなる実施態様では、本発明の組成物は、「局所的に（locoregionally）」（すなわち、膀胱内に、病変内に、および／または局所的に（tropically））に投与される。本発明の他の実施態様では、本発明の組成物は、注射、吸入、座剤、経皮送達などにより全身的に投与される。本発明のさらなる実施態様において、組成物は、カテーテルまたは他のデバイスで投与され、目的の遠隔組織（例えば、内部器官）への接触を可能にする。また、本発明の組成物は、貯蔵型デバイス、移植物、または被包製剤で投与され得、組成物を徐放的または持続的に放出させ得る。
本発明は、適切なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解または懸濁された本発明の組成物の溶液を含む、投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリア、例えば、水、緩衝化水、0.8％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などが使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得るか、またはろ過滅菌され得る。得られた水性溶液は使用のためにそのままパッケージされ得るか、または凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌溶液と合わせられる。組成物は、適切な生理学的状態が必要である場合、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、pH調整剤および緩衝化剤、緊張調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。
薬学的処方物における本発明の組成物濃度は、広範囲に、すなわち、約0.1重量％未満から、通常、約２重量％か、少なくとも約２重量％、20〜50重量％以上までに変動し得、選択した特定の投与態様に従って、主に液体容量、粘度などにより選択される。
また、本発明の組成物をリポソームにより投与し得る。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液状結晶、リン脂質分散液、葉状層などがある。これらの調製物では、送達する本発明の組成物を、単独で、あるいは抗体などの所望の標的と結合する分子または他の治療用もしくは免疫原性組成物と共にリポソームの一部として組み込む。従って、本発明の所望の組成物を充填もしくは塗布したリポソームを全身に送達し得るか、または目的の組織に向け得る。そこで、次いでリポソームは、選択した治療用／免疫原性ペプチド組成物を送達する。
本発明に使用するリポソームを、一般に中性および負電荷のリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む標準的な小胞形成脂質から形成する。脂質の選択は、一般的に、例えば、リポソームサイズ、酸易変性および血流におけるリポソームの安定性を考慮して行う。例えば、Szokaら、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467（1980）、米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号および第5,019,369号に記載され、本明細書中で参考として援用されるように、様々な方法が、リポソームを調製するために利用可能である。
本発明の組成物を含有するリポソーム懸濁液を、とりわけ、投与方法、送達する本発明の組成物および処置される疾病段階に応じて用量を増減して静脈内、局部的、局所的などにより投与し得る。
固形組成物については、従来の非毒性固形キャリア（例えば、医薬等級のマンニトール、乳糖、デン粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどを含む）を使用し得る。経口投与については、薬学的に受容可能な非毒性組成物を、前記のキャリアのような通常用いる任意の賦形剤、および一般に10〜95％の活性成分（すなわち、１つ以上の本発明の組成物）およびより好ましくは25％〜75％の濃度で、取り込むことによって形成される。
エアロゾル投与には、本発明の組成物は、好ましくは界面活性化剤および噴射剤と共に細かく分割して供給される。本発明の組成物の代表的な百分率は、0.01〜20重量％で、1〜10重量％が好ましい。界面活性化剤は、もちろん非毒性でなければならず、好ましくは噴射剤に可溶性である。このような薬剤の代表的なものとして、炭素原子６〜22個を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタノン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸、およびオレイン酸）と脂肪族多価アルコールのエステルもしくは部分エステルまたはその環状無水物などがある。混合または天然グリセリドなどの混合エステルを用い得る。界面活性化剤は、組成物の0.1〜20重量％を構成し得、0.25〜5重量％が好ましい。組成物の残りを、通常、噴射剤にあてる。また、所望により、キャリアに、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンを含め得る。
本発明の構築物をさらに、当該分野で周知の技術により、貯蔵（depot）型システム、カプセル化形態、またはインプラントで送達し得る。同様に、構築物をポンプにより目的の組織に送達し得る。
本発明のいくつかの実施態様では、本発明の組成物を、患者から外移植した細胞または組織に、エキソビボで投与した後に患者に戻す。遺伝子治療構築物のエキソビボでの投与の例には、ArteagaらCancer Research 56（5）:1098-1103（1996）;NoltaらProc. Natl.Acad. Sci. USA 93（6）:2414-9（1996）; KocらSeminars in Oncology 23（1）:46-65（1996）;RaperらAnnals of Surgery 223（2）:116-26（1996）;DalesandroらJ. Thorac. Cardi. Surg.11（2）:416-22（1996）;およびMakarovらProc. Natl. Acad. Sci. USA 93（1）:402-6（1996）が含まれる。
本発明の幾つかの実施態様では、本発明の構築物を、バルーン式血管形成術後に、心大動脈に投与し、再狭窄を予防またはその重篤度を軽減する。本発明の構築物を使用し、血管形成術に使用するデバイスを被覆し得る（例えば、WillartらCirculation 89:2190-2197（1994）;Frenchら、Circulation 90:2402-2413（1995）を参照）。さらなる実施態様において、本発明の融合ポリペプチドを同じ方法により使用し得る。
以下の実施例は、例示の目的のために含まれ、本発明を限定するものとして考えるべきではない。
実施例
実施例Ｉ
E2F-RB融合
Ａ．序論
この実施例において、RB56ポリペプチドに融合したE2Fの異なるセグメントをコードする発現プラスミドを構築した。RB56は、増殖抑制に必要な「ポケット」ドメインを有する完全長RBのサブフラグメントである（HiebertらMCB 13:3384-3391（1993）;QinらGenes and Dey、6:953-964（1992））。E2F194は、E2Fアミノ酸95〜194を含む。このフラグメントは、E2FのDNA結合ドメインのみを含有する。E2F286は、DNA結合ドメインおよびDP-1ヘテロダイマー化ドメインを含有する。両E2Fフラグメントは、N-末端サイクリンA-キナーゼ結合ドメインを欠いているため、E2FのDNA結合活性をダウンレギュレーションするようである（KrekらCell 83:1149-1158（1995）;KrekらCell 78:161-172（1994））。
Ｂ．ベクターの構築
プラスミドpCTMは、CMVプロモーター、T7およびSP6プロモーターが隣接する三部分アデノウイルスリーダー、ならびにウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化部位および下流にSV-40ポリアデニル化部位を有する複数クローニング部位を有する。図３にpCTMの模式図を提供する。pCTMのDNA配列を図４に提供する。
pCTMIを、Xho IおよびNot Iにより消化し、そしてpCMV-β-galベクター（Clonetech）からの180bpイントロンXho I-Not IフラグメントをサブクローニングすることによってpCTMから構築した。pCTMIの模式図を図５に提供する。そのDNA配列を図６に提供する。
pCTMIEを、ポリメラーゼ連鎖反応でSV40ウイルスDNAからのSV40エンハンサーを増幅することにより構築した。増幅産物をBglIIで消化し、そしてBamH1-消化pCMTIに挿入した後、BamHIの存在下で連結した。このプラスミドを図７に模式図で示す。このDNA配列を図８に提供する。
pCTM-RBを次のように調製した。完全長ヒトRB cDNAを含むpETRBcの3.2KB Xba I-Cla Iフラグメント（HuangらNature 350:160-162（1991））を、Xba I-Cla I消化pCTMに連結した。pCTM-RB56を、RB56コード配列を有する1.7KB Xba I-Cla Iフラグメントに、消化pCTMを連結して調製した。pCTMI-RB、pCTMIE-RB、pCTMI-RB56（アミノ酸381〜928）、およびpCTMIE-RB56（アミノ酸381〜928）をすべて同様の方法により構築した。
Ｃ．RB-E2F融合構築物
図９は、これらの研究に使用した融合構築物を示す。これらのE2F構築物は、アミノ酸95で始まり、サイクリンＡ結合ドメインの一部を欠いた。E2F437は、DNA結合ドメイン（黒）、ヘテロダイマー化ドメイン（白）、およびトランス活性化ドメイン（点描）を含有したE2F194は、DNA結合ドメインのみを含有した。E2F286は、そのDNA結合ドメインおよびDP-1ヘテロダイマー化ドメインを有した。RB56-5sは、アミノ酸残基606、612、788、807、および811にアラニン置換を有するRB変異体をいう。E2F194-RB56-5sおよびE2F286-RB56-5sにおいて、E2Fフラグメントをフレーム内でRB-5sのコドン379に融合した。RB56-C706Fは、不活化点変異を含有した（KayeらProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  87:6922-6926（1990））。
pCMV-E2F194およびpCMV-E2F437を以下の通り構築した。E2F（DNA結合ドメインを含有）のアミノ酸95〜194またはアミノ酸95〜437をコードするDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、HindIIで消化した後、SmaI/HindII消化pCMV-RB56ベクターに連結した。pCMVE2F286を、AflIIでpCMV-E2F437を消化し、DNA pol I（Klenowフラグメント）で末端を処理した後、AflIIの存在下で再連結して構築した。平滑末端連結により、287位に終止コドンを作製した。pCMV-E2F286-5sを、RB56-5sコード配列を含むSal I（平滑）-HindIIIフラグメントにAflII（平滑）/HindIII消化pE2F437を連結して構築した。pCTMIE-E2F194-5sおよびpCTMIE-E2F286-RB5sを、pCMV-E2F194-RB5sまたはpCMV-E2F286-RB5sのいずれかからのHindIII（平滑）-EcoRIフラグメントに、EcoRI-EcoRV消化pCTMIE（4.2KB）を連結して構築した。
Ｄ．プロモーター抑制
E2F-RB融合タンパク質の効果を測定するために、子宮頸ガン細胞株C33A（ATCC#HTB-31）を、E2-CATレポータープラスミドと等量のE2F194-RB56またはE2FRB56でトランスフェクトした（例えば、Weintraubら、Nature 358:259〜261（1992）を参照のこと）。
C33Aアッセイにおいて、250,000個のC33A細胞を６ウェル組織培養プレートのそれぞれのウェルに播種し、一晩接着させた。pCMV-RB56、pCMV-E2F RB56、またはpCMV-E2Fプラスミドの各５μgを、２連のウェル中で、ウェル当たり５μgの示されたレポーター構築物E2-CATまたはSVCAT、およびウェル当たり2.5μgのβ-galプラスミド（pCMV-β、Clontech）と同時トランスフェクトした（リン酸カルシウム法、MBSトランスフェクションキット、Stratagene）。細胞をトランスフェクションの72時間後に採取し、抽出物を調製した。
5637アッセイにおいて、250,000個の5637細胞を、上記のように播種した。RBまたはE2F-RB融合プラスミド、E2-CATまたはSV-CATレポータープラスミド、およびpCMV-β-ガラクトシダーゼの各１μgを、製造業者の説明書に従い、リポフェクチン試薬（BRL,Bethesda, Maryland）を用いて同時トランスフェクトした。
CATアッセイを、細胞抽出物の20μl（C33A）または50μl（5637）のいずれかを用いて実施した（Gormanら、Mol. Cell. Biol. 2:1044（1982））。TLCをPhosphoimager SF（Molecular Dynamics）で分析した。CAT活性を、各抽出物のβ-ガラクトシダーゼ活性に照らして、トランスフェクション効率について規格化した。抽出物のβ-ガラクトシダーゼ活性を、Rosenthalら（Meth. Enzym. 152:704（1987））に記載されるように、アッセイした。
これらの研究の結果は、以下のとおりである。E2-CATレポーターのみのトランスフェクションまたは非機能性コントロールRB56-H209変異体の存在下でのE2-CATレポーターのトランスフェクションは、比較的高いCAT活性を生じた。野生型RB56または改変体RB56-5sの同時トランスフェクションは、10〜12倍（fold）のCAT活性の抑制をもたらし、このことは、RB56またはRB56-5sは、両方がE2F依存性転写を効率的に抑制し得ることを示す。E2F194-RB5sおよびE2F286-RB56sは、転写を約50倍抑制した。転写抑制は、融合タンパク質のRB56およびE2F両成分を必要とした。なぜならば、E2F194およびE2F286の発現は、転写抑制を媒介しなかったからである。E2F-RB構築物では、SV40-CAT転写抑制が起こらなかった。従って、このことは、E2プロモーターに関する、E2FRBによる転写抑制の特異性を示す。これらの結果は、図10に図示した。
Ｅ．細胞周期停止
Saos-2（RB-/-細胞）（ATCC #HTB-85）およびC33A細胞におけるG1期停止を引き起こすE2F-RB融合ポリペプチドの能力を、調査した。以前の研究では、RB媒介E2プロモーター抑制およびG1期停止は、Saos-2細胞においては連結しているが、C33A（RB変異体）細胞では、分離していることが示されている（Xuら、PNAS92:1357-1361）。細胞をPBS中で洗浄し、1mlの−20℃の70％エタノール中で、30分間固定した。細胞を、遠心分離して回収し、そして、10μg/mlのRNase Aを含む２％血清0.5mlに再懸濁し、37℃で30分間、インキュベートした。ヨウ化プロピジウム100μg/ml）を含む0.5mlのPBSを各サンプルに添加して混合し、細胞をFACSチューブキャプストレイナーを通して濾過した。FACS分析を、二重線弁別（doublet discrimination）を用いてFACS-Scan（Becton-Dickenson）で実施した。5,000〜10,000個のCD20+事象を分析した。G0/G1、S、およびG2/Mの細胞の割合を、Modfitモデリングソフトウェアを用いて決定した。
この実験の結果は以下のとおりである。全長RB110および短縮型RB56の両方は、Saos-2細胞のG1期停止を引き起こしたが、コントロール変異体RB-H209は引き起こさなかった（表１）。同様にRB56-5s、E2F-194-RB56-5s、およびE2F286-RB56-5sの全ては、G0/G1に細胞を停止させ得た。DNA結合ドメインであるE2F194のトランスフェクションは、以前に齧歯類細胞について記載されたように（Dobrowolskiら、Oncogene 9:2605〜2612（1994））、Saos-2においてS期進入をブロックしなかった。対照的に、RB110、RB56、およびE2F-RB融合タンパク質は、C33A細胞株を停止し得なかった。このことは、これらの細胞で観察された転写抑制は、G1停止に翻訳されないことを示す。
5637細胞を停止するE2F-RB融合タンパク質の能力もまた、調査した（表２）。RB56およびRB56-5sの両方は、G0/G1に細胞を効率的に停止させた（G0/G1における細胞の約90％）。一方、E2F194-RB56-5sおよびE2F286-RB56-5sは、G0/G1停止を促進することにおいてわずかながら効率的ではなかった（G0/G1における細胞の約80％）。任意のある理論に限定されることなく、Saos-2細胞および5637細胞両方のE2F-RB融合タンパク質による効率的に劣る停止は、これらの細胞で産生される定常状態のタンパク質のより低いレベルに起因するようである（図11、パネルbおよびc）。
0004109721.tif 000002
0004109721.tif 000003
Ｆ．機能的RBバックグラウンドにおける融合タンパク質の活性
次いで、機能的RBを含む細胞性バックグラウンドにおけるE2F-RB融合タンパク質の活性を、測定した。NIH-3T3細胞を、RB56またはE2F-RB56融合体でトランスフェクトし、そして、抗RBモノクローナル抗体3C8で染色した（Wenら、J.Immuno. Meth. 169:231〜240（1994））。FACS分析を、RB発現細胞について実施した。結果を図12に示した。非ゲート化（non-gated）集団（g）は、NIH-3T3細胞について特徴的な細胞周期分布を示す（60％ G0、28％ S、10％ G2/M）。対照的に、RB56（a, b）またはE2F-RB融合タンパク質（c〜f）でトランスフェクトされた細胞において、90％を超えるRB発現細胞が、G0/G1において停止された。これらのデータは、G0/G1において細胞を停止させるRBおよびE2F-RB56融合体の能力は、RB陰性腫瘍細胞に制限されないことを実証する。トランスフェクトされたNIH-3T3細胞において発現されるタンパク質の相対的レベルもまた、調査した。これらの細胞において、RB110は効率的に発現されなかった。
従って、これらのデータは、E2F-RB融合タンパク質は、pRBまたはRB56のいずれか単独より効率的な転写リプレッサーであり、そして、RBは、E2Fのトランス活性化ドメインを直接ブロックするのではなく、E2Fに結合されたままでいることにより、転写を抑制し得ることを実証した。これらのデータは、RB+細胞およびRB陰性細胞またはRB変異細胞の両方におけるRBアゴニストとしてのE2F-RBの融合体の使用を支持する。
実施例  II．
E2F-RB融合体の組織特異的発現
Ａ．組換えアデノウイルスの構築：
この実験では、CMVプロモーターまたは平滑筋α−アクチンプロモーターの制御下に、RBポリペプチドを含む組換えアデノウイルスを作製した。
平滑筋α−アクチンプロモーター（塩基-670から+5、Reddyら「Structure of the Human Smooth Muscle α-Actin Gene」J. Biol. Chem. 265: 1683-1687（1990）, Nakanoら「Transcriptional Regulatory Elements In The 5’Upstream and First Intron Regions of The Human Smooth Muscle（aortictype）α-Actin-Encoding Gene」Gene 99: 285-289（1991））を、ゲノムライブラリーからPCRにより単離した。5’Xho IおよびAvr II、ならびに3’Xba I、Cla IおよびHind III制限部位を、クローニングの目的のために付加した。そのフラグメントを、配列決定して、塩基組成を確認するため、プラスミド中にXho I Hind IIIフラグメントとしてサブクローン化した。p56（全長RBのアミノ酸379-928）に連結した、E2F-1のDNAおよびヘテロダイマー化ドメイン（塩基95-286）を含む融合構築物286-56を、平滑筋α−アクチンプロモーターのすぐ下流にXba I、Cla Iフラグメントとしてサブクローン化し、そして、この発現カセットを消化し、そしてXba I〜Avr IIおよびCla IフラグメントとしてプラスミドpAd/ITR/IX-へクローン化してプラスミドpASN286-56を作製した。このプラスミドは、pBR322バックグラウンド中に、アデノウイルス５型の逆方向末端反復（ITR）、パッケージングシグナルおよびElaエンハンサー、続いてヒト平滑筋α−アクチンプロモーターおよび286-56カセット、次いで、Ad2配列4021-10462（E1b/タンパク質IXポリAシグナルを有する）からなった。組換えアデノウイルスを、標準的手順により作製した。プラスミドpASN286-56をNgo MIで直線化し、そしてアデノウイルス５型のE3領域とE4領域との両方に欠失を有する、Cla I消化したrAd34の大きなフラグメントとともに293細胞へ同時トランスフェクトした。Ad34は、血清型５の誘導体であった。Xba I制限フラグメントの欠失から生じた初期領域３における1.9kB欠失は、Ad5座標28593から30470まで広がり、そして、E4のTaq1フラグメント（座標33055-35573）から生じる初期領域４の1.4KB欠失はE4 0RF 6および6/7を有するcDNAで置換された。
相同組換えにより作製される組換えアデノウイルスを、制限消化分析により単離し、同定し、そして限界希釈によりさらに精製した。さらなるコントロール組換えアデノウイルスは、他に記載され、そしてコントロールウイルスACN（CMVプロモーター、Willsら、「Gene Therapy For Hepatocellular Carcinoma:Chemosensitivity Conferred By Adenovirus-Mediated Transfer of The HSV-1 Thymidne Kinase Gene.」Cancer Gene Therapy 2:191-197（1995））、およびACN56（CMVプロモーターの制御下で発現したRB）を含む。
ACN56は以下の様に調製した。p56cDNAを有するプラスミドpET 9a-Rb56（Antelmanら、Oncogene10:697-704（1995））から単離された1.7KB Xba I-BamHIフラグメントで、プラスミドACNP53（Willsら、Human Gene Therapy 5:1079-1088（1994））由来のp53 cDNAを置換することにより、p56 cDNAを有するプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、p56のアミノ酸381-928、Ad5の逆方向末端反復、ウイルスパッケージングシグナルおよびElaエンハンサー、続いてp56の発現を駆動するヒトサイトメガロウイルス即時プロモーター（CMV）およびAd2の三部分リーダーcDNAを含んだ。pBR322バックグラウンドにおいて、このp56 cDNAの後に、Ad2配列4021-10462が続いた。このプラスミドをEcoRIで直線化し、そしてbsp106消化DL327（E3欠失；Thimmappaayaら、Cell31:543-551（1982））またはh5ile4（E4欠失；Hemstromら、J. Virol. 62: 3258-3264（1988）））の大きなフラグメントと同時トランスフェクトした。組換えウイルスを、限界希釈によりさらに精製した。
Ｂ．細胞増殖
この実験において、細胞株に、培養液中で、RBポリペプチドの相対的発現および細胞増殖への効果を確めるために組換えアデノウイルスRB構築体を感染させた。
H358（ATCC # Crl 5807）およびMDA-MB468（ATCC # HTB 132、胸腺ガン）細胞に関しては、5,000細胞／ウェルを、96ウェルマイクロタイタープレート（Costar）中の通常の増殖にプレートし、そして37℃、７％CO2で一晩インキュベートさせた。ウイルスを増殖培地中で連続的に希釈し、そして48時間、指示された用量で細胞に感染させるために用いた。この時点で、3Hチミジン（Amersham、0.5μCi/ウェル）を添加し、そしてこの細胞を、採取する前にさらに３時間、37℃でインキュベートした。A7r5（ATCC CRL1444、ラット平滑筋）とA10（ATCC CRL1476、ラット平滑筋）細胞の両方を、それぞれ、DME+0.5％FCSまたはDME+20％ FCSのいずれかで、3,000細胞／ウェルで播種した。ウイルスを、播種培地で連続的に希釈し、そして図に示される用量で細胞に感染させた。この感染および標識手順は、2μCi/ウェルの標識を使用したことを除いて、A10細胞に関しては、H358ならびにMDA-MB468細胞と同じであった。A7r5細胞は、播種後48時間まで、ウイルスに感染しなかった。感染後48時間で、血清濃度は10％FCSまで増加させ、そして2μCi/ウェルの3Hチミジンを添加し、そして採取前にさらに３時間インキュベーションを続けた。全細胞を、ウェルからの培地のアスピレーション、細胞のトリプシン処理、およびPackard Top細胞計数採取器を備える96ウェルGF/Cフィルターを使用して採取することにより採取した。結果を、培地で処理したコントロール増殖対ウイルスの用量の平均パーセンテージ（±SD）として図13および14中にプロットする。
従って、図13は、筋細胞A10およびA7R5細胞に対するアデノウイルスp56構築物の効果の比較を示す。CMV駆動性p56（ACN56）ウイルスは、アクチンプロモーター駆動性E2F融合構築物（ASN586-56 #25,26）とほぼ同じ程度でA10増殖を阻害した。図14には、乳ガン細胞株（MDA Mβ468）および非小細胞肺悪性腫瘍株（H358）の阻害に対するアデノウイルス構築物の効果を示す。これらの実験において、アクチンプロモーター駆動性E2F-p56が有効ではなかった一方、CMVプロモーター駆動性p56は、非平滑筋細胞の増殖の阻害に有効であった。
用いた平滑筋細胞株より非平滑筋細胞株の方がアデノウイルスにより感染可能かどうかを判断するため、４個の細胞株H358、MB468、A7R5およびA10を、５のMOIでβ-ガラクトシダーゼ（ACβGL；Wills,ら、Human Gene Therapy 5:1079-1088（1994））を発現するアデノウイルスに感染させ、そしてβ-gal染色の程度を試験した。図15（上部）に示すように、非平滑筋細胞株は、平滑筋細胞株よりも有意に感染可能であった。さらなる試験において、細胞は、ACN56に、より高い感染多重度（50、100、250、500）で感染し、そして感染細胞に存在するp56の量をオートラジオグラフィーによって検出した。図15（底部）に見出され得るように、非平滑筋細胞株は有意に、より多くp56が存在した。なぜならば、そのより強い感染性の結果として、感染細胞は、より高いウイルス負荷を有し、従って非組織特異的CMVプロモーターに駆動されるより多くのp56鋳型コピーを有するからである。
さらなる実験において、平滑筋組織のアクチン平滑筋プロモーターの特異性を確実にした。本実験において、異なるプロモーターによって駆動される、β-gal構築物に感染した細胞でのβ-gal発現レベルを測定した。図19に見出され得るように、平滑筋細胞はより低い感染性であるにもかかわらず、平滑筋αアクチンプロモーターを用いるこれらの細胞においてのみ、発現は明らかであった。
図21は、CMVあるいは平滑筋αアクチンプロモーター（このプロモーターは下流にトランスジーン（それぞれ、示されるACNE3またはASBE3-2単離物）を含まない）のいずれかを含む、CMV駆動性p56組換えアデノウイルス（ACN56E4）対ヒト平滑筋αアクチンプロモーター駆動性E2F-p56融合構築物（ASN286-56）対コントロールアデノウイルス構築物の効果の比較を示す。アッセイは、平滑筋細胞株（A7R5）または非筋細胞株（MDA-MB468、乳ガン）のいずれかへの3H-チミジンの取り込みであった。結果は、平滑筋αアクチンプロモーターを使用する筋肉組織特異性、ならびにp56トランスジーンおよびE2F-p56トランスジーンの両方をそれぞれのコントロールと比較して特異的に阻害することを証明した。
Ｃ．再狭窄の阻害
バルーン損傷のモデルはClowesら（Clowes,Lab.Invest.49:327-333（1983））によって記載されたものを基とした。体重400g〜500gの雄性Sprague-Dawleyラットを、ペントバルビタールナトリウム（45mg/kg。Abbot Laboratories,North Chicago,Illinois）の腹腔内注射により麻酔した。左総頸動脈の分岐を正中切開で露出させ、そして左総頸動脈、内頸動脈および外頸動脈を一時的に結紮した。2F塞栓摘出カテーテル（Baxter Edwards Healthcare Corp.,Irvine,CA）を外頸動脈内に導入し、そして総頸動脈の遠位結紮まで進行させた。バルーンを生理食塩水で膨らませ、膨張した内皮創傷を作製するために動脈切開部位の方へ３回引っ張り、次いでカテーテルを回収した。15％（重量／容量）のPoloxamer407を用いて10μl容量を100μl（BASF,Parsippany,N.J.）に希釈したアデノウイルス（１×109pfuのAd-RB（ACNRb）もしくはAd-p56（ACN56））またはAd-β-Gal（１×109pfu、上記のように希釈した）を、ちょうど頸動脈分岐の近位に挿入したカニューレを介して、一時的に単離した動脈のセグメントに注射した。アデノウイルス溶液を20分間インキュベートした後、ウイルス注入を取り除き、そしてカニューレを取り除いた。次いで、近位外頸動脈を結紮し、そして結紮の解放により血流を総頸動脈に回復させた。実験プロトコルはInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認され、そして「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.」（NIH Publication番号86-23、1985年改訂）に編纂された。
ラットを、処置後14日目にペントバルビタール（100mg/kg）で腹腔内注射屠殺した。左総頸動脈の初期バルーン創傷セグメント（肩甲舌骨の頸動脈分岐近位端由来）を生理食塩水で灌流し、そして周辺組織から切除した。組織をパラフィン中に包埋するまでに100％メタノール中で固定した。いくつかの4μmの切片を、各組織標本から切り出した。各標本からの一つの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして別の切片をリチャードソン組合せ弾性三原色（eastic-trichrome）染色で染色し、通常の光学顕微鏡分析を行った。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色または弾性三原色染色した頸動脈切片の横断面の組織学的画像は、デジタル化基板（Summagraphics）に投影され、そして血管内膜領域、中膜領域および管腔領域をコンピューター化スケッチング（sketching）プログラム（MACMEASURE,バージョン1.9,National Institute of Mental Health）を用いて形態計測学的定量分析により測定した。
結果は、平均値±S.E.M.で示した。グループ間の差異は、独立両側スチューデントのt検定を用いて分析した。統計学的な有意性は、効果無しの可能性が＜0.05の場合を仮定した。
結果を図17および18に示す。図17において、新規内膜形成の相対的阻害をグラフで表し、p56およびRBの新規内膜形成阻害の能力を証明した。図18は、p56存在下における新規内膜の劇的な減少の写真の証拠を提供する。
アデノウイルス処置頸動脈を、バルーン創傷および感染の後２日目にラットから採取した。組織はパラフィンに包埋するまでにリン酸緩衝化ホルマリン中で固定した。組織を４μmの横断面に切断し、そしてキシレンおよび等級のアルコールによってロウを取り除いた。内因性ペルオキシダーゼを、30分間、１％過酸化水素でクエンチした。抗原の取り出し（retrieval）は、10mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）中で95℃で10分間行った。モノクローナル抗RB抗体（AB-5、Oncogene Sciences、Uniondale、New York）を、湿潤チャンバー内で４℃で24時間10μg/ml PBSに適用した。Unitect Mouse Immunohistochemistry Kit（Oncogene Sciences、Uniondale、New York）からの二次抗体を製造者説明書に従って、適用した。抗体複合体を3,3’-ジアミノベンジデン（DAB,Vector Laboratories,Burlingame,CA）を用いて可視化した。スライドをヘマトキシリンで軽く対比染色し、そして標本とした。結果を図20に示す。
本明細書中に引用された参考文献はすべて、全目的のためにその全体を参考として本明細書中で援用する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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