(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質をプラスミノゲン、プラスミノーゲンアクチベーター及びプラスミンの基質と接触させ、プラスミノーゲンアクチベーターによるプラスミノゲンの活性化を測定する工程を含む、プラスミノゲンのアンジオスタチン様活性を有する断片への変換を促進する化合物の探索方法。
【請求項２】
（ｉ）プラスミノゲンのアミノ酸位置Ｖ７９−Ｒ５６１のアミノ酸からなるポリペプチド、または
プラスミノゲンのアミノ酸位置Ｖ７９−Ｋ２０８及びＮ２０９−Ｒ５６１のアミノ酸からなるポリペプチドがジスルフィド結合で連結したポリペプチドと、
（ii）プラスミノゲンのアミノ酸位置Ｖ５６２−Ｎ７９１のアミノ酸からなるポリペプチドの断片であって、
プラスミノゲンのアミノ酸位置Ｖ５６２−Ｒ５８０、Ｖ５６２−Ｋ６０７、Ｖ５６２−Ｋ６１５、Ｖ５６２−Ｋ６９８、Ｖ６０６−Ｒ６７７、Ｖ６１６−Ｋ６４５、Ｖ６１６−Ｋ６５１、Ｖ６１６−Ｋ６９８、Ｌ６５２−Ｋ６９８、Ｌ６５２−Ｋ７０８、Ｖ６６２−Ｒ６７７、Ｖ６６２−Ｋ６９８、Ｅ６９９−Ｒ７８９、Ｅ６９９−Ｎ７９１、Ｖ７０９−Ｒ７１９、Ｖ７０９−Ｎ７９１、Ｖ７２０−Ｋ７５０、Ｖ７２０−Ｒ７７６、Ｖ７２０−Ｒ７８９、Ｖ７２０−Ｎ７９１、Ｄ７５１−Ｒ７８９またはＹ７５３−Ｒ７７６からなる群から選択されるポリペプチド
とがジスルフィド結合で連結したポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の方法によって得られる化合物であって、
下記：
【化１】
0004190753.tif 000005
をからなる群から選択される化合物を含むプラスミノゲンのアンジオスタチン様活性を有する断片への変換促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、血管新生阻害作用を持つプラスミノゲン断片の生成を促進する化合物の探索方法、該活性をもつ化合物の利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アンジオスタチンはプラスミノゲン（線溶酵素プラスミンの不活性前駆体）が限定分解を受けて生ずる分子量約４万の蛋白質（プラスミノゲンの第１クリングル領域から第４クリングル領域までの単一ポリペプチド）であり、血管新生を阻害することによりがんの増殖、転移を抑制する。アンジオスタチンは動物実験で劇的な効果を示し、現在アメリカで臨床治験中である。また、クリングル１−３、クリングル１−５、クリングル５などのプラスミノゲン部分分解物にも同様な活性が報告されている。
【０００３】
アンジオスタチンによるがん治療は、精製アンジオスタチン（大腸菌を用いた組換え蛋白あるいは血漿プラスミノゲンのエラスターゼ消化断片を高度に精製）の静脈内投与により行われている。いずれの精製方法も、大きなコストを必要とすし、さらに、エラスターゼ消化によるアンジオスタチン生成においては、エラスターゼの基質特異性の低いことなどが原因で、選択的にアンジオスタチンを生産することができない（多くの副産物を生ずる）、生産されるアンジオスタチンの活性が再現性よく現れない、などの問題点を抱えている。また、アンジオスタチンは蛋白質であり、血液中に直接投与する必要がある。さらに、全身的なアンジオスタチンの投与は、がん組織特異的に血管新生を阻害することが困難である。これに対して、主にがん組織で起る生体内でのアンジオスタチンあるいは同様の活性をもつプラスミノゲン断片の生成を促進する化合物は、生体の持つ調節能力に依存して作用を発揮すると考えられ、がんの進行状態など種々の病態に応じたより有効な血管新生阻害活性（抗がん作用）を示すものと期待される。
【０００４】
このような活性をもつ化合物の例はこれまでに知られていない。また、これを探索して発見・同定するためには、例えば、プラスミノゲンからアンジオスタチンが生成される反応（以下の課題を解決するための手段の項目を参照）をインビトロに再構築し、生成するプラスミノゲン断片をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動などの方法で分析しなければならず、その実行には非常に多くの労力、時間および費用が要求される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、プラスミノゲンからアンジオスタチン様活性をもつ断片への変換を促進する物質を探索するための有効かつ簡便な方法を提供すること、この方法により同定した化合物の利用である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
プラスミノゲンは約９２ｋＤａの一本鎖糖蛋白質であり、アミノ末端側から順にＮ末端ペプチド（ＮＴＰ）、５つのクリングル領域（Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３，Ｋ４，Ｋ５）、セリンプロテアーゼ領域から構成される。プラスミノゲンアクチベーターによりＡｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２間の加水分解により活性型酵素プラスミンとなり、血栓溶解、組織再構築、創傷治癒、排卵など多くの生理機能を発現する。一方、クリングル領域を持つプラスミノゲン断片（Ｋ１−Ｋ５からなるアンジオスタチン、Ｋ１−Ｋ３、Ｋ１−Ｋ４．５、Ｋ５など）は、血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成を抑制して血管新生を阻害する。この作用により、アンジオスタチンは抗がん剤として現在臨床開発中である。プラスミノゲンからのアンジオスタチン生成は次に示す経路で進行する。腫瘍組織に豊富に存在するウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）によりプラスミノゲンがプラスミンに活性化され、その一部は腫瘍組織のホスホグリセリン酸キナーゼの作用により還元されＫ５内のジスルフィド結合が開裂する。この分子がプラスミンなどにより限定分解されＫ１−Ｋ４．５となり、これがさらに腫瘍組織内のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）による限定分解を受けてＫ１−Ｋ４（アンジオスタチン）となる。循環血液中のプラスミノゲンは、ＮＴＰとＫ５との分子内結合をもちタイトなコンホーメーションをとるため、プラスミノゲンアクチベーターによる活性化に抵抗性を示す。発明者は、プラスミノゲンのコンホーメーションをリラックスさせることにより、▲１▼プラスミノゲンのプラスミンへの変換、および▲２▼プラスミンなどのプロテアーゼによるプラスミノゲン断片化が促進でき、アンジオスタチンあるいはアンジオスタチンと同様の活性をもつプラスミノゲン断片の生成が可能となるとの仮説を立てた。すなわち、プラスミノゲンの活性化の促進を指標として、アンジオスタチン様活性をもつプラスミノゲン断片の生成を促進する化合物を発見できると考えた。これを確かめるために、プラスミノゲンの活性化を測定するためのインビトロ反応系を用いて約５０００株の微生物の培養抽出液からこの活性を促進する化合物を探索した。その結果、スタキボトリス・ミクロスポラ（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＩＦＯ３００１８株が生産するスタプラビン（ｓｔａｐｌａｂｉｎ；  請求項２に記載の化合物１）およびＳＭＴＰ−４から８（請求項２に記載の化合物２から６）、無胞子不完全菌Ｆ１６４株が生産するプラクチン（ｐｌａｃｔｉｎ）ＢおよびＤ（請求項２に記載の化合物７および８）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅｓ  ｓｐ．）Ｒ１４０１株が生産するチオプラビン（ｔｈｉｏｐｌａｂｉｎ）Ａ、ＢおよびＣ（請求項２に記載の化合物２１から２３）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ａ１６３１株が生産するコンプレスタチン（ｃｏｍｐｌｅｓｔａｔｉｎ）およびクロロペプチン（ｃｈｌｏｒｏｐｅｐｔｉｎ）Ｉ（請求項２に記載の化合物２４および２５）を活性物質として同定した。また、化学合成したプラクチン誘導体の活性を調べた結果、請求項２に記載の化合物９から２０が同様の活性をもつことを明らかにした。
【０００７】
これらの化合物はプラスミノゲンをｕＰＡで活性化した際に、一過性にプラスミン生成を劇的に促進したが、その後生じたプラスミンの断片化をもたらした。生成したプラスミノゲン断片は分子量５０ｋＤａから７２ｋＤａにまたがり、Ｋ１−Ｋ５を含み、さらにプロテアーゼ領域の一部をジスルフィド結合で連結した新規な分子であった。各種化合物の作用で得られたプラスミノゲン断片は、培養血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成をアンジオスタチンと同様に阻害し、血管新生阻害剤として有用であることが明らかとなった。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明をより詳細に説明する。
【０００９】
Ａ．本発明の第１は、プラスミノゲンのアンジオスタチン様活性をもつ断片への変換を促進する化合物を効率的に探索する方法の開発である。上記の課題を解決する手段の項目で述べたように、これを、プラスミノゲンの活性化の促進を指標に探索する点が本発明の重要なポイントである。これにより、９６穴以上（３８４穴、１５３６穴など）のアッセイプレートを用いた自動測定が可能となり、探索効率の飛躍的上昇がもたらされた。
【００１０】
Ｂ．本発明の第２は、上記方法を用いて同定された化合物（請求項２に記載の化合物１から２５）の作用により生ずるプラスミノゲン断片である。これは、分子量５０ｋＤａから７２ｋＤａにまたがり、Ｋ１−Ｋ５を含み、さらにプロテアーゼ領域の一部をジスルフィド結合で連結した新規な分子であり、培養血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成をアンジオスタチンと同様に阻害した。
【実施例】
以下に本発明の実施例を具体的に説明する。
【００１１】
実施例１
プラスミノゲンのアンジオスタチン様活性をもつ断片への変換を促進する化合物の効率的探索方法。
【００１２】
以下に、９６穴アッセイプレートを用いる活性測定の方法を示す。１００ｎＭプラスミノゲン、５０ＩＵ／ｍｌ  ｕＰＡ、１００μＭ  Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（プラスミンの基質）、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む５０μｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を９６穴アッセイプレート中で３７°Ｃでインキュベートし随時（１から３分ごとに）４０５ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダーで測定した。得られた吸光度を縦軸に、時間の２乗を横軸にとることにより反応初速度（プラスミン生成速度）を求めることができる。微生物培養抽出液の一定量を減圧乾固後この反応液に加え、反応初速度の増加を与えるものを活性検体とした。なお、実施例の数値は１例を示すもので、この測定系においての各成分の濃度、緩衝液の成分とｐＨ、反応液の量、反応温度、反応時間は適宜変更可能であり、本発明はこれらの数値に限定されるものではない。また、プラスミノゲンの代わりにＮ末端リジン型プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）あるいは血漿（最終濃度で１％から５０％程度）を、ｕＰＡの代わりに他のプラスミノゲンアクチベーター（組織型プラスミノーゲンアクチベーターなど）を用いることもできる。
【００１３】
約５０００株の微生物の培養抽出液からこの活性を促進する化合物を探索した結果、ストレプトマイセス属Ｒ１４０１株、ストレプトマイセス属Ａ１６３１株、無胞子不完全菌Ｆ１６４株、スタキボトリス・ミクロスポラＩＦＯ３００１８株の培養液に強い活性を認めた。活性物質を精製単離し、構造決定した結果、請求項２に記載の化合物１から８および化合物２１から２５を同定した。また、また、化学合成したプラクチン誘導体の活性を調べた結果、請求項２に記載の化合物９から２０が同様の活性をもつことが示された（表１）。また、図１に本活性測定結果の１例を示す。
【００１４】
【表１】
0004190753.tif 000002
【００１５】
実施例２
化合物４、８、２２および２４の作用によるプラスミノゲンの断片化（図２）。
【００１６】
図２ＡおよびＢに結果を示す対照の実験ではプラスミノゲン（１００ｎＭ）、ｕＰＡ（５０ＩＵ／ｍｌ）を、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む５０μｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）中３７°Ｃでインキュベートし、反応０から６０分後に反応液の一部（４５μｌ）を取った。これに５μｌの１ｍＭ  Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリドを加え、３７°Ｃでインキュベートし随時（１から３分ごとに）４０５ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダーで測定した。得られた直線の傾きからプラスミン濃度を算出した（図２Ａ）。また、同時に反応液の一部（２１０μｌ）を７０μｌの４０％トリクロロ酢酸と混合して蛋白質を遠心により回収した。これをアセトンで洗浄後１１μｌのＳＤＳサンプルバッファー（２％  ＳＤＳ、５％  ２−メルカプトエタノール、１０％ショ糖、０．０２％ブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を含む６２．５  ｍＭトリス塩酸，ｐＨ６．８）と混合し、その後１０％のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳゲル電気泳動によりプラスミノゲンの断片化を観察した（図２Ｂ）。最初の反応液に、化合物４（２５０μＭ）、化合物８（６０μＭ）、化合物２２（３０μＭ）、および化合物２４（０．３μＭ）を用いて得られた結果を、図２Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦにそれぞれ示す。
【００１７】
図２Ａに示すように、プラスミノゲンの活性化により生ずるプラスミン濃度は経時的に上昇した。これと一致して、プラスミンのＡ鎖およびＢ鎖の増加がＳＤＳゲル電気泳動で確認された（図２Ｂ）。これに対してＳＭＴＰ−６存在下では、プラスミン活性は一過性に上昇したが、その後減少に転じた（図２Ｃ）。活性の減少に伴い、プラスミンＢ鎖の量の減少がＳＤＳゲル電気泳動で示されたが、Ａ鎖の量は経時的に増加した（図２Ｄ）。この結果は、化合物４の存在下ではプラスミンＡ鎖は比較的安定なものの、Ｂ鎖は断片化することを示している。同様に、化合物８、化合物２２、および化合物２４の存在下でもプラスミン濃度の増加は反応１０から３０分後以降見られなくなり（図２Ａ）、これと一致してプラスミンＡ鎖に対するＢ鎖の割合が減少し（図２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ）、Ｂ鎖の断片化が顕著に誘導されることが示された。
【００１８】
実施例３
プラスミノゲン断片の構造解析（図３、図４、表２、表３）。
【００１９】
実験例２に記載の方法で得られたプラスミノゲン断片を、還元条件下で２０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳゲル電気泳動（図３）で分画し、それをＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｉｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜にブロット後クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０で染色した。プラスミノゲン断片のバンド（図３の１から５の矢印）を切り出し、プロテインシークエンサーでＮ末端アミノ酸配列を分析し、表２の結果を得た。また、実験例２に記載の方法で得られたプラスミノゲン断片を凍結乾燥後、還元カルボキシメチル化し、これをＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩後、質量分析（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｏｆｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により分析した。得られた結果を表３に示す。
【００２０】
【表２】
0004190753.tif 000003
【００２１】
【表３】
0004190753.tif 000004
【００２２】
得られた情報を総合して、プラスミノゲン断片の構造を図４に示すように決定した。この結果は、活性化合物の存在下に生成するプラスミノゲン断片は、部分的に断片化したプラスミンＡ鎖とジスルフィド結合で連結したＢ鎖の種々の断片からなる不均一な分子であること示している。これまでにこのような物質は報告されていない。
【００２３】
実施例４
プラスミノゲン断片の精製（図５）。
【００２４】
実験例２に記載の方法で得られたプラスミノゲン断片を含む反応液を水に対して４°Ｃで一晩透析し、これを凍結乾燥した。得られた乾燥物を０．１％トリフルオロ酢酸溶液に溶解後、μＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ  ５μ  Ｃ８−３００Åカラム（１９  ｘ  １５０  ｍｍ；  Ｗａｔｅｒｓ）を用いた高速液体クロマトグラフィーで分画した。この際、展開溶媒として２−プロパノールと０．１％トリフルオロ酢酸溶液の混合溶媒を用い、流速５ｍｌ／分で２−プロパノール濃度を０％で２０分送液した後、毎分０．８％の割合で増加させた。検出は２１０ｎｍの吸収および２８７ｎｍで励起した３４８ｎｍの蛍光の測定により行なった。溶出時間約６０から６２．５分のピークを分取し、これを凍結乾燥した。これを、０．４５μＭの孔経のフィルターで濾過滅菌後、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳゲル電気泳動により非還元条件で分析した（図５）。
【００２５】
電気泳動の結果、精製したプラスミノゲン断片の分子量は６６から７２ｋＤａにまたがることが判明した（図５）。
【００２６】
実施例５
プラスミノゲン断片による血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成の阻害（図６）。
【００２７】
以下の（１）の実験では、実施例４の方法で精製したプラスミノゲン断片を用いた。また（２）、（３）および（４）の実験に用いたプラスミノゲン断片は次の方法で調製された。プラスミノゲン（１００ｎＭ）を化合物４（２５０μＭ）あるいは化合物８（６０μＭ）とともに、ｕＰＡ（５０ＩＵ／ｍｌ）、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で３７°Ｃで１時間インキュベート後、反応液に１ｍＭとなるようにフェニルメタンスルホニルふるおらいど（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）を加え、精製水に対して４°Ｃで一晩透析した。得られた透析液を凍結乾燥後、０．４５μＭの孔経のフィルターで濾過滅菌した。
【００２８】
（１）ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）の増殖阻害。ＢＣＥＣ（１２，５００細胞）を２４穴組織培養プレートに０．５ｍｌの１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ；  ＤＭＥＭ）を用いて播き込んだ。この細胞を２４時間培養後、培地を取り除き、実施例４の方法で精製したプラスミノゲン断片（０．４から４０μｇ／ｍｌ）と０．２５ｍｌの５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭを加え、２０分間インキュベートした。その後、さらに３ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭを０．２５ｍｌ加え、３日間培養を続けた。その後、培地を取り除き、１００μｌの０．０５％トリプシンを含むリン酸緩衝生理食塩水を加え、３７°Ｃで５分間放置後、細胞を懸濁して血球計算版で細胞数を測定した。
【００２９】
図６Ａに示すように、実施例４の方法で精製したプラスミノゲン断片は、培養ＢＣＥＣの増殖を０．２−２０μｇ／ｍｌで１７−５３％阻害した。
【００３０】
（２）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖阻害。ＨＵＶＥＣは内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ；２％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、１２μｇ／ｍｌウシ脳抽出液（ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒａｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔ）を含む内皮細胞基礎培地（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて培養した。トリプシンにより剥離したＨＵＶＥＣ（２，５００細胞）を９６穴組織培養プレートに０．１ｍｌのＥＧＦを含まないＥＧＭを用いて播き込んだ。この細胞を２４時間培養後、培地を取り除き、プラスミノゲン断片（０．６から６μｇ／ｍｌ）あるいはアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）（２０μｇ／ｍｌ）と０．１ｍｌのＥＧＦ不含ＥＧＭを加え、２０分間インキュベートした。その後、さらに２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子を含むＥＧＭを０．１ｍｌ加え、３日間培養を続けた。その後、培地を取り除き、０．１ｍｌのＥＧＭと１０μｌ  ＷＳＴ−１試薬（ＭＴＴ法に基づく細胞増殖測定キット）（同人化学）加え、４時間３７°Ｃでインキュベートした。その後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞数の指標とした。
【００３１】
図６Ｂに示すように、化合物４および８の作用で生ずるプラスミノゲン断片は、培養ＨＵＶＥＣの増殖を０．３−３μｇ／ｍｌで６８−８６％阻害した。比較のために用いたアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）は、１０μｇ／ｍｌで７４％の増殖阻害を示した。
【００３２】
また、この増殖阻害作用の特異性を確認するため、血管内皮細胞以外の細胞の増殖に対するプラスミノゲン断片およびアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）の影響を調べた。用いた細胞は、ＨＴ１０８０ヒトファイブロサルコーマ（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞および初代ラット皮膚繊維芽細胞で、ＨＴ１０８０細胞およびラット繊維芽細胞は１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、血管内皮細胞を用いた実験と同様の方法で細胞増殖活性を測定した。その結果、図６Ｃに示すように、化合物４および８の作用で生ずるプラスミノゲン断片はアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）と同様に、１０μｇ／ｍｌでこれらの細胞の増殖に影響しないことが示された。
【００３３】
（３）ＨＵＶＥＣの遊走阻害。ＨＵＶＥＣを血清およびＥＧＦを含まず、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＥＧＭで１晩培養後、２０μｇ／ｍｌのプラスミノゲン断片あるいは２０μｇ／ｍｌのアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）を添加した同培地に懸濁し、２０分間インキュベートした。１５μｇフィブロネクチンでコートした８μｍの孔経のポリカーボネート膜インサートを、０．１％ウシ血清アルブミンと１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む０．５ｍｌのＥＧＭの入った２４穴組織培養プレートに差し込み、ポリカーボネート膜上に上記の細胞懸濁液０．５ｍｌ（１１０，０００細胞を含む）を播き込んだ。これを５時間培養し、ポリカーボネート膜インサートを取り出した。膜上面の細胞を綿棒で取り除いた後に、膜を通して移動した細胞をギムザで染色し、顕微鏡観察（１００倍）した。
【００３４】
図６Ｄに示すように、化合物４および８の作用で生ずるプラスミノゲン断片は、培養ＨＵＶＥＣの遊走を１０μｇ／ｍｌで２３−３１％阻害した。なお、比較のために用いたアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）は３７％の阻害を示した。
【００３５】
（４）ＨＵＶＥＣの管腔形成阻害。２４穴組織培養プレートに、２．６％ウシ胎児血清と０．２４％タイプＩコラーゲンを含む０．２ｍｌ  ＭＣＤＢ１３１培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）入れてゲルを形成させ、これにＨＵＶＥＣ（４０，０００細胞）を０．１ｍｌの２％ウシ胎児血清を含むＭＣＤＢ１３１培地を用いて播き込んだ。この細胞を２時間培養後、培地を取り除き、１０μｇ／ｍｌプラスミノゲン断片あるいは１０μｇ／ｍｌアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）、２．６％ウシ胎児血清および０．２４％タイプＩコラーゲンを含む０．２ｍｌ  ＭＣＤＢ１３１培地を重層した。３０分後、さらに１０μｇ／ｍｌプラスミノゲン断片と２％ウシ胎児血清を含む０．２ｍｌ  ＭＣＤＢ１３１培地を加え２４時間培養した。その後、倒立顕微鏡（４０倍）で細胞を観察した。
【００３６】
図６Ｅに示すように、化合物４および８の作用で生ずるプラスミノゲン断片は、ＨＵＶＥＣの管腔形成を１０μｇ／ｍｌで強く阻害した。比較のために用いたアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）にも同様の阻害作用がみられた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、プラスミノゲンのアンジオスタチン様活性をもつ断片への変換を促進する化合物の有効かつ効率的な探索が可能となった。また、この方法により同定された化合物の作用により生ずるプラスミノゲン断片は新規な血管新生阻害物質であり、これを提供することを可能とした。
【図面の簡単な説明】
【図１】活性測定結果の一例。
【図２】活性化合物の作用によるプラスミノゲン活性化の促進とその結果生ずるプラスミンの断片化。Ａには化合物４（ＳＭＴＰ−６）、８（ｐｌａｃｔｉｎ  Ｄ）、２２（ｔｈｉｏｐｌａｂｉｎ  Ｂ）および２４（ｃｏｍｐｌｅｓｔａｔｉｎ）の作用によるプラスミノゲン活性化の経時変化を、ＢからＦにはそれぞれ、対照（化合物無添加）および化合物４、８、２２、２４の存在下での反応のＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す。図中の矢印ＡはプラスミンのＡ鎖、矢印ＢはＢ鎖の位置を示す。
【図３】活性化合物の作用により生ずるプラスミノゲン断片の解析。化合物４（ＳＭＴＰ−６）、８（ｐｌａｃｔｉｎ  Ｄ）、２２（ｔｈｉｏｐｌａｂｉｎＢ）および２４（ｃｏｍｐｌｅｓｔａｔｉｎ）の作用により生ずるプラスミノゲン断片を、還元条件下で２０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳゲル電気泳動で分画した。図中の矢印ＢはプラスミンのＢ鎖を示す。
【図４】活性化合物の作用により生ずるプラスミノゲン断片の構造の数例太い実線はペプチド鎖を示し、細い実線はシステイン残基間のジスルフィド結合を表す。各アミノ酸は１文字表記で表されている。
【図５】活性化合物の作用により生ずるプラスミノゲン断片の精製。化合物４（ＳＭＴＰ−６）、８（ｐｌａｃｔｉｎ  Ｄ）、２２（ｔｈｉｏｐｌａｂｉｎＢ）および２４（ｃｏｍｐｌｅｓｔａｔｉｎ）の作用により生ずるプラスミノゲン断片をμＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ  ５μ  Ｃ８−３００Åカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで精製後、非還元条件下で７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳゲル電気泳動で分析した。Ｍは分子量マーカー、Ｐｌｇはプラスミノゲンを示す。レーン１は化合物４存在下に生ずるプラスミノゲン断片（精製前）、レーン２はその精製後のサンプル、レーン３は化合物２４存在下に生ずるプラスミノゲン断片（精製前）、レーン４はその精製後のサンプル、レーン５は化合物２２存在下に生ずるプラスミノゲン断片（精製前）、レーン６はその精製後のサンプル、レーン７は化合物８存在下に生ずるプラスミノゲン断片（精製前）、レーン８はその精製後のサンプル。
【図６】活性化合物の作用により生ずるプラスミノゲン断片による血管内皮細胞の増殖、遊走および管腔形成の阻害。ＡはＢＣＥＣの、ＢはＨＵＶＥＣの、ＣはＨＴ１０８０細胞、ラット繊維芽細胞ならびにＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖に対する影響を示す。ＤはＨＵＶＥＣの遊走、ＥはＨＵＶＥＣの管腔形成に対する影響を示す。ＡＳ（Ｋ１−Ｋ３）はアンジオスタチン（Ｋ１−Ｋ３）を示す。
【図１】
0004190753.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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