(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から成る群から選ばれる繊維芽細胞増殖因子（FGF）同族ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド分子：
ａ）SEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82〜ヌクレオチド621のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
ｂ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）〜アミノ酸残基207（Ala）のアミノ酸配列と90％以上同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び
ｃ）SEQ ID NO：６に示すヌクレオチド82〜ヌクレオチド621のヌクレオチド配列；
を含んで成るポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチド分子がSEQ ID NO：１に示すヌクレオチド１〜ヌクレオチド621又はSEQ ID NO：６に示すヌクレオチド１〜ヌクレオチド621のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド分子がSEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82〜ヌクレオチド621のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１記載の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
下記の作用可能式に連結した要素を含んで成る発現ベクター：
転写プロモーター；
下記から成る群から選ばれるDNAセグメント：
ａ）SEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82〜ヌクレオチド621のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
ｂ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）〜アミノ酸残基207（Ala）のアミノ酸配列と90％以上同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び
ｃ）SEQ ID NO：６に示すヌクレオチド82〜ヌクレオチド621のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；並びに
転写ターミネーター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターが導入されている培養細胞であって、前記DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項７】
FGF同族ポリペプチドを製造するための方法であって：
請求項５記載の発現ベクターを導入した細胞を培養し、当該細胞に前記DNAセグメントによりコードされるFGF同族ポリペプチドを発現させる；そして
前記FGF同族ポリペプチドを回収する；
ことを含んで成る方法。
【請求項８】
下記から成る群から選ばれる単離FGF同族ポリペプチド：
ａ）SEQ ID NO：２に示す残基28（Glu）〜残基175（Met）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；及び
ｂ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）〜アミノ酸残基175（Met）と90％以上同一であるポリペプチド分子。
【請求項９】
下記から成る群から選ばれる単離FGF同族ポリペプチド：
ａ）SEQ ID NO：２に示す残基28（Glu）〜残基196（Lys）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；及び
ｂ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）〜アミノ酸残基196（Lys）と90％以上同一であるポリペプチド分子。
【請求項１０】
下記から成る群から選ばれる単離FGF同族ポリペプチド：
ａ）SEQ ID NO：２に示す残基28（Glu）〜残基207（Ala）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；及び
ｂ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）〜アミノ酸残基207（Ala）と90％以上同一であるポリペプチド分子。
【請求項１１】
シグナル配列を更に含んで成る、請求項８記載のFGF同族ポリペプチド。
【請求項１２】
SEQ ID NO：２に示すアミノ酸残基１（Met）〜アミノ酸残基27（Ala）のシグナル配列を更に含んで成る請求項８記載のFGF同族ポリペプチド。
【請求項１３】
薬理学的に許容されるビヒクルを組合さった、請求項８記載の精製FGF同族ポリペプチドを含んで成る薬理組成物。
【請求項１４】
SEQ ID NO：２に示す残基１（Met）〜残基207（Ala）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子のエピトープに結合する抗体。
【請求項１５】
SEQ ID NO：２に示す残基28（Gla）〜残基196（Lys）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子に結合する請求項14記載の抗体。
【請求項１６】
筋細胞又は先祖筋細胞の増殖を刺激するための方法であって、かかる刺激を要するヒトを除く哺乳動物に、当該動物中の筋細胞又は先祖筋細胞の数を臨床学的に有意に増加させるのに十分な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子によりコードされるFGF同族ポリペプチド又は請求項８〜12のいずれか１項に記載のFGF同族ポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
【請求項１７】
前記筋細胞又は先祖筋細胞が心筋細胞又は先祖心筋細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
先祖筋細胞又は筋細胞のex vivo刺激のための方法であって、心臓細胞を請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子によりコードされるFGF同族ポリペプチド又は請求項８〜12のいずれか１項に記載のFGF同族ポリペプチドと、当該FGF同族ポリペプチドの非存在下で培養した心臓組織先祖筋細胞又は筋細胞と比べて当該FGF同族ポリペプチドの存在下で培養した心臓組織細胞における先祖筋細胞又は筋細胞の数が増大するのに十分な量で一緒に培養することを含んで成る方法。
【請求項１９】
前記筋細胞又は先祖筋細胞が心筋細胞又は先祖心筋細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
剤又は薬剤をヒトを除く哺乳動物の心臓組織に選択的に輸送する方法であって：
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子によりコードされるFGF同族ポリペプチド又は請求項８〜12のいずれか１項に記載のFGF同族ポリペプチドを含んで成る第一分子を剤又は薬剤を含んで成る第二分子と連結してキメラを形成し；そして
当該キメラを心臓組織に投与する；
ことを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
繊維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーは少なくとも９つの個別の構成員から成り（BasilicoらAdv. Cancer Res. 59：115-165, 1992及びFernigらProg. Growth Factor Res. 5（4）：353-377, 1994）、それらは一般に細胞の広域スペクトルにとってのマイトジェン因子として作用する。例えば、塩基性FGF（FGF−２としても知られる）は内皮細胞、脈管平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び中胚葉又は神経外胚葉起源の細胞のためにin vitroで分裂促進性である（GospodarowiczらJ. Cell. Biol. 70：395-405, 1976；GospodarowiczらJ. Cell. Biol. 89：568-578, 1981及びKardami, J. Mol. Cell. Biochem. 92：124-134, 1990）。in vivoで、bFGFは鳥類心臓発達において役割を果たし（Sugiら、Dev. Biol. 168：567-574, 1995及びMimaら、Proc. Natl. Acad. Sci. 92：467-471, 1995）、そしてイヌにおいて冠状側副枝の発達を誘導することが示されている（Lazarousら、Circulation 94：1074-1086, 1996）。更に、FGFファミリーの様々な構成員に関して非分裂促進活性が示されている。酸性及び／又は塩基性FGFに関わる非増殖活性には、組織プラスミノゲンアクチベーターの内皮放出の増大、細胞外マトリックス合成の刺激、内皮細胞の化学走性、心筋細胞における胎児収縮遺伝子の誘導発現（Parkerら、J. Clin. Invest. 85：507-514, 1990）及び増大した下垂体ホルモン応答（Bairdら、J. Cellular Physiol. ５：101-106, 1987）が挙げられる。
FGFファミリーのいくつかの構成員はシグナル配列（aFGF, bFGF及び可能としてはFGF−９）をもたず、それ故分泌されないと予測されうる。更に、FGFファミリー構成員のいくつかは細胞核へと移動する能力を有する（Frieselら、FASEB ９：919-925, 1995）。FGFファミリーの構成員は全て構造的類似性によりヘパリンに結合する。構造の相同性は種間にわたるものであり、その構造／機能関係の保存が示唆される（Ornitzら、J. Biol. Chem. 271（25）：15292-15297, 1996）。
４種類の既知の細胞外FGFレセプターがあり（FGFR）、そしてそれらは全てチロシンキナーゼである。一般に、FGFファミリーの構成員は全ての公知のFGFRに結合するが、特定のFGFは特定のレセプターに高度の親和力をもって結合する。FGFファミリー内の特異性に関するその他の意義は胚形成の際のリガンド及びそのレセプターの位置及び時期的発現である。FGFはそのヘパリン結合親和力に基づきほとんどオートクライン式及び／又はパラクライン式でしか働かないようである証拠が提示されており、これは放出部位からのその拡散を制約するものである（Flaumenhaftら、J. Cell. Biol. 111（4）：1651-1659, 1990）。塩基性FGFはシグナル配列を欠き、それ故パラクライン又はオートクライン作用態様に限定される。塩基性FGFは細胞内貯蔵され、そして組織損傷により放出されるものと推定されている。塩基性FGFはヘパリン結合部位とは異なる２つのレセプター結合領域を有することが示されている（Abrahamら、EMBO J. 5（10）：2523-2528, 1986）。
FGFR−３は骨の成長において役割を果たしていることが示されている。FGFR−３に対してホモ接合ヌルとされているマウス（−／−）は生後骨格異常をもたらす（Colvinら、Nature Genet. 12：309-397, 1996及びDengら、Cell 84：911-921, 1996）。突然変異表現型は正常マウスにおいて、FGFR−３が骨の増殖板領域における軟骨細胞分裂の調節において機能することを示唆する（Goldfarb, Cytokine and Growth Factor Rev. 7（4）：311-325, 1996）。骨増殖板におけるFGFR−３に対するリガンドは同定されていない。
４種のFGFRが同定されているが、全て機能的なスプライス変異体を有することが示されており、親和FGFレセプターがかなり存在する可能性がある。例えば、FGF−８aアイソフォームについてのレセプターは同定されていない（MacArthurら、J. Virol. 69（4）：2501-2507, 1995）。
FGF−８は本来乳癌腫細胞からアンドロゲン−誘導性マイトジェンとして単離されたFGFファミリーの構成員である。それはヒト染色体10q25-q26にマッピングされている（Whiteら、Genomics 30：109-11, 1995）。FGF−８は胚の肢の発達に関与する（Vogelら、Development 122：1737-1750, 1996及びTanakaら、Current Biology 5（6）：594-597, 1995）。心臓、尿生殖器及び神経組織における胚形成の際のFGF−８の発現は、それがこのような組織の発達に役割を果しうることを示唆する（Crossleyら、Development 121：439-451, 1995）。とがった頭部並びに水かきの付いた手及び足指により示される先天症、尖頭合指症はFGF−８点突然変異に関係するといういくつかの証拠がある（Whiteら、1995、前掲）。
FGF−８は、３つのエキソンしか有さない他の公知のFGFと異なり、５つのエキソンを有する。FGF−８の最初の３つのエキソンは他のFGFの第一エキソンに相当する（MacArthurら、Development 121：3603-3613, 1995）。FGF−８のヒト遺伝子は４つのアイソフォームをコードし、それらはそのＮ−末端領域において相違する：FGFアイソフォームａ，ｂ，ｅ及びｆ。対して、マウス遺伝子は８つのFGF−８アイソフォームを供する（Crossleyら、1995前掲）。ヒトFGF−8a及びFGF−8bはマウスタンパク質と100％の相同性を有し、そしてFGF−8e及びFGF−8fタンパク質はヒト及びマウス間で98％の相同性を有する（Gemelら、Genomics 35：253-257, 1996）。
心臓病は米国における主たる死因であり、全死亡率の30％までを占める。心筋梗塞（MI）は米国において年間750,000人の来院を占め、うち500万人以上が冠状疾患と診断されている。MIの危険因子には真性糖尿病、高血圧、体幹肥満症、喫煙、血漿中での高レベルの低密度リポタンパク質又は遺伝的素因が挙げられる。
心臓肥大は心筋細胞増殖の増大であり、そしてヒト及びラットの正常な老化（OlivettiらJ. Am. Coll. Cardiol. 24（1）：140-9, 1994及びAnversaらCirc. Res. 67：871-885, 1990）並びにラットのカテコールアミン誘導化心筋症（DeisherらAm. J. Cardiovasc. Pathol. 5（1）：79-88, 1994.）に伴って起こることが実証されている。筋細胞の増大がある先祖細胞に由来するか、又はより終末的な分化細胞タイプの増殖であるかが論争の的となっている。
しかしながら、梗塞及びその他の心筋壊死の原因は治療不能のようであるため、心臓肥大の正常なメカニズムは多量の筋細胞死を補うことができないようであり、従って過形成を促進し、結果として心臓の再生能力を機能させる外的因子のニーズが残っている。
骨の再生はダイナミックな過程であり、それにより組織塊及び骨格構造は維持される。この過程は骨再吸収と骨形成とのバランスであり、２通りの細胞タイプが主たる機能体と考えられる。これらの細胞は骨芽細胞及び破骨細胞である。骨芽細胞はマトリックスを合成及び沈着させ、新たな骨にする。骨芽細胞及び破骨細胞は多くの全身性及び局部性因子、例えば増殖因子により調節される。
局部性及び全身性因子間での相互作用は完全には理解されていないが、増殖因子が正常な骨格再生及び骨折修復の双方の調節に重要な機能を果たしているという合意があるようである。骨において同定されているいくつかの増殖因子にはIGF−Ｉ，IGF−II，TGF−β１，TGF−β２，bFGF，aFGF，PDGF及び骨形態タンパク質のファミリーが挙げられる（Baylinkら、J. Bone Mineral Res. 8（付録2）：S565-S572, 1993）。
骨再吸収が骨形成を上まわると、骨の正味の損失が起こり、そして骨折のし易さが高まる。低下した骨形成は老化及び一定の病理状態に関わる。米国だけで、骨粗しょう症に原因する骨折が年間約150万ある。患者の生活のクオリティーに対するこのような骨折のインパクトは多大である。米国におけるヘルスケアシステムにかかる関連の出費は、長期ケア費を除き、年間1000億ドルと概算される。
骨再生に影響を及ぼす増殖因子についてのその他の治療用途には、例えば骨折の如きを治癒するための骨芽細胞の増殖、並びに間葉細胞増殖の刺激、及び骨折修復の観点として示唆されている膜内骨の合成を要する損傷の処置が含まれる（Joyceら、36th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, 1990年２月５〜８日、New Orleans, LA）。
本発明はこのような用途及び本明細書における教示から当業者に明らかとなるその他の用途のためのかかるポリペプチドを提供する。
発明の概要
一の観点において、本発明は下記から成る群より選ばれる繊維芽細胞増殖因子（FGF）同族ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド分子を提供する：ａ）SEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；ｂ）（ａ）のアレル変異体；ｃ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）からアミノ酸残基207（Ala）に至るアミノ酸配列と少なくとも60％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及びｄ）SEQ ID NO：６に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子。
一の態様において、この単離ポリヌクレオチド分子はSEQ ID NO：１に示すヌクレオチド１からヌクレオチド621までのヌクレオチド配列、又はSEQ ID NO：６に示すヌクレオチド１からヌクレオチド621までのヌクレオチド配列を含んで成る。
別の態様において、この単離ポリヌクレオチド分子はSEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621までのヌクレオチド配列を含んで成る。
別の態様において、本発明は以下の作用可能式に連結された要素を含んで成る発現ベクターを提供する：転写プロモーター；下記から成る群より選ばれるDNA：ａ）SEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；ｂ）（ａ）のアレル変異体；ｃ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）からアミノ酸残基207（Ala）に至るアミノ酸配列と少なくとも60％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及びｄ）SEQ ID NO：６に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；並びに転写ターミネーター。
別の観点において、本発明は下記の作用可能式に連結された要素を含んで成る発現ベクターの導入された培養細胞を提供する：転写プロモーター；下記から成る群より選ばれるDNAセグメント：ａ）SEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；ｂ）（ａ）のアレル変異体；ｃ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）からアミノ酸残基207（Ala）に至るアミノ酸配列と少なくとも60％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及びｄ）SEQ ID NO：６に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；並びに転写ターミネーター。ここで、当該細胞は当該DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。
別の観点において、本発明はFGF同族ポリペプチドを製造する方法を提供する。この方法は：下記の作用可能式に連結された要素を含んで成る発現ベクターの導入された細胞を培養する：転写プロモーター：下記から成る群より選ばれるDNAセグメント：ａ）SEQ ID NO：１に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；ｂ）（ａ）のアレル変異体；ｃ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）からアミノ酸残基207（Ala）に至るアミノ酸配列と少なくとも60％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及びｄ）SEQ ID NO：６に示すヌクレオチド82からヌクレオチド621に至るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；並びにターミネーター；
これにより当該細胞は当該DNAセグメントによりコードされるFGF同族ポリペプチドを発現する；そして
当該FGF同族ポリペプチドを回収する；
ことを含んで成る。
別の観点において、本発明は下記から成る群より選ばれる単離FGF同族ポリペプチドを提供する：ａ）SEQ ID NO：２に示す残基28（Glu）から残基175（Met）に至るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；ｂ）（ａ）のアレル変異体；及びｃ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）からアミノ酸残基175（Met）までと少なくとも60％同一であるポリペプチド分子。
別の観点において、本発明は下記から成る群より選ばれる単離FGF同族ポリペプチドを提供する：ａ）SEQ ID NO：２に示す残基28（Glu）から残基196（Lys）に至るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；ｂ）（ａ）のアレル変異体；及びｃ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）からアミノ酸残基196（Lys）までと少なくとも60％同一であるポリペプチド分子。
別の態様において、本発明は下記から成る群より選ばれる単離FGF同族ポリペプチドを提供する：ａ）SEQ ID NO：２に示す残基28（Glu）から残基207（Ala）に至るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；ｂ）（ａ）のアレル変異体；及びｃ）SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）から残基207（Ala）までと少なくとも60％同一であるポリペプチド分子。
更なる態様において、本発明はシグナル配列を更に含んで成るFGF同族ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明はSEQ ID NO：２に示すアミノ酸残基１（Met）からアミノ酸残基27（Ala）に至るシグナル配列を更に含んで成るFGF同族ポリペプチドを提供する。
本発明は更に、薬理学的に許容されるビヒクルと組合さった精製FGF同族ポリペプチドを含んで成る薬理組成物を提供する。
別の態様において、本発明はSEQ ID NO：２に示す残基１（Met）から残基207（Ala）に至るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子のエピトープに結合する抗体を提供する。
別の態様において、本発明はSEQ ID NO：２に示す残基28（Glu）から残基196（Lys）に至るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子に結合する抗体を提供する。
別の観点において、本発明は筋細胞又は先祖筋細胞の増殖を刺激する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、当該哺乳動物における筋細胞又は先祖筋細胞の数の臨床学的に有意な増加を供するのに十分な量のFGF同族ポリペプチドを投与することを含んで成る方法を提供する。
別の態様において、本発明は筋細胞又は先祖筋細胞を刺激する方法を提供し、ここで当該筋細胞又は先祖筋細胞は心筋細胞又は心筋先祖細胞である。
別の観点において、本発明は先祖筋細胞又は筋細胞のex vivo刺激のための方法であって、心臓組織細胞を、FGF同族ポリペプチドの非存在下で培養した心臓組織先祖筋細胞又は筋細胞と比べ、FGF同族ポリペプチドの存在下で培養した心臓組織細胞中の先祖筋細胞又は筋細胞の数の増大を供するのに十分な量のFGF同族ポリペプチドと培養することを含んで成る方法を提供する。
別の態様において、本発明は先祖筋細胞又は筋細胞のex vivo刺激の方法を提供し、ここで当該筋細胞又は先祖筋細胞は心臓細胞又は先祖心筋細胞である。
別の観点において、本発明は心臓組織へと剤又は薬剤を選択的に輸送する方法であって：FGF同族ポリペプチドを含んで成る第一分子と剤又は薬剤を含んで成る第二分子とを連結してキメラを形成し；そしてかかるキメラを心臓組織に投与することを含んで成る方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１及び２はヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子１（FHF−１）、ヒト筋細胞活性化性因子（FGF−10）、ヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子４（FHF−４）、ヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子２（FHF−２）、ヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子３（FHF−３）、ヒトFGF−４、ヒトFGF−６、ヒトFGF−２（塩基性）、ヒトFGF−１（酸性）、ヒトケラチン細胞増殖因子２（KGF−２）、ヒトケラチン細胞増殖因子先祖細胞（FGF−７）、ヒトzFGF−５、ヒトFGF−８、ヒトFGF−５、ヒトFGF−９、及びヒトFGF−３の多重アラインメントを示す。「*」は保存アミノ酸を示す；「：」は保存アミノ酸置換を示す；そして「・」は低ストリンジェンシー保存アミノ酸置換を示す。
図３はヒトFGF−５、ヒトFGF−６、ヒトFGF−７、ヒトFGF−８、ヒトFGF−９、ヒトzFGF−５、ヒトFGF−10、ヒトFGF−１、ヒトFHF−１、ヒトFGF−２、ヒトFHF−２、ヒトFHF−４、ヒトFGF−３、ヒトKGF−２、ヒトFGF−３及びヒトFGF−４間での％同一性を示すファミリー間類似性マトリックスである。
発明の詳細な説明
「オルソログ」（又は「種相同」）なる語は、別の種に由来する類似のポリペプチド又はタンパク質に対する相同性を有する一の種から得たポリペプチド又はタンパク質を意味する。
「パラログ」なる語は同じ種に由来する異なるポリペプチド又はタンパク質に対する相同性を有する一定の種から得たポリペプチド又はタンパク質を意味する。
「アレル変異体」なる語は同一の染色体座を占める遺伝子の任意の２種以上の別の形態を意味する。アレル変異体は突然変異を通じて自然に生じ、そして集団内での表現型多形態性をもたらしうる。遺伝子突然変異はサイレント（コードポリペプチドの変化なし）であるか、又は改変アミノ酸を有するポリペプチドをコードしうる。アレル変異体なる語は遺伝子のアレル変異体によりコードされるタンパク質を意味するためにも本明細書において使用する。
「発現ベクター」なる語は線形又は環状のDNA分子であって、その転写を司る追加のセグメントに作用可能式に連結された注目のポリペプチドをコードするセグメントを含んで成るものを意味する。かかる追加のセグメントには、プロモーター及びターミネーター配列が含まれ、そして任意的に１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、等が含まれうる。発現ベクターは一般にプラスミドもしくはウィルス性DNAに由来し、又は双方の要素を含みうる。
「単離」なる語は、ポリヌクレオチド分子に適用されている場合、そのポリペプチドがその天然遺伝子環境から取り出され、それ故その他の外性又は不要なコード配列を含まず、そして遺伝子操作タンパク質製造系内での利用に適する形態にあるポリヌクレオチドを意味する。かかる単離分子はその自然環境から分離され、且つcDNA及びゲノムクローンを含むものである。本発明の単離DNA分子はそれらが通常一体化しているその他の遺伝子を含まないが、天然の５′及び３′非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターは含みうる。一体化した領域の特定は当業者にとって明らかであろう（例えば、Dynan and Tijan, Nature 316：774-78, 1985参照）。タンパク質に適用した場合、「単離」なる語はそのタンパク質がその天然環境以外の状況、例えば血液及び動物組織とは離れて見い出せることを示す。好適な形態において、単離タンパク質は実質的にその他のタンパク質、特に動物起源のその他のタンパク質を含まない。タンパク質を高純度で、即ち、95％超の純度、より好ましくは99％超の純度で提供するのが好ましい。
「作用可能式に連結」なる語は、DNAセグメントについて言及しているとき、それらのセグメントがその意図する目的のために協力に合うように、例えば転写がプロモーターにおいて開始され、そしてターミネーターに至るまでコード配列を通じて進行するよう機能するように並んでいることを意味する。
「ポリヌクレオチド」なる語は５′から３′末端に至るデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドにはRNA及びDNAが含まれ、そして天然資源から単離されたものであるか、in vitroで合成されたものであるか、又は天然及び合成分子の組合せから調製されたものであってよい。
「ポリヌクレオチド分子の相補体」なる語は、対照の配列と比較して相補性の塩基配列且つ反対の配向を有するポリヌクレオチド分子を意味する。
「縮重ヌクレオチド配列」なる語は、１又は複数の縮重コドン（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドと比較して）を含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンは、異なるヌクレオチドトリプレットを含むが、同一のアミノ酸残基をコードする（即ち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
「プロモーター」なる語は、RNAのポリメラーゼの結合及び転写の開始を担うDNA配列を含む遺伝子の領域を意味する。プロモーター配列は一般に、但し常ではなく、遺伝子の５′非コード領域において見い出せる。
「分泌シグナル配列」なる語は、大型のポリペプチドの一成分として、この大型ポリペプチドをそれが合成される細胞の分泌経路に導くポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするDNA配列を意味する。大型のポリペプチドは通常、分泌経路を通過する際に切断され、分泌ペプチドを除去する。
「レセプター」なる語は生物活性分子（即ち、リガンド）に結合し、そして細胞上のリガンドの作用を媒介する細胞結合化タンパク質を意味する。膜結合レセプターは細胞外リガンド結合性ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを含んで成る多重ドメイン構造を特徴とし、典型的にはシグナル変換に関与する。レセプターに対するリガンドの結合はそのレセプターにコンホメーション変化を及ぼし、エフェクタードメインと当該細胞内のその他の分子との間の相互作用を引き起こす。この相互作用は次に細胞の代謝の変化を招く。レセプター−リガンド相互作用に結びついている代謝現象には遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP生産の増大、細胞性カルシウムの移動、膜脂質の移動、細胞接着、イノシトル脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解が挙げられる。ほとんどの抗レセプターはマルチドメイン構造、例えばアミノ末端、トランス活性化性ドメイン、DNA結合ドメイン及びリガンド結合ドメイン等も示す。一般に、レセプターは膜結合、細胞質ゾル又は核；モノマー（例えば甲状腺刺激ホルモンレセプター、ベーターアドレナリン作用性レセプター）、又は多量体（例えば、PDGFレセプター、成長ホルモンレセプター、IL−３レセプター、GM−CSFレセプター、Ｇ−CSFレセプター、エリトロポイエチンレセプター及びIL−６レセプター）でありうる。
「補体／抗補体ペアー」なる語は、適当な条件下で非共有結合した安定なペアーを形成する非同一成分同志を意味する。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプトアビジン）が補体／抗補体ペアーの典型的な構成員である。その他の典型的な補体／抗補体ペアーにはレセプター／リガンドペアー、抗体／抗原（又はハプテンもしくはエピトープペアー）、センス／アンチセンスポリヌクレオチドペアー、等が挙げられる。補体／抗補体ペアーのその後の分離が所望され、補体／抗補体ペアーは好ましくは＜109Ｍ-1の結合親和力を有する。
本発明はある程度、FGF−８に対する相同性を有する繊維芽細胞増殖因子（FGF）同族ポリペプチドをコードする新規のDNA配列の発見に基づく。この新規のDNAに相当するmRNAの組織分布の分析は、発現が胎児心臓組織及び成体心臓組織において最大であり、それに続き胎児の肺、骨格筋、平滑筋組織、例えば小腸、結腸及び気管における見かけ上下降した発現レベルを示す。FGF同族ポリペプチドはzFGF−５と称する。
本発明のこの新規のzFGF−５ポリペプチドは増殖因子のESTデーターベースを調べることによりまず同定する。一本のEST配列が発見され、そしてFGFファミリーに関連すると予測された。全長cDNAによりコードされるこの新規のFGF同族ポリペプチドは次式のモチーフを含んだ：CXFXEX｛６｝Y（ここで、Ｙは任意のアミノ酸であり、そしてX｛  ｝は１より大きいＸのアミノ酸の数である）。このモチーフはFGFファミリーの全ての既知の構成員に認められ、そしてこれらのタンパク質に固有である。
zFGF−５cDNAのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：１に記述され、そしてその推定アミノ酸配列はSEQ ID NO：２に記載されている。SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）からアミノ酸残基181（Gln）をFGF−８の対応の領域と比較するとき（図１及び２参照）、アライニングし、且つ推定されたアミノ酸配列は約56％の同一性を有した。
ここに記載のポリヌクレオチドによりコードされる新規のポリペプチドはFGFファミリーの全ての構成員に存在するCXFXE｛６｝Yモチーフを含む。このCXFXE｛６｝Yモチーフは高度に保存されている。CXFXEX｛６｝Yドメインの共通アミノ酸配列には、ヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子１（FHF−１；Smallwoodら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：9850-9857, 1996）、ヒト筋細胞活性化性因子（FGF−10；HSU76381, GENBANK identifier, http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）、ヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子４（FHF−４；Smallwoodら1996，前掲）、ヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子２（FHF−２；Smallwoodら1996，前掲）、ヒト繊維芽細胞増殖因子同族因子３（FHF−３；Smallwoodら1996，前掲）、ヒトFGF−４（BasilicoらAdv. Cancer Res. 59：115-165, 1992）、ヒトFGF−６（Basilicoら1992，前掲）、ヒトFGF−２（塩基性；Basilicoら1992，前掲）、ヒトFGF−１（酸性；Basilicoら1992，前掲）、ヒトケラチン細胞増殖因子２（KGF−２；HSU67918 GENBANK identifier, http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）、ヒトケラチン細胞増殖因子先祖細胞（FGF−７；Basilicoら1992，前掲）、ヒトzFGF−５、ヒトFGF−８（GemelらGenomics 35：253-257, 1996）、ヒトFGF−５（Basilicoら1992，前掲）、ヒトFGF−９（MiyamotoらMol. Cell. Biol. 13：4251-4259, 1993）及びヒトFGF−３（Basilicoら1992，前掲）が挙げられる。
zFGF−５ポリペプチド（SEQ ID NO：１）をコードするcDNAの分析は、180個のアミノ酸の成熟ポリペプチド（SEQ ID NO：２の残基28乃至残基207）を含んで成る207個のアミノ酸（SEQ ID NO：２）をコードするオープンリーディングフレームを示す。zFGF−５とその他の既知のFGFとの多重アライメントは、SEQ ID NO：２のアミノ酸残基127（Cys）乃至アミノ酸残基138（Tyr）に相当する高いパーセント同一性のブロックを示す。FGFファミリーのいくつかの構成員はシグナル配列を有さない。
FGFファミリーの構成員はヘパリン結合ドメインを特徴とする。zFGF−５の推定ヘパリン結合ドメインはSEQ ID NO：２のアミノ酸残基148（Gly）乃至アミノ酸残基169（Gln）の領域において同定された。レセプター媒介式シグナル生成は細胞表層硫酸ヘパリンプロテオグリカンと複合したFGFリガンドの結合により開始するものと推定される。多くのFGFファミリー構成員は、その構造及び機能に基づき２つの近縁ファミリーのいづれかに属しうる。aFGF及びbFGFは様々な長さの２つのイントロンにより分離した３つのエキソンより成る。FGF−８は５つのエキソンより成り、最初の３つはaFGF及びbFGFの最初のエキソンに相当する。既知のFGFファミリー構成員は全て一本のポリペプチドを形成するようにスプライシングされている。
SEQ ID NO：６はSEQ ID NO：２のzFGF−５ポリペプチド（アミノ酸１又は28〜207）をコードしうる全てのポリヌクレオチドを包括する縮重ポリヌクレオチドである。かくして、SEQ ID NO：６のヌクレオチド１又は82〜ヌクレオチド621に範囲するzFGF−５ポリペプチドコードポリヌクレオチドが本発明により考慮される。また、SEQ ID NO：６の類似の領域より成り、成熟zFGF−５分子をコードするSEQ ID NO：６のヌクレオチド82乃至621がSEQ ID NO：１のヌクレオチド82乃至621に相当するSEQ ID NO：１について前述したフラグメント及び融合体も本発明により考慮される。
SEQ ID NO：６における記号は以下の表６にまとめる。
0004091122.tif 000002
所定のアミノ酸についての全ての考えられるコドンを包括するSEQ ID NO：６に用いる縮重コドンを以下の表２に示す。
0004091122.tif 000003
当業者は、各アミノ酸をコードする全ての考えられるコドンを代表する縮重コドンを決定するうえで多少のあいまいさが入ることを理解するであろう。例えば、セリンについての縮重コドン（WSN）は、ある状況においてはアルギニンをコードし（AGR）、そしてアルギニンについての縮重コドン（MGN）は、ある状況においてセリン（AGY）をコードしうる。フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間でも似たような関係がある。かくして、縮重配列により包括されるいくつかのポリヌクレオチドは多少の不正確なアミノ酸を有し得るが、当業者はSEQ ID NO：２のアミノ酸配列を参照することによってかかる誤配列を容易に特定しうる。
zFGF−５における高度に保存されたアミノ酸が新たなファミリー構成員を同定するための手段として利用されうる。ESTデーターベース中の新たなファミリー構成員を同定するため、保存CXFXEX｛６｝Yモチーフを利用できる。ポリヌクレオチドプローブ及びハイブリダイゼーション方法を利用する別の方法において、様々な組織起源から得られるRNAをcDNAライブラリー及びこれらのライブラリーを新たなファミリー構成員のためにプロービングするプローブを作製するために利用できる。特に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）を、SEQ ID NO：２のアミノ酸残基127（Cys）乃至アミノ酸残基138（Tyr）に対応する配列からデザインされた高度縮重DNAプライマーをコードする配列を増幅するために用いることができる。
本発明の好適な態様において、単離ポリヌクレオチドはプローブを担い、そしてストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO：１の似たようなサイズの領域又はその相補配列にハイブリダイズするであろう。一般に、ストリンジェンシー条件下は一定のイオン強度及びpHで特異的な配列についての熱融点（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選定されるであろう。Ｔmは標的配列の50％が完璧に対合したプローブをハイブリダイズする温度である（一定のイオン強度及びpH下で）。典型的なストリンジェンシー条件は塩濃度がpH７で少なくとも約0.02Ｍ、そして温度が少なくとも約60℃のものをいう。
前述の通り、本発明の単離ポリヌクレオチドはDNA及びRNAを含む。DNA及びRNAを単離するための方法は当業界において周知である。RNAを心臓組織から単離するのが一般に好適であるが、DNAはその他の組織からRNAを用いて調製する又はゲノムDNAとして単離することもできうる。全RNAはグアニジンHCl抽出、それに次ぐCsCl勾配における遠心分離による単離を利用して調製できる（Chirgwinら、Biochemistry 18：52-94, 1979）。ポリ（A）+RNAはAriv and Leder（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69：1408-1412, 1972）の方法を利用して全RNAから調製する。相補性DNA（cDNA）は公知の方法を利用してポリ（A）+RNAから調製する。zFGF−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはかくして同定され、そして例えばハイブリダイゼーション又はPCRにより単離される。
本発明は更にその他の種由来の対応のポリペプチド又はポリヌクレオチドを提供する（オルソログ又はパラログ）。特に注目されるのは他の哺乳動物種、例えばマウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ及びその他の霊長類タンパク質由来のzFGF−５ポリペプチドである。ヒト配列のパラログの同定が特に注目され、なぜならマウスFGF−８の８つのパラログが同定されているにもかかわらず、４つのヒトパラログしか知られていないからである。ヒトタンパク質のヒトパラログ又は種同族体は本発明により供される情報及び組成と、慣用のクローニング技術との組合せを利用してクローニングできうる。例えば、cDNAをタンパク質を発現する組織又は細胞タイプから得られるmRNAを用いてクローニングできうる。mRNAの適当な起源はノーザンブロットを、本明細書において開示する配列からデザインしたプローブでプロービングすることにより同定できる。次いでライブラリーを陽性組織又は細胞系のmRNAから調製する。zFGF−５をコードするcDNAはかくして様々な方法、例えば完全又は部分ヒトcDNAによる、又は開示配列に基づく１もしくは複数の縮重プローブセットによるプロービングにより単離されうる。cDNAはポリメラーゼ連鎖反応又はPCRを利用して、本明細書開示の配列からデザインしたプライマーを用いクローニングすることもできる（Mullis、米国特許第4,683,202号）。更なる方法において、宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするのにcDNAを用いてよく、そして注目のcDNAの発現はzFGF−５に対する抗体により検出できる。類似の技術をゲノムクローンの単離に適用することもできる。
当業者はSEQ ID NO：１及びSEQ ID NO：２で開示の配列がヒトzFGF−５遺伝子及びポリペプチドの単一アレルであり、そしてアレル変異及び他のスプライシングが起こるものと予測されることを認識するであろう。アレル変異体は標準の手順に従い様々な個体からcDNA又はゲノムライブラリーをプロービングすることによりクローニングできうる。サイレント突然変異を含むもの及び突然変異がアミノ酸変化を供するものを含むSEQ ID NO：１に示すDNA配列のアレル変異体は、SEQ ID NO：２のアレル変異体であるタンパク質と同様、本発明の範囲に属する。
本発明は更にSEQ ID NO：２のポリペプチド及びその種同族体／オルソログに実質的に相同性である単離zFGF−５ポリペプチドも提供する。本明細書において用いる語「実質的に相同性」とは、SEQ ID NO：２に示す配列又はそのオルソログもしくはパラログと50％、好ましくは60％、より好ましくは80％以上の配列同一性を有するポリペプチドを意味する。かかるポリペプチドはSEQ ID NO：２又はそのオルソログもしくはパラログとより好ましくは90％以上同一、そして最も好ましくは95％以上同一であろう。％配列同一性は慣用の方法により決定される。例えば、Altschulら、Bull. Math. Bio. 48：603-616, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-10919, 1992参照のこと。簡単に述べると、２本のアミノ酸配列をアライニングし、10のギャップオープニングペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー及び表３に示すHenikoff and Henikoff（前掲）の「ブロッサム62」評点マトリックス（アミノ酸は標準の１文字コードにより表示）を利用してアラインメント評点を最適化する。％同一性は下記の通りに計算した：
0004091122.tif 000004
0004091122.tif 000005
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は上記に開示の比を利用して似たような方法により決定する。
実質的に相同性のタンパク質及びポリペプチドは１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有することを特徴とする。これらの変化は好ましくは微細なもの、即ち、保存性アミノ酸置換（表４参照）及びその他のタンパク質又はポリペプチドのフォルディング又は活性に有意な影響を及ぼさない置換；小欠失、典型的には１〜約30個のアミノ酸の欠失；並びに小アミノ酸又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基数の小リンカーペプチド、又は精製を促進する小伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジントラクト、プロテインＡ（NilssonらEMBO J. ４：1075, 1985；NilssonらMethods Enzymol. 198：３, 1991）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67：31, 1988）、マルトース結合タンパク質（Kellerman and Ferenci, Methods Enzymol. 90：459-463, 1982；GuanらGene 67：21-30, 1987）又はその他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインの伸長である。一般には、Fordら、Protein Expression and Purification ２：95-107, 1991（引用することで本明細書に組入れる）を参照のこと。アフィニティータグをコードするDNAは商業的供給者から入手できる（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ；New England Biolabs, Beverly, MA）。
0004091122.tif 000006
本発明のタンパク質は20個の標準のアミノ酸に加え、非天然アミノ酸残基を含んで成りうる。非天然アミノ酸には、限定することなく、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、cis−４−ヒドロキシプロリン、trans−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチル−グリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチル−システイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニル−アラニン、４−フルオロフェニルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリンが挙げられる。タンパク質に非天然アミノ酸残基を組込むためのいくつかの方法が当業界において公知である。例えば、ナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーRNAを利用して抑制されているin vitro系が利用される。アミノ酸及びアミノアシル化性tRNAを合成するための方法が当業界において周知である。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳をＥ．コリＳ30エキス並びに市販の酵素及びその他の試薬を含んで成る無細胞系において実施する。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製する。例えば、RobertsonらJ. Am. Chem. Soc. 113：2722, 1991；EllmanらMeth. Enzymol. 202：301, 1991；ChungらScience 259：806-09, 1993；及びChungらProc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10145-49, 1993参照のこと。第二の方法において、翻訳はアフリカツメガエル（Xenopus）卵細胞において、突然変異mRNA及び化学アミノアシル化サプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより実施される（Turcattiら、J. Biol. Chem. 271：19991-98, 1996）。第三の方法においては、Ｅ．コリ細胞を交換すべき天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）の非存在下で、且つ所望の非天然アミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。この非天然アミノ酸はその天然対応物の代わりにタンパク質の中に組込まれる。KoideらBiochem. 33：7460-76, 1994参照のこと。天然アミノ酸残基はin vitro化学修飾により非天然種へと変換させることができる。化学修飾は部位特異的突然変異誘発と組合せ、置換の域を更に広げることができる（Wynn and Richards, Protein Sci. ２：395-403, 1993）。
本発明のzFGF−５ポリペプチドにおける必須アミノ酸は当業界に公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発（Cunningham and Wells, Science 244：1081-1085, 1989）に従って同定できる。後者の技術において、単一アラニン突然変異を分子内の各残基に導入し、そして得られる突然変異分子を生物活性について試験し（例えば、心筋細胞もしくは繊維芽細胞の増殖、又は骨形成の刺激）、分子の活性に本質的であるアミノ酸残基を特定する。更には、Hiltonら、J. Biol. Chem. 271：4699-4708, 1996参照のこと。リガンド−レセプター相互作用部位は構造の物理分析により、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和ラベリングの如き技術と同様に、推定接触部位アミノ酸と一緒に決定することもできる。例えば、de VosらScience 255：306-312, 1992；SmithらJ. Mol. Biol. 224：899-904, 1992；WlodaverらFEBS Lett. 309：59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の特定は近縁のFGFとの相同性の分析からも供され、そして図１及び２に示す。
zFGF−５のアミノ酸配列の分析はポリペプチドのＣ末端において二塩基部位を示す（アミノ酸残基196−197（Lys−Arg））。SEQ ID NO：２に示すアミノ酸残基28（Glu）乃至アミノ酸残基196（Lys）のアミノ酸配列を含んで成るＣ末端トランケーション化ポリペプチドは生物活性を有することが示された。二塩基性アミノ酸、例えばArg-X-X-Arg（ここでＸは任意のアミノ酸残基である）、Arg−Arg又はLys−Argをいくつかの酵素、例えば、限定することなくトロンビン及びカルボキシペプチダーゼによる切断に付す。従って、二塩基性アミノ酸残基、特にSEQ ID NO：２のアミノ酸残基196及び197（Lys及びArgのそれぞれ）にある二塩基性残基に保存的変化を供することは本請求の範囲に属する。
FGFファミリーの分析に基づき、SEQ ID NO：２のアミノ酸残基28（Glu）乃至残基175（Met）を含んで成るＣ末端トランケーション化分子は生物学的に活性でありうる。分子間ジスルフィド結合がSEQ ID NO：２のアミノ酸残基109（Cys）と残基129（Cys）との間にあると推定される。
FGF−１及びFGF−２結晶構造体の相同性アライソメントに基づき（Erikssonら、Prot. Sci. 2：1274, 1993）、zFGF−５のベーター鎖構造についての二次構造推定はSEQ ID NO：２のアミノ酸残基56−59, 64−69, 73−76, 85−92, 96−102, 106−111, 115−l19, 128−134, 138−144, 149−155及び173−177に相関する。レセプターに対するzFGF−５結合についてのアミノ酸基準はzFGF−５ポリペプチド全体の部位特異的突然変異誘発により同定される。より詳しくは、これらはzFGF−５ポリペプチドにおけるアミノ酸の部位特異的突然変異誘発を利用して同定でき、これはそのレセプターに対するそのFGFの結合のための基準として同定された酸性FGF（FGF−１）及び塩基性FGF（FGF2）のアミノ酸残基に対応する（Blaberら、Biochem. 35：2086-2094, 1996）。これらのアミノ酸には、図１及び図２に示すようにヒトFGF2におけるTyr33, Arg53, Asn110, Tyr112, Lys119, Trp123, Leu149及びMet151、並びにヒトFGF−１におけるTyr30, Arg50, Asn107, Tyr109, Lys116, Trp122, Leu148及びLeu150が挙げられる。zFGF−５における対応のアミノ酸は、図１及び図２に示すように、Tyr58, Gly77, Asn136, Tyr138, Lys145, Trp149, Met175及びArg177であろう。当業者はFGFファミリーのその他の構成員が、全体的に又は部分的に、zFGF−５に対して構造的又は生化学的類似性を有することがあり、そしてかかる分析を行うために代用できうることを理解するであろう。かかる領域は分子の生物学的機能にとって重要であろう。
多重アミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer（Science 241：53-57, 1988）又はBowie and Sauer（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：2152-2156, 1989）により開示の如き突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法を利用して成し遂げ、且つ試験できうる。簡単には、これらの著者はポリペプチド内の２以上の位置を同時にランダム化する、機能性ポリペプチドについて選別する、次いで各位置での許容の置換のスペクトルを決定するためにこの突然変異誘発したポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。利用できうるその他の方法にはファージディスプレー（例えばLowmanらBiochem. 30：10832-10837, 1991；Ladnerら米国特許第5,223,409；Huse, WIPO公開WO 92/06204）及び領域特異的突然変異誘発（DerbyshireらGene 46：145, 1986；NerらDNA ７：127, 1988）が挙げられる。
以上で開示した突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローニングされた突然変異誘発化ポリペプチドの活性を検出するための高仕込量自動化スクリーニングと組合せることができる。活性ポリペプチド（例えば細胞増殖）をコードする突然変異DNA分子は近代的な設備を利用して宿主細胞から回収し、且つ迅速に配列決定できる。これらの方法は注目のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能とし、そして未知の構造のポリペプチドに応用できる。
上述の方法を利用し、当業者はSEQ ID NO：２の残基28（Glu）〜196（Lys）又は残基28（Glu）〜207（Ala）、そのアレル変異体、又はその生物学的に活性なフラグメントと実質的に相同であり、且つ野生型タンパク質の増殖特性を保持する様々なポリペプチドを同定及び／又は調製できる。かかるポリペプチドには上記に概して開示した更なるポリペプチドセグメントも含みうる。
全長タンパク質、そのフラグメント及び融合タンパク質を含む本発明のポリペプチドは慣用の技術に従って遺伝子操作宿主細胞内で生産されうる。適当な宿主細胞は外因性DNAで形質転換又はトランスフェクションされることができ、且つ培養増殖できうるタイプの細胞であり、そして細菌、真菌細胞及び培養高等真核細胞が挙げられる。真核細胞、特に多細胞生体の培養細胞が好ましい。クローニング化DNA分子の取扱い及び様々な宿主細胞への外性DNAの導入のための技術は引用することで本明細書に組入れるSambrookらMolecular Cloning：A Laboratory Manual, 第２版Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989及びAusubelら（編）Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987に開示されている。
一般に、本発明のzFGF−５ポリペプチドをコードするDNA配列はその発現のために必要とされるその他の遺伝子要素、例えば発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能式に連結されている。このベクターは更に１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製起点も通常含み、しかしながら当業者は一定のシステムにおいて、選択マーカーを別々のベクターに供し、そして外性DNAの複製が宿主細胞ゲノムへのその組込みにより供されうることを認識しているであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及びその他の要素の選択は当業者レベル内の周知の技術である。多くのかかる要素は論文の中に記述され、そして商業的供給者を通じて入手できる。
zFGF−５ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くため、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）を発現ベクターの中に設ける。この分泌シグナル配列は天然配列、又はその他の分泌型タンパク質（例えばtPA及びα−プレ−プロ分泌リーダー）に由来する又はde vivo合成されたシグナル配列を含んで成るキメラであってよい。この分泌シグナル配列はzFGF−５ DNA配列に適正なリーディングフレーム内で連結されている。分泌シグナル配列は注目のポリペプチドをコードするDNA配列に対して一般に５′側に位置するが、一定のシグナル配列は注目のDNA配列のどこにでも位置してよい（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号参照のこと）。
注目の任意のポリペプチド、例えばポリペプチド融合体をコードするDNAをクローニングするために利用することのできる万能アクセプタープラスミドを開示する。このプラスミドは二本鎖環状DNA分子を調製するための方法において有用である。この方法は（ａ）注目のポリペプチドをコードする二本鎖ドナーDNAフラグメントを用意する；（ｂ）平滑の第一及び第二末端を有し、且つサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）において機能的である選択マーカー及び複製配列を含んで成る二本鎖線形アクセプタープラスミドを用意する（ここで、当該アクセプタープラスミドは本質的に注目のポリペプチドをコードするDNAを含まない）；（ｃ）前記アクセプタープラスミドの第一領域と配列同一性である第一セグメントと、前記ドナーフラグメントの第一領域と配列同一性である第二セグメントとを含んで成る第一二本鎖DNAリンカーを用意する（ここで、この第一リンカーの第一及び第二セグメントはそれぞれ少なくとも長さ10bpである）；（ｄ）前記アクセプタープラスミドの第二領域と配列同一性である第一セグメントと、前記ドナーDNAフラグメントの第二領域と配列同性である第二セグメントとを含んで成る第二二本鎖DNAリンカーを用意する（ここで、この第二リンカーの第一及び第二セグメントはそれぞれ少なくとも長さ10bpである）；そして（ｅ）当該ドナーDNAフラグメント、アクセプタープラスミド、第一DNAリンカー及び第二DNAリンカーをサッカロマイセス・セレビジエの中で組合せ、これにより当該ドナーDNAフラグメントを当該ドナーDNA、アクセプタープラスミド及びリンカーの相同組換により当該アクセプタープラスミドに連結し、閉環プラスミドを形成する；工程を含んで成る。当該アクセプタープラスミドは更に前記第一末端に近位の転写プロモーターを含んで成り、そして前記ドナーDNAフラグメントは前記閉環プラスミド内の転写プロモーターと作用可能式に連結されている。このアクセプタープラスミドは更にリーダーペプチドをコードするDNA及び／又はペプチドタグをコードする１もしくは複数のDNAセグメントを、これらのDNAセグメントがこの閉環プラスミド内のドナーDNAフラグメントに作用可能式に連結されているように配置されて含んで成る。好適な態様において、当該アクセプタープラスミドは更に、（ａ）プロモーター、リーダーペプチドをコードするDNAセグメント、及び第一ペプチドタグをコードするDNAセグメント（ここで、リーダーペプチドをコードする当該DNAセグメントは前記プロモーターと、当該アクセプタープラスミドの第一末端に近位する第一ペプチドタグをコードするDNAセグメントとの間に位置し、ここで当該プロモーター、リーダーペプチドをコードするDNAセグメント、及び第一ペプチドタグをコードするDNAセグメントは作用可能式に連結されている）；並びに（ｂ）前記アクセプタープラスミドの第二末一端に近位する第二ペプチドタグをコードするDNAセグメント；を含んで成る。
二本鎖環状DNA分子を調製するための方法であって（ａ）まとまって注目のポリペプチドをコードする複数の重複二本鎖ドナーDNAフラグメントを用意する；（ｂ）平滑な第一及び第二末端を有し、且つサッカロマイセス・セレビジエ内で機能的である選択マーカーと複製配列とを含んで成る二本鎖線形アクセプタープラスミドを用意する（ここで、当該アクセプタープラスミドは注目のポリペプチドをコードするDNAを本質的に含まない）；（ｃ）前記第一アクセプタープラスミドの第一領域と配列同一性である第一セグメントと前記ドナーフラグメントのいづれかの第一領域と配列同一性である第二セグメントとを含んで成る第一二本鎖DNAリンカーを用意する（ここで、当該第一リンカーの第一及び第二セグメントのそれぞれは少なくとも長さ10bpである）；（ｄ）前記アクセプタープラスミドの第二領域と配列同一性である第一セグメントを前記DNAフラグメントの別の領域と配列同一性である第二セグメントとを含んで成る第二二本鎖DNAリンカーを用意する（ここで当該第二リンカーの第一及び第二セグメントはそれぞれ少なくとも長さ10bpである）；そして（ｅ）前記ドナーDNAフラグメント、アクセプタープラスミド、第一DNAリンカー及び第二DNAリンカーをサッカロマイセス・セレビジエ内で組合せ、これにより当該DNAフラグメントを当該アクセプタープラスミドに相同性組換により連結することで注目のポリペプチドをコードする領域を含んで成る閉環プラスミドを形成する工程を含んで成る方法を開示する。このアクセプタープラスミドは更に１又は複数の転写プロモーター、リーダーペプチドをコードするDNAセグメント、及びペプチドタグをコードする１又は複数のDNAセグメントを上述の通りに含んで成る。
真菌細胞、例えば酵母細胞、そして特にサッカロマイセス又はピチア（Pichia）属の細胞がzFGF−５フラグメント又はポリペプチド融合体の製造のための宿主のために特に好適な細胞である。
酵母細胞を外性DNAにより形質転換し、そしてそれから組換ポリペプチドを生産するためのその他の方法は、引用することで本明細書に組入れるKawasakiの米国特許第4,599,311号；Kawasakiら米国特許第4,931,373号；Brakeの米国特許第4,870,008号；Welchらの米国特許第5,037,743号；及びMurrayらの米国特許第4,845,075号により開示されている。形質転換細胞は選択マーカー、通常は薬剤耐性又は特定の栄養素（例えばロイシン）の非存在下で増殖する能力により選択される。酵母において利用するための別の好適なベクター系はKawasakiら（米国特許第4,931,373号）に開示のPOT1ベクター系であり、それはグルコース含有培地の中での増殖により形質転換細胞を選択することを可能にする。酵母において利用するための適当なプロモーター及びターミネーターには解糖系酵素（例えば、Kawasakiの米国特許第4,599,311号；Kingsmanらの米国特許第4,615,974号；及びBitterの米国特許第4,977,092号を参照のこと；これは引用することで本明細書に組入れる）及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が挙げられる。更には、引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,990,446号；5,063,154号；5,139,936号及び4,661,454号を参照のこと。その他の酵母、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴ・メイジス（Ustilago maydis）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・ギレルモンジイ（Pichia guillermondii）及びカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）が当業界において公知である。特に好適な系はピチア・メタノリカ（P. methanolica）を利用する（PCT出願WO9717450参照）。別の形質転換系については、例えばJ. Gen. Microbiol. 132：3459-3465, 1986及びCreggの米国特許第4,882,279号を参照のこと。アスペルギルス（Aspergillus）細胞は引用することで本明細書に組入れるMcKnightらの米国特許第4,935,349号の方法に従って利用できうる。アクレモニウム・クリソゲヌムを形質転換するための方法は引用することで本明細書に組入れるSuminoらの米国特許第5,162,228号参照のこと。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は引用することで本明細書に組入れるLambowitzの米国特許第4,486,533号を参照のこと。
培養哺乳動物細胞も本発明に属する好適な宿主である。外性DNAを哺乳動物宿主細胞の中に導入するための方法にはリン酸カルシウム媒介トランスフェクション（WiglerらCell 14：725, 1978；Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics ７：603, 1981：Graham and Van der Eb, Virology 52：456,1973）、エレクトロポレーション（NeumannらEMBO J. １：841-845, 1982）、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション（Ausubelら編Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987）及びリポソーム媒介トランスフェクション（Hawley-NelsonらFocus 15：73, 1993；CiccaroneらFocus 15：80, 1993）、全て引用することで本明細書に組入れる）が挙げられる。培養哺乳動物細胞における組換ポリペプチドの生産は例えば引用することで本明細書に組入れるLevinsonら米国特許第4,713,339号；Hagenら米国特許第4,784,950号；Palmiterら米国特許第4,579,821号；及びRingold米国特許第4,656,134号に開示されている。好適な培養哺乳動物細胞にはCOS−１（ATCC No. CRL 1650）、COS−７（ATCC No. CRL 1651）、BHK 570（ATCC No. CRL 10314）、293（ATCC No. CRL 1573；GrahamらJ. Gen. Virol. 36：59-72, 1972）及びチャイニーズハムスター卵巣（例えばCHO−K1；ATCC No. CCL 61）細胞系が挙げられる。更に適当な細胞系は当業界において公知であり、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, Rockville, Marylandの如き公共寄託機関から入手できる。一般に、強力な転写プロモーター、例えばSV−40又はサイトメガロウィルス由来のプロモーターが好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照のこと。その他の適当なプロモーターにはメタロチオネイン遺伝子（米国特許第4,579,821号及び同4,601,978号；引用することで本明細書に組入れる）並びにアデノウィルス主要後期プロモーターが挙げられる。
薬剤選択は一般に外来DNAが挿入された培養哺乳動物細胞の選択のために利用される。かかる細胞は一般に「トランスフェクタント」と呼ばれている。選択因子の存在下で培養され、そして注目の遺伝子をその子孫へと受け継がせることのできる細胞を「適当なトランスフェクタント」と称する。好適な選択マーカーは抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を意味する。選択はネオマイシン型薬剤、例えばＧ−418等の存在下で実施する。選択系は注目の遺伝子の発現レベルを高める「増幅」と称されるプロセスにも利用されうる。増幅は低レベルの選択因子の存在下でトランスフェクタントを培養し、次いで選択因子の量を増やして導入遺伝子の高い産物レベルを示す細胞を選択することにより実施する。好適な増幅可能選択マーカーはジヒドロホレートリダクターゼであり、これはメトトレキセートに対する耐性を供与する。その他の薬剤耐性遺伝子（例えばヒグロマイシン耐性、マルチ薬剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も利用できうる。
その他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞も宿主として利用できうる。昆虫細胞の形質転換及びその中の外来ポリペプチドの生産はGuarinoら、米国特許第5,162,222号；Bangら米国特許第4,775,624号；及びWIPO公開WO 94/06463号に開示されている。これらは引用することで本明細書に組入れる。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリア・リゾジェンス（Agrobacterium rhizogenes）の利用はSinkarらJ. Biosci.（Banglore）11：47-58, 1987を参照のこと。
形質転換又はトランスフェクション宿主細胞は栄養素及び選定の宿主細胞の増殖のために必要とされるその他の成分を含む培養培地中で慣用の手順に従って培養する。規定培地及び複合培地を含む様々な適当な培地が当業界において公知であり、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。培地は更に成長因子又は血清等の成分を適宜含みうる。この増殖培地は一般に外性付加DNAを含む細胞について、例えば薬剤選択により又は発現ベクター上に担持された選択マーカー又は宿主細胞の中に同時トランスフェクションされた選択マーカーにより補充される必須栄養素の欠乏により選択される。
発現組換zFGF−５ポリペプチド（又はキメラzFGF−５ポリペプチド）は分画及び／又は慣用の精製方法及び培地を利用して精製できる。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロープ抽出をサンプルの分画のそれに利用してよい。典型的な精製工程はヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーが含まれうる。適当な陰イオン交換媒体には誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特製シリカ等が含まれる。PEI, DEAE, QAE及びＱ誘導体が好ましく、DEAE Fast-Flow Sephrose（Pharmacia, Piscataway, NJ）が特に好ましい。典型的なクロマトグラフィー媒体にはフェニル、ブチル又はオクチル基で誘導されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF（Phamacia）、Toyopearlブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharose（Pharmacia）等；又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG 71（Toso Haas）等が挙げられる。適当な固相支持体には、ガラスビーズ、シリカベース樹脂、セルロース系樹脂、アガロースビーズ、架橋化アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋化ポリアクリルアミド樹脂、等が挙げられ、それらはそれらを利用する条件下で不溶性である。これらの支持体はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の付加を可能とする反応性基で修飾されていてよい。化学物質のカップリングの例には臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性、並びにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体が挙げられる。これら及びその他の固体媒体は周知であり、且つ当業界において幅広く利用され、そして商業的供給者から入手できる。固相支持体に対してレセプターポリペプチドを結合するための方法は当業界において周知である。特定の方法の選択は選定した支持体の特性によりある程度決定される。例えば、Affinity Chromatography：Principles & Methods, Phamacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988参照のこと。
本発明のポリペプチドはそのヘパリン結合特性の開発によっても単離できうる。Burgeesら、Ann. Rev. of Biochem. 58：575-606, 1989参照のこと。FGFファミリーの構成員はヘパリン−Sepharoseアフィニティークロマトグラフィーにより見かけ上均質となるまで精製でき（Gospodarowiczら、Proc. Natl. Acad. Sci. 81：6963-6967, 1984）、そしてNaClの線形段階勾配により溶出される（Ronら、J. Biol. Chem. 268（4）：2984-2988, 1993；Chromatography：Principles & Methods, pp. 77-80, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1993；「Immobilized Affinity Ligand Techniques」Hermansonら編pp. 165-167, Academic Press, San Diego, 1992；KjellenらAnn. Rev. Biochem. Ann. Rev. Biochem. 60：443-474, 1991；及びKeらProtein Expr. Purif. 3（6）：497-507, 1992）。
その他の精製方法には、ヒスチジン濃厚タンパク質を精製するための固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーの利用が挙げられる。簡単には、ゲルに二価の金属イオンをまず負荷し、キレートを形成する（E. Sulkowski, Trends in Biochem. ３：1-7, 1985）。ヒスチジン濃厚タンパク質は利用した金属イオンに依存して様々な親和力をもってこのマトリックスに吸着し、そして競合溶出、pHの降下、又は強力な錯形成剤の利用により溶出されるであろう。その他の精製方法にはレクチンアフィニティークロマトグラフィー及びイオンクロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が挙げられる（Methods in Enzymol., Vol. 182,「Guide to Protein Purification」M. Deutscher,（編）、Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39）。他方、注目のポリペプチドとアフィニティータグ（例えば、ポリヒスチジン、マルトース結合タンパク質及びイムノグロブリンドメイン）との融合体を精製の促進のために構築することができうる。
タンパク質リフォルディング（及び任意的に再酸化）手順が好適に利用されうる。タンパク質を＞80％の純度、より好ましくは＞90％の純度、更により好ましくは＞95％の純度、そして特に好ましくは薬理学的に純粋な状態、即ち、夾雑巨大分子、特にその他のタンパク質及び核酸との関係で99％より高い純度であり、且つ感染性及びパイロジェン因子を含まない状態にまで精製するのが好ましい。好ましくは、精製タンパク質はその他のタンパク質、特にその他の動物起源のタンパク質を実質的に含まない。
zFGF−５ポリペプチド又はそのフラグメントは化学合成を介して調製することもできうる。zFGF−５ポリペプチドは単量体又は多量体；グリコシル化又は非グリコシル化；ペギル化又は非ペギル化；及び一次メチオニンアミノ酸残基を含む又は含まないものであってよい。
本発明の分子の活性は様々なアッセイ、即ち、例えば成体心臓における組織特異性に基づく心臓細胞の新生又は過形成（即ち、増殖）を測定するアッセイを利用して測定されうる。本発明のポリペプチドに関連しそうである更なる活性には、直接又はその他の成長因子を介する非間接的な内皮細胞、心筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞の増殖；内皮細胞、繊維芽細胞及び／又は食細胞についての化学走性因子としての作用；骨形成因子；並びに間葉幹細胞及び前駆集団を増殖するための因子としての作用が挙げられる。
増殖は培養心細胞を用いて、又はin vivoで適当な動物モデルに対する本発明の分子の投与を利用して測定できうる。一般に、増殖効果は細胞数の増大として認められ、それ故アポプトシス及び有糸分裂誘発の阻害が挙げられうる。培養細胞には一次培養物由来の心臓繊維芽細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ヒト臍静脈内皮細胞が挙げられる。樹立された細胞系には：NIH 3T3繊維芽細胞（ATCC No. CRL-1680）、H9c2ラット心筋細胞（ATCC No. CRL-1446）、シオノギ乳癌腫細胞（Tanakaら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89：8928-8932, 1992）及びLNCap. FGCアデノ癌腫細胞（ATCC No. CRL-1740）が挙げられる。細胞増殖を測定するためのアッセイは当業界において周知である。例えば、増殖を測定するためのアッセイには、中性赤色色素に対する化学感度（Cavanaughら、Investigational New Drugs ８：347-354, 1990；引用することで本明細書に組入れる）、放射性ラベル化核種の組込み（Cookら、Analytical Biochem. 179：1-7, 1989；引用することで本明細書に組入れる）、５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（BrdU）の増殖細胞のDNAへの組込み（Porstmannら、J. Immunol. Methods 82：169-179, 1985；引用することで本明細書に組入れる）、及びテトラゾリウム塩の利用（Mosmann, J. Immunol. Methods 65：55-63, 1983；AlleyらCancer Res. 48：589-601, 1988；MarshallらGrowth Req. ５：69-84, 1995；及びScudieroらCancer Res. 48：4827-4833, 1988；全て引用することで本明細書に組入れる）が挙げられる。
分化は斬新且つダイナミックな過程であり、多能性幹細胞から始まり、そして終末的に分化した細胞で終える。系列へと傾倒することなく再生できうる多能性幹細胞は細胞系列へと傾倒するときに失われる一連の分化マーカーを発現する。先祖細胞は、細胞が細胞系列経路を経て成熟に向って進行する際に発現し続ける又は続けない一連の分化マーカーを発現する。成熟細胞によりもっぱら発現される分化マーカーは通常機能特性であり、例えば細胞産物、細胞産物を産生するための酵素及びレセプターである。細胞集団の分化の段階は細胞集団の中に存在するマーカーの同定によりモニターされる。筋細胞、骨芽細胞、アジポ細胞、軟骨細胞、繊維細胞及び網状細胞は共通の間葉幹細胞に由来するものと信じられている（Owenら、Ciba Fdn. Symp. 136：42-46, 1988）。間葉幹細胞についてのマーカーはよく同定されておらず（Owenら、J. of Cell Sci. 87：731-738, 1987）、従って、同定は通常は先祖細胞及び成熟細胞段階においてなされる。早期段階心筋先祖細胞の存在（往々にして心筋幹細胞と称される）が成体心臓組織内に推定されたが、実証はされていない。本発明の新規のポリペプチドはin vivo及びex vivoの双方で間葉幹細胞及び心筋先祖細胞を単離する研究のために有用である。
特定の細胞タイプを終末分化又は脱分化に向う経路に進むように刺激する因子は共通の先祖又は幹細胞に由来する細胞集団全体に影響することを示唆する証拠がある。かくして、本発明は筋細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、アジポ細胞、軟骨細胞及び内皮細胞の阻害又は増殖を刺激することを含む。本発明の分子は、心筋細胞の増殖又は分化を刺激すると同時に、その共通の先祖／幹細胞に対する作用によりアジポ細胞の増殖又は分化を阻害する。本発明の分子は軟骨肉腫、アテローム硬化症、再狭窄及び肥満症の抑制においての用途を有する。
分化を測定するためのアッセイには、例えば段階特異的な組織の発現、酵素活性、機能活性又は形態変化に関連する細胞表層マーカーの測定を含む（Watt, FASEB, ５：281-284, 1991；Francis, Differentiation 57：63-75, 1994；Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989；全て引用することで本明細書に組入れる）。
心臓新生又は肥大を評価するためのin vivoアッセイには新生及び成熟ラットの本発明の分子による処置が含まれる。動物の心臓機能は心拍数、血圧及び左心室機能を決定するための心臓アウトプットとして測定される。心臓改善を評価するための死後方法には：増大した心臓重量、核／細胞質容積、心臓組織切片を染色して増殖細胞核抗原（PCNA）、対、細胞質アクチンレベルを決定すること、が挙げられる（QuainiらCirculation Res. 75：1050-1063, 1994及びReissらProc. Natl. Acad. Sci. 93：8630-8635, 1996）。
骨形成速度の変化を測定するためのin vivoアッセイには骨組織検査（Recker, R.,編Bone Histomorphometry：Techniques and Interpretation. Boca Raton：CRC Press, Inc., 1983）及び定量コンピュータートモグラフィー（QCT；Ferretti, J. Bone 17：353S-364S, 1995；OrphanoludakisらInvestig. Radiol. 14：122-130, 1979及びDurandらMedical Physics 19：569-573, 1992）の実施が挙げられる。骨形成の変化を測定するためのex vivoアッセイは、例えば頭蓋冠アッセイ（Gowenら、J. Immunol. 136：2478-2482, 1986）であろう。
エネルギーバランスの調節に関し、特にアジポ細胞代謝、増殖及び分化に関し、zFGF−５ポリペプチドは代謝反応に対する作用を調節する。かかる代謝反応にはアジポゲネシス、グルコネオゲネシス、グリコゲノリシス、リポゲネシス、グルコース摂取、タンパク質合成、サーモゲネシス、酸素利用等が挙げられる。当業界に公知の又は本明細書に記載のその他の方法のなかでとりわけ、哺乳動物のエネルギーバランスは１又は複数の上記の代謝機能をモニターすることにより評価できうる。これらの代謝機能は当業者に公知の技術（アッセイ又は動物モデル）によりモニターされ、それは以下に詳細する。例えば、インスリンのグルコ調節作用は肝臓、骨格筋及びアジポース組織の中で主に発揮される。骨格筋及びアジポース組織において、インスリンはグルコースの摂取、貯蔵及び利用を刺激するように作用する。
上記の代謝機能の全てをモニターするための当業界公知の方法がある。かくして、当業者は代謝調節機能のためのzFGF−５ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、拮抗因子及び作動因子を評価できる。典型的な調節技術を以下に記載する。
例えばインスリン刺激化リポゲネシスは14Ｃ−酢酸のトリグリセリドへの組込み（Mackallら、J. Biol. Chem. 251：6462-6464, 1976）又はトリグリセリド蓄積（Kletzienら、Mol. Pharmacol 41：393-398, 1992）を測定することによりモニターできうる。
zFGF−５刺激化摂取は例えばインスリン刺激化グルコース輸送のためのアッセイにおいて評価できうる。一次アジポ細胞又はNIH 3T3 LI細胞（ATCC No. CCL-92.1）を１ｇ／ｌのグルコース、0.5又は1.0％のBSA、20mMのHepes及び２mMのグルタミンを含むDMEMの中に入れる。２〜５時間培養後、この培地を0.5又は1.0％のBSA、20mMのHepes、１mMのピルビン酸塩及び２mMのグルタミンを含む新鮮なグルコースフリーDMEMと交換する。適当な濃度のzFGF−５、インスリンもしくはIGF−１、又は試験物質の希釈系列を添加し、そして細胞を20〜30分インキュベーションする。3Ｈ又は14Ｃ−ラベル化デオキシグルコースを
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最終濃度となるように加え、そして細胞を約10〜30分インキュベーションする。次いで細胞を冷バッファー（例えばPBS）ですばやくすすぎ、次いで適当な溶解剤（例えば１％のSDS又は１ＮのNaOH）で溶解する。その細胞リゼートをシンチレーションカウンターでの計測により評価する。細胞を一体化した放射能を、細胞をチトコラシンｂ、即ち、グルコース輸送の阻害剤の存在下でインキュベーションすることにより決定した非特異的結合を差し引いて、グルコース輸送の尺度とする。その他の方法には例えばManchesterら、Am. J. Physiol. 266（Endocrinol. Metab. 29）：E326-E333, 1994（インスリン刺激化グルコース輸送）により記載されている。
タンパク質合成は、例えば、試験細胞を35Ｓ−メチオニン及び35Ｓ−メチオニンとタンパク質合成の推定モジュレーターのインキュベーション後の35Ｓ−メチオニンラベル化タンパク質の沈殿の比較により評価できうる。
サーモゲネシスはB. StanleyのThe Biology of Neuropeptide Y and Related Peptided, W. Colmers and C. Wahlestedt（編）, Hum ana Press, Ottawa, 1993, pp. 457-509；C. BillingtonらAm. J. Physiol. 260：R321, 1991；N. ZarjevskiらEndocrinology 133：1753, 1993；C. BillingtonらAm. J. Physiol. 266：R1765, 1994；HellerらAm. J. Physiol. 252（4 Pt 2）：R661-7, 1987；及びHellerらAm. J. Physiol. 245（3）：R321-8, 1983に記載の通りに評価できうる。また、様々な技術により測定し得る代謝速度はサーモゲネシスの間接測定である。
酸素利用はHellerら、Pflugers Arch 369（1）：55-9, 1977に記載の通りに評価し得る。この方法は更に低体温及び代謝心臓生産率の分析を包括する。酸素利用及び熱調節はヒトにおいてHaskellら、J. Appl. Physiol 51（4）：948-54, 1981に記載の通りにして評価することもできうる。
zFGF−５ポリペプチドはzFGF−５エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するにも利用できうる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製するための方法は当業界において周知である（例えばSambrookらMolecular Cloning：A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor, NY, 1989；及びHurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982を参照のこと：これらは引用することで本明細書に組入れる）。当業者に明らかな通り、ポリクローナル抗体は温血動物、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス及びラットから作製できる。
zFGF−５ポリペプチドの免疫原性はアジュバンド、例えばみょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロインドの完全もしくは不完全アジュバンドの利用を通じて高めることができうる。免疫のために有用なポリペプチドには融合ポリペプチド、例えばzFGF−５又はその一部とイムノグロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体が挙げられる。このポリペプチド免疫原は全長分子又はその一部であってよい。もしポリペプチド部分が「ハプテン様」あるなら、かかる部分は免疫のために巨大分子担体（例えばキーホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風毒素）に好適に連結又は結合されうる。
本明細書において用いる「抗体」なる語にはポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合性フラグメント、例えばF（ab′）2及びFabタンパク質分解フラグメントが挙げられる。遺伝子操作されたインタクト抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体等、並びに合成抗原結合性ペプチド及びポリペプチドも含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトフレームワーク及び定常領域のみをグラフティングすることにより、又は非ヒト可変ドメイン全体を組込むことにより（任意的に、それらに露出表層の交換によりヒト様表層を「装わさせる」ことによる：ここでその結果は「ベニア」抗体となる）ヒト化できうる。ある状況においては、ヒト化抗体は適切な結合特性を高めるためにヒト可変領域フレームワーク内に非ヒト残基を保持しうる。抗体をヒト化することにより、生物学的半減期は高まり得、そしてヒトへの投与による有害な免疫反応についての潜在性は低まる。本明細書において有用な抗体を作製又は選択するための別の技術にはzFGF−５タンパク質又はペプチドに対するリンパ球のin vitro曝露、及びファージ又は類似のベクターにおける抗体ディスプレーライブラリーの選択（例えば、固定化又はラベル化zFGF−５タンパク質又はペプチドの利用を通じて）が挙げられる。
抗体はもしそれらがzFGF−５ポリペプチドに対して106Ｍ-1又はそれより高い結合親和力をもって、好ましくは107Ｍ-1又はそれより高い、より好ましくは108Ｍ-1又はそれより高い、そして最も好ましくは109Ｍ-1又はそれより高い親和力をもって結合するなら、特異的結合性と定義する。抗体の結合親和力は当業者により容易に決定できうる（例えば、Scatchard分析により）。
当業者公知の様々なアッセイがzFGF−５タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するのに利用できうる。典型的なアッセイはAntibodies：A Laboratory Manual, Harlow and Cane（編）Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に詳細されている。かかるアッセイの代表例には共存免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素連結免疫収着アッセイ（ELISA）、ドットブロット又はウェスタンブロットアッセイ、阻害又は競合アッセイ、及びサンドイッチアッセイが挙げられる。更に、抗体は、野生型、対、突然変異zFGF−５タンパク質又はペプチドに対する結合についてスクリーニングできうる。
zFGF−５に対する抗体は、zFGF−５を発現する細胞の標識のため、別のタンパク質、小タンパク質又は化学物質を心臓を標的とさせるため；アフィニティー精製によりzFGF−５を単離するため；zFGF−５ポリペプチドの循環レベルを決定する診断アッセイのため；基礎となる病理又は疾患のマーカーとしての可溶性zFGF−５を検出又は定量するため；FACSを利用する分析方法において；発現ライブラリーのスクリーニングのため；抗イディオタイプ抗体の作製のため；並びにin vitro及びin vivoでzFGF−５媒介増殖をブロッキングする中和抗体又は拮抗因子として、利用されうる。適当な直接タグ又はラベルには、放射性核種、酵素、基質、補酵素、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子、等が挙げられる。間接タグ又はラベルは中間体としてのビオチン−アビジン又はその他の補体／抗補体ペアーの利用を特徴としうる。本明細書における抗体は薬剤、毒素、放射性核種等に直接又は間接的に接合されていてよく、そしてこれらのコンジュゲートはin vivo診断又は治療用途に利用される。
本発明の分子は心筋増殖に関与するレセプターを同定及び単離するために利用できうる。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドはカラム上及びカラムに流して膜調製品に固定しうる（Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermansonら編Academic Press, San Diego, CA, 1992, pp. 195-202）。タンパク質及びペプチドは放射能ラベル（Methods in Enzymol., vol. 182,「Guide to Protein Purification」M. Deutscher, 編Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737）又は光アフィニティーラベルしてよく（BrunnerらAnn. Rev. Biochem. 62：483-514, 1993及びFedanらBiochem. Pharmacol. 33：1167-1180, 1984）そして特異的細胞表層タンパク質が同定できる。
拮抗因子は筋細胞、繊維芽細胞又は内皮細胞；骨芽細胞及び軟骨細胞を含む心臓細胞の如き細胞タイプにおけるzFGF−５分子の増殖活性の阻害のために有用であろう。zFGF−５ポリペプチド結合ドメインをコードする遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレー）で又は細菌、例えばＥ．コリ（E. coli）上でディスプレーされたランダムペプチドをスクリーニングすることにより得られうる。当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は幾多の方法、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を介して得られうる。このようなランダムペプチドディスプレーライブラリーは、タンパク質又はポリペプチド、例えばリガンド又はレセプター、生物又は合成巨大分子、又は有機又は無機物質でありうる既知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングするために利用できうる。かかるランダムペプチドディスプレーライブラリーを構築及びスクリーニングするための技術は当業界において公知であり（Ladnerら、米国特許第5,223,409号；Ladnerら同5,403,484号及びLadnerら同5,571,698号）、そしてランダムペプチドディスプレーライブラリー及びかかるライブラリーをスクリーニングするためのキットは例えばClontech（Palo Alto, CA）、Invitrogen Inc.（San Diego, CA）、New England Biolabs, Inc.（Beverly, MA）及びPharmacia LKB Biotechnology Inc.（Piscataway, NJ）より市販されている。ランダムペプチドディスプレーライブラリーはzFGF−５に結合するタンパク質を同定するために本明細書に開示のzFGF−５配列を利用してスクリーニングできる。このようなzFGF−５ポリペプチドに相互作用する「結合タンパク質」は細胞の標識のため、アフィニティー精製による同族ポリペプチドの単離のために利用し得、それらは薬剤、毒素、放射性核種等に直接又は間接的に接合されうる。このような結合性タンパク質は分析方法、例えば発現ライブラリー及び中和活性のスクリーニングのためにも利用できうる。これらの結合性タンパク質はポリペプチドの循環レベルを決定するため、基礎となる病理又は疾患のマーカーとしての可溶性ポリペプチドの検出又は定量のための診断アッセイにも利用できうる。このような結合性タンパク質はin vitro及びin vivoでzFGF−５結合及びシグナル変換をブロッキングするためのzFGF−５「拮抗因子」としても働きうる。このような抗zFGF−５結合性タンパク質は増殖又は分化をもたらす遺伝子の発現を阻害するためにも有用である。かかる抗zFGF−５結合性タンパク質は横紋筋肉腫、心臓粘液腫、骨芽細胞起源の骨癌、及び小人症、関節炎、じん帯及び軟骨修復の処置のため、単独で、又はその他の治療と併合して利用されうる。
本発明の分子は心臓組織細胞、例えば心筋細胞又は筋原細胞；骨格筋細胞又は筋原細胞及び平滑筋細胞；軟骨細胞；内皮細胞；アジポ細胞及び骨芽細胞のin vitroでの増殖のために有用であろう。例えば、本発明の分子は規定細胞培養培地の成分として有用であり、そして単独で、又はその他のサイトカイン及びホルモンと組合せて、細胞培養に一般に利用されている血清を代用するように利用されうる。本発明の分子は培養物内で筋細胞の増殖及び／又は発達を極めて促進するために特に有用であり、そして心筋細胞過形成及び再生の研究における有用性も実証されうる。
本発明のポリペプチド、核酸及び／又は抗体は心筋梗塞、うっ血性心不全、肥大型心筋症及び拡張型心筋症に関連する障害の処置において有用でありうる。本発明の分子は更に心臓発作の後の梗塞の大きさを制約する、血管形成を促進する、及び血管形成術又は動脈内膜切除術後の創傷治癒を促進する、冠状側副枝循環を発達させる、目の再血管形成のため、糖尿病足潰瘍の如き循環低下に関連する合併症のため、薬理学的方法及び血管形成術が有利であるその他の処置を利用した冠状再灌流後の発作のためにも有用である。本発明の分子は心臓の機能を、心筋細胞新生及び／又は過形成を誘導することにより、冠状側副枝形成を誘導することにより、又は壊死筋細胞領域を再生させることにより、高めるのに有用でありうる。本発明のその他の治療的用途には骨格筋新生及び／又は過形成、腎再生の誘導、及び／又は全身及び肺性高血圧の処置が挙げられる。
zFGF−５誘導化冠側副枝発達は慢性冠状閉塞のモデルを利用してウサギ、イヌ又はブタで測定する（Landauら、Amer. Heart J. 29：924-931, 1995；Sellkeら、Surgery 120（2）：182-188, 1996及びLazarousら1996前掲）。発作の処置に有利なzFGF−５を左右の頸動脈閉塞を利用し、組織変化及び迷路機能を測定することにより試験する（Gageら、Neurobiol. Aging ９：645-655, 1988）。高血圧におけるzFGF−５効能を全身高血圧について自発高血圧ラット（SHR）を用いてin vivoで試験する（Marcheら、Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. １：S114-116, 1995）。
本発明の分子は剤又は薬剤の心臓への輸送をターゲッティングさせるために利用できる。例えば、本発明の分子はzFGF−５プロモーターにより誘導される組織特異的発現により心臓に対する限定発現に有用であろう。例えば、心臓特異的発現はzFGF−５アデノウィルスジスシストロン構築体を利用して成し遂げることができる（Rothmannら、Gene Therapy 3：919-926, 1996）。更に、zFGF−５ポリペプチドは、zFGF−５ポリペプチドを別のタンパク質に、zFGF−５同族ポリペプチドより構成される第一分子を剤又は薬剤と連結させてキメラを形成することにより連結させることで（Franzら、Circ. Res. 73：629-638, 1993）、心臓に対するその他の剤又は薬剤を制約するのに利用できる。タンパク質、例えば抗体は本発明のzFGF−５分子とのキメラを形成するのに利用できる（Narulaら、J. Nucl. Cardiol. 2：26-34, 1995）。剤又は薬剤の例には、限定することなく、生物活性ポリペプチド、遺伝子、毒素、放射性抗種、小分子薬剤等が挙げられる。連結は直接又は間接的であってよく（例えばリポソーム）、そして組換手段、化学結合、強力な非共有相互作用等により行ってよい。
本発明の一の態様において、zFGF−５タンパク質を含んで成る組成物を骨芽細胞媒介骨形成を増強するために治療剤として利用する。当該組成物及び本発明のこの組成物を利用する方法は骨の欠陥及び欠乏症、例えば閉塞、開放及び非一体型骨折において生ずるものの修復を促進させるため；整形外科における骨治癒を促進するため；非セメント詰め補てつジョイント及び歯科インプラントへの骨の内成長を刺激するため；歯周病及び欠陥の処置において；伸延骨形成の際の骨の形成を増大させるため；並びに骨芽細胞活性の刺激により処置されうるその他の骨格障害、例えば骨粗しょう症及び関節炎の処置において適用されうる。本発明の方法により供されるde nove骨形成は骨の先天性、外傷誘導、腫瘍遺伝子性の切除の修復又は放射線誘導骨壊死を経た骨の治癒において有用であろう（Hartら、Cancer 37：2580-2585, 1976）。本発明の方法は整形外科においても有用でありうる。
薬理用途のため、本発明のタンパク質は非経腸、特に静脈内又は皮下、慣用の方法に従う投与のために処方される。静脈内投与はボーラス注射により、又は典型的には１〜数時間の時間にわたる点滴によるであろう。一般に、薬理製剤はzFGF−５タンパク質を薬理学的に許容されるビヒクル、例えば食塩水、緩衝食塩水、５％のデキストロース水等と一緒に含むであろう。製剤は更に１又は複数種の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、ウィルス表層上のタンパク質損失を防ぐためのアルブミン、等を含みうる。処方の方法は当業界において周知であり、そして例えば引用することで本明細書を組入れるRemington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro編、Mack Publishing Co., Easton PA, 1990において開示されている。治療用量は一般に１日当り患者の体重１kgにつき0.1〜100μｇ／kg、好ましくは0.5〜20μｇ／kg／日の範囲内にあり、正確な用量は許容の基準に従って医師により、処置すべき症状の種類及び症度、患者の履歴等を考慮に入れて決定される。用量の決定は当業者レベルであろう。これらのタンパク質は急性処置のために、１週間以内の期間をかけて、往々にして１〜３日間かけて投与してよく、又は数ヵ月から数年かけて慢性処置に利用してよい。一般に、治療的に有効な量のzFGF−５とは筋細胞増殖、心機能、骨形成において臨床的に有意な変化を及ぼす、又は間葉幹細胞並びに筋細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞のための先祖細胞に関わる特異的な細胞タイプの増大を及ぼすのに十分な量である。特に、筋細胞又は先祖筋細胞の数の有意な増大は、zFGF−５分子の投与の前後での左心室拍出分率を測定し、そして全拍出分率の少なくとも５％の上昇、好ましくは10％以上の上昇で決定される。一の心拍当り拍出される血液により測定される拍出分率を決定する試験は当業者に周知である。
本発明を以下の非限定実施例に例示する。
実施例
実施例１
EST配列の範囲
成長因子の疑いを利用する翻訳DNAデーターベースのスキャニングは発現配列タグ（EST）配列がFGFファミリーの新規の構成員であることを見い出し、そしてzFGF−５と命名する。
オリゴヌクレオチドプライマーZC11,676（SEQ ID NO：３）及びZC11,677（SEQ ID NO：４）を発現配列タグ（EST）の配列からデザインした。これらのプライマーをESTの内部でのプライミングのため、及びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における鋳型として成体心臓組織由来のMARATHON READY cDNA（Clontech, Palo Alto, CA）を用いてPCRを実施するときに用いた。
PCRについて利用した条件は94℃で90秒のサイクル１、94℃で15秒のサイクル35、68℃で１分、次いで72℃で10分サイクル１、及び４℃でインキュベーション期間とした。PCR反応は160bpのEST配列を再構築し、そしてEST配列が正しいことが確認できる。
このオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅できるその他のライブラリーには骨格筋、肺、胃、小腸及び甲状腺のものが挙げられる。
実施例２
組織分布
Clontech由来のHuman Multiple Tissue Blots（Palo Alto, CA）を用いてノーザンを実施した。実施例１記載の160bpのDNAフラグメントを１％のアガロースゲル上で電気泳動し、画分を電気溶出させ、次いでランダムプライミングMEGAPRIME DNAラベリング系（Amersham, Arlington Heights, IL）を用い、製造者の仕様書に従って放射性ラベリングした。プローブはNUCTRAPプッシュカラム（Stratagenc Cloning Systems, La Jolla, CA）を用いて精製した。EXPRESSHYB（Clontech, Palo Alto, CA）溶液をプレハイブリダイゼーションのため、及びノーザンブロットのためのハイブリダイゼーション溶液として用いた。ハイブリダイゼーションは68℃で一夜かけて実施し、そしてブロットは２×のSSC及び0.05％のSDSでRTで洗い、続いて0.1×のSSC及び0.1％のSDSで50℃で洗った。一本のバンドが約2.0kbで観察された。シグナルの強度は成体心臓に関して最も高く、骨格筋及び胃では比較的弱い強度のシグナルであった。
実施例３
zFGF−５のin vitro活性についてのアッセイ
Ａ．
zFGF−５の有系分裂活性を一次培養物由来の細胞系及び細胞を利用してアッセイした。組換タンパク質及び／又は精製タンパク質を発現する細胞由来のコンディショニング培地を下記の細胞系の培養物に加えた：NIH 3T3繊維芽細胞（ATCC No. CRL-1658）、CHH-１チャム（Chum）心臓細胞（ATCC No. CRL−1680）、H9c2ラット心筋原細胞（ATCC No. CRL-1446）、シオノギ乳腺癌腫細胞（Tanakaら、1992、前掲）及びLNCaP. FGCアデノ癌腫細胞。zFGF−５の増幅活性を試験するために有用な単離したばかりの細胞には、心臓繊維芽細胞、心筋細胞、骨格筋細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞が挙げられる。
有系分裂活性はRaines and Rossの方法（Meth. Enzymology 109：749-773, 1985）に基づく3Ｈ−チミジン組込みの測定によりアッセイした。簡単に述べると、休止細胞を適当な培地の中で３×104細胞／mlの密度でプレート培養する。典型的な増殖培地は10％の胎児牛血清（FCS）を含むDulbecco増殖培地（GIBCO-BRL, Galthersburg, MA）である。細胞を96穴プレートの中で培養し、そして３〜４日増殖させる。増殖培地を取り出し、そして0.1％のFCSを含む180μｌのDFC（表５）を各ウェルに加える。ウェルの半分にはzFGF−５タンパク質を加え、残り半分はネガティブコントロールとし、zFGF−５抜きとする。細胞を５％のCO2の中で37℃で３日間までインキュベーションし、そして培地を取り出す。0.1％のFCS及び２μCi／miの3Ｈ−チミジンを含む100μｌのDFCを各ウェルに加え、そしてプレートを更に１〜24時間37℃でインキュベーションする。培地をアスピレーション除去し、そして150μｌのトリプシンを各ウェルに加える。プレートを細胞が脱離するまで37℃でインキュベーションする（少なくとも10分）。脱離した細胞をLKB Wallac 1295-001 Cell Harvester（LKB Wallac, Pharmacia, Gaithersburg, MD）を用いてフィルター上に回収する。フィルターを電子レンジの中ので10分加熱することにより乾燥させ、そしてLKB Bctaplate 1250シンチレーションカウンター（LKB Wallac）で供給者の説明通りに計測する。
0004091122.tif 000008
Ｂ．
心臓を生後１日目の新生児マウスから取り出し、そしてBrandら（J. Biol. Chem. 268：11500-11503, 1993）のプロトコールに従う反復コラゲナーゼ消化によりばらした。個々の筋細胞をPercoll勾配で単離し、そして２mlを６穴組織培養皿の中で0.5×106細胞／mlでプレート培養する。３日後、ウェルでカルシウム又はマグネシウム抜きのPBSで３回洗い、そして１mlの無血清培地（表６）を再供給した。ウェルに1011粒子のAdCMV−zFGF５／ウェル又はコントロールとしてのAdCMV−GFP（緑色蛍光タンパク質）を接種し、そして37℃で８時間インキュベーションする。次いでウェルをカルシウム又はマグネシウム抜きのPBSで３回再び洗い、次いで２mlの無血清培地を再供給した。
AdCMV−zFGF５の接種の48時間後以内に培養筋細胞は拍動しなくなり、そして形態変化を受け、一方、AdCMV−GFPを接種したウェルは自発的に拍動し続け、そして接種により形態は影響を受けなかった。AdCMV-zFGF５を接種したウェルは、48時間後に、生きた非付着性細胞の集密層も含み、付着筋細胞層の集密の損失は全くなく、培養マウス筋細胞に対するadCMV−zFGF５の増殖活性を示唆する。
0004091122.tif 000009
Ｃ．
実施例９Ａに記載の通りであり、且つ実施例10に記載の通りに精製したマルトース結合性タンパク質（MBP）に融合したzFGF−５を0.1ng／mlの濃度で筋細胞（実施例３Ｂ）に加えた。MBP−zFGF５は同様に筋細胞の増殖を刺激することが示された。
実施例４
zFGF５のex vivo活性についてのアッセイ
心臓有系分裂はex vivoで、新生又は生後８週のマウス又はラットから心臓全部を取り出すことにより測定する。切り出した心臓をJoklik（Sigma, St. Louis, MO）又はDulbecco培地の中に37℃, ５％のCO2で４〜24時間入れておく、このインキュベーション時間中、zFGF−５ポリペプチドを１pg／ml〜100μｇ／mlの濃度範囲で加える。ネガティブコントロールはバッファーのみを用いる。3Ｈ−チミジンを加え、そしてサンプルを１〜４時間インキュベーションし、次いで心臓を切片にし、そして有系分裂をオートラジオグラフィーにより決定する。切片は核／細胞質容積を決定するためのヒストモルホメトリーに用いる（VcLaughlin, Am. J. Physiol. 271：R122-R129, 1996）。
他方、心臓を凍結乾燥し、そして１mlの0.1ＮのNaOHの中に再懸濁した。このDNAを氷冷の10％のトリクロロ酢酸（TCA）を用いて沈殿させた。その上清液を９mlのシンチレーション液に加え、非特異的3Ｈ−チミジン組込みを測定した。得られるペレットを1mlのBTS-450組織溶解剤。（Beckman, Fullerton, CA）の中に再懸濁し、そして９mlのシンチレーション液に加え、3Ｈ−チミジンの特異的DNA組込みを測定した。
左及び右心室を生後１日後のCD−１マウス（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）から取り出し、そして３ng／mlのzFGF−５Hep２（ｎ＝13；実施例10参照）又はコントロール（ｎ＝10）と４時間インキュベーションした。3Ｈ−チミジンを１時間加えておいた。これらの心室を数回洗い、そして１mlのJoklik培地にホモジナイズした。得られるホモジネート品を９mlのシンチレーションカクテルに加え、そして全3Ｈ−チミジン摂取及びDNA組込みについて分析した。
zFGF５−Hep２はコントロールと比べ3Ｈ−チミジン摂取及びDNA組込みを2.068±0.489倍高め、zFGF５が心臓細胞にとってマイトジェンであることを示唆する。
実施例５
zFGF−５のin vivo活性についてのアッセイ
zFGF−５の増殖効果は生後２週間の新生ラット及び／又は生後２ヶ月の成体ラットを用いてin vivoでアッセイする。ラットに急性又は慢性的に周囲心臓内注射を施す。
Ａ．
新生ラットをzFGF−５で１〜14日間、50ng／日〜100μｇ／日の用量範囲で処置する。処置後、zFGF−５、対、偽処置動物の効果を心臓重量の増大、in vivo及びex vivo右心室機能の改善、並びに増大した心臓核、対、細胞質ゾル容積の分率（ヒストモルホメトリー決定）により評価する。
慢性カテコールアミン点滴、冠状結紮により誘導した心筋症をもつラット、又は心筋症のモデル、例えばシリア心筋症ハムスター（Soleら、Amer. J. Cardiol. 62（11）：209-249, 1988）も心機能及び組織に対するzFGF−５の効果を評価するために用いる。
カテコールアミンを用いて心筋症を誘導するには、生後７週間のラットにエピネフリンを、その肩甲骨の間に皮下移植した浸透圧ミニポンプを介して２週間連続点滴する。エピネフリン点滴は左心室繊維症損傷評点を、0.005±0.005から2.11±0.18に至る増大（０〜３のスケール）；左心室筋細胞幅の17.36±0.46μｍから23.05±0.62μｍまでの増大；及び食塩水点滴ラットと比べイソプロテレノールに対する無視できるほどの左心室乳頭筋収縮反応（0.2対1.1ｇ引張）を供する。２週の処置期間後、ラットにビヒクル、zFGF−５、bFGF、IGF−Ｉ又はIGF−IIのいずれかを14日間まで毎日周囲心臓内注射する。ラットを殺し、ヒスモルホメトリー及びヒストサイトケミストリーを実施する。
上述の通りに処置したラットをカテコールアミン処置の終了時でも評価し、そしてここでも成長因子の処置後、心臓再生が、降下した左心室繊維症評点、縮小した筋細胞幅及びイソプロテレノールに対する増大した左心室乳頭収縮として測定される。
実施例６
zFGF−５の染色体マッピング
zFGF−５はWhitehead Institute/MIT Center for Genome Researchの「Gene Bridge 4 Radiation Hybrid Panel」（Research Genetics, Inc., Huntsville, AL）の市販バージョンを用い、染色体５にマッピングされた。適切なGene Bridge 4 Radiation Hybrid Panelは93の放射線ハイブリドクローンそれぞれに由来するPCRに適当なDNAと、２つのコントロールDNA（HFLドナー及びＡ23受容体）とを含む。公共的に入手できるwwwサーバー（http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl）は、Gene Bridge 4 Radiation Hybrid Panelにより構築されたWhitehead Institute/MIT Center for Genome Researcherのヒトゲノム放射線ハイブリドマップ（「WICGR」放射線ハイブリドマップ）に対するマッピングも可能とする。
「Gene Bridge 4 RH Panel」によるzFGF−５のマッピングのため、25μｌの反応体を96穴マイクロタイタープレート（Stratagene, La Jolla, CA）の中に用意し、そして「RoboCycler Gradient 96」サーマルサイクラー（Stratagene）の中でのPCRのために用いた。各PCR反応体は2.5μｌの50Ｘ「Advantage Klen Taq Polymerase Mix」（Clontech）、２μｌのdNTPミックス（2.5mMづつ；Perkin-Elmer, Foster City, CA）、1.25μｌのセンスプライマー、ZC11,677（SEQ ID NO：４）、1.25μｌのアンチセンスプライマーZC12,053（SEQ ID NO：５）より成る。
2.5μｌの「RediLoad」（Rcsearch Genetics, Inc）、0.5μｌの「Advantage Klen Taq Polymerase Mix」（Clontech Laboratories, Inc.）、個々のハイブリドクローン又はコントロール由来の25ngのDNA、全容量25μｌのddH2O。反応体に等量の鉱物油をかぶせ、そしてシールした。PCRサイクラー条件は下記の通りとした：94℃で４分の初期サイクル１；94℃で１分のサイクル35；66℃で1.5分のアニーリング；及び72℃1.5分の伸長、それに続く72℃で７分の最終伸長サイクル１。反応体は３％のNuSieve GTGアガロースゲル（FMC Bioproducts, Rockland, ME）での電気泳動により分離させた。
結果はzFGF−５がWICGR放射線ハイブリドマップ上のヒト染色体第５リンケージグループの頂上から541.12cRにマッピングしていることを示す。動原体を中心に、最も近い近位マーカーはWI-16922であり、そしてその最も近い遠位マーカーはWI-14692であった。周辺CHLCマップマーカーの利用も、CHLC染色体第５バージョンv8c7組込マーカーマップ（The Cooperative Human Linkage Center, wwwサーバーhttp://www.chlc.org/Chlc IntegratedMaps.html）上の５ｑ34−ｑ35領域におけるzFGF−５の位置決定に役立った。
実施例７
骨に対するzFGF−５の結果
Ａ．zFGF−５についてのcDNAを含むアデノウィルスベクターをBeckerら（Methods in Cell Biology 43：161-189, 1994）に記載の方法を用いて構築した。簡単には、zFGF−５についてのcDNA（SEQ ID NO：１に示す）をpACCMV（Gluzmanら、In Eucaryotic Viral Vectors, Gluzman（編）pp.187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 1982）の中にXbaＩ−SalＩフラグメントとしてクローニングした。このpACCMVベクターはアデノウィルス５ゲノムの一部、CMVプロモーター及びSV40ターミネーター配列を含む。当該ベクター及びcDNAインサートを含むプラスミドをアデノウィルス５ゲノムを含むプラスミドpJM17と293細胞（ATCC No. CRL-1573；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville, MD）の中に同時トランスフェクションし、組換現象及びzFGF−５を含む組換アデノウィルス、AdCMV-zFGF５の生産を及ぼした。zFGF−５cDNAの存在はPCRにより確認した。
アデノウィルスベクターAdCMV-zFGF５を１×1011〜５×1011粒子／マウスの静脈内注射によりin vivoでの遺伝子移入のために用いた。静脈内注射の後、ウィルスの大半が肝臓をターゲッティングし、そして肝細胞を非常に効率的に形質導入せしめることを示した（Herzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：2812-2816, 1993）。細胞はcDNAによりコードされるタンパク質を産生し、そして分泌タンパク質の場合、それらを循環系へと分泌せしめることを実証した。高レベルの発現及び生理学的効果が実証された（OhwadaらBlood 88：768-774, 1996；StevensonらArteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15：479-484, 1995；SetoguchiらBlood 84：2946-2953, 1994；及びSakamotoらProc. Natl. Acad. Sci. USA 91：12368-12372, 1994）。
生後６週目のCD−１マウス（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）をcDNAインサー（AdCMV−ヌル）又はAdCMV−zFGF５を含まないアデノウィルスにより、層静脈を介するIVにより又は周囲心臓内（IPC）的に処置した。全部で５×1011ウィルス粒子／100μｌ／マウスを与えた。注射の14日後、動物を殺し、そして脛骨及び大腿骨を分離することなく取り出し、任意の潜在的な炎症反応を検査した。骨を10％の中性緩衝ホルマリンで固定し、そして処理した。それらを10％のクエン酸ナトリウム入りの５％のギ酸で脱灰し、水で洗い、一連の70％〜100％のエタノールで脱水し、キシレンで浄化し、そしてパラフィン包埋した。検体を脛骨及び大腿骨端線に沿って縦方向に切り、そして骨細胞の同定のためにヘモトキシリン及びエオシンで染色した。骨芽細胞は中心ネガティブゴルジ領域及び偏心核により同定され、破骨細胞はこのような多核不均一形質及びこのような滲出細胞に関わるハウシップ凹窩により同定された。
骨ヒストモルホメトリーのため、大腿サンプルを選んだ。癌性骨体積は、サンプリング部位の多核性に基づき測定しなかった（即ち、大腿サンプルは同平面で正確に切片化しなかった）。３つの骨パラメーターをヒストモルホメトリー変化のために評価した。
１．骨内膜骨芽細胞の数：癌性骨の骨内膜に沿って、成長板に対して1.22mm近位の領域において180×の倍率で測定した。
２．骨内膜破骨細胞の数：癌性骨の骨内膜に沿って、成長板に対して1.22mm近位の領域において180×の倍率で測定した。
３．成長板幅：成長板活性を決定するための末梢端を除き成長板全体に沿って72μｍ毎に90×の倍率で測定した。
データー（平均±SD, ｎ＝４〜７／グループ）の分析は以下を実証した：
１．脛骨と大腿骨との間の接続部において検出可能な炎症反応は認められた。
２．マウスにIV又はIPCで与えたAdCMV−zFGF５は遠位大腿端線において、２週目に検査したときに、骨形成活性を有意に強めた。この骨形成活性の刺激は以下により表示される：
ａ）コントロールのみの対応のベクターと比べての、AdCMV−zFGF５のIV点滴又はIPC注射後の末梢大腿の癌性骨における骨内膜骨芽細胞の数のそれぞれ530％及び263％の有意な増大；並びに
ｂ）骨芽細胞系列に対する骨髄支質細胞の増大した分化を示唆する、骨表層上の増加した骨形成組織の観察。
３．骨内膜破骨細胞の数は、コントロールのみの対応のベクターと比べ、AdCMV−zFGF５のIV又はIPC投与により有意に影響されなかった。
４．成長板幅はAdCMV−zFGF５のIV点滴によっては有意に縮小し、IPC注射では縮小せず、IV点滴後の成長板活性の抑制が示唆される。AdCMV-zFGF５の投与の異なる効果は明らかとならなかった。
これらの結果はzFGF−５が骨芽細胞増列の刺激のための強力なマイトジェンであり、そしてzFGF−５が新しい骨形成を誘導する能力を有することを示唆する。
Ｂ．
上記７Ａと本質的に同じ手順を利用し、マウス当り１×1011粒子のAdCMV-zFGF５を注射した雌CD−１（Jackson Labs）に対してQCTを行った。マウスを注射して30日後に殺し、そして心臓／脛骨長の比はコントロール（空アデノウィルス又は食塩水を注射）と比べて増大していた。グループの間でこの変化を担う脛骨長においては差はなく、またグループ間での任意のその他の器官重量の相違もなかった。かくして、zFGF−５アデノウィルスはQCTによる測定に従い、全骨密度、柱骨密度及び大腿骨の皮質の厚みを選択的に大きくすることを示された。
実施例８
心臓に対するzFGF５の効果
Ｚ．Ｂ．に記載の通り、CD−１マウスにAdCMV−zFGF５の一回のIV注射を与え、４週間後に殺し、そして心臓／脛骨長の比は空のアデノウィルス又は食塩水処置マウスと比べて増大していることが認められた。その結果は、グループ間でこの変化を担う脛骨長における差がないこと、またこのグループ間で任意の他の器官重量に差がないことを示した。この結果は、AdCMV−zFGF５がIVアデノウィルス構築体として投与されたとき、選択的に心臓成長を増大させることを示唆した。
実施例９
zFGF−５の発現
Ａ．zFGF５コードプラスミドの構築
繊維芽細胞成長因子同族体zFGF５をNew England Biolabs（NEB；Beverly, MA）由来のMBP（マルトース結合性タンパク質）融合システムを用いたＥ．コリにおいて発現させた。この系において、zFGF５cDNAをmalE遺伝子の３’末端に付加し、MBP-zFGF５融合タンパク質を形成した。融合タンパク質発現はtacプロモーターにより駆動する；発現はプロモーターが１mmolのIPTG（イソプロピルｂ−チオガラクトシルピラノシド）の添加により誘導されるまで「オフ」となっている。この融合タンパク質の３通りの変異体を作り、それらはMBPからzFGF５を遊離させるその切断部位においてのみ相違する。一つの構築体はMBPとzFGF５ドメインとの間に操作されたトロンビン切断部位を有する。この第二構築体はトロンビン切断部位の代わりにXa因子切断部位を有した。この第三の構築体はトロンビン切断部位の代わりにエンテロキナーゼ切断部位を有した。
これらの構築体はpMAL−Ｃ２ベクター（NEB）の多重クローニング部位（MCS）に従い、且つその製造者の仕様書に従ってMBPとのインフレーム融合体として構築した。zFGF５は慣用のクローニング部位及び切断部位の導入するプライマーを用い、且つ下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRを介して増幅した：１）トロンビン構築体については：ZC12,652（SEQ ID NO：７）及びZC12,631（SEQ ID NO：８）；２）Xa因子構築体についてはZC15,290（SEQ ID NO：９）及びZC12,631（SEQ ID NO：８）；そしてエンテロキナーゼ構築体についてはZC15,270（SEQ ID NO：10）及びZC12,631（SEQ ID NO：８）。各ケースにおいて、天然zFGF５シグナル配列は増幅させなかった；zFGF５はSEQ ID NO：２のアミノ酸残基26で始まる（ValはAlaに変わっている）。トロンビン構築体はXbaＩ-SalＩ zFGF５フラグメントをpMAL−Ｃ２のXbaＩ−SalＩ部位に挿入することにより構築した。Xa因子構築体は平滑SalＩフラグメントをMCSのXmnＩ-SalＩ部位に挿入することにより構築した。エンテロキナーゼ構築体はXbaＩ-SalＩフラグメントをpMAL−Ｃ２のXbaＩ-SalＩ部位の挿入することにより構築した。これらの構築体が構築できたら、それらを様々なＥ．コリ宿主株に形質転換し、そして高レベル発現について分析した。トロンビン構築体（pSDH90.5と命名）をDH10B細胞（GIBCO-BRL）にトランスフェクションし、Xa因子構築体（pSDH117.3）及びエンテロキナーゼ構築体（pSDH116.3）の双方はTOP10細胞（Invitrogen, San Diego, CA）にトランスフェクションした。３つのBPD融合体は全て約63kDである（MBPドメインにおいて43kD、そしてzFGF５ドメインにおいて約20kD）。
Ｂ．相同組換／zFGF５
ピチア・メタノリカにおけるzFGF５の発現は、引用することで本明細書に組入れるPCT WO 9717450記載の発現系を利用する。zFGF５をコードするポリヌクレオチドの全体又は一部を含む発現プラスミドを相同組換により構築する。この発現ベクターはpCZR204から構築し、それはAUG１プロモーター、それに続くαFppリーダー配列、アミノ末端ペプチドタグ、平滑末端SmaＩ制限部位、カルボキシ末端ペプチドタグ、翻訳停止コドン、それに続くAUG１プロモーター、ADE２選択マーカー、そして最後にAUG１ ３’非翻訳領域を含む。また、このベクターの中にはＳ．セレビジエの中での選択及び複製のために必要なURA３及びCEN-ARS配列を含み、更にはＥ．コリでの選択及び複製のために必要なAmpR及びcoLE１ ori配列も含む。このベクターの中に挿入されたzFGF５配列はzFGFアミノ酸配列の残基27（Ala）で始まる。
Ｐ．メタノリカにおけるzFGF５の発現のためのプラスミド、pSDH114を構築するため、下記のDNAフラグメントをＳ．セレビジエの中に形質転換した。SamＩで消化された100ngの「アクセプターベクター」pCZR204；pSDH90.5から遊離され且つzFGF５コード配列を包括する１μｇのXbaＩ−SalＩ制限フラグメント；１μｇの合成PCR構築二本鎖リンカーセグメント〔これは一端において70塩基対のaFppコード配列を含み、そして他端において成熟zFGF５配列由来の70塩基対のアミノ末端コード配列と連続し、それは４本のオリゴヌクレオチドZC13,497（SEQ ID NO：11）、ZC15,131（SEQ ID NO：12）；ZC15,132（SEQ ID NO：18）；ZC15,134（SEQ ID NO：13）から構築したものであり、二本鎖配列のセンス鎖をSEQ ID NO：19に示す（５’リンカー配列（aFpp→zFGF５Ｎ末端））〕、並びに１μｇの合成PCR構築二本鎖リンカーセグメント〔これは一端のzFGF５由来の70塩基対のカルボキシ末端コード配列を含み、その70塩基対のAUG１ターミネーター配列は４本のオリゴヌクレオチドZC13,529（SEQ ID NO：14）；ZC13,525（SEQ ID NO：15）；ZC13,526（SEQ ID NO：16）；ZC13,528（SEQ ID NO：17）から作られたものであり、二本鎖のセンス鎖をSEQ ID NO：２０に示す（3’リンカー配列（zFGF５Ｃ末端→AUG１ターミネーター））〕。Ura+コロニーを選択し、そして得られる酵母コロニー由来のDNAを抽出し、そしてＥ．コリに形質転換させた。適正な発現構築体を担持する個々のクローンをオリゴヌクレオチドZC13,497（SEQ ID NO：11）及びZC13,528（SEQ ID NO：12）によるPCRスクリーニング、それに次ぐzFGF５インサートの存在の確認のための制限消化及び所望のDNA配列が互いに連結されているかを確認するためのDNA配列決定により同定した。大スケールプラスミドDNAを適正なクローンの一つから単離し、そしてそのcDNAをSfiで消化し、ベクター骨格からピチアーzFGF５発現カセットを遊離させた。次にSfiＩ−切断DNAをピチア・メタノリカ発現宿主PMAD16に形質転換し、そしてADEDプレート上で選択のためにプレート培養した。様々なクローンを拾い、そして高レベルzFGF５発現についてウェスタンブロットを介してスクリーニングした。
より詳しくは、小スケールタンパク質製造のため（例えばプレート又は振盪フラスコ製造）、メタノール調節型プロモーター（例えばAUG１プロモーター）を含んで成る発現カセットを担持するＰ．メタノリカ形質転換体をメタノールの存在下及び妨害量のその他の炭素源（例えばグルコース）の非存在下で増殖させる。小スケール実験、例えば発現レベルの一次スクリーニングのため、形質転換体を例えば20ｇ／ｌのBactoアガー（Difco）、6.7ｇ／ｌの酵母窒素ベース（アミノ酸抜き）（Difco）、10ｇ／ｌのメタノール、0.4mg／ｌのビオチン及び0.56ｇ／ｌの−Ade−Thr−Trp粉末を含む固体を培地上で30℃で増殖させてよい。メタノールは揮発性炭素源であるため、それは長時間インキュベーションにより容易に損失する。メタノールの連続供給を、逆さにしたプレートのフタの中に50％のメタノール水溶液を載せ、これによりメタノールが蒸発移動により増殖中の細胞へと移動することにより供与する。一般に、100mmのプレート当り１mlより多くのメタノールは使用しない。若干大きめのスケールの実験は振盪フラスコの中で培養増殖を利用して実施できる。典型的な手順において、細胞を最少メタノールプレートの上に上述の通り30℃で２日間培養し、次いでコロニーを小容量の最少メタノール培地（6.7ｇ／ｌの酵母窒素ベース（アミノ酸抜き）、10ｇ／ｌのメタノール、0.4mg／ｌのビオチン）に約１×106細胞／mlの細胞密度で接種を施すために用いた。細胞は30℃で増殖させる。メタノール上で増殖する細胞は高酸素要求を有し、培養の際に強力な振盪を必要とする。メタノールは毎日再供給した（典型的には１日当り１／100容量の50％のメタノール）。
製造スケール培養のため、高生産性クローンの新鮮培養物を振盪フラスコの中で調製した。次いで得られるクローンを発酵槽の中で培養培地を接種するために用いた。典型的には、強力な撹拌で１〜２日間にわたり30℃で増殖させた500mlのYEPD培養物を５リッターの発酵槽に接種するために用いた。細胞を塩、グルコース、ビオチン及び微量元素を含む適当な培地の中で28℃にて、pH5.0で、＞30％のＯ2を溶解させて増殖させた。グルコースの第一負荷が消費されたら（酵素消費用の低下により表示）、グルコース／メタノール供給物をこの槽に導入し、注目のタンパク質の製造を誘導した。大量スケール発酵は制限炭素条件下で実施するため、供給物の中のグルコースの存在はメタノール誘導性プロモーターを抑制しない。
実施例10
zFGF−５の精製
Ｅ．コリ発酵培地をマルトース結合性タンパク質融合体として（pSDH 90.5；上記）zFGF５を発現する株から得た。MBPzFGF５融合体は音波処理又はフレンチプレス破砕で、20mMのHepes, 0.4ＭのNaCl, 0.01ＭのEDTA, 10mMのDTT, pH7.4を含むバッファーを用いて可溶化した。抽出バッファーは５μｇ／mlの量のペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、ベスタチンも含んだ。フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）も0.5Ｍの最終濃度で含ませた。
この抽出物を18,000ｇで30分４℃で遠心した。得られる上清液をアミロース樹脂（Pharmacia LKB Biotechnology）で処理した。この樹脂は融合体のMBPドメインと結合する。カラムの洗浄により、結合MBPzFGF５融合体は抽出バッファーと同じバッファーであるがDTT及びプロテアーゼインヒビターがなく、10mMのマルトースを含むもので溶出させた。
MBPzFGF５の溶出プールを１：100（ｗ／ｗ）の牛トロンビン：MBPzFGF５融合体で処理した。切断反応は室温で６〜８時間行い、その後反応混合物をベンズアミドSepharose（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ）のベッドに、アミロースアフィニティークロマトグラフィーについて上記したものと同じバッファーを用いて通し、トロンビンを除去した。
切断生成物zFGF５及び遊離MBPドメインを含む通過画分を0.5ＭのNaCl, 20mMのHepes, 0.01ＭのEDTA, pH7.4で平衡にしたToso Haasヘパリンアフィニティーマトリックス（Toso Haas, Montgomeryville, PA）に適用した。MBP及びzFGF５は共にこれらの条件下でヘパリンを結合した。結合タンパク質をカラムバッファー中の0.5ＭのNaCl〜2.0ＭのNaClで形成される２〜３カラム容量の勾配で溶出させた。
MBPは約0.7ＭのNaClで早めに溶出し、そして切断zFGF５は約1.3ＭのNaClで溶出した。プールしたzFGF５画分をもう一回アミロース工程にかけ、微量な夾雑物である任意の残留MBPzFGF５を除去した。精製物質をzFGF５−Hep２と称し、そして還元SDS-PAGE分析で〜20kDaにて一本の高純度物質を示した。
アミノ酸Ｎ末端配列決定は天然IV末端配列を示したが、マススペクトルデーターはＣ末端が「二塩基性部位」が存在するSEQ ID NO：２の残基196（Lys）でトランケーションされたにちがいないことを示唆する分子量を示した。
zFGF５炭水化物は1.3ＭのNaClで非常に安定できる。PBSへの透析により、zFGF５は凝集し、そして溶液相を残した。従って、ヘパリン及びその他の「ポリアニオン」を含む製剤を純粋zFGF５の凝集を防ぐために用いることができうる。
実施例11
抗体の製造
zFGF５に対する抗体を当業界周知の標準技術及び前述の技術を用い、モルモット、ウサギ及びマウスをペプチドQTRARDDVSRKQLRLYC（SEQ ID NO：２アミノ酸残基40〜残基56）（zFGF−１）；YTTVTKRSRRIRPTHRAC（SEQ ID NO：２アミノ酸残基191〜残基207；Ｃ末端にCysが追加）、（zFGF−５）又はSEQ ID NO：２に示す全長zFGF５ポリペプチドとMBP融合タンパク質（MBP-zFGF５）により免疫することで製造した。ペプチドをCys残基を介してマレイミド活性化KLH（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を用いて接合させた。
表７は動物、免疫レベル及び抗体分離の説明である。
0004091122.tif 000010
実施例12
ob／obマウスに対するzFGF５の効果
アジポ細胞及び脂肪代謝に対するzFGF５の効果を雌ob／obマウス（Ｃ57Ｂ１／GJ, Jackson Labs, Bar Harbor, ME）を用いて調べた。マウスは肥満であり、インスリン耐性であり、そして「脂肪骨」を有する。マウスを秤量し、そして全て同じ体重であり、そしてマウス１匹当り1011粒子のAdCMVzFGF−５又はコントロールのための食塩水のみもしくはAdsCMV−GFPを実施例７の通りにIV注射した。注射の17日後、Ad5CMV−GFPの注射したコントロールマウスは注射日の体重と比べて5.342±0.5ｇ増量し、一方AdCMVzFGF−５処置マウスは3.183±0.743ｇ体重が減量していた。
配列表
（２）SEQ ID NO：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：917塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子タイプ：cDNA
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：コード配列
（Ｂ）位置：1...621
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１：
0004091122.tif 000011
0004091122.tif 000012
（２）SEQ ID NO：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：207アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子タイプ：タンパク質
（ｖ）フラグメントのタイプ：内部
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：２：
0004091122.tif 000013
（２）SEQ ID NO：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：24塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC11676
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：３：
0004091122.tif 000014
（２）SEQ ID NO：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC11677
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：４：
0004091122.tif 000015
（２）SEQ ID NO：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC12053
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：５：
0004091122.tif 000016
（２）SEQ ID NO：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：621塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：６：
0004091122.tif 000017
（２）SEQ ID NO：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：47塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC12652
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：７：
0004091122.tif 000018
（２）SEQ ID NO：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC12631
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：８：
0004091122.tif 000019
（２）SEQ ID NO：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：22塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC15290
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：９：
0004091122.tif 000020
（２）SEQ ID NO：10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：47塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC15270
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：10：
0004091122.tif 000021
（２）SEQ ID NO：11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：41塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC13497
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：11：
0004091122.tif 000022
（２）SEQ ID NO：12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：63塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC15131
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：12：
0004091122.tif 000023
（２）SEQ ID NO：13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：39塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC15134
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：13：
0004091122.tif 000024
（２）SEQ ID NO：14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：42塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC13529
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：14：
0004091122.tif 000025
（２）SEQ ID NO：15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：61塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC13525
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：15：
0004091122.tif 000026
（２）SEQ ID NO：16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：61塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC13526
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：16：
0004091122.tif 000027
（２）SEQ ID NO：17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：44塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：cDNA
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC13528
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：17：
0004091122.tif 000028
（２）SEQ ID NO：18の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：62塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（vii）直接起源：
（Ｂ）クローン：ZC15132
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：18：
0004091122.tif 000029
（２）SEQ ID NO：19の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：141塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：19：
0004091122.tif 000030
（２）SEQ ID NO：20の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：144塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：20：
0004091122.tif 000031
【図１】
0004091122.tif 000032
【図２】
0004091122.tif 000033
【図３】
0004091122.tif 000034