(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、ヒトのサイクリックＧＭＰ結合性、サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ（ｃＧＢ-ＰＤＥ）ポリペプチドをコードする、ことを特徴とする精製および単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、発現制御配列と作動可能に連結される請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドで安定に形質転換またはトランスフェクトされて、その細胞内での、配列番号：２３に記載のアミノ酸配列で表されるヒトのｃＧＢ-ＰＤＥポリペプチドの発現が許容された宿主細胞。
【請求項６】
ヒトのｃＧＢ-ＰＤＥポリペプチドの製造方法であって、以下の工程、すなわち；
好適な栄養培地にて請求項５に記載の宿主細胞を生育せしめ、および
当該細胞または当該培地からｃＧＢ-ＰＤＥポリペプチドを単離する、
工程を含む、ことを特徴とするヒトのｃＧＢ-ＰＤＥポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって製造されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：２２に記載のＤＮＡ配列で表されるポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とする精製および単離されたｃＧＢ-ＰＤＥポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列の第５１６位〜第８７５位の連続するアミノ酸からなる、ことを特徴とするヒトのｃＧＢ-ＰＤＥポリペプチド断片。
【請求項１０】
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列で表されるヒトのｃＧＢ-ＰＤＥポリペプチドに対して特異的な免疫反応性を示す抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９３年３月２７日に提出せる係属中の米国特許番号第０８／０６８，０５１号の一部継続出願である。
本明細書中に記載の実験作業は、研究助成金ＧＭ１５７３１、ＤＫ２１７２３、ＤＫ４００２９およびＧＭ４１２６９ならびにナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスにより授与された医科学訓練プログラム助成金ＧＭ０７３４７によって維持された。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
発明の分野
本発明は一般に、ｃＧＢ−ＰＤＥと名付けたサイクリックグアノシンモノホスフェート結合性、サイクリックグアノシンモノホスフェート特異的ホスホジエステラーゼに関し、さらに詳細にはｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドをコードする新規な精製され単離されたポリヌクレオチド、ｃＧＢ−ＰＤＥポリヌクレオチドの組換え製造のための方法および材料、ならびにｃＧＢ−ＰＤＥ活性のモジュレーターを同定するための方法に関する。
背景
サイクリックグアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）およびサイクリックアデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）などの３’５’サイクリックヌクレオチドの対応するヌクレオシド５’モノホスフェートへの加水分解を触媒するサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、酵素の複合ファミリーを構成している。サイクリックヌクレオチドの細胞内濃度を媒介することによって、サイクリックヌクレオチドセカンドメッセンジャーを含むシグナルトランスダクションにおいてＰＤＥアイソザイムは機能する。
異なる組織供給源から種々のＰＤＥが単離され、今日までに特徴付けされたＰＤＥの多くは、物理化学的性質、基質特異性、阻害剤に対する感度、免疫学的反応性および調節の態様を含む生物学的性質において差異を呈する。（ビーボ（Beavo）ら、サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼズ：ストラクチャー、レギュレーション・アンド・ドラッグ・アクション（Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action）、ジョーン・ウィレイ・アンド・サンズ（John Wiley & Sons）、チチェスター（Chichester）、英国）を参照されたい）種々のＰＤＥの既知のアミノ酸配列の比較により、ほとんどのＰＤＥが別の触媒および調節ドメインを有するキメラ性マルチドメインタンパク質であることが示される。（シャーボンニュー（Charbonneau）、ビーボら、前出、267〜296頁を参照されたい）今日までに特徴付けがなされたすべての哺乳動物のＰＤＥは、触媒部位を含んでなると考えられ、酵素のカルボキシル末端領域に位置する長さおよそ２５０アミノ酸残基の配列を共有している。アロステリック分子または調節分子と相互作用するＰＤＥドメインは、アイソザイムのアミノ末端領域に位置すると思われる。それらの生物学的性質に基づき、ＰＤＥは以下の６つの概括的なファミリーに分類され得る：Ｃａ2+／カルモジュリンで刺激されるＰＤＥ（Ｉ型）、ｃＧＭＰで刺激されるＰＤＥ（II型）、ｃＧＭＰで阻害されるＰＤＥ（III型）、ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ（IV型）、本発明の主題であるｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼｃＧＢ−ＰＤＥ（Ｖ型）およびｃＧＭＰ特異的フォトレセプターＰＤＥ（VI型）。ｃＧＭＰ結合性ＰＤＥ（II型、Ｖ型およびVI型ＰＤＥ）は、それらのカルボキシル末端近傍に相同な触媒ドメインを有するに加えて、それらのアミノ末端により近く位置し、アロステリックなｃＧＭＰ結合ドメインを含み得る第２の保存された配列を有する。シャーボンニューら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、87巻、288〜292頁（1990年）を参照されたい。
II型のｃＧＭＰで刺激されるＰＤＥ（ｃＧｓ−ＰＤＥ）は、異なる組織のタイプに広く分布し、１００〜１０５ｋＤａのサブユニットのホモダイマーとして存在すると考えられる。ｃＧｓ−ＰＤＥは生理的条件下においてｃＡＭＰ加水分解の速度を高めることによって上昇したｃＧＭＰ濃度に応答する。ウシ心臓ｃＧｓ−ＰＤＥのアミノ酸配列およびウシ副腎ｃＧｓ−ＰＤＥの部分ｃＤＮＡ配列はレトロング（LeTrong）ら、Biochemistry、29巻、10280〜10288頁（1990）に報告され、さらにウシ副腎およびヒト胎児脳ｃＧＢ−ＰＤＥの全長のｃＤＮＡ配列が1992年10月29日公開のＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１８５４１号に記載されている。ウシ副腎の全長のｃＤＮＡ配列はソネンバーグ（Sonnenburg）ら、J.Biol.Chem.、266巻、17655〜17661頁（1991）にも記載されている。
フォトレセプターＰＤＥおよびｃＧＢ−ＰＤＥはｃＡＭＰよりもｃＧＭＰに対して、加水分解について５０倍またはそれより多くの選択性を呈するので、ｃＧＭＰ特異的なＰＤＥとして記載されている。
フォトレセプターＰＤＥは桿状体外部セグメントＰＤＥ（ＲＯＳ−ＰＤＥ）および円錐体（cone）ＰＤＥである。ＲＯＳ−ＰＤＥのホロ酵素構造は、いずれも触媒的に活性を有する２つの大きなサブユニットα（８８ｋＤａ）およびβ（８４ｋＤａ）ならびに２つのもっと小さなγ調節サブユニット（いずれも１１ｋＤａ）からなる。α、β、およびγサブユニットならびにＣＯＳ−ＰＤＥの１５ｋＤａサブユニットと同じであるらしいδサブユニット（１５ｋＤａ）を含むＲＯＳ−ＰＤＥの可溶性型もまた同定されている。ウシの膜会合性ＲＯＳ−ＰＤＥ α−サブユニットに対応する全長のｃＤＮＡは、オブチニコフ（Ovchinnikov）ら、FEBS Lett.、223巻169〜173頁（1987）に記載されており、ウシ桿状体外部セグメントＰＤＥ β−サブユニットに対応する全長のｃＤＮＡは、リプキン（Lipkin）ら、J.Biol.Chem.、265巻、12955〜12959頁（1990）に記載されている。オブチニコフら、FEBS Latt.、204巻、169〜173頁（1986）は、ウシＲＯＳ−ＰＤＥ γ−サブユニットに対応する全長のｃＤＮＡおよびそのδサブユニットのアミノ酸配列を示している。ＲＯＳ−ＰＤＥの発現が、脳においてもコリンズ（Collins）ら、ゲノミックス（Genomics）、13巻、698〜704頁（1992）にて報告されている。ＣＯＳ−ＰＤＥは、２つの同一のα’（９４ｋＤａ）サブユニットならびに１１ｋＤａ、１３ｋＤａおよび１５ｋＤａの３つのもっと小さなサブユニットで構成される。ウシＣＯＳ−ＰＤＥ α’−サブユニットに対応する全長のｃＤＮＡは、リー（Li）ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、293〜297頁（1990）に報告されている。
ｃＧＢ−ＰＤＥは、ラット（フランシス（Francis）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）、159巻、722〜729頁（1988））およびウシ肺組織（トーマス（Thomas）ら、J.Biol.Chem.、265巻14964〜14970頁（1990）、以下「トーマスＩ」と記載）から均質に精製されている。この酵素または類似の酵素の存在が、ラットならびにヒトの血小板（ハメット（Hamet）ら、
Adv.Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylation Res.、16巻、119から136頁（1984））、ラット脾臓（コンクイル（Conquil）ら、Biochem. Biophys.Res.Commun.、127巻、226〜231頁（1985））、モルモット肺（デイビス（Davis）ら、J.Biol.Chem.、252巻4078〜4084頁（1977））、管平滑筋（コンクイルら、Biocehm.Biophys.Acta、61巻、148〜165頁（1980））、およびウニ精子（フランシスら、J.Biol.Chem.、255巻、620〜626頁（1979））を含めた種々の組織および種において報告されている。ｃＧＢ−ＰＤＥは２つの９３ｋＤａサブユニットからなるホモダイマーかもしれない。（トーマスＩ、前出、参照）ｃＧＢ−ＰＤＥは、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｃＧＫ）によりリン酸化され、より低い親和性でｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによりリン酸化される、他の既知ｃＧＭＰ結合性ＰＤＥにおいては見出されない単一の部位を含むことが示されている。（トーマスら、J.Biol.Chem.、265巻、14971〜14978頁（1990）、以下「トーマスII」と記載、参照）当該リン酸化部位およびｃＧＢ−ＰＤＥのキモトリプシン消化により作製された断片のアミノ末端部の１次アミノ酸配列は、トーマスII、前出およびトーマスＩ、前出にそれぞれ記載されている。しかしながら、ｃＧＢ−ＰＤＥのアミノ酸配列の大半はこれまでに報告されていない。
異なる型のＰＤＥの阻害剤が、文献に記載されている。Ｖ型ＰＤＥにいくらか特異性を呈する２つの阻害剤は、ザプリナスト（zaprinast）およびジピリダモル（dipyridamole）である。ビーボら、前出中、117〜140頁、フランシスら、を参照のこと。
ｃＧＢ−ＰＤＥをコードするＤＮＡおよびアミノ酸配列の解明ならびに組換え法によるｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドの製造により、ｃＧＢ−ＰＤＥの活性を選択的に修飾する新規物質の同定を可能ならしめる情報および材料が提供されるであろう。ＰＤＥアイソザイムの別々の型またはファミリーがあること、および異なる組織が異なるＰＤＥの異なる補体を発現することが認められることが、セカンドメッセンジャーとしてサイクリックヌクレオチドを用いるシグナルトランスダクション経路に関連する病状に対する治療上の示唆を有し得るＰＤＥモジュレーターの開発における興味をもたらしている。ＰＤＥ活性の種々の選択的および非選択的阻害剤が、ムレイ（Murray）ら、Biochem.Soc.Trans.、202（2）巻、460〜464頁（1992）において議論されている。組換えＤＮＡ技術による、特異的なＰＤＥ産生能をもたないＰＤＥモジュレーターの開発は、あらゆるＰＤＥが同じ基本的な反応を触媒し、重複する基質特異性を有し、且つ微量のみしか生じないために困難である。結果的に、多くのＰＤＥを均質にまで精製するのは冗長で困難な過程である。
かくしてｃＧＢ−ＰＤＥに対するＤＮＡおよびアミノ酸配列の情報、ｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドの組換え製造のための方法および材料ならびにｃＧＢ−ＰＤＥ活性の特異的なモジュレーターを同定するための方法の必要性が、当該技術において現存し続けている。
発明の要約
本発明は、ｃＧＢ−ＰＤＥと称されるｃＧＭＰ結合性、ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥをコードする新規な精製され単離されたポリヌクレオチド（たとえば、センスおよびアンチセンスストランドのいずれものＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写産物、それらのスプライス変異体も含めて）を提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列は、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列のみならず全体的または部分的に化学的に合成されたＤＮＡ配列を含む。配列番号：９または２０で示されるｃＧＢ−ＰＤＥをコードするＤＮＡ配列およびストリンジェント条件下で当該配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列または遺伝コードの縮重なしに当該配列とハイブリダイズするであろうＤＮＡ配列が、本発明により企図される。本発明により、本発明のＤＮＡ配列の生物学的複製物（たとえば、生体内または生体外で作製された、単離されたＤＮＡ配列）もまた企図される。ｃＧＢ−ＰＤＥ配列を組込んだプラスミドおよびウイルスＤＮＡベクター、ならびに、特にｃＧＢ−ＰＤＥをコードするＤＮＡが内在または外来の発現制御ＤＮＡ配列および転写ターミネーターなどに作動可能に連結されたベクターなどの、自律的に複製する組換え構築体もまた提供される。特に例証となる本発明の発現プラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、12301, Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852に、1993年５月４日に受託番号69296として寄託された大腸菌株ＪＭ１０９中のプラスミドhcgbmet156-2 6nである。
本発明の他の特徴において、原核細胞および真核細胞を含む宿主細胞が、その中で所望のペプチドが発現されることを許容する方法で本発明のＤＮＡ配列を用いて形質転換される。ｃＧＢ−ＰＤＥ産物を発現している宿主細胞は、種々の有用な目的で役立つことができる。このような細胞は、ｃＧＢ−ＰＤＥと特異的に免疫反応性を有する抗体物質を作製するための免疫源用の貴重な供給源を構成する。本発明の宿主細胞は、ｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドの大量産生のための方法において顕著に有用である。この方法において、細胞が好適な培養培地中で生育され、当該細胞からまたは当該細胞が生育された培地から、たとえばイムノアフィニティー精製により所望のポリペプチド産物が単離される。
ｃＧＢ−ＰＤＥ産物は、天然細胞供給源から単離物として得られてもよく、または化学的に合成されてもよいが、好ましくは本発明の宿主細胞を包含する組換え手法により製造される。
哺乳動物宿主細胞を用いることで、本発明の組換え発現産物に至適な生物学的活性を付与するために必要とされ得るような転写後の修飾（たとえば、グリコシレーション、トランケーション、リピデーションおよびチロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化）を提供することが期待される。本発明のｃＧＢ−ＰＤＥ産物は、全長のポリペプチド、断片または変異体であってよい。変異体は、（１）ｃＧＢ−ＰＤＥに特異的な生物学的活性または免疫学的性質の１以上を喪失することなく；または（２）ｃＧＢ−ＰＤＥの特定の生物学的活性を特に損なわせた：１以上の特定の（すなわち、天然にコードされた）アミノ酸が欠失されたもしくは置換された、または１以上の特定されないアミノ酸が付加された、ｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチド類似体からなり得る。
本発明にさらに包含されるのは、抗体物質（たとえば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−移植（grafted）抗体など）ならびにｃＧＢ−ＰＤＥに特異的な他の結合タンパク質である。特異的な結合タンパク質は、単離されたもしくは組換えｃＧＢ−ＰＤＥまたはｃＧＢ−ＰＤＥ変異体もしくはこのような産物を発現している細胞を用いて作製することができる。結合タンパク質はさらに、免疫のためのみならず、ｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドの精製ならびに既知の免疫学的手法による体液および組織試料におけるｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドの検出または定量のための組成物においても有用である。それらはまた、ｃＧＢ−ＰＤＥの生化学的活性、特にシグナルトランスダクションに関連するそれらの活性の修飾（すなわち、ブロッキング、阻害または促進）において極めて有用である。抗ｃＧＢ−ＰＤＥ抗体物質に対して特異的な抗イデオタイプ抗体も企図される。
本発明のＤＮＡおよびアミノ酸配列の開示を通して与えられる情報の科学的な価値が明示される。一連の例として、ｃＧＢ−ＰＤＥに対するｃＤＮＡの配列を知ることで、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションによりｃＧＢ−ＰＤＥをコードするゲノムＤＮＡ配列を単離すること、ならびにプロモーター、オペレーターなどのｃＧＢ−ＰＤＥ発現制御調節配列を特定することが可能となる。ストリンジェント条件下で本発明のＤＮＡ配列を用いて行われるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションにより、ｃＧＢ−ＰＤＥの対立変異体、ｃＧＢ−ＰＤＥに特異的な生化学的および／または免疫学的特性を共有する、他の構造的に関連するタンパク質、ならびにｃＧＢ−ＰＤＥと相同な非ヒト種のタンパク質をコードするＤＮＡの単離を可能とすることが期待される。本発明のポリヌクレオチドは、好適に標識された場合、ｃＧＢ−ＰＤＥを合成する細胞の能力を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、１または複数の疾病状態の根底にあるｃＧＢ−ＰＤＥ遺伝子座における遺伝的変化を同定するために有用な診断法の基礎となるかもしれない。本発明により利用可能となるのはまた、通常はｃＧＢ−ＰＤＥを発現している細胞による、ｃＧＢ−ＰＤＥの発現調節に関連のあるアンチセンスポリヌクレオチドである。
本発明によって提供されるＤＮＡおよびアミノ酸配列情報はまた、ｃＧＢ−ＰＤＥの構造および機能のシステム分析ならびにｃＧＢ−ＰＤＥが相互作用するであろう分子の定義付けをも可能とする。ｃＧＢ−ＰＤＥ活性を修飾する薬剤は、推定モジュレーターを組換えｃＧＢ−ＰＤＥを発現する真核細胞からの溶解物とインキュベートし、次いでｃＧＢ−ＰＤＥホスホジエステラーゼ活性に対する推定モジュレーターの効果を決定することによって同定され得る。好ましい実施態様において、真核細胞は内在性のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を欠くものである。特に例証となるこのような真核細胞は、受託番号74225として1993年５月19日にＡＴＣＣに寄託された酵母株ＹＫＳ４５である。ｃＧＢ−ＰＤＥの活性を修飾する化合物の選択性は、ｃＧＢ−ＰＤＥに対する当該化合物の活性を他のＰＤＥアイソザイムに対する活性と比較することにより評価することができる。一連の独立した分析における、本発明の組換えｃＧＢ−ＰＤＥ産物と他の組換えＰＤＥ産物との組合せによって、ｃＧＢ−ＰＤＥの選択的なモジュレーターを開発するためのシステムが提供される。
選択的モジュレーターには、たとえば、ｃＧＢ−ＰＤＥまたはｃＧＢ−ＰＤＥ核酸に選択的に結合する抗体および他のタンパク質またはペプチド、ｃＧＢ−ＰＤＥまたはｃＧＢ−ＰＤＥ核酸に選択的に結合するオリゴヌクレオチドならびにｃＧＢ−ＰＤＥまたはｃＧＢ−ＰＤＥ核酸に選択的に結合する他の非ペプチド化合物（たとえば、単離された、または合成の有機分子）が含まれ得る。野生型ｃＧＢ−ＰＤＥの酵素活性または細胞局在に影響を及ぼすｃＧＢ−ＰＤＥの変異型もまた、本発明により企図される。選択的なモジュレーターの開発のための好ましい標的には、たとえば、（１）他のタンパク質と接触し、および／または細胞内にてｃＧＢ−ＰＤＥが局在するｃＧＢ−ＰＤＥの領域、（２）基質が結合するｃＧＢ−ＰＤＥの領域、（３）ｃＧＢ−ＰＤＥの１または複数のアロステリックなｃＧＭＰ結合部位、（４）ｃＧＢ−ＰＤＥの１または複数のリン酸化部位並びに（５）ｃＧＢ−ＰＤＥサブユニットのダイマー形成に関与するｃＧＢ−ＰＤＥの領域が含まれる。ｃＧＢ−ＰＤＥ活性のモジュレーターは、広範囲の疾病および生理学的条件の処置において治療上有用であるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
本発明の多くの他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を考慮することで明らかとなるであろう。ここで参照されるべき図面は以下の通りである：
図１Ａ〜１Ｃは、種々のＰＤＥアイソザイムの保存された触媒ドメインのアラインメントであり、ここで、掲げられたすべてのＰＤＥにおいて同一の残基は「保存された」線の１文字のアミノ酸略号により示され、ｃＧＢ−ＰＤＥおよびフォトレセプターＰＤＥのみにおいて同一な残基は「保存された」線における星印によって示され、さらに至適なアラインメントのために導入されたギャップが、ピリオドにより示される；
図２Ａ〜２Ｃは、種々のＰＤＥアイソザイムのｃＧＭＰ結合ドメインのアラインメントであり、ここで、掲げられたすべてのＰＤＥにおいて同一の残基は「保存された」線の１文字のアミノ酸略号により示され、さらに至適なアラインメントのために導入されたギャップが、ピリオドにより示される；
図３は、種々のＰＤＥアイソザイムからの内的に相同であるリピートのアラインメントであり、掲げられたすべてのｃＧＭＰ結合性ＰＤＥからのそれぞれのリピートＡおよびＢにおいて同一の残基は「保存された」線の１文字のアミノ酸略号により示され、さらに「保存された」線における星印はすべての残基が化学的に保存されている位置を表す；
図４は、ｃＧＢ−ＰＤＥのドメインの構成を模式的に記す；
図５は、ウシｃＧＢ−ＰＤＥ配列でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの抽出物またはトランスフェクトされていないＣＯＳ細胞からの抽出物を基質として２０μＭ ｃＧＭＰかまたは２０μＭ ｃＡＭＰを用いてホスホジエステラーゼ活性について分析した実験の結果を示す棒グラフである；
図６は、ウシｃＧＢ−ＰＤＥ配列でトランスフェクトされた細胞からの抽出物をジピリダモル（黒塗り四角）、メトキシメチルキサンチン（黒塗り三角）およびロリプラム（白抜き円）を含むホスホジエステラーゼ阻害剤の一連の濃度存在下で、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ活性について分析した結果を表すグラフである；
図７は、ウシｃＧＢ−ＰＤＥ配列でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞またはコントロールのトランスフェクトされていないＣＯＳ細胞からの抽出物を、０．２ｍＭのＩＢＭＸの非存在下（−）または存在下（＋）で［3Ｈ］ｃＧＭＰ結合活性について分析した実験の結果を示す棒グラフである；
図８は、ウシｃＧＢ−ＰＤＥ配列でトランスフェクトされた細胞からの抽出物を過剰の非標識ｃＡＭＰ（白抜き円）またはｃＧＭＰ（黒塗り円）を、示した濃度で存在させたもとで［3Ｈ］
ｃＧＭＰ結合活性について分析した結果を示すグラフである。
詳細な説明
下記の実施例により、本発明を説明する。実施例１に、ＰＣＲによるウシｃＧＢ−ＰＤＥｃＤＮＡ断片の単離および引続いてそのＰＣＲ断片をプローブとして用いた全長のｃＧＢ−ＰＤＥｃＤＮＡの単離を記載する。実施例２は、種々の他のＰＤＥに対して報告された配列と、ウシｃＧＢ−ＰＤＥアミノ酸配列の関係の分析を示す。種々のウシ組織中のｃＧＢ−ＰＤＥｍＲＮＡのノザンブロット分析を、実施例３に示す。ＣＯＳ細胞におけるウシｃＧＢ−ＰＤＥｃＤＮＡの発現を、実施例４に記載する。実施例５には、ｃＧＢ−ＰＤＥ ＣＯＳ細胞発現産物のホスホジエステラーゼ活性、ｃＧＭＰ結合活性およびＺｎ2+加水分解酵素についての分析の結果を示す。実施例６は、ウシｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡと相同性を有するヒトｃＤＮＡの単離を記載する。酵母細胞内でのヒトｃＧＢ−ＰＤＥｃＤＮＡの発現を、実施例７に示す。ヒト組織におけるｃＧＢ−ＰＤＥを検出するためのＲＮａｓｅプロテクションアッセイを、実施例８に記載する。実施例９には、ヒトｃＧＢ−ＰＤＥｃＤＮＡの細菌における発現および当該細菌のｃＧＢ−ＰＤＥ発現産物と反応性を有する抗体の作製を記載する。実施例１０には、ｃＧＢ−ＰＤＥ類似体と断片を記載する。ｃＧＢ−ＰＤＥを認識するモノクローナル抗体の作製を、実施例１１に記載する。実施例１２は、ｃＧＢ−ＰＤＥの生物学的活性を選択的に修飾する薬剤を開発するための本発明の組換えｃＧＢ−ＰＤＥ産物の利用に関する。
実施例１
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ウシ肺第１ストランドから、ｃＧＢ−ＰＤＥの一部をコードするｃＤＮＡ断片を単離するために利用した。トーマスＩ、前出に記載の部分的なｃＧＢ−ＰＤＥアミノ酸配列および新規な部分アミノ酸配列情報に基づいて、充分に縮重したセンスおよびアンチセンスＰＣＲプライマーを設計した。
Ａ．ｃＧＢ−ＰＤＥタンパク質の精製
ｃＧＢ−ＰＤＥは、トーマスＩ、前出に記載のように、またはその方法を下記のように変更することによって精製した。
新鮮なウシ肺（５〜１０kg）を屠殺場から得、直ちに氷上に置いた。組織を細切し、冷ＰＥＭ緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）と合わせた。ホモジナイズして遠心した後、得られた上清を４〜７リットルのＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン（Whatman）、英国）と３〜４時間インキュベートした。次いでそのＤＥＡＥスラリーを真空下で濾過し、冷ＰＥＭを大量に用いて濯いだ。その樹脂をガラスカラムに注ぎ、３〜４倍容量のＰＥＭを用いて洗浄した。タンパク質は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＥＭを用いて溶出し、１２の１リットル画分を集めた。画分を、トーマスら、前出に記載された標準法によってＩＢＭＸ−刺激ｃＧＭＰ結合およびｃＧＭＰホスホジエステラーゼ活性について分析した。適切な画分をプールし、冷脱イオン水を用いて２倍に希釈し、次いでブルーセファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア・エル・ケー・ビー・バイオテクノロジー（Phermacia LKB Biotechnology）社、ピスカタウェイ（Piscataway）、ＮＪ）クロマトグラフィーに付した。次にアガロースまたはセファロースベースのゲルマトリックスを用いて、亜鉛キレートアフィニティー吸収クロマトグラフィーを行った。亜鉛キレート工程から得られたタンパク質のプールを、トーマスＩ、前出に記載のように処理するか、または変更を施した精製法に付した。
トーマスＩ、前出に記載のようにタンパク質のプールは、４℃でＰＥＭ中に平衡化したＨＰＬＣ Bio-Sil ＴＳＫ−５４５ ＤＥＡＥカラム（150 x 21.5mm）（バイオラッド・ラボラトリーズ（BioRad Laboratories）、ハーカルズ（Hercules）、ＣＡ）を複数回付した。平衡化の後、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＥＭ １２０−ｍｌで洗浄し、続いて２ｍｌ／分の流速にて１２０−ｍｌの直線濃度勾配（５０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＥＭ）での溶出を行った。適切な画分をプールし、透析チューブ中でセファデックスＧ−２００（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）、英国）に対して、１．５ｍｌの最終容量までに濃縮した。濃縮されたｃＧＢ−ＰＤＥプールは、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  β−メルカプトエタノール中に平衡化したＨＰＬＣゲル濾過カラム（Bio-Sil ＴＳＫ−２５０、500 x 21.5mm）に供し、４℃で２ｍｌ／分の流速にて溶出した。
より煩わしくない変法を行う場合は、タンパク質プールをＰＥＭに対して２時間透析し、ＰＥＭ緩衝液中に平衡化した１０ｍｌの調製用ＤＥＡＥセファセルカラム（ファルマシア）にかけた。タンパク質を０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＥＭを用いてバッチ法にて溶出し、およそ１０〜１５倍濃度のタンパク質を得た。濃縮されたタンパク質試料を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＥＭ中に平衡化した８００ｍｌ（2.5cm x 154cm）のセファクリルＳ４００ゲル濾過カラム（ベーリンガー）にかけ、１．７ｍｌ／分の流速で溶出した。
タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の後、クマシー染色により評価した。ウシ肺１０ｋｇ当たりおよそ０．５〜３．０ｍｇの純粋なｃＧＢ−ＰＤＥが得られた。
精製されたウシｃＧＢ−ＰＤＥに特異的なウサギポリクローナル抗体を、標準法によって作製した。
Ｂ．ｃＧＢ−ＰＤＥのアミノ酸配列決定
ｃＧＢ−ＰＤＥは、［32Ｐ］ＡＴＰを用いてリン酸化し、次いで32Ｐで標識されたホスホペプチドを得るため、プロテアーゼで消化した。およそ１００μｇの精製されたｃＧＢ−ＰＤＥを、９ｍＭ ＭｇＣｌ2、９μＭ［32Ｐ］ＡＴＰ、１０μＭ  ｃＧＭＰ、および４．２μｇのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｃＡＫ）の、精製されたウシの触媒能を有するサブユニットを含む反応混液（９００μｌの最終容量）中でリン酸化した。ｃＡＫの触媒能を有するサブユニットは、マランゴス（Marangos）ら、Brain Receptor Methodologies, Part A、Academic Press、Orlando、フロリダ（1984）、209〜215頁。フロックハート（Flockhart）らの方法に従って調製した。反応は３０℃にて３０分インキュベートを行い、６０μｌの２００ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって停止した。
ｃＧＢ−ＰＤＥから第１のペプチド配列を得るために、ＫＰＥ緩衝液中のα−キモトリプシン１ｍｇ／ｍｌ溶液（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）３．７μｌを、１００μｇの精製されリン酸化されたｃＧＢ−ＰＤＥに添加し、混液を３０℃にて３０分インキュベートした。タンパク質分解は、５０μｌの１０％ ＳＤＳおよび２５μｌのβ−メルカプトエタノールを添加することで停止した。容量が４００μｌより少なく減じられるまで試料を沸騰させ、８％の調製用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけ、５０ｍＡｍｐにて電気泳動に付した。分離された消化産物は、マツダイラ（Matsudaira）、J.Biol.Chem.、262巻、10035〜10038頁（1987）の方法に従ってイモビロン・ポリビニリデン・ジフルオリド（ミリポア、ベドフォード、ＭＡ）上に電気的にブロットした。転写したタンパク質は、クマシーブルー染色によって同定し、自動ガス相アミノ酸配列決定用に、５０ｋＤａのバンドを膜から切り出した。α−キモトリプシン消化の手順により得られたペプチドの配列は、以下の配列番号：１に示す。
0004150070.tif 000002
第２の配列は、Ｖ８タンパク分解により作製されたｃＧＢ−ＰＤＥペプチド断片から得られた。およそ２００μｇの精製されたペプチド断片を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０μＭ［32Ｐ］ＡＴＰ、１００μＭ ｃＧＭＰ、および１μｇ／ｍｌの精製されたｃＡＫの、最終容量１．４ｍｌ中に添加した。反応は、３０℃にて３０分インキュベートを行い、１６０μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡを添加することによって停止した。次に、ＫＰＥ中に希釈した９μｌの１ｍｇ／ｍｌのStaphylococcal aureus Ｖ８プロテアーゼ（インターナショナル・ケミカル・ヌクレアー・バイオメディカルズ（International Chemical Nuclear Biomedicals）、コスタ・メサ（Costa Mesa）、ＣＡ）を添加し、続いて３０℃にて１５分インキュベートした。タンパク質分解は、８８μｌの１０％ＳＤＳおよび４５μｌのβ−メルカプトエタノールを添加することにより停止した。消化産物は、２５ｍＡｍｐで４．５時間行った調製用１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳同により分離した。タンパク質は電気的にブロットし、前記したように染色した。２８ｋＤａのタンパク質のバンドを膜から切り出し、自動ガス相アミノ酸配列決定に付した。得られた配列を以下の配列番号：２に示す。
0004150070.tif 000003
Ｃ．ウシｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
プライマーを設計するために用いられる部分アミノ酸配列（配列番号：３、下記、配列番号：１のアミノ酸９〜２０）ならびに対応するＰＣＲプライマー（ＩＵＰＡＣ命名法で）に対応する配列を以下に示す。ここで配列番号：３は、トーマスＩ、前出において報告された配列である。
0004150070.tif 000004
アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）モデル３８０Ａシンセサイザー（フォスター・シティー（Foster City）、ＣＡ）を用いて合成されたセンスおよびアンチセンスプライマーを、下記のようにウシ肺第１ストランドｃＤＮＡからｃＧＢ−ＰＤＥ特異的な配列を増幅するために可能なあらゆる組合せで用いた。
エタノール沈殿の後、オリゴヌクレオチドの対を１つのＰＣＲ反応においてそれぞれ４００ｎＭで組合わせた（配列番号：４または５を配列番号：６、７または８と組合わせた）。５０ｎｇのウシ肺第１ストランドのｃＤＮＡ（オリゴｄＴで選択したウシ肺ｍＲＮＡについてＡＭＶ逆転写酵素およびランダムプライマーを用いて作製した）、２００μＭ ｄＮＴＰ、および２単位のＴａｑポリメラーゼを用いて反応を行った。初めの変性工程は、９４℃にて５分間行い、引続き９４℃における１分の変性工程、５０℃における２分のアニーリング工程、７２℃における２分の伸長（extension）工程を３０サイクル行った。ＰＣＲは、Hybaid Thermal Reactor（ENK Scientific Products, Saratoga, CA）を用いて実施し、産物を４０ｍＭトリス−酢酸、２ｍＭ ＥＤＴＡで流した１％低融点アガロースゲルでのゲル電気泳動により分離した。約800〜840ｂｐの弱いバンドが、配列番号：４および７で示されるプライマーを用いた場合および配列番号：４および８で示されるプライマーを用いた場合に認められた。配列番号：４および７で示されるプライマーを用いた増幅により作製されるＰＣＲ産物を、ジーン・クリーン（Gene Clean（登録商標））（Ｂｉｏ１０１、ラ・ヨラ（La jolla）、ＣＡ）ＤＮＡ精製キットを用い、製造業者のプロトコルに従って単離した。ＰＣＲ産物（２０ｎｇ）は、２００ｎｇの直鎖状としたpBluescript ＫＳ（＋）（ストラタジーン、ラ・ヨラ、ＣＡ）へと連結し、そして得られたプラスミド構築体を、大腸菌ＸＬ１ Blue Cell（ストラタジーン・クローニング・システムズ、ラ・ヨラ、ＣＡ）を形質転換するために用いた。形質転換陽性と推定されるものを、配列決定によりスクリーニングした。得られた配列は、既知のいかなる配列ともまたは既知のｃＧＢ−ＰＤＥ部分配列とも相同でなかった。
配列番号：４および７で示されるプライマーを用いて、ウシ肺の第１ストランドｃＤＮＡについて再びＰＣＲを行った。単一の大きなオープンリーディングフレームを有する０．８Ｋｂのインサートを含むクローンが同定された。オープンリーディングフレームは、アミノ酸ＫＮＴＭ（配列番号：７で示されるプライマー配列を設計するのには用いられなかった配列番号：１のアミノ酸１７〜２０0）を含み、且つｃＧｓ−、ＲＯＳ−およびＣＯＳ−ＰＤＥの演繹されたアミノ酸配列と高い程度の相同性をもつポリペプチドをコードしていた。同定されたクローンは、配列番号：９のヌクレオチド４８９〜１３１２に対応する。
Ｄ．ウシｃＤＮＡライブラリーの構築およびハイブリダイゼーションスクリーニング
全長のｃＧＢ−ＰＤＥをコードするｃＤＮＡを得るために、ウシ肺ｃＤＮＡライブラリーを、プローブとして32Ｐで標識されたＰＣＲで作製されたｃＤＮＡインサートを用いてスクリーニングした。
ポリアデニル化ＲＮＡは、ソネンバーグ（Sonnenburg）ら、J.Biol.Chem.、266巻、17655〜17661頁（1991）に記載のとおりにウシ肺から調製した。第１ストランドｃＤＮＡは、アウスベル（Ausubel）ら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、ニューヨーク（1987）に記載のとおりにランダムヘキサヌクレオチドプライマーとＡＭＶ逆転写酵素（ライフ・サイエンシズ（Life Sciences）、St. Petersberg、ＦＬ）を用いて合成した。第２ストランドｃＤＮＡは、大腸菌ＤＮＡリガーゼおよび大腸菌ＲＮＡｓｅ Ｈの存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成した。５００ｂｐより大きいｃＤＮＡの選択は、セファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂ（ミリポア）クロマトグラフィーによって行った。EcoRIアダプター（プロメガ（Promega）、マディソン（Madison）、ＷＩ）を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて当該ｃＤＮＡに連結した。熱によるリガーゼの不活性化に続いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてｃＤＮＡをリン酸化した。連結されなかったアダプターは、セファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ＮＪ）によって除去した。ｃＤＮＡはEcoRIで消化し、脱リン酸化したラムダＺａｐ（登録商標）IIアーム（ストラタジーン）へと連結し、製造業者のプロトコルに従ってGigapack（登録商標）Gold（ストラタジーン）を用いてパッケージングした。未増幅のライブラリーのタイターは、１８％の非組換え体で、９．０ｘ１０5であった。ライブラリーは、２０の１５０ｍｍプレートに対して50,000プラーク形成単位（pfu）を播くことにより増幅し、最終的なタイターとして２１％の非組換え体で５．９５ｘ１０6pfu／mlが得られた。
ライブラリーを50,000 pfu／mlで２４枚の１５０ｍｍプレートに播き、32Ｐで標識したｃＤＮＡクローンを用いてスクリーニングした。プローブはファインバーグ（Feinberg）ら、Anal.Biochem.、137巻、266〜267頁（1984）の方法を用いて調製し、32Ｐで標識されたＤＮＡはElutip-D（登録商標）カラム（シュライヒャー・アンド・シュエル（Schleicher and Schuell）社、キーン（Keene）、ＮＨ）を用い、製造業者のプロトコルを用いて精製した。プラーク−リフトは、１５ｃｍニトロセルロースフィルターを用いて行った。変性および中和に続いて、８０℃にて２時間ベーキングすることにより、ＤＮＡをフィルター上に固定した。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．７５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２ｘ  デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、９０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、およびおよそ１０6cpm／ｍｌの32Ｐで標識されたプローブ（５ｘ１０8cpm／μｇ）を含む溶液中で、４２℃にて一晩行った。フィルターは、１回の洗浄について１５分間、室温にて０．１ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ中で２回洗浄し、続いて４５℃にて０．１ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ中で２０分間１度、洗浄した。次にフィルターを−７０℃で、数日間Ｘ線フィルムに露光した。
標識したプローブとハイブリダイズしたプラークを再度播種し、再度のスクリーニングを数回行うことによって精製した。ｃＤＮＡインサートは、製造業者のプロトコルにより記載されたインビボの切出し方法によってpBluescript ＳＫ（−）ベクター（ストラタジーン）の中にサブクローン化した。救出されたｃＤＮＡがＰＣＲプローブとハイブリダイズすることを明らかにするため、サザンブロットを行った。推定されるｃＧＢ−ＰＤＥ  ｃＤＮＡを、Sequanse（登録商標）バージョン2.0（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション（United States Biochemical Corporation）、クリーブランド、オハイオ）またはTaqTrack（登録商標）キット（プロメガ）を用いて配列決定した。
ｃＧＢ−２、ｃＧＢ−８およびｃＧＢ−１０と名付けた３つの異なるｃＤＮＡクローンを単離した。クローンｃＧＢ−８のＤＮＡおよび演繹されたアミノ酸配列を配列番号：９および１０に示す。ヌクレオチド2686の下流のＤＮＡ配列は、クローニングのアーティファクトを表すのかもしれない。ｃＧＢ−１０のＤＮＡ配列は、１つのヌクレオチドを例外としてｃＧＢ−８の配列と同一である。クローンｃＧＢ−２のＤＮＡ配列は、クローンｃＧＢ−８の５’からクローンｃｇｂ−８（配列番号：９参照）のヌクレオチド219までの配列より分岐しており、異なるアミノ末端を有するタンパク質をコードし得た。
ｃＧＢ−８  ｃＤＮＡクローンは長さ4474ｂｐであり、2625ｂｐの大きなオープンリーディングフレームを含む。ヌクレオチド配列中、第99〜101位のトリプレットＡＴＧは、枠内終止コドンの前にあり、且つ周囲の塩基が真核細胞のｍＲＮＡに対するコザックのコンセンサス開始部位に適合するので、ｃＧＢ−ＰＤＥ遺伝子の翻訳開始部位であることが予測される。終止コドンＴＡＧは2724〜2726位に位置し、３’非翻訳配列の1748ｂｐが続く。ｃＧＢ−８の配列は、転写終了コンセンサス配列を含まず、従ってクローンは、対応するｍＲＮＡの全体の３’非翻訳領域は示さないのかもしれない。
ｃＧＢ−８  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは、875アミノ酸のポリヌクレオチドをコードし、計算された分子量は９９．５ｋＤである。この計算された分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると約９３ｋＤａであると見積もられた、精製されたｃＧＢ−ＰＤＥの分子量の報告値よりわずかに少しだけ大きい。ｃＧＢ−８の演繹されたアミノ酸配列は、精製されたウシ肺ｃＧＢ−ＰＤＥから得られたすべてのペプチド配列に正確に対応しており、ｃＧＢ−８がｃＧＢ−ＰＤＥをコードする強い証拠を提供するものである。
実施例２
Genetics Computer Group（ＧＣＧ）Software Package（Madison, Wisconsin）が提供しているＦＡＳＴＡプログラムを用いて行ったＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＧＥｎＥｍｂｌデータバンク（1992年２月リリース）の検索により、他のＰＤＥに対して報告されたＤＮＡおよびアミノ酸配列のみがクローンｃＧＢ−８のＤＮＡおよび演繹されたアミノ酸と有意な類似性を呈することが明らかになった。
ｃＧＢ−ＰＤＥの演繹されたアミノ酸配列を８つの他のＰＤＥの配列とペアで比較することが、ＡＬＩＧＮ（デイホフ（Dayhoff）ら、Methods Enzymol.、92巻、524〜545頁（1983））およびＢＥＳＴＦＩＴ（ウィルバー（Wilbur）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80巻、726〜730頁（1983））プログラムを用いて行われた。今日までに配列決定がなされたすべての哺乳動物ホスホジエステラーゼのように、ｃＧＢ−ＰＤＥは、触媒活性に必須であると思われる、タンパク質のカルボキシル末端の半分のおよそ２５０アミノ酸の保存された触媒ドメイン配列を含んでいる。このセグメントは、配列番号：９のアミノ酸578〜812を含んでなり、他のＰＤＥの対応する領域と配列の保存性を呈する。以下の表１に、他のＰＤＥのｃＧＢ−ＰＤＥのアミノ酸578〜812とのペアでの比較において得られる特定の同一性値を示す。ここで「ラットダンス（dunce）」はラットｃＡＭＰ特異的ＰＤＥであり、「６１ｋＣａＭ」はウシ６１ｋＤａカルシウム／カルモジュリン依存性ＰＤＥであり、「６３ｋＣａＭ」はウシ６３ｋＤａカルシウム／カルモジュリン依存性ＰＤＥであり、「ドロスダンス」はドロソフィアｃＡＭＰ特異的ダンスＰＤＥであり、「ＲＯＳ−α」はウシＲＯＳ−ＰＤＥ α−サブユニットであり、「ＲＯＳ−β」はウシＲＯＳ−ＰＤＥ β−サブユニットであり、「ＣＯＳ−α」はウシＣＯＳ−ＰＤＥ α’サブユニットであって、さらに「ｃＧｓ」はウシｃＧｓ−ＰＤＥである（612〜844）。
0004150070.tif 000005
ＰＩＬＥＵＰプログラム（ＧＣＧソフトウェア）で実行される、Progressive Alignment Algorithm（フェン（Feng）ら、Methods Enzymol.、183巻、375〜387頁（1990））を用いて、複数の配列のアラインメントを行った。図１Ａ〜１Ｃに、ｃＧＢ−ＰＤＥの提唱される触媒ドメインの、表１のＰＤＥのすべての対応する領域との複数の配列アラインメントを示す。２８残基（図１Ａから１Ｃの「保存された」線での１文字のアミノ酸略号により示される残基を参照されたい）が、触媒において機能的な役割を果たすと予測されるいくつかの保存されたヒスチジン残基を含めて、アイソザイム間において不変である。シャーボンニューら、Proc.Natl.Acad USA、前出を参照されたい。ｃＧＢ−ＰＤＥの触媒ドメインは、他のＰＤＥアイソザイムの対応する領域よりＲＯＳ−ＰＤＥおよびＣＯＳ−ＰＤＥの触媒ドメインに、より類似している。フォトレセプターＰＤＥとｃＧＢ−ＰＤＥとの間に、他のＰＤＥが共有しないいくつかの保存領域がある。フォトレセプターＰＤＥとｃＧＢ−ＰＤＥ配列において不変なこれらの領域におけるアミノ酸の位置は、図１Ａ〜１Ｃの「保存された」線の星印により示される。ｃＧＢ−ＰＤＥならびにＲＯＳ−およびＣＯＳ−ＰＤＥの間の相同性領域は、ｃＡＭＰ加水分解に比してｃＧＭＰ加水分解に対する特異性を賦与すること、または特定の生理学的薬剤への感受性を賦与することにおいて重要な役割を果たすかもしれない。
ｃＧＢ−ＰＤＥ、ｃＧｓ−ＰＤＥおよびフォトレセプターＰＤＥ間の配列の類似性は、保存された触媒ドメインに限定されず、タンパク質のアミノ末端半分における非触媒ｃＧＭＰ結合ドメインにも含まれる。ｃＧＢ−ＰＤＥ、ｃＧｓ−ＰＤＥおよびフォトレセプターＰＤＥ間のアラインメントの至適化により、アミノ末端保存セグメントが配列番号：９のアミノ酸142〜526を含めて存在するかもしれないことが示される。ｃＧＢ−ＰＤＥの提唱されるｃＧＭＰ結合ドメインと、フォトレセプターＰＤＥおよびｃＧｓ−ＰＤＥの対応する領域との配列のペアでの分析によって、２６〜２８％の配列の同一性が明らかとなった。当該提唱されるｃＧＭＰ結合ドメインと、ｃＧＭＰ結合性ＰＤＥとの複数の配列とのアラインメントを図２Ａ〜２Ｃに示し、ここで略号は表１に示したと同様である。この非触媒ドメインにおける３８の位置が、すべてのｃＧＭＰ結合性ＰＤＥの間で不変であることがわかる（図２Ａ〜２Ｃの「保存された」線での１文字のアミノ酸の略号により示される位置を参照されたい）。
ｃＧＭＰ結合性ＰＤＥのｃＧＭＰ結合ドメインは、２つの類似するが別異のサブユニット間またはサブユニット内のｃＧＭＰ結合部位を形成するかもしれない、内的に相同性のあるリピートを含む。図３に、ｃＧＭＰ結合ＰＤＥのリピートａ（ｃＧＢ−ＰＤＥのアミノ酸228〜311に対応する）およびｂ（ｃＧＢ−ＰＤＥのアミノ酸410〜500に対応する）の複数の配列アラインメントを示す。７つの残基が、各ＡおよびＢ領域において不変である（図３の「保存された」線で１文字のアミノ酸の略号により示される残基を参照されたい）。ＡおよびＢ領域において化学的に保存されている残基を、図３の「保存された」線で星印により示す。ｃＧＢ−ＰＤＥのｃＧＭＰ類似体研究により、ｃＧＢ−ＰＤＥ上のサイクリックヌクレオチド結合部位とｃＧＭＰの２’ＯＨとの間に水素結合が存在することが裏付けられる。
ｃＧＢ−ＰＤＥの３つの領域は、他のＰＤＥアイソザイムと有意な配列の類似性を有していない。これらの領域には、触媒ドメインのカルボキシル末端のフランキング配列（アミノ酸812〜875）、ｃＧＭＰ結合ドメインと触媒ドメインを分かつ配列（アミノ酸527〜577）およびアミノ酸1〜141にわたるアミノ末端配列が含まれる。ｃＧＫによるｃＧＢ−ＰＤＥのリン酸化の部位（配列番号：１０の９２位のセリン）は、この配列のアミノ末端領域に位置する。ｃＧＢ−ＰＤＥ上のアロステリック部位へのｃＧＭＰの結合が、そのリン酸化に必要とされる。
前記した他のＰＤＥアイソザイムとの比較に基づき提唱されるｃＧＢ−ＰＤＥのドメイン構造を図４に示す。このドメイン構造は、ウシ肺から精製されたｃＧＢ−ＰＤＥの生化学的研究により裏付けられる。
実施例３
種々のウシ組織におけるｃＧＢ−ＰＤＥｍＲＮＡの存在を、ノザンブロットハイブリダイゼーションにより実験した。
ポリアデニル化ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従ってPoly（A） Quick（登録商標）ｍＲＮＡ精製キット（スタラタジーン（Stratagene）を用いて総ＲＮＡ調製物から精製した。ＲＮＡ試料（５μｇ）を１．２％アガロース、６．７％ホルムアルデヒドゲル上にのせた。電気泳動およびＲＮＡ転写は、ソネンバーグら、前出に以前報告されたとおりに実施した。ＲＮＡブロックのプレハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、２ｘ デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および０．１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを含む溶液中で４５℃にて４時間行った。ランダムヘキサヌクレオチド−プライマー−標識プローブ（５ｘ  １０8cpm／μｇ）は、AccIおよびSacIIを用いた消化により切出した実施例２の４．７ｋＢのｃＧＢ−８ ｃＤＮＡクローンを用いて、フェインバーグら、前出に記載のとおりに調製した。プローブを加熱変性し、プレハイブリダイゼーションに続いてブロッティングバッグの中に注入した（６ｘ１０5cpm／ｍｌ）。ノザンブロットは、４５℃にて一晩ハイブリダイズし、続いて室温で２ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて、１５分間１回洗浄し、次いで４５℃にて０．１ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて２０分間、３回洗浄した。ブロットは−７０℃で２４時間、Ｘ線フィルムに露光した。ｃＧＢ−ＰＤＥプローブとハイブリダイズするＲＮＡのサイズは、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光で目視化した、０．２４〜９．５ｋｂのＲＮＡラダーを用いて評価した。
32Ｐで標識されたｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡは、単一の６．８ｋｂウシ肺ＲＮＡ種とハイブリダイズした。同一のサイズのｍＲＮＡが、ウシの気管、大動脈、腎臓および脾臓から単離されたポリアデニル化ＲＮＡにおいても検出された。
実施例４
実施例２のクローンｃＧＢ−８におけるｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）内で発現させた。
制限酵素XbaIを用いた消化に続いて、ｃＧＢ−ＰＤＥの一部を単離した。XbaIは、ｃＧＢ−８インサートの５’末端の30ｂｐ上流に位置するpBluescriptポリリンカー配列における位置で、および当該ｃＧＢ−８インサートの中の3359位で切断する。この結果得られた3389ｂｐ断片（ｃＧＢ−８の全体のコード領域を含む）を、次いで発現ベクターｐＣＤＭ８（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、ＣＡ）の独特なXba8Iクローニング部位に連結した。ｐＣＤＭ８プラスミドはサイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサー、ＳＶ−４０由来の複製の起点、ポリアデニル化シグナル、複製の原核性起点（ｐＢＲ３２２由来）および原核性遺伝マーカー（supF）を含む４．５ｋｂの真核性発現ベクターである。大腸菌ＭＣ１０６１／Ｃ３細胞（インビトロゲン）を、得られた連結産物を用いて形質転換し、形質転換陽性のコロニーをＰＣＲおよび制限酵素分析を用いて、ｃＧＢ−８が正しい方向となっているかについてスクリーニングした。正しい方向でｃＧＢ−８インサートを含む、得られた発現構築体をｐＣＤＭ８−ｃＧＢ−ＰＤＥと言及する。
ｐＣＤＭ８−ｃＧＢ−ＰＤＥのＤＮＡはQiagen pack-500カラム（チャツウォース（Chatsworth）、ＣＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って大量のプラスミド調製物から精製した。ＣＯＳ−７細胞は、１０％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）（ＤＭＥＭ）中で、３７℃にて、給湿した５％ＣＯ2大気中で培養した。トランスフェクションのおよそ２４時間前に、集密な細胞の１００ｍｍディッシュを、もとの密度の４分の１または５分の１で再度播いた。典型的なトランスフェクション実験において、細胞は１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．１ｍＭ リン酸カリウム、および８．１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を含む緩衝液で洗浄した。次いで１０％NuSerum（コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ（Collaborative biomedical Products）、ベドフォード、ＭＡ）を含む４〜５ｍｌのＤＭＥＭを各プレートに添加した。６０μｌＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ2、および０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中、４００μｇのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア）と混合した１０μｇのｐＣＤＭ８−ｃＧＢ−ＰＤＥのＤＮＡまたはｐＣＤＭ８ベクターＤＮＡでのトランスフェクションを、各プレートに混合物を滴下により添加して行った。細胞を３７℃にて５％ＣＯ2で４時間インキュベートし、次いで１０％ジメチルスルホキシド含有ＰＢＳで１分間処理した。２分後、ジメチルスルホキシドを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄して完全培地中でインキュベートした。４８時間後、細胞のプレートあたり０．５〜１ｍｌの冷ホモジナイズ緩衝液（４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ ベンズアミジン、１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．７μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡ、０．５μｇ／ｍｌ ロイペプチン、および５μＭ ＥＤＴＡ）に細胞を懸濁し、ダウンス（Dounce）ホモジナイザーを用いて破砕した。その結果得られた全細胞抽出物を、ホスホジエステラーゼ活性、ｃＧＭＰ結合活性および総タンパク質濃度について以下の実施例５に記載するようにアッセイした。
実施例５
実施例４のトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の抽出物又はモックトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の抽出物におけるホスホジエステラーゼ活性を、Martins et al., J. Biol. Chem.,257:1973-1979（1982）のｃＧｓ−ＰＤＥについて記載されているアッセイ手法を改良したものを用いて測定した。細胞を採取し、トランスフェクション後４８時間で抽出物を調製した。インキュベーション混合物は、全容量２５０μｌ中に、４０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７）、０．８ｍＭのＥＤＴＡ、１５ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２０μＭ、［3Ｈ］ｃＧＭＰ又は［3Ｈ］ｃＡＭＰ（100,000-200,000cpm/アッセイ）及びＣＯＳ−７細胞抽出物を含んでいる。この反応混合物を３０℃にて１０分間インキュベートした。次に、１０ｍｇ／ｍｌのCrotalus atrox venom（Sigma）を１０μｌ加え、さらに３０℃で１０分間インキュベートした。ヌクレオシド産物は、Martins et al.、前出に記載されているとおりに未反応のヌクレオチドから分離した。全ての実験において、全［3Ｈ］環状ヌクレオチドの１５％以下が、反応中に加水分解されていた。
アッセイの結果を第５図に示すが、ここでは３つの別々のトランスフェクションの平均が示されている。ＣＯＳ−７細胞のｐＣＤＭ８−ｃＧＢ−ＰＤＥ ＤＮＡによるトランスフェクションは、モックトランスフェクト細胞又はｐＣＤＭ８ベクター単独でトランスフェクトされた細胞より、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ活性が１５倍高いレベルとなっている。モック又はベクター単独トランスフェクト細胞におけるｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性の増大は、ｐＣＤＭ８−ｃＧＢ−ＰＤＥ ＤＮＡでトランスフェクトした細胞からの抽出物中では検出されなかった。これらの結果により、ｃＧＢ−ＰＤＥ ウシｃＤＮＡはｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼをコードしていることが確認された。
また、実施例４のトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの抽出物を、ＰＤＥ阻害剤、ザプリナスト、ジピリダモル（Sigma），イソブチル−１−メチル−８−メトキシメチルキサンタン（ＭｅＯｘＭｅＭＩＸ）及びロリプラム（Rolipram）の一連の濃度の存在下におけるｃＧＭＰ ＰＤＥ活性のアッセイに供した。アッセイの結果は第６図に示されており、阻害剤のない場合の活性を１００％とし、各データポイントは２つの別々の測定の平均を示している。発現されたｃＧＢ−ＢＰＤＥ ｃＤＮＡタンパク産物によるｃＧＭＰ加水分解の阻害に対するＰＤＥ阻害剤の相対的効能は、ウシ肺（トーマスＩ、前出）から精製したｃＧＢ−ＰＤＥ本来のものについて報告されているこれらの相対的効能と一致している。第６図の曲線から計算したＩＣ50値は以下のとおりである：
ザプリナスト（黒塗り円），２μＭ；ジピリダモル（黒塗り四角），３．５μＭ；ＭｅＯｘＭｅＭＩＸ（黒塗り三角），３０μＭ；及びロリプラム（白抜き円）、＞３００μＭ。ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの比較的特異的な阻害剤であるザプリナストのＩＣ50値は、ｃＧｓ−ＰＤＥ又はｃＧＭＰ阻害ホスホジエステラーゼ（ｃＧｉ−ＰＤＥ）（Reeves et al.,pp.300-316 Beavo et al.,前出）のホスホジエステラーゼ活性の阻害について報告されているものより、少なくとも２オーダー低かった。選択されたｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの効果的な阻害剤であるジピリダモルは、発現されたｃＧＢ−ＰＤＥの協力な阻害剤でもある。相対的に選択的な、カルシウム／カルモジュリンにより刺激されるホスホジエステラーゼ（ＣａＭ−ＰＤＥ），ＭｅＯｘＭｅＭＩＸの選択的阻害剤は、ザプリナスト及びジピリダモルより１０倍近い効能であり、これはウシ肺から精製されたｃＧＢ−ＰＤＥ活性体を使用した結果と一致している。低いＫmのｃＡＭＰホスホジエステラーゼであるロリプラムは、発現されたｃＧＢ−ＢＰＤＥ ｃＤＮＡタンパク産物に対しては低い阻害剤である。これらの結果は、ｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡが、ウシ組織から単離されたｃＧＢ−ＰＤＥの触媒活性特性を有するホスホジエステラーゼをコードしていることを示しており、これにより、ｃＧＢ−８ ｃＤＮＡクローンがｃＧＢ−ＰＤＥと同一であることが確認された。
ｃＧＭＰ加水分解の阻害に対するＰＤＥ阻害剤の相対的な効能は、組換え遺伝子及びウシ単離ｃＧＢ−ＰＤＥに対する場合と同様であるものの、全ての阻害剤についての絶対値ＩＣ50値は、組換えｃＧＢ−ＰＤＥより２〜７倍高いことは興味深い。この違いは、ＣＯＳ−７細胞抽出物に存在する因子のｃＧＭＰ加水分解活性に対する影響に起因すると考えることはできない。なぜなら、ウシ組織から単離されたｃＧＢ−ＰＤＥは、純粋な酵素と同様か、又はモックトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の抽出物に戻した場合と同様の阻害速度を示すからである。この薬理学的感度の明らかな違いは、触媒部位及びその近傍における翻訳後修飾などの組換えｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡタンパク産物及びウシ肺ｃＧＢ−ＰＤＥの構造におけるわずかな違いによっている。この違いはまた、いくつかの精製工程におけるウシ肺ｃＧＢ−ＰＤＥの触媒活性の変化によっている。
細胞抽出物を０．２ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Sigma）の存在下及び非存在下における［3Ｈ］ｃＧＭＰ結合活性のアッセイに供した。トーマスI,前出に記載されているアッセイを改変したｃＧＭＰ結合活性のアッセイは、８０μｌの総容量で行った。その混合物の成分の最終濃度が、１μＭ［3Ｈ］ｃＧＭＰ，５μＭｃＡＭＰ，及び１０μＭ８−ブロモ−ｃＢＭＰとなるように、６０μｌの細胞抽出物を２０μｌの結合カクテルに加えた。ｃＡＭＰ及び８−ブロモ−ｃＢＭＰは、それぞれ［3Ｈ］ｃＧＭＰがｃＡＫ及びｃＧＫに結合するのを阻止するために加えた。アッセイは、０．２ｍＭのＩＢＭＸの存在下及び非存在下で行った。反応は細胞抽出物の添加により開始し、０℃で６０分間インキュベートした。トーマスI、前出に記載されているとおりに反応混合物を濾過した。細胞抽出物に代えて均質化緩衝液、又は非標識ｃＧＭＰの１００倍量を用いて並行してインキュベーションを行い、ブランクを決定した。同様の結果が両方の方法で得られた。細胞抽出物の総タンパク質濃度は、Bradford, Anal. Biochem., 72:248-254（1976）により、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。
アッセイの結果を第７図に示した。０．２ｍＭのＩＢＭＸの存在下、１μＭの［3Ｈ］ｃＧＭＰで測定した場合、ｐＣＤＭ８−ｃＧＢ−ＰＤＥでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞からの抽出物は、モックトランスフェクトされた細胞からの抽出物より８倍高いｃＧＭＰ結合活性を示した。バックグラウンドｃＧＭＰ結合のＩＢＭＸの促進は観察されず、内在性のｃＧＢ−ＰＤＥは、ＣＯＳ−７細胞抽出物には、ほんのわずか又は全く存在していないことを示している。ｐＣＤＭ８−ｃＧＢ−ＰＤＥトランスフェクトされた細胞の抽出物中では、ｃＧＭＰ特異活性は０．２ｍＭのＩＢＭＸの添加により、約１．８倍に促進されている。ＩＢＭＸのｃＧＭＰ結合を２〜５倍に促進する能力は、ｃＧＭＰ結合ホスホジエステラーゼ特有の性質である。
上述したように、細胞抽出物を、過剰の非標識ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの存在下で、［3Ｈ］ｃＧＭＰ結合性のアッセイ（ここでの［3Ｈ］ｃＧＭＰの濃度は２．５μＭである）に供した。結果を第８図に示し、ここでは非標識の競合剤の非存在下におけるｃＧＭＰ結合を１００％とし、各データポイントは３つの別々の測定の平均を表している。ｃＧＢ−ＰＤＥによってコードされたタンパク産物の結合活性は、ｃＧＭＰがｃＡＭＰに比較して特異的である。１０倍未満の高濃度の非標識ｃＧＭＰが、［3Ｈ］ｃＧＭＰ結合活性を５０％まで阻害するのに必要であったが、約１００倍の濃度のｃＡＭＰがこれと同程度の阻害に必要であった。
本実施例におけるこの結果は、ｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡが、ネイティブなｃＧＭＢ−ＰＤＥの生化学的活性特性を有するホスホジエステラーゼをコードすることを示している。
哺乳類ＰＤＥ及びドロソフィアＰＤＥの触媒ドメインは、サーモリシン（thermolysin、Vallee and Auld, Biochem., 29:5647-5659（1990））などの、Ｚｎ2+加水分解酵素における典型的なＺｎ2+結合モチーフである２つの直列保存配列（ＨＸ3ＨＸ24-25Ｅ）を含んでいる。ｃＧＢ−ＰＤＥは過剰のＭｇ2+，Ｍｎ2+，Ｆｅ2+，Ｆｅ3+，Ｃａ2+又はＣｄ2+の存在下でＺｎ2+と結合する。添加金属の非存在下では、ｃＧＢ−ＰＤＥは４０ｍＭのＭｇ2+の存在下で見られる最大の活性の約２０％のＰＤＥ活性を有し、この基礎活性は１，１０−フェナントロリン又はＥＤＴＡにより阻害される。このことは、金属を除去する完全な処理にも関わらず、痕跡量の金属がＰＤＥ活性に影響していることを示唆している。ＰＤＥ活性は、Ｚｎ2+（０．０２−１μＭ）又はＣｏ2+（１−２０μＭ）の添加により促進されるが、Ｆｅ2+，Ｆｅ3+，Ｃａ2+，Ｃｄ2+又はＣｕ2+によって阻害されない。Ｚｎ2+は、４０ｍＭのＭｇ2+によってもたらされる最大の促進の約７０％まで基礎ＰＤＥ活性を増大させる。これらのアッセイにおけるＺｎ2+の促進効果は、１＞１μＭのＺｎ2+濃度による阻害効果の妥協によるものである。Ｚｎ2+によって支持されたＰＤＥ活性及びｃＧＢ−ＰＤＥによるＺｎ2+結合は、Ｚｎ2+の同様の濃度において現れる。このように、ｃＧＢ−ＰＤＥはＺｎ2+加水分解酵素であると考えられ、Ｚｎ2+はこの酵素の活性における重要な役割を演じていると考えられる。Colbran et al., The FASEB J., 8: Abstruct 2148（March 15, 1994）を参照されたい。
実施例６
ｃＧＢ−ＰＤＥをコードするウシｃＤＮＡクローンと相同のいくつかのヒトｃＤＮＡクローンが、ウシｃＧＢ−８クローン（配列番号：９のヌクレオチド４８９−１３１２）の部分に相当する核酸プローブを使用するストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションによって単離された。
ヒトｃＧＢ−ＰＤＥをコードするｃＤＮＡ断片の単離
ベクターラムダＺａｐの、３つのヒトｃＤＮＡライブラリー（２つのグリア芽細胞腫及び１つの肺）を、ウシｃＧＢ−ＰＤＥ配列によりプローブ探針した。実施例１に記載した配列番号：９のヌクレオチド４８４〜１３１２に相当する、ＰＣＲで作製したクローンを、EcoRI及びSalIで消化し、得られた０．８ｋｂのｃＤＮＡインサートを単離して、アガロース電気泳動により精製した。この断片を、ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（Boehringer）を用いて放射性ヌクレオチドで標識した。
ｃＤＮＡライブラリーは、プレート当たり約５０，０００プラークの密度となるように１５０ｍｍのペトリ皿に播種した。二重のニトロセルロースフィルターレプリカを調製した。プレハイブリダイゼーション緩衝液は、３Ｘ ＳＳＣ，０．１％サルコシル，１０Ｘデンハーツ，２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）および５０μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮＡである。プレハイブリダイゼーションは、１〜５×１０5ｃｐｍ／ｍｌのプローブを加えた同様の組成の緩衝液中で、６５℃で一夜行った。フィルターを６５℃で２Ｘ ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイズしたプラークを、オートラジオグラフィで検出した。ウシプローブにハイブリダイズしたｃＤＮＡの数、およびスクリーニングされたｃＤＮＡの数を表２に示す。
0004150070.tif 000006
ｃｇｂＳ２．１，ｃｇｂＳ３．１，ｃｇｂＬ２３．１，ｃｇｂＬ２７．１及びｃｇｂＳ２７．１と命名されたプラスミドを、ラムダＺａｐクローン及び配列から、in vivoで試験した。
クローンｃｇｂＳ３．１は、推定イントロンに続くＰＤＥオープンリーディングフレームの２０６０ｂｐを含んでいる。ｃｇｂＳ２．１の分析は、これがｃｇｂＳ３．１の位置６６４から２０６０に相当し、読み取り前の付加的な５８５ｂｐのＰＤＥオープンリーディングフレームを推定イントロンまで伸ばすものである。推定５’非翻訳領域の配列およびｃｇｂＳ２．１，ｃｇｂＳ３．１クローンの部分をコードするタンパク質は、それぞれ配列番号：１１及び１２で示される。２つのｃＤＮＡを結合することにより、ＰＤＥのオープンリーディングをコードする約２．７ｋｂを含む配列が得られる。他の３つのｓＤＮＡは、ｃＤＮＡ  ｃｇｂＳ３．１又はｃｇｂＳ２．１を５’又は３’よりさらに伸長しているものではなかった。
さらなるｃＤＮＡを単離するために、クローンｃｇｂＳ３．１の５’末端およびクローンｃｇｂＳ２．１の３’末端を調製し、ＳＷ１０８８グリア芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリーおよびヒト大動脈ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。５’プローブは、プライマーｇｂＳ３．１Ｓ３１１及びｃｇｂＬ２３．１Ａ１２８６を用いたＰＣＲにより、クローンｃｇｂＳ３．１に由来し、上記プライマーｇｂＳ３．１Ｓ３１１及び上記ｃｇｂＬ２３．１Ａ１２８６はそれぞれ、配列番号：８及び９、並びに下記によって示されている。
0004150070.tif 000007
ＰＣＲ反応は、ｃｇｂＳ３．１ ｃＤＮＡを５０ｐｇ，ｄＮＴＰを０．２ｍＭ，各プライマーを１０μｇ／ｍｌ，ＫＣｌを５０ｍＭ，トリス塩酸ｐＨ８．２を１０ｍＭ，ＭｇＣｌ2を１．５ｍＭおよびＴａｑポリメラーゼを含む５０μｌの反応容量中で行った。最初の９４℃での４分間の変性後、９４℃で１分、５０℃で２分及び７２℃で４分の、サイクルを３０回行った。ＰＣＲ反応によって約０．２ｋｂの断片が生成し、これはクローンｃｇｂＳ３．１のヌクレオチド３００〜４９６に相当する。
３’プローブは、下記の配列を有するオリゴｃｇｂＬ２３．１Ｓ１１９０およびｃｇｂＳ２．１Ａ２３１を用いたＰＣＲにより、ｃＤＮＡｃｇｂＳ２．１に由来するものであった。
0004150070.tif 000008
ＰＣＲ反応は、５’プローブの生成で上述したと同様に行い、ｃＤＮＡ ｃｇｂＳ２．１のヌクレオチド１３５８〜２１３９に相当する約０．８ｋｂの断片を得た。ＰＣＲ断片（配列番号：１２には示していない）の３’１５７ヌクレオチドは、推定イントロン内にある。
２つのＰＣＲ断片を、アガロースゲル電気泳動により精製および単離し、ランダムプライムにより放射性ヌクレオチドで標識した。ランダムプライムＳＷ１０８８ｃＤＮＡライブラリー（１．５×１０6プラーク）を、上記標識された断片でスクリーニングし、１９のハイブリダイジングプラークを単離した。さらに５０のハイブリダイズするグプラークが、ヒト大動脈ｃＤＮＡライブラリー（ｄＴ及びランダムプライム，Clontech, Palo Alto, CA）から単離された。
プラスミドを、陽性のラムダZapクローン及び配列のいくつかから、in vivoで切り出した。ｃｇｂＳ５３．２と命名された一つのクローン（その配列は、配列番号：１７で示される）は、その配列がｃｇｂＳ３．１の最後の６１ｂｐに重複する約１．１ｋｂのインサートを含んでおり、さらなる１３５ｂｐのＰＤＥオープンリーディングフレームを、ｃｇｂＳ２．１に見出されるものを越えて伸長するものである。このクローンは、終止コドンと、推定３’非翻訳配列の約０．３ｋＢを含んでいる。
ヒトｃＧＢ−ＰＤＥをコードする複合ｃＤＮＡの生成
クローンｃｇｂＳ３．１，ｃｇｂＳ２．１およびｃｇｂＳ５３．２を、以下のパラグラフに記載されているように、完全なヒトｃＧＢ−ＰＤＥのオープンリーディングフレームを含む複合ｃＤＮＡを構築するために使用した。複合ｃＤＮＡをｃｇｂｍｅｔ１５６−２と命名し、酵母ＡＤＨ１発現ベクターｐＢＮＹ６Ｎに挿入した。
先ず、ｃＧＢ−ＰＤＥオープンリーディングフレームの３’末端を含むｃｇｂｓｔｏｐ−２と命名されたプラスミドを生成した。プラスミドのインサートの一部を、鋳型としてクローンｃｇｂＳ５３．２を使用して、ＰＣＲによって作製した。使用したプライマーはｃｇｂＳ２．１Ｓ１７００及びｃｇｂｓｔｏｐ−２であった。
0004150070.tif 000009
ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡを５０pg，ｄＮＴＰを０．２ｍＭ，トリス塩酸ｐＨ８．２を２０ｍＭ，ＫＣｌを１０ｍＭ，（ＮＨ4）2ＳＯ4を６ｍＭ，ＭｇＣｌ2を１．５ｍＭ，０．１％Triton-X-100，各プライマー５００ｎｇおよびPfuポリメラーゼ（Stratagene）の０．５単位を含む５０μｌ中で行った。反応液は９４℃で４分間加熱し、９４℃で１分、５０℃で２分及び７２℃で４分の３０回のサイクルを行った。ポリメラーゼは最初のサイクルで５０℃の間に添加した。得られたＰＣＲ産物は、フェノール／クロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行い、そして制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限断片は、アガロースゲルで精製して溶出させた。
この断片を、ｄａｍ Ｅ．ｃｏｉｌ内で成長させたｃＤＮＡ ｃｇｂＳ２．１に結合させ、制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｈｏＩで切断し、及びPromega magic PCR Kitを用いてゲル精製を行った。結果として得られるプラスミドは、ｃｇｂｓｔｏｐ−２がｃＧＢ−ＰＤＥオープンリーディングフレームの３’部分を含んでいることを確認するために配列決定された。
二番目に、ヒトｃＧＢ−ＰＤＥオープンリーディングフレームの５’末端を担持するプラスミドを生成させた。そのインサートは、鋳型としてクローンｃｇｂＳ３．１を用いてＰＣＲにより生成させた。ＰＣＲは、プライマーｃｇｂｍｅｔ１５６及びｃｇｂＳ２．１Ａ２１５０を用い、上述と同様にして行った。
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結果として得られるＰＣＲ断片は、フェノール／クロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行い、Sepharose CL-6Bカラムで精製した。この断片を、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩで切断してアガロースゲルを通し、そしてガラスウールを通すスピニングにより精製した。フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿の後に、この断片はＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶで消化されたBluescript II SK（+）に連結し、プラスミドｃｇｂｍｅｔ１５６を作製した。インサートと接合部のＤＮＡ配列を決定した。インサートは新たなＥｃｏＲＩ部位を含み、開始コドンの元の１５５ヌクレオチド５’を互いに置換した付加的な５ヌクレオチドを含んでいる。インサートは、開始コドンより５３１ヌクレオチドから始まるＥｃｏＲＶ部位まで伸びている。
ｃＧＢ−ＰＤＥオープンリーディングフレームの５’および３’の部分を、次いでベクターｐＢＮＹ６ａに集めた。ベクターｐＢＮＹ６ａを、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで切断し、ゲルにより単離し、アガロースゲルで精製したｃｇｂｍｅｔ１５６からのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片と、アガロースゲルで精製したｃｇｂｓｔｏｐ−２からのＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩとに結合させた。インサートの接合部を配列決定し、そして、構築体を、ｈｃｂｇｍｅｔ１５６−２ ６ａと命名した。
次に、ｈｃｂｇｍｅｔ１５６−２ ６ａからのｃＧＢ−ＰＤＥインサートを、発現ベクターｐＢＮＹ６ｎに移動させた。このベクターに挿入されたＤＮＡの発現は、酵母ＡＤＨ１プロモータおよびターミネーターより導かれる。このベクターは、酵母の２ミクロンの複製起点、複製のｐＵＣ１９起点、およびアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。ベクターｐＢＮＹ６ｎをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、ゲル精製を行った。ｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ａからのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩインサートをPromega Magic PCRカラムを用いてゲル精製し、ｐＢＮＹ６ｎに結合させた。結果として得られる構築体ｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎにおける全ての新しい接合部を配列決定した。複合ヒトｃＧＢ−ＰＤＥをコードするｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎのインサートのＤＮＡと推定アミノ酸配列を、配列番号：２２及び２３に示す。インサートは、クローンｃｇｂＳ３．１（ヌクレオチド１５６）の最初のメチオニンから複合ｃＤＮＡの終止コドン（ヌクレオチド２７８１）まで伸びている。そのメチオニンは、クローンｃｇｂＳ３．１にて最も５’側のメチオニンであるので、また、メチオニンを有するフレームには、終止コドンが存在しないので、ｐＢＮＹ６ｎにおけるインサートは、オープンリーディングフレームの端を切欠した形状を現しているのかもしれない。
変異ｃＤＮＡ
ｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎ複合ｃＤＮＡとは異なる４つのヒトｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡが単離されている。一つのｃＤＮＡ、ｃｇｂＬ２３．１は、ｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎの内部領域（ヌクレオチド９９７〜１０００から１４４４〜１４４７）が欠損しているものである。欠損部分の正確な終端は、それらの位置におけるｃＤＮＡ配列から決定することはできない。４つの変異ｃＤＮＡのうちの３つは、ｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎ配列のヌクレオチド１５１（ｃＤＮＡ ｃｇｂＡ７ｆ，ｃｇｂＡ５Ｃ，ｃｇｂＩ２）の上流から分岐する５’末端配列を有している。これらのｃＤＮＡは、選択的スプライシングを受けた又はスプライシングを受けていないｍＲＮＡを表しているのかもしれない。
実施例７
複合ヒトｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡ構築体、ｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎを、酵母菌株ＹＫＳ４５（ＡＴＣＣ７４２２５）（ＭＡＴα his3 trp1 ura3 leu3 pde1::HIS3 pde2::TRP1）へ形質転換したが、これは２つの内在性ＰＤＥ遺伝子が欠損してたものである。ＹＫＳ４５菌株のｌｅｕ-欠損を補足する形質転換体を選択し、ｃＧＢ−ＰＤＥ活性についてアッセイを行ったプラスミドｈｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎを産出する細胞からの抽出物は、以下に示すアッセイにより、サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ活性を呈することを調べた。
プラスミドｃｇｂｍｅｔ１５６−２ ６ｎで形質転換されＳＣ−ｌｅｕ培地で１〜２×１０7細胞／ｍｌの密度まで成長したＹＫＳ４５細胞の１リットルを遠心分離により採集し、脱イオン水で一度洗浄し、ドライアイス／エタノールで凍結させて−７０℃で保存した。細胞ペレット（１〜１．５ｍｌ）を、等容量の２５ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）／５ｍＭ ＥＤＴＡ／５ｍＭ ＥＧＴＡ／１ｍＭ オルトフェナントロリン／０．５ｍＭ ＡＥＢＳＦ（Calbiochem）／０．１％ β−メルカプトエタノールおよび１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチンＡのそれぞれの存在下に、氷上で解凍した。解凍した細胞は、１５ｍｌのＣｏｒｅｘチューブ内の酸洗浄したガラスビーズ（４２５〜６００μＭ、Sigma）２ｍｌに加えた。１セットした３０秒間のボルテックスと、次に６０秒間の氷上でのインキュベーションとからなるサイクルを４回行うことにより、細胞を破壊した。細胞溶解液を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を０．８μのフィルターに通した。上清を以下に示すようにｃＧＭＰ ＰＤＥ活性のアッセイに供した。４５ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＧＴＡ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．２ｍＭ オルトフェナントロリン，２μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ，ロイペプチン及びアプロチニンのそれぞれ、０．１ｍＭ ＡＥＢＳＦ，０．０２％ β−メルカプトエタノールおよび基質として０．１ｍＭの［3Ｈ］ｃＧＭＰの存在下に、試料を３０℃で２０分間インキュベートした。［14Ｃ］−ＡＭＰ（０．５Ｃｉ／アッセイ）を回収標準物として加えた。反応は停止緩衝液（０．１ＭエタノールアミンｐＨ９．０，０．５Ｍ硫酸アンモニウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，最終濃度０．０５％のＳＤＳ）で停止した。生成物は、ＢｉｏＲａｄ  Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ６０１上のクロマトグラフィーにより、サイクリックヌクレオチド基質から分離した。カラム緩衝液（０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１ＭエタノールアミンｐＨ９．０）で平衡化したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ６０１の約０．２５ｍｌを含むカラムを適用した。カラムはカラム緩衝液の０．５ｍｌで５回洗浄した。生成物は、０．２５の酢酸の０．５ｍｌで４回溶出させ、５ｍｌのEcolume（ICN Biochemicals）と混合した。放射性生成物をシンチレーション計数により測定した。
実施例８
ヒト組織におけるｃＧＢ−ＰＤＥ ｍＲＮＡの発現の分析を、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイにより行った。
ｃＧＢ−ＰＤＥ（配列番号：１３のヌクレオチド１４５０から１８５１に相当する４０２ｂｐ）の推定ｃＧＭＰ結合ドメインの部分に相当するプローブを、ＰＣＲにより生成させた。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＢＳＩＩ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドＲＰ３を作製した。ＲＰ３プラスミドＤＮＡをＸｂａＩで直鎖状化し、アンチセンスプローブをStratagene T7 RNAポリメラーゼキットの改変によって作製した。２５ｎｇの直鎖状化されたプラスミドを、２０μキュリーのアルファ32ＰｒＵＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍｌ），１Ｘ転写緩衝液（４０ｍＭトリスＣｌ，ｐＨ８，８ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ スペリミジン，５０ｍＭ ＮａＣｌ），０．２５ｍＭの各ｒＡＴＰ，ｒＧＴＰおよびｒＣＴＰ，０．１単位のＲＮａｓｅ ＢｌｏｃｋＩＩ，５ｍＭ ＤＴＴ，８μＭ ｒＵＴＰおよび全容量５μｌの５単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼと合わせた。室温で１時間反応を行い、ＲＮａｓｅ不含のＤＮａｓｅでＤＮＡ鋳型を消化させた。反応液を１００μｌの４０ｍＭ トリスＣｌ，ｐＨ８、６ｍＭのＭｇＣｌ2，及び１０ｍＭのＮａＣｌで希釈した。ＲＮａｓｅ不含の５単位のＤＮａｓｅを加え、更に１５分間、３７℃で反応を継続した。フェノール抽出によって反応を停止させ、次にフェノールクロロホルム抽出を行った。７．５ＭのＮＨ4ＯＡｃの半分の容量を加え、プローブをエタノール沈殿させた。
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを、Ambion RNase Protection kit（Austin,TX）と、酸グアニジニン抽出法によるヒト組織から単離した１０μｇのＲＮＡとを用いて行った。ｃＧＢ−ＰＤＥ ｍＲＮＡの発現は、骨格筋、子宮、気管支、ヒフ、右の伏在静脈、大動脈およびＳＷ１０８８グリア芽細胞腫細胞から抽出したＲＮＡで容易に検出された。右心房、右心室、腎臓皮質および腎臓髄質ではわずかに検出し得る発現が見られた。ＰＲ３プローブの完全な保護のみが見られた。部分的保護がないことは、少なくともこれらのＲＮＡ試料で主要な転写を表すｃＤＮＡ ｃｇｂＬ２３．１（実施例７に記載した変異ｃＤＮＡ）と反対の結論である。
実施例９
ポリクロナール抗血清を、ヒトｃＧＢ−ＰＤＥの大腸菌生成断片に起用した。
ヒトｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡ（配列番号：２２のヌクレオチド１６６８〜２６１２，配列番号：２３のアミノ酸５１５〜８１９）の部分をＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩとしてＥ．ｃｏｉｌ発現ベクターｐＧＥＸ２Ｔ（Pharmacia）に挿入した。ｐＧＥＸ２Ｔプラスミドは、アンピシリンＲ因子（耐性遺伝子）、大腸菌ｌａｑ Ｉq因子、及び日本住血吸虫（Schistosoma Japonicum）グルタチオン−Ｓ−転写（ＧＳＴ）因子を運ぶ。プラスミドに挿入されたＤＮＡは、ＧＳＴとの融合タンパク質として発現され、トロンビンによりこのタンパクのＧＳＴ部分から分割されることができる。この結果得られるｃｇｂＰＥ３と表されるプラスミドを、大腸菌株ＬＥ３９２（Stratagene）に形質転換した。形質転換された細胞は、３７℃で、０．６のＯＤ６００までに成長させた。ＩＰＴＧ（イソプロピルチオアラクトピラノシド）を０．１ｍＭまで加え、細胞を３７℃で更に２時間成長させた。細胞を遠心分離により集め、超音波で溶解させた。細胞の残滓を遠心分離により除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。ゲルを冷０．４Ｍ ＫＣｌで着色し、ＧＴＳ−ｃｇｂ融合タンパクのバンドを切り出し、電気溶出させた。タンパク質のＰＤＥ部分は、スロンビンの消化によりＧＴＳ部分から分離された。消化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ＰＤＥタンパク質を電気溶出して、ウサギに皮下注射した。結果として得られる抗血清は、抗原として使用したウシｃＧＢ−ＰＤＥ断片と、酵母に発現された（実施例８を参照されたい）ヒトｃＧＢ−ＰＤＥタンパクの全長との両方を認識する。
実施例１０
種々のｃＧＢ−ＰＤＥ類似体をコードするポリヌクレオチドおよびｃＧＢ−ＰＤＥ断片を標準の方法により生成させた。
Ａ．ｃＧＢ−ＰＤＥ類似体
公知のｃＧＭＰ結合ＰＤＥの全ては、それらの推定ｃＧＭＰ結合ドメインに２つの内的に一致する直列のリピートを含んでいる。本発明のウシｃＧＢ−ＰＤＥでは、リピートは少なくとも配列番号：１０の残基２２８〜３１１（リピートＡ）及び４１０〜５００（リピートＢ）にわたる。公知のｃＧＭＰ結合ＰＤＥの全てのリピートＡ及びＢに保持されているアスパラギン酸の部位特異的突然変異誘発を、Ａｌａ（Ｄ２８９Ａ）で置換したＡｓｐ−２８９か、又はＡｌａ（Ｄ４７８Ａ）で置換したＡｓｐ−４７８を有する類似のｃＧＢ−ＰＤＥを作製するのに使用した。組換え体の野生型（ＷＴ）のウシ及び突然変異ウシｃＧＢ−ＰＤＥを、ＣＯＳ−７細胞にて発現させた。ウシ肺（自然のｃＧＢ−ＰＤＥ）から精製されたｃＧＢ−ＰＤＥと、ＷＴ ｃＧＢ−ＰＤＥとは同じｃＧＭＰ結合動力学を示して、Ｋdは約２μＭであり、曲直線（curvlinear）解離プロファイル（４℃でｔ1/2＝１．３時間）を示した。この曲直線性は、ｃＧＭＰ結合の明らかに高い親和性と低い親和性の部位の存在によるのかもしれない。Ｄ２８９Ａの突然変異体は、ｃＧＭＰに対して明らかに減少した親和性を有し（Ｋd＞２０μＭ）、ｃＧＭＰ群のの単一の速度（ｔ1/2＝０．５時間）を有しており、これは、ＷＴおよび自然のｃＧＢ−ＰＤＥの速い部位について計算したものと同じである。このことは、突然変異体のリピートＡにおける遅いｃＧＭＰ結合部位の損失を示唆している。逆に、Ｄ４７８Ａ突然変異体はｃＧＭＰに対して高い親和性と（約０．５μＭのＫd）、単一のｃＧＭＰ解離速度（ｔ1/2＝２．８時間）を示し、これは、ＷＴおよび自然のｃＧＢ−ＰＤＥの遅い部位について計算したものと同様である。このことは、リピートＢの改変に際して、速い部位が損失されることを示唆している。これらの結果は、２量体ｃＧＭＰは２つの相同であるが動力学的に区別されるｃＧＭＰ結合部位を有しており、この部位は各部位でｃＧＭＰと相互作用するのに重要なアスパラギン酸を保持している。Colbran et al., FASEB J., 8:Abstract 2149（May 15, 1994）を参照されたい。
Ｂ．アミノ末端を切欠したｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチド
配列番号：２３のアミノ酸５１６〜８７５を含む末端を切欠したヒトｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドを、酵母において発現させた。配列番号：２２のヌクレオチド１５５５のＮｃｏＩから、配列番号：２２の３’末端のＸｈｏＩ部位まで伸びるｃＤＮＡインサートを、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで消化しておいたＡＤＨ２酵母発現ベクターＹＥｐＣ−ＰＡＤＨ２ｄ（Price et al., Meth. Enzymol., 18:308-318（1990））に挿入して、プラスミドＹＥｐＣ−ＰＡＤＨ２ｄ ＨｃＧＢを作製した。このプラスミドは、酵母菌株ｙＢＪ２−５４（prcl-407 prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3-52 Δpdel::URA3, HIS3 Δpde2::TRPl cir）のスフェロプラストへと形質転換した。内在性のＰＤＥ因子は、この菌株では欠落している。細胞を、２％のグルコースを含むＳＣ−ｌｅｕ培地で１０7個まで生育し、濾過によって集め、３％グリセロールを含むＹＥＰ培地で２４時間生育した。細胞は遠心分離によりペレット化し、凍結保存した。細胞をガラスビーズで粉砕し、細胞懸濁液を、Prpic et al., Anal. Biochem., 208:155-160（1993）に本質的に記載されているホスホジエステラーゼ活性のためのアッセイに供した。末端を切欠したヒトｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドは、ホスホジエステラーゼ活性を示した。
Ｃ．カルボキシ末端を切欠したｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチド
カルボキシ末端を切欠したｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドをコードする２つの異なるプラスミドを構築した。
配列番号：２３のアミノ酸１〜４９４をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＪ６−８４Ｈｉｎを、ベクターＹＥｐＣ−ＰＡＤＨ２ｄのＮｃｏＩ及びＳａｌＩ部位に挿入した。ｃＤＮＡのインサートは、配列番号：２２のヌクレオチドの第１０位のＮｃｏＩ部位から、リンカーに続く配列番号：２２のヌクレオチドの第１４９４位のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＹＥｐＣ−ＰＡＤＨ２ｄのＳａｌＩ部位まで伸びている。
プラスミドｐＢＪ６−８４Ｂａｎは、ベクターＹＥｐＣ−ＰＡＤＨ２ｄのＮｃｏＩ及びＳａｌＩ部位に挿入された、配列番号：２３のアミノ酸１〜５４９をコードするｃＤＮＡを含んでいる。このｃＤＮＡインサートは、配列番号：２２のヌクレオチドの位置１０のＮｃｏＩ部位から、リンカーに続く配列番号：２２のヌクレオチドの位置１６５４のＢａｎＩ部位とＹＥｐＣ−ＰＡＤＨ２ｄのＳａｌＩ部位まで伸びている。
末端を切欠したｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチドは、ｃＧＢ−ＰＤＥ活性のモジュレーターをスクリーニングするのに有用である。
実施例１１
ヒトｃＧＢ−ＰＤＥと反応するモノクロナール抗体を生成した。
プラスミドＹＥｐＡＤＨ２ ＨｃＧＢを含む酵母ｙＢＪ２−５４（実施例１０Ｂ）を、New Brunswick Scientificの１０リットルのMicrofarm内で発酵させた。プラスミドＹＥｐＡＤＨ２ ＨｃＧＢ内のｃＧＢ−ＰＤＥ ｃＤＮＡインサートは、配列番号：２２のヌクレオチドの第１２位のＮｃｏＩ部位から、配列番号：２２の３’末端のＸｈｏＩ部位まで伸びている。４×１０9個の細胞の接種物を、ＳＣ−ｌｅｕ、５％グルコース、微量金属、及び微量ビタミンを含む８リットルの培地に加えた。発酵は２６℃を保ち、標準の微生物用の撹拌翼を用いて６００ｒｐｍで撹拌し、圧搾空気で１分間当たり１０倍容積のエアレーションを行った。接種後２４時間でグルコースが０．３％に減少したとき、培養液に１５％のグリセロールを含む２リットルの５Ｘ ＹＥＰ培地を注入した。接種後６６時間で、４℃、４，０００ｘｇで３０分間遠心分離することにより、発酵液から酵母を収穫した。この発酵におけるバイオマスの収量は、湿重量で３５０ｇに達した。
ヒトｃＧＢ−ＰＤＥ酵素を、酵母細胞ペレットから精製した。基質として１ｍＭのｃＧＭＰを使用するＰＤＥ活性のためのアッセイを、この酵素のクロマトグラフィーに続いて採用した。全てのクロマトグラフィーの操作は、４℃で行った。
酵母（湿重量で２９ｇ）を、再び７０ｍｌの緩衝液Ａ（２５ｍＭのトリスｐＨ８．０，０．２５ｍＭのＤＴＴ，５ｍＭのＭｇＣｌ2，１０μＭのＺｎＳＯ4，１ｍＭのベンズアミジン）に分散させ、２２−２４，０００ｐｓｉでマイクロフリュイダイザーを通して溶解させた。溶解液は、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、２０ｍＭのビストリス−プロパンｐＨ６．８，０．２５ｍＭのＤＴＴ，１ｍＭのＭｇＣｌ2，及び１０μＭのＺｎＳＯ4を含む緩衝液Ｂで平衡化したPharmacia Fast Flow Q noアニオン交換樹脂を充填した２．６×２８ｃｍのカラムに上清を通した。このカラムをカラム容量の５倍の、０．１２５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗浄し、次に０．１２５Ｍから１．０ＭまでのＮａＣｌの直線勾配で展開した。酵素を含む画分をプールし、２０ｍＭのビストリス−プロパン  ｐＨ６．８，０．２５ｍＭのＤＴＴ，０．２５ＭのＫＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ2，及び１０μＭのＺｎＳＯ4を含む緩衝液Ｃで平衡化したセラミックヒドロキシアパタイト（BioRad）の５×２０ｃｍのカラムに直接付した。このカラムをカラム容量の５倍の緩衝液Ｃで洗浄し、緩衝液Ｃ中で０から２５０ｍＭまでのリン酸カリウムの直線勾配で溶出させた。プールした酵素を限外濾過（ＹＭ３０メンブレン、Amicon）で８倍まで濃縮した。濃縮した酵素を、２５ｍＭのビストリス−プロパン ｐＨ６．８，０．２５ｍＭのＤＴＴ，０．２５ＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ2，及び２０μＭのＺｎＳＯ4で平衡化したPharmacia Sephacryl S300（Piscataway, NJ）の２．６×９０ｃｍのカラムでのクラマトグラフィーにかけた。約４ｍｇのタンパクが得られた。組換えヒトｃＧＢ−ＰＤＥ酵素は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動と、次のクマシーブルー染色とにより、得られたタンパクの約９０％であると計算された。
精製したタンパク質を、モノクロナール抗体を惹起するための抗原として使用した。１９週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Char les River Biotechnical Service, Inc., Wilmington, Mass）の皮下に、５０％のフロイント完全アジュバント（Sigma Chemical Co．）からなる２００μｌのエマルジョン中の５０μｇの精製ヒトｃＧＢ−ＰＤＥ酵素を免疫投与した。続く追加免疫を、２０日と４３日に不完全フロイントアジュバントで投与した。ＰＢＳ中の５０μｇの酵素を用いて、前融合の後追加免疫を８６日に行った。融合は９０日に行った。マウス＃１８１７からの脾臓を無菌的に取り出し、１０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ １６４０中に入れた。単細胞懸濁液を形成し、無菌の７０メッシュのNitex細胞ストレーナ（Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey）に通して、２００ｇで５分間遠心分離により２回洗浄し、２０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ中にペレットを再び分散させた。３匹の無処置Ｂａｌｂ／ｃマウスから取り出した胸腺細胞を同様の方法で調製した。
１１％の胎児クローン（Fetalclone）（ＦＢＳ）（Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah）を含むＲＰＭＩ中に、融合に先立って３日間、対数増殖期で保存しておいたＮＳ−１骨髄腫細胞を、２００ｇで５分間遠心分離し、ペレットを前述のパラグラフに記載したようにして２回洗浄した。洗浄後、各細胞懸濁液を最終的に１０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ容量となるように加え、２０μｌを１ｍｌの無血清ＲＰＭＩに１：５０で希釈した。各希釈液の２０μｌを取り出し、０．８５％シラン（Gibco）中の０．４％トリパンブルー染色液の２０μｌと混合し、血球計算器（Baxter Healthcare Corp., Deerfield, Illinois）上に付して計数を行った。
２×１０8個の脾臓細胞を４．０×１０7個のＮＳ−１細胞と合わせ、遠心分離して上清をアスピレータで吸引した。細胞ペレットは、チューブをタッピングすることにより移動させ、３７℃のＰＥＧ１５００（７５ｍＭのＨｅｐｅ ｐＨ８．０中５０％）２ｍｌを撹拌しながら１分間にわたって加え、次に１４ｍｌの無血清ＲＰＭＩを７分間にわたって加えた。更に１６ｍｌのＲＰＭＩを加え、細胞を２００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨てた後、１５％のＦＢＳ，１００μＭのヒポキサンチンナトリウム，０．４μＭのアミノプテリン，１６μＭのチミジン（ＨＡＴ）（Gibco），２５単位／ｍｌのＩＬ−６（Boehringer Mannheim）及び１．５×１０6の胸腺細胞／ｍｌを含む２００ｍｌのＲＰＭＩにペレットを再分散させた。先ず、懸濁液を９６のウェルの平底組織培養プレート１０枚に、１ウェル当たり２００μｌで分配する前の２時間、Ｔ２２５フラスコ（Corning, United Kingdom）に３７℃で２時間入れておいた。プレート中の細胞は、融合後３，４，５日で、２０Ｇの針を用いて各ウェルから約１００μｌを吸引することにより、そして、１０単位／ｍｌのＩＬ−６を含み胸腺細胞を含まないことを除いて上述と同様の１ウェル当たり１００μｌの播種培地を加えることにより、栄養供給した。
融合体を、先ずＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。Ｉｍｍｕｎｏｎｅ ４ プレート（Dynatech）を、組換え精製ヒトｃＧＢ−ＰＤＥ酵素（５０ｍＭのカーボネート緩衝液ｐＨ９．６中、１００ｎｇ／ウェル）で一晩、４℃にて被覆した。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３回洗浄した。個々のハイブリドーマウェルからの上清を、酵素で被覆したウェルに加えた（５０μｌ／ウェル）。３７℃で３０分間インキュベート後、上述と同様に洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗-マウスＩｇＧ（ｆｃ）（Jackson ImmunoReserch, West Grove, Pennsylvania）をＰＢＳＴで１：３５００に希釈したものを５０μｌ加えた。プレートを上述と同様にインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン（Sigma），及び１００ｍＭのクエン酸塩溶液中の３０％Ｈ2Ｏ2の０．１μ／ｍｌからなる１００μｌの基質を加えた。着色反応を５分で１５％Ｈ2ＳＯ4のμｌを加えて停止した。プレートリーダ（Dynatech）にて、Ａ490を読み取った。
ウェルＣ５Ｇ，Ｅ４Ｄ，Ｆ１Ｇ，Ｆ９Ｈ，Ｆ１１Ｇ，Ｊ４Ａ，及びＪ５Ｄを拾い、それぞれ１０２Ａ，１０２Ｂ，１０２Ｃ，１０２Ｄ，１０２Ｅ，１０２Ｆ，及び１０２Ｇと名付け、ＲＰＭＩ、１５％のＦＢＳ，１００μＭのヒポキサンチンナトリウム，１６μＭのチミジン（ＨＡＴ）（Gibco），および１０単位／ｍｌのＩＬ−６に２回希釈することにより、２又は３回連続してクローニングを行った。クローンプレートのウェルを、４日後には目視に評価し、最も密度の低いウェルのコロニーの数を記録した。各クローニングの選択されたウェルを、ＥＬＩＳＡによってテストした。
上述のハイブリドーマによって生成したモノクロナール抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイによってアイソタイプ判定した。その結果、モノクロナール抗体１０２Ａから１０２ＥはＩｇＧ１，１０２ＦはＩｇＧ２ｂ，１０２ＧはＩｇＧ２ａであることが示された。
ウェスタン分析によって判定したところ、７つの全てのモノクロナール抗体がヒトｃＧＳ−ＰＤＥと反応した。
実施例１２
特異的ＰＤＥの生物学的活性のモジュレーターを開発するためには、特定のアッセイの調製物に存在するＰＤＥアイソザイムを識別することが必要である。天然の組織源からＰＤＥを単離し、新しいアイソザイムのそれぞれを研究する伝統的な酵素学的アプローチは、精製技術の限界と、アイソザイムの完全な分離が為されるかどうかを明確に評価するのが不可能であることによって阻まれている。一つのアイソザイムの寄与に助力し、調製における他の寄与を最小限にするアッセイ条件を同定する他のアプローチもある。更にまた、ＰＤＥの分離を免疫学的手段によって分離する他のアプローチもある。先に述べたＰＤＥアイソザイムを識別するアプローチのそれぞれは、時間を要し、技術的に困難である。結果的に、選択的ＰＤＥモジュレーターを開発する多くの試みが、１以上のアイソザイム調製物を用いて為されてきた。更に、天然組織源からのＰＤＥの調製物は、限定されたタンパク分解に感受性が高く、そして全長のＰＤＥとは異なる動力学、異なる調節、及び異なる物理学的性質を有する活性なタンパク分解産物の混合物を含んでいるかもしれない。
本発明の組換えｃＧＢ−ＰＤＥポリペプチド産物は、新たなそして特異的ｃＧＢ−ＰＤＥモジュレーターの開発を大いに促進する。モジュレーターのスクリーニングのためのヒト組換え酵素の使用は、多くの固有の利点を有している。内在性のホスホジエステラーゼ活性を欠いている宿主細胞（例えば、ＡＴＣＣ ７４２２５として寄託した酵母菌株ＹＫＳ４５）において組換え法により発現させることによって、アイソザイムの精製の必要性を回避することができる。ヒトタンパク質に対する化合物をスクリーニングすることで、非ヒトタンパクについて至適化された化合物がヒトタンパク質に対して特異的ではないか又はヒトタンパク質と反応しない場合に、非ヒトタンパク質に対するスクリーニングから起こることの多い複雑さを回避することができる。例えば、ヒトと齧歯類５ＨＴ1Bセロトニンレセプタとの間の単一のアミノ酸の違いが、受容体に対する化合物の結合の差の原因となっている。（Oskenberg et al., Nature, 360:161-163（1992）を参照されたい）。ひとたびｃＧＢ−ＰＤＥの活性をモジュレートする化合物が発見されると、その選択性は、ｃＧＢ−ＰＤＥにおけるその活性を他のＰＤＥアイソザイムに対するその活性と比較することにより評価され得る。このように、一連の独立したアッセイでの、本発明の組換えｃＧＢ−ＰＤＥ産物と他の組換えＰＤＥとの組み合わせば、ｃＧＢ−ＰＤＥの選択的モジュレーターを開発するシステムを提供する。選択的モジュレーターには、例えば、抗体及び他のタンバク、又はｃＧＢ−ＰＤＥ若しくはｃＧＢ−ＰＤＥ核酸、又はオリゴヌクレオチドに特異的に結合するペプチドが含まれ得、上記オリゴヌクレオチドは、ｃＧＢ−ＰＤＥ（特許協力条約国際公開第ＷＯ９３／０５１８２、1993年３月18日、これには、目的生物分子に選択的に結合するオリゴヌクレオチドを選択する方法が記載されている）に、又はｃＧＢ−ＰＤＥ核酸（即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に、及びｃＧＢ−ＰＤＥ若しくはｃＧＢ−ＰＤＥ核酸に特異的に結合する他の非ペプチド天然若しくは合成化合物に、特異的に結合する。ｃＧＢ−ＰＤＥの酵素活性又は局在性を変化させるｃＧＢ−ＰＤＥの突然変異体も企図される。組換えｃＧＢ−ＰＤＥ単独、およびモジュレーターとの組み合わせの結晶化、Ｘ線結晶学による原子構造の分析、並びにこれらのコンピュータモデリングは、非ペプチド選択的モジュレーターの設計と最適化に有用な方法である。例えば、構造に基づくドラッグデザインの一般的総説である、Erickson et al, Ann Rep. Med. Chem., 27:271-289（1992）を参照されたい。
選択的モジュレーターの開発の目的は、例えば、以下のものを含んでいる：（1）他のタンパクと接触する、及び／又は細胞内でのｃＧＢ−ＰＤＥを局在化させるｃＧＢ−ＰＤＥの領域、（2）基質を結合するｃＧＢ−ＰＤＥの領域、（3）ｃＧＢ−ＰＤＥのアロステリックなｃＧＭＰ結合部位、（4）ｃＧＢ−ＰＤＥの金属結合領域、（5）ｃＧＢ−ＰＤＥのリン酸化部位（１以上）、ならびに（6）ｃＧＢ−ＰＤＥサブユニットの２量化に関係するｃＧＢ−ＰＤＥの領域。
本発明は特定の実施例の事項について記載されているが、当業者には種々の変更と改変が想起されることを理解すべきである。従って、添付の特許請求の範囲の限定のみが、本発明に付されるべきである。
配列表
（1）一般情報
（i）出願人：ザ  ボード  オブ  リージェンツ  オフ  ザ  ユニバーシティー  オブ  ワシントン
（ii）発明の名称：環状GMP-結合性、環状GMP-特異性ホスホジエステラーゼ物質および方法
（iii）配列の数：23
（iv）連絡先住所：
（A）名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー  アンド  ボーラン
（B）番地：6300シアーズ  タワー、233サウス  ワッカー  ドライブ
（C）都市名：シカゴ
（D）州名：イリノイ
（E）国名：米国
（F）郵便番号：60606
（v）コンピューター読取形式：
（A）媒体：フロッピー  ディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換機
（C）操作システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテント  イン  リリース#1.0、バージョン#1.25
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）先行出願データ：
（A）出願番号：US 08/068,051
（B）出願日：27-5月-1993
（viii）弁護士／弁理士情報：
（A）氏名：ノーランド、グレタ  イー
（B）登録番号：35,302
（C）参照／事件番号：32083
（ix）通信情報：
（A）電話：（312）474-6300
（B）ファックス：（312）474-0448
（C）テレックス：25-3856
（2）配列番号：１の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：20アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：１
0004150070.tif 000011
（2）配列番号：２の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：９アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：２
0004150070.tif 000012
（2）配列番号：３の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：８アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：３
0004150070.tif 000013
（2）配列番号：４の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：４
0004150070.tif 000014
（2）配列番号：５の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iv）アンチ−センス：YES
（xi）配列：配列番号：５
0004150070.tif 000015
（2）配列番号：６の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：６
0004150070.tif 000016
（2）配列番号：７の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iv）アンチ−センス：YES
（xi）配列：配列番号：７
0004150070.tif 000017
（2）配列番号：８の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：36塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iv）アンチ−センス：YES
（xi）配列：配列番号：８
0004150070.tif 000018
（2）配列番号：９の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：4474塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：99..2723
（xi）配列：配列番号：９
0004150070.tif 000019
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（2）配列番号：10の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：875アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：10
0004150070.tif 000027
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（2）配列番号：11の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：2060塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号：11
0004150070.tif 000032
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（2）配列番号：12の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：1982塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号：12
0004150070.tif 000034
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（2）配列番号：13の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：13
0004150070.tif 000036
（2）配列番号：14の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：14
0004150070.tif 000037
（2）配列番号：15の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：15
0004150070.tif 000038
（2）配列番号：16の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：16
0004150070.tif 000039
（2）配列番号：17の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：1107塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号：17
0004150070.tif 000040
（2）配列番号：18の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：18
0004150070.tif 000041
（2）配列番号：19の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：29塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：19
0004150070.tif 000042
（2）配列番号：20の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：20
0004150070.tif 000043
（2）配列番号：21の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列：配列番号：21
0004150070.tif 000044
（2）配列番号：22の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：2645塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：12..2636
（xi）配列：配列番号：22
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（2）配列番号：23の情報
（i）配列特徴：
（A）配列の長さ：875アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：23
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
0004150070.tif 000059
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
0004150070.tif 000061
【図３】
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【図４】
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【図５】
0004150070.tif 000064
【図６】
0004150070.tif 000065
【図７】
0004150070.tif 000066
【図８】
0004150070.tif 000067