(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
(a)Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号２）
(b)Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号３）
(c)Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号４）
(d)Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号５）
(e)Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号６）
(f)Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val （配列番号７）
【請求項２】
Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されたものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分とする抗菌剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分とする医薬。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分とする細菌感染症治療剤。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分とするエンドトキシンショック抑制剤。
【請求項７】
不溶性担体に固着された請求項１又は２に記載のペプチドからなる、エンドトキシン除去剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な抗菌性ペプチドに関し、詳しくは、ヒト由来の抗菌性タンパク質の部分ペプチドの一部アミノ酸残基を置換した抗菌性ペプチドに関する。また本発明は、前記抗菌性ペプチドを有効成分とする抗菌剤、並びに、細菌感染症治療剤及びエンドトキシンショック抑制剤などの医薬に関する。さらに、本発明は、不溶性担体に固着された前記抗菌性ペプチドからなる、エンドトキシン除去剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
CAP18(Cationic antimicrobial protein of 18kDa)は、ヒト及びウサギの顆粒球から見いだされた抗菌性タンパク質である。
【０００３】
特表平８−５０４０８５号公報には、ヒト由来のCAP18の、シグナルペプチド部分を含む全アミノ酸配列が記載されている。また、一部の配列がウサギ由来の配列で置換されているヒト由来のCAP18のＣ末端側３７アミノ酸残基からなる部分ペプチドも記載されている。
【０００４】
「ミノファーゲン・メディカル・レビュー(MINOPHAGEN MEDICAL REVIEW)」第43巻 第１号 pp1-15 (1998)には、ヒト由来のCAP18の全アミノ酸配列が記載されている。またヒト由来のCAP18のＣ末端領域の３４、３２、３０、２７、２４又は２２アミノ酸残基からなる部分ペプチドも記載されている。またこれらペプチドの、大腸菌、サルモネラ菌、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)に対する抗菌活性についてのデータが示されている。
【０００５】
「現代医療」第28巻(増刊III) pp2367-2375 (1996)には、ヒト由来のCAP18の全アミノ酸配列が記載されている。またヒト由来のCAP18のＣ末端領域の３４、３０、２７、２４又は２２アミノ酸残基からなる部分ペプチドも記載されている。またこれらペプチドによるリポポリサッカライド（ＬＰＳ；エンドトキシンとも呼ばれる）活性の抑制についてのデータが記載されている。
【０００６】
SHOCK；From Molecular and Cellular Level to Whole Body (Proceedings of the Third International Shock Congress-Shock'95, Hamamatsu, Japan, 21-23 October, 1995), Okada,K., Ogata,H. eds. Elsevier Science B.V. pp109-115, (1996)には、ヒト由来のCAP18の全アミノ酸配列が記載されている。またヒト由来のCAP18のＣ末端領域の３４、３０、２７又は２４アミノ酸残基からなる部分ペプチドも記載されている。またこれらペプチドのＬＰＳへの結合活性についてのデータが記載されている。
【０００７】
Bacterial Endotoxins；Lipopolysaccharides From Genes to Therapy. Levin,J., Alving,C.R, Munford,R.S., Redl,H. eds. Wiley-Liss, Inc, New York, pp317-326, (1995)には、ヒト由来のCAP18のＣ末端領域の３７又は３２アミノ酸残基からなる部分ペプチドが記載されている。またこれらペプチドの、ＬＰＳによる組織因子産生に与える影響、エンドトキシンショックによる致死の抑制及び抗菌活性についてのデータが記載されている。
【０００８】
しかしながら、CAP18の公知の部分ペプチドに共通する部分において特定の位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換したペプチドについては、記載もないし示唆もない。また、このように特定のアミノ酸残基を置換した部分ペプチドが、公知の部分ペプチドよりも顕著に高いＬＰＳ結合活性、抗菌活性及びＬＰＳ中和活性を示すことについての記載もないし示唆もない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ヒト由来であり、かつＬＰＳ結合活性、抗菌活性及びＬＰＳ中和活性が非常に高いペプチドが得られれば、ヒトに対して安全な抗菌剤、細菌感染症治療剤、エンドトキシンショック抑制剤、エンドトキシン除去剤などを、極めて安価に提供することができる。
【００１０】
本発明は上記観点からなされたものであり、ＬＰＳ結合活性、抗菌活性及びＬＰＳ中和活性が顕著に高いヒト由来のペプチド、並びに当該ペプチドを有効成分とする抗菌剤、細菌感染症治療剤、エンドトキシンショック抑制剤及びエンドトキシン除去剤などを提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒト由来のCAP18の部分ペプチドの特定の位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換したペプチドが、公知の部分ペプチドよりも顕著に高いＬＰＳ結合活性、抗菌活性及びＬＰＳ中和活性を示すことを見出し、さらにこのペプチドが抗菌剤、細菌感染症治療剤、エンドトキシンショック抑制剤及びエンドトキシン除去剤として利用可能であることを確認し、本発明に至った。
【００１２】
すなわち本発明は、下記アミノ酸配列（配列番号１）を少なくとも含むペプチド（以下、本発明ペプチドともいう）を提供する。
Lys Xa1 Phe Lys Arg Ile Val Xa2 Arg Ile Xaa Xa2 Phe Leu Arg Xa2 Leu Val
（但し、Xa1は疎水性アミノ酸残基を、Xa2は親水性アミノ酸残基を、Xaaは任意のアミノ酸残基を示す）
【００１３】
本発明ペプチドは、好ましくは、下記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなる。
(a)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号２）
(b)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号３）
(c)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号４）
(d)
Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号５）
(e)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号６）
(f)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val（配列番号７）
【００１４】
さらに本発明は、本発明ペプチドを有効成分とする抗菌剤（以下、本発明抗菌剤という）、並びに、細菌感染症治療剤（以下、本発明細菌感染症治療剤という）、及びエンドトキシンショック抑制剤（以下、本発明エンドトキシンショック抑制剤という）を包含する医薬（以下、本発明医薬という）、並びに、エンドトキシン除去剤（以下、本発明エンドトキシン除去剤という）を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態について説明する。
＜１＞本発明ペプチド
本発明ペプチドは、下記アミノ酸配列（配列番号１）を少なくとも含むペプチドである。
Lys Xa1 Phe Lys Arg Ile Val Xa2 Arg Ile Xaa Xa2 Phe Leu Arg Xa2 Leu Val（但し、Xa1は疎水性アミノ酸残基を、Xa2は親水性アミノ酸残基を、Xaaは任意のアミノ酸残基を示す）
【００１６】
本発明ペプチドには、下記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが包含される。
(a)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号２）
(b)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号３）
(c)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号４）
(d)
Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号５）
(e)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号６）
(f)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val（配列番号７）
【００１７】
なお、本発明においてアミノ酸とは、特にことわらない限りＬ−アミノ酸を意味する。
また、本発明において疎水性アミノ酸残基は、疎水性のアミノ酸残基である限りにおいて特に限定されないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群から選ばれる残基が好ましい。より好ましい疎水性アミノ酸残基は、フェニルアラニンまたはロイシンである。
【００１８】
また、本発明において親水性アミノ酸残基は、親水性のアミノ酸残基である限りにおいて特に限定されないが、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選ばれる残基が好ましい。より好ましい親水性アミノ酸残基はリジンである。
【００１９】
また本発明において任意のアミノ酸残基とは、上記の疎水性アミノ酸残基及び親水性アミノ酸残基から選ばれる任意のアミノ酸残基を意味する。具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選ばれる残基が好ましい。さらに好ましいのは疎水性アミノ酸残基であり、極めて好ましいのはフェニルアラニンまたはロイシンである。
【００２０】
本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列が本発明により開示されたので、その配列に基づいてペプチドの公知の化学合成法（例えば液相合成法や固相合成法等；泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇  道典、「ペプチド合成の基礎と実験」1985、丸善（株）参照）により製造することが可能である。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、固相合成法で製造する場合、アミノ酸配列の１８位がバリン残基のときは、α-アミノ基(Nα)-保護-バリンのカルボキシル基を直接、或いは場合によりスペーサーを介して、クロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させた後、Nα-保護基を除去し、アミノ酸配列の１７位から１位までの各保護アミノ酸（Nα-及び側鎖官能基保護アミノ酸を、単に「保護アミノ酸」と略称する）を固相合成法に従って順次結合し、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸のNα-及び側鎖官能基の保護基を脱離させて、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。
【００２１】
本発明ペプチドを合成する場合に使用される前記のクロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂及びスペーサー、場合により保護アミノ酸を該不溶性樹脂に結合した保護アミノ酸樹脂等は、公知の方法で調製でき、各種のものが市販されている。
【００２２】
該不溶性樹脂としては、Ｃ末端の保護アミノ酸のカルボキシル基と直接、或いは場合によりスペーサーを介して、結合可能であり、かつ、その後脱離可能なものであれば如何なるものでもよい。かかる不溶性樹脂としては、例えば、Boc（t-ブチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、クロロメチル樹脂（クロロメチル化スチレン-ジビニルベンゼン共重合体）、オキシメチル樹脂あるいはスペーサーを導入した４−オキシメチル−Ｐａｍ（フェニルアセタミドメチル）−樹脂が、Ｆmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、オキシメチルフェノキシメチル樹脂（Ｗａｎｇ）樹脂及びこれらの誘導体等が好ましい。
【００２３】
保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されている。
本発明ペプチドを合成する場合には、以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基はＢｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ (９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）である。アルギニン（Ａｒｇ）のグアニジノ基の保護基は、Ｔｏｓ（トシル）、ＮＯ2（ニトロ）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２,３,６−トリメチルベンゼンスルホニル）又はＰｍｃ（２, ２, ５, ７, ８- ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）である。リジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基の保護基は、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Ｃl・Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｏｃ、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。ヒスチジン（Ｈｉｓ）のイミダゾリル基の保護基は、Ｔｏｓ、Ｚ、Ｐａｃ（フェナシル）、Ｂｏｍ（ベンジルオキシメチル）、Ｄｎｐ（ジニトロフェニル）又はＴｒｔ（トリチル）である。システイン（Ｃｙｓ）のメルカプト基の保護基としてはＢｚｌ (ベンジル）、ＭＢｚｌ (４−メトキシベンジル）、４−ＭeＢｚｌ（４−メチルベンジル）、Ａｃｍ（アセタミドメチル）、Ｔｒｔ、Ｎｐｙｓ、t-Ｂｕ (t-ブチル）、t-ＢｕＳ（t-ブチルチオ）が挙げられるが、ＭＢｚｌ、４−ＭeＢｚｌ、Ｔｒｔ、Ａｃｍ、Ｎｐｙｓが好ましい。チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基の保護基は、Ｂｚｌ、Ｃl2・Ｂｚｌ（２, ６−ジクロロベンジル）、t-Ｂｕであるか、あるいは保護しなくてもよい。トリプトファン（Ｔｒｐ）のインドール基の保護基はＣＨＯ（フォルミル）であるか、あるいは保護しなくてもよい。メチオニン（Ｍｅｔ）のチオメチル基の保護基は、メチルスルホキシドであるか、あるいは保護しなくてもよい。セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基の保護基は、Ｂｚｌ又はｔ−Ｂｕである。アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）のカルボキシル基の保護基は、ＯＢｚｌ（ベンジルエステル）、ＯｔＢｕ（ｔ−ブチルエステル）、ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステル）、ＯＰａｃ（フェナシルエステル）等が挙げられる。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）のカルバミド基の保護基は、ＴｒｔまたはＸａｎ（キサンチル）である。
【００２４】
各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適当なものをそれ自体公知の中から選択することが好ましい。
保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法［Tartar,A.ら；J.Org.Chem.，44、5000（1979）］、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイミダゾール法、ＤＣＣ−ＨＯＮＳu(N-ヒドロキシスクシンイミド)法[Weygand, F.ら、Z.Naturforsch.,B,21,426(1966)]、ＤＣＣ- ＨＯＢt(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法［Koenig,W.ら；Chem.Ber.,103、788 、2024、2034（1970）］、ジフエニルホスホリルアジド法、ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩）を用いるＢＯＰ−ＨＯＢｔ法（Hudson, D., J.Org.Chem.,53, 617(1988))、ＨＢＴＵ（2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ法（Knorr,R.ら, Tetrahedron Lett., 30, 1927 (1989)）、ＴＢＴＵ（2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレイト）−ＨＯＢｔ法（Knorr, R. ら, Tetrahedron Lett., 30, 1927 (1989)）等に従って行なうことができる。しかしこれらのうち、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−ＨＯＢt法、ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法、対称酸無水物法が好ましい。
【００２５】
これらの縮合反応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。
【００２６】
α-アミノ基の保護基の脱離試薬としては、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、ＨＣl ／ジオキサン、ピペリジン／ＤＭＦ又はピペリジン／ＮＭＰ等が用いられ、該保護基の種類により適宜選択する。
【００２７】
また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ．カイサーらの方法[Anal. Biochem., 34, 595(1970) ］（ニンヒドリン反応法）によって検査される。
【００２８】
以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることができる。
保護ペプチド樹脂は、フッ化水素、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）［Academic Press 発行、E. Gross編集、Yajima,Hら; "The Peptides"５、65(1983)］、ＴＭＳＯＴf（トリメチルシリルトリフラート）［Fujii,N.ら； J. Chem．Soc., Chem. Commun., 274 (1987)］、ＴＭＳＢr(トリメチルシリルブロミド）[Fujii,N.ら； Chem. Pharm. Bull.,35、3880 (1987)］、またはトリフルオロ酢酸などで処理することにより、該樹脂および保護基を同時に脱離させることができる。上記の脱離試薬は、用いたストラテジー（Ｂoc又はＦmoc)、樹脂および保護基の種類により適宜選択する。これら一連の方法によって本発明ペプチドを製造することができる。
【００２９】
また本発明ペプチドのアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を製造し、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法により製造することもできる。
【００３０】
製造した本発明ペプチドは、タンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって精製することができる。具体的には、例えば抽出、再結晶、硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配等や、これらの組合せ等の処理操作が挙げられるが、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が最も効果的である。
【００３１】
製造された本発明ペプチドは、例えば塩酸やメタンスルホン酸等の酸で加水分解して公知の方法でアミノ酸組成を調べることができ、これによって本発明ペプチドが正しく製造されたか否かを推定することができる。
【００３２】
より厳密には、製造されたペプチドのアミノ酸配列を、公知のアミノ酸配列決定法（例えばエドマン分解法等）により決定し、本発明ペプチドが正しく製造されたか否かを確認することができる。
【００３３】
なお、本発明ペプチドには塩の形態も包含される。後述するように、本発明ペプチドは医薬用途として特に有用であることから、本発明ペプチドの塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【００３４】
本発明ペプチドは、酸付加により塩を形成しうる。このような塩としては、例えば無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）または有機カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸など）、グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸等の酸性糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩類、アルギン酸等の酸性多糖、または有機スルホン酸（メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸など）等が例示される。これらの塩のうち、薬学的に許容される塩が好ましい。
【００３５】
また本発明ペプチドは、塩基性物質との塩を形成しうる。このような塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩が例示される。
【００３６】
本発明ペプチドは、後述する実施例の記載から明らかなように、顕著に高い抗菌活性、エンドトキシン結合活性及びエンドトキシン中和活性を示すことから、以下に詳述するような本発明抗菌剤、本発明細菌感染症治療剤、本発明エンドトキシンショック抑制剤及び本発明エンドトキシン除去剤の有効成分として用いることができる。
【００３７】
本発明ペプチドが、顕著に高い抗菌活性、エンドトキシン（ＬＰＳ）結合活性及びエンドトキシン（ＬＰＳ）中和活性を有する理由は以下のように推定される。
【００３８】
ヒト由来のCAP18のＬＰＳ結合ドメインのペプチドはα−ヘリックス構造をもっており、このα−ヘリックス構造を軸方向に投影して見ると（ヘリカルホイール表示を図１、図３に示す）、親水性の部分（アルギニン、リジンなどの親水性アミノ酸残基(塩基性アミノ酸残基)の多い部分）と疎水性の部分（フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンなどの疎水性アミノ酸残基の多い部分）とが認められる。そして、ペプチドの親水性の部分とＬＰＳのリピドＡ部分のリン酸基の部分とがイオン結合し、疎水性の部分とリピドＡの脂肪酸部分とが疎水結合し、この結果、抗菌活性やＬＰＳ中和活性が導かれるものと思われる。本発明による、特定の部位のアミノ酸残基の他の特定のアミノ酸残基への置換によって、親水性部分と疎水性部分との間のバランスが変化し（図２、図４）、この変化が抗菌活性、ＬＰＳ結合活性及びＬＰＳ中和活性の上昇に関与すると考えられる。
【００３９】
本発明ペプチドは、α−ヘリックス構造を軸方向に投影したヘリカルホイールにおける親水性部分と疎水性部分とのバランスを考慮してアミノ酸配列を設計することにより、抗菌活性、ＬＰＳ結合活性及びＬＰＳ中和活性を高めるという基本的思想に基づきなされたものである。このように本発明ペプチドの抗菌活性、ＬＰＳ結合活性及びＬＰＳ中和活性には、ヘリカルホイールにおける親水性部分と疎水性部分とのバランスが重要と考えられる。
【００４１】
＜２＞本発明抗菌剤
本発明抗菌剤は、本発明ペプチドを有効成分とする抗菌剤である。
本発明抗菌剤は、種々のグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対し強力な抗菌作用を有する。
【００４２】
本発明抗菌剤は少なくとも本発明ペプチドが含有されていればよい。例えば本発明抗菌剤は、本発明ペプチドのみから構成されていてもよく、また本発明ペプチドおよび適宜の担体からなる組成物の形態であってもよい。
【００４３】
本発明抗菌剤は、医薬に使用することができる他、食品の細菌汚染防止や防腐を目的として食品に添加するなど、従来の抗菌剤に代えて、または、従来の抗菌剤と併用して使用することができる。
【００４４】
また、本発明抗菌剤を適当な素材の表面に付着させたり、あるいは適当な素材と混合することにより、抗菌性素材を製造することができる。このような抗菌性素材は、ビーズ、フィルム、プレート、モノフィラメント、不織布、スポンジ、織物、編物、短繊維、チューブ、中空糸等の種々の形状で使用できる。具体的には、抗菌性医用複合材料として人工臓器、カテーテル、手術用縫合糸、透析膜等に用いることができ、また衛生用品、抗菌フィルター等にも利用することができる。
【００４５】
なお本発明抗菌剤に用いる本発明ペプチドのうち、下記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドは、後述の実施例において具体的にその抗菌活性が示されているように抗菌活性が高いことから好ましいものである。
(a)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号２）
(b)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号３）
(c)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号４）
(d)
Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号５）
(e)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号６）
(f)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val （配列番号７）
【００４６】
また上記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのうち、特に(e)又は(f)のアミノ酸配列からなるペプチドは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれに対しても極めて高い抗菌活性を示すことから、特に好ましいものである。
【００４７】
＜３＞本発明医薬
本発明医薬は、本発明ペプチドを有効成分とする医薬である。
本発明医薬は、上述のような、顕著に高い抗菌活性、エンドトキシン結合活性及びエンドトキシン中和活性などの本発明ペプチドの活性に基づき、種々の医薬用途に使用できる。
【００４８】
本発明医薬は少なくとも本発明ペプチドが含有されていればよい。例えば本発明医薬は、本発明ペプチドのみから構成されていてもよく、また本発明ペプチドおよび医薬担体からなる組成物の形態であってもよい。用いることができる医薬担体も特に限定されず、医薬分野で用いることができる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等を用いることができる。
【００４９】
本発明医薬は、処置の目的に応じて、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）、点眼、点入、経皮、経口、吸入等、適宜投与方法を選択することができる。
また投与方法に応じて注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、座剤、ペッサリー等の剤形を適宜選択し、製剤化することができる。
【００５０】
本発明医薬の投与量は、投与の目的（予防、維持(悪化防止)、軽減(症状の改善)または治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年令、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されない。
【００５１】
以下、代表的な医薬について説明する。
【００５２】
＜３−１＞抗菌薬
本抗菌薬は、本発明抗菌剤を含む医薬（以下、本発明抗菌薬という）であり、本発明ペプチドを有効成分とする。
【００５３】
本発明抗菌剤は、上述のようにグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対し強力な抗菌作用を有する。従って、本発明抗菌薬は、種々のグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して適用できる。適用対象となる細菌は特に限定されないが、グラム陰性菌としては大腸菌、Klebsiella、Salmonella等が好ましく、グラム陽性菌としては黄色ブドウ球菌等が好ましい。
【００５４】
また本発明抗菌薬は、多剤耐性グラム陽性菌（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)、バンコマイシン耐性腸球菌等）や多剤耐性グラム陰性菌（多剤耐性のヘリコバクター、赤痢菌、サルモネラ菌等）に対しても用いることができる。
【００５５】
本発明抗菌薬は、大腸菌の中でも「病原性大腸菌O-157」や、黄色ブドウ球菌の中でも「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)」や「メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)」に対して強い抗菌活性を示すことから、これらの細菌を適用対象とすることがより好ましい。
【００５６】
本発明抗菌薬は、本発明ペプチドのみから構成されていてもよく、また本発明ペプチドおよび医薬担体からなる組成物の形態であってもよい。用いることができる医薬担体も特に限定されず、医薬分野で用いることができる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等を用いることができる。またリゾチームや抗生物質等、他の抗菌薬と併用してもよい。
【００５７】
本発明抗菌薬は、例えば生体外部の微生物感染部の処置、あるいは生体内部の微生物感染の処置等に用いることができ、処置の目的に応じて、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）、点眼、点入、経皮、経口、吸入等、適宜投与方法を選択することができる。
【００５８】
また投与方法に応じて注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、座剤、ペッサリー等の剤形を適宜選択し、製剤化することができる。
【００５９】
本発明抗菌薬の投与量は、細菌の種類、感染の状況、患者の症状、性別、年令、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、本発明ペプチドとして５〜１５(mg/kg体重)程度を投与することができる。
【００６０】
なお本発明抗菌薬に用いる本発明ペプチドのうち、下記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドは、後述の実施例において具体的にその抗菌活性が示されているように抗菌活性が高いことから好ましいものである。
(a)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号２）
(b)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号３）
(c)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号４）
(d)
Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号５）
(e)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号６）
(f)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val （配列番号７）
【００６１】
また上記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのうち、特に(e)又は(f)のアミノ酸配列からなるペプチドは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれに対しても極めて高い抗菌活性を示すことから、特に好ましいものである。
【００６２】
＜３−２＞本発明細菌感染症治療剤
本発明細菌感染症治療剤は、本発明ペプチドを有効成分とする細菌感染症治療剤である。
【００６３】
本発明細菌感染症治療剤は、その有効成分である本発明ペプチドがグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対し強力な抗菌作用を有することから、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に起因する細菌感染症に対して適用できる。細菌感染症の原因となる細菌は特に限定されないが、グラム陰性菌感染症としては大腸菌、Klebsiella、Salmonella等に起因する細菌感染症が好ましく、グラム陽性菌感染症としては黄色ブドウ球菌等に起因する細菌感染症が好ましい。
【００６４】
また本発明細菌感染症治療剤は、多剤耐性グラム陽性菌（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)、バンコマイシン耐性腸球菌等）や多剤耐性グラム陰性菌（多剤耐性のヘリコバクター、赤痢菌、サルモネラ菌等）に起因する細菌感染症に対しても用いることができる。
【００６５】
本発明細菌感染症治療剤は、大腸菌に起因する細菌感染症の中でも「病原性大腸菌O-157」に起因する細菌感染症や、黄色ブドウ球菌に起因する細菌感染症の中でも「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)」に起因する細菌感染症を適用対象とすることがより好ましい。
本発明細菌感染症治療剤は少なくとも本発明ペプチドが含有されていればよい。例えば本発明細菌感染症治療剤は、本発明ペプチドのみから構成されていてもよく、また本発明ペプチドおよび医薬担体からなる組成物の形態であってもよい。本発明細菌感染症治療剤は、前述の本発明抗菌薬と同様に適宜投与方法を選択することができるが、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）が好ましい。
【００６６】
また投与方法に応じて、前述の本発明抗菌薬と同様に適宜剤形を選択することができるが、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）として製剤化することが好ましい。
【００６７】
本発明細菌感染症治療剤の投与量は、細菌の種類、感染の状況、患者の症状、性別、年令、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、本発明ペプチドとして５〜１５(mg/kg体重)程度を投与することができる。
【００６８】
なお本発明細菌感染症治療剤に用いる本発明ペプチドのうち、下記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドは、後述の実施例において具体的にその抗菌活性が示されているように抗菌活性が高いことから好ましいものである。
(a)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号２）
(b)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号３）
(c)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号４）
(d)
Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号５）
(e)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val （配列番号６）
(f)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val （配列番号７）
【００６９】
また上記(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのうち、特に(e)又は(f)のアミノ酸配列からなるペプチドは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれに対しても極めて高い抗菌活性を示すことから、特に好ましいものである。
【００７０】
＜３−３＞本発明エンドトキシンショック抑制剤
本発明エンドトキシンショック抑制剤は、本発明ペプチドを有効成分とするエンドトキシンショック抑制剤である。
【００７１】
本発明エンドトキシンショック抑制剤は、敗血症に伴うエンドトキシンショック、グラム陰性菌感染症に伴うエンドトキシンショック等に対して優れた抑制効果を有し、このようなエンドトキシンショックによる致死抑制効果も有する。
【００７２】
本発明エンドトキシンショック抑制剤は少なくとも本発明ペプチドが含有されていればよい。例えば本発明エンドトキシンショック抑制剤は、本発明ペプチドのみから構成されていてもよく、また本発明ペプチドおよび医薬担体からなる組成物の形態であってもよい。用いることができる医薬担体、投与方法、剤形、投与量等は、前述の本発明細菌感染症治療剤と同様である。
【００７３】
なお、本発明エンドトキシンショック抑制剤として好ましい本発明ペプチドは、下記(a)〜(d)及び(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。
(a)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号２）
(b)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号３）
(c)
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号４）
(d)
Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号５）
(f)
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val（配列番号７）
【００７４】
また本発明エンドトキシンショック抑制剤としてより好ましい本発明ペプチドは上記(b)〜(d)および(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであり、さらに好ましい本発明ペプチドは、上記(b)、(c)および(f)のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００７５】
＜４＞本発明エンドトキシン除去剤
本発明エンドトキシン除去剤は、不溶性担体に固着された本発明ペプチドからなるエンドトキシン除去剤である。本発明エンドトキシン除去剤は、本発明ペプチドが有する高いエンドトキシン結合活性をエンドトキシン吸着及び除去の目的に応用したものである。
【００７６】
本発明ペプチドが固着される不溶性担体の形状は特に限定されないが、膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜形等）、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形、マイクロプレート状等の形態を有するものを挙げることができる。
【００７７】
不溶性担体の材質も特に限定されないが、ポリスチレン系、ポリプロピレン系、ポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系等の材質を挙げることができる。
【００７８】
不溶性担体に本発明ペプチドを固着させる方法も特に限定されず、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を利用して、不溶性担体に本発明ペプチドを固着させることができる。
【００７９】
例えばポリスチレン系やポリプロピレン系の不溶性担体には、物理的に本発明ペプチドを固着させることができる。また、例えばポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系の不溶性担体には、化学的に本発明ペプチドを固着させることができる。化学的な固着(結合)方法としては、不溶性担体の芳香族アミノ基を利用してジアゾカップリングさせるジアゾ化法、不溶性担体の水酸基をＣＮＢｒで活性化してペプチド結合させるＣＮＢｒ法、不溶性担体のヒドラジン誘導体等を用いてペプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に富む不溶性担体の官能基を利用してペプチドをアルキル化するアルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のアミノ基と反応する架橋試薬によって不溶性担体とペプチドの遊離のアミノ基との間を架橋する方法、カルボジイミド法、エポキシ活性化法、さらにこれらの方法を用いてスペーサーを介して結合させる方法等が挙げられる。これらの公知の結合法から、不溶性担体の種類に応じて適宜選択して本発明ペプチドの結合に利用することができる。
【００８０】
本発明ペプチドが固着された不溶性担体を、エンドトキシン除去を望む溶液に接触させて、該溶液中のエンドトキシンと本発明ペプチドが固着された不溶性担体との複合体を形成させ、次いで該複合体を分離除去することによって、前記溶液中のエンドトキシンを除去することができる。
【００８１】
本発明ペプチドが固着された不溶性担体とエンドトキシン除去を望む溶液との接触方法は、公知の固液接触手段によればよく、特に限定されない。例えば、フィルター状、中空糸状又は平膜状の不溶性担体に溶液を通液させる方法、粒状の不溶性担体を充填したカラムに溶液を通液させる方法、マイクロプレート状のウェルに溶液を入れて一定時間放置した後に溶液を分離する方法、任意の形状の不溶性担体を溶液に添加して一定時間振とうするか、又は静置して、通常の固液分離手段（濾過、遠心分離、吸引、デカンテーション等）によってエンドトキシンが除去された溶液を得る方法等を挙げることができる。
【００８２】
エンドトキシン除去を望む溶液も特に限定されず、例えば医薬品製造工場や医療施設等で用いる溶液、具体的には人工透析液、輸液、血液、医薬品、超純水等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
なお、本発明ペプチドが固着される不溶性担体は、エンドトキシンフリーであることが好ましい。
【００８４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００８５】
【実施例１】
＜１＞本発明ペプチドの調製
株式会社ペプチド研究所に委託し、下記(a)〜(f)の本発明ペプチドを固相合成法により製造した。
(a)（２７量体置換体）
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号２）
(b)（２７量体置換体）
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号３）
(c)（２７量体置換体）
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号４）
(d)（２２量体置換体）
Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号５）
(e)（１８量体置換体）
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号６）
(f)（１８量体置換体）
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val（配列番号７）
【００８６】
また比較実験に用いるため、株式会社ペプチド研究所に委託し、アミノ酸を置換していない下記A1、A3、A5、A6およびA7のペプチド（公知；非置換体）を固相合成法により製造した。
A1（２７量体非置換体）
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号８）
A3（２２量体非置換体）
Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号９）
A5（２４量体非置換体）
Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号１０）
A6（２３量体非置換体）
Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号１１）
A7（１８量体非置換体）
Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val（配列番号１２）
【００８７】
なお、本発明ペプチド(a)〜(f)並びに公知ペプチドA1、A3、A5、A6およびA7の関係を表１に示す。なお表１において、アミノ酸残基は１文字記号で示した。また置換したアミノ酸残基には下線を付した。
【００８８】
【表１】
0004037525.tif 000002
【００８９】
また、製造した上記ペプチドのうち、A1、(b)、A3、(d)、A5およびA6について、(1)アミノ酸分析値（加水分解条件：6N HCl、110℃、22時間）および(2)純度（％；高速液体クロマトグラフィーにより算出）を表２に示す。またこれらのペプチドの高速液体クロマトグラフィー(逆相クロマトグラフィー)の溶出パターンでは単一のピークが認められた。なおクロマトグラフィーの条件は下記の通りである。
【００９０】
0004037525.tif 000003
【００９１】
【表２】
0004037525.tif 000004
【００９２】
製造したペプチドは、いずれも白色の凍結乾燥体であった。
これらの結果から、製造したペプチドはいずれも純度が９７％以上で、高速液体クロマトグラフィー(逆相クロマトグラフィー)において単一ピークを示すと考えられる。また、アミノ酸分析値がアミノ酸配列から求めた理論値とよく一致することが示され、このことから、ペプチドが正しく製造されていることが分かる。
【００９３】
また本発明ペプチド(a)〜(f)は、いずれも下記アミノ酸配列を少なくとも含むペプチドである点において共通しており、さらに後述するようにＬＰＳ結合活性、抗菌活性およびエンドトキシン中和活性を有している点においても共通している。  よって本発明ペプチドは、下記アミノ酸配列（配列番号１）を少なくとも含むペプチドとして総括できる。
Lys Xa1 Phe Lys Arg Ile Val Xa2 Arg Ile Xaa Xa2 Phe Leu Arg Xa2 Leu Val
（但し、Xa1は疎水性アミノ酸残基を、Xa2は親水性アミノ酸残基を、Xaaは任意のアミノ酸残基を示す）
【００９４】
＜２＞ＬＰＳ結合活性
ＬＰＳ結合活性の測定方法：１％ヒツジ赤血球浮遊液1.0mLに、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)由来のRe型ＬＰＳ(Re-LPS；List Lab社製)溶液(100μg/mL)を0.2mL加え、37℃で30分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で遠心洗浄して１％のＬＰＳ感作赤血球を調製した。２倍段階希釈した検体(ペプチド)50μLにＬＰＳ感作赤血球50μLを加え、Ｕ型マイクロプレート(γ線滅菌済み；Nunc社製)中、37℃で１時間インキュベートした。凝集反応を示す検体の最高希釈倍数を求め、これから算出される濃度を最小凝集濃度(ＭＡＣ；minimum agglutinating concentration)とした。ＭＡＣの数値が低いほど、検体のＬＰＳ結合活性は強い。
【００９５】
２−１．アミノ酸残基の置換による効果(1)
A1、本発明ペプチド(b)、A3または本発明ペプチド(d)を検体とし、上記の測定方法によってＬＰＳ結合活性を調べた。結果を表３に示す。
【００９６】
【表３】
0004037525.tif 000005
【００９７】
表３より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して約１５〜３１倍ＬＰＳ結合活性が高いことが示された。
【００９８】
２−２．アミノ酸残基の置換による効果(2)
A1、本発明ペプチド(b)、本発明ペプチド(a)または本発明ペプチド(c)を検体とし、上記の測定方法によってＬＰＳ結合活性を調べた。結果を表４に示す。
【００９９】
【表４】
0004037525.tif 000006
【０１００】
表４より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して約８〜１６倍ＬＰＳ結合活性が高いことが示された。
【０１０１】
２−３．修飾ペプチドのＬＰＳ結合活性
ペプチドのＮ末端をアセチル化しＣ末端をアミド化したペプチド（A7、本発明ペプチド(e)、または本発明ペプチド(f)）を検体とし、上記の測定方法によってＬＰＳ結合活性を調べた。結果を表５に示す。
【０１０２】
【表５】
0004037525.tif 000007
【０１０３】
表５より、修飾された本発明ペプチド（置換体）は修飾された非置換体（公知）に比して約３１〜１２５倍ＬＰＳ結合活性が高いことが示された。またＬＰＳ結合活性は、ペプチドの修飾による影響を受けなかった。
【０１０４】
＜３＞薬効薬理試験
３−１．抗菌活性
抗菌活性の測定方法：抗菌活性の測定には、大腸菌[E.coli O157：H7(岡山県、神奈川県および岩手県盛岡市のE.coli O157患者より採取]、Klebsiellaまたはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus；MRSA)を用いた。
【０１０５】
これらの細菌を液体培地(Tryptosoy broth；栄研化学製)中で増殖させた。対数増殖期の細菌を集め、ＰＢＳ(pH7.2)で洗浄し、終濃度5x103〜1x104細胞／mLとなるように調整した。450μLの細菌懸濁液に種々の濃度の50μLの検体(ペプチド)を添加し、37℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、100μLの反応液をアガロース培地(Nutrient agar；栄研化学製)に塗抹した。37℃で24時間インキュベートし、コロニー形成単位(colony-forming units；ＣＦＵ)をカウントし、50％阻害濃度(IC50)を求めた。
【０１０６】
３−１−１．大腸菌(E.coli O157)に対する抗菌活性(1)
ポリミキシンＢ(公知の抗菌剤)、A1、本発明ペプチド(b)、A3、本発明ペプチド(d)、A5またはA6を検体とし、上記の測定方法によって大腸菌[E.coli O157：H7(岡山県、神奈川県および岩手県盛岡市のE.coli O157患者より採取]に対する抗菌活性を調べた。結果を表６に示す。
【０１０７】
【表６】
0004037525.tif 000008
【０１０８】
表６より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して約４〜１５倍、E.coli O157：H7に対する抗菌活性が高いことが示された。
この結果はポリミキシンＢと同等であるが、ポリミキシンＢは毒性が強いため、本発明ペプチドの方が有利である。
【０１０９】
３−１−２．大腸菌(E.coli O157)に対する抗菌活性(2)
A1、本発明ペプチド(b)、本発明ペプチド(a)または本発明ペプチド(c)を検体とし、上記の測定方法によって大腸菌[E.coli O157：H7(岡山県のE.coli O157患者より採取]に対する抗菌活性を調べた。結果を表７に示す。
【０１１０】
【表７】
0004037525.tif 000009
【０１１１】
表７より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して約８〜１４倍、E.coli O157：H7に対する抗菌活性が高いことが示された。
【０１１２】
３−１−３．種々のグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対する抗菌活性（１）
ポリミキシンＢ(公知の抗菌剤)、A1、本発明ペプチド(b)、A3、または本発明ペプチド(d)（いずれも濃度２０μg/mL）を検体とし、上記の抗菌活性測定方法によってグラム陰性菌[E.coli O157：H7またはKlebsiella]およびグラム陽性菌[メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)]のコロニー形成単位(CFU)をカウントした。検体無添加(濃度 ０μg/mL)時のＣＦＵを１００％としたときのＣＦＵの相対値を求め、「１００％−ＣＦＵの相対値」の値を算出し、抗菌活性の値とした。結果を図５に示す。
【０１１３】
なお図５中の＊は、検体(ペプチド)のかわりにＰＢＳを用いた結果に対してp＜0.05で有意差があることを示す。
図５より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して顕著に抗菌活性が高く、グラム陰性菌およびグラム陽性菌のいずれに対しても抗菌活性を示すことが示された。また、本発明ペプチド(b)及び(d)は、特にグラム陰性菌に対して強力な抗菌活性を有することが示された。
【０１１４】
３−１−４．種々のグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対する抗菌活性（２）
A7、本発明ペプチド(e)または本発明ペプチド(f)(いずれも濃度 ２０μg/mL)を検体とし、上記の抗菌活性測定法と同様にしてグラム陰性菌[E.ColiまたはSalmonella typhimurium]およびグラム陽性菌[メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)]のコロニー形成単位(CFU)をカウントした。検体無添加(濃度 ０μg/mL)時のＣＦＵを１００％としたときのＣＦＵの相対値を求め、「１００％−ＣＦＵの相対値」の値を算出し、抗菌活性の値とした。結果を図６に示す。
【０１１５】
図６より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して顕著に抗菌活性が高いことが示された。また本発明ペプチド(e)および(f)は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌のいずれに対しても強力な抗菌活性を示すことが示された。
【０１１６】
また種々の濃度のA7、本発明ペプチド(e)または本発明ペプチド(f)を検体とし、同様にコロニー形成単位(CFU)をカウントした。グラム陰性菌に対する結果を図７に、グラム陽性菌に対する結果を図８に示す。なお図７および図８中、横軸は検体の濃度を示し、縦軸は、検体(ペプチド)のかわりにＰＢＳ(検体濃度 ０μg/mL)を用いた時のＣＦＵを１００％としたときの、ＣＦＵの相対値を示す。また図７および図８中の＊は、検体(ペプチド)のかわりにＰＢＳ(検体濃度 ０μg/mL)を用いた結果に対してｐ＜0.05で有意差があることを示す。
【０１１７】
図７および図８より、本発明ペプチド（置換体）の抗菌活性は用量依存的であり、また非置換体（公知）に比して抗菌活性が高いことが示された。
また図７および図８の結果に基づき、検体（A7、本発明ペプチド(e)または本発明ペプチド(f)）の抗菌活性(IC50)を求めた。結果を表８に示す。
【０１１８】
【表８】
0004037525.tif 000010
【０１１９】
表８より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して少なくとも約３〜２５倍、グラム陰性菌およびグラム陽性菌に対する抗菌活性が高いことが示された。
【０１２０】
３−２．ＬＰＳ中和活性（致死抑制活性）
ＬＰＳ中和活性の測定方法：マウス１匹あたり、20μgまたは40μgの検体(ペプチド)、0.1μgのＬＰＳおよび25mgのガラクトサミンを腹腔内注射した。マウスの生死を観察し（３０日間）、生存率(％)を求めた。
【０１２１】
３−２−１．ＬＰＳ中和活性(1)
A1、本発明ペプチド(b)、A3または本発明ペプチド(d)を検体とし、上記の測定方法によってＬＰＳ中和活性を調べた。結果を表９に示す。なお用いたマウスの数は表中に示した。
【０１２２】
【表９】
0004037525.tif 000011
【０１２３】
表９より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して８倍以上のＬＰＳ中和活性を有しており、ＬＰＳによる致死を抑制することが示された。
【０１２４】
３−２−２．ＬＰＳ中和活性(2)
A1、本発明ペプチド(b)、本発明ペプチド(a)または本発明ペプチド(c)を検体とし、上記の測定方法によってＬＰＳ中和活性を調べた。結果を表１０に示す。なお用いたマウスの数は表中に示した。
【０１２５】
【表１０】
0004037525.tif 000012
【０１２６】
表１０より、本発明ペプチド（置換体）は非置換体（公知）に比して４〜８倍のＬＰＳ中和活性を有しており、ＬＰＳによる致死を抑制することが示された。
なお、上記ＬＰＳ中和活性(1)及び(2)の試験において、マウスには、ＬＰＳの投与により通常に生じる症状以外は認められなかった。従って、本発明ペプチドに急性の毒性はないものと思われる。
【０１２７】
３−２−３．修飾ペプチドのＬＰＳ中和活性
ペプチドのＮ末端をアセチル化しＣ末端をアミド化したペプチド（A7、本発明ペプチド(e)、または本発明ペプチド(f)）を検体とし、上記の測定方法によってＬＰＳ中和活性を調べた。結果を表１１に示す。なお用いたマウスの数は表中に示した。
【０１２８】
【表１１】
0004037525.tif 000013
【０１２９】
表１１より、修飾された本発明ペプチド（置換体）の(f)は修飾された非置換体（公知）に比して約２〜３倍のＬＰＳ中和活性を有しており、ＬＰＳによる致死を抑制することが示された。またこの活性は、ペプチドの修飾による影響を受けなかった。
【０１３０】
＜４＞エンドトキシン除去試験
エンドトキシンフリーの担体（Sepharose 4B(ファルマシア製)）１００ｍＬをガラスフィルター(#2)に移し、２リットルの注射用蒸留水で吸引洗浄した後、１リットル容量のビーカーに入れ、注射用蒸留水２００ｍＬを加えた。マグネチックスターラーで攪拌しながら、10Ｍ NaOHによってｐＨ１１〜１２に調整し、注射用蒸留水５００ｍＬに溶解した臭化シアン(CNBr) ２５ｇを徐々に添加して、ｐＨが変化しなくなった時点で反応を終了させた。このCNBr活性化担体をガラスフィルターで濾過し、冷水２リットル、0.1Ｍ NaHCO3 １リットルの順で洗浄した。このCNBr活性化担体 １０mLに、0.2mg/mLとなるように本発明ペプチド(b)の凍結乾燥物を加え、ローテーターで攪拌しながら４℃で２４時間処理した。反応後、残存する不純物（イミドカーボネート体）を不活化するために、0.2Ｍトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)中で５時間放置した。
【０１３１】
これによって得られた本発明ペプチド固定化担体 （本発明ペプチドが固定化された担体）1.0ｇに、エンドトキシン含有溶液５mL（0.1、1.0、10 または100ng/mL）を加え、マルチシェイカーで３０分間連続攪拌することにより処理した。処理後、本発明ペプチドの固定化担体を遠心により沈殿させて上清を回収した。この上清５０μLにエンドトキシン特異的合成基質試薬（エンドスペシー ＥＳ−５０Ｍ、生化学工業(株)製）50μLを加え、溶液中のエンドトキシン濃度を測定した。また、「（処理前のエンドトキシン濃度−処理後のエンドトキシン濃度）／処理前のエンドトキシン濃度×１００」の値を算出し、エンドトキシン除去率(％)とした。結果を表１２に示す。
【０１３２】
【表１２】
0004037525.tif 000014
【０１３３】
表１２より、本発明ペプチド固定化担体によりエンドトキシン含有溶液を処理すると、当該溶液中のエンドトキシンが非常によく除去されることが示された。
【０１３４】
【実施例２】
以下に本発明抗菌薬、本発明細菌感染症治療剤および本発明エンドトキシンショック抑制剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明各剤の剤形がこれらに限定されるものではない。
【０１３５】
（１）本発明抗菌薬（軟膏剤）
本発明ペプチド(d)                               １０ｍｇ
モノステアリン酸ソルビタン                        ７ｍｇ
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン      ７ｍｇ
パルミチン酸イソプロピル                        ３７ｍｇ
ワセリン                                        ３７ｍｇ
流動パラフィン                                  ３７ｍｇ
セタノール                                      ５０ｍｇ
グリセリン                                      ７０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ２ｍｇ
上記成分に精製水を加えて、１ｇのクリームとした。
【０１３６】
（２）本発明抗菌薬（錠剤）
本発明ペプチド(c)             １００ｍｇ
乳糖                          ６７０ｍｇ
バレイショデンプン            １５０ｍｇ
結晶セルロース                  ６０ｍｇ
軽質無水ケイ酸                  ５０ｍｇ
上記成分を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースを３０ｍｇをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロピルセルロース１０重量％）を加えて混練したのち造粒した。これを径０．８ｍｍのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１５ｍｇを加え２００ｍｇづつ打錠して錠剤を得た。
【０１３７】
（３）本発明細菌感染症治療剤（カプセル剤）
本発明ペプチド(b)             １００ｍｇ
乳糖                            ８０ｍｇ
上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。
【０１３８】
（４）本発明細菌感染症治療剤（注射剤）
本発明ペプチド(e)               ３０ｍｇ
上記成分を５％マンニトール水溶液２ｍＬに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプルに入れて密封した。
【０１３９】
（５）本発明エンドトキシンショック抑制剤（用時溶解用注射剤）
(A)本発明ペプチド(f)（凍結乾燥体）３０ｍｇ（アンプルに封入した）
(B)無菌濾過したＰＢＳ ２ｍＬ（アンプルに封入した）
上記(A)および(B)を１セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には(A)を(B)で溶解して用いることができる。
【０１４０】
【発明の効果】
本発明ペプチドは、ヒト由来の抗菌性タンパク質(CAP18)の公知の部分ペプチドの特定のアミノ酸残基を置換した部分ペプチドであり、公知の部分ペプチドに比して顕著に高いエンドトキシン結合活性、抗菌活性及びエンドトキシン中和活性等を示すので、抗菌剤、細菌感染症治療剤、エンドトキシンショック抑制剤及びエンドトキシン除去剤等の有効成分として極めて有用である。
【０１４１】
また本発明ペプチドは上記した通り非常に高い薬理活性を有するので、本発明ペプチドを有効成分とする本発明抗菌薬、本発明細菌感染症治療剤および本発明エンドトキシンショック抑制剤等の医薬中の有効成分量を減ずることができ、これにより安全かつ安価な本発明医薬を提供することができる。また本発明ペプチドはヒト由来の部分ペプチドをベースにしているので、本発明医薬は特にヒトに対する安全性が高い薬剤として極めて有用である。
【０１４２】
また、本発明ペプチドの非常に高いエンドトキシン結合活性を利用して、不溶性担体に固着された本発明ペプチドからなるエンドトキシン除去剤を提供することができ、本発明ペプチドを含有するエンドトキシン測定剤も提供しうる。
【０１４３】
【配列表】
0004037525.tif 000015
【０１４４】
0004037525.tif 000016
【０１４５】
0004037525.tif 000017
【０１４６】
0004037525.tif 000018
【０１４７】
0004037525.tif 000019
【０１４８】
0004037525.tif 000020
【０１４９】
0004037525.tif 000021
【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で製造したペプチド（A1）のヘリカルホイール表示を示す。
【図２】実施例１で製造したペプチド（(b)）のヘリカルホイール表示を示す。
【図３】実施例１で製造したペプチド（A3）のヘリカルホイール表示を示す。
【図４】実施例１で製造したペプチド（(d)）のヘリカルホイール表示を示す。
【図５】ポリミキシンＢおよび実施例１で製造したペプチド（A1、(b)、A3および(d)）の、種々の細菌に対する抗菌活性を示す。
【図６】  実施例１で製造したペプチド（A7、(e)および(f)）の、種々の細菌に対する抗菌活性を示す。
【図７】実施例１で製造したペプチド（A7、(e)および(f)）の、種々のグラム陰性菌に対する、用量と抗菌活性との関係を示す。
【図８】実施例１で製造したペプチド（A7、(e)および(f)）の、種々のグラム陽性菌に対する、用量と抗菌活性との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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