(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
認識対象化合物、機能性モノマーおよび架橋剤を含む反応混合物をバイアル中で重合させてバイアル内に生成ポリマーの薄膜を形成させ、
バイアル内を洗浄して認識対象化合物等を生成ポリマーから除去し、
バイアル内へ該認識対象化合物と同一または異なる認識対象化合物の溶液を注入した後、該溶液の上清液中に含まれる未結合の認識対象化合物の量を測定し、その結果に基づいて人工レセプターを評価することを特徴とする人工レセプターの評価方法。
【請求項２】
認識対象化合物、機能性モノマーおよび架橋剤を含む反応混合物をバイアル中で重合させてバイアル内に生成ポリマーの薄膜を形成させた後、
該反応混合物の上清液中に含まれる未結合の認識対象化合物の量を測定し、その結果に基づいて人工レセプターを評価することを特徴とする人工レセプターの評価方法。
【請求項３】
使用されるバイアルが複数である請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
コンビナトリアルケミストリーの手法により行なわれる請求項３に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
最近、分離剤、センサ素材、アッセイ用試薬等として、人工レセプターが用いられている。この発明は、その人工レセプターを開発する際の評価法に関するものである。
【０００１】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
生体内では、極めて多種の化学物質の分子認識が正確に行なわれることにより、生体が諸機能を発現している。例えば、酵素はある特定な物質のみを認識することにより、生体内での化学反応を効率的に触媒している。また、細胞膜に存在する各種レセプターは特定物質とのみ選択的に結合して、その物質のもつ細胞外部の情報を細胞内に伝達し、その情報により細胞は生体内で必要とされる様々な抑制・調整等の機能を果たしている。
【０００２】
このレセプター分子を模倣し、優れた分子認識機能を有するように人為的に設計・合成されたものが人工レセプターと呼ばれている。人工レセプターの設計・合成法としては様々な方法があるが、近年開発されたモレキュラーインプリンティング法［Ｗｕｆｆ、Ｇ．；アンゲバイテ・ケミー・インターナショナル・エディション，２４，１８１２〜１８３２（１９９５）］が特に優れており、好ましい方法であると言われている。
【０００３】
モレキュラーインプリンティング法（以下、「ＭＩ法」と略す）によれば、認識対象化合物と、該認識対象化合物と相互作用を有する重合可能な有機化合物（機能性モノマー）とを、架橋剤の存在下に重合させて得られた重合体から、前記認識対象化合物を遊離、除去させて、分子認識物質を得ることができる。この分子認識物質は、前記標的分子の分子形状構造に相当する空間を有する重合体であることに特徴がある。
【０００４】
この人工分子認識物質（人工抗体）の製造法とその利用は、特表平８−５０６３２０号に開示されている。その人工抗体の利用としては、イムノアッセイによる抗原抗体反応の検出法が挙げられている。
また、ＭＩ法で得られた薄膜ポリマー（以下、モレキュラーインプリンティングポリマーと称する）を利用したバイオミメティックセンサーが、特開平８−１５１６０号で開示されている。
【０００５】
このＭＩ法により、認識対象化合物に対し適切な機能性モノマーを配し、架橋性モノマーとの重合を行なえば、認識対象化合物にぴったりあった分子認識ポリマーすなわち人工レセプターを得ることが可能である。しかも、このモレキュラーインプリンティングポリマーは物理的、化学的にも安定であり、耐久性に優れている。
【０００６】
しかし、ＭＩ法で最適なモレキュラーインプリンティングポリマーを得るためには、幾つかの問題点がある。まず、認識対象化合物に対する機能性モノマー、架橋性モノマー等の成分の組み合わせや使用割合、重合時に用いる溶媒などの条件検討が必要である。さらに、得られたモレキュラーインプリンティングポリマーを評価するためには、得られたポリマーを粉砕し、カラムに充填し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて認識対象化合物に対する認識の度合いを測定するのに、時間と手間がかかりすぎる。この時間と手間を軽減するものとして開発された従来のｉｎ−ｓｉｔｕ法［Ｊ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｔ．Ｋａｔｏ，Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｅ．Ｔａｍｉｙａ，Ｉ．Ｋａｒｕｂｅ，アナリティカル・ケミストリー，６５，２２２３（１９９３）］は、認識対象化合物、機能性モノマー、架橋性モノマー、重合溶媒、反応開始剤等からなる混合液を、ＨＰＬＣ用のカラムに充填し、その中で重合させることにより、カラム内でモレキュラーインプリンティングポリマーを直接製造する方法である。この方法によれば、カラムをＨＰＬＣ用のポンプに接続するだけで、モレキュラーインプリンティングポリマーの分子認識能力を評価できるが、それでもなお満足できるものではない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、人工レセプターの開発にコンビナトリアルケミストリーの手法を採り入れることにより、分子認識物質の開発の効率化とその高性能化を図り得ることを見出した。すなわち、本発明は、新規ｉｎ−ｓｉｔｕ法を用いて、多数のバイアル内で多種類の分子認識ポリマーをそれぞれ製造し、その生成物からなる薄膜を各バイアル内に形成させ、得られたポリマーの分子認識の程度を評価する方法に関するものである。
【０００８】
この発明によれば、多種類のモレキュラーインプリンティングポリマーを各バイアル内で同時に製造し、得られたポリマーの分子認識性能をフローインジェクション分析法またはＨＰＬＣにより迅速に、かつ簡便に行なうことができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、認識対象化合物、機能性モノマーおよび架橋剤をバイアル中で重合させてバイアル内に生成ポリマーの薄膜を形成させ、次いでバイアル内を洗浄して認識対象化合物をポリマーから除去し、次いでバイアル内へ認識対象化合物の溶液を注入した後、上清液中に含まれる認識対象化合物の量を測定し、その結果に基づいて個々の認識対象化合物にとって最適な人工レセプターを見出す評価法が提供される。
【００１０】
この発明で使用される機能性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、トリフルオロメタクリル酸、ビニルピリジン、ビニルイミダゾール、ビニル安息香酸、４−ビニルベンジルイミドジ酢酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、２，６−ビスアクリルアミドピリジン等が挙げられる。これらの機能性モノマーは複数種組み合わせて使用してもよい。
【００１１】
この発明で使用される架橋剤としては、エチレングリコール、エチレングリコールジメチルアクリレート、１，４−ジビニルベンゼン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−フェニレンビスアクリルアミド、トリメチルプロパントリメタクリレート等が挙げられる。
【００１２】
重合溶媒としては、機能性モノマーと認識対象化合物の相互作用を損なわず、各成分を溶解することができ、かつポリマーを多孔性にするためのポロジエンとなり得るものがよく、具体的にはトルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等が挙げられ、なかでもトルエンおよびジクロロメタンが好ましい。
機能性モノマーの使用割合としては、認識対象化合物および機能性モノマーの種類にもよるが、通常、認識対象化合物１モルに対して機能性モノマーが１から１００モルの割合で用いられる。
【００１３】
重合反応の条件としては、ラジカル重合（塊状重合、懸濁重合、溶液重合、乳化重合、シード重合、分散重合、逆懸濁重合、ソープフリー重合）、イオン重合（アニオン重合、カチオン重合）、溶融重合、固相重合、界面重合等が挙げられる。
【００１４】
重合終了後のポリマーを洗浄するための洗浄液としては、認識対象化合物とポリマーとの結合様式にもよるが、通常、アルコール、水、各種の酸もしくは塩基またはそれらの混合物等が挙げられる。
【００１５】
本発明の方法では、コンビナトリアルケミストリーの手法により、複数のバイアルを使用して、ポリマーの製造から得られたポリマーの評価までが一貫して行なわれる。具体的には、認識対象化合物、機能性モノマー、架橋剤、重合溶媒、重合開始剤等のポリマー製造のための試剤の分注；重合反応終了後、得られたポリマーから認識対象化合物等を除去するための洗浄液の注入および排出；認識対象化合物の溶液のバイアル内への注入およびバイアル内での上清液のバイアルからの排出、得られた上清液中に含まれる認識対象化合物の定量等を、コンビナトリアルライブラリー製造のための合成ロボット、ライブラリーを評価するためのアッセイロボット等を使用することにより、この発明の方法を効率よく実施することができる。
【００１６】
認識対象化合物の定量方法は、吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、電気化学的検出、酵素活性を指標とするものなどをＨＰＬＣやフローインジェクション分析法と組み合わせて行なうことができる。
【００１７】
なお、この発明の方法を簡略化した次の方法によっても、人工レセプターを評価することができる。
すなわち、認識対象化合物、機能性モノマーおよび架橋剤をバイアル中で重合させてバイアル内に生成ポリマーの薄膜を形成させたのち、反応混合物の上清液中に含まれる未結合の認識対象化合物の量を測定し、その結果に基づいて人工レセプターを評価することを特徴とする人工レセプターの評価方法によっても、ある程度の精度でもって人工レセプターを評価することができる。
【００１８】
【実施例】
実施例１
（１）ポリマーライブラリー［ＰＬ（Ａｍｅ）］の合成
トリアジン系除草剤であるアメトリン［４−（エチルアミノ）−６−（イソプロピルアミノ）−２−メチルチオ−１，３，５−トリアジン］およびアトラジン［２−クロロ−４−（エチルアミノ）−６−（イソプロピルアミノ）−１，３，５−トリアジン］の選択性ポリマーを、公知の方法［Ｊ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．Ｍｉｙｏｓｈｉ、Ｏ．Ｄｏｂｌｈｏｆｆ−Ｄｉｅｒ、Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，アナリティカル・ケミストリー６７，４４０４−４４０８（１９９５）およびＪ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｏ．Ｄｏｂｌｈｏｆｆ−Ｄｉｅｒ、Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，ケミストリー・レターズ、４８９（１９９５）］を参考にして製造した。
【００１９】
図１は合成および評価の手順を示すフローチャートである。認識対象化合物（テンプレート分子）としてアメトリン１．９５μｍｏｌ、（和光純薬工業）、機能性モノマーとしてメタクリル酸（以下、「ＭＭＡ」と略す、片山化学工業）および２−トリフルオロメチルアクリル酸（以下、「ＴＦＭＡＡ」と略す、東京化成工業）を用いた。架橋剤にはエチレングリコールジメタクリレート３０．０ｍｇ（以下、「ＥＧＤＭＡ」と略す、片山化学工業）、重合開始剤に２，２’−アゾビスイソブチロニトリル０．７４７ｍｇ（以下、「ＡＩＢＮ」と略す、和光純薬工業）、重合溶媒にはクロロホルム５９．０μＬ（片山化学工業）を用いた。この際、上記の二つの機能性モノマーをアメトリンに対してそれぞれ０〜６当量の範囲で使用することにより、４９通りにテンプレート分子と機能性モノマー間の量比を変えた。そして、アメトリンに対して機能性モノマーの合計が１２当量になるように、不足分をメチルメタクリレート（和光純薬工業）を添加して補った。
【００２０】
合成ロボットを用いてこれらの試剤をバイアルに分注した後、各バイアルを窒素ガスで置換し、５℃で１２時間、ＵＶを照射して重合反応を行なった。各バイアルに洗浄液（メタノール／水／酢酸、７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）の注入および吸引を１０回繰り返し、認識対象化合物、未反応の機能性モノマー、架橋剤、重合開始剤等を各バイアルから除去した。さらに、各バイアルにクロロホルムの注入および吸引を３回繰り返し、各バイアル内の洗浄液をクロロホルムで置換した。その結果、バイアル瓶の内面を被覆する形で４９種のポリマーからなるポリマーライブラリー（以下、「ＰＬ（Ａｍｅ）」と略す）を得た。
【００２１】
（２）ＰＬ（Ａｍｅ）とアメトリンの結合実験
ＰＬ（Ａｍｅ）が生成した上記の各バイアルにアメトリン（５００μＭ）のクロロホルム溶液１．５ｍｌを注入し、２４時間放置した後、ＨＰＬＣまたはフローインジェクション分析法により上清液中の未結合アメトリンの濃度を測定した。アメトリンの初期濃度５００μＭと上清液中のアメトリン濃度の差からアメトリンとＰＬ（Ａｍｅ）との結合量を算出した。その結果を図２に示す。
【００２２】
（３）ＰＬ（Ａｍｅ）とアトラジンの結合実験
上記（２）の試験後の各バイアルに洗浄液（メタノール／水／酢酸、７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）の注入および吸引を１０回繰り返し、各バイアルからアメトリンを除去した。さらに、各バイアルにクロロホルムの注入・吸引を３回繰り返して各バイアル中の洗浄液をクロロホルムで置換した。
ＰＬ（Ａｍｅ）にアトラジン（５００μＭ）のクロロホルム溶液を注入する以外は、実施例１（２）と同様にして、アトラジンとＰＬ（Ａｍｅ）との結合量を算出した。その結果を、図３に示す。
【００２３】
なお、上清液中のアメトリンおよびアトラジンのＨＰＬＣ測定には、カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＬＣ−８−ＤＢ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｉ．Ｄ．））を備えた日立ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−６２００  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｐｕｍｐ、Ｌー３０００  ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用した。上清液のインジェクションにはオートサンプラー（Ｇｉｌｓｏｎ  ２３１ＸＬ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）を使用した。ＨＰＬＣの測定に際しては、溶出液には酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０、０．１Ｍ）／アセトニトリル（アメトリン検出時には６／４、アトラジン検出時には７／３、それぞれｖ／ｖ）を流量１．０ｍｌ／分で流し、検出器の吸収波長を２６０ｎｍに設定した。なお、フローインジェクション分析法は、上記のシステムからカラムを除き、キャリア溶液としてクロロホルムを用いた。
【００２４】
（４）ＰＬ（Ａｍｅ）のアメトリンへの選択性評価
ＰＬ（Ａｍｅ）に属する各ライブラリーメンバーのアメトリンへの選択性について検討するため、［ＰＬ（Ａｍｅ）におけるアメトリン結合量］／［ＰＬ（Ａｍｅ）におけるアトラジン結合量］の比を選択性として算出した。その結果を図４に示す。
図２より、ＭＡＡとＴＦＭＡＡのいずれが増加してもインプリントポリマーのアメトリンへの結合量が増加する傾向が見られた。また、図３より、ＭＡＡとＴＦＭＡＡのいずれが増加してもインプリントポリマーのアトラジンへの結合量があまり増加しない傾向が見られた。また図４より、ＭＡＡはポリマーのアメトリンへの選択性に寄与していないが、ＴＦＭＡＡを多く含んでいるポリマーほどアメトリンに対する選択性が向上する傾向が認められた。よって、アメトリンに対しては、ＴＦＭＡＡがＭＡＡより優れた機能性モノマーであることが示唆され、アメトリンに対してＴＦＭＡＡ６当量を用いるポリマーが特に優れていることがわかった。
【００２５】
実施例２
（１）ポリマーライブラリー［ＰＬ（Ａｔｒ）］の合成
認識対象化合物をアトラジン（農薬から精製して得た）に変えた以外は前記の実施例１（１）と同様にして、４９種のポリマーからなるポリマーライブラリー（以下、「ＰＬ（Ａｔｒ）」と略す）を合成した。
【００２６】
（２）ＰＬ（Ａｔｒ）とアトラジンの結合実験
ＰＬ（Ａｔｒ）にアトラジン（５００μＭ）のクロロホルム溶液を注入する以外は、実施例１（２）と同様にして、ＰＬ（Ａｔｒ）とアトラジンの結合量を算出した。その結果を、図５に示す。
【００２７】
（３）ＰＬ（Ａｔｒ）とアメトリンの結合実験
ＰＬ（Ａｔｒ）にアメトリン（５００μＭ）のクロロホルム溶液を注入する以外は、実施例１（３）と同様にしてアメトリンとＰＬ（Ａｔｒ）との結合量を算出した。その結果を図６に示す。
【００２８】
（４）ＰＬ（Ａｔｒ）のアトラジンへの選択性評価
ＰＬ（Ａｔｒ）に属する各ライブラリーメンバーのアトラジンへの選択性について検討するため、［ＰＬ（Ａｔｒ）におけるアトラジン結合量］／「ＰＬ（Ａｔｒ）におけるアメトリン結合量］の比を算出した。その結果を図７に示す。
【００２９】
図５より、ＴＦＭＡＡを機能性モノマーとして含んでいないポリマー、つまりＴＦＭＡＡ量が０のときに認識対象分子に対するＭＡＡの量比を増加させたとき、アトラジンに対するインプリントポリマーの結合量増加が見られた。また、ＭＡＡ量が少ないときにＴＦＭＡＡの量比増大に伴ない、アトラジンに対するインプリントポリマーの結合量増加が見られた。また、図７より、認識対象分子に対しＴＦＭＡＡ量比が少ないインプリントポリマーほどアトラジンに対する選択結合性が向上していることが確認された。よって、アトラジンに対しては、ＴＦＭＡＡよりＭＡＡがより優れた機能性モノマーであることが示唆され、アトラジンに対し、ＭＡＡ６当量を用いたポリマーが特に優れていることがわかった。
【００３０】
実施例３
実施例１（１）と同様にポリマーライブラリー［ＰＬ（Ａｍｅ）］を合成した後、各バイアルにアセトニトリルを１．５ｍｌずつ注入し、２４時間放置した。上清をＨＰＬＣにて分析し、未結合アメトリンの濃度を測定した。アメトリンの初期量（ポリマー合成に使われたアメトリン量）１．９５μｍｏｌを上清中のアメトリン濃度の差からアメトリンとＰＬ（Ａｍｅ）との結合量を算出した。その結果を図８に示す。この結果は実施例１のパターンと類似しており、実施例１のように洗浄液（メタノール／水／酢酸、７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）でアメトリンを完全に除去しなくても、ある程度予備的な結果が得られることがわかった。
【００３１】
実施例４
実施例１（４）の結果に基づいて、認識対象化合物１当量に対して、ＭＡＡ１当量およびＴＦＭＡＡ６当量を用いて合成したポリマーが、最適な人工レセプターと判明した。そこで、認識対象化合物１当量に対してＭＡＡ１当量およびＴＦＭＡＡ６当量を用いて、実施例１（１）と同様にしてポリマーを合成した。得られたポリマーは、アメトリンとの強い結合活性を示した。
【００３２】
実施例５
実施例２（４）の結果に基づいて、認識対象化合物１当量に対して、ＭＡＡ４当量（ＴＦＭＡＡ０当量）を用いて合成したポリマーが、最適な人工レセプターと判明した。そこで、認識対象化合物１当量に対してＭＡＡ４当量（ＴＦＭＡＡ０当量）を用いて、実施例２（１）と同様にしてポリマーを合成した。得られたポリマーは、アトラジンとの強い結合活性を示した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明は、モレキュラーインプリントポリマーをコンビナトリアルケミストリーの手法およびｉｎ−ｓｉｔｕ法を用いることにより、同時に多種合成、多種評価することを可能とした。すなわち、本発明は、モレキュラーインプリントポリマー設計・合成に際して、認識対象分子と相性のよい機能性モノマーの種類、認識対象分子に対する機能性モノマーの量比、さらに機能性モノマーを複数種用いるときはそれらの混合比といったような条件検討を、簡便に行なうことを可能とした。
【図面の簡単な説明】
【図１】人工レセプターの合成および評価の手順を示すフローチャートである。
【図２】ＰＬ（Ａｍｅ）とアメトリンとの結合量を示すグラフである。
【図３】ＰＬ（Ａｍｅ）とアトラジンとの結合量を示すグラフである。
【図４】アメトリンに対するアメトリンインプリントポリマーの選択性を示すグラフである。
【図５】ＰＬ（Ａｔｒ）とアトラジンとのとの結合量を示すグラフである。
【図６】ＰＬ（Ａｔｒ）とアメトリンとの結合量を示すグラフである。
【図７】アトラジンに対するアトラジンインプリントポリマーの選択性を示すグラフである。
【図８】ＰＬ（Ａｍｅ）とアメトリンとの結合量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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