(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体を、陰イオンが共役塩基イオンに置換されている陰イオン交換体に吸着させた後、該ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体を該陰イオン交換体から遊離させる陰イオン交換体による処理を行うことを特徴とする、精製された、ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法。
【請求項２】
陰イオン交換体による処理を液体クロマトグラフィー法を用いて行うことを特徴とする請求項１記載の精製された、ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
ヘパリンもしくはその塩を分子量降下処理を行い、ついで、得られた低分子ヘパリンもしくはその塩を、陰イオンが共役塩基イオンに置換されている陰イオン交換体に吸着させた後、該陰イオン交換体から遊離させる陰イオン交換体による処理を行うことを特徴とする、精製された、低分子ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法。
【請求項４】
陰イオン交換体による処理を液体クロマトグラフィー法を用いて行うことを特徴とする請求項３記載の精製された、低分子ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体を特定の陰イオン交換体による処理をすることを特徴とする、精製された、ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法及びヘパリンもしくはその塩を分子量降下処理し、ついで、得られた低分子ヘパリンもしくはその塩を、特定の陰イオン交換体による処理をすることを特徴とする、精製された、低分子ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンは、強い血液抗凝固活性を有しており、汎発性血管内血液凝固症候群の治療、心筋梗塞症や脳塞栓症等の種々の血栓塞栓症の治療及び予防の他に、血液透析・人工心肺等の体外循環装置使用時や血管カテーテル挿入時又は輸血、及び血液検査の際等における血液凝固の防止に用いられている。ヘパリンを上記治療もしくは予防に用いる場合、血液凝固時間の延長に伴う出血傾向の増大という問題が生じるため、ヘパリンの低分子化等が検討されており、その中でも陰イオン吸着体を用いることについての検討がなされている（特公昭６３−４４７６４号公報）。
【０００３】
しかしながら、ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体（以下、これらを総称してヘパリン類ということがある）を一旦、陰イオン吸着体に吸着させ、その後に遊離させると、得られるヘパリン類の活性が落ちるという問題点がある。
【０００４】
ヘパリンの具体的な精製方法、低分子ヘパリンの具体的な製造方法としては、特公昭６３−４４７６４号公報に記載された製造方法を挙げることができるが、該公報に記載された精製方法、製造方法は、高い抗Xa因子活性を保ったヘパリンを得るという点で未だ課題を有している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した。その結果、陰イオンが共役塩基イオンに置換されている陰イオン交換体に、ヘパリン類を吸着させた後、該ヘパリン類を遊離させる陰イオン交換体による処理を行うこと、好ましくは液体クロマトグラフィー法を用いて該処理を行うことにより、精製された、ヘパリン類を容易に製造できること、およびヘパリンもしくはその塩に分子量降下処理を行い、ついで陰イオン交換体による処理を行うこと、好ましくは液体クロマトグラフィー法を用いて該処理を行うことにより、精製された、低分子ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体を容易に製造できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、ヘパリン類の活性が低下しにくい精製ヘパリン類の製造方法および抗Xa因子活性の高い、精製された低分子ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、陰イオンが共役塩基イオンに置換されている陰イオン交換体に、ヘパリン類を吸着させた後に、再び該ヘパリン類を遊離させる陰イオン交換体による処理を行うこと、好ましくは該処理を液体クロマトグラフィー法を用いて行うことを特徴とする、精製されたヘパリン類の製造方法およびヘパリンもしくはその塩に分子量降下処理を行い、ついで得られた低分子ヘパリンもしくはその塩を陰イオンが共役塩基イオンに置換されている陰イオン交換体を用いて陰イオン交換体による処理を行うこと、好ましくは該処理を液体クロマトグラフィー法を用いて行うことを特徴とする、精製された、低分子ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用するヘパリンは特に限定されるものではないが、該ヘパリンとしては、例えば、肝臓もしくは肺臓を自己消化させたのち、硫酸アンモニウムで飽和した水酸化ナトリウム溶液で温抽出し、該抽出液を中和後アルコールでヘパリンとたんぱく質の複合体を沈殿させ、アルコール洗浄し、次いでアルカリ溶液に溶かすことにより、タンパク質をトリプシンで消化除去した後、アルコールで沈殿させ粗製品を得て、その粗製品を塩化カドミウムで処理して不純物を除き、アセトンで沈殿させることにより得られたものを挙げることができる。
【０００８】
本発明において使用するヘパリン塩は特に限定されるものではないが、例えば、ヘパリンの金属塩等を挙げることができ、該金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウム及びカリウム等を挙げることができる。中でもヘパリンナトリウムは、日本薬局方収載品であることから本発明に好ましく使用することができる。また、ヘパリンの金属塩は、前述の方法で得られたヘパリンを、塩酸ベンジジン塩もしくはブルシン塩として分離し、金属塩に変えることにより得られる。また、ヘパリンナトリウムとしては、第１３改正  日本薬局方記載のヘパリンナトリウムを用いることが例示できる。
【０００９】
なお、本発明において低分子ヘパリンもしくはその塩とは、標準ヘパリンもしくはその塩よりも小さい平均分子量を有するヘパリンもしくはその塩のことである。標準ヘパリンもしくはその塩の平均分子量は抽出源によっても異なることから、本発明の製造方法によって得られる低分子ヘパリンもしくはその塩の平均分子量は特定されるものではないが、具体的には１０００〜７０００の範囲のものである。
【００１０】
本発明で用いるヘパリン誘導体とは、該ヘパリンもしくはその塩を原料として化学構造を変化させたものを例示でき、具体的には亜硝酸ナトリウムもしくは亜硝酸カリウム等を当該ヘパリンやその塩に添加し、分子量を降下させたもの、また、該分子量を降下させたものを還元剤を用いて還元したものなどを例示することができる。還元剤としては水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等が例示できる。
【００１１】
本発明で用いる陰イオン交換体とは、セルロースを担持体とし、エピクロルヒドリン等をスペーサーとして、アミノエチル基、ジエチルアミノエチル基、トリエチルアミノエチル基、グアニドエチル基、ｐ−アミノベンジル基等をリガントとしたものを例示できる。また、該担持体としてセルロース以外にアガロース、スチレンポリマー等を用いることも例示できる。
【００１２】
該陰イオン交換体として、より具体的には、ＤＥＡＥ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、商標） Ａ−２５、ＤＥＡＥ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、商標） Ａ−５０、ＱＡＥ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、商標） Ａ−２５、ＱＡＥ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、商標） Ａ−５０、ＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、ＤＥＡＥ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、商標） ＣＬ−６Ｂ、Ｑ−セファロースファストフロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、商標）、ＤＥＡＥ セファロースファストフロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、商標）、ＭｏｎｏＱ（以上、アマシャムファルマシアバイオテク社製）、
【００１３】
ＤＥＡＥ−トヨパール（商標）６５０、ＱＡＥ−トヨパール（商標）５５０、ＳｕｐｅｒＱ−トヨパール６５０（商標、以上、東ソー社製）、ＤＥＡＥ−セルロファイン（商標）Ａ−２００−ｍ、ＤＥＡＥ−セルロファイン（商標）Ａ−５００−ｍ、ＤＥＡＥ−セルロファイン（商標）Ａ−５００−ｓｆおよびＤＥＡＥ−セルロファイン（商標）Ａ−８００−ｍ（以上、生化学工業社製）などの市販の陰イオン交換体を挙げることができる。
【００１４】
本発明に用いる陰イオンが共役塩基イオンに置換されている陰イオン交換体とは、上述の陰イオン交換体に、塩酸、硫酸、酢酸等を浸透させたものを例示でき、陰イオン交換体の対イオンを塩素イオン、硫酸イオン、酢酸イオン等の共役塩基に置換したものを例示することができる。該陰イオン交換体を用いて、ヘパリン、その塩を処理することにより、ヘパリン類が薬理作用を有するようになり、ヘパリン分子内のO−もしくはＮ−硫酸基の加水分解による脱離を抑制し、抗Xa因子活性が高いヘパリン類が得られる。具体的には、陰イオン交換体を0.05〜6.0mol/lの塩酸と振盪させる方法が例示でき、経済性の点で液体クロマトグラフィ−装置を用いて共役塩基イオンに置換された陰イオン交換体に変換することが好ましい。
【００１５】
本発明の、精製されたヘパリン類の製造方法は、上述の陰イオン交換体に、上述のヘパリン類を吸着させた後に、再びヘパリン類をを遊離させる陰イオン交換体による処理を行うことを特徴とする製造方法である。ここで、該吸着とは、上述の陰イオン交換体にヘパリン類を水等に溶解させた溶液を浸透させて吸着させることであり、具体的には、上述の陰イオン交換体とヘパリン類の該溶液とを振盪後、溶液を濾過する方法を例示することができ、経済性の点で液体クロマトグラフィ−法を用いて行うことが好ましい。また、該遊離とは、該吸着させた陰イオン交換体に塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の水溶液を浸透させ、陰イオン交換体から該水溶液中に上述のヘパリン類を移行させることである。具体的には、上述の陰イオン交換体と、該水溶液とを振盪後、濾過により該水溶液を分離する方法が例示でき、経済性の点で液体クロマトグラフィ−法を用いて行うことが好ましい。該分離した水溶液は、晶析用溶媒中で晶析させることにより、固体状のヘパリン類を得ることができる。
【００１６】
本発明における分子量降下処理とは、亜硝酸ナトリウムもしくは亜硝酸カリウム等もしくははヘパリン分解酵素等を当該ヘパリンもしくはその塩に添加することを例示できる。また、収率の点で上述の亜硝酸ナトリウムを添加した後に、塩酸、硫酸、酢酸等の酸性溶液を用いることが好ましい処理方法である。より好ましくは塩酸を用いる方法である。なお、収率の点で酸性溶液を用いた後に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等の無機塩基により中和する。収率の点で該中和の後に、還元剤を用いた処理を行うことが好ましく、該還元剤としては水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムが例示できる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例に用いた評価方法を下記に示す。
【００１８】
（１）平均分子量
較正用試料及び試料を移動相で10mg/mLになるように溶解する。これらの溶液25μLにつき、液体クロマトグラフ法により試験を行う。検出器は紫外可視分光光度計、示差屈折計の順に連結させ、予め紫外可視分光光度計と示差屈折計を用いて紫外可視分光光度と示差屈折率を求め、紫外可視分光光度計から得られたクロマトグラム保持時間を示差屈折計のピーク保持時間に補正する。標準溶液は紫外可視分光光度計及び示差屈折計から得られたクロマトグラムを、試料溶液は示差屈折計から得られたクロマトグラムを一定間隔で分割し、其々の保持時間(ｉ)におけるピーク高さを求める。次の式により相対平均分子量を求め、その値を平均分子量とした。
標準溶液の紫外可視分光光度計及び示差屈折計から得られた２つのクロマトグラムから平均分子量の計算に用いる係数を求める。
ｒ＝ΣRISi／ΣUVSi
ΣRISi：標準溶液の示差屈折計から得られた主ピークの保持時間(ｉ)におけるピーク高さの合計
ΣUVSi：標準溶液の紫外可視分光光度計から得られた主ピークの保持時間(ｉ)におけるピーク高さの合計
ｆ＝Ｍｎ／ｒ
Ｍｎ：平均分子量測定用標準品の数平均分子量
Ｍｉ(保持時間(ｉ)に対する分子量)＝ｆ×RISi／UVSi
RISi：標準溶液の示差屈折計から得られたピークの保持時間(ｉ)におけるピーク高さ
UVSi：標準溶液の紫外可視分光光度計から得られたピークの保持時間(ｉ)におけるピーク高さ
平均相対分子量＝ΣRITi／Σ(RITi／Mi)
RITi：試料溶液の示差屈折計から得られたピークの保持時間(ｉ)におけるピーク高さ
尚、較正用試料として分子量校正用低分子量ヘパリン標準品(90/686)（National Institute for Biological Standards and Control製）を用いた。
【００１９】
（２）抗Xa因子活性
テストチームヘパリンSキット（第一化学薬品株式会社製）を用い、該キットの添付文章に基づきヘパリン濃度（IU/ml）を測定し、これを抗Xa因子活性とした。
【００２０】
実施例１
DEAE−セルロファイン（商標）Ａ−500mを150ml充填させたカラム（44mmφ×100mm）に、0.3mol/lの塩酸を750ml流し、その後イオン交換水900mlを流して共役塩基イオンに置換された陰イオン交換体を調製した。次に、ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム2.0gをイオン交換水20mlに溶解させた溶液を、全量、該カラムに流して該陰イオン交換体に吸着させた。ついで、0.28mol/lの塩化ナトリウム水溶液150mlを用いて吸着されたヘパリンナトリウムを遊離、溶出させて、ヘパリンナトリウム水溶液を分取した。この水溶液にエタノールを加えて晶析し、ろ過を行い、精製されたヘパリンナトリウム1.26gを得た。このヘパリンナトリウムの平均分子量は3050、抗Xa因子活性は72IU／mgであった。
【００２１】
比較例１
DEAE−セルロファイン（商標）Ａ−500mを150ml充填させたカラム（44mmφ×100mm）に、ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム2.0gをイオン交換水20mlに溶解させた溶液を、全量、該カラムに流した。ついで、0.28mol/lの塩化ナトリウム水溶液150mlを用いて吸着されたヘパリンナトリウムを遊離、溶出させて、ヘパリンナトリウム水溶液を分取した。この水溶液にエタノールを加え晶析し、ろ過を行いヘパリンナトリウムを1.21gを得た。このヘパリンナトリウムは、平均分子量3100、抗Xa因子活性58IU／mgであった。
【００２２】
実施例２
ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム15.0gをイオン交換水220mlに溶解させ5℃に冷却させた。冷却後、亜硝酸ナトリウム0.33gをイオン交換水6mlに溶解させた水溶液を加え、さらに約5℃に冷却させた1mol／l塩酸45.8gを加え15分間撹拌して分解反応を行った。ついで1mol／l水酸化ナトリウム水溶液47.4gを加え反応を停止させた。次に反応液を25℃に加温し、水素化ホウ素ナトリウム0.075gを加え４時間撹拌して還元反応を行った。その後、1mol／l酢酸水溶液22.3gを加え、pHを4にして過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解させ、1mol／l水酸化ナトリウム水溶液を28.1g加えてpHを7にした。ついで反応液に6500gのエタノールを加えて晶析し、濾過することで分解・還元された低分子ヘパリンナトリウムを15.1g得た。
次に、、DEAE−セルロファイン（商標）Ａ−500mを150ml充填させたカラム（44mmφ×100mm）に0.3mol/lの塩酸を750ml流し、その後イオン交換水900ml流して調製された共役塩基イオンに置換された陰イオン交換体が充填されたカラムに、この分解・還元された低分子ヘパリンナトリウム2.0gをイオン交換水20mlに溶解させた溶液を全量流して、該陰イオン交換体に吸着させた。この後、イオン交換水93ml、0.19規定の塩化ナトリウム水溶液を225ml流し、ついで0.28規定の塩化ナトリウム水溶液150mlで、遊離、溶出させてヘパリンナトリウムの分画液を分取した。この分画液（0.28規定の塩化ナトリウム水溶液）にエタノールを加えて晶析し、ろ過を行い低分子ヘパリンナトリウム0.58gを得た。この低分子ヘパリンナトリウムの平均分子量は4800、抗Xa因子活性は126IU／mgであった。
【００２３】
実施例３
ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム15.0gをイオン交換水220mlに溶解させ5℃に冷却させた。冷却後、亜硝酸ナトリウム0.33gをイオン交換水6mlに溶解させた水溶液を加え、さらに約5℃に冷却させた1mol／l塩酸45.8gを加え15分間撹拌し分解反応を行った。ついで1mol／l水酸化ナトリウム水溶液47.4gを加えて分解反応を停止させた。次に該反応液を25℃に加温し、水素化ホウ素ナトリウム0.075gを加えて４時間撹拌し還元反応を行った後、1mol／l酢酸水溶液22.3gを加えてpHを4にし過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解させ、1mol／l水酸化ナトリウム水溶液を28.1g加えてpHを7にした。ついで反応液に6500gのエタノールを加えて晶析し、濾過することで分解・還元された低分子ヘパリンナトリウム15.1gを得た。
次に、、DEAE−セルロファイン（商標）Ａ−500m  150mlを充填させたカラム（44mmφ×100mm）に0.3mol/lの塩酸を750ml流した後、イオン交換水900mlを流して調製した、共役イオンで置換された陰イオン交換体を充填したカラムに、この分解・還元されたヘパリンナトリウム2.0gをイオン交換水20mlに溶解させた溶液を全量流して、該陰イオン交換体に吸着させた。つぎに、イオン交換水93ml、0.19規定の塩化ナトリウム水溶液を225ml流したのち、0.28規定の塩化ナトリウム水溶液150mlで吸着されたヘパリンナトリウムを遊離、溶出させてヘパリンナトリウムの分画液を分取した。この分画液（0.28規定の塩化ナトリウム水溶液）にエタノールを加えて晶析し、ろ過を行い低分子ヘパリンナトリウム0.50gを得た。この低分子ヘパリンナトリウムの平均分子量は5100、抗Xa因子活性は145IU／mgであった。
【００２４】
実施例４
ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム15.0gをイオン交換水220mlに溶解させ5℃に冷却させた。冷却後、亜硝酸ナトリウム0.33gをイオン交換水6mlに溶解させた溶液を加え、さらに約5℃に冷却させた1mol／l塩酸45.8gを加えて15分間撹拌し分解反応を行った。ついで1mol／l水酸化ナトリウム水溶液47.4gを加えて分解反応を停止させた。次に反応液を25℃に加温し、水素化ホウ素ナトリウム0.075gを加え４時間撹拌して還元反応を行った後、1mol／l酢酸水溶液22.3gを加えてpHを4にし、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解させ、ついで、1mol／l水酸化ナトリウム水溶液28.1gを加えてpHを7にした。ついで反応液に6500gのエタノールを加えて晶析し、濾過することで分解・還元された低分子ヘパリンナトリウムを15.1g得た。
次に、、DEAE−セルロファイン（商標）Ａ−500mを150ml充填させたカラム（44mmφ×100mm）に0.3mol/lの塩酸を750ml流し、その後イオン交換水900ml流して調製された共役塩基イオンに置換された陰イオン交換体が充填されたカラムに、この分解・還元されたヘパリンナトリウム2.0gをイオン交換水20mlに溶解させた溶液を全量流した。つぎに、イオン交換水93ml流して、該陰イオン交換体に吸着させたのち、0.28規定の塩化ナトリウム水溶液150mlで吸着された低分子ヘパリンナトリウムを遊離、溶出させてヘパリンナトリウムの分画液を分取した。この分画液（0.28規定の塩化ナトリウム水溶液）にエタノールを加え晶析し、ろ過を行い低分子ヘパリンナトリウム1.12gを得た。この低分子ヘパリンナトリウムの平均分子量は3200、抗Xa因子活性は86IU／mgであった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の精製されたヘパリン類の製造方法は、経済性に優れ、ヘパリンの抗Xa因子活性の低下を防ぎながら、精製されたヘパリン類を容易に製造することができる。また、本発明の低分子ヘパリンもしくはその塩の製造方法は、経済性に優れ、抗Xa因子活性が高い低分子ヘパリンもしくはその塩を容易に製造することができる。