(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物起源の哺乳類の結合組織中のヒアルロナンの局所含量の増大に関連した臓器移植と関係のある間隙性水腫の症状の治療のための薬剤の製造におけるヒアルロニダーゼの使用。
【請求項２】
前記哺乳類に局所的にまたは全身的に投与する場合に１日用量が１〜１０００００  ＩＵ／体重１ｋｇとなる量でヒアルロニダーゼを包含する薬剤の製造における請求項１の使用。
【請求項３】
前記１日用量が１００〜１５０００ＩＵ／体重１ｋｇである請求項２の使用。
【請求項４】
前記１日用量が５００〜１００００ＩＵ／体重１ｋｇである請求項３の使用。
【請求項５】
予防的にまたは治療的に投与される薬剤の製造における前記請求項のいずれかの使用。
【請求項６】
ヒアルロニダーゼを有効成分とする、ヒトまたは動物起源の哺乳類の結合組織中のヒアルロナンの局所含量の増大に関連した臓器移植と関係のある間隙性水腫の症状の治療用薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、臓器移植と関係があるヒアルロナンの増大された局所合成に関連した間隙性水腫の症状に罹患したヒトまたは動物起源の哺乳類の治療のための製剤製造におけるヒアルロニダーゼの使用に関する。
発明の背景
ヒアルロニダーゼは、例えば哺乳類、ヒルおよびオキアミ類で産生される酵素であり、これは多数の組織から抽出可能である。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンと呼ばれる、そしてヒアルロン酸とも呼ばれるムコ多糖類を分解する（Balazs EA et al, Biochem. J. 1986;235:903）。
ヒアルロナンは、反復二糖類であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−Ｄ−グルクロン酸により作り上げられる直鎖ポリマーである。それは、細胞外マトリックスの構造および構成における鍵的役割を有し、胚形成中の（Toole, P.B. in Cellular Biology of Extracellular Matrix（ed. Hay, E.D.）251-294（Plenum Publishing Corp., New York, 1981））、並びに迅速な組織増殖、再生および修復が起きるときはいつでも、細胞外マトリックスの主要成分である。それは、間葉細胞により産生される（Comper WD, Laurent TC, Physiol. Rev. 1978;58:255-315）。
ヒアルロナンは、部分的にその分子サイズに関連したいくつかの生物学的作用を有する（West, D.C., Kumar, S. Exp. Cell. Res. 183, 179-196, 1989）。ヒアルロナンの独特の水結合能力は十分認識されており、治療目的に、例えば眼の手術に利用される。
臓器中のヒアルロナンの含量は、その臓器の炎症の異なる症状で増大することが示されている。したがって、ヒアルロナン濃度の増大は、例えば肺胞炎（Net-telbladt O et al, Am Rev Resp Dis 1989;139:759-762）および心筋梗塞（Waldenstroem et al, J Clin Invest 1991;88(5):1622-1628）といった炎症性−免疫学的損傷の症状を特徴とする異なる臓器からの組織で示されている。この種の症状のその他の例は、腎臓（Haellgren et al, J Exp Med 1990a;171:2063-2076;Wells et al, Transplantation 1990;50:240-243）、小腸（Wallander et al, Transplant Int 1993;6:133-137）または心臓（Haellgren et al, J Clin Invest 1990b;85:668-673）移植後の同種異系移植片拒否反応（allograft rejection）、あるいはウイルス起源の心筋炎症（Waldenstroem et al, Eur J Clin Invest 1993;23:277-282）である。
ヒアルロナンの顕著な水結合能力（Mason RM, Progr Clin Biol 1981;Res 54:87-112）のために、臓器の結合組織中のヒアルロナンの局所的産生および蓄積の増大は有害な間隙組織水腫の危険性を伴う液体の局所的蓄積を引き起こし、次にこれがその臓器の機能の損傷を引き起こす。例えば、炎症状態の臓器中のヒアルロナンのこの蓄積が非常に重篤な結果を生じ得ることは明らかである。臓器移植の場合、移植水腫の発症は、例えば細胞外圧の増大および微小血管系の圧縮のための、あるいは酸素に関する拡散距離の増大のための、臓器移植片の機能に対する脅威を示す。これは、ついには臓器の非可逆的拒否反応を、そしていくつかの場合には生命の危機的症状をも引き起こし得る。したがって、この危険な状態を軽減する方法が大いに必要とされる。本発明の目的は、これを達成する手段を提供することである。
ヒアルロニダーゼは、従来、７０年代に、心筋梗塞の影響を低減するために用いられている（Maroko PR et al, Circulation 1972;46(3):430-7;Maclean D, et al, Science 1976;194(4261):199-200）。しかしながら、作用の様式は分かっていない。in vitro動物モデルでは、虚血性損傷後の心臓性能は、ヒアルロニダーゼを投与すると、改良された（Rovetto,MJ, Circ-Res 1977;41(3):373-9;Fischer JH et al, Transplantation 1994;58(6):748-53）。さらに、Waldenstroem等（J Clin Invest 1991;88(5):1622-1628）は、ヒアルロナンがラットで誘発された実験的心筋梗塞における梗塞領域に蓄積されるという事実にかんがみて、虚血中の細胞損傷を制限するに際してのヒアルロニダーゼ使用の成功の可能性について考えたが、しかしながら彼等の理論を実行に移さなかった。
ヒアルロニダーゼ治療はさらに、おそらくは側副血流の形成、すなわち新規の血管の形成を刺激することによる心筋梗塞治療の手段として、その他の研究者により提案された（Sleight P, Interventions during and after acute myocardial infarction. Postgrad. Med. J. 59,suppl 3:80-8(1983)）。しかしながら、急性の梗塞形成の状態のヒト被験者に関する大規模な無作為試験はこれを確証できなかった。１４８８名の急性心筋梗塞被験者に関する試験では、致死率に及ぼす有益な作用は、プラセボ群と比較した場合、ヒアルロニダーゼ処置群において示されなかった（Julian DG, Simpson JM, Cadigan PJ, Petri MC et al. Cardiology 75(3):177-183(1988)）。８５１名の心筋梗塞罹患被験者に関する別の二重盲検多施設試験も、それぞれヒアルロニダーゼ処置被験者とプラセボ処置被験者との間にいかなる有意差も示すことができなかった（MILIS Study Group. Am J Cardiol 57(15):1236-1243, (1986)）。
明らかに、これらの大規模試験はどれも、ヒアルロニダーゼを用いた治療によるヒト被験者の心筋梗塞に及ぼすいかなる有益な作用も示せなかった。
ヒアルロニダーゼを用いたイヌにおける心臓リンパの能動的ドレナージの試みが、イヌで成功している（Taira A et al., Angiology(United States)Dec 1990, 41(12)p1029-36, ISSN 003-3197, Journal Code:4UA）。リンパおよび間隙性水腫のドレナージは、互いに間接的に関係があるだけである。我々が提案した本発明では、リンパドレナージは正常であると推測される。
間隙性ヒアルロナン蓄積は、虚血性／炎症性損傷に対していくつかの臓器で十分実証されている。移植臓器では、ヒアルロナンは、おそらくは臓器の獲得および保存により誘発される虚血性損傷のために、術後早い期間に蓄積される。しかしながら、急性拒否反応の発現中は、おそらくは臓器移植片の拒否反応の免疫学的および／または炎症性反応に関連した多数の炎症生成物により刺激された間隙細胞によるヒアルロナン合成の増強のために、漸増性のそして非常に顕著な間隙性ヒアルロナン蓄積が認められる。
臓器移植に関連した間隙性水腫の発生は、移植手術の領域に重大な問題を設定する。実際、例えば腎臓移植の領域では、統計学的に２５％という多さの移植片が、すなわち１００例中２５例の移植片が、機能が一時的に喪失される程度に腫脹する。さらに、症例の約２〜３％において、腫脹は腎臓の破裂を引き起こし、その結果大出血を引き起こすほど重篤である。
したがって、移植臓器の腫脹は、移植手術を受けた被験者に重篤な危険をもたらす。これに対する治療を見つけだすことが緊急に必要であることは明らかである。しかしながら、この緊急の必要性にもかかわらず、本発明のような、これを達成するための簡単で且つ信頼できる方法があることを、今日までだれも示していない。これは、いくつかの理由から、これが使用可能な治療方法であると、当業者が思わなかったためである。第一に、酵素が水腫組織に達するということはほとんどありそうもないと考えられた。第二に、ヒアルロニダーゼは酸性ｐＨでその最適活性を有するが、一方組織のｐＨは中性であり、したがって組織中の酵素の活性は低いと予測された。最後に、酵素が活性であることが立証された場合でも、水腫中だけでなく全身のヒアルロナンの分解が引き起こされるおそれがあった。
実際、本発明の基礎をなした、臓器移植に関連したヒアルロナンの増大した局所合成を用いて間隙性水腫を治療することができるという発見は、本発明にとっても全く意外であった。
したがって、今日まで、ヒアルロナン蓄積により引き起こされる間隙性水腫に適した治療はなかった。唯一の治療は間接的で、炎症の治療に拠っていた。その場合、「自然」が蓄積ヒアルロナンを希望的に分解し、それにより水腫を低減する。
ヒアルロニダーゼを用いる炎症誘発性間隙性水腫の治療の成功は、ヒアルロナンが炎症を起こしていない組織中では分解されないという事実に拠っている。したがって、我々は、実験で、非炎症化「対照」腎臓の天然ヒアルロナン含量が攪乱されないことを示した。
本発明の一般的説明
本発明は、結合組織中に蓄積されたヒアルロナンの酵素的消化により余分の水分が遊離され、したがって、ヒアルロナンのこの含量増大に起因する組織水腫が軽減されるということを示し得た。この当業者にとって非常に意外な発見が、臓器移植に関係した結合組織中のヒアルロナンの局所含量増大に関連した間隙性水腫の症状の治療のためのヒアルロニダーゼをベースにした製剤を本発明者に開発させた。
したがって本発明の目的は、臓器移植に関係したヒトまたは動物起源の哺乳類の結合組織中のヒアルロナンの局所含量増大に関連した間隙性水腫の症状の治療のための製剤の製造におけるヒアルロニダーゼの使用である。
本発明の別の目的は、臓器移植に関係したヒトまたは動物起源の哺乳類の結合組織中のヒアルロナンの局所含量増大に関連した間隙性水腫の症状の治療方法であって、ヒアルロニダーゼを包含する製剤による前記の哺乳類の全身的または局所的治療による方法を提供することである。
以下で本発明を詳細に説明するが、本発明は添付の請求の範囲に限定される。
発明の詳細な説明
本発明の好ましい一実施態様は、動物またはヒト起源の哺乳類における臓器移植に関係した間隙性水腫の治療のための製剤の製造におけるヒアルロニダーゼの使用に言及する。この治療は、予防的または治療的特性を有し得る。臓器は、動物またはヒト起源の哺乳類の例えば肝臓、腎臓または心臓である。
本発明によれば、ヒアルロニダーゼは全身的にまたは局所的に投与される製剤の製造に用いられる。
ヒアルロニダーゼは、製剤の全身的または局所的投与により１日用量が体重１ｋｇ当たり、１  ＩＵ〜１００  ０００  ＩＵ、さらに好ましくは、１００  ＩＵ〜１５  ０００  ＩＵ、あるいは、５００  ＩＵ〜１０  ０００  ＩＵとなるような量で、製剤中に混入される必要がある。
本発明の製剤は、当業者に公知の慣用的方法で調製される。局所適用製剤は、ヒアルロニダーゼの他に、慣用的臓器保存溶液の構成成分、例えばデキストラン、陰イオン、陽イオンおよび浸透性分子を含有する。その全身性使用形態は、安定剤および塩類（saline）を含有し得る。
本発明はさらに、ヒアルロナンの局所合成増大に関連した症状に罹患した哺乳類の治療方法に関する。本発明の好ましい一実施態様は、ヒアルロニダーゼを包含する製剤を用いた全身的または局所的治療による、ヒアルロナンの局所合成増大に関連した間隙性水腫に罹患した哺乳類の治療方法である。
本発明の特に好ましい一実施態様は、ヒアルロニダーゼを包含する製剤を用いた全身的または局所的治療による、臓器移植に関係して生じ、そしてヒアルロナンの局所合成増大に関連する間隙性水腫に罹患した哺乳類の治療方法である。
本発明の方法では、製剤の全身的または局所的投与により、製剤は、１日用量が哺乳類の体重１ｋｇ当たり１  ＩＵ〜１００  ０００  ＩＵ、さらに好ましくは１００  ＩＵ〜１５  ０００  ＩＵ、或いは５００  ＩＵ〜１０  ０００  ＩＵとなるような量で、哺乳類に全身的にまたは局所的に投与される。
本発明は、体重約２００ｇの雄Lewisラットのラットモデルで先ず試験された。１０匹のラットの多数が左腎臓の６０分間温虚血を施され、炎症性水腫およびヒアルロナン蓄積を誘発された。これらの動物のうちの５匹はさらに、０、１および２日目、および実験終了の２時間前に、ヒアルロニダーゼ静注を施された。５匹の未処置動物は、左腎臓の水分蓄積（水腫）およびヒアルロナン蓄積を発症した。この現象は、ヒアルロニダーゼ静注で付加的に治療された動物には全く生じなかった。実験未使用ラット５匹と比較測定した場合、右腎臓の含水量またはヒアルロナン含量に変化は認められなかった。
次に、下記に詳述するように、ラットにおいて異所性心臓移植の方法を用いて、別の試験を実行した。
体重１７５〜２５０ｇの雄ＰＶＧ（ＲＴ１C）およびWistar/Kyoto（ＲＴ１1v）ラットをそれぞれドナーおよびレシピエントとして用いた。この動物は、Mφllegaard（Skensved, Denmark）から入手し、手術前に少なくとも１週間安静にさせて、餌および水を自由に摂取させた。手術は、抱水クロラール（１８０ｍｇ／体重１ｋｇ）、ベントバルビタール（４０ｍｇ／体重１ｋｇ）および硫酸マグネシウム（９０ｍｇ／体重１ｋｇ）の混合物の腹腔内注射による麻酔下で実施した。
非縫合法を用いて、異所性心臓移植を実施した。ドナー心臓の大動脈をレシピエントの右総頸動脈に、肺動脈を右頸静脈に吻合した。移植完了時に、セフロキシム（ZinacefTM, Glaxo, Greenford, UK）２０ｍｇ／ラットを筋注により１回投与した。毎日触診して移植片を監視し、移植片に拍動が全く検出されなくなると、心臓は拒絶されたとみなされた。
移植片の再還流直後に、レシピエントラットにヒツジ精巣ヒアルロニダーゼＶ型（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を２０，０００  Ｕ／体重１ｋｇ静注した。２０，０００  Ｕ／体重１ｋｇの静注用量を、１、２、３および４日目に１日１回、５日目に１日２回投与し、２０，０００  Ｕ／体重１ｋｇの最終投与は、６日目の摘出の２時間前に投与した。さらに、この実験群（ｎ＝１１）において、ドナー心臓を獲得時にヒアルロニダーゼで洗い流した。先ず、０．５ｍｌのＦＷ−溶液（Froedin Wolgast、細胞外ヒスチジン溶液）を大動脈に通して心臓を洗浄し、その後さらに０．５ｍｌの２，５００Ｕのヒアルロニダーゼを含有するＦＷ−溶液で洗浄した。対照群（ｎ＝１１）のラットは、移植後６日目に摘出するまで、未処置のままであった。この群では、ドナー心臓はヒアルロニダーゼを含有しない１．０ｍｌのＦＷ溶液で洗浄した。
別個の実験として、移植片生存時間に及ぼすヒアルロニダーゼ処置の作用を調べた。２群のラット、すなわち未処置ラット（ｎ＝１０）およびヒアルロニダーゼ処置ラット（ｎ＝１１）を試験した。この実験は前記と同様の方法で実施したが、但し、移植片が機能している間は１日１回、ヒアルロニダーゼを投与し、移植片が拒絶されるまで全動物を保持した。
摘出時に、移植心臓の１／３を、１％セチルピリジニウムクロリドを含有する緩衝４％ホルマリン、ｐＨ７．３中に固定し、１／３を冷イソペンタン中に凍結させて、残りの１／３を含水量およびヒアルロン酸（ＨＡ）含量の確定に用いた。対照用に、４匹の未処置、非移植ラットから心臓を得た。
摘出直後に、検体を濾紙の上に置き、３分後に計量した（湿重量  ｗ．ｗ．）。検体を一夜凍結乾燥して、再び計量した（乾燥重量  ｄ．ｗ．）。粉砕後、０．５Ｍ  ＮａＣｌを用いて１６時間、ＨＡを組織から抽出した。２，０００ｇで１５分間遠心分離後、市販の放射線測定検定（radiometric assay）（Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden）を用いて上清のＨＡ含量を分析した。技法は、ＨＡの、特異的ヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）との結合に基づいている。要するに、１００μｌの標本を、２００μｌの125Ｉ−標識化ＨＡＢＰとともに４〜７℃で６０分間インキュベートする。ＨＡ−Sepharose  １００μｌを付加し、同一温度で４５分以上インキュベーションを継続する。２，０００ｇで１０分間遠心分離する前に、洗浄溶液  ２ｍｌを付加する。デカント後、ペレット中の放射能をガンマ計数器で測定する。既知量のＨＡを含有する標本から標準曲線を作成する。各標本に関して二重分析を実施した結果、変動性は１０％未満であった。相対的含水量は、組織の総重量に対する水の％で表した場合、１００ｘ（ｗ．ｗ．−ｄ．ｗ．）／ｗ．ｗ．として算出された。
データは、平均値＋平均標準誤差（ＳＥＭ）で示した。群間の比較は、ＨＡ含量および含水量に関してはスチューデント無対ｔ検定により、移植片（graft）生存時間に関してはMann-WhitneyＵ検定により評価した。０．０５未満のｐレベルは統計的に有意と見なされた。結果を下表に示す。
0004087453.tif 000002
ＨＡの分布をつきとめるために、免疫組織化学的染色を実施した。このために、主として前記と同様に、アビジン−酵素、ビオチン−タンパク質系を用いた。要するに、パラフィン包埋４μｍ厚切片をウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｖ分画、Sigma Chemical Co, St.Louis, MO, USA）とともにインキュベートして、非特異的結合部位を遮断し、その後、ＰＢＳ中の３％Ｈ2Ｏ2中に入れて内因性ペルオキシダーゼを抑制した。ＨＡＢＰとともに２時間インキュベーション後、切片をＡＢＣ  Vectastain試薬（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）とともに１時間インキュベートした。最後に、基質としてＨ2Ｏ2を、電子供与体として３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（ＡＥＣ）を付加し、その後検体をメイヤーヘマトキシリンで対比染色した。対照切片を、ストレプトミセス属（Streptomyces）ヒアルロニダーゼとともに２時間インキュベートした。スライドはすべて、目隠し評価した。
ホルマリンに固定した心臓移植片をパラフィンに包埋し、４μｍ厚切片に切断して、エオシンおよびメイヤーヘマトキシリンで染色した。スライドはすべて、目隠し評価した。
同種異系移植後６日目の心臓移植片の組織切片では、拡張した間隙に顕著な細胞浸潤が認められた。ヒアルロナンの蓄積は、富細胞拡張間隙に認められた。ヒアルロニダーゼを毎日静注後、間隙は低減し、貧細胞となって、ヒアルロナンに対する染色は全く分散した。
本発明のラットモデルにおけるヒアルロニダーゼ処置は、水腫形成を低減しただけでなく、移植片生存時間を有意に改良した。したがって、未処置ラットでは、８．３±０．３日後に移植片拒否反応が起きたが、一方ヒアルロニダーゼによる毎日静注処置ラットは移植片生存時間を１．５日延長した（平均生存時間  ９．７±０．５日；ｐ＜０．０１）。拒否反応発現がこのように迅速な工程であるこの全体的非免疫抑制系においてこのような顕著な効果が得られたということは、注目に値する。