(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から標的物質を精製する方法であって、
(a) 標的物質を固相上に吸着させる工程、ここで、標的物質の固相への結合が高親和性結合対の第１結合相手と第２結合相手との相互作用を含むものであり、前記結合対の第１結合相手は標的物質に直接的または間接的に結合し、前記結合対の第２結合相手は固相に結合するものである、
(b) 吸着されなかった試料成分を固相から分離する工程、
(c) 固相を遊離状態の前記結合対の第１結合相手またはその類似体と接触させることにより、固相から標的物質を吸着させる工程、ならびに
(d) 標的物質を固相から分離する工程
を含む、上記方法。
【請求項２】
試料から標的物質を精製する方法であって、
(a) 固定化された反応物R1を有する固相を準備する工程、ここで、R1は標的物質に特異的に結合することができる少なくとも一つの基および高親和性結合対の第１結合相手を含む少なくとも一つの基を含有し、そしてR1の固相への結合は高親和性結合対の第２結合相手を含む基を含有する固定化された反応物R2によって生じるものであり、
(b) 試料を固相と接触させることにより、R1への結合を介して固相上への標的物質の吸着を生じさせる工程、
(c) 吸着されなかった試料成分を固相から分離する工程、
(d) 固相を遊離形態の前記結合対の第１結合相手またはその類似体と接触させることにより、固相からR1との複合体として標的物質を脱離させる工程、ならびに
(e) 複合体を固相から分離する工程
を含む、上記方法。
【請求項３】
高親和性結合対の第１結合相手が結合している標的物質を試料から精製する方法であって、
(a) 高親和性結合対の固定化された第２結合相手を含有する固相を準備する工程、
(b) 試料を固相と接触させることにより、前記結合対の第１結合相手と第２結合相手との結合によって標的物質を固相上に吸着させる工程、
(c) 吸着されなかった試料成分を固相から分離する工程、
(d) 固相を遊離形態の前記結合対の第１結合相手またはその類似体と接触させることにより、固相から標的物質を脱離させる工程、ならびに
(e) 標的物質を固相から分離する工程
を含む、上記方法。
【請求項４】
精製される物質が、細胞、細胞画分、細胞オルガネラ、ウイルス粒子、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、核酸、ホルモン、代謝産物、神経伝達物質および仲介物質から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
精製される物質がポリペプチドおよび核酸から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
粒子状固相を使用する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
精製する物質に特異的に結合することができるR1の基が抗体および核酸から選択される、請求項２および４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
結合対の第１結合相手と第２結合相手との親和定数が106 l/mol 〜1010 l/molの範囲になるように結合対の結合相手を選択する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
結合対の第１結合相手としてハプテン基を使用し、かつ結合対の第２結合相手としてこのハプテン基に特異的な抗体を使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ハプテンがジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール、甲状腺ホルモン、ルテニウム若しくはロジウム-(ビスピリジル)3錯体、テオフィリン、バルビツル酸またはジフェニルヒダントインから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結合対の第１結合相手として糖を使用し、結合対の第２結合相手としてレクチンを使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第１結合相手としてマンノース基を含有する糖を使用し、第２結合相手としてコンカナバリンＡを使用する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
結合対の第１結合相手として低分子受容体リガンドを使用し、結合対の第２結合相手として生物学的受容体を使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
結合対の第１結合相手としてペプチドエピトープを使用し、結合対の第２結合相手として該ペプチドエピトープに対して特異的な抗体を使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
固相からの脱離が生理的条件下で実施される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
脱離のため、結合対の遊離第１結合相手が、結合対の結合した第１結合相手に対してモル過剰で使用される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
脱離のため、結合対の遊離第１結合相手が、担体分子およびこれに結合している第１結合相手のいくつかの分子を含む結合体の形態で使用される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
脱離のため、結合対の遊離第１結合相手として結合対の結合した第１結合相手の類似体を使用し、該遊離の類似体が、結合対の結合した第１結合相手よりも結合対の第２結合相手に対して高い結合親和性を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
精製される物質の反応物R1との複合体からの放出をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
反応物R1が結合対の第１結合相手と異なる検出基を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
組換えにより製造したポリペプチドの精製のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２２】
結合対の第１結合相手に特異的に結合することができる第１ドメインおよび第２の所望の標的ドメインを含む融合タンパク質が製造される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
第１および第２ドメインの間にプロテアーゼ切断部位を導入し、脱離後に融合ポリペプチドをタンパク質分解によって切断する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
試料から標的物質を精製するための試薬キットであって、
(a) 固相、
(b) 精製する物質に特異的に結合することができる１以上の基および高親和性結合対の第１結合相手を含む１以上の基を含有する反応物R1、
(c) 高親和性結合対の第２結合相手を含む基を含有する反応物R2であって、R2が固相に結合しているか、または固相に結合することができる基を含有しているもの、
(d) 遊離形態の結合対の第１結合相手またはその類似体
を含む、上記試薬キット。
【請求項２５】
試料から標的物質を精製するための試薬キットであって
(a)  固相、
(bi) 標的物質への導入に適した形態の高親和性結合対の第１結合相手 、
(bii)結合対の第１結合相手を標的物質に導入するための手段、
(c)  固相に結合した結合対の第２結合相手、および
(d) 遊離形態の結合対の第１結合相手またはその類似体
を含む、上記試薬キット。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法における、請求項２４または２５に記載の試薬キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、高親和性結合対によって標的物質を固相上に固定化し、その後遊離形態の結合対の結合相手の添加によってこれを溶離させることによる、生物学的試料からの標的物質の調製的精製に関する。その上、この方法を実施するための試薬キットも開示される。
【０００２】
生物学的物質、例えばタンパク質などの巨大分子の免疫吸着精製は血清、尿または細胞溶解物などの複合した生物学的材料からこうした物質を効率的に単離することができるものとして、長い間知られている方法である（Eveleigh and Levy,J.Solid-phase Biochem.2(1977),45-78；Cooper,"Biochemische Arbeitsmethoden",pp.222-241(1981),Walter de Gruyter,Berlin；Pharmacia Fine Chemicals,Affinity Chromatography:Principles and Methods(1983),pp 92-95；Wawrazynczak and Cumber,in:Immunochemical Protocols,M.M.Manson ed.Methods in Molecular Biology 10,chapter 32(1992),Humana Press,Totowa,N.J.USA）。固定化された抗体に結合した物質の脱離は通常は非特異的な方法、例えば低い（＜2.5）若しく は高い（＞10）pH値の緩衝液、尿素若しくは塩酸グアニジンなどのカオトロピック試薬、有機溶媒または界面活性剤の溶離緩衝液への添加によって達成される。
【０００３】
いくつかの事例においては、例えばハプテン類似体との置換によるハプテンの単離、または低分子ペプチドとの置換によるタンパク質の単離のための、特異的な脱離方法も記載されている。しかし、これらは非常に限定された数の物質のみについて実施することができるものなので、こうした特異的な脱離プロセスは免疫吸着プロセスにおける例外である。したがって、上記の非特異的脱離方法が主として使用され、特に例えば 1 M プロピオン酸によるなどの低pHでの溶離が使 用される。
【０００４】
しかし、生物学的材料からの免疫吸着精製方法においては、存在する生体分子、例えばいくつかの事例ではタンパク質も、免疫吸着剤に相当程度まで非特異的に、すなわち抗体-抗原相互作用を経由しないで結合することが示された。 脱離が例えば酸性緩衝液を使用する非特異的なものの場合、これらの物質もまた免疫吸着剤から溶離し、所望の物質以外に不純物として存在する。これは、精製する物質が非常に低濃度でしか存在しない場合に特に不利である。なぜならば、これは免疫吸着剤から溶離される全体の材料のわずかな比率にしか相当せず、所望の物質を十分な純度で得るためには、存在し得るごく少量の物質で可能である場合、さらに手間のかかる精製工程が必要となる。
【０００５】
例えば、前立腺特異的抗原（PSA）はヒト血清中に約1〜1500 ng/mlの濃度で存在し、一方ヒト血清アルブミン（HSA）などのその他のタンパク質は約70 mg/ml という105〜107倍の高濃度で存在する。これらのタンパク質は免疫吸着剤に非特異的に結合するので、非常に低濃度で存在するPSAなどの物質を免疫吸着によって精製する場合は、所望の物質が非特異的脱離の結果として溶離した全タンパク質のごく少ない割合でしか存在せず、また例えば溶離液のゲル電気泳動分離において全く同定できないこともある（例えば図２参照）。この場合、そのタンパク質の特性付けは、混入タンパク質の存在により、例えばプロテアーゼ消化後においては不可能であるかまたはに多大な困難を伴わないと可能でない。その他の分析方法、例えば質量分析などにおいても同様の問題が発生する。なぜならば、この場合も、特に試験されるタンパク質の正確な質量が未知の場合には特に多くの混入タンパク質によって分析が非常に困難であるかまたは不可能であるからである。もっとも、MALDI-TOF質量分析および免疫吸着の組合せが記載されており、ここでは免疫吸着によって結合した材料が酸性MALDIマトリックス（トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに溶解したケイ皮酸誘導体）によって溶離され、直接測定されている（Nelsonら、Anal.Chem.67(1995),1153-1158）。しかし、精製する物質が非常に低濃度でしか存在しない場合は、多数のその他のタンパク質が生じ、それらのどれかが所望の標的物質よりも相当高いシグナルを出すことは明らかである（Kroneら、Mass Spectrometric Immunoassay,Poster Session ABRF'96:Biomolecular Techniques(1996),San Francisco,USA、から引用した図１参照）。
【０００６】
したがって、本発明の課題は、先行技術の欠点が少なくとも部分的に解消された、生物学的試料から物質を精製するための一般的に適用し得る方法を見出すことであった。特に、その方法は非特異的脱離の欠点を回避し、特異的免疫吸着の利点を利用すべきである。特に本発明の方法は、極端なpH値による免疫反応性または／および生物学的活性の消失に関係する標的物質への損傷を回避するために、本質的に中性pH範囲での溶離を可能にすべきものである。
【０００７】
本発明の課題は、試料から標的物質を精製する方法であって、
(a) 標的物質を固相上に吸着させる工程、ここで、標的物質の固相への結合が高親和性結合対の第１結合相手と第２結合相手との相互作用を含むものであり、前記結合対の第１結合相手は標的物質に直接的または間接的に結合し、前記結合対の第２結合相手は固相に結合するものである、
(b) 吸着されなかった試料成分を固相から分離する工程、
(c) 固相を遊離状態の前記結合対の第１結合相手またはその類似体と接触させることにより、固相から標的物質を吸着させる工程、ならびに
(d) 標的物質を固相から分離する工程
を含む、上記方法によって達成される。
【０００８】
本発明の第１の好ましい実施形態は、試料から標的物質を精製する方法であって、
(a) 固定化された反応物R1を有する固相を準備する工程、ここで、R1は標的物質に特異的に結合することができる少なくとも一つの基および高親和性結合対の第１結合相手を含む少なくとも一つの基を含有し、そしてR1の固相への結合は高親和性結合対の第２結合相手を含む基を含有する固定化された反応物R2によって生じるものであり、
(b) 試料を固相と接触させることにより、R1への結合を介して固相上への標的物質の吸着を生じさせる工程、
(c) 吸着されなかった試料成分を固相から分離する工程、
(d) 固相を遊離形態の前記結合対の第１結合相手またはその類似体と接触させることにより、固相からR1との複合体として標的物質を脱離させる工程、ならびに
(e) 複合体を固相から分離する工程
を含む、上記方法である。
【０００９】
本発明の方法のこの実施形態においては、精製される標的物質に特異的に結合することができ、そして高親和性結合対の第１結合相手と結合する反応物R1、例えばハプテンが使用される。さらに、この第１結合相手に特異的に結合することができ、そして結合対の第２結合相手を含有する反応物R2、例えば抗ハプテン抗体が使用され、これは反応物R1が遊離形態の第１結合相手またはその誘導体によって効率的に置換され得るような第１結合相手に対する親和性を有する。遊離の第１結合相手による溶離によって、反応物R1および検出される物質を含んでなる複合体を固相からきわめて特異的に、非特異的に吸着された不純物を含まないように溶離することができる。一例としてヒト血清からのPSAおよびPSA/ACT複合体の単離を使用して、この精製方法の原理および結果ならびに非特異的酸性溶離との比較を図２に示す。
【００１０】
その存在がそれ以後の分析またはこの物質の使用を妨害しない第１結合相手を用意することができる場合、本発明の精製原理を用いて物質を直接単離することもできる。この例を、二重標識DNAおよび融合タンパク質の単離について示す。
【００１１】
したがって、本発明の第２の好ましい実施形態は、高親和性結合対の第１結合相手が結合している標的物質を試料から精製する方法であって、
(a) 高親和性結合対の固定化された第２結合相手を含有する固相を準備する工程、
(b) 試料を固相と接触させることにより、前記結合対の第１結合相手と第２結合相手との結合によって標的物質を固相上に吸着させる工程、
(c) 吸着されなかった試料成分を固相から分離する工程、
(d) 固相を遊離形態の前記結合対の第１結合相手またはその類似体と接触させることにより、固相から標的物質を脱離させる工程、ならびに
(e) 標的物質を固相から分離する工程
を含む、上記方法に関する。
【００１２】
生物学的試料から物質を精製するために固相からハプテン／抗ハプテン免疫複合体を特異的に脱離させるという原理は以前には知られていなかった。Ishikawa（欧州特許出願No.88 112 927.4）は、ポリスチレン粒子上に固定化された抗ジニトロフェニル(DNP)−抗体／DNP標識抗分析物抗体／分析物／抗分析物抗体−酵素結合体(conjugate)の複合体をジニトロフェニルの添加によって放出させる、定量イムノアッセイについて実際に記載している。放出された免疫複合体を、ハプテン化した抗体に対して特異的な受容体を含有する第２のポリスチレン粒子に結合させ、酵素活性によって定量的に測定する。Ishikawaによって記載された方法とは対照的に、本発明は測定媒体中に存在する標識試薬の除去を目的とするのではなく、精製される物質に加えて生物学的試料中に非常に大過剰に存在する随伴物質を標的とする。したがって、これらの随伴する物質の選択的除去のためにIshikawaによって記載された脱離工程を使用できるか否かは、以前には予見することができなかった。本発明の方法においては、免疫吸着剤から脱離した物質の直接の分析が好ましく、Ishikawaによって記載されたような別の固相への特異的結合を含むその後の精製工程がないので、これは特に正当である。驚くべきことに、効率的な精製のためにはこうしたさらなる結合は必ずしも必要ではなく、むしろ第１の固相から特異的に溶離した溶液中では随伴する物質のすぐれた分離がすでに観察されることが見出された。
【００１３】
本発明の方法は、動物由来の体液、例えば全血、血漿、血清、尿、唾液その他、または植物組織、土壌試料若しくは細胞抽出物などの複合生物学的試料から、あるいは分子生物学的反応混合物から、物質、特に生物学的分子であって、主として非常に低濃度で存在する物質を精製しなければならない場合のすべての精製課題に対して使用することができる。精製される物質は最も広い意味での生体分子、すなわち生物学的試料中に存在する成分である。こうした物質の例は細胞、細胞画分、細胞オルガネラ、ウイルス粒子、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、核酸、ホルモン、代謝産物、神経伝達物質およびメディエーターである。精製される物質の好ましい例はポリペプチドおよびDNA若しくはRNAなどの核酸である。
【００１４】
本発明の第１の好ましい実施形態によれば、高親和性結合対の第１結合相手に結合させる必要がない標的物質が精製される。本発明の方法のこの実施形態は、生物学的試料中に天然に存在する非修飾標的物質の精製に特に適している。本発明の第２の好ましい実施形態によれば、高親和性結合対の第１結合相手にすでに結合されている標的物質が精製される。本方法のこの実施形態は、分子生物学的反応混合物からの、対応する基で修飾されている標的物質、例えば増幅混合物からのハプテン修飾核酸の精製、または組換えポリペプチドの精製に特に適している。
【００１５】
本発明の方法において使用する固相は従来技術で知られているどんな支持材料をも含むことができる。磁性微粒子などの粒状固相が好ましい。
【００１６】
第１の実施形態で使用される反応物R1は、好ましくは精製される物質に特異的に結合することができる少なくとも一つの基ならびに高親和性結合対の第１結合相手を含む少なくとも一つの基を含む結合体である。R１は好ましくは第１結合対の基１個のみを含有する。特異的に結合することができる基は、検出すべき物質のタイプに応じて、その物質に対して特異的な抗体、検出すべき物質に相補的な核酸、レクチンまたは検出すべき物質に特異的に結合する生物学的受容体であり得る。特異的に結合することができる基は好ましくは抗体（この用語には抗体フラグメント若しくは抗体誘導体も含まれる）または核酸（この場合、この用語にはペプチド核酸などの核酸類似体もまた含まれる）である。
【００１７】
本発明の方法の本質的な特徴は、遊離または可溶性形態の結合対の第１結合相手またはその類似体と固相を接触させることによって、固相に結合した標的物質を溶離させ得るということである。結合対の結合相手は、好ましくは溶離を生理学的pH条件下、例えば５〜８のpH範囲で行うことができるように選択される。さらに、結合対の結合相手は、高親和性結合が達成されるように、結合対の第１結合相手と第２結合相手との親和定数が106 l/mol〜1010 l/molの範囲になるように選択することが好ましい。遊離形態の第１結合相手により良好に置換させるために、第１結合相手と第２結合相手の結合は適度な可逆性を有するべきである。
【００１８】
結合対の第１結合相手として、好ましくは4 kDまで、そして特に好ましくは2kDまでの最大分子量を有する低分子物質を使用するのが好ましい。この例の１つとしてハプテン基があり、この場合、結合対の第２結合相手としてハプテン基に対して特異的な抗体が使用される。好適なハプテンの例は生物中に免疫応答を生じさせて特異的な抗ハプテン抗体の産生を導くことができる分子である。ハプテンの特定の例は、プロゲステロン若しくはその合成誘導体などのステロイド類、ジゴキシン若しくはジゴキシゲニンなどのカルデノリド類、フルオレセイン若しくはその誘導体などの蛍光染料、甲状腺ホルモン、例えばT3若しくはT4などのホルモン、バルビツル酸若しくはテオフィリンなどの薬物、金属錯体、特にルテニウム若しくはロジウム-(ビスピリジル)3錯体などの電気化学発光金属錯体、またはジニトロフェノール若しくはジフェニルヒダントインなどのその他の化合物である。ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール、甲状腺ホルモン、ルテニウム若しくはロジウム錯体、テオフィリン、バルビツル酸またはジフェニルヒダントインなどの非常に特異的な抗体がすでに存在する物質が特に好ましい。
【００１９】
さらに、糖、特に単糖若しくはオリゴ糖を結合対の第１反応物として使用し、レクチンを結合対の第２結合相手として使用することができる。この例として、マンノース基を含有する糖を結合対の第１結合相手として使用し、コンカナバリンＡを第２結合相手として使用することができる。
【００２０】
さらに、結合対の第１結合相手として低分子受容体リガンドを使用し、そして結合対の第２結合相手として生物学的受容体を使用することもできる。こうした結合対の例はアセチルコリン／アセチルコリン受容体またはヒスタミン／ヒスタミン受容体である。
【００２１】
さらに別の好ましい実施形態においては、結合対の第１結合相手としてペプチドエピトープが使用され、そして結合対の第２結合相手としてそのペプチドエピトープに対して特異的な抗体が使用される。
【００２２】
一方、結合対の第１結合相手を形成するペプチドエピトープは、ハプテン、糖若しくは受容体リガンドのように、活性化誘導体、例えば活性エステルの形態で結合することによって、反応物R1若しくは標的物質に結合させることができる。反応物R１若しくは標的物質が核酸の場合、第１結合相手は、酵素反応によって、例えば標識プライマー、標識オリゴヌクレオチド構築ブロックを使用することによって、または／および標識核酸断片を付着させることによって導入することもできる。反応物R1若しくは標的物質がペプチド若しくポリペプチドの場合、結合対の第１結合相手としてペプチドエピトープをR1若しくは標的物質中に遺伝子操作によって導入することもできる。
【００２３】
遊離若しくは可溶性形態の結合対の第１結合相手若しくはその類似体と固相を接触させることによって、標的物質またはR1および標的物質を含んでなる複合体が固相から溶離される。結合対の遊離の第１結合相手を、R1に結合した結合対の第１結合相手に対してモル過剰にて使用する場合、可能な限り定量的な溶離を行うことができる。このモル過剰量は、好ましくは少なくとも50倍、特に好ましくは100〜500倍の範囲である。
【００２４】
さらに、担体分子およびこれに結合された結合対の第１結合相手であるいくつかの分子を含む結合体の形態にある遊離の結合対の第１結合相手を使用することによって、固相からの溶離を改良することができる。好適な担体分子の例はポリリシン、アルブミン、非特異的抗体その他などのポリペプチドまたはデキストリンなどの多糖である。結合対の第１結合相手のいくつかの分子は、既知の方法、例えば第１結合相手の活性化誘導体を使用して、この担体分子に結合させることができる。こうした結合体の例はポリリシン-ジゴキシゲニン、ウシ 血清アルブミン-ジゴキシゲニンその他などのポリハプテニル化担体分子である。
【００２５】
固相からの溶離を改良する別の方法は、結合対の遊離の第１結合相手として、R1に結合した結合対の第１結合相手の類似体であって、この遊離の類似体が結合対の第２の結合相手に対して、R1若しくは標的物質に結合した結合対の第１結合相手よりも高い結合親和性を有するものを使用することである。したがって、結合対の第１結合相手がハプテンの場合、この類似体として、結合対の第２結合相手が結合したハプテンに対するよりも高い親和性を有する修飾ハプテンを使用することができる。例えば、結合したハプテン基としてジゴキシゲニン、結合相手として抗ジゴキシン抗体、そして遊離結合相手としてジゴキシンを使用することができる。同様の例は、結合したハプテンとしてニトロフェノール、抗ジニトロフェノール抗体および遊離ハプテンとしてジニトロフエノールの使用、結合したハプテンとしてT3、抗T4抗体および遊離のT4の使用、あるいは結合したハプテンとしてロジウム(ビスピリジル)3錯体、抗ロジウム(ビスピリジル)3錯体抗体および遊離のハプテンとしてロジウム(ビスピリジル)3錯体の使用である。
【００２６】
遊離のおよび結合した結合相手として同一の基を使用するが、それぞれが異なるリンカーを有している場合にも、溶離を改善することができる。よって、基ハプテン-リンカー１をハプテン-リンカー２に対して特異的な抗体とともに結合した結合相手として使用し、基ハプテン-リンカー２を遊離の結合相手として使用することができる。ペプチドエピトープの場合、結合した結合相手として第１ペプチド配列、この第１配列とはアミノ酸について異なっている第２ペプチド配列に対して特異的な抗体を使用し、遊離の結合相手として第２のペプチド配列を使用することができる。
【００２７】
固相から溶離させた後、標的物質を例えばHPLC、ゲル電気泳動または質量分析によって分析することができる。場合によってはさらに精製工程、例えばその精製される物質の反応物R1との複合体からの放出を実施することができる。その上、精製される物質の必要でない部分を切断によって除去することができる。この例として、融合タンパク質の場合、必要でない部分を例えばエンテロキナーゼ、Xa因子またはIgAプロテアーゼでのタンパク質分解切断によって分離することができる。
【００２８】
本発明の方法の特定の適用は組換えペプチドまたはポリペプチド、例えば細菌細胞中、例えば大腸菌細胞中で産生される真核ペプチドまたはポリペプチドの精製である。ここでは、反応物R1に特異的に結合することができる第１ドメインおよび第２の所望の標的ドメインを含有する融合ポリペプチドを製造することができる。この融合ポリペプチドを脱離後に例えば固定化プロテアーゼでタンパク質分解することができるように、第１ドメインと第２ドメインの間にプロテアーゼ切断部位を導入することができる。所望の標的ドメインが純粋な形態で得られるように、次の工程において、融合ポリペプチドの結合した第１ドメインを含有する反応混合物中に残留する反応物R1を、固定化された反応物に結合させることによって、分離することができる。
【００２９】
単離および第１ドメインのために使用した複合体R1を切断せずに、標的物質、例えばペプチドまたはポリペプチド標的ドメインを試験しようとする場合、R1上に結合対の結合相手とは構造的に異なるその他の検出基を導入することができる。固相への結合をこのその他の基によって、例えばビオチン／ストレプトアビジン若しくはハプテン／抗ハプテン抗体システムを介して行うことができる。あるいは検出のために結合体、例えばビオチン／ストレプトアビジン酵素（例えばペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、ハプテン／抗ハプテン抗体酵素を付着させることができる。あるいは、検出基として、直接検出し得るマーカー基、例えばルミネセンス金属錯体または蛍光染料を使用することもできる。
【００３０】
さらに別の本発明の主題は、試料から標的物質を精製するための試薬キットであって、
(a) 固相、
(b) 精製する物質に特異的に結合することができる１以上の基および高親和性結合対の第１結合相手を含む１以上の基を含有する反応物R1、
(c) 高親和性結合対の第２結合相手を含む基を含有する反応物R2であって、R2が固相に結合しているか、または固相に結合することができる基を含有しているもの、
(d) 遊離形態の結合対の第１結合相手またはその類似体
を含む、上記試薬キットである。
【００３１】
さらに、第１の結合相手を標的物質中に導入し、続いて標的物質を精製するために、
(a)  固相、
(bi) 標的物質への導入に適した形態の高親和性結合対の第１結合相手 、
(bii)結合対の第１結合相手を標的物質に導入するための手段、
(c)  固相に結合した結合対の第２結合相手、および
(d) 遊離形態の結合対の第１結合相手またはその類似体
を含む、試薬キットが提供される。
【００３２】
試薬キットの成分についての好ましい実施形態は上記で説明されている。成分(a) 、(b)および(c)は１個の試薬として、またはいくつかに別れた試薬として存在させることができる。成分(d)はその他の成分から分離した状態で存在する。試薬キットの成分はどんな所望の形態で存在させてもよく、例えばパッケージ単位、凍結乾燥物、溶液、懸濁液その他である。試薬キットは上記の方法において使用するのが好ましい。
本発明を以下の実施例および図面によってさらに説明する。
【００３３】
【実験例】
実施例１  ヒト血清からのPSAの免疫吸着による単離：ハプテンによる溶離お よび酸による溶離の比較
ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上で免疫吸着をそれぞれ実施する。各試料についてビーズ懸濁液（0.72 mg/ml）1 mlを使用する。試料を添加する前に、ビーズを洗浄液（リン酸緩衝化生理食塩水 PBS、pH 7.2）各回 1 mlで３ 回洗浄し、磁力でビーズを分離した後、上清を除去した。以下の組成の６混合物をそれぞれビーズの１アリコートに添加する：
【００３４】
混合物１および２：(1) モノクローナル抗体（MAB）抗ジゴキシゲニン-IgG、
ビオチニル化（50μg/ml） 500μl、および(2) MAB 抗PSA
-IgG、ジゴキシゲニル化（50μg/ml） 500μl
混合物３〜６：    MAB 抗PSA-Fab'、ビオチニル化（16.6μg/ml） 500μl
各溶液を添加した後、これらを室温で60分、振盪しながらインキュベートする。溶液(1)および(2)を混合物１および２にそれぞれ順次添加する。続いてビーズを上清から分離し、洗浄溶液で４回洗浄し、上清を除去する。
【００３５】
次に、各混合物に試料（血漿） 0.5 mlを添加する。PSAを含まない血漿を対照として使用する。60分インキュベートし、続いて上記のように４回洗浄した後、上清を除去し、以下の溶離液を添加する：
混合物１および２：飽和ジゴキシゲニン-リシンHCl溶液 pH＝7.2 200μl
混合物３および４：1 Mプロピオン酸 200μl
混合物５および６：1：3：2の比率のギ酸／水／アセトニトリル 200μl
【００３６】
混合物を室温で60分振盪し、ビーズを分離した後、上清をSpeed Vacで凍結乾 燥する。次にこの凍結乾燥物を水 10μl中にとり、非還元条件下でSDSポリアク リルアミドゲル電気泳動に使用する。その結果を図３に示す。
【００３７】
ゲル電気泳動の結果：
各場合に酸溶離を実施した混合物３〜６においては、ヒト血清から非常に多くのタンパク質バンドが見られ、これは磁性ビーズに非特異的結合し、酸性溶離剤によって脱離されたものに起因する。以後のMALDI-TOF-MSにとって好都合なアセトニトリルを含有する溶離剤は 1Mプロピオン酸よりもかなり多くのタンパク質を非特異的に脱離させることもまた観察され得る。対照的に、ジゴキシゲニン-リシンHClによる脱離においては、PSAおよびPSA/ACTに関する所望のバンドと、血清中に高濃度にあるためビーズのこの特異的溶離においてもわずかな程度やはり脱離する少量の血清アルブミンの他には、ジゴキシゲニル化抗PSA MABの IgGバンド のみが観察され得る。酸溶離においては、得られる多数のタンパク質バンドによって、これらのゲル中の特定の標的タンパク質を同定するのは非常に困難である。これは、例えばプロテアーゼ消化後のMALDI-TOF-MSによるこうしたバンドのその後の分析にもかなり障害となる。
【００３８】
実施例２  ルミネセンス金属錯体のハプテンとしての使用
実施例１に記載した操作法と同様に、ヒト血清からのPSAの免疫吸着単離を実 施した。ハプテンとしてジゴキシゲニンに代えてルテニウム(ビスピリジル)3錯体およびロジウム(ビスピリジル)3錯体を、そしてこれに対応する抗ハプテン抗体を使用した。遊離の金属錯体の添加によって溶離を実施した。
実施例１のように、特異的な溶離が観察された。
【００３９】
実施例３  融合タンパク質の単離
特異的なジゴキシゲニル化抗体が入手し得るタンパク質１若しくはペプチド１ならびに所望の標的タンパク質２を含んでなる融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質の例えば大腸菌中での組換え発現の後、細胞溶解を実施する。抗ジゴキシゲニンMABを配合した上記の磁性ストレプトアビジ ンビーズとともに、ホモジネートを撹拌しながら室温で１時間振盪する。磁力分離後、ジゴキシゲニル化抗体および融合タンパク質を含んでなる純粋複合体は上清中に存在する。融合タンパク質の１の部分と２の部分の間に例えばエンテロキナーゼに対するタンパク質切断部位があれば、この融合タンパク質の切断にこの酵素を使用することが可能である。例えばタンパク質A-Sepharoseによって、タンパク質１が結合したジゴキシゲニル化抗体を分離した後、純粋な標的タンパク質２が溶液中に存在する。
【００４０】
ジゴキシゲニル化抗体は別の検出基、例えばジゴキシゲニンとは異なるハプテンを保有することができる。この別の検出基を抗ハプテン抗体に結合させることによる固定化または検出のために使用することができる。
【００４１】
実施例４  ジゴキシゲニル化DNAの特異的脱離
ポリクローナル抗Dig抗体で被覆したマイクロタイタープレート（AD-MATP,Boehringer Mannheim製、cat.Mo.1 754 289）上で免疫吸着を実施した。DNAとしてクロラムフェニコール遺伝子（CAT）の長さ397 bpのPCR断片（0.1 pmol/μl）を使用し；プライマー１（TAT CCG GCC TTT ATT CAC ATT CTT G）を5'ジゴキシゲニンで標識し、プライマー２（CCA GCG GCA TCA GCA CCT T）を5'ビオチンで標識する。
【００４２】
A) PCRによる脱離の検出
0.1 mg/mlニシンDNAを含有する緩衝液（100 mmol/l リン酸ナトリウム pH7.5、50 mmol/l NaCl、0.5 mmol/l EDTA、1％カゼイン、0.1％Tween 20および0.02％MIT）中で1:10000に希釈したCAT断片の 50μlアリコートを、8組の混合物（1組2個）として、室温で30分、振盪しながらAD-MTPに結合させる。これらを洗浄緩衝液（0.1％Tweenを含有するPBS）250μlで10回洗浄する。
【００４３】
50％〜0.78％Dig-リシン飽和再蒸留水（1：2連続希釈）を含有する既製のPCR 混合物（0.4 pmol/μlプライマー１および２を含有するPCRマスターミックス(mastermix)）50μlの添加によって、振盪しながら37℃で１時間、溶離を実施する 。Dig-リシンを含有しない緩衝液をネガティブ対照として使用し、50％ Dig-リシンおよび1：200希釈CAT断片 1μlを含有する溶液をポジティブ対照として使用する。
【００４４】
続いて、混合物について以下のPCRプログラムを実施する：
変性：          94℃、2分
20ｘまたは25ｘ：94℃、10秒、68℃、30秒
最終伸長：      72℃、7分
【００４５】
各PCR混合物の10μlアリコートを1.5％アガロースゲル電気泳動によって分析 する。図３に示すように、20（上段）または25（下段）サイクル後、すべてのDig-リシンを含有するPCR混合物について、ポジティブ対照（右から２および３番目のレーン）と同様に、産生されたCAT断片が観察される。，ネガティブ対照（ 右から４および５番目のレーン）は予想通りに空白のままである。
【００４６】
B) ELISAによる脱離の検出
DNA結合体希釈用緩衝液（100 mmol/l リン酸ナトリウム pH7.5、50 mmol/l NaCl、0.5 mmol/l EDTA、1％カゼイン、0.1％Tween 20および0.02％MIT(メチルイソチアゾロン)）中で、1:1000に希釈したCAT断片（Gene Bank ACC.NO.X65321）の 100μlアリコートおよびCATを含有しない１個の試料を、7組の混合物（1組2個）として、振盪しながら室温で30分、ADマイクロタイタープレートに結合させる。これらを洗浄緩衝液 250μlで5回洗浄する。
【００４７】
10％〜0.001％Dig-リシン飽和再蒸留水（1：10連続希釈）を含有するPBS 100 μl、およびDig-リシンを含まない100％対照を添加することによって振盪しながら37℃で１時間溶離を実施する。
【００４８】
続いて上記のように洗浄し、希釈緩衝液中のストレプトアビジン-ペルオ キシダーゼ結合体（200 mU/ml) 100μlによって30分検出する。次にこ れを再び上記のように洗浄し、TMB基質（テトラメチルベンジジン）100μlで発 色させる。1 M H2SO4 50μlによって反応を停止させ、ELISAリーダーで450 nmで測定する。
ELISAデータの評価によりDig-標識DNAの特異的な脱離が示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  （上部トレース）  ヘビペプチド（Myotoxin ａ） 0.05 mg/mlを添加したヒト血液の正常MALDIマススペクトルを示す。（中部および下部トレース）  ヘビペ プチドを抗Myotoxin ａ抗体に結合させ、酸性MALDIマトリックスによる溶離した後のMALDIスペクトルを示す。わずかに0.00002 mg/ml のMyotoxin ａを添加した下部トレースにおいては、酸性マトリックスによって溶離し、しかもいくつかの場合においてはMyotoxin ａよりもかなり高いシグナルを有する血液からの多数の非特異的結合ぺプチドおよびタンパク質が明らかに観察される。
【図２】  各種の溶離剤による脱離後の、前立腺癌血漿から免疫吸着したPSAおよびPSA/ACT複合体のゲル電気泳動分離の比較を示す。各場合において、対照としてPSAおよびPSA/ACTを含まない血漿試料について実施した。
【図３】  ジゴキシゲニン-リシンによる脱離後のDIG-標識PCR産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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