(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
マツタケ由来である、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含んでなる、ベクター。
【請求項５】
プラスミドベクター、ウイルスベクター、およびリポソームベクターからなる群から選択される、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載のベクターによって形質転換された、宿主細胞。
【請求項７】
大腸菌、酵母、枯草菌、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒトケラチノサイト、ＣＯＰ−５、Ｃ１２７、マウス３Ｔ３細胞、ＦＲ３Ｔ３、およびＨＢ１０１からなる群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
大腸菌が、ＳＯＬＲ株、ＪＭ１０９株、ＳＵＲＥ株、ＴＯＰＰ株、およびＢＬ２１株からなる群から選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
酵母がＹＲＧ−２株である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、そしてその培養物から請求項１に記載のタンパク質を単離することを含む、請求項１に記載のタンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、抗腫瘍タンパク質およびこれをコードするＤＮＡ配列に関する。
【０００２】
背景技術
食用キノコの抗腫瘍性物質に関する研究は以前から多く行われてきている。
【０００３】
例えば、特開昭５２−６１２１４号、特開昭５５−７４７９７号、特開昭６１−２９３９２３号、特公昭６１−４７５１８号、特公昭６１−４７５１９号、特公平３−２６１７２号、特開平５−７０３６２号および特開平６−８０６９９号には、キノコ類由来の抗腫瘍性多糖類および糖タンパク質が記載されている。また、これ以外にもキノコ類を経口投与し、抗腫瘍活性が認められたとの報告がなされている。
【０００４】
しかし、本発明者らが知る限り、ガン細胞に直接作用するマツタケ（Tricholoma matsutake）由来の抗腫瘍タンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードするＤＮＡ配列は報告されていない。
【０００５】
【発明の概要】
今般、本発明者らは、マツタケ由来の抗腫瘍タンパク質を精製しこのタンパク質をコードするｃＤＮＡおよびそのアミノ酸配列を決定した。また、該タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、そのｃＤＮＡ配列を含んだベクターで大腸菌を形質転換し、抗腫瘍タンパク質を発現させることに成功した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００６】
従って、本発明は、抗腫瘍タンパク質、該タンパク質をコードする塩基配列、該塩基配列を含んでなるベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該タンパク質等の製造法、および該タンパク質に対する抗体の提供をその目的とする。
【０００７】
そして、本発明によるタンパク質は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または
（ｂ）１以上のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列であって、抗腫瘍活性を有するアミノ酸配列、
を有するもの、である。
【０００８】
【発明の具体的説明】
タンパク質
本発明によるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は後記実施例に記載されるように抗腫瘍活性を有する。
【０００９】
本発明によるタンパク質としては、配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失され、前記改変アミノ酸配列が抗腫瘍活性を有するものが挙げられる。ここにいう付加、挿入、置換、および欠失とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の抗腫瘍活性を損なわないようなものをいう。付加、挿入、置換、欠失の数は、抗腫瘍活性を損なわなければ特に限定されるものではないが、通常は１〜８個程度であることができる。
【００１０】
アミノ酸配列中における付加、挿入、置換、および欠失は、例えば、Molecular Cloning (A laboratory manual), second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol.2, Chap. 15(1989); Botstein, D. et al., Science, 229:1193(1985); Craik, C.S, Bio Techniques, 3:12(1985); Itakura, K. et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323(1984); Shortle, D. et al., Annu. Rev. Genet. 15:265(1981); Smith, M. Annu, Rev. Genet. 19:423(1985) に従って得ることができる。
【００１１】
本発明において、「抗腫瘍活性を有するタンパク質」とは、当業者により抗腫瘍活性が認められたと評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例１（３）と同様の条件において実験した場合に抗腫瘍活性が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。
【００１２】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約６５ｋＤａである。
【００１３】
配列番号１のアミノ酸配列は、例えば、そのｃＤＮＡ配列（配列番号２のＤＮＡ配列）を細菌等において常法に従って発現させることによって得ることができる。ｃＤＮＡ配列は抗腫瘍活性を有するタンパク質に対する抗体をプローブとして用い、マツタケ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（実施例２）。
本発明によるタンパク質は、抗腫瘍活性を有する。従って、子宮頚ガン、子宮体ガン、ガン抑制遺伝子ｐ５３やｐＢＲの発現異常に起因する各種ガン（皮膚ガン、肺ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、乳ガン等）の治療剤として用いることができる。
【００１４】
本発明による治療剤は、また、経口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）することができ、薬剤として経口または非経口投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物に使用される。薬剤として直接患部に到達させる方法（例えば、局所で溶解する錠剤、塗布、注射等）が有効であると考えられる。
【００１５】
治療剤は、例えばその用途に応じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠などの該タンパク質の安定性とドラッグデリバリー経路を勘案した経口剤、静注および筋注などの注射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいずれかの製剤形態に調製することができる。これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、例えば、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
【００１６】
種々の治療のための投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適宜決定される。
【００１７】
塩基配列
本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。この塩基配列の典型的配列は、また、配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。
【００１８】
配列番号２のＤＮＡ配列は、前記のようにマツタケ由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたものである。このＤＮＡ配列は、前記タンパク質のオープンリーディングフレームを含み、オープンリーディングフレームは１〜３番のＡＴＧから始まり、１６９９〜１７０１番のＴＡＡで終了する。
【００１９】
本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。
【００２０】
従って、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番号２に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００２１】
本発明による塩基配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよい。また、天然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。塩基配列は、染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法、等によって得ることができる。本発明による塩基配列は、例えば、マツタケｃＤＮＡライブラリーから配列番号３〜１８のいずれかに示されたペプチドに対応するオリゴヌクレオチドをスクリーニングの際のプローブとして用いることによって得ることができる。
【００２２】
塩基配列が天然由来のものである場合、その起源は特に限定されず、マツタケ由来のものであっても、それ以外を由来とするものであってもよい。
【００２３】
ベクターおよび形質転換
本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、ベクターが宿主細胞内で複製可能な状態で、かつその塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含むベクターが提供される。更に、本発明によれば、このベクターによって形質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。
【００２４】
融合タンパク質発現系としては、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ等との融合タンパク質が挙げられる。
【００２５】
ベクターとしては、プラスミドベクター（例えば、pBluescript SK(-) 、pBluescript SK(+) 、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＧＥＸ−５Ｔ、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＢＰＶ、およびｐＳＶＫ３（以上ファルマシア社等）、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＭＡＭ、およびｐＯＧ（以上東洋紡社等）、ｐＥＴ−１１ａ〜ｄ、ｐＥＴ２０ｂ、ｐＥＴ２８ａ〜ｃ、およびｐＥＴ−３２ａ〜ｂ（以上Novagen 社）、ｐＱＥ−１０、１６、３０、４０、５０、６０、および７０（以上Qiagen社））やウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）が挙げられる。
【００２６】
本発明によるベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるためには、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制御する配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列）や宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。また、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した形で（例えば、タンデムで）含んでいてもよい。これらは常法に従いベクターに導入してよく、このベクターによる宿主細胞の形質転換の方法も、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００２７】
本発明によるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００２８】
また、宿主細胞としては、例えば、大腸菌（例えば、ＳＯＬＲ、ＪＭ１０９、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’、およびＢＬ２１（ＤＥ３））、酵母（例えば、ＹＲＧ−２株）、枯草菌、動物由来の細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒトケラチノサイト、ＣＯＰ−５、Ｃ１２７、マウス３Ｔ３細胞、ＦＲ３Ｔ３、ＨＢ１０１等）が挙げられる。
上記形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパク質を得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供される。この方法により、抗腫瘍タンパク質を大量に生産することができる。
【００２９】
形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよい。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回収、精製も常法に従って行うことができる（後記実施例参照）。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法を使用することができる。
【００３０】
抗体
本発明によれば、本発明によるタンパク質に対する抗体が提供される。本発明において、抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。
【００３１】
本発明による抗体は、当業界において慣用されている方法によって製造することができる。例えば、配列番号１に記載されるタンパク質を、任意の担体（例えば、フロイント完全および不完全アジュバンド）とともに動物体内（例えば、ウサギ、ラット、マウス）に注射し、一定期間の後に、その動物の血清を精製することによって得ることができる。
【００３２】
このポリクローナル抗体の特異的な反応（すなわち、免疫反応）は、抗腫瘍タンパク質の存在の１つの指標となる。従って、本発明による抗体は抗腫瘍タンパク質の精製やスクリーニングに用いることができる。
【００３３】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 抗腫瘍タンパク質の精製
（１）タンパク質の精製
市販されている（あるいは自生している）新鮮なマツタケを常法により破砕して、カラムクロマトグラフィー、HPLC、電気泳動等を用いる精製手段によって抗腫瘍作用を有するタンパク質を得た。具体的には下記のように行った。
【００３４】
トリス緩衝液にＮａＣｌとプロテアーゼインヒビターとを含む溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、および１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）でタンパク質の粗抽出をおこない、硫安沈殿処理（９０％飽和硫安）をおこなった。硫安による沈殿を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）は前記の１０分の１、以下同様）に対して透析し脱塩した。次いで、ＤＥＡＥ  トヨパール（イオン交換クロマトグラフティー）、活性画分の濃縮、フェニルセファロース（疎水クロマトグラフティー）による精製、活性画分の濃縮、ＨＰＬＣ  （ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ）によるゲル濾過を行い、該タンパク質を精製した。
【００３５】
イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水クロマトグラフィーは、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（ＰＩを含む）で溶出した。直線濃度勾配は、それぞれＮａＣｌと（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を用いた。ゲル濾過は、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）バッファー中０．１Ｍ  Ｎａ2 ＳＯ4 ，およびＰＩを含む溶液で溶出した。
【００３６】
ＨＰＬＣによりゲル濾過をおこなったサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル上のタンパク質ＰＶＤＦ膜に転写したのち、ＣＢＢ染色して一本のバンド（約６５ｋＤａ）を検出した。
【００３７】
なお、新鮮でないマツタケを用いた場合やプロテアーゼインヒビターを精製工程において用いなかった場合には、収率が低下し、後記する抗腫瘍活性も低下することを本発明等は確認した。
【００３８】
また、一部のサンプルについては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルをＣＢＢで染色し、ゲルを切りだして、電気抽出法でサンプルを回収した。このサンプルはアミノ酸配列の決定（実施例２）に用いた。
【００３９】
また、後記（２）の抗体をCNBr-activated Sepharose 6MB樹脂（ファルマシア社）に結合させたカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、タンパク質を精製できることを確認した。
【００４０】
（２）ポリクローナル抗体
（１）で精製したタンパク質をウサギに免疫して抗血清を調製した。具体的に下記のように行った。
【００４１】
精製した該タンパク質１５μｇをフロントの完全アジュバンドと混和し、強く攪拌してエマルションとした後、ウサギの背皮下に注射した。３週間後、該タンパク質１５０μｇをフロイント不完全アジュバンドと混和してエマルションとし、追加免疫をおこなった。２週間後、抗原５０μｇを用いて直接ブースター免疫をおこない、１週間後、耳から採血をした。
【００４２】
次いで、５ｍｌ抗血清を５６℃で３０分間処理した後、ＰＢＳ（−）を５ｍｌ加え、飽和（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を等量加え、氷水中に静置した。遠心後沈殿をナトリウム・リン酸緩液に再溶解し、２０％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 になるように飽和（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を加えた。遠心後、上清を集め、３３％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 になるように飽和（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を加え、遠心後、沈殿を集め、再溶解した。透析および脱塩の後、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥ５２樹脂）にかけてＩｇＧ画分とした。
【００４３】
（３）抗腫瘍活性試験
マウスやヒトの細胞をガン化することが知られているシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によってガン化した細胞に対して、その致死作用を調べた。具体的には、細胞死をもって抗腫瘍活性を測定した。上記（１）で精製したタンパク質を細胞に与えた場合に５０％の細胞を死に至らしめるタンパク質量はＳＶＴ２細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）では１０ｎｇ／ｍｌ、Ａ３１（ＳＶ４０形質転換細胞）では１００ｎｇ／ｍｌ、ヒト包皮細胞（ＨＰＶ１６形質転換）では１５−２０ｎｇ／ｍｌであった。
【００４４】
実施例２ ｃＤＮＡクローニングおよび配列決定
プロテインシークエンサー（ヒューレットパッカード社）を用いて、実施例１で精製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号３および４）を決定した。
【００４５】
さらに、実施例１で得られたタンパク質をリシルエンド酵素（又は更にポストプロリンクリーベイジ酵素）で分解して多くのペプチドフラグメントを調製し、それらのうちの１４個のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した（配列番号５〜１８）。
【００４６】
一方、マツタケのmRNAをｏｌｉｇｏ−ｄＴ  Ｌａｔｅｘ（ｏｌｉｇｏ−ｄＴ粒子）（タカラ社）を用いて精製し、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（販売元：東洋紡社）を用いて精製し、cDNAを合成した。ｃＤＮＡ合成後、ギガパックIII ゴールド（ストラタジーン社、販売元：東洋紡社）を用いて、ｃＤＮＡをラムダファージにin vitroパッケージングしてファージライブラリーを作成した。
【００４７】
実施例１の（２）で得られた抗体をプローブとして、ファージライブラリーから抗腫瘍タンパク質の遺伝子をもつファージをスクリーニングし、２１個の陽性ファージを得た。具体的には以下のようにして行った。
【００４８】
ライブラリーの濃度を知るために、タイターを測定した。１５０ｍｍ  ＮＺＹＭ培地のプレートに、約２，０００から２０，０００個のファージと６００ｕｌのＥ．Ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）宿主を６ｍｌのＮＺＹＭ  Ｔｏｐ  Ａｇａｒ（０．７％）と共にプレーティングした。４２℃で３〜４時間プラークが１ｍｍ程の適当な大きさになるまで培養した。１０ｍＭ  ＩＰＴＧをしみ込ませた１３０−１４０ｍｍのニトロセルロース膜をプレートにのせ、３７℃で３時間培養した。プレートを１時間以上４℃で冷やした後、ニトロセルロースフィルターをプレートからはがし、３％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ緩衝液にてしんとうした。
【００４９】
次いで、１次抗体（実施例１の（２））の緩衝液にフィルターをひたし、３％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ緩衝液にてゆるやかに振盪した。アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）結合２次抗体の緩衝液にフィルターをひたした後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄した。アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）用緩衝液で洗浄した後、陽性ファージを検出した。
【００５０】
得られた陽性ファージを用いて大腸菌 SOLR 株( ストラタジーン社) をin vivo Excision法によって形質転換した。形質転換は、ストラタジーン社のＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（販売元：東洋紡社）を用いて、その使用説明書に従って、行った。
【００５１】
この形質転換体から、図１に示されるプラスミドｐＴＳ１８を得た。なお、プラスミドｐＴＳ１８（配列番号１のｃＤＮＡ配列を含む）は実施例３において発現ベクターとして用いた。
【００５２】
このｐＴＳ１８を Exo/Mung DNA Sequencing System （ストラタジーン社）を用いてディレーションしたのち両端を平滑末端にし、ｓｅｌｆ−ＤＮＡにライゲーションした（図２）。次いで、大腸菌 JM 109 （東洋紡社）をディレーションしたプラスミドDNA で形質転換した。これらのディレーション変異が挿入された遺伝子部分の塩基配列を、ABI PRISM Cycle Sequencing Kit  （パーキンエルマー社）を用いて、センス鎖とアンチセンス鎖の全塩基配列を解読した。
【００５３】
解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせて、抗腫瘍タンパク質のアミノ酸配列とｃＤＮＡ配列を得た（配列番号２）。推定分子量は約６２ｋＤａであった。
【００５４】
Ｎ末端のアミノ酸配列（配列番号３および４）は、配列番号１の２〜３０番のアミノ酸配列および２〜５８番のアミノ酸配列と、それぞれ一致した。
【００５５】
さらに、ペプチドフラグメントの配列（配列番号５〜１８）が配列番号１に示したアミノ酸配列とそれぞれ一致した。対応関係は下記のとおりであった。
【００５６】
配列番号５：配列番号１の５９〜７７番、配列番号６：配列番号１の８９〜１４９番、配列番号７：配列番号１の１５０〜１７８番、配列番号８：配列番号１の１７９〜２０９番、配列番号９：配列番号１の２１０〜２６７番、配列番号10：配列番号１の２６８〜２９７番、配列番号11：配列番号１の２９８〜３５５番、配列番号12：配列番号１の３５６〜４０６番、配列番号13：配列番号１の４０７〜４３６番、配列番号14：配列番号１の４３７〜４８６番、配列番号15：配列番号１の４８７〜５２１番、配列番号16：配列番号１の５２２〜５５４番、配列番号17：配列番号１の５５５〜５６６番、配列番号１８：配列番号１の７８〜９９番。
これらのペプチドは、抗腫瘍タンパク質のスクリーニングおよび精製に用いることができる抗腫瘍タンパク質に対する抗体を得るための抗原として有用である。
【００５７】
実施例３ 抗腫瘍タンパク質の製造（１）
−８０℃のコンピテント細胞（ＪＭ１０９株：東洋紡社）を融解して、Ｆａｌｃｏｎチューブ（コード２０５９）にその１００μｌを移した。ｐＴＳ１８のディレーションクローン（実施例２）を加え氷中３０分間放置した。ヒートショック（４２℃）を３０秒間与え、氷中２分間冷却した。ＳＯＣ培地を９００μｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。ＬＢ／Ａｍｐプレートに適量播種し、３７℃で一晩培養した。次にプレート上に現れたコロニーから一白金耳かきとって液体ＬＢ培地（Ａｍｐを含む）に接種し、３７℃で６６０ｎｍの吸収（Ａｂｓ６６０）が約０．２になるまで培養した。ＩＰＴＧを最終１０ｍＭまで加え、Ａｂｓ６６０＝約１になるまで培養して集菌した。
【００５８】
菌体を実施例１の（１）で使用したＰＩを含む、抽出液に（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）懸濁し、超音波で破壊した。抽出液を（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）遠心し、上清を集め、実施例１の（２）の抗体を結合させたアフィニティークロマトグラフィー（CNBr-activated Sepharose 6MB樹脂、ファルマシア社）にかけ、溶出液にて回収した。
【００５９】
溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、実施例１の（２）の抗体でウエスタンブロット解析を行った。その結果、本発明によるタンパク質が発現されていることが確認された。
【００６０】
実施例４ 抗腫瘍タンパク質の製造（２）
（１）発現ベクターｐＥＴ−２８ａの調製
抗腫瘍タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴＳ１８（１０ｎｇ）（実施例２）を鋳型ＤＮＡとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって得た。ＰＣＲ反応を市販キット（タカラ社）の試薬および下記プライマー１および２（それぞれ５ｐｍｏｌｅ）を用いて使用説明書に基づいて実施した。
プライマー1:GAGAGACCATGGGGTATCGTCTTTCC (配列番号19)
プライマー2:GAGAGAGGATCCGGAGACGCCAAGGAT ( 配列番号20)
ＰＣＲ反応後、生成物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩによって切断した。生じた断片（０．１μｇ）をｐＥＴ−２８ａベクター（０．５μｇ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ／ＢａｍＩ部位に連結した。
生じたＤＮＡ構築物をコンピテント細胞（大腸菌、ＤＨ５αおよびＪＭ１０９株；東洋紡社）に導入した。これら形質転換細胞から収集したプラスミドＤＮＡをさらにコンピテント細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）株；Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入した。
【００６１】
（２）発現ベクターｐＥＴ−２８ｂの調製
抗腫瘍タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴＳ１８（実施例２）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を収集することにより調製した。生じた断片（０．１μｇ）をｐＥＴ−２８ｂベクター（０．５μｇ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に連結した。
生じたＤＮＡ構築物をコンピテント細胞（大腸菌、ＤＨ５αおよびＪＭ１０９株；東洋紡社）に導入した。これら形質転換細胞から収集したプラスミドＤＮＡをさらにコンピテント細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）株；Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入した。
【００６２】
（３）抗腫瘍タンパク質遺伝子の発現
一白金耳の上記実施例４（１）および（２）において記載されるように得られた形質転換細胞（ｐＥＴ−２８ａを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株およびｐＥＴ−２８ｂを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株）を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＮＺＹＭ培地（１ｍｌ）に接種し、３７℃で一晩前培養した。培養後の培地から１００μｌを取り出し、これを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＮＺＹＭ培地（１０ｍｌ）に接種し、Ａｂｓ６００が約０．４となるまで２５℃にて培養した。ＩＰＴＧを最終濃度で１．０ｍＭ加えた後、２４時間培養した。
細胞を培養培地から収集し、実施例１（１）において用いたＰＩを含む抽出液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波で破砕した。
【００６３】
抽出液を遠心した後、沈殿物を回収した。この沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。その結果、単一のバンドが６５ｋＤａの位置に観察された。
沈殿物をまた実施例１（２）に記載された抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。免疫反応がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて観察されたタンパク質のバンドと同じ位置に観察された。この結果は、抗腫瘍遺伝子が宿主細胞において発現されたことを示す。
【００６４】
【配列表】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドベクターｐＴＳ１８の構造を示した図である。
【図２】ＴＴＭ遺伝子のディレーションを示した図である。点線はディレーションされた部分を示す。
【図１】
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【図２】
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