(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と、ヒトhsp65の配列に由来するT細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体とを含む組成物であって、該ペプチドまたは類似体は、
(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h)、
(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278m)、
(c) VLGGGSALLRSI (Pep II)、および
(d) 以下のPep278h:
0004087898.tif 000017
の類似体であって、残基E459がE或いはDであり；残基D460がD或いはEであり；残基K462がK或いはRまたはオルニチン(Orn)であり；残基I463がI或いはL、V、M、F、ノルロイシン(Nle)またはノルバリン(Nva)であり；残基I465がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基E466がE或いはDであり；残基I467がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基I468がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K469がK或いはRまたはOrnであり；残基R470がR或いはKまたはOrnであり；残基L472がL或いはI、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K473がK或いはRまたはOrnであり；及び残基I474がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaである、類似体、
からなるペプチドの群から選択されるものであり、前記抗原の免疫原性を実質的に増大させることができるものである、前記組成物。
【請求項２】
抗原と、ヒトhsp65の配列に由来するT細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体との結合体であって、該ペプチドまたは類似体は、
(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h)、
(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278m)、
(c) VLGGGSALLRSI (Pep II)、および
(d) 以下のPep278h:
0004087898.tif 000018
の類似体であって、残基E459がE或いはDであり；残基D460がD或いはEであり；残基K462がK或いはRまたはオルニチン(Orn)であり；残基I463がI或いはL、V、M、F、ノルロイシン(Nle)またはノルバリン(Nva)であり；残基I465がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基E466がE或いはDであり；残基I467がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基I468がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K469がK或いはRまたはOrnであり；残基R470がR或いはKまたはOrnであり；残基L472がL或いはI、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K473がK或いはRまたはOrnであり；及び残基I474がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaである、類似体、
からなるペプチドの群から選択されるものであり、前記抗原の免疫原性を実質的に増大させることができるものである、前記結合体。
【請求項３】
抗原と、ヒトhsp65の配列に由来するT細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体との結合体であって、該ペプチドまたは類似体は、前記抗原と共有結合で結合しており、かつ
(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h)、
(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278m)、
(c) EGDEATGANIVKVALEA (Pep278mt)、
(d) VLGGGSALLRSI (Pep II)、および
(e) 以下のPep278h:
0004087898.tif 000019
の類似体であって、残基E459がE或いはDであり；残基D460がD或いはEであり；残基K462がK或いはRまたはオルニチン(Orn)であり；残基I463がI或いはL、V、M、F、ノルロイシン(Nle)またはノルバリン(Nva)であり；残基I465がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基E466がE或いはDであり；残基I467がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基I468がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K469がK或いはRまたはOrnであり；残基R470がR或いはKまたはOrnであり；残基L472がL或いはI、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K473がK或いはRまたはOrnであり；及び残基I474がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaである、類似体、
からなるペプチドの群から選択されるものであり、前記抗原の免疫原性を実質的に増大させることができるものである、前記結合体。
【請求項４】
前記抗原がペプチド、タンパク質または多糖である、請求項２または３に記載の結合体。
【請求項５】
hsp65のT細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体に共有結合で接合した抗原を含む結合体であって、該合成ペプチド担体が、
(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h)、
(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278m)、
(c) EGDEATGANIVKVALEA (Pep278mt)、
(d) VLGGGSALLRSI (Pep II)、および
(e) 以下のPep278h:
0004087898.tif 000020
の類似体であって、残基E459がE或いはDであり；残基D460がD或いはEであり；残基K462がK或いはRまたはオルニチン(Orn)であり；残基I463がI或いはL、V、M、F、ノルロイシン(Nle)またはノルバリン(Nva)であり；残基I465がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基E466がE或いはDであり；残基I467がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基I468がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K469がK或いはRまたはOrnであり；残基R470がR或いはKまたはOrnであり；残基L472がL或いはI、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K473がK或いはRまたはOrnであり；及び残基I474がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaである、類似体、
からなるペプチドの群から選択されるものであり、結合体が生体内に投与された際に前記抗原の免疫原性を実質的に増大させることができるものである、前記結合体。
【請求項６】
前記合成ペプチド担体がPep278mである、請求項２に記載の結合体。
【請求項７】
前記合成ペプチド担体がPep IIである、請求項２に記載の結合体。
【請求項８】
前記合成ペプチド担体またはその類似体が、抗原分子と直接結合している、請求項２に記載の結合体。
【請求項９】
前記合成ペプチド担体またはその類似体が、スペーサーを介して抗原分子と結合しており、該スペーサーは-O-R-CO-、-NH-R-CO-、-NH-R-NH-、-O-R-NH-または-NH-R-CH2-より選ばれ、ここでRは炭素原子3〜16個を含む脂肪族炭化水素鎖である、請求項２に記載の結合体。
【請求項１０】
前記Rがε-アミノカプロン酸の残基である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１１】
式：
【化１】
0004087898.tif 000021
［式中、Acはアセチル、ACはε-アミノカプロン酸の残基、Pepはペプチド担体Pep278hまたはPepIIの残基及び糖残基は腸チフス菌のVi莢膜多糖の反復単位を表し、nは反復単位の数である］
である、請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは９に記載の結合体を含む、ワクチン。
【請求項１３】
さらにアジュバントを含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
抗原分子の免疫原性を増大させる方法であって、該抗原分子をヒトhsp65の配列に由来するT細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体に結合させることを含み、該ペプチドまたは類似体は、
(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h)、
(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278m)、
(c) EGDEATGANIVKVALEA (Pep278mt)、
(d) VLGGGSALLRSI (Pep II)、および
(e) 以下のPep278h:
0004087898.tif 000022
の類似体であって、残基E459がE或いはDであり；残基D460がD或いはEであり；残基K462がK或いはRまたはオルニチン(Orn)であり；残基I463がI或いはL、V、M、F、ノルロイシン(Nle)またはノルバリン(Nva)であり；残基I465がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基E466がE或いはDであり；残基I467がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基I468がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K469がK或いはRまたはOrnであり；残基R470がR或いはKまたはOrnであり；残基L472がL或いはI、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K473がK或いはRまたはOrnであり；及び残基I474がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaである、類似体、
からなるペプチドの群から選択されるものであり、前記抗原の免疫原性を実質的に増大させることができるものである、前記方法。
【請求項１５】
抗原分子の免疫原性を増大させる方法であって、該抗原分子をヒトhsp65の配列に由来するT細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体と混合することを含み、該ペプチドまたは類似体は、
(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h)、
(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278m)、
(c) VLGGGSALLRSI (Pep II)、および
(d) 以下のPep278h:
0004087898.tif 000023
の類似体であって、残基E459がE或いはDであり；残基D460がD或いはEであり；残基K462がK或いはRまたはオルニチン(Orn)であり；残基I463がI或いはL、V、M、F、ノルロイシン(Nle)またはノルバリン(Nva)であり；残基I465がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基E466がE或いはDであり；残基I467がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基I468がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K469がK或いはRまたはOrnであり；残基R470がR或いはKまたはOrnであり；残基L472がL或いはI、V、M、F、NleまたはNvaであり；残基K473がK或いはRまたはOrnであり；及び残基I474がI或いはL、V、M、F、NleまたはNvaである、類似体、
からなるペプチドの群から選択されるものであり、前記抗原の免疫原性を実質的に増大させることができるものである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体に基づく増強された免疫原性の結合体、その製造方法、および該結合体からなる免疫用ワクチンに関する。
背景技術
抗体応答はＴ細胞の要求性に基づいて２つの大きな型に分類される。Ｔ細胞依存性（Ｔ−ｄｅｐ）抗原への体液性の一次免疫応答は、一方では血漿細胞と免疫グロブリン分泌につながり、また他方では胚中心の形成と免疫記憶につながるＢおよびＴ細胞活性化と増殖によって特徴づけられる。抗原による再刺激に出会うと、これらの記憶細胞が二次抗体応答において主要な役割を果たす。Ｔ−ｄｅｐ抗原に対する二次応答の基本的特徴は、抗体産生が迅速なこと、一次応答と比較して応答が大きいこと、およびＩｇＭからＩｇＧへの免疫グロブリンクラススイッチである。
しかしながら、Ｔ細胞非依存性（Ｔ−ｉｎｄ）抗原と呼ばれる、Ｔ細胞の助けとは独立にＢ細胞を活性化することのできる少数の抗原が存在する。これらにはストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）莢膜多糖のような細菌の莢膜多糖、重合化サルモネラフラゲリン（Salmonella flagellin）、ポリ−Ｄ−アミノ酸、および大腸菌リポ多糖が含まれる。Ｔ−ｉｎｄ抗原は繰り返し構造をもつ高分子量で、多くの場合ゆっくりと分解する特徴をもつ。Ｔ−ｉｎｄ抗原は長期間特定のマクロファージの表面上にとどまって、これらがクロスリンクする相補的免疫グロブリンレセプターとの多価結合によって抗原特異的Ｂ細胞と大きな結合活性で結合する。十分高い濃度においては、これらはＢ細胞プールの実質的比率をポリクローナル的に、すなわち表面レセプターの超可変部に特異的な抗原とは関係なく、活性化する能力をもつ。一般に、Ｔ−ｉｎｄ抗原は主としてＩｇＭ応答、マウスではいくらかのＩｇＧ３と、もしあったとしても比較的弱い記憶を引き起こす。
インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）ｂ型、ストレプトコッカス・ニューモニア、ネイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、グループＢストレプトコッカス、および大腸菌Ｋ１型のような莢膜をもつ細菌は、ヒト、特に幼児や免疫抵抗性が減弱な人に深刻な侵潤性疾患を引き起こす。血漿の抗多糖抗体は、これらの病原体の多くによって引き起こされる侵潤性疾患に対して防御性を示し、また精製莢膜多糖（ＣＰＳ）からなるワクチンが、このような危険にさらされた人に抗体を誘導するために開発されてきた。しかしながら、多糖は幼児では免疫原性が弱く、このためにこれをワクチンとして使用することが妨げられてきた。免疫原性に乏しい理由は、これがＴ−ｉｎｄ抗原群に属することと関連すると信じられている。
多糖をタンパク質担体と結合すると免疫原性が増加するというAveryおよびGoebel(1929)の発見を用いて、最近になってヒトに使用するためのワクチン製造が行われている。ヒトおよびげっ歯類の両方で、これらの結合体は免疫記憶を誘導することによりＴ−ｄｅｐ抗原のようにふるまう。多糖ワクチン結合体とタンパク質担体−ハプテン系との間には類似性がある。したがって、ＣＰＳ単独では幼児に防御的レベルのＣＰＳ抗体を誘導できないが、ＣＰＳ結合体はできる。純粋多糖と比べて結合体の免疫原性が勝るのは、げっ歯類における担体−ハプテン系で証明されたような、担体−特異的Ｔ細胞による助けのためである可能性がある。
多くの場合、Ｔ−ｉｎｄ抗原を、破傷風トキソイド、コレラ毒素、またはジフテリアトキソイドのような大きな免疫原性タンパク質と結合させてきた。しかしながら、刺激的かつ抑制的Ｔ細胞エピトープをもつ高分子量担体分子との免疫的応答は予測できない。受血者があらかじめ非修飾タンパク質で免疫されている場合には、担体タンパク質と結合したハプテンに対する抗体応答も阻害されることが示された。この現象は担体誘導エピトープ抑制と呼ばれ、多数のハプテン−タンパク質結合体で起こることが最近示された。多数の極めて感染力をもつ生物に対するより強力な結合体ワクチンの開発が重要であるので、必要なＴ細胞エピトープを提供するさらに適当な担体分子を探求する努力が行われている。顕著な免疫的性質をもつ特定ペプチドによって定義される普遍的に免疫原性をもつＴ細胞エピトープがあれば、このような代替分子を新たに作製できるであろう。免疫系によって十分認識されるタンパク質は、かかる目的に使用できるペプチドの適当な材料となりうる。
自己に密接に関連するタンパク質、および系統発生学的に遠い関係のタンパク質を含む各種タンパク質を用いる研究により、多くのＴ細胞が少数の免疫優生エピトープに集まり、少数のＴ細胞がその他のもの、つまり準優生な抗原決定基と応答することが示された。Ｔ細胞によるこのような抗原決定基利用の優先順位は、利用できるＭＨＣ分子に対する異なる親和性、Ｔ細胞レパートリーの多様性、ＭＨＣ−結合部位における内部競合、およびプロセシングの相違などの結果でありうる。
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）のファミリーに属するタンパク質が多くの病原体の主要抗原であるという証拠が集まってきている（Youngら、１９８８）。ｈｓｐは突然高温にさらした細胞によって産生されると最初文献に記載され、後にこのことによって命名された。ｈｓｐは２０ｋｄ、６０ｋｄ、６５−６８ｋｄ、７０ｋｄ、９０ｋｄ、１１０ｋｄなどの各種分子量のタンパク質を含む。現在では、ｈｓｐは酸化的障害、栄養欠乏および細胞内病原体による感染を含む多くの環境劣化によってすべての細胞中で誘導されることが明らかとなり、ｈｓｐ応答は、さもなければ好ましくない条件下で細胞が生存するのを可能にする。細胞のストレスはｈｓｐ合成を増加させるが、多くのｈｓｐはまた、正常な細胞機能中でも構成的に発現して本質的な役割を果たしている。ｈｓｐ応答は原核および真核生物を通して普遍的であり、ｈｓｐは最も保存された分子に属する。１０億年以上にわたる進化の分岐にもかかわらず、例えば、ヒトとマイコバクテリウムのｈｓｐ６５分子は、約５０％のアミノ酸残基が同じである。この化学的保存には全長またはほとんどが同一である多くのアミノ酸配列を含む。したがって、必然的にあらゆる生物はいかなる外来細胞のｈｓｐ６５とも免疫交差反応性を共有する。よって、あらゆる感染性細胞要因のｈｓｐ６５分子は、免疫系をもつあらゆる宿主と部分的に自己であり、部分的に非自己である。このため、ｈｓｐ６５とその他のｈｓｐは免疫原性に乏しいと予測される。しかし全く反対に、ｈｓｐは最も優先的免疫原であることを証拠は示している。
多数の異なる細菌による感染または免疫感作がｈｓｐ６５分子に特異的な抗体及びＴ細胞を誘導するので、ｈｓｐファミリーに属するタンパク質の代表例であるｈｓｐ６５は、優先的抗原であると考えられる（Youngら、１９８８）。結核菌（Mycobacterium tuberculosis）で感作したマウスでは、細菌と応答したすべてのＴ細胞の２０％がｈｓｐ６５に対して特異的である。興味深いことに、ｈｓｐ６５との反応性をもつＴ細胞は、疾患の臨床的兆候の全くない正常な健常人にも同定された（Munkら、１９８８）。Lambら（１９８７）およびMunkら（１９８８）は、合成ペプチドを用いて、マイコバクテリウムおよびヒトのｈｓｐ６５の共通エピトープと応答するＴ細胞を示した。これによって、正常人におけるｈｓｐ６５の自己エピトープに対するＴ細胞の存在が公式に証明された。
この免疫優先性の結果として、ｈｓｐ６５分子が自己免疫反応に関与しているように思えるのは驚くことではない。ｈｓｐ６５に対する免疫は、マウスにおいて自己免疫性糖尿病を引き起こし、また、ラット及びヒトにおいて自己免疫性関節炎に関与しているかも知れない（Eliasら、１９９０；Pearson、１９６４）。したがって、ｈｓｐ６５に対する免疫は自己免疫疾患と関連するが、健康状態とも関連する。
感染の過程で、病原体及び宿主は、いずれも他者によって負わされたストレスを防御するために、ｈｓｐの合成を劇的に増加する。自己抗原に対するＢ細胞応答と同様に、ｈｓｐ６５を特異的に認識するＴ細胞のようなｈｓｐ反応性Ｔ細胞は、ストレス細胞を除去することにより炎症の治癒を有利に行うことが考えられる。しかしながら、この応答が正しく制御されない場合には自己免疫疾患が発症するのであろう。CohenおよびYoung（１９９１）は、限られた数の制御された自己抗原に対する一連の高度に管理かつ制御された免疫ネットワークに基づく免疫系によって、健常人の“自然免疫”の保持は確保されていることを示唆した。ｈｓｐ６５分子は、このような高度に組織化された免疫応答が自然に存在する抗原のうちの１つであることが示唆されている（Eliasら、１９９０）。
Coxら（１９８８）は、結核菌６５ｋＤａタンパク質の６５−８５ペプチドのダイマーはＴ細胞増殖を誘導する能力に影響しないが抗体産生を増加することを示したが、マイコバクテリウムの６５−８５配列のＮ−末端をもつ異種ペプチドの組み合わせがペプチドワクチンの増強に一般に適していることを示唆した。Lussowら（１９９０）およびBarriosら（１９９２）は、マイコバクテリウム・ボビス（bovis）のｈｓｐ６５とｈｓｐ７０がマウスでの抗ハプテン抗体の誘導のための担体分子として作用しうることを示した。さらに、Ｍ．ボビスｈｓｐ６５の多くのＴ細胞エピトープが同定され、全タンパク質が異なるＭＨＣハプロタイプをもつ広範囲なマウス株で免疫原性を有することが示された（Brettら、１９８９）。
（宿主および寄生体それぞれの）ｈｓｐ６５タンパク質の配列中のいくつかのＴ細胞エピトープは免疫優性を示し、かつ免疫記憶を誘導することができるが、一方、その他のものは特権的免疫認識を発現しないか、あるいは自己免疫の誘導に関与しないと推定される。これらの機能的に異なるＴ細胞エピトープ間の区別が、Ｔ−ｉｎｄ抗原の担体分子として安全で規格化されかつ強力な代替物として使用しうる普遍的免疫原性ペプチドを同定することにつながるであろう。
欧州特許ＥＰ２６２７１０および米国特許第５，１５４，９２３号は、自己免疫関節炎および類似の自己免疫疾患に対する耐性を誘導する免疫原として使用しうる、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ  ６４ｋＤポリペプチドのそれぞれ１７１−２４０および１７２−１９２位に対応するアミノ酸配列をもつペプチドについて記載する。
ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９０／１０４４９は、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）に対する耐性を誘導する免疫原として使用しうる、ヒトｈｓｐ６５分子の４３７−４６０位に対応するアミノ酸配列をもつｐ２７７と呼ばれるペプチドを記載する。ヒトｈｓｐ６５の４５８−４７４位に対応するｐ２７８と呼ばれる対照ペプチドは、ＩＤＤＭに対する耐性を誘導しなかった。
Lussowら（１９９０）は、結核菌変種ボビス（ＢＣＧ）の生菌によるマウスの初回抗原刺激及び、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）と結合させた反復マラリア合成ペプチド（ＮＡＮＰ）40による感作が、高くて長期間続く力価をもつ抗ペプチドＩｇＧ抗体を誘導することを示した。その後、Lussowら（１９９１）は、６５ｋＤａ（ＧｒｏＥＬ型）および７０ｋＤａ（Ｄｎａｋ型）のマイコバクテリウム熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）が、結核菌変種ボビス（bacillus Calmette-Guerin、ＢＣＧ）であらかじめ初回抗原刺激しておいたマウスにおいて、反復マラリア合成ペプチド（ＮＡＮＰ）40に対する高くて長期間続く力価のＩｇＧを誘導するための担体分子として作用することを示した。マイコバクテリウムｈｓｐと結合したマラリアペプチドを何らアジュバントを用いずに与えた場合に、抗ペプチド抗体が誘導された。
Barriosら（１９９２）は、７０ｋＤａ  ｈｓｐと結合させたペプチドまたはオリゴサッカライドで感作したマウスが、ＢＣＧであらかじめ初回抗原刺激しなくても高力価のＩｇＧ抗体を産生することを示した。この抗ペプチド抗体応答は少なくとも１年続いた。無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスでは抗ペプチドＩｇＧ抗体も抗７０ｋＤａ  ＩｇＧ抗体も誘導しなかったので、７０ｋＤａ  ｈｓｐのこの無アジュバント担体効果はＴ細胞依存性である。６５ｋＤａまたは７０ｋＤａ  ｈｓｐによるマウスの前もっての感作は、ｈｓｐ−ペプチド結合体でアジュバントの不存在下に感作した後の抗ペプチドＩｇＧ抗体の誘導に何ら否定的効果をもたらさなかった。さらに、６５ｋＤａ  ｈｓｐによる前感作は、抗（ＮＡＮＰ）40抗体の誘導のための効果的初回抗原刺激を提供することで、ＢＣＧを代用することができた。最後に、６５ｋＤａおよび７０ｋＤａ  ｈｓｐは、アジュバントの不存在下にグループＣ髄膜炎（meningococcus）オリゴサッカライドに対するＩｇＧ抗体の誘導のための担体分子として作用した。このことは、抗ペプチドおよび抗オリゴサッカライド抗体の誘導のための結合構築物における担体としてｈｓｐを使用することが、ヒトにおいて実際に使用できる新規ワクチンを計画する上で価値あるものであることを示唆する。
上述した文献のいずれも免疫原性に乏しい分子と結合したヒトｈｓｐ６５の特異的Ｔ細胞エピトープについて記載していない。
発明の概略
本発明の目的は、免疫原性に乏しい抗原分子の免疫原性を増強し、これによってこれらを免疫感作に適した抗原に変える方法を提供することである。
この目的のために、本発明は、免疫原性に乏しい抗原と、ヒトｈｓｐ６５の配列に由来するＴ細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体との結合体であって、該ペプチドまたは類似体は免疫原性に乏しい抗原の免疫原性を実質的に増加することができる上記結合体を提供する。
ヒトおよびマウスを含む哺乳動物ｈｓｐ６５はｈｓｐ６０属ファミリーに属するので、他の著者はしばしば“ｈｓｐ６０”と呼ぶ。本明細書では、ヒトまたはマウスｈｓｐ６５を言及するときにはいつも、“ｈｓｐ６０”または当業界でこれらに与えられたその他のすべての呼び方の分子を包含する。
Ｔ細胞エピトープを構成するヒトｈｓｐ６５に由来し、かつ免疫原性に乏しい抗原の免疫原性を実質的に増加するすべてのペプチドまたはその類似体を本発明で使用できる。
Ｐｅｐ２７８ｈまたは２７８ｈと呼ぶ本発明の好ましいペプチドはヒトｈｓｐ６５分子の４５８−４７４位に対応し、以下の配列をもつ：
0004087898.tif 000002
Ｐｅｐ２７８ｈの好ましい類似体は、Ｐｅｐ２７８ｈのＴ471残基がＡ471で置換された本明細書でＰｅｐ２７８ｍまたは２７８ｍと呼ぶもの、および以下の配列のＰｅｐ２７８ｍｔまたは２７８ｍｔである：
0004087898.tif 000003
本明細書でペプチドＩＩまたはＰｅｐＩＩと呼ぶヒトｈｓｐ６５分子に由来する本発明の別のＴ細胞エピトープは、４４２位と４４７位のシステイン部分がセリンで置換されたヒトｈｓｐ６５分子の４３７−４４８位に対応し、以下の配列をもつ：
0004087898.tif 000004
免疫原性に乏しい抗原分子は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、例えばＨＩＶウイルスまたはマラリア抗原由来のペプチド、あるいは細菌多糖、例えばインフルエンザ菌ｂ型、ストレプトコッカス・ニューモニア、ネイセリア・メニンギティディス、グループＢストレプトコッカス、大腸菌Ｋ１型、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）のようなサルモネラなどからの莢膜多糖である。
担体ペプチドは、免疫原性に乏しい抗原分子と直接またはスペーサーを介して共有結合的に結合する。
本発明はさらに、本発明の結合体、または免疫原性に乏しい抗原と適当なペプチド担体との混合物を含むワクチンに関する。
別の態様においては、本発明は、有効量の本発明の結合体を宿主に投与するか、あるいは有効量の免疫原性に乏しい抗原分子と、ヒトｈｓｐ６５の配列に由来するＴ細胞エピトープを構成する合成ペプチド担体またはその類似体（該ペプチドまたは類似体は免疫原性に乏しい抗原の免疫原性を実質的に増加することができる）とを同時投与することを含む、哺乳動物宿主を免疫感作する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ−Ｂは、１：５０（Ａ）および１：５００（Ｂ）の血清希釈での、初回の免疫感作の１２日および２４日後、ならびに２回目の免疫感作の１２日後における、Ｖｉのみによってマウスで誘導された血清抗Ｖｉ抗体応答を示す。
図２ａ−ｂ（Ａ−Ｃ）は、初回の免疫感作の１２日後（Ａ）および２４日後（Ｂ）、ならびに２回目の免疫感作の１２日後（Ｃ）における、Ｖｉのみによって、またはＶｉ結合体Ｖｉ−Ｐｅｐ−ＩＩ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈおよびＶｉ−Ｐｅｐ３４８ｈによってマウスで誘導された（マウス１匹当たり（ａ）２．５μｇおよび（ｂ）０．２５μｇＶｉを注射）抗Ｖｉ抗体応答を示す。
図３ａ−ｂ（Ａ−Ｂ）は、初回の免疫感作の１２日および２４日後、ならびに２回目の免疫感作の１２日後における、Ｖｉ−タンパク質／ペプチド結合体（Ａ）およびＶｉのみ（Ｂ）によって誘導された（マウス１匹当たり（ａ）２．５μｇおよび（ｂ）０．２５μｇＶｉを注射）抗Ｖｉ抗体産生の動力学（Kinetics）を示す。
図４Ａ−Ｂは、Ｖｉのみによって、または結合体Ｖｉ−ＰｅｐＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによって免疫感作したマウスにおいて引き出された抗Ｖｉ抗体の特異性を示す。抗体は、１ウエル当たり２．５μｇ（パネルＡ）または１．２５μｇ（パネルＢ）ＶｉでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート中で決定した。
図５Ａ−Ｂは、Ｖｉのみによって、または結合体Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによってマウスにおいて引き出された抗Ｖｉ抗体のイソタイプの性質を示す。パネルＡ：  ＶｉおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈに対する抗Ｖｉ  ＩｇＭイソタイプ応答；パネルＢ：  ＶｉおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈに対する抗Ｖｉ  ＩｇＧイソタイプ応答。
図６Ａ−Ｂは、１：１００（パネルＡ）および１：１０００（パネルＢ）の血清希釈での、Ｖｉのみによってまたは結合体Ｖｉ−ＰｅｐＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによって免疫感作したマウスにおける抗Ｖｉ抗体産生の経時変化を示す。
図７Ａ−Ｂ（ａ−ｃ）は、初回の免疫感作の１２日後（パネルａ）および２４日後（パネルｂ）、ならびに２回目の免疫感作の１２日後（パネルｃ）における、（Ａ）皮下（ｓｃ）または（Ｂ）筋肉内（ｉｍ）注射したＶｉ−ＰｅｐＩＩによってマウスで誘導された抗Ｖｉ抗体のアジュバントおよび免疫感作方法の効果を示す。
図８Ａ−Ｃは、免疫感作前、初回の免疫感作の１２日後（パネルＡ）および２４日後（パネルＢ）、ならびに２回目の免疫感作の１２日後（パネルＣ）における、Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ結合体またはＶｉと混合した遊離のＰｅｐＩＩによってマウスで誘導された抗Ｖｉ抗体産生を示す。
図９は、結合体Ｖｉ−ＰｅｐＩＩによって免疫感作、免疫感作１４日前にＩＦＡ中の遊離ＰｅｐＩＩでｓｃ初回抗原刺激した（左）またはしなかった（右）マウスにおける、抗Ｖｉ抗体産生に対する担体初回抗原刺激の効果を示す。
図１０ａ−ｂ（Ａ−Ｂ）は、１：５０（ａ）および１：１０００（ｂ）の血清希釈での、初回の免疫感作の１２日後（パネルＡ）、ならびに２回目の免疫感作の１２日後（パネルＢ）における、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）（抗原Ａ）、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ（抗原Ｂ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）をマウスに注射した後）、Ｖｉのみ（抗原Ｃ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）をマウスに注射した後）、およびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ（抗原Ｄ）によって同じ個体マウスで誘導された抗Ｖｉ免疫応答を示す。
図１１Ａ−Ｆは、抗Ｖｉ血清Ｂｕｒｒｏ２６０（パネルＡ）を参照として、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたＶｉのみ（パネルＢ）、ならびに結合体Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ（パネルＣ）、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ（パネルＤ）、Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ*（パネルＣ）およびＶｉ−ＰＣＲＰ７７−８３（パネルＦ）のスクリーニングの認識を示す。
図１２Ａ−Ｅは、ＶｉおよびＶｉ結合体に対する異なるマウスの系の免疫応答を示す。パネルＡ：Ｖｉ、Ｖｉ−２７８ｈ、Ｖｉ−２７８ｍ、Ｖｉ−２７８ｍｔ、Ｖｉ−ＳＲｅｓ、Ｖｉ−３４８およびＶｉ−２７７（Ｓ）に対するＢＡＬＢ／ｃマウスの応答；パネルＢ：Ｖｉ、Ｖｉ−２７８ｈ、Ｖｉ−２７８ｍ、Ｖｉ−２７８ｍｔ、Ｖｉ−２７７（Ｓ）およびＶｉ−ＳＲｅｓに対するＢＡＬＢ／ｋマウスの応答；パネルＣ：パネルＢと同じ抗原に対するＢＡＬＢ／ｂマウスの応答；パネルＤ：Ｖｉ、Ｖｉ−２７８ｈ、Ｖｉ−２７８ｍ、Ｖｉ−２７８ｍｔおよびＶｉ−ＳＲｅｓに対するＮＯＤマウスの応答；パネルＥ：Ｖｉ、Ｖｉ−２７８ｈおよびＶｉ−２７８ｍｔに対するＮＯＮ．ＮＯＤマウスの応答。
図１３Ａ−Ｃは、ＩＦＡ中にエマルジョン化したＶｉ−２７８ｈ結合体、ＩＦＡ中のＶｉおよびＩＦＡ／ＰＢＳでそれぞれ免疫感作したマウスの血清のＩｇＧイソタイプの分布を示す。
図１４は、Ｖｉ断片およびＶｉ断片−２７８ｈ結合体に対するマウスの免疫応答を示す。
図１５は、マウスにおけるＶｉ、ならびに結合体Ｖｉ−２７８ｈ、Ｖｉ−２７８ｍ、Ｖｉ−２７８ｍｔおよびＶｉ−ＳｅｒＲｅｓの免疫原性を示す。
図１６は、ポリペプチドＦＥＰＫのみ、またはペプチド２７８ｈと３４８ｈとの結合体で免疫感作した後のマウスで得られたＩｇＧ１免疫応答を示す。
発明の詳細な説明
本発明の好ましい結合体は、Ｐｅｐ２７８ｈまたはＰｅｐＩＩを、細菌多糖、例えば反応式１に示すように、Ｃ3−位でＯ−アセチル化されていてもよいポリ−α−（１−４）ＧａｌＮＡｃの線状ホモポリマーであるサルモネラ・チフィのＣＰＳ  Ｖｉ（これ以後Ｖｉという）と共有結合的に結合することによって形成される。Ｖｉのみでは他のＣＰＳと同様、再注射したときに動物およびヒトを含む哺乳動物において追加免疫応答を引き出さないが、ヒトｈｓｐ６５由来の適当なペプチドまたはその類似体と結合させた本発明の結合体として、あるいはこのようなペプチドまたは類似体との混合物として提示する場合には、その免疫原性を増加する。Ｖｉ−ペプチド結合体を再注射すると、主としてＩｇＧイソタイプとして提示される抗Ｖｉ抗体レベルの増加（追加免疫効果）を誘導する。
Ｐｅｐ２７８ｈの場合、本発明の活性ペプチドは顕著に荷電している、すなわち、強い電気的性質をもつ（Ｐｅｐ２７８ｈの１７個の構成アミノ酸残基のうち７個は負または正に荷電している）こと、および顕著に疎水性（６アミノ酸残基）であることを特徴とする。Ｐｅｐ２７８ｈペプチドはさらに、極性の負に荷電したＮ末端ドメイン、極性の正に荷電したＣ末端ドメイン、および顕著に疎水性の中心部をもつことを特徴とする。これらの全体としての性質が、有効性を保持するために維持されるべきである。したがって、上述した一般的性質に従ういくつかのアミノ酸置換は活性ペプチドとなる。さらに特定すると、Ｐｅｐ２７８ｈペプチド鎖中の６、８、１０、１１、１５および１７位（ヒトｈｓｐ６５分子の４６３、４６５、４６７、４６８、４７２および４７４位に対応）は、ＩまたはＬまたはその他の疎水性アミノ酸によって、Ｖ、ＭまたはＦなどの天然アミノ酸によって、あるいはノルロイシン（Ｎｌｅ）やノルバリン（Ｎｖａ）などの非天然アミノ酸によって置換されてもよい。Ｐｅｐ２７８ｈ鎖中の５、１２、１３および１６位（ヒトｈｓｐ６５分子の４６２、４６９、４７０および４７３位に対応）は、ＫまたはＲまたはオルニチン（Ｏｒｎ）などの非天然正荷電アミノ酸によって置換されてもよい。ＥとＤを交換しても活性誘導体となる。
本発明における“類似体”という用語は、それらが免疫原性に乏しい抗原分子の免疫原性を実質的に増強する能力を保持する限り、Ｔ細胞エピトープの配列に対するアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって得られるペプチドをいう。例えば、安定な誘導体は、ＰｅｐＩＩの場合のように、もとのシステイン残基をセリン残基で置換することによって得られる。Ｐｅｐ２７８ｈの場合には、類似体はペプチド分子の電気的性質および疎水性の少なくとも７０％、好ましくは９０−１００％を保持するペプチドである。これらのペプチドは上述した記載によって得ることができる。
本発明のペプチドはすべてがＬまたはＤ形の光学活性アミノ酸残基であってもよく、あるいはアミノ酸残基のいくつかがＬ形でその他がＤ形であってもよい。
“免疫原性に乏しい抗原分子の免疫原性を実質的に増加する”という用語は、該抗原に対する抗体レベルの増加を誘導すること、ならびに該抗体を主としてＩｇＧイソタイプとして提示することの両方を含むことを意味する。
ペプチド担体は直接またはスペーサーを介して抗原分子と結合することができる。
ペプチドとＶｉとの直接結合を反応式１に示すが、ここで結合体：
0004087898.tif 000005
は後述する工程３によって得られる。
スペーサーは式−Ｏ−Ｒ−ＣＯ−または−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−をもち、これによりＶｉのカルボキシル基とそれぞれエステルまたはアミドを形成し、そしてペプチドの末端アミノ基とペプチド結合を形成するか；式−Ｏ−Ｒ−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−をもち、これによりＶｉのカルボキシル基とそれぞれエステルまたはアミドを形成し、そしてペプチドの末端カルボキシル基とアミドを形成する；あるいは式−ＮＨ−Ｒ−ＣＨ2−（式中、Ｒは１または２以上の芳香族基によって、あるいはＯ、ＳまたはＮなどのヘテロ原子によって任意に置換および／または中断されていてもよい飽和または不飽和の炭化水素鎖である）をもつ。好ましくは、Ｒはε−アミノカプロン酸の残基のように３−１６個の炭素原子を含む脂肪族炭化水素である。
以下の式の結合体：
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（式中、Ａｃはアセチルであり、ＡＣはε−アミノカプロン酸の残基であり、Ｐｅｐはペプチド担体Ｐｅｐ２７８ｈまたはＰｅｐＩＩの残基であり、そして糖残基はサルモネラ・チフィのＶｉ莢膜多糖の繰り返し単位を表す）は、反応式１に示され、また以下に詳述する３つの異なる工程１、２および４によって製造できる。
スペーサーが−ＮＨ−Ｒ−ＣＨ2−である結合体は、−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−基の還元によって得られる。
本発明はまた、本発明の結合体からなるワクチンに関する。これらのワクチンは適当なビヒクル中に入れて皮下経路でヒトおよび獣医用に投与するのが好ましい。
本発明を以下の非限定的実施例によってさらに説明する。
実施例
実施例においては以下の材料と方法を用いる。
材料および方法
ａ．材料：すべての溶媒、薬剤は分析グレードのものであり、特記しない限りＡｌｄｒｉｃｈ（米国）から入手した。
ｂ．ペプチド合成：α−Ｎ−末端アミノ基の保護基としてｔ−Ｂｏｃを用いる固相合成によってペプチドを得た。１ｇ当たり０．５−０．７ｍｅｑ／ｇの活性塩素をもつメリフィールド（Merrifield）樹脂をＣｈｅｍａｌｏｇ（Ｎ．Ｊ．、米国）から入手した。適当な側鎖保護をもつＢｏｃ−保護アミノ酸はＢｅｅｃｈａｍ（Ｃａ．、米国）から入手した。最初のアミノ酸の樹脂へのカップリングはアミノ酸誘導体のセシウム塩によって実施した。ペプチド鎖の伸長は固相合成法の一般的方法に従って実施した（Merrifield、１９６３）。樹脂からのペプチドの切り出しおよび側鎖の脱保護はＨＦ法によって行った。合成したペプチドおよび類似体の配列を表１に示す。
類似体ペプチド２７８ｍはマウスｈｓｐ６５の４５８−４７４位に対応し、また類似体２７８ｍｔはマイコバクテリウムｈｓｐ６５の４３１−４４７位に対応する。
次の対照ペプチドも合成した：ヒトｈｓｐ６５（ＷＯ  ９０／１０４４９）の４３７−４６０位に対応し、その３４２および３４７位のＣｙｓ（Ｃ）残基がＳｅｒ（Ｓ）残基で置換されているペプチド２７７（Ｓ）の類似体；ヒトｈｓｐ６５の４４９−４６０位に対応するペプチド３４８ｈ；ヒトＣ−反応性タンパク質の７７−８３位に対応するペプチドＣＲＰ７７−８３；およびウニ由来のペプチドＳｅｒＲｅｓ。
ペプチドＩＩ、２７７（Ｓ）、ＳｅｒＲｅｓ、２７８ｍｔおよびＣＲＰ７７−８３は上述したように合成した。ペプチド２７８ｈ、２７８ｍおよび３４８ｈは、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）用の製造者のプロトコルに従って自動合成機（Applied Biosystem model  ４３０Ａ）で製造した。
ｃ．逆層ＨＰＬＣ：ペプチド産物の最終精製は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水−アセトニトリルグラジエント中で、ＳＰ８７３３可変波長検出器を付けたＳＰ８７５０液体クロマトグラフィーシステムを用いるセミプレパラティブＨＰＬＣ：カラムＲＰ１８（Merck、Darmstadt、ドイツ）によって実施した。溶出液を２２０ｎｍにおけるＵＶ吸収によってモニターした。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルはＭｅｒｃｋ（Darmstadt；ドイツ）から購入した。ＨＰＬＣ精製ペプチドをアミノ酸分析により性状決定した。
ｄ．Ｖｉ：シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）ＷＲ７０１１（National Institute of Health、Bethesda、MarylandのJ.B.RobbinsおよびＳ．Ｃ．Ｓｚｕから恵与された）から精製されたＶｉは、＜１％（それぞれ）のタンパク質、核酸、およびリポ多糖を含んでいた。Ｖｉの分子量は３ｘ１０3ｋＤａと推定された。
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ｅ．Ｖｉと合成ペプチドの結合：種々の結合体合成工程を反応式１に示す。
工程１：
スペーサー（ａ）を介するＶｉとペプチドのカップリング：固相合成の過程で、ペプチドＩＩを通常のアミノ酸残基付加方法によって、Ｖｉ−ペプチド結合体中においてスペーサーとして作用するｔ−Ｂｏｃ−ε−アミノカプロン酸（ＡＣ）によってＮ末端で伸長した。等量のＶｉとペプチドＩＩ−ＡＣを最少量の２回蒸留水（ｄｄｗ）に溶解し、ｐＨを約６に調整した。２当量（ｅｑｖ．）の水溶性カルボジイミド（ＣＤＩ；１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）を数時間の間をおいて２回添加し、反応混合物を一晩（ＯＮ）インキュベートした。粗結合体をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に対して透析し、Ｖｉ中のペプチド密度、すなわちＶｉと結合したペプチド量をアミノ酸分析によって決定した（表２参照）。
ペプチドと共有結合したＶｉの量の評価はフーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴＩＲ）によって実施した。
工程２：
スペーサーを介するＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化Ｖｉとペプチドのカップリング：ペプチドＩＩ−ＡＣと結合する前に、Ｖｉのカルボキシル機能をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｇｍａ）との反応によって活性化した。１当量のＶｉをＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン、Ｒｉｅｄａｌ  Ｄｅ、Ｈａａｎ、ドイツ）中に懸濁し、撹拌してエッペンドルフ遠心管中で５分遠心した。ペレットをＮＭＰに再懸濁し、各５当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと水溶性カルボジイミド（ＣＤＩ）をそれぞれ添加し、おだやかに撹拌しながらインキュベートした。数時間後に、反応混合物を遠心し、ＶｉのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む上清を、ｐＨ７．５の水溶液に溶解した１当量のペプチドＩＩ−ＡＣと混合した。数時間インキュベートした後、結合体をｄｄｗに対して透析し、ペプチド密度をアミノ酸分析によって決定した（表２参照）。
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工程３：
スペーサーを用いないＶｉとタンパク質／ペプチドの結合：１当量のＶｉと１当量のタンパク質／ペプチドとを、最少量のｄｄｗに溶解し、２当量の水可溶性ＣＤＩ（結合ペプチド用）および６０当量の水溶性ＣＤＩ（タンパク質の場合）それぞれの存在下に、ｐＨ６、室温（ＲＴ）で１２時間インキュベートした。反応混合物の透析後、結合体中のタンパク質／ペプチド密度をアミノ酸分析により決定した（表２参照）。
工程４：
溶液（ｂ）中のスペーサーを用いるペプチド鎖の伸長後のＶｉとペプチドのカップリング：ｔ−Ｂｏｃ−εアミノカプロン酸（ｔ−Ｂｏｃ−ＡＣ）のカルボキシル機能をＮ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性化するために、ｔ−Ｂｏｃ−ＡＣ  １ｍｍｏｌを最少量のジオキサン（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．１５ｍｍｏｌと混合し；ジオキサンに溶解したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１．１５ｍｍｏｌを添加し、３時間後に反応混合物を濾過し、ジオキサンで洗浄した。所望のペプチド０．１ｍｍｏｌを少量のｄｄｗに溶解し、ＫＨＣＯ3（Ｍｅｒｃｋ）０．２ｍｍｏｌと混合した。ｔ−Ｂｏｃ−ＡＣのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液と調製したペプチド溶液とを混合し、激しく撹拌しながら１時間反応させた。反応混合物を次いでｄｄｗ（１０ｍｌ）で希釈し、冷却して１Ｎ  ＫＨＳＯ4溶液で酸性にした。生成物を酢酸エチルで抽出した。有機溶液をｄｄｗで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、蒸発乾燥した。Ｐ2Ｏ5で生成物を２時間乾燥した後、これをＴＦＡ（Ｍｅｒｃｋ）４−５ｍｌに溶解して１０分反応させ、液体を３０℃、真空で蒸発させた。この化合物をＣＨ2Ｃｌ2で２回洗浄し、液体を蒸発させてＰ2Ｏ5で２−３時間乾燥した。次いで、ペプチド−ＡＣ産物をｄｄｗに溶解し、ｐＨを８に調製した。ＶｉのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（上記の工程２により調製）５ｍｇを添加した。数時間のインキューベーション後、得られるＶｉ−ＡＣ−ペプチド結合体をｄｄｗに透析した。結合体中のペプチド密度はアミノ酸分析により評価し、結果を表２にまとめた。
ｆ．Ｖｉ断片と合成ペプチドとの結合：Ｖｉ断片（Pasteur-Merieux、フランスのDominique Schulzにより恵与された）を上記の工程３に記載するように合成ペプチドとカップリングさせた。
ｇ．すべてのＤ合成ポリペプチド  ポリ（Ｐｈｅ、ＤＧｌｕ）−ポリ（Ｐｒｏ）−ポリ（Ｌｙｓ）（これ以後ＦＥＰＫという）と合成ｈｓｐ６５ペプチドとの結合：合成のランダム分岐ポリペプチドＦＥＰＫ（Weizmann Institute of Science、イスラエルのEdna MozesおよびMichael Sela教授から恵与された）を工程３により合成ｈｓｐ６５ペプチドとカップリングした。
ｈ．免疫感作：２−３カ月齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｏｌａｃから購入）を、Ｖｉのみ、Ｖｉ−結合体、またはペプチドと混合したＶｉによって、１２日間隔でそれぞれ１、２または３回皮下（ｓｃ）または筋肉内（ｉｍ）に免疫感作した。注射した抗原およびアジュバントの量は実験により異なっていた。各実験群のマウスを各注射の１２日後（抗Ｖｉ抗体産生の長期間追跡用として、最後の注射の７２日後）に採血した。
ｉ．血清学：天然または結合Ｖｉによってマウス中に引き出され得たＶｉ抗体レベルを酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。負に荷電した多糖は固相ＥＬＩＳＡに一般に使用されるポリスチレンに十分付着しないので、正に荷電したメチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて非常に少ない非特異的結合で個体表面上でＶｉをコーティングした。詳しく述べると、Ｖｉ０．５ｍｇをＰＢＳ１ｍｌに溶解し、ＲＴで１時間撹拌した。Ｈ2Ｏ１ｍｌにメチル化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇを懸濁し、得られる溶液を０．８μｍフィルターで濾過した。コーティング溶液を調製するために、溶解多糖１ｍｌをＲＴで２０分間、メチル化ＢＳＡ溶液５０μｌとともに撹拌し、次いでＰＢＳで１：２０に希釈した。Ｎｕｎｃｌｏｎ  ｄｅｌｔａ  Ｓｉマイクロウエルプレートを、１ウエル当たりコーティング溶液１００μｌ（２．５μｇＶｉ／ウエル）を用いて３７℃、３時間コーティングした。プレートを０．３３％Ｂｒｉｊ３５（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳ溶液および１％乾燥スキムミルクで３７℃、２時間ブロックした。洗浄後、希釈した未知の血清および希釈した標準血清（ＰＢＳ中に１％スキムミルクおよび０．３３％Ｂｒｉｊ３５を含む希釈バッファー）のアリコート１００μｌを添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。対照と試験血清を、プレートに二重試験で適用した。洗浄により非結合抗体を除去し、試験血清の場合には適当な希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ2−アルカリホスファターゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）を、標準血清の場合にはヤギ抗ウマＩｇＧ  Ｆａｂ2酵素結合体（Ｓｉｇｍａ）を、プレートに添加した（ウエル当たり１００μｌ）。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ジエタノールアミン−Ｈ2Ｏ、ｐＨ９．８中のｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）０．６ｇ／ｍｌを含む基質溶液１００μｌを添加して発色させた。１ウエル当たり５Ｎ  ＮａＯＨ１０μｌを添加することにより、２０分後に酵素反応を停止した。４０５ｎｍでの光学密度を読み取った。５５０ｍｇＶｉ抗体／ｍｌを含む抗Ｖｉ標準血清Ｂｕｒｒｏ２６０は、ホルマリン固定したＳ．チフィＴｙ２（ＮＩＨ、ＭａｒｙｌａｎｄのＪ．Ｂ．ＲｏｂｂｉｎｓおよびＳ．Ｃ．Ｓｚｕにより恵与された）を多数回静脈内注射することにより調製した。得られる結果を４０５ｎｍにおける光学密度で読み取るか、あるいはμｇＶｉ抗体／ｍｌとして表現する。
実施例
実施例１．Ｖｉ−ペプチド／タンパク質結合体の調製
ＶｉとペプチドＩＩとの結合体をカップリング工程１（Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ）または２（Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ*）によって調製した。Ｖｉとペプチド２７８、２７８ｍ、２７８ｍｔ、３４８ｈおよびオボアルブミン（Ｏｖａ）との結合体をカップリング工程３によって調製し、ＶｉとＣＲＰ７７−８３および２７７（Ｓ）との結合体は工程４によって調製した。
Ｖｉ−結合体のいくつかの組成をアミノ酸分析によって決定した。表２に示す結果は、Ｖｉモノマー当たりのペプチド／タンパク質のモル比がさまざまであることを表す。糖−ペプチド結合体として、マウス当たりに注射したペプチド用量０．１−２．０μｇが最も有効であることが示された。
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実施例２．ＶｉおよびＶｉ−結合体の免疫学的性質
２．１．天然Ｖｉの抗原性：Ｖｉによって誘導される抗体応答を試験するため、２−３カ月齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり４−５匹マウス）に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の種々の用量のＶｉ−抗原のみを２週間ごとに皮下（ｓｃ）注射した。初回の免疫感作の１２日および２４日後、ならびに２回目の免疫感作の１２日後にマウスから採血した。１群に属するすべてのマウスの血清を集めた。材料および方法の項で記載したＥＬＩＳＡによって抗Ｖｉ抗体を測定し、特異的抗体レベルを吸光度405（Ａ405）で表した。
図１に示すように、１回のＶｉ注射でマウスにＶｉ抗体を引き出した。Ｖｉの再注射は、Ｔ−ｉｎｄ抗原で予期されるような追加免疫効果を誘導しなかった。マウス当たりＩＦＡ中の２．５μｇＶｉで皮下免疫感作すると、最も強い特異的抗体産生が得られる；用量を多くしても増強された免疫応答をもたらさなかった。
この実験で使用したＶｉ−調製物は少量の（＜１％）のタンパク質を含んでいた。比較的高いＶｉ−免疫応答はこの事実で説明できるかも知れない。
２．２．Ｖｉ−結合体の抗原性
２．２．１．注射した抗原用量との関連：Ｖｉの天然および結合形の免疫原性に対する種々の用量の効果を調べた。２．５μｇまたは０．２５μｇのＶｉのみ、あるいはＶｉを２．５μｇまたは０．２５μｇ含むＶｉ−結合体：  Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ、Ｖｉ−Ｐｅｐ３４８ｈの注射によってマウスに抗Ｖｉ抗体応答を誘導した。１群当たり４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにＶｉ２．５μｇのみ、あるいはＩＦＡ中の結合体として２週間ごとに免疫感作した（結合体としてのペプチド注射量は表３を参照）。抗Ｖｉ抗体応答はＥＬＩＳＡで測定し、特異的免疫応答の大きさは図２に示すように、Ａ405で表した。各パネルは、同じ抗原を注射した４匹の個々のマウスから得られた血清の幾何平均を示す。Ｖｉのみ、またはＩＦＡ中のＰＢＳで免疫感作した４匹のマウスから集めた血清をそれぞれ対照として用いた。
図２に示す結果は、２．５μｇのＶｉのみ、または結合体として（対応するペプチドの注射量は表３ｂを参照）初回免疫した１２日後に、すべてのＶｉ−ペプチド結合体が、天然形Ｖｉで引き出されたものよりも低い抗Ｖｉ免疫応答を示した（図２ａ、パネルＡ）。新たに免疫感作することなくさらに１２日間Ｖｉ抗体レベルをモニターしたところ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈを注射したマウスでＶｉ特異的抗体の明瞭な増加が示唆された（図２ａ、パネルＢ）。再注射によって、Ｖｉ−ＰｅｐＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈでそれぞれ免疫感作したものに顕著な追加免疫応答が引き出されたが、Ｖｉのみでは引き出されなかった（図２ａ、パネルＣ）。
マウス当たり０．２５μｇにＶｉ注射用量を減少する（対応するペプチドの注射量は表３ａを参照）と、Ｖｉのみ、およびＶｉ−ＰｅｐＩＩで誘導されるＶｉ抗体レベルがごくわずかであった（図２ｂ、パネルＡ−Ｃ）。これとは対照的に、２回目の免疫感作でＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ結合体によって引き出された免疫応答は明瞭な追加免疫効果を示した（図２ｂ、パネルＣ）。興味深いことに、この結合体中の注射されたペプチド量は動物当たり０．１７μｇにすぎないことに注意されたい（表３ａ参照）。
２．２．２．上述したように免疫感作したマウスにおけるＶｉまたはＶｉ−結合体で誘導された抗Ｖｉ抗体産生の動力学を試験した。Ｖｉのみによって誘導されるよりも高いレベルの抗Ｖｉ抗体を陽性とみなし、Ｖｉのみによって誘導されるよりも低いレベルの抗Ｖｉ抗体を陰性とみなした。ＥＬＩＳＡによって血清のＶｉ抗体をアッセイした。結果を図３にＡ405として表し、１抗原につき注射した４匹のマウスの血清から得られた幾何平均±ＳＤを示す。
図３（ａ−ｂ）は、２つの異なる抗原用量でＶｉおよびＶｉ−結合体を２回連続注射したときのＶｉ抗体産生の進展を示す。図３ａ（Ａ）：Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ、Ｖｉ−Ｏｖａ、Ｖｉ−Ｐｅｐ３４８およびＶｉ−ＣＲＰ７７−８３のマウス当たり２．５μｇＶｉ注射；図３ｂ（Ａ）：Ｖｉ−ＰｅｐＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈのマウス当たり０．２５μｇＶｉ注射。パネルＢ：  比較のため、Ｖｉ２．５μｇのみによって誘導されるＶｉ抗体レベル。図３ａ（Ａ）に示すように、同量のＶｉを注射したにもかかわらず、初回の免疫感作の１２日後に、すべての結合体は、Ｖｉのみによって引き出されるよりも明らかに低いＶｉ抗体レベルを誘導した。約１２日間の“遅延”期の後、Ｖｉ−結合体で免疫感作した動物の血清は、特異的Ｖｉ抗体レベルの顕著な増加を示した。この効果はいずれの用量においても結合体Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈで特に明瞭である（図３ａ−ｂ、パネルＡ）。２４日後の再注射は、Ｔ−ｄｅｐ抗原に典型的な追加免疫応答を引き出した（比較のため図３ａ−ｂのパネルＢを参照されたい）。Ｖｉ−ＰｅｐＩＩ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈおよびＶｉ−Ｏｖａは、Ｖｉのみの注射によって引き出されるよりも高いＶｉ抗体レベルを誘導した。注目すべきは、結合体Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈが、Ｖｉ−タンパク質結合体Ｖｉ−Ｏｖａよりも強い抗Ｖｉ免疫応答を引き起こしたことである（図３ａ、パネルＡ）。
１０倍低い抗原用量での免疫感作は、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによって誘導されるＶｉ抗体産生の上記効果を強調した（図３ｂ、パネルＡ）。
Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ結合体によってマウス中に引き出されたＶｉ抗体濃度を表４に示す。Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによって誘導される特異的抗体レベルは、初回の免疫感作の１３日から２４日後に３０倍増加した。再注射はＶｉ抗体濃度を約３μｇ／ｍｌまで倍増し、Ｖｉのみによって引き出されるよりも５５倍高かった。
２．２．３．抗Ｖｉ抗体の特異性。Ｔ−ｄｅｐ抗原に対する免疫応答は、免疫記憶の概念と関連してきた胚中心の形成を特徴とする。これらはＢ細胞にＶ遺伝子が過剰突然変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）させることを可能とする特定の微小環境を提供して、高い親和性のレセプター及び変更したイソタイプ分布をもつ抗体を発現させると信じられている。
Ｖｉ−ペプチド結合体によって誘導されるＶｉ−特異的Ｂ細胞がこの突然変異過程を経るのか否かを試験するために、天然および結合体形によって引き出されるＶｉ抗体の特異性を比較した。４−５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、それぞれ２．５μｇのＶｉを単独または結合体として含む、ＩＦＡ中の抗原Ｖｉ、Ｖｉ−ＰｅｐＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈを免疫感作（ｓｃ）した。２回目の注射の１２日後に動物を採血し、Ｖｉ抗体をＥＬＩＳＡで測定した。図４中の記号は各群の個々の代表的マウスを表す。ＥＬＩＳＡプレートはウエル当たり２．５μｇＶｉ（パネルＡ）、またはウエル当たり１．２５μｇＶｉ（パネルＢ）でコーティングした；図４（パネルＡ）は、Ｖｉのみによって誘導されたＶｉ特異的抗体の力価はＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによって誘導されたものよりも低いことを示す。ＥＬＩＳＡプレートにコーティングする抗原量を減少する（図４、パネルＢ）と、さらにはっきりした結果が明らかとなる。Ｖｉ−ペプチド結合体によって誘導されたＶｉ抗体は、減少した量のＶｉを有意なレベルで認識するが、天然Ｖｉのみによって免疫感作したマウスの血清は、単に何らかの結合を示すだけである。
Ｖｉ−ペプチド結合体のＴ−ｄｅｐ性質をさらに確認するために、Ｖｉのみ、またはＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈで上記のように免疫感作したマウスで引き出されたＶｉ抗体のイソタイプ分布を決定した。免疫感作したマウスにおける抗Ｖｉ抗体のＩｇＭおよびＩｇＧ組成をＥＬＩＳＡでアッセイした。Ｖｉを認識する特異的ＩｇＭ抗体をヤギ抗マウスＦａｂ2ＩｇＭパーオキシダーゼ結合体を用いて検出し（図５、パネルＡ）、特異的ＩｇＧ抗体をヤギ抗マウスＦａｂ2ＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体を用いて検出した（図５、パネルＢ）。結果を１匹の代表的マウスで示す。
免疫感作を繰り返した後に得られた抗Ｖｉ血清のイソタイプ特異性を図５に示す。天然Ｖｉ分子に対する抗体は、ＩｇＭイソタイプクラスに主として限定されるように思われるが、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ結合体はさらにＶｉ抗原に対する明瞭なＩｇＧ抗体応答を引き出し、このことは、選択されたＴ細胞エピトープ（この場合にはペプチド２７８ｈ）のＴ−ｉｎｄ抗原（Ｖｉなど）へのカップリングが、Ｔ−ｄｅｐ抗原で普通観察されるＶｉ−特異的Ｂ細胞集団のイソタイプクラススイッチをもたらすことを示唆する。
長期間の抗Ｖｉ抗体産生を追跡するために、動物に３回目の免疫感作を行い、特異的免疫応答を７２日間にわたってモニターした。４−５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、ＩＦＡ中のＶｉのみ、Ｖｉ−ＰｅｐＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ抗原を図６に示す時点でｓｃ注射した。個々の血清中のＶｉ抗体レベルをＥＬＩＳＡで測定することによって、１０８日間（最後の免疫感作の７２日後）にわたって免疫応答をモニターした。得られた結果を幾何平均で表し、１：１００（パネルＡ）および１：１０００（パネルＢ）の血清希釈度で示す。Ｖｉ−ペプチド結合体Ｖｉ−ＰｅｐＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈを追加的に注射した後の追加免疫効果は観察されなかった。これらの結合体によって誘導される抗ＶｉレベルはＶｉのみによって引き出されるレベルよりも高く、２．５カ月間減少せず（図６）、さらに最後の注射の６カ月後にも減少しなかった（データ示さず）。
２．２．４．Ｖｉ−Ｐｅｐ  ＩＩにより誘導される抗Ｖｉ抗体産生に対するアジュバントおよび免疫処置方法の効果。天然および修飾ＶｉによるＶｉ特異的抗体形成に及ぼすアジュバントの影響を試験するため、抗原をＩＦＡまたはＰＢＳに混ぜて皮下注射した。Ｖｉ−Ｐｅｐ II結合体は、ＩＦＡおよびＰＢＳに混ぜて調製した。４匹のマウスからなる１グループには各抗原調製物を皮下注射し（パネルＡ）、第２グループにはそれを筋肉内注射した（パネルＢ）（マウス１匹あたりＶｉ  ２．５μｇを注射）。初回の免疫処置後１２日（パネルａ）および２４日（パネルｂ）、ならびに第２回の免疫処置後１２日（パネルｃ）に血清を採取した。抗Ｖｉ抗体をＥＬＩＳＡにより測定し、Ａ405として表し、平均値±ＳＤを示してある。図７Ａに提示されている結果は、Ｔ細胞依存性免疫応答の反応速度論を表現するためにはＩＦＡが必要であることを示している。
Ｖｉを筋肉内に投与することによる免疫処置方法の変更は、（図７Ｂに示されるように）２つの事実を例証する。第１に、Ｖｉ結合体の筋肉内投与は、同一の抗原調製物の皮下投与によってもたらされるものよりも高い一次Ｖｉ免疫応答を引き起こす。第２に、この筋肉内への注射経路は、皮下免疫処置では観察されるブースター効果をもたらさない。同じ傾向が、ＰＢＳに混ぜたＶｉ−Ｐｅｐ  ＩＩを皮下または筋肉内に注射することにより観察された（図７Ａ−Ｂ）。
ＩＦＡ、ＰＢＳまたはＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）に混ぜた結合体Ｖｉ−２７８ｈで免疫処置したマウスを用いた更なる実験において、これら３つのアジュバントについて抗Ｖｉ抗体の同等な力価が得られた（データはここに示していない）。
２．２．５．免疫処置の前にＶｉと混合した遊離ペプチドＩＩによって誘導される抗Ｖｉ抗体産生。免疫処置の前にＶｉをペプチドエピトープと共有結合で結合させる必要性を評価するために、ＶｉとＰｅｐ  ＩＩを物理的に混合し、ＩＦＡに混ぜて雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに皮下注射し、結合体Ｖｉ−ＰｅＰ  ＩＩを用いた免疫処置と比較した。抗原調製物は両方ともＩＦＡに混ぜて４匹のマウスからなるグループに皮下注射した（Ｐｅｐ  ＩＩとＶｉの混合物は１本の注射器で注射した）。初回免疫処置後１２日および２４日後（それぞれパネルＡおよびＢ参照）、ならびに第２回免疫処置後１２日（パネルＣ参照）に動物から採血した。抗Ｖｉ抗体をＥＬＩＳＡにより測定し、結果をＡ405として示した。各曲線は幾何平均±ＳＤを表す。
図８に示されるように、ＶｉとＰｅｐ  ＩＩの混合は、Ｖｉ−Ｐｅｐ  ＩＩ結合体について描かれているのと全く同一の免疫応答をもたらした。最初の免疫処置だけでは低いＶｉ抗体レベルとなったが、再注射は明確なブースター効果を生じた。
２．２．６．抗Ｖｉ抗体産生に対する「担体」プライミングの効果。Ｖｉ−ペプチド結合体により誘導される多糖応答に対する遊離ペプチドによるプライミングの効果を試験するため、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹からなるグループを、１匹あたりＩＦＡに混ぜたペプチドＩＩ  １μｇを用いて皮下注射でプライミングした。２週間後、動物に２．５μｇのＶｉを含有するＶｉ−Ｐｅｐ  ＩＩ結合体を注射した。血清を図９に示す時点で採取し、ＥＬＩＳＡにより分析した。これらの図示された時点で測定した抗多糖抗体レベルを図９に示す。マウス１匹あたりペプチド  ＩＩ  １μｇの用量を用いてのプライミングは、プライミングしていない動物において誘導される抗体レベルと比較して、Ｖｉへのより強い一次免疫応答をもたらした。しかし、二次免疫応答に関してはプライミングのいかなる効果も観察されなかった。
２．２．７．同一個体マウスにおいて、抗Ｖｉ免疫反応はＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによって誘導され得るが、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）によってはなされない。４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスよりなるグループに、ＩＦＡに混ぜたＶｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）を２週間の間隔をおき皮下注射した（各マウスに注射された結合体のＶｉ含有量は２．５μｇ）。抗Ｖｉ免疫応答を初回注射後１２日および第２回注射後１２日にＥＬＩＳＡにより測定した（それぞれ図１０、パネルＡおよびＢ参照）。これらの動物のうち２匹にＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈを再注射し、他の２匹にＶｉのみを再注射した（Ｖｉ単独でまたは結合体として２．５μｇ）。再度、初回および第２回免疫処置後１２日にマウスから採血し、Ｖｉ抗体レベルを測定した。比較のため、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈのみを注射した動物において誘導された免疫応答を同じ図面に描いてある。結果は、Ａ405として示され、２つの異なる血清希釈率１：５０（図１０、パネルａ参照）および１：１０００（図１０、パネルｂ参照）で表されている。これらのデータは幾何平均±ＳＤを示す。抗原Ａ＝Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）、抗原Ｂ＝Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ（マウスにＶｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）を注射した後）、抗原Ｃ＝Ｖｉ単独（マウスにＶｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）を注射した後）、抗原Ｄ＝Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ。
図１０に示されるように、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）による雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫処置は検出可能なＶｉ抗体応答をもたらさなかった（抗原Ａ）。この非応答性を個々のマウスに、または特定結合体に存在する特徴に、帰し得るかどうかを調べるため、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）に反応しなかった同じマウスをＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ（抗原Ｂ）または天然Ｖｉ（抗原Ｃ）でそれぞれ免疫処置した。Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈを用いた再注射は、最終的にＶｉ抗体レベルを、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ（抗原Ｄ）のみを注射されたマウスについて示されているように高めることができた。Ｖｉのみを用いた再注射もＶｉ免疫応答を増大させたが、Ｖｉ結合体によって誘導されたものより程度は低かった。
２．２．８．種々の抗Ｖｉ血清によるＶｉ−ペプチド結合体の認識。ＶｉならびにＶｉ−ペプチド結合体、すなわちＶｉ−ＰｅｐＩＩ、Ｖｉ−Ｐｅｐ II*、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈおよびＶｉ−ＣＲＰ７７−８３を免疫原として使用し、ＥＬＩＳＡプレートに塗布して、対応する結合体によって免疫処置された動物から得た血清または他のＶｉ結合体によって免疫処置された動物から得た血清による認識を検査した。結合した抗体の量はＥＬＩＳＡにより測定し、図１１にＡ405として示してある。標準抗Ｖｉ血清Burro 260（パネルＡ）を１：１２０００の血清希釈で使用し、他の血清（パネルＢ〜Ｆ）は１：２００に希釈した。
ペプチドの結合が結合体のＶｉ部分の抗原構造を変化させたかどうかを分析するため、異なるＶｉ結合体および天然のＶｉを、基準となる抗Ｖｉ血清Burro 260による認識についてスクリーニングした（図１１、パネルＡ参照）。ペプチドのＶｉへの結合は、Ｖｉ分子の抗原活性に影響を与えたように思われた。なぜなら、すべての結合体は天然のＶｉに比較してBurro 260抗血清による減少した認識を示したからである。Ｖｉ分子に負荷したペプチドの量との相関関係は全く見いだされなかった（表２参照）。しかし、これらの結果は異なるＶｉ−ペプチド結合体によって示された抗原活性に見られる差を一部説明するかもしれない。Ｖｉ−Ｐｅｐ  ＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈは、より免疫原性の低い結合体Ｖｉ−Ｐｅｐ  ＩＩ*およびＶｉ−ＣＲＰ７７−８３に較べ、Burro 260抗血清中に含有されるＶｉ抗体のより多くの量と結合するように見える。
異なる結合体によって誘導されるＶｉ抗体の特徴づけを図１１、パネルＢ〜Ｆに示す。Ｖｉ−Ｐｅｐ  ＩＩおよびＶｉ−Ｐｅｐ２７８ｈによって誘導された抗血清は、天然のＶｉ分子と最も高い交差反応性を示したが、驚くべきことに、抗血清をもたらした結合体には低い認識しか示さなかった。Ｖｉ−Ｐｅｐ  ＩＩ*およびＶｉ−ＣＲＰ７７−８３の注射後に得られた抗血清は、天然Ｖｉ分子または提示された結合体抗原への結合を何ら示さなかった。選択されたペプチドの性質はさて置き、これらの結果はＶｉ−ペプチド結合体の免疫原性へのペプチド負荷および結合方法の影響を示している。
２．２．９．異なるマウス系統におけるＶｉ−ペプチド結合体への免疫応答。ＭＨＣ遺伝子のみが異なるマウスの共通遺伝子系系統におけるＶｉ−ペプチド結合体の免疫原性を調べるため、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２a）、ＢＡＬＢ／ｋ（Ｈ−２k）およびＢＡＬＢ／ｂ（Ｈ−２b）マウスをＶｉ単独または結合体Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｈ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｍ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７８ｍｔ、Ｖｉ−Ｐｅｐ２７７（Ｓ）、Ｖｉ−ＳＲｅｓ（Ｖｉ−ＳｅｒＲｅｓ）により免疫処置した。ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＡＬＢ／ｋ、ＢＡＬＢ／ｂ、ＮＯＤおよびＮＯＮ．ＮＯＤの各系統（図１２、それぞれパネルＡからＥ参照）の１グループあたり５匹のマウスに、図に示された結合体のＶｉ  ２μｇをＩＦＡ中に乳化して皮下注射した。４週間後にマウスは同一抗原用量のブースター注射を受け、１２日後に放血された。個々のマウスの血清を、Ｖｉ抗体についてＥＬＩＳＡにより検査した。特異的抗体レベルを図１２に標準抗Ｖｉ血清（Burro 260）の百分率として示してある。
図１２の結果は、Ｖｉ−２７８ｈおよびＶｉ−２７８ｍ結合体反応が、あるＭＨＣ制限に限定されないことを示している。ペプチドは、ＢＡＬＢ／ｃおよびＢＡＬＢ／ｋマウスの両方において結合体の糖部分に対して増強された抗体力価を誘導した。対照的に、ＢＡＬＢ／ｂマウスは注射したいかなる結合体とも反応しなかった。したがって、３つのＭＨＣ遺伝子型のうち２つは応答者（responder）であった。
同一のＭＨＣ遺伝子（Ｈ−２NOD）を共有するＮＯＤおよびＮＯＮ．ＮＯＤマウスはＶｉ−ペプチド結合体に対して異なった免疫学的反応パターンを示す。ミコバクテリア２７８ｍｔ相同体のみがＶｉ特異的ヘルパー効果を与えることができた。
２．２．１０．抗Ｖｉ血清のＩｇＧイソタイプ分布。１グループあたり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをＩＦＡ中に乳化した２μｇのＶｉ単独またはＶｉ−２７８ｈ結合体で皮下注射により免疫処置した。４週間後にマウスに同一抗原用量のブースターを与え、１２日後に放血させた。個々の血清サンプルを、ビオチニル化ウサギ抗マウスサブクラス特異的抗血清およびストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼを使用して、抗多糖ＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡにより分析した。Ｖｉ抗体レベルは吸光度４０５nm（Ａ405）として示されている。
細菌の炭水化物に対するマウス抗体のサブクラス分布の検討は、炭水化物のみが希なＩｇＧ３サブクラスに主として限定されたＩｇＧ応答を刺激する、という驚くべき観察をもたらした。細菌莢膜多糖類と結合したＢＳＡまたは破傷風トキソイドのような担体タンパク質は、マウスにおいて主にＩｇＧ１イソタイプの抗糖抗体を誘導する傾向がある。
Ｖｉと結合したペプチド２７８ｈの効果を調べるため、抗Ｖｉ血清のＩｇＧサブクラス分布を測定した。図１３に描かれるように、単独で注射したＶｉは主にＩｇＧ３サブクラスに限定された免疫応答を引き出した。他方、ペプチド−糖  Ｖｉ−２７８ｈ結合体はサブクラス分布をＩｇＧ１が優勢なものに明白に変えた。
それゆえ、ｈｓｐ６５ペプチドのＴ細胞非依存性抗原への結合は、複合体のＴ細胞非依存性部分に対する免疫反応においてかなりの質的変化を誘導し得るように思われる。
実施例３．
３．１．Ｖｉ断片−ペプチド結合体の抗原性。Ｖｉ抗原を含む多糖類の免疫原性は、その分子サイズに関連している。超音波開裂（単量体単位の構造を変えずまた比較的均質な多糖をもたらす）により調製されるＶｉ断片（約４５ｋＤａ）は、天然のＶｉ（約３ｘ１０3ｋＤａ）よりも免疫原性が低い（Szuら、1989）。１グループあたり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＩＦＡ中に乳化した２μｇのＶｉ断片を単独で、またはペプチド２７８ｈとの結合体として、皮下注射した。ブースター注射後１２日目に、血清サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによりＶｉ断片抗体について試験した。特異的抗体レベルは標準抗Ｖｉ血清の百分率として表わされている。
図１４に示されるように、２μｇのＶｉ断片単独によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫処置は、いかなる抗Ｖｉ応答も引き起こさなかった。対照的に、ペプチド２７８ｈと結合したＶｉ断片は、抗Ｖｉ抗体の有意な力価を引き起こす増強された抗原性を示した。
実施例４．
４．１．ペプチド２７８ｈの相同体と結合したＶｉの抗原性。ｈｓｐ６５から誘導された、自己および非自己エピトープを提示するペプチドが、マウスにおいてＴ細胞非依存性抗原のためのＴ細胞担体として機能し得るかどうかを確認するため、我々はヒト２７８配列のマウスおよびマイコバクテリア変異体にそれぞれ対応するペプチド２７８ｍおよび２７８ｍｔを合成し（表１参照）、それらをＶｉに結合した。４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＩＦＡ中で乳化した２μｇのＶｉ単独またはＶｉ−２７８ｈ、Ｖｉ−２７８ｍ、Ｖｉ−２７８ｍｔ、およびＶｉ−ＳｅｒＲｅｓ結合体を皮下注射した。ブースター注射の１２日後に、マウスを放血させ、血清をＥＬＩＳＡによりＶｉ抗体について調べた。特異的抗体レベルは標準抗Ｖｉ血清の百分率として表わされる。
図１５は、マウス２７８ｍ相同体によって提示された自己エピトープが、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射されたＴ細胞非依存性抗原Ｖｉに対する免疫応答を増強できることを明確に示している。マイコバクテリアの２７８エピトープはＢＡＬＢ／ｃマウスにおいていかなるヘルパー効果も示さなかったが、これはＮＯＤおよびＮＯＮ．ＮＯＤマウスにおいてＴ細胞担体として機能している唯一の調査されたペプチドであった（図１２参照）。
実施例５．
５．１．合成ランダム分枝ポリペプチドのＤ異性体のためのＴ細胞担体として機能するペプチド２７８ｈの能力。アミノ酸のＤ異性体によって構成される合成ポリマーは、Ｔ細胞非依存性抗原のグループに属することが知られている。ｈｓｐ６５誘導ペプチドがこの抗原グループに対してもＴ細胞担体として機能し得るかどうかを突き止めるため、我々はＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ｈｓｐ６５ペプチド２７８ｈまたは３４８ｈと合成ポリペプチド  ポリ（Ｐｈｅ，Ｇｌｕ）−ポリ（Ｐｒｏ）−ポリ（Ｌｙｓ）（ＦＥＰＫ）との結合体に対する免疫応答を調べた。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ポリペプチドＦＥＰＫを単独で、またはペプチド２７８ｈまたは３４８ｈと結合させて、ＩＦＡ中に乳化させて皮下注射し免疫処置した。同一の抗原調製物によるブースター注射の１０日後に、個々のマウスの血清サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡの変法によりＦＥＰＫ特異的抗体について調べた。プレートを２．５μｇのＦＥＰＫで覆い、１晩４℃でインキュベートした。残りの手順は「材料および方法」に記述したように実施した。結果は光学濃度４０５（ＯＤ405）として示してある。
ポリペプチド単独により引き出されるＩｇＧ１免疫応答と、ペプチド２７８ｈと結合したポリペプチドにより誘導されるそれとの比較は、結合体の優れた免疫原性を実証する。対照ペプチド３４８ｈは、このペプチドを多糖Ｖｉと結合することによって得た結果と一致して、ヘルパー効果を何ら示さなかった（図１６参照）。それゆえ、ペプチド２７８ｈはＴ細胞非依存性糖抗原のＴ細胞担体としてだけではなく、アミノ酸で構成された合成ポリペプチドのＴ細胞担体としても機能し得る。
上記の実験は、本発明のＶｉ−ペプチド結合体がＴ細胞依存性抗原に特徴的な免疫応答をもたらすＴリンパ球ヘルパー効果を増強することができるという証拠を提供する。この証拠は以下のように要約することができる。
（ｉ）Ｖｉの免疫原性は、特定のペプチド候補と結合した結合体として提供されたとき、増大した；この効果は共有結合に依存するものではないかもしれない、なぜならこの２つの成分の単純な混合が同様な免疫応答をもたらしたからである。
（ｉｉ）結合体のＶｉ成分の免疫原性は、多糖と結合したペプチドが何であるかに関連しているかもしれない。本発明によるペプチドＰｅｐ  IIおよびＰｅｐ２７８ｈは、Ｖｉの免疫原性を増強した。他方、対照ペプチド３４８ｈ、２７７（Ｓ）およびＣＲＰ  ７７−８３は、血清抗Ｖｉ応答を誘導しなかった。
（ｉｉｉ）Ｖｉ−ペプチド結合体の再注射は、抗Ｖｉ抗体レベルの上昇（ブースター効果）を引き起こした。
（ｉｖ）Ｖｉ−ペプチド結合体により誘導された抗Ｖｉ抗体は、Ｖｉ単独によって誘導された抗Ｖｉ抗体よりも抗原特異性が高いように思われ、そして主としてＩｇＧイソタイプによりもたらされる。
（ｖ）Ｐｅｐ  ＩＩにより誘導される「ペプチドプライミング」は、対応するＶｉ−ペプチド結合体を用いた最初の免疫処置に対する増強された血清抗Ｖｉ抗体応答をもたらした。
（ｖｉ）皮下経路による抗原投与およびＩＦＡの使用の両方が、Ｔ細胞依存性抗原に特徴的な抗Ｖｉ免疫応答の誘導に必要であるように思われる。
ヒトＰｅｐ２７８ｈを用いた上記の結果のすべては、マウス変異体Ｐｅｐ２７８ｍ配列（これは４７１位でＡがＴに置換されている点でヒトＰｅｐ２７８ｈと違っている）を用いて繰り返された。Ｐｅｐ２７８ｍはマウスの自己エピトープであるという事実にも関わらず、それはＶｉの免疫原性を増大させる際、Ｔ細胞担体として機能した。それゆえ、マウスは自己および殆ど自己であるマウスおよびヒト配列の両方に応答し、このことはマウスがマウス配列に応答するのと全く同じようにヒトはヒト配列に応答するであろうことを示す。
これらすべては、多糖−ペプチド結合体のＶｉ成分が胸腺非依存性から胸腺依存性免疫原に転換されたことを示す。
ヒトｈｓｐ６５から誘導されたペプチドを、免疫原性に乏しい抗原分子の免疫原性を増強するのに使用し得ることは自明ではない。なぜなら第一に、自己タンパク質として、ヒトｈｓｐ６５はヒトにおいて免疫原性があるとは考えられていないからである。第２に、ヒト配列由来のペプチド（例えば、Ｐｅｐ２７８など）は、自己免疫応答の寛容／ダウンレギュレーションの誘導に関して何ら効果をもたないことが以前に示されたからである（WO90/10449）。
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【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号：２
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号：３
配列の長さ：17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号：４
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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【図１】
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【図２】
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0004087898.tif 000026
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004087898.tif 000032
【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
0004087898.tif 000036
【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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