(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
0004160149.tif 000005
で表されるＡＣＡＴ阻害活性を有する化合物である新規ＦＯ−６９７９物質。
【請求項２】
ボーベリア属に属し、請求項１に記載のＦＯ−６９７９物質を生産する能力を有するボーベリア  エスピー  ＦＯ−６９７９（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．ＦＯ−６９７９  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１６）を培地に培養し、培養液中にＦＯ−６９７９物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＯ−６９７９物質を採取することを特徴とする新規ＦＯ−６９７９物質の製造法。
【請求項３】
ボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１６）株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ＦＯ−６９７９物質およびその製造法に関する。更に詳しくは、アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素阻害作用を有する新規物質、ＦＯ−６９７９物質およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食生活の向上に伴い成人の高脂血症や動脈硬化などコレステロール蓄積に起因する症状が現代病として問題視されている。コレステロールはアシルコエンザイムＡのアシル基転位によりコレステロールエステルとなり、細胞内および血中リポ蛋白に蓄積される。このアシル基転位反応を触媒する酵素がアシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素であり、コレステロールの腸管からの吸収、肝臓でのリポタンパク質生成および冠動脈における泡末細胞の形成に深くかかわっている（Ｓｌｉｓｋｏｖｉｃ，Ｄ．Ｒ．とＷｈｉｔｅ，Ａ．Ｄ．Ｔｒｅｎｄ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１２巻、１９４〜１９９頁、１９９１年）。
従って、アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素を阻害する物質は、かかる疾病に有効であることが推察される。しかし、現在まで、このような作用機構に基づく医薬品の開発には至っていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
かかる実情において、アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素阻害活性を有する物質を提供することは、高脂血症やそれに基づく動脈硬化などの成人病の新しい予防および治療法を提供するものであり有用なことである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物の生産する代謝産物について研究を続けた結果、新たに土壌から分離したＦＯ−６９７９株の培養中にアシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素阻害活性を有する物質が産生されることを見出した。次いで、該培養物から該アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素阻害活性物質を分離、精製した結果、このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、本物質をＦＯ−６９７９と称することにした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記式
【０００５】
【化２】
0004160149.tif 000002
で表される化合物である新規ＦＯ−６９７９物質に関するものである。
【０００６】
本発明はさらに、ボーベリア属に属し、ＦＯ−６９７９物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養液中にＦＯ−６９７９を蓄積せしめ、該培養物からＦＯ−６９７９物質を採取する新規ＦＯ−６９７９物質の製造法に関するものである。
【０００７】
本発明はまた、ボーベリア属に属し、ＦＯ−６９７９物質を生産する能力を有する微生物が、ボーベリア  エスピー  ＦＯ−６９７９（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．ＦＯ−６９７９  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１６）である。更に本発明は、ボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９（ＦＥＲＭＰ−１６７１６）株に関するものである。
【０００８】
前記の式で表されるＦＯ−６９７９物質を生産する能力を有する微生物（以下、「ＦＯ−６９７９物質生産菌」と称する）は、ボーベリア属に属するが、例えば本発明者らが新たに土壌から分離したボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９株は、本発明において最も有効に使用される株の一例である。本ＦＯ−６９７９株の菌学的性状を示すと、以下の通りである。
【０００９】
１．形態的性質
本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、コーン・ミール寒天培地、麦芽汁寒天培地、三浦寒天培地などで良好に生育し、分生子の着生も良好である。また、イーストエキストラクト・ソルブルスターチ寒天培地での生育は良好であるが、分生子の着生は観察されなかった。
【００１０】
コーン・ミール寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は透明で隔壁を有している。分生子柄は基底菌糸より直接、あるいは短い枝から生じる。分生子柄の基部は球状あるいはフラスコ状に膨らんで大きさ２．０〜３．３×２．５〜３．７μｍとなる。先端は細く伸長し、分生子形成にしたがってジグザグ状になり、長さ１２〜２０μｍとなる。分生子は分生子柄の小突起（約１μｍ）上に出芽形成し、球形あるいは、幅広い楕円形でときに基部はとがり、無色で大きさ１．８〜２．５×２．５〜３．３μｍである。
【００１１】
２．各種培地上での培養性状
本菌株を各種寒天培地上で２５℃、１４日間培養した場合の肉眼的に観察した結果は下記表１に示す通りである。なお、下記の培地において、菌核または菌核様の構造は形成されない。
【００１２】
【表１】
0004160149.tif 000003
【００１３】
３．生理的、生態的性状
（１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、ｐＨ４〜７、温度１５〜３０℃である。
（２）生育範囲
本菌株の生育範囲は、ｐＨ４〜１０、温度１１〜３２℃である。
（３）好気性、嫌気性の区別      好気性
【００１４】
以上のように、本菌株ＦＯ−６９７９株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属に属する一菌株と同定し、ボーベリア  エスピー  ＦＯ−６９７９と命名した。なお、本菌株はボーベリア  エスピー  ＦＯ−６９７９（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．ＦＯ−６９７９）として、茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在する工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年３月１８日にＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１６として寄託されている。
【００１５】
本発明で使用されるＦＯ−６９７９物質生産菌としては、前述のボーベリアエスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９菌株が好ましい例として挙げられるが、菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等を用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ボーベリア属に属し、ＦＯ−６９７９物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
【００１６】
また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株も含め、ボーベリア属に属し、前記の式で表されるＦＯ−６９７９物質（以下、特記しない限り「ＦＯ−６９７９物質」と称する）を生産する菌株は、全て本発明において使用することができる。
【００１７】
本発明を実施するに当たっては、先ずボーベリア属に属するＦＯ−６９７９物質生産菌を培地に培養することにより行われる。上記ＦＯ−６９７９物質生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉等の糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
【００１８】
窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類等が単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、その他本ＦＯ−６９７９物質の生産に好適なものが適宜添加される。
【００１９】
培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフイン、動物油、植物油、シリコン等、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記の栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい。少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。
【００２０】
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
【００２１】
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込み等既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを使用する。培養温度は、本ＦＯ−６９７９物質生産菌が本ＦＯ−６９７９物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２０〜３０℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは、通常は５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は１０〜２０日程度である。
【００２２】
このようにして得られたＦＯ−６９７９物質は培養菌体および培養ろ液に存在する。培養物から目的とするＦＯ−６９７９物質を採取するには、全培養物をアセトン等の水混和性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧下有機溶媒を留去後、続いて残渣を酢酸エチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行われる。
【００２３】
上記の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは繰り返すことにより、ＦＯ−６９７９物質を分離、精製することができる。
【００２４】
本発明によるＦＯ−６９７９物質の理化学的性状は次のとおりである。
（１）性状：白色粉末
（２）分子量：４８７（高速原子衝撃質量分析による）
（３）分子式：Ｃ27Ｈ41Ｎ3 Ｏ5 
（４）比旋光度：［α］D 23＝−３７．８°（ｃ＝０．３、クロロホルム：メタノール＝４：１）
【００２５】
（５）紫外部吸収極大（メタノール中）：図１に示すとおり、２１５ｎｍ（ε＝２７３００に吸収を有する。
（６）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：図２に示すとおり、１５３９、１６３９、１６８６、１７２６ｃｍ-1に極大吸収を有する。
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム：重メタノール＝４：１）：図３に示すとおり。
（８）13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム：重メタノール＝４：１）：図４に示すとおり。
【００２６】
（９）溶剤に対する溶解性：メタノール、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチルに可溶。水、ヘキサンに難溶。
（１０）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸に陽性。
（１１）酸性、中性、塩基性の区別：中性物質。
【００２７】
以上に詳しく述べたように、本ＦＯ−６９７９物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを検討した結果、本ＦＯ−６９７９物質は次の化学構造であることが決定された。
【００２８】
【化３】
0004160149.tif 000004
【００２９】
次に、本発明のＦＯ−６９７９物質の生物学的性状および毒性について詳しく述べる。
（１）マウス由来アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素に対す
る阻害作用
アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素活性は、Ｕｅｌｍｅｎらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０巻、２６１９２〜２６２０１頁、１９５５年）を一部改変して行った。
酵素源としては、マウス肝ミクロソーム及びマウス腹腔マクロファージ由来の膜画分を用いた。マウス肝は緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス塩酸液（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオリド）中でポッター型ホモジナイザー（Ｔｏｋｙｏ−ＲＩＫＯ社製）でホモジナイズする。
【００３０】
これを１２，０００×ｇで遠心した上清を１００，０００×ｇで超遠心した沈渣をミクロソーム画分とした。一方、腹腔マクロファージは緩衝液Ａで懸濁後、超音波機（Ｍｉｓｏｎｉｘ社製）で破壊後、１００，０００×ｇで超遠心し、その沈渣を膜画分とした。いずれの画分も５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度となるように緩衝液Ａで調製した。
【００３１】
アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素活性の測定は、緩衝液Ａ中で酵素源２００μｇ蛋白量、２００ｍＭ牛血清アルブミン、〔１−14Ｃ〕オレオイルコエンザイムＡ（最終濃度１７０μＭ、０．０９μＣｉ）とＦＯ−６９７９物質を加え全量１００μｌとして、３７℃で１０分間反応させた。
【００３２】
次いでそこに、０．５ｍｌエタノールを加えて反応を停止させ、１．５ｍｌヘキサンを加えてよく攪拌した。ヘキサン層１ｍｌを乾固後、ＴＬＣ（シリカゲルプレート、メルク社製、厚さ０．５ｍｍ）にスポットし、石油エーテル／ジエチルエーテル／酢酸（９０：１０：１、ｖ／ｖ）の溶媒で展開した。次に生成した〔14Ｃ〕コレステリルオレートの量をラジオスキャナー（アンビス社製）で定量した。
【００３３】
その結果、ＦＯ−６９７９物質のアシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）は、マウス肝ミクロソームを酵素源としたときは２１μＭ、そしてマウス腹腔マクロファージ膜画分を酵素源としたときは１０μＭと測定された。
【００３４】
（２）マウス腹腔マクロファージ内でのコレステリルエステル及び油滴形成に対する阻害作用
マウス腹腔マクロファージ内でのコレステリルエステル形成および油滴形成は西川らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５巻、５２２６〜５２３１頁、１９９０年）を一部改変して行った。
マウス腹腔より単離したマクロファージを６．８％リポ蛋白質欠乏血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（６．８％ＬＰＤＳ−ＤＭＥＭ培地）に２．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁して、４８穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）あるいはスライドチャンバー（Ｎｕｎｃ社製）に０．２５ｍｌずつまく。
【００３５】
次に、５％炭酸ガスインキュベーター内で３７℃で２時間培養を行った後、付着しない細胞をハンクス液（Ｈａｎｋｓ’ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄することにより除去する。洗浄後、６．８％ＬＰＤＳ−ＤＭＥＭ培地で一時間培養した後、ＦＯ−６９７９物質（２．５μｌメタノール溶液）、リポソーム（１０μｌの０．３Ｍグルコース中にホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン／ジセチルホスフェート／コレステロール＝１０：１０：２：１５（ｎｍｏｌ）の組成から構成されている）及び〔１−14Ｃ〕オレイン酸（５μｌ、０．０５μＣｉ、１ｎｍｏｌ）を添加し、さらに１４時間培養した。
【００３６】
培養後上清を除去し、細胞内中性脂質をヘキサン０．６ｍｌとイソプロパノール０．４ｍｌを加えて２回抽出した。これを濃縮後、ＴＬＣ（シリカゲルプレート、メルク社製、厚さ０．５ｍｍ）にスポットし、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０：３０：１、ｖ／ｖ）の溶媒で展開し、分離した〔14Ｃ〕コレステリルオレートと〔14Ｃ〕トリアシルグリセロールの量をラジオスキャナー（アンビス社製）で定量した。その結果、ＦＯ−６９７９物質は〔14Ｃ〕コレステリルオレートの生成を選択的に阻害し、そのＩＣ50値は０．４１μＭと測定された。
【００３７】
一方、細胞内に形成した油滴は、マクロファージを６．８％ＬＰＤＳ−ＤＭＥＭ培地でＦＯ−６９７９物質と上記リポソームで１４時間培養後、油滴及び核をそれぞれオイルレッドＯ（ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ）及びヘマトキシリンで二重染色し、光学顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。その結果、ＦＯ−６９７９物質１０μＭ存在下で、細胞質に蓄積する油滴の量は薬剤無添加（コントロール）と比較すると約５０％に減少していた。
【００３８】
（３）毒性試験
ＦＯ−６９７９物質は、マウス腹腔マクロファージの生育に対して最終濃度２０μＭでも全く毒性を示さなかった。
また、ＦＯ−６９７９物質を１００ｍｇ／ｋｇでマウス腹腔内に投与したが、何ら毒性変化は認められなかった。
【００３９】
以上に詳しく述べたように、本発明のＦＯ−６９７９物質は毒性が低く、アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素に対して特異的な阻害を示し、マクロファージ内での油滴形成を阻害することから、ヒトのコレステロール蓄積に起因する疾病の予防治療に有用であると期待される。
【００４０】
【実施例】
５００ｍｌ容三角フラスコにグルコース２．０％、ポリペプトン０．５％、イーストエキストラクト０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．１％、アガー０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０５％を水道水で溶解した培地（ｐＨ６．０に調整）１００ｍｌを仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、寒天培地上に生育させたボーベリアエスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１６）を白金耳にて無菌的に接種し、２７℃で３日間振とう培養して種培養液を得た。
【００４１】
一方、１０００ｍｌ容ルー型フラスコ５０本それぞれにスクロース２．０％、グルコース１．０％、コーンスチープパウダー０．５％、肉エキス０．５％、炭酸カルシウム０．３％、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．１％、アガー０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００１％、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ  ０．００１％、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００１％、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ  ０．００１％、ＣｏＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ  ０．００１％、を水道水で溶解した培地（ｐＨ６．０に調整）２００ｍｌを仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、種培養した培養液２ｍｌを無菌的に移植し、２７℃で１４日間静置培養した。
【００４２】
培養後、培養液１０リットルをアセトン１０リットルで処理してろ過した後、ろ液を減圧濃縮してアセトンのみを留去し、水溶液を得た。次いで、その水溶液を酢酸エチル１０リットルで抽出し、抽出液を減圧濃縮して粗製物９．４ｇを得た。この粗製物をＯＤＳゲル（４７０ｇ、ペガシル、センシュー科学社製）のカラムにチャージし、４０％〜１００％アセトニトリル、１００％クロロホルム（各５００ｍｌ）で溶出するカラムクロマトグラフィーを行った。
【００４３】
各フラクションは４０ｍｌずつ分画し、活性成分を含む７０％〜１００％アセトニトリル、１００％クロロホルム画分を集め、減圧乾固して粗活性黄色物質６０５ｍｇを得た。更に、粗活性物質をシリカゲル（３０ｇ、シリカゲル６０、メルク社製）のカラムにチャージし、クロロホルム−メタノール（１００：１〜０：１００）（各１００ｍｌ）で溶出するカラムクロマトグラフィーを行った。各フラクションは１０ｍｌずつ分画し、活性成分を含むクロロホルム−メタノール（１００：２〜１００：３）画分を集め、減圧乾固して粗活性白色物質１６８ｍｇを得た。
【００４４】
これを５０回に分けて高速液体クロマトグラフィーにより分離、精製した。装置はモデルＳＤ−２００（ＲＡＮＩＮ社製）を用い、カラムはＹＭＣ−ＰａｃｋＳ−５（ＯＤＳ系樹脂、２０×２５０ｍｍ、山村科学研究所社製）を用い、溶媒系は５２．５％のアセトニトリル水を用い、検出はＵＶ２１５ｎｍ、流速は６ｍｌ／分で行った。その結果、ＦＯ−６９７９物質１５ｍｇを単離した。
【００４５】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明の新規ＦＯ−６９７９物質は、毒性が低く、アシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素を特異的に阻害することから、ヒトのコレステロール蓄積に起因する疾病の予防および治療に有用であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＦＯ−６９７９物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
【図２】本発明のＦＯ−６９７９物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
【図３】本発明のＦＯ−６９７９物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム：重メタノール＝４：１）を示したものである。
【図４】本発明のＦＯ−６９７９物質の13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム：重メタノール＝４：１）を示したものである。
【図１】
0004160149.tif 000006
【図２】
0004160149.tif 000007
【図３】
0004160149.tif 000008
【図４】
0004160149.tif 000009