(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒体の性質とは異なる少なくとも１つの測定可能な性質を有する、液体媒体に懸濁される細胞を、分析する方法であって、
（ａ）前記サンプル細胞懸濁液の第１アリコートをセンサーに通し、
（ｂ）前記細胞懸濁液中の前記少なくとも１つの性質を測定し、
（ｃ）前記細胞の第１アリコートについての前記性質の測定を記録し、
（ｄ）前記サンプル細胞懸濁液の前記第１のアリコート又は少なくとも１つの他のアリコートに対して、知られる程度又は同定できる程度に細胞の形状を変更する可能性を有する細胞環境の少なくとも１つのパラメーターを変更することにより、変更された細胞懸濁液を作製し、
（ｅ）前記変更された細胞懸濁液をセンサーに通し、
（ｆ）前記変更された細胞懸濁液の前記少なくとも１つの性質を測定し、
（ｇ）前記変更された懸濁液についての前記少なくとも１つの性質の測定を記録し、
（ｈ）段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータを比較し、そしてサンプル特異的細胞形状修正係数を決定し、そして
（ｉ）段階（ｃ）における前記細胞の第１アリコートの測定値に前記修正係数を適用し、これにより段階（ｃ）における前記第１のアリコートと段階（ｇ）における前記変更された細胞懸濁液との間で形状の変動を考慮して、細胞パラメーターを計算する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記液体媒体とは異なる細胞の性質が、細胞の体積に関連する性質である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の性質が電気抵抗又はインピーダンスである請求の範囲第１又は２項記載の方法。
【請求項４】
前記環境パラメーター変化が、オスモル濃度の変更である請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記環境パラメーター変化がオスモル濃度の変更であり、そして段階（ｈ）において決定された前記形状修正係数が、下記式：
0004160117.tif 000018
〔式中、Ｋshapeは、形状補正係数であり、SR１は既知の又は同定できる形状でのセンサー読取りであり、SR２は注目のオスモル濃度でのセンサー読取りであり、そしてKaは装置依存定数である〕
により与えられる請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記センサー読取りが電圧の大きさの読取りである請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
注目のオスモル濃度での細胞の前記体積が、下記式：
細胞体積＝SRn×Ｋvolts×Ｋshape
〔式中、SRnは注目のオスモル濃度でのセンサー読取りであり、Ｋvoltsは電圧から細胞体積へのあらかじめ定められた転換係数であり、そしてＫshapeは前記センサー読取りSRnのために決定された形状修正係数である〕
から決定される請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】
前記既知の又は同定できる形状が球形状である請求の範囲第５〜７のいづれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが溶液中に連続的に供給され、そのオスモル濃度が連続して変えられ、検出領域を通過するアリコートの連続した濃度勾配が生成される、請求の範囲第１〜８のいづれか１項記載の方法。
【請求項１０】
サンプルの或る部分が環境パラメーター変化を強要されてから検出領域を通過するまでの時間が、オスモル濃度の変化の全体にわたって、当該サンプルの部分のそれぞれについて実質的に同じである請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】
前記変更された細胞懸濁液の前記少なくとも１つの性質が、多くの細胞の個々がセンサーを通して通過するにつれて測定され、前記変更された細胞懸濁液のための前記少なくとも１つの性質の測定が細胞ごとに記録され、そして段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータが、細胞環境の前記パラメーターの前記変更の程度及び前記少なくとも１つの性質の度数分布の関数として比較される請求の範囲第１〜10のいづれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記分析の結果を、三次元プロットの形で表示する段階をさらに含んで成る請求の範囲第11項記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプル細胞懸濁液の第２アリコートに対して、前記細胞膜を通過する流体の流れを誘発しそしてそれにより当該細胞の少なくとも１つの性質を変更する可能性を有する細胞環境の少なくとも１つのパラメーターの変更を課し、ここで前記段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータが、前記細胞環境の前記パラメーターの前記変更の程度、及び前記サンプルの細胞透過性の測定を決定するために前記少なくとも１つの性質の記録された測定値の変化の程度の関数として比較される請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１〜13のいづれか１項記載の方法に従って液体媒体中のサンプル細胞懸濁液を処理するための装置であって、前記第１アリコートの細胞と前記変更された細胞懸濁液中の細胞との間の形状の変動を考慮して、細胞パラメーターの計算において前記第１アリコートの細胞の前記少なくとも１つの性質の測定に適用されるべき形状修正係数を決定するために前記段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータを比較するようプログラムされたデータ処理手段を含んで成る装置。
【請求項１５】
前記データ処理手段が、前記細胞環境の前記パラメーターの変更の程度、及び前記少なくとも１つの性質の度数分布の関数として細胞ごとに段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータを比較するようプログラムされている請求の範囲第14項記載の装置。
【請求項１６】
前記データ処理手段がパーソナルコンピューターの内部マイクロプロセッサーを含んで成る請求の範囲第14又は15項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞サンプル又は流体サンプルを試験するための方法に関する。
赤血球及び白血球細胞の試験のために特に適切であるが、多くのタイプの細胞及び人工細胞が本発明の方法に従って試験され得る。
背景技術
一定の疾病が血液そして特に赤血球細胞の状態の変化を生ぜしめることは良く知られている。血液の特徴、たとえば赤血球細胞の計数、平均細胞体積、ヘモグロビンの計数、及びヘマトクリットが疾病の診断に通常使用される。
細胞体積の測定は、臨床医学において最も情報を与える調査の１つである。細胞サイズは、病理学の重要なインジケーターであり、そしてヘモグロビンと共に、貧血の基本的分類を形成する。それは、白血球細胞及び白血病の識別、すなわち疾病の評点における予後の評価の基準であり、そしてサラセミア、すなわち世界における最とも一般的な遺伝子疾患のための非常に貴重なスクリーニング装置である。
既存の方法は、大多数の患者において良好な細胞サイズの測定を達成するが、赤血球細胞形状が正常なものとは有意に異なる患者及び異常な血清オスモル濃度を有する患者においてのみ達成できない。細胞形状は正規分布しているので、集団の4.56％は標準偏差の２倍以上正常細胞の形状からずれる赤血球細胞を有する。それらの異常サンプルは、その偏差が正常限界内の偏差よりも一層しばしば疾病に関連しているので、病院においては、過度に表わされる。結果的に、臨床実験室は、報告された結果のうち少なくとも4.56％に誤った細胞体積値を提供し、すなわち毎日、アメリカ合衆国において約100,000の誤った細胞体積測定値を表わしている。大部分の患者においては、それらの結果は有意な問題を引き起こさないが、しかし時折、誤った測定値は誤診及び患者の死をもたらす。しかしながら、この誤りは、存在する自動化された方法がそれを検出することができないので、めったに認識されていない。
正常なヒト血液サンプルは、約290mosmKg-1のオスモル濃度を有する溶液と等張であり、そしてこのオスモル濃度で、平均的な個人における平均的な赤血球細胞は両凹形状を有するであろう。赤血球細胞を取り囲む溶液のオスモル濃度の臨海レベル以下への低下は、細胞の膨潤、次に破裂を引き起こし、その内容物、すなわちヘモグロビンをその周囲媒体中にほとんど完全にゆっくりと開放するゴースト細胞を形成することは十分に知られている。溶血と呼ばれるこの工程は、水を用いて（浸透圧的に）、又は界面活性剤、毒物又は他の化学物質、熱的、機械的又は電気的物質により誘発され得る。細胞体積を決定するための試験は典型的には、等張オスモル濃度で実施される。
細胞の自動化された測定は、試験される細胞のサイズ及び形状に依存する。存在する装置は細胞形状を決定することができないので、Coulter Electronics Inc.により商品名Coulter Counterとして市販されている粒子カウンターのような装置が、サンプル中の細胞形状が正常な集団からそれる場合いつでも誤っている固定された平均推定値である項により等張細胞体積の計算を補足している。前記方法が最もしばしば失敗することは、精度が最も必要とされる病理学のしるしであるそれらの異常サンプルである。
サンプル中の赤血球細胞のサイズ、及び前記細胞の数及び性質の計算を推定するためには、使用され得るいくつかの市販の粒子カウンターが存在する。それらの粒子カウンターは、狭い管にそって通過する細胞の流れの電気的又は光学的性質のいづれかを測定することによって作動する。測定される性質は通常、管における懸濁液を通して流れる電流又は管内の電場である。発生されるシグナルは、いくつかの要因、たとえば細胞サイズ、細胞形状、細胞膜の性質、及び細胞及び懸濁媒体の電気的性質の差異に依存する。
発明の開示
本発明の第１の観点によれば、液体媒体に懸濁される、前記液体媒体の性質とは異なる少なくとも１つの測定可能な性質を有する細胞のサンプルが、分析にゆだねられる新規方法が提供され、ここで前記方法は、
（ａ）前記サンプル細胞懸濁液の第１アリコートをセンサーに通し、
（ｂ）前記細胞懸濁液中の前記少なくとも１つの性質を測定し、
（ｃ）前記細胞の第１アリコートについての前記性質の測定を記録し、
（ｄ）変更された細胞懸濁液を作製するために、知られているか又は同定できる程度に細胞の形状を変更する可能性を有する細胞環境の少なくとも１つのパラメーターの変更に、前記サンプル細胞懸濁液の第１又は少なくとも１つの他のアリコートをゆだね、
（ｅ）前記変更された細胞懸濁液をセンサーに通し、
（ｆ）前記変更された細胞懸濁液の前記少なくとも１つの性質を測定し、
（ｇ）前記変更された懸濁液についての前記少なくとも１つの性質の測定を記録し、
（ｈ）段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータを比較し、そして段階（ｃ）における前記細胞の第１アリコートと段階（ｇ）における前記変更された細胞懸濁液との間で形状の変動を考慮するために、細胞パラメーターの計算において段階（ｃ）における細胞の第１アリコートの前記少なくとも１つの性質の測定に適用されるべき形状補正因子を決定する段階を包含する。
本発明においては、細胞パラメーター、たとえば細胞体積は、細胞がサンプル特異的形状補正因子を得るために特定の形状を達成する点を同定するためにサンプル細胞懸濁液の１又は複数のアリコートを、細胞環境の少なくとも１つのパラメーターの１又は複数の変更にゆだねることによって、決定される。
すべての存在する自動化方法は、細胞環境が、装置を校正するために通常使用される球形状粒子からの細胞の偏差を補正する試験の間に変更されない単一細胞懸濁液から取られるセンサー読取りの処理における同定された形状修正を包含する。しかしながら、細胞体積の計算においては、細胞形状が未知である場合、約1.5の固定された修正が、サンプル細胞が両凹円板の形状を有するという仮定のもとに計算に入れられる。この修正は、等張オスモル濃度で平均的な個人における平均的な細胞を補正するが、しかしそれは、仮定された同定補正が細胞体積の評価において60％までの誤差を誘発する多くのカテゴリーの疾病のためには正しくない。本発明の方法においては、インビボ細胞形状が評価され、その結果、すべての形状での細胞体積又は他の細胞パラメーターの真の評価が得られる。本発明の好ましい態様においては、その細胞サンプルに対して特異的な細胞の形状の測定である形状修正係数を生成するために使用される形状修正関数が決定される。次に、この関数により生成される形状修正係数は、細胞体積及び他の細胞パラメーターの真の測定値を得るために、1.5の従来の固定された形状修正値にとって代る。
本発明の第２の観点によれば、本発明の第１の観点の方法に従って液体媒体中のサンプル細胞懸濁液を試験するための装置は、前記細胞の第１アリコートと前記変更された細胞懸濁液との間の形状の変動を考慮するために細胞パラメーターの計算において前記細胞の第１アリコートの前記少なくとも１つの性質の測定に適用されるべき形状修正係数を決定するために前記段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータを比較するようプログラムされたデータ処理手段を含んで成る。
好ましくは、前記データ処理手段は、パーソナルコンピューターの内部マイクロプロセッサーを含んで成る。
好ましくは、前記液体媒体とは異なる、細胞の性質は、細胞の体積に直接的に関連する性質である。そのような性質は、電気抵抗又はインピーダンスであり、そしてこれは、細胞懸濁液がセンサーの検出領域を通過するにつれてその懸濁液を通しての電流の流れを決定することによって通常のCoulter Counterにおけるようにして測定される。検出領域は通常、細胞懸濁液が流れを引き起こされるチャネル又は開口である。いづれのタイプのセンサーでも使用され得るが、但し、そのセンサーは細胞サイズに比例するシグナルを生成すべきである。そのようなセンサータイプは、電圧、電流、RF、NMR、光学、音又は磁気性質に依存することができる。最も好ましくは、センサーは、この日にまた出願された本出願人の同時継続出願の国際出願（代理人の参照：62／2681／03）に実質的に記載されている通りである。
前記方法は通常、血液細胞、たとえば白血球又は通常、赤血球細胞に対して実施されるが、それは、植物もしくは動物細胞又は微生物細胞、たとえば細菌細胞であり得る他の細胞懸濁液を調査するためにも使用され得る。
前記方法において変えられる環境パラメーターは、変更される細胞の測定可能パラメーターをもたらすであろういづれかの変更であり得る。前記方法は、環境パラメーターの変更が細胞のサイズ、形状又は他の分析性質を変える場合、最とも価値あるものである。前記方法は、周囲媒体のオスモル濃度の変化の結果として細胞の体積の変化を検出することにおいて特に価値するものである。従って、好ましくは、環境パラメーターの変化は、オスモル濃度の変更、通常、低下である。典型的には、前記第１アリコートの環境は等張性であり、そして従って、段階（ｇ）における変更された懸濁液の環境は、たとえば、低浸透性希釈剤により等張サンプル懸濁液の一部を希釈することによって、低浸透性にされる。
本発明の方法、及び上記のような細胞に適用できる方法はまた、内部空間を取り囲む膜、すなわち環境パラメーターを変更することによって変更され得る形状又はサイズ、もしくは変形性を含んで成る他の天然の及び合成の小胞にも適用できる。そのような小胞は、膜モデルとして、たとえば薬物供給装置として、又は他の活性成分を貯蔵し、そして／又は安定化するための装置として、又は血液置換体におけるヘモグロビンを含むために有用である。
この方法においては、検出領域を通しての細胞の通過と環境の変更の開始との間の時間は、種々であり得るが、しかし好ましくは、１分以下、より好ましくは10秒以下である。その時間は一般的に、前記方法において調布され、そして好ましくは、それは一定に維持される。それが変化する場合、時間は、段階（ｈ）の計算段階に考慮される追加の因子であり得る。
本発明の方法がサンプル細胞懸濁液の２つのアリコートの処理から単に構成されることは可能であるが、より一般的には、本発明は、サンプル細胞懸濁液のもう１つのアリコートも、センサーを通して前記変更されたアリコートを通過せしめる細胞環境の少なくとも１つのパラメーターにおける第２変更にゆだね、前記アリコートの多くの細胞の個々がセンサーを通過するにつれて、変更された環境下で細胞懸濁液の前記性質の変化を記録し、細胞ごとに基づいて前記変化と一緒に、前記環境の同時発生性質のすべてを記録し、そして環境パラメーターの前記第２変更の程度の関数として、先の段階（ｃ）及び前述の段階からのデータを比較する段階を包含する。通常、類似する手段で処理される多くの追加のアリコートが存在する。試験されるアリコートの数が多くなるほど、得られる結果の可能性ある正確度、精度及び解明性は高くなる。サンプル懸濁液の単に１つのアリコートを、細胞環境の少なくとも１つのパラメーターの一連のそのような変更にゆだねることもまた可能である。
その単純な形においては、試験は２種のセンサー測定値に依存し、ここでその１つは最大で存在するか、又はそれに近いかである。しかしながら、細胞が最大サイズに達するよう誘発するために必要とされる環境は完全に未知である。さらに、環境の変化は、連続的、非連続的、ランダム、持続的又は断続的であり得るが、但し最大の達成できる細胞サイズが記録されるべきである。これを確保する１つの便利な手段は、すべての可能な細胞サイズ、たとえば最大のものも、記録されるよう、連続的に変化する環境下で細胞を試験することである。
細胞環境における第２の変更は通常、第１の変更と同じタイプのものである。それは第１の変更と同じ程度のものでもあるが、しかし変更の開始と検出領域を通しての細胞通過との間の時間は、異なることができ、それにより、環境パラメーターの特定の変化にゆだねられる場合、細胞性質の変化の速度をモニターする。この技法はまた、数年間、貯蔵されている細胞をモニターするためにも使用され得る。
もう１つの観点において、環境パラメーターの第２の変更は、第１の変更と同じタイプのものであるが、しかしその程度が異る。そのような場合、好ましくは、変更の開始と検出領域を通しての細胞の通過との間の時間が、細胞懸濁液の個々のアリコートのために同じである。好ましくは、本発明のこの態様においては、細胞懸濁液の第２及び続くアリコートが、環境パラメーターの連続的に高まる程度の変更にゆだねられ、その結果、前記性質の変化が最大点に達し、そして次に、環境パラメーターの変更の程度が高められるにつれて、低下する。モニターされる細胞懸濁液の性質が細胞の体積に直接関与し、そして第２及び続くアリコートのための環境パラメーターの変更が細胞の体積上昇をもたらす好ましい態様においては、環境変化は、細胞体積が最大点を通過するまで、変化する。
本発明の方法の好ましい用途は、赤血球細胞を分析することであるので、次の議論は、そのような細胞の研究に主に基づかれている。しかしながら、上記のような方法は、他の細胞型に、及びそのような細胞型の研究から生物に関する他の情報を決定するために適用できることが現実化されるであろう。
この実施においては、細胞形状、特に赤血球細胞形状は、いづれの自動化された方法によっても評価されない。本発明は、細胞形状の決定、及び他のデータ、たとえば細胞体積、表面積、表面積：体積の比、球形度指数、細胞の厚さ、及び表面積／mlの誘導を使用者に可能にする。調査及び実験用の実験室を除いて、それらの測定値はいづれの臨床実験室においても現在利用できず、そして今までのところ、60秒以内に完結され得ない。特に、サンプルの細胞懸濁液が濃度グラジエントにゆだねられる好ましい方法は、自動検出を可能にし、又は細胞が、溶解の直前、実質的に球状の形状を採用する場合、正確な検出を使用者に可能にする。
市販のCoulter Counter粒子カウンター装置は、検出領域を通過する粒子の体積に比例してシグナルを、典型的には、個々の粒子のための電圧パルスを生成する。前記シグナルのサイズは、測定されたシグナル、典型的には電圧を粒子体積、典型的にはフェムトリッターに転換するための転換係数を生成するために、既知体積の球状ラテックス粒子に対して校正される。生物学的サンプル、たとえばディスク形状を有する血小板、繊維芽細胞又は赤血球細胞において典型的であるように、球状でない粒子のサイズを測定するためにこのタイプの粒子カウンターを用いる場合、固定された形状修正係数が、転換係数の他に使用される。電圧パルスのサイズは単独で、細胞体積に関連していないので、球状ではない粒子を測定する場合、理論的及び実験的データに基づいてのこの固定された形状修正は、正しい体積の評価をもたらすように企画されている。たとえば、通常の赤血球細胞は、それらの装置に基づいて測定される場合、約1.5倍、小さ過ぎるセンサーパルスを生成し、そして従って、1.5の固定された修正が、正しい値を生成するために細胞体積の計算中に導入される。
本発明の好ましい方法においては、この固定された形状修正係数が、形状修正関数から生成される、サンプル特異的形状修正係数ｆ（Ｋshape）により置換される。この形状修正関数は、すべての細胞形状のために連続的であり、そして球状細胞についての1.0の値〜好ましくは平らな細胞についての無限大の値までの範囲である。形状修正関数は、解剖学的測定に依存する細胞パラメーター、たとえば細胞体積が決定され得る際の精度を高める。
環境パラメーターの変化がオスモル濃度の低下である好ましい方法においては、次の一般的な関数が、いづれかの２つのセンサー読取り、すなわち測定された電圧に基づいての形状修正係数を記述する：
ｆ（Ｋshape）＝（SR１，SR２）
ここで、SR１は、既知の形状、特に球状でのセンサー読取り（測定された電圧）であり、そしてSR２は興味あるオスモル濃度、典型的には等張でのセンサー読取りである。好ましい方法において、そのセンサー読取りは、電圧振幅の１つである。
分析は、これが一次関数であり、そして下記の通りであることを示した：
0004160117.tif 000002
ここで、Kaは装置依存定数である。
好ましくは、血液細胞の形状修正係数は、測定された電圧（SR１）と、いくらかの既知の又は同定できる形状での同じ血液サンプルの細胞、最も便利には、球状形状を採用する細胞の測定された電圧（SR２）とを比較することによって決定される。
本発明の第３の観点によれば、液体媒体に懸濁される、前記液体媒体の性質とは異なる少なくとも１つの測定可能な性質を有する細胞のサンプルが、分析にゆだねられる新規方法が提供され、ここで前記方法は、
（ａ）前記サンプル細胞懸濁液の第１のアリコートをセンサーに通し、
（ｂ）前記第１アリコートの多くの細胞の個々がセンサーを通過するにつれて、前記細胞懸濁液中の前記少なくとも１つの性質を測定し、
（ｃ）前記細胞の第１アリコートについての前記性質の測定を細胞ごとに基づいて記録し、
（ｄ）変更された細胞懸濁液を作製するために、前記細胞の少なくとも１つの性質を変更する可能性を有する細胞環境の少なくとも１つのパラメーターの変更に、前記サンプル細胞懸濁液の第１又は少なくとも１つの他のアリコートをゆだね、
（ｅ）前記変更された細胞懸濁液をセンサーに通し、
（ｆ）前記変更された細胞懸濁液の多くの細胞の個々がセンサーを通過するにつれて、前記変更された細胞懸濁液の前記少なくとも１つの性質を測定し、
（ｇ）前記変更された懸濁液についての前記少なくとも１つの性質の測定を細胞ごとに基づいて記録し、
（ｈ）前記細胞環境のパラメーターの前記変更の程度及び前記少なくとも１つの性質の頻度分布の関数として段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータを比較する段階を包含する。
本発明の方法を実施することによって、そして特に、細胞についての性質の変化データを細胞ごとに基づいて記録することによって、データは続いて、環境パラメーター変更の強要下でお互い異なって応答するサンプル内の細胞の副集団を同定するために処理され得る。
本発明は、細胞ごとに基づいてデータの獲得を可能にする、血液サンプルを処理するための方法を提供する。細胞ごとに基づいてデータを用いることによって、それは、新規パラメーターの測定を可能にし、そして集団間の異なったサイズの細胞の分布に基づく情報の獲得、及びそれらの解剖学的及び生理学的性質に基づいて細胞の副集団の表示を可能にする。
再現性の測定は、実施される観察の標準偏差である。本発明の観点は、得られる結果の標準偏差が臨床学的利用性を確保するために低められる改良点を提供することである。
本発明の第４の観点によれば、本発明の第３の観点の方法に従って液体媒体中、サンプル細胞懸濁液を試験するための装置は、前記細胞環境のパラメーターの前記変更及び前記少なくとも１つの性質の頻度分布の程度の関数として、前記段階（ｃ）及び（ｇ）からのデータを比較するようプログラムされたデータ処理手段を含んで成る。
調査され得る他の環境パラメーターの変化は、pHの変化、温度、圧力、又はイオン透過担体の変化、溶解剤、たとえば毒素、又は細胞膜孔阻止剤との接触による変化、又はそれらのパラメーターのいづれかの組合せを包含する。たとえば、環境パラメーター、たとえばオスモル濃度、pH又は温度の変化、又は細胞体積変化の量又は速度を変えるために、溶解剤及び／又は孔阻止剤の有効性を決定することが有用である。さらに、お互い、細胞中への又は細胞からの成分の輸送に影響を及ぼす複数の剤の効果が、この技法により決定され得る。いづれの他の環境パラメーターの変更を伴わないで又は他の環境パラメーターの変更を伴って、センサーを通しての流速を変えることによって、検出領域を通しての細胞懸濁液の通過の間、細胞懸濁液の剪断応力の変化にゆだねることもまた可能である。剪断応力の変化は、細胞の形状、及び従って、センサーにより測定される電気、光学又は他の性質に影響を及ぼすことができる。細胞の変形のそのような変化のモニターリングは、価値あるものである。特に、疾病により、又は他の環境パラメーター、たとえば懸濁媒体中の成分、pH、温度又はオスモル濃度を人工的に変えるこにより、付与される変化に基づく変形性の変化をモニターすることは、価値あることである。
好ましくは、データ処理手段は、パーソナルコンピューターの内部マイクロプロセッサーを含んで成る。
十分なデータが、溶解を引き起こす決定的なオスモル濃度よりも少々低いオスモル濃度で、広範囲の低浸透性溶液における溶血ショックにゆだねられる特定細胞集団における細胞サイズの分布に基づいて入手できる場合、その集団におけるギャップが見える。三次元プロット又はデータを表わす他の手段、たとえば輪郭地図に基づいて、ゴースト細胞が明確に見え、そして破壊されていない細胞は明確に同定できるが、しかしそれらの間に、たとえば細胞が広く分布する、オスモル濃度及び細胞サイズにより定義される領域が存在する。本発明者が、“ゴーストギャップ”と称しているこの現象の存在は、これまで認識されておらず、そしてこの現象の性質は、種により、及び特定種の健康な個人と疾病の個人との間で異なることが発見された。それは赤血球不同（サイズ不均等性）の程度の測定であり、そしてすべての貧血病を分類するための基礎としてしばしば使用される、細胞集団の変形赤血球（形状不均等性）の程度の測定に使用され得る。
細胞パラメーター変化の測定値は、貯蔵され、そして電圧パルスとして回収され、そしてそれらは、パラメーター変化を引き起こす溶液のオスモル濃度に対する電圧の表示に基づく個々のドットとして表示され得る。観察が単一の張度での懸濁液を用いて行なわれる場合、その得られるプロットは、同じ体積の細胞を表わすドットの強度により電圧の度数分布を示す。
計数される、個々のアリコート内の血液細胞の数は、典型的には、少なくとも1000であり、そして次に、細胞ごとのデータが、サイズの正確な度数分布を生成するために使用される。適切には、この強度は、天気の予報に使用されるレーダー降雨画像に見られる効果に類似する三次元効果を付与するために、異なった色を用いることによって、より可視化され得る。他方では、いづれかの張度の単一の溶液のためには、その測定されるパラメーター変化は、同じ変化を示す個々の細胞の数に対して表示され得る。この場合、考えられるオスモル濃度の特定張度での細胞体積又は電圧の分布が得られる。
本発明の方法は、代わりに、個々のアリコートを形成するために異なったオスモル濃度の一連の低浸透圧溶液の１つにサンプルの部分をゆだねることによってさらに改良され得、ここで前記サンプルは溶液に連続的に供給され、そしてそのオスモル濃度は、検出領域を通しての通過のためにアリコートの連続したグラジエントを形成するために連続して変更される。好ましくは、試験下でのサンプルの同一の部分が、環境パラメーター変化の強要から検出領域を通しての通過の時間まで、同じ時間の後の試験下での範囲を通して個々のオスモル濃度の溶液にゆだねられる。この技法は、細胞が、その特定のサンプルにおける決定的な変化を引き起こす正確な濃度にゆだねられることを確保する。さらに、連続的に変化するオスモル濃度グラジエント中に試験下でのサンプルを供給する効果は、その連続して変化するグラジエントによる１つの特定の細胞サンプルの処理に等しい測定値を得ることである。この技法は、この日、また出願された本発明者の同時継続国際特許出願（代理人の参照番号：62／2684／03）の主題である。
さらに、本発明においては、種々の時間の間隔で特定の血液サンプルを試験し、そして細胞機能における力学的変化を示すためにそれらの組の結果を比較することが可能である。
それらの力学的変化は、細胞が時間にわたってそれらの機能する能力をゆっくり低めるが、しかしそれらはまた、予測できない態様で変化することを示した。血液サンプル中の細胞のサイズ及び形状は、複雑で非線形ではあるが、しかし数日間にわたって及び連続的な試験に基づいて、いくつかの特徴的パターンを反復する反復可能な態様で変化する。一定時間にわたって出現するそれらのパターンは、サンプル間で類似性を示し、そしてしばしば、特徴的な波形運動を示す。変化のパターンは、個人の健康を反映しながら個人間で異なり、又はそのパターンはサンプル内で異なる。従って、最初に試験される場合均質であるサンプルは、時間と共に変化する２又はいくつかの副集団に分けられ、そしてそれらの存在は、サンプルを広範囲の異なった張度（tonicity）にゆだね、そして記載される手段で細胞サイズを記録することによって検出され得る。
完全な一連の段階が元のサンプルのさらなるアリコートに対して一定時間の間隔で反復され、そしてその得られる性質の変化がオスモル濃度、時間及び度数分布に対してプロットされる場合、変化する天気図に類似する四次元表示が得られる。個々の試験を実施するために取られる時間に対しての性質の変化の速度は、試験の間に生じるいづれかの変化が結果に実質的に影響を及ぼさないようにあるべきである。
特定の血液サンプルの特徴的なパターンを提供するのはこの移動三次元表示（時間での動きは四次元である）である。そのパターンは、特定の細胞電圧の密度及びそれによるサイズ、ゴースト細胞を表わす領域の形状、及び特に、完全な細胞とゴースト細胞との間のギャップの形状及び位置を包含する。このパターン、及び種及び種内での個人の健康に関するその変動は、臨床的診断及び他の訓練に使用され得る特徴を提供する。細胞形状は、この躍動し又は変化する表示の基礎である１つの性質である。最初の数時間、細胞は元のサンプル中でだんだん球状になり、次にそれは数時間、平らになり、次に再び球状になり、そして次により薄くなり、そして最終的に、再び膨潤することができる。この１組の奇妙な形状変化は、血餅内でも生じ、そしてNMRにより観察される発作の後の脳の混濁における従来の難解な変化の基本である、（１）Gomori J. M., Grossman R. I.など、Radiology 157, 1985, p87〜93；（２）Bydder G. M., Pennock J. M., Porteous R.など、1988, Nearo - radiology 30, p367〜371；（３）Alanen A., Kormano M. 1985, J. Ultrasound Med 4., 421〜425。本発明の方法を用いることによって、観察される変化が血餅内で又は完全な血液サンプル中で生じる速度が、pH、温度、及び利用できるエネルギーにより影響されることが決定されている。
三次元パターンは、特定の細胞がそれらの最大の体積に達する時点、すなわちそれらが球状になる時点で、正確なオスモル濃度の同定を可能にする。適切な校正により、及び電圧パルスの大きさを用いて、そのような細胞の実際の体積を精密且つ精確に定義することが可能である。細胞のそれらの最大での通過を引き起し、そして識別することによって、溶解の点、すなわち球状化された細胞の同定が、最も近くの１／10m.osmＫ-1で得られる。平均細胞体積が必要とされる場合、データは電圧から取られ、そしてそれにより、等張オスモル濃度での体積が、正常よりも的状赤血球性（leptocytotic）であり又は球状赤血球性（sherocytic）である細胞の割合及びその偏差の程度について修正される。個々の細胞体積が必要とされる場合、それらは観察された電圧パルス、又は分散統計学又はそのグラフ的な表示によるその度数分布から直接的に得られる。
本発明の好ましい形においては、血液サンプルの測定が連続したグラジエントのオスモル濃度に対して行なわれ、そしてその結果が、個々の細胞の測定値のパターン又は輪隔地図として表示され、そして前記パターンの密度による異なったサイズの細胞の分布を示す場合、時間の間隔でのこの測定の反復及び次に、時系列での個々の試験は、典型的な細胞サンプルが、そのサンプルにおける他の細胞と異なった態様で時間と共に変化する細胞の副集団を含むことができることを示す。異なった時点で得られるパターンの試験は、好ましくは、移動画像の形で細胞の力学的変化の効果を付与するコンピューター配列決定により行なわれる。この技法を用いて、複数の細胞副集団が、個々の集団の運命及び相対的割合に関して決定され得る。これは、たとえば処理下にある貧血症、化学療法を受けている白血病、骨髄移植における骨髄の回復性をモニターするための手段として、又は貯蔵された血液における貯蔵損傷を研究するための手段として有用である。
本発明のさらなる特徴によれば、本発明を用いることを含んで成る、血液細胞サンプルにおける異常性の診断のための方法が提供され、個々の細胞に基づいて回収された、又は実験源からのデータが、個人の細胞に基づいて標準サンプルから回収されたデータと比較される。本発明の改良された方法から入手できるデータが、標準サンプルと比較できる多くの個人血液サンプルを計算するパターン及び方法を提供することが、上記に付与される記載から明白であろう。この比較は、広範囲の臨床的診断のための基礎を提供する。特に、連続グラジエントのオスモル濃度に対する測定を行なうことによって得られるパターン又は輪隔地図が、多量の診断情報及びそのようなデータの要約を付与することができるパターンを提供する。
異なった時間の間隔で実施される測定により得られるデータの使用にまた、注意が引かれる。そのような時間の間隔で細胞集団を調べ、そして起こるパターンの変化に注目することによって、一層価値ある診断情報が当業者により得られる。再び、多量の研究が、このパターンでの特定の変更を同定し、そしてそれと臨床学的状態とを関連づけるために実施される必要がある。しかしながら、パターンのこの経時的変動の存在が、有意な診断手段であることがわかっているであろうことは明白である。
本発明の方法は、医学において、たとえば疾病の存在を検出するために、又は疾病状態の軽減及び予後を評価するために臨床学的診断において、又は貯蔵された血液の状態を評価するために血液バンクにおいて使用され得る。本発明はまた、獣医においても価値を有するであろう。再び、多くの研究が、このパターンでの特定の変化を同定し、そしてそれと臨床学的状態とを関連づけるために実施される必要がある。しかしながら、パターンのこの経時的変動の存在が、有意な診断手段であることがわかっているであろうことは明白である。
本発明の方法は、医学において、たとえば疾病の存在を検出するために、又は疾病状態の軽減及び予後を評価するために臨床学的診断において、又は貯蔵された血液の状態を評価するために血液バンクにおいて使用され得る。本発明はまた、診断のために獣医学において、及び分類学への案内として動物学においても価値を有するであろう。
本発明は、細胞が既存の方法により検出できる著しい変化を示すよりはるかに前に、赤血球細胞形態の微妙な変化、そして特に、細胞形状の変化を検出することができる利点を有する。たとえば、定量化され得ないが、しかし通常、光顕微鏡により検出され得る赤血球細胞の厚さの著しい変化が、本発明の方法を用いて定量化され得る。赤血球細胞の厚さのさらなる小さな変化は、既存の方法により検出、又は定量化され得ないが、しかし本発明の方法を用いれば、検出され、そして定量化され得る。
本発明は、薄い細胞及び特に下記に関する多くの状態の臨床学的診断において有用であることが示された：
薄い細胞又は的状赤血球（leptocytes）
１．遺伝性ストマトサイト増加症
２．地中海ストマトサイト増加症
３．低温水増加症（cryohydrocytosis）
４．アデニンデアミナーゼ機能亢進
５．閉塞性肝疾患
６．Rh null血液型群
本発明は、次のものの１つの徴候であり得る、サンプル中の球状赤血球細胞（すなわち、正常よりも球形の形状を有する細胞）の臨床学的診断において有用であることが示されている：
１．ABO溶血性疾病
２．遺伝性球状赤血球症
３．免疫溶血性貧血（Coombs陽性）
４．輸血反応
５．クロストリジア（Clostridia）感染
６．熱傷
７．ヘビ、クモ又はハチからの毒物
８．低リン酸血症
９．脾機能亢進症
10．妊娠
この列挙は、その変化が定量化され得、そして微妙な変化が疾病に関連していれば、ひじょうに高められる本発明の臨床学的価値の徴候を与える。細胞の厚さ又は薄さの程度を測定する能力は、疾病の進行の研究、及び特に初期段階での処理の価値の評価の可能性を与える。
本発明の方法により同定できる他のパラメーターは、他の種を同定するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付図面により詳細に説明されるであろう。
詳細な説明
図１は、血液細胞をサンプリングし、そして試験するために使用される装置を図示し；
図２は、図１の装置のグラジエント発生器部分の液体供給注入器からの流体の排出のための速度プロフィールを示し；
図３は、図１の装置に使用されるデータ処理段階を示すブロック図を示し；
図４は、本発明に従って分析される血液サンプル中の細胞についての測定された電圧に対するオスモル濃度の三次元プロットの例を示し；
図５は、一定間隔で血液細胞の度数分布を示す、測定された電圧に対するオスモル濃度の三次元プロットのもう１つの例を示し；
図６は、一時間の間隔で試験されたサンプルについての一連の三次元プロットを示し；
図７及び８は、日常の装置校正の一部としての球状ラテックス粒子についての結果を示し；
図９は、それぞれ、測定された電圧及び真の体積に対するオスモル濃度（Ｘ軸）の重ねプロットを示し；
図10ａ〜10ｄは、健康な個人の試験からの結果を示し；
図11は、図10ａ〜10ｄに示される結果のPrice - Jones曲線を示し；そして
図12は、異常な個人についての三次元度数分布プロット及び細胞パラメーターを示す。
図１は、本発明の方法に使用するための血液サンプラーの配置を図示する。その血液サンプラーは、サンプル調製部分１、グラジエント発生器部分２及びセンサー部分３を含んで成る。
サンプル容器５に含まれる全血サンプル４は、サンプルプローブ６のためのサンプル溜めとして作用する。サンプルプローブ６は、PTFE流体ライン26にそって、複数位置分配弁８及び複数位置分配弁９を通して希釈器ポンプ７に連結される。希釈器ポンプ７は、複数位置分配弁９の＃１口を通して溜め（示されていない）から塩溶液を抜き取る。下記で詳細に説明されるように、希釈器ポンプ７は、塩溶液の容量と共に、血液のサンプルを、サンプリング工程における第１の希釈段階の一部として、第１ウェル10に排出するよう調節される。
第２の希釈段階においては、希釈器ポンプ７は、複数位置分配弁11を通して第１ウェル10から血液の希釈サンプルを、PTFE流体ライン12中に抜き取り、そして塩溶液の追加の容量と共にこのサンプルを第２ウェル13中に排出する。第２ウェル13は、下記に詳細に説明されるグラジエント発生器部分２のための希釈サンプル源を供給する。
全血液を用いる代わりに、サンプル容器15中の血液14の予備希釈されたサンプルが使用され得る。この場合、サンプルプローブ16は、PTFA流体ライン30、複数位置分配弁11、PTFE流体ライン12及び複数位置分配弁９を通して、希釈器ポンプ７に連結される。第２の希釈段階においては、希釈器ポンプ７は、予備希釈されたサンプル14の容量を、サンプル容器15から、流体ライン30及び複数位置分配弁11を通して、流体ライン12中に抜き取り、そして塩溶液の追加の容量と共に、第２ウェル13中に前記サンプルを排出し、グラジエント発生器部分２のための希釈サンプル源を提供する。
グラジエント発生器部分２は、複数位置分配弁18を通して供給物から水を抜き取り、そしてPTFE流体ライン20にそって混合チャンバー19に水を排出する第１流体供給注入器17を含んで成る。グラジエント発生器部分12はまた、複数位置分配弁22を通してサンプル調製部分１における第２ウェル13から希釈された血液サンプルを抜き取り、そしてそれをPTFE流体ライン23にそって混合チャンバー19に排出する（ここで、それは、第１流体供給注入器17からの水と共に混合される）第２流体供給注入器21を含んで成る。下記で詳細に説明されるであろうように、第１流体供給注入器17からの水の排出の速度及び第２流体供給注入器21から混合チャンバーへの希釈血液サンプルの排出の速度は、PTFE流体ライン24にそって混合チャンバー19を出るサンプル懸濁液の予定された濃度プロフィールを生成するために調節される。流体ライン24は、典型的には、３ｍまでの長さである。適切なグラジエント発生器は、この日また出願された本出願人の同時継続国際出願（代理人の参照番号62／2684／03）に詳細に記載される。
下記において詳細にまた説明されるように、サンプル懸濁液は、流体ライン24にそって混合チャンバー19を出、そしてセンサー部分３に入り、ここでそれは、サンプルが多くの廃棄物出口を通して捨てられる前、サンプル懸濁液中の個々の細胞を検出する検出領域25を通過する。
通常の試験においては、全システムは、塩溶液によりまず、フラッシュされ、そしてプライムされ、装置が清浄され、空気ポケット及び残骸物が除去され、そしてキャリーオーバーが減じられる。
希釈器ポンプ７は、ステッパーモーター（示されていない）により駆動される流体供給注入器を含んで成り、そして典型的には、複数位置分配弁９の口＃１を通して塩溶液溜め（示されていない）から注入器本体中に５〜10mlの塩溶液を抜き取るよう初期において配置されている。適切な流体供給注入器及びステッパーモーターの配置は、この日にまた、出願された本出願人の同時継続出願（代理人の参照番号80／4936／01）に詳細に記載されている。次に、複数位置分配弁９の口＃１が閉じられ、そして複数位置分配弁９及び８の両者の口＃０が開口される。典型的には、次に、完全な血液100μｌが、サンプル容器５から抜き取られ、流体ライン26におけるデッド空間が取られる。次に、複数位置分配弁８の口＃０が閉じられ、そして流体ライン27中に抜き取られた完全な血液サンプル４からのいづれかの血液が希釈器ポンプ７により、複数位置分配弁８の口＃１を通して廃棄物に排出される。
第１の希釈段階においては、複数位置分配弁８の口＃０が開口され、そして希釈器ポンプ７が既知体積、典型的には１〜20μｌの完全な血液をPTFE流体ライン27中に抜き取る。次に、口＃０が閉じられ、口＃２が開口され、そして希釈器ポンプ７が、流体ライン27における既知体積、典型的には0.1〜２mlの塩溶液と共に、流体ライン27における血液サンプルを、第１ウェル10中に排出する。次に、複数位置分配弁８の口＃２及び複数位置分配弁９の口＃０が閉じられる。
これに続いて、複数位置分配弁11の口＃０及び複数位置分配弁９の口＃３が開口され、第１ウェル10に保持される第１サンプル希釈溶液の希釈器ポンプ７での抜き取りを可能にされ、PTFE流体ライン28におけるデッド空間が取られる。次に、複数位置分配弁11の口＃０が閉じられ、そして口＃１が開口され、流体ライン12中に抜き取られた第１サンプル希釈液のいづれかの口＃１を通して廃棄物への排出が希釈器ポンプ７により可能にされる。
第２希釈段階においては、複数位置分配弁11の口＃０が再開口され、そして希釈器ポンプ７が既知体積、典型的には１〜20μｌの第１サンプル希釈溶液を流体ライン12中抜き取る。流体ライン12は、希釈器ポンプ７を汚染するサンプルを防止するために、溜めを供給する遅延コイル29を包含する。次に、複数位置分配弁11の口＃０が閉じられ、口＃３が開口され、そして次に、希釈器ポンプ７が、既知体積、典型的には0.1〜20mlの塩溶液と共に、第２ウェル13中に、流体ライン12における第１サンプル希釈溶液を排出する。次に、複数位置分配弁11の口＃３が閉じられる。この段階で、完全な血液サンプルが、典型的には10000：１の割合に希釈されている。下記で説明されるであろうように、装置は、日常の試験の開始で、予定された許容度内に予定された細胞数を達成するために、サンプル懸濁液の希釈度を変えるよう第２希釈段階を調節するために自動的に配置される。
グラジエント発生器部分２においては、第１流体供給注入器17が、水溜めからの水によりプライムされる。複数位置分配弁22の口＃３が開口され、そして第２流体供給注入器が、注入器本体中に第２ウェル13から一定体積の希釈血液サンプルを抜き取る。次に、複数位置分配弁22の口＃３が閉じられ、そして複数位置分配弁８及び22の両者の口＃２が開口され、その後、混合チャンバー19中への水及び希釈血液サンプルの同時排出が調節される。
図２は、第１及び第２流体供給注入器の個々から排出される流体の速度が、流体ライン24にそって、混合チャンバー19を出るサンプル懸濁液の予定された連続グラジエントのオスモル濃度を達成するためにいかにして時間と共に変化するかを示す。サンプル懸濁液の流速は典型的には、測定が行なえながら、一定に維持される200μｌ／秒の範囲で存在する。この特徴は、本出願人の同時継続出願（代理人の参照番号62／2684／01）に詳細に記載される。図２に示されるように、流体供給注入器21を駆動するカムに関連するカムプロフィールは、速度Ｖ1でサンプルを排出するよう注入器プランジャーを加速し、同時に、流体供給注入器17を駆動するカムに関連するカムプロフィールは、より遅い速度Ｖ2で流体を排出するよう前記関連する注入器プランジャーを加速せしめる。個々の供給注入器からの一定の流速が時間Ｔ0で確立されるとすぐに、時間Ｔ1で、流体供給注入器21に関連するカムプロフィールが、期間Ｔ2−Ｔ1にわたって速度Ｖ2に直線的に減速するようサンプル排出の速度を引き起こし、同時に、流体供給注入器17に関連するカムプロフィールが速度Ｖ1に直線的に加速するよう流体排出の速度を引き起こす。この期間の間、２つの注入器の組合わされた流速は、約200μｌ／秒で実質的に一定して存続する。最終的に、２つの注入器は、期間Ｔ3−Ｔ2にわたってフラッシュされる。
第１流体供給注入器17及び第２流体供給注入器21の両者がそれらの内容物を排出したならすぐに、第１供給注入器は、次の試験のための調整において、水により再び満たされる。異なった対象からの血液サンプルが使用される場合、第２流体供給注入器21は、複数位置分配弁22の口＃１を通して塩溶液供給物からの塩溶液によりフラッシュされ、注入器の汚染された本体が清浄される。
混合チャンバー19を出るサンプル懸濁液は、流体ライン24にそってセンサー部分３に通過する。適切なセンサー部分は、この日にまた出願された本出願人の同時継続国際出願（代理人の参照番号62／2681／03）に詳細に記載されている。サンプル懸濁液は、そのサンプル懸濁液中の個々の細胞が通過すべきである開口に隣接して生成される電場を含んで成る検出領域25に通過する。サンプル懸濁液中の個々の血液細胞は、前記開口を通過するので、個々の細胞の電気的抵抗に対する電場の応答が電圧パルスとして記録される。特定の中断期間、典型的には0.2秒間、電圧パルスの合計数と共に、個々の電圧パルスの大きさはまた、同時に測定されるとすぐにサンプル懸濁液のオスモル濃度との比較を包含する続く分析のために記録され、そして貯蔵される。サンプル懸濁液のオスモル濃度はまた、グラジエント発生器部分２により生成される予定された連続浸透グラジエントの知識から、測定を伴わないで決定され得る。下記に記載されるように、オスモル濃度（圧力）は、細胞パラメーターを決定するために必要とされない。
図３は、データがいかにして収集され、そして処理されるかを示す。内部の個々の測定器は、その測定器内での特定の仕事を担当する専用ハードウェア又は低コストの固定されたコントローラー、たとえば操作用希釈器、弁、及びステッパーモーターにより、測定器を管理し、そして制御し、又はパルスをデジタル化し、そしてそれを緩衝器記憶に移行することを担当する主要マイクロプロセッサーである。その測定器を運転するソフトウェアは、Ｃ及びアセンブリーコードで書かれており、そして32Ｋの長さよりもわずかに短い。
サンプルが試験される場合、センサーにより生成される個々の電圧パルスの大きさ及び長さは、12−ビットの精度にデジタル化され、そして前記大きさの合計、前記長さの合計、及び試験されるパルスの数と共に、２つの16Ｋ緩衝器の１つに貯蔵される。測定器がセンサーのためのデータを収集している間、１つの緩衝器はデジタル化された値により満たされ、そして同時に、主要マイクロプロセッサーが完全な緩衝器を空にし、そして処理する。この処理は、所望しないパルスを濾過し、測定器の制御を変更するためにデータを分析し、そして最終的に、データが複合分析のためにパーソナルコンピューターに送られる前、そのデータを圧縮することから成る。
測定器により実施される任意の処理は、濾過を改良し、ピーク検出の精度を改良し、そしてパルスの形状及びサイズについての情報を提供するために、個々のセンサーパルスのデジタルシグナル処理を包含する。そのようなデジタルシグナル処理は、細胞当たり約25の16−ビット値を生成し、すなわち試験当たり約25メガビットのデータを生成する。
パーソナルコンピューターでのデータ処理は、Ｃ及びパスカルで書かれている特注400Ｋプログラムから成る。PCは、実時間でデータを表示し、そして分析し、使用者インターフェース（ウィンドウズ、メニューズ、等）を制御し、そして個々のサンプルを貯蔵し、そしてプリントする。
ソフトウェアはまた、試験されるあらゆるサンプルのデータベースを維持し、前に試験されたいづれかのサンプルとの急速な比較を可能にする。さらに、ソフトウェアは、機能障害及び誤差、たとえば低い流体レベル、システムのクラッシュ、又は測定器をつけることを忘れている使用者を検出するために測定器の操作をモニターする。
サンプル懸濁液が検出領域25の開口を通して通過するにつれて、その中の個々の細胞により生成される電圧パルスが、測定された電圧に対するオスモル濃度のプロットとしてPCのVDU上にグラフ形で表示される。サンプル懸濁液は、200μｌ／秒の速度でセンサー部分を通過する。第２希釈段階は、いづれかの試験の開始で測定される場合、１秒当たり約5000個の細胞の初期細胞計数を達成するよう調節され、その結果、0.20秒の継続期間において、約1000個の細胞が検出され、そして測定される。これは、第２希釈段階における流体ライン12から希釈器ポンプ７により排出される塩溶液の体積を自動的に変えることによって達成される。40秒の試験期間にわたって、合計200の中間期間が生じ、そしてこれは、いづれかの特定のオスモル濃度での測定された電圧の度数分布を示すために三次元形での連続曲線として表示され、この例は図４及び５に示されている。
個々の細胞に基づいて貯蔵され、そして回収された、測定細胞電圧が、その電圧変化を引き起こす溶液のオスモル濃度に対する電圧のプロット上に表示されることが示される。個々の細胞についての測定されたパラメーター変化を示すために個々のドットの使用は、表示をもたらし、それにより、電圧による及びそれによって、体積による細胞の分布が、オスモル濃度グラジエントにより包含される溶液の完全な範囲のために示される。完全な効果は、細胞がゆだねられた変更されたパラメーター、この場合、溶液のオスモル濃度に対する測定された電圧パルスの大きさ、及び特定のオスモル濃度にゆだねられた集団内の特定サイズの細胞の分布又は密度に関して、測定された性質変化として示される三次元表示である。その効果は、最大の強さの領域を示すために色彩を用いることによって増強され得る輪隔地図に類似する表示を生成することである。
十分なデータが広範囲の低浸透性溶液において溶血性ショックにゆだねられる細胞の特定集団における細胞サイズの分布に基づいて入手できる場合、溶解を引き起こす決定的なオスモル濃度よりも少々低いオスモル濃度で、集団におけるギャップが見える。図４に示されるように、ゴースト細胞は三次元プロットにおいて十分に見え、又は同定でき、そして破壊されていない細胞が明白に同定できるが、しかしそれらの間に、比較的少数の個体が現われる、オスモル濃度及び細胞体積により定義される領域が存在する。本発明者が“ゴーストギャップ”と称するこの現象の存在は、これまで認識されてはいない。
一連の全段階が、元のサンプルの追加のアリコートに対して一定時間の間隔で反復され、そして得られる測定された電圧がオスモル濃度、時間及び度数分布に対してプロットされる場合、天気図における変化にたとえられ得る四次元表示が得られる。この移動性三次元表示（その時間での移動が四次元である）は、特定の血液サンプルの特徴的な追加のパターンを提供する。これは、図６における一連の像に示される。図６に示される像は、37℃の温度で１時間間隔で実施された試験の結果である。測定値がひじょうに正確である場合、反復値は、コンピューター配列決定技法を用いて、重ねることができる。
示されたように、細胞は時間にわたってそれらの機能する能力をゆっくりと失なうが、しかしそれらはまた、予期しない手段で変化する。血液サンプルにおける細胞のサイズ及び形状は、複雑で、非線状であるが、しかし反復性の手段で変化し、数日間にわたって及び連続的な試験に基づいて、特徴的なパターンのいくつかを反復する。時間にわたって出現するパターンは、サンプル間で類似性を示し、そしてしばしば、特徴的な波形運動を示す。個人の健康に影響を及ぼす変化のパターンは、個人間で変化することができ、又はそのパターンはサンプル内で変化することができる。従って、最初に試験される場合、均質であるサンプルは、時間と共に変化する２つ又はいくつかの副集団に分離し、そしてそれらの存在は、サンプルを広範囲の異なった緊張性にゆだね、そして記載される手段で電圧パルスを記録することによって検出され得る。図６に示されるように、最初の数時間の後、細胞は元のサンプルにおいてますます球状になり、次に、それは数時間、平らになり、次に再びより球状になり、限界に達し、そして次に、より薄くなり、そして最終的に再び膨潤する。観察される変化が起こる割合は、pH、温度、利用できるエネルギー及び他の要因により影響される。
三次元パターンは、特定の細胞が、球状になる場合、それらの最大体積に達する正確なオスモル濃度の同定を可能にするデータを提供する。下記に詳細に記載される適切な校正により、及び電圧パルスの大きさを用いて、そのような細胞の正確な体積を精密且つ正確に定義し、そしてその後、臨床学的に興味ある多くの他の細胞パラメーターを誘導することが可能である。
個々の細胞が電場を通過するにつれてセンサー25により生成される電圧パルスの大きさは、個々の細胞の体積に比例する。しかしながら、転換が細胞体積の測定を付与するために実施され得る前、測定器は校正を必要とする。これは、既知の体積の球状ラテックス粒子を用い、そして従来の技法を用いて実施される細胞体積との比較により実施される。
実験結果は、市販のラテックス粒子の球状体積に対する測定された電圧の地図が線状関数であることを示した。従って、球状ラテックス粒子の単一サイズのみが、正しい転換係数を決定するために使用される必要がある。最初の校正段階においては、5.06μｍの直径、すなわち67.834ｍ3の体積を有する、Bangs Laboratories Inc.により製造されるラテックス粒子を含むサンプルが、測定器によりサンプリングされた。ラテックス粒子についての三次元プロットが、図８に示される平均電圧に対するオスモル濃度のプロットと共に、図７に示される。この特別な試験においては、測定器は、691.97mVの平均電圧を生成した。球状体積は、次の等式により与えられる：
球状体積＝測定された電圧×Ｋvolts
ここで、Ｋvoltsは電圧転換係数である。この等式の再配置は、下記式を付与し：
0004160117.tif 000003
そしてこの場合、次の値を付与する：
0004160117.tif 000004
Ｋvoltsのこの値は、試験される特定の測定器のために単に有効であり、そしてその測定器内の記憶に貯蔵される。
第２校正段階においては、形状修正係数が、平均的な個人における平均血液細胞が両凹形状を有する事実を考慮して決定される。上記電圧転換係数Ｋvoltsの適用は、ラテックス粒子のように、血液細胞が球状であることを仮定し、そして従って、球状以外の細胞形状について誤った細胞体積を付与するであろう。本発明においては、種々の形状修正機能が決定され、その結果、溶解を引き起こす決定的なオスモル濃度までのいづれかのオスモル濃度で血液細胞の平均体積が極端に正しく計算され得る。
これを示すために、サンプルが、多くの正確に知られているオスモル濃度で試験され、そして血液細胞の体積が、標準の参照方法、すなわち充填された細胞体積技法を用いて測定された。同じサンプルの一部がまた、図１の測定器を用いて本発明の方法により試験され、その対応するオスモル濃度で個々の細胞から電圧パルスが測定された。それらの方法の結果は、表１に示されており、そして図９において、それぞれ、測定された電圧及び真の体積に対するオスモル濃度（Ｘ−軸）の２つの重ねられたグラフとしてプロットされる。
290mosmの等張オスモル濃度で、充填された細胞体積技法により決定される場合、真の体積は92.0flであり、そして測定された平均電圧は670mVであった。
細胞の真の等張体積が、次の等式により付与される：
Volumeiso＝Voltageiso×Ｋvolts×Ｋshape
ここで、電圧isoは測定された電圧であり、そしてＫshapeは形状修正係数である。
再配置は次の式を付与し：
0004160117.tif 000005
そしてこの例においては、次の値を付与する：
0004160117.tif 000006
表１は、他のアリコートの個々についての形状修正係数Ｋshapeを示し、そして個々のサンプルに適用されるべきその因子は、異なり、そして最大形状修正が、血液細胞が球状よりもむしろ両凹状である場合、等張オスモル濃度で適用されることを示す。興味あるいづれかのオスモル濃度でのＫshapeの計算を自動化するために、形状修正関数が、必要とされる。次の一般的な関数が、いづれか２種のセンサー読取り、すなわち測定された電圧に基づいての形状修正係数を記載する：
ｆ（Ｋshape）＝ｆ（SR１，SR２），
ここで、SR１は、既知の形状、典型的には球状でのセンサー読取り（測定された電圧）であり、そしてSR２は興味あるオスモル濃度、典型的には等張でのセンサー読取りである。
分析は、これが一次関数であり、そして下記の通りであることを示した：
0004160117.tif 000007
ここで、Kaは、次の通りにして決定される装置依存定数である：
290mosmのオスモル濃度でのＫshapeは知られており（上記を参照のこと）、そして上記等式に、値SR１＝1432mV，SR２＝670mV及びＫshape＝1.4を適用すると、下記のようになり：
0004160117.tif 000008
従って、その再配置は、Ka＝0.7518を付与する。
このKa値は、この測定器のための定数である。
血液サンプルの真の等張体積が、いくらかの既知の又は同定できる形状で同じ血液サンプル中の細胞、最とも便利には、球状の形状を採用している細胞の測定された電圧と、興味ある等張体積での測定された電圧とを比較することによって、下記等式により決定される：
0004160117.tif 000009
本発明においては、血液細胞が、予定された連続した浸透グラジエントにゆだねられる場合、球状になる点が、ひじょうに正確に決定され得る。図10ａ〜10ｄは、健康な個人からの正常な血液サンプルについての結果を示す。図10ａはオスモル濃度に対する測定された電圧の三次元プロットを示し、図10ｂは一連のサンプルの試験についての測定された電圧の％変化率に対するオスモル濃度のグラフを示し、図10ｃは表化された形での結果を示し、そして図10ｄはオスモル濃度に対する、それぞれ試験のための平均電圧及び細胞数の重ねられたグラフを示す。示されるように、試験の開始で、初めに5000個の細胞／秒である細胞数が、グラジエント発生器部分２におけるサンプルの希釈溶液のために試験を通して低下する。平均電圧は、血液細胞が球状の形状に達する臨界オスモル濃度で最大まで上昇し、そして次に、低下する。標準の統計学的技法を用いて、図10ｂにおける曲線の最大点、及び従って、その最大点での平均電圧が決定され得る。この点での平均電圧が、上記等式のためのSR１値を提供する。次に、興味あるいづれかのオスモル濃度及び関連する測定された電圧SR２を選択し、そしてそのオスモル濃度での細胞の真の体積を計算することが可能である。典型的には、数290mosmに相当する等張オスモル濃度が選択される。
上記試験に関しては、290mosmで、SR１は1432mVであり、そしてSR２は670mVである。従って、下記の通りである：
0004160117.tif 000010
球状化された細胞の平均体積の知識は、下記のようにして球半径の計算を可能にし：
0004160117.tif 000011
これから、球半径は次の通りである：
0004160117.tif 000012
決定されたVolumeiso，Volumeshp及び球状細胞半径を有すれば、次の多くの他のパラメーターを計算することが可能である：
１．表面積（SA）
表面積SAはすべてのオスモル濃度で実質的に変化しないので、細胞膜は実質的に非弾性であり、そして特に、球状と等張との間で、表面積SAは、下記式にγを置換することによって計算され得る：
SA＝４πγ2
＝４π×（3.22）2
＝130.29μｍ2
２．体積に対する表面積の比（SAVR）
赤血球細胞の壁がそれらの面積を変更しないで変形される場合、表面積SAがいづれか特定の形状の細胞又は細胞の組に関して知られるなら、その表面積がいづれか他の形状に関して知られ、従って、体積に対する表面積の比SAVRが、いづれかの体積に関して計算され得る。SAVRは下記式により与えられる：
0004160117.tif 000013
３．球形度指数（SI）
本発明は、SAVR、すなわち広く引用されているが、しかしこれまでめったに測定されていない細胞形状の表示を容易に測定することができる。球状細胞に関しては、それは３／γの値を有するが、しかし同じ形状であるが、しかし異なったサイズの細胞は異なったSAVR値を有することができるので、細胞サイズに無関係な寸法のない単位である球形度指数SIを使用することが所望され、ここで前記SIは、下記式により与えられる：
0004160117.tif 000014
４．細胞の直径（Ｄ）
正常な細胞が等張オスモル濃度で両凹ディスク形で存在する場合、両凹ディスクの半径に対する球形の半径の比が0.8155であることが知られている。従って、これに基づけば、両凹ディスク形での細胞の直径Ｄは、次の式により付与される：
0004160117.tif 000015
同じパラメーターが、すべての他のオスモル濃度のために決定され得る。細胞直径の度数分布は、分散統計学及び度数分布プロットとして与えられる。本発明は、Price - Jones曲線として知られている等張細胞直径の度数分布のプロット化の既知主導方法の自動化されたバージョンを提供する。本発明は、いづれかの形状の細胞及び特に、等張で球状のゴースト細胞についての細胞直径のPrice - Jones曲線を生成することができ、そして典型的には、250,000個の細胞に基づかれている。これは図10に示される。
５．細胞の厚さ（CT）
細胞が両凹ディスクの形で存在する場合、細胞の厚さのおおよその測定値は、断面積及び体積に由来することができる。前記断面積はまた、もちろん、球状形での細胞の半径から誘導することができる。
従って、細胞の厚さは、次のようにして計算され得る：
0004160117.tif 000016
６．表面積／ml（SAml）
表面積（SA）及び細胞数（RBC）の積が、生理学的交換のために利用できる表面積／ml（SAml）である。典型的には、健康な成人男性は、1,000,000mm2／ml又は１ｍ2／mlの値を有する。体液の酸−塩基調節を担当する近位腎管の合計表面積は、５ｍ2である。また、酸−塩基バランスの調節において重要な役割を演じる赤血球細胞の合計表面積は、4572ｍ2であり、ほとんど３の大きさの程度大きい。RBCが、希釈された血液サンプルの流速、個々のサンプルについての細胞数、及び元の完全な血液の希釈溶液の知識から内部的に計算される。典型的には、RBCは、約4.29×109個の赤血球細胞／mlである。
SAml＝SA×RBC（ml当たり）
＝130.29μｍ2×4.29×109／ml
＝0.56ｍ2／ml
上記パラメーターは、図10ｂにおける電圧の％変化率に対するオスモル濃度の特徴的な曲線と共に計算され、そして表示される。
図12は、HbCC疾病を有する患者からのサンプルの三次元度数分布を示す。示されるように、そのプロットは、ひじょうに異常である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｄ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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