(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性同位元素で標識された、平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平滑筋ミオシン軽鎖とは反応しないヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する、解離性大動脈瘤用画像診断薬または血管平滑筋細胞の壊死を伴う血管炎用画像診断薬。
【請求項２】
平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平滑筋ミオシン軽鎖とは反応しないヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメント及び二官能性キレート化剤とからなるカップリング化合物と放射性同位元素溶液とを含有する、解離性大動脈瘤の画像診断薬用キットまたは血管平滑筋細胞の壊死を伴う血管炎の画像診断薬用キット。
【請求項３】
放射性同位元素で標識された以下の特性を有するヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する、解離性大動脈瘤用画像診断薬。
（抗体の特性）
▲１▼反応特異性：平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平滑筋ミオシン軽鎖とは反応しない
▲２▼交叉反応性：平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
▲３▼種特異性  ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【請求項４】
以下の特性を有するヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメント及び二官能性キレート化剤とからなるカップリング化合物と放射性同位元素溶液とを含有する、解離性大動脈瘤の画像診断用キット。
（抗体の特性）
▲１▼反応特異性：平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平滑筋ミオシン軽鎖とは反応しない
▲２▼交叉反応性：平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
▲３▼種特異性  ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【請求項５】
放射性同位元素で標識された以下の特性を有するヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する、血管平滑筋細胞の壊死を伴う血管炎用画像診断薬。
（抗体の特性）
▲１▼反応特異性：平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平絹筋ミオシン軽鎖とは反応しない
▲２▼交叉反応性：平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
▲３▼種特異性  ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【請求項６】
以下の特性を有するヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメント及び二官能性キレート化剤とからなるカップリング化合物と放射性同位元素溶液とを含有する、血管平滑筋細胞の壊死を伴う血管炎の画像診断用キット。
（抗体の特性）
▲１▼反応特異性：平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平滑筋ミオシン軽鎖とは反応しない
▲２▼交叉反応性：平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
▲３▼種特異性：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、解離性大動脈瘤（大動脈解離とも称されている）、血管炎等の血管障害性疾患の画像診断法による診断に有用な診断薬および診断薬用キットに関するものである。
背景技術
解離性大動脈瘤は、大動脈の内膜の一部が裂け、その裂孔から中膜に血液が流入して血管壁の解離を生じ、血管平滑筋細胞の壊死をひきおこして発症するもので、激しい胸痛を伴う疾患であり、非常に重篤な疾患で致命率が高い。これらの疾患の発症要因としては、動脈硬化による中膜の変性や脆弱化、変性疾患による大動脈の嚢胞状中膜壊死に加え、高血圧なども指摘されている。
一方、血管炎は膠原病などが原因で生ずるが、その病変はしばしば全身の血管におよび、血管平滑筋細胞の壊死を伴って、ＤＩＣ（播種性血管内凝固）、血栓症、塞栓症などの重篤な致命的合併症を引き起こす。
このように、解離性大動脈瘤や血管炎等の如き血管平滑筋細胞の壊死を伴う血管障害性疾患は重篤なものが多く、迅速で正確な診断が合併症の予防や効果的な治療に必要である。
従来、これらの血管障害性疾患に特有な検査法はないため、画像診断検査による形態学的診断や原疾患から派生する様々な一般血液生化学検査の異常値から血管障害性疾患を推測診断するしかなく、その診断は極めて困難であった。
かかる診断法のうち、たとえば、解離性大動脈瘤の診断法としては、他の心疾患と同様に、エコー検査、ＣＴ（Ｘ線コンピュータートモグラフィー）、ＤＳＡ（デジタル・サブトラクション・アンギオグラフィー）、ＭＲＩ（マグネチック・レゾナンス・イメージング）、大動脈造影などが用いられている。このうち、ＤＳＡや大動脈造影は侵襲が多いため疾患の急性期には危険を伴う検査であり、一方、エコー検査、ＣＴ及びＭＲＩは急性期でも危険の少ない検査であるが、これらの画像診断は総じて形態学的診断であり、古い陳旧性病変と新しい急性期の病変の鑑別は不可能である。つまり、血管平滑筋細胞の障害が生じている急性期の病変部位を特定診断することはできない。
また、血管炎の診断法については、血管炎自体が特異的な形態変化を伴わない疾患であるため、解離性大動脈瘤以上に従来の画像診断法による診断は困難である。
したがって、本発明は、解離性大動脈瘤や血管炎の急性期において障害された血管平滑筋細胞に特異的に結合して、その正確な疾患部位の特異的画像診断を可能にするためのトレーサー製剤の開発を目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成すべく研究を重ねた結果、血管の主要なタンパク質である平滑筋ミオシンが、解離性大動脈瘤、血管炎等の血管障害性疾患、特に急性期の画像診断に有用であることを見いだし、本願発明を完成した。
すなわち、本発明は、放射性同位元素で標識された、平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平滑筋ミオシン軽鎖とは反応しないヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する、解離性大動脈瘤用画像診断薬または血管平滑筋細胞の壊死を伴う血管炎用画像診断薬を提供するものである。また、本発明は、平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平滑筋ミオシン軽鎖とは反応しないヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメント及び二官能性キレート化剤とからなるカップリング化合物と放射性同位元素溶液とを含有する、解離性大動脈瘤の画像診断薬用キットまたは血管平滑筋細胞の壊死を伴う血管炎の画像診断薬用キットを提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、標準曲線を示したものである。図２は、交叉反応性を検討した結果を示したものである。図３は、組織１ｇあたりの125Ｉカウントの結果を示したものである。図４は、オートラジオグラフィーによるイメージングの結果を示したものである。図５は、抗平滑筋ミオシン抗体のラット体内分布を示したものである。図６は、オートラジオグラフィーによるイメージングの結果を示したものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の診断薬は、放射性同位元素により標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを血管障害性疾患の疾患部位に特異的に結合させることにより、疾患部位を正確に画像診断するために使用するものである。よって、少なくとも放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含んでいる必要がある。
本発明に使用するモノクローナル抗体としては、ヒト平滑筋ミオシン、特にヒト平滑筋ミオシン重鎖に対して特異的に結合するものであれば特に限定されないが、他のミオシンに交差反応性が小さいものを使用するのが好ましい。
このようなモノクローナル抗体は、後述の実施例に示すように公知の方法を適宜用いることにより調製することができる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学編、１〜８８頁（１９８６年）、Biochemistry,27,3807-3811(1988)、Eur.J.Biochem.,179,79-85(1989)、J.Mol.Biol.,198,143-157(1987)、J.Biol.Chem.,264,9734-9737(1989)、J.Biol.Chem.,264,18272-18275(1989)、J.Biol.Chem.,266,3768-3773(1991)、Circulation,88,1804-1810(1993)等参照）。
使用するモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体そのものでもよいが、活性フラグメントを使用することもできる。かかる活性フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの各種フラグメントで、本発明のモノクローナル抗体の特徴を有するものであれば特に制限されない。このような活性フラグメントを使用することで、血中の半減期を短縮し、生体内クリアランスを高めることも可能である。
これらの活性フラグメントの調製には、精製モノクローナル抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシン処理などの公知の方法を適用することができる（「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学編、８９頁（１９８６年）参照）。
このようにして調製されたモノクローナル抗体および活性フラグメントは、放射性同位元素で標識することにより、本発明の診断薬として使用することができる。
ここで、放射性同位元素の核種としては、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、テクネチウム−９９ｍ、ガリウム−６７、鉛−２０３、ルテニウム−９７、水銀−１９７、タリウム−２０１、ビスマス−２１２などが挙げられる。
かかる標識化法としては、種々の公知の方法の中から、それぞれの核種に応じて選択して用いることができ、例えば、クロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など放射性同位元素を抗体または活性フラグメントに直接標識する方法、あるいは、抗体または活性フラグメントに二官能基性キレート剤を共有結合させ、このカップリング化合物を上記核種で標識する方法などが挙げられる。
ここで使用される二官能基性キレート剤としては、１−アミノ−６，１７−ジヒドロキシ−７，１０，２８，２１−テトラオキソ−２７−（Ｎ−アセチルヒドロキシイミノ）−６，１１，１７，２２−テトラアザヘプタエイコサン（デスフェリオキサミン）、８−ヒドロキシキノリン、エチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ジアミノシクロヘキシルテトラ酢酸などが例示され、これらと抗体または活性フラグメントとの結合法は、カルボジイミド法、酸無水物法、グルタルアルデヒド法など通常使用している方法を採用すればよい。
本発明の診断用キットは、放射性同位元素により標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを調製し、この標識されたモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを血管障害性疾患の疾患部位に特異的に結合させることで疾患部位を正確に画像診断するのに使用するためものであり、少なくとも放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを調製できるように構成されていなければならない。その具体的な態様の１つとしては、ヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメント及び二官能性キレート化剤からなるカップリング化合物と放射性同位元素溶液とを含有するキットを挙げることができる。
本発明診断薬およびキットには、上記試薬の他、核種を精製するためのクロマトグラフィー用カラム、投与形態に調製するための塩化ナトリウム溶液やグルコース溶液などの担体、その他安定化剤などを組合わせることもできる。
また、本発明診断薬は、静脈内注射により人体に投与するものである。従って、本発明薬剤は、上述のような担体などを使用することによって、注射投与に適した形態で用いられる。本発明薬剤の投与量は、標識に使用する放射性同位元素の各種にもよるが、通常１００μＣｉ〜３０ｍＣｉ、好ましくは５００μＣｉ〜３ｍＣｉの範囲で投与される。
本発明薬剤を使用した画像診断の方法は、本発明薬剤投与後１〜４８時間後に、オートラジオグラフィー、シンチレーションスキャナー、シンチレーションカメラなどにより、患者の心臓部などの血管障害が発生していると思われる部位を走査して、本発明薬剤由来の放射能を検出しそれを画像描写することにより行うことができる。
実施例
以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
実施例１（各種ミオシンの調製）
ヒト子宮平滑筋ミオシン、ヒト大動脈平滑筋ミオシン、ヒト小腸平滑筋ミオシン、ヒト血小板ミオシン及びヒト骨格筋ミオシンは佐賀医科大学、松村先生より分与された。ヒト心筋ミオシンは矢崎の方法（Circ.Res.,36:208,1975）により精製した。各種ミオシンともＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認後、ローリー法（J.Biol.Chem.,193:265-275,1951）によりウシ血清アルブミンを標準物質としてタンパク定量を行い濃度を求めた。
実施例２（モノクローナル抗体の作製）
１）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ヒト子宮平滑筋ミオシン２５〜５０μｇをフロインド完全アジュバントと共に、６〜８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに、２〜４週間おきに４〜７回腹腔内に投与し、最後にヒト子宮平滑筋ミオシン１０μｇを静脈内投与した。
最終免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９７）を１０：１で混合後、遠心分離して得たペレットに、５０％ポリエチレングリコール含有ＲＰＭＩ１６４０溶液１ｍｌを徐々に加えて細胞融合を行った。さらにＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１０ｍｌとし、遠心分離して得たペレットを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＰ３Ｕ１として３×１０4個／０．１ｍｌとなるように懸濁させ、９６ウェルマイクロプレートに各ウェル０．１ｍｌずつ分注した。
１日後、ＨＡＴ培地を０．１ｍｌ添加し、その後３〜４日おきに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換した。
融合後７〜１０日目に培養上清をサンプリングし、あらかじめヒト子宮平滑筋ミオシンでコートし、３％ゼラチンでブロッキングしてある９６ウェルポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）プレートに５０μｌ添加し室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター社製）を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳで１／５００に希釈した溶液を、５０μｌずつ分注し室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ−アビジンＤ（ベクター社製）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１／２０００に希釈した溶液を、５０μｌずつ分注し室温で１５分間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、基質溶液（４−アミノアンチピリン，０．２５ｍｇ／ｍｌ、フェノール，０．２５ｍｇ／ｍｌ，０．４Ｍ過酸化水素）２００μｌを加え室温で発色させた。マイクロプレートフォトメーターを用いて５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ヒト子宮平滑筋ミオシンに特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択した。
このようにして選択した各ハイブリドーマは限界希釈法によりクローニングを行いヒト子宮平滑筋ミオシンに対する抗体産生ハイブリドーマ５株（１Ｈ６，４Ｅ１２，９Ａ１２，９Ｄ７，１０Ｇ２）を樹立した。特異抗体陽性ウェル数、増殖ウェル数及び全ウェル数を表１に示す。この中で、ハイブリドーマ１Ｈ６とハイブリドーマ４Ｅ１２は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５））にＳＭＨＭＷ１Ｈ６およびＳＭＨＭＷ４Ｅ１２としてブタペスト条約に基づき１９９４年１０月１３日に国際寄託され、１９９４年１０月１３日付けで受託番号としてＦＥＲＭＢＰ−４８２９およびＦＥＲＭＢＰ−４８３０が付与されている。
0004035167.tif 000002
２）モノクローナル抗体の調製及び精製
次に、樹立した各ハイブリドーマを培養し、あらかじめプリスタンを投与してあるマウスの腹腔内に１匹当り３×１０6個を投与した。約２週間後マウス１匹当り５ｍｌの腹水を採取した。
３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン塩酸緩衝液及び等量の同グリシン塩酸緩衝液と混合した腹水をｐＨ８．９にて平衡化したプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）カラムに流した。充分量の同グリシン塩酸緩衝液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて抗体を溶出した。溶出液をＰＢＳにて透析後、ＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて純度を確認し、精製モノクローナル抗体とした。
実施例３（モノクローナル抗体の性質）
１）アイソタイプ
ヒト子宮平滑筋ミオシンをコートし、３％ゼラチンでブロッキング処理してある９６ウェルＰＶＣプレートに各ハイブリドーマの培養上清を添加し、ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ  ＥＩＡキット（ザイメッド社製）を用いて抗体のアイソタイプの検索を行った。結果を表２に示す。
0004035167.tif 000003
２）ウエスタンブロッティングによる特異性の解析
各モノクローナル抗体の特異性をウエスタンブロッティングにより解析した。
ヒト子宮平滑筋ミオシン１ｍｇ／ｍｌを同量の還元処理液を加えて１００℃で５分間加熱処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１０％分離ゲル、５％濃縮ゲルを用い、ミニゲル電気泳動装置（マリソル社製）で１０ｍＶ、約３時間、を行った。ブロッティングはミニゲル用ブロッティング装置（マリソル社製）を用い、３７Ｖで約１８時間通電してニトロセルロース膜にタンパク質を転写させた。このニトロセルロース膜を試料の泳動ラインに沿って短冊状に切断し、一部はアミドブラックを用いてタンパク質を染色した。残りは３％ゼラチンでブロッキング後、各ハイブリドーマの培養上清と室温で１時間反応させた。
０．０５％ツイーン２０含有２０ｍＭトリス、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液（Ｔ−ＴＢＳ）で１０分ずつ２回洗浄後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター社製）の１／５００希釈液と室温で１時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分ずつ２回洗浄後、ペルオキシダーゼ−アビジンＤ（ベクター社製）の１／２０００希釈液と室温で１５分間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分ずつ２回洗浄後、発色液（ＨＲＰ発色試薬（バイオラッド社製）３０ｍｇ、メタノール１０ｍｌ、ＴＢＳ５０ｍｌ、３０％過酸化水素水３０μｌ含有）にて発色後、蒸留水で洗浄した。
アミドブラックによるタンパク染色の結果、２００Ｋ（子宮平滑筋ミオシン重鎖）、１４０Ｋ（子宮平滑筋ミオシン重鎖のフラグメント）、７０Ｋ（子宮平滑筋ミオシン重鎖のフラグメント）、２０Ｋ（子宮平滑筋ミオシン軽鎖）、１７Ｋ（子宮平滑筋ミオシン軽鎖）５本のバンドがみられた。いずれの抗体もヒト子宮平滑筋ミオシン重鎖に反応し、軽鎖には反応しないことが確認された。
３）サンドイッチ法を利用した交叉反応性の解析
▲１▼ビオチン化抗体の調製
上記各モノクローナル抗体を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に透析後、セントリフロー（アミコン製）により２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。ビオチン（ロングアーム）ＮＨＳ試薬（ベクター社製）を１０ｍｇ／ｍｌになるようにジメチルフォルムアミドに溶解し、その２０μｌと上記抗体溶液１ｍｌを混合し、室温で２時間反応させた。エタノールアミン５μｌを加え反応を止めた後、ＰＢＳに２回透析し、ビオチン化抗体を得た。このビオチン化抗体を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、ビオチン化抗体溶液を得た。
▲２▼固相化抗体の調製
抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体（４Ｅ１２）をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｈタイプ：住友ベークライト社製）に５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、０．５％スキムミルクを３００μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。スキムミルク溶液を除去し、固相化抗体試薬を得た。
▲３▼その他の試薬の調製およびキットの調製
・平滑筋ミオシン標準液；
ヒト大動脈平滑筋ミオシンを２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６３、０．７８１、０．３９１ｎｇ／ｍｌとなるように１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈して調製した。
・洗浄液；
Ｔｗｅｅｎ２０をＰＢＳに０．０５％（ｗ／ｖ）になるように溶解させて調製した。
・酵素標識アビジン溶液；
ペルオキシダーゼ標識アビジンＤ（Ａ−２００４：ベクター社製）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１／５０００に希釈して調製した。
・基質溶液；
０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）に３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン二塩酸塩（ＴＭＢＺ）が０．３ｍＭ、過酸化水素水が０．００５％（ｗ／ｗ）になるように溶解させて調製した。
・酵素反応停止液；
１Ｎ硫酸を用いる。
▲４▼標準曲線
固相化抗体試薬の各ウェルに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μｌずつ分注後、平滑筋ミオシン標準液を５０μｌずつ分注し撹拌後、室温で４時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、ビオチン化抗体（１Ｈ６）溶液を５０μｌずつ分注し、室温で３０分間静置した。洗浄液で３回洗浄後、酵素標識アビジン溶液を５０μｌずつ分注し、室温で１５分間静置した。洗浄液で３回洗浄後、基質溶液を１００μｌずつ分注し、室温で１０分間静置して発色させた。酵素反応停止液を１００μｌずつ加えて反応を停止させ、マイクロプレートフォトメーターを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた標準曲線を図１に示す。
▲５▼交叉反応性
上記▲４▼の操作法に準じ、各種ミオシンとの交叉反応性を検討した。その結果、図２に示すように、子宮平滑筋ミオシンおよび大動脈平滑筋ミオシンとは同等に反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とはほとんど反応しないことが確認された。
実施例４（モノクローナル抗体の標識化）
１ｍｇ／ｍｌの抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体（９Ｄ７）溶液２０μｌとＮａ125Ｉ  ３．７ＭＢｑを混合し、さらに０．３％クロラミンＴ溶液５μｌを加えて正確に３０秒間ボルテックスで混合した。この混合液に０．５％ピロ亜硫酸ナトリウム溶液１０μｌ、１％ヨウ化カリウム溶液５μｌ、１％ＢＳＡ溶液５μｌを順次加え混合した。反応液を１％ＢＳＡ溶液で平衡化してあるＰＤ１０カラム（ファルマシア社製）にかけ、１％ＢＳＡ溶液で溶出し、１ｍｌずつ分取した。各フラクションをオートガンマカウンターで測定した結果、２つのピークがみられたため、最初のピークのフラクションを集めて125Ｉ抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体とした。
実施例５（125Ｉ抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体による画像診断）
体重３００ｇの雄のラットを用いて、ペントバルビタール麻酔下に大腿動脈よりカニュレーションを行い、０．０１４インチのスプリングコイルガイドワイヤー（spring coil guide wire）を腹部大動脈にまで挿入するとともに、開腹して腹部大動脈を鉗子により圧迫し、ガイドワイヤーを操作することにより血管中膜にまで損傷を加えた。直ちに、125Ｉ標識抗平滑筋モノクローナル抗体１．２３ＭＢｑを大腿静脈より静注し、創部を縫合した。
４時間後及び４８時間後に屠殺して、各臓器を摘出し、組織１ｇ当たりの125Ｉのカウントを比較するとともに、オートラジオグラフィーによるイメージングを行った。
その結果、図３に示すように大動脈の損傷部のカウントは正常部に比べて４時間後、４８時間後ともに高値で、４８時間後においてはより顕著であった。
また、図４に示すように、オートラジオグラフィーでは、損傷部に一致して125Ｉの集積が認められた。
実施例６
ヒト子宮平滑筋ミオシンの代わりにヒト小腸平滑筋ミオシンを用い、実施例２の１）と同様の方法でヒト小腸平滑筋ミオシンに特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ８Ｂ８を樹立した。このハイブリドーマ８Ｂ８は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５））にＩＭＨ８Ｂ８としてブタペスト条約に基づき１９９６年３月５日に国際寄託され、１９９６年３月５日付けで受託番号としてＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４４が付与されている。
このハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を実施例２の２）と同様の方法で精製後、モノクローナル抗体の諸性質を実施例３に記載の方法と同様の方法を用いて調べた。その結果を以下に示す。
▲１▼アイソタイプ：ＩｇＧ２ｂ／κ
▲２▼反応特異性  ：平滑筋重鎖と反応し、軽鎖とは反応しない
▲３▼交叉反応性  ：小腸平滑筋ミオシン、子宮平滑筋ミオシンおよび大動脈平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシン及び血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
▲４▼種特異性    ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
次に、このモノクローナル抗体（８Ｂ８）を実施例４と同様の方法で標識化し、実施例５に記載の方法に従ってラットを用いたモデル実験における大動脈損傷部位の画像診断を試みた。その結果、大動脈の損傷部位に一致して125Ｉの集積が確認され、イメージングにおいては、モノクローナル抗体（９Ｄ７）を用いた時の結果よりもよりコントラストのはっきりした画像を得ることができた。
実施例７（モノクローナル抗体のＦａｂ化）
抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体ＩＭＨ８Ｂ８をＰＢＳで２ｍｇ／ｍｌに調製後、ＥＤＴＡを終濃度が２ｍＭになるように添加した。マーキュリーパパイン（シグマ製）を５ｍＭシステイン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに調製後、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。抗体量の１％重量のパパイン溶液を抗体溶液に加え混合後、３７℃で１５分間、酵素処理した。ヨードアセトアミドを終濃度が５ｍＭになるように添加し酵素反応を止めた。酵素処理した抗体溶液と同量の３Ｍ  ＮａＣｌ，１．５Ｍグリシンバッファー（ｐＨ８．９）と混合し、同バッファーで平衡化してあるプロテインＡセファロース  カラム（ファルマシア製）にかけ抗体溶液中のＦｃを吸着させた。溶出液を限外濾過により濃縮し、ＰＢＳに透析後、Ｆａｂの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。
実施例８（125Ｉ抗平滑筋ミオシンモノクローナルＦａｂ抗体による画像診断）
実施例７で作製したＩＭＨ８Ｂ８−Ｆａｂを、実施例４の方法により125Ｉ標識した。体重３００ｇの雄のラットを用いて、ペントバルビタール麻酔下に大腿動脈よりカニュレーションを行い、０．０１４インチのspring coil guide wireを腹部大動脈にまで挿入するとともに、開腹して腹部大動脈を鉗子により圧迫し、guide wireを操作することにより血管中膜にまで損傷を加えた。直ちに125Ｉ標識ＩＭＨ８Ｂ８−Ｆａｂ抗体１．２３ＭＢｑを大腿静脈より静注し、創部を縫合した。１時間後及び６時間後に屠殺して、各臓器を摘出し、組織１ｇ当たりの125Ｉのカウントを比較するとともに、オートラジオグラフィーによるイメージングを行った。
その結果、実施例６の125Ｉ標識ＩＭＨ８Ｂ８−ＩｇＧ抗体を用いた場合に比べ、血中の半減期が著しく改善され、静注後６時間で、血中のカウントが大動脈の損傷部のカウントを下回ることが示された（図５）。また、オートラジオグラフィーでは実施例６と同様に損傷部に一致して125Ｉの集積が認められた（図６）。
産業上の利用可能性
放射性同位元素により標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを血管障害性疾患の疾患部位に特異的に結合、集積することにより、その正確な疾患部位の特異的な画像診断を行えることは、本願発明者らによって初めて見いだされたことである。
従って、本願発明の診断薬および診断薬用キットは、解離性大動脈瘤、血管炎等の血管障害性疾患、特に該疾患の急性期の画像診断に有用なものであり、これらを使用することにより、疾患部位の特定が初めて可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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