(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 固相化した抗原KL-6と、肺癌患者から採取された検体試料を反応させた後、非反応物質を洗浄除去する工程
(b) 上記工程で得られた反応物質と標識した抗ヒトIgG 抗体とを反応させた後、結合しない余分の標識抗ヒトIgG 抗体を洗浄除去する工程
(c) 結合した標識抗ヒトIgG 抗体量を測定することにより検体試料中の抗KL-6自己抗体量を定量する工程
からなることを特徴とする肺癌患者の予後検査方法。
【請求項２】
標識物質が、酵素または電気化学発光物質である請求項１記載の方法。
【請求項３】
検体試料が、血清である請求項１記載の方法。
【請求項４】
肺癌患者が、進行性非小細胞肺癌患者である請求項１記載の方法。
【請求項５】
抗原KL-6を含むことを特徴とする、抗KL-6自己抗体量を測定することによる肺癌患者の予後を検査する検査試薬。
【請求項６】
肺癌患者が、進行性非小細胞肺癌患者である請求項５記載の検査試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清等の検体試料中の抗ムチンMUC1抗体を測定することにより肺癌患者の予後を検査する方法及び検査試薬であって、医療の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】
ムチンは上皮細胞の産生する粘液の主成分であり、セリン、スレオニンの含量が多く、O-グリコシド結合糖鎖、シアル酸、硫酸基に富むなどの生化学的特徴を有している物質である。
ムチンは最近、上皮由来の腫瘍マーカーとして注目され、MUC1からMUC8まで知られている。なかでもMUC1ムチンは膜貫通型糖蛋白として存在し、腫瘍細胞とその微小循環を形成している宿主の細胞との相互作用を規定する糖鎖表出分子である。乳癌をはじめ大腸癌、膵臓癌などの各種の癌におけるムチン分子の診断・治療への研究が報告されており、機能分子としてその重要性が認識され始めている。
【０００３】
MUC1ムチンは種々の癌細胞に発現し、癌の増殖、細胞接着さらに転移に関与することが知られている。大腸癌においては、進行度とともにMUC1ムチンの発現量が増加し、さらに原発巣より転移巣において発現量が増加していることが報告されている。また、MUC1ムチンの免疫原性の高いことも注目されており、潰瘍性大腸炎患者の一部において抗MUC1抗体陽性者を検出したとの報告（Hinode et al.,Immunol. Lett., 35, 163-168, 1993)や乳癌あるいは卵巣癌患者の一部において、MUC1と抗MUC1抗体の免疫複合体が検出されたと報告されている（Gourevitch et al., Br.J.Cancer, 72, 934-938, 1995)。しかし、ムチンと癌との関係は不明な点が多く、診断への応用はいまだ確立されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ムチンMUC1の血清中自己抗体を測定することにより、肺癌との関係を究明し、該抗体を肺癌予後検査に応用することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、肺腺癌由来の細胞株VMRC-LCRを免疫し、間質性肺炎患者の病体の活動性を鋭敏に診断することができるモノクロナール抗体、抗KL-6抗体を作製した（特公平7-31207)。さらに、本抗体が認識する抗原KL-6が、IASLC 主催の肺細胞抗原国際分類においてクラスター９であるMUC1に属するムチンの一つであることを明らかにした(Stahl,R.A. et al., Int.J.Cancer, ８(Suppl.), 6-26, 1994) 。
【０００６】
本発明者らは、抗KL-6抗体と肺癌との関係をさらに明らかにするために、抗KL-6抗体を用いるイムノアフィニティカラムを用いて抗原KL-6の精製を行った。肺腺癌患者腹水を原料として、アフィニティクロマトグラフィ、次いでゲルろ過クロマトグラフィ操作により抗原KL-6を精製し、その性状を解析したところ、ムチンMUC1であることが確認された。
そこで抗原KL-6を用いてELIZA 法により、正常者および肺癌患者血清中に抗MUC1抗体が存在するか否かを検査したところ、驚くべきことに、肺癌患者および正常者の全例において抗MUC1抗体が検出された。この事実は、抗MUC1自己抗体が存在することを意味し、さらにその値は肺癌患者の方が低く、患者の抗MUC1自己抗体価と生存期間との相関を見たところ、有意な正の相関を有することを見出し本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、
(a) 固相化した抗原KL-6と、肺癌患者から採取された検体試料を反応させた後、非反応物質を洗浄除去する工程
(b) 上記工程で得られた反応物質と標識した抗ヒトIgG 抗体とを反応させた後、結合しない余分の標識抗ヒトIgG 抗体を洗浄除去する工程
(c) 結合した標識抗ヒトIgG 抗体量を測定することにより検体試料中の抗KL-6自己抗体量を定量する工程
からなることを特徴とする肺癌患者の予後検査方法、及び抗原KL-6を含むことを特徴とする、上記検査に用いられる検査試薬に関する。
【０００８】
MUC1ムチンとしては、好ましくは抗原KL-6が挙げられ、これ以後の記載は抗原KL-6を代表例として記載する。なお、KL-6の名称は、抗原名を意味し、それに対する抗体は抗KL-6抗体と記載する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、抗原KL-6の自己抗体が正常者及び肺癌患者の血清中に存在することを見出し、この抗原KL-6がMUC1ムチンと同一物質であることを確認したことに基づくものである。自己抗体の測定法は、抗原KL-6を用いて、通常の免疫学的手法を用いればよく、凝集法、ELIZA 法、サンドイッチ法などいずれの手法も可能である。通常、第２反応物質として、標識抗ヒトIgG 抗体を使用するが、標識物質としては、酵素、色素、発光物質、蛍光色素、電気化学発光物質など常用されているものを含め特に限定されない。
【００１０】
抗原KL-6は、本発明者らの開発した抗KL-6抗体と反応する物質を、たとえば肺腺癌患者腹水を原料として精製することができる（Hirasawa,Y.et al., Am.J.Respir.Cell Mol.Biol., 17, 501-507, 1997)。なお、MUC1ムチンはMCF7,ZR75-1など乳癌細胞株培養上清あるいはその他の癌細胞株培養上清を原料として常法により精製することができる。抗KL-6抗体は、特公平7-312207に記載されているごとく、肺腺癌由来の細胞株VMRC-LCRを抗原としてマウスに免疫し、常法のモノクロナール抗体の作製法に準じて作製することができる（Koehler G. Milstein C., Eur.J.Immunol., ６, 511-519, 1976)。
【００１１】
本発明の検査試薬の具体的態様は、ELIZA 法を１例として示せば次のようになる。抗原KL-6が固相化されたものを必須の構成成分とし、自己抗体検出用試薬として標識抗ヒトIgG 抗体を含有するものである。また検査実施のための適当な抗原希釈液、反応希釈液、基質溶解液、反応停止液などがセット中に添付されることは自由であり、これらは本発明を限定するものではない。抗原KL-6の固相化体は、マイクロタイターウエル、粒子、磁気粒子、合成樹脂など通常使用されているものが用いられ特に限定されない。
【００１２】
本発明の検査方法は、まず固相化抗原KL-6に検体血清を反応させたのち非反応物質を洗浄除去した後、標識抗ヒトIgG 抗体を反応させ、その後結合しない余分の標識抗ヒトIgG 抗体を洗浄除去する。次いで、結合した標識抗ヒトIgG 抗体量を標識物質の特性に応じて測定することにより、検体血清中の抗KL-6自己抗体量を定量し、コントロール値、標準サンプル値などと比較して解析することにより肺癌患者の予後を検査する。
【００１３】
【実施例】
以下に記載する実施例をもって、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
実施例１  抗原KL-6の精製
本発明者らの開発した抗KL-6抗体のアフィニティカラムを作製し、肺腺癌患者腹水を原料として抗原KL-6を精製した。
まず、CNBr-Sepharose4Bと抗KL-6抗体とを常法により結合させアフィニティカラム(size:10x60mm)を作成した。0.1M Tris-HCl buffer(pH 8.0)にてよく緩衝化後、腹水390ml を負荷した後、同bufferにて洗浄。3M MgCl2含有同bufferにて溶出した。溶出液をSuperose 6 ゲル濾過カラム(size:15x320mm, 溶媒0.1M Tris-HCl buffer, pH8.0)にかけ、高分子溶出画分を凍結乾燥し、精製KL-6抗原を得た。
【００１５】
上記の方法により精製された抗原KL-6をSDS-PAGEにて電気泳動後Western blotting法により解析した。SDS-PAGEは４％ポリアクリルアミドゲルを使用し、サンプル量35μl(10μg/ml) を負荷し、70V 27mA（定電圧) で２時間泳動した。ニトロセルロース膜にブロッティング(100V,27mA,1.5hr) 後、解析した結果、抗原KL-6はPAS 染色および抗KL-6抗体での免疫染色で200kD より高分子量の領域にdisperse patternを示すバンドが確認された。また、MUC1ムチン抗原のコア蛋白の繰り返し領域を認識するDF-3抗体（Abe,M.et al., Cancer Res., 49, 2834-2839,1989, Tray-Fuji Bionics Inco., Tokyo, Japan より供与されたもの) で免疫染色した場合も、抗KL-6抗体の場合と同様な染色パターンを確認した。このことから抗原KL-6はMUC1ムチンに属することが判明した。
【００１６】
実施例２  抗KL-6自己抗体の検出
ELIZA 法にて測定した。実施例１の方法により精製した抗原KL-6を固相化したプレートに、対象患者血清 (20倍および 100倍希釈したもの) またはコントロール血清（288U/ml のものを 320倍および1280倍希釈したものを使用) を添加し反応させた。洗浄後、ワサビペルオキシダーゼを標識した抗ヒトIgG 抗体を添加反応させたのち洗浄した。次いで酵素基質（o-フェニレンジアミン）と反応させ、発色度を測定し、肺腺癌患者腹水の抗KL-6自己抗体価を70U/mlとして、40倍希釈から 320倍希釈までの倍数希釈サンプルのODを基に作成した検量線を基準として、検体のOD値から抗体価をユニットとして表わした。結果を図１に示す。
図１の結果から明らかなように、肺癌患者、コントロールの全例において、抗KL-6自己抗体を検出し、コントロール値は 108±26.2 U/ml 、肺癌患者は32±13 U/ml で、患者の抗KL-6自己抗体価は有意に低下していた。
【００１７】
実施例３  抗KL-6自己抗体の確認
実施例２に記載のELIZA 法により検出された抗KL-6自己抗体が、真に抗MUC1抗体であるかどうかを確認するために、ヒト血清を原料として抗KL-6自己抗体を精製した。まず正常者のプール血清を、硫酸アンモニウムによって塩析し、60％飽和硫安分画を分取した。
次いで、マウス抗KL-6抗体を結合させたイムノアフィニティカラム (size:10x60mm、樹脂名：CNBr-Sepharose）に、実施例１により精製した抗原KL-6 (1mg,使用溶媒：0.1M Tris-HCl buffer, pH 8.0）を負荷し、抗KL-6抗体と抗原KL-6の結合した免疫複合体カラムを作製した。このカラムに60％飽和硫安沈殿分画(500mg, 溶媒0.15M NaCl含有0.02M Tris-HCl buffer, pH8.0に溶解) を負荷し同溶媒で洗浄した後、50mlの2M MgCl2含有0.1M Tris-HCl buffer, pH8.0 で溶出し、セントリコンプラス（限外濾過) にて２mlに濃縮した。これを精製抗KL-6抗体とし、その蛋白濃度は５μg/mlであった。
【００１８】
得られた溶出液を、12％ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS-PAGEにて分析した結果、２−メルカプトエタノール共存下、非共存下において、IgG の泳動パターンと一致する領域、すなわちＨ鎖50kD、Ｌ鎖25kDの位置にバンドを認めた。さらに、精製抗原KL-6をSDS-PAGEで泳動した後、抗KL-6抗体、抗MUC1抗体Ma695(MUC1のCarbohydrate epitopeを認識する抗体、Van Daken A.et al., Anticancer Res., 16, 2339-1343, 1996, YLEM 社、Roma, Italy)およびHMFG2抗体（MUC1を認識する抗体、Fisken J.et al., Br.J.Cancer, 67, 1065-1070, 1993, YLEM 社、Roma, Italy)で免疫染色した結果、これら３抗体により、同様の高分子量の領域にバンドを認めた。この際、精製ヒトIgG による免疫染色ではなんのバンドも認められなかった。これらのことからヒト血清中には抗MUC1抗体が存在することが確認された。
【００１９】
実施例４  抗MUC1抗体価と生存期間との相関
PS 0, 1, 2のStage III, IV 期の進行非小細胞肺癌患者30例を対象として、血清中の抗MUC1抗体価を分析し、生命予後との関連を検討した。コントロールとして対象患者と年齢分布を合わせた非坦癌者60例を用いた。
その結果、図２に示すごとく、50％生存率は約12ヶ月、３年生存率は17％であった。コントロールの抗MUC1抗体価の平均値マイナス３SD値を計算し、32 U/ml をcut off 値として２つのグループに分けて解析した結果、図３に示すごとく、平均生存期間において32 U/ml 以上の群は26ヶ月、32 U/ml 未満の群は7.7 ヶ月と32 U/ml 以上の群において有意な生存率の向上が認められた。その相関は図４に示すようにきれいな相関が見られた。また、治療成績と抗MUC1抗体価の間にも有意な相関を認めた。
この事より、患者血清中の抗MUC1抗体価を測定することは、予後の検査法として有用な方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  正常者及び肺癌患者血清中の抗MUC1抗体価を示す図である。
【図２】  肺癌患者の生存率曲線である。
【図３】  抗MUC1抗体価32U/mlを境とした肺癌患者の生存率曲線である。
【図４】  抗MUC1抗体価と肺癌患者の生存期間との相関を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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