(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
採血チューブを備えた親バッグの天面に連結チューブを介して凍結バッグ、第１の子バッグ及び第２の子バッグが連結されたものであって、
前記第１のバッグは前記親バッグの上部に取り付けられた連結チューブにより連結されてなり、
前記親バッグには採取された臍帯血が収容してなる血液母液処理バッグを使用する、下記（ａ）〜（ｇ）の工程を含んでなる白血球の分離、濃縮方法。
（ａ）親バッグの底部が上になるように当該親バッグを倒立させて軽遠心または吊り下げ静置し、臍帯血液母液を上層の白血球層と下層の赤血球層に分離する。
（ｂ）親バッグの底部が上になるように倒立させたまま、下層の赤血球を第１の子バッグへと通じる連結チューブを経由して第１の子バッグに移注する。
（ｃ）赤血球の移注された第１の子バッグのみを、第１の子バッグへと通じる連結チューブを溶断して親バッグから分離する。
（ｄ）赤血球の除かれた親バッグの底部が下になるように当該親バッグを正立させて軽遠心し、白血球層を上層の血漿層と下層の白血球濃厚液層に分離する。
（ｅ）上層の血漿を、親バッグの容量が所定量になるまで第２の子バッグにゆっくり移注する。
（ｆ）白血球濃厚液を収容した親バッグに所定量の凍害防止剤を無菌的に添加する。
（ｇ）凍結防止剤を含む白血球濃厚液を凍結バッグに移注し、凍結バッグと連結する連結チューブを溶断して、凍結バッグを親バッグから分離する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液成分を含有する血液母液から白血球を分離し、濃縮する方法に関し、特に臍帯血、骨髄液、造血幹細胞および／または造血前駆細胞を含む白血球を、末梢血等から安全かつ無菌的に、効率よく、迅速に、そして経済的に採血し、分離し、濃縮する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臍帯血移植、骨髄移植或いは末梢血幹細胞移植による造血幹細胞移植が、再生不良性貧血や白血病などの血液疾患や、乳癌、精巣癌などの固形癌、或いは、リューマチなどの自己免疫疾患の根治療法として注目されつつある。
造血幹細胞移植を行うに当たっては、臍帯血、骨髄或いは末梢血等の血液母液から、造血幹細胞や造血前駆細胞を含む白血球を安全かつ無菌的に、効率良く、迅速に、そして、経済的に採取し、分離し、濃縮して、移植に備えておく必要がある。
また、血液母液の処理工程においては、移植される造血幹細胞数を厳密に把握するために、バッグ間で移注される血液成分の容量を把握しつつ処理作業を行う必要があるが、さらに、煩雑な作業を極力排除して作業効率を向上させるとともに、煩雑な作業に起因する製剤の汚染やコストアップを防止する必要がある。
【０００３】
白血球を採血し、分離し、濃縮して凍結保存する方法としては、従来、血液母液を汚染させないよう厳重な注意の下に、注射器を用いて採血し、これを清潔な試験管に移し、これに赤血球沈降剤を添加して、軽遠心を行った後、上清のみを清潔な試験管に移し、凍害防止剤を添加して凍結保存する方法（試験管法）や、血液母液を採血バッグに採取し、赤血球沈降剤を添加して軽遠心を行った後、採血バッグのポートに白血球バッグの接続チューブのプラスチック針を接続して、採血バッグ中の濃縮された白血球層を白血球バッグに移注し、さらに遠心分離して上清を除去することによって、白血球層を適切な液量まで濃縮し、これに凍害防止などの処置を施して凍結保存する方法（バッグ法、ＷＯ９６／１７５１４号公報）などが知られている。
【０００４】
一般に、造血幹細胞製剤等の生物製剤を製造する場合、生物製剤を滅菌することが極めて難しいことから、細菌による汚染を防ぐために、全ての製造工程をクローズドシステムにすることが必要とされる。
しかしながら、上記の方法は、試験管法では、血液母液等を注射器から試験管に移注する時、試験管を密封して凍結保存する時に、また、バッグ法では、血液等を採血バッグから他のバッグに移注する時に、血液等が直接外気に触れる工程を含んでおり、環境中に存在する細菌等により汚染される可能性があり、血液母液処理法としては、決して満足できるものではない。
従って、汚染の虞のない造血幹細胞製剤を製造するために、完全な無菌操作を前提に、血液母液の新しい処理方法の開発が望まれている。
【０００５】
また、臍帯血移植時には、副作用の原因となることが懸念される赤血球の混入を無くするか、または、極力少なくすることが要求される。そこで、血液母液に、収容した親バッグを遠心分離後、底に開口した連結チューブから赤血球を抜く方法（いわゆるトップ＆ボトム法、特公昭６３−２０１４４公報参照）を適用することが考えられる。この方法では、白血球層と赤血球層の界面を乱すことなく赤血球を除くことができるので赤血球の混入を少なくすることが出来る。また、無菌操作も、移植される造血幹細胞数を厳密に把握することも可能である。
しかしながら、上記トップ＆ボトム法を単純に血液母液に適用したところ、理由は明らかでないが、赤血球の混入に関して必ずしも満足すべき結果が得られなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、如上の事情に鑑みてなされたもので、赤血球の混入や汚染を極力防止することができ、移植される造血幹細胞数を厳密に把握することのできる、無菌操作の可能な白血球の分離、濃縮方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討の結果、軽遠心により分画された白血球層をさらに軽遠心して、血漿層と白血球濃厚液層に分画することにより上記の課題が解決されることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、採血チューブを備えた親バッグに連結チューブを介して凍結バッグ、第１の子バッグ及び第２の子バッグが連結されたものであって、前記第１のバッグは前記親バッグの上部に取り付けられた連結チューブにより連結されてなり、前記親バッグには採取された臍帯血が収容してなる血液母液処理バッグを使用する、下記（ａ）〜（ｇ）の工程を含んでなる白血球の分離、濃縮方法。（ａ）親バッグの底部が上になるように当該親バッグを倒立させて軽遠心または吊り下げ静置し、血液母液を上層の白血球層と下層の赤血球層に分離する。（ｂ）親バッグの底部が上になるように倒立させたまま、下層の赤血球を第１の子バッグへと通じる連結チューブを経由して第１の子バッグに移注する。（ｃ）赤血球の移注された第１の子バッグのみを、第１の子バッグへと通じる連結チューブを溶断して親バッグから分離する。（ｄ）赤血球の除かれた親バッグの底部が下になるように当該親バッグを正立させて軽遠心し、白血球層を上層の血漿層と下層の白血球濃厚液層に分離する。（ｅ）上層の血漿を、親バッグの容量が所定量になるまで第２の子バッグにゆっくり移注する。（ｆ）白血球濃厚液を収容した親バッグに所定量の凍害防止剤を無菌的に添加する。（ｇ）凍結防止剤を含む白血球濃厚液を凍結バッグに移注し、凍結バッグと連結する連結チューブを溶断して、凍結バッグを親バッグから分離する。の各工程を含んでなる。尚、工程（ａ）の前に、血液母液の採取された親バッグに所定量の赤血球沈降剤を添加してもよい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施例について図面に基づいて説明する。図１および図２は本発明で使用する血液母液処理バッグの例を示す説明図である。図１に示す血液母液処理バッグは、血液抗凝固剤を含む親バッグ１に、先端に採血針２１を備えた採血チューブ２および、第１の子バッグ４、第２の子バッグ３、凍結バッグ５を接続したもので、採血チューブ２および、第１の子バッグ４、第２の子バッグ３、凍結バッグ５が全て天面で接続されている。ここで６１、６３、６４、６５は連結チューブ、７３、７４、７５はクランプ、８は赤血球沈降剤を添加するためのポートである。また、図２に示す血液母液処理バッグは、図１において第２の子バッグ３および凍結バッグ５が底面で接続されたものである。
【０００９】
図１に示す血液母液処理バッグを使用する場合について説明する。先ず、親バッグ１（容量２００ｍｌ、血液凝固剤としてＣＰＤ液２８ｍｌ収容）に採血チューブ２を通して臍帯血を採取する。血液母液を採取後、必要に応じて、親バッグ１にポート８を通して所定量の赤血球沈降剤（例えばＤＭＳＯ５ｍｌ）を加えてもよく、また、ポート８から検査試料を採取してもよい。次に、この親バッグ１を、第１の子バッグ４、第２の子バッグ３、（容量１５０ｍｌ）と連結する連結チューブ６１の取り付け部を下にして、すなわち、底部が上になるように倒立させて軽遠心する（工程ａ）。これにより、比重の大きい赤血球層が親バッグ１の下層に沈降し、白血球層と赤血球層の間に明確な界面が形成され、血液母液が上層の白血球層と下層の赤血球層に分離される。尚、赤血球沈降剤を加えた場合、赤血球は短時間で沈降するが、充分な時間が許される場合は、赤血球沈降剤を加えなくても、さらには軽遠心をしないで吊り下げ静置しただけでも、赤血球が沈降して、血液母液を白血球層と赤血球層に分離することができる。
【００１０】
次に、この親バッグ１を倒立させたまま、落差または分離スタンド（図示していない）を利用して、下層の赤血球を連結チューブ６１、６４を経由して第１の子バッグ４に移注する（工程ｂ）。この際、上清の白血球が混入しないように注意しつつ、静かに、ゆっくり移注する必要がある。この移注操作は、第１の子バッグ４に通じる連結チューブ６１の親バッグ１への取付部が下になっているので、下層の赤血球を落差を利用して第１の子バッグ４に移注させた時に、白血球層と赤血球層の界面が水平を保ったまま乱れることなく下降する。従って、上層の白血球が赤血球層に混入することがないので、下層の赤血球の殆どを第１の子バッグ４に移送することができる。下層の赤血球の移注された第１の子バッグ４は、これに繋がる連結チューブ６４を、例えばチューブシーラー（図示していない）等を用いて溶断して親バッグ１から分離し（工程ｃ）、廃棄する。
【００１１】
次に赤血球が除かれ白血球層が残っている親バッグ１を、第１の子バッグ４と通じていた連結チューブ６１の取り付け部を上にして、すなわち、底部が下になるように正立させて軽遠心する（工程ｄ）。これにより、目的の白血球が一層凝縮されて親バッグ１の下層に沈降し、上清は白血球を含まない血漿層になる。この上清の血漿層を分離スタンド（図示していない）を用いて、親バッグ１の重量を観察しながら（通常、親バッグ１を電子天秤に載せて重量を観察する）、落差により親バッグ１の容量が所定量になるまで第２の子バッグ３に静かにゆっくり移注する（工程ｅ）。ここで、造血幹細胞製剤の品質管理の最重要管理項目は、製剤中の白血球数の管理であり、そのため白血球の正確な容量管理が要求される。従って、本発明では、一旦第２の子バッグ３に移注された血漿を適当量親バッグ１に無菌的、かつ正確に戻すことができるように、血液母液処理バッグは親バッグ１と第２の子バッグ３が連結チューブ６１、６３で一体に接続されている。親バッグ１中の白血球数は、正確に所定容量に調整された白血球濃厚液の容量と、別途サンプリング白血球濃厚液の検査結果から、正確に算出することができる。また、工程ｅにおいては、白血球が親バッグ１の底に沈降していることから、第２の子バッグ３への移注の際に発生する白血球の損失を極めて少なくすることができる。
【００１２】
次に、この白血球濃厚液を収容した親バッグ１に、ポート８を通して無菌的に所定量の凍害防止剤を添加する（工程ｇ）。添加される凍害防止剤の量は、例えばＤＭＳＯとデキストラン４０を１：１の比率で混合した凍害防止剤の場合、白血球濃厚液２０ｍｌに対して５ｍｌである。所定の容量に濃縮され、血液凝固剤および凍害防止剤を含んだ白血球濃厚液は、落差を利用して凍結バッグ５に移注し、全て移注し終わったら連結チューブ６５を溶断して凍結バッグ５を親バッグ１から分離する（工程ｈ）。得られた造血幹細胞製剤は、常法に従って液体窒素中に凍結保存される。
尚、図２に示す血液母液処理バッグを使用する場合については、工程ｂを除いて、図１に示す血液母液処理バッグを使用する場合と同様の操作を行えばよい。すなわち、図２に示す血液母液処理バッグを使用する場合には、工程ｂでは、血液母液処理バッグを倒立させる必要がなく、底を下にして正立した状態で軽遠心を行う。
【００１３】
〔実施例１〜２〕出産後に娩出された胎盤および臍帯を滅菌済みトレーに入れて、これを清潔な臍帯血採血室に移した後、胎盤保持具と胎盤シーツを用いて臍帯側を下向きにしてスタンドに吊るし、臍帯の表面を良く消毒してから、図１（実施例１）および図２（実施例２）に示すような血液母液処理バッグを用いて、それぞれ本発明の方法に従い血液母液から白血球を分離、濃縮した後、白血球の収容された凍結バッグ５を常法に従って液体窒素中で凍結保存した。こうして得られた造血幹細胞製剤を各６単位ずつ用意し、それぞれ３７℃の温水中で解凍して、無菌性および品質（有核細胞回収率、造血前駆細胞回収率および色）の検査を行ったところ、表１のような結果が得られた。なお、本試験においては、親バッグ１に血液母液を採血後、採血量の２０％に相当するＨＥＳ４０（６％ヒドロキシエチル澱粉、菱山製薬（株）製）を、３０ｍｌシリンジを用いてポート８から親バッグ１に添加している。また、工程ａおよび工程ｄにおける遠心は、それぞれ遠心力７０Ｇで５分間、および遠心力４００Ｇで５分間行った。また、無菌性の検査は血液検査用ボトル（ベクトン・ディキンソン社製）を用いて、３５℃の好気的雰囲気および２５℃の嫌気的条件下で２週間培養して行った。有核細胞数は自動血球数測定機（コールター社製）を用いて測定し、造血前駆細胞数はメチルセルローズ培地を用いて温度３７℃、ＣＯ2 濃度５％の雰囲気で２週間培養し、顕微鏡下で観察計数した。赤血球混入の程度は製剤の赤色化（濃淡）の程度を目視で比較することにより判定した。
【００１４】
〔比較例１〜３〕
出産後に娩出された胎盤および臍帯を滅菌済みトレーに入れて、これを清潔な臍帯血採血室に移した後、胎盤保持具と胎盤シーツを用いて臍帯側を下向きにしてスタンドに吊るし、臍帯の表面を良く消毒してから、従来のバッグ法（比較例１）および試験管法（比較例２）に従い、また図２に示すような血液母液処理バッグにバッグ法を適用して（比較例３）、それぞれ血液母液から白血球を分離、濃縮した後、白血球の収容された凍結バッグ５を常法に従って液体窒素中で凍結保存した。こうして得られた造血幹細胞製剤を各６単位ずつ用意し、それぞれ３７℃の温水中で解凍して、試験例１と同様の検査を行ったところ、表１のような結果が得られた。
表から、本発明による造血幹細胞の品質が、従来法と比較して、無菌性、有核細胞回収率、造血前駆細胞回収率に優れ、赤血球の混入が少ないのがわかる。
【００１５】
【表１】
0004061715.tif 000002
【００１６】
【発明の効果】
以上説明してきたことから明らかなように、本発明の方法を採用することにより、血液母液から白血球製剤を安全かつ無菌的に効率よく分離し濃縮して、造血幹細胞製剤として凍結保存することができる。また、製剤に含まれる造血幹細胞数を精度良く管理することができ、さらに製剤中への赤血球の混入を極力防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用する血液母液処理バッグの一例を示す説明図である。
【図２】本発明で使用する血液母液処理バッグの他の例を示す説明図である。
【符号の説明】
１  親バッグ
２  採血チューブ
２１  採血針
３、４  子バッグ
５  凍結バッグ
６１、６３、６４、６５  連結チューブ
７３、７４、７５  クランプ
８  ポート
【図１】
0004061715.tif 000003
【図２】
0004061715.tif 000004