(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる蛍光標識物質によって染色された微生物を検査する検査方法であって、
前記試料の全領域に前記蛍光標識物質が蛍光を放出する波長を有する励起光を照射し、前記試料の全領域から前記励起光により蛍光を放出する蛍光体の所在位置を抽出する位置抽出工程と、
前記抽出された各所在位置ごとに前記抽出された蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定するように、前記抽出された蛍光体の面積、曲線長さ、曲線幅、または、円形度係数が微生物の判定基準を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体であるとして特定する検査工程と、
前記特定された蛍光体の各所在位置に対して前記蛍光標識物質が蛍光を放出する第１波長を有する第１励起光と、異物が蛍光を放出するが前記蛍光標識物質が蛍光を放出しない第２波長を有する第２励起光とを含む複数の励起光を照射する照射工程と、
前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記第１励起光により蛍光を放出するが前記第２励起光により蛍光を放出しない蛍光体を前記試料中に含まれる前記蛍光標識物質で染色された微生物として個別に識別する識別工程と、
を含むことを特徴とする。
【請求項２】
請求項１に記載の検査方法であって、
前記微生物の判定基準は、前記抽出された蛍光体の面積が５〜２００μｍ2、前記抽出された蛍光体の曲線長さが０．１〜５０μｍ、前記抽出された蛍光体の曲線幅が０．１〜１０μｍ、または、前記抽出された蛍光体から得られる円形度係数が１〜１０であることを特徴とする。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記検査工程では、更に、前記抽出された蛍光体の平均輝度が微生物の判定基準である１０〜２５５を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体と特定し、前記識別工程では、前記検査工程で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。
【請求項４】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記照射工程では、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順に前記試料に照射することを特徴とする。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記照射工程では、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を同時に前記試料に照射することを特徴とする。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、
前記識別工程では、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。
【請求項７】
請求の範囲第６項に記載の検査方法であって、
前記識別工程では、前記各蛍光体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各蛍光体が微生物であるか否かを判定することを特徴とする。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の検査方法であって、
前記微生物は特定の微生物であることを特徴とする。
【請求項９】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、
前記識別工程では、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。
【請求項１０】
請求の範囲第９項に記載の検査方法であって、
前記識別工程では、前記各蛍光体から得られる蛍光スペクトルを前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各蛍光体が微生物であるか否かを判定することを特徴とする。
【請求項１１】
請求の範囲第１０項に記載の検査方法であって、
前記微生物は特定の微生物であることを特徴とする。
【請求項１２】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
１次検査工程と、
２次検査工程とを含み、
前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光体を特定し、
前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で特定された各蛍光体を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各蛍光体の蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。
【請求項１３】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
１次検査工程と、
２次検査工程とを含み、
前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出し、
前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で抽出した各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各標的の微生物の蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、該フィルタ上に捕捉された微生物を含む物体を蛍光標識物質を用いて染色する試料調製工程を更に含むことを特徴とする。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、２つ以上の波長を含む励起光を照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が１つ以上の蛍光におけるピークを有するように該フィルタ上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことを特徴とする。
【請求項１６】
請求の範囲第１５項に記載の検査方法であって、
前記２つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることを特徴とする。
【請求項１７】
請求の範囲第１５項に記載の検査方法であって、
前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（DAPI）、プロビディウム・イオダイド、およびフルオレセインニソチシオシアネート（FITC）のうちのいずれか１つ以上の蛍光標識物質が用いられることを特徴とする。
【請求項１８】
請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、３つ以上の波長を含む励起光を該フィルタに照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が２つ以上の蛍光におけるピークを有するように、該フィルタ上に捕捉された微生物を異なる種類の蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことを特徴とする。
【請求項１９】
請求の範囲第１８項に記載の検査方法であって、
前記３つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される３つ以上の励起光が用いられることを特徴とする。
【請求項２０】
請求の範囲第１８項に記載の検査方法であって、
前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（DAPI）、プロビディウム・イオダイドおよびフルオレセインニソチシオシアネート（FITC）のうちのいずれか２つ以上の蛍光標識物質が用いられることを特徴とする。
【請求項２１】
試料中に含まれる蛍光標識物質によって染色された微生物を検査する検査装置であって、
前記試料の全領域に前記蛍光標識物質が蛍光を放出する波長を有する励起光を照射し、前記試料の全領域から前記励起光により蛍光を放出する蛍光体の所在位置を抽出する位置抽出手段と、
前記抽出された各所在位置ごとに前記抽出された蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定するように、前記抽出された蛍光体の面積、曲線長さ、曲線幅、または、円形度係数が微生物の判定基準を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体として特定する検査手段と、
前記特定された蛍光体の各所在位置に対して前記蛍光標識物質が蛍光を放出する第１波長を有する第１励起光と、異物が蛍光を放出するが前記蛍光標識物質が蛍光を放出しない第２波長を有する第２励起光とを含む複数の励起光を照射する照射手段と、
前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記第１励起光により蛍光を放出するが前記第２励起光により蛍光を放出しない蛍光体を前記試料中に含まれる前記蛍光標識物質で染色された微生物として個別に識別する識別手段と、を有することを特徴とする。
【請求項２２】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記微生物の判定基準は、前記抽出された蛍光体の面積が５〜２００μｍ2、前記抽出された蛍光体の曲線長さが０．１〜５０μｍ、前記抽出された蛍光体の曲線幅が０．１〜１０μｍ、または、前記抽出された蛍光体から得られる円形度係数が１〜１０であることを特徴とする。
【請求項２３】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記検査手段では、更に、前記抽出された蛍光体の平均輝度が微生物の判定基準である１０〜２５５を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体と特定し、前記識別手段では、前記検査手段で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。
【請求項２４】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記照射手段は、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順に前記試料に照射することを特徴とする。
【請求項２５】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記照射手段は、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を同時に前記試料に照射することを特徴とする。
【請求項２６】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、
前記識別手段は、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。
【請求項２７】
請求の範囲第２６項に記載の検査装置であって、
前記識別手段は、前記各蛍光体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各蛍光体が微生物であるか否かを判定することを特徴とする。
【請求項２８】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別手段は、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。
【請求項２９】
請求の範囲第２８項に記載の検査装置であって、
前記識別手段は、前記各蛍光体から得られる蛍光スペクトルを前記励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各蛍光体が微生物であるか否かを識別することを特徴とする。
【請求項３０】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記位置抽出手段と前記検査手段と前記照射手段と前記識別手段とを制御する制御手段を更に備え、
前記制御手段は、
前記位置抽出手段を用いて、前記試料の全領域に前記蛍光標識物質が蛍光を放出する波長を有する励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で撮像し、前記検査手段を用いて前記位置抽出手段による撮像結果を分析して前記試料中に含まれる蛍光体の所在位置を抽出し、前記検査手段を用いて前記抽出された各所在位置ごとに前記抽出された蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定するように制御し、
次に、前記特定された各蛍光体の各所在位置のみを前記照射手段を用いて前記第１励起光と前記第２励起光とを含む複数の励起光で照射しながら前記各蛍光体から得られる蛍光を前記第１倍率よりも高い第２倍率で撮像してピークの分布を取得し、前記識別手段を用いて前記取得したピークの分布を分析して前記第１励起光により蛍光を放出するが前記第２励起光により蛍光を放出しない蛍光体を前記試料中に含まれる前記蛍光標識物質で染色された微生物として個別に識別するように制御することを特徴とする。
【請求項３１】
請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記複数の励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることを特徴とする。
【請求項３２】
請求の範囲３０項に記載の検査装置であって、
前記位置抽出手段は、電動ステージを更に備え、
前記制御手段は、前記電動ステージを制御して前記試料の全領域を走査しながら前記試料の全領域を撮像するように前記位置抽出手段を制御することを特徴とする。
【請求項３３】
請求の範囲第３２項に記載の検査装置であって、
前記位置抽出手段は、対物レンズと、前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保つように予め設定されている方程式とを備え、前記制御手段は、前記走査の際に前記方程式に基づいて焦点のずれが生じないように前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保ちながら前記試料の全領域を撮像するように前記位置抽出手段を制御することを特徴とする。
【請求項３４】
請求項１に記載の検査方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項３５】
請求項３４に記載のプログラムを格納したことを特徴とするコンピュータ可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、微生物の検査装置および検査方法に関し、例えば、試料液中に含まれる微生物などをフィルターで捕捉し、捕捉した微生物に蛍光染色し、顕微鏡を用いて微生物を微生物以外のものと自動識別して表示する微生物の検査装置および検査方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
従来、微生物検査、例えば、ビールなどの飲料、食品、医薬品、化粧品などの製造工程管理、製品品質管理などにおける微生物検査は、多種多様な培地を必要とする培養検査により行なわれており、検査が終了するまでに相当な日数を要していた。
【０００３】
このため検査対象中に微生物が存在するか否か、あるいは微生物の数、あるいは存在している微生物種の同定などの検査結果の判明が遅れ、種々の分野における研究、開発、製造あるいは製品出荷の段階で多大な制約があった。
【０００４】
このような背景から、現在に至るまで多くの微生物を含む液体試料中などから微生物を迅速に測定する方法が考案されている（例えば、「微生物検査技術の最新動向」,食品と開発 35(1), P32−40（2000）など）。
【０００５】
微生物を迅速に測定する方法として知られているものとしては、例えば、インピーダンス法（Brown,D.、Warner,M.、Taylor,C.、Warren,R.、Clin.Pathol.、37、65〜69（1984））、酵素−蛍光検出法（特開昭５８−１１６７００号公報）、ＰＣＲ法、メンブレンフィルター法と蛍光顕微鏡法とを組み合わせたＤＥＦＴ法（G.L.PETTIPHER,  UBALDINAM.RODRIGUES,  J.Appl.Bacteriol.53,323（1982））、あるいはメンブランフィルター法とＡＴＰ法を組み合わせたＲＭＤＳ法（Takahashi,T.,  Nakakita.Y.,  Watari.J.,  Shinotsuka.K., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(5), P1032−1037 (2000)）などがあり、これらの測定原理を応用した機器も市販されている。
【０００６】
しかしながら、上記説明した方法には、１）精度が不十分である、２）迅速な測定に適さない、３）定量性が不十分である、４）人為的誤差を含む可能性が高いなど、多くの問題が残されている。また、５）測定に必要な培地や試薬等のランニングコストが高い点も問題である。
【０００７】
一方、試料溶液中に存在する微生物をろ過して微生物等を分離し、得られた微生物を含む試料を蛍光染色し、この試料を蛍光顕微鏡で、観測者が目視観察しながら微生物と微生物以外のものを識別する方法も知られている。
【０００８】
しかしながら、上記の方法では、蛍光染色した試料から発生する蛍光像を観測者が目視観察しながら微生物と微生物以外のものとに識別するために、測定結果に対して測定者の誤認などによる誤りが入る可能性もあった。また、微生物と微生物以外のものとを無人で識別することは不可能であった。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、上記説明した従来技術の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、例えば、検査対象となる試料中に含まれる微生物を自動で迅速に識別可能な微生物の検査装置および検査方法を提供することである。
【００１０】
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査方法は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる蛍光標識物質によって染色された微生物を検査する検査方法であって、前記試料の全領域に前記蛍光標識物質が蛍光を放出する波長を有する励起光を照射し、前記試料の全領域から前記励起光により蛍光を放出する蛍光体の所在位置を抽出する位置抽出工程と、前記抽出された各所在位置ごとに前記抽出された蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定するために、前記抽出された蛍光体の面積、曲線長さ、曲線幅、または、円形度係数が微生物の判定基準を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体であるとして特定する検査工程と、前記特定された蛍光体の各所在位置に対して前記蛍光標識物質が蛍光を放出する第１波長を有する第１励起光と、異物が蛍光を放出するが前記蛍光標識物質が蛍光を放出しない第２波長を有する第２励起光とを含む複数の励起光を照射する照射工程と、前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記第１励起光により蛍光を放出するが前記第２励起光により蛍光を放出しない蛍光体を前記試料中に含まれる前記蛍光標識物質で染色された微生物として個別に識別する識別工程と、を含むことを特徴とする。
【００１１】
ここで、例えば、前記微生物の判定基準は、前記抽出された蛍光体の面積が５〜２００μｍ2、前記抽出された蛍光体の曲線長さが０．１〜５０μｍ、前記抽出された蛍光体の曲線幅が０．１〜１０μｍ、または、前記抽出された蛍光体から得られる円形度係数が１〜１０であることが好ましい。また、前記検査工程では、更に、前記抽出された蛍光体の平均輝度が微生物の判定基準である１０〜２５５を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体と特定し、前記識別工程では、前記検査工程で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
【００１２】
ここで、例えば、前記照射工程では、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順にまたは同時に前記試料に照射することが好ましい。
【００１３】
ここで例えば、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別工程では、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
【００１４】
ここで例えば、前記識別工程では、前記各蛍光体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各蛍光体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
【００１５】
ここで、例えば、前記微生物は特定の微生物であることが好ましい。
【００１６】
ここで例えば、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別工程では、前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
【００１７】
ここで例えば、前記識別工程では、前記各蛍光体から得られる蛍光スペクトルを前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各蛍光体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
【００１８】
ここで、例えば、前記微生物は特定の微生物であることが好ましい。
【００１９】
ここで例えば、前記検査方法は、１次検査工程と、２次検査工程とを含み、前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光体を特定し、前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で特定された各蛍光体を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各蛍光体の蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
【００２０】
ここで例えば、前記検査方法は、１次検査工程と、２次検査工程とを含み、前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出し、前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で抽出した各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各標的の微生物の蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。
【００２１】
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、該フィルタ上に捕捉された微生物を含む物体を蛍光標識物質を用いて染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
【００２２】
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、２つ以上の波長を含む励起光を照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が１つ以上の蛍光におけるピークを有するように該フィルタ上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
【００２３】
ここで、例えば、前記２つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
【００２４】
ここで、例えば、前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（DAPI）、プロビディウム・イオダイド、およびフルオレセインニソチシオシアネート（FITC）のうちのいずれか１つ以上の蛍光標識物質が用いられることが好ましい。
【００２５】
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、３つ以上の波長を含む励起光を該フィルタに照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が２つ以上の蛍光におけるピークを有するように、該フィルタ上に捕捉された微生物を異なる種類の蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
【００２６】
ここで、例えば、前記３つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される３つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
【００２７】
ここで、例えば、前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（DAPI）、プロビディウム・イオダイドおよびフルオレセインニソチシオシアネート（FITC）のうちのいずれか２つ以上の蛍光標識物質が用いられることが好ましい。
【００２８】
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査装置は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる蛍光標識物質によって染色された微生物を検査する検査装置であって、前記試料の全領域に前記蛍光標識物質が蛍光を放出する波長を有する励起光を照射し、前記試料の全領域から前記励起光により蛍光を放出する蛍光体の所在位置を抽出する位置抽出手段と、前記抽出された各所在位置ごとに前記抽出された蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定するために、前記抽出された蛍光体の面積、曲線長さ、曲線幅、または、円形度係数が微生物の判定基準を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体として特定する検査手段と、前記特定された蛍光体の各所在位置に対して前記蛍光標識物質が蛍光を放出する第１波長を有する第１励起光と、異物が蛍光を放出するが前記蛍光標識物質が蛍光を放出しない第２波長を有する第２励起光とを含む複数の励起光を照射する照射手段と、前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各蛍光体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記第１励起光により蛍光を放出するが前記第２励起光により蛍光を放出しない蛍光体を前記試料中に含まれる前記蛍光標識物質で染色された微生物として個別に識別する識別手段と、を有することを特徴とする。
【００２９】
ここで、例えば、前記微生物の判定基準は、前記抽出された蛍光体の面積が５〜２００μｍ2、前記抽出された蛍光体の曲線長さが０．１〜５０μｍ、前記抽出された蛍光体の曲線幅が０．１〜１０μｍ、または、前記抽出された蛍光体から得られる円形度係数が１〜１０であることが好ましい。
【００３０】
ここで例えば、前記検査手段では、更に、前記抽出された蛍光体の平均輝度が微生物の判定基準である１０〜２５５を満たすものを微生物の可能性がある蛍光体と特定し、前記識別手段では、前記検査手段で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
【００３１】
ここで、例えば、前記照射手段は、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順にまたは同時に前記試料に照射することが好ましい。
【００３２】
ここで例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別手段は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
【００３３】
ここで、例えば、前記識別手段は、前記各物体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
【００３４】
ここで、例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別手段は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
【００３５】
ここで、例えば、前記識別手段は、前記各物体から得られる蛍光スペクトルを前記励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各蛍光体が微生物であるか否かを識別することが好ましい。
【００３６】
ここで、前記位置抽出手段と前記検査手段と前記照射手段と前記識別手段とを制御する制御手段を更に備え、前記制御手段は、前記位置抽出手段を用いて、前記試料の全領域に前記蛍光標識物質が蛍光を放出する波長を有する励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で撮像し、前記検査手段を用いて前記位置抽出手段による撮像結果を分析して前記試料中に含まれる蛍光体の所在位置を抽出し、前記検査手段を用いて前記抽出された各所在位置ごとに前記抽出された蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定するように制御し、次に、前記特定された各蛍光体の各所在位置のみを前記照射手段を用いて、前記第１励起光と前記第２励起光とを含む複数の励起光で照射しながら前記各蛍光体から得られる蛍光を前記第１倍率よりも高い第２倍率で撮像してピークの分布を取得し、前記識別手段を用いて前記取得したピークの分布を分析して前記第１励起光により蛍光を放出するが前記第２励起光により蛍光を放出しない蛍光体を前記試料中に含まれる前記蛍光標識物質で染色された微生物として個別に識別するように制御することが好ましい。
【００３８】
ここで、例えば、前記複数の励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
【００３９】
ここで例えば、前記位置抽出手段は、電動ステージを更に備え、前記制御手段は、前記電動ステージを制御して前記試料の全領域を走査しながら前記試料の全領域を撮像するように前記位置抽出手段を制御することが好ましい。
【００４０】
ここで、例えば、前記位置抽出手段は、対物レンズと、前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保つように予め設定されている方程式とを備え、前記制御手段は、前記走査の際に前記方程式に基づいて焦点のずれが生じないように前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保ちながら前記試料の全領域を撮像するように前記位置抽出手段を制御することが好ましい。
【００４１】
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態のプログラムは、上記に記載の検査方法をコンピュータに実行させるためのプログラムである。
【００４２】
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態のコンピュータ可読記憶媒体は、上記に記載のプログラムを格納したコンピュータ可読記憶媒体である。
【００４３】
上記構成を有する微生物の検査方法および装置により、２波長または３波長以上の励起光を試料に照射し、それぞれの励起光に対応して得られる複数の蛍光像を比較することにより、試料液中に混入した微生物を自動で識別することが可能となるため検査時間が短縮でき、人為的なミスによる測定の誤りを防止することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に図面を参照して、本発明に係る好適な実施の形態を説明する。
【００４５】
［微生物の検査装置：図１、２］
まず図１および図２を用いて本発明に係る一実施形態の微生物検出装置１について説明する。図１は、微生物検査装置１の全体構成を説明する図であり、図２は、微生物検査装置１の各部の制御を説明する図である。
【００４６】
図１において、微生物検査装置１は、蛍光顕微鏡部２と画像解析部３より構成されている。
【００４７】
蛍光顕微鏡部２は、微生物を含む試料を拡大観察する蛍光顕微鏡本体１０と、蛍光顕微鏡本体１０で拡大観察された試料像を光電変換して画像化する画像取得部２１（例えば、冷却ＣＣＤカメラ等のモノクロあるいはカラーのカメラ）とを有する。画像取得部２１は、画像解析部３によって制御２３され、画像取得部２１で取得した画像データ２２は、画像解析部３に送られる。画像データ２２は演算部５０や識別部４４で解析され、試料に含まれる微生物が識別される。
【００４８】
ここで、微生物を含む試料とは、例えば、ビールなどの飲料であり、本来は微生物や微生物以外の混入物を含まないもの（検査試料液）であるが、製造工程などで、微生物や微生物以外の混入物が混入しているか否かを調べるために検査試料液から所定量取り出したものをいう。また、検査試料液から微生物検出装置１で用いる試料は、メンブレンフィルタを用いたろ過器を用いて検査試料液をろ過して、メンブレンフィルタ上に微生物や微生物以外の混入物を捕捉し、次に、ろ過器からメンブレンフィルタを取り出し、微生物や微生物以外のものが捕捉されたメンブレンフィルタに蛍光標識物質を作用させて、試料中の微生物を蛍光標識物質で染色する手順で調製される。なお試料中の微生物の染色に用いる蛍光標識物質は、必要に応じて１種または複数使用する。
【００４９】
光学顕微鏡１０は、蛍光染色した微生物を含む試料の載置用の顕微鏡電動ステージ１６、電動フォーカスモーター１７、高出力水銀ランプ、キセノンランプなどを用いて発生する励起光を上記試料に照射し、標的微生物を強く蛍光標識する光源部１８、光源部１８から顕微鏡電動ステージ１６への光路中に設けられた励起光のうちの１つあるいは複数の特定波長を選択するフィルタおよび励起光の照射により試料から発生する蛍光のうち１つあるいは複数の特定波長を選択するフィルターを備えた蛍光フィルターブロック切り換え部１９および対物レンズを切り換えるレンズ切り換え部２０を備えている。
【００５０】
光学顕微鏡１０は、蛍光標識物質で染色した微生物を含む試料を励起するために、異なる特定波長を有する複数の励起光を順次、この試料に照射し、蛍光フィルターブロック切り換え部１９を順次切り替えることにより、各励起光に応じて得られる蛍光をそれぞれ検出することができる。また、異なる特定波長を有する複数の励起光を同時にこの試料に照射してもよい。
【００５１】
光学顕微鏡１０より、画像解析部３には、現在の諸条件、例えば、レンズ、フィルタ、ステージ位置、フォーカス位置などの測定情報２４が送られる。
【００５２】
また、画像解析部３は、顕微鏡電動ステージ１６用の電動フォーカスモーター１７の制御に必要な演算を実行する制御部４０、得られた画像データ２２に適切な処理を施し、後述する個々の画素の連結成分に基づいて微生物か否かを識別するための特徴情報を自動で算出する演算部５０、検査方法の定義入力や微生物の判定に使用する閾値などを入力するキーボード７２とステージフォーカス移動用トラックボール７１などからなる入力部７０および光学顕微鏡による撮像結果や各種解析結果等を表示する表示部６０とを備えている。
【００５３】
なお画像解析部３における処理は、各励起光ごとに行われるため、異なる波長を有する複数の特定波長を有する励起光を用いて各領域ごとに蛍光体が発する蛍光像を取得することができる。また、蛍光像を取得した場合には、各励起光ごとに得られる蛍光像を記憶すると共に、各励起光ごとに得られる蛍光像を組み合わせて蛍光スペクトル（あるいはピークの波長）を作成し、この蛍光スペクトルを予め設定されている判定用蛍光スペクトル（あるいは判定基準）と比較することで、蛍光体を、標的の微生物、標的以外の微生物、微生物でない異物などに識別することができる。判定用蛍光スペクトル（あるいは判定基準）は、画像解析部３に記憶されている。
【００５４】
画像解析部３では、試料の測定から微生物を識別する解析までの各工程を制御する自動蛍光検査機能を有している。この自動蛍光検査機能は、画像解析部３のＲＯＭに格納された自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３のＣＰＵがＲＡＭを用いて実行するものであり、蛍光染色された試料（例えば、メンブレンフィルター上に微生物を捕捉してこれを蛍光染色した試料）の全面を走査できるように顕微鏡電動ステージ１６を駆動させる機能、試料の全面走査に連動して各測定視野ごとに行われるフォーカス制御機能、試料における蛍光信号の検出部位を記憶しておき、試料を走査した後にこの部位の蛍光体を顕微鏡観察によって再確認できるようにする機能（例えば１次全領域検査時よりも高倍率レンズを用いる、あるいは１次検査に用いた励起光に加えて一つ以上の異なる励起光を照射する方法、あるいは両者を組み合わせる方法、すなわち無人自動および目視のValidation機能）、あるいは取得した画像中の個々の連結成分から蛍光強度や形状の特徴量を自動検出し、微生物の可能性がある蛍光体を特定する機能、この特定された微生物の可能性がある蛍光体に基づいて蛍光スペクトルやピークの波長を自動で作成し、微生物を識別する機能などがある。
【００５５】
なお制御部４０は、メンブランフィルタの全領域に励起光を順次照射するためにメンブランフィルタの全領域を所定領域ずつに分割し、試料台をその所定領域ずつ移動させる顕微鏡電動ステージ１６の移動に追従しながらフォーカス制御を実行して常に焦点を合わせる電動フォーカス制御部４１、顕微鏡電動ステージ１６を駆動させて微生物を含む試料の全面走査を可能にする電動ステージ制御部４２および顕微鏡及びカメラ制御部４３および画像取得部２１から送信される画像データ２２から微生物を識別する識別部４４を有する。顕微鏡及びカメラ制御部４３は、光源シャッター、レンズ切り替え、蛍光フィルターブロック切り替え、露光開始タイミング、露光時間の制御などを行う。また、制御部４０を用いて種々の制御ができるが、一例を示すと、光学顕微鏡１０の倍率を低倍率のレンズを用いて低倍率にしてから、特定波長を有する励起光で微生物を含む試料の各領域を順次照射しながら微生物を含む試料の全面を走査することにより蛍光体を検出し記憶し（第１次自動識別）、次に、蛍光体が検出された領域のみを、高倍率のレンズを用いて１種または２種以上の複数の特定波長を有する励起光で順次照射しながら各蛍光体の詳細な識別を行えるように制御することもできる。
【００５６】
測定する蛍光体の最大径の定義域内において、試料走査域数を計算する演算部５０は、検査域定義演算部５１および、顕微鏡電動ステージ１６と電動フォーカスモーター１７を制御することにより、微生物を含む試料を全面走査する際に微生物を含む試料の所定平面に焦点を設定すると常にその同一平面に自動的に焦点を合わせるようにする（プレディクティブフォーカス法などと呼ぶことがある）プレディクティブフォーカス演算部５２とを有する。
【００５７】
プレディクティブフォーカス法を更に詳しく説明すると、プレディクティブフォーカス法とは、走査定義範囲（ＸＹ一定範囲）内において、試料面と対物レンズとの距離（Ｚ一定）を一定に保つ方程式（試料平面の式）を予め設定し、測定走査の際には走査座標に応じて自動的に試料平面方程式どおりに焦点位置を制御する方法である。
【００５８】
［微生物の検査方法］
次に、上記説明した微生物検査装置１を用いる微生物の自動識別方法について説明する。
【００５９】
すなわち、まず、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出する第１次自動識別処理を図５を用いて説明し、次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理について、１波長識別法（図６）、２波長識別法（図７）、３波長識別法（図１５）の３種類の識別法を詳細に説明する。
【００６０】
なお、第１次および第２次自動識別処理は、どのようなレンズの倍率で行うことも可能であるが、以下の説明では、第１次自動識別処理を低倍率のレンズを用いて行い、第２次自動識別処理を高倍率のレンズを用いて行う場合を例にとって説明する。
【００６１】
［第１次自動識別処理の概要：図５］
図５は、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出するための第１次自動識別処理の手順について説明するフローチャートである。
【００６２】
なお、ステップＳ９１〜Ｓ９３は、前処理であり、ステップＳ９４〜Ｓ９９が第１次自動識別処理である。この第１次自動識別処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
【００６３】
まず、ステップＳ９１において、検査試料液を所定のフィルタ径、例えば１０〜５０ｍｍ径を有するメンブレンフィルタを用いるろ過器でろ過し、メンブレンフィルタ上に微生物や微生物以外の混入物を捕捉する。
【００６４】
次に、ステップＳ９２において、メンブレンフィルター上に捕捉した微生物を所定の蛍光標識物質で染色する。例えば、この染色方法として、ＦＩＳＨ法、蛍光抗体法、核酸染色法および酸素染色法などがある。
【００６５】
次に、ステップＳ９３において、染色された試料を含むメンブレンフィルタを微生物検査装置１の顕微鏡電動ステージ１６に固定することにより、検査試料液からの試料の調製が完了する。
【００６６】
次に、ステップＳ９４において、顕微鏡電動ステージ１６に固定された染色された試料を含むメンブレンフィルタに、各蛍光標識物質に対応する特定波長を有する励起光を照射する。なお、励起光が照射されるメンブレンフィルタは、予め所定の大きさを有する領域に分割されており、励起光はその分割された領域ごとに照射される。
【００６７】
次に、ステップＳ９５において、照射された励起光に応じて、試料中の各蛍光標識物質が微生物に吸収された部分から発生する特有波長を有する蛍光像を撮像する。
【００６８】
次に、ステップＳ９６において、得られた蛍光像について、２値化手法を用いて１ビット階調の２値化画像データを取得し、微生物の識別処理に必要な連結成分を抽出する。若しくは、得られた蛍光像に適当な画像処理を施し、この画像処理後のイメージ像について、２値化手法を用いて１ビット階調の２値化画像データを取得し、微生物の識別処理に必要な連結成分を抽出することもある。
【００６９】
次に、ステップＳ９７において、微生物と微生物以外とを識別する画像解析処理ならびに各連結成分からなる蛍光体の所在位置の決定を行う。この一連の１領域についての、ステップＳ９４の励起光の照射からステップＳ９７の微生物の識別処理までの工程を、試料の各領域毎にそれぞれ行い、試料の全領域を走査して、各領域ごとに蛍光体の所在位置の決定およびその蛍光体が微生物であるか否かの第１次判定を行う。
【００７０】
次に、ステップＳ９８において、微生物と微生物以外の所在位置マップの生成処理を行い、表示画面に検出された微生物を表示する。表示画面には、３種の識別表示で、微生物や微生物以外を表示することができる。
【００７１】
次に、ステップＳ９９において、画像解析処理結果を保存する。
【００７２】
［検査試料液：図５］
次に、図５の第１次自動識別処理について詳細に説明する。この１次自動識別処理は低倍率のレンズを用いて行なわれる。
【００７３】
微生物検査装置１で測定する検査試料液とは、例えば、ビールなどの飲料であり、本来は微生物や微生物以外の混入物を含まないものである。
【００７４】
しかしながら、製造工程などで、上記説明した微生物や微生物以外の混入物が飲料中に混入する可能性がある。飲料中の微生物としては、例えば、細菌や酵母などがある。その一例を示すと、ビールに有害な細菌であるぺクチネータス属菌は幅０．５〜２μｍ、曲線長さは１．５〜１０μｍである。もう一例を示すと、酵母は幅並びに曲線長さは３〜１０μｍである。このように混入する対象物の大きさには種々の大きさが考えられる。そのため微生物検査装置１で使用するフィルタの孔径は、混入する対象物の大きさに応じて適宜変更して使用することができる。
【００７５】
そこで、飲料の一部を適時、検査試料液として取り出し、上記説明した微生物検査装置１を用いて分析することにより、迅速かつ定量的に飲料中に微生物や微生物以外の混入物が含まれているかを自動で識別して、微生物と微生物以外の混入物に分けて表示することにより上記飲料の品質管理を行う。
【００７６】
［検査試料液からの試料の調製：図５のステップＳ９１、９２］
微生物検査装置１を用いて、検査試料液中の微生物の定量分析を行うために、まず試料調製を以下の手順で行う。
【００７７】
まず、ビールなどの飲料から所定量の検査試料液を採取する。次に、メンブレンフィルタを用いたろ過器を用いて検査試料液をろ過することにより、検査試料液中に含まれる全ての微生物や微生物以外の混入物は、メンブレンフィルタ上に捕捉される。
【００７８】
そこで、微生物検査装置１を用いてメンブレンフィルタ上に捕捉された微生物の全数を計数することにより、検査試料液中に含まれる全ての微生物および微生物以外の混入物の数を定量的に分析することができる。（この詳細については後述する。）
【００７９】
次に、ろ過器からメンブレンフィルタを取り出し、メンブレンフィルタ上に捕捉された微生物および微生物以外のもの（以下、試料と呼ぶ）に蛍光標識物質を作用させることにより、試料中の微生物を蛍光標識物質で染色する。ここで、試料中の微生物の染色は、例えば、図３より選ばれた１種または複数の蛍光標識物質を用いて行う。
【００８０】
次に、染色された試料を含むメンブレンフィルタを微生物検査装置１の顕微鏡電動ステージ１６に固定することにより検査試料液からの試料の調製が完了する。
【００８１】
［メンブレンフィルタ：図５のステップＳ９１］
なお上記説明したメンブレンフィルタについて説明すると、メンブレンフィルタは、例えば、多くの孔を有する円盤等の平板形状を有し、フィルタ直径は１０〜５０ｍｍ程度であり、フィルタ孔径は、例えば、０．２〜５０μｍであり、孔数は、必要に応じて任意に設計することができる。このため、上記メンブレンフィルタを用いて、フィルタ孔径よりも大きな微生物を捕捉することが可能である。
【００８２】
［蛍光標識物質による染色法：図５のステップＳ９２］
次に、上記説明したメンブレンフィルター上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する方法について詳細に説明する。微生物を蛍光標識物質で染色する方法としては、以下説明するＦＩＳＨ法や蛍光抗体法などがある。
【００８３】
まずＦＩＳＨ法について説明すると、ＦＩＳＨ法は、核酸プローブを用い、細胞内の核酸を標的として微生物を蛍光染色して検出する方法である。この方法は、微生物からの核酸抽出工程を必要とせず、前処理した微生物に直接蛍光標識した核酸プローブを添加して微生物細胞内の核酸のうちｒＲＮＡあるいは染色体ＤＮＡとハイブリダイズさせる方法である。
【００８４】
一般的には、微生物細胞内の核酸のうちｒＲＮＡをプローブの標的とする。ｒＲＮＡは生きた微生物細胞内には数千から数十万コピー存在するため、プローブの標的がｒＲＮＡコピー数分だけ存在することになる。このため、核酸プローブに結合した蛍光標識物質が標的とする微生物細胞内に多く留まり、使用した蛍光標識物質に対し適当な励起光を照射すると、蛍光顕微鏡下で標的微生物細胞のみが形態を維持したまま蛍光を発して観察できる。
【００８５】
また染色体ＤＮＡの菌種特異的な領域の相補配列をプローブに使用することも可能であり、同様に菌種特異的な微生物細胞を蛍光染色することができる。
【００８６】
次に、蛍光抗体法について説明すると、蛍光抗体法は、標的微生物細胞のタンパク質や糖類もしくは脂質などからなる抗原を特異的に認識する抗体を用いて、標的微生物を選択的に染色する方法である。この方法は、一般的には、細胞表層に存在する抗原を認識する抗体を用いる。抗体を直接蛍光標識するか、あるいは、一次抗体に結合する２次抗体を蛍光標識することにより、一次抗体が認識する表面抗原を有する微生物を特異的に蛍光染色して検出する。
【００８７】
なお上記説明したメンブレンフィルター上に捕捉した微生物をＦＩＳＨ法または蛍光抗体法を用いて染色する場合に使用する蛍光標識物質の一例を図３に示す。図３は、蛍光標識物質とその励起光および蛍光の関係を示す図である。
【００８８】
図３において、各蛍光標識物質に対応する特定波長を有する励起光を照射すると、各蛍光標識物質に対応する特有波長を有する蛍光を発する。そこで、図３を用いて、蛍光標識物質の選択および励起光と蛍光の波長の選択をすることができる。例えば、蛍光標識物質として、インドカルボシアニン色素（Ｃｙ３）を選択し、５５０ｎｍの波長を有する励起光を照射すると、５７０ｎｍの波長を有する蛍光を観測できる。また、予め、図３に示す複数の蛍光標識物質で試料を染色し、対応する励起光を試料に照射すると、試料より異なる波長を有する複数の蛍光を観測することもできる。
【００８９】
［試料の全面分析と連結成分の抽出：図５のステップＳ９５］
次に、画像解析部３で行う自動蛍光検査機能を用いた試料の全面分析について説明する。
【００９０】
自動蛍光検査機能では、まず試料全域の適正な走査範囲を決定する。すなわち測定対象とする蛍光体の最大径定義域、例えば、１μｍ〜２０μｍの範囲から対物レンズの倍率を例えば、１０倍に設定し、これにより一義的に決定されるＣＣＤカメラ有効視野例えば、横方向１１００μｍ縦方向８７０μｍと、測定対象とする蛍光体の最大径最大値２０μｍから、１画面あたりの走査ステップ量（横方向：１０６０μｍ＝１１００−２０＊２、縦方向：８５０μｍ＝８７０−２０）を自動的に求める。
【００９１】
また、画像解析部３では、１画面あたりにつき撮像エリア以外に測定エリアを定義し、これをステップ量と同じ値とする。すなわち、カメラ撮像範囲１視野につき横方向の両側２０μｍと縦方向の上方２０μｍが走査撮像により隣り合うカメラ撮像範囲視野と重複するように設定する。
【００９２】
画像解析部３では、測定エリア内に連結成分終点（連結成分の占有エリアのうち画面上でもっとも下側かつ右側の画面上での座標）が存在する連結成分を測定対象とするために、上記設定方法を採用することによって対象蛍光体を過不足なく確実に測定できる。
【００９３】
上記説明した内容を図４に示す画面の測定エリア８０で具体的に説明する。図４は、後述する２値化画像であり、画素８１のうち、所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素を斜線で表示し、「アクティブ」画素が接続している「塊」を、連結成分８２と定義する。
【００９４】
また、図４の中央部に示す連結成分８２の占有するエリアを連結成分の占有エリア８３といい、連結成分の占有エリア８３のうち画面上でもっとも下側かつ右側の画面上での画素を連結成分終点８４という。
【００９５】
また画像解析部３では、同時に顕微鏡電動ステージ１６および電動フォーカスモーター１７を制御することにより、常に試料が捕捉されているメンブレンフィルターの同一平面上に自動的に焦点を合わせる。そして制御される顕微鏡電動ステージ１６の位置座標（カメラ撮像範囲視野の座標）とその画面上で測定される連結成分の位置座標から、対象とする蛍光体の像のメンブレンフィルター上における絶対的な位置座標が自動的に決定される。
【００９６】
この方法で試料上全域で得られる蛍光体の像を無人の自動走査で検出することができる。そして、個々の蛍光体の像の蛍光強度や形状の特徴量、例えば、面積、曲線長と曲線幅など（詳細は後述する）のパラメータにて微生物判定のための閾値を予め設けておき、また複数もしくは一つの蛍光強度測定結果から得られる上記特徴量と各閾値とを比較することによって蛍光体が微生物であるか微生物以外であるかなどを無人で自動判定できる。
【００９７】
なお、メンブレンフィルター上での位置座標が求められているために、個々の蛍光体の像について、対物レンズの倍率を上記設定した１０倍から例えば２０倍、４０倍などに変更した後で順次走査することにより、個々の蛍光体の像を更に正確に無人自動などで測定することができる（この操作をValidation操作という）。このため、微生物や微生物以外の判定がより容易にできる。
【００９８】
なお、上記説明した方法によって得られた測定データおよび個々の蛍光体の画像は、画像解析部３にファイルして保存され、必要があればこのファイルを画像解析部３の管理下で任意に引き出して参照することができる。
【００９９】
［蛍光体の２値化手法による画像処理：図５のステップＳ９６］
次に、上記説明した試料上全域で得られる蛍光体の像について、画像解析部３が画像解析の前に行う画像処理（２値化手法）について説明する。
【０１００】
画像解析部３で扱う画像は多値のディジタル情報により構成されている。例えば、モノクロ画像では、２５６階調（８ビット階調）などを用いる。
【０１０１】
画像解析部３は、取り込んだ画像をディジタル化する機能を有するが、本実施形態の場合には、画像取得部２１としてディジタルカメラを使用するため、取得した画像はすでにディジタル化され、多階調画像となっている（２５６階調（８ビット階調））。
【０１０２】
次に、画像解析部３は、２値化手法による画像処理を行う。すなわち、２値化とは、この多階調画像から画像を構成する各画素を、任意の範囲の輝度を「アクティブ」とし、他の輝度を「ネガティブ」として「２値」化し、８ビット階調の画像を１ビット階調に変更する。
【０１０３】
［連結成分の抽出：図４］
次に、メンブレンフィルターの各測定領域ごとに得られる上記説明した１ビット階調の２値化画像を用いて、微生物の識別処理に必要な連結成分の抽出方法について説明する。
【０１０４】
図４は、所定領域である測定エリア８０を測定した画像を上記説明した２値化方法で画像処理した２値化画像の一例である。
【０１０５】
図４の中央部に位置する画素８１のうち所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素（斜線部）が接続している「塊」を連結成分８２と定義し、連結成分８２の占有するエリアが連結成分の占有エリア８３であり、連結成分終点８４は、連結成分の占有エリアのうちで最も右下の画面上の座標である。
【０１０６】
図４において、所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素の集合体である連結成分８２より、後述する画像解析法を用いて、占有エリア８３の占める面積、平均輝度、曲線長、曲線幅、円形度係数を求めることができる。
【０１０７】
［第２次自動識別処理：１波長識別法：図６］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理として、１波長識別法（図６）、２波長識別法（図７）、３波長識別法（図１２）の３種類の識別法について詳細に説明する。
【０１０８】
この第２次自動識別処理は、微生物を精度良く識別するため高倍率のレンズを用いて行う。
【０１０９】
最初に、１波長識別法による第２次自動識別処理について説明する。
【０１１０】
図６に、１波長を用いた第２次自動識別処理のフローチャートを示す。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
【０１１１】
図６において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ１９５に進み、第１次自動識別処理によって、抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
【０１１２】
次に、ステップＳ９５とステップＳ９６の処理を行ってからステップＳ１９６に進む。なお、図６のステップＳ９５とステップＳ９６は、図５で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するのでここでの説明は省略する。
【０１１３】
ステップＳ１９６は、１波長の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、微生物の自動識別処理として、蛍光体の像の蛍光強度や形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する面積法、平均輝度法、曲線長法などがある。以下、図８〜図１０を用いて詳細に説明する。
【０１１４】
図８は、１波長の励起光を用いる微生物の識別処理法の一例として、面積法、平均輝度法、曲線長法、曲線幅法および円形度係数法と各方法における微生物の判定基準を示している。
【０１１５】
図９は、図８に示した曲線長法、曲線幅法および円形度係数法における曲線長、曲線幅および円形度係数の算出式を示している。
【０１１６】
図１０は、具体的な蛍光像から曲線長法、曲線幅法および円形度係数法を用いて曲線長、曲線幅および円形度係数を算出した一例を示している。
【０１１７】
［面積法：図８］
まず面積法について説明する。
【０１１８】
面積法は、図８に示すように、撮像によって得られる連結成分の全画素数（pix）と、予め作成されている単位画素当たりの実面積であるキャリブレーション値（（μｍ）２/pix）との積である連結成分の実面積（（μｍ）２）を求め、次に、予め設定されている判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する方法である。判定基準（図８）の例として、例えば、連結成分の実面積が５〜２００（μｍ）２であれば、連結成分は微生物であると識別する。
【０１１９】
［平均輝度法：図８］
次に、平均輝度法について説明する。
【０１２０】
平均輝度法は、図８に示すように、連結成分を構成する各画素の輝度（０〜２５５）より平均輝度を求める方法であり、各画素の輝度を合計した全輝度を全画素数（pix）で割った値である。判定基準（図８）の例として、例えば、連結成分の平均輝度が１０〜２５５であれば、連結成分は微生物であると識別する。
【０１２１】
［曲線長法：図８］
次に、曲線長法について説明する。
【０１２２】
曲線長(ＣＬ：Curve Length)法は、図８に示すように、対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も長い画素サイドの長さ（pix）と、予め作成されている単位画素長さであるキャリブレーション値（μｍ/pix）との積である曲線長（μｍ）を求める。
【０１２３】
例えば、図１０Ａの対象連結成分の曲線長は、１１（pix）であり、図１０Ｂの対象連結成分の曲線長は、５（pix）である。
【０１２４】
次に、予め設定されている微生物の判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する。
【０１２５】
なお対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も長い画素サイドの長さは、図９に示す定義式を用いて算出する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線長が０．５〜５０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。なお曲線長の値は、曲げられた微生物、ファイバ等の長さを与える。
【０１２６】
［曲線幅法：図８］
次に、曲線幅法について説明する。
【０１２７】
曲線幅（ＣＷ：Curve Width）法は、図８に示すように、対象連結成分と同じエリア、および、周囲長を持つ長方形の最も短いサイドの長さ（pix）と、予め作成されている単位画素長さであるキャリブレーション値（μｍ/pix）との積である曲線長（μｍ）を求める。
【０１２８】
例えば、図１０Ａの対象連結成分の曲線幅は、２（pix）であり、図１０Ｂの対象連結成分の曲線幅は、２（pix）である。
【０１２９】
次に、予め設定されている微生物の判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する。
【０１３０】
なお対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も短い画素サイドの長さは、図９に示す定義式を用いて算出する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線幅が０．１〜１０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。なお曲線長の値は、曲げられた微生物、ファイバ等の幅を与える。
【０１３１】
［円形度係数法：図８］
次に、円形度係数法について説明する。
【０１３２】
円形度係数（Ｒ：Roundness）法は、図９に示す定義式によって与えられる無次元数であり、対象連結成分が円の場合に最小値１を与え、対象連結成分がそれ以外の場合に１より大きな値を与える。
【０１３３】
例えば、図１０Ａの対象連結成分の円形度係数は、２．３であり、図１０Ｂの対象連結成分の円形度係数は、１．５である。
【０１３４】
なお図９に示す定義式において、１．０６４は調整ファクタであり、画像のディジタル化によって発生するコーナーの誤差を全周にわたって訂正する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、円形度係数が１〜１０であれば、連結成分は微生物であると識別する。
【０１３５】
次に、図６のステップＳ１９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ１９５に戻り上記説明したステップＳ１９５〜ステップＳ１９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ１９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進む。
【０１３６】
次に、ステップＳ１９８において、ステップＳ９９で抽出された各蛍光体に対してステップＳ１９６での判定に基づき、微生物と微生物以外の所在位置マップの生成処理を行い、表示画面に検出された微生物を表示する。表示画面には、３種の識別表示で微生物や微生物以外を表示できる。
【０１３７】
次にステップＳ１９９において、各蛍光体に関して画像解析処理による微生物判定結果を保存することにより、１波長の励起光を用いる微生物の自動識別処理が終了する。
【０１３８】
このようにして、１波長識別法では、蛍光体の形状の特徴から微生物を識別することができる。
【０１３９】
［第２次自動識別処理：２波長識別法：図７］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理の２番目の方法として、２波長の励起光を用いる２波長識別法について詳細に説明する。
【０１４０】
なお、２波長識別法では、検出したい微生物、すなわち標的とする微生物が特定の励起光を照射したときに蛍光を発するように、試料は予め図３に示す蛍光標識物質を用いて染色しておく。
【０１４１】
まず、２波長識別法の概要を説明すると、１種類の蛍光標識物質を用いて試料に含まれる標的微生物を染色し、この蛍光標識物質に対応する励起光とそれ以外の励起光をこの試料に順次照射し、対応して各蛍光体から放出される蛍光像を順次検出し、各励起光に対応して得られる蛍光像を組み合わせて各蛍光体ごとに蛍光スペクトルを作成し、得られた蛍光スペクトルを予め設定されている判定基準用の蛍光スペクトルと比較する。その結果より、各蛍光体が標的微生物なのか、あるいは、標的微生物以外の物であるのかを個々に識別し、試料中の標的微生物を識別することができる。
【０１４２】
図７および図１４に、２波長を用いた微生物の自動識別処理のフローチャートを示す。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
【０１４３】
図７において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ２９３に進み、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
【０１４４】
次に、第１波長を有する励起光を用いてステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を行って蛍光体の形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してからステップＳ２９４に進む。なお、図７のステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その詳しい説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
【０１４５】
次に、ステップＳ２９４で、蛍光フィルターを切り換えてから、ステップＳ２９５に進み、第２波長を有する励起光を用いて上記説明したステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を繰り返し行う。
【０１４６】
次に、ステップＳ２９５の処理が終了すると、次にステップＳ２９６に進む。ステップＳ２９６では、ステップＳ１９６で特定された各標的の微生物の可能性がある蛍光体の中から標的の微生物を識別する。ステップＳ２９６は、２波長の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、その詳細を図１４に示す。すなわち、ステップＳ２００で、各励起光に対して各フィールドごとに得られる蛍光体より蛍光スペクトルまたはピークの波長を作成し、次に、ステップＳ２０１で、得られた蛍光スペクトルまたはピークの波長を判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と照合して各フィールドの蛍光体から微生物を識別する。
【０１４７】
次に、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ２９８に進み、蛍光フィルターを原位置に戻してからステップＳ２９３に戻り上記説明したステップＳ２９３〜ステップＳ２９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進み、ステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理を行う。
【０１４８】
なお、図７のステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
【０１４９】
次に、上記説明した２波長識別法における第２次自動識別処理について図１１〜図１３を用いて具体的に説明する。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
【０１５０】
２波長の励起光を用いる第２次自動識別処理では、まず、１波長識別法で説明した面積法、平均輝度法、曲線長法などを２波長の励起光にそれぞれ適用して各励起光に対する蛍光体の蛍光強度や形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してから（ステップＳ１９６）、次に、各励起光に対して得られる標的の微生物の可能性がある蛍光体の違いを利用して微生物を識別する（ステップＳ２９６）。
【０１５１】
図１１は、２波長の励起光を用いる第２次識別処理で得られる各フィールドの蛍光体（２値化画像）の例を説明する図である。
【０１５２】
２波長の励起光を用いる第２次識別処理では、異なる２つの励起光１（例：Ｃｙ３検出用）および励起光２をメンブランフィルタ上の試料に照射し、例えば図１１に示すように、それぞれの励起光に対応して各フィールド（ここでは、Ａ、Ｂ、Ｃの３フィールド）ごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）３０１〜３０６を取得する。
【０１５３】
次に、図１２に示すように２つの励起光１および励起光２に対してフィールドＡ、Ｂ、Ｃでそれぞれ得られる６つの蛍光体３０１〜３０６を組み合わせて、蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４またはピークの波長３５１、３５３、３５５を作成する。
【０１５４】
例えば、フィールドＡでは、２つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体３０１と３０４とを組み合わせて２つのピークを有する蛍光スペクトル３５０またはピークの波長３５１を作成する。フィールドＢでは、２つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体３０２と３０５とを組み合わせて１つのピークを有する蛍光スペクトル３５２またはピークの波長３５３を作成する。フィールドＣも同様に行って、蛍光スペクトル３５４またはピークの波長３５５を作成する。
【０１５５】
次に、作成した蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４またはピークの波長３５１、３５３、３５５を、図１３に一例を示す標的の微生物を示す判定用蛍光スペクトル３６０，異物を示す判定用蛍光スペクトル３６１または判定基準（２波長用）３６２とそれぞれ比較する。判定用蛍光スペクトルまたは判定基準は、予め各励起光に対応して得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルまたはピークの波長が標的の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。例えば、図１１の各フィールドごとに得られた蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４を標的の微生物を示す判定用蛍光スペクトル３６０，異物を示す判定用蛍光スペクトル３６１と比較することにより、図１１の３つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＡ、Ｃの蛍光体は異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルまたは判定基準は、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
【０１５６】
このようにして、蛍光体（２値化画像）３０１〜３０６から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
【０１５７】
［第２次自動識別処理：３波長以上識別法：図１５］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理の３番目の方法として、３波長以上の励起光を用いる３波長以上識別法について、３波長の励起光を用いる３波長識別法を例にとり詳細に説明する。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
【０１５８】
なお、３波長を用いる識別法では、予め試料中に含まれる標的の微生物、標的以外の微生物を識別できるように、試料を２種の蛍光標識物質（例えば、Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって染色する。一例を示せば、標的の微生物（例えば、ペクチネータス菌）は、２種の蛍光標識物質（Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって２重に染色し、標的以外の微生物は、１種の蛍光標識物質（ＤＡＰＩ）のみで染色する。
【０１５９】
まず３波長識別法の概要を説明する。  ２種の蛍光標識物質を用いて試料に含まれる微生物を標的微生物とそれ以外の微生物が識別できるように染色し、この蛍光標識物質に対応する２種の励起光とそれ以外の励起光をこの試料に順次照射し、対応して各蛍光体から放出される蛍光像を順次検出し、各励起光に対応して得られる蛍光像を組み合わせて各蛍光体ごとに蛍光スペクトルを作成し、得られた蛍光スペクトルを予め設定されている判定用の蛍光スペクトルと比較する。その結果、各蛍光体が標的の微生物なのか、その他の微生物か、あるいは、それ以外の物体であるのかを個々に識別し、試料中の標的微生物を識別することができる。
【０１６０】
図１５および図１４に、３波長を用いた微生物の自動識別処理のフローチャートを示す。
【０１６１】
図１５において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ２９３に進み、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
【０１６２】
次に、第１波長を有する励起光を用いてステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を行って蛍光体の蛍光強度や形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してからステップＳ２９４に進む。なお、図１５のステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
【０１６３】
次に、ステップＳ３９０に進み、次の励起光による照射を行うために次の蛍光フィルターに切り替える必要がある場合には、ステップＳ２９４に進み、蛍光フィルターを切り替えてから、ステップＳ２９５に進み、第２波長を有する励起光を用いて上記説明したステップＳ９５とステップＳ９６の処理を繰り返し行ったのちに、ステップＳ３９６に進む。一方、ステップＳ３９０において、全ての励起光による照射が終了し、次のフィルタの切り替えが必要ない場合には、ステップＳ３９６に進む。
【０１６４】
ステップＳ３９６では、ステップＳ１９６でそれぞれ特定された標的の微生物の可能性がある蛍光体の中から標的の微生物を識別する。ステップＳ３９６は、３波長以上の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、その詳細を図１４に示す。すなわち、ステップＳ２００で、各励起光に対して各フィールドごとに得られる蛍光体より蛍光スペクトルまたはピークの波長を作成し、次に、ステップＳ２０１で、得られた蛍光スペクトルまたはピークの波長を判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と照合して各フィールドの蛍光体から微生物を識別する。
【０１６５】
次に、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ２９８に進み、蛍光フィルターを原位置に戻してからステップＳ２９３に戻り上記説明したステップＳ２９３〜ステップＳ３９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進み、ステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理を行う。
【０１６６】
なお、図１２のステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
【０１６７】
次に、上記説明した３波長識別法における第２次自動識別処理について図１６〜図２０を用いて具体的に説明する。
【０１６８】
３波長の励起光を用いる第２次自動識別処理では、まず、１波長識別法で説明した面積法、平均輝度法、曲線長法などを３波長の励起光にそれぞれ適用して各励起光に対する蛍光体の蛍光強度や形状から標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定し（ステップＳ１９６）、次に、各励起光に対して得られる標的の微生物の可能性がある蛍光体の違いを利用して微生物を識別する（ステップＳ３９６）。
【０１６９】
図１６は、３波長の励起光を用いる第１次および第２次識別処理で得られる各フィールドの蛍光体（２値化画像）の例を説明する図である。
【０１７０】
３波長の励起光を用いる第１次識別処理では、低倍率のレンズを用い、例えば励起光２（ＤＡＰＩ検出用）をメンブランフィルタ上の試料に照射し、励起光２に対応して各フィールドごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）４１３〜４１６を取得する。
【０１７１】
次に、３波長の励起光を用いる第２次識別処理では、第１次識別処理で蛍光体が検出されたフィールドのみに、異なる３つの励起光１〜励起光３を順次照射し、例えば図１６に示すように、それぞれの励起光に対応して各フィールド（ここでは、Ａ〜Ｄの４フィールド）ごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）４０１〜４１２を取得する。
【０１７２】
次に、図１７に示すように３つの励起光１〜励起光３に対してフィールドＡ〜Ｄでそれぞれ得られる３つの蛍光体４０１〜４１２を組み合わせて、蛍光スペクトル４５１〜４５４を作成する。なお図１７では省略したが、蛍光スペクトル４５１〜４５４の代わりに図１２で示したようなピークの波長を作成してもよい。
【０１７３】
例えば、フィールドＡでは、３つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体４０１と４０５と４０９とを組み合わせて３つのピークを有する蛍光スペクトル４５１を作成する。フィールドＢでは、３つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体４０２と４０６と４１０とを組み合わせて２つのピークを有する蛍光スペクトル４５２を作成する。フィールドＣおよびＤも同様に行って、１つのピークを有する蛍光スペクトル４５３、４５４を作成する。
【０１７４】
次に、作成した蛍光スペクトル４５１〜４５４を、図１８に一例を示す判定用蛍光スペクトル４６０〜４６３とそれぞれ比較する。判定用蛍光スペクトルは、１次識別用に用いた励起光と、２次識別用に用いた励起光の組み合わせに対応してそれぞれ用意されており、得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルが標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。
【０１７５】
なお、図１８に一例を示す判定用蛍光スペクトル４６１〜４６３は、４６０に示す１次識別用励起光として励起光２を照射したときに試料から検出された蛍光体について、励起光１〜３を用いて２次識別するときに用いる３波長用の判定用蛍光スペクトルの例であり、４６１は異物を、４６２は標的の微生物を、４６３は標的以外の微生物をそれぞれ示している。
【０１７６】
図１６の各フィールドごとに得られた蛍光スペクトル４５１〜４５４を判定用蛍光スペクトル４６１〜４６３と照合することにより、図１６の４つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＣ、Ｄの蛍光体は標的以外の微生物、フィールドＡは異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルは、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
【０１７７】
また、上記説明した蛍光スペクトルを作成するかわりに図１２で示したピークの波長を作成してもよい。この場合には、判定用蛍光スペクトルの代わりに予め画像解析部３に記憶されている図１３で示したような３波長用の判定基準を用いればよい。
【０１７８】
このようにして、蛍光体（２値化画像）４０１〜４１２から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準とを比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
【０１７９】
［３波長識別法の別の例：図１９］
図１９は、３波長の励起光を用いる第２次識別処理の別の例について説明する図である。試料中に含まれる微生物は、予め標的の微生物、標的以外の微生物を識別できるように、試料は２種の蛍光標識物質（例えば、Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって染色されている。
【０１８０】
図１９の例が図１６に示した例と異なる点は、図１６では、第２次識別処理に先だっで低倍率で蛍光体を検出する第１次識別処理で使用する励起光に励起光２（ＤＡＰＩ検出用）を用いるのに対して、図１９では、第１次識別処理で使用する励起光に励起光１（Ｃｙ３検出用）を用いる点である。
【０１８１】
図１９の５０１〜５０５は、第１次識別処理で検出される蛍光体を示している。すなわち、励起光１（Ｃｙ３検出用）をメンブランフィルタ上の試料に照射し、励起光１に対応して各フィールド（ここでは、Ａ〜Ｅの５フィールド）から検出される蛍光体の２値化画像である。なお、フィールドＥからは蛍光体は得られないことを示している。
【０１８２】
次に、図１９に示すように３つの励起光１〜励起光３に対してフィールドＡ〜Ｄでそれぞれ得られる３つの蛍光体５０６〜５１７を組み合わせて、図示はしないが、図１７と同様の蛍光スペクトルあるいは図１２で示したピークの波長を作成する。
【０１８３】
次に、作成した蛍光スペクトルを、図２０に一例を示す３波長用の判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４とそれぞれ比較する。なお図２０の判定用蛍光スペクトルは、４７０に示す１次識別用に用いた励起光と、２次識別用に用いた励起光の組み合わせに対応してそれぞれ用意されており、得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルが標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。
【０１８４】
なお、図２０に一例を示す判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４は、４７０に示す１次識別用励起光として励起光１を照射したときに試料から検出された蛍光体について、励起光１〜３を用いて２次識別するときに用いる３波長用の判定用蛍光スペクトルの例であり、４７１は異物を、４７２は標的の微生物を、４７３、４７４は異物をそれぞれ示している。
【０１８５】
図１９の各フィールドごとに得られた図示しない蛍光スペクトルを判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４と照合することにより、図１９の４つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＡ、Ｃ、Ｄの蛍光体は異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルは、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
【０１８６】
このようにして、蛍光体（２値化画像）５０６〜５１７から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準とを比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
【０１８７】
なお、図１９では、第１次識別処理で使用する励起光に標的の微生物のみを識別する励起光１（Ｃｙ３検出用）を用いるため、標的以外の微生物は、第１次自動識別によって除外される。このため、試料中に含まれる微生物のうちで標的の微生物のみを第１次自動識別で、識別できる。また図１９に示す識別法は、第１次自動識別で識別された蛍光体（フィールドＡ〜Ｄ）の中から標的の微生物（フィールドＢ）を異物（フィールドＡ，Ｃ，Ｄ）と精度良く識別することができる。
【０１８８】
以上説明したように、本実施形態の微生物の検査装置は、微量の蛍光を検出することが可能であるため、試料中の１個体の標的微生物を検出することができる。そのため、従来のように多量の微生物を含む試料を作製するために培養に長時間かけてコロニー形成させる必要も無い。
【０１８９】
また検出された蛍光体の画像より、形状の特徴量、例えば、連結成分の平均蛍光強度、面積、曲線長と曲線幅の比など各種パラメータを算出し、算出された各種パラメータに基づいて、蛍光体の画像が微生物によるものか否かを無人自動で検出できる。そのため、従来のように目視で微生物の識別を確認も必要としないため精度の高い迅速な微生物の自動検出が可能となる。
【０１９０】
したがって、本発明による測定装置は、飲料、食品、医薬、化粧品等の工程管理、製品品質管理等における微生物検査の他、排水、工業用水、環境サンプル、上下水道における微生物検査、生命工学等の種々の研究分野における微生物検査、更には自家蛍光をもつ微小片の検出および数の検査等に応用できる。
【０１９１】
以上説明したように、本発明によれば、例えば、検査対象となる試料中に含まれる微生物に関する情報を自動で迅速に取得可能な微生物の検査装置および検査方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
図１は、本発明に係る一実施形態の微生物の検査装置である。
図２は、本発明に係る一実施形態の微生物の検査装置の全体構成を説明する図である。
図３は、蛍光標識物質、励起光および蛍光の関係を示す図である。
図４は、連結成分について説明する図である。
図５は、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出する第１次自動識別処理のフローチャートである。
図６は、１波長識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図７は、２波長識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図８は、微生物の識別方法とその判定基準を説明する図である。
図９は、画素の連結成分から曲線長、曲線幅および円形度係数の算出方法を説明する図である。
図１０は、画素の連結成分から曲線長、曲線幅および円形度係数を算出する例を説明する図である。
図１１は、２波長識別法の第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の例を説明する図である。
図１２は、２波長識別法で、各フィールドの２値化画像から蛍光スペクトル（あるいはピークの波長）を得る手順を説明する図である。
図１３は、２波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルまたは判定基準の一例を示す図である。
図１４は、各フィールドの蛍光体から微生物を識別する処理のフローチャートである。
図１５は、３波長以上識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図１６は、３波長識別法の第１および第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の例を説明する図である。
図１７は、３波長識別法の一例で、第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像から蛍光スペクトルを得る手順を説明する図である。
図１８は、３波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルまたは判定基準の一例を示す図である。
図１９は、３波長識別法の第１および第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の別の例を説明する図である。
図２０は、図１９の３波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルの別の例を示す図である。
【図１】
0004029983.tif 000002
【図２】
0004029983.tif 000003
【図３】
0004029983.tif 000004
【図４】
0004029983.tif 000005
【図５】
0004029983.tif 000006
【図６】
0004029983.tif 000007
【図７】
0004029983.tif 000008
【図８】
0004029983.tif 000009
【図９】
0004029983.tif 000010
【図１０Ａ】
0004029983.tif 000011
【図１０Ｂ】
0004029983.tif 000012
【図１１】
0004029983.tif 000013
【図１２】
0004029983.tif 000014
【図１３】
0004029983.tif 000015
【図１４】
0004029983.tif 000016
【図１５】
0004029983.tif 000017
【図１６】
0004029983.tif 000018
【図１７】
0004029983.tif 000019
【図１８】
0004029983.tif 000020
【図１９】
0004029983.tif 000021
【図２０】
0004029983.tif 000022