(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸管における上皮細胞の細胞保護作用、増殖、および／または分化を増大させるための組成物であって、
ＫＧＦタンパク質産物および
ＧＬＰ−２産物
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＫＧＦタンパク質産物が、Ｃ（１，１５）Ｓ（配列番号４）、ΔＮ１５（配列番号１４）、ΔＮ１６（配列番号１６）、ΔＮ１７（配列番号１８）、ΔＮ１８（配列番号２０）、ΔＮ１９（配列番号２２）、ΔＮ２０（配列番号２４）、ΔＮ２１（配列番号２６）、ΔＮ２２（配列番号２８）、ΔＮ２３（配列番号３０）、ΔＮ２４（配列番号３２）、ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ（配列番号６）、ΔＮ３／Ｃ（１５）−（配列番号８）、ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ（配列番号１０）、ΔＮ８／Ｃ（１５）−（配列番号１２）、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ（配列番号３４）、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ（配列番号３６）、およびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ（配列番号３８）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＧＬＰ−２産物およびＫＧＦ−２タンパク質産物が、粘膜炎を処置するのに予防的に有効な量で存在することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−２産物が、ヒトＧＬＰ−２（配列番号６７）、ｈＧＬＰ−２（Ｇ２）（配列番号６８）、およびｈＧＬＰ−２（Ｓ２）（配列番号６９）からなる群より選択される、請求項１または３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ケラチノサイト増殖因子およびその使用に関する。
発明の背景
組織生成および再生の複雑なプロセスは、時に軟組織増殖因子として呼ばれる多くのタンパク質因子によって媒介される。これらの分子は、一般に１つの細胞型によって放出され、そして他の細胞型の増殖に影響を及ぼすように作用する（Rubinら、（1989）、Proc. Nat’l.Acad. Sci. USA, 86: 802-806）。それら自体が、そのような増殖因子に応答する能力を有する細胞から放出されるいくつかの増殖因子もまた存在する。いくつかの軟組織増殖因子は、特定の細胞型によって分泌され、そして多細胞生物の発生における応答性細胞の増殖、分化、および／または成熟に影響を及ぼす（Finchら、（1989）, Science, 245: 752-755）。発生している生物におけるそれらの役割に加えて、いくつかの軟組織増殖因子は、連続性の健常、およびより成熟な系の維持において重要である。例えば、哺乳動物において、急速な細胞ターンオーバーが起こる多くの系が存在する。そのような系は、皮膚および胃腸管を含み、その両方は、上皮細胞から構成される。線維芽細胞増殖因子（FGF）のタンパク質ファミリーは、この軟組織増殖因子の群内に含まれる。
線維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーは、現在、少なくとも14のメンバー（すなわち、FGF-1〜FGF-10および相同な因子FHF-1〜FHF-4）からなることが公知であり、これらは、一次構造において関連性を共有する：塩基性線維芽細胞増殖因子、bFGF（Abrahamら、（1986）、EMBO J., 5: 2523-2528）；酸性線維芽細胞増殖因子、aFGF（Jayeら、（1986）、Science, 233: 541-545）；int-2遺伝子産物、int-2（DicksonおよびPeters（1987）, Nature, 326: 833）；hst/kFGF（Delli-Boviら、（1987）, Cell, 50: 729-737およびYoshidaら、（1987）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7305-7309）；FGF-5（Zhanら、（1988）, Mol. Cell. Biol., 8: 3487-3495）; FGF-6（Maricsら、（1989）,Oncogene, 4: 335-340）; ケラチノサイト増殖因子KGF（Finchら、（1989）, Science, 24: 752-755）; ヒサクトフィリン（hisactophilin）（Habazzettlら、（1992）, Nature, 359: 855-858）; FGF-9（Miyamotoら、（1993）, Mol. Cell Biol., 13（7）: 4251-4259）; およびケラチノサイト増殖因子-2 KGF-2としてもまた公知の（WO 96/25422）線維芽増殖因子-10。より最近では、４つの相同因子（すなわち「FHF」）は、ランダムなcDNA配列決定、存在する配列データベースの探索、および相同性に基づくポリメラーゼ連鎖反応の組み合わせによって、ヒト網膜から単離された（Smallwoodら、（1996）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9850-9857）。FHF-1、FHF-2、FHF-3、およびFHF-4は、Nomenclature Committeeの推奨に従って、それぞれFGF-11、FGF-12、FGF-13、およびFGF-14と命名されるべきであると提案されている（Coulierら、（1997）, Journal of Molecular Evolution, 44: 43-56）。
ケラチノサイト増殖因子およびその使用方法を提供することが、本発明の目的である。
発明の要旨
本発明は、KGFタンパク質産物に関する。これらのKGFタンパク質産物は、一般的な適応性を有し、そしてKGFの生物学的活性のいくらかまたは全てを維持し得る。
なお別の局面は、上皮細胞の増殖および分化を調節する方法に関する。詳細には、上皮細胞の刺激（細胞保護作用、増殖、および／または分化を含む）を必要とする患者は、治療的に有効または予防的に有効な量のKGFタンパク質産物を投与される。
本発明のさらなる局面および利点は、本発明の実施を詳述する以下の説明の考慮に基づいて、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
本発明の多数の局面および利点は、図面の再検討に基づいて明らかになる、ここで：
図１は、KGFのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示し（成熟KGFの成熟形態をコードするヌクレオチドは、配列番号１の塩基96〜582によって示され、そしてKGFの成熟形態は、配列番号２のアミノ酸残基32〜194によって示される）、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図２は、C（1,15）S（KGFのアミノ酸１位および15位でシステインからセリンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図３は、ΔN3/C（15）S（KGFのアミノ末端の最初の３アミノ酸の欠失およびアミノ酸15位でシステインからセリンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図４は、ΔN3/C（15）-（KGFのアミノ末端の最初の３アミノ酸の欠失およびアミノ酸15位でシステインの欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図５は、ΔN8/C（15）S（KGFのアミノ末端の最初の８アミノ酸の欠失およびアミノ酸15位でシステインからセリンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号10）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図６は、ΔN8/C（15）-（KGFのアミノ末端の最初の８アミノ酸の欠失およびアミノ酸15位でシステインの欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号11）およびアミノ酸配列（配列番号12）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図７は、ΔN15（KGFのアミノ末端の最初の15アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号13）およびアミノ酸配列（配列番号14）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図８は、ΔN16（KGFのアミノ末端の最初の16アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号15）およびアミノ酸配列（配列番号16）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図９は、ΔN17（KGFのアミノ末端の最初の17アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号17）およびアミノ酸配列（配列番号18）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図10は、ΔN18（KGFのアミノ末端の最初の18アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号19）およびアミノ酸配列（配列番号20）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図11は、ΔN19（KGFのアミノ末端の最初の19アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号21）およびアミノ酸配列（配列番号22）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図12は、ΔN20（KGFのアミノ末端の最初の20アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号23）およびアミノ酸配列（配列番号24）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図13は、ΔN21（KGFのアミノ末端の最初の21アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号25）およびアミノ酸配列（配列番号26）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図14は、ΔN22（KGFのアミノ末端の最初の22アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号27）およびアミノ酸配列（配列番号28）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図15は、ΔN23（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号29）およびアミノ酸配列（配列番号30）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図16は、ΔN24（KGFのアミノ末端の最初の24アミノ酸の欠失を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号31）およびアミノ酸配列（配列番号32）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図17は、C（1,15）S/R（144）E（KGFのアミノ酸１位および15位でシステインからセリンへの置換、およびアミノ酸144位でアルギニンからグルタミン酸への置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号33）およびアミノ酸配列（配列番号34）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図18は、C（1,15）S/R（144）Q（KGFのアミノ酸１位および15位でシステインからセリンへの置換、およびアミノ酸144位でアルギニンからグルタミンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号35）およびアミノ酸配列（配列番号36）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図19は、ΔN23/R（144）Q（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸144位でアルギニンからグルタミンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号37）およびアミノ酸配列（配列番号38）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図20は、C（1,15,40）S（KGFのアミノ酸１位、15位および40位でシステインからセリンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号39）およびアミノ酸配列（配列番号40）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図21は、C（1,15,102）S（KGFのアミノ酸１位、15位および102位でシステインからセリンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号41）およびアミノ酸配列（配列番号42）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図22は、C（1,15,102,106）S（KGFのアミノ酸１位、15位、102位および106位でシステインからセリンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号43）およびアミノ酸配列（配列番号44）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図23は、ΔN23/N（137）E（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸137位でアスパラギンからグルタミン酸への置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号45）およびアミノ酸配列（配列番号46）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図24は、ΔN23/K（139）E（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸139位でリジンからグルタミン酸への置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号47）およびアミノ酸配列（配列番号48）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図25は、ΔN23/K（139）Q（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸139位でリジンからグルタミンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号49）およびアミノ酸配列（配列番号50）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図26は、ΔN23/R（144）A（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸144位でアルギニンからアラニンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号51）およびアミノ酸配列（配列番号52）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図27は、ΔN23/R（144）E（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸144位でアルギニンからグルタミン酸の置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号53）およびアミノ酸配列（配列番号54）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図28は、ΔN23/R（144）L（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸144位でアルギニンからロイシンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号55）およびアミノ酸配列（配列番号56）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図29は、ΔN23/K（147）E（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸147位でリジンからグルタミン酸への置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号57）およびアミノ酸配列（配列番号58）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図30は、ΔN23/K（147）Q（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸147位でリジンからグルタミンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号59）およびアミノ酸配列（配列番号60）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図31は、ΔN23/K（153）E（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸153位でリジンからグルタミン酸への置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号61）およびアミノ酸配列（配列番号62）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図32は、ΔN23/K（153）Q（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸153位でリジンからグルタミンへの置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号63）およびアミノ酸配列（配列番号64）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
図33は、ΔN23/Q（152）E/K（153）E（KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失、およびアミノ酸152位でグルタミンからグルタミン酸、およびKGFのアミノ酸153位でリジンからグルタミン酸への置換を有するKGFアナログ）のヌクレオチド配列（配列番号65）およびアミノ酸（配列番号66）を示し、最初のアミノ酸はMnであり、ここでｎは０または１に等しい。
発明の詳細な説明
KGFタンパク質
本発明に従って、用語「KGFタンパク質」は、配列番号２のアミノ酸Cys32〜Thr194（成熟KGF）およびその改変タンパク質により規定されるタンパク質を意味する。（他に示さない限り、本明細書中に記載される分子についてのアミノ酸の番号付けは、配列番号２のアミノ酸32〜194によって示されるような、分子の成熟形態について示されるものに対応する（すなわち、シグナル配列を引く）（そのような配列の各々の最初のMETは、残基番号「０」である）。）
従って、用語「KGFタンパク質」は、１つ以上のアミノ酸残基が、配列番号２のアミノ酸配列内の残基から欠失されている（「欠失改変体」）か、配列番号２のアミノ酸配列内の残基に挿入されている（「付加改変体」）か、および／または配列番号２のアミノ酸配列内の残基を置換しており（「置換改変体」）、そして生物学的活性を保持するタンパク質を含む。
最終のタンパク質が生物学的に活性である限り、欠失、挿入、および置換（個別にまたは集団的に「改変体」）の多くの組合せがなされ得ることが当業者に理解される。本明細書中で使用される用語「生物学的活性」は、KGFタンパク質が、必ずしも全てではないが幾分、KGFの同じ（KGFと必ずしも同程度ではない）特性を有することを意味する。目的の特定の特性の選択は、所望のKGFタンパク質の所望の使用に依存する。
アミノ酸配列改変体の構築における２つの主要な改変が存在する：変異部位の位置および変異の性質。各改変体を設計する際に、各変異部位の位置および各変異の性質は、改変されるべき生化学的特徴に依存する。各変異部位は、個々にまたは連続して改変され得る。例えば、（１）標的アミノ酸残基を欠失させること、（２）配置部位に隣接する１つ以上のアミノ酸残基を挿入すること、または（３）保存的アミノ酸選択でまず置換することによる。そして、達成される結果に依存して、より極端な選択で改変する。
アミノ酸配列欠失は、一般に、約１〜30アミノ酸残基、好ましくは約１〜20アミノ酸、より好ましくは約１〜10アミノ酸残基、および最も好ましくは約１〜５残基に及ぶ。アミノ末端、カルボキシ末端、および内部配列内欠失が意図される。例えば、FGFファミリーの他のメンバーの配列との低い相同性の領域において、KGFのアミノ酸配列内の欠失が作製され得る。FGFファミリーの他のメンバーの配列との実質的な相同性の領域におけるKGFのアミノ酸配列内の欠失は、生物学的活性を有意に改変する可能性がより高い。全欠失および／または連続的欠失の数は、好ましくは、影響されるドメインにおけるKGFの三次構造（例えば、システイン架橋）を保存するように選択される。
アミノ酸配列付加は、１残基〜100以上の残基の長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合の挿入、ならびに単一または複数アミノ酸残基の内部配列内挿入を含み得る。内部付加は、一般的には、約１〜20アミノ酸残基、好ましくは、約１〜10アミノ酸残基、より好ましくは約１〜５アミノ酸残基、そして最も好ましくは約１〜３アミノ酸残基に及び得る。KGFのアミノ酸配列内の付加は、FGFファミリーの他のメンバーの配列との低い相同性の領域において作製され得る。FGFファミリーの他のメンバーの配列との実質的に相同性の領域におけるKGFのアミノ酸配列内の付加は、生物学的活性を有意に改変する可能性がより高い。挿入または付加は、好ましくは、他のFGFファミリーメンバーの配列に由来するアミノ酸配列を含む。
アミノ末端付加は、メチオニン付加（例えば、細菌性組換え細胞培養における直接発現の人工産物として）またはアミノ酸残基もしくはKGFの配列の付加を含むことが意図される。アミノ末端付加のさらなる例は、組換え宿主細胞からのタンパク質の分泌を容易にするためのKGFのアミノ末端へのシグナル配列の融合を含む。このようなシグナル配列は、一般に、意図される宿主細胞種から得られ、従ってその種に相同である。未変性シグナル配列を認識も、プロセシングもしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ配列、ペニシリナーゼ配列または熱安定性エンテロトキシンIIリーダー配列の群から選択される原核生物シグナル配列に置換され得る。酵母細胞における発現について、各ポリペプチドは、例えば、酵母インバターゼ、α因子または酸ホスファターゼリーダー配列の群から選択されるシグナル配列を有し得る。哺乳動物細胞発現において、詳細には、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得、例えば、他のFGFファミリーメンバーに由来する配列が適切であり得るが、KGFのシグナル配列が申し分ない。
アミノまたはカルボキシ末端付加の例には、ヒトイムノグロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインの全部または部分との、KGFタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端融合を含むキメラタンパク質（個別または集合的に、「KGF Fc」）が挙げられる。このようなキメラポリペプチドは、各々のイムノグロブリン部分が、ヒトイムノグロブリン（例えば、IgG（例えばIgG1もしくはIgG3）、IgA、IgM、またはIgE）の重鎖の定常領域の第一ドメインを除く全てのドメインを含む場合に好ましい。当業者は、イムノグロブリン部分の任意のアミノ酸が欠失され得るか、または１つ以上のアミノ酸によって置換され得るか、あるいは１つ以上のアミノ酸がKGFタンパク質部分が上皮細胞を刺激し得、そしてイムノグロブリン部分が１つ以上のその特徴的特性を示す限り、付加され得ることを理解する。
改変体の別の群は、KGFのアミノ酸配列のアミノ酸置換改変体である。これらは、KGFにおける少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして異なる残基がその位置に挿入される改変体である。置換改変体は、対立遺伝子変異体を含み、これは、種の集団における天然に存在するヌクレオチド配列変化によって特徴づけられ、これは、アミノ酸変化を生じるかまたは生じなくてもよい。当業者は、可能な変異部位の選択におけるポリペプチドの結合部位または活性部位について、公知の任意の情報を使用し得る。
タンパク質の変異誘発についてのアミノ酸残基または領域を同定するための１つの方法は、CunninghamおよびWells（1989）、Science、244:1081-1085（この開示は本明細書中で参考として援用される）に記載されるような「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法において、タンパク質のアミノ酸残基または標的残基の群が同定され（例えば、Arg、Asp、His、Lys、およびGluのような荷電残基）、そして中性のまたは陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、アミノ酸と細胞内または外側をとりまく水性環境との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対して機能的な感受性を示すこれらのドメイン／残基は、置換の部位におけるさらなる残基または代替残基を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列改変を導入するための部位は、予め決定される。所定の部位での変異の能力を最適化するために、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発が行われ得、そして改変体は、所望の活性および活性の程度の最適の組合せについて、スクリーニングされ得る。
置換変異誘発についての最も興味深い部位は、KGF内の特定の残基が、側鎖のかさ（bulk）、電荷、および／または疎水性に関して、種々の種または他のFGFファミリーメンバーとは実質的に異なっている部位を含む。興味深い他の部位は、KGF内の特定の残基が、種々の種のまたは他のFGFファミリーメンバーの間で同一である部位を含む。なぜなら、このような位置は、一般に、タンパク質の生物学的な活性に重要であるからである。当業者は、これらの部位は当初は比較的保存された様式で置換によって改変されるべき部位であることを理解する。
このような保存的置換は表１において「好ましい置換」というタイトルで示される。このような置換が生物学的活性変化を生じる場合、より実質的な変化（置換例）が導入され得るか、そして／または他の付加／欠失がなされ得、そして得られるポリペプチドがスクリーニングされ得る。
0004091988.tif 000002
このような変化を作製する際に、アミノ酸の親水性疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を付与するのにおける親水性疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に、当該分野で理解される（KyteおよびDoolittle（1982）、J.Mol.Biol.,157:105-131。この開示は本明細書中で参考として援用される）。特定のアミノ酸が同様の親水性疎水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、そしてなお、同様の生物学的活性を保持し得ることは公知である。
類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効に（特に、本発明の場合のように、それによって作製された機能的等価体タンパク質またはペプチドが、免疫学的実施態様における使用のために意図される場合）なされ得ることも当該分野において理解される。米国特許第4,554,101号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質の最大の局所平均親水性が、その隣接のアミノ酸の親水性に支配される場合、その免疫原性および抗原性と、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関していると記載している。
米国特許第4,554,101号はまた、親水性に基づく一次アミノ酸配列由来のエピトープの同定および調製を教示する。米国特許第4,554,101号に開示された方法を通じて、当業者は、エピトープ（例えば、KGFのアミノ酸配列内のエピトープ）を同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と言及される。多くの科学文献は、アミノ酸配列の分析からの、二次構造の予想、およびエピトープの同定に集中している（ChouおよびFasman（1974）、Biochemistry、13（2）:222-245；ChouおよびFasman（1974）、Biochemstry 13（2）:211-222；ChouおよびFasman（1978）、Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.、47:45-148;ChouおよびFasman（1978）、Ann.Rev.Biochem.、47：251-276、ならびにChouおよびFasman（1979）、Biophys.J.、26：367-384、これらの開示は本明細書中で参考として援用される）。さらに、コンピュータープログラムは、現在、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域を予想することを補助するのに利用可能である。例には、Jameson-Wolf分析（JamesonおよびWolf（1988）、Comput.Appl.Biosci.、4（1）:181-186、ならびにWolfら（1988）、Comput.Appl.Biosci.、4（1）:187-191、これらの開示は本明細書中で参考として援用される）に基づくプログラム；プログラムPepPlot▲Ｒ▼（Brutlagら、（1990）、CABS、6:237-245およびWeinbergerら（1985）Science、228：740-742、これらの開示は本明細書中に参考として援用される）；ならびにタンパク質三次構造予測についての他のプログラム（FetrowおよびBryant（1993）、BIOTECHNOLOGY、11:479-483、この開示は本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。
対照的に、KGFの機能的および／または化学的特徴における実質的改変は、（a）置換の領域のポリペプチドバックボーンの構造（例えば、シートまたはらせん構造）、（b）標的部位におけるタンパク質の相対電荷または疎水性、または（c）側鎖の暈を維持することにおけるそれらの効果において有意に異なる置換を選択することによって達成され得る。天然に存在する残基は、一般の側鎖特性に基づく群に分割される：
１）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
２）中性親水性：Cys、Ser、Thr；
３）酸性：Asp、Glu；
４）塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
５）芳香族：Trp、Tyr、Phe；および
６）鎖の方向に影響する残基：Gly、Pro。
非保存的置換は、これらの群の１つのメンバーと他のメンバーの交換を含み得る。このような置換された残基は、例えば、ほかのFGFファミリーメンバーと相同であるKGFの領域に、またはそのタンパク質の非相同領域に導入され得る。
種々のアミノ酸置換または欠失は、N-結合またはO−結合グリコシル化部位を改変または付加するために作製され得、改変グリコシル化を伴うタンパク質を生じる。配列は、改変されて、グリコシル化部位を付加し得るか、またはKGFタンパク質からN-結合またはO-結合グリコシル化部位を欠失し得る。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、トリペプチド配列を含み、これは、適切な細胞グリコシル化酵素によって、特別に認識される。これらのトリペプチド配列は、Asn-Xaa-ThrまたはAsn-Xaa-Serのいずれかであり、ここで、Xaaは、Proとは異なる任意のアミノ酸である。KGFの配列の特定の変異は、N-結合グリコシル化部位を挿入するための、50位での非天然Asnおよび52位でのThrの置換を含む。このような改変は、炭化水素の付加において特に有用であり得、これは、凝集を減少し（熱および保存安定性を増加するため）、循環中の半減期を増加し、等電点を減少し、可溶性を増加し、そしてタンパク質の抗原性を減少し得る。
特定の実施態様において、改変体ポリペプチドは、好ましくは、KGFのアミノ酸配列（配列番号２）と実質的に相同である。本明細書中で用いられる用語「実質的に相同」は、80％を超えるか、好ましくは90％を超えるか、より好ましくは95％を超えるか、そして最も好ましくは99％を超える相同性の程度を意味する。本明細書中に記載される相同性の百分率は、Dayhoff（1972）（Atlas of Protein Sequence and Structure、5：124、National Biochemical Research Foundation、Washington、D.C.、この開示は本明細書によって参考として援用される）によって示されているように、その整列を補助するために100アミノ酸長について４ギャップが導入され得る場合に、比較される配列における同一のアミノ酸残基と整列する２つの配列のより小さな方に見い出されるアミノ酸残基の百分率として計算される。用語「実質的に相同」に含まれるのはまた、配列番号２のアミノ酸配列に対する抗体との交叉反応性によって単離され得るKGFの改変体、またはその遺伝子が配列番号１のDNAもしくはそのセグメントとのハイブリダイゼーションを通して単離され得る改変体である。
KGFタンパク質は、その物理的特性を評価するために迅速にスクリーニングされ得る。例えば、生物学的活性（例えば、レセプター結合および／または親和性、分裂促進活性、細胞増殖性、および／またはインビボ活性）のレベルは、種々のアッセイを用いて試験され得る。１つのこのようなアッセイは、DNA合成を刺激するタンパク質の能力を試験する分裂促進アッセイを含む（Rubinら、（1989）、前出、この開示は本明細書によって参考として援用される）。別のこのようなアッセイは、細胞増殖を刺激するタンパク質の能力を試験する細胞増殖アッセイを含む（Falcoら、（1988）、Oncogene、２：573-578、この開示は本明細書によって参考として援用される）。
KGFの特定の改変体は、WO 9008771、WO 9622369、WO 9611949、およびWO 9611951（この開示は本明細書によって参考として援用される）に開示される。KGFの１つの例としては、親分子と比較して、得られる分子が、改良された安定性を有するように、配列番号２のCys1およびCys15に対応する残基を置換または欠失されたタンパク質が挙げられる（WO 96/11949）。KGFの別の例としては、荷電ポリペプチドが挙げられ、ここで天然のKGFのアミノ酸残基41〜154の１つ以上（好ましくは、残基Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153、またはThr154）は、欠失されるか、または減少した正電荷を有するタンパク質をもたらすように選択された中性残基または負に荷電した残基と置換される（WO 96/11951）。KGFのなおさらなる例としては、より高いループ形成能力を有する少なくとも１つのアミノ酸と、天然のKGFのAsn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119のループ形成領域内の少なくとも１つのアミノ酸を置換することによって作製されたタンパク質が挙げられる（WO96/11950）。なおさらなる例としては、天然のKGFの123〜133（配列番号２のアミノ酸154〜164）内の１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を有するタンパク質が挙げられる；これらのタンパク質は、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有し得る。
詳細には、開示されるタンパク質は、以下を含む：C（1,15）S（図２）；ΔN3/C（15）S（図３）；ΔN3/C（15）-（図４）；ΔN8/C（15）S（図５）；ΔN8/C（15）（図６）；ΔN15（図７）；ΔN16（図８）；ΔN17（図９）；ΔN18（図10）；ΔN19（図11）；ΔN20（図12）；ΔN21（図13）；ΔN22（図14）；ΔN23（図15）；ΔN24（図16）；C（1,15）S/R（144）E（図17）；C（1,15）S/R（144）Q（図18）；ΔN23/R（144）Q（図19）；C（1,15,40）S（図20）；C（1,15,102）S（図21）；C（1,15,102,106）S（図22）；ΔN23/N（137）E（図23）；ΔN23/K（139）E（図24）；ΔN23/K（139）Q（図25）；ΔN23/R（144）A（図26）；ΔN23/R（144）E（図27）；ΔN23/R（144）L（図28）；ΔN23/K（147）E（図29）；ΔN23/K（147）Q（図30）；ΔN23/K（153）E（図31）；ΔN23/K（153）Q（図32）；およびΔN23/Q（152）E/K（153）E（図33）。
ポリペプチド誘導体
タンパク質の特性を改変するためにタンパク質がポリマーに結合されているKGFタンパク質の化学改変誘導体（本明細書中で「誘導体」という）は、本発明の範囲内に含まれる。このような誘導体は、本明細書中の開示が与えられれば、当業者によって調製され得る。結合体は、グリコシル化、非グリコシル化、または脱グリコシル化KGFタンパク質、および適切な化学的部分を用いて調製され得る。代表的には、非グリコシル化タンパク質および水溶性ポリマーが使用される。
水溶性ポリマーが望ましい。なぜなら、各々が結合しているタンパク質が水性環境（例えば、生理的環境）において沈澱しないからである。好ましくは、ポリマーは、治療用製品または組成物の調製のために薬学的に受容可能である。当業者は、ポリマー／タンパク質結合体が治療的に使用されるかどうか、そしてその場合、そのタンパク質の治療的プロフィール（例えば、徐放の持続期間；タンパク質分解に対する耐性、もしあれば投薬量に対する効果；生物学的活性；扱い易さ；抗原性の程度または欠如、および治療タンパク質における水溶性ポリマーの他の公知の効果）のような考慮事項に基づき所望のポリマーを選択し得る。
適切な臨床的に受容可能な水溶性ポリマーには、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ポリエチレングリコール（PEG）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１、３、６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（PPG）、および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（POG）（例えば、グリセロール）および他のポリオキシエチレン化ポリオール、ポリオキシエチレン化ソルビトール、またはポリオキシエチレン化グルコース、コロン酸（colonic acid）もしくは他の炭水化物ポリマー、Ficollもしくはデキストラン、ならびにそれらの混合物。本明細書において使用される場合、ポリエチレングリコールとは、他のタンパク質（例えば、モノ−（C1−C10）アルコキシポリエチレングリコールポリエチレングリコールまたはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を誘導体化するために使用されている任意の形態を包含することが意味される。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性に起因して製造の際に利点を有し得る。
水溶性ポリマーは各々、任意の分子量であり得、そして分枝されていてもされていなくてもよい。一般に、分子量または分枝が増えるにつれ、ポリマー：タンパク質比は高くなる。水溶性ポリマーは各々、代表的に、約２kDa〜約100kDaの間の平均分子量を有する（用語「約」とは、水溶性ポリマーの調製の際、いくらかの分子は標示された分子量より重く、いくらかは軽いことを示す）。各水溶性ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５kDa〜約40kDaの間で、より好ましくは、約10kDa〜約35kDaの間で、そして最も好ましくは、約15kDa〜約30kDaの間である。
当業者に利用可能な結合方法は多数存在し、これには、反応性水溶性分子を用いる（好ましくは、アミノ末端化学改変タンパク質を生成するための）アシル化反応またはアルキル化反応が挙げられる。例えば、EP 0 401 384を参照のこと。この開示は、本明細書中に参考として援用される；さらに、Malikら、（1992）Exp.Hematol.20:1028-1035；Francis（1992）、Focus on Growth Factors、3（2）：4-10、Mediscript、Mountain Court、Friern Barnet Lane、London N20 ODL,UKにより発行；EP 0 154 316；EP 0 401 384；WO 92/16221；WO 95/34326；WO 95/13312；WO 96/11953；US96/19459；および本明細書中で引用されるPEG化（pegylation）に関する他の刊行物（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
本発明の特定の実施態様は、KGFタンパク質に還元アルキル化を介して結合体化している、約20kDaもしくは約33kDa（例えば、30kDa〜35kDa）のいずれかの平均分子量を有する非分枝モノメトキシ−ポリエチレングリコールアルデヒド分子、または約33kDa（例えば、30kDa〜35kDa）の平均分子量を有する第３ブチルポリエチレングリコール添加剤である。
多価形態
多価形態（すなわち、２つ以上の活性部分を含む分子）が構築され得る。１つの実施態様において、この分子は、複数のKGFタンパク質を有し得る。さらに、この分子は、少なくとも１つのKGFタンパク質および、多価形態の所望の特徴に依存して、少なくとも１つの他の分子を有し得る。
１つの実施態様において、多価形態は、例えば、少なくとも１つのKGFタンパク質および別の部分での、任意の臨床的に受容可能なリンカー（例えば、水溶性ポリマー）との化学結合によって構築され得る。原則として、リンカーは、新たな免疫原性を与えてはならないし、新たなアミノ酸残基によって、その生体内分布およびクリアランスに影響を与える、構造の疎水性および荷電バランスを変更してもならない。
水溶性ポリマーは、上記に列挙したモノマーに基づいて、直鎖または分枝鎖、置換または非置換のホモポリマー、ランダムもしくはブロックコポリマー、ターポリマーであり得る。ポリマーは、任意の長さまたは分子量であり得るが、これらの特徴は、生物学特性に影響を与え得る。薬学的適用におけるクリアランス速度を減少させるのに特に有用なポリマー平均分子量は、2,000〜35,000ダルトンの範囲である。さらに、ポリマーの長さは、所望の生物学的活性を至適化または付与するように変化し得る。
活性部分は、従来の結合技術を用いて連結され得る（例えば、WO 92/16221, WO 95/13312、およびWO 95/34326（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
あるいは、二価分子は、ポリペプチドリンカー領域によって分離された、KGFタンパク質の２つのタンデム反復から構成され得る。ポリペプチドリンカーの設計は、タンパク質の新規な設計におけるドメインの間の短いループ配列の挿入のための設計と同様である（Mutter（1988）, TIBS, 13:260-265、ならびにReganおよびDegrado（1988）, Science, 241:976-978、この開示を本明細書中で参考として援用する）。いくつかの異なるリンカー構築物が組み立てられており、そして単鎖抗体を形成するのに有用であることが示されている；親水性配列をともに構成する、12〜25個のアミノ酸（非反応性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、およびグリシン）でサイズが変化する最も機能的なリンカーは、可溶性を増強するいくつかの反対に荷電した残基を有し、そして可撓性である（WhitlowおよびFilpula（1991）,Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105；およびBrigidoら、（1993）, J.Immunol., 150:469-479（これらの開示を本明細書中で参考として援用する）。
さらに、KGFタンパク質は、ビオチンに化学結合されて、次いで得られる結合体をアビジンに結合させて、四価のアビジン／ビオチン／KGFタンパク質を生じ得る。KGFタンパク質はまた、ジニトロフェノール（DNP）またはトリニトロフェノール（TNP）に共有結合され得、そして生じる結合体を、抗DNP-IgMまたは抗TNP-IgMと沈澱させて、十量体の結合体を形成させ得る。
さらに別の実施態様において、組換え融合タンパク質もまた、生成され得、ここで各組換えキメラ分子は、ヒトイムノグロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインの全てまたは部分（であるが、少なくとも１つのヒトイムノグロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメイン）にアミノ末端またはカルボキシ末端で融合されたKGFタンパク質配列を有する。例えば、キメラKGFタンパク質／IgG1（またはIgG1/KGFタンパク質）融合タンパク質は、軽鎖含有キメラ遺伝子から生成され得る：KGFタンパク質／ヒトκ軽鎖キメラ（KGFタンパク質／Ck）またはヒトκ軽鎖／KGFタンパク質キメラ（Ck/KGFタンパク質）；または重鎖含有キメラ遺伝子：KGFタンパク質／ヒトγ-1重鎖キメラ（KGFタンパク質/Cg-1）またはヒトγ-1重鎖／KGFタンパク質キメラ（Cg-1/KGFタンパク質）。重鎖キメラ遺伝子、または軽鎖含有遺伝子および重鎖キメラ遺伝子の転写および翻訳後に、遺伝子産物をアセンブルさせて、二価を呈するKGFタンパク質を有する単一のキメラ分子とし得る。このようなキメラ分子の構築に関するさらなる詳細は、米国特許第5,116,964号、WO 89/09622、WO 91/16437、およびEP 315062に開示される。これらの開示は本明細書中で参考として援用される。
なおさらなる実施態様において、組換え融合タンパク質もまた生成され得、ここで、組換えキメラ分子は各々、上記のように、少なくとも１つのKGFタンパク質、および欧州特許出願第96309363.8号（これらの開示は本明細書中で参考として援用される）に記載されるようなオステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（OPG）の領域186-401の少なくとも一部を有する。KGFタンパク質またはオステオプロトゲリン（osteoprotogerin）の部分のいずれかは、キメラ分子のアミノ末端またはカルボキシ末端に存在し得る。
KGFタンパク質の生成は、以下にさらに詳細に記載される。このようなタンパク質は、例えば、所望のKGFタンパク質の、組換え技術またはインビトロ化学合成によって調製され得る。
ポリヌクレオチド
本記載に基づいて、そして普遍的コドン表を用いて、当業者は、KGFタンパク質のアミノ酸配列をコードする全ての核酸配列を容易に決定し得る。
下記に示す説明に従って行なわれる組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを生成し、コードされるタンパク質を発現させ得る。例えば、KGFタンパク質をコードする核酸配列を、適切なベクターに挿入することにより、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、配列を用いて検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、KGFタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することにより、所望のタンパク質を多量に生成し得る。
本明細書中にさらに記載されるように、所望の核酸配列の増殖および／または所望のタンパク質の生成に利用可能な多数の宿主／ベクター系が存在する。これらは、プラスミド、ウイルス、および挿入ベクター、ならびに原核生物宿主および真核生物宿主を包含するが、これらに限定されない。当業者は、異種DNAを増殖させ得るかまたは発現し得る宿主／ベクター系を適応させて本発明の配列を産生または発現させ得る。
さらに、本開示を考慮すると、本発明の範囲内の核酸配列は、図１の核酸配列、ならびにその縮重核酸配列、KGFの改変体をコードする核酸配列、および（下記のcDNAライブラリースクリーニングの節において開示されるハイブリダイゼーション条件、または同等な条件もしくはよりストリンジェントな条件下で）図１の核酸配列の相補体にハイブリダイズする核酸配列を含むことが当業者に認識される。
本発明により、所望のタンパク質をコードするDNA配列とともにベクターDNAを含む組換えDNA構築物もまた提供される。このようなDNA構築物の各々において、所望のタンパク質（シグナルペプチドを有するかまたは有さない）をコードする核酸配列は、選択された宿主において所望のタンパク質の複製および／または発現を指向し得る適切な発現制御配列または発現調節配列と作動可能に連結している。
ポリヌクレオチドの調製
KGFタンパク質をコードする核酸配列は、化学合成、cDNAもしくはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはcDNAのPCR増幅を含むがこれらに限定されない、種々の方法において容易に入手され得る。このような核酸配列を単離するために有用であるこれらの方法および他の方法は、Sambrookら，（1989）, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubelら（1994）, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press; ならびにBergerおよびKimmel（1987）, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, 第152巻, Academic Press, Inc., San Diego, CAに示される。これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。
所望のタンパク質をコードする核酸配列の化学合成は、当該分野で周知の方法（例えば、Engelsら（1989）, Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734およびWellsら（1985）, Gene, 34:315（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に示される方法）を用いて達成され得る。これらの方法は、特に、核酸配列合成のホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法を含む。大きな核酸配列、例えば、約100より大きなヌクレオチド長の核酸配列は、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、フラグメントは、一緒に連結されて適切な核酸配列を形成し得る。好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いるポリマー支持合成である。
あるいは、適切な核酸配列は、適切なcDNAライブラリー（すなわち、このタンパク質を発現すると考えられる１つ以上の組織または細胞の供給源から調製されたライブラリー）またはゲノムライブラリー（全ゲノムDNAから調製されたライブラリー）をスクリーニングすることにより入手され得る。cDNAライブラリーの供給源は、代表的には、妥当な量で所望のタンパク質を発現すると考えられる任意の種からの組織である。ゲノムライブラリーの供給源は、所望のタンパク質をコードする遺伝子を有すると考えられる任意の哺乳動物または他の種からの１種類または複数種類の任意の組織であり得る。
ハイブリダイゼーション媒体は、所望のタンパク質をコードするDNAの存在について、ライブラリー中に存在するcDNAまたは遺伝子に選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブ（クローン化されるcDNAまたは遺伝子に対して受容可能なレベルの相同性を有する、オリゴヌクレオチド、cDNA、またはゲノムDNAフラグメント）を用いてスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングに用いられるプローブは、代表的には、ライブラリーを調製した種と同じ種または類似の種からの小さな領域のDNA配列をコードする。あるいは、プローブは、本明細書中に議論されるように、縮重し得る。
ハイブリダイゼーションは、代表的には、オリゴヌクレオチドプローブまたはcDNAを、非特異的結合を防ぐがこのプローブまたはプライマーに有意なレベルの相同性を有するクローンの結合を可能にするストリンジェンシーの条件下で、クローンにアニーリングさせることにより達成される。代表的なハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシー条件は、cDNAまたはオリゴヌクレオチドプローブのサイズ（すなわち、長さにおけるヌクレオチドの数）、およびこのプローブが縮重しているか否かに部分的に依存する。クローンを同定する確率はまた、ハイブリダイゼーション媒体を設計する際に考慮される（例えば、cDNAがスクリーニングされるか、またはゲノムライブラリーがスクリーニングされるか）。
DNAフラグメント（例えば、cDNA）がプローブとして用いられる場合、代表的なハイブリダイゼーション条件は、Ausubelら（1994）前出に示される条件を含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション媒体は、いくつかの要素（例えば、プローブサイズ、クローンに対するプローブの予測される相同性、スクリーニングされるハイブリダイゼーション媒体、スクリーニングされるクローンの数など）に依存して、適切なストリンジェンシーで洗浄される。
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×SSC中62〜67℃でのハイブリダイゼーション、続いて0.1×SSC中62〜67℃での約１時間の洗浄である。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、45〜55％ホルムアミド中、６×SSC、40〜45℃でのハイブリダイゼーション、続いて0.1×SSC中62〜67℃での約１時間の洗浄である。図１に示す核酸配列に、弛緩したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつKGFタンパク質をコードするDNA配列もまた含まれる。このような弛緩したストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例は、６×SSC、45〜55℃、または30〜40％ホルムアミドにて40〜45℃でのハイブリダイゼーション、続いて１〜２×SSC中55℃での約30分間の洗浄である。Maniatisら（1982）, Molecular Cloning（A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory, 387-389頁を参照のこと（この開示を、本明細書中で参考として援用する）。
オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション媒体をスクリーニングする、ストリンジェントな洗浄条件についての例示的なプロトコルもまた存在する。例えば、第１のプロトコルは、0.05％ピロリン酸ナトリウムを有する６×SSCを、プローブの長さに依存して、約35℃と約63℃との間の温度で使用する。例えば、14塩基のプローブは35℃〜40℃で、17塩基のプローブは45〜50℃で、20塩基のプローブは52〜57℃で、そして23塩基のプローブは57〜63℃で洗浄される。バックグラウンドの非特異的結合が高いようである場合、温度を２〜３℃上昇させ得る。第２のプロトコルは、塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を洗浄のために使用する。１つのこのようなストリンジェントな洗浄溶液は、３Ｍ TMAC、50mM Tris-HCl、pH8.0、および0.2％ SDSである。
KGFタンパク質をコードする適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。本方法において、cDNAは、ポリ（A）＋RNAまたは全RNAから、酵素逆転写酵素を用いて調製される。次いで、代表的には、所望のタンパク質をコードするcDNA（オリゴヌクレオチド）の２つの別々の領域に相補的な、２つのプライマーは、ポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼ）とともにcDNAに添加され、そしてポリメラーゼは、２つのプライマー間のcDNA領域を増幅する。
プローブまたはプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、スクリーニングまたはPCR増幅の間に生じ得る非特異的結合の量を最少化するために適切な長さでかつ十分に明白であるものである。プローブまたはプライマーの実際の配列は、通常、保存されたまたは高度に相同な配列または領域に基づく。必要に応じて、プローブまたはプライマーは、完全にまたは部分的に縮重し得る。すなわち、そうするために全てが同じアミノ酸配列をコードするが異なるコドンを用いるプローブ／プライマーの混合物を含み得る。縮重プローブを調製するための別の方法は、イノシンを、種によって異なるコドンの位置のいくつかまたは全てに配置することである。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本明細書中に記載されるようなDNAについての化学合成法により調製され得る。
ベクター
所望のタンパク質をコードするDNAは、さらにクローニングする（DNAの増幅）ためまたは発現のためにベクター中に挿入され得る。適切なベクターは市販されているか、または特異的に構築され得る。適切なベクターの選択または構築は、（1）ベクターがDNA増幅に使用されるか、またはDNA発現に使用されるか、（2）ベクター中に挿入されるDNAのサイズ、および（3）ベクターで形質転換されることが意図される宿主細胞に依存する。
ベクターは、各々、代表的には、選択された宿主細胞による所望のタンパク質の発現を指向するか、制御するか、さもなければ発現をもたらし得る１つ以上の以下の発現制御配列または発現調節配列に作動性に連結された所望のタンパク質をコードする核酸配列を含む。各ベクターは、その機能（DNAの増幅またはDNAの発現）および意図される宿主細胞とのその適合性に依存して種々の成分を含む。ベクター成分は、一般に、以下の１つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択またはマーカー遺伝子、プロモーター、エンハンサーエレメント、転写終結配列など。これらの成分は、天然の供給源から入手され得るか、または公知の手順により合成され得る。
適切な原核生物クローニングベクターの例は、バクテリオファージ（例えば、λ誘導体）またはE.coliからのプラスミド（例えば、pBR322、col E1、pUC、Ｆ因子、およびBluescript▲Ｒ▼プラスミド誘導体（Stratagene, LaJolla, CA））を含む。他の適切な発現ベクター（多数の型の発現ベクターが、本明細書中に記載の宿主細胞について当該分野で公知である）はまた、この目的のために用いられ得る。
シグナル配列
シグナル配列をコードする核酸は、所望のタンパク質をコードする配列（例えば、これはベクターの成分であり得るかまたは所望のタンパク質をコードする核酸の一部であり得る）の5’側に挿入され得る。KGFの天然のシグナル配列をコードする核酸は、公知である（WO 90/08771）。
複製起点
発現ベクターおよびクローニングベクターは、各々、一般に、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含む。クローニングベクターにおいて、この配列は、代表的に、ベクターが宿主の染色体DNAとは独立して複製するのを可能にする配列であり、そして複製起点または自律的に複製する配列を含む。このような配列は周知である。プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌について適切であり、種々の起点（例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターについて有用である。一般的に、複製起点は、哺乳動物発現ベクターについては必要でない（例えば、SV40起点は、しばしば、初期プロモーターを含むことからのみ用いられる）。
選択遺伝子
発現ベクターおよびクローニングベクターは、各々、代表的には、選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培養培地において増殖させた場合に、形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な「マーカー」タンパク質をコードする。ベクターで形質転換されていない宿主細胞は、選択遺伝子を含まず、それゆえ、これらはその培養培地で生存しない。代表的な選択遺伝子は、（a）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるか；（b）栄養素要求性欠損を相補するか；または（c）培養培地から利用可能でない必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために用いられ得る。増幅は、増殖に必須のタンパク質の生成のためにより多く要求される遺伝子が、組換え細胞の継続した世代の染色体内にタンデムで反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミジンキナーゼを含む。細胞形質転換体は、ベクター中に存在するマーカーのために形質転換体のみが唯一適応して生存する選択圧の下に置かれる。選択圧は、形質転換細胞を、培地中の選択薬剤の濃度が連続的に変化し、それにより選択遺伝子および所望のタンパク質をコードするDNAの両方の増幅をもたらす条件下で培養することにより負わされる。結果として、増加した量の所望のタンパク質は、増幅されたDNAから合成される。
例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換した細胞は、全ての形質転換体を、メトトレキサート（DHFRの競合的アンタゴニスト）を含む培養培地中で培養することによりまず同定される。適切な宿主細胞は、野生型DHFRが用いられる場合、DHFR活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞株（UrlaubおよびChasin（1980）, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77（7）:4216-4220、この開示は本明細書中に参考として援用される）である。次いで、形質転換された細胞は、増加したレベルのメトトレキサートに曝露される。これは、複数コピーのDHFR遺伝子および同時に発現ベクター中に存在する複数コピーの他のDNA（例えば、所望のタンパク質をコードするDNA）の合成を導く。
プロモーター
発現およびクローニングベクターは、各々、代表的には、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、そして所望のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される。プロモーターは、特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（5’）（一般に、約100〜1000bp内）に位置する翻訳されない配列である。プロモーターは、従来、誘導性プロモーターおよび構成性プロモーターを含む２つのクラスの一方にグループ分けされ得る。誘導性プロモーターは、培養条件における何らかの変化（例えば、栄養素の存在もしくは非存在、または温度の変化）に応答してその制御下でDNAからの増加したレベルの転写を開始する。種々の強力な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。プロモーターは、制限酵素消化により供給源DNAからプロモーターを除去し、そして所望のプロモーター配列を挿入することにより、所望のタンパク質をコードするDNAに作動可能に連結され得る。天然のKGFプロモーター配列は、所望のタンパク質をコードする増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、天然のプロモーターと比較して発現されるタンパク質のより大きな転写およびより多くの収量を可能にする場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合する場合は、異種プロモーターが好ましい。例えば、他のFGFファミリーのメンバーの任意の１つの天然のプロモーター配列は、所望のタンパク質をコードするDNAの増幅および／または発現を指向するために用いられ得る。
原核生物宿主での使用に適切なプロモーターとしては、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系；細菌のルミネッセンス（luxR）遺伝子系およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた適切である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それにより当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するために必要であるリンカーまたはアダプターを用いて、それらを所望のDNA配列に連結し得る。
酵母宿主での使用に適切なプロモーター配列もまた、当該分野において周知である。哺乳動物宿主細胞での使用に適切なプロモーターは周知であり、そしてポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Adenovirus 2）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、Simian Virus 40（SV40）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
エンハンサーエレメント
発現ベクターおよびクローニングベクターは、各々、代表的には、所望のタンパク質をコードするDNA配列の高等真核生物による転写を増大するためのエンハンサー配列を含む。エンハンサーは、DNAのシス作用性エレメントであり、通常、約10〜300bpの長さであり、その転写を増大するためにプロモーターにおいて作用する。
エンハンサーは、比較的配向および位置とは無関係である。それらは、転写ユニットの5’および3’に見出された。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に使用される。哺乳動物の遺伝子から入手可能であるいくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェト-タンパク質、およびインスリン）。さらに、ウイルスエンハンサー（例えば、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサー）は、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーが所望のタンパク質をコードするDNAの5’または3’位置でベクターにスプライスされ得る場合、それは代表的にはプロモーターの5’部位に配置される。
転写終結
真核生物宿主細胞に使用される発現ベクターは、各々、代表的には、転写の終結のため、そしてmRNAを安定化させるために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物のDNAまたはcDNAの5’および時には3’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、所望のタンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
ベクター構築
１以上の上記の成分（所望のコード配列とともに）を含む適切なベクターの構築は、標準的な連結技術によって達成され得る。単離されたプラスミドまたはDNAフラグメントは切断され、調整され、そして必要とされるベクターを生成するために所望の順番で再連結される。正確な配列が構築されたことを確認するために、連結混合物が使用されて、E.coliが形質転換され得、そして上首尾な形質転換体が上記のような公知の技術によって選択され得る。次いで、形質転換体から大量のベクターが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、そして/または所望の構築物の存在を確認するために配列決定される。
哺乳動物細胞中の所望のタンパク質をコードするDNAの一過性発現を提供するベクターもまた使用され得る。一般に、一過性発現は、宿主細胞が多コピーの発現ベクターを蓄積し、次いでこの発現ベクターによってコードされる高レベルの所望のタンパク質を合成するように宿主細胞中で効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む各々の一過性発現系は、クローン化DNAによってコードされるタンパク質の簡便なポジティブ同定、ならびに所望の生物学的および生理学的特性についてのこのようなタンパク質の迅速なスクリーニングを可能にする。
宿主細胞
任意の種々の組換え宿主細胞（各々が所望のタンパク質を発現するのに使用するための核酸配列を含む）もまた、本発明によって提供される。例示的な原核生物および真核生物の宿主細胞としては、細菌、哺乳動物、真菌、昆虫、酵母または植物細胞が挙げられる。
原核生物宿主細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性の生物のような真正細菌（例えば、E.coli（HB101, DH5a, DH10およびMC1061）；B.subtilisのようなBacillus種; Pseudomonas種（例えば、P.aeruginosa）；Streptomyces spp.；Salmonella種（例えば、S. typhimurium）；またはSerratia種（例えば、S. marcescans）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、所望のタンパク質がE.coliにおいて発現され得る。
原核生物宿主細胞に加えて、KGFタンパク質は、多細胞生物に由来する多数の適切な宿主細胞の内のいずれか１つによってグリコシル化形態で発現され得る。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活性を有し得る。原則として、任意の高等真核生物の細胞培養（脊椎動物細胞、または植物および昆虫の細胞を含む無脊椎動物細胞を含もうと、含むまいと）が使用され得る。
真核生物微生物（例えば、糸状真菌または酵母）は、所望のタンパク質の発現に適切な宿主であり得る。Saccharomyces cerevisiae、または一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般に使用さ肌るが、多数の他の属、種および株が周知であり、そして一般的に利用可能である。
培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は周知の手順であるので、脊椎動物細胞が使用され得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（293細胞または懸濁培養における増殖のためにサブクローン化された293細胞）、新生仔ハムスター腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物細胞株としては、HeLa、マウスL-929細胞、Swiss、Balb-c、またはNIHマウス由来の3T3株、およびBHKまたはHaKハムスター細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、所望のタンパク質は、COS細胞またはバキュロウイルス細胞において発現され得る。
宿主細胞は、核酸の発現を許容する適切な条件下で所望の核酸でトランスフェクトされ得、そして好ましくは形質転換され得る。適切な宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングならびに産物の産生および精製のための方法は、当該分野で周知である（GethingおよびSambrook（1981）, Nature, 293:620-625、あるいは、Kaufmanら、（1985）, Mol.Cell.Biol., 5（7）:1750-1759, または米国特許第4,419,446号、これらの開示は、参考として本明細書に援用される）。例えば、細胞壁を有さない哺乳動物細胞については、リン酸カルシウム沈殿法が使用され得る。エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよび他の公知の技術もまた使用され得る。
所望のタンパク質が、相同性組換えによって、またはKGFタンパク質をコードするDNAを既に含有する細胞に導入される制御エレメントを利用する組換え産生法で産生され得ることもまた可能である。相同性組換えは、本来は転写的に活性な遺伝子において変異を誘導するかまたは補正するように、遺伝子を標的化するために開発された技術である（Kucherlapati（1989）, Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36:301、この開示は、参考として本明細書に援用される）。基本技術は、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Thomasら、（1986）, Cell, 44:419-428; ThomasおよびCapecchi（1987）, Cell, 51:503-512およびDoetschmanら、（1988）, Proc.Natl.Acad.Sci., 85:8583-8587、この開示は参考として本明細書に援用される）または欠損遺伝子内の特定の変異を補正するため（Doetschmanら、（1987）, Nature, 330:576-578，この開示は参考として本明細書に援用される）の方法として開発された。例示的技術は、米国特許第5,272,071号；WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650およびWO 94/31560に記載されている。これらの開示は参考として本明細書に援用される。
宿主細胞の培養
所望のタンパク質の産生のために１以上の組換え宿主細胞の各々を培養する方法は、多くの要因および考慮に依存して変化する；所定の状況について最適な産生手順は、最小限の実験により当業者に明らかである。このような組換え宿主細胞は、適切な培地において培養され、次いで発現されるタンパク質は、必要に応じて、当業者に公知の適切な手段によって培養培地（または細胞内で発現される場合には、細胞）から回収され、単離され、そして精製される。
詳細には、所望のタンパク質を産生するために使用される組換え細胞の各々は、プロモーターの誘導、適切な組換え宿主細胞の選択または所望のタンパク質をコードする遺伝子の増幅のために適切な培地において培養され得る。培地は、必要な場合には、ホルモンおよび/または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、HEPES）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（通常、マイクロモル濃度の範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは別のエネルギー供給源を補充され得る。他の補充物もまた、当業者に理解されるように、適切な濃度で含まれ得る。適切な培養条件（例えば、温度、pHなど）はまた、選択された宿主細胞での使用について当業者に周知である。
次いで、得られる発現産物は、当該分野で公知の手順を用いてほぼ均一になるまで精製され得る。例示的な精製技術は、WO90/08771およびWO 96/11952に教示され、これらの開示は、参考として本明細書に援用される。
使用
KGFタンパク質および生物学的活性を有するその化学的に修飾された誘導体（集合的に、「KGFタンパク質産物）は、研究試薬として、ならびに治療薬剤および診断薬剤として使用され得る。したがって、KGFタンパク質産物は、インビトロおよび/またはインビボ診断アッセイにおいて使用されて、組織または器官のサンプル中のKGFの量を定量化し得る。
例えば、KGFタンパク質産物は、当該分野で公知の技術（WO 90/08771）を用いて種々の体液および組織のサンプル中のKGFタンパク質のレセプターの同定のために使用され得る。
本発明はまた、KGFタンパク質産物（KGFを含む）に対して作製される抗体の生成におけるKGFタンパク質産物の使用を意図する。当業者は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体を得るために周知の、刊行された手順を使用し得る。次いで、このような抗体は、KGFタンパク質産物を精製および特徴付けるために使用され得る。
薬学的組成物
本発明は、各々、治療的にまたは予防的に有効量のKGFタンパク質産物を含有する薬学的調製物を意図する。
薬学的組成物は、各々、一般に、ビヒクルとの混合物として治療的に有効または予防的に有効な量のKGFタンパク質産物を含有する。ビヒクルは、好ましくは、KGFタンパク質産物との混合物として１以上の薬学的および生理学的に受容可能な処方物物質を含む。
ビヒクル中の主な溶媒は、本質的に、水性または非水性のいずれかであり得る。さらに、ビヒクルは、以下を改変または維持するための他の薬学的に受容可能な賦形剤を含有し得る：pH（好ましくは、約6.5〜7.0のpHを維持するため）（例えば、クエン酸、リン酸、およびグリシンのようなアミノ酸のような緩衝液）；浸透圧（例えば、マンニトールおよび塩化ナトリウム）；粘性；明澄性；呈色；無菌性；安定性（例えば、スクロースおよびソルビトール）;処方物のにおい；溶解の速度（例えば、アルコール、ポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウムのような溶解剤または可溶化剤）；放出の速度；ならびに凍結乾燥処方物のためのバルク剤（例えば、マンニトールおよびグリシン）；界面活性剤（例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80、トリトン、およびプルーロニック）；抗酸化剤（例えば、亜硫酸ナトリウムおよび亜硫酸水素ナトリウム）; 保存剤（例えば、安息香酸およびサリチル酸）; 香料および希釈剤；乳化剤；懸濁剤；溶媒；充填剤；送達ビヒクル；希釈剤および/または薬学的アジュバント。他の有効な投与形態（例えば、非経口徐放物、吸入霧、経口活性処方物、または坐薬）もまた意図される。
組成物はまた、ポリマー化合物（例えば、バルク侵食ポリマー（例えば、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）コポリマー、PLGAポリマーブレンド、PEGならびに乳酸およびグリコール酸のブロックコポリマー、ポリ（シアノアクリレート））; 表面侵食ポリマー（例えば、ポリ（無水物）およびポリ（オルトエステル））；ヒドロゲルエステル（例えば、プルーロニックポリオール、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水リンゴ酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、セルロース、ヒアルロン酸誘導体、アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ならびに澱粉およびデキストラン）およびそれらの組成物の系）の粒子性調製物、あるいはリポソームまたはミクロスフェアの調製物を含む。このような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスに影響し得る。所望のタンパク質について最適な薬学的処方物は、投与の経路および所望の用量に応じて当業者に決定される。例示的な薬学的組成物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版、（1990）, Mack Publishing Co., Easton PA 18042, 1435-1712頁；GombotzおよびPettit（1995）, Bioconjugate Chem., 6:332-351; Leone-Bayら、（1995）, Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haasら、（1995）, Clinical Immunology and Immunopathology, 76（1）:93; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772およびWO 94/21235に開示されており、これらの開示は参考として本明細書に援用される。
特定の持続放出組成物は、種々の供給会社（Depotech Corp．（DepofoamTM, 多小胞リポソーム）およびAlkermes, Inc．（ProLeaseTM, PLGAミクロスフェア）を含む）から入手可能である。本明細書中で使用される場合、ヒアルロナンは、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、それらの塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、エステル、エーテル、酵素的誘導体およびヒアルロン酸の架橋ゲル、ならびにヒアルロン酸の化学的に修飾された誘導体（例えば、ヒラン（hylan））を含むことが意図される。ヒアルロナンの例示的な形態は、米国特許第4,582,865号、同第4,605,691号、同第4,636,524号、同第4,713,448号、同第4,716,154号、同第4,716,224号、同第4,772,419号、同第4,851,521号、同第4,957,774号、同第4,863,907号、同第5,128,326号、同第5,202,431号、同第5,336,767号、同第5,356,883号; 欧州特許出願第0 507 604 A2号、同第0 718 312 A2; およびWO 96/05845に開示されており、これらの開示は参考として本明細書に援用される。ヒアルロナンの供給業者としては、BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ; Fidia S.p.A., Abano Terme, Italy; Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan; Pharmacia AB, Stockholm, Sweden; Genzyme Corporation, Cambridge, MA; Pronova Biopolymer, Inc. Postsmouth, NH; Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Switzerland; Intergen Company, Purchase, NYおよびKyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japanが挙げられる。
口腔徴候の処置および/または予防のために、液体溶液または懸濁物が口内洗浄剤と類似の様式で使用され得る。ここで、液体は、病変の処置を最大化するように口の周辺にひと振り（swish）される（米国特許第5,102,870号、この教示は、参考として本明細書に援用される）。粘膜表面とのより長い接触は、粘膜をコートし得る適切なビヒクルを選択することによって達成され得る。代表的な例は、OrabaseTM（Colgate-Hoyt Laboratories, Norwood, MA）、スクラルファート懸濁物、KaopectateおよびMagnesiaのMilkのようなペクチン含有処方物である。処方物はまた、薬学的に受容可能な非毒性ビヒクルまたはキャリアを有する塗布可能なクリーム、ゲル、ローションまたは軟膏である。KGFタンパク質産物はまた、例えば、緩徐に溶解する錠剤またはトローチ、チューイングガムベース、または舌下錠あるいは後方臼歯にホックでとめられた緩徐送達補綴具中に取り込まれ得る。
一旦、薬学的組成物が処方されると、溶液、懸濁物、ゲル、乳液、固体、または脱水されたかもしくは凍結乾燥された粉末として無菌バイアル中で保存され得る。このような処方物は、調製済み形態または投与の前に再構築を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存され得る。
特定の実施態様において、本発明は、単一用量の投与単位を製造するためのキットに関する。キットは、各々、乾燥したタンパク質を有する第１の容器および水性処方物を有する第２の容器の両方を含有する。本発明の範囲内に含まれるキットは、単一および複数のチャンバーの予め充填されたシリンジ；見本用予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ、およびLyo-Ject▲Ｒ▼、二重チャンバーの予め充填された分散シリンジ（lyosyringe）のような分散シリンジ）がVetter GmbH, Ravensburg, Germanyから入手可能である。
KGFタンパク質産物は、上皮細胞への損傷を有するか、または臨床的に不十分な数の上皮細胞を有することによって特異的に特徴付けられる器官または組織に治療的および予防的に有効な量で適用され得る。本明細書中に記載されるKGFタンパク質産物処方物が、獣医学ならびにヒト適用のために使用され得、そして用語「患者」は限定的な様式で解釈されるべきでないことに留意すべきである。
患者にKGFタンパク質産物を投与する頻度は、疾患および患者の状態、ならびに処方される場合にKGFタンパク質産物の薬学的動態学的パラメータ、および投与の経路に依存する。KGFタンパク質産物は、１回投与され得るか、毎日投与され得るか、または最初のボーラス投与、続く継続的投与または持続的送達により投与され得る。他の様式の継続的またはほぼ継続的投与が実施され得ることもまた意図される。例えば、化学的誘導体化は、決定された投与計画に基づいて、予想可能な量で、血流における継続的存在の作用を有するタンパク質の徐放形態を生じ得る。
上皮細胞の刺激（細胞保護作用、増殖、および/または分化を含む）を必要とする患者は、KGFタンパク質産物の有効量を投与されて、患者において所望の応答を誘発し得る。特定の状態を予防または処置する方法に関与する投与計画は、一般に、担当医によって、薬物の作用を改変する種々の要因（例えば、患者の年齢、状態、体重、性別、および食餌）を考慮して、任意の感染の重篤度、投与の時間、および他の臨床的要因を決定される。適切な投与量は、適切な用量応答データと共に利用して投薬量を決定するための確立されたアッセイの使用を介して確かめられ得る。代表的な投薬量は、0.001mg/kg体重〜500mg/kg体重の範囲であり、好ましくは200mg/kg体重、より好ましくは100mg/kg体重である。
KGFタンパク質産物は、局所的か、経腸的か、または非経口的な投与（注入、動脈内、関節内、皮膜内、心臓内、皮内、筋肉内、目窩内、くも膜下腔内、静脈内、腹腔内、脊髄内、胸骨内注射、脳室内、皮下、角質下、被膜下、くも膜下、および経気管を含むがこれらに限定されない）を介して、投与され得る。KGFタンパク質産物は、経口投与されるか、または粘膜（すなわち、全身送達のための頬側、鼻腔内、直腸内、舌下の粘膜）を介して投与される。KGFタンパク質産物は、疾患および患者の状態に依存して単回使用され得るかまたは繰り返し投与され得る。いくつかの場合、KGFタンパク質産物は、他の治療に対するアジュバントとして、そしてまた他の薬学的調製物とともに投与され得る。
別の実施態様において、細胞治療（例えば、KGFタンパク質を産生する細胞の移植）もまた意図される。本発明のこの実施態様は、生物学的活性型のKGFタンパク質の合成および分泌し得る患者細胞への移植を含み得る。KGFタンパク質を産生するこのような細胞は、KGFタンパク質を正常に分泌しないが、KGFタンパク質の産生が改変されている細胞であり得るか、またはKGFタンパク質を産生する能力が、KGFタンパク質の発現および分泌に適したポリヌクレオチドでの形質転換によって増大されている細胞であり得る。外来種のKGFタンパク質が投与されている患者において潜在的な免疫学的反応を最小化するために、細胞が患者（例えば、ヒト）と同種であるか、または細胞が免疫学的認識に対する保護を与える物質でカプセル化されているか、免疫学的に特異な（privilege）解剖学的位置（例えば、精巣、目、および中枢神経系）へ配置された細胞であることが好ましい。
ヒトまたは非ヒト動物細胞は、KGFタンパク質の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織由来の他の有害な因子による細胞の崩壊を妨げる、生体適合性の、半透性の高分子封入物または膜中で、患者に移植され得る。あるいは、KGFタンパク質を産生するようにエキソビボで形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化を有さない患者へ直接移植され得る。生存細胞の膜カプセル化の方法論は、当業者に周知であり、そしてカプセル化細胞の調製および患者におけるそれらの移植は、公知の技術（米国特許第4,892,538号；同第5,011,472号；および同第5,106,627号、これらの開示は本明細書によって参考として援用される）を用いて達成され得る。
なお別の実施態様において、インビボ遺伝子治療もまた意図され、ここでKGFタンパク質をコードする核酸配列は、直接患者に導入される。肝細胞への効率的かつ長期耐久性の遺伝子導入は、肝疾患の予防および/または処置するタンパク質の局所的発現のため、および/または他の器官または組織における疾患の予防および/または処置するタンパク質の分泌のための効率的な遺伝子治療を必要とする。
DNA構築物は、DNAが、そのような組織で活性であるプロモーターに作動可能に連結される場合、インビボで組み込まれそして発現される処置されるべき器官の組織へ直接注射され得る。DNA構築物はまた、細胞内の組み込みを助けるために、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、および/またはヘルペスウイルスベクターのようなそのようなベクター由来のベクター配列をさらに含み得る。身体への導入は、所望の核酸構築物または所望の核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所的な注射（例えば、リポソーム媒介導入、直接注射（裸のDNA）、レセプター媒介導入（リガンドDNA複合体）、または微粒子照射（遺伝子銃））によってインビボで達成され得る。肝臓における肝細胞のインビボ再生のために、モロニーレトロウイルスベクターの使用が、特に有効であり得る（Boschら（1996）;Cold Spring Harbor,Gene Therapy Meeting,1996年9月25〜29日;およびBoschら（1996）,Journal of Clinical Investigation, 98（12）:2683-2687、この開示は本明細書中で参考として援用される）。KGFタンパク質産物は、治療有効量および予防有効量で、損傷を有することまたは臨床的に不十分な数の上皮細胞によって特異的に特徴づけられる器官または組織に、適用され得る。KGFタンパク質産物は、獣医学的におよびヒトへの適用に使用され得ること、ならびに用語「患者」は、限定的な様式に解釈されるべきではないことに留意すべきである。
本発明に従って、KGFタンパク質産物は、インビボで、上皮細胞（目、耳、歯肉、髪、肺、皮膚、膵臓（内分泌および外分泌）、胸腺、甲状腺、膀胱、肝臓、および胃腸管（口腔の細胞、食道の細胞、腺胃および小腸の細胞、結腸および腸粘膜の細胞、直腸の細胞、ならびに肛門管の細胞を含む）を含むが、これらに限定されない）の刺激（細胞保護作用、増殖、および/または分化を含む）、増殖、および/または分化を誘導するために使用され得る。KGFタンパク質産物が首尾良く投与され得る適応症には、以下が含まれるが、これらに限定されない：火傷および毛包、汗腺、および皮脂腺のような副腎構造の刺激を必要とする他の部分厚および全厚（full-thickness）外傷；表皮水疱症によって引き起こされる病変（これは下層の真皮への表皮の接着における欠損であり、重篤な病的状態を引き起こし得る開口した有痛性の水疱を頻繁に生じる）；化学療法によって誘導される脱毛症および男性型ハゲ、または男性および女性における髪の進行性損失；胃および十二指腸潰瘍；放射線および化学療法処置養生法における腸毒性；びらん性胃炎、食道炎、食道逆流、またはクローン病のような炎症性腸疾患（主に小腸を冒す）および潰瘍性結腸炎（主に大腸を冒す）を含む胃腸管（例えば、食道、胃、および小腸）の侵食；放射腺/化学療法効果を含む唾液腺組織に対する障害または損傷、シェーグレン症候群のような自己免疫疾患（これは、唾液腺機能不全（sicca症候群）を引き起こし得る）；胃腸管全体の粘液の機能不全的な産生；成人呼吸促進症候群（ARDS）、肺炎、新生児硝子膜症（すなわち、小児呼吸促進症候群および気管支肺の異形成）；吸入傷害（高酸素レベルを含む）に起因する急性または慢性の肺損傷または機能不全、気腫、化学療法、人工呼吸器外傷、または他の肺損傷環境に起因する肺損傷；肝硬変、激症肝不全、急性ウイルス性肝炎によって引き起こされる損傷および/または肝臓に対する中毒性発作および/または胆管障害、および肝臓へのウイルス媒介性遺伝子導入；化学薬品、細菌、またはウイルスに起因する角膜の剥離および/または角膜の潰瘍；進行性歯肉疾患；鼓膜損傷；化学療法および/または感染から生じる状態を含む潰瘍および/または炎症；糖尿病（Ｉ型およびII型）、膵炎、嚢胞性線維症を含み、および島細胞移植における付随するものとしての膵臓障害および膵臓機能不全。
鎮痛薬および麻酔薬のような治療用薬剤もまた、疼痛を緩和するために投与され得、そして、例えば、抗感染剤、抗菌剤、抗真菌剤、および／または防腐剤もまた、病変の二次感染を予防および／または処置するために投与され得る。
従って、本発明は、これらの特定の細胞型に対する損傷かまたはその欠損の開始を低減、遅延、および/またはブロックするための、KGFの予防的および/または治療的使用によって特異的に特徴づけられるKGFタンパク質産物の適用を可能にするのに関する有意な意味を有する。以下は、本発明に従ってKGFタンパク質産物で処置され得る疾患および医学的状態のより特異的な記載である。
KGFタンパク質産物は、肝臓機能を増大させるための肝細胞の細胞保護、増殖、および/または分化を増大させるのに有用である。KGFタンパク質産物は、肝硬変、激症肝不全、急性ウイルス性肝炎によって引き起こされる損傷、肝臓および/または胆管障害に対する中毒性発作を処置ならびに/または予防するために有用である。
肝硬変（ウイルス性肝炎および慢性のアルコール摂取に対して二次性である）は、罹患率および死亡率の有意な原因である。KGFタンパク質産物は、肝硬変の発症を処置および/または予防するために有用である。肝硬変の標準的なインビボモデルは、公知である（Tomaszewskiら（1991）, J. Appl. Toxicol., 11:229-231、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
激症肝不全は、末期肝硬変で生じる生命を危険に晒す状態であり、そして現在肝臓移植によってのみ処置し得る。KGFタンパク質産物は、激症肝不全を処置および/または予防するために有用である。激症肝不全の標準的なインビボモデルは、公知である（Mitchellら（1973）, J. Pharmacol. Exp. Ther., 187:185-194; ThakoreおよびMehendale（1991）, Toxicologic Pathol., 19:47-58;およびHavillら（1994）, FASEB Journal, 8（4-5）:A930, Abstract 5387、この開示は本明細書中で参考として援用される）。
急性のウイルス性肝炎は、頻繁に不顕性で、そして自己制限的（self-limiting）である。しかし、少数の患者において、重篤な肝臓損傷が、数週間にわたって生じ得る。KGFタンパク質産物は、ウイルス性肝炎を予防および/または処置するにおいて有用である。肝細胞増殖の標準的なインビボモデルは、公知である（Housleyら（1994）, Journal of Clinical Investigation, 94（5）:1764-1777；およびHavillら（1994）、前出、この開示は本明細書中で参考として援用される）。
アセトアミノフェン、ハロタン、四塩化炭素、および他の毒素によって引き起こされる肝臓に対する中毒性発作は、KGFタンパク質産物によって予防および/または処置され得る。肝臓毒素の標準的なインビボモデルは、公知である（Mitchellら、（1973）、前出；ThakoreおよびMehendale（1991）、前出；およびHavillら（1994）、前出、この開示は本明細書中で参考として援用される）。
KGFタンパク質産物は、胃腸管（例えば、口腔、食道、胃、小腸、結腸、直腸、および肛門管）における上皮細胞の細胞保護、増殖、および/または分化を増大させるために有用である。本明細書中で定義されるように、用語「胃腸管」および「腸」は、当該分野で認識されている用語であり、そして交換可能に使用される。特に、KGFタンパク質産物は、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、腸毒性、および胃腸管の侵食を処置および/または予防するために有用である。
胃潰瘍は、有意な罹患率を引き起こし、比較的高い再発率を有し、そして粘膜の裏打ちの上に瘢痕を形成することによって治癒する。KGFタンパク質産物は、腺粘膜の分解を予防し、そしてより迅速に腺粘膜を再生するのに有用であり、例えば、胃潰瘍の処置における有意な治療的改善を提供する。胃潰瘍の標準的なインビボモデルは、公知である（Tarnawskiら、（1991）、「Indomethacin Impairs Quality of Experimental Gastric Ulcer Healing: A Quantitative Histological and Ultrastructural Analysis」、Mechanisms of Injury, Protection and Repair of the Upper Gastrointestinal Tract、（編）GarnerおよびO’Brien, Wiley & Sons; Brodie（1968）Gastroenterology, 55:25; およびOhningら（1994）, Gastroenterology, 106（補遺4）:A624、この開示は本明細書中で参考として援用される）。
十二指腸潰瘍は、胃潰瘍と同様に、有意な罹患率を引き起こし、そして比較的高い再発率を有する。KGFタンパク質産物は、十二指腸の粘膜の裏打ちの分解を予防し、そして十二指腸の粘膜の裏打ちを迅速に再生して、潰瘍を治癒してその再発を減少させるのに有用である。十二指腸潰瘍の標準的なインビボモデルは、公知である（Bergら（1949）, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 7:374-376; SzaboおよびPihan, Chronobiol. Int. （1987）, 6:31-42;およびRobertら（1970）, Gastroenterology, 59:95-102、この開示は本明細書中で参考として援用される）。
腸毒性は、放射線（腹部、全身または局所（例えば、頭部および頚部））および化学療法の両方でのガン処置に関連する主要な限定因子である。主な関心は、以下を受けている患者である：ガン（例えば、白血病、乳ガン）のための化学療法または腫瘍の除去に対するアジュバントとして；頭および首のガンのための放射線治療；ならびに骨髄移植のための化学療法および放射線治療の組み合わせ。損傷の重篤度は、化学療法剤のタイプおよび用量、ならびに放射線治療のような併用療法に関連する。
胃腸管の部分における粘膜炎（mucositis）は、これらの患者の有意な疼痛および不快感の原因となり得、そして重篤度は赤熱状態および腫脹からあからさまな潰瘍性病変までにわたり得る。病変は、しばしば二次的に感染され、そして治癒するのが一層困難になる。放射線誘導性の腸毒性の標準的なインビボモデルは、公知である（WithersおよびElkind（1970）, Int. J. Radiat., 17（3）:261-267、その開示は本明細書中で参考として援用される）。化学療法誘導性の腸毒性の標準的なインビボモデルは、公知である（Farrellら、The American Society of Hematology, 38th Annual Meeting（Orlando, FL）, 1996年12月6〜8日；Sonisら（1990）, Oral Surg. Oral Med & Oral Pathol., 69（4）:437-443;およびMoore（1985）, Cancer Chemotherapy Pharmacol., 15:11-15、その開示は本明細書中で参考として援用される）。
例示的な化学療法剤には、BCNU、ブスルファン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シスプラチン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン（gemcytabine）、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、メトトレキサート、ナベルビン（navelbine）、トポテカン、タキソール、およびタキソテールが含まれるが、これらに限定されず、そして例示的な処置養生法には、BEAM（ブスルファン、エトポシド、シトシンアラビノシド、メトトレキサート）；シクロホスファミドおよび全身放射線照射；シクロホスファミド、全身放射線照射およびエトポシド；シクロホスファミドおよびブスルファン；ならびにロイコボリンまたはレバミソールを伴う5-フルオロウラシルが含まれるが、これらに限定されない。
KGFタンパク質産物での処置、前処置、および/または後処置は、例えば、小腸粘膜上での細胞保護効果または再生またはその両方を生成するのに有用であり、このような治療の増大した用量を可能にする一方、腸毒性の潜在的に致死的な副作用を低減する。
KGFタンパク質産物は、好ましくは、以下の設定で投与され得る。結腸直腸の患者は、毎日、5-フルオロウラシルをロイコボリンとともに、１日目〜５日目に投与され得る；KGFタンパク質産物は、-2、-1、および0日目に投与され得る。頭部および頚部のガン患者は、７週間の期間にわたり低分画放射線治療ならびに5-フルオロウラシルおよびシスプラチンを毎日投与される：KGFタンパク質産物は、-2、-1、および0日目に投与され得、そしてその後放射線治療が終わるまで週一回投与され得る。リンパ腫移植においては、患者はBEAM治療を６日間（１日目〜６日目）頻繁に投与される；KGFタンパク質産物は、-2、-1、および0日目に、そして３日間の後処置として投与され得る（７〜９日目）。
特定の実施態様において、KGFタンパク質産物は、粘膜炎の発症（化学療法および/または放射線治療に起因する）を低減、遅延、および/またはブロックするために、血球減少の発症を遅延および/またはブロックするための１つ以上のサイトカインと組み合わせて、予防的に、および/または治療的に投与され得る。
代表的には、骨髄、末梢血前駆細胞、または幹細胞（McNieceら（1989）, Blood, 74:609-612およびMooreら（1979）, Blood Cells, 5:297-311、その開示が本明細書中で参考として援用される）は、骨髄抑制性の細胞減少性の治療（化学療法単独または放射線治療との組み合わせ）の前に患者から除去され、次いでこのような治療の骨髄抑制性効果を相殺するために、細胞減少性の治療と同時にかまたはその後に患者に再び投与される。
多くの異なるアプローチが、放射線または有毒な化学薬品の副作用から生体を保護するために行われている。１つのアプローチは、毒性が発生する前に骨髄細胞を置換することである。別のアプローチは、末梢血（PBPC）から前駆細胞を使用することである。これらのPBPCは、サイトカイン治療単独（G-CSFまたはGM-CSF）の後に、または化学療法もしくはサイトカインとともにの治療の後に、アフェレーシスまたは瀉血によって回収され得る。これらは、そのまま患者に戻され得るか、あるいは凍結保存され得る。所望であれば、細胞は、CD34+選択され得るか、Tn細胞枯渇され得るか、腫瘍細胞枯渇され得、または前駆細胞は、投与前に、当該分野で公知の手段によって増殖（増加を引き起こ）され得る。骨髄抑制性治療の後の自己または異種の前駆細胞の再注入の利点は、文献に記載されている（Morseら、（1992）, Ann. Clin. Lab. Sci., 22:221-225; KessingerおよびArmitage（1991）, Blood, 77:211-213; Kessingerら、（1989）, Blood, 74:1260-1265; Takamら（1989）, Blood, 74:1245-1251およびKessingerら（1988）, Blood, 171:723-727、これらの開示は本明細書中で参考として援用される）。
本明細書中で使用される用語「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとして別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものには、インスリン様成長因子；ヒト成長ホルモン；N-メチオニルヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体形成ホルモン（LH））；造血性増殖因子；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン；神経成長因子（例えば、NGF-β）；血小板増殖因子（例えば、TPOおよびMGDF）；トランスフォーミング増殖因子（TGF）（例えば、TGF-αおよびTGF-β）；インスリン様成長因子Iおよびインスリン様成長因子II；エリスロポエチン；骨誘導性（osteoinductive）因子；インターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ）；コロニー刺激因子（CSF）（例えば、マクロファージCSF（M-CSF）、顆粒球マクロファージCSF（GM-CSF）、および顆粒球CSF（G-CSF））；インターロイキン（IL）（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、およびIL-16）；ならびに他のポリペプチド因子が挙げられる。サイトカインは、単独で、または組み合わせて、細胞傷害性因子に関連する骨髄毒性または造血性毒性に対して保護し、緩和し、および/または反転させるために使用され得る。
KGFタンパク質産物およびサイトカインの投与の態様は、同調および最適化されるべきである。状況に応じて、KGFタンパク質産物の適切な用量が、治療薬剤の投与の前または後に、投与され得る。例えば、考慮されるべきパラメーターは、サイトカインが、治療の経過の間に単回用量で、または複数回用量で投与されるか否かである。特定のサイトカインは、身体から迅速に除去され、そしてその効力が最大化されるために定期的または連続的な投与を必要とする。投与の様式は、サイトカインの前処置または後処置が与えられるか否かにより異なり得る。例えば、サイトカインが細胞傷害性因子の前に与えられる場合には、数時間の静脈内ボーラス注射によってサイトカインを投与すること、必要に応じて、細胞傷害性治療の完了の間および後に、このような投与を１日以上反復することが好ましい。
特定の実施態様において、KGFタンパク質産物は、0.1〜500マイクログラム/kg/用量、好ましくは約200マイクログラム/kg/用量で、化学療法または放射線治療の前（例えば、１〜３日前）および/またはその後に投与（例えば、静脈内）され、そしてG-CSF（NeupogenTMまたはLenograstimTM）またはGM-CSF（SargramostimTM）は、5マイクログラム/kg/用量で、化学療法の後に１〜10日間（好ましくは、７〜10日間）投与（例えば、皮下で）される。
胃腸管（例えば、食道、胃、および小腸）の侵食には、びらん性胃炎、食道炎、食道逆流、および炎症性腸疾患が含まれる。炎症性腸疾患（例えば、クローン病（おもに小腸を冒す）および潰瘍性結腸炎（主に大腸を冒す））は、未知の病因の慢性の疾患であり、これは粘膜表面の破壊、炎症、瘢痕、および修復の間の接着形成、ならびに罹患した個体に有意な罹患率を生じる。KGFタンパク質産物は、粘膜の裏打ちを再生し、そしてこれらの侵食の再発を減少させ、より早い治癒を生じるのに有用であり、そして疾患の進行を制御するのに有利であり得る。胃腸管の侵食の標準的なインビボモデルは、公知である（Geisingerら（1990）, Mod-Pathol., 3（5）:619-624; Carlborgら（1983）, Laryngoscope, 93（2）:184-187; Carlborgら（1980）Eur-Surg-Res., 12（4）:270-282; Keshavarzianら（1991）, Alcohol-Clin-Exp-Res., 15（1）:116-121; Katzら（1988）, Dig-Dis-Sci., 33（2）:217-224; およびZeehら（1996）, Gastroenterology, 110（4）:1077-1083、これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）。炎症性腸疾患の標準的なインビボモデルは、周知である（Morrisら、（1989）, Gastroenterology, 96:795-803; Rachmilewtzら、（1989）, Gastroenterology, 97:326-327; Allgayerら、（1989）, Gastroenterology, 96:1290-1300; ならびにKimおよびBorstad（1992）, Scand. J. Gastroenterol, 27（7）:529-537、これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）。
動物研究は、全非経口栄養法（TPN）と腸粘膜萎縮症との間の関係を確立している（Buchmanら（1995）, Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 19:453-460）。腸絨毛の高さの減少は、栄養物の経口摂取によって提供される増殖刺激の欠如に起因する。これは、標識指標（増殖の尺度である）の低減に反映される。絨毛の高さの減少はまた、栄養の吸収に関与する酵素の特定の活動の減少に相関している。KGFタンパク質産物は、絶食の間の萎縮に対して保護するため、および/または経口的栄養物の再導入の際の再増殖を容易にするためのいずれかに有用である。
特定の実施態様において、本発明は、KGFタンパク質産物およびGLP-2タンパク質産物を組み合わせて用いて、胃腸管における末梢細胞の細胞保護作用、増殖、および／または分化を増加させる方法に関する。詳細には、組合せ治療は、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、腸毒性、および胃腸管の侵食を処置および／または予防するのに有用である。用語「GLP-2ペプチド」は、本明細書中で総括的に、ヒトGLP-2（配列番号67）およびその改変体（例えば、WO 96/32414において定義され、そして例えば、本明細書中に記載される、hGLP-2（G2）（２位でアスパラギンからグリシンに置換されている改変体GLP-2（配列番号68））、およびhGLP-2（S2）（２位でアスパラギンからセリンに置換されている改変体GLP-2（配列番号69））をいう。GLP-2およびその改変体は、標準的な技術によって産生および精製され得る（例えば、WO 96/32414（この開示を本明細書中において参考として援用する）を参照のこと）。WO 96/32414は、GLP-2が、小腸および膵臓島において効果を有することを報告した。
成熟前乳児のヒアリン膜疾患は、肺内のII型肺細胞によって界面活性物質を産生せず、これにより肺胞の崩壊を生じる。KGFタンパク質産物は、ヒアリン膜疾患を処置および/または予防するのに有用である。
煙の吸入は、細気管支上皮および肺胞の壊死により、火傷損傷の後の週における罹患率および死亡率の有意な原因である。KGFタンパク質産物は、吸入損傷を処置および/または予防するのに有用である。
肺気腫は、肺胞の進行性の損失から生じる。KGFタンパク質産物は、肺気腫を処置および/または予防するのに有用である。
膵臓の障害は、内分泌関連性（例えば、I型またはII型糖尿病）であり得るか、または外分泌性関連（例えば、膵炎および膵不全または嚢胞性線維症）であり得る。I型糖尿病と診断された患者は、連続的な外因性インスリン投与を必要とする。II型糖尿病と診断された患者は、インスリン耐性/不全性の変化する段階を介して進行し、最終的には同様に外因性インスリン投与を必要とする。KGFタンパク質産物は、糖尿病の持続性の症状を軽減、遅延および/または回避するため、または変化する代謝的需要の間に血中グルコースレベルを正常化するため、さらに頻繁なまたは著明な低血糖を回避するために、膵臓のβ細胞機能を誘導することによって島細胞移植の設定における補助剤として有用である。糖尿病の標準的なモデルが公知である（Junodら、（1967）, Proc.Soc.Exp.Bio.Med. 126（1）:201-205; Rerup（1970）, Pharm. Rev., 22:485-518; Rossiniら、（1977）, P.N.A.S., 74:2485-2489; およびAr’RajabおよびAhren（1993）, Pancreas, 8:50-57、これらの開示は参考として本明細書中に援用される）。膵臓細胞増殖の標準モデルが公知である（Yiら、（1994）, American Journal of Pathology, 145（1）:80-85、これらの開示は参考として本明細書中に援用される）。
角膜細胞は、化学薬品、細菌またはウイルスに起因する角膜剥離および/または角膜腫瘍化によって損傷され得る。KGFタンパク質産物は、角膜変性を処置および/または予防するのに有用である。角膜細胞再生の標準的インビボモデルが公知である（Inatomiら、（1994）, Investigative Opthalmology and Visual Science, 35（4）:1318, Abstract 299; Sotozonoら（1994）, Investigative Opthalmology and Visual Science, 35（4）:1941, Abstract 317; Wilsonら（1994）, Investiative Opthalmology and Visual Science, 35（4）:1319, Abstract 301; Wilsonら、（1993）, The FASEB Journal, 7（3）:A493, Abstract 2857; Inatomiら、（1994）, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 35（4）:1318; Wilsonら、（1994）, Experimental Eye Research, 59（6）:665-678; およびSotozonoら、（1995）, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 36（8）:1524-1529, これらの開示は参考として本明細書中で援用される）。
KGFタンパク質産物は、歯肉疾患を処置および/または予防するのに有用である。歯肉疾患の標準的インビボモデルが公知である。
KGFタンパク質産物は、化学療法（上記のような）ならびに/または感染に関連する状態を含む潰瘍形成および/もしくは炎症状態を処置および/または予防するのに有用である。泌尿器膀胱損傷の標準的なインビボモデルが公知である（FordおよびHess（1976）, Arch.Intern.Med., 136:616-619およびDrollerら、（1982）, Urol., 20:256-258、これらの開示は、参考として本明細書中に援用される）。
KGFタンパク質産物は、鼓膜損傷を処置および/もしくは予防するのに有用である。鼓膜穿孔の標準的なインビボモデルが公知である（Clymerら、（1996）, Laryngoscope（USA）, 106（3）:280-285、この開示は参考として本明細書中で援用される）。
KGFタンパク質産物は、唾液腺組織に対する障害または損傷（放射線/化学療法の効果（上記のような）および唾液腺不全（乾燥症候群）を引き起こし得るシェーグレン症候群のような自己免疫疾患を含む）を処置および/または予防するのに有用である。唾液腺組織損傷の標準的なインビボモデルが公知である。
以下の実施例は、本発明をより完全に示すために含まれる。改変が、示された手順において、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
実施例
以下の実施例において記載される多くの手順、または適切に改変された手順についての標準的な方法は、例えば、Molecular Cloning,第二版、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1987）およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausabelら（1990）、Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, New Yorkのような分子生物学の広く認められたマニュアルに提供される。全ての化学薬品は、分析グレードまたはUSPグレードのいずれかである。
材料
以下のインビボ研究において使用された試験材料は、標準的な技術（WO 96/11949）を用いて、KGFのアミノ末端の最初の23アミノ酸の欠失を有するKGF（すなわち、ΔN23 KGF）であった。全てのタンパク質を、E.coliにおける組換え発現によって産生し、そして均質に精製した。各タンパク質を、皮下処方物として投与した。
hGLP-2（G2）ポリペプチドを、Fmoc（フルオレニルメトキシカルボニル／t-ブチルベースの固相ペプチド化学法によって合成した。シングルカップリングプログラムに有用なABI 431A（Perkin Elmer Corp., Foster City, CA）ペプチド合成機を使用して、鎖集合を行った。市販の先行荷重Fmoc-アミノ酸-HMP（ヒドロキシメチル-フェニルアセチル）誘導体化ポリスチレン樹脂を使用して、カルボキシ末端酸ペプチドを調製した。続いてアミノ酸を、HOBT（ヒドロキシベンズトリアゾール）エステルとしてカップリングした。側鎖保護を、以下のように使用した：Arg（PMC（2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル）、Asn（Trt）、Asp（OtBu）、Cys（Trt）、Gln（Trt）、Glu（OtBu）、His（Trt）、Lys（Boc）、Ser（tBu）、Thr（tBu）、およびTyr（tBu）。Gly（FmocHmb）を取り込んで、アスパルチミド（aspartimide）またはピペリジド副産物の形成の危険を除去した。最終N-末端Fmocの除去の際に、側鎖保護基を除去し、そしてペプチドを、TFA：トリイソプロピルシラン：水：フェノール（85:5:5:5）とともに４時間処置することによって、樹脂から切断した。得られる懸濁物を濾過し、そして濾液の容量を、回転エバポレーションによって減少した。粗ペプチドを沈殿させ、そしてエーテルで洗浄し、次いで真空で一晩乾燥させた。
全ての粗ペプチドを、分離用（2.5cm×25cm）Vydac C18カラムにて、99.95％アセトニトリル＋0.05％TFA：0.1％水性TFAの直線勾配で、逆相HPLCによって＞95％均質まで精製した。
合成ペプチドについての質量スペクトルを、Sciex API（Perkin Elmer Corp.）single quadropole質量分析計で得た。全ての質量スペクトルサンプルは、分離用HPLC精製からの画分であった。
アミノ酸分析を、130A分離系を備えたABI 420A hydrolyzer/derivatizer（Perkin Elmer Corp.）で行った。ペプチドを、６N HClを用いて200℃にて30分間加水分解し、次いでPTC（フェニルイソチオシアネート）誘導体として誘導体化した。次いで、アミノ酸混合物を、５ミクロンポアサイズ、2.1×220mmのBrownlee PTC C18で、70％アセトニトリル：水の直線勾配で、HPLCによって分離した。両方の溶媒を、酢酸ナトリウムで、pH=5.4に緩衝化した。アミノ酸決定を、未知のピーク比の等モルアミノ酸標準との比較によって定量した。
実施例１：正常動物の腸管成長
正常BDFlマウスを、ΔN23 KGFを５mg/kg/日の単独の単回注射として毎日与えるか、hGLP-2（G2）を30μg/注射の１日２回の注射として与えるか、またはその両方で処置した。マウスを６日間処置し、そして７日目に腸の摘出のために安楽死させた。全長の小腸を摘出し、そして長さを測定するために５g張力下でつるし、そして３つのセグメントに解体した。最初の10cmを、十二指腸と称し、最後の10cmを回腸と称し、そして残りの中央部分を、空腸と称した。これらのセグメントを、氷冷生理食塩水でフラッシュし、たたいて乾燥させ、そして重量を量った。平均湿潤重量値を、コントロールに相関するパーセント増加に変換し、そしてデータを、以下の表２に示す。
0004091988.tif 000003
表２に見られるように、hGLP-2（G2）またはΔN23 KGFの単独投与での処置は、各々、腸の湿潤重量に有意な効果を有した。驚くべくことに、ΔN23 KGFおよびhGLP-2（G2）での前処置は、腸の湿潤重量の増加に相乗効果を示した。
実施例２-化学治療誘導した粘膜性モデル
化学治療誘導した粘膜の動物モデルを使用して、ΔN23 KGFとhGLP-2（G2）との組合せ治療を研究した。
5-フルオロウラシル（Roche Laboratories, Nutley NJ）で処置したマウス（15／群）を、ビヒクル単独（生理食塩水）、およびΔN23 KGF（0.1M重炭酸アンモニウム中生理食塩水および／またはhGLP-2（G2）に処方した）で、以下のスケジュールにしたがって投与した：
コントロール群：−２〜０日で、一群のマウスに、−２〜０日で生理食塩水を投与し、そして１〜４日で5-フルオロウラシル（5-FU、60mg/kg/日）を腹腔内注射した。
ΔN23 KGF前処置：−２〜０日で、一群のマウスに、ΔN23 KGF（５mg/kg）を皮下注射した。１〜４日で、マウスに、5-フルオロウラシル（5-FU、60mg/kg/日）を腹腔内注射した。
hGLP-2（G2）前処置：−５〜０日で、一群のマウスに、hGLP-2（G2）（３mg/kg（分割用量））を皮下注射した。１〜４日で、マウスに、5-フルオロウラシル（5-FU、60mg/kg/日）を腹腔内注射した。
ΔN23 KGFおよびhGLP-2（G2）前処置：−２〜０日で、一群のマウスに、hGLP-2（G2）（３mg/kg（分割用量））を皮下注射し、そしてΔN23 KGF（５mg/kg）を皮下注射した。１〜４日で、マウスに、5-フルオロウラシル（5-FU、60mg/kg/日）を腹腔内注射した。
種々の群の体重および生存性における効果を分析した。体重を、０日から30日の終結まで毎日測定した。マウスを、疾病率の徴候について、30日間２回／日で、視覚的に試験し、そして消耗しかかっている全ての動物を安楽死させた。６日の最下点における体重におけるパーセント変化を、表３に示す。
0004091988.tif 000004
表３に見られるように、単独投与されたhGLP-2（G2）での前処置は、体重減少を防がながったが、単独投与されたΔN23 KGFでの前処置は、有意な効果を示した。ΔN23 KGFおよびhGLP-2（G2）での前処置は、ΔN23 KGFまたはhGLP-2（G2）単独での前処置に比べて改良を示した。肝臓膿瘍は、一般的に、コントロールに見られるが、ΔN23 KGF前処置した生存マウスには見られず、これは5-FUの毒性は、胃腸障壁機能の欠失に一部起因することを示す。さらに、ΔN23 KGF前処置マウスは、ほとんど体重を減少せず、5-FU処置期間の間に、より多い食物および水を消費する。
ΔN23 KGFでの前処置は、生理食塩水に比べて、30日での生存性を増加した（75％対35％）が、同時処置は増加しなかった（０％対35％）。ΔN23 KGFおよびhGLP-2（G2）での前処置は、全ての動物が30日間生存させた。前処置としてΔN23 KGFを同時に与えたhGLP-2（G2）は、前処置としてΔN23 KGF単独を与えた群における生存性と比べて、生存性を有意に改善した。
本発明は、一般的および好ましい実施態様の観点の両方で上に記載されているが、他の改変および改良が、上記に照らして、当業者になされることが理解される。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：アムジェン  インコーポレーション
（ii）発明の名称：ケラチノサイト増殖因子およびその使用
（iii）配列数：69
（iv）連絡住所：
（A）名称：アムジェン  インコーポレイテッド
（B）番地：デハビランド  ドライブ  1840
（C）市：サウザンド  オークス
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：91320-1789
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピー ディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン  リリース#1.0, バージョン#1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：まだ知らされていない
（B）出願日：1997年12月8日
（C）分類：
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：US 60/032,533
（B）出願日：1996年12月6日
（vii）先願データ：
（A）出願番号：US 60/062,074
（B）出願日：1997年10月15日
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：ジンドリック, トーマス ディ．
（B）登録番号：32,185
（C）照会／記録番号：A-481B
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：862塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：108..692
（xi）配列：配列番号１：
0004091988.tif 000005
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：195アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２：
0004091988.tif 000006
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：495塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..495
（xi）配列：配列番号３：
0004091988.tif 000007
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：165アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号４：
0004091988.tif 000008
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：483塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..483
（xi）配列：配列番号５：
0004091988.tif 000009
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：161アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号６：
0004091988.tif 000010
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：480塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..480
（xi）配列：配列番号７：
0004091988.tif 000011
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：160アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号８：
0004091988.tif 000012
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：468塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..468
（xi）配列：配列番号９：
0004091988.tif 000013
（2）配列番号10の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：156アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号10：
0004091988.tif 000014
（2）配列番号11の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：465塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..465
（xi）配列：配列番号11：
0004091988.tif 000015
（2）配列番号12の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：155アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号12：
0004091988.tif 000016
（2）配列番号13の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：450塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..450
（xi）配列：配列番号13：
0004091988.tif 000017
（2）配列番号14の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：150アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号14：
0004091988.tif 000018
（2）配列番号15の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：447塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..447
（xi）配列：配列番号15：
0004091988.tif 000019
（2）配列番号16の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：149アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号16：
0004091988.tif 000020
（2）配列番号17の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：444塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..444
（xi）配列：配列番号17：
0004091988.tif 000021
（2）配列番号18の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：148アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号18：
0004091988.tif 000022
（2）配列番号19の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：441塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..441
（xi）配列：配列番号19：
0004091988.tif 000023
（2）配列番号20の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：147アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号20：
0004091988.tif 000024
（2）配列番号21の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：438塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..438
（xi）配列：配列番号21：
0004091988.tif 000025
（2）配列番号22の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：146アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号22：
0004091988.tif 000026
（2）配列番号23の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：435塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..435
（xi）配列：配列番号23：
0004091988.tif 000027
（2）配列番号24の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：145アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号24：
0004091988.tif 000028
（2）配列番号25の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：432塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..432
（xi）配列：配列番号25：
0004091988.tif 000029
（2）配列番号26の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：144アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号26：
0004091988.tif 000030
（2）配列番号27の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：429塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..429
（xi）配列：配列番号27：
0004091988.tif 000031
（2）配列番号28の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：143アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号28：
0004091988.tif 000032
（2）配列番号29の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号29：
0004091988.tif 000033
（2）配列番号30の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号３０：
0004091988.tif 000034
（2）配列番号31の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：423塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..423
（xi）配列：配列番号31：
0004091988.tif 000035
（2）配列番号32の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：141アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号32：
0004091988.tif 000036
（2）配列番号33の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：495塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..495
（xi）配列：配列番号33：
0004091988.tif 000037
（2）配列番号34の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：165アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号34：
0004091988.tif 000038
（2）配列番号35の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：495塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..495
（xi）配列：配列番号35：
0004091988.tif 000039
（2）配列番号36の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：165アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号36：
0004091988.tif 000040
（2）配列番号37の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号37：
0004091988.tif 000041
（2）配列番号38の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号38：
0004091988.tif 000042
（2）配列番号39の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：495塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..495
（xi）配列：配列番号39：
0004091988.tif 000043
（2）配列番号40の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：165アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号40：
0004091988.tif 000044
（2）配列番号41の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：495塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..495
（xi）配列：配列番号41：
0004091988.tif 000045
（2）配列番号42の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：165アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号42：
0004091988.tif 000046
（2）配列番号43の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：495塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..495
（xi）配列：配列番号43：
0004091988.tif 000047
（2）配列番号44の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：165アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号44：
0004091988.tif 000048
（2）配列番号45の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号45：
0004091988.tif 000049
（2）配列番号46の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号46
0004091988.tif 000050
（2）配列番号47の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号47：
0004091988.tif 000051
（2）配列番号48の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号48：
0004091988.tif 000052
（2）配列番号49の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号49：
0004091988.tif 000053
（2）配列番号50の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号50：
0004091988.tif 000054
（2）配列番号51の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号51：
0004091988.tif 000055
（2）配列番号52の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号52：
0004091988.tif 000056
（2）配列番号53の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号53：
0004091988.tif 000057
（2）配列番号54の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号54：
0004091988.tif 000058
（2）配列番号55の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号55：
0004091988.tif 000059
（2）配列番号56の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号56：
0004091988.tif 000060
（2）配列番号57の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号57：
0004091988.tif 000061
（2）配列番号58の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号58：
0004091988.tif 000062
（2）配列番号59の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号59：
0004091988.tif 000063
（2）配列番号60の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号60：
0004091988.tif 000064
（2）配列番号61の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号61：
0004091988.tif 000065
（2）配列番号62の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号62：
0004091988.tif 000066
（2）配列番号63の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号63：
0004091988.tif 000067
（2）配列番号64の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号64：
0004091988.tif 000068
（2）配列番号65の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表わす記号：CDS
（B）存在位置：1..426
（xi）配列：配列番号65：
0004091988.tif 000069
（2）配列番号66の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：142アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号66：
0004091988.tif 000070
（2）配列番号67の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：33アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号67：
0004091988.tif 000071
（2）配列番号68の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：33アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号68：
0004091988.tif 000072
（2）配列番号69の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：33アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号69：
0004091988.tif 000073
【図１】
0004091988.tif 000074
【図２】
0004091988.tif 000075
【図３】
0004091988.tif 000076
【図４】
0004091988.tif 000077
【図５】
0004091988.tif 000078
【図６】
0004091988.tif 000079
【図７】
0004091988.tif 000080
【図８】
0004091988.tif 000081
【図９】
0004091988.tif 000082
【図１０】
0004091988.tif 000083
【図１１】
0004091988.tif 000084
【図１２】
0004091988.tif 000085
【図１３】
0004091988.tif 000086
【図１４】
0004091988.tif 000087
【図１５】
0004091988.tif 000088
【図１６】
0004091988.tif 000089
【図１７】
0004091988.tif 000090
【図１８】
0004091988.tif 000091
【図１９】
0004091988.tif 000092
【図２０】
0004091988.tif 000093
【図２１】
0004091988.tif 000094
【図２２】
0004091988.tif 000095
【図２３】
0004091988.tif 000096
【図２４】
0004091988.tif 000097
【図２５】
0004091988.tif 000098
【図２６】
0004091988.tif 000099
【図２７】
0004091988.tif 000100
【図２８】
0004091988.tif 000101
【図２９】
0004091988.tif 000102
【図３０】
0004091988.tif 000103
【図３１】
0004091988.tif 000104
【図３２】
0004091988.tif 000105
【図３３】
0004091988.tif 000106