(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地にモノバクタム系抗生物質を添加することによって、実質的にストレプトコッカス・ソブリヌスのみを単離する方法。
【請求項２】
ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地にモノバクタム系抗生物質を添加したストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地。
【請求項３】
口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地が、ミティス・サリバリウス寒天（Ｍｉｔｉｓ  Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ａｇａｒ；ＭＳ培地，Ｄｉｆｃｏ社製）であることを特徴とする、請求項２に記載のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地。
【請求項４】
モノバクタム系抗生物質が、アズトレオナム（ＡＺＴ）又はカルモナム（ＣＲＭＮ）であることを特徴とする、請求項２又は３に記載のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地。
【請求項５】
モノバクタム系抗生物質が、アズトレオナム（ＡＺＴ）であることを特徴とする、請求項４に記載のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地。
【請求項６】
モノバクタム系抗生物質を、０．０５〜０．５ｇ／Ｌの濃度で含有することを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地。
【請求項７】
ホスホマイシン及び／又はバシトラシンを含有することを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地。
【請求項８】
下記組成を有することを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地。
ミティス・サリバリウス培地            ９０ｇ／Ｌ
アズトレオナム            ０．０５〜０．５ｇ／Ｌ
ホスホマイシン            ０．０５〜０．５ｇ／Ｌ
バシトラシン                    ５〜５０単位／Ｌ
塩化ナトリウム                    ５〜４０ｇ／Ｌ
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、口腔に存在する齲蝕（虫歯）の原因菌（ミュータンス・ストレプトコッキィ）のうち、ストレプトコッカス・ソブリヌスを選択的に単離する方法及びストレプトコッカス・ソブリヌスのみを選択的に増殖させる培地に関する。
背景技術
従来、ヒトの齲蝕の原因菌は口腔に生息する連鎖球菌（口腔連鎖球菌）のうちのストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）であると言われてきた。しかしながら、このストレプトコッカス・ミュータンスが細分化され、現在では、ａ〜ｈの異なる血清型によって識別される細菌種からなる、ミュータンス・ストレプトコッキィ（ｍｕｔａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）と呼ばれる菌群によって齲蝕が引き起こされると考えられている（Ｈａｍａｄａ，Ｓ．及びＨ．Ｄ．Ｓｌａｄｅ，１９８０，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ４４：３３１−３８４；Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｍ．ら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２７：１００３−１０１１；及びＬｏｅｓｃｈｅ，Ｗ．Ｊ．，１９８６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５０：３５３−３８０）。ミュータンス・ストレプトコッキィに分類される口腔連鎖球菌種としては、ストレプトコッカス・クリセタス、ストレプトコッカス・ラッタス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリヌス及びストレプトコッカス・ダウネイが挙げられる。
さらに、ミュータンス・ストレプトコッキィに分類される細菌のうち、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）が、齲蝕において特に重要な役割を有していると近年では認識されてきている。特に欧州においては、ストレプトコッカス・ソブリヌスの重要性がクローズアップされており、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの両者が口腔中に存在する場合、ストレプトコッカス・ミュータンス単独の場合よりもカリエスリスクが高いことを示す研究報告もある（Ｂａｂａａｈｍａｄｙ，Ｋ．Ｇ．ら，１９９８，Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．３２：５１−５８；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．及びＳ．Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９８７，Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｄｅｎｔ．Ｏｒａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１５：３３２−３３５；及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．及びＣ．Ｇ．Ｅｍｉｌｓｏｎ，１９９１，Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．２５：１４６−１５２）。しかしながら、齲蝕中のストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの分布並びに齲蝕に対する相対的重要性は未だ明らかにされていない。
日本においては、齲蝕臨床サンプル（齲窩、歯垢及び唾液）中から見出されるのはストレプトコッカス・ミュータンスが主であると言われてきたが、ストレプトコッカス・ソブリヌスが実際どの程度口腔内に存在しているのか、また、ストレプトコッカス・ソブリヌスがカリエスリスクにおいて真に重要であるのか否かが、現在、研究者の間で議論されている。
従来より、口腔の連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の選択培地としてミティス・サリバリウス寒天（Ｍｉｔｉｓ  Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ａｇａｒ；ＭＳ，Ｄｉｆｃｏ社製）が使われており、これにショ糖と抗生物質バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ）を添加したものをミュータンス・ストレプトコッキィの選択培地（ＭＳＢ培地）として使用している。しかしながら、ＭＳＢ培地は、ストレプトコッカス・ミュータンスに比べてストレプトコッカス・ソブリヌスの回収率が低いことが知られている。また、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスは、コロニー形状等が酷似しているため、これらのコロニー形態を熟知した研究者でなければ、同一平板培地上での肉眼による区別ができないのが現状である。
ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスのそれぞれを検出し、同定する幾つかの方法が報告されている。これらの方法は、これら２種の細菌を含む口腔連鎖球菌の中から、これら２種の細菌のみを実質的に選択できる培地によって分離し、次いで生化学的又は血清学的試験によって、これら２種の細菌を分別する（Ｇｏｌｄ，Ｏ．Ｇ．ら，１９７３，Ａｒｃｈｓ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．１８：１３５７−１３６４；Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｍ．ら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２７：６９７−６９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ｌ．及びＮ．Ｔｉｎａｎｏｆｆ，１９９１，Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７５−２７９；Ｌｉｎｋｅ，Ｈ．Ａ．Ｂ．，１９７７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：６０４−６０９；Ｓｃｈａｅｋｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｍ．ら，１９８６，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．６５：９０６−９０８；Ｔａｋａｄａ，Ｋ．ら，１９８４，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：４６４−４６９；及びＷａｄａ，Ｗ．Ｇ．ら，１９８６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：３１９−３２３）か、又はＤＮＡプローブ法によって分別する（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．ら，１９９６，Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９４−２９８；及びＳｈｉｒｏｚａ，Ｔ．ら，１９９８，Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１１−１６）ものである。また、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する幾つかの選択培地が報告されている（Ｇｏｌｄ，Ｏ．Ｇ．ら，１９７３，Ａｒｃｈｓ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．１８：１３５７−１３６４；Ｋｉｍｍｅｌ，Ｌ．及びＮ．Ｔｉｎａｎｏｆｆ，１９９１，Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７５−２７９；Ｌｉｎｋｅ，Ｈ．Ａ．Ｂ．，１９７７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：６０４−６０９；Ｓｃｈａｅｋｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｍ．ら，１９８６，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．６５：９０６−９０８；及びＷａｄａ，Ｗ．Ｇ．ら，１９８６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：３１９−３２３）が、現在までのところ、ストレプトコッカス・ソブリヌスのみを単離できる選択培養技術については報告されていない。さらに、ミュータンス・ストレプトコッキィの異なる血清型の間での抗生物質に対する感受性の差が報告されている（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｗ．Ａ．ら，１９７９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１５：４４０−４４３）が、ストレプトコッカス・ソブリヌスのみを選択することができる可能性のある抗生物質は見出されていない。
発明の開示
そこで、本発明は、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌の中からストレプトコッカス・ソブリヌスのみを選択的に単離するための方法及びストレプトコッカス・ソブリヌスを選択するための培地を開発することを課題とした。
上記課題を解決するために、本発明者らは、ミュータンス・ストレプトコッキィの間の細胞壁阻害剤に対する感受性に焦点を当て、種々の抗生物質に対する感受性を試験した結果、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとの間で、モノバクタム系抗生物質に対する感受性に差違が有ることを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌が増殖しうる培地にモノバクタム系抗生物質を添加することによって、実質的にストレプトコッカス・ソブリヌスのみを単離する方法及びミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌が増殖しうる培地にモノバクタム系抗生物質を添加したストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地を提供する。
本発明においては、口腔連鎖球菌のみが増殖しうる培地が、ミティス・サリバリウス寒天（Ｍｉｔｉｓ  Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ａｇａｒ；ＭＳ培地，Ｄｉｆｃｏ社製）であることが好ましい。
本発明においては、モノバクタム系抗生物質が、アズトレオナム（ＡＺＴ）又はカルモナム（ＣＲＭＮ）であることが好ましく、アズトレオナム（ＡＺＴ）であることが特に好ましい。なお、モノバクタム系抗生物質を、０．０５〜０．５ｇ／Ｌの濃度で含有することが好ましい。
本発明のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地は、ホスホマイシン及び／又はバシトラシンを含有することが好ましい。
さらに、本発明のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地は下記組成を有することが特に好ましい。
ミティス・サリバリウス培地            ９０ｇ／Ｌ
アズトレオナム            ０．０５〜０．５ｇ／Ｌ
ホスホマイシン            ０．０５〜０．５ｇ／Ｌ
バシトラシン                    ５〜５０単位／Ｌ
塩化ナトリウム                    ５〜４０ｇ／Ｌ
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法及び選択用培地は、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌が増殖しうる培地にモノバクタム系抗生物質を添加することを特徴とする。
本発明の背景には、ミュータンス・ストレプトコッキィに属する口腔連鎖球菌のうち、齲蝕の主な原因菌として注目されているストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスは、上述のように、コロニー形状等が極めて近似しているため、両者が混在する培地上でコロニー形態学的にこれらを識別するには極めて熟練を要するという事実が存在する。なお、ここで、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌス以外のミュータンス・ストレプトコッキィについては、それぞれコロニー形状等において特別な熟練を必要とせずに識別可能な特徴があるため、これらの菌が培地上で混在していたとしてもその分別は容易である。
上記背景に鑑み、本発明においては、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスを明確に分別することに焦点を絞り、種々の抗生物質に対するこれら２つの菌の感受性に有意な差が観察されるものを探索し、実質的にストレプトコッカス・ソブリヌスのみが増殖可能なストレプトコッカス・ソブリヌスの選択用培地を作製した。
ここで、本発明の研究において行った試験で用いた材料及び方法等の試験条件について説明する。
＜材料及び方法＞
細菌株
この研究で用いた全ての細菌株は下記表１に示すとおりである。
0004091912.tif 000002
0004091912.tif 000003
上記細菌株のうち、ＮＵＭ−Ｓｍｅ、ＮＵＭ−Ｓｍｆ、ＮＵＭ−Ｓｓｄ及びＮＵＭ−Ｓｓｇで示される株は臨床単離株であり、コロニー形態学的方法、生化学的方法及び血清学的方法の組み合わせによって同定した（Ｈａｍａｄａ，Ｓ，及びＨ．Ｄ．Ｓｌａｄｅ，１９８０，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ４４：３３１−３８４；Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｍ．ら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２７：６９７−６９９；及びＴａｋａｄａ，Ｋ．ら，１９８４，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：４６４．４６９）。
その他の細菌株のうち、ＡＴＣＣが付されている株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、ＮＣＴＣが付されている株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅから購入し、それ以外の株は、本発明者の所属する研究室に従来より保存されてきたものである。
上記全ての細菌株を、５％（ｖ／ｖ）ウマ血液を添加したブレイン・ハート・インフュージョン（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ；ＢＨＩブロス、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、デトロイト、ＭＩ）寒天プレート上で、３７℃で嫌気的に増殖及び維持した。
抗生物質感受性試験
感受性試験は、マイクロブロス希釈法によって行った。
ストレプトコッカス・ソブリヌスに対する選択培地の開発のために、ディスク感受性試験（ｄｉｓｋ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ；Ｓｅｎｓｉ−Ｄｉｓｃ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．社製、ＵＳＡ）によって抗生物質選択の予備研究を行い（データは示さない）、その結果に基づいて、本試験に用いる抗生物質を決定した。本試験に用いた抗生物質は以下のとおりである。
セファロリジン（ｃｅｐｈａｌｏｒｉｄｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製、ＭＯ、ＵＳＡ）
セファゾリン（ｃｅｆａｚｏｌｉｎｅ；和光純薬社製、東京、日本）
クロキサシリン（ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ；Ｓｉｇｍａ社製）
イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ；萬有製薬社製、東京、日本）
アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ；ＡＺＴ；ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．社製；ＯＨ、ＵＳＡ）
カルモナム（ｃａｒｕｍｏｎａｍ；ＣＡＭ；武田薬品工業社製、大阪、日本）
セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ；Ｓｉｇｍａ社製）
ベンジルペニシリン（和光純薬社製）
セフォキシチン（ｃｅｆｉｘｉｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ社製）
上記抗生物質を適当な溶液に溶解し、ＢＨＩブロスを含む９６ウエルマイクロタイタープレート中に連続的に２倍希釈となるように分注した。細菌をＢＨＩブロス中で予備培養し、抗生物質を含むウエル溶液中に接種し、細菌の最終濃度を１×１０４細胞／ウエルとした。このプレートを、３７℃で４８時間、嫌気的に培養した。ピペットを用いてウエルの培養液を混合した後、５５０ｎｍにおける各ウエルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｃｏｒｏｎａ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．社製、茨城、日本）で計測し、細菌増殖を測定した。細菌増殖が観察されない抗生物質濃度を最小阻止濃度（ＭＩＣ）と定義した。
細菌増殖のないウエルの培養液１０μｌをミティスサリバリウス寒天（ＭＳ培地；Ｄｉｆｃｏ社製）プレート上に接種し、３７℃で４８時間嫌気的に培養した。接種された細菌の回収率を計算し、増殖阻害機序が殺菌性であるか静菌性であるかを評価した。
結果
β−ラクタム系抗生物質に対するストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの感受性試験の結果を下記表２に示す。
0004091912.tif 000004
0004091912.tif 000005
表２の結果から、セファロリジン、セファゾリン及びセファレキシンについては、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとの間で有意な感受性の差は観察されなかった。
クロキサシリンについては、ストレプトコッカス・ミュータンスの方が約２倍クロキサシリンに感受性が高かった。
イミペネムについては、ストレプトコッカス・ミュータンスに比べてストレプトコッカス・ソブリヌスの方が約４〜８倍よりも感受性が高かった。
ベンジルペニシリンについては、クロキサシリンとは逆に、ストレプトコッカス・ソブリヌスの方が約２倍ベンジルペニシリンに感受性が高かった。
セフォキシチンについては、ストレプトコッカス・ソブリヌスのうち、ＯＭＺ１７６株のみが、他の細菌株に比べて約４倍感受性が高かったが、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとの間では有意な感受性の差は観察されなかった。
モノバクタム系抗生物質に分類されるアズトレオナム及びカルモナムについては、両抗生物質に対して、ストレプトコッカス・ミュータンスのＭＩＣがそれぞれ１２５μｇ／ｍＬであるのに対し、ストレプトコッカス・ソブリヌスのＭＩＣはそれぞれ２０００μｇ／ｍＬであり、ストレプトコッカス・ミュータンスは、ストレプトコッカス・ソブリヌスに比べて１６倍も感受性が高いことが明らかになった。これらの観察は、モノバクタム系抗生物質が、ストレプトコッカス・ミュータンスからストレプトコッカス・ソブリヌスを分離するのに有効な試薬であることを示している。
イミペナム、アズトレオナム及びカルモナムは、大腸菌に対してはペニシリン結合タンパク質−３（ＰＢＰ−３）を標的としていることが報告されているが（Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏｕ，Ｎ．Ｈ．ら，１９８２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２１：９５０−９５６；及びＩｍａｄａ，Ａ．ら，１９８５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２７：８２１−８２７）、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスに対してはイミペナムとモノバクタム系抗生物質とは同じ作用様式を示さなかった。
なお、アズトレオナム及びカルモナムの両者は、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスに対して殺菌性の作用様式を有していた。
上記抗生物質感受性試験では、ストレプトコッカス・ミュータンスについては血清型ｃの２種の細菌株のみ、そしてストレプトコッカス・ソブリヌスについては血清型ｄの２種の細菌株のみを用いたが、さらに種々の血清型の細菌株のモノバクタム系抗生物質に対する感受性を検討した。結果を下記表３に示す。
0004091912.tif 000006
0004091912.tif 000007
表３の結果から、ストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｃ及びｅの細菌株は、表２の結果と同様の１２５μｇ／ｍＬのＭＩＣを有していた。ストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｆの細菌株は、２５０μｇ／ｍＬのＭＩＣを有し、血清型ｃ及びｅ株に比べてアズトレオナム及びカルモナムに対する感受性が低かった。
ストレプトコッカス・ソブリヌスの血清型ｄ及びｇの細菌株は、血清型ｇのＯＭＺ６５株のカルモナムに対するＭＩＣが１０００μｇ／ｍＬであり他の細菌株に比べて２倍感受性が高かった以外は、表２の結果と同様のＭＩＣを有していた。
なお、アズトレオナム及びカルモナムの両者は、表３に示す細菌株についてもストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスに対して殺菌性の作用様式を有していた。
表２及び３の結果から、ストレプトコッカス・ソブリヌスのモノバクタム系抗生物質に対する感受性はストレプトコッカス・ミュータンスと比べて有意に低いことが明らかになった、従って、ストレプトコッカス・ミュータンスが増殖できない濃度のモノバクタム系抗生物質を含有する培地上でも、ストレプトコッカス・ソブリヌスは増殖可能であり、ストレプトコッカス・ソブリヌスのみを選択的に増殖させることができることがわかる。すなわち、本発明者らは、モノバクタム系抗生物質を用いれば、ストレプトコッカス・ソブリヌスのみを選択的に単離することができることを見出した。
実施例
次に、実施例によって本発明を具体的に説明する。上記の発見に基づき、本発明者らはストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地を試作し、評価した。
選択用培地の作製
下記表４に示す組成のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地（以下、この培地をＭＳ−ＳＯＢ培地と称する。）を作製した。
0004091912.tif 000008
表４中のミティス・サリバリウス培地（ＭＳ培地）はＤｉｆｃｏ社製であり、ミュータンス・ストレプトコッキィだけでなく他の連鎖球菌の単離のために一般に使用されているものであり、以下の組成からなっている。
0004091912.tif 000009
しかしながら、本発明のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地のベースとなる培地はＭＳ培地に限定されず、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌のみが増殖できる培地であればよい。
ＭＳ−ＳＯＢ培地では、モノバクタム系抗生物質としてアズトレオナムを使用しているが、本発明はこれに限定されず、モノバクタム系に分類される抗生物質、例えば、カルモナムであってもよい。さらに、現在日本において市販されているモノバクタム系抗生物質はアズトレオナムとカルモナムの２種のみであるが、本発明はこれら２種に限定されない。モノバクタム系抗生物質の添加濃度は、上記表２及び３の結果から、ストレプトコッカス・ソブリヌスのみが増殖可能で、且つ、他のミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌の増殖を有意に抑制できる範囲で設定する。モノバクタム系抗生物質の濃度は、通常０．０５〜０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．２ｇ／Ｌである。
ホスホマイシン及びバシトラシンはＳｉｇｍａ社から購入したものを使用した。ホスホマイシン及びバシトラシンの作用機序は、それぞれ、ピルビン酸Ｎ−アセチルグルコサミン−３−ｏ−エノールトランスフェラーゼ、及び膜リン脂質への結合によるピロホスファターゼの阻害、すなわち、細胞壁ペプチドグリカンの合成をブロックすることである。モノバクタム系抗生物質とは異なる作用様式を有するホスホマイシン及びバシトラシンを組み合わせて用いることで、相乗効果を示すことを期待した。しかしながら、本発明でモノバクタム系抗生物質以外に培地に添加する抗生物質等の試薬は、ホスホマイシン及びバシトラシンに限定されない。ホスホマイシンは０．０５〜０．５ｇ／Ｌの濃度で、バシトラシンは５〜５０単位／Ｌの濃度で用いるのが好ましい。
塩化ナトリウムは、浸透圧の調整等の目的で添加され、その培地中での濃度は、他の成分の種類、濃度等との関係に基づいて適宜決定されるが、５〜４０ｇ／Ｌが好ましい。
本発明のストレプトコッカス・ソブリヌス選択用培地は、上記表４の構成成分以外に、よりストレプトコッカス・ソブリヌスの選択性を増加させることができる添加成分を加えることができる。
ＭＳ培地に塩化ナトリウムを添加したものを滅菌し、５０℃まで冷却した後に上記３種類の抗生物質を添加することによりＭＳ−ＳＯＢ培地を調製した。
ストレプトコッカス・ソブリヌスの選択性能評価試験
ＭＳ−ＳＯＢ培地及びミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌が増殖できる培地としてＭＳ培地を用いて、ストレプトコッカス・ソブリヌスの回収率を求め、ＭＳ−ＳＯＢのストレプトコッカス・ソブリヌスの選択性能を評価した。
下記表５に示す細菌株をＢＨＩブロス中、３７℃で一晩、細菌を予め嫌気的に培養した。０．９ｍｌのトリス−塩酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ７．２）で培養液の１０倍希釈物を作製し、０．１ｍｌをプレーティングし、試験培地（ＭＳ−ＳＯＢ及びＭＳ）上に播いた。プレートを３７℃で３日間嫌気的に培養し、コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）を計数した。結果を下記表５に示す。
0004091912.tif 000010
0004091912.tif 000011
上記表５から明らかなように、試験に用いた全ての細菌株がＭＳ培地上で１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍＬで良好に増殖した。これに対しＭＳ−ＳＯＢ培地上で増殖できる細菌株は、血清型ａのうちストレプトコッカス・クリセタスＯＭＺ−６１株（回収率：１３．５％）、血清型ｄ及びｇのストレプトコッカス・ソブリヌスの全細菌株（回収率：平均で７４．１％）、血清型ｈのストレプトコッカス・ダウネイＮＣＴＣ１１３９１株（回収率：６０．２％）、並びにストレプトコッカス・アンギノーサスＡＴＣＣ９８９５株（回収率：０．００２５％）及びＮＣＴＣ１０７０９株（回収率：０．０００３％）のみに限定された。
ＭＳ−ＳＯＢ培地上で増殖できるミュータンス・ストレプトコッキィの内、血清型ａのストレプトコッカス・クリセタスＯＭＺ−６１株は、ヒトの口腔から検出されることは稀な細菌株であり、血清型ｈのストレプトコッカス・ダウネイＮＣＴＣ１１３９１株は６０．２％という高い回収率であるが、この細菌株は今までヒトの口腔から検出されたことはない。さらに、これらの細菌株はコロニー形態学的にストレプトコッカス・ソブリヌスと区別することができる。それ故、これらの細菌株をストレプトコッカス・ソブリヌスと混同することはまず無い。
口腔連鎖球菌であるストレプトコッカス・アンギノーサスＡＴＣＣ９８９５株及びＮＣＴＣ１０７０９株は、極めて低い回収率であり、またコロニー形態学的にストレプトコッカス・ソブリヌスとはかなり異なった特徴を有しており、たとえ培地上でストレプトコッカス・ソブリヌスと混在していたとしてもこれらの間の識別はコロニー形態学に精通していなくとも確実に行える。
試験したミュータンス・ストレプトコッキィの内、ストレプトコッカス・ソブリヌスとコロニー形態学的区別が極めて難しいストレプトコッカス・ミュータンスは、ＭＳ−ＳＯＢ培地上では全く増殖できないので、この培地上でのストレプトコッカス・ソブリヌスとの混同を招くことは無い。
上記のことから、ＭＳ−ＳＯＢ培地を用いれば、ストレプトコッカス・ソブリヌスを選択的に単離することが可能であることがわかる。
臨床サンプルを用いたＭＳ−ＳＯＢ培地の選択性の確認
ヒト口腔の齲蝕部位から得た臨床サンプルについてＭＳ−ＳＯＢ培地の選択性を確認した。
齲蝕部位のサンプリングエリアをコットンロールでぬぐい、短時間の空気の衝風を当てて唾液を除去した後、齲蝕部位から滅菌した歯科用探針でサンプル材料を取り出した。各サンプルを５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．２）１ｍｌを含む滅菌マイクロ遠心チューブ中に入れた。超音波分散後、同じバッファーで各サンプルの１０倍段階希釈溶液を調製し、適当な希釈溶液をＭＳ平板培地及びＭＳ−ＳＯＢ平板培地上に３枚づつ塗布した。この平板培地を３７℃で３日間嫌気的に培養した後、回収率（ＣＦＵ％）を計算した。ＭＳ平板培地上に平均１×１０６〜１０８の総細菌数を含むサンプルを臨床分析用に用いた。
そのコロニー形態学に基づいてストレプトコッカス・ソブリヌスであると思われる、被験者当たり５個のコロニーを継代培養してストレプトコッカス・ソブリヌスの存在を確認した。
各分離株の純粋な培養株を、１）コロニー形態学；２）それらのラピッドＩＤ  ３２  ＳＴＲＥＰ（ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）又はストレプトグラム（Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍ；和光純薬社製）を用いるそれらの発酵パターン；及び３）上記の我々の研究室で調製された対照株に対して調製されたウサギ抗血清を用いる寒天ゲル免疫拡散試験（Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｍ．ら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２７：６９７−６９９；及びＩｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．ら，１９９６，Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９４−２９８）によって同定した。
存在するストレプトコッカス・ソブリヌスの数に基づいて、臨床サンプルを、全連鎖球菌中のストレプトコッカス・ソブリヌスのが１％未満のグループＩと１％以上グループＩＩの２つに分けた。全てのサンプルは、ＭＳ平板培地上に平均連鎖球菌数１０６〜１０７個を含んでいた。
上記臨床サンプルを用いて、ストレプトコッカス・ソブリヌスの回収率を計算した。結果を下記表６に示す。
0004091912.tif 000012
上記表６の結果から明らかなように、、グループＩの場合、ストレプトコッカス・ソブリヌスは、混み合ったＭＳ平板培地上で検出できなかった。一方、ＭＳ−ＳＯＢ培地では、総細菌数１０６〜１０７個の細菌中に存在する、１％未満のストレプトコッカス・ソブリヌスであっても検出できた。、ＭＳ−ＳＯＢ培地を用いると、ストレプトコッカス・ソブリヌス以外の細菌は、ほとんど完全に阻害された。ＭＳ−ＳＯＢ培地上で増殖するこれらのストレプトコッカス・ソブリヌス以外の細菌は、通常、わずかな又はピンポイントコロニーを形成した。
グループＩＩのサンプルでは、ＭＳ−ＳＯＢ培地上に純粋なストレプトコッカス・ソブリヌス菌株が得られ、他の細菌（汚染細菌）は、ＭＳ−ＳＯＢ平板培地上で増殖しなかった。ＭＳ培地上では、ほぼ同量のストレプトコッカス・ソブリヌスとその他の細菌が共存していた。グループＩＩのＭＳ平板培地上の他の細菌によって汚染されたものからストレプトコッカス・ソブリヌスを見出すのはやはり困難であった。
上記表６の結果から、ＭＳ−ＳＯＢ培地によって、臨床齲蝕サンプルからストレプトコッカス・ソブリヌスを選択的に単離することが可能であることがわかる。
臨床齲蝕サンプルのＭＳ−ＳＯＢ培地による細菌増殖の検討
６０個のヒト臨床齲蝕試料をＭＳ−ＳＯＢ培地で培養した結果を下記表７に示す。なお、これら６０個のサンプルはいずれもＭＳ平板培地上で測定したところ、平均１×１０７個の細菌を含有していた。
0004091912.tif 000013
６０個のサンプルのうち、１４個でストレプトコッカス・ソブリヌスのみの増殖を示し、２３個のサンプルでは、いずれの細菌の増殖も観察されなかった。
４個のサンプルで他の細菌（汚染細菌）のわずかなコロニー（コロニー数：最大７０個）を伴って、主としてストレプトコッカス・ソブリヌスの増殖が観察された。これらの他の細菌は、コロニー形態学的にストレプトコッカス・ソブリヌスと識別可能であった。
１９個のサンプルで他の細菌のみの増殖が観察されたが、これらは多くても５×１０２ＣＦＵ／ｍＬ未満のコロニー数であった。これらの他の細菌は、当然ながら、コロニー形態学的にストレプトコッカス・ソブリヌスと識別可能であった。
産業上の利用可能性
本発明によって、実質的にストレプトコッカス・ソブリヌスのみを選択的に単離する方法及びストレプトコッカス・ソブリヌスの選択用培地が提供された。
本発明によれば、コロニー形態学的に互いに酷似しており、その識別に熟練を要するストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスのコロニー形態学的分別の必要がなく、これらの細菌種の間での混同を生じることが無い。また、その他のミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌とストレプトコッカス・ソブリヌスとの混同を生じることも無い。
本発明の選択用培地を用いれば、ミュータンス・ストレプトコッキィを含む口腔連鎖球菌の中からストレプトコッカス・ソブリヌスのみを選択的に単離・培養することができ、これにより、臨床齲蝕サンプル中のストレプトコッカス・ソブリヌスの正確な存在状況を明らかにすることができる。
ストレプトコッカス・ソブリヌスの存在状況を正確に把握することができれば、当業界で現在議論されているストレプトコッカス・ソブリヌスのカリエスリスクに対する重要性、役割を明確にすることが可能となる。
また、将来的にはストレプトコッカス・ソブリヌスの口腔内分布を検査することにより、患者のカリエスリスクの診断に利用することができるであろう。