(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドを有する細胞除去材料であって、細胞除去材料表面にポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤を有することを特徴とする特異的細胞除去材料。
【請求項２】
細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドが、細胞表面抗原に対する抗体及び／又はその一部である請求項１記載の特異的細胞除去材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドを有する細胞除去材料に関する。本発明の細胞除去材料は、血液等の細胞集団からの特定の細胞の除去・回収に使用される。
【０００２】
【従来の技術】
近年、全身性エリテマトーデス、悪性関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病等の自己免疫性疾患、白血病、癌などの治療、或いは移植前の免疫抑制の目的で白血病等を選択的に除去する技術が進歩してきた。
このように、細胞を選択的に分離、除去等する目的で、ペプチド、タンパク質、合成物等を固定した材料が開発されている。特に、抗体、ペプチド等のタンパク質を固定した材料を用いて血液細胞を特異的に除去する技術が進歩してきている。
タンパク質及びペプチドはアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物であり、アミノ酸は酸性であるカルボキシル基と塩基性であるアミノ基を共有する電解質である。タンパク質及びペプチドの立体構造は、ペプチド結合や−Ｓ−Ｓ−結合のような共有結合の他に水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力のような弱い非共有結合により保持されているため、構造上極めて不安定な物質である。よって、物理的、化学的、生物学的な要因によりタンパク質及びペプチド固有の立体構造が破壊される変性が極めて起こり易い。特に水溶液中では、室温で１日程度放置しておくだけで、その固有の機能を発揮しなくなるのが一般的である。更には、冷蔵保存によっても長期の保存は不可能とされている。このようにタンパク質及びペプチドは安定性の面で問題があるため、機能を維持するためには特別の工夫をして立体構造を安定に保つ必要がある。多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドを有する細胞除去材料において、溶液中でタンパク質及び／又はペプチドの立体構造を安定に保持する方法はこれまでになく、タンパク質を安定に保持する方法が強く望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記タンパク質及び／又はペプチドの不安定性の問題点に鑑み、タンパク質及び／又はペプチドの立体構造を安定に保持する特異的白血球除去材料を提供する事を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドと共にポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤を存在させることにより驚くべき程、タンパク質及び／又はペプチドの立体構造を安定に保持することができ、細胞特異性の保持に大きく効果があることを見出した。即ち本発明は、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドを有する細胞除去材料であって、細胞除去材料表面にポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤を有することを特徴とする特異的細胞除去材料である。
【０００５】
本発明で言う多孔質材料とは、細胞が通過できるポアを持ち、細胞が接触できる表面を持つ多孔質な材料の事を言う。形状は、液層で細胞が高頻度に接触できるようにするため、表面積が大きいことが好ましい。好ましい形状の例を挙げると、不織布状、繊維状、綿状、糸状、束状、簾状、織布状等の繊維構造体、スポンジ等の高分子多孔質体、ビーズ状、ゲル状等の形状が挙げられる。特に血液成分のうち白血球を除去する場合、除去効率の面より、織布、不織布がより好ましい。中でも構造の安定性、制御のし易さ、表面積が大きい等の点で不織布が最も好ましい。
【０００６】
本発明で言う細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドとは、細胞に特異的或いは選択的に親和性を有する物質である。一般に細胞表面抗原と相互作用を成すタンパク質或いはペプチド等が用いられる。好ましくは、アミノ酸数３〜５０程度のペプチド、アフィニティの高さより抗体等が挙げられる。更に好ましくは細胞とのアフィニティの高さからモノクローナル抗体或いはその一部からなるペプチドが良好に用いられる。抗体をその機能により例示すると、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、抗ＣＤ１ａ，抗ＣＤ１ｂ，抗ＣＤ５，抗ＣＤ３Ｒ、抗ＣＤ６、抗ＣＤ７、抗ＣＤ９、抗ＣＤ１０、抗ＣＤｌｌａ，抗ＣＤ１８，抗ＣＤ１９，抗ＣＤ２０，抗ＣＤ２１，抗ＣＤ２２，抗ＣＤ２３，抗ＣＤ２４，抗ＣＤ３７，抗ＣＤ４０，抗ＣＤ７２，抗ＣＤ７７，抗ＣＤｌ６，抗ＣＤ３２，抗ＣＤ３３，抗ＣＤ３４，抗ＣＤ３５，抗ＣＤ６４、抗ＣＤ６５，抗ＣＤｗ６５，抗ＣＤ６６ｂ、抗ＣＤ６６ｅ、抗ＣＤ８９，抗ＣＤｗ９０，抗ＣＤ５６，抗ＣＤ５７，抗ＣＤ９４，抗ＣＤ１０５，抗ＣＤ１０６，抗ＣＤ４６，抗ＣＤ３１，抗ＣＤｗ３６，抗ＣＤ４１，抗ＣＤ４２ａ，抗ＣＤ４２ｂ，抗ＣＤ６３，抗ＣＤ１１ａ，抗ＣＤ１１ｂ，抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１８，抗ＣＤ２９，抗ＣＤ４４，抗ＣＤ４８，抗ＣＤ４９ａ，抗ＣＤ４９ｂ，抗ＣＤ４９ｃ，抗ＣＤ４９ｄ，抗ＣＤ４９ｅ，抗ＣＤ４９ｆ，抗ＣＤ５０，抗ＣＤ５１，、抗ＣＤ５４，抗ＣＤ５８，抗ＣＤ６１，抗ＣＤ６２Ｅ、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ６２Ｐ、抗ＣＤ１０３，抗ＣＤ２６，抗ＣＤ３０、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ１１７、抗ＣＤ１２２、抗ＣＤｗ１２４，抗ＣＤ１２６，抗ＣＤ１２７、抗ＩＬ−２Ｒ等の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更にこれらの抗体は単独で用いることができるが、複数固定しても良い。更にこれらの抗体の一部よりなるペプチドも良好に用いることができる。
【０００７】
本発明の特異的細胞除去材料には、タンパク質及び／又はペプチドが多孔質材料表面に直接結合していてもよいし、活性基を介して結合していてもよい。固定時の結合方法はタンパク質及び／又はペプチドの活性を維持できる方法であればいずれの反応も良好に用いることができるが、敢えて例示すると、置換反応、縮合反応、開環反応等を用いることができる。前記活性基は、タンパク質及び又はペプチドを結合できる構造であれば公知のいずれの官能基であってもよい。例示すれば、Ｎ−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルブロモアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルクロロアセトアミド等のＮ−ヒドロキシメチルハロアセトアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα−アセトアミノハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルジハロプロピオンアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα、β−プロピオンアミノハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα、α−アセトアミノジハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルトリハロアセトアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα、α、α−アセトアミノトリハロゲン基等のハロアセトアミノアルカン化剤を用いた活性基、エピクロロヒドリン等を用いて多孔質材料を活性化したエポキシ基等が挙げられる。他にイソシアネート基、イソチアシアネート基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ビニル基、ブロモシアンによる活性基等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。特にタンパク質及び／又はペプチドの活性を維持できる点、穏和な条件で反応できる点より、好ましくは、ハロアセトアミノアルカン化剤を用いた活性基が良好に用いられる。
【０００８】
本発明でいうタンパク質安定化剤とは、多孔質材料表面の細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチド近傍に存在し、タンパク質及び／又はペプチドを室温或いは低温状態で長期に安定に保つことができる材料である。タンパク質安定化剤としては、疎水基と親水基を共有する界面活性剤が良好に用いられる。疎水基を有することで多孔質材料表面或いはタンパク質及び／又はペプチドの疎水部分に吸着され、親水基を有することで材料表面を親水化することにより、タンパク質及び／又はペプチドを安定に保持できるものと考えられる。物質的に安定で、電気的に中性な界面活性剤が好ましいことが判った。電気的に中性であることで、不要な荷電を有さず物質的に安定化することができる。非イオン性界面活性剤が、両イオン性界面活性剤よりも物質的に安定しているため更に好ましく、親水性部分にポリオキシエチレン鎖を含む構造である非イオン性界面活性剤が最も好ましい。
界面活性剤の基本的構造は、１分子の中に親水性部分と疎水性部分を共有している化合物である。界面活性剤を水に溶解又は分散させた場合に、その疎水性部分が一部解離した時に示すイオン性により大別して分類している。
ポリオキシエチレンの構造を含む非イオン性界面活性剤の例を挙げると、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリンエステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。最も好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンエステルに属するポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。
但し例外として、膜タンパク質可溶化作用を有する界面活性剤、例として非イオン性であるオクチルβ−グルコシド、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノサイ、両イオン性である３−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸、３−３−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸等は好ましくない。
【０００９】
本発明の特異的細胞除去材料はそのままの状態はもとより、少なくとも入口と出口を有する容器に充填して、細胞の特異的除去或いは回収や、細胞特異除去を目的とする体外循環用用途に有効に用いられる。これらの特異的細胞除去材料を用いて、白血球、リンパ球、単球、顆粒球等の各分画細胞の特異的分離又は吸着、除去等に有効に活用できる。更に、血漿成分の特異的除去及び回収にも良好に用いることができる。
本発明における細胞の状態は全血のみならず、リンパ球浮遊液、単核球浮遊液、骨髄液、バフィーコート等に加え、血小板濃厚液、赤血球濃厚液等の処理を施した血液も含まれる。更に体外循環やＧ−ＣＳＦ等の造血因子を投与した末梢血等についても良好に用いることができる。また、これらに必要に応じて抗凝固剤や血液保存液等を加えて良好に用いることができる。
以下に、本発明の実施例を比較例と共に示すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１０】
【実施例１】
ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド０．６ｇ、濃硫酸５．７ｍＬ及びニトロベンゼン７．２ｍＬを加えて攪拌溶解し、更に氷浴中でパラホルムアルデヒド０．０４ｇを加え、攪拌した。これにポリプロピレンからなる不織布（平均繊維直径３．３μｍ）０．３ｇを入れ４時間反応した。４時間反応後不織布を取り出し、エタノール及び純水にて洗浄し、これを真空乾燥して、活性化不織布を得た。
この活性化不織布を直径０．６８ｃｍの円に切断したもの４枚をカルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩液（以下ＰＢＳ（−））に溶解した抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体液（以下抗ヒトＣＤ４液と略す）４００μＬ（１６μｇ／４００μＬ）に２．５時間浸し、モノクローナル抗体（以下抗体と略す）を固定後、２．５時間後ＰＢＳ（−）で洗浄した。次に０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート／ＰＢＳ（−）溶液（以下Ｔｗｅｅｎ２０溶液と略す）を加え２．５時間固定した後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＣＤ４陽性細胞（以下ＣＤ４（＋）細胞と略す）を特異的に除去する特異的細胞除去材料を得た。
入口と出口を有する容量１ｍＬの容器に上記特異的細胞除去材料を４枚充填（充填密度０．１ｇ／ｃｍ3）し、充填液としてＰＢＳ（−）を充填し特異的細胞除去器を作成した。
ＡＣＤ−Ａ加ヒト新鮮血液５ｍＬ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて流速１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の液を回収した。更に残留した血液は、空気により圧をかけて回収した。
この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率を、フローサイトメーター（ＣＯＵＬＴＥＲ  ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ  ＡＳＳＹ  ＮＯ．６６０５６０７８）で測定し、処理前後の細胞の存在率より求めたＣＤ４（＋）細胞の除去率は９６％であった。また、この時ＣＤ８（＋）細胞の除去率は３３％、Ｂリンパ球の除去率は４０％、血小板の除去率は１５％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に除去できた。
【００１１】
【実施例２】
実施例１と同様に作成した特異的細胞除去器を５０℃で１時間加温後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。
ＡＣＤ−Ａ加ヒト新鮮血液５ｍＬ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて流速１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の液を回収した。更に残留した血液は、空気により圧をかけて回収した。
この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率を、フローサイトメーター（ＣＯＵＬＴＥＲ  ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ  ＡＳＳＹ  ＮＯ．６６０５６０７８）で測定し、処理前後の細胞の存在率より求めたＣＤ４（＋）細胞の除去率は９６％であった。また、この時ＣＤ８（＋）細胞の除去率は３３％、Ｂリンパ球の除去率は２７％、血小板の除去率は１０％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に除去できた。
【００１２】
【比較例１】
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を用いる代わりにＰＢＳ（−）溶液を用いた以外は実施例１と同様に行い、特異的細胞除去材料を作成し、実施例２と同様の実験操作を行ったところ、この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率は２３％であった。またこの時ＣＤ８（＋）細胞の除去率は１０％、Ｂリンパ球の除去率は１０％、血小板の除去率は３０％であり、加温によるタンパク質の変性が起こったものと考えられた。
【００１３】
【実施例３】
充填液としてＰＢＳ（−）を用いる代わりに１％キトサン／ＰＢＳ（−）（以下キトサン溶液と略す）を用いた以外は全く実施例１と同様に行い、特異的細胞除去器を作成した。この特異的細胞除去器にγ線５０ｋＧｙを照射して滅菌した後、５０℃で１時間加温し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。
ＡＣＤ−Ａ加ヒト新鮮血液５ｍＬ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて流速１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の液を回収した。更に残留した血液は、空気により圧をかけて回収した。
この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率を、フローサイトメーター法で測定し、処理前後の細胞の存在率より求めたＣＤ４（＋）細胞の除去率は９７％であった。また、この時ＣＤ８（＋）細胞の除去率は２４％、Ｂリンパ球の除去率は３０％、血小板の除去率は１６％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に除去できた。
【００１４】
【比較例２】
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を用いる代わりにキトサン溶液を用いた以外は実施例１と同様に行い、特異的細胞除去材料を作成し、充填液としてＰＢＳ（−）液を用いる代わりにキトサン溶液を用いた以外は実施例１と同様に行い、特異的細胞除去器を作成した。この後、実施例３と同様の実験操作を行ったところ、この時のＣＤ４（＋）細胞の除去率は５０％であった。またこの時ＣＤ８（＋）細胞の除去率は３５％、Ｂリンパ球の除去率は３８％、血小板の除去率は３０％であった。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の特異的細胞除去材料は、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び／又はペプチドを有する細胞除去材料表面にタンパク質安定化剤を保有させたことにより、タンパク質の立体構造を安定に保持することができ、タンパク質及び／又はペプチドの細胞特異性の保存安定性が大幅に改善された。更に滅菌保護剤と組合せることにより、滅菌保護剤との親和性も上がり、細胞特異性の保存安定性が更に向上した。
本発明の特異的細胞除去材料はタンパク質及び／又はペプチドの構造を室温及び低温保存でも長期間安定に保持するので、血液等の細胞浮遊液から目的細胞を特異的に除去することが実用的に行える様になった。